JP2020124200A - 方法 - Google Patents

Abstract

【課題】培養時間を最小限にしつつ造血幹細胞の十分な遺伝子改変を可能とする、改良された臨床使用のために適したプロトコールの提供。【解決手段】造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団から臨床使用のための治療用細胞集団を調製する方法であって、前記出発細胞集団からＣＤ３８を実質的に発現しないがＣＤ３４を発現する細胞の集団を分離すること、および分離した細胞集団にベクターで形質導入して治療用細胞集団を得ることを含んでなる、方法。【選択図】なし

Description

本発明は、造血幹細胞(haematopoietic stem cells)（ＨＳＣ）および造血前駆細胞に関する。より具体的には、本発明は、ＨＳＣの遺伝子改変のための改良された方法に関する。本発明はまた、遺伝子療法における遺伝的に改変された造血幹細胞および前駆細胞の使用のための改良された方法に関する。

造血系は、種々の成熟細胞系譜の細胞の複雑な階層である。これらは病原体からの保護を与える免疫系の細胞、体に酸素を運ぶ細胞および創傷治癒に関与する細胞を含む。これらの成熟細胞は総て、自己再生能を有し、いずれの血液細胞系譜へも分化が可能な造血幹細胞（ＨＳＣ）のプールに由来する。

ＨＳＣは造血系全体を補充する能力を有するので、例えば放射線療法もしくは化学療法などの血液毒性傷害後の移植、または白血病細胞の置換のために使用可能である。

造血細胞移植(hematopoietic cell transplantation)（ＨＣＴ）は、いくつかの遺伝性障害および後天性障害のための治癒的療法である。しかしながら、同種ＨＣＴは、適合ドナーの利用可能性の低さ、および同種法に伴う死亡率（ほとんどが移植片対宿主病(graft-versus-host disease)（ＧｖＨＤ）および重度の持続的免疫不全状態によって引き起こされる感染性合併症に関連する）によって制限されている。

遺伝的に改変された自己ＨＳＣの移植に基づく遺伝子療法アプローチは、同種ＨＣＴよりも潜在的に向上した安全性および有効性を与える。このようなアプローチは適合ドナーのいない患者に特に適切である。

幹細胞遺伝子療法の概念は、比較的少数の幹細胞の遺伝子改変に基づく。これらは、自己再生を受け、一般に「矯正された」多数の後代を生成することにより体内で長期持続する。これにより、その患者の残りの生涯の間、矯正された細胞の連続的供給が保証される。ＨＳＣは、それらの遺伝子改変が、それらが分化した際に血液細胞系譜の総てに受け渡されることから遺伝子療法の特に魅力的な標的である。さらに、ＨＳＣは、例えば、骨髄、動員末梢血および臍帯血から容易かつ安全に得ることができる。

ＨＳＣおよびそれらの後代の効率的な長期的遺伝子改変は、ＨＳＣ機能に影響を及ぼさずにゲノムに矯正的ＤＮＡの安定な組み込みを可能とする技術を必要とする。

長期的利益は、前処置した骨髄に再定着して総ての造血系譜の矯正された血液細胞を生成し得るだけの十分に多数の改変ＨＳＣの移植を必要とする。従って、自己ＨＳＣは、移植法を総ての患者に利用可能とし、ＧｖＨＤにつながる免疫適合問題を回避し、最小限の免疫抑制前処置計画を可能とし、従って、感染性合併症を劇的に低減する。

レンチウイルスに基づくＨＳＣ遺伝子療法の治験は、遺伝病の治癒に治療能を示した。しかしながら、ＨＳＣの遺伝子改変に使用される方法にはなお欠点がある。

現行のＨＳＣ遺伝子療法プロトコール（例えば、Cartier N et al. Science 2009;326:818-823; Cavazzana-Calvo M et al. Nature 2010;467:318-322; Biffi A et al. Science 2013;341:1233158; Aiuti A et al.Science. 2013;341:1233151）では、ＨＳＣ遺伝子改変過程で２〜４日のｅｘ ｖｉｖｏ培養を用いる。一般に培養時間が長いほど高い形質導入レベルが得られる。しかしながら、ｅｘ ｖｉｖｏ培養はＨＳＣ機能に悪影響があり、この悪影響は培養持続時間と明らかに相関がある(Guenechea G et al. Blood 1999;93:1097-1105; Xu R et al. Transfusion 2001;41:213-218; Mazurier F et al. Blood 2004;103:545-552; Ahmed et al. Blood 2004;103:2079-2087; Glimm H et al. Exp. Hematol. 2005;33:20-25; Kallinikou K et al. Br. J. Haematol. 2012;158:778-787)。ＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ拡大培養を改善する方向の推移も見られたが(Zhang CC et al. Blood 2008;111:3415-3423; Boitano AE et al. Science 2010;329:1345-1348; Delaney C et al. Nat. Med. 2010;16:232-236; Himburg HA et al. Nat. Med. 2010;16:475-482; Csaszar E et al. Cell Stem Cell 2012;10:218-229; Walasek MA et al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2012;1266:138-150)、結果としてのプロトコールは臨床解釈にいくつかの難題を与え、変動のある、多くの場合再現性の低い結果をもたらし、関連のある臨床現場で証明する必要がなおある。結論として、ＨＳＣ遺伝子療法に関するｅｘ ｖｉｖｏ培養はできるだけ短期間で維持するべきである。

Cartier N et al. Science 2009;326:818-823 Cavazzana-Calvo M et al. Nature 2010;467:318-322 Biffi A et al. Science 2013;341:1233158 Aiuti A et al.Science. 2013;341:1233151 Guenechea G et al. Blood 1999;93:1097-1105 Xu R et al. Transfusion 2001;41:213-218 Mazurier F et al. Blood 2004;103:545-552 Ahmed et al. Blood 2004;103:2079-2087 Glimm H et al. Exp. Hematol. 2005;33:20-25 Kallinikou K et al. Br. J. Haematol. 2012;158:778-787 Zhang CC et al. Blood 2008;111:3415-3423 Boitano AE et al. Science 2010;329:1345-1348 Delaney C et al. Nat. Med. 2010;16:232-236 Himburg HA et al. Nat. Med. 2010;16:475-482 Csaszar E et al. Cell Stem Cell 2012;10:218-229 Walasek MA et al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2012;1266:138-150

よって、培養時間を最小限にしつつ造血幹細胞の十分な遺伝子改変を可能とする改良されたプロトコールを考案する必要がある。さらに、その改良されたプロトコールは臨床使用のために適したものとする必要がある。

発明の概要
本発明者らは、予期しないことに、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ ＨＳＣが、高純度で存在する場合により効率的な形質導入を受けることを示した。本発明者らは、臨床使用のために好適な様式でこれらの細胞を精製および形質導入するためのプロトコールを開発した。

本発明者らはまた、プロスタグランジンＥ２およびその誘導体がＣＤ３４^＋ ＨＳＣおよびＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ ＨＳＣへの遺伝子導入の効率を高めることも見出した。

これらの予期しない発見は、適用するベクターの量の低減およびｅｘ ｖｉｖｏ培養の最小化を可能とする高い形質導入効率をもたらす。

これらの発見から引き続き、本発明者らは、形質導入された、高精製、長期間再定着細胞（例えば、ＣＤ３４を発現するがＣＤ３８を発現しない細胞）と非操作前駆細胞（例えば、ＣＤ３８を発現する細胞）の共移植に基づく革新的プロトコールを開発した。このプロトコールは、
１．形質導入効率の上昇、
２．形質導入に必要な細胞数の低減（この結果、対象に浸透させるのに必要な組み込み量が少なくなる）
３．迅速な造血系回復の保証
により遺伝子療法の安全性および有効性を改善し得る。

加えて、本発明者らはまた、形質導入造血前駆細胞の移植に基づく革新的プロトコールも開発した。

本発明の第１の態様によれば、造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団から臨床使用のための治療用細胞集団を調製する方法であって、前記出発細胞集団からＣＤ３８を実質的に発現しないがＣＤ３４を発現する細胞の集団を分離すること、および分離した細胞集団にベクター、好ましくはウイルスベクターで形質導入して治療用細胞集団を得ることを含んでなる方法が提供される。

本発明の一実施形態では、本方法は、
ａ．造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団からＣＤ３８発現細胞を分離する工程、
ｂ．ＣＤ３８を発現しない工程（ａ）で得られた細胞集団からＣＤ３４発現細胞を分離する工程、
ｃ．工程（ｂ）で得られたＣＤ３４発現細胞集団にベクターで形質導入して治療用細胞集団を得る工程を含んでなる。

別の実施形態では、本方法は、
ａ．造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団をＣＤ３８に対して反応性のある薬剤と接触させる工程、
ｂ．ＣＤ３８反応性細胞をＣＤ３８非反応性細胞から分離する工程、
ｃ．工程（ｂ）で得られたＣＤ３８非反応性細胞をＣＤ３４に対して反応性のある薬剤と接触させる工程、
ｄ．ＣＤ３４反応性細胞をＣＤ３４非反応性細胞から分離する工程、ここで、ＣＤ３４反応性細胞は形質導入細胞集団を形成する、
ｅ．前記形質導入細胞集団にベクターで形質導入して治療用細胞集団を得る工程
を含んでなる。

治療用細胞集団は、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻表現型を持ち得る。

一実施形態では、前記ベクターは、対象とするヌクレオチドを含んでなるか、または対象とするヌクレオチドそれ自体である。

一実施形態では、分離したＣＤ３８発現細胞またはＣＤ３８反応性細胞またはその一部を保持して支持細胞集団とする。支持細胞集団は、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋表現型を持ち得る。

本発明の一実施形態では、細胞集団にベクターで形質導入する工程が、約４４時間以上細胞を培養することを含んでなる。「細胞集団にベクターで形質導入する工程」は、前刺激相およびベクター暴露相と理解される。例えば、細胞集団は、ベクターによる形質導入の工程中、約４４〜６６時間、４４〜６０時間、４４〜５４時間または４４〜４８時間培養可能である。一実施形態では、細胞集団は、ベクターによる形質導入の工程中、約６６、６０、５４、４８または４４時間培養される。

本発明の別の実施形態では、細胞集団にベクターで形質導入する工程は、細胞を約４４時間未満（すなわち、前刺激およびベクター接触中）培養することを含んでなる。例えば、細胞集団は、ベクターによる形質導入の工程中、約１２〜４２時間、１２〜３６時間、１２〜２４時間または１２〜１８時間培養可能である。一実施形態では、細胞集団は、ベクターによる形質導入の工程中、約４２、３６、３０、２４、１８または１２時間培養される。好ましくは、細胞集団は、ベクターによる形質導入の工程中、約２４時間培養される。

本発明の一実施形態では、本発明の方法において形質導入効率を高めるためにプロスタグランジンＥ２またはその誘導体が使用される。

プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体（例えば、１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２（ｄｍＰＧＥ２））は、ベクターによる形質導入の工程中、好ましくは、この工程の前刺激相に、細胞集団に添加され得る。プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体は前刺激相の開始時、または前刺激相中に添加され得る。例えば、プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体は、細胞集団をベクターに曝す約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２時間前に添加され得る。好ましくは、プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体は、前刺激相中、細胞をベクターに曝す約２時間前に細胞集団に添加される。別の実施形態では、プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体は、ベクターに曝すのと同時に細胞集団に添加される。

本発明の一実施形態では、造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団は、組織サンプルから得られる。

別の実施形態では、造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団は、動員末梢血、骨髄または臍帯血から得られる。

別の態様では、本発明は、本発明の方法によって調製された治療用細胞集団を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明の方法によって調製された支持細胞集団を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明の治療用細胞集団または支持細胞集団を、好ましくは、薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤の存在下で含んでなる医薬組成物を提供する。

別の態様では、本発明は、医薬において使用するための治療用細胞集団および／または支持細胞集団を提供する。

一実施形態では、治療用細胞集団は、本発明の支持細胞集団と組み合わせて投与される。

別の実施形態では、治療用細胞集団は、支持細胞集団の投与前に対象に投与される。

別の実施形態では、治療用細胞集団は、支持細胞集団の投与と同期または同時に対象に投与される。

別の態様では、本発明は、本発明の治療用細胞集団と支持細胞集団を含んでなるキットを提供する。

別の態様では、本発明は、本発明の治療用細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる治療方法を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明の治療用細胞集団と本発明の支持細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる治療方法を提供する。

好ましくは、治療は遺伝子療法による治療である。

別の態様では、本発明は、対象とするヌクレオチドで形質導入された、遺伝子療法において使用するための造血前駆細胞集団を提供する。

対象とするヌクレオチドによる形質導入の工程は、例えば、本明細書に記載の細胞形質導入の方法のいずれかを利用し得る。

別の態様では、本発明は、遺伝子療法において使用するための造血前駆細胞集団を提供し、ここで、前記細胞は造血幹細胞および前駆細胞を含んでなる細胞集団から分離された後対象とするヌクレオチドで形質導入されたものである。

一実施形態では、造血前駆細胞集団はＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ表現型を有する。別の実施形態では、造血前駆細胞集団はＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋表現型を有する。よって、造血前駆細胞集団は、例えば、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻表現型の細胞を含まなくてよい。

別の実施形態では、形質導入前駆細胞集団は、造血幹細胞集団、例えば、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻表現型を有する細胞集団と組み合わせて投与される。

別の態様では、本発明は、造血前駆細胞集団を、それを必要とする対象を投与することを含んでなる遺伝子療法の方法を提供し、ここで、造血前駆細胞集団は対象とするヌクレオチドで形質導入されたものである。

別の態様では、本発明は、患者において導入遺伝子発現の持続時間を制御する方法を提供し、ここで、導入遺伝子発現の持続時間は、形質導入造血幹細胞および／または前駆細胞をＣＤ３８発現レベルに基づいて選択的に投与することにより制御される。導入遺伝子発現持続時間の延長は、低レベルのＣＤ３８発現を有する細胞を投与することにより達成され得る。

別の態様では、本発明は、造血幹細胞または前駆細胞をベクター、好ましくはウイルスベクターで形質導入する際の遺伝子導入効率を高めるためのプロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体の使用を提供する。

一実施形態では、プロスタグランジンＥ２誘導体は、１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２である。

プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体（例えば、１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２（ｄｍＰＧＥ２））は、前刺激相中に細胞集団に添加され得る。一実施形態では、プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体は、前刺激相の開始時に添加される。別の実施形態では、プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体は、前刺激相中に添加される。

例えば、プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体は、細胞集団がベクターに曝される約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２時間前に添加され得る。好ましくは、プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体は、前刺激相中、細胞がベクターに曝される約２時間前に細胞集団に添加される。

別の実施形態では、プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体は、ベクターに曝すのと同時に細胞集団に添加される。

別の態様では、本発明は、細胞集団にベクター、好ましくはレンチウイルスベクターで形質導入する方法を提供し、ここで、細胞集団にベクターで形質導入する工程は、細胞を約４４時間以上培養することを含んでなる。「細胞集団にベクターで形質導入する工程」は、前刺激相およびベクター暴露相と理解される。例えば、細胞集団は、ベクターによる形質導入の工程中、約４４〜６６時間、４４〜６０時間、４４〜５４時間または４４〜４８時間培養可能である。一実施形態では、細胞集団は、ベクターによる形質導入の工程中、約６６、６０、５４、４８または４４時間培養される。

別の態様では、本発明は、細胞集団にベクター、好ましくはレンチウイルスベクターで形質導入する方法を提供し、ここで、細胞集団にベクターで形質導入する工程は、細胞を約４４時間未満（すなわち、前刺激およびベクター接触中）培養することを含んでなる。例えば、細胞集団は、ベクターによる形質導入の工程中、約１２〜４２時間、１２〜３６時間、１２〜２４時間または１２〜１８時間培養可能である。一実施形態では、細胞集団は、ベクターによる形質導入の工程中、約４２、３６、３０、２４、１８または１２時間培養される。好ましくは、細胞集団は、ベクターによる形質導入の工程中、約２４時間培養される。

本明細書に記載の治療用細胞集団を調製する方法の工程は異なる順序で行えると認識される。よって、治療用細胞集団を調製する方法は、
ａ．造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団からＣＤ３４発現細胞を分離する工程、
ｂ．ＣＤ３４を発現する工程（ａ）で得られた細胞集団からＣＤ３８発現細胞を分離する工程、
ｃ．工程（ｂ）で得られたＣＤ３８を発現しない細胞集団をベクターで形質導入して治療用細胞集団を得る工程
を含んでなり得る。

ＣＤ３８を発現しない工程（ｂ）で得られた細胞またはその一部を保持して支持細胞集団とし得る。

本出願は、支持細胞集団の使用に言及する。本発明の一態様において、本明細書に言及される支持細胞集団は、上記に定義される支持細胞集団と置き換えることができる。

あるいは、ＣＤ３８を発現しない工程（ｂ）で得られた細胞またはその一部は、ベクターで形質導入され得る。このような形質導入細胞は、両方に使用する（例えば、対象に投与する）ことができる。このアプローチは、遺伝子（例えば、治療用遺伝子）の対象への一過性送達を可能とし得る（例えば、癌の遺伝子療法に使用するため）。
本願は、以下の態様を含む。
[1] 造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団から臨床使用のための治療用細胞集団を調製する方法であって、前記出発細胞集団からＣＤ３８を実質的に発現しないがＣＤ３４を発現する細胞の集団を分離すること、および分離した細胞集団にベクターで形質導入して治療用細胞集団を得ることを含んでなる、方法。
[2] ａ．造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団からＣＤ３８発現細胞を分離する工程、
ｂ．ＣＤ３８を発現しない工程（ａ）で得られた細胞集団からＣＤ３４発現細胞を分離する工程、
ｃ．工程（ｂ）で得られたＣＤ３４発現細胞集団にベクターで形質導入して治療用細胞集団を得る工程
を含んでなる、[1]に記載の方法。
[3] ａ．造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団をＣＤ３８に対して反応性のある薬剤と接触させる工程、
ｂ．ＣＤ３８反応性細胞をＣＤ３８非反応性細胞から分離する工程、
ｃ．工程（ｂ）で得られたＣＤ３８非反応性細胞をＣＤ３４に対して反応性のある薬剤と接触させる工程、
ｄ．ＣＤ３４反応性細胞をＣＤ３４非反応性細胞から分離する工程、ここで、ＣＤ３４反応性細胞は形質導入細胞集団を形成する、
ｅ．前記形質導入細胞集団にベクターで形質導入して治療用細胞集団を得る工程
を含んでなる、[1]に記載の方法。
[4] 治療用細胞集団がＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻表現型を有する、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5] 造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団が動員末梢血、骨髄または臍帯血から得られる、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6] ＣＤ３８またはＣＤ３４に対して反応性のある薬剤がそれぞれ抗ＣＤ３８抗体または抗ＣＤ３４抗体である、[3]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7] 抗ＣＤ３８抗体および／または抗ＣＤ３４抗体が磁性ビーズまたは検出可能なマーカーにコンジュゲートされている、[6]に記載の方法。
[8] ＣＤ３８発現細胞および／またはＣＤ３４発現細胞が磁性ビーズに基づく分離またはフローサイトメトリーを用いて分離される、[2]または[4]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9] ＣＤ３８反応性細胞および／またはＣＤ３４反応性細胞が磁性ビーズに基づく分離またはフローサイトメトリーを用いて分離される、[3]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[10] 前記ベクターがウイルスベクターである、[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11] 前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、[10]に記載の方法。
[12] 前記ウイルスベクターが対象とするヌクレオチドを含んでなる、[10]に記載の方法。
[13] 細胞集団にベクターで形質導入する工程が約４４時間未満細胞を培養することを含んでなる、[1]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14] 分離したＣＤ３８発現細胞またはその一部を保持して支持細胞集団とする、[2]、[4]〜[8]または[10]〜[13]のいずれかに記載の方法。
[15] 分離したＣＤ３８反応性細胞またはその一部を保持して支持細胞集団とする、[3]〜[7]または[9]〜[13]のいずれかに記載の方法。
[16] 前記支持細胞集団がＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋表現型を有する、[14]または[15]のいずれかに記載の方法。
[17] [1]〜[16]のいずれかに記載の方法に従って調製された治療用細胞集団。
[18] [14]〜[16]のいずれかに記載の方法によって調製された支持細胞集団。
[19] [17]に記載の治療用細胞集団を含んでなる医薬組成物。
[20] [18]に記載の支持細胞集団を含んでなる医薬組成物。
[21] 医薬において使用するための[17]に記載の治療用細胞集団。
[22] 治療用細胞集団が[18]に記載の支持細胞集団と組み合わせて投与される、医薬において使用するための[17]に記載の治療用細胞集団。
[23] 支持細胞集団が[17]に記載の治療用細胞集団と組み合わせて投与される、医薬において使用するための[18]に記載の支持細胞集団。
[24] 治療用細胞集団が自己幹細胞移植法または同種幹細胞移植法の一部として投与される、[21]または[22]に記載の使用のための治療用細胞集団。
[25] 支持細胞集団が自己幹細胞移植法または同種幹細胞移植法の一部として投与される、[23]に記載の使用のための支持細胞集団。
[26] 治療用細胞集団が支持細胞集団の投与の前に対象に投与される、[21]〜[24]のいずれかに記載の使用のための治療用細胞集団または支持細胞集団。
[27] 治療用細胞集団が支持細胞集団の投与と同期または同時に対象に投与される、[22]〜[25]のいずれかに記載の使用のための治療用細胞集団または支持細胞集団。
[28] [17]および[18]に記載の治療用細胞集団および支持細胞集団を含んでなるキット。[29] [17]に記載の治療用細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる治療方法。
[30] [17]に記載の治療用細胞集団と[18]に記載の支持細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる治療方法。
[31] 治療用細胞集団が支持細胞集団の投与の前に対象に投与される、[30]に記載の方法。
[32] 治療用細胞集団が支持細胞集団の投与と同期または同時に対象に投与される、[30]に記載の方法。
[33] 対象とするヌクレオチドで形質導入されている、遺伝子療法において使用するための造血前駆細胞集団。
[34] 造血幹細胞および前駆細胞を含んでなる細胞集団から分離された後に対象とするヌクレオチドで形質導入された、遺伝子療法において使用するための造血前駆細胞集団。
[35] ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ表現型を有する、[33]または[34]に記載の使用のための造血前駆細胞集団。
[36] ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋表現型を有する、[33]または[34]に記載の使用のための造血前駆細胞集団。
[37] 形質導入前駆細胞集団が造血幹細胞集団と組み合わせて投与される、[33]〜[36]のいずれかに記載の使用のための造血前駆細胞集団。
[38] 造血前駆細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含んでなり、前記造血前駆細胞集団に対象とするヌクレオチドで形質導入されている、遺伝子療法の方法。
[39] 造血前駆細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含んでなり、前記細胞は造血幹細胞および前駆細胞を含んでなる細胞集団から分離された後に対象に投与する前に対象とするヌクレオチドで形質導入されたものである、遺伝子療法の方法。
[40] 造血前駆細胞集団がＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ表現型を有する、[38]または[39]に記載の方法。
[41] 造血前駆細胞集団がＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋表現型を有する、[38]または[39]に記載の方法。
[42] 形質導入前駆細胞集団が造血幹細胞集団と組み合わせて投与される、[38]〜[41]のいずれかに記載の方法。
[43] 患者において導入遺伝子発現の持続時間を制御する方法であって、導入遺伝子発現の持続時間が形質導入造血幹細胞および／または前駆細胞をＣＤ３８発現レベルに基づいて選択的に投与することにより制御される、方法。
[44] 導入遺伝子発現の持続時間の延長が低レベルのＣＤ３８発現を有する細胞を投与することにより達成される、[43]に記載の方法。
[45] 造血幹細胞または前駆細胞にベクターで形質導入する際の遺伝子導入効率を高めるためのプロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体の使用。
[46] プロスタグランジンＥ２誘導体が１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２である、[45]に記載の使用。
[47] 造血幹細胞の形質導入が[1]〜[16]のいずれかに記載の方法の一部として実施される、[45]または[46]に記載の使用。

（Ａ）臍帯血または成人骨髄（Ｌｏｎｚａ）由来のＣＤ３４^＋細胞を解凍し、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯおよびＩＬ６で１２時間前刺激し、抗ＣＤ３４、抗ＣＤ１３３および抗ＣＤ３８抗体で染色し、ＦＡＣＳ選別を行い、棒グラフのｘ軸に示される部分集団を得た。ＳＯＲＴ−ＬＶプロトコールは、選別１２時間後のレンチウイルスベクター（ＰＧＫ．ＧＦＰ、１０^８ＴＵ／ｍＬ）による形質導入を含み、ＬＶ−ＳＯＲＴプロトコールでは、バルクＣＤ３４^＋細胞を２４時間の前刺激の後にレンチウイルスベクターで形質導入し、その後、選別を行った。形質導入効率は、分化条件での１４日間のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養（コロニー形成アッセイまたは液体培養）後のベクターコピー数(vector copy number)（ＶＣＮ）分析によるかまたは７日間の培養後のフローサイトメトリー分析（緑の棒グラフ、左下のパネル）によって評価した。骨髄の場合、ＶＣＮは、全コロニー生成に対して、または顕微鏡ガイド下で単一のコロニーを採取することにより個別に骨髄コロニーおよび赤血球コロニーに対しての両方で決定した。（Ｂ）４名の臍帯血ドナー（Ｌｏｎｚａ）由来のＣＤ３４^＋細胞を解凍し、２群に分けた：バルク：ＣＤ３４^＋細胞；ステム：バルクから得た選別したＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞（ＣＤ３８ゲート：最低１０％；ＣＤ３８抗体：ＩＢ２−ＰＥＶｉｏ７７０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）。両群を１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ３Ｌ、５０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−６を添加したステムスパン無血清培地（ＳＦＥＭ）中、１０^６細胞／ｍＬの密度で培養下におき、１８時間前刺激を行った。形質導入は１０^８ＴＵ／ｍＬのＰＧＫ．ＧＦＰレンチウイルスベクターを用いて行った。細胞を、亜致死的照射を行った８週齢のＮＳＧマウスに注射した（バルク：１．２６×１０^５細胞／マウス；ｎ＝６；ステム：１．８×１０^４細胞／マウス；ｎ＝６）。ベクターコピー数は、移植３か月後に、ヒト細胞に特異的なプライマーを用いて末梢血有核細胞に対して行ったｑＰＣＲにより評価した。（Ｃ）（Ｂ）に記載のヘマトキメラマウス由来のＢＭに対して移植２０週後に行ったＶＣＮ。総ＣＤ３４^＋細胞に比べてＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞へのより高い遺伝子導入レベルが、個々の出発集団に由来する異種移植細胞に長期維持される。 Ｏｓｐｅｄａｌｅ ｓａｎ Ｒａｆｆａｅｌｅの承認済みプロトコールに従い、帝王切開分娩後の臍帯静脈から全臍帯血（４０ｍＬ）を採取した。単核細胞（２×１０^８）をフィコールにより単離し、系譜抗体とＣＤ３８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｃａｔ １３０−０９２−２６３）のカクテルで標識した。陽性標識細胞（１０^８）を磁性マイクロビーズに結合させ、ＬＤカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）により分離した。通過画分（１０^８ Ｌｉｎ⁻／ＣＤ３８⁻細胞）をＣＤ３４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）とともにインキュベートし、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞をＭＳカラムで富化した。ＮＳＧマウスにおいてＣＤ３８^＋部分集団およびＣＤ３８⁻部分集団の造血増殖物の追跡を可能とするために、Ｌｉｎ^＋／ＣＤ３８^＋画分（第１カラム）およびＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻画分（第２カラム）をＣＤ３４に関してＦＡＣＳ選別を行った（それぞれ高純度のＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋細胞およびＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞が得られた）。再分析は、ビーズに基づくＣＤ３８^{−／ｌｏｗ}細胞およびＣＤ３８^＋細胞への効率的な分離を示す。これらの画分を次に、ＧＦＰ発現およびＯＦＰ発現レンチウイルスベクターで示差的に標識し、１：５（ＣＤ３４^＋３８⁻：ＣＤ３４^＋３８^＋）の比率で混合し、ｎ＝４のＮＳＧマウスに注射した。ＧＦＰ／ＯＦＰキメラを２８週間追跡した。 ＮＳＧマウスにおける幹細胞／前駆細胞共移植のモデル化：骨髄ＣＤ３８⁻対ＣＤ３８^ｈｉｇｈ。ＣＤ３４^＋成体骨髄造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）をＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻（＋／−）細胞とＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｈｉ（＋／ｈｉ）細胞に選別し、ＳＣＦ（３００ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ３Ｌ（３００ｎｇ／ｍＬ）、ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ６（６０ｎｇ／ｍＬ）およびｄｍＰＧＥ２（１０μＭ）を含有するステムスパンＳＦＥＭ中で１６時間前刺激し、ＧＦＰ−ＬＶ（＋／−）またはＯＦＰ−ＬＶ（＋／ｈｉ）で形質導入した。２４時間の形質導入後、細胞を８週齢の亜致死照射ＮＳＧマウスに次のように注射した：群１：２７，０００ ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞／マウス（ｎ＝３）；群２：２４８，０００ ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｈｉ細胞／マウス（ｎ＝３）；群３：２７，０００ ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻および２４８，０００ ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｈｉ細胞／マウス（ｎ＝３）。生着（群１、２、３）およびキメラ性（群３）を末梢血において経時的にモニタリングし、造血器官を移植１８週後に分析した。 （Ａ）ＮＳＧマウスにおける：幹細胞／前駆細胞共移植のモデル化：動員末梢血ＣＤ３８⁻対ＣＤ３８^{ｉｎｔｍ１}対ＣＤ３８^{ｉｎｔｍ２}対ＣＤ３８^ｈｉ。本発明者らは、ＣＤ３４^＋ ＭＰＢを、ＣＤ３８発現レベルが上昇している４つのサブセット（ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８⁻；ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｉｎｔ１；ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｉｎｔ２；ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｈｉ）に選別し、これらのサブセットをＳＣＦ（３００ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ３Ｌ（３００ｎｇ／ｍＬ）、ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ６（６０ｎｇ／ｍＬ）およびｄｍＰＧＥ２（１０μＭ）を含有するステムスパンＳＦＥＭ中で１６時間前刺激し、これらのサブセットを以下のレンチウイルスベクター：ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８⁻：グリーンＦＰ．ＬＶ；ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｉｎｔ１：チェリーＦＰ．ＬＶ；ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｉｎｔ２：シアンＦＰ．ＬＶ；ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｈｉオレンジＦＰ．ＬＶで形質導入した。２４時間の形質導入後、細胞を８週齢の亜致死照射ＮＳＧマウスに次のように注射した：群１：１２９，０００ ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８⁻細胞／マウス（ｎ＝６）；群２：８６９，０００前駆細胞（ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｉｎｔ１細胞、ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｉｎｔ２細胞およびＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｈｉ細胞を合わせたもの、各集団は前駆細胞混合物に対して３３％を占める）／マウス（ｎ＝７）；群３：１２９，０００ ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８⁻細胞と８６９，０００プール前駆細胞の混合物／マウス（ｎ＝６）。生着（群１、２、３）およびキメラ性（群３）を末梢血において経時的にモニタリングした。（Ｂ）Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血ＣＤ３４^＋細胞をＣＤ３８発現レベルに従って選別し、異なる画分を、上記の図４（Ａ）に記載の通りに異なる蛍光タンパク質を発現する４種類のレンチウイルスベクターで標識した。示差的に標識された画分をプールし（図４（Ａ）の群３に相当）、８週齢の亜致死照射ＮＳＧマウスに注射した。Ｎ＝２の動員末梢血ドナー（ＣＤ３４^＋細胞はＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）、２回の独立した実験。ＣＤ３８部分画分からのヒト移植細胞への経時的な相対的寄与が示される（各時点でｎ＝１０個体のマウス、実験１から６個体および実験２から４個体；平均＋／−ｓｅｍ）。実験１：群３、１２９，０００ ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞（０〜１２％）と８６９，０００ ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｌｏｗ−ｉｎｔｍ−ｈｉｇｈ}（１２〜１００％）プール前記細胞の混合物／マウス（ｎ＝６）。実験２：群３、１４９，０００ ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞（０〜１２％）と１，３２０，０００ ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｌｏｗ−ｉｎｔｍ−ｈｉｇｈ}（１２〜１００％）プール前駆細胞の混合物／マウス（ｎ＝４）。 （Ａ）臍帯血ＣＤ３４^＋細胞に対するｄｍＰＧＥ２の効果（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）。ｎ＝４の臍帯血ドナー（Ｌｏｎｚａ）由来のＣＤ３４^＋細胞を解凍し、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ３Ｌ、５０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ６を添加したステムスパン無血清拡大培養培地（ＳＦＥＭ）中、１０μＭのｄｍＰＧＥ２の存在下または不在下で１８時間、培養下に置いた（前刺激）。前刺激後、細胞を１０^８ＴＵ／ｍＬのレンチウイルスベクターとともに２４時間インキュベートした。次に、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにてＩＭＤＭ＋１０％ＦＣＳ中で１４日間培養し（ｎ＝５反復）、その後、ベクターコピー数（ＶＣＮ）をGentner, B.et al.(2009) Nat. Methods 6: 63-6に記載のようにｑＰＣＲにより測定した。ｄｍＰＧＥ２前刺激は、遺伝子導入に５０％の増加をもたらした。（Ｂ）Ｇ−ＣＳＦ動員ＣＤ３４＋末梢血幹細胞に対するｄｍＰＧＥ２の効果（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）。３個体の動員末梢血ドナーのＮ＝６形質導入。細胞を解凍し、無血清の市販培養培地（例えば、ＣｅｌｌＧｒｏ）に、以下のサイトカイン：３００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、３００ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ３Ｌ、１００ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、６０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−３の存在下、１０^６細胞／ｍＬの密度で再懸濁させ、ｄｍＰＧＥ２の不在下（対照、Ｃｔｒｌ）又は存在下で１８時間全刺激した。形質導入は、レンチウイルスベクター（３つの異なるバッチ）で１０^８ＴＵ／ｍＬにて１２〜２４時間行った。ベクターコピー数は、ＩＭＤＭおよび１０％ＦＣＳ中での１４日間のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の後にｑＰＣＲにより評価した。相対的ＶＣＮ（対照群に対して正規化）を示す。（Ｃ）レンチウイルスベクターによるヒトＨＳＰＣの形質導入能に対するｄｍＰＧＥ２刺激のタイミングの効果。ＬＶ暴露の２時間前にｄｍＰＧＥ２を加えた場合に効果は最大となると思われ（ｔ＝−２時間：ＶＣＮが１００％増加）、解凍時（ｔ＝−１６時間）にｄｍＰＧＥ２を加えると、（Ａ）および（Ｂ）に示す実験と同様に、約５０％のＶＣＮ増加となった。この実験は１名の臍帯血ドナーおよび１名の動員末梢血ドナーに対して行い、相対的ＶＣＮを示す（その個々の対照に対して正規化）。（Ｄ）ｅｘ ｖｉｖｏでのｄｍＰＧＥ２刺激により得られたベクターコピー数の増加は、異種移植後に臍帯血由来ＣＤ３４^＋細胞の後代において長期維持される。臍帯血ＣＤ３４^＋細胞を解凍し、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ３Ｌ、５０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−６を添加したステムスパン無血清培地（ＳＦＥＭ）中で１８時間培養下に置き（１０^６細胞／ｍＬ）（前刺激）、その後、レンチウイルスベクター、１０^８ＴＵ／ｍＬで２４時間形質導入した。細胞を亜致死照射した８週齢のＮＳＧマウスに注射し（１．５〜３×１０^５細胞／マウス）、ベクターコピー数（ＶＣＮ）を、示された時点で各マウス群のプール血液または骨髄において、ヒト細胞に特異的なプライマーを用いて分析した。３反復の実験を示す。左のグラフ：細胞をＰＧＫ．ＴＲＡＩＬ ＬＶで形質導入し、１０μＭ ｄｍＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２群、ｎ＝５マウス）またはＤＭＳＯ（Ｃｔｒｌ群、ｎ＝５マウス）を解凍後に直接加えた（ベクター添加に対してｔ＝−１６時間）。中央のグラフ：細胞をＰＧＫ．ＴＲＡＩＬ ＬＶで形質導入し、１０μＭ ｄｍＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２群＝５）またはＤＭＳＯ（Ｃｔｒｌ群；ｎ＝８）をベクター添加の１２０分前に加えた（ｔ＝−２時間）。中央のグラフ：細胞をＰＧＫ．ＯＦＰ ＬＶで形質導入し、１０μＭ ｄｍＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２群ｎ＝５）またはＤＭＳＯ（Ｃｔｒｌ群；ｎ＝５）をベクター添加の１２０分前に加えた（ｔ＝−２時間）。３つの実験の総てにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで見られた形質導入における利益は、異種移植後１８週間まで長期安定に維持された。 （Ｅ〜Ｇ）ｅｘ ｖｉｖｏ ｄｍＰＧＥ２刺激により見られたベクターコピー数の増加は、成体供給源（例えば、動員末梢血）由来ＣＤ３４^＋細胞の後代で、特定の培養条件を用いた場合、すなわち、総培養を４４時間未満におさえた場合にのみ、長期維持される。Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血（ｍＰＢ）由来ＣＤ３４^＋細胞を解凍し、ＳＣＦ（３００ｎｇ／ｍＬ）、ＦＬＴ３Ｌ（３００ｎｇ／ｍＬ）、ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−３（６０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＣｅｌｌＧｒｏ培地中の培養下に置いた（１０^６細胞／ｍＬ）。細胞を、ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする第３世代レンチウイルスベクター（慢性肉芽腫性疾患の遺伝子療法に好適なベクター）１０^８ＴＵ／ｍＬ用量で形質導入した。ｍＰＢ ＣＤ３４＋細胞のｅｘ ｖｉｖｏ形質導入に用いたものとは異なるプロトコールを（Ｅ）に示し、ｄｍＰＧＥ２の存在（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）または不在（Ｐ０、Ｐ４）、ｄｍＰＧＥ２添加のタイミング（解凍後：Ｐ１、Ｐ２；形質導入の１２０分前：Ｐ３）および培養の持続時間（２４時間：Ｐ２、Ｐ４に対して４４時間：Ｐ０、Ｐ１、Ｐ３）に関して異なる。（Ｆ）ドナー１由来の１０×１０^６ ＣＤ３４^＋ｍＰＢ細胞を解凍し、４等分し、Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２またはＰ３に応じ、工業グレードの製造（Ｍｏｌｍｅｄ Ｓｐａ）からのＳＰ１４６／ｇｐ９１．ｃｏｇｐ９１^ｐｈｏｘ．１２６ＴＬＶで形質導入した。０時点で培養下に置いた５×１０^５細胞の増殖物を各マウスに注射した（実際の数：Ｐ０ ３．６６×１０＾５／マウス；Ｐ１：４．６６×１０＾５／マウス；Ｐ２：３．０×１０＾５／マウス；Ｐ３：４．８６×１０＾５／マウス）。マウスを移植後２０週目に安楽死させた。ＢＭを洗い流し、同じ群に属するマウスからプールし（Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２：ｎ＝５／群；Ｐ３：ｎ＝３／群）、マウス細胞を除去した。次に、富化されたヒト細胞に対して、ヒト細胞に特異的なプライマーを用いてベクターコピー数（ＶＣＮ）分析を行った（技術的反復５回）。統計分析は、ボンフェローニ事後検定補正を伴う一元配置ＡＮＯＶＡにより行い、Ｐ２条件で長期再定着細胞にＶＣＮの約５０％増を示す。第２のドナー（Ｇ）由来のｍＰＢ ＣＤ３４^＋細胞を用いて反復実験を行った。１５×１０^６ ＣＤ３４^＋ｍＰＢ細胞を解凍し、４等分し、プロトコールＰ０、Ｐ１（４４時間−／＋ ｄｍＰＧＥ２）またはＰ４、Ｐ２（２４時間−／＋ ｄｍＰＧＥ２）に従って研究室グレードの製造から得られるＳＰ１４６／ｇｐ９１．ｇｐ９１^ｐｈｏｘＴＧＴ．１２６Ｔ ＬＶ（ＣＧＤ遺伝子療法に好適なベクター）で形質導入した。０時点で培養下に置いた９×１０^５細胞の増殖物を各マウスに注射した（実際の数：Ｐ０ １０×１０^５／マウス；Ｐ１：８．２×１０^５／マウス；Ｐ４：４．５×１０^５／マウス；Ｐ２：５．３×１０^５／マウス）。ＶＣＮは、移植１３週後の各１個体のマウスに由来するＢＭ細胞に対して、ヒト細胞に特異的なｑＰＣＲアッセイを用いて分析した。Ｐ１プロトコールがｉｎ ｖｉｔｒｏ読出しを用いてＶＣＮの増加をもたらしたＭＰＢ ＣＤ３４^＋前駆細胞（図５Ｂ参照）とは全く対照的に、また、「標準」培養プロトコールに関連するｄｍＰＧＥ２が長期再定着細胞においてＶＣＮ増加をもたらす臍帯血（図５Ｄ）とは対照的に、第１の実験と一致して、Ｐ１条件は、成体供給源由来の長期再定着細胞においてｄｍＰＧＥ２により媒介される形質導入効率の持続的増加をもたらさかった。予期しないことに、本発明者らは、ＭＰＢ ＣＤ３４^＋細胞培養プロトコールを２４時間まで短縮することが（Ｐ２）、長期再定着細胞におけるｄｍＰＧＥ２の形質導入促進効果を救済しただけでなく、４４時間の標準プロトコールによって達成されるレベルを十分超えて形質導入を高めたことを見出した。可能性のある説明として、・ＨＳＣ（前駆細胞ではそうではない）に対するｄｍＰＧＥ２の暴露時間依存的効果、ここでは、ＬＶ形質導入に対する寛容性の窓は１６〜２４時間に限られる（この仮説に一致して、統計的に有意でないとしても、ｄｍＰＧＥ２暴露がＰ１よりも後に来たＰ３プロトコールは、ＶＣＮの若干の増加を示唆し得る；図５Ｆ参照）、・ｄｍＰＧＥ_２刺激には感受性であるが培養２４時間後には生着能を失うもの、およびｄｍＰＧＥ２には不感受性であるが培養中に生着能を良好に維持する、従って、長期培養に有利なものの、機能的に異なるＨＳＣの存在、が挙げられる。 ｄｍＰＧＥ２の使用は、成体骨髄由来のＣＤ３４^＋ＨＳＣ、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ ＨＳＣおよびＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋前駆細胞への遺伝子導入を高める。これらの実験は次のように行った：Ｎ＝３の骨髄ドナー（Ｌｏｎｚａ）由来のＣＤ３４^＋細胞を解凍し、ステムスパン無血清拡大培養培地（ＳＦＥＭ）中、以下の条件下での培養下に置いた：３００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、３００ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ３Ｌ、１００ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、６０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ３での１８時間の前刺激。次に、細胞を３群に分けた：バルクＣＤ３４^＋、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋（ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＣＤ３８−ＡＰＣ抗体で標識した後にＭｏＦｌｏｗサイトメーターにてＦＡＣＳ選別を行った）。次に、本発明者らは、ｄｍＰＧＥ２（１０μＭ）またはＤＭＳＯを培養物に加え、細胞をさらに１６時間前刺激し、その後、ＧＦＰ発現レンチウイルスベクター（ＬＶ．ＰＧＫ．ＧＦＰ）１０^８ＴＵ／ｍＬで形質導入を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養アッセイは、ＩＭＤＭ＋１０％ＦＣＳ中での１４日間の液体培養（左）またはコロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイ（右；８００細胞／ｍＬメソカルトを播種し、１４日後にコロニー形成を分析した）として行った。ベクターコピー数は、Gentner B et al. Nat. Methods 2009;6:63-66に記載の通りにｑＰＣＲによって評価した。 培養／形質導入ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻幹細胞と非培養ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／＋}前駆細胞の共投与のモデル化。白血球分離によりＧ−ＣＳＦ動員末梢血細胞を得、ＣＤ３４^＋細胞を富化し、ＦＡＣＳ（ＭｏＦｌｏ ＸＤＰソーターおよびＣＤ３８ ＰＥ−Ｖｉｏ７７０ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗体）によって、より始原的なＣＤ３８⁻幹細胞画分（０〜７％ＣＤ３８パーセンタイル）およびＣＤ３８^{ｉｎｔ／＋}前駆細胞画分（１３〜１００％ＣＤ３８パーセンタイル）に選別した。各画分の複数のアリコートを冷凍した。（Ａ）ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻（幹細胞（ステム））画分を解凍し、３００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、３００ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ３Ｌ、１００ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、６０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−３および１０μＭ ｄｍＰＧＥ２を添加したステムスパン無血清拡大培養培地（ＳＦＥＭ）に１０^６細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた。細胞を２０時間前刺激し（スキームのグレーの四角）、スキームに示されるように、ＰＧＫ．ＧＦＰレンチウイルスベクター（１０^８ ＴＵ／ｍＬ）で２４時間形質導入した（赤い四角）。次に、培養／遺伝子改変された幹細胞を新たに解凍したＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／＋}前駆細胞と１：８比で混合し、８週齢の亜致死照射ＮＳＧマウスに注射した（４７，４００ ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞／３２７，０００非培養前駆細胞／マウス、ｎ＝６）。幹細胞コンパートメントの形質導入効率は、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻幹細胞のみを移植したＮＳＧマウス（ｎ＝６）で測定した場合、ｉｎ ｖｉｖｏで９５％であった。左側のグラフは、培養ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞に由来する細胞のサロゲートマーカーとしての、示された時点でのヒト移植細胞中のＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ（黒丸）、および非培養前駆細胞移植物に由来する細胞のサロゲートマーカーとしてのＧＦＰ−細胞のパーセンテージ（白丸）を示す。ＨＳＣにより誘導される造血を反映する時点であるＢＭＴ後２４週目に、移植細胞の６０％前後がＧＦＰ＋であり、従って、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻幹細胞画分由来であった。この図は、Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋）、骨髄細胞（ＣＤ３３^＋）およびＣＤ３４^＋ ＨＳＰＣを含む総ての系譜に関して同様であった（右側のグラフ）。他方、長期移植細胞の３０〜４０％は、図４に記載されている試験と比較して予期されないほど高かった画分である、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／＋}前駆細胞に由来するものと思われる。さらに、幹細胞と前駆細胞の寄与間の平衡に達するまで、図４Ｂに記載の試験では９週間であったのに対し、１５週間かかった（図７Ａ）。（Ｂ）高密度の遺伝子改変ＨＳＣと非培養前駆細胞支持物の注射に基づく遺伝子療法プロトコールを改良するために、本発明者らは幹細胞と前駆細胞の比率を変更し（１：５と１：１０）、かつ、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞におけるＨＳＣ機能のより良好な維持を可能とするために培養条件を変更した（ＩＬ３などの前駆細胞サイトカインを避け、培養時間を２４時間に短縮）。（Ａ）と同じドナー由来のＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻（幹細胞（ステム））細胞を解凍し、３００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、３００ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ３Ｌ、１００ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯおよび１０μＭ ｄｍＰＧＥ２を添加したＣｅｌｌＧｒｏ培地に１０^６／ｍＬで再懸濁し、１６時間前刺激した（スキームのグレーの四角）。形質導入は、スキームに示されているようにＰＧＫ．ＧＦＰレンチウイルスベクター１０^８ＴＵ／ｍＬで８時間行った（赤い四角）。次に、培養／遺伝子改変した幹細胞を新たに解凍したＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／＋} 前駆細胞と１：５（４６，５００ ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞／２３２，５００ 非培養前駆細胞／マウス、ｎ＝５）または１：１０（４６，５００ ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞／４６５，０００非培養前駆細胞／マウス、ｎ＝５）比で混合し、８週齢の亜致死照射ＮＳＧマウスに注射した。上のグラフは、培養ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞に由来する細胞のサロゲートマーカーとしての、示された時点でのヒト移植細胞中のＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ（黒丸）、および非培養前駆細胞移植物に由来する細胞のサロゲートマーカーとしてのＧＦＰ−細胞のパーセンテージ（白丸）を示す。形質導入ＣＤ３４＋ＣＤ３８−幹細胞からのはるかに迅速な寄与が示され、１２週目にすでに最大７０％に達した（図７Ａの４０％と比較）。ＧＦＰ＋細胞画分は、短命の造血系統（ＣＤ３３^＋またはＣＤ３４^＋細胞）では、幹細胞／前駆細胞比１：５または１：１０に関わらず同等であった（下のグラフ）。これらのデータは、高機能の遺伝子改変ＨＳＣを得るためには短い培養時間が重要であることを裏付ける。 遺伝子療法中の遺伝子改変細胞の持続性の調製。（Ａ）安定な長期導入遺伝子発現は、形質導入ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞を非形質導入ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{＋／ｉｎｔ}前駆細胞とともに投与することにより達成される。このようなアプローチは、遺伝性遺伝子疾患を治療するために十分好適であり得る。（Ｂ）一過性短期導入遺伝子発現は、形質導入ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{＋／ｉｎｔ}前駆細胞を非形質導入ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞とともに投与することにより達成される。（Ｃ）一過性中期発現は、形質導入ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／ｌｏ}細胞を非形質導入ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞とともに投与することにより達成される。（Ｂ）および（Ｃ）に示されるアプローチは、腫瘍の標的化に十分好適であり得る。これらの図は、２回の独立した実験（ドナー１：ｎ＝２１マウス；ドナー２：ｎ＝１２マウス）からのデータを示す。 ＨＳＰＣ画分の生着に対するｅｘ ｖｉｖｏ培養時間の影響（ＢおよびＣ：全ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣ；Ｄ：ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ ＨＳＰＣ；Ｅ：ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／＋}前駆細胞）。（Ａ）試験したｅｘ ｖｉｖｏ培養条件のスキーム。総ての試験は白血球分離により採取されたＧ−ＣＳＦ動員末梢血（ｍＰＢ）幹細胞に対して行った。細胞を解凍し、３００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、３００ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ３Ｌ、１００ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、６０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−３を添加した無血清培地中、スキームにグレーの四角で示されるように、２４時間（標準）または１６時間（短期）培養下に置いた（１０^６細胞／ｍＬ）。形質導入は、第３世代レンチウイルスベクター１０^８ＴＵ／ｍＬで、赤い四角（濃い四角）で示されるように２０時間（標準）または８時間（短期プロトコール）行った。同数の細胞（ｅｘ ｖｉｖｏ培養の開始時の投入数による）を亜致死照射した８週齢のＮＳＧマウスに注射し、生着を経時的にモニタリングした。統計分析は、ボンフェローニ事後検定を伴う２元配置ＡＮＯＶＡにより行った。（Ｂ）（左）標準または短期プロトコールに従って操作したＳＰ１４６／ｇｐ９１．ｃｏｇｐ９１^ｐｈｏｘ．１２６ＴＬＶで形質導入されたｍＰＢ ＣＤ３４^＋細胞による異種移植後の示された時点での、ＮＳＧマウスの末梢血（ＰＢ）および骨髄（ＢＭ）におけるヒトＣＤ４５^＋の生着（ｎ＝５マウス／群 それぞれ５×１０^５ｍＰＢＣＤ３４^＋細胞の増殖物を注射）。（右）生着レベルは、各マウスに注射されたＣＤ３４^＋細胞の実際の数に対して正規化した。この数は、短期培養プロトコールでは、それらの細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖時間が少なかったために少なかった。（Ｃ）（Ｂ）に記載したものと同様の繰り返し実験により、短い時間で培養したＣＤ３４^＋細胞（４４時間に対して２４時間）が有意に高い再定着能を持っていたことが確認された。（Ｄ）短期プロトコール（ｎ＝６マウス、４．７×１０^４細胞／マウス）または標準プロトコール（ｎ＝６マウス、４．７×１０^４細胞／マウス）に従って操作したＰＧＫ．ＧＦＰＬＶで形質導入されたｍＰＢ ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻幹細胞および初期前駆細胞による異種移植後の示された時点での、ＮＳＧマウスの末梢血（ＰＢ）および骨髄穿刺液（ＢＭａｓｐ）におけるヒトＣＤ４５^＋ＧＦＰ＋の生着。ＣＤ３８⁻のレベルは、抗ＣＤ３８抗体（ＩＢ６−ＰＥ−Ｖｉｏ７７０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）とともにインキュベートした場合のＣＤ３８染色のレベルに応じ、最低ＣＤ３８発現細胞（０〜７％の間、０は最低発現細胞であり、１００％は最高発現細胞である）から始めてランク付けされた７％のＣＤ３４^＋細胞と定義された。（Ｅ）標準プロトコール（ｎ＝４マウス）または短期プロトコール（ｎ＝５マウス）に従って操作したＰＧＫ．ＧＦＰＬＶで形質導入されたｍＰＢ ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／＋}前駆細胞による異種移植後の示された時点での、ＮＳＧマウスの末梢血（ＰＢ）および骨髄穿刺液（ＢＭａｓｐ）におけるヒトＣＤ４５^＋の生着。加えて、ｎ＝５のマウスに、新たに解凍した（非培養）ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／＋}前駆細胞で異種移植を行った。マウスに５×１０^５ｍＰＢＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／＋}細胞相当を注射した。ＣＤ３８^{ｉｎｔ／＋}のレベルは、抗ＣＤ３８抗体（ＩＢ６−ＰＥ−Ｖｉｏ７７０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）とともにインキュベートした場合のＣＤ３８染色のレベルに応じ、最高ＣＤ３８発現細胞（１３〜１００％の間、０は最低発現細胞であり、１００％は最高発現細胞である）から始めてランク付けされた８７％のＣＤ３４＋細胞として定義された。 臨床遺伝子療法適用に使用される可能性のある形質導入プロトコールのスキーム。プロトコールＡ、Ｂ、ＣおよびＤが好ましいプロトコールである。

発明の詳細な説明
本発明の種々の好ましい特徴および実施形態を以下、限定されない例によって説明する。

本発明の実施は、特に断りのない限り、当業者の能力の範囲内にある化学、分子生物学、微生物学および免疫学の従来技術を使用する。このような技術は文献に説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, NY; B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg (1992) Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press参照。これらの一般的テキストはそれぞれ引用することにより本明細書の一部とされる。

本発明の第１の態様によれば、臨床使用のための治療用細胞集団を調製する方法が提供され、前記細胞はＣＤ３４を発現するがＣＤ３８を実質的に発現しない。これらの細胞は、造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団から調製される．本方法は、出発細胞集団からＣＤ３８を実質的に発現しないがＣＤ３４を発現する細胞集団を分離すること、および分離した細胞集団をベクター、好ましくはウイルスベクターで形質導入して治療用細胞集団を得ることを含んでなる。好ましくは、ベクターは、対象とするヌクレオチドを含んでなる。

治療用細胞集団は、対象に投与した際に治療効果を生じる細胞集団と理解すべきである。治療効果は、対象において疾患またもしくは障害を改善するもしくは実質的に治癒すること、または疾患またもしくは障害のその後の発現を軽減するもしくは実質的に予防することであり得る。例えば、ゲノムシーケンシングによる遺伝性遺伝子疾患の同定および治療用細胞集団の投与による障害発現の予防が可能である。治療用細胞集団は、遺伝子療法に有用な遺伝子を含んでなり得る。

「臨床使用」により、治療用細胞集団は動物対象、好ましくはヒト対象に投与可能な形態で調製されると理解されるべきである。

造血幹細胞
幹細胞は多くの細胞種に分化することができる。総ての細胞種に分化することができる細胞は全能性として知られる。哺乳動物では、接合子と初期胚細胞だけが全能性である。幹細胞は、総てではないとしてもほとんどの多細胞生物に見られる。幹細胞は、有糸分裂によりそれ自身再生しかつ多様な範囲の特定の細胞種に分化する能力を特徴とする。哺乳動物幹細胞の２つの主要なタイプとして、胚盤胞の内部細胞塊から単離される胚性幹細胞と成体組織に見られる成体幹細胞がある。発生中の胚で、幹細胞は特殊化した胚組織の総てに分化することができる。成体生物では、幹細胞および前駆細胞は身体の修復系として働き、特殊化した細胞を補充するだけでなく、血液、皮膚または腸管組織などの再生器官の通常のターンオーバーを維持する。

造血幹細胞（ＨＳＣ）は、例えば、末梢血、骨髄および臍帯血に見出すことができる多能性幹細胞である。ＨＳＣは自己再生能およびいずれの血液細胞系譜へも分化する能力を持つ。ＨＳＣは、全免疫系、ならびに総ての造血組織（例えば、骨髄、脾臓および胸腺）の赤血球および骨髄系譜に再定着することができる。ＨＳＣは、総ての造血細胞系譜の終生の生産を提供する。

造血前駆細胞は、特定タイプの細胞に分化する能力を有する。しかしながら、幹細胞とは対照的に、造血前駆細胞はすでにかなり特異的であり、それらの「ターゲット」細胞への分化を課せられている。幹細胞と前駆細胞の違いは、幹細胞は無期限に再生するが、前駆細胞は限られた回数しか分裂できないことである。造血前駆細胞は、機能的ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（すなわち、移植および長期間総ての血液系譜を生じ得るかどうかの証明）によってのみＨＳＣから厳密に区別することができる。

分化細胞は、幹細胞または前駆細胞に比べてより特殊化した細胞である。分化は、多細胞生物の発生中に、生物が単一の接合子から組織および細胞種の複雑なシステムへと変化する際に起こる。分化はまた成体においても一般的なプロセスであり、成体幹細胞は、組織修復および通常の細胞ターンオーバーの際に分裂して完全に分化した娘細胞を作り出す。分化は、細胞の大きさ、形状、膜電位、代謝活性およびシグナルに対する反応性を劇的に変化させる。これらの変化は主として遺伝子発現における高度に制御された改変によるものである。言い換えれば、分化細胞は、特異的構造を有し、特定の遺伝子の活性化および不活性化を含む発生過程によりある特定の機能を実行する細胞である。ここで、分化細胞は、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞などの造血系譜の分化細胞を含む。例えば、造血系譜の分化細胞は、未分化細胞では発現されないかまたは低い適度でしか発現されない細胞表面分子の検出により、幹細胞および前駆細胞から識別することができる。好適なヒト細胞系譜マーカーの例としては、ＣＤ３３、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５（骨髄）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ（Ｂ）、ＣＤ３６、ＣＤ７１、ＣＤ２３５ａ（赤血球）、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８（Ｔ）、ＣＤ５６（ＮＫ）が挙げられる。

ＨＳＣ供給源
本発明の一実施形態では、造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団は、組織サンプルから得られる。

例えば、ＨＳＣは、成体および胎児末梢血、臍帯血、骨髄、肝臓または脾臓から得ることができる。好ましくは、これらの細胞は、末梢血または骨髄から得られる。ＨＳＣは、増殖因子処置の手段によりｉｎ ｖｉｖｏで細胞を動員した後に得てもよい。

動員は、例えば、Ｇ−ＣＳＦ、プレリキサフォルまたはそれらの組合せを用いて行ってもよい。ＮＳＡＩＤ、ＣＸＣＲ２リガンド（Ｇｒｏｂｅｔａ）およびジペプチジルペプチダーゼ阻害剤などの他の薬剤も動員剤として有用であり得る。

幹細胞増殖因子ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦが利用可能であるので、ほとんどの造血幹細胞移植法は、今や、骨髄からではなく末梢血から採取された幹細胞を用いて行われる。末梢血幹細胞を採取することでより多量の移植細胞が得られ、ドナーが移植細胞を採取するために全身麻酔を受ける必要はなく、生着時間が短縮され、長期再発率は低くなり得る。

骨髄は、標準的吸引法（定常状態もしくは動員後）により、または次世代採取ツール（例えば、Ｍａｒｒｏｗ Ｍｉｎｅｒ）により採取され得る。

加えて、ＨＳＣはまた、誘導多能性幹細胞に由来してもよい。

ＨＳＣの特徴
ＨＳＣは一般に、フローサイトメトリー法により低前方散乱および側方散乱性である。ミトコンドリア活性の判定を可能とするローダミン標識により示されるように、代謝を休止しているものもある。ＨＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ９０およびＣＤ４９ｆなどの特定の細胞表面マーカーを含んでなり得る。ＨＳＣは、ＣＤ３８およびＣＤ４５ＲＡ細胞表面マーカーの発現を欠く細胞としても定義できる。しかしながら、これらのマーカーのいくつかの発現は、発生段階およびＨＳＣの組織特異性に依存する。「サイドポピュレーション細胞」と呼ばれる一部のＨＳＣは、フローサイトメトリーにより検出した場合、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素を排除する。従って、ＨＳＣは、それらの同定および単離を可能とする記述的特性を有する。

陰性マーカー
ＣＤ３８は、ヒトＨＳＣの最も確立された有用な陰性マーカーである。

ヒトＨＳＣはまた、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ２７１およびＣＤ４５ＲＡなどの細胞系譜マーカーについても陰性である。しかしながら、これらのマーカーは、ＨＳＣ富化のためには、組み合わせて使用する必要のある場合がある。

陰性マーカーにより、ヒトＨＳＣはこれらのマーカーの発現を欠くことが理解されるべきである。

陽性マーカー
ＣＤ３４およびＣＤ１３３は、ＨＳＣの最も有用な陽性マーカーである。

一部のＨＳＣはまた、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ９３などの細胞系譜マーカーについても陽性である。しかしながら、これらのマーカーは、ＨＳＣ富化のためには、組み合わせて使用する必要のある場合がある。

陽性マーカーにより、ヒトＨＳＣはこれらのマーカーを発現することが理解されるべきである。

よって、治療用細胞集団は、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻であり得る。例えば、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ９０^＋ＣＤ４９ｆ^＋細胞を得るためにさらなる分離を行うことができる。

細胞の分離
細胞集団の分離は、特定の表現型または特徴を示す細胞集団をその表現型または特徴を示さない、または低い程度でしか示さない他の細胞から精製することを意味する。例えば、特定のマーカー（例えばＣＤ３８）を発現しない細胞集団を出発細胞集団から分離することができる。その代わりに、またはそれに加えて、別のマーカー（例えばＣＤ３４）を発現する細胞集団を分離することもできる。

本発明の一実施形態では、本方法は、
ａ．造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団からＣＤ３８発現細胞を分離する工程、
ｂ．ＣＤ３８を発現しない工程（ａ）で得られた細胞集団からＣＤ３４発現細胞を分離する工程、
ｃ．工程（ｂ）で得られたＣＤ３４発現細胞集団にベクターで形質導入して治療用細胞集団を得る工程
を含んでなる。

特異的マーカー（例えば、ＣＤ３８またはＣＤ３４）を発現する細胞集団の分離は、そのマーカーと結合する薬剤を使用することによって達成され得る。

別の実施形態では、本方法は、
ａ．造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団をＣＤ３８に対して反応性のある薬剤と接触させる工程、
ｂ．ＣＤ３８反応性細胞をＣＤ３８非反応性細胞から分離する工程、
ｃ．工程（ｂ）で得られたＣＤ３８非反応性細胞をＣＤ３４に対して反応性のある薬剤と接触させる工程、
ｄ．ＣＤ３４反応性細胞をＣＤ３４非反応性細胞から分離する工程、ここで、ＣＤ３４反応性細胞は形質導入細胞集団を形成する、
ｅ．前記形質導入細胞集団にベクターで形質導入して治療用細胞集団を得る工程
を含んでなる。

ＣＤ３８またはＣＤ３４などの特異的マーカーに対して反応性のある薬剤は、そのマーカーに実質的に特異的に結合する薬剤と理解されるべきである。

本発明の一実施形態では、ＣＤ３８またはＣＤ３４に反応性のある薬剤は、それぞれ抗ＣＤ３８抗体または抗ＣＤ３４抗体である。

抗体は、本明細書で使用する場合、選択された標的と結合できる完全抗体または抗体フラグメントを意味し、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）_２、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体およびヒト化抗体を含む操作抗体、ならびにファージディスプレーまたは別の技術を用いて産生された人為的に選択した抗体が含まれる。

加えて、古典的抗体の代替、例えば、「アビボディー」、「アビマー」、「アンチカリン」、「ナノボディー」および「ＤＡＲＰｉｎｓ」も本明細書において使用可能である。

よって、例えば、ＣＤ３８反応性細胞は、ＣＤ３８マーカーを発現し、従って、ＣＤ３８反応性薬剤と結合する細胞と理解されるべきである。これに対して、ＣＤ３８非反応性細胞は、ＣＤ３８反応性薬剤と実質的に結合しない。同じ理解がＣＤ３４反応性細胞と非反応性細胞にも同様に当てはまる。

特異的マーカーに対して反応性のある薬剤は、当技術分野で公知のいくつかの技術のいずれかを用いて検出可能なように標識することができる。反応性薬剤は、本質的に標識されてもよく、またはそれに標識をコンジュゲートすることによって修飾されてもよい。コンジュゲートにより、反応性薬剤と標識が機能するように連結されることが理解されるべきである。これは、反応性薬剤と標識が両方とも実質的に障害なくそれらの機能（例えば、マーカーへの結合、蛍光同定可能、または磁場に置いた場合に分離が可能）を遂行できるように相互に連結されることを意味する。コンジュゲーションの好適な方法は当技術分野で周知であり、当業者により容易に特定可能である。

標識は、例えば、それが結合されている標識薬剤および任意の細胞をその環境から精製（例えば、反応性薬剤は磁性ビーズ、またはアビジンなどの親和性タグで標識できる）、検出またはその両方を可能とする。標識として使用するのに好適な検出可能マーカーとしては、蛍光団（例えば、グリーン、チェリー、シアンおよびオレンジ蛍光タンパク質）およびペプチドタグ（例えば、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグおよびＨＡタグ）が含まれる。

本発明の一実施形態では、抗ＣＤ３８抗体および／または抗ＣＤ３４抗体は磁性ビーズとコンジュゲートされる。

別の実施形態では、抗ＣＤ３８抗体および／または抗ＣＤ３４抗体は検出可能マーカーとコンジュゲートされる。

別の実施形態では、検出可能マーカーは蛍光団である。

特異的マーカーを発現する細胞集団を分離するためのいくつかの技術が当技術分野で公知である。これらには、磁性ビーズに基づく分離技術（例えば、閉回路磁性ビーズに基づく分離）、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、親和性タグ精製（例えば、アフィニティーカラムまたはビーズ、例えば、アビジン標識薬剤を分離するためのビオチンカラム）および顕微鏡に基づく技術が含まれる。

一実施形態では、ＣＤ３８発現細胞および／またはＣＤ３４発現細胞は、磁性ビーズに基づく分離またはフローサイトメトリーを用いて分離される。

別の実施形態では、ＣＤ３８反応性細胞および／またはＣＤ３４反応性細胞は、磁性ビーズに基づく分離またはフローサイトメトリーを用いて分離される。

異なる技術の組合せ、例えば、磁性ビーズに基づく分離工程とその後の得られた細胞集団の、フローサイトメトリーによる１以上の付加的（陽性または陰性）マーカーに関する選別を用いて分離を行うこともできる。

臨床グレードの分離は例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて行うことができる。これは閉回路磁性ビーズに基づく分離技術の一例である。

色素排除特性（例えば、サイドポピュレーションまたはローダミン標識）または酵素活性（例えば、ＡＬＤＨ活性）がＨＳＣの富化のために使用可能であることも想定される。

現行の磁性ビーズに基づく分離技術を用いる場合、陰性分離工程（すなわち、ＣＤ３８発現細胞の除去）陽性分離工程（すなわち、ＣＤ３４発現細胞の富化）の前に行うことが好ましい。しかしながら、陰性分離および陽性分離とも他の技術、例えば、高精度フローサイトメトリー技術（例えば、閉回路ＦＡＣＳ）とともに実施可能であることも想定される。

しかしながらまた、陰性分離工程（すなわち、ＣＤ３８発現細胞の除去）の前に陽性分離工程（すなわち、ＣＤ３４発現細胞の富化）を行うこともできる。

本発明の細胞集団は、ＣＤ３８発現レベルに応じて画分に分離することができる。ＣＤ３８発現レベルは、当技術分野で公知の好適な技術、例えば、フローサイトメトリー技術を用いて定量することができる（例えば、図４参照）。例えば、ＣＤ３８発現レベルは、ＩＢ６クローンまたは類似／等価な試薬を用いた抗体染色により測定することができる。

細胞によるＣＤ３８発現の量は発現レベルのパーセントによって表すことができ、０％は最低発現細胞であり、１００％は最高発現細胞である。

細胞集団はＣＤ３８発現レベルに基づき部分集団（例えば、ＣＤ３４^＋集団に由来する部分集団）に分類または分離することができる。細胞集団は、ＣＤ３８⁻、ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３８^ｉｎｔ２またはＣＤ３８^＋部分集団（この順序でＣＤ３８発現レベルが高い）に分類または分離することができる（例えば、全ＣＤ３４^＋集団がＣＤ３８発現／染色強度に応じてランク付けされる）。例えば、（分析にＣＤ３４^＋細胞のプレゲーティングを行う場合）、ＣＤ３８⁻表現型を有する細胞集団は、ＣＤ３８発現レベルに基づき最低１０％の細胞の範囲内に含まれ；ＣＤ３８^ｉｎｔ１（ＣＤ３８^{ｉｎｔ／ｌｏ}とも呼ばれる）表現型を有する細胞集団は、ＣＤ３８⁻細胞の次に高い３０％の細胞の範囲内に含まれ；ＣＤ３８^ｉｎｔ２（ＣＤ３８^{＋／ｉｎｔ}とも呼ばれる）表現型を有する細胞集団は、ＣＤ３８^ｉｎｔ１細胞の次に高い３０％の細胞の範囲内に含まれ；ＣＤ３８^＋（ＣＤ３８^ｈｉとも呼ばれる）表現型を有する細胞集団は、ＣＤ３８^ｉｎｔ２細胞の次に高い３０％の細胞の範囲内に含まれ得る。

従って、ＣＤ３８⁻表現型を有する細胞集団は、例えば、約０〜１２％、例えば、約０〜１０％のＣＤ３８発現の範囲内に含まれ得る。

ＣＤ３８^ｉｎｔ１（ＣＤ３８^{ｉｎｔ／ｌｏ}とも呼ばれる）表現型を有する細胞集団は、例えば、約１０〜４０％、例えば、約１２〜４０％または約１３〜４０％のＣＤ３８発現の範囲内に含まれ得る。

ＣＤ３８^ｉｎｔ２（ＣＤ３８^{＋／ｉｎｔ}とも呼ばれる）表現型を有する細胞集団は、例えば、約４０〜７０％、例えば、約４１〜７０％のＣＤ３８発現の範囲内に含まれ得る。

ＣＤ３８^＋（ＣＤ３８^ｈｉとも呼ばれる）表現型を有する細胞集団は、例えば、約７０〜１００％、例えば、約７１〜１００％のＣＤ３８発現の範囲内に含まれ得る。

当業者ならば、本明細書の開示に基づき、意図される使用に応じて、ＣＤ３８発現レベルに基づき細胞集団を容易に選択することができるであろう。実際に、当業者ならば、開示されるＣＤ３８発現レベルは所望の使用に応じて若干調整可能であることを認識するであろう。

好ましい実施形態では、ＣＤ３８⁻集団（幹細胞含有画分）は、０〜１０％の範囲のＣＤ３８発現を有すると定義され；ＣＤ３８^ｉｎｔ１集団（短期〜中期の再定着能を備えた多能性前駆細胞含有画分）は、１０〜４０％の範囲のＣＤ３８発現を有すると定義され；ＣＤ３８^ｉｎｔ２集団（短期再定着能を備えた前駆細胞含有画分）は、４０〜７０％の範囲のＣＤ３８発現を有すると定義され；ＣＤ３８^＋集団（有意な再定着能を実質的に欠く前駆細胞）は、７０〜１００％の範囲のＣＤ３８発現を有すると定義される。

また、これらの画分の細胞は要すれば組み合わせてもよい。例えば、ＣＤ３８^ｉｎｔ１画分とＣＤ３８^ｉｎｔ２画分を組み合わせてＣＤ３８^ｉｎｔ画分（約１０〜７０％の範囲のＣＤ３８発現内に含まれる）を形成してもよく；ＣＤ３８^ｉｎｔ１群とＣＤ３８^ｉｎｔ２群とＣＤ３８^＋群を組み合わせてＣＤ３８^{ｌｏｗ−ｉｎｔｍ−ｈｉｇｈ}（ＣＤ３８^{ｉｎｔ／＋}とも呼ばれる）画分（約１０〜１００％の範囲、例えば、約１２〜１００％または約１３〜１００％の範囲のＣＤ３８発現の範囲内に含まれる）を形成してもよい。

ベクター
ベクターは、ある環境から別の環境へ実体の移入を可能とするまたは助けツールである。本発明においては、例として、組換え核酸技術で使用されるいくつかのベクターは、核酸のセグメント（例えば、異種ＤＮＡセグメント、例えば、異種ｃＤＮＡセグメント）などの実体を標的細胞へ移入可能とする。ベクターは、異種核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞内に維持し、核酸セグメントを含んでなるベクターの複製を助けるか、または核酸セグメントによりコードされるタンパク質の発現を助ける目的を果たし得る。ベクターは非ウイルスまたはウイルスであり得る。組換え核酸技術で使用されるベクターの例としては、限定されるものではないが、プラスミド、染色体、人工染色体およびウイルスが挙げられる。ベクターはまた、例えば、裸の核酸（例えば、ＤＮＡ）であり得る。その最も単純な形態では、ベクターはそれ自体対象とするヌクレオチドであり得る。

本発明で使用されるベクターは例えば、プラスミドまたはウイルスベクターであり得、ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよび場合によりプロモーターのレギュレーターを含み得る。

本発明で使用されるポリヌクレオチドを含んでなるベクターは、形質転換および形質導入などの当技術分野で公知の様々な技術を用いて細胞に導入することができる。いくつかの技術が当技術分野で知られ、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、および単純ヘルペスウイルスベクターなどの組換えウイルスベクター感染、核酸の直接的注入および微粒子銃形質転換などがある。

非ウイルス送達系としては、限定されるものではないが、ＤＮＡトランスフェクション法が挙げられる。ここで、トランスフェクションは、非ウイルスベクターを用いて遺伝子を標的細胞へ送達するプロセスを含む。

典型的なトランスフェクション法としては、エレクトロポレーション、ＤＮＡ微粒子銃、脂質媒介トランスフェクション、コンパクトＤＮＡ媒介トランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、カチオン因子媒介トランスフェクション、カチオン界面両親媒物質(cationic facial amphiphiles)（ＣＦＡｓ）(Nature Biotechnology 1996 14; 556)およびそれらの組合せが挙げられる。

加えて、本発明は、遺伝子標的プロトコール、例えば、ＤＮＡ修飾剤の送達を使用し得る。

ウイルスベクター
一実施形態では、ウイルスベクターが本発明で使用される。

別の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターである。

別の実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。

レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター
本発明で使用されるレトロウイルスベクターは、いずれの好適なレトロウイルスに由来してもよく、またはいずれの好適なレトロウイルスから誘導な可能であり得る。多数の異なるレトロウイルスが同定されている。例として、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤浪肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄芽球腫症ウイルス−２９（ＭＣ２９）およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）が挙げられる。レトロウイルスの詳細なリストはCoffin et al. (1997) “Retroviruses”, Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds:JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763に見出せる。

レトロウイルスは、２つのカテゴリー、すなわち、「単純」および「複雑」に大別することができる。レトロウイルスはさらに７群に分けることができる。これらの群のうち５つが、発癌能を有するレトロウイルスに相当する。残りの２群はレンチウイルスおよびスプーマウイルスである。これらのレトロウイルスの総説はCoffin et al (1997)同書に示されている。

レトロウイルスおよびレンチウイルスのゲノムの基本構造は、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ、これらが位置する部位の間または内部に、ゲノムのパッケージングを可能とするパッケージングシグナル、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノムへの組み込みを可能とする組み込み部位、ならびにパッケージング成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子などの多くの共通の特徴を持ち、これらはウイルス粒子の組み立てに必要なポリペプチドである。レンチウイルスは、核から感染した標的細胞の細胞質へ、組み込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写産物の効率的輸送を可能とする、ＨＩＶにおけるｒｅｖおよびＲＲＥ配列などの付加的特徴を備える。

プロウイルスでは、これらの遺伝子の両末端には長い末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれる領域が隣接している。ＬＴＲはプロウイルスの組み込みおよび転写を担う。ＬＴＲはまたエンハンサー−プロモーター配列としても働き、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。

ＬＴＲはそれら自体、Ｕ３、ＲおよびＵ５と呼ばれる３つの要素に分けることができる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端にユニークな配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両末端で繰り返される配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端にユニークな配列に由来する。これら３つの要素の大きさは、異なるレトロウイルス間でかなりの変動があり得る。

欠陥型レトロウイルスベクターゲノムでは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖは存在しない、または機能がない場合がある。ＲＮＡの両末端のＲ領域は反復配列である。Ｕ５およびＵ３は、ＲＮＡゲノムのそれぞれ５’末端および３’末端におけるユニークな配列に相当する。

本発明で使用される典型的なレトロウイルスベクターでは、複製に不可欠な１以上のタンパク質コード領域の少なくとも一部をウイルスから除去することができる。これにより、ウイルスベクターは複製欠陥となる。また、標的非分裂宿主細胞の形質導入および／またはそのゲノムの宿主ゲノムへの組み込みが可能な候補調節部分を含んでなるベクターを作出するために、ベクターゲノム内の調節制御領域およびリポーター部分と機能し得るように連結された候補調節部分をコードするライブラリーでウイルスゲノムの一部を置換してもよい。

レンチウイルスベクターは、より大きなレトロウイルスベクター群の一部である。レンチウイルスの詳細なリストは、Coffin et al (1997) “Retroviruses” Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds:JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763に見出せる。要するに、レンチウイルスは、霊長類群および非霊長類群に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例としては、限定されるものではないが、ヒト自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長類レンチウイルス群としては、プロトタイプ「スローウイルス」 ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連のヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）およびより最近記載されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が挙げられる。

レンチウイルスファミリーは、レンチウイルスは分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染能を持つという点でレトロウイルスとは異なる(Lewis et al (1992) EMBO J 11(8):3053-3058 およびLewis and Emerman (1994) J Virol 68 (1):510-516)。対照的に、ＭＬＶなどの他のレトロウイルスは、例えば、筋肉、脳、肺および肝臓組織を構成するものなどの非分裂細胞または分裂の遅い細胞には感染できない。

レンチウイルスベクターは、本明細書で使用する場合、レンチウイルスから誘導可能な少なくとも１つの構成成分を含んでなるベクターである。好ましくは、その構成成分は、ベクターが細胞に感染し、遺伝子を発現するかまたは複製される生物機構に関与する。

レンチウイルスベクターは、「非霊長類」ベクターであり、すなわち、主として霊長類、特にヒトには感染しないウイルスに由来し得る。

非霊長類レンチウイルスの例は、本来霊長類には感染しないレンチウイルス科のいずれのメンバーであってもよく、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、マエディウイルス（ＭＶＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）が挙げられる。

ウイルスベクターは、ＥＩＡＶに由来し得る。ＥＩＡＶは、レンチウイルスの最も単純なゲノム構造を有する。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子に加え、ＥＩＡＶは他の３つの遺伝子：ｔａｔ、ｒｅｖ、およびＳ２をコードする。ｔａｔは、ウイルスＬＴＲの転写アクチベーターとして働き(Derse and Newbold (1993) Virology 194(2):530-536およびMaury et al (1994) Virology 200(2):632-642)、ｒｅｖは、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を介してウイルス遺伝子の発現を調節および協調させる(Martarano et al. (1994) J Virol 68(5):3102-3111)。これらの２つのタンパク質の作用機構は、大きくは霊長類ウイルスの類似の機構と同様であると思われる(Martarano et al. (1994) J Virol 68(5):3102-3111)。Ｓ２の機能は未知である。加えて、ＥＩＡＶタンパク質Ｔｔｍは、膜貫通タンパク質の開始部にある、ｅｎｖコード配列にスプライシングされるｔａｔの最初のエキソンによりコードされることが確認されている。

好ましくは、本発明で使用されるウイルスベクターは、最小のウイルスゲノムを有する。

本明細書で使用する場合、用語「最小ウイルスゲノム」は、標的宿主細胞に感染し、形質導入し、対象とするヌクレオチド配列を送達するために必要とされる機能を提供するために、非必須要素を除去し、必須要素を保持するようにウイルスベクターが操作されていることを意味する。この戦略のさらなる詳細はＷＯ１９９８／０１７８１５に見出すことができる。

しかしながら、宿主細胞／パッケージング細胞内でウイルスゲノムを産生するために使用されるプラスミドベクターは、宿主細胞／パッケージング細胞内でゲノムの転写を指示するために、レトロウイルスゲノムに機能し得るように連結された転写調節制御配列を含むと考えられる。これらの調節配列は、転写されたレトロウイルス配列と会合している天然配列、すなわち、５’Ｕ３領域であり得るか、またはそれらは別のウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーターなどの異種プロモーターであり得る。いくつかのレンチウイルスゲノムは、効率的なウイルス生産のためにさらなる配列を必要とする。例えば、特に、ＨＩＶの場合には、ｒｅｖおよびＲＲＥ配列が含まれ得る。しかしながら、ｒｅｖおよびＲＲＥ要求はコドンの最適化により軽減または排除することができる。この戦略のさらなる詳細はＷＯ２００１／０７９５１８に見出すことができる。ｒｅｖ／ＲＲＥ系と同じ機能を果たす別の配列も知られている。例えば、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の機能的類似体がマソン・ファイザーサルウイルスに見られる。これは構成的輸送要素（ＣＴＥ）として知られ、ゲノム内に、感染細胞中の因子と相互作用すると考えられるＲＲＥ型配列を含んでなる。細胞因子はｒｅｖ類似体であると考えることができる。従って、ＣＴＥをｒｅｖ／ＲＲＥ系の代替として使用することができる。既知または利用可能となる他のいずれの機能的等価物も本発明に関連し得る。例えば、ＨＴＬＶ−ＩのＲｅｘタンパク質はＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質と機能的に置き換えることができることも知られている。ＲｅｖおよびＲＲＥは、本発明の方法で使用するためのベクターには存在しないかまたは機能しなくてよく、代わりにｒｅｖおよびＲＲＥが存在してよい。

本発明の方法において使用するためのベクターでは、ウイルスエンハンサーおよびプロモーター配列が削除されている自己不活型(self-inactivating)（ＳＩＮ）ベクターを使用し得る。ＳＩＮベクターは、野生型ベクターと同等の有効性でｉｎ ｖｉｖｏにおいて生成され、非分裂細胞に形質導入することができる。ＳＩＮプロウイルスにおける長い末端反復配列（ＬＴＲ）の転写不活性化は、複製可能ウイルスによる動員を回避するべきである。これはまた、ＬＴＲのシス作用効果を排除することにより内部プロモーターからの遺伝子の発現調節を可能とするべきである。

例として、自己不活型レトロウイルスベクター系は、転写エンハンサーまたは３’ＬＴＲのＵ３領域のエンハンサーおよびプロモーターを削除することによって構築されたものである。１ラウンドのベクター逆転写および組み込みの後、これらの変化は５’ ＬＴＲと３’ＬＴＲの両方にコピーされ、転写が不活性なプロウイルスを産生する。しかしながら、このようなベクターのＬＴＲより内部のプロモーターはなお転写活性があるであろう。この戦略は、内部に配置された遺伝子からの転写に対するウイルスＬＴＲのエンハンサーおよびプロモーターの効果を排除するために使用されてきた。このような効果は、転写増強または転写抑制を含む。この戦略はまた、３’ＬＴＲからゲノムＤＮＡへの下流転写を排除するために使用することもできる。これは、内因性癌遺伝子の偶発的活性化を防ぐことが重要であり得るヒト遺伝子療法において特に懸念されることである。Yu et al., (1986) PNAS 83:3194-98; Marty et al., (1990) Biochimie 72:885-7; Naviaux et al., (1996) J. Virol.70:5701-5; Iwakuma et al., (1999) Virol. 261:120-32; Deglon et al., (2000) Human Gene Therapy 11:179-90。

非複製レンチウイルスベクター
複製欠陥レンチウイルスベクターゲノムにおいて、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖは存在しないかまたは機能しなくてよい。

本発明で使用される典型的なレンチウイルスベクターでは、複製に不可欠な１以上のタンパク質コード領域の少なくとも一部がウイルスから除去され得る。これにより、ウイルスベクターは複製欠陥型となる。標的非分裂宿主細胞を形質導入し、かつ／またはそのゲノムを宿主ゲノムに組み込むことができるＮＯＩを含んでなるベクターを作出するために、
ウイルスゲノムの一部を対象とするヌクレオチド（ＮＯＩ）に置き換えてもよい。

一実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＷＯ２００７／０７１９９４に記載のような非組み込みベクターである。

レンチウイルスベクターは、「非霊長類」ベクターであり得、すなわち、本来、霊長類、特にヒトには感染しないウイルスに由来し得る。

アデノウイルスベクター
本発明の別の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクターであり得る。アデノウイルスは、ＲＮＡ中間体を介さない二本鎖の直鎖ＤＮＡウイルスである。アデノウイルスには５０を超える異なるヒト血清型が存在し、遺伝子の配列相同性に基づき６つのサブグループに分けられる。アデノウイルスの天然標的は呼吸器系および消化管上皮であり、一般に軽度の症状のみを生じる。アデノウイルスベクター系で血清型２および５（９５％の配列相同性を有する）が最もよく用いられ、通常、若年者の上気道感染に関連する。

アデノウイルスは、エンベロープを持たない正２０面体である。典型的なアデノウイルスは、１４０ｎｍキャプシド封入ＤＮＡウイルスを含んでなる。このウイルスの２０面体対称は、２４０のヘキソンと１２のペントンの１５２のカプソマーから構成される。粒子のコアは、５’末端においてＤＮＡ複製のプライマーとして働く末端タンパク質（ＴＰ）と共有結合されている３６ｋｂの直鎖二重鎖ＤＮＡを含む。ＤＮＡは逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を有し、これらの長さは血清型によって異なる。

アデノウイルスは、ヒト起源および非ヒト起源の広範な細胞種のｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入が可能である。これらの細胞には、呼吸器系気道上皮細胞、肝細胞、筋肉細胞、心筋細胞、滑膜細胞、初代乳腺上皮細胞、および分裂終了最終分化細胞、例えばニューロンが含まれる。

アデノウイルスベクターはまた、非分裂細胞に形質導入することができる。このことは、肺上皮の罹患細胞のターンオーバー速度が遅い嚢胞性線維症などの疾患には極めて重要である。実際、いくつかの治験で、罹患した成人嚢胞性線維症患者の肺への、アデノウイルスを介した嚢胞性線維症輸送体（ＣＦＴＲ）の移入の利用が進行中である。

アデノウイルスは、遺伝子療法および異種遺伝子の発現のためのベクターとして使用されてきた。大きな（３６ｋｂ）ゲノムは、最大８ｋｂの外来挿入ＤＮＡを収容することができ、相補的細胞株において効率的に複製して最大１０１２の極めて高い力価をもたらすことができる。従って、アデノウイルスは、基本的に複製しない細胞において遺伝子の発現を研究するために最良の系の１つである。

アデノウイルスゲノムからのウイルス遺伝子または外来遺伝子の発現は、複製中の細胞を必要としない。アデノウイルスベクターは、受容体を介するエンドサイトーシスによって細胞に侵入する。ひと度細胞内に入れば、アデノウイルスベクターは宿主染色体に組み込まれることはまれである。その代わり、アデノウイルスは、宿主核内の直鎖ゲノムとしてエピソーム的に（宿主ゲノムとは独立に）機能する。ゆえに、組換えアデノウイルスの使用により、宿主ゲノム中へのランダムな組み込みに伴う問題が緩和される。

アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、高頻度の組み込みを有し非分裂細胞に感染可能であることから、本発明で使用するために魅力的なベクター系である。これにより、ＡＡＶは組織培養下の哺乳動物細胞への遺伝子送達に有用なものとなる。ＡＡＶは感染力に関して広い宿主域を有する。ｒＡＡＶベクターの作製および使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号および米国特許第４，７９７，３６８号に記載されている。

組換えＡＡＶベクターは、マーカー遺伝子およびヒト疾患に関与する遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ形質導入に成果を持って使用されている。

単純ヘルペスウイルスベクター
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ニューロンに自然感染するエンベロープを有する二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＨＳＶは外来ＤＮＡの大きな切片を収容することができ、これにより、ＨＳＶはベクター系として魅力的なものとなり、ニューロンへの遺伝子送達用のベクターとして使用されてきた。

治療手順におけるＨＳＶの使用には、それらの株を溶解サイクルが確立できないように弱める必要がある。特に、ＨＳＶベクターがヒトの遺伝子療法に使用される場合には、ポリヌクレオチドは好ましくは必須遺伝子中に挿入されるべきである。これは、ベクターウイルスが野生型ウイルスと遭遇した場合に、組換えにより野生型ウイルスへの異種遺伝子の移入が起こり得るからである。しかしながら、ポリヌクレオチドが必須遺伝子に挿入される限り、この組換え移入はレシピエントウイルス内の必須遺伝子も欠損させ、複製能のある野生型ウイルス集団への異種遺伝子の「エスケープ」を防ぐ。

対象とするヌクレオチド
本発明で使用されるベクターは好ましくは、対象とするヌクレオチドを含んでなる。

好ましくは、対象とするヌクレオチドは治療効果を生じる。

好適なＮＯＩとしては、限定されるものではないが、酵素、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化分子、操作免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、免疫共刺激分子、免疫調節分子、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、ｍｉＲＮＡ標的配列、標的タンパク質のトランスドメイン陰性突然変異、毒素、条件付き毒素、抗原、腫瘍抑制タンパク質、増殖因子、転写因子、膜タンパク質、表面受容体、抗癌分子、血管作用性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、ならびにそれらの誘導体（例えば、会合リポーター基を有する誘導体）をコードする配列が挙げられる。ＮＯＩはまた、プロドラッグ活性化酵素をコードし得る。

ＮＯＩの一例は、地中海貧血／鎌状赤血球疾患の遺伝子療法に使用可能なβ−グロビン鎖である。

ＮＯＩはまた、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ、例えば、ｇｐ９１ｐｈｏｘ導入遺伝子）、白血球接着不全、重度感染中および遺伝性骨髄不全症候群（例えば、ファンコニ貧血）でない患者における他の食細胞障害、ならびに原発性免疫不全症（ＳＣＩＤ）などの骨推系に非緊急／選択的遺伝子矯正を必要とする他の疾患の治療に有用なものを含む。

支持細胞集団
精製度の高いＨＳＣはベクター、特に、レンチウイルスベクターによる形質導入能が高いという本発明者らの予期しない発見は、本発明者らをＨＳＣ遺伝子療法プロトコールの根本的に新しい設計を評価するように促した。この新規なプロトコールは、出発細胞集団（例えば、動員末梢血、骨髄または臍帯血から得られるもの）をＨＳＣ富化画分（例えば、ＣＤ３４^＋細胞が富化されたＨＳＣ内容物を有する治療用細胞集団）と前駆細胞含有画分（支持細胞集団）に分離することを含んでなる。後者はｅｘ ｖｉｖｏ操作を行わずに冷凍することができ、骨髄破壊的前処置の後に血液回復を増強するために対象に注入することができる。精製度の高いＨＳＣ含有画分は、本明細書に記載のように「最小の」ｅｘ ｖｉｖｏ培養を用い、標準的ＣＤ３４^＋細胞形質導入プロトコールよりも培養時間およびベクター用量を減じて形質導入される。

本発明の一実施形態では、分離したＣＤ３８発現細胞またはＣＤ３８反応性細胞またはその一部を保持して支持細胞集団を形成する。この集団はＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３８^＋画分を含んでなり得る。

治療用細胞集団および／または支持細胞集団は、後の移植まで貯蔵を容易にするためにそれらの調製後に冷凍することができる。支持細胞集団は治療用細胞集団を調製するための方法の初期段階で分離されるので、分離後できるだけすぐに、好ましくは分離直後に冷凍されることが好ましい。生存力を維持するために細胞を冷凍する方法は当技術分野で周知である。

冷凍細胞は、例えば対象への投与のためなど使用する必要がある場合に解凍することができる。

細胞形質導入
ベクターによる細胞集団の形質導入は、細胞がベクターに曝される培養の第２相の前に前刺激相を用いる。前刺激相では、細胞を、例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）、ならびに場合により、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１１、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＧＦＢＰ２、ＡＮＧＰＴＬ３または５を含んでなる培養培地中で培養することができる。

細胞集団は、例えば、本明細書に記載の治療用細胞集団、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞の集団、造血幹細胞の集団または造血前駆細胞の集団であり得る。

好ましくは、ベクターはレンチウイルスベクターである。

下記のプロトコール標準または短期プロトコールのいずれかを本明細書に記載の方法の際に実施することができる。しかしながら、標準プロトコールおよび短期プロトコールの両方をベクター（例えば、レンチウイルスベクター）で細胞集団を形質導入する任意の方法の際に実施してよいことも認識されよう。これは本発明にさらなる態様を与える。

ベクターによる細胞集団の形質導入は、細胞が対象に投与する前に４４時間以上の培養を受ける標準プロトコールを用いて行うことができる。

従って、本発明は、細胞集団にベクターで形質導入する工程が、細胞を約４４時間以上培養すること（「標準」プロトコール）を含んでなる方法を提供する。「細胞集団にベクターで形質導入する工程」は、前刺激およびベクター暴露相として理解されるべきである。

例えば、細胞集団は、ベクターによる形質導入の工程中、約４４〜６６時間、４４〜６０時間、４４〜５４時間または４４〜４８時間培養され得る。一実施形態では、細胞集団は、ベクターによる形質導入の工程中、約６６、６０、５４、４８または４４時間培養される。

しかしながら、本発明者らは、培養時間が造血幹細胞および前駆細胞の両方の機能的生着能に悪影響を及ぼすことを見出した。よって、本発明者らは、生着の向上と対応する形質導入効率の低下が釣り合いを取る短期形質導入プロトコールを開発した。

従って、本発明は、細胞集団にベクターで形質導入する工程が細胞を約４４時間未満培養すること（「短期」プロトコール）を含んでなる方法を提供する。

例えば、細胞集団は、ベクターによる形質導入の工程中、約１２〜４２時間、１２〜３６時間、１２〜２４時間または１２〜１８時間培養され得る。一実施形態では、細胞集団は、ベクターによる形質導入の工程中、約４２、３６、３０、２４、１８または１２時間培養される。好ましくは、細胞集団は、ベクターによる形質導入の工程中、約２４時間培養される。

標準プロトコールまたは短期プロトコールのいずれかにおいて、前刺激相は、例えば、約１２、１４、１６、１８または２２時間の持続時間であり得る。好ましくは、前刺激相は、約１６時間の持続時間である。

標準プロトコールまたは短期プロトコールのいずれかにおいて、ベクター暴露相は、例えば、約８、１０、１２、１４または１６時間の持続時間であり得る。好ましくは、ベクター暴露相は、約８時間の持続時間である。

標準プロトコールまたは短期プロトコールのいずれかにおいて、細胞集団にベクターで形質導入する工程は、対象に細胞を投与する前に前刺激相およびベクター暴露相を繰り返すことを含んでなり得る。例えば、これらの細胞は、前刺激、次いでベクター暴露、次いで第２の前刺激相、次いで第２のベクター暴露相を受け得る。

好ましくは、細胞集団にベクターで形質導入する工程中の細胞培養培地は、ＩＬ３を含まない。

プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体（例えば、１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２（ｄｍＰＧＥ２））を前刺激相中に細胞集団に加え得る。プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体は、前刺激相の開始時、または前刺激相中に加え得る。例えば、プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体は、細胞集団をベクターに曝す約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２時間前に加え得る。好ましくは、プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体は、前刺激相中、細胞集団をベクターに曝す約２時間前に細胞集団に加えられる。別の実施形態では、プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体は、ベクター暴露と同時に細胞集団に加えられる。

好ましい形質導入プロトコールを実施例８に示す。

医薬組成物
本発明は、本発明の治療用細胞集団および／または支持細胞集団を含んでなる医薬組成物を提供する。

本発明の細胞は、対象に投与するために薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤とともに処方することができる。好適な担体および希釈剤としては、等張生理食塩水、例えば、リン酸緩衝生理食塩水が含まれ、おそらくはヒト血清アルブミンを含有する。

細胞療法製品の取り扱いは、好ましくは、細胞療法に関するＦＡＣＴ−ＪＡＣＩＥ国際規定に応じて実施される。

造血幹細胞移植
本発明は、医薬において使用するための、例えば、遺伝子療法において使用するための治療用細胞集団を提供する。

本使用は造血幹細胞移植手順の一部であり得る。

造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、骨髄（この場合、骨髄移植として知られる）または血液に由来する血液幹細胞の移植である。幹細胞移植は、血液学および腫瘍学の分野で、血液もしくは骨髄の疾患、またはある種の癌を有する人々に対して最もよく実施される医療行為である。

ＨＳＣＴの多くのレシピエントは、化学療法による長期処置から利益を受けないと思われる、または化学療法に対してすでに耐性のある多発性骨髄腫または白血病患者である。ＨＳＣＴの候補は、患者が欠陥幹細胞を伴う重症複合免疫不全症または先天性好中球減少症などの先天的欠陥を有する小児科症例、およびまた誕生後に幹細胞を失ってしまった再生不良性貧血を有する小児または成人を含む。幹細胞移植で処置される他の病態としては、鎌状赤血球症、骨髄異形成症候群、神経芽腫、リンパ腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍およびホジキン病が挙げられる。より最近では、必要な前化学療法および放射線の用量がより少ない非骨髄破壊的、またはいわゆる「ミニ移植」法が開発された。これにより、高齢者およびそれ以外で従来の治療計画に耐えるには弱すぎると考えられる他の患者でＨＳＣＴの実施が可能となった。

本発明の一実施形態では、治療用細胞集団は、本発明の支持細胞集団と組み合わせて投与される。

一実施形態では、本発明の治療用細胞集団および／または支持細胞集団は、自己幹細胞移植法の一部として投与される。

別の実施形態では、本発明の治療用細胞集団および／または支持細胞集団は同種幹細胞移植法の一部として投与される。

自己幹細胞移植法により、出発細胞集団（治療用細胞集団および／または支持細胞集団が由来する）は治療用細胞集団および／または支持細胞集団が投与される対象と同じ対象から得られると理解されるべきである。これまでに述べたように、自己移植法は、免疫不適合性に伴う問題を避け、および遺伝的に適合するドナーが得られるかどうかに関わらず対象に利用できることから有利である。

同種幹細胞移植法により、出発細胞集団（治療用細胞集団および／または支持細胞集団が由来する）は治療用細胞集団および／または支持細胞集団が投与される対象と異なる対象から得られると理解されるべきである。好ましくは、免疫不適合性のリスクを最小にするために、ドナーは細胞が投与される対象と遺伝的に適合される。

本発明の一実施形態では、治療用細胞集団は、支持細胞集団の投与前に対象に投与される。

治療用細胞集団は、支持細胞集団の投与の例えば、約１〜７２、１２〜６０または２４〜４８時間前、例えば、支持細胞集団の投与の約１、２、３、４、５、６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、６０または７２時間前に対象に投与され得る。

別の実施形態では、治療用細胞集団は、支持細胞集団の投与と同期または同時に対象に投与される。

治療用細胞集団および支持細胞集団の好適な用量は、例えば治療上および／または予防上有効なものである。投与すべき用量は、対象および処置される病態によって異なる場合があり、当業者ならば容易に決定できる。

支持細胞集団内のＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋細胞の可能性のある用量は、およそ４〜５００万細胞／ｋｇであり得る。この用量は、骨髄破壊的前処置後適時に短期の生着を保証するべきである。

よって、本発明の支持細胞集団ＣＤ３４^＋細胞が富化されないので、支持細胞集団の可能性のある目標用量は、およそ５千万〜１０億のＣＤ３８^＋有核細胞／ｋｇ、例えば、約１億細胞／ｋｇ（５％のＣＤ３４^＋細胞濃度と想定）であり得る。例えば、動員末梢血由来細胞の可能性のある用量は約１億〜５億細胞／ｋｇであり得、骨髄由来細胞の可能性のある用量は約５千万〜２億細胞／ｋｇであり得る。

治療用細胞集団可能性のある用量は、およそ０．１〜２００万細胞／ｋｇ、例えば、約５０万〜１００万細胞／ｋｇであり得る。

治療用細胞集団：支持細胞集団の総合比率は、臨床内容および支持細胞集団が調製される方法によって異なる。支持細胞集団が事前のＣＤ３４富化を行わずにＣＤ３８選択（例えば、白血球分離または骨髄採取の）により調製される場合、治療用細胞集団：支持細胞集団の総合比率は、およそ１：１００〜１：１０００、例えば、約１：５００または１：１００であり得る。含まれるＣＤ３４^＋細胞の絶対数に基づき（ＣＤ３４^＋前富化が行われたかどうかによらない）支持細胞集団を投与することが好ましい。

一実施形態では、対象が骨髄破壊的前処置を受けた場合、細胞の用量は、支持細胞集団中で投与されるＣＤ３４^＋細胞の数が、治療用細胞集団中で投与されるＣＤ３４^＋細胞の数の約５〜１５倍、好ましくは５〜１０倍となるように調整することができる。よって、例えば、対象に投与するＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞と非培養ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋前駆細胞の比率は約１：１０または１：５であり得る。

投与すべき支持細胞集団は、最小絶対数約２．５〜３００万のＣＤ３４^＋細胞／ｋｇ患者体重を含んでなり得る。

対象が骨髄破壊的前処置を受けていない場合には、治療用細胞集団は対象に単独で投与してよい（すなわち、支持細胞集団は必要とされない）。

本発明の治療用細胞集団および／または支持細胞集団は、ＷＯ１９９８／００５６３５に挙げられている障害の処置に有用であり得る。参照しやすいように、そのリストの一部をここに示す：癌、炎症または炎症性疾患、皮膚科障害、発熱、心血管作用、出血、凝固および急性期応答、悪液質、食欲不振症、急性感染、ＨＩＶ感染、ショック状態、移植片対宿主反応、自己免疫疾患、再潅流傷害、髄膜炎、片頭痛およびアスピリン依存性抗血栓症；腫瘍増殖、浸潤および拡散、血管新生、転移、悪性、腹水および悪性胸腔滲出；脳虚血、虚血性心疾患、骨関節炎、関節リウマチ、骨粗鬆症、喘息、多発性硬化症、神経変性、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、血管炎、クローン病および潰瘍性大腸炎；歯周炎、歯肉炎；乾癬、アトピー性皮膚炎、慢性潰瘍、表皮水疱症；角膜潰瘍、網膜症および外科的創傷治癒；鼻炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、アナフィラキシー；再狭窄、鬱血性心不全、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化症または内部硬化症(endosclerosis)。

それに加えて、またはその代わりに、本発明の治療用細胞集団および／または支持細胞集団は、ＷＯ１９９８／００７８５９に挙げられている傷害の処置に有用であり得る。参照しやすいように、そのリストの一部をここに示す：サイトカインおよび細胞増殖／分化活性；免疫抑制または免疫賦活活性（例えば、ヒト免疫不全ウイルス感染を含む免疫不全を処置するため；リンパ球増殖の調節；癌および多くの自己免疫疾患の処置、および移植拒絶の防止または腫瘍免疫の誘導のため）；造血調節、例えば、骨髄系またはリンパ系疾患の処置；例えば、創傷治癒、火傷、潰瘍および歯周病および神経変性の処置のための、骨、軟骨、腱、靱帯および神経組織の成長の促進；卵胞刺激ホルモンの阻害または活性化（受精能の調整）；化学走性／化学運動性活性（例えば、特定の細胞種を損傷または感染部位に動員するため）；止血および血栓溶解活性（例えば、血友病および脳卒中を処置するため）；抗炎症活性（例えば、敗血性ショックまたはクローン病を処置するため）；抗微生物剤として；例えば、代謝または挙動のモジュレーター；鎮痛薬として；特定の欠乏性障害の処置；ヒトまたは獣医学における例えば乾癬の処置において。

それに加えて、またはその代わりに、本発明の治療用細胞集団および／または支持細胞集団は、ＷＯ１９９８／００９９８５に挙げられている傷害の処置に有用であり得る。参照しやすいように、そのリストの一部をここに示す：マクロファージ阻害活性および／またはＴ細胞阻害活性、および従って、抗炎症活性；抗免疫活性、すなわち、炎症に無関連の応答を含む、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答に対する阻害効果；マクロファージおよびＴ細胞の細胞外マトリックス成分およびフィブロネクチン接着能の阻害、ならびにＴ細胞においてアップレギュレートされたｆａｓ受容体発現；関節リウマチを含む関節炎、過敏感感受性、アレルギー反応、喘息、全身性紅斑性狼瘡、膠原病および他の自己免疫疾患に関連する炎症；アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、アテローム動脈硬化性心疾患、再潅流傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性傷害、呼吸窮迫症候群または他の心肺疾患に関連する炎症；消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎および他の消化管疾患に関連する炎症、肝線維症、肝硬変または他の肝臓疾患、甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎または他の腎および泌尿器疾患、耳炎または他の耳鼻咽喉科疾患、皮膚炎または他の皮膚疾患、歯周病または他の歯科疾患、睾丸炎または睾丸副睾丸炎、不妊症、睾丸外傷または他の免疫関連精巣疾患、胎盤機能不全、胎盤不全、習慣性流産、子癇、前子癇および他の免疫および／または炎症関連婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ぶどう膜網膜炎、視神経炎、眼内炎症、例えば、網膜炎または嚢胞様黄斑浮腫、交感神経性眼炎、強膜炎、色素性網膜炎、変性性眼底疾患(degenerative fondus disease)の免疫および炎症成分、眼の外傷、感染により引き起こされる眼の炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、例えば緑内障濾過手術後の過度の瘢痕化の炎症成分、眼内インプラントに対する免疫および／または炎症反応、ならびに他の免疫および炎症関連眼性疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）または他の任意の器官の療法において免疫および／または炎症抑制が有益であると思われる自己免疫疾患もしくは病態もしくは障害に関連する炎症、パーキンソン病、パーキンソン病の処置に由来する合併症および／または副作用、ＡＩＤＳ関連認知症複合ＨＩＶ関連脳症、デビック病、ジデナム舞踏病、アルツハイマー病およびＣＮＳの他の変性疾患、病態または障害、ストークスの炎症成分、ポリオ後症候群、精神障害の免疫および炎症成分、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性汎脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ギラン−バレー症候群、ジデナム舞踏病、重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ＣＮＳ圧迫もしくはＣＮＳ外傷もしくはＣＮＳ感染の炎症成分、筋萎縮および筋ジストロフィーの炎症成分、ならびに免疫および炎症関連疾患、中枢神経系および末梢神経系の病態または障害、外傷後炎症、敗血症性ショック、感染性疾患、手術の炎症性合併症または副作用、骨髄移植または他の移植合併症および／もしくは副作用、遺伝子療法の炎症および／または免疫合併症ならびに副作用（例えばウイルス担体の感染による）、あるいは、体液性および／もしくは細胞性の免疫応答を抑制または阻害するため、単球もしくは白血球増殖性疾患、例えば白血病を、単球もしくはリンパ球の量を低減することによって治療または改善するため、角膜、骨髄、器官、水晶体、ペースメーカー、天然もしくは人工皮膚組織などの天然または人工の細胞、組織および器官を移植する場合の移植片拒絶を予防および／または治療するための、ＡＩＤに関連する炎症を含む望ましくない免疫反応および炎症の阻害。

キット
別の態様では、本発明は、本発明の治療用細胞集団および支持細胞集団を含んでなるキットを提供する。

治療用細胞集団および支持細胞集団は好適な容器で提供され得る。

本キットはまた、使用説明書も含み得る。

造血前駆細胞の移植
本発明は、遺伝子療法において使用するための造血前駆細胞集団を提供し、この造血前駆細胞集団は対象とするヌクレオチドで形質導入されたものである。

本発明者らが示したように、このような前駆細胞は短期生着をもたらす。よって、このような遺伝子療法は、対象に非永続的効果をもたらすと考えられる。例えば、効果は形質導入された造血前駆細胞の投与後１〜６か月に限定され得る。このアプローチの利点は、治療介入の自然治癒特性のためにより安全かつ忍容性があることであろう。

よって、本発明者らは、遺伝子改変細胞の持続性を調整することができる（実施例３参照）。例えば、対象とするヌクレオチドの発現が望まれる期間に応じて、異なる条件の処置のために異なる細胞集団が投与できるということが想定される、例えば、
１．長期：遺伝性の遺伝病の治癒のためのＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞（例えば、０〜１０％パーセンタイル）；
２．中期：約３〜４か月の処置期間でＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／ｌｏ}細胞（例えば、１２〜４０％パーセンタイル）（例えば、抗癌タンパク質の微小環境標的化送達のため）；
３．短期：約１〜２か月の処置時間でＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{＋／ｉｎｔ}細胞（例えば、４１〜７０％パーセンタイル）（例えば、抗癌タンパク質の微小環境標的化送達のため）。

別の態様では、本発明は、遺伝子療法において使用するための造血前駆細胞集団を提供し、前記細胞は造血幹細胞および前駆細胞を含んでなる細胞集団から分離され、次いで、対象とするヌクレオチドで形質導入されたものである。

このような造血前駆細胞遺伝子療法は、後天性障害、例えば、癌の処置に適合させることができ、疾患を根絶するには（可能性としては、毒性の）対象とする抗癌ヌクレオチドの時限的発現で十分であり得る。

造血前駆細胞遺伝子療法での適用に特に好適な対象ヌクレオチドとしては、例えば、インターフェロン−α２ｂ、他のタイプ−１インターフェロン、他の免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２）、アポトーシス誘導導入遺伝子、例えば、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）および腫瘍微小環境破壊因子が挙げられる。

一実施形態では、造血前駆細胞集団はＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ表現型を有し、例えば、造血前駆細胞集団はＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ表現型が富化されたものである。

ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ表現型を有する細胞集団は、フローサイトメトリー法を用いて分離され得る。造血前駆細胞のＣＤ３８^ｉｎｔ集団は、フローサイトメトリーで決定した場合に１０〜７０％の範囲のＣＤ３８発現を含み得る（例えば、実施例３および図４参照−ここでは、ＣＤ３８^ｉｎｔ集団はさらにＣＤ３８^ｉｎｔ１とＣＤ３８^ｉｎｔ２に分離されている）。造血幹細胞は、０〜１０％の範囲のＣＤ３８発現を含み得る。

別の実施形態では、造血前駆細胞集団は、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋表現型を有し、例えば、造血前駆細胞集団は、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋表現型が富化されたものである。よって、例えば、前駆細胞集団は、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２細胞および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋細胞を実質的に含んでなり得る。

別の実施形態では、形質導入前駆細胞集団は、造血幹細胞、例えば、非改変造血幹細胞の集団と組み合わせて投与される。造血幹細胞はＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻表現型を持ち得る。

別の態様では、本発明は、遺伝子療法において使用するためのＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ表現型を有する細胞集団、例えば、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ表現型を有する細胞が富化された細胞集団を提供し、前記細胞集団は対象とするヌクレオチドで形質導入されている。

別の態様では、本発明は、遺伝子療法において使用するためのＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋表現型を有する細胞集団、例えば、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋表現型を有する細胞が富化された細胞集団を提供し、前記細胞集団は対象とするヌクレオチドで形質導入されたものである。よって、例えば、前駆細胞集団は、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２細胞および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋細胞を実質的に含んでなり得る。

別の態様では、本発明は、遺伝子療法において使用するための造血前駆細胞集団を提供し、前記造血前駆細胞集団はＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ表現型を有し（例えば、前記造血前駆細胞集団はＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ表現型が富化されたものである）、かつ、対象とするヌクレオチドで形質導入されたものである。

別の態様では、本発明は、遺伝子療法において使用するための造血前駆細胞集団を提供し、前記造血前駆細胞集団はＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋表現型を有し（例えば、前記造血前駆細胞集団はＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋表現型が富化されたものである）、かつ、対象とするヌクレオチドで形質導入されたものである。よって、例えば、前記前駆細胞集団は、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２細胞および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋細胞を実質的に含んでなり得る。

別の態様では、本発明は、臨床使用のための造血前駆細胞集団を調製する方法を提供し、前記方法は、造血幹細胞および前駆細胞を含んでなる細胞集団から造血前駆細胞集団を分離すること、および分離した細胞集団を対象とするヌクレオチドで形質導入することを含んでなる。

一実施形態では、造血前駆細胞集団はＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ表現型を有し、例えば、前記造血前駆細胞集団はＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ表現型が富化されたものである。

別の実施形態では、造血前駆細胞集団はＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋表現型を有し、例えば、前記造血前駆細胞集団はＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋表現型が富化されたものである。よって、例えば、前駆細胞集団は、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２細胞および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋細胞を実質的に含んでなり得る。

治療方法
本明細書において処置という場合には総て、治癒的処置、待期的処置および予防的処置を含むが、本発明に関して予防という場合には、より一般的には予防的処置に関連すると認識されるべきである。哺乳動物、特にヒトの処置が好ましい。ヒトの処置および獣医学的処置の両方が本発明の範囲内にある。

プロスタグランジン
プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体は、造血幹細胞または前駆細胞をベクター、好ましくはウイルスベクターで形質導入する際に遺伝子導入効率を高めるために使用され得る。

本発明の一実施形態では、プロスタグランジンＥ２誘導体は１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２である。

誘導体により、プロスタグランジンＥ２が、造血幹細胞をベクターで形質導入する際に遺伝子導入効率を高めるその機能を保持したまま、好ましくは安定性および活性などの特性を改善するために、当技術分野で公知のいくつかの技術のいずれかによって改変されると理解されるべきである。

本明細書に記載の態様および実施形態のいずれにおいても、プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体を、プロスタグランジン受容体アゴニスト、例えば、ＥＰ４受容体に作用する小分子薬で置換可能であるということも想定される。

実施例１
高精製ＨＳＣはレンチウイルスベクターでより形質導入可能となる
本発明者らは造血幹細胞集団および前駆細胞集団に対するマイクロＲＮＡの種々の効果を研究した。この目的で、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻およびＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋臍帯血ＨＳＰＣにレンチウイルスｍｉＲＮＡスポンジまたは過剰発現ベクターで形質導入した（データは示されていない）。予期しないことに、当技術分野で広く想定されていることとは対照的に、本発明者らは、より始原的なＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ＨＳＣが富化されたサブセットへの遺伝子導入１．５倍増であったことを認めた。本発明者らは独自に、複数の臍帯血ドナーおよび成人骨髄ドナーに対して、マーカー遺伝子を発現する生物学的に中立なベクターを用いてこの所見を確認し、バルクＣＤ３４^＋細胞またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋細胞の形質導入に比べて選別されたＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ＨＳＣ富化画分への遺伝子導入効率が１．５〜２倍増であったことを示した（図１（Ａ））。

バルクＣＤ３４^＋ ＨＳＰＣは小サブセットのＣＤ３８⁻細胞を含むので、本発明者らはこの高いより始原的な細胞の形質導入性がバルク培養物でも維持されていたかどうか、またはこの効果をみるために前選別が必要であったかどうかを調べてみたいと考えた。よって、本発明者らは、選別−ＬＶプロトコール（まず、ＣＤ３８部分集団を選別し、次に、２４時間の前刺激の後にレンチウイルスベクター形質導入）とＬＶ−選別プロトコール（２４時間の前刺激の後に、レンチウイルスベクター形質導入、そして形質導入の２４時間後にＣＤ３８部分集団の選別）の並行比較を行った。ＣＤ３８⁻細胞の高い形質導入はＬＶ−選別群でも明かであったが、この効果は形質導入前に選別を行った場合に有意に大きかった（図１（Ａ））。

従って、高精製ＨＳＣ富化部分集団に対して操作を行うことが、形質導入に関して明らかな利点を与えた。

本発明者らは、バルクＣＤ３４^＋細胞とは対照的に前精製したＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ＨＳＰＣへの高い遺伝子導入が、異種移植後にｉｎ ｖｉｖｏで維持されることを確認した（図１（Ｂ））。これらのデータは、この効果は造血幹細胞のレベルで起こっており、遺伝子療法を受けた患者でおそらく長期持続することを示唆する。

実施例２
ビーズに基づくＣＤ３８およびＣＤ３４のそれぞれに関する一連の陰性／陽性選択は優れたＮＳＧ生着能を有する細胞の精製を可能とする
ビーズに基づくＣＤ３８およびＣＤ３４それぞれの一連の陰性／陽性選択の実現可能性を調べるために、本発明者らは市販のＣＤ３８選択キットをヒト臍帯血単核細胞に適用し、ＮＳＧマウスにおいて競合移植により、ＣＤ３８⁻画分（陽性選択によりＣＤ３４がさらに富化されたもの）およびＣＤ３８^＋画分の生着能を調べた（図２）。第１世代の非最適化選択プロトコールを用いた場合であっても、本発明者らはＣＤ３８⁻画分に関して生着の優位性を明らかに示すことができた。ＣＤ３８⁻細胞は移植細胞の２０％未満を占めるに過ぎなかったが、長期生着細胞の７０〜８０％がこの画分に由来するものであり、この精製プロトコールのさらなる最適化の動機付けとなった。

実施例３
ＮＳＧマウスにおける分割移植細胞のモデル化
遺伝的に改変された長期再定着細胞と短期前駆細胞の共移植をモデル化するために、本発明者らは幹細胞富化画分および種々の前駆細胞画分を蛍光タンパク質発現レンチウイルスベクター（ＬＶ）セットで示差的に標識し、競合的条件および非競合的条件の両方でＮＳＧマウスの生着動態を検討した。

まず、ＣＤ３４^＋成体骨髄ＨＳＰＣをＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻（＋／−）細胞およびＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｈｉ（＋／ｈｉ）細胞に選別し、ＳＣＦ（３００ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ３Ｌ（３００ｎｇ／ｍＬ）、ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ６（６０ｎｇ／ｍＬ）およびｄｍＰＧＥ２（１０μＭ）を含有するＳｔｅｍ Ｓｐａｎ ＳＦＥＭで１６時間前刺激し、ＧＦＰ−ＬＶ（＋／−）またはＯＦＰ−ＬＶ（＋／ｈｉ）で形質導入した。２４時間の形質導入後、細胞を８週齢の亜致死照射ＮＳＧマウスに次のように注射した：
群１：２７，０００＋／−細胞／マウス（ｎ＝３）；
群２：２４８，０００＋／ｈｉ細胞／マウス（ｎ＝３）；
群３：２７，０００＋／−および２４８，０００＋／ｈｉ細胞／マウス（ｎ＝３）。
生着（群１、２、３）およびキメラ性（群３）を末梢血において経時的にモニタリングし、造血器官を移植１８週間後に分析した（図３）。

本発明者らは、ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｈｉ細胞がマウスにおいては生着せず、移植後３週間の短期であっても生着しなかったことを認めた。ＯＦＰ陽性ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｈｉ細胞とＧＦＰ陽性ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８⁻細胞を混合した群３では、本発明者らは示された造血部分集団（ＨＳＣ：ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ＣＤ９０^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻；ＭＰＰ：ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ＣＤ９０⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻；ＭＬＰ：ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ＣＤ９０⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋）において経時的にＧＦＰ／ＯＦＰキメラを追跡した。著しくも、ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｈｉ由来細胞は総ての時点で、ならびに骨髄でも脾臓でも（後者は示されていない）ほとんど存在しなかった。

本発明者らは、ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８⁻細胞は、総てではないにしてもほとんどの場合、短期でも長期でもＳＣＩＤ再定着能を含むと結論付ける。

次に、本発明者らは、ＣＤ３４^＋動員末梢血（ＭＰＢ）細胞（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）は、遺伝子療法プロトコールの改善が小児科の状況に比べてより差し迫って必要とされる、成人患者において好ましいＨＳＣ供給源であることから、本発明者らはこれに移った（図４）。本発明者らは、ＣＤ３４^＋ ＭＰＢを漸増するＣＤ３８発現レベルを有する４つのサブセット（ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８⁻；ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｉｎｔ１；ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｉｎｔ２；ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｈｉ）に選別し、これらのサブセットを、ＳＣＦ（３００ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ３Ｌ（３００ｎｇ／ｍＬ）、ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ６（６０ｎｇ／ｍＬ）およびｄｍＰＧＥ２（１０μＭ）を含有するＳｔｅｍ Ｓｐａｎ ＳＦＥＭ中で１６時間前刺激し、それらのサブセットに以下のＬＶ：＋／−：グリーンＦＰ．ＬＶ；＋／ｉｎｔ１：チェリーＦＰ．ＬＶ；＋／ｉｎｔ２：シアンＦＰ．ＬＶ；＋／ｈｉ：オレンジＦＰ．ＬＶで形質導入した。２４時間の形質導入後、細胞を８週齢の亜致死照射ＮＳＧマウスに次のように注射した：群１：１２９，０００＋／−細胞／マウス（ｎ＝６）；
群２：８６９，０００前駆細胞（＋／ｉｎｔ１細胞、＋／ｉｎｔ２細胞および＋／ｈｉ細胞を合わせたもの、各集団は前駆細胞混合物の３３％を占める）／マウス（ｎ＝７）；
群３：１２９，０００＋／−プール前駆細胞と８６９，０００プール前駆細胞の混合物／マウス（ｎ＝６）
生着（群１、２、３）およびキメラ性（群３）を末梢血において経時的にモニタリングした（図４（Ａ））。

ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｈｉ（＋／ｈｉ）細胞は、最も早い時点でＮＳＧマウスにおいてわずかな、しかし検出可能な生着能を示し、それらの増殖物はその後消失した。興味深いことに、ＭＰＢ由来のＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻（＋／−）集団は、移植後３週間でわずかな造血増殖物を示した。代わりに、この時点での短期生着はほとんどＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ細胞によって維持された（ｉｎｔ２＞ｉｎｔ１）。種々の画分の寄与は移植後９〜１５週間で変化した：群１および群３はこの時点で同等レベルのヒトＣＤ４５^＋細胞生着を示した。全幹細胞集団と前駆細胞集団の混合物を移植した群３では、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻（＋／−）集団はｈｕＣＤ４５^＋生着の＞７０〜８０％、ｈｕＣＤ１３^＋生着の＞９８％に寄与したが、＋／ｉｎｔ１がＢ細胞に寄与したのはおよそ２０〜１０％であった。＋／ｉｎｔ２細胞および＋／ｈｉ細胞は９および１５週の時点で造血に有意な寄与を示さなかった。

本発明者らは、ＭＰＢ由来のＣＤ３４^＋ＣＤ３８−（＋／−）細胞は、総てではないにしてもほとんどの場合、長期ＳＣＩＤ再定着能を含み、一方、短期再定着はＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^{ｉｎｔ２−ｈｉｇｈ}（第一波）およびＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｉｎｔ１細胞（第二波）によってもたらされると結論づける。これは、Ｇ−ＣＳＦ動員ＭＰＢ由来ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞（全ＣＤ３４^＋細胞の１０％）の遺伝子改変で、総てではないにしてもほとんどの場合、遺伝子改変細胞により長期生着を達成するには十分であるという原則の証明となる。形質導入培養物にＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｉｎｔ細胞を含むかどうかの選択は、形質導入された細胞による造血の引き継ぎが達成されるに必要な時間枠によって異なる。代わりに、ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^ｉｎｔ２細胞は短期生着をもたらし、遺伝子療法を受けている患者において前処置後に造血回復を増強して、感染性合併症および出血性合併症のリスクを軽減するための非培養、非遺伝子改変サポーター細胞として与えられるべき理想的集団に相当する。

図４（Ａ）に示される試験を長期間継続すると、さらなる洞察が得られる。図４（Ｂ）は、安定なＨＳＣ由来造血を測定する長期読み出しを提供する２４週間までの試験の継続を示す。さらに、本発明者らは、別の動員末梢血ドナーを用い、ＣＤ３８画分を標識するレンチウイルスベクターを入れ替えて反復実験を行った。

この長期分析から、長期生着の＞９５％が培養ＣＤ３４^＋動員末梢血ＨＳＰＣのＣＤ３８⁻画分（最低１２％のＣＤ３８発現細胞）に由来することが確認される。これらのデータはまた、異なるレベルのＣＤ３８発現によって定義される前駆細胞集団の生着動態を裏付け、ＣＤ３８^{ｉｎｔ／ｌｏ}（１２〜４０％ＣＤ３８パーセンタイル）細胞は３週間の時点で最も高い寄与を示し、４か月の時間窓にわたってゆっくり減衰し；ＣＤ３８^{＋／ｉｎｔ}（４１〜７０％ＣＤ３８パーセンタイル）細胞は３週間の時点で最も高い寄与を示し、２か月の時間窓にわって急速に減衰した。ＣＤ３８^ｈｉ（７１〜１００％ＣＤ３８パーセンタイル）細胞は、３週間の時点低い生着を示した。

これらのデータはここで、本発明者らに遺伝子改変細胞の持続性を調整することを可能とする：
・長期：遺伝病の治癒のためにＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞（０〜１０％パーセンタイル）；
・中期：３〜４か月の処置期間でＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／ｌｏ}細胞（１２〜４０％パーセンタイル）（例えば、抗癌タンパク質の微小環境標的化送達のため）；
・短期：１〜２か月の処置期間でＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{＋／ｉｎｔ}細胞（４１〜７０％パーセンタイル）（例えば、抗癌タンパク質の微小環境標的化送達のため）。

実施例４
プロスタグランジンＥ２は、ＮＳＧ再定着能を有するヒト造血幹細胞および前駆細胞への遺伝子導入を高める。
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の抗アポトーシス特性を利用する試みにおいて(Pelus LM et al. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2011;96:3-9)、本発明者らはストレス（冷凍／解凍サイクル、毒性ベクターでの形質導入、エレクトロポレーション）に曝されたＣＤ３４^＋ ＨＳＰＣを長時間作用するＰＧＥ２同族体１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２（ｄｍＰＧＥ２；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃａｔ １４７５０）で処理した。予期しないことに、本発明者らは、ｄｍＰＧＥ２処理後に臍帯血（図５（Ａ））および成体骨髄（図６）由来のＣＤ３４^＋またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ ＨＳＰＣへの遺伝子導入効率が１．５倍高まったことを見出した。このベクターコピー数（ＶＣＮ）の違いはＮＳＧマウスへの細胞の移植後４か月を超えて維持され、生着レベルはｄｍＰＧＥ２処理によって悪影響を受けなかった。

本発明者らは、Ｇ−ＣＳＦ動員ＣＤ３４^＋末梢血幹細胞もまた、ｄｍＰＧＥ２で前刺激した場合、レンチウイルスベクターにより効率的な形質導入を受けることを確認した（図５（Ｂ））。

加えて、本発明者らは、レンチウイルスベクターによるヒトＨＳＰＣの形質導入に対するｄｍＰＧＥ２刺激のタイミングの効果を検討した。効果はｄｍＰＧＥ２がＬＶ暴露の２時間前に添加された場合に最大となると思われる（図５（Ｃ））。

さらに、本発明者らは、さらなる実験で、ｅｘ ｖｉｖｏでのｄｍＰＧＥ２刺激により得られた高いベクターコピー数が異種移植後１８週間まで長期間維持されることを確認した（図５（Ｄ））。

要約すると、本発明者らは、本明細書に、始原的なＨＳＣ調製物ほど第３世代のレンチウイルスベクターであるＶＳＶｇ偽型により形質導入されやすく、その効果はｄｍＰＧＥ２による前刺激によってさらに増進され得ることを示す。本発明者らは、これらの改善をｅｘ ｖｉｖｏ操作に組み込む革新的ＨＳＣ遺伝子療法プロトコールを考案した。本発明者らは初めて、この新規プロトコールを臍帯血、骨髄および動員末梢血由来のヒトＨＳＣで試験し、最新のＮＳＧ異種移植モデルと急速短期再定着能を有する前駆細胞に由来する、分離した長期多系譜生着細胞（全ＣＤ３４^＋細胞の＜１０％）を用いてＣＤ３８発現の量的差異に基づく、免疫表現型的に定義されたＣＤ３４^＋動員末梢血集団の多系譜再構成動態のデコンボルーションを行った。このプロトコールは、改善されたｅｘ ｖｉｖｏ培養、非培養前駆細胞により持続される急速な造血回復および患者へのより低い組み込み用量の注射を介した質的により良い遺伝子改変ＨＳＣ画分を提供することによって安全性を改善する。このプロトコールはまた、ベクター用量の実質的低減を可能とすることによりＨＳＣ遺伝子療法の持続性も改善するであろう。

実施例５
臨床プロトコール（Biffi A et al. Science 2013;341:1233158から適合）：全骨髄を、内部ＳＯＰに従い、全身麻酔を用いて腸骨稜から無菌条件下で採取する。あるいは、白血球分離の６〜９時間前に単回用量のプレリキサフォルを用いまたは用いずに、−３日から出発して、５〜１０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦにより患者にＨＳＰＣ動員を施す。採取し、専用バッグに回収し、封止し、識別表示をした骨髄または動員末梢血を、次に、ＧＭＰ施設に移す。細胞精製は、ＧＭＰ条件で製造者の手順（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）に従い、免疫磁性ビーズを用いた陰性／陽性選択によって行う。次に、精製された細胞をレトロネクチンコーティングＶｕｅＬｉｆｅバッグ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ、ゲイザースバーグ、ＭＤ）内のＧＭＰグレードのサイトカイン（上記参照）を添加した無血清培地中で培養し、ＧＭＰグレードの精製ベクターに３０〜１００の多重感染度で１回または２回、４０〜６０時間の総培養時間で曝す。形質導入手順の終了時に、形質導入されたＣＤ３４^＋細胞を採取し、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗ培地で洗浄し、患者に注射するために生理食塩水中に２〜１０×１０^６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させる。形質導入の終了時に、上記のようにクローン形成アッセイ、フローサイトメトリーおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のために細胞の一画分を採取する。細胞は、品質管理試験（注射時に利用可能な生存力、免疫表現型、内毒素、ラージＴ Ａｇ ＤＮＡ、マイコプラズマに関する結果）に従い、バッチリリース(batch release)時に注射時まで４℃で維持する。

実施例６
培養／形質導入ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻幹細胞と非培養ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／＋}前駆細胞の共投与のモデル化
図７に示されるデータは、非培養ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／＋}動員末梢血前駆細胞（前駆細胞）と遺伝子改変ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ ＨＳＰＣ（幹細胞（ステム））の併用移植に関する。この実験は、非培養ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／＋}（１３〜１００％ＣＤ３８パーセンタイル）前駆細胞が長期持続し、培養／形質導入ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／＋}細胞よりも高い再定着能を有することを示す。

これは以下のことを意味する。
１．支持細胞集団として患者に与えられる新鮮な前駆細胞は、遺伝子療法患者において造血回復を加速化し、強化する可能性があり、従って、治療後の初期数ヶ月に感染性合併症および出血性合併症のリスクを実質的に軽減する。
２．遺伝子改変幹細胞と新鮮前駆細胞の比率（現行で１：８）は、効率的な長期遺伝子マーカーを改善するために幹細胞に有利になるように調整することができる（例えば、１：５）。
３．遺伝子改変ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞との競合を軽減するために、支持細胞集団からＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１集団の一部を除去することができる。
４．高機能の遺伝子改変ＨＳＣを得るためには短期の培養時間が重要である。遺伝子改変ＨＳＣの機能的特性を改善することで、１：５比と１：１０比の両方でｉｎ ｖｉｖｏのＣＤ３４＋およびＣＤ３３高細胞において類似の遺伝子マーカーにより示されるように、項目（２）および（３）に記載した介入の重要度が低くなる（図７Ｂ参照）。

実施例７
図５、７および９のデータは、培養時間が動員末梢血由来の幹細胞および前駆細胞の両方の機能的生着能に悪影響を及ぼすことを示す。培養時間を２４時間に短縮すると、培養の悪影響が軽減され、薬効のある遺伝子療法産物の質が改善され得る。ｄｍＰＧＥ２の使用により、短期２４時間のｅｘ ｖｉｖｏ操作プロトコールにおけるＨＳＣの効率的形質導入が可能となり（図５）、従って、今後の遺伝子療法研究において本プロトコールを実施するための強い根拠となる。これらのデータはまた、長期のｅｘ ｖｉｖｏ培養からのＣＤ３４^＋細胞は新鮮なＣＤ３４^＋細胞または短期間の培養のＣＤ３４^＋細胞とは機能的に等価ではないことから、幹細胞移植物の投与に使用される標準的尺度であるＣＤ３４細胞数の情報価値が減ることを意味する。実際に、本発明者らが４４時間培養よりも少ない２４時間培養からのＣＤ３４^＋細胞を注射したとしても、前記のプロトコールからより高レベルの長期生着が得られた。

実施例８
動員末梢血（Ｇ−ＣＳＦおよび／またはプレリキサフォルまたは新規の治験動員剤により動員）または骨髄由来のＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ ＨＳＰＣへの効率的遺伝子導入を得るために好ましい形質導入プロトコール
考察するプロトコールを図１０に示す。

参照プロトコール：２Ｈｉｔ標準−６６ｈ：ＣＤ３４^＋細胞の形質導入のための現行水準プロトコールである標準２ｈｉｔプロトコール（６６時間）(Biffi, A et al. (2013) Science 341: 1233158; Scaramuzza, S. et al. (2013) Mol. Ther. 21: 175-84)で形質導入したＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞。

本発明者らが試験した１Ｈｉｔ−４４ｈプロトコール（図７および９参照）は最適化には至っていないことが示され、さらなる追跡はされていない。

以下のプロトコールは参照より優れていると思われ、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞の遺伝子改変に好ましいプロトコールである：
プロトコールＡ：ＩＬ３不含培地での「シングルヒット」プロトコール（３８時間）を用いて形質導入されたＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞；
プロトコールＢ：ＬＶ暴露の１２０分前にｄｍＰＧＥ２暴露を行い、ＩＬ３不含培地での「シングルヒット」プロトコール（３８時間）を用いて形質導入されたＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞；
プロトコールＣ：ＩＬ３不含培地での短縮「シングルヒット」プロトコール（２４時間）を用いて形質導入されたＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞；
プロトコールＤ：ＬＶ暴露の１２０分前にｄｍＰＧＥ２暴露を行い、ＩＬ３不含培地での短縮「シングルヒット」プロトコール（２４時間）を用いて形質導入されたＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞。

ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞は、企図される技術選択肢の１つ（例えば、マイクロチップに基づく選別またはビーズに基づく一連の選択）に従って動員末梢血または骨髄から精製し、培養／形質導入培地に約１０^６細胞／ｍｌの密度で播種する。臨床グレードのＬＶ（適用に応じて１０^７〜１０^８ＴＵ／ｍＬ）をスキームに示された時点で添加する。プロトコールＢおよびＤでは、スキームに示されたようにｄｍＰＧＥ２をＬＶ暴露の１２０分前に培養物に加える。培養の想定終了時に（実験スキーム参照）、細胞を洗浄し、低温保存または直接患者投与（医薬品）のために調製する。

ＭＰＢ ＣＤ３４^＋細胞形質導入中の環境条件
インキュベーター
培養は細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）で維持する。

培養ディッシュ
レトロネクチンコーティングプレートまたはバッグ
前刺激／形質導入培地
参照プロトコール：ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＳＣＦ ３００ｎｇ／ｍｌ、ＦＬＴ３Ｌ（３００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ３（６０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、使用前に濾過除菌した（０．２２μｍ）ＣｅｌｌＧｒｏ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）。

プロトコールＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ：ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＳＣＦ ３００ｎｇ／ｍｌ、ＦＬＴ３Ｌ（３００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、使用前に濾過除菌した（０．２２μｍ）ＣｅｌｌＧｒｏ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）培地（または造血幹細胞の培養に好適な他の臨床グレード培地）。プロトコールに示したようにｄｍＰＧＥ２（１０μＭ）をいくつかの群に添加する。

好ましくは、好適な患者前処置の後に医薬品を骨内注入する。場合により、好適な用量の支持細胞（好適な用量の定義：非骨髄破壊的前処理の場合にはゼロ；骨髄破壊的前処置の場合には、ＣＤ３８^＋調製物由来のＣＤ３４^＋細胞の数がＣＤ３８⁻調製物中に含まれるＣＤ３４^＋細胞の数の５倍〜１０倍、最小絶対数は２５０万〜３００万／ｋｇ患者体重）を医薬品の注射の好ましくは１〜２日後に静脈投与することができる。あるいは、医薬品は好ましくは支持細胞との共投与として静脈投与することもできる。

上記の明細書に挙げられている総ての刊行物は引用することにより本明細書の一部とされる。記載される本発明の方法および系の種々の改変および変形が本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者には自明である。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求される本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないと理解すべきである。実際に、記載されている本発明を実施するための様式に関する、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連の分野の熟練者に自明の種々の改変は、以下の特許請求の範囲内にあるものとされる。

Claims (47)

1. 造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団から臨床使用のための治療用細胞集団を調製する方法であって、前記出発細胞集団からＣＤ３８を実質的に発現しないがＣＤ３４を発現する細胞の集団を分離すること、および分離した細胞集団にベクターで形質導入して治療用細胞集団を得ることを含んでなる、方法。
2. ａ．造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団からＣＤ３８発現細胞を分離する工程、
   ｂ．ＣＤ３８を発現しない工程（ａ）で得られた細胞集団からＣＤ３４発現細胞を分離する工程、
   ｃ．工程（ｂ）で得られたＣＤ３４発現細胞集団にベクターで形質導入して治療用細胞集団を得る工程
   を含んでなる、請求項１に記載の方法。
3. ａ．造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団をＣＤ３８に対して反応性のある薬剤と接触させる工程、
   ｂ．ＣＤ３８反応性細胞をＣＤ３８非反応性細胞から分離する工程、
   ｃ．工程（ｂ）で得られたＣＤ３８非反応性細胞をＣＤ３４に対して反応性のある薬剤と接触させる工程、
   ｄ．ＣＤ３４反応性細胞をＣＤ３４非反応性細胞から分離する工程、ここで、ＣＤ３４反応性細胞は形質導入細胞集団を形成する、
   ｅ．前記形質導入細胞集団にベクターで形質導入して治療用細胞集団を得る工程
   を含んでなる、請求項１に記載の方法。
4. 治療用細胞集団がＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻表現型を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 造血幹細胞を含んでなる出発細胞集団が動員末梢血、骨髄または臍帯血から得られる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. ＣＤ３８またはＣＤ３４に対して反応性のある薬剤がそれぞれ抗ＣＤ３８抗体または抗ＣＤ３４抗体である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 抗ＣＤ３８抗体および／または抗ＣＤ３４抗体が磁性ビーズまたは検出可能なマーカーにコンジュゲートされている、請求項６に記載の方法。
8. ＣＤ３８発現細胞および／またはＣＤ３４発現細胞が磁性ビーズに基づく分離またはフローサイトメトリーを用いて分離される、請求項２または４〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. ＣＤ３８反応性細胞および／またはＣＤ３４反応性細胞が磁性ビーズに基づく分離またはフローサイトメトリーを用いて分離される、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ウイルスベクターが対象とするヌクレオチドを含んでなる、請求項１０に記載の方法。
13. 細胞集団にベクターで形質導入する工程が約４４時間未満細胞を培養することを含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 分離したＣＤ３８発現細胞またはその一部を保持して支持細胞集団とする、請求項２、４〜８または１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 分離したＣＤ３８反応性細胞またはその一部を保持して支持細胞集団とする、請求項３〜７または９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記支持細胞集団がＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋表現型を有する、請求項１４または１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法に従って調製された治療用細胞集団。
18. 請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法によって調製された支持細胞集団。
19. 請求項１７に記載の治療用細胞集団を含んでなる医薬組成物。
20. 請求項１８に記載の支持細胞集団を含んでなる医薬組成物。
21. 医薬において使用するための請求項１７に記載の治療用細胞集団。
22. 治療用細胞集団が請求項１８に記載の支持細胞集団と組み合わせて投与される、医薬において使用するための請求項１７に記載の治療用細胞集団。
23. 支持細胞集団が請求項１７に記載の治療用細胞集団と組み合わせて投与される、医薬において使用するための請求項１８に記載の支持細胞集団。
24. 治療用細胞集団が自己幹細胞移植法または同種幹細胞移植法の一部として投与される、請求項２１または２２に記載の使用のための治療用細胞集団。
25. 支持細胞集団が自己幹細胞移植法または同種幹細胞移植法の一部として投与される、請求項２３に記載の使用のための支持細胞集団。
26. 治療用細胞集団が支持細胞集団の投与の前に対象に投与される、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の使用のための治療用細胞集団または支持細胞集団。
27. 治療用細胞集団が支持細胞集団の投与と同期または同時に対象に投与される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の使用のための治療用細胞集団または支持細胞集団。
28. 請求項１７および１８に記載の治療用細胞集団および支持細胞集団を含んでなるキット。
29. 請求項１７に記載の治療用細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる治療方法。
30. 請求項１７に記載の治療用細胞集団と請求項１８に記載の支持細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる治療方法。
31. 治療用細胞集団が支持細胞集団の投与の前に対象に投与される、請求項３０に記載の方法。
32. 治療用細胞集団が支持細胞集団の投与と同期または同時に対象に投与される、請求項３０に記載の方法。
33. 対象とするヌクレオチドで形質導入されている、遺伝子療法において使用するための造血前駆細胞集団。
34. 造血幹細胞および前駆細胞を含んでなる細胞集団から分離された後に対象とするヌクレオチドで形質導入された、遺伝子療法において使用するための造血前駆細胞集団。
35. ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ表現型を有する、請求項３３または３４に記載の使用のための造血前駆細胞集団。
36. ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋表現型を有する、請求項３３または３４に記載の使用のための造血前駆細胞集団。
37. 形質導入前駆細胞集団が造血幹細胞集団と組み合わせて投与される、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の使用のための造血前駆細胞集団。
38. 造血前駆細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含んでなり、前記造血前駆細胞集団に対象とするヌクレオチドで形質導入されている、遺伝子療法の方法。
39. 造血前駆細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含んでなり、前記細胞は造血幹細胞および前駆細胞を含んでなる細胞集団から分離された後に対象に投与する前に対象とするヌクレオチドで形質導入されたものである、遺伝子療法の方法。
40. 造血前駆細胞集団がＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ表現型を有する、請求項３８または３９に記載の方法。
41. 造血前駆細胞集団がＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ１、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｉｎｔ２および／またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋表現型を有する、請求項３８または３９に記載の方法。
42. 形質導入前駆細胞集団が造血幹細胞集団と組み合わせて投与される、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 患者において導入遺伝子発現の持続時間を制御する方法であって、導入遺伝子発現の持続時間が形質導入造血幹細胞および／または前駆細胞をＣＤ３８発現レベルに基づいて選択的に投与することにより制御される、方法。
44. 導入遺伝子発現の持続時間の延長が低レベルのＣＤ３８発現を有する細胞を投与することにより達成される、請求項４３に記載の方法。
45. 造血幹細胞または前駆細胞にベクターで形質導入する際の遺伝子導入効率を高めるためのプロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＥ２誘導体の使用。
46. プロスタグランジンＥ２誘導体が１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２である、請求項４５に記載の使用。
47. 造血幹細胞の形質導入が請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法の一部として実施される、請求項４５または４６に記載の使用。

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