CN107427581A - T细胞群的改变方法 - Google Patents

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杉山治夫
藤木文博
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International Institute of Cancer Immunology Inc
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Abstract

本发明提供一种增大T细胞群中记忆T细胞的比例的方法，包括将类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂添加到T细胞群中的步骤。

Description

T细胞群的改变方法
技术领域
本发明涉及调节免疫细胞、尤其T细胞的分化而改变T细胞群的方法。
背景技术
所谓免疫疗法，通常是指通过种种方法活化患者的免疫系统，或通过将在患者的体外活化的免疫细胞导入患者体内等，来治疗疾病的方法。作为免疫疗法，迄今开发了免疫细胞疗法、肽疫苗疗法、细胞因子疗法、抗体疗法等的种种方法。
近年来，人们发现，通过使用癌基因产物WT1来源的部分肽(WT1肽)刺激免疫细胞(尤其抗原提呈细胞或T细胞)，可达成肿瘤特异性细胞毒性T细胞(CTL)的诱导或辅助T细胞的活化(专利文献1~4和非专利文献1)，作为基于WT1肽疫苗的癌免疫疗法，面向实用化的研究正在开展。
然而，如上述WT1肽疫苗那样在临床试验中显示有效性的免疫疗法为数不多。另外，取决于患者的免疫状态(免疫抑制、免疫细胞的分化阶段和活性)，免疫疗法有时也无法得到充分的效果，人们期望开发提高免疫疗法的效果的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1 ：国际公开2003/106682号公报
专利文献2 ：国际公开2005/095598号公报
专利文献3 ：国际公开2007/097358号公报
专利文献4 ：国际公开2012/046730号公报
非专利文献
非专利文献1 ： Oka Y等人， Immunogenetics. 2000 Feb；51(2)：99-107。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供能够改变对象的免疫状态以增强免疫疗法的效果的物质和方法。
用于解决课题的手段
本发明人发现，通过调节类视黄醇代谢途径或视黄酸信号传导系统，可增大T细胞群中记忆T细胞的比例，增强对象的免疫应答，从而完成了本发明。
即，本发明提供：
(1) 增大T细胞群中记忆T细胞的比例的方法(以下亦称“本发明的记忆T细胞比例增大方法”)，其包括下述步骤：将类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂添加到T细胞群中；
(2) (1)所述的方法，其中，调节剂是类视黄醇代谢途径的抑制剂和/或视黄酸信号传导系统的抑制剂；
(3) (2)所述的方法，其中，抑制剂抑制视黄醇向视黄醛的转化、视黄醛向视黄酸的转化、β-胡萝卜素向视黄醛的转化、β-胡萝卜素向β-阿朴胡萝卜素醛的转化、或β-阿朴胡萝卜素醛向视黄醛和视黄酸的转化；
(4) (2)或(3)所述的方法，其中，抑制剂是抑制编码选自视黄醇脱氢酶、视黄醛氧化酶、视黄醛脱氢酶、β-胡萝卜素-15,15'-单加氧酶1、和β-胡萝卜素加氧酶2的酶的基因表达的RNA分子，产生该RNA分子的核酸分子，包含该核酸分子的载体，抑制该酶作用的化合物，或该酶的显性失活变体蛋白；
(5) (4)所述的方法，其中，抑制剂是抑制编码视黄醇脱氢酶的基因表达的RNA分子，该RNA分子选自siRNA、shRNA、miRNA、stRNA和反义RNA；
(6) (4)所述的方法，其中，抑制剂是抑制视黄醇脱氢酶作用的化合物；
(7) (2)所述的方法，其中，抑制剂是抑制编码视黄酸受体拮抗剂、视黄酸受体的显性失活变体蛋白、视黄酸受体的基因表达的RNA分子，产生该RNA分子的核酸分子，或包含该核酸分子的载体；
(8) (1)所述的方法，其中，调节剂是视黄酸信号传导系统的促进剂；
(9) (8)所述的方法，其中，促进剂是视黄酸受体激动剂；
(10) 癌或传染病的预防和/或治疗的辅助剂(以下亦称“本发明的癌/传染病的预防/治疗辅助剂”)，其包含类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂；
(11) 癌的免疫疗法的辅助剂(以下亦称“本发明的癌免疫疗法辅助剂”)，其包含类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂；
(12) 免疫力增强剂(以下亦称“本发明的免疫力增强剂”)，其包含类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂；
(13) T细胞群的制作方法(以下亦称“本发明的T细胞群制作方法”)，其包括下述步骤：通过将类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂添加到T细胞群中，增大该T细胞群中记忆T细胞的比例；
(14) T细胞群(以下亦称“本发明的T细胞群”)，其通过(13)的方法制作；
(15) 用于癌或传染病的预防和/或治疗的药盒(以下亦称“本发明的癌/传染病的预防/治疗用药盒”)，其包含：
(a) 癌抗原、该传染病的病原体或该病原体的抗原、或者经这些抗原或病原体刺激或活化的免疫细胞，和
(b) 类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂；
(16) 用于增大T细胞群中记忆T细胞的比例的类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂；
(17) 用于在癌或传染病的预防和/或治疗中的用途的类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂；
(18) (17)所述的调节剂，其用于癌的免疫疗法中的用途；
(19) 用于癌或传染病的预防和/或治疗中的用途的联合药物，其包含：
(a) 癌抗原、该传染病的病原体或该病原体的抗原、或者经这些抗原或病原体刺激或活化的免疫细胞，和
(b) 类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂；
(20) 癌或传染病的预防和/或治疗方法(以下亦称“本发明的癌/传染病的预防/治疗方法”)，其包括：将有效量的癌抗原、该传染病的病原体或该病原体的抗原、或者经这些抗原或病原体刺激或活化的免疫细胞、以及有效量的类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂给予对象；
(21) 传染病的预防和/或治疗方法(以下亦称“本发明的传染病预防/治疗方法”)，其包括：将有效量的类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂给予对象；
(22) 对象的免疫力增强方法(以下亦称“本发明的免疫力增强方法”)，其包括：将有效量的类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂给予对象；
(23) 类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂在制造用于癌或传染病的预防和/或治疗的药物中的用途；以及
(24) 下述(a)和(b)在制造用于癌或传染病的预防和/或治疗的药物中的联合用途：
(a) 癌抗原、该传染病的病原体或该病原体的抗原、或者经这些抗原或病原体刺激或活化的免疫细胞，和
(b) 类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂。
发明效果
本发明中所用的类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂可经由增大T细胞群中记忆T细胞的比例而增强对象的针对抗原的免疫应答。因此，本发明的记忆T细胞比例增大方法、癌/传染病的预防/治疗辅助剂、癌免疫疗法辅助剂、免疫力增强剂、T细胞群制作方法和通过该方法制作的T细胞群、以及癌/传染病的预防/治疗用药盒可以用于包括癌和传染病在内的种种疾病的预防/治疗。另外，通过将它们与针对包括癌和传染病在内的种种疾病的免疫疗法组合，可以提高该免疫疗法的效果。
附图简述
图1是显示 T细胞分化的概况的图。
图2是显示使用shRNA抑制视黄醇脱氢酶10表达对T细胞群的构成的影响的图。
图3是显示视黄醇脱氢酶10的表达抑制和高表达对T细胞增殖和效应子功能的影响的图。图表以相对于对照(DMSO)的变化率显示。mock表示对照载体。
图4是显示RDH10高表达对类视黄醇代谢的影响的图。横轴是HPLC分馏的级分编号。
图5是显示用于制作RDH10敲除小鼠的构建体的图。
图6是显示RDH10基因敲除对类视黄醇代谢的影响的图。横轴是HPLC分馏的级分编号。“f/f”表示对照小鼠，“f/f cre”表示RDH10条件性敲除小鼠。
图7是显示RDH10敲除小鼠中记忆T细胞的增加的图。
图8是显示RDH10敲除小鼠中记忆T细胞的增加的图。
图9是显示RDH10敲除小鼠中T细胞表面分子及其转录因子的表达的图。
图10是显示RDH10敲除小鼠中淋巴器官的细胞数的图。
图11是显示RDH10敲除小鼠中T细胞数的图。
图12是显示使用李斯特菌属菌传染病模型的RDH10缺失T细胞的功能分析和记忆T细胞形成的评价试验概况的图。“f/f cre”是RDH10条件性敲除小鼠，“f/f”表示对照小鼠。
图13是显示李斯特菌属菌传染病模型中移入的T细胞比率的图。“f/f cre”表示RDH10条件性敲除小鼠来源的T细胞，“f/f”表示对照小鼠来源的T细胞。
图14是显示李斯特菌属菌传染病模型中移入的T细胞表型的图。“f/f cre”表示RDH10条件性敲除小鼠来源的T细胞，“f/f”表示对照小鼠来源的T细胞。右下的图中，未涂盖的峰表示RDH10敲除小鼠来源的T细胞，涂盖的峰表示对照小鼠来源的T细胞。
图15是显示李斯特菌属菌传染病模型中移入的T细胞表型的图。“f/f cre”表示RDH10条件性敲除小鼠来源的T细胞，“f/f”表示对照小鼠来源的T细胞。
图16是显示李斯特菌属菌传染病模型中移入的T细胞的增殖能力和李斯特菌属菌排除能力的图。“f/f cre”表示移入了RDH10条件性敲除小鼠来源的T细胞的小鼠，“f/f”移入了对照小鼠来源的T细胞的小鼠。
图17是示意性地显示李斯特菌属菌传染病模型中评价的RDH10基因敲除效果的图。
图18是显示维生素A缺乏状态中RDH10缺失的影响的图。“f/f cre”表示RDH10条件性敲除小鼠，“f/f”表示对照小鼠。
图19是显示视黄酸对T细胞分化的促进的图。
图20是显示视黄酸和RAR拮抗剂对T细胞的凋亡易感性的影响的图。
图21是显示视黄酸和RAR拮抗剂对T细胞的分裂能力和增殖能力的影响的图。
图22是显示视黄酸和RAR拮抗剂对记忆T细胞比例的影响的图。
图23是显示视黄酸和RAR拮抗剂对小鼠中T细胞群的重新构建的影响的图。
图24是显示视黄酸和RAR拮抗剂对WT1332特异性记忆T细胞的比例和增殖能力的影响的图。
图25是显示从效应T细胞诱导记忆T细胞的实验概况的图。
图26是显示视黄酸和RAR拮抗剂对效应T细胞的影响的图。
图27是显示视黄酸和RAR拮抗剂对从效应T细胞重新形成的T细胞群中记忆T细胞的比例和T细胞的增殖能力的影响的图。
图28是显示使用人WT1肽和RAR拮抗剂的抗肿瘤免疫诱导实验概况的图。
图29是显示使用人WT1肽和RAR拮抗剂的抗肿瘤免疫诱导实验结果的图。
图30是显示各种RAR激动剂所致的记忆T细胞频率减少的图。CD62L表达量图表的纵轴是平均荧光强度(MFI)。
图31是显示各种RAR拮抗剂所致的记忆T细胞频率增加的图。CD62L表达量图表的纵轴是平均荧光强度(MFI)。
图32是显示RAR拮抗剂所致的CD4＋T细胞的细胞毒活性增强的图。E/T比表示CD4＋T细胞数相对于靶细胞数的比率。
图33是显示检测细胞的微粒体级分中所含的RDH10蛋白的Western分析结果的图。
图34是显示RDH10的酶活性测定结果的图。
图35是显示低分子抑制剂对RDH10的酶活性的影响的图。
图36是显示在体外RDH10抑制剂对记忆T细胞频率的影响的图。
图37是显示在体外RDH10抑制剂对记忆T细胞频率的影响的图。
图38是显示对重组李斯特菌属感染小鼠的RDH10抑制剂给予试验概况的图。
图39是显示在体内RDH10抑制剂对记忆T细胞频率的影响的图。
图40是显示在体内RDH10抑制剂对记忆T细胞频率的影响的图。
图41是显示使用RDH10抑制剂的抗肿瘤免疫诱导实验概况的图。
图42是显示仅使用RDH10抑制剂的肿瘤增殖抑制实验概况的图。
图43是显示使用RDH10抑制剂的抗肿瘤免疫诱导实验结果的图。
图44是显示仅使用RDH10抑制剂的肿瘤增殖抑制实验结果的图。
具体实施方式
就T细胞而言，从未分化状态的幼稚T细胞分化成具有种种功能的T细胞亚群。在分化的T细胞中，在免疫应答中发挥较大作用的是CD4阳性T细胞(辅助T细胞)和CD8阳性T细胞(杀伤T细胞)。CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞中的任一者均可视分化阶段而分类成记忆细胞(中央记忆细胞和效应记忆细胞)和效应细胞(效应细胞和终末效应细胞)。需说明的是，在本说明书中，以“+”号表示CD抗原表达的阳性，以“-”号表示阴性。例如，CD4阳性T细胞表示CD4＋T细胞。
这些T细胞亚群可通过鉴定细胞所表达的表面抗原、所产生的细胞因子或干扰素等来确定。例如，取决于表面抗原CD127和CD62L的表达，CD4＋T细胞和CD8＋T细胞可被分类成中央记忆细胞(CD127＋、CD62L＋)、效应记忆细胞(CD127＋、CD62L-)、效应细胞(CD127-、CD62L＋)或终末效应细胞(CD127-、CD62L-)的任一种。受刺激的T细胞依次分化成中央记忆细胞、效应记忆细胞、效应细胞、终末效应细胞(图1)。这些细胞中，中央记忆细胞具有最高的增殖能力，IL-2产生量最多。随着分化向终末效应细胞的进行，IL-2产生量减少，IFN-γ产生量增加，且容易发生凋亡。作为记忆T细胞的特征，可举出难以发生凋亡和具有强的增殖能力。因此，通过本发明的方法增大T细胞群中记忆T细胞的比例，有助于达成更强的免疫。
本发明的记忆T细胞比例增大方法中所用的类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂可以是类视黄醇代谢途径的抑制剂或视黄酸信号传导系统的抑制剂，也可以是该代谢途径的促进剂或该信号传导系统的促进剂。一个优选的方案中，该调节剂是类视黄醇代谢途径的抑制剂或视黄酸信号传导系统的抑制剂。另一个优选的方案中，该调节剂是视黄酸信号传导系统的促进剂。也可以组合使用这些调节剂的2种以上。
对于向T细胞群中添加类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂，既可以在体外进行，也可以在体内进行。作为体外添加的实例，可举出向培养T细胞群的培养基中添加该调节剂。作为体内添加的实例，可举出向对象的体内注入该调节剂。
类视黄醇代谢途径的抑制剂
通过本发明的记忆T细胞比例增大方法增大T细胞群中记忆T细胞的比例，可经由抑制从幼稚T细胞或记忆T细胞向效应T细胞的分化和/或从效应(或终末效应)T细胞诱导记忆T细胞(尤其中央记忆T细胞)来达成。
一个方案中，本发明的记忆T细胞比例增大方法通过抑制类视黄醇代谢途径来增大T细胞群中记忆T细胞、尤其中央记忆T细胞的比例。在本说明书中，所谓抑制类视黄醇代谢途径，是指抑制从视黄醇或β-胡萝卜素等的维生素A(类视黄醇)或前维生素A(类视黄醇前体)生成视黄酸的代谢途径中的任一的反应。本发明的一个方案中，类视黄醇代谢途径的抑制剂抑制下述反应中的任一个以上：视黄醇转化成视黄醛的反应、视黄醛转化成视黄酸的反应、β-胡萝卜素转化成视黄醛的反应、β-胡萝卜素转化成β-阿朴胡萝卜素醛的反应、和β-阿朴胡萝卜素醛转化成视黄醛和视黄酸的反应。
本发明的一个方案中，类视黄醇代谢途径的抑制剂抑制催化类视黄醇代谢途径中的任一的反应的酶(以下亦称“类视黄醇代谢酶”)的表达或作用，该酶例如视黄醇脱氢酶、视黄醛氧化酶、视黄醛脱氢酶、β-胡萝卜素-15,15'-单加氧酶1(BCMO1)、β-胡萝卜素加氧酶2(BCO2)等。一个优选的方案中，类视黄醇代谢途径的抑制剂是视黄醇脱氢酶的抑制剂，更优选为由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成的视黄醇脱氢酶10(编码该酶的DNA序列示为SEQID NO: 2)或其同系物的抑制剂。在此，所谓视黄醇脱氢酶10的同系物，是指由与SEQ IDNO: 1的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的序列同源性的氨基酸序列组成的蛋白，或由在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中1个或数个、例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个的氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列组成的蛋白。
本发明的一个方案中，类视黄醇代谢途径的抑制剂是抑制编码上述类视黄醇代谢酶的基因表达的RNA分子、产生该RNA分子的核酸分子和包含该核酸分子的载体中的任一者。
抑制编码类视黄醇代谢酶的基因表达的RNA分子通常以编码类视黄醇代谢酶的mRNA为靶标，通过诱导该mRNA的分解或抑制其翻译等来抑制该代谢酶的产生。作为这样的RNA分子，可举出siRNA、shRNA、miRNA、stRNA和反义RNA等。优选的RNA分子的实例是siRNA和shRNA。一个方案中，成为基因表达的抑制对象的类视黄醇代谢酶是视黄醇脱氢酶，尤其是视黄醇脱氢酶10。一个优选的方案中，抑制编码视黄醇脱氢酶的基因表达的RNA分子以从由SEQ ID NO: 2的核苷酸序列或与该序列具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上或98%以上的序列同源性的核苷酸序列组成的DNA转录的mRNA为靶标，抑制视黄醇脱氢酶10的产生。一个优选的方案中，该RNA分子是双链部分的有义链由SEQ ID NO: 3的核苷酸序列组成，且该双链部分的反义链由SEQ ID NO: 4的核苷酸序列组成的siRNA或shRNA，尤其shRNA。
所谓上述产生RNA分子的核酸分子，是指直接或间接产生该RNA分子的核酸分子，可举出例如包含对应于该RNA分子的核苷酸序列的DNA构建体或重组逆转录病毒RNA。在此提及的所谓“直接”，是指通过例如自DNA的转录或前体RNA的加工(剪接或编辑等)来产生目标RNA分子的情况等，另一方面，所谓“间接”，是指通过例如自RNA的逆转录产生DNA，接着通过自该DNA的转录产生目标RNA分子的情况等。
上述包含核酸分子的载体可以是引起目标RNA分子的瞬时表达(生产)的“表达载体”，也可以是通过将DNA序列插入到染色体中引起目标RNA分子的稳定表达(生产)的“转化载体”。作为本发明中可用的载体种类，可举出质粒载体、DNA病毒载体、RNA病毒载体等，动物细胞，只要是例如人细胞中可使用的载体，就不限于此。例如，若使包含含有所期望的RNA分子和启动子的核苷酸序列的RNA构建体的逆转录病毒载体感染细胞，则通过逆转录而生成对应于该RNA构建体的DNA构建体，该DNA构建体被插入到该细胞的染色体中，由该插入的DNA构建体转录该所期望的RNA分子。
抑制类视黄醇代谢酶作用的化合物可以是低分子化合物，也可以是高分子化合物。作为该高分子化合物，可举出例如与类视黄醇代谢酶结合的抗体及其抗原结合性片段(Fab、F(ab’)2等)以及ScFv等。抑制类视黄醇代谢酶作用的低分子化合物可通过例如从以对该酶活性的抑制作用为指标的化合物文库进行筛选等该技术领域公知的方法来获取。与类视黄醇代谢酶结合的抗体、其抗原结合性片段、ScFv等还可以通过将酶用作抗原的动物免疫或噬菌体展示等该技术领域公知的方法来获取。
一个方案中，抑制类视黄醇代谢酶作用的化合物是抑制视黄醇脱氢酶作用的化合物，优选为抑制视黄醇脱氢酶10(SEQ ID NO: 1)作用的化合物(以下亦称“RDH10抑制剂”)。一个方案中，RDH10抑制剂是具有以下式(I)所表示的结构的化合物或其盐：
[化学式1]
[式中，R是H或CH3，
Z是HO-或HOOC-Y-COO-，
Y是-CH2CH2-、-CH＝CH-或亚苯基]。
优选的方案中，式(I)中的Z是HOOC-Y-COO-。更优选地，Y是-CH＝CH-或亚苯基。
另外，作为式(I)所表示的化合物的盐，可举出钠盐、钾盐等，优选钠盐。
优选RDH10抑制剂是选自RDHI-001、RDHI-002、RDHI-003、RDHI-004、RDHI-005、RDHI-006、RDHI-007、RDHI-008、RDHI-009、RDHI-010和RDHI-011的1种以上的化合物。
更优选RDH10抑制剂是选自RDHI-001、RDHI-002、RDHI-003和RDHI-004的1种以上的化合物。
进一步优选RDH10抑制剂是选自RDHI-001、RDHI-002和RDHI-003的1种以上的化合物。
RDHI-001~RDHI-011分别是以下的式所表示的化合物。
[化学式2]
[化学式3]
[化学式4]
[化学式5]
[化学式6]
[化学式7]
[化学式8]
[化学式9]
[化学式10]
[化学式11]
[化学式12]
。
本发明中，也可将类视黄醇代谢酶的显性失活变体蛋白用作类视黄醇代谢途径的抑制剂。该显性失活变体蛋白可通过例如制作类视黄醇代谢酶的变体蛋白并选择与底物具有结合能力但不具有原本的催化作用的变体蛋白等来获取。另外，通过分析酶的功能部位，可以使所期望的变体蛋白的制作和选择步骤更为有效。
类视黄醇代谢途径的促进剂或抑制剂也可通过所谓的SBDD(Structure-BasedDrug Design, 基于结构的药物设计)方法获取。例如，纯化视黄醇脱氢酶10等的类视黄醇代谢酶、结晶并经X射线分析来确定立体结构，基于该立体结构设计该类视黄醇代谢酶所结合的化合物，并试验该化合物的活性，从而可以鉴定作为类视黄醇代谢途径的促进剂或抑制剂起作用的化合物。
视黄酸信号传导系统及其抑制剂
所谓视黄酸信号传导系统，是指通过视黄酸(以下亦称“RA”)与细胞核内的视黄酸受体(以下亦称“RAR”)结合而产生的信号(例如，具有视黄酸应答序列的基因的转录调节等)的传导系统。一个方案中，本发明的记忆T细胞比例增大方法通过抑制所述信号传导系统来增大T细胞群中记忆T细胞、尤其中央记忆T细胞的比例。一个优选的方案中，本发明的记忆T细胞比例增大方法通过抑制视黄酸信号传导系统来增大T细胞群中CD4阳性记忆T细胞的比例。
作为视黄酸信号传导系统的抑制剂，可举出视黄酸受体拮抗剂、视黄酸受体的显性失活变体蛋白、抑制编码视黄酸受体的基因表达的RNA分子、产生该RNA分子的核酸分子和包含该核酸分子的载体等。一个优选的方案中，该抑制剂是视黄酸受体拮抗剂。
作为视黄酸受体拮抗剂，可举出LE540、LE135、LE550、BMS195614、MM11253、AGN194310、Ro41-5253、AGN193109、CD2665、BMS493等的化合物和它们的类似物或衍生物、以及阻断视黄酸和视黄酸受体的结合的抗体等。一个优选的方案中，视黄酸受体拮抗剂是选自LE540、LE135、BMS195614和MM11253以及它们的类似物和衍生物的1种以上的化合物。LE540、LE135、LE550、BMS195614、MM11253、AGN194310、Ro41-5253、AGN193109、CD2665和BMS493分别由以下的式表示。
[化学式13]
[化学式14]
[化学式15]
[化学式16]
[化学式17]
[化学式18]
[化学式19]
[化学式20]
[化学式21]
[化学式22]
。
作为视黄酸受体拮抗剂起作用的上述以外的化合物可通过从与视黄酸或LE540等具有类似结构的化合物文库进行筛选等该技术领域公知的方法来获取。
本发明中，也可以将视黄酸受体的显性失活变体蛋白用作视黄酸信号传导系统的抑制剂。该显性失活变体蛋白可通过例如制作视黄酸受体的变体蛋白并选择与视黄酸具有结合能力但不产生信号的变体蛋白等来获取。另外，通过分析受体的功能部位，可使所期望的变体蛋白的制作和选择步骤更为有效。
本发明的另一方案中，可以将抑制编码视黄酸受体的基因(RAR基因)表达的RNA分子用作视黄酸信号传导系统的抑制剂。抑制RAR基因表达的RNA分子通常以编码RAR的mRNA为靶标，通过诱导该mRNA的分解或抑制其翻译等来抑制RAR的产生。作为所述RNA分子的种类，可举出siRNA、shRNA、miRNA、stRNA和反义RNA等。优选的RNA分子的实例是siRNA和shRNA。
例如对于人而言，作为视黄酸受体已知有RARα、RARβ和RARγ这3种亚型，并报道了各个亚型的多个同种型(变体)。例如，对于RARα，已知有由NP_000955、NP_001019980和NP_001138774的氨基酸序列组成的同种型，对于RARβ，已知有由NP_000956和NP_057236的氨基酸序列组成的同种型，对于RARγ，已知有由NP_000957、NP_001036193、NP_001230661、NP_001230659和NP_001230660(均以NCBI(National Center for BiotechnologyInformation，美国国立生物技术信息中心)的检索号表示)的氨基酸序列组成的同种型，在本说明书中，编码这些同种型的DNA序列分别表示为SEQ ID NO: 5~14。因此，一个优选的方案中，抑制RAR基因表达的RNA分子以从由SEQ ID NO: 5~14的任一的核苷酸序列或与该序列具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上或98%以上的序列同源性的核苷酸序列组成的DNA转录的mRNA为靶标，抑制RARα、RARβ和RARγ中1种以上的产生。
另外，对于(直接或间接)产生抑制RAR基因表达的RNA分子的“核酸分子”和包含该核酸分子的“载体”的定义和例示，与上文就产生“抑制编码类视黄醇代谢酶的基因表达的RNA分子”的核酸分子和包含该核酸分子的载体叙述的内容一样。
视黄酸信号传导系统的促进剂
一个方案中，本发明的记忆T细胞比例增大方法通过促进视黄酸信号传导系统来增大T细胞群中记忆T细胞的比例。例如，通过使视黄酸信号传导系统的促进剂作用于幼稚T细胞，可有效地使该T细胞分化以增加记忆T细胞。因此，一个方案中，本发明的记忆T细胞比例增大方法通过将视黄酸信号传导系统的促进剂添加到包含幼稚T细胞的T细胞群中来增大该T细胞群中记忆T细胞的比例。在所述方案中，添加视黄酸信号传导系统的促进剂的T细胞群中幼稚T细胞的比例优选为20%以上，例如30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上或95%以上。添加视黄酸信号传导系统的促进剂的T细胞群也可以仅由幼稚T细胞组成。
作为视黄酸信号传导系统的促进剂，可举出视黄酸受体激动剂、具有编码视黄酸受体的核苷酸序列的核酸分子等，优选为视黄酸受体激动剂。一个优选的方案中，视黄酸受体激动剂是视黄酸、尤其全反式视黄酸(ATRA)。另一个优选的方案中，视黄酸受体激动剂是选自全反式视黄酸(ATRA)、LE511、AM580、AC55649和CD437以及它们的类似物和衍生物的1种以上的化合物。全反式视黄酸(ATRA)、LE511、AM580、AC55649和CD437分别由以下的式表示。
[化学式23]
全反式视黄酸
[化学式24]
[化学式25]
[化学式26]
[化学式27]
。
具有编码视黄酸受体的核苷酸序列的核酸分子可以为了例如使视黄酸受体过量表达以促进视黄酸信号传导系统而利用表达载体等该技术领域公知的方法导入到T细胞中。
癌/传染病的预防/治疗辅助剂
本发明的癌/传染病的预防/治疗辅助剂包含类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂作为有效成分。通过调节(抑制或促进)该代谢途径或信号传导系统，T细胞群中记忆T细胞的比例增大。一个优选的方案中，本发明的癌/传染病的预防/治疗辅助剂增大免疫疗法、尤其使用癌抗原肽的免疫疗法的癌的治疗效果。作为癌免疫疗法中所用的癌抗原肽，不限于此，可举出各种的WT1肽(例如人WT1332(SEQ ID NO: 15，记载于国际公布2012/046730号等)、MAGE-A4278-299(SEQ ID NO: 16)、存活素97-111(SEQ ID NO: 17)以及与它们具有同等活性的变异肽等。
另外，调节(抑制或促进)类视黄醇代谢途径或视黄酸信号传导系统，不仅带来记忆T细胞比例的增大，而且带来T细胞数本身的增加。因此，类视黄醇代谢途径或视黄酸信号传导系统的调节剂作为传染病的预防(例如疫苗)和治疗(例如免疫疗法)中的辅助剂亦有效。
另外，视黄酸信号传导系统的抑制剂(例如RAR拮抗剂)可增强CD4＋T细胞的细胞毒活性。因此，视黄酸信号传导系统的抑制剂作为癌或传染病的治疗、尤其癌或传染病的免疫疗法中的辅助剂有效。
作为本发明的癌/传染病的预防/治疗辅助剂的适用对象的癌不受特别限定，包括癌瘤、肉瘤、造血器官肿瘤等。一个优选的方案中，该辅助剂的适用对象是表达WT1基因的各种癌或肿瘤，例如白血病、骨髄增生异常综合征、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤等的造血器官肿瘤，以及胃癌、大肠癌、肺癌、乳癌、胚细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、卵巢癌、脑肿瘤等的实体癌或实体肿瘤。
作为本发明的癌/传染病的预防/治疗辅助剂的适用对象的传染病不受特别限定。这是因为，经由类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂所带来的T细胞数的增加和记忆T细胞比例的增大，可与传染病的种类无关地带来强的免疫。一个方案中，该辅助剂的适用对象可以是细菌、病毒、原生动物等所致的传染病。
免疫力增强剂
如上所述，类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂带来记忆T细胞比例的增大和T细胞数本身的增加。因此，该调节剂可以用作使对象的免疫力非特异性地提高的免疫力增强剂的有效成分。
除了有效成分即类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂以外，本发明的癌/传染病的预防/治疗辅助剂、癌免疫疗法辅助剂和免疫力增强剂还可以含有例如载体、赋形剂等。本发明的癌/传染病的预防/治疗辅助剂、癌免疫疗法辅助剂和免疫力增强剂的给予方法可根据疾病的种类、对象的状态、靶部位等的条件适宜选择。作为该方法，可举出例如皮内给予、皮下给予、肌内给予、静脉内给予、经鼻给予、经口给予等，但不限于此。本发明的癌/传染病的预防/治疗辅助剂、癌免疫疗法辅助剂和免疫力增强剂中所含的上述有效成分量、该辅助剂和增强剂的剂型、给予次数等可根据疾病的种类、对象的状态、靶部位等条件适宜选择。
T细胞群的制作方法
本发明的T细胞群制作方法通过将类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂添加到T细胞群中，与通常所用的T细胞培养法相比，得到记忆T细胞比例增大的T细胞群。该方法中，向T细胞群中添加类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂可以在体外或体内进行，优选为在体外进行。作为体外添加的实例，可举出向培养着T细胞群的培养基中添加该调节剂。作为体内添加的实例，可举出向对象的体内给予该调节剂。
通过本发明的T细胞群制作方法制作的T细胞群可用于种种疾病、优选癌或传染病的预防和/或治疗，尤其癌或传染病的免疫疗法中为了增大该预防和/或治疗的效果而使用。
治疗方法和药盒
本发明的癌/传染病的预防/治疗方法和癌/传染病的预防/治疗用药盒并用：类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂，和癌或传染病的预防和/或治疗、尤其癌或传染病的免疫疗法中的其他有效成分。作为所述有效成分，可举出例如癌抗原、传染病的病原体或该病原体的抗原、经它们的抗原或病原体刺激或活化的免疫细胞等。
所谓癌抗原，是指癌细胞或肿瘤细胞特异性表达的表面抗原(所谓的肿瘤特异性抗原)和该抗原的部分肽，可举出例如癌基因WT1的产物WT1蛋白、该蛋白的部分肽WT1332等的WT1肽。作为传染病的病原体，可举出细菌、真菌、病毒、原生动物等。作为病原体的抗原，可举出细菌、真菌、病毒等的表面上表达的蛋白、糖蛋白和糖链等，以及细菌或真菌的细胞壁及其构成成分(脂多糖等)。作为经抗原或病原体刺激或活化的免疫细胞，可举出抗原提呈细胞(例如树突细胞、巨噬细胞和B细胞)和经该抗原提呈细胞活化的T细胞等。
本发明的癌/传染病的预防/治疗辅助剂、癌免疫疗法辅助剂和免疫力增强剂可与种种疾病(优选癌或传染病)的预防和/或治疗、尤其癌或传染病的免疫疗法中的有效成分并用。作为所述有效成分，可举出上述癌抗原、传染病的病原体或该病原体的抗原、经它们的抗原或病原体刺激或活化的免疫细胞等。
对于可适用本发明的记忆T细胞比例增大方法、癌/传染病的预防/治疗辅助剂、癌免疫疗法辅助剂、免疫力增强剂、癌/传染病的预防/治疗用药盒、癌/传染病的预防/治疗方法、传染病预防/治疗方法和免疫力增强方法的对象，只要是具有免疫系统、尤其获得性免疫系统的动物，即脊椎动物，就不受特别限定。作为所述对象，可举出例如人、小鼠、大鼠、狗、猫、兔、马、牛、绵羊、猪、山羊、猴、黑猩猩等。一个优选的方案中，所述对象是人。
本发明的癌/传染病的预防/治疗方法、传染病预防/治疗方法和免疫力增强方法中，给予对象的类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂的有效量以及癌抗原、传染病的病原体或该病原体的抗原、或者经它们的抗原或病原体刺激或活化的免疫细胞的有效量，可根据疾病的种类、对象的状态、靶部位等的条件，并使用本领域技术人员周知的方法(包括各种非临床和/或临床试验)，来适宜确定。本发明的癌/传染病的预防/治疗方法、传染病预防/治疗方法和免疫力增强方法中可使用的癌抗原、传染病的病原体或该病原体的抗原、经它们的抗原或病原体刺激或活化的免疫细胞的实例如上述所示。
需说明的是，本发明的癌/传染病的预防/治疗辅助剂、癌免疫疗法辅助剂、免疫力增强剂、T细胞群制作方法、癌/传染病的预防/治疗用药盒、癌/传染病的预防/治疗方法、传染病预防/治疗方法和免疫力增强方法中，也可以将与“记忆T细胞比例增大方法”相关地记载的各种类视黄醇代谢途径的抑制剂、视黄酸信号传导系统的抑制剂和视黄酸信号传导系统的促进剂用作类视黄醇代谢途径或视黄酸信号传导系统的调节剂。
以下示出实施例对本发明进行具体且详细地说明，但实施例不应解释为限制本发明。
实施例
实施例1
shRNA对视黄醇脱氢酶10表达的抑制
将用于表达以视黄醇脱氢酶10为靶标且由SEQ ID NO: 18所示的序列组成的shRNA(RDH10靶向性shRNA)的构建体导入到人CD4＋CD45RO＋T细胞中。具体而言，使用慢病毒载体系统，使在克隆位点插入了由SEQ ID NO: 19的核苷酸序列组成的DNA的载体和包装载体共转染包装细胞(293T细胞株)，用由此生成的重组病毒感染人CD4＋CD45RO＋T细胞。对于shRNA表达构建体在染色体中的插入，以shRNA表达构建体的下游存在的GFP的表达作为报道分子进行了确认。就通过所述方法表达RDH10靶向性shRNA的T细胞群而言，与通过同样的方法表达对照shRNA(SEQ ID NO: 20)的T细胞群相比，终末效应细胞(CD127-、CD62L-)的比例减少，中央记忆细胞(CD127＋、CD62L＋)的比例增大(图2)。
在人CD4＋CD45RO＋T细胞中，使用慢病毒载体导入上述RDH10靶向性shRNA(sh＃10-2，SEQ ID NO: 18)，或作为对照导入以荧光素酶为靶标的shRNA(sh-luc，SEQ ID NO: 20)。另外，同样地，在人CD4＋CD45RO＋T细胞中导入插入了RDH10基因的慢病毒载体，由此制作了高表达RDH10的T细胞。
将这些细胞在抗CD3抗体、抗CD28抗体和IL-2的存在下，与各种浓度的视黄醇(全反式型)一起培养一周，测定细胞数，同时通过细胞内细胞因子测定调查了产生IFN-γ的细胞频率。结果示于图3。
由于视黄醇的存在，细胞数和IFN-γ产生细胞均视黄醇浓度依赖性地增加。另一方面，通过RDH10的表达抑制，它们的增加率受抑制，并通过过量表达而得到增强。
将上述高表达RDH10的T细胞(在图4中记为＃10)和导入对照载体的T细胞(在图4中记为mock)的各自每5×107个与培养液一起放入到10cm的培养皿中，以1μM的浓度添加3H标记的全反式视黄醇。在4小时、37℃的条件下培养之后，回收细胞，用己烷萃取细胞内的类视黄醇。经离心干燥除去用于萃取的己烷之后，将浓缩的类视黄醇溶解于乙腈，并使用HPLC进行分馏，用液体闪烁计数器测定了各级分中所含的3H。另外，预先通过HPLC分离标准样品(全反式视黄醇和全反式视黄醛)，确定了各标准样品被分离到哪些级分中。HPLC的溶剂使用乙腈：50mM乙酸铵＝75：25，分离柱使用 Syhergi 4u Hydro-RP 80A(Phenomenex公司制)。流速以1.5ml/分进行，制作了每1分钟的级分。结果示于图4。
高表达RDH10的T细胞中，从全反式视黄醇向全反式视黄醛的转化得到促进。
实施例2
视黄醇脱氢酶10敲除小鼠中的T细胞群
(1) 条件性敲除小鼠的制作
使用靶向载体，制作了染色体上的视黄醇脱氢酶10(以下亦称RDH10)基因被图5所示的构建体A取代的小鼠。通过使该小鼠与表达Flp重组酶的转基因小鼠交配，制作了具有LacZ和neo基因被除去的基因结构(图5的B：以下将所述结构称为“flox等位基因”)的小鼠。通过使如此得到的具有flox等位基因的小鼠与表达Cre重组酶的转基因小鼠交配，制作了具有RDH10的外显子2被除去的基因结构(图5的C)的敲除小鼠。
(2) 敲除小鼠中的类视黄醇代谢
使用细胞分选仪，自通过如上述所示地制作的RDH10条件性敲除小鼠(flox/flox cre)和对照小鼠(flox/flox)的脾细胞分离了CD4＋T细胞。使用抗CD3抗体、抗CD28抗体和IL-2，使分离的CD4＋T细胞活化和增殖之后，将其各自每3×107个与培养液一起放入到10cm的培养皿中，以1μM的浓度添加了3H标记的全反式视黄醇。在4小时、37℃的条件下培养之后，回收细胞，用己烷萃取细胞内的类视黄醇。经离心干燥除去用于萃取的己烷之后，将浓缩的类视黄醇溶解于乙腈，并使用HPLC进行分馏，用液体闪烁计数器测定了各级分中所含的3H。另外，预先通过HPLC分离标准样品(全反式视黄醇和全反式视黄醛)，确定了各标准样品被分离到哪些级分中。HPLC的溶剂使用乙腈：50mM乙酸铵＝75：25，分离柱使用 Syhergi 4uHydro-RP 80A(Phenomenex公司制)。流速以1.5ml/分进行，制作了每1分钟的级分。结果示于图6。
RDH10敲除小鼠中，与对照小鼠相比，从全反式视黄醇向全反式视黄醛的转化受到抑制。
(3) 敲除小鼠中的T细胞亚群的鉴定
使表达Cre重组酶的转基因小鼠与关于RDH10基因座位具有野生型纯合(wt/wt)、flox等位基因/野生型杂合(flox/wt)或flox等位基因纯合(flox/flox)的基因型的敲除小鼠交配，在由此得到的小鼠(以下亦称检验用小鼠)中，以CD44和CD62L的表达为指标，鉴定了T细胞亚群。其结果，与RDH10 wt/wt小鼠相比，RDH10 flox/flox小鼠和RDH10 flox/wt小鼠中，CD4＋T细胞群和CD8＋T细胞群两者中，CD62L的表达高的记忆型T细胞的比例均增大(图7)。
(4) 敲除小鼠中的记忆T细胞的增加
通过流式细胞术分析了在6-8周龄的RDH10条件性敲除小鼠(f/f cre)和对照小鼠(f/f)的外周淋巴结中存在的CD4＋T细胞和CD8＋T细胞的CD62L和CD127表达。结果示于图8。RDH10敲除小鼠中显示出：CD62L和CD127的表达高，记忆型T细胞的比例增大。
(5) T细胞表面分子及其转录因子的表达
调查了上述检验用小鼠中T细胞表面分子及其转录因子的表达，RDH10 flox/flox小鼠中，与RDH10 wt/wt小鼠和RDH10 flox/wt小鼠相比，与记忆型T细胞所特有的细胞表面分子(CD62L(Sell)、S1p1(Edg1)、Ccr7、IL7ra)及其表达相关的转录因子(Klf2、Foxo1、Foxo3、Ets1、Sp1、Irf1)的表达高(图9)。
(6) 淋巴器官的细胞数和该淋巴器官中的T细胞数
调查了上述检验用小鼠中淋巴器官的细胞数和该淋巴器官中的T细胞数，其暗示到：RDH10 flox/flox小鼠和RDH10 flox/wt小鼠中，与RDH10 wt/wt小鼠相比，初级淋巴器官(胸腺)和次级淋巴器官(淋巴结、脾脏)的细胞数增加，淋巴细胞的增殖得到促进(图10)。另外，RDH10 flox/flox小鼠和RDH10 flox/wt小鼠中，与RDH10 wt/wt小鼠相比，淋巴结和脾脏中的CD4＋T细胞数和CD8＋T细胞数均增加(图11)。
(7) 使用李斯特菌属菌传染病模型的RDH10缺失T细胞的功能分析和记忆T细胞形成的评价
[方法]
由导入了OT-I TCR基因(转基因)且敲除了Rag1基因的小鼠，制作了RDH10条件性敲除小鼠(flox/flox cre)和对照小鼠(flox/flox)。另外，为了区分两者的T细胞，使RDH10条件性敲除小鼠带有标志物分子即CD45.1和CD45.2这2种分子标志物。另一方面，对照小鼠中仅带有CD45.1。从这些小鼠得到T细胞(仅表达OT-I TCR的CD8＋T细胞)，以各1×104个、1：1的比率混合之后，经尾静脉给予仅带有CD45.2的野生型小鼠(C57BL/6J)。
次日，使其感染1×104CFU的表达识别OT-I TCR的OVA肽的重组单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)(LM-OVA)，经时性地摘出脾脏和淋巴结并分析移入的T细胞比率变化和表型。
另外，为了评价记忆T细胞的功能，自处于记忆期的感染后经过了30天以上的小鼠的脾脏和淋巴结，用FACS分选仪分离了移入的RDH10条件性敲除小鼠来源的T细胞(CD45.1＋CD45.2＋)和对照小鼠来源的T细胞(CD45.1＋CD45.2-)，将其各自每1×104个移入到不同的野生型小鼠中。次日，使其感染1×106CFU的LM-OVA(二次感染)，再过5天后，分析脾脏和肝脏中存在的李斯特菌属菌数和移入的T细胞的细胞数。
上述试验的概况示于图12。
[结果]
LM-OVA感染后的移入的T细胞比率变化和表型示于图13~图15。在脾脏和淋巴结的任一者中，与对照小鼠来源的T细胞相比，RDH10条件性敲除小鼠来源的T细胞比率均高(图13)。另外，RDH10条件性敲除小鼠来源的T细胞中，与对照小鼠来源的T细胞相比，记忆T细胞(CD62L＋ CD127＋细胞)和记忆前体效应细胞(MPEC)(KLRG1＋ CD127＋细胞)的比例高(图14和15)。
二次感染后，RDH10敲除小鼠来源的T细胞与对照小鼠来源的T细胞相比，显示出具有强的增殖能力和强的李斯特菌属菌排除能力(图16)。
由以上结果确认到：RDH10敲除小鼠的T细胞产生更多的记忆T细胞，且质量上记忆功能也高(图17)。
(8) 维生素A缺乏状态下RDH10缺失的影响
为了分析RDH10缺失T细胞的CD62L表达过度是否是由于RDH10所致的维生素A(视黄醇)的代谢缺失，对RDH10条件性敲除小鼠(flox/flox cre)和对照小鼠(flox/flox)给予4周维生素A缺乏食物。此后，用流式细胞术分析了淋巴结(腋下＋腹股沟)、肠系膜淋巴结和脾脏的T细胞的CD62L和CD127表达。结果示于图18。维生素A缺乏状态下，未见RDH10缺失T细胞中CD62L和CD127的表达上升，因此可知，RDH10经由维生素A的代谢调节着这些分子的表达。
实施例3
T细胞的分化促进和分化抑制
(1) 视黄酸对分化的促进
用各种方法(IL-2、抗CD3/CD28抗体、抗CD3/CD28抗体和IL-2)刺激人CD4＋CD45RO＋T细胞，并在DMSO(对照)或全反式视黄酸的存在下进行了培养(需说明的是，以下的实施例中使用的视黄酸均为全反式视黄酸)。其结果，在视黄酸存在下培养的细胞群中，中央记忆细胞(图表右上)的比例减少，终末效应细胞(图表左下)的比例增加(图19)。所述结果显示：视黄酸促进了从中央记忆细胞向效应记忆细胞、效应细胞、终末效应细胞的分化。
(2) 凋亡耐性
用抗Fas抗体(7C11)刺激在DMSO(对照)、视黄酸或RAR拮抗剂(LE540)的存在下培养了8天的人CD4＋CD45RO＋T细胞，调查分析了凋亡细胞和活细胞的比例。其结果，通过用视黄酸促进T细胞的分化，凋亡细胞增加，而活细胞减少。另一方面，若用RAR拮抗剂抑制分化，则凋亡细胞减少，而活细胞增加(图20)。
(3) 记忆T细胞的分裂能力和增殖能力
用抗CD3/CD28抗体进行刺激，并在DMSO(对照)、视黄酸或RAR拮抗剂(LE540)的存在下培养8天，对所得的人CD4＋CD45RO＋T细胞，用抗CD3/CD28抗体和IL-2或IL-7进行再刺激并培养，评价了分裂能力和增殖能力。分裂能力的评价中使用了Cell Trace(商标) Violet细胞增殖试剂盒(Life Technologies公司制)。其结果明确了：若用视黄酸促进T细胞的分化，则分裂能力和增殖能力均降低，另一方面，若用RAR拮抗剂抑制分化，则分裂能力和增殖能力均增加(图21)。
(4) 记忆T细胞群形成能力
用抗CD3/CD28抗体进行刺激，并在DMSO(对照)、视黄酸或RAR拮抗剂(LE540)的存在下培养8天，对所得的人CD4＋CD45RO＋T细胞，用抗CD3/CD28抗体和IL-2或IL-7进行7天的再刺激和培养，鉴定了T细胞亚群。其结果，从在RAR拮抗剂的存在下培养的T细胞群重新高频率地出现记忆T细胞，另一方面，在DMSO和视黄酸存在下的培养中，记忆T细胞的出现频率低(图22)。
记忆T细胞具有多分化能力和自体复制能力。由于该自体复制能力，大量含有记忆T细胞的细胞群即使反复分裂、增殖，也可以维持记忆T细胞的高频率。因此，在RAR拮抗剂存在下培养的T细胞群大量含有记忆T细胞。
(5) 小鼠体内的重新构建能力(再构建能力)
用抗CD3/CD28抗体进行刺激，并在DMSO(对照)、视黄酸或RAR拮抗剂(LE540)的存在下培养8天，对所得的人CD4＋CD45RO＋T细胞，将其与除去了T细胞的人PBMC一起移入到缺失了T细胞、B细胞和NK细胞的免疫缺陷小鼠(NOG小鼠)的体内，在4周后分析了脾脏的T细胞。其结果显示出：在RAR拮抗剂的存在下培养的人CD4＋T细胞在免疫缺陷小鼠体内的增殖能力高，未分化(图23)。
实施例4
通过RAR拮抗剂增大记忆T细胞比例
用人WT1332刺激导入了人WT1332特异性TCR基因的CD4＋T细胞，并在DMSO(对照)、视黄酸或RAR拮抗剂(LE540)的存在下培养。其结果显示出：若在RAR拮抗剂的存在下培养，则记忆型CD4＋T细胞的比例增大(图24)。另外，对在RAR拮抗剂的存在下培养的T细胞群，使用经人WT1332脉冲的PBMC进行再刺激和培养(T细胞：30000细胞/孔，PBMC：100000细胞/孔，IL-2：无)时显示出：与在DMSO或视黄酸存在下培养的细胞相比，增殖能力高(图24)。
实施例5
RAR拮抗剂对记忆T细胞的诱导
方法：
用经人WT1332脉冲的树突细胞刺激单一细胞来源的人WT1332特异性CD4＋T细胞克隆中所含的终末效应分馏，并在DMSO(对照)、视黄酸或RAR拮抗剂(LE540)的存在下培养了7天。接着，用CFSE标记细胞，并用经人WT1332脉冲的树突细胞进行再刺激，在DMSO(对照)、视黄酸或RAR拮抗剂(LE540)的存在下进一步培养。在4天或6天的培养之后，进行了FACS分析和3H胸苷摄入测定(细胞增殖测定)。试验流程示于图25。
结果：
在10μM的LE540的存在下培养终末效应CD4＋T细胞时，再次诱导了中央记忆CD4＋T细胞(图26)。另外，在再刺激后的评价中也确认到：通过在LE540的存在下的培养，产生了分裂能力和增殖能力高的记忆T细胞(图27)。
实施例6
癌免疫疗法中RAR拮抗剂的效果
方法：
将同时表达WT1蛋白和荧光素酶的肿瘤细胞移植到NOD/Shi-scid，IL-2Rγnull小鼠(NOG小鼠)的腹部皮下。在移植的3天后，静脉注射了106个的人WT1332特异性CD4＋T细胞(GFP阳性) (第0天)。在该静脉注射的8小时后，向腹腔内给予了DMSO(对照)、视黄酸或LE540。在静脉注射的1天后，除去CD3＋T细胞，静脉注射了2×106个经人WT1332肽脉冲的人外周血单核细胞(第1天)。此后，观察存活时间，同时每周给予荧光素酶的底物即荧光素，从体外测定由荧光素酶诱导的发光强度，从而测定了肿瘤量。试验流程示于图28。
结果：
小鼠的存活曲线和肿瘤量的测定结果(第21天)示于图29。在视黄酸给予组中，与对照相比缩短了存活时间。另一方面，在LE540给予组中，与对照相比延长了存活时间。另外，在LE540给予组中，与DMSO组和视黄酸组相比，肿瘤的大小显著地小(按照从第0天开始变成了几倍来评价)。所述结果证实：给予WT1肽等癌抗原肽、癌抗原肽特异性T细胞、或经癌抗原肽脉冲的抗原提呈细胞等所带来的抗肿瘤效果因给予RAR拮抗剂而增强。
实施例7
种种RAR激动剂和拮抗剂对T细胞群分化的调节
方法：
用抗CD3/CD28抗体和IL-2刺激人CD4＋CD45RO＋T细胞，并以DMSO作为对照，在各种RAR激动剂(图30)或RAR拮抗剂(图31)存在下培养了8天。
结果：
在全反式视黄酸(ATRA)以及RARα、RARβ和RARγ各自的选择性激动剂即AM580、AC55649和CD437的存在下培养而得的细胞群的任一者中，记忆T细胞所特有的细胞表面分子即CD62L的表达均降低，且记忆T细胞(CD62L＋CD127＋细胞)的比例均减少(图30)。
另一方面，在RARα、RARβ和RARγ的通用拮抗剂即LE540，以及RARα、RARβ和RARγ各自的选择性拮抗剂即BMS195614、LE135和MM11253的存在下培养而得的细胞群的任一者中，CD62L的表达均增加，且记忆T细胞(CD62L＋CD127＋细胞)的比例均增大(图31)。
实施例8
RAR拮抗剂对细胞毒活性的增强
方法：
对于使用慢病毒载体表达HLA-DPB1*05：01(DP5)限制性WT1332特异性TCR的CD4＋T细胞(WT1332特异性CD4＋T细胞)，在全反式视黄酸(ATRA)、RAR拮抗剂(LE540)或作为对照的DMSO的存在下，使用经WT1332脉冲的外周血单核细胞进行刺激，并培养。从培养开始的11天后，以表达WT1但不带有HLA-DPB1*05：01的白血病细胞株TF1(TF1为HLA-DPB1*02：01和DPB1*04：01阳性)和使得表达HLA-DPB1*05：01的TF1(记为TF1-DP5)作为靶细胞，测定了在上述3种条件下培养的WT1332特异性CD4＋T细胞的细胞毒活性。
结果：
关于TF1和TF1-DP5的任一的靶细胞，通过在RAR拮抗剂存在下的CD4＋T细胞的培养，该CD4＋T细胞的细胞毒活性均得到增强(图32)。
实施例9
视黄醇脱氢酶10的低分子抑制剂
(1) RDH10蛋白的检测
将293T细胞(1×106)、导入了RDH10基因的293T细胞(1×106)和活化人CD4＋T细胞(1×107)用PBS充分洗涤之后，悬浮于600μl的0.25M蔗糖・0.1M磷酸Na缓冲液(pH7.4)中。将细胞悬液匀浆化，并在10000g、10分钟、4℃的条件下离心之后，将上清在100000g、1小时、4℃的条件下离心，由此得到微粒体级分。将微粒体级分悬浮于20μl的0.1M磷酸Na缓冲液(pH7.4)中，用于蛋白印迹法。
将微粒体级分中所含的RDH10蛋白经SDS-PAGE分离之后，转转印到PVDF膜上，并进行封闭，然后使其与作为一次抗体的抗RDH10抗体(ab87586)、作为二次抗体的抗兔IgG-HRP抗体反应，并使用Luminata Forte Western HRP Substrate(Millipore公司制)进行了检测。
其结果，可以确认到：导入RDH10基因的293T细胞和活化人CD4＋T细胞的微粒体级分中含有RDH10蛋白(图33)。
(2) RDH10的酶活性测定
向反应缓冲液(90mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，40mM KCl)中加入全反式视黄醇、BSA和作为辅酶的NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，使其各自的终浓度为10μM、10μM和1mM。将该混合液以200μl等份装入硅化管中，将从293T细胞和表达RDH10的293T细胞分离的微粒体级分以10μl等份加入不同的管中，在37℃反应了15分钟。为终止反应，加入200μl甲醇，然后使用己烷萃取类视黄醇，并浓缩。将浓缩的类视黄醇溶解于150μl乙腈后，用HPLC分离，并检测波长350nm的紫外光吸收，由此检测了底物(全反式视黄醇)和产物(全反式视黄醛)。另外，预先通过HPLC分离标准样品(全反式视黄醇和全反式视黄醛)，确定了各标准样品的保留时间。HPLC的溶剂使用乙腈：50mM乙酸铵＝75：25，分离柱使用 Syhergi 4u Hydro-RP 80A(Phenomenex公司制)。流速以2.0ml/分进行。
其结果，293T细胞株来源的微粒体中，没有从全反式视黄醇生成全反式视黄醛，相比之下，导入RDH10基因的293T细胞株来源的微粒体中，生成了全反式视黄醛(图34)。
(3) 低分子抑制剂对RDH10酶活性的抑制
向反应缓冲液(90mM 磷酸钾缓冲液(pH7.4)，40mM KCl)中加入全反式视黄醇、BSA和作为辅酶的NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，使其各自的终浓度为10μM、10μM和1mM。将该混合液以200μl等份装入硅化管中，将从表达RDH10的293T细胞分离的微粒体级分以10μl等份加入不同的管中。在各自的管中添加溶解于DMSO中的RDH10抑制剂(RDHI-001~011)，使其终浓度为20μM，另外，在对照的管中添加等量的DMSO。在37℃反应了15分钟，加入200μl甲醇之后，使用己烷萃取类视黄醇，并浓缩。将浓缩的类视黄醇溶解于150μl的乙腈后，用HPLC分离，并检测波长350nm的紫外光吸收，由此检测了底物(全反式视黄醇)和产物(全反式视黄醛)。另外，预先通过HPLC分离标准样品(全反式视黄醇和全反式视黄醛)，确定了各标准样品的保留时间。HPLC的溶剂使用乙腈：50mM 乙酸铵＝75：25，分离柱使用 Syhergi 4u Hydro-RP80A(Phenomenex公司制)。流速以2.0ml/分进行。
酶活性以相对于未反应的底物(全反式视黄醇)的波形面积的产物(全反式视黄醛)的波形面积的方式求出，相对于对照的酶活性的相对值概括示于图表(图35)。
(4) 在体外RDH10抑制剂所致的记忆T细胞的扩增
在抗CD3抗体(2μg/ml)、抗CD28抗体(2μg/ml)和IL-2(20 IU/ml)的存在下，将人CD4＋CD45RO＋T细胞(1×105/孔)与DMSO(对照)或RDH10抑制剂(10μM)一起培养8天后，通过FACS分析求出了记忆T细胞的频率。
其结果显示出：通过在RDH10抑制剂(RDHI-001~004)的存在下的培养，记忆T细胞(CD62L＋CD127＋)的频率增大(图36)。另外，RDH10抑制剂浓度对记忆T细胞频率的影响示于图37。
(5) 在体内RDH10抑制剂所致的记忆T细胞的扩增
对于RDH10抑制剂给予组和玉米油给予对照组的B6小鼠，使其经尾静脉感染1×105cfu(菌落形成单位)的表达OVA蛋白的重组单核细胞增多性李斯特菌(LM-OVA)，从感染的前一天(第-1天)到感染后第7天(第7天)连续给予了RDH10抑制剂(200μg/日)。经时性地(感染后第5、7、10和14天)由尾静脉采血，并用四聚体法分析了外周血中所含的OVA特异性CD8＋T细胞。该试验的概况示于图38。
分析的结果显示出：通过给予RDH10抑制剂(RDHI-001~003)，记忆型(CD62L＋CD127＋)的OVA特异性CD8＋T细胞频率增大(图39和40)。
实施例10
癌免疫疗法中视黄醇脱氢酶10抑制剂的效果
方法：
通过皮下注射将2×106个EG7肿瘤细胞(表达OVA蛋白的EL4细胞)移植到B6小鼠的腹部皮下(第0天)。在移植后第5天，为了提高移植细胞的成活率，对小鼠照射放射线(3Gy)，然后，静脉注射了2×105个OT-ICD8＋T细胞(OVA特异性CD8＋T细胞)。接着，在移植后第6天、第8天和第10天，静脉注射了100μg/小鼠的RDH10抑制剂(RDHI-001、RDHI-002或RDHI-003)。作为对照，静脉注射了RDH抑制剂的溶剂即DMSO(DMSO 50μl＋PBS 150μl/小鼠)。使用游标测定肿瘤体积的长径、短径和高度，使用长径×短径×高度÷2的计算式经时性地进行了测定。实验的流程示于图41。
另外，不向上述的肿瘤移植小鼠中移入OT-ICD8＋T细胞，而是在移植的5天前、第0天和7天后，仅腹腔内注射了100μg/小鼠的RDH10抑制剂(RDHI-001，RDHI-002，或RDHI-003)。作为对照，腹腔内注射了玉米油(100μg/100μl/小鼠)。与上述同样地，经时性地测定了肿瘤体积。实验的流程示于图42。
结果：
小鼠的经时性肿瘤体积的测定结果示于图43。RDH10抑制剂RDHI-001、RDHI-002、RDHI-003这3种均抑制了肿瘤的增殖。实施例9(5)中，通过给予这些抑制剂，移入的OT-ICD8＋T细胞(OVA特异性CD8＋T细胞)在小鼠外周血中显著增加。另一方面，在不移入OT-ICD8＋T细胞而仅给予抑制剂的情况下，未见肿瘤增殖抑制效果(图44)。因此，可以认为，RDH10抑制剂的肿瘤增殖抑制效果是经由OT-ICD8＋T细胞的增幅而引起的。
产业上的可利用性
根据本发明，提供使用类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂来增大T细胞群中记忆T细胞比例的方法、包含该调节剂的癌或传染病的预防和/或治疗辅助剂、包含该调节剂的免疫力增强剂等。它们可用于药品等领域，例如用于包括癌和传染病在内的种种疾病的预防和/或治疗的药物的开发和制造，以及该疾病的治疗方法、尤其免疫疗法的开发等的领域。

Claims (15)

1.增大T细胞群中记忆T细胞的比例的方法，其包括下述步骤：将类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂添加到T细胞群中。
2.权利要求1所述的方法，其中，调节剂是类视黄醇代谢途径的抑制剂和/或视黄酸信号传导系统的抑制剂。
3.权利要求2所述的方法，其中，抑制剂抑制视黄醇向视黄醛的转化、视黄醛向视黄酸的转化、β-胡萝卜素向视黄醛的转化、β-胡萝卜素向β-阿朴胡萝卜素醛的转化、或β-阿朴胡萝卜素醛向视黄醛和视黄酸的转化。
4.权利要求2或3所述的方法，其中，抑制剂是抑制编码选自视黄醇脱氢酶、视黄醛氧化酶、视黄醛脱氢酶、β-胡萝卜素-15,15'-单加氧酶1和β-胡萝卜素加氧酶2的酶的基因表达的RNA分子，产生该RNA分子的核酸分子，包含该核酸分子的载体，抑制该酶作用的化合物；或该酶的显性失活变体蛋白。
5.权利要求4所述的方法，其中，抑制剂是抑制编码视黄醇脱氢酶的基因表达的RNA分子，该RNA分子选自siRNA、shRNA、miRNA、stRNA和反义RNA。
6.权利要求4所述的方法，其中，抑制剂是抑制视黄醇脱氢酶作用的化合物。
7.权利要求2所述的方法，其中，抑制剂是抑制编码视黄酸受体拮抗剂、视黄酸受体的显性失活变体蛋白、视黄酸受体的基因表达的RNA分子，产生该RNA分子的核酸分子，或包含该核酸分子的载体。
8.权利要求1所述的方法，其中，调节剂是视黄酸信号传导系统的促进剂。
9.权利要求8所述的方法，其中，促进剂是视黄酸受体激动剂。
10.癌或传染病的预防和/或治疗的辅助剂，其包含类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂。
11.癌的免疫疗法的辅助剂，其包含类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂。
12.免疫力增强剂，其包含类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂。
13. T细胞群的制作方法，其包括下述步骤：通过将类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂添加到T细胞群中，增大该T细胞群中记忆T细胞的比例。
14. T细胞群，其通过权利要求13的方法制作。
15. 用于癌或传染病的预防和/或治疗的药盒，其包含：
(a) 癌抗原、该传染病的病原体或该病原体的抗原、或者经这些抗原或病原体刺激或活化的免疫细胞，和
(b) 类视黄醇代谢途径的调节剂和/或视黄酸信号传导系统的调节剂。
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