JP2021529556A - 抗腫瘍アンタゴニスト - Google Patents

Abstract

免疫チェックポイント調節因子、血管新生経路調節因子、及び／又はＴＧＦ経路調節因子に特異的に結合する、抗腫瘍アンタゴニストが開示される。また、本明細書に記載の腫瘍アンタゴニストを用いて、増殖性障害、感染症、及び免疫障害を治療する方法も開示される。【選択図】図５Ａ−５Ｂ

Description

本出願は、２０１８年６月２９日出願の米国仮特許出願第６２／６９１，６５８号、及び２０１９年３月２６日出願の米国仮特許出願第６２／８２３，９８９号に対する優先権を主張するものであり、これらの仮特許出願の内容は、参照により本出願に明示的に援用される。

本出願は一般に癌治療に関し、特に腫瘍形成、腫瘍免疫、及び血管新生に関連する経路を調節できる、二重特異性及び三重特異性アンタゴニストに関する。

宿主が癌細胞を排除できないことは、大きな問題であり続けている。様々な癌の治療のためにますます多くの治療用モノクローナル抗体が認可されているが、癌の成長、及び転移への進行の根底に、多数の異なる分子経路が存在することを考慮すると、これらの抗体に対する耐性の出現が頻繁に観察される。免疫系は癌予防の腫瘍な機序であるが、癌細胞は免疫監視に対抗する。従って、改良された治療用結合アンタゴニスト又は抗体、並びにこのような試薬を用いて癌及び慢性ウイルス感染を治療する方法が必要とされている。自然の制御メカニズムが同定されており、これは、Ｔ細胞の活性化を制限することによって、制約を受けていないＴ細胞活性化に起因する付帯的な損傷を防止するものである。このプロセスを腫瘍細胞が利用して、免疫応答を回避する。免疫エフェクタ細胞、特にＴ細胞の、癌を認識及び排除する能力を復元することは、免疫療法の主な目的である。ＴＧＦβ及び血管新生経路の両方が、チェックポイント阻害剤に対する耐性に関係するとされている。

ＴＧＦβ及びＶＥＧＦ経路の両方を阻害するチェックポイント阻害剤に対する耐性を克服できる、改良された治療用結合アンタゴニスト又は抗体、並びに癌及び慢性ウイルス感染を治療する方法が、必要とされている。

本出願のある態様は、ＴＧＦβ１に特異的に結合する第１の標的指向性ドメインと、ＰＤ‐１又はＰＤ‐Ｌ１に特異的に結合する第２の標的指向性ドメインとを含有する、抗腫瘍アンタゴニストに関する。

本出願の別の態様は、ＴＧＦβ１に特異的に結合する第１の標的指向性ドメインと、ＶＥＧＦに特異的に結合する第２の標的指向性ドメインとを含有する、抗腫瘍アンタゴニストに関する。

本出願の別の態様は、哺乳類細胞中での発現が増大した、改良されたバージョンのベバシズマブを含有する、抗腫瘍アンタゴニストに関する。

本出願の別の態様は、被験者の体内の細胞増殖性障害の治療方法に関する。上記方法は、このような治療を必要とする被験者に、有効量の本出願の抗腫瘍アンタゴニストを投与するステップを含む。

図１は、特定の抗ＰＤ‐１ ｍＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を示す。対応するフレームワーク領域（ＦＲ）配列は、図３６に配列番号１３０〜１５９として記載されている。 図２Ａ〜２Ｂは、抗ＰＤ‐１抗体可変ドメイン配列の複数の実施形態を示す。 同上。 図３は、特定の抗ＰＤ‐Ｌ１ ｍＡｂのＣＤＲ配列を示す。対応するＦＲ配列は、図３６に配列番号１６０〜１８２として記載されている。 図４Ａ〜４Ｃは、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体可変ドメイン配列の複数の実施形態を示す。 同上。 同上。 図５Ａ〜５Ｂは、４つの異なる二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト構成であるＢｉ‐ＰＢ‐１、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１、Ｂｉ‐ＰＢ‐２、及びＢｉ‐ＰＬＢ‐２を示し、これらはそれぞれ、（１）抗ＰＤ‐１又は抗ＰＤ‐Ｌ１可変領域、及び（２）ＴＧＦ‐β ＲＩＩ ＥＣＤドメインを含む。 図６は、図５の二重特異性抗体に対応する例示的な機能性ドメイン配列を示す。 図７は、図５の選択された二重特異性抗体に対応する、例示的な重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）配列を示す。 図８Ａ〜８Ｃは、３つの異なる二重特異性アンタゴニストであるＢｉ‐ＡＢ‐１、Ｂｉ‐Ａ１Ｂ‐１、及びＢｉ‐ＺＢ‐１をそれぞれ示し、これらはそれぞれ、変異型ＩｇＧ１（Ｋ４４７Ａ）足場（scaffold）にカルボキシ末端ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。Ｂｉ‐ＡＢ‐１及びＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１はいずれも、Ａｖａｓｔｉｎ／ベバシズマブからのアミノ末端抗ＶＥＧＦ可変領域（ＶＨ１、ＶＬ１）を含有し；Ｂｉ‐Ａ１Ｂ‐１は、ＶＨ領域に２つのアミノ酸置換（Ｅ６Ｑ、Ｌ１１Ｖ）を含む。Ｂｉ‐ＺＢ‐１は、ＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｋ４４７Ａ）領域の上流に、アミノ末端アフリベルセプトドメインを含有する。 図９Ａ及び９Ｂは、図８に示されている二重特異性アンタゴニスト中に存在する様々な機能性ドメイン配列を示す。 同上。 図１０は、図８に示されている二重特異性アンタゴニストに対応する重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を示す。 図１１は、図８に示されている二重特異性アンタゴニストの機能性ドメインの配置をまとめたものである。 図１２は、非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって決定される、ＨＥＫ２９３細胞へと一過性トランスフェクションされた場合の、Ｅ６Ｑ及びＬ１１Ｖ変異を含有する二重特異性抗体アンタゴニストＢｉ‐ＡＢ‐１及びＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１の改善された発現レベルを示す、クマシーブルー染色済みポリアクリルアミドゲルである。 図１３Ａは、Ｂｉ‐ＡＢ‐１及びＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）プロファイルを示す。図１３Ｂは、タンパク質Ａ精製済みＢｉ‐ＡＢ‐１及びＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１が、高分子量（ＨＭＷ、それぞれ１％、１％）種及び低分子量（ＬＭＷ、それぞれ０．４％、０．４％）種を、二量体（それぞれ９８．６％、９８．７％）に比べて低いレベルで有することを示す。 図１４Ａ〜１４Ｂは、非還元条件（図１４Ａ）及び還元条件（図１４Ｂ）下での、一過性発現Ｂｉ‐ＺＢ‐１のＰＡＧＥゲルを示す。 図１５は、タンパク質Ａ精製済みＢｉ‐ＺＢ‐１が、高分子量（ＨＭＷ、３．４％）種及び低分子量（ＬＭＷ、０．５％）種を、二量体（９６．１％）に比べて低いレベルで有することを示す、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）プロファイルを示す。 図１６は、細胞ベースアッセイの結果を示し、この細胞ベースアッセイでは、ＮＦＡＴ応答要素の制御下でヒトＶＥＧＦＲ２及びホタルルシフェラーゼを発現する組換えＨＥＫ‐２９３細胞を、２つの抗ＶＥＧＦアンタゴニスト、Ｂｉ‐Ａ１Ｂ‐１及び抗体Ａの段階希釈物の存在下で、ｈｕＶＥＧＦ１６５で刺激した。生体活性は、ルシフェラーゼ仲介型発光の量の減少を測定することによって測定した。 図１７は、Ｂｉ‐Ａ１Ｂ‐１によるＴＧＦ‐β１及びＶＥＧＦ１６５の同時結合を実証するＥＬＩＳＡ分析であり、ここでは、ｈｕＴＧＦ‐β１コーティング済み９６ウェルプレートを、段階希釈されたサンプルＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１、及びこれに続いてビオチン化されたｈｕＶＥＧＦ１６５を用いてインキュベーションすることによって、結合した分子を、ＴＭＢ基質を用いたストレプトアビジン‐ＨＲＰによって検出した。 図１８は、細胞ベースアッセイの結果を示し、この細胞ベースアッセイでは、ＳＭＡＤ応答要素の制御下でヒトＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ受容体及びホタルルシフェラーゼを発現する組換えＨＥＫ‐２９３細胞を、Ｂｉ‐Ａ１Ｂ‐１、Ｂｉ‐ＺＢ‐１、及び対照の段階希釈物（それぞれＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）融合を含む）の存在下で、ｈｕＴＧＦ‐β１で刺激した。生体活性は、ルシフェラーゼ仲介型発光の量の減少によって測定した。 図１９は、６〜１０週齢のメスＣＤ１マウスへの尾静脈注射後の二重特異性アンタゴニストＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１の生体内半減期（Ｔ_１／２）を示す薬物動態プロファイルである。血清中のＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１アンタゴニストを注射後の様々な時点で回収し、ＥＬＩＳＡによる分析に供した。 図２０Ａ〜２０Ｂは、２つの二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２（図２０Ａ）及びＢｉ‐ＰＬＢ‐１．２（図２０Ｂ）を示し、これらはそれぞれ、抗ＰＤ‐１及び抗ＰＤ‐Ｌ１由来の可変領域ドメインを有する抗体バックボーン（ＩｇＧ４ Ｋ４４７Ａ、又はＩｇＧ１ Ｋ４４７Ａ）を含み、更に各重鎖ＣＨ３領域のカルボキシ末端に融合するＴＧＦ‐β‐ＲＩＩ ＥＣＤを含む。 図２１は、図２０Ａ及び２０Ｂの二重特異性抗体中に存在する機能性ドメイン配列を示す。 図２２は、図２０Ａ及び２０Ｂに示されている二重特異性アンタゴニストに対応する重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を示す。 図２３は、図２０Ａ及び２０Ｂに示されている二重特異性アンタゴニストの機能性ドメインの配置をまとめたものである。 図２４Ａは、親対照抗体（２Ｐ１７）と比較して、タンパク質Ａアフィニティ精製後の一過性発現系におけるＢｉ‐ＰＢ‐１．２及びＢｉ‐ＰＬＢ‐１．２の発現の増加を示す、非変性ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）分析を示す。図２４Ｂは、タンパク質Ａ精製済みＢｉ‐ＰＢ‐１．２、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２、及びベンチマーク抗体（２Ｐ１７）を示す、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）プロファイルを示す。図２４Ｃは、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２、及びベンチマーク抗体（２Ｐ１７）が、二量体と比べて低いレベルの高分子量（ＨＭＷ）種及び低分子量（ＬＭＷ）種を有することを示す。 図２５Ａ〜２５Ｂは、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２（図２５Ａ）及びＢｉ‐ＰＬＢ‐１．２（図２５Ｂ）の二量体、ＨＭＷ、及びＬＭＷ形態が、４℃において少なくとも４週間にわたって良好な安定性を示すことを示す。 図２６Ａ〜２６Ｅは、ＰＤ‐１及びＴＧＦ‐β１の、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２（それぞれ図２６Ａ、２６Ｂ）並びに対応する抗ＰＤ‐１及び抗ＰＤＬ１‐ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤベンチマーク分子（それぞれ図２６Ｃ、２６Ｄ）への結合の結果を、得られた結合親和性定数（図２６Ｅ）と共に示す。 図２７Ａ〜２７Ｅは、ＰＤ‐Ｌ１及びＴＧＦ‐β１の、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２（それぞれ図２７Ａ、２７Ｂ）並びに抗ＰＤＬ１‐ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤベンチマーク分子（図２７Ｃ、２７Ｄ）への結合の結果を、得られた結合親和性定数（図２７Ｅ）と共に示す。 図２８Ａは、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２によるＴＧＦ‐β１及びＰＤ‐１の同時結合を実証するＥＬＩＳＡアッセイを示し、ここでは、ｈｕＴＧＦ‐β１コーティング済み９６ウェルプレートを、段階希釈されたＢｉ‐ＰＢ‐１．２のサンプル、及びこれに続いてビオチン化されたｈｕＰＤ‐１を用いてインキュベーションすることによって、結合した分子を、ＴＭＢ基質を用いたストレプトアビジン‐ＨＲＰによって検出した。図２８Ｂは、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２によるＴＧＦ‐β１及びＰＤ‐Ｌ１の同時結合を実証するＥＬＩＳＡアッセイを示し、ここでは、ｈｕＴＧＦ‐β１コーティング済み９６ウェルプレートを、段階希釈されたＢｉ‐ＰＬＢ‐１．２のサンプル、及びこれに続いてビオチン化されたｈｕＰＤ‐Ｌ１を用いてインキュベーションすることによって、結合した分子を、ＴＭＢ基質を用いたストレプトアビジン‐ＨＲＰによって検出した。 図２９Ａは、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２及び抗ＰＤ‐１ベンチマーク抗体の、ＰＤ‐１のＰＤ‐Ｌ１への結合を遮断する能力を示す。図２９Ｂは、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２及び抗ＰＤＬ１‐ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤベンチマーク分子の段階希釈物の、ＳＭＡＤ応答要素の制御下でルシフェラーゼ発現を活性化するＴＧＦ‐β１の能力を遮断する能力を示す、細胞ベースアッセイの結果である。生体活性は、ルシフェラーゼ仲介型発光の量の減少によって測定した。 図３０Ａ〜３０Ｂは、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２、並びに抗ヒトＰＤ‐１及び抗カニクイザルＰＤ‐１ベンチマーク抗体両方の、ヒトＰＤ‐１（図３０Ａ）及びカニクイザルＰＤ‐１（図３０Ｂ）への結合を、対応するＥＣ５０値と共に示し、これは、ヒトＰＤ‐１及びカニクイザルＰＤ‐１への結合それぞれに関する、ベースライン応答と最大応答との間の半分の応答を生成する半数効果濃度（ＥＣ_５０）を反映したものである。 図３１Ａは、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２及び抗ＰＤ‐Ｌ１ベンチマーク抗体の、ＰＤ‐Ｌ１のＰＤ‐１への結合を遮断する能力を示す。図３１Ｂは、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２及び抗ＰＤＬ１‐ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤベンチマーク分子の段階希釈物の、ＳＭＡＤ応答要素の制御下でルシフェラーゼ発現を活性化するＴＧＦ‐β１の能力を遮断する能力を示す、細胞ベースアッセイの結果である。生体活性は、ルシフェラーゼ仲介型発光の量の減少によって測定した。 図３２Ａ〜３２Ｂは、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２、並びに抗ヒトＰＤ‐Ｌ１及び抗カニクイザルＰＤ‐Ｌ１ベンチマーク抗体両方の、ヒトＰＤ‐Ｌ１（図３２Ａ）及びカニクイザルＰＤ‐Ｌ１（図３２Ｂ）への結合を、対応するＥＣ５０値と共に示し、これは、ヒトＰＤ‐Ｌ１及びカニクイザルＰＤ‐Ｌ１への結合それぞれに関する、ベースライン応答と最大応答との間の半分の応答を生成する半数効果濃度（ＥＣ_５０）を反映したものである。 図３３Ａ〜３３Ｂは、陰性対照処理に対する、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２によるヒトＰＢＭＣ（ドナー１、図３３Ａ；ドナー２、図３３Ｂ）からのＩＦＮ‐γ分泌の増大を示す。図３３Ｃ〜３３Ｄは、陰性対照処理に対する、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２によるヒトＰＢＭＣ（ドナー１、図３３Ｃ；ドナー２、図３３Ｄ）からのＩＬ‐２分泌の増大を示す。 図３４Ａ〜３４Ｂは、親抗ＰＤ‐Ｌ１抗体及び陰性対照処理に対する、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２によるヒトＰＢＭＣ（ドナー８、図３４Ａ；ドナー９、図３４Ｂ）からのＩＦＮ‐γ分泌の増大を示す。図３４Ｃ〜３４Ｄは、親抗ＰＤ‐Ｌ１抗体及び陰性対照処理に対する、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２によるヒトＰＢＭＣ（ドナー８、図３４Ｃ；ドナー９、図３４Ｄ）からのＩＬ‐２分泌の増大を示す。 図３５Ａ〜３５Ｆは、６〜１０週齢のメスＣＤ１マウスへの尾静脈注射後に、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２及びＢｉ‐ＰＬＢ‐１．２が、ベンチマーク抗体に対して改善された薬物動態プロファイルを示すことを示す。抗体アンタゴニスト、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２、及びベンチマークを、注射後の様々な時点で血清から回収し、ＥＬＩＳＡ（それぞれ図３５Ａ、３５Ｃ、３５Ｅ）及びウエスタンブロット（それぞれ図３５Ｂ、３５Ｄ、３５Ｆ）による分析に供した。 図３６は、図１の抗ＰＤ‐１‐ＣＤＲ及び図３の抗ＰＤ‐Ｌ１‐ＣＤＲに対応するフレームワーク領域（ＦＲ）を示す。

定義
他の定義がされていない限り、本明細書中で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示の方法及び組成物が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書及び添付の請求項中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、そうでないことが文脈によって明確に規定されない限り、複数の指示物を含むことに留意しなければならない。よって例えば、「あるペプチド（ａ ｐｅｐｔｉｄｅ）」に関する言及は、「１つ以上の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」ペプチド、又は「複数（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）」のこのようなペプチドを含む。本出願の教示に関して、本出願に記載されているいずれの発行済みの特許又は特許出願公開は、参照により本出願に明示的に援用される。

本明細書中で使用される場合、用語「ＰＤ‐１」は、いずれの形態のＰＤ‐１、及びＰＤ‐１の活性の少なくとも一部を保持したその多様体を指す。ヒトＰＤ‐１を指定して言及すること等による別の指示がない限り、ＰＤ‐１は、天然配列ＰＤ‐１の全ての哺乳類種、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシを含む。

本明細書中で使用される場合、用語「ＰＤ‐Ｌ１」は、いずれの形態のＰＤ‐Ｌ１、及びＰＤ‐Ｌ１の活性の少なくとも一部を保持したその多様体を指す。ヒトＰＤ‐Ｌ１を指定して言及すること等による別の指示がない限り、ＰＤ‐Ｌ１は、天然配列ＰＤ‐Ｌ１の全ての哺乳類種、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシを含む。

用語「アゴニスト」は、別の分子の生物学的活性又は効果を促進する（即ち誘発する、引き起こす、強化する、又は増大する）物質を指す。用語「アゴニスト」は、受容体に結合する抗体等の物質、及び受容体に結合することなく（例えば関連するタンパク質を活性化することによって）受容体の機能を促進する物質を包含する。

用語「アンタゴニスト」又は「阻害剤」は、受容体又はリガンドといった別の分子の生物学的活性又は効果を妨げる、遮断する、阻害する、中和する、又は低減する物質を指す。

本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、抗原を特異的に認識して、１つ以上の免疫グロブリン可変領域を通して該抗原に結合する、ポリペプチド又はポリペプチド複合体を指す。抗体は、全抗体、抗原結合断片、又はその一本鎖であってよい。用語「抗体」は、生化学的に区別できる多様なクラスのポリペプチドを包含する。重鎖は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミュー（即ちα、δ、ε、γ、及びμ）として分類され、これらの間に多少のサブクラス（例えばγ１〜γ４）が存在することは、当業者には理解されるだろう。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、又はＩｇＥとして決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等は、十分に特性決定されており、機能的な専門性を付与するものであることが分かっている。これらのクラス及びアイソタイプそれぞれを修飾したバージョンは、当業者であれば本開示を参照して容易に識別可能であるため、本開示の範囲内である。全ての免疫グロブリンクラスは本開示の範囲内であり、以下の議論は全体として、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスを対象とする。

本出願の抗体又は抗体アンタゴニストとしては、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、二重特異性、三重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化、キメラ、及び一本鎖抗体が挙げられる。本明細書で開示される抗体は、鳥類及び哺乳類を含むいずれの動物に由来するものであってよい。好ましくは上記抗体は、ヒト、マウス、ラット、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、又はニワトリ抗体である。いくつかの実施形態では、可変領域は軟骨魚類に由来する（例えばサメに由来する）ものであってよい。

用語「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ又はＶＨドメインを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって生成される断片、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体といった抗体の一部分を指して使用される。その構造にかかわらず、抗体断片は、完全な状態の抗体が認識する抗原と同一の抗原に結合する。用語「抗体断片」は、ＤＡＲＴ及びダイアボディを含む。用語「抗体断片」はまた、特異的抗原に結合して複合体を形成することによって抗体と同様に作用する免疫グロブリン可変領域を含む、いずれの合成又は遺伝子操作タンパク質を含む。「一本鎖抗体」又は「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質を指す。いくつかの態様では、上記領域は、１０〜約２５個のアミノ酸の短鎖リンカーペプチドと接続される。上記リンカーは、柔軟性のためにグリシンを多く含むことができ、また可溶性のためにセリン又はトレオニンを多く含むことができ、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続できるか、又はその逆である。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量がおよそ２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量が５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチド鎖とを含む。これら４つの鎖は典型的には、「Ｙ」字型構成で、ジスルフィド結合によって接合され、このジスルフィド結合では、軽鎖が重鎖から張り出して支えられ、この張り出した構造が、「Ｙ」字型の最も開いた部分から始まって、可変領域を通して続く。

軽鎖及び重鎖はいずれも、構造的及び機能的に相同である領域に分割される。用語「定常」及び「可変」は、機能に関して使用される。これに関して軽鎖可変（ＶＬ）及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインの部分の両方が、抗原認識及び特異性を決定することが理解されるだろう。対照的に、軽鎖定常（ＣＬ）及び重鎖定常（ＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３）ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合等といった重要な生物学的特性を付与する。慣例として、従来の抗体の定常領域ドメインの番号は、抗体の抗原結合部位又はアミノ末端から離れるほど大きくなる。従来の抗体では、Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分には定常領域があり、ＣＨ３及びＣＬドメインは実際には、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。

上述のように、可変領域により、抗体は、抗原上のエピトープを選択的に認識して、これに特異的に結合できる。即ち、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、３次元的な抗原結合部位を画定する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Ｙ字型の各腕状部分の端部に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖それぞれの３つのＣＤＲ（即ちＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）によって画定される。いくつかの例では、例えば特定の免疫グロブリン分子、ラクダ種に由来するか、又はラクダ免疫グロブリンをベースとして操作される。あるいは、免疫グロブリン分子は、軽鎖を有さずに重鎖のみから、又は重鎖を有さずに軽鎖のみからなってよい。

自然に発生する抗体では、各抗原結合ドメイン内に存在する６個のＣＤＲは、アミノ酸の短く不連続な配列であり、上記配列は、水性環境下でその３次元構成を取るときにこの抗原結合ドメインを形成するよう、特異的に配置される。抗原結合ドメイン中のアミノ酸の残基は「フレームワーク」領域と呼ばれるが、これは、分子間変動が比較的小さい。フレームワーク領域は主にβシート構造を採用し、ＣＤＲはループを形成し、このループはβシート構造に接続され、場合によってはβシート構造の一部を形成する。よってフレームワーク領域は、鎖間の非共有結合的な相互作用による、正しい配向でのＣＤＲの配置を提供する、足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対して相補性の表面を画定する。この相補性表面は、抗体とそのコグネイトエピトープとの非共有結合を促進する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域を含むアミノ酸はそれぞれ、既に正確に定義されているため、いずれの所与の重鎖又は軽鎖可変領域に関して当業者が容易に同定できる。

本明細書中で使用される場合、用語「ＶＨ１」及び「ＶＨ２」は、２つの異なる結合特異性に対応する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを指す。同様に、用語「ＶＬ１」及び「ＶＬ２」は、２つの異なる結合特異性に対応する軽鎖可変ドメインを指す。これらが共に使用される場合、ＶＨ１領域及びＶＬ１領域は共通の結合特異性を画定すること、並びにＶＨ２ドメイン及びＶＬ２ドメインは第２の結合特異性を画定することを理解されたい。

本明細書中で使用される場合、用語「フレームワーク領域（ＦＲ）」は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基を指す。各可変ドメインは典型的には、対応するＣＤＲに隣接する４つのＦＲを有する。例えばＶＨドメインは典型的には、３つのＨＣＤＲにＨＦＲ１‐ＨＣＤＲ１‐ＨＦＲ２‐ＨＣＤＲ２‐ＨＦＲ３‐ＨＣＤＲ３‐ＨＦＲ４という構成で隣接する、４つのＨＦＲ、即ちＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３、及びＨＦＲ４を有する。同様に、ＬＨドメインは典型的には、３つのＬＣＤＲにＬＦＲ１‐ＬＣＤＲ１‐ＬＦＲ２‐ＬＣＤＲ２‐ＬＦＲ３‐ＬＣＤＲ３‐ＬＦＲ４という構成で隣接する４つのＬＦＲを有する。本明細書に記載のアンタゴニストで利用できる例示的なＦＲを図３６にまとめる。

軽鎖は、カッパ又はラムダ（κ、λ）として分類される。各重鎖クラスは、カッパ又はラムダ軽鎖と結合できる。一般に軽鎖及び重鎖は互いに共有結合し、２つの重鎖の「後端（ｔａｉｌ）」部分は、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、又は遺伝子操作された宿主細胞によって免疫グロブリンが生成された場合に、共有ジスルフィド結合又は非共有結合によって互いに結合する。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ字型構成のフォーク状の端部のＮ末端から、各鎖の下部のＣ末端まで連なる。

本明細書中で使用される場合、用語「軽鎖定常領域」又は「ＣＬ」は、抗体軽鎖由来のアミノ酸配列を指して、相互交換可能なものとして使用される。好ましくは、軽鎖定常領域は、定常カッパドメイン及び定常ラムダドメインのうちの少なくとも一方を含む。

本明細書中で使用される場合、用語「重鎖定常領域」は、免疫グロブリン重鎖由来のアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば上部、中央、及び／又は下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、並びに多様体又はその断片のうちの少なくとも１つを含む。例えば、本開示で使用するための抗原結合ポリペプチドは：ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインと、少なくともヒンジドメインの一部分と、ＣＨ２ドメインとを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインと、少なくともヒンジドメインの一部分と、ＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖；又はＣＨ１ドメインと、少なくともヒンジドメインの一部分と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖を含んでよい。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。更に、本開示で使用するための抗体は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えばＣＨ２ドメインの全体又は一部）を含まなくてよい。重鎖定常領域を修飾することにより、そのアミノ酸配列を、自然に発生する免疫グロブリン分子から変化させることができることを理解されたい。

例えば、本開示においてこれ以降で考察されるように、本出願人は、ＣＨ３ドメインが、ＣＨ３ドメインのＦｃループ（例えば図５ＢのＢｉ‐ＰＢ‐２、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐２を参照）への相当な（例えば１００ａａを超える）挿入に耐えることができる、又はこのような挿入を収容できることを発見した。従って本出願では、配列番号１２３〜１２５を含むがこれらに限定されない本開示のいずれの阻害性ドメインを、ＴＧＦβ１ ＲＩＩ ＥＣＤドメインをＦｃループに挿入するのと同様の方法で、同様に重鎖のＦｃループに挿入できる。

本明細書で開示されている抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来するものであってよい。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域とを含んでよい。別の例では、重鎖定常領域は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、かつ一部がＩｇＧ３分子に由来する、ヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、かつ一部がＩｇＧ４分子に由来する、キメラヒンジを含むことができる。

「軽鎖‐重鎖対」は、軽鎖のＣＬドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとの間のジスルフィド結合によって二量体を形成できる、軽鎖と重鎖との集合を指す。

様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び３次元構成が十分に公知である。本明細書中で使用される場合、用語「ＶＨドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、用語「ＣＨ１ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の第１の（ほとんどの場合アミノ末端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対するアミノ末端である。

本明細書中で使用される場合、用語「ＣＨ２ドメイン」は、慣用の番号付与スキームを用いた場合に概ね抗体の残基２４４から残基３６０にまでわたる（Ｋａｂａｔ番号付与体系では残基２４４〜３６０、ＥＵ番号付与体系では残基２３１〜３４０）、重鎖分子の一部分を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接な対を形成しないという点で独特である。そうではなく、２つのＮ結合型分岐炭水化物鎖が完全な状態のネイティブＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に介在する。ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端にまでわたりし、およそ１０８個の残基を含む。

本明細書中で使用される場合、用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに接合する、重鎖分子の一部分を含む。このヒンジ領域はおよそ２５個の残基を含み、柔軟であるため、２つのＮ末端抗原結合領域を独立して動かすことができる。ヒンジ領域は：上部、中央、及び下部ヒンジドメインという３つの別個のドメインに細分化できる。

本明細書中で使用される場合、用語「ジスルフィド結合」は、２つの硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成できる、又は第２のチオール基と架橋できる、チオール基を含む。自然に発生するほとんどのＩｇＧ分子では、ＣＨ１領域とＣＬ領域とはジスルフィド結合によって結合され、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔ番号付与体系を用いた２３９及び２４２に対応する位置（ＥＵ番号付与体系の２２６位又は２２９位）において、２つのジスルフィド結合によって結合される。

本明細書中で使用される場合、抗体、抗体断片、又は抗体ドメインの「多様体」は：（１）元の抗体、抗体断片、又は抗体ドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し；（２）元の抗体、抗体断片、又は抗体ドメインが特異的に結合する標的と同一の標的に特異的に結合する、抗体、抗体断片、又は抗体ドメインを指す。「少なくともｘ％同一である」又は「少なくともｘ％の同一性」といった句の形式で配列同一性の測定値が提示されている場合、このような実施形態は、この下限以上のあらゆる整数のパーセンテージを含むことを理解されたい。更に、本出願においてアミノ酸配列が提示されている場合、これは、該アミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を追加で開示する、又は包含するものとして解釈されるものとすることを理解されたい。

本明細書中で使用される場合、句「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体、典型的にはマウスモノクローナル抗体に由来する抗体を指す。あるいはヒト化抗体は、親抗体である非ヒト抗体の抗原結合特性を保持しているか又は略保持しているものの、ヒトへの投与時に親抗体に比べて低い免疫原性を示す、キメラ抗体に由来するものであってよい。

本明細書中で使用される場合、句「キメラ抗体」は、免疫反応性領域又は部位が第１の種から得られるか又は第１の種に由来し、（完全なものであっても、部分的なものであっても、本開示に従って修飾されたものであってもよい）定常領域が第２の種から得られる、抗体を指す。特定の実施形態では標的結合領域又は部位は、非ヒトソース（例えばマウス又は霊長類）からのものとなり、定常領域はヒトである。

本出願の多重特異性抗体の範囲内に含まれるのは、以下を含む様々な組成物及び方法論である：非対称ＩｇＧ様抗体（例えばトリオマブ／クアドローマ、Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ‐ｉｎｔｏ‐ｈｏｌｅｓ）抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；Ｃｒｏｓｓ ｍＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）；静電気適合抗体（ＡＭＧＥＮ）；ＬＵＺ‐Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ストランド・エクスチェンジ・エンジニアード（ｓｔｒａｎｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ドメイン（ＳＥＥＤ）ボディ（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ；Ｂｉｏｌｏｎｉｃ、Ｍｅｒｕｓ）；Ｆａｂ交換抗体（Ｇｅｎｍａｂ）；対照ＩｇＧ様抗体（例えば二重標的（ｄｕａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ＤＴ）‐Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）；トゥ・イン・ワン（ｔｗｏ‐ｉｎ‐ｏｎｅ）抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；架橋ｍＡｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）；ｍＡｂ^２（Ｆ‐ｓｔａｒ）；Ｃｏｖ Ｘ‐ｂｏｄｙ（Ｃｏｖ Ｘ／Ｐｆｉｚｅｒ）；二重可変ドメイン（ＤＶＤ）‐Ｉｇ融合（Ａｂｂｏｔｔ）；ＩｇＧ様二重特異性抗体（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）；Ｔｓ２Ａｂ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡＺ）；ＢｓＡｂ（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）；ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ，ＴｖＡｂ、Ｒｏｃｈｅ）；ｓｃＦｖ／Ｆｃ融合；ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ、ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）；二重親和性標的転換技術（Ｆｃ‐ＤＡＲＴ、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）；二重（ｓｃＦｖ）_２‐Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）；Ｆ（ａｂ）_２融合（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）；二重作用又はＢｉｓ‐Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ドック・アンド・ロック（Ｄｏｃｋ‐ａｎｄ‐Ｌｏｃｋ）（ＤＮＬ、ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）；Ｆａｂ‐Ｆｖ（ＵＣＢ‐Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；ｓｃＦｖ及びダイアボディベース抗体（例えば二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）；タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ、Ａｆｆｉｍｅｄ）；ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）；一本鎖ダイアボディ；ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌｏｇｉｃｓ）；ヒト血清アルブミンｓｃＦｖ融合（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）；ＣＯＭＢＯＤＩＥＳ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；及びＩｇＧ／非ＩｇＧ融合（例えば免疫サイトカイン（ＥＭＤＳｅｒｏｎｏ、Ｐｈｉｌｏｇｅｎ、ＩｍｍｕｎＧｅｎｅ、ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ））。

「特異的に結合する」又は「・・・に対する特異性を有する」は一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してあるエピトープに結合すること、及びこの結合が、抗原結合ドメインと該エピトープとの間のある程度の相補性を伴うことを意味する。この定義に従うと、抗体は、その抗原結合ドメインを介したあるエピトープへの結合が、ランダムで無関係なエピトープへの結合に比べて、より容易である場合に、該エピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は本明細書では、特定の抗体が特定のエピトープに結合する相対親和性を定量化するために使用される。例えば、抗体「Ａ」は所与のエピトープに対して、抗体「Ｂ」よりも高い特異性を有するとみなされる場合があり、又は抗体「Ａ」は、エピトープ「Ｃ」に、関連するエピトープ「Ｄ」に関してよりも高い特異性で結合すると言われる場合がある。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、１０^−６Ｍ以下、１０^−７Ｍ以下、１０^−８Ｍ以下、１０^−９Ｍ以下、又は１０^−１０Ｍ以下の解離定数（Ｋ_ｄ）を有する抗原との複合体を形成する場合に、ある抗原「に対して特異性を有する」。

句「免疫チェックポイント調節因子」は、免疫チェックポイントを通したシグナル伝達を阻害又は刺激する作用剤の機能的クラスを指す。「免疫チェックポイント調節因子」は、一体としてＴ細胞活性化に関連するシグナル伝達経路を阻害又は刺激する手段を提供する、細胞表面受容体及びその関連するリガンドを含む。細胞表面受容体である免疫チェックポイント調節因子は典型的には、免疫応答を抑制するようにチェックポイントシグナル伝達経路を誘導できる、ＴＮＦ受容体又はＢ７スーパーファミリーのメンバーであり、ＰＤ‐１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ‐３、ＴＩＭ‐３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＣＴＬＡ‐４、及びこれらそれぞれのリガンドを含むがこれらに限定されない負の共刺激分子に結合する作用剤を含む。

句「チェックポイント調節因子アンタゴニスト」、「免疫チェックポイント結合アンタゴニスト」、及び「免疫チェックポイントアンタゴニスト」は本明細書において、免疫チェックポイント調節因子の活性に干渉する（又はこれを阻害する）ことによって、チェックポイント調節因子又はそのリガンドへの結合の結果として、チェックポイント調節因子受容体を通したシグナル伝達を遮断又は阻害する作用剤のクラスに関して、相互交換可能なものとして使用される。このシグナル伝達を阻害することによって、免疫抑制を反転させることができ、これにより、癌細胞に対するＴ細胞免疫を再確立又は強化できる。例示的な免疫チェックポイントアンタゴニストとしては、限定するものではないが：ＰＤ‐１並びにそのリガンドであるＰＤ‐Ｌ１及びＰＤ‐Ｌ２；ＴＩＧＩＴ及びそのＣＤ１５５リガンドであるＰＶＲ；ＬＡＧ‐３、並びに肝類洞内皮細胞レクチン（ＬＳＥＣｔｉｎ）及びガレクチン‐３を含むそのリガンド；ＣＴＬＡ‐４並びにそのリガンドであるＢ７‐１及びＢ７‐２；ＴＩＭ‐３及びそのリガンドであるガレクチン‐９；ＣＤ１２２及びそのＣＤ１２２Ｒリガンド；ＣＤ７０、Ｂ７Ｈ３、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）；並びにＶＩＳＴＡが挙げられる。免疫チェックポイント調節因子アンタゴニストとしては、単離された形態の、又は融合タンパク質若しくはコンジュゲートの一部としての、抗体断片、ペプチド阻害剤、ドミナントネガティブペプチド、及び小分子薬剤が挙げられる。

句「免疫チェックポイント結合アゴニスト」、及び「免疫チェックポイントアゴニスト」は、免疫チェックポイント調節因子の活性を刺激することによって、チェックポイント調節因子又はそのリガンドへの結合の結果として、チェックポイント調節因子受容体を通したシグナル伝達を刺激する作用剤のクラスに関して、相互交換可能なものとして使用される。このシグナル伝達を刺激することによって、癌細胞に対するＴ細胞免疫を再確立又は強化できる。例示的な免疫チェックポイント調節因子アゴニストとしては、限定するものではないが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバー、例えばＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲファミリー関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、及び４‐１ＢＢ（ＣＤ１３７）、並びにこれらのリガンドが挙げられる。更なるチェックポイント調節因子アゴニストは、ＣＤ２８及びＩＣＯＳを含むＢ７‐ＣＤ２８スーパーファミリーに属する。免疫チェックポイント調節因子としては、単離された形態の、又は融合タンパク質若しくはコンジュゲートの一部としての、抗体断片、ペプチド阻害剤、ドミナントネガティブペプチド、及び小分子薬剤が挙げられる。

用語「アンタゴニスト抗体」は、標的に結合してこの標的の生物学的効果を阻害又は低減する抗体を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、抗体であって、この抗体が結合する標的、例えばＰＤ‐１が生物学的機能を実施するのを阻害する、抗体を指すことができる。

本明細書中で使用される場合、「抗ＰＤ‐１アンタゴニスト抗体」は、ＰＤ‐１の生物学的活性、及び／又はＰＤ‐１によって仲介される１つ以上の下流のイベントを阻害できる抗体を指す。抗ＰＤ‐１アンタゴニスト抗体は、ＰＤ‐１の生物学的活性を（「ほとんど」を含む何らかの程度まで）遮断する、拮抗する、抑制する、又は低減する抗体を包含し、上記生物学的活性は、ＰＤ‐１によって仲介される下流のイベント、例えばＰＤ‐１結合及び下流シグナル伝達、Ｔ細胞増殖の阻害、Ｔ細胞活性化の阻害、ＩＦＮ分泌の阻害、ＩＬ‐２分泌の阻害、ＴＮＦ分泌の阻害、ＩＬ‐１０の誘導、及び抗腫瘍免疫応答の阻害を含む。本発明の目的に関して、用語「抗ＰＤ‐１アンタゴニスト抗体」（相互交換可能な用語として「アンタゴニストＰＤ‐１抗体」、「アンタゴニスト抗ＰＤ‐１抗体」、又は「ＰＤ‐１アンタゴニスト抗体」が使用される）は、ＰＤ‐１自体、ＰＤ‐１の生物学的活性、又は生物学的活性の結果を、略無化する、低減する、又は何らかの意味のある程度に中和する、これまでに同定されているあらゆる用語、名称、並びに機能的状態及び特性を包含することが、明確に理解されるだろう。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ‐１アンタゴニスト抗体はＰＤ‐１に結合して抗腫瘍免疫応答を上方制御する。

本明細書中で使用される場合、「抗ＰＤ‐Ｌ１アンタゴニスト抗体」は、ＰＤ‐Ｌ１の生物学的活性、及び／又はＰＤ‐Ｌ１によって仲介される１つ以上の下流のイベントを阻害できる抗体を指す。抗ＰＤ‐Ｌ１アンタゴニスト抗体は、ＰＤ‐Ｌ１の生物学的活性を（「ほとんど」を含む何らかの程度まで）遮断する、拮抗する、抑制する、又は低減する抗体を包含し、上記生物学的活性は、ＰＤ‐Ｌ１によって仲介される下流のイベント、例えばＰＤ‐Ｌ１結合及び下流シグナル伝達、Ｔ細胞増殖の阻害、Ｔ細胞活性化の阻害、ＩＦＮ分泌の阻害、ＩＬ‐２分泌の阻害、ＴＮＦ分泌の阻害、ＩＬ‐１０の誘導、及び抗腫瘍免疫応答の阻害を含む。本発明の目的に関して、用語「抗ＰＤ‐Ｌ１アンタゴニスト抗体」（相互交換可能な用語として「アンタゴニストＰＤ‐Ｌ１抗体」、「アンタゴニスト抗ＰＤ‐Ｌ１抗体」、又は「ＰＤ‐Ｌ１アンタゴニスト抗体」が使用される）は、ＰＤ‐Ｌ１自体、ＰＤ‐Ｌ１の生物学的活性、又は生物学的活性の結果を、略無化する、低減する、又は何らかの意味のある程度に中和する、これまでに同定されているあらゆる用語、名称、並びに機能的状態及び特性を包含することが、明確に理解されるだろう。抗ＰＤ‐Ｌ１アンタゴニスト抗体は、ＰＤ‐Ｌ１に結合して抗腫瘍免疫応答を上方制御するように設計される。

句「ドミナントネガティブタンパク質」又は「ドミナントネガティブペプチド」は、野生型タンパク質に由来するタンパク質又はペプチドであって、変異及び／又は欠失によって遺伝子的に修飾されていることによって、修飾済みのタンパク質又はペプチドが、それが由来する内因性野生型タンパク質の機能に干渉する、タンパク質又はペプチドを指す。

句「ＶＥＧＦ結合アンタゴニスト」は、ＶＥＧＦ‐Ａ又はその受容体であるＶＥＧＦＲ‐２に結合することによって、この結合の結果として、ＶＥＧＦ‐ＡによるＶＥＧＦＲ‐２の活性化を遮断又は阻害する、作用剤の機能的クラスを指す。本明細書中で使用される場合、用語「ＶＥＧＦ結合アンタゴニスト」は、単離された形態の、又は融合タンパク質若しくはコンジュゲートの一部としての、抗体断片、ペプチド阻害剤、ドミナントネガティブペプチド、及び小分子薬剤を含む。

句「Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体結合アンタゴニスト」は、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体、又はそのリガンドのうちの１つに結合することによって、この結合の結果として、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体の、そのリガンド（即ちＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３、及びＡｎｇ４）のうちの１つ以上による活性化を遮断又は阻害する、作用剤の機能的クラスを指す。本明細書中で使用される場合、用語「Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体結合アンタゴニスト」は、単離された形態の、又は融合タンパク質若しくはコンジュゲートの一部としての、抗体断片、ペプチド阻害剤、ドミナントネガティブペプチド、及び小分子薬剤を含む。

句「小分子薬剤」は、医薬活性を有し、かつ分子量が約２ｋＤａ未満、約１ｋＤａ未満、約９００Ｄａ未満、約８００Ｄａ未満、又は約７００Ｄａ未満である、ポリマーでない、多くの場合有機又は有機金属である分子実体を指す。この用語は、タンパク質又は核酸以外の「薬剤」と呼ばれる大半の医薬化合物を包含するが、小さなペプチド又は核酸類似体は小分子薬剤とみなすことができる。例としては、化学療法抗癌剤及び酵素阻害剤が挙げられる。小分子薬剤は、合成によって、半合成によって（即ち自然に発生する前駆体から）、又は生物学的に導出できる。

個々のドメインの間にハイフンを用いてポリペプチドドメインの構成を記述する場合（例えばＣＨ２‐ＣＨ３）、列挙されているドメインの順序は、アミノ末端からカルボキシ末端へのものであることを理解されたい。

用語「免疫複合体」は、共有結合によって阻害性ペプチド又は小分子薬剤に融合する抗体を指す。上記ペプチド又は小分子薬剤は、定常重鎖のＣ末端に、又は可変軽鎖及び／若しくは重鎖のＮ末端に結合できる。

「リンカー」は、メイタンシノイド等のペプチド又は小分子薬剤を抗腫瘍アンタゴニストに安定した共有結合で結合するために使用できる。リンカーは、化合物又は抗体が活性のままとなる条件において、酸誘導型切断、光誘導型切断、ペプチダーゼ誘導型切断、エステラーゼ誘導型切断、及びジスルフィド結合切断に対して、感受性を有してよく、又は実質的な耐性を有してもよい。好適なリンカーは当該技術分野で公知であり、例えばジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基、及びエステラーゼ不安定性基が挙げられる。リンカーは、本明細書に記載され、かつ当該技術分野で公知の、ＧＧＧＧＳ、荷電リンカー及びその親水性形態も含む。免疫複合体は更に、抗腫瘍アンタゴニストとペプチド及び／又は小分子薬剤との間に、可撓性３‐１５アミノ酸ペプチド（又はスペーサ）を含んでよい。いくつかの実施形態では、リンカー は、ＧＧＧＧＳの３、４、５、６、７、又は８回の反復を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳの３又は４回の反復からなる。

本明細書中で使用される場合、用語「免疫グロブリン足場」は、抗体特異性の付加、抗体機能の強化、又は抗体構造及び安定性の支持を含む、アンタゴニストの機能をサポートするために望ましい特性を示すアミノ酸のいずれのポリマーを指す。免疫グロブリン足場は、免疫グロブリン重鎖由来のＣＨ１、ＣＨ２、及び／若しくはＣＨ３領域、並びに／又は免疫グロブリン軽鎖由来のＣＬ領域を含む、１つ以上の免疫グロブリン定常領域を有してよい。免疫グロブリン足場にドナーポリペプチドの結合ドメインを移植することにより、足場にドナーポリペプチドの結合特異性を与えることができる。

本明細書中で使用される場合、句「多重特異性阻害剤」は、異なる結合特異性を有する少なくとも２つの標的指向性ドメインを含む分子を指す。いくつかの実施形態では、多重特異性阻害剤は、足場と、異なる抗原又はエピトープを標的とする２つ以上の免疫グロブリン抗原結合ドメインとを含む、ポリペプチドである。特定の実施形態では、多重特異性阻害剤は二重特異性抗体又はアンタゴニストである。他の実施形態では、多重特異性阻害剤は三重特異性抗体又はアンタゴニストである。

本明細書中で使用される場合、句「二重特異性」は、異なる結合特異性を有する少なくとも２つの標的指向性ドメインを含む分子を指す。各標的指向性ドメインは１つの標的分子に特異的に結合でき、該標的分子への結合時に該標的分子の生物学的機能を阻害できる。いくつかの実施形態では、二重特異性チェックポイント調節因子アンタゴニストは、２つ以上のポリペプチドを含むポリマー分子である。いくつかの実施形態では、標的指向性ドメインは、抗体の抗原結合ドメイン又はＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性阻害剤は二重特異性抗体である。

用語「二重特異性抗体」、及び「二重特異性アンタゴニスト」は、２つの異なる抗原（又はエピトープ）に特異的に結合できる抗体に関して、相互交換可能なものとして使用される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、その２つの結合アームのうちの一方（１対のＨＣ／ＬＣ）において１つの抗原（又はエピトープ）に結合し、その第２のアーム（異なる１対のＨＣ／ＬＣ）において異なる抗原（又はエピトープ）に結合する、全長抗体である。これらの実施形態では、二重特異性抗体は、（特異性及びＣＤＲ配列いずれについても）別個のものである２つの抗原結合アームを有し、これが結合する各抗原に対して１価である。

他の実施形態では、二重特異性抗体は、その２つの結合アーム（２対のＨＣ／ＬＣ）それぞれにおいて２つの異なる抗原（又はエピトープ）に結合できる、全長抗体である。これらの実施形態では、二重特異性抗体は、同一の特異性及び同一のＣＤＲ配列を有する２つの同一の抗原結合アームを有し、これが結合する各抗原に対して２価である。

例示的な二重特異性としては：非対称ＩｇＧ様抗体（例えばトリオマブ／クアドローマ、Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ‐ｉｎｔｏ‐ｈｏｌｅｓ）抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；Ｃｒｏｓｓ ｍＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）；静電気適合抗体（ＡＭＧＥＮ）；ＬＵＺ‐Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ストランド・エクスチェンジ・エンジニアード（ｓｔｒａｎｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ドメイン（ＳＥＥＤ）ボディ（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ；Ｂｉｏｌｏｎｉｃ、Ｍｅｒｕｓ）；Ｆａｂ交換抗体（Ｇｅｎｍａｂ）；対照ＩｇＧ様抗体（例えば二重標的（ｄｕａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ＤＴ）‐Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）； トゥ・イン・ワン（ｔｗｏ‐ｉｎ‐ｏｎｅ）抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；架橋ｍＡｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）；ｍＡｂ^２（Ｆ‐ｓｔａｒ）；Ｃｏｖ Ｘ‐ｂｏｄｙ（Ｃｏｖ Ｘ／Ｐｆｉｚｅｒ）；二重可変ドメイン（ＤＶＤ）‐Ｉｇ融合（Ａｂｂｏｔｔ）；ＩｇＧ様二重特異性抗体（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）；Ｔｓ２Ａｂ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡＺ）；ＢｓＡｂ（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）；ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ，ＴｖＡｂ、Ｒｏｃｈｅ）；ｓｃＦｖ／Ｆｃ融合；ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ、ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）；二重親和性標的転換技術（Ｆｃ‐ＤＡＲＴ、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）；二重（ｓｃＦｖ）_２‐Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）；Ｆ（ａｂ）_２融合（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）；二重作用又はＢｉｓ‐Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ドック・アンド・ロック（Ｄｏｃｋ‐ａｎｄ‐Ｌｏｃｋ）（ＤＮＬ、ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）；Ｆａｂ‐Ｆｖ（ＵＣＢ‐Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；ｓｃＦｖ及びダイアボディベース抗体（例えば二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）；タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ、Ａｆｆｉｍｅｄ）；ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）；一本鎖ダイアボディ；ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌｏｇｉｃｓ）；ヒト血清アルブミンｓｃＦｖ融合（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）；ＣＯＭＢＯＤＩＥＳ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；及びＩｇＧ／非ＩｇＧ融合（例えば免疫サイトカイン（ＥＭＤＳｅｒｏｎｏ、Ｐｈｉｌｏｇｅｎ、ＩｍｍｕｎＧｅｎｅ、ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ））が挙げられる。

用語「治療する」及び「治療」は、細胞増殖性障害に関連する１つ以上の症状の改善；細胞増殖性障害の１つ以上の症状の発症の予防若しくは遅延；及び／又は細胞増殖性障害の１つ以上の症状の重篤度若しくは頻度の低減を指す。

句「それを必要とする患者」、「治療を必要とする患者」、又は「治療を必要とする被験者」は、細胞増殖性障害の治療のための本開示の抗腫瘍アンタゴニストの投与から利益を得る、哺乳類被験者等の被験者を含む。

用語「治療有効量」、「薬理学的有効量」、及び「生理学的有効量」は、血流又は標的組織中に閾値レベルの活性アンタゴニスト作用剤を提供するために必要な抗腫瘍アンタゴニストの量を意味するために、相互交換可能なものとして使用される。正確な量は、例えば特定の活性剤、成分、及び成分の物理的特徴、目的とする患者集団、患者の考慮事項等といった多数の因子に左右され、本明細書中で提供される情報、又は関連文献で入手できる情報に基づいて、当業者が容易に決定できる。

本文脈で使用される場合、用語「改善する」、「増大させる」、又は「低減する」は、本明細書に記載の治療を開始する前の同一個体における測定値、又は本明細書に記載の治療を受けない対照個体（若しくは複数の対照個体）における測定値といったベースライン測定値と比較した、値又はパラメータを示す。

「対照個体」は、治療を受ける個体と同一の細胞増殖性障害に苦しむ、（治療を受ける個体と１体以上の対照個体との疾患のステージが同等であることを保証するために）治療を受ける個体と概ね同年齢である、個体である。治療を受ける個体（「患者」又は「被験者」と呼ばれる場合もある）は、細胞増殖性障害を有するヒトの胎児、乳児、小児、青年、又は成人であってよい。

用語「細胞増殖性障害」は、細胞の異常増殖を特徴とする障害を指す。増殖性障害は、細胞成長の速度に関するいかなる制限も含意せず、単に成長及び細胞分裂に影響を及ぼす正常な制御の喪失を示す。従っていくつかの実施形態では、増殖性障害の細胞は、正常細胞と同一の細胞分裂速度を有し得るものの、このような成長を制限するシグナルに応答しない。「細胞増殖性障害」の範囲内には、新生物、癌、又は腫瘍が存在する。

用語「癌」又は「腫瘍」は、周囲の組織に侵入する、及び／又は新たな定着部位に転移する能力を有する、細胞の増殖を特徴とする多様な悪性新生物のいずれの１つを指し、白血病、リンパ腫、癌腫、黒色腫、肉腫、胚細胞腫瘍、及び芽細胞腫を含む。本開示の方法での治療のための例示的な癌としては、脳癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、中皮腫、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、及び子宮癌、白血病、並びに髄芽腫が挙げられる。

用語「白血病」は、造血器官の進行性悪性疾患を指し、一般に、血液及び骨髄中での白血球及びその前駆体の増殖及び発達の異常を特徴とする。例示的な白血病としては例えば、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球症性白血病、好塩基球性白血病、芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリー細胞白血病、血芽球性白血病、血球始原細胞性白血病、組織球性白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ液性白血病（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ行性白血病（ｌｙｍｐｈｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ球白血病（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄性顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血病性白血病、及び未分化細胞性白血病が挙げられる。

用語「癌腫」は、周辺組織に浸潤して転移を引き起こす傾向を有する、上皮細胞の悪性成長を指す。例示的な癌腫としては例えば、腺房癌（ａｃｉｎａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ａｃｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌、腺腫性癌、副腎皮質の癌腫、肺胞癌、肺胞細胞癌、基底細胞癌（ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、類基底細胞癌、基底細胞上皮腫（ｂａｓｏｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、細気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原性癌、大脳様癌、胆管細胞癌、絨毛膜癌、膠様腺癌、面皰癌、子宮体癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円柱腫、円柱細胞癌、乳管癌、硬癌、胎児性癌、脳様癌、類表皮癌、腺様上皮癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅ ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、外向発育癌、潰瘍癌、線維性癌、膠様癌（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌（ｇｉａｎｔ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血液様癌、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子様癌（ｈｙａｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、副腎様腫、乳児胎児性癌、非浸潤性癌、表皮内癌、上皮内癌、クロンペッカー癌（Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ’ｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クルチッキー細胞癌（Ｋｕｌｃｈｉｔｚｋｙ‐ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大細胞癌、レンズ状癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫様癌、リンパ上皮癌、髄様癌、（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｄｕｌｌａｒｅ、ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、軟性腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｏｌｌｅ）、粘液性癌腫（ｍｕｃｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液分泌性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘表皮癌（ｍｕｃｏｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液性癌（ｍｕｃｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｙｘｏｍａｔｏｄｅｓ）、鼻咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨腫、乳頭状癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、粥状癌腫、腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫性癌、シュナイダー膜癌腫、スキルス癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、バレイショ状癌（ｓｏｌａｎｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、球状細胞癌、紡錘細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、ひも状癌、血管拡張性癌腫、末梢血管拡張性癌腫、移行上皮癌、結節癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣贅性癌、及び絨毛癌が挙げられる。

用語「肉腫」は、胚性結合組織様の物質で構成され、一般に線維状の又は均質な物質に埋入された、密に詰まった細胞で構成される、腫瘍を指す。例示的な肉腫としては例えば、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アベメシー肉腫（Ａｂｅｍｅｔｈｙ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪性肉腫、脂肪肉腫、胞巣状軟部肉腫、エナメル芽細胞性肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫、絨毛癌、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫（例えば非ホジキンリンパ腫）、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、ジェンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫肉腫、傍骨肉腫、細網肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、及び毛細血管拡張性肉腫が挙げられる。

用語「黒色腫」は、皮膚及び他の器官のメラニン細胞系から発生する腫瘍を指す。黒色腫としては例えば、末端性黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング‐パッセー黒色腫、若年性黒色腫、黒子性悪性黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫、及び表層進展性黒色腫が挙げられる。．

更なる癌としては例えば、ホジキン病、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵インスラノーマ、悪性カルチノイド、前癌性皮膚病変、精巣癌、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、泌尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、及び副腎皮質癌が挙げられる。

Ｉ．ＴＧＦ‐β経路を標的とする二重特異性アンタゴニスト
ＴＧＦ‐βは、Ｔ調節性細胞の誘導及び維持、並びにＮＫ、ＤＣ、及びＴ細胞といった自然免疫細胞及び適応免疫細胞の直接的な抑制によって免疫抑制を仲介する、一次サイトカインと考えられている。ＴＧＦ‐βはまた、血管新生及び腫瘍血管の安定化、並びに細胞の遊走及び浸潤につながる上皮間葉転換によって腫瘍に直接影響を与えることにおいて、役割を果たす。血管新生の強力な誘導因子として、ＴＧＦ‐β１は、固形腫瘍の重要なサポートシステムを提供し、腫瘍細胞の播種において重要な役割を果たす。従ってＴＧＦ‐βの状態は、抗ＰＤ１／ＰＤ‐Ｌ１耐性、及び様々な癌に関する全生存の、強力な予測因子である。

多くの細胞がＴＧＦ‐βを合成し、これらのうちのほとんど全てが、これらのペプチドに対する特異的受容体を有する。ＴＧＦ‐β１、ＴＧＦ‐β２、及びＴＧＦ‐β３は全て、同一の受容体シグナル伝達系を介して機能する。ＴＧＦ‐βの活性形態は、セリンスレオニン１型及び２型受容体、それぞれＴＧＦ‐β ＲＩ及びＴＧＦβ ＲＩＩで構成される膜結合ヘテロ四量体の形成を介してシグナルを送る二量体である。近年、ＴＧＦ‐β経路阻害剤が、ＴＧＦ‐β１又はＴＧＦ‐β１ ＲＩＩに対する抗体又は結合断片、例えばＴＧＦ‐β１ ＲＩＩの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含有するドミナントネガティブ融合タンパク質断片の形態で、開発されている。

一態様では、本出願は、ＴＧＦβ経路及びＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１チェックポイント調節因子経路の両方を阻害する二重特異性アンタゴニストを提供する。

別の態様では、本出願は、ＴＧＦβ経路及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）経路の両方、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、又はこれら全てを阻害する二重特異性アンタゴニストを提供する。

Ａ．ＴＧＦ‐β及びＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１経路を標的とする二重特異性アンタゴニスト
いくつかの実施形態では、二重特異性アンタゴニストは、ＴＧＦ‐β経路に特異的に結合する第１の標的指向性ドメインと、ＰＤ‐１又はＰＤ‐Ｌ１に特異的に結合する第２の標的指向性ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、第１の標的指向性ドメインはＴＧＦ‐β経路阻害剤を含む。

ＴＧＦ‐β経路阻害剤
ＴＧＦ‐βは、細胞増殖及び分化、遊走及び接着、腫瘍間質及び免疫抑制を含む細胞外マトリックス修飾、血管新生及び線維形成、アポトーシス、並びに他の機能を多数の細胞タイプにおいて制御する、ペプチドの多機能セットを含む。ＴＧＦ‐βは、Ｔ調節性細胞の誘導及び維持、並びにＮＫ、ＤＣ、及びＴ細胞といった自然免疫細胞及び適応免疫細胞の直接的な抑制によって免疫抑制を仲介する、一次サイトカインと考えられている。ＴＧＦ‐βはまた、血管新生及び腫瘍血管の安定化、並びに細胞の遊走及び浸潤につながる上皮間葉転換によって腫瘍に直接影響を与えることにおいて、役割を果たす。血管新生の強力な誘導因子として、ＴＧＦ‐β１は、固形腫瘍の重要なサポートシステム、及び腫瘍細胞の播種のための機序を提供する。

ＴＧＦ‐βの状態は、抗ＰＤ１／ＰＤ‐Ｌ１耐性、及び様々な癌に関する全生存の、強力な予測因子である。例えば、高いＴＧＦ‐β１レベルは、転移性尿路上皮癌におけるＰＤ１／ＰＤ‐Ｌ１阻害に対する応答不良に関連し（Ｎａｔｕｒｅ （２０１８） ５５４（７６９３）：５４４‐５４８）、また高いＴＧＦβシグネチャは、３３種の異なる癌にわたる予後不良に関連する（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ （２０１８） ４８：８１２‐８３０）。抗ＰＤ１／ＰＤ‐Ｌ１によるＴＧＦβの阻害は更に、ＣＤ８エフェクタ細胞を放出して腫瘍細胞を殺滅し、他の細胞タイプを刺激して細胞殺滅能力を高める。

多くの細胞がＴＧＦ‐βを合成し、これらのうちのほとんど全てが、これらのペプチドに対する特異的受容体を有する。ＴＧＦ‐β１、ＴＧＦ‐β２、及びＴＧＦ‐β３は全て、同一の受容体シグナル伝達系を介して機能する。ＴＧＦ‐βの活性形態は、セリンスレオニン１型及び２型受容体、それぞれＴＧＦ‐β ＲＩ及びＴＧＦβ ＲＩＩで構成される膜結合ヘテロ四量体の形成を介してシグナルを送る二量体である。

本明細書中で使用される場合、ＴＧＦ‐β経路阻害剤は例えば、ＴＧＦ‐β１又はＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ、ＴＧＦ結合ペプチド、又はＴＧＦ‐β１ ＲＩＩの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）等のドミナントネガティブ融合タンパク質断片に対する、抗体又は可変ドメイン断片の形態であってよい。

ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤ
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ‐β経路阻害剤はＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤを含む。例示的なヒトＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤ（野生型）は、配列番号８９に記載のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、ＴＧＦ‐β経路阻害剤は、例えば図５Ａ〜５Ｂ及び８Ａ〜８Ｃに示すように、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストのＩｇＧのカルボキシ末端に融合する。あるいは、ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤは、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストのＩｇＧのアミノ末端に融合してよい。更に他の実施形態では、ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤは、例えば図５Ｂに示すように、ＩｇＧのＩｇＧ Ｆｃ受容体（即ちＣＨ２又はＣＨ３領域）内に挿入される。

いくつかの実施形態では、抗ＴＧＦ‐β１、抗ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ抗体、又はその可変領域断片を、ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤの代わりに用いてよい。例示的な抗ＴＧＦ‐β１抗体は、米国特許第７，０６７，６３７号、米国特許第７，４９４，６５１号、米国特許第７，５２７，７９１号、及び米国特許第７，６１９，０６９号に記載されている。例示的な抗ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ抗体は、米国特許第７，５７９，１８６号に記載されている。あるいは、ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤを１つ以上の抗ＴＧＦ‐β１及び／又は抗ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩペプチド阻害剤に置き換えてよい。例示的なＴＧＦ‐β１ペプチド阻害剤は、KRIWFIPRSSWYERA（配列番号１１１）である。

抗ＰＤ‐１抗体及び抗ＰＤ‐１抗体断片
いくつかの実施形態では、二重特異性ＴＧＦβ経路アンタゴニストは、抗ＰＤ‐１抗体又は抗体断片を含む。一実施形態では、本出願で使用するためのＰＤ‐１阻害剤は：配列番号１、４、７、９、及び１２からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）配列；配列番号２、５、１０、及び１３からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２配列；配列番号３、６、８、１１、及び１４からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３配列；配列番号１５、１８、２１〜２３、及び２６からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１配列；配列番号１６、１９、２４、及び２７からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２配列；又は配列番号１７、２０、２５、及び２８からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３配列を含む、抗体又はその抗原結合部分である。

別の実施形態では、（例えば第２の標的指向性ドメインとして）本出願で使用するためのＰＤ‐１阻害剤は：配列番号１、４、７、９、及び１２からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１配列；配列番号２、５、１０、及び１３からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２配列；配列番号３、６、８、１１、及び１４からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３配列；配列番号１５、１８、２１〜２３、及び２６からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１配列；配列番号１６、１９、２４、及び２７からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２配列；並びに配列番号１７、２０、２５、及び２８からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３配列を含む、抗体又はその抗原結合部分である。

別の実施形態では、本出願で使用するためのＰＤ‐１阻害剤は：配列番号２９、３１、３３、３５、３７、及び３９からなる群から選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；配列番号３０、３２、３４、３６、３８、及び４０からなる群から選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；あるいはこれら両方を含む。

別の実施形態では、本出願で使用するためのＰＤ‐１阻害剤は：配列番号２９、３１、３３、３５、３７、及び３９からなる群から選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列；配列番号３０、３２、３４、３６、３８、及び４０からなる群から選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列；又はこれら両方を含む。

一実施形態では、ＰＤ‐１阻害剤は：配列番号３９のＨＣＶＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するＨＣＶＲ；配列番号４０のＬＣＶＲアミノ酸配列少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するＬＣＶＲ；あるいははこれら両方を含む。更に特定の実施形態では、ＰＤ‐１阻害剤は：配列番号３９のＨＣＶＲ配列；配列番号４０のＬＣＶＲアミノ酸配列；又はこれら両方を有する。

別の実施形態では、ＰＤ‐１阻害剤は：（１）配列番号１２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４の重鎖ＣＤＲ３と、（２）配列番号１５０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１、配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する重鎖ＦＲ２、配列番号１５５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するＨＦＲ３、配列番号１４１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ４とを含む、免疫グロブリンＨＣＶＲ；並びに（１）配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２７のＬＣＤＲ２、及び配列番号２８のＬＣＤＲ３と、（２）配列番号１５６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するＬＦＲ１、配列番号１５７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するＬＦＲ２、配列番号１５８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するＬＦＲ３、及び配列番号１５９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するＬＦＲ４とを含む、免疫グロブリン重鎖可変領域を有する。

別の実施形態では、ＴＧＦ‐β１抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号９２又は配列番号１０６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する免疫グロブリン重鎖；配列番号９３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する軽鎖；あるいはこれら両方を含む、ＰＤ‐１阻害剤を含む。更に特定の実施形態では、ＴＧＦ‐β１抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号９２又は配列番号１０６のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖；配列番号９３のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖；あるいはこれら両方を含む、ＰＤ‐１阻害剤を含む。

別の実施形態では、ＴＧＦ‐β１抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号９４又は配列番号１２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する免疫グロブリン重鎖；配列番号９５のＬＣＶＲアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する免疫グロブリン軽鎖；あるいはこれら両方を含む、ＰＤ‐１阻害剤を含む。更に特定の実施形態では、ＴＧＦ‐β１抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号９４又は配列番号１２６のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖；配列番号９５のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖；あるいはこれら両方を含む、ＰＤ‐１阻害剤を含む。別の実施形態では、ＰＤ‐１／ＴＧＦ‐β１抗腫瘍アンタゴニストは、図５Ｂに示すようにＣＨ３ループ内に挿入されたＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤを含む。

一実施形態では、ＴＧＦ‐β１抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号１０７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する重鎖；配列番号１０８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する軽鎖；あるいはこれら両方を含む、ＰＤ‐１阻害剤を含む。更に特定の実施形態では、ＴＧＦ‐β１抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号１０７のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖；配列番号１０８のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖；又はこれら両方を含む、ＰＤ‐１阻害剤を含む。

他のＰＤ‐１標的化アンタゴニストとしては、ニボルマブ（ＢＭＳ‐９３６５５８、ＭＤＸ‐１１０６、ＯＰＤＩＶＯ（商標））、ヒト化免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４） ｍＡｂ（Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；ペンブロリズマブ（ＭＫ‐３４７５、ランブロリズマブ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標））（Ｍｅｒｃｋ）；ピジリズマブ（ＣＴ‐０１１）（Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）；及びＡＭＰ‐２２４（Ｍｅｒｃｋ）といった、抗ＰＤ‐１抗体が挙げられる。抗ＰＤ‐１抗体は例えば、ＡＢＣＡＭ（ＡＢ１３７１３２）、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（商標）（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＲＭＰ１‐１４）、及びＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（Ｊ１０５、Ｊ１１６、ＭＩＨ４）から市販されている。抗ＰＤ‐１標的化抗腫瘍アンタゴニストは、図１〜２に記載されているものを含む本明細書に記載の抗ＰＤ‐１抗体のうちのいずれかに由来するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及びＣＤＲを含んでよい。

抗ＰＤ‐Ｌ１抗体及び抗ＰＤ‐Ｌ１抗体断片
いくつかの実施形態では、二重特異性ＴＧＦ‐β１経路アンタゴニストは、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体又は抗体断片を更に含む。一実施形態では、本出願で使用するためのＰＤ‐Ｌ１阻害剤は：配列番号４１、４４、５０、及び５３からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１配列；配列番号４２、４５、４７、４９、５１、及び５４からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２配列；配列番号４３、４６、４８、５２、及び５５からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３配列；配列番号５６、５９、６３、６６、及び６９からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１配列；配列番号５７、６０、６４、６７、及び７０からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２配列；又は配列番号５８、６１、６２、６５、６８、及び７１からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３配列を含む、抗体又はその抗原結合部分である。

別の実施形態では、（例えば第２の標的指向性ドメインとして）本出願で使用するためのＰＤ‐Ｌ１阻害剤は：配列番号４１、４４、５０、及び５３からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１配列；配列番号４２、４５、４７、４９、５１、及び５４からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２配列；配列番号４３、４６、４８、５２、及び５５からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３配列；配列番号５６、５９、６３、６６、及び６９からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１配列；配列番号５７、６０、６４、６７、及び７０からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２配列；及び配列番号５８、６１、６２、６５、６８、及び７１からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３配列を含む、抗体又はその抗原結合部分である。

別の実施形態では、本出願で使用するためのＰＤ‐Ｌ１阻害剤は：配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、及び８６からなる群から選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する免疫グロブリンＨＣＶＲ；配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、及び８７からなる群から選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する免疫グロブリンＬＣＶＲ；あるいはこれら両方を含む。別の実施形態では、本出願で使用するためのＰＤ‐Ｌ１阻害剤は：配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、及び８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ；配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、及び８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲ；又はこれら両方を含む。

一実施形態では、ＰＤ‐Ｌ１阻害剤は：配列番号８６のＨＣＶＲアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するＨＣＶＲ；配列番号８７のＬＣＶＲアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するＬＣＶＲ；あるいはこれら両方を含む。更に特定の実施形態では、ＰＤ‐Ｌ１阻害剤は：配列番号８６のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ；配列番号８７のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲ；又はこれら両方を含む。

別の実施形態では、ＴＧＦ‐β１抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号９４又は配列番号１２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する免疫グロブリン重鎖；配列番号９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する免疫グロブリン軽鎖；あるいはこれら両方を含む、ＰＤ‐Ｌ１阻害剤を含む。更に特定の実施形態では、ＴＧＦ‐β１抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号９４又は配列番号１２６のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖；配列番号９５のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖；あるいはこれら両方を含む、ＰＤ‐Ｌ１阻害剤を含む。

別の実施形態では、ＰＤ‐Ｌ１／ＴＧＦ‐β１抗腫瘍アンタゴニストは、図５Ｂに示すようにＣＨ３ループ内に挿入されたＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤを含む。

ある特定の実施形態では、ＴＧＦ‐β１抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号１０９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する免疫グロブリン重鎖；配列番号１１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する免疫グロブリン軽鎖；あるいはこれら両方を含む、ＰＤ‐Ｌ１阻害剤を含む。更に特定の実施形態では、ＴＧＦ‐β１抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号１０９のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖；配列番号１１０のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖；又はこれら両方を含む、ＰＤ‐Ｌ１阻害剤を含む。

他の抗ＰＤ‐Ｌ１標的化アンタゴニストとしては：アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６）、完全ヒトＩｇＧ４ ｍＡｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）；ＢＭＳ‐９３６５５９（ＭＤＸ‐１１０５）、完全ヒト化ＩｇＧ４ ｍＡｂ（Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；ＭＥＤＩ４７３６、ヒト化ＩｇＧ抗体（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；及びＭＳＢ００１０７１８Ｃ、完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体（Ｍｅｒｃｋ、ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）といった抗ＰＤ‐Ｌ１抗体が挙げられる。抗ＰＤ‐Ｌ１標的化抗腫瘍アンタゴニストは、図３〜４に記載されているものを含む本明細書に記載の抗ＰＤ‐Ｌ１抗体のうちのいずれかに由来するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及びＣＤＲを含んでよい。

Ｂ．ＴＧＦ‐β１及び１つ以上の血管新生経路を標的とする二重特異性アンタゴニスト
別の態様では、本出願の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、ＴＧＦβ１又はＴＧＦβ１ ＲＩＩに特異的に結合する第１の標的指向性ドメインと、ＶＥＧＦ‐Ａ、ＶＥＧＦＲ、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ｔｉｅ２Ｒ、又はこれらの組み合わせに特異的に結合する第２の標的指向性ドメインとを含む。これらの実施形態では、上述のＴＧＦβ１又はＴＧＦβ１ ＲＩＩ結合断片のうちのいずれを、第２の標的指向性ドメインと組み合わせて使用してよい。

血管新生経路
血管新生、即ち既に存在する血管からの新たな血管の発達は、腫瘍の成長及び転移のために重要である。血管新生の阻害は、進行（例えば転移）が血管新生に依存する癌等の疾患の治療のための、潜在的に価値のある戦略を提示する。血管新生の阻害は腫瘍細胞の死をもたらし、これにより、腫瘍抗原を宿主の抗原提示経路に供給できる。血管新生経路阻害剤は、例えば抗体、可変ドメイン断片、又はドミナントネガティブ融合タンパク質断片の形態であってよい。

１．ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ経路
主要なＶＥＧＦ経路は、膜透過性チロシンキナーゼＶＥＧＦ‐Ｒ２によって仲介される。ＶＥＧＦの様々なアイソフォーム、特にＶＥＧＦ‐Ａは、ＶＥＧＦＲ‐２に結合して、様々な下流のチロシンキナーゼのリン酸化によって、二量体化及び活性化をもたらす。

いくつかの実施形態では、本出願のアンタゴニストはＶＥＧＦ経路アンタゴニストを含み、これは、ＶＥＧＦ‐Ａ、又はその受容体ＶＥＧＦＲ‐２に結合し、この結合の結果として、ＶＥＧＦ‐ＡによるＶＥＧＦＲ‐２の活性化が遮断又は阻害される。

一実施形態では、ＴＧＦβ経路アンタゴニストは、ヒトＶＥＧＦ受容体１又は２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対応するドミナントネガティブＶＥＧＦＲアンタゴニストの形態の、ＶＥＧＦ経路アンタゴニストを更に含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ経路アンタゴニストとしてはアフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐとしても知られる）が挙げられ、これは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分と融合した、ヒトＶＥＧＦ受容体１及び２の細胞外ドメイン由来のＶＥＧＦ‐Ａ結合部分を含有する、組換え融合タンパク質である。アフリベルセプト等のＶＥＧＦＲ ＥＣＤは、ＶＥＧＦ‐Ａのための可溶性受容体デコイとして作用する。

一実施形態では、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、ＴＧＦβ経路阻害剤を含む第１の標的指向性ドメインと、ＶＥＧＦ‐Ａに特異的に結合する第２の標的指向性ドメインとを含み、上記第２の標的指向性ドメインはアフリベルセプトを含む。アフリベルセプトの好適なソースは、配列番号８８に記載のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、図８Ｃに示すように、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃ受容体（Ｂｉ‐ＺＢ‐１）を介してカルボキシ末端においてＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤに結合されたアミノ末端アフリベルセプトドメインを含む、修飾済み免疫グロブリン重鎖を含む。一実施形態では、この修飾済み免疫グロブリン重鎖は、配列番号１０５のアミノ酸配列を有する。あるいはＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤはアミノ末端に位置してよく、アフリベルセプトドメインがカルボキシ末端に位置してよい。

別の実施形態では、ＴＧＦβ経路アンタゴニストは更に、ベバシズマブ由来のもの等の抗ＶＥＧＦＡ又は抗ＶＥＧＦＲ‐２可変領域配列を含むＶＥＧＦ経路アンタゴニストを含む。ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））は、変異したヒトＩｇＧ１フレームワーク領域（ＦＲ）と、ＶＥＧＦＲ‐２に対するヒトＶＥＧＦ‐Ａの結合を遮断するマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ４．６．１由来の抗原結合相補性決定領域とを含む、ヒト化抗体である。ベバシズマブのアミノ酸配列のおよそ９３％（フレームワーク領域の大半を含む）は、ヒトＩｇＧ１由来であり、上記配列の約７％はマウス抗体Ａ４．６．１由来である。ベバシズマブは、約１４９，０００ダルトンの分子質量を有し、グリコシル化されている。一実施形態では、本出願で使用するためのベバシズマブのＨＣＶＲは、配列番号９０に記載のアミノ酸配列を有し、ベバシズマブのＬＣＶＲは、配列番号９１に記載のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、米国特許第７，５７５，８９３号に記載されているように、ベバシズマブ／Ａｖａｓｔｉｎ抗体又はその断片にアミノ酸置換が含まれていてよい。例示的なアミノ酸置換としては、限定するものではないが、Ｅ１Ｑ、Ｅ６Ｑ、Ｌ１１Ｖ、Ｑ１３Ｋ、Ｌ１８Ｖ、Ｒ１９Ｋ、Ａ２３Ｋ、又はこれらの組み合わせが挙げられる。一実施形態では、本出願で使用するためのベバシズマブの変異型ＨＣＶＲは、配列番号９６に記載のアミノ酸配列を有し、これは配列番号９１のＬＣＶＲと併せて使用できる。

一実施形態では、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、ＴＧＦβ１ ＲＩＩ ＥＣＤ等のＴＧＦβ１に特異的に結合する（又は抗ＴＧＦ β１若しくは抗ＴＧＦβ１ ＲＩＩ可変ドメインを含有する）第１の標的指向性ドメインと、ベバシズマブ又は他のいずれの抗ＶＥＧＦ若しくは抗ＶＥＧＦＲ２抗体、その可変領域断片、若しくはその機能的に活性の変異型断片といった、ＶＥＧＦ Ａ又はＶＥＧＦＲ２に特異的に結合する第２の標的指向性ドメインとを含む。

ある特定の実施形態では、二重特異性抗腫瘍ＴＧＦ‐β／ＶＥＧＦ‐ＶＥＧＦＲ２アンタゴニストは：配列番号１０２のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖；配列番号１０３のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖；又はこれら両方を含む（野生型ベバシズマブ可変領域配列を含有するＢｉ‐ＡＢ‐１（図８Ａ）等）。

別の実施形態では、二重特異性抗腫瘍ＴＧＦ‐βアンタゴニストは：配列番号１０４のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖；配列番号１０３のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖；又はこれら両方を更に含む（変異型ベバシズマブ可変領域配列を含有するＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１（図８Ｂ）等）。

更なる抗ＶＥＧＦ若しくは抗ＶＥＧＦＲ抗体、又はその断片は：ベバシズマブと同一の親マウス抗体に由来するモノクローナル抗体断片である、ラニビズマブ（商品名：Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標））；米国公開特許第２００６／０２８０７４７号、米国公開特許第２００７／０１４１０６５号、及び／又は米国公開特許第２００７／００２０２６７号に記載されているＧ６又はＢ２０シリーズ抗体（例えばＧ６‐２３、Ｇ６‐３１、Ｂ２０‐４．１）；並びに米国特許第７，２９７，３３４号、米国特許第７，０６０，２６９号、米国特許第６，８８４，８７９号、米国特許第６，５８２，９５９号、米国特許第６，７０３，０２０号、米国特許第６，０５４，２９７号、米国特許出願公開第２００７／０５９３１２号、米国特許出願公開第２００６／００９３６０号、米国特許出願公開第２００５／０１８６２０８号、米国特許出願公開第２００３／０２０６８９９号、米国特許出願公開第２００３／０１９０３１７号、及び米国特許出願公開第２００３／０２０３４０９号に記載の抗体をベースとするものであってよい。

例示的な抗ＶＥＧＦＲ‐２抗体アンタゴニストは、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体であるラムシルマブであり、これは、ＶＥＧＦＲ‐２の細胞外ドメインに結合することによって、ＶＥＧＦＲ‐２とＶＥＧＦ‐Ａとの相互作用を遮断する。更なる抗ＶＥＧＦＲ‐２抗体は、米国特許第７，４９８，４１４号、米国特許第６，４４８，０７７号、及び米国特許第６，３６５，１５７号に記載されている。

いくつかの実施形態では、抗腫瘍アンタゴニストは更に、ＶＥＧＦ経路の１つ以上の例示的な小分子アンタゴニスト、例えばスニチニブ、ソラフェニブ、セディナニブ、パゾパニブ、及びニンテダニブを含むＶＥＧＦＲ‐２のマルチキナーゼ阻害剤を含む。

２．Ａｎｇ‐Ｔｉｅ２Ｒ経路
いくつかの実施形態では、二重特異性アンタゴニストは、少なくとも１つのＴｉｅ２受容体結合アンタゴニストを含有する標的指向性ドメインを含む。Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体結合アンタゴニストは、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体又はそのリガンド（即ちＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３、及びＡｎｇ４）のうちの１つに結合し、その結合の結果として、そのリガンドのうちの１つ以上によるＴｉｅ２チロシンキナーゼ受容体の活性化を遮断又は阻害する。ＶＥＧＦと同様に、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）は腫瘍血管新生において重要な役割を果たす。ＡＮＧ２及びＶＥＧＦはまた、連携して、樹状細胞及びマクロファージの抗原提示を防止し、Ｔｒｅｇの蓄積を強化し、Ｔｅｆｆの蓄積を抑制するように作用する。ＶＥＧＦ及びＡｎｇ２の両方を阻害することにより、マウス乳癌モデルＴｇ ＭＭＴＶ‐ＰｙＭＴにおける生存が改善されることが既に示されている。更に、抗ＰＤ１を追加すると、応答が更に改善される。

本出願で使用するためのＴｉｅ２チロシンキナーゼ受容体結合アンタゴニストとしては、単離された形態の、又は融合タンパク質若しくはコンジュゲートの一部としての、抗体断片、ペプチド阻害剤、ドミナントネガティブペプチド、及び小分子薬剤が挙げられる。一実施形態では、Ｔｉｅ２受容体結合アンタゴニストは、トレバナニブ由来の阻害性ペプチドＴＢＮ‐Ｐである。ある特定の実施形態では、上記阻害性ペプチドは、アミノ酸配列：AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE（配列番号１１３）を含む。別の実施形態では、Ｔｉｅ２受容体結合アンタゴニストは配列番号１１４を含む。

本出願で使用するためのＴｉｅ２活性化の他のペプチド阻害剤（Ａｎｇ‐２阻害剤を含む）としては：アミノ酸配列ETFLSTNKLENQ（配列番号１２３）を含むＡ‐１１（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ）；ＣＶＸ‐０６０ペプチドＱＫ（Ａｃ）ＹＱＰＬＤＥＫ（Ａｃ）ＤＫ（０Ｐ）ＴＬＹＤＱＦＭＬＱＱＧ（配列番号１２４、Ｐｆｉｚｅｒ）；ＣＶＸ‐０３７ペプチド（ＤＦＢ）ＴＮＦＭＰＭＤＤＬＥＫ（０Ｐ）ＲＬＹＥＱＦＩＬＱＱＧ（配列番号１２５、Ｐｆｉｚｅｒ）；及びＣＧＥＮ‐２５０１７（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ）が挙げられる。更なるＴｉｅ２活性化のペプチド阻害剤は、米国特許第７，１３８，３７０号に記載されている。

本出願で使用するためのＴｉｅ２活性化（及び／又はアンジオポエチン‐２）の抗体阻害剤としては：ＡＭＧ‐７８０（Ａｍｇｅｎ）；ＭＥＤＩ‐３６１７（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＤＸ‐２２４０（Ｄｙａｘ／Ｓａｎｏｆｉ‐Ａｖｅｎｔｉｓ）；ＲＥＧＮ‐９１０（Ｓａｎｏｆｉ／Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）；ＲＧ７５９４（Ｒｏｃｈｅ）；ＬＣ０６（Ｒｏｃｈｅ）；ＴＡｖｉ６（Ｒｏｃｈｅ）；ＡＴ‐００６（Ｒｏｃｈｅ／Ａｆｆｉｔｅｃｈ）が挙げられる。更なるＴｉｅ２受容体結合抗体アンタゴニスト、及びこれに由来する抗体結合配列は、米国特許第７，５２１，０５３号、米国特許第７，６５８，９２４号、及び米国特許第８，０３０，０２５号、並びに米国特許出願公開第２０１３／００７８２４８号、米国特許出願公開第２０１３／０２５９８５９号、及び米国特許出願公開第２０１５／０１９７５７８号に記載されている。

本出願で使用するためのＴｉｅ２結合アンタゴニストとしては更に、小分子分子阻害剤であるＣＧＩ‐１８４２（ＣＧＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＬＰ‐５９０（Ｌｏｃｕｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＣＴＢ‐１００３（Ａｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｂａｙｅｒ ＡＧ）、ＣＥＰ‐１１９８１（Ｃｅｐｈａｌｏｎ／Ｔｅｖａ）、ＭＧＣＤ２６５（Ｍｅｔｈｙｌｇｅｎｅ）、レゴラフェニブ（Ｂａｙｅｒ）、カボザンチニブ／ＸＬ‐１８４／ＢＭＳ‐９０７３５１（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、フォレチニブ（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＭＧＣＤ‐２６５（ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ Ｉｎｃ．）が挙げられる。

特定の実施形態では、二重特異性チェックポイント調節因子アンタゴニストは、その２つの結合アームのうちの一方（１対のＨＣ／ＬＣ）においてヒトＰＤ‐１又はＰＤ‐Ｌ１に結合し、その第２のアーム（異なる１対のＨＣ／ＬＣ）において異なる抗原（又はエピトープ）に結合する、全長抗体である。これらの実施形態では、二重特異性抗体は、（特異性及びＣＤＲ配列の両方において）別個のものである２つの抗原結合アームを有し、これが結合する各抗原に対して１価である。

いくつかの実施形態では、二重特異性チェックポイント調節因子アンタゴニストは、その２つの結合アーム（１対のＨＣ／ＬＣ）それぞれにおいてヒトＰＤ‐１及び／又はＰＤ‐Ｌ１に結合できる、全長抗体である。これらの実施形態では、二重特異性チェックポイント調節因子アンタゴニストは、同一の特異性及び同一のＣＤＲ配列を有する２つの同一の抗原結合アームを有し、これが結合する各抗原に対して２価である。

免疫グロブリン及び非免疫グロブリン足場
本出願の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、本明細書に記載されているように、免疫グロブリンバックボーン又は非免疫グロブリン足場を用いて構築できる。いく[つかの実施形態では、本出願の二重特異性アンタゴニストは、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメインを含む、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４足場等の免疫グロブリン足場を用いて構築される。ＩｇＧ１バックボーンの使用は癌治療に好ましく、この場合標的は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を仲介できる抗原提示細胞上に存在する。ＩｇＧ４バックボーンを使用すると、抗原結合のみで所望の治療的利益を十分に生成できる場合に、抗原を標的化できる。ＩｇＧ４系アンタゴニストは、例えばＩｇＧ１抗体に関連する、ＦｃγＲ結合及び補体活性化を含む望ましくないエフェクタ機能を排除する。

好ましくは、第１及び第２の標的指向性ドメインは、ヒト化ＩｇＧ１又はＩｇＧ４足場で提示される。更に、第２の標的指向性ドメインは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４足場のカルボキシ末端に融合できる。更に、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４足場は、Ｎ２９７Ａ又はＫ４４７Ａアミノ酸置換を有してよい。いくつかの実施形態では、第１の標的指向性ドメインは、Ｅ１Ｑ、Ｅ６Ｑ、Ｌ１１Ｖ、Ｑ１３Ｋ、Ｌ１８Ｖ、Ｒ１９Ｋ、Ａ２３Ｋ、又はこれらのいずれの組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、１つ以上のフレームワーク領域を含んでよい。他の実施形態では、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４足場の１つ以上のアミノ酸残基を脱グリコシル化又は変異させて、その非グリコシル化多様体を生成する。本明細書に記載の二重特異性分子で使用するための例示的な免疫グロブリン足場は、配列番号１０３、１０４、１０５、１１５〜１２２、及び１２７〜１２９からなる群から選択してよい。

抗体又はアンタゴニストのうちのいずれの１つは、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ｓｃＦｖ、又は多重特異性アンタゴニストの形態とすることができる。更に、本明細書に記載の抗体アンタゴニストのいずれは、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、アンジオポエチン、及び／又はＴｉｅ２Ｒを標的とする多重結合特異性を有することができる。更に、抗体アンタゴニストのいずれは、所与の標的中の複数のエピトープを標的とするように操作されていてよい。更に、いくつかの実施形態では、チェックポイントアンタゴニスト及び／又は血管新生特異性が、対応する受容体に由来する細胞外ドメイン（ＥＣＤ）等のドミナントネガティブ融合タンパク質の形態で含まれていてよい。

本明細書に記載のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、自然に発生するＦｃ領域、あるいは自然に発生しない若しくは変異したＦｃ領域、例えばエフェクタ機能を有しない若しくはほとんど有しないＦｃ（例えばヒトＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４）、又は腫瘍環境下でのＴ_ｒｅｇ枯渇を強化するために１つ以上の活性化Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ若しくはＦｃγＲＩＩＩａ）への結合が強化されたＦｃに結合され得る。従って特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、及び／又は抗ＶＥＧＦ ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、典型的には血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／又は抗原依存性細胞傷害性といった抗体の１つ以上の機能的特性を変化させるために、１つ以上の修飾を含むＦｃに結合され得る。更に、本明細書に記載の抗体は、抗体の１つ以上の機能的特性を変化させるために、化学的に修飾されていてよく（例えば１つ以上の化学的部分を抗体に付着させることができ）、又はそのグリコシル化を変化させるように修飾されていてよい。より具体的には、特定の実施形態では、本出願の抗体は、Ｆｃ領域に修飾を含んでよく、これにより、親Ｆｃと比較して、（ａ）抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が上昇若しくは低下し、（ｂ）補体介在性細胞傷害性（ＣＤＣ）が上昇若しくは低下し、（ｃ）Ｃ１ｑに対する親和性が上昇若しくは低下し、及び／又は（ｄ）Ｆｃ受容体に対する親和性が上昇若しくは低下した、Ｆｃ多様体が生成される。このようなＦｃ領域多様体は一般に、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むことになる。複数のアミノ酸修飾を組み合わせることは、特に望ましいものと考えられる。例えば多様体Ｆｃ領域はその中に、例えば本明細書中で同定されている特定のＦｃ領域の位置の、２つ、３つ、４つ、５つ等の置換を含んでよい。

エフェクタ機能が完全に回避されるべき用途、例えば所望の治療的利益の生成には抗原結合だけで十分であり、エフェクタ機能が望ましくない副作用をもたらす（又はそのリスクを上昇させる）だけである場合に関しては、ＩｇＧ４抗体を使用してよく、又はＦｃ領域若しくはその実質的な部分を欠いた抗体若しくは断片を考えることができ、又はＦｃを変異させてグリコシル化（例えばＮ２９７Ａ）を完全に排除してよい。あるいは、エフェクタ機能を欠き、ＦｃγＲ（ＩｇＧ２等）に結合して補体（ＩｇＧ４等）を活性化する能力を欠いた、ヒトＩｇＧ２（ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域）とヒトＩｇＧ４（ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）とのハイブリッド構築物を生成してよい。ＩｇＧ４定常ドメインを使用する場合、置換Ｓ２２８Ｐを含むことが好ましい場合が多く、これは、ＩｇＧ１のヒンジ配列を模倣することによってＩｇＧ４分子を安定させ、治療用抗体と、治療を受ける患者の内因性ＩｇＧ４との間での、Ｆａｂアームの交換を減少させる。

特定の実施形態では、抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＶＥＧＦ、抗アンジオポエチン、及び／又は抗Ｔｉｅ２Ｒ抗体、又はこれらの断片を修飾することによって、その生物学的半減期を増大させてよい。例えばＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合親和性を上昇させるアプローチを含む、様々なアプローチを採用できる。一実施形態では、米国特許第５，８６９，０４６号、及び米国特許第６，１２１，０２２号に記載されているように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られたサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、抗体をＣＨ１又はＣＬ領域内で変化させる。Ｆｃ領域内の残基の番号付与は、ＥＵインデックスのものである。本明細書で開示される配列多様体は、残基番号と、これに続く、自然に発生するアミノ酸の代わりとなるアミノ酸とを参照して提供され、必要に応じて、その位置の自然に発生する残基がその前に記載される。所与の位置に複数のアミノ酸が存在し得る場合、例えば配列が自然に発生する複数のアイソタイプ間で異なる場合、又は複数の変異がその位置において置換され得る場合、これらはスラッシュで区切られる（例えば「Ｘ／Ｙ／Ｚ」）。

ＦｃＲｎへの結合を増大させる、及び／又は薬物動態特性を改善する、例示的なＦｃ多様体は、２５９、３０８、及び４３４位の置換を含み、これらは例えば、２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、及び４３４Ｍを含む。ＦｃＲｎへのＦｃの結合を増大させる他の多様体としては：２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９（８）：６２１３‐６２１６、Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７６：３４６‐３５６）、２５６Ａ、２７２Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６（９）：６５９１‐６６０４）、２５２Ｆ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、４３３Ｒ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６９：５１７１‐５１８０， Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（２００６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２８１：２３５１４‐２３５２４、及び米国特許第８，３６７，８０５号）が挙げられる。

Ｎ４３４Ａ多様体（Ｙｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８２：７６６３）等の、ＩｇＧ Ｆｃ中の特定の保存された残基の修飾（１２５３、Ｈ３１０、Ｑ３１１、Ｈ４３３、Ｎ４３４）が、ＦｃＲｎ親和性を上昇させることによって循環中の抗体の半減期を増大させる方法として提案されている（国際公開特許第９８／０２３２８９号）。Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含む複合Ｆｃ多様体は、ＦｃＲｎ結合を増大させ、半減期を最大５倍まで増大させることが示されている（Ｚａｌｅｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２８：１５７）。Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、及びＮ４３４Ａ修飾を含む複合Ｆｃ多様体もまた、ＩｇＧ１抗体の半減期を延長する（Ｐｅｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８：１７５９）。更に、Ｍ２５２Ｙ‐Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｌ‐Ｎ４３４Ｈ、Ｍ４２８Ｌ‐Ｎ４３４Ｆ、Ｍ４２８Ｌ‐Ｎ４３４Ｙ、Ｍ４２８Ｌ‐Ｎ４３４Ａ、Ｍ４２８Ｌ‐Ｎ４３４Ｍ、及びＭ４２８Ｌ‐Ｎ４３４Ｓ多様体を含む複合Ｆｃ多様体もまた、半減期を延長することが示されている（米国公開特許第２００６／１７３１７０号）。更に、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅを含む複合Ｆｃ多様体は、半減期を４倍近く増大させることが報告されている（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８１：２３５１４）。

ホモ二量体及びヘテロ二量体
二重特異性抗体調製物を効率的に製造するための課題の１つは、結合特異性が異なる鎖が同時発現される際の、重鎖及び軽鎖の誤った対合に関する。表１は、結合特異性が異なる重鎖間の誤った対合を克服するための、複数のアミノ酸置換選択肢を示し、これは、所望の重鎖間での正しい会合を「強制する」、又は優先的に促進する。重鎖間の誤った対合を防止又は低減するためのいずれのアプローチを用いて、本開示による二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを作製してよい。

「ノブ・イントゥ・ホール」（ＫｉＨ）アプローチは、ほとんどの相互作用が発生する２つのＣＨ３ドメイン間の境界の修飾に依存する。典型的には、嵩高い残基を一方の抗体重鎖のＣＨ３ドメインに導入し、これは鍵のように機能する。他方の重鎖には「ホール」が形成され、これは上述の嵩高い残基を収容でき、錠を模倣する。得られるヘテロ二量体Ｆｃ部分は、人工的なジスルフィド架橋によって更に安定化できる。

別のアプローチは、イオン相互作用又は立体的相補性を有する荷電残基に基づくものである。これは、ＣＨ３境界の電荷の極性を変更するステップを含み、これにより、静電気的に一致したＦｃドメインの同時発現が、疎水性コアを保持しながら、好ましい牽引性の相互作用及びヘテロ二量体形成をサポートし、その一方で、好ましくない反発性の電荷の相互作用がホモ二量体化を抑制する。表１を参照。表１のアミノ酸の番号付与は、Ｋａｂａｔ番号付与スキームに従っており、本明細書に記載の抗体の重鎖アミノ酸配列に適用できる。

更なるアプローチでは、本出願の二重特異性分子は、ロイシンジッパー（ＬＺ）ドメインを含有する非免疫グロブリン足場を用いて構築してよい。ロイシンジッパーは、典型的には様々な転写因子中のＤＮＡ結合ドメインの一部としての、タンパク質中の一般的な３次元構造モチーフである。単一のＬＺは、典型的には４〜５個のロイシン残基をおよそ７残基の間隔で含有し、これは、片側に沿って疎水性領域が延在する両親媒性アルファヘリックスを形成する。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質足場は、ｃ‐ｆｏｓ転写因子からのＬＺに関連するｃ‐ｊｕｎ転写因子からのＬＺを含む。ｃ‐ｊｕｎは、ｊｕｎ‐ｊｕｎホモ二量体を形成することが知られており、ｃ‐ｆｏｓはヘテロ二量体を形成しないが、ｊｕｎ‐ｆｏｓホモ二量体の形成はｊｕｎ‐ｊｕｎヘテロ二量体よりもはるかに好ましい。

ロイシンジッパードメインは、タンパク質足場中にＣＨ２‐ＣＨ３配列の代わりに組み込むことができ、又は二重特異性抗腫瘍アンタゴニストの２つの重鎖のカルボキシ末端に配置できる。後者の場合、フリン切断部位をＣＨ３のカルボキシ末端とロイシンジッパーのアミノ末端との間に導入してよい。これにより、適切な哺乳類細胞発現系において二重特異性抗腫瘍アンタゴニストの重鎖及び軽鎖が同時発現されたときに、ヘテロ二量体化ステップの後に、ロイシンジッパーのフリン仲介型切断を促進できる。（Ｗｒａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ， ２８７（５）：４３３３１‐４３３３９， ２０１２を参照）。

表１のアミノ酸の番号付与は、Ｋａｂａｔ番号付与スキームに従っており、本明細書に記載の抗体の重鎖アミノ酸配列に適用できる。表１に記載の変異は、いずれの免疫グロブリンＩｇＧ１重鎖、並びに本明細書中の他の免疫グロブリンクラス及びサブクラス（又はアイソタイプ）の配列（公開されているもの又はそうではないもの）に適用され得る。

二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖の同時発現時、ある結合特異性の軽鎖が、異なる結合特異性の重鎖と誤って対合される場合もある。従って特定の実施形態では、重鎖、軽鎖、又はこれら両方の部分を、これらが由来する「野生型」抗体鎖に比べて修飾することによって、両方の重鎖定常領域の互いに対する誤った対合、及び軽鎖定常領域の、対応する重鎖に対する誤った対合を、防止又は低減できる。

軽鎖の誤った対合の問題には、複数の方法で対処できる。いくつかの実施形態では、立体的相補性変異及び／又はジスルフィド架橋を２つのＶＬ／ＶＨ境界に組み込むことができる。他の実施形態では、変異を、イオン性又は静電気的相互作用に基づいて組み込むことができる。いくつかの実施形態では、軽鎖の誤った対合は、重鎖のＣＨ１ドメインのＳ１８３Ｅ変異と、軽鎖のＣＬドメインのＳ１７６Ｋ変異とを伴う第１のアームを採用することによって、防止又は低減できる。第２のアームは、重鎖のＣＨ１ドメインのＳ１８３Ｋ変異と、軽鎖のＣＬドメインのＳ１７６Ｅ変異とを含んでよい。他の実施形態では、「ＣｒｏｓｓＭａｂ」アプローチが採用され、ここでは、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト中の一方のアーム（例えばＦａｂ）は触られないままであるが、他の結合特異性を有する他方のアームでは、軽鎖の１つ以上のドメインが、重鎖：軽鎖の境界において、重鎖の１つ以上のドメインと交換される。

上で開示されている重鎖及び軽鎖の誤った対合を防止するための方法、特異的変異を含む免疫グロブリンドメイン配列は、米国特許出願公開第２０１４／０２４３５０５号、米国特許出願公開第２０１３／００２２６０１号に更に記載されている。

コンジュゲート
特定の実施形態では、本出願の抗腫瘍アンタゴニストは、１つ以上のペプチド及び／又は小分子薬剤に化学的にコンジュゲートされる。上記ペプチド又は小分子薬剤は、同一であっても異なっていてもよい。上記ペプチド又は小分子薬剤は例えば、還元されたＳＨ基及び／又は炭水化物側鎖に付着させることができる。ペプチド又は小分子薬剤と抗体との共有又は非共有結合を作製する方法は当該技術分野において公知であり、いずれのこのような公知の方法を利用してよい。

いくつかの実施形態では、ペプチド又は小分子薬剤は、ジスルフィド結合の形成によって、還元された抗体成分のヒンジ領域に付着させられる。あるいは、このような作用剤は、Ｎ‐スクシニル３‐（２‐ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）等のヘテロ二官能性架橋剤を用いて付着させることができる。このようなコンジュゲーションのための一般的な技法は、当該技術分野において公知である。いくつかの実施形態では、ペプチド又は小分子薬剤は、抗体のＦｃ領域の炭水化物部分を介してコンジュゲートされる。炭水化物基は、チオール基に結合する同一の作用剤の負荷を増大させるために使用でき、又は炭水化物部分は、異なる治療剤若しくは診断剤に結合するために使用できる。抗体の炭水化物部分を介してペプチド阻害剤又は小分子薬剤を抗体にコンジュゲートする方法は、当業者には公知である。例えば一実施形態では、上記方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有する担体ポリマーと反応させるステップを伴う。この反応により、最初のシッフ塩基（イミン）結合が生じ、これを還元して２級アミンとすることによって安定化させて、最終的なコンジュゲートを形成できる。小分子薬剤及びペプチドを抗体にコンジュゲートする例示的な方法は、米国特許出願公開第２０１４／０３５６３８５号に記載されている。

好ましくは、本開示の抗腫瘍アンタゴニストは、試験管内及び生体内安定性（例えば長い半減期及び貯蔵寿命安定性）、所望の標的細胞への効率的な送達、結合パートナーに対する親和性の向上、所望の抗体依存性細胞介在性細胞傷害性及び補体依存性細胞傷害性、並びに腎クリアランス又は排泄の低減を含む、抗体の特定の所望の特徴及び薬物動態特性を保持している。従って、抗腫瘍アンタゴニストの設計において、サイズへの十分な配慮、及び特定の定常領域のエフェクタ機能の必要性を、考慮できる。

本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストのサイズは、５０ｋＤ〜３００ｋＤ、５０ｋＤ〜２５０ｋＤ、６０ｋＤ〜２５０ｋＤ、８０ｋＤ〜２５０ｋＤ、１００ｋＤ〜２５０ｋＤ、１２５ｋＤ〜２５０ｋＤ、１５０ｋＤ〜２５０ｋＤ、６０ｋＤ〜２２５ｋＤ、７５ｋＤ〜２２５ｋＤ、１００ｋＤ〜２２５ｋＤ、１２５ｋＤ〜２２５ｋＤ、１５０ｋＤ〜２２５ｋＤ、６０ｋＤ〜２００ｋＤ、７５ｋＤ〜２００ｋＤ、１００ｋＤ〜２００ｋＤ、１２５ｋＤ〜２００ｋＤ、１５０ｋＤ〜２００ｋＤ、６０ｋＤ〜１５０ｋＤ、７５ｋＤ〜１５０ｋＤ、１００ｋＤ〜１５０ｋＤ、６０ｋＤ〜１２５ｋＤ、７５ｋＤ〜１２５ｋＤ、７５ｋＤ〜１００ｋＤ、又は上述の範囲内で挙げられている整数のいずれの組み合わせによって包含されるいずれの範囲、又は上述の範囲のうちのいずれかの間の整数のいずれの組み合わせによって指定されるいずれの範囲内であってよい。

キット
本出願は更に、本出願のチェックポイント調節因子アンタゴニスト又は抗腫瘍アンタゴニストを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、上記キットは、少なくとも１つのＴＧＦβ経路阻害性ドメインを含有する、１つ以上の二重特異性免疫チェックポイント調節因子を含む。いくつかの実施形態では、上記キットは更に、検出用の二次抗体、及び本明細書に記載の追加のヒト抗体（例えば同一の抗原中の異なるエピトープに結合する、相補的活性を有するヒト抗体等）を内包する。キットは典型的には、キットの内容物の用途を指示する説明書を伴うラベルを含む。用語「ラベル（ｌａｂｅｌ）」には、キット上に若しくはキットと共に供給される、又は他の方法でキットに付属している、いずれの記述、又は記録された資料が含まれる。

ＩＩ．抗腫瘍アンタゴニストの使用方法
本出願の抗腫瘍アンタゴニストは、例えば免疫応答の強化、及び癌、感染症、又は自己免疫疾患の治療を含む、多数の試験管内及び生体内利用法を有する。

本出願の抗腫瘍アンタゴニストを、培養中、試験管内、若しくは生体外の細胞に、又はヒト被験者、例えば生体内に投与して、多様な疾患における免疫を強化できる。従って、本明細書で提供されるのは、被験者における免疫応答を改変する方法であって、上記方法は、上記被験者に、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与することにより、上記被験者の免疫応答を強化する、刺激する、又は上方制御するステップを含む。好ましい被験者としては、免疫応答の強化が望まれるヒト患者が挙げられる。上記方法は特に、免疫応答（例えばＴ細胞仲介型免疫応答）の増強によって治療できる障害を有するヒト患者の治療に好適である。上記方法は特に、生体内の癌又は慢性感染の治療に公的である。例えば、抗原特異的免疫を強化するために、抗腫瘍アンタゴニストを、関心対象の抗原と共に投与してよく、又は上記抗原が、治療対象の被験者（例えば担腫瘍若しくは担ウイルス被験者）の体内に既に存在していてもよい。抗腫瘍アンタゴニストを別の作用剤と共に投与する場合、これら２つを別個に投与しても、同時に投与してもよい。

いくつかの実施形態では、上述の方法におけるチェックポイント調節因子アンタゴニストは、ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ、ＶＥＧＦＲ ＥＣＤ、又はこれら両方と組み合わされた、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦＲ抗体、又はこれらのいずれの断片である。

本明細書に記載の抗体の実施形態のいずれにおいて、抗体は好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体である。

また、サンプル中の標的分子の存在を検出及び／又は測定するための方法も、本出願の範囲に包含され、上記方法は、上記サンプル及び対照サンプルを、標的分子に特異的に結合するその本出願の抗体、抗体断片、又は二重特異性アンタゴニストと、上記アンタゴニストと上記標的分子との間での複合体の形成が可能な条件下で接触させるステップを含む。続いて複合体の形成が検出され、ここでサンプルと対照サンプルとの間での複合体形成の差は、サンプル中の標的分子の存在の指標となる。

本出願の抗腫瘍アンタゴニストの、Ｔ細胞応答、例えば抗原特異的Ｔ細胞応答の阻害又は同時阻害を遮断する能力を考えると、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の抗体を用いて抗原特異的Ｔ細胞応答、例えば抗腫瘍Ｔ細胞応答を刺激する、強化する、又は上方制御する、試験管内及び生体内方法である。特定の実施形態では、（膜ＣＤ３を発現する細胞との同時インキュベーションによって）ＣＤ３刺激も提供され、この刺激は、チェックポイント調節因子アンタゴニストによる治療と同時に、該治療の前に、又は該治療の後に提供できる。例えば本明細書で提供されるのは、抗原特異的Ｔ細胞応答を強化する方法であり、上記方法は、上記Ｔ細胞を本明細書に記載のチェックポイント調節因子アンタゴニスト、及び任意にＣＤ３と接触させて、例えばチェックポイント調節因子仲介型阻害効果を除去することによって、抗原特異的Ｔ細胞応答を強化するステップを含む。抗原特異的Ｔ細胞応答のいずれの好適なインジケータを用いて、抗原特異的Ｔ細胞応答を測定できる。このような好適なインジケータの非限定的な例としては、抗体の存在下でのＴ細胞増殖の増大、及び／又は抗体の存在下でのサイトカイン産生の増大が挙げられる。ある好ましい実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン‐２及び／又はインターフェロン‐γ産生が強化される。

本出願に更に包含されるのは、被験者の免疫応答（例えば抗原特異的Ｔ細胞応答）を強化する方法であって、上記方法は、本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを被験者に投与することによって、該被験者の免疫応答（例えば抗原特異的Ｔ細胞応答）を強化するステップによるものである。ある好ましい実施形態では、被験者は担腫瘍被験者であり、腫瘍に対する免疫応答が強化される。腫瘍は固形腫瘍であっても、液体腫瘍、例えば血液学的悪性腫瘍であってもよい。特定の実施形態では、腫瘍は免疫原性腫瘍である。他の実施形態では、腫瘍は非免疫原性である。特定の実施形態では、腫瘍はＰＤ‐Ｌ１陽性である。他の実施形態では、腫瘍はＰＤ‐Ｌ１陰性である。被験者は担ウイルス被験者であってもよくこの被験者の体内では、本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストの投与の結果として、ウイルスに対する免疫応答が強化される。

一実施形態では、被験者の体内での腫瘍の成長を阻害するための方法は、上記被験者に、本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを投与することによって、上記被験者の体内で腫瘍の成長を阻害するステップを含む。また、被験者の慢性ウイルス感染を治療する方法も提供され、上記方法は、上記被験者に、本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを投与することによって、上記被験者の体内で慢性ウイルス感染を治療するステップを含む。

また本明細書には、腫瘍、例えば癌性腫瘍を有する被験者の腫瘍微小環境から、Ｔ_ｒｅｇ細胞を枯渇させるための方法も包含され、上記方法は、上記被験者に、腫瘍微小環境中でのＴ_ｒｅｇ細胞の枯渇を刺激するＦｃを含む、治療有効量の、本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを投与するステップを含む。Ｆｃは例えば、エフェクタ機能又は強化されたエフェクタ機能を有する、例えば１つ以上の活性化Ｆｃ受容体に結合するか又はこのような結合が強化されている、Ｆｃであってよい。

ある好ましい実施形態では、Ｔ_ｒｅｇ枯渇は、腫瘍微小環境におけるＴ_ｅｆｆの大幅な枯渇又は阻害を伴わず、また腫瘍微小環境の外でのＴ_ｅｆｆ細胞及びＴ_ｒｅｇ細胞の大幅な枯渇又は阻害を伴わずに、発生する。特定の実施形態では、被験者は、例えば腫瘍微小環境中において、Ｔ_ｅｆｆ細胞に比べてＴ_ｒｅｇ細胞において高いレベルの１つ以上のチェックポイント調節因子を有する。特定の実施形態では、二重特異性アンタゴニストは、腫瘍中のＴ_ｒｅｇ、及び／又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）中のＴ_ｒｅｇを枯渇させることができる。例えばＣＴ２６腫瘍モデルでは、（エフェクタ機能を示す）マウスＩｇＧ２ａとしてフォーマットされた抗マウスＴＩＧＩＴ抗体は、Ｔ_ｒｅｇ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を部分的に枯渇させるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇させることが発見された。これに対応する、マウスＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａとしてフォーマットされたエフェクタ機能を有しない抗体又はアンタゴニストは、Ｔ細胞を枯渇させなかった。

特定の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、補助療法として被験者に投与される。本出願による二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを用いた癌患者の治療は、現在の標準的な治療と比較して長期間持続する反応、少なくとも１年、２年、３年、４年、５年、１０年、又はそれ以上の長期生存、少なくとも１年、２年、３年、４年、５年、若しくは１０年、又はそれ以上の無再発生存をもたらすことができる。特定の実施形態では、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを用いた癌患者の治療は、癌の再発を防止するか、又は癌の再発を例えば１年、２年、３年、４年、５年、１０年、若しくはそれ以上遅延させる。よって、これらのアンタゴニストを用いた治療は、一次治療又は二次治療として使用できる。

特定の好ましい実施形態では、被験者は、細胞増殖性疾患又は癌を有する。本明細書で提供されるのは、癌を有する被験者を治療するための方法であって、上記方法は、上記被験者に、本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを投与することによって、上記被験者を治療する、例えば癌性腫瘍の成長を阻害若しくは低減する、及び／又は癌を退縮させるステップを含む。本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、単独で使用して癌性腫瘍の成長を阻害できる。あるいは、これらの抗腫瘍アンタゴニストのうちのいずれを、別の作用剤、例えばこれ以降に記載される他の抗癌標的、免疫原性剤、標準的な癌治療、又は他の抗体と組み合わせて使用できる。

従って、本明細書で提供されるのは、例えば腫瘍細胞の成長を阻害することによって、被験者の体内の癌を治療する方法であり、上記方法は、上記被験者に、本明細書に記載の治療有効量の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを投与するステップを含む。好ましくは、抗体はヒト又はヒト化免疫グロブリン配列を含有する。

本発明の抗体を用いて成長を阻害できる癌としては、免疫療法に典型的な応答を示す癌が挙げられる。治療対象の癌の非限定的な例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、胃腸癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）（例えば淡明細胞癌）、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）（例えば腎細胞癌（ＲＣＣ））、前立腺癌（例えばホルモン不応性前立腺腺癌）、甲状腺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、膠芽腫（多形膠芽腫）、子宮頸癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、大腸癌、及び頭頸部癌（又は癌腫）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、胚細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫（例えば転移性悪性黒色腫、例えば皮膚又は眼内悪性黒色腫）、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門領域の癌、精巣癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、小児期の固形腫瘍、尿管の癌、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、中枢神経系原発リンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎軸腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮嚢癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発型癌、ウイルス関連癌（例えばヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連腫瘍）、並びに２つの主要な血球系統のいずれか、即ち（顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージ、及び肥満細胞を産生する）骨髄細胞株又は（Ｂ、Ｔ、ＮＫ、及び形質細胞を産生する）リンパ系細胞株に由来する血液悪性腫瘍、例えばあらゆるタイプの白血病、リンパ腫、及び骨髄腫、例えば急性、慢性、リンパ性及び／又は骨髄性白血病、例えば急性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、未分化ＡＭＬ（ＭＯ）、骨髄芽球性白血病（Ｍ１）、骨髄芽球性白血病（Ｍ２；細胞成熟を伴う）、前骨髄球性白血病（Ｍ３、又はＭ３多様体［Ｍ３Ｖ］）、骨髄単球性白血病（Ｍ４、又は好酸球増加症を伴うＭ４多様体［Ｍ４Ｅ］）、単球性白血病（Ｍ５）、赤白血病（Ｍ６）、巨核芽球性白血病（Ｍ７）、限局顆粒球性肉腫、及び緑色腫；リンパ腫、例えばホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＥＩＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、未分化（例えばＫｉ１＋）大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性；及びリンパ腫／白血病（Ｔ‐Ｌｂｌｙ／Ｔ‐ＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、臓器移植後リンパ増殖性疾患、真の組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）、リンパ系の造血器腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性組織球性リンパ腫（ＤＨＬ）、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＬＣ）（菌状息肉症又はセザリー症候群とも呼ばれる）、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）；骨髄腫、例えばＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌型骨髄腫、くすぶり型骨髄腫（無症候性骨髄腫とも呼ばれる）、孤立性形質細胞腫、及び多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞リンパ腫；骨髄系の造血器腫瘍、間葉系起源の腫瘍（線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む）；精上皮腫、奇形癌腫、中枢及び末梢神経の腫瘍（星状細胞腫、神経鞘腫を含む）；間葉系起源の腫瘍（線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む）；並びに他の腫瘍（黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、精上皮腫、甲状腺濾胞癌、及び奇形癌腫を含む）、リンパ系の造血器腫瘍、例えばＴ細胞及びＢ細胞腫瘍（限定するものではないが、小細胞及び大脳様細胞型のものを含むＴ前リンパ球性白血病（Ｔ‐ＰＬＬ）等のＴ細胞障害を含む）；好ましくはＴ細胞型の、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；ａ／ｄ Ｔ‐ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢性／成熟Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽球性サブタイプ）；血管中心性（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部の癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、直腸癌、甲状腺の癌；急性骨髄性リンパ腫、並びに以上の癌のいずれの組み合わせが挙げられる。本明細書に記載の方法は、転移性癌、難治性癌（例えば、例えば遮断ＣＴＬＡ‐４又はＰＤ‐１抗体を用いた過去の免疫療法に対して、抵抗性を有する癌）、及び再発癌の治療にも使用してよい。

本出願の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、単独で、別の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて、又は別の抗腫瘍アンタゴニストと同時に投与できる。あるいは、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストもまた、免疫原性剤、例えば癌性細胞、腫瘍ワクチン、精製腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、及び炭水化物分子を含む）、癌ワクチン戦略において免疫刺激性サイトカインをエンコードする遺伝子でトランスフェクトした細胞（Ｈｅ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７３：４９１９‐２８）、又は腫瘍溶解性ウイルスと、組み合わせて又は同時に投与できる。

腫瘍に対するワクチン接種のための多数の実験的戦略が考案されている。これらの戦略のうちの１つでは、ワクチンは、自家腫瘍又は同種異系腫瘍細胞を用いて調製される。これらの細胞ワクチンのいくつかは、腫瘍細胞がＧＭ‐ＣＳＦを発現するように形質導入される場合に、最も効果的であることが示されている。ＧＭ‐ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力な活性化因子であることが示されている（Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０： ３５３９‐４３）。前臨床モデルにおいて、癌ワクチンは、腫瘍内へのエフェクタＴ細胞浸潤を強化することが示されている。癌ワクチンの主要なタイプとしては、ペプチドワクチン、ベクターベースの抗原特異的ワクチン、全細胞ワクチン、及び樹状細胞ワクチンが挙げられる。全てのワクチンベースの療法は、単一又は複数の抗原性エピトープ又は抗原を、全細胞から患者に送達して、腫瘍特異的エフェクタＴ細胞を誘導するように設計されている。よって、ワクチンベースの療法は、腫瘍へのＴ細胞浸潤を誘発するための最も効率的な方法である可能性がある。

様々な腫瘍における遺伝子発現及び大規模遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義がもたらされた（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ Ａ （１９９９） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０： ２８１‐７）。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍中、及び腫瘍が発生する細胞中で発現される分化抗原であり、例えばメラニン細胞抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、及びＴｒｐ‐２である。更に重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主の体内に見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的となることを示すことができる。

チェックポイント調節因子経路、ＴＧＦ‐β経路、及び／又は血管新生経路の阻害を、腫瘍中で発現される一連の組換えタンパク質及び／又はペプチドと組み合わせて使用して、これらのタンパク質に対する免疫応答を生成できる。このようなタンパク質は、免疫系によって自己抗原とみなされる可能性があり、従って免疫系に対して耐性を有する。腫瘍抗原はタンパク質テロメラーゼを含むことができ、これは、染色体のテロメアの合成に必要であり、ヒトの癌の８５％超、及びごく限られた数の体細胞組織において発現される（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６： ２０１１‐２０１３）。腫瘍抗原は、タンパク質配列を変化させるか又は２つの無関係な配列の間で融合タンパク質（即ちフィラデルフィア染色体中のｂｃｒ‐ａｂｌ）を生成する体細胞変異によって癌細胞中で発現される「ネオ抗原」、あるいはＢ細胞腫瘍からのイディオタイプであってもよい。

腫瘍ワクチンの非限定的な例としては、転移性前立腺癌のためのＦＤＡ認可済み腫瘍ワクチンであるシプリューセル‐Ｔ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標））；顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）を発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞、例えば全細胞ＧＭ‐ＣＳＦ分泌性被照射同種異系膵臓癌ワクチン（ＧＶＡＸ； Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ）；乳癌抗原、ｎｅｕ、レグマイン、及びβ‐カテニンに由来する免疫原性ペプチドからなるマルチペプチドワクチン（これを抗ＰＤ‐１抗体と組み合わせて投与すると、担乳がんマウスの、ワクチンによって誘発される無進行生存が延長された（Ｋａｒｙａｍｐｕｄｉ Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７４：２９７４‐２９８５）；黒色腫抗原のペプチド、例えばｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ‐２、ＭＡＲＴＩ及び／又はチロシナーゼのペプチドが挙げられる。他の腫瘍ワクチンとしては、ヒトの癌に関与するウイルスからのタンパク質が挙げられ、上記ウイルスは例えば：ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（例えばＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）、Ｇａｒｄａｓｉｌ ９（登録商標）、及びＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）；Ｂ型肝炎ウイルス（例えばＥｎｇｅｒｉｘ‐Ｂ及びＲｅｃｏｍｂｉｖａｘ ＨＢ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；カポジ肉腫関連ヘルペス肉腫ウイルス（ＫＳＨＶ）である。ＴＩＧＩＴ阻害と組み合わせて使用できる別の形態の腫瘍特異的抗原は、腫瘍組織自体から単離された精製済み熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞由来のタンパク質の断片を含有し、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達において非常に効率的である。タリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔ‐ＶＥＣ、又はＩｍｌｙｇｉｃ（登録商標））は、手術で除去できない転移性黒色腫を有する一部の患者の治療のための、ＦＤＡ認可済みの腫瘍溶解性ウイルスである。

樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答のプライミングに使用できる、強力な抗原提示細胞である。ＤＣを生体外で生成して、様々なタンパク質及びペプチド抗原、並びに腫瘍細胞抽出物を担持させることができる（Ｎｅｓｔｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４： ３２８‐３３２）。また、ＤＣを、これらの腫瘍抗原を発現するように、遺伝的手段で形質導入することもできる。またＤＣは、免疫化を目的として、腫瘍細胞に直接融合されている（Ｋｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：３３２‐３３６）。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫化をチェックポイント調節因子遮断と効果的に組み合わせることにより、より強力な抗腫瘍応答を活性化する（引き出す）ことができる。

チェックポイント調節因子経路、ＴＧＦ‐β経路、及び／又は血管新生経路の阻害は、標準的な癌治療（例えば手術、放射線、及び化学療法）と組み合わせることもできる。特にチェックポイント調節因子阻害は、化学療法レジメンと効果的に組み合わせることができる。これらの例では、投与される化学療法試薬の用量を削減できる可能性がある（Ｍｏｋｙｒ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８： ５３０１‐５３０４）。このような組み合わせの例は、黒色腫の治療のための抗腫瘍アンタゴニストとダカルバジンとの組み合わせである。このような組み合わせの別の例は、黒色腫の治療のためのチェックポイント調節因子アンタゴニスト又は抗腫瘍アンタゴニストとインターロイキン‐２（ＩＬ‐２）との組み合わせである。例えば、チェックポイント調節因子阻害、ＴＧＦ‐β１／ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ阻害、及び／又は血管新生阻害と、化学療法とを組み合わせて使用することによって、大半の化学療法用化合物の細胞傷害作用と、それによる抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの上昇とにより、細胞死を促進できる。細胞死によるチェックポイント調節因子阻害、ＴＧＦ‐β１／ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ阻害、及び／又は血管新生阻害との相乗効果をもたらすことができる他の併用療法は、放射線、手術、及びホルモン抑制である。これらのプロトコルはそれぞれ、宿主の腫瘍抗原のソースを生成する。

本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、Ｆｃα又はＦｃγ受容体発現性エフェクタ細胞を腫瘍細胞に対して標的化するように構築してもよい（例えば米国特許第５，９２２，８４５号、及び米国特許第５，８３７，２４３号を参照）。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えばＨｅｒ‐２／ｎｅｕ）二重特異性抗体は、マクロファージを腫瘍の複数の部位に対して標的化するために使用されている。このタイプの標的化を、本実施形態に適合させることにより、腫瘍特異的応答をより効果的に活性化できる。これらの応答のＴ細胞アームは、本明細書に記載の１つ以上のチェックポイント調節因子アンタゴニストの阻害によって増強されることになる。あるいは、腫瘍抗原に結合する二重特異性抗体と、樹状細胞特異的細胞表面マーカーとを使用することによって、抗原をＤＣに直接送達できる。

腫瘍は、多様な機序によって宿主の免疫監視を回避する。これらの機序の多くは、腫瘍が発現する免疫抑制タンパク質の不活性化によって克服される可能性がある。これらには特に、ＴＧＦ‐β、ＩＬ‐１０、及びＦａｓリガンドが含まれる。これらの実体それぞれに対する抗体を、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用することにより、免疫抑制剤の効果を打ち消し、宿主による腫瘍免疫応答を促進できる。

宿主の免疫応答性を活性化する他の抗体を、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用できる。これらには、ＤＣ機能及び抗原提示を活性化する、樹状細胞の表面上の分子が含まれる。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性を効果的に代替でき（Ｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９３： ４７４‐４７８）、本明細書に記載の二重特異性アンタゴニストと組み合わせて使用できる。ＯＸ‐４０（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４： ２１６０‐２１６９）、ＣＤ１３７／４‐１ＢＢ（Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３： ６８２‐６８５ （１９９７）、及びＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ ３９７： ２６２‐２６６）といったＴ細胞共刺激分子に対する活性化抗体も、Ｔ細胞活性化のレベルの上昇を提供できる。更に、これ以降で更に説明されるように、他の免疫チェックポイント調節因子の阻害剤も、本明細書に記載の他の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用してよい。

骨髄移植は現在、造血器起源の多様な腫瘍の治療に使用されている。移植片対宿主病はこの治療の結果であるが、チェックポイント調節因子阻害を用いて、移植片対腫瘍応答を低減することにより、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の効力を増大させることができる。

特定の実施形態では、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストを、感染性疾患、特に慢性感染を有する被験者に投与してよい。この場合、癌への応用と同様に、抗体仲介型チェックポイント調節因子阻害を単独で、又はアジュバントとしてワクチンと組み合わせて使用して、病原体、毒素、及び自己抗原に対する免疫応答性を強化できる。この治療アプローチを適用できる例示的な病原体としては、限定するものではないが、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、及びＣ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、及び緑膿菌が挙げられる。チェックポイント調節因子阻害、ＴＧＦ‐β１／ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ阻害、及び／又は血管新生阻害は、感染の経過にわたって新規の又は変化した抗原を提示するＨＩＶ等の病原体による、確立された感染に対して、特に有用である。二重特異性抗腫瘍アンタゴニストの投与により、これらの抗原を外来性として認識させることで、適切なＴ細胞応答を誘発できる。

本明細書に記載の方法によって治療可能な感染症を引き起こす他の病原性ウイルスとしては、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、又はＣ）、ヘルペスウイルス感染症（例えばＶＺＶ、ＨＳＶ‐１、ＨＡＶ‐６、ＨＳＶ‐ＩＩ、及びＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、並びにアデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、おたふく風邪ウイルス、ロタウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、アルボウイルス性脳炎ウイルス、又はこれらの組み合わせによって引き起こされる感染症が挙げられる。

本明細書に記載の方法によって治療可能であり得る、例示的な病原性細菌又はそれらによって引き起こされる疾患としては、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ属、プロテウス属、セラチア属、シュードモナス属、レジオネラ菌、ジフテリア菌、サルモネラ菌、桿菌菌、コレラ菌、レプトスピラ症、破傷風、ボツリヌス中毒、炭疽、ペスト、及びライム病が挙げられる。

本明細書に記載の方法によって治療可能な感染症を引き起こす例示的な病原性真菌としては、カンジダ属（例えばカンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルーセイ、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・トロピカリス等）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス属（例えばアスペルギルス・フミガーツス、クロコウジカビ等）、ケカビの一種（例えばケカビ、ユミケカビ、クモノスカビ）、スポロスリックス・シェンキィ、ブラストミセス・デルマチチジス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、コクシジオイデス・イミチス、及びヒストプラズマ・カプスラーツムが挙げられる。

本明細書に記載の方法によって治療可能な感染症を引き起こす例示的な病原性寄生虫としては、赤痢アメーバ、大腸バランジウム、フォーラーネグレリア、アカントアメーバの一種、ザンビアジアルジア、クリプトスポリジウムの一種、ニューモシスチス・カリニ、三日熱マラリア原虫、バベシア・ミクロチ、ブルーストリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ドノバンリーシュマニア、トキソプラズマ・ゴンジ、及びニッポストロンギルス・ブラジリエンシスが挙げられる。

上述の方法の全てにおいて、チェックポイント調節因子阻害、ＴＧＦ‐β１／ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ阻害、及び／又は血管新生阻害を、サイトカイン治療（例えばインターフェロン、ＧＭ‐ＣＳＦ、Ｇ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐２）、又は２つの異なる結合特異性を用いる二重特異性抗体療法といった、他の形態の免疫療法と組み合わせることにより、腫瘍抗原の提示の強化を提供できる。

本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、これらの抗体のうちのいずれか１つ以上と、関心対象の抗原（例えばワクチン）との同時投与によって、抗原特異的免疫応答を強化するために使用できる。従って、本明細書で提供されるのは、被験者の体内での抗原に対する免疫応答を強化する方法であって、上記方法は、上記被験者に：（ｉ）上記抗原；及び（ｉｉ）二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを投与することによって、上記被験者の体内での上記抗原に対する免疫応答を強化するステップを含む。上記抗原は例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、又は病原体由来の抗原とすることができる。このような抗原の非限定的な例としては、上述のセクションに記載したもの、例えば上述の腫瘍抗原（若しくは腫瘍ワクチン）、又は上述のウイルス、細菌、若しくは他の病原体由来の抗原が挙げられる。

特定の実施形態では、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストが結合するエピトープを含むペプチド又は融合タンパク質を、１つ以上の抗腫瘍アンタゴニストの代わりに、又は１つ以上の抗腫瘍アンタゴニストに加えて、ワクチンとして使用してよい。

上述の抗体組成物（例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異性抗体又はアンタゴニスト、及び免疫複合体）を生体内及び試験管内で投与する好適な経路は、当該技術分野において公知であり、当業者が選択できる。例えば抗体組成物は、注射（例えば静脈内又は皮下）によって投与できる。使用される分子の好適な投薬量は、被験者の年齢及び体重、並びに抗体組成物の濃度及び／又は処方に左右される。

併用療法
別の態様では、本出願は、被験者の体内での抗原特異的Ｔ細胞応答を強化するための併用療法を提供する。一実施形態では、上記方法は、Ｔ細胞を、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストと、第２の抗体、抗体断片、アンタゴニスト、又は薬剤との組み合わせと接触させることによって、抗原特異的Ｔ細胞応答又はアポトーシス経路を強化するステップを含む。例えばいくつかの実施形態では、第１の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、ＰＤ‐１又はＰＤ‐Ｌ１等の第１のチェックポイント調節因子に特異的に結合し、第２の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、異なるチェックポイント調節因子又は異なるエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２の抗体又は抗体断片は、ＰＤ‐１及び／又はＰＤ‐Ｌ１由来の１つ以上の異なるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、又は１つ以上のＣＤＲを含む。

関連する態様では、それを必要とする被験者の腫瘍中の調節性Ｔ細胞を減少させる又は枯渇させる方法は、有効量の抗体又は抗体断片と、第２の抗体、抗体断片、アンタゴニスト、又は薬剤との組み合わせを投与することによって、上記被験者の体内の調節性Ｔ細胞の数を減少させるステップを含む。

いくつかの実施形態では、上記被験者は、本明細書に記載の細胞増殖性疾患又は癌を有する。

他の実施形態では、本明細書に記載の上記被験者は、慢性ウイルス感染、炎症性疾患、又は自己免疫疾患を有する。

Ｔ細胞に２つの別個のシグナルを提供することは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による休止Ｔ細胞リンパ球のリンパ球活性化に関する、広く受け入れられているモデルである。このモデルは更に、自己と非自己との識別、及び免疫寛容を提供する。一次シグナル、即ち抗原特異的シグナルは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）との関連で提示される外来抗原ペプチドの認識に続いて、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して伝達される。第２のシグナル、即ち共刺激シグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現される共刺激分子によって、Ｔ細胞に送達される。これによりＴ細胞が、クローン増殖、サイトカイン分泌、及びエフェクタ機能を促進するように誘導される。共刺激がない場合、Ｔ細胞は抗原刺激に対して不応性となる可能性があり、その結果、外来又は内因性抗原に対する寛容原性応答が生じる。

この２シグナルモデルでは、Ｔ細胞は、正の共刺激シグナル及び負の共阻害シグナルの両方を受け取る。このような正及び負のシグナルの調節は、免疫寛容を維持し、かつ自己免疫を防止しながら、宿主の防御免疫応答を最大化するために、重要である。負のシグナルは、Ｔ細胞寛容の誘導に必要と思われ、正のシグナルはＴ細胞活性化を促進する。共刺激シグナル及び共阻害シグナルの両方が、抗原に曝露されたＴ細胞に供給され、共刺激シグナルと共阻害シグナルとの間の相互作用は、免疫応答の大きさを制御するために不可欠である。更に、Ｔ細胞に供給されるシグナルは、感染又は免疫誘発が解消される、悪化する、又は持続するに従って変化し、これらの変化は、応答するＴ細胞に強力に影響を及ぼして、免疫応答を再形成する。

共刺激の機序は治療上の関心の対象となる。というのは、共刺激シグナルの操作は、細胞ベースの免疫応答を強化する又は終了させるための手段を提供することが示されているためである。近年、Ｔ細胞の機能不全又はエネルギが、免疫チェックポイント調節因子、例えばプログラム死１ポリペプチド（ＰＤ‐１）並びにそのリガンドＰＤ‐Ｌ１及びＰＤ‐Ｌ２の、誘導された持続的な発現と、同時に発生し得る可能性があることが発見された。ＰＤ‐Ｌ１は多くの癌で過剰発現し、多くの場合、予後不良と関連している（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｒ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６，６６（７）：３３８１）。更に、腫瘍浸潤性Ｔリンパ球の大半は、主にＰＤ‐１を発現するが、これは、腫瘍応答性Ｔ細胞上のＰＤ‐１の上方制御が抗腫瘍免疫応答の障害に寄与する可能性があることを示す、正常組織中のＴリンパ球及び末梢血Ｔリンパ球とは対照的である（Ｂｌｏｏｄ ２００９ １１４（８）：１５３７）。これは、ＰＤ‐１発現性Ｔ細胞と相互作用するＰＤ‐Ｌ１発現性腫瘍細胞が仲介するＰＤ‐Ｌ１シグナル伝達を利用して、Ｔ細胞活性化の減衰及び免疫監視の回避をもたらすことによるものである可能性がある。ＰＤ‐Ｌ１／ＰＤ‐１相互作用の阻害は、ＣＤ８＋Ｔ細胞仲介型の癌細胞及び腫瘍の殺滅を含む、Ｔ細胞免疫の強化のための手段を提供する。同様のＴ細胞免疫の強化は、ＰＤ‐Ｌ１の、結合パートナーＢ７‐１への結合を阻害することによって観察されている。従って、ＰＤ‐１及び他の免疫チェックポイント調節因子の治療的標的化は、極めて高い関心が持たれている分野である。

ＴＧＦ‐β１シグナル伝達、チェックポイント調節因子シグナル伝達、及び／又は血管新生シグナル伝達の阻害を、腫瘍細胞において調節解除された他のシグナル伝達経路と組み合わせることにより、治療の効力を強化する手段を提供できる。近年、受容体及びそのリガンドの形態の多数の免疫チェックポイント調節因子が同定されている。共刺激又は共阻害受容体に結合する膜結合型リガンドの１つの重要なファミリーは、Ｂ７ファミリーであり、これは：ＣＴＬＡ‐４並びにそのリガンドであるＢ７‐１及びＢ７‐２；ＰＤ‐１並びにそのリガンドであるＰＤ‐Ｌ１（Ｂ７‐Ｈ１）及びＰＤ‐Ｌ２（Ｂ７‐ＤＣ）；Ｂ７‐Ｈ２（ＩＣＯＳ‐Ｌ）；Ｂ７‐Ｈ３；Ｂ７‐Ｈ４；Ｂ７‐Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）；並びにＢ７‐Ｈ６を含む。更なる免疫チェックポイントアンタゴニストとしては、限定するものではないが：ＴＩＭ‐３及びそのリガンドであるガレクチン‐９；ＬＡＧ‐３、並びに肝類洞内皮細胞レクチン（ＬＳＥＣｔｉｎ）及びガレクチン‐３を含むそのリガンド；ＣＤ１２２及びそのＣＤ１２２Ｒリガンド；ＣＤ７０；Ｂ７Ｈ３；Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）；並びにＶＩＳＴＡが挙げられる（Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， （６）， Ａｒｔｉｃｌｅ ４１８）。更に、多数のチェックポイント調節因子アンタゴニストが同定されており、様々な臨床及び前臨床モデルで試験され、並びに／又はＦＤＡによって認可されている（Ｋｙｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８８：３６８‐３７６ （２０１４））。免疫チェックポイント遮断薬としても知られる阻害性受容体遮断薬のコンセプトは、転移性黒色腫に関するＰＤ‐１阻害剤ニボルマブ及びペンブロリズマブ並びに抗ＣＴＬＡ‐４抗体イピリムマブのＦＤＡ認可によって検証されている。

免疫チェックポイントアンタゴニストは、免疫チェックポイント調節因子の活性を調節する、又は上記活性に干渉し、チェックポイント調節因子又はそのリガンドへの結合の結果として、チェックポイント調節因子受容体を通したシグナル伝達を遮断又は阻害する。このシグナル伝達を阻害することにより、免疫抑制を反転させることができ、従って、癌細胞に対するＴ細胞免疫を再確立又は強化できる。対照的に、（例えば共刺激分子の）免疫チェックポイントアゴニストは、免疫チェックポイント調節因子の活性を刺激し、チェックポイント調節因子又はそのリガンドへの結合の結果として、チェックポイント調節因子受容体を通したシグナル伝達を刺激する。このシグナル伝達を刺激することによって、癌細胞に対するＴ細胞免疫を再確立又は強化できる。

従って一実施形態では、被験者の体内での免疫応答を刺激する方法は、上記被験者に、本明細書に記載の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを、本明細書中で上述されている別の免疫チェックポイント調節因子と組み合わせて投与することによって、上記被験者の体内において免疫応答を刺激して、例えば腫瘍成長を阻害するか、又は抗ウイルス応答を刺激する、ステップを含む。特に、１つ以上の上記二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、別個のアンタゴニストとして、又は複数の産物に対する結合特異性を有する多重特異性アンタゴニストとして、投与できる。

いくつかの実施形態では、本出願の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、免疫応答を刺激するために：（ｉ）Ｔ細胞活性化を阻害するＩｇＳＦファミリータンパク質、Ｂ７ファミリー、若しくはＴＮＦファミリーのアンタゴニスト、若しくはＴ細胞の活性化を阻害するサイトカイン（例えばＩＬ‐６、ＩＬ‐１０、ＴＧＦ‐β、ＶＥＧＦ、若しくは他の免疫抑制性サイトカイン）のアンタゴニスト；及び／又は（ｉｉ）免疫応答を刺激するために、Ｔ細胞活性化を刺激するための、ＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリー、若しくはＴＮＦファミリー、若しくはサイトカインの刺激性受容体のアゴニストと組み合わせることができる。他の実施形態では、被験者には、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを抗ＣＴＬＡ‐４抗体又はＣＴＬＡ‐４アンタゴニストと組み合わせて投与する。本出願に従って使用するための例示的な抗ＣＴＬＡ‐４抗体としては、イピリムマブ、トレビリズマブ、及びトレメリムマブが挙げられる。

いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子のリガンドの高発現を示す癌を有する被験者に、異なるチェックポイント調節因子アンタゴニストを標的とする二重特異性アンタゴニストを投与してよい。例えば一実施形態では、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）及び／若しくはネクチン‐２（ＣＤ１１２）の高発現、並びに／又はＰＤ‐Ｌ１の低発現を示す癌を有する被験者は、本出願の抗ＴＩＧＩＴ若しくは抗ＬＡＧ‐３抗体、若しくはその断片のみを用いた単剤療法、又はＰＤ‐１アンタゴニスト若しくは他の免疫チェックポイント調節因子を用いた併用療法のために選択できる。本出願の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、免疫応答及び／又はアポトーシスを刺激するのに有効な１つ以上の量の、いずれの１つ以上の更なる作用剤、例えば抗体、アンタゴニスト、又は薬剤と、同時投与してよく、これにより、被験者の体内での免疫応答及び／又はアポトーシスが更に強化される、刺激される、又は上方制御される。

いくつかの実施形態では、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、異なる抗腫瘍アンタゴニストを用いた治療の後に投与される。例えばいくつかの実施形態では、本出願の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、単一特異性抗腫瘍アンタゴニストを用いた治療が失敗した後；治療応答が不完全となった後；又は腫瘍の再発若しくは再燃があった（例えば「ＰＤ‐１失敗」となった）後でのみ、投与され得る。いくつかの実施形態では、このような失敗を示す癌を、例えばＰＶＲ及び／又はネクチン‐２の発現に関してスクリーニングし、高レベルの発現を有するものだけを、本出願の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストを用いて治療する。

特定の実施形態では、抗腫瘍アンタゴニストは、免疫チェックポイント調節因子のドミナントネガティブタンパク質ドメインを含む。特定の実施形態では、ドミナントネガティブタンパク質は、ＰＤ‐Ｌ１、ＰＤ‐Ｌ２、ＰＤ‐１、Ｂ７‐１、Ｂ７‐２、Ｂ７Ｈ３、ＣＴＬＡ‐４、ＬＡＧ‐３、ＴＩＭ‐３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ７０、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーに由来する、細胞外ドメインを含む。特定の実施形態では、これらの細胞外ドメインは、本明細書に記載の抗体の免疫グロブリン定常領域又はＦｃ受容体に融合する。このような変異体は、内因性受容体に結合でき、これにより、シグナル伝達が不足した複合体が形成される。特定の実施形態では、細胞外ドメインは、免疫グロブリン定常領域若しくはＦｃ断片、又はオリゴマータンパク質複合体中のモノマーに融合する。

特定の実施形態では、ドミナントネガティブＰＤ‐Ｌ１アンタゴニストは、ＰＤ‐Ｌ１、ＰＤ‐Ｌ２、又はＰＤ‐１の細胞外ドメインを含む。別の実施形態では、ドミナントネガティブＰＤ‐１アンタゴニストが採用され、これは変異を有するため、ＰＤ‐Ｌ１には結合できない。例示的なドミナントネガティブタンパク質はＡＭＰ‐２２４（Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ及びＡｍｐｌｉｍｍｕｎｅが共同開発）であり、これは、ＰＤ‐Ｌ２の細胞外ドメイン及びヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む組換え融合タンパク質である。

例示的な免疫チェックポイント調節因子アゴニストとしては、限定するものではないが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバー、例えばＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及び４‐１ＢＢ（ＣＤ１３７）、並びにこれらのリガンド、又はＣＤ２８及びＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）を含むＢ７‐ＣＤ２８スーパーファミリーのメンバーが挙げられる。更なるチェックポイント調節因子アゴニストとしては、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ‐１、ＬＦＡ‐１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７‐Ｈ３、ＣＤ８３リガンドが挙げられる。免疫チェックポイントアゴニストとしては、１つ以上の共刺激ドメインを含む抗体又は可溶性融合タンパク質アゴニストが挙げられる。アゴニスト抗体としては、限定するものではないが：抗ＣＤ４０ ｍＡｂ、例えばＣＰ‐８７０、８９３、ルカツムマブ、及びダセツズマブ；抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ、例えばＢＭＳ‐６６３５１３ウレルマブ、及びＰＦ‐０５０８２５６６；抗ＯＸ４０ ｍＡｂ；抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ、例えばＴＲＸ５１８；抗ＣＤ２７ ｍＡｂ、例えばＣＤＸ‐１１２７；並びに抗ＩＣＯＳ ｍＡｂが挙げられる。

例示的なＧＩＴＲアゴニストとしては例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質及び抗ＧＩＴＲ抗体（例えば２価抗ＧＩＴＲ抗体）、例えば米国特許第６，１１１，０９０号、及び米国特許第８，５８６，０２３号；欧州特許第０９０５０５Ｂ１号、国際公開特許第２０１０／００３１１８号、及び国際公開特許第２０１１／０９０７５４号に記載されているＧＩＴＲ融合タンパク質が挙げられる。抗ＧＩＴＲ抗体は例えば、米国特許第７，０２５，９６２号、米国特許第７，６１８，６３２号、米国特許第７，８１２，１３５号、米国特許第８，３８８，９６７号、及び米国特許第８，５９１，８８６号；欧州特許第１９４７１８３Ｂ１号、及び欧州特許第１８６６３３９号；国際公開特許第２０１１／０２８６８３号、国際公開特許第２０１３／０３９９５４号、国際公開特許第２００５／００７１９０号、国際公開特許第２００７／１３３８２２号、国際公開特許第２００５／０５５８０８号、国際公開特許第９９／４０１９６号、国際公開特許第２００１／０３７２０号、国際公開特許第９９／２０７５８号、国際公開特許第２００６／０８３２８９号、国際公開特許第２００５／１１５４５１号、国際公開特許第２０１１／０５１７２６号に記載されている。例示的な抗ＧＩＴＲ抗体は、ＴＲＸ５１８である。

共刺激又は共阻害性受容体に結合する別の膜結合型リガンドのファミリーは、コグネイトＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに結合する分子のＴＮＦファミリーであり、これは、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌ、ＯＸ‐４０、ＯＸ‐４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４‐１ＢＢＬ、ＣＤ１３７／４‐１ＢＢ、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２‐Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＥＤＡ１、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンフォトキシンα／ＴＮＦ γ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンフォトキシンα１（３２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、ＮＧＦＲ（例えばＴａｎｓｅｙ， Ｍ．Ｇ． ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ， １４（２３‐２４）：１０８２‐１０８８を参照）を含む。

免疫チェックポイントアゴニスト、又は共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な、抗原受容体以外の細胞表面分子又はそのリガンドを含み、限定するものではないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ‐１、ＬＦＡ‐１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４‐１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７‐Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ‐１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ‐６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ‐１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ‐１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ‐Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ‐３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ‐７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含む。

一態様では、Ｔ細胞応答は、本発明の抗ＰＤ‐１、又は抗ＰＤ‐Ｌ１ ｍＡｂと、（ｉ）Ｔ細胞活性化を阻害するタンパク質のアンタゴニスト（例えば免疫チェックポイント阻害剤）、例えばＣＴＬＡ‐４、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＰＤ‐Ｌ２、ＬＡＧ‐３、ＴＩＭ‐３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ‐１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン‐１、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ‐１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ‐１、ＣＤ９６、及びＴＩＭ‐４、並びに（ｉｉ）Ｔ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニスト、例えばＢ７‐１、Ｂ７‐２、ＣＤ２８、４‐１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４‐１ＢＢＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ‐Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３、及びＣＤ２８Ｈのうちの１つ以上との組み合わせによって、刺激できる。

上述のタンパク質のうちの１つを調節する例示的な作用剤を、癌治療のために本出願の抗ＰＤ‐１抗体又は抗ＰＤ‐Ｌ１抗体と組み合わせることができ、上記作用剤としては例えば、（ＣＴＬＡ‐４に対する）ＹＥＲＶＯＹ（商標）／イピリムマブ又はトレメリムマブ、（Ｂ７．１に対する）ガリキシマブ、（ＰＤ‐１に対する）ＯＰＤＩＶＯ（商標）／ニボルマブ／ＢＭＳ‐９３６５５８、（ＰＤ‐１に対する）ピジリズマブ／ＣＴ‐０１１、（ＰＤ‐１に対する）ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）／ペンブロリズマブ／ＭＫ‐３４７５、（Ｂ７‐ＤＣ／ＰＤ‐Ｌ２に対する）ＡＭＰ２２４、（Ｂ７‐Ｈ１に対する）ＢＭＳ‐９３６５５９、（Ｂ７‐Ｈ１に対する）ＭＰＤＬ３２８０Ａ、（ＩＣＯＳに対する）ＭＥＤＩ‐５７０、（Ｂ７Ｈ２に対する）ＡＭＧ５５７、（Ｂ７Ｈ３に対する）ＭＧＡ２７１、（ＬＡＧ‐３に対する）ＩＭＰ３２１、（ＣＤ１３７／４‐１ＢＢに対する）ウレルマブマブ／ＢＭＳ‐６６３５１３及びＰＦ‐０５０８２５６６、（ＣＤ２７に対する）ＣＤＸ‐１１２７、（ＯＸ４０に対する）ＭＥＤＩ‐６３８３及びＭＥＤＩ‐６４６９、（ＯＸ４０Ｌに対する）ＲＧ‐７８８８、（ＴＡＣＩに対する）アタシセプト、（ＣＤ４０に対する）ＣＰ‐８７０８９３、（ＣＤ４０に対する）ルカツムマブ、（ＣＤ４０に対する）ダセツズマブ、（ＣＤ３に対する）ムロモナブ‐ＣＤ３が挙げられる。

癌の治療のために本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせることができる他の分子としては、ＮＫ細胞の阻害性受容体のアンタゴニスト、又はＮＫ細胞の活性化受容体のアゴニストが挙げられる。例えば、アンタゴニスト抗ＰＤ‐１及び／又は抗ＰＤ‐Ｌ１抗体を、ＫＩＲのアンタゴニスト（例えばリリルマブ）、ＲＧ７１５５等のＣＳＦ‐１Ｒアンタゴニストと組み合わせることができる。

腫瘍は、多様な機序によって宿主の免疫監視を回避する。これらの機序の多くは、腫瘍が発現する免疫抑制タンパク質の不活性化によって克服される可能性がある。これらには特に、ＴＧＦ‐β、ＩＬ‐１０、及びＦａｓリガンドが含まれる。これらの実体それぞれに対する抗体を、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用することにより、免疫抑制剤の効果を打ち消し、宿主による腫瘍免疫応答を促進できる。

宿主の免疫応答性を活性化する他の抗体を、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用できる。これらには、ＤＣ機能及び抗原提示を活性化する、樹状細胞の表面上の分子が含まれる。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性を効果的に代替でき、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用できる。ＯＸ‐４０、ＣＤ１３７／４‐１ＢＢ、及びＩＣＯＳといったＴ細胞共刺激分子に対する活性化抗体も、Ｔ細胞活性化のレベルの上昇を提供できる。

特定の実施形態では、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストは、１つ以上の他の治療剤、例えば抗癌剤、放射性毒性剤、又は免疫抑制剤と同時投与できる。このような同時投与により、薬剤に対する耐性の発生、腫瘍細胞のアンタゴニストに対する反応性を低下させる抗原性の変化、及び（１つ以上の薬剤を低用量で投与することによる）毒性による問題を解決できる。

本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストは、（免疫複合体として）作用剤に結合でき、又は作用剤とは別個に投与できる。後者の場合（別個に投与する場合）、抗体は、作用剤の前、後、若しくは作用剤と同時に投与でき、又は他の公知の療法、例えば抗癌療法、例えば放射線と同時投与できる。本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストは、１つ以上の抗癌剤と同時投与してよく、これにより、異なる機序で相乗的に作用する２つの抗癌剤を提供することで、ヒト癌細胞において細胞傷害効果が得られる。

本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストは、抗癌剤、例えば：アルキル化剤；アントラサイクリン抗生物質；代謝拮抗剤；解毒剤；インターフェロン；ポリクローナル若しくはモノクローナル抗体；ＥＧＦＲ阻害剤；ＨＥＲ２阻害剤；ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤；ホルモン；有糸分裂阻害剤；ホスファチジルイノシトール‐３‐キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤；Ａｋｔ阻害剤；哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤；プロテアソーム阻害剤；ポリ（ＡＤＰ‐リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤；Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路阻害剤；中心体クラスター分離剤；マルチキナーゼ阻害剤；セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤；チロシンキナーゼ阻害剤；ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害剤；タキサン若しくはタキサン誘導体、アロマターゼ阻害剤、アントラサイクリン、微小管標的化剤、トポイソメラーゼ毒型薬剤、分子標的若しくは酵素（例えばキナーゼ若しくはタンパク質メチルトランスフェラーゼ）の阻害剤、シチジン類似体、又はこれらの組み合わせと組み合わせることができる。

例示的なアルキル化剤としては、限定するものではないが：シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ；Ｎｅｏｓａｒ）；クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ）；メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ）；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ）；ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ）；ロムスチン（ＣｅｅＮＵ）；ダカルバジン（ＤＴＩＣ‐Ｄｏｍｅ）；オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ）；カルムスチン（Ｇｌｉａｄｅｌ）；イホスファミド（Ｉｆｅｘ）；メクロレタミン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ）；ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ）；カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）；シスプラチン（ＣＤＤＰ；Ｐｌａｔｉｎｏｌ）；テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ）；チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ）；ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ）；又はストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ）が挙げられる。

例示的なアントラサイクリン抗生物質としては、限定するものではないが：ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）；ドキソルビシンリポソーム（Ｄｏｘｉｌ）；ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ）；ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）；ダウノルビシンリポソーム（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ）；ダクチノマイシン（Ｃｏｓｍｅｇｅｎ）；エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ）；イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ）；プリカマイシン（Ｍｉｔｈｒａｃｉｎ）；マイトマイシン（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ）；ペントスタチン（Ｎｉｐｅｎｔ）；又はバルルビシン（Ｖａｌｓｔａｒ）が挙げられる。

例示的な代謝拮抗剤としては、限定するものではないが：フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ）；カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）；ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ）；メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ）；ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ）；フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ）；ネララビン（Ａｒｒａｎｏｎ）；クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ Ｎｏｖａｐｌｕｓ）；クロファラビン（Ｃｌｏｌａｒ）；シタラビン（Ｃｙｔｏｓａｒ‐Ｕ）；デシタビン（Ｄａｃｏｇｅｎ）；シタラビンリポソーム（ＤｅｐｏＣｙｔ）；ヒドロキシ尿素（Ｄｒｏｘｉａ）；プララトレキサート（Ｆｏｌｏｔｙｎ）；フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）；ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）；クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ）；フルダラビン（Ｏｆｏｒｔａ）；メトトレキサート（ＭＴＸ；Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ）；メトトレキサート（Ｔｒｅｘａｌｌ）；チオグアニン（Ｔａｂｌｏｉｄ）；ＴＳ‐１又はシタラビン（Ｔａｒａｂｉｎｅ ＰＦＳ）が挙げられる。

例示的な解毒剤としては、限定するものではないが、アミホスチン（Ｅｔｈｙｏｌ）又はメスナ（Ｍｅｓｎｅｘ）が挙げられる。

例示的なインターフェロンとしては、限定するものではないが、インターフェロンアルファ‐２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ）又はインターフェロンアルファ‐２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ‐Ａ）が挙げられる。

例示的なポリクローナル又はモノクローナル抗体としては、限定するものではないが：トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）；オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ）；ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）；リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）；セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）；パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）；トシツモマブ／ヨウ素１３１トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ）；アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）；イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ；Ｉｎ‐１１１；Ｙ‐９０ Ｚｅｖａｌｉｎ）；ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）；エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ）；又はデノスマブが挙げられる。

例示的なＥＧＦＲ阻害剤としては、限定するものではないが：ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）；セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）；エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）；パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）；ＰＫＩ‐１６６；カネルチニブ（ＣＩ‐１０３３）；マツズマブ（Ｅｍｄ７２００）；又はＥＫＢ‐５６９が挙げられる。

例示的なＨＥＲ２阻害剤としては、限定するものではないが、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）；又はＡＣ‐４８０が挙げられる。

例示的なヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としては、限定するものではないが、ボリノスタット（Ｚｏｌｉｎｚａ）、バルプロ酸、ロミデプシン、エンチノスタット、アベキシノスタット、ギビノスタット、及びモセチノスタットが挙げられる。

例示的なホルモンとしては、限定するものではないが：タモキシフェン（Ｓｏｌｔａｍｏｘ；Ｎｏｌｖａｄｅｘ）；ラロキシフェン（Ｅｖｉｓｔａ）；メゲストロール（Ｍｅｇａｃｅ）；リュープロリド（Ｌｕｐｒｏｎ；Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ；Ｅｌｉｇａｒｄ；Ｖｉａｄｕｒ）；フルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ）；レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ）；トリプトレリン（Ｔｒｅｌｓｔａｒ ＬＡ；Ｔｒｅｌｓｔａｒ Ｄｅｐｏｔ）；エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）；ゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ）；ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ）；アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）；フルオキシメステロン（Ａｎｄｒｏｘｙ；Ｈａｌｏｔｅｓｔｉｎ）；メドロキシプロゲステロン（Ｐｒｏｖｅｒａ；Ｄｅｐｏ‐Ｐｒｏｖｅｒａ）；エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ）；フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ）；トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）；デガレリックス（Ｆｉｒｍａｇｏｎ）；ニルタミド（Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ）；アバレリクス（Ｐｌｅｎａｘｉｓ）；又はテストラクトン（Ｔｅｓｌａｃ）が挙げられる。

例示的な有糸分裂阻害剤としては、限定するものではないが：パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ；Ｏｎｘｏｌ；Ａｂｒａｘａｎｅ）；ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）；ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ；Ｖｉｎｃａｓａｒ ＰＦＳ）；ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ）；エトポシド（Ｔｏｐｏｓａｒ；Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ；ＶｅＰｅｓｉｄ）；テニポシド（Ｖｕｍｏｎ）；イクサべピロン（Ｉｘｅｍｐｒａ）；ノコダゾール；エポチロン；ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；カンプトテシン（ＣＰＴ）；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）；トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）；アムサクリン；又はラメラリンＤ（ＬＡＭ‐Ｄ）が挙げられる。

例示的なホスファチジルイノシトール‐３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤としては、ウォルトマンニン（ＰＩ３Ｋの非可逆的阻害剤）、デメトキシビリジン（ウォルトマンニンの誘導体）、ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋの可逆的阻害剤）；ＢＫＭ１２０（ブパリシブ）；イデラリシブ（ＰＩ３Ｋデルタ阻害剤）；デュベリシブ（ＩＰＩ‐１４５（ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマの阻害剤））；アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）（アルファ特異性ＰＩ３Ｋ阻害剤）；ＴＧＲ１２０２（かつてはＲＰ５２６４として公知）（経口ＰＩ３Ｋデルタ阻害剤）；並びにコパンリシブ（ＢＡＹ８０‐６９４６）（主にＰＩ３Ｋα、δアイソフォームの阻害剤）が挙げられる。

例示的なＡｋｔ阻害剤としては、限定するものではないが、ミルテフォシン、ＡＺＤ５３６３、ＧＤＣ‐００６８、ＭＫ２２０６、ペリフォシン、ＲＸ‐０２０１、ＰＢＩ‐０５２０４、ＧＳＫ２１４１７９５、及びＳＲ１３６６８が挙げられる。

例示的なＭＴＯＲ阻害剤としては、限定するものではないが：エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ）又はテムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）；シロリムス（ｒａｐａｍｕｎｅ）；リダフォロリムス又はデフォロリムス（ＡＰ２３５７３）、ＡＺＤ８０５５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＯＳＩ‐０２７（ＯＳＩ）、ＩＮＫ‐１２８、ＢＥＺ２３５、ＰＩ‐１０３、Ｔｏｒｉｎ１、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、Ｋｕ‐００６３７９４、ＷＡＹ‐６００、ＷＹＥ‐６８７、ＷＹＥ‐３５４、及びＣＣ‐２２３が挙げられる。

例示的なプロテアソーム阻害剤としては、限定するものではないが、ボルテゾミブ（ＰＳ‐３４１）、イキサゾミブ（ＭＬＮ２２３８）、ＭＬＮ９７０８、デランゾミブ（ＣＥＰ‐１８７７０）、カルフィルゾミブ（ＰＲ‐１７１）、ＹＵ１０１、オプロゾミブ（ＯＮＸ‐０９１２）、マリゾミブ（ＮＰＩ‐００５２）、及びジスフィラムが挙げられる。

例示的なＰＡＲＰ阻害剤としては、限定するものではないが、オラパリブ、イニパリブ、ベラパリブ、ＢＭＮ‐６７３、ＢＳＩ‐２０１、ＡＧ０１４６９９、ＡＢＴ‐８８８、ＧＰＩ２１０１６、ＭＫ４８２７、ＩＮＯ‐１００１、ＣＥＰ‐９７２２、ＰＪ‐３４、Ｔｉｑ‐Ａ、Ｐｈｅｎ、ＰＦ‐０１３６７３３８、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

例示的なＲａｓ／ＭＡＰＫ経路阻害剤としては、限定するものではないが、トラメチニブ、セルメチニブ、コビメチニブ、ＣＩ‐１０４０、ＰＤ０３２５９０１、ＡＳ７０３０２６、ＲＯ４９８７６５５、ＲＯ５０６８７６０、ＡＺＤ６２４４、ＧＳＫ１１２０２１２、ＴＡＫ‐７３３、Ｕ０１２６、ＭＥＫ１６２、及びＧＤＣ‐０９７３が挙げられる。

例示的な中心体クラスター分離剤としては、限定するものではないが：グリセオフルビン；ノスカピン、ノスカピン誘導体、例えば臭素化ノスカピン（例えば９‐ブロモノスカピン）、還元型ブロモノスカピン（ＲＢＮ）、Ｎ‐（３‐ブロモベンジル）ノスカピン、アミノノスカピン、及びこれらの水溶性誘導体；ＣＷ０６９；フェナントリジン由来ポリ（ＡＤＰ‐リボース）ポリメラーゼ阻害剤、ＰＪ‐３４；Ｎ２‐（３‐ピリジルメチル）‐５‐ニトロ‐２‐フラミド、Ｎ２‐（２‐チエニルメチル）‐５‐ニトロ‐２‐フラミド、並びにＮ２‐ベンジル‐５‐ニトロ‐２‐フラミドが挙げられる。

例示的なマルチキナーゼ阻害剤としては、限定するものではないが：レゴラフェニブ；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）；スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）；ＢＩＢＷ２９９２；Ｅ７０８０；Ｚｄ６４７４；ＰＫＣ‐４１２；モテサニブ；又はＡＰ２４５３４が挙げられる。

例示的なセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤としては、限定するものではないが：ルボキシスタウリン；塩酸エリル／イースジル；フラボピリドール；セリシクリブ（ＣＹＣ２０２；Ｒｏｓｃｏｖｉｔｒｉｎｅ）；ＳＮＳ‐０３２（ＢＭＳ‐３８７０３２）；Ｐｋｃ４１２；ブリオスタチン；ＫＡＩ‐９８０３；ＳＦ１１２６；ＶＸ‐６８０；Ａｚｄ１１５２；Ａｒｒｙ‐１４２８８６（ＡＺＤ‐６２４４）；ＳＣＩＯ‐４６９；ＧＷ６８１３２３；ＣＣ‐４０１；ＣＥＰ‐１３４７；又はＰＤ３３２９９１が挙げられる。

例示的なチロシンキナーゼ阻害剤としては、限定するものではないが：エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）；ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）；イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）；スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）；トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）；ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）；リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）；セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）；パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）；エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ）；アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）；ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）；テニシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）；パゾバニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ）；ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）；ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ）；バタラニブ（Ｐｔｋ７８７；ＺＫ２２２５８４）；ＣＥＰ‐７０１；ＳＵ５６１４；ＭＬＮ５１８；ＸＬ９９９；ＶＸ‐３２２；Ａｚｄ０５３０；ＢＭＳ‐３５４８２５；ＳＫＩ‐６０６ＣＰ‐６９０；ＡＧ‐４９０；ＷＨＩ‐Ｐ１５４；ＷＨＩ‐Ｐ１３１；ＡＣ‐２２０；又はＡＭＧ８８８が挙げられる。

例示的なＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害剤としては、限定するものではないが：ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）；スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）；ラニビズマブ；ペガプタニブ；又はバンデタニブが挙げられる。

例示的な微小管標的化剤としては、限定するものではないが、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン、及びナベルビンが挙げられる。

例示的なトポイソメラーゼ毒型薬剤としては、限定するものではないが、テニポシド、エトポシド、アドリアマイシン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エピルビシン、及びイダルビシンが挙げられる。

例示的なタキサン又はタキサン誘導体としては、限定するものではないが、パクリタキセル及びドセタキソールが挙げられる。

例示的な一般的化学療法剤、抗新生物剤、抗増殖剤としては、限定するものではないが、アルトレタミン（Ｈｅｘａｌｅｎ）；イソトレチノイン（Ａｃｃｕｔａｎｅ；Ａｍｎｅｓｔｅｅｍ；Ｃｌａｒａｖｉｓ；Ｓｏｔｒｅｔ）；トレチノイン（Ｖｅｓａｎｏｉｄ）；アザシチジン（Ｖｉｄａｚａ）；ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）；アスパラギナーゼ（Ｅｌｓｐａｒ）；レバミソール（Ｅｒｇａｍｉｓｏｌ）；ミトタン（Ｌｙｓｏｄｒｅｎ）；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ）；ペガスパルガーゼ（Ｏｎｃａｓｐａｒ）；デニロイキンディフチトクス（Ｏｎｔａｋ）；ポルフィマー（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ）；アルデスロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）；レナリドミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）；ベキサロテン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）；サリドマイド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）；テニシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）；三酸化ヒ素（Ｔｒｉｓｅｎｏｘ）；ベルテポルフィン（Ｖｉｓｕｄｙｎｅ）；ミモシン（Ｌｅｕｃｅｎｏｌ）；（１Ｍ テガフール‐０．４Ｍ ５‐クロロ‐２，４‐ジヒドロキシピリミジン‐１Ｍ カリウムオキソネート）、又はロバスタチンが挙げられる。

特定の実施形態では、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストは、治療用量未満で投与され、別の抗免疫チェックポイント調節因子抗体又はアンタゴニストは、治療用量未満で投与され、血管新生アンタゴニストは、治療用量未満で投与され、あるいは、アンタゴニストの組み合わせの中のいずれのアンタゴニストはそれぞれ、治療用量未満で投与される。

特定の実施形態では、ＴＧＦβ／ＴＧＦβ ＲＩＩ、チェックポイント調節因子、及び／又は血管新生経路の阻害を、従来の化学療法レジメンに従って、標準的な癌治療（例えば手術、放射線、及び化学療法）と組み合わせてよい。これらの例では、投与される化学療法試薬の用量を削減できる可能性がある。このような組み合わせの例は、黒色腫の治療のための、本出願のチェックポイント調節因子アンタゴニストと、ダカルバジンとの組み合わせである。このような組み合わせの別の例は、黒色腫の治療のための、本出願のチェックポイント調節因子アンタゴニストと、インターロイキン‐２（ＩＬ‐２）との組み合わせである。チェックポイント調節因子阻害と化学療法とを組み合わせて使用することで、アポトーシスを強化でき、また細胞傷害性免疫のための腫瘍抗原提示を増大させることができると考えられる。他の相乗的併用療法としては、放射線、手術、又はホルモン抑制と組み合わせて使用した場合の、細胞死によるチェックポイント調節因子阻害が挙げられる。これらのプロトコルはそれぞれ、宿主の腫瘍抗原のソースを生成する。

特定の実施形態では、本明細書に記載のチェックポイント調節因子アンタゴニストは、多重特異性アンタゴニスト中で、又はＦｃα若しくはＦｃγ受容体発現性エフェクタ細胞を腫瘍細胞に対して標的化する二重特異性抗体と組み合わせて、使用できる（例えば米国特許第５，９２２，８４５号、及び米国特許第５，８３７，２４３号を参照）。二重特異性抗体は、２つの別個の抗原を標的とするために使用できる。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えばＨｅｒ‐２／ｎｅｕ）二重特異性抗体は、マクロファージを複数の癌細胞又は腫瘍に対して標的化するために使用されている。この標的化により、腫瘍特異的応答をより効果的に活性化できる。これらの応答のＴ細胞アームは、チェックポイント調節因子阻害によって増強されることになる。あるいは、腫瘍抗原に結合する二重特異性抗体と、樹状細胞特異的細胞表面マーカーとを使用することによって、抗原をＤＣに直接送達できる。

ＩＩＩ．抗腫瘍アンタゴニストを発現するための核酸及び宿主
別の態様では、本出願は、重鎖及び軽鎖を含む本出願の抗腫瘍アンタゴニストをコードする核酸、並びにこのような核酸を含む発現ベクターを提供する。特に、核酸は、本明細書に記載の抗体、アンタゴニスト、又は断片のうちのいずれに対応する１つ以上のＨＣＤＲ、ＬＣＤＲ、ＨＣＶＲ及び／又はＬＣＶＲをコードする。

従って一態様では、本出願は、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニスト、抗体、又はその抗原結合部分のうちのいずれをコードする、１つ以上の核酸を提供する。

別の態様では、本出願は、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニスト、抗体、又はその抗原結合部分のうちのいずれをコードする１つ以上の核酸を含む、１つ以上の発現ベクターを提供する。

別の態様では、本出願は、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニスト、抗体、又はその抗原結合部分のうちのいずれをコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を提供する。

抗原結合部位をコードする１つ以上のＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、ハイブリドーマ細胞で産生されたモノクローナル抗体から単離して配列決定できる。あるいは、関心対象の免疫グロブリンからのアミノ酸配列を、タンパク質の直接の配列決定によって決定でき、好適なコードヌクレオチド配列は、普遍的なコドン表に従って設計できる。他の場合においては、定常領域、ヒンジ領域等を含む、抗原結合部位のヌクレオチド及びアミノ酸配列、又は他の免疫グロブリン配列は、当業者に公知の、公開されているソースから得ることができる。

一態様では、本出願の結合アンタゴニスト断片のうちのいずれは、例えば抗体可変ドメイン等に対応する、コドン最適化済み合成ＤＮＡ断片の使用を含んでよい。例えば、免疫グロブリンＶＨ、ＶＬ、ＨＣ、ＬＣ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及び／又はフレームワーク領域をコードするｃＤＮＡ配列を、様々なヒト、霊長類、又は哺乳類細胞、例えばＨＥＫ又はＣＨＯ細胞での発現のために、コドン最適化できる。本発明はまた、本明細書に記載の抗ＰＤ‐Ｌ１抗体分子の重鎖及び軽鎖可変領域、ＣＤＲ、超可変ループ、フレームワーク領域をコードする、一方又は両方の核酸配列を含む、核酸分子を特徴とする。

特定の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストをコードする発現ベクターを用いて、本開示の抗腫瘍アンタゴニストを、試験管内の培養細胞中で合成してよく、あるいは上記発現ベクターを患者に直接投与して、生体内又は生体外で抗腫瘍アンタゴニストを発現させてよい。本明細書中で使用される場合、「発現ベクター」は、本開示の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストに対応する１つ以上のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、ウイルス又は非ウイルスベクターであって、抗体の調製を目的として、又は治療剤としての直接投与のために、宿主細胞中で１つ以上の上記ポリヌクレオチドから発現させるのに好適な形態の、ウイルス又は非ウイルスベクターを指す。

ある核酸配列は、別の核酸配列とある機能的な関係に配置されたときに、上記別の核酸配列に対して「作動可能に結合」される。例えば、プレ配列又はシグナルペプチドのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、上記ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に結合され；プロモータ又はエンハンサは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、このコード配列に作動可能に結合され；あるいはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に結合されている。一般に、「作動可能に結合される」は、結合される複数のＤＮＡ配列が連続していること、及びシグナルペプチドの場合は連続しておりかつ読み取り段階にあることを意味する。しかしながら、エンハンサは必ずしも連続していなくてよい。結合は、便利な制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプタ又はリンカーを、従来の慣行に従って使用してよい。

抗腫瘍アンタゴニストを発現するための核酸配列は典型的には、アミノ末端シグナルペプチド配列を含み、これは成熟タンパク質から除去される。シグナルペプチド配列は発現のレベルに影響を及ぼし得るため、ポリヌクレオチドは、多様な異なるＮ末端シグナルペプチド配列のいずれをコードしてよい。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベル等といった因子に左右され得ることは、当業者には理解されるであろう。

上述の「調節性配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、１つ以上の宿主生物の体内における、作動可能に結合されたコード配列の発現に必要な、ＤＮＡ配列を指す。用語「調節性配列」は、プロモータ、エンハンサ、及び他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことを意図したものである。調節性配列は多数のタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、又は特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば組織特異性調節性配列）を含む。発現ベクターは一般に、転写終結のための配列を含有し、更に、ｍＲＮＡの安定性にプラスの影響を及ぼす１つ以上の要素を含有し得る。

発現ベクターは、抗腫瘍アンタゴニストの発現を指示するための、プロモータ及び／又はエンハンサを含む１つ以上の転写調節性要素を含有する。プロモータは、転写開始部位に関して比較的固定された位置から転写を開始させるように機能する、ＤＮＡ配列を含む。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的な相互作用に必要なコア要素を含有し、他の上流の要素及び応答要素と連動して作動し得る。

本明細書中で使用される場合、用語「プロモータ」は、その最も広い文脈において解釈されるべきであり、ゲノム遺伝子由来の転写調節性要素（ＴＲＥ）、又はそれ由来のキメラＴＲＥを含み、これは、正確な転写開始のためのＴＡＴＡボックス又はイニシエータ要素を含み、またこれは、発達刺激及び／又は外部刺激に応答してそれに作動可能に結合される遺伝子の活性化又は抑制を調節する更なるＴＲＥ（即ち上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサ、及びサイレンサ）、並びにトランス作用性調節性タンパク質又は核酸を、伴っても伴わなくてもよい。プロモータは、ゲノム断片を含有してよく、又は組み合わされる１つ以上のＴＲＥのキメラを含有してよい。

好ましいプロモータは、関心対象の標的細胞中での高レベルの発現を指示できるプロモータである。プロモータとしては、構成的プロモータ（例えばＨＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子‐１α（ＥＦ‐１α））、又は関心対象の特定の細胞タイプにおいて優先的な発現を示すプロモータが挙げられる。エンハンサは一般に、転写開始部位から離れて機能する、転写ユニットに対して５’又は３’となることができるＤＮＡ配列を指す。更にエンハンサは、イントロン内及びコード配列内に存在してよい。これらの長さは通常１０〜３００ｂｐであり、シスで機能する。エンハンサは、近隣のプロモータからの転写を増大させる、及び／又は調節するように機能する。好ましいエンハンサは、抗体産生細胞中での高レベルの発現を指示するものである。細胞又は組織特異的転写調節性要素（ＴＲＥ）は、発現ベクターに組み込むことによって、発現を所望の細胞タイプに制限できる。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモータ（Ｈ１又はＵ６）は、ｓｉＲＮＡが発現されるｓｈＲＮＡの発現に特に有用である。発現ベクターは、１つ以上の細胞タイプでの抗腫瘍アンタゴニストの発現を促進するように設計できる。

特定の実施形態では、１つ以上の発現ベクターを操作して、抗腫瘍アンタゴニストと、Ｔｉｅ２経路、ＶＥＧＦ経路、又は免疫チェックポイント調節因子を標的とする１つ以上のｓｉＲＮＡとの両方を発現させることができる。

ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導するように操作できる、二本鎖ＲＮＡである。合成によって産生されたｓｉＲＮＡは、酵素Ｄｉｃｅｒによって細胞内で通常処理されるタイプのｓｉＲＮＡを構造的に模倣する。発現ベクターから発現される場合、この発現ベクターは、処理される短い二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を、細胞内の標的化ｓｉＲＮＡへと転写するように、操作される。合成ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、公知のアルゴリズムを用いて設計でき、また従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザを用いて合成できる。

抗腫瘍アンタゴニストの個々の鎖を共発現させるために、好適なスプライスドナー及びスプライスアクセプタ配列を組み込んで、両方の産物を発現させることができる。あるいは、内部リボソーム結合配列（ＩＲＥＳ）又は２Ａペプチド配列を採用して、１つのプロモータから複数の産物を発現させることができる。ＩＲＥＳは、リボソームが結合できる構造を提供し、上記リボソームは必ずしもｍＲＮＡの５’末端にある必要はない。従って、ｍＲＮＡ内の第２の開始コドンにおいて翻訳を開始するようリボソームに指示でき、これにより、単一のｍＲＮＡから２つ以上のポリペプチドを産生できる。２Ａペプチドは、２Ａ部位の上流及び下流でペプチドの同時翻訳自己切断を仲介する短い配列を含有し、これにより、２つの異なるタンパク質を、１回の転写から同一のモル量で産生できる。ＣＨＹＳＥＬが２Ａペプチドの非限定的な例であり、これは、翻訳中の真核生物リボソームに、ｍＲＮＡから解離することなく合成されている成長中のポリペプチド鎖を放出させる。このリボソームは翻訳を続け、第２のポリペプチドを産生する。

発現ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを含んでよい。ウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス（ＨＩＶ‐１及びＨＩＶ‐２等のレンチウイルスを含む）、シンドビス及び他のＲＮＡウイルス、アルファウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポーバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス等に由来するものであってよい。非ウイルスベクターは単に、ウイルス由来成分（例えばカプシド及び／又はエンベロープ）でパッケージされていない「裸の」発現ベクターである。

特定のケースにおいて、これらのベクターは、これらのウイルスベクターが生来有する、又は操作によってウイルスベクターに与えられた、標的化特性を用いて、特定の疾患又は細胞集団を標的とするように操作できる。特定の細胞を、ポリヌクレオチドの送達及び発現のために「標的化」してよい。従って用語「標的化」はこの場合：カプシド、エンベロープタンパク質、特定の細胞への送達のための抗体の形態での、内因性又は異種結合剤の使用；発現を細胞の１つ以上の特定のサブセットに制限するための組織特異的調節性要素の使用；あるいはこれら両方に基づくものとすることができる。

いくつかの実施形態では、抗体鎖の発現は、組織特異的又は遍在性プロモータといった調節性要素の制御下にある。いくつかの実施形態では、ＣＭＶプロモータ、ＣＭＶ‐ニワトリベータアクチンハイブリッド（ＣＡＧ）プロモータといった遍在性プロモータ、又は特定の抗体の重鎖若しくは軽鎖若しくは一本鎖誘導体の発現を制御するための組織特異的若しくは腫瘍特異的プロモータを用いてよい。

非ウイルス発現ベクターは、裸のＤＮＡの直接注入によって、又は抗腫瘍アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドをリポソーム、微粒子、マイクロカプセル、ウイルス様粒子、若しくは赤血球ゴーストでカプセル化することによって、非ウイルス遺伝子の導入に利用できる。このような組成物は、標的指向性ドメインへの化学的コンジュゲーションによって更に結合されて、関心対象の所望の細胞への核酸の標的化された送達及び／又は移入を促進できる。更に、プラスミドベクターを、ポリリジン、プロタミン、及びアルブミンのような高分子ＤＮＡ結合カチオン等の合成遺伝子導入分子と共にインキュベートし、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトース、又はトランスフェリンといった細胞標的化リガンドに結合させることができる。

あるいは、裸のＤＮＡを採用してもよい。裸のＤＮＡの取り込み効率は、圧縮によって、又は生分解性ラテックスビーズの使用によって、改善できる。このような送達は、ビーズを処理して疎水性を向上させて、エンドソームの破壊及び細胞質へのＤＮＡの放出を促進することによって、更に改善できる。

ＩＶ．二重特異性アンタゴニストの製造方法
別の態様では、本出願は、本出願の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストをコードする核酸又は発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、本出願の二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト（その免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含む）を発現できるいずれの真核又は原核細胞とすることができる。

更なる態様では、抗腫瘍アンタゴニストの製造方法は、好適な細胞で発現されたアンタゴニスト、抗体、又はその断片の産生及び精製が可能な条件下で、本出願の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストをコードする１つ以上の核酸又は発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップを含む。

更なる態様では、本出願は、抗体の製造方法を提供し、上記方法は：上記抗体中の１つ以上のポリペプチド鎖をコードする１つ以上の構築物を一時的又は安定的に発現する細胞を培養するステップ；及び培養した上記細胞から上記抗体を精製するステップを含む。機能的な抗体を産生できるいずれの細胞を使用してよい。好ましい実施形態では、抗体発現細胞は、真核生物又は哺乳類由来であり、好ましくはヒト細胞である。様々な組織細胞タイプ由来の細胞を用いて、抗体を発現させることができる。他の実施形態では、細胞は酵母細胞、昆虫細胞、又は細菌細胞である。好ましくは、抗体産生細胞は、上記抗体を発現するベクターで安定的に形質転換される。

抗体重鎖又は軽鎖を発現する１つ以上の発現ベクターを、Ｎａｋｅｄ ＤＮＡ技法、カチオン性脂質仲介型トランスフェクション、ポリマー仲介型トランスフェクション、ペプチド仲介型トランスフェクション、ウイルス仲介型感染、物理的又は化学的な作用剤又は処理、電気穿孔法等といったいずれの従来の方法で、細胞内に導入できる。更に、細胞は、抗体を発現する安定的に形質転換されたクローンの選択を促進する選択可能なマーカーと共に、抗体を発現するための、１つ以上の発現ベクターでトランスフェクトしてよい。このような細胞によって産生された抗体は、遠心分離、クロマトグラフィ等といった当該技術分野で公知の技法に従って、回収及び／又は精製できる。

哺乳類細胞に対して好適な、選択可能なマーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイグロマイシン、及びピューロマイシンが挙げられる。このような選択可能なマーカーを哺乳類宿主細胞内に良好に移入すると、形質転換された哺乳類宿主細胞は、選択された圧力下に置かれた場合に生き残ることができる。選択方式については、２つの広く使用されている別個のカテゴリが存在する。第１のカテゴリは、細胞の代謝と、補充培地から独立して成長する能力を欠いた変異細胞株の使用とに基づくものである。その２つの例は、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞及びマウスＬＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジン又はヒポキサンチンといった栄養素を追加せずに成長する能力に欠けている。これらの細胞が、完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子を欠いているため、これらの細胞は、不足しているヌクレオチドが補充培地で提供されない限り、生き残ることができない。培地の補充に代わる選択肢は、無傷のＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子を、これらの各遺伝子を欠いている細胞に導入することによって、成長要件を変更することである。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、補充されていない培地中では生き残ることができない。

第２のカテゴリは、いずれの細胞タイプにおいて使用される選択スキームを指す優生選択であり、変異細胞株の使用を必要としない。これらのスキームは典型的には、宿主細胞の成長の阻止のために薬剤を使用する。新規の遺伝子を有する細胞は、薬剤耐性を伝達するタンパク質を発現し、上記選択を生き残ることになる。このような優生選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸、又はハイグロマイシンといった薬剤を使用する。これら３つの例は、真核細胞の制御下にある細菌遺伝子を採用して、適切な薬剤Ｇ４１８、即ちネオマイシン（ジェネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、又はハイグロマイシンそれぞれに対する耐性を伝達する。他には、ネオマイシン類似体Ｇ４１８及びピューロマイシンが挙げられる。

例示的な抗体発現性細胞としては、ヒトＪｕｒｋａｔ、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＷＥＨＩ線維肉腫細胞、及びリーシュマニア・タレントラエ等の単細胞原生動物種が挙げられる。更に、安定的に形質転換された抗体産生細胞株は、ｃ‐ｍｙｃ又は他の不死化剤で不死化された一次細胞を用いて産生できる。

一実施形態では、上記細胞株は、安定的に形質転換されたリーシュマニア・タレントラエ等のリーシュマニア細胞株を含む。リーシュマニアは、哺乳類タイプのグリコシル化パターンを示す真核細胞タンパク質の高レベルの発現のための、ロバストで迅速に成長する単細胞宿主を提供することが知られている。市販のリーシュマニア真核細胞発現キットが入手可能である（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ、イエナ（ドイツ））。

いくつかの実施形態では、上記細胞株は、培養物１リットルあたり、少なくとも１ｍｇ、少なくとも２ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも２００ｍｇ、少なくとも３００ｍｇ、少なくとも４００ｍｇ、又は少なくとも５００ｍｇの抗体を発現する。

本出願の抗体は、いずれの適切な培養培地、例えばＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、及びＡＩＭ Ｖ（登録商標）中での培養及び保持の後、抗体発現細胞から単離できる。抗体は、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ免疫アフィニティ精製を含む従来のタンパク質精製方法（例えばアフィニティ精製、クロマトグラフィ等）を用いて精製できる。いくつかの実施形態では、抗体を、培養物上清からの単離のために培養物上清に分泌されるように操作する。

Ｖ．医薬組成物及び治療方法
本出願の別の態様は、癌、慢性感染症、又は易感染性疾患状態といった細胞増殖性障害を治療するための、医薬組成物及び方法に関する。一実施形態では、上記医薬組成物は、本出願の１つ以上の抗腫瘍アンタゴニストを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の上記抗腫瘍アンタゴニストは：（１）ＰＤ‐１阻害剤若しくはＰＤ‐Ｌ１阻害剤；又は（２）１つ以上の血管新生阻害剤、例えばＶＥＧＦ阻害剤、ＶＥＧＦＲ２阻害剤、アンジオポエチン‐１／２阻害剤、及びＴｉｅ２Ｒ阻害剤と組み合わされた、１つ以上のＴＧＦ‐β１阻害剤又はＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ阻害剤を含む。１つ以上の上記アンタゴニストは、薬学的に許容可能な担体と共に処方される。本出願の医薬組成物は、本明細書に記載されるように、１つ以上の異なる抗体、１つ以上の多重特異性抗体、１つ以上の免疫複合体、又はこれらの組み合わせを含んでよい。

上述のように、本明細書に記載の医薬組成物を使用するための方法は、それを必要とする被験者に、有効量の本開示による医薬組成物を投与するステップを含む。

患者に治療有効量又は予防有効量の抗体又はアンタゴニストを提供するために、いずれの好適な投与経路又はモードを採用できる。例示的な投与経路又はモードとしては、非経口（例えば静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内）、経口、局所（経鼻、経皮、皮内、又は眼内）、粘膜（例えば鼻腔、舌下、頬内、直腸、膣内）、吸入、リンパ管内、脊髄内、頭蓋内、腹腔内、気管内、膀胱内、髄腔内、経腸、肺内、リンパ管内、腔内、眼窩内、被膜内、及び経尿道、並びにカテーテル又はステントによる局所送達が挙げられる。

本開示による抗体又はアンタゴニストを含む医薬組成物は、いずれの１つ以上の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤中で処方してよい。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的適合性を有するありとあらゆる溶剤、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含む。医薬組成物は、好適な固体又はゲル相の担体又は賦形剤を含んでよい。例示的な担体又は賦形剤としては、限定するものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコール等のポリマーが挙げられる。薬学的に許容可能な例示的な担体としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、及びこれらの組み合わせが挙げられる。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを、組成物中に含めることが好ましい。薬学的に許容可能な担体は更に、微量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、防腐剤又は緩衝剤を含んでよく、これらは治療剤の貯蔵期間又は効力を強化する。

抗腫瘍アンタゴニストは、非経口投与に好適な医薬組成物に組み込むことができる。好適な緩衝剤としては、限定するものではないが、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、又はリン酸カリウムが挙げられる。塩化ナトリウムは、溶液の毒性を改変するために、０〜３００ｍＭ（最適には液体剤形に関して１５０ｍＭ）の濃度で使用できる。凍結乾燥剤形には凍結防止剤、主に０〜１０％のスクロース（最適には０．５〜１．０％）を含めることができる。他の好適な凍結防止剤としては、トレハロース及びラクトースが挙げられる。凍結乾燥剤形には増量剤、主に１〜１０％のマンニトール（最適には２〜４％）を含めることができる。安定剤は、液体剤形及び凍結乾燥剤形の両方で使用でき、主に１〜５０ｍＭのＬ‐メチオニン（任意に５〜１０ｍＭ）である。他の好適な増量剤としては、グリシン、アルギニンが挙げられ、これらは０〜０．０５％のポリソルベート‐８０（最適には０．００５〜０．０１％）として含めることができる。更なる界面活性剤としては、限定するものではないが、ポリソルベート２０及びＢＲＩＪ界面活性剤が挙げられる。

治療用抗腫瘍アンタゴニスト調製物を凍結乾燥し、滅菌粉体として好ましくは真空下で保存でき、その後、（例えばベンジルアルコール防腐剤を含有する）静菌水又は滅菌水中で再構築してから注射できる。医薬組成物は、注射、例えばボーラス注射又は持続注入による非経口投与のために処方できる。

医薬組成物中の治療剤は、「治療有効量」又は「予防有効量」で処方してよい。「治療有効量」は、複数回の投薬量で、必要な期間にわたって、所望の治療効果を達成するために有効な量を指す。組換えベクターの治療有効量は、治療対象の状態；状態の重篤度及び経過；投与のモード；抗体又は作用剤を予防目的で投与するか治療目的で投与するか；１つ以上の特定の作用剤のバイオアベイラビリティ；抗腫瘍アンタゴニストが個体内で所望の応答を誘発する能力；過去の療法；患者の年齢、体重、及び性別；患者の臨床履歴及び抗体に対する応答；使用される抗腫瘍アンタゴニストのタイプ；主治医の裁量等に応じて変化し得る。治療有効量はまた、組換ベクターのいずれの毒性の又は有害な影響を治療上有益な効果が上回る、量でもある。「予防有効量」は、複数回の投薬量で、必要な期間にわたって、所望の予防的結果を達成するために有効な量を指す。

好ましくは、抗腫瘍アンタゴニスト中のポリペプチドドメインは、これらが投与される宿主と同一の宿主に由来するものであり、これにより、投与された治療剤に対する炎症反応が低減される。

抗腫瘍アンタゴニストは、患者に１回で又は複数回の一連の治療にわたって好適に投与され、診断以降のいずれの時点に患者に投与してよい。抗腫瘍アンタゴニストは、単独の治療として、又は問題となっている状態の治療に有用な他の薬剤もしくは療法と組み合わせて、投与してよい。

一般的な案として、治療有効量又は予防有効量の抗腫瘍アンタゴニストは、１回又は複数回の投与で、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲内で投与されることになる。ある特定の実施形態では、各抗腫瘍アンタゴニストは、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１μｇ／ｋｇ体重／日、１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１μｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲内で投与される。

他の実施形態では、抗腫瘍アンタゴニストは、３日毎に５００μｇ〜２０ｇ、又は３日毎に２５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。

他の実施形態では、各抗腫瘍アンタゴニストは、投与１回あたり約１０ｎｇ〜約１００ｎｇ、投与１回あたり約１０ｎｇ〜約１μｇ、投与１回あたり約１０ｎｇ〜約１０μｇ、投与１回あたり約１０ｎｇ〜約１００μｇ、投与１回あたり約１０ｎｇ〜約１ｍｇ、投与１回あたり約１０ｎｇ〜約１０ｍｇ、投与１回あたり約１０ｎｇ〜約１００ｍｇ、注射１回あたり約１０ｎｇ〜約１０００ｍｇ、投与１回あたり約１０ｎｇ〜約１０，０００ｍｇ、投与１回あたり約１００ｎｇ〜約１μｇ、投与１回あたり約１００ｎｇ〜約１０μｇ、投与１回あたり約１００ｎｇ〜約１００μｇ、投与１回あたり約１００ｎｇ〜約１ｍｇ、投与１回あたり約１００ｎｇ〜約１０ｍｇ、投与１回あたり約１００ｎｇ〜約１００ｍｇ、注射１回あたり約１００ｎｇ〜約１０００ｍｇ、投与１回あたり約１００ｎｇ〜約１０，０００ｍｇ、投与１回あたり約１μｇ〜約１０μｇ、投与１回あたり約１μｇ〜約１００μｇ、投与１回あたり約１μｇ〜約１ｍｇ、投与１回あたり約１μｇ〜約１０ｍｇ、投与１回あたり約１μｇ〜約１００ｍｇ、注射１回あたり約１μｇ〜約１０００ｍｇ、投与１回あたり約１μｇ〜約１０，０００ｍｇ、投与１回あたり約１０μｇ〜約１００μｇ、投与１回あたり約１０μｇ〜約１ｍｇ、投与１回あたり約１０μｇ〜約１０ｍｇ、投与１回あたり約１０μｇ〜約１００ｍｇ、注射１回あたり約１０μｇ〜約１０００ｍｇ、投与１回あたり約１０μｇ〜約１０，０００ｍｇ、投与１回あたり約１００μｇ〜約１ｍｇ、投与１回あたり約１００μｇ〜約１０ｍｇ、投与１回あたり約１００μｇ〜約１００ｍｇ、注射１回あたり約１００μｇ〜約１０００ｍｇ、投与１回あたり約１００μｇ〜約１０，０００ｍｇ、投与１回あたり約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、投与１回あたり約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、注射１回あたり約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、投与１回あたり約１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、投与１回あたり約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ、注射１回あたり約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、投与１回あたり約１０ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、注射１回あたり約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、投与１回あたり約１００ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、及び投与１回あたり約１０００ｍｇ〜約１０，０００ｍｇの範囲内で投与される。抗腫瘍アンタゴニストは毎日、２、３、４、５、６若しくは７日毎、又は１、２、３、若しくは４週間毎に投与される。

他の特定の実施形態では、抗腫瘍アンタゴニストは、約０．０００６ｍｇ／日、０．００１ｍｇ／日、０．００３ｍｇ／日、０．００６ｍｇ／日、０．０１ｍｇ／日、０．０３ｍｇ／日、０．０６ｍｇ／日、０．１ｍｇ／日、０．３ｍｇ／日、０．６ｍｇ／日、１ｍｇ／日、３ｍｇ／日、６ｍｇ／日、１０ｍｇ／日、３０ｍｇ／日、６０ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、３００ｍｇ／日、６００ｍｇ／日、１０００ｍｇ／日、２０００ｍｇ／日、５０００ｍｇ／日、又は１０，０００ｍｇ／日の用量で投与してよい。予想されるように、投薬量は、患者の状態、サイズ、年齢に左右されることになる。

特定の実施形態では、抗腫瘍アンタゴニストのコード配列を、細胞増殖性障害を有する患者の体内で有効量の抗腫瘍アンタゴニストを発現するために、好適な発現ベクター（例えばウイルス又は非ウイルスベクター）に組み込む。例えば１つ以上の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスの投与を含む特定の実施形態では、医薬組成物は、１ｋｇあたり少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１、少なくとも１０^１２、少なくとも１０^１３、又は少なくとも１０^１４個のゲノムコピー（ＧＣ）又は組換えウイルス粒子を含む量、又はそのいずれの範囲の量の、ｒＡＡＶを含んでよい。特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１、少なくとも１０^１２、少なくとも１０^１３、少なくとも１０^１４、少なくとも１０^１５個のゲノムコピー又は組換えウイルス粒子を含む量、又はそのいずれの範囲の量の、有効量のｒＡＡＶ等の組換えウイルスを含む。

投薬量は、いずれの特定の細胞増殖性障害に好適な、いくつかの当該技術分野で許容された動物モデルで試験できる。

送達方法としては、殺滅されたウイルスに結合した又はしていないポリカチオン性凝縮ＤＮＡの使用、リガンド結合ＤＮＡの使用、リポソームの使用、真核細胞送達ビヒクル細胞の使用、光重合性ヒドロゲル材料の堆積、ハンドヘルド遺伝子導入パーティクルガンの使用、電離放射線の使用、核酸電荷中和、又は細胞膜との融合、粒子仲介型遺伝子導入等を挙げることもできる。

限定として解釈されるべきではない以下の実施例によって、本発明を更に説明する。本出願全体を通して引用されている全ての参考文献、特許、及び公開特許出願の内容、並びに図面及び表は、参照により本出願に援用される。

実施例１：モノクローナル抗体の生成
本出願のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、当該技術分野で公知の技法を用いて生成及びスクリーニングされる。例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。抗原特異的ハイブリドーマｍＡｂは、当該技術分野で公知の技法を用いてクローニング、配列決定、及び操作される。例えばＬｏ． Ｂ．Ｋ．Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｔｒａｄｅｍａｒｋ）． Ｖｏｌｕｍｅ ２４８ ２００４． Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを参照。

実施例２：二重特異性抗腫瘍アンタゴニストの設計
図５Ａ及び５Ｂは、それぞれ２つの二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、Ｂｉ‐ＰＢ‐１（又はＢｉ‐ＰＬＢ‐１）及びＢｉ‐ＰＢ‐１（又はＢｉ‐ＰＬＢ‐２）を示す。これらのアンタゴニストは、チェックポイント調節因子抗体バックボーン（抗ＰＤ‐１又は抗ＰＤ‐Ｌ１）を：（ｉ）２つの重鎖それぞれのＣＨ３領域のカルボキシ末端に融合した（図５Ａ）；又は（ｉｉ）ＦｃループのＣＨ３領域内に挿入された（図５Ｂ）、ＴＧＦ‐β ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＴＧＦ‐β‐ＲＩＩ ＥＣＤ）と共に含む。

図５Ａ及び５Ｂに示されている実施形態では、二重特異性抗体はＩｇＧ１又はＩｇＧ４バックボーンを有することができる。更に、抗体特異性のうちのいずれの１つ以上を、他のいずれのチェックポイント調節因子アンタゴニスト特異性、及び／又はいずれの腫瘍標的化抗体特異性、例えばＣＤ２０、ＥＧＦＲ等で置き換えてよい。

図６は、図５Ａ及び５Ｂの二重特異性抗体に対応する例示的な機能性ドメイン配列を示す。

図７Ａ〜７Ｂは、図５Ａ及び５Ｂに示されている二重特異性抗体に対応する、例示的な重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）配列を示す。

実施例３：更なる二重特異性アンタゴニストの設計
図８Ａ〜８Ｃは、３つの異なる二重特異性アンタゴニスト、Ｂｉ‐ＡＢ‐１、Ｂｉ‐Ａ１Ｂ‐１、及びＢｉ‐ＺＢ‐１の設計をそれぞれ示し、これらはそれぞれ、変異型ＩｇＧ１（Ｋ４４７Ａ）足場にカルボキシ末端ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。Ｂｉ‐ＡＢ‐１及びＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１はいずれも、Ａｖａｓｔｉｎ／ベバシズマブ由来のアミノ末端抗ＶＥＧＦ可変領域（ＶＨ１、ＶＬ１）を含有し、Ｂｉ‐Ａ１Ｂ‐１は、ＶＨ領域の２つのアミノ酸置換（Ｅ６Ｑ、Ｌ１１Ｖ）を含む。Ｂｉ‐ＺＢ‐１は、ＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｋ４４７Ａ）領域の上流にアミノ末端アフリベルセプトドメインを含有する。他の実施形態では、変異型ＩｇＧ１（Ｋ４４７Ａ）足場の代わりに、二重特異性アンタゴニストは、野生型ＩｇＧ１足場、異なる変異型ＩｇＧ１足場、ＩｇＧ２足場、変異型ＩｇＧ２足場、ＩｇＧ４足場、又は変異型ＩｇＧ４足場を含む。

図９Ａ及び９Ｂは、図８Ａ〜８Ｃに示されている二重特異性アンタゴニスト中に存在する様々な機能性ドメイン配列を示す。

図１０は、図８Ａ〜８Ｃに示されている二重特異性アンタゴニスト荷対応する重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を示す。

図１１は、図８Ａ〜８Ｃに示されている二重特異性アンタゴニストの機能性ドメインの配置をまとめたものである。

実施例４：図１０〜１１のアンタゴニストの発現及び精製
図１２は、非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって決定される、ＨＥＫ２９３細胞へと一過性トランスフェクションされた場合の、ｗｔ ＶＥＧＦ‐Ａ又は変異型Ｅ６Ｑ及びＬ１１Ｖ変異を含有するアンタゴニスト（即ちそれぞれＢｉ‐ＡＢ‐１及びＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１）の改善された発現レベルを示す、クマシーブルー染色済みポリアクリルアミドゲルである。図１２に示されている力価は、ＰＯＲＯＳ Ａカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて細胞上清を定量することによって決定された。この分析の結果により、Ｂｉ‐Ａ１Ｂ‐１の発現レベルが、Ｂｉ‐ＡＢ‐１に比べて１６７％上昇することが示された。

図１３Ａは、タンパク質Ａ精製済みＢｉ‐ＡＢ‐１及びＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１から得られた高分子量（ＨＭＷ）種、低分子量（ＬＭＷ）種、及び二量体の相対レベルを示す、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）プロファイルを示す。図１３Ｂは、Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ ＵＰ‐Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを用いてＳＥ‐ＵＰＬＣによって決定されるように、二量体のパーセンテージ（Ｂｉ‐ＡＢ‐１に関して９８．６％；Ｂｉ‐Ａ１Ｂ‐１に関して９８．７％）が、ＨＭＷ種（１％）及びＬＭＷ種（０．４％）を大幅に上回ることを示している。これらの結果は、ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のＢｉ‐ＡＢ‐１及びＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１への融合が、明らかなレベルの高分子量（ＨＭＷ）種又は低分子量（ＬＭＷ）種をもたらさなかったことを示す。

図１４Ａ〜１４Ｂは、Ｂｉ‐ＺＢ‐１の一過性トランスフェクションの後に得られた上清からの、それぞれ非還元条件及び還元条件下での、クマシーブルー染色済みＰＡＧＥ分析を示す。この分析の結果により、試験管内での８日間の細胞の成長の後、Ｂｉ‐ＺＢ‐１の良好な一過性発現レベル（２２０μｇ／ｍｌ）が確認された。

図１５は、タンパク質Ａ精製済みＢｉ‐ＺＢ‐１が、高分子量（ＨＭＷ、３．４％）種及び低分子量（ＬＭＷ、０．５％）種を、二量体（９６．１％）に比べて低いレベルで有することを示す、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）プロファイルを示す。

実施例５：図８Ａ〜８Ｃの抗腫瘍アンタゴニストの機能的特性決定
抗ＶＥＧＦアンタゴニストＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１の、ＶＥＧＦＲ２（即ちコグネイト受容体）のＶＥＧＦ仲介型活性化に拮抗する能力を評価するために、細胞ベースルシフェラーゼアッセイを実施した。この実験では、ＮＦＡＴ応答要素の制御下でヒトＶＥＧＦＲ２及びホタルルシフェラーゼ構築物を発現する組換えＨＥＫ‐２９３細胞株を、抗ＶＥＧＦアンタゴニスト（Ｂｉ‐Ａ１Ｂ‐１）の段階希釈物の存在下で、ｈｕＶＥＧＦ１６５を用いて刺激した。このアッセイの結果を図１６に示す。予想されたように、抗ＶＥＧＦアンタゴニストのレベルの上昇により、ＶＥＧＦ１６５の、ＶＥＧＦＲ２を活性化してＮＦＡＴ仲介型ルシフェラーゼ活性を誘導する能力が、徐々に無効化された。

二重特異性アンタゴニストＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１の、ＴＧＦ‐β１及びＶＥＧＦ１６５に同時に結合する能力を評価するために、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを実施した。この実験では、ｈｕＴＧＦ‐β１を９６ウェルプレート上にコーティングして５％ＢＳＡでブロッキングした後、Ｂｉ‐Ａ１Ｂ‐１の段階希釈サンプルを追加してインキュベーションし、続いてビオチン化ｈｕＶＥＧＦ１６５を加えた。結合した分子を、ＴＭＢ基質を用いたストレプトアビジン‐ＨＲＰで検出した。図１７のこの分析の結果は、二重特異性アンタゴニストＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１がＴＧＦ‐β１及びＶＥＧＦ１６５の両方に同時に結合できることを示す。

ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤの、ヒトＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ（即ちコグネイト受容体）のＴＧＦ‐β１仲介型活性化に拮抗する能力を評価するために、細胞ベースルシフェラーゼアッセイを実施した。この実験では、ＳＭＡＤ応答要素の制御下でヒトＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ受容体及びホタルルシフェラーゼ構築物を発現する組換えＨＥＫ‐２９３細胞を、ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤに融合した抗体（Ｂｉ‐Ａ１Ｂ‐１、Ｂｉ‐ＺＢ‐１）の段階希釈物の存在下で、ｈｕＴＧＦ‐β１を用いて刺激した。この分析の結果を図１８に示す。予想されたように、ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤを含有する抗体のレベルの上昇により、ＴＧＦ‐β１の、ヒトＴＧＦ‐β１ ＲＩＩを活性化してＮＦＡＴ仲介型ルシフェラーゼ活性を誘導する能力が、徐々に無効化された。このケースでは、Ｂｉ‐Ａ１Ｂ‐１及びＢｉ‐ＺＢ‐１は同等の拮抗能力を示したが、これはＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１に関する０．３２ｎＭのＩＣ５０、及びＢｉ‐ＺＢ‐１に関する０．３１のＩＣ５０に反映されている。これらのＩＣ５０は、対照ＴＧＦＢＲ２融合産物（ＩＣ５０＝０．２０ｎＭ）と同等であった。

Ｂｉ‐Ａ１Ｂ‐１の生体内薬物動態特性を評価するために、薬物動態プロファイルを生成した。簡潔に述べると、１０ｍｇ／ｋｇの各アンタゴニストを、６〜１０週齢のメスのＣＤ１マウスの尾部静脈に静脈内注射した（ｎ＝マウス２頭／分子）。注射の３分後、３時間後、１日後、３日後、７日後、及び１０日後に血清を回収した。血清中の抗体を検出するために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、５μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片でコーティングした後、ＰＢＳ中で５％のミルクでブロッキングした。５％のミルク中の、段階希釈されたマウス血清、並びに標準として段階希釈及び精製されたタンパク質分子を、プレートに加えた。ペルオキシダーゼコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧとのインキュベーション、及び更なる洗浄に続いて、ＴＭＢ‐ＥＬＩＳＡ基質とのインキュベーションの後二重特異性アンタゴニストＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１（図１９）抗体を検出した。この分析の結果は、二重特異性アンタゴニストＢｉ‐Ａ１Ｂ‐１の半減期（Ｔ_１／２）が７．４〜１６日であることを示した。

実施例６：ＴＧＦ‐β１ ＥＣＤを有する二重特異性ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１アンタゴニストの設計
図２０Ａ〜２０Ｂは、２つの二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２（図２０Ａ）及びＢｉ‐ＰＬＢ‐１．２（図２０Ｂ）を示し、これらはそれぞれ抗ＰＤ‐１及び抗ＰＤ‐Ｌ１由来の可変領域ドメインを有する抗体バックボーン（ＩｇＧ４ Ｋ４４７Ａ又はＩｇＧ１ Ｋ４４７Ａ）を含み、更に各重鎖ＣＨ３領域のカルボキシ末端に融合したＴＧＦ‐β‐ＲＩＩ ＥＣＤを含む。

図２１は、図２０Ａ及び２０Ｂの二重特異性抗体中に存在する機能性ドメイン配列を示す。図２２は、図２０Ａ及び２０Ｂに示されている二重特異性アンタゴニストに対応する重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を示す。図２３は、図２０Ａ及び２０Ｂに示されている二重特異性アンタゴニストの機能性ドメインの配置をまとめたものである。

実施例７：図２０Ａ〜２０Ｂの二重特異性アンタゴニストの発現及び精製
図２４Ａは、親対照抗体（２Ｐ１７）と比較して、タンパク質Ａアフィニティ精製後の一過性発現系におけるＢｉ‐ＰＢ‐１．２及びＢｉ‐ＰＬＢ‐１．２の発現の増加を示す、非変性ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）分析を示す。図２４Ｂは、一過性トランスフェクション済みＨＥＫ２９３細胞由来のタンパク質Ａ精製済みＢｉ‐ＰＢ‐１．２、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２、及び２Ｐ１７（ベンチマーク）が、図２４Ｃに示すように二量体化分子（Ｄｉｍｅｒ）に比べて低いレベルの高分子量（ＨＭＷ）種及び低分子量（ＬＭＷ）種を有することを示す、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）プロファイルを示す。図２５Ａ〜２５Ｂは、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２及びＢｉ‐ＰＬＢ‐１．２の二量体、ＨＭＷ、及びＬＭＷ形態が、４℃において少なくとも４週間にわたって良好な安定性を示すことを示す。

実施例８：図２０Ａ〜２０ＢのＢｉ‐ＰＢ‐１．２及びＢｉ‐ＰＬＢ‐１．２アンタゴニストの機能的特性決定
１．バイオレイヤー干渉法によるＢｉ‐ＰＢ‐１．２のＰＤ‐１及びＴＧＦ‐β１への結合
Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてバイオレイヤー干渉法を実施し、Ｈｉｓタグ付与ヒトＰＤ‐１タンパク質又はＨｉｓタグ付与ＴＧＦ‐β１に対する抗体の結合動態を特性決定した。２０ｎＭの抗体を、抗ヒトＩｇＧキャプチャバイオセンサに装入した。バイオセンサを、分析物の２倍又は３倍段階希釈物（最高濃度７２ｎＭ）を内包するウェルに５分間入れることによって、分析物（Ｈｉｓタグ付与ヒトＰＤ‐１又はＴＧＦ‐β１タンパク質）の会合を観察した。バイオセンサを動態緩衝液のみの中に移し、干渉法のシグナルを１０分間監視した後で、解離を測定した。観察されたオン及びオフレート（Ｋａ及びＫｄ）を、試験した少なくとも５つの濃度を含む１：１結合グローバルフィットモデルを用いてフィッティングし、平衡結合定数Ｋ_Ｄを計算した。

図２６Ａ〜２６Ｅは、ＰＤ‐１及びＴＧＦ‐β１の、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２（それぞれ図２６Ａ、２６Ｂ）並びに対応する抗ＰＤ‐１抗体及びベンチマーク（Ｍｅｒｃｋ ＫＧＡからのＭ７８２４）（それぞれ図２６Ｃ、２６Ｄ）への結合の結果を、得られた結合親和性定数（図２６Ｅ）と共に示す。この結果は、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２のＰＤ‐１及びＴＧＦ‐β１に対する結合親和性が、抗ＰＤ‐１ベンチマーク及びＭ７８２４ベンチマークより良好であることを示す。

２．バイオレイヤー干渉法によるＢｉ‐ＰＬＢ‐１．２のＰＤ‐Ｌ１及びＴＧＦ‐β１への結合
バイオレイヤー干渉法によるＢｉ‐ＰＬＢ‐１．２のＰＤ‐Ｌ１及びＴＧＦ‐β１への結合を、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２に関して上述したように実施した。図２７Ａ〜２７Ｅは、ＰＤ‐１及びＴＧＦ‐β１の、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２（それぞれ図２７Ａ、２７Ｂ）並びに対応する抗ＰＤ‐１及び抗ＴＧＦ‐β１ベンチマーク抗体（それぞれ図２７Ｃ、２７Ｄ）への結合の結果を、得られた結合親和性定数（図２７Ｅ）と共に示す。この結果は、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２のＴＧＦ‐β１に対する結合親和性が、ＴＧＦ‐β１ ＥＣＤベンチマークより良好であること、及びＢｉ‐ＰＬＢ‐１．２のＰＤ‐Ｌ１に対する結合親和性が、抗ＰＤ‐Ｌ１ベンチマークと同等であることを示す。

３．Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２及びＢｉ‐ＰＬＢ‐１．２によるＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１への同時結合
図２８Ａは、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２によるＴＧＦ‐β１及びＰＤ‐１の同時結合を実証するＥＬＩＳＡアッセイを示し、ここでは、ｈｕＴＧＦ‐β１コーティング済み９６ウェルプレートを、段階希釈されたＢｉ‐ＰＢ‐１．２のサンプル、及びこれに続いてｈｉｓタグ付与ｈｕＰＤ‐１を用いてインキュベーションすることによって、結合した分子を、ＴＭＢ基質を用いた抗Ｈｉｓタグ‐ＨＲＰによって検出した。図２８Ｂは、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２によるＴＧＦ‐β１及びＰＤ‐Ｌ１の同時結合を実証するＥＬＩＳＡアッセイを示し、ここでは、ｈｕＴＧＦ‐β１コーティング済み９６ウェルプレートを、段階希釈されたＢｉ‐ＰＬＢ‐１．２のサンプル、及びこれに続いてＨｉｓタグ付与ｈｕＰＤ‐Ｌ１を用いてインキュベーションすることによって、結合した分子を、ＴＭＢ基質を用いた抗Ｈｉｓタグ‐ＨＲＰによって検出した。ＥＣ５０値は、ヒトＰＤ‐１又はＰＤ‐Ｌ１への結合に関する、ベースライン応答と最大応答との間の半分の応答を生成する半数効果濃度を反映したものである。

４．Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２は、ＰＤ‐Ｌ１及びＴＧＦ‐β１両方の、その受容体への結合を、強力に遮断する
遮断アッセイを実施し、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２とＰＤ‐Ｌ１との間の結合に対応するＩＣ５０値を、抗ＰＤ‐１ベンチマーク抗体と比較して計算した。簡潔に述べると、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２又はベンチマーク抗体の２倍段階希釈物（最高Ａｂ濃度：１２８ｎＭ；各ｍＡｂについて３回）を調製した。ヒトＰＤ‐１トランスフェクト済みＣＨＯ‐Ｋ１細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ ２ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、１０^６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。ＦＩＴＣ標識ヒトＰＤ‐Ｌ１‐Ｆｃタンパク質を、ヒトＰＤ‐１トランスフェクト済みＣＨＯ‐Ｋ１細胞に、最終濃度７μｇ／ｍｌで加え、よく混合した。インキュベーションせずに、２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中の２，０００個のこれらのＣＨＯ‐Ｋ１細胞（ＰＤ‐Ｌ１タンパク質を含む）を、９６ウェル丸底プレートに即座に加え、２０μｌの、又は２倍に段階希釈した抗体を、上記細胞に即座に加えて、４℃で３０分間インキュベーションした。続いて細胞を洗浄し、３０μｌの７ＡＡＤ溶液中で再懸濁し；続いて３５μｌの１０％中性緩衝ホルマリン溶液を加えて１５分間インキュベーションした後、ｉＱｕｅ ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔシステムを用いて分析した。この分析の結果を図２９Ａに示す。予想されたように、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２のレベルの上昇により、ＰＤ‐Ｌ１の、受容体に結合する能力が、徐々に遮断された。更に、計算されたＢｉ‐ＰＢ‐１．２のＰＤ‐Ｌ１に関するＩＣ５０は、抗ＰＤ‐１ベンチマークのＰＤ‐Ｌ１に関するＩＣ５０と同等であることが分かった。

ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤの、ヒトＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ（即ちコグネイト受容体）のＴＧＦ‐β１仲介型活性化に拮抗する能力を評価するために、細胞ベースルシフェラーゼアッセイを実施した。この実験では、ＳＭＡＤ応答要素の制御下でヒトＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ受容体及びホタルルシフェラーゼ構築物を発現する組換えＨＥＫ‐２９３細胞を、ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤを含有するＢｉ‐ＰＢ‐１．２の段階希釈物の存在下で、ｈｕＴＧＦ‐β１を用いて刺激した。生体活性は、ルシフェラーゼ仲介型発光の量の減少によって測定した。

このアッセイの結果を図２９Ｂに示す。予想されたように、ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ ＥＣＤを含有する抗体のレベルの上昇により、ＴＧＦ‐β１の、ヒトＴＧＦ‐β１ ＲＩＩを活性化してＮＦＡＴ仲介型ルシフェラーゼ活性を誘導する能力が、徐々に無効化された。更に、計算されたＢｉ‐ＰＢ‐１．２のＴＧＦ‐β１に関するＩＣ５０は、抗ＰＤ‐１ベンチマークのＴＧＦ‐β１に関するＩＣ５０と同等であることが分かった。

５．Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２は、ヒト及びカニクイザルＰＤ‐１の両方に同様の活性で結合する
Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２の、ヒト及びカニクイザルＰＤ‐１の両方に結合する能力を評価するために、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２の段階希釈物を、ヒト又はカニクイザルＰＤ‐１を過剰発現するＣＨＯ‐Ｋ１細胞（２０，０００細胞／ウェル）に加えた。混合物を４℃で２０分間インキュベーションし、３回洗浄し、二次抗体であるＰＥ標識Ｆ（ａｂ’）２‐ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｈ１０１０４）を用いて４℃で２０分間染色した。細胞を洗浄して７ＡＡＤ溶液中に再懸濁し、１０％中性緩衝ホルマリン溶液中で１５分間固定した後、ｉＱｕｅ Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔシステムで分析した。図３０Ａ〜３０Ｂは、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２の、ヒトＰＤ‐１（図３０Ａ）及びカニクイザルＰＤ‐１（図３０Ｂ）両方への結合を示す。予想されたように、抗ヒトＰＤ‐１ベンチマーク抗体は、ヒトＰＤ‐１（図３０Ａ）及びカニクイザルＰＤ‐１（図３０Ｂ）に同様に結合することが分かった。ヒトＰＤ‐１及びカニクイザルＰＤ‐１への結合それぞれに関するベースライン応答と最大応答との間の半分の応答を生成する半数効果濃度（ＥＣ_５０）を反映した、対応するＥＣ５０値も決定した。このケースでは、ＥＣ５０値は、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２の、ベンチマーク抗体と同様の結合特性を示す。

６．Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２は、ＰＤ‐１及びＴＧＦ‐β１両方の、その受容体への結合を、強力に遮断する
基本的に実施例８のセクション４で上述したように、遮断アッセイを実施し、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２とＰＤ‐Ｌ１との間の結合に対応するＩＣ５０値を、抗ＰＤ‐Ｌ１ベンチマーク抗体と比較して計算した。図３１Ａは、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２又は抗ＰＤ‐Ｌ１ベンチマーク抗体の濃度の上昇により、ＰＤ‐１の、ＰＤ‐Ｌ１‐ＴＧＦＢＲ２に結合する能力が、徐々に遮断されたことを示す。得られたＩＣ５０値に反映されているように、二重特異性は抗ＰＤ‐Ｌ１ベンチマークと同等である。

Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２とＴＧＦ‐β１との間の結合に対応するＩＣ５０値を、抗ＴＧＦ‐β１ベンチマーク抗体と比較して計算するために、実施例８のセクション４に記載の細胞ベースアッセイを実施した。図３１Ｂは、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２及び抗ＰＤＬ１‐ＴＧＦＢＲ２ベンチマーク抗体の段階希釈物の、ＳＭＡＤ応答要素の制御下でルシフェラーゼ発現を活性化するＴＧＦ‐β１の能力を遮断する能力を示す。得られたＩＣ５０値に反映されているように、二重特異性抗体は抗ＴＧＦ‐β１ベンチマークと同様の結合特性を示した。

７．Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２は、ヒト及びカニクイザルＰＤ‐１の両方に同様の活性で結合する
Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２の、ヒト及びカニクイザルＰＤ‐Ｌ１の両方に結合する能力を評価するために、基本的に実施例９のセクション５で上述したように、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２の段階希釈物を、ヒト又はカニクイザルＰＤ‐Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ‐Ｋ１細胞（２０，０００細胞／ウェル）に加えた。図３２Ａ〜３２Ｂは、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２がヒトＰＤ‐Ｌ１（図３２Ａ）及びカニクイザルＰＤ‐Ｌ１（図３２Ｂ）の両方に結合したことを示す。ヒトＰＤ‐１及びカニクイザルＰＤ‐１への結合それぞれに関するベースライン応答と最大応答との間の半分の応答を生成する半数効果濃度（ＥＣ_５０）を反映した、結果的なＥＣ５０値も決定した。

８．Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２はＴ細胞活性化を強化する
ヒトＴ細胞アッセイを実施して、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２抗体の機能性を示した。簡潔に述べると、ドナー１及び２から収集した正常で健康なヒトＰＢＭＣそれぞれを、ＳＥＢ（Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ＃： ＢＴ２０２）ＳＥＢで活性化した。ＩＦＮ‐γ産生を評価するために、９６ウェルプレート中で、１００，０００個の細胞を０．５μｇ／ｍｌのＳＥＢで刺激した。２５，０００個の腫瘍抑制性ＳＨＰ７７細胞を加え、阻害性シグナルを提供した。６６ｎＭのＢｉ‐ＰＢ‐１．２ ｍＡｂ、又はアイソタイプ対照Ａｂを加えた。５日後、上清をＥＬＩＳＡによってＩＦＮ‐γ及びＩＬ‐２に関して検査した。図３３Ａ〜３３Ｂは、陰性対照処理に対する、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２による増大したＩＦＮ‐γ（ドナー１、図３３Ａ；ドナー２、図３３Ｂ）、及びＩＬ‐２（ドナー１、図３３Ｃ；ドナー２、図３３Ｄ）を示す。

９．Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２はＴ細胞活性化を強化し、腫瘍細胞によるＴ細胞抑制を親抗ＰＤ‐Ｌ１抗体より良好に克服する
図３４Ａ〜３４Ｂは、陰性対照及び親抗ＰＤ‐Ｌ１抗体処理に対する、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２によるヒトＰＢＭＣ（ドナー８、図３４Ａ；ドナー９、図３４Ｂ）からのＩＦＮ‐γ分泌の増大を示す。図３４Ｃ〜３４Ｄは、陰性対照及び親抗ＰＤ‐Ｌ１抗体処理に対する、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２によるヒトＰＢＭＣ（ドナー８、図３４Ｃ；ドナー９、図３４Ｄ）からのＩＬ‐２分泌の増大を示す。これらの結果は、「Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２が、腫瘍細胞によるＴ細胞抑制を親抗ＰＤ‐Ｌ１抗体より良好に克服する」という考えと一致している。

１１．ベンチマーク抗体に比べて改善された、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２及びＢｉ‐ＰＬＢ‐１．２に関するマウスにおける薬物動態プロファイル
Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２、及びベンチマーク抗体の生体内薬物動態特性を評価するために、薬物動態プロファイルを生成した。簡潔に述べると、１０ｍｇ／ｋｇの各アンタゴニストを、６〜１０週齢のメスのＣＤ１マウスの尾部静脈に静脈内注射した（ｎ＝マウス２頭／分子）。注射の３分後、３時間後、１日後、３日後、７日後、及び１０日後に血清を回収した。血清中の抗体を検出するために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、５μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片でコーティングした後、ＰＢＳ中で５％のミルクでブロッキングした。５％のミルク中の、段階希釈されたマウス血清、並びに標準として段階希釈及び精製されたタンパク質分子を、プレートに加えた。

ペルオキシダーゼコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧとのインキュベーション、及び更なる洗浄に続いて、ＴＭＢ‐ＥＬＩＳＡ基質とのインキュベーションの後、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２（図３５Ａ）、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２（図３５Ｃ）、及びベンチマーク（図３５Ｅ）抗体（ＰＤＬ１‐ＴＧＦＢＲ２、Ｍ８７２４）を検出した。マウス血清中に注射された抗体Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２（図３５Ｂ）、Ｂｉ‐ＰＬＢ‐１．２（図３５Ｄ）、及びベンチマーク（図３５Ｆ）の完全性及びクリッピングも、抗ヒトＦｃウエスタンブロットで分析した。この分析の結果は、ベンチマーク抗体に比べて改善された、Ｂｉ‐ＰＢ‐１．２及びＢｉ‐ＰＬＢ‐１．２に関するマウスにおける薬物動態プロファイルを示す。

以上の説明は、当業者に本発明の実施方法を教示することを目的としており、この説明を読めば当業者には明らかになるであろう明白な修正形態及び変形形態の全てを詳述することを意図したものではない。しかしながら、全てのこのような明白な修正形態及び変形形態は、以下の請求項によって定義される本発明の範囲内に含まれることが意図されている。請求項は、文脈によってそうでないことが明確に示されていない限り、請求対象である構成要素及びステップを、意図されている目的を達成するために有効ないずれの順序で、包含することを意図している。

Claims (34)

1. ＴＧＦ‐β１ ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む、第１の標的指向性ドメイン；及び
   ＰＤ‐１結合アンタゴニスト、ＰＤ‐Ｌ１結合アンタゴニスト、ＶＥＧＦ結合アンタゴニスト、又はＴｉｅ２チロシンキナーゼ受容体結合アンタゴニストを含む、第２の標的指向性ドメイン
   を含む、抗腫瘍アンタゴニスト。
2. 前記ＥＣＤは、配列番号８９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
3. 前記第２の標的指向性ドメインはＰＤ‐１に特異的に結合する、請求項１又は２に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
4. 前記第２の標的指向性ドメインは：
   （１）３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）であって、
   前記ＨＣＤＲ１は、配列番号１、４、７、９、及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
   前記ＨＣＤＲ２は、配列番号２、５、１０、及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
   前記ＨＣＤＲ３は、配列番号３、６、８、１１、及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；並びに
   （２）３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、免疫グロブリンＬＣＶＲであって
   前記ＬＣＤＲ１は、配列番号１５、１８、２１、２１〜２３、及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
   前記ＬＣＤＲ２は、配列番号１６、１９、２４、及び２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
   前記ＬＣＤＲ２は、配列番号１７、２０、２５、及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＬＣＶＲ
   を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
5. 配列番号２９、３１、３３、３５、３７、及び３９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、免疫グロブリンＨＣＶＲ；並びに／又は
   配列番号３０、３２、３４、３６、３８、及び４０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、免疫グロブリンＬＣＶＲ
   を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
6. 配列番号２９、３１、３３、３５、３７、及び３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、免疫グロブリンＨＣＶＲ；並びに／又は
   配列番号３０、３２、３４、３６、３８、及び４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、免疫グロブリンＬＣＶＲ
   を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
7. 配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、免疫グロブリンＨＣＶＲ；及び／又は
   配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、免疫グロブリンＬＣＶＲ
   を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
8. 配列番号３９のアミノ酸配列を含む、免疫グロブリンＨＣＶＲ；及び／又は
   配列番号４０のアミノ酸配列を含む、免疫グロブリンＬＣＶＲ
   を含む、請求項７に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
9. 配列番号９２若しくは配列番号１０６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、免疫グロブリン重鎖；及び／又は
   配列番号９３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、免疫グロブリン軽鎖
   を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
10. 配列番号１０７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、免疫グロブリン重鎖；及び／又は
    配列番号１０８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、免疫グロブリン軽鎖
    を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
11. 前記第２の標的指向性ドメインはＰＤ‐Ｌ１に特異的に結合し、
    前記第２の標的指向性ドメインは：
    （１）３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、免疫グロブリンＨＣＶＲであって、
    前記ＨＣＤＲ１は、配列番号４１、４４、５０、及び５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
    前記ＨＣＤＲ２は、配列番号４２、４５、４７、４９、５１、及び５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
    前記ＨＣＤＲ３は、配列番号４３、４６、４８、５２、及び５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＨＣＶＲ；並びに
    （２）３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、免疫グロブリンＬＣＶＲであって、
    前記ＬＣＤＲ１は、配列番号５６、５９、６３、６６、及び６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
    前記ＬＣＤＲ２は、配列番号５７、６０、６４、６７、及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
    前記ＬＣＤＲ３は、配列番号５８、６１、６２、６５、６８、及び７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＬＣＶＲ
    を含む、請求項１又は２に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
12. 配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、及び８６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、免疫グロブリンＨＣＶＲ；並びに／又は
    配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、及び８７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、免疫グロブリンＬＣＶＲ
    を含む、請求項１１に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
13. 配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、及び８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＨＣＶＲ；並びに／又は
    配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、及び８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＬＣＶＲ
    を含む、請求項１２に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
14. 配列番号８６のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＨＣＶＲ、及び／又は配列番号８７のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＬＣＶＲを含む、請求項１３に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
15. 配列番号９４若しくは配列番号１２６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、免疫グロブリン重鎖；及び／又は
    配列番号９５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、免疫グロブリン軽鎖
    を含む、請求項１１に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
16. 配列番号１０９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、免疫グロブリン重鎖；及び／又は
    配列番号１１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、免疫グロブリン軽鎖
    を含む、請求項１１に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
17. 前記第２の標的指向性ドメインは、ＶＥＧＦに特異的に結合する、請求項１又は２に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
18. 配列番号８８のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
19. 前記第２の標的指向性ドメインは、配列番号９０又は配列番号９６のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＨＣＶＲを含む、請求項１７に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
20. 配列番号１０５のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖を含む、請求項１７又は１８に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
21. 配列番号１０２のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖；及び／又は
    配列番号１０３のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖
    を含む、請求項１９に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
22. 配列番号１０４のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖；及び／又は
    配列番号１０３のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖
    を含む、請求項１９に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
23. ＶＥＧＦに結合する抗腫瘍アンタゴニストであって、
    前記アンタゴニストは、哺乳類細胞中での発現の改善を提供する変異を含む、抗腫瘍アンタゴニスト。
24. 前記アンタゴニストは、配列番号９６のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖を含む、請求項２３に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
25. 前記アンタゴニストは、配列番号９１のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＬＣＶＲを含む、請求項２３又は２４に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
26. 前記第１の標的指向性ドメインは、ペプチドリンカーを介して前記免疫グロブリン足場に結合される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
27. 前記ペプチドリンカーは、配列番号１０１又は配列番号１１２のアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
28. 免疫グロブリン足場を含み、
    前記免疫グロブリン足場は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４足場である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
29. 前記免疫グロブリン足場は、Ｎ２９７Ａ変異及び／又はＫ４４７Ａ変異を含有するＩｇＧ１足場である、請求項２８に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
30. 前記免疫グロブリン足場は、配列番号１００、１１５〜１２２、及び１２７〜１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２８又は２９に記載の抗腫瘍アンタゴニスト。
31. 被験者の体内の細胞増殖性障害を治療する方法であって、
    それを必要とする被験者に、有効量の請求項１〜３０のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニストを投与するステップを含む、方法。
32. 請求項１〜３０のいずれか１項に記載の抗腫瘍アンタゴニストをコードする、１つ以上の核酸。
33. 請求項３２に記載の１つ以上の核酸を含む、１つ以上の発現ベクター。
34. 請求項３３に記載の１つ以上の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。

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