CN106062201A

CN106062201A - 方法

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Publication number: CN106062201A
Application number: CN201480070868.7A
Authority: CN
Inventors: L.纳尔迪尼; B.R.根特纳; E.佐纳里; F.博卡拉特
Original assignee: SAN RAFFAELE CENTRO FOND; Fondazione Telethon
Current assignee: SAN RAFFAELE CENTRO FOND; Fondazione Telethon; Ospedale San Raffaele SRL
Priority date: 2013-10-24
Filing date: 2014-10-24
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2034-10-24
Also published as: KR20160075676A; US20160256492A1; AU2014338555B2; JP2016539659A; WO2015059674A1; ES2747951T3; CY1122612T1; EP3060670A1; EP3613859A1; JP6691048B2; SG11201603166UA; US10617721B2; CA2927712A1; EP3060670B1; CN106062201B; JP2020124200A; US20200338131A1

Abstract

由包含造血干细胞的起始细胞群制备用于临床应用的治疗性细胞群的方法，所述方法包括从起始细胞群中分离基本不表达CD38但表达CD34的细胞群，并用载体转导分离的细胞群以获得该治疗性细胞群。

Description

方法

技术领域

本发明涉及造血干细胞（HSC）和造血祖细胞。更具体地，本发明涉及用于HSC的基因修饰的改进方法。本发明还涉及用于基因修饰的造血干细胞和祖细胞在基因疗法中的用途的改进方法。

发明背景

造血系统是不同的成熟细胞谱系的细胞的复杂层次结构。这些包括提供对病原体的防护的免疫系统的细胞、携带氧通过身体的细胞以及涉及伤口愈合的细胞。所有这些成熟细胞来自于能够自我更新并分化成任何血细胞谱系的造血干细胞（HSC）的池。

由于HSC能够补充整个造血系统，它们可用于移植，例如在血液毒性损伤如放疗或化疗之后，或用于更换白血病细胞。

造血细胞移植（HCT）是对数种遗传性和获得性疾病的治愈性疗法。但是，同种异体HCT受限于匹配供体的低可获得性，以及与同种异体程序相关的死亡率，其大多涉及移植物抗宿主疾病（GvHD）和深远且持久的免疫功能紊乱状态所引发的感染性并发症。

基于移植基因改造的自体HSC的基因治疗途径提供了超出同种异体HCT的潜在改善的安全性和有效性。它们对缺少匹配的供体的患者尤其重要。

干细胞基因疗法的概念基于较少数量的干细胞的基因修饰。这些在体内通过进行自我更新而长期存留，并生成大量基因“修正的”后代。这确保了在患者的余生持续供应修正的细胞。HSC对基因疗法是特别有吸引力的目标，因为在它们分化时，它们的基因修饰将传递至所有血细胞谱系。此外，HSC可以容易和安全地获自例如骨髓、动员的外周血和脐带血。

HSC及其后代的有效的长期基因修饰需要能够将校正DNA稳定整合到基因组中而不影响HSC功能的技术。

长期的益处需要移植足够高数量的修饰的HSC，其可以重新填充经调整的骨髓，产生所有造血谱系的修正的血细胞。自体HSC因此令移植程序可用于所有患者，避免导致GvHD的免疫相容性问题，并允许最低限度的免疫抑制调节疗法，由此大大减少感染性并发症。

基于慢病毒的HSC基因疗法试验已经证实了它们在治疗遗传疾病方面的治疗潜力。但是，用于HSC的基因修饰的方法仍困难重重。

现有的HSC基因疗法方案（例如Cartier N等人, Science 2009;326:818-823；Cavazzana-Calvo M等人, Nature 2010;467:318-322；Biffi A等人, Science 2013;341:1233158；Aiuti A等人, Science. 2013;341:1233151）在HSC基因修饰过程中使用2-4天的体外培养。更长的培养时间通常产生更高的转导水平。但是，体外培养不利地影响HSC功能，并且这种负面影响明显与培养的持续时间相关联（Guenechea G等人, Blood 1999;93:1097-1105；Xu R等人, Transfusion 2001;41:213-218；Mazurier F等人, Blood 2004;103:545-552；Ahmed等人, Blood 2004;103:2079-2087；Glimm H等人, Exp. Hematol.2005;33:20-25；Kallinikou K等人, Br. J. Haematol. 2012;158:778-787）。尽管对改善HSC的体外扩增已经取得了一些进展（Zhang CC等人, Blood 2008;111:3415-3423；Boitano AE等人, Science 2010;329:1345-1348；Delaney C等人, Nat. Med. 2010;16:232-236；Himburg HA等人, Nat. Med. 2010;16:475-482；Csaszar E等人, Cell StemCell 2012;10:218-229；Walasek MA等人, Ann. N. Y. Acad. Sci. 2012;1266:138-150），所得方案对临床转化存在一些挑战，给出变数并常常给出再现性不佳的结果，并仍需要在相关的临床情况下得到证实。因此，在HSC基因疗法背景下的体外培养应保持尽可能短。

因此，需要设计能够获得造血干细胞的有效基因修饰同时最大程度缩短培养时间的改进方案。此外，该改进方案必须适于临床应用。

发明内容

我们已经预料不到地显示，当CD34⁺CD38^- HSC以高纯度呈现时经历更有效的转导。我们已经开发了以适于临床应用的方式纯化和转导这些细胞的方案。

我们还发现，前列腺素E2及其衍生物提高了基因转移到CD34⁺和CD34⁺CD38^- HSC中的效率。

这些预料不到的发现导致了提高的转导效率，这能够减少施加的载体量并最大程度减少体外培养。

由这些发现继续，我们已经开发了基于转导的、高度纯化的长期再植细胞（例如表达CD34而不表达CD38的细胞）与未经处理的祖细胞（例如表达CD38的细胞）的共同移植的创新方案。该方案可以通过以下手段改善基因疗法的安全性和有效性：

1．提高转导效率；

2．减少转导所需的细胞数量，这导致了较低的灌注到受试者中所需的整合负荷；

3．确保了快速造血恢复。

此外，我们还开发了基于转导的造血祖细胞的移植的创新方案。

根据本发明的第一方面，提供了由包含造血干细胞的起始细胞群制备用于临床应用的治疗性细胞群的方法，所述方法包括从起始细胞群中分离基本不表达CD38但表达CD34的细胞群，并用载体，优选用病毒载体转导分离的细胞群以获得治疗性细胞群。

在本发明的一个实施方案中，该方法包括以下步骤：

a．从包含造血干细胞的起始细胞群分离表达CD38的细胞；

b．从不表达CD38的步骤（a）中获得的细胞群中分离表达CD34的细胞；

c．用载体转导步骤（b）中获得的表达CD34的细胞群以获得治疗性细胞群。

在另一实施方案中，该方法包括以下步骤：

a．使包含造血干细胞的起始细胞群与CD38反应性试剂接触；

b．使CD38反应性细胞与CD38非反应性细胞分离；

c．使步骤（b）中获得的CD38非反应性细胞与CD34反应性试剂接触；

d．使CD34反应性细胞与CD34非反应性细胞分离，其中该CD34反应性细胞构成转导细胞群；

e．用载体转导所述转导细胞群以获得治疗性细胞群。

该治疗性细胞群可能具有CD34⁺CD38^-表型。

在一个实施方案中，该载体包含相关核苷酸，或本身为相关核苷酸。

在一个实施方案中，分离的表达CD38的细胞或CD38反应性细胞或其一部分被保留以形成支持细胞群。该支持细胞群可以具有CD34⁺CD38^int1、CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺表型。

在本发明的一个实施方案中，用载体转导细胞群的步骤包括培养该细胞大约44小时或更久。“用载体转导细胞群的步骤”理解为预刺激和载体暴露阶段。例如，在用载体转导的步骤过程中，细胞群可以培养大约44-66小时、44-60小时、44-54小时或44-48小时。在一个实施方案中，在用载体转导的步骤过程中，细胞群培养大约66、60、54、48或44小时。

在本发明的另一实施方案中，用载体转导细胞群的步骤包括培养该细胞（即在预刺激和载体接触过程中）小于大约44小时。例如，在用载体转导的步骤过程中，细胞群可以培养大约12-42小时、12-36小时、12-24小时或12-18小时。在一个实施方案中，在用载体转导的步骤过程中，细胞群培养大约42、36、30、24、18或12小时。在用载体转导的步骤过程中，细胞群优选培养大约24小时。

在本发明的一个实施方案中，前列腺素E2 或其衍生物用于本发明的方法以提高转导效率。

前列腺素E2或前列腺素E2衍生物（例如16,16-二甲基前列腺素E2 (dmPGE2)）可以在用载体转导的步骤过程中，优选在该步骤的预刺激阶段过程中添加到细胞群中。前列腺素E2或前列腺素E2衍生物可以在预刺激阶段开始时或在预刺激阶段过程中加入。例如，前列腺素E2或前列腺素E2衍生物可以在细胞群暴露于载体之前大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时加入。优选地，在预刺激阶段过程中，在细胞暴露于载体之前大约2小时将该前列腺素E2或前列腺素E2衍生物加入到细胞群中。在另一实施方案中，在暴露于载体的同时将该前列腺素E2或前列腺素E2衍生物加入到细胞群中。

在本发明的一个实施方案中，包含造血干细胞的起始细胞群获自组织样本。

在另一实施方案中，包含造血干细胞的起始细胞群获自动员的外周血、骨髓或脐带血。

在另一方面，本发明提供了根据本发明的方法制备的治疗性细胞群。

在另一方面，本发明提供了根据本发明的方法制备的支持细胞群。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的治疗性细胞群或支持细胞群的药物组合物，优选在可药用载体、稀释剂或赋形剂的存在下。

在另一方面，本发明提供了用于药物的治疗性细胞群和/或支持细胞群。

在一个实施方案中，该治疗性细胞群与本发明的支持细胞群组合施用。

在另一实施方案中，在施用该支持细胞群之前向受试者施用该治疗性细胞群。

在另一实施方案中，该治疗性细胞群与支持细胞群的施用同时期或同时地施用于受试者。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的治疗性细胞群和支持细胞群的试剂盒。

在另一方面，本发明提供了一种治疗方法，包括向需要其的受试者施用本发明的治疗性细胞群。

在另一方面，本发明提供了一种治疗方法，包括向需要其的受试者施用本发明的治疗性细胞群和本发明的支持细胞群。

优选地，该治疗是通过基因疗法进行的治疗。

在另一方面，本发明提供了用于基因疗法的造血祖细胞群，其中该造血祖细胞群已经用相关核苷酸转导。

用相关核苷酸转导的步骤可以例如采用本文中描述的任何细胞转导方法。

在另一方面，本发明提供了用于基因疗法的造血祖细胞群，其中所述细胞已经从包含造血干细胞和祖细胞的细胞群中分离并随后用相关核苷酸转导。

在一个实施方案中，该造血祖细胞群具有CD34⁺CD38^int表型。在另一实施方案中，该造血祖细胞群具有CD34⁺CD38^int1、CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺表型。由此该造血祖细胞群可以例如不包含CD34⁺CD38^-表型的细胞。

在另一实施方案中，该转导祖细胞群与造血干细胞群，例如具有CD34⁺CD38^-表型的细胞群组合施用。

在另一方面，本发明提供基因治疗方法，包括向需要其的受试者施用造血祖细胞群，其中该造血祖细胞群已经用相关核苷酸转导。

在另一方面，本发明提供了在患者中控制转基因表达的持续时间的方法，其中通过根据CD38表达水平选择性施用转导的造血干细胞和/或祖细胞来控制转基因表达的持续时间。提高的转基因表达持续时间可以通过施用具有降低的CD28表达水平的细胞来实现。

在另一方面，本发明提供了在用载体，优选病毒载体转导造血干细胞或祖细胞时前列腺素E2或前列腺素E2衍生物用于提高基因转移效率的用途。

在一个实施方案中，该前列腺素E2衍生物是16,16-二甲基前列腺素E2。

前列腺素E2或前列腺素E2衍生物（例如16,16-二甲基前列腺素E2 (dmPGE2)）可以在预刺激阶段过程中加入到细胞群中。在一个实施方案中，该前列腺素E2或前列腺素E2衍生物在预刺激阶段开始时加入。在另一实施方案中，该前列腺素E2或前列腺素E2衍生物在预刺激阶段过程中加入。

例如，前列腺素E2或前列腺素E2衍生物可以在细胞群暴露于载体之前大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时加入。优选地，该前列腺素E2或前列腺素E2衍生物在预刺激阶段过程中，在细胞暴露于载体之前大约2小时加入到细胞群中。

在另一实施方案中，该前列腺素E2或前列腺素E2衍生物与暴露于载体同时加入到细胞群中。

在另一方面，本发明提供了用载体，优选慢病毒载体转导细胞群的方法，其中用载体转导细胞群的步骤包括培养该细胞大约44小时或更久。“用载体转导细胞群的步骤”理解为预刺激和载体暴露阶段。例如，在用载体转导的步骤过程中，细胞群可以培养大约44-66小时、44-60小时、44-54小时或44-48小时。在一个实施方案中，在用载体转导的步骤过程中，细胞群培养大约66、60、54、48或44小时。

在另一方面，本发明提供了用载体，优选慢病毒载体转导细胞群的方法，其中用载体转导细胞群的步骤包括培养该细胞（即在预刺激和载体接触过程中）小于大约44小时。例如，在用载体转导的步骤过程中，细胞群可以培养大约12-42小时、12-36小时、12-24小时或12-18小时。在一个实施方案中，在用载体转导的步骤过程中，细胞群培养大约42、36、30、24、18或12小时。在用载体转导的步骤过程中，细胞群优选培养大约24小时。

要理解的是，本文中所述的制备治疗性细胞群的方法的步骤可以以不同的次序进行。由此，制备治疗性细胞群的方法可以包括以下步骤：

a．从包含造血干细胞的起始细胞群中分离表达CD34的细胞；

b．从表达CD34的步骤（a）中获得的细胞群中分离表达CD38的细胞；

c．用载体转导步骤（b）中获得的不表达CD38的细胞群以获得该治疗性细胞群。

表达CD38的步骤（b）中获得的细胞或其一部分可以保留以形成支持细胞群。

本申请涉及支持细胞群的用途。在本发明的一个方面，在本文中提及的支持细胞群可以用上文定义的支持细胞群代替。

或者，表达CD38的步骤（b）中获得的细胞或其一部分可以用载体转导。此类转导的细胞可用于治疗（例如施用于受试者）。这种方法可以允许向受试者（如用于癌症基因疗法）瞬时递送基因（例如治疗性基因）。

附图说明

图1

（A）将来自脐带血或成人骨髓的CD34⁺细胞（Lonza）解冻，用SCF、FLT3L、TPO和IL6预刺激12小时，用抗CD34、抗CD133和抗CD38抗体染色，并FACS分选为柱状图的x轴上显示的亚群。该SORT-LV方案包括在分选后12小时用慢病毒载体（PGK.GFP, 10⁸ TU/毫升）转导，而在LV-SORT方案中，本体CD34⁺细胞在预刺激24小时后慢病毒载体-转导，随后在次日分选。通过在分化条件下体外培养14天后的载体拷贝数（VCN）分析（集落形成测定或液体培养）或通过培养7天后的流式细胞检测分析（绿色柱状图，左下图）来测量转导效率。在骨髓的情况下，对总集落生长物测定VCN，或在显微镜引导下通过拔除单个菌落单独地对骨髓集落和红细胞集落测定VCN。

（B）将来自4个脐带血供体的CD34⁺细胞（Lonza）解冻并分为2组：本体: CD34⁺细胞；干细胞: 获自本体的分选的CD34⁺CD38^-细胞（CD38门：最低10%；CD38抗体：IB2-PEVio770,Miltenyi）。将两个组在补充有100纳克/毫升SCF、100纳克/毫升FLT3L、50纳克/毫升TPO、50纳克/毫升IL-6的Stem Span无血清培养基（SFEM）中以10⁶细胞/毫升的密度放置在培养物中并预刺激18小时。以10⁸ TU/毫升用PGK.GFP慢病毒载体进行转导。将细胞注入亚致死剂量照射过的8周龄NSG小鼠（本体：1.26×10⁵细胞/小鼠; n=6；干细胞：1.8×10⁴细胞/小鼠;n=6）。使用人细胞特异性底物，在移植后3个月通过对外周血有核细胞进行的qPCR来评估载体拷贝数。

（C）对来自（B）中描述的造血嵌合（hematochimeric）小鼠的BM在移植后20周进行VCN。相对于总CD34⁺细胞，更高的向CD34⁺CD38^-细胞中的基因转移水平在衍生自相应的起始群体的异种移植物中长期保持。

图2

在Ospedale san Raffaele根据批准的方案在剖腹产后由脐静脉收集总脐带血（40毫升）。

通过Ficoll分离单核细胞（2×10⁸），并用谱系抗体和CD38的混合物（Miltenyi,Cat 130-092-263）标记。阳性标记细胞（10⁸）连接到磁性微珠上并通过LD柱（Miltenyi）分离。

流经物（10⁸ Lin^-/CD38^-细胞）用CD34微珠（Miltenyi）培育，在MS柱上富集CD34⁺CD38^-细胞。

为了能够追踪NSG小鼠体内CD38⁺和CD38^-亚群的造血输出，该Lin⁺/CD38⁺（第一柱）和CD34⁺CD38^-级分（第二柱）对CD34进行FACS分选（分别产生高纯CD34⁺CD38⁺和CD34⁺CD38^-细胞）。

再分析显示基于磁珠有效地分离为CD38^-/low和CD38⁺细胞。这些级分随后不同地用表达GFP和表达OFP的慢病毒载体标记，以1:5的比（CD34⁺38^-:CD34⁺38⁺）混合并注射到n=4的NSG小鼠中。随后GFP/OFP嵌合28周。

图3

对NSG小鼠中干/祖细胞共同移植建模：

骨髓CD38^- vs CD38^high。

将CD34⁺成人骨髓造血干细胞和祖细胞（HSPCs）分选为CD34⁺CD38^-（+/-）和CD34⁺CD38^hi（+/hi）细胞，在含有SCF（300纳克/毫升）、Flt3L（300纳克/毫升）、TPO（100纳克/毫升）、IL6（60纳克/毫升）和dmPGE2（10 µM）的Stem Span SFEM中预刺激16小时并用GFP-LV（+/-）或OFP-LV（+/hi）转导。在转导24小时后，如下将细胞注入8周龄、亚致死量照射过的NSG小鼠：

第1组：每只小鼠27,000 CD34⁺CD38^-细胞（n=3）；

第2组：每只小鼠248,000 CD34⁺CD38^hi细胞（n=3）；

第3组：每只小鼠27,000 CD34⁺CD38^-和248,000 CD34⁺CD38^hi细胞（n=3）。

在外周血中经时监控植入（第1、2、3组）和嵌合性（第3组），并在移植后18周分析造血器官。

图4

（A）对NSG小鼠中干/祖细胞共同移植建模：

动员的外周血CD38^- 对. CD38^intm1 对 CD38^intm2 对 CD38^hi。

我们将CD34⁺ MPB分选为具有提高的CD38表达水平的4个子集（CD34⁺/CD38^-；CD34⁺/CD38^int1；CD34⁺/CD38^int2；CD34⁺/CD38^hi），这些子集在含有SCF（300纳克/毫升）、Flt3L（300纳克/毫升）、TPO（100纳克/毫升）、IL6（60纳克/毫升）和dmPGE2（10 µM）的Stem Span SFEM中预刺激16小时，并用以下慢病毒载体转导这些子集：CD34⁺/CD38^-：GreenFP.LV；CD34⁺/CD38^int1：CherryFP.LV；CD34⁺/CD38^int2：CyanFP.LV；CD34⁺/CD38^hi：OrangeFP.LV。在转导24小时后，如下将细胞注入8周龄、亚致死量照射过的NSG小鼠：

第1组：每只小鼠129,000 CD34⁺/CD38^-细胞（n=6）；

第2组：每只小鼠869,000祖细胞（CD34⁺/CD38^int1、CD34⁺/CD38^int2和CD34⁺/CD38^hi细胞的总和，各群落向祖细胞混合物贡献33%）（n=7）；

第3组：每只小鼠129,000 CD34⁺/CD38^-与869,000汇集的祖细胞的混合物（n=6）。

在外周血中经时监控植入（第1、2、3组）和嵌合性（第3组）。

（B）按照CD38表达水平分选G-CSF-动员的外周血CD34⁺细胞，并如上图4（A）中所述，通过表达不同的荧光蛋白质的4种慢病毒载体标记不同的级分。将差异化标记的级分汇集（对应于图4(A)中的第3组）并注入8周龄亚致死量照射过的NSG小鼠。N=2动员的外周血供体（购自Stem Cell Technologies的CD34⁺细胞），2个独立的试验。

显示了随时间推移来自CD38亚级分对人移植物的相对贡献（n=每个时间点10只小鼠，6只来自实验1，4只来自实验2；平均 +/- sem）。

实验1：第3组，每只小鼠129,000 CD34⁺CD38^-（0-12%）和869,000 CD34⁺CD38^low ^-intm-high（12-100%）汇集祖细胞的混合（n=6）。

实验2：第3组，每只小鼠149,000 CD34⁺CD38^-（0-12%）和1,320,000 CD34⁺CD38^low ^-intm-high（12-100%）汇集祖细胞的混合（n=4）。

图5

（A）dmPGE2对脐带血CD34⁺细胞的影响（体外）。

将来自n=4个脐带血供体的CD34⁺细胞（Lonza）解冻并在存在或不存在10 µMdmPGE2的情况下在补充有100纳克/毫升SCF、100纳克/毫升FLT3L、50纳克/毫升TPO、50纳克/毫升IL6的StemSpan无血清培养基（SFEM）中培养18小时（预刺激）。在预刺激后，细胞与10⁸ TU/毫升的慢病毒载体一起培育24小时，细胞随后在IMDM + 10% FCS中体外培养（n=5次重复）14天，随后如Gentner, B.等人 (2009) Nat. Methods 6: 63-6中所述通过qPCR测量载体拷贝数（VCN）。dmPGE2预刺激导致基因转移的50%提高。

（B）dmPGE2对G-CSF-动员的CD34⁺外周血干细胞的影响（体外）。

N=3个动员的外周血受体的6次转导。将细胞解冻，在以下细胞因子的存在下以10⁶细胞/毫升的密度重新悬浮在无血清的商业培养基（例如CellGro）中：300纳克/毫升SCF、300纳克/毫升FLT3L、100纳克/毫升TPO、60纳克/毫升IL-3，并在不存在（对照，Ctrl）或存在dmPGE2的情况下预刺激18小时。以10⁸ TU/毫升用慢病毒载体转导（3个不同批次）12-24小时。在IMDM和10% FCS中体外培养14天后通过qPCR评估载体拷贝数。显示了相对VCN（归一化至对照组）。

（C）dmPGE2刺激的时间选择对通过慢病毒载体转导人HSPCs的能力的影响。

当LV暴露前2小时加入dmPGE2时该影响似乎最大化（t=-2h：VCN的100%提高），而在解冻时添加dmPGE2（t=-16h）导致~50%的VCN提高，类似于（A）和（B）中显示的实验。对1个脐带血和1个动员的外周血供体进行该实验，显示了相对VCN（归一化至其相应的对照物）。

（D）通过dmPGE2体外刺激获得的提高的载体拷贝数在异种移植后在衍生自脐带血的CD34⁺细胞的后代中长期保持。

将脐带血CD34⁺细胞解冻并在补充有100纳克/毫升SCF、100纳克/毫升FLT3L、50纳克/毫升TPO、50纳克/毫升IL-6的Stem span无血清培养基（SFEM）中培养（10⁶细胞/毫升）18小时（预刺激），随后以10⁸ TU/毫升用慢病毒载体转导24小时。将细胞注入亚致死量照射过的8周龄NSG小鼠（每只小鼠1.5-3×10⁵细胞），并使用人细胞特异性底物在所示时间点处在各组小鼠的汇集的血液或骨髓中分析载体拷贝数（VCN）。显示了3次重复实验。左图：细胞用PGK.TRAIL LV转导，并在解冻后直接加入10 µM dmPGE2（dmPGE2组，n=5只小鼠）或DMSO（对照组，n=5只小鼠）（相对于载体添加，t=-16小时）。中图：细胞用PGK.TRAIL LV转导，并在添加载体前120分钟加入10 µM dmPGE2（dmPGE2组，n=5）或DMSO（对照组；n=8）（t=-2小时）。中图：细胞用PGK.OFP LV转导，并在添加载体前120分钟加入10 µM dmPGE2（dmPGE2组，n=5）或DMSO（对照组；n=5）（t=-2小时）。在所有三个实验中，体外观察到的转导的益处稳定地长期保持，最高至异种移植后18周。

（E-G）仅当采用特定培养条件（即将总培养时间降低至小于44小时）时，通过dmPGE2体外刺激获得的提高的载体拷贝数在来自成人来源（如动员的外周血）的CD34⁺细胞的后代中长期保持。

将来自G-CSF动员的外周血（mPB）的CD34⁺细胞解冻并在补充有SCF（300纳克/毫升）、FLT3L（300纳克/毫升）、TPO（100纳克/毫升）和IL-3（60纳克/毫升）的CellGro培养基中培养（10⁶细胞/毫升）。细胞用对gp91^phox编码的第三代慢病毒载体（适于慢性肉芽肿病的基因疗法的载体）以10⁸ TU/毫升的剂量转导。用于mPB CD34+细胞的体外转导的不同方案显示在（E）中，并在以下方面不同：存在（P1、P2、P3）或不存在（P0、P4）dmPGE2、加入dmPGE2的时间选择（在解冻后：P1、P2；在转导前120分钟：P3）以及培养的持续时间（24小时：P2、P4 对44小时：P0、P1、P3）。

（F）将来自供体1的10×10⁶ CD34⁺ mPB细胞解冻，分为四等份，并按照P0、P1、P2或P3用来自工业级生产（Molmed Spa）的SP146/gp91.cogp91^phox.126TLV转导。在时间0处向每只小鼠注射培养的5×10⁵细胞产物（实际数字：P0: 每只小鼠3.66×10⁵；P1: 每只小鼠4.66×10⁵；P2: 每只小鼠3.0×10⁵；P3: 每只小鼠4.86×10⁵）。在移植后20周对小鼠实施安乐死。由属于同一组的小鼠冲洗并汇集BM（P0、P1、P2：每组n=5；P3：每组n=3）并贫化小鼠细胞。富集的人细胞随后使用人细胞特异性底物施以载体拷贝数（VCN）分析（5次技术重复）。通过具有Bonferroni测试后修正的One-way ANOVA进行统计，并在P2条件下表现出在VCN进入长期再植细胞方面~50%的提高。

（G）使用来自第二供体的mPB CD34⁺细胞进行重复实验。将15×10⁶ CD34⁺ mPB细胞解冻，分为四等份，并按照方案P0、P1（44 h -/+ dmPGE2）或P4、P2（24h -/+ dmPGE2）用来自实验室级生产的SP146/gp91.gp91^phoxTGT.126T LV（适于CGD基因疗法的载体）转导。在时间0处向每只小鼠注射培养的9×10⁵细胞产物（实际数字：P0: 每只小鼠10×10⁵；P1: 每只小鼠8.2×10⁵；P4: 每只小鼠4.5×10⁵；P2: 每只小鼠5.3×10⁵）。使用人细胞特异性qPCR分析对来自移植后13周的各单一小鼠的BM细胞进行VCN分析。与第一实验一致，P1条件在来自成人来源的长期再植细胞中通过dmPGE2介导的转导效率方面并未产生持久的增益，与之形成鲜明对比的是MPB CD34⁺祖细胞，其中使用体外读出器，P1方案导致提高的VCN（参见图5B），并与脐带血不同，其中与“标准”培养方案关联的dmPGE2在长期再植细胞中导致提高的VCN（图5D）。我们预料不到地发现，将MPB CD34⁺细胞培养方案缩短至24小时（P2）不仅拯救了dmPGE2在长期再植细胞中的转导促进效果，还提高转导至显著高于通过44小时标准方案所实现的水平。可能的解释包括：

·dmPGE2对HSC（但并非对祖细胞）的暴露时间依赖性效应，其中许可LV转导的窗口限于16-24小时（与以下假设一致：即使并非统计学显著的，其中相对于P1延迟dmPGE2暴露的P3方案可能意味着在VCN方面的一定提高；参见图5F）。

·存在功能不同的HSC物种，一种对dmPGE₂刺激敏感，但在培养24小时后失去植入潜力，一种对dmPGE2不敏感，但在培养中更好地保持植入潜力，由此在更长时间的培养中占据主要地位。

图6

使用dmPGE2提高向来自成人骨髓的CD34⁺、CD34⁺CD38^- HSC和CD34⁺CD38⁺祖细胞中的基因转移。

如下进行该实验：将来自N=3个骨髓供体的CD34⁺细胞（Lonza）解冻并在Stem Span无血清培养基（SFEM）中在以下条件下培养：在300纳克/毫升SCF、300纳克/毫升FLT3L、100纳克/毫升TPO、60纳克/毫升IL3中预刺激18小时。随后将细胞分为三组：本体CD34⁺、CD34⁺CD38^-、CD34⁺CD38⁺（在用来自BD Bioscience的CD38-APC抗体标记后在MoFlow细胞仪上FACS分选）。我们随后向培养物中加入dmPGE2（10 µM）或DMSO，并预刺激该细胞另外的16小时，随后用表达GFP的慢病毒载体（LV.PGK.GFP）以10⁸ TU/毫升转导它们。以IMDM+10%FCS中液体培养14天（左）或集落形成细胞（CFC）分析（右；以800细胞/毫升methocult铺板，在14天后分析菌落生长）形式进行体外培养分析。如Gentner B等人, Nat. Methods 2009;6:63-66中所述通过qPCR评估载体拷贝数。

图7

对共同施用培养/转导CD34⁺CD38^-干细胞与未培养的CD34⁺CD38^int/+祖细胞建模。

通过白细胞分离法获得G-CSF-动员的外周血细胞，对CD34⁺细胞富集，通过FACS（MoFlo XDP分选仪和CD38 PE-Vio770 Miltenyi抗体）分选成更原始的CD38^-干细胞级分（0-7% CD38百分位）和CD38^int/+祖细胞级分（13-100% CD38百分位）。将各级分的多个等分试样冷冻。

（A）将CD34⁺CD38^-（干细胞）级分解冻，以10⁶细胞/毫升的密度重新悬浮在补充有300纳克/毫升SCF、300纳克/毫升FLT3L、100纳克/毫升TPO、60纳克/毫升IL-3和10 µMdmPGE2的Stem Span无血清培养基（SFEM）中。如示意图中所示，细胞预刺激20小时（示意图中的灰色框）并用PGK.GFP慢病毒载体（10⁸ TU/毫升）转导24小时（红色框）。培养/基因修饰的干细胞随后与新鲜解冻的CD34⁺CD38^int/+祖细胞以1:8的比混合，并注入到8周龄的亚致死量照射过的NSG小鼠中（每只小鼠47,400 CD34⁺CD38^-/327,000未培养的祖细胞，n=6）。干细胞区室的转导效率在体内为95%，如在排它地用CD34⁺CD38^-干细胞移植的NSG小鼠中测得的那样（n=6）。左侧的图显示了作为衍生自培养的CD34⁺CD38^-细胞的细胞的替代标记物在所述时间点处在人移植物（实心圆）中GFP⁺细胞的百分比，以及作为衍生自未培养祖细胞移植物的细胞的替代标记物的GFP^-细胞（空心圆）的百分比。在BMT后24周（反映来自HSC的造血作用的时间点），该移植物的大约60%是GFP⁺并由此衍生自CD34⁺CD38^-干细胞级分。该图对包括B细胞（CD19⁺）、骨髓细胞（CD33⁺）和CD34⁺ HSPC的所有谱系是类似的（右侧图）。另一方面，长期移植物的30-40%似乎衍生自CD34⁺CD38^int/+祖细胞——与图4中描述的研究相比预料不到地高的级分。此外，在达到干细胞和祖细胞贡献之间的平衡之前花费了15周（图7A），与图4B中描述的研究中的9周形成对照。

（B）为了基于输注高度富集的基因修饰HSC和未培养的祖细胞支持来改进基因疗法方案，我们调节了干细胞对祖细胞的比例（1:5 对 1:10）和培养条件（将培养时间减少至24小时，避免祖细胞细胞因子如IL3）以便能够在CD34⁺CD38^-细胞中更好地保持HSC功能。将来自于（A）中相同供体的CD34⁺CD38^-（干细胞）细胞解冻，以10⁶/毫升重新悬浮在补充有300纳克/毫升SCF、300纳克/毫升FLT3L、100纳克/毫升TPO和10 µM dmPGE2的CellGro介质中并预刺激16小时（示意图中的灰色框）。如示意图中所示，用PGK.GFP慢病毒载体以10⁸ TU/毫升转导8小时（红色框）。培养/基因修饰的干细胞随后与新鲜解冻的CD34⁺CD38^int/+祖细胞以1:5（每只小鼠46,500 CD34⁺CD38^-/232,500未培养的祖细胞，n=5）或1:10（每只小鼠46,500CD34⁺CD38^-/465,000未培养的祖细胞，n=5）的比混合，并注入到8周龄的亚致死量照射过的NSG小鼠中。上图显示了作为衍生自培养的CD34⁺CD38^-细胞的细胞的替代标记物在所述时间点处在人移植物（实心圆）中GFP⁺细胞的百分比，以及作为衍生自未培养祖细胞移植物的细胞的替代标记物的GFP^-细胞（空心圆）的百分比。注意到来自转导的CD34⁺CD38^-干细胞的快得多的贡献，在12周时已经达到最高70%（与图7A中的40%相比）。该GFP⁺细胞的分数在短寿命造血细胞谱系（CD33⁺或CD34⁺细胞）中是类似的，与1:5或1:10的干细胞/祖细胞比无关（下图）。这些数据支持了这样的观点：短培养时间对获得高度官能的、基因修饰的HSC而言至关重要。

图8

定制基因疗法过程中基因修饰的细胞的持久性。

（A）通过施用转导的CD34⁺CD38^-细胞与未转导的CD34⁺CD38^+/int祖细胞来实现稳定的长期转基因表达。此类方法非常适于治疗遗传的遗传性疾病。

（B）通过施用转导的CD34⁺CD38^+/int祖细胞与未转导的CD34⁺CD38^-细胞来实现瞬时短期转基因表达。

（C）通过施用转导的CD34⁺CD38^int/lo细胞与未转导的CD34⁺CD38^-细胞来实现瞬时中期表达。

（B）和（C）中显示的途径非常适于靶向肿瘤。

这些图显示了来自2个独立实验的数据（供体1: n=21只小鼠；供体2: n=12只小鼠）。

图9

体外培养时间对植入HSPC级分的影响（B和C：总CD34⁺HSPC；D：CD34⁺CD38^- HSPC；E：CD34⁺CD38^int/+祖细胞）

（A）测试体外培养条件的方案。所有实验对通过白细胞分离法收集的G-CSF动员外周血（mPB）干细胞进行。将细胞解冻并在补充有300纳克/毫升SCF、300纳克/毫升FLT3L、100纳克/毫升TPO、60纳克/毫升IL-3的无血清介质中（10⁶细胞/毫升）培养24小时（标准）或16小时（短），如通过灰色方框在该示意图中所示。如通过红色方框所示（更暗的方框），用第三代慢病毒载体以10⁸ TU/毫升进行转导20小时（标准）或8小时（短方案）。将同等数量的细胞（按照体外培养开始时的输入数量）注入亚致死量照射过的8周龄NSG小鼠，并经时监控植入。通过具有Bonferroni测试后的Two-way ANOVA进行统计。

（B）（左）按照标准或短期方案（每组n=5只小鼠，各自用5×10⁵ mPB CD34⁺细胞的产物注射）操作用SP146/gp91.cogp91^phox.126TLV转导的mPB CD34⁺细胞异种移植后在所示时间点处在NSG小鼠的外周血（PB）和骨髓（BM）中的人CD45⁺植入。（右）植入水平归一化至注入各小鼠的CD34⁺细胞的实际数量。该数字对短期培养方案较低，因为细胞的体外增殖时间较少。

（C）类似（B）中所述的复制实验证实，培养较短持续时间（24小时对44小时）的CD34⁺细胞具有显著提高的种群恢复潜力。

（D）按照短期方案（n=6只小鼠，每只小鼠4.7×10⁴细胞）或标准方案（n=6只小鼠，每只小鼠4.7×10⁴细胞）操作用PGK.GFPLV转导的mPB CD34⁺CD38^-干细胞和早期祖细胞异种移植后在所示时间点处在NSG小鼠的外周血（PB）和骨髓抽出物（BMasp）中的人CD45⁺GFP⁺植入。CD38^-的水平定义为按照用抗CD38抗体（IB6-PE-Vio770, Miltenyi）培育时的CD38染色水平排序并从最低CD38表达细胞（0-7%间隔，0为最低，100%为最高表达细胞）开始的CD34⁺细胞的7%。

（E）按照标准方案（n=4只小鼠）或短期方案（n=5只小鼠）操作用PGK.GFPLV转导的mPB CD34⁺CD38^int/+祖细胞异种移植后在所示时间点处在NSG小鼠的外周血（PB）和骨髓抽出物（BMasp）中的人CD45⁺植入。此外，n=5只小鼠用新解冻（未培养）的CD34⁺CD38^int/+祖细胞异种移植。用等效的5×10⁵ mPB CD34⁺CD38^int/+细胞注射小鼠。CD38^int/+的水平定义为按照用抗CD38抗体（IB6-PE-Vio770, Miltenyi）培育时的CD38染色水平排序并从最高CD38表达细胞（13-100%间隔，0为最低，100%为最高表达细胞）开始的CD34⁺细胞的87%。

图10

待用于临床基因疗法应用的潜在转导方案的示意图。方案A、B、C和D是优选方案。

发明详述

现在将通过非限制性实施例来描述本发明的各种优选特征和实施方案。

除非另行说明，本发明的实施将采用化学、分子生物学、微生物学和免疫学的常规技术，其在本领域普通技术人员的能力范围之内。在文献中说明了此类技术。参见例如J.Sambrook, E. F. Fritsch和T. Maniatis (1989) Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 第二版, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel, F. M.等人 (1995并定期增补) Current Protocols in Molecular Biology, 第9、13和16章,John Wiley & Sons, New York, NY；B. Roe, J. Crabtree和A. Kahn (1996) DNAIsolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons；J. M. Polak和James O’D. McGee (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice;Oxford University Press; M. J. Gait (编辑) (1984) Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach, IRL Press；以及D. M. J. Lilley和J. E. Dahlberg (1992)Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysisof DNA Methods in Enzymology, Academic Press。这些常规文本各自经引用并入本文。

根据本发明的第一方面，提供了制备用于临床应用的治疗性细胞群的方法，其中所述细胞表达CD34但基本不表达CD38。该细胞由包含造血干细胞的起始细胞群制备。该方法包括从起始细胞群中分离基本不表达CD38但表达CD34的细胞群，并用载体，优选病毒载体转导分离的细胞群以获得该治疗性细胞群。该载体优选包含相关核苷酸。

治疗性细胞群应理解为当施用于受试者时产生治疗效果的细胞群。该治疗效果可以是改善或基本治愈受试者的疾病或病症，或减少或基本防止疾病或病症在未来的出现。例如，有可能通过基因组测序来识别遗传的遗传疾病并通过施用该治疗性细胞群来防止该疾病出现。该治疗性细胞群可以包含可用于基因疗法的基因。

“临床应用”应理解为以可以施用于动物受试者，优选人类受试者的形式制备该治疗性细胞群。

造血干细胞

干细胞能够分化成多种细胞类型。能够分化成所有细胞类型的细胞被称为全能细胞。在哺乳动物中，仅有受精卵和早期胚胎细胞是全能的。干细胞在大多数（如果并非全部）多细胞生物中发现。它们的特征在于通过有丝细胞分裂自我更新和分化成各种各样的特定细胞类型的能力。两种主要类型的哺乳动物干细胞是从囊胚的内细胞团中分离的胚胎干细胞，以及在成体组织中发现的成体干细胞。在发育的胚胎中，干细胞可以分化成所有特定胚胎组织。在成年生物体中，干细胞和祖细胞充当身体的修复系统，补充特定的细胞，但还维持再生性器官如血液、皮肤或肠组织的正常周转。

造血干细胞（HSC）是例如可以在外周血、骨髓和脐带血中发现的多能干细胞。HSC能够自我更新并分化成任何血细胞谱系。它们能够再移植（recolonising）整个免疫系统，并在所有造血组织（如骨髓、脾脏和胸腺）中再移植红细胞和骨髓细胞谱系。它们提供所有造血细胞谱系的终身生产。

造血祖细胞能够分化成特定类型的细胞。但是，不同于干细胞，它们已经更具体得多：它们被推进到分化成它们的“靶”细胞。干细胞与祖细胞之间的差别在于，干细胞可以无限复制，而祖细胞仅能分裂有限的次数。造血祖细胞可以仅通过功能体内试验（即移植并证明是否它们能够在延长的时段产生所有血细胞谱系）与HSC严格区分。

分化的细胞是与干细胞或祖细胞相比已经变得更特定的细胞。分化在多细胞生物发育过程中发生，当生物体由单个受精卵变为组织和细胞类型的复杂体系。分化还是在成体中的常见过程：在组织修复和正常细胞更新过程中，成体干细胞分裂并产生完全分化的子代细胞。分化显著改变了细胞的尺寸、形状、膜电势、代谢活性和对信号的响应。这些变化在很大程度上是由于基因表达中的高度受控的修饰。换句话说，分化细胞是具有特定结构并由于涉及特定基因的激活与失活的发育过程而发挥特定功能的细胞。在这里，分化细胞包括造血细胞谱系的分化细胞，如单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞、T细胞、B细胞和NK细胞。例如，造血细胞谱系的分化细胞可以通过检测在未分化细胞上不表达或表达程度较低的细胞表面分子来与干细胞和祖细胞区分开。合适的人细胞谱系标记物的实例包括CD33、CD13、CD14、CD15（骨髓细胞）、CD19、CD20、CD22、CD79a（B细胞）、CD36、CD71、CD235a（红系细胞）、CD2、CD3、CD4、CD8（T细胞）、CD56（NK细胞）。

HSC来源

例如，HSC可以获自成人和胎儿的外周血、脐带血、骨髓、肝脏或脾脏。优选地，这些细胞获自外周血或骨髓。它们可以在通过生长因子治疗在体内动员细胞后获得。

可以使用例如G-CSF、普乐沙福(plerixaphor)或其组合来进行动员。其它试剂如NSAIDs、CXCR2配体（Grobeta）和二肽基肽酶抑制剂也可用作动员剂。

由于干细胞生长因子GM-CSF和G-CSF的可用性，大多数造血干细胞移植程序现在使用由外周血而非由骨髓收集的干细胞来进行。收集外周血干细胞提供了更大的移植物，不需要对供体施以全身麻醉以收集该移植物，导致了植入时间更短，并可以提供较低的长期复发率。

可以通过标准吸引法或通过使用下一代收获工具（例如Marrow Miner）来收集骨髓（稳定状态或动员后）。

此外，HSC还可以衍生自诱导的多能干细胞。

HSC特性

通过流式细胞术程序，HSC通常具有低前向散射和侧向散射轮廓。一些是代谢静止的，如通过罗丹明标记（其能够测定线粒体活性）所展现的那样。HSC可以包含某些细胞表面标记物如CD34、CD45、CD133、CD90和CD49f。它们还可以定义为缺少CD38和CD45RA细胞表面标记物的表达的细胞。但是，这些标记物的一些的表达依赖于该HSC的发育阶段和组织特异性背景。称为“侧群细胞”的一些HSC如通过流式细胞术检测的那样排除Hoechst 33342染料。由此，HSC具有允许它们的识别和分离的描述性特性。

阴性标记物

CD38是人HSC的最成熟和使用的单一阴性标记物。

人HSC还可能对谱系标记物如CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD36、CD56、CD66b、CD271和CD45RA是阴性的。但是，对于HSC富集，这些标记物必须组合使用。

阴性标记物应理解为人HSC缺乏这些标记物的表达。

阳性标记物

CD34和CD133是对HSC最有用的阳性标记物。

某些HSC对谱系标记物如CD90、CD49f和CD93也是阳性的。但是，对于HSC富集，这些标记物必须组合使用。

阳性标记物应理解为人HSC表达这些标记物。

因此，该治疗性细胞群可以是CD34⁺CD38^-。可以进行进一步分离以获得例如CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺CD49f⁺细胞。

细胞的分离

分离细胞群指的是将表现出特定表型或特性的细胞群从不表现出该表型或特性或以较低程度表现的其它细胞中提纯。例如，可以从起始细胞群中分离不表达特异性标记物（如CD38）的细胞群。或者或此外，可以分离表达另一标记物（如CD34）的细胞群。

在本发明的一个实施方案中，该方法包括以下步骤：

a．从包含造血干细胞的起始细胞群中分离表达CD38的细胞；

c．用载体转导步骤（b）中获得的表达CD34的细胞群以获得该治疗性细胞群。

分离表达特定标记物（例如CD38或CD34）的细胞群可以通过使用结合到该标记物的试剂来实现。

在另一实施方案中，该方法包括以下步骤：

a．使包含造血干细胞的起始细胞群与CD38反应性试剂接触；

b．将CD38反应性细胞与CD38非反应性细胞分离；

d．将CD34反应性细胞与CD34非反应性细胞分离，其中该CD34反应性细胞构成该转导细胞群；

e．用载体转导该转导细胞群以获得该治疗性细胞群。

对特定标记物如CD38或CD34为反应性的试剂应理解为基本特异性结合到该标记物上的试剂。

在本发明的一个实施方案中，对CD38或CD34为反应性的试剂分别是抗CD38或抗CD34抗体。

本文中所用的抗体指的是能够结合到所选靶上的完全抗体或抗体片段，并包括Fv、ScFv、F(ab’)和F(ab’)₂，单克隆和多克隆抗体，工程抗体，包括嵌合抗体、CDR移植抗体和人源化抗体，以及使用噬菌体展示或替代技术产生的人工选择抗体。

此外，传统抗体的替代物也可用于本发明，例如“avibodies”、“avimers”、“anticalins”、“nanobodies”和“DARPins”。

因此，例如CD38反应性细胞应理解为表达CD38标记物并因此结合到CD38反应性试剂上的那些细胞。相反，CD38非反应性细胞基本上不结合到CD38反应性试剂。相同的理解可以类推地适用于CD34反应性和非反应性细胞。

可以使用多种本领域已知的技术的任一种标记特定标记物反应性试剂以使得可以识别。该反应性试剂可以固有地被标记，或可以通过向其缀合标签来修饰。缀合理解为该反应性试剂与标签操作性连接。这意味着反应性试剂与标签以能够基本无阻碍地执行其功能（例如结合至标记物、允许荧光标识、或当置于磁场时能够进行分离）的方式连接在一起。合适的缀合方法在本领域是公知的，并可以由技术人员容易地识别。

标签例如可以允许被标记的试剂及结合于其上的任何细胞从其环境中纯化（例如该反应性试剂可以用磁珠或亲和标记物如亲和素进行标记）和/或检测。适于用作标签的可检测的标记物包括荧光基团（例如绿色、樱桃色、蓝绿色和橙色荧光蛋白）和肽标记物（例如His标记物、Myc标记物、FLAG标记物和HA标记物）。

在本发明的一个实施方案中，抗CD38和/或抗CD34抗体缀合到磁珠上。

在另一实施方案中，抗CD38和/或抗CD34抗体缀合到可检测的标记物上。

在另一实施方案中，可检测的标记物是荧光基团。

大量用于分离表达特定标记物的细胞群的技术在本领域是已知的。这些包括基于磁珠的分离技术（例如基于磁珠的闭路分离）、流式细胞术、荧光激活细胞分选技术（FACS）、亲和标记物纯化（例如使用亲和柱或珠，如生物素柱来分离亲和素标记的试剂）和基于显微术的技术。

在一个实施方案中，使用基于磁珠的分离法或流式细胞术来分离表达CD38的细胞和/或表达CD34的细胞。

在另一实施方案中，使用基于磁珠的分离法或流式细胞术来分离CD38反应性细胞和/或CD34反应性细胞。

还有可能采用不同技术的组合来进行分离，如在基于磁珠的分离步骤后通过流式细胞术对一种或更多种附加（阳性或阴性）标记物来分选所得细胞群。

可以进行临床级分离，例如使用CliniMACS^®系统（Miltenyi）。这是基于磁珠的闭路分离技术的一个实例。

还可以设想，染料排斥性质（例如侧群细胞或罗丹明标记）或酶活性（例如ALDH活性）可用于富集HSC。

当使用现有的基于磁珠的分离技术时，优选的是负分离步骤（即贫化表达CD38的细胞）应当先于正分离步骤（即富集表达CD34的细胞）。但是，可以设想，可以采用替代技术，例如先进的流式细胞术技术（例如闭路FACS）同时进行负分离和正分离步骤。

但是，还可以在负分离步骤（即贫化表达CD38的细胞）之前进行正分离步骤（即富集表达CD34的细胞）。

本发明的细胞群可以根据CD38表达水平分离成多个级分。CD38表达水平可以采用本领域已知的合适技术，例如流式细胞术技术（参见例如图4）来量化。例如，CD38表达水平可以通过用IB6克隆或类似/等效试剂染色抗体来测量。

细胞的CD38表达量可以以百分比表达水平来表示，0%为最低表达细胞，100%为最高表达细胞。

细胞群可以基于CD38表达水平分类或分离为亚群（例如衍生自CD34⁺群的亚群）。细胞群可以分类或分离为CD38^-、CD38^int1、CD38^int2或CD38⁺亚群，其以此顺序具有渐增的CD38表达水平（例如整个CD34⁺群根据CD38表达/染色强度评级）。例如（当预门控对CD34⁺细胞的分析时），具有CD38^-表型的细胞群可以根据CD38表达水平包含在最低的10%细胞中；具有CD38^int1表型的细胞群（也称为CD38^int/lo）可以包含在该CD38^-细胞的下一个最高的30%细胞中；具有CD38^int2表型的细胞群（也称为CD38^+/int）可以包含在CD38^int1细胞的下一个最高30%的细胞中；并且具有CD38⁺表型的细胞群（也称为CD38^hi）可以包含在CD38^int2细胞的下一个最高30%的细胞中。

由此，具有CD38^-表型的细胞群可以例如包含在CD38表达的大约0-12%范围内，例如大约0-10%范围。

具有CD38^int1表型的细胞群（也称为CD38^int/lo）可以例如包含在CD38表达的大约10-40%范围内，例如大约12-40%或大约13-40%范围。

具有CD38^int2表型的细胞群（也称为CD38^+/int）可以例如包含在CD38表达的大约40-70%范围内，例如大约41-70%范围。

具有CD38⁺（也称为CD38^hi）表型的细胞群可以例如包含在CD38表达的大约70-100%范围内，例如大约71-100%范围。

根据本文中的公开内容，本领域技术人员将能够容易地根据预期用途基于CD38表达水平来选择细胞群。事实上，本领域技术人员将容易理解，公开的CD38表达水平可以根据所需用途略微调整。

在一个优选实施方案中，该CD38^-群（含有干细胞的级分）定义为具有0-10%范围的CD38表达；CD38^int1群（含有多能祖细胞的级分，具有短期或中期再植能力）定义为具有10-40%范围的CD38表达；CD38^int2群（含有祖细胞的级分，具有短期再植能力）定义为具有40-70%范围的CD38表达；并且CD38⁺群（前体细胞，基本不具有显著的再植能力）定义为具有70-100%范围的CD38表达。

细胞的这些级分可以按需合并。例如，CD38^int1和CD38^int2级分可以合并以形成CD38^int级分（包含在CD38表达的大约10-70%范围内）；并且CD38^int1、CD38^int2和CD38⁺组可以合并以形成CD38^{low-intm-high}（也称为CD38^int/+）级分（包含在CD38表达的大约10-100%范围内，例如大约12-100%或大约13-100%范围）。

载体

载体是允许或促进实体由一种环境转移至另一种环境的工具。按照本发明并举例而言，用于重组核酸技术的一些载体允许实体，如核酸片段（例如异源DNA片段，如异源cDNA片段）转移到靶细胞中。该载体可以用于以下目的：将该异源核酸（DNA或RNA）保持在细胞中，促进包含核酸片段的载体的复制，或促进由核酸片段编码的蛋白质的表达。载体可以是非病毒的或病毒的。用于重组核酸技术的载体的实例包括但不限于质粒、染色体、人工染色体和病毒。该载体还可以是例如裸露的核酸（例如DNA）。在其最简单的形式中，该载体本身可以是相关核苷酸。

本发明中使用的载体例如可以是质粒或病毒载体，并可以包括用于多核苷酸的表达的启动子和任选该启动子的调节子。

用于本发明的包含多核苷酸的载体可以使用本领域已知的多种技术引入到细胞中，如转化和转导。几种技术在本领域是已知的，例如用重组病毒载体，如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒和单纯性疱疹病毒载体感染；直接注射核酸和生物射弹转化。

非病毒递送系统包括但不限于DNA转染法。这里，转染包括使用非病毒载体向靶细胞递送基因的过程。

通常的转染方法包括电穿孔、DNA生物射弹、脂类介导的转染、紧凑型DNA介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂转染剂（lipofectin）、阳离子试剂介导的转染、阳离子表面亲水脂分子（CFAs）（Nature Biotechnology 1996 14; 556）及其组合。

此外，本发明可以采用基因靶向协议，例如DNA修饰剂的递送。

病毒载体

在一个实施方案中，在本发明中使用病毒载体。

在另一实施方案中，该病毒载体是逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。

在另一实施方案中，该逆转录病毒载体是慢病毒载体。

逆转录病毒和慢病毒载体

本发明中使用的逆转录病毒载体衍生自或可以衍生自任何合适的逆转录病毒。已经确定了大量不同的逆转录病毒。实例包括：鼠白血病病毒（MLV）、人T细胞白血病病毒（HTLV）、小鼠乳腺瘤病毒（MMTV）、劳斯氏肉瘤病毒（RSV）、弗吉纳米肿瘤病毒（FuSV）、莫洛尼氏鼠白血病病毒（Mo MLV）、FBR小鼠骨肉瘤病毒（FBR MSV）、莫洛尼氏小鼠肉瘤病毒（Mo-MSV）、艾贝尔逊氏白小鼠白血病病毒（A-MLV）、鸟类骨髓细胞瘤病毒-29（MC29）和鸟类成红细胞增多症病毒（AEV）。逆转录病毒的详细清单可见于Coffin等人(1997) “Retroviruses”, ColdSpring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus, 第758-763页。

逆转录病毒可以大致分为两类，即“简单”和“复杂”。逆转录病毒甚至可以进一步分为七组。这些组中的五组代表具有致癌潜能的逆转录病毒。剩余两组是慢病毒和泡沫病毒。这些逆转录病毒的综述见于Coffin等人(1997)，同上。

逆转录病毒和慢病毒基因组的基本结构有许多共同特征，如5’ LTR和3’ LTR（使得能够包装基因组的包装信号位于其之间或其之中）、引物结合位点、使得能够整合到宿主细胞基因组中的整合位点以及编码包装组件的gag、pol和env基因——这些是装配病毒粒子所需的多肽。慢病毒具有附加特征，如在HIV中的rev和RRE序列，这使得能够将整合的前病毒的RNA转录体由细胞核有效输出至感染的目标细胞的细胞质。

在前病毒中，这些基因在两个末端处侧接称为长末端重复序列（LTRs）的区域。该LTRs负责前病毒整合和转录。LTRs还充当增强子-启动子序列，并可以控制病毒基因的表达。

该LTRs本身是相同的序列，可以分为三个组分，其称为U3、R和U5。U3衍生自RNA的3’末端独有的序列。R衍生自在RNA两个末端处重复的序列，U5衍生自RNA的5’末端独有的序列。三个组分的尺寸在不同的逆转录病毒中可以显著不同。

在有缺陷的逆转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可以不存在或无功能。在RNA两个末端处的R区域是重复序列。U5和U3分别代表在RNA的5’和3’末端处的独特序列。

在用于本发明的典型逆转录病毒载体中，复制所必需的一个或更多个蛋白质编码区的至少一部分可以从该病毒中除去。这使该病毒载体为复制缺陷型。该病毒基因组的部分还可以被操作性连接到调控区的库编码候选调制部分和该载体基因组中的报道基因部分替代以生成包含候选调制部分的载体，其能够转导目标非分裂宿主细胞和/或将其基因组整合到宿主基因组中。

慢病毒载体是更大的一组逆转录病毒载体的一部分。慢病毒的详细清单可见于Coffin等人(1997) “Retroviruses”, Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JMCoffin, SM Hughes, HE Varmus, 第758-763页。简而言之，慢病毒可以分为灵长类动物组和非灵长类动物组。灵长类动物慢病毒的实例包括但不限于：人免疫缺陷症病毒（HIV）、人免疫缺陷综合征的病原体（AIDS）和猴免疫缺陷病毒（SIV）。非灵长类动物慢病毒组包括原型“慢病毒”绵羊髓鞘脱落病毒/绵羊慢性进行性肺炎病毒（VMV），以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒（CAEV）、马传染性贫血病毒（EIAV）和更近来描述的猫免疫缺陷病毒（FIV）和牛免疫缺陷病毒（BIV）。

慢病毒家族不同于逆转录病毒之处在于慢病毒能够感染分裂和非分裂的细胞（Lewis等人(1992) EMBO J 11(8):3053-3058，以及Lewis和Emerman (1994) J Virol 68(1):510-516）。相反，其它逆转录病毒如MLV不能感染非分裂或缓慢分裂的细胞，如构成例如肌肉、脑、肺和肝脏组织的那些。

本文中所用的慢病毒载体是包含至少一个可以衍生自慢病毒的组成部分的载体。优选地，该组成部分涉及载体由此感染细胞、表达基因或被复制的生物学机制。

慢病毒载体可以是“非灵长类”载体，即衍生自并非主要感染灵长类动物，尤其是人的病毒。

非灵长类动物慢病毒的实例可以是不会天然地感染灵长类动物的慢病毒科的任何成员，并可以包括猫免疫缺陷病毒（FIV）、牛免疫缺陷病毒（BIV）、山羊关节炎-脑炎病毒（CAEV）、梅-维病毒（MVV）或马传染性贫血病毒（EIAV）。

该病毒载体可以衍生自EIAV。EIAV具有最简单的慢病毒基因组结构。除了gag、pol和env基因之外，EIAV编码三种其它基因：tat、rev和S2。Tat充当病毒LTR的转录激活因子（Derse和Newbold (1993) Virology 194(2):530-536，以及Maury等人(1994)Virology 200(2):632-642），并且rev通过rev应答元件（RRE）调节和协调病毒基因的表达（Martarano等人(1994) J Virol 68(5):3102-3111）。这两种蛋白质的作用机制据认为大致相似于灵长类动物病毒中的类似机制（Martarano等人(1994) J Virol 68(5):3102-3111）。S2的功能未知。此外，已经确定了EIAV蛋白，Ttm，其通过被剪接到跨膜蛋白起始处的env编码序列的tat的第一个外显子来编码。

本发明中使用的病毒载体优选具有最小病毒基因组。

本文中所用的术语“最小病毒基因组”指的是病毒载体已经被操纵以便去除非必需元件并保留必需元件以提供感染、转导和递送相关核苷酸序列至目标宿主细胞所需的功能性。这种策略的更多细节可见于WO 1998/017815。

但是，用于在宿主细胞/包装细胞中产生病毒基因组的质粒载体将包括转录调节控制序列，这些调节控制序列操作性连接到逆转录病毒基因组以引导基因组在宿主细胞/包装细胞中的转录。这些调节序列可以是与被转录的逆转录病毒序列，即5’ U3区域相关的天然序列，或者它们可以是异源启动子，如另一种病毒启动子，例如CMV启动子。一些慢病毒基因组需要额外的序列以便有效地产生病毒。例如特别是在HIV的情况下，可以包括rev和RRE序列。但是，通过密码子优化可以减少或消除对rev和RRE的需要。这种策略的更多细节可见于WO 2001/079518。执行与rev/RRE系统相同功能的替代性序列也是已知的。例如，rev/RRE系统的功能性类似物存在于Mason Pfizer猴病毒中。这被称为组成型转运元件（CTE）并包含被认为与受感染细胞中的因子相互作用的该基因组中的RRE-型序列。该细胞因子可以被认为是rev类似物。由此，CTE可以用作rev/RRE系统的替代物。已知或可用的任何其它功能等同物可以与本发明相关。例如，还已知HTLV-I的Rex蛋白可以在功能上替代HIV-1的Rev蛋白。在本发明的方法中使用的载体中，Rev和RRE可能不存在或无功能；在替代物中可能存在rev和RRE。

用于本发明的方法的载体可以使用其中已经删除病毒增强子和启动子序列的自身失活型（SIN）载体。SIN载体可以以类似于野生型载体的效率在体内生成并转导非分裂细胞。 SIN前病毒中的长末端重复序列（LTR）的转录失活应通过可复制病毒防止动员。这应当还能够通过消除LTR的任何顺式作用效果由内部启动子进行基因的调节表达。

例如，通过删除转录增强子或3’ LTR的U3区域中的增强子或启动子，已经构建了自身失活型逆转录病毒载体系统。在一轮载体反转录和整合后，这些变化被拷贝到5’和3’LTR中，产生无转录活性的前病毒。但是，此类载体中位于LTRs内部的任何启动子仍将是转录活性的。这种策略已经用于消除病毒LTRs中的增强子和启动子对来自内部放置基因的转录的影响。此类影响包括提高的转录或转录抑制。这种策略还可用于消除由3’ LTR向基因组DNA中的下游转录。这在其中重要的是防止内源性致癌基因的偶发性激活的人类基因疗法中是特别值得关注的。Yu等人, (1986) PNAS 83: 3194-98；Marty等人, (1990)Biochimie 72: 885-7；Naviaux等人, (1996) J. Virol. 70: 5701-5；Iwakuma等人,(1999) Virol. 261: 120-32；Deglon等人, (2000) Human Gene Therapy 11: 179-90。

非复制型慢病毒载体

在复制缺陷型慢病毒载体基因组中，gag、pol和env可以不存在或无功能。

在用于本发明的典型慢病毒载体中，复制所必需的一个或更多个蛋白质编码区的至少一部分可以从该病毒中除去。这使该病毒载体为复制缺陷型。该病毒基因组的部分还可以被相关核苷酸（NOI）替代以生成包含NOI的载体，其能够转导目标非分裂宿主细胞和/或将其基因组整合到宿主基因组中。

在一个实施方案中，该慢病毒载体是WO 2007/071994中描述的非整合载体。

该慢病毒载体可以是“非灵长类”载体，即衍生自并非主要感染灵长类动物，尤其是人类的病毒。

腺病毒载体

在本发明的另一实施方案中，该载体可以是腺病毒载体。腺病毒是双链的线性DNA病毒，其不经过RNA中间体。存在超过50种不同的腺病毒的人血清型，其基于基因序列同源性分为6个亚组。腺病毒的天然目标是呼吸道和消化道上皮细胞，通常仅引起轻微的症状。血清型2和5（具有95%的序列同源性）最常用于腺病毒载体系统，并通常与年轻人的上呼吸道感染相关。

腺病毒是无包膜的正二十面体。典型的腺病毒包含140纳米包被的DNA病毒。该病毒的二十面体对称性由152个壳粒组成：240个六邻体和12个五邻体。该颗粒的芯含有36 kb线性双链DNA，其在5’末端处与末端蛋白（TP）共价相连，所述末端蛋白充当DNA复制的引物。该DNA具有末端反向重复序列（ITR），并且这些的长度随血清型而不同。

腺病毒能够体内和体外转导多种人和非人来源的细胞类型。这些细胞包括呼吸道上皮细胞、肝细胞、肌肉细胞、心肌细胞、滑膜细胞、原代乳腺上皮细胞和有丝分裂后终末分化细胞如神经元。

腺病毒载体也能够转导非分裂细胞。这对疾病非常重要，如囊性纤维化，其中肺上皮细胞中受影响的细胞具有缓慢的更新率。事实上，一些实验正在利用囊性纤维化转运蛋白（CFTR）向患病成人囊性纤维化患者肺内的腺病毒介导的转移。

腺病毒已经用作用于基因疗法和用于异源基因的表达的载体。大的（36 kb）基因组可以容纳最多8 kb的外来插入DNA，并能够在互补细胞系中有效地复制以制造高达1012的极高滴度。腺病毒因此是研究原代非复制性细胞中的基因表达的最佳系统之一。

病毒或来自腺病毒基因组的外源基因的表达不需要复制细胞。腺病毒载体通过受体介导的内吞作用进入细胞。一旦在细胞内部，腺病毒载体很少整合到宿主染色体中。相反，它们在宿主细胞核中基因游离地（独立于宿主基因组）起到线性基因组的作用。因此，使用重组腺病毒减轻了与随机整合到宿主基因组中相关的问题。

腺相关病毒载体

腺相关病毒（AAV）是用于本发明的有吸引力的载体系统，因为其具有高整合频率，并且其可以感染非分裂细胞。这使其可用于在组织培养中向哺乳动物细胞中递送基因。AAV具有广泛的易感染宿主范围。关于rAAV载体的生成和使用的细节描述在美国专利号5,139,941和美国专利号4,797,368中。

重组AAV载体已经成功地用于标记物基因和涉及人类疾病的基因的体外和体内转导。

单纯性疱疹病毒载体

单纯性疱疹病毒（HSV）是一种包膜的双链DNA病毒，其天然感染神经元。其可以容纳外源DNA的大片段，这使其作为载体系统具有吸引力，并已经用作向神经元递送基因的载体。

在治疗程序中使用HSV需要对菌株进行减毒以使得它们不能建立裂解循环。特别地，如果HSV载体用于人体内的基因疗法，多核苷酸应优选插入到必需基因中。这是因为，如果载体病毒遇到野生型病毒，将通过重组发生异源基因向野生型病毒中的转移。但是，只要多核苷酸被插入必需基因，这种重组转移将删除容受病毒中的必需基因，并防止异源基因“逃逸”到可复制型野生型病毒群中。

相关核苷酸

本发明中使用的载体优选包含相关核苷酸。

该相关核苷酸优选产生治疗效果。

合适的NOIs包括但不限于编码酶、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化剂分子、工程化的免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、反义RNA、microRNA、shRNA、siRNA、核酶、miRNA靶序列、靶蛋白的跨域负突变体、毒素、条件毒素、抗原、肿瘤抑制蛋白、生长因子、转录因子、膜蛋白、表面受体、抗癌分子、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶及其衍生物（如具有相关报告基团的衍生物）的序列。该NOIs还可以编码前药激活酶。

NOI的一个实例是β-球蛋白链，其可用于地中海贫血/镰状细胞疾病的基因疗法。

NOIs还包括可用于治疗需要骨髓系中的非紧急/选择性基因修正的其它疾病的那些，如：慢性肉芽肿病（CGD，例如gp91phox转基因）、白细胞粘附缺陷、在未发生严重感染的患者体内的其它巨噬细胞疾病和遗传性骨髓衰竭综合征（例如范可尼贫血症），以及原发性免疫缺陷（SCID）。

支持细胞群

我们的预料不到的发现——高度纯化的HSC明显更可被载体，特别是慢病毒载体转导——促使我们评估HSC基因疗法方案的全新设计。该新方案包括将起始细胞群（例如获自动员的外周血、骨髓或脐带血的细胞群）分离为富含HSC的级分（治疗性细胞群，例如对于CD34⁺细胞具有富集的HSC含量）和含有祖细胞的级分（支持细胞群）。后者可以在未经离体操作的情况下冷冻并可以注入到受试者体内以促进骨髓脱离调理后的血液学恢复。高度纯化的含有HSC的级分将使用如本文中所述的“最小”体外培养（相对于标准CD34⁺细胞转导方案降低的培养时间和载体剂量）来转导。

在本发明的一个实施方案中，保留分离的表达CD38的细胞或CD38反应性细胞或其一部分以形成支持细胞群。该群可以包含CD38^int1、CD38^int2和/或CD38⁺级分。

该治疗性细胞群和/或支持细胞群可以在其制备后冷冻以便于后继移植之前的储存。当支持细胞群在制备该治疗性细胞群的方法的早期阶段分离时，优选其应当在分离后尽快地冷冻，优选在分离后立即冷冻。冷冻细胞以保持其存活的方法在本领域是公知的。

当需要例如用于施用于受试者时，可以将冷冻的细胞解冻。

细胞转导

用载体转导细胞群可以利用在第二培养阶段之前的预刺激阶段，在此过程中细胞暴露于载体。在预刺激阶段过程中，细胞可以在培养基中培养，所述培养基包含例如干细胞因子（SCF）、FLT3配体（FLT3L）和促血小板生成素（TPO），以及任选IL3、IL6、IL11、M-CSF、FGF-1、IGF-2、IGFBP2、ANGPTL3或5。

细胞群例如可以是如本文中所述的治疗性细胞群、CD34⁺CD38^-细胞群、造血干细胞群或造血祖细胞群。

优选地，该载体是慢病毒载体。

下面描述的标准或短方案可以在本文中所述的方法的过程中实施。但是，还要理解的是，标准方案和短方案可以在用载体（例如慢病毒载体）转导细胞群的任何方法的过程中实施。这向本发明提供了进一步的方面。

用载体转导细胞群可以使用标准方案进行，其中细胞在施用于受试者之前经历44小时或更久的培养。

本发明因此提供其中用载体转导细胞群的步骤包括培养细胞大约44小时或更久（“标准”方案）的方法。“用载体转导细胞群的步骤”应理解为预刺激和载体暴露阶段。

例如，在用载体转导的步骤过程中，细胞群可以培养大约44-66小时、44-60小时、44-54小时或44-48小时。在一个实施方案中，在用载体转导的步骤过程中，细胞群培养大约66、60、54、48或44小时。

但是，本发明人已经发现，培养时间不利地影响造血干细胞和祖细胞的功能植入能力。因此，本发明人已经开发了短转导方案，其平衡了植入方面的改进与转导效率方面的相应降低。

本发明因此提供了其中用载体转导细胞群的步骤包括培养细胞小于大约44小时的方法（“短”方案）。

例如，在用载体转导的步骤过程中，细胞群可以培养大约12-42小时、12-36小时、12-24小时或12-18小时。在一个实施方案中，在用载体转导的步骤过程中，细胞群培养大约42、36、30、24、18或12小时。在用载体转导的步骤过程中，细胞群优选培养大约24小时。

在标准方案或短方案中，该预刺激阶段例如可以为大约12、14、16、18或22小时的持续时间。优选地，该预刺激阶段具有大约16小时的持续时间。

在标准方案或短方案中，该载体暴露阶段例如可以为大约8、10、12、14或16小时的持续时间。优选地，该载体暴露阶段具有大约8小时的持续时间。

在标准方案或短方案中，用载体转导细胞群的步骤可以包括在将细胞施用于受试者之前重复该预刺激和载体暴露阶段。例如，该细胞可以经受预刺激，接着是载体暴露，接着是第二预刺激阶段，接着是第二载体暴露阶段。

优选地，在用载体转导细胞群的步骤的过程中该细胞培养基不包含IL3。

前列腺素E2或前列腺素E2衍生物（例如16,16-二甲基前列腺素E2 (dmPGE2)）可以在预刺激阶段过程中添加至细胞群。前列腺素E2或前列腺素E2衍生物可以在预刺激阶段开始时、或在预刺激阶段过程中加入。例如，前列腺素E2或前列腺素E2衍生物可以在细胞群暴露于载体之前大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12 小时加入。优选地，前列腺素E2或前列腺素E2衍生物在预刺激阶段过程中在细胞暴露于载体之前大约2小时添加到细胞群中。在另一实施方案中，前列腺素E2或前列腺素E2衍生物与暴露于载体同时添加到细胞群中。

实施例8中陈述了优选的转导方案。

药物组合物

本发明提供包含本发明的治疗性细胞群和/或支持细胞群的药物组合物。

本发明的细胞可以用可药用载体、稀释剂或赋形剂配制以便施用于受试者。合适的载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲的盐水，并可能含有人血清白蛋白。

细胞疗法产品的处理优选遵照用于细胞疗法的FACT-JACIE国际标准来进行。

造血干细胞移植

本发明提供了用于医学，例如用于基因疗法的治疗性细胞群。

该用途可以作为造血干细胞移植程序的一部分。

造血干细胞移植（HSCT）是衍生自骨髓（在这种情况下称为骨髓移植）或血液的血液干细胞的移植。干细胞移植是血液学和肿瘤学领域中的医疗方法，最通常对患有血液或骨髓疾病或某些类型的癌症的人进行。

许多HSCTs的接受者是多发性骨髓瘤或白血病患者，其将不会受益于长期治疗，或已经耐受化疗。HSCTs的候选者包括儿科病例，其中患者具有天生的缺陷如严重的联合免疫缺陷或先天性中性白细胞减少，干细胞存在缺陷，以及在出生后失去他们的干细胞的患有再生障碍性贫血的孩子或成人。用干细胞移植治疗的其它病症包括镰状细胞疾病、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、淋巴瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和何杰金氏病。更近来，已经开发了需要较小剂量的术前化疗和辐射的非骨髓脱离性，或所谓“微移植”程序。这允许在被认为过于虚弱以致不能承受常规治疗方案的中老年和其他患者中进行HSCT。

在本发明的一个实施方案中，该治疗性细胞群与本发明的支持细胞群结合施用。

在一个实施方案中，本发明的治疗性细胞群和/或支持细胞群作为自体干细胞移植程序的一部分施用。

在另一实施方案中，本发明的治疗性细胞群和/或支持细胞群作为同种异体干细胞移植程序的一部分施用。

自体干细胞移植程序应理解为起始细胞群（该治疗性细胞群和/或支持细胞群衍生于此）获自施用该治疗性细胞群和/或支持细胞群的同一受试者。如上所述，自体移植程序是有利的，因为它们避免了与免疫学的组织不相容性相关的问题，并可用于受试者而不考虑基因匹配供体的可得性。

同种异体干细胞移植程序理解为起始细胞群（该治疗性细胞群和/或支持细胞群衍生于此）获自与施用该治疗性细胞群和/或支持细胞群的受试者不同的受试者。优选地，该供体与施用该细胞的受试者基因匹配以尽量减少免疫学的组织不相容性的风险。

在本发明的一个实施方案中，该治疗性细胞群在施用支持细胞群之前施用于受试者。

该治疗性细胞群例如在施用该支持细胞群之前大约1-72、12-60或24-48小时，如施用该支持细胞群之前大约1、2、3、4、5、6、12、18、24、30、36、42、48、60或72小时施用于受试者。

在另一实施方案中，该治疗性细胞群与施用支持细胞群同时期或同时地施用于受试者。

合适剂量的治疗性和支持细胞群使得是治疗和/或预防有效的。待施用的剂量可能取决于待治疗的受试者与病症，并可以容易地由技术人员确定。

支持细胞群中CD34⁺CD38⁺细胞的可能剂量可能为大约4-5百万细胞/千克。该剂量应确保在骨髓脱离调理后及时短期植入。

因此，当本发明的支持细胞群并未对CD34⁺细胞富集时，该支持细胞群的可能的目标剂量可以为大约50-1000百万CD38⁺有核细胞/千克，如大约100百万细胞/千克（假定CD34⁺细胞浓度为5%）。例如，衍生自动员的外周血的细胞的可能剂量可以为大约100-500百万细胞/千克，而衍生自骨髓的细胞的可能剂量可以为大约50-200百万细胞/千克。

治疗性细胞群的可能剂量可以为大约0.1-2百万细胞/千克，例如大约0.5-1百万细胞/千克。

治疗性细胞群:支持细胞群的总比率取决于临床情况，并取决于制备支持细胞群的方式。在其中通过未预先进行CD34富集的CD38选择（例如白细胞分离法或骨髓收获）制备支持细胞群的情况下，治疗性细胞群:支持细胞群的总比率可以为大约1:100-1:1000，例如大约1:500或1:100。优选根据其中所含的CD34⁺细胞的绝对数量来定量施用支持细胞群（与是否进行CD34⁺预富集无关）。

在一个实施方案中，当受试者已经经受骨髓脱离调理时，细胞的剂量可以调整以使得在支持细胞群中施用的CD34⁺细胞的数量为大约5-15×、优选5-10×在治疗性细胞群中施用的CD34⁺细胞的数量。由此，例如，施用于受试者的CD34⁺CD38^-细胞对未培养的CD34⁺CD38⁺祖细胞的比率可以为大约1:10或1:5。

待施用的支持细胞群可以包含最小绝对数量大约2.5-3百万CD34⁺细胞/千克患者体重。

当受试者未经骨髓脱离调理时，该治疗性细胞群可以单独施用于受试者（即可以不需要支持细胞群）。

本发明的治疗性和/或支持细胞群可用于治疗WO 1998/005635中列举的病症。为了容易参考，下面提供该疾病列表的部分：癌症、炎症或炎性疾病、皮肤病症、发热、心血管作用（cardiovascular effects）、出血、凝血和急性期反应、恶病质、食欲缺乏、急性感染、HIV感染、休克状态、移植物抗宿主反应、自身免疫病、再灌注损伤、脑膜炎、偏头痛和阿司匹林依赖性抗血栓形成；肿瘤生长、侵袭和扩散、血管生成、转移瘤、恶性肿瘤、腹水和恶性胸腔积液；脑缺血、缺血性心脏病、骨关节炎、类风湿性关节炎、骨质疏松症、哮喘、多发性硬化、神经变性、阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化、中风、脉管炎、克罗恩病（Crohn′s disease）和溃疡性结肠炎；牙周炎、龈炎；银屑病、特应性皮炎、慢性溃疡、大疱性表皮松解；角膜溃疡、视网膜病和手术伤口愈合；鼻炎、变应性结膜炎、湿疹、过敏反应；再狭窄、充血性心力衰竭、子宫内膜异位症、动脉粥样硬化或内皮硬化（endosclerosis）。

此外，或在备选方法中，本发明的治疗性和/或支持细胞群可用于治疗WO 1998/007859中列举的病症。为了容易参考，下面提供该列表的部分：细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性（例如用于治疗免疫缺陷，包括被人免疫缺陷病毒感染；调节淋巴细胞生长；治疗癌症和许多自身免疫病，并防止移植排斥或诱导肿瘤免疫力）；调节造血作用，例如治疗骨髓病或淋巴病；促进骨、软骨、腱、韧带和神经组织的生长，例如用于伤口愈合、治疗烧伤、溃疡和牙周病和神经变性；抑制或激活促卵泡激素（调节生育力）；趋化/化学激动活性（例如用于将特定细胞类型动员到损伤或感染部位）；止血和溶栓活性（例如用于治疗血友病和中风）；抗炎活性（用于治疗例如败血症性休克或克罗恩病）；作为抗微生物药；例如代谢或行为（behaviour）的调节剂；作为镇痛药；治疗特定营养缺乏症；用于治疗例如银屑病、用于人用或兽用药物。

此外，或在备选方法中，本发明的治疗性和/或支持细胞群可用于治疗WO 1998/009985中列举的病症。为了容易参考，下面提供该列表的部分：巨噬细胞抑制和/或T细胞抑制活性及因而的抗炎活性；抗免疫活性，即针对细胞和/或体液免疫应答（包括与炎症无关的反应）的抑制作用；抑制巨噬细胞和T细胞粘附胞外基质组分和纤连蛋白的能力，以及增量调节fas受体在T细胞中的表达；抑制不良免疫反应和炎症，包括关节炎，包括类风湿性关节炎、超敏反应相关炎症、变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原病和其它自身免疫病、动脉粥样硬化相关炎症、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化性心脏病、再灌注损伤、心脏停搏、心肌梗死、血管炎性疾病、呼吸窘迫综合征或其它心肺病、与消化性溃疡、溃疡性结肠炎和胃肠道的其它疾病相关的炎症、肝纤维化、肝硬化或其它肝病、甲状腺炎或其它腺病、肾小球性肾炎或其它肾病和泌尿科疾病、耳炎或其它耳鼻喉病、皮炎或其它皮肤病、牙周病或其它牙病、睾丸炎或附睾-睾丸炎、不育症、睾丸创伤或其它免疫相关的睾丸疾病、胎盘功能障碍、胎盘功能不全、习惯性流产、子痫、先兆子痫和其它免疫和/或炎症相关性妇科疾病、后葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、前葡萄膜炎、结膜炎、脉络膜视网膜炎、葡萄膜视网膜炎、视神经炎、眼内炎症例如视网膜炎或囊样黄斑水肿、交感性眼炎、巩膜炎、色素性视网膜炎、退行性眼底病变（degenerative fondus disease）的免疫和炎性成分、眼外伤的炎性成分、由感染引起的眼炎、增殖性玻璃体视网膜病、急性缺血性视神经病变、例如青光眼滤过手术后的过度瘢痕形成、对眼植入物的免疫和/或炎症反应及其它免疫和炎症相关性眼科疾病、其中在中枢神经系统（CNS）或任何其它器官两者中免疫和/或炎症抑制可能有益的与自身免疫病或病况或病症有关的炎症、帕金森病（Parkinson′s disease）、因帕金森病治疗引起的并发症和/或副作用、艾滋病相关痴呆综合症、HIV相关脑病、德维克病、小舞蹈病、阿尔茨海默氏病和CNS的其它变性疾病、病况或病症、中风的炎性成分、脊髓灰质炎后综合征、精神障碍的免疫和炎性成分、脊髓炎、脑炎、亚急性致硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、格-巴综合征（Guillaim-Barre syndrome）、小舞蹈病、重症肌无力、假脑瘤、唐氏综合征、亨廷顿舞蹈病（Huntington′s disease）、肌萎缩性侧索硬化、CNS压迫或CNS创伤或CNS感染的炎性成分、肌萎缩和营养不良的炎性成分、中枢神经系统和外周神经系统的免疫和炎症相关疾病、病况或病症、创伤后炎症、败血症性休克、感染性疾病、手术的炎症并发症或副作用、骨髓移植或其它移植并发症和/或副作用、基因治疗的炎症和/或免疫并发症和副作用（例如因病毒载体感染所致）或爱滋病相关炎症、用于阻抑或抑制体液和/或细胞免疫应答、通过减少单核细胞或淋巴细胞的量治疗或改善单核细胞或白细胞增殖性疾病（例如白血病）、在移植天然或人工细胞、组织和器官（例如角膜、骨髓、器官、晶状体、起博器、天然或人工皮肤组织）的情况下用于预防和/或治疗移植排斥。

试剂盒

该治疗性细胞群和支持细胞群可以在合适的容器中提供。

该试剂盒还可以包括使用说明。

造血祖细胞移植

本发明提供了用于基因疗法的造血祖细胞群，其中该造血祖细胞群已经用相关核苷酸转导。

如我们已经表明的那样，此类祖细胞提供短期植入。因此，此类基因疗法将在受试者体内提供非永久效果。例如，该效果可以限于施用该转导造血祖细胞后1-6个月。由于治疗干预的自限性，这种方法的优点是更好的安全性和耐受性。

因此，我们可以调整基因修饰的细胞的持久性（参见实施例3）。例如，可以设想，可以根据需要相关核苷酸的表达的时间长度施用不同的细胞群用于治疗不同的病症，如：

1．长期：CD34⁺CD38^-细胞（例如0-10%百分位数）用于治愈遗传性遗传疾病；

2．中期：CD34⁺CD38^int/lo细胞（例如12-40%百分位数）用于大约3-4个月的治疗持续时间（例如用于抗癌蛋白质的微环境靶向递送）；

3．短期：CD34⁺CD38^+/int细胞（例如41-70%百分位数）用于大约1-2个月的治疗持续时间（例如用于抗癌蛋白质的微环境靶向递送）。

此类造血祖细胞基因疗法可以适于治疗后天性疾病，例如癌症，其中（可能有毒的）抗癌相关核苷酸的时间受限的表达足以根除该疾病。

特别适于在造血祖细胞基因疗法中应用的相关核苷酸包括例如干扰素-alpha2b、其它1型干扰素、其它免疫刺激细胞因子（例如IL-2、IL-12）、细胞凋亡诱导转基因如TNF相关细胞凋亡诱导配体（TRAIL）和肿瘤微环境破坏性因子。

在一个实施方案中，该造血祖细胞群具有CD34⁺CD38^int表型，例如该造血祖细胞群已经对CD34⁺CD38^int表型进行了富集。

具有CD34⁺CD38^int表型的细胞群可以使用流式细胞术法分离。该CD38^int造血祖细胞群可以包含在通过流式细胞术所确定的CD38表达的10-70%范围内（参见例如实施例3和图4——这里CD38^int群已经进一步分离为CD38^int1和CD38^int2）。造血干细胞可以包含在CD38表达的0-10%范围内。

在另一实施方案中，该造血祖细胞群具有CD34⁺CD38^int1,CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺表型，例如，该造血祖细胞群已经对CD34⁺CD38^int1、CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺表型进行了富集。由此，例如，该祖细胞群可以基本上包含CD34⁺CD38^int1、CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺细胞。

在另一实施方案中，该转导祖细胞群与造血干细胞群，例如未修饰的造血干细胞组合施用。该造血干细胞可以具有CD34⁺CD38^-表型。

在另一方面，本发明提供了用于基因疗法的具有CD34⁺CD38^int表型的细胞群，例如对具有CD34⁺CD38^int表型的细胞进行了富集的细胞群，其中所述细胞群已经用相关核苷酸转导。

在另一方面，本发明提供了用于基因疗法的具有CD34⁺CD38^int1、CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺表型的细胞群，例如对具有CD34⁺CD38^int1、CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺表型的细胞进行富集的细胞群，其中所述细胞群已经用相关核苷酸转导。由此，例如，该祖细胞群基本上包含CD34⁺CD38^int1、CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺细胞。

在另一方面，本发明提供了用于基因疗法的造血祖细胞群，其中该造血祖细胞群具有CD34⁺CD38^int表型（例如该造血祖细胞群已经对CD34⁺CD38^int表型进行了富集）并已经用相关核苷酸转导。

在另一方面，本发明提供了用于基因疗法的造血祖细胞群，其中该造血祖细胞群具有CD34⁺CD38^int1、CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺表型（例如该造血祖细胞群已经对CD34⁺CD38^int1,CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺表型进行了富集）并已经用相关核苷酸转导。由此，例如，该祖细胞群可以基本上包含CD34⁺CD38^int1、CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺细胞。

在另一方面，本发明提供了制备用于临床应用的造血祖细胞群的方法，所述方法包括从包含造血干细胞和祖细胞的细胞群中分离造血祖细胞群，并用相关核苷酸转导分离的细胞群。

在另一实施方案中，该造血祖细胞群具有CD34⁺CD38^int1、CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺表型，例如该造血祖细胞群已经对CD34⁺CD38^int1、CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺表型进行了富集。由此，例如，该祖细胞群可以基本上包含CD34⁺CD38^int1、CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺细胞。

治疗方法

要理解的是，本文中所有提到治疗包括治愈、治标和预防性治疗；尽管在本发明上下文中提到预防更通常与预防性治疗相关。哺乳动物，特别是人的治疗是优选的。人和兽医治疗均在本发明的范围内。

前列腺素

当用载体，优选病毒载体转导造血干细胞或祖细胞时，前列腺素E2或前列腺素E2衍生物可用于提高基因转移效率。

在本发明的一个实施方案中，该前列腺素E2衍生物是16,16-二甲基前列腺素E2。

衍生物应理解为前列腺素E2被本领域已知的多种技术的任一种修饰，优选以改善性质如稳定性和活性，同时仍保留其在用载体转导造血干细胞时提高基因转移效率的功能。

还可以设想，在本文中描述的任何方面和实施方案中，该前列腺素E2或前列腺素E2衍生物可以被前列腺素受体激动剂取代，例如作用于EP4受体的小分子药物。

实施例

实施例1

高度纯化的HSC更易被慢病毒载体转导

我们研究了microRNA对造血干细胞和祖细胞群的不同影响。为此，用慢病毒miRNA海绵或过表达载体（数据未显示）转导CD34⁺CD38^-和CD34⁺CD38⁺脐带血HSPCs。预料不到地并且与本领域中普遍认为的相反，我们注意到提高1.5倍的基因转移到更初级的CD34⁺CD38^- HSC富集的子集中。我们独立地证实了使用表达标记物基因的生物中性载体对多个脐带血和成人骨髓供体的观察结果，显示了与批量CD34⁺或CD34⁺CD38⁺细胞转导相比进入分选的CD34⁺CD38^- HSC富集级分的提高1.5至2倍的基因转移效率（图1(A)）。

由于本体CD34⁺ HSPCs含有小的CD38^-细胞子集，我们想要测试这种更初级的细胞的提高的转导性是否还能在批量培养中保持，或者预分选对发现此类效果是否是必要的。我们因此进行了分选-LV方案（首先分选CD38亚群，随后在24小时的预刺激后进行慢病毒载体转导）与LV-分选方案（24小时预刺激，随后进行慢病毒载体转导，并在转导后24小时分选CD38亚群）的并列比较。虽然在LV-分选组中提高的CD38^-细胞的转导也是明显的，如果在转导前进行分选，该效果明显更大（图1(A)）。

由此，对高度纯化的HSC富集的亚群的工作在转导方面给出了明显的优势。

我们已经证实，与批量CD34⁺细胞相反，提高的向预纯化CD34⁺CD38^- HSPCs中的基因转移在异种移植后在体内保持（图1(B)）。这些数据表明，该效果在造血干细胞水平下存在，并有可能在经历基因疗法的患者体内长期存留。

实施例2

基于珠的分别对CD38和CD34的连续负/正选择能够提纯具有优异的NSG植入潜力的细胞。

为了测试基于珠的分别对CD38和CD34A的连续负/正选择的可行性，我们将市售CD38选择试剂盒应用于人脐带血单核细胞并通过竞争性移植在NSG小鼠中测试了CD38^-（通过正选择进一步富集了CD34）和CD38⁺级分的植入潜力（图2）。即使我们使用第一代、未优化的选择方案，我们可以清楚地证明CD38^-级分的植入优势。而CD38^-细胞构成该移植物的小于20%，70-80%的长期植入衍生自该级分，激励了对该纯化方案的进一步优化。

实施例3

NSG小鼠中的分割移植的建模

为了对基因修饰长期再植细胞与短期祖细胞的共同移植建模，我们用一组表达荧光蛋白的慢病毒载体（LV）不同地标记干细胞富集级分和各种祖细胞级分，并在竞争与非竞争环境中研究了在NSG小鼠中的植入动力学。

首先，将CD34⁺成人骨髓HSPC分选为CD34⁺CD38^-（+/-）和CD34⁺CD38^hi（+/hi）细胞，在含有SCF（300纳克/毫升）、Flt3L（300纳克/毫升）、TPO（100纳克/毫升）、IL6（60纳克/毫升）和dmPGE2（10 µM）的Stem Span SFEM中预刺激16小时，并用GFP-LV（+/-）或OFP-LV（+/hi）转导。在转导24小时后，如下将细胞注入8周龄、亚致死量照射过的NSG小鼠：

第1组：每只小鼠27,000 +/-细胞（n=3）；

第2组：每只小鼠248,000 +/hi细胞（n=3）；

第3组：每只小鼠27,000 +/-和248,000 +/hi细胞（n=3）

在外周血中经时监控植入（第1、2、3组）和嵌合性（第3组），并在移植后18周分析造血器官（图3）。

我们发现，CD34⁺/CD38^hi细胞并未在小鼠中植入，甚至在移植后3周的短期内也未植入。在第3组中，其中我们将OFP-阳性CD34⁺/CD38^hi细胞与GFP-阳性CD34⁺/CD38^-细胞混合，我们经时并在指定的造血亚群（HSC：CD34⁺CD38^-CD90⁺CD45RA^-；MPP：CD34⁺CD38^-CD90^-CD45RA^-；MLP：CD34⁺CD38^-CD90^-CD45RA⁺）中跟踪GFP/OFP嵌合性。引人注目的是，该CD34⁺/CD38^hi衍生细胞在所有时间点过程中以及在骨髓和脾脏中几乎不存在（后者未显示）。

我们的结论是：CD34⁺/CD38^-细胞含有大多数（如果不是全部的话）SCID再生潜力，短期以及长期。

接着，我们移至CD34⁺动员的外周血（MPB）细胞（购自Stem Cell Technologies），因为这是与儿科环境相比更迫切地需要改进基因疗法方案的成人患者中的优选HSC来源（图4）。我们将CD34⁺ MPB分选为具有提高的CD38表达水平的4个亚群（CD34⁺/CD38^-；CD34⁺/CD38^int1；CD34⁺/CD38^int2；CD34⁺/CD38^hi），在含有SCF（300纳克/毫升）、Flt3L（300纳克/毫升）、TPO（100纳克/毫升）、IL6（60纳克/毫升）和dmPGE2（10 µM）的Stem Span SFEM中预刺激这些亚群16小时，并用以下LVs转导该亚群：+/-：GreenFP.LV；+/int1：CherryFP.LV；+/int2：CyanFP.LV；+/hi：OrangeFP.LV。在转导24小时后，如下将细胞注入8周龄、亚致死量照射过的NSG小鼠：

第1组：每只小鼠129,000 +/-细胞（n=6）；

第2组：每只小鼠869,000祖细胞（+/int1、+/int2和+/hi细胞之和，各群落向祖细胞混合物贡献33%）（n=7）；

第3组：每只小鼠129,000 +/-和869,000汇集的祖细胞的混合物（n=6）

在外周血中经时监控植入（第1、2、3组）和嵌合性（第3组）（图4(A)）。

CD34⁺CD38^hi（+/hi）细胞显示在早期时间点处在NSG小鼠中几乎没有但可检测的植入潜力，它们的输出随后消失。有趣的是，来自MPB的CD34⁺CD38^-（+/-）群在移植后3周几乎不显示造血输出。相反，在该时间点的短期植入大部分被CD34⁺CD38^int细胞维持（int2 >int1）。在移植后9-15周，不同级分的贡献改变：第1组和第3组现在显示类似的人CD45⁺细胞植入水平。在第3组中，其用所有干细胞和祖细胞群的混合物移植，该CD34⁺CD38^-（+/-）群贡献>70-80%的huCD45⁺和>98%的huCD13⁺植入，而+/int1贡献了大约20-10%的B细胞。在9和15轴的时间点处，该+/int2与+/hi细胞未显示对造血的显著贡献。

我们的结论是：来自MPB的CD34⁺CD38-（+/-）细胞含有大多数（如果不是全部的话）长期SCID再生潜力，而短期再生由CD34⁺/CD38^int2-high（第一波）和CD34⁺/CD38^int1细胞（第二波）提供。这证明了以下原则：G-CSF-动员MPB衍生CD34⁺CD38^-细胞（所有CD34⁺细胞的10%）的基因修饰通过基因修饰细胞足以实现大多数（如果并非全部的话）的长期植入。在转导介质中是否包括CD34⁺/CD38^int细胞的选择取决于其中需要实现通过转导细胞接管造血作用的时间框架。相反，该CD34⁺/CD38^int2细胞提供了短期植入，并代表了以未培养、未基因修饰的支持细胞的形式给出以便在调理后促进造血恢复的理想种群，降低了经受基因疗法的患者的感染和出血性并发症的风险。

在较长时间段内持续进行图4（A）中显示的研究提供了进一步的了解。图4（B）显示了研究持续至24周，其提供了长期读出测量稳定的、HSC衍生的造血作用。此外，我们已经进行了使用另一动员的外周血供体并变更了标记该CD38级分的慢病毒载体的重复实验。

长期分析证实，>95%的长期植入衍生自培养的CD34⁺动员外周血HSPC的CD38^-级分（最低12%的CD38表达细胞）。这些数据还支持了由不同的CD38表达水平限定的祖细胞群的植入动力学：CD38^int/lo（12-40% CD38百分位数）细胞在第3周给出了它们的最高贡献，并经4个月的时间窗口缓慢衰减；CD38^+/int（41-70% CD38百分位数）细胞在第3周给出了它们的最高贡献，并经2个月的时间窗口快速衰减。CD38^hi（71-100% CD38百分位数）细胞在第3周时给出了低植入。

这些数据使我们能够定制该基因修饰细胞的持久性：

·长期：CD34⁺CD38^-细胞（0-10%百分位数），用于治愈遗传疾病；

·中期：CD34⁺CD38^int/lo细胞（12-40%百分位数），用于3-4个月的治疗持续时间（例如用于抗癌蛋白的微环境靶向递送）；

·短期CD34⁺CD38^+/int细胞（41-70%百分位数）用于大约1-2个月的治疗持续时间（例如用于抗癌蛋白质的微环境靶向递送）。

实施例4

前列腺素E2提高了向具有NSG再生潜力的人造血干细胞和祖细胞中的基因转移

尝试利用前列腺素E2（PGE2）的抗凋亡性质（Pelus LM等人 Prostaglandins OtherLipid Mediat. 2011;96:3-9），我们用长效PGE2同系物16,16-二甲基前列腺素E2（dmPGE2；Cayman Chemical，Cat 14750）处理暴露于应力的CD34⁺ HSPC（冷冻/解冻循环，用有毒载体转导，电穿孔）。预料不到地，我们发现在dmPGE2处理后向来自脐带血（图5(A)）和成人骨髓（图6）的CD34⁺或CD34⁺CD38^- HSPC中的基因转移效率提高了1.5倍。这种在载体拷贝数（VCN）方面的差异在该细胞移植到NSG小鼠中之后保持超过4个月，并且植入水平未受dmPGE2处理的负面影响。

我们已经证实，如果用dmPGE2预刺激的话，G-CSF-动员CD34⁺外周血干细胞还经历更高效的慢病毒载体的转导（图5(B)）。

此外，我们已经研究了dmPGE2刺激的时间选择对慢病毒载体转导人HSPCs的影响。当在LV暴露前2小时加入dmPGE2时，该影响似乎最大化（图5(C)）。

此外，我们已经在附加实验中证实，通过dmPGE2体外刺激获得的提高的载体拷贝数长期保持，高达异种移植后18周（图5(D)）。

总之，我们在这里首次展示了更原始的HSC制剂更容易被VSVg-假型，第三代慢病毒载体转导，其效果可以通过用dmPGE2预刺激来进一步增强。我们已经制定了创新的HSC基因疗法方案，其在体外操作中结合了这些改进。我们对来自来自脐带血、骨髓和动员的外周血的人HSC测试了这种新的方案，基于使用现有技术的NSG异种移植模型在CD38表达方面的量化差异首次将免疫表型限定的CD34⁺动员的外周血群落的多谱系重建动力学去卷积，并从具有快速短期再生潜力的祖细胞中分离了长期多谱系移植细胞（全部CD34⁺细胞的<10%）。这种方案将通过以下特征改善安全性：通过改善的体外培养提供质量更好的基因修饰HSC级分，通过未培养的祖细胞延续快速造血恢复，以及向患者输注较低的累积剂量。这还通过大幅度降低载体剂量改善了HSC基因疗法的可持续性。

实施例5

临床方案（改编自Biffi A等人 Science 2013;341:1233158）：全部骨髓按照内部SOP在无菌条件下且使用全身麻醉收集自髂嵴。或者，患者通过从第-3天开始的5-10微克/千克G-CSF经受HSPC动员，在白细胞分离法之前6-9小时使用或不使用单一剂量的plerixaphor。收获的骨髓或动员的外周血，收集在专用袋中，密封并鉴别，随后转移到GMP设施。通过负/正选择使用免疫磁珠按照制造商的程序（Miltenyi Biotec，Bergisch-Gladbach，Germany）在GMP条件中进行细胞纯化。纯化的细胞随后在涂有纤维连接蛋白的VueLife袋（AmericanFluoroseal，Gaithersburg，MD）中在补充有GMP级别细胞因子（见上文）的无血清介质中培养并在30-100的多次感染下暴露于GMP级别的纯化载体一次或两次，总培养时间为40-60小时。在转导程序结束时，收获转导CD34⁺细胞，用Cell Grow介质洗涤并以2-10×10⁶细胞/毫升的浓度重新悬浮在盐水溶液中以便输注到患者体内。在转导结束时，如上收集细胞级分用于克隆试验、流式细胞术和体外培养。细胞保持在4℃下直到输注时，根据品质控制测试批量释放时（输注时可获得的结果：生存能力、免疫表型、内毒素、大T Ag DNA、支原体）。

实施例6

对培养/转导CD34⁺CD38^-干细胞与未培养的CD34⁺CD38^int/+祖细胞的共同施用建模

图7中显示的数据涉及未培养的CD34⁺CD38^int/+动员的外周血祖细胞（祖细胞）与基因修饰的CD34⁺CD38^- HSPC（干细胞）的结合移植。该实验表明，相对于培养/转导CD34⁺CD38^int/+细胞，未培养的CD34⁺CD38^int/+（13-100% CD38百分位数）祖细胞坚持更长时间，并具有更高的再生能力。

这意味着：

1．作为支持细胞群提供给患者的新鲜祖细胞将可能加速和巩固基因疗法患者体内的造血恢复，从而显著降低治疗后第一个月的感染和出血并发症的风险；

2．基因修饰干细胞超出新鲜祖细胞的比（目前1:8）可以偏向干细胞进行调节（例如1:5）以改善有效的长期基因标记；

3．CD34⁺CD38^int1群的部分可以从支持细胞群中去除以减少与基因修饰的CD34⁺CD38^-细胞的竞争；

4．短的培养时间对获得高度功能性的基因修饰的HSC至关重要。改善基因修饰的HSC的功能特性使得点（2）和（3）中描述的干预变得不那么关键，如通过对1:5和1:10比例在体内的CD34+和CD33high细胞中的类似基因标记所显示的那样（参见图7B）。

实施例7

图5、7和9中的数据表明，培养时间不利地影响来自动员的外周血的干细胞和祖细胞的官能植入能力。将培养时间降低至24小时可以减轻培养的不利影响，改善药用基因疗法产品的品质。使用dmPGE2能够在24小时离体操作短方案中有效地转导HSC（图5），由此形成强有力的理由在未来的基因疗法研究中实施该方案。这些数据还牵涉CD34细胞数量（用于定量进行干细胞移植的标准量度）具有降低的信息价值，因为来自延长的体外培养的CD34⁺细胞在功能上不等效于新鲜CD34⁺细胞或短期培养的CD34⁺细胞。事实上，即使我们注射较少的来自24小时培养的CD34⁺细胞，与44小时培养相比，前面的方案提供更高水平的长期植入。

实施例8

优选的转导方案以获得向来自动员的外周血（用G-CSF和/或Plerixaphor或新的在研动员剂来动员）或骨髓的CD34⁺CD38^- HSPC中的有效的基因转移

讨论的方案显示在图10中。

参比方案：2Hit Standard-66小时：用标准2 hit方案（66小时）转导的CD34⁺CD38^-细胞，这是对CD34⁺细胞转导的现行基准方案（Biffi, A等人 (2013) Science 341:1233158；Scaramuzza, S.等人 (2013) Mol. Ther. 21: 175-84）。

我们测试的1Hit-44小时方案（参见图7和9）显示是次优的，不会进一步推行。

下面的方案期望胜过参考方案并且是用于CD34⁺CD38^-细胞的基因修饰的更佳方案：

方案A：在无IL-3的介质中用“single hit”方案（38小时）转导的CD34⁺CD38^-细胞；

方案B：在无IL-3的介质中用“single hit”方案（38小时）转导的CD34⁺CD38^-细胞，在LV暴露前在120分钟时进行dmPGE2暴露；

方案C：在无IL-3的介质中用缩短的“single hit”方案（24小时）转导的CD34⁺CD38^-细胞；

方案D：在无IL-3的介质中用缩短的“single hit”方案（24小时）转导的CD34⁺CD38^-细胞，在LV暴露前在120分钟时进行dmPGE2暴露。

将按照设想的技术选项之一（例如基于微芯片的分选或基于珠的顺序选择）从动员的外周血或骨髓中纯化CD34⁺CD38^-细胞，并以大约10⁶细胞/毫升的密度在培养/转导介质中铺板。临床级LV（10⁷至10⁸ TU/毫升，根据应用）在方案中安排的时间点处加入。在方案B和D中，如方案中所安排的那样，在LV暴露前120分钟向培养物中加入dmPGE2。在培养的预见结束时（参见实验方案），细胞将被洗涤并冷冻保存或预备直接施用于患者（药物产品）。

MPB CD34⁺细胞转导过程中的环境条件

培养器

培养将保持在细胞培养箱中（37℃，5% CO₂）

培养皿

涂有纤维连接蛋白的板或袋

预刺激/转导介质

参比方案：补充有青霉素/链霉素和SCF（300纳克/毫升）、FLT3L（300纳克/毫升）、TPO（100纳克/毫升）、IL3（60纳克/毫升）的CellGro（CellGenix）介质，在使用前无菌过滤（0.22微米）。

方案A、B、C、D：补充有青霉素/链霉素和SCF（300纳克/毫升）、FLT3L（300纳克/毫升）、TPO（100纳克/毫升）的CellGro（CellGenix）介质（或适于培养造血干细胞的其它临床级介质），在使用前无菌过滤（0.22微米）。如方案中安排的那样，向一些组中加入dmPGE2（10µM）。

优选地，在适当的患者预处理后，将该药物产品骨内（intraosseously）输注。任选地，适当剂量的支持细胞（合适剂量的定义：在非骨髓脱离调理的情况下为零；在骨髓脱离调理的情况下：相对于CD38^-制剂中含有的CD34⁺细胞数量，5×-10×来自CD38⁺制剂的CD34⁺细胞数量，最小绝对数量为每千克患者体重2.5-3百万）可以静脉内施用，优选在输注药物产品后1-2天。或者，该药物产品可以静脉内施用，优选与支持细胞共同施用。

上面的说明书中提到的所有出版物经此引用并入本文。所描述的本发明的方法和系统的各种修改和变化将对本领域技术人员显而易见，而不脱离本发明的精神与范围。尽管已经结合特定优选实施方案描述了本发明，应当理解，所要求保护的本发明不应不适当地局限于此类特定实施方案。事实上，对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的实施本发明的所述方式的各种改变意欲在以下权利要求的范围内。

Claims

1.由包含造血干细胞的起始细胞群制备用于临床应用的治疗性细胞群的方法，所述方法包括从起始细胞群中分离基本不表达CD38但表达CD34的细胞群，并用载体转导所述分离的细胞群以获得该治疗性细胞群。

2.权利要求1的方法，其中该方法包括以下步骤：

a.从包含造血干细胞的起始细胞群中分离表达CD38的细胞；

b.从不表达CD38的步骤（a）中获得的细胞群中分离表达CD34的细胞；

c.用载体转导步骤（b）中获得的表达CD34的细胞群以获得治疗性细胞群。

3.权利要求1的方法，其中该方法包括以下步骤：

a.使包含造血干细胞的起始细胞群与CD38反应性试剂接触；

b.将CD38反应性细胞与CD38非反应性细胞分离；

c.使步骤（b）中获得的CD38非反应性细胞与CD34反应性试剂接触；

d.将CD34反应性细胞与CD34非反应性细胞分离，其中所述CD34反应性细胞构成所述转导细胞群；

e.用载体转导所述转导细胞群以获得所述治疗性细胞群。

4.前述权利要求任一项的方法，其中所述治疗性细胞群具有CD34⁺CD38^-表型。

5.前述权利要求任一项的方法，其中包含造血干细胞的起始细胞群获自动员的外周血、骨髓或脐带血。

6.权利要求3-5中任一项的方法，其中CD38或CD34反应性试剂分别是抗CD38或抗CD34抗体。

7.权利要求6的方法，其中所述抗CD38和/或抗CD34抗体结合到磁珠或可检测标记物上。

8.权利要求2或4-7中任一项的方法，其中表达CD38的细胞和/或表达CD34的细胞使用基于磁珠的分离或流式细胞术来分离。

9.权利要求3-7中任一项的方法，其中CD38反应性细胞和/或CD34反应性细胞使用基于磁珠的分离或流式细胞术来分离。

10.前述权利要求任一项的方法，其中所述载体是病毒载体。

11.权利要求10的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体。

12.权利要求10的方法，其中所述病毒载体包含相关核苷酸。

13.前述权利要求任一项的方法，其中所述用载体转导细胞群的步骤包括培养所述细胞小于大约44小时。

14.权利要求2、4-8或10-13中任一项的方法，其中保留所述分离的表达CD38的细胞或其一部分以构成支持细胞群。

15.权利要求3-7或9-13中任一项的方法，其中保留所述分离的CD38反应性细胞或其一部分以构成支持细胞群。

16.权利要求14或15中任一项的方法，其中所述支持细胞群具有CD34⁺CD38^int1、CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺表型。

17.按照前述权利要求任一项的方法制备的治疗性细胞群。

18.按照权利要求14-16中任一项的方法制备的支持细胞群。

19.包含权利要求17的治疗性细胞群的药物组合物。

20.包含权利要求18的支持细胞群的药物组合物。

21.用于药物的权利要求17的治疗性细胞群。

22.用于药物的权利要求17的治疗性细胞群，其中所述治疗性细胞群与权利要求18的所述支持细胞群组合施用。

23.用于药物的权利要求18的支持细胞群，其中所述支持细胞群与权利要求17的所述治疗性细胞群结合施用。

24.用于如权利要求21或22所述的用途的治疗性细胞群，其中作为自体干细胞移植程序或同种异体干细胞移植程序的一部分施用所述治疗性细胞群。

25.用于如权利要求23所述的用途的支持细胞群，其中作为自体干细胞移植程序或同种异体干细胞移植程序的一部分施用所述支持细胞群。

26.用于如权利要求21-24中任一项所述的用途的治疗性或支持细胞群，其中所述治疗性细胞群在施用所述支持细胞群之前施用于受试者。

27.用于如权利要求22-25中任一项所述的用途的治疗性或支持细胞群，其中所述治疗性细胞群与所述支持细胞群的施用同时期或同时地施用于受试者。

28.包含权利要求17和18的治疗性和支持细胞群的试剂盒。

29.治疗方法，包括向需要其的受试者施用权利要求17的治疗性细胞群。

30.治疗方法，包括向需要其的受试者施用权利要求17的治疗性细胞群和权利要求18的支持细胞群。

31.权利要求30的方法，其中在施用所述支持细胞群之前向所述受试者施用所述治疗性细胞群。

32.权利要求30的方法，其中所述治疗性细胞群与所述支持细胞群的施用同时期或同时地施用于受试者。

33.用于基因疗法的造血祖细胞群，其中该造血祖细胞群已经用相关核苷酸转导。

34.用于基因疗法的造血祖细胞群，其中所述细胞已经从包含造血干细胞和祖细胞的细胞群中分离并随后用相关核苷酸转导。

35.用于如权利要求33或34的用途的造血祖细胞群，其中该造血祖细胞群具有CD34⁺CD38^int表型。

36.用于如权利要求33或34的用途的造血祖细胞群，其中该造血祖细胞群具有CD34⁺CD38^int1、CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺表型。

37.用于如权利要求33-36中任一项所述的用途的造血祖细胞群，其中所述转导的祖细胞群与造血干细胞群组合施用。

38.基因疗法，包括向需要其的受试者施用造血祖细胞群，其中该造血祖细胞群已经用相关核苷酸转导。

39.基因疗法，包括向需要其的受试者施用造血祖细胞群，其中在施用于所述受试者之前，所述细胞已经从包含造血干细胞和祖细胞的细胞群中分离并随后用相关核苷酸转导。

40.权利要求38或39的方法，其中所述造血祖细胞群具有CD34⁺CD38^int表型。

41.权利要求38或39的方法，其中所述造血祖细胞群具有CD34⁺CD38^int1、CD34⁺CD38^int2和/或CD34⁺CD38⁺表型。

42.权利要求38-41中任一项的方法，其中所述转导的祖细胞群与造血干细胞群组合施用。

43.在患者体内控制转基因表达的持续时间的方法，其中通过根据CD38表达水平选择性施用转导的造血干细胞和/或祖细胞来控制转基因表达的持续时间。

44.权利要求43的方法，其中通过施用具有降低的CD38表达水平的细胞来实现提高的转基因表达持续时间。

45.前列腺素E2或前列腺素E2衍生物用于当用载体转导造血干细胞或祖细胞时提高基因转移效率的用途。

46.权利要求45的用途，其中所述前列腺素E2衍生物是16,16-二甲基前列腺素E2。

47.权利要求45或46的用途，其中作为权利要求1-16中任一项的方法的一部分进行造血干细胞的转导。