TWI708786B - 針對ｔｉｇｉｔ之抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供結合於人類TIGIT(具有Ig及ITIM結構域之T細胞免疫受體)之抗體或其抗原結合片段，以及此等抗體或片段用於治療應用，諸如治療癌症或慢性病毒感染之用途。此類治療方法包括與諸如PD-1/PD-L1相互作用之其他免疫調節受體相互作用之抑制劑的組合療法。本發明進一步提供編碼抗體之重鏈及/或輕鏈可變區的聚核苷酸、包含編碼抗體之重鏈及/或輕鏈可變區之聚核苷酸的表現載體、包含該等載體之細胞及藉由自該等細胞表現抗體或片段來製備抗體或片段之方法。

Description

針對TIGIT之抗體
TIGIT(具有Ig及ITIM結構域之T細胞免疫受體)為一種共抑制受體蛋白質，亦稱為WUCAM、Vstm3或Vsig9。TIGIT係在針對在T細胞上特異性表現之蛋白質的基因組搜索中發現，且具有免疫球蛋白可變結構域、跨膜結構域及基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(ITIM)，且含有PVR蛋白質家族之特徵序列元件。已知其與脊髓灰白質炎病毒受體(PVR；CD155)及連接素2(CD112)相互作用。參見例如Stengel等人(2012)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)19：5399；WO 2006/124667；WO 2009/126688。雖然PVR可與共活化受體DNAM-1(CD226)相互作用以增強腫瘤殺死，但高親和性TIGIT/PVR相互作用將抑制此類殺死，且可用於防止亦表現PVR之正常(自身)細胞殺死。Stanietsky等人(2009)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)106：17858。此抑制相互作用之優勢在遏制抗自身免疫反應中可為重要的，但在腫瘤背景下其抑制腫瘤根除。同上
TIGIT藉由促進成熟免疫調節樹突狀細胞產生而遏制T細胞活化。Yu等人(2009)Nat.Immunol.10：48。TIGIT及其他此類共抑制分子(例如CTLA-4、PD-1、Lag3及BTLA)可在腫瘤細胞逃避免疫監視中起一定作用。實驗已展示PVR/CD155在黑素瘤細胞(Inozume等人(2014)J.Invest.Dermatol.134：S121-Abstract693)及各種其他腫瘤上過度表現。可能TIGIT/PVR相互作用可藉由抑制T細胞及NK細胞之抗腫瘤反 應，保護此類腫瘤細胞免於免疫介導之根除。Stanietsky等人(2009)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)106：17858和Lozano等人(2012)J.Immunol.188：3869。其他實驗已鑑別選擇性地遏制Th1及Th17反應之調控性T細胞(Treg)之TIGIT+子集(Joller等人(2014)Immunity 40：569)，此表明抗-TIGIT抗體可增強抗腫瘤免疫反應之一種替代性機制。
TIGIT可用於「切斷」免疫反應，類似於其他共抑制受體，注諸如CTLA-4、PD-1及BTLA。同上。靶向CTLA-4(伊派利單抗(ipilimumab))及PD-1(尼沃單抗(nivolumab)、派立珠單抗(pembrolizumab))之抗體已批准用於治療人類癌症，驗證此治療方法。結合於人類TIGIT之抗體亦可用於治療癌症。參見例如WO 2006/124667。在小鼠模型中，PD-L1與TIGIT之抗體阻斷引起CD8+ T細胞介導之腫瘤排斥反應的協同增強。Grogan等人(2014)J.Immunol.192(1)增刊203.15；Johnston等人(2014)Cancer Cell 26：1-15。類似結果已在黑色素瘤動物模型中獲得。Inozume等人(2014)J.Invest.Dermatol.134：S121-Abstract 693。一些實驗表明僅僅在與TIGIT競爭結合於PVR/CD155之共活化受體DNAM-1/CD226存在下TIGIT阻斷有效增強抗腫瘤CD8+ T細胞反應。Johnston等人(2014)Cancer Cell 26：1-15。
近期實驗已證實表現Fap2蛋白質之瘤內細菌可藉由結合於TIGIT抑制NK細胞介導之腫瘤殺死(Gur等人(2015)Immunity 42：344)，此表明消除此類細菌、阻斷TIGIT與Fap2之相互作用或阻斷TIGIT之活性一般可用於治療癌症，例如結腸直腸癌。Hampton(2015)JAMA 313：1305。
需要改善之治療癌症及慢性病毒感染之方法及用於方法中之藥劑，諸如治療性單株抗體。用於此類改善之治療方法的藥物可包含特 異性結合於TIGIT且逆轉或部分逆轉TIGIT介導之抗腫瘤或抗病毒免疫反應遏制的抗體或抗體片段。
本發明提供改善之治療癌症及慢性病毒感染的藥物及方法，其包含結合於huTIGIT之抗體或其抗原結合片段。本文提供特異性結合huTIGIT且具有諸如以下所希望功能特性的經分離抗體，諸如單株抗體，尤其人類單株抗體：高親和力特異性結合於huTIGIT、結合於猴TIGIT(例如食蟹獼猴TIGIT)，能夠阻斷TIGIT與PVR及/或連接素-2之結合，能夠阻斷TIGIT與DNAM之相互作用或此等特性之任何組合。
本發明進一步提供改善之治療癌症之方法及用於方法中之治療性抗體，該等癌症包括TIGIT介導之信號傳導遏制抗腫瘤免疫反應的癌症、TIGIT與共活化受體DNAM-1/CD226之相互作用遏制抗腫瘤免疫反應的腫瘤、表現TIGIT之調控性T細胞遏制抗腫瘤免疫反應的腫瘤或TIGIT以其他方式抑制抗腫瘤免疫反應之腫瘤。本發明亦提供用於治療TIGIT遏制抗病毒免疫反應之慢性病毒感染的方法及治療性抗體。
在另一態樣中，本發明係關於與具有本文所揭示之重鏈及輕鏈可變結構域序列之抗體競爭結合於huTIGIT及/或交叉阻斷具有本文所揭示之重鏈及輕鏈可變結構域序列之抗體結合於huTIGIT的抗體。
在某些實施例中，本發明之抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段增強抗腫瘤免疫反應，例如抗原特異性T細胞反應。在其他實施例中，本發明之抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段阻斷TIGIT介導之抑制信號傳導，允許NK細胞之PVR/DNAM共刺激以增加NK介導之抗腫瘤反應殺死。在又一實施例中，本發明之抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段耗盡腫瘤內將以其他方式遏制抗腫瘤免疫反應之調控性T細胞群體。在又一實施例中，格式化為IgG1的本發明之抗-TIGIT抗體耗盡CD8+耗竭 之T細胞及Treg，允許新鮮、非耗竭CD8+ T細胞流入。在其他實施例中，本發明之抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段藉由一或多個上文提及之機制起作用，因為該等機制不一定彼此互斥。
在某些實施例中，本發明之抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段不會結合於活化Fcγ受體(FcγR)，例如在依賴於增強表現TIGIT之細胞的抗腫瘤活性的實施例中。在替代實施例中，本發明之抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段結合於一或多種活化FcγR，例如在依賴於殺死表現TIGIT之細胞，諸如耗竭CD8+ T細胞或Treg的實施例中。
本發明亦提供經分離單株抗體(15A6)或其抗原結合片段，其特異性結合於huTIGIT且包含分別包含SEQ ID NO：14、15及16之重鏈CDRH1、CDRH2及CDRH3序列及/或分別包含SEQ ID NO：17、18及19之輕鏈CDRL1、CDRL2及CDRL3序列。
本發明亦提供經分離單株抗體(22G2)或其抗原結合片段，其特異性結合於huTIGIT且包含分別包含SEQ ID NO：20、21及22之重鏈CDRH1、CDRH2及CDRH3序列及/或分別包含SEQ ID NO：23、24及25之輕鏈CDRL1、CDRL2及CDRL3序列。
本發明進一步提供經分離單株抗體(11G11)或其抗原結合片段，其特異性結合於huTIGIT且包含分別包含SEQ ID NO：26、27及28之重鏈CDRH1、CDRH2及CDRH3序列及/或分別包含SEQ ID NO：29、30及31之輕鏈CDRL1、CDRL2及CDRL3序列。
本發明進一步提供經分離單株抗體(10D7)或其抗原結合片段，其特異性結合於huTIGIT且包含分別包含SEQ ID NO：32、33及34之重鏈CDRH1、CDRH2及CDRH3序列及/或分別包含SEQ ID NO：35、36及37之輕鏈CDRL1、CDRL2及CDRL3序列。
本發明亦提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其特異性結合於huTIGIT且包含揭示於SEQ ID NO：2(或3、4、5)及6、SEQ ID NO：7(或8)及9、SEQ ID NO：10及11以及SEQ ID NO：12及13的可變重鏈及可變輕鏈序列。
本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其結合於huTIGIT且包含重鏈及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO：2、3、4、5、7、8、10及12組成之群之胺基酸序列至少90%、95%或99%一致的胺基酸序列。
本發明亦提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其結合於huTIGIT且包含重鏈及輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO：6、9、11及13組成之群之胺基酸序列至少90%、95%或99%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之經分離單株抗體或其抗原結合片段(a)結合於huTIGIT上與15A6、22G2、11G11及/或10D7相同的抗原決定基，及/或(b)如例如藉由FACS或ELISA量測，抑制15A6、22G2、11G11及/或10D7與huTIGIT之結合。
在某些實施例中，本發明之抗-huTIGIT抗體或其抗原結合片段結合於包含huTIGIT(SEQ ID NO：1)之殘基E60、1109、L65、N70、F107、T117、I68、H76及N58(抗體22G2)中一或多者或由其組成的抗原決定基，在包含殘基G74、N70、H76、L65、L73、Q56、I68、H111及P114(抗體11G11)中一或多者或由其組成的抗原決定基，或在包含殘基H76、G74、L65、N58、I68、Q139、G135、L73、F107、N70、E60、H134、A132及1109(抗體15A6)中一或多者或由其組成的抗原決定基。
或者，本發明之抗-huTIGIT抗體或其抗原結合片段結合在包含一或多種序列或由其組成的抗原決定基，該一或多種序列選自由NWEQQDQLLAICNADLGWH(SEQ ID NO：38)及FCIYHTYPDGT(SEQ ID NO：39)(抗體22G2)組成之群，或選自由 QVNWEQQDQLLAICNADLGWH(SEQ ID NO：40)及HTYP(SEQ ID NO：41)(抗體11G11)組成之群，或選自由NWEQQDQLLAICNADLGWH(SEQ ID NO：38)、FCI及AEHGARFQ(SEQ ID NO：43)(抗體15A6)組成之群。
在其他實施例中，本發明之抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段結合於huTIGIT(SEQ ID NO：1)上包含殘基L65、I68、N70及H76中一或多者或由其組成的核心抗原決定基，及/或在包含LLAICNADLGWH(SEQ ID NO：44)或由其組成的抗原決定基。
在一些實施例中，本發明之抗-huTIGIT抗體或其抗原結合片段亦結合於食蟹獼猴TIGIT。
在各種實施例中，本發明之抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段為人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體或其變異體。在某些實施例中，包括(但不限於)阻斷「耗竭」腫瘤特異性T細胞中TIGIT信號傳導或阻斷NK細胞上抑制信號，允許DNAM-1/PVR介導之共刺激的方法或阻斷TIGIT與DNAM-1/CD226相互作用以削弱DNAM-1均二聚之方法，抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段包含無效應或大部分無效應Fc。此類Fc區包括例如人類IgG2或IgG4或具有以下突變中一或多者之人類IgG1之無效應變異體：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S(EU編號)，包括包含所有五個所列突變之IgG1.1f(SEQ ID NO：48)。
在替代實施例中，包括(但不限於)耗盡TIGIT+調控性T細胞之方法，抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段包含優先結合於活化FcγR(FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)之Fc，諸如人類IgG1，或相對於野生型IgG1 Fc，與活化FcγR之結合增強的序列變異體。在涉及使用本發明之抗-TIGIT抗體之IgG1形式驅動Treg消除的實施例中，瘤內注射可視情況用於使對腫瘤微環境之作用局部化，最小化周圍組織中由活性所引起的潛在副作用。
在某些實施例中，本發明之抗-TIGIT抗體之CDR區中的甲硫胺酸殘基(例如10D7之CDRH3中的M115，SEQ ID NO：34)或其抗原結合片段經不進行氧化之胺基酸殘基置換。
在某些實施例中，競爭結合、交叉阻斷或結合於與15A6、22G2、11G11或10D7相同之抗原決定基的抗-huTIGIT抗體或其抗原結合片段為人類或人類化抗體。
在一些實施例中，本發明之抗-huTIGIT抗體非為美國專利申請公開案第2009/0258013號描述的抗體或不結合於與其相同的抗原決定基，例如其不結合於與抗-huTIGIT mAb 10A7或1F4相同的抗原決定基。亦參見Johnston等人(2014)Cancer Cell 26：1；Yu等人(2009)Nat.Immunol.10：48。
在其他實施例中，抗-huTIGIT抗體包含源自於與本文所揭示之抗體相同的人類V結構域生殖系序列的可變結構域，包括重鏈V結構域V4-39、V4-61或V1-69。在更特定實施例中，抗-huTIGIT抗體包含源自於與本文所揭示之抗體相同之人類重鏈及輕鏈V結構域生殖系序列的重鏈及輕鏈可變結構域，諸如V4-39/VA27(15A6)、V4-61/VL6(22G2)、V4-39/VL6(11G11)及V1-69/VL15(10D7)。
在各種實施例中，本發明之抗-huTIGIT抗體以小於10nM、5nM、2nM、1nM、300pM或100pM之KD結合於huTIGIT。在其他實施例中，本發明之抗-huTIGIT抗體以2nM與100pM之間的KD結合於huTIGIT。
在其他實施例中，本發明之抗-huTIGIT抗體基本上由抗體15A6、22G2、11G11及10D7之CDR之一些組合組成或包含其，諸如CDRH1(SEQ ID NO：14、20、26及32)；CDRH2(SEQ ID NO：15、21、27及33)；CDRH3(SEQ ID NO：16、22、28及34)；CDRL1(SEQ ID NO：17、23、29及35)；CDRL2(SEQ ID NO：18、24、30及36)； 以及CDRL3(SEQ ID NO：19、25、31及37)。在其他實施例中，抗體基本上由抗體15A6、22G2、11G11及10D7之CDR序列的各別特定組合組成或包含其。
在其他實施例中，本發明之抗-huTIGIT抗體基本上由抗體15A6(SEQ ID NO：2-5及6)、22G2(SEQ ID NO：7-8及9)、11G11(SEQ ID NO：10及11)及10D7(SEQ ID NO：12及13)之重鏈及/或輕鏈可變結構域或與此等揭示之序列共享至少80%、85%、90%及95%序列一致性之序列組成或包含其。
在其他實施例中，本發明之抗-huTIGIT抗體基本上由包含抗體15A6(SEQ ID NO：2-5及6)、22G2(SEQ ID NO：7-8及9)、11G11(SEQ ID NO：10及11)及10D7(SEQ ID NO：12及13)之可變結構域序列或與此等揭示之序列共享至少80%、85%、90%及95%序列一致性之序列之重鏈及/或輕鏈組成或包含其。
在其他實施例中，本發明之抗體之抗原結合結構域存在於進一步包含特異性地結合於不同免疫調節受體，包括(但不限於)PD-1、CTLA-4或LAG3之抗原結合結構域的雙特異性分子。
本發明進一步提供編碼本發明之抗-huTIGIT抗體或其抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈可變區的核酸，包含核酸分子之表現載體，經表現載體轉型之細胞，及藉由表現經表現載體轉型之細胞產生抗體且回收抗體之方法。
本發明亦提供包含本文所述之抗-huTIGIT抗體連接於試劑，諸如可偵測標記或細胞毒性劑的免疫結合物。
本發明亦提供包含本發明之抗-huTIGIT抗體或其抗原結合片段及載劑的醫藥組合物。本文亦提供包含抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段及使用說明書的套組。
在另一態樣中，本發明提供一種增強抗原特異性T細胞反應之方 法，其包含使T細胞與本發明之抗-huTIGIT抗體或其抗原結合片段接觸，使得例如藉由減少將以其他方式減弱抗腫瘤反應之抑制信號，增強抗原特異性T細胞反應。在一些實施例中，抗原特異性T細胞為腫瘤-抗原特異性效應T細胞，諸如CD8+ T細胞，且例如經由阻斷TIGIT介導之抑制作用的該增強引起抗腫瘤活性增加。本發明之抗-huTIGIT抗體或其抗原結合片段亦可減少NK細胞中之抑制信號且因此增加其抗腫瘤活性。不意欲受理論限制，本發明之抗-huTIGIT抗體藉由阻斷TIGIT與PVR之結合，增加效應T細胞或NK細胞功能，因此減少或消除將以其他方式傳遞至細胞之抑制信號。或者或另外，本發明之抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段可抑制將以其他方式減少DNAM-1介導之免疫活化的TIGIT與DNAM-1/CD226之間的相互作用。
本發明進一步提供一種增加T細胞中IL-2和/或IFN-γ產生及/或T細胞增殖之方法，其包含使T細胞與有效量之抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段接觸。
在另一態樣中，本發明提供一種減少或耗盡有需要之個體中腫瘤中之Treg的方法，其包含投與有效量之本發明之抗-huTIGIT抗體，其中抗體具有效應功能或增強之效應功能，以減少腫瘤中的Treg數目。
本發明提供一種增強個體中免疫反應之方法，其包含向該個體投與有效量之本發明之抗-huTIGIT抗體或其抗原結合片段，使得個體中之免疫反應得到增強。在某些實施例中，個體具有腫瘤且針對該腫瘤之免疫反應得到增強。在另一個實施例中，個體具有病毒感染且抗病毒免疫反應得到增強。
本發明亦提供一種抑制個體中腫瘤生長之方法，其包含向該個體投與本發明之抗-huTIGIT抗體或其抗原結合片段，使得腫瘤之生長得到抑制。
本發明進一步提供一種例如藉由免疫療法治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之例如呈醫藥組合物形式的本發明之抗-huTIGIT抗體或其抗原結合片段，因而治療癌症。在某些實施例中，癌症為膀胱癌、乳癌、子宮/子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、食道癌、腸胃癌、胰臟癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎癌、頭頸癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝癌、甲狀腺癌、皮膚癌、中樞神經系統之贅瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤及病毒相關癌症。在某些實施例中，癌症為轉移性癌症、難治性癌症或復發性癌症。
在某些實施例中，本文所述之調節免疫功能之方法及治療方法包含本發明之抗-huTIGIT抗體與例如以下一或多種其他治療劑組合投與，或本發明之抗-huTIGIT抗體呈與例如以下一或多種其他治療劑之雙特異性藥劑形式投與：抗-PD-1抗體、抗-PD-L1抗體、抗-LAG3抗體、抗-GITR抗體、抗-OX40抗體、抗-CD73抗體、抗-CD40抗體、抗-CD137 mAb、抗-CD27 mAb、抗-CSF-1R抗體及/或抗-CTLA-4抗體、TLR促效劑或IDO或TGFβ之小分子拮抗劑。在特定實施例中，抗-huTIGIT療法與抗-PD-1和/或抗-PD-L1療法，例如用結合於人類PD-1之抗體或其抗原結合片段或結合於人類PD-L1之抗體或其抗原結合片段治療組合。
在一些實施例中，來自患者之樣品，例如生檢，針對T細胞或NK細胞上DNAM-1之表現進行篩選，以選擇最可能對抗-TIGIT療法起反應之患者，其中T細胞上DNAM-1之存在表明患者在抗-TIGIT療法，例如用本發明之抗-huTIGIT抗體或片段治療後將具有有益的抗腫瘤反應，且缺乏DNAM-1鑑別出不大可能得益於抗-TIGIT療法之患者。在其他實施例中，來自患者之樣品針對腫瘤細胞或腫瘤浸潤骨髓細胞上PVR及/或連接素-2之表現進行篩選，以選擇最可能對抗-TIGIT療法起 反應之患者，其中PVR及/或連接素-2之存在表明患者在抗-TIGIT療法，例如用本發明之抗-huTIGIT抗體或片段治療後將具有有益的抗腫瘤反應，且缺乏PVR及/或連接素-2/CD112鑑別出不大可能得益於抗-TIGIT療法之患者。在各種實施例中，TIGIT、DNAM、PVR及/或連接素-2之細胞表面表現係藉由FACS、IHC或LC-MS。在另一態樣中，本發明提供治療有需要之個體的方法，其包含如本文所述確定TIGIT、DNAM、PVR及/或連接素-2之細胞表面表現，且優先或僅僅向最可能得到治療益處者投與本發明之抗-TIGIT抗體。
在一個實施例中，在考慮用本發明之抗-TIGIT抗體治療之個體中量測可溶性PVR及/或可溶性連接素-2(sPVR、s連接素-2)之含量，且僅僅顯示升高之可溶性PVR及/或連接素-2的個體用該等抗體治療。在一些實施例中，藉由ELISA或LC-MS偵測血清中sPVR及/或s連接素-2。
本發明亦提供偵測樣品中、樣品內之細胞上(例如FACS)或細胞或組織中特定位置中(例如IHC)TIGIT之存在或基於其表面上TIGIT存在或不存在分選細胞(例如FACS)的方法，其包含在允許抗體或其抗原結合片段與TIGIT之間形成複合物的條件下使樣品與本發明之抗-huTIGIT抗體或其抗原結合片段接觸，且偵測該複合物之形成。在一些實施例中，用於偵測之抗-TIGIT抗體與可偵測標記結合。
本發明之其他特徵及優點將自以下詳細描述及實例顯而易見，該等實例不應視為限制性的。
圖1展示「分組」實驗之示意圖，其中針對阻斷其他抗體與huTIGIT結合之能力，逐對測試本發明之各種抗-huTIGIT抗體。結果展示抗體在有限數目之類別或「組」內。參見實例3。
圖2A、2B及2C分別展示huTIGIT序列變異體與抗體22G2、11G11 及15A6之結合的酵母展示資料。成熟huTIGIT中各胺基酸殘基之殘基編號沿橫座標呈現。殘基編號比SEQ ID NO：1之編號低21，因為序列表包括信號肽，其不包括於圖中。如實例4中詳述，展示huTIGIT之序列變異體的酵母係基於其不能結合於相應抗體(22G2、11G11、15A6)來選擇。因此，對抗體結合而言關鍵之沿huTIGIT序列之位置由於其在非結合酵母純系池中過度表示而高頻出現(亦即呈上升至縱座標以上之條/線)。變異體(非野生型)殘基在各殘基出現之頻率在一個條(線)或各殘基下表示(以對數)在縱座標上。頻率數據相對於未選文庫，亦即尚未基於不能結合於本發明之抗-huTIGIT抗體而選擇的文庫中變異體殘基出現在各位置之頻率校正。參見實例4。
圖3展示抗-TIGIT mAb 22G2對溶解之作用，表示為藉由人類NK細胞對表現人類PVR之細胞的特異性溶解%。參見實例5。對於各抗體，左條為野生型P815細胞且右條為表現人類PVR之P815細胞。
圖4A展示用抗原肽之混合物(CETF=來自CMV、EBV、流感及破傷風之肽)處理健康人類供體血液誘發CD8+ T細胞上PD-1及TIGIT之上調。「無刺激」樣品未用CEFT處理，而「刺激」樣品經處理。圖4B展示抗-TIGIT mAb及/或抗-PD-1 mAb對來自四種經CETF刺激之健康人類供體血液樣本之IFNγ表現的作用。參見實例6。
圖5A及5B展示在小鼠模型中單獨或與其他免疫調節療法組合之抗-TIGIT抗體對腫瘤生長的作用。圖5A展示對於用具有效應功能可用之鼠類IgG2a Fc結構域之抗-小鼠TIGIT抗體(「TIGIT G2a」)、具有效應功能缺乏之IgG1 D265AFc結構域之抗-小鼠TIGIT抗體(「TIGIT G1 D265A」)、具有效應功能缺乏之IgG1 D265AFc結構域之抗-小鼠PD-1抗體(「PD-1 G1 D265A」)、其組合或對照IgG1抗體處理的小鼠，CT26小鼠結腸癌模型中之腫瘤體積(立方毫米)，其係藉由將腫瘤寬度平方乘以長度一半來計算。圖5B展示抗-TIGIT單一療法以及與抗 -PD-1及抗-CTLA-4抗體之組合療法的作用。在實驗結束時提供每組十隻小鼠之各組中腫瘤體積以及無腫瘤(TF)小鼠之數目。各線表示一隻小鼠。mIgG1同型對照未得到無腫瘤小鼠，與作為單一療法之抗-TIGIT一樣。抗-PD-1作為單一療法得到一隻無腫瘤小鼠，且當與抗-TIGIT組合時，得到五隻。抗-CTLA-4作為單一療法得到三隻無腫瘤小鼠，且當與抗-TIGIT組合時得到六隻。參見實例7。
圖6A及6B展示癌症組織中升高之PVR表現。圖6A展示如在阿特拉斯癌症基因組(The Cancer Genome Atlas，TCGA)資料集中偵測到的各種腫瘤類型中PVR mRNA表現。提供腎上腺皮質癌(ACC)、嫌色腎細胞癌(KICH)、肝細胞癌(LIHC)、結腸及直腸腺癌(COAD、READ)、胰管腺癌(PAAD)、副神經節瘤及副神經節瘤(PCPG)、乳頭狀腎癌瘤(KIRP)、肺腺癌(LUAD)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSC)、前列腺癌(PRAD)、子宮內膜癌(UCEC)、子宮頸癌(CESC)、皮膚黑色素瘤(SKCM)、間皮瘤(MESO)、尿道上皮膀胱癌(BLCA)、透明細胞腎癌(KIRC)、肺鱗狀細胞癌(LUSC)、子宮癌肉瘤(UCS)、肉瘤(SARC)、卵巢漿液性囊腺癌(OV)、乳頭狀甲狀腺癌(THCA)、多形性膠質母細胞瘤(GBM)、乳癌(BRCA)、低級別膠質瘤(LGG)及彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBC)的資料。此處揭示之結果整體或部分基於由TCGA研究網路產生之資料。圖6B展示與正常結腸上皮相比，結腸腺癌組織中之人類PVR，其中腺癌樣品中之較暗區域指示PVR表現升高。參見實例9。
圖7展示格式化為IgG1f(SEQ ID NO：45)或IgG1.1f(SEQ ID NO：48)之抗-TIGIT mAb 22G2的Fcγ受體結合，表示為理論最大受體結合百分比值(Rmax)。如所指示，對於在10μM及1μm下使用之兩種不同批次IgG1.1f抗體，呈現六種不同Fcγ受體之資料。在條之各簇內，Fcγ受體之資料按次序自左至右呈現：hCD64(FcγRI)；hCD32a-H131 (FcγRIIA-H131)；hCD32a-R131(FcγRIIA-R131)；hCD32b(FcγRIIB)；hCD16a-V158(FcγRIIIA-V158)；以及hCD16b-NA2(FcγRIIIB-NA2，其中NA2表示異型變異體)。雖然Fcγ受體對由相同條表示，但其身分自呈現其之次序清晰。對於結合於食蟹獼猴Fcγ受體CD64、CD32a、CD32b及CD16，觀測到相同減少(未顯示)。
本發明揭示經分離抗體，尤其單株抗體，例如人類單株抗體，其特異性結合於人類TIGIT(「huTIGIT」)且阻斷與PVR/CD155之結合，藉此減少或消除將以其他方式在表現TIGIT之細胞中出現之免疫抑制信號。本發明亦提供經分離抗體，尤其單株抗體，例如人類或人類化單株抗體，其特異性結合於人類TIGIT且阻斷將以其他方式阻止DNAM-1均二聚且因此防止DNAM-1介導之共刺激的人類TIGIT與DNAM-1/CD226之相互作用。提供各種人類抗-huTIGIT單株抗體之序列。在某些實施例中，本文所述之抗體源自於特定重鏈及輕鏈生殖系序列及/或包含特定結構特徵，諸如包含特定胺基酸序列之CDR區。
本文進一步提供製備此類抗體之方法、包含此類抗體或其抗原結合片段之免疫結合物及雙特異性分子以及經調配以含有抗體或片段之醫藥組合物。本文亦提供使用單獨或與其他免疫刺激劑(例如抗體)及/或癌症或抗感染療法組合之抗體增強免疫反應之方法。因此，本文所述之抗-huTIGIT抗體可用於各種治療應用中之治療，包括例如抑制腫瘤生長及治療慢性病毒感染。
定義
為使本發明之描述可更易於理解，首先定義某些術語。在通篇【實施方式】中，闡述其他定義。
TIGIT係指「具有Ig及ITIM結構域之T細胞免疫受體」，為免疫球蛋白之PVR(脊髓灰白質炎病毒受體)家族一員，其結合於PVR/CD155 及連接素-2/CD112。TIGIT亦稱為TIGIT、WUCAM、Vstm3及Vsig9。除非另外指示或自上下文清晰可見，否則本文中對TIGIT之提及係指人類TIGIT(「huTIGIT」)，且抗-TIGIT抗體係指抗-人類TIGIT抗體。人類TIGIT進一步描述於GENE ID NO：201633及MIM(人類孟德爾遺傳學(Mendelian Inheritance in Man))：612859。人類TIGIT(NP_776160.2)之序列，包括21胺基酸信號序列提供於SEQ ID NO：1。除非另外指示或自上下文清晰可見，否則TIGIT之「抑制」係指阻斷PVR結合及信號傳導。本發明之抗-TIGIT抗體可藉由抑制TIGIT信號傳導，阻斷TIGIT/DNAM-1相互作用及/或其他機制，諸如引導調控性T細胞之耗盡起作用。
PVR(脊髓灰白質炎病毒受體)與TIGIT相互作用以誘發免疫抑制信號。PVR亦稱為PVS；HVED；CD155；NECL5；TAGE4；Necl-5。除非另外指示或自上下文清晰可見，否則本文中對PVR/CD155之提及係指人類PVR(「huPVR」)。人類PVR進一步描述於GENE ID NO：5817及MIM：173850。存在四種已知之人類PVR轉錄物變異體：α(NP_006496.4)、β(NP_001129240.1)、γ(NP_001129241.1)及δ(NP_001129242.2)，其序列提供於SEQ ID NO：50-53。除非另外指示，否則對PVR或人類PVR之提及涉及α轉錄物多肽。
除非另外指示或自上下文清晰可見，否則如用於本文中之術語「抗體」可包括全抗體及任何抗原結合片段(亦即「抗原結合部分」)或其單鏈。在一個實施例中，「抗體」係指包含由二硫鍵互連之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈的醣蛋白或其抗原結合片段。各重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區組成。在某些天然存在之IgG、IgD及IgA抗體中，重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2及CH3構成。在某些天然存在之抗體中，各輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區構成。輕鏈恆定區由一個結構域CL構成。VH及VL 區可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，穿插稱為構架區(FR)之更保守區。各VH及VL由三個CDR及四個構架區(FR)構成，按以下次序自胺基端至羧基端配置：FRI、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合結構域。抗體恆定區可介導免疫球蛋白結合於宿主組織或因子，包括免疫系統之多種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)。
抗體通常以高親和力特異性結合於其同源抗原，高親和力反映在10-7至10-11M或更低之解離常數(KD)。一般認為大於約10-6M之任何KD指示非特異性結合。如本文所用，「特異性結合」於抗原之抗體係指以高親和力結合於抗原且大體上相同抗原，但不以高親和力結合於不相關抗原的抗體，高親和力意謂具有10-7M或更低，較佳10-8M或更低，甚至更佳5×10-9M或更低，且最佳10-8M與10-10M之間或更低之KD。若抗原顯示與既定抗原高度序列一致性，例如若其顯示與既定抗原序列至少80%、至少90%、較佳至少95%、更佳至少97%或甚至更佳至少99%序列一致性，則其與既定抗原「大體上相同」。舉例而言，特異性結合於人類TIGIT之抗體亦可與來自某些非人類靈長類動物物種(例如食蟹獼猴)之TIGIT交叉反應，但不可與來自其他物種之TIGIT交叉反應，或與除TIGIT外之抗原交叉反應。
抗體可顯示在N端及/或C端胺基酸殘基之修飾。舉例而言，本發明之抗體可由編碼例如重鏈上C端離胺酸殘基之構築體產生，但此類C端離胺酸可部分或完全不存在於出售或投與之治療性抗體中。或者，抗體可由特異性非編碼C端離胺酸殘基之構築體產生，即使此類離胺酸存在於治療性抗體所來源之親本抗體中。在另一實例中，本發明之抗體中N端麩醯胺酸或麩胺酸殘基可在出售或投與之治療性抗體中部分或完全轉化成焦麩胺酸。存在於抗體鏈之N端的任何形式麩醯胺酸或麩胺酸，包括焦麩胺酸，均涵蓋在如本文所用之術語「麩醯胺 酸」內。因此，本文提供之具有N端麩醯胺酸或麩胺酸殘基之抗體鏈序列涵蓋抗體鏈，無論焦麩胺酸形成水準如何。
除非另外指示，否則免疫球蛋白可來自任一通常已知之同型，包括(但不限於)IgA、分泌性IgA、IgG及IgM。IgG同型在某些物種中劃分成亞類：人類中IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，以及小鼠中IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3。免疫球蛋白，例如人類IgG1，以若干異型存在，該等異型之不同至多為幾個胺基酸。除非另外指示，否則「抗體」可包括例如單株及多株抗體；嵌合及人類化抗體；人類及非人類抗體；完全合成抗體；以及單鏈抗體。
如本文所用，術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」係指保留與抗原(例如人類TIGIT)特異性結合之能力之抗體的一或多個片段。術語抗體之「抗原結合部分/片段」內涵蓋之結合片段的實例包括(i)Fab片段-由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段-包含在鉸鏈區由二硫橋鍵連接的兩個Fab片段之二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL及VH結構域組成之Fv片段，及(v)由VH結構域組成之dAb片段(Ward等人，1989 Nature 341：544-546)。經分離之互補決定區(CDR)或由合成連接子接合之兩個或兩個以上之經分離CDR組合可包含能夠結合抗原的抗體之抗原結合結構域。
本發明中亦包括單鏈抗體構築體。儘管Fv片段之兩個結構域(VL及VH)由各別基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接子接合，該連接子能夠使其製造成VL與VH區成對形成單價分子之單蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人，(1988)Science 242：423-426，及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此類單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分/片段」內。此等及其他潛在構築體描述於Chan及Carter(2010)Nat.Rev.Immunol. 10：301。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且片段以與完整抗體相同之方式來篩選供使用。抗原結合部分/片段可藉由重組DNA技術，或藉由完整免疫球蛋白之酶促或化學裂解來產生。
除非另外指示，否則詞語「片段」在諸如申請專利範圍中提及抗體時一起使用時係指抗體之抗原結合片段，使得「抗體或片段」具有與「抗體或其抗原結合片段」相同之含義。
「雙特異性」或「雙功能抗體」為具有兩個不同重鏈/輕鏈對，產生對不同抗原具有特異性之兩個抗原結合位點的人工雜交抗體。雙特異性抗體可藉由包括融合瘤融合或Fab'片段連接之多種方法產生。參見例如Songsivilai及Lachmann(1990)Clin.Exp.Immunol.79：315；Kostelny等人(1992)J.Immunol.148：1547。
如本文所用，術語「單株抗體」係指對特定抗原決定基顯示單一結合特異性及親和力之抗體或其中所有抗體對特定抗原決定基顯示單一結合特異性及親和力之抗體組合物。通常此類單株抗體將源自於編碼抗體之單細胞或核酸，且在無意引入任何序列改變下增加。因此，術語「人類單株抗體」係指具有源自於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及視情況存在之恆定區的單株抗體。在一個實施例中，人類單株抗體藉由融合瘤產生，該融合瘤例如藉由將自轉殖基因或轉殖染色體之非人類動物(例如具有包含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因組的轉殖基因小鼠)獲得的B細胞與永生化細胞融合來獲得。
如本文所用，術語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離的所有人類抗體，諸如(a)自人類免疫球蛋白基因之轉殖基因或轉殖染色體動物(例如小鼠)或自其製備之融合瘤中分離的抗體；(b)自經轉型以表現抗體之宿主細胞(例如自轉染瘤)中分離的抗體；(c)自重組、組合人類抗體文庫中經分離抗體；及(d)藉由包括 將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他方式製備、表現、產生或分離的抗體。此類重組人類抗體包含利用特定人類生殖系免疫球蛋白序列，由生殖系基因編碼，但包括隨後例如在抗體成熟期間發生之重排及突變的可變區及恆定區。如此項技術中所知(參見例如Lonberg(2005)Nature Biotech.23(9)：1117-1125)，可變區含有抗原結合結構域，其由各種重排形成對外來抗原具有特異性之抗體的基因編碼。除重排之外，可變區可藉由多個單胺基酸變化(稱為體細胞突變或高突變)進一步修飾以增加抗體對外來抗原之親和力。恆定區將對抗原進一步反應而改變(亦即同型切換)。因此，對抗原反應，編碼輕鏈及重鏈免疫球蛋白多肽的重排及體細胞突變之核酸序列可與原始生殖系序列不一致，但實際上將大體上相同或類似(亦即具有至少80%一致性)。
「人類」抗體(HuMAb)係指具有其中構架區與CDR區均源自於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區的抗體。另外，若抗體含有恆定區，則恆定區亦源自於人類生殖系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。然而，如本文中所用，術語「人類抗體」並不意欲包括源自於另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系之CDR序列已移植於人類構架序列上的抗體。術語「人類」抗體與「完全人類」抗體同義使用。
「人類化」抗體係指其中非人類抗體、例如小鼠抗體之CDR結構域外的一些、大部分或所有胺基酸經源自於人類免疫球蛋白之對應胺基酸置換的抗體。在抗體之人類化形式之一個實施例中，CDR結構域外的一些、大部分或所有胺基酸經來自人類免疫球蛋白之胺基酸置換，而一或多個CDR區內之一些、大部分或所有胺基酸不變。胺基酸 小的添加、缺失、插入、取代或修飾為容許的，只要其未消除抗體結合於特定抗原之能力即可。「人類化」抗體保留類似於原始抗體之抗原特異性。
「嵌合抗體」係指其中可變區源自於一個物種且恆定區源自於另一物種之抗體，諸如其中可變區源自於小鼠抗體且恆定區源自於人類抗體之抗體。「雜交」抗體係指具有不同類型重鏈及輕鏈，諸如小鼠(親本)重鏈及人類化輕鏈或小鼠(親本)輕鏈及人類化重鏈的抗體。
如本文所用，「同型」係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE抗體)。
「異型」係指特定同型組內天然存在之變異體，該等變異體不同之處在於一個或幾個胺基酸。參見例如Jefferis等人(2009)mAbs 1：1。
片語「識別抗原之抗體」及「對抗原具有特異性之抗體」在本文中可與術語「特異性結合於抗原之抗體」互換使用。
如本文所用，「經分離抗體」係指大體上不含其他具有不同抗原特異性之抗體的抗體(例如特異性結合於TIGIT之經分離抗體大體上不含特異性結合除TIGIT以外之抗原之抗體)。然而，特異性結合於人類TIGIT之抗原決定基的經分離抗體與來自不同物種之其他TIGIT蛋白質具有交叉反應性。
如本文所用，「抑制PVR與TIGIT結合」之抗體係指在此項技術中公認之方法中，例如在基於FACS之細胞結合分析中，以約1μg/mL或更低，諸如約0.9μg/mL或更低、約0.85μg/mL或更低、約0.8μg/mL或更低、約0.75μg/mL或更低、約0.7μg/mL或更低、約0.65μg/mL或更低、約0.6μg/mL或更低、約0.55μg/mL或更低、約0.5μg/mL或更低、約0.45μg/mL或更低、約0.4μg/mL或更低、約0.35μg/mL或更低、約0.3μg/mL或更低、約0.25μg/mL或更低、約0.2μg/mL或更低、約0.15μg/mL或更低或約0.1μg/mL或更低之EC50抑制人類PVR 與人類TIGIT結合之抗體。
源自於抗體Fc區與某些Fc受體之相互作用的「效應功能」包括但不一定限於C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、FcγR介導之效應功能(諸如ADCC及抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP))及細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調。此類效應功能一般需要Fc區與抗原結合結構域(例如抗體可變結構域)組合。
「Fc受體」或「FcR」為結合於免疫球蛋白之Fc區的受體。結合於IgG抗體之FcR包含FcγR家族之受體，包括此等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式。FcγR家族由三種活化(小鼠中FcγRI、FcγRIII及FcγRIV；人類中FcγRIA、FcγRIIA及FcγRIIIA)及一種抑制(FcγRIIb或相等地FcγRIIB)受體組成。人類FcγR之各種特性概述於表1中。大部分先天性效應細胞類型共表現一或多種活化FcγR及抑制FcγRIIb，而自然殺手(NK)細胞選擇性地表現一種活化Fc受體(小鼠中FcγRIII及人類中FcγRIIIA)，而非表現小鼠及人類中之抑制FcγRIIb。人類IgG1結合於大部分人類Fc受體且關於其結合之活化Fc受體的類型，視為同等於鼠類IgG2a。
Figure 104143215-A0202-12-0021-1
「Fc區」(片段可結晶區)或「Fc結構域」或「Fc」係指介導免疫球蛋白與宿主組織或因子結合，包括結合於位於免疫系統各種細胞(例如效應細胞)上之Fc受體或結合於經典補體系統之第一組分(C1q)的抗體重鏈之C端區。因此，Fc區包含除第一恆定區免疫球蛋白結構域(例如CH1或CL)外之抗體之恆定區。IgG、IgA及IgD抗體同型中，Fc區在抗體之兩個重鏈每一者中包含CH2及CH3恆定結構域；IgM及IgE Fc區在各多肽鏈中包含三個重鏈恆定結構域(CH結構域2-4)。對於IgG，Fc區包含免疫球蛋白結構域Cγ2及Cγ3以及Cγ1與Cγ2之間的鉸鏈。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常界定為自位置C226或P230之胺基酸殘基(或此兩個胺基酸之間的胺基酸)延伸至重鏈之羧基端，其中編號係根據如Kabat中之EU索引。Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,MD；亦參見美國專利申請公開案第2008/0248028號之圖3c-3f。人類IgG Fe區之CH2結構域自約胺基酸231延伸至約胺基酸340，而CH3結構域位於Fc區中CH2結構域之C端側，亦即其自IgG之約胺基酸341延伸至約胺基酸447(包括C端離胺酸)。如本文所用，Fc區可為天然序列Fc，包括任何異型變異體或變異Fc(例如非天然存在之Fc)。Fc亦可指分離或在包含Fc之蛋白質多肽(諸如「包含Fc區之結合蛋白」)之情況下的此區域，亦稱為「Fc融合蛋白」(例如抗體或免疫黏附素)。
除非另外指示或自上下文清晰可見，否則抗體Fc區中之胺基酸殘基編號係根據EU編號慣例，除序列表中特定提及序列中之殘基(在此情況下編號需為連續的)外。舉例而言，關於Fc區中胺基酸取代之作用的參考文獻將通常使用EU編號，其允許藉由相同數字提及抗體Fc區中之任何既定殘基，無論其附接之可變結構域的長度如何。在罕見情況下，可需要提及所參考之文獻以證實所提及之精確Fc殘基。
「天然序列Fc區」或「天然序列Fc」包含與在自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。天然序列人類Fc區包括天然序列人類IgG1 Fc區；天然序列人類IgG2 Fc區；天然序列人類IgG3 Fc區；以及天然序列人類IgG4 Fc區以及其天然存在之變異體。天然序列Fc包括Fc之各種異型。參見例如Jefferis等人(2009)mAbs 1：1。
術語「抗原決定基」或「抗原決定子」係指抗原(例如TIGIT)上免疫球蛋白或抗體特異性結合之位點。蛋白質抗原內之抗原決定基可由相鄰胺基酸(通常線性抗原決定基)或由蛋白質三級摺疊並置的非相鄰胺基酸(通常構形抗原決定基)形成。由相鄰胺基酸形成之抗原決定基通常但未必總在暴露於變性溶劑後保留，而藉由三級摺疊形成之抗原決定基通常在用變性溶劑處理後喪失。抗原決定基通常包括呈獨特空間構形之至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。
術語「抗原決定基定位」係指鑑別抗原上與抗體-抗原識別有關之分子決定子的過程。用於確定既定抗體結合什麼抗原決定基之方法為此項技術中所熟知，且包括例如免疫墨點法及免疫沈澱分析，其中測試重疊或相鄰肽(例如來自TIGIT)與既定抗體(例如抗-TIGIT抗體)之反應性；x射線結晶學；2維核磁共振；酵母展示(參見本文中實例4)；及HDX-MS(參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris編輯，(1996))。
提及兩種或兩種以上抗體之術語「結合於相同抗原決定基」意謂如藉由既定方法所測定，抗體結合於胺基酸殘基之相同區段。用於確定抗體是否與本文所述之抗體結合於「TIGIT上相同抗原決定基」的技術包括例如抗原決定基定位法，諸如抗原：抗體複合物晶體之x射線分析，其提供抗原決定基之原子解析；以及氫/氘交換質譜分析(HDX-MS)。其他方法監測抗體與抗原片段(例如蛋白分解片段)或抗 原之突變變體的結合，其中歸因於抗原序列內胺基酸殘基修飾之結合喪失常常視為指示抗原決定基組分，諸如丙胺酸掃描突變誘發(Cunningham及Wells(1985)Science 244：1081)或突變標靶序列變異體之酵母展示(參見本文中之實例4)。此外，亦可使用抗原決定基定位之計算組合方法。此等方法依賴於所關注之抗體自組合噬菌體展示肽庫親和分離特定短肽的能力。預期具有相同或緊密相關VH及VL或相同CDR序列之抗體結合於相同抗原決定基。
「與另一抗體競爭結合於標靶」之抗體係指抑制(部分或完全)另一抗體與標靶結合的抗體。兩個抗體是否彼此競爭結合於標靶，亦即一種抗體是否抑制另一抗體與標靶結合且達什麼程度可使用已知競爭實驗測定。在某些實施例中，抗體與另一抗體競爭結合，且抑制另一抗體結合於標靶至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。抑制或競爭之程度可視哪個抗體為「阻斷抗體」(亦即首先與標靶一起培育之冷抗體)而不同。競爭分析可如例如以下中所述進行：Ed Harlow及David Lane,Cold Spring Harb.Protoc.；2006；doi：10.1101/pdb.prot4277或「Using Antibodies」第11章，Ed Harlow及David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA 1999。競爭抗體結合於相同抗原決定基、重疊抗原決定基或相鄰抗原決定基(例如如藉由位阻證明)。
其他競爭性結合分析包括：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見Stahli等人，Methods in Enzymology 9：242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見Kirkland等人，J.Immunol.137：3614(1986))；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(參見Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125標記之固相直接標記RIA(參見Morel等人，Mol.Immunol.25(1)：7 (1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，Virology 176：546(1990))；及直接標記RIA(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32：77(1990))。
如本文所用，術語「特異性結合」、「選擇性結合」、「選擇性地結合」及「特異性地結合」係指抗體結合於預定抗原上抗原決定基，而不結合於其他抗原。通常，抗體(i)當在BIACORE® 2000表面電漿子共振儀中使用預定抗原，例如重組人類TIGIT作為分析物及抗體作為配位體，藉由例如表面電漿子共振(SPR)技術，或抗體與抗原陽性細胞之結合的史卡查分析(Scatchard analysis)測定時，以大約小於10-7M，諸如大約小於10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低之平衡解離常數(KD)結合；且(ii)以比其對結合於除預定抗原外之非特異性抗原(例如BSA酪蛋白)或緊密相關抗原之親和力大至少兩倍的親和力結合於預定抗原。因此，「特異性地結合於人類TIGIT」之抗體係指以10-7M或更低，諸如大約小於10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低之KD，結合於可溶性或結合細胞之人類TIGIT的抗體。「與食蟹獼猴TIGIT交叉反應」之抗體係指以10-7M或更低，諸如大約小於10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低之KD結合於食蟹獼猴TIGIT之抗體。
如本文所用，術語「kassoc」或「ka」係指特定抗體-抗原相互作用之締合速率常數，而如本文所用，術語「kdis」或「kd」係指特定抗體-抗原相互作用之解離速率常數。如本文所用，術語「KD」係指平衡解離常數，其獲自kd與ka之比率(亦即kd/ka)且以莫耳濃度(M)表示。抗體之KD值可使用此項技術中充分確立之方法測定。用於測定抗體KD之較佳方法包括生物層干擾量測(BLI)分析，較佳使用Fortebio Octet RED裝置；表面電漿子共振，較佳使用生物感測器系統，諸如BIACORE®表面電漿子共振系統(參見例如實例2)或流動式細胞量測術及史卡查分析。
如本文所用，術語IgG抗體之「高親和力」係指抗體對標靶抗原具有10-8M或更低，更佳10-9M或更低且甚至更佳10-10M或更低之KD。然而，「高親和力」結合對於其他抗體同種型可變化。舉例而言，對於IgM同型，「高親和力」結合係指抗體具有10-7M或更低，更佳或10-8M或更低之KD。
在使用抗體或其抗原結合片段之活體外或活體內分析之情況下術語「EC50」係指抗體或其抗原結合片段誘發最大反應50%，亦即最大反應與基線之間一半之反應的濃度。
術語「結合於固定TIGIT」係指本文所述之抗體能夠結合於例如在細胞表面上表現或附接於固體支撐物的TIGIT。
如本文所用，術語「交叉反應」係指本文所述之抗體能夠結合於來自不同物種之TIGIT。舉例而言，結合人類TIGIT的本文所述之抗體亦可結合來自另一物種之TIGIT(例如食蟹獼猴TIGIT)。如本文所用，交叉反應性可藉由在結合分析(例如SPR、ELISA)中偵測與純化抗原之特定反應性，或與生理學上表現TIGIT之細胞結合或以其他方式功能上相互作用來量測。用於測定交叉反應性之方法包括如本文所述之標準結合分析，例如BIACORE®表面電漿子共振(SPR)分析，使用BIACORE® 2000 SPR儀器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)或流動細胞量測技術。
如本文所用，術語「天然存在」在應用於一個物體時係指一個物體可在自然界中找到的事實。舉例而言，存在於可自自然界中之來源經分離生物體(包括病毒)中且未經人類在實驗室中有意修飾的多肽或聚核苷酸序列為天然存在的。
「多肽」係指包含至少兩個連續連接之胺基酸殘基的鏈，鏈長無上限。蛋白質中之一或多個胺基酸殘基可含有修飾，諸如(但不限於)糖基化、磷酸化或雙硫鍵。「蛋白質」可包含一或多個多肽。
如本文所用，術語「核酸分子」意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單股或雙股，且可為cDNA。
亦提供對本文提供之抗體序列的「保守序列修飾」，亦即未消除由核苷酸序列編碼或含有胺基酸序列之抗體與抗原之結合的核苷酸及胺基酸序列修飾。舉例而言，修飾可藉由此項技術中已知之標準技術，諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發引入。保守序列修飾包括保守胺基酸取代，其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換。此項技術中已界定具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β分支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。因此，抗-TIGIT抗體中預測非必需胺基酸殘基較佳經來自相同側鏈家族之另一胺基酸殘基置換。鑑別未消除抗原結合之核苷酸及胺基酸保守取代的方法為此項技術中熟知。參見例如Brummell等人，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；及Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：412-417(1997)。
或者，在另一個實施例中，突變可沿抗-TIGIT抗體編碼序列之全部或部分，諸如藉由飽和突變誘發任意引入，且所得經修飾之抗-TIGIT抗體可針對提高之結合活性進行篩選。
對於核酸，術語「大體同源」指示兩個核酸或其指示序列在進行最佳比對及比較時在至少約80%核苷酸、通常至少約90%至95%且更佳至少約98%至99.5%核苷酸中一致，具有適當核苷酸插入或缺失。或者，當區段將在選擇性雜交條件下與該股互補序列雜交時存在 大體同源。
對於多肽，術語「大體同源」指示兩個多肽或其指示序列在進行最佳比對及比較時在至少約80%胺基酸、通常至少約90%至95%且更佳至少約98%至99.5%核苷酸中一致，具有適當核苷酸插入或缺失。
兩個序列之間的一致性百分比為當序列最佳比對時序列共享之相同位置數目的函數(亦即同源性%=相同位置數/總位置數×100)，其中測定之最佳比對考慮間隙數目及各間隙長度，需要引入該等間隙以使兩個序列最佳比對。如下文非限制性實例中所述，序列比較及測定兩個序列之間的一致性百分比可使用數學演算法完成。
兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用GCG套裝軟體中之GAP程式，使用NWSgapdna.CMP矩陣及間隙權數40、50、60、70或80及長度權數1、2、3、4、5或6來測定。亦可使用E.Meyers及W.Miller(CABIOS,4：11-17(1989))之演算法(其已併入ALIGN程式(2.0版)中)，使用PAM120權數殘基表、12分之間隙長度罰分及4分之間隙罰分來測定兩個核苷酸或胺基酸序列之間的一致性百分比。另外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))演算法(其已併入GCG套裝軟體中之GAP程式中)，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，及間隙權數16、14、12、10、8、6或4及長度權數1、2、3、4、5或6來測定。
本文所述之核酸及蛋白質序列可進一步用作「查詢序列」以針對公共資料庫進行搜索，從而例如鑑別相關序列。此等搜索可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10之NBLAST及XBLAST程式(2.0版)進行。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程式(得分=100，字長=12)執行以獲得與本文所述之核酸分子同源之核苷酸序列。BLAST蛋白質搜索可用XBLAST程式(得分=50，字長=3)執行以獲得與本文所述 之蛋白質分子同源的胺基酸序列。為實現間隙比對以達成比較目的，可如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述使用間隙BLAST。使用BLAST及間隙BLAST程式時，可使用相應程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。
核酸可存在於全細胞、細胞溶胞物中或以部分純化或大體上純形式存在。當藉由標準技術，包括鹼性/SDS處理、CsCl聚束、管柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳及在此項技術中熟知之其他技術進行純化而遠離其他細胞組分或其他污染物，例如其他細胞核酸(例如染色體之其他部分)或蛋白質時，核酸「分離」或「大體上純」。參見F.Ausubel等人編輯，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。
如本文所用，術語「載體」意欲指能夠運輸其已連接之另一種核酸的核酸分子。一種載體類型為「質體」，其係指其中可接合其他DNA區段的環形雙股DNA環。另一類型之載體為病毒載體，其中其他DNA區段可接合至病毒基因組。某些載體能夠在引入其之宿主細胞中自發複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)當引入宿主細胞中時可整合至宿主細胞之基因組中，藉此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引起其以可操作方式連接之基因的表現。此類載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體常常呈質體形式。在本發明書中，由於質體為最常用之載體形式，因此「質體」與「載體」可互換使用。然而，亦包括提供同等功能之其他表現載體形式，諸如病毒載體(例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
如本文所用，術語「重組宿主細胞」(或簡稱為「宿主細胞」)意欲指包含非天然存在於細胞中之核酸的細胞，且可為已引入重組表現 載體之細胞。應瞭解，此類術語不僅意指特定個體細胞，且亦指此類細胞之後代。因為某些修飾可因突變或環境影響而出現在後代中，所以此類後代可實際上與親本細胞不一致，然而仍包括於如本文所用之術語「宿主細胞」範圍內。
「免疫反應」係指脊椎動物內針對外來因子之生物反應，該反應保護生物體避免此等因子及由該等因子所引起之疾病。免疫反應藉由免疫系統之細胞(例如T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜伊紅血球、肥大細胞、樹突狀細胞或嗜中性白血球)及藉由任一此等細胞或肝產生之引起選擇性靶向、結合於、損害、破壞及/或自脊椎動物體內消除侵入病原體、感染病原體之細胞或組織、癌性或其他異常細胞或在自體免疫或病理性發炎之情況下正常人類細胞或組織的可溶性大分子(包括抗體、細胞因子及補體)之作用介導。免疫反應包括例如活化或抑制T細胞，例如效應T細胞或Th細胞，諸如CD8+或CD4+ T細胞，或抑制或消除Treg細胞。「T效應」(「Teff」)細胞係指具有細胞溶解活性之T細胞(例如CD4+及CD8+ T細胞)以及分泌細胞因子且活化及引導其他免疫細胞之T輔助(Th)細胞，但不包括調控性T細胞(Treg細胞)。
如本文所用，術語「T細胞介導之反應」係指藉由T細胞，包括效應T細胞(例如CD8+細胞)及輔助T細胞(例如CD4+細胞)介導之反應。T細胞介導之反應包括例如T細胞細胞毒性及增殖。
如本文所用，術語「細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應」係指藉由細胞毒性T細胞誘發之免疫反應。CTL反應主要藉由CD8+ T細胞介導。
「免疫調節劑」或「免疫調控劑」係指可參與調節、調控或改善免疫反應之試劑，例如信號傳導路徑之組分。「調節」、「調控」或「改善」免疫反應係指免疫系統細胞或此類細胞(例如效應T細胞)活性 之任何改變。此類調節包括刺激或遏制免疫系統，其可顯現為各種細胞類型數目增加或降低、此等細胞活性增加或降低或免疫系統內可發生之任何其他改變。已鑑別抑制與刺激免疫調節劑，其中一些可在腫瘤微環境中具有增強功能。在較佳實施例中，免疫調節劑位於T細胞表面上。「免疫調節標靶」或「免疫調控標靶」為經靶向以結合物質、試劑、部分、化合物或分子且活性藉由物質、試劑、部分、化合物或分子之結合改變的免疫調節劑。免疫調節標靶包括例如細胞表面上之受體(「免疫調節受體」)及受體配位體(「免疫調節配位體」)。
「免疫療法」係指藉由包含誘導、提高、遏制或以其他方式改善免疫反應之方法治療罹患疾病或處於感染或遭受疾病復發之風險中的個體。
「免疫刺激療法」或「免疫刺激性療法」係指引起個體中免疫反應增加(誘導或增強)的療法，例如以治療癌症。
「增強內源性免疫反應」意謂增加個體中存在之免疫反應的有效性或效能。此有效性及效能增加可例如藉由克服遏制內源性宿主免疫反應之機制或藉由刺激增強內源性宿主免疫反應之機制來實現。
如本文所用，術語「連接」係指兩個或兩個以上分子締合。連接可為共價或非共價的。連接亦可為遺傳的(亦即重組融合)。此類連接可使用各種技術公認之技術實現，諸如化學結合及重組蛋白質產生。
如本文所用，「投與」係指使用熟習此項技術者已知之多種方法及傳遞系統中之任一者向個體物理引入包含治療劑之組合物。本文所述之抗體的較佳投藥途徑包括靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、脊椎或其他非經腸投藥途徑，例如藉由注射或輸注。如本文所用，片語「非經腸投與」意謂通常藉由注射之除腸及局部投與之外的投與模式，且包括(但不限於)靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、鞘內、淋 巴管內、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注，以及活體內電穿孔。或者，本文所述之抗體可經由非腸胃外途徑投與，諸如局部、表皮或黏膜投藥途徑，例如鼻內、經口、經陰道、經直腸、舌下或局部。投與亦可例如進行一次、複數次及/或經一或多個長時段。
如本文所用，術語「抑制」或「阻斷」(例如提及抑制/阻斷PVR與細胞上之TIGIT結合)可互換使用且涵蓋部分與完全抑制/阻斷例如至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%。
如本文所用，「癌症」係指特徵為異常細胞在體內不受控生長之一組廣泛疾病。不受調控之細胞分裂可引起惡性腫瘤或細胞形成，該等腫瘤或細胞侵入鄰近組織且可經由淋巴系統或血流轉移至身體遠端部分。
「血液惡性病」包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴性惡性疾病以及脾及淋巴結之癌症。示例性淋巴瘤包括B細胞淋巴瘤與T細胞淋巴瘤。B細胞淋巴瘤包括霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphomas)及大部分非霍奇金氏淋巴瘤。B細胞淋巴瘤之非限制性實例包括彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、黏膜相關之淋巴組織淋巴瘤、小細胞淋巴細胞性淋巴瘤(與慢性淋巴細胞性白血病重疊)、套細胞淋巴瘤(MCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、縱隔大B細胞淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenström macroglobulinemia)、結內邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫。T細胞淋巴瘤之非限制性實例包括結外T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、多形性大細胞淋巴瘤及血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤。血液惡性疾病亦包括白血病，諸如(但不限於)繼發性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性 白血病、慢性骨髓性白血病及急性淋巴母細胞白血病。血液惡性疾病進一步包括骨髓瘤，諸如(但不限於)多發性骨髓瘤及鬱積型多發性骨髓瘤。術語血液惡性病涵蓋其他血液及/或B細胞或T細胞相關之癌症。
如本文所用，術語「治療(treat)」、「治療(treating)」及「治療(treatment)」係指在個體上進行或投與活性劑至個體的任何類型介入或過程，目標為逆轉、緩解、改善、抑制或減緩或阻止症狀、併發症、病狀或與疾病相關之生物化學標誌進展、發展、嚴重程度或復發。預防係指投與未患疾病之個體以防止疾病出現或若患其，則將其作用降至最低。
術語「有效劑量(effective dose)」或「有效劑量(effective dosage)」定義為足以達成或至少部分達成所要作用之量。藥物或治療劑之「治療有效量」或「治療有效劑量」為藥物當單獨或與另一治療劑組合使用時促進疾病消退之任何量，疾病消退體現在疾病症狀之嚴重程度降低、無疾病症狀期之頻率及持續時間增加或預防因患病引起之損傷或失能。藥物之「預防有效量」或「預防有效劑量」為藥物當單獨或與另一治療劑組合投與處於發展疾病或經歷疾病復發之風險下的個體時抑制疾病發展或復發的量。治療或預防藥劑促進疾病消退或抑制疾病發展或復發之能力可使用熟習此項技術者已知之多種方法，諸如在人類個體中臨床試驗期間，在預測人類中之功效之動物模型系統中，或藉由在活體外分析中分析藥劑活性來評估。
舉例而言，抗癌劑為減緩個體中癌症進展或促進癌症消退之藥物。在較佳實施例中，治療有效量之藥物促進癌症消退至消除癌症之點。「促進癌症消退」意謂有效量之藥物單獨或與抗贅生劑組合投與引起患者中腫瘤生長或尺寸減少、腫瘤壞死、至少一種疾病症狀之嚴重程度降低、無疾病症狀期之頻率及持續時間增加、預防由患病引起 之損傷或失能或以其他方式改善疾病症狀。藥理學有效性係指藥物促進患者中癌症消退之能力。生理學安全性係指由投與藥物產生之毒性程度，或對細胞、器官及/或生物體含量之其他不良生理學作用(不良作用)可接受地低。
舉例而言，關於腫瘤治療，藥物之治療有效量或劑量較佳相對於未經治療之個體抑制細胞生長或腫瘤生長達至少約20%、更佳至少約40%、甚至更佳至少約60%且再更佳至少約80%。在最佳實施例中，藥物之治療有效量或劑量完全抑制細胞生長或腫瘤生長，亦即較佳抑制細胞生長或腫瘤生長達100%。化合物抑制腫瘤生長之能力可使用下文描述之分析評估。腫瘤生長之抑制可並非在治療後即時的，且可僅僅在一段時間之後或在重複投與之後發生。或者，組合物之此特性可藉由檢查化合物抑制細胞生長之能力來評估，此類抑制可藉由熟練從業者已知之分析在活體外量測。在本文所述之其他較佳實施例中，可觀測到腫瘤消退且可持續至少約20天、更佳至少約40天或甚至更佳至少約60天之時間段。
除非上下文另外清晰可見，否則如本文所用，「組合」療法意謂涵蓋以協同方式投與兩種或兩種以上治療劑，且包括(但不限於)同時給藥。特定言之，組合療法涵蓋共同投與(例如投與共調配物或同時投與分開的治療組合物)與連續或依序投與，其限制條件為在投與另一治療劑時以一定方式調節一種治療劑之投與。舉例而言，一種治療劑可僅僅在已投與不同治療劑且使其起作用一段指定時間之後投與。參見例如Kohrt等人(2011)Blood 117：2423。
術語「患者」及「個體」係指接收預防性或治療性治療之任何人類或非人類動物。舉例而言，本文所述之方法及組合物可用於治療患有癌症之個體。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、狗、牛、雞、兩 棲動物、爬蟲等。
在以下子部分中進一步詳細描述本文所述之各種態樣。
I.抗-TIGIT抗體
本申請案揭示具有用作治療諸如癌症之疾病之治療劑的所希望特性之完全人類抗-huTIGIT抗體。此等特性包括以下中之一或多者：以高親和力結合於人類TIGIT之能力、結合於食蟹獼猴TIGIT之能力、阻斷PVR結合(且因此信號傳導)之能力及缺乏可降低抗體之化學穩定性的序列傾向。
本文藉由序列所揭示之抗-TIGIT抗體結合於人類TIGIT上特定抗原決定基，如實例4中所述及圖2A-2C中所示來測定。測定抗原決定基之三種特異性抗體結合在人類TIGIT之類似區域但不同在於接觸之特定胺基酸殘基。該等抗體共享以高親和力結合於人類TIGIT及能夠阻斷PVR結合之特性。因此，結合於相同或緊密相關之抗原決定基的其他抗體將可能共享此等所希望特性，且可藉由競爭實驗發現。
另外，抗體22G2以與其結合於人類TIGIT大體上相同之親和力結合於食蟹獼猴TIGIT，當需要執行毒性研究以支持監管部門批准使用抗體作為人類治療劑時此為合宜的。結合於與15A6及22G2相同或類似之抗原決定基的其他抗-TIGIT抗體可能共享此結合於獼猴TIGIT之有利特性。可藉由進行競爭實驗或藉由直接測定其抗原決定基來發現抗體與類似抗原決定基之結合。
與本文所揭示之抗-huTIGIT抗體競爭之抗-TIGIT抗體
與本發明之抗體競爭結合於huTIGIT之抗-huTIGIT抗體，諸如15A6及22G2，可使用類似於本文所述之方案(實例1)的免疫接種方案培養。與本文所述之抗-huTIGIT抗體競爭結合的抗體亦可藉由用人類TIGIT或包含其細胞外域(SEQ ID NO：1之殘基22-141；NP_776160.2)之構築體免疫接種小鼠，或藉由用含有本文所揭示之抗-huTIGIT抗體 (例如15A6、22G2及11G11)結合之抗原決定基的人類TIGIT之片段免疫接種來產生。所得抗體可藉由此項技術中熟知之方法，針對阻斷15A6或22G2與人類TIGIT結合之能力，例如在ELISA中阻斷TIGIT之細胞外域與免疫球蛋白Fc結構域之融合蛋白的結合，或例如藉由FACS阻斷結合於在表面上表現huTIGIT之細胞的能力進行篩選。在各種實施例中，在添加15A6或22G2之前、同時或在其之後使測試抗體與TIGIT-Fc融合蛋白(或在表面上表現huTIGIT之細胞)接觸。舉例而言，可進行「分組」實驗(實例3)以確定抗體是否分在與抗體15A6或22G2相同之「組」，其中實驗抗體15A6或22G2稱為「參考」抗體，且待測試抗體稱為「測試」抗體。尤其在大致化學計量濃度下減少15A6及/或22G2與TIGIT(呈Fc融合物或在細胞上)結合之抗體可能結合在相同、重疊或相鄰抗原決定基，且因此可共享15A6及22G2之所希望功能特性。
亦可使用此項技術中已知之其他方法鑑別競爭抗體。舉例而言，可使用標準ELISA分析或競爭性ELISA分析，其中重組人類TIGIT蛋白質構築體固定在盤上，添加各種濃度之未標記測試抗體，洗滌盤，添加標記之參考抗體，洗滌，且量測結合標記之量。若增加濃度之未標記測試抗體抑制標記參考抗體之結合，則稱測試抗體抑制參考抗體與盤上標靶之結合，或稱其與參考抗體之結合競爭。或者或另外，BIACORE® SPR分析可用於評估抗體競爭之能力。測試抗體抑制本文所述之抗-huTIGIT抗體與TIGIT結合之能力證實測試抗體可與參考抗體競爭結合於TIGIT。
因此，本文提供抗-TIGIT抗體，例如如藉由ELISA或FACS，諸如藉由使用在以下段落中所述之分析所量測，其抑制本文所述之抗-huTIGIT抗體與細胞，例如活化T細胞上TIGIT之結合達至少10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，及/或其與細胞，例如活化T細胞上TIGIT之結合抑制達至少10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
一種確定測試抗體是否阻斷參考抗體之結合(亦即「競爭」)的示例性競爭實驗可如下進行：如下製備活化人類T細胞：外周血單核細胞(PBMC)自人類全血，使用菲科爾梯度(Ficoll gradient)分離且用10μg/mL植物凝血素(PHA-L)(USBiol#P3370-30)及200IU/mL重組IL-2(Peprotech#200-02)活化3天。使活化T細胞再懸浮於FACS緩衝液(具有5%胎牛血清之PBS)中且以每個樣品孔105個細胞接種在96孔盤中。將未結合之測試抗體以在0至50μg/mL(以50μg/mL之最高濃度開始，三倍滴定)範圍內的濃度添加至盤。不相關IgG可用作測試抗體之同型對照且以相同濃度添加(以50μg/mL之最高濃度開始，三倍滴定)。可包括與50μg/mL未標記參考抗體一起預培育之樣品作為陽性對照以完全阻斷(100%抑制)，且在初級培育中不具有抗體之樣品可用作陰性對照(無競爭；0%抑制)。培育30分鐘後，標記，例如生物素標記之參考抗體在不洗滌下以每孔2μg/mL之濃度添加。樣品再培育30分鐘。未結合之抗體藉由用FACS緩衝液洗滌細胞來移除。細胞結合之標記參考抗體用偵測標記之試劑，例如偵測生物素之PE結合之抗生蛋白鏈菌素(Invitrogen，目錄號S21388)偵測。樣品在FACS Calibur流式細胞儀(BD,San Jose)上獲得且用Flowjo軟體(Tree Star,Inc,Ashland,OR)分析。結果可表示為抑制%(亦即自100%減去在各濃度下之標記量除以在無阻斷抗體下獲得之標記的量)。
通常，接著相反地進行相同實驗，亦即測試抗體為參考抗體且參考抗體為測試抗體。在某些實施例中，抗體至少部分(例如至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%)或完全(100%)阻斷另一抗體與標靶，例如人類TIGIT或其片段之結合，且無論抑制發生在一種還是另一抗體為測試抗體時。當該等抗體彼此以兩種方式競爭時，亦即在首先添加測試抗體之競爭實驗中及首先添加參考抗體之競爭實驗中，測試及參考抗體均「交叉阻斷」彼此與標靶之結合。
若在大致同等濃度下，例如在如實例3中所述之實驗的競爭實驗中，抗-huTIGIT抗體抑制15A6及/或22G2與人類TIGIT之結合達至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%(若存在)，則認為其與本文所揭示之抗-huTIGIT抗體競爭。除非另外指示，否則若如在與前兩段中所概述之競爭ELISA實驗中所量測，當以與所選抗體大致同等莫耳濃度使用時，抗體減少選自由本發明之抗-huTIGIT抗體組成之群的抗體與人類TIGIT之結合至少20%，則將認為其與所選抗體競爭。
結合於相同抗原決定基之抗-TIGIT抗體
結合於與本文所揭示之抗體相同或類似之抗原決定基的抗-huTIGIT抗體可使用類似於本文所述之方案(實例1)的免疫接種方案培養。所得抗體可針對高親和力結合於人類TIGIT進行篩選(實例2)。接著可在酵母展示分析中研究所選抗體，其中huTIGIT之序列變異體呈現在酵母細胞之表面上(實例4)以測定抗體結合之精確抗原決定基。
抗原決定基測定可藉由此項技術中已知之任何方法進行。本文所揭示之抗原決定基藉由酵母展示測定，如實例4描述及圖2A-2C呈現。在各種實施例中，在如下情況下認為抗-huTIGIT抗體結合於與本文所揭示之抗-huTIGIT mAb，例如15A6及/或22G2相同的抗原決定基：其接觸15A6或22G2所接觸之huTIGIT的至少一個區域內之一或多個相同殘基；其接觸15A6或22G2所接觸之huTIGIT的至少一個區域內 之大部分殘基；其接觸15A6或22G2所接觸之huTIGIT各區域內的大部分殘基；其接觸沿15A6或22G2所接觸之huTIGIT整個長度的大部分觸點；其接觸15A6或22G2所接觸之人類TIGIT之所有不同區域內；其接觸15A6或22G2所接觸之人類TIGIT上任一個區域的所有相同殘基；或其接觸15A6或22G2所接觸之所有區域的所有殘基。抗原決定基「區域」為沿抗體15A6或22G2所接觸之一級序列的殘基簇，例如如提供在SEQ ID NO：38-44。
用於測定與本文所述之抗體結合於「TIGIT上相同抗原決定基」的技術包括抗原：抗體複合物晶體之x射線分析，其提供抗原決定基之原子解析。其他方法監測抗體與抗原片段或抗原之突變變體之結合，其中歸因於抗原序列內胺基酸殘基之修飾的結合損失視為抗原決定基組分之指示。方法亦可依賴於相關抗體自組合噬菌體展示肽庫或自標靶蛋白之蛋白酶消化，親和分離特定短肽(呈天然三維形式或呈變性形式)的能力。該等肽則視為定義與用於篩選肽庫之抗體對應之抗原決定基的榜樣。為定位抗原決定基，亦已開發已展示定位構形不連續之抗原決定基的計算演算法。
抗原決定基或包含抗原決定基之區域亦可藉由針對與一系列跨越TIGIT之重疊肽之結合篩選來鑑別。或者，Jespers等人(1994)Biotechnology 12：899之方法可用於導引具有與本文所述之抗-TIGIT抗體相同之抗原決定基且因此具有與本文所述之抗-TIGIT抗體類似之特性的抗體之選擇。使用噬菌體展示，首先抗-TIGIT抗體之重鏈與(較佳人類)輕鏈之譜系成對以選擇TIGIT結合抗體，且接著新輕鏈與(較佳人類)重鏈譜系成對以選擇具有與本文所述之抗-huTIGIT抗體相同之抗原決定基或抗原決定基區域的(較佳人類)結合TIGIT抗體。或者本文所述之抗體之變異體可藉由編碼抗體重鏈及輕鏈之cDNA的突變誘發來獲得。
如Cunningham及Wells(1989)Science 244：1081所述之丙胺酸掃描突變誘發或TIGIT中胺基酸殘基之點突變誘發的一些其他形式(諸如實例4提供之酵母展示方法)亦可用於確定抗-TIGIT抗體之功能性抗原決定基。
特異性抗體結合之抗原決定基或抗原決定基區域(「抗原決定基區域」為包含抗原決定基或與抗原決定基重疊之區域)亦可藉由評估抗體與包含TIGIT片段之肽的結合來測定。可合成涵蓋TIGIT(例如人類TIGIT)序列之一系列重疊肽且例如在直接ELISA、競爭性ELISA(其中評估肽阻止抗體與結合於微量滴定盤之孔之TIGIT結合的能力)中或在晶片上針對結合進行篩選。此類肽篩選方法可能無法偵測一些不連續的功能性抗原決定基，亦即涉及沿TIGIT多肽鏈之一級序列不相鄰之胺基酸殘基的功能性抗原決定基。
抗原決定基亦可藉由基於MS之蛋白質足紋法，諸如氫/氘交換質譜分析(HDX-MS)及蛋白質快速光化學氧化(FPOP)來鑑別。HDX-MS可例如如Wei等人(2014)Drug Discovery Today 19：95進一步描述來進行，該方法特別以引用的方式併入本文中。FPOP可例如如Hambley及Gross(2005)J.American Soc.Mass Spectrometry 16：2057進一步描述來進行，該方法特別以引用的方式併入本文中。
抗-TIGIT抗體結合之抗原決定基亦可藉由結構方法測定，諸如X射線晶體結構測定(例如WO2005/044853)、分子模型化及核磁共振(NMR)波譜學，包括當游離時及當與所關注之抗體以複合物形式結合時，TIGIT中不穩定醯胺氫之H-D交換速率的NMR測定(Zinn-Justin等人(1992)Biochemistry 31：11335；Zinn-Justin等人(1993)Biochemistry 32：6884)。
關於X射線結晶學，結晶可使用此項技術中任一已知方法(例如Giege等人(1994)Acta Crystallogr.D50：339；McPherson(1990)Eur. J.Biochem.189：1)，包括微批量法(例如Chayen(1997)Structure 5：1269)、懸滴蒸氣擴散(例如McPherson(1976)J.Biol.Chem.251：6300)、接種及透析實現。需要使用具有至少約1mg/mL及較佳約10mg/mL至約20mg/mL之濃度的蛋白質製劑。結晶可最佳在含有濃度在約10%至約30%(w/v)範圍內之聚乙二醇1000-20,000(PEG；平均分子量在約1000至約20,000Da範圍內)，較佳約5000至約7000Da，更佳約6000Da之沈澱劑溶液中實現。亦可能需要包括蛋白質穩定劑，例如濃度在約0.5%至約20%範圍內之甘油。沈澱劑溶液中亦可能需要適合之鹽，諸如氯化鈉、氯化鋰或檸檬酸鈉，較佳濃度在約1mM至約1000mM範圍內。沈澱劑較佳緩衝至約3.0至約5.0、較佳約4.0之pH值。適用於沈澱劑溶液之特定緩衝液可變化且為此項技術中熟知(Scopes,Protein Purification：Principles and Practice，第三版，(1994)Springer-Verlag,New York)。適用緩衝劑之實例包括(但不限於)HEPES、Tris、MES及乙酸鹽。晶體可在各種溫度下生長，包括2℃、4℃、8℃及26℃。
抗體：抗原晶體可使用熟知之X射線繞射技術研究且可使用以下電腦軟體細化，諸如X-PLOR(Yale University,1992,Molecular Simulations,Inc.發佈；參見例如Blundell及Johnson(1985)Meth.Enzymol.114 & 115,H.W.Wyckoff等人編輯，Academic Press；美國專利申請公開案第2004/0014194號)及BUSTER(Bricogne(1993)Acta Cryst.D49：37-60；Bricogne(1997)Meth.Enzymol.276A：361-423,Carter及Sweet編輯；Roversi等人(2000)Acta Cryst.D56：1313-1323)，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
高親和力結合之抗-TIGIT抗體
在一些實施例中，本發明之抗-huTIGIT抗體以高親和力結合於huTIGIT，如本文所揭示之抗-huTIGIT抗體，增加其為有效治療劑之 可能性。在各種實施例中，本發明之抗-huTIGIT抗體以小於10nM、5nM、2nM、1nM、300pM、100pM或60pM之KD結合於huTIGIT。在其他實施例中，本發明之抗-huTIGIT抗體以2nM與60pM之間的KD結合於huTIGIT。評估抗體對huTIGIT之結合能力的標準分析包括ELISA、RIA、西方墨點法、生物層干擾量測法(BLI)及BIACORE® SPR分析(參見實例2)。
抗-TIGIT抗體序列變異體
可容許本文所揭示之抗體序列的一些變化且仍然維持抗體之所希望特性。CDR區使用Kabat系統(Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號)描繪。因此，本發明進一步提供包含與本文所揭示之抗體(例如15A6、22G2及11G11)的CDR序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之CDR序列的抗-huTIGIT抗體。本發明亦提供包含與本文所揭示之抗體(例如15A6、22G2及11G11)的重鏈及/或輕鏈可變結構域序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈及/或輕鏈可變結構域序列的抗-huTIGIT抗體。
源自於相同生殖系之抗-TIGIT抗體
在抗原結合特異性主要由CDR決定下，與本文所揭示之抗體(例如15A6、22G2及11G11)共享CDR序列的抗體可能共享其所希望特性。另外，本文所揭示之所選抗體(15A6、22G2及11G11)結合於沿huTIGIT一級序列之類似區域，且一些重鏈及輕鏈源自於相同生殖系序列。因此，亦可預期組合(「混合及匹配」)來自抗體與15A6、22G2及11G11之CDR區的抗體結合於huTIGIT且保留其所希望特性。可選擇具有與本文所揭示之特異性抗體同等或優於其之結合親和力、生物活性及/或其他特性的「混合及匹配」抗體用於本發明之方法。
在某些實施例中，本發明之抗-huTIGIT抗體包含源自於特定人類生殖系重鏈免疫球蛋白基因之重鏈可變區及/或來自特定人類生殖系輕鏈免疫球蛋白基因之輕鏈可變區。抗體15A6具有源自於人類生殖系V4-39、D6-19及JH4b之重鏈及輕鏈生殖系VA27及JK2。抗體22G2具有源自於人類生殖系V4-61、D3-10及JH6b之重鏈及輕鏈生殖系VL6及JK3。抗體11G11具有源自於人類生殖系V4-39、D3-10及JH4b之重鏈及輕鏈生殖系VL6及JK2。抗體10D7具有源自於人類生殖系V1-69、D6-13及JH6b之重鏈及輕鏈生殖系VL15及JK5。結合於人類TIGIT且源自於此等生殖系序列中之一些或所有的其他抗體可能序列緊密相關，尤其源自於相同V區基因之抗體，且因此將預期其共享相同的所希望特性。
如本文所用，若抗體之可變區自使用人類生殖系免疫球蛋白基因之系統獲得，且抗體序列足夠與生殖系相關，使得比起任何其他生殖系，其更可能源自於既定生殖系，則人類抗體包含「源自於」特定生殖系序列之重鏈或輕鏈可變區。此類系統包括用所關注之抗原將攜帶人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠免疫接種或用所關注之抗原篩選展示在噬菌體上之人類免疫球蛋白基因庫。抗體序列所源自於之人類生殖系免疫球蛋白序列可藉由將人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列進行比較且選擇序列上最接近(亦即最大一致性%)人類抗體序列之人類生殖系免疫球蛋白序列來鑑別。「源自於」特定人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體可含有與生殖系序列相比，歸因於例如天然存在之體細胞突變或有意引入定點突變之胺基酸差異。然而，所選人類抗體通常在胺基酸序列上與由人類生殖系免疫球蛋白基因(例如V區)編碼之胺基酸序列至少90%一致，且含有當與其他物種之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列(例如鼠類生殖系序列)相比時鑑別人類抗體為人類的胺基酸殘基。在某些情況下，人類抗體在 胺基酸序列上可與由生殖系免疫球蛋白基因(例如V區)編碼之胺基酸序列至少95%或甚至至少96%、97%、98%或99%一致。通常，源自於特定人類生殖系序列之人類抗體將展示與由人類生殖系免疫球蛋白基因(例如V區)編碼之胺基酸序列不超過10個胺基酸差異。在某些情況下，人類抗體可展示與由生殖系免疫球蛋白基因(例如V區)編碼之胺基酸序列不超過5個，或甚至不超過4個、3個、2個或1個胺基酸差異。
II.經工程改造及修飾之抗體 VH及VL區
亦提供可使用具有本文所揭示之VH及/或VL序列中之一或多者的抗體作為工程改造修飾抗體之起始物質來製備經工程改造及經修飾之抗體，該經修飾之抗體可具有自起始抗體改變之特性。抗體可藉由修飾一或兩個可變區(亦即VH及/或VL)內，例如一或多個CDR區內及/或在一或多個構架區內的一或多個殘基而經工程改造。或者或另外，抗體可藉由修飾恆定區內之殘基例如以改變抗體之效應功能而經工程改造。
可進行之可變區工程改造之一種類型為CDR接枝。此類接枝尤其用於人類化與本文所揭示之抗-huTIGIT抗體競爭結合及/或結合於與本文所揭示之抗-huTIGIT抗體相同抗原決定基的非人類抗-TIGIT抗體。抗體主要經由位於六個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)的胺基酸殘基與標靶抗原相互作用。出於此原因，個別抗體之間的CDR內之胺基酸序列與CDR外之序列相比更多樣化。因為CDR序列引起大部分抗體-抗原相互作用，所以可藉由構築包括來自特定參考抗體之CDR序列接枝至來自具有不同特性之不同抗體之構架序列的表現載體來表現模擬特定參考抗體之特性的重組抗體(參見例如Riechmann,L.等人(1998)Nature 332：323-327；Jones,P.等人(1986)Nature 321：522- 525；Queen,C.等人(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033；頒予Winter之美國專利第5,225,539號以及頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
此類構架序列可獲自公共DNA資料庫或包括生殖系抗體基因序列之公開文獻。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可見於「VBase」人類生殖系序列數據庫，以及Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號；Tomlinson,I.M.等人(1992)「The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops」J.Mol.Biol.227：776-798；及Cox,J.P.L.等人(1994)「A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage」Eur.J.Immunol.24：827-836；每一者之內容以引用之方式明確併入本文中。
用於本文所述之抗體之較佳構架序列為結構上類似於本文所述之抗體使用之構架序列的構架序列。VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列可接枝至具有與構架序列所源自於之生殖系免疫球蛋白基因中發現之序列一致的序列的構架區上，或CDR序列可接枝至含有相較生殖系序列至多20個胺基酸取代(較佳保守胺基酸取代)的構架區上。舉例而言，已發現，在某些情況下，為了維持或提高抗體之抗原結合能力，將構架區內之殘基突變是有益的(參見例如頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,762號及第6,180,370號)。
本文所述之經工程改造之抗體包括已對VH及/或VL內之構架殘基進行修飾例如以提高抗體特性者。此類構架修飾常用以降低抗體之免 疫原性。舉例而言，一種方法是使一或多個構架殘基「回復突變」成相應生殖系序列。更特定言之，已經歷體細胞突變之抗體可含有不同於抗體所來源之生殖系序列的構架殘基。此類殘基可藉由比較抗體構架序列與抗體所來源之生殖系序列來鑑別。為使構架區序列恢復至其生殖系組態，體細胞突變可藉由例如定點突變誘發或PCR介導之突變誘發「回復突變」至生殖系序列。此類「回復突變」抗體亦意欲涵蓋於內。
另一類型構架修飾包括使構架區內或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基產生突變，以移除T細胞抗原決定基，藉此降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫」，且進一步詳細描述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。
另一類型可變區修飾是使CDR區內之胺基酸殘基產生突變以改善相關抗體之一或多種結合特性(例如親和力)。可進行定點突變誘發或PCR介導之突變誘發以引入突變及對抗體結合之作用或其他相關功能特性。較佳是引入保守修飾。突變可為胺基酸添加、缺失或較佳取代。另外，通常在CDR區內不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基改變。
抗體之CDR中甲硫胺酸殘基可經氧化，會引起潛在化學降解且因此降低抗體效能。因此，本發明亦提供在重鏈及/或輕鏈CDR中一或多個甲硫胺酸殘基經不會進行氧化降解之胺基酸殘基置換的抗-TIGIT抗體。
類似地，去醯胺位點可自抗-TIGIT抗體，尤其在CDR中移除。
較佳消除抗原結合結構域內潛在的糖基化位點以防止可干擾抗原結合之糖基化。參見例如美國專利第5,714,350號。
靶向抗原結合
在各種實施例中，本發明之抗體經修飾以選擇性地阻斷其中抗 原結合將為不利的組織及環境中之抗原結合，但允許其中其將為有益的抗原結合。在一個實施例中，產生阻斷肽「遮罩」，其特異性結合於抗體之抗原結合表面且干擾抗原結合，該遮罩藉由肽酶可裂解連接子連接於抗體各結合臂。參見例如頒予CytomX之美國專利第8,518,404號。此類構築體適用於治療其中與非腫瘤組織相比，腫瘤微環境中蛋白酶含量大大增加之癌症。腫瘤微環境中可裂解連接子之選擇性裂解允許遮蔽/阻斷肽分離，使得選擇性地在腫瘤中，而非在其中抗原結合可引起不必要副作用之周圍組織中進行抗原結合。
或者，在相關實施例中，研發一種包含兩個抗原結合結構域之二價結合化合物(「遮蔽配位體」)，其結合於(二價)抗體之兩個抗原結合表面且干擾抗原結合，其中兩個結合結構域遮罩藉由例如藉由肽酶可裂解之可裂解連接子彼此連接(而非抗體)。參見例如頒予Tegopharm Corp.之國際專利申請公開案第WO 2010/077643號。遮蔽配位體可包含或源自於抗體意欲結合之抗原或可獨立產生。此類遮蔽配位體適用於治療其中與非腫瘤組織相比，腫瘤微環境中蛋白酶含量大大增加之癌症。腫瘤微環境中可裂解連接子之選擇性裂解允許兩個結合結構域彼此解離，降低對抗體之抗原結合表面的親合力。所產生的遮蔽配位體與抗體之解離使得選擇性地在腫瘤中，而非在其中抗原結合可引起不必要副作用之周圍組織中進行抗原結合。
Fc及經修飾之Fc
除由抗原結合結構域與抗原結合產生的治療性抗體之活性(例如在拮抗劑抗體之情況下阻斷同源配位體或受體蛋白質，或在促效劑抗體之情況下誘發信號傳導)之外，抗體之Fc部分與免疫系統一般以複雜方式相互作用以引發多種生物作用。效應功能，諸如免疫球蛋白之Fc區，負責許多引起標靶細胞殺死之重要抗體功能，諸如抗原依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞介導 之吞噬作用(ADCP)，儘管機制不同。重鏈恆定區存在五個主要類別或同型(IgA、IgG、IgD、IgE、IgM)，各具有特徵性效應功能。此等同型可進一步再分成亞類，例如IgG分成四個稱為IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之亞類。IgG分子與對抗體IgG類別具有特異性之三個類別Fcγ受體(FcγR)，亦即FcγRI、FcγRII及FcγRIII相互作用。已報導對IgG與FcγR受體結合而言重要之序列位於CH2及CH3結構域中。抗體之血清半衰期受抗體結合於新生Fc受體(FcRn)之能力影響。
本發明之抗體可包含本發明之可變結構域與包含不同Fc區之恆定結構域組合，Fc區係基於用於所欲用途之抗體的生物活性(如存在)選擇。Salfeld(2007)Nat.Biotechnol.25：1369。例如人類IgG可分類成四個亞類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，且此等每一者包含具有用於結合於Fcγ受體中之一或多者(活化受體FcγRI(CD64)、FcγRIIA、FcγRIIC(CD32)；FcγRIIIA及FcγRIIIB(CD16)及抑制受體FcγRIIB)及用於補體第一組分(C1q)的獨特型態之Fc區。人類IgG1及IgG3結合於所有Fcγ受體；IgG2結合於FcγRIIAH131，且以較低親和力結合於FcγRIIAR131、FcγRIIIAV158；IgG4結合於FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC及FcγRIIIAV158；且抑制受體FcγRIIB具有對IgG1、IgG2及IgG3比所有其他Fcγ受體更低之親和力。Bruhns等人(2009)Blood 113：3716。研究已展示FcγRI不結合於IgG2，且FcγRIIIB不結合於IgG2或IgG4。同上。一般而言，關於ADCC活性，人類IgG1≧IgG3≫IgG4≧IgG2。因此，舉例而言，可選擇IgG1恆定結構域而非IgG2或IgG4用於其中希望ADCC之藥物中；若活化表現FcγRIIIA之NK細胞、巨噬細胞之單核細胞，則可選擇IgG3；且若抗體用於使過敏患者不敏感，則可選擇IgG4。若希望抗體缺乏所有效應功能，則亦可選擇IgG4。
本文所述之抗-TIGIT可變區可連接(例如共價連接或融合)於Fc， 例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc，Fc可為任何異型或異種異型，例如對於IgG1：G1m、G1m1(a)、G1m2(x)、G1m3(f)、G1m17(z)；對於IgG2：G2m、G2m23(n)；對於IgG3：G3m、G3m21(g1)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(b1)、G3m13(b3)、G3m14(b4)、G3m10(b5)、G3m15(s)、G3m16(t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v)。參見例如Jefferis等人(2009)mAbs 1：1)。異型之選擇可受潛在的免疫原性問題影響，例如以將抗藥物抗體之形成降至最低。
在某些實施例中，本文所述之抗-TIGIT可變區連接於結合於一或多種活化Fc受體(FcγRI/CD64、FcγRIIa/CD32或FcγRIIIa/CD16)之Fc，且藉此刺激ADCC且可引起T細胞耗盡。在某些實施例中，本文所述之抗-TIGIT可變區連接於人類IgG1或IgG3 Fc，亦即抗體為IgG1或IgG3同型。在某些實施例中，抗-TIGIT抗體為耗盡抗體，詳言之，其在腫瘤微環境中耗盡Treg細胞而非Teff細胞(且從而增強抗腫瘤活性)，但在腫瘤微環境外，例如在外周中不顯著耗盡Treg及Teff細胞。在某些實施例中，抗-TIGIT抗體為同型，天然存在或非天然存在(例如包括突變)，刺激腫瘤位點之Treg細胞耗盡或消除及伴隨Teff細胞活化。在某些實施例中，抗-TIGIT抗體在腫瘤位點產生升高之Teff：Treg比率，此指示有效抗腫瘤活性，較佳在腫瘤微環境外，例如在外周中不顯著耗盡Treg及Teff細胞。
在其他實施例中，抗-TIGIT抗體阻斷Treg之免疫抑制活性。在某些實施例中，抗-TIGIT抗體具有FcR結合減少或消除，例如結合於活化FcR減少之Fc。
本文所述之抗-TIGIT可變區可連接於非天然存在之Fc區，例如無效應或大部分無效應Fc(例如人類IgG2或IgG4)，或者具有增強之與一或多種活化Fc受體(FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)結合的Fc，諸如以增強 在腫瘤環境中之Treg耗盡。
本文所述之可變區可連接於包含一或多種修飾之Fc，該一或多種修飾通常改變抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本文所述之抗體可經化學修飾(例如可使一或多個化學部分附接於抗體)，或其可經修飾以改變其糖基化，以改變抗體之一個多種功能特性。此等實施例各進一步詳細描述於下文中。Fc區中之殘基編號為Kabat EU索引編號。本文所揭示之序列變異體藉由提及殘基編號，接著代替天然存在之胺基酸取代之胺基酸，視情況前面為該位置天然存在之殘基來提供。在多個胺基酸可存在於既定位置之情況下，例如若天然存在之同型之間序列不同，或若在該位置多個突變可取代，則其由斜線隔開(例如「X/Y/Z」)。
舉例而言，可在Fc區中進行修飾以產生如下Fc變異體：相對於親本Fc，(a)抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)增加或減少；(b)補體介導之細胞毒性(CDC)增加或減少；(c)對C1q之親和力增加或減少；及/或(d)對Fc受體之親和力增加或減少。此類Fc區變異體將一般在Fc區中包含至少一個胺基酸修飾。認為組合胺基酸修飾為尤其所希望的。舉例而言，變異Fc區可在其中包括例如本文中鑑別之特定Fc區位置的兩個、三個、四個、五個等取代。示例性Fc序列變異體在本文中揭示，且亦提供於美國專利第5,624,821號；第6,277,375號；第6,737,056號；第6,194,551號；第7,317,091號；第8,101,720號；PCT專利公開案WO 00/42072；WO 01/58957；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752；WO 04/074455；WO 04/099249；WO 04/063351；WO 05/070963；WO 05/040217、WO 05/092925及WO 06/020114。
降低效應功能
ADCC活性可藉由修飾Fc區來降低。在某些實施例中，可移除影響與Fc受體結合之位點，較佳除救助受體結合位點外之位點。在其他實施例中，Fc區可經修飾以移除ADCC位點。ADCC位點為此項技術中已知；關於IgG1中之ADCC位點參見例如Sarmay等人(1992)Molec.Immunol.29(5)：633-9。在一個實施例中，人類IgG1之G236R及L328R變異體有效消除FcγR結合。Horton等人(2011)J.Immunol.186：4223及Chu等人(2008)Mol.Immunol.45：3926。在其他實施例中，具有減少之與FcγR結合的Fc包含胺基酸取代L234A、L235E及G237A。Gross等人(2001)Immunity 15：289。
CDC活性亦可藉由修飾Fc區來降低。IgG1位置之突變D270、K322、P329及P331，特別丙胺酸突變D270A、K322A、P329A及P331A，顯著降低對應抗體結合C1q及活化補體之能力。Idusogie等人(2000)J.Immunol.164：4178；WO 99/51642。已展示IgG1之位置331之修飾(例如P331S)減少補體結合。Tao等人(1993)J.Exp.Med.178：661及Canfield及Morrison(1991)J.Exp.Med.173：1483。在另一實例中，胺基酸位置231至239內之一或多個胺基酸殘基改變，藉此改變抗體固定補體之能力。WO 94/29351。
在一些實施例中，具有減少之補體固定的Fc具有胺基酸取代A330S及P331S。Gross等人(2001)Immunity 15：289。
對於完全避免效應功能之用途，例如當單獨抗原結合足夠產生所希望治療效益且效應功能只會引起不希望副作用(或增加風險)時，可使用IgG4抗體，或可設計缺乏Fc區或其大體性部分之抗體或片段，或Fc可經突變以完全消除糖基化(例如N297A)。或者，已產生不含效應功能，缺乏結合FcγR之能力(如IgG2)且無法活化補體(如IgG4)的人類IgG2(CH1結構域及鉸鏈區)及人類IgG4(CH2及CH3結構域)之雜交構築體。Rother等人(2007)Nat.Biotechnol.25：1256。亦參見Mueller等 人(1997)Mol.Immunol.34：441；Labrijn等人(2008)Curr.Op.Immunol.20：479(一般論述減少效應功能之Fc修飾)。
在其他實施例中，Fc區藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變，以降低抗體之所有效應功能。舉例而言，一或多個選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322之胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，使得抗體具有降低之對效應配位體之親和力，但保留親本抗體之抗原結合能力。親和力改變之效應配位體可為例如Fc受體(殘基234、235、236、237、297)或補體之C1組分(殘基297、318、320、322)。均為Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號。
一個早期專利申請案提出IgG Fc區之修飾以減少與FcγRI之結合，從而降低ADCC(234A；235E；236A；G237A)或阻斷與補體組分C1q之結合以消除CDC(E318A或V/K320A及K322A/Q)。WO 88/007089。亦參見Duncan及Winter(1988)Nature 332：563；Chappel等人(1991)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)88：9036；及Sondermann等人(2000)Nature 406：267(論述此等突變對FcγRIII結合之作用)。
降低效應功能之Fc修飾亦包括位置234、235、236、237、267、269、325及328之取代、插入及缺失，諸如234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L及328R。Fc變異體可包含236R/328R。減少FcyR與補體相互作用之其他修飾包括取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P及234V。此等及其他修飾綜述於Strohl(2009)Current Opinion in Biotechnology 20：685-691中。可藉由使位置233-236及327-331中之一或多者的IgG殘基突變，諸如IgG1中E233P、L234V、L235A、視情況G236△、A327G、A330S及P331S，IgG4中E233P、F234V、L235A、視情況G236△，及IgG2中A330S及P331S， 降低效應功能(ADCC與補體活化)，同時維持新生FcR結合(維持半衰期)。參見Armour等人(1999)Eur.J.Immunol.29：2613；WO 99/58572。降低效應功能之其他突變包括IgG1中L234A及L235A(Alegre等人(1994)Transplantation 57：1537)；IgG2中V234A及G237A(Cole等人(1997)J.Immunol.159：3613；亦參見美國專利第5,834,597號)；以及對於IgG4，S228P及L235E(Reddy等人(2000)J.Immunol.164：1925)。人類IgG1中用於降低效應功能之突變的另一組合包括L234F、L235E及P331S。Oganesyan等人(2008)Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.64：700。一般參見Labrijn等人(2008)Curr.Op.Immunol.20：479。在Fc(IgG1)融合蛋白(阿巴西普(abatacept))之情況下發現降低效應功能之額外突變為C226S、C229S及P238S(EU殘基編號)。Davis等人(2007)J.Immunol.34：2204。
具有降低之ADCC及/或CDC之其他Fc變異體揭示於Glaesner等人(2010)Diabetes Metab.Res.Rev.26：287(IgG4中F234A及L235A以降低ADCC及ADCP)；Hutchins等人(1995)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)92：11980(IgG4中F234A、G237A及E318A)；An等人(2009)MAbs 1：572及美國專利申請公開案2007/0148167(IgG2中H268Q、V309L、A330S及P331S)；McEarchern等人(2007)Blood 109：1185(IgG1中C226S、C229S、E233P、L234V、L235A)；Vafa等人(2014)Methods 65：114(IgG2中V234V、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、P331S)。
在某些實施例中，選擇基本上不具有效應功能之Fc，亦即其具有減少之與FcγR之結合及減少之補體固定。一種無效應之示例性Fc，例如IgG1 Fc包含以下五個突變：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。Gross等人(2001)Immunity 15：289。此五個取代亦可與N297A組合以消除糖基化。
增強效應功能
或者，ADCC活性可藉由修飾Fc區增加。關於ADCC活性，人類IgG1≧IgG3≫IgG4≧IgG2，因此可選擇IgG1恆定結構域而非IgG2或IgG4用於其中ADCC為所希望的藥物中。或者，Fc區可經修飾以增加抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或藉由修飾以下位置之一或多個胺基酸增加對Feγ受體之親和力：234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。參見WO 2012/142515；亦參見WO 00/42072。示例性取代包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D及332E。示例性變異體包括239D-332E、236A-332E、236A-239D-332E、268F-324T、267E-268F、267E-324T及267E-268F-324T。舉例而言，已展示包含可視情況與I332E組合之G236A變異體的人類IgG1Fc增加FcγRIIA/FcγRIIB結合親和力比率大約15倍。Richards等人(2008)Mol.Cancer Therap.7：2517；Moore等人(2010)mAbs 2：181。用於增強FcyR及補體相互作用之其他修飾包括(但不限於)取代298A、333A、334A、326A、247I、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、305I及396L。此等及其他修飾綜述於Strohl(2009)Current Opinion in Biotechnology 20：685-691。特定言之，ADCC與CDC可藉由IgG1之位置E333的改變，例如E333A增強。Shields等人(2001)J.Biol.Chem.276：6591。使用P247I及A339D/Q突變增強IgG1中之效應功能揭示於 WO 2006/020114，且D280H、K290S±S298D/V揭示於WO 2004/074455。人類IgG1中K326A/W及E333A/S變異體及IgG2中之E333S已展示增加效應功能。Idusogie等人(2001)J.Immunol.166：2571。
特定言之，已定位人類IgG1上對FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點且已描述結合提高之變異體。Shields等人(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604。位置256、290、298、333、334及339之特定突變展示提高與FcγRIII之結合，包括組合突變體T256A-S298A、S298A-E333A、S298A-K224A及S298A-E333A-K334A(具有增強之FcγRIIIa結合及ADCC活性)。已鑑別具有強烈增強之與FcγRIIIa結合的其他IgG1變異體，包括具有S239D-I332E及S239D-I332E-A330L突變之變異體，其展示對FcγRIIIa之親和力增加最大，FcγRIIb結合降低，且在食蟹獼猴中之細胞毒活性強。Lazar等人(2006)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)103：4005；Awan等人(2010)Blood 115：1204；Desjarlais及Lazar(2011)Exp.Cell Res.317：1278。三重突變引入諸如阿侖單抗(CD52特異性)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(HER2/neu特異性)、利妥昔單抗(rituximab)(CD20特異性)及西妥昔單抗(cetuximab)(EGFR特異性)之抗體在活體外轉變成大大增強之ADCC活性，且S239D-I332E變異體展示增強之耗盡猴中B細胞之能力。Lazar等人(2006)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)103：4005。另外，已鑑別含有L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I及P396L突變之IgG1突變體，其顯示B細胞惡性疾病及乳癌之模型中表現人類FcγRIIIa之轉殖基因小鼠中增強之與FcγRIIIa結合及同時增強之ADCC活性。Stavenhagen等人(2007)Cancer Res.67：8882；美國專利第8,652,466號；Nordstrom等人(2011)Breast Cancer Res.13：R123。
不同IgG同型亦顯示差異CDC活性(IgG3>IgG1>>IgG2
Figure 104143215-A0202-12-0055-97
IgG4)。 Dangl等人(1988)EMBO J.7：1989。對於其中希望增強CDC之用途，亦可引入增加與C1q結合之突變。募集補體(CDC)之能力可藉由IgG2中K326及/或E333之突變增強，諸如K326W(其降低ADCC活性)及E333S，以增加與C1q(補體級聯之第一組分)之結合。Idusogie等人(2001)J.Immunol.166：2571。S267E/H268F/S324T(單獨或任何組合)引入人類IgG1中增強C1q結合。Moore等人(2010)mAbs 2：181。Natsume等人(2008)Cancer Res.68：3863(其中圖1)之IgG1/IgG3雜交同型抗體「113F」的Fc區亦賦予增強之CDC。亦參見Michaelsen等人(2009)Scand.J.Immunol.70：553及Redpath等人(1998)Immunology 93：595。
可增加或降低效應功能之額外突變揭示於Dall'Acqua等人(2006)J.Immunol.177：1129。亦參見Carter(2006)Nat.Rev.Immunol.6：343；Presta(2008)Curr.Op.Immunol.20：460。
雖然不一定與本發明之拮抗劑抗-TIGIT mAb有關，但增強對抑制受體FcyRIIb之親和力的Fc變異體可增強誘導細胞凋亡或輔助活性。Li及Ravetch(2011)Science 333：1030；Li及Ravetch(2012)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)109：10966；美國專利申請公開案2014/0010812。此類變異體可提供具有與FcyRIIb+細胞，包括例如B細胞及單核細胞相關之免疫調節活性的抗體。在一個實施例中，Fc變異體提供相對於一或多種活化受體，選擇性地增強之對FcyRIIb之親和力。改變與FcyRIIb結合之修飾包括選自由以下各者組成之群的位置之一或多種修飾：根據EU索引234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328及332。用於增強FcyRIIb親和力之示例性取代包括(但不限於)234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y及 332E。示例性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W及328Y。用於增強與FcyRIIb結合之其他Fc變異體包括235Y-267E、236D-267E、239D-268D、239D-267E、267E-268D、267E-268E及267E-328F。特定言之，人類IgG1之S267E、G236D、S239D、L328F及I332E變異體，包括S267E-L328F雙重變異體，對特別增強對抑制FcyRIIb受體之親和力而言尤其有價值。Chu等人(2008)Mol.Immunol.45：3926；美國專利申請公開案2006/024298；WO 2012/087928。增強之對FcγRIIb之特異性(區別於FcγRIIaR131)可藉由添加P238D取代及其他突變(Mimoto等人(2013)Protein.Eng.Des.& Selection 26：589；WO 2012/115241)以及V262E及V264E(Yu等人(2013)J.Am.Chem.Soc.135：9723及WO 2014/184545)獲得。
半衰期延長
在某些實施例中，抗體經修飾以延長其生物半衰期。可進行多種方法。舉例而言，此可藉由增加Fc區對FcRn之結合親和力進行。在一個實施例中，抗體在CH1或CL區內改變以含有獲自IgG之Fc區之CH2結構域的兩個環的救助受體結合抗原決定基，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所述。增加與FcRn結合及/或改善藥物動力學特性之其他示例性Fc變異體包括位置259、308及434之取代，包括例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y及434M。增加Fc與FcRn結合之其他變異體包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人，2004,J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216；Hinton等人2006 Journal of Immunology 176：346-356)、256A、272A、305A、307A、311A、312A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人，Journal of Biological Chemistry,2001,276(9)：6591-6604)、252F、252Y、252W、254T、256Q、256E、256D、433R、 434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H(Dall'Acqua等人Journal of Immunology,2002,169：5171-5180；Dall'Acqua等人，2006,Journal of Biological Chemistry 281：23514-23524)。參見美國專利第8,367,805號。
已提出IgG Fc中某些保守殘基之修飾(I253、H310、Q311、H433、N434)，諸如N434A變異體(Yeung等人(2009)J.Immunol.182：7663)作為一種增加FcRn親和力，因此增加抗體在循環中之半衰期的方式。WO 98/023289。包含M428L及N434S之組合Fc變異體已展示增加FcRn結合且增加血清半衰期多達五倍。Zalevsky等人(2010)Nat.Biotechnol.28：157。包含T307A、E380A及N434A修飾之組合Fc變異體亦延長IgG1抗體之半衰期。Petkova等人(2006)Int.Immunol.18：1759。另外，包含M252Y-M428L、M428L-N434H、M428L-N434F、M428L-N434Y、M428L-N434A、M428L-N434M及M428L-N434S變異體之組合Fc變異體亦已展示延長半衰期。WO 2009/086320。
此外，包含M252Y、S254T及T256E之組合Fc變異體增加半衰期幾乎4倍。Dall'Acqua等人(2006)J.Biol.Chem.281：23514。提供增加之FcRn親和力但減少之pH值依賴性的相關IgG1修飾(M252Y-S254T-T256E-H433K-N434F)已用於產生用作競爭者以防止其他抗體與FcRn結合之IgG1構築體(「MST-HN Abdeg」)，增加其他抗體，內源性IgG(例如在自身免疫環境下)或另一外源性(治療性)mAb之清除。Vaccaro等人(2005)Nat.Biotechnol.23：1283；WO 2006/130834。
用於增加FcRn結合之其他修飾描述於Yeung等人(2010)J.Immunol.182：7663-7671；6,277,375；6,821,505；WO 97/34631；WO 2002/060919。
在某些實施例中，雜交IgG同型可用於增加FcRn結合，且可能增 加半衰期。舉例而言，IgG1/IgG3雜交變異體可藉由將CH2及/或CH3區中之IgG1位置用來自兩個同型不同之位置之IgG3的胺基酸取代來構築。因此，可構築包含一或多個取代，例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435R及436F之雜交變異IgG抗體。在本文所述之其他實施例中，IgG1/IgG2雜交變異體可藉由將CH2及/或CH3區中之IgG2位置用來自兩個同型不同之位置之IgG1的胺基酸取代來構築。因此，可構築包含一或多個取代，例如以下胺基酸取代中之一或多者的雜交變異IgG抗體：233E、234L、235L、-236G(提及位置236之甘胺酸之插入)及327A。參見美國專利第8,629,113號。已產生據稱增加血清半衰期及提高表現之IgG1/IgG2/IgG4序列之雜交物。美國專利第7,867,491號(其中序號18)。
本發明之抗體之血清半衰期亦可藉由聚乙二醇化增加。抗體可經聚乙二醇化以例如增加抗體之生物(例如血清)半衰期。為使抗體發生聚乙二醇化，通常使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)試劑(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在其中使一或多個PEG基團附接於抗體或抗體片段的條件下反應。較佳地，聚乙二醇化經由與反應性PEG分子(或類似之反應性水溶聚合物)之醯化反應或烷基化反應來進行。如本文所用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白質之任一種PEG形式，諸如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，待聚乙二醇化之抗體為無糖基化(aglycosylate)抗體。蛋白質聚乙二醇化方法為此項技術中已知且可應用於本文所述之抗體。參見例如Nishimura等人之EP 0154316及Ishikawa等人之EP 0401384。
或者，在一些情形下，可能需要減少本發明之抗體之半衰期而非增加其。人類IgG1之Fc中諸如I253A(Hornick等人(2000)J.Nucl. Med.41：355)及H435A/R、I253A或H310A(Kim等人(2000)Eur.J.Immunol.29：2819)之修飾可降低FcRn結合，因此減少半衰期(增加清除率)，用於快速清除為較佳之情形，諸如醫學成像。亦參見Kenanova等人(2005)Cancer Res.65：622。其他增強清除之方式包括將本發明之抗原結合結構域格式化為缺乏結合FcRn之能力的抗體片段，諸如Fab片段。此類修飾可將抗體之循環半衰期自數週減少至數小時。接著必要時抗體片段之選擇性聚乙二醇化可用於微調(增加)抗體片段之半衰期。Chapman等人(1999)Nat.Biotechnol.17：780。抗體片段亦可與人類血清白蛋白融合，例如融合蛋白構築體中，以增加半衰期。Yeh等人(1992)Proc.Nat'l Acad.Sci.89：1904。或者，雙特異性抗體可用本發明之第一抗原結合結構域及結合於人類血清白蛋白(HSA)之第二抗原結合結構域構築。參見國際專利申請公開案WO 2009/127691及其中所引用之專利參考文獻。或者，專門多肽序列可添加至抗體片段以增加半衰期，例如「XTEN」多肽序列。Schellenberger等人(2009)Nat.Biotechnol.27：1186；國際專利申請公開案WO 2010/091122。
額外Fc變異體
當使用IgG4恆定結構域時，通常較佳包括取代S228P，其模擬IgG1中之鉸鏈序列且從而使IgG4分子穩定，例如減少所治療之患者中治療性抗體與內源性IgG4之間的Fab臂交換。Labrijn等人(2009)Nat.Biotechnol.27：767；Reddy等人(2000)J.Immunol.164：1925。
IgG1構築體之鉸鏈中潛在蛋白酶裂解位點可藉由D221G及K222S修飾消除，增加抗體之穩定性。WO 2014/043344。
Fc變異體對其配位體(Fc受體)之親和力及結合特性可藉由此項技術中已知之多種活體外分析方法(基於生物化學或免疫之分析)測定，該等方法包括(但不限於)平衡方法(例如酶聯結免疫吸附分析法 (ELISA)或放射免疫分析(RIA))或動力學(例如BIACORE® SPR分析)及其他方法，諸如間接結合分析、競爭性抑制分析、螢光共振能量轉移(FRET)、凝膠電泳及層析法(例如凝膠過濾)。此等及其他方法可利用所檢驗之組分中一或多者上的標記及/或採用多種偵測方法，包括(但不限於)發色、螢光、發光或同位素標記。結合親和力及動力學之詳細描述可見於Paul,W.E.編輯，Fundamental Immunology，第4版，Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)，其聚焦於抗體-免疫原相互作用。
在其他實施例中，抗體之糖基化經修飾以增加或降低效應功能。舉例而言，可藉由使位置297之保守天冬醯胺殘基突變(例如N297A)，因此消除補體及FoγRI結合來製備缺乏所有效應功能之無糖基化抗體。Bolt等人(1993)Eur.J.Immunol.23：403。亦參見Tao及Morrison(1989)J.Immunol.143：2595(IgG1中使用N297Q以消除位置297之糖基化)。
雖然去糖基化抗體一般缺乏效應功能，但可引入突變以恢復該功能。去糖基化抗體，例如由N297A/C/D/或H突變產生或在系統(例如大腸桿菌)中產生之不使蛋白質糖基化的抗體，可進一步突變以恢復FcγR結合，例如S298G及/或T299A/G/或H(WO 2009/079242)或E382V及M428I(Jung等人(2010)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)107：604)。
另外，具有增強ADCC之抗體可藉由改變糖基化製備。舉例而言，基於提高之與FcγRIIIa結合，已展示自重鏈Asn297連接之寡醣移除岩藻糖增強ADCC。Shields等人(2002)JBC 277：26733；Niwa等人(2005)J.Immunol.Methods 306：151；Cardarelli等人(2009)Clin.Cancer Res.15：3376(MDX-1401)；Cardarelli等人(2010)Cancer Immunol.Immunotherap.59：257(MDX-1342)。此類低岩藻糖抗體可例 如在缺乏岩藻糖基轉移酶(FUT8)之基因剔除中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中(Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol.Bioeng.87：614)或在產生無岩藻糖基化抗體之其他細胞中產生。參見例如Zhang等人(2011)mAbs 3：289及Li等人(2006)Nat.Biotechnol.24：210(均描述糖基工程改造之甲醇酵母(Pichia pastoris)中的抗體產生)；Mossner等人(2010)Blood 115：4393；Shields等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733；Shinkawa等人(2003)J.Biol.Chem.278：3466；EP 1176195B1。ADCC亦可如PCT公開案WO 03/035835中所述增強，該公開案揭示變異CHO細胞株Lec13之使用，該細胞株具有降低之附接岩藻糖於Asn(297)連接之碳水化合物的能力，亦引起在該宿主細胞中表現之抗體的次岩藻糖基化。亦參見Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740。或者，在抗體產生期間岩藻糖類似物可添加至培養基中以抑制岩藻糖併入抗體上之碳水化合物中。WO 2009/135181。
增加抗體連接之寡醣中二等分GlcNac結構亦增強ADCC。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342描述經工程改造以表現醣蛋白修飾之糖基轉移酶(例如β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III(GnTIII))的細胞株，使得在該等經工程改造之細胞株中表現的抗體顯示增加之二等分GlcNac結構，此引起抗體之ADCC活性增加(亦參見Umana等人(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。
已研發額外糖基化變異體，其不含半乳糖、唾液酸、岩藻糖及木糖殘基(所謂GNGN糖型)，其顯示增強之ADCC及ADCP但減少之CDC；以及不含唾液酸、岩藻糖及木糖之其他變異體(所謂G1/G2糖型)，其顯示增強之ADCC、ADCP及CDC。美國專利申請公開案第2013/0149300號。具有此等糖基化模式之抗體視情況在其中內源性木糖基及岩藻糖基轉移酶基因已敲除的遺傳修飾之本生菸草 (N.benthamiana)中產生。
藉由改變Fc區之Asn297處附接的碳水化合物鏈之α2,6唾液酸基含量，糖基工程改造亦可用於修飾IgG構築體之消炎特性，其中增加比例之α2,6唾液酸化形式引起消炎作用增強。參見Nimmerjahn等人(2008)Ann.Rev.Immunol.26：513。相反，具有α2,6唾液酸化碳水化合物之抗體的比例減少可適用於不想要消炎特性之情況。例如藉由選擇性純化α2,6唾液酸化形式或藉由酶修飾，改變抗體之α2,6唾液酸化含量的方法提供於美國專利申請公開案第2008/0206246號。在其他實施例中，Fc區之胺基酸序列可經修飾以模擬α2,6唾液酸化之作用，例如藉由包括F241A修飾。WO 2013/095966。
III.抗體物理特性
本文所述之抗體可在輕鏈或重鏈可變區中含有一或多個糖基化位點。此類糖基化位點可增加抗體之免疫原性，或因改變抗原結合而改變抗體之pK(Marshall等人(1972)Ann.Rev.Biochem.41：673-702；Gala及Morrison(2004)J.Immunol.172：5489-94；Wallick等人(1988)J.Exp.Med.168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh等人(1985)Nature 316：452-7；Mimura等人(2000)Mol.Immunol.37：697-706)。已知糖基化在含有N-X-S/T序列之基元進行。在一些情況下，較佳具有不含可變區糖基化之抗-TIGIT抗體。此可藉由選擇在可變區中不含糖基化基元之抗體或藉由使糖基化區域內之殘基突變來實現。
在某些實施例中，本文所述之抗體不含天冬醯胺異構位點。天冬醯胺之去醯胺可在N-G或D-G序列上發生且產生異天冬胺酸殘基，其將扭接引入多肽鏈且降低其穩定性(異天冬胺酸作用)。
各抗體將具有獨特等電點(pI)，其一般在6與9.5之間的pH值範圍內。IgG1抗體之pI通常在7-9.5之pH值範圍內，且IgG4抗體之pI通常 在6-8之pH值範圍內。推測pI在正常範圍外之抗體可在活體內條件下具有一定展開及不穩定性。因此，較佳具有pI值在正常範圍內之抗-TIGIT抗體。此可藉由選擇pI在正常範圍內之抗體或藉由使帶電表面殘基突變來實現。
各抗體將具有特徵性熔融溫度，其中熔融溫度愈高，表明活體內整體穩定性愈大(Krishnamurthy R及Manning M C(2002)Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。一般來說，較佳TM1(初始展開溫度)大於60℃，較佳大於65℃，甚至更佳大於70℃。抗體之熔點可使用差示掃描熱量測定(Chen等人(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol Lett 68：47-52)或圓二色性(Murray等人(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)量測。
在一個較佳實施例中，選擇不會迅速降解之抗體。可使用毛細電泳法(CE)及MALDI-MS量測抗體之降解(Alexander A J及Hughes D E(1995)Anal Chem.67：3626-32)。
在另一個較佳實施例中，選擇具有最低聚集作用之抗體，聚集作用可觸發不必要的免疫反應及/或改變或不利之藥物動力學特性。一般而言，在聚集為25%或更低，較佳20%或更低，甚至更佳15%或更低，甚至更佳10%或更低且甚至更佳5%或更低下，抗體為可接受的。聚集可藉由若干技術，包括尺寸排阻管柱(SEC)、高效液相層析(HPLC)及光散射量測。
IV.核酸分子
本文所述之另一態樣係關於編碼本文所述之抗體的核酸分子。核酸可存在於全細胞、細胞溶解物中或以部分純化或大體上純形式存在。當藉由標準技術，包括鹼性/SDS處理、CsCl聚束、管柱層析法、限制酶、瓊脂糖凝膠電泳及在此項技術中熟知之其他技術純化而遠離其他細胞組分或其他污染物，例如其他細胞核酸(例如其他染色體 DNA，例如在自然界中連接於分離DNA之染色體DNA)或蛋白質時，核酸「分離」或「大體上純」。參見F.Ausubel等人編輯，(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本文所述之核酸可為例如DNA或RNA且可含有或可不含有內含子序列。在某些實施例中，核酸為cDNA分子。
本文所述之核酸可使用標準分子生物學技術獲得。對於藉由融合瘤(例如由如下文進一步描述，攜帶人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠製備之融合瘤)表現之抗體，編碼藉由融合瘤製備之抗體之輕鏈及重鏈的cDNA可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術獲得。對於自免疫球蛋白基因庫獲得(例如使用噬菌體展示技術)之抗體，編碼抗體之核酸可自該庫重新獲得。
一旦獲得編碼VH及VL區段之DNA片段，此等DNA片段可藉由標準重組DNA技術進一步操縱，例如以將可變區基因轉變成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等操縱中，編碼VL或VH之DNA片段可操作地連接於編碼另一蛋白質(諸如抗體恆定區或可撓性連接子)之另一DNA片段。如此上下文中所用，術語「可操作地連接」意欲意謂兩種DNA片段接合，使得由兩種DNA片段編碼之胺基酸序列保持同框。
編碼VH區之經分離DNA可藉由將編碼VH之DNA可操作地連接於編碼重鏈恆定區(鉸鏈、CH1、CH2及/或CH3)之另一DNA分子而轉變成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知(參見例如Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號)且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，例如IgG1區域。對於Fab片段重鏈基 因，編碼VH之DNA可操作地連接於僅僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。
編碼VL區之經分離DNA可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接於編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子來轉變成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知(參見例如Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號)且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。
為產生scFv基因，編碼VH及VL之DNA片段可操作地連接於編碼可撓性連接子，例如編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3，之另一片段，使得VH及VL序列可表現為相鄰單鏈蛋白質，其中VL及VH區由可撓性連接子接合(參見例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，(1990)Nature 348：552-554)。
V.抗體產生
可使用多種已知之技術，諸如Kohler及Milstein,Nature 256：495(1975)描述之標準體細胞雜交技術，產生本發明之各種抗體，例如與本文所揭示之抗-人類TIGIT抗體競爭或結合於與本文所揭示之抗-人類TIGIT抗體相同之抗原決定基的抗體。雖然體細胞雜交程序為較佳，但原則上亦可採用用於產生單株抗體之其他技術，例如B淋巴細胞之病毒或致癌轉型、使用人類抗體基因庫之噬菌體展示技術。
用於製備融合瘤之較佳動物系統為鼠類系統，小鼠中融合瘤產生為完全公認之程序。分離經免疫之脾細胞用於融合之免疫接種方案及技術為此項技術中已知。融合搭配物(例如鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序亦為已知。
本文所述之嵌合或人類化抗體可基於如上所述製備之鼠類單株抗體之序列製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可使用標準分子生物學技術自相關鼠類融合瘤獲得且經工程改造以含有非鼠類(例如人類)免疫球蛋白序列。舉例而言，為產生嵌合抗體，可使用此項技術中已知之方法使鼠類可變區與人類恆定區連接(參見例如Cabilly等人之美國專利第4,816,567號)。為產生人類化抗體，可使用此項技術中已知之方法使鼠類CDR區插入至人類構架中(參見例如頒予Winter之美國專利第5,225,539號及頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
在一個實施例中，本文所述之抗體為人類單株抗體。此類針對TIGIT之人類單株抗體可使用攜帶部分人類免疫系統而非小鼠系統之轉殖基因或轉染色體小鼠來產生。此等轉殖基因及轉染色體小鼠包括在本文中分別稱為HuMAb小鼠及KM小鼠且在本文中統稱為「人類Ig小鼠」之小鼠。
HuMAb小鼠®(Medarex,Inc.)含有編碼未重排人類重鏈(μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列的人類免疫球蛋白基因微型基因座；以及不活化內源性μ及κ鏈基因座的靶向突變(參見例如Lonberg等人，1994 Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠展現降低之小鼠IgM或κ表現，且作為對免疫接種的反應，所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因經歷類別轉換及體細胞突變而產生高親和性單株人類IgGκ(Lonberg,N.等人(1994)，上述；以下中評述：Lonberg,N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg,N.及Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93，及Harding,F.及Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb小鼠之製備及使用以及此類小鼠所攜帶之基因組修飾進一步描述於Taylor,L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen,J.等人(1993) International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen,J.等人(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor,L.等人(1994)International Immunology 6：579-591；及Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，該等所有文獻之內容以全文引用之方式併入本文中。進一步參見美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,789,650號、第5,877,397號、第5,661,016號、第5,814,318號、第5,874,299號及第5,770,429號；均頒予Lonberg及Kay；頒予Surani等人之美國專利第5,545,807號；PCT公開案第WO 92/03918號、第WO 93/12227號、第WO 94/25585號、第WO 97/13852號、第WO 98/24884號及第WO 99/45962號，均頒予Lonberg及Kay；及頒予Korman等人之PCT公開案第WO 01/14424號。
在某些實施例中，本文所述之抗體使用在轉殖基因及轉染色體上攜帶人類免疫球蛋白序列之小鼠，諸如攜帶人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠來培養。此類小鼠(在本文中稱為「KM小鼠」)詳細描述於頒予Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478中。
再者，表現人類免疫球蛋白基因之替代轉殖基因動物系統為此項技術中可獲得，且可用於培養本文所述之抗-TIGIT抗體。舉例而言，可使用稱為Xenomouse(Abgenix,Inc.)之替代性轉殖基因系統；此類小鼠描述於例如頒予Kucherlapati等人之美國專利第5,939,598號、第6,075,181號、第6,114,598號、第6,150,584號及第6,162,963號。
另外，表現人類免疫球蛋白基因之替代轉染色體動物系統可在此項技術中獲得，且可用於培養本文所述之抗-TIGIT抗體。舉例而言，可使用稱為「TC小鼠」之攜帶人類重鏈轉染色體與人類輕鏈轉 染色體之小鼠；此類小鼠描述於Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727。此外，攜帶人類重鏈及輕鏈轉染色體之母牛已描述於此項技術中(Kuroiwa等人，2002 Nature Biotechnology 20：889-894)，且可用於培養本文所述之抗-TIGIT抗體。
此項技術中描述之用於培養人類抗體，例如人類抗-TIGIT抗體的額外小鼠系統包括(i)VELOCIMMUNE®小鼠(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)，其中內源性小鼠重鏈及輕鏈可變區已經由同源重組經人類重鏈及輕鏈可變區置換，可操作地連接於內源性小鼠恆定區，使得在小鼠中培養嵌合抗體(人類V/小鼠C)且接著隨後使用標準重組DNA技術轉變成完全人類抗體；以及(ii)MeMo®小鼠(Merus Biopharmaceuticals,Inc.)，其中小鼠含有未經重排之人類重鏈可變區，但單一重排人類常見輕鏈可變區。此類小鼠及其培養抗體之用途描述於例如WO 2009/15777、US 2010/0069614、WO 2011/072204、WO 2011/097603、WO 2011/163311、WO 2011/163314、WO 2012/148873、US 2012/0070861及US 2012/0073004。
本文所述之人類單株抗體亦可使用篩選人類免疫球蛋白基因庫之噬菌體展示方法來製備。此類用於分離人類抗體之噬菌體展示方法在此項技術中確立。參見例如頒予Ladner等人之美國專利第5,223,409號、第5,403,484號及第5,571,698號；頒予Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號、頒予McCafferty等人美國專利第5,969,108號及第6,172,197號以及頒予Griffiths等人美國專利第5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第6,582,915號及第6,593,081號。
本文所述之人類單株抗體亦可使用人類免疫細胞已重組以使得可在免疫接種時產生人類抗體反應之SCID小鼠來製備。此類小鼠描述於例如頒予Wilson等人之美國專利第5,476,996號及第5,698,767號 中。
免疫接種
為產生人類TIGIT之完全人類抗體，含有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因或轉殖染色體小鼠(例如HCo12、HCo7或KM小鼠)可經TIGIT抗原之純化或富集製劑及/或表現TIGIT之細胞免疫接種，如例如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851及WO 98/24884針對其他抗原所述。或者，小鼠可用編碼人類TIGIT之DNA免疫接種。較佳地，在第一次輸注時小鼠將為6-16週齡。舉例而言，重組TIGIT抗原之純化或富集製劑(5-50μg)可用於腹膜內免疫接種HuMAb小鼠。在使用不產生抗體之TIGIT抗原的純化或富集製劑免疫接種的情況下，小鼠亦可用表現TIGIT之細胞，例如細胞株免疫接種，以促進免疫反應。示例性細胞株包括過度表現TIGIT之穩定CHO及Raji細胞株。
各種抗原之累積經歷已展示當最初用含抗原之Ribi佐劑腹膜內(IP)或皮下(SC)免疫接種，接著每隔一週用含抗原之Ribi佐劑進行IP/SC免疫接種(至多總共10次)時HuMAb轉殖基因小鼠反應最佳。免疫反應可在免疫接種方案之過程期間進行監測，其中血漿樣品藉由眶後出血獲得。血漿可藉由ELISA及FACS(如下所述)篩選，且具有抗-TIGIT人類免疫球蛋白之足夠效價的小鼠可用於融合。小鼠可靜脈內經抗原增強3天，接著處死及移除脾及淋巴結。預期可需要進行各免疫接種之2-3次融合。6至24隻小鼠通常針對各抗原進行免疫接種。通常，使用HCo7、HCo12及KM品系。另外，HCo7與HCo12轉殖基因可一起培育至具有兩種不同人類重鏈轉殖基因(HCo7/HCo12)之單一小鼠中。
產生TIGIT之單株抗體之融合瘤的產生
為產生製造本文所述之單株抗體的融合瘤，來自免疫接種小鼠 之脾細胞及/或淋巴結細胞可分離且與適當永生化細胞株，諸如小鼠骨髓瘤細胞株融合。接著可篩選所得融合瘤以產生抗原特異性抗體。舉例而言，來自免疫接種小鼠之脾淋巴細胞的單細胞懸浮液可在50% PEG下與Sp2/0非分泌小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL 1581)融合。細胞以大約2×105塗鋪在平底微量滴定盤中，接著在含有10%胎純系血清、18%「653」條件培養基、5% origen(IGEN)、4mM L-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鈉、5mM HEPES、0.055mM 2-巰基乙醇、50單位/毫升青黴素、50mg/ml鏈黴素、50mg/ml慶大黴素及1X HAT(Sigma)之選擇性培養基中培育兩週。在大約兩週之後，可在以HT置換HAT之培養基中培養細胞。接著可針對人類單株IgM及IgG抗體，藉由ELISA篩選個別孔。一旦發生大量融合瘤生長，則通常可在10-14天之後觀測培養基。可將分泌融合瘤之抗體再次塗鋪，再次篩選，且若對人類IgG仍為陽性，則可藉由限制稀釋法次選殖單株抗體至少兩次。接著可活體外培養穩定次純系以在組織培養基中產生少量抗體，用於進一步表徵。
為純化單株抗體，所選融合瘤可在兩公升旋轉瓶中生長用於單株抗體純化。上清液可過濾且濃縮，接著用蛋白A-瓊脂糖凝膠(Pharmacia,Piscataway,N.J.)親和層析。溶離IgG可藉由凝膠電泳及高效液相層析檢查以確保純度。緩衝溶液可更換為PBS，且濃度可藉由OD280使用1.43消光係數測定。單株抗體可等分且儲存在-80℃下。
VI.抗體製造 產生TIGIT之單株抗體之轉染瘤細胞的產生
本發明之抗體，包括提供序列之特定抗體與其他相關抗-TIGIT抗體，可在宿主細胞轉染瘤中使用例如此項技術中所熟知之重組DNA技術與基因轉染方法之組合產生(Morrison,S.(1985)Science 229：1202)。
舉例而言，為表現抗體或其抗體片段，編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA可藉由標準分子生物學技術(例如使用表現相關抗體之融合瘤的PCR擴增或cDNA選殖)獲得且DNA可插入至表現載體中，使得基因可操作地連接於轉錄及轉譯控制序列。在此背景下，術語「可操作地連接」欲意謂抗體基因接合至載體，使得載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮調節抗體基因之轉錄及轉譯的其預期功能。選擇表現載體及表現控制序列與所用表現宿主細胞相容。抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因可插入至分離載體中或兩種基因插入至相同表現載體中。藉由標準方法(例如抗體基因片段及載體上互補限制位點之接合或若無限制位點存在時之鈍端接合)將抗體基因插入至表現載體中。本文所述之抗體之輕鏈及重鏈可變區可藉由其插入已編碼所需同型之重鏈恆定區及輕鏈恆定區之表現載體中，使得VH區段可操作地連接於載體內之CH區段且VL區段可操作地連接於載體內之CL區段，用於產生任何抗體同型之全長抗體基因。或者或另外，重組表現載體可編碼促進抗體鏈自宿主細胞分泌之信號肽。抗體鏈基因可選殖至載體中，使得信號肽同框連接於抗體鏈基因之胺基端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(亦即來自非免疫球蛋白蛋白質之信號肽)。
除抗體鏈基因外，重組表現載體可攜帶控制宿主細胞中抗體鏈基因之表現的調控序列。術語「調控序列」意欲包括控制抗體鏈基因之轉錄或轉譯的啟動子、強化子及其他表現控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。此類調控序列描述於例如Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))。熟習此項技術者應瞭解表現載體之設計，包括調控序列之選擇，可視注入待轉型之宿主細胞之選擇、所需蛋白質之表現量等因素而定。用於哺乳動物宿主細胞表現之較佳調控序列包括引導哺乳動物細胞中高蛋白質表現量之病毒元件，諸如源自於細胞巨大病毒 (CMV)、猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及/或多瘤病毒之啟動子及/或強化子。或者，可使用非病毒調控序列，諸如泛素啟動子或β-血球蛋白啟動子。再此外，調控元件由來自不同來源之序列構成，諸如SRα啟動子系統，其含有來自SV40早期啟動子之序列及人類T細胞白血病病毒類型1之長末端重複序列(Takebe,Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
除抗體鏈基因及調控序列之外，重組表現載體可攜帶額外序列，諸如調控宿主細胞中載體之複製的序列(例如複製起點)及可選擇標記基因。可選擇標記基因促進已引入載體之宿主細胞的選擇(參見例如美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號，均為Axel等人)。舉例而言，在已引入載體之宿主細胞上，可選擇標記基因通常賦予對諸如G418、潮黴素或甲胺喋呤之藥物之抗性。較佳可選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於具有甲胺喋呤選擇/擴增之dhfr-宿主細胞)及neo基因(用於G418選擇)。
對於輕鏈及重鏈之表現，編碼重鏈及輕鏈之表現載體藉由標準技術轉染至宿主細胞。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋常用於引入外源性DNA至原核或真核宿主細胞中的各種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及其類似技術。儘管理論上可在原核或真核宿主細胞中表現本文所述之抗體，但由於真核細胞且尤其哺乳動物細胞與原核細胞相比更可能組裝且分泌經適當摺疊且具免疫活性之抗體，故抗體在真核細胞且最佳哺乳動物宿主細胞中之表現為最佳。抗體基因之原核表現據報導無法高產率產生活性抗體(Boss,M.A.及Wood,C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。本發明之抗體亦可在酵母甲醇酵母之糖基工程改造品系中產生。Li等人(2006)Nat.Biotechnol.24：210。
用於表現本文所述之重組抗體的較佳哺乳動物宿主細胞包括中 國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括dhfr- CHO細胞，描述於Urlaub及Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中，與DHFR可選擇標記物一起使用，例如如R.J.Kaufman及P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所述)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。詳言之，對於用於NSO骨髓瘤細胞，另一較佳表現系統為WO 87/04462、WO 89/01036及EP 338,841中所揭示之GS基因表現系統。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，抗體係藉由培養宿主細胞持續足以允許抗體在宿主細胞中表現或更佳地，將抗體分泌至生長宿主細胞之培養基中之時間段來產生。可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體。
本發明之抗體多肽鏈之N及C端可因通常觀測到之轉譯後修飾而不同於預期序列。舉例而言，C端離胺酸殘基常常在抗體重鏈中缺少。Dick等人(2008)Biotechnol.Bioeng.100：1132。在治療性抗體之輕鏈與重鏈上，N端麩醯胺酸殘基及更低程度上麩胺酸酯殘基，時常轉變成焦麩胺酸鹽殘基。Dick等人(2007)Biotechnol.Bioeng.97：544；Liu等人(2011)JBC 28611211；Liu等人(2011)J.Biol.Chem.286：11211。
本發明之各種促效劑抗-huTIGIT抗體的胺基酸序列提供於序列表中，序列表概述於表5。出於上述原因，C端離胺酸不包括於序列表中重鏈或重鏈恆定結構域之任一序列中。然而，在一替代實施例中，本發明之抗-huTIGIT抗體的各重鏈及/或編碼此類抗體或其重鏈或輕鏈之遺傳構築體在重鏈之C端包括此額外離胺酸殘基。
VII.分析
可藉由例如標準ELISA測試本文所述之抗體與TIGIT之結合。簡言之，微量滴定盤用PBS中1-2μg/ml之純化TIGIT塗佈，且接著用含5%牛血清白蛋白之PBS阻斷。抗體之稀釋液(例如來自TIGIT免疫接種 之小鼠的血漿稀釋液)添加至各孔且在37℃下培育1-2小時。盤用PBS/Tween洗滌且接著與例如用於人類抗體或另外具有人類重鏈恆定區之抗體之二級試劑、與辣根過氧化酶(HRP)結合之山羊抗人類IgGFc特異性多株試劑一起在37℃下培育1小時。在洗滌之後，盤用ABTS受質(Moss Inc，產品：ABTS-1000)顯影且藉由分光光度計在OD 415-495下分析。來自免疫接種小鼠之血清接著藉由流動式細胞量測術，針對結合於表現人類TIGIT之細胞株而不結合於表現TIGIT之對照細胞株進一步篩選。簡言之，抗-TIGIT抗體之結合藉由將表現TIGIT之CHO細胞與1：20稀釋之抗-TIGIT抗體一起培育來評估。將細胞洗滌且用PE標記之抗人類IgG Ab偵測結合。使用FACScan流動式細胞量測術(Becton Dickinson,San Jose,CA)進行流動細胞學分析。較佳地，發展最高效價之小鼠將用於融合物。若將偵測小鼠抗-huTIGIT抗體，則可使用抗小鼠偵測抗體進行類似實驗。
如上所述之ELISA分析可用於篩選展示與TIGIT免疫原之陽性反應性的抗體，且因此篩選產生該等抗體之融合瘤。產生較佳以高親和力結合於TIGIT之抗體的融合瘤可接著進行次選殖且進一步表徵。可接著自保留親本細胞之反應性之各融合瘤選擇一個純系(藉由ELISA)用於製造細胞庫及用於抗體純化。
為純化抗-TIGIT抗體，所選融合瘤可在兩公升旋轉瓶中生長用於單株抗體純化。上清液可過濾且濃縮，接著用蛋白A-瓊脂糖凝膠(Pharmacia,Piscataway,NJ)親和層析。溶離IgG可藉由凝膠電泳及高效液相層析檢查以確保純度。緩衝溶液可更換為PBS，且濃度可藉由OD280使用1.43消光係數測定。單株抗體可等分且儲存在-80℃下。
為確定所選抗-TIGIT單株抗體是否結合於獨特抗原決定基，可使用市售試劑(Pierce,Rockford,IL)對每一抗體進行生物素標記。可使用抗生蛋白鏈菌素標記之探針偵測生物素標記之單抗結合。使用未標 記單株抗體及生物素標記單株抗體之競爭研究可使用TIGIT塗佈之ELISA盤如上所述進行。
為測定純化抗體之同型，可使用對特定同型之抗體具有特異性之試劑進行同型ELISA。舉例而言，為測定人類單株抗體之同型，在4℃下微量滴定盤之孔可用1μg/ml抗人類免疫球蛋白塗佈過夜。在用1% BSA阻斷之後，使盤與1μg/ml或更低之測試單株抗體或純化同型對照在周圍溫度下反應一至兩個小時。接著可使孔與人類IgG1或人類IgM特異性鹼性磷酸酶結合之探針反應。使盤顯影，且如上所述分析。
為測試單株抗體與表現TIGIT之活細胞的結合，可使用流動式細胞量測術，如實例中所述。簡言之，表現膜結合TIGIT之細胞株(在標準生長條件下生長)與含有0.1% BSA之PBS中各種濃度之單株抗體在4℃下混合1小時。在洗滌之後，使細胞與藻紅素(PE)標記之抗-IgG抗體在與初級抗體染色相同之條件下反應。樣品可藉由使用光散射及側向散射特性對單細胞進行閘控之FACScan儀器來分析，且測定經標記抗體之結合。除流動式細胞量測分析之外或代替流動式細胞量測分析，可利用使用螢光顯微法之替代性分析。細胞可如上所述準確染色且藉由螢光顯微法檢驗。此方法允許目測個別細胞，但可具有降低之靈敏度，視抗原密度而定。
可藉由西方墨點法進一步測試抗-TIGIT抗體與TIGIT抗原之反應性。簡言之，可由表現TIGIT之細胞製備細胞提取物且進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳。在電泳之後，經分離抗原轉移至硝化纖維膜，用20%小鼠血清阻斷，且用待測試之單株抗體探測。可使用抗-IgG鹼性磷酸酶偵測IgG結合且用BCIP/NBT受質片劑(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO)顯影。
用於分析各種抗-TIGIT抗體之結合親和力、交叉反應性與結合動 力學的方法包括此項技術中已知之標準分析，例如生物層干擾量測(BLI)分析及使用BIACORE® 2000 SPR儀器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)之BIACORE®表面電漿子共振(SPR)分析。
在一個實施例中，抗體特異性結合於人類TIGIT之細胞外區域。抗體可特異性結合於TIGIT之細胞外域內的特定結構域(例如功能結構域)。在一特定實施例中，抗體特異性結合於TIGIT上PVR結合之位點。在某些實施例中，抗體特異性結合於人類TIGIT之細胞外區域及食蟹獼猴TIGIT之細胞外區域。較佳地，抗體以高親和力結合於人類TIGIT。
VIII.雙特異性分子
本文所述之抗體可用於形成雙特異性分子。抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段可衍生化或連接於另一功能分子，例如另一肽或蛋白質(例如受體之另一抗體或配位體)，以產生結合於至少兩個不同結合位點或標靶分子之雙特異性分子。本文所述之抗體可實際上衍生化或連接於一個以上其他功能分子以產生與兩個以上不同結合位點及/或標靶分子結合之多特異性分子；此類多特異性分子亦意欲涵蓋於如本文所用之術語「雙特異性分子」下。為產生本文所述之雙特異性分子，本文所述之抗體可在功能上與一或多個其他結合分子(諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬劑)連接(例如藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或以其他方式連接)，從而產生雙特異性分子。
因此，本文提供包含對TIGIT之至少一種第一結合特異性及對第二標靶抗原決定基之第二結合特異性的雙特異性分子。在本文所述之雙特異性分子為多特異性的一個實施例中，分子可進一步包括第三結合特異性。
在一個實施例中，本文所述之雙特異性分子包含至少一種抗體或其抗體片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv作為結合特 異物。抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚體，或其任何最小片段，諸如Fv或單鏈構築體，如Ladner等人之美國專利第4,946,778號中所述，其內容以引用的方式明確併入。
雖然人類單株抗體為較佳，但在本文所述之雙特異性分子中可採用的其他抗體為鼠類、嵌合及人類化單株抗體。
本文所述之雙特異性分子可藉由使用此項技術中已知之方法將成分結合特異物結合來製備。舉例而言，雙特異性分子之各結合特異物可分別產生，且隨後彼此結合。當結合特異物為蛋白質或肽時，多種偶合劑或交聯劑可用於共價結合。交聯劑之實例包括蛋白質A、碳化二亞胺、N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰伸苯基二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)及磺基丁二醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)(參見例如Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu,MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括以下文獻中所述之方法：Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan等人(1985)Science 229：81-83；及Glennie等人(1987)J.Immunol.139：2367-2375。較佳結合劑為SATA及磺基-SMCC，其均購自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)。
當結合特異物為抗體時，其可藉由兩條重鏈之C端鉸鏈區之硫氫基鍵結來結合。在一個尤佳實施例中，在結合之前，鉸鏈區經修飾以含有奇數個硫氫基殘基，較佳一個。
或者，兩種結合特異物可在同一載體中編碼，且在同一宿主細胞中表現及組裝。此方法尤其適用於雙特異性分子為mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2或配位體×Fab融合蛋白質之情況。本文所述之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗體及一個結合決定子之單鏈分 子，或包含兩個結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。製備雙特異性分子之方法描述於例如美國專利5,260,203號、美國專利第5,455,030號、美國專利第4,881,175號、美國專利第5,132,405號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,476,786號、美國專利第5,013,653號、美國專利第5,258,498號及美國專利第5,482,858號中。
雙特異性分子與其特異性標靶之結合可使用此項技術中公認之方法，諸如酶聯結免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方墨點分析證實。此等分析中之每一者通常藉由採用經標記之試劑(例如抗體)來偵測尤其關注之蛋白質-抗體複合物的存在，該經標記之試劑對所關注之複合物具特異性。
IX.組合物
進一步提供組合物，例如醫藥組合物，其含有與醫藥學上可接受之載劑一起調配的本文所述之抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段。此類組合物可包括一種本文所述之抗體或免疫結合物或雙特異性分子或(例如兩種或兩種以上不同的)本文所述之抗體或免疫結合物或雙特異性分子之組合。舉例而言，本文所述之醫藥組合物可包含結合於標靶抗原上不同抗原決定基或具有互補活性之抗體(或免疫結合物或雙特異性物)的組合。
在某些實施例中，組合物包含至少1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml或1-300mg/ml或100-300mg/ml之濃度的抗-TIGIT抗體。
本文所述之醫藥組合物亦可在組合療法中投與，亦即與其他藥劑組合。舉例而言，組合療法可包括本文所述之抗-TIGIT抗體與至少一種其他抗癌及/或T細胞刺激(例如活化)劑組合。可用於組合療法之 治療劑的實例更詳細地描述於下文關於本文所述之抗體之用途部分中。
在一些實施例中，本文所揭示之治療組合物可包括用於治療癌症之其他化合物、藥物及/或藥劑。此類化合物、藥物及/或藥劑可包括例如化學療法藥物、小分子藥物或刺激對既定癌症之免疫反應的抗體。在一些情況下，治療組合物可包括例如以下中之一或多者；抗-CTLA-4抗體、抗-PD-1抗體、抗-PD-L1抗體、抗-CD40抗體、抗-OX40(亦稱為CD134、TNFRSF4、ACT35及/或TXGP1L)抗體、抗-LAG-3抗體、抗-CD73抗體、抗-CD137抗體、抗-CD27抗體、抗-CSF-1R抗體、TLR促效劑或IDO或TGFβ之小分子拮抗劑。
如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。較佳地，載劑適用於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊椎或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。視投與途徑而定，活性化合物(亦即抗體、免疫結合物或雙特異性分子)可以材料塗佈以保護化合物避免酸作用及其他可使化合物失活之天然條件影響。
本文所述之醫藥化合物可包括一或多種醫藥學上可接受之鹽。「醫藥學上可接受之鹽」係指保留母體化合物之所需生物活性且不會賦予任何非所需毒理學作用之鹽(參見例如Berge,S.M.等人，(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。此類鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括衍生自無毒無機酸之鹽，諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及其類似物；以及衍生自無毒有機酸之鹽，諸如脂族單羧酸及脂族二羧酸、經苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸及其類似物。鹼加成鹽包括衍生自鹼土金屬之鹽，諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物；以及衍生自無毒有機胺之鹽，諸如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基還原葡糖胺、氯普魯卡因、膽鹼、 二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因(procaine)及其類似物。
本文所述之醫藥組合物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化劑。醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物；(2)油溶性抗氧化劑，諸如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基甲氧苯(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及其類似物；及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。
可在本文所述之醫藥組合物中採用的適合水性及非水性載劑之實例包括水、乙醇、多元醇(諸如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。可例如藉由使用包衣材料(諸如卵磷脂)，在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。
此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。預防微生物之存在可藉由滅菌程序(上述)及藉由包括各種抗細菌及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及其類似物)來確保。亦可需要在組合物中包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，可注射醫藥形式之延長吸收可藉由包括延遲吸收之試劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。
醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。此類介質及試劑用於醫藥活性物質之用途為此項技術中熟知。除非任何習知介質或試劑與活性化合物不相容，否則涵蓋其用於本文所述之醫藥組合物中。亦可將補充活性化合物併入組合物中。
治療組合物通常必須在製造及儲存條件下無菌且穩定。組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或適合於高藥物濃度之其他有序結 構。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物之溶劑或分散介質。可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣，在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持溶液之適當流動性。在許多情況下，組合物中將較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來達成。
無菌可注射溶液可藉由視需要將所需量活性化合物與上文所列一種成分或成分組合併入適當溶劑中，繼而滅菌微過濾來製備。一般而言，分散液藉由將活性化合物併入含有鹼性分散介質及所需上列其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其由其先前無菌過濾溶液得到活性劑加任何額外所需成分之粉末。
可與載劑物質組合以產生單一劑型的活性成分之量將視所治療之個體及特定投藥模式而變化。可與載劑材料組合以製造單一劑型的活性成分之量一般將為產生治療作用之組合物的量。一般而言，在100%中，此量將在約0.01%至約99%之活性成分、較佳約0.1%至約70%、最佳約1%至約30%之活性成分範圍內，與醫藥學上可接受之載劑組合。
調節劑量方案以得到最佳所需反應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單一藥團，可隨時間投與若干分次劑量，或可依治療情況之緊急性所指示按比例減少或增加劑量。就易投藥性及劑量之均一性而言，將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文所使用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療之個體的物理離散單元；各單元含有與所需醫藥載劑結合，經計算以產生所需治療效果之預定量活性化合物。本文所述之單位劑型之規格係由以下指定且直接視以下而 定：(a)活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療作用，及(b)用於治療個體過敏性之此類活性化合物之混配技術中的固有限制。
為投與抗體，劑量在每公斤宿主體重約0.0001至100mg範圍內，且更通常在0.01至5mg範圍內。舉例而言，劑量可為每公斤體重0.3mg、每公斤體重1mg、每公斤體重3mg、每公斤體重5mg或每公斤體重10mg或在1-10mg/kg範圍內。一種示例性治療方案需要每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、一月一次、每3個月一次或每三至6個月一次投與。在一個較佳實施例中，本發明之抗-TIGIT抗體每兩週投與。本文所述之抗-TIGIT抗體的其他較佳劑量方案包括經由靜脈內投與每公斤體重1mg、每公斤體重3mg或每公斤體重5mg，同時使用以下給藥時程中之一者給予抗體：(i)每四週六劑，接著每三個月；(ii)每三週；(iii)每三週每公斤體重3mg體重一次，接著每公斤體重1mg。
在一些方法中，同時投與具有不同結合特異性之兩種或兩種以上單株抗體，在此情況下，所投與之各抗體之劑量在所指示之範圍內。治療性抗體通常在多個時機投與。單次劑量之間的時間間隔可為例如每週、每月、每三個月或每年。時間間隔亦可為不規律的，如藉由量測患者中針對標靶抗原之抗體的血液含量所指示。在一些方法中，調節劑量以達到約1-1000μg/ml之血漿抗體濃度，且在一些方法中達到約25-300μg/ml。
或者，抗體可以持續釋放調配物之形式投與，在此情況下，需要較低投藥頻率。劑量及頻率視患者中抗體之半衰期變化。一般而言，人類抗體展示最長半衰期，接著為人類化抗體、嵌合抗體及非人類抗體。投藥劑量及頻率可視治療是預防還是治療而變化。在預防性應用中，在長時間段內，以相對不頻繁之間隔時間投與相對低之劑量。一些患者在其餘生中繼續接受治療。在治療性應用中，有時需要 以相對較短之時間間隔投與相對較高之劑量，直至疾病之進展降低或終止，且較佳直至患者展示疾病之症狀部分或完全改善。此後，患者可視情況投與預防方案，不過在許多免疫-腫瘤學適應症中持續治療為不必要的。
本文所述之醫藥組合物中活性成分之實際劑量可變化以便獲得有效達成特定患者、組合物及投與模式之所要治療反應而對患者無毒性的活性成分之量。所選劑量將視多種藥物動力學因素而定，包括本文所述之具體組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投與途徑、投與時間、所用具體化合物之排泄速率、治療持續時間、與所用具體化合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、整體健康及先前病史，以及醫學技術中熟知之類似因素。
「治療有效劑量」之本文所述之抗-TIGIT抗體較佳使得疾病症狀之嚴重程度降低、疾病無症狀期之頻率或持續時間增加或預防疾病病痛所致之損傷或失能。在癌症之情況下，治療有效劑量較佳防止與癌症相關之身體症狀進一步惡化。癌症之症狀為此項技術中熟知且包括例如異常痣特徵；痣外觀改變，包括不對稱性、邊界、顏色及/或直徑；新的有色皮膚區域；異常痣；指甲下區域變暗；乳房結塊；乳頭改變；乳房囊腫；乳房疼痛；死亡；重量減輕；無力；過度疲乏；難以進食；食慾不振；慢性咳嗽；呼吸困難加重；咳血、尿血、便血、噁心、嘔吐、肝癌轉移、肺癌轉移、骨骼癌轉移、腹痛下墮、腹脹、腹膜腔液、陰道出血、便秘、腹部膨脹、結腸穿孔、急性腹膜炎(感染、發熱、疼痛)、疼痛、吐血、大量出汗、發熱、高血壓、貧血、腹瀉、黃疸、眩暈、發冷、肌肉痙攣、結腸癌轉移、肺癌轉移、膀胱癌轉移、肝癌轉移、骨骼癌轉移、腎癌轉移及胰臟癌轉移、吞咽困難及其類似症狀。可在第一次投與本發明之抗-huTIGIT mAb之後很快 觀測到治療功效，或其可僅僅在一段時間及/或一系列劑量之後觀測到。此類延遲功效僅僅可在若干月治療、長達6、9或12個月之後觀測到。按照一些免疫-腫瘤學藥劑顯示之延遲功效，不應過早決定本發明之抗-huTIGIT mAb缺乏治療功效。
治療有效劑量可防止或延遲癌症發作，諸如當存在早期或初始疾病徵象時可為所希望的。癌症診斷中利用之實驗室測試包括化學反應(包括量測TIGIT含量)、血液學、血清學及放射學。因此，監測以上任一者之任何臨床或生物化學分析可用於確定具體治療是否為治療癌症之治療有效劑量。一般技術者將能夠基於諸如個體體型、個體症狀之嚴重程度及所選特定組合物或投與途徑之因素來確定該等量。
本文所述之組合物可經由一或多種投藥途徑，使用此項技術中已知之多種方法中之一或多者來投與。如熟習此項技術者應瞭解，投與途徑及/或投與模式將視所要結果而變化。本文所述之抗體的較佳投藥途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、脊椎或其他非經腸投藥途徑，例如藉由注射或輸注。如本文所用，片語「非經腸投與」意指除經腸及局部投與以外通常藉由注射進行之投與模式，且包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。
或者，本文所述之抗體可經由非腸胃外途徑投與，諸如局部、表皮或黏膜投藥途徑，例如鼻內、經口、經陰道、經直腸、舌下或局部。
活性化合物可與將保護化合物免於快速釋放之載劑一起製備，該等載劑諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼劑及微膠囊化傳遞系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此 類調配物之許多方法已獲得專利或一般為熟習此項技術者已知。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
治療組合物可用此項技術中已知之醫療裝置投與。舉例而言，在一個較佳實施例中，本文所述之治療組合物可用無針皮下注射裝置投與，諸如美國專利第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號或第4,596,556號中所揭示之裝置。熟知適用於本文所述之抗-TIGIT抗體的插入物及模組之實例包括：美國專利第4,487,603號，其揭示以控制速率分配藥物治療之可植入微輸注泵；美國專利第4,486,194號，其揭示用於經由皮膚投與藥劑之治療裝置；美國專利第4,447,233號，其揭示用於以精確輸注速率傳遞藥物治療之藥物治療輸注泵；美國專利第4,447,224號，其揭示用於連續藥物傳遞之可變流率可植入輸注設備；美國專利第4,439,196號，其揭示具有多腔室隔室之滲透藥物傳遞系統；以及美國專利第4,475,196號，其揭示滲透藥物傳遞系統。此等專利以引用的方式併入本文中。許多其他此類插入物、傳遞系統及模組為熟習此項技術者已知的。
在某些實施例中，本文所述之抗-TIGIT抗體可經調配以確保恰當活體內分佈。舉例而言，血腦障壁(BBB)排除多種高度親水性化合物。為確保本文所述之治療化合物跨過BBB(必要時)，其可例如在脂質體中調配。關於製造脂質體之方法，參見例如美國專利第4,522,811號；第5,374,548號；及第5,399,331號。脂質體可包含選擇性輸送至特定細胞或器官中之一或多個部分，由此增強靶向藥物傳遞(參見例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性靶向部分包括葉酸鹽或生物素(參見例如頒予Low等人之美國專利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun. 153：1038)；抗體(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；界面活性劑蛋白A受體(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；亦參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
X.用途及方法
本文所述之抗體、抗體組合物及方法具有大量活體外及活體內效用，包括例如藉由阻斷TIGIT信號傳導或偵測TIGIT增強免疫反應。在一個較佳實施例中，本文所述之抗體為人類或人類化抗體。舉例而言，本文所述之抗-TIGIT抗體可投與培養、活體外或離體之細胞，或投與例如活體內人類個體，以增強在多種疾病中之免疫性。因此，本文提供改善個體中之免疫反應的方法，其包含向該個體投與本文所述之抗體或其抗原結合片段，以增強、刺激或上調個體中之免疫反應。
較佳個體包括將需要增強免疫反應之人類患者。該等方法尤其適合於治療患有可藉由加強免疫反應(例如T細胞介導之免疫反應)治療之病症的人類患者。在一特定實施例中，該等方法尤其適合於活體內治療癌症。為實現抗原特異性之免疫性增強，可投與本文所述之抗-TIGIT抗體以及相關抗原或抗原已存在於待治療之個體(例如負載腫瘤或負載病毒之個體)。當針對TIGIT之抗體與另一藥劑一起投與時，兩者可分開或同時投與。
亦涵蓋用於偵測樣品中人類TIGIT抗原之存在或量測人類TIGIT抗原之量的方法，其包含使該樣品及對照樣品與特異性結合於人類TIGIT之人類單株抗體或其抗原結合片段在允許抗體或其片段與人類TIGIT之間形成複合物的條件下接觸。接著偵測複合物之形成，其中 樣品與對照樣品相比的複合物形成差異指示樣品中存在人類TIGIT抗原。此外，本文所述之抗-TIGIT抗體可用於經由免疫親和力純化來純化人類TIGIT。
假定本文所述之抗-TIGIT抗體能夠阻斷T細胞反應，例如抗原特異性T細胞反應之抑制或共抑制，本文提供使用本文所述之抗體刺激、增強或上調抗原特異性T細胞反應，例如抗腫瘤T細胞反應之活體外及活體內方法。在某些實施例中，亦提供CD3刺激(例如藉由與表現膜CD3之細胞共培育)，該刺激可與抗-TIGIT抗體治療同時、在抗-TIGIT抗體治療前或後提供。舉例而言，本文提供增強抗原特異性T細胞反應之方法，其包含使該T細胞與本文所述之抗-TIGIT抗體及視情況與CD3接觸，使得抗原特異性T細胞反應例如藉由移除TIGIT介導之抑制作用而增強。抗原特異性T細胞反應之任何適合指示物可用於量測抗原特異性T細胞反應。此類適合指示物之非限制性實例包括在抗體存在下增加T細胞增殖及/或在抗體存在下增加細胞因子產生。在一個較佳實施例中，增強抗原特異性T細胞之介白素-2及/或干擾素-γ產生。
進一步涵蓋增強個體中免疫反應(例如抗原特異性T細胞反應)之方法，其包含向所述個體投與本文所述之抗-TIGIT抗體使得個體中免疫反應(例如抗原特異性T細胞反應)得到增強。在一個較佳實施例中，個體為負載腫瘤之個體且針對腫瘤之免疫反應得到增強。腫瘤可為實體腫瘤或液體腫瘤，例如血液惡性病。在某些實施例中，腫瘤為免疫原性腫瘤。在某些實施例中，細胞為非免疫原性。在某些實施例中，腫瘤為PD-L1陽性。在某些實施例中，腫瘤為PD-L1陰性。個體亦可為負載病毒之個體且針對病毒之免疫反應得到增強。
進一步提供抑制個體中之腫瘤細胞生長的方法，其包含向該個體投與本文所述之抗-TIGIT抗體，使得個體中腫瘤生長得到抑制。亦 提供治療個體之慢性病毒感染之方法，其包含向該個體投與本文所述之抗-TIGIT抗體，使得個體之慢性病毒感染得到治療。
本文中亦涵蓋用於耗盡來自患有腫瘤，例如癌性腫瘤之個體的腫瘤微環境之Treg細胞的方法，其包含向該個體投與治療有效量之包含刺激腫瘤微環境中Treg細胞耗盡之Fc的本文所述之抗-TIGIT抗體。Fc可例如為具有效應功能或諸如結合之效應功能增強或與一或多種活化Fc受體之結合增強的Fc。在一個較佳實施例中，在不顯著耗盡或抑制腫瘤微環境中Teff下且在不顯著耗盡或抑制腫瘤微環境外之Teff細胞及Treg細胞下發生Treg耗盡。在某些實施例中，例如在腫瘤微環境中，個體之Treg細胞上TIGIT含量比Teff細胞上高。在某些實施例中，抗-TIGIT抗體可耗盡腫瘤中之Treg及/或腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)中之Treg。舉例而言，在CT26腫瘤模型中，格式化為小鼠IgG2a(其顯示效應功能)之抗小鼠TIGIT抗體部分耗盡Treg與CD8+ T細胞，但未耗盡CD4+ T細胞。格式化為小鼠IgG1 D265A之無效應對應體抗-TIGIT抗體未耗盡T細胞。當考慮使用具有效應功能還是無效應抗-TIGIT抗體時，必須考慮可增強抗腫瘤免疫反應之Treg耗盡與將消除一些實際上殺死腫瘤細胞所需之細胞的CD8+ T細胞耗盡之間的權衡。雖然可預期Treg之耗盡增強抗腫瘤活性，但近期研究已證實TIGIT+ Treg上TIGIT之接合促進Treg細胞介導之Teff細胞增殖遏制(Joller等人(2014)Immunity 40：569)，此表明TIGIT信號傳導之阻斷(例如使用本發明之拮抗劑抗-TIGIT抗體)亦可增強抗腫瘤活性。因此，使用缺乏效應功能之拮抗劑抗-TIGIT抗體可為最有效的，其i)阻斷Treg中之TIGIT信號傳導，因此降低其免疫抑制活性；ii)藉由阻斷TIGIT抑制作用，同時避免其效應功能介導之耗盡，活化抗腫瘤CD8+ T細胞；及iii)藉由使DNAM結合於否則將由TIGIT結合之PVR(且藉由減少直接TIGIT-DNAM相互作用)，增強DNAM介導之活化(Johnston等人(2014)Cancer Cell 26：923)。
在某些實施例中，抗-TIGIT抗體作為輔助療法給予個體。相對於當前標準照護療法，用抗-TIGIT抗體治療患有癌症之個體可產生長期耐久的反應；至少1年、2年、3年、4年、5年、10年或更多年之長期存活、至少1年、2年、3年、4年、5年或10年或更多年之無復發存活。在某些實施例中，用抗-TIGIT抗體治療患有癌症之個體防止癌症復發或癌症延遲復發例如1年、2年、3年、4年、5年或10年或更多年。抗-TIGIT治療可用作一線或二線治療。
以下進一步詳細論述此等方法及本文所述之其他方法。
癌症
藉由抗-TIGIT抗體阻斷經由TIGIT之PVR/連接素-2信號傳導可增強患者中對癌細胞之免疫反應。本文提供用於治療患有癌症之個體的方法，其包含向該個體投與本文所述之抗-TIGIT抗體，使得個體經治療，例如使得癌性腫瘤之生長得到抑制或減少及/或腫瘤消退。可單獨使用抗-TIGIT抗體以抑制癌性腫瘤生長。或者，抗-TIGIT抗體可結合另一藥劑，例如如下所述之其他免疫原性藥劑、標準癌症治療或其他抗體使用。亦提供與PD-1抑制劑，諸如抗-PD-1或抗-PD-L1抗體組合。
因此，本文提供例如藉由抑制腫瘤細胞生長治療個體癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之本文所述之抗-TIGIT抗體，例如15A6、22G2、11G11或10D7或其抗原結合片段。抗體可為人類抗-TIGIT抗體(諸如本文所述之任一人類抗-huTIGIT抗體)，或其可為嵌合或人類化非人類抗-huTIGIT抗體，例如與至少一種本文所述之抗-TIGIT抗體競爭結合或結合於與至少一種本文所述之抗-TIGIT抗體相同之抗原決定基的嵌合或人類化抗-TIGIT抗體。
生長可使用本發明抗體來抑制之癌症包括通常回應於免疫療法 之癌症。用於治療之癌症之非限制性實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀非小細胞肺癌(NSCLC)、非NSCLC、神經膠瘤、腸胃癌、腎癌(例如透明細胞癌)、卵巢癌、肝癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌(例如腎細胞癌(RCC))、前列腺癌(例如激素難治性前列腺腺癌)、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、胰臟癌、神經膠母細胞瘤(多形性膠質母細胞瘤)、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝瘤、乳癌、結腸癌及頭頸癌(或癌瘤)、胃癌、生殖細胞腫瘤、兒科肉瘤、鼻腔鼻竇自然殺手、黑色素瘤(例如轉移性惡性黑色素瘤，諸如皮膚或眼內惡性黑色素瘤)、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門區癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童實體腫瘤、尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊椎軸腫瘤、腦幹神經膠瘤、垂體腺瘤、卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘發之癌症(包括藉由石棉誘發之癌症)、病毒相關癌症(例如人類乳頭狀瘤病毒(HPV)相關腫瘤)及源自於兩種主要血細胞譜系中之任一者，亦即骨髓細胞株(其產生粒細胞、紅血球、凝血細胞、巨噬細胞及肥大細胞)或淋巴性細胞株(其產生B、T、NK及漿細胞)的血液科惡性疾病，諸如所有類型白血病、淋巴瘤及骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴細胞性及/或骨髓性白血病，諸如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)及慢性骨髓性白血病(CML)、未分化AML(M0)、骨髓母細胞白血病(M1)、骨髓母細胞白血病(M2；細胞成熟)、前髓細胞性白血病(M3或M3變異體[M3V])、骨髓單核細胞性白血病(M4或嗜伊紅血球增多之M4變異體[M4E])、單核細胞性白血病(M5)、紅白血病(M6)、巨核母細胞白血病(M7)、孤立性顆粒球性肉瘤及綠色瘤；淋巴瘤，諸如霍奇 金氏淋巴瘤(HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞樣淋巴瘤、單核細胞樣B細胞淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤、多形性(例如Ki 1+)大細胞淋巴瘤、成人T細胞淋巴瘤/白血病、套細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、腸T細胞淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、前驅T-淋巴母細胞性淋巴瘤、T-淋巴母細胞性；以及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、周圍T細胞淋巴瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤、移植後淋巴組織增生病症、真組織細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤(LBL)、淋巴性譜系之造血腫瘤、急性淋巴母細胞白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、彌漫性組織細胞淋巴瘤(DHL)、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前驅B-淋巴母細胞性淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(CTLC)(亦稱作蕈樣真菌病或塞紮萊症候群(Sezary syndrome))及具有瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症之淋巴漿細胞樣淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，諸如IgG骨髓瘤、輕鏈骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、鬱積型骨髓瘤(亦稱作惰性骨髓瘤)、孤立性漿細胞瘤及多發性骨髓瘤、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、毛狀細胞淋巴瘤；骨髓譜系之造血腫瘤、間質來源腫瘤(包括纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤)；精原細胞瘤、畸胎癌、中樞及周圍神經腫瘤(包括星形細胞瘤)、神經鞘瘤；間質來源腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；以及其他腫瘤，包括黑色素瘤、著色性乾皮病、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡癌及畸胎癌、淋巴譜系之造血腫瘤，例如T細胞及B細胞腫瘤，包括(但不限於)T細胞病症，諸如T-前淋巴細胞性白血病(T-PLL)，包括小細胞及腦狀細胞類型；大顆粒狀淋巴細胞白血病(LGL)，較佳T細胞類型；及T-NHL肝脾淋巴瘤；周圍/胸腺後T細胞淋巴瘤(多形性及免疫母細胞亞型)；血管中心性(經鼻)T細胞淋巴瘤；頭或頸癌、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌；急性骨髓 淋巴瘤以及該等癌症之任何組合。本文所描述之方法亦可用於治療轉移性癌症、難治性癌症(例如先前免疫療法，例如用阻斷CTLA-4或PD-1抗體難治之癌症)及復發性癌症。
在癌症疫苗策略中，抗-TIGIT抗體可作為單一療法投與，或作為唯一免疫刺激療法投與，或其可與免疫原性劑組合，該免疫原性劑諸如癌細胞、純化腫瘤抗原(包括重組蛋白質、肽及碳水化合物分子)或經編碼免疫刺激細胞因子之基因轉染之細胞(He等人(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可使用之腫瘤疫苗之非限制性實例包括黑素瘤抗原之肽，諸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MARTI及/或酪胺酸酶之肽，或經轉染以表現細胞因子GM-CSF之腫瘤細胞。
已設計出針對腫瘤之許多實驗性疫苗接種策略(參見Rosenberg,S.,2000,Development of Cancer Vaccines,ASCO Educational Book Spring：60-62；Logothetis,C.,2000,ASCO Educational Book Spring：300-302；Khayat,D.2000,ASCO Educational Book Spring：414-428；Foon,K.2000,ASCO Educational Book Spring：730-738；亦參見Restifo,N.及Sznol,M.,Cancer Vaccines，第61章，第3023-3043頁，DeVita等人(編輯)，1997,Cancer：Principles and Practice of Oncology,第5版)。在此等策略之一中，使用自體或同種異體腫瘤細胞製備疫苗。已顯示此等細胞疫苗在腫瘤細胞經轉導以表現GM-CSF時最有效。已顯示GM-CSF為用於腫瘤疫苗接種之抗原呈遞之強活化劑(Dranoff等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：3539-43)。
各種腫瘤中基因表現及大規模基因表現模式之研究已產生所謂腫瘤特異性抗原之定義(Rosenberg,S A(1999)Immunity 10：281-7)。在許多情況下，此等腫瘤特異性抗原為腫瘤中及出現腫瘤之細胞中表現的分化抗原，例如黑素細胞抗原gp100、MAGE抗原及Trp-2。更重要地，許多此等抗原可展示為宿主中發現之腫瘤特異性T細胞的標 靶。TIGIT抑制可與表現於腫瘤中之一批重組蛋白質及/或肽結合使用以產生針對此等蛋白質之免疫反應。此等蛋白質通常由免疫系統視為自抗原且因此對其具耐受性。腫瘤抗原可包括蛋白質端粒酶，其為合成染色體端粒所需且在超過85%人類癌症中及僅僅有限數目之身體組織中表現(Kim等人(1994)Science 266：2011-2013)。腫瘤抗原亦可為由於改變蛋白質序列或在兩個無關序列之間形成融合蛋白(亦即費城染色體(Philadelphia chromosome)中之bcr-abl)之體細胞突變而在癌細胞中表現之「新抗原」或B細胞腫瘤之個體基因型。
其他腫瘤疫苗可包括來自人類癌症中所牽涉之病毒的蛋白質，該等病毒為諸如人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV及HCV)及卡堡氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可與TIGIT抑制結合使用之腫瘤特異性抗原的另一形式為自腫瘤組織自身經分離經純化熱休克蛋白質(HSP)。此等熱休克蛋白質含有來自腫瘤細胞之蛋白質之片段且此等HSP高效傳遞至抗原呈遞細胞以引發腫瘤免疫性(Suot,R及Srivastava,P(1995)Science 269：1585-1588；Tamura等人(1997)Science 278：117-120)。
樹突狀細胞(DC)為可用於引發抗原特異性反應之強力抗原呈遞細胞。DC可離體產生且負載有各種蛋白質及肽抗原以及腫瘤細胞提取物(Nestle等人(1998)Nature Medicine 4：328-332)。DC亦可藉由基因方法轉導以亦表現此等腫瘤抗原。DC亦已出於免疫接種目的而直接與腫瘤細胞融合(Kugler等人(2000)Nature Medicine 6：332-336)。作為疫苗接種之方法，DC免疫接種可與TIGIT阻斷有效組合以活化(發揮)更強力之抗腫瘤反應。
TIGIT抑制亦可與標準癌症治療(例如手術、放射線及化學療法)組合。TIGIT抑制可有效地與化學治療方案組合。在此等情形下，可減少所投與之化學治療劑的劑量(Mokyr等人(1998)Cancer Research 58：5301-5304)。此類組合之一實例為抗-TIGIT抗體與達卡巴嗪組合用於治療黑色素瘤。此類組合之另一實例為抗-TIGIT抗體與介白素-2(IL-2)組合用於治療黑色素瘤。支持TIGIT抑制與化學療法組合使用之科學基本原理在於作為大部分化學治療化合物之細胞毒性作用結果的細胞死亡應引起抗原呈遞路徑中腫瘤抗原之含量增加。可經由細胞死亡而與TIGIT抑制產生協同作用的其他組合療法為放射線、手術及激素去除。此等方案中之每一者在宿主中產生腫瘤抗原源。血管生成抑制劑亦可與TIGIT抑制組合。抑制血管生成引起腫瘤細胞死亡，從而可將腫瘤抗原饋至宿主抗原呈遞路徑中。
本文所述之抗-TIGIT抗體亦可與將表現Fcα或Fcγ受體之效應細胞靶向腫瘤細胞之雙特異性抗體組合使用(參見例如美國專利第5,922,845號及第5,837,243號)。雙特異性抗體可用於靶向兩種各別抗原。舉例而言，抗-Fc受體/抗腫瘤抗原(例如Her-2/neu)雙特異性抗體已用於將巨噬細胞靶向腫瘤位點。此靶向可更有效地活化腫瘤特異性反應。此等反應之T細胞臂藉由抑制TIGIT來強化。或者，可藉由使用結合於腫瘤抗原及樹突狀細胞特異性細胞表面標記物之雙特異性抗體將抗原直接傳遞至DC。
腫瘤藉由多種機制逃避宿主免疫監視。許多此等機制可藉由腫瘤表現之免疫抑制蛋白質的失活來解決。此等尤其包括TGF-β(Kehrl等人(1986)J.Exp.Med.163：1037-1050)、IL-10(Howard及O'Garra(1992)Immunology Today 13：198-200)及Fas配位體(Hahne等人(1996)Science 274：1363-1365)。針對此等實體中之每一者的抗體可與抗-TIGIT抗體組合使用，以抵消免疫抑制劑之影響且促進宿主之腫瘤免疫反應。
可活化宿主免疫反應之其他抗體可與抗-TIGIT抗體組合使用。此等藥劑包括樹突狀細胞表面上活化DC功能及抗原呈遞的分子。抗- CD40抗體能夠有效取代T細胞輔助活性(Ridge等人(1998)Nature 393：474-478)且可與抗-TIGIT抗體結合使用。活化諸如OX-40(Weinberg等人(2000)Immunol 164：2160-2169)、CD137/4-IBB(Melero等人(1997)Nature Medicine 3：682-685(1997))及ICOS(Hutloff等人(1999)Nature 397：262-266)之T細胞共刺激分子之抗體亦可增加T細胞活化程度。PD-1或PD-L1或CTLA-4之抑制劑(例如美國專利第5,811,097號)亦可與抗-TIGIT抗體結合使用。
骨髓移植目前用於治療多種造血來源之腫瘤。雖然移植物抗宿主病為此治療之後果，但可自移植物抗腫瘤反應獲得治療效益。TIGIT抑制可用於增加供體移植之腫瘤特異性T細胞的有效性。
亦存在涉及抗原特異性T細胞之離體活化及擴增及將此等細胞授受性轉移至受體中以便刺激針對腫瘤之抗原特異性T細胞的數個實驗性治療方案(Greenberg及Riddell(1999)Science 285：546-51)。此等方法亦可用於活化針對諸如CMV之感染物的T細胞反應。在抗-TIGIT抗體存在下之離體活化可增加授受性轉移T細胞之頻率及活性。
慢性病毒感染
在另一態樣中，本文所述之本發明提供一種治療個體之感染性疾病的方法，其包含向該個體投與抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段，使得個體針對該感染性疾病進行治療。
類似於如上文所論述其應用於腫瘤，抗體介導之TIGIT抑制可單獨使用，或作為佐劑，與疫苗組合使用，以增強對病原體、毒素及自抗原之免疫反應。此治療方法可特別適用之病原體之實例包括(但不限於)HIV、肝炎(A、B及C)、流感、疱疹、梨形鞭毛蟲屬(Giardia)、瘧疾、利什曼原蟲、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。TIGIT抑制特別適用於針對諸如HIV之在感染過程中呈現改變之抗原的因子的感染。此等新穎抗原決定基在 抗-人類TIGIT抗體投與時識別為外來物，因此引起強T細胞反應。
引起可藉由本文所述之方法治療之感染的病原性病毒的一些實例包括HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II及CMV、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黃病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、科沙奇病毒(coxsackie virus)、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳突狀瘤病毒、軟疣病毒(molluscum virus)、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒及蟲媒病毒腦炎病毒。
引起可藉由本文所述之方法治療之感染的病原性細菌的一些實例包括衣原體(chlamydia)、立克次體細菌、分枝桿菌、葡萄狀球菌、鏈球菌、肺炎球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)及淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙雷氏菌屬(serratia)、假單胞菌(pseudomonas)、軍團菌屬(legionella)、白喉(diphtheria)、沙門氏菌(salmonella)、桿菌(bacilli)、霍亂(cholera)、破傷風(tetanus)、肉毒中毒(botulism)、炭疽病(anthrax)、瘟疫(plague)、鉤端螺旋體病(leptospirosis)及萊姆病細菌(Lymes disease bacteria)。
引起可藉由本文所述之方法治療之感染的病原性真菌的一些實例包括念珠菌屬(白色念珠菌(albicans)、克魯斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、麴菌屬(菸麯黴(fumigatus)、黑麴菌(niger)等)、毛黴屬(Mucorales)(毛黴菌(mucor)、犁頭黴(absidia)、根黴菌屬(rhizophus))、申克氏胞絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及莢膜組織胞漿菌 (Histoplasma capsulatum)。
引起可藉由本文所述之方法治療之感染的病原性寄生蟲的一些實例包括溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)、大腸纖毛蟲(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴原蟲(Naegleriafowleri)、棘阿米巴蟲屬(Acanthamoeba sp.)、蘭伯氏梨形鞭毛蟲屬(Giardia lambia)、隱胞子蟲屬(Cryptosporidium sp.)、肺炎肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、微小巴倍蟲(Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondi)、巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有上述方法中，TIGIT抑制可與其他形式之免疫療法，諸如細胞因子治療(例如干擾素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或雙特異性抗體療法組合，此增強腫瘤抗原呈遞(參見例如Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak(1994)Structure 2：1121-1123)。
疫苗佐劑
本文所述之抗-TIGIT抗體可藉由共同投與抗-TIGIT抗體與相關抗原(例如疫苗)用於增強抗原特異性免疫反應。因此，本文提供增強個體中對抗原之免疫反應的方法，其包含向該個體投與：(i)抗原；及(ii)抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段，使得個體中對抗原之免疫反應得到增強。抗原可為例如腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或來自病原體之抗原。此類抗原之非限制性實例包括以上部分中所論述之抗原，諸如上文所論述之腫瘤抗原(或腫瘤疫苗)，或來自上文所述之病毒、細菌或其他病原體的抗原。
在某些實施例中，代替抗-TIGIT抗體或除抗-TIGIT抗體之外，包含抗-TIGIT抗體結合之抗原決定基的肽或融合蛋白用作疫苗。
活體內及活體外投與本文所述之抗體組合物(例如人類單株抗體、多特異性及雙特異性分子及免疫結合物)的適合途徑為此項技術中所熟知，且可由一般技術者選擇。舉例而言，抗體組合物可藉由注射(例如靜脈內或皮下)投與。所用分子之適合劑量將視個體之年齡及體重以及抗體組合物之濃度及/或調配而定。
如先前所描述，本文所述之抗-TIGIT抗體可與一或多種其他治療劑(例如細胞毒性劑、放射毒性劑或免疫抑制劑)一起共同投與。抗體可連接於藥劑(以免疫複合物形式)或可與藥劑分開投與。在後一情況(分開投與)下，可在藥劑之前，之後或同時投與抗體，或可與其他已知療法(例如抗癌療法，例如放射線)共同投與。此類治療劑尤其包括抗贅生性劑，諸如小紅莓(阿德力黴素(adriamycin))、順鉑博萊黴素硫酸鹽(cisplatin bleomycin sulfate)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、達卡巴嗪及環磷醯胺羥基脲(cyclophosphamide hydroxyurea)，其本身僅在對患者具毒性或亞毒性之含量下有效。順鉑每四週一次以100mg/ml劑量靜脈內投與，且阿德力黴素每21天一次以60-75mg/ml劑量靜脈內投與。本文所述之抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段與化學治療劑共同投與提供經由不同機制起作用，對人類腫瘤細胞產生細胞毒性作用之兩種抗癌劑。此類共同投與可解決因出現耐藥性或腫瘤細胞之抗原性改變而將使其不與肽起反應所引起的問題。
包含本文所述之抗體組合物(例如人類抗體、雙特異性或多特異性分子或免疫結合物)及使用說明書的套組亦在本文所述之範疇內。套組可進一步含有至少一種其他試劑，或一或多種本文所述之其他人類抗體(例如具有結合於TIGIT抗原中不同於第一人類抗體之抗原決定基之互補活性的人類抗體)。套組通常包括指示套組內含物之預期用途的標籤。術語標籤包括在套組上或與套組一起供應或以其他方式伴 隨套組之任何書面或記錄材料。
組合療法
除以上提供之組合療法之外，本文所述之抗-TIGIT抗體亦可用於組合療法，例如用於治療癌症，如下所述。
本發明提供組合療法方法，其中抗-TIGIT抗體與一或多種有效刺激免疫反應，藉此進一步增強、刺激或上調個體中之免疫反應的其他藥劑，例如抗體共同投與。如實例7中所示及圖5A及5B中所示，拮抗劑抗-TIGIT抗體及拮抗劑抗-PD-1抗體投與小鼠對抑制腫瘤生長具有增強之作用。
一般而言，本文所述之抗-TIGIT抗體可與(i)共刺激受體之促效劑及/或(ii)T細胞上抑制信號之拮抗劑組合，其中任一者引起抗原特異性T細胞反應擴增(免疫檢查點調節劑)。大部分共刺激及共抑制分子為免疫球蛋白超家族(IgSF)之成員，且本文所述之抗-TIGIT抗體可與靶向IgSF家族一員之藥劑一起投與以增加免疫反應。結合於共刺激或共抑制受體之膜結合配位體的一個重要家族為B7家族，其包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)及B7-H6。結合於共刺激或共抑制受體之膜結合配位體的另一家族為結合於同源TNF受體家族成員之分子的TNF家族，其包括CD40及CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137/4-1BB、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TLIA、TRAMP/DR3、EDAR、EDA1、XEDAR、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY、NGFR(參見例如Tansey(2009) Drug Discovery Today 00：1)。
T細胞活化亦藉由可溶性細胞因子調控。因此，抗-TIGIT抗體可與以下組合使用：(i)抑制T細胞活化之IgSF家族或B7家族或TNF家族之蛋白質的拮抗劑(或抑制劑或阻斷劑)或抑制T細胞活化之細胞因子(例如IL-6、IL-10、TGF-ß、VEGF或其他免疫抑制細胞因子)的拮抗劑；及/或(ii)IgSF家族、B7家族或TNF家族之刺激受體之促效劑或刺激T細胞活化之細胞因子之促效劑，用於刺激免疫反應，例如用於治療增生性疾病，諸如癌症。
在一個態樣中，T細胞反應可藉由本發明之抗-TIGIT mAb與以下中之一或多者之組合刺激：(i)抑制T細胞活化之蛋白質(例如免疫檢查點抑制劑)，諸如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、半乳糖凝集素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳糖凝集素-1、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1、CD96(WO 2015/024060；Bernhardt等人(2014)Nat.Immunol.15：406)及TIM-4之拮抗劑；及(ii)刺激T細胞活化，諸如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、CD40、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、DR3及CD28H之蛋白質的促效劑。
調節以上蛋白質之一且可與促效劑抗-TIGIT抗體，例如本文所述之抗-TIGIT抗體組合用於治療癌症的示例性藥劑包括：YERVOY®/伊派利單抗或曲美單抗(tremelimumab)(針對CTLA-4)、加利昔單抗(galiximab)(針對B7.1)、OPDIVO®/尼沃單抗/BMS-936558(針對PD-1)、皮立珠單抗(pidilizumab)/CT-011(針對PD-1)、KEYTRUDA®/派立珠單抗/MK-3475(針對PD-1)、AMP224(針對B7-DC/PD-L2)、BMS-936559(針對B7-H1)、MPDL3280A(針對B7-H1)、MEDI-570(針對ICOS)、AMG557(針對B7H2)、MGA271(針對B7H3-WO 11/109400)、IMP321(針對LAG-3)、優瑞路單抗(urelumab)/BMS-663513及PF-05082566(針對CD137/4-1BB)、CDX-1127(針對CD27)、MEDI-6383及MEDI-6469(針對OX40)、RG-7888(針對OX40L-WO 06/029879)、阿塞西普(Atacicept)(針對TACI)、CP-870893(針對CD40)、魯卡木單抗(lucatumumab)(針對CD40)、達西珠單抗(dacetuzumab)(針對CD40)及莫羅莫那-CD3(muromonab-CD3)(針對CD3)。
可與拮抗劑抗-TIGIT抗體組合用於治療癌症之其他分子包括NK細胞上抑制受體之拮抗劑或NK細胞上活化受體之促效劑。舉例而言，拮抗劑抗-TIGT抗體可與KIR拮抗劑(例如利瑞路單抗)組合。
用於組合療法之其他藥劑包括抑制或耗盡巨噬細胞或單核細胞之藥劑，包括(但不限於)CSF-1R拮抗劑，諸如CSF-1R拮抗劑抗體，包括RG7155(WO11/70024、WO11/107553、WO11/131407、WO13/87699、WO13/119716、WO13/132044)或FPA-008(WO11/140249、WO13169264、WO14/036357)。
一般而言，本文所述之拮抗劑抗-TIGIT抗體可與以下中之一或多者一起使用：接合陽性共刺激受體之促效劑、減弱經由抑制受體之信號傳導之阻斷劑及一或多種全身性增加抗腫瘤T細胞頻率之藥劑、戰勝腫瘤微環境內不同免疫抑制路徑(例如阻斷抑制受體接合(例如PD-L1/PD-1相互作用)、耗盡或抑制Treg(例如使用抗-CD25單株抗體(例如達利珠單抗)或藉由離體抗-CD25珠粒耗盡)、抑制代謝酶(諸如IDO)或逆轉/防止T細胞失能或耗盡)之藥劑以及觸發先天性免疫活化及/或腫瘤位點發炎之藥劑。
本文提供用於刺激個體中之免疫反應的方法，其包含向該個體投與拮抗劑抗-TIGIT分子，例如抗體，及一或多種其他免疫刺激抗體，諸如PD-1拮抗劑(例如拮抗劑抗體)、PD-L1拮抗劑(例如拮抗劑抗 體)、CTLA-4拮抗劑(例如拮抗劑抗體)及/或LAG3拮抗劑(例如拮抗劑抗體)，從而刺激個體中免疫反應，例如抑制腫瘤生長或刺激抗病毒反應。在一個實施例中，個體投與拮抗劑抗-TIGIT抗體及拮抗劑抗-PD-1抗體。在一個實施例中，個體投與拮抗劑抗-TIGIT抗體及拮抗劑抗-PD-L1抗體。在一個實施例中，個體投與拮抗劑抗-TIGIT抗體及拮抗劑抗-CTLA-4抗體。在一個實施例中，至少一種其他免疫刺激抗體(例如抗-PD-1、抗-PD-L1、抗-CTLA-4及/或抗-LAG3)為人類抗體。或者，至少一種其他免疫刺激抗體可為例如嵌合或人類化抗體，例如由小鼠抗-PD-1、抗-PD-L1、抗-CTLA-4及/或抗-LAG3抗體製備。
本文提供用於治療過度增生性疾病(例如癌症)之方法，其包含向個體投與拮抗劑抗-TIGIT抗體及拮抗劑PD-1抗體。TIGIT及PD-1在黑色素瘤中共表現(Chauvin等人(2015)J.Clin.Invest.125：2046)，且亦以相對較高水準在來自非小細胞肺癌(NSCLC)及腎細胞癌(RCC)患者之CD8+ TILS上共表現。參見表2(展示對於來自若干患者之樣品，作為總CD3+CD8+ TILS之百分比的TIGIT+/PD-1+細胞之百分比)。
Figure 104143215-A0202-12-0103-2
在某些實施例中，抗-TIGIT抗體以低於治療劑量投與，抗-PD-1抗體以低於治療劑量投與，或兩者以低於治療劑量投與。本文亦提供 用於改變與用免疫刺激劑治療過度增生性疾病相關之不良事件的方法，其包含向個體投與抗-TIGIT抗體及低於治療劑量之抗-PD-1抗體。在某些實施例中，個體為人類。在某些實施例中，抗-PD-1抗體為人類序列單株抗體且抗-TIGIT抗體為人類序列單株抗體，諸如包含本文所揭示之抗體之CDR或可變區的抗體。
在一個實施例中，僅僅選擇患有顯示PVR及/或連接素-2高度表現及PD-L1高度表現之腫瘤的個體進行本發明之抗-TIGIT抗體與PD-1拮抗劑之組合治療。在另一個實施例中，選擇患有顯示PVR及/或連接素-2高度表現但PD-L1表現低之腫瘤的個體進行本發明之抗-TIGIT抗體之單一療法，或本發明之抗-TIGIT抗體與除PD-1拮抗劑外之另一治療劑的組合療法。
在其他實施例中，本發明提供組合療法，其中本發明之抗-TIGIT抗體在用PD-1/PD-L1拮抗劑治療之後投與。在一個實施例中，抗-TIGIT抗體僅僅在用PD-1/PD-L1拮抗劑治療失敗，導致不完全治療反應，或已復發腫瘤或復發(在本文中稱作「PD-1失效」)後投與。在另一個實施例中，篩選此類PD-1失效中之腫瘤用於表現PVR及/或連接素-2且僅僅具有高表現量之腫瘤用抗-TIGIT抗體治療。
適用於本文所描述之方法的PD-1拮抗劑包括(但不限於)配位體、抗體(例如單株抗體及雙特異性抗體)及多價藥劑。在一個實施例中，PD-1拮抗劑為融合蛋白，例如Fc融合蛋白，諸如AMP-244。在一個實施例中，PD-1拮抗劑為抗-PD-1或抗-PD-L1抗體。
一種示例性抗-PD-1抗體為OPDIVO®/尼沃單抗(BMS-936558)或WO 2006/121168中所述之包含抗體17D8、2D3、4H1、5C4、7D3、5F4及4A11之一之CDR或可變區的抗體。在某些實施例中，抗-PD-1抗體為WO2012/145493中描述之MK-3475(KEYTRUDA®/派立珠單抗/以前拉立珠單抗(lambrolizumab))；WO 2012/145493中描述之AMP- 514/MEDI-0680；以及CT-011(皮立珠單抗(pidilizumab)；先前CT-AcTibody或BAT；參見例如Rosenblatt等人(2011)J.Immunotherapy 34：409)。其他已知之PD-1抗體及其他PD-1抑制劑包括WO 2009/014708、WO 03/099196、WO 2009/114335、WO 2011/066389、WO 2011/161699、WO 2012/145493、美國專利第7,635,757號及第8,217,149號及美國專利公開案第2009/0317368號中所述之PD-1抗體及PD-1抑制劑。亦可使用WO2013/173223中所揭示之任一抗-PD-1抗體。與此等抗體之一競爭結合及/或結合於PD-1上與此等抗體之一相同之抗原決定基的抗-PD-1抗體亦可用於組合治療中。
本文提供用於治療過度增生性疾病(例如癌症)之方法，其包含向個體投與拮抗劑抗-TIGIT抗體及拮抗劑PD-L1抗體。在某些實施例中，抗-TIGIT抗體以低於治療劑量投與，抗-PD-L1抗體以低於治療劑量投與，或兩者以低於治療劑量投與。本文提供用於改變與用免疫刺激劑治療過度增生性疾病相關之不良事件的方法，其包含向個體投與抗-TIGIT抗體及低於治療劑量之抗-PD-L1抗體。在某些實施例中，個體為人類。在某些實施例中，抗-PD-L1抗體為人類序列單株抗體且抗-TIGIT抗體為人類序列單株抗體，諸如包含本文所揭示之抗體之CDR或可變區的抗體。
在一個實施例中，抗-PD-L1抗體為BMS-936559(WO 2007/005874及美國專利第7,943,743號中稱為12A4)、MSB0010718C(WO2013/79174)或包含描述於PCT公開案WO 07/005874及美國專利第7,943,743號中的3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7及13G4之CDR或可變區的抗體。在某一實施例中，抗-PD-L1抗體為MEDI4736(亦稱為抗-B7-H1)或MPDL3280A(亦稱為RG7446)。亦可使用WO2013/173223、WO2011/066389、WO2012/145493、美國專利第7,635,757號及第8,217,149號及美國公開 案第2009/145493號中所揭示之任一抗-PD-L1抗體。與任一此等抗體競爭及/或結合於與任一此等抗體相同之抗原決定基的抗-PD-L1抗體亦可用於組合治療中。
在其他實施例中，本發明之促效劑抗-huCD40抗體與PD-1/PD-L1信號傳導之拮抗劑，諸如PD-1拮抗劑或PD-L1拮抗劑組合，與第三免疫治療劑組合。在一個實施例中，第三免疫治療劑為GITR拮抗劑或OX-40拮抗劑，諸如本文所揭示之抗-GITR或抗-OX40抗體。
在另一態樣中，免疫-腫瘤學藥劑為GITR促效劑，諸如促效GITR抗體。適合之GITR抗體包括例如BMS-986153、BMS-986156、TRX-518(WO06/105021、WO09/009116)及MK-4166(WO11/028683)。
在另一態樣中，免疫-腫瘤學藥劑為IDO拮抗劑。適合之IDO拮抗劑包括例如INCB-024360(WO 2006/122150、WO 07/75598、WO 08/36653、WO 08/36642)、因多莫得(indoximod)或NLG-919(WO 09/73620、WO 09/1156652、WO 11/56652、WO 12/142237)。
本文提供用於治療過度增生性疾病(例如癌症)之方法，其包含向個體投與本文所述之抗-TIGIT抗體及CTLA-4拮抗劑抗體。在某些實施例中，抗-TIGIT抗體以低於治療劑量投與，抗-CTLA-4抗體以低於治療劑量投與，或兩者以低於治療劑量投與。本文提供用於改變與用免疫刺激劑治療過度增生性疾病相關之不良事件的方法，其包含向個體投與抗-TIGIT抗體及低於治療劑量之抗-CTLA-4抗體。在某些實施例中，個體為人類。在某些實施例中，抗-CTLA-4抗體為選自由以下各者組成之群的抗體：YERVOY®(伊派利單抗或抗體10D1，描述於PCT公開案WO 01/14424中)、曲美單抗(tremelimumab)(以前為替西單抗(ticilimumab)、CP-675,206)及以下公開案中描述之抗-CTLA-4抗體：WO 98/42752；WO 00/37504；美國專利第6,207,156號；Hurwitz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(17)：10067-10071；Camacho 等人(2004)J.Clin.Oncology 22(145)：Abstract No.2505(抗體CP-675206)；及Mokyr等人(1998)Cancer Res.58：5301-5304。亦可使用WO2013/173223中所揭示之任一抗-CTLA-4抗體。
本文提供用於治療過度增生性疾病(例如癌症)之方法，其包含向個體投與抗-TIGIT抗體及抗-LAG-3抗體。在其他實施例中，抗-TIGIT抗體以低於治療劑量投與，抗-LAG-3抗體以低於治療劑量投與，或兩者以低於治療劑量投與。本文提供用於改變與用免疫刺激劑治療過度增生性疾病相關之不良事件的方法，其包含向個體投與抗-TIGIT抗體及低於治療劑量之抗-LAG-3抗體。在某些實施例中，個體為人類。在某些實施例中，抗-LAG-3抗體為人類序列單株抗體且抗-TIGIT抗體為人類序列單株抗體，諸如包含本文所揭示之抗體之CDR或可變區的抗體。抗-LAG3抗體之實例包括包含描述於美國專利公開案第US2011/0150892號及WO2014/008218中的抗體25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5之CDR或可變區的抗體。在一個實施例中，抗-LAG-3抗體為BMS-986016。其他技術公認之可使用之抗-LAG-3抗體包括US 2011/007023中所述之IMP731。亦可使用IMP-321。與任一此等抗體競爭及/或結合於與任一此等抗體相同之抗原決定基的抗-LAG-3抗體亦可用於組合治療中。
投與本文所述之抗-TIGIT抗體及一或多種第二標靶抗原(諸如LAG-3及/或CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1)之拮抗劑(例如拮抗劑抗體)可增強患者中對癌細胞之免疫反應。生長可使用本發明抗體來抑制之癌症包括通常回應於免疫療法之癌症。用本發明之組合療法治療之癌症的代表性實例包括上文在論述抗-TIGIT抗體單一療法中特別列出之彼等癌症。
在某些實施例中，本文中論述之治療性抗體之組合可作為醫藥學上可接受之載劑中之單一組合物並行投與，或作為各抗體於醫藥學 上可接受之載劑中之分開組合物並行投與。在另一個實施例中，治療性抗體之組合可依序投與。舉例而言，抗-CTLA-4抗體及抗-TIGIT抗體可依序投與，諸如抗-CTLA-4抗體首先投與，且抗-TIGIT抗體其次投與，或抗-TIGIT抗體首先投與且抗-CTLA-4抗體其次投與。或者或另外，抗-PD-1抗體及抗-TIGIT抗體可依序投與，諸如抗-PD-1抗體首先投與且抗-TIGIT抗體其次投與，或抗-TIGIT抗體首先投與且抗-PD-1抗體其次投與。或者或另外，抗-PD-L1抗體及抗-TIGIT抗體可依序投與，諸如抗-PD-L1抗體首先投與且抗-TIGIT抗體其次投與，或抗-TIGIT抗體首先投與且抗-PD-L1抗體其次投與。或者或另外，抗-LAG-3及抗-TIGIT抗體可依序投與，諸如抗-LAG-3抗體首先投與且抗-TIGIT抗體其次投與，或抗-TIGIT抗體首先投與且抗-LAG-3抗體其次投與。
此外，若依序投與一劑以上組合療法，則依序投與之次序在每個投與時間點可顛倒或保持相同次序，依序投與可與同時投與組合或其任何組合。舉例而言，抗-CTLA-4抗體及抗-TIGIT抗體組合之第一次投與可為同時投與，第二次投與可為抗-CTLA-4抗體首先及抗-TIGIT抗體其次依序投與，且第三次投與可為抗-TIGIT抗體首先及抗-CTLA-4抗體其次依序投與等。或者或另外，抗-PD-1抗體及抗-TIGIT抗體組合之第一次投與可為同時投與，第二次投與可為抗-PD-1抗體首先及抗-TIGIT抗體其次依序投與，且第三次投與可為抗-TIGIT抗體首先及抗-PD-1抗體其次依序投與等。或者或另外，抗-PD-L1抗體及抗-TIGIT抗體組合之第一次投與可為同時投與，第二次投與可為抗-PD-L1抗體首先及抗-TIGIT抗體其次依序投與，且第三次投與可為抗-TIGIT抗體首先及抗-PD-L1抗體其次依序投與等。或者或另外，抗-LAG-3抗體及抗-TIGIT抗體組合之第一次投與可為同時投與，第二次投與可為抗-LAG-3抗體首先及抗-TIGIT抗體其次依序投與，且第三 次投與可為抗-TIGIT抗體首先及抗-LAG-3抗體其次依序投與等。另一代表性給藥流程可包括抗-TIGIT首先及抗-CTLA-4抗體(及/或抗-PD-1抗體及/或抗-PD-L1抗體及/或抗-LAG-3抗體)其次依序投與之第一次投與，且隨後投與可同時投與。
視情況，作為唯一免疫治療劑之抗-TIGIT，或抗-TIGIT抗體與一或多種其他免疫治療性抗體(例如抗-CTLA-4及/或抗-PD-1及/或抗-PD-L1及/或抗-LAG-3阻斷)之組合可進一步與免疫原性劑組合，該免疫原性劑為諸如癌細胞、純化腫瘤抗原(包括重組蛋白質、肽及碳水化合物分子)、細胞及經編碼免疫刺激細胞因子之基因轉染之細胞(He等人(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可使用之腫瘤疫苗的非限制性實例包括黑素瘤抗原之肽，諸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1及/或酪胺酸酶之肽，或經轉染以表現細胞因子GM-CSF之腫瘤細胞(下文進一步論述)。TIGIT抑制劑及一或多種其他抗體(例如CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷)亦可進一步與標準癌症治療組合。舉例而言，TIGIT抑制劑及一或多種其他抗體(例如CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷)可有效地與化學治療方案組合。在此等情況下，可減少與本發明之組合一起投與的其他化學治療試劑之劑量(Mokyr等人(1998)Cancer Research 58：5301-5304)。此類組合之一實例為有或無其他抗體(諸如抗-CTLA-4抗體及/或抗-PD-1抗體及/或抗-PD-L1抗體及/或抗-LAG-3抗體)之抗-TIGIT促效抗體組合進一步與達卡巴嗪組合用於治療黑色素瘤。另一實例為有或無抗-CTLA-4抗體及/或抗-PD-1抗體及/或抗-PD-L1抗體及/或LAG-3抗體之抗-TIGIT抗體組合進一步與介白素-2(IL-2)組合用於治療黑色素瘤。支持TIGIT抑制及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷與化學療法組合使用之科學基本原理在於作為大部分化學治療化合物之細胞毒性作用結果的細胞死亡應引起抗原呈遞路徑中腫瘤抗原之含量增加。可經由細胞 死亡而與組合之TIGIT抑制及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷產生協同作用的其他組合療法為放射線、手術及激素去除。此等方案中之每一者在宿主中產生腫瘤抗原源。血管生成抑制劑亦可與組合之TIGIT抑制及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷組合。抑制血管生成導致腫瘤細胞死亡，其可為饋至宿主抗原呈遞路徑中之腫瘤抗原之來源。
作為唯一免疫治療劑之抗-TIGIT拮抗劑抗體或TIGIT拮抗抗體及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷抗體之組合亦可與將表現Fcα或Fcγ受體之效應細胞靶向腫瘤細胞的雙特異性抗體組合使用(參見例如美國專利第5,922,845號及第5,837,243號)。雙特異性抗體可用於靶向兩種各別抗原。此等反應之T細胞臂將藉由使用組合之TIGIT抑制及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷而強化。
在另一實例中，作為唯一免疫治療劑之抗-TIGIT拮抗劑抗體或抗-TIGIT抗體與其他免疫刺激劑(例如抗-CTLA-4抗體及/或抗-PD-1抗體及/或抗-PD-L1抗體及/或LAG-3劑，例如抗體)之組合可結合抗贅生性抗體，諸如RITUXAN®(利妥昔單抗)、HERCEPTIN®(曲妥珠單抗)、BEXXAR®(托西莫單抗(tositumomab))、ZEVALIN®(布突默單抗(ibritumomab))、CAMPATH®(阿侖單抗(alemtuzumab))、LYMPHOCIDE®(依帕珠單抗(eprtuzumab))、AVASTIN®(貝伐單抗(bevacizumab))及TARCEVA®(埃羅替尼(erlotinib))及其類似物使用。舉例而言且不希望受理論束縛，用抗癌抗體或結合於毒素之抗癌抗體治療可引起癌細胞死亡(例如腫瘤細胞)，此將增強免疫刺激劑(例如TIGIT、CTLA-4、PD-1、PD-L1或LAG-3劑，例如抗體)介導之免疫反應。在一示例性實施例中，過度增生性疾病(例如癌症腫瘤)之治療可包括抗癌劑，例如抗體，與抗-TIGIT及視情況其他免疫刺激劑(例如抗-CTLA-4及/或抗-PD-1及/或抗-PD-L1及/或抗-LAG-3劑，例如抗體) 組合，並行或依序或其任何組合，此可增強宿主之抗腫瘤免疫反應。
腫瘤藉由多種機制逃避宿主免疫監視。許多此等機制可藉由使腫瘤所表現且具免疫抑制性之蛋白質不活化來克服。此等尤其包括TGF-β(Kehrl等人(1986)J.Exp.Med.163：1037-1050)、IL-10(Howard及O'Garra(1992)Immunology Today 13：198-200)及Fas配位體(Hahne等人(1996)Science 274：1363-1365)。此等實體每一者之抗體可進一步與有或無其他免疫刺激劑(例如抗-CTLA-4及/或抗-PD-1及/或抗-PD-L1及/或抗-LAG-3劑，諸如抗體)之抗-TIGIT抗體組合以抵消免疫抑制劑之作用且促進宿主之抗腫瘤免疫反應。
可用於活化宿主免疫反應之其他藥劑，例如抗體，可進一步與有或無其他免疫刺激劑(諸如抗-CTLA-4及/或抗-PD-1及/或抗-PD-L1及/或抗-LAG-3抗體)之抗-TIGIT抗體組合使用。此等藥劑包括樹突狀細胞表面上活化DC功能及抗原呈遞的分子。抗-CD40抗體(Ridge等人，上文)可結合抗-TIGIT抗體及視情況其他免疫刺激劑(例如抗-CTLA-4及/或抗-PD-1及/或抗-PD-L1及/或抗-LAG-3劑，例如抗體)使用。T細胞共刺激分子OX-40(Weinberg等人(2000)Immunol 164：2160-2169)、CD137/4-1BB(Melero等人(1997)Nature Medicine 3：682-685(1997))及ICOS(Hutloff等人(1999)Nature 397：262-266)之其他活化抗體亦可增加T細胞活化程度。
如上文所論述，骨髓移植當前用於治療多種造血來源腫瘤。單獨或與CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷組合之抗-TIGIT免疫療法可用於增加供體移植之腫瘤特異性T細胞之有效性。
若干實驗性治療方案包括抗原特異性T細胞之離體活化及擴增及將此等細胞授受性轉移至受體中以產生針對腫瘤之抗原特異性T細胞(Greenberg及Riddell，上文)。此等方法亦可用於活化對諸如CMV之感染物的T細胞反應。在有或無其他免疫刺激療法(例如抗-CTLA-4及/或 抗-PD-1及/或抗-PD-L1及/或抗-LAG-3抗體)之抗-TIGIT存在下離體活化可預期增加授受性轉移之T細胞的頻率及活性。
本文提供用於改變與用免疫刺激劑治療過度增生性疾病(例如癌症)相關之不良事件的方法，其包含向個體投與抗-TIGIT抗體，有或無低於治療劑量之抗-CTLA-4及/或抗-PD-1及/或抗-PD-L1及/或抗LAG-3劑，例如抗體。舉例而言，本文所描述之方法提供一種降低免疫刺激治療性抗體誘發之結腸炎或腹瀉之發病率的方法，其藉由向患者投與不可吸收類固醇。如本文所用，「不可吸收類固醇」為展現廣泛首次代謝之糖皮質激素，使得在肝臟中代謝後，類固醇之生物利用率低，亦即小於約20%。在本文所述之一個實施例中，不可吸收類固醇為布地奈德(budesonide)。布地奈德為局部起效之糖皮類固醇，其在經口投與後主要藉由肝臟深入代謝。ENTOCORTEC®(Astra-Zeneca)為經研發以使藥物傳遞至迴腸及貫穿結腸最佳化之布地奈德的pH及時間依賴性經口調配物。ENTOCORT EC®在美國核准用於治療涉及迴腸及/或升結腸之輕度至中度克羅恩氏病(Crohn's disease)。用於治療克羅恩氏病之ENTOCORT EC®的常用口服劑量為6至9毫克/天。ENTOCORT EC®在腸中釋放，隨後吸收且保留在腸道黏膜中。一旦其穿過腸道黏膜目標組織，ENTOCORT EC®在肝臟中藉由細胞色素P450系統深入代謝成具有可忽略之糖皮質激素活性的代謝物。因此，生物利用率低(約10%)。布地奈德之低生物利用率使得與具有較不深入之首次代謝的其他糖皮質激素相比，治療比率得以改善。布地奈德與全身起效之皮質類固醇相比產生較少不良作用，包括下丘腦-垂體抑制作用較小。然而，長期投與ENTOCORT EC®可導致全身性糖皮質激素效應，諸如腎上腺皮質機能亢進症及腎上腺抑制。參見PDR第58版2004；608-610。
在其他實施例中，結合不可吸收類固醇的有或無CTLA-4及/或 PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷之TIGIT抑制(亦即免疫刺激治療性抗體抗-TIGIT及視情況抗-CTLA-4及/或抗-PD-1及/或抗-PD-L1及/或抗-LAG-3抗體)可進一步與水楊酸酯組合。水楊酸酯包括5-ASA劑，諸如：柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)(AZULFIDINE®，Pharmacia & UpJohn)；奧沙拉嗪(olsalazine)(DIPENTUM®，Pharmacia & UpJohn)；巴柳氮(balsalazide)(COLAZAL®，Salix Pharmaceuticals,Inc.)；及美沙拉嗪(mesalamine)(ASACOL®，Procter & Gamble Pharmaceuticals；PENTASA®，Shire US；CANASA®，Axcan Scandipharm,Inc.；ROWASA®，Solvay)。
根據本文所描述之方法，與有或無抗-CTLA-4及/或抗-PD-1及/或抗-PD-L1及/或LAG-3抗體之抗-TIGIT及不可吸收類固醇組合投與之水楊酸酯可包括水楊酸酯與不可吸收類固醇之任何重疊或依序投與，以降低免疫刺激抗體誘發之結腸炎的發病率。因此，舉例而言，用於降低本文所述之免疫刺激抗體誘發之結腸炎的發病率的方法涵蓋並行或依序投與水楊酸酯及不可吸收類固醇(例如水楊酸酯在不可吸收類固醇之後6小時投與)或其任何組合。此外，水楊酸酯及不可吸收類固醇可藉由相同途徑投與(例如兩者經口投與)或藉由不同途徑投與(例如水楊酸酯經口投與且不可吸收類固醇經直腸投與)，其可不同於用於投與抗-TIGIT及抗-CTLA-4及/或抗-PD-1及/或抗-PD-L1及/或抗-LAG-3抗體之途徑。
本文所述之抗-TIGIT抗體及組合抗體療法亦可結合其他熟知之因針對所治療適應症(例如癌症)之特定適用性而選擇的療法使用。本文所述之抗-TIGIT抗體之組合可與已知之醫藥學上可接受之藥劑依序使用。
舉例而言，本文所述之抗-TIGIT抗體及組合抗體療法可與諸如以下之其他治療組合使用(例如同時或分開)：輻射、化學療法(例如使用 喜樹鹼(CPT-11)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、順鉑(cisplatin)、小紅莓(doxorubicin)、伊立替康(irinotecan)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑、太平洋紫杉醇、卡鉑(carboplatin)-太平洋紫杉醇(紫杉醇(Taxol))、小紅莓、5-fu或喜樹鹼+apo2l/TRAIL(6X combo))、一或多種蛋白酶體抑制劑(例如硼替佐米(bortezomib)或MG132)、一或多種Bcl-2抑制劑(例如BH3I-2'(bcl-xl抑制劑)、吲哚胺二加氧酶-1(IDO1)抑制劑(例如INCB24360)、AT-101(R-(-)-棉籽醇衍生物)、ABT-263(小分子)、GX-15-070(奧巴拉西(obatoclax))或MCL-1(骨髓白血病細胞分化蛋白質-1)拮抗劑)、iAP(細胞凋亡蛋白質之抑制劑)拮抗劑(例如smac7、smac4小分子smac模擬劑、合成smac肽(參見Fulda等人，Nat Med 2002；8：808-15)、ISIS23722(LY2181308)或AEG-35156(GEM-640))、HDAC(組蛋白脫乙醯基酶)抑制劑、抗-CD20抗體(例如利妥昔單抗)、血管生成抑制劑(例如貝伐單抗)、靶向VEGF及VEGFR之抗血管生成劑(例如AVASTIN®)、合成三萜化合物(參見Hyer等人，Cancer Research 2005；65：4799-808)、c-FLIP(細胞FLICE抑制蛋白質)調節劑(例如PPARγ(過氧化物酶體增殖劑活化受體γ)之天然及合成配位體、5809354或5569100)、激酶抑制劑(例如索拉非尼(Sorafenib))、曲妥珠單抗、西妥昔單抗、坦羅莫司、mTOR抑制劑(諸如雷帕黴素(rapamycin)及坦羅莫司)、硼替佐米、JAK2抑制劑、HSP90抑制劑、PI3K-AKT抑制劑、來那度胺(Lenalildomide)、GSK3β抑制劑、IAP抑制劑及/或基因毒性藥物。
本文所述之抗-TIGIT抗體及組合抗體療法可進一步與一或多種抗增殖性細胞毒性劑組合使用。可用作抗增殖性細胞毒性劑之化合物類別包括(但不限於)以下：烷基化劑(包括(但不限於)氮芥(nitrogen mustard)、伸乙基亞胺衍 生物、烷基磺酸酯、亞硝基脲(nitrosourea)及三氮烯(triazene))：尿嘧啶氮芥(Uracil mustard)、氮芥(Chlormethine)、環磷醯胺(Cyclophosphamide)(CYTOXANTM)磷醯胺、美法侖(Melphalan)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、哌泊溴烷(Pipobroman)、三伸乙基三聚氰胺(Triethylenemelamine)、三伸乙基硫代磷胺(Triethylenethiophosphoramine)、白消安(Busulfan)、卡莫司汀(Carmustine)、洛莫司汀(Lomustine)、鏈脲菌素(Streptozocin)、達卡巴嗪及替莫唑胺(Temozolomide)。
抗代謝物(包括(但不限於)葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷脫胺酶抑制劑)：甲胺喋呤(Methotrexate)、5-氟尿嘧啶、氟尿苷(Floxuridine)、阿糖胞苷(Cytarabine)、6-巰基嘌呤(6-Mercaptopurine)、6-硫代鳥嘌呤(6-Thioguanine)、氟達拉賓磷酸鹽(Fludarabine phosphate)、噴司他丁(Pentostatine)及吉西他濱(Gemcitabine)。
與拮抗劑抗-TIGIT抗體組合之適合抗增殖劑(但不限於)：紫杉烷(taxane)、太平洋紫杉醇(太平洋紫杉醇可以TAXOLTM購得)、多烯紫杉醇(docetaxel)、迪斯德莫來(discodermolide，DDM)、迪克斯汀(dictyostatin，DCT)、派洛西德A(Peloruside A)、埃博黴素(epothilone)、埃坡黴素A、埃坡黴素B、埃坡黴素C、埃坡黴素D、埃坡黴素E、埃坡黴素F、呋喃并埃坡黴素D(furanoepothilone D)、去氧埃坡黴素B1、[17]-去氫去氧埃坡黴素B、[18]去氫去氧埃坡黴素B、C12,13-環丙基-埃坡黴素A、C6-C8橋接埃坡黴素A、反式-9,10-去氫埃坡黴素D、順式-9,10-去氫埃坡黴素D、16-去甲基埃坡黴素B、埃坡黴素B10、迪斯德莫來(discoderomolide)、帕土匹龍(patupilone)(EPO-906)、KOS-862、KOS-1584、ZK-EPO、ABJ-789、XAA296A(迪斯德莫來)、TZT-1027(索利多汀(soblidotin))、ILX-651(塔斯汀鹽酸鹽 (tasidotin hydrochloride))、軟海綿素B、艾日布林甲磺酸鹽(Eribulin mesylate)(E-7389)、哈米特林(Hemiasterlin)(HTI-286)、E-7974、斯普新(Cyrptophycin)、LY-355703、類美登素免疫結合物(DM-1)、MKC-1、ABT-751、T1-38067、T-900607、SB-715992(伊品斯波(ispinesib))、SB-743921、MK-0731、STA-5312、艾榴塞洛素(eleutherobin)、17β-乙醯氧基-2-乙氧基-6-側氧基-B-高-雌甾-1,3,5(10)-三烯-3-醇、環曲汀(cyclostreptin)、異勞瑪麗德(isolaulimalide)、勞瑪麗德(laulimalide)、4-表-7-去羥基-14,16-二去甲基-(+)-迪斯德莫來及奎托酮1(cryptothilone 1)，以及此項技術中已知之其他微管穩定劑。
在需要結合用本文所述之抗-TIGIT抗體治療或在用本文所述之抗-TIGIT抗體治療前使異常增殖細胞處於靜止期的情況下，激素及類固醇(包括合成類似物)，諸如17a-炔雌醇、二乙基己烯雌酚、睪固酮、潑尼松(Prednisone)、氟甲睾酮(Fluoxymesterone)、屈他雄酮丙酸鹽(Dromostanolone propionate)、睾內酯、甲地孕酮乙酸鹽(Megestrolacetate)、甲基潑尼龍(Methylprednisolone)、甲基-睪固酮(Methyl-testosterone)、潑尼龍(Prednisolone)、曲安西龍(Triamcinolone)、氯三芳乙烯(Chlorotrianisene)、羥基孕酮(Hydroxyprogesterone)、胺魯米特(Aminoglutethimide)、雌氮芥(Estramustine)、甲羥孕酮乙酸鹽(Medroxyprogesteroneacetate)、亮丙立德(Leuprolide)、氟他胺(Flutamide)、托瑞米芬(Toremifene)、ZOLADEXTM亦可投與患者。當採用本文所述之方法或組合物時，在臨床環境下調節腫瘤生長或轉移所用之其他藥劑，諸如止吐劑亦可按需要投與。
安全且有效投與化學治療劑之方法為熟習此項技術者所已知。另外，其投與描述於標準文獻中。舉例而言，許多化學治療劑之投與 描述於Physicians' Desk Reference(PDR)，例如1996版(Medical Economics Company,Montvale,N.J.07645-1742,USA)中；其揭示內容以引用的方式併入本文中。
化學治療劑及/或放射療法可根據此項技術中熟知之治療方案投與。熟習此項技術者將顯而易見化學治療劑及/或放射療法之投與可視所治療之疾病及化學治療劑及/或放射療法對該疾病之已知作用而變化。此外，根據熟練臨床醫師之知識，治療方案(例如劑量及投與時間)可鑒於所投治療劑對患者之觀測作用且鑒於疾病對所投治療劑之觀測反應變化。
患者選擇
在本發明之各種實施例中，患者在用本發明之抗-TIGIT抗體治療前測試以確定其是否可能對抗-TIGIT療法起反應，且僅僅治療顯示與治療反應相關之特性的患者。可量測與TIGIT路徑相關之蛋白質，包括TIGIT、DNAM、PVR、連接素-2、可溶性PVR(sPVR)及可溶性連接素-2(s連接素-2)或其組合的表現。PVR及連接素-2mRNA在大部分人類腫瘤中均高度表現。參見實例9及圖6A。在一個實施例中，在人類血清中例如藉由ELISA偵測到sPVR及/或s連接素-2，其中升高之sPVR及/或s連接素-2含量指示可能對用本發明之抗-TIGIT抗體治療起反應的患有癌症之個體。
在一些實施例中，針對T細胞上DNAM-1之表現篩選來自患者之樣品以選擇最可能對抗-TIGIT療法起反應之患者，其中T細胞或NK細胞上DNAM-1之存在表明患者在抗-TIGIT療法，例如用本發明之抗-huTIGIT抗體或片段治療後將具有有益抗腫瘤反應，且T細胞或NK細胞上DNAM-1之缺乏鑑別不大可能得益於抗-TIGIT療法之患者。在其他實施例中，針對腫瘤細胞或腫瘤浸潤骨髓細胞上PVR及/或連接素-2/CD112之表現篩選來自患者之樣品以選擇最可能對抗-TIGIT療法起 反應之患者，其中腫瘤細胞或腫瘤浸潤骨髓細胞上PVR及/或連接素-2/CD112之存在表明患者在抗-TIGIT療法，例如用本發明之抗-huTIGIT抗體或片段治療後將具有有益抗腫瘤反應，且腫瘤細胞或腫瘤浸潤骨髓細胞上PVR及/或連接素-2/CD112之缺乏鑑別不大可能得益於抗-TIGIT療法之患者。
在一個實施例中，在考慮用本發明之抗-TIGIT抗體治療之個體中量測可溶性PVR及/或連接素-2之含量，且僅僅顯示可溶性PVR及/或連接素-2升高之個體用抗體治療。舉例而言，高可溶性PVR及/或連接素-2可用作患者選擇生物標記物。
若腫瘤細胞表現升高含量之PVR及/或連接素-2，且同樣若此類腫瘤具有高含量之浸潤TIGIT+ CD8+ T細胞，則腫瘤類型及個別個體中之腫瘤最可能對用本發明之抗-TIGIT抗體治療起反應。
藉由以下實例進一步說明本發明，該等實例不應視作進一步限制。所有圖及在整個本申請案中所引用之所有參考文獻、Genbank序列、專利及公開專利申請案的內容明確地以引用的方式併入本文中。詳言之，PCT公開案WO 09/045957、WO 09/073533、WO 09/073546、WO 09/054863及PCT/US2013/072918以及美國專利公開案第2011/0150892號之揭示內容明確地以引用的方式併入本文中。
實例 實例1 抗-huTIGIT抗體之產生
使用表現人類抗體基因之轉殖基因小鼠如下產生人類抗-huTIGIT單株抗體。
抗原
huTIGIT可溶性重組蛋白質用作免疫接種之抗原。可溶性融合蛋白具有40.7kD之MW且由在C端連接於小鼠IgG2a Fc之huTIGIT之細胞 外部分構成。此融合蛋白在本文中稱作「huTIGIT-muFc融合蛋白」。藉由標準重組DNA方法產生融合蛋白，且在經轉染之CHO細胞中表現，該等細胞分泌可溶性融合蛋白至培養物上清液中。用於轉染之CHO宿主細胞自Invitrogen(目錄號11619-012)獲得。分泌之可溶性融合蛋白經純化用作免疫原。包括信號序列之全長人類TIGIT的序列提供於SEQ ID NO：1。
轉殖基因小鼠
使用來自CHD**；CKD2**；CMD++；JKD++；KCo5(9272)+^；SC20+基因型之小鼠(下文稱作KM®小鼠)製備人類TIGIT之完全人類單株抗體。個別轉殖基因名稱在圓括號中，接著為任意整合轉殖基因之株系編號。符號++及+指示純合子或半合子；然而，因為小鼠通常使用不允許針對任意整合之人類Ig轉殖基因區分異型接合性與純合性的基於PCR之分析篩選，所以+名稱可給予實際上為此等要素純合的小鼠。在此株系中，內源性小鼠κ輕鏈基因已在同型結合上破壞，如Chen等人(1993)EMBO J.12：811-820中所述，且內源性小鼠重鏈基因已在同型結合上破壞，如WO 2001/09187之實例1中所述。此外，此小鼠品系攜有人類κ輕鏈轉殖基因KCo5，如Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851中所述；攜帶大部分人類κ輕鏈基因座之酵母人工染色體(YAC)，如WO 2000/026373中所述。
小鼠免疫接種
為產生人類TIGIT之完全人類單株抗體，將KM小鼠用純化之huTIGIT-muFc融合蛋白免疫接種。通用免疫接種流程描述於Lonberg,N等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild,D等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851及WO 98/24884。小鼠在第一次輸注抗原時大約4月齡。純化之重組huTIGIT-muFc抗原製劑(自表現融合蛋白之經轉染之哺乳動物細胞純化10μg)或經人類TIGIT轉染之300-19 細胞用於腹膜內及皮下免疫接種小鼠。免疫原與RIBI佐劑(Sigma目錄號M6536)1：1混合。
小鼠以5-7天時間間隔免疫接種5次。第一及第二免疫接種用重組蛋白質進行。第三次免疫接種用細胞，第4次免疫接種用蛋白質，且第5次免疫接種用細胞。在上一次免疫接種之後一週將小鼠抽血以評估抗原特異性效價。藉由眶後出血監測免疫反應。血漿藉由FACS分析使用經轉染之300-19細胞篩選，且對抗-人類TIGIT人類IgG具有最高效價之小鼠用於融合物。小鼠藉由靜脈內(IV)及腹膜內(IP)注射可溶性抗原2天及經轉染細胞3天接受最終增強，接著處死及移除脾。
產生人類TIGIT之人類單株抗體之融合瘤的產生
使用基於電場之電融合，使用Cyto Pulse大腔室細胞融合電致孔器(Cyto Pulse Sciences,Inc.,Glen Burnie,MD)將自高效價KM小鼠經分離小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤融合搭配物融合。來自免疫接種小鼠之脾淋巴細胞的單細胞懸浮液與相同數目之不分泌小鼠骨髓瘤細胞的P3X63 Ag8.6.53(ATCC CRL 1580)融合(融合物編號：2541)。所得細胞於含有高葡萄糖(Cellgro #10-013-CM)及10%胎牛血清(Hyclone #SH30071.03)且補充有β-巰基乙醇(1000X，Gibco #21985-023)、7mM HEPES(Cellgro 25-060-C1)、額外2mM L-麩醯胺酸(Cellgro 25-005-C1)、HAT(50X，Sigma #H-0262)、5%融合瘤選殖因子(BioVeris #210001)、10% P388DI(ATCC #CRL TIB-63)條件培養基及青黴素-鏈黴素(100x，Cellgro #30-002-CI)之選擇性DMEM培養基中以2.0×104個細胞/孔塗鋪在平底微量滴定盤中。在約7天之後，含有HAT之一些培養基經含有HT(Cellgro #25-047-CI)之培養基置換。
在10至12天之後，使用均質HTRF分析，針對人類IgG/人類κ輕鏈抗體之存在，篩選個別孔。在此分析中，來自96孔融合盤之上清液與銪-穴狀合物標記之山羊抗人類IgG(Fc片段特異性)、生物素標記之山 羊抗人類κ輕鏈(Bethyl #A80-115B)、抗生蛋白鏈菌素-XLent混合且培育1小時。接著盤在RUBYstar讀數器上讀取。
接著藉由FACS，使用經人類TIGIT轉染之300-19細胞及作為對照之300-19未轉染細胞，篩選來自對人類IgG/人類κ輕鏈或人類IgG/人類λ輕鏈抗體呈陽性之孔的融合瘤細胞。FACS陽性親本株系轉移至24孔盤。幾天後，藉由FACS再次篩選來自個別孔之細胞上清液以證實對人類TIGIT之IgG特異性。
藉由連續稀釋選殖融合瘤且藉由FACS再次篩選。選擇三十六種抗體用於擴增及純化。隨後選擇四種抗體(15A6、22G2、11G11、10D7)用於測序及進一步分析。
實例2 抗-huTIGIT抗體與可溶性人類TIGIT之結合
抗-huTIGIT抗體與可溶性人類TIGIT之結合藉由BIACORE®表面電漿子共振(SPR)分析測定。抗-huTIGIT抗體捕捉在人類κ塗佈之晶片(約5KRU；Southernbiotech目錄號2060-01)上，且重組人類TIGIT(rhTIGIT/Fc)以500nM、250nM、125nM、62nM及31nM之濃度流過晶片。每體積mAb之捕捉濃度為2-40μg/mL(5μL，10μL/min)。抗原締合時間為15μL/min下5分鐘，抗原解離時間為6分鐘，且用50mM HCl/50mM NaOH(12μL，各在100μL/min下)進行再生。結果展示於表3中。
Figure 104143215-A0202-12-0121-3
Figure 104143215-A0202-12-0122-4
抗體14B2、19H2及26D8之結合太弱而無法可靠地量測。
表3中所示之初始結合常數測定用於幫助選擇抗-huTIGIT抗體進行進一步研究。接著使用全滴定曲線，測得次選殖及純化之抗體15A6及22G2的結合常數分別為1.5nM及90pM。
進行比較具有經修飾之構架殘基及改變之人類IgG1恆定區的15A6及22G2抗體的其他SPR實驗。人類IgG1f序列提供於SEQ ID NO：45，其中異型變異體提供於SEQ ID NO：46(其與SEQ ID NO：45之不同之處為R97K、E239D及M241L)。人類IgG1.3提供於SEQ ID NO：47(其與SEQ ID NO：45之不同之處為對應於EU編號之L234A、L235E及G237A的L117A、L118E及G120A)。另一無效應人類IgG1恆定區，人類IgG1.1f提供於SEQ ID NO：48(其與SEQ ID NO：45之不同之處為對應於EU編號之L234A、L235E、G237A、A330S及P331S的L117A、L118E、G120A、A213S及P214S)。圖7展示在IgG1.1f構築體中Fcγ受體結合之顯著降低。此類「惰性」Fc區之使用為可取的，因為TIGIT在CD8+ TIL上高度表現，且具有效應功能之抗-TIGIT抗體可耗盡根除 腫瘤所需之大部分抗腫瘤CD8+ TIL及/或NK細胞。
比較具有構架變異體A72S及/或N112T之15A6及具有構架變異體H3Q之22G2抗體與其未經修飾之形式的SPR實驗證實構架改變與同型均不會顯著影響與人類TIGIT之結合。在表4中提供結果。
Figure 104143215-A0202-12-0123-5
其他SPR實驗發現mAb 22G2以0.06nM之KD結合於人類TIGIT，且以0.09nM之KD結合於食蟹獼猴TIGIT。
序列表中之胺基酸殘基編號為117，低於文獻中之編號，此係因為使用EU編號且序列表中之IgG序列中缺乏可變結構域。存在於人類抗體之遺傳構築體中的C端離胺酸(K)殘基常常在商業產生之抗體，諸如本發明之治療性抗體中缺少。Dick等人(2008)Biotechnol.Bioeng.100：1132。因此，此離胺酸不包括於SEQ ID NO：45-48任一者中，但在一個實施例中，本發明之抗-huTIGIT抗體在重鏈C端包括此額外離胺酸殘基。在一些實施例中，本發明之抗體在包含具有C端離胺酸之重鏈與例如由於不希望C端截割而缺乏C端離胺酸之重鏈的混合物之製劑中。在一些實施例中，本發明之抗-huTIGIT抗體包含一或多個重鏈及一或多個輕鏈，諸如兩個重鏈及兩個輕鏈。
實例3 分成多組之抗-TIGIT抗體組
進行抗體分組實驗以確定哪種抗人類TIGIT抗體與其他哪些競爭結合於huTIGIT，且因此結合於類似抗原決定基。研究抗體14B2、13E6、6F9、11G11、10C9、16F6、11C9、27A9、10D7、20G6、24E8、24G1、27F1、15A6、4E4、13D1、9B11、10B8、22G2、19H2、8C8、17G4、25E7、26D8及16A8。
如下測定抗-huTIGIT抗體之間的逐對競爭，其中第一抗體結合於感測器晶片之表面，第二抗體與TIGIT多肽構築體在混合物中一起預培育，且預先培育之混合物流過感測器晶片以確定第二抗體干擾TIGIT多肽構築體與晶片表面上第一抗體結合之程度。簡言之，第一抗-huTIGIT抗體固定至感測器晶片CM5晶片(系列S，GE Healthcare目錄號BR-1005-30)表面上flowcell2、flowcell3及flowcell4(5000 RU)且flowcell1用作陰性對照。第二抗體在開始濃度下稀釋至120μg/mL(2X)。藉由用緩衝液1：3稀釋抗體濃度，達成七個不同濃度，及0.0μg/ml之對照樣品，製備第二抗體之一系列稀釋液，以獲得滴定曲線。各抗體濃度系列劃分成兩半。在濃度系列第一半中，添加40nM(2X)TIGIT抗原(rhTIGIT/Fc)以製備最終濃度系列(60μg/ml-0.0μg/ml)及各孔中20nM最終抗原濃度。在濃度系列第二半中，代替抗原，添加緩衝液以將抗體稀釋至相同濃度，且此一半作為空白處理。將第二抗-TIGIT抗體與rhTIGIT/Fc之複合物培育2小時。40μL複合物以30μL/min流速注射在抗體(第一)塗佈之表面上。使用BIACORE® T200表面電漿子共振儀器且操作緩衝液為HBE-EP(GE Healthcare目錄號BR-1001-88，過濾脫氣)、0.01M HEPES pH7.4、0.15 NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性劑P20。表面用25mM NaOH(型號：BR-1003-58，GE Healthcare)以100μL/min再生5秒。使用Microsoft Excel分析資料，其中第二抗體之濃度系列針對對應反應單元繪製以獲得滴定曲線。
結果指示測試抗體分成四組。參見圖1。組1中之抗體(14B2、13E6、6F9、11G11、10C9、16F6、11C9、27A9、10D7、20G6、24E8、24G1、27F1、15A6、4E4、13D1、9B11、10B8)阻斷組1內其他抗體以及22G2、19H2、8C8及17G4之結合。組2中之抗體(25E7、26D8、16A8)阻斷組2內其他抗體以及22G2、19H2及8C8之結合。抗體22G2、19H2及8C8(組3)阻斷組3中之其他抗體以及組1與2中之抗體的結合，但不阻斷17G4(組4)之結合。抗體17G4阻斷組1內抗體之結合，但不阻斷任一其他抗體之結合。
實例4 藉由酵母展示定位抗原決定基
所選本發明之抗-huTIGIT抗體(純系22G2、11G11及15A6)的抗原決定基藉由在酵母上展示任意誘變之huTIGIT細胞外區域變異體，且基於其無法結合於特定抗體而分選此等酵母來測定。無法結合之所選酵母細胞進行擴增且基於其無法結合於本發明之特定抗體而經受其他輪之選擇。參見例如Chao等人(2004)J.Mol.Biol.342：539。針對所得酵母測定huTIGIT變異體之序列且針對各殘基對抗體結合之作用進行分析。確定本發明之抗體的結合抗原決定基為huTIGIT序列內單胺基酸突變破壞與本發明之抗-huTIGIT抗體結合的基因座。
簡言之，易錯PCR用於選殖人類TIGIT編碼DNA至構築體，允許huTIGIT變異體表現為進一步包含c-myc標籤序列及酵母細胞壁蛋白質Agα1p之融合蛋白之胺基端部分。此類構築體在酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中表現時，在酵母細胞之表面上展示變異huTIGIT多肽，藉由Aga1p多肽錨定至細胞表面。c-myc標籤可視情況用作在既定酵母細胞上展示huTIGIT-融合蛋白之陽性對照。酵母細胞藉由FACS分選，且將表現為恰當摺疊之huTIGIT-融合蛋白(如藉由對照小鼠抗-huTIGIT抗體之結合藉由別藻藍蛋白(APC)標記之山羊抗小 鼠IgG二次抗體偵測到所測定)，但未結合於本發明之抗體(如藉由用藻紅素(PE)標記之山羊抗人類IgG作為二次抗體偵測到所測定)的酵母細胞彙集、擴增且用於隨後輪之選擇中。針對來自在若干輪選擇之後剩餘的酵母的構築體，測定huTIGIT序列。不進行抗-huTIGIT抗體選擇之對照實驗證實在沿huTIGIT序列之各位置優良的突變體覆蓋率，且提供校正用所選文庫獲得之結果的基線。
數百萬高品質序列讀數針對huTIGIT突變分子之各抗體選擇群體進行。發現殘基60在結構上對突變耐受，但在此位置之突變體未結合於抗體22G2，表明E60與抗原決定基有關。類似地，亦發現殘基I109、L65、N70、F107、T117、I68、H76及N58為抗體22G2之抗原決定基中重要的殘基。22G2之抗原決定基殘基叢集至包含殘基58-76(NWEQQDQLLAICNADLGWH；SEQ ID NO：38)及殘基107-117(FCIYHTYPDGT；SEQ ID NO：39)之一級序列區。參見圖2A。此抗原決定基與TIGIT/PVR結合界面重疊，如藉由X射線晶體結構所測定。Stengel等人(2012)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)109：5399。
使用抗體11G11之類似實驗展示在殘基G74、N70、H76、L65、L73、Q56、I68、H111及P114之重要觸點。11G11之抗原決定基殘基叢集至包含殘基56-76(QVNWEQQDQLLAICNADLGWH；SEQ ID NO：40)及殘基111-114(HTYP；SEQ ID NO：41)之一級序列區域，其中其他潛在觸點在殘基120-139(GRIFLEVLESSVAEHGARFQ；SEQ ID NO：42)中。參見圖2B。
使用抗體15A6之類似實驗展示在殘基H76、G74、L65、N58、I68、Q139、G135、L73、F107、N70、E60、H134、A132及I109之重要觸點。15A6之抗原決定基殘基叢集至包含殘基58-76(NWEQQDQLLAICNADLGWH；SEQ ID NO：38)及殘基107-109(FCI)之一級序列區域，其中其他潛在觸點在殘基132-139(AEHGARFQ； SEQ ID NO：43)中。參見圖2C。
所有三個抗原決定基均包括殘基L65、I68、N70及H76，表明僅僅考慮15A6及22G2，此等殘基及此區域，亦即殘基65-76(LLAICNADLGWH；SEQ ID NO：44)或58-76代表本發明之抗-huTIGIT抗體之結合的重要區域(「核心抗原決定基」)。
關於huTIGIT結合於人類PVR/CD155之類似實驗展示在殘基Q56、N58、I68、N70、L73、G74、W75、H76、H111、T112、Y113、P114、D115及G116之重要觸點，該等觸點主要在抗體22G2、11G11及15A6結合之抗原決定基區域中。
實例5 經抗-TIGIT抗體處理之NK細胞的PVR + 細胞溶解增強
評估活體外抗-人類TIGIT抗體22G2對NK細胞介導之PVR+細胞溶解的作用。野生型與經工程改造以表現人類PVR的P815細胞(小鼠肥胖細胞瘤細胞株)暴露於在抗-huTIGIT mAb 22G2-IgG1、22G2-IgG1.1或同型對照存在下的人類NK細胞
簡言之，人類NK細胞、效應細胞自全血分離且與IL-2一起培育過夜。NK細胞用標靶細胞P815/PVR或P815[wt]塗鋪，E：T細胞比率為10：1或20：1。抗體以5μg/mL之最終濃度添加至孔。盤培育2-4小時且評估細胞上清液之乳酸去氫酶(LDH)(死亡或瀕死細胞之產物)的釋放。
結果呈現在圖3。特異性溶解%(%)計算為[(測試信號-平均自發溶解)/(平均最大溶解-平均自發溶解)]×100。使用抗-TIGIT抗體22G2阻斷TIGIT減少NK細胞上抑制信號傳導，其以DNAM-1特異性方式引起表現PVR之標靶細胞溶解增加。
實例6 藉由抗-TIGIT抗體活化CD8 + T細胞
進行實驗以確定單獨及與抗-人類PD-1抗體組合之抗-人類TIGIT抗體對用抗原肽刺激之人類T細胞的作用。作為基本事實，觀測到PD-1+/TIGIT+ CD8+ T細胞在來自暴露於抗原肽混合物(來自CMV、EBV、流感及破傷風)之健康人類供體之血液中比來自未暴露血液中更普遍。參見圖4A。在經CEFT處理之血液中量測到IFNγ產生。參見圖4B。雖然作為單一療法無效，但抗-TIGIT mAb 22G2增強抗-PD-1刺激IFNγ自暴露於抗原肽混合物之人類T細胞產生之能力。亦參見Chauvin等人(2015)J.Clin.Invest.125：2046，其中在來自暴露於NY-ESO-1肽之黑色素瘤患者之外周血單核細胞(PBMC)中有或無抗-huPD-1抗體同時投與下測定抗-人類TIGIT抗體10D7對人類腫瘤特異性CD8+ T細胞的作用。
實例7 鼠類CT26腫瘤模型中抗-TIGIT抗體之抗腫瘤活性
在同基因型CT26結腸腺癌模型中測試單獨及與抗-小鼠PD-1抗體組合之抗-小鼠TIGIT抗體之抗腫瘤活性。用於此等實驗中之抗-muTIGIT抗體為本發明之抗-huTIGIT抗體的小鼠代替物。
簡言之，抗-muTIGIT mAb(純系4B1)用鼠類IgG2a或鼠類IgG1D265A(具有降低之效應功能)Fc區製備，以及抗-muPD-1(純系4H2)用鼠類IgG1 D265AFc區製備。在同基因型CT26結腸腺癌模型中此等抗體及其組合與小鼠IgG1同型對照一起投與小鼠以確定抗腫瘤活性。用於研究之IgG1對照抗體為具有小鼠IgG1同型之重組人類抗白喉毒素抗體。
第0天，每組十五隻BALB/c小鼠(總計90隻小鼠)皮下注射1×106個CT26腫瘤細胞。治療在移植後第7天開始。量測腫瘤，隨機化至處理組以便具有類似的平均腫瘤體積(45-50mm3)，且接著用指定抗體(每劑200μg)腹膜內(IP)處理，且再在第10天及第14天進行。各實驗亦包 括每劑200μg對照IgG1抗體，且因此對照IgG1實驗本身包括每劑400μg。每週量測腫瘤體積兩次。
結果呈現在圖5A中，其呈現隨時間變化之各實驗之平均腫瘤體積。抗-TIGIT抗體(G1 D265A)之降低之效應功能型式並不影響腫瘤生長且並不去除任何小鼠之腫瘤，而IgG2a減少腫瘤生長且使得十五隻小鼠中之三隻在第35天無腫瘤。IgG2a抗-TIGIT抗體與抗-PD-1抗體之組合高度有效地減少腫瘤生長且使得十五隻小鼠中之十隻無腫瘤，而抗-TIGIT G1 D265A與抗-PD-1之組合略微不太有效地減少腫瘤生長且使得十五隻小鼠中之七隻無腫瘤。儘管如此，IgG2a與IgG1 D265A抗-TIGIT抗體增強抗-PD-1抗體之活性，單獨抗-PD-1抗體僅僅使得十五隻小鼠中之兩隻無腫瘤。
進行類似實驗以比較作為單一療法之抗-TIGIT與抗-TIGIT/抗-PD-1及抗-TIGIT/抗-CTLA-4組合療法。抗-TIGIT與抗-PD-1抗體格式化為Fc惰性小鼠IgG1-D265A同型，且抗-CTLA-4格式化為小鼠IgG2b。第0天，雌性BALB/c小鼠植入1×106個腫瘤細胞，且第10天、第14天及第17天，抗體以10mg/kg IP投與。結果提供於圖5B。添加抗-TIGIT至用抗-PD-1及抗-CTLA-4治療顯著增強腫瘤生長抑制(TGI)，如自組合療法曲線顯而易見，其中與抗-TIGIT、抗-PD-1及抗-CTLA-4之單一療法分別7%、18%及13% TGI相比，抗-TIGIT/抗-PD-1為56% TGI且抗-TIGIT/抗-CTLA-4為49% TGI。對於與抗-PD-1之組合，組合療法亦將實驗結束時無腫瘤小鼠數目自1/10增加至5/10，且對於與抗-CTLA-4之組合，自3/10增加至6/10。
實例8 抗-huTIGIT抗體15A6、22G2、11G11發10D7之其他特性
進行各種其他活體外分析以確定所選本發明抗體之特性。發現抗-huTIGIT mAb 15A6、22G2、11G11及10D7結合於表現huTIGIT之 Jurkat細胞。Jurkat/hTIGIT細胞之生物分析證實抗體15A6、11G11及10D7以大致同等功效阻斷PVR信號傳導，且抗體22G2約兩倍更佳(IC50=0.21nM)。抗體15A6及22G2展示當在CHO細胞上表現時以大體上與人類TIGIT相同之親和力結合於來自食蟹獼猴之TIGIT，而11G11及10D7不結合。舉例而言，抗體22G2 IgG1.1f分別以0.09nM及0.07nM之KD結合於人類及猴TIGIT，且亦分別具有0.55nM及0.28-0.58nM之結合於CD8+ T細胞的EC50，但不結合於大鼠或小鼠TIGIT。然而，隨後使用初級細胞之實驗證實在此背景下15A6不充分結合於獼猴TIGIT。抗體22G2及15A6染色人類淋巴細胞，但高達10μg/ml之濃度，不染色22種其他人類組織(大腦、小腦、心臟、肝、肺、腎、脾、扁桃體、胸腺、結腸、小腸、胃、胰臟、皮膚、骨胳肌肉、腎上腺、甲狀腺、周圍神經、前列腺、胎盤、睪丸及子宮)。當以10μg/ml培育20小時時抗體22G2不增加75種來自八種供體之人類全血之不同細胞因子及趨化因子(包括GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-13、IL-2、IFNγ、IP-10)的表現，表明細胞因子釋放症候群之風險低。
在另一實驗中，當各以其EC90濃度(分別14.1nM及12.8nM)存在時，抗-TIGIT mAb 22G2 IgG1.1f展示分別阻斷TIGIT-mFc與過度表現人類PVR及人類連接素-2之P815細胞結合的15.4nM及5.72nM之IC50。
發現抗體22G2 IgG1.1f在重鏈上N310具有單一N-糖基化位點，其中聚糖型態為在CHO中產生之單株抗體典型的。
此等結果表明抗體22G2具有用於本發明之方法中治療用途的理想特性，因為當其存在於細胞之表面上時其結合於TIGIT，其抑制PVR及連接素-2信號傳導，其不結合於額外人類組織或誘發不必要的細胞因子或趨化因子釋放，且其結合於獼猴TIGIT，此有助於進行毒理學研究以用於支持監管部門批准之研究中。
實例9 基於TIGIT、DNAM、PVR及連接素-2之表現的患者選擇
與TIGIT路徑(TIGIT、PVR/CD155、連接素-2/CD112、DNAM/CD226)相關之蛋白質表現量可用於導引用本發明之抗-TIGIT抗體治療。PVR及連接素-2之可溶性形式(sPVR及s連接素-2)可在血清中例如藉由ELISA或其他習知方式偵測到。TIGIT、PVR、連接素-2及DNAM可在諸如腫瘤細胞、CD8+ T細胞、調控性T細胞、NK細胞或腫瘤浸潤骨髓細胞的細胞之表面上，例如藉由免疫組織化學(IHC)、流動式細胞量測術(FACS)或質譜方法，包括液相層析質譜分析(LC-MS)偵測到。
不意欲受理論限制，用本發明之抗-TIGIT抗體治療將基於阻斷TIGIT與相互作用細胞上其配位體，例如PVR或連接素-2之結合及/或阻止TIGIT與相同細胞上DNAM之相互作用。因此，最可能對此類治療起反應之腫瘤或腫瘤類型將為TIGIT活性對腫瘤進展重要，使得阻斷此類TIGIT活性將增強腫瘤根除之腫瘤。特定言之，高含量TIGIT+ TIL，諸如TIGIT+ CD8+ T細胞、TIGIT+ Treg或TIGIT+ NK細胞將表明可能對拮抗劑抗-TIGIT治療起反應之腫瘤。此等TIGIT+ TIL上DNAM表現將進一步表明腫瘤可對抗-TIGIT治療起反應。類似地，在腫瘤細胞本身上或在腫瘤浸潤骨髓細胞上TIGIT配位體PVR及/或連接素-2之表現量高的腫瘤亦將為用本發明之抗-TIGIT抗體治療的優良候選腫瘤。
可在治療適應症選擇水準下或在個別患者水準下(「患者分層」)針對TIGIT路徑之蛋白質之表現量進行篩選。舉例而言，可在來自患有許多不同癌症各者的許多患者之組織樣品中測定表現量，以確定哪種類型癌症展示蛋白質表現模式，表明該特定類型癌症將易受用本發明之拮抗劑抗-TIGIT mAb治療影響。一旦針對統計學上足夠數目之樣品進行此類測定，則抗-TIGIT療法可推薦用於罹患預期對抗-TIGIT 療法起反應之癌症類型的任何個別患者。或者，可改為測試來自個別患者之樣品，以幫助導引對該患者而言特定之治療決策。
因為待測試TIGIT路徑蛋白質之表現的相關細胞為在腫瘤中及微環境周圍的細胞，所以此類篩選可能需要例如藉由生檢或切除術來獲得腫瘤樣品。
因此，本發明亦提供用於鑑別作為用本發明之拮抗劑抗-TIGIT抗體治療之優良候選腫瘤的腫瘤類型或特異性腫瘤之方法，其係藉由量測浸潤CD8+ T細胞、Treg或NK細胞中TIGIT含量及/或藉由量測腫瘤細胞或腫瘤浸潤骨髓細胞中PVR及/或連接素-2之表現。
在一個實例中，抗-TIGIT療法代替、結合或補充用PD-1或PD-L1抑制劑治療採用。顯示高PVR/連接素-2表現及低PD-L1表現之腫瘤可用作為單一療法之抗-TIGIT抗體或抗-TIGIT抗體與除PD-1/PD-L1拮抗劑外之另一免疫-腫瘤學藥劑(若此類藥劑存在生物基本原理)組合處理。在顯示高PVR/連接素-2表現以及高PD-L1表現之腫瘤中本發明之抗-TIGIT抗體可大體上與抗-PD-1/PD-L1抗體並行投與。或者，在難治患者、復發患者或具有任何其他不完全或不令人滿意之反應的患者中，若其腫瘤展示升高之PVR及/或連接素-2表現，則本發明之抗-TIGIT抗體可在抗-PD-1/PD-L1療法之後投與。
在確定可能易受用本發明之拮抗劑抗-TIGIT抗體治療影響之腫瘤類型的實驗中，使用TCGA資料集測定各種人類癌症之人類PVR mRNA之表現。結果呈現於圖6A。結果以降序呈現，其中頂部為PVR mRNA含量最高且因此最可能易受用本發明之抗-TIGIT抗體治療影響的腫瘤。
另外，藉由IHC偵測到PVR在結腸腺癌樣品中之含量比結腸上皮對照樣品中偵測到之含量高得多。參見圖6B。其他IHC實驗揭露100%肝細胞癌樣品(10/10)、90%結腸直腸癌樣品(9/10)及44%卵巢癌 樣品(4/9)中PVR表現升高。此等結果表明此等癌症、尤其肝細胞及結腸直腸癌之患者將為用本發明之拮抗劑抗-TIGIT抗體治療的優良候選患者。
本發明亦提供治療、例如治療結腸直腸癌之方法，其包含確定瘤內細菌具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)之存在或不存在，該細菌之存在表明腫瘤可為本發明之抗-TIGIT抗體治療的優良候選物。此類治療方法亦視情況包括向具有瘤內細菌具核梭桿菌之個體投與抗生素，例如甲硝噠唑(metronidazole)、哌拉西林(piperacillin)/他佐巴坦(tazobactum)、替卡西林(ticarcillin)/棒酸鹽、阿莫西林(amoxicillin)/舒巴坦(sulbactum)、安比西林(ampicillin)/舒巴坦、厄他培南(ertupenem)、亞胺培南(imipenem)、美羅培南(meropenem)、克林達黴素(clindamycin)或頭孢西丁(cefoxitin)。
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關於抗體序列，序列表提供重鏈及輕鏈之成熟可變區的序列，亦即序列不包括信號肽。
相等物：熟習此項技術者最多使用常規實驗將識別或能夠確定本文所揭示之特定實施例的許多相等物。此類相等物欲由以下申請專利範圍涵蓋。
<110> 美商必治妥美雅史谷比公司(BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY)
<120> 針對TIGIT之抗體
<140> TW104143215
<141> 2015-12-22
<150> 62/096,267
<151> 2014-12-23
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 244
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<213> 人工序列
<220>
<223> 具有A72S修飾之人類序列
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<213> 人工序列
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<223> 具有N112Q修飾之人類序列
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<213> 人工序列
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<223> 具有A72S及N112T修飾之人類序列
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<213> 人工序列
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<223> 具有H3Q修飾之人類序列
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Claims (21)

  1. 一種經分離抗體或其抗原結合片段，其結合於TIGIT(具有Ig及ITIM結構域之人類T細胞免疫受體)，其包含：a)重鏈可變結構域，其包含：i)包含SEQ ID NO.：20之序列的CDRH1；ii)包含SEQ ID NO.：21之序列的CDRH2；及iii)包含SEQ ID NO.：22之序列的CDRH3；及b)輕鏈可變結構域，其包含：i)包含SEQ ID NO.：23之序列的CDRL1；ii)包含SEQ ID NO.：24之序列的CDRL2；及iii)包含SEQ ID NO.：25之序列的CDRL3。
  2. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含一或多種重鏈及一或多種輕鏈，其中：a)該重鏈包含與SEQ ID NO：7之序列具有至少80%序列一致性之重鏈可變區；且b)該輕鏈包含與SEQ ID NO：9之序列具有至少80%序列一致性之輕鏈可變區。
  3. 如請求項2之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含一或多種重鏈及一或多種輕鏈，其中：a)該重鏈包含SEQ ID NO：7之重鏈可變區；且b)該輕鏈包含SEQ ID NO：9之輕鏈可變區。
  4. 如請求項1至3中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人類IgG1抗體或具有增加之效應功能之其變異體。
  5. 如請求項1至3中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為具有降低或消除之效應功能的人類IgG1 Fc變異體。
  6. 如請求項5之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含以下突變：藉由EU編號之L234A、L235E、G237A、A330S及P331S(SEQ ID NO：48)。
  7. 如請求項6之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含一或多種重鏈及一或多種輕鏈，其中：a)該重鏈包含SEQ ID NO：7之重鏈可變區及SEQ ID NO：48之重鏈恆定區；且b)該輕鏈包含SEQ ID NO：9之輕鏈可變區及SEQ ID NO：49之輕鏈恆定區。
  8. 一種核酸，其編碼如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈可變區。
  9. 一種表現載體，其包含如請求項8之核酸。
  10. 一種宿主細胞，其係經以下轉型：i)如請求項9之表現載體；或ii)第一表現載體及第二表現載體，該第一表現載體編碼如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區；該第二表現載體編碼如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區。
  11. 一種產生抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段之方法，其包含在允許產生該抗體或其抗原結合片段之條件下培養如請求項10之宿主細胞，且自該細胞純化該抗體或其抗原結合片段。
  12. 一種如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途，其係用於製造供增強個體中抗原特異性T細胞反應之醫藥品。
  13. 如請求項12之用途，其中該個體患有腫瘤或慢性病毒感染，且針對該腫瘤或病毒感染之免疫反應會得到增強。
  14. 一種如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段的用途， 其係用於製造供減少或耗盡個體腫瘤中調控性T細胞之醫藥品。
  15. 一種如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途，其係用於製造供治療癌症之醫藥品。
  16. 如請求項12至15中任一項之用途，其中該醫藥品進一步包含一或多種選自由以下各者組成之群的其他治療劑或與其一起投與：抗-PD-1抗體、抗-LAG-3抗體、抗-CTLA-4抗體及抗-PD-L1抗體。
  17. 如請求項16之用途，其中該其他治療劑為抗-PD-1抗體。
  18. 如請求項16之用途，其中該其他治療劑為抗-PD-L1抗體。
  19. 一種雙特異性抗體，其包含第一抗原結合結構域及第二抗原結合結構域，其中：a)該第一抗原結合結構域來自如請求項1至3中任一項之抗-huTIGIT抗體或其抗原結合片段；且b)該第二抗原結合結構域來自選自由以下各者組成之群的抗體：抗-PD-1抗體、抗-LAG-3抗體、抗-CTLA-4抗體及抗-PD-L1抗體。
  20. 如請求項19之雙特異性抗體，其中該第二結合結構域來自抗-PD-1抗體。
  21. 如請求項19之雙特異性抗體，其中該第二結合結構域來自抗-PD-L1抗體。
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