JP2011505372A - 抗ｂ７ｈ４モノクローナル抗体−薬物コンジュゲートおよび使用方法 - Google Patents

抗ｂ７ｈ４モノクローナル抗体−薬物コンジュゲートおよび使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、B7H4と高い親和性で特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。本開示の抗体をコードする核酸分子、本開示の抗体を発現させるための発現ベクター、宿主細胞および方法も提供され、本開示の抗体を含む、抗体-薬物コンジュゲートを含む免疫コンジュゲート、二重特異性分子および薬学的組成物も提供される。本開示はまた、癌を治療するための方法も提供する。

Description

発明の分野
本発明は、薬物、放射性同位体および毒素などのパートナー分子とコンジュゲート（conjugate）された、抗B7-H4抗体、抗体断片および抗体模倣物を提供する。
発明の背景
乳癌および卵巣癌は、米国における女性の癌による死亡のそれぞれ2番目および4番目に多い原因である（American Cancer Society (2005) Cancer facts and figures）。米国癌学会（American Cancer Society）は、2005年に米国でおよそ40,000人の女性が乳癌で死亡し、約16,000人が卵巣癌で死亡すると推定している。卵巣悪性腫瘍全体の中で表層上皮腫瘍が80％超を占めており、これには漿液性腫瘍、粘液性腫瘍、類内膜腫瘍および明細胞癌が含まれる（Seidman et al. "Blaustein' s Pathology of the Female Genital Tract" 791-4 (Kurman, editor, 5th ed. New York, Springer-Verlag, 2002)。卵巣癌は往々にして受診時には転移性腫瘍（metastatic disease）が局部および遠隔部位へと広がった進行期にある（Pettersson, (1994) Int. Fed. of Gyn. and Obstetrics, Vol. 22；およびHeintz et al (2001) J. Epidermiol. Biostat. 6: 107-38）。このため、生涯のうちに乳癌を発症する確率は卵巣癌の場合よりも有意に高いが、乳癌患者の5年生存率は卵巣癌を有する者の場合よりもかなり良好である。
B7様分子は免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーに属する。B7様分子の細胞外部分は単一のIgVドメインおよびIgCドメインを有し、アミノ酸同一性はおよそ20％〜40％である。B7様分子は、抗原特異的な免疫応答の制御および微調整において決定的な役割を果たしている。O8E、B7xおよびB7S1としても知られるB7-H4は、B7ファミリーのメンバーであり、T細胞応答の刺激性調節および抑制性調節の両方に役割を果たすと考えられている（Carreno et al, (2002) Ann. Rev. Immunol. 20:29-53およびKhoury et al, (2004) Immunity 20:529-538）。ヒトB7-H4は第1番染色体にマッピングされており、66kbの範囲にわたって6つのエクソンおよび5つのイントロンで構成され、そのうちエクソン6が選択的スプライシングに用いられることで2種類の転写物が生じる（Choi et al. (2003) J. Immunol. 171:4650-4654）。
B7-H4はその生理的機能をT細胞上の受容体と結合することによって発揮し、次にはそれが細胞周期停止を誘導し、サイトカインの分泌、細胞傷害作用の発生ならびにCD4+およびCD8+ T細胞のサイトカイン産生を阻害する（Prasad et al. (2003) Immunity 18:863-873；Sica et al. (2003) Immunity 18:849-861；Wang et al (2004) Microbes Infect. 6:759-66；およびZang et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:10388-10392）。B7-H4は炎症反応の減弱化因子（attenuator）であること、ならびに抗原特異的な免疫応答および抗腫瘍応答のダウンレギュレーションに役割を果たすことが示唆されている（Zang et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100:10388-10392；Prasad et al (2003) Immunity 18:863-873；Sica et al. (2003) Immunity 18:849-861；Choi et al (2003) J Immunol. 171:4650-4654；およびCarreno et al. (2003) Trends lmmunol. 24:524-7）。
B7-H4タンパク質ではないが、B7-H4 mRNAの発現は、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓および小腸を含む、広範囲にわたる正常な体細胞組織で検出されている（Sica et al. (2003) Immunity 18:849-61 and Choi et al. (2003) J. Immunol. 171:4650-4)。B7-H4はT細胞、B細胞、単球および樹状細胞の刺激によって誘導されうる；しかし、免疫組織化学分析では、卵巣癌および肺癌の一部における陽性染色を例外として、いくつかの末梢組織では発現がほとんどみられないことが判明している（同上）。加えて、B7-H4は、原発性および転移性乳癌において、腫瘍のグレードにも病期にも関係なく一貫して過剰発現されており、このことは乳癌の生物学的過程（biology）におけるこのタンパク質の決定的な役割を示唆する（Tringler et al. (2005) Clinical Cancer Res. U: 1842-48）。同じく、米国特許第6,962,980号；第6,699,664号；第6,468,546号；第6,488,931号；第6,670,463号；および第6,528,253号も参照のこと、これらのそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
進行した乳癌および卵巣癌の治療のためには、放射線療法、細胞傷害性抗腫瘍薬を用いる従来の化学療法、ホルモン療法（アロマターゼ阻害薬、黄体形成ホルモン放出ホルモン類似体）、ビスホスフォネート製剤およびシグナル伝達阻害薬を含む、非常にさまざまな治療様式が利用可能である（Smith (2002) Lancet, 360:790-2）。しかし、残念ながら、多くの患者はこれらの治療様式のいずれに対しても、ほとんど反応しないか、または全く反応しないかのいずれかである。それ故に、乳癌および卵巣癌に対する新たな分子マーカーおよび治療剤を同定することが必要とされている。このため、B7-H4は、卵巣癌および乳癌を含む癌、ならびにB7-H4発現によって特徴づけられる種々の他の疾患の治療のための、利用価値のある標的である。
本開示は、B7-H4（別名O8E、B7S1およびB7x）と結合し、かつ数多くの望ましい特性を呈する、モノクローナル抗体、特にヒト配列モノクローナル抗体を含む、抗体-パートナー分子コンジュゲート（antibody-partner molecule conjugate）を提供する。これらの特性には、ヒトB7-H4との高親和性結合、B7-H4を発現する細胞によるインターナリゼーション（internalization）、抗体依存性細胞傷害作用を媒介する能力、および／または、細胞毒とコンジュゲートされた時にインビボで、B7-H4を発現する細胞の増殖を阻害する能力が含まれる。種々のB7-H4媒介性疾患を、本開示の抗体-パートナー分子コンジュゲートを用いて治療するための方法も同じく提供される。
1つの局面において、本開示は、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む抗体-パートナー分子コンジュゲートに関し、ここで抗体は、
（a）ヒトB7-H4と1×10-8 Mまたはそれ未満の親和性で結合する；
（b）B7-H4発現細胞によるインターナリゼーションを受ける；
（c）B7-H4発現細胞に対する抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）を呈する；および
（d）細胞毒とコンジュゲートされた時にインビボでB7-H4発現細胞の増殖を阻害する。
好ましくは、抗体は、特性（a）、（b）、（c）および（d）のうち少なくとも2つを呈する。より好ましくは、抗体は、特性（a）、（b）、（c）および（d）のうち少なくとも3つを呈する。より好ましくは、抗体は、特性（a）、（b）、（c）および（d）の4つすべてを呈する。もう1つの好ましい態様において、抗体はB7-H4と5×10-9 Mまたはそれ未満の親和性で結合する。さらにもう1つの好ましい態様において、抗体は、抗体が細胞毒とコンジュゲートされた時にインビボで、B7-H4を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する。
ある態様において、抗体は、細胞系SKBR3（ATCCアクセッション番号HTB-30）などの乳房細胞癌腫瘍細胞系と結合する。
典型的には、抗体はヒト抗体であるが、代替的な態様において、抗体はマウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。
もう1つの態様において、抗体は、SKBR3乳房細胞癌の腫瘍細胞上に発現されたB7-H4との結合後に、それらの細胞によるインターナリゼーションを受ける。
もう1つの態様において、本開示は、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む抗体-パートナー分子コンジュゲートを提供し、ここで抗体はB7-H4との結合をめぐって参照抗体と交差競合（cross-compete）し、ここで参照抗体は、
（a）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（b）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（c）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（d）SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（e）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域である。
1つの局面において、本開示は、ヒトVH 4-34遺伝子（そのタンパク質産物は本明細書ではSEQ ID NO：51と提示される）の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含み、該抗体がB7-H4と特異的に結合する、抗体-パートナー分子コンジュゲートに関する。本開示はまた、ヒトVH 3-53遺伝子（そのタンパク質産物は本明細書ではSEQ ID NO：52と提示される）の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含み、抗体がB7-H4と特異的に結合する、抗体-パートナー分子コンジュゲートに関する。本開示はまた、ヒトVH 3-9／D3-10／JH6b遺伝子（そのタンパク質産物は本明細書ではSEQ ID NO：53と提示される）の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含み、該抗体がB7-H4と特異的に結合する、抗体-パートナー分子コンジュゲートに関する。
本開示はさらになお、ヒトVK A27遺伝子（そのタンパク質産物は本明細書ではSEQ ID NO：54と提示される）の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含み、該抗体がB7-H4と特異的に結合する、抗体-パートナー分子コンジュゲートに関する。本開示はさらになお、ヒトVK L6／JK1遺伝子（そのタンパク質産物は本明細書ではSEQ ID NO：55と提示される）の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含み、該抗体がB7-H4と特異的に結合する、抗体-パートナー分子コンジュゲートに関する。
他の局面において、本開示は、
（a）ヒトVH 4-34、3-53または3-9遺伝子の重鎖可変領域；および
（b）ヒトVK A27またはVK L6の軽鎖可変領域、
を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含み、該抗体がB7-H4と特異的に結合する、抗体-パートナー分子コンジュゲートを提供する。
関連する1つの態様において、抗体は、ヒトVH 4-34遺伝子の重鎖可変領域およびヒトVK A27遺伝子の軽鎖可変領域を含む。もう1つの関連した態様において、抗体は、ヒトVH 3-53遺伝子の重鎖可変領域およびヒトVK A27遺伝子の軽鎖可変領域を含む。さらにもう1つの関連した態様において、抗体は、ヒトVH 3-9遺伝子の重鎖可変領域およびヒトVK L6遺伝子の軽鎖可変領域を含む。さらにもう1つの局面において、本開示は、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域；ならびにCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで、
（a）重鎖可変領域CDR3配列は、SEQ ID NO：21、22、23、24および25からなる群より選択されるアミノ酸配列アミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変物（conservative modification）を含む；
（b）軽鎖可変領域CDR3配列は、SEQ ID NO：36、37、38、39および40からなる群より選択されるアミノ酸配列アミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変物を含む；
（c）前記抗体はヒトB7-H4と1×10-7 Mまたはそれ未満のKDで結合する；
（d）B7-H4をトランスフェクトしたヒトCHO細胞と結合する。
好ましくは、重鎖可変領域CDR2配列は、SEQ ID NO：16、17、18、19および20のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変物を含む；かつ、軽鎖可変領域CDR2配列は、SEQ ID NO：31、32、33、34および35のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変物を含む。
好ましくは、重鎖可変領域CDR1配列は、SEQ ID NO：11、12、13、14および15のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変物を含む；かつ、軽鎖可変領域CDR1配列は、SEQ ID NO：26、27、28、29および30のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変物を含む。1つの具体的な組み合わせは、以下を含む：
（a）SEQ ID NO：11を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）SEQ ID NO：16を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）SEQ ID NO：21を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）SEQ ID NO：26を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）SEQ ID NO：31を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）SEQ ID NO：36を含む軽鎖可変領域CDR3。
もう1つの具体的な組み合わせは、以下を含む：
（a）SEQ ID NO：12を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）SEQ ID NO：17を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）SEQ ID NO：22を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）SEQ ID NO：27を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）SEQ ID NO：32を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）SEQ ID NO：37を含む軽鎖可変領域CDR3。
もう1つの具体的な組み合わせは、以下を含む：
（a）SEQ ID NO：13を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）SEQ ID NO：18を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）SEQ ID NO：23を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）SEQ ID NO：28を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）SEQ ID NO：33を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）SEQ ID NO：38を含む軽鎖可変領域CDR3。
もう1つの具体的な組み合わせは、以下を含む：
（a）SEQ ID NO：14を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）SEQ ID NO：19を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）SEQ ID NO：24を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）SEQ ID NO：29を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）SEQ ID NO：34を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）SEQ ID NO：39を含む軽鎖可変領域CDR3。
もう1つの具体的な組み合わせは、以下を含む：
（a）SEQ ID NO：15を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）SEQ ID NO：20を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）SEQ ID NO：25を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）SEQ ID NO：30を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）SEQ ID NO：35を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）SEQ ID NO：40を含む軽鎖可変領域CDR3。
本開示の抗体またはその抗原結合部分のその他の具体的な抗体は、以下を含む：
（a）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（b）SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
もう1つの具体的な組み合わせは、以下を含む：
（a）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（b）SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
もう1つの具体的な組み合わせは、以下を含む：
（a）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（b）SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
もう1つの具体的な組み合わせは、以下を含む：
（a）SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（b）SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
もう1つの具体的な組み合わせは、以下を含む：
（a）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（b）SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
本開示のもう1つの局面において、B7-H4との結合をめぐって前述の抗体のいずれかと競合する、抗体またはその抗原結合部分を含む抗体-パートナー分子コンジュゲートが提供される。
本開示の抗体は、例えば、IgG1、IgG2またはIgG4アイソタイプの完全長抗体であってよい。または、抗体が、Fab、Fab'もしくはFab'2断片などの抗体断片、または一本鎖抗体（例えば、scFv）であってもよい。
本開示はまた、細胞毒または放射性同位体などの治療剤と結合した、本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む抗体-パートナー分子コンジュゲートも提供する。1つの特に好ましい態様において、本発明は、化合物「毒素A」と結合した（例えば、チオール結合を介して）、本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む抗体-パートナー分子コンジュゲートを提供する。例えば、さまざまな態様において、本発明は、以下の好ましい抗体-パートナー分子コンジュゲートを提供する：
（i）（a）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（b）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（c）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（d）SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（e）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体またはその抗原結合部分を含み、該抗体またはその抗原結合部分が、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第60／882,461号で詳細に考察されている毒素Aなどの毒素と結合している、抗体-パートナー分子コンジュゲート；
（ii）毒素Aなどの毒素と結合している、
（a）SEQ ID NO：11を含む重鎖可変領域CDR1、
（b）SEQ ID NO：16を含む重鎖可変領域CDR2、
（c）SEQ ID NO：21を含む重鎖可変領域CDR3、
（d）SEQ ID NO：26を含む軽鎖可変領域CDR1、
（e）SEQ ID NO：31を含む軽鎖可変領域CDR2、および
（f）SEQ ID NO：36を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む抗体もしくはその抗原結合部分、または
（a）SEQ ID NO：12を含む重鎖可変領域CDR1、
（b）SEQ ID NO：17を含む重鎖可変領域CDR2、
（c）SEQ ID NO：22を含む重鎖可変領域CDR3、
（d）SEQ ID NO：27を含む軽鎖可変領域CDR1、
（e）SEQ ID NO：32を含む軽鎖可変領域CDR2、および
（f）SEQ ID NO：37を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む抗体もしくはその抗原結合部分、または
（a）SEQ ID NO：13を含む重鎖可変領域CDR1、
（b）SEQ ID NO：18を含む重鎖可変領域CDR2、
（c）SEQ ID NO：23を含む重鎖可変領域CDR3、
（d）SEQ ID NO：28を含む軽鎖可変領域CDR1、
（e）SEQ ID NO：33を含む軽鎖可変領域CDR2、および
（f）SEQ ID NO：38を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む抗体もしくはその抗原結合部分、または
（a）SEQ ID NO：14を含む重鎖可変領域CDR1、
（b）SEQ ID NO：19を含む重鎖可変領域CDR2、
（c）SEQ ID NO：24を含む重鎖可変領域CDR3、
（d）SEQ ID NO：29を含む軽鎖可変領域CDR1、
（e）SEQ ID NO：34を含む軽鎖可変領域CDR2、および
（f）SEQ ID NO：39を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む抗体もしくはその抗原結合部分、または
（a）SEQ ID NO：15を含む重鎖可変領域CDR1、
（b）SEQ ID NO：20を含む重鎖可変領域CDR2、
（c）SEQ ID NO：25を含む重鎖可変領域CDR3、
（d）SEQ ID NO：30を含む軽鎖可変領域CDR1、
（e）SEQ ID NO：35を含む軽鎖可変領域CDR2、および
（f）SEQ ID NO：40を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む抗体もしくはその抗原結合部分を含む、抗体-パートナー分子コンジュゲート；ならびに
（iii）（a）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（b）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（c）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（d）SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（e）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体によって認識される（例えば、ヒトB7-H4との結合をめぐって交差競合する）のと同じエピトープと結合し、毒素Aなどの毒素と結合している、抗体またはその抗原結合部分を含む抗体-パートナー分子コンジュゲート。
本開示はまた、本開示の抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第2の機能的部分と結合している、前記抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子も提供する。
本開示の抗体もしくはその抗原結合部分または抗体-パートナー分子コンジュゲートまたは二重特異性分子、および薬学的に許容される担体を含む組成物も、同じく提供される。
本開示の、抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子、ならびに核酸を含む発現ベクター、そのような発現ベクターを含む宿主細胞、およびそのような宿主細胞を用いて抗B7-H4抗体を作製するための方法も、本開示の範囲に含まれる。さらに、本開示は、本開示の抗体を発現するマウスである、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス、ならびに、本開示の抗体を産生するハイブリドーマである、そのようなマウスから調製されたハイブリドーマも提供する。
本開示はまた、B7-H4と高い親和性で特異的に結合する、単離された抗B7-H4抗体-パートナー分子コンジュゲート、特にヒトモノクローナル抗体を含むものも提供する。そのような抗体-パートナー分子コンジュゲートのある種のものは、B7-H4発現細胞内へのインターナリゼーションを受けることができ、かつ抗体依存性細胞傷害作用を媒介することができる。本開示はまた、乳癌および卵巣癌などの癌を、本明細書で開示される抗B7-H4抗体-パートナー分子コンジュゲートを用いて治療するための方法も提供する。
本開示のパートナー分子とコンジュゲートされた抗体またはその抗原結合部分を含む組成物も同じく提供される。本明細書で開示される抗体パートナー分子コンジュゲート中で抗体と好都合にコンジュゲートさせることができるパートナー分子には、薬物、毒素、マーカー分子（例えば、放射性同位体）、タンパク質および治療剤としての分子が非限定的に含まれる。抗体-パートナー分子コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む組成物も本明細書で開示される。
1つの局面において、そのような抗体-パートナー分子コンジュゲートは、化学リンカーを介してコンジュゲートされる。いくつかの態様において、リンカーはペプチジルリンカーであり、本明細書では(L4)p-F-(L1)mとして表される。他のリンカーには、ヒドラジンリンカーおよびジスルフィドリンカーが含まれ、本明細書ではそれぞれ(L4)p-H-(L1)mまたは(L4)p-J-(L1)mとして表される。パートナーと結合するリンカーに加えて、本発明はまた、本質的にあらゆる分子種に対する結合のために適切な、切断可能なリンカーアームも提供する。
さらにもう1つの局面において、本開示は、B7-H4を発現する腫瘍細胞の増殖によって特徴づけられる疾患を治療または予防する方法であって、対象に対して、本開示の抗B7-H4ヒト抗体を含む抗体-パートナー分子コンジュゲートを、その疾患を治療または予防するために有効な量で投与する段階を含む方法を提供する。疾患は、乳房細胞癌または卵巣癌などの癌でありうる。
さらにもう1つの局面において、本開示は、自己免疫疾患を治療する方法であって、対象に対して、本開示の抗B7-H4ヒト抗体を含む抗体-パートナー分子コンジュゲートを、自己免疫疾患を治療するために有効な量で投与する段階を含む方法を提供する。
本開示のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および実施例から明らかになるであろうが、それらは限定的なものとみなされるべきではない。本出願の全体を通じて引用されるすべての参考文献、GenBank登録番号、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
1G11ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（SEQ ID NO：41）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO：1）を示している。CDR1（SEQ ID NO：11）、CDR2（SEQ ID NO：16）およびCDR3（SEQ ID NO：21）領域が線で描かれており、VおよびJ生殖系列起源（germline derivation）が表示されている。 1G11ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（SEQ ID NO：46）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO：6）を示している。CDR1（SEQ ID NO：26）、CDR2（SEQ ID NO：31）およびCDR3（SEQ ID NO：36）領域が線で描かれており、VおよびJ生殖系列起源が表示されている。 2A7ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（SEQ ID NO：42）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO：2）を示している。CDR1（SEQ ID NO：12）、CDR2（SEQ ID NO：17）およびCDR3（SEQ ID NO：22）領域が線で描かれており、V、DおよびJ生殖系列起源表示されている。 2A7ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（SEQ ID NO：47）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO：7）を示している。CDR1（SEQ ID NO：27）、CDR2（SEQ ID NO：32）およびCDR3（SEQ ID NO：37）領域が線で描かれており、VおよびJ生殖系列起源が表示されている。 2F9ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（SEQ ID NO：43）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO：3）を示している。CDR1（SEQ ID NO：13）、CDR2（SEQ ID NO：18）およびCDR3（SEQ ID NO：23）領域が線で描かれており、V、DおよびJ生殖系列起源が表示されている。 2F9ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（SEQ ID NO：48）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO：8）を示している。CDR1（SEQ ID NO：28）、CDR2（SEQ ID NO：33）およびCDR3（SEQ ID NO：38）領域が線で描かれており、VおよびJ生殖系列起源が表示されている。 12E1ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域ヌクレオチド配列（SEQ ID NO：44）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO：4）を示している。CDR1（SEQ ID NO：14）、CDR2（SEQ ID NO：19）およびCDR3（SEQ ID NO：24）領域が線で描かれており、V、DおよびJ生殖系列起源が表示されている。 12E1ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（SEQ ID NO：49）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO：9）を示している。CDR1（SEQ ID NO：29）、CDR2（SEQ ID NO：34）およびCDR3（SEQ ID NO：39）領域が線で描かれており、VおよびJ生殖系列起源が表示されている。 13D12ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（SEQ ID NO：45）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO：5）を示している。CDR1（SEQ ID NO：15）、CDR2（SEQ ID NO：20）およびCDR3（SEQ ID NO：25）領域が線で描かれており、V、DおよびJ生殖系列起源が表示されている。 13D12ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（SEQ ID NO：50）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO：10）を示している。CDR1（SEQ ID NO：30）、CDR2（SEQ ID NO：35）およびCDR3（SEQ ID NO：40）領域が線で描かれており、VおよびJ生殖系列起源が表示されている。 1G11および13D12の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖系列VH 4-34アミノ酸配列（SEQ ID NO：51）とのアラインメントを示している。 2A7および2F9の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖系列VH 3-53アミノ酸配列（SEQ ID NO：52）とのアラインメントを示している。 12E1の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖系列VH 3-9／D3-10／JH6bアミノ酸配列（SEQ ID NO：53）とのアラインメントを示している。 1G11、2A7、2F9および13D12の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖系列VK A27アミノ酸配列（SEQ ID NO：54）とのアラインメントを示している。 12E1の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、複合（combined）ヒト生殖系列VK L6／JK1アミノ酸配列（SEQ ID NO：55）とのアラインメントを示している。 ヒトO8Eに対するヒトモノクローナル抗体がO8Eと特異的に結合することを実証しているELISA実験の結果を示している。図11Aは、ヒト抗O8E抗体でコーティングした後に精製O8Eタンパク質を添加し、ウサギ抗O8E抗血清で検出したELISAプレートによる結果を示している。図11Bは、抗マウスFcおよびその後にモノクローナル抗C9（0.6μg／ml）でコーティングし、続いて指定の通りに用量調節したPenta-O8Eタンパク質、続いて1μg／mlのヒト抗O8E抗体を用いたELISAプレートによる結果を示している。 抗O8Eヒトモノクローナル抗体2A7が、O8EをトランスフェクトしたCHO細胞と結合することを実証しているサイトメトリー実験の結果を示している。 SKBR3乳癌細胞、ならびにO8EをトランスフェクトしたSKOV3細胞およびHEK細胞におけるO8Eの発現を実証しているフローサイトメトリー実験の結果を示している。 ヒトO8Eに対するヒトモノクローナル抗体が、O8E+ CHO細胞内へのインターナリゼーションを受けることが可能なことを実証している、Hum-Zapインターナリゼーション実験の結果を示している。 ヒトO8Eに対するヒトモノクローナル抗体が、O8E+ SKBR3細胞内へのインターナリゼーションを受けることが可能なことを実証している、Hum-Zapインターナリゼーション実験の結果を示している。 1G11、2A7、2F9および13D12を含むさまざまなヒト抗O8Eモノクローナル抗体を用いたエピトープマッピング試験の結果を示している。 ヒトモノクローナル抗O8E抗体が、ヒト乳癌細胞系SKBR3をADCC依存的な様式で死滅させることを実証している、抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）アッセイの結果を示している。 ヒトモノクローナル抗O8E抗体が、O8EをトランスフェクトしたSKOV3細胞をADCC依存的な様式で死滅させることを実証している、抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）アッセイの結果を示している。 ヒトモノクローナル抗O8E抗体がヒト乳癌細胞系SKBR3を濃度およびADCCに依存的な様式で死滅させることを実証している、抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）アッセイの結果を示している。 抗O8E抗体によるHEK-B7H4腫瘍の腫瘍増殖阻害を示している、SCIDマウスに対するインビボ試験の結果を示している。 インビボHEK293-B7H4異種移植マウスモデルの結果を示すグラフを提示しており、媒体のみ、裸の抗体または抗体-パートナー分子コンジュゲートの種々の濃度で処置したマウスにおける腫瘍体積の中央値を提示している。 インビボHEK293-B7H4異種移植マウスモデルの結果を示すグラフを提示しており、媒体のみ、裸の抗体または抗体-パートナー分子コンジュゲートの種々の濃度で処置したマウスにおける体重変化の中央値を提示している。
詳細な説明
本開示は、B7-H4（別名O8E、B7S1およびB7x）と高い親和性で特異的に結合する、モノクローナル抗体、特にヒト配列モノクローナル抗体を含む抗体-パートナー分子コンジュゲートに関する。ある態様において、本開示の抗体は、特定の重鎖および軽鎖生殖系列配列に由来する、および／または特定のアミノ酸配列を含むCDR領域などの構造的特徴を含む。本開示は、単離された抗体、そのような抗体、そのような抗体を含む抗体-パートナー分子コンジュゲートおよび二重特異性分子を作製する方法、ならびに本開示の抗体、抗体-パートナー分子コンジュゲートまたは二重特異性分子を含む薬学的組成物を提供する。本開示はまた、B7-H4を検出するため、ならびに癌などの、B7-H4の発現と関連のある疾患を治療するために、抗体-パートナー分子コンジュゲートを用いる方法にも関する。したがって、本開示はまた、さまざまな癌を治療するために、例えば、乳房細胞癌、転移性乳癌、卵巣細胞癌、転移性卵巣癌および腎細胞癌の治療において、本開示の抗B7-H4抗体-パートナー分子コンジュゲートを用いる方法にも関する。
本開示をより理解しやすくするために、若干の用語についてまず定義する。そのほかの定義は、詳細な説明の全体を通じて示される。
「B7-H4」、「O8E」、「B7x」および「B7S1」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、ヒトB7-H4の変異体、アイソフォーム、相同体、オルソログおよびパラログを含む。例えば、B7-H4に対して特異的な抗体は、ある場合には、ヒト以外の種由来のB7-H4と交差反応することができる。他の態様において、ヒトB7-H4に対して特異的な抗体は、ヒトB7-H4に対して完全に特異的であってよく、種間交差反応性も他のタイプの交差反応性も示さなくてもよい。「ヒトB7-H4」という用語は、Genbankアクセッション番号NP_078902を有するヒトB7-H4の完全アミノ酸配列（SEQ ID NO：56）などのヒト配列B7-H4のことを指す。B7-H4は当技術分野において、例えば、BL-CAM、B3、Leu-14およびLyb-8としても知られている。ヒトB7-H4配列は、例えば、保存的な突然変異または非保存的領域における突然変異を有する点でSEQ ID NO：56のヒトB7-H4と異なってもよく、そのB7-H4はSEQ ID NO：56のヒトB7-H4と実質的に同じ生物学的機能を有する。例えば、ヒトB7-H4の生物学的機能の1つは、B7-H4の細胞外ドメイン内に、本開示の抗体によって特異的に結合するエピトープを有することであり、またはヒトB7-H4の生物学的機能には、例えば、T細胞増殖の阻害、サイトカイン産生の阻害、細胞周期生成の阻害、もしくはT細胞受容体との結合が含まれる。
個々のヒトB7-H4配列は一般に、SEQ ID NO：56のヒトB7-H4とアミノ酸配列の点で少なくとも90％同一であると考えられ、他の種（例えば、マウス）のB7-H4アミノ酸配列と比較した場合に、そのアミノ酸配列がヒトのものであることを特定するアミノ酸残基を含む。ある場合には、ヒトB7-H4は、SEQ ID NO：56のB7-H4とアミノ酸配列の点で少なくとも95％、またはさらには少なくとも96％、97％、98％もしくは99％同一であってもよい。ある態様において、ヒトB7-H4配列は、SEQ ID NO：56のB7-H4とは、10個以下のアミノ酸配列の違いを呈すると考えられる。ある態様において、ヒトB7-H4は、SEQ ID NO：56のB7-H4とは、5個以下、またはさらには4個、3個、2個もしくは1個以下のアミノ酸の違いを呈してもよい。
「免疫応答」とは、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞の、または自己免疫もしくは病理的炎症の場合には、正常なヒト細胞もしくは組織の、選択的な損傷、破壊または人体からの排除をもたらす、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球および、上記の細胞または肝臓によって産生される可溶性高分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の作用のことを指す。
「シグナル伝達経路」とは、細胞の1つの部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達に役割を果たすさまざまなシグナル伝達分子間の生化学的関係のことを指す。本明細書で用いる場合、「細胞表面受容体」という語句には、例えば、シグナルを受け取って、細胞の原形質膜を横断してそのようなシグナルを伝達することのできる分子および分子の複合体が含まれる。本開示の「細胞表面受容体」の一例は、B7-H4受容体である。
本明細書で言及される「抗体」という用語には、完全な抗体および任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）またはそれらの一本鎖が含まれる。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも2つの重（H）鎖および2つの軽（L）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分のことを指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではVHと略す）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではVLと略す）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLで構成される。VH領域およびVL領域は、相補性決定領域（CDR）と名付けられた複数の超可変性領域と、散在するフレームワーク領域（FR）と名付けられたより保存的な領域にさらに細分することができる。各VHおよびVLは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に並んだ、3つのCDRおよび4つのFRからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系のさまざまな細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第1成分（C1q）を含む、宿主の組織または因子との結合を媒介することができる。
抗体の「抗原結合部分」（または「抗体部分」）という用語は、本明細書で用いる場合、抗原（例えば、B7-H4）と特異的に結合する能力を保っている抗体の1つまたは複数の断片のことを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって遂行されうることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲に含まれる結合断片の例には、（i）VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価の断片であるFab断片；（ii）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した2つのFab断片を含む二価の断片であるF(ab')2断片；（iii）本質的にはヒンジ領域の一部を有するFabであるFab'断片（FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3rd ed. 1993を参照)；（iv)VHおよびCH1ドメインからなるFd断片；（v）抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFv断片；（vi）VHドメインからなるdAb断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）；（vii）単離された相補性決定領域（CDR）；および（viii）単一の可変ドメインおよび2つの定常ドメインを有する重鎖可変領域であるナノボディ（nanobody）が含まれる。さらに、Fv断片の2つのドメインVLおよびVHは別個の遺伝子によってコードされるが、組換え法を用いて、それらを、VLおよびVH領域が対合して一価の分子を形成している単一のタンパク質鎖（一本鎖Fv（scFv）として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426；およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）として作製することを可能にする合成リンカーによって連結することもできる。そのような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲に含まれるものとする。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の手法を用いて得られ、断片は元のままの（intact）抗体と同じ様式でその有用性に関してスクリーニングされる。
「単離された抗体」とは、本明細書で用いる場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すものとする（例えば、B7-H4と特異的に結合する単離された抗体は、B7-H4以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、B7-H4と特異的に結合する単離された抗体が、他の抗原、例えば他の種由来のB7-H4分子などに対する交差反応性を有することもある。さらに、単離された抗体が、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まないこともある。
本明細書で用いる場合、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物のことを指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。「ヒト抗体」または「ヒト配列抗体」という用語は、本明細書で用いる場合、フレームワーク領域およびCDR領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体が含まれるものとする。さらに、抗体が定常領域を含む場合は、定常領域もまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、天然の改変または合成的改変を含む、以後の改変を含みうる。本開示のヒト抗体は、ヒトの生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的な突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含んでもよい。しかし、「ヒト抗体」という用語には、本明細書で用いる場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトのフレームワーク配列上にグラフティングされている抗体は含まれないものとする。
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワーク領域およびCDR領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を呈する抗体のことを指す。1つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、ヒトの重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスなどから得られたB細胞を、不死化細胞と融合させたものを含む、ハイブリドーマによって産生される。
「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書で用いる場合、組換え手段によって調製、発現、作製または単離されたすべてのヒト抗体を含み、これには例えば（a）ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニック性もしくは染色体導入性（transchromosomal）の動物（例えば、マウス）から、またはそれから調製されたハイブリドーマ（以下にさらに記載）から単離された抗体、（b）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマ（transfectoma）などから単離された抗体、（c）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（d）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを含む、任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体、などが含まれる。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびCDR領域がヒトの生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、ある態様においては、そのような組換えヒト抗体を、インビトロ突然変異誘発（または、ヒトIg配列に関するトランスジェニック動物を用いる場合には、インビボ体細胞突然変異誘発）に供することができ、それ故に、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VHおよびVL配列に由来し、かつ関連しているが、インビボのヒト抗体生殖系列レパートリーの中に天然には存在しない可能性がある配列である。
本明細書で用いる場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、IgMまたはIgG1）のことを指す。「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」という用語は、本明細書において「抗原と特異的に結合する抗体」という用語と互換的に用いられる。
「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒト抗体の任意の改変された形態、例えば、抗体と別の作用物質または抗体とのコンジュゲートのことを指す。「ヒト化抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトのフレームワーク配列上に移植されている抗体を指すものとする。さらなるフレームワーク領域の改変を、ヒトのフレームワーク配列の内部に加えてもよい。
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が1つの種に由来して、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体などを指すものとする。
「抗体模倣物」という用語は、抗体が抗原と結合する能力を模倣することができるが、ネイティブ性の抗体構造に限定されない分子を指すものとする。そのような抗体模倣物の例には、アフィボディ（Affibody）、ダルピン（DARPin）、アンチカリン（Anticalin）、アビマー（Avimer）およびバーサボディ（Versabody）が非限定的に含まれ、これらはすべて、従来型の抗体結合を模倣しながらも、異なる機序によって生成されかつそれを介して機能する結合性構造を用いている。
本明細書で用いる場合、「パートナー分子」という用語は、抗体-パートナー分子コンジュゲートにおいて抗体とコンジュゲートされる実体のことを指す。パートナー分子の例には、薬物、毒素、マーカー分子（ペプチドおよび低分子マーカー、例えば蛍光色素マーカーなど、ならびに放射性同位体などの単一原子マーカーが非限定的に含まれる）、タンパク質ならびに治療剤が含まれる。
本明細書で用いる場合、「ヒトB7-H4と特異的に結合する」抗体とは、ヒトB7-H4と、1×10-7 Mまたはそれ未満、より典型的には5×10-8 Mまたはそれ未満、より典型的には3×10-8 Mまたはそれ未満、より典型的には1×10-8 Mまたはそれ未満、さらにより典型的には5×10-9 Mまたはそれ未満のKDで結合する抗体を指すものとする。
タンパク質または細胞と「実質的に結合しない」という用語は、本明細書で用いる場合、タンパク質または細胞と結合しないか、または高い親和性で結合しない、すなわちタンパク質または細胞と1×10-6 Mを上回る、より好ましくは1×10-5 Mを上回る、より好ましくは1×10-4 Mを上回る、より好ましくは1×10-3 Mを上回る、さらにより好ましくは1×10-2 Mを上回るKDで結合することを意味する。
「Kassoc」または「Ka」という用語は、本明細書で用いる場合、特定の抗体-抗原相互作用の会合速度を指すものとし、一方、「Kdis」または「Kd」という用語は、本明細書で用いる場合、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を指すものとする。「KD」という用語は、本明細書で用いる場合、KdとKaとの比（すなわちKd／Ka）から得られる解離定数のことを指すものとし、これはモル濃度（M）として表現される。抗体のKD値は、当技術分野において十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗体のKDを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いて、好ましくはBiacore（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いることによる。
本明細書で用いる場合、IgG抗体に関する「高親和性」という用語は、標的抗原に対して1×10-7 Mまたはそれ未満、より好ましくは5×10-8 Mまたはそれ未満、さらにより好ましくは1×10-8 Mまたはそれ未満、さらにより好ましくは5×10-9 Mまたはそれ未満、さらにより好ましくは1×10-9 Mまたはそれ未満のKDを有する抗体のことを指す。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに関しては異なりうる。例えば、IgMアイソタイプに関する「高親和性」結合は、10-6 Mまたはそれ未満、より好ましくは10-7 Mまたはそれ未満、さらにより好ましくは10-8 Mまたはそれ未満のKDを有する抗体のことを指す。
「対象」という用語は、本明細書で用いる場合、任意のヒトまたは非ヒト動物が含まれる。「非ヒト動物」という用語には、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。
結合として用いられるか、または結合に対して垂直に提示される記号「-」は、提示された部分が分子の残り、固体支持体などと結合する箇所を指し示す。
単独でのまたは別の置換基の一部としての、「アルキル」という用語は、別に明記しない限り、直鎖状もしくは分岐鎖状または環状の炭化水素基（hydrocarbon radical）、またはそれらの組み合わせを意味し、それは完全に飽和、単不飽和もしくは多価不飽和のいずれであってもよく、かつ指定された数の炭素原子を有する（すなわちC1-C10は1〜10個の炭素を意味する）二価および多価基を含みうる。飽和炭化水素基の例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、シクロヘキシル、(シクロヘキシル)メチル、シクロプロピルメチルなどの基や、例えばn-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチルなどの相同体および異性体が非限定的に含まれる。不飽和アルキル基とは、1つまたは複数の二重結合または三重結合を有するもののことである。不飽和アルキル基の例には、ビニル、2-プロペニル、クロチル、2-イソペンテニル、2-(ブタジエニル)、2,4-ペンタジエニル、3-(1,4-ペンタジエニル)、エチニル、1-および3-プロピニル、3-ブチニル、ならびにより高級な相同体および異性体が非限定的に含まれる。「アルキル」という用語はまた、別に明記しない限り、以下でより詳細に定義されるアルキルの誘導体、例えば「ヘテロアルキル」も含むものとする。炭化水素基に限定されたアルキル基は「ホモアルキル」と称される。
単独でのまたは別の置換基の一部としての「アルキレン」という用語は、-CH2CH2CH2CH2-によって例示されるがそれには限定されないアルカンから導き出される二価基を意味し、以下で「ヘテロアルキレン」として記載される基をさらに含む。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、1〜24個の炭素原子を有すると考えられ、10個またはそれ未満の炭素原子を有する基が本発明では好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」とは、一般に8個またはそれ未満の炭素原子を有する、より短鎖のアルキル基またはアルキレン基のことである。
単独でのまたは別の用語と組み合わせられた「ヘテロアルキル」という用語は、別に明記しない限り、明記された数の炭素原子、ならびにO、N、SiおよびSからなる群より選択される少なくとも1つのヘテロ原子からなる、安定な直鎖状もしくは分岐鎖状または環状の炭化水素基、またはそれらの組み合わせを意味し、ここで窒素、炭素およびイオウ原子は酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子は四級化されてもよい。ヘテロ原子O、N、SおよびSiは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置、または分子の残りと結び合わされたアルキル基の位置に配置されうる。その例には、-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3、および-CH＝CH-N(CH3)-CH3が非限定的に含まれる。例えば-CH2-NH-OCH3および-CH2-O-Si(CH3)3などのように、最大で2つのヘテロ原子が連続してもよい。同様に、単独でのまたは別の置換基の一部としての「ヘテロアルキレン」という用語は、-CH2-CH2-S-CH2-CH2-および-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-によって例示されるがそれらには限定されないヘテロアルキルから誘導される二価基を意味する。ヘテロアルキレン基に関して、ヘテロ原子が鎖の末端の一方または両方を占有することもできる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。「ヘテロアルキル」および「ヘテロアルキレン」という用語は、ポリ(エチレングリコール)およびその誘導体を範囲に含む（例えば、Shearwater Polymers Catalog, 2001を参照）。さらになお、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基に関して、連結基の方向は連結基の式が記された方向によって示されるのではない。例えば、式-C(O)2R'は-C(O)2R'および-R'C(O)2の両方を表す。
「アルキル」または「ヘテロアルキル」という用語と組み合わされた「低級」という用語は、1〜6個の炭素原子を有する部分のことを指す。
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、「アルキルスルホニル」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という用語は、それらの従来の意味で用いられ、それぞれ酸素原子、アミノ基、SO2基またはイオウ原子を介して分子の残りと結び合わされたアルキル基のことを指す。「アリールスルホニル」という用語は、SO2基を介して分子の残りと結び合わされたアリール基のことを指し、「スルフヒドリル」という用語はSH基のことを指す。
一般に、「アシル置換基」も、以上に示された基から選択される。本明細書で用いる場合、「アシル置換基」という用語は、本発明の化合物の多環核と結び合わされて、それと直接的または間接的に結び合わされたカルボニル炭素の原子価を満たす基のことを指す。
単独でのまたは別の用語と組み合わせられた、「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、別に明記しない限り、それぞれ、環状型の置換または非置換「アルキル」、および置換または非置換「ヘテロアルキル」のことを指す。さらに、ヘテロシクロアルキルに関して、ヘテロ原子は、複素環が分子の残りと結び合わされた位置を占有することができる。シクロアルキルの例には、シクロペンチル、シクロヘキシル、1-シクロヘキセニル、3-シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが非限定的に含まれる。ヘテロシクロアルキルの例には、1-(1,2,5,6-テトラヒドロピリジル)、1-ピペリジニル、2-ピペリジニル、3-ピペリジニル、4-モルホリニル、3-モルホリニル、テトラヒドロフラン-2-イル、テトラヒドロフラン-3-イル、テトラヒドロチエン-2-イル、テトラヒドロチエン-3-イル、1-ピペラジニル、2-ピペラジニルなどが非限定的に含まれる。環状構造のヘテロ原子および炭素原子は酸化されてもよい。
単独でのまたは別の置換基の一部としての、「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、別に明記しない限り、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むものとする。例えば、「ハロ（C1-C4）アルキル」という用語には、トリフルオロメチル、2,2,2-トリフルオロエチル、4-クロロブチル、3-ブロモプロピルなどが非限定的に含まれるものとする。
「アリール」という用語は、別に明記しない限り、置換型もしくは非置換型の多価不飽和芳香族炭化水素置換基を意味し、これは単一の環、または一つに縮合しているかもしくは共有結合している複数の環（好ましくは1〜3個の環）でありうる。「ヘテロアリール」という用語は、N、OおよびSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有するアリール基（または環）のことを指し、ここで窒素、炭素およびイオウ原子は酸化されてもよく、窒素原子は四級化されてもよい。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りと結び合わされうる。アリール基およびヘテロアリール基の非限定的な例には、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、4-ビフェニル、1-ピロリル、2-ピロリル、3-ピロリル、3-ピラゾリル、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル、ピラジニル、2-オキサゾリル、4-オキサゾリル、2-フェニル-4-オキサゾリル、5-オキサゾリル、3-イソオキサゾリル、4-イソオキサゾリル、5-イソオキサゾリル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、5-チアゾリル、2-フリル、3-フリル、2-チエニル、3-チエニル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-ピリミジル、4-ピリミジル、5-ベンゾチアゾリル、プリニル、2-ベンズイミダゾリル、5-インドリル、1-イソキノリル、5-イソキノリル、2-キノキサリニル、5-キノキサリニル、3-キノリル、および6-キノリルが含まれる。上述したアリール環系およびヘテロアリール環系のそれぞれに関する置換基は、下記の許容される置換基の群から選択される。「アリール」および「ヘテロアリール」はまた、縮合されるかまたは他の様式でアリールもしくはヘテロアリール系と結合している1つまたは複数の非芳香環系などの環系も範囲に含む。
簡略化のため、「アリール」という用語は、他の用語（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と併用される場合、以上で定義されたアリール環およびヘテロアリール環の両方を含む。したがって、「アリールアルキル」という用語は、アリール基が、炭素原子（例えば、メチレン基）が例えば酸素原子によって置換されているアルキル基（例えば、フェノキシメチル、2-ピリジルオキシメチル、3-(1-ナフチルオキシ）プロピルなど）などを含むアルキル基と結び合わされているような基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を含むものとする。
上記の用語のそれぞれ（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は、指示された基の置換形態および非置換形態の両方を含む。基の各タイプに関して好ましい置換基は以下に提示する。
アルキル基およびヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとしばしば称される基を含む）に対する置換基は、一般にそれぞれ「アルキル置換基」および「ヘテロアルキル置換基」と称され、0から（2m'＋1）までの範囲にわたる数（式中、m'はそのような基における炭素原子の総数である）の、以下のものを非限定的に含む種々の基の1つまたは複数でありうる：-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、NR'-C(O)NR''R'''、-NR''C(O)2R'、-NR-C(NR'R''R''')=NR''''、NR-C(NR'R'')=NR'''、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-NRSO2R'、-CNおよび-NO2。R'、R''、R'''およびR''''はそれぞれ、好ましくは独立して、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、例えば1〜3個のハロゲンで置換されたアリール、置換もしくは非置換アルキル基、アルコキシ基またはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基のことを指す。本発明の化合物が例えば複数のR基を含む場合、R基のそれぞれは独立に選択され、各R'、R''、R'''およびR''''基についてもこれらの基の複数が存在する場合には同様である。R'およびR''が同じ窒素原子と結合する場合、それらは窒素原子と結合し、5、6、もしくは7員環が形成されうる。例えば、-NR'R''には、1-ピロリジニルおよび4-モルホリニルが非限定的に含まれるものとする。置換基に関する以上の考察から、当業者は、「アルキル」という用語が、水素基以外の基と結合した炭素原子を含む基、例えばハロアルキル（例えば、-CF3および-CH2CF3）およびアシル（例えば、-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3など）を含むものとすることを理解するであろう。
アルキル基に関して記載した置換基と同様に、アリール置換基およびヘテロアリール置換基は一般にそれぞれ「アリール置換基」および「ヘテロアリール置換基」と称され、さまざまであり、例えば、0から芳香環系の空の原子価（open valence）の総数までの範囲にわたる数の、以下のもの：ハロゲン、-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR'-C(O)NR''R'''、-NR''C(O)2R'、-NR-C(NR'R'')=NR'''、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-NRSO2R'、-CNおよび-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、フルオロ(C1-C4)アルコキシおよびフルオロ(C1-C4)アルキルから選択され、ここでR'、R''、R'''およびR''''は好ましくは、水素、(C1-C8)アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリールおよびヘテロアリール、(非置換アリール)-(C1-C4)アルキルおよび(非置換アリール)オキシ-(C1-C4)アルキルから独立に選択される。本発明の化合物が例えば複数のR基を含む場合、R基のそれぞれは独立に選択され、各R'、R''、R'''およびR''''基についてもこれらの基の複数が存在する場合には同様である。
アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上のアリール置換基の2つが、式-T-C(O)-(CRR')q-U-の置換基で置換されてもよく、ここでTおよびUは独立に-NR-、-O-、-CRR'-または単結合であり、qは0から3までの整数である。または、アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上のアリール置換基の2つが、式-A-(CH2)r-B-の置換基で置換されてもよく、ここでAおよびBは独立に-CRR'-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR'-または単結合であり、rは1から4までの整数である。このようにして形成された新たな環の単結合の1つが二重結合で置換されてもよい。または、アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の2つが式-(CRR')s-X-(CR''R''')d-の置換基で置換されてもよく、ここでsおよびdは独立に0から3までの整数であり、Xは-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-または-S(O)2NR'-である。置換基R、R'、R''およびR'''は、好ましくは、水素または置換もしくは非置換(C1-C6)アルキルから独立に選択される。
本明細書で用いる場合、「ジホスフェート」という用語は、2つのリン酸基を含むリン酸のエステルを非限定的に含む。「トリホスフェート」という用語は、3つのリン酸基を含むリン酸のエステルを非限定的に含む。例えば、二リン酸または三リン酸を有する具体的な薬物には、以下が含まれる：
Figure 2011505372
本明細書で用いる場合、「ヘテロ原子」という用語は、酸素（O）、窒素（N）、イオウ（S）およびケイ素（Si）を含む。
記号「R」は、置換または非置換アルキル基、置換または非置換ヘテロアルキル基、置換または非置換アリール基、置換または非置換ヘテロアリール基、および置換または非置換ヘテロシクリル基から選択される置換基を表す一般的な略語である。
本発明のさまざまな局面を、以下のサブセクションでさらに詳細に説明する。
特定の機能特性を有する抗B7-H4抗体
本開示の抗体は、抗体の特定の機能的特徴または特性によって特徴づけられる。例えば、本抗体は、ヒトB7-H4、例えば細胞の表面上に発現されるヒトB7-H4と特異的に結合する。好ましくは、本開示の抗体は、ヒトB7-H4と、高い親和性で、例えば1×10-7 Mまたはそれ未満のKD、より好ましくは5×10-8 Mまたはそれ未満のKD、さらにより好ましくは1×10-8 M以下のKDで結合する。本開示の抗B7-H4抗体は、ヒトB7-H4と結合し、かつ、好ましくは以下の特性：
（a）ヒトB7-H4と1×10-8 Mまたはそれ未満で結合する；
（b）B7-H4発現細胞によるインターナリゼーションを受ける；
（c）B7-H4発現細胞に対する抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）を呈する；および
（d）細胞毒とコンジュゲートされた時にインビボでB7-H4発現細胞の増殖を阻害する、
のうち1つまたは複数を呈する。
1つの好ましい態様において、抗体は、特性（a）、（b）、（c）および（d）のうち少なくとも2つを呈する。1つのより好ましい態様において、抗体は、特性（a）（b）、（c）および（d）のうち少なくとも3つを呈する。1つのさらにより好ましい態様において、抗体は、特性（a）、（b）、（c）および（d）の4つすべてを呈する。もう1つの好ましい態様において、抗体はB7-H4と5×10-9 Mまたはそれ未満の親和性で結合する。さらにもう1つの好ましい態様において、抗体は、抗体が細胞毒とコンジュゲートされた時にインビボで、B7-H4を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する。
好ましくは、本開示の抗体は、B7-H4タンパク質と、5×10-8 Mまたはそれ未満のKDで結合するか、B7-H4タンパク質と3×10-8 Mまたはそれ未満のKDで結合するか、B7-H4タンパク質と1×10-8 Mまたはそれ未満のKDで結合するか、B7-H4タンパク質と7×10-9 Mまたはそれ未満のKDで結合するか、B7-H4タンパク質と6×10-9 Mまたはそれ未満のKDで結合するか、またはB7-H4タンパク質と5×10-9 Mまたはそれ未満のKDで結合する。B7-H4に対する抗体の結合親和性は、例えば、標準的なBIACORE分析によって評価可能である。
B7-H4に対する抗体の結合能力を評価するための標準的なアッセイは当技術分野で公知であり、これには例えば、ELISA、ウエスタンブロット、RIAおよびフローサイトメトリー分析が含まれる。抗体の結合動態（例えば、結合親和性）を、ELISA、スキャッチャードおよびBiacore（登録商標）システム分析といった当技術分野で公知の標準的なアッセイによって評価することもできる。もう1つの例として、本開示の抗体は、乳癌腫瘍細胞系、例えばSKBR3細胞系と結合しうる。
モノクローナル抗体1G11、2A7、2F9、12E1および13D12
本開示の例示的な抗体には、その全体が参照により本明細書に組み入れられるPCT出願PCT/US2006/061816号に記載されたように単離され、構造的に特徴づけられているヒトモノクローナル抗体1G11、2A7、2F9、12E1および13D12が含まれる。1G11、2A7、2F9、12E1および13D12のVHアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：1、2、3、4および5に示されている。1G11、2A7、2F9、12E1および13D12のVLアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：6、7、8、9および10に示されている。
これらの抗体のそれぞれがB7-H4と結合しうることを考慮に入れると、VH配列およびVL配列を「うまく組み合わせて（mixed and matched）」、本開示の他の抗B7H4結合性分子を作り出すことができる。そのような「うまく組み合わされた」抗体のB7-H4結合は、上記の結合アッセイ（例えば、FACSまたはELISA）を用いて検査することができる。好ましくは、VH鎖およびVL鎖をうまく組み合わせる場合には、特定のVH/VL対由来のVH配列を、構造的に類似したVH配列で置き換える。同様に、典型的には、特定のVH/VL対由来のVL配列を構造的に類似したVL配列で置き換える。したがって、1つの局面において、本開示は、
（a）SEQ ID NO：1、2、3、4および5からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびに
（b）SEQ ID NO：6、7、8、9および10からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含み；抗体がB7-H4、好ましくはヒトB7-H4と特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
好ましい重鎖および軽鎖の組み合わせには、以下が含まれる：
（a）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（b）SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（c）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（d）SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（e）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（f）SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（g）SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（h）SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（i）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（j）SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
もう1つの局面において、本開示は、1G11、2A7、2F9、12E1および13D12の重鎖および軽鎖のCDR1、CDR2およびCDR3、またはそれらの組み合わせを含む抗体を提供する。1G11、2A7、2F9、12E1および13D12のVH CDR1のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：11、12、13、14および15に示されている。1G11、2A7、2F9、12E1および13D12のVH CDR2のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：16、17、18、19および20に示されている。1G11、2A7、2F9、12E1および13D12のVH CDR3のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：21、22、23、24および25に示されている。1G11、2A7、2F9、12E1および13D12のVK CDR1のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：26、27、28、29および30に示されている。1G11、2A7、2F9、12E1および13D12のVK CDR2のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：31、32、33、34および35に示されている。1G11、2A7、2F9、12E1および13D12のVK CDR3のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：36、37、38、39および40に示されている。CDR領域は、Kabatシステム（Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）を用いて線で描かれている。
1G11、2A7、2F9、12E1および13D12と命名されたヒト抗体のそれぞれがB7-H4と結合しうること、ならびに抗原結合特異性が主としてCDR1、CDR2およびCDR3領域によって与えられることを考慮に入れると、VH CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにVK CDR1、CDR2およびCDR3配列を「うまく組み合わせて」（すなわち、異なる抗体由来のCDRをうまく組み合わせることが可能だが、各抗体はVH CDR1、CDR2およびCDR3ならびにVK CDR1、CDR2およびCDR3を含まなければならない）、本開示の他の抗B7-H4結合性分子を作り出すことができる。そのような「うまく組み合わされた」抗体のB7-H4との結合は、上記の結合アッセイ（例えば、FACS、ELISA、Biacore（登録商標）システム分析）を用いて検査することができる。好ましくは、VH CDR配列をうまく組み合わせる場合には、特定のVH配列由来のCDR1、CDR2および／またはCDR3配列を、構造的に類似したCDR配列で置き換える。同様に、VK CDR配列をうまく組み合わせる場合には、特定のVK配列由来のCDR1、CDR2および／またはCDR3配列を、典型的には、構造的に類似したCDR配列で置き換える。1つまたは複数のVHおよび／またはVLCDR領域の配列を、モノクローナル抗体1G11、2A7、2F9、12E1および13D12に関して本明細書に開示したCDR配列由来の構造的に類似した配列によって置換することによって、新規のVH配列およびVL配列を作り出せることは、当業者に容易に理解されるであろう。したがって、もう1つの局面において、本開示は、
（a）SEQ ID NO：11、12、13、14および15からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）SEQ ID NO：16、17、18、19および20からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）SEQ ID NO：21、22、23、24および25からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）SEQ ID NO：26、27、28、29および30からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）SEQ ID NO：31、32、33、34および35からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2；ならびに
（f）SEQ ID NO：36、37、38、39および40からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3
を含み；
B7-H4、好ましくはヒトB7-H4と特異的に結合する、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
1つの好ましい態様において、抗体は以下を含む：
（a）SEQ ID NO：11を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）SEQ ID NO：16を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）SEQ ID NO：21を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）SEQ ID NO：26を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）SEQ ID NO：31を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）SEQ ID NO：36を含む軽鎖可変領域CDR3。
もう1つの好ましい態様において、抗体は以下を含む：
（a）SEQ ID NO：12を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）SEQ ID NO：17を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）SEQ ID NO：22を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）SEQ ID NO：27を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）SEQ ID NO：32を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）SEQ ID NO：37を含む軽鎖可変領域CDR3。
もう1つの好ましい態様において、抗体は以下を含む：
（a）SEQ ID NO：13を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）SEQ ID NO：18を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）SEQ ID NO：23を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）SEQ ID NO：28を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）SEQ ID NO：33を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）SEQ ID NO：38を含む軽鎖可変領域CDR3。
もう1つの好ましい態様において、抗体は以下を含む：
（a）SEQ ID NO：14を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）SEQ ID NO：19を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）SEQ ID NO：24を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）SEQ ID NO：29を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）SEQ ID NO：34を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）SEQ ID NO：39を含む軽鎖可変領域CDR3。
もう1つの好ましい態様において、抗体は以下を含む：
（a）SEQ ID NO：15を含む重鎖可変領域CDR1；
（b）SEQ ID NO：20を含む重鎖可変領域CDR2；
（c）SEQ ID NO：25を含む重鎖可変領域CDR3；
（d）SEQ ID NO：30を含む軽鎖可変領域CDR1；
（e）SEQ ID NO：35を含む軽鎖可変領域CDR2；および
（f）SEQ ID NO：40を含む軽鎖可変領域CDR3。
CDR3ドメインがCDR1および／またはCDR2ドメインとは独立に単独でコグネイト抗原に対する抗体の結合特異性を決定しうること、ならびに共通のCDR3配列に基づく同じ結合特異性を有する複数の抗体が予測通りに作製されうることは、当技術分野で周知である。例えば、Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000)（マウス抗CD30抗体Ki-4の重鎖可変ドメインCDR3のみを用いたヒト化抗CD30抗体の作製を記載）；Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000)（親マウスMOC-31抗EGP-2抗体の重鎖CDR3配列のみを用いた組換え上皮糖タンパク質-2（EGP-2）抗体を記載）；Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998)（各メンバー抗体がCDR3ドメイン外部の異なる配列を含み、親マウス抗体と同じ高さのまたはそれよりも高い親和性で親マウス抗体と同じエピトープと結合可能である、マウス抗インテグリンαvβ3抗体LM609の重鎖および軽鎖の可変CDR3ドメインを用いた一群のヒト化抗インテグリンαvβ3抗体を記載）；Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994)（CDR3ドメインが抗原結合に対して最も大きな寄与をもたらすことを開示）；Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:2529-2533 (1995)（ヒト胎盤DNAに対する3種のFab（SI-1、SI-40およびSI-32）の重鎖CDR3配列を抗破傷風トキソイドFabの重鎖上にグラフティングし、それによって既存の重鎖CDR3を置き換えることを記載し、CDR3ドメインが単独で結合特異性を付与することを実証）；Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996)（単一特異性IgGである破傷風トキソイド結合性Fab p313抗体の重鎖に対する多重特異性親Fab LNA3の重鎖CDR3のみの移行が親Fabの結合特異性を保つために十分であったというグラフティング試験を記載）；Berezov et al., BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001)（抗HER2モノクローナル抗体のCDR3を基にしたペプチド模倣物を記載）；Igarashi et al., J. Biochem (Tokyo) 117:452-7 (1995)（抗ホスファチジルセリン抗体のCDR3ドメインに対応する12アミノ酸の合成ポリペプチドを記載）；Bourgeois et al., J. Virol 72:807-10 (1998)（抗呼吸器合胞体ウイルス（RSV）抗体の重鎖CDR3ドメインに由来する単一のペプチドがインビトロでウイルスを中和しうることを示す）；Levi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4374-8 (1993)（マウス抗HIV抗体の重鎖CDR3ドメインを基にしたペプチドを記載）；Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 (1994)（Z-DNA結合性抗体の重鎖CDR3領域のグラフティングによってscFvの結合を可能にすることを記載）；ならびにXu and Davis, Immunity 13:37-45 (2000)（重鎖CDR3での多様性が、他の点では同一であるIgM分子が種々のハプテンとタンパク質抗原との識別を可能にするのに十分であることを記載）を参照のこと。また、単一のCDRドメインによって定義される特許化された抗体を記載している、米国特許第6,951,646号；第6,914,128号；第6,090,382号；第6,818,216号；第6,156,313号；第6,827,925号；第5,833,943号；第5,762,905号および第5,760,185号も参照のこと。これらの参考文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
したがって、ある局面の範囲内で、本開示は、マウス抗体またはラット抗体などの非ヒト抗体由来の1つまたは複数の重鎖および／または軽鎖CDR3ドメインを含むモノクローナル抗体であって、B7-H4と特異的に結合しうるモノクローナル抗体を提供する。いくつかの態様の範囲内で、非ヒト抗体由来の1つまたは複数の重鎖および／または軽鎖CDR3ドメインを含むそのような本発明の抗体は、（a）結合をめぐって競合可能である；（b）機能特性を保つ；（c）同じエピトープと結合する；および／または（d）対応する非ヒト親抗体と類似の結合親和性を有する。
他の局面の範囲内で、本開示は、例えば非ヒト動物から得られるヒト抗体などの第1のヒト抗体由来の1つまたは複数の重鎖および／または軽鎖CDR3ドメインを含むモノクローナル抗体であって、第1のヒト抗体がB7-H4と特異的に結合することができ、第1のヒト抗体由来のCDR3ドメインがB7-H4に対する結合特異性を欠くヒト抗体内のCDR3ドメインを置き換えることでB7-H4と特異的に結合しうる第2のヒト抗体が作製されるようなモノクローナル抗体を開示する。いくつかの態様の範囲内で、第1のヒト抗体由来の1つまたは複数の重鎖および／または軽鎖のCDR3ドメインを含む本発明の抗体は、（a）結合をめぐって競合可能である；（b）機能特性を保つ；（c）同じエピトープと結合する；および／または（d）対応する第1の親ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。
特定の生殖系列配列を有する抗体
ある態様において、本開示の抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。
例えば、1つの好ましい態様において、本開示は、B7-H4と特異的に結合する抗体である、ヒトVH 4-34遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。もう1つの好ましい態様において、本開示は、B7-H4と特異的に結合する抗体である、ヒトVH 3-53遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
もう1つの好ましい態様において、本開示は、B7-H4と特異的に結合する抗体である、複合ヒトVH 3-9／D3-10／JTH6b遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
もう1つの好ましい態様において、本開示は、B7-H4と特異的に結合する抗体である、ヒトVK A27遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
もう1つの好ましい態様において、本開示は、B7-H4と特異的に結合する抗体である、ヒトVK L6／JK1遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
さらにもう1つの好ましい態様において、本開示は、抗体が、
（a）ヒトVH 4-34遺伝子、ヒトVH 3-53遺伝子または複合ヒトVH 3-9／D3-10／JH6b遺伝子（これらの遺伝子はそれぞれSEQ ID NO：51、52および53に示されたアミノ酸配列をコードする）の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み；
（b）ヒトVK A27遺伝子または複合ヒトVK L6／JK1遺伝子（これらの遺伝子はそれぞれSEQ ID NO：54および55に示されたアミノ酸配列をコードする）の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み；かつ
（c）前記抗体がB7-H4、典型的にはヒトB7-H4と特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。VH 4-34およびVK A27のVHおよびVKを有する抗体の例は、それぞれ1G11および13D12である。VH 3-53およびVK A27のVHおよびVKを有する抗体の例は、それぞれ2A7および2F9である。VH 3-9／D 3-10／JH6bおよびVK L6／JK1のVHおよびVKを有する抗体の一例は12E1である。
本明細書で用いる場合、ヒト抗体は、その抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、特定の生殖系列配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含む。そのような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを関心対象の抗原によって免疫化する段階、またはファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリを関心対象の抗原でスクリーニングする段階を含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較して、配列の点でヒト抗体の配列と最も近い（すなわち、一致度（％ identity）が最も大きい）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することによって、そのようなものとして同定しうる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、生殖系列配列と比較して、例えば自然発生的な体細胞突然変異、または部位特異的突然変異の意図的導入に起因する、アミノ酸の違いを有しうる。しかし、選択されるヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列の点で典型的には少なくとも90％同一であり、かつ、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖系列配列）と比較した場合にヒト抗体をヒトのものと同定させるアミノ酸残基を有する。ある場合には、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列の点で少なくとも95％、またはさらには少なくとも96％、97％、98％もしくは99％同一でありうる。典型的には、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とはアミノ酸10個以下の違いを呈すると考えられる。ある場合には、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは5個以下、またはさらには4個、3個、2個もしくは1個以下のアミノ酸の違いを呈しうる。
相同抗体
さらにもう1つの態様において、本開示の抗体は、本明細書に記載した好ましい抗体のアミノ酸配列に対して相同なアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで該抗体は本開示の抗B7-H4抗体の所望の機能特性を保っている。
例えば、本開示は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む、抗体-パートナー分子コンジュゲートを提供し、ここで、
（a）重鎖可変領域はSEQ ID NO：1、2、3、4および5からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80％相同なアミノ酸配列を含む；
（b）軽鎖可変領域はSEQ ID NO：6、7、8、9および10からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80％相同なアミノ酸配列を含む；
（c）前記抗体はヒトB7-H4と1×10-7 Mまたはそれ未満のKDで結合する；
（d）前記抗体は、B7-H4がトランスフェクトされたヒトCHO細胞と結合する；ならびに／または
（e）前記抗体は、細胞毒とコンジュゲートされた時にインビボで、B7-H4を発現する腫瘍細胞の腫瘍増殖を阻害する。
さまざまな態様において、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でありうる。
他の態様において、VHおよび／またはVLアミノ酸配列は、上記に示された配列に対して85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％相同でありうる。上記に示された配列のVHおよびVL領域に対して高い（すなわち、80％以上の）相同性を有するVHおよびVL領域を有する抗体は、SEQ ID NO：41、42、43、44、45、46、47、48、49および50をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的またはPCRによる突然変異誘発）に続いて、コードされる改変抗体の機能（すなわち、上記（c）、（d）および（e）に示される機能）の保持に関して、本明細書に記載した機能アッセイを用いて検査することによって得ることができる。
本明細書で用いる場合、2つのアミノ酸配列間の相同度（percent homology）は、2つの配列間の一致度（percent identity）と等価である。2つの配列間の一致度は、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた上で、配列が共有する同一な位置の数の関数（すなわち、相同度＝同一な位置の数／位置の総数×100）。配列の比較および2つの配列間の一致度の決定は、以下の非限定的な例で述べるように、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。
2つのアミノ酸配列間の一致度は、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている、E. Meyers and W. Millerのアルゴリズム（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)）を用いて決定可能であり、これはPAM120加重残基表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティ（gap length penalty）12およびギャップペナルティ（gap penalty）4を用いる。加えて、2つのアミノ酸配列間の一致度を、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）中のGAPプログラムに組み込まれている、Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）のアルゴリズムを用いて、Blossum 62マトリックスまたはPAM25Oマトリックスのいずれか、およびギャップ加重（gap weight）16、14、12、10、8、6または4、および長さ加重（length weight）1、2、3、4、5または6を用いることで決定することもできる。
追加的または代替的に、本開示のタンパク質配列を、例えば関連配列を同定するために公開データベースに対する検索を行うための、「クエリー配列」としてさらに用いることもできる。そのような探索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のXBLASTプログラム（バージョン2.0）を用いて行うことができる。BLASTタンパク質探索をXBLASTプログラム、スコア＝50、ワード長＝3を用いて行うことで、本開示の抗体分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップ有りアラインメント（gapped alignment）を得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されたようにギャップ有りBLAST（Gapped BLAST）を利用することができる。BLASTおよびギャップ有りBLASTプログラムを用いる場合には、各々のプログラムのデフォルトのパラメーター（例えば、XBLASTおよびNBLAST）が有用である。www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。
保存的改変物を有する抗体
ある態様において、本開示の抗体は、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域ならびにCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここでこれらのCDR配列のうち1つまたは複数は、本明細書に記載した好ましい抗体（例えば、1G11、2A7、2F9、12E1または13D12）に基づく特定のアミノ酸配列またはその保存的改変物を含み、かつ抗体は本開示の抗B7-H4抗体の所望の機能特性を保っている。
したがって、本開示は、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域ならびにCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む、抗体-パートナー分子コンジュゲートを提供し、ここで、
（a）重鎖可変領域CDR3配列は、SEQ ID NO：21、22、23、24および25からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変物を含む；
（b）軽鎖可変領域CDR3配列は、SEQ ID NO：36、37、38、39および40からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変物を含む；
（c）前記抗体はヒトB7-H4と1×10-7 Mまたはそれ未満のKDで結合する；
（d）前記抗体はB7-H4がトランスフェクトされたヒトCEO細胞と結合する；および／または
（e）前記抗体は細胞毒とコンジュゲートされた時にインビボで、B7-H4を発現する腫瘍細胞の腫瘍増殖を阻害する。
1つの好ましい態様において、重鎖可変領域CDR2配列は、SEQ ID NO：16、17、18、19および20からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変物を含み；かつ、軽鎖可変領域CDR2配列は、SEQ ID NO：31、32、33、34および35からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変物を含む。もう1つの好ましい態様において、重鎖可変領域CDR1配列は、SEQ ID NO：11、12、13、14および15からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変物を含み；かつ、軽鎖可変領域CDR1配列は、SEQ ID NO：26、27、28、29および30からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変物を含む。
さまざまな態様において、抗体は、例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でありうる。
本明細書で用いる場合、「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意な影響を及ぼすこともそれを変更させることもないアミノ酸の改変のことを指すものとする。そのような保存的改変にはアミノ酸の置換、付加および欠失が含まれる。改変は、当技術分野で公知の標準的な手法、例えば部位指定突然変異誘発およびPCRを介した突然変異誘発などによって、本開示の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、本開示の抗体のCDR領域内の1つまたは複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基と置き換えて、変更された抗体を機能の保持に関して検査することができる。
本開示の抗B7-H4抗体と同じエピトープと結合する抗体
もう1つの態様において、本開示は、本開示のB7-H4モノクローナル抗体（すなわち、B7-H4との結合をめぐって本開示のモノクローナル抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体）のいずれかによって認識されるヒトB7-H4上の同じエピトープと結合する抗体を提供する。好ましい態様において、交差競合試験のための参照抗体は、モノクローナル抗体1G11（それぞれSEQ ID NO：1および6に示されたVHおよびVL配列を有する）またはモノクローナル抗体2A7（それぞれSEQ ID NO：2および7に示されたVHおよびVL配列を有する）またはモノクローナル抗体2F9（それぞれSEQ ID NO：3および8に示されたVHおよびVL配列を有する）またはモノクローナル抗体12E1（それぞれSEQ ID NO：4および9に示されたVHおよびVL配列を有する）またはモノクローナル抗体13D12（それぞれSEQ ID NO：5および10に示されたVHおよびVL配列を有する）でありうる。そのような交差競合性の抗体は、標準的なB7-H4結合アッセイにおいて1G11、2A7、2F9、12E1または13D12と交差競合するその能力に基づいて同定することができる。例えば、BlAcore（登録商標）システム分析、ELISAアッセイまたはフローサイトメトリーを、本開示の抗体との交差競合を実証するために用いてもよい。被験抗体が、例えば1G11、2A7、2F9、12E1または13D12のヒトB7-H4との結合を阻害する能力能により、試験抗体がヒトB7-H4との結合をめぐって1G11、2A7、2F9、12E1または13D12と競合し、それ故に1G11、2A7、2F9、12E1または13D12と同じヒトB7-H4上のエピトープと結合しうることが実証される。1つの好ましい態様において、1G11、2A7、2F9、12E1または13D12によって認識されるものと同じヒトB7-H4上のエピトープと結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。
人為的に操作されて改変された抗体
本開示の抗体はさらに、本明細書に開示したVHおよび／またはVL配列のうちの1つまたは複数を有する抗体を、改変抗体を人為的に操作する（engineer）ための出発材料として用いて調製することができ、その改変抗体は出発時の抗体から変更された特性を有しうる。抗体は、一方もしくは両方の可変領域（すなわち、VHおよび／またはVL）の内部、例えば1つもしくは複数のCDR領域の内部および／または1つもしくは複数のフレームワーク領域の内部の、1つまたは複数の残基の改変によって人為的に操作することができる。追加的または代替的に、抗体を、例えば抗体のエフェクター機能を変更するために、定常領域内部の残基を改変することによって人為的に操作することもできる。実施することのできる可変領域の人為的操作の1つのタイプは、CDRグラフティングである。
抗体は、標的抗原と、主として6つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（CDR）内に位置するアミノ酸残基を介して相互作用する。この理由から、CDR内部のアミノ酸配列は、CDRの外部の配列よりも、個々の抗体間での多様性が大きい。CDR配列はほとんどの抗体-抗原相互作用を担っているため、特定の天然に存在する抗体からのCDR配列が異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列上にグラフティングされたものを含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることができる（例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327；Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525；Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033；Winterに対する米国特許第5,225,539号、ならびにQueen et al.に対する米国特許第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号および第6,180,370号を参照）。
したがって、本開示のもう1つの態様は、それぞれSEQ ID NO：11、12、13、14および15；SEQ ID NO：16、17、18、19および20；ならびにSEQ ID NO：21、22、23、24および25からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびにそれぞれSEQ ID NO：26、27、28、29および30；SEQ ID NO：31、32、33、34および35；およびSEQ ID NO：36、37、38、39および40からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、そのような抗体は、モノクローナル抗体1G11、2A7、2F9、12E1または13D12のVHおよびVL CDR配列を含み、さらにこれらの抗体由来の異なるフレームワーク配列を有してもよい。
そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開DNAデータベースまたは刊行された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列DNA配列は、「VBase」ヒト生殖系列配列データベース（インターネット上のwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能）、ならびにKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242；Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798；およびCox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836中に見出すことができる；それらのそれぞれの内容は、参照により明示的に本明細書に組み入れられる。もう1つの例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列DNA配列を、Genbankデータベース中に見出すこともできる。例えば、HCo7 HuMAbマウスで見いだされた以下の重鎖生殖系列配列を、以下のGenbankアクセッション番号で入手することが可能である：1-69（NG_0010109、NT_024637およびBC070333）、3-33（NG_0010109およびNT_024637）および3-7（NG_0010109およびNT_024637）。もう1つの例として、HCo12 HuMAbマウスで見いだされた以下の重鎖生殖系列配列を、以下のGenbankアクセッション番号で入手することが可能である：1-69（NG_0010109、NT_024637およびBC070333）、5-51（NG_0010109およびNT_024637）、4-34（NG_0010109およびNT_024637）、3-30.3（CAJ556644）および（AJ406678）。ヒト重鎖および軽鎖生殖系列配列のさらにもう1つの供給源は、IMGT（http://imgt.cines.fr）から入手可能なヒト免疫グロブリン遺伝子のデータベースである。
抗体タンパク質配列を、当業者に周知のギャップ有りBLAST（Gapped BLAST）（Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402）と呼ばれる配列類似性の検索方法の1つを用いてまとめられたタンパク質配列データベースに対して比較する。BLASTは、抗体配列とデータベース配列との間の統計学的に有意なアラインメントが、整列化されたワードの高スコアリングセグメント対（HSP）を含む可能性が高いという点でヒューリスティックなアルゴリズムである。スコアを延長およびトリミングのいずれによっても改善させることができないセグメント対はヒットと呼ばれる。手短に述べると、VBASE由来のヌクレオチド配列（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php）が翻訳され、FR1からFR3までのフレームワーク領域を含む領域が保持される。データベース配列の平均長は98残基である。タンパク質の全長にわたって正確に一致する二重配列は除去される。低複雑性フィルタ（low complexity filter）をオフにし、BLOSUM62の置換マトリックスを用いる点を例外として、blastpプログラムをデフォルトの標準的なパラメーターで用いるタンパク質におけるBLAST探索で、配列一致が得られる上位5つのヒットを選別する。ヌクレオチド配列を6つのフレームすべてで翻訳させ、データベース配列の一致するセグメント内に終止コドンを全く有しないフレームはヒットの可能性があると考える。続いてこのことを、抗体配列を6つのフレームすべてで翻訳し、それらの翻訳物を6つのフレームすべてで動的に翻訳されたVBASEヌクレオチド配列と比較する、BLASTプログラムtblastxを用いて確認する。IMGT（http://imgt.cines.fr）から入手可能なものなどの、他のヒト生殖系列配列のデータベースを、上記のVBASEと同様に検索することもできる。
同一性とは、抗体配列とタンパク質データベースとの間の、配列の全長にわたっての正確なアミノ酸の一致である。ポジティブ（同一性＋置換の一致）とは同一ではなく、BLOSUM62置換行列によって導かれるアミノ酸置換である。抗体配列がデータベース配列のうちの2つと同じ同一性で一致する場合には、最もポジティブが多いヒットが一致する配列ヒットであると判断されると考えられる。
本開示の抗体において用いるための好ましいフレームワーク配列は、本開示の選択された抗体によって用いられるフレームワーク配列と構造的に類似したもの、例えば、本開示の好ましいモノクローナル抗体によって用いられるVH 4-34フレームワーク配列（SEQ ID NO：51）および／またはVH 3-53フレームワーク配列（SEQ ID NO：52）および／または複合VH 3-9／D3-10／JH6bフレームワーク配列（SEQ ID NO：53）および／またはVK A27フレームワーク配列（SEQ ID NO：54）および／または複合VK L6／JK1フレームワーク配列（SEQ ID NO：55）と類似したものである。VH CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにVK CDR1、CDR2およびCDR3配列は、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子中に見いだされる配列と同一の配列を有するフレームワーク領域上にグラフティングすることができ、またはCDR配列を、生殖系列配列と比較して1つもしくは複数の突然変異を有するフレームワーク領域上にグラフティングすることもできる。例えば、抗体の抗原結合能力を維持するため、または高めるために、フレームワーク領域内部の残基を突然変異させることが有益なことが見いだされている（例えば、Queenらに対する米国特許第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号および第6,180,370号を参照）。
もう1つのタイプの可変領域改変は、VHおよび／またはVK CDR1、CDR2およびCDR3領域内のアミノ酸残基を突然変異させて、それによって関心対象の抗体の1つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を向上させることである。突然変異を導入するために部位指定突然変異誘発またはPCRを介した突然変異誘発を行って、抗体の結合または関心対象の他の機能特性に対する影響を、本明細書中に記載され、実施例に提示されているインビトロアッセイまたはインビボアッセイで評価することができる。典型的には、（以上に考察したような）保存的改変を導入する。突然変異はアミノ酸の置換、追加および欠失であってよいが、典型的には置換である。さらに、典型的には、CDR領域内の変更は1、2、3、4または5残基以下である。
したがって、もう1つの態様において、本開示は、（a）SEQ ID NO：11、12、13、14および15からなる群より選択されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：11、12、13、14および15と比べて1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つのアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むVH CDR1領域；（b）SEQ ID NO：16、17、18、19および20からなる群より選択されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：16、17、18、19および20と比べて1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つのアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むVH CDR2領域；（c）SEQ ID NO：21、22、23、24および25からなる群より選択されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：21、22、23、24および25と比べて1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つのアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むVH CDR3領域；（d）SEQ ID NO：26、27、28、29および30からなる群より選択されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：26、27、28、29および30と比べて1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つのアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むVK CDR1領域；（e）SEQ ID NO：31、32、33、34および35からなる群より選択されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：31、32、33、34および35と比べて1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つのアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むVK CDR2領域；ならびに（f）SEQ ID NO：36、37、38、39および40からなる群より選択されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：36、37、38、39および40と比べて1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つのアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むVK CDR3領域、を含む重鎖可変領域を含む抗B7-H4モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む、抗体-パートナー分子コンジュゲートを提供する。
本開示の人為的に操作された抗体には、例えば抗体の特性を向上させるために、VHおよび／またはVK内部のフレームワーク残基内に改変が加えられたものが含まれる。典型的には、そのようなフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を低下させるために加えられる。例えば、1つのアプローチは、1つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰突然変異させる」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を経ている抗体は、抗体が由来する生殖系列とは異なるフレームワーク残基を含みうる。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列と比較することによって同定することができる。
例えば、1G11に関して、VHのアミノ酸残基#71（FR3の内部）はアラニンであり、一方、対応するVH 4-34生殖系列配列中ではこの残基はバリンである。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列構成に戻すために、体細胞突然変異を、例えば、部位指定突然変異誘発およびPCRを介した突然変異誘発によって、生殖系列配列に「復帰突然変異」させることができる（例えば、1G11のVHのFR3の残基#71をアラニンからバリンに「復帰突然変異」させることができる）。そのような「復帰突然変異した」抗体も本開示の範囲に含まれるものとする。
もう1つの例として、1G11に関して、VHのアミノ酸残基#81（FR3の内部）はアルギニンであり、一方、対応するVH 4-34生殖系列配列中ではこの残基はリジンである。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列構成に戻すために、例えば、1G11のVHのFR3の残基#81をアルギニンからリジンに「復帰突然変異」させることができる。そのような「復帰突然変異した」抗体も本開示の範囲に含まれるものとする。
もう1つの例として、13D12に関して、VHのアミノ酸残基#83（FR3の内部）はアスパラギンであり、一方、対応するVH 4-34生殖系列配列中ではこの残基はセリンである。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列構成に戻すために、例えば、13D12のVHのFR3の残基#83をアスパラギンからセリンに「復帰突然変異」させることができる。そのような「復帰突然変異した」抗体も本開示の範囲に含まれるものとする。
もう1つの例として、2A7に関して、VHのアミノ酸残基#67（FR3の内部）はバリンであり、一方、対応するVH 3-53生殖系列配列中ではこの残基はフェニルアラニンである。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列構成に戻すために、例えば、2A7のVHのFR3の残基#67をアスパラギンからセリンに「復帰突然変異」させることができる。そのような「復帰突然変異した」抗体も本開示の範囲に含まれるものとする。
もう1つの例として、2F9に関して、VHのアミノ酸残基#28（FR1の内部）はイソロイシンであり、一方、対応するVH 3-53生殖系列配列中ではこの残基はトレオニンである。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列構成に戻すために、例えば、2F9のVHのFR1の残基#28をイソロイシンからトレオニンに「復帰突然変異」させることができる。そのような「復帰突然変異した」抗体も本開示の範囲に含まれるものとする。
もう1つの例として、12E1に関して、VHのアミノ酸残基#23（FR1の内部）はバリンであり、一方、対応するVH 3-9生殖系列配列中ではこの残基はアラニンである。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列構成に戻すために、例えば、12E1のVHのFR1の残基#23をバリンからアラニンに「復帰突然変異」させることができる。そのような「復帰突然変異した」抗体も本開示の範囲に含まれるものとする。
もう1つの例として、1G11に関して、VKのアミノ酸残基#7（FR1の内部）はフェニルアラニンであり、一方、対応するVK A27生殖系列配列中ではこの残基はセリンである。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列構成に戻すために、例えば、1G11のVKのFR1の残基#7をフェニルアラニンからセリンに「復帰突然変異」させることができる。そのような「復帰突然変異した」抗体も本開示の範囲に含まれるものとする。
もう1つの例として、1G11に関して、VKのアミノ酸残基#47（FR2の内部）はバリンであり、一方、対応するVK A27生殖系列配列中ではこの残基はロイシンである。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列構成に戻すために、例えば、1G11のVKのFR2の残基#47をバリンからロイシンに「復帰突然変異」させることができる。そのような「復帰突然変異した」抗体も本開示の範囲に含まれるものとする。
もう1つのタイプのフレームワーク改変は、T細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的免疫原性を低下させるために、フレームワーク領域内部、またはさらには1つもしくは複数のCDR領域内部の1つもしくは複数の残基を突然変異させることを伴う。このアプローチは「脱免疫化（deimmunization）」とも称され、Carrらによる米国特許公報第20030153043号に詳細に記載されている。
フレームワーク領域またはCDR領域の内部に加えられる改変に対して追加的または代替的に、典型的には抗体の1つまたは複数の機能特性、例えば血清中半減期、補体固定、Fc受容体結合および／または抗原依存性細胞傷害作用を変更するために、Fc領域内に改変を含むように本発明の抗体を人為的に操作することもできる。さらに、本発明の抗体を、同じく抗体の1つまたは複数の機能特性を変更するために、化学的に改変する（例えば、1つまたは複数の化学部分が抗体に結合できる）またはそのグリコシル化が変更されるように改変することもできる。これらの態様のそれぞれについては、以下でさらに詳細に説明する。Fc領域内の残基の番号付けは、KabatのEUインデックスのものである。
1つの態様においては、CH1のヒンジ領域を、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化するように、例えば増加または減少するように改変する。このアプローチは、Bodmerらによる米国特許第5,677,425号にさらに記載されている。CH1のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の集合を促進するため、または抗体の安定性を増大もしくは低下させるために変更される。
もう1つの態様においては、抗体の生物学的半減期を減少させるために、抗体のFcヒンジ領域を突然変異させる。より具体的には、ネイティブ性Fc-ヒンジドメインのブドウ球菌プロテインA（SpA）結合性に比して抗体のSpA結合性が損なわれるように、Fc-ヒンジ断片のCH2-CH3ドメイン境界領域に1つまたは複数のアミノ酸突然変異を導入する。このアプローチは、Wardらによる米国特許第6,165,745号にさらに詳細に記載されている。
もう1つの態様において、抗体は、その生物学的半減期が増大するように改変される。さまざまなアプローチが可能である。例えば、Wardに対する米国特許第6,277,375号に記載されているように、以下の突然変異：T252L、T254S、T256Fの1つまたは複数を導入することができる。または、生物学的半減期を増大させるために、Prestaらによる米国特許第5,869,046号および第6,121,022号に記載されているように、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから得られるサルベージ（salvage）受容体結合エピトープを含むように、抗体をCH1またはCL領域内部で変更することもできる。
さらに他の態様において、Fc領域は、抗体のエフェクター機能を変更するために、少なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置き換えることによって変更される。例えば、抗体がエフェクターリガンドに対して変更された親和性を有するが親抗体の抗原結合能は保っているように、アミノ酸残基234、235、236、237、297、318、320および322から選択される1つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基と置き換えることができる。親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えばFc受容体または補体のC1成分であり得る。このアプローチは、いずれもWinterらによる米国特許第5,624,821号および第5,648,260号にさらに詳細に記載されている。
もう1つの例では、抗体のC1q結合が変更する、および／または補体依存性細胞傷害作用（CDC）が低下もしくは消失するように、アミノ酸残基329、331および322から選択される1つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基と置き換える。このアプローチは、Idusogieらによる米国特許第6,194,551号にさらに詳細に記載されている。
もう1つの例では、アミノ酸位置231および239内の1つまたは複数のアミノ酸残基を変更し、それによって抗体が補体を固定する能力を変更する。このアプローチは、BodmerらによるPCT公報WO 94/29351号にさらに記載されている。
さらにもう1つの例では、以下の位置：
Figure 2011505372
の1つまたは複数のアミノ酸を改変することによって、抗体が抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）を媒介する能力を増大させるため、および／またはFcγ受容体に対する抗体の親和性を高めるために、Fc領域を改変する。このアプローチはさらに、PrestaによるPCT公報WO 00/42072号にさらに記載されている。さらに、ヒトIgG1上のFcγR1、FcγRII、FcγRIIIおよびFcRnの結合位置がマッピングされており、結合性が向上した変異体も記載されている（Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604を参照）。位置256、290、298、333、334および339での特定の変異がFcγRIIIに対する結合を向上させることが示されている。加えて、以下の組み合わせ突然変異体がFcγRIIIに対する結合を改善することも示されている：T256A／S298A、S298A／E333A、S298A／K224AおよびS298A／E333A／K334A。
さらにもう1つの態様において、本発明の抗体のC末端は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第60／957,271号に記載されたように、システイン残基の導入によって改変される。そのような改変には、完全長重鎖配列のC末端またはその付近での既存のアミノ酸残基の置き換え、ならびに完全長重鎖配列のC末端への、システインを含む伸長部の導入が非限定的に含まれる。好ましい態様において、システインを含む伸長部は（N末端からC末端の順に）アラニン-アラニン-システインの配列を含む。
好ましい態様において、そのようなC末端システイン改変の存在は、治療剤またはマーカー分子などのパートナー分子のコンジュゲーションのための位置をもたらす。特に、C末端システインの改変に起因する反応性チオール基の存在を利用して、以下に詳述するジスルフィドリンカーを用いたパートナー分子をコンジュゲートすることができる。この様式での抗体とパートナー分子とのコンジュゲーションは、特定の結合部位に対する制御を向上させることを可能にする。さらに、C末端またはその付近に結合部位を導入することによって、コンジュゲーションを、それが抗体の機能特性との干渉を低下または除去し、かつ簡易化された分析およびコンジュゲート調製物の質の制御を可能にするように最適化することができる。
さらにもう1つの態様においては、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、無グリコシル化（aglycosylated）抗体を作製することができる（すなわち、抗体がグリコシル化を欠く）。グリコシル化を改変することで、例えば、抗原に対する抗体の親和性を高めることができる。そのような糖質改変は、例えば、抗体配列内部の1つまたは複数のグリコシル化部位を変更することによって達成することができる。例えば、1つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それによってその部位でのグリコシル化を消失させる、1つまたは複数のアミノ酸置換を行うことができる。そのような無グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高めることがある。そのようなアプローチは、Coらに対する米国特許第5,714,350号および第6,350,861号にさらに記載されている。グリコシル化を変更するためのさらなるアプローチが、Hanaiらに対する米国特許第7,214,775号、Prestaに対する米国特許第6,737,056号、Prestaに対する米国特許出願第20070020260号、Dickeyらに対するPCT公報WO／2007／084926号、Zhuらに対するPCT公報WO／2006／089294号、およびRavetchらに対するPCT公報WO／2007／055916号にさらに詳述されており、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
追加的または代替的に、フコシル残基の量が少ない低フコシル化（hypofucosylated）抗体または二分性GlcNAc構造を多く有する抗体のような変化したタイプのグリコシル化を有する抗体を作製することもできる。そのような変化したグリコシル化パターンは、抗体のADCC能力を増大させることが示されている。そのような糖質改変は、例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞内で抗体を発現させることによって達成することができる。グリコシル化機構が変化した細胞は当技術分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それにより、グリコシル化が変化した抗体を産生させるための宿主細胞として用いることができる。例えば、細胞系Ms704、Ms705およびMs709はフコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8（α(1,6)フコシルトランスフェラーゼ）を欠いており、その結果、Ms704、Ms705およびMs709細胞系で発現される抗体はその糖質上にフコースを有しない。Ms704、Ms705およびMs709 FUT8-/-細胞系は、2つの置換ベクターを用いたCHO／DG44細胞におけるFUT8遺伝子の標的化破壊によって作り出された（Yamaneらによる米国特許出願第20040110704号、およびYamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22を参照）。もう1つの例として、Hanaiらによる欧州特許第1,176,195号は、フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が機能的に破壊された細胞系であって、その結果、そのような細胞系で発現された抗体はα1,6結合に関連した酵素が減少または消失することによって低フコシル化を呈するような細胞系を記載している。Hanaiらはまた、抗体のFc領域と結合するN-アセチルグルコサミンにフコースを付加する酵素活性が低いか、またはその酵素活性を有しない細胞系、例えばラット骨髄腫細胞系YB2／0（ATCC CRL 1662）も記載している。PrestaによるPCT公報WO 03／035835号は、Asn（297）が結合した糖質にフコースを結合させる能力が低下しており、同じくその宿主細胞で発現された抗体の低フコシル化をもたらす変異CHO細胞系であるLec13細胞を記載している（Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照）。UmanaらによるPCT公報WO 99／54342号は、糖タンパク質を改変するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（GnTIII））を発現するように人為的に操作された細胞系であって、その結果、人為的に操作された細胞系で発現される抗体が、抗体のADCC活性の増加をもたらす二分性GlcNac構造の増加を呈するような細胞系を記載している（Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照）。または、抗体のフコース残基をフコシダーゼ酵素を用いて切断して除去することもできる。例えば、フコシダーゼα-L-フコシダーゼは、フコシル残基を抗体から除去する（Tarentino, A. L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23）。
追加的または代替的に、変化したタイプのグリコシル化を有し、その変化が抗体のシアル化のレベルと関係している抗体を作製することもできる。そのような改変は、Dickeyらに対するPCT公報WO／2007／084926号およびRavetchらに対するPCT公報WO／2007／055916号に記載されており、それらは両方ともその全体が参照により組み入れられる。例えば、アルスロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafacens）シアリダーゼなどのシアリダーゼによる酵素反応を用いることができる。そのような反応の条件は一般に、米国特許第5,831,077号に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。適した酵素の他の非限定的な例には、それぞれSchloemer et al., J. Virology, 15(4), 882-893 (1975)およびLeibiger et al., Biochem J. 338, 529-538 (1999)に記載されているノイラミニダーゼおよびN-グリコシダーゼFがある。脱シアル化抗体を、アフィニティークロマトグラフィーを用いてさらに精製することもできる。または、シアリルトランスフェラーゼ酵素を用いることなどによる、シアル化のレベルを上昇させるための方法を用いることもできる。そのような反応の条件は一般に、Basset et al., Scandinavian Journal of Immunology, 51(3), 307-311(2000)に記載されている。
本発明によって想定される本明細書における抗体のもう1つの改変はペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を延長させるためにペグ化することができる。抗体をペグ化するためには、抗体またはその断片を、典型的には、ポリエチレングリコール（PEG）、例えばPEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などと、1つまたは複数のPEG基が抗体または抗体断片と結合するような条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性PEG分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）を用いるアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われる。本明細書で用いる場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質を誘導体化するために用いられるあらゆる形態のPEG、例えば、モノ(C1-C10)アルコキシ-もしくはアリールオキシ-ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール-マレイミドなどを範囲に含むものとする。ある態様において、ペグ化される抗体は、無グリコシル化（aglycosylated）抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当技術分野において公知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、Nishimuraらによる欧州特許第0 154 316号、およびIshikawaらによる欧州特許第0 401 384号を参照。
抗体断片および抗体模倣物
本発明のコンジュゲートは、抗原結合成分として従来の抗体には限定されず、抗体断片および抗体模倣物の使用を通じて実施することもできる。非常にさまざまな抗体断片および抗体模倣技術が現在では開発されており、当技術分野で広く知られている。
ドメイン抗体（dAb）は、抗体の最小の機能的結合単位―分子量およそ13kDa―であり、抗体の重鎖（VH）または軽鎖（VL）のいずれかの可変領域に対応する。ドメイン抗体およびそれらの作製方法のさらなる詳細については、米国特許第6,291,158号；第6,582,915号；第6,593,081号；第6,172,197号；および第6,696,245号；米国特許出願第2004／0110941号；欧州特許第1433846号、第0368684号および第0616640号；WO 2005／035572号、2004／101790号、2004／081026号、2004／058821号、2004／003019号および2003／002609号に記載があり、これらのそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
ナノボディ（Nanobody）は、天然の重鎖抗体の固有の構造および機能特性を含む抗体由来のタンパク質である。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（VHH）および2つの定常ドメイン（CH2およびCH3）を含む。重要なことに、クローニングされて単離されたVHHドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能を保有する安定的なポリペプチドである。ナノボディはヒト抗体のVHドメインとの高い相同性を有し、活性の低下を全く伴うことなしにさらにヒト化することができる。重要なことに、ナノボディは免疫原性である可能性が低い。
ナノボディは、従来の抗体の利点と低分子医薬の重要な特徴とを兼ね備えている。ナノボディは、従来の抗体と同様に、高い標的特異性および親和性ならびに低い固有毒性を示す。さらに、ナノボディは極めて安定であり、注射以外の手段によって投与することができ（例えば、WO 2004／041867号を参照）、かつ製造が容易である。ナノボディの他の利点には、その小さいサイズの結果として希少なまたは隠されたエピトープを認識すること、その固有の三次元構造のためにタンパク質標的の空洞または活性部位の中に高い親和性および選択性で結合性すること、薬物形式の柔軟性、半減期の調節性ならびに薬物発見の容易さおよび速さが含まれる。
ナノボディは単一の遺伝子によってコードされ、ほぼすべての原核生物および真核生物宿主、例えば大腸菌（E.coli）（例えば、米国特許第6,765,087号を参照、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）、カビ（例えば、コウジカビ属（Aspergillus）またはトリコデルマ属（Trichoderma））および酵母（例えば、サッカロミセス属（Saccharomyces）、クリベロミセス属（Kluyveromyces）、ハンゼヌラ属（Hansenula）またはピキア属（Pichia））（例えば、米国特許第6,838,254号を参照、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）において効率的に産生される。
ナノクローン（Nanoclone）法（例えば、WO 06／079372号を参照、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）は、B細胞の自動化ハイスループット選択に基づいて所望の標的に対するナノボディを生成させ、本発明の状況で用いうると考えられる。
ユニボディ（UniBody）はもう1つの抗体断片技術であり、これはIgG4抗体のヒンジ領域の除去に基づく。ヒンジ領域の欠失は、従来のIgG4抗体の本質的に半分のサイズでありかつIgG4抗体の二価結合領域ではなく一価結合領域を有する分子を生じさせる。さらに、ユニボディは大体より小さいため、より大きな固形腫瘍全体にわたってより良好な分布を示し、有利な有効性を発揮する可能性がある。ユニボディのさらなる詳細は、WO 2007／059782号の参照によって得ることができ、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
アフィボディ（Affibody）分子は、ブドウ球菌プロテインAの3ヘリックスバンドル（three helix bundle）IgG結合ドメインに由来する、58アミノ酸残基のタンパク質ドメインを基にした親和性タンパク質である。このドメインはコンビナトリアルファージミドライブラリーの構築のためのスカフォールドとして用いられており、それから所望の分子を標的にするアフィボディ変異体をファージディスプレイ技術を用いて選択することができる（Nord et al., Nat Biotechnol l997;15:772-7；Ronmark et al., Eur J Biochem 2002;269:2647-55）。アフィボディ分子の単純で強固な構造および低い分子量（6kDa）のために、それらは検出用試薬および受容体相互作用の阻害薬といった非常にさまざまな用途に適している。アフィボディに関するさらなる詳細は、米国特許第5,831,012号に記載があり、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。標識されたアフィボディは、アイソフォームの存在量を決定するための画像化用途においても有用である。
ダルピン（DARPin）（設計されたアンキリンリピートタンパク質）は、抗体でないポリペプチドの結合能力を利用するDRP（設計されたリピートタンパク質）抗体模倣技術を具現化したものである。アンキリンおよびロイシンリッチリピートタンパク質などのリピートタンパク質は遍在性の結合性分子であり、抗体とは異なり、細胞内および細胞外に生じる。それらの固有のモジュール構造は構造単位の反復（リピート）を特徴とし、これらはともに積み重なって、可変かつモジュール式の標的結合表面を呈する伸長したリピートドメインを形成する。このモジュール性に基づき、非常に多様化した結合特異性を有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを作製することができる。この戦略は、可変な表面残基を示す自己適合性（self-compatible）リピートの共通設計およびそれらのリピートドメインへのランダムな集合を含む。ダルピンおよび他のDRP技術に関するそのほかの情報は、米国特許出願第2004／0132028号およびWO 02／20565号に記載があり、それらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
アンチカリンはもう1つの抗体模倣技術である。この場合、結合特異性は、ヒトの組織および体液中で天然かつ豊富に発現される低分子量タンパク質のファミリーであるリポカリンに由来する。リポカリンは、化学的感受性があるかまたは不溶性の化合物の生理的輸送および貯蔵に関連したインビボでのある範囲の機能を遂行するように進化している。リポカリンは、タンパク質の一方の末端で4つのループを支持する高度に保存されたβ-バレルを含む強固な固有の構造を有する。これらのループは結合ポケットへの入口を形成し、分子のこの部分におけるコンフォメーションの違いは、個々のリポカリン間の結合特異性の差異の一因となる。
保存されたβシートフレームワークによって支持される超可変ループの全体構造は免疫グロブリンを連想させるが、リポカリンはサイズの点で抗体とはかなり異なり、単一の免疫グロブリンドメインよりもわずかに大きい160〜180アミノ酸の単一のポリペプチド鎖で構成される。
リポカリンをクローニングして、そのループを人為的な操作に供することでアンチカリンが作り出される。構造的に多様なアンチカリンのライブラリーが作製されており、アンチカリンディスプレイは、結合機能の選択およびスクリーニングと、それに続く原核系または真核系におけるさらなる分析のための可溶性タンパク質の発現および産生を可能にする。諸研究により、事実上あらゆるヒト標的タンパク質に対して特異的なアンチカリンを開発することができ、ナノモルまたはより高い範囲にある結合親和性を得ることができることが実証されている。アンチカリンに関するそのほかの情報は、米国特許第7,250,297号およびWO 99／16873号に記載があり、それらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
アビマー（Avimer）は、本発明の状況で有用なもう1つのタイプの抗体模倣技術である。アビマーは、インビトロでのエクソンシャッフリングおよびファージディスプレイによってヒト細胞外受容体ドメインの大規模ファミリーから進化させたものであり、結合特性および阻害特性を備えた多ドメインタンパク質を生成する。複数の独立した結合ドメインを結合することによってアビディティーがもたらされ、結果として従来の単一エピトープ結合タンパク質と比べて親和性および特異性が向上することが示されている。他の可能性のある利点には、大腸菌（Escherichia coli）内での多重標的特異的分子の単純および効率的な産生、熱安定性の向上、およびプロテアーゼに対する抵抗性が含まれる。ナノメートル以下の親和性を有するアビマーが種々の標的に対して得られている。アビマーに関するそのほかの情報は、米国特許出願第2006／0286603号、第2006／0234299号、第2006／0223114号、第2006／0177831号、第2006／0008844号、第2005／0221384号、第2005／0164301号、第2005／0089932号、第2005／0053973号、第2005／0048512号、第2004／0175756号に記載があり、それらはすべてその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
バーサボディ（Versabody）は、本発明の状況で用いうるもう1つの抗体模倣技術である。バーサボディは、システインが15％を超える3〜5kDaの小型タンパク質であり、典型的なタンパク質が有する疎水性コアを置き換えるジスルフィド密度の高いスカフォールドを形成する。この置き換えは、より小型で、より親水性であり（すなわち、凝集および非特異的結合が低い傾向がある）、プロテアーゼおよび熱に対してより抵抗性であり、かつMHC提示の大部分に寄与する残基が疎水性であることからT細胞エピトープの密度が低いタンパク質を生じさせる。これらの特性は免疫原性に影響を及ぼすことが周知であり、それらは相まって免疫原性の大きな低下を引き起こすと予想される。
バーサボディの構造を考えると、これらの抗体模倣物は多価性、多重特異性、半減期機構の多様性、組織標的化モジュール、および抗体Fc領域の欠如を含む、用途の広い形式を提供する。さらに、バーサボディは大腸菌で高収量で製造され、かつ、その親水性および小さなサイズのために可溶性が高く、高濃度で製剤化することができる。バーサボディは極めて熱安定性が高く、長い貯蔵寿命をもたらす。バーサボディに関するそのほかの情報は、米国特許出願第2007／0191272号に記載があり、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
抗体断片および抗体模倣技術に関する以上の説明は、包括的であることを意図してはいない。Qui et al., Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007)に概説されている相補性決定領域の融合物のようなポリペプチドに基づく代替的な技術、ならびに米国特許第5,789,157号、第5,864,026号、第5,712,375号、第5,763,566号、第6,013,443号、第6,376,474号、第6,613,526号、第6,114,120号、第6,261,774号および第6,387,620号に記載されているRNAアプタマー技術のような核酸に基づく技術、を含む、種々のさらなる技術を本発明の状況で用いることが可能と考えられ、これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる。
抗体の物理的特性
本開示の抗体は、抗B7-H4抗体のさまざまな物理的特性によってさらに特徴づけることができる。さまざまなアッセイを用いて、これらの物理的特性に基づいて種々のクラスの抗体の検出および／または識別が可能である。
いくつかの態様において、本開示の抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかにおいて1つまたは複数のグリコシル化部位を有しうる。可変領域内に1つまたは複数のグリコシル化部位が存在する結果、抗原結合の変化によって抗体の免疫原性の増大または抗体のpKの変化が生じうる（Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702；Gala FA and Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94；Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109；Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R；Parekh et al (1985) Nature 316:452-7；Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706）。グリコシル化は、N-X-S／T配列を含むモチーフで生じることが知られている。可変領域のグリコシル化は、抗体の切断によりFabを生じさせ、続いて過ヨウ素酸酸化およびシッフ塩基形成を測定するアッセイを用いてグリコシル化を調べる、Glycoblotアッセイを用いて検査することができる。または、可変領域のグリコシル化を、糖類をFabから切断させて単糖類にして、個々の糖類の含有量を分析する、Dionex光クロマトグラフィー（Dionex-LC）を用いて検査することもできる。場合によっては、可変領域のグリコシル化を含まない抗B7-H4抗体を有することが好ましい。これは、可変領域内にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択するか、またはグリコシル化モチーフ内部の残基を当技術分野で周知の標準的な手法を用いて突然変異させることによって実現しうる。
1つの好ましい態様において、本開示の抗体はアスパラギン異性部位を含まない。脱アミド化またはイソアスパラギン酸の影響はそれぞれN-GまたはD-G配列で生じうる。脱アミド化またはイソアスパラギン酸の影響は、主鎖ではなく側鎖のカルボキシ末端から離れてキンク構造を生成することによって抗体の安定性を低下させるイソアスパラギン酸を生じさせる。イソアスパラギン酸の生成は、逆相HPLCを用いてイソアスパラギン酸について検査する、異性体定量分析（iso-quant assay）を用いて測定可能である。
各抗体は固有の等電点（pI）を有すると考えられるが、抗体は一般に6〜9.5のpH範囲に収まると考えられる。IgG1抗体に関するpIは典型的には7〜9.5のpH範囲に収まり、IgG4抗体に関するpIは典型的には6〜8のpH範囲に収まる。抗体はこの範囲外のpIを有することもある。その影響は一般に未知であるが、正常な範囲外のpIを有する抗体はインビボ条件下である程度のアンフォールディングおよび不安定性を有しうるという推測がある。等電点は、pH勾配を作り出して、精度向上のためにレーザー集光を利用することもできる、キャピラリー等電点電気泳動アッセイを用いて検査可能である（Janini et al (2002) Electrophoresis 23:1605-11；Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89；Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67）。場合によっては、正常な範囲内に収まるpI値を含む抗B7-H4抗体を有することが好ましい。これは、正常な範囲内のpIを有する抗体を選択するか、または荷電表面残基を当技術分野で周知の標準的な技術を用いて突然変異させることによって実現しうる。
各抗体は、熱安定性を示す融解温度を有すると考えられる（Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71）。熱安定性が高いほど、インビボでの全体的な抗体安定性が高いことを示す。抗体の融点は、示差走査熱量測定などの手法を用いて測定することができる（Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60；Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52）。TM1は抗体の初期アンフォールディングの温度を示す。TM2は抗体の完全なアンフォールディングの温度を示す。一般に、本開示の抗体のTM1は60℃より高く、好ましくは65℃より高く、さらにより好ましくは70℃より高いことが好ましい。または、抗体の熱安定性を円二色性を用いて測定することもできる（Murray et al. (2002) J Chromatogr Sci 40:343-9）。
1つの好ましい態様においては、急速に分解することのない抗体が選択される。抗B7-H4抗体の断片化は、当技術分野で十分に理解されているようにキャピラリー電気泳動（CE）およびMALDI-MSを用いて測定することができる（Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32）。
もう1つの好ましい態様においては、最小の凝集効果を有する抗体が選択される。凝集は、望ましくない免疫応答の誘発および／または変化したもしくは好ましくない薬物動態学的特性を招くことがある。一般に、抗体では25％またはそれ未満、好ましくは20％またはそれ未満、さらにより好ましくは15％またはそれ未満、さらにより好ましくは10％またはそれ未満、さらにより好ましくは5％またはそれ未満の凝集が許容される。凝集は、単量体、二量体、三量体または多量体を同定するための、サイズ排除カラム（SEC）高速液体クロマトグラフィー（HPLC）および光散乱を含む、当技術分野で周知のいくつかの手法によって測定しうる。
抗体を人為的に操作する方法
以上に考察したように、本明細書で開示したVHおよびVK配列を有する抗B7-H4抗体を用いることで、VHおよび／またはVK配列またはそれに結合した定常領域を改変することにより、新しい抗B7-H4抗体を作り出すことができる。したがって、本開示のもう1つの局面において、本開示の抗B7-H4抗体、例えば1G11、2A7、2F9、12E1または13D12の構造的特徴は、本開示の抗体の少なくとも1つの機能特性、例えばヒトB7-H4との結合を保っている構造的に関連した抗B7-H4抗体を作り出すために用いられる。例えば、1G11、2A7、2F9、12E1もしくは13D12またはその変異体の1つまたは複数のCDR領域を、既知のフレームワーク領域および／または他のCDRと組換え的に組み合わせて、組換え操作されたさらなる本開示の抗B7-H4抗体を作り出すことができる。他のタイプの改変には、前セクションで記載したものが含まれる。人為的操作の方法のための出発材料は、本明細書で提供したVHおよび／もしくはVK配列の1つもしくは複数、またはそれらの1つもしくは複数のCDR領域である。人為的に操作された抗体を作り出すために、本明細書で提供したVHおよび／もしくはVR配列の1つもしくは複数またはそれらの1つもしくは複数のCDR領域を有する抗体を実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現させる）必要はない。その代わりに、配列に含まれる情報を出発材料として用いて、元の配列に由来する「第2世代」配列を作り出し、続いて「第2世代」配列を調製して、タンパク質として発現させる。
したがって、もう1つの態様において、本開示は、抗B7-H4抗体を調製するための方法であって、
（a）（i）SEQ ID NO：11、12、13、14および15からなる群より選択されるCDR1配列、SEQ ID NO：16、17、18、19および20からなる群より選択されるCDR2配列、および／またはSEQ ID NO：21、22、23、24および25からなる群より選択されるCDR3配列を含む重鎖可変領域抗体配列、ならびに／または（ii）SEQ ID NO：26、27、28、29および30からなる群より選択されるCDR1配列、SEQ ID NO：31、32、33、34および35からなる群より選択されるCDR2配列、および／またはSEQ ID NO：36、37、38、39および40からなる群より選択されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を調製する段階；
（b）重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列の内部の少なくとも1つのアミノ酸残基を変更して、少なくとも1つの変更された抗体配列を作り出す段階；ならびに
（c）変更された抗体配列をタンパク質として発現させる段階、
を含む方法を提供する。
変更された抗体配列の調製および発現のためには、標準的な分子生物学技術を用いることができる。典型的には、変更された抗体配列によってコードされる抗体は、本明細書に記載した抗B7-H4抗体の機能特性のうちの1つ、一部またはすべてを保っており、これらの機能特性には以下のものが非限定的に含まれる：
（a）ヒトB7-H4と1×10-7 Mまたはそれ未満の親和性で結合する；
（b）B7-H4がトランスフェクトされたヒト細胞またはCHO細胞と結合する；
（d）B7-H4発現細胞に対するADCCを媒介する能力；および／または
（e）細胞毒とコンジュゲートされた時にインビボでB7-H4発現細胞の増殖を阻害する。
変更された抗体の機能特性は、当技術分野で利用可能なおよび／または本明細書に記載した標準的なアッセイ、例えば実施例で示されるアッセイ（例えば、フローサイトメトリー、結合アッセイ）を用いて評価することができる。
本開示の抗体を人工的に操作する方法のある態様においては、突然変異を、抗B7-H4抗体のコード配列の全体または一部に沿ってランダムまたは選択的に導入することができ、その結果得られた改変された抗B7-H4抗体を、結合活性および／または本明細書に記載した他の機能特性に関してスクリーニングすることができる。突然変異の方法は当技術分野で記載されている。例えば、ShortによるPCT公報WO 02／092780号は、抗体変異を、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー（synthetic ligation assembly）またはそれらの組み合わせを用いて作り出して、スクリーニングするための方法を記載している。または、LazarらによるPCT公報WO 03／074679号は、コンピュータによるスクリーニング方法を用いて抗体の生理化学的特性を最適化する方法を記載している。
本開示の抗体をコードする核酸分子
本開示のもう1つの局面は、本開示の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞内に、細胞溶解液中に、または部分精製形態もしくは実質的に純粋な形態で存在しうる。核酸は、当技術分野で周知のアルカリ／SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他のものを含む標準的な技術によって、他の細胞成分または他の混入物質、例えば他の細胞核酸もしくはタンパク質から除去精製されている場合、「単離されている」または「実質的に純粋にされている」。F. Ausubel, et al, ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley lnterscience, New Yorkを参照。本開示の核酸は、例えばDNAまたはRNAであってよく、イントロン配列を含んでも含まなくともよい。1つの好ましい態様において、核酸はcDNA分子である。
本開示の核酸は、標準的な分子生物学の手法を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下でさらに述べるようなヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）によって発現される抗体に関しては、ハイブリドーマによって作られた抗体の軽鎖および重鎖をコードするcDNAを、標準的なPCR増幅またはcDNAクローニングの手法によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を用いて）得られる抗体については、抗体をコードする核酸を遺伝子ライブラリーから回収することができる。本開示の好ましい核酸分子は、1G11、2A7、2F9、12E1または13D12モノクローナル抗体のVHおよびVL配列である。1G11、2A7、2F9、12E1および13D12のVH配列をコードするDNA配列は、それぞれSEQ ID NO：41、42、43、44および45に示されている。1G11、2A7、2F9、12E1および13D12のVL配列をコードするDNA配列は、それぞれSEQ ID NO：46、47、48、49および50に示されている。VHおよびVLセグメントをコードするDNA断片がひとたび得られれば、これらのDNA断片を標準的な組換えDNA技術によってさらに操作することで、例えば可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Fab断片遺伝子またはscFv遺伝子に変換することができる。これらの操作では、VLまたはVHをコードするDNA断片を、別のタンパク質、例えば抗体の定常領域またはフレキシブルリンカーをコードする別のDNA断片と機能的に連結させる。この状況で用いられる「機能的に連結される」という用語は、2つのDNA断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままに保たれるように2つのDNA断片が連結されることを意味するものとする。
VH領域をコードする単離されたDNAは、VHをコードするDNAを、重鎖定常領域（CH15、CH2およびCH3）をコードする別のDNA分子と機能的に連結させることによって完全長重鎖遺伝子に変換させることができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で既知であり（例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照）、これらの領域を範囲に含むDNA断片を標準的なPCR増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgMまたはIgD定常領域でありうるが、最も典型的にはIgG1またはIgG4定常領域である。Fab断片重鎖遺伝子については、VHをコードするDNAを、重鎖CH1定常領域のみをコードする別のDNA分子と機能的に連結させることができる。
VL領域をコードする単離されたDNAは、VLをコードするDNAを、軽鎖定常領域CLをコードする別のDNA分子と機能的に連結させることによって完全長軽鎖遺伝子（およびFab軽鎖遺伝子）に変換させることができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で既知であり（例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照）、これらの領域を範囲に含むDNA断片を標準的なPCR増幅によって得ることができる。好ましい態様において、軽鎖定常領域はκまたはλ定常領域でありうる。
scFv遺伝子を作り出すためには、VHおよびVLをコードするDNA断片を、フレキシブルリンカー、例えばアミノ酸配列(Gly4-Ser)3をコードする別の断片と機能的に連結させることで、VHおよびVL配列を、フレキシブルリンカーで連結されたVLおよびVH領域を有する隣接した一本鎖タンパク質として発現させることができる（例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426；Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554を参照）。
本開示のモノクローナル抗体の作製
本開示のモノクローナル抗体（mAb）は、従来のモノクローナル抗体の方法、例えばKohler and Milstein (1975) Nature 256: 495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、種々の手法によって作製することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原理的には、モノクローナル抗体を作製するための他の手法、例えばBリンパ球のウイルス性または発癌性の形質転換を用いることもできる。
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマの作製は極めて十分に確立された方法である。融合用の免疫化された脾細胞の単離のための免疫化プロトコールおよび手法は当技術分野で公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。
本開示のキメラ抗体またはヒト化抗体は、上記のように調製された非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAは、関心対象の非ヒトハイブリドーマから得ることができ、標準的な分子生物学の手法を用いて非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を有するように人為的に操作することができる。例えば、キメラ抗体を作り出すために、マウス可変領域を当技術分野で公知の方法を用いてヒト定常領域に連結させることができる（例えば、Cabillyらに対する米国特許第4,816,567号を参照）。ヒト化抗体を作り出すために、マウスCDR領域を当技術分野で公知の方法を用いてヒトフレームワークに挿入することができる（例えば、Winterに対する米国特許第5,225,539号、ならびにQueenらに対する米国特許第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号および第6,180,370号を参照）。
1つの好ましい態様において、本開示の抗体はヒトモノクローナル抗体である。B7-H4を対象とするそのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックまたは導入染色体マウスを用いて産生されうる。これらのトランスジェニックマウスおよび染色体導入マウスには、本明細書でそれぞれHuMAb Mouse（登録商標）およびKM Mouse（登録商標）と称されるマウスが含まれ、これらは本明細書で「ヒトIgマウス」と総称される。
HuMAb Mouse（登録商標）（Medarex（登録商標）,Inc.）は、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化突然変異とともに、再配列を受けていないヒト重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座（miniloci）を有する（例えば、Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859を参照）。したがって、マウスはマウスIgMまたはκの発現の低下を呈し、免疫化に応じて、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラススイッチおよび体細胞突然変異を来し、高親和性のヒトIgGκモノクローナル抗体が産生される（Lonberg, N. et al. (1994), 前記；Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101における総説；Lonberg, N. and Huszar, D). (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93およびHarding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546）。HuMAb Mouse（登録商標）の調製および使用、ならびにそのようなマウスによって保有されるゲノム改変は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656；Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724；Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123；Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830；Tuaillon et al. (1994) J lmmunol. 152:2912-2920；Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591；およびFishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに記載されており、これらすべての内容はその全体が参照により本明細書に特定的に組み入れられる。さらに、いずれもLonberg and Kayに対する米国特許第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,789,650号；第5,877,397号；第5,661,016号；第5,814,318号；第5,874,299号；および第5,770,429号；Suraniらに対する米国特許第5,545,807号；いずれもLonberg and Kayに対するPCT公報WO 92／03918号、WO 93／12227号、WO 94／25585号、WO 97／13852号、WO 98／24884号およびWO 99／45962号；ならびにKormanらに対するPCT公報WO 01／14424号も参照のこと。BruggemannによるPCT公報WO 00／26373号に記載されているような、ヒトλ軽鎖遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを用いることもできる。例えば、ヒトλ軽鎖導入遺伝子を保有するマウスを、ヒト重鎖導入遺伝子（例えば、HCo7）を保有し、任意でヒトκ軽鎖導入遺伝子（例えば、KCo5）も保有するマウスと交配させて、ヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子の両方を保有するマウスを作製することができる。
もう1つの態様において、本開示のヒト抗体を、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウス、例えばヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保有するマウスなどを用いて産生させることもできる。このマウスは、本明細書で「KMマウス（登録商標）」と称され、Ishidaら対するPCT公報WO 02／43478号に詳述されている。
さらになお、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的なトランスジェニック動物系も当技術分野で利用可能であり、それを用いることで、本開示の抗B7-H4抗体が産生させることができる。例えば、ゼノマウス（Xenomouse）（Abgenix,Inc.）と称される代替的なトランスジェニック系の使用が可能である；そのようなマウスは、例えばKucherlapatiらに対する米国特許第5,939,598号；第6,075,181号；第6,114,598号；第6,150,584号および第6,162,963号に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的な導入染色体動物系も当技術分野で利用可能であり、それを用いることで、本開示の抗B7-H4抗体を産生させることができる。例えば、「TCマウス」と称される、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を保有するマウスの使用が可能であり、そのようなマウスについてはTomizukaら（2000年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727頁に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を保有するウシが当技術分野で記載されており（例えば、Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894およびPCT公報WO 2002／092812号）、それを用いることで、本開示の抗B7-H4抗体を産生させることができる。
また、本開示のヒトモノクローナル抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いて調製することもできる。ヒト抗体を単離するためのそのようなファージディスプレイ法は、当技術分野で確立されている。例えば、Ladnerらに対する米国特許第5,223,409号；第5,403,484号；および第5,571,698号；Dowerらに対する米国特許第5,427,908号および第5,580,717号；McCaffertyらに対する米国特許第5,969,108号および第6,172,197号；ならびにGriffithsらに対する米国特許第5,885,793号；第6,521,404号；第6,544,731号；第6,555,313号；第6,582,915号および第6,593,081号を参照のこと。
また、本開示のヒトモノクローナル抗体を、免疫化に応じてヒト抗体応答が生じうるようにヒト免疫細胞が再構成されているSCIDマウスを用いて調製することもできる。そのようなマウスは、例えばWilsonらに対する米国特許第5,476,996号および第5,698,767号に記載されている。
もう1つの態様において、ヒト抗B7-H4抗体は、Buechlerらによる米国特許第6,794,132号に記載されているようにヒトIgマウスおよびファージディスプレイの手法を併用して調製される。より具体的には、本方法はまず、ヒトIgマウス（上記のHuMabマウスまたはKMマウスなど）において、1つまたは複数のB7-H4抗原によるマウスの免疫化を行うことによって抗B7-H4抗体応答を生じさせ、続いてマウスのリンパ細胞由来のヒト抗体鎖をコードする核酸を単離してた上で、ディスプレイパッケージのライブラリーを得るために、これらの核酸をディスプレイベクター（例えば、ファージ）に導入することを伴う。このため、各ライブラリーメンバーはヒト抗体鎖をコードする核酸を含み、各抗体鎖がディスプレイパッケージから提示される。続いて、ライブラリーをB7-H4タンパク質を用いてスクリーニングし、B7-H4と特異的に結合するライブラリーメンバーを単離する。続いて、選択されたライブラリーメンバーの核酸挿入物が単離およびシークエンシングを標準的な方法によって行い、選択されたB7-H4結合物質（binder）の軽鎖および重鎖可変配列を決定する。可変領域は、例えば、VH領域がCH領域に機能的に連結されかつVL領域がCL領域に機能的に連結されるように、ヒト重鎖および軽鎖定常領域を保有する発現ベクター中に可変領域をクローニングするといった標準的な組換えDNA技術によって、完全長抗体鎖に変換させることができる。
ヒトIgマウスの免疫化
ヒトIgマウスを用いて本開示のヒト抗体を産生させる場合には、Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859；Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851；およびPCT公報WO 98／24884号および第WO 01／14424号に記載されているように、そのようなマウスに対して、B7-H4抗原の精製もしくは富化調製物および／または組換えB7-H4タンパク質、またはB7-H4タンパク質を発現している細胞、またはB7-H4融合タンパク質による免疫化を行うことができる。好ましくは、マウスは1回目の注入時に6〜16週齢であると考えられる。例えば、B7-H4抗原の精製または組換え調製物（5〜50μg）を用いて、ヒトIgマウスの腹腔内および／または皮下への免疫化を行うことができる。より好ましくは、本開示の抗体を産生させるために用いられる免疫原は、B7-H4タンパク質の細胞外ドメインがそのN末端で非B7-H4ポリペプチド（例えば、Hisタグ）と融合されたものを含むB7-H4融合タンパク質である（実施例1にさらに記載されている）。
B7-H4と結合する完全ヒトモノクローナル抗体を作製するための詳細な方法は、以下の実施例1に記載されている。さまざまな抗原を用いる試験を重ねることで、最初に完全フロイントアジュバント中の抗原により腹腔内（IP）に免疫化を受け、それに続いて不完全フロイントアジュバント中の抗原によって隔週に最大で合計6回のIP免疫化を受けた場合に、トランスジェニックマウスが応答することが示されている。しかし、フロイント以外のアジュバント（例えば、RIBIアジュバント）も有効であることが見いだされている。加えて、アジュバントの非存在下での全細胞も免疫原性が高いことが見いだされている。免疫応答は、後眼窩（retroorbital）採血によって得られる血漿試料を用いる免疫プロトコールを通じてモニターすることができる。血漿をELISAでスクリーニングして（以下に述べるように）、十分な力価の抗B7-H4ヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合のために用いることができる。マウスに対して、殺処理および脾臓摘出の例えば3日前に、抗原による静脈内への追加免疫を行うことができる。各免疫化ごとに2〜3回を融合を行う必要があると予想される。典型的には、各抗原についてマウス6〜24匹に免疫化を行う。通常、HCo7系統およびHCo12系統の両方が用いられる。加えて、HCo7およびHCo12導入遺伝子を、2つの異なるヒト重鎖導入遺伝子（HCo7／HCo12）を有する単一のマウスへと交配させることもできる。代替的または追加的に、KM Mouse（登録商標）系統を用いることもできる。
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫化を受けたマウス由来の脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離して、適切な不死化細胞系、例えばマウス骨髄腫細胞系と融合させることができる。その結果得られたハイブリドーマを、抗原特異的な抗体の産生についてスクリーニングすることができる。例えば、免疫化を受けたマウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、1／6の数のP3X63-Ag8.653非分泌マウス骨髄腫細胞（ATCC、CRL1580）と50％ PEGを用いて融合させることができる。または、免疫マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、CytoPulse大型チャンバ細胞融合エレクトロポレーター（CytoPulse Sciences,Inc., Glen Burnie, Maryland）を用いる、電場を利用する電気融合法を用いて融合させることもできる。細胞を平底マイクロタイタープレート中に約2×105個プレーティングし、その後、20％胎仔クローン血清、18％「653」馴化培地、5％オリゲン（origen）（IGEN）、4mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、5mM HEPES、0.055mM 2-メルカプトエタノール、50単位／mlのペニシリン、50mg／mlのストレプトマイシン、50mg／mlのゲンタマイシンおよび1×HAT培地（Sigma；HATは融合の24時間後に添加する）を含む選択培地中で2週間インキュベートする。およそ2週間後に、HATがHTと置き換えた培地中で細胞を培養することができる。続いて、各ウェルを、ヒトモノクローナルIgMおよびIgG抗体に関してELISAによってスクリーニングすることができる。ひとたび多数のハイブリドーマの増殖が起これば、培地を通常10〜14日後に観察することができる。抗体を分泌するハイブリドーマを再プレーティングして再びスクリーニングし、依然としてヒトIgG陽性であれば、モノクローナル抗体を限界希釈によって少なくとも2回サブクローニングすることができる。続いて、安定なサブクローンをインビトロで培養することで、特徴づけのための少量の抗体が組織培地中に産生されうる。
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体の精製用の2リットルのスピナーフラスコ内で増殖させることができる。上清を濾過して濃縮した後に、プロテインA-セファロース（Pharmacia、Piscataway、N.J.）を用いるアフィニティークロマトグラフィーを行う。純度を保証するために、溶出したIgGをゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーによって調べる。緩衝液をPBSに交換して、濃度を減衰係数1.43を用いてOD280によって決定することができる。モノクローナル抗体は一定量に分割して-80℃で保存することができる。
本発明のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
本開示の抗体を、例えば当技術分野で周知のように組換えDNA技術および遺伝子トランスフェクション法を併用して、宿主細胞のトランスフェクトーマ内で産生させることもできる（例えば、Morrison, S. (1985) Science 229:1202を参照）。
例えば、抗体またはその抗体断片を発現させるために、部分長または完全長の軽鎖および重鎖をコードするDNAを、標準的な分子生物学の手法（例えば、関心対象の抗体を発現するハイブリドーマを用いるPCR増幅またはcDNAクローニング）により得ることができ、そのDNAを、遺伝子が転写および翻訳制御配列と機能的に連結されるように発現ベクター中に挿入することができる。この状況における「機能的に連結される」という用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図された機能を果たすようにベクターと連結されていることを意味するものとする。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いられる発現宿主細胞と適合性であるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクター中に挿入することができ、または、より典型的には両方の遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入することもできる。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上での相補的制限部位の連結、または制限部位が全く存在しない場合には平滑末端連結）によって発現ベクター中に挿入することができる。本明細書に記載した抗体の軽鎖および重鎖可変領域は、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクター中に、VHセグメントがベクター中のCHセグメントと機能的に連結され、かつVLセグメントがベクター中のCLセグメントと機能的に連結されるようにそれらを挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製するために用いることができる。追加的または代替的に、組換え発現ベクターが、抗体鎖の宿主細胞からの分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることもできる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームに連結されるようにベクター中にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でありうる。
本発明の組み換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子に加えて、宿主細胞内での抗体鎖遺伝子の発現を調節する制御配列を保有している。「制御配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を調節するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。そのような制御配列は、例えば、Goeddel（Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)）に記載されている。当業者は、制御配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存することを理解するであろう。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい制御配列には、サイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP）およびパピローマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーといった哺乳動物細胞におけるタンパク質高発現を導くウイルスエレメントが含まれる。または、ユビキチンプロモーターまたはβ-グロビンプロモーターなどの非ウイルス性制御配列を用いることもできる。さらに、調節エレメントはSRαプロモーター系などの異なる起源由来の配列で構成され、これにはSV40初期プロモーターおよびヒトT細胞白血病ウイルス1型の長い末端反復配列由来の配列が含まれる（Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472）。
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞内でのベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子などの追加の配列も保有することができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、いずれもAxel et al.による米国特許第4,399,216号、第4,634,665号および第5,179,017号を参照）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に対して、G418、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子（dhfr-宿主細胞でメトトレキサート選択／増幅に用いるため）およびneo遺伝子（G418選択用）が含まれる。
軽鎖および重鎖の発現のためには、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」という用語のさまざまな形態は、原核生物または真核生物宿主細胞への外来性DNAの導入のために一般的に用いられる広範囲にわたる技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクションなどを範囲に含むものとする。本開示の抗体は原核生物または真核生物宿主細胞のいずれで発現させることも理論的には可能であるが、真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現は最も好ましく、それはそのような真核細胞、特に哺乳動物細胞が、原核生物に比べて、適切にフォールディングした免疫学的活性のある抗体を集合させて分泌する可能性がより高いためである。抗体遺伝子の原核生物における発現は、活性抗体の高収量での産生には有効でないことが報告されている（Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13）。
本開示の組み換え抗体の発現のために好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）（Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されたdhfr- CHO細胞を含み、これは例えばR. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J Mol. Biol. 159:601-621に記載されているようにDHFR選択マーカーとともに用いられる）、NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2細胞が含まれる。特に、NSO骨髄腫細胞とともに用いるための、もう1つの好ましい発現系は、WO 87／04462号（Wilson）、WO 89／01036号（Bebbington）および欧州特許第338,841号（Bebbington）に開示されているGS遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞中に導入する場合には、宿主細胞における抗体の発現、より好ましくは宿主細胞が増殖されている培地中への抗体の分泌を可能にするための十分な期間にわたって宿主細胞を培養することによって抗体が産生される。抗体は標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収することができる。
抗原に対する抗体の結合の特徴づけ
本発明の抗体は、例えば標準的なELISAによって、B7-H4に対する結合に関して検査することができる。手短に述べると、マイクロタイタープレートを、1μg／mlの精製および／または組換えB7-H4タンパク質（例えば、実施例1に記載されたB7-H4融合タンパク質）のPBS溶液でコーティングし、続いて5％ウシ血清アルブミンのPBS溶液でブロッキングする。抗体の希釈物（例えば、B7-H4免疫化マウスからの血漿の希釈物）を各ウェルに添加し、37℃で1〜2時間インキュベートする。プレートをPBS／Tweenで洗浄し、続いてアルカリホスファターゼを結合させた二次試薬（例えば、ヒト抗体の場合は、ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的ポリクローナル試薬）とともに37℃で1時間インキュベートする。洗浄の後に、プレートをpNPP基質（1mg／ml）によって発色させ、OD 405〜650で分析する。好ましくは、最大の力価を示したマウスを融合のために用いる。
上記のELISA法はまた、B7-H4タンパク質との陽性反応を示すハイブリドーマに関するスクリーニングのために用いることもできる。B7-H4に対して高いアビディティーおよび／または親和性で結合するハイブリドーマをサブクローニングし、さらに特徴を調べる。親細胞の反応性（ELISAによる）を保っている各ハイブリドーマからの1つのクローンを、-140℃で保存するバイアル5〜10本の細胞バンクを作製するため、および抗体の精製のために選択することができる。
抗B7-H4抗体を精製するために、選択したハイブリドーマをモノクローナル抗体精製用の2リットルスピナーフラスコ内で増殖させることができる。上清を濾過して濃縮した後に、プロテインA-セファロースによるアフィニティクロマトグラフィー（Pharmacia, Piscataway, NJ）を行うことができる。溶出したIgGは、純度を保証するためにゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーによって調べることができる。緩衝液をPBSに交換して、濃度を減衰係数1.43を用いてOD280によって決定することができる。モノクローナル抗体は一定量に分割して-80℃で保存することができる。
選択された抗B7-H4モノクローナル抗体が固有のエピトープと結合するか否かを判定するために、各抗体を市販の試薬（Pierce, Rockford, IL）を用いてビオチン化することができる。非標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を用いる競合試験は、上記のようにB7-H4タンパク質をコーティングしたELISAプレートを用いて行うことができる。ビオチン化mAbの結合は、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼプローブによって検出することができる。
精製抗体のアイソタイプを決定するために、特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を用いるアイソタイプELISAを行うことができる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するためには、マイクロタイタープレートのウェルを1μg／mlの抗ヒト免疫グロブリンによって4℃で一晩コーティングすることができる。1％ BSAでブロッキングした後に、プレートを1μg／mlまたはそれ未満の被験モノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照と室温で1〜2時間反応させる。続いて、ウェルを、ヒトIgG1またはヒトIgMに特異的なアルカリホスファターゼを結合させたプローブと反応させることができる。プレートを上記のように発色させて分析する。
抗B7-H4ヒトIgGを、ウェスタンブロット法によってB7-H4抗原との反応性に関してさらに検査することができる。手短に述べると、B7-H4を調製して、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動の後に、分離された抗原をニトロセルロース膜に転写して、10％ウシ胎仔血清でブロッキングし、被験モノクローナル抗体によってプロービングした。ヒトIgG結合は、抗ヒトIgGアルカリホスファターゼを用いて検出して、BCIP／NBT基質タブレット（Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.）によって発色させることができる。
本開示の抗体の結合特異性は、抗体とB7-H4タンパク質を発現する細胞との結合を、例えばフローサイトメトリーによってモニターすることによって判定することもできる。B7-H4タンパク質を天然に発現する細胞または細胞系、例えばOVCAR3、NCI-H226、CFPAC-1もしくはKB細胞（実施例3でさらに記載）を用いることもでき、または、CHO細胞系などの細胞系に対して、B7-H4が細胞の表面に発現されるように、B7-H4をコードする発現ベクターをトランスフェクトすることもできる。トランスフェクトされるタンパク質は、タグに対する抗体を用いる検出のために、mycタグまたはhisタグなどのタグを好ましくはN末端に含むことができる。本開示の抗体のB7-H4タンパク質との結合は、トランスフェクトされた細胞を抗体とともにインキュベートし、結合した抗体を検出することによって判定することができる。トランスフェクトされたタンパク質上のタグに対する抗体の結合を、陽性対照として用いることができる。
二重特異性分子
もう1つの局面において、本開示は、本開示の抗B7-H4抗体またはその断片を含む二重特異性分子を特徴とする。本開示の抗体またはその抗原結合部分を、別の機能性分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば、別の抗体、または受容体のリガンド）と誘導体化または連結させて、少なくとも2つの異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性分子を作製することができる。本開示の抗体は、実際には1つを上回る他の機能性分子と誘導体化または連結させて、2つを上回る異なる結合部位および／または標的分子と結合する多重特異性分子を作製することができる；そのような多重特異性分子は、本明細書で用いる「二重特異性分子」という用語の範囲にも含まれるものとする。本開示の二重特異性分子を作り出すために、本開示の抗体を、二重特異性分子が結果的に生じるように、1つまたは複数の他の結合性分子、例えば別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合性模倣物などと機能的に連結させる（例えば、化学結合、遺伝子融合、非共有性会合またはその他により）ことができる。
したがって、本開示は、B7-H4に対する少なくとも1つの第1の結合特異性部（binding specificity）および第2の標的エピトープに対する第2の結合特異性部を含む二重特異性分子を含む。本開示の1つの特定の態様において、第2の標的エピトープはFc受容体、例えばヒトFcγRI（CD64）またはヒトFcα受容体（CD89）である。したがって、本開示は、FcγRまたはFcαRを発現するエフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージまたは多形核球細胞（PMN））およびB7-H4を発現する標的細胞の両方と結合することのできる二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子は、B7-H4発現細胞をエフェクター細胞に向かわせて、Fc受容体を介したエフェクター細胞活性、例えばB7-H4発現細胞の食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）、サイトカイン放出またはスーパーオキシド陰イオンの生成などを誘発する。
二重特異性分子が多重特異性である本開示の1つの態様において、本分子は、抗Fc結合特異性部および抗B7-H4結合特異性部に加えて、第3の結合特異性部をさらに含みうる。1つの態様において、第3の結合特異性部は抗促進因子（anti-enhancement factor）（EF）部分、例えば細胞傷害活性に関与する表面タンパク質と結合し、それによって標的細胞に対する免疫応答を増大させる分子である。「抗促進因子部分」は、所与の分子、例えば抗原または受容体と結合し、それによってFc受容体または標的細胞抗原に対する結合決定部（binding determinant）の効果の促進をもたらす抗体、機能抗体断片またはリガンドでありうる。「抗促進因子部分」は、Fc受容体または標的細胞抗原と結合しうる。または、抗促進因子部分は、第1および第2の結合特異性の結合対象である実体とは異なる実体と結合しうる。例えば、抗促進因子部分は、細胞傷害性T細胞と結合しうる（例えば、CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1、または標的細胞に対する免疫応答の増大をもたらす他の免疫細胞を介して）。
1つの態様において、本開示の二重特異性分子は、結合特異性部として、例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、dAbまたは一本鎖Fvを含む、少なくとも1つの抗体またはその抗体断片を含む。抗体は、軽鎖もしくは重鎖の二量体、またはFv、もしくはその全体が参照により明示的に組み入れられるLadnerらに対する米国特許第4,946,778号に記載されている一本鎖構築物などのその任意の最小断片であってもよい。
1つの態様において、Fcγ受容体に対する結合特異性部はモノクローナル抗体によって与えられ、その結合はヒト免疫グロブリンG（IgG）によっては阻害されない。本明細書で用いる場合、「IgG受容体」という用語は、第1番染色体上に位置する8つのγ鎖遺伝子の任意のものを指す。これらの遺伝子は合計12種の膜貫通性または可溶性受容体アイソフォームをコードし、それらは3つのFcγ受容体クラス：FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）およびFcγRIII（CD16）にグループ化される。1つの好ましい態様において、Fcγ受容体はヒト高親和性FcγRIである。ヒトFcγRIは72kDaの分子であり、単量体IgGに対して高い親和性を示す（108〜109M-1）。
ある種の好ましい抗Fcγモノクローナル抗体の作製および特徴づけは、FangerらのPCT公報WO 88／00052号および米国特許第4,954,617号に記載されており、それらの教示は参照により本明細書に完全に組み入れられる。これらの抗体は、受容体のFcγ結合部位とは異なる部位でFcγRI、FcγRII、またはFcγRIIIのエピトープと結合し、それ故にその結合は生理的レベルのIgGによっては実質的に阻害されない。本開示において有用な具体的な抗FcγRI抗体は、mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62、およびmAb 197である。mAb 32を産生するハイブリドーマは、American Type Culture Collection ATCCアクセッション番号HB 9469から入手可能である。他の態様において、抗Fcγ受容体抗体は、モノクローナル抗体22のヒト化型（H22）である。H22抗体の作製および特徴づけは、Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002およびPCT公報WO 94／10332号（Tempest et al.）に記載されている。H22抗体を産生する細胞系は、American Type Culture CollectionにHA022CL1の名称で寄託され、アクセッション番号CRL 11177を有する。
さらに他の好ましい態様において、Fc受容体に対する結合特異性部は、ヒトIgA受容体、例えばFc-α受容体（FcαRI（CD89））と結合する抗体によって与えられ、その結合は好ましくはヒト免疫グロブリンA（IgA）によっては阻害されない。「IgA受容体」という用語は、第19番染色体上に位置する1つのα遺伝子の遺伝子産物（FcαRI）を含むものとする。この遺伝子は、選択的スプライシングを受ける55〜110kDaのいくつかの膜貫通アイソタイプをコードすることが知られている。FcαRI（CD89）は、単球／マクロファージ、好酸球および好中球顆粒球上に構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団では発現されない。FcαRIは、IgA1およびIgA2の両方に関して中程度の親和性（およそ5×107 M-1）を有し、これはG-CSFまたはGM-CSFなどのサイトカインへの暴露時に増大する（Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440）。IgAリガンド結合ドメイン外でFcαRIと結合する、A3、A59、A62およびA77として同定された4つのFcαRI特異的モノクローナル抗体が記載されている（Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764）。
FcαRIおよびFcγRIは、それらが（1）免疫エフェクター細胞、例えば単球、PMN、マクロファージおよび樹状細胞上で主として発現される；（2）高レベルで発現される（例えば、細胞1個当たり5,000〜100,000個）；（3）細胞傷害活性（例えば、ADCC、食作用）のメディエーターである；（4）それらを標的とする自己抗原を含む抗原の抗原提示の増強を媒介する、という理由から、本開示の二重特異性分子に用いるための好ましい誘発受容体である。
ヒトモノクローナル抗体が好ましいものの、本開示の二重特異性分子に用いうる他の抗体には、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体がある。
本開示の二重特異性分子は、構成要素となる結合特異性部、例えば抗FcRおよび抗B7-H4結合特異性部を、当技術分野で公知の方法を用いてコンジュゲートさせることによって調製することができる。例えば、二重特異性分子のそれぞれの結合特異性部を個別に作製した上で、それらを互いにコンジュゲートさせることができる。結合特異性部がタンパク質またはペプチドである場合、さまざまなカップリング剤または架橋剤を共有結合のために用いることができる。架橋剤の例には、プロテインA、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート（SATA）、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)（DTNB）、o-フェニレンジマレイミド（oPDM）、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）およびスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルホ-SMCC）が含まれる（例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686；Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照）。他の方法には、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132；Brennan et al. (1985) Science 229:81-83, and Glennie et al. (1987) J. lmmunol. 139: 2367-2375に記載されたものが含まれる。好ましいコンジュゲート剤はSATAおよびスルホ-SMCCであり、いずれもPierce Chemical Co.（Rockford, IL）から入手可能である。
結合特異性部が抗体である場合は、それらを、2つの重鎖のC末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合形成を介してコンジュゲートさせることができる。1つの特に好ましい態様において、ヒンジ領域は、コンジュゲーションの前に、奇数の、好ましくは1つのスルフヒドリル残基を含むように改変される。
または、同一のベクター中で両方の結合特異性部をコードさせ、同一の宿主細胞で発現させて、集合させることもできる。この方法は、二重特異性分子が、mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2またはリガンド×Fab融合タンパク質である場合に特に有用である。本開示の二重特異性分子は、1つの一本鎖抗体および1つの結合決定部を含む一本鎖分子、または2つの結合決定部を含む1つの一本鎖二重特異性分子でありうる。二重特異性分子は、少なくとも2つの一本鎖分子を含んでよい。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第5,260,203号；第5,455,030号；第4,881,175号；第5,132,405号；第5,091,513号；第5,476,786号；第5,013,653号；第5,258,498号；および第5,482,858号に記載されている。
二重特異性分子のそれらの特異的な標的との結合は、例えば、固相酵素免疫アッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、FACS分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）またはウエスタンブロット分析によって確認することができる。これらの分析のそれぞれは、一般に、関心対象の複合体に対して特異的な標識された試薬（例えば、抗体）を用いることによって、特に関心対象のタンパク質-抗体複合体の存在を検出する。例えば、FcR-抗体複合体は、例えば、抗体-FcR複合体を認識して特異的に結合する、酵素が連結された抗体または抗体断片を用いて検出することができる。または、任意のさまざまな他のイムノアッセイを用いて複合体を検出することもできる。例えば、抗体を放射標識して、ラジオイムノアッセイ（RIA）に用いることができる（例えば、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照のこと。これは参照により本明細書に組み入れられる）。放射性同位体は、ガンマカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
コンジュゲート
本発明のコンジュゲートにおいて、パートナー分子は化学リンカー（本明細書では時には単に「リンカー」と称する）によって抗体とコンジュゲートされる。本発明のコンジュゲートにおいて、パートナー分子は治療剤またはマーカーでありうる。治療剤は例えば、細胞毒、非細胞毒性薬（例えば、免疫抑制薬）、放射性物質、別の抗体または酵素でありうる。好ましくは、パートナー分子は細胞毒である。マーカーは、検出可能なシグナルを生成する任意の標識、例えば放射標識、蛍光標識、または基質に対する検出可能な改変を触媒する酵素でありうる。抗体はターゲティング機能を果たす：その抗原が見いだされる標的組織または細胞と結合することにより、抗体はコンジュゲートを標的組織または細胞へと導く。そこでリンカーが切断され、パートナー分子が放出されてその所望の生物学的機能を遂行する。
結合するパートナー分子の比は、コンジュゲーション反応の際に用いるパートナー分子の量および実験条件といった要因に応じてさまざまでありうる。好ましくは、パートナー分子と抗体との比は1〜3、より好ましくは1〜1.5である。当業者は、抗体Zの各個の分子は整数個のパートナー分子とコンジュゲートされるものの、コンジュゲート調製物を分析すると、統計学的平均を反映してパートナー分子と抗体との比が非整数になる可能性があることを理解しているであろう。
リンカー
いくつかの態様において、リンカーはペプチジルリンカーであり、本明細書では(L4)p-F-(L1)mとして表される。他のリンカーには、ヒドラジンリンカーおよびジスルフィドリンカーが含まれ、本明細書ではそれぞれ(L4)p-H-(L1)mまたは(L4)p-J-(L1)mとして表される。F、HおよびJはそれぞれ、切断されてパートナー分子を抗体から放出することのできるペプチジル、ヒドラジンおよびジスルフィド部分であり、一方、L1およびL4はリンカー基である。F、H、J、L1およびL4については、下付き文字のpおよびmとともに、本明細書で以下にさらに詳細に定義する。上記および他のリンカーの調製および使用はWO 2005／112919号に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。
抗体-パートナーコンジュゲートにおけるペプチジルリンカーおよび他のリンカーの使用は、米国特許出願第2006／0004081号；第2006／0024317号；第2006／0247295号；米国特許第6,989,452号；第7,087,600号；および第7,129,261号；WO 2007／051081号；WO 2007／038658号；WO 2007／059404号；およびWO 2007／089100号に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる。
そのほかのリンカーは、米国特許第6,214,345号；米国特許出願第2003／0096743号；および第2003／0130189号；de Groot et al., J. Med. Chem. 42, 5277 (1999)；de Groot et al. J. Org. Chem. 43, 3093 (2000)；de Groot et al., J. Med. Chem. 66, 8815, (2001)；WO 02／083180号；Carl et al., J. Med. Chem. Lett. 24, 479, (1981)；Dubowchik et al., Bioorg & Med. Chem. Lett. 8, 3347 (1998)に記載されており、それらの開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。
抗体およびパートナー分子を連結させることに加えて、リンカーは、パートナー分子に安定性を与え、そのインビボ毒性を低下させ、または他の様式でその薬物動態、生物学的利用能および／もしくは薬力学に好ましい影響をもたらすことができる。コンジュゲートがその作用部位に送達された時点で、リンカーが切断されて、パートナー分子が放出されることが一般に好ましい。同じく好ましくは、リンカーは、ひとたび切断された後にはリンカーの存在の痕跡を残さないというように、無痕跡性（traceless）である。
もう1つの態様において、リンカーは、パートナー部位の治療作用またはマーカー活性の部位といった、標的細胞内またはその付近の治療作用部位で切断される能力によって特徴づけられる。そのような切断は酵素的な性質でありうる。この特徴は、パートナー分子の全身的な活性化を低下させ、毒性および全身的な副作用を低下させるのに役立つ。酵素的切断のために好ましい切断可能基には、前述のF、HおよびJ部分のようなペプチド結合、エステル結合およびジスルフィド結合が含まれる。他の態様において、リンカーはpH感受性であり、pHの変化を通じて切断される。
1つの重要な局面は、リンカーが切断する速度を制御しうることである。速やかに切断されるリンカーが望ましい場合が多い。しかし、いくつかの態様においては、より緩徐に切断されるリンカーが好ましい場合がある。例えば、徐放製剤または速やかな放出成分と緩徐な放出成分の両方を有する製剤では、より緩徐に切断されるリンカーを提供することが有用でありうる。前に引用したWO 2005／112919号は、極めて速やかなものから極めて緩徐なものまでの範囲にわたる速さで切断されるように設計することのできるヒドラジンリンカーを開示している。
リンカーはまた、コンジュゲートが循環中にあり、それが標的組織または細胞に到達する前の時点で、パートナー分子を分解に対して安定化するのにも役立ちうる。このことは、それがパートナー分子の循環中半減期を延長させるため、大きな利点である。リンカーはまた、コンジュゲートが循環中にある時には比較的有害でないようにパートナー分子の活性を弱めるが、所望の作用部位での活性化の後ではパートナー分子が所望の効果を有する―例えば細胞傷害性である―ようにするのに役立つ。治療剤コンジュゲートの場合、リンカーのこの特徴は薬剤の治療指数を向上させるのに役立つ。
切断可能なペプチド基、ヒドラジン基またはジスルフィド基であるそれぞれF、HまたはJに加えて、1つまたは複数のリンカー基L1を、パートナー分子と、その場合に応じたF、HまたはJとの間に導入してもよい。これらのリンカー基L1はスペーサー基として記載することもでき、少なくとも2つの官能基を含む。下付き文字mの値（すなわち、存在するL1基の数）および特定の基L1の位置に応じて、基L1の化学的官能性部（chemical functionality）を、パートナー分子の、その場合に応じたF、HもしくはJの、または別のリンカー基L1（複数のL1基が存在する場合）の化学的官能性部と結合させることができる。スペーサー基L1に関する適した化学的官能性部の例には、ヒドロキシ基、メルカプト基、カルボニル基、カルボキシ基、アミノ基、ケトン基およびメルカプト基が含まれる。
リンカーL1は、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換アリール基、置換もしくは非置換ヘテロアリール基、または置換もしくは非置換ヘテロアルキル基でありうる。1つの態様において、アルキル基またはアリール基は1〜20個の炭素原子を含みうる。それらはまた、ポリエチレングリコール部分を含んでもよい。
例示的な基L1には、例えば、6-アミノヘキサノール、6-メルカプトヘキサノール、10-ヒドロキシデカン酸、グリシンおよび他のアミノ酸、1,6-ヘキサンジオール、β-アラニン、2-アミノエタノール、システアミン(2-アミノエタンチオール)、5-アミノペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、3-マレイミド安息香酸、フタリド、α-置換フタリド、カルボニル基、アミナールエステル、核酸、ペプチドなどが含まれる。
基L1の1つの機能は、その場合に応じたF、HまたはJと、パートナー分子との間に、後者が（例えば、立体的または電子的な効果を介して）F、HまたはJでの切断化学反応に干渉することのないように空間的分離を与えることである。基L1はまた、追加の分子量および化学的官能性部をコンジュゲートに導入するためにも役立ちうる。一般に、追加の分子量および官能性部はコンジュゲートの血清半減期および他の特性に影響を及ぼす。したがって、スペーサー基の注意深い選択を通じて、一定範囲の血清半減期を有するコンジュゲートを作製することができる。任意で、1つまたは複数のリンカーL1は、本明細書で以下に述べるように自己犠牲基（self-immolative group）であってもよい。
下付き文字mは、0、1、2、3、4、5および6から選択される整数である。複数のL1基が存在する場合、それらは同じでも異なってもよい。
L4は、その場合に応じたF、HまたはJと、抗体との間に、F、HもしくはJが抗体による抗原結合に干渉することのないように、または抗体がF、HもしくはJでの切断化学反応に干渉することのないように、空間的分離を与えるリンカー部分である。好ましくは、L4は、そのモイエティを含むリンカーを利用するコンジュゲートに対して溶解度の増大もしくは凝集特性の低下をもたらすか、またはコンジュゲートの加水分解速度を改変する。L1の場合と同じく、L4は任意で自壊的基であってもよい。1つの態様において、L4は、置換アルキル、非置換アルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアルキルまたは非置換ヘテロアルキルであり、これらはいずれも直鎖状、分岐鎖状または環状のいずれであってもよい。置換物は、例えば、低級(C1-C6)アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノまたはジアルキルアミノでありうる。ある態様において、L4は非環状部分を含む。もう1つの態様において、L4は正または負に荷電したアミノ酸重合体、例えばポリリジンまたはポリアルギニンなどを含む。L4はポリエチレングリコール部分などの重合体を含みうる。加えて、L4は、例えば、重合体成分および低分子部分の両方を含みうる。
1つの好ましい態様において、L4はポリエチレングリコール（PEG）部分を含む。L4のPEG部分は1〜50単位の長さであってよい。好ましくは、PEGは1〜12回の反復単位、より好ましくは3〜12回の反復単位、より好ましくは2〜6回の反復単位、またはさらにより好ましくは3〜5回の反復単位、最も好ましくは4回の反復単位を有すると考えられる。L4はPEG部分のみからなってもよく、またはそれがさらに別の置換もしくは非置換アルキルもしくはヘテロアルキルを含んでもよい。PEGをL4部分の一部として化合させることは、複合体の水溶性を高めるために有用である。加えて、PEG部分は、薬物の抗体とのコンジュゲーションの際に起こりうる凝集の度合いも低下させる。
下付き文字pは0または1である；すなわち、L4の存在は任意である。L4が存在する場合、それは少なくとも2つの官能基を有し、一方の官能基はその場合に応じたF、HまたはJにおける化学的官能性部と結合し、もう一方の官能基は抗体と結合する。基L4の適した化学的官能性部の例には、ヒドロキシ基、メルカプト基、カルボニル基、カルボキシ基、アミノ基、ケトン基およびメルカプト基が含まれる。抗体は典型的には、スルフヒドリル基（例えば、非酸化システイン残基、イミノチオランによるリジン残基へのスルフヒドリル含有伸長部の付加、またはジスルフィド架橋の還元に由来）、アミノ基（例えば、リジン残基に由来）、アルデヒド基（例えば、グリコシド側鎖の酸化に由来）またはヒドロキシル基（例えば、セリン残基に由来）とコンジュゲートされるため、抗体への結合のための好ましい化学官能性部は、前述の基と反応性があるものであり、その例にはマレイミド基、スルフヒドリル基、アルデヒド基、ヒドラジン、セミカルバジド基およびカルボキシル基が含まれる。抗体上のスルフヒドリル基とL4上のマレイミド基との化合が好ましい。
いくつかの態様において、L4は、(AA1)cのN末端と直接結合した、
Figure 2011505372
を含む。R20は、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。R25、R25'、R26およびR26'のそれぞれは、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、および置換または非置換ヘテロシクロアルキルから独立に選択される；かつ、sおよびtは独立に1から6までの整数である。好ましくは、R20、R25、R25'、R26およびR26'は疎水性である。いくつかの態様において、R20はHまたはアルキル（好ましくは非置換低級アルキル）である。いくつかの態様において、R25、R25'、R26およびR26'は、独立にHまたはアルキル（好ましくは非置換C1〜C4アルキル）である。いくつかの態様において、R25、R25'、R26およびR26'はすべてHである。いくつかの態様において、tは1であり、sは1または2である。
ペプチドリンカー（F）
以上に考察したように、本発明のペプチジルリンカーは、一般式:(L4)p-F-(L1)mによって表すことができ、式中、Fはペプチジル部分を含む部分を表す。1つの態様において、F部分は任意で追加の自壊的リンカーL2および1つのカルボニル基を含み、これは式（a）：
Figure 2011505372
のコンジュゲートに対応する。
この態様において、L1、L4、pおよびmは上記で定義した通りである。X4は抗体であり、Dはパートナー分子である。下付き文字oは0または1であり、L2は、存在する場合には、自壊的リンカーを表す。AA1は1つまたは複数の天然アミノ酸および／または非天然α-アミノ酸を表す；cは1から20までの整数である。いくつかの態様において、cは2から5までの範囲にあるか、または2もしくは3である。
式（a）において、AA1は、そのアミノ末端でL4と直接連結されるか、またはL4が不在の場合にはX4と直接連結される。いくつかの態様において、L4が存在する場合には、L4は(AA1)cのN末端と直接結合したカルボン酸アシル基を含まない。
もう1つの態様において、F部分は1つのアミノ基および任意で1つのスペーサー基L3を含み、かつL1は存在せず（すなわち、mは0である）、これは式（b）：
Figure 2011505372
のコンジュゲートに対応する。
この態様において、X4、D、L4、AA1、cおよびpは上記で定義した通りである。下付き文字oは0または1である。L3は存在する場合には第1級もしくは第2級アミンまたはカルボキシル官能基を含むスペーサー基であり、L3のアミンがDのペンダント（pendant）カルボキシル官能基とアミド結合を形成するか、またはL3のカルボキシルがDのペンダントアミン官能基とアミド結合を形成するかのいずれかである。
自壊的リンカー
自壊的リンカーとは、間隔のあいた2つの化学部分を1つに共有結合させて通常は安定な三部構造（tripartate）分子にすることのできる二官能性化学部分のことであり、酵素切断によって三部構造分子から前記間隔のあいた化学部分の一方を放出する；前記酵素切断の後に、分子の残りから自発的切断が生じて、前記間隔のあいた化学部分のもう一方が放出される。本発明によれば、自壊的スペーサーはその一方の末端でペプチド部分と共有結合し、もう一方の末端で、誘導体化によって薬理活性が阻害される薬物部分の化学的反応部位と共有結合しており、そうすることで、ペプチド部分および薬物部分を間隔をおいて1つに共有結合させて、標的酵素の非存在下では安定で薬理学的に不活性な三部構造分子としているが、これはペプチド部分および薬物部分を共有結合させている結合部でそのような標的酵素によって酵素的に切断可能であり、それによって三部構造分子からのペプチド部分の放出を生じさせる。そのような酵素的切断は、次にはスペーサー部分の自壊的特徴を活性化して、スペーサー部分を薬物部分と共有結合させている結合の自発的切断を開始させ、それによって薬理活性形態にある薬物の放出を生じさせると考えられる。例えば、Carl et al., J. Med. Chem., 24 (3), 479-480 (1981)；Carl et al., WO 81／01145号(1981)；Toki et al., J. Org. Chem. 67, 1866-1872 (2002)；Boyd et al., WO 2005／112919号；およびBoyd et al., WO 2007／038658号を参照のこと、それらの開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。
1つの特に好ましい自壊的スペーサーは、式（c）：
Figure 2011505372
によって表すことができる。
アミノベンジル基の芳香環は1つまたは複数の「K」基によって置換されうる。「K」基は、環構造の一部である4つの非置換炭素のうちの1つと通常であれば結合している水素を置き換える芳香環上の置換基である。「K」基はハロゲンなどの単一の原子であってもよく、または複数原子の基、例えばアルキル、ヘテロアルキル、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキルおよびシアノであってもよい。各Kは、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、NO2、NR21R22、NR21COR22、OCONR21R22、OCOR21およびOR21からなる群より独立に選択され、式中、R21およびR22は、H、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキルおよび非置換ヘテロシクロアルキルからなる群より独立に選択される。例示的なK置換基には、F、Cl、Br、I、NO2、OH、OCH3、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3およびメチルが非限定的に含まれる。「Ki」については、iは整数0、1、2、3または4である。1つの好ましい態様において、iは0である。
上記の構造のエーテル酸素原子はカルボニル基と接続している（図示せず）。NR24官能性部から芳香環の中への線は、アミン官能性部が、いずれも環を形成する5個の炭素のいずれかと結合することができ、-CH2-O-基によっては置換されないことを示す。好ましくは、XのNR24官能性部は-CH2-O-基に対してパラ位で芳香環と共有結合している。R24は、H、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキルおよび非置換ヘテロアルキルからなる群より選択されるメンバーである。1つの特定的な態様において、R24は水素である。
1つの態様において、本発明は、上記の式（a）のペプチドリンカーを提供し、ここでFは構造：
Figure 2011505372
を含み、式中、R24、AA1、K、iおよびcは上記で定義した通りである。
もう1つの態様において、上記の式（a）のペプチドリンカーは、構造：
Figure 2011505372
を含む-F-(L1)m-を含み、式中、R24、AA1、K、iおよびcは上記で定義した通りである。
いくつかの態様において、自壊的スペーサーL1およびL2は、
Figure 2011505372
を含み、式中、R17、R18およびR19のそれぞれは、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、および置換または非置換アリールから独立に選択され、wは0から4までの整数である。いくつかの態様において、R17およびR18は独立にHまたはアルキル（好ましくは非置換C1-C4アルキル）である。好ましくは、R17およびR18はC1-C4アルキル、例えばメチルまたはエチルである。いくつかの態様において、wは0である。この特定の自壊的スペーサーは比較的速やかに環化することが実験的に見いだされている。
いくつかの態様において、L1またはL2は、
Figure 2011505372
を含み、式中、R17、R18、R19、R24およびKは上記で定義した通りである。
スペーサー基
スペーサー基L3は第1級もしくは第2級アミンまたはカルボキシル官能基を含むことによって特徴づけられ、L3のアミンがDのペンダントカルボキシル官能基とアミド結合を形成するか、またはL3のカルボキシルがDのペンダントアミン官能基とアミド結合を形成するかのいずれかである。L3は、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルからなる群より選択されうる。1つの好ましい態様において、L3は芳香族基を含む。より好ましくは、L3は安息香酸基、アニリン基またはインドール基を含む。-L3-NH-スペーサーとして役立ちうる構造の非限定的な例には、以下の構造：
Figure 2011505372
が含まれ、式中、ZはO、SおよびNR23から選択されるメンバーであり、R23は、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよびアシルから選択されるメンバーである。
L3を含む本発明のリンカーが切断された後、L3部分は薬物Dと結合したままに保たれる。したがって、L3部分は、それとDとの結合がDの活性を大きく変化させないように選択される。もう1つの態様において、薬物D自体の一部分がL3スペーサーとして機能する。例えば、1つの態様において、薬物Dは、薬物の一部分がL3スペーサーとして機能するデュオカルマイシン誘導体である。そのような態様の非限定な例には、NH2-(L3)-Dが以下からなる群より選択される構造：
Figure 2011505372
を有するものが含まれ、式中、ZはO、SまたはNR23であり、R23は、H、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、またはアシルから選択される；各構造上のNH2基は(AA1)cと反応して-(AA1)c-NH-を形成する。
ペプチド配列(AA 1 ) c
基AA1は、単一のアミノ酸、またはアミド結合によって1つに連結された複数のアミノ酸を表す。アミノ酸は天然アミノ酸および／または非天然α-アミノ酸でありうる。それらはL立体配置またはD立体配置でありうる。1つの態様において、少なくとも3種の異なるアミノ酸が用いられる。もう1つの態様においては、2種のアミノ酸のみが用いられる。
「アミノ酸」という用語は、天然および非天然アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物のことを指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびにその後に改変されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸およびO-ホスホセリンなどである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、α炭素が水素、カルボキシル基、アミノ基およびR基と結合したものを指し、これには例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムがある。そのような類似体は改変されたR基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保っている。特に用いうる1つのアミノ酸はシトルリンであり、これはアルギニンの前駆体であり、肝臓における尿素の形成に関与する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様の様式で機能する化合物のことを指す。「非天然アミノ酸」という用語は、上記の20種の天然アミノ酸の「D」型立体化学形態を表すものとする。非天然アミノ酸という用語に、天然アミノ酸の相同体および天然アミノ酸の合成的改変形態が含まれることはさらに認識されている。合成的改変形態には、最大2個までの炭素原子が短縮または延長されたアルキレン鎖を有するアミノ酸、任意で置換されたアリール基を含むアミノ酸、ならびにハロゲン化基、好ましくはハロゲン化アルキル基およびアリール基を含むアミノ酸が非限定的に含まれる。本発明のリンカーまたはコンジュゲートと結合した場合、アミノ酸は、アミノ酸のカルボン酸基がケト(C(O))基で置き換えられている「アミノ酸側鎖」の形態にある。すなわち、例えば、アラニン側鎖は-C(O)-CH(NH2)-CH3であり、その他も同様である。
ペプチド配列(AA1)cは、機能的には、単一のアミノ酸の（c＝1の場合）またはアミド結合によって互いに結合した複数のアミノ酸のアミド化残基である。ペプチド配列(AA1)cは、好ましくは、生体系における関心対象の位置で酵素による酵素触媒切断を受けるように選択される。例えば、細胞に標的化されるがインターナリゼーションは受けないコンジュゲートの場合は、ペプチドが細胞外で切断されるように、細胞外マトリックス中でプロテアーゼ、例えば近傍の死滅中の細胞によって放出されるプロテアーゼまたは腫瘍関連プロテアーゼによって切断されるペプチドが選択される。細胞によるインターナリゼーション用に設計されるコンジュゲートの場合は、配列(AA1)cは、好ましくは、エンドソームまたはリソソームのプロテアーゼによって切断されるように選択される。ペプチド内部のアミノ酸の数は1〜20個の範囲にわたってよい；しかし、より好ましくは、1〜8個のアミノ酸、1〜6個のアミノ酸または1、2、3もしくは4個のアミノ酸が(AA1)cを構成する。特定の酵素または酵素クラスによる切断を受けやすいペプチド配列は当技術分野で周知である。
好ましくは、(AA1)cは、プロテアーゼによる切断部位であるアミノ酸配列（「切断認識配列」）を含む。多くのプロテアーゼ切断配列が当技術分野で公知である。例えば、Matayoshi et al. Science 247: 954 (1990)；Dunn et al. Meth. Enzymol. 241: 254 (1994)；Seidah et al. Meth. Enzymol. 244: 175 (1994)；Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994)；Weber et al. Meth. Enzymol. 244: 595 (1994)；Smith et al. Meth. Enzymol. 244: 412 (1994)；Bouvier et al. Meth. Enzymol. 248: 614 (1995), Hardy et al., in Amyloid Protein Precursor in Development, Aging, and Alzheimer's Disease, ed. Masters et al. pp. 190-198 (1994)を参照のこと。
本ペプチドは、典型的には3〜12個（またはそれ以上の）アミノ酸を含む。具体的なアミノ酸の選択は、少なくとも一部には、ペプチドを切断するために用いる酵素、ならびにインビボでのペプチドの安定性に依存すると考えられる。適した切断可能なペプチドの一例は、β-Ala-Leu-Ala-Leu（SEQ ID NO：27）である。これを安定化基と化合させることで、スクシニル-β-Ala-Leu-Ala-Leu（SEQ ID NO：30）を形成させることができる。適した切断可能なペプチドの他の例は、以下に引用した参考文献に提示されている。または、WO 2008／103693号に開示されているように、単一のアミノ酸残基を含むリンカーを用いることもでき、これは参照により本明細書に組み入れられる。
1つの好ましい態様において、ペプチド配列(AA1)cは、リソソームプロテアーゼによって切断されるその能力に基づいて選択され、その例にはカテプシンB、C、D、H、LおよびSが含まれる。好ましくは、ペプチド配列(AA1)cはインビトロでカテプシンBにより切断可能である。カテプシンBはリソソームプロテアーゼ（lysosomal proteaste）であるが、腫瘍組織の周囲の細胞外マトリックス中にはそれがある程度の濃度で存在すると考えられている。
もう1つの態様において、ペプチド配列(AA1)cは、腫瘍関連プロテアーゼ、例えば腫瘍細胞の近傍で細胞外に見いだされるプロテアーゼなどによって切断されるその能力に基づいて選択され、その例にはサイメット（thimet）オリゴペプチダーゼ（TOP）およびCD10が含まれる。または、配列(AA1)cを、ウロキナーゼまたはトリプターゼによる選択的切断を受けるように設計する。
1つの実例として、ネプリライシン、中性エンドペプチダーゼ（NEP）および急性リンパ芽球性白血病共通抗原（CALLA）としても知られるCD10は、II型細胞表面亜鉛依存性メタロプロテイナーゼである。CD10とともに用いるために適した切断可能な基質には、Leu-Ala-LeuおよびIle-Ala-Leuが含まれる。
もう1つの実例は、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）に基づく。これは腫瘍と関連のあるおそらく最も良く特徴づけられたタンパク質分解酵素であり、腫瘍微小環境内でのMMPの活性化には明らかな相関がある。特に、可溶性マトリックス酵素MMP2（ゼラチナーゼA）およびMMP9（ゼラチナーゼB）に対しては集中的な研究が行われており、腫瘍増殖を含む組織リモデリングの間に選択的に活性化されることが示されている。MMP2およびMMP9によって切断されるように設計されたペプチド配列が、デキストランおよびメトトレキサート（Chau et al., Bioconjugate Chem. 15:931-941 (2004)）；PEG（ポリエチレングリコール）およびドキソルビシン（Bae et al., Drugs Exp. Clin. Res. 29:15-23 (2004)）；ならびにアルブミンおよびドキソルビシン（Kratz et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2001-2006 (2001)）のコンジュゲートに関して設計されて検討されている。MMPとともに用いるために適した配列の例には、Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly（SEQ. ID NO：21）、Gly-Pro-Leu-Gly-Val（SEQ. ID NO：22）、Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln（SEQ. ID NO：23）、Pro-Leu-Gly-Leu（SEQ. ID NO：24）、Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Leu-Ser-Gln（SEQ. ID NO：25）およびGly-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-Gln（SEQ. ID NO：26）が非限定的に含まれる（例えば、上記の参考文献ならびにKline et al., Mol. Pharmaceut. 1:9-22 (2004)およびLiu et al., Cancer Res. 60:6061-6067 (2000)を参照）。
さらにもう1つの例は、II型膜貫通セリンプロテアーゼである。この酵素群には、例えばヘプシン、テスチシンおよびTMPRSS4が含まれる。Gln-Ala-Argは、マトリプターゼ／MT-SP1（乳癌および卵巣癌で過剰発現される）の場合に有用な1つの基質配列であり、Leu-Ser-Argは、ヘプシン（前立腺癌および一部の他の種類の腫瘍で過剰発現される）の場合に有用である（例えば、Lee et.al., J. Biol. Chem. 275:36720-36725およびKurachi and Yamamoto, Handbook of Proeolytic Enzymes Vol. 2, 2nd edition (Barrett AJ, Rawlings ND & Woessner JF, eds) pp. 1699-1702 (2004)を参照)。
本発明のコンジュゲート中に用いるのに適したペプチド配列の適した、ただし非限定的な例には、
Figure 2011505372
が含まれる。好ましいペプチド配列はVal-CitおよびVal-Lysである。
もう1つの態様において、薬物部分の最も近くに位置するアミノ酸は、以下からなる群より選択される：Ala、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrおよびVal。さらになおもう1つの態様において、薬物部分の最も近くに位置するアミノ酸は、以下からなる群より選択される：Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrおよびVal。
当業者は、一連のペプチド配列を容易に評価して、不必要な実験を行使することなく、本発明におけるそれらの有用性を判定することができる。例えば、Zimmerman, M., et al., (1977) Analytical Biochemistry 78:47-51；Lee, D., et al., (1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9:1667-72；およびRano, T.A., et al., (1997) Chemistry and Biology 4:149-55を参照。
本発明のコンジュゲートは、任意で2つまたはそれ以上のリンカーを含んでもよい。これらのリンカーは同じでも異なってもよい。例えば、薬物をリガンドと連結させるためにペプチジルリンカーを用い、第2のペプチジルリンカーがその複合体に診断用薬を結合させてもよい。追加のリンカーの他の用途には、分析用薬、生体分子、標的指向性薬および検出可能な標識を、抗体-パートナー分子複合体に連結させることが含まれる。
ヒドラジンリンカー（H）
もう1つの態様において、本発明のコンジュゲートはヒドラジン自壊的リンカーを含み、ここでコンジュゲートは構造：
X4-(L4)p-H-(L1)m-D
を有し、式中、D、L1、L4、p、mおよびX4は、上記で定義され、本明細書でさらに述べる通りであり、Hは構造：
Figure 2011505372
を含むリンカーであり、式中、n1は1から10までの整数であり；n2は0、1または2であり；各R24は、H、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキルおよび非置換ヘテロアルキルからなる群より独立に選択されるメンバーであり；Iは結合（すなわち、骨格の炭素と隣接する窒素との間の結合）または以下のもの：
Figure 2011505372
のいずれかであり、式中、n3は0または1であるが、ただしn3が0である場合、n2は0ではない；かつn4は1、2または3である。
1つの態様において、フェニル環上での置換はパラ置換である。好ましい態様において、n1は2、3もしくは4である、またはn1は3である。好ましい態様において、n2は1である。好ましい態様において、Iは結合（すなわち、骨格の炭素と隣接する窒素との間の結合）である。1つの局面において、ヒドラジンリンカーであるHは、例えば、n3が0でn4が2である場合、切断時に1つの六員自壊的リンカーを形成しうる。もう1つの態様において、ヒドラジンリンカーHは、切断時に2つの五員自壊的リンカーを形成しうる。さらに他の態様において、Hは切断時に1つの五員自壊的リンカーを形成するか、Hは1つの七員自壊的リンカーを形成するか、またはHは1つの五員自壊的リンカーおよび1つの六員自壊的リンカーを形成する。切断の速度は、切断時に形成される環のサイズに影響される。したがって、所望の切断の速度に応じて、切断時に形成させようとする適切なサイズの環を選択することができる。
もう1つのヒドラジン構造であるHは、式：
Figure 2011505372
を有し、式中、qは0、1、2、3、4、5または6であり；各R24は、H、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキルおよび非置換ヘテロアルキルからなる群より独立に選択されるメンバーである。このヒドラジン構造はまた、五員環、六員環または七員環も形成することができ、追加の成分を加えて複数の環を形成させることもできる。
さまざまなヒドラジンリンカーの調製、切断化学反応および環化動態は、WO 2005／112919号に開示されており、その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。
ジスルフィドリンカー（J）
さらにもう1つの態様において、リンカーは酵素的に切断可能なジスルフィド基を含む。1つの態様において、本発明は、式（d）：
Figure 2011505372
による構造を有する細胞傷害性抗体-パートナー化合物を提供し、式中、D、L1、L4、p、mおよびX4は上記で定義され、本明細書でさらに述べる通りであり、Jは構造：
Figure 2011505372
を有する基を含むジスルフィドリンカーであり、式中、各R24は、H、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキルおよび非置換ヘテロアルキルからなる群より独立に選択されるメンバーであり；各Kは、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、NO2、NR21R22、NR21COR22、OCONR21R22、OCOR21およびOR21からなる群より独立に選択され、式中、R21およびR22は、H、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキルおよび非置換ヘテロシクロアルキルからなる群より独立に選択される；iは整数0、1、2、3または4である；dは整数0、1、2、3、4、5もしくは6である。
ジスルフィドリンカーの芳香環は1つまたは複数の「K」基によって置換されうる。「K」基は、環構造の一部である4つの非置換炭素のうちの1つと通常であれば結合している水素を置き換える置換基である。「K」基はハロゲンなどの単一の原子であってもよく、または複数原子の基、例えばアルキル、ヘテロアルキル、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキルおよびシアノであってもよい。例示的なK置換基には、F、Cl、Br、I、NO2、OH、OCH3、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3およびメチルが非限定的に含まれる。「Ki」については、iは整数0、1、2、3または4である。1つの特定的な態様において、iは0である。
1つの好ましい態様において、リンカーは、以下の式：
Figure 2011505372
の酵素的に切断可能なジスルフィド基を含み、式中、L4、X4、pおよびR24は上記で定義された通りであり、dは0、1、2、3、4、5または6である。1つの特定の態様において、dは1または2である。
より特定的なジスルフィドリンカーは以下の式で示される：
Figure 2011505372
好ましくは、dは1もしくは2であり、各KはHである。
もう1つのジスルフィドリンカーは以下の式で示される：
Figure 2011505372
好ましくは、dは1または2であり、各KはHである。
さまざまな態様において、ジスルフィドはアミンに対してオルトである。もう1つの特定的な態様において、aは0である。好ましい態様において、R24はHおよびCH3から独立に選択される。
上記のようなジスルフィドリンカーの調製および使用は、WO 2005／112919号に開示されており、その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。
細胞毒、リンカーのタイプ、および治療剤と抗体とのコンジュゲーションのさらなる考察については、米国特許第7,087,600号；第6,989,452号；第7,129,261号；米国特許出願第2006／0004081号；第2006／0247295号；WO 02／096910号；WO 2007／051081号；WO 2005／112919号；WO 2007／059404号；WO 2008／083312号；WO 2008／103693号；Saito et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215；Trail et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337；Payne. (2003) Cancer Cell 3:207-212；Allen (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763；Pastan and Kreitman (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091；Senter and Springer (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264を参照のこと、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み入れられる。
パートナー分子としての細胞毒
1つの局面において、本発明は、細胞毒、薬物（例えば、免疫抑制薬）または放射性毒物などのパートナー分子とコンジュゲートされた抗体を特徴とする。そのようなコンジュゲートを、本明細書では「免疫毒素」とも称する。細胞毒または細胞毒性物質には、細胞に対して有害な（例えば、死滅させる）任意の作用物質が含まれる。本明細書において、「細胞毒」には、プロドラッグ形態にあってインビボで実際の毒性種に変換される化合物が含まれる。
本発明のパートナー分子の例には、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または相同体が含まれる。また、パートナー分子の例には、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU）およびロムスチン（CCNU）、シクロホスファミド、ブスルファン、チューブリシン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、シスプラチン、アントラサイクリン系薬剤（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（AMC））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）も含まれる。本発明の抗体とコンジュゲートさせることのできるパートナー分子の他の好ましい例には、カリケアマイシン、メイタンシンおよびアウリスタチン、ならびにそれらの誘導体が含まれる。
パートナー分子の好ましい例には、CC-1065および構造的に関連したデュオカルマイシン系薬剤の類似体および誘導体が含まれる。その強力かつ広域な抗腫瘍活性にもかかわらず、CC-1065は実験動物において遅発性死亡を引き起こすことからヒトでは使用することができず、このことからより優れた治療指数を有する類似体および誘導体の探索が促された。
CC-1065およびデュオカルマイシン系薬剤の多数の類似体および誘導体が当技術分野で公知である。多数の化合物の構造、合成および特性に関する研究について総説がなされている。例えば、Boger et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 1438 (1996)；およびBoger et al., Chem. Rev. 97: 787 (1997)を参照のこと。CC-1065類似体または誘導体に関するその他の開示には、以下が含まれる：米国特許第5,101,038号；第5,641,780号；第5,187,186号；第5,070,092号；第5,703,080号；第5,070,092号；第5,641,780号；第5,101,038号；第5,084,468号；第5,739,350号；第4,978,757号、第5,332,837号および第4,912,227号；WO 96/10405号；ならびに欧州特許第0,537,575 A1号。
1つの特に好ましい局面において、パートナー分子は、以下の式（e）：
Figure 2011505372
を有するCC-1065／デュオカルマイシン類似体であり、ここで環系Aは、置換または非置換アリール基、置換または非置換ヘテロアリール基および置換または非置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーである。例示的な環系Aにはフェニルおよびピロールが含まれる。
記号EおよびGは、H、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立に選択されるか、またはEおよびGが連結して、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリールおよび置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルから選択される環系を形成してもよい。
記号Xは、O、SおよびNR23から選択されるメンバーを表す。R23は、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
記号R3は、(=O)、SR11、NHR11およびOR11から選択されるメンバーを表し、ここでR11は、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、スルホネート、アシル、C(O)R12R13、C(O)OR12、C(O)NR12R13、P(O)(OR12)2、C(O)CHR12R13、SR12またはSiR12R13R14である。記号R12、R13およびR14は、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよび置換または非置換アリールを独立に表し、ここでR12およびR13は、それらが結合している窒素または炭素原子とともに連結して、四員〜六員を有し、任意で2つまたはそれ以上のヘテロ原子を含んでもよい置換または非置換ヘテロシクロアルキル環系を形成してもよい。
R4、R4'、R5およびR5'は、H、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15=NR16およびO(CH2)nN(CH3)2（式中、nは1から20までの整数である）から独立に選択されるメンバーであるか、またはR4、R4'、R5およびR5'のいずれかの隣接した対が、それらが結合している炭素原子とともに連結して、四員〜六員を有する置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル環系を形成する。R15およびR16は、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキルおよび置換または非置換ペプチジルを独立に表し、ここでR15およびR16は、それらが結合している窒素原子とともに連結して、四員〜六員を有し、任意で2つまたはそれ以上のヘテロ原子を含んでもよい置換または非置換ヘテロシクロアルキル環系を形成してもよい。1つの例示的な構造はアニリンである。
R3、R4、R4'、R5およびR5'の1つは、細胞毒を、本明細書に記載したような本発明のリンカーまたは酵素的に切断可能な基質と、例えば存在するならばL1もしくはL3と、またはF、HもしくはJと連結させる。
R6は、存在するかまたは存在しない単結合である。R6が存在する場合、R6およびR7は連結してシクロプロピル環を形成する。R7はCH2-X1もしくは-CH2-である。R7が-CH2-である場合、それはシクロプロパン環の成分である。記号X1は、ハロゲン、例えばCl、BrまたはFなどの脱離基を表す。R6およびR7の組み合わせは、化学結合価の原理に反しないように解釈される。
X1は任意の離脱基であってよい。有用な離脱基には、ハロゲン、アジド、スルホン酸エステル（例えば、アルキルスルホニル、アリールスルホニル）、オキソニウムイオン、アルキル過塩素酸塩、アンモニオアルカンスルホン酸エステル、アルキルフルオロスルホネートおよびフッ素化化合物（例えば、トリフレート、ノナフレート、トレシレート）などが非限定的に含まれる。離脱基として有用な具体的なハロゲンは、F、ClおよびBrである。
六員環内部の曲線は、環が1つまたは複数の不飽和度を有し、それが芳香族性でありうることを示す。したがって、以下に示されたものなどの環構造およびそれに関連した構造は、式（f）:
Figure 2011505372
の範囲内にある。
1つの態様において、R11は、自己環化することなく薬物を、存在するならばL1もしくはL3と、またはF、HもしくはJと連結させる部分X5を含む。部分X5は、好ましくは酵素を用いて切断可能であり、切断された場合に活性薬物をもたらす。一例として、R11は、以下の構造（右側が薬物の残りとカップリングしている）：
Figure 2011505372
を有しうる。
いくつかの態様において、R4、R4'、R5およびR5'の少なくとも1つは、前記薬物を、存在するならばL1と、またはF、H、JもしくはX2と連結させ、かつR3は、SR11、NHR11およびOR11から選択される。R11は、
Figure 2011505372
ならびにそれらの薬学的に許容される塩から選択され、式中、nは1から10までの範囲の任意の整数であり、mは1から4までの範囲の任意の整数であり、pは1から6までの範囲の任意の整数であり、かつAAは任意の天然または非天然アミノ酸である。式（e）の化合物がR4、R4'、R5またはR6を介してコンジュゲートされる場合、R3は好ましくは、その存在が化合物の細胞傷害活性を阻害するが、意図した作用部位で見いだされる条件下では、細胞毒を抗体とコンジュゲートさせるリンカーの切断のための機序とは異なる機序によって切断可能である、切断可能な阻害基を含む。こうすることで、もし血漿中でコンジュゲートの偶発的な切断があっても、放出された細胞毒の細胞傷害性を遮断基が弱める。例えば、コンジュゲートがヒドラゾンリンカーまたはジスルフィドリンカーを有するならば、遮断基は酵素的に切断可能なアミドでありうる。または、リンカーがプロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカーであるならば、遮断基はカルボキシエステラーゼによって切断可能なエステルまたはカルバメートでありうる。
例えば、1つの好ましい態様において、Dは構造（j）：
Figure 2011505372
を有する細胞毒である。
この構造では、R3、R6、R7、R4、R4'、R5、R5'およびXは、式（e）に関して上述した通りである。ZはO、SおよびNR23から選択されるメンバーであり、ここでR23は、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
R1は、H、置換もしくは非置換低級アルキル、C(O)R8またはCO2R8であり、ここでR8はNR9R10およびOR9から選択されるメンバーであり、ここでR9およびR10は、H、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから独立に選択されるメンバーである。
R1'は、H、置換もしくは非置換低級アルキル、またはC(O)R8であり、ここでR8はNR9R10およびOR9から選択されるメンバーであり、ここでR9およびR10は、H、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから独立に選択されるメンバーである。
R2は、H、または置換もしくは非置換低級アルキル、または非置換ヘテロアルキル、またはシアノまたはアルコキシであり；R2'は、Hまたは置換もしくは非置換低級アルキルまたは非置換ヘテロアルキルである。
R3、R4、R4'、R5またはR5'の1つは、細胞毒を、本明細書に記載したような本発明のリンカーまたは酵素的に切断可能な基質と、例えば存在するならばL1もしくはL3と、またはF、HもしくはJと連結させる。
1つのさらなる態様は、式：
Figure 2011505372
を有する。
この構造では、A、R6、R7、X、R4、R4'、R5およびR5'は、式（e）に関して上述した通りである。ZはO、SおよびNR23から選択されるメンバーであり、ここでR23は、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
R34はC(=O)R33またはC1-C6アルキルであり、式中、R33は、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15またはOR15、CR15=NR16およびO(CH2)nN(CH3)2から選択され、式中、nは1から20までの整数である。R15およびR16は、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキルおよび置換または非置換ペプチジルを独立に表し、式中、R15およびR16は、それらが結合している窒素または炭素原子とともに連結して、四員〜六員を有し、任意で2つまたはそれ以上のヘテロ原子を含んでもよい置換または非置換ヘテロシクロアルキル環系を形成してもよい。
好ましくは、Aは、置換もしくは非置換フェニルまたは置換もしくは非置換ピロールである。さらに、R11に対する本明細書に記載した置換基の選択はいずれもR33にも適用可能である。
好ましいパートナー分子は、式（1）によって表される構造を有する。
Figure 2011505372
式（I）中、PDはプロドラッグ化基（prodrugging group）を表す（時には保護基とも称される）。化合物（I）はインサイチューで加水分解されて（好ましくは酵素的に）、式（II）の化合物を放出する。当業者は認識しているであろうが、化合物（II）は、CBI化合物として知られるクラスの化合物に属する（Boger et al., J. Org. Chem. 2001, 66, 6654-6661およびBoger et al., 米国特許出願第2005/0014700 A1号(2005)。CBI化合物はインサイチューで（または、患者に投与される場合はインビボで）化合物（III）などのそのシクロプロピル誘導体に変換されて、DNAの副溝（minor groove）と結合し、続いてDNAをアデニン基でアルキル化するが、シクロプロピル誘導体が実際のアルキル化剤と考えられている。
Figure 2011505372
適したプロドラッグ化基PDの非限定的な例には、以下に図示したように、エステル、カルバメート、ホスフェート、グリコシドが含まれる。
Figure 2011505372
好ましいプロドラッグ化基PDは、カルボキシエステラーゼによって加水分解可能なカルバメート（上記の最初の5つの構造によって例示されている）；アルカリホスファターゼによって加水分解可能なホスフェート（上記の6番目の構造）、およびβ-グルクロニダーゼによって加水分解可能なβ-グルクロン酸である。特に好ましいパートナー分子は、式（IV）によって表される、カルバメートでプロドラッグ化されたものである：
Figure 2011505372
パートナー分子としてのマーカー
パートナー分子がマーカーである場合、それは検出可能な物理的または化学的な特性を有するかまたは生成し、それによって特定の組織または細胞におけるその存在を指し示す、任意の部分でありうる。マーカー（時にはレポーター基とも呼ばれる）は、イムノアッセイ、生物医学研究および医学的診断の分野で十分に開発されている。マーカーは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出しうる。その例には、磁気ビーズ（例えば、DYNABEADS（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、3H、125I、35S、14Cまたは32P）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびELISAに一般に用いられるその他のもの）、ならびにコロイド金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスその他）などの比色標識を含む。
マーカーは、好ましくは、放射性同位体、蛍光物質、蛍光物質前駆体、発色団、酵素およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるメンバーである。適した酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシダーゼがある。蛍光物質には、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれる。化学発光化合物には、ルシフェリンおよび2,3-ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールが含まれる。用いうるさまざまな標識系またはシグナル生成系の総説については、米国特許第4,391,904号を参照のこと。
マーカーは間接的な手段によって結合させることができる：リガンド分子(例えば、ビオチン）を抗体と共有結合させる。続いてリガンドを別の分子（例えば、ストレプトアビジン）と結合させるが、それは本質的に検出可能であるかまたはシグナル系、例えば検出可能な酵素、蛍光化合物もしくは化学発光化合物と共有結合している。
コンジュゲートの例
本発明の抗体のコンジュゲーションのために適したパートナー分子-リンカーの組み合わせの具体例を以下に示す：
Figure 2011505372
Figure 2011505372
Figure 2011505372
Figure 2011505372
Figure 2011505372
Figure 2011505372
前記の化合物において、下付き文字rが式中に存在する場合には、それは0から24までの整数、好ましくは4である。Rは、それが存在する場合には常に、
Figure 2011505372
である。
前記の化合物のそれぞれはマレイミド基を有し、そこにあるスルフヒドリル基を介してそのまま抗体とのコンジュゲーションを行える。
薬学的組成物
もう1つの局面において、本開示は、組成物、例えば薬学的に許容される担体とともに製剤化された本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分のうちの1つまたは組み合わせを含む薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、本開示の抗体またはイムノコンジュゲート（immunoconjugate）もしくは二重特異性分子のうちの1つまたはそれらの組み合わせ（例えば、2種またはそれ以上の異なるもの）を含みうる。例えば、本開示の薬学的組成物は、標的抗原上の複数の異なるエピトープと結合するかまたは相補的活性を有する抗体（またはイムノコンジュゲートもしくは二重特異性抗体）の組み合わせを含みうる。
また、本開示の薬学的組成物は、併用療法において、すなわち他の作用物質と組み合わせて投与することもできる。例えば、併用療法は、本開示の抗B7-H4抗体と、少なくとも1つの他の抗癌薬との併用を含みうる。併用療法に用いることのできる治療剤の例は、本開示の抗体の使用に関する下記の項において、より詳細に記載されている
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」には、生理学的な適合性のある、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。投与経路によっては、活性化合物、すなわち抗体、イムノコンジュゲートまたは二重特異性分子を、化合物を酸の作用および化合物を不活性化しうる他の天然条件から保護するための材料でコーティングしてもよい。
本開示の薬学的化合物は、1つまたは複数の薬学的に許容される塩を含みうる。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保ち、かつ、望ましくない毒物学的作用を全くもたらすことのない塩のことを指す（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J Pharm. Sci. 66:1-19を参照）。そのような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無毒な無機酸から導かれるもの、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの無毒な有機酸から導かれるものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属から導かれるもの、ならびにN,N'-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒な有機アミンから導かれるものが含まれる。
本開示の薬学的組成物はまた、薬学的に許容される酸化防止剤を含んでもよい。薬学的に許容される酸化防止剤の例には、以下のものが含まれる：（1）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；（2）アスコルビルパルミテート、ブチルヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；および（3）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤。
本開示の薬学的組成物中に用いうる適した水性および非水性の担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適した混合物、オリーブオイルなどの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合の必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
これらの組成物は、さらに保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含んでもよい。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順、ならびにさまざまな抗菌薬および抗真菌薬、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有の両方によって確実に行うことができる。組成物中に、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが望ましいこともある。加えて、注射可能な剤形の持続吸収を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる作用物質を含めることによって実現することもできる。
薬学的に許容される担体には、無菌注射溶液または分散液を即時に調製するための、無菌水溶液または分散液および無菌粉末が含まれる。薬学的活性物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、当技術分野において公知である。任意の従来の媒質または作用物質は、活性化合物との適合性がない場合を除いて、本開示の薬学的組成物中の使用が想定される。補足的な活性化合物を組成物に組み入れることもできる。
治療用組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソームまたは高い薬物濃度に適する他の秩序立った構造として製剤化することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適した混合物を含む、溶媒または分散媒でありうる。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液の場合の必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合には、組成物中に、糖、マンニトールもしくはソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが好ましいと考えられる。注射可能な組成物の持続吸収は、組成物中に、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによって実現することができる。
無菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した成分の1つまたは組み合わせとともに適切な溶媒に組み入れ、その後に滅菌マイクロ濾過を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基礎分散媒および上記に列挙した成分のうち必要とされる他の成分を含む無菌の媒体中に組み入れることによって調製される。無菌注射溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に任意の所望の追加の成分を加えたものの粉末を、そのあらかじめ無菌濾過された溶液から得る、真空乾燥および凍結乾燥（凍結乾燥法）である。
担体材料と組み合わせて単一の剤形を生成することができる活性成分の量は、治療される対象および具体的な投与様式に応じて変化すると考えられる。担体材料と組み合わせて単一の剤形を生成することができる活性成分の量は一般に、治療効果を生じさせる組成物の量と考えられる。一般にこの量は、薬学的に許容される担体と組み合わせて100％のうち、約0.01％〜約99％の活性成分、好ましくは約0.1％〜約70％、最も好ましくは約1％〜約30％の活性成分の範囲と考えられる。
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）が得られるように調節される。例えば、単回ボーラス投与を行ってもよく、または数回に分割した用量を時間をかけて投与してもよく、または治療状況の必要性に合わせて用量を減らすかもしくは増やしてもよい。投与の容易さおよび用量の均一性のために、非経口用組成物を投与単位形態で調製することが特に有利である。本明細書で用いる場合、単位投薬剤形とは、治療される対象に対する単位用量として適する物理的に離散的な単位のことを指す；各単位は、所望の治療効果を生じさせるように計算された所定の量の活性化合物を必要な薬学的担体とともに含む。本開示の単位投薬剤形に関する仕様は、（a）活性化合物の固有の特性および達成しようとする特定の治療効果、ならびに（b）そのような活性化合物を個体における感受性の処置のために調合する場合の当技術分野に内在する限界、によって規定され、かつそれらに直接依存する。
抗体を投与する場合、用量は、約0.0001〜100mg／kg宿主体重、より通常は0.01〜5mg／kg宿主体重の範囲である。例えば、用量は0.3mg／kg体重、1mg／kg体重、3mg／kg体重、5mg／kg体重もしくは10mg／kg体重であってよく、または1〜10mg／kgの範囲内であってよい。例示的な治療レジメンには、1週間に1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回、4週間毎に1回、毎月1回、3カ月毎に1回、または3〜6カ月毎に1回の投与が含まれる。本開示の抗B7-H4抗体に関する好ましい投与レジメンは、静脈内投与を介した1mg／kg体重または3mg／kg体重を含み、抗体は以下の投与スケジュールの1つを用いて投与される：（i）4週間毎に6回投与し、その後は3カ月毎；（ii）3週間毎；（iii）3mg／kg体重を1回、その後は1mg／kg体重を3週間毎。
いくつかの方法においては、異なる結合特異性を有する2つまたはそれ以上のモノクローナル抗体が同時に投与されるが、この場合、投与される各抗体の用量は示された範囲内に収まる。抗体は通常は複数回投与される。単回投与の間隔は、例えば毎週、毎月、3カ月毎または毎年であってよい。間隔はまた、患者における標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することによって指示される場合には不規則となる可能性もある。いくつかの方法において、用量は約1〜1000μg／mlの、方法によっては約25〜300μg／mlの血漿中抗体濃度が達成されるように調節される。
または、抗体を徐放性製剤として投与することもでき、この場合には必要な投与回数はより少なくなる。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、その後にヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与の用量および頻度は、治療が予防的であるか治療的であるかに応じて変化しうる。予防的用途では、比較的低用量を比較的頻繁でない間隔で長期間にわたって投与する。患者によっては、人生の残りの期間を通じて治療を受け続ける。治療的用途では、疾患の進行が減少または停止するまで、好ましくは患者が疾患症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的高用量を比較的短い間隔で投与することが時に必要である。その後、患者に予防レジメンを投与することができる。
異常な細胞増殖が関係する疾患の予防および／または治療における使用に関しては、投与された化合物の約0.001μM〜20μMの循環中濃度が好ましく、約0.01μM〜5μMが好ましい。
本明細書に記載した化合物の経口投与のための患者への用量は、典型的には約1mg／日〜約10,000mg／日、より典型的には約10mg／日〜約1,000mg／日、最も典型的には約50mg／日〜約500mg／日の範囲である。患者体重に換算して記述すると、典型的な用量は、約0.01〜約150mg／kg／日、より典型的には約0.1〜約15mg／kg／日、最も典型的には約1〜約10mg／kg／日、例えば5mg／kg／日または3mg／kg／日の範囲である。
少なくともいくつかの態様において、腫瘍増殖を遅延させるかまたは阻害する患者への用量は1μmol／kg／日またはそれ未満でありうる。例えば、患者への用量は、0.9、0.6、0.5、0.45、0.3、0.2、0.15または0.1μmol／kgまたはそれ未満でありうる（薬物のモル数に言及している）。好ましくは、抗体-薬物コンジュゲートは、少なくとも5日間にわたって毎日投与された場合に腫瘍増殖を遅延させる。少なくともいくつかの態様において、腫瘍はSCIDマウスにおけるヒト型腫瘍である。一例として、SCIDマウスはCB17.SCIDマウスであってよい（Taconic, Germantown, NYから入手可能）。
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与レベルは、患者に対して毒性を示すことなく、特定の患者、組成物および投与様式に関して所望の治療反応を得るために有効な活性成分の量が得られるように変化させることができる。選択される用量レベルは、用いられる本開示の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与の経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排泄速度、治療期間、他の薬物、用いられる特定の組成物と併用される化合物および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康状態および過去の病歴を含む種々の薬物動態学的な要因、ならびに医学の技術分野において周知である同様の要因に依存すると考えられる。
本開示の抗B7-H4抗体の「治療的有効量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない期間の頻度および持続時間の増大、または疾患の罹患による障害もしくは能力障害の予防をもたらす。例えば、腫瘍を持つ対象の治療に関して、「治療的有効量」は、好ましくは、細胞増殖を、治療されていない対象に比して少なくとも約20％、より好ましくは少なくとも約40％、さらにより好ましくは少なくとも約60％、さらにより好ましくは少なくとも約80％阻害する。化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価することができる。または、組成物のこの特性を、化合物が細胞増殖を阻害する能力を検討することによって評価することもでき、そのような阻害は当業者に公知のアッセイによってインビトロで測定することができる。治療用化合物の治療的有効量は、対象において、腫瘍サイズを減少させるか、そうでなければ症状を改善することができる。当業者は、対象の大きさ、対象の症状の重症度、および選択された特定の組成物または投与経路などの要因に基づいて、そのような量を決定することができると考えられる。
本開示の組成物は、当技術分野で公知の種々の方法の1つまたは複数を用いて、1つまたは複数の投与経路によって投与することができる。当業者は理解しているであろうが、投与の経路および／または様式は所望の結果に応じて変化すると考えられる。本開示の抗体の好ましい投与経路には、例えば注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄への、または他の非経口的な投与経路が含まれる。本明細書で用いる場合、「非経口的投与」という語句は、経腸および局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、これには静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内への注射および注入が非限定的に含まれる。
または、本開示の抗体を、局所的、表皮、粘膜投与経路などの非経口的経路を介して、例えば鼻腔内、口内、膣内、直腸内、舌下または局所に投与することもできる。
インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、活性化合物を、急速な放出から化合物を保護する担体とともに製剤化することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの、生分解性で生体適合性のポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製のための多くの方法は、特許を得ているか、または当業者に一般に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。
治療用組成物は、当技術分野で公知の医療装置を用いて投与することができる。例えば、1つの好ましい態様において、本開示の治療用組成物を、米国特許第5,399,163号；第5,383,851号；第5,312,335号；第5,064,413号；第4,941,880号；第4,790,824号；または第4,596,556号中に開示された装置などの針なし皮下注射装置で投与することができる。本開示において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例には、以下のものが含まれる：米国特許第4,487,603号、これは制御された速度で医薬品を投薬するための植え込み型マイクロ注入ポンプを開示している；米国特許第4,486,194号、これは皮膚を通して医薬品を投与するための治療装置を開示している；米国特許第4,447,233号、これは正確な注入速度で医薬品を送達するための医薬品注入ポンプを開示している；米国特許第4,447,224号、これは連続的な薬物送達のための可変流量植え込み型注入装置を開示している；米国特許第4,439,196号、これはマルチチャンバー区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示している；および米国特許第4,475,196号、これは浸透圧薬物送達システムを開示している。これらの特許は、参照により本明細書に組み入れられる。他の多くのそのようなインプラント、送達システムおよびモジュールが当業者に公知である。
ある態様において、本開示のヒトモノクローナル抗体は、インビボでの適切な分布を確実にするために製剤化することができる。例えば、血液脳関門（BBB）は多くの高親水性化合物を排除する。本開示の治療用化合物が（所望であれば）BBBを越えることを確実にするために、それらを例えばリポソーム中に製剤化することができる。リポソームを製造する方法については、例えば米国特許第4,522,811号；第5,374,548号；および第5,399,331号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送され、それ故に標的化された薬物送達を促す1つまたは複数の部分を含んでもよい（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照）。例示的な標的指向性部分には、葉酸またはビオチン（例えば、Lowらに対する米国特許第5,416,016号を参照）；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；サーファクタントプロテインA受容体（Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）；p120（Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）が含まれる；同じく、K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123；J.J. Killion; I.J. Fidler （1994）; Immunomethods 4:273も参照のこと。
本開示の使用および方法
本開示の、抗体、特にヒト抗体を含む本開示の抗体-パートナー分子コンジュゲート、抗体組成物および方法は、例えば、B7-H4の検出、癌の治療、またはB7-H4の阻害による免疫応答の強化を含め、数多くのインビトロおよびインビボでの診断上および治療上の有用性を有する。1つの好ましい態様において、本開示の抗体はヒト抗体である。例えば、これらの分子を、培養下にある細胞に対してインビトロまたはエクスビボで、またはヒト対象に対して例えばインビボで、種々の障害を治療するため、予防するため、および診断するために、または種々の状況下で免疫を強化するために、投与することができる。
本明細書で用いる場合、「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むものとする。「非ヒト動物」という用語には、すべての脊椎動物、例えば非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生動物および爬虫類などの哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。好ましい対象には、B7-H4の発現と関連のある、または免疫応答の強化を必要とする障害を有するヒト患者が含まれる。本方法は、異常なB7-H4発現と関連のある障害を有するヒト患者を治療するために特に適している。本方法はまた、T細胞によって媒介される免疫応答を増強することによって治療しうる障害を有するヒト患者を治療するためにも特に適している。免疫の抗原特異的な強化を達成するために、抗B7-H4抗体を、関心対象の抗原とともに投与することができる。B7-H4に対する抗体を別の作用物質とともに投与する場合は、この2つをいずれの順序で投与することもでき、または同時に投与することもできる。
本開示の抗体のB7-H4に対する特異的結合を考慮すれば、本開示の抗体は、細胞表面でのB7-H4発現を特異的に検出するために用いることができ、さらに、イムノアフィニティー精製によってB7-H4を精製するために用いることもできる。
B7-H4は、乳房細胞癌、転移性乳癌、卵巣細胞癌、転移性卵巣癌および腎細胞癌を含む種々のヒト癌で発現される（Tringler et al (2005) Clinical Cancer Res. U: 1842-48；Salceda et al. (2005) Exp Cell Res. 306:128-41；Tringler et al. (2006) Gynecol Oncol. 100:44-52；Krambeck et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:10391-6；Chen et al. (2006) Kidney Int. Epub；Sun et al. (2006) Lung Cancer 53:143-51；Bignotti et al. (2006) Gynecol Oncol. 103:405-16；Kryczek et al. (2006) J Exp Med 203:871-81；Simon et al. (2006) Cancer Res. 66:1570-5）。抗B7-H4抗体を、癌性腫瘍の増殖を阻害するために単独で用いてもよい。または、抗B7-H4抗体を、以下に述べるように、他の免疫原性物質、標準的な癌治療または他の抗体とともに用いることもできる。
BおよびTリンパ球アテニュエーター（BTLA）は、B7-H4の受容体であることが見いだされており、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA-4）およびprogrammed death-1（PD-1）と同様に、免疫応答に対する阻害作用を有する（Carreno and Collins (2003) Trends Iminunol 24:524-7）。B7-H4は、T細胞増殖、サイトカイン産生および細胞周期生成の阻害によってT細胞免疫を負に調節することによって機能する（Choi et al. (2003) J Immunol. 171:4650-4）。B7-H4-Ig融合タンパク質はT細胞活性化を阻害し、一方、抗体によるB7-H4の阻害は患者における免疫応答を強化することができる（Sica et al. (2003) Immunity 18:849-61）。
1つの局面において、本開示は、癌性腫瘍の増殖が阻害されるような、抗B7-H4抗体を用いたインビボでの対象の治療に関する。抗B7-H4抗体を、癌性腫瘍の増殖を阻害するために単独で用いてもよい。または、抗B7-H4抗体を、以下に述べるように、他の免疫原性物質、標準的な癌治療または他の抗体とともに用いることもできる。
したがって、1つの態様において、本開示は、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、対象に対して抗B7-H4抗体またはその抗原結合部分の治療的有効量を投与する段階を含む方法を提供する。好ましくは、抗体はヒト抗B7-H4抗体（本明細書に記載されたヒト抗ヒトB7-H4抗体のいずれかなど）である。追加的または代替的に、抗体はキメラ抗体またはヒト化抗B7-H4抗体であってもよい。
本開示の抗体を用いて増殖を阻害しうる可能性のある好ましい癌には、典型的には免疫療法に応答する癌が含まれる。治療のための好ましい癌の非限定的な例には、乳癌（例えば、乳房細胞癌）、卵巣癌（例えば、卵巣細胞癌）および腎細胞癌（RCC）が含まれる。本開示の方法を用いて治療しうる可能性のある他の癌の例には、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、前立腺癌、結腸癌、肺癌、骨悪性腫瘍（bone cancer）、膵癌、皮膚癌、脳腫瘍、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性または急性白血病、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性CNSリンパ腫、T細胞リンパ腫）、鼻咽頭癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、乳腺癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形癌、膀胱癌、腎癌または尿管癌、乳癌または骨盤癌、中枢神経系（CNS）新生物、腫瘍血管新生、脊椎（spinal axis）腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発性の癌、例えば中皮腫、および前記癌の組み合わせが含まれる。
任意で、B7-H4に対する抗体を、免疫原性物質、例えば癌細胞、精製腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび糖質分子を含む）、細胞、および免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子がトランスフェクトされた細胞などと組み合わせてもよい（He et al, J. Immunol. 173:4919-28 (2004)）。用いうる腫瘍ワクチンの非限定的な例には、黒色腫抗原のペプチド、例えばgp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1および／もしくはチロシナーゼのペプチド、またはサイトカインGM-CSFを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞が含まれる。ヒトでは、黒色腫などのある種の腫瘍は免疫原性であることが示されている。B7-H4の阻害によってT細胞活性化の閾値を上昇させることにより、腫瘍に対する、宿主における応答が活性化されると予想される。
B7-H4の阻害は、ワクチン接種プロトコールと組み合わせた場合に最も有効である可能性が高い。腫瘍に対するワクチン接種については多くの実験戦略が考案されている（Rosenberg, "Development of Cancer Vaccines" ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000)；Logothetis, ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000)；Khayat, ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000)；Foon, ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000)を参照；同じく、De Vita et al. (ed.) Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition (1997)中のRestifo and Sznol, Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043も参照のこと）。これらの戦略の1つにおいては、ワクチンを自家または同種腫瘍細胞を用いて調製する。典型的には、これらの細胞ワクチンは、GM-CSFを発現するように腫瘍細胞に形質導入を行った場合に最も有効である。GM-CSFは、腫瘍ワクチン接種における抗原提示の強力な活性化因子であることが示されている（Dranoff et al. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90: 3539-43 (1993)）。
さまざまな腫瘍における遺伝子発現および大規模な遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義が導かれた（Rosenberg, Immunity 10:281-7 (1999)）。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍内および腫瘍が発生した細胞内で発現される分化抗原であり、これには例えばメラノサイト抗原gp100、MAGE抗原およびTrp-2がある。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主内に見いだされる腫瘍特異的T細胞の標的であることを示すことができる。B7-H4の阻害は、腫瘍内で発現される組換えタンパク質および／またはペプチドの集合と、これらのタンパク質に対する免疫応答を生じさせることを目的として併せて用いることができる。これらのタンパク質は通常、免疫系によって自己抗原として捉えられ、そのためそれらに対して寛容である。腫瘍抗原には、染色体のテロメアの合成のために必要とされ、かつヒト癌の85％超で発現され、ごくわずかな数の体組織でしか発現されないタンパク質であるテロメラーゼも含まれうる（Kim et al, Science 266:2011-2013 (1994)）。（これらの体組織はさまざまな手段によって免疫攻撃から防御されうる）。腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を変化させるかもしくは関連のない2つの配列間の融合タンパク質（すなわち、フィラデルフィア染色体におけるbcr-abl）を作り出す体細胞突然変異、またはB細胞腫瘍由来のイディオタイプの理由から、癌細胞で発現される「新抗原（neo-antigen）」でもありうる。
他の腫瘍ワクチンには、ヒトパピローマウイルス（HPV）、肝炎ウイルス（HBVおよびHCV）およびカポジヘルペス肉腫ウイルス（KHSV）などの、ヒト癌と関連づけられているウイルス由来のタンパク質が含まれうる。B7-H4の阻害と併せて用いうるもう1つの形態の腫瘍特異的抗原は、腫瘍組織自体から単離される精製熱ショックタンパク質（HSP）である。これらの熱ショックタンパク質は腫瘍細胞由来のタンパク質の断片を含み、これらのHSPは腫瘍に対する免疫を惹起させるための抗原提示細胞への送達において効果が非常に高い（Suot and Srivastava Science 269:1585-1588 (1995))；Tamura et al. Science 278:117- 120 (1997)）。
樹状細胞（DC）は、抗原特異的応答のプライミングのために用いうる強力な抗原提示細胞である。DCをエクスビボで作製し、さまざまなタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物による負荷刺激を加えることができる（Nestle, F. et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332）。DCに対して、これらの腫瘍抗原を発現させるための遺伝的手段によって形質導入を行ってもよい。DCはまた、免疫化を目的として腫瘍細胞と直接融合されてもいる（Kugler, A. et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336）。ワクチン接種の方法として、DC免疫化をPD-1の阻害と有効に併用することで、より強力な抗腫瘍応答を活性化させることができる。
また、B7-H4の阻害を、標準的な癌治療と併用することもできる。B7-H4の阻害を、化学療法レジメンと有効に併用することができる。これらの場合に、投与される化学療法試薬の用量を減らすことができることもある（Mokyr, M. et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304）。そのような併用の一例は、さまざまな癌の治療のためにデカルバジン（decarbazine）と併用される抗B7-H4抗体である。そのような併用のもう1つの例は、さまざまな癌の治療のための、抗B7-H4抗体とインターロイキン-2（IL-2）の併用である。B7-H4の阻害と化学療法薬の併用の背後にある科学的根拠は、大部分の化学療法用化合物の細胞毒性作用の帰結である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの上昇をもたらすはずと考えられることである。細胞死を通じてB7-H4の阻害との相乗効果をもたらす可能性のある他の併用療法には、放射線、外科手術およびホルモン除去がある。これらのプロトコールはそれぞれ、宿主における腫瘍抗原の供給源を作り出す。血管新生阻害薬をB7-H4の阻害と併用することもできる。血管新生の阻害は腫瘍細胞死を引き起こし、それによって腫瘍抗原が宿主の抗原提示経路に供給される可能性がある。
また、B7-H4を阻害する抗体を、FcαまたはFcγ受容体を発現するエフェクター細胞を腫瘍細胞に向かわせる二重特異性抗体と併用することもできる（例えば、米国特許第5,922,845号および第5,837,243号を参照）。二重特異性抗体は、2つの別々の抗原を標的化するために用いることができる。例えば、抗Fc受容体／抗腫瘍抗原（例えば、Her-2／neu）二重特異性抗体は、腫瘍の部位にマクロファージを向かわせるために用いられている。この標的化は、腫瘍特異的な応答をより有効に活性化することができる。これらの応答のT細胞による部分（T cell arm）は、B7-H4阻害の使用によって増強されると考えられる。または、抗原を、腫瘍抗原および樹状細胞特異的な細胞表面マーカーと結合する二重特異性抗体の使用によってDCに直接送達することもできる。
腫瘍は多種多様な機序によって宿主の免疫監視を回避する。これらの機序の多くは、腫瘍によって発現され、かつ免疫抑制性であるタンパク質の不活性化によって克服することができる。これらには特に、TGF-β（Kehrl, J. et al (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050）、IL-10（Howard, M. & O'Garra, A. (1992) Immunology Today 13: 198-200）およびFasリガンド（Hahne, M. et al (1996) Science 274: 1363-1365）が含まれる。これらの実体のそれぞれに対する抗体を抗PD-1と併用することで、免疫抑制薬の効果を打ち消して、宿主による腫瘍に対する免疫応答を援助することができる。
宿主の免疫応答性を活性化するために用いうる他の抗体を、抗B7-H4と併用することもできる。これらには、DCの機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子が含まれる。抗CD40抗体は、T細胞ヘルパー活性を有効に代替することができ（Ridge, J. et al. (1998) Nature 393: 474-478）、B7-H4抗体と併用することができる。CTLA-4（例えば、米国特許第5,811,097号）、OX-40（Weinberg, A. et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169）、4-1BB（Melero, I. et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997）、PD-1（del Rio et al. (2005) Eur J lmmunol 35:3545-60）およびICOS（Hutloff, A. et al (1999) Nature 397: 262-266）などのT細胞副刺激分子に対する抗体の活性化も、T細胞活性化のレベルの上昇をもたらしうる。
種々の造血由来の腫瘍を治療するために、現在では骨髄移植が用いられている。移植片対宿主病はこの治療の1つの帰結であるが、一方、移植片対腫瘍応答から治療上の利益を得ることもできる。B7-H4の阻害を用いて、ドナーに移植された腫瘍特異的T細胞の有効性を高めることができる。
腫瘍に対する抗原特異的T細胞を同定するための、抗原特異的T細胞のエクスビボ活性化および増量ならびにこれらの細胞のレシピエントへの養子移入を含む実験的治療プロトコールもいくつか存在する（Greenberg, R. & Riddell, S. (1999) Science 285: 546-51）。これらの方法を、CMVなどの感染因子に対するT細胞応答を活性化させるために用いることもできる。抗B7-H4抗体の存在下におけるエクスビボ活性化は、養子移入されたT細胞の頻度および活性を高めることが予想される。
さまざまな腫瘍細胞上でのB7-H4の発現を考慮すれば、本開示のヒト抗体、抗体組成物および方法は、腫瘍形成性障害、例えば乳癌（例えば、乳房細胞癌）、卵巣癌（例えば、卵巣細胞癌）および腎癌を含む、B7-H4を発現する腫瘍細胞の存在によって特徴づけられる障害を有する対象を治療するために用いることができる。本開示の方法を用いて治療しうる可能性のある他の癌の例には、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、前立腺癌、結腸癌、肺癌、骨悪性腫瘍、膵癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ球性白血病（ALL）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ALCL）、多発性骨髄腫、皮膚T細胞リンパ腫、結節性小切れ込み核細胞リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球リンパ腫、T細胞白血病／リンパ腫（ATLL）、成人T細胞白血病（T-ALL）、中心芽型／中心細胞型（cb／cc）濾胞性リンパ腫癌、B系統びまん性大細胞型リンパ腫、血管免疫芽細胞リンパ節症（AILD）様T細胞リンパ腫、HIV関連体腔リンパ腫、胎児性癌、鼻咽頭未分化癌（例えば、シュミンケ（Schmincke）腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームのマクログロブリン血症および他のB細胞リンパ腫、食道癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性または急性白血病、小児固形癌、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎癌または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系（CNS）新生物、原発性CNSリンパ腫、神経膠腫、脳腫瘍、鼻咽頭癌、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、T細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発性の癌、および前記癌の組み合わせが含まれる。本開示はまた、転移性癌の治療のためにも有用である。
したがって、1つの態様において、本開示は、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、対象に対して抗B7-H4抗体またはその抗原結合部分の治療的有効量を投与する段階を含む方法を提供する。典型的には、抗体はヒト抗B7-H4抗体（本明細書に記載されたヒト抗ヒトB7-H4抗体のいずれかなど）である。追加的または代替的に、抗体はキメラ抗体またはヒト化抗B7-H4抗体であってもよい。
本開示の他の方法は、特定の毒素または病原体に曝露されている患者を治療するために用いられる。したがって、本開示のもう1つの局面は、対象における感染性疾患を治療する方法であって、対象に対して、対象における感染性疾患が治療されるように、抗B7-H4抗体またはその抗原結合部分を投与する段階を含む方法を提供する。好ましくは、抗体はヒト抗ヒトB7-H4抗体（本明細書に記載されたヒト抗B7-H4抗体のいずれかなど）である。追加的または代替的に、抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。
以上に考察したような腫瘍に対するその適用と同様に、抗体を介したB7-H4の阻害を単独で用いるかまたはアジュバントとしてワクチンと併用することで、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を刺激することができる。この治療的アプローチが特に有用な可能性のある病原体の例には、有効なワクチンが現在存在しない病原体、または従来のワクチンが十分に有効とはいえない病原体が含まれる。これらには、HIV、肝炎（A、BおよびC型）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア属（Giardia）、マラリア、リーシュマニア属（Leishmania）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）が非限定的に含まれる。PD-1の阻害は、感染の経過を通じて変化した抗原を提示するHIVなどの病原因子による確立された感染症に対して特に有用である。これらの新規エピトープは、抗ヒトB7-H4の投与の時点で外来性として認識され、それ故に、B7-H4を経由する負のシグナルによって抑制されることのない強力なT細胞応答を誘発する。
本開示の方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例には、HIV、肝炎（A、BおよびC型）、ヘルペスウイルス（例えば、VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-IIおよびCMV、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス（cornovirus）、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、HTLVウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、モルスカムウイルス（molluscum virus）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、JCウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスが含まれる。
本開示の方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性細菌のいくつかの例には、クラミジア、リケッチア菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌およびコノコッカス、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭疽菌、ペスト菌、レプトスピラ菌およびライム病菌が含まれる。
本開示の方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性真菌のいくつかの例には、カンジダ属（Candida）（アルビカンス（albicans）、クルセイ（krusei）、グラブラタ（glabrata）、トロピカリス（tropicalis）など）、クリプトコックス-ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、アスペルギルス（Aspergillus）属（フミガーツス（fumigatus）、ニガー（niger）など）、ケカビ目（Mucorales）の属（ケカビ属（mucor）、アブシディア属（absidia）、クモノスカビ属（rhizophus））、スポロスリックス-シェンキー（Sporothrix schenkii）、ブラストミセス-デルマチチジス（Blastomyces dermatitidis）、ブラジル-パラコクシジオイデス（Paracoccidioides brasiliensis）、コクシジオイデス-イミチス（Coccidioides immitis）およびヒストプラスマ-カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）が含まれる。
本開示の方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性寄生生物のいくつかの例には、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、大腸バランチジウム（Balantidium coli）、ネグレリア-フォーレリ（Naegleriafowleri）、アカントアメーバ（Acanthamoeba）種、ランブル鞭毛虫（Giardia lambia）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）種、ニューモシスティス-カリニ（Pneumocystis carinii）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、ネズミバベシア（Babesia microti）、トリパノソーマ-ブルセイ（Trypanosoma brucei）、クルーズ-トリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）、ドノバンリーシュマニア（Leishmania donovani）、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）、ブラジル鉤虫（Nippostrongylus brasiliensis）が含まれる。
上記の方法のすべてにおいて、B7-H4の阻害は、腫瘍抗原提示の強化をもたらす、サイトカイン治療（例えば、インターフェロン、GM-CSF、G-CSF、IL-2）または二重特異性抗体療法などの他の形態の免疫療法と併用することができる（例えば、Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak (1994) Structure 2:1121-1123を参照）。
自己免疫反応
抗B7-H4抗体は自己免疫反応を引き起こして増幅することができる。実際に、腫瘍細胞およびペプチドワクチンを用いた抗腫瘍応答の誘発により、多くの抗腫瘍応答が、van Elsas et al. 前記における抗自己反応性（抗CTLA-4＋GM-CSF-改変B16黒色腫で観察された脱色）；Trp-2ワクチン接種マウスにおける脱色（Overwijk, W. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987）；TRAMP腫瘍細胞ワクチンにより誘発される自己免疫性前立腺炎（Hurwitz, A. (2000) 前記）；メラノーマペプチド抗原ワクチン接種およびヒト臨床試験で観察された白斑（Rosenberg, SA and White, DE (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immnunol 19 (1): 81-4）を含むことが判明している。
このため、抗B7-H4阻害とさまざまな自己タンパク質との併用を、疾患治療のためにこれらの自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に生じさせるためのワクチン接種プロトコールを考案する目的で、考慮に入れることが可能である。例えば、アルツハイマー病は脳内のアミロイド沈着物中にAβペプチドの不適切な蓄積を伴う；アミロイドに対する抗体応答により、これらのアミロイド沈着物を除去することができる（Schenk et al., (1999) Nature 400: 173- 177）。
また、アレルギーおよび喘息の治療のためのIgE、ならびに関節リウマチのためのTNFαというように、他の自己タンパク質を標的として用いることもできる。さらに、さまざまなホルモンに対する抗体応答を抗B7-H4抗体の使用によって誘発させることもできる。生殖ホルモンに対する中和抗体応答は、避妊のために用いることができる。特定の腫瘍の増殖に必要とされるホルモンおよび他の可溶性因子に対する中和抗体応答を、有望なワクチン接種標的として考慮に入れることもできる。抗B7-H4抗体の使用に関して以上に記載したものと類似の方法を、他の自己抗原、例えばアルツハイマー病におけるAβを含むアミロイド沈着物、TNFαなどのサイトカインおよびIgEなどの不適切な蓄積を有する患者を治療するための治療的な自己免疫応答の誘発のために用いることができる。
ワクチン
抗B7-H4抗体は、抗B7-H4抗体と関心対象の抗原（例えば、ワクチン）との共投与によって抗原特異的な免疫応答を刺激するために用いることができる。したがって、もう1つの局面において、本開示は、対象における抗原に対する免疫応答を強化する方法であって、対象に対して：（i）抗原；および（ii）抗B7-H4抗体またはその抗原結合部分を、対象における抗原に対する免疫応答が強化されるように投与する段階を含む方法を提供する。好ましくは、抗体はヒト抗ヒトB7-H4抗体（本明細書に記載されたヒト抗B7-H4抗体のいずれかなど）である。追加的または代替的に、抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。抗原は、例えば腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来の抗原でありうる。そのような抗原の非限定的な例には、上記の項で考察したもの、例えば上記で考察した腫瘍抗原（または腫瘍ワクチン）または上記のウイルス、細菌もしくは他の病原体に由来する抗原が含まれる。
本開示の抗体組成物（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびにイムノコンジュゲート）をインビボおよびインビトロで投与する適切な経路は、当技術分野で周知であり、当業者によって選択されうる。例えば、抗体組成物を注射（例えば、静脈内または皮下）によって投与することができる。用いられる分子の適した用量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および／または製剤に依存すると考えられる。
前述の通り、本開示のヒト抗B7-H4抗体を、1つもしくは他の複数の治療剤、例えば細胞毒性物質、放射性毒性物質または免疫抑制薬と共投与してもよい。抗体を（免疫複合体としての）作用物質と連結させることもでき、または作用物質とは別々に投与することもできる。後者（別々の投与）の場合には、抗体を作用物質の前、後もしくはそれと同時に投与することができ、または他の既知の治療法、例えば抗癌療法、例えば放射線と併せて共投与することもできる。そのような治療剤には特に、それら単独では患者に対して毒性または亜毒性のレベルでのみ有効な、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン 硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよびシクロホスファミド ヒドロキシウレアなどの抗悪性腫瘍薬が含まれる。シスプラチンは4週毎に1回、1回の投与当たり100mgとして静脈内投与され、アドリアマイシンは21日毎に1回、60〜75mg／mlの用量として静脈内投与される。本開示のヒト抗B7-H4抗体またはそれらの抗原結合断片と化学療法薬の共投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞傷害効果を生じさせる複数の異なる機序を介して作用する2つの抗癌薬を提供する。そのような共投与は、薬物に対する耐性の発生、または腫瘍細胞を抗体に反応しないようにさせると考えられる腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題を解決することができる。また、本開示の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性もしくは多重特異性の分子またはイムノコンジュゲート）および使用説明書を含むキットも本開示の範囲に含まれる。キットは、少なくとも1つのさらなる試薬または1つもしくは複数のさらなる本開示のヒト抗体（例えば、第1のヒト抗体とは異なるB7-H4抗原内のエピトープと結合する補完的活性を有するヒト抗体）をさらに含むことができる。キットは典型的には、キットの内容物の使用目的を表示するラベルを含む。ラベルという用語には、キットの表面にもしくはキットとともに添付されるか、それ以外の様式でキットに付属する、何らかの書き込みまたは記録された材料が含まれる。
1つの態様において、本開示は、過剰増殖性疾患を治療するための方法であって、B7-H4抗体ならびにCTLA-4抗体および／またはPD-1抗体を対象に投与する段階を含む方法を提供する。さらなる態様において、抗B7-H4抗体は治療量以下の用量（subtherapeutic dose）で投与される、抗CTLA-4および／もしくはPD-1抗体は治療量以下の用量で投与される、またはいずれも治療量以下の用量で投与される。もう1つの態様において、本開示は、免疫刺激薬による過剰増殖性疾患の治療に付随する有害事象を変更するための方法であって、抗B7-H4抗体、ならびに治療量以下の用量の抗CTLA-4および／または抗PD-1抗体を対象に投与する段階を含む方法を提供する。
ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、抗CTLA-4抗体はヒト配列モノクローナル抗体10D1であり、抗PD-1抗体は17D8、2D3、4H1、5C4および4A11などのヒト配列モノクローナル抗体である。米国特許第6,984,720号に記載されているように、ヒト配列モノクローナル抗体10D1は単離され、構造的に特徴づけられている。米国仮特許出願第60／679,466号に記載されているように、ヒト配列モノクローナル抗体17D8、2D3、4H1、5C4および4A11は単離され、構造的に特徴づけられている。
本開示の、抗B7-H4、抗CTLA-4抗体および抗PD-1モノクローナル抗体（mAb）ならびにヒト配列抗体は、例えばKohler and Milstein (1975) Nature 256:495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法などの、従来のモノクローナル抗体の方法を含む、種々の手法によって産生させることができる。モノクローナル抗体を産生させるための任意の手法、例えば、Bリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換などを用いることができる。ハイブリドーマを調製するための1つの動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は非常によく確立された手順である。免疫化プロトコール、および融合のために免疫化した脾臓を単離する手法は、当技術分野で公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順も同様に公知である（例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New Yorkを参照）。抗体の組み合わせは、B7-H4ならびにPD-1および／またはCTLA-4の阻害による、過剰増殖性疾患に対する免疫応答の強化のために有用である。1つの好ましい態様において、本開示の抗体はヒト抗体である。例えば、これらの分子は、培養下にある細胞に対してインビトロもしくはエクスビボで、またはヒト対象に対して、例えばインビボで、種々の状況下で免疫を強化するために、投与することができる。したがって、1つの局面において、本開示は、対象における免疫応答を改変する方法であって、対象に対して、本開示の抗体の組み合わせまたはそれらの抗原結合部分の組み合わせを、対象における免疫応答が改変されるように投与する段階を含む方法を提供する。好ましくは、応答は強化される、刺激される、またはアップレギュレートされる。もう1つの態様において、本開示は、免疫刺激薬による過剰増殖性疾患の治療に付随する有害事象を変更するための方法であって、抗B7-H4抗体、ならびに治療量以下の用量の抗CTLA-4および／または抗PD-1抗体を対象に投与する段階を含む方法を提供する。
抗体によるB7-H4、PD-1およびCTLA-4の阻害は、患者における癌細胞に対する免疫応答を強化することができる。本開示の抗体を用いて増殖が阻害される可能性のある癌には、典型的には免疫療法に応答する癌が含まれる。本開示の併用療法による治療のための癌の代表的な例には、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌および肺癌が含まれる。本開示の方法を用いて治療しうる可能性のある他の癌の例には、骨悪性腫瘍、膵癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性または急性白血病、小児固形癌、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎癌または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系（CNS）新生物（neoplasm of the central nervous system（CNS）5） 原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、T細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発性の癌、および前記癌の組み合わせが含まれる。本開示はまた、転移性癌の治療のためにも有用である。
ある態様において、本明細書で考察した治療用抗体の組み合わせは、薬学的に許容される担体中にある単一の組成物として同時に投与すること、または各抗体が薬学的に許容される担体中にある別々の組成物として同時に投与することができる。もう1つの態様において、治療用抗体の組み合わせは逐次的に投与することができる。例えば、抗B7-H4を1番目に投与して抗PD1を2番目に投与する、または抗PD-1を1番目に投与して抗B7-H4を2番目に投与するというように、抗B7-H4抗体および抗PD-1抗体を逐次的に投与することができる。さらに、併用療法の複数回の投与を逐次的に行う場合には、投与の各時点で逐次的投与の順序を逆にすること、または同じ順序を保つこと、逐次投与を同時投与と組み合わせること、またはそれらの任意の組み合わせを行うことができる。例えば、抗B7-H4抗体および抗PD-1抗体の組み合わせの第1の投与が同時であり、第2の投与は抗B7-H4が1番目で抗PD-1が2番目という逐次的であり、第3の投与は抗PD-1が1番目で抗B7-H4が2番目という逐次的である、などということが可能である。もう1つの代表的な投薬方式は、抗PD-1が1番目で抗B7-H4が2番目である第1の投与を含み、その後の投与は同時であってよい。
任意で、抗B7-H4ならびに抗CTLA-4および／または抗PD-1抗体の組み合わせを、さらに、免疫原性物質、例えば癌細胞、精製腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび糖質分子を含む）、細胞、および免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子がトランスフェクトされた細胞などと組み合わせてもよい（He et al, J. Immunol. 173:4919-28 (2004)）。用いうる腫瘍ワクチンの非限定的な例には、黒色腫抗原のペプチド、例えばgp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1および／もしくはチロシナーゼのペプチド、またはサイトカインGM-CSFを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞が含まれる（以下でさらに考察する）。
複合的なB7-H4ならびにPD-1および／またはCTLA-4の阻害を、さらに、ワクチン接種プロトコールと組み合わせてもよい。腫瘍に対するワクチン接種については多くの実験戦略が考案されている（Rosenberg, S. "Development of Cancer Vaccines" ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000)；Logothetis, C. ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000)；Khayat, D. ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000)；Foon, K. ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000)を参照；同じく、De Vita et al. (ed.) Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition (1997)中のRestifo and Sznol, Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043も参照のこと）。これらの戦略の1つにおいては、ワクチンを自家または同種腫瘍細胞を用いて調製する。これらの細胞ワクチンは、GM-CSFを発現するように腫瘍細胞に形質導入を行った場合に最も有効であることが示されている。GM-CSFは、腫瘍ワクチン接種における抗原提示の強力な活性化因子であることが示されている（Dranoff et al. (1993) Proc. Natl Acad. Sci U.S.A. 90: 3539-43）。
また、複合的なB7-H4ならびにPD-1および／またはCTLA-4の阻害を、さらに、標準的な癌治療と併用することもできる。例えば、複合的なB7-H4ならびにPD-1および／またはCTLA-4の阻害は、化学療法レジメンと有効に化学療法レジメンと有効に併用することができる。抗B7-H4ならびに抗CTLA-4および／またはPD-1の組み合わせで観察されているように、これらの場合に、本開示の組み合わせとともに投与される他の化学療法試薬の用量を減らすことができることもある（Mokyr, M. et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304）。B7-H4ならびにPD-1および／またはCTLA-4の阻害と化学療法との併用の背後にある科学的根拠は、大部分の化学療法用化合物の細胞毒性作用の帰結である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの上昇をもたらすはずと考えられることである。細胞死を通じて複合的なB7-H4ならびにPD-1および／またはCTLA-4の阻害との相乗効果をもたらす可能性のある他の併用療法には、放射線、外科手術およびホルモン除去がある。これらのプロトコールはそれぞれ、宿主における腫瘍抗原の供給源を作り出す。血管新生阻害薬を、複合的なB7-H4ならびにPD-1および／またはCTLA-4の阻害と併用することもできる。血管新生の阻害は、同じく腫瘍抗原が宿主の抗原提示経路に供給される源となりうる腫瘍細胞死を招く。
また、B7-H4ならびにPD-1および／またはCTLA-4阻害抗体の組み合わせを、FcαまたはFcγ受容体を発現するエフェクター細胞を腫瘍細胞に向かわせる二重特異性抗体と併用することもできる（例えば、米国特許第5,922,845号および第5,837,243号を参照）。二重特異性抗体は、2つの別々の抗原を標的化するために用いることができる。例えば、抗Fc受容体／抗腫瘍抗原（例えば、Her-2／neu）二重特異性抗体は、腫瘍の部位にマクロファージを向かわせるために用いられている。この標的化は、腫瘍特異的な応答をより有効に活性化することができる。これらの応答のT細胞による部分は、複合的なB7-H4ならびにPD-1および／またはCTLA-4の阻害の使用によって増強されると考えられる。または、抗原を、腫瘍抗原および樹状細胞特異的な細胞表面マーカーと結合する二重特異性抗体の使用によってDCに直接送達することもできる。もう1つの例において、抗PD-1および抗CTLA-4抗体の組み合わせを、リツキサン（Riruxan）（登録商標）（リツキシマブ）、ハーセプチン（Herceptin）（登録商標）（トラスツズマブ）、ベクザー（Bexxar）（登録商標）（トシツモマブ）、ゼバリン（Zevalin）（登録商標）（イブリツモマブ）、キャンパス（Campath）（登録商標）（アレムツズマブ）、リンホシド（Lymphocide）（登録商標）（エプラツズマブ（eprtuzumab））、アバスチン（Avastin）（登録商標）（ベバシズマブ）およびタルセバ（Tarceva）（登録商標）（エルロチニブ）などの抗新生物抗体とともに用いることができる。一例であって理論に拘束されることは望まないが、抗癌抗体、または毒素とコンジュゲートされた抗癌抗体は、癌細胞死（例えば、腫瘍細胞）を引き起こし、それはB7-H4、CTLA-4またはPD-1によって媒介される免疫応答を増強すると考えられる。1つの例示的な態様において、過剰増殖性疾患（例えば、癌腫瘍）の治療は、抗癌抗体と抗B7-H4ならびに抗PD-1および／または抗CTLA-4抗体との、同時または逐次的またはそれらの任意の組み合わせでの併用を含むことができ、これは宿主による抗腫瘍に対する免疫応答を増強することができる。腫瘍は多種多様な機序によって宿主の免疫監視を回避する。これらの機序の多くは、腫瘍によって発現され、かつ免疫抑制性であるタンパク質の不活性化によって克服することができる。これらには特に、TGF-β（Kehrl, J. et al. (1986) J Exp. Med. 163: 1037-1050）、IL-10（Howard, M. & O'Garra, A. (1992) Immunology Today 13: 198-200）およびFasリガンド（Hahne, M. et al. (1996) Science 274: 1363-1365）が含まれる。もう1つの例では、これらの実体のそれぞれに対する抗体を抗B7-H4ならびに抗PD-1および／または抗CTLA-4の組み合わせと併用することで、免疫抑制薬の効果を打ち消して、宿主による腫瘍に対する免疫応答を援助することができる。
宿主の免疫応答性を活性化するために用いうる他の抗体を、抗B7-H4ならびに抗PD-1および／または抗CTLA-4抗体と併用することもできる。これらには、DCの機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子が含まれる。抗CD40抗体は、T細胞ヘルパー活性を有効に代替することができ（Ridge, S. et al. (1998) Nature 393: 474-478）、抗CTLA-4との併用下で有効なことが示されている（Ito, N. et al. (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40）。OX-40（Weinberg, A. et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169）、4-1BB（Melero, I. et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997）、PD-1（del Rio et al. (2005) Eur J lmmunol 35:3545-60）およびICOS（Hutloff, A. et al. (1999) Nature 397: 262-266）などのT細胞副刺激分子に対する抗体の活性化も、T細胞活性化のレベルの上昇をもたらしうる。
種々の造血由来の腫瘍を治療するために、現在では骨髄移植が用いられている。移植片対宿主病はこの治療の1つの帰結であるが、一方、移植片対腫瘍応答から治療上の利益を得ることもできる。複合的なB7-H4ならびにPD-1および／またはCTLA-4の阻害を用いて、ドナーに移植された腫瘍特異的T細胞の有効性を高めることができる。
腫瘍に対する抗原特異的T細胞のための、抗原特異的T細胞のエクスビボ活性化および増量ならびにこれらの細胞のレシピエントへの養子移入を含む実験的治療プロトコールもいくつか存在する（Greenberg, R. & Riddell, S. (1999) Science 285: 546-51）。これらの方法を、CMVなどの感染因子に対するT細胞応答を活性化させるために用いることもできる。抗B7-H4ならびに抗PD-1および／または抗CTLA-4抗体の存在下におけるエクスビボ活性化は、養子移入されたT細胞の頻度および活性を高めることが予想される。
本明細書で示されているように、諸臓器は、抗CTLA-4抗体による治療後の消化管（下痢および結腸炎）および皮膚（皮疹および掻痒）のように、免疫刺激性の治療用抗体療法の後に免疫関連有害事象を呈する可能性がある。例えば、非結腸性の胃腸の免疫関連有害事象は、抗CTLA-4抗体治療後に、食道（食道炎）、十二指腸（十二指腸炎）および回腸（回腸炎）でも観察されている。
ある態様において、本開示は、免疫刺激薬による過剰増殖性疾患の治療に付随する有害事象を変更するための方法であって、抗B7-H4抗体、ならびに治療量以下の用量の抗CTLA-4抗体を対象に投与する段階を含む方法を提供する。例えば、本開示の方法は、免疫刺激性の治療用抗体により誘発される結腸炎または下痢の発生率を、非吸収性ステロイドを患者に投与することによって低下させる方法を提供する。免疫刺激性の治療用抗体を投与される患者はいずれも、そのような抗体によって誘発される結腸炎または下痢を発症するリスクがあるため、この患者集団全体に本開示の方法による治療法が適している。ステロイドは炎症性腸疾患（IBD）を治療するため、およびIBDの増悪を予防するために投与されているものの、それらは、IBDと診断されていない患者におけるIBDを予防するため（その発生率を低下させるため）には用いられていない。ステロイドには、たとえ非吸収性ステロイドでも重大な副作用が伴うことから、予防的使用は阻まれている。
さらなる態様において、B7-H4ならびにPD-1および／またはCTLA-4複合阻害（すなわち、免疫刺激性の治療用抗体である抗B7-H4ならびに抗PD-1および／または抗CTLA-4）を、さらに、任意の非吸収性ステロイドの使用と組み合わせることができる。本明細書で用いる場合、「非吸収性ステロイド」とは、高度の初回通過代謝を呈するグルココルチコイドのことであり、その結果、肝臓における代謝後のこのステロイドの生物学的利用能は低く、すなわち約20％未満である。本開示の1つの態様において、非吸収性ステロイドはブデソニドである。ブデソニドは局所作用性のグルココルチコイドであり、経口投与後に主として肝臓によって高度に代謝される。エントコートEC（ENTOCORT EC）（登録商標）（Astra-Zeneca）は、回腸および結腸全体への薬物送達を最適化するために開発されたブデソニドのpHおよび時間依存性経口製剤である。エントコートEC（登録商標）は、米国において、回腸および／または下行結腸にかかわる軽症ないし中等症のクローン病の治療に対して承認されている。クローン病の治療のためのエントコートEC（登録商標）の経口常用量は6〜9mg／日である。エントコートEC（登録商標）は小腸で放出され、その後に消化管粘膜で吸収されて保持される。ひとたび消化管粘膜標的組織を通過すると、エントコートEC（登録商標）は肝臓のシトクロムP450系で高度に代謝されて、グルココルチコイド活性が無視しうる程度である代謝物となる。このため、生物学的利用能は低い（約10％）。ブデソニドの生物学的利用能の低さは、初回通過代謝がそれほど高度でない他のグルココルチコイドと比較して、治療効果比（therapeutic ratio）の改善をもたらす。全身作用性のコルチコステロイドと比較して、視床下部-下垂体抑制が少ないことを含め、ブデソニドがもたらす有害効果はより少ない。しかし、エントコートEC（登録商標）の長期投与は、高コルチコイド症および副腎抑制といったグルココルチコイドの全身性影響をもたらす恐れがある。PDR 58th ed. 2004；608-610を参照。
さらに別の態様において、B7-H4ならびにPD-1および／またはCTL A-4複合阻害（すなわち、免疫刺激性の治療用抗体である抗B7-H4ならびに抗PD-1および／または抗CTLA-4）と非吸収性ステロイドとの組み合わせを、さらに、サリチレートと組み合わせることができる。サリチレートには、例えば、以下のものなどの5-ASA剤が含まれる：スルファサラジン（アザルフィジン（AZULFIDINE）（登録商標）、Pharmacia ＆ UpJohn）、オルサラジン（ディペンタム（DIPENTUM）（登録商標）、Pharmacia ＆ UpJohn）、バルサラジド（コラザル（COLAZAL）（登録商標）、Salix Pharmaceuticals，Inc.）およびメサラミン（アサコール（ASACOL）（登録商標）、Procter ＆ Gamble Pharmaceuticals；ペンタサ（PENTASA）（登録商標）、Shire US；カナサ（CANASA）（登録商標）、Axcan Scandipharm，Inc.；ロワサ（ROWASA）（登録商標）、Solvay）。本開示の方法によれば、抗B7-H4ならびに抗PD-1および／または抗CTLA-4、ならびに非吸収性ステロイドとサリチレートとの併用投与は、免疫刺激性抗体によって誘発される結腸炎の発生率を低下させる目的で、サリチレートおよび非吸収性ステロイドの任意の重複投与または逐次投与を含みうる。すなわち、例えば、本開示による免疫刺激性抗体によって誘発される結腸炎の頻度を低下させる方法は、サリチレートおよび非吸収性ステロイドを同時または逐次的に（例えば、サリチレートを非吸収性ステロイドの6時間後に投与する）またはその任意の組み合わせを範囲に含む。さらに、本開示によれば、サリチレートおよび非吸収性ステロイドは、同じ経路（例えば、両方を経口投与する）または異なる経路（例えば、サリチレートを経口投与し、非吸収性ステロイドを直腸投与する）のいずれによって投与することもでき、それは抗B7-H4ならびに抗PD-1および／または抗CTLA-4抗体を投与するために用いる経路とは異なってもよい。
また、補体と結合するIgG1、-2もしくは-3またはIgM由来の部分などの補体結合部位を有する本開示の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびにイムノコンジュゲート）を、補体の存在下で用いることもできる。1つの態様において、標的細胞を含む細胞集団の、本開示の結合物質および適切なエフェクター細胞によるエクスビボ処理は、補体または補体を含む血清の添加によって補強することができる。本開示の結合物質でコーティングされた標的細胞の食作用を、補体タンパク質の結合によって向上させることができる。もう1つの態様において、本開示の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）でコーティングされた標的細胞を、補体によって溶解させることもできる。さらにもう1つの態様において、本開示の組成物は補体を活性化しない。
また、本開示の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびにイムノコンジュゲート）を、補体とともに投与することもできる。したがって、ヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子、および血清または補体を含む組成物は、本開示の範囲に含まれる。これらの組成物は、補体がヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子に対して非常に近位に存在するという点で有利である。または、本開示のヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子、および補体または血清を別々に投与することもできる。したがって、本開示の抗体組成物によって治療された患者に、ヒト抗体の治療効果を強化または増強する細胞傷害物質または放射性毒性物質のようなもう1つの治療剤をさらに投与する（本開示のヒト抗体の前、同時または後に）ことができる。
他の態様において、対象を、例えば対象をサイトカインによって治療することによって、FcγまたはFcγ受容体の発現または活性をモジュレートする、例えば強化または阻害する作用物質によってさらに治療することができる。多重特異的分子による治療の際の投与のために好ましいサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロン-γ（IFN-γ）および腫瘍壊死因子（TNF）が含まれる。
また、本開示の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）を用いて、FcγRまたはB7-H4を発現する細胞を、例えばそのような細胞を標識するために標的とすることができる。そのような用途のために、結合物質を、検出可能な分子と連結させることができる。したがって、本開示は、FcγRなどのFc受容体またはB7-H4を発現するエクスビボまたはインビトロの細胞の位置を特定するための方法を提供する。検出可能な標識は、例えば、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素または酵素補因子でありうる。
1つの特定の態様において、本開示は、試料中のB7-H4の存在を検出するため、またはB7-H4抗原の量を測定するための方法であって、試料および対照試料を、B7-H4と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、抗体またはその部分とB7-H4との間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階を含む方法を提供する。続いて、複合体の形成を検出し、対照試料と比較して試料間で複合体の形成に違いがあれば、試料中のB7-H4抗原の存在が指し示される。
他の態様において、本開示は、対象におけるB7-H4を介した障害を治療するための方法を提供する。
さらにもう1つの態様において、本開示の抗体-パートナー分子コンジュゲートは、化合物（例えば、治療剤、標識、細胞毒、放射性毒素、免疫抑制薬など）を、そのような化合物を抗体と連結させることによって、B7-H4細胞表面受容体を有する細胞に向かわせるために用いることができる。例えば、抗B7-H4抗体は、米国特許出願第10／160,972号、第10／161,233号、第10／161,234号、第11／134,826号、第11／134,685号および米国仮特許出願第60／720,499号に記載されたUPT5、ならびに／または、米国特許第6,281,354号および第6,548,530号、US特許公報第20030050331号、第20030064984号、第20030073852号および第20040087497号に記載されているかもしくはWO 03／022806号に公開されている毒素化合物のいずれかとコンジュゲートさせることができ、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。したがって、本開示はまた、B7-H4を発現する細胞をエクスビボまたはインビボで位置特定する（例えば、検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子を用いて）ための方法も提供する。または、抗体-パートナー分子コンジュゲートを用いて、B7-H4細胞表面受容体を有する細胞を、細胞毒または放射性毒素をB7-H4に向かわせることによって死滅させることが可能である。
本開示を以下の実施例によってさらに例示するが、それらはさらなる限定とみなされるべきではない。本出願の全体を通じて引用されるすべての図面およびすべての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書中に明示的に組み入れられる。
実施例1
O8Eに対するヒトモノクローナル抗体の作製
本実施例は、ヒトO8E（別名、B7H4、B7S1およびB7x）と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体の作製を開示する。
抗原
CHO細胞およびHEK-293細胞に、標準的な組換えトランスフェクション法を用いてO8Eをトランスフェクトして、免疫化のための抗原として用いた。加えて、単独での組換えO8Eも、免疫化のための抗原として用いた。
トランスジェニックHuMAbマウス（登録商標）KMマウス（登録商標）
O8Eに対する完全ヒトモノクローナル抗体を、それぞれがヒト抗体遺伝子を発現する、HuMabトランスジェニックマウス（登録商標）のHCo7系統およびHCo12系統、ならびにトランスジェニック染色体導入性マウスのKM系統を用いて調製した。これらのマウス系統のそれぞれにおいて、内因性マウスκ軽鎖遺伝子は、Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820に記載されたようにホモ接合性に破壊されており、内因性マウス重鎖遺伝子はPCT公報WO 01／09187号の実施例1に記載されたようにホモ接合性に破壊されている。これらのマウス系統のそれぞれは、Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851に記載のヒトκ軽鎖導入遺伝子KCo5を保有する。HCo7系統は、米国特許第5,545,806号；第5,625,825号；および第5,545,807号に記載のHCo7ヒト重鎖導入遺伝子を保有する。HCo12系統は、PCT公報WO 01／09187号の実施例2に記載のHCo12ヒト重鎖導入遺伝子を保有する。KMマウス（登録商標）系統は、PCT公報WO 02／43478号に記載のSC20導入染色体を含む。
HuMAbおよびKMの免疫化：
O8Eに対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製するために、HuMAbマウス（登録商標）およびKMマウス（登録商標）のマウスに対して、CHO-O8Eトランスフェクト細胞、HEK293-O8Eトランスフェクト細胞および／または精製組換えO8Eタンパク質による免疫化を行った。HuMAbマウス（登録商標）に対する一般的な免疫化スキームは、Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859；Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびPCT公報WO 98／24884号に記載されている。マウスは抗原の初回注入時に6〜16週齢であった。O8Eタンパク質の精製組換え調製物（5〜50μg）を用いて、HuMabマウス（商標）およびKMマウス（商標）の免疫化を行った。
トランスジェニックマウスに対して、完全フロイントアジュバント中の抗原による免疫化を腹腔内（IP）または皮下（Sc）のいずれかで2回行い、その後に不完全フロイントアジュバント中の抗原により3〜21日間のIPまたはSC免疫化（最大で合計11回の免疫化）を行った。免疫応答は後眼窩の採血によってモニターした。血漿をELISA（下記の通り）によってスクリーニングし、抗O8Eヒト免疫グロブリンの力価が十分なマウスを融合のために用いた。マウスには殺処理および脾臓摘出の3日前および2日前に静脈内に追加免疫を行った。典型的には、各抗原について10〜35回の融合を行った。各抗原に関して数十匹のマウスに免疫化を行った。
抗O8E抗体を産生するHuMbマウス（商標）またはKMマウス（商標）の選択
O8Eと結合する抗体を産生するHuMabマウス（商標）またはKMマウス（商標）を選択するために、免疫化マウスからの血清を、Fishwild, D. et al. (1996)(前記)に記載された通りにELISAによって検査した。手短に述べると、マイクロタイタープレートをPBS中1〜2μg／mlの精製組換えO8Eでコーティングし、50μl／ウェルを4℃で一晩インキュベートした後に、PBS／Tween（0.05％）中の200μl／ウェルの5％ニワトリ血清でブロッキングした。O8E-免疫化マウスからの血漿の希釈物を各ウェルに添加し、周囲温度で1〜2時間インキュベートした。プレートをPBS／Tweenで洗浄し、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）をコンジュゲートさせたヤギ-抗ヒトIgG Fcポリクローナル抗体とともに室温で1時間インキュベートした。洗浄後に、プレートをABTS基質（Sigma, A-1888, 0.22mg／ml）で発色させ、分光光度計によりOD 415〜495で分析した。抗O8E抗体の最大の力価が生じたマウスを融合のために用いた。融合は以下に述べるように行い、ハイブリドーマ上清をELISAおよびFACSによって抗O8E活性に関して検査した。
O8Eに対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
HuMabマウス（商標）およびKMマウス（商標）から単離したマウス脾細胞を、標準的なプロトコールに基づいてPEGを用いて、マウス骨髄腫細胞系とPEGとを融合させた。続いて、その結果得られたハイブリドーマを抗原特異的な抗体の産生に関してスクリーニングした。免疫化マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、1／4の数のSP2／0非分泌マウス骨髄腫細胞（ATCC、CRL 1581）と、50％ PEG（Sigma）を用いて融合させた。細胞を平底マイクロタイタープレートにおよそ1×105個／ウェルでプレーティングし、その後に、10％ウシ胎仔血清（Hyclone, Logan, UT）、10％ P388D1（ATCC、CRL TIB-63）馴化培地、3〜5％オリゲン（IGEN）をDMEM（Mediatech、CRL 10013、高グルコース、L-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含む）＋5mM HEPES、0.055mM 2-メルカプトエタノール、50mg／mlゲンタマイシンおよび1×HAT（Sigma、CRL P-7185）中に含む選択培地中で2週間のインキュベーションを行った。1〜2週間後に、細胞を、HATをHTに交換した培地中で培養した。続いて個々のウェルをELISAおよびFACS（上記）によってヒト抗O8EモノクローナルIgG抗体に関してスクリーニングした。陽性クローンを、続いて、ELISAによってO8E組換えタンパク質に対して、またはFACSによってO8E発現細胞、例えばCHO-O8Eトランスフェクト細胞に対して、O8E陽性抗体に関してスクリーニングした。手短に述べると、O8Eを発現する細胞を組織培養フラスコから新たに採取し、単細胞懸濁液を調製した。O8Eを発現する細胞懸濁液を一次抗体で直接染色するか、またはPBS中の1％パラホルムアルデヒドによる固定後に染色した。およそ100万個の細胞を0.5％ BSAおよび50〜200μg／mlの一次抗体を含むPBS中に再懸濁させ、氷上で30分間インキュベートした。細胞を、0.1％ BSA、0.01％ NaN3を含むPBSで2回洗浄し、ヤギ-抗ヒトIgGをコンジュゲートさせたFITC（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）の1：100希釈物の100μl中に再懸濁させ、氷上でさらに30分間インキュベートした。細胞を再び2回洗浄し、0.5mlの洗浄用緩衝液中に再懸濁させて、FACSCalibur血球計算器（BectonDickinson, San Jose, CA）で蛍光染色に関して分析した。
大規模なハイブリドーマ増殖が起こったところで、培地を通常は10〜14日後にモニターした。抗体を分泌するハイブリドーマを再プレーティングし、再びスクリーニングして、依然としてヒトIgGに関して陽性であれば、抗O8Eモノクローナル抗体を、限界希釈によって少なくとも2回サブクローニングした。続いて安定なサブクローンをインビトロで培養し、さらなる特徴づけのために組織培養液中で少量の抗体を産生させた。
ハイブリドーマクローン1G11、2A7、2F9、12E1および13D12をさらなる分析のために選択した。
実施例2
ヒトモノクローナル抗体1G11、2A7、2F9、12E1および13D12の構造的特徴づけ
本実施例は、O8Eと特異的に結合する5種のヒトモノクローナル抗体の配列解析を開示する。
1G11、2A7、2F9、12E1および13D12モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするcDNA配列を、それぞれ1G11、2A7、2F9、12E1および13D12ハイブリドーマから標準的なPCR手法を用いて入手し、標準的なDNAシークエンシング手法を用いてシークエンシングを行った。
1G11の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、図1A中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：41および1に示されている。
1G11の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、図1B中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：46および6に示されている。
1G11重鎖免疫グロブリン配列と公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列との比較により、1G11重鎖がヒト生殖系列VH 4-34からのVHセグメントを利用していることが実証された。1G11 VH配列の生殖系列VH 4-34配列に対するアラインメントは図6に示されている。Kabatシステムを用いた1G11 VH配列のさらなる分析によってCDR領域を決定し、図1Aおよび6中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：11、16および21に示されている重鎖CDR1、CDR2およびCD3領域の描写を得た。
1G11軽鎖免疫グロブリン配列と公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列との比較により、1G11軽鎖がヒト生殖系列VK A27からのVLセグメントを利用していることが実証された。1G11 VL配列の生殖系列VK A27配列に対するアラインメントは図9に示されている。Kabatシステムを用いた1G11 VL配列のさらなる分析によってCDR領域を決定し、図1Bおよび9中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：26、31および36中に示されている軽鎖CDR1、CDR2およびCD3領域の描写を得た。
2A7の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、図2A中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：42および2に示されている。
2A7の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、図2B中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：47および7に示されている。
2A7重鎖免疫グロブリン配列と公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列との比較により、2A7重鎖がヒト生殖系列VH 3-53からのVHセグメントおよびヒト生殖系列JH 6bからのJHセグメントを利用していることが実証された。2A7 VH配列の生殖系列VH 3-53配列に対するアラインメントは図7に示されている。Kabatシステムを用いた2A7 VH配列のさらなる分析によってCDR領域を決定し、図2Aおよび7中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：12、17および22に示されている重鎖CDR1、CDR2およびCD3領域の描写を得た。
2A7軽鎖免疫グロブリン配列と公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列との比較により、2A7軽鎖がヒト生殖系列VK A27からのVLセグメントを利用していることが実証された。2A7 VL配列の生殖系列VK A27配列に対するアラインメントは図9に示されている。Kabatシステムを用いた2A7 VL配列のさらなる分析によってCDR領域を決定し、図2Bおよび9中、ならびにそれぞれSEQ ID NO：27、32および37に示されている軽鎖CDR1、CDR2およびCD3領域の描写を得た。
2F9の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、図3A中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：43および3に示されている。
2F9の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、図3B中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：48および8に示されている。
2F9重鎖免疫グロブリン配列と公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列との比較により、2F9重鎖がヒト生殖系列VH 3-53からのVHセグメントおよびヒト生殖系列JH 6bからのJHセグメントを利用していることが実証された。2F9 VH配列の生殖系列VH 3-53配列に対するアラインメントは図7に示されている。Kabatシステムを用いた2F9 VH配列のさらなる分析によってCDR領域を決定し、図3Aおよび7中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：13、18および23に示されている重鎖DR1、CDR2およびCD3領域の描写を得た。
2F9軽鎖免疫グロブリン配列と公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列との比較により、2F9軽鎖がヒト生殖系列VK A27からのVLセグメントを利用していることが実証された。2F9 VL配列の生殖系列VK A27配列に対するアラインメントは図9に示されている。Kabatシステムを用いた2F9 VL配列のさらなる分析によってCDR領域を決定し、図3Bおよび9中、ならびにそれぞれSEQ ID NO：28、33および38に示されている軽鎖CDR1、CDR2およびD3領域の描写を得た。
12E1の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、図4A中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：44および4に示されている。
12E1の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、図4B中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：49および9に示されている。
12E1重鎖免疫グロブリン配列と公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列との比較により、12E1重鎖がヒト生殖系列VH 3-9からのVHセグメント、ヒト生殖系列3-10からのDセグメント、およびヒト生殖系列JH 6bからのJHセグメントを利用していることが実証された。12E1 VH配列の生殖系列VH 3-9配列に対するアラインメントは図8に示されている。Kabatシステムを用いた12E1 VH配列のさらなる分析によってCDR領域を決定し、図3Aおよび8中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：14、19および24に示されている重鎖CDR1、CDR2およびCD3領域の描写を得た。
12E1軽鎖免疫グロブリン配列と公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列との比較により、12E1軽鎖がヒト生殖系列VK L6からのVLセグメントおよびヒト生殖系列JK 1からのJKセグメントを利用していることが実証された。12E1 VL配列の生殖系列VK L6配列に対するアラインメントは図10に示されている。Kabatシステムを用いた12E1 VL配列のさらなる分析によってCDR領域を決定し、図3Bおよび10中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：29、34および39に示されている軽鎖CDR1、CDR2およびCD3領域の描写を得た。
13D12の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、図5A中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：45および5に示されている。
13D12の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、図5B中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：50および10に示されている。
13D12重鎖免疫グロブリン配列と公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列との比較により、13D12重鎖がヒト生殖系列VH 4-34からのVHセグメントを利用していることが実証された。13D12 VH配列の生殖系列VH 4-34配列に対するアラインメントは図6に示されている。Kabatシステムを用いた13Dl2 VH配列のさらなる分析によってCDR領域を決定し、図5Aおよび6中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：15、20および25に示されている重鎖CDR1、CDR2およびCD3領域の描写を得た。
13D12軽鎖免疫グロブリン配列と公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列との比較により、13D12軽鎖がヒト生殖系列VK A27からのVLセグメントを利用していることが実証された。13D12 VL配列の生殖系列VK A27配列に対するアラインメントは図9に示されている。Kabatシステムを用いた13D12 VL配列のさらなる分析によってCDR領域を決定し、図5Bおよび9中に、ならびにそれぞれSEQ ID NO：30、35および40に示されている軽鎖CDR1、CDR2およびCD3領域の描写を得た。
実施例3
抗O8Eヒトモノクローナル抗体の結合特異性の特徴づけ
本実施例は、O8Eに対する結合の特異性を検討するために標準的なELISAによって行った、抗O8E抗体の免疫精製O8Eに対する結合の比較を開示する。
組換えHisタグ付加およびmycタグ付加O8Eをプレート上に一晩コーティングし、抗O8Eヒトモノクローナル抗体2A7、12E1および13D12に対する結合に関して検査した。標準的なELISA手順を行った。抗O8Eヒトモノクローナル抗体を1μg／mlの濃度で添加し、1：2 の段階希釈によって用量調節を行った。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）をコンジュゲートさせたヤギ-抗ヒトIgG（Fcまたはκ鎖に特異的な）ポリクローナル抗体を二次抗体として用いた。
組換えB7-H4-Igは、プロテインAを用いるクロマトグラフィーにより、B7H4-Ig構築物がトランスフェクトされた293T細胞の上清から精製した。ELISAプレートをヒト抗体でコーティングした後に、精製タンパク質を添加し、続いてウサギ抗B7H4抗血清による検出を行った。図11A参照。C-9タグを有する組換えPenta-B7H4タンパク質を、2A7アフィニティーカラムを用いるクロマトグラフィーにより、Penta-B7H4-C9構築物がトランスフェクトされた293T細胞の上清から精製した。ELISAプレートを、抗マウスFc、続いてモノクローナル抗C9（0.6ug／ml）でコーティングし、続いて指定の通りに用量調節したPenta-B7H4、続いて1μg／mlのヒトモノクローナル抗体を用いた。プレートを、抗マウスFc、続いてM-抗C9（0.6ug／ml）でコーティングし、続いて指定の通りにPenta-08Eを用いて用量調節し、続いて1μg／mlのhumabを用いた。例えば、図11Bを参照。
抗O8Eヒトモノクローナル抗体2A7、12E1および13D12は高い特異性でO8Eと結合した。
実施例4
乳癌細胞系の表面に発現されたO8Eに対する抗O8E抗体の結合の特徴づけ
本実施例は、フローサイトメトリーによる、O8Eを細胞表面に発現するCHO-O8E（別名B7H4、B7S1およびB7x）トランスフェクタントおよび乳房細胞癌細胞に対する結合に関する抗O8E抗体の検査を開示している。
O8EがトランスフェクトされたCHO細胞系、ならびに乳房細胞癌細胞系SKBR3（ATCCアクセッション番号HTB-30）を抗体結合に関して検査した。HuMAb 2A7抗O8Eヒトモノクローナル抗体の結合は、1×105個の細胞を濃度1μg／mlの2A7とともにインキュベートすることによって評価した。細胞を洗浄し、結合をFITC標識抗ヒトIgG Abにより検出した。フローサイトメトリー分析は、FACScanフローサイトメトリー（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いて行った。結果は図12および13に示されている。
これらのデータは、抗O8E HuMAbが、O8Eを発現するCH0細胞および例示的な乳房細胞癌細胞系と結合することを実証している。
実施例5
抗O8Eモノクローナル抗体の結合親和性に関するスキャッチャード分析
本実施例は、スキャッチャード分析を用いた、O8EがトランスフェクトされたHEK細胞系に対する結合親和性に関するヒトモノクローナル抗体1G11、2F9、2A7、12E1および13D12モノクローナル抗体の検査を開示している。
HEK細胞に標準的な手法を用いて完全長O8Eをトランスフェクトし、10％ウシ胎仔血清（FBS）を含むRPMI培地中で増殖させた（図12は、2A7ヒト抗O8Eモノクローナル抗体によるこれらのHEK-O8E細胞のFACs分析を提示している）。細胞をトリプシン処理し、Trisベースの結合緩衝液（24mM Tris pH 7.2、137mM NaCl、2.7mM KCl、2mMグルコース、1mM CaCl2、1mM MgCl2、0.1％ BSA）で1回洗浄し、結合緩衝液中で2×106個／mlに調整した。ミリポア（Millipore）プレート（MAFB NOB）を1％脱脂粉乳を含む水でコーティングし、4℃で一晩保存した。プレートを0.2mlの結合緩衝液で3回洗浄した。50μlの緩衝液のみを最大結合ウェルに添加した（全結合）。25μlの緩衝液のみを対照ウェルに添加した（非特異的結合）。さまざまな濃度の125I-抗O8E抗体を25μlの量で全ウェルに添加した（場合によってはFITC標識抗体を用量設定のために用いたが、これは非標識材料が入手できず、これらの場合には結合が損なわれている可能性がある）。100倍過剰のさまざまな濃度の非標識抗体を25μlの量で対照ウェルに添加し、結合緩衝液中のO8EがトランスフェクトされたCHO細胞（2×106個／ml）25μlも全ウェルに添加した。プレートを振盪器上で200RPMにて4℃で2時間インキュベートした。インキュベーションの完了後、Milliporeプレートを、0.2mlの低温の洗浄用緩衝液（24mM Tris pH 7.2、500mM NaCl、2.7mM KCl、2mMグルコース、1mM CaCl2、1mM MgCl2、0.1％ BSA）で3回洗浄した。フィルターを取り出し、ガンマカウンターで計数した。平衡結合の評価は、Prismソフトウエア（San Diego, CA）により単一部位結合パラメーターを用いて行った。
データを、シグモイド用量反応（PRIZM（商標））を用いる非線形回帰によって分析し、EC50の算出値を得た上で、それを用いて抗体を表2に示したようにランク付けした。これらの実験で算出したEC50値は抗体の定性的尺度であり、O8Eに対する絶対的な親和性を表しているわけではない。
（表２）
Figure 2011505372
*最小および最大の値は、不完全な曲線を補うために定数として調整した。
実施例6
抗O8Eモノクローナル抗体のインターナリゼーション
本実施例は、Hum-Zapインターナリゼーションアッセイを用いた、抗O8E HuMAbの、O8Eを発現するCHOおよび乳癌細胞へのインターナリゼーション能力に関する検査を示している。Hum-Zapアッセイは、毒素サポリンとコンジュゲートされたヒトIgGに対する親和性を有する二次抗体との結合を介した一次ヒト抗体のインターナリゼーションを調べる。
O8Eを発現する乳癌細胞系SKBR3を、1.25×104個／ウェルで100μl中に播種して一晩おいた。抗O8E HuMAb抗体である1G11、2F9、2A7、12E1または13D12を10pMの濃度でウェルに添加した。O8Eに非特異的なアイソタイプ対照抗体を陰性対照として用いた。Hum-Zap（Advanced Targating Systems, San Diego, CA, IT-22-25）を11nMの濃度で添加し、プレートを72時間インキュベートした。続いて、プレートに1.0μCiの3H-チミジンによるパルス刺激を24時間加え、採取した上でTop Count Scintillation Counter（Packard Instruments, Meriden, CT）で読み取った。結果は以下の表3およびおよび図14〜15に提示されている。抗O8E抗体1G11、2F9、2A7、12E1および13D12は、O8Eを発現するSKBR3乳癌細胞において、3H-チミジン取り込みの抗体濃度依存的な減少を示した。
これらのデータは、抗O8E抗体1G11、2F9、2A7、12E1および13D12が乳癌細胞系へのインターナリゼーションを受けることを実証している。
（表３）
Figure 2011505372
インターナリゼーション効率に関するランク付けを、SKBR3における3回の実験およびCHO-O8Eにおける2回の実験に関して平均した。インターナリゼーションのランク付けを、CHO-O8Eに対する結合のEC50とともに表4および5に提示している。これらの結果は、インターナリゼーション効率が結合親和性と直接には相関しないことを示しており、このことはインターナリゼーションがエピトープ依存的であることを示唆する。
（表４）SBKR3乳癌細胞系におけるインターナリゼーション別に並べたインターナリゼーション効率
Figure 2011505372
（表５）CHO-O8E細胞系におけるインターナリゼーション別に並べたインターナリゼーション効率
Figure 2011505372
CHO-O8Eにおけるサポリンコンジュゲートのインターナリゼーション活性を、ヒトモノクローナル抗体2A7、2F9および1G11を用いて、およそ500pM〜1pMの範囲での用量反応によって測定した。図14に図示されているように、インターナリゼーションは極めて効率的であり、EC50は低いpM範囲にあった。CHO親細胞系およびHu IgG-SAPを陰性対照として用いたところ、有意なバックグラウンド毒性も非特異的なインターナリゼーションも示されなかった。SAPとの直接的な抗O8EコンジュゲートをSKBR3細胞に用いた。Ig-SAP用量の関数としてのインターナリゼーションのパーセンテージ（対照との比較）が図15に提示されている。
実施例7
乳房細胞癌細胞系に対する毒素がコンジュゲートされた抗O8E抗体による細胞死の評価
本実施例は、細胞増殖アッセイにおける、毒素とコンジュゲートされた抗O8Eモノクローナル抗体がO8E+乳房細胞癌細胞系を死滅させる能力の検査を開示する。
抗O8E HuMAb抗体1G11、2F9、2A7、12E1または13D12を、ペプチジルリンカー、ヒドラゾンリンカーまたはジスルフィドリンカーなどのリンカーを介して毒素とコンジュゲートさせることができる。SKBR3などのO8Eを発現する乳癌細胞系を、約1〜3×104個／ウェルで100μlウェル中に播種して3時間おく。抗O8E抗体-毒素コンジュゲートをウェルに開始濃度30nMで添加し、1：3段階希釈で用量調節を行う。O8Eに非特異的なアイソタイプ対照抗体を陰性対照として用いる。プレートを69時間インキュベートする。続いて、プレートに1.0μCiの3H-チミジンによるパルス刺激を24時間加え、採取した上でTop Count Scintillation Counter（Packard Instruments, Meriden, CT）で読み取る。抗O8E抗体は、O8Eを発現する乳癌細胞において、3H-チミジン取り込みの毒素濃度依存的な減少を示すと予想される。このデータは、抗O8E抗体1G11、2F9、2A7、12E1および13D12が、毒素とコンジュゲートされた場合に乳癌細胞系に対して細胞傷害性である可能性を示す。
実施例8
抗O8E抗体のADCC活性の評価
本実施例は、蛍光細胞傷害性アッセイにおける、抗O8Eモノクローナル抗体が、エフェクター細胞の存在下での抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）を介してO8E+細胞系を死滅させる能力に関する検査を開示する。
ヒトエフェクター細胞を以下のように全血から調製した。ヒト末梢血単核細胞を標準的なFicoll-paque分離によってヘパリン化全血から精製した。細胞を10％ FBSおよび200 U／mlのヒトIL-2を含むRPMI1640培地中に再懸濁させ、37℃で一晩インキュベートした。翌日に細胞を収集し、培地中で4回洗浄し、2×107個／mlで再懸濁させた。標的O8E+細胞を、1×106個の標的細胞／mL当たりBATDA 2.5μlのBATDA試薬（Perkin Elmer, Wellesley, MA）とともに37℃で20分間インキュベートした。標的細胞を4回洗浄し、遠心沈降させて最終量を1×105個／mlにした。
O8E+細胞系SKBR3、ならびにO8EがトランスフェクトされたSKOV3細胞系を、ヒト抗O8Eモノクローナル抗体に対する抗体特異的なADCCについて、以下のDelfia蛍光放射分析を用いて検査した。各標的細胞系（標識した標的細胞100μl）を、エフェクター細胞50μlおよび抗体50μlとともにインキュベートした。すべての実験を通じて標的とエフェクターとの比として1：50を用いた。すべての試験において、ヒトIgG1アイソタイプ対照を陰性対照として用いた。2000rpmのパルス遠心および37℃で1時間のインキュベーションの後に、上清を採取し、再び高速回転を加え、上清20μlを平底プレートに移し、それに対してEu溶液（Perkin Elmer, Wellesley, MA）180μlを添加し、RubyStarリーダー（BMG Labtech）で読み取った。溶解率は以下の通りに計算した：（試料放出−自然放出*100）／（最大放出−自然放出）、式中、自然放出は標的細胞のみを有するウェルからの蛍光であり、最大放出は標的細胞を含み、2％Triton-Xで処理したウェルからの蛍光である。抗O8E抗体1G11、2F9および2A7によるSKBR3細胞の細胞傷害性溶解率は図17に提示されている；抗O8E抗体1G11、2F9および2A7によるSKOV3-O8Eトランスフェクト細胞系の細胞傷害性溶解率は図18に提示されている；抗O8E抗体2F9および2A7によるSKBR3細胞の濃度依存的な細胞細胞傷害性溶解率は図19に提示されている。O8E+発現細胞系SKBR3およびSKOV3-O8Eは両方とも、HuMAb抗O8E抗体1G11、2F9および2A7による抗体媒介性細胞傷害性を示した。これらのデータは、HuMAb抗O8E抗体がO8E+発現細胞に対して特異的な細胞傷害性を示すことを実証している。
実施例9
裸の抗O8E抗体および細胞毒とコンジュゲートされた抗O8E抗体を用いた、インビボ腫瘍異種移植モデルの治療
本実施例は、腫瘍増殖に対する抗体のインビボ効果を検討するための、毒素とコンジュゲートされた抗O8E抗体による、乳房細胞癌腫瘍が移植されたマウスのインビボ治療を開示する。
SKBR3または他の適した乳房細胞癌細胞を、標準的な実験手順を用いてインビトロで増やす。6〜8週齢の雄性Ncr無胸腺ヌードマウス（Taconic, Hudson, NY）の右側腹に、マウス1匹当たりPBS／マトリゲル（1:1）0.2ml中に7.5×106個のACHNまたはA-498細胞を皮下移植する。移植後は週2回、マウスを秤量し、その腫瘍について電子キャリパーを用いて三次元的に測定する。腫瘍体積を高さ×幅×長さとして計算する。平均270mm3のACHN腫瘍または平均110mm3のA498腫瘍を有するマウスを治療群に無作為化する。第0日の時点で、マウスに対して、PBS媒体、細胞毒とコンジュゲートされたアイソタイプ対照抗体、または細胞毒とコンジュゲートされた抗O8E HuMAbを腹腔内投与する。本開示の抗体とコンジュゲートさせることができる毒素化合物の例は、係属中の米国特許出願MEDX-0034US4号に記載されている。抗O8E HuMAbを投与されるマウスには、3種の異なる毒素化合物で検査を行う。投与後60日間、マウスを腫瘍増殖についてモニターした。腫瘍が腫瘍エンドポイント（2000mm3）に達した時点でマウスを安楽死させた。毒素とコンジュゲートされた適した抗O8E抗体は、腫瘍が腫瘍エンドポイント体積（2000mm3）に達するまでの平均時間を延長させ、腫瘍増殖の進行を緩徐にする。したがって、抗O8E抗体-毒素コンジュゲートによる治療は、腫瘍増殖に対して直接的なインビボ阻害効果を有する。
実施例10
抗O8E HuMAb 2A7による免疫組織化学
本実施例は、正常マウス組織アレイ（IMGENEX Histo-Array；Imgenex Corp., San Diego, CA）を用いた免疫組織化学により、抗O8E HuMAb 2A7がO8Eを認識することを開示する。
免疫組織化学には2,000μmの組織コアを用いた。30分間乾燥させた後に、切片をアセトンで固定し（室温で10分間）、5分間風乾させた。スライドをPBSですすぎ、続いてPBS中の10％正常ヤギ血清とともに20分間プレインキュベートし、その後にPBS中の10μg／mlのFITC化（fitcylated）抗体とともに、10％正常ヤギ血清ともに室温で30分間インキュベートした。次に、スライドをPBSで3回洗浄し、マウス抗FITC（10μg／ml DAKO）とともに室温で30分間インキュベートした。スライドをPBSで再び洗浄し、ヤギ抗マウスHRPコンジュゲート（DAKO）とともに室温で30分間インキュベートした。スライドをPBSでさらに3回洗浄した。ジアミノベンジジン（シグマSigma）を基質として用いて、褐色の染色を得た。蒸留水で洗浄した後に、スライドをヘマトキシリンで1分間対比染色した。その後に、スライドを蒸留水を流しながら10秒間洗浄し、グリセルゲル（glycergel）（DAKO）にマウントした。これらの試験の結果は表6に提示されている。
（表６）正常マウス組織アレイにおけるO8Eの免疫反応性
Figure 2011505372
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免疫反応性の強度：+-（不明確）；+（弱い）；2+（中程度）；3+（強い）；4+（非常に強い）；-（陰性）。Freq：頻度が高い；Ocas：時々
抗O8E抗体1G11および2F9に関して収集されたこれらのデータおよび対応するデータは、結腸および小腸内の腸内分泌様細胞、ならびに精嚢の内腔液中に強いないし非常に強いO8E免疫反応性（3+、4+）が存在すること；弱いないし中程度のO8E免疫反応性（1+、2+）が大脳のニューロン、大脳および橋の神経網および線維、小脳の白質、小腸の陰窩上皮細胞、および脾臓内の少数の大きなリンパ系細胞に認められること；弱いO8E免疫反応性（1+）が結腸表面上皮、小脳のプルキンエ細胞、ならびに唾液腺および膵臓の腺房上皮に認められること；不明確ないし弱いO8E免疫反応性が膀胱の移行上皮、精巣の一次精母細胞および胃の神経叢で示されること；ならびにすべての他の臓器は陰性ないし不明確な染色を呈し、これには皮膚、肝臓、心臓、肺、胸腺、腎臓、子宮、卵巣、精巣上体、舌およびおよび骨格筋が含まれることを実証している。
実施例11
脱フコシル化HuMAbの産生
本実施例は、フコシル残基が欠損している抗O8E HuMAbの産生について示す。
フコシル残基の量が減少した抗体は、抗体のADCC能力を増大させることが実証されている。フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8が欠損したCHO細胞系Ms704-PF（Biowa,Inc., Princeton, NJ）に対して、抗O8E HuMAbの重鎖および軽鎖を発現するベクターのエレクトロポレーションを行う。薬剤耐性クローンを、6mMのL-グルタミンおよび500μg／mlのG418（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含むEx-Cell 325-PF CHO培地（JRH Biosciences, Lenexa, KS）中での増殖によって選択する。クローンを、IgGの発現に関して標準ELISAアッセイによってスクリーニングする。2つの別々のクローンB8A6およびB8C11が作製され、それらは1.0〜3.8ピコグラム／細胞／日の範囲の産生速度を有する。
実施例12
脱フコシル化抗O8E抗体のADCC活性の評価
本実施例は、蛍光細胞傷害性アッセイにおける、脱フコシル化された、または脱フコシル化されていない抗O8Eモノクローナル抗体が、抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）を介してエフェクター細胞の存在下でO8E+細胞系を死滅させる能力に関する検査を開示する。
ヒト抗O8Eモノクローナル抗体を、上記のように脱フコシル化する。ヒトエフェクター細胞は以下のように全血から調製する。ヒト末梢血単核細胞を、標準的なFicoll-paque分離によってヘパリン化全血から精製する。細胞を、10％ FBS（培地）および200 U／mlのヒトIL-2を含むRPMI1640培地中に再懸濁させ、37℃で一晩インキュベートする。翌日に細胞を収集し、培地中で1回洗浄し、2×107個／mlで再懸濁させる。標的O8E+細胞を、1×106個の標的細胞／mL当たりBATDA 2.5μlのBATDA試薬（Perkin Elmer, Wellesley, MA）とともに37℃で20分間インキュベートする。アッセイ培地中で標的細胞を20mM HEPESおよび2.5mMプロベネシドを含むPBSで4回洗浄し、遠心沈降させて最終量を1×105個／mlにする。
O8E+細胞系ARH-77（ヒトBリンパ芽球性白血病；ATCCアクセッション番号CRL1621）を、脱フコシル化されたまた脱フコシル化されていないヒト抗O8Eモノクローナル抗体2H5に対する抗体特異的なADCCについて、Delfia蛍光放射分析を用いて以下の通りに検査する。標的細胞系ARH77（標識した標的細胞100μl）を、50μlのエフェクター細胞および50μlの1G11または脱フコシル化1G11のいずれかとともにインキュベートする。標的とエフェクターとの比としてはすべて1：100を用いる。ヒトIgG1アイソタイプ対照を陰性対照として用いる。2100rpmのパルス遠心および37℃で1時間のインキュベーションの後に、上清を採取し、再び高速回転を加え、上清20μlを平底プレートに移し、それに対してEu溶液（Perkin Elmer, Wellesley, MA）180μlを添加し、Fusion Alpha TRF プレートリーダー（Perkin Elmer）で読み取る。溶解率は以下の通りに計算する：（試料放出−自然放出*100）／（最大放出−自然放出）、式中、自然放出は標的細胞のみを有するウェルからの蛍光であり、最大放出は標的細胞を含み、3％ Lysolで処理したウェルからの蛍光である。O8E+発現細胞系ARH-77は、HuMAb抗O8E抗体1G11による抗体媒介性細胞傷害性、および抗O8E抗体1G11の脱フコシル化形態に伴う特異的溶解率の増加を示すと考えられる。したがって、脱フコシル化HuMAb抗O8E抗体は、O8E+発現細胞に対する特異的な細胞傷害性を増大させる。
実施例13
免疫蛍光染色分析によるHuMab抗O8E抗体のインターナリゼーション
標的細胞系O8E+ SKBR3（ヒト乳癌、ATCC# HTB-30）およびZR-75（ヒト乳癌、ATCC# CRL-1500）を、HuMab抗O8E抗体2A7C11、1G11H1および2F9E6の細胞との結合時のインターナリゼーションについて、免疫蛍光染色を用いて検査した。
組織培養フラスコから0.25％トリプシン／EDTAでの処理によって採取したSKBR3細胞およびZR-75細胞（96ウェルプレート内に、104個／100μl／ウェル）を、FACS緩衝液（PBS＋5％ FBS、培地）中、5μg／mlの各HuMab抗O8E抗体とともに氷上で30分間インキュベートした。ヒトIgG1アイソタイプ対照を陰性対照として用いた。培地中での2回の洗浄後、細胞を培地（100μl／ウェル）中に再懸濁させ、続いてPEとコンジュゲートさせたヤギ抗ヒト二次抗体（Jackson ImmunoResearch Lab）とともに氷上で30分間インキュベートした。培地中で洗浄した後に、細胞を0分時に蛍光顕微鏡（Nikon）下で直ちに画像化するか、または37℃でさまざまな時間インキュベートした。以下の図に示されているように、染色細胞の細胞形態および免疫蛍光強度の画像をさまざまな時点で記録した。蛍光はHuMab抗O8E抗体で染色された細胞でのみ観察された。IgG1対照抗体の場合には蛍光は観察されなかった。同様の結果が、アッセイにおいてFITCと直接コンジュゲートさせたHuMab抗O8E抗体でも観察された。
画像化データにより、0分時に3種のHuMab抗O8E抗体のすべてで細細胞表面膜上での蛍光の出現が示された。30分間のインキュベーション後では、膜蛍光強度が有意に低下する一方、細胞内部の染色は増大した。120分の時点で、膜蛍光は消失し、その代わりに細胞内区画内に存在するように見られた。このデータは、HuMab抗O8E抗体が、O8Eを発現する内因性腫瘍細胞との結合時に特異的にインターナリゼーションを受けることができることを示す。
実施例14
SCIDマウスにおけるHEK-B7H4腫瘍に対する抗O8E抗体の有効性
本実施例では、腫瘍増殖に対する抗体のインビボ効果を検討するために、HEK-B7H4腫瘍が移植されたSCIDマウスを、裸の抗O8E抗体によってインビボで治療する。
機能性BおよびTリンパ球が欠損した重症複合免疫不全（SCID）マウスを、腫瘍増殖の試験のために用いた。B7H4がトランスフェクトされたHEK腫瘍細胞系からの細胞を、マトリゲル（50％v／v）中に500万個／マウスで皮下に移植した。各マウスに第0日に0.2mlの細胞を接種した。マウスを第10日から腫瘍増殖について検査し、およそ6週間にわたって腫瘍増殖について週2回モニターした。腫瘍が約130mm3に達した時点で、マウスを腫瘍体積別に3群にランダム化した。マウスに、10mg／kgの裸の抗O8E抗体2A7、アイソタイプ対照抗体、または陰性対照としての製剤化緩衝液による治療を行った。動物個体に対する投与は5日毎の5回の腹腔内注射によって行った。電子キャリパーを用いて腫瘍を三次元的に測定し（高さ×幅×長さ）、腫瘍体積を計算した。腫瘍が1500mm3に達した時点、または15％を超える体重減少が認められた時点でマウスを安楽死させた。結果は図20に示されている。腫瘍増殖は抗O8E抗体2A7による治療によって阻害された。2A7による治療を受けた群についての腫瘍増殖阻害の中央値は第34日で63％であった。投与を中止すると腫瘍は再び増殖を始めた。これらの結果は、抗O8E抗体が、インビボでO8Eを発現する腫瘍を治療する上で有効であることを示している。
実施例15
B7H4抗体薬物コンジュゲートの調製：
B7-H4モノクローナル抗体成分および毒素Bのコンジュゲーションは、以下の通りに行った。100mM Na-リン酸、50mM NaCl、2mM DTPA、pH 8.0中の約5mg／mlの抗体を、7倍モル過剰量の2-イミノチオランによってチオール化させた。チオール化反応は連続混合下で室温で1時間かけて進行させた。
毒素Bとのコンジュゲーション：
チオール化の後に、PD10カラム（Sephadex G-25）を介して、抗体の緩衝液をコンジュゲーション用緩衝液（50mM HEPES、5mMグリシン、0.5％ポビドン（10K）、2mM DTPA、pH 5.5）に交換した。チオール化抗体の濃度を280nmで決定した。チオール濃度はジチオジピリジンアッセイを用いて測定した。
DMSO中のMED-毒素Bの5mM貯蔵液を、抗体のチオールに対して3倍モル過剰量で添加し、室温で90分間混合した。コンジュゲーション後に、未反応のチオールを失活させるために、DMSO中の100mM N-エチルマレイミドを抗体のチオールに対して10倍モル過剰量で添加した。この失活反応は連続混合下で室温で1時間かけて行った。
精製：
B7H4抗体薬物コンジュゲートを0.2μmのフィルターに通した上で、陽イオン交換クロマトグラフィー精製を行った。SP Sepharose High Performance Cation Exchangeカラム（CEX）を、5 CV（カラム容積）の50mM HEPES、5mMグリシン、0.5％ポビドン、1M NaCl、pH 5.5によって再生させた。再生後に、カラムを3CVの平衡化緩衝液（50mM HEPES、5mMグリシン、0.5％ポビドン、pH 5.5）によって平衡化した。B7H4-毒素Bコンジュゲートをローディングし、カラムを平衡化緩衝液で1回洗浄した。コンジュゲートを50mM HEPES、5mMグリシン、230mM NaCl、0.5％ポビドン、pH 5.5で溶出させた。溶出液を複数の画分に収集した。続いて、タンパク質凝集物および未反応のMED毒素Bを除去するために、カラムを50mM HEPES、5mMグリシン、1M NaCl、0.5％ポビドン、pH 5.5で再生させた。
単量体の抗体コンジュゲートを含む画分をプールした。抗体コンジュゲートの濃度および置換比を、280nmおよび340nmでの吸光度を測定することによって決定した。
製剤化
精製されたCEX溶出液プールの緩衝液を、10MWCOメンブレンを用いる透析により、50mM HEPES、5mMグリシン、100mM NaCl、0.5％ポビドン、pH 6.0に交換した。透析後に、抗体コンジュゲートの濃度および置換比を、280nmおよび340nmでの吸光度を測定することによって決定した。
実施例16
SCIDマウスにおけるHEK-B7H4腫瘍に対する抗体-薬物コンジュゲートの有効性
HEK293-B7H4異種移植試験を、以下の通りに行った。500万個のHEK293-B7H4細胞を、SCIDマウスの皮下に移植した。腫瘍が平均70mm3を上回った時点でマウスを治療群に割り付けた。腫瘍が平均70mm3を上回った時点で、マウスに対して2A7-毒素B、lgG対照-毒素B、または媒体（対照）による処置を単回投与（毒素Bに関する計算で0.1umol／kg）で行った。移植後は週1回、マウスを秤量し、腫瘍について電子キャリパーを用いて三次元的に測定した。腫瘍体積は高さ×幅×長さ／2として計算した。このHEK293-B7H4モデルは細胞表面にB7H4を高レベルで発現する。IgG対照-毒素Bは、異種移植片がIgGに関して陰性であるため、アイソタイプ対照として用いる。
図21に示されているように、HEK293-B7H4腫瘍はマウスにおいて十分に増殖し、媒体（対照）と毒素がコンジュゲートされたアイソタイプ対照との間で腫瘍増殖について差はみられなかったが、2A7-毒素Bによる治療は、この群の全マウスにおいて完全な腫瘍退縮をもたらした。対照的に、図22はさまざまな群間で体重には差がみられなかったことを示している。したがって、2A7-毒素Bによる、B7H4のこのタンパク質を発現する腫瘍上での標的化はこのモデルにおける完全な腫瘍退縮を引き起こしたが、その一方で、この試験は、2A7-毒素Bの投与による標的の毒性の徴候が認められなかったことも示している。
実施例17
抗O8E抗体を用いた免疫組織化学
抗B7H4 HuMAb 2A7がB7H4を認識する能力を、卵巣癌、肺癌、乳癌および頭頸部癌の臨床生検試料を用いた免疫組織化学によって検討した。
免疫組織化学には5μmの凍結切片を用いた（Ardais Inc, USA）。30分間乾燥させた後に、切片をアセトンで固定し（室温で10分間）、5分間風乾させた。スライドをPBSですすぎ、続いてPBS中の10％正常ヤギ血清とともに20分間プレインキュベートし、その後にPBS中の10μg／mlのFITC化抗体とともに、10％正常ヤギ血清ともに室温で30分間インキュベートした。次に、スライドをPBSで3回洗浄し、マウス抗FITC（10μg／ml DAKO）とともに室温で30分間インキュベートした。スライドをPBSで再び洗浄し、ヤギ抗マウスHRPコンジュゲート（DAKO）とともに室温で30分間インキュベートした。スライドをPBSでさらに3回洗浄した。ジアミノベンジジン（シグマSigma）を基質として用いて、褐色の染色を得た。蒸留水で洗浄した後に、スライドをヘマトキシリンで1分間対比染色した。その後に、スライドを蒸留水を流しながら10秒間洗浄し、グリセルゲル（glycergel）（DAKO）にマウントした。臨床生検試料の免疫組織化学染色により、肺癌、乳癌、卵巣癌および頭頸部癌の試料で陽性染色が示された。
実施例18
正常組織および癌組織に対する定量的RT-PCR
さまざまな正常組織試料および癌組織試料を、定量的逆転写酵素PCR（RT-PCR）を用いてO8E mRNAの発現に関してスクリーニングした。mRNAの発現はO8Eタンパク質の発現を指し示す。
定量的RT-PCRには、Operon（Huntsville, AL）によって提供された以下のO8Eプライマーを用いた：
Figure 2011505372
標準的な反応条件を用いた（1ng／μlのcDNAテンプレート5μl、40μMの上流プライマー0.1μl、40μMの下流プライマー0.1μl、2X SYBR Green PCR mix（Applied Biosystems # 4367659）6μl、および水0.8μl）。cDNAを、ABI Prism 7900HT（Applied Biosystems, Foster City, CA）において標準的なPCR条件を用いて40サイクル増幅させた。定量的RT-PCRの結果は以下の表7に示されている。カウント未確定とした試料は、蛍光閾値未満であった値を表している。乳房、卵巣および頭頸部の腫瘍はO8Eを発現することが示され、最も高いレベルの発現は一部の卵巣癌および頭頸部癌の試料で認められた。このことは、乳房、卵巣および頭頸部の腫瘍試料では正常組織に比してO8Eの発現が増大していることを実証している。
（表７）正常組織および癌組織における定量的RT-PCRでの発現
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配列表の概略
Figure 2011505372
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Claims (39)

  1. ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む抗体-パートナー分子コンジュゲート（antibody-partner molecule conjugate）であって、前記抗体がヒトB7-H4と結合し、かつ前記抗体-パートナー分子コンジュゲートが以下の特性のうち少なくとも1つを呈する、抗体-パートナー分子コンジュゲート：
    （a）ヒトB7-H4と1×10-8 Mまたはそれ未満の親和性で結合する；または
    （b）細胞毒とコンジュゲートされた時にインビボでB7-H4発現細胞の増殖を阻害する。
  2. 抗体が特性（a）および（b）の両方を呈する、請求項1記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート。
  3. ヒトB7-H4と5×10-9 Mまたはそれ未満の親和性で結合する、請求項1記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート。
  4. 参照抗体によって認識されるヒトB7-H4上のエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む抗体-パートナー分子コンジュゲートであって、参照抗体が以下を含む、抗体-パートナー分子コンジュゲート：
    （a）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
    （b）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
    （c）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
    （d）SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
    （e）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
  5. 参照抗体が以下を含む、請求項4記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート：
    SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
  6. 参照抗体が以下を含む、請求項4記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート：
    SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
  7. 参照抗体が以下を含む、請求項4記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート：
    SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
  8. 参照抗体が以下を含む、請求項4記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート：
    SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
  9. 参照抗体が以下を含む、請求項4記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート：
    SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
  10. （a）SEQ ID NO：11を含む重鎖可変領域CDR1；
    （b）SEQ ID NO：16を含む重鎖可変領域CDR2；
    （c）SEQ ID NO：21を含む重鎖可変領域CDR3；
    （d）SEQ ID NO：26を含む軽鎖可変領域CDR1；
    （e）SEQ ID NO：31を含む軽鎖可変領域CDR2；および
    （f）SEQ ID NO：36を含む軽鎖可変領域CDR3
    を含む、請求項1記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート。
  11. （a）SEQ ID NO：12を含む重鎖可変領域CDR1；
    （b）SEQ ID NO：17を含む重鎖可変領域CDR2；
    （c）SEQ ID NO：22を含む重鎖可変領域CDR3；
    （d）SEQ ID NO：27を含む軽鎖可変領域CDR1；
    （e）SEQ ID NO：32を含む軽鎖可変領域CDR2；および
    （f）SEQ ID NO：37を含む軽鎖可変領域CDR3
    を含む、請求項1記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート。
  12. （a）SEQ ID NO：13を含む重鎖可変領域CDR1；
    （b）SEQ ID NO：18を含む重鎖可変領域CDR2；
    （c）SEQ ID NO：23を含む重鎖可変領域CDR3；
    （d）SEQ ID NO：28を含む軽鎖可変領域CDR1；
    （e）SEQ ID NO：33を含む軽鎖可変領域CDR2；および
    （f）SEQ ID NO：38を含む軽鎖可変領域CDR3
    を含む、請求項1記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート。
  13. （a）SEQ ID NO：14を含む重鎖可変領域CDR1；
    （b）SEQ ID NO：19を含む重鎖可変領域CDR2；
    （c）SEQ ID NO：24を含む重鎖可変領域CDR3；
    （d）SEQ ID NO：29を含む軽鎖可変領域CDR1；
    （e）SEQ ID NO：34を含む軽鎖可変領域CDR2；および
    （f）SEQ ID NO：39を含む軽鎖可変領域CDR3、
    を含む、請求項1記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート。
  14. （a）SEQ ID NO：15を含む重鎖可変領域CDR1；
    （b）SEQ ID NO：20を含む重鎖可変領域CDR2；
    （c）SEQ ID NO：25を含む重鎖可変領域CDR3；
    （d）SEQ ID NO：30を含む軽鎖可変領域CDR1；
    （e）SEQ ID NO：35を含む軽鎖可変領域CDR2；および
    （f）SEQ ID NO：40を含む軽鎖可変領域CDR3
    を含む、請求項1記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート。
  15. （a）SEQ ID NO：1〜5からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
    （b）SEQ ID NO：6〜10からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
    を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む抗体-パートナー分子コンジュゲートであって、前記抗体がヒトB7-H4タンパク質と特異的に結合する、抗体-パートナー分子コンジュゲート。
  16. 抗体またはその抗原結合部分が以下を含む、請求項15記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート：
    （a）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
    （b）SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
  17. 抗体またはその抗原結合部分が以下を含む、請求項15記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート：
    （a）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
    （b）SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
  18. 抗体またはその抗原結合部分が以下を含む、請求項15記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート：
    （a）SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
    （b）SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
  19. 抗体またはその抗原結合部分が以下を含む、請求項15記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート：
    （a）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
    （b）SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
  20. 抗体またはその抗原結合部分が以下を含む、請求項15記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート：
    （a）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
    （b）SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
  21. 請求項1記載の抗体-パートナー分子コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む、組成物。
  22. パートナー分子が治療剤である、請求項1記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート。
  23. 請求項22記載の抗体-パートナー分子コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む、組成物。
  24. 治療剤が細胞毒である、請求項22記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート。
  25. 請求項24記載の抗体-パートナー分子コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む、組成物。
  26. 治療剤が放射性同位体である、請求項22記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート。
  27. 請求項17記載の抗体-パートナー分子コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む、組成物。
  28. B7-H4を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、B7-H4を発現する腫瘍細胞を、請求項1記載の抗体-パートナー分子コンジュゲートと、B7-H4腫瘍細胞の増殖が阻害されるように接触させる段階を含む、方法。
  29. B7-H4を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、B7-H4を発現する腫瘍細胞を、請求項22記載の抗体-パートナー分子コンジュゲートと、B7-H4腫瘍細胞の増殖が阻害されるように接触させる段階を含む、方法。
  30. 治療剤が細胞毒である、請求項29記載の方法。
  31. B7-H4を発現する腫瘍細胞が、前立腺癌または膀胱癌の腫瘍細胞である、請求項28記載の方法。
  32. B7-H4を発現する腫瘍細胞が、前立腺癌および膀胱癌からなる群より選択される癌由来である、請求項28記載の方法。
  33. 対象に対して、請求項1記載の抗体-パートナー分子コンジュゲートを、対象における癌が治療されるように投与する段階を含む、対象における癌を治療する方法。
  34. 対象に対して、請求項22記載の抗体-パートナー分子コンジュゲートを、対象における癌が治療されるように投与する段階を含む、対象における癌を治療する方法。
  35. 治療剤が細胞毒である、請求項34記載の方法。
  36. 癌が前立腺癌または膀胱癌である、請求項34記載の方法。
  37. 癌が前立腺癌および膀胱癌からなる群より選択される、請求項34記載の方法。
  38. パートナー分子とコンジュゲートされた請求項1記載の抗体を含む抗体-パートナー分子コンジュゲートであって、パートナー分子が化学リンカーによって抗体とコンジュゲートされている、抗体-パートナー分子コンジュゲート。
  39. 化学リンカーがペプチジルリンカー、ヒドラジンリンカーおよびジスルフィドリンカーからなる群より選択される、請求項38記載の抗体-パートナー分子コンジュゲート。
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