JP2004534529A - 組換え融合蛋白質及びその三量体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、三量体を形成し得る性質を有する組換え融合蛋白質に関する。前記組換え融合蛋白質は、成分Ａを少なくとも１つと、成分Ｂを少なくとも１つ含むものである。成分Ｂは、三量体を形成する性質を有し、成分Ａは、生物学的な性質を有する。本発明は、また前記組換え融合蛋白質の三量体にも関する。本発明は、さらに薬剤の製造において前記三量体を使用する方法又は体外診断のために前記三量体を使用する方法又は体外診断薬の製造において前記三量体を使用する方法に関する。本発明は、また前記融合蛋白質をコードするDNA配列及び該DNA配列を含む発現ベクター及び該発現ベクターを含む宿主細胞にも関する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三量体を形成することが可能な組換え融合蛋白質及びこの組換え融合蛋白質の三量体に関し、該組換え融合蛋白質は、成分Ａを少なくとも１つ以上と、成分Ｂを少なくとも１つ以上含み、成分Ｂは、三量体を形成する特性を有し、かつ成分Ａは、生物学的な特性を有する。本発明は、さらに薬剤を製造するために当該三量体を使用する方法、体外診断のために当該三量体を使用する方法又は体外診断薬を製造するために当該三量体を使用する方法に関する。また、本発明は、さらに当該融合蛋白質をコードするDNA配列及び該DNA配列を含む発現ベクター及び該発現ベクターを含む宿主細胞にも関する。
【背景技術】
【０００２】
生理学的な形態が三量体である蛋白質は自然界に多数存在する。溶液中で三量体を形成するこれらの蛋白質の表面における相互作用により蛋白質凝集するという結果となり、その凝集は、自発的に或いは遅延して起こり、例えばこれらの凝集は、濃度又は溶媒に依存するという事実によって動力学的に遅延する。この原因となる力には、疎水性相互作用、水素結合、例えばジスルフィド架橋などの共有結合及び／又はクーロン力がある。
【０００３】
しかし、特定の蛋白質は構造モチーフを有し、その構造モチーフにより特異的な構造に依存した分子内超二次構造が形成され、したがって蛋白質の三量体や、その他の多量体の状態である蛋白質が生じる。超二次構造は、このような三量体を形成する蛋白質の特徴的なアミノ酸配列に基づいて形成される。超二次構造について述べると、該構造は、例えば、「コイルド−コイル三重らせん」として知られているものであり、特徴的なαヘリックスの相互作用によって蛋白質の三量体を形成し、コイルド−コイルの形状を形成している各蛋白質で見られるものである。蛋白質の分子間の「三量体形成ドメイン」としてのコイルド−コイル三重らせんは、構造上は相互に巻きついている三重鎖の超らせんである。三重らせんの特徴を有するそのようなコイルド−コイルモチーフは細胞外蛋白質の三量体で特に見られるが、結合組織の蛋白質又は蛋白質複合体でことの他見られるものである。
【０００４】
したがって、例えばBeckらは、結合組織蛋白質について説明しており（J, Mol. Biol. (1996) 256, 909-923）、該蛋白質は、軟骨マトリックス蛋白質（cartilage matrix protein, CMP）と呼ばれていて、コイルド−コイル型である三重らせんに基づいてホモ三量体へ凝集しており、該三重らせんは、３個の相補的ならせん（それぞれポリペプチド成分として）が凝集した結果生じたものである。７アミノ酸のパターン (abcdefg)nが、当該三重らせんを形成するらせんのアミノ酸配列の特徴である。このような３つのらせんから構成される三重らせんの場合、７アミノ酸のパターンのうちa及びdの位置にあるアミノ酸は通常無極性の側鎖を有し、それにより上記の超らせん構造の形成を可能にする。
【０００５】
特異的な構造依存性の多量体化現象は、超二次構造が形成することが原因であり、コラーゲンファミリー由来の蛋白質でも見られる。ここで、コラーゲン繊維の構造は、トロポコラーゲンによって特徴付けられ、該トロポコラーゲンは、３個のらせんがねじれているポリペプチドから構成される。また、髪のプロトフィブリル（protofibril）も、左巻きの形であるが、「コイルド−コイル」モチーフを有するα−ケラチンの三重らせんから構成される。
【０００６】
さらに、Clq蛋白質、コラーゲンα１（X）、α２（VII）、越冬蛋白質（the overwintering protein）であるACRP30、内耳構造蛋白質であるセレベリン（cerebellin）及びマルチメリン（multimerin）は、それぞれの多重体を形成する配列断片において配列が相同していることと（Kischore and Reid, Immunopharmacol., 42 (1999) 15-21）、その構造から、Clqファミリーと呼ばれる蛋白質ファミリーとして分類されており、これらの蛋白質は、例えば三量体といった高次の凝集体の形をとっている。このファミリーにおいて見られる多量体を形成する特性を有する蛋白質のうち、例えば補体系で知られているClq蛋白質の構造は単量体に特徴付けられており、単量体は、それぞれ“ヘッド”及び“コラーゲン様の（collagenaceous）”らせんの配列断片として知られている球状ドメインを有している。このようならせんの配列断片は、コイルド−コイル三重らせんを形成して、単量体が三量体を形成する。次に、６個のこのようなClq三量体はオリゴマーを形成し、その蛋白質の三量体のオリゴマー化は、個々のコイルド−コイル三重らせん間の相互作用によるものである。蛋白質をこのように構造的に配置した結果生じたもの又は多量体化（オリゴマー化）した蛋白質複合体Clqは「花束」とも呼ばれる構造であり、18個の球状のC末端に配置されている「ヘッド」ドメインを結合して、三量体の六量体が生じるようにする。
【０００７】
Clq蛋白質の構造と似た構造は、Clqファミリー由来の別の蛋白質であるACRP30でも見られている（Hu et al., J. Biol. Chem., Vol. 271, No. 18, 10697-10703, 1996）。この血清蛋白質は、脂肪細胞から分泌され、三量体の四量体であることが最も多く、Clq蛋白質の場合と同様に、球状のC末端のドメインが、コラーゲン様の（collagenaceous）三重らせんによって結合している。これら４個の三重らせんも、また適切な相互作用によって最終的にはオリゴマーを形成することが考えられる。X線構造回析を用いて決定したACRP30のホモ三量体の構造が、Shapiro及びSchererによって示されている（Current Biology 1998, 8:335-338）。
【０００８】
その他にも文献から既知である蛋白質には、コレクチン・クラスに由来するものがあり、このコレクチン・クラスは、コラーゲン様の（collagenaceous）ドメイン、ネック領域、さらにはカルボキシ末端にある球状のレクチン結合ドメインに特徴付けられている。コレクチンも、三量体のオリゴマーとして生理的に見られる。したがって、例えば、それぞれコレクチンファミリーに由来する肺表面活性物質蛋白質Ａ（SP-A）やマンノース結合蛋白質（MBP）は、その「コラーゲン様の（collagenaceous）」ドメインの相互作用により三量体を形成して、最終的には三量体の六量体として存在している（Esptein et al., Current Opinion in Immunology, Vol. 8, No.1, 1996, 29-35）。従って、コレクチンの名で知られている蛋白質も、それ故に多量体（例えば三量体）のオリゴマー（例えば六量体）を形成している。
【０００９】
さらに、シグナル分子として生理的に作用する蛋白質の多くは、特異的な状態でのみ生物学的なシグナルを変換することができることが文献に開示されている。従って、例えば、膜結合型FasLは、生物学的に、すなわちアポトーシス性の活性がある一方で、膜結合型断片から細胞外の蛋白質断片を除去してからは（sFasLとして知られている）、前記非膜結合型sFasL画分は、もはや目標の細胞に対して生理的にアポトーシス性の作用をすることができない。しかしながら、上記で説明したように膜結合型蛋白質断片から除去して得られるsFasLの三量体の生物学的な作用が、架橋抗体を用いることによってその生理的機能に関してどのように再活性化され得るのかについてSchneiderらの刊行物に記載されている（J. Exp. Med., Vol. 187, No. 8, 1998, 1205-1213）。この目的を達するために、FasLの三量体形成ドメイン、短いリンカー配列及びflagタグ（flagのアミノ酸配列DYKDDDDK（1文字表記）を有する）から構成される融合蛋白質を構築し、発現させて、構造に依存せずに三量体を形成している（すなわち、特異的な二次構造の相互作用によらないで、超二次構造を形成する）当該融合蛋白質は、flagタグに対して作られた抗体によって架橋される。
【００１０】
非公開のドイツ特許出願第19963859号には、二量体、三量体、四量体若しくは五量体の二量体又はオリゴマー、すなわち高次凝集体が開示されており、該高次凝集体は、２つの成分Ａ及びＢを包含する組換え融合蛋白質で構成されている。例えば、TNFサイトカインの生物学的な（アポトーシス性の）活性を高めるためには、ドイツ特許出願第19963859号によれば、組換え融合蛋白質の成分Ａは、例えばTNFサイトカインであってもよく、成分Ｂは、組換え融合蛋白質を結合させて高次凝集体を生じさせる蛋白質断片であってもよい。
【００１１】
強いアポトーシス活性を有する当該複合体は、多くの医療適用において求められているが、多くの病気の治療には、アポトーシス現象が誘発されるのを確実に阻止する物質の提供が必要とされている。可溶型FasL三量体が、オリゴマー化した分子によって誘導されるアポトーシスを特定の環境下で阻止できることがSudaらの刊行物から既知である（J. Exp. Med. 1997, 186, pp. 2045-2050）。しかしながら、例えばタンパクを基にした物質であって、例えばアポトーシス現象の誘発を受容体自体において阻止する能力があり、かつ実際には非天然型である故にin vivoでの生理的分解からよりよく保護される物質は従来の技術では未だ知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明の目的は、生体分子であり、受容体自体を生物学的に遮断するものとして作用する能力があり、したがって例えばアポトーシスのシグナル伝達カスケードの誘発を抑制する物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本目的は、請求項１記載の対象、すなわち組換え融合蛋白質の三量体によって明らかにされ、該組換え融合蛋白質の三量体は、成分Ａを少なくとも１つ以上と、成分Ｂを少なくとも１つ以上含み、成分Ａは、生物学的な機能、特に結合する機能を有する蛋白質又は蛋白質の断片を含み、成分Ｂは、第３の分子が働かなくても組換え融合蛋白質を三量体化する、すなわち生物学的に活性のある成分Ａの三量体を生成する蛋白質又は蛋白質の断片を含む。従って、本発明は三量体を提供し、該三量体は、高次凝集体、例えば三量体の二量体を形成することができないが、本質的には、三量体の総数のうち少なくとも90％まで、好ましくは三量体の総数のうち少なくとも95％まで、極めて特に好ましいのは三量体の総数のうち99％までが三量体を形成している組換え融合蛋白質として溶液中に存在している。
【発明の効果】
【００１４】
生物学的な機能を有する蛋白質又は蛋白質断片（融合蛋白質における成分Ａ）は、特に、詳細には抗体又は受容体に対するリガンドの機能を有する（すなわち一つ又はそれ以上の分子と結合のパートナーとして相互作用することができる）蛋白質、修飾アミノ酸配列、例えば共有結合で若しくは非共有結合で結合した活性成分（適切であれば、有機化学的性質の）を有するアミノ酸配列、抗体又は抗原結合部位を有する抗体断片あるいは例えばペプチドホルモンのようなホルモンを意味するものとして理解される。これとの関連で、本発明は、本発明において、特に成分Ａとして用いられるシグナル蛋白質又はその断片又はその誘導体は、高次凝集体の形でのみ生物学的な活性があるが、対照的に三量体としては、それらはin vitro及びin vivoで受容体に結合するが、これらの受容体を活性化するのではなく、むしろ競合して結合部位を塞ぎ、生物学的に活性化するシグナルを誘発する能力はなく、阻止する能力のみあるという知見を基にしている。
【００１５】
生理的に膜に結合するシグナル蛋白質のうち、例えばTNFサイトカインの場合、膜外の、特に細胞外の蛋白質断片を包含する分解産物が、三量体を形成する組換えシグナル蛋白質の成分Ａとして好ましい。しかしながら、抗原として作用することができるアミノ酸配列も組換え融合蛋白質中の成分Ａとして用いてもよい。最後に、受容体、例えばTNFレセプターファミリー由来のレセプター（例えばFasR）又は当該受容体の断片もしくは誘導体は、結合機能を同様に有する（従って、結合のパートナーとして別の分子、例えば膜結合型FasLと相互作用する）ことから、本発明において「リガンド」という用語に包含され、それらもまた成分Ａとして使用してもよい。そのような結合能力がある生物学的なレセプターの断片は、相補的な生物学的なリガンドが、非生理学的に高い濃度で患者内に存在する場合に薬剤として使用するのに特に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
好ましい実施態様では、本発明による三量体で存在する成分Ａは、同一の成分Ａ（ホモ三量体）又は相違する成分Ａ（ヘテロ三量体）を包含してもよく、すなわち種々の組換え融合蛋白質が、本発明による三量体を形成することができる。このように、種々の成分Ａを有する蛋白質、適切であれば異なる生物学的な機能を有する蛋白質は、本発明による三量体において共に結合することができる。ここで、２つの組換え蛋白質の成分Ａは同一であるが、第３の融合蛋白質の成分Ａは該成分Ａと異なっていてもよく、あるいは３つすべての融合蛋白質が成分Ａについて相違してもよい。このように、三量体における成分Ａの選択、配置、特定の組み合わせ及び／又は数によって、抑制効果を、適切であれば活性化する効果と共に通常は細かく調節することができ、これを達成することができる。
【００１７】
さらに好ましい実施態様では、組換え融合蛋白質中の成分Ａは、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン又はこれらの断片、好ましくは結合可能な断片の形をとる。しかしながら、上記のペプチド、蛋白質の断片及び／又は蛋白質の機能を有する誘導体も、本発明による三量体の構成物質である組換え融合蛋白質中の成分Ａとして使用してもよい。
【００１８】
本発明による三量体の組換え融合蛋白質のさらに好ましい実施態様によれば、その成分Ａは、受容体、例えば、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキンの受容体を包含するか、又は本発明による該融合蛋白質の該成分Ａは、当該受容体の断片若しくは誘導体の形をとる。当該受容体の特に好ましい例としては、THF受容体のファミリー由来の受容体があり、詳細にはFasR（以下、簡単にFasと呼ぶ）がある。
【００１９】
生物学的に活性のある蛋白質、蛋白質断片又はペプチドの機能を有する誘導体とは、詳細には生物学的な機能、特に相互作用のパートナー、例えば膜結合型受容体と結合する性質を保持しているが、その配列には、対応する天然の配列との違いが認められる蛋白質をいう。これらの配列の違いは、１つ又はそれ以上の挿入、欠損及び／又は置換によるものであってもよく、使用する誘導体と天然の配列との間の配列相同性は、好ましくは少なくとも70％以上、より好ましくは85％以上、特に好ましくは90％以上である。機能を有する誘導体という用語には、詳細には生理学的な配列と比較して同類置換がなされているアミノ酸配列が含まれている。同類置換とは、同類のアミノ酸を別の同類のアミノ酸に交換するという置換をいう。具体的には、脂肪族の側鎖を有するアミノ酸、正電荷又は負電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸、側鎖内に芳香族基を有するアミノ酸又は側鎖が水素結合を形成する能力をもつアミノ酸、例えばヒドロキシ基を有するアミノ酸が存在している。このような置換とは、例えば極性の側鎖を有するアミノ酸を同様に極性の側鎖を有する別のアミノ酸へ置換するか、又は例えば疎水性の側鎖を特徴とするアミノ酸を同様に疎水性の側鎖を有する別のアミノ酸へ置換する（例えばセリン（スレオニン）をスレオニン（セリン）へ、又はロイシン（イソロイシン）をイソロイシン（ロイシン）へ）ことをいう。特に、空間構造に変化が生じない配列の位置又は結合領域に関する配列の位置で挿入及び置換を行うことができる。挿入又は欠損による空間構造の変化は、例えばCDスペクトル（円偏光二色性スペクトル）を用いて容易に検出することができる。（Urry, 1985, Absorption, circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods, in Biochemistry, Neuberger et al. (Ed.), Elsevier, Amsterdam）。天然の配列と比較して置換がなされているアミノ酸配列を有する蛋白質を生成するのに適した方法は、例えば、米国特許第4,737,462号, 第4,588,585号, 第4,959,314号, 第5,116,943号, 第4,879,111号及び 第5,017,691号に開示されている。誘導体の生成は、Sambrookらによって詳細に説明されており（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratoty Press）、コドンを省略したり、補足したり、又は置換したりすることができる。その他にも誘導体は、特に置換によって蛋白質のバックボーンを安定させることで生理学的な分解を避けるために安定化した蛋白質であってもよく、例えばアミド結合を置換することによって、例えばβアミノ酸を使用することにもよって、蛋白質のバックボーンを安定させることで安定化した蛋白質であってもよい。
【００２０】
本発明において、リガンドは、結合反応に加わる全ての分子を意味するものとして理解される。従って、リガンドは、また通常は受容体と呼ばれている蛋白質であってもよい。また、当該受容体は、例えば、その相互作用のパートナー、例えばシグナル分子に結合する場合、本発明における「リガンド」であってもよい。
【００２１】
組換え融合蛋白質の三量体は、該組換え融合蛋白質中の成分Ａが、TNFサイトカインファミリー由来のサイトカイン、当該TNFサイトカインの断片又はTNFサイトカイン若しくは対応するTNFサイトカイン断片の機能を有する誘導体である場合、特に好ましい。対応する受容体にin vivoで結合することによって（例えば、高次凝集体の形態で結合する場合）、目標細胞で使用されるTNFサイトカインの生物学的な作用により、例えばアポトーシス効果、増殖効果又は活性化効果が生じるが、三量体の時には、典型的には当該受容体への結合を確実なものとするのみであり、もはや活性化機能を発揮することはない。適したTNFサイトカイン、つまり融合蛋白質中の適した成分Ａは、詳細にはOX40Ｌ、RANKL、TWEAK、Lta、Ltab2、LIGHT、CD27L、41-BB、GITRL、APRIL、VEGI及びBAFFといった蛋白質又はその断片若しくは誘導体であるが、これらに制限されることはない。特に好ましいものは、CD40L、FasL、TRAIL、TNF（特にTNF-R2受容体に結合するTNF）、CD30L及びEDAといった蛋白質又はその断片若しくは誘導体である。組換え融合蛋白質中の成分Ａには、上記膜結合型TNFサイトカインの細胞外断片又はその機能を有する誘導体を使用するのが特に好ましい。これらの分解産物は、特に当該受容体に対するその結合能力を保持している場合、特に好ましい。上記TNFサイトカイン又は該TNFサイトカインの断片の上記の意味での機能を有する誘導体も融合蛋白質の成分Ａとして使用してもよい。特に好ましい実施態様では、組換え融合蛋白質の成分Ａは、本発明による三量体の構成成分であり、hFasL（139から281番目までのアミノ酸）、hTRAIL（95から281番目までのアミノ酸）、hCD40L（116から261番目までのアミノ酸）及びm若しくはhTNFα（77から235番目までのアミノ酸）から成る群から選択される。
【００２２】
従って、本発明によると、組換え融合蛋白質のために選択された成分Ａは、本発明によるオリゴマーの構成成分となるものであり、すでに溶液中で三量体の形態で存在している可能性がある。そのような場合、成分Ｂは、成分Ａの三量体化をさらに促進するだろう。このような状況は、例えば、成分Ａ、例えばTNFリガンド又はその断片又はその誘導体が、通常はすでに溶液中で三量体を形成しており、前記成分Ｂによって三量体の形態でさらに安定するものである場合に見られる。その一方、組換え融合蛋白質の成分Ａが、それ自体は表面相互作用による三量体構造を溶液中又はin vivoで示さない場合には、成分Ｂは、本発明によれば、該組換え融合蛋白質の成分Ａが、三量体の形成を保証する必要があるだろう。後者の場合には、例えば、典型的には天然の蛋白質の断片のみを組換え融合蛋白質の成分Ａとして用いた場合があり、該天然の蛋白質の断片は、それ自体では例えば平衡が単量体の方へ大きく移動しているので三量体を形成することができないか、又は少なくともin vivoで三量体の形態で存在しないものであり、つまり、例えばサイトカインの断片、特にFasL、CD40L、CD30L、TRAIL、EDA又はTNFのＣ末端の断片（例えばＣ末端から少なくとも100アミノ酸以上を含む断片（Ｃ末端から計算した場合）、好ましくはＣ末端から少なくとも120アミノ酸以上を含む断片、特に好ましいのはＣ末端から150アミノ酸以上を含む断片）である。
【００２３】
しかしながら、好ましい実施態様では、組換え融合蛋白質の成分Ａは、本発明によるアミノ酸配列の形を取ってもよく、該アミノ酸配列は、受容体のアゴニスト又は受容体のアンタゴニストの担体として作用するのに適するものである。従って、例えば、薬理活性がある有機化学物質の小さい分子を、典型的には共有結合で、例えばスレオニン若しくはセリンとのエーテル結合、アミド様の結合又はエステル結合によって当該アミノ酸配列に結合させることができる。当該結合したアゴニスト又はアンタゴニストは、本発明による三量体の結合定数を好ましくは少なくとも10-9Ｍ-1の値まで上昇させることができるか、又は生物活性、特にアポトーシスのシグナルカスケードが誘発されるのを抑制することに関する本発明による三量体の抑制作用を調節することができる。さらに、本発明による三量体を、薬理活性がある物質の担体として使用することができる。適した担体である本発明による三量体を選択することによって、薬理活性のある成分を、これらの活性成分の薬理的な目標である特定の細胞の空間付近へこのような方法で選択的に輸送することができる。例えば、当該活性成分をFasLの三量体に結合させて、活性成分を目標細胞へ直接投与しながら、FasL三量体が結合することによってFasRを抑制する（従って、本発明によれば、アポトーシスを抑制し、このような方法で細胞の生存を保護する）可能性がある。例えば、活性成分としての細胞毒性物質に三量体を結合させることによってそのようなシステムを使用することが可能であり、該物質は、例えば変性疾患、詳細には神経変性疾患、特にパーキンソン病又はアルツハイマー病の場合に、目標細胞に対して免疫細胞が攻撃するのを防ぐ。従って、パーキンソン病の場合、黒質においてドーパミン生産細胞が死滅するのを本発明によれば防ぐことができる。従って、本発明による担体と、適切であれば共有結合で結合した活性成分である成分のそのようなシステムをヒト又は獣医学の薬剤として使用する方法を、総体的に明らかにする。
【００２４】
組換え融合蛋白質の成分Ｂは、通常はClq蛋白質ファミリー又はコレクチンファミリーに由来する蛋白質の形を取るものである。オリゴマー形成ドメインではなく三量体形成ドメインのみが組換え融合蛋白質の構成成分として転写されるか、又は翻訳される場合、Clqに由来する蛋白質又はコレクチンファミリーに由来する前記蛋白質は、組換え融合蛋白質の構成成分、すなわち成分Ｂとして特に好ましい。組換え融合蛋白質中の成分Ｂは、また上記蛋白質本来の特徴である球状の「ヘッド」ドメインを含まないものであるのが好ましい。従って、本発明による組換え融合蛋白質の上記成分Ｂは、典型的には、例えば三重らせんを形成することによる、三量体を形成するための機能性を有するコラーゲン様の（collagenaceous）断片のみを含み、他の三重らせんとの二量体又はオリゴマーの構造（例えば三重らせんの四量体又は六量体）を形成する能力をさらに有する配列断片を含まない配列を有するものである。
【００２５】
従って、三量体を形成する融合蛋白質は、三量体の形成を担う成分Ｂとして、典型的にはClq蛋白質ファミリー又はコレクチンファミリーに由来する蛋白質のドメインのみを含むものである一方で、その各「ヘッド」ドメインを、生物学的な機能を同様に発揮する成分Ａとしての他の蛋白質又は蛋白質断片に置換することができる。従って、本発明では、「組換え融合蛋白質」という用語は、組換え融合蛋白質において少なくとも一つ以上の成分Ａ及び少なくとも一つ以上の成分Ｂが人工的に融合していること、すなわち本発明のための融合蛋白質は、天然の蛋白質に該当しないことを意味するものとして理解される。
【００２６】
Clq蛋白質ファミリー若しくはコレクチンファミリーの蛋白質の機能を有する誘導体、すなわち三量体を形成する誘導体又は上記蛋白質の断片の機能を有する誘導体も、組換え融合蛋白質を凝集させて三量体を得るための成分Ｂとして用いてもよい。例えば、成分Ｂは、Clq、MBP、SP-A（肺表面活性物質蛋白質Ａ）、SP-D（肺表面活性物質蛋白質Ｄ）、BC（ウシ血清コングルチニン）、CL43（ウシコレクチン−43）及び／又はACRP30といった蛋白質の対応する配列断片あるいはこれらの蛋白質断片の機能を有する誘導体を含むものである。
【００２７】
組換え融合蛋白質の三量体は、該組換え融合蛋白質の成分Ｂが、三重らせんを形成するコラーゲン様（collagenaceous）の配列領域に由来するClq蛋白質若しくはACRP30蛋白質の蛋白質断片又はこれらの機能を有する誘導体を含む場合、その配列断片の全長が少なくとも8アミノ酸以上、典型的には全長が少なくとも20アミノ酸以上であることが特に好ましい。本発明の特に好ましい実施態様は、組換え融合蛋白質の三量体の成分Ｂが、図１に示すアミノ酸配列（枠に囲まれた配列、45から111番目までのアミノ酸）又はこのマウス（m）のアミノ酸配列の機能を有する誘導体（例えば類似するヒトの配列又は類似する別の哺乳類の配列）又はこの配列の断片を含む該組換え融合蛋白質の三量体である。
【００２８】
種々の宿主生物由来の配列を含む融合蛋白質の三量体が特に好ましい。本発明による凝集体は、それがキメラ融合蛋白質から由来し、成分Ａが成分Ｂとは異なる動物種から由来する場合、非常に好ましい。従って、成分Ａは、マウス、ラット、ブタ若しくは特に哺乳類である他の脊椎動物由来のアミノ酸配列又は当該配列の機能を有する誘導体に該当し、成分Ｂはヒト由来のものであるか、あるいは逆の場合も同様に好都合である。もう一つの方法としては、本発明による三量体を形成する本発明による融合蛋白質中の成分Ａ及び成分Ｂの配列は、同じ動物種から由来していても好ましい。
【００２９】
本発明のさらに好ましい実施態様において、6アミノ酸以上、好ましくは8から30までのアミノ酸、極めて特に好ましいのは8から20までのアミノ酸である短いアミノ酸配列によって組換え融合蛋白質は三量体を形成し、該配列は、成分Ｂとして組換え融合蛋白質中に存在している。このような融合蛋白質の三量体形成は、これらの短いアミノ酸配列により達成され、典型的には超二次構造、特にコイルド−コイル三重らせんが形成することによるものである。このような目的に適しているのは、例えば、超二次構造、例えば典型的なコラーゲン様の（collagenaceous）三重らせん又はこの断片（例えばCMP、COMP、コラーゲン又はラミニンといった蛋白質の三重らせん又はその断片）が形成されることにより三量体を生成する全ての蛋白質の配列断片である。
【００３０】
本発明によれば、三量体の形成をもたらす組換え融合蛋白質の成分Ｂは、特に高次ではない凝集体を形成すべきであるので、成分Ｂは、通常は分子内ジスルフィド架橋を形成することが可能なシステイン残基を含むべきではない。したがって、組換え融合蛋白質中の成分Ｂは、システイン残基を全く含まないか、又は分子内、すなわち組換え融合蛋白質自体の中にジスルフィド架橋があるシステイン残基のみを、他の三量体である融合蛋白質の少なくとも一つ以上のシステイン残基との共有結合が酸化条件下で生ずる可能性のある状況を回避するために含むものであるのが好ましい。
【００３１】
成分Ａ及びＢに加えて、融合蛋白質は、さらに配列断片を含んでもよい。これとの関連で、本発明において好ましい配列は、タグ配列として知られている配列であり、例えば少なくとも１つ以上のflagタグ、すなわちDYKDDDDKであるアミノ酸配列及び／又は他には例えば少なくとも１つ以上のHisタグ（いくつかの連続したヒスチジン、例えば少なくとも５つ以上連続したヒスチジンを含む）及び／又は更なるタグ配列又は抗原性配列がある。さらに、本発明による融合蛋白質の個々の断片（成分Ａ、Ｂ又はタグ配列、２つ又はそれ以上の成分Ａが本発明による融合蛋白質中に存在することも可能である）をリンカー配列によってお互いを区切ってもよい。これらのリンカー配列（少なくとも2アミノ酸以上、好ましくは少なくとも5アミノ酸以上のもの）は、組換え融合蛋白質における種々の機能的な成分の構造上の境界として働き、「ヒンジ」機能、すなわち可動性の構造であるアミノ酸配列の機能を発揮することもできることが好ましい。少なくとも一つ以上の蛋白質分解性の切断部位を含み、成分Ａを、成分Ｂと区別できるようにするリンカーが非常に好ましい。リンカー内の蛋白質分解性の切断部位は、トロンビン・コンセンサス配列であるのが好ましい。
【００３２】
基本的には、成分Ａは、成分Ｂに比べてＣ末端又はＮ末端に、好ましくはＣ末端に配置することができる。タグ配列は、本発明による組換え融合蛋白質の任意の位置に、好ましくはＮ末端の位置にあってもよい。
【００３３】
細胞膜外の受容体を抑制する方法も、本発明のさらなる対象として明らかにする。当該方法は、生物学的機能を有する蛋白質又は蛋白質の断片に該当する少なくとも１つ以上の成分Ａ及び三量体を形成する少なくとも１つ以上の成分Ｂを組換えることを特徴とし、最初に（ａ）当該組換え融合蛋白質を、例えば発現ベクターにおいて発現し、（ｂ）単離して、（ｃ）次にin vitroでの研究用の細胞培養液、例えば細胞懸濁液に添加する方法である。従って、本方法は、in vitroでの研究において細胞を保護する、例えばアポトーシス性の細胞死から細胞を保護するのに適している。次に、前記方法で記載したとおりに結合する本発明による三量体を有する当該細胞を、さらなるin vitroでの研究のために、あるいは薬剤を製造するために用いることができる。結合定数が高いのであれば、in vitroで処理した当該細胞を再移植することができる。例えば、そのような手法は、in vivoにおけるアポトーシスによる死から細胞を保護するために、自己免疫性疾患又は変性疾患の場合に適している。
【００３４】
上記のような方法では、成分Ａは、TNFサイトカイン、TNFサイトカインの断片又は当該蛋白質若しくは蛋白質断片の機能を有する誘導体である場合が特に好ましい。
【００３５】
本発明の三量体は、医学すなわち人間医学と獣医学の両方で用いる薬剤の製造又は疾患若しくは障害の治療に適し、特に成分Ａが、シグナル蛋白質又は当該シグナル蛋白質の断片又は該蛋白質若しくは断片の誘導体である場合に適している。本発明の特許請求の範囲に記載されている三量体（ヘテロ若しくはホモ三量体）を用いて広範囲の疾患又は障害を治療することができる。詳細には、各生理学的なリガンドの細胞外濃度の増加又は膜結合型受容体の数の増加が症状の中で認められた場合にそれらを使用する。例としては、膜結合型シグナル分子、例えばTNFサイトカイン（例えばFasL）の濃度が細胞自体の表面上で増加すること、又はプロテアーゼによって切断されて可溶性となった可溶型シグナル分子、例えばTNFサイトカインの濃度が増加することがある。本発明による当該三量体を、例えば高炎症性の障害、自己免疫疾患、過剰なアポトーシス反応による疾患又は変性疾患、詳細には神経変性疾患（例えばパーキンソン病）、適切であればウイルス性感染症の治療用薬剤の製造にも用いることができるが、これらに限定されることはない。本発明による三量体は、天然のサイトカインの生物活性を抑制することを目的とする治療、すなわち対応するサイトカイン受容体を抑制する働きをする治療が疾患に必要である場合に特に適している。例としては、ウイルス性肝炎（HBV、HCV）、アルコール性肝疾患、胆汁鬱滞性肝炎、ウィルソン病、自己免疫システムの非機能性による肝炎、肝臓移植後の拒絶反応である肝炎、GvHD、TEN（中毒性表皮壊死症（toxic epidermal necrolysis））、橋本甲状腺炎又は多発性硬化症がある。
【００３６】
本発明は、さらに上記の種類の融合蛋白質をコードするDNA配列に関する。当該DNA配列を発現ベクターで発現し、本発明による融合蛋白質のDNA配列を含む、該当する発現ベクターも本発明の対象である。さらに、本発明は、本発明による融合蛋白質をコードするDNA配列を形質移入した宿主細胞にまで及ぶ。これとの関連で、発現ベクターを形質移入した宿主細胞が特に好ましく、該発現ベクターは、本発明による融合蛋白質をコードするDNA配列を含むものであることが特に好ましい。本発明による上記の対象物は、すべて薬剤として又は薬剤の製造に適しており、特に本特許出願に開示されている疾患の治療に、適切であれば組成物の構成成分として適している。
【００３７】
本発明による三量体又は本発明の他の対象物を、薬剤の製造あるいは上記疾患又は障害の治療のために、非経口投与、すなわち例えば皮下投与、筋肉内投与、動脈内投与若しくは静脈内投与、又は経口投与又は鼻空内投与又は肛門投与、腹腔内投与、膣投与又は口腔内投与、脳内投与、眼球内投与（注射又は注入）、適切であれば局所投与にも適する方法で使用するのが好ましく、このように使用することも本発明の範囲内である。
【００３８】
本発明による三量体又は本発明による三量体を形成する宿主細胞又は三量体を形成することが可能な組換え融合蛋白質をコードするDNA配列又は適切な発現ベクターは、それぞれがそれ自体薬剤として作用することができるか、又はそれぞれを薬剤の製造に使用することができる。しかしながら、他の活性成分である成分又は薬剤の補助剤、担体若しくは添加剤と組み合わせた薬剤として使用することもできる。したがって、本発明による三量体又は本発明のさらなる対象物は、薬剤的に受容可能な担体、補助剤及び／又は添加剤と共に構成成分として混合することができる。従って、本発明による対象物、特に本発明による三量体を含む（薬剤の）組成物も本発明に従って明らかにする。適した製造方法は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」（Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980）に開示されており、これは参照して本明細書にその内容が取りこまれるものである。非経口投与に適した担体は、例えば滅菌水、滅菌した生理食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化したナフタレン、及び特に生物学的適合性のラクチド重合体、ラクチド／グリコリド共重合体又はポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン共重合体である。本発明による組成物は、賦形剤又はラクトース、マンニトール等の物質、例えばポリエチレングリコール等の重合体を本発明による抑制物質に共有結合させるための物質、金属イオンと錯体を形成するための物質又は例えばポリラクテート、ポリグリコール酸、ヒドロゲル等の重合体化合物の特別な製造中に又は該製造によって又はリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層若しくは多層の小胞、赤血球の断片又はスフェロプラストによって物質を封入するための物質を含んでもよい。前記組成物の個々の実施態様を、例えば可溶性、安定性、生物学的利用性又は分解能力に関する物質の性質によって選択する。前記組成物中の本発明による活性成分である成分を徐放するもの又は絶え間なく放出するものとしては脂肪親和性のデポー（例えば脂肪酸、ワックス又は油）による製剤が挙げられる。同様に、本発明による物質の被膜又は当該物質を含む組成物の被膜、すなわち重合体による被膜が本発明の範囲内であることは明らかである（例えばポロキサマー又はポロキサミン）。さらに、本発明による物質又は組成物は、保護被膜、例えばプロテアーゼ抑制物質や浸透剤を用いて提供される。
【００３９】
本発明による三量体を、体外診断の分野であるいは例えば生化学的な精製処理に用いることも好ましい。生化学的な精製処理、特に例えば対応する細胞外受容体を発現している細胞の単離を可能にするために、例えば当該複合体を充填することができる精製カラム上でクロマトグラフフィー処理をするという状況において本発明による三量体を使用することも可能である。従って、当該複合体を検出目的で使用することも本発明の範囲内であることは明らかである。
【００４０】
ここに記載されている本発明の更なる対象は、融合蛋白質であり、該融合蛋白質は、組換え融合蛋白質が、成分Ａを少なくとも１つ以上と、成分Ｂを少なくとも１つ以上含むものであり、成分Ａは、生物学的な機能、特に抗体若しくは受容体に対するリガンド機能を有する蛋白質又は蛋白質断片を含むものであり、成分Ｂは、本発明による三量体の構成成分として上記のような蛋白質の三量体を形成する断片又は該蛋白質断片の機能を有する誘導体を含むものである限り、三量体を形成するのに適している。従って、本発明による三量体の構成成分として先に開示されているすべての組換え融合蛋白質は、本発明において明らかにされている。従って、成分Ａ及びＢに関して、並びに組換え融合蛋白質の構築に関して、本発明による三量体と関連する上記の開示は、本発明による組換え蛋白質の実施態様自体に該当する。従って、本発明による組換え融合蛋白質の成分Ｂは、典型的にはClq蛋白質ファミリー若しくはコレクチンファミリーからなる群から、又はコラーゲン様の蛋白質ファミリーから選択された蛋白質断片であり、組換え融合蛋白質の成分Ｂは、三量体のオリゴマーを形成する構造又は球状の「ヘッド」ドメインを含まずに三量体を形成する断片のみを含んでいるのが好ましい。従って、典型的には、成分Ｂは、（abcdefg）nという７アミノ酸のパターンであるアミノ酸配列を少なくとも１つ以上含み、該アミノ酸配列は、三重らせんを形成しているらせんを構造上形成するものであり、そのa及びdの位置のアミノ酸は、好ましくは無極性の側鎖を有しており、それ故に上記の超らせん構造、この場合では３つのらせんから構成されている三重らせんの形成を可能にする。少なくとも１つ以上、好ましくは少なくとも２つ以上の７個のパターンがある配列は、例えばケラチン、コラーゲン、Clq、MBP、SP-A、SP-D、BC、CL43又はACRP30といった蛋白質のうちの１つに由来するものである。上記蛋白質の当該断片の機能を有する誘導体を用いることも本発明の範囲内であり、上記で選択された成分Ａの機能を有する誘導体の定義も、同様に成分Ｂに適用することができる。
【００４１】
本発明のさらなる対象は抑制物質であり、該抑制物質は、ジスルフィド架橋を形成することにより六量体（2ｘ3）としてin vitroの溶液中で存在している（ApoFasL-060）。この抑制物質は、適切であれば酸化媒体中で三量体の形態でin vivoで存在するか、又は三量体のような形態で挙動し、それ故に抑制する性質を発揮する。ApoFasL-060は、Ｎ末端のflag配列、リンカー及び特異的なリンカー及びhFasLの103から138番目までのアミノ酸及び同様にhFasLの139から281番目までのアミノ酸（成分Ａ）から構成されている（図１参照）。同様に、成分ＡとしてApoFasL-060型の抑制物質は、また他のTNFサイトカイン、例えばOX40L、RANKL、TWERK、Lta、Ltab2、LIGHT、CD27L、41-BB、GITRL、APRIL、VEGI及びBAFF又はそれらの断片又は誘導体の対応する結合断片も有してもよい。CD40L、FasL、TRIL、TNF（特にTNF-R2受容体に結合するTNF）、CD30L及びEDAといった蛋白質並びにそれらの断片及び誘導体、特にそれぞれがヒトの配列であるものが特に好ましい。
【００４２】
以下、本発明を、図面によりさらに詳細に説明する。
【００４３】
図１は、本発明によるFasLキメラのアミノ酸配列（FasL-199、FasL-060及びFasL-267）を一文字表記で示す。２つのキメラ蛋白質FasL-199及びFasL-267は、血漿蛋白質であるACRP30蛋白質の構成成分を含み、該蛋白質は、補体因子Clqに構造上似ており、脂肪細胞によって生産される。天然のACRP30蛋白質は、全長が247アミノ酸であり、そのN末端には分泌シグナル配列（1から17番目までのアミノ酸）があり、それに続く27アミノ酸の配列（18から44番目までのアミノ酸）は、蛋白質のオリゴマー形成を担うものである。それに続く該天然蛋白質の断片（45から110番目までのアミノ酸）は、22のコラーゲン様（collagenaceous）配列の繰り返しを含み、従ってコイルド−コイル・ドメインを形成する。本来、このコイルド−コイル・ドメインは三量体の形成をもたらす。
【００４４】
キメラ蛋白質FasL-199（コントロール）はPCR増幅により構築され、マウスACRP30（mACRP30）の完全なオリゴマー形成ドメイン（18から110番目までのアミノ酸）を含むものである。FasLキメラ蛋白質のＣ末端の方にはFasLの三量体形成ドメイン（139から281番目までのアミノ酸）がある。リンカー配列は、Ｎ末端のflagタグとmACRP30断片との間、及びmACRP30（成分Ｂ）とヒトhFasL断片（成分Ａ）との間（LQ）にある。
【００４５】
キメラ蛋白質FasL-267は、その大部分がFasL-199と一致するが、mACRP30断片に欠損がある。該キメラ蛋白質には、ACRP30のオリゴマー形成ドメイン（18から44番目までのアミノ酸）がない。その欠失変異体は、ESTクローンAA673154からPCR法を用いて生成された。mACRP30の18から44番目までのアミノ酸が欠損していることが原因で、前記コンストラクトは三量体の形態で存在し、このことはゲル濾過実験によって実証された。
【００４６】
キメラ蛋白質FasL-060は、Ｎ末端にflag配列を有し、続いてリンカー（GPGQVQLQ）、ジスルフィド架橋を形成することができる特異的なリンカー、ヒトFasL（hFasl）の103から138番目までのアミノ酸、最後に成分ＡとしてhFasLの139から281番目までのアミノ酸を有する。ジスルフィド架橋が構築されるかどうかによって、ApoFasL-060は、三量体あるいは六量体のように振る舞う。
【００４７】
図２Ａにおいて、図２は、Bjab細胞の生存能力に関するApoFasL-060及びApoFasL-267のin vitroでの活性を示す。OD 490nmにおける吸光度をy軸にプロットし、細胞毒性試験のために添加した融合蛋白質の濃度をx軸にプロットした（対数で）。490nmにおける吸光度は、細胞の生存能力の指標である（吸光度が高いと、添加した物質のアポトーシス活性が低いということになり、従って細胞の生存能力が高いということになる）。図に示されている曲線は、架橋する抗体を加えない場合におけるApoFasL-267（白丸）及びApoFasL-060の定量用の曲線（白四角）又は架橋する抗体を加えた場合におけるApoFasL-267（黒丸）及びApoFasL-060の曲線（黒四角）である。架橋する抗体があるFasL-267と違い、FasL-267単独では、高濃度（すなわち、ほとんど希釈していないもの）でも細胞に対する細胞毒性がなかった。
【００４８】
図２Ｂは、図２Ａに示されているApoFasL-267（白丸）及びApoFasL-060（白四角）の抑制活性を示す。抑制活性が測定できるようにするために、50ng/mlの濃度のオリゴマー化したFasLを、アポトーシスを誘発するために全ての実験で添加した。
【００４９】
図２Ｃは、FasL-199及びFasL-267のBjab細胞に対するアフィニティーをそれぞれ比較した、アフィニティー研究の結果を示す。ApoFasL-267及びFasL-199は、Bjab細胞上のFasへ結合するためにZB4抗体と競合する。ZB4（抗Fas抗体）の結合パーセンテージを、FasL-199（白四角）及びFasL-267（白丸）の濃度に対してそれぞれプロットした。測定のばらつきの範囲内で、２つのFasLリガンドのアフィニティーについて違いが見られなかった。従って、２つのリガンド間の細胞毒性についての違いは受容体に対する結合アフィニティーの違いによるものではないことが実証された。
【００５０】
図３は、in vivo実験の結果、すなわちアゴニストである抗Fas抗体J02によって誘導される肝細胞の破壊に対するApoFasL-060の抑制効果を示す。図３Ａは、5μgのJ02抗体を静脈内注射する前にApoFasL-060（25μg/マウス）又は生理食塩水（コントロール）のいずれかをマウスに静脈内注射した実験の結果を示している。図３Ａにおいて、静脈内注射から4時間後の測定結果として、黒塗りの棒はALTの血清力価（U/ml）を示し、白抜きの棒はASTの血清力価を示す。右のプロットは、コントロールの実験の結果を示す。図３Ｂは、生理食塩水溶液（黒塗りの棒）又はApoFasL-060（20μg）で前処理した（淡灰色の棒、いずれの場合でも左から3番目にある）後に10μgのJ02抗体を与えられたマウスの生存率又はApoFasL-060のみで前処理した後のマウスの生存率（濃灰色の棒、いずれの場合でも左から3番目にある）又はApoFasL-060と架橋抗体で前処理した後のマウスの生存率（中間の灰色の棒、いずれの場合でも最も右にある）を、それぞれ投与後経過した時間（2時間、4時間、24時間）の関数として示している。4時間後、アゴニストであるJ02抗体のみを与えられたマウスはいずれも生存していなかったが、抑制物質（淡灰色の棒）により、ほとんどすべてのマウスが生存していた。従って、ApoFasL-060は、アゴニストである抗Fas抗体J02のマウスにおける致死作用を防いだ。なお、架橋抗体は、ApoFasL-060の抑制効果を無効にした（中間の灰色の棒）。
【００５１】
図４は、オリゴマー化したFasLによって誘導される肝臓障害に関するApoFasL-267の効果を示す。図４は、オリゴマー化したFasL（FasL-199）を静脈内注射する前に、生理食塩水又は25μgのApoFasL-267のいずれかをマウスに静脈内注射した際の実験結果を示す。ALT（黒塗りの棒）及びAST（白抜きの棒）の血清力価を4時間経過後に分析した。さらに、棒グラフは、各々の力価をU/mlで示す。図４において中央及び右のプロットは、アゴニストである、すなわちアポトーシスを誘発するFasLを投与した後の結果を示し、左のプロットは、アゴニストであるFasLを投与していない比較実験を示す。従って、図４は、コントロール実験の結果だけではなく、保護リガンドを用いないでFasL-199を用いた実験の結果及び保護リガンドFasL-267と併用したFasL-199の実験結果も示す。
【００５２】
図５は、AAPによって誘導される肝炎の場合における可溶型FasLの効果を示す。AAP（300mg/kg）を腹腔内注射する前に、ApoFasL-267（図５Ａ）又はApoFasL-060（図５Ｂ及び図５Ｃ）のいずれかをマウスに静脈内注射した。図５Ａ及び図５Ｂのプロットは、ALT（黒塗りの棒）及びAST（白抜きの棒）の力価（U/ml）を示し、いずれの場合でも注射から5時間後に測定した。図５Ａ及び図５Ｂにおける左のプロットは比較実験に対応し、右のプロット（図５Ａ）及び図５Ｂの場合では中央及び右のプロットは、本発明による抑制物質の投与後の結果を示す。図５Ｃは、偽処理した（コントロール）動物（100％）と比べて、アミノトランスフェラーゼが相対的に減少した量を示す。
【００５３】
図６は、AAPで処理したマウスの肝臓に対するApoFasL-267及びApoFasL-060の効果を示す。図５において上述したとおりにマウスを処理した。肝炎を誘導してから24時間後に肝臓を解剖して組織学的に評価した。図６には、３つの組織の切断面の画像（AAPを添加したもの、AAP及びApoFasL-267を添加したもの、最後は生理食塩水を投与した後のもので対照となるもの（コントロール））がある。コントロール動物由来の組織の切断面と比較すると、ApoFasL-267（又はApoFasL-060、図示せず）でマウスを処理することにより、肝臓障害が抑制されたことが分かった。対照的に、AAPのみで処理した動物の肝臓は、中央の細静脈部分の壊死及びアポトーシス、洞様毛細血管炎症性の血液の鬱血並びに肝細胞の空胞化を示した。
【００５４】
図７Ａは、本発明によるFasキメラであるFas-ACRP（MKB216）のcDNA配列及びその配列から推定されるアミノ酸配列を示す。コンストラクトは、Fasの細胞外ドメインの17から172番目までのアミノ酸（すなわちFas受容体）を含み、該アミノ酸は、全長が14アミノ酸であるリンカーを介してマウスACRP30の完全なオリゴマー形成ドメイン（18から110番目までのアミノ酸）と融合している。そのアミノ末端に、前記コンストラクトは、さらにIg重鎖のシグナル配列とflagタグを含む。また、制限酵素切断部位をその図に示す。
【００５５】
図７Ｂは、図７Ａのコンストラクトの切断部位を示す制限酵素地図を示す。
【００５６】
図８は、A20細胞においてFasLによって仲介されるアポトーシスに対するin vitroでのFas-ACRP30の抑制作用を実証するものである。490nmにおける吸光度（細胞の生存の指標、図２参照）をy軸にプロットし、該当する融合蛋白質の濃度をx軸にng/mlでプロットした。Fas-ACRP30の抑制効果を、Fasのニ量体型であるFas-Fc、及びFasの五量体型であるFas-COMPのものと比較した。アポトーシス誘導剤は、本発明によるFasLキメラであるFasL-199を用いた。Fas-ACRP30コンストラクトは、FasLによって誘導されるアポトーシスを抑制し、IC50値は80ng/mlだった。この値は、五量体のFas誘導体であるFas-COMPの値（35ng/ml）に匹敵する一方で、（二量体の）Fas-FcのIC50は1μg/mlを越えていた。
【００５７】
以下、本発明を、実施例によりさらに詳細に説明する
【００５８】
以下の（a）から（f）までの実験の条件を、特に指定がない限り６つの実施例に適用した。
【００５９】
（a）FasL、TRAIL、TNFα及びCD40L融合蛋白質のベクタ-の構築。
FasLの三量体形成ドメイン（139から281番目までのアミノ酸）を、オリゴヌクレオチドJT398（ACT GCA GGA AAA AAA GGA GCT G）及びJ290（CAA CAT TCT CGG TGC CTG TAA C）を用いてヒトcDNAから増幅した。PCR産物を、pCRII（In Vitrogen）にライゲーションし、次にコード配列を、720から769番目までの塩基が削除されている（PS 038）改変したpCRIIIベクター（PS038、In-Vitrogen、NV Leek, オランダ）の制限酵素切断部位であるHindIIIとBamHIの間にサブクローニングした。該コード配列は、制限酵素切断部位であるPstIとEcoRIに囲まれており、血球凝集素のシグナルペプチドをコードするDNA断片を含み、５’−非翻訳配列（CAA AAC ATG GCT ATC ATC TAC CTC ATC CTC CTG TTC ACC GCT GTG CGG GGC）の6塩基及びflagのエピトープ（GAT TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA）、リンカー（GGA CCC GGA CAG GTG CAG）、制限酵素切断部位であるPstI、SalI、XhoI及びBamHIを含むものである。
【００６０】
FasL-199の発現ベクターを下記の通りに構築した。ESTクローンAA673154を用いて、最初にオリゴヌクレオチドJT1147（ACA ATG CAT GAA GAT GAC GTT ACT AC）及びJT1148（AGA CTG GAG AGC GGC TTC TCC AGG）を使用してPCR増幅を行った。マウスACRP30の18から111番目までのアミノ酸をコードする配列は、制限酵素切断面部位であるNsiIとPstIに囲まれており、これを三量体のFasLをコードするベクターのPstI切断部位に（融合したNsiI/PstI切断部位がコード配列の５’側にあるように）クローニングした。融合蛋白質FasL-167を発現するベクター（mACRP30の44から111番目までのアミノ酸を有する）を、別の５’−オリゴヌクレオチドJT1421（AAA ATG CAT GCA GGC ATC CCA GGA C）を使用して増幅した。PCR産物を、PCR“blunt”システムにライゲーションし、Nsi/PstIカセットを、上記のFasLを含むベクターにサブクローニングした。ACRP30と結合した別のTNFサイトカインを有する他の融合蛋白質を、発現ベクターFasL-ACRP30における制限切断部位であるPstIとEcoRI内のFasLの各配列を各リガンド配列に置換して生成した。
【００６１】
（b）組換え蛋白質の発現及び精製
リン酸カルシウム法を使用して、HEK293細胞を安定的に形質移入した。３日間インキュベーションした後、800μg/mlのG418を含む選択倍地でHEK293細胞を2週間培養した（前記の箇所：Schneider et al., J. Exp. Med. 1998も参照）。これらの安定的に形質移入されたクローンを採取して、選択倍地を入れた96ウェルのプレートに分注した。抗flag抗体によるウェスタンブロット法を用いて、組換え蛋白質が存在するか否かについて上清を分析した。
【００６２】
安定的に形質移入された細胞を、800mlの非選択培地中で10から14日間フラスコ内で培養した。培養物を遠心して、上清を濾過滅菌した。次にマウスACRP30とFasLの融合蛋白質（FasL-267又はFasL-199）を下記の通りに精製した。NaCl及びCaCl2（最終濃度は、NaClは150ｍM、CaCl2は2ｍM）で上清を処理し、塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH値を7.0にした。その後、組換え蛋白質を、1mlのM2-アガロースカラム（Sigma, Switzerland）にアプライし（0.5ml/分、48時間、4℃）、2ｍMのCaCl2を含む10倍容量のTBSでカラムを洗浄し、最後にTBS-EDTA（10ｍM）（0.1ml/分, 4℃）又は50ｍMクエン酸/NaOH（pH2.5）（1ml/分, 4℃）で溶出し、適切であれば0.2倍量の1MのTris-HCl（pH8）で中和した。排除限界が30kDaである濃縮器（Millipore）でバッファーをPBSに交換した。精製した蛋白質の濃度を、ビシンコニン酸（bicinchonic acid）法（Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA）によって、ウシ血清アルブミンを標準として用いて決定し、サンプルの純度を、SDS-PAGEとクマシーブルー染色によって決定した。
【００６３】
（c）細胞
ヒトTリンパ芽腫であるJurkat細胞（human T-lymphoblastoma Jurkat cells）、BJAB バーキット（Burkitt） リンパ腫細胞又はRaji細胞を、10％FCSを添加したRPMIで培養した。ヒト胚性腎臓細胞293を、2％FCSを加えたDMEM multi-substance mix F12（1:1）で培養した。全ての培地には、抗生物質（5μg/mlのペニシリン、5μg/mlのストレプトマイシン及び10μg/mlのネオマイシン）を入れた。
【００６４】
（d）細胞毒性試験
細胞毒性試験を、基本的にはSchneiderらの文献（J. Biol. Chem. 272:18827-18833, 1997）に上記に記載されているとおりに行った。ここでは、50,000の細胞を、100μlの培地で16時間インキュベートした。該培地には、1μg/mlのM2抗体の存在下又は非存在下で上記に示した濃度でリガンドが含まれている。細胞生存率を、PMS/MTS（フェナンジン・メトスルフェート ３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−５−［３−カルボキシメトキシフェニル］−２−［４−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩）（Promega Corp., Madison, WI）を用いて決定した。所要の時間（典型的には１から３時間）発色させて、490nmにおける吸光度を測定した。その490nmにおける吸光度を、細胞の生存能力の指標とした（吸光度が高いと、添加した物質のアポトーシス効果は低いということになり、従って細胞の生存能力が高いということになる）。
【００６５】
（e）マウスの処理
雌のBalb/cマウス（8から10週齢）に種々のコンストラクトを静脈内注射した。定められた期間が経過した後、該マウスから血液を採取して、続いてアミノトランスフェラーゼであるAST及びALT（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びアラニンアミノトランスフェラーゼ）の力価を定量した。
【００６６】
（f）材料
アガロース結合抗flag-M1抗体及びアガロース結合抗flag-M2抗体は、Sigma（Buchs, Switzerland）から入手した。J02抗体はPharmingenから、細胞培養試薬はLife Sciences（Basle, Switzerland）から入手した。
【００６７】
（g）バインディングの研究
ApoFasL-267及びFasL-199のアフィニティーを競合試験によって決定した。このために、抗Fasモノクロナール抗体ZB4を、iodo-Gen法（Pierce, Rockford, IL）によって100μCiの125Iでラベルした。これにより、比放射能が1.5μCi/μgである蛋白質が得られた。1x105のBjab細胞を、放射能ラベルしたZB4及び非ラベルの競合剤を系列希釈したもの（100μg/mlから10μg/mlまで）と共に37℃で１時間インキュベートした。１％BSAを含む冷却したPBSで３回洗浄した後、細胞に結合した放射活性をγカウンターで測定し、結合量cpmのパーセンテージで表した。すべての実験を三連で行った。
【００６８】
さらに、Schneiderらの文献（J. Exp. Med., Vol.187, No. 8, 1998, 1205-1213）及びそこに参考文献として引用されている刊行物を参照して、実施例を行うために使用した方法について明確に記載する。
【実施例１】
【００６９】
成分ＡとしてhFasL（hはヒトを指す）の139から281番目までのアミノ酸を含み、成分ＡのhFasLの139番目にあたるアミノ酸のＮ末端に、成分Ｂとして全長が94アミノ酸である配列（mACRP30の18から111番目までのアミノ酸）を含む組換え融合蛋白質（１、FasL-199）を発現した。さらに、融合蛋白質のＮ末端（成分ＢのＮ末端）に、アミノ酸DYKDDDDKを有するflag配列が発現しており、flagタグと成分Ｂの間に配置されたリンカー配列GPGQVQLQLHが連結している（図１参照）。成分Ａ及びＢは、リンカー配列LQによって区切られている。
【００７０】
比較実験のために、Ｎ末端に同様に上記のflag配列、そのＣ末端に続く同じリンカー配列、配列のＣ末端にhFasLの139から281番目までのアミノ酸を含む融合蛋白質（２、FasL-267）を発現した。融合蛋白質（１）は、特異的なリンカーとhFasLの103から138番目までのアミノ酸を包含する欠失が融合蛋白質（２）と異なる（図１）。
【００７１】
融合蛋白質（１）及び（２）のベクターを、上記の手法に従って構築した。融合蛋白質を、（ｂ）の方法で詳述したとおりに発現して、精製した。
【００７２】
精製した融合蛋白質（１及び２）の多量体化又はオリゴマー化の程度を電子顕微鏡で判定した。その結果、FasL-199は六量体（2x3mer）であって、同様にFasL-267を測定した結果、FasL-267は三量体であり、かつApoFasL-060は六量体様であった。
【実施例２】
【００７３】
（FasLによって仲介されるin vitroでのアポトーシスに対するApoFasL-060及びApoFasL-267の抑制効果）
（c）に記載したとおりに培養したBjab-Burkittリンパ腫細胞を採取し、その細胞の細胞毒性試験を、（d）に記載したとおりに行った。この細胞株に対して、抗flag M2抗体（Sigma, Buchs, Switzerland）の存在下又は非存在下で三量体を形成した融合蛋白質ApoFasL-060及びApoFasL-267の濃度を増加させて、それぞれの濃度において試験を行い、OD 490nmにおける吸光度を測定した（図２Ａ）。用いた抑制物質であるApoFasL-060及びApoFasL-267は図１に示されている（実施例１参照）。
【００７４】
抑制物質の両方とも、flagタグに対して作られた抗体と架橋した場合にアポトーシスを誘導するという類似した性質を示した（図２Ａ）。ApoFasL-060は、また架橋する抗体が存在しない場合でもその凝集体の構造によってアポトーシスを誘導した。従って、実施例２の結果は、ApoFasL-060とApoFasL-267は、それぞれFas受容体に結合する能力を有するが、死シグナルを変換するためにはオリゴマーを形成することが必要であることを示している。オリゴマー化したFasL（FasL-199）に対するアフィニティーが減少しなかったことから、２つの抑制物資の細胞毒性が減少したことは、Fas受容体に対するアフィニティーが減少したためではないことが判明した。
【００７５】
さらに、Bjab細胞を、ApoFasL-267の濃度を増加させてプレインキュベートし、続いてFasL-199を添加してアポトーシスを誘導した（図２Ｂ参照）。その結果、FasL-199によって誘導されるアポトーシスは、ApoFasL-267によって防ぐことが可能であることが明らかとなった。一連の測定から、分子形状が三量体であるApoFasL-267は、100ng/mlの抑制濃度（IC）でin vitroにおけるアポトーシスを防ぐことが可能であることが分かった。したがって、三量体の形であるApoFasL-267は、受容体を遮断することによってアポトーシスを防ぐが、凝集しているApoFasL-060は、その構造によりそれ自体がアポトーシスを誘導する効果を有するので、FasL-199によって誘導されるin vitroにおけるアポトーシスを防ぐことができない。
【実施例３】
【００７６】
（肝細胞の破壊の誘導に関するin vivo実験）
Ａ．ApoFasL-060の効果
この目的のために、アゴニストであるJ02抗Fas抗体をマウスに注射した。該抗体は、劇症肝不全によりそのように処理したマウスに死をもたらす。アミノトランスフェラーゼ（AST及びALT）の血清力価の高さによって、これらのマウスにおける肝細胞の破壊を検出した。ApoFasL-060（1mg/kg）でマウスを実験的に前処理して、J02抗体の投与後に該抗体によって誘発される肝不全（肝細胞の破壊）から動物を保護した（図３Ａ参照）。予想通り、ApoFaL-060の保護効果は濃度依存性であった。5μgのJ02抗体を投与した場合、観察されたAST及びALTの力価はコントロールのマウスのものと一致した。J02抗体の投与量が10μgの際には、顕著な保護効果が認められた（AST及びALTの力価が90％減少した）。従って、ApoFasL-060自体は、架橋抗体を使用しなければ毒性はなく（図３Ｂ）、その結果、この場合も先と同様に、アポトーシスを抑制する効果は、死シグナルを誘発することなくFas受容体に結合することによるものである。
【００７７】
致死量のJ02抗体（静脈内注射でマウス当たり10μg）によって、研究したすべてのマウスが4時間以内に死亡した（図３Ｂ）。これらの動物をApoFasL-060で前処理すると、死亡率が大幅に減少し、24時間後の生存率が86％に達した。抑制物質であるApoFasL-060（単独で注射したもの）には毒性がないことが判明したが、架橋抗体と共に注射した後で毒性効果が上昇し、４時間後の死亡率は80％であった。
【００７８】
Ｂ．ApoFasL-267の効果
本実施例において、生理食塩水（コントロールとして）又はApoFasL-267のいずれかをFasL-199を注射する前にマウスに注射した。次に、このように処理したマウスの肝細胞の破壊を分析する際に、それぞれのAST及びALTの血清力価を評価した（図４参照）。ApoFasL-267で前処理したマウスは、オリゴマーであるFasL（FasL-199）によって誘導される肝細胞の破壊から保護された。コントロールとして用いた動物では、FasLによって誘導される肝細胞の破壊がFasL-199の投与後直ちに（2時間以内に）観察され、アミノトランスフェラーゼの力価が第10因子によって増加したことが示された。従って、ApoFasL-267で動物を前処理することによって、AST及びALTの血清力価で決定された動物の肝臓障害が回避された。
【実施例４】
【００７９】
（アセトアミノフェン（AAP）によって誘導される肝炎の抑制）
アセトアミノフェン（AAP）は鎮痛剤であり、劇症肝不全を誘導することが知られている。その分子機構は、Fasによって仲介されるアポトーシスに基づいている。従って、三量体であるApoFasL-267及び／又は六量体であるApoFasL-060がAAPによって誘導されるアポトーシスから肝細胞を保護する可能性を本実施例で検討した。このために、亜致死量のAAP（0.3g/kg）をマウスに腹腔内注射した。5時間後、ALT及びASTの血清力価を測定して肝臓障害を決定した。ALT及びASTの力価は、IFCC（国際臨床化学連盟）のガイドラインに従って酵素試験によって決定した。ApoFasL-267又はApoFasL-060の投与により、AAPによって誘発されたAST又はALTの力価の増加が抑制された。未処理のマウスと比較すると、本発明に従って前処理したマウスを観察した時のアミノトランスフェラーゼの力価は著しく減少していた（75から90％まで）。
【００８０】
ApoFasL-060を用いた前処理による保護効果は濃度依存的なものであることが判明した（図５Ｂ及び図５Ｃ）。25μgのApoFasL-060（1mg/kg）を投与すると、AAPによって誘導される肝細胞の破壊は全く認められず、12.5μgを注射した場合は、アミノトランスフェラーゼの力価はわずかに増加し、すなわち肝臓障害がわずかに生じ、さらに低い用量、例えば6μg/マウスでは保護効果が消失するという結果となった。このような低用量で処理した動物と、生理食塩水のみで処理したコントロールの動物との間には違いが認められなかった。従って、観察された抑制作用は、受容体上の結合部位を競合的に塞ぐという形式で起きることを明言することができる。
【００８１】
AAPによって誘導される肝臓障害を組織学的に調べた（図６）。その結果を以下に述べる。中央の細静脈に壊死とアポトーシス、洞様毛細血管炎症性の血液の鬱血、空胞化した肝細胞が見られた。対照的に図６Ｂで見られるように、ApoFasL-267（又はApoFasL-060、図示せず）で前処理した場合は、そのような肝臓障害の症状は全く認められなかった。
【実施例５】
【００８２】
Ａ．Fas受容体キメラの構築
FasLによって仲介されるアポトーシスの非常に有効な抑制物質を製造するために、Fas受容体の細胞外ドメイン（17から172番目までのアミノ酸）及びマウスACRP30の完全なオリゴマー形成ドメイン（18から110番目までのアミノ酸）から構成され、これらの蛋白質が、全長が14アミノ酸であるリンカーを介して連結されている融合蛋白質を製造した（図７）。前記組換え蛋白質をSDS-PAGEで分析したところ、その見かけの分子量は、還元条件下では55kDa、非還元条件下では150kDaであった。従って、MKB216コンストラクト（以下、Fas-ACRP30と呼ぶ）は、基本的には六量体（2x3mer）の形で存在することが推論される。
【００８３】
Ｂ．FasLによって仲介されるアポトーシスに対するFas-ACRP30の抑制効果
FasLによって仲介されるin vitroでのアポトーシスに対する本発明によるFas-ACRP30融合蛋白質の抑制効果を確認するために、FasL感受性であるA20細胞を、オリゴマー化したFasLを添加する前にFas-ACRP30の濃度を増加させてプレインキュベートした。本発明によるFasL-199コンストラクトは、本実験において特に効果的なFasLオリゴマーとして作用した。このように、本発明によるFas-ACPR30コンストラクトの抑制効果を、二量体型のFas（Fas-Fc）の効果及び五量体型のFas（Fas-COMP）の効果と比較した。図８に示したように、Fas-ACRP30は、80ng/mlの濃度でFasLによって仲介されるアポトーシスを50％減少させた。この値は、二量体の比較コンストラクトであるFas-Fc（IC50＞1μg/ml）のものよりも著しく低いものであった。Fas-COMPの抑制効果は、IC50値が35ng/mlであり、Fas-ACRP30の効果に匹敵するものであった。従って、これらのデータより、Fas-ACRP30は、FasLによって仲介されるアポトーシスの有効な抑制物質であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、本発明によるFasLキメラのアミノ酸配列（FasL-199、FasL-060及びFasL-267）を一文字表記で示す図である。
【図２】図２は、Bjab細胞の生存能力に関するApoFasL-060及びApoFasL-267のin vitroでの活性を示す図である。
【図３】図３は、in vivo実験の結果示す図である。
【図４】図４は、オリゴマー化したFasLによって誘導される肝臓障害に関するApoFasL-267の効果を示す図である。
【図５】図５は、AAPによって誘導される肝炎の場合における可溶型FasLの効果を示す図である。
【図６】図６は、AAPで処理したマウスの肝臓に対するApoFasL-267及びApoFasL-060の効果を示す図である。
【図７】図７は、本発明によるFasキメラであるFas-ACRP（MKB216）のcDNA配列及びその配列から推定されるアミノ酸配列並びにFas-ACRP（MKB216）コンストラクトの切断部位を示す制限酵素地図を示す図である。
【図８】図８は、A20細胞においてFasLによって仲介されるアポトーシスに対するin vitroでのFas-ACRP30の抑制作用を実証する図である。
【０００１】
本発明は、三量体を形成することが可能な組換え融合蛋白質及びこの組換え融合蛋白質の三量体に関し、該組換え融合蛋白質は、成分Ａを少なくとも１つ以上と、成分Ｂを少なくとも１つ以上含み、成分Ｂは、三量体を形成する特性を有し、かつ成分Ａは、生物学的な特性を有する。本発明は、さらに薬剤を製造するために当該三量体を使用する方法、体外診断のために当該三量体を使用する方法又は体外診断薬を製造するために当該三量体を使用する方法に関する。また、本発明は、さらに当該融合蛋白質をコードするDNA配列及び該DNA配列を含む発現ベクター及び該発現ベクターを含む宿主細胞にも関する。
【背景技術】
【０００２】
生理学的な形態が三量体である蛋白質は自然界に多数存在する。溶液中で三量体を形成するこれらの蛋白質の表面における相互作用により蛋白質凝集するという結果となり、その凝集は、自発的に或いは遅延して起こり、例えばこれらの凝集は、濃度又は溶媒に依存するという事実によって動力学的に遅延する。この原因となる力には、疎水性相互作用、水素結合、例えばジスルフィド架橋などの共有結合及び／又はクーロン力がある。
【０００３】
しかし、特定の蛋白質は構造モチーフを有し、その構造モチーフにより特異的な構造に依存した分子内超二次構造が形成され、したがって蛋白質の三量体や、その他の多量体の状態である蛋白質が生じる。超二次構造は、このような三量体を形成する蛋白質の特徴的なアミノ酸配列に基づいて形成される。超二次構造について述べると、該構造は、例えば、「コイルド−コイル三重らせん」として知られているものであり、特徴的なαヘリックスの相互作用によって蛋白質の三量体を形成し、コイルド−コイルの形状を形成している各蛋白質で見られるものである。蛋白質の分子間の「三量体形成ドメイン」としてのコイルド−コイル三重らせんは、構造上は相互に巻きついている三重鎖の超らせんである。三重らせんの特徴を有するそのようなコイルド−コイルモチーフは細胞外蛋白質の三量体で特に見られるが、結合組織の蛋白質又は蛋白質複合体でことの他見られるものである。
【０００４】
したがって、例えばBeckらは、結合組織蛋白質について説明しており（J, Mol. Biol. (1996) 256, 909-923）、該蛋白質は、軟骨マトリックス蛋白質（cartilage matrix protein, CMP）と呼ばれていて、コイルド−コイル型である三重らせんに基づいてホモ三量体へ凝集しており、該三重らせんは、３個の相補的ならせん（それぞれポリペプチド成分として）が凝集した結果生じたものである。７アミノ酸のパターン (abcdefg)nが、当該三重らせんを形成するらせんのアミノ酸配列の特徴である。このような３つのらせんから構成される三重らせんの場合、７アミノ酸のパターンのうちa及びdの位置にあるアミノ酸は通常無極性の側鎖を有し、それにより上記の超らせん構造の形成を可能にする。
【０００５】
特異的な構造依存性の多量体化現象は、超二次構造が形成することが原因であり、コラーゲンファミリー由来の蛋白質でも見られる。ここで、コラーゲン繊維の構造は、トロポコラーゲンによって特徴付けられ、該トロポコラーゲンは、３個のらせんがねじれているポリペプチドから構成される。また、髪のプロトフィブリル（protofibril）も、左巻きの形であるが、「コイルド−コイル」モチーフを有するα−ケラチンの三重らせんから構成される。
【０００６】
さらに、Clq蛋白質、コラーゲンα１（X）、α２（VII）、越冬蛋白質（the overwintering protein）であるACRP30、内耳構造蛋白質であるセレベリン（cerebellin）及びマルチメリン（multimerin）は、それぞれの多重体を形成する配列断片において配列が相同していることと（Kischore and Reid, Immunopharmacol., 42 (1999) 15-21）、その構造から、Clqファミリーと呼ばれる蛋白質ファミリーとして分類されており、これらの蛋白質は、例えば三量体といった高次の凝集体の形をとっている。このファミリーにおいて見られる多量体を形成する特性を有する蛋白質のうち、例えば補体系で知られているClq蛋白質の構造は単量体に特徴付けられており、単量体は、それぞれ“ヘッド”及び“コラーゲン様の（collagenaceous）”らせんの配列断片として知られている球状ドメインを有している。このようならせんの配列断片は、コイルド−コイル三重らせんを形成して、単量体が三量体を形成する。次に、６個のこのようなClq三量体はオリゴマーを形成し、その蛋白質の三量体のオリゴマー化は、個々のコイルド−コイル三重らせん間の相互作用によるものである。蛋白質をこのように構造的に配置した結果生じたもの又は多量体化（オリゴマー化）した蛋白質複合体Clqは「花束」とも呼ばれる構造であり、18個の球状のC末端に配置されている「ヘッド」ドメインを結合して、三量体の六量体が生じるようにする。
【０００７】
Clq蛋白質の構造と似た構造は、Clqファミリー由来の別の蛋白質であるACRP30でも見られている（Hu et al., J. Biol. Chem., Vol. 271, No. 18, 10697-10703, 1996）。この血清蛋白質は、脂肪細胞から分泌され、三量体の四量体であることが最も多く、Clq蛋白質の場合と同様に、球状のC末端のドメインが、コラーゲン様の（collagenaceous）三重らせんによって結合している。これら４個の三重らせんも、また適切な相互作用によって最終的にはオリゴマーを形成することが考えられる。X線構造回析を用いて決定したACRP30のホモ三量体の構造が、Shapiro及びSchererによって示されている（Current Biology 1998, 8:335-338）。
【０００８】
その他にも文献から既知である蛋白質には、コレクチン・クラスに由来するものがあり、このコレクチン・クラスは、コラーゲン様の（collagenaceous）ドメイン、ネック領域、さらにはカルボキシ末端にある球状のレクチン結合ドメインに特徴付けられている。コレクチンも、三量体のオリゴマーとして生理的に見られる。したがって、例えば、それぞれコレクチンファミリーに由来する肺表面活性物質蛋白質Ａ（SP-A）やマンノース結合蛋白質（MBP）は、その「コラーゲン様の（collagenaceous）」ドメインの相互作用により三量体を形成して、最終的には三量体の六量体として存在している（Esptein et al., Current Opinion in Immunology, Vol. 8, No.1, 1996, 29-35）。従って、コレクチンの名で知られている蛋白質も、それ故に多量体（例えば三量体）のオリゴマー（例えば六量体）を形成している。
【０００９】
さらに、シグナル分子として生理的に作用する蛋白質の多くは、特異的な状態でのみ生物学的なシグナルを変換することができることが文献に開示されている。従って、例えば、膜結合型FasLは、生物学的に、すなわちアポトーシス性の活性がある一方で、膜結合型断片から細胞外の蛋白質断片を除去してからは（sFasLとして知られている）、前記非膜結合型sFasL画分は、もはや目標の細胞に対して生理的にアポトーシス性の作用をすることができない。しかしながら、上記で説明したように膜結合型蛋白質断片から除去して得られるsFasLの三量体の生物学的な作用が、架橋抗体を用いることによってその生理的機能に関してどのように再活性化され得るのかについてSchneiderらの刊行物に記載されている（J. Exp. Med., Vol. 187, No. 8, 1998, 1205-1213）。この目的を達するために、FasLの三量体形成ドメイン、短いリンカー配列及びflagタグ（flagのアミノ酸配列DYKDDDDK（1文字表記）を有する）から構成される融合蛋白質を構築し、発現させて、構造に依存せずに三量体を形成している（すなわち、特異的な二次構造の相互作用によらないで、超二次構造を形成する）当該融合蛋白質は、flagタグに対して作られた抗体によって架橋される。
【００１０】
非公開のドイツ特許出願第19963859号には、二量体、三量体、四量体若しくは五量体の二量体又はオリゴマー、すなわち高次凝集体が開示されており、該高次凝集体は、２つの成分Ａ及びＢを包含する組換え融合蛋白質で構成されている。例えば、TNFサイトカインの生物学的な（アポトーシス性の）活性を高めるためには、ドイツ特許出願第19963859号によれば、組換え融合蛋白質の成分Ａは、例えばTNFサイトカインであってもよく、成分Ｂは、組換え融合蛋白質を結合させて高次凝集体を生じさせる蛋白質断片であってもよい。
【００１１】
強いアポトーシス活性を有する当該複合体は、多くの医療適用において求められているが、多くの病気の治療には、アポトーシス現象が誘発されるのを確実に阻止する物質の提供が必要とされている。可溶型FasL三量体が、オリゴマー化した分子によって誘導されるアポトーシスを特定の環境下で阻止できることがSudaらの刊行物から既知である（J. Exp. Med. 1997, 186, pp. 2045-2050）。しかしながら、例えばタンパクを基にした物質であって、例えばアポトーシス現象の誘発を受容体自体において阻止する能力があり、かつ実際には非天然型である故にin vivoでの生理的分解からよりよく保護される物質は従来の技術では未だ知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明の目的は、生体分子であり、受容体自体を生物学的に遮断するものとして作用する能力があり、したがって例えばアポトーシスのシグナル伝達カスケードの誘発を抑制する物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本目的は、請求項１記載の対象、すなわち組換え融合蛋白質の三量体によって明らかにされ、該組換え融合蛋白質の三量体は、成分Ａを少なくとも１つ以上と、成分Ｂを少なくとも１つ以上含み、成分Ａは、生物学的な機能、特に結合する機能を有する蛋白質又は蛋白質の断片を含み、成分Ｂは、第３の分子が働かなくても組換え融合蛋白質を三量体化する、すなわち生物学的に活性のある成分Ａの三量体を生成する蛋白質又は蛋白質の断片を含む。従って、本発明は三量体を提供し、該三量体は、高次凝集体、例えば三量体の二量体を形成することができないが、本質的には、三量体の総数のうち少なくとも90％まで、好ましくは三量体の総数のうち少なくとも95％まで、極めて特に好ましいのは三量体の総数のうち99％までが三量体を形成している組換え融合蛋白質として溶液中に存在している。
【発明の効果】
【００１４】
生物学的な機能を有する蛋白質又は蛋白質断片（融合蛋白質における成分Ａ）は、特に、詳細には抗体又は受容体に対するリガンドの機能を有する（すなわち一つ又はそれ以上の分子と結合のパートナーとして相互作用することができる）蛋白質、修飾アミノ酸配列、例えば共有結合で若しくは非共有結合で結合した活性成分（適切であれば、有機化学的性質の）を有するアミノ酸配列、抗体又は抗原結合部位を有する抗体断片あるいは例えばペプチドホルモンのようなホルモンを意味するものとして理解される。これとの関連で、本発明は、本発明において、特に成分Ａとして用いられるシグナル蛋白質又はその断片又はその誘導体は、高次凝集体の形でのみ生物学的な活性があるが、対照的に三量体としては、それらはin vitro及びin vivoで受容体に結合するが、これらの受容体を活性化するのではなく、むしろ競合して結合部位を塞ぎ、生物学的に活性化するシグナルを誘発する能力はなく、阻止する能力のみあるという知見を基にしている。
【００１５】
生理的に膜に結合するシグナル蛋白質のうち、例えばTNFサイトカインの場合、膜外の、特に細胞外の蛋白質断片を包含する分解産物が、三量体を形成する組換えシグナル蛋白質の成分Ａとして好ましい。しかしながら、抗原として作用することができるアミノ酸配列も組換え融合蛋白質中の成分Ａとして用いてもよい。最後に、受容体、例えばTNFレセプターファミリー由来のレセプター（例えばFasR）又は当該受容体の断片もしくは誘導体は、結合機能を同様に有する（従って、結合のパートナーとして別の分子、例えば膜結合型FasLと相互作用する）ことから、本発明において「リガンド」という用語に包含され、それらもまた成分Ａとして使用してもよい。そのような結合能力がある生物学的なレセプターの断片は、相補的な生物学的なリガンドが、非生理学的に高い濃度で患者内に存在する場合に薬剤として使用するのに特に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
好ましい実施態様では、本発明による三量体で存在する成分Ａは、同一の成分Ａ（ホモ三量体）又は相違する成分Ａ（ヘテロ三量体）を包含してもよく、すなわち種々の組換え融合蛋白質が、本発明による三量体を形成することができる。このように、種々の成分Ａを有する蛋白質、適切であれば異なる生物学的な機能を有する蛋白質は、本発明による三量体において共に結合することができる。ここで、２つの組換え蛋白質の成分Ａは同一であるが、第３の融合蛋白質の成分Ａは該成分Ａと異なっていてもよく、あるいは３つすべての融合蛋白質が成分Ａについて相違してもよい。このように、三量体における成分Ａの選択、配置、特定の組み合わせ及び／又は数によって、抑制効果を、適切であれば活性化する効果と共に通常は細かく調節することができ、これを達成することができる。
【００１７】
さらに好ましい実施態様では、組換え融合蛋白質中の成分Ａは、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン又はこれらの断片、好ましくは結合可能な断片の形をとる。しかしながら、上記のペプチド、蛋白質の断片及び／又は蛋白質の機能を有する誘導体も、本発明による三量体の構成物質である組換え融合蛋白質中の成分Ａとして使用してもよい。
【００１８】
本発明による三量体の組換え融合蛋白質のさらに好ましい実施態様によれば、その成分Ａは、受容体、例えば、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキンの受容体を包含するか、又は本発明による該融合蛋白質の該成分Ａは、当該受容体の断片若しくは誘導体の形をとる。当該受容体の特に好ましい例としては、THF受容体のファミリー由来の受容体があり、詳細にはFasR（以下、簡単にFasと呼ぶ）がある。
【００１９】
生物学的に活性のある蛋白質、蛋白質断片又はペプチドの機能を有する誘導体とは、詳細には生物学的な機能、特に相互作用のパートナー、例えば膜結合型受容体と結合する性質を保持しているが、その配列には、対応する天然の配列との違いが認められる蛋白質をいう。これらの配列の違いは、１つ又はそれ以上の挿入、欠損及び／又は置換によるものであってもよく、使用する誘導体と天然の配列との間の配列相同性は、好ましくは少なくとも70％以上、より好ましくは85％以上、特に好ましくは90％以上である。機能を有する誘導体という用語には、詳細には生理学的な配列と比較して同類置換がなされているアミノ酸配列が含まれている。同類置換とは、同類のアミノ酸を別の同類のアミノ酸に交換するという置換をいう。具体的には、脂肪族の側鎖を有するアミノ酸、正電荷又は負電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸、側鎖内に芳香族基を有するアミノ酸又は側鎖が水素結合を形成する能力をもつアミノ酸、例えばヒドロキシ基を有するアミノ酸が存在している。このような置換とは、例えば極性の側鎖を有するアミノ酸を同様に極性の側鎖を有する別のアミノ酸へ置換するか、又は例えば疎水性の側鎖を特徴とするアミノ酸を同様に疎水性の側鎖を有する別のアミノ酸へ置換する（例えばセリン（スレオニン）をスレオニン（セリン）へ、又はロイシン（イソロイシン）をイソロイシン（ロイシン）へ）ことをいう。特に、空間構造に変化が生じない配列の位置又は結合領域に関する配列の位置で挿入及び置換を行うことができる。挿入又は欠損による空間構造の変化は、例えばCDスペクトル（円偏光二色性スペクトル）を用いて容易に検出することができる。（Urry, 1985, Absorption, circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods, in Biochemistry, Neuberger et al. (Ed.), Elsevier, Amsterdam）。天然の配列と比較して置換がなされているアミノ酸配列を有する蛋白質を生成するのに適した方法は、例えば、米国特許第4,737,462号, 第4,588,585号, 第4,959,314号, 第5,116,943号, 第4,879,111号及び 第5,017,691号に開示されている。誘導体の生成は、Sambrookらによって詳細に説明されており（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratoty Press）、コドンを省略したり、補足したり、又は置換したりすることができる。その他にも誘導体は、特に置換によって蛋白質のバックボーンを安定させることで生理学的な分解を避けるために安定化した蛋白質であってもよく、例えばアミド結合を置換することによって、例えばβアミノ酸を使用することにもよって、蛋白質のバックボーンを安定させることで安定化した蛋白質であってもよい。
【００２０】
本発明において、リガンドは、結合反応に加わる全ての分子を意味するものとして理解される。従って、リガンドは、また通常は受容体と呼ばれている蛋白質であってもよい。また、当該受容体は、例えば、その相互作用のパートナー、例えばシグナル分子に結合する場合、本発明における「リガンド」であってもよい。
【００２１】
組換え融合蛋白質の三量体は、該組換え融合蛋白質中の成分Ａが、TNFサイトカインファミリー由来のサイトカイン、当該TNFサイトカインの断片又はTNFサイトカイン若しくは対応するTNFサイトカイン断片の機能を有する誘導体である場合、特に好ましい。対応する受容体にin vivoで結合することによって（例えば、高次凝集体の形態で結合する場合）、目標細胞で使用されるTNFサイトカインの生物学的な作用により、例えばアポトーシス効果、増殖効果又は活性化効果が生じるが、三量体の時には、典型的には当該受容体への結合を確実なものとするのみであり、もはや活性化機能を発揮することはない。適したTNFサイトカイン、つまり融合蛋白質中の適した成分Ａは、詳細にはOX40Ｌ、RANKL、TWEAK、Lta、Ltab2、LIGHT、CD27L、41-BB、GITRL、APRIL、VEGI及びBAFFといった蛋白質又はその断片若しくは誘導体であるが、これらに制限されることはない。特に好ましいものは、CD40L、FasL、TRAIL、TNF（特にTNF-R2受容体に結合するTNF）、CD30L及びEDAといった蛋白質又はその断片若しくは誘導体である。組換え融合蛋白質中の成分Ａには、上記膜結合型TNFサイトカインの細胞外断片又はその機能を有する誘導体を使用するのが特に好ましい。これらの分解産物は、特に当該受容体に対するその結合能力を保持している場合、特に好ましい。上記TNFサイトカイン又は該TNFサイトカインの断片の上記の意味での機能を有する誘導体も融合蛋白質の成分Ａとして使用してもよい。特に好ましい実施態様では、組換え融合蛋白質の成分Ａは、本発明による三量体の構成成分であり、hFasL（139から281番目までのアミノ酸）、hTRAIL（95から281番目までのアミノ酸）、hCD40L（116から261番目までのアミノ酸）及びm若しくはhTNFα（77から235番目までのアミノ酸）から成る群から選択される。
【００２２】
従って、本発明によると、組換え融合蛋白質のために選択された成分Ａは、本発明によるオリゴマーの構成成分となるものであり、すでに溶液中で三量体の形態で存在している可能性がある。そのような場合、成分Ｂは、成分Ａの三量体化をさらに促進するだろう。このような状況は、例えば、成分Ａ、例えばTNFリガンド又はその断片又はその誘導体が、通常はすでに溶液中で三量体を形成しており、前記成分Ｂによって三量体の形態でさらに安定するものである場合に見られる。その一方、組換え融合蛋白質の成分Ａが、それ自体は表面相互作用による三量体構造を溶液中又はin vivoで示さない場合には、成分Ｂは、本発明によれば、該組換え融合蛋白質の成分Ａが、三量体の形成を保証する必要があるだろう。後者の場合には、例えば、典型的には天然の蛋白質の断片のみを組換え融合蛋白質の成分Ａとして用いた場合があり、該天然の蛋白質の断片は、それ自体では例えば平衡が単量体の方へ大きく移動しているので三量体を形成することができないか、又は少なくともin vivoで三量体の形態で存在しないものであり、つまり、例えばサイトカインの断片、特にFasL、CD40L、CD30L、TRAIL、EDA又はTNFのＣ末端の断片（例えばＣ末端から少なくとも100アミノ酸以上を含む断片（Ｃ末端から計算した場合）、好ましくはＣ末端から少なくとも120アミノ酸以上を含む断片、特に好ましいのはＣ末端から150アミノ酸以上を含む断片）である。
【００２３】
しかしながら、好ましい実施態様では、組換え融合蛋白質の成分Ａは、本発明によるアミノ酸配列の形を取ってもよく、該アミノ酸配列は、受容体のアゴニスト又は受容体のアンタゴニストの担体として作用するのに適するものである。従って、例えば、薬理活性がある有機化学物質の小さい分子を、典型的には共有結合で、例えばスレオニン若しくはセリンとのエーテル結合、アミド様の結合又はエステル結合によって当該アミノ酸配列に結合させることができる。当該結合したアゴニスト又はアンタゴニストは、本発明による三量体の結合定数を好ましくは少なくとも10-9Ｍ-1の値まで上昇させることができるか、又は生物活性、特にアポトーシスのシグナルカスケードが誘発されるのを抑制することに関する本発明による三量体の抑制作用を調節することができる。さらに、本発明による三量体を、薬理活性がある物質の担体として使用することができる。適した担体である本発明による三量体を選択することによって、薬理活性のある成分を、これらの活性成分の薬理的な目標である特定の細胞の空間付近へこのような方法で選択的に輸送することができる。例えば、当該活性成分をFasLの三量体に結合させて、活性成分を目標細胞へ直接投与しながら、FasL三量体が結合することによってFasRを抑制する（従って、本発明によれば、アポトーシスを抑制し、このような方法で細胞の生存を保護する）可能性がある。例えば、活性成分としての細胞毒性物質に三量体を結合させることによってそのようなシステムを使用することが可能であり、該物質は、例えば変性疾患、詳細には神経変性疾患、特にパーキンソン病又はアルツハイマー病の場合に、目標細胞に対して免疫細胞が攻撃するのを防ぐ。従って、パーキンソン病の場合、黒質においてドーパミン生産細胞が死滅するのを本発明によれば防ぐことができる。従って、本発明による担体と、適切であれば共有結合で結合した活性成分である成分のそのようなシステムをヒト又は獣医学の薬剤として使用する方法を、総体的に明らかにする。
【００２４】
組換え融合蛋白質の成分Ｂは、通常はClq蛋白質ファミリー又はコレクチンファミリーに由来する蛋白質の形を取るものである。オリゴマー形成ドメインではなく三量体形成ドメインのみが組換え融合蛋白質の構成成分として転写されるか、又は翻訳される場合、Clqに由来する蛋白質又はコレクチンファミリーに由来する前記蛋白質は、組換え融合蛋白質の構成成分、すなわち成分Ｂとして特に好ましい。組換え融合蛋白質中の成分Ｂは、また上記蛋白質本来の特徴である球状の「ヘッド」ドメインを含まないものであるのが好ましい。従って、本発明による組換え融合蛋白質の上記成分Ｂは、典型的には、例えば三重らせんを形成することによる、三量体を形成するための機能性を有するコラーゲン様の（collagenaceous）断片のみを含み、他の三重らせんとの二量体又はオリゴマーの構造（例えば三重らせんの四量体又は六量体）を形成する能力をさらに有する配列断片を含まない配列を有するものである。
【００２５】
従って、三量体を形成する融合蛋白質は、三量体の形成を担う成分Ｂとして、典型的にはClq蛋白質ファミリー又はコレクチンファミリーに由来する蛋白質のドメインのみを含むものである一方で、その各「ヘッド」ドメインを、生物学的な機能を同様に発揮する成分Ａとしての他の蛋白質又は蛋白質断片に置換することができる。従って、本発明では、「組換え融合蛋白質」という用語は、組換え融合蛋白質において少なくとも一つ以上の成分Ａ及び少なくとも一つ以上の成分Ｂが人工的に融合していること、すなわち本発明のための融合蛋白質は、天然の蛋白質に該当しないことを意味するものとして理解される。
【００２６】
Clq蛋白質ファミリー若しくはコレクチンファミリーの蛋白質の機能を有する誘導体、すなわち三量体を形成する誘導体又は上記蛋白質の断片の機能を有する誘導体も、組換え融合蛋白質を凝集させて三量体を得るための成分Ｂとして用いてもよい。例えば、成分Ｂは、Clq、MBP、SP-A（肺表面活性物質蛋白質Ａ）、SP-D（肺表面活性物質蛋白質Ｄ）、BC（ウシ血清コングルチニン）、CL43（ウシコレクチン−43）及び／又はACRP30といった蛋白質の対応する配列断片あるいはこれらの蛋白質断片の機能を有する誘導体を含むものである。
【００２７】
組換え融合蛋白質の三量体は、該組換え融合蛋白質の成分Ｂが、三重らせんを形成するコラーゲン様（collagenaceous）の配列領域に由来するClq蛋白質若しくはACRP30蛋白質の蛋白質断片又はこれらの機能を有する誘導体を含む場合、その配列断片の全長が少なくとも8アミノ酸以上、典型的には全長が少なくとも20アミノ酸以上であることが特に好ましい。本発明の特に好ましい実施態様は、組換え融合蛋白質の三量体の成分Ｂが、図１に示すアミノ酸配列（枠に囲まれた配列、45から111番目までのアミノ酸）又はこのマウス（m）のアミノ酸配列の機能を有する誘導体（例えば類似するヒトの配列又は類似する別の哺乳類の配列）又はこの配列の断片を含む該組換え融合蛋白質の三量体である。
【００２８】
種々の宿主生物由来の配列を含む融合蛋白質の三量体が特に好ましい。本発明による凝集体は、それがキメラ融合蛋白質から由来し、成分Ａが成分Ｂとは異なる動物種から由来する場合、非常に好ましい。従って、成分Ａは、マウス、ラット、ブタ若しくは特に哺乳類である他の脊椎動物由来のアミノ酸配列又は当該配列の機能を有する誘導体に該当し、成分Ｂはヒト由来のものであるか、あるいは逆の場合も同様に好都合である。もう一つの方法としては、本発明による三量体を形成する本発明による融合蛋白質中の成分Ａ及び成分Ｂの配列は、同じ動物種から由来していても好ましい。
【００２９】
本発明のさらに好ましい実施態様において、6アミノ酸以上、好ましくは8から30までのアミノ酸、極めて特に好ましいのは8から20までのアミノ酸である短いアミノ酸配列によって組換え融合蛋白質は三量体を形成し、該配列は、成分Ｂとして組換え融合蛋白質中に存在している。このような融合蛋白質の三量体形成は、これらの短いアミノ酸配列により達成され、典型的には超二次構造、特にコイルド−コイル三重らせんが形成することによるものである。このような目的に適しているのは、例えば、超二次構造、例えば典型的なコラーゲン様の（collagenaceous）三重らせん又はこの断片（例えばCMP、COMP、コラーゲン又はラミニンといった蛋白質の三重らせん又はその断片）が形成されることにより三量体を生成する全ての蛋白質の配列断片である。
【００３０】
本発明によれば、三量体の形成をもたらす組換え融合蛋白質の成分Ｂは、特に高次ではない凝集体を形成すべきであるので、成分Ｂは、通常は分子内ジスルフィド架橋を形成することが可能なシステイン残基を含むべきではない。したがって、組換え融合蛋白質中の成分Ｂは、システイン残基を全く含まないか、又は分子内、すなわち組換え融合蛋白質自体の中にジスルフィド架橋があるシステイン残基のみを、他の三量体である融合蛋白質の少なくとも一つ以上のシステイン残基との共有結合が酸化条件下で生ずる可能性のある状況を回避するために含むものであるのが好ましい。
【００３１】
成分Ａ及びＢに加えて、融合蛋白質は、さらに配列断片を含んでもよい。これとの関連で、本発明において好ましい配列は、タグ配列として知られている配列であり、例えば少なくとも１つ以上のflagタグ、すなわちDYKDDDDKであるアミノ酸配列及び／又は他には例えば少なくとも１つ以上のHisタグ（いくつかの連続したヒスチジン、例えば少なくとも５つ以上連続したヒスチジンを含む）及び／又は更なるタグ配列又は抗原性配列がある。さらに、本発明による融合蛋白質の個々の断片（成分Ａ、Ｂ又はタグ配列、２つ又はそれ以上の成分Ａが本発明による融合蛋白質中に存在することも可能である）をリンカー配列によってお互いを区切ってもよい。これらのリンカー配列（少なくとも2アミノ酸以上、好ましくは少なくとも5アミノ酸以上のもの）は、組換え融合蛋白質における種々の機能的な成分の構造上の境界として働き、「ヒンジ」機能、すなわち可動性の構造であるアミノ酸配列の機能を発揮することもできることが好ましい。少なくとも一つ以上の蛋白質分解性の切断部位を含み、成分Ａを、成分Ｂと区別できるようにするリンカーが非常に好ましい。リンカー内の蛋白質分解性の切断部位は、トロンビン・コンセンサス配列であるのが好ましい。
【００３２】
基本的には、成分Ａは、成分Ｂに比べてＣ末端又はＮ末端に、好ましくはＣ末端に配置することができる。タグ配列は、本発明による組換え融合蛋白質の任意の位置に、好ましくはＮ末端の位置にあってもよい。
【００３３】
細胞膜外の受容体を抑制する方法も、本発明のさらなる対象として明らかにする。当該方法は、生物学的機能を有する蛋白質又は蛋白質の断片に該当する少なくとも１つ以上の成分Ａ及び三量体を形成する少なくとも１つ以上の成分Ｂを組換えることを特徴とし、最初に（ａ）当該組換え融合蛋白質を、例えば発現ベクターにおいて発現し、（ｂ）単離して、（ｃ）次にin vitroでの研究用の細胞培養液、例えば細胞懸濁液に添加する方法である。従って、本方法は、in vitroでの研究において細胞を保護する、例えばアポトーシス性の細胞死から細胞を保護するのに適している。次に、前記方法で記載したとおりに結合する本発明による三量体を有する当該細胞を、さらなるin vitroでの研究のために、あるいは薬剤を製造するために用いることができる。結合定数が高いのであれば、in vitroで処理した当該細胞を再移植することができる。例えば、そのような手法は、in vivoにおけるアポトーシスによる死から細胞を保護するために、自己免疫性疾患又は変性疾患の場合に適している。
【００３４】
上記のような方法では、成分Ａは、TNFサイトカイン、TNFサイトカインの断片又は当該蛋白質若しくは蛋白質断片の機能を有する誘導体である場合が特に好ましい。
【００３５】
本発明の三量体は、医学すなわち人間医学と獣医学の両方で用いる薬剤の製造又は疾患若しくは障害の治療に適し、特に成分Ａが、シグナル蛋白質又は当該シグナル蛋白質の断片又は該蛋白質若しくは断片の誘導体である場合に適している。本発明の特許請求の範囲に記載されている三量体（ヘテロ若しくはホモ三量体）を用いて広範囲の疾患又は障害を治療することができる。詳細には、各生理学的なリガンドの細胞外濃度の増加又は膜結合型受容体の数の増加が症状の中で認められた場合にそれらを使用する。例としては、膜結合型シグナル分子、例えばTNFサイトカイン（例えばFasL）の濃度が細胞自体の表面上で増加すること、又はプロテアーゼによって切断されて可溶性となった可溶型シグナル分子、例えばTNFサイトカインの濃度が増加することがある。本発明による当該三量体を、例えば高炎症性の障害、自己免疫疾患、過剰なアポトーシス反応による疾患又は変性疾患、詳細には神経変性疾患（例えばパーキンソン病）、適切であればウイルス性感染症の治療用薬剤の製造にも用いることができるが、これらに限定されることはない。本発明による三量体は、天然のサイトカインの生物活性を抑制することを目的とする治療、すなわち対応するサイトカイン受容体を抑制する働きをする治療が疾患に必要である場合に特に適している。例としては、ウイルス性肝炎（HBV、HCV）、アルコール性肝疾患、胆汁鬱滞性肝炎、ウィルソン病、自己免疫システムの非機能性による肝炎、肝臓移植後の拒絶反応である肝炎、GvHD、TEN（中毒性表皮壊死症（toxic epidermal necrolysis））、橋本甲状腺炎又は多発性硬化症がある。
【００３６】
本発明は、さらに上記の種類の融合蛋白質をコードするDNA配列に関する。当該DNA配列を発現ベクターで発現し、本発明による融合蛋白質のDNA配列を含む、該当する発現ベクターも本発明の対象である。さらに、本発明は、本発明による融合蛋白質をコードするDNA配列を形質移入した宿主細胞にまで及ぶ。これとの関連で、発現ベクターを形質移入した宿主細胞が特に好ましく、該発現ベクターは、本発明による融合蛋白質をコードするDNA配列を含むものであることが特に好ましい。本発明による上記の対象物は、すべて薬剤として又は薬剤の製造に適しており、特に本特許出願に開示されている疾患の治療に、適切であれば組成物の構成成分として適している。
【００３７】
本発明による三量体又は本発明の他の対象物を、薬剤の製造あるいは上記疾患又は障害の治療のために、非経口投与、すなわち例えば皮下投与、筋肉内投与、動脈内投与若しくは静脈内投与、又は経口投与又は鼻空内投与又は肛門投与、腹腔内投与、膣投与又は口腔内投与、脳内投与、眼球内投与（注射又は注入）、適切であれば局所投与にも適する方法で使用するのが好ましく、このように使用することも本発明の範囲内である。
【００３８】
本発明による三量体又は本発明による三量体を形成する宿主細胞又は三量体を形成することが可能な組換え融合蛋白質をコードするDNA配列又は適切な発現ベクターは、それぞれがそれ自体薬剤として作用することができるか、又はそれぞれを薬剤の製造に使用することができる。しかしながら、他の活性成分である成分又は薬剤の補助剤、担体若しくは添加剤と組み合わせた薬剤として使用することもできる。したがって、本発明による三量体又は本発明のさらなる対象物は、薬剤的に受容可能な担体、補助剤及び／又は添加剤と共に構成成分として混合することができる。従って、本発明による対象物、特に本発明による三量体を含む（薬剤の）組成物も本発明に従って明らかにする。適した製造方法は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」（Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980）に開示されており、これは参照して本明細書にその内容が取りこまれるものである。非経口投与に適した担体は、例えば滅菌水、滅菌した生理食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化したナフタレン、及び特に生物学的適合性のラクチド重合体、ラクチド／グリコリド共重合体又はポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン共重合体である。本発明による組成物は、賦形剤又はラクトース、マンニトール等の物質、例えばポリエチレングリコール等の重合体を本発明による抑制物質に共有結合させるための物質、金属イオンと錯体を形成するための物質又は例えばポリラクテート、ポリグリコール酸、ヒドロゲル等の重合体化合物の特別な製造中に又は該製造によって又はリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層若しくは多層の小胞、赤血球の断片又はスフェロプラストによって物質を封入するための物質を含んでもよい。前記組成物の個々の実施態様を、例えば可溶性、安定性、生物学的利用性又は分解能力に関する物質の性質によって選択する。前記組成物中の本発明による活性成分である成分を徐放するもの又は絶え間なく放出するものとしては脂肪親和性のデポー（例えば脂肪酸、ワックス又は油）による製剤が挙げられる。同様に、本発明による物質の被膜又は当該物質を含む組成物の被膜、すなわち重合体による被膜が本発明の範囲内であることは明らかである（例えばポロキサマー又はポロキサミン）。さらに、本発明による物質又は組成物は、保護被膜、例えばプロテアーゼ抑制物質や浸透剤を用いて提供される。
【００３９】
本発明による三量体を、体外診断の分野であるいは例えば生化学的な精製処理に用いることも好ましい。生化学的な精製処理、特に例えば対応する細胞外受容体を発現している細胞の単離を可能にするために、例えば当該複合体を充填することができる精製カラム上でクロマトグラフフィー処理をするという状況において本発明による三量体を使用することも可能である。従って、当該複合体を検出目的で使用することも本発明の範囲内であることは明らかである。
【００４０】
ここに記載されている本発明の更なる対象は、融合蛋白質であり、該融合蛋白質は、組換え融合蛋白質が、成分Ａを少なくとも１つ以上と、成分Ｂを少なくとも１つ以上含むものであり、成分Ａは、生物学的な機能、特に抗体若しくは受容体に対するリガンド機能を有する蛋白質又は蛋白質断片を含むものであり、成分Ｂは、本発明による三量体の構成成分として上記のような蛋白質の三量体を形成する断片又は該蛋白質断片の機能を有する誘導体を含むものである限り、三量体を形成するのに適している。従って、本発明による三量体の構成成分として先に開示されているすべての組換え融合蛋白質は、本発明において明らかにされている。従って、成分Ａ及びＢに関して、並びに組換え融合蛋白質の構築に関して、本発明による三量体と関連する上記の開示は、本発明による組換え蛋白質の実施態様自体に該当する。従って、本発明による組換え融合蛋白質の成分Ｂは、典型的にはClq蛋白質ファミリー若しくはコレクチンファミリーからなる群から、又はコラーゲン様の蛋白質ファミリーから選択された蛋白質断片であり、組換え融合蛋白質の成分Ｂは、三量体のオリゴマーを形成する構造又は球状の「ヘッド」ドメインを含まずに三量体を形成する断片のみを含んでいるのが好ましい。従って、典型的には、成分Ｂは、（abcdefg）nという７アミノ酸のパターンであるアミノ酸配列を少なくとも１つ以上含み、該アミノ酸配列は、三重らせんを形成しているらせんを構造上形成するものであり、そのa及びdの位置のアミノ酸は、好ましくは無極性の側鎖を有しており、それ故に上記の超らせん構造、この場合では３つのらせんから構成されている三重らせんの形成を可能にする。少なくとも１つ以上、好ましくは少なくとも２つ以上の７個のパターンがある配列は、例えばケラチン、コラーゲン、Clq、MBP、SP-A、SP-D、BC、CL43又はACRP30といった蛋白質のうちの１つに由来するものである。上記蛋白質の当該断片の機能を有する誘導体を用いることも本発明の範囲内であり、上記で選択された成分Ａの機能を有する誘導体の定義も、同様に成分Ｂに適用することができる。
【００４１】
本発明のさらなる対象は抑制物質であり、該抑制物質は、ジスルフィド架橋を形成することにより六量体（2ｘ3）としてin vitroの溶液中で存在している（ApoFasL-060）。この抑制物質は、適切であれば酸化媒体中で三量体の形態でin vivoで存在するか、又は三量体のような形態で挙動し、それ故に抑制する性質を発揮する。ApoFasL-060は、Ｎ末端のflag配列、リンカー及び特異的なリンカー及びhFasLの103から138番目までのアミノ酸及び同様にhFasLの139から281番目までのアミノ酸（成分Ａ）から構成されている（図１参照）。同様に、成分ＡとしてApoFasL-060型の抑制物質は、また他のTNFサイトカイン、例えばOX40L、RANKL、TWERK、Lta、Ltab2、LIGHT、CD27L、41-BB、GITRL、APRIL、VEGI及びBAFF又はそれらの断片又は誘導体の対応する結合断片も有してもよい。CD40L、FasL、TRIL、TNF（特にTNF-R2受容体に結合するTNF）、CD30L及びEDAといった蛋白質並びにそれらの断片及び誘導体、特にそれぞれがヒトの配列であるものが特に好ましい。
【００４２】
以下、本発明を、図面によりさらに詳細に説明する。
【００４３】
図１は、本発明によるFasLキメラのアミノ酸配列（FasL-199、FasL-060及びFasL-267）を一文字表記で示す。２つのキメラ蛋白質FasL-199及びFasL-267は、血漿蛋白質であるACRP30蛋白質の構成成分を含み、該蛋白質は、補体因子Clqに構造上似ており、脂肪細胞によって生産される。天然のACRP30蛋白質は、全長が247アミノ酸であり、そのN末端には分泌シグナル配列（1から17番目までのアミノ酸）があり、それに続く27アミノ酸の配列（18から44番目までのアミノ酸）は、蛋白質のオリゴマー形成を担うものである。それに続く該天然蛋白質の断片（45から110番目までのアミノ酸）は、22のコラーゲン様（collagenaceous）配列の繰り返しを含み、従ってコイルド−コイル・ドメインを形成する。本来、このコイルド−コイル・ドメインは三量体の形成をもたらす。
【００４４】
キメラ蛋白質FasL-199（コントロール）はPCR増幅により構築され、マウスACRP30（mACRP30）の完全なオリゴマー形成ドメイン（18から110番目までのアミノ酸）を含むものである。FasLキメラ蛋白質のＣ末端の方にはFasLの三量体形成ドメイン（139から281番目までのアミノ酸）がある。リンカー配列は、Ｎ末端のflagタグとmACRP30断片との間、及びmACRP30（成分Ｂ）とヒトhFasL断片（成分Ａ）との間（LQ）にある。
【００４５】
キメラ蛋白質FasL-267は、その大部分がFasL-199と一致するが、mACRP30断片に欠損がある。該キメラ蛋白質には、ACRP30のオリゴマー形成ドメイン（18から44番目までのアミノ酸）がない。その欠失変異体は、ESTクローンAA673154からPCR法を用いて生成された。mACRP30の18から44番目までのアミノ酸が欠損していることが原因で、前記コンストラクトは三量体の形態で存在し、このことはゲル濾過実験によって実証された。
【００４６】
キメラ蛋白質FasL-060は、Ｎ末端にflag配列を有し、続いてリンカー（GPGQVQLQ）、ジスルフィド架橋を形成することができる特異的なリンカー、ヒトFasL（hFasl）の103から138番目までのアミノ酸、最後に成分ＡとしてhFasLの139から281番目までのアミノ酸を有する。ジスルフィド架橋が構築されるかどうかによって、ApoFasL-060は、三量体あるいは六量体のように振る舞う。
【００４７】
図２Ａにおいて、図２は、Bjab細胞の生存能力に関するApoFasL-060及びApoFasL-267のin vitroでの活性を示す。OD 490nmにおける吸光度をy軸にプロットし、細胞毒性試験のために添加した融合蛋白質の濃度をx軸にプロットした（対数で）。490nmにおける吸光度は、細胞の生存能力の指標である（吸光度が高いと、添加した物質のアポトーシス活性が低いということになり、従って細胞の生存能力が高いということになる）。図に示されている曲線は、架橋する抗体を加えない場合におけるApoFasL-267（白丸）及びApoFasL-060の定量用の曲線（白四角）又は架橋する抗体を加えた場合におけるApoFasL-267（黒丸）及びApoFasL-060の曲線（黒四角）である。架橋する抗体があるFasL-267と違い、FasL-267単独では、高濃度（すなわち、ほとんど希釈していないもの）でも細胞に対する細胞毒性がなかった。
【００４８】
図２Ｂは、図２Ａに示されているApoFasL-267（白丸）及びApoFasL-060（白四角）の抑制活性を示す。抑制活性が測定できるようにするために、50ng/mlの濃度のオリゴマー化したFasLを、アポトーシスを誘発するために全ての実験で添加した。
【００４９】
図２Ｃは、FasL-199及びFasL-267のBjab細胞に対するアフィニティーをそれぞれ比較した、アフィニティー研究の結果を示す。ApoFasL-267及びFasL-199は、Bjab細胞上のFasへ結合するためにZB4抗体と競合する。ZB4（抗Fas抗体）の結合パーセンテージを、FasL-199（白四角）及びFasL-267（白丸）の濃度に対してそれぞれプロットした。測定のばらつきの範囲内で、２つのFasLリガンドのアフィニティーについて違いが見られなかった。従って、２つのリガンド間の細胞毒性についての違いは受容体に対する結合アフィニティーの違いによるものではないことが実証された。
【００５０】
図３は、in vivo実験の結果、すなわちアゴニストである抗Fas抗体J02によって誘導される肝細胞の破壊に対するApoFasL-060の抑制効果を示す。図３Ａは、5μgのJ02抗体を静脈内注射する前にApoFasL-060（25μg/マウス）又は生理食塩水（コントロール）のいずれかをマウスに静脈内注射した実験の結果を示している。図３Ａにおいて、静脈内注射から4時間後の測定結果として、黒塗りの棒はALTの血清力価（U/ml）を示し、白抜きの棒はASTの血清力価を示す。右のプロットは、コントロールの実験の結果を示す。図３Ｂは、生理食塩水溶液（黒塗りの棒）又はApoFasL-060（20μg）で前処理した（淡灰色の棒、いずれの場合でも左から3番目にある）後に10μgのJ02抗体を与えられたマウスの生存率又はApoFasL-060のみで前処理した後のマウスの生存率（濃灰色の棒、いずれの場合でも左から3番目にある）又はApoFasL-060と架橋抗体で前処理した後のマウスの生存率（中間の灰色の棒、いずれの場合でも最も右にある）を、それぞれ投与後経過した時間（2時間、4時間、24時間）の関数として示している。4時間後、アゴニストであるJ02抗体のみを与えられたマウスはいずれも生存していなかったが、抑制物質（淡灰色の棒）により、ほとんどすべてのマウスが生存していた。従って、ApoFasL-060は、アゴニストである抗Fas抗体J02のマウスにおける致死作用を防いだ。なお、架橋抗体は、ApoFasL-060の抑制効果を無効にした（中間の灰色の棒）。
【００５１】
図４は、オリゴマー化したFasLによって誘導される肝臓障害に関するApoFasL-267の効果を示す。図４は、オリゴマー化したFasL（FasL-199）を静脈内注射する前に、生理食塩水又は25μgのApoFasL-267のいずれかをマウスに静脈内注射した際の実験結果を示す。ALT（黒塗りの棒）及びAST（白抜きの棒）の血清力価を4時間経過後に分析した。さらに、棒グラフは、各々の力価をU/mlで示す。図４において中央及び右のプロットは、アゴニストである、すなわちアポトーシスを誘発するFasLを投与した後の結果を示し、左のプロットは、アゴニストであるFasLを投与していない比較実験を示す。従って、図４は、コントロール実験の結果だけではなく、保護リガンドを用いないでFasL-199を用いた実験の結果及び保護リガンドFasL-267と併用したFasL-199の実験結果も示す。
【００５２】
図５は、AAPによって誘導される肝炎の場合における可溶型FasLの効果を示す。AAP（300mg/kg）を腹腔内注射する前に、ApoFasL-267（図５Ａ）又はApoFasL-060（図５Ｂ及び図５Ｃ）のいずれかをマウスに静脈内注射した。図５Ａ及び図５Ｂのプロットは、ALT（黒塗りの棒）及びAST（白抜きの棒）の力価（U/ml）を示し、いずれの場合でも注射から5時間後に測定した。図５Ａ及び図５Ｂにおける左のプロットは比較実験に対応し、右のプロット（図５Ａ）及び図５Ｂの場合では中央及び右のプロットは、本発明による抑制物質の投与後の結果を示す。図５Ｃは、偽処理した（コントロール）動物（100％）と比べて、アミノトランスフェラーゼが相対的に減少した量を示す。
【００５３】
図６は、AAPで処理したマウスの肝臓に対するApoFasL-267及びApoFasL-060の効果を示す。図５において上述したとおりにマウスを処理した。肝炎を誘導してから24時間後に肝臓を解剖して組織学的に評価した。図６には、３つの組織の切断面の画像（AAPを添加したもの、AAP及びApoFasL-267を添加したもの、最後は生理食塩水を投与した後のもので対照となるもの（コントロール））がある。コントロール動物由来の組織の切断面と比較すると、ApoFasL-267（又はApoFasL-060、図示せず）でマウスを処理することにより、肝臓障害が抑制されたことが分かった。対照的に、AAPのみで処理した動物の肝臓は、中央の細静脈部分の壊死及びアポトーシス、洞様毛細血管炎症性の血液の鬱血並びに肝細胞の空胞化を示した。
【００５４】
図７Ａは、本発明によるFasキメラであるFas-ACRP（MKB216）のcDNA配列及びその配列から推定されるアミノ酸配列を示す。コンストラクトは、Fasの細胞外ドメインの17から172番目までのアミノ酸（すなわちFas受容体）を含み、該アミノ酸は、全長が14アミノ酸であるリンカーを介してマウスACRP30の完全なオリゴマー形成ドメイン（18から110番目までのアミノ酸）と融合している。そのアミノ末端に、前記コンストラクトは、さらにIg重鎖のシグナル配列とflagタグを含む。また、制限酵素切断部位をその図に示す。
【００５５】
図７Ｂは、図７Ａのコンストラクトの切断部位を示す制限酵素地図を示す。
【００５６】
図８は、A20細胞においてFasLによって仲介されるアポトーシスに対するin vitroでのFas-ACRP30の抑制作用を実証するものである。490nmにおける吸光度（細胞の生存の指標、図２参照）をy軸にプロットし、該当する融合蛋白質の濃度をx軸にng/mlでプロットした。Fas-ACRP30の抑制効果を、Fasのニ量体型であるFas-Fc、及びFasの五量体型であるFas-COMPのものと比較した。アポトーシス誘導剤は、本発明によるFasLキメラであるFasL-199を用いた。Fas-ACRP30コンストラクトは、FasLによって誘導されるアポトーシスを抑制し、IC50値は80ng/mlだった。この値は、五量体のFas誘導体であるFas-COMPの値（35ng/ml）に匹敵する一方で、（二量体の）Fas-FcのIC50は1μg/mlを越えていた。
【００５７】
以下、本発明を、実施例によりさらに詳細に説明する
【００５８】
以下の（a）から（f）までの実験の条件を、特に指定がない限り６つの実施例に適用した。
【００５９】
（a）FasL、TRAIL、TNFα及びCD40L融合蛋白質のベクタ-の構築。
FasLの三量体形成ドメイン（139から281番目までのアミノ酸）を、オリゴヌクレオチドJT398（ACT GCA GGA AAA AAA GGA GCT G）及びJ290（CAA CAT TCT CGG TGC CTG TAA C）を用いてヒトcDNAから増幅した。PCR産物を、pCRII（In Vitrogen）にライゲーションし、次にコード配列を、720から769番目までの塩基が削除されている（PS 038）改変したpCRIIIベクター（PS038、In-Vitrogen、NV Leek, オランダ）の制限酵素切断部位であるHindIIIとBamHIの間にサブクローニングした。該コード配列は、制限酵素切断部位であるPstIとEcoRIに囲まれており、血球凝集素のシグナルペプチドをコードするDNA断片を含み、５’−非翻訳配列（CAA AAC ATG GCT ATC ATC TAC CTC ATC CTC CTG TTC ACC GCT GTG CGG GGC）の6塩基及びflagのエピトープ（GAT TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA）、リンカー（GGA CCC GGA CAG GTG CAG）、制限酵素切断部位であるPstI、SalI、XhoI及びBamHIを含むものである。
【００６０】
FasL-199の発現ベクターを下記の通りに構築した。ESTクローンAA673154を用いて、最初にオリゴヌクレオチドJT1147（ACA ATG CAT GAA GAT GAC GTT ACT AC）及びJT1148（AGA CTG GAG AGC GGC TTC TCC AGG）を使用してPCR増幅を行った。マウスACRP30の18から111番目までのアミノ酸をコードする配列は、制限酵素切断面部位であるNsiIとPstIに囲まれており、これを三量体のFasLをコードするベクターのPstI切断部位に（融合したNsiI/PstI切断部位がコード配列の５’側にあるように）クローニングした。融合蛋白質FasL-167を発現するベクター（mACRP30の44から111番目までのアミノ酸を有する）を、別の５’−オリゴヌクレオチドJT1421（AAA ATG CAT GCA GGC ATC CCA GGA C）を使用して増幅した。PCR産物を、PCR“blunt”システムにライゲーションし、Nsi/PstIカセットを、上記のFasLを含むベクターにサブクローニングした。ACRP30と結合した別のTNFサイトカインを有する他の融合蛋白質を、発現ベクターFasL-ACRP30における制限切断部位であるPstIとEcoRI内のFasLの各配列を各リガンド配列に置換して生成した。
【００６１】
（b）組換え蛋白質の発現及び精製
リン酸カルシウム法を使用して、HEK293細胞を安定的に形質移入した。３日間インキュベーションした後、800μg/mlのG418を含む選択倍地でHEK293細胞を2週間培養した（前記の箇所：Schneider et al., J. Exp. Med. 1998も参照）。これらの安定的に形質移入されたクローンを採取して、選択倍地を入れた96ウェルのプレートに分注した。抗flag抗体によるウェスタンブロット法を用いて、組換え蛋白質が存在するか否かについて上清を分析した。
【００６２】
安定的に形質移入された細胞を、800mlの非選択培地中で10から14日間フラスコ内で培養した。培養物を遠心して、上清を濾過滅菌した。次にマウスACRP30とFasLの融合蛋白質（FasL-267又はFasL-199）を下記の通りに精製した。NaCl及びCaCl2（最終濃度は、NaClは150ｍM、CaCl2は2ｍM）で上清を処理し、塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH値を7.0にした。その後、組換え蛋白質を、1mlのM2-アガロースカラム（Sigma, Switzerland）にアプライし（0.5ml/分、48時間、4℃）、2ｍMのCaCl2を含む10倍容量のTBSでカラムを洗浄し、最後にTBS-EDTA（10ｍM）（0.1ml/分, 4℃）又は50ｍMクエン酸/NaOH（pH2.5）（1ml/分, 4℃）で溶出し、適切であれば0.2倍量の1MのTris-HCl（pH8）で中和した。排除限界が30kDaである濃縮器（Millipore）でバッファーをPBSに交換した。精製した蛋白質の濃度を、ビシンコニン酸（bicinchonic acid）法（Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA）によって、ウシ血清アルブミンを標準として用いて決定し、サンプルの純度を、SDS-PAGEとクマシーブルー染色によって決定した。
【００６３】
（c）細胞
ヒトTリンパ芽腫であるJurkat細胞（human T-lymphoblastoma Jurkat cells）、BJAB バーキット（Burkitt） リンパ腫細胞又はRaji細胞を、10％FCSを添加したRPMIで培養した。ヒト胚性腎臓細胞293を、2％FCSを加えたDMEM multi-substance mix F12（1:1）で培養した。全ての培地には、抗生物質（5μg/mlのペニシリン、5μg/mlのストレプトマイシン及び10μg/mlのネオマイシン）を入れた。
【００６４】
（d）細胞毒性試験
細胞毒性試験を、基本的にはSchneiderらの文献（J. Biol. Chem. 272:18827-18833, 1997）に上記に記載されているとおりに行った。ここでは、50,000の細胞を、100μlの培地で16時間インキュベートした。該培地には、1μg/mlのM2抗体の存在下又は非存在下で上記に示した濃度でリガンドが含まれている。細胞生存率を、PMS/MTS（フェナンジン・メトスルフェート ３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−５−［３−カルボキシメトキシフェニル］−２−［４−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩）（Promega Corp., Madison, WI）を用いて決定した。所要の時間（典型的には１から３時間）発色させて、490nmにおける吸光度を測定した。その490nmにおける吸光度を、細胞の生存能力の指標とした（吸光度が高いと、添加した物質のアポトーシス効果は低いということになり、従って細胞の生存能力が高いということになる）。
【００６５】
（e）マウスの処理
雌のBalb/cマウス（8から10週齢）に種々のコンストラクトを静脈内注射した。定められた期間が経過した後、該マウスから血液を採取して、続いてアミノトランスフェラーゼであるAST及びALT（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びアラニンアミノトランスフェラーゼ）の力価を定量した。
【００６６】
（f）材料
アガロース結合抗flag-M1抗体及びアガロース結合抗flag-M2抗体は、Sigma（Buchs, Switzerland）から入手した。J02抗体はPharmingenから、細胞培養試薬はLife Sciences（Basle, Switzerland）から入手した。
【００６７】
（g）バインディングの研究
ApoFasL-267及びFasL-199のアフィニティーを競合試験によって決定した。このために、抗Fasモノクロナール抗体ZB4を、iodo-Gen法（Pierce, Rockford, IL）によって100μCiの125Iでラベルした。これにより、比放射能が1.5μCi/μgである蛋白質が得られた。1x105のBjab細胞を、放射能ラベルしたZB4及び非ラベルの競合剤を系列希釈したもの（100μg/mlから10μg/mlまで）と共に37℃で１時間インキュベートした。１％BSAを含む冷却したPBSで３回洗浄した後、細胞に結合した放射活性をγカウンターで測定し、結合量cpmのパーセンテージで表した。すべての実験を三連で行った。
【００６８】
さらに、Schneiderらの文献（J. Exp. Med., Vol.187, No. 8, 1998, 1205-1213）及びそこに参考文献として引用されている刊行物を参照して、実施例を行うために使用した方法について明確に記載する。
【実施例１】
【００６９】
成分ＡとしてhFasL（hはヒトを指す）の139から281番目までのアミノ酸を含み、成分ＡのhFasLの139番目にあたるアミノ酸のＮ末端に、成分Ｂとして全長が94アミノ酸である配列（mACRP30の18から111番目までのアミノ酸）を含む組換え融合蛋白質（１、FasL-199）を発現した。さらに、融合蛋白質のＮ末端（成分ＢのＮ末端）に、アミノ酸DYKDDDDKを有するflag配列が発現しており、flagタグと成分Ｂの間に配置されたリンカー配列GPGQVQLQLHが連結している（図１参照）。成分Ａ及びＢは、リンカー配列LQによって区切られている。
【００７０】
比較実験のために、Ｎ末端に同様に上記のflag配列、そのＣ末端に続く同じリンカー配列、配列のＣ末端にhFasLの139から281番目までのアミノ酸を含む融合蛋白質（２、FasL-267）を発現した。融合蛋白質（１）は、特異的なリンカーとhFasLの103から138番目までのアミノ酸を包含する欠失が融合蛋白質（２）と異なる（図１）。
【００７１】
融合蛋白質（１）及び（２）のベクターを、上記の手法に従って構築した。融合蛋白質を、（ｂ）の方法で詳述したとおりに発現して、精製した。
【００７２】
精製した融合蛋白質（１及び２）の多量体化又はオリゴマー化の程度を電子顕微鏡で判定した。その結果、FasL-199は六量体（2x3mer）であって、同様にFasL-267を測定した結果、FasL-267は三量体であり、かつApoFasL-060は六量体様であった。
【実施例２】
【００７３】
（FasLによって仲介されるin vitroでのアポトーシスに対するApoFasL-060及びApoFasL-267の抑制効果）
（c）に記載したとおりに培養したBjab-Burkittリンパ腫細胞を採取し、その細胞の細胞毒性試験を、（d）に記載したとおりに行った。この細胞株に対して、抗flag M2抗体（Sigma, Buchs, Switzerland）の存在下又は非存在下で三量体を形成した融合蛋白質ApoFasL-060及びApoFasL-267の濃度を増加させて、それぞれの濃度において試験を行い、OD 490nmにおける吸光度を測定した（図２Ａ）。用いた抑制物質であるApoFasL-060及びApoFasL-267は図１に示されている（実施例１参照）。
【００７４】
抑制物質の両方とも、flagタグに対して作られた抗体と架橋した場合にアポトーシスを誘導するという類似した性質を示した（図２Ａ）。ApoFasL-060は、また架橋する抗体が存在しない場合でもその凝集体の構造によってアポトーシスを誘導した。従って、実施例２の結果は、ApoFasL-060とApoFasL-267は、それぞれFas受容体に結合する能力を有するが、死シグナルを変換するためにはオリゴマーを形成することが必要であることを示している。オリゴマー化したFasL（FasL-199）に対するアフィニティーが減少しなかったことから、２つの抑制物資の細胞毒性が減少したことは、Fas受容体に対するアフィニティーが減少したためではないことが判明した。
【００７５】
さらに、Bjab細胞を、ApoFasL-267の濃度を増加させてプレインキュベートし、続いてFasL-199を添加してアポトーシスを誘導した（図２Ｂ参照）。その結果、FasL-199によって誘導されるアポトーシスは、ApoFasL-267によって防ぐことが可能であることが明らかとなった。一連の測定から、分子形状が三量体であるApoFasL-267は、100ng/mlの抑制濃度（IC）でin vitroにおけるアポトーシスを防ぐことが可能であることが分かった。したがって、三量体の形であるApoFasL-267は、受容体を遮断することによってアポトーシスを防ぐが、凝集しているApoFasL-060は、その構造によりそれ自体がアポトーシスを誘導する効果を有するので、FasL-199によって誘導されるin vitroにおけるアポトーシスを防ぐことができない。
【実施例３】
【００７６】
（肝細胞の破壊の誘導に関するin vivo実験）
Ａ．ApoFasL-060の効果
この目的のために、アゴニストであるJ02抗Fas抗体をマウスに注射した。該抗体は、劇症肝不全によりそのように処理したマウスに死をもたらす。アミノトランスフェラーゼ（AST及びALT）の血清力価の高さによって、これらのマウスにおける肝細胞の破壊を検出した。ApoFasL-060（1mg/kg）でマウスを実験的に前処理して、J02抗体の投与後に該抗体によって誘発される肝不全（肝細胞の破壊）から動物を保護した（図３Ａ参照）。予想通り、ApoFaL-060の保護効果は濃度依存性であった。5μgのJ02抗体を投与した場合、観察されたAST及びALTの力価はコントロールのマウスのものと一致した。J02抗体の投与量が10μgの際には、顕著な保護効果が認められた（AST及びALTの力価が90％減少した）。従って、ApoFasL-060自体は、架橋抗体を使用しなければ毒性はなく（図３Ｂ）、その結果、この場合も先と同様に、アポトーシスを抑制する効果は、死シグナルを誘発することなくFas受容体に結合することによるものである。
【００７７】
致死量のJ02抗体（静脈内注射でマウス当たり10μg）によって、研究したすべてのマウスが4時間以内に死亡した（図３Ｂ）。これらの動物をApoFasL-060で前処理すると、死亡率が大幅に減少し、24時間後の生存率が86％に達した。抑制物質であるApoFasL-060（単独で注射したもの）には毒性がないことが判明したが、架橋抗体と共に注射した後で毒性効果が上昇し、４時間後の死亡率は80％であった。
【００７８】
Ｂ．ApoFasL-267の効果
本実施例において、生理食塩水（コントロールとして）又はApoFasL-267のいずれかをFasL-199を注射する前にマウスに注射した。次に、このように処理したマウスの肝細胞の破壊を分析する際に、それぞれのAST及びALTの血清力価を評価した（図４参照）。ApoFasL-267で前処理したマウスは、オリゴマーであるFasL（FasL-199）によって誘導される肝細胞の破壊から保護された。コントロールとして用いた動物では、FasLによって誘導される肝細胞の破壊がFasL-199の投与後直ちに（2時間以内に）観察され、アミノトランスフェラーゼの力価が第10因子によって増加したことが示された。従って、ApoFasL-267で動物を前処理することによって、AST及びALTの血清力価で決定された動物の肝臓障害が回避された。
【実施例４】
【００７９】
（アセトアミノフェン（AAP）によって誘導される肝炎の抑制）
アセトアミノフェン（AAP）は鎮痛剤であり、劇症肝不全を誘導することが知られている。その分子機構は、Fasによって仲介されるアポトーシスに基づいている。従って、三量体であるApoFasL-267及び／又は六量体であるApoFasL-060がAAPによって誘導されるアポトーシスから肝細胞を保護する可能性を本実施例で検討した。このために、亜致死量のAAP（0.3g/kg）をマウスに腹腔内注射した。5時間後、ALT及びASTの血清力価を測定して肝臓障害を決定した。ALT及びASTの力価は、IFCC（国際臨床化学連盟）のガイドラインに従って酵素試験によって決定した。ApoFasL-267又はApoFasL-060の投与により、AAPによって誘発されたAST又はALTの力価の増加が抑制された。未処理のマウスと比較すると、本発明に従って前処理したマウスを観察した時のアミノトランスフェラーゼの力価は著しく減少していた（75から90％まで）。
【００８０】
ApoFasL-060を用いた前処理による保護効果は濃度依存的なものであることが判明した（図５Ｂ及び図５Ｃ）。25μgのApoFasL-060（1mg/kg）を投与すると、AAPによって誘導される肝細胞の破壊は全く認められず、12.5μgを注射した場合は、アミノトランスフェラーゼの力価はわずかに増加し、すなわち肝臓障害がわずかに生じ、さらに低い用量、例えば6μg/マウスでは保護効果が消失するという結果となった。このような低用量で処理した動物と、生理食塩水のみで処理したコントロールの動物との間には違いが認められなかった。従って、観察された抑制作用は、受容体上の結合部位を競合的に塞ぐという形式で起きることを明言することができる。
【００８１】
AAPによって誘導される肝臓障害を組織学的に調べた（図６）。その結果を以下に述べる。中央の細静脈に壊死とアポトーシス、洞様毛細血管炎症性の血液の鬱血、空胞化した肝細胞が見られた。対照的に図６Ｂで見られるように、ApoFasL-267（又はApoFasL-060、図示せず）で前処理した場合は、そのような肝臓障害の症状は全く認められなかった。
【実施例５】
【００８２】
Ａ．Fas受容体キメラの構築
FasLによって仲介されるアポトーシスの非常に有効な抑制物質を製造するために、Fas受容体の細胞外ドメイン（17から172番目までのアミノ酸）及びマウスACRP30の完全なオリゴマー形成ドメイン（18から110番目までのアミノ酸）から構成され、これらの蛋白質が、全長が14アミノ酸であるリンカーを介して連結されている融合蛋白質を製造した（図７）。前記組換え蛋白質をSDS-PAGEで分析したところ、その見かけの分子量は、還元条件下では55kDa、非還元条件下では150kDaであった。従って、MKB216コンストラクト（以下、Fas-ACRP30と呼ぶ）は、基本的には六量体（2x3mer）の形で存在することが推論される。
【００８３】
Ｂ．FasLによって仲介されるアポトーシスに対するFas-ACRP30の抑制効果
FasLによって仲介されるin vitroでのアポトーシスに対する本発明によるFas-ACRP30融合蛋白質の抑制効果を確認するために、FasL感受性であるA20細胞を、オリゴマー化したFasLを添加する前にFas-ACRP30の濃度を増加させてプレインキュベートした。本発明によるFasL-199コンストラクトは、本実験において特に効果的なFasLオリゴマーとして作用した。このように、本発明によるFas-ACPR30コンストラクトの抑制効果を、二量体型のFas（Fas-Fc）の効果及び五量体型のFas（Fas-COMP）の効果と比較した。図８に示したように、Fas-ACRP30は、80ng/mlの濃度でFasLによって仲介されるアポトーシスを50％減少させた。この値は、二量体の比較コンストラクトであるFas-Fc（IC50＞1μg/ml）のものよりも著しく低いものであった。Fas-COMPの抑制効果は、IC50値が35ng/mlであり、Fas-ACRP30の効果に匹敵するものであった。従って、これらのデータより、Fas-ACRP30は、FasLによって仲介されるアポトーシスの有効な抑制物質であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、本発明によるFasLキメラのアミノ酸配列（FasL-199、FasL-060及びFasL-267）を一文字表記で示す図である。
【図２】図２は、Bjab細胞の生存能力に関するApoFasL-060及びApoFasL-267のin vitroでの活性を示す図である。
【図３】図３は、in vivo実験の結果示す図である。
【図４】図４は、オリゴマー化したFasLによって誘導される肝臓障害に関するApoFasL-267の効果を示す図である。
【図５】図５は、AAPによって誘導される肝炎の場合における可溶型FasLの効果を示す図である。
【図６】図６は、AAPで処理したマウスの肝臓に対するApoFasL-267及びApoFasL-060の効果を示す図である。
【図７】図７は、本発明によるFasキメラであるFas-ACRP（MKB216）のcDNA配列及びその配列から推定されるアミノ酸配列並びにFas-ACRP（MKB216）コンストラクトの切断部位を示す制限酵素地図を示す図である。
【図８】図８は、A20細胞においてFasLによって仲介されるアポトーシスに対するin vitroでのFas-ACRP30の抑制作用を実証する図である。
Claims (19)
- 組換え融合蛋白質の三量体であり、該組換え融合蛋白質は、成分Ａを少なくとも１つと、成分Ｂを少なくとも１つ含み、成分Ａは、生物学的な機能、特に抗体に対する、可溶型もしくは膜結合型シグナル分子に対する又は受容体に対するリガンドの機能を有する蛋白質又は蛋白質断片、あるいは抗体あるいは抗体断片を含み、成分Ｂは、成分Ａを三量体化する蛋白質又は蛋白質断片を含むことを特徴とする、該組換え融合蛋白質の三量体。
- 前記三量体における前記組換え融合蛋白質の成分Ａは、同一又は相違するものであることを特徴とする、請求項１記載の組換え融合蛋白質の三量体。
- 前記組換え融合蛋白質の成分Ａは、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、受容体、これらの断片又は上記配列の機能を有する誘導体であることを特徴とする、請求項１又は２記載の組換え融合蛋白質の三量体。
- 前記組換え融合蛋白質の成分Ａは、TNFサイトカインファミリー由来のサイトカインあるいはTNFサイトカイン受容体、当該TNFサイトカイン又は受容体の断片、あるいはTNFサイトカイン又は受容体又は当該TNFサイトカインもしくは受容体の断片の機能を有する誘導体であることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１つの請求項に記載の組換え融合蛋白質の三量体。
- 前記組換え融合蛋白質の成分Ａは、CD40L、FasL、TRAIL、TNFα、CD30L、OX40Ｌ、RANKL、TWEAK、Lta、Ltab2、LIGHT、CD27L、41-BB、GITRL、AP-RIL、EDA、VEGI及びBAFFから成る群から選択されるTNFサイトカイン又はTNFサイトカインの断片、あるいは上記配列の機能を有する誘導体であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１つの請求項に記載の組換え融合蛋白質の三量体。
- 成分Ｂは、コラーゲンドメインの少なくとも１つの７アミノ酸のパターンを含む蛋白質断片を含むことを特徴する、請求項１ないし５のいずれか１つの請求項に記載の組換え融合蛋白質の三量体。
- 成分Ｂは、蛋白質ACRP30の断片を含み、該断片は、三量体を形成するドメインを含むが、三量体の高次な凝集体を形成する能力がないことを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１つの請求項に記載の組換え融合蛋白質の三量体。
- 成分Ｂは、ACRP30の44から111番目までのアミノ酸配列について図１に示したアミノ酸配列又はこの配列の機能を有する誘導体を含み、この場合、図１は、本請求項の構成要素であることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１つの請求項に記載の組換え融合蛋白質の三量体。
- 前記組換え融合蛋白質は、図１に示すFasL-267配列を有し、この場合、図１は、本請求項の構成要素であることを特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１つの請求項に記載の組換え融合蛋白質の三量体。
- 前記組換え融合蛋白質は、成分Ａと成分Ｂとの間にリンカー配列を含むことを特徴とする、請求項１ないし９のいずれか１つの請求項に記載の組換え融合蛋白質の三量体。
- 前記リンカー配列は、ジペプチドLQを含むことを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれか１つの請求項に記載の組換え融合蛋白質の三量体。
- 前記組換え融合蛋白質は、タグ配列、好ましくはＮ末端にタグ配列を含むことを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれか１つの請求項に記載の組換え融合蛋白質の三量体。
- 三量体中に存在する３つの組換え融合蛋白質のうち少なくとも２つが相違する成分Ｂを有することを特徴とする、組換え融合蛋白質の三量体。
- 薬剤を製造するために、請求項１ないし１３のいずれか１つの請求項に記載の三量体を使用する方法。
- ウイルス性肝炎（HBV、HCV）、アルコール性肝炎、胆汁鬱滞性肝炎、ウィルソン病、自己免疫性肝炎、肝臓移植の拒絶反応、過剰なアポトーシス反応による疾患、変性疾患、特に神経変性疾患、炎症性疾患、中毒性表皮壊死症（TEN）、多発性硬化症、橋本甲状腺炎又はGvHDを治療するための薬剤を製造するために請求項１ないし１３のいずれか１つの請求項に記載の三量体を使用する方法。
- 組換え融合蛋白質であり、該組換え融合蛋白質は、成分Ａ及び成分Ｂを含み、成分Ａは、生物学的な機能、特に抗体又は受容体あるいは抗体又は抗体断片に対するリガンド機能、又は可溶型もしくは膜結合型シグナル分子に対するリガンド機能を有する蛋白質又は蛋白質断片であり、成分Ｂは、蛋白質、特にClq蛋白質ファミリー及びコレクチンファミリーから構成される群から選択される蛋白質の三量体を形成する断片又は当該断片の機能を有する誘導体を含むことを特徴とする、組換え融合蛋白質。
- 請求項１ないし１３のいずれか１つの請求項に記載の組換え融合蛋白質をコードすることを特徴とする、DNA配列。
- 請求項１７記載のDNA配列を含むことを特徴とする、発現ベクター。
- 請求項１８記載の発現ベクターを用いて形質移入されることを特徴とする、宿主細胞。
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