TWI476001B

TWI476001B - 三倍體Ｆｃ融合蛋白及其用途

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Publication number: TWI476001B
Application number: TW100148544A
Authority: TW
Inventors: Min Yuan Chou; Wei Chun Chiu; Ya Ping Lai
Original assignee: Ind Tech Res Inst
Priority date: 2011-12-26
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2015-03-11
Also published as: US20130164286A1; CN103172746A; CN103172746B; TW201325612A; US8669350B2

Description

三倍體Fc融合蛋白及其用途

本發明關於新穎的三倍體Fc融合蛋白，特別是關於具有穩定三倍體Fc融合蛋白結構的新穎膠原蛋白模體之新穎Fc融合蛋白。

腫瘤壞死因子(TNF-α)為發炎反應的關鍵調節物，已知涉及多種疾病狀態，例如類風濕性關節炎、發炎性腸炎、乾癬性關節炎、血管炎、僵直性脊椎炎、及慢性幼年型關節炎等。TNF-α以相似的同質三倍體蛋白存在，每一次單元(subunit)由巨噬細胞及單核球的免疫系統的細胞起始轉譯為26kDa的第II型穿膜前驅蛋白。在經由TNF-α轉變酵素(TNF-α converting enzyme;TACE)將TNF-α穿膜區域遠端的位置分解後，釋放出TNF-α可溶性三倍體(17kD)，並藉由結合至效應細胞上的兩個結構不同的第I型及第II型TNF-α受體(TNFRI及TNFRII)以發揮其活性。穿膜(transmembrane) TNF-α在傳遞訊息上扮演雙重角色，可作為配體及細胞受體。因此穿膜TNF-α在細胞與細胞接觸的局部發炎作用中扮演重要角色。抗TNF-α劑，包括infliximab、adalimumab、etanercept及certolizumab pegol，結合於穿膜TNF-α轉染細胞的穿膜TNF-α，結合的親和力較可溶型TNF-α的親和力差(Kaymakcalan,Sakorafas et al. 2009)。先前報導指出infliximab、adalimumab及etanercept皆結合於TNF-α產出細胞的穿膜TNF-α，infliximab及adalimumab單株抗體似乎透過穿膜TNF-α傳遞較強的抑制訊號(Nesbitt,Fossati et al. 2007)。這些拮抗物對穿膜TNF-α的結合效應不同，在臨床上可能造成不同結果(Taylor 2010)。與抗TNF-α抗體不同的是，etanercept臨床上對肉芽腫疾病的發病並不有效，其中穿膜TNF-α可能扮演關鍵角色(Mitoma,Horiuchi et al. 2008)。Etanercept為二倍體分子(結構如第1E圖所示)，由TNF-α受體2(p75 TNF受體)的細胞外區域及人類IgG1的Fc片段所組成。目前被使用在風濕性關節炎的治療。然而，25%至28%的患者對此治療沒有反應，懷疑可能是因為此蛋白質與TNF-α的親和力不足。雙價的etanercept分子與TNF-α三倍體形成1:1複合體時，TNF-α上的三個受體結合位，其中兩個被etanercept佔據，但第三個受體結合位為開放(Scallon,Cai et al. 2002)。表現結合etanercept的穿膜TNF-α的細胞在體外不被胞解(lysis)，不論補體存在或不存在(Arora,Padaki et al. 2009)。先前的報導顯示etanercept相較於infliximab對穿膜TNF-α展現相對較差的親和力。發明人等假設透過高親和力的TNF-α結合劑(例如sTNFR1或抗TNF-α抗體infliximab)造成的細胞自滅(apoptosis)的誘導是因為穿膜TNF-α的接合(ligation)，而不是因為分泌的TNF-α被中和，此可作為單核細胞的存活因子。因此促使雙價的etanercept與穿膜TNF-α的結合強度可能是增加風濕性關節炎及克隆氏症(Crohn’s disease)治療效果的解決之道。

功能性的親和力(總結合力(avidity))是抗原與多種抗原決定子(antigenic determinant)及多價抗體的整體結合強度的量測。抗原結合對象的聚合作用大幅地增加在非常接近目標細胞時結合於專一的相同配體群的效應(或價數)。TNF-α家族受體在結合至其同族的配體時，形成同質的三倍體。可溶型嵌合受體的寡聚合作用在與配體的親和性上的效應已被研究。美國專利公開案US2005/0255547記載最佳的結果如預期地不是與三倍體的結合，而是與五倍體的結合。三倍體的結合效果與二倍體相似，但是卻低於五倍體的結合效果的五倍。

使用三倍體聚合區域使異質的標靶結合區域三價聚合已有報導。三倍體聚合區域，例如原骨膠原蛋白(procollagen)的C-前胜肽(propeptide)、膠原凝集素(collectin)家族蛋白質的螺旋頸區域(coiled-coil neck domain)、FasL及噬菌體T4的fibririn三倍體聚合區域(foldon domain)的C端部分(Holler,Kataoka et al. 2000)。標靶結合區域可為蛋白質荷爾蒙、細胞激素、淋巴細胞激素(lymphokine)、生長激素、凝集素(lectin)、酵素及可溶性受體片段；或黏結分子，例如選凝素(selectin)及整合素(integrin)。可自我三倍體聚合及從C端或N端方向傳送異質融合蛋白的短鏈α-螺旋膠原蛋白狀的胜肽也已被歐洲專利EP1798240B1報導。與免疫球蛋白G(IgG)分子相比，這些三倍體融合蛋白在醫療的應用上有下列缺點：(1)下游步驟：不像IgG分子可輕易地由親和性層析法在蛋白質A或G共軛的樹脂中經結合於IgG的Fc片段而純化，使得在純化流程的第1步驟就獲得超過98%的均質產物，上述三倍體融合蛋白用於醫療應用的純化是具挑戰性的工作，因為沒有商業上可獲得的親和性柱；以及(2)低血清半衰期。

因此，三倍體融合蛋白仍有改良的需求，以增加血漿中半衰期及藥物動力，以及容易被純化而應用於醫療用途。

本案提供一種三倍體融合蛋白，包含三條多胜肽(polypetides)，每一多胜肽由N端向C端依序融合一結合區域、一膠原蛋白區域及一Fc區域所構成，其中該膠原蛋白區域包括由(GPP)重複單元及GXKGE(D)模體所構成的多胜肽。

本案更提供一種六倍體融合蛋白，由上述的三倍體融合蛋白經二倍體聚合(dimerization)所形成。

本案再提供一種治療與TNF-α相關的疾病之醫藥組成物，包括至少一種的上述三倍體融合蛋白及六倍體融合蛋白。

本案的發明策略之一為，誘導Fc片段形成三倍體分子的一端，形成三倍體Fc融合蛋白。由於三倍體Fc融合分子可在蛋白質A-共軛的樹脂上有效地被純化，更重要地，因為Fc結合至存在於血管內皮細胞的新生兒Fc受體(FcRn)，IgG分子的Fc片段具有延長的全身性半衰期。藉由結合於FcRn，IgG受到保護不被分解，並再生循環回到循環系統，使此分子存在於循環系統中的時間較長所以可同時解決純化及藥物動力的問題。

形成三倍體Fc融合蛋白的方法已有描述，可藉由Fc片段與不同的TNF同質性區域由N端向C端方向依序融合，之後在哺乳動物細胞中以分泌的融合蛋白表現(Muller,Wyzgol et al. 2008;Wyzgol,Muller et al. 2009)。TNF同質性區域(TNF homology domain;THD)位於TNF配體家族的C端，負責TNF配體的三倍體聚合及其同源受體的結合。實驗結果顯示當Fc的N端與不同的THD融合時，Fc區域的二倍體聚合力會與不同的THD的三倍體聚合力彼此競爭，導致生產出二倍體、三倍體、六倍體的不同寡聚合型態。為了有效地形成均質的三倍體或六倍體Fc-THD融合蛋白，必須使用另外一個聚合力較強的三倍體，例如：將tenascin-C(TNC)的次級三倍體螺旋區域導入於Fc及THD區域之間，以穩定生產出均質-寡聚物結構。美國專利公開案US2005/0255547記載六倍體多胜肽可藉由TNF受體家族蛋白的細胞外區域與六倍體部分融合而聚成，此述六倍體部分可以是真實的六倍體，或者是「三倍體的二倍體」或「二倍體的三倍體」。然而，沒有實例證實上述穩定的六倍體結構可以成功地聚合。因此，為了獲得一主要且均質、含Fc片段的三倍體及/或六倍體融合分子，需要一新穎的三倍體聚合區域，用以克服Fc穩定的二倍體聚合力，形成穩定融合蛋白的三倍體聚合物。

胜肽序列Gly-Pro-Hyp是最穩定且在膠原蛋白中常見的三聯體(triplet)，胜肽(Gly-Pro-Hyp)₁₀ 可在體外自我形成高度安定的三聯體螺旋結構(Chopra and Ananthanarayanan 1982;Yang,Chan et al. 1997)。短鏈膠原蛋白狀的胜肽(Gly-Pro-Pro)₁₀ 過去被選用於驅動其單體融合對象的三倍體聚合作用，透過重組cDNA構築體在哺乳動物系統中表現(Fan,Huang et al. 2008)。然而，實施例並未提及當穩定的二倍體區域，例如IgG Fc片段，導入其N端或C端時，(Gly-Pro-Pro)₁₀ 是否仍可引發其融合對象在哺乳動物細胞中的三倍體聚合。

為了有效地形成均質含Fc片段與(Gly-Pro-Pro)₁₀ 的三倍體融合蛋白聚合物，強化(Gly-Pro-Pro)₁₀ 的三倍體聚合力用以克服Fc穩定的二倍體聚合力也許是一種選擇。強化(Gly-Pro-Pro)₁₀ 膠原蛋白-胜肽的三倍體聚合穩定度的方法可能有以下數種：(1)導入具有高度聚合能力的其他三倍體區域。例如原骨膠原蛋白(procollagen)的C-前胜肽、膠原凝集素(collectin)家族蛋白質的螺旋頸區域、FasL及噬菌體T4的fibririn三倍體聚合區域(foldon domain)的C端部分，或是使用前案tenascin-C(TNC)的次級三倍體螺旋區域；(2)增加Gly-Pro-Pro三聯體(triplet)重複的數目。但是，人類血小板上的糖蛋白VI與交聯的Gly-Pro-Hyp三聯體胜肽的黏合隨著其中所含有的Gly-Pro-Hyp的量而增加(Smethurst,Onley et al. 2007)，可能會引發血小板活化與血拴的隱憂；(3)加入含有離胺酸(lysine)等有關的膠原蛋白三聯體序列，利用電穩定作用(electrostatic interaction)方式來穩定膠原蛋白三倍體聚合力(Persikov,Ramshaw et al. 2005)。文獻曾經報導脂聯素(adiponectin)分子結構中的膠原蛋白區域中有4個保守性的離胺酸殘基羥基化及糖基化模體(motif)，稱為GXKGE(D)模體。多倍體聚合脂聯素分子能有效的調節胰島素敏感活性(Wang,Xu et al. 2002)。而這些GXKGE(D)模體是脂聯素能夠形成多倍體聚合的重要因子(Richards,Stephens et al. 2006)。但是，前述並未提及GXKGE(D)模體本身是否能強化(Gly-Pro-Pro)₁₀ 的三倍體聚合力用以克服Fc穩定的二倍體聚合力。

另一方面，如果減弱Fc二倍體聚合區域的聚合力，來獲得一不穩定、甚至於單倍體的Fc片段，如此一來(Gly-Pro-Pro)₁₀ 的三倍體聚合區域應該可以有效地形成均質含Fc片段與(Gly-Pro-Pro)₁₀ 的三倍體融合蛋白聚合物。目前已知在兩個IgG₁ Fc區域間有許多非共價的交互作用，這些交互作用足以維持二倍體而無需形成雙硫鍵。關鍵殘基的改變可減弱二倍體聚合的力量，導致單體的Fc區域的量增加。例如使用立體互補的”knobs-into-holes”突變重新設計抗體重鏈的策略，也可促使IgG的異質二倍體聚合作用(Ridgway,1996)。根據此策略，也可使用結構引導的噬菌體展示法以篩選出促進穩定的異質二倍體形成的Fc CH₃ 區域的界面殘基的組合(Shane Atwell,1997)。先前的研究證實在CH₃ 區域之T366S:L368A:Y407V突變可形成最穩定的IgG異質二倍體，因此顯示出此突變具有二倍體聚合力較弱的Fc區域。因此，突變型Fc區域(FcM)與三倍體區域的融合可獲得均質的三倍體FcM融合蛋白。

基於上述的認知，本案提出利用一段新穎的膠原蛋白區域來強化(Gly-Pro-Pro)n的三倍體聚合力，用以形成含有Fc片段的三倍體融合蛋白。本案所述之三倍體融合蛋白由三個相同結構的融合蛋白所聚合而成，每一個融合蛋白由N端向C端依序融合一結合區域(binding domain)、一膠原蛋白區域(collagenous domain)及一Fc區域(Fc fragmant domain)所構成(如第1A圖所示)。

此述的「結合區域」表示用於結合活性分子的區域，可例如受體或抗體，更具體地如TNF-α受體、抗-β-半乳糖苷酶的抗體等，但不限於此。本案所述之「膠原蛋白區域」為由(GPP)重複單元及GXKGE(D)模體(motif)所構成的多胜肽。具體地說，本案之膠原蛋白區域可為(GPP)n-GXKGE(D)模體-(GPP)m所表示之胺基酸序列，n及m表示5或以上的整數。此述「GXKGE(D)模體(motif)」係指由GEKGEKGDPGPKGDP或GEKGEKGDPGPKGDI之胺基酸序列所構成的三級蛋白質結構。在透過GXKGE(D)模體與(GPP)重複單元形成(GPP)n-GXKGE(D)模體-(GPP)m的排列，當n及m值等於5或以上時(如表1所示)，各融合蛋白的膠原蛋白區域之間的三倍體聚合力開始大於Fc區域之間的二倍體聚合力，而形成穩定三倍體的融合蛋白。此述「Fc區域」表示來自人類IgG1的Fc片段的區域，因為人類IgG1的Fc片段本能上可穩定地形成二倍體。

當形成上述三倍體融合蛋白時，由於Fc三倍體包含一個未配對的單體Fc片段，透過兩個三倍體的未配對片段的分子間二倍體聚合，形成1個六倍體融合蛋白(如第1B圖所示)。如後述的實施例所示，本案之六倍體融合蛋白對結合對象的親和力遠高於習知二價體etanercept親和力的6倍以上。而且，在血中的半衰期與etanercept相當，表示Fc具有藥物動力的提升之效果。

更具體地說，本案之三倍體融合蛋白中的一多胜肽，可由序列識別號9、11或13其中之一所示的胺基酸序列所構成，或者由序列識別號10、12或14其中之一所示的核苷酸序列所編碼的多胜肽所構成。

本案一實施例中，結合區域由TNF-α受體所構成。因此在此實施例中，所形成的三倍體融合蛋白或六倍體融合蛋白可專一性且高親和力地與TNF-α結合。因此，本案可進一步提供治療與TNF-α相關之疾病的醫藥組成物，包括結合區域由TNF-α受體所構成之上述三倍體及/或六倍體融合蛋白。

本案所述「與TNF-α相關之疾病」包括所有與TNF-α分泌增加有關之疾病或症狀，沒有特別限定，可例如退化性關節炎、類風濕性關節炎、僵直性脊椎炎、乾癬性關節炎、慢性幼年型關節炎、血管炎、發炎性腸炎或克隆氏症(Crohn's disease)等疾病。

本案之醫藥組成物除包含上述三倍體及/或六倍體融合蛋白作為活性成分外，可視需要添加醫藥上容許的載劑或添加劑。此述醫藥上容許的載劑或添加劑可例如賦形劑、抗氧化劑、乳化劑、分散劑、制菌劑、矯味劑、著色劑、緩衝劑、溶劑、pH調整劑、界面活性劑等。可製成的劑型包括錠劑、膠囊劑、膜衣錠、發泡劑、顆粒、粉末、懸浮液、糖漿等，透過口服、經皮膚投藥、腹腔注射、靜脈注射等路徑投藥。本案之較佳實施例為口服投藥。再者，本案之醫藥組成物可單獨投藥或者與其他藥劑組合投藥。投藥的劑量可根據患者年齡、體重、健康狀況、疾病種類、疾病的進展、患部等因素，由相關醫療人員依該技術領域中共通知識決定。

相較於習知的二價etanercept，本案之三倍體融合蛋白因具有新穎的(GPP)n-GXKGE(D)模體-(GPP)m所示之膠原蛋白區域與Fc區域，可穩定地形成三倍體及六倍體，並可大幅增加與結合對象的結合強度，促進藥效。其次，雖有報導膠原蛋白區域中的GXKGE(D)模體具有相當的三倍體聚合度，但本發明證實當含有Fc融合同時存在時，僅能形成二倍體的聚合體，並未穩定地形成三倍體或六倍體。再者，利用習知技術(Muller,Wyzgol et al. 2008;Wyzgol,Muller et al. 2009)教導將Fc區域融合於膠原蛋白支架複合物的N端，本發明實驗結果發現該融合蛋白無法分泌於宿主細胞外的問題(表1，型態B)。根據本案發明，將Fc區域融合於膠原蛋白支架複合物的C端的設計，可有效地使蛋白質分泌於宿主細胞外，解決習知技術的難題。而且，由於Fc片段可利用蛋白A管柱層析法分離純化，本案發明之三倍體融合蛋白克服習知三倍體膠原融合蛋白無法純化的困難。本案更證實在酸性環境下，例如pH5.5，本案之六倍體Fc融合蛋白展現與人類新生兒FcRn受體優良的結合強度。藥物動力分析亦證實小鼠體內靜脈血液中三倍體Fc或六倍體Fc融合蛋白濃度測量值與etanercept相當。

本發明之具體實施詳細說明如下，然而以下的實施例僅用於進一步揭露本發明之技術內容，不應藉以限制本案的發明範疇。

[實施例1]構築EnbCSFc、EnbhFcCS6、EnbCS4hFc,EnbCS5hFc、EnbCS6hFc、EnbCS6hFcM及bGalCS6hFc

EnbCSFc、EnbhFcCS6、EnbCS4hFc,EnbCS5hFc、EnbCS6hFc及EnbCS6hFcM各構築體的型態示意圖如第1C圖所示。

(1)編碼EnbCSFc的cDNA核苷酸序列如序列識別號2所示，經重疊PCR(overlapping PCR)製備。所得的PCR產物中NheI及BamHI限制酶切割位之間的片段，選殖於表現載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。

EnbCSFc之胺基酸序列(序列識別號1)，從N端向C端包括訊號胜肽、TNFαRII細胞外區域、樞紐區、(GPP)₁₀ 膠原蛋白狀區域、第XXI型膠原蛋白的雙硫鍵節(disulfide knot)(GICDPSLC)、及人類IgG1的CH2及CH3區域(如第1C圖型態A)。

(2)編碼EnbhFcCS6的cDNA核苷酸序列如序列識別號4所示，經重疊PCR製備。所得的PCR產物中NheI及BamHI限制酶切割位之間的片段，選殖於表現載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。

EnbhFcCS6之胺基酸序列(序列識別號3)，從N端向C端包括訊號胜肽、TNFαRII細胞外區域、樞紐區、人類IgG1的CH2及CH3區域、結合子、及編碼(GPP)₆ -GEKGEKGDPGPKGDP-(GPP)₆ 胜肽序列的膠原蛋白狀區域(如第1C圖型態B)。

(3)編碼EnbCS4hFc的cDNA核苷酸序列如序列識別號6所示，經重疊PCR製備。所得的PCR產物中NheI及BamHI限制酶切割位之間的片段，選殖於表現載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。

EnbCS4hFc之胺基酸序列(序列識別號5)，從N端向C端包括訊號胜肽、TNFαRII細胞外區域、樞紐區、編碼(GPP)₄ -GEKGEKGDPGPKGDI-(GPP)₄ 胜肽序列的膠原蛋白狀區域及人類IgG1的CH2及CH3區域(如第1C圖型態C)。

(4)　編碼EnbCS5hFc的cDNA核苷酸序列如序列識別號8所示，經重疊PCR製備。所得的PCR產物中NheI及BamHI限制酶切割位之間的片段，選殖於表現載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。

EnbCS5hFc之胺基酸序列(序列識別號7)，從N端向C端包括訊號胜肽、TNFαRII細胞外區域、樞紐區、編碼(GPP)₅ -GEKGEKGDPGPKGDI-(GPP)₄ 胜肽序列的膠原蛋白狀區域及人類IgG1的CH2及CH3區域(如第1C圖型態C)。

(5)　編碼EnbCS6hFc的cDNA核苷酸序列如序列識別號10所示，經重疊PCR製備。所得的PCR產物中NheI及BamHI限制酶切割位之間的片段，選殖於表現載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。

EnbCS6hFc之胺基酸序列(序列識別號9)，從N端向C端包括訊號胜肽、TNFαRII細胞外區域、樞紐區、編碼(GPP)₆ -GEKGEKGDPGPKGDI-(GPP)₆ 胜肽序列的膠原蛋白狀區域及人類IgG1的CH2及CH3區域(如第1C圖型態C)。

(6)　編碼EnbCS6hFcM的cDNA核苷酸序列如序列識別號12所示，經重疊PCR製備。所得的PCR產物中NheI及BamHI限制酶切割位之間的片段，選殖於表現載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。

EnbCS6hFcM之胺基酸序列(序列識別號11)，從N端向C端包括訊號胜肽、TNFαRII細胞外區域、樞紐區、編碼(GPP)₆ -GEKGEKGDPGPKGDI-(GPP)₆ 胜肽序列的膠原蛋白狀區域及人類IgG1的CH2及帶有3個點突變(序列識別號11之第Ser⁴⁷² 、Ala⁴⁷⁴ 與Val⁵¹³ 個胺基酸)之CH3區域(如第1C圖型態D)。

(7)　編碼bGalCS6hFc的cDNA核苷酸序列如序列識別號14所示，經重疊PCR製備。所得的PCR產物中NheI及BamHI限制酶切割位之間的片段，選殖於表現載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。

bGalCS6hFc之胺基酸序列(序列識別號13)，從N端向C端包括訊號胜肽、抗-β-半乳糖苷酶的V_H 區域抗體、結合子、編碼(GPP)₆ -GEKGEKGDPGPKGDP-(GPP)₆ 胜肽序列的膠原蛋白狀區域、樞紐區及人類IgG1的CH2及CH3區域(如第1C圖型態E)。

[實施例2]　含膠原蛋白狀的胜肽之Fc融合蛋白的表現與純化

將實施例1構築的EnbCSFc、EnbhFcCS6、EnbCS4hFc、EnbCS5hFc、EnbCS6hFc、EnbCS6hFcM、及bGalCS6hFc構築體，使用Effectene(Qiagen)根據其操作指示，轉染至小鼠骨髓瘤(myeloma) NS0細胞(European Collection of Animal Cell Cultures,Wiltshire,UK)。以Hygromycin B(400μg/ml)篩選4週後，將穩定的選殖株(clone)培養於含2%胎牛血清之無血清化學定義培養基(chemically-defined medium)HyQCDM4NS0(Hyclone)的搖瓶，起始的接種密度為5×10⁵ cells/ml。於37℃維持130 rpm培養5天。將經過濾的培養基約每1公升加入HiTrap蛋白質A HP管柱(1-ml柱床體積，GE HealthcaTe)，以pH 7.4磷酸緩衝食鹽水(PBS)(0.01 M磷酸緩衝液、0.0027 M KCl、0.14 M NaCl)流速60 ml/h平衡，以純化上述含膠原蛋白狀的胜肽之Fc融合蛋白。之後以相同緩衝液清洗後，以pH 2.5的50 mM磷酸鈉緩衝液洗提重組抗體。監測280nm的UV吸收光譜，收集峰的分層，以1.0 M碳酸氫鈉中和至pH 7.5。

進行SDS-PAGE，使用4~12% NuPAGE雙-三聚乙醯胺膠，以MES作為移動的緩衝液(Invitrogen,San Diego,CA)。蛋白質以InstantBlue(Expedeon,Cambridgeshire,UK)染色，使用HiMark and Bench Mark(Invitrogen,San Diego,CA)作為分子體積標準。

下列表1顯示上述Fc融合分子的結果。EnbCSFc的型態A由TNFαRII的N端細胞外區域、(GPP)₁₀ 膠原蛋白狀胜肽及人類IgG₁ 的Fc片段所構成，在小鼠骨髓瘤細胞NS0中表現為可溶性分泌蛋白。然而，在SDS膠中的主要型態在非還原狀態時為二元體，顯示Fc片段的二倍體聚合力強於(GPP)₁₀ 膠原蛋白狀胜肽區域與其融合蛋白的三倍體聚合力。為了獲得主要的含三倍體Fc的融合分子，含有GXKGE(D)模體的胜肽序列GEKGEKGDPGPKGDP之新穎三倍體區域，首先用於取代(GPP)₁₀ 膠原蛋白模體。然而，串聯的GXKGE(D)模體仍然形成含Fc的融合分子二倍體結構。因此，本案設計具有(GPP)n-GEKGEKGDPGPKGDP-(GPP)m序列之組合的膠原蛋白狀胜肽，希望在穩定的二倍體Fc片段存在時，穩定地形成融合蛋白的三倍體聚合。如表1所示的型態C及E的不同結構，經由逐漸增加橫跨於串聯的GXKGE(D)模體的GPP三聯體的重複數目，穩定的三倍體Fc融合蛋白開始較二倍體結構強勢。由於Fc三倍體包含一個未配對的單體Fc片段，透過兩個三倍體的未配對片段的分子間二倍體聚合，形成一個六倍體Fc融合蛋白。

選擇EnbCS6hFc、EnbCS6FcM及bGalCS6hFc的結構特徵做為進一步的特徵。在第2A圖，etanercept的非還原狀態在SDS-PAGE的移動是二倍體，分子量為150kD(lane 2)，顯示在鍵間雙硫鍵還原後，為分子量75kD的單體形態(lane 3)。當樣本以50mM的DTT在75℃處理10分鐘後(lane 5)，呈現EnbCS6hFc單體形態，分子量為85kD。在非還原的狀態，分子量大於500kD的主要條帶(major band)顯現(lane 4)。此寡聚物的結構被認為是EnbCS6hFc的六倍體結構，其中兩個三倍體經分子間的二倍體聚合作用及未配對的Fc片段交聯，之後經鍵間雙硫鍵在樞紐區域內形成橋而結合。此發現由培養樣本於溫和的還原條件(50mM的DTT室溫下處理10分鐘)證實，EnbCS6hFc的鍵間雙硫鍵鍵結的六倍體還原且經SDS分解成兩個分子量255kD的三倍體。特別是，多數的三倍體穩定到足以抵抗SDS的分解(第2B圖，lane 3)。在第2C圖中，在非還原狀態，EnbCS6FcM表現如三倍體結構(lane 2)，當樣本經50mM的DTT在75℃處理10分鐘時多數還原成單體(lane 3)。在第2D圖中，當樣本經50mM的DTT在75℃處理10分鐘時多數還原成單體，bGalCS6hFc呈現分子量53kD的單體形態(lane 3)。在非還原狀態，呈現分子量400kD及200kD的兩個主要帶，分別對應於bGalCS6hFc的六倍體及三倍體形態(lane 2)。此述的三倍體可能是衍生自非鍵間的雙硫鍵(non-interchain disulfide bond)鍵結六倍體的兩個三倍體，此三倍體在非還原狀態下，在SDS分解成兩個三倍體。

EnbCS6hFc以膠過濾法分離。將0.2mg的蛋白A純化的EnbCS6hFc總體積100μl以Superdex 200(HR 10/30)膠過濾柱分離，以磷酸緩衝食鹽水平衡。如第4圖所示，空白(V₀ )及洗提(elution)體積對應的蛋白質分子量標準以箭頭標示。流速為0.4ml/min。

[實施例3]　以ELISA確認與TNF-α的結合活性

以ELISA確認adalimumab(Humira,Abbott Park,IL,USA)、etanercept(Enbrel,Wyeth Taiwan Corporation)及EnbCS6hFc對可溶性TNF-α的結合活性。將微滴定盤在4℃以PBS中2 μg/ml的TNF-α塗覆過夜。以StartingBlock^TM blocking buffer(Thermo Scientific)填滿未塗覆到之空白處，加入2倍系列稀釋的TNF-α拮抗物，在37℃下作用1小時。清洗後，與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗人類IgG Fcγ片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)在37℃作用1小時，清洗後使用3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)為基質，偵測已結合的TNF-α拮抗物。以微滴定盤讀取器讀取在450nm的吸光度。計算每一拮抗物的解離常數(K_D )為達到所有結合(最大吸光度)的半飽和度所需的拮抗物的濃度。在第5圖中，etanercept、adalimumab及EnbCS6hFc的K_D 值分別計算為0.044 nM、0.059 nM及0.007 nM。此結果顯示二價的etanercept、adalimumab對TNF-α擁有幾乎相同的結合親和力，但是EnbCS6hFc顯示高於etanercept、adalimumab 6倍以上的結合親和力。由於可溶性TNF-α塗覆於微滴定盤上，類似表現於細胞表面的穿膜TNF-α。可瞭解的是，EnbCS6hFc六倍體形式的親和力效應，再結合穿膜TNF-α為目標的高結合能力中，扮演重要的角色。

[實施例4]競爭性取代的結合分析

使用穩定表現細胞表面的穿膜TNF-α的NS0細胞進行的競爭性取代結合分析，係用於呈現評估拮抗物對穿膜TNF-α的結合能力。此方法包括初步飽和分析(preliminary saturation assay)，用於在確認異硫氰酸(FITC)-標記etanercept可完全與細胞膜上之TNF-α結合所需的初始濃度。之後，將穩定表現穿膜TNF-α的NS0細胞與2倍系列稀釋的EnbCS6hFc、etanercept及adalimumab在含有2%胎牛血清的PBS(螢光活化的細胞分類[FACS]緩衝液)中4℃作用培養1小時。直接加入一固定的、飽和量(2.5 μg/ml，以流式細胞技術測定)的以FIT C-標記的etanercept於4℃作用1小時後，以FACS緩衝液清洗細胞3次，使用FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson,San Jose,CA,USA)分析免疫螢光。以無TNF-α拮抗物存在時，etanercept-FITC染色表現在穿膜TNF-α的NS0細胞之平均螢光強度定義為最大螢光強度的百分比抑制率。數據為計算抑制最大螢光強度的一半(IC50)所需的TNF-α拮抗物濃度。

如第6圖所示，雖然etanercept與adalimumab在TNF-α的抗原決定位(epitope)不同，但FITC-標記etanercept的立體阻障可防止adalimumab結合。EnbCS6hFc、adalimumab及etanercept的IC50分別計算為0.03 nM、0.23 nM及2.18 nM。此結果顯示EnbCS6hFc可結合至穿膜TNF-α勝於其他TNF-α拮抗物，此為多價的總結合力效應的緣故。

[實施例5]　人類新生兒Fc受體(FcRn)在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞上的穩定表現

人類新生兒Fc受體(FcRn)為穿膜固定重鏈(transmembrane anchored heavy chain)(αFcRn)及可溶性輕鏈β2-微球蛋白(soluble light chain β2-microglobulin)(β2m)所構成的非共價鍵結的異質二倍體蛋白質。編碼人類αFcRn及β2m的開放閱讀框架的cDNA分別選殖(cloned)入表現載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen,San Diego,CA)及pCpG-mcsG2(Invivogen,San Diego,CA)。CHO-RD細胞(RCB1477,RIKEN Bioresource Center,Japan)與上述表現構築物以1:1比例使用Effectence轉染試劑根據操作指示進行共轉染(co-transfection)。將細胞培養於含2%胎牛血清、4mM麩醯胺(glutamine)、碳酸氫鈉(3 g/L)及400 μg/ml的Hygromycin B之F-12K培養基3週。以BD FACSAria系統，使用異硫氰酸酯螢光素(FITC)標記的抗人β2-微球蛋白(Clone 2M2,BioLegend,San Diego,CA)，收集對Hygromycin有抗性且穩定表現功能性人類FcRn的細胞。將收集的細胞進行限制性稀釋，以獲得數個穩定的單株抗體。每一選殖株中的細胞進一步以流式細胞儀分析，確認細胞表面FcRn的表現程度。選擇具有最高人類FcRn表現程度的穩定細胞株進行結合分析(如下述)。

[實施例6]TNF-α拮抗物與表現人類新生兒FcRn受體的CHO細胞的結合

為了分析純化的EnbCS6hFc結合至穩定表現人類新生兒FcRn受體的CHO細胞是否有pH依賴性，將細胞接種於96孔盤(三重覆)，形成3×10⁵ cells/well，培養於含2%胎牛血清、4 mM麩醯胺(glutamine)、碳酸氫鈉(3 g/L)及400 μg/ml Hygromycin B的F-12K培養基16小時。以冰冷的0.1M乙酸鈉緩衝液(pH 5.5)或磷酸緩衝生理食鹽水(PBS,pH 7.2)清洗細胞3次，之後與不同濃度的異硫氰酸酯螢光素(FITC)標記的血藍蛋白(KLH)、etanercept及EnbCS6hFc於0.1M乙酸鈉緩衝液(pH 5.5)或磷酸緩衝生理食鹽水(PBS,pH 7.2)分別於4℃培養1小時。在4℃培養1小時後，以相同緩衝液清洗細胞3次，以微滴定盤讀取器分析免疫螢光度。如第7圖所示，etanercept及EnbCS6hFc對穩定表現人類新生兒Fc受體的CHO細胞顯示典型的pH依賴的結合圖譜。六價的EnbCS6hFc在酸性pH5.5展現較etanercept強及劑量依賴的結合親和力，但是在pH7.2的結合幾乎可以忽略。FITC-標記的KLH缺少Fc片段，顯示對人類FcRn無結合親和力，作為負對照組。

[實施例7]藥物動力分析

使用3群(一群9隻)7至8周齡的雄BALB/c鼠，分析etanercept、EnbCS6hFc及EnbCS6hFcM的血中清除率。每群的小鼠分別靜脈注射50 μg各TNFα拮抗物。接下來的24小時，收集每一時期的血液樣本。殘存在血漿中的各TNFα拮抗物的量以塗覆於ELISA盤的重組TNFα定量，使用辣根過氧化酶(HRP)標記的山羊抗人類IgG Fcγ片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)作為偵測抗體，及3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)作為基質。以微滴定盤讀取器讀取在450nm的吸光度。每一TNFα拮抗物的濃度符合一室消除模式(one-compartment elimination model)，使用WinNonlin第3.0版(Pharsight,Mountain View,CA)。如第8圖所示，藥物動力分析顯示小鼠體內靜脈血液中三倍體Fc(EnbCS6hFcM)或六倍體Fc(EnbCS6hFc)融合蛋白濃度測量值與etanercept相當。

[實施例8] TNFα中和能力分析

以放射菌素(actinomycin D)處理的豚鼠纖維母細胞L929細胞(ATCC Cat. No. CCL-1)，測量adalimumab、etanercept、EnbCS6hFc及EnbCS6hFcM的中和活性。將L929細胞接種於96孔盤(三重覆)，形成3×10⁵ cells/well，培養於添加10%(v/v)胎牛血清的RPMI 1640培養基16小時。之後製備2倍系列稀釋的adalimumab(▼)、etanercept(△)、EnbCS6hFc(●)及EnbCS6hFcM(○)於含有actinomycin D(2 μg/ml)及重組人類TNFα(100 ng/ml)的培養基中，在37℃培養16小時。移除上清液後，加入5 mg/ml的MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide)(Sigma-Aldrich)，37℃培養4小時。之後每孔(well)加入SDS溶液(10%)。室溫培養24小時後，以色度計紀錄在570nm的每孔(well)的顏色。

為了檢查抗-TNFα拮抗物的功能活性，進行拮抗物抑制可溶性TNFα活性的能力。TNFα對豚鼠L929細胞具有細胞毒性。在L929分析中使拮抗物與重組人類TNFα共培養，評估Etanercept、adalimumab、EnbCS6hFc及EnbCS6hFcM。如第9圖所示，以100 ng/ml人類TNFα處理的L929細胞中，TNFα造成的細胞毒性有效地以劑量依賴性的被這些拮抗物中和。etanercept、adalimumab、EnbCS6hFcM及EnbCS6hFc的EC50分別為0.20μg/ml、0.23μg/ml、0.35μg/ml及0.10μg/ml。此結果顯示EnbCS6hFc及EnbCS6hFcM展現TNFα中和活性的濃度與TNFα拮抗物相同。

[實施例9]以etanercept及EnbCS6hFc體內抑制豚鼠膠原蛋白抗體誘導的關節炎

關於膠原蛋白抗體誘導關節炎的試驗，8至10周齡雄BALB/c鼠購自國家實驗研究院實驗動物中心(南港，台灣)。小鼠維持在12小時日夜循環的氣候控制環境。每隻腹腔注射(i.p.) 3 mg第II型膠原蛋白專一性抗體(ArthritoMAB^TM Arthritis Inducing Antibody Cocktail,MD Biosciences,Switzerland)，誘發小鼠關節炎。這些小鼠於第3天再以腹腔注射100 μg的脂多醣(lipopolysaccharides)(MDLPS.5,MD Biosciences,Switzerland)。臨床關節炎級數以每一腳掌為0至2級評估，總級數為8。腳掌的臨床級數以級數指標設計：0=正常；0.25=1或2個腫脹腳趾；0.5=3或4個腫脹腳趾；0.75=輕微腫脹的足底或踝；1=腫脹的足底或踝；1.25=1或2個腫脹腳趾及腫脹的足底或踝；2.0=腫脹腳趾及腫脹的足底或踝。一發病時，腹腔注射每劑量50 μg，連續10天。級數結果以平均值±標準差(SD)。控制組(磷酸緩衝生理食鹽水)存在統計學的差異。結果顯示，相較於未處理組或etanercept處理組，以EnbCS6hFc處理的小鼠顯著地發展為較不嚴重的病狀(P＜0.05)。

本案所引用的參考資料如下所示，此述之參考資料在此全文併入本文內容。

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雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110>　財團法人工業技術研究院

<120>　三倍體Fc融合蛋白及其用途

<130>　0965-A23834-TW

<160>　14

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　536

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　EnbCsFc

<400>　1

<210>　2

<211>　1161

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　EnbCSFc

<400>　2

<210>　3

<211>　559

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　EnbhFcCS6

<400>　3

<210>　4

<211>　1680

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　EnbhFcCS6

<400>　4

<210>　5

<211>　541

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　EnbCS4hFc

<400>　5

<210>　6

<211>　1626

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　EnbCS4hFc

<400>　6

<210>　7

<211>　544

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　EnbCS5hFc

<400>　7

<210>　8

<211>　1635

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　EnbCS5hFc

<400>　8

<210>　9

<211>　553

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　EnbCS6hFc

<400>　9

<210>　10

<211>　1662

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　EnbCS6hFc

<400>　10

<210>　11

<211>　553

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　EnbCS6hFcM

<400>　11

<210>　12

<211>　1662

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　EnbCS6hFcM

<400>　12

<210>　13

<211>　447

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　bGalCS6hFc

<400>　13

<210>　14

<211>　1344

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　bGalCS6hFc

<400>　14

1．．．結合區域

2．．．膠原蛋白區域

3．．．Fc區域

11．．．結合區域

12．．．膠原蛋白區域

13．．．Fc區域

31．．．TNF-α受體區域

32．．．Fc區域

第1A圖顯示本案所述之三倍體融合蛋白之示意圖；

第1B圖顯示本案所述之六倍體融合蛋白之示意圖；

第1C圖顯示實施例1構築的融合蛋白的不同型式的示意圖，型式A表示EnbCSFc；型式B表示EnbhFcCS6；型式C表示EnbCS4hFc、EnbCS5hFc及EnbCS6hFc；型式D：表示EnbCS6hFcM；及型式E表示bGa1CS6hFc；及

第1D圖顯示etanercept的結構示意圖。

第2A~2D圖顯示以蛋白A柱層析法自培養基中純化的Fc融合分子的結構特徵。

第2A圖顯示Etanercept及EnbCS6hFc在非還原狀態及還原狀態的電泳結果，樣本以50 mM的DTT在75℃處理10分鐘。

第2B圖顯示EnbCS6hFc在非還原狀態及還原狀態的電泳結果，樣本以50 mM的DTT在室溫處理10分鐘。

第2C圖顯示EnbCS6hFcM在非還原狀態及還原狀態的電泳結果，樣本以50 mM的DTT在75℃處理10分鐘。

第2D圖顯示bGalCS6hFc在非還原狀態及還原狀態的電泳結果，樣本以50 mM的DTT在75℃處理10分鐘。

第2A~2D圖的所有樣本以相同量的蛋白質在4~10%SDS/Bis-Tri聚醯醯胺膠中電泳，以MES為電泳緩衝液。膠以GelCode藍安全蛋白染色溶液染色。

第3圖顯示以ELISA評估bGalCS6hFc對β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的結合。塗有5 μg/ml的β-半乳糖苷酶的96孔滴定盤(Sigma)，與不同濃度的純化bGalCS6hFc培養，以辣根過氧化酶標記的山羊抗人類IgG Fcγ片段偵測。測定在450nm的吸光度。

第4圖顯示膠過濾法分離EnbCS6hFc。0.2mg的蛋白A純化的EnbCS6hFc總體積100μl以Superdex 200(HR 10/30)膠過濾柱分離，以磷酸緩衝食鹽水平衡。空白(V₀ )及洗提(elution)體積對應的蛋白質分子量標準以箭頭標示。流速為0.4ml/min。

第5圖顯示不同TNF-α拮抗物與TNF-α的結合親和力。使用塗有2 μg/ml的TNF-α的96孔微滴定盤。2倍系列稀釋的TNF-α拮抗物，adalimumab(▼)、etanercept(○)及EnbCS6hFc(●)37℃培養1小時。清洗後以辣根過氧化酶標記的山羊抗人類IgG Fcγ片段偵測已結合的TNF-α拮抗物，及使用3,3’,5,5’,-四甲基聯苯胺為基質。以微滴定盤讀取器讀取在450nm的吸光度。

第6圖顯示競爭性取代結合分析。穩定表現穿膜型TNF-α的NS0細胞與系列稀釋的adalimumab(▼)、etanercept(○)及EnbCS6hFc(●)在4℃培養1小時。加入飽和量的FITC標記的etanercept，再培養1小時。清洗細胞，以流式細胞技術定量已結合的FITC標記的etanercept。以無TNF-α拮抗物存在時，etanercept-FITC染色表現在穿膜TNF-α的NS0細胞之平均螢光強度定義為最大螢光強度的百分比抑制率。

第7圖顯示以pH依賴的結合ELISA分析人類FcRn與TNF-α拮抗物的細胞結合分析。將FITC標記的KLH(○)、etanercept(△)及EnbCS6hFc(●)與穩定表現功能性人類FcRn的CHO細胞在pH7.2(實線)或pH5.5(虛線)的96孔盤4℃培養1小時。以相同緩衝液清洗細胞後，以微滴定盤讀取器分析盤中的免疫螢光度。

第8圖顯示小鼠體內etanercept、EnbCS6hFc及EnbCS6hFcM的藥物動力。雄BALB/c鼠分別靜脈注射50 μg各TNF-α拮抗物。在不同時點紀錄血液樣本。殘存在血漿中的各TNFα拮抗物的量以塗覆於ELISA盤的重組TNFα定量，使用辣根過氧化酶(HRP)-標記的山羊抗人類IgG Fcγ片段。結果為每一時點的3隻動物的平均值。

第9圖顯示不同TNF-α拮抗物在L929細胞中TNFα媒介的細胞毒性的中和活性。將L929細胞與2倍系列稀釋的adalimumab(▼)、etanercept(△)、EnbCS6hFc(●)及EnbCS6hFcM(○)分別於含有放射菌素(actinomycin D)(2 μg/ml)及重組人類TNF-α(100 ng/ml)的培養基中37℃培養16小時。細胞變化以MTT顯色分析法分析。

第10圖顯示關節炎小鼠模式中etanercept與EnbCS6hFc的效力。在發病時間(第0天)，每群小鼠每日分別給予腹腔注射100 μl磷酸緩衝食鹽水(未處理組)、etanercept(50 μg)或EnbCS6hFc(50 μg)連續10天。比較未處理組(n=2)、etanercept處理組(n=4)及EnbCS6hFc處理組(n=4)在處理過程中的關節炎級數。

1．．．結合區域

2．．．膠原蛋白區域

3．．．Fc區域

Claims

一種三倍體融合蛋白，包含三條多胜肽，每一多胜肽由N端向C端依序融合一結合區域、一膠原蛋白區域及一Fc區域所構成，其中該結合區域由TNF-α受體細胞外區域或抗體所構成，其中該膠原蛋白區域包括由三聯體(GPP)重複單元及GXKGE(D)模體所構成的多胜肽胺基酸序列，X表示任意胺基酸，其中該膠原蛋白區域包括(GPP)n-GXKGE(D)模體-(GPP)m所示之胺基酸序列，n及m表示6或以上的整數，其中該Fc區域包括人類IgG的CH2及CH3區域。
如申請專利範圍第1項所述之三倍體融合蛋白，其中該GXKGE(D)模體包括由胺基酸序列GEKGEKGDPGPKGDP或GEKGEKGDPGPKGDI所構成。
如申請專利範圍第1項所述之三倍體融合蛋白，其中該三倍體融合蛋白中的每一多胜肽由序列識別號9、11或13其中之一所示的胺基酸序列所構成。
如申請專利範圍第1項所述之三倍體融合蛋白，其中該三倍體融合蛋白中的每一多胜肽由序列識別號10、12或14其中之一所示的核苷酸序列所編碼的多胜肽所構成。
如申請專利範圍第1項所述之三倍體融合蛋白，其中該三倍體融合蛋白在酸性環境中與人類新生兒Fc受體具有結合親和力。
一種六倍體融合蛋白，由申請專利範圍第1-5項所述之三倍體融合蛋白經二倍體聚合所形成。
一種治療與TNF-α相關的疾病之醫藥組成物，包括至少一種如申請專利範圍第1-5項所述之三倍體融合蛋白及如申請專利範圍第6項所述之六倍體融合蛋白，其中該結合區域由TNF-α受體細胞外區域所構成。
如申請專利範圍第7項所述之醫藥組成物，其中，與TNF-α相關的疾病包括退化性關節炎、類風濕性關節炎、僵直性脊椎炎、乾癬性關節炎、慢性幼年型關節炎、血管炎、發炎性腸炎或克隆氏症(Crohn's disease)。