CN109071656B - 检查点调节物拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

公开的是特异性结合TIGIT、PD‑1和/或PD‑L1的检查点调节物拮抗剂。还公开了制造和使用所述检查点调节物抑制剂的方法，包括其单特异性、双特异性和三特异性检查点调节物拮抗剂。

Description

检查点调节物拮抗剂
本申请要求于2017年1月5日提交的美国临时专利申请序列号62/442,642的优先权。上述申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请一般涉及癌症治疗，并且特别地，涉及检查点调节物拮抗剂，包括能够调节与抗肿瘤免疫有关的途径的抗T细胞Ig和ITIM结构域(TIGIT)抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂，包括其双特异性和三特异性检查点调节物拮抗剂。
背景技术
宿主无法消除癌细胞仍然是一个主要问题。尽管越来越多的治疗性单克隆抗体已被批准用于治疗各种癌症，但是鉴于癌症生长和进展至转移的许多不同分子途径，经常观察到出现对这些抗体的抗性。虽然免疫系统是预防癌症的主要机制，但癌细胞可以抵抗免疫监视。自然控制机制已被确定为限制T细胞激活，以防止由于不受限制的T细胞活性造成的附带损伤。这个过程已被肿瘤细胞利用来逃避免疫反应。恢复免疫效应细胞特别是T细胞以识别和消除癌症的能力是免疫疗法的主要目标。
T细胞Ig和ITIM结构域(TIGIT)蛋白是一种免疫调节剂，其可以阻断针对癌细胞的T细胞免疫。TIGIT拮抗剂和其他免疫检查点拮抗剂干扰(或抑制)免疫检查点调节物的活性，因此，作为与检查点调节物或其配体结合的结果，通过检查点调节物受体的信号传导被阻断或抑制。除TIGIT外，其他免疫检查点调节物还包括TIGIT配体CD112、CD155，PD-1及其配体PD-L1和PD-L2；CTLA-4及其配体B7-1和B7-2；TIM-3及其配体半乳糖凝集素-9；LAG-3及其配体，包括肝窦内皮细胞凝集素(LSECtin)和半乳糖凝集素-3；CD122及其CD122R配体；B7H3，B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)和VISTA。
需要存在改进的治疗性结合拮抗剂或抗体以及用这些试剂治疗癌症和慢性病毒感染的方法。用于这种改进的治疗方法的药物可以包含特异性结合TIGIT、PD-1和/或PD-L1并且逆转或部分逆转TIGIT-、PD-1和/或PD-L1介导的抑制抗肿瘤或抗病毒免疫应答的抗体或抗体片段。
鉴于宿主消除癌细胞的能力的限制，需要存在更有效的用于癌症治疗的组合物和方法。
发明内容
概要
本申请的一个方面涉及抗体或其抗原结合部分，包含：(1)重链可变区，其中所述重链可变区包含三个互补决定区(HCDR)：HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1具有与选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20和SEQID NO：23的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，其中HCDR2具有与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21和SEQID NO：24的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，并且其中HCDR3具有与选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；和(2)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含三个互补决定区(LCDR)：LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1具有与选自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，其中LCDR2具有与选自SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，并且其中LCDR3具有与选自SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人TIGIT。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分包含：(1)重链可变区，其具有与选自SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123和SEQ ID NO：125的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；和(2)轻链可变区，其具有与选自SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ IDNO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124和SEQ ID NO：126的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人TIGIT。
本申请的另一个方面涉及抗体或其抗原结合部分，包含：(1)重链可变区，其中所述重链可变区包含三个互补决定区(HCDR)：HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1具有与选自SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：59的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，其中HCDR2具有与选自SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：60的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，并且其中HCDR3具有与选自SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：58和SEQID NO：61的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；和(2)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含三个互补决定区(LCDR)：LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1具有与选自SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：73的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，其中LCDR2具有与选自SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，并且其中LCDR3具有与选自SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：75的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人PD-1。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分包含：(1)重链可变区，其具有与选自SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：137的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；(2)轻链可变区，其具有与选自SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：138的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，其中抗所述体或其抗原结合部分特异性结合人PD-1。
本申请的另一个方面涉及抗体或其抗原结合部分，包含：(1)重链可变区，其中所述重链可变区包含三个互补决定区(HCDR)：HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1具有与选自SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：88的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，其中HCDR2具有与选自SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86和SEQ IDNO：89的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，并且其中HCDR3具有与选自SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：90的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；和(2)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含三个互补决定区(LCDR)：LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1具有与选自SEQ ID NO：91、SEQ IDNO：94、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：104的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，其中LCDR2具有与选自SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：102和SEQ ID NO：105的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，并且其中LCDR3具有与选自SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100、SEQID NO：103和SEQ ID NO：106的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人PD-L1。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分包含：(1)重链可变区，其具有与选自SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：147、SEQID NO：149、SEQ ID NO：151和SEQ ID NO：153的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；和(2)轻链可变区，其具有与选自SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ IDNO：150、SEQ ID NO：152和SEQ ID NO：154的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人PD-L1。
本申请的另一方面涉及双特异性抗体，包含：第一抗原结合域，其包含本申请的抗TIGIT、抗PD-1和/或抗PD-L1抗体的抗原结合部分；和第二抗原结合域，其包含本申请的另一种抗TIGIT、抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体的抗原结合部分。
在一个实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂TP-M2T8P5包含：(1)重链可变区，其具有与SEQ ID NO：155中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；(2)可变轻链可变区，其具有与SEQ ID NO：156中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂TP-M4T8P5包含：(1)轻链可变区2/重链可变区1(VL2/VH1)，其具有与SEQ ID NO：157中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；和(2)重链可变2区/轻链可变区1(VH2/VL1)，其具有与SEQ ID NO：158中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂TP-M6T8P5包含：(1)重链可变区，其具有与SEQ ID NO：159中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；(2)轻链可变区2/轻链恒定区(VL2/CL)，其具有与SEQ ID NO：160中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；和(3)重链可变区1/重链恒定区1(VH1/CH1)，其具有与SEQID NO：161中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂TP-M6T8L8包含：(1)重链可变区，其具有与SEQ ID NO：162中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；(2)轻链可变区2/轻链恒定区(VL2/CL)，其具有与SEQ ID NO：163中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；和(3)重链可变区1/重链恒定区1(VH1/CH1)，其具有与SEQID NO：164中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂TP-M8T10P1(TP-83)包含：(1)重链可变区，其具有与SEQ ID NO：165中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；和(2)轻链，其具有与SEQ ID NO：166中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂TP-M9T10P1(TP-93)包含：(1)重链，其与SEQ ID NO：167中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性；和(2)轻链，其具有与SEQ ID NO：168中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂TP-M9T10P5包含：(1)重链，其与SEQ ID NO：169中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性；和(2)轻链，其具有与SEQ ID NO：170中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂TP-M10T8P5(TP-92)包含：(1)重链，其与SEQ ID NO：171中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性；和(2)轻链可变区，其具有与SEQ ID NO：172中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂TP-M10T8L8包含与SEQ IDNO：173中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂TP-M14T8P5包含：(1)重链可变区2/重链恒定区1(VH2/CH1)，其具有与SEQ ID NO：174中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；(2)可变轻链区1/重链恒定区1(VL1/CH1)，其具有与SEQ ID NO：175中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；(3)轻链可变区2/轻链恒定区(VL2/CL)，其具有与SEQ ID NO：176中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；和(4)重链可变区1/轻链恒定区(VH1/CL)，其具有与SEQ ID NO：177中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂TP-M14T8L8包含：(1)重链可变区2/重链恒定区1(VH2/HC1)，其具有与SEQ ID NO：178中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；(2)可变轻链区1/重链恒定区2(VL1/HC2)，其具有与SEQ ID NO：179中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；(3)轻链可变区2/轻链恒定区(VL2/CL)，其具有与SEQ ID NO：180中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列；和(4)重链可变区1/轻链恒定区(VH1/CL)，其具有与SEQ ID NO：181中的氨基酸序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％至约100％同源性的氨基酸序列。
本申请的另一个方面涉及编码本申请的抗体、其抗原结合片段或双特异性抗体的核酸。
本申请的另一方面涉及包含本申请的核酸的表达载体。
本申请的另一方面涉及用本申请的表达载体转化的宿主细胞。
本申请的另一个方面涉及生产抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、其抗原结合片段的方法，包括单特异性、双特异性和三特异性检查点调节物拮抗剂，以及它们的组合。
本申请的另一个方面涉及减少或消耗有此需要的受试者的肿瘤中的调节性T细胞的方法，包括：向所述受试者施用有效量的本申请的抗体、抗体片段或双特异性检查点调节物拮抗剂。
附图说明
图1显示抗TIGIT单克隆抗体(mab)竞争TIGIT和PVR(CD155)(TIGIT配体)的结果。
图2显示抗TIGIT小鼠单克隆抗体增强人T细胞功能。
图3A-C显示抗TIGIT小鼠单克隆抗体的CDR序列(图3A)；抗PD-1小鼠单克隆抗体(图3B)；和抗PD-L1小鼠单克隆抗体(图3C)。
图4A-H显示了抗TIGIT抗体可变结构域序列的几个实施方式(图4A-C)；抗PD-1抗体可变结构域序列(图4D-E)；抗PD-L1抗体可变结构域序列(图4F-H)。
图5A-G显示了示例性的针对PD1和TIGIT的双特异性检查点调节物拮抗剂序列。
图6显示了抗TIGIT小鼠单克隆抗体与表达全长人TIGIT(hu TIGIT)的细胞的结合。
图7显示在基于细胞的测定中，抗TIGIT单克隆抗体阻断hu TIGIT与其配体人PVR(CD155)之间的相互作用。
图8显示抗TIGIT单克隆抗体增强由人PBMC产生IFN-γ。
图9显示抗TIGIT单克隆抗体增强原代人T细胞增殖。
图10A显示在基于细胞的测定中抗TIGIT单克隆抗体与hu TIGIT和cyno-hu TIGIT的结合。图10B显示在基于细胞的测定中抗TIGIT单克隆抗体抑制抗体与hu TIGIT和cyno-hu TIGIT的结合。
图11A显示抗PD-1单克隆抗体阻断人PD-1与人PD-L1之间的相互作用。图11B显示抗PD-1单克隆抗体阻断cyno hu PD-1与cyno hu PD-L1之间的相互作用。
图12A显示了抗PD-1单克隆抗体与hu PD-L1的结合。图12B显示抗PD-1单克隆抗体与cyno-hu PD-L1的结合。
图13A-C显示了抗PD-1抗体对人PD-1的结合亲和力，包括PD-01单克隆抗体(图13A)，PD-02单克隆抗体(图13B)和基准(BM)抗PD-1单克隆抗体(图13C)。
图14显示了抗PD-1单克隆抗体提高了由人PBMC产生IFN-γ。
图15显示通过抗TIGIT和抗PD-1单克隆抗体的组合增加的由人PBMC的IFN-γ产生。
图16A和16B显示通过抗TIGIT和抗PD-1单克隆抗体的组合增加的人T细胞增殖的增殖。
图17A-17N显示了多种不同的双特异性检查点调节物拮抗剂M1-M14，其中：(1)VH1和VL1区域对应于抗PD1，抗PD-L1或任何其他单克隆抗体可变结构域；和(2)VH2和VL2区域对应于抗TIGIT可变结构域。
图18A-18J显示了各种不同的三特异性检查点调节物拮抗剂，其中：(1)VH1和VL1区域对应于抗TIGIT可变结构域；(2)VH2和VL21区域对应于抗PD1，抗PD-L1或任何其他单克隆抗体可变结构域；和(3)圆形区域对应于AMG386或任何其他生物肽。
图19A-D显示用于识别能够阻断PD-1结合(图19A，图19B)和TIGIT结合(图19C，图19D)的双特异性抗体的筛选测定的结果。
图20A-B显示了双特异性抗体(TP-83，TP-92和TP-B)阻断PD-L1与PD-1结合(图20A)以及阻断PVR与TIGIT结合(图20B)的能力。
图21A和21B显示了显示产生双特异性抗体TP-83、TP-92和TP-93的Coomasie染色的凝胶。
图22显示双特异性检查点拮抗剂TP-93和TP-83的示例性尺寸排阻色谱(SEC)曲线，说明一步纯化后分子的可制造性。
图23A-D显示相对于单独的抗TIGIT(T-08)和抗PD-1(PD-01)单克隆抗体，用双特异性单克隆抗体(TP-93)增加了由人PBMC(供体333，图23A，图23C；供体287，图23B，图23D)的IFN-γ产生。
具体实施方式
详细说明
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。必须注意的是，除非上下文另外明确指出，否则如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数形式。因此，例如，提及“一种肽”包括“一种或多种”肽或“多种”这样的肽。关于本申请的教导，本申请中描述的任何已发布的专利或专利申请公开明确地通过引用并入本文。
如本文所用，术语“TIGIT”是指保留至少部分TIGIT活性的任何形式的TIGIT及其变体。除非另有说明，例如通过特别提到人TIGIT，否则TIGIT包括全部哺乳动物物种(例如，人，犬，猫，马和牛)的天然序列TIGIT。以下是示例性的人TIGIT氨基酸序列：MTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPLLGAMAATLVVICTAVIVVVALTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG(SEQ ID NO:182)
如本文所用，术语“PD-1”是指保留PD-1的至少部分活性的任何形式的PD-1及其变体。除非另有说明，例如通过特别提到人PD-1，否则PD-1包括全部哺乳动物物种(例如，人，犬，猫，马和牛)的天然序列PD-1。下面列出示例性的人PD-1氨基酸序列：
LDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL(SEQ ID NO:183)。
如本文所用，术语“PD-L1”是指保留PD-L1的至少部分活性的任何形式的PD-L1及其变体。除非有不同的指示，例如通过特别提到人PD-L1，否则PD-L1包括全部哺乳动物物种(例如，人，犬，猫，马和牛)的天然序列PD-L1。下面列出了示例性的人PD-L1氨基酸序列：FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNER(SEQ ID NO:184)。
术语“激动剂”是指促进(即，诱导、引起、增强或增加)另一种分子的生物学活性或作用的物质。术语激动剂包括结合受体的物质(如抗体)，以及促进受体功能而不与其结合(例如，通过激活相关蛋白质)的物质。
术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指防止、阻断、抑制、中和或降低另一分子(如受体)的生物活性或作用的物质。
如本文所用，术语“抗体”是指通过一个或多个免疫球蛋白可变区特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整抗体，抗原结合片段或其单链。术语“抗体”涵盖可以在生物化学上区分的各种广泛类型的多肽。本领域技术人员将会理解，重链在它们中用一些亚类(例如，γ1-γ4)被分类为alpha(希腊字母的第一个字母)、delta(希腊字母的第四个字母)、epsilon(希腊字母的第五个字母)、gamma(希腊字母的第三个字母)和mu(希腊字母的第十二个字母)，或α、δ、ε、γ和μ)。正是这链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等已被充分表征，并且已知赋予功能特化。鉴于本公开内容，这些类别和同种型中的每一个的修改版本对于本领域技术人员是容易辨别的，并且因此在本公开的范围内。所有免疫球蛋白类别都在本公开的范围内，下面的讨论通常针对IgG类免疫球蛋白分子。
本公开的抗体包括但不限于多克隆，单克隆，多特异性，双特异性，三特异性，人的，人化的，灵长类化的，嵌合和单链抗体。本文公开的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人，鼠，驴，兔，山羊，天竺鼠，骆驼，美洲驼，马或鸡抗体。在一些实施方式中，可变区可以是condricthoid起源(例如来自鲨鱼)。
术语“抗体片段”或“抗原结合片段”参照抗体的一部分使用，例如F(ab')2，F(ab)2，Fab'，Fab，Fv，单链Fvs(scFv)，单链抗体，二硫键连接的Fvs(sdFv)，包含VL或VH结构域的片段，由Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗Id)抗体。无论结构如何，抗体片段都与完整抗体识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”包括适体，镜像异构体和双抗体。术语“抗体片段”还包括任何合成或基因工程蛋白质，其包含通过与特定抗原结合形成复合物起抗体作用的免疫球蛋白可变区。
“单链片段可变”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。在一些方面，所述区域与10至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以获得灵活性，以及用于溶解性的丝氨酸或苏氨酸的，并且可以连接VH的N端和VL的C端，反之亦然。尽管去除了恒定区和引入了接头，但该蛋白质仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。
关于IgG，标准免疫球蛋白分子包含两个相同的分子量约为23,000道尔顿的轻链多肽和两个相同的分子量为53,000-70,000的重链多肽。这四条链典型地通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”的口开始并继续通过可变区支撑重链。
轻链和重链均分为结构和功能同源性。术语“恒定”和“可变”在功能上使用。就此而言，应该理解轻链(VL)和重链(VH)链部分的可变结构域决定了抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1，CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘流动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，常规抗体中恒定区结构域的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。在常规抗体中，N端部分是可变区，在C端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。
如上所述，可变区允许抗体选择性识别并特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL结构域和VH结构域，或互补决定区(CDR)的亚类结合形成限定三维抗原结合位点的可变区。该四元抗体结构(quaternary antibody structure)形成存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由VH和VL链每条链上的三个CDR(即CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3，CDR-L1，CDR-L2和CDR-L3)限定。在一些情况下，例如，某些免疫球蛋白分子来自骆驼科动物物种或基于骆驼科动物免疫球蛋白工程化改造。或者，免疫球蛋白分子可以仅由重链组成，不含轻链，或仅由轻链组成，不含重链。
在天然存在的抗体中，每个抗原结合域中存在的六个CDR是短的，非连续的氨基酸序列，当抗体在含水环境中呈现其三维构型时，这些氨基酸特异性地定位以形成抗原结合域。被称为“框架”区域的抗原结合域中的其余氨基酸显示出较小的分子间可变性。框架区大部分采用β-折叠构象，并且CDR形成环，其连接，并且在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。因此，框架区起到形成支架的作用，该支架通过链间非共价相互作用提供了将CDR置于正确方向的位置。由定位的CDR形成的抗原结合域限定与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进抗体与其同源表位的非共价结合。本领域普通技术人员可以容易地鉴定包含CDR和框架区的氨基酸对于任何给定的重链或轻链可变区，因为它们已被精确定义。
如本文所用，术语“VH1”和“VH2”是指对应于两种不同结合特异性的免疫球蛋白重链可变结构域。同样，术语“VL1”和“VL2”是指对应于两种不同结合特异性的轻链可变结构域。当一起使用时，应该理解的是VH1和VL1区限定了共同的结合特异性并且VH2和VL2区限定了第二结合特异性。
轻链分为kappa(希腊文字母第十个字母)或lambda(希腊文字母第十一个字母)(K，λ)。每个重链类可以与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链彼此共价结合，并且当免疫球蛋白由杂交瘤B细胞或基因工程宿主细胞产生时，两条重链的“尾部”部分通过共价二硫键或非共价键相互键合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉形末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。
如本文所用，术语“轻链恒定区”包括衍生自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。
如本文所用，术语“重链恒定区”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽包含下列中的至少一个：CH1结构域，铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。例如，用于本公开的抗原结合多肽可以包含含有CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH3结构域的多肽链，或包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在一些实施方式中，本公开内容的多肽包含含有CH3结构域的多肽链。此外，用于本公开的抗体可缺少CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。应该理解，可以修饰重链恒定区使得它们在天然存在的免疫球蛋白分子的氨基酸序列中发生变化。
本文公开的抗体的重链恒定区可以源自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包含源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链恒定区可以包含部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可以包含部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG4分子的嵌合铰链。
“轻链-重链对”是指可以通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。
各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。如本文所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，以及术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(大部分氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域与VH结构域相邻并且是免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基端。
如本文所用，术语“CH2结构域”包括使用常规编号方案例如从抗体的约第244号残基延伸至至第360号残基的重链分子的部分(残基244至360，Kabat编号系统；以及残基231-340，EU编号系统)。CH2域是独特的，因为它不与另一个域紧密配对。相反，两个N-连接的分支碳水化合物链插入完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C-末端并包含约108个残基。
如本文所用，术语“铰链区”包括将CH1结构域连接至CH2结构域的重链分子的部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N端抗原结合区独立移动。铰链区可以细分为三个不同的结构域：上部、中部和下部铰链结构域。
如本文所用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可形成二硫键或与第二巯基桥连的巯基。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，并且两个重链通过两个二硫键在对应于使用Kabat编号系统的239和242的位置连接(位置226或229，EU编号系统)。
如本文所用，抗体、抗体片段或抗体结构域的“变体”是指：(1)与原始抗体、抗体片段或抗体结构域共享至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性的抗体、抗体片段或抗体结构域，和(2)特异性结合与原始抗体、抗体片段或抗体结构域特异性结合的相同靶标的抗体、抗体片段或抗体结构域。
应该理解的是，在本文呈现序列同源性范围的情况下，如，例如短语“约80％至约100％”，这样的实施方式包括其中的任何和所有子范围，其中较低数目可以是80和100之间的任何整数。
如本文所用，短语“人化抗体”是指源自非人抗体的抗体，通常是小鼠单克隆抗体。或者，人化抗体可以来源于嵌合抗体，其保留或基本上保留了亲本非人抗体的抗原结合特性，但与亲本抗体相比，当施用于人时表现出与亲本抗体相比降低的免疫原性。
如本文所用，短语“嵌合抗体”是指其中免疫反应性区域或位点获自或衍生自第一物种并且恒定区(根据本公开可以是完整的、部分的或修改的)获自第二物种。在某些实施方式中，靶结合区或位点将来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)并且恒定区是人的。
包括在本申请的多特异性抗体的范围内的是各种组合物和方法，包括不对称的IgG样抗体(例如，triomab/细胞杂交瘤，Trion Pharma/Fresenius Biotech)；knobs-into-holes抗体(基因泰克)；Cross Mab(罗氏)；静电匹配抗体(AMGEN)；LUZ-Y(基因泰克)；链交换工程化结构域(SEED)体(EMD Serono；biolonic，Merus)；Fab交换的抗体(Genmab)，对称的IgG样抗体(例如双重靶向(DT)-Ig(GSK/Domantis)；二合一抗体(基因泰克)；交联的Mab(Karmanos癌症中心)，mAb2(F-star)；Cov X-body(Cov X/Pfizer)；双可变结构域(DVD)-Ig融合(Abbott)；IgG样双特异性抗体(Eli Lilly)；Ts2Ab(Medimmune/AZ)；BsAb(ZymoGenetics)；HERCULES(Biogen Idec，TvAb，罗氏)；scFv/Fc融合；SCORPION(EmergentBioSolutions/Trubion,ZymoGenetics/BMS)；双亲和再靶向技术(Fc-DART)，MacroGenics；双(scFv)2-Fabs(国家抗体医学研究中心)；F(ab)2融合(Medarex/AMGEN)；双作用或Bis-Fab(基因泰克)；Dock-and-Lock(DNL，ImmunoMedics)；Fab-Fv(UCB-Celltech)；基于scFv和双抗体的抗体(例如，双特异性T细胞接合物(BiTE，Micromet)；串联双抗体(Tandab，Affimed)；DART(MacroGenics)；单链双抗体；TCR样抗体(AIT，Receptor Logics)；人血清白蛋白scFv融合(Merrimack)；COMBODIES(Epigen Biotech)；和IgG/非IgG融合物(例如免疫细胞因子(EMDSerono，Philogen，ImmunGene，ImmunoMedics)。
通过“特异性结合”或“对…具有特异性”，通常意味着抗体通过其抗原结合域与表位结合，并且该结合需要抗原结合域和表位之间的一些互补性。根据该定义，当抗体相比于其将结合随机的，不相关的表位而言更容易通过其抗原结合域与表位结合时，抗体被称为“特异性结合”该表位。术语“特异性”在本文中用于限定某种抗体与某个表位结合的相对亲和力。例如，可以认为抗体“A”对给定表位具有比抗体“B”更高的特异性，或抗体“A”可以说比与其相关表位“D”相比结合具有更高的特异性的表位“C”。在一些实施方式中，如果抗体或抗体片段以10-6M或更小，10-7M或更小，10-8M或更小，10-9M或更小或10-10M或更小的解离常数(Kd)与抗原形成复合物，则所述抗体或抗体片段“对于所述抗原具有特异性”。
如本文所用，短语“嵌合抗体”是指其中免疫反应性区域或位点获自或衍生自第一物种并且恒定区(根据本公开可以是完整的、部分的或修改的)获自第二物种。在某些实施方式中，靶结合区或位点将来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)并且恒定区是人的。
术语“拮抗剂抗体”是指与靶标结合并防止或降低该靶标的生物学作用的抗体。在一些实施方式中，该术语可以表示阻止与其结合的靶标例如TIGIT执行生物学功能的抗体。
如本文所用，“抗PD-1拮抗剂抗体”是指能够抑制由PD-1介导的PD-1生物学活性和/或下游事件的抗体。抗PD-1拮抗剂抗体包括阻断、拮抗、抑制或降低(到任何程度，包括显著)PD-1生物学活性的抗体，包括由PD-1介导的下游事件，如PD-1结合和下游信号传导，抑制T细胞增殖，抑制T细胞活化，抑制IFN分泌，抑制IL-2分泌，抑制TNF分泌，诱导IL-10和抑制抗肿瘤免疫应答。为了本发明的目的，将明确理解的是，术语“抗PD-1拮抗剂抗体”(可互换地称为“拮抗剂PD-1抗体”，“拮抗剂抗PD-1抗体”或“PD-1拮抗剂抗体”)包括所有先前鉴定的术语、标题和功能状态和特征，由此PD-1本身，PD-1生物学活性或生物学活性的后果在任何有意义的程度上基本上无效、减少或中和。在一些实施方式中，抗PD-1拮抗剂抗体结合PD-1并上调抗肿瘤免疫应答。
如本文所用，“抗PD-L1拮抗剂抗体”是指能够抑制由PD-L1介导的PD-L1生物学活性和/或下游事件的抗体。抗PD-L1拮抗剂抗体包括阻断、拮抗，抑制或降低(到任何程度，包括显著)PD-L1生物学活性的抗体，包括由PD-1介导的下游事件，如PD-1结合和下游信号传导，抑制T细胞增殖，抑制T细胞活化，抑制IFN分泌，抑制IL-2分泌，抑制TNF分泌，诱导IL-10和抑制抗肿瘤免疫应答。为了本发明的目的，将明确理解的是，术语“抗PD-L1拮抗剂抗体”包括(可互换地称为“拮抗剂PD-L1抗体”，“拮抗剂抗PD-L1抗体”或“PD-L1拮抗剂抗体”)所有先前鉴定的术语、标题和功能状态和特征，由此PD-L1本身，PD-L1生物学活性或生物学活性的后果在任何有意义的程度上基本上无效，减少或中和。在一些实施方式中，抗PD-L1拮抗剂抗体结合PD-L1并上调抗肿瘤免疫应答。短语“免疫检查点调节物”是指通过免疫检查点抑制或刺激信号传导的功能类别的试剂。“免疫检查点调节物”包括受体及其相关配体，它们一起提供抑制或刺激否则会导致T细胞活化的信号传导通路的手段。
短语“免疫检查点结合拮抗剂”和“免疫检查点拮抗剂”在本文中可参照干扰(或抑制)免疫检查点调节物活性的试剂的类别互换使用，因此，作为与检查点调节物或其配体结合的结果，通过检查点调节物受体的信号传导被阻止或抑制。通过抑制这种信号传导，可以逆转免疫抑制，从而可以重新建立或增强针对癌细胞的T细胞免疫。示例性免疫检查点拮抗剂包括但不限于TIGIT及其CD155配体PVR；PD-1及其配体PD-L1和PD-L2；CTLA-4及其配体B7-1和B7-2；TIM-3及其配体半乳糖凝集素-9；LAG-3及其配体，包括肝窦内皮细胞凝集素(LSECtin)和半乳糖凝集素-3；CD122及其CD122R配体；CD70，B7H3，B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)和VISTA。免疫检查点调节物拮抗剂包括抗体片段，肽抑制剂，显性负性肽和小分子药物，以分离的形式或作为融合蛋白或缀合物的一部分。
短语“免疫检查点结合激动剂”和“免疫检查点激动剂”在本文中可参考刺激免疫检查点调节物活性的试剂的类别互换使用，因此，作为与检查点调节物或其配体结合的结果，通过检查点调节物受体的信号传导被刺激。通过刺激这种信号传导，可以重新建立或增强对抗癌细胞的T细胞免疫。示例性免疫检查点调节物激动剂包括但不限于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员，如CD27、CD40、OX40(CD134)，糖皮质激素诱导的TNFR家族相关蛋白(GITR)和4-1BB(CD137)和它们的配体。其他检查点调节物激动剂属于B7-CD28超家族，包括CD28和ICOS。
短语“显性负性蛋白质”或“显性负性肽”是指来自野生型蛋白质的蛋白质或肽，其已经通过突变和/或缺失遗传修饰使得修饰的蛋白质或肽干扰其来源的内源野生型蛋白质的功能。
短语“VEGF结合拮抗剂”是指与VEGF-A或其受体VEGFR-2结合的一类功能性试剂，因此，作为结合的结果，VEGF-A对VEGFR-2的激活被阻断或抑制。如本文所用，术语“VEGF结合拮抗剂”包括抗体片段，肽抑制剂，显性负性肽和小分子药物，以分离的形式或作为融合蛋白或缀合物的一部分。
短语“Tie2酪氨酸激酶受体结合拮抗剂”是指结合Tie2酪氨酸激酶受体或其配体之一的功能类别的试剂，作为结合的结果，Tie2酪氨酸激酶受体或其一个或多个配体(即Ang1，Ang2，Ang3和Ang4)的活化被阻断或抑制。如本文所用，术语“Tie2酪氨酸激酶受体结合拮抗剂”包括抗体片段，肽抑制剂，显性负性肽和小分子药物，以分离的形式或作为融合蛋白或缀合物的一部分。
短语“小分子药物”是指分子实体，通常是有机或有机金属，不是聚合物，具有药物活性，并且其分子量小于约2kDa，小于约1kDa，小于约900Da，小于约800Da或小于约700Da。除了蛋白质或核酸之外，该术语还包括大多数被称为“药物”的医药化合物，尽管小肽或核酸类似物可以被认为是小分子药物。例子包括化疗抗癌药物和酶抑制剂。小分子药物可以合成地、半合成地(即从天然存在的前体)或生物学地获得。
如本文所用，术语“重组”是指不是天然存在的多肽或多核苷酸，其可以通过以通常不会一起发生的排列组合多核苷酸或多肽而产生。本文所述的检查点调节物拮抗剂根据定义是“重组的”。
当描述在各个结构域之间具有连字号的多肽结构域排列(例如，CH2-CH3)时，应该理解，列出的结构域的顺序是从氨基末端到羧基末端。
通过“特异性结合”或“对…具有特异性”，通常意味着抗体通过其抗原结合域与表位结合，并且该结合需要抗原结合域和表位之间的一些互补性。根据该定义，当抗体相比于其将结合随机的，不相关的表位而言更容易通过其抗原结合域与该表位结合时，抗体被称为“特异性结合”该表位。术语“特异性”在本文中用于限定某种抗体与某个表位结合的相对亲和力。例如，可以认为抗体“A”对给定表位具有比抗体“B”更高的特异性，或抗体“A”可以说比与其相关表位“D”相比结合具有更高的特异性的表位“C”。
术语“免疫缀合物”是指通过共价键与抑制肽或小分子药物融合的抗体。肽或小分子药物可以连接于恒定重链的C端或可变轻链和/或重链的N端。
可以使用“连接物”以稳定的共价方式将肽或小分子药物(如美登木素生物碱)与检查点调节物拮抗剂连接。在化合物或抗体保持活性的条件下，连接物可能对酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割敏感或基本上耐受对酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割。合适的连接物在本领域中是众所周知的，并且包括例如二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。连接物还包括带电连接物，以及本文所述和本领域已知的其亲水形式。免疫缀合物可进一步在检查点调节物拮抗剂与肽和/或小分子药物之间包含柔性3-15个氨基酸的肽(或间隔物)。
如本文所用，短语“多特异性抑制剂”是指包含至少两个具有不同结合特异性的靶向结构域的分子。在一些实施方式中，多特异性抑制剂是包含支架和两种或更多种靶向不同抗原或表位的免疫球蛋白抗原结合域的多肽。在某些实施方式中，多特异性抑制剂是双特异性抗体。
如本文所用，短语“双特异性检查点调节物拮抗剂”是指包含至少两个具有不同结合特异性的靶向结构域的分子。每个靶向结构域能够与靶分子特异性结合并且在结合靶分子时抑制靶分子的生物学功能。在一些实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂是具有两种或更多种肽的聚合物分子。在一些实施方式中，靶向结构域包含抗体的抗原结合域或CDR。在一些实施方式中，双特异性抑制剂是双特异性抗体。
术语“双特异性抗体”和“双特异性检查点调节物拮抗剂”在本文中参考可以特异性结合两种不同抗原(或表位)的抗体可交换地使用。在一些实施方式中，双特异性抗体是在其两个结合臂之一(一对HC/LC)上结合一个抗原(或表位)并且在其第二臂(一对不同的HC/LC)上结合不同抗原(或表位)的全长抗体。在这些实施方式中，双特异性抗体具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列中)，并且对于它结合的每种抗原是单价的。
在其他实施方式中，双特异性抗体是全长抗体，其可以在其两个结合臂(两对HC/LC)中的每一个中结合两种不同抗原(或表位)。在这些实施方式中，双特异性抗体具有两个相同的抗原结合臂，具有相同的特异性和相同的CDR序列，并且对于它结合的每种抗原是二价的。
术语“双特异性抗体”和“双特异性检查点调节物拮抗剂”在本文中参考包含三种具有三种不同结合特异性的靶向结构域的分子可互换使用。每个靶向结构域能够与靶分子特异性结合并且在结合靶分子时抑制靶分子的生物学功能。在一些实施方式中，三特异性检查点调节物拮抗剂是具有两种或更多种肽的聚合物分子。在一些实施方式中，靶向结构域包含抗体的抗原结合域或CDR。在一些实施方式中，三特异性检查点调节物拮抗剂是三特异性抗体。
示例性双特异性和三特异性抗体可以包括不对称IgG样抗体(例如，triomab/细胞杂交瘤，Trion Pharma/Fresenius Biotech)；knobs-into-holes抗体(基因泰克)；CrossMAb(罗氏)；静电匹配抗体(AMGEN)；LUZ-Y(基因泰克)；链交换工程化结构域(SEED)体(EMDSerono；biolonic，Merus)；Fab交换的抗体(Genmab)，对称的IgG样抗体(例如双重靶向(DT)-Ig(GSK/Domantis)；二合一抗体(基因泰克)；交联的MAb(Karmanos癌症中心)，mAb2(F-star)；Cov X-body(Cov X/Pfizer)；双可变域(DVD)-Ig融合(Abbott)；IgG样双特异性抗体(Eli Lilly)；Ts2Ab(Medimmune/AZ)；BsAb(ZymoGenetics)；HERCULES(Biogen Idec，TvAb，罗氏)；scFv/Fc融合蛋白；SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion，ZymoGenetics/BMS)；双亲和再靶向技术(Fc-DART)，MacroGenics；双(scFv)2-Fabs(国家抗体医学研究中心)；F(ab)2融合(Medarex/AMGEN)；双作用或Bis-Fab(基因泰克)；Dock-and-Lock(DNL，ImmunoMedics)；Fab-Fv(UCB-Celltech)；基于scFv和双抗体的抗体(例如，双特异性T细胞接合物(BiTE，Micromet)；串联双抗体(Tandab，Affimed)；DART(MacroGenics)；单链双抗体；TCR样抗体(AIT，Receptor Logics)；人血清白蛋白scFv融合(Merrimack)；COMBODIES(Epigen Biotech)；和IgG/非IgG融合物(例如免疫细胞因子(EMDSerono，Philogen，ImmunGene，ImmunoMedics)。
术语“治疗(动词)”和“治疗(名词)”是指改善与细胞增殖性疾病相关的一种或多种症状；预防或延迟细胞增殖性病症的一种或多种症状的发作；和/或减轻细胞增殖性病症的一种或多种症状的严重性或频率。
短语“由此需要的患者”、“需要治疗的患者”或“需要治疗的受治疗者”的包括将受益于施用本公开的检查点调节物拮抗剂以治疗细胞增殖性病症的受试者，例如哺乳动物受试者。
术语“治疗有效量”、“药理学有效量”和“生理有效量”可互换使用，是指被需要以在血流中或在目标组织中提供阈水平的活性拮抗剂试剂的检查点调节物拮抗剂的量。确切的量将取决于许多因素，例如特定的活性剂，组合物的组分和物理特征，预期的患者群体，患者考虑因素等，并且可以由本领域技术人员基于本文提供的信息或在相关文献中以其他方式获得的信息容易地确定。
在本上下文中使用的术语“改善”、“增加”或“减少”指示相对于基线测量的值或参数，例如在本文所述的治疗开始之前在同一个体中的测量，或在没有本文所述治疗的情况下在对照个体(或多个对照个体)中的测量。
“对照个体”是患有与正在接受治疗的个体相同的细胞增殖性疾病的个体，其与被治疗个体的年龄大致相同(以确保治疗个体和对照个体的疾病阶段是可比较的)。治疗的个体(也被称为“病人”或“受试者”)可以是具有细胞增殖性疾病的胎儿、婴儿、儿童、青少年或成人。
术语“细胞增殖性病症”是指以细胞异常增殖为特征的病症。增殖性病症并不意味着对细胞生长速度的任何限制，而仅仅表明丧失了影响生长和细胞分裂的正常对照。因此，在一些实施方式中，增殖性病症的细胞可以具有与正常细胞具有相同的细胞分裂速率，但对限制这种生长的信号没有反应。在“细胞增殖性病症”的范围内是新生物(neoplasm)、癌症或肿瘤。
术语“癌症”是指以能够侵入周围组织和/或转移至新的定植部位的细胞增殖为特征的各种恶性新生物中的任何一种，并且包括白血病、淋巴瘤、癌(carcinoma)、黑素瘤、肉瘤、生殖细胞肿瘤和母细胞瘤。用本发明方法治疗的示例性癌症包括脑癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和子宫癌、白血病和髓母细胞瘤。
术语“白血病”是指造血器官的进行性恶性疾病，并且通常特征在于血液和骨髓中的白细胞及其前体的变形增殖和发育。示例性白血病包括例如急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞白血病、白细胞不增多性白血病、白血病细胞性白血病(leukocythemic leukemia)、嗜碱性颗粒球白血病、干细胞性白血病、牛白血病、慢性粒细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸性粒细胞白血病、格罗斯白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、成血细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、淋巴原白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、微粒白血病、单核细胞白血病、成髓细胞白血病、粒细胞性白血病、髓细胞性白血病、粒单核细胞白血病、内格利白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、前髓细胞性白血病、Rieder细胞白血病、希林白血病、干细胞白血病、亚白血病性白血病和未分化细胞性白血病。
术语“癌”是指上皮细胞的倾向于渗透周围组织并引起转移的恶性生长。示例性的癌包括例如腺泡癌(acinar carcinoma)、腺泡癌(acinous carcinoma)、囊性腺样癌、腺样囊性癌、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底细胞癌(carcinoma basocellulare)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管原癌、髓样癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶体癌、粉刺状癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状细胞癌(cylindrical carcinoma)、柱状细胞癌(cylindrical cell carcinoma)、导管癌、硬粒癌、胚胎性癌、髓样癌、表皮样癌(epiennoidcarcinoma)、腺样基底细胞癌、外植癌、溃疡性癌、硬癌、胶样癌(gelatiniformcarcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌、颗粒细胞癌、毛母质癌、多血癌、肝细胞癌、许特尔细胞癌、透明细胞癌、超形态癌(hypemephroid carcinoma)、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗佩赫氏癌、库尔希茨基细胞癌、大细胞癌、豆状癌(lenticularcarcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、髓质癌、髓样癌、黑色素瘤、软癌、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、黏液细胞癌(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽癌(naspharyngealcarcinoma)、燕麦细胞癌、骨化性癌、类骨质癌、乳头状癌、门静脉癌、浸润前癌、棘细胞癌(prickle cell carcinoma)、粉刺癌、肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、schneiderian癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、海绵状癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、血管扩张性癌(carcinomatelangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌和绒毛状癌。
术语“肉瘤”是指由诸如胚胎结缔组织的物质组成的肿瘤，并且通常由包埋在纤维状或均质物质中的紧密排列的细胞组成。示例性肉瘤包括例如软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy肉瘤、脂肪肉瘤、脂肉瘤、肺泡软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、维尔姆斯瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤因氏肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、何杰金氏肉瘤、特发性多发色素性出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤)、T-细胞免疫母细胞肉瘤、Jensen肉瘤、卡波西肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶肉瘤、骨旁骨肉瘤、网状细胞肉瘤、劳氏肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤和毛细血管肉瘤。
术语“黑素瘤”是指由皮肤和其他器官的黑素细胞系统引起的肿瘤。黑色素瘤包括例如肢端黑色素瘤、无黑素性黑色素瘤、良性幼年黑素瘤、Cloudman黑素瘤、S91黑素瘤、Harding-Passey黑素瘤、幼年型黑素瘤、恶性雀斑样黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤亚黑素瘤和表面扩散黑素瘤。
其他癌症包括例如霍奇金病、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺癌(malignant pancreatic insulanoma)、恶性类癌、恶变前皮肤病变、睾丸癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌和肾上腺皮质癌。
检查点调节物拮抗剂
本申请提供了与TIGIT、PD-1和PD-L1特异性结合并抑制一种或多种其相应生物学功能的检查点调节物拮抗剂。在一些实施方式中，所述检查点调节物拮抗剂是抗TIGIT抗体或抗体片段。在一些实施方式中，所述检查点调节物拮抗剂是抗PD-1抗体或抗体片段。在其他实施方式中，所述检查点调节物拮抗剂是抗PD-L1抗体或抗体片段。在其他实施方式中，双特异性或三特异性检查点调节物拮抗剂包含用于结合几个检查点调节物的多种特异性(抗TIGIT、抗PD-1和/或抗PD-L1)。
抗TIGIT抗体和抗TIGIT抗体片段
在一些实施方式中，本申请的TIGIT抑制剂是抗体或其抗原结合部分，包含：(1)重链可变区，其中所述重链可变区包含三个互补决定区(HCDR)：HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1具有与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，其中HCDR2具有与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，并且其中HCDR3具有与选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；和(2)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含三个互补决定区(LCDR)：LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1具有与选自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQID NO：39、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，其中LCDR2具有与选自SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，其中LCDR3具有与选自SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQID NO：38、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人TIGIT。
在一些实施方式中，本申请的TIGIT抑制剂是抗体或其抗原结合部分，包含(1)重链可变区，其具有与选自SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123和SEQ IDNO：125的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；和(2)轻链可变区，其具有与选自SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124和SEQ ID NO：126的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人TIGIT。
抗PD-1抗体和抗PD-1抗体片段
在一些实施方式中，本申请的PD-1抑制剂是抗体或其抗原结合部分，包含：(1)重链可变区，其中所述重链可变区包含三个互补决定区(HCDR)：HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1具有与选自SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56和SEQ IDNO：59的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，其中HCDR2具有与选自SEQID NO：49、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：60的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，并且其中HCDR3具有与选自SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：53、SEQID NO：55、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：61的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；和(2)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含三个互补决定区(LCDR)：LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1具有与选自SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：73的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，其中LCDR2具有与选自SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，并且其中LCDR3具有与选自SEQID NO：64、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：75的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人PD-1。
在一些实施方式中，本申请的PD-1抑制剂是抗体或其抗原结合部分，包含：(1)重链可变区，其具有与选自SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：137的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；(2)轻链可变区，其具有与选自SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQID NO：136和SEQ ID NO：138的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人PD-1。
抗PD-L1抗体和抗PD-L1抗体片段
在一些实施方式中，本申请的PD-L1抑制剂是抗体或其抗原结合部分，包含：(1)重链可变区，其中所述重链可变区包含三个互补决定区(HCDR)：HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1具有与选自SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：88的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，其中HCDR2具有与选自SEQ ID NO：77、SEQID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：89的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，并且其中HCDR3具有与选自SEQ ID NO：78、SEQ IDNO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：90的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；和(2)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含三个互补决定区(LCDR)：LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1具有与选自SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：94、SEQ IDNO：98、SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：104的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，其中LCDR2具有与选自SEQ ID NO：SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：102和SEQ ID NO：105的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，并且其中LCDR3具有与选自SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：106的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人PD-L1。
在一些实施方式中，本申请的PD-L1抑制剂是抗体或其抗原结合部分，包含：(1)重链可变区，其具有与选自SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：151和SEQ ID NO：153的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；和(2)轻链可变区，其具有与选自SEQ ID NO：140、SEQID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：152和SEQ ID NO：154的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人PD-L1。
所述抗TIGIT、抗PD-1和/或抗PD-L1抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人化抗体、scFv或多特异性抗体，其包含靶向其他TIGIT、PD-1和/或PD-L1表位的其他结合特异性或如下文进一步描述其他结合靶标。图4显示了根据本申请的对应于抗TIGIT、抗PD-1和抗PD-L1单克隆抗体的CDR的氨基酸序列。
本文所述的HCVR和LCVR可以与天然存在的Fc区或非天然存在或突变的Fc区(例如，无效应子或大多无效应子Fc(例如，人IgG2或IgG4))连接，或可选地，与一种或多种活化Fc受体(FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)增强结合的Fc，以增强肿瘤环境中Treg消耗。
因此，在某些实施方式中，本文描述的抗TIGIT、抗PD-1和/或抗PD-L1HCVR和LCVR可以与包含一个或多个修饰的Fc连接，通常改变所述抗体的一个或多个功能性质，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本文描述的抗体可以是化学修饰的(例如，一个或多个化学部分可以连接到抗体上)或者可以修饰它以改变其糖基化，从而改变抗体的一种或多种功能特性。更具体而言，在某些实施方式中，本申请中的抗体可以包括Fc区中的修饰以产生具有(a)增加或减少的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，(b)增加的或减少补体介导的细胞毒性(CDC)，(c)对C1q的亲和力增加或降低，和/或(d)相对于亲本Fc，对Fc受体的亲和力增加或降低的Fc变体。此类Fc区变体通常将在Fc区中包含至少一个氨基酸修饰。结合氨基酸修饰被认为是特别合乎需要的。例如，变体Fc区可以在其中包含例如本文中鉴定的特定Fc区位置的两个、三个、四个、五个等等置换。
对于要完全避免效应子功能的应用，例如，当单独的抗原结合足以产生所需的治疗益处，并且效应子功能仅导致(或增加不期望的副作用的风险)时，可以使用IgG4抗体，或者可以设计缺乏Fc区或其大部分的抗体或片段，或者Fc可以被突变以完全消除糖基化(例如，N297A)。或者，可产生缺乏效应子功能、缺乏结合FcγR(如IgG2)和激活补体(如IgG4)的能力的人IgG2(CH1结构域和铰链区)和人IgG4(CH2和CH3结构域)的杂交构建体。当使用IgG4恒定结构域时，通常优选包括置换S228P，其模拟IgG1中的铰链序列并由此稳定IgG4分子，减少待治疗患者中治疗性抗体与内源性IgG4之间的Fab臂交换。
在某些实施方式中，可以修饰抗TIGIT、抗PD-1或抗PD-L1抗体或其片段以增加其生物半衰期。可以采用各种方法，包括例如增加Fc区对FcRn的结合亲和力。在一个实施方式中，抗体在CH1或CL区域内改变以包含取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如美国专利号5,869,046和6,121,022所述。Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引的编号。参照残基编号接着是替代天然存在的氨基酸取代的氨基酸，(任选地在该位置存在天然存在的残基在前)，提供本文公开的序列变体。在多个氨基酸可能存在于给定位置的情况下，例如，如果序列在天然存在的同种型之间不同，或者如果多个突变可以在该位置被取代，则它们被斜线分开(例如，“X/Y/Z”)。
增加对FcRn的结合和/或改善药代动力学性质的示例性Fc变体包括在位置259、308和434处的取代，包括例如259I，308F，428L，428M，434S，434H，434F，434Y和434M。增加Fc结合FcRn的其他变体包括：250E，250Q，428L，428F，250Q/428L(Hinton等，2004，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216，Hinton等，2006Journal of Immunology 176：346-356)，256A，272A，305A，307A，31IA，312A，378Q，380A，382A，434A(Shields等(2001)J.Biol.Chem.276(9)：6591-6604)，252F，252Y，252W，254T，256Q，256E，256D，433R，434F，434Y，252Y/254T/256E，433K/434F/436H(Dall'Acqua等，(2002)J.Immunol.169：5171-5180，Dall'Acqua等，(2006)J.Biol.Chem，281：23514-23524和美国专利号8,367,805。
已经提出修饰IgG Fc中的某些保守残基(1253，H310，Q311，H433，N434)，如N434A变体(Yeung等，(2009)J.Immunol.182：7663)作为增加FcRn亲和力的方式，因此增加了循环中抗体的半衰期(WO 98/023289)。已显示包含M428L和N434S的组合Fc变体以增加FcRn结合并将血清半衰期增加高达五倍(Zalevsky等，(2010)Nat.Biotechnol.28：157)。包含T307A、E380A和N434A修饰的组合Fc变体也延长了IgG1抗体的半衰期(Petkova等(2006)Int.Immunol.18：1759)。另外，包含M252Y-M428L，M428L-N434H，M428L-N434F，M428L-N434Y，M428L-N434A，M428L-N434M和M428L-N434S变体的组合Fc变体也显示延长了半衰期(U.S.2006/173170)。此外，据报道包含M252Y、S254T和T256E的组合Fc变体增加半衰期接近4倍。Dall’Acqua等，(2006)J.Biol.Chem.281:23514。
双特异性检查点调节物拮抗剂
本申请的另一方面涉及双特异性检查点调节物拮抗剂，包含：特异性结合检查点调节物的第一靶向结构域和特异性结合第二靶标的第二靶向结构域。在一些实施方式中，第二靶标选自血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、免疫检查点调节物、Tie2酪氨酸激酶受体和Tie2酪氨酸激酶受体的配体。
在一些实施例中，第二靶标也是检查点调节物。
在一些实施方式中，第一靶向结构域包含本申请的抗TIGIT、抗PD-1和/或抗PD-L1抗体的抗原结合部分。在一些实施方式中，第二靶向结构域包含本申请的另一种抗TIGIT、抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体的抗原结合部分。在一些实施方式中，第一靶向结构域和第二靶向结构域各自包含本申请的抗TIGIT、抗PD-1和/或抗PD-L1抗体的抗原结合部分，其中第一靶向结构域与第二靶向结构域不同。
在一些实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂包含特异性结合人TIGIT的第一靶向结构域和特异性结合PD-1或PD-L1的第二靶向结构域。
在一些实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂包含图3B的一个或多个PD-1特异性CDR或可包含图3C的一个或多个PD-L1特异性CDR。在一些实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂包含图4D-E的一个或多个PD-1特异性可变区或图4F-H的一个或多个PD-L1特异性可变区。
在一些实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂是全长抗体，其在其两个结合臂之一(一对HC/LC)上结合人TIGIT，并在其第二臂(不同的HC/LC对)上结合不同抗原(或表位)。在这些实施方式中，双特异性抗体具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列中)，并且对于它结合的每种抗原是单价的。
在其他实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂是可在其两个结合臂(一对HC/LC)中的每一个中结合人TIGIT和其他抗原的全长抗体。在这些实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂具有两个相同的抗原结合臂，具有相同的特异性和相同的CDR序列，并且对于它结合的每种抗原是二价的。
图17A-17N显示了多种不同的双特异性检查点调节物拮抗剂M1-M14，其中：(1)VH1和VL1区对应于抗PD1、抗PD-L1或任何其他单克隆抗体可变结构域；和(2)VH2和VL2区对应于抗TIGIT可变结构域。图17A-17D描绘了示例性双特异性检查点调节物拮抗剂的实施方式，其包含同型二聚体支架，所述同型二聚体支架包含具有双重结合特异性(抗TIGIT和抗PD-1)的双链臂。图17E和17F描绘了示例性的双特异性检查点调节物拮抗剂的实施方式，其包含同型二聚体支架，该同型二聚体支架含有在恒定区的N端具有第一结合特异性的一对双链臂和在恒定区的C端具有第二结合特异性的一对双链臂。图17G-17J描绘了示例性的双特异性检查点调节物拮抗剂的实施方式，其包含同型二聚体支架，该同型二聚体支架包含在恒定区的N端具有第一结合特异性的一对双链臂和在恒定区的C端具有第二结合特异性的一对单链Fv(ScFv)片段。图17K-17N描绘了示例性双特异性检查点调节物拮抗剂的实施方式，其包含异二聚体支架，所述异二聚体支架含有各自具有不同的结合特异性的一对双链臂。在这些图中，星号表示免疫球蛋白恒定区中的突变，其防止来自一种结合特异性的轻链或重链与来自另一种结合特异性的轻链或重链的错配，如下面进一步讨论。
示例性双特异性检查点调节物拮抗剂序列显示于图5中。在一个实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂TP-M2T8P5包含：(1)重链可变区，其具有与SEQ ID NO：155中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；和(2)可变轻链可变区，其具有与SEQID NO：156中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物拮抗剂TP-M4T8P5包含：(1)轻链可变区2/重链可变区1(VL2/VH1)，其具有与SEQ ID NO：157中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；和(2)重链可变2区/轻链可变区1(VH2/VL1)，其具有与SEQ IDNO：158中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物抑制剂TP-M6T8P5包含：(1)重链可变区，其具有与SEQ ID NO：159中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；(2)轻链可变区2/轻链恒定区(VL2/CL)，其具有与SEQ ID NO：160中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；和(3)重链可变区1/重链恒定区1(VH1/CH1)，其具有与SEQ ID NO：161中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物抑制剂TP-M6T8L8包含：(1)重链可变区，其具有与SEQ ID NO：162中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列的；(2)轻链可变区2/轻链恒定区(VL2/CL)，其具有与SEQ ID NO：163中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；和(3)重链可变区1/重链恒定区1(VH1/CH1)，其具有与SEQ ID NO：164中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物抑制剂TP-M8T10P1(TP-83)包含：(1)重链可变区，其具有与SEQ ID NO：165中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；和(2)轻链，其具有与SEQ ID NO：166中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物抑制剂TP-M9T10P1(TP-93)包含：(1)重链，其与SEQ ID NO：167中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性；和(2)轻链，其具有与SEQ ID NO：168中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物抑制剂TP-M9T10P5包含：(1)重链，其与SEQ ID NO：169中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性；和(2)轻链，其具有与SEQ ID NO：170中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物抑制剂TP-M10T8P5(TP-92)包含：(1)重链，其与SEQ ID NO：171中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性；和(2)轻链可变区，其具有与SEQ ID NO：172中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物抑制剂TP-M10T8L8包含：与SEQ IDNO：173中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物抑制剂TP-M14T8P5包含：(1)重链可变区2/重链恒定区1(VH2/CH1)，其具有与SEQ ID NO：174中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；(2)可变轻链区1/重链恒定区1(VL1/CH1)，其具有与SEQ IDNO：175中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；(3)轻链可变区2/轻链恒定区(VL2/CL)，其具有与SEQ ID NO：176中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；和(4)重链可变区1/轻链恒定区(VH1/CL)，其具有与SEQ ID NO：177中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，双特异性检查点调节物抑制剂TP-M14T8L8包含：(1)重链可变区2/重链恒定区1(VH2/HC1)，其具有与SEQ ID NO：178中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；(2)可变轻链区1/重链恒定区2(VL1/CH2)，其具有与SEQ IDNO：179中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；(3)轻链可变区2/轻链恒定区(VL2/CL)，其具有与SEQ ID NO：180中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列；和(4)重链可变区1/轻链恒定区(VH1/CL)，其具有与SEQ ID NO：181中的氨基酸序列具有约80％至约100％同源性的氨基酸序列。
三特异性检查点调节物拮抗剂
在一些实施方式中，三特异性检查点调节物拮抗剂包含：(1)第一靶向结构域，其具有由一个或多个抗TIGIT可变结构域赋予的第一结合特异性；(2)由一个或多个可变区赋予的第二靶向，所述可变区包含一个或多个抗PD1可变结构域、一个或多个抗PD-L1可变结构域、或对应于任何其他抗癌靶标的一个或多个可变区结构域，包括其他检查点调节物，如本文进一步所述；(3)如本文进一步描述的由一个或多个肽序列(例如AMG386)或包含VEGF结合拮抗剂、Tie2酪氨酸激酶受体拮抗剂或Tie2酪氨酸激酶受体配体拮抗剂的可变结构域赋予的第三靶向结构域。
图18A-18J显示了各种不同的三特异性检查点调节物拮抗剂，其中：(1)VH1和VL1区域对应于抗TIGIT可变结构域；(2)VH2和VL21区域对应于抗PD1、抗PD-L1或任何其他单克隆抗体可变结构域；和(3)圆形区域对应于AMG386或任何其他生物肽。
同型二聚体和异型二聚体
有效生产双特异性和三特异性检查点调节物拮抗剂制剂的挑战之一涉及当共表达不同结合特异性的链时重链和轻链的错配。表1列出了用于克服不同结合特异性重链之间错配的几种氨基酸取代选择，其“强制”或优先促进期望重链之间的正确结合。根据本公开，可以使用任何防止或减少重链之间错配的方法来制造双特异性或三特异性检查点调节物拮抗剂。
所述“knobs-into-hole”(KiH)方法依赖于大多数相互作用发生处的两个CH3结构域之间界面的修饰。通常，大体积残基被引入到一个抗体重链的CH3结构域中，并且起到类似钥匙的作用。在另一条重链中，形成了一个“孔”，能够容纳这种庞大的残基，模仿锁。得到的异二聚体Fc-部分可以通过人造二硫键进一步稳定。
另一种方法是基于具有离子相互作用或空间互补性的带电残基。这包括改变CH3界面中的电荷极性，以便静电匹配的Fc结构域的共表达支持有利的吸引相互作用和异二聚体形成，同时保留疏水核心，而不利的排斥电荷相互作用抑制同源二聚化。参见表1。表1中的氨基酸编号遵循Kabat编号方案并且可以应用于本文所述的抗体的重链氨基酸序列。
在另一种方法中，可以将亮氨酸拉链(LZ)结构域整合到蛋白质支架中。亮氨酸拉链是蛋白质中常见的三维结构基序，通常作为各种转录因子中DNA结合域的一部分。单个LZ通常含有约7个残基间隔的4-5个亮氨酸残基，其形成具有沿一侧延伸的疏水区域的两亲性α螺旋。在一个具体的实施方式中，异二聚体蛋白质支架包含来自与来自c-fos转录因子的LZ相关的c-jun转录因子的LZ。尽管已知c-jun形成jun-jun同型二聚体并且c-fos不形成同型二聚体，但jun-fos异二聚体的形成大大优于jun-jun同型二聚体。
亮氨酸拉链结构域可以替代在蛋白质支架中的CH2-CH3序列而引入，或者可以将其置于双特异性或三特异性检查点调节物拮抗剂中的两条重链的羧基末端。在后者的情况下，可以在CH3的羧基末端和亮氨酸拉链的氨基末端之间引入弗林蛋白酶切割位点。当在合适的哺乳动物细胞表达系统中共表达双特异性或三特异性检查点调节物拮抗剂的重链和轻链时，这可以促进在异二聚化步骤后的弗林蛋白酶介导的亮氨酸拉链的切割(参见Wranik等，J.Biol.Chem.,287(5)：43331-43339，2012)。
表1
Figure BDA0001652427810000331
表1中的氨基酸编号遵循Kabat编号方案并且可以应用于本文所述的抗体的重链氨基酸序列。表1中描述的突变可以应用于任何免疫球蛋白IgG1重链的序列(公开的或其他)，以及其他免疫球蛋白类别和其中的亚类(或同种型)。
当共表达双特异性或三特异性抗体的重链和轻链时，一种结合特异性的轻链也可能与具有不同结合特异性的重链错配。因此，在某些实施方式中，重链、轻链或两者的部分可相对于它们来源的“野生型”抗体链进行修饰，以防止或减少两个重链恒定区彼此错配，以及防止或减少轻链恒定区与其重链对应物错配。
轻链错配问题可以通过几种方式解决。在一些实施方式中，空间互补突变和/或二硫键可以被并入两个VL/VH界面中。在其他实施方式中，可以基于离子或静电相互作用掺入突变。在一些实施方式中，通过采用在重链的CH1结构域中具有S183E突变和在轻链的CL结构域中具有S176K突变的第一臂，可以防止或减少轻链错配。第二臂可包含重链CH1结构域中的S183K突变和轻链CL结构域中的S176E突变。在其他实施方式中，使用“CrossMab”方法，其中双特异性或三特异性检查点调节物拮抗剂(例如Fab)中的一个臂保持不变，但在含有其他结合特异性的另一个臂中，在重链:轻链界面处轻链中的一个或多个结构域与重链处的重链中的一个或多个结构域交叉。
在美国专利申请公开第2014/0243505号、第2013/0022601号中进一步描述了包括用于防止重链和轻链错配的特定突变的免疫球蛋白结构域序列。
图18G-18J描绘了示例性三特异性检查点调节拮抗剂的实施方式，其中星号表示免疫球蛋白恒定区中的突变，其防止来自一种结合特异性的轻链或重链与来自另一结合特异性的轻链或重链的错配。
缀合物
在某些实施方式中，本申请的检查点调节物拮抗剂与一种或多种肽和/或小分子药物化学缀合。肽或小分子药物可以相同或不同。肽或小分子药物可以附着于例如减少的SH基团和/或碳水化合物侧链。用于制备肽或小分子药物与抗体的共价或非共价缀合物的方法在本领域中是已知的，并且可以使用任何这样的已知方法。
在一些实施方式中，肽或小分子药物通过二硫键形成与减少的抗体组分的铰链区连接。或者，可以使用异双功能交联剂，如N-琥珀酰3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(N-succinyl 3-(2-pyridyldithio)propionate，SPDP)来连接这些试剂。用于这种缀合的一般技术是本领域公知的。在一些实施方式中，肽或小分子药物通过抗体的Fc区中的碳水化合物部分缀合。碳水化合物基团可以用于增加与硫醇基团结合的相同试剂的加载，或碳水化合物部分可用于结合不同的治疗剂或诊断剂。通过抗体碳水化合物部分将肽抑制剂或小分子药物缀合至抗体的方法是本领域技术人员熟知的。例如，在一个实施方式中，所述方法包括使具有氧化碳水化合物部分的抗体组分与具有至少一个游离胺官能团的载体聚合物反应。该反应产生初始席夫碱(亚胺)键，其可通过还原为仲胺而形成最终缀合物来稳定。美国专利申请公开号2014/0356385中描述了用于将小分子药物和肽缀合至抗体的示例性方法。
优选地，本公开的检查点调节物拮抗剂保持抗体的某些期望的特征和药代动力学性质，包括期望的体外和体内稳定性(例如，长半衰期和保质期稳定性)，有效递送到期望的靶细胞，对结合配偶体的亲和力增加，理想的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性，以及肾清除或排泄减少。因此，在检查点调节物拮抗剂的设计中可以考虑对特定恒定区域效应子功能的大小和需要的仔细注意。
抗TIGIT、抗PD-1和抗PD-L1抑制剂，包括由此得到的单特异性、双特异性和三特异性检查点调节物拮抗剂的大小范围可以是50kD至300kD，50kD至250kD，60kD至250kD，80kDa至250kD，100kD至250kD，125kD至250kD，150kD至250kD，60kD至225kD，75kD至225kD，100kD至225kD，125kD至225kD，150kD至225kD，60kD至200kD，75kD至200kD，100kD至125kD至200kD，150kD至200kD，60kD至150kD，75kD至150kD，100kD至150kD，60kD至125kD，75kD至125kD，75kD至100kD，或由上述范围中列出的整数的任何组合所涵盖的任何范围或由任何的上述范围之间所列的整数的组合限定的任何范围。
试剂盒
本申请还提供了包含本申请的检查点调节物拮抗剂的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒包含一种或多种抗TIGIT、抗PD-1或抗PD-L1抗体，以及其双特异性或三特异性检查点调节物拮抗剂。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含额外的试剂，包括用于检测的二抗以及本文所述的另外的人抗体(例如，具有与TIGIT抗原中不同于第一人抗体的表位结合的互补活性的人抗体)。试剂盒通常包含标签，其中包含说明试剂盒内容的预期用途的说明书。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的任何书写或记录材料，或者试剂盒附带的任何其他文字或记录材料。
使用检查点调节物拮抗剂的方法
本申请的检查点调节物拮抗剂，例如抗TIGIT抗体、抗TIGIT抗体片段、抗PD-1拮抗剂、抗PD-1抗体片段、抗PD-L1抗体、抗PD-L1抗体片段、特异性结合TIGIT、PD-1和/或PD-L1的双特异性检查点调节物拮抗剂和三特异性检查点调节物拮抗剂，具有许多体外和体内应用，包括例如通过TIGIT、PD-1和/或PD-L1阻断信号传导来增强免疫应答，治疗癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病，以及检测TIGIT、PD-1和/或PD-L1。
在一些实施方式中，将本申请的检查点调节物拮抗剂施用于体外的或离体的培养的细胞，或施用于人类受试者(例如体内)，以增强对各种疾病的免疫力。因此，本文提供了改变受试者的免疫应答的方法，包括向受试者施用如本文所述的抗体或其抗原结合片段，使得受试者中的免疫应答得到增强、刺激或上调。优选的受试者包括需要增强免疫应答的人类患者。该方法特别适用于治疗具有可通过增强免疫应答(例如T细胞介导的免疫应答)治疗的病症的人类患者。该方法特别适用于在体内治疗癌症或慢性感染。例如，可以将抗TIGIT、抗PD-1或抗PD-L1组合物与目的抗原一起施用，或抗原可能已经存在于待治疗的受试者(例如携带肿瘤或携带病毒的受试者)中，以增强抗原特异性免疫。当抗TIGIT抗体与另一种药剂一起施用时，两者可以分开或同时施用。
在一些实施方式中，在上述方法中使用的检查点调节物拮抗剂是抗TIGIT、抗PD-1、抗PD-L1抗体，其片段或其组合。在一些实施方式中，检查点调节物拮抗剂是本申请的双特异性或三特异性抗体。
在一些实施方式中，检查点调节物拮抗剂是抗体或片段。在一些实施方式中，本文描述的抗体是人或人化抗体。
还包含用于检测和/或测量样品中人TIGIT、人PD-1或人PD-L1的存在的方法，包括使所述样品和对照样品与其人单克隆抗体或其抗原结合片段相接触，所述人单克隆抗体或抗原结合片段在允许在抗体或其片段与人TIGIT、人PD-1或人PD-L1之间形成复合物的条件下特异性结合人TIGIT、人PD-1或人PD-L1。然后检测复合物的形成，其中与对照样品相比，样品之间复合物形成的差异表明样品中存在人TIGIT抗原。此外，本文所述的抗TIGIT、抗PD-1或抗PD-L1抗体可用于通过免疫亲和纯化来纯化人TIGIT。
考虑到抗TIGIT、抗PD-1和抗PD-L1抗体阻断对T细胞应答(例如，抗原特异性T细胞应答)的抑制或共抑制的能力，本文提供了使用本文所述抗体的在体外和在体内的方法来刺激、增强或上调抗原特异性T细胞应答，例如，抗肿瘤T细胞应答。在某些实施方式中，还提供了CD3刺激(例如通过与表达膜CD3的细胞共孵育)，该刺激可以在用抗TIGIT、抗PD-1或抗PD-L1抗体治疗的同时、之前或之后提供。例如，本文提供了增强抗原特异性T细胞应答的方法，包括使所述T细胞与本文所述的抗TIGIT、抗PD-1或抗PD-L1抗体以及任选地与CD3接触，使得抗原特异性T细胞应答增强，例如通过除去TIGIT-、PD-1或PD-L1介导的抑制作用。可以使用任何合适的抗原特异性T细胞应答指示剂来测量抗原特异性T细胞应答。这种合适的指示剂的非限制性实例包括在所述抗体存在下增加的T细胞增殖，和/或在所述抗体存在下增加细胞因子产生。在一个优选的实施方式中，通过抗原特异性T细胞的白细胞介素-2和/或干扰素-γ的生产增强。
进一步包括用于增强受试者的免疫应答(例如，抗原特异性T细胞应答)的方法，包括对受试者施用抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或者双特异性或三特异性检查点调节物拮抗剂，使得受试者中的免疫应答(例如，抗原特异性T细胞应答)增强。在一个优选的实施方式中，所述受试者是携带肿瘤的受试者并且针对所述肿瘤的免疫应答增强。肿瘤可以是实体瘤或液体肿瘤，例如血液恶性肿瘤。在某些实施方式中，肿瘤是免疫原性肿瘤。在其他实施方式中，肿瘤是非免疫原性的。在某些实施方式中，肿瘤是PD-L1阳性。在其他实施方式中，肿瘤是PD-L1阴性。受试者还可以是带病毒的受试者，其中由于施用如本文所述的抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂，或三特异性检查点调节物拮抗剂，而使得针对病毒的免疫应答增强。
在一个实施方式中，用于抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法包括向受试者施用如本文所述的抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂或三特异性检查点调节物拮抗剂，使得患者中肿瘤的生长受到抑制。还提供了治疗受试者的慢性病毒感染的方法，包括向受试者施用如本文所述的抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂或三特异性检查点调节物拮抗剂，使得在受试者中治疗慢性病毒感染。
本文还包含用于从患有肿瘤(例如癌性肿瘤)的受试者的肿瘤微环境中消耗Treg细胞的方法，包括向受试者施用治疗有效量的如本文所述的抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂或三特异性检查点调节物拮抗剂，其包含刺激肿瘤微环境中Treg细胞消耗的Fc。Fc可以例如是具有效应子功能或增强的效应子功能的Fc，例如与一种或多种活化性Fc受体的结合或增强的结合。
在一个优选的实施方式中，Treg消耗发在没有显著消耗或抑制肿瘤微环境中的Teff情况下，以及没有显著消耗或抑制肿瘤微环境外的Teff细胞和Treg细胞的情况下。在某些实施方式中，患者在Treg细胞上比在Teff细胞上具有更高水平的TIGIT，例如在肿瘤微环境中。在某些实施方式中，抗TIGIT抗体或拮抗剂可消耗肿瘤中的Treg和/或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中的Treg。例如，在CT26肿瘤模型中，格式化为小鼠IgG2a(其显示效应子功能)的抗小鼠TIGIT抗体部分消耗Treg和CD8+T细胞，但不消耗CD4+T细胞。格式化为小鼠IgG1D265A的无效应子配对物抗TIGIT抗体不会耗尽T细胞。
当考虑是否采用Fc效应子功能或无效应子抗TIGIT抗体时，必须适当考虑Tregs消耗(可增强抗肿瘤免疫应答)和CD8+T细胞消耗(将消除实际杀死肿瘤细胞所需的一些细胞)之间的权衡(tradeoff)。虽然Tregs的消耗可能预期会增强抗肿瘤活性，但最近的研究已经证明TIGIT在TIGIT+Tregs上的连接促进Treg细胞介导的抑制Teff细胞增殖(Joller等(2014)Immunity 40：569)，表明阻断TIGIT信号传导(例如使用本发明的拮抗性抗TIGIT抗体)也可以增强抗肿瘤活性。因此，使用缺乏效应子功能的拮抗剂抗TIGIT抗体可能是最有效的，其：i)阻断Treg中的TIGIT信号传导，从而降低它们的免疫抑制活性；ii)通过阻断TIGIT的抑制作用而激活抗肿瘤CD8+T细胞，同时避免其效应子功能介导的耗尽；和iii)通过允许DNAM结合PVR(CD155，TIGIT配体)而增强DNAM介导的活化，否则所述PVR会与TIGIT结合(并且通过减少直接的TIGIT-DNAM相互作用)(Johnston等(2014)Cancer Cell26：923)。同样的适用于使用抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂或三特异性检查点调节物拮抗剂。
在某些实施方式中，将本文所述的抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂或三特异性检查点调节物拮抗剂作为辅助疗法给予受试者。根据本申请，相对于目前的护理标准，用抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂或三特异性检查点调节物拮抗剂治疗癌症患者可导致长期持久的应答；至少1、2、3、4、5、10年或更多年的长期存活，至少1、2、3、4、5或10年或更多年的无复发存活。在某些实施方式中，用抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂或三特异性检查点调节物拮抗剂治疗癌症患者可防止癌症复发或延迟癌症复发，例如1、2、3、4、5或10年或更多年。抗TIGIT、抗PD-1和/或抗PD-L1治疗可以用作主要或次要治疗线。
在某些优选的实施方式中，受试者患有细胞增殖性疾病或癌症。通过抗TIGIT抗体阻断通过TIGIT的PVR/结合素-2(Nectin-2)信号传导可以增强患者对癌细胞的免疫应答。类似地，本文提供的阻断是用于治疗患有癌症的受试者的方法，包括向受试者施用如本文所述的抗TIGIT、抗PD-1、抗PD-L1、双特异性检查点调节物拮抗剂或三特异性检查点调节物拮抗剂，使得患者被治疗，例如使得癌性肿瘤的生长受到抑制或降低和/或肿瘤消退。如本文所述的抗TIGIT抗PD-1，抗PD-L1，其双特异性检查点调节物拮抗剂或三特异性检查点调节物拮抗剂可单独用于抑制癌肿瘤的生长。可选地，这些检查点调节物拮抗剂中的任一种可以与另一种药剂一起使用，例如其他抗癌靶标、免疫原性药剂、标准癌症治疗剂或其他抗体，如下所述。
因此，本文提供了治疗受试者中的癌症的方法，例如通过抑制肿瘤细胞的生长，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所述的抗TIGIT、抗PD-1、抗PD-L1、双特异性检查点调节物拮抗剂或三特异性检查点调节物拮抗剂。优选地，所述抗体是包括本文所述的抗TIGIT、抗PD-1或抗PD-L1HCVR和LCVR的人抗TIGIT、抗PD-1或抗PD-L1抗体，或者其可以是嵌合的或人化的非人抗hu TIGIT、抗hu PD-1或抗PD-L1抗体，例如嵌合或人化抗TIGIT、抗PD-1或抗PD-L1抗体，其竞争性的用于与本文所述的抗TIGIT、抗PD-1或抗PD-L1抗体中的至少一种结合或结合至相同的表位。
使用本发明的抗体可以抑制其生长的癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症。用于治疗的癌症的非限制性例子包括：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非NSCLC、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌(例如透明细胞癌)、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(例如肾细胞癌(RCC))、前列腺癌(例如激素难治性前列腺癌)、甲状腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤)、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和头颈癌(或癌瘤)、胃癌、生殖细胞肿瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤细胞、黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤、如皮肤或眼内恶性黑素瘤)、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛门区癌症、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症，包括由石棉、与病毒有关的癌症(例如人乳头瘤病毒(HPV)相关肿瘤)诱导的癌症，以及源自两种主要血细胞谱系中任一种的血液恶性肿瘤，即骨髓细胞系(产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞)或淋巴样细胞系(产生B、T、NK和浆细胞)，诸如所有类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴细胞和/或诸如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性骨髓性白血病(CML)、未分化AML(MO)、成髓细胞性白血病(M1)、成髓细胞性白血病(M2；伴有细胞成熟)、前髓细胞性白血病(M3或M3变体[M3V])、骨髓单核细胞白血病(M4或具有嗜伊红血球[M4E]的M4变体)、单核细胞白血病(M5)、红白血病(M6)、成巨核细胞白血病(M7)、分离的粒细胞肉瘤和绿色瘤；淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NEIL)、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、系统性间变性(例如，Ki 1+)大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、肠T细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、前体T淋巴母细胞性淋巴瘤、T-淋巴细胞；以及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、移植后淋巴增殖性疾病、真性组织细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤(LBL)、造血细胞淋巴系肿瘤、急性淋巴细胞瘤、淋巴母细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫组织细胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)(也称为真菌病蕈样肉瘤或Sezary综合征)、和具有瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom’s)巨球蛋白血症的淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，例如IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、阴燃骨髓瘤(也称为无痛性骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤、和多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞淋巴瘤；骨髓谱系的造血肿瘤、间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；精原细胞瘤、畸胎瘤、中枢和周围神经肿瘤，包括星形细胞瘤、神经鞘瘤；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑素瘤、色素干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌，淋巴谱系造血肿瘤，例如T-细胞和B-细胞肿瘤，包括但不限于T-细胞疾病，如T-幼淋巴细胞白血病(T-PLL)，包括小细胞和脑细胞型；大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)最好T细胞类型；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/后胸腺T细胞淋巴瘤(多形性和免疫母细胞亚型)；血管中心(鼻)T细胞淋巴瘤；头或颈的癌症、肾癌、直肠癌、甲状腺癌；急性骨髓性淋巴瘤，以及所述癌症的任何组合。本文所述的方法还可以用于治疗转移性癌症、难治性癌症(例如对先前免疫疗法难以治疗的癌症，例如用阻断性CTLA-4或PD-1抗体)和复发性癌症。
抗TIGIT、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂或三特异性检查点调节物拮抗剂可以单独施用，与另一种检查点调节物拮抗剂组合施用，或与另一种检查点调节物拮抗剂同时施用。抗TIGIT、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂或三特异性检查点调节物拮抗剂也可以与免疫原性剂组合给药或同时给药，所述免疫原性剂例如为癌症细胞、肿瘤疫苗、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞，在癌症疫苗策略中(He等人(2004)J.Immunol.173：4919-28)或溶瘤病毒中。
已经设计了针对肿瘤疫苗的许多实验策略。在其中一种策略中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。当肿瘤细胞被转导以表达GM-CSF时，这些细胞疫苗中的一些已被证明是最有效的。GM-CSF已被显示是一种用于肿瘤疫苗的有效的抗原表达激活剂(Dranoff等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：3539-43)。已显示癌症疫苗在临床前模型中增强效应T细胞向肿瘤的浸润。癌症疫苗的主要类型包括肽疫苗、基于载体的抗原特异性疫苗、全细胞疫苗和树突状细胞疫苗。所有基于疫苗的疗法均设计用于将来自全细胞的单个或多个抗原表位或抗原递送至患者并诱导肿瘤特异性效应T细胞。因此，基于疫苗的疗法可能是诱导T细胞浸润到肿瘤中的最有效方式。
研究各种肿瘤中的基因表达和大规模基因表达模式，导致了所谓的肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg，S A(1999)Immunity 10：281-7)。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤和产生肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100，MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可显示出是宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。
TIGIT、PD-1和/或PD-L1抑制可以与肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽的集合一起使用，以产生针对这些蛋白质的免疫应答。这些蛋白质通常被免疫系统视为自体抗原，因此对它们耐受。所述肿瘤抗原包括蛋白质端粒酶，其是染色体端粒合成所必需的，且在超过85％的人类癌症和仅在有限数量的体细胞组织中表达(Kim等(1994)Science 266：2011-2013)。由于改变蛋白质序列或在两个不相关序列(即费城染色体中的bcr-abl)之间产生融合蛋白的体细胞突变，或来自B细胞肿瘤的独特型，肿瘤抗原也可以是在癌细胞中表达的“新抗原”。
肿瘤疫苗的非限制性实例包括sipuleucel-T(
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FDA批准的用于转移性前列腺癌的肿瘤疫苗；转染的肿瘤细胞以表达细胞因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，如全细胞GM-CSF分泌照射的同种异体胰腺癌疫苗(GVAX；约翰霍普金斯(JohnsHopkins))；由从乳腺癌抗原、neu、legumain和β-连环蛋白(β-catenin)衍生的免疫原性肽组成的多肽疫苗，当与抗PD-1抗体联合给药时，延长了携带乳腺肿瘤的小鼠的疫苗诱导的无进展存活(Karyampudi L.等(2014)Cancer Res 74：2974-2985)；黑色素瘤抗原的肽，例如gp100的肽、MAGE抗原、Trp-2、MARTI和/或酪氨酸酶等。其他肿瘤疫苗包括来自涉及人类癌症的病毒的蛋白质，例如人乳头瘤病毒(HPV)(例如，
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和
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)；乙肝病毒(例如安在时(Engerix-B)和Recombivax HB)；丙型肝炎病毒(HCV)、卡波西肉瘤相关性疱疹肉瘤病毒(KSHV)。另一种可与TIGIT抑制结合使用的肿瘤特异性抗原是从自身肿瘤组织中分离出来的纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的片段，并且这些HSP高效地传递至抗原呈递细胞以产生肿瘤免疫。Talimogenelaherparepvec(T-VEC或
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)是FDA批准的用于治疗一些患有无法手术切除的、转移性黑色素瘤患者的溶瘤病毒的疫苗。
突状细胞(DC)是可用于引发抗原特异性应答的有效抗原呈递细胞。DC可以体外产生并载入各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle等(1998)Nature Medicine 4：328-332)。DC也可以通过遗传手段转导以表达这些肿瘤抗原。为了免疫的目的，DC也直接与肿瘤细胞融合(Kugler等(2000)Nature Medicine 6：332-336)。作为接种疫苗的方法，DC免疫可以有效地与TIGIT阻断结合以激活(释放)更有效的抗肿瘤应答。
TIGIT、PD-1和/或PD-L1抑制也可以与标准癌症治疗(例如手术、放疗和化疗)组合。特别是，TIGIT、PD-1和/或PD L1抑制可以有效地与化疗方案相结合。在这些情况下，可能减少施用的化学治疗剂的剂量(Mokyr等(1998)Cancer Research 58：5301-5304)。这种组合的一个例子是检查点调节物拮抗剂与达卡巴嗪联合用于治疗黑素瘤。这种组合的另一个例子是检查点调节物拮抗剂与白细胞介素-2(IL-2)组合用于治疗黑素瘤。例如，TIGIT、PD-1和/或PD-L1抑制和化疗联合使用以促进细胞死亡的科学原理是大多数化疗化合物的细胞毒性作用的结果，应导致抗原呈递途径中肿瘤抗原水平的增加。通过细胞死亡可能导致与TIGIT、PD-1和/或PD-L1抑制协同作用的其他联合疗法是辐射、手术和激素剥夺。这些方案中的每一个都在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可以与TIGIT、PD-1和/或PD-L1抑制结合使用。血管生成的抑制导致肿瘤细胞死亡，其可以将肿瘤抗原喂入宿主抗原呈递途径。
本文所述的抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂和三特异性检查点调节物拮抗剂还可以与靶向Fcα或Fcγ受体表达的效应细胞至肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用(参见，例如，美国专利号5,922,845和5,837,243)。双特异性抗体可用于靶向两种不同的抗原。例如抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性抗体已被用于将巨噬细胞靶向至肿瘤部位。这种靶向可以更有效地激活肿瘤特异性应答。这些应答的T细胞臂将通过TIGIT、PD-1和/或PD-L1的抑制而增强。可选地，可以通过使用结合肿瘤抗原和树突细胞特异性细胞表面标记的双特异性抗体将抗原直接递送至DC。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。这些机制中的许多可以通过灭活由肿瘤表达的免疫抑制蛋白来克服。这些包括TGF-β、IL-10和Fas配体等。这些实体中的每一个的抗体可与本文所述的检查点调节物拮抗剂组合使用，以抵消免疫抑制剂的作用并有利于宿主的肿瘤免疫应答。
其他的激活宿主免疫反应性的抗体可以与本文所述的检查点调节物拮抗剂组合使用。这些包括激活DC功能和抗原呈递的树突细胞表面上的分子。抗CD40抗体能够有效取代T细胞辅助活性(Ridge等(1998)Nature 393：474-478)，并且可以与抗TIGIT抗体联合使用。活化针对T细胞共刺激分子如OX-40(Weinberg等(2000)Immunol 164：2160-2169)、CD137/4-1BB(Melero等(1997)Nature Medicine 3：682-685(1997)和ICOS(Hutloff等(1999)Nature 397：262-266)的抗体也可以提供增加的T细胞活化水平。此外，其他免疫检查点调节物的抑制剂也可以与如本文所述的检查点调节物拮抗剂联合使用，如下面进一步描述的。
骨髓移植目前正用于治疗各种造血系统肿瘤。尽管移植物抗宿主病是该治疗的结果，但TIGIT抑制可用于通过降低移植物对肿瘤响应来增加供体移植的肿瘤特异性T细胞的效力。
为了在抗TIGIT抗体存在下刺激抗原特异性T细胞针对癌症或病毒感染，体外激活和扩增抗原特异性T细胞并将这些细胞过继性转移到受体中，可以增加过继性转移的T细胞的频率和活性。
还有几种实验性治疗方案涉及抗原特异性T细胞的体外激活和扩增，以及将这些细胞过继性转移到受体中以刺激针对肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg&Riddell(1999)Science 285：546-51)。这些方法也可用于激活T细胞对感染性病原体如CMV的应答。在抗TIGIT抗体存在下的体外激活可以增加过继性转移的T细胞的频率和活性。
在某些实施方式中，可以将本文所述的检查点调节物拮抗剂施用于患有传染性疾病(特别是慢性感染)的受试者。在这种情况下，与其在癌症中的应用类似，抗体介导的TIGIT、PD-1和/或PD-L1抑制可单独使用，或作为佐剂与疫苗组合使用，以增强对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。可以应用该治疗方法的示例性病原体包括但不限于HIV、肝炎(A、B和C)、流感、疱疹、贾第鞭毛虫属(Giardia)、疟疾、利什曼虫属(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。TIGIT、PD-1和/或PD-L1抑制特别可用于针对由如HIV的作用物引起的已确定的感染，如HIV的作用物在感染过程中呈现新颖或改变的抗原。施用抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂和三特异性检查点调节物拮抗剂可以允许将这些抗原识别为外来的，从而引发适当的抗原T细胞应答。
可通过本文所述方法治疗的其它病毒引起的感染包括HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒感染(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV，Epstein Barr病毒)，和由腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒、虫媒脑炎病毒或其组合引起的感染。
可由本文所述方法治疗的示例性病原细菌或由其引起的疾病包括衣原体属(Chlamydia)、立克次氏体属(Rickettsia)、分枝杆菌属(Mycobacteria)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌属(Streptococci)、肺炎球菌(Pneumonococci)、脑膜炎球菌(Meningococci)和淋球菌(Gonococci)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙雷菌(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、军团菌属(Legionella)、白喉(Diphtheria)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacilli)、霍乱(Cholera)、钩端螺旋体病破伤风(Leptospirosis tetanus)、肉毒中毒、炭疽、瘟疫和莱姆病。
引起可通过本文所述方法治疗的感染的示例性病原真菌包括念珠菌属(Candida)(例如白色念珠菌(albicans)、克鲁丝酵母(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉属(Aspergillus)(例如烟曲霉(fumigatus)，黑曲霉(niger)等)、毛霉菌目(Mucorales)(例如，毛霉菌属(mucor)、犁头菌属(absidia)、根霉菌属(rhizopus))，申克孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可通过本文所述方法治疗的感染的示例性病原性寄生虫包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠肠袋虫(Balantidium coli)、福氏耐格里原虫(Naegleriafowleri)、棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)、赞比亚贾第鞭毛虫(GiardiaZambia)、隐孢子虫(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微型巴氏锥虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Babesiamicroti)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)、巴西钩虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有上述方法中，可以将TIGIT、PD-1和/或PD-L1抑制与其他形式的免疫疗法组合使用，例如细胞因子处理(例如，干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)、或使用两种不同的结合特异性来提供增强的肿瘤抗原的呈递的双特异性抗体疗法。
本文所述的抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂和三特异性检查点调节物拮抗剂可用于通过共同施用这些抗体的一种或多种与目的抗原(例如疫苗)来增强抗原特异性免疫应答。因此，本文提供了增强受试者对抗原的免疫应答的方法，其包括向受试者施用：(i)抗原，和(ii)抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂、三特异性检查点调节物拮抗剂或其组合，从而增强受试者中对抗原的免疫应答。所述抗原可以是例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。这样的抗原的非限制性实例包括在以上部分讨论的那些，例如肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)，或如上所述的来自病毒、细菌或其他病原体的抗原。
在某些实施方式中，可使用包含抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂、三特异性检查点调节物拮抗剂结合的表位的肽或融合蛋白，作为替代或除检查点调节物拮抗剂之外的疫苗。
本文所述体内和体外施用抗体组合物(例如，人单克隆抗体、多特异性抗体或拮抗剂和免疫缀合物)的合适途径是本领域众所周知的并且可由本领域普通技术人员选择。例如，抗体组合物可以通过注射(例如，静脉内或皮下)施用。所用分子的合适剂量取决于受试者的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或制剂。
联合疗法
另一方面，本申请提供了用于增强受试者中抗原特异性T细胞应答的组合疗法。在一个实施方式中，所述方法包括使T细胞与抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、其抗体片段、双特异性检查点调节物拮抗剂、或三特异性检查点调节物拮抗剂接触，并与第二抗体、抗体片段、拮抗剂或药物组合，从而使得抗原特异性T细胞应答或凋亡途径得到增强。例如，在一些实施方式中，第一抗体或抗体片段特异性结合TIGIT并且第二抗体或抗体片段特异性结合PD-1或PD-L1。在一些实施方式中，所述第二抗体或抗体片段包括图3B的一个或多个抗PD-1CDR。在一些实施方式中，所述第二抗体或抗体片段包括图4D-E的一个或多个抗PD-1可变区。
在相关方面，减少或消耗有此需要的受试者的肿瘤中调节性T细胞的方法包括将有效量的抗体或抗体片段与第二抗体、抗体片段、拮抗剂或药物组合施用，使得受试者中调节性T细胞的数量减少。
在一些实施方式中，所述受试者具有如本文所述的细胞增殖性疾病或癌症。
在其他实施方式中，所述受试者患有本文所述的慢性病毒感染、炎症性疾病或自身免疫性疾病。
向T-细胞提供两种不同信号是广泛接受的模型，用于抗原呈递细胞(APC)对静止T淋巴细胞的淋巴细胞活化。该模型进一步提供了自我与非自我辨别和免疫耐受性。初始信号或抗原特异性信号在识别主要组织相容性复合体(MHC)背景中呈递的外来抗原肽后通过T细胞受体(TCR)转导。次级或共刺激信号通过抗原呈递细胞(APCs)上表达的共刺激分子递送至T细胞，并诱导T细胞促进克隆扩增、细胞因子分泌和效应功能。在缺乏共刺激的情况下，T细胞对抗原刺激可能变得难以控制，这导致对外源或内源抗原的致耐受性应答。
在双信号模型中，T细胞接受阳性共刺激信号和阴性共抑制信号。调节这些阳性和阴性信号对于最大化宿主的保护性免疫应答至关重要，同时保持免疫耐受和预防自身免疫。负信号对于诱导T细胞耐受似乎是必需的，而正信号促进T细胞活化。共刺激信号和共抑制信号都提供给暴露于抗原的T细胞，并且共刺激信号和共抑制信号之间的相互作用对于控制免疫反应的幅度是必不可少的。此外，当感染或免疫激发被清除、恶化或持续存在时，提供给T细胞的信号发生变化，这些变化强烈影响响应的T细胞并重新塑造免疫应答。
共刺激的机制具有治疗意义，因为共刺激信号的操作已经显示提供了增强或终止的基于细胞免疫应答的方式。最近，已经发现T细胞功能障碍或无反应性可与诱导的和持续的免疫检查点调节物(如程序性死亡1多肽(PD-1)及其配体PD-L1和PD-L2)表达同时发生。PD-L1在许多癌症中过表达并且通常与不良预后相关(Thompson R H等，Cancer Res 2006,66(7)：3381)。此外，与正常组织和外周血T淋巴细胞中的T淋巴细胞相比，大多数肿瘤浸润性T淋巴细胞主要表达PD-1，表明肿瘤反应性T细胞上PD-1的上调可导致抗肿瘤免疫应答受损(Blood 2009 114(8)：1537)。这可能是由于表达PD-L1的肿瘤细胞与表达PD-1的T细胞相互作用介导的PD-L1信号传导的利用，导致T细胞活化的减弱和免疫监视的逃避。抑制PD-L1/PD-1相互作用提供了增强T细胞免疫性的方式，包括CD8+T细胞介导的对癌细胞和肿瘤的杀伤。通过抑制PD-L1与结合伴侣B7-1的结合，已经观察到类似的T细胞免疫的增强。因此，PD-1和其他免疫检查点调节物的治疗靶向是一个令人关注的领域。
将对TIGIT、PD-1和/或PD-L1信号传导的抑制与肿瘤细胞中失调的其他信号传导途径相结合可提供增强治疗功效的方式。近年来，已经确定了许多受体及其配体形式的免疫检查点调节物。结合共刺激或共抑制受体的一个重要的膜结合配体家族是B7家族，其包括CTLA-4及其配体，B7-1和B7-2；PD-1及其配体，PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)；B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)和B7-H6。另外的免疫检查点拮抗剂包括但不限于TIM-3及其配体，半乳糖凝集素-9；LAG-3及其配体，包括肝窦内皮细胞凝集素(LSECtin)和半乳糖凝集素-3；CD122及其CD122R配体；CD70、B7H3、B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、和VISTA(Le Mercier等(2015)Front.Immunol.，(6)，第418条)。另外，已经在各种临床和临床前模型中和/或由FDA批准鉴定并检测了许多检查点调节物拮抗剂(Kyi等，FEBS Letters，588：368-376(2014))。抑制性受体阻断的概念，也称为免疫检查点阻断，已经通过例如FDA批准的针对转移性黑素瘤的PD-1抑制剂、nivolumab和pembrolizumab、以及抗CTLA-4抗体、ipipimumab的验证而生效。
免疫检查点拮抗剂调节或干扰免疫检查点调节物的活性，使得作为与检查点调节物或其配体结合的结果，阻断或抑制通过检查点调节物受体的信号传导。通过抑制这种信号传导，可以逆转免疫抑制，从而可以重新建立或增强对抗癌细胞的T细胞免疫。相反，免疫检查点激动剂(例如，共刺激分子)刺激免疫检查点调节物的活性，从而作为与检查点调节物或其配体结合的结果，刺激通过检查点调节物受体的信号传导。通过刺激这种信号传导，可以重新建立或增强对抗癌细胞的T细胞免疫。
因此，在一个实施方式中，用于刺激受试者的免疫应答的方法包括向受试者施用如本文所述的抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、其抗体片段(例如，抗TIGIT HCVR和/LCVR)或双特异性检查点调节物拮抗剂、或三特异性检查点调节物拮抗剂，与上文所述的另一种免疫检查点调节物组合，使得免疫反应在受试者中受到刺激，例如抑制肿瘤生长或刺激抗病毒应答。
在一个实施方式中，根据本申请的抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、其抗体片段、双特异性检查点调节物拮抗剂、或三特异性检查点调节物拮抗剂与另一种免疫检查点调节物组合施用，作为单独的抗体或在包括对多种产物的结合特异性的多特异性抗体。一般来说，本文描述的抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂、或三特异性检查点调节物拮抗剂可以与如下物质组合以刺激免疫应答，其中所述物质为(i)抑制T细胞活化的IgSF家族蛋白质、B7家族或TNF家族的拮抗剂，或抑制T细胞活化的细胞因子拮抗剂(例如，IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF或其他免疫抑制性细胞因子)和/或(ii)IgSF家族、B7家族或TNF家族的刺激性受体的激动剂，或刺激T细胞活化的细胞因子的激动剂，用于刺激免疫应答。
在一个实施方式中，给受试者施用与抗PD-1抗体或PD-1拮抗剂组合的抗TIGIT抗体或其HCVR和/或LCVR片段。在另一个实施方式中，对受试者施用与抗PD-L1抗体或PD-L1拮抗剂组合的抗-TIGIT抗体或其HCVR和/或LCVR片段。在另一个实施方式中，给受试者施用与抗CTLA-4抗体或CTLA-4拮抗剂组合的抗TIGIT抗体或其HCVR和/或LCVR片段。
在某些实施方式中，仅选择具有表现出针对免疫检查点调节物的配体的高表达的癌症的受试者用于与本申请的抗TIGIT、抗PD-1和/或抗PD-L1抗体、其片段、或任何双特异性或三特异性拮抗剂来联合治疗。举例来说，在一个实施方式中，可选择具有表现出高表达PVR(CD155)和/或结合素-2(Nectin-2)(CD112)和/或低表达PD-L1的癌症的受试者用于用本申请的抗TIGIT抗体、其片段或TIGIT拮抗剂的单一疗法，或与PD-1拮抗剂或其他免疫检查点调节物的组合疗法。
可以与第二抗体、抗体片段或拮抗剂分开施用抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体，或者可以施用包括至少一个对TIGIT结合特异性和对其他靶产物的第二结合特异性的多特异性抗体或拮抗剂。此外，根据本申请的抗TIGIT、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或双特异性或三特异性拮抗剂可以与一种或多种另外的药剂共同施用，例如，以有效刺激免疫应答和/或编程性细胞死亡的量的抗体、拮抗剂或药物，以进一步增强、刺激或上调受试者的免疫应答和/或凋亡。
在一些实施方式中，抗TIGIT、抗PD-1或抗PD-L1抗体或其片段在用不同的免疫检查点调节物拮抗剂治疗后施用。例如，在一个实施方式中，可以仅在用PD-1/PD-L1拮抗剂治疗失败后才施用抗TIGIT、抗PD-1或抗PD-L1抗体，导致了不完全的治疗反应，或已有肿瘤复发或再发(或“PD-1失败”)。在一些实施方式中，可针对例如PVR和/或结合素-2(Nectin-2)的表达筛选表现出这种失败的癌症，并且仅对具有高水平表达的那些癌症用本申请的抗TIGIT、抗PD-1或抗PD-L1抗体、片段或拮抗剂来治疗。
在一个具体的实施方式中，将抗TIGIT、抗PD-1或抗PD-L1抗体或片段与PD-1、PD-L1、PD-L2或TIGIT拮抗剂组合施用。
其他的抗PD-1抗体包括但不限于nivolumab(BMS-936558，MDX-1106，OPDIVOTM)，一种人化免疫球蛋白G4(IgG4)mAb(百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))；pembrolizumab(MK-3475，lambrolizumab，KEYTRUDATM)(Merck)；pidilizumab(CT-011)(Medivation)；和AMP-224(Merck)。抗PD-1抗体是商购可得的，例如来自ABCAM(AB137132)，BIOLEGENDTM(EH12.2H7，RMP1-14)和AFFYMETRIX EBIOSCIENCE(J105，J116，MIH4)。抗PD-1抗体还包括含有图3B的一个或多个抗PD-1CDR、或者图4D-E的一个或多个抗PD-1可变区的抗体或抗体片段。
其他抗PD-L1抗体包括阿唑珠单抗(MPDL3280A，RG7446)，一种完全人化IgG4单抗(基因泰克/罗氏)；BMS-936559(MDX-1105)，一种完全人化的IgG4单抗(Bristol-MyersSquibb)；MEDI4736，一种人化IgG抗体(Medimmune/AstraZeneca)；和MSB0010718C，一种完全人IgG4单克隆抗体(Merck，EMD Serono)。
根据本发明方法使用的示例性抗-CTLA-4抗体包括易普利姆玛(伊匹木单抗)、trevilizumab和曲美木单抗(tremelimumab)。示例性的抗CTLA-4显性负性蛋白包括人化融合蛋白阿巴西普(Abatacept(Orencia))，其包括与CTLA-4ECD融合的IgG1的Fc区，和贝拉西普(Belatacept
Figure BDA0001652427810000511
)，相对于阿巴西普，其为在CTLA-4ECD中具有两个氨基酸取代的、第二代更高亲和力的CTLA-4-Ig变体。
在某些实施方式中，免疫检查点调节物拮抗剂是免疫检查点调节物的显性负蛋白。在具体的实施方式中，所述显性负性蛋白包含源自选自PD-L1、PD-L2、PD-1、B7-1、B7-2、B7H3、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、BTLA、VISTA、CD70及其组合组成的组中的成员的胞外域。在某些特定实施方式中，这些胞外域与目前描述的抗体中的免疫球蛋白恒定区或Fc受体融合。这种突变体可以结合内源性受体以形成信号转导缺陷的复合体。在某些实施方式中，胞外域是与免疫球蛋白恒定区或Fc片段融合或与寡聚蛋白复合物中的单体融合。
在某些实施方式中，显性负性PD-L1拮抗剂包括PD-L1、PD-L2或PD-1的胞外域。在另一个实施方式中，使用显性负性PD-1拮抗剂，其具有突变以使其不再能够结合PD-L1。示例性的显性负性蛋白是AMP-224(由Glaxo Smith Kline和Amplimmune共同开发)，其为包含PD-L2的胞外域和人IgG的Fc区的重组融合蛋白。
示例性免疫检查点调节物激动剂包括但不限于：肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员，如CD27、CD40、OX40、GITR和4-1BB(CD137)及其配体，或B7-CD28超家族成员，包括CD28和ICOS(CD278)。其他检查点调节物激动剂包括CD2、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、CD30、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、CD83配体。免疫检查点激动剂可以包括包含一个或多个共刺激结构域的抗体或可溶性融合蛋白激动剂。激动剂抗体包括但不限于：抗-CD40单克隆抗体，如CP-870,893、鲁卡木单抗(lucatumumab)和达西珠单抗(dacetuzumab)；抗CD137单克隆抗体，如BMS-663513urelumab和PF-05082566；抗OX40单克隆抗体；抗GITR单克隆抗体，如TRX518；抗CD27单克隆抗体，如CDX-1127；和抗-ICOS单克隆抗体。
示例性的GITR激动剂包括例如GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如，二价抗GITR抗体)，如美国专利号：6,111,090和8,586,023；欧洲专利号：090505B1，美国专利PCT公开号：WO 2010/003118和2011/090754中描述的GITR融合蛋白。抗GITR抗体描述于例如美国专利号7,025,962、7,618,632、7,812,135、8,388,967和8,591,886；欧洲专利号：1947183B1和1866339；PCT公开号：WO2011/028683、WO2013/039954、WO2005/007190、WO2007/133822、WO2005/055808、WO99/40196、WO2001/03720、WO99/20758、WO2006/083289、WO 2005/115451、WO2011/051726。示例性的抗GITR抗体是TRX518。
与共刺激或共抑制性受体结合的膜结合配体的另一个家族是与同源TNF受体家族成员结合的TNF家族分子，其包括CD40和CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137/4-1BB、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDAR、EDA1、XEDAR、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFγ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1(32,FAS、FASL、RELT、DR6、TROY、NGFR(参见例如Tansey，M.G.等人(2009)Drug Discovery Today，14(23-24)：1082-1088)。
免疫检查点激动剂或共刺激分子包括除有效免疫应答所需的抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，并且包括但不限于：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号转导的淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活的NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。
在一个方面，T细胞应答可以通过本发明的抗TIGIT、抗PD-1或抗PD-L1单克隆抗体与以下一种或多种的组合来刺激：(i)抑制T细胞活化的蛋白质的拮抗剂(例如免疫检查点抑制剂)，例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、半乳凝素-9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素-1、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD-1H、LAIR1、TIM-1、CD96和TIM-4，以及(ii)刺激T细胞活化的蛋白质的激动剂，如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、CD40、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、DR3和CD28H。
调节上述蛋白之一并且可以与抗TIGIT抗体(例如本文所述的那些用于治疗癌症)组合的示例性药剂包括：YERVOY TM/伊匹木单抗(ipilimumab)或曲美木单抗(针对CTLA-4)、加利希单抗(galiximab)(针对B7.1)、OPDIVOTM/nivolumab/BMS-936558(针对PD-1)、pidilizumab/CT-011(针对PD-1)、KEYTRUDATM/pembrolizumab/MK-3475(针对PD-1)、AMP224(针对B7-DC/PD-L2)、BMS-936559(针对B7-H1)、MPDL3280A(至B7-H1)、MEDI-570(针对ICOS)、AMG557(针对B7H2)、MGA271(针对B7H3)、IMP321(针对LAG-3)、urelumab/BMS-663513和PF-05082566(针对CD137/4-1BB)、CDX-1127(针对CD27)、MEDI-6383和MEDI-6469(针对OX40)、RG-7888(针对OX40L)、阿塞西普(Atacicept)(针对TACI)、CP-870893(针对CD40)、鲁卡木单抗(针对CD40)、达西珠单抗(针对CD40)和muromonab-CD3(针对CD3)。
可以与本文所述用于治疗癌症的检查点调节物拮抗剂组合的其它分子包括NK细胞上的抑制性受体的拮抗剂或激活NK细胞上的受体的激动剂。例如，可以将拮抗剂抗TIGIT、抗PD-1和/或抗PD-L1抗体与KIR的拮抗剂(例如，lirilumab)、CSF-1R拮抗剂(如RG7155)组合。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。这些机制中的许多可以通过灭活由肿瘤表达的免疫抑制蛋白来克服。这些包括TGF-β、IL-10和Fas配体等。这些实体中的每一个的抗体可与本文所述的检查点调节物拮抗剂组合使用，以抵消免疫抑制剂的作用并有利于宿主的肿瘤免疫应答。
激活宿主免疫反应性的其他抗体可以与本文所述的检查点调节物拮抗剂组合使用。这些包括激活DC功能和抗原呈递的树突细胞表面上的分子。抗CD40抗体能够有效取代T细胞辅助活性，并且可以与本文所述的检查点调节物拮抗剂联合使用。活化T细胞共刺激分子如OX-40、CD137/4-1BB和ICOS的抗体也可以提供用于提高T细胞活化水平。
在某些实施方式中，本文所述的检查点调节物拮抗剂可以与一种或多种其他治疗剂，例如抗癌剂、放射性毒剂或免疫抑制剂共同施用。这种共同施用可以解决由对药物的耐受发展、肿瘤细胞的抗原性改变(其使抗体与抗体不反应)、和毒性(通过施用较低剂量的一种或多种药剂)而导致的问题。
本文描述的检查点调节物拮抗剂可以与药剂(作为免疫复合物)连接或可以与药剂分开施用。在后一种情况下(分开给药)，抗体可以在药剂之前、之后或同时给药，或者可以与其它已知疗法，例如抗癌疗法(例如辐射)，共同给药。本文所述的检查点调节物拮抗剂可以与一种或多种抗癌剂共同施用，以提供通过两种通过不同机制协同操作的抗癌剂，从而在人类癌细胞中产生细胞毒效应。
本文所述的检查点调节物拮抗剂可以与抗癌剂组合使用，例如烷化剂、蒽环类抗生素、抗代谢物、解毒剂、干扰素、多克隆或单克隆抗体、EGFR抑制剂、HER2抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、激素、有丝分裂抑制剂、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)抑制剂、Akt抑制剂、哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂、Ras/MAPK途径抑制剂、中心体去簇剂、多激酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、紫杉烷或紫杉烷衍生物、芳香酶抑制剂、蒽环霉素、微管靶向药物、拓扑异构酶毒物药物、分子靶标或酶抑制剂(例如，激酶或蛋白质甲基转移酶)、胞苷类似物或其组合。
示例性的烷化剂包括但不限于：环磷酰胺(Cytoxan；Neosar)；苯丁酸氮芥(留可然(Leukeran))；美法仑(爱克兰(Alkeran))；卡莫司汀(BiCNU)；白消安(Busulfex)；洛莫司汀(CeeNU)；达卡巴嗪(DTIC-Dome)；奥沙利铂(Eloxatin)；卡莫司汀(Gliadel)；异环磷酰胺(Ifex)、双氯乙基甲胺(Mustargen)；白消安(Myleran)；卡铂(Paraplatin)；顺铂(CDDP；Platinol)；替莫唑胺(Temodar)；噻替派(Thioplex)；苯达莫司汀(Treanda)；或链唑霉素(Zanosar)。
示例性的蒽环类抗生素包括但不限于：多柔比星(Adriamycin)；多柔比星脂质体(Doxil)；米托蒽醌(Novantrone)；博来霉素(Blenoxane)；柔红霉素(Cerubidine)；柔红霉素脂质体(DaunoXome)；放线菌素(Cosmegen)；表柔比星(Ellence)；伊达比星(伊达霉素)；普卡霉素(Mithracin)；丝裂霉素(Mutamycin)；喷司他丁(Nipent)；或戊柔比星(Valstar)。
示例性的抗代谢物包括但不限于：氟尿嘧啶(Adrucil)；氟尿嘧啶卡培他滨(希罗达(Xeloda))；羟基脲(Hydrea)；巯嘌呤(嘌呤醇(Purinethol))；培美曲塞(Alimta)；氟达拉滨(Fludara)；奈拉滨(Arranon)；克拉屈滨(Cladribine Novaplus)；氯法拉滨(Clolar)；阿糖胞苷(Cytosar-U)；地西他滨(Dacogen)；阿糖胞苷脂质体(DepoCyt)；羟基脲(Droxia)；普拉曲沙(Folotyn)；氟尿苷(FUDR)；吉西他滨(Gemzar)；克拉屈滨(Leustatin)；氟达拉滨(Oforta)；甲氨蝶呤(MTX；Rheumatrex)；甲氨蝶呤(Trexall)、硫鸟嘌呤(Tabloid)；TS-1或阿糖胞苷(Tarabine PFS)。
示例性的解毒剂包括但不限于阿米斯丁(Ethyol)或美司钠(Mesnex)。
示例性的干扰素包括但不限于干扰素α-2b(Intron A)或干扰素α-2a(Roferon-A)。
示例性的多克隆或单克隆抗体包括但不限于：曲妥珠单抗(赫赛汀)；奥法木单抗(Ofatumumab)(Arzerra)；贝伐单抗(Avastin)；利妥昔单抗(Rituxan)；西妥昔单抗(Erbitux)；帕尼单抗(Vectibix)；托西莫单抗/碘131托西莫单抗(Bexxar)；阿仑单抗(Campath)；ibritumomab(Zevalin；In-111；Y-90Zevalin)、吉妥单抗(Mylotarg)；依库珠单抗(Soliris)ordenosumab。
示例性的EGFR抑制剂包括但不限于：吉非替尼(Iressa)；拉帕替尼(Tykerb)；西妥昔单抗(Erbitux)；埃罗替尼(特罗凯(Tarceva))、帕尼单抗(Vectibix)；PKI-166；卡纽替尼(canertinib)(CI-1033)；马妥珠单抗(Emd7200)或EKB-569。
示例性HER2抑制剂包括但不限于曲妥珠单抗(Herceptin)；拉帕替尼(Tykerb)；或AC-480。
示例性的组蛋白脱乙酰酶抑制剂包括但不限于：伏立诺他(Zolinza)、丙戊酸、罗米地辛、恩替司他、abexinostat、格维诺司他、和莫西汀司他。
示例性的激素包括但不限于：他莫昔芬(Soltamox；Nolvadex)；雷洛昔芬(Evista)；甲地孕酮(Megace)；亮丙瑞林(Lupron；Lupron Depot；Eligard；Viadur)；氟维司群(Faslodex)；来曲唑(Femara)；曲普瑞林(Trelstar LA；Trelstar Depot)；依西美坦(Aromasin)；戈舍瑞林(Zoladex)；比卡鲁胺(Casodex)；阿那曲唑(Arimidex)；氟甲睾酮(Androxy；Halotestin)；甲羟孕酮(Provera；Depo-Provera)；雌莫司汀(Emcyt)；氟他胺(Eulexin)；托瑞米芬(Fareston)；地加瑞克(Firmagon)；尼鲁米特(Nilandron)；阿布雷里克斯(Plenaxis)；或睾内酯(Teslac)。
示例性的有丝分裂抑制剂包括但不限于：紫杉醇(Taxol；Onxol；Abraxane)；多西他赛(Taxotere)；长春新碱(Oncovin；Vincasar PFS)；长春碱(Velban)；依托泊苷(Toposar；Etopophos；VePesid)；替尼泊苷(Vumon)；伊沙匹隆(Ixempra)；诺考达唑；埃博霉素；长春瑞滨(Navelbine)；喜树碱(CPT)；伊立替康(Camptosar)；托泊替康(Hycamtin)；安吖啶或lamellarin D(LAM-D)。
示例性的磷脂酰-肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂包括不可逆的PI3K抑制剂渥曼青霉素、渥曼青霉素衍生物去甲氧基吡啶LY294002、PI3K可逆抑制剂；BKM120(Buparlisib)、Idelalisib(一种PI3Kδ抑制剂)；duvelisib(IPI-145，PI3Kδ和γ的抑制剂)；alpelisib(BYL719)(一种α特异性PI3K抑制剂)；TGR 1202(以前称为RP5264)(一种口服PI3Kδ抑制剂)；和copanlisib(BAY80-6946)(一种PI3Kα、δ亚型占优势抑制剂)。
示例性的Akt抑制剂包括但不限于：米替福新、AZD5363、GDC-0068、MK2206、哌立福辛、RX-0201、PBI-05204、GSK2141795、和SR13668。
示例性MTOR抑制剂包括但不限于：依维莫司(Afinitor)或替西罗莫司(Torisel)；雷帕鸣(rapamune)，地磷莫斯(ridaforolimus)；地磷莫斯(deforolimus)(AP23573)；AZD8055(AstraZeneca)、OSI-027(OSI)、INK-128、BEZ235、PI-103、Torin1、PP242、PP30、Ku-0063794、WAY-600、WYE-687、WYE-354、和CC-223。
示例性的蛋白酶体抑制剂包括但不限于：硼替佐米(PS-341)、ixazomib(MLN2238)、MLN 9708、delanzomib(CEP-18770)、卡非佐米(carfilzomib)(PR-171)、YU101、oprozomib(ONX-0912)、marizomib(NPI-0052)、和戒酒硫(disufiram)。
示例性的PARP抑制剂包括但不限于：奥拉帕尼、伊帕利布、velaparib、BMN-673、BSI-201、AG014699、ABT-888、GPI21016、MK4827、INO-1001、CEP-9722、PJ-34、Tiq-A、Phen、PF-01367338及其组合。
示例性的Ras/MAPK途径抑制剂包括但不限于：trametinib、司美替尼(selumetinib)、cobimetinib、CI-1040、PD0325901、AS703026、RO4987655、RO5068760、AZD6244、GSK1120212、TAK-733、U0126、MEK162和GDC-0973。
示例性的中心体去簇剂包括但不限于：灰黄霉素；诺斯卡品(noscapine)、诺斯卡品衍生物，例如溴化诺斯卡品(例如，9-溴苯斯卡平(9-bromonoscapine))、还原溴代斯卡斯汀(RBN)、N-(3-溴苄基)诺斯卡品、氨诺卡西平及其水溶性衍生物；CW069；菲衍生的聚(ADP-核糖)聚合酶抑制剂PJ-34；N2-(3-吡啶基甲基)-5-硝基-2-糠酰胺、N2-(2-噻吩基甲基)-5-硝基-2-糠酰胺和N2-苄基-5-硝基-2-糠酰胺。
示例性的多激酶抑制剂包括但不限于：瑞格非尼；索拉非尼(Nexavar)；舒尼替尼(Sutent)；BIBW 2992；E7080；ZD6474；PKC-412；莫特塞尼；或AP24534。
示例性的丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂包括但不限于：芦布妥林(ruboxistaurin)；依立卢(eril)/easudil盐酸盐；黄酮类抗肿瘤药；塞利西利(seliciclib)(CYC202；Roscovitrine)；SNS-032(BMS-387032)；PKC412；苔藓虫素；KAI-9803；SF1126；VX-680；AZD1152；Arry-142886(AZD-6244)；SCIO-469；GW681323；CC-401；CEP-1347或PD 332991。
示例性的酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于：埃罗替尼(Tarceva)；吉非替尼(Iressa)；伊马替尼(Gleevec)；索拉非尼(Nexavar)；舒尼替尼(Sutent)；曲妥珠单抗(Herceptin)；贝伐单抗(Avastin)；利妥昔单抗(Rituxan)；拉帕替尼(Tykerb)；西妥昔单抗(Erbitux)；帕尼单抗(Vectibix)；依维莫司(Afinitor)；阿仑单抗(Campath)；吉姆单抗(Mylotarg)；坦西莫司(temsirolimus)(Torisel)；帕唑帕尼(Votrient)；达沙替尼(Sprycel)；尼罗替尼(Tasigna)；vatalanib(Ptk787；ZK222584)；CEP-701；SU5614；MLN518；XL999；VX-322；AZD0530；BMS-354825；SKI-606CP-690；AG-490；WHI-P154；WHI-P131；AC-220；或者AMG888。
示例性的VEGF/VEGFR抑制剂包括但不限于：贝伐单抗(Avastin)；索拉非尼(Nexavar)；舒尼替尼(Sutent)；兰尼单抗；哌加他尼；或vandetinib。
示例性的微管靶向药物包括但不限于：紫杉醇；多西他赛；长春新碱(vincristin)；长春碱(vinblastin)；诺考达唑；埃博霉素和诺维本。
示例性的拓扑异构酶毒物药物包括但不限于：替尼泊苷、依托泊苷、阿霉素、喜树碱、柔红霉素、放线菌素D、米托蒽醌、安吖啶、表柔比星和伊达比星。
示例性的紫杉烷或紫杉烷衍生物包括但不限于紫杉醇和多西他赛。
示例性的一般化学治疗剂、抗肿瘤剂、抗增殖剂包括但不限于：六甲蜜胺(Hexalen)；异维甲酸(Accutane；Amnesteem；Claravis；Sotret)；维甲酸(Vesanoid)；阿扎胞苷(Vidaza)；硼替佐米(Velcade)天冬酰胺酶(Elspar)；左旋咪唑(Ergamisol)；米托坦(Lysodren)；丙卡巴肼(Matulane)；培门冬酶(pegaspargase)(Oncaspar)；地尼白介素-毒素连接物(Ontak)；卟菲尔(Photofrin)；阿地白介素(aldesleukin)(Proleukin)；来那度胺(Revlimid)；贝沙罗汀(Targretin)；沙利度胺(Thalomid)；temsirolimus(Torisel)；三氧化二砷(Trisenox)；维替泊芬(Visudyne)；mimosine(Leucenol)；(1M替加氟-0.4M 5-氯-2、4-二羟基嘧啶-1M氧代膦酸钾)或洛伐他汀。
在某些实施方式中，本文所述的抗TIGIT抗体或抗TIGIT抗体片段可以与一种或多种血管生成抑制剂组合。血管生成，从现有血管开发新血管，对肿瘤生长和转移至关重要。血管生成抑制对于治疗其中进展(例如转移)依赖于新血管形成的疾病(如癌症)的呈现为潜在有价值的策略。两种重要的血管生成途径包括血管内皮生长因子(VEGF)途径和Tie2途径。主要的VEGF途径由跨膜酪氨酸激酶VEGF-R2介导。VEGF的各种亚型，特别是VEGF-A与VEGF-R2结合，导致通过各种下游酪氨酸激酶的磷酸化的二聚作用和活化。Tie2途径是已经开发了治疗性抗体和小分子药物的另一种血管生成途径。Tie2酪氨酸激酶受体响应其一种血管生成素(Ang)配体(即Ang1、Ang2、Ang3(小鼠)和Ang4)的结合而激活血管生成。血管生成的抑制导致肿瘤细胞死亡，其可以将肿瘤抗原喂入宿主抗原呈递途径。
在一些实施方式中，给受试者施用与一种或多种VEGF结合拮抗剂和/或一种或多种Tie2受体结合拮抗剂组合的抗TIGIT抗体或其HCVR和/或LCVR片段。VEGF结合拮抗剂结合VEGF-A或其受体VEGFR-2，从而由于结合，使得VEGF-A对VEGFR-2的活化被阻断或抑制。Tie2受体结合拮抗剂结合Tie2酪氨酸激酶受体或其血管生成素(Ang)配体之一(即Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4)，从而由于结合，使得Tie2受体被其一个或多个配体的活化被阻断或抑制。
优选的VEGF抗体拮抗剂是贝伐单抗(AVASTINTM)，一种人化抗体。贝伐单抗包括突变的人IgG1框架区和来自鼠抗-hVEGF单克隆抗体A.4.6.1的抗原结合互补决定区，其阻断人VEGF-A与VEGFR-2的结合。贝伐单抗的氨基酸序列(包括大部分框架区)的约93％来源于人IgG1，约7％的序列来源于鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量并被糖基化。
另外的抗VEGF抗体包括：雷珠单抗(ranibizumab，商品名Lucentis TM)，源自与贝伐单抗相同的亲本鼠抗体的单克隆抗体片段；美国公开号2006/0280747、2007/0141065和/或2007/0020267中所述的G6或B20系列抗体(例如G6-23、G6-31、B20-4.1)，以及美国专利号7,060,269、6,884,879、6,582,959、6,703,020、6,054,297中；美国专利申请公开号U.S.2007/059312、U.S.2006/009360、U.S.2005/0186208、U.S2003/0206899，U.S.2003/0190317和U.S.2003/0203409中所述的抗体。
示例性的显性负性抗VEGF拮抗剂是阿柏西普(Aflibercept)，一种重组融合蛋白，其包含有与人类IgG1Fc部分融合的来自人类VEGF受体1和2的胞外域的VEGF-A结合部分。阿柏西普用作VEGF-A的可溶性受体诱饵。
示例性的抗VEGFR-2拮抗剂是人化IgG1单克隆抗体雷莫芦单抗(Ramucirumab)，其结合VEGFR-2的胞外域，由此阻断其与VEGF-A的相互作用。
VEGF途径的示例性小分子拮抗剂包括VEGFR-2的多激酶抑制剂，包括舒尼替尼、索拉非尼、塞来替尼、帕唑尼布和宁替尼尼。
Tie2受体结合拮抗剂结合Tie2酪氨酸激酶受体或其血管生成素(Ang)配体之一(即Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4)，从而由于结果，使得Tie2受体被一个或多个其配体的活化被阻断或抑制。在一个实施方式中，Tie2受体结合拮抗剂是抑制性肽。在具体实施方式中，所述抑制性肽包括SEQ ID NO：185中的氨基酸序列，即AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE。在另一个实施方式中，Tie2受体结合拮抗剂包括与Fc片段融合的SEQ ID NO：93的肽，即DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGAQ
QEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE(SEQ ID NO：186)。
Tie2活化的其它肽抑制剂(包括Ang-2抑制剂)包括：A-11(Compugen)，其包含氨基酸序列ETFLSTNKLENQ(SEQ ID NO：187)；CVX-060肽(辉瑞公司(Pfizer))；CVX-037肽(辉瑞公司)；和CGEN-25017(Compugen)。另外的Tie2激活的肽抑制剂描述于美国专利号7138370。
Tie2激活的抗体抑制剂(和/或血管生成素-2)包括：AMG-780(Amgen)、MEDI-3617(MedImmune/AstraZeneca)、DX-2240(Dyax/Sanofi-Aventis)、REGN-910(Sanofi/Regeneron)、RG7594(罗氏)、LC06(罗氏)、TAvi6(罗氏)、AT-006(罗氏/Affitech)。另外的Tie2受体结合抗体拮抗剂及由其得到的抗体结合序列描述于美国专利号7,521,053、7,658,924和8,030,025以及美国专利申请公开号2013/0078248、2013/0259859和2015/0197578。
Tie2结合拮抗剂还包括：小分子抑制剂、CGI-1842(CGI Pharmaceuticals)、LP-590(Locus Pharmaceuticals)、ACTB-1003(Act Biotech/Bayer AG)、CEP-11981(Cephalon/Teva)、MGCD265(甲基)、瑞戈非尼(Bayer)、Cabozantinib/XL-184/BMS-907351(Exelixis)、Foretnib(Exelixis)、MGCD-265(MethylGene公司)。
在某些实施方式中，本文描述的检查点调节物拮抗剂以亚治疗剂量施用，另一种抗免疫检查点调节物抗体或拮抗剂以亚治疗剂量施用，血管发生拮抗剂以亚治疗剂量施用，或其组合中的任何拮抗剂各自以亚治疗剂量施用。
在某些实施方式中，将TIGIT、PD-1和/或PD-L1抑制与标准癌症治疗(例如，手术、放疗和化疗)相结合。TIGIT、PD-1和/或PD-L1抑制可以有效地与化疗方案相组合。在这些情况下，可能减少施用的化学治疗剂的剂量。这种结合的一个实例是抗-TIGIT、抗-PD-1或抗PD-L1抗体与氨烯咪胺(decarbazine)组合用于治疗黑素瘤。这种组合的另一个实例是抗TIGIT、抗PD-1或抗PD-L1抗体与白细胞介素-2(IL-2)组合用于治疗黑素瘤。被认为的是将TIGIT、PD-1和/或PD-L1抑制与化学疗法组合可增强细胞凋亡，并增加用于细胞毒性免疫的肿瘤抗原呈递。其他协同组合疗法包括与辐射、手术或激素剥夺组合使用时，通过细胞死亡的TIGIT、PD-1和/或PD-L1抑制。这些方案中的每一个都在宿主中产生肿瘤抗原的来源。
在某些实施方式中，本文所述的检查点调节物拮抗剂也可用于多特异性拮抗剂，或与双特异性抗体组合使用，所述双特异性抗体将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向至肿瘤细胞(参见，例如，美国专利5,922,845和5,837,243)。双特异性抗体可用于靶向两种不同的抗原。例如，已经使用抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如，Her-2/neu)双特异性抗体将巨噬细胞靶向癌细胞或肿瘤。这种靶向可以更有效地激活肿瘤特异性应答。这些应答的T细胞臂将通过TIGIT、PD-1和/或PD-L1的抑制而增强。可选地，可以通过使用结合肿瘤抗原和树突细胞特异性细胞表面标记的双特异性抗体来将抗原直接递送至DC。
用于表达检查点调节物拮抗剂的核酸和宿主细胞
另一方面，本申请提供了编码本申请的检查点调节物拮抗剂的核酸，以及包括此类核酸的表达载体。在一些实施方式中，核酸编码根据本文实施方式所述的抗体或片段的HCVR和/或LCVR片段，或本文所述的任何其他抗体和抗体片段。
编码单克隆抗体中的抗原结合位点的DNA可以使用常规方法从杂交瘤细胞中分离和测序(例如，通过使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可选地，可以通过直接蛋白质测序来确定目的免疫球蛋白的氨基酸序列，并且可以根据通用密码子表设计合适的编码核苷酸序列。在其他情况下，抗原结合位点或其他免疫球蛋白序列(包括恒定区、铰链区等)的核苷酸和氨基酸序列可以从本领域公知的来源获得。
编码特定的单特异性、双特异性或三特异性检查点调节物拮抗剂的表达载体可以用于在体外培养的细胞中合成本公开的检查点调节物拮抗剂，或者它们可以直接施用于患者从而在体内或体外表达检查点调节物拮抗剂。如本文所用，“表达载体”是指病毒或非病毒载体，其包括编码一个或多个对应于本公开的单特异性、双特异性或三特异性检查点调节物拮抗剂的多肽链，其形式适于从宿主细胞中的多核苷酸表达以用于抗体制备目的或用作治疗剂直接施用。
当一核酸序列与另一核酸序列处于功能关系时，前者与后者“可操作地连接”。例如，如果前序列或信号肽的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该前序列或信号肽的DNA可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或者如果核糖体结合位置被定位以便于翻译，则该核酸体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在信号肽的情况下是连续的并处于阅读相。但是，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点进行连接来完成。如果这样的位点不存在，则根据常规实践可以使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
用于表达检查点调节物拮抗剂的核酸序列通常包括从成熟蛋白质中去除的氨基末端信号肽序列。由于信号肽序列可以影响表达水平，所以多核苷酸可以编码多种不同N端信号肽序列中的任何一种。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化宿主细胞的选择，所需蛋白质表达水平等因素。
上述“调控序列”是指在一种或多种宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达调控元件(例如，聚腺苷酸化信号)。调控序列包括那些在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达，或者仅在某些宿主细胞(例如组织特异性调控序列)中指导核苷酸序列表达的那些。表达载体通常包含用于转录终止的序列，并且可以另外包含一个或多个正向影响mRNA稳定性的元件。
表达载体包含一种或多种转录调控元件，包括启动子和/或增强子，用于指导检查点调节物拮抗剂的表达。启动子包括起到转录起始位点相对固定位置起始转录功能的DNA序列。启动子包含RNA聚合酶和转录因子基本相互作用所需要的核心元件，并且可以与其他上游元件和响应元件一起操作。
如本文所使用的，术语“启动子”应为其最广泛的含义，并且包括来自基因组基因或来自其的嵌合TRE的转录调控元件(TRE)，包括用于精确转录起始的TATA盒或起始子元件，带有或没有另外的TRE(即，上游激活序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)，其响应发育和/或外部刺激调节与其可操作地连接的基因的激活或抑制，以及反式作用调节蛋白或核酸。启动子可以包含基因组片段，或其可能含有一个或多个TRE组合在一起的嵌合体。
优选的启动子是能够在目标靶细胞中指导高水平表达的启动子。启动子可以包括组成型启动子(例如，HCMV、SV40、延伸因子-1α(EF-1α))或那些在特定的目标细胞类型中呈现出优先表达的启动子。增强子通常是指远离转录起始位点起作用的DNA序列，并且可以是转录单位的5'或3'。此外，增强子可以在内含子内以及在编码序列内。他们通常在10到300bp之间的长度，且它们以顺式起作用。增强子的功能是增加和/或调控附近启动子的转录。优选的增强子是指导抗体产生细胞中高水平表达的增强子。可以将细胞或组织特异性转录调控元件(TRE)引入表达载体中以将表达限制为期望的细胞类型。Pol III启动子(H1或U6)特别适用于表达siRNAs表达的shRNAs。表达载体可以设计成以促进检查点调节物拮抗剂在一种或多种细胞类型中的表达。
在某些实施方式中，可以工程化一个或多个表达载体以同时表达检查点调节物拮抗剂和一种或多种靶向Tie2途径、VEGF途径或免疫检查点调节物的siRNA。
siRNA是双链RNA，其可以被工程化以诱导mRNA的序列特异性转录后基因沉默。合成产生的siRNA在结构上模拟通过Dicer酶在细胞中正常加工的siRNA的类型。当由表达载体表达时，表达载体被工程化以转录在细胞内被加工成靶向siRNA的短双链发夹样RNA(shRNA)。可以使用众所周知的算法设计合成的siRNA和shRNA，并使用常规的DNA/RNA合成器合成。
为了共表达检查点调节物拮抗剂的单个链，可以引入合适的剪接供体和剪接受体序列以表达两个产物品。可选地，可以使用内部核糖体结合序列(IRES)或2A肽序列来表达来自一个启动子的多个产物。IRES提供了核糖体可以结合的结构，不需要位于mRNA的5'末端。因此它可以指导核糖体在mRNA内的第二个起始密码子处启动翻译，从而允许从单个mRNA产生多于一个多肽。2A肽包含介导自2A位点上游和下游肽的共翻译自我切割的短序列，允许以等摩尔量从单个转录物产生两种不同蛋白质。CHYSEL是2A肽的一个非限制性实例，其引起翻译的真核生物核糖体以释放正在增长的多肽链，其合成不需不从mRNA解离。核糖体继续翻译，从而产生第二多肽。
表达载体可以包括病毒载体或非病毒载体。病毒载体可以来源于腺伴随病毒(AAV)、腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、逆转录病毒(包括慢病毒，如HIV-1和HIV-2)、Sindbis和其他RNA病毒、α病毒、星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多泡病毒、副粘病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、披膜绦虫病毒等。非病毒载体仅仅是未与病毒衍生组分(例如衣壳和/或包膜)一起包装的“裸”表达载体。
在某些情况下，可以通过使用病毒载体固有的靶向特征或工程化入病毒载体，将这些载体工程化以靶向某些疾病或细胞群。特定细胞可以“靶向”用于递送多核苷酸以及表达。因此，在这种情况下，术语“靶向”可以基于使用用于递送至特定细胞的衣壳、包膜蛋白、抗体的形式的内源或异源结合剂，限制表达到细胞的特定子集，或两者的组织特异性调控元件的使用。
在一些实施方式中，抗体链的表达处于调控元件诸如组织特异性或普遍存在的启动子的控制之下。在一些实施方式中，普遍存在的启动子如CMV启动子、CMV-鸡β-肌动蛋白杂合体(CAG)启动子、组织特异性或肿瘤特异性启动子，以控制来自其的特定抗体重链或轻链或单链衍生物的表达。
非病毒表达载体可以用于非病毒基因转移，可以通过直接注射裸DNA或通过将编码检查点调节物拮抗剂的多核苷酸包封在脂质体、微粒、微胶囊、病毒样颗粒或红细胞血影中。这种组合物可以通过化学缀合与靶向结构域进一步连接，以促进靶向递送和/或将核酸进入期望的目的细胞。此外，可以将质粒载体与合成的基因转移分子如聚合DNA结合阳离子如聚赖氨酸、鱼精蛋白和白蛋白一起孵育，并与细胞靶向配体如非唾液血清类粘蛋白、胰岛素、半乳糖、乳糖或转铁蛋白连接。
可选地，可以使用裸DNA。裸DNA的摄取效率可以通过压实(compaction)或通过使用可生物降解的乳胶珠来改善。这种递送可以通过处理小珠以增加疏水性并由此促进内体的破坏和将DNA释放到细胞质中而进一步改善。
产生单特异性或多特异性抗体的方法
另一方面，本申请提供了用抗TIGIT、抗PD-1和/或抗PD-L1HCVR和/或LCVR编码核酸或表达载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是能够表达抗TIGIT、抗PD-1和/或抗PD-L1HCVR和/或LCVR编码核酸或表达载体或本文所述的任何其他共同施用的任何抗体或拮抗剂的细菌或真核细胞。
另一方面，产生检查点调节物拮抗剂的方法包括：在允许产生抗体或片段的条件下，培养用一种或多种抗TIGIT、抗PD-1和/或抗PD-L1HCVR和/或LCVR编码核酸或表达载体转化的宿主细胞，并从细胞中纯化抗体。
另一方面，本申请提供了产生抗体的方法，包括：培养在抗体中瞬时或稳定表达一种或多种编码一种或多种多肽链的构建体的细胞；并从所培养的细胞中纯化抗体。可以使用任何能够产生功能性抗体的细胞。在优选的实施方式中，抗体表达细胞是真核或哺乳动物来源的，优选人细胞。来自各种组织细胞类型的细胞可用于表达抗体。在其他实施方式中，细胞是酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞。优选地，抗体产生细胞用表达抗体的载体来稳定转化。
编码抗体重链或轻链的一种或多种表达载体可通过任何常规方法引入细胞中，例如通过裸DNA技术、阳离子脂质介导的转染、聚合物介导的转染、肽介导的转染、病毒介导的感染、物理或化学试剂或处理、电穿孔等。此外，细胞可以用一种或多种用于表达抗体的表达载体连同促进选择稳定转化的表达抗体的克隆的选择标记一起转染。由这些细胞产生的抗体可根据本领域已知的技术来收集和/或纯化，例如通过离心、层析等。
适用于哺乳动物细胞的选择性标记的实例包括：二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、水霉素和嘌呤霉素。当这种选择性标记被成功转移到哺乳动物宿主细胞中时，如果置于选择压力下，转化的哺乳动物宿主细胞可以存活。有两种广泛使用的不同类别的选择性制度。第一类是基于细胞的代谢，以及使用独立于补充培养基缺乏生长能力的突变细胞系。两个实例是CHO DHFR-细胞和小鼠LTK-细胞。这些细胞在不添加胸苷或次黄嘌呤等营养素的情况下缺乏生长能力。因为这些细胞缺乏完整的核苷酸合成途径所必需的某些基因，所以它们不能存活，除非在补充的培养基中提供缺失的核苷酸。补充培养基的替代方法是将完整的DHFR或TK基因引入缺乏相应基因的细胞中，从而改变其生长需求。未用DHFR或TK基因转化的个体细胞在非补充培养基中将不能存活。
第二类是显性选择，其指代任何细胞类型中使用的选择方案，并且不需要使用突变细胞系。这些方案通常使用药物来阻止宿主细胞的生长。那些具有新基因的细胞会表达传递耐药性的蛋白质，并能在选择中存活下来。这种显性选择的实例是使用药物新霉素、麦考酚酸或潮霉素。这三个实例在真核细胞控制下使用细菌基因来分别传递对适当的药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的耐受性。其他包括新霉素类似物G418和嘌呤霉素。
示例性的抗体表达细胞包括人Jurkat、人胚胎肾(HEK)293、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠WEHI纤维肉瘤细胞以及单细胞原生动物物种，如利什曼原虫(Leishmaniatarentolae)。另外，可以使用由c-myc或其他永生化试剂而永生化的原代细胞来生产稳定转化的产生抗体的细胞系。
在一个实施方式中，所述细胞系包括稳定转化的利什曼原虫细胞系，例如利什曼原虫。众所周知，利什曼原虫可为高水平表达显示哺乳动物型糖基化模式的真核蛋白质提供强大、快速增长的单细胞宿主。市售的利什曼原虫真核表达试剂盒是可用的(JenaBioscience GmbH，Jena，德国)。
在一些实施方式中，所述细胞系表达至少1mg、至少2mg、至少5mg、至少10mg、至少20mg、至少50mg、或至少100mg的抗体/升培养物。
在任何合适的培养基如RPMI、DMEM和AIM
Figure BDA0001652427810000661
中培养和维持后，本申请中的抗体可以从抗体表达细胞中分离。可以使用常规蛋白质纯化方法(例如亲和纯化、层析等)纯化抗体，包括使用蛋白质A、或蛋白质-G免疫亲和纯化。在一些实施方式中，抗体被工程化以分泌到培养上清液中以从中分离。
药物组合物和治疗方法
本申请的另一方面涉及用于治疗细胞增殖性病症(例如癌症、慢性感染或免疫受损的疾病状态)的药物组合物和方法。在一个实施方式中，所述药物组合物包括本申请的检查点调节物拮抗剂。在一些实施方式中，所述检查点调节物拮抗剂包括如本文所述的抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、双特异性检查点调节物拮抗剂、三特异性检查点调节物拮抗剂、或其抗原结合片段，其与药学上可接受的载体一起配制。这样的组合物可以包括本文所述的一种或多种不同抗体、一种或多种多特异性抗体、一种或多种免疫偶联物或其组合。
如上所述，使用本文所述的药物组合物的方法包括向有此需要的受试者施用有效量的根据本公开的药物组合物。
可以采用任何合适的施用途径或方式来为患者提供治疗或预防有效剂量的抗体或拮抗剂。示例性的施用途径或模式包括肠胃外(例如静脉内、动脉内、肌内、皮下、瘤内)、口服、局部(鼻腔、透皮、皮内或眼内)、粘膜(例如，鼻腔、舌下、口腔、直肠、阴道)吸入、淋巴管内、脊柱内、颅内、腹膜内、气管内、膀胱内、鞘内、肠内、肺内、淋巴内、血管内、眶内、囊内和经尿道，以及通过导管或支架局部递送。
根据本公开的包含抗体或拮抗剂的药物组合物可以配制在任何药学上可接受的载体或赋形剂中。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药物组合物可以包括合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。示例性的载体或赋形剂包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物如聚乙二醇。示例性的药学上可接受的载体包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，或氯化钠。药学上可接受的载体可以进一步包括少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加了治疗剂的保质期或效力。
检查点调节物拮抗剂可以被引入适于胃肠外给药的药物组合物中。合适的缓冲剂包括但不限于琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。可以使用氯化钠来改变浓度为0-300mM的溶液的毒性(对于液体剂型最佳为150mM)。冷冻保护剂可包含在内用于冻干剂型，主要为0-10％蔗糖(最佳为0.5-1.0％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。可以包含填充剂用于冻干剂型，主要是1-10％甘露醇(最佳为2-4％)。稳定剂可用于液体和冻干剂型，主要是1-50mM L-甲硫氨酸(最佳为5-10mM)。其他合适的填充剂包括甘氨酸、精氨酸，可以包含0-0.05％聚山梨酯-80(最佳为0.005-0.01％)。另外的表面活性剂包括但不限于聚山梨酸酯20和BRIJ表面活性剂。
治疗性检查点调节物拮抗剂制剂可以冻干并作为无菌粉末储存，优选在真空下储存，然后在注射前在抑菌水(包含例如苯甲醇防腐剂)或在无菌水中重构。药物组合物可以配制用于通过注射进行肠胃外给药，例如通过快速浓注或连续输注。
药物组合物中的治疗剂可以以“治疗有效量”或“预防有效量”配制。“治疗有效量”是指在必需的剂量和时间段内有效达到所需治疗结果的量。重组载体的治疗有效量可以根据待治疗的病症，病症的严重程度和过程，施用模式，抗体或药剂是为了预防还是治疗目的施用，特定试剂的生物利用度，检查点调节物拮抗剂在个体中引起期望的应答的能力，先前的疗法，患者的年龄、体重和性别，患者的临床病史和对抗体的反应，使用的检查点调节物拮抗剂的类型，主治医师的考量等。治疗有效量也是其中重组载体的任何毒性或有害作用超过治疗有益效果的量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需预防结果的量。
优选地，检查点调节物拮抗剂中的多肽结构域来源于它们将被施用的相同宿主，以便减少针对施用的治疗剂的炎症反应。
检查点调节物拮抗剂适于一次或通过一系列治疗合适地施用于该患者，并且可以在从诊断开始的任何时间对患者施用。检查点调节物拮抗剂可作为单一治疗或与可用于治疗所述疾病的其它药物或疗法联合施用。
作为一般建议，检查点调节物拮抗剂的治疗有效量或预防有效量将以约1ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的范围施用，不论是通过一次或多次施用。在一个具体实施方式中，每个检查点调节物拮抗剂以以下范围施用：约1ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约10ng/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天，10ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天，约100ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约100ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约100ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天，约100ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，约100ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天，约100ng/kg体重/天到约1μg/kg体重/天，约1μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约1μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约1μg/kg体重约1mg/kg体重/天，约1μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，约1μg/kg体重/天至约10μg/kg体重体重/天，约10μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约10μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约10μg/kg体重/天至约1mg/kg体重体重/天，约10μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，约100μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约100μg/kg体重体重/天至约10mg/kg体重/天，约100μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天，约1mg/kg体重/天至约100mg/kg体体重/天，约1mg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约10mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天。
在其他实施方式中，检查点调节物拮抗剂以每三天500μg至20g、或每三天25mg/kg体重的剂量施用。
在其他实施方式中，每个检查点调节物拮抗剂施用的范围为：每个个体施用约10ng至约100ng，每个个体施用约10ng至约1μg，每个个体施用约10ng至约10μg，每个个体施用约10ng至约100μg，每个个体施用约10ng至约1mg，每个个体施用约10ng至约10mg，每次单独施用约10ng至约10mg，约10ng至约100mg，每次注射约10ng至约1000mg，每个个体施用约10ng至约10,000mg，每个个体施用约100ng至约1μg，每个个体施用约100ng至约10μg，每个个体施用约100ng至约100μg，每个个体施用约100ng至约1mg，每个个体施用约100ng至约10mg，每个个体施用约100ng至约100mg，每次注射约100ng至约1000mg，每个个体施用约100ng到约10,000mg，每个个体使用约1μg至约10μg，每个个体施用约1μg至约100μg，每个个体施用约1μg至约1mg，每个个体施用约1μg至约10mg，每个个体施用1μg至约100mg，每次注射约1μg至约1000mg，每个个体施用约1μg至约10,000mg，每个个体施用约10μg至约100μg，每个个体施用约10μg至约1mg，每个个体施用约10μg至约10mg，每个个体约10μg至约100mg，每次注射约10μg至约1000mg，每个个体施用约10μg至约10,000mg，每个体施用约100μg至约1mg，每个个体施用约100μg至约10mg，每个个体施用约100μg至约100mg，每次注射约100μg至约1000mg，每个个体施用约100μg至约10,000mg，每个个体施用约1mg至约10mg，每个个体施用约1mg至约100mg，每次注射约1mg至约1000mg，每个个体施用约1mg至约10,000mg，每个个体施用约10mg至约100mg，每次注射约10mg至约1000mg，每个个体施用约10mg至约10,000mg，每次注射约100mg至约1000mg，每个个体施用约100mg至约10,000mg，和每个个体施用约1000mg至约10,000mg。检查点调节物拮抗剂可以每2、3、4、5、6或7天或每1、2、3或4周日常给药。
在其他具体实施方式中，检查点调节物拮抗剂的量可以以以下剂量施用：约0.0006mg/天，0.001mg/天，0.003mg/天，0.006mg/天，0.01mg/天，0.03mg/天，0.06mg/天，0.1mg/天，0.3mg/天，0.6mg/天，1mg/天，3mg/天，6mg/天，10mg/天，30mg/天，60mg/天，100mg/天，300mg/天，600mg/天，1000mg/天，2000mg/天，5000mg/天或10,000mg/天。如预期的那样，剂量将取决于患者的病症、大小、年龄和状况。
在某些实施方式中，将检查点调节物拮抗剂的编码序列引入合适的表达载体(例如病毒或非病毒载体)中，用于在患有细胞增殖性病症的患者中表达有效量的检查点调节物拮抗剂。在包含施用例如一种或多种重组AAV(rAAV)病毒的某些实施方式中，所述药物组合物可以包括rAAV，其量为包含至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、或至少1014个基因组拷贝(GC)或重组病毒颗粒/每千克，或其任何范围。在某些实施方式中，所述药物组合物包括有效量的重组病毒，如rAAV，其量为包含至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015个基因组拷贝或重组病毒颗粒/受试者，或其任何范围。
剂量可以在适用于任何特定细胞增殖性病症的几种本领域接受的动物模型中进行测试。
递送方法学还可以包括使用聚阳离子缩合DNA连接或不连接至已杀死的病毒、配体连接的DNA、脂质体、真核细胞递送载体细胞、光聚合水凝胶材料的沉积、使用手持基因转移颗粒枪、电离辐射、核电荷中和或与细胞膜融合、颗粒介导的基因转移等。
本发明通过以下实施例进一步说明，其不应被解释为限制性的。本申请通篇引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请以及附图和表格的内容通过引用并入本文。
实施例
实施例1：单克隆抗体的产生
使用本领域熟知的技术产生本申请的单克隆抗体(mAb)并进行筛选，参见例如Harlow和Lane(1988)抗体，实验室手册，(Antibodies，A Laboratory Manual)Cold SpringHarbor出版，纽约。使用本领域公知的技术克隆，测序和工程化抗原特异性杂交瘤单克隆抗体，参见例如Lo.B.K.C分子生物学方法TM，卷248 2004抗体工程(Methods in MolecularBiologyTM.Volume 248 2004.Antibody Engineering)。
实施例2：TIGIT粘合剂筛选测定
在4℃下将1μg/ml TIGIT-His蛋白质包被过夜并用1％BSA的PBS溶液在室温下封闭1小时，然后在室温下与50μl杂交瘤上清液孵育1小时，通过抗小鼠IgG HRP检测小鼠IgG30分钟，然后加入TMB底物并通过加入2N的H2SO4终止反应。OD值至少为背景5倍的孔被选为阳性粘合剂。
实施例3：TIGIT阻断剂筛选测定
在4℃下将3×104个TIGIT+CHO-K1细胞在50μl杂交瘤上清液中孵育20分钟，然后加入人PVR人Fc标签融合蛋白至最终浓度为0.6μg/ml；在4℃孵育30分钟后，用FACS缓冲液(0.5％BSA，2mM EMTA的PBS溶液)洗涤细胞，然后将细胞与1μg/ml PE标记的抗人Fc抗体在4℃孵育20分钟。然后用FACS缓冲液洗涤细胞，然后重悬浮于7-氨基-放线菌素D(7AAD)溶液中，然后用iQue intellicyt系统分析。完全阻断TIGIT和PVR(Fc标签)结合的孔被选作阻断剂。在第一次筛选中，从65种粘合剂中鉴定出18种阻断剂。在第二次筛查中，从30种粘合剂中鉴定出17种阻断剂。图1显示了各种小鼠抗TIGIT单克隆抗体的竞争测定的示例性结果。
实施例4：抗TIGIT单克隆抗体阻断/IC50测定
用FACS缓冲液(0.5％BSA，2mM EMTA的PBS溶液)洗涤稳定表达人TIGIT的CHO-K1细胞，并以10^6个细胞/ml的浓度重悬。将生物素化的hPVR-mIg(目录号：555-030，Ancell)以1μg/ml加入到重悬细胞中；混合均匀；将在20μl FACS缓冲液中的20,000个这些CHO-K1细胞(含人CD155/PVR蛋白)在不孵育的情况下加入至96孔圆底板；向细胞中加入20μl的2倍连续稀释的抗人TIGIT单克隆抗体并在4℃下孵育30分钟。将细胞洗涤2次，然后在4℃下用PE链霉抗生物素蛋白(BioLegend)染色20分钟。然后洗涤细胞，重悬于30μl的7AAD溶液中，并加入35μl的10％中性缓冲福尔马林溶液。然后将细胞孵育15分钟。进行流式细胞术，使用iQueintellicyt系统计算IC50。表2显示了各种抗hu TIGIT单克隆抗体的IC 50。表3显示了几种抗hu TIGIT单克隆抗体的结合常数。
表2
Figure BDA0001652427810000711
Figure BDA0001652427810000721
表3
Figure BDA0001652427810000722
实施例5：抗TIGIT单克隆抗体结合测定
图6显示了抗TIGIT小鼠单克隆抗体与表达全长人TIGIT(hu TIGIT)的细胞的结合。简而言之，将抗TIGIT单克隆抗体的连续稀释物加入到过表达人或犬(cyno)TIGIT的CHO-K1细胞(20,000细胞/孔)中。混合物在4℃孵育20分钟并洗涤3次。用二抗(PE标记的F(ab')2-山羊抗人IgG Fc(Thermo H10104))在4℃染色混合物20分钟。洗涤细胞并重悬于7AAD溶液中，并在用iQue Intellicyt系统分析前用10％中性缓冲福尔马林溶液固定15分钟。
实施例6：抗TIGIT单克隆抗体阻断huTIGIT与其配体之间的相互作用
使用实施例4中描述的基于细胞的阻断测定，评价抗TIGIT单克隆抗体阻断huTIGIT与其配体人PVR(CD155)之间相互作用的能力。该测定的结果显示于图7中。
实施例7：用来自正常供体的PBMC和来自预包被的PVR-mIgG的PVR信号的人T细胞测定
进行两种人类T细胞测定以显示抗TIGIT抗体的功能。简而言之，在具有表达高水平TIGIT的PBMC的6孔板中用SEB(毒素技术(Toxin Technology)，目录号：BT202)或抗CD3+抗CD28活化正常健康人PBMC 5至7天。在4℃用hu PVR/CD155小鼠IgG2a Fc标签(ACROBiosystems)包被96孔平底板过夜。
为了测定IFN-γ的产生，将100,000个细胞铺板到预先包被的孔中并用0.5ug/ml葡萄球菌肠毒素B(SEB)再刺激。加入66μg/ml的抗TIGIT单克隆抗体或同种型对照抗体(Ab)。3至5天后，通过ELISA检测上清液中的IFN-γ。图8显示抗TIGIT单克隆抗体诱导来自人类PBMC的IFN-γ产生。
为了测定T细胞增殖，将CellTrace Far Red标记的100,000个细胞铺板到预包被的孔中并用0.5ug/ml SEB再刺激。将66ug/ml的抗TIGIT或同种型匹配的对照抗体加入用人CD155/PVR包被的孔中。每孔总体积为200μl。平板在37℃温育。刺激后4或5天，用FITC标记的抗人CD3Ab(BioLegend)对PBMC细胞进行染色，并使用iQue intellicyt系统进行分析。基于门控CD3+T细胞上CellTrace Far Red信号的MFI(平均荧光强度)的降低来计算T细胞增殖指数。如图9所示，该测定的结果显示抗TIGIT单克隆抗体诱导T细胞增殖。
实施例8：抗TIGIT单克隆抗体与hu TIGIT和cyno-hu TIGIT的结合
图10A显示了使用实施例5中描述的结合测定法，抗TIGIT单克隆抗体与hu TIGIT和cyno-hu TIGIT的结合。图10B显示使用实施例4中描述的阻断测定法通过抗TIGIT单克隆抗体抑制抗体与huTIGIT和cyno-hu TIGIT的结合。
实施例9：PD-1粘合剂筛选测定
在4℃下将1μg/ml的huPD-1-His蛋白质包被在孔中过夜，并在室温下用1％BSA的PBS溶液封闭1小时，然后与50μl杂交瘤上清液在室温下孵育1小时。通过将孔用抗小鼠IgGHRP孵育30分钟、加入TMB底物、并用2N硫酸溶液停止反应来检测小鼠IgG。选择OD450值至少为背景5倍的孔作为阳性结合剂。
实施例10：PD-1阻断剂筛选测定
将3×104个huPD1+CHO-K1细胞在50μl杂交瘤上清液中于4℃孵育20分钟，然后加入人PD-L1人Fc标签融合蛋白至终浓度为0.6μg/ml。在4℃下孵育30分钟后，用FACS缓冲液(0.5％BSA，2mM EMTA的PBS溶液)洗涤细胞，然后在4℃用1μg/ml PE标记的抗人Fc抗体孵育20分钟。然后用FACS缓冲液洗涤细胞，在使用iQue intellicyt系统进行分析之前将细胞重悬于7AAD溶液中。选择完全阻断PD-1和PD-L1(Fc标签)结合的孔作为阻断剂。
实施例11：抗PD-1单克隆抗体阻断/IC 50测定
进行阻断测定以计算所选择的抗PD-1抗体的IC 50。简而言之，制备2或3倍系列稀释的抗人PD-1单克隆抗体或双特异性Ab(最高Ab浓度：128nM；每种单克隆抗体三份)。将人或犬PD-1转染的CHO-K1细胞用FACS缓冲液(PBS中0.5％BSA 2mM EDTA)洗涤并以106细胞/ml的浓度重悬。将FITC标记的人PD-L1-Fc蛋白以7μg/ml的终浓度添加到人或犬PD-1转染的CHO-K1细胞中并充分混合。在没有孵育的情况下，将在20μl FACS缓冲液中的2000个这些CHO-K1细胞(具有PD-L1蛋白)立即加入到96孔圆底培养板中，并将20μl或2或3倍系列稀释的抗人PD-1单克隆抗体立即加入到细胞中，并在4℃孵育30分钟。然后洗涤细胞并重悬于30μl的7AAD溶液中；然后在使用iQue intellicyt系统进行分析之前，加入35μl的10％中性缓冲福尔马林溶液并孵育15分钟。图11A、12A和12B显示了证明几种抗PD-1单克隆抗体阻断人PD-1和人PD-L1之间相互作用的能力的结果。图11B显示了抗PD-1单克隆抗体阻断cyno huPD-1和cyno PD-L1之间相互作用的能力。
实施例12：通过生物层干涉测量的抗PD-1抗体/动力学分析
使用Octet RED96系统(ForteBio Octet RED96系统)进行生物光干涉测量以表征抗体针对His标记的人PD-1蛋白的结合动力学。将20nM的抗体加载到抗人IgG捕获生物传感器上。通过将生物传感器放置于含有2或3倍连续稀释的分析物(最高浓度为72nM)的孔中5分钟来观察分析物(His标记的人PD-1蛋白)的关联性。在将生物传感器单独转移至动力学缓冲液后测量解离，并监测干涉测量信号10分钟。使用包含至少5个测试浓度的1:1结合整体拟合模型拟合观察到的开和关速率(Ka和Kd)，然后计算平衡结合常数KD。图13A-C显示了PD-01单克隆抗体(图13A)、PD-02单克隆抗体(图13B)和基准(BM)抗PD-1单克隆抗体(图13C)的结合亲和力。
实施例13：单独或与抗TIGIT单克隆抗体组合使用抗-PD-1单克隆抗体增强的IFN-γ产生
为了显示抗PD-1抗体诱导IFN-γ产生的能力，用SEB(毒素技术)活化100,000个正常健康人PBMC。加入H358癌细胞系以提供PD-L1配体信号。加入10μg/ml的抗PD-1单克隆抗体或同种型对照Ab。3天后，通过ELISA检测上清液中的IFN-γ。图14显示了通过描绘的抗PD-1单克隆抗体增强人类PBMC产生IFN-γ。图15和16B显示抗TIGIT(T-08)和抗PD-1(PD-01)单克隆抗体的组合相对于单独的抗PD-1抗体水平进一步增加了来自人PBMC的IFN-γ产生。
实施例14：单独或与抗TIGIT单克隆抗体组合使用抗PD-1单克隆抗体增强的T细胞增殖
为了评价抗PD-1抗体诱导T细胞增殖的能力，除了加入H358癌细胞系以提供PD-L1配体信号之外，采用类似于实施例7中所述的测定法进行测定。图16A和16B显示了通过抗TIGIT和抗PD-1单克隆抗体的组合增加的人T细胞增殖的增殖。
实施例15：用于选择双特异性抗体的筛选测定
图19A-D显示了用于鉴定能够阻断PD-1结合(图19A、图19B)和TIGIT结合(图19C、图19D)的双特异性抗体构造的筛选测定的结果。这些筛选测定采用实施例6和11中所述的IC50阻断测定法。显示有效结合的抗体构造示于图17。
实施例16：双特异性抗体的表达和功能评价
实施例11中的阻断测定用于计算三种示例性双特异性检查点调节物拮抗剂TP-83、TP-92和TP-93的IC 50。图20A-B显示了这些双特异性检查点调节物拮抗剂阻断PD-L1与PD-1结合(图20A)并阻断PVR与TIGIT结合的能力(图20B)。这些图进一步显示了阻断PD-L1与PD-1结合(图20A)和阻断PVR与TIGIT结合的计算的IC50(图20B)。图21示出了Coomasie染色凝胶，其显示双特异性抗体TP-83、TP-92和TP-93的产生。
实施例17：双特异性检查点调节物拮抗剂的示例性尺寸排阻色谱(SEC)曲线(profile)
图22显示了一步纯化后示例性双特异性检查点调节物拮抗剂的示例性SEC特征。简而言之，将20μg样品(TP-93或TP-83)装载到Zenix SEC-300柱(3μm，
Figure BDA0001652427810000761
7.8×300mm)上。流动相(150mM磷酸钠，pH7.0)以0.80mL/min的流速递送。在280nm处监测UV吸光度。主峰表示所需产物(TP-93为86％，TP-83为74％)。次要峰代表不正确聚集的或装配的产品。该分析强调了根据本申请的双特异性检查点调节物拮抗剂的可制造性。
实施例18：通过双特异性检查点调节物拮抗剂增加IFN-γ产生的上调
为了评价双特异性检查点调节物拮抗剂(TP-93)与单特异性抗TIGIT(T-08)和抗-PD-1(PD-01)单克隆抗体相比诱导T细胞增殖的能力，进行了CMV抗原特异性回忆测定。简言之，从Astarte Biologics购买来自个体供体的预筛选的CMV抗原反应性的PBMC(供体333和供体287)。来自CMV感染的细胞的细胞裂解物(用作CMV抗原)也购自Astarte Biologics。1)对于IFN-g产生：将250,000个PBMC铺板并且通过加入0.1μg/ml的CMV Ag进行抗原特异性刺激，其刺激CMV反应性T细胞。将SHP-77细胞与PBMC共培养以提供免疫功能抑制环境。分别将IgG4对照、抗TIGIT Ab、抗PD-1Ab、抗TIGIT Ab加抗PD-1Ab和双特异性Ab加入到每个板中。5天后，通过ELISA检查上清液的IFN-γ产量。2)对于T细胞增殖，将250,000个PBMC铺板并用0.1μg/ml的CMV Ag活化2天，然后用CellTrace Far Red标记。然后将100,000个标记的PBMC重新铺板并用1μg/ml CMV Ag再刺激。分别将128nM的IgG4对照、抗TIGIT Ab、抗PD-1Ab、抗TIGIT Ab加抗PD-1Ab或双特异性Ab加入到每个板中。每孔总体积为200μl。所述板在37℃孵育。或刺激后5天，PBMC细胞用PE标记的抗人CD4Ab(BioLegend)染色并通过iQueintellicyt系统分析。根据CellTrace Far Red信号在门控CD4+T细胞上的平均荧光强度(MFI)的减少来计算T细胞增殖指数。3)通过FACS在第5天用APC标记的抗人CD3、PE标记的抗TIGIT和FITC标记的抗PD-1抗体(数据未显示)检测TIGIT和PD-1的T细胞表面表达。
图23A和23B显示了双特异性检查点调节物拮抗剂TP-93，比单独的单特异性抗TIGIT(T-08)和抗PD-1(PD-01)单克隆抗体或者使用两种不同的人PBMC细胞群(供体333，图23A；供体287，图23B)的单特异性抗TIGIT和抗PD-1抗体的组合，更大程度地增加IFN-γ产生。图23C和23D显示了双特异性检查点调节物拮抗剂TP-93，比单独的单特异性抗TIGIT(T-08)和抗PD-1(PD-01)抗体或者使用两种不同的人PBMC细胞群(供体333，图23C；供体287，图23D)的单特异性抗TIGIT和抗PD-1抗体的组合，显示出更高的T细胞增殖指数。
以上描述是为了教导本领域普通技术人员如何实施本发明，并非旨在详述对于当本领域技术人员阅读说明书时变得显而易见的所有这些明显的修改和变化。但是，所有这些明显的修改和变化都意图包括在由以下权利要求限定的本发明的范围内。权利要求旨在以任何顺序覆盖要求保护的组件和步骤，其有效地满足其预期的目标，除非上下文具体指明相反。
SEQUENCE LISTING
<110> 源晟生物制药股份有限公司(GENSUN BIOPHARMA INC.)
盛泽琪(SHENG, Jackie)
<120> 检查点调节物拮抗剂
<130> 2022-002 PCT
<150> US 62/442,642
<151> 2017-01-05
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Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
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Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCDR3; PD-L1
<400> 78
Ser Asp Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 79
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCDR1; PD-L1
<400> 79
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCDR2; PD-L1
<400> 80
Met Ile His Pro Asn Val Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 81
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCDR3; PD-L1
<400> 81
Ser Arg Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 82
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCDR2; PD-L1
<400> 82
Met Ile His Pro Asn Ser Gly Gly Asn Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 83
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCDR3; PD-L1
<400> 83
Ser Trp Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCDR2; PD-L1
<400> 84
Met Ile His Pro Thr Gly Val Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 85
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCDR1; PD-L1
<400> 85
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCDR2; PD-L1
<400> 86
Tyr Ile Ser Asp Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCDR3; PD-L1
<400> 87
Ser Phe Leu Arg Leu Arg Ser Tyr Phe Asp His
1 5 10
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCDR1; PD-L1
<400> 88
Ser Tyr Gly Ile Asn
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR1; PD-L1
<400> 89
Cys Ile Tyr Ile Gly Asn Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR2; PD-L1
<400> 90
Ala Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Asp Tyr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR1; PD-L1
<400> 91
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR2; PD-L1
<400> 92
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR3; PD-L1
<400> 93
Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR1; PD-L1
<400> 94
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR2; PD-L1
<400> 95
Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser
1 5
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR3; PD-L1
<400> 96
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR3; PD-L1
<400> 97
Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR1; PD-L1
<400> 98
Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Val Ala Val Ala
1 5 10
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR2; PD-L1
<400> 99
Trp Ala Ser Thr Arg His Ile
1 5
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR3; PD-L1
<400> 100
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 101
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR1; PD-L1
<400> 101
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR2; PD-L1
<400> 102
Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro
1 5
<210> 103
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR3; PD-L1
<400> 103
Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Tyr Thr
1 5
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR1; PD-L1
<400> 104
Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His
1 5
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR2; PD-L1
<400> 105
Cys Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly
1 5
<210> 106
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCDR3; PD-L1
<400> 106
Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 107
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCVR; TIGIT
<400> 107
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Met Ile Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 108
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCVR; TIGIT
<400> 108
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val
20 25 30
Val Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gln
85 90 95
Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
Ile Lys Arg
115
<210> 109
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCVR; TIGIT
<400> 109
Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gln Ile Gly Leu Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 110
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCVR; TIGIT
<400> 110
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gln Asp Leu Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ser Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gln
85 90 95
Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
Ile Lys
<210> 111
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCVR; TIGIT
<400> 111
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Met Leu Arg Trp Phe Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Ile Thr Val Ser Val Ala
115
<210> 112
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCVR; TIGIT
<400> 112
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Thr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 113
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCVR; TIGIT
<400> 113
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Ser Lys Tyr Asn Val Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Met Leu Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 114
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCVR; TIGIT
<400> 114
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Phe Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 115
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCVR; TIGIT
<400> 115
Glu Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Gln
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Thr Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Met Leu Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 116
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCVR; TIGIT
<400> 116
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 117
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCVR; TIGIT
<400> 117
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gln Val Gly Leu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 118
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCVR; TIGIT
<400> 118
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr His Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 119
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCVR; TIGIT
<400> 119
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Ser Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Gln Val Gly Leu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 120
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCVR; TIGIT
<400> 120
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Thr Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Phe Lys
100 105
<210> 121
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCVR; TIGIT
<400> 121
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Pro Tyr Gly Tyr Asp Val Arg Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 122
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCVR; TIGIT
<400> 122
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 123
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCVR; TIGIT
<400> 123
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe
20 25 30
Ala Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Met Asp Tyr Ser Tyr Phe Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 124
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCVR; TIGIT
<400> 124
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Leu Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Trp Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 125
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCVR; TIGIT
<400> 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Gln Met Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Glu Glu Gln Trp Pro Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ile Ile Pro Pro
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20 25 30
Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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65 70 75 80
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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<220>
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<220>
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<400> 141
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCVR; PD-L1
<400> 145
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<220>
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<400> 147
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<210> 148
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCVR; PD-L1
<400> 148
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1 5 10 15
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50 55 60
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100 105
<210> 149
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCVR; PD-L1
<400> 149
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCVR; PD-L1
<400> 150
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Phe Val Gly
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50 55 60
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100 105
<210> 151
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCVR; PD-L1
<400> 151
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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100 105 110
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115
<210> 152
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCVR; PD-L1
<400> 152
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100
<210> 153
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: HCVR; PD-L1
<400> 153
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
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20 25 30
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115 120
<210> 154
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LCVR; PD-L1
<400> 154
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 155
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VH; TP-M2T8P5
<400> 155
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Pro Tyr Gly Tyr Asp Val Arg Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val
130 135 140
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr Ile
145 150 155 160
Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly
165 170 175
Ile Asn Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys Ile
180 185 190
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Arg Tyr His Gly Tyr Asp Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 156
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VL; TP-M2T8P5
<400> 156
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln
130 135 140
Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Phe Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys
165 170 175
Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro
195 200 205
Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln His Thr Trp Glu
210 215 220
Leu Pro Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 157
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Gln Val Gln
115 120 125
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
130 135 140
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr Ile Tyr
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile
165 170 175
Asn Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys Ile Arg
180 185 190
Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu
195 200 205
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg
210 215 220
Tyr His Gly Tyr Asp Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 158
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VH2/VL1; TP-M4T8P5
<400> 158
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Pro Tyr Gly Tyr Asp Val Arg Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser
130 135 140
Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Phe Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu
180 185 190
Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln His Thr Trp Glu Leu Pro Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 159
<211> 679
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VH; TP-M6T8P5
<400> 159
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Pro Tyr Gly Tyr Asp Val Arg Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val
450 455 460
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln Arg Ala
465 470 475 480
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Phe Ser
485 490 495
Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
500 505 510
Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
515 520 525
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu
530 535 540
Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln His Thr Trp Glu Leu Pro
545 550 555 560
Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
565 570 575
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
580 585 590
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
595 600 605
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
610 615 620
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
625 630 635 640
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
645 650 655
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
660 665 670
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
675
<210> 160
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VL2/CL; TP-M6T8P5
<400> 160
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 161
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VH1/CH1; TP-M6T8P5
<400> 161
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ile Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr His Gly Tyr Asp Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235
<210> 162
<211> 675
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VH; TP-M6T8L8
<400> 162
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Pro Tyr Gly Tyr Asp Val Arg Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
450 455 460
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
465 470 475 480
Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Leu Asn Trp
485 490 495
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Thr
500 505 510
Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
515 520 525
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
530 535 540
Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly
545 550 555 560
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
565 570 575
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
580 585 590
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
595 600 605
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
610 615 620
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
625 630 635 640
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
645 650 655
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
660 665 670
Gly Glu Cys
675
<210> 163
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VL2/CL; TP-M6T8L8
<400> 163
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 164
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VH1/CH1; TP-M6T8L8
<400> 164
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Gly Asn Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235
<210> 165
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VH; TP-M8T10P1 (TP-83)
<400> 165
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Gln Met Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Glu Glu Gln Trp Pro Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 166
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: LC; TP-M8T10P1 (TP-83)
<400> 166
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ile Ile Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln
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Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys
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<220>
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
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420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
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565 570 575
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Leu Ile Lys Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
645 650 655
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Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu
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Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Lys Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 175
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VL1/CH1; TP-M14T8P5
<400> 175
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Phe Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln His Thr Trp
85 90 95
Glu Leu Pro Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala
100 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser
115 120 125
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr
180 185 190
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
195 200 205
Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
210 215 220
Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
225 230 235 240
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
245 250 255
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
260 265 270
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
275 280 285
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
290 295 300
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
305 310 315 320
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
325 330 335
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
340 345 350
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
355 360 365
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Ala Thr
370 375 380
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asp
385 390 395 400
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
405 410 415
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435
<210> 176
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VL2/CL; TP-M14T8P5
<400> 176
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VH1/CL; TP-M14T8P5
<400> 177
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ile Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr His Gly Tyr Asp Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
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<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VH2/HC1; TP-M14T8L8
<400> 178
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Pro Tyr Gly Tyr Asp Val Arg Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Lys Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 179
<211> 434
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VL1/HC2; TP-M14T8L8
<400> 179
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Thr Lys Gly
100 105 110
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
115 120 125
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
130 135 140
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
145 150 155 160
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
165 170 175
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
180 185 190
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
195 200 205
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
210 215 220
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
225 230 235 240
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
245 250 255
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
260 265 270
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
275 280 285
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
290 295 300
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
305 310 315 320
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
325 330 335
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
340 345 350
Thr Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
355 360 365
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Ala Thr Thr Pro Pro Val
370 375 380
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp
385 390 395 400
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
405 410 415
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
420 425 430
Gly Lys
<210> 180
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VL2/CL; TP-M14T8L8
<400> 180
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 181
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: VH1/CL; TP-M14T8L8
<400> 181
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Gly Asn Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 182
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TIGIT
<400> 182
Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly
1 5 10 15
Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val
20 25 30
Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys Asn
35 40 45
Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala
50 55 60
Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp
65 70 75 80
Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr
85 90 95
Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His
100 105 110
Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly Ala Met Ala Ala Thr Leu
115 120 125
Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val Val Ala Leu Thr Arg Lys
130 135 140
Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu Gly Asp Leu Arg Arg Lys
145 150 155 160
Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Pro Gly
165 170 175
Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala Gly Leu Cys Gly Glu Gln
180 185 190
Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp Tyr Phe Asn Val Leu Ser
195 200 205
Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe Thr Glu Thr Gly
210 215 220
<210> 183
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: PD-1
<400> 183
Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro
35 40 45
Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln
50 55 60
Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg
65 70 75 80
Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
100 105 110
Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro
115 120 125
Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr
130 135 140
Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu
145 150 155 160
Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile
165 170 175
Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val
180 185 190
Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu
195 200 205
Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr
210 215 220
Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg
225 230 235 240
Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu
245 250 255
Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
260
<210> 184
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: PD-L1
<400> 184
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
20 25 30
Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
35 40 45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
50 55 60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
130 135 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
145 150 155 160
Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr
165 170 175
Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr
180 185 190
Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
195 200 205
Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg
210 215 220
<210> 185
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: Tie2R-抑制性肽
<400> 185
Ala Gln Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Gly Ser Ala Thr His Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr
35 40 45
Cys Glu His Met Leu Glu
50
<210> 186
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: Tie2R-抑制性肽-FcR 融合
<400> 186
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Glu Glu Cys Glu Trp
225 230 235 240
Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Gln Glu
260 265 270
Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu
275 280 285
<210> 187
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: Ang-2抑制剂
<400> 187
Glu Thr Phe Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Asn Gln
1 5 10
<210> 188
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 188
Ala Ser Thr Lys Gly Pro
1 5
<210> 189
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 189
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 190
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 190
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1 5 10
<210> 191
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 191
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 192
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 192
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10

Claims (8)

1.一种抗体或其抗原结合部分，包含：
(1)重链可变区，其中所述重链可变区包含三个互补决定区(HCDR)：HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25；以及
(2)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含三个互补决定区(LCDR)：LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，
其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人TIGIT。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，包含：
(1)重链可变区，其为SEQ ID NO：125的氨基酸序列；以及
(2)轻链可变区，其为SEQ ID NO：126的氨基酸序列。
3.一种双特异性检查点调节物拮抗剂，包含：
抗原结合域，其包含权利要求1中所述的抗体的抗原结合部分。
4.一种双特异性检查点调节物拮抗剂，包含：
抗原结合域，其包含权利要求2中所述的抗体的抗原结合部分。
5.一种编码权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分的核酸。
6.一种编码权利要求2所述的抗体或其抗原结合部分的核酸。
7.一种包含权利要求5所述的核酸的表达载体。
8.一种包含权利要求6所述的核酸的表达载体。
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