CN111148514A - 与免疫调节剂联合应用于癌症免疫治疗的rar选择性激动剂 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了用于治疗癌症的方法，其包括施用CAR修饰的免疫细胞和至少一种视黄酸受体激动剂。

Description

与免疫调节剂联合应用于癌症免疫治疗的RAR选择性激动剂
相关申请
本申请要求于2017年8月31日提交的美国临时专利申请号为62/552814的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
多年来，癌症治疗的基础一直是手术、化学疗法和放射疗法。在过去的十年中，靶向疗法-通过针对主要在癌细胞中见到的特定分子变化而靶向癌细胞的药物-也已成为许多癌症的标准疗法。利用免疫疗法的新方法涉及改造免疫细胞以识别和攻击肿瘤。
正常的造血干细胞(HSC)可能对类视黄醇(视黄酸受体或RAR特异的化合物)高度敏感，但通过将它们与类视黄醇的生理水平隔离，可以保持为类视黄醇信号未成熟的状态。骨髓微环境通过酶CYP26的表达使视黄酸代谢失活，从而调节骨髓对类视黄醇的暴露。这种机制(CPY26介导的类视黄醇代谢)是动态的，并且被骨髓基质用于使HSC行为与生理需要相匹配。例如，骨髓生境中稳态的低水平类视黄醇将HSC维持在静止状态，而在应激情况下(即，暴露于放射线或化学疗法)，维持较高的类视黄醇水平以将HSC募集进入细胞分裂并拯救造血作用。
在患有血液系统恶性肿瘤的受试者中，基质CYP26保护癌症HSC免受类视黄醇的侵害，其作用方式与正常情况相似。然而，由于血液恶性肿瘤中骨髓生境的其他改变，例如醛脱氢酶(ALDH)活性的差异，存在类视黄醇可用于治疗血液恶性肿瘤的治疗窗口。骨髓微环境中CYP26的表达有助于保护未成熟的急性髓性白血病(AML)细胞免受全反式视黄酸(ATRA)的侵害，并可能解释了为什么ATRA对治疗AML无效。暴露于通过视黄酸受体γ(RARγ)作用的ATRA药理浓度可诱导CYP26在骨髓微环境中表达，从而保护其中的癌症干细胞免受类视黄醇活性的影响。该机制还屏蔽了骨髓中的非造血转移肿瘤细胞。然而，使用未被CYP26灭活的类视黄醇类似物可使此类类视黄醇最终从保护性骨髓生境中分化出来，从而消除癌症HSC。由于这种分化是由RARα介导的，并且使用对CYP26具有抗性的RARα特异性类似物使得能够诱导治疗分化活性，而无需被CYP26酶灭活。
因此，诱导癌症干细胞的分化的RAR激动剂和靶向的免疫疗法的组合在治疗癌症中特别有用。
发明内容
本文公开了用于增强靶向癌症免疫疗法的化合物。作用于视黄酸受体(RAR)的化合物与嵌合抗原受体(CAR)修饰的免疫细胞(有时缩写为CAR-MIC)结合使用，以增强CAR修饰的免疫细胞和/或免疫检查点靶向疗法的抗癌活性。
类视黄醇和rexinoids具有多种活性。特定的类视黄醇在终末分化的癌症干细胞中具有抗癌作用。这些分化性类视黄醇或分化性RAR活性剂可与CAR-MIC结合使用，以提高免疫疗法的整体有效性。在一些实施方式中，分化性类视黄醇是RARα激动剂。在一些实施方式中，RARα激动剂是RARα特异性或选择性激动剂。在一些实施方式中，RARα激动剂是CYP26抗性的。
在一些实施方式中，CAR修饰的免疫细胞是或包含CAR修饰的T细胞。在一些实施方式中，CAR修饰的免疫细胞是或包含CAR修饰的NK细胞。在一些实施方式中，CAR修饰的免疫细胞是CAR修饰的NKT细胞或者包含CAR修饰的NKT细胞。在一些实施方式中，CAR修饰的免疫细胞是CAR修饰的巨噬细胞或包含CAR修饰的巨噬细胞。其他实施方式可包含这些细胞类型的混合物。最典型地，这种细胞制剂通过输注例如静脉内输注给药。相反，RARα激动剂是可以口服给药的小分子，例如作为丸剂或胶囊剂等。因此，可以按照独立的时间施用RARα激动剂和CAR修饰的免疫细胞。
在一些实施方式中，RARα激动剂是：
在其他实施方式中，所述RARα激动剂是他米巴罗汀(AM80)、AM580或Re80。
Figure BDA0002395209170000022
Figure BDA0002395209170000031
其他实施方式明确地排除了这些RARα激动剂中的一种或多种。
在一些实施方式中，癌症是血液系统恶性肿瘤，例如急性髓细胞性白血病或多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，癌症是实体瘤。
在一些实施方式中，该方法进一步包括向受试者施用至少一种免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4、PD-1、TIM-3、LAG-3、PD-L1配体、B7-H3、B7-H4、BTLA中的至少一种的抑制剂，或是ICOS或OX40激动剂。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是对CTLA-4、PD-1、TIM-3、LAG-3、PD-L1配体、B7-H3、B7-H4、BTLA、ICOS或OX40中的至少一种的特异性抗体。其他实施方式具体排除了这些试剂中的一种或多种。
在一些实施方式中，该方法包括另外施用至少一种抗肿瘤剂，例如癌症化学治疗剂或靶向治疗剂。在一些实施方式中，抗肿瘤药是硼替佐米。
本文还公开了与接受CAR修饰的免疫细胞但不接受所述RARα激动剂的患者相比，延长癌症患者的无病生存的方法，所述方法包括施用CAR修饰的免疫细胞和至少一种RARα激动剂。其他实施方式是延长癌症患者的无进展生存期或总体生存期的方法，其包括施用CAR修饰的免疫细胞和至少一种RARα激动剂。
本文还公开了降低CAR修饰的免疫细胞毒性的方法，该方法包括向有需要的受试者施用至少一种RARα激动剂与CAR修饰的免疫细胞组合，使得这种组合的结果是，与单独使用CAR修饰的免疫细胞相比，施用较低剂量的CAR修饰的免疫细胞可以更安全、更有效，或使得更高剂量的CAR-MIC可以更高疗效和同等安全地施用。
本文还公开了治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用嵌合抗原受体(CAR)修饰的免疫细胞、至少一种RARα激动剂和至少一种免疫检查点抑制剂。
本文还公开了通过在培养介质中包含RARα激动剂来增加CAR修饰的免疫细胞产生的方法。
附图说明
图1描绘了使用反式激活测定法的化合物IRX5183与RARα、RARβ和RARγ结合并激活其转录的程度。
图2A-C显示了RAR受体特异性激动剂调节FoxP3、α4β7和CCR9表达。将纯化的CD4+CD25-FoxP3-细胞在具有特定浓度的每种RAR激动剂的培养基中培养，并通过流式细胞仪分析FoxP3(图2A)、α4β7(图2B)和CCR9(图2C)在总CD4 T细胞中的表达。FoxP3结果代表了三次独立的实验。CCR9和α4β7结果代表了多次实验。
图3A-H描绘了血浆标志物BCL6(图3A和E)、BLIMP-1(图3B和F)、XBPS-1(图3C和G)和CHOP(图3D和H)的相对浓度，其在没有基质(液体)、有或没有AGN(RA受体拮抗剂AGN194310，1μM)的情况下，将来自三个不同患者样品的多发性骨髓瘤(MM)细胞系H929(图3A-D)或CD138+MM细胞(图3E-H)中孵育5天，或在有或没有R115(CYP26抑制剂R115866，1μM)或IRX(CYP26耐药类视黄醇IRX5183，1μM)的条件下与BM间充质细胞(基质细胞)共同培养。在未处理的液体条件下的表达设为1。数据代表3次具有相似结果的独立实验，并代表平均值±SEM.*P≤0.05和**P≤0.01，通过重复测量1-方差分析确定两组之间的统计显著性；使用Dunnett检验对P值进行多次比较校正。Ctrl，对照；max，最大。
图4A-B描绘了来自3种不同患者样品的H929细胞的克隆恢复(CFU)(图4A)或原代CD138+MM细胞的细胞恢复(图4B)。MM细胞在没有基质(液体)，有或没有泛RAR抑制剂AGN(1μM)的条件下，或在存在BM间充质细胞(基质)，有或没有CYP26抑制剂R115(1μM)或CYP26抗性类视黄醇IRX(1μM)的条件下孵育5天后，用硼替佐米(BTZ；2.5nM)处理48小时。在没有BTZ的情况下，将克隆恢复或细胞恢复归一化。
图5描绘了用BTZ(2.5nM)处理的H929细胞的克隆恢复。在不存在(液体)或存BM间充质细胞(基质)，有或没有R115(1μM)的情况下，将MM细胞孵育5天。预培养后，将H929细胞与BM基质分离，在新鲜培养基中培养0至48小时，然后用BTZ(2.5nM)处理48小时。在不存在BTZ的情况下，将每种情况的克隆恢复均归一化。
图6描绘了全身性MM异种移植物的生物发光图像。植入H929 Luc+细胞后，小鼠用IRX(n＝4)、BTZ(n＝5)或两者的组合(n＝5)处理4周。数据代表从第0天起生物发光倍数变化的平均值±SEM(光子/秒)。
图7A-C描述了MM细胞对BM基质中CYP26A1表达的影响。在不存在(Ctrl)或存在(共培养或Transwell)MM细胞(H929[图7A、MM.1S[图7B]、U266[图7C])的情况下孵育24小时的人BM间充质细胞中CYP26A1 mRNA的相对定量。将未经处理的BM基质(Ctrl)中的表达任意设置为1。
图8A-C描绘了在不存在(Ctrl)或存在(共培养或Transwell)MM细胞(H292，MM.1S，U266)的情况下孵育24小时的小鼠野生型(WT)或Smo-KO BM基质中CYP26A1 mRNA的相对定量。对于各个处理条件，未处理的WT或Smo-KO基质中的表达任意设定为1。数据代表3次独立实验的平均值±SEM.*P≤0.05和**P≤0.01，通过不配对的双尾t检验。
图9描绘了小鼠的生物发光图像，显示了用IRX(10mg/kg)、BTZ(0.5mg/kg)或其组合处理4周期间的肿瘤负荷。前部肿瘤由MM.1S荧光素酶+细胞和与对照载体(WT BM基质)转导的SmoFl/Fl BM基质细胞的组合组成。后部肿瘤由经Cre-重组酶(Smo KO BM基质)转导的MM.1S荧光素酶+细胞和SmoFl/Fl BM基质细胞组成。
图10描绘了处理4周期间肿瘤的生物发光(光子/秒)的倍数变化。将第1天每个肿瘤的生物发光变化标准化为第14天和治疗结束时(第28天)的生物发光变化。
图11A-H描绘了在无基质(Ctrl)的或与WT或Smo-KO基质细胞共培养情况下孵育5天的条件下，来自3位不同患者的H929细胞(分别为图11A-D)和原代CD138+MM细胞(分别为图11E-H)中BCL6(B细胞标记)、BLIMP、XBP1和CHOP(PC标记)的相对定量。在未处理的液体条件下的表达设为1。数据代表平均值±SEM.*P<0.05和**P<0.01，通过重复测量1次方差分析确定治疗组之间的统计学显著性；使用Dunnett检验对P值进行多次比较校正。
图12A-C描绘了ATRA介导的基质阻滞而不是AM80或IRX5183诱导的AML分化和消除。(图12A)用10-7MTRA、IRX5183或10-8AM80处理的NB4细胞的CFU实验；与用AM80和IRX5183的对照相比，用10-6MTRA、IRX5183或10-7AM80处理的OCl-AML3细胞(图12B)和Kasumi-1细胞(图12C)显示基质上的克隆形成的生长减少。数据为三次独立实验。
详细描述
本文公开了用于癌症治疗的组合，其包括类视黄醇化合物的协调施用以及表达嵌合抗原受体的免疫细胞(CAR修饰的免疫细胞或CAR-MIC)和/或免疫检查点靶向治疗剂的过继转移。作用于视黄酸受体(RAR)的化合物，尤其是RARα激动剂，可以通过使癌症干细胞分化并离开骨髓或肿瘤部位，增强CAR修饰的免疫细胞的活性，并变得可被CAR修饰的免疫细胞攻击。
所述增强，是指当将RARα激动剂与CAR修饰的免疫细胞一起使用时，与不将RARα选择性激动剂与CAR修饰的免疫细胞一起使用时，CAR修饰的免疫细胞具有更大和/或更快速的作用。类似地，与不使用RARα选择性激动剂时相比，当还使用RARα激动剂时，可以用较小剂量的CAR修饰的免疫细胞获得给定程度的效果。
如本文所用，术语“增强”是指与在不存在RARα激动剂干扰的情况下使用CAR修饰的免疫细胞相比，与RARα激动剂组合使用时，CAR修饰的免疫细胞的功效提高，或患者的反应改善。如本文所使用的，与不使用RARα激动剂的情况相比，术语“增强”还指的是当使用RARα激动剂时的改善的效果。
许多(即使不是大多数)恶性肿瘤是由稀有的细胞群体引起的，这些细胞仅维持自我更新和维持肿瘤的能力。这些癌症干细胞通常在生物学上不同于表征该疾病的大部分分化癌细胞。例如，慢性粒细胞白血病(CML)发生在造血干细胞水平，并且像它们的正常对应物一样，CML干细胞经历有序分化。因此，CML中的大部分白血病块由分化的血细胞组成，而负责疾病维持的稀有细胞类似于正常的造血干细胞。同样，在以肿瘤浆细胞为特征的多发性骨髓瘤(MM)中，这些细胞似乎像其正常对应细胞一样最终分化。形成大部分肿瘤的骨髓瘤浆细胞来自分化较差的癌症干细胞，其类似于胚后中心B细胞。其他癌症包括但不限于血液恶性肿瘤、骨髓增生异常综合征、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌和脑癌均来自相应的癌变细胞。
因此，本文公开了用药剂治疗癌症的方法，该药剂可靶向受保护的骨髓生态位或肿瘤内的癌症干细胞，通过可诱导癌干细胞分化成易于接受CAR修饰的免疫疗法治疗的成熟癌细胞。先前的研究表明，骨髓基质细胞在多发性骨髓瘤和骨髓中的急性髓白血病细胞中诱导不成熟的耐药表型。骨髓基质通过CYP26产生低视黄酸(RA-low)的环境，阻止正常细胞和恶性细胞分化。由于类视黄醇信号传导促进PC分化和Ig产生，因此RA信号传导的调节是克服骨髓微环境中耐药性的一种有吸引力的治疗策略。可以对骨髓生态位中的癌症干细胞起作用的RARα激动剂的给药(因为它们未被CYP26灭活)并引起细胞分化(因此使它们对被CAR修饰的免疫细胞杀伤敏感)是一种这样的方法。这种分化也可以与细胞对抗癌药物敏感的变化有关。在一些实施方式中，这样的抗癌药是硼替佐米。在某些实施方式中，本文公开的使用RARα激动剂的疗法的有效性导致在受保护的环境中癌症干细胞的数量大大减少。
在本文公开的一些实施方式中是用一种或多种RARα激动剂和CAR修饰的免疫细胞的组合治疗癌症的方法。本文还公开了用一种或多种RARα激动剂和一种或多种免疫检查点靶向的癌症治疗剂的组合治疗癌症的方法。本文还公开了用于治疗癌症的方法，其包括一种或多种RARα激动剂和一种或多种靶向免疫检查点的癌症治疗剂和CAR修饰的免疫细胞。
RARα激动剂
具有类视黄醇活性的化合物(维生素A及其衍生物)在细胞增殖和分化过程中具有活性。类视黄醇的许多生物学作用是通过调节核视黄酸受体(RAR)介导的。RAR通过与具有类视黄醇X受体(称为RXR)之一的异二聚体形式的DNA序列元件结合来激活转录，DNA序列元件被称为RAR反应元件(RARE)。已经确定并描述了人类RAR的三种亚型：RARα、RARβ和RARγ。
如本文所用，术语“RARα选择性激动剂”是指选择性结合RARα的化合物。如本文所用，术语“选择性结合”，当涉及到RARα选择性激动剂时，是指所述RARα选择性激动剂与所指示的靶标RARα的分化性结合，使得所述RARα选择性激动剂基本上不与非靶标受体如RARβ或RARγ等结合。尽管优选实施方式使用了RARα选择性激动剂，但是其他实施方式可以使用不一定对单独的RARα具有选择性的RARα激动剂。因此，尽管许多实施方式描述了使用RARα选择性激动剂，但应理解，另外还公开了使用普通RARα激动剂的类似实施方式。
如本文所用，术语“激动剂”应理解为是指与受体结合并激活它，产生基因转录和随后的药理反应(例如，收缩、松弛、分泌、酶激活等)的化合物。如本文所用，术语“RARα激动剂”是指相比于与另一分子例如不同的RAR结合相比，以更高的亲和力与RARα结合的化合物。在示例性实施方式中，相对于RARγ和/或RARβ，RARα激动剂对RARα具有选择性。RAR选择性激动剂倾向于以接近有效排斥其他RAR的高结合亲和力结合特定的RAR受体靶标。如本文所用，术语“激动剂”包括选择性激动剂。
本文使用的术语“拮抗剂”是指通过在与激动剂相同的位点结合而不激活受体来减弱激动剂作用的化合物。拮抗剂本身不会影响未占用受体的基因转录活性。按照惯例，RARα拮抗剂是抑制RARα激动剂活性的化学试剂。如本文使用的，术语“拮抗剂”包括选择性拮抗剂。
如本文所用，术语“反向激动剂”应理解为是指产生与激动剂相反的作用但作用于相同受体的化合物。反向激动剂本身将减少空位受体的基础基因转录活性。
RARα激动剂与RARα的选择性结合包括结合特性，例如结合亲和力和结合特异性。结合亲和力是指RARα激动剂停留在其RARα结合位点的时间长度，并且可以被视为RARα激动剂与RARα结合的强度。结合特异性是RARα激动剂区分RARα与不包含其结合位点的受体(例如，RARβ或RARγ)的能力。一种测量结合特异性的方法是将RARα的RARα激动剂的缔合率与不包含其结合位点的受体的RARα激动剂的缔合率进行比较，例如，比较相对于RARβ和/或RARγ的ARα的RARα激动剂的缔合速率常数。
在一些实施方式中，相对于RARβ和/或RARγ，RARα激动剂的活性比将为例如至少大5倍、至少大10倍、至少大15倍、至少大20倍、或至少大于100倍。RAR泛激动剂将在RARα、RARβ和RARγ处具有活性，即在RARα、RARβ和RARγ处具有相似的亲和力。
选择性结合RARα的RARα激动剂的结合特异性也可以表征为该RARα激动剂可以通过与其RARα结合相对于与不包含其结合位点的受体(例如，RARβ或RARγ)的结合而发挥的活性比。在一些实施方式中，与RARα选择性结合的RARα激动剂具有通过与RARα结合相对于与不包含其结合位点的受体的结合的活性比，例如至少2∶1、至少3∶1、至少4∶1、至少5：1、至少6：1、至少7：1、至少8：1、至少9：1、至少10：1、至少15：1、至少20：1、至少25：1、至少30：1、至少35：1或至少40：1。在一些实施方式中，与RARα选择性结合的RARα激动剂具有通过与RARα结合相对于与RARβ和/或RARγ的结合的活性比，例如至少2∶1、至少3∶1、至少4∶1、至少5：1、至少6：1、至少7：1、至少8：1、至少9：1、至少10：1、至少15：1、至少20：、1至少25：1、至少30：1、至少35：1或至少40：1。
在一些实施方式中，可用于本文公开的方法的RARα激动剂是不被CYP26代谢的RARα激动剂。CYP26是一种细胞色素P450单加氧酶，它可以将视黄酸代谢为无活性或活性较低的物质，这些物质也可以很容易地从细胞中消除并调节细胞中的视黄酸水平。容易被CYP26代谢的RARα选择性激动剂不在这些实施方式的范围内。
如本文所用，术语“CYP26抗性”是指未被CYP26酶代谢、降解或以其他方式失活并且在骨髓内具有活性的RARα激动剂。
在该实施方式的一个方面，RARα激动剂是具有式(I)的结构的化合物：
Figure BDA0002395209170000081
其中R1为H或C1-6烷基；R2和R3独立地为H或F；R4为卤素。
在式I的一些实施方式中，卤素是F、Cl、Br或I。在式I的一些实施方式中，卤素是F。在一些式I的实施方案中，卤素是Cl。在式I的一些实施方式中，卤素是Br。在式I的一些实施方式中，卤素是I。
在该实施方式的一个方面，RARα激动剂是具有式(II)的结构的化合物：
Figure BDA0002395209170000082
其中R1为H或C1-6烷基。
在该实施方式的另一方面，RARα激动剂是具有式(III)的结构的化合物：
Figure BDA0002395209170000083
在R1为C1-6烷基任一实施方式中，R1可以为C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基或其任意组合。
在另一个实施方式中，所述RARα激动剂是他米巴罗汀(AM80；4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)氨基甲酰基]苯甲酸)。在另一个实施方式中，所述RARα激动剂是AM580(4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸)。在另一个实施方式中，所述RARα激动剂是Re 80(4-[1-羟基-3-氧代-3-(5,6,7,8-四氢-3-羟基-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯基]苯甲酸)。
在美国专利5856490；5965606；和6387950中描述了用作本文公开的化合物的其他RARα激动剂；每一个均通过引用整体并入。这些参考文献还提供了数据，表明该化合物确实是RARα激动剂。可以测试化合物并将其确定为RARα激动剂的测定方法是本领域已知的，并且在许多现有技术出版物和专利中进行了描述。例如，在美国专利5455265中详细描述了一种嵌合受体反式激活测定法，该测定法测试了RARα、RARβ、RARγ和RXRα受体亚型中的激动剂样活性，该专利在此全文引入作为参考。
本说明书的各方面部分地提供了包含RARα激动剂的组合物。RARα激动剂包括本文公开的化合物。
CAR修饰的免疫细胞
肿瘤细胞通常下调主要组织相容性复合体(MHC)的表达，此外，当它们确实表达MHC等位基因时，通常并不知道免疫优势表位。因此，依赖MHC的癌症免疫疗法通常无效。嵌合抗原受体(CAR)修饰的免疫细胞与癌细胞上的靶抗原发生MHC独立反应。CAR允许通过抗原结合结构域与靶细胞结合，其中CAR修饰的细胞通过与靶细胞结合并诱导针对肿瘤目标的修饰细胞的激活和细胞毒性作用以MHC非限制性方式杀死靶细胞。与靶细胞的结合也可以诱导CAR修饰的细胞的增殖。
如本文所用，术语“靶细胞”是指表达可被CAR结合的表面抗原的细胞。抗原也可以称为“靶抗原”。靶抗原是在癌细胞上差异表达的抗原，因此CAR优先于非癌细胞靶向癌细胞。
一旦修饰的免疫细胞与靶抗原结合，CAR的内部刺激结构域就会为免疫细胞充分激活提供必要的信号。在这种完全激活的状态下，免疫细胞可以更有效地增殖并攻击癌细胞。
CAR修饰的细胞可以识别多种类型的抗原，不仅可以识别蛋白质，还可以识别通常在肿瘤细胞表面表达的碳水化合物和糖脂结构。与T细胞受体(TCR)识别不同，该抗原不需要由MHC处理和呈递，因此无论HLA类型如何，所有表达相同肿瘤抗原的患者都可以使用相同的CAR分子。
CAR包含重组多肽构建体，该重组多肽构建体至少包含抗原结合结构域，跨膜结构域和一个或多个细胞内刺激结构域(也称为细胞质信号结构域或细胞内信号结构域)。抗原结合结构域允许修饰的免疫细胞特异性结合靶抗原，跨膜结构域将CAR锚定在免疫细胞的质膜中，而细胞内刺激结构域则在转导的细胞中诱导持久性，运输和效应子功能。
CAR的抗原结合结构域通常源自单克隆抗体，但是也可以使用其他配体(例如调蛋白、细胞因子)和受体(例如NKp30)。抗原结合结构域可包括抗体，或保留抗原结合功能的抗体的片段。例如，CAR抗原结合结构域通常由单链可变片段(scFv)贡献，该单链可变片段由抗体的重链和轻链的可变区形成。
一方面，跨膜结构域包含与T细胞受体复合物相关的zeta(ζ)链的序列，例如人CD3ζ链的胞内结构域。
一种或多种CAR的细胞内刺激结构域可包括CD28、4-1BB(CD137)、CD134(OX-40)、ICOS和CD40L中的一种或多种。
抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内刺激结构域直接或通过间隔序列连接。
CAR序列被掺入表达载体中。多种表达载体是本领域已知的，并且可以使用任何此类载体。在一些实施方式中，载体将是逆转录病毒或慢病毒载体。在其他实施方式中，载体将衍生自腺相关病毒。
免疫细胞用CAR转化，然后CAR在细胞表面表达。通常，免疫细胞稳定表达CAR，尽管在一些实施方式中，免疫细胞可以瞬时表达CAR。免疫细胞因此被编码CAR的核酸例如mRNA、cDNA、DNA转染。本公开的免疫细胞包括哺乳动物细胞(例如人细胞)，并且可以是自体细胞、同系细胞、同种异体细胞，甚至在某些情况下是异种细胞。这些细胞被改造成表达CAR，因此像CAR本身没有发现天然的。示例性免疫细胞包括T淋巴细胞(T细胞)、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞和巨噬细胞(包括单核细胞和树突状细胞)。
然后培养CAR修饰的免疫细胞以扩大种群，以单剂量或多剂量获得合适数量的细胞。
在某些实施方式中，在培养期间将一种或多种类视黄醇和/或rexinoid活性剂(例如，RARα拮抗剂、RARγ激动剂、RXR拮抗剂或其组合)添加至扩增培养基中，并直接对CAR修饰的细胞产生作用。例如，在培养CAR-MIC时，将选择添加至扩增培养基中的一种或多种类视黄醇和/或rexinoid活性剂，用于例如抑制Treg细胞发育的能力和/或促进Th 17细胞发育的能力。在一些实施方式中，一种或多种类视黄醇和/或rexinoid活性剂包括在CAR修饰的免疫细胞的扩增培养基中，并直接施用于受试者。类视黄醇和/或rexinoid活性剂的这种用途在美国专利申请号16/034064和16/034123中进行了描述，它们教导了与该用途有关的所有内容通过引用并入本文。
在某些实施方式中，在培养期间将一种或多种RARα激动剂添加至扩增培养基中，并直接对CAR修饰的细胞产生作用。在一些实施方式中，一种或多种RARα激动剂包括在CAR修饰的免疫细胞的扩增培养基中，并直接施用于受试者。
免疫检查点靶向的癌症疗法
免疫检查点疗法的目标是调节T细胞分化和激活的途径，以通过这些检查点促进T细胞发育程序，从而可以实现抗肿瘤(或其他治疗)活性。引起免疫检查点治疗的药剂通常被称为免疫检查点抑制剂，应该理解的是，对T细胞发育的检查被抑制了。因此，尽管许多免疫检查点抑制剂也抑制受体-配体对(例如抗PD-1、抗PD-L1和CTLA-4)的相互作用，但其他作为靶标的抑制剂(例如抗OX40和抗ICOS)，释放或以其他方式抑制T细胞发育检查，最终促进效应子功能和/或抑制调节功能。
本文公开了免疫检查点抑制剂分子与CAR修饰的免疫细胞和RARα激动剂结合使用。抑制免疫检查点蛋白的分子包括对PD-1、PD-1配体、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、B7-H3和B7-H4中的一种或多种具有特异性的抗体。
程序性死亡-1(PD-1)是T细胞上的检查点蛋白，通常充当“关闭开关”的一种，有助于防止T细胞攻击机体内的其他细胞。它通过与程序性死亡配体-1(PD-L1)结合来实现此目的，PD-L1是一些正常细胞和癌细胞上的蛋白质。当PD-1与PD-L1结合时，T细胞将不会攻击靶细胞。一些癌细胞具有大量的PD-L1，这有助于它们逃避免疫攻击。靶向PD-1或PD-L1的单克隆抗体(mAbs)可以增强针对癌细胞的免疫反应，并且在治疗某些癌症方面显示出巨大的希望。靶向PD-1/PD-L1的单克隆抗体的例子包括：抗PD-1 mAbs纳武单抗(nivolumab)(
Figure BDA0002395209170000111
百时美施贵宝)和派姆单抗(pembrolizumab)(
Figure BDA0002395209170000113
默沙东公司)、BMS-936559(百时美施贵宝)、pidilizumab(Medivation)：和抗PD-L1 mAbs durvalumab(MEDI4736，IMFINZITM，Medimmune)、阿特珠单抗(atezolizumab)(MPDL3280A；
Figure BDA0002395209170000112
Hoffman-La Roche)和avelumab(
Figure BDA0002395209170000114
EMD Serono)。这些抗体在各种方面已证明可用于治疗各种癌症，包括恶性黑色素瘤(MM)、肾细胞癌(RCC)、默克尔细胞癌、尿路上皮癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。PD-1/PD-I1相互作用的非抗体抑制剂也正在开发；例如，基于Stefin A的小型工程蛋白(称为
Figure BDA0002395209170000115
分子)。除PD-L1外，PD-1还可以与PD-L2结合。除PD-1外，PD-L1还可以与B7-1(CD80)结合。
CTLA-4是在CD4和CD8 T细胞表面以及CD25+FOXP3+T调节(Treg)细胞上表达的免疫检查点分子。CTLA-4产生阻断T细胞反应的抑制信号，并使肿瘤生长。抗CTLA-4mAb，例如伊匹单抗(ipilimumab)(
Figure BDA0002395209170000116
百时美施贵宝)在动物模型中引起肿瘤缩小。伊匹单抗可改善MM患者的总体生存率，并被批准用于MM治疗。在肾细胞癌(RCC)和非小细胞肺癌(NSCLC)中也观察到了反应。其他示例性的抗CTLA-4抗体包括tremelimumab(Medimmune)。
TIM-3(T细胞免疫球蛋白和含有粘蛋白结构域-3)是在产生IFN-γ的CD4+T辅助细胞1(Th1)和CD8+T细胞毒性1(Tc1)T细胞上选择性表达的分子。TIM-3是一种免疫检查点受体，其功能特别是限制Th1和Tc1 T细胞反应的持续时间和强度。在美国专利申请公开20160075783中公开了针对TIM-3的示例性抗体，其包含的关于抗TIM-3抗体的全部内容通过引用并入本文。
LAG-3(淋巴细胞激活基因3；CD223)以与CTLA-4和PD-1类似的方式负调节T细胞的细胞增殖、激活和稳态，并在Treg抑制功能中发挥作用。针对LAG-3的示例性抗体包括GSK2831781(葛兰素史克)、BMS-986016(百时美施贵宝)和美国专利申请公开2011/0150892中公开的抗体，该专利所包含的有关抗LAG-3抗体的全部内容通过引用并入本文。
共刺激蛋白的B7家族在抗原呈递细胞表面表达并与T细胞上的配体相互作用。B7-H3(CD276)是该家族的分子之一。针对B7-H3的抗体埃罗妥珠单抗(Enoblituzumab)(EMPLICITITM，百时美施贵宝)批准了用于治疗多发性骨髓瘤。该家族中的另一个分子是B7-H4(含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1)，目前正在开发针对其的抗体。
其他免疫检查点抑制剂靶标、B细胞和T细胞减毒剂(BTLA)、诱导型T细胞共刺激物(ICOS)、OX40(肿瘤坏死因子受体超家族，成员4)等在公开的方法中可能有用。几种抗-OX40对抗mAbs正在早期癌症临床试验中，包括MEDI0562和MEDI6469(Medimmune)、MOXR0916(Genetech)和PF-04518600(Pfizer)；以及抗ICOS激动剂抗体、JTX-2011(JounceTherapeutics)。
本文公开了治疗癌症的方法，该方法包括施用CAR修饰的免疫细胞、一种或多种RARα激动剂和一种或多种靶向免疫检查点的免疫治疗剂，所述免疫治疗剂包括CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂、TIM-3抑制剂、LAG-3抑制剂、PD-1配体(例如PD-L1)、PD-1配体的抑制剂、OX40激动剂、ICOS激动剂、B7-H3蛋白、B7-H3蛋白的抑制剂、B7-H4蛋白和B7-H4的抑制剂蛋白。在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂是抗体。
靶向免疫治疗抗体的免疫检查点可以是完整抗体或抗体片段。术语“抗体的片段”、“抗体片段”和“抗体的功能片段”在本文可互换使用，是指保留特异性结合抗原的能力的一个或多个抗体片段。抗体片段理想地包含例如一个或多个互补决定区(CDR)、可变区(或其部分)、恒定区(或其部分)或其组合。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；和F(ab')2片段，其为包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段二价片段；Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；单链Fv，其中VL和VH结构域通过肽接头序列连接；Fab'片段，其是通过使用温和的还原条件打破F(ab')2片段的二硫键而产生的；二硫键稳定的Fv片段(dsFv)；域抗体(dAb)，是特异性结合抗原的抗体单可变区域(VH或VL)多肽。还应该认识到，这些形式的抗原结合抗体片段中的任何一种都可以提供CAR的抗原结合结构域。
在替代的实施方式中，将免疫检查点抑制剂抗体替换为类似地结合至免疫检查点靶分子的另一种蛋白质。在一些情况下，这些非抗体分子包含免疫检查点靶分子的配体或结合伴侣的细胞外部分，即，至少介导与免疫检查点靶分子结合所需的细胞外部分。在一些实施方式中，配体的该细胞外结合部分与融合蛋白中的另外的多肽连接。在一些实施方式中，另外的多肽包含抗体的Fc或恒定区。
治疗方法
本文提供了通过施用一种或多种RARα激动剂和CAR修饰的免疫细胞来治疗哺乳动物中的癌症的方法。在一些实施方式中，除了CAR修饰的免疫细胞和一种或多种RARα激动剂之外，还施用免疫检查点抑制剂。还提供了减少癌症患者的肿瘤负担和/或增加无疾病或无进展生存的方法。其他实施方式涉及用于治疗癌症和用于制备用于治疗癌症的药物的包含此类试剂的组合物。应当理解，所使用的多种药剂可以以单独的组合物或药物的形式提供，所述单独的组合物或药物可以通过单独的施用途径和/或在不同的时间施用。但是，要协调使用这种多种组合物或药物，以便向其给药的患者从多种药物的联合相互作用中受益。对于本文公开的治疗癌症的每种方法，都有相应的癌症免疫疗法方法。对于每种治疗癌症或癌症免疫疗法的方法，都有相应的增强癌症治疗/免疫疗法的方法。
在各种实施方式中，向接受或计划接受CAR修饰的免疫细胞或免疫检查点抑制剂的受试者施用一种或多种RARα激动剂。在这些实施方式中，在受试者中存在CAR修饰的免疫细胞或免疫检查点抑制剂之前和/或间隔期间施用这些分化性RARα激动剂。优选的是，RARα激动剂是CYP26抗性的。
在一些实施方式中，该方法包括施用一种或多种RARα激动剂和CAR修饰的免疫细胞。在一些实施方式中，该方法包括施用一种或多种RARα激动剂和一种或多种免疫检查点抑制剂。在其他实施方式中，该方法包括施用一种或多种RARα激动剂、CAR修饰的免疫细胞，和一种或多种RARα激动剂和一种或多种免疫检查点抑制剂。在某些实施方式中，所述RARα激动剂是IRX5183(AGN 195183)。关于在本文所述的各种用途或治疗实施方式的方法中使用多种RARα激动剂，可以将任何公开的通式类、其子类以及单个种类与任何其他通式类组合、其子类和单个物种的组合，每个这种组合定义一个单独的实施方式。
本文公开的化合物、药物组合物和方法对于癌症的治疗特别有用。如本文所用，术语“癌症”是指细胞失调，其特征在于细胞增殖不受控制或失调，细胞分化降低，侵袭周围组织的不适当能力和/或在异位部位建立新的生长的能力。术语“癌症”包括但不限于实体瘤和血液肿瘤。术语“癌症”涵盖皮肤、组织、器官、骨骼、软骨、血液和血管的疾病。术语“癌症”进一步涵盖原发性和转移性癌症。术语“癌细胞”包括癌症干细胞。
所公开的方法可以用于治疗本领域已知的任何类型的癌症。在某些实施方式中，癌症是血液系统恶性肿瘤。血液系统恶性肿瘤的非限制性实例包括急性髓细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病(CML)，包括加速的CML和CML急变期、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤，包括滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、骨髓增生异常综合症，包括难治性贫血、带环状铁粒母细胞的难治性贫血、过度成胚的难治性贫血(RAEB)和转化中的RAEB以及骨髓增生异常综合征。
在一些实施方式中，癌症是实体瘤。在其他实施方式中，癌症是可转移至骨的实体瘤。可以通过所公开的方法治疗的实体瘤的非限制性实例包括胰腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌(例如，雄激素依赖性和非雄激素依赖性前列腺癌)、肾癌、肝细胞癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、支气管肺泡癌(BAC)和肺腺癌)、卵巢癌(例如进行性上皮或原发性腹膜癌)、宫颈癌癌症、胃癌、食道癌、头颈癌(例如头颈部鳞状细胞癌)、黑素瘤、神经内分泌癌、脑肿瘤(例如神经胶质瘤、间变性少突胶质细胞瘤、成年成胶质母细胞瘤和成年间变性星形细胞瘤)、骨癌和软组织肉瘤。
在选择的实施方式中，治疗特定类型的癌症。在其他选择的实施方式中，将特定类型的癌症排除在治疗之外。
另外，一种或多种RARα激动剂可以通过允许以相同的功效施用较低剂量的CAR修饰的免疫细胞或可以以相同的安全度施用较高剂量的CAR修饰的免疫细胞来降低与CAR修饰的免疫细胞相关的毒性。还预期了较低的相同疗效剂量和较高的相同安全剂量之间的中间剂量。因此，将RARα激动剂与CAR修饰的免疫细胞癌免疫疗法配合使用可导致减少或避免与CAR修饰的免疫细胞活性相关的毒性和不良事件的发生频率或严重性，或者至少不存在与临床相关的增加。改善或相同的安全性是指分别减少或至少不增加与使用CAR修饰的免疫细胞有关的一种或多种毒性或不良事件的频率、严重性或两者。应当理解，在治疗威胁生命的疾病如癌症时，具有潜在毒性的治疗被认为是足够安全的。
癌症干细胞可以通过各种机制枚举，并且通过施用由此测量的对CYP26抗性的RARα激动剂可以减少其数量。在本文公开的实施方式中，由于施用RARα激动剂，骨髓中的癌症干细胞减少了大于约0.5log，大于约1log，大于约1.5log，大于约2.0log，大于约2.5log，大于约3.0log，大于约3.5log，大于约4.0log，大于约4.5log，或大于约5.0log。
术语“治疗”或“治疗”广泛地包括任何种类的治疗活动，包括对人或其他动物疾病的诊断、缓解或预防，或其他会影响人或其他动物的结构或身体功能的任何活性。治疗活动包括特别是根据本文公开的各种治疗方法，无论是由医疗保健专业人员、患者本人还是任何其他人向患者施用本文所述的药物、剂型和药物组合物。治疗活动包括医疗保健专业人员(例如医师、医师的助手、护士从业人员等)的命令、指示和建议，然后由包括其他医疗保健专业人员或患者本人在内的任何其他人执行操作。在一些实施方式中，治疗活动还可包括鼓励、诱导或要求选择特定药物或其组合来治疗疾病-并且该药物已实际使用-通过批准该药物的保险范围、拒绝该药物替代药物的范围，包括药物配方中的药物或从药物配方中排除替代药物，或提供使用该药物的经济诱因，例如保险公司或药房福利管理公司可能会这样做。在一些实施方式中，治疗活动还可以包括治疗活动还可以包括鼓励、诱导,或要求特定药剂选择治疗的条件和实际使用的药剂，其是由医院,诊所,健康维护组织,医疗实践或医师组等建立的政策或实践标准。
CAR修饰的免疫细胞的典型剂量可以是例如每剂量1×106至3×1010个细胞。在一些实施方式中，以至少1x106细胞/剂量、至少3x106细胞/剂量、至少1x107细胞/剂量、至少3x107细胞/剂量、至少1x108细胞/剂量、至少3x108细胞/剂量、至少1x109细胞/剂量、至少3x109细胞/剂量、至少1x1010个细胞/剂量、至少3x1010个细胞/剂量，或由上述任意两个值定义的范围的剂量施用CAR修饰的免疫细胞。在一些实施方式中，CAR修饰的免疫细胞的典型剂量可以在例如每千克患者体重1×105至1×108个细胞的范围内。在一些实施方式中，以至少1×105细胞/kg、至少3×105细胞/kg、至少6×105细胞/kg、至少1×106细胞/kg的剂量、至少3x106个细胞/kg，至少6x106个细胞/kg、至少1x107个细胞/kg、至少3x107个细胞/kg或由上述任意两个值定义的范围的剂量施用CAR修饰的免疫细胞。
可以通过定期评估接受治疗的患者来监测治疗或预防功效。对于几天或更长的重复给药，取决于疾病状况，可以重复治疗，直到发生所需的疾病或疾病症状抑制为止。然而，其他剂量方案可能是有用的并且在本公开的范围内。可以通过单次大剂量施用，多次大剂量施用或通过连续输注CAR修饰的免疫细胞来递送所需剂量。在各种实施方式中，连续输注可以持续半小时、一个小时、几个小时、一天或几天。治疗可以包括单次或多次输注。
在一些实施方式中，将CAR修饰的免疫细胞与其他药剂一起进行其他预处理或同时给药。在一些实施方式中，将要接受CAR修饰的免疫细胞的受试者用非清髓性淋巴细胞消耗疗法进行预处理，例如但不限于用环磷酰胺和/或氟达拉滨治疗。在一些实施方式中，将CAR修饰的免疫细胞与白介素2一起施用。
CAR修饰的免疫细胞可以向受试者一次或多次施用。可以每周、每两周、每月、每两个月或根据癌症进展的证据来施用细胞。
如本文所用，“施用”是指向受试者提供药剂或组合物，包括但不限于由医学专业人员施用和自我施用。给药包括但不限于口服、鼻腔给药、肺部给药、皮下给药、静脉内给药、肌肉内给药、肿瘤内给药、腔内给药、玻璃体内给药、皮肤给药和透皮给药等。
根据癌症的类型和要治疗的患者以及给药途径，可以以不同的治疗有效剂量向有需要的患者施用所公开的RARα选择性激动剂。
然而，在本方法的上下文中，向哺乳动物，特别是人施用的剂量应足以在合理的时间内在哺乳动物中产生治疗反应。本领域技术人员将认识到，确切剂量和组成以及最合适的递送方案的选择还将受到制剂的药理特性、所治疗病症的性质和严重程度以及接受者的身体状况和心理敏锐度，以及特定化合物的功效、年龄、状况、体重、性别和待治疗患者的反应以及疾病的阶段/严重程度的影响。
作为非限制性实例，当向哺乳动物施用本文公开的RARα激动剂时，治疗有效量通常可以在约1mg/m2/天至约100mg/m2/天的范围内。在一些实施方式中，本文公开的RARα激动剂的有效量可以为约5mg/m2/天至约90mg/m2/天，约10mg/m2/天至约80mg/m2/天，约15mg/m2/天至约70mg/m2/天，约20mg/m2/天至约65mg/m2/天，约25mg/m2/天至约60mg/m2/天，或约30mg/m2/天至约55mg/m2/天。在一些实施方式中，本文公开的化合物或组合物的治疗有效量可以是至少10mg/m2/天，至少15mg/m2/天，至少20mg/m2/天，至少25mg/m2/天，至少30mg/m2/天，至少35mg/m2/天，至少40mg/m2/天，至少45mg/m2/天，至少50mg/m2/天，至少55mg/m2/天，至少60mg/m2/天，至少65mg/m2/天，或至少75mg/m2/天。在一些实施方式中，本文公开的RARα激动剂的治疗有效量可以是至多15mg/m2/天，至多20mg/m2/天，至多25mg/m2/天，至多30mg/m2/天，至多35mg/m2/天，至多40mg/m2/天，至多45mg/m2/天，至多50mg/m2/天，至多55mg/m2/天，至多60mg/m2/天，至多65mg/m2/天，至多70mg/m2/天，至多mg/m2/天，至多90mg/m2/天，或至多100mg/m2/天。
通常，人体的平均表面积对于成年男性为1.9m2，对于成年女性为1.6m2，对于12-13岁的孩子为1.33m2。这些值可用于为前几段中的值计算每日剂量的剂量范围。RARα激动剂的每日总剂量可以单剂量给药，也可以以间隔8至16个小时或10至14个小时的24小时周期施用两次的剂量施用。RARα激动剂与CAR修饰的免疫细胞协同给药，如上所述，可以通过定期评估治疗的患者来监测治疗或预防功效。对于几天或更长的重复给药，取决于疾病状况，可以重复治疗直到发生所需的疾病或疾病症状抑制为止。然而，其他剂量方案可能是有用的并且在本公开的范围内。可通过单次输注组合物、多次输注组合物或连续输注组合物来递送所需剂量。
给药可以是连续的或间歇的。剂量还可以通过给药的时间和频率来确定。因此，本文公开的RARα激动剂可以每天、每周、每两周或每月一次给予一段时间，随后是任选的药物休假(无药期)，并且可以重复该药物施用/药物休假周期有必要的。在某些实施方式中，RARα激动剂的总日剂量可以以单剂量或以以间隔8至16小时或10至14小时的24小时周期施用两次的剂量施用。
RARα激动剂与CAR修饰的免疫细胞协同给药，如上所述，可以通过定期评估治疗的患者来监测治疗或预防功效。对于几天或更长的重复给药，取决于疾病状况，可以重复治疗直到发生所需的疾病或疾病症状抑制为止。然而，其他剂量方案可能是有用的并且在本公开的范围内。可通过单次输注组合物、多次输注组合物或连续输注组合物来递送所需剂量。
可以使用标准的给药技术将RARα激动剂给药于哺乳动物，包括肠胃外、口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌内、鼻内、口腔、舌下或栓剂给药。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给药。通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送向哺乳动物施用CAR修饰的免疫细胞。RARα激动剂优选适于口服给药，例如作为丸剂、片剂或胶囊剂。
在一个实施方式中，在施用CAR修饰的免疫细胞之前，每天施用RARα激动剂持续一段时间，即至少2天，至少3天，至少4天，至少5天，至少6天，至少1周，至少2周，至少3周或至少一个月。在一些实施方式中，在获得患者外周血淋巴细胞以产生自体CAR修饰的免疫细胞的1-7天内开始施用RARα激动剂。CAR修饰的免疫细胞通常会在体内持续较长时间，比RARα激动剂更长。预期RARα激动剂疗法将每天进行一段时间，并且可能比CAR修饰的免疫细胞更长。在一些实施方式中，施用RARα的时间比CAR修饰的免疫细胞的时间长，例如总共30天，90天，1年，2年，5年或更长时间。或者，RARα激动剂的施用可能不会在CAR修饰的免疫细胞持续在体内的整个过程中持续进行，并且可能会在在施用CAR修饰的免疫细胞长达一周之前，一天之前或之后，之后1到14天的任何其他时间。该治疗可以以多个周期进行，在这种情况下，如上所述，可以在预期的CAR修饰的免疫细胞的施用之前恢复RARα激动剂的施用。
此外，CAR修饰的免疫细胞以单次推注方式施用，或者每天、每周或每月一次施用0.5-20×106个细胞。
本文公开的CAR修饰的免疫细胞和RARα激动剂可以与其他药物联合给药，例如至少一种其他抗癌/抗肿瘤剂，包括例如本领域已知的任何化学治疗剂或靶向治疗剂、电离辐射、小分子抗癌药、癌症疫苗、生物疗法(例如其他单克隆抗体、杀癌病毒、基因疗法和过继性T细胞转移)和/或手术。在其他实施方式中，CAR-修饰的免疫细胞和RARα激动剂是施用的唯一治疗剂或给出的唯一治疗方法；或提供的唯一治疗方法或试剂，其主要用途是促进抗癌免疫反应。
在一些示例性实施方式中，治疗是通过施用RARα激动剂开始的。在一些实施方式中，所述RARa激动剂是CYP26抗性的。在施用RARα激动剂的同时或之后，同时或顺序施用CAR-MIC和任选的抗肿瘤剂。在这些实施方式的一些方面，如果使用抗肿瘤剂，则在施用CAR-MIC之前施用抗肿瘤剂。抗肿瘤药的给药间隔为1天至1个月，例如2天、5天、1、2、3或4周。在一些实施方式中，在施用CAR-MIC之前1天至1周停止施用抗肿瘤药。在一些实施方式中，CAR-MIC是CAR-T细胞。在一些实施方式中，抗肿瘤药是硼替佐米。在这些实施方式的不同方面中，癌症可以是骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤，或白血病，例如AML、CML或急性早幼粒细胞白血病(APL)。在这些实施方式的另一方面，RARα激动剂可以是式(III)(IRX5183)。
癌症治疗的有效性通常用“反应”来衡量。监视反应的技术可以类似于用于诊断癌症的测试，例如但不限于：
·可以通过体检从外部感觉并测量到涉及一些淋巴结的肿块或肿瘤。
·一些内部癌症肿瘤会在X射线或CT扫描中显示出来，并且可以用尺子进行测量。
·可以进行血液检查，包括那些测量器官功能的检查。
·可以对某些癌症进行肿瘤标志物测试。
无论使用哪种测试，无论是血液测试、细胞计数测试还是肿瘤标志物测试，都以特定的时间间隔重复进行，以便可以将结果与相同类型的早期测试进行比较。对癌症治疗的反应定义了以下几种方式：
对癌症治疗的反应定义为以下几种方式：
·完全反应-所有癌症或肿瘤消失；没有疾病的证据。肿瘤标志物的表达水平(如果适用)可能在正常范围内。
·部分反应-癌症缩小了一定百分比，但疾病仍然存在。肿瘤标志物的水平(如果适用)可能下降(或增加，基于肿瘤标志物，以指示肿瘤负担减轻)，但仍存在疾病证据。
·疾病稳定-癌症既没有增长也没有缩小；疾病的数量没有改变。肿瘤标志物(如果适用)没有明显变化。
·疾病进展-癌症已发展；现在的疾病比治疗前要多。肿瘤标志物测试(如果适用)表明肿瘤标志物已升高。
癌症治疗功效的其他衡量指标包括总体生存时间间隔(即从任何原因到死亡的时间，从诊断或评估开始的治疗开始测量)、无癌症生存时间(即无法检测到完全反应的癌症的时间长度)和无进展生存期(即无法检测到疾病稳定后或恢复肿瘤生长的部分反应后的时间长度)。
有两种标准方法可以评估关于肿瘤大小(肿瘤负担)的实体癌治疗反应，即WHO和RECIST标准。这些方法测量实体瘤，以将当前肿瘤与过去的测量结果进行比较，或将变化与未来的测量结果进行比较，并改变治疗方案。在WHO方法中，实体瘤的长轴和短轴是用这两个测量值的乘积来计算的；如果存在多个实体瘤，则计算所有乘积的总和。在RECIST方法中，仅测量长轴。如果存在多个实体瘤，则计算所有长轴测量值的总和。但是，对于淋巴结，测量的是短轴而不是长轴。
在当前方法的一些实施方式中，治疗的患者的肿瘤负担降低了约5％，约10％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约90％，约95％，约100％或这些值限制的任何范围。
在其他实施方式中，治疗的受试者的1年存活率提高了约5％，约10％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约90％，约95％，约100％或这些值限制的任何范围。
在其他实施方式中，治疗的受试者的5年存活率提高了约5％，约10％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约90％，约95％，约100％或这些值限制的任何范围。
在其他实施方式中，治疗的受试者的10年存活率提高了约5％，约10％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约90％，约95％，约100％或这些值限制的任何范围。
在其他实施方式中，受试者持续缓解至少6个月，至少7个月，至少8个月，至少9个月，至少10个月，至少11个月，至少12个月，至少14个月，至少16个月，至少18个月，至少20个月，至少22个月，至少24个月，至少27个月，至少30个月，至少33个月，至少36个月，至少42个月，至少48个月，至少54个月或至少60个月或更长时间。
在其他实施方式中，该方法可以帮助治疗或减轻与癌症有关的状况、症状或病症。在一些实施方式中，这些状况或症状可包括但不限于贫血、乏力、恶病质、库欣综合征、疲劳、痛风、牙龈疾病、血尿、高钙血症、甲状腺功能减退、内出血、脱发、间皮瘤、恶心、夜间出汗、中性粒细胞减少、副肿瘤综合征、胸膜炎、风湿性多肌痛、横纹肌溶解症、压力、淋巴结肿大、血小板减少症、维生素D缺乏症或体重减轻。在其他实施方式中，相对于仅用CAR修饰的免疫细胞进行治疗，施用RARα激动剂和CAR修饰的免疫细胞均延长了被治疗个体的存活期。
具体实施方式
下面的实施方式的列表说明了在本文中阐明的关于本发明的幅度、组合和子组合、类别等的各种实施方式，但是并不意图是在本文中得到支持的所有实施方式的详尽列举。
实施方式1.一种癌症免疫疗法的方法，其包括向有此需要的受试者施用嵌合抗原受体-修饰的免疫细胞(CAR-MIC)和至少一种分化性RAR活性剂。
实施方式2.一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者(CAR-MIC)施用至少一种分化性性RAR活性剂。
实施方式3.一种增强CAR-MIC癌症免疫疗法的方法，包括对正在接受、已经接受或计划接受CAR-MIC的癌症患者施用至少一种分化性RAR活性剂。
实施方式4.一种癌症免疫疗法的方法，包括向有需要的受试者施用分化性的RAR活性剂和CAR-MIC，其中在向该受试者施用之前，将CAR-MIC在包含至少一种免疫调节性RAR/RXR活性剂的培养基中进行培养。
实施方式5.一种延长癌症患者无病生存时间的方法，包括施用CAR-MIC和至少一种分化性RAR活性剂。
实施方式6.一种降低CAR-MIC疗法毒性的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用至少一种分化性RAR活性剂与CAR-MIC的组合，使得这种组合的结果是，与单独使用CAR-MIC相比，施用CAR-MIC的剂量更低。
实施方式7.实施方式6的方法，其中与单独施用CAR-MIC相比，功效相同或增加。
实施方式8.一种提高CAR-MIC疗法功效的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用至少一种分化性RAR活性剂与CAR-MIC组合，使得这种组合的结果是，与单独使用CAR-MIC相比，施用CAR-MIC的剂量更低。
实施方式9.实施方式8的方法，其中与单独施用CAR-MIC相比，毒性相同或降低。
实施方式10.实施方式1-9中任一项的方法，其进一步包括给予免疫检查点抑制剂。
实施方式11.实施方式10的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4、PD-1、TIM-3、LAG-3、PD-L1配体、B7-H3、B7-H4、BTLA中的至少一种的抑制剂或是ICOS或OX40激动剂。
实施方式12.实施方式10或11的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是抗体。
实施方式13.实施方式1-12中任一项的方法，其中分化性RAR活性剂是RARα激动剂。
实施方式14.实施方式12的方法，其中所述RARα激动剂是CYP26抗性的。
实施方式15.实施方式12或13的方法，其中所述RARα激动剂是RARα选择性激动剂。
实施方式16.实施方式13-15中任一项的方法，其中所述RARα激动剂是通式(V)的化合物：
Figure BDA0002395209170000201
其中R1为H或C1-6烷基，R2和R3独立为H或F，且R4为卤素。
实施方式17.实施方式16的方法，其中R4为F、CL、BR或I。
实施方式18.实施方式13-15中任一项的方法，其中所述RARα激动剂是通式(VI)的化合物：
Figure BDA0002395209170000202
其中R1为H或C1-6烷基。
实施方式19.实施方式13-15中任一项的方法，其中所述RARα激动剂是通式(III)的化合物：
Figure BDA0002395209170000203
实施方式20.实施方式13-14中任一项的方法，其中所述RARα激动剂是他米巴罗汀(AM80；4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)氨基甲酰基]苯甲酸)。
实施方式21.实施方式13-14中任一项的方法，其中所述RARα激动剂是AM580
(4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)甲酰胺基]苯甲酸)。
实施方式22.实施方式13-14中任一项的方法，其中所述RARα激动剂是Re 80(4-[1-羟基-3-氧代-3-(5,6,7,8-四氢-3-羟基-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯基]苯甲酸)。
实施方式23.实施方式1-22中任一项的方法，其中所述分化性RAR活性剂或RARα激动剂每天施用。
实施方式24.实施方式1-22中任一项的方法，其中所述分化性RAR活性剂或RARα激动剂每天施用两次。
实施方式25.实施方式23或24的方法，其中RAR活性剂或RARα激动剂的日剂量在约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75mg/m2/天，至约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg/m2/天的范围，选择的范围的端点为使范围的下限小于或等于范围的上限。
实施方式26.实施方式1-25中任一项的方法，其进一步包括施用至少一种癌症化学治疗剂或靶向治疗剂。
实施方式27.实施方式26的方法，其中所述至少一种癌症化学治疗剂或靶向治疗剂是硼替佐米。
实施方式28.实施方式1-26中任一项的方法，其中所述受试者或癌症患者患有血液系统恶性肿瘤。
实施方式29.实施方式28的方法，其中血液系统恶性肿瘤选自急性髓细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病(CML)，包括加速的CML和CML急变期、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤包括滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、骨髓增生异常综合症包括难治性贫血、带环状铁粒母细胞的难治性贫血、过度成胚的难治性贫血(RAEB)和转化中的RAEB以及骨髓增生异常综合征。
实施方式30.实施方式28或29的方法，其中血液系统恶性肿瘤是白血病。
实施方式32.实施方式28或29的方法，其中血液系统恶性肿瘤是多发性骨髓瘤。
实施方式33.实施方式1-26中任一项的方法，其中所述受试者或癌症患者患有实体瘤。
实施方式34.实施方式33的方法，其中胰腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌(例如，雄激素依赖性和非雄激素依赖性前列腺癌)、肾癌、肝细胞癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、支气管肺泡癌(BAC)和肺腺癌)、卵巢癌(例如进行性上皮或原发性腹膜癌)、宫颈癌癌症、胃癌、食道癌、头颈癌(例如头颈部鳞状细胞癌)、黑素瘤、神经内分泌癌、脑肿瘤(例如神经胶质瘤、间变性少突胶质细胞瘤、成年成胶质母细胞瘤和成年间变性星形细胞瘤)、骨癌和软组织肉瘤。
实施方式35.实施方式1-34中任一项的方法，其中在施用CAR-MIC之前施用所述分化性RAR活性剂或RARα激动剂至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周或至少1个月。
实施方式36.实施方式35的方法，其中在施用CAR-MIC之前2至10天中断施用分化性RAR活性剂或RARα激动剂。
实施方式37.实施方式35的方法，其中在施用CAR-MIC后的2天之前的2天的间隔中的某个时间点，中断施用分化性RAR活性剂或RARα激动剂。
实施方式38.实施方式35的方法，其中在施用CAR-MIC后大于2天的间隔持续施用分化性RAR活性剂或RARα激动剂。
实施方式39.实施方式38的方法，其中在施用CAR-MIC后14天中断施用分化性RAR活性剂或RARα激动剂。
实施方式40.实施方式35-39中任一项的方法，其中在计划开始施用CAR-MIC之前的4周开始施用所述分化性RAR活性剂或RARα激动剂一段时间。
实施方式41.一种构成多个治疗周期的治疗方法，其中实施方式35-40中的任一个构成一个周期。
实施方式42.实施方式35-41中任一项的方法，其中已经中断了施用分化性RAR活性剂或RARα激动剂，其中在计划进一步施用CAR-MIC之前恢复施用分化性RAR活性剂或RARα激动剂。
实施方式43.实施方式42的方法，其中在施用CAR-M IC之前，施用分化性RAR活性剂或RARα激动剂至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周或至少一个月。
实施方式44.实施方式41-43中任一项的方法，其中在第一次施用CAR-MIC后，治疗周期持续至少6个月。
实施方式45.实施方式41-43中任一项的方法，其中治疗周期持续直至获得持久的完全应答。
实施方式46.实施方式41-43中任一项的方法，其中只要有持续的肿瘤消退，治疗周期就继续。
实施方式47.实施方式41-43中任一项的方法，其中只要存在稳定的疾病或癌症不进展，治疗周期就继续。
实施方式48.实施方式45或47的方法，其中在达到完全应答或稳定疾病后中止治疗，并且在疾病进展时恢复治疗周期。
实施方式49.实施方式1-48中任一项的方法，其中所述CAR-MIC通过静脉内注射或输注施用。
实施方式50.实施方式1-48中任一项的方法，其中所述CAR-MIC通过肿瘤内注射施用。
实施方式51.实施方式1-50中任一项的方法，其中施用1×106至3×1010个细胞。
实施方式52.实施方式1-51的方法，其中每千克患者体重施用1×105至1×108个细胞。
实施方式53.实施方案1-52中任一项的方法，其中所述CAR-MIC是CAR-T细胞。
实施方式54.实施方式1-52中任一项的方法，其中所述CAR-MIC是CAR-NKT细胞。
实施方式55.实施方式1-52中任一项的方法，其中所述CAR-MIC是CAR巨噬细胞。
实施方式56.分化性RAR活性剂用于降低CAR-MIC治疗毒性。
实施方式57.分化性的RAR活性剂用于增强CAR-MIC在癌症治疗中的免疫治疗作用。
实施方式58.CAR-MIC和分化性RAR活性剂用于治疗癌症的应用。
实施方式59.CAR-MIC和分化性RAR活性剂用于癌症免疫治疗的应用。
实施方式60.根据实施方式56或57的分化性RAR活性剂的应用，或根据实施方式58或59的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，用于正在接受、已经接受或计划接受CAR-MIC的癌症患者。
实施方式61.分化性RAR活性剂在制备用于增强CAR-MIC在癌症治疗中的免疫治疗作用的药物中的用途。
实施方式62.CAR-MIC和分化性RAR活性剂在制备用于癌症免疫疗法的药物中的用途。
实施方式63.CAR-MIC和分化性RAR活性剂在制备用于延长癌症患者的无病生存期的药物中的用途。
实施方式64.分化性RAR活性剂在制备用于降低CAR-MIC治疗毒性的药物中的用途。
实施方式65.CAR-MIC和RAR分化性活性剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
实施方式66.实施方式61-65中任一项的用途，其中所述分化性RAR活性剂药物用于正在接受、已经接受或计划接受CAR-MIC的癌症患者中。
显然，实施方式56-66中的每一个都可以以与实施方式1-6被实施方式7-55修改的类似的方式修改。
实施例
提供以下非限制性实施例仅出于说明性目的，以便于更全面地理解现在考虑的代表性实施方式。这些实施例不应被解释为限制本说明书中描述的任何实施方式。
实施例1
测试化合物与RAR受体的结合和报告基因的激活
视黄酸受体的反式激活活性和结合效率基本上如美国专利号5298429和5071773中所述，通过引用并入本文。反式激活测定法采用编码全长受体RARα、RARβ和RARγ的表达质粒。含有疱疹病毒胸苷激酶启动子和适当的视黄酸受体反应元件(RARE)的报告质粒位于编码萤火虫荧光素酶的开放编码区的上游。
使用经典竞争测定形式进行结合测定，其中首先将克隆的受体RAR分子装载放射性标记的全反式视黄酸(RAR)，然后测量随着测试化合物浓度的增加而释放的放射性量。
该测定用于鉴定如本文以上公开的RARα激动剂。
实施例2
化合物IRX5183是RARα特异性的
为了确定具有式I结构的化合物是否为RARα选择性激动剂，使用位移测定法测量激动剂结合亲和力和反式激活法测定激动剂活性来检测化合物IRX5183与RARα、RARβ和RARγ结合的能力。(在美国专利5455265中描述，其通过引用并入本文)。这些结果表明化合物IRX5183以高亲和力选择性结合至RARα(表1)并特异性地激活RARα(图1)。在临床研究中，这种RARα选择性激动剂可以将与包括粘膜皮肤毒性、头痛和促炎事件的泛激活相关的不良影响降至最低。
表1.IRX5183对于RARα、RARβ和RARγ的结合亲和力
RARα RARβ RARγ
4.7nM >10000nM >10000nM
实施例3
RARα信号传导诱导Foxp3表达
为了确定哪种RAR(RARα、RARβ、RARγ)信号传导通路在参与Foxp3表达的诱导，使用流式细胞仪通过基于GFP表型的分选和分离从Foxp3-GFP小鼠中纯化未成熟的CD4+CD25-FoxP3-细胞。在IL-2和TGF-β存在下，这些细胞在体外用αCD3进行了多克隆激活。为了鉴定参与RA诱导的Foxp3表达的RAR，将培养的细胞与RAR选择性激动剂一起孵育。然后对培养的细胞GFP+(Foxp3+)频率的评分。关于选择性激动剂的使用，只有RARα激动剂对诱导近100％的Foxp3+T细胞的Foxp3表达有显著影响，其对α4β7和CCR9(肠归巢受体)的表达增强(图2)。RARγ和RARβ激动剂没有作用。
实施例4
RARα选择性激动剂调节T细胞分化
为了确定RARα激动剂是否可以影响T细胞分化，将T细胞与RARα激动剂一起孵育以确定其对Foxp3表达的影响。使用流式细胞仪通过基于GFP表型的分选和分离从Foxp3-GFP小鼠中纯化未成熟的CD4+CD25-FoxP3-细胞细胞。在IL-2和TGF-β存在下，这些细胞在体外用αCD3进行了多克隆激活。然后将这些细胞在含有各种浓度的化合物IRX5183(一种RARα激动剂)的培养基中培养，并通过流式细胞仪分析FoxP3-GFP的表达。RARα激动剂化合物IRX5183在体外可增强免疫抑制Treg细胞的分化，并抑制炎性TH17细胞从未成熟的T细胞的分化(表2)。
表2.RARα激动剂对T细胞分化的影响
Figure BDA0002395209170000251
为了扩展上述发现，在小鼠模型中评估了RARα激动剂对T细胞分化的体内作用。每隔一天用100μg化合物IRX5183或等体积的DMSO(媒介物对照)处理小鼠，持续10天。然后从血液和脾脏中分离淋巴细胞，并评估CD4+ T细胞中FoxP3的表达。数据显示，施用化合物IRX5183后，治疗小鼠的脾脏和血液中Foxp3+ T细胞的百分比显著增加(表3)。
表3.RARα激动剂对T细胞分化的影响
Figure BDA0002395209170000252
相反，在上述体外和体内试验中，RARα选择性拮抗剂AGN 196996增加Th17细胞数并降低Treg细胞数(数据未显示)。
实施例5
骨髓微环境在多发性骨髓瘤中诱导硼替佐米耐药
多发性骨髓瘤(MM)的特征在于BM内恶性浆细胞(PC)的增殖及其单克隆免疫球蛋白(Ig)的产生。包括蛋白酶体抑制剂在内的新疗法显著延长了MM患者的生存期，但未能治愈。越来越多的证据表明，BM微环境的相互作用在化疗期间对MM细胞的存活起着至关重要的作用。然而，介导这种依赖于BM生态位的化学保护机制尚不完全清楚，仍然是研究的关键领域。
某些MM细胞类似于成熟B细胞并且对硼替佐米(BTZ)有抗性。像其正常B细胞对应物一样，这些CD138-MM细胞能够克隆生长并分化为CD138+PC。此外，这些细胞在最小残留疾病(MRD)期间富集，表明在疾病复发中起关键作用。CD138+和CD138-MM细胞的BTZ差异敏感性可以通过其分泌活性来解释。由于其大量的Ig产生，CD138+PC高度依赖完整的蛋白酶体途径以降解不正确折叠的蛋白质。通过蛋白酶体破坏蛋白质降解的条件会激活称为未折叠蛋白质反应(UPR)的细胞应激途径，该途径通过减少蛋白质合成并促进蛋白质降解来抵消内质网应激。如果体内平衡无法重建，UPR激活最终会导致细胞凋亡。另一方面，CD138-MM细胞表现出有限的Ig产生和低ER应力，并且较少依赖蛋白酶体介导的错误折叠蛋白的降解。
先前的研究表明，BM基质细胞在MM中诱导不成熟的耐药表型。BM基质通过CYP26产生低视黄酸(RA-low)的环境，阻止正常细胞和恶性细胞的分化。由于类视黄醇信号传导促进PC分化和Ig产生，因此本研究确定了经由基质CYP26活性的BM生态位是否通过阻止PC分化来诱导BTZ抗性(Alonso S.et al.,J.Clin.Invest.126:4460-4468,2016)。由基质CYP26诱导的低RA环境负责维持MM细胞中的B细胞样、BTZ抗性表型。通过CYP26抗性的类视黄醇直接抑制CYP26或绕过基质保护，可拯救PC分化和BTZ敏感性。此外，我们描述了双向串扰，其中MM细胞分泌的旁分泌刺猬(Hedgehog)通过增加BM基质灭活RA的能力来增强保护位。这些数据表明，RA信号传导的调节是克服MM BM微环境中BTZ抗性的有吸引力的治疗策略。
方法
细胞培养。所有细胞系均购自美国典型培养物保藏中心。将H929、MM.1S和U266细胞在含有10％FCS(胎牛血清)、2mM L-谷氨酰胺和100μg/ml青霉素-链霉素(P/S)的RPMI1640中培养。OP-9细胞在α-MEM、20％FCS、L-谷氨酰胺和P/S中培养。通过短串联重复序列分析对细胞系进行鉴定。
根据IRB认可的方案，从新诊断或复发性MM的患者中获得原代MM细胞。简而言之，通过密度梯度离心(Ficoll-Paque)从新鲜的BM抽吸物中分离出单核细胞。然后通过磁珠和柱子选择CD138+细胞，并在RPMI 1640、10％FCS、L-谷氨酰胺和P/S中于37℃孵育。
根据IRB认可的方案，原代人BM基质细胞是从健康供体收集的抽吸物中获得的。简而言之，将从BM抽吸物中分离的总单核细胞在补充有10％马血清、10％FCS、10-5M氢化可的松21-半琥珀酸酯、P/S和0.1mMβ-巯基乙醇(β-ME)(FBMD1培养基)的Iscove’s改良的Dulbecco’s培养基(IMDM)中培养。第二天，通过用PBS洗涤两次除去悬浮液中的细胞，并更换培养基。将附着的基质细胞在33℃下孵育，直到获得融合的单层。从小鼠股骨中分离出总的BM单核细胞后，按照相同的方案分离小鼠原代BM基质细胞。
载体和病毒上清液。为了产生Smo-KO和WT基质，BM基质细胞衍生自Smofl/fl小鼠，并分别用编码Cre-重组酶(Addgene；目录50935)的逆转录病毒载体PIG-Cre或对照载体(Addgene；目录18751)进行转导。使用4μg/ml嘌呤霉素5天筛选成功感染的细胞，并经流式细胞仪通过GFP表达进行确认。使用pLenti-CMV-LUC-Puro慢病毒载体(质粒17477)生成H929 Luc+细胞。
为了产生过量表达CYP26A1的基质细胞，用经工程改造以编码CYP26A1的慢病毒载体pBABE-neo(Addgene；目录1767)转导WT和Smo-KO基质细胞。简而言之，使用掺入限制性酶切位点BamHI和EcoRI的引物通过PCR扩增Cyp26a1 cDNA(Origene)，并将其克隆到pCR2.1载体中。通过Sanger测序证实了Cyp26a1 cDNA，并且在用限制酶BamHI和EcoRI消化后分离了该片段，并将其亚克隆到pBABE载体的相应位点。如前所述产生慢病毒颗粒。使用3μg/ml G-41810天筛选成功感染的基质细胞，并通过qRT-PCR确认Cyp26a1的表达。
共培养实验。在37℃下用0.1％明胶的PBS溶液包被24孔板30分钟。除去明胶溶液，并将基质细胞以5×104细胞/孔的密度培养过夜，以获得融合的单层。那时，将MM细胞系或原代MM细胞(2ml中1×105)加入基质培养物中。在37℃下，将基质共培养物在含有10％FCS、L-谷氨酰胺和P/S、有或没有AGN194310(1μM持续5天)、R115866(1μM持续5天)、IRX5183(1μM5天)或BTZ(2.5nM持续48小时)的RPMI中孵育。
Transwell实验。对于Transwell实验，在37℃下将6孔板用0.1％明胶的PBS溶液包被30分钟。除去明胶溶液，并将基质细胞在FBMD1培养基中在2ml培养基中以10×104细胞/孔的密度培养过夜，以获得融合的单层。那时，将Transwell插入物(Corning)置于基质培养物上，并在37℃下将MM细胞系(1ml中1×106)接种于Transwell中24小时。孵育后，去除Transwell和MM细胞，并从孔中分离基质细胞，并通过qRT-PCR分析CYP26的表达。
动员实验。通过在孔周围轻轻吸打几次，将MM细胞与BM基质细胞分离。将分离的细胞离心，重悬于新鲜培养基中，并在24孔板中于37℃孵育1小时。在短暂的孵育期间，污染的基质细胞附着在孔中，而MM细胞则保持悬浮状态。然后通过轻轻移液回收MM细胞。该方案用于qRT-PCR和CFU共培养实验。通过流式细胞仪确认使用该方案获得的纯度为98％-99％MM细胞和少于2％的污染基质。
克隆分析。处理后，收集MM细胞，用PBS洗涤，并以5000细胞/ml的密度铺板于添加有30％FBS、10％BSA、L-谷氨酰胺、P/S和0.1mMβ-ΜΕ的1.32％的1ml的甲基纤维素中。将细胞一式三份铺在35mm培养皿中，在37℃下孵育，并在14天后对菌落的存在进行评分。
qRT-PCR。根据制造商的说明，使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)提取总RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)通过逆转录合成cDNA。使用序列特异性引物通过iTaqSYBR Green Supermix(Bio-Rad)进行qRT-PCR。将基因表达相对于GAPDH标准化，并使用ΔΔCt计算相对定量。所有实验均重复进行，并在Bio-Rad CFX96机器上运行。
流式细胞仪。处理后，收集MM细胞，用PBS洗涤，并在室温下用藻红蛋白缀合的(PE缀合的)抗CD138染色15分钟。洗涤细胞以去除未结合的抗体，并在FACSCalibur系统(BDBiosciences)中进行评估。通过GFP表达鉴定基质细胞，并使用7-氨基放线菌素D(7-AAD)鉴定活细胞。为了计算细胞数量，将活的GFP细胞标准化为校准珠。
小鼠异种移植。将1x106 H929 Luc+细胞和1x106小鼠BM基质细胞重悬于100μl
Figure BDA0002395209170000281
中，用RPMI(1：1)稀释，并皮下注射到16周龄的雄性NSG小鼠中。4天后，开始用BTZ(每周两次注射0.5mg/kg i.p.)和IRX(每天注射10mg/kg i.p.)进行治疗。使用体内成像系统(PerkinElmer)通过生物发光评估肿瘤负担。为了成像，在成像前10-5分钟通过腹膜内注射使小鼠暴露于120mg/kg D-荧光素，并使用异氟烷麻醉。使用2.5版活体图像软件(PerkinElmer)分析图像，并将数据量化为光子/秒。
对于全身性MM模型，通过尾静脉将2×106Luc+/GFP+H929细胞注射到16周龄的雄性NSG小鼠中。植入后，如通过生物发光的指数增加所确定的，小鼠用每周两次BTZ(0.5mg/kg i.p.)和每天一次10mg/kg)进行治疗。如上所述，通过生物发光评估肿瘤负担。
统计。首先使用1-way ANOVA评估治疗组是否与对照组不同。如果ANOVA检验产生了统计学上显著的结果，使用Dunnett检验对P值进行多次比较调整评估对照组和每个治疗组之间的差异。对于仅分析两组数据的实验，使用未配对的2尾Student t检验(2-tailedStudent’s t test)评估统计学显著性。使用GraphPad Prism 7(GraphPad软件)计算Pearson相关性的R值和P值。
结果
BM微环境(也称为“生态位”)通过调节类视黄醇信号传导来限制PC分化。在表型上与B细胞相似的MM祖细胞对BTZ具有内在抗性，并有助于MRD和复发。为了研究BM生态位是否在确定MM细胞的表型中起作用，使用人类特异性引物与小鼠BM基质共培养后，分析在MMH929细胞系(图3A-D)和MM CD138+原代细胞(图3E-H)中B细胞和PC标志物的mRNA的表达。B细胞淋巴瘤6(BCL6)是一种转录抑制因子，可促进生发中心B细胞的自我更新并防止PC分化，其在BM基质细胞的存在下上调(图3A、3E)。相反，MM细胞与BM基质的共培养降低了B淋巴细胞诱导的成熟蛋白1(BLIMP1)和剪接的X盒结合蛋白1(XBP1 s)的mRNA表达(图3B、C、F、G)，它们是PC分化的关键媒介。类似地，在BM基质细胞的存在下，UPR途径的关键成分C/EBP同源蛋白(CHOP)被下调(图3D、H)。
BM生态位通过表达类视黄醇灭活酶CYP26来调节造血干细胞(HSC)的分化。CYP26酶在BM间充质干细胞中高表达，而在MM细胞中几乎检测不到。由于类视黄醇信号传导促进PC分化并增强Ig分泌，因此确定基质CYP26是否负责诱导MM细胞中的B细胞表型。为此，共培养条件用CYP26抑制剂R115866(R115)或抗CYP26的RA受体α选择性(RARα-选择性)类视黄醇IRX5183(IRX)处理。与R115或IRX一起进行基质共培养的孵育使所有标记物恢复到与液体对照条件相当的水平(图3A-H)。此外，用泛RAR拮抗剂AGN194310(AGN)处理MM细胞模仿了由BM基质细胞诱导的变化(图3A-H)，限制了PC分化。
CD138的表达是正常PC分化以及MM PCs的标志。与PC标记物的mRNA水平一致，与BM基质细胞共培养或与AGN孵育显著降低了表面CD138表达。BM基质细胞与R115或IRX共培养可恢复MM细胞中CD138的表达。通过定量逆转录PCR(qRT-PCR)或流式细胞仪，R115不会显著影响液体条件下的分化标志物的表达，而IRX诱导可比的变化，无论是否存在BM基质。综上所述，这些数据表明类视黄醇信号传导促进MM细胞的PC分化，并且该过程被基质CYP26介导的RA代谢所阻断。
低RA的微环境会诱导BTZ抗性。为了确定降低的类视黄醇信号传导是否有助于BM生态位内的BTZ抗性，将MM细胞系和MM CD138+原代细胞与BM基质一起孵育5天，然后进行BTZ处理。在不存在BM基质(液体)的情况下，MM细胞对BTZ高度敏感(图4A-B)。但是，与BM基质的孵育会诱导BTZ抗性，这可通过R115抑制CYP26或通过抗CYP26的类视黄醇IRX克服。此外，用泛RAR拮抗剂AGN处理MM细胞模仿了由BM基质细胞诱导的变化(图5)，降低了BTZ敏感性。
克服依赖微环境的化学保护的策略集中在将癌细胞从BM生态位动员到外周循环中。分析了从BM基质中分离出来的MM细胞的表型变化和随后的BTZ抗性是否丢失，这一过程类似于动员。为此，在5天的基质共培养后，将H929细胞与BM间充质细胞分离，在新鲜培养基(含10％FBS的RPMI)中孵育0至48小时，然后用BTZ处理。有趣的是，从基质脱离后，MM细胞在长达48小时内仍保持部分对BTZ的抗性(图5)。此外，用R115处理共培养条件阻止了BTZ抗性表型的发展(图5)。因此，由肿瘤细胞动员不能立即逆转由MM细胞表型改变引起的微环境依赖性BTZ抗性。
为了测试类视黄醇是否能增强MM中的BTZ活性，通过经由非肥胖、糖尿病、严重的联合免疫缺陷IL-2受体γ-KΟ(NSG)小鼠的尾静脉注射2x106 H929荧光素酶+(Luc+)细胞，开发了全身性MM异种移植。使动物随机接受IRX、BTZ或两者的组合，并且每周通过生物发光成像跟踪疾病负担(图6)。与未经治疗的对照组相比，经BTZ治疗的小鼠肿瘤生长降低；然而，一些MM细胞仍然对BTZ具有抗性，如生物发光的持续增加所证明的。同样，与未治疗的小鼠相比，接受IRX单一疗法治疗的小鼠肿瘤负荷降低。最重要的是，IRX使MM细胞对BTZ敏感，导致疾病负担显著减少(P<0.01)。总体而言，这些数据表明由间质CYP26产生的低RA微环境诱导了BTZ抗性表型，即使从BM生态位置换后也保持了这种表型。
MM细胞诱导间质CYP26。最近的研究证明了双向串扰(bi-directionalcrosstalk)的存在，在这种串扰中，不仅基质细胞提供了保护性微环境，而且癌细胞也积极地适应并建立了增强的生态位。因此，确定了MM细胞是否通过增强BM基质使类视黄醇失活的能力来增强保护性微环境。与MM细胞共培养24小时后，通过qRT-PCR分析BM间质细胞中的基质CYP26表达。同工酶CYP26A1被所有测试的3种MM细胞系高度上调(图7A-C)。相反，同工酶CYP26B1在mRNA水平上几乎没有变化。来自MM细胞的条件培养基在BM基质细胞中也上调CYP26A1，尽管程度较小。可以通过共培养实验中存在物理相互作用，或者在条件培养基实验中缺乏MM细胞连续产生可溶性配体的现象来解释。与后者一致，当通过阻止物理接触但允许可溶性因子扩散的Transwell实验分离MM和BM基质细胞时，基质CYP26A1被高度上调(图7A-C)。
MM细胞产生各种可溶性因子，包括细胞因子(IL-1、IL-3、IL-6、TNF-α)以及刺猬(Hedgehog)配体，例如声波刺猬(Hedgehog)(SHH)，它们可能会影响BM基质区室。因此，确定这些因子是否与观察到的BM基质细胞中CYP26A1的上调有关。在测试的可溶性因子中，只有SHH产生了CYP26A1的持续过表达，而IL-1、IL-3、IL-6和TNF-a没有明显的作用。尽管SHH由BM基质细胞表达，因此可能能够以自分泌方式激活Hedgehog途径，但与BM基质中检测到的相比，其在MM细胞中的表达要高得多，这表明旁分泌激活可能起主导作用。与此相一致，在MM细胞中SHH的mRNA水平与基质刺猬(Hedgehog)信号传导的激活之间存在统计学上的显著相关性，这由蛋白修补的同源物1(PTCH1)表达确定。此外，基质刺猬(Hedgehog)的激活与CYP26A1上调显著相关。具体而言，SHH的最高表达的MM.1S细胞也在基质细胞中诱导了PTCH1和CY26A1的最高表达。SHH的半衰期少于1小时，这可能解释了与共培养和Transwell实验相比，MM条件培养基对基质CYP26A1表达的影响降低。
为了证实旁分泌刺猬(Hedgehog)在这种相互作用中的作用，在基因组水平上在间充质区室中敲除了转导SHH信号的膜受体Smoothened(Smo)。为此，用编码Cre重组酶(Smo-KO基质)的逆转录病毒载体转导源自Smofl/fl小鼠的BM间充质细胞。用空的逆转录病毒载体转导的小鼠Smofl/fl基质细胞用作对照(WT基质)。将转导的BM基质细胞与MM细胞共培养24小时。如所预期的，与WT基质相比，Smo-KO基质的反应于MM细胞的上调Cyp26a1的能力降低(图8A-C)。同样，SMO抑制剂环巴胺部分克服了MM细胞对基质Cyp26a1的上调作用。这些数据表明MM细胞至少部分通过旁分泌SHH调节基质CYP26表达。
MM细胞产生的旁分泌刺猬(Hedgehog)增强了保护性微环境。鉴于观察到间质CYP26活性可能与MM细胞的BTZ抵抗有关，因此评估了MM细胞分泌的旁分泌刺猬(Hedgehog)是否通过调节类视黄醇代谢来增强化学保护位。首先研究了刺猬(Hedgehog)信号传导的调节是否平行于以前观察到的类视黄醇依赖性表型。Smo-KO基质共培养物中旁分泌刺猬(Hedgehog)信号传导的破坏部分恢复了H929(图11A-D)和原代CD138+MM细胞(图11E-H)中的PC分化(BCL6的下调和BLIMP1、XBP1和CHOP的上调)。在存在Smo-KO基质的情况下，CD138的表面表达也得以恢复。如所预期的，与WT基质相比，这些发现与在存在Smo-KO基质的情况下处理的MM细胞对BTZ的敏感性增强有关。
为了证明旁分泌刺猬(Hedgehog)确实通过增加BM基质使类视黄醇失活的能力而诱导了BTZ抗性表型，通过慢病毒介导的基因转移(pBABE-Cyp26a1)挽救了Smo-KO基质中Cyp26a1的表达，从而获得了可比的CYP26A1水平在WT(WT-Cyp26a1)和Smo-KO(Smo-KO-Cyp26a1)基质细胞中表达。如果旁分泌刺猬(Hedgehog)的作用不依赖于类视黄醇信号传导，则即使在Cyp26a1上调后，Smo-KO基质诱导B细胞表型和BTZ抗性的相对无能也应持续存在。然而，Cyp26a1的过表达挽救了Smo-KO基质诱导B细胞表型的能力，并使分化标志物的表达和BTZ抗性恢复到与WT和WT-Cyp26a1基质共培养条件下检测到的水平相当的水平。这一发现与旁分泌刺猬(Hedgehog)通过Cyp26a1上调增强保护性生态位的假设是一致的。
为了研究由BM基质产生并由MM细胞通过旁分泌刺猬(Hedgehog)信号传导增强的低RA环境在多大程度上促进了BTZ抗性，建立了MM-生态位相互作用的异种移植模型。每只小鼠携带2个由H929 Luc+细胞和WT(前部肿瘤)或Smo-KO基质(后部肿瘤)组成的皮下肿瘤。小鼠接受IRX(每天10mg/kg i.p.)、BTZ(每周两次0.5mg/kg i.p.)或两者结合治疗。在未经治疗或经IRX治疗的组中，携带WT或Smo-KO基质的肿瘤的生长没有差异(图9和10)。与体外数据一致，WT基质的肿瘤对于BTZ治疗是难治的，这是由生物发光的指数增加所确定的，而带有Smo-KO基质的肿瘤则表现出显著的反应(图8)。此外，无论基质隔室的表型如何，IRX和BTZ的组合均导致显著且等效的反应(图10)。尽管接受IRX和BTZ联合治疗的治疗组中的某些肿瘤似乎已经完全消退，即使经过解剖学研究，但并非该组中的所有小鼠都如此。治疗后对肿瘤的流式细胞仪分析表明，WT或Smo-KO基质的体内生长无差异。综上所述，这些数据表明，MM细胞分泌的旁分泌刺猬(Hedgehog)通过CYP26A1上调来调节BM生态位中的类视黄醇信号传导和BTZ敏感性。
由于PC的Ig分泌量很高，因此PC对蛋白酶体抑制特别敏感，这解释了用该家族药物治疗的MM患者获得的高缓解率。但是，BTZ未能治愈。在表型上与B细胞相似的MM细胞群体在BTZ治疗中幸存下来，能够分化成PC并再现原始疾病。尽管有效消除了MM PC，但这些MM B细胞在BTZ治疗中仍能存活，并成为MRD期间的主要细胞群。因此，需要靶向MM B细胞的新治疗策略。基质CYP26产生的低类视黄醇微环境在MM中保持了不成熟的BTZ抗性表型。因此，这些数据揭示了在MM微环境中使用CYP26抗性类视黄醇克服BTZ抗性的治疗机会。
尽管已在许多血液系统恶性肿瘤中进行了广泛研究，但已证明将类视黄醇用作分化治疗仅对急性早幼粒细胞白血病(APL)患者有益。BM基质细胞的CYP26表达可能解释了天然类视黄醇尽管具有体外活性但缺乏临床益处。最近的研究强调了CYP抗性合成类视黄醇在分化癌细胞并使它们对靶向治疗敏感的功效。例如，AM80可以区分FMS样酪氨酸激酶3/内部串联复制(FLT3/ITD)急性髓细胞白血病(AML)细胞，并提高其对FLT3抑制剂的敏感性。类似地，合成类视黄醇逆转了BCR-ABL1+白血病淋巴母细胞中的干细胞表型，并大大提高了它们对体内酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗的反应性。这种绕过基质CYP26的策略可能会扩大类视黄醇治疗的临床效果。
MM细胞利用物理接触来维持耐药性并在BM生态位中生存。因此，克服基质化学保护作用的治疗策略集中在通过靶向粘附分子或趋化因子例如CXCR4，从BM生态位动员恶性细胞。暴露于低类视黄醇微环境的MM细胞获得了BTZ抗性表型，即使这些细胞从其生态位转移后也能保持这种表型。最初的临床研究表明，接受CXCR4抑制剂普乐沙福(plerixafor)联合BTZ的复发/难治性患者的缓解率有所提高。但是，这些数据表明，这种动员方法可能不足以消除MM B细胞。
最近的研究表明双向通讯的存在，在这种通讯中，不仅基质细胞提供了化学保护生态位，而且癌细胞也积极地塑造和增强了它们的微环境。旁分泌刺猬(Hedgehog)在实体恶性肿瘤中的作用已被广泛研究。在该系统中，癌细胞分泌的配体激活了邻近基质细胞中的Hedgehog途径，通过不完全了解的机制增强了它们的化学保护特性。该数据表明，旁分泌刺猬(Hedgehog)可能至少部分以通过CYP26的上调而增加基质失活类视黄醇的能力而起作用，从而维持MM的BTZ抗性表型。有趣的是，在胰腺癌患者中，CYP26的上调与“激活的基质亚型”相关，并且预后诊断明显较差，胰腺癌是一种建立了旁分泌刺猬(Hedgehog)信号的疾病。癌细胞产生的刺猬(Hedgehog)配体对这种“激活的”基质表型和高CYP26水平有多大贡献尚不清楚。此外，BM间充质细胞迁移并成为这些肿瘤的基质室中的相关细胞群。
骨内膜区域是实体瘤引起的MM、AML和微转移性疾病的主要生态位。在成骨细胞区域内，这些癌细胞保持静止的干细胞表型，并受到化学疗法诱导的细胞凋亡的保护。这些癌细胞有可能像正常造血干细胞一样依靠BM微环境中的线索来生存，从而使其在化学疗法中幸存下来并使这种疾病永存。BM微环境通过CYP3A4和其他解毒酶的表达直接使各种化学治疗剂失活，从而保护MM和AML细胞。现在证明了微环境介导的耐药性的另一个潜在机制：建立视类视黄醇的生态位，该生态位维持耐药性B细胞表型。CYP26抗性类视黄醇(IRX5183)增强了BTZ在BM生态位中针对MM的活性，为绕过这种耐药机制提供了治疗机会。
实施例6
lRX5183在急性髓样白血病中的I/II期临床研究
急性骨髓性白血病(AML)仅在30-40％的年轻患者和极少数年龄较大的患者中采用标准化学疗法成功治疗。鉴于全反式视黄酸(ATRA；视黄酸，RA)在急性早幼粒细胞白血病(APL)中的临床活性，ATRA被认为是其他AML亚型的引人注目的治疗策略。APL和大多数非APL AML经历了终末分化，因此在体外可以通过ATRA成功治疗。但是，尚未在临床试验中证明ATRA在非APL AML中有效。
视黄酸(RA)在造血干细胞(HSC)的分化中起重要作用。在骨髓(BM)基质细胞中表达的细胞色素P450酶CYP26使RA失活，从而限制了HSC的分化。几种AML细胞系，无论是APL还是非APL，对RA诱导的分化均敏感，但在BM基质存在时，这种作用被取消。因此，用通过CYP26途径抗代谢的类视黄醇治疗AML可能有用。IRX5183是对CYP26代谢具有抗性的RARα选择性激动剂。IRX5183在AML中的使用为这种疾病提供了一种新型的靶向治疗方法，它有可能改变该疾病和其他血液系统恶性肿瘤的预后诊断。因此，将在复发/难治性AML中对IRX5183进行I/II期临床试验。
研究目标
剂量递增阶段的主要目标：
·通过确定剂量限制毒性(DLT)和最大耐受剂量(MTD)，评估与IRX5183联合治疗在复发和难治性AML患者内的安全性和毒性。
·确定IRX5183在外周血中的药代动力学(PK)参数。
剂量递增阶段的次要目标：
·确定IRX5183在骨髓中的PK参数。
·定义与IRX5183、BM细胞类视黄醇浓度、原始细胞计数和不同剂量水平的细胞遗传学相关的分化特征。
剂量扩大阶段的主要目标：
·在最佳剂量水平下，为AML患者定义分化标志物、BM类视黄醇浓度、原始细胞计数和细胞遗传学。
·获得两组患者在完全缓解(CR)、部分缓解(PR)和血液学改善(HI)方面的IRX5183初步疗效数据。
剂量扩大阶段的次要目标：
·在两组患者中以最佳剂量定义IRX5183的毒性谱。
·获得有关IRX5183诱导的分化与毒性和临床反应之间相关性的数据。
资格标准-剂量递增/确定。
·患者必须能够理解并自愿签署知情同意书。
·签署知情同意书时的年龄为18-70岁。
·能够遵守研究访问时间表和其他协议要求。
·预期寿命超过6个月。
·必须有经过病理学证实的AML，且之前接受过一两个疗程的诱导化学疗法或次甲基化剂治疗，或者在完全缓解后，同种异体骨髓移植之前或之后复发，并且没有进一步强化化疗的计划。
·在试验开始后的三周内，患者不得接受任何其他疾病治疗方法(除了用羟基尿素控制AML患者的母细胞计数)，包括造血生长因子，并且应从先前治疗的所有毒性中恢复(达到0或1级)。
·研究进入时的ECOG绩效状态为≤2，或者Karnofsky≥60％。
·实验室测试结果在以下范围内：
ο通过MDRD(CrCL)计算的肌酐清除率>50ml/min/1.73平方米
ο总胆红素≤2.0mg/dL，除非由于吉尔伯特综合征，溶血或无效的造血功能AST(SGOT)和ALT(SGPT)≤3xULN
·有生育能力的女性必须接受阴性的妊娠试验。
·患者必须没有中枢神经系统或肺白细胞增多、弥散性血管内凝血或中枢神经系统白血病的临床证据。
·患者必须没有严重或不受控制的医疗状况。
·资格标准-剂量增加。此阶段将遵循上面提到的资格标准，包括在转诊时经病理证实的具有高风险特征的慢性粒细胞性白血病(CMML)，定义如下：
·INT-2或IPSS高分
·CMML具有≥5％骨髓原始细胞、RBC或血小板输注依赖性、异常核型或增生特征
治疗方案
对于剂量递增阶段，IRX5183在28天的周期内以每日剂量连续口服，直至毒性或疾病进展。前四个周期中每个周期的骨髓测试可确定骨髓状态和反应。单一药物IRX5183的起始剂量(DL1)为30mg/m2/天，个体给药水平如下：
剂量水平(DL) 每日剂量(mg/m<sup>2</sup>)
DL(-1) 15
DL1 30
DL2 45
DL3 60
DL4 75
本研究的阶段扩展部分使用本研究阶段扩展部分中确定的最佳剂量，并将招募26名患者。
根据传统的3+3设计探索剂量水平，旨在一次招募3名受试者以确定IRX5183对AML患者的毒性特征。如果接受DL1的三名患者均未经历DLT，则将以下一个更高的剂量治疗另外三名患者。但是，如果前三名患者中的一位经历DLT，则将以相同的剂量水平治疗三名患者。剂量递增将持续到3-6名患者中的至少两名患者经历DLT。如果两个或更多患者在DL1上经历了DLT，则下一个患者将被招募到DL(-1)。在六名受试者的队列中，单一药物IRX5183的MTD将是在0或1DLT时最高的剂量。
对于2期剂量扩大队列，将继续在MTD中招募AML患者，目标是招募26名患者(包括在试验的第一阶段在MTD中接受治疗的患者)。患者继续使用单一药物IRX5183，直到他们经历毒性或疾病进展。如果患者完全缓解，则可以选择合并移植、化疗和/或继续维持IRX5183。如果患者获得部分缓解或血液学改善，则可以选择与IRX5183结合使用挽救疗法。
药代动力学分析。使用LCM-MS(液相色谱-质谱联用)通过药代动力学，针对IRX5183的血浆浓度进行了逐步评估和扩展阶段评估，确定了安全有效的类视黄醇水平。达到1pM的峰值水平应避免全身毒性，同时应保持局部BM生态位类视黄醇水平。IRX5183的血浆浓度是在第14天使用剂量为2mL的血液样本获得的。样品被运送到指定的分析实验室并进行分析。
药效学分析。除了评估标准的临床反应标准外，还确定了BM细胞(正常HSC和LSC)浓度、外周血和骨髓胚细胞计数、分化、凋亡和克隆形成的标记。在基线、第14天以及治疗的前4个周期中的每个周期结束时进行骨髓穿刺和活检。使用流式细胞仪评估分化，比较第14天骨髓相对于基线的CD45阳性细胞和ALDHint LSCs上的分化标志物表达。在每个周期后还对基线异常的患者进行FISH分析，以确定在第14天是否仍存在白血病克隆。
预期成果
基于血液学参数(包括全血细胞计数和外周血和骨髓中白血病母细胞百分率)的血液学参数监测接受RARα选择性激动剂的患者的反应标准。嗜中性粒细胞计数提高、红细胞和血小板的输血需求降低以及骨髓中胚细胞百分比降低以及这些恶性胚细胞分化和凋亡诱导的患者被认为对治疗有反应。评估生命质量参数，例如疼痛、表现状态和参与日常活动以及日常器械活动，以评估该疗法对研究患者的影响。预期使用这种RARα选择性激动剂可改善AML和实体恶性肿瘤患者的血液学和生命质量参数。另外，使用CYP26抗性的RARα激动剂可以导致分化，从而消除这些患者的骨髓中的最小残留疾病。
实施例7
lRX5183+CAR修饰的免疫细胞在急性髓细胞白血病中的临床研究
资格标准与实施例6中的相同。
治疗方案
该研究使用了阶段扩展研究(实施例6)中确定的IRX5183的最佳剂量，并包括两个独立的组。一个用于单独接受CAR修饰的免疫细胞的患者(第1组)，另一个用于同时接受IRX5183和CAR修饰的免疫细胞的患者(第2组)，这两个组各招募26名患者。
在第D-5至D-3天对所有患者静脉内施用氟达拉滨25mg/m2，在第D-3天静脉内施用900mg/m2环磷酰胺。
第1组患者接受Minagawa等人(PLoS One 12:e0172640,2017)公开和制备的自体CD33-CAR-T细胞，以5x106细胞/kg患者体重的单次推注剂量静脉内给药。
第2组患者在开始自体CD33-CAR-T细胞治疗(D-30)之前每天接受IRX5183治疗30天，并持续6个月或直到发生毒性或进展。在IRX5183给药开始后30天，以单次推注剂量以5×106细胞/kg患者体重的单次推注剂量施用CD33-CAR-T细胞。
药代动力学分析。使用LCM-MS(液相色谱-质谱联用)通过药代动力学，针对IRX5183的血浆浓度进行了逐步评估和扩展阶段评估，确定了安全有效的类视黄醇水平。达到1pM的峰值水平应避免全身毒性，同时应保持局部BM生态位类视黄醇水平。IRX5183的血浆浓度是在第14天使用剂量为2mL的血液样本获得的。样品被运送到指定的分析实验室并进行分析。
药效学分析。除了评估标准的临床反应标准外，还确定了BM细胞(正常HSC和LSC)浓度、外周血和骨髓胚细胞计数、分化、凋亡和克隆形成的标记。在基线、第14天以及治疗的前4个周期中的每个周期结束时进行骨髓穿刺和活检。使用流式细胞仪评估分化，比较第14天骨髓相对于基线的CD45阳性细胞和ALDHint LSCs上的分化标志物表达。在每个周期后还对基线异常的患者进行FISH分析，以确定在第14天是否仍存在白血病克隆。
预期成果
根据血液学参数(包括全血细胞计数和外周血和骨髓中白血病母细胞的百分率)，对接受RARα激动剂+CD33-CAR-T治疗的患者的反应标准进行监测。嗜中性粒细胞计数提高、红细胞和血小板的输血需求降低以及骨髓中胚细胞百分比降低以及这些恶性胚细胞分化和凋亡诱导的患者被认为对治疗有反应。评估生命质量参数，例如疼痛、表现状态和参与日常活动以及日常器械活动，以评估该疗法对研究患者的影响。预期使用这种RARα激动剂+CD33-CAR-T治疗可改善AML患者的血液学和生活质量参数。此外，与CYP26耐药的RARα激动剂与CAR-T疗法联合使用可导致分化，从而消除这些患者骨髓中的最小残留疾病。
实施例8
lRX5183+CAR修饰的免疫细胞在多发性骨髓瘤中的临床研究
多发性骨髓瘤(MM)是血液癌症的一种形式，通常是在骨髓中发现的被称为浆细胞的白细胞生长失控并发展成肿瘤。美国今年将诊断出约30000例新的多发性骨髓瘤病例。已知的可导致这种疾病危险因素很少，并且直到它发展到肾脏和其他器官之前，它可能不会引起导致诊断的体征或症状。
B细胞成熟抗原(BCMA)在所有浆细胞上表达，包括MM中的癌浆细胞。自体BCMA-CAR-T细胞及其在MM中的用途在AN等人(Ali SA et al.Blood 128:1688-1700,2016)中公开。
入选标准：
·患者必须由病理学家在组织学上证实为MM，具有表达BCMA的MM细胞，先前已接受过2种以上的先前疗法治疗，包括IMiD和PI，患有难治性、持续性或进行性疾病
·年龄≥18岁
·肌酐≤2.0mg/dL，直接胆红素≤2.0mg/dL，AST和ALT≤3.0x正常上限(ULN)
·足够的肺功能，通过脉搏血氧饱和度法测定房间空气中氧饱和度≥92％来评估。
排除标准：
·卡诺夫斯基的表现状态<70
·孕妇或哺乳期妇女。育龄男女应使用在此研究中有效避孕，并在所有治疗结束后持续1年
·通过ECHO或MUGA扫描评估的心脏功能受损(LVEF<40％)
·患有以下心脏病的患者将被排除在外：
ο纽约心脏协会(NYHA)III或IV期充血性心力衰竭
ο入院前≤6个月的心肌梗塞
ο临床上明显的室性心律不齐或不明原因的晕厥史，本质上不认为是血管迷走神经或由于脱水引起
ο严重非缺血性心肌病的病史
·患有HIV或活动性乙型肝炎或丙型肝炎的患者不符合资格
·除皮肤鳞状和基底细胞癌外，同时发生活动性恶性肿瘤的患者需要进行除预期观察或激素治疗以外的任何治疗
·先前曾接受过异基因移植ARE的患者符合条件，除非之前或目前经历需要全身性激素治疗或其他全身性淋巴毒性治疗的GvHD
·在收集后的两周内使用全身性类固醇的患者(除非仅用于肾上腺替代)
·活动性自身免疫疾病，包括结缔组织疾病、葡萄膜炎、结节病、炎性肠病或多发性硬化症，或有严重的(根据主要研究者的判断)自身免疫病病史，需要长期的免疫抑制治疗
·预先用基因修饰的T细胞治疗
·先前或活跃的中枢神经系统受累于骨髓瘤(例如软脑膜疾病)。仅当出现可疑症状或影像学表现时才需要进行筛查，例如腰椎穿刺
·浆细胞白血病
·先前存在的(活动或严重)的神经系统疾病(例如先前存在的癫痫紊乱)
·活动性不受控制的急性感染
·治疗医师认为会使患者不符合研究条件的任何其他问题
调理化学疗法(环磷酰胺和选择性氟达拉滨)完成后的2-7天进行改良T细胞输注。BCMA-CAR-T细胞以1-10x106 CAR-T细胞/kg的剂量给药。
调理化学疗法包括第D-7天至D-2天一次以3000mg/m2 IV的环磷酰胺或低强度cy/flu(环磷酰胺300mg/m2/天x 3+氟达拉滨30mg/m2/天x 3)，最后一天发生在D-7至D-2天。
该研究使用两种剂量的IRX5183，剂量范围为15-75mg/m2/天(根据实施例6中的临床试验结果，该范围可能会缩小)，包括三个独立的组；一个用于单独接受BCMA-CAR-T细胞的患者(第1组)，另一个用于同时接受IRX5183剂量1(第2组)和IRX5183剂量2(第3组)的IRX5183和BCMA-CAR-T细胞的患者，这两组的每一组将招募26名患者。
第1组的患者在接受条件化疗后，从D0开始，以单次推注剂量1-10x106细胞/kg病人体重的剂量静脉内使用BCMA-CAR-T进行治疗。
第2组和第3组患者在开始BCMA-CAR-T细胞之前每天接受IRX5183治疗30天，并持续6个月或直到发生毒性或进展。BCMA-CAR-T细胞以1-10x106细胞/kg病人体重的单次推注剂量静脉内施用。
预期成果
根据受试者中BCMA-CAR-T细胞的持续时间、肿瘤生长、转移等情况，对接受RARα激动剂+BCMA-CAR-T治疗的患者的反应标准进行监测。评估生命质量参数，例如疼痛、表现状态和参与日常活动以及日常器械活动，以评估该疗法对研究患者的影响。预期使用这种RARα激动剂+BCMA-CAR-T治疗可改善表达BCMA的肿瘤患者的生命质量，并防止疾病进展。另外，将CYP26抗性的RARα激动剂与BCMA-CAR-T疗法联合使用可导致分化，从而消除这些患者骨髓中的最小残留疾病。
实施例9
lRX5183+CAR修饰的免疫细胞在表达间皮素的实体瘤中的临床研究
间皮素是一种40KDa的细胞表面肿瘤分化抗原，来源于间皮素基因编码的69KDa前体蛋白。间皮素的正常生物学功能几乎仍然未知。一些研究表明间皮素是CA125/MUC16的受体，间皮素-CA125之间的相互作用介导细胞粘附，可能是卵巢癌转移的关键点。间皮素的过表达促进肿瘤细胞增殖和区域侵袭，并与不良的预后相关，例如较差的无复发生存期和总生存期。血清中的可溶性间皮素作为一种肿瘤标志物，在恶性胸膜间皮瘤(MPM)和卵巢癌患者的诊断和监测治疗效果中起着重要作用。间皮素在正常组织(包括胸膜、心包、腹膜、阴道膜)中低水平表达，但在各种恶性肿瘤(包括MPM、卵巢癌、胰腺癌和非小细胞肺癌)中过表达。由于在正常组织中的弱表达和在几种癌症中的强表达，间皮素是基于免疫疗法的有吸引力的靶标。
患者将接受非清髓性但淋巴细胞耗竭的制备方案，然后静脉输注自体抗间皮素CAR工程化细胞(间质CAR-T细胞；公开于Adusumilli et al.,Sci Transl.Med.6(261):26ra151,2014)加上低剂量IV阿地白介素。
将通过白细胞分离术获得的外周血单核细胞(PBMC)进行培养，以刺激T细胞的生长。通过将大约1-5x108个细胞暴露于含有抗间皮素CAR的逆转录病毒上清液来启动转导。患者将接受非清髓性但淋巴细胞耗竭的治疗方案，其中包括环磷酰胺和氟达拉滨(每天25mg/m2/天IVPB 30分钟，持续5天；环磷酰胺60mg/kg/天x2天IV在250ml D5W中1个小时)，然后在每24小时内约每8小时(+/-1小时)进行IV输注前CAR基因转导的PBMC和低剂量醛固酮(72000lU/kg IV)15分钟，并以最多15剂持续最多5天。
资格
18岁或18岁以上的患者必须患有表达间皮素的转移性或不可切除的癌症，并且该患者以前曾接受过标准治疗，并且对标准治疗无反应或复发。患者可能没有低剂量醛固酮给药的禁忌症。
纳入标准：
·表达间皮素的转移性或不可切除的可测量癌症。不需要评估上皮间皮瘤和胰腺癌的间皮素表达，因为所有这些肿瘤均已显示出表达间皮素。通过RT-PCR或免疫化学在肿瘤组织上评估，必须显示出其他转移性或不可切除的癌症表达间皮素。双相间皮瘤必须在上皮成分中50％以上的细胞上表达间皮素。
·如果已知对转移或不可切除的疾病有效，则患者必须至少接受过一种针对转移或不可切除疾病的全身性标准护理(或有效的挽救性化疗方案)，并且曾经是无反应者(进行性疾病)或已经复发。
·大于或等于18岁且小于或等于70岁。
·愿意签署持久授权书。
·能够理解并签署知情同意书。
·ECOG 0或1的临床表现状态。
·从登记本研究之日起至治疗后四个月内，这两种性别的患者都必须愿意进行节育。
·血清学：
ο HIV抗体的血清阴性。
ο乙型肝炎抗原血清阴性、丙型肝炎抗体血清阴性。如果丙型肝炎抗体检测呈阳性，则必须通过RT-PCR检测患者是否存在抗原，并且HCV RNA呈阴性。
·有生育能力的妇女必须接受阴性的妊娠试验，因为该疗法可能会对胎儿造成危险。
·血液学：
ο在没有非格司亭的支持下，绝对中性粒细胞计数大于1000/mm3。
ο WBC(>3000/mm3)。
ο血小板计数大于100000/mm3。
ο血红蛋白大于8.0g/dl。
·化学：
ο血清ALT/AST小于或等于正常上限的2.5倍。
ο血清肌酐小于或等于1.6mg/dl。
ο总胆红素小于或等于1.5mg/dl，但吉尔伯特综合症患者的总胆红素必须小于3.0mg/dl
·自患者接受准备方案之时起，任何先前的全身治疗必须已经过去超过四个星期，并且患者的毒性必须恢复到1级或更低(除了诸如脱发症或白癜风之类的毒性)。
排除标准：
·肉瘤样间皮瘤患者。
·怀孕或哺乳的有生育能力的妇女。
·已知脑转移的患者。
·接受全剂量抗凝治疗的患者。
·活动性全身感染(例如，需要抗感染治疗)、凝血功能障碍或任何其他重大内科疾病。
·任何形式的原发性免疫缺陷。
·并发机会感染。
·糖尿病视网膜病变患者。
·全身性激素治疗。
·对本研究中使用的任何药物有严重的立即超敏反应的历史。
·冠状动脉血运重建或缺血性病史。
·在以下患者中测试的LVEF小于或等于45％：
ο临床显著的房性和/或室性心律失常，包括但不限于房颤、室性心动过速、二级或三级听力障碍、胸痛或缺血性心脏病。
ο年龄大于或等于60岁。
·在以下情况的患者中记录的FEV1小于或等于预期的50％：
ο长期吸烟史(过去两年内吸烟20pk/年)。
ο呼吸功能不全的症状。
·正在接受任何其他研究药物的患者。
调理化学疗法包括第D-7天至D-2天一次以3000mg/m2 IV的环磷酰胺或低强度cy/flu(环磷酰胺300mg/m2/天x 3+氟达拉滨30mg/m2/天x 3)，最后一天发生在D-7至D-2天。
该研究使用两种剂量的IRX5183，剂量范围为15-75mg/m2/天(根据实施例6中的临床试验结果，该范围可能会缩小)，包括三个独立的组；一个用于单独接受meso-CAR-T细胞的患者(第1组)，另一个用于同时接受IRX5183剂量1(第2组)和IRX5183剂量2(第3组)的IRX5183和meso-CAR-T细胞的患者，这两组的每一组将招募26名患者。
第1组的患者在接受条件化疗后，从D0开始，以单次推注剂量1-10x106细胞/kg病人体重的剂量静脉内使用meso-CAR-T进行治疗。
第2组和第3组患者在开始meso-CAR-T细胞之前每天接受IRX5183治疗30天，并持续6个月或直到发生毒性或进展。以1-10×106细胞/kg患者体重的单次推注剂量静脉内施用meso-CAR-T细胞。
预期成果
根据受试者中meso-CAR-T细胞的持续时间、肿瘤生长、转移等情况，对接受RARα激动剂+meso-CAR-T治疗的患者的反应标准进行监测。评估生命质量参数，例如疼痛、表现状态和参与日常活动以及日常器械活动，以评估该疗法对研究患者的影响。预期使用这种RARα激动剂+meso-CAR-T治疗可改善中度表达肿瘤患者的生活质量，并预防疾病进展。另外，将CYP26抗性的RARα激动剂与meso-CAR-T疗法组合使用可导致分化，从而消除这些患者的骨髓中的最小残留疾病。
实施例10
lRX5183+CAR修饰的免疫细胞+靶向免疫疗法治疗肺癌的临床研究
纳入标准和实验设计将基本上与实施例9相同，如下所示：
第1组 meso-CAR-T
第2组 IRX5183(在实施例9中确定的最佳剂量)+meso-CAR-T
第3组 meso-CAR-T+PD-1抑制
第4组 IRX5193+meso-CAR-T+PD-1抑制
剂量、伴随用药和结果评估与实施例9相同。
实施例11
lRX5183在制造CAR修饰的T细胞中的用途
从患者的外周血中纯化自体T淋巴细胞，并与饲养细胞(例如自体抗原呈递细胞)和生长因子(例如IL-2)一起培养。
在激活过程中，将T细胞与编码CAR的病毒载体孵育，几天后，通过稀释和/或培养基交换将载体从培养物中洗出。病毒载体利用病毒机制附着在患者细胞上，进入细胞后，载体以RNA形式引入遗传物质。就CAR T细胞疗法而言，这种遗传物质编码CAR。RNA被反转录成DNA，并永久整合到患者细胞的基因组中。因此，随着细胞分裂并在生物反应器中大量生长，CAR表达得以维持。然后，CAR被患者细胞转录和翻译，并且CAR在细胞表面表达。慢病毒载体的整合位点谱比伽马逆转录病毒载体更安全，通常用于CAR T细胞疗法的临床试验中。
然后将转导的细胞培养至所需数量，以进行多轮CAR-T治疗。可以将培养细胞冷冻保存以备将来使用。
在用病毒载体转导之前和/或之后，将RARα激动剂包括在培养物中，以促进CAR表型的生长和维持。
除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的所有表示成分数量、性质例如分子量、反应条件等的数字均应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。本文所用的术语“约”和“大约”是指在10％至15％之内、优选在5％至10％之内。因此，除非有相反的指示，否则说明书和所附权利要求书中列出的数字参数是近似值，其可以根据本发明试图获得的期望性质而变化。至少，并且不试图将等同原则的应用限制于权利要求的范围，每个数字参数至少应根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值被尽可能精确地报道。但是，任何数值都固有地包含某些误差，这些误差必定是由它们各自的测试测量中发现的标准偏差引起的。
除非另有说明或上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中使用的术语“一”、“一个”、“该”和类似指示物(特别是在以下权利要求的上下文中)应解释为涵盖单数和复数两者。本文中数值范围的列举仅意图用作分别指代该范围内的每个单独数值的简写方法。除非本文另外指出，否则每个单独的值都被并入说明书中，就好像它在本文中被单独引用一样。除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对以其他方式要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为表示对实施本发明必不可少的任何未要求保护的要素。
本文公开的本发明的替代元素或实施方式的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独引用或要求保护，也可以与该组的其他成员或此处找到的其他元素组合使用。预期出于方便和/或可专利性的原因，组中的一个或多个成员可以包括在组中或从中删除。当发生任何这样的包含或删除时，说明书被认为包含经修改的基团，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什基团的书面描述。
本文描述了本发明的某些实施方式，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。当然，在阅读了前面的描述之后，这些描述的实施方式的变型对于本领域普通技术人员将变得显而易见。发明人期望熟练的技术人员适当地采用这样的变型，并且发明人希望以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同物。而且，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元素在其所有可能的变化中的任何组合。
本文所公开的特定实施方式可以使用由语言组成或基本上由语言组成来限制在权利要求中。当在权利要求书中使用时，无论是按修正案提交还是增加，过渡术语“由...组成”排除了权利要求书中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡术语“基本上由组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤以及那些不会实质性地影响基本和新颖特征的材料或步骤。如此要求保护的本发明的实施方式在本文中被固有地或明确地描述和启用。
此外，在整个说明书中，已经对专利和印刷出版物进行了大量参考。上面引用的参考文献和印刷出版物中的每一个均通过引用以其整体全文并入本文。
最后，应理解，本文公开的本发明的实施方式是本发明原理的说明。可以采用的其他修改在本发明的范围内。因此，作为示例而非限制，可以根据本文的教导来利用本发明的替代配置。因此，本发明不限于精确地如所示出和描述的那样。

Claims (64)

1.一种增强嵌合抗原受体-修饰的免疫细胞(CAR-MIC)癌症免疫疗法的方法，其包括向正在接受、已经接受或计划接受CAR-MIC的癌症患者施用至少一种分化性视黄酸受体(RAR)活性剂，其中该分化性RAR活性剂是RARα激动剂。
2.一种癌症免疫治疗的方法，其包括向有需要的受试者施用CAR-MIC和至少一种分化性RAR活性剂，其中所述分化性RAR活性剂是RARα激动剂。
3.一种降低CAR-修饰的免疫细胞毒性的方法，该方法包括向有需要的受试者施用至少一种RARα激动剂与CAR-修饰的免疫细胞的组合，使得这种组合的结果是，与单独施用CAR-修饰的免疫细胞相比，施用CAR-修饰的免疫细胞的剂量更低，但功效没有降低。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，与单独施用CAR-修饰的免疫细胞相比，安全性相同或提高。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，进一步包括给予免疫检查点抑制剂，其中所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4、PD-1、TIM-3、LAG-3、PD-L1配体、B7-H3、B7-H4、BTLA中的至少一种抑制剂或是ICOS或OX40激动剂，其中所述免疫检查点抑制剂是抗体或其他免疫检查点抑制剂。
6.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述RARα激动剂是选择性RARα激动剂。
7.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述RARα激动剂是CYP26代谢-抗性RARα激动剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述CYP26代谢-抗性RARα激动剂是选择性RARα阿尔法激动剂。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述RARα激动剂是通式(I)的化合物：
Figure FDA0002395209160000011
其中R1为H或C1-6烷基，R2和R3独立为H或F，且R4为卤素。
10.根据权利要求9所述的方法，其中R4为F、Cl、Br或I。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述RARα激动剂是具有式(II)的结构的化合物：
Figure FDA0002395209160000021
其中R1为H或C1-6烷基。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述RARα激动剂是具有式(III)的结构的化合物：
Figure FDA0002395209160000022
13.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述RARα激动剂是他米巴罗汀(AM80；4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)氨基甲酰基]苯甲酸)。
14.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述RARα激动剂是AM580(4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)甲酰胺基]苯甲酸)。
15.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述RARα激动剂是Re 80(4-[1-羟基-3-氧代-3-(5,6,7,8-四氢-3-羟基-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯基]苯甲酸)。
16.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述CAR修饰的免疫细胞是CAR修饰的T细胞。
17.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述CAR修饰的免疫细胞是CAR修饰的NK细胞。
18.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述CAR修饰的免疫细胞是CAR修饰的巨噬细胞。
19.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述癌症是血液系统恶性肿瘤。
20.根据权利要求19所述的方法，其中血液系统恶性肿瘤选自急性髓细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病(CML)、加速的CML、CML急变期(CML-BP)、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、骨髓增生异常综合症(MDS)、难治性贫血(RA)、带环状铁粒母细胞的RA、过度成胚的RA(RAEB)、转化中的RAEB或骨髓增生异常综合征。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述血液系统恶性肿瘤是急性髓细胞性白血病。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述血液系统恶性肿瘤是多发性骨髓瘤。
23.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症是可转移至骨骼的实体瘤，其中所述实体瘤是胰腺癌；膀胱癌；结肠直肠癌；乳腺癌，包括转移性乳腺癌；前列腺癌，包括雄激素依赖性和非雄激素依赖性前列腺癌；肾癌、转移性肾细胞癌；肝细胞癌；肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌、支气管肺泡癌(BAC)和肺腺癌；卵巢癌、进行性上皮癌、原发性腹膜癌；宫颈癌；胃癌；食道癌；头颈癌、头颈部鳞状细胞癌；黑色素瘤、神经内分泌癌、转移性神经内分泌肿瘤；脑肿瘤、神经胶质瘤、间变性少突胶质细胞瘤、成年成胶质母细胞瘤、成年间变性星形细胞瘤；骨癌和软组织肉瘤。
25.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中施用RARα激动剂导致对CAR修饰的免疫细胞的最小残留疾病敏感，由此将RARα激动剂与CAR修饰的免疫细胞组合导致对受试者的无病生存期的改善。
26.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在施用CAR-修饰的免疫细胞之前施用RARα激动剂至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周或至少1个月。
27.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在施用CAR-修饰的免疫细胞之前中断施用所述RARα激动剂。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述RARα激动剂是式III(IRX5183)。
29.根据权利要求28的方法，进一步包括施用硼替佐米。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
31.分化性RAR活性剂在正在接受、已经接受或计划接受嵌合抗原受体-修饰的免疫细胞(CAR-MIC)的癌症患者的癌症治疗中，增强CAR-MIC的免疫治疗作用中的应用，其中分化性RAR活性剂是RARα激动剂。
32.分化性RAR活性剂在制造药物中的用途，所述药物用于在正在接受、已经接受或计划接受CAR-MIC的癌症患者的癌症治疗中增强CAR-MIC的免疫治疗，其中所述分化性RAR活性剂是RARα激动剂。
33.嵌合抗原受体-修饰的免疫细胞(CAR-MIC)和分化性RAR活性剂在癌症免疫疗法中的应用，其中分化性RAR活性剂是RARα激动剂。
34.分化性RAR活性剂在制造用于癌症免疫疗法的药物中的用途，其中分化性RAR活性剂是RARα激动剂，并且其中该药物适合与CAR-MIC配合使用。
35.分化性RAR活性剂在正在接受、已经接受或计划接受CAR-MIC的癌症患者中，降低嵌合抗原受体-修饰的免疫细胞(CAR-MIC)的癌症免疫疗法的毒性中的应用，其中分化性RAR活性剂是RARα激动剂，并且与单独使用CAR-MIC相比，其中可以使用较低剂量的CAR-MIC而不降低功效。
36.分化性RAR活性剂在制造药物中的用途，所述药物用于在正在接受、已经接受或计划接受CAR-MIC的癌症患者中，降低CAR-MIC癌症免疫疗法毒性，其中所述分化性RAR活性剂是RARα激动剂，并且与单独使用CAR-MIC相比，可以使用更低剂量的CAR-MIC而不降低功效。
37.根据权利要求35所述的分化性RAR活性剂的应用或权利要求36所述的用途，其中，与单独施用所述CAR-修饰的免疫细胞相比，安全性相同或提高。
38.嵌合抗原受体-修饰免疫细胞(CAR-MIC)、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂在正在接受、已经接受或计划接受CAR-MIC的癌症患者的癌症免疫治疗中的应用，其中分化性RAR活性剂是RARα激动剂，所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4、PD-1、TIM-3、LAG-3、PD-L1配体、B7-H3、B7-H4、BTLA中的至少一种抑制剂或是ICOS或OX40激动剂。
39.分化性RAR活性剂在制造药物中的用途，所述药物用于正在接受、已经接受或计划接受CAR-MIC的癌症患者中用于癌症免疫治疗，其中分化性RAR活性剂是RARα激动剂，并且其中该药物适合与CAR-MIC和免疫检查点抑制剂配合使用，其中所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4、PD-1、TIM-3、LAG-3、PD-L1配体、B7-H3、B7-H4、BTLA中的至少一种的抑制剂或是ICOS或OX40激动剂。
40.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项的用途，其中所述RARα激动剂是选择性RARα激动剂。
41.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中所述RARα激动剂是CYP26代谢-抗性的RARα激动剂。
42.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中所述RARα激动剂是CYP26代谢-抗性的选择性RARα阿尔法激动剂。
43.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中所述RARα激动剂是通式(I)的化合物
Figure FDA0002395209160000051
其中R1为H或C1-6烷基，R2和R3独立为H或F，且R4为卤素。
44.根据权利要求43所述的分化性RAR活性剂的应用或所述的用途，其中R4为F、Cl、Br或I。
45.根据权利要求43所述的分化性RAR活性剂的应用或所述的用途，其中所述RARα激动剂是具有式(II)结构的化合物：
Figure FDA0002395209160000052
其中R1为H或C1-6烷基。
46.根据权利要求45所述的分化性RAR活性剂的应用或所述的用途，其中所述RARα激动剂是具有式(III)结构的化合物：
Figure FDA0002395209160000053
47.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中所述RARα激动剂是他米巴罗汀(AM80；4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)氨基甲酰基]苯甲酸)。
48.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中所述RARα激动剂是AM580(4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)甲酰胺基]苯甲酸)。
49.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中所述RARα激动剂为Re 80(4-[1-羟基-3-氧代-3-(5,6,7,8-四氢-3-羟基-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯基]苯甲酸)。
50.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中所述CAR修饰的免疫细胞是CAR修饰的T细胞。
51.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中所述CAR修饰的免疫细胞是CAR修饰的NK细胞。
52.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中所述CAR修饰的免疫细胞是CAR修饰的巨噬细胞。
53.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中所述癌症是血液系统恶性肿瘤。
54.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中所述癌症是选自急性髓细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病(CML)、加速的CML、CML急变期(CML-BP)、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、骨髓增生异常综合症(MDS)、难治性贫血(RA)、带环状铁粒母细胞的RA、过度成胚的RA(RAEB)、转化中的RAEB以及骨髓增生异常综合征中的血液系统恶性肿瘤。
55.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中所述癌症是急性髓细胞性白血病。
56.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项的用途，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
57.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中所述癌症是实体瘤。
58.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中所述癌症是可转移至骨骼的实体肿瘤，其中所述实体瘤选自胰腺癌；膀胱癌；结肠直肠癌；乳腺癌，包括转移性乳腺癌；前列腺癌，包括雄激素依赖性和非雄激素依赖性前列腺癌；肾癌、转移性肾细胞癌；肝细胞癌；肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌、支气管肺泡癌(BAC)和肺腺癌；卵巢癌、进行性上皮癌、原发性腹膜癌；宫颈癌；胃癌；食道癌；头颈癌、头颈部鳞状细胞癌；黑色素瘤、神经内分泌癌、转移性神经内分泌肿瘤；脑肿瘤、神经胶质瘤、间变性少突胶质细胞瘤、成年成胶质母细胞瘤、成年间变性星形细胞瘤；骨癌和软组织肉瘤。
59.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中施用RARα激动剂导致对CAR修饰的免疫细胞的最小残留疾病敏感，由此RARα激动剂与CAR修饰的免疫细胞组合导致对受试者的无病生存期的改善。
60.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中在施用CAR-MIC之前施用所述RARα激动剂至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周或至少1个月。
61.根据权利要求31、35或37中任一项所述的分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求33所述的CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用，根据权利要求38所述的CAR-MIC、免疫检查点抑制剂和分化性RAR活性剂的应用，或根据权利要求32、34、36或39中任一项所述的用途，其中在施用CAR-修饰的免疫细胞之前中断施用所述RARα激动剂。
62.根据权利要求61所述的分化性RAR活性剂的应用，CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用或用途，其中所述RARα激动剂为式III(IRX5183)。
63.根据权利要求62所述的分化性RAR活性剂的应用，CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用或用途，癌症患者也要施用硼替佐米。
64.根据权利要求63所述的分化性RAR活性剂的应用，CAR-MIC和分化性RAR活性剂的应用或用途，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
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