CN1602358A - 重组融合蛋白及其三聚体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有能够形成三聚体的性能的重组融合蛋白。该重组融合蛋白包括至少一种组分A和至少一种组分B。组分B具有三聚化性能，而组分A具有生物性能。本发明还涉及该重组融合蛋白的三聚体。本发明还涉及该三聚体在药物生产中的应用和它们用于体外诊断或体外诊断试剂的生产的应用。本发明还涉及编码该融合蛋白的DNA序列和表达载体和含有该DNA序列或表达载体的宿主细胞。

Description

重组融合蛋白及其三聚体

本发明涉及能够形成三聚体的重组融合蛋白，该重组融合蛋白包括至少一种组分A和至少一种组分B，组分B具有三聚化性能，而组分A具有生物性能；本发明还涉及这些重组融合蛋白的三聚体。本发明还涉及这些三聚体用于生产药物的应用及其用于体外诊断或生产体外诊断试剂的应用。本发明还涉及编码这种融合蛋白的DNA序列、表达载体和包括该DNA序列或表达载体的宿主细胞。

大量的蛋白质天然存在，其生理形式为三聚体形式。这些在溶液中发生三聚化的蛋白质表面的相互作用可能导致蛋白质聚集，这种聚集自发发生或由于以下的事实而以延迟的方式，例如动力学延迟的方式发生：这些聚集是依赖于浓度或介质的。这些原因作用力是疏水相互作用，氢键、共价键如二硫桥键和/或库仑力。

但是此外，某些蛋白质具有导致形成特定的结构依赖性分子间超二级结构，从而导致形成蛋白质三聚体和其它多聚化状态的结构基元。超二级结构的形成基于形成这些三聚体的蛋白质特征氨基酸序列。例如可以提及的超二级结构是已知的为“卷曲螺旋式三股螺旋”的超二级结构，它通过特征性α-螺旋的相互作用而发生蛋白质的三聚化，这种现象在每一种形成卷曲螺旋形式的蛋白质的情况下发现。作为蛋白质的分子间“三聚化结构域”的卷曲螺旋式三股螺旋在结构方面是一种彼此卷曲环绕的三链超螺旋。这些具有三股螺旋特征的卷曲螺旋基元具体在细胞外蛋白质三聚体中发现，但非常特别地在结缔组织的蛋白质或蛋白质复合体中发现。

因此，例如Beck等人(J.Mol.Biol.(1996)256，909-923)描述一种已知为软骨基质蛋白(CMP)的结缔组织蛋白，其聚集成为同源三聚体的基础是具有卷曲螺旋模式的三股螺旋，这种螺旋导致三种互补螺旋(各自作为多肽组分)聚集。七氨基酸模式(abcdefg)_n是这种形成三股螺旋的螺旋的氨基酸序列的特征。在位置a和d的七氨基酸模式的氨基酸通常已经连接到它们的非极性侧链，从而导致形成上述的超螺旋结构，在这种情况下，三股螺旋包含三螺旋。

还在来自胶原家族的蛋白质中发现由于超二级结构的形成导致的特定的结构依赖性多聚化现象。这里，胶原纤维的结构特征是原胶原，它由三条螺旋扭曲的多肽组成。而且，头发的原纤维由具有“卷曲螺旋”基元的α-角蛋白三股螺旋组成，虽然它是左旋形式。

此外，根据术语Clq家族，蛋白质Clq、胶原α1(X)、α2(VII)、越冬(overwintering)蛋白质、ACRP30，内耳结构蛋白质、小脑肽和多聚体蛋白(multimerin)归类于蛋白质家族，因为它们的各自多聚化序列片段具有序列同源性(Kischore和Reid，Immunopharmacol.，42(1999)15-21)，并且由于它们的结构，这些蛋白质是较高聚集体的形式，例如三聚体。例如，在此家族中发现的具有多聚化性能的蛋白质中，已知来自补体系统的蛋白质Clq的结构特征是单体，这些单体的每一个具有一个已知为“头”的球形结构域和“胶原的(collagenaceous)”螺旋状序列片段。这种螺旋状序列片段形成卷曲螺旋式三股螺旋，由此发生单体的三聚化。接着，6个这些Clq三聚体形成寡聚体，接着蛋白质三聚体的寡聚化基于单独的卷曲螺旋式三股螺旋之间的相互作用。这种蛋白质或多-(寡-)聚化蛋白质复合体Clq的结构排列是一种还称为“花束”的构建体，它确保18个球状、C-末端排列的“头”域连接得到一种三聚体的六聚体。

还在蛋白质ACRP30，另一种来自Clq家族的蛋白质中发现类似于Clq蛋白质的结构(Hu等人，J.Biol.Chem.，Vol.271，No.18，10697-10703，1996)。这种血清蛋白由脂肪细胞分泌，它三聚体的最可能四聚体，其中球状C-末端结构域通过胶原性三股螺旋连接；Clq蛋白质的情况也是如此。据估计四个这些三股螺旋接着通过适宜的相互作用而最终形成寡聚体。Shapiro和Scherer的公开(Current Biology 1998，8：335-338)表明了在X射线结构分析的帮助下测得的ACRP30同源三聚体的结构。

其它现有文献中已知的蛋白质是来自胶原凝集素类的蛋白质，它们的特征是胶原结构域、颈区以及球状羧基末端凝集素结合域。同样在生理学上发现这些胶原凝集素作为三聚体的寡聚体。因此，例如蛋白质肺表面活性剂蛋白质A(SP-A)和甘露糖结合蛋白(MBP)，各自来自胶原凝集素家族，由于它们的“胶原”结构域的相互作用而发生三聚化作用，并最终作为三聚体的六聚体形式出现(Epstein等人，CurrentOpinion in Immunology，Vol.8，No.1，1996，29-35)。因此，已知名为胶原凝集素的蛋白质还形成多聚体(例如三聚体)的寡聚体(例如六聚体)。

文献还公开大量的在生理上作为信号分子的蛋白质仅能够转导处于特定状态的生物信号。因此，例如膜结合的FasL具有生物活性，即细胞凋亡活性，但从膜结合的片段(已知为sFasL)中消去细胞外蛋白片段之后，该非膜结合的sFasL部分不再能够在生理学上使靶细胞发生细胞凋亡作用。Schneider等人的公开(J.Exp.Med.，Vol.187，No.8，1998，1205-1213)描述如何通过使用交联抗体实现在从膜结合的蛋白片段消去以后得到的上述sFasL三聚体的生物作用的生理功能的再活化。为此目的，构建并表达由FasL的三聚化结构域、短接头序列和flag标记(具有flag氨基酸序列(一字母编码)DYKDDDDK)组成的融合蛋白，通过指向对抗flag标记的抗体使这种非结构依赖性三聚化(即不通过导致形成超二级结构的特定的二级结构相互作用)融合蛋白发生交联。

未公开的德国专利申请DE 19963859公开了二、三、四或五聚体的二聚体或寡聚体，即较高级的聚集体，它由包含两组分A和B的重组融合蛋白组成。例如，为了增加TNF细胞因子的生物(细胞凋亡)活性，根据DE 19963859的重组融合蛋白的组分A可以例如是TNF细胞因子，而组分B是连接重组融合蛋白得到较高级聚集体的蛋白质片段。

虽然这些具有潜在的细胞凋亡活性的复合体在许多医学适应症中是理想的，但许多疾病的治疗需要提供可靠地阻断细胞凋亡事件触发的物质。根据Suda等人的公开(J.Exp.Med.1997，186，pp.2045-2050)已知可溶的FasL三聚体可以在某些情况下阻断由寡聚分子导致的细胞凋亡。物质如基于蛋白质的物质能够可靠地阻断例如受体本身的细胞凋亡事件的触发，它在性质上不是天然的，因而被更好的保护以对抗体内生理退化，但它在现有技术中是未知的。

因此，本发明的目的是提供这样的物质：作为一种生物分子，它能够用作受体本身的生物阻断剂，从而例如抑制细胞凋亡信号转导级联的引发。

本发明的目的定义为权利要求1的主题，即包括至少一种组分A和至少一种组分B的重组融合蛋白的三聚体，组分A包括一种具有生物功能，特别是具有结合功能的蛋白质或蛋白片段，而组分B包括一种将不具有第三分子活性的重组融合蛋白三聚化，即产生生物学活性组分A的三聚体的蛋白质或蛋白片段。因此本发明提供这样的三聚体：它不能形成较高级聚集体，例如三聚体的二聚体；但在每种情况下以三聚体的总数计，基本上以至少90％，优选至少95％，非常具体地优选至少99％的数量作为三聚化重组融合蛋白存在于溶液。

具有生物功能的蛋白质或蛋白片段(融合蛋白中的组分A)理解为具体意指具有配体功能的蛋白质，非常具体地意指对抗体或受体，(即它能够作为一种结合配偶体与一种或多种分子相互作用)、修饰的氨基酸序列如具有共价或非共价结合的活性成分(如果合适的话具有有机化学性质)的氨基酸序列、具有互补位的抗体或抗体片段或者激素如肽激素。在上下文中，本发明基于这样的发现：用作本发明组分A的特定的信号蛋白、其片段或衍生物仅在较高级聚集体形式时具有生物活性；相反作为三聚体，它们在体外和体内与受体结合，但不激活这些受体，而是竞争性占据结合位点，且不能触发生物激活信号，而仅仅是阻断。

在生理学膜结合信号蛋白中，例如在TNF细胞因子的情况下，包含膜外，特别是细胞外蛋白片段的裂解产物优选作为三聚化重组信号蛋白的组分A。但是，可以用作抗原的氨基酸序列也可以用作重组融合蛋白中的组分A。最后，受体，如来自TNF受体家族的受体(例如FasR)或这种受体的片段或衍生物同样具有结合功能(因而作为结合配偶体与另一种分子如膜结合FasL相互作用)，因而对于本发明的目的它也被术语“配体”所涵盖，它也可以用作组分A。当患者身上存在高非生理浓度的互补生物配体时，这些能够结合的生物受体片段特别适于用作药物。

在一个优选的实施方案中，在本发明的三聚体中存在的组分A可以包含相同的组分A(同源三聚体)或不同的组分A(异源三聚体)，即多种重组融合蛋白可以形成本发明的三聚体。通过这种方式，具有多种组分A，如果合适的话具有不同生物功能的蛋白质可以在本发明的三聚体中结合在一起。这里两种重组蛋白质的组分A可以相同，而第三个融合蛋白可以关于其组分A不同，或者所有三个融合蛋白可以关于其组分A不同。以这种方式选择、排列、特定组合和/或三聚体中的组分A的数目一般可以细微地调节抑制作用，如果合适的话可以完成与激活作用组合。

在另一个优选的实施方案中，重组融合蛋白中的组分A采用以下形式：肽类激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素或这些物质的片段，优选能够结合的片段。但是，上述肽、蛋白片段和/或蛋白质的功能衍生物也可以用作是本发明三聚体成分的重组融合蛋白中的组分A。

根据本发明的三聚重组融合蛋白的另一个优选的实施方案，它的组分A包含一种受体，例如肽类激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素的受体，或者本发明的融合蛋白的组分A采用这些受体的片段或衍生物的形式。这些受体的特别优选的实例为来自TNF受体家族的受体，特别是FasR(下文简称为Fas)。

术语生物活性蛋白质、蛋白片段或肽的功能衍生物具体指保持生物功能，特别是与相互作用的配偶体，如膜结合的受体结合的性能，但其序列表现出与对应的天然序列不同的蛋白质。这些序列衍生物可以采用一种或多种插入、缺失和/或置换的形式，所用的衍生物和天然序列之间的序列同源性优选为至少70％，更优选至少85％，特别优选至少90％。术语功能衍生物具体涵盖具有与生理序列比较有更保守置换的氨基酸序列。术语保守置换指同类氨基酸彼此交换的置换。具体而言，存在具有脂肪族侧链、带正电或负电的侧链、位于侧链的芳基的氨基酸，或者侧链能够形成氢桥键，例如具有羟基官能的侧链的氨基酸。这意味着例如具有极性侧链的氨基酸被另一个具有相同极性的侧链的氨基酸置换，或例如以疏水侧链为特征的氨基酸被另一个具有同样的疏水侧链的氨基酸置换(例如丝氨酸(苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)置换，或者亮氨酸(异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)置换)。插入和置换具体可能存在于不发生空间结构变化或涉及结合区域的序列位置。例如，可以借助CD光谱(圆二色谱)容易地检测插入或缺失导致的空间结构的变化(Urry，1985，Absorption，circular Dichroism和ORD of Polypeptides，in：Modern Physical Methods in Biochemistry，Neuberger等人(Ed.)，Elsevier，Amsterdam)。例如在以下出版物中公开了用于产生具有包含相较于天然序列的置换的氨基酸序列的蛋白质的适宜的方法US4,737,462、US 4,588,585、US 4,959,314、US 5,116,943、US 4,879,111和US 5,017,691。Sambrook等人(1989，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press)也具体描述了衍生物的产生，它可遗漏、补充或置换密码子。其它衍生物可以具体为这样的蛋白质：该蛋白质被稳定以避免生理学降解，例如通过取代酰胺类型键，如还可以使用β-氨基酸稳定蛋白质主链。

为本发明目的，配体理解为意指所有参与结合反应的分子。因此，配体还可以是一般称为受体的蛋白质。而且这种受体可以是用于本发明目的的“配体”，例如当它与它的相互作用的配偶体如信号分子结合时。

重组融合蛋白的三聚体具体优选的情况是：该重组融合蛋白中的组分A是来自TNF细胞因子家族的细胞因子，这种TNF细胞因子的片段，或者TNF细胞因子或对应的TNF细胞因子片段的功能衍生物。通过与对应的受体在体内结合(例如在以较高级聚集体的形式结合的情况下)，用于靶细胞的TNF细胞因子的生物作用可以导致诸如细胞凋亡、增殖或激活等作用，但这些三聚体一般仅确保与所关注的受体结合而不再发挥激活功能。在一个非限制性的列举中，适宜的TNF细胞因子和因此的适宜的融合蛋白中的组分A，具体为蛋白质OX40L、RANKL、TWEAK、Lta、Ltab2、LIGHT、CD27L、41-BB、GITRL、APRIL、VEGI和BAFF或它们的片段或衍生物。非常具体优选蛋白质CD40L、FasL、TRAIL、TNF(特别是与受体TNF-R2结合的TNF)、CD30L和EDA或者它们的片段或衍生物。优选使用的重组融合蛋白中的组分A是上述膜结合的TNF细胞因子的细胞外片段或它们的功能衍生物。这些裂解产物在保持它们对所关注的受体的结合能力时非常特别优选。上述TNF细胞因子或TNF细胞因子的片段的上述意义的功能衍生物还可以用作融合蛋白的组分A。在一个非常优选的实施方案中，重组融合蛋白的组分A是本发明三聚体的组分，它选自hFasL(AA139-281)、hTRAIL(AA9 5-281)、hCD40L(AA 116-261)和m或hTNFα(AA 77-235)。

因此，根据本发明以下可能结果已经以在三聚体形式存在于溶液中：选择重组融合蛋白的组分A，而该重组融合蛋白将成为本发明寡聚物的组分。在这种情况下，组分B将更进一步促进组分A的三聚化。例如这种情况发生在已在溶液中发生典型的三聚化的组分A如TNF配体或它的片段或衍生物进一步被组分B稳定化为它的三聚形式的时候。相反，在重组融合蛋白的组分A本身在溶液或体内不表现出表面相互作用调节的三聚体结构的情况下，本发明的组分B必须确保重组融合蛋白的组分A的三聚化。后者的情况是例如典型地当仅天然蛋白质的片段同样不能三聚化或至少在体内不以三聚体形式存在的时候，例如因为平衡向单体大大转移，也就是说，例如细胞因子的片段，特别是以下C-末端片段(例如包含来自C末端的至少100 AA(在每种情况下根据C末端计算)，优选至少120 AA，特别优选至少150AA)：FasL、CD40L、CD30L、TRAIL、EDA或TNF用作重组融合蛋白的组分A。

但是在一个优选的实施方案中，重组融合蛋白的组分A还可以采用本发明的氨基酸序列的形式，其适于用作受体激动剂或受体拮抗剂的载体。因此，例如药理学活性小有机化学分子一般可以共价偶联成这种氨基酸序列，例如通过与苏氨酸或丝氨酸形成的醚键，一种类酰胺键或者通过酯键共价偶联。这种偶联的激动剂或拮抗剂可以增大本发明三聚体的结合常数，优选将其增大到至少10^-9M^-1，或者可以调节生物活性，特别是本发明三聚体的抑制行为，尤其是关于抑制细胞凋亡信号级联的触发。此外，本发明的三聚体可以用作药理学活性物质的载体。通过选择适宜的载体，可以这种方式将本发明的三聚体，一种药理学活性成分选择性地转运到特定细胞的附近空间，而这些特定的细胞构成这些活性成分的药理学靶体。例如一种可能性是使这种活性成分与FasL三聚体偶联，FasL三聚体的结合阻断FasR(从而根据本发明，以这种方式抑制细胞凋亡，安全地保护所述细胞的存活)，并使活性成分直接应用于靶细胞。这种系统的一种可能的应用例如可以是三聚体与细胞毒性物质如活性成分连接导致的，所述的物质阻止免疫细胞攻击靶细胞，例如在发生变性，特别是神经变性疾病，尤其是帕金森氏病或阿耳茨海默氏病的情况下。这样根据本发明在帕金森氏病的情况下可以因此防止黑质中产生多巴胺的细胞的凋亡。因此本发明总体上公开了本发明的这种载体系统和，如果合适的话共价偶联活性成分的组分用作人或兽医的药物的应用。

重组融合蛋白的组分B一般将采用来自Clq蛋白质家族或胶原凝集素家族的蛋白质的形式。特别优选来自Clq或胶原凝集素家族的蛋白质作为重组融合蛋白的组分，即作为组分B，此时仅三聚化结构域，而不是寡聚化结构域被转录或翻译成为重组融合蛋白的组分。优选重组融合蛋白中的组分B也不包括球状“头”域，即上述天然状态蛋白质的特征。因此，本发明的重组融合蛋白中的上述组分B会具有一般仅包括如胶原、片段的序列，这种序列具有由于形成三股螺旋而发生三聚化的功能，但它不是还具有与其它三股螺旋形成二或寡聚结构(例如三股螺旋的四或六聚体)的能力的序列片段。

因此三聚化融合蛋白一般仅包含来自Clq蛋白质家族或胶原凝集素家族的蛋白质的结构域作为负责三聚化的组分B，而它们各自的“头”域将被其它作为同样表现生物功能的组分A的蛋白质或蛋白片段取代。因此为本发明的目的，术语“重组融合蛋白”理解为意指重组融合蛋白中至少一种组分A和至少一种组分B发生人工融合，即用于本发明目的的融合蛋白对应于非天然存在的蛋白质。

Clq蛋白质家族或胶原凝集素家族的蛋白质的功能性，即三聚化衍生物，或者上述蛋白质的片段的功能衍生物也可以用作使重组融合蛋白聚集得到三聚体的组分B。例如，组分B将包括相关的蛋白质Clq、MBP、SP-A(肺表面活性剂蛋白质A)、SP-D(肺表面活性剂蛋白质D)、BC(牛血清胶固素)、CL43(牛胶原凝集素-43)和/或ACRP30的序列片段，或者这些蛋白片段的功能衍生物。

特别优选重组融合蛋白的三聚体的情况是：当重组融合蛋白的组分B包括来自形成三股螺旋的胶原序列区域的序列片段长度至少为8AA，一般至少20AA的蛋白质Clq或蛋白质ACRP30的蛋白片段，或者这些蛋白片段的功能衍生物。本发明的非常特别优选的实施方案是重组融合蛋白的三聚体，它的组分B包括如图1所示的氨基酸序列(读框序列，AA 45-111)或这种鼠(m)氨基酸序列的功能衍生物(例如同源的人序列或同源的另一种哺乳动物的序列)或这种序列的片段。

特别优选包含来自不同宿主微生物的序列的融合蛋白的三聚体。非常特别优选本发明的聚集体的情况是：它们来自嵌合融合蛋白，组分A来自不同于组分B的动物种类。因此，这种情况可能是有利的：组分A对应于来自小鼠、大鼠、猪或另一种脊椎动物，特别是哺乳动物的氨基酸序列，或者对应于这种序列的功能衍生物，而组分B来自人，反之亦然。可选择地，形成本发明的三聚体的本发明的融合蛋白中的组分A和组分B的序列还可以优选来自相同的动物种类。

在本发明的另一个优选的实施方案中，在重组融合蛋白中作为组分B存在的大于6个氨基酸，优选8-30个氨基酸，非常特别优选8-20个氨基酸的短氨基酸序列引起重组融合蛋白三聚化。由于这些短氨基酸序列实现的这种融合蛋白的三聚化一般基于超二级结构的形成，特别是基于卷曲螺旋式三股螺旋的形成。例如，适用于此目的是所有由于形成超二级结构，例如典型的胶原三股螺旋或这些螺旋的片段而产生三聚体的蛋白质的序列片段(在它们[脱漏]例如在蛋白质CMP、COMP、胶原或层粘连蛋白的情况下)。

由于根据本发明，导致三聚化的重组融合蛋白的组分B应该基本上不形成较高的聚集体，组分B通常应当不包括能形成分子间二硫桥键的半胱氨酸残基。优选重组融合蛋白中的组分B因此[脱漏]不是半胱氨酸残基，或者仅仅是包含分子内二硫桥键的半胱氨酸残基，也就是说处在重组融合蛋白本身之内，以避免在氧化条件下可能出现与另一种三聚体的融合蛋白的至少一种半胱氨酸残基形成共价键的情况。

除了组分A和B之外，该融合蛋白可以包括其它序列片段。在上下文本中，优选用于本发明目的的序列是已知为标记序列，如至少一个flag标记序列，即氨基酸序列DYKDDDDK，和/或例如至少一个组氨酸标记(包括若干连续的组氨酸，例如至少5个)和/或其它标记序列或抗原序列。此外，本发明的融合蛋白的各种片段(组分A、B或标记序列，也可以是在本发明的融合蛋白中存在的两个或更多个组分A)可以通过接头序列彼此分离。这些接头序列(至少2AA，优选至少5AA)用于重组融合蛋白中各种功能性组分的结构界定，并还可以优选发挥“绞链”功能，即具有柔性结构的氨基酸序列。特别优选包括至少一个蛋白酶剪切位点的接头，它使组分A能与组分B分离。该接头中的蛋白酶剪切位点优选是凝血酶共有序列。

原则上，可以将组分A排列为与组分B发生C-或N-末端相联，优选C-末端。标记序列可以存在于本发明重组融合蛋白的任何位置，优选在N末端。

用于阻断细胞膜外受体的方法也公开为本发明的另一个主题。这些方法的特征是至少一种对应于具有生物功能的蛋白质或蛋白片段的组分A和至少一种三聚化组分B的重组，其中首先(a)在例如表达载体中表达这种重组融合蛋白，(b)分离，然后(c)加到细胞培养物，例如细胞悬浮液，用于进行体外研究。因此本发明的方法适于在体外研究中保护细胞，例如保护细胞免于细胞凋亡性细胞死亡。这些具有如该方法所述结合的本发明的三聚体的细胞可以进一步用于体外研究或用于生产药物。如果结合常数高，则这种体外处理的细胞可以再移植。例如，这种方法适用于自身免疫疾病或变性疾病的情况，以保护细胞免于发生体内细胞凋亡性死亡。

上述类型的方法在以下情况下特别优选：组分A为TNF细胞因子、TNF细胞因子的片段或这种蛋白质或蛋白片段的功能衍生物。

本发明的三聚体适于生产药物或用于治疗疾病或病症以进行医学应用，即用于人和兽医学，特别是当组分A为信号蛋白或这种信号蛋白的片段或所述蛋白质或片段的衍生物。可以用本发明主张的三聚体(异源或同源三聚体)治疗大量的疾病或病症。它们具体应用于在这些症状中观察到各种生理学配体的细胞外浓度增大或膜结合的受体的数量增大的时候。实例是细胞本身的膜结合的信号分子如TNF细胞因子(例如FasL)或可溶性信号分子如由于蛋白酶剪切而可溶的TNF细胞因子的浓度增大。在一个非限制性的举例中，本发明的这种三聚体可以用于例如生产治疗过度炎症、自体免疫疾病、基于过度细胞凋亡反应，或者变性的疾病，特别是神经变性疾病(例如帕金森氏病)的药物，如果合适的话还病毒感染。本发明的三聚体在以下情况下非常特别地合适：当所述疾病要求意在防止天然细胞因子的生物活性的治疗，即用于阻断对应的细胞因子受体。提及的实例为：治疗病毒性肝炎(HBV，HCV)、酒精性肝炎病、胆汁淤积性肝炎、威尔森病、由自体免疫系统无功能导致的肝炎，治疗以下肝移植排斥反应：GvHD、TEN(毒性表皮坏死松解症)、桥本甲状腺炎或多发性硬化。

本发明还涉及编码上述类型的融合蛋白的DNA序列。这些DNA序列在表达载体上表达，对应的包括本发明融合蛋白的DNA序列的的表达载体也是本发明的主题。本发明还延伸到用编码本发明的融合蛋白的DNA序列转染的宿主细胞。本发明中非常特别优选用表达载体转染的宿主细胞，该表达载体进一步包括编码本发明的融合蛋白的DNA序列。所有上述的本发明的主题适于作为药物或用于生产药物，特别是用于治疗本专利申请公开的疾病，如果合适的话作为组合物的组分。

在本发明的范围内，本发明的三聚体或本发明的其它主题优选以这种方式用于生产药物或用于治疗上述疾病或病症，因而它们适于肠胃外，例如皮下、肌内、动脉内或静脉内或口服或鼻内或肛门、腹膜内、阴道或颊的、大脑内、眼内给药(注射或灌输)，如果合适的话还用于局部应用。

每一种本发明的三聚体或形成本发明的三聚体的宿主细胞，或者编码能够形成三聚体的重组融合蛋白的DNA序列，或者适宜的表达载体可以本身作为药物或用于生产药物。但是，它们还可以用作与其它活性成分组分或药学助剂、载体或添加剂组合的药物。因此，本发明的三聚体或本发明的另一主题可以与药学上可接受的载体、助剂和/或添加剂结合成为组分。因此本发明还公开了包括本发明的主题，特别是本发明的三聚体的(药物)组合物。适宜的制备方法公开在“Remington′s Pharmaceutical Sciences”(Mack Pub.Co.，Easton，PA，1980)，这里引用该文献的内容作为参考。例如，用于肠胃外给药的适宜的载体为无菌水、无菌盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘，特别是生物相容的交酯聚合物、交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。本发明的组合物可以包括填充剂或诸如以下的物质：乳糖，甘露醇，用于将聚合物如聚乙二醇共价连接到本发明的抑制剂上、与金属离子络合或将材料包含在特定的聚合物化合物制剂内部或上面的物质，例如聚乳酸、聚乙酸、水凝胶或脂质体、微乳剂、胶束、单层或多层脂质体、红细胞片段或原生质球。各组合物的实施方案的选择取决于物理行为，例如根据溶解度、稳定性、生物利用度或降解性。本发明的组合物中受控或恒定释放的活性成分组分包括基于亲脂贮存物(例如脂肪酸、蜡或油)的配方。本发明的物质的包衣或包括这些物质的组合物，即含聚合物的包衣同样在本发明的公开范围之内(例如泊洛沙姆或poloxamines)。而且，可以提供具有保护性包衣，例如蛋白酶抑制剂或渗透剂的本发明的物质或组合物。

本发明的三聚体还优选用于体外诊断或例如生物化学纯化方法领域。本发明三聚体在生物化学纯化方法中，特别是在层析方法中的应用也是可行的，例如用于填充有这种复合体例如以能够分离表达对应的细胞外受体的细胞的纯化柱。因此，这种复合体用于检测目的的应用也公开本发明的范围之内。

这里描述的本发明的另一个主题是适于进行[缺漏]三聚化的融合蛋白，条件是该重组融合蛋白包括至少一种组分A和至少一种组分B，组分A包括一种具有生物功能，特别是对抗体或受体的配体功能的蛋白质或蛋白片段，而组分B包含三聚化片段或这种蛋白片段的功能衍生物，如上述作为本发明的三聚体的组分的片段。因此，所有这些重组融合蛋白为以上公开的作为本发明的三聚体组分的本发明公开的重组融合蛋白。因此以上的公开-关于本发明的三聚体-关于组分A和B和关于重组融合蛋白的构建对应于本发明的重组蛋白质的实施方案。因此，本发明重组融合蛋白的组分B通常是一种选自Clq蛋白质家族或胶原凝集素家族，或者选自胶原蛋白家族的蛋白片段；而该重组融合蛋白的组分B优选排它地包括三聚片段，但不包含三聚体寡聚结构或球形“头”域。因此通常组分B将包括至少一个具有七氨基酸模式的氨基酸序列(abcdefg)_n，该氨基酸序列在结构上形成一种形成三股螺旋的螺旋，其中在位置a和d的氨基酸优选与它们的非极性侧链连接，因而能够形成上述的超螺旋结构，在这种情况下三股螺旋由三条螺旋组成。这种至少一个七氨基酸模式，优选至少2个七氨基酸模式的序列可以来自例如以下蛋白质之一的角蛋白：胶原、Clq、MBP、SP-A、SP-D、BC、CL43或ACRP30。上述蛋白质的这种片段的功能衍生物也可以在本发明的范围内使用，以上选择的组分A的功能衍生物的定义也类似地适用于组分B。

本发明的其它主题是一种由于形成二硫桥键(ApoFasL-060)而在体外在溶液中作为六聚体(2×3)存在的抑制剂。这种抑制剂在体内存在-如果合适的话存在于氧化介质-以三聚体形式存在，或者表现为类似三聚体的方式，因而发挥抑制性能。ApoFasL-060由N-末端flag序列、接头和特定的接头与来自hFasL的AAs 103-138，同样来自hFasL的AAs139-281(组分A)组成(见图1)。类似地，作为组分A的ApoFasL-060类型的抑制剂还可以具有对应的其它TNF细胞因子的结合片段，例如OX40L、RANKL、TWEAK、Lta、Ltab2、LIGHT、CD27L、41-BB、GITRL、APRIL、VEGI和BAFF或它们的片段或衍生物。非常特别优选蛋白质CD40L，FasL，TRAIL，TNF(特别是与受体TNF-R2结合的TNF)、CD30L和EDA和它们的片段和衍生物，尤其是它们各自的人序列。

通过以下的图更为详细地例示本发明：

图1表示一个字母编码的本发明的FasL嵌合体(FasL-199、FasL-060和FasL-267)的氨基酸序列。两种蛋白质嵌合体FasL-199和FasL-267包括蛋白质ACRP30组分，一种在结构上类似互补因子Clq并由脂肪细胞生产的血浆蛋白质。天然ACRP30蛋白质的长度为247个氨基酸，具有在N末端的分泌信号序列(AA1 to 17)和其后的27个氨基酸的序列(AA18-44)，所述序列负责蛋白质的寡聚。天然蛋白质之后的片段(AA45-110)包括22个胶原序列重复，从而形成卷曲螺旋结构域。在天然状态下，这种卷曲螺旋结构域导致发生三聚化。

蛋白质嵌合体FasL-199(对照)在PCR扩增的帮助下构建，并包括完全的鼠ACRP30(mACRP30)的寡聚化结构域(氨基酸18-110)。在C末端方向，FasL嵌合蛋白FasL的三聚化结构域(氨基酸139-281)、接头序列位于N-末端flag标记和mACRP30片段之间，并位于mACRP30(组分B)和人hFasL片段(组分A)(LQ)之间。

嵌合蛋白FasL-267主要对应于构建体FasL-199，但它缺失mACRP30片段。它不包含ACRP30的寡聚化结构域(氨基酸18-44)。缺失突变体由EST克隆AA673154通过PCR方法产生。mACRP30的氨基酸18-44的缺失导致构建体以三聚体的形式存在，这得到凝胶过滤实验证明。

嵌合蛋白质FasL-060具有在N末端的flag序列，随后是接头(GPGQVQLQ)，一种可以形成二硫桥键的特定接头，人FasL(hFasL)的AA103-138，和最后作为组分A的hFasL的AA139-281。根据是否形成二硫桥键，ApoFasL-060表现为类似于三聚体或六聚体。

在图2A中，图2显示ApoFasL-060和ApoFasL-267的体外关于Bjab细胞的存活力的活性。在Y轴上绘制在OD490nm处的吸光率，并在X轴绘制该细胞毒性试验中加入的融合蛋白的浓度(取对数)。在490nm处的光密度是细胞存活力的度量(高光密度对应于加入物质的低细胞凋亡活性，从而对应于高细胞存活力)。所示的曲线是关于在每一种不加入交联抗体的情况下，或者在每一种加入交联抗体(●，■)的情况下的ApoFasL-267(o)、ApoFasL-060()的试验曲线。与具有交联抗体的FasL-267相比，FasL-267单独对细胞不具有细胞毒性，甚至在高浓度(即微稀释)下也如此。

图2B显示图2A所示的ApoFasL-267(o)和ApoFasL-060()的抑制活性。为了能够测定抑制活性，在所有的实验中加入浓度为50ng/ml的寡聚FasL以触发细胞凋亡。

图2C显示亲合力研究的结果，并在每种情况下将FasL-199和FasL-267对Bjab细胞的亲合力进行比较。ApoFasL-267和FasL-199与ZB4抗体竞争以结合到BJAB细胞上的Fas。分别绘制结合的ZB4(抗Fas抗体)的百分率对FasL199()和FasL-267(o)的浓度的图。在测定误差的范围内，在两种FasL配体的亲合力方面没有发现差别。因此证明两种配体之间在它们的细胞毒性方面的差别的基础不是对受体的不同结合亲合力。

图3显示体内实验的结果，即ApoFasL-060对激动性抗Fas抗体J02诱导的肝细胞溶解的抑制作用。图3A显示实验的结果，其中对小鼠在静脉内注射5μg的J02抗体之前静脉内注射ApoFasL-060(25μg/小鼠)或盐水(对照)。图3A中的实心棒条代表ALT的血清滴定度(以U/ml为单位)，而空心的棒条代表AST的，作为静脉注射注射后4小时的测定结果。右边的图表示对照实验的结果。图3B表示小鼠的存活率，该小鼠已在用盐水溶液(实心棒条)或ApoFasL-060(20μg)(浅灰色棒条，在每种情况下为从左开始的第二个棒条)预处理或仅用ApoFasL-060(深灰色棒条，在每种情况下为从左开始的第三个棒条)或ApoFasL-060和交联抗体(中等灰色棒条，在每种情况下处在右边)预处理之后接受10μg的J02抗体，将所述存活率作为给药后经过的时间(2小时、4小时、24小时)的函数。在4小时后，仅接受激动性J02抗体(黑色棒条)的小鼠无一存活，而抑制剂(浅灰色棒条)使基本上所有的小鼠存活。因此，ApoFasL-060防止激动性抗Fas抗体J02对小鼠的致死作用。进而交联抗体取消ApoFasL-060(中等灰色棒条)的抑制作用。

图4显示在寡聚FasL诱导肝损害之后的ApoFasL-267的作用。图4显示小鼠在静脉内注射寡聚FasL(FasL-199)之前静脉内注射盐水或25μgApoFasL-267的实验结果。在过4小时后分析ALT(实心棒条)和AST(空心的棒条)的血清滴定度。而且，这些棒条代表各种以U/ml为单位的滴定度。图4的中间和右边的图表示施用激动性，即触发细胞凋亡的FasL之后的结果，而左边的图代表不施用激动性FasL的情况下的对比实验。因此图4不仅表示对照实验的结果，而且表示不含保护性配体的FasL-199的实验结果，以及与保护性配体FasL-267结合的FasL-199的结果。

图5显示在AAP诱导的肝炎的情况下可溶的FasL的作用。在给小鼠腹膜内注射AAP(300mg/kg)之前静脉内注射ApoFasL-267(图5A)或ApoFasL-060(图5B或5C)。图5A和5B的图是在每种情况下在注射后5小时测得的ALT(实心棒条)和AST(空心棒条)的滴定度(U/ml)。图5A和5B中左边的图对应于对比实验，而右边的图(图5A)以及在图5B的情况下中间和右边的图显示施用本发明的抑制剂之后的结果。图5C显示与模拟处理(对照)动物(100％)相比的氨基转移酶滴定度的相对减小。

图6显示ApoFasL-267和ApoFasL-060对AAP处理的鼠肝的作用。如图5所述处理小鼠。在诱导肝炎后24小时，解剖肝并进行组织学评价。图6包含三幅组织学切片图(加入AAP、加入AAP和ApoFasL-267，最后在加入盐水后的对比设置(对照))。用ApoFasL-267(或ApoFasL-060，未显示)处理小鼠防止肝损害，这可以从与对照动物的组织切片的比较中看出。相反，单独用AAP处理的动物的肝表现为中央小静脉区坏死和细胞凋亡、窦状隙炎性充血和形成空泡的肝细胞。

图7A显示本发明的Fas嵌合体Fas-ACRP30(MKB216)的cDNA序列和它的衍生氨基酸序列。该构建体包括细胞外Fas域(即Fas受体)的氨基酸17-172，通过长度为14个氨基酸的接头融合到鼠ACRP30的完全寡聚化结构域(氨基酸18-110)。在其氨基末端，该构建体还包括Ig重链的信号序列和flag标记。而且，图中显示了限制切割位点。

图7B显示一个限制图，表示图7A的构建体的剪切位点。

图8记录Fas-ACRP30的体外在A20细胞中抗FasL介导的细胞凋亡的抑制作用。在Y轴上绘制在490nm处的吸光率(细胞存活力测定；还参照图2)，而在X轴上绘制以ng/ml为单位的所关注的融合蛋白的浓度。将Fas-ACRP30的抑制作用与Fas-Fc，Fas的二聚体形式的抑制作用和Fas-COMP，Fas的五聚体形式的抑制作用进行比较。所用的细胞凋亡诱导剂是本发明的FasL嵌合体，FasL-199。Fas-ACRP30构建体抑制FasL诱导的细胞凋亡，且其IC₅₀值为80ng/ml。此值与五聚Fas衍生物Fas-COMP(35ng/ml)的值相当，而(二聚)FasFc的IC₅₀值大于1μg/ml。

用以下实施例更详细地例示本发明：

除非这里另外指定，以下的实验条件(a)-(f)适用于以下6个应用实施例：

(a)FasL、TRAIL、TNFα和CD4OL融合蛋白的载体构建体：

使用寡核苷酸JT398(ACT GCA GGA AAA AAA GGA GCT G)和J290(CAA CAT TCT CGG TGC CTG TAA C)，由人cDNA扩增FasL的三聚化结构域(AA 139-281)。将此PCR产物连接到pCRII(InVitrogen)，然后在缺失碱基720-769的修饰的PCRIII载体(PS038，InVitrogen，NV Leek，The Netherlands)(PS 038)的限制剪切位点HindIII和BamHI之间亚克隆编码序列，该编码序列通过限制剪切位点PstI和EcoRI进行读框，包括编码血细胞凝集素信号肽的DNA片段，包括5′-未翻译的序列(CAA AAC ATG GCT ATC ATC TAC CTC ATC CTCCTG TTC ACC GCT GTG CGG GGC)和flag表位(GAT TAC AAA GACGAT GAC GAT AAA)的6个碱基、接头(GGA CCC GGA CAG GTGCAG)、限制剪切位点PstI、SalI、XhoI和BamHI。

如下构建FasL-199的表达载体。使用EST克隆AA673154，在寡核苷酸JT1147(ACA ATG CAT GAA GAT GAC GTT ACT AC)和JT1148(AGA CTG GAG AGC GGC TTC TCC AGG)的帮助下首先完成PCR扩增。将通过限制剪切位点NsiI和PstI读框的编码鼠ACRP30的氨基酸18-111的序列[缺漏]克隆到编码三聚FasL的载体的PstI剪切位点中(以这处方式使融合的NsiI/PstI剪切位点在该编码序列的5′侧)。借助可选择的5′-寡核苷酸JT1421(AAA ATG CAT GCA GGC ATC CCAGGA C)扩增表达融合蛋白FasL-167(含mACRP30的AA44-111)的载体。将PCR产物连接到PCR“平”系统，并将Nsi/PstI盒亚克隆到上述含有FasL的载体。通过使各个配体序列进入限制剪切位点PstI和EcoRI而取代表达载体FasL-ACRP30上的各FasL序列，从而产生其它具有可选择的与ACRP30结合的TNF细胞因子的融合蛋白。

(b)重组蛋白质的表达和纯化：

借助磷酸钙法稳定地转染HEK293细胞。HEK293细胞在培养三天后在包括800μg/ml G418的选择培养基中生长两周(还参见loc.cit.：Schneider等人，J.Exp.Med.1998)。移出这些稳定转染的克隆并将其分配到含有选择培养基的96孔平板。借助抗flag蛋白质印迹技术分析上清液中重组蛋白质的存在。

稳定转染的细胞在处在烧瓶中的800ml非选择性培养基中生长10-14天。将培养物离心，并将上清液过滤灭菌。然后如下纯化含有鼠ACRP30(FasL-267或FasL-199)的FasL的融合蛋白。用NaCl和CaCl₂(最终浓度分别为150mM和2mM)处理上清液，用盐酸/氢氧化钠水溶液使pH变为7.0。然后，将重组蛋白质应用于1ml M2-琼脂糖柱(Sigma，Switzerland)(0.5ml/min，48小时，40℃)，并用10体积包括2mMCaCl₂的TBS洗涤该柱，最后用TBS-EDTA(10mM)(0.1ml/min，40℃)或50mM柠檬酸盐/NaOH(pH2.5)(1ml/min，40℃)洗脱，如果合适的话用0.2体积的1M Tris-HCl(pH8)中和。在30kDA排阻限的浓缩器(Millipore)中用PBS换缓冲液。通过bicinchonic酸法，使用牛血清清蛋白作为标准品测定纯化蛋白质的浓度(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL.USA)，并通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色来测定样品纯度。

(c)细胞：

使人T-lymphoplastoma Jurkat细胞、BJAB Burkitt淋巴瘤细胞或Raji细胞在伴有10％FCS的RPMI中生长。在补充2％FCS的DMEM多物质混合物F12(1∶1)中培养人胚肾细胞293。所有的培养基包括抗生素(每种情况下5μg/ml的青霉素和链霉素和10μg/ml的新霉素)。

(d)细胞毒性试验：

基本上如上述Schneider等人(J.Biol.Chem.272：18827-18833，1997)所述完成细胞毒性试验。这里在100μl培养基中将50 000个细胞培养16小时，所述培养基包括存在或不存在1μg/ml M2抗体的以上所示的配体浓度。借助PMS/MTS(phenanzine硫酸二甲酯3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-5-[3-羰基甲氧基苯基]-2-[4-磺苯基]-2H-四氮唑，盐)(PromegaCorp.，Madison，WI)测定细胞存活率。使颜色在需要的时间内发育(一般1-3小时)。在490nm处测定吸光率。490nm处的光密度是细胞存活力的度量(高光密度对应于加入物质的低细胞凋亡作用，从而对应于高细胞存活力)。

(e)小鼠的治疗

给雌性Balb/c小鼠(8-10周龄)静脉内注射多种构建体。在指定的时间之后使小鼠流血，然后对氨基转移酶AST和ALT(天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶)的滴定度进行定量。

(f)材料

从Sigma(Buchs，Switzerland)购得偶联琼脂糖的抗-flag-M1和抗-flag-M2抗体。从Pharmingen购得J02抗体，并从Life Sciences(Basle，Switzerland)购得细胞培养试剂。

(g)结合研究

使用竞争试验测定ApoFasL-267和FasL-199的亲合力。为此目的，利用iodo-Gen法(Pierce，Rockford，IL)用100μCi(125I)标记单克隆ZB4抗Fas抗体。这导致1.5μCi/μg蛋白质的特定活性。在37℃下用连续稀释的(100μg/ml-10ng/ml)放射性标记的ZB4和未标记的竞争物将1×105Bjab细胞培养1小时。用包括1％BSA的冷PBS洗涤三次后，使用γ-计数器测定细胞上结合的放射活性，并表示为结合的cpm的百分率。所有的实验以一式三份完成。

而且，关于用于实施应用实施例的方法的说明，特别参考Schneider等人(J.Exp.Med.，Vol.187，No.8，1998，1205-1213)和本文引用作为参考的出版物。

应用实施例1

表达重组融合蛋白(1，FasL-199)，该重组融合蛋白包括hFasL(h：人)的氨基酸139-281作为组分A，和组分A的氨基酸139的N末端长度为94AA的序列(mACRP30的AA18-111)作为组分B。在融合蛋白的N末端(组分B的N末端)，还表达具有氨基酸DYKDDDDK的flag序列和排列在flag标记和结合的偶联B之间的接头序列GPGQVQLQLH(见图1)。组分A和B被接头序列LQ分隔。

关于对比实验，表达这样的融合蛋白(2，FasL-267)：它在其N末端同样包括上述flag序列和C末端之后的相同接头序列，而在C末端的排列中包括hFasL的氨基酸139-281。因此通过缺失包含特定的接头和hFasL的氨基酸103-138而使融合蛋白(1)不同于融合蛋白(2)(图1)。

如以上方法所述构建融合蛋白(1)和(2)的载体。表达该融合蛋白，并如在方法(b)中所述进行纯化。

通过电子显微镜法测定纯化的融合蛋白(1和2)的多聚化或寡聚化程度。结果是作为六聚体(2×3聚体)的FasL-199和关于FasL-267的对应的测定值得到三聚体和同样作为六聚体的ApoFasL-060的结果。

应用实施例2

ApoFasL-060和ApoFasL-267对Fas介导的体外细胞凋亡的抑制作用

移出根据(c)所述生长的Bjab-Burkitt淋巴瘤细胞，并根据(d)所述对其进行细胞毒性试验。关于此细胞系，如下完成试验：在每种情况下使用增加浓度的三聚化融合蛋白ApoFasL060和ApoFasL-267，在抗flagM2抗体(Sigma，Buchs，Switzerland)(图2A)存在或不存在下，通过测定在OD 490nm下的吸光率。所用的抑制剂，ApoFasL-060和ApoFasL-267如图1所示(参见应用实施例1)。

当与指向flag标记的抗体交联时，两种抑制剂均揭示类似的细胞凋亡诱导性能(图2A)。当不存在交联抗体时，由于ApoFasL-060的聚集体结构，它也诱导细胞凋亡。因此应用实施例2的结果证明，虽然ApoFasL-060和ApoFasL-267各自能够与Fas受体结合，但它们需要寡聚化以转导死亡信号。两种抑制剂的细胞毒性降低并不有助于Fas受体亲合力的减小，因为它们对寡聚FasL(FasL-199)的亲合力没有减小。

此外，用增加的ApoFasL-267浓度预培养Bjab细胞，然后加入FasL-199以诱导细胞凋亡(参见图2B)。它表明可以由ApoFasL-267防止FasL-199诱导的细胞凋亡。从这一系列的测定可以看出，三聚体分子形式的ApoFasL-267能够在体外防止抑制浓度(IC)100ng/ml下的细胞凋亡。因此，虽然三聚体形式的ApoFasL-267通过阻断受体而防止细胞凋亡，但ApoFasL-060聚集不能在体外防止FasL-199诱导的细胞凋亡，因为它本身由于其结构导致其具有细胞凋亡诱导作用。

应用实施例3

诱导肝细胞溶解后的体内实验

A.ApoFasL-060的作用

为此目的，给小鼠注射激动性J02-抗-Fas抗体，从而由于暴发性肝功能衰竭而导致处理小鼠死亡。通过高氨基酸转移酶(AST和ALT)血清滴定度来检测这些小鼠的肝细胞溶解。用ApoFasL-060(1mg/kg)对小鼠进行实验预处理，从而保护在给动物施用J02抗体之后免于由后者触发的肝功能衰竭(肝细胞溶解)(参见图3A)。如所预期的，ApoFasL-060的保护作用是依赖于剂量的。当施用5μg的J02抗体时，所观察到的AST和ALT滴定度对应于对照小鼠的那些。在10μg的J02抗体的剂量下，观察到显著的保护作用(AST和ALT滴定度降低大约90％)。因此结果是，除非使用一种交联抗体(图3B)，ApoFasL-060本身不具有毒性，因而细胞凋亡抑制作用的也基于与Fas受体的结合而不触发死亡信号。

J02抗体的致死剂量(10μg/每只小鼠，静脉内注射)导致所有研究的小鼠在4小时内死亡(图3B)。用ApoFasL-060预处理这些动物大幅度地降低死亡率-24小时后的存活率总计86％。抑制剂ApoFasL-060(本身注射)证明无毒-但是在注射交联抗体之后它具有高毒性作用，且在4小时后的死亡率为80％。

B.ApoFasL-267的作用

在此应用实施例中，在注射FasL-199之前给小鼠注射盐水(作为对照)或ApoFasL-267。因此随后评价在被处理的小鼠的肝细胞溶解分析中的各AST和ALT血清滴定度(参见图4)。用ApoFasL-267预处理的小鼠被保护免于发生由寡聚FasL(FasL 199)诱导的肝细胞溶解。在用作对照的动物中，可以在FasL-199给药之后非常快速地观察到FasL诱导的肝细胞溶解(在2小时内)，表明氨基转移酶滴定度增加10倍。因此，用ApoFasL-267预处理动物防止动物的肝损害，这可以由AST和ALT血清滴定度测得。

应用实施例4

对乙酰氨基酚(AAP)诱导的肝炎的抑制

对乙酰氨基酚(AAP)，一种止痛药，已知诱导暴发性肝功能衰竭。其分子机理基于Fas介导的细胞凋亡。因此在本应用实施例中研究了三聚ApoFasL-267和/或六聚ApoFasL-060保护肝细胞免于AAP诱导的细胞凋亡的可能性。为此目的，给小鼠腹膜内注射次致死剂量的AAP(0.3g/kg)。5小时后，通过测定ALT和AST血清滴定度而测定肝损害。根据IFCC(国际临床化学联盟)指南在酶试验中测定ALT和AST滴定度。施用ApoFasL-267或ApoFasL-060防止AAP导致的AST或ALT滴定度增大。与未处理的小鼠相比，对已根据本发明预处理的小鼠进行观测时的氨基转移酶滴定度显著降低(75-90％)。

用ApoFasL-060预处理的保护作用证明是依赖于剂量的(参见图5B和5C)。施用25μg的ApoFasL-060(1mg/kg)，没有观察到AAP诱导的肝细胞溶解；当注射12.5μg时，氨基转移酶滴定度稍微增加，即发生轻微的肝损害，而甚至更低的剂量如6μg/小鼠导致保护作用丧失。在低剂量和已用盐水处理的对照动物之间没有观察到差别。因此可以指出，所观察的抑制作用采用受体上结合位点发生竞争性占据的形式。

对AAP诱导的肝损害进行组织学检查(图6A)。必须提及以下：中心小静脉区域的坏死和细胞凋亡、窦状隙炎性充血、形成空泡的肝细胞。相反，如图6B所示，在用ApoFasL-267(或ApoFasL-060，未显示)预处理时这些肝损害的症状是不可辨别的。

应用实施例5

A.Fas受体嵌合体的构建

为了制备一种非常有效的FasL介导的细胞凋亡的抑制剂，制备一种由通过长度为14个氨基酸的接头连接的Fas受体的细胞外结构域(氨基酸17-172)和鼠ACRP30的完全寡聚化结构域(氨基酸18-110)组成的融合蛋白(图7)。该重组蛋白用SDS-PAGE法分析，在还原条件下的表观分子量为55kDa，而在非还原条件下的表观分子量为150kDa。因此可以断定构建体MKB216(下文称为Fas-ACRP30)基本上以六聚体(2×3聚体)的形式存在。

B.Fas-ACRP30对FasL介导的细胞凋亡的抑制作用

为了证明本发明的融合蛋白Fas-ACRP30对FasL介导的体外细胞凋亡的抑制作用，用增加的Fas-ACRP30浓度预培养FasL-敏感性A20细胞，然后加入寡聚FasL。本发明的构建体FasL199具体用作本实验中的特别有效FasL寡聚体。以这种方式将本发明的构建体Fas-ACRP30的作用与Fas的二聚体形式(Fas-Fc)和Fas的五聚体形式(Fas-COMP)的作用进行比较。如图8所示，80ng/ml的Fas-ACRP30浓度可以导致FaSL介导的细胞凋亡降低大约50％。此值显著低于二聚的对比构建体Fas-Fc的值(IC₅₀＞1μg/ml)。IC₅₀为35ng/ml的Fas-COMP的抑制作用与Fas-ACRP30的抑制作用相当。因此这些数据证实Fas-ACRP30是一种有效的FasL介导的细胞凋亡的抑制剂。

                                      序列表

<110>Apotech Research & Development Ltd.(除了US)

TSCHOPP，Jur(仅US)

SCHNEIDER，Pascal(仅US)

<120>重组融合蛋白及其三聚体

<130>AP01P002WO

<140>PCT/EP02/05103

<141>2002-05-08

<160>14

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>213

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述ApoFasL-060

<220>

<221>结构域

<222>(1)..(8)

<223>Flag

<220>

<221>结构域

<222>(9)..(16)

<223>接头

<220>

<221>结构域

<222>(17)..(34)

<223>特定的接头

<220>

<221>结构域

<222>(35)..(70)

<223>人FasL aa 103-138

<220>

<221>结构域

<222>(71)..(213)

<223>人FasL aa 139-281

<220>

<221>二硫键

<222>(29)

<400>1

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu Gln

  1               5                  10                  15

Val Asp Leu Glu Gly Ser Thr Ser Asn Gly Arg Gln Cys Ala Gly Ile

             20                  25                  30

Arg Leu Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu

         35                  40                  45

Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly

     50                  55                  60

His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His

 65                  70                  75                  80

Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp

                 85                  90                  95

Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly

            100                 105                 110

Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr

        115                 120                 125

Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr

    130                 135                 140

Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys

145                 150                 155                 160

Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr

                165                 170                 175

Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn

            180                 185                 190

Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe

        195                 200                 205

Gly Leu Tyr Lys Leu

    210

<210>2

<211>255

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：ApoFasL-199

<220>

<221>结构域

<222>(1)..(8)

<223>Flag

<220>

<221>结构域

<222>(9)..(16)

<223>接头

<220>

<221>结构域

<222>(17)..(110)

<223>小鼠ACRP30 aa 18-111

<220>

<221>结构域

<222>(111)..(112)

<223>接头

<220>

<221>结构域

<222>(113)..(255)

<223>人FasL aa 139-281

<400>2

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu His

  1               5                  10                  15

Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val Pro

             20                  25                  30

Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly His

         35                  40                  45

Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Pro

     50                  55                  60

Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gly Leu Leu Gly Pro Lys Gly

 65                  70                  75                  80

Glu Thr Gly Asp Val Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly Phe

                 85                  90                  95

Pro Gly Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Ala Ala Leu Gln

            100                 105                 110

Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn

        115                 120                 125

Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu

    130                 135                 140

Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr

145                 150                 155                 160

Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys

                165                 170                 175

Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr

            180                 185                 190

Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr

        195                 200                 205

Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn

    210                 215                 220

Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu

225                 230                 235             240

Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

                245                 250                 255

<210>3

<211>229

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：ApoFasL-267

<220>

<221>结构域

<222>(1)..(8)

<223>Flag

<220>

<221>结构域

<222>(9)..(16)

<223>接头

<220>

<221>结构域

<222>(17)..(84)

<223>小鼠ACRP30 aa 44-111

<220>

<221>结构域

<222>(85)..(86)

<223>接头

<220>

<221>结构域

<222>(87)..(229)

<223>人FasL aa 139-281

<400>3

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu His

  1               5                  10                  15

Ala Gly Ile Pro Gly His Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp

             20                  25                  30

Gly Arg Asp Gly Thr Pro Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gly

         35                  40                  45

Leu Leu Gly Pro Lys Gly Glu Thr Gly Asp Val Gly Met Thr Gly Ala

     50                  55                  60

Glu Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro

 65                  70                  75                  80

Gly Glu Ala Ala Leu Gln Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His

                 85                  90                  95

Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp

            100                 105                 110

Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly

        115                 120                 125

Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr

    130                 135                 140

Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr

145                 150                 155                 160

Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys

                165                 170                 175

Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr

            180                 185                 190

Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn

        195                 200                 205

Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe

    210                 215                 220

Gly Leu Tyr Lys Leu

225

<210>4

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

在本发明的重组融合蛋白中的Flag序列

<400>4

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

  1               5

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

     在重组融合蛋白ApoFasL-060中的接头序列

<400>5

Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu Gln

  1               5

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：接头

     序列(说明书28页)

<400>6

Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu Gln Leu His

  1               5                  10

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

寡核苷酸JT398(用于hFasL-三聚化结构域

的扩增)(说明书24页)

<400>7

actgcaggaa aaaaaggagc tg                                      22

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

寡核苷酸J290(用于hFasL-三聚化结构域

的扩增)(说明书24页)

<400>8

caacattctc ggtgcctgta ac                                      22

<210>9

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

编码血细胞凝集素的信号肽的DNA片段

(说明书24页)

<400>9

caaaacatgg ctatcatcta cctcatcctc ctgttcaccg ctgtgcgggg c      51

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：Flag表位，

本发明的FasL-蛋白质的部分编码序列

(说明书24页)

<400>10

gattacaaag acgatgacga taaa                                     24

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：接头，part

本发明FasL-蛋白质的部分编码序列(说明书24页)

<400>11

ggacccggac aggtgcag                                            18

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

寡核苷酸JT1147(在用于FasL-199的载体构建体中用于PCR扩增)

(说明书25页)

<400>12

acaatgcatg aagatgacgt tactac                                    26

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

寡核苷酸JT1148(在用于FasL-199的载体构建体中用于PCR扩增)

(说明书25页)

<400>13

agactggaga gcggcttctc cagg                                      24

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：

寡核苷酸JT1421(在用于FasL-167的载体构建体中用于PCR扩增)

(说明书25页)

<400>14

aaaatgcatg caggcatccc aggac                                     25

Claims (19)

1.一种重组融合蛋白的三聚体，其特征在于所述重组融合蛋白包括至少一种组分A和至少一种组分B，组分A包括具有生物功能，特别是对抗体，对可溶或膜结合的信号分子或者对受体或抗体或抗体片段具有配体功能的蛋白质或蛋白质片段；而组分B包括一种将组分A三聚化的蛋白质或蛋白质片段。

2.如权利要求1所述的重组融合蛋白的三聚体，其特征在于在该三聚体中的重组融合蛋白的组分A相同或不同。

3.如权利要求1或2所述的重组融合蛋白的三聚体，其特征在于该重组融合蛋白的组分A为肽类激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体、这些物质的片段或上述序列的功能衍生物。

4.如前述权利要求任何项所述的重组融合蛋白的三聚体，其特征在于该重组融合蛋白的组分A为来自TNF细胞因子家族的细胞因子或TNF细胞因子受体，这种TNF细胞因子或受体的片段，或者TNF细胞因子或受体的功能衍生物，或者这种TNF细胞因子或受体的片段的功能衍生物。

5.如前述权利要求任何项所述的重组融合蛋白的三聚体，其特征在于该重组融合蛋白的组分A为选自以下的TNF细胞因子或TNF细胞因子的片段：CD40L、FasL、TRAIL、TNF-α、CD30L、OX40L、RANKL、TWEAK、Lta、Ltab2、LIGHT、CD27L、41-BB、GITRL、AP-RIL、EDA、VEGI和BAFF，或者上述序列的功能衍生物。

6.如前述权利要求任何项所述的重组融合蛋白的三聚体，其特征在于组分B包括一种蛋白质片段，该蛋白质片段包括至少一个七氨基酸模式的胶原结构结构域。

7.如前述权利要求任何项所述的重组融合蛋白的三聚体，其特征在于组分B包括蛋白质ACRP30的片段，包括三聚化结构域，而不能形成更高级的三聚体的聚集体。

8.如前述权利要求任何项所述的重组融合蛋白的三聚体，其特征在于组分B包括一种如图1所示的关于ACRP30的氨基酸序列44-111的氨基酸序列，或这种序列的功能衍生物，其中图1是权利要求的组成。

9.如前述权利要求任何项所述的重组融合蛋白的三聚体，其特征在于该重组融合蛋白具有如图1所示的FasL-267序列，其中图1是本权利要求的组成。

10.如前述权利要求任何项所述的重组融合蛋白的三聚体，其特征在于该重组融合蛋白包括组分A和组分B之间的接头序列。

11.如前述权利要求任何项所述的重组融合蛋白的三聚体，其特征在于该接头序列包括二肽LQ。

12.如前述权利要求任何项所述的重组融合蛋白的三聚体，其特征在于该重组融合蛋白包括标记序列，优选N-末端标记序列。

13.一种重组融合蛋白的三聚体，其特征在于所述三聚体中存在的三个重组融合蛋白中的至少两个具有不同的组分B。

14.如权利要求1-13任何项所述的三聚体用于制备药物的用途。

15.如权利要求1-13任何项所述的三聚体用于制备治疗以下疾病的药物的用途：病毒性肝炎(HBV、HCV)、酒精性肝炎、胆汁淤积性肝炎、威尔森氏病、自体免疫肝炎、肝移植排斥、过度细胞凋亡反应导致的疾病、变性疾病，特别是神经变性疾病、炎症、毒性表皮坏死松解症(TEN)、多发性硬化、桥本甲状腺炎、GvHD。

16.一种重组融合蛋白，其特征在于该重组融合蛋白包括组分A和组分B，组分A是一种具有生物功能，特别是对抗体或受体或者抗体或抗体片段或者对可溶或膜结合的信号分子具有配体功能的蛋白质或蛋白质片段，而组分B包括三聚化片段或蛋白质的这种片段，特别是选自Clq蛋白质家族和胶原凝集素家族的蛋白质片段的功能衍生物。

17.一种DNA序列，其特征在于该DNA序列编码如权利要求1-13任何项所述的重组融合蛋白。

18.一种表达载体，其特征在于该表达载体包括如权利要求17所述的DNA序列。

19.一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞被如权利要求18所述的表达载体转染。

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