CZ297278B6

CZ297278B6 - Deriváty hydroxamové a karboxylové kyseliny a jejich pouzití

Info

Publication number: CZ297278B6
Application number: CZ0036899A
Authority: CZ
Inventors: Alan Owen@David; Gary Montana@John; Fraser Keily@John; John Watson@Robert; Douglas Baxter@Andrew
Original assignee: Darwin Discovery Limited
Priority date: 1996-08-07
Filing date: 1997-08-07
Publication date: 2006-10-11
Also published as: ES2217425T3; NO314452B1; WO1998005635A1; DE69729007T2; AU3856497A; CZ36899A3; CN1227540A; DK0968182T3; PL193829B1; EP0968182B1; PT968182E; ATE266000T1; NO990543L; PL331598A1; DE69729007D1; AU730464B2; US6118001A; KR20000029858A; BR9711027A; EP0968182A1

Abstract

Deriváty hydroxamové a karboxylové kyseliny obecného vzorce I, a jejich pouzití pro výrobu farmaceutického prípravku obsahující tyto deriváty spolu sfarmaceuticky prijatelným roztokem nebo nosicem pro lécbu nebo prevenci stavu souvisejících s matrixovými metaloproteinázami nebo zpusobených TNF-.alfa. ci enzymy úcastnícími se odvrhování L-selektinu, TNF receptoru nebo IL-6 receptoru.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká derivátů hydroxamové a karboxylové kyseliny a jejich použití v medicíně.

Dosavadní stav techniky

Metaloproteinázy, včetně matrixových metaloproteináz (MMP), (lidské fibroblastové) kolagenázy, gelatinázy a konvertázy TNF (TÁCE), a způsoby jejich účinku, a také jejich inhibitory a jejich klinické účinky, jsou pospány ve WO-A-96/11209, WO-A-97/12902 a WO-A-97/19075, jejichž obsahy jsou uvedeny zde v referencích. Inhibitory MMP jsou užitečné při inhibici ostatních savčích metaloproteináz jako je skupina adamalyzinů (neboli ADAMs), mezi jejíž členy patří konvertáza TNF (TÁCE) a ADAM-10, které vyvolávají uvolnění TNF-α z buněk, a další, které jsou tvořeny buňkami lidské chrupavky a uplatňují se také v destrukci myelinového bazického proteinu (MBP), což je fenomén spojený s roztroušenou sklerózou.

Ukázalo se, že látky, které mají vlastnost inhibovat působení metaloproteináz účastnících se destrukce konvektivní tkáně, jako je kolagenáza, stromelyzin a gelatináza, zabraňují uvolňování TNF jak in vitro, tak in vivo. Viz Gearing et al. (1994), Nátuře 370: 555-557, McGeehan et al (1994), Nátuře 370: 558-561, GB-A-2 268 934 a WO-A-93/20047. Všechny tyto uváděné inhibitory mají zinek-vázající skupinu hydroxamové kyseliny podobně jako imidazolemsubstituované látky uvedené ve WO-A-95/23790. Další látky, které inhibují MMP a/nebo TNF, jsou popsány ve WO-A-95/13289, WO-A-96/11209, WO-A-96/035687, WO-A-96/035711, WOA-96/035712 a WO-A-96/035714.

WO-A-9718888 popisuje inhibitory MMP vzorce

Ph'-Ph²-X-(CH₂)₀₆-(CZ)oi-CO-NHOH kde Ph¹ a Ph² jsou každý popřípadě substituovaný fenyl, X chybí nebo jde o O, NH či S, Z znamená -CONR²R³, a R¹ je H, alkyl, alkenyl, OH popřípadě substituovaný fenylalkyl nebo fenyl-SO() ₂-alkyl nebo alkyl-COOR⁷.

EP-A-0780386 uvádí látky, které mají inhibiční aktivitu na MMP a TNF, se vzorcem

Y-CO-CR¹ R²-CR³R⁴-S(O)_nR⁵ kde n je 0, 1 nebo 2; Y je OH nebo NHOH; R¹ je H nebo nižší alkyl; R² je H, nižší alkyl, heteroalkyl, aryl, aralkyl, arylheteroalkyl, cykloalkyl, heteroaryl, heteroalkyl, heteroarylheteroalkyl, heterocyklo-, heterocyklo-nižší alkyl, heterocyklo-nižší heteroaryl nebo NR R ; R je H, nižší alkyl, cykloalkyl, cykloalkylalkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl, heteroaralkyl, heteroalkyl nebo nižší alkoxy; R⁴ je H, nižší alkyl, cykloalkyl nebo cykloalkylalkyl; R⁵ je nižší alkyl, cykloalkyl, cykloalkylalkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl nebo heteroaralkyl.

Látky EP-A-0 780 386 prvně popisované v US přihlášce 8939, podané 20. prosince 1995, jsou stejného vzorce, kde R¹ je H; R² je H, nižší alkyl, aralkyl, cykloalkyl, nebo cykloalkylalkyl; R⁵ je nižší alkyl, cykloalkyl, cykloalkylalkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl nebo heteroaralkyl.

US 4 325 964 odhaluje, že určité benzhydrylové sulfinylové hydroxamáty způsobují neuropsychické zdravotní potíže.

-1 CZ 297278 B6

Zayed et al, Zeitschrift fur Naturforschung (1966) 180-182, odhaluje, že N-hydroxamid kyseliny 3-fenylsulfony (propanové je fungicid.

Podstata vynálezu

Vynález obsahuje nové látky obecného vzorce I, jež jsou užitečnými inhibitory matrixových metaloproteináz a/nebo chorob způsobených TNF-α včetně degenerativních chorob a určitých typů rakoviny.

V souladu s vynálezem jsou nové látky obecného typu reprezentovaného vzorcem I:

B-X-(CH₂)_n-CHR'-(CH₂)_m-CONHOH (I), kde m je 0 a n je 1 nebo m a 1 a n je 0;

X je O nebo S(O)₀.₂;

R¹ je H nebo skupina popřípadě substituovaná skupinou R⁹ a je vybraná ze skupiny zahrnující Ci_6 alkyl, C_2ň alkenyl, aiyl, arylC|_₆ alkyl, heteroaryl, heteroaryl C_t_6 alkyl, heterocykloalkyl, heterocykloalkyl, Ci_6 alkyl, cykloalkyl a cykloalkyl C|_6 alkyl,

R² je H nebo C₁₆ alkyl;

B je cykloalkenyl, heterocykloalkenyl, heterocykloalkyl nebo heterocykloalkyl Ci_6 alkyl, jejíž jakékoliv skupiny jsou popřípadě substituovány substituentem vybraným z R⁵, R⁵ Cj alkylu, R⁵ C2_6 alkenylu, arylu (popřípadě substituovaného R ), R Ci_6 alkylarylu, aryl Cj.q alkylu (popřípadě substituovaného R⁵), heteroaryl Ci_ó alkylu (popřípadě substituovaného R⁵), R⁷ C2^ alkenyl-arylu heteroarylu (popřípadě substituovaného R⁵), R⁵ C| 6 alkylheteroarylu, cykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵, benzo-fúzovaného cykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵), heterocykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵), benzo-fúzovaného heterocykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵) a skupin

a předpokladu, že B není benzhydryl, pokud X je SO a R¹ je H;

R⁵ je C^ alkyl R⁷ C2_6 alkenyl, atom halogenu, CN, NO2, N(R⁶)2, OR⁶, COR⁶, CO2R², CON(R⁶)2, NR⁶R⁷, S(0)o_2R⁸ nebo SO2N(R⁶)₂;

R⁶ je H nebo skupina vybraná ze skupiny Ci_6 alkyl, aryl, aryl C| 6 alkyl, heteroaryl, heteroaryl Ci_6 alkyl, cykloalkyl, cykloalkyl Ci_6 alkyl, heterocykloalkyl a heterocykloalkyl C^ alkyl, kde je uvedená skupina popřípadě substituována R⁸, COR⁸, SO0_₂R⁸, CO2R⁸, OR⁸, CONR²R⁸, NR²R⁸, atomem halogenu, CN, SO2NR²R⁸ nebo NO2 a pro každý případ N(R⁶)2 jsou skupiny R⁶ stejné nebo rozdílné nebo N(R⁶)2 je heterocykloalkyl, popřípadě substituovaný R⁸, COR⁸, SO0 2R⁸, CO2R⁸, OR⁸, CONR², NR²R⁸, atomem halogenu, CN, SO2NR²R⁸nebo NO₂;

-2CZ 297278 B6

R⁷ je COR⁶, NOC(R⁶)2, CO2R⁸ nebo SO2R⁸;

R⁸ je C|_6 alkyl, aryl, aryl Cj_6 alkyl, heteroaryl nebo heteroaryl Cj_6 alkyl; a

R⁹ je OR⁶, COR⁶, CO2R², NR²R⁷, S(O)0 2R⁸, SO2N(R⁶)2, ftalimidová, sukcinimidová skupina nebo skupina

a jejich soli, soldáty, hydráty, chráněné aminoderiváty a chráněné karboxyderiváty.

Kombinace substituentů a/nebo proměnných jsou povoleny pouze tehdy, je-li výsledkem takové kombinace stabilní látka.

Výhodné látky vynálezu jsou ty, pro které platí jedna nebo více následujících:

X je S, SO nebo SO₂;

R¹ je H nebo skupina popřípadě substituovaná skupinou R⁹ a je vybraná ze skupiny zahrnující C| « alkyl, C_{2 6} alkenyl, aryl C|_6 alkyl, heteroaryl C|_6 alkyl, heterocykloalkyl C| ₆ alkyl a cykloalkyl Ci_6 alkyl,

B je cykloalkenyl nebo heterocykloakenyl, jejichž jakékoliv skupiny jsou popřípadě substituovány substituentem vybraným z R⁵, R⁵ C| __ň alkylu, arylu (popřípadě substituovaného R⁵), R⁵Cj.6 alkylarylu, aryl C|_6 alkylu (popřípadě substituovaného R⁵), heteroaryl Ci_6 alkylu (popřípadě substituovaného R⁵), heteroarylu (popřípadě substituovaného R⁵), R⁵ alkylheteroarylu, cykloakylu (popřípadě substituovaného R⁵), benzo-fúzovaného cykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵), heterocykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵), benzofúzovaného heterocykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵) a skupin

R⁵ je, halogen, CN, NO2, N(R⁶)2, OR⁶, COR⁶, CON(R⁶)2, NR⁶R⁷ nebo S(O)0_₂-R⁸;

R⁷ je COR⁶; a

R⁹ je OR⁶, CO?R², ftalimidová, sukcinimidová skupina nebo skupina

O

Obzvláště preferovány jsou látky z příkladů.

Je třeba si uvědomit, že látky podle vynálezu obsahují jeden nebo více asymetricky substituovaných atomů uhlíku. Přítomnost jednoho nebo více těchto asymetrických center v látce podle vzorce I dá vznik stereoizomerům, a v každém případě vynálezu má být porozuměno tak, že je rozšířen o všechny takové stereoizomery, věetně enantiomerů a diastereomerů a směsí včetně jejich racemických směsí.

Jak je používáno v popisu tohoto vynálezu, samostatně nebo v kombinaci, termín „alkylová skupina Ct-ó“ se týká přímého nebo větveného řetězce alkylové skupiny, která má jeden až šest uhlíkových atomů, což zahrnuje například methyl, ethyl, propyl, izopropyl, butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl apod.

Termín „alkenylová skupina C₂_6“ se týká přímého nebo větveného řetězce alkylové skupiny, která má dva až šest atomů uhlíku a nevíc jednu dvojnou vazbu buď E, nebo Z stereochemie, pokud je to aplikovatelné. Tento termín by zahrnoval například vinyl, 1-propenyl, 1- a 2-butenyl, 2-methyl-2-propenyl atd.

Termín „cykloalkylová skupina“ se týká saturované alicyklické skupiny, která má tři až šest atomů uhlíku a zahrnuje například cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl a podobně. „Benzofúzovaný cykloalkyl“ zahrnuje indanyl a tetrahydronaftyl.

Termín „heterocykloalkyl“ se týká saturované heterocyklické skupiny, která má od tří do šesti uhlíkových atomů a jeden nebo více heteroatomů ze skupiny N, O, S a zahrnuje například azetinidyl, pyrolidinyl, tetrahydrofuiyl, piperidyl a podobně. „Benzofúzovaný heterocykloalky“ zahrnuje například indolinyl a tetrahydrochinolyl.

Termín „cykloalkenyl“ se týká alicyklické skupiny, která má tři až šest uhlíkových atomů a navíc jednu dvojnou vazbu. Tento termín by zahrnoval například cyklopentenyl nebo cyklohexenyl.

Termín „heterocykloalkenyl“ se týká alicyklické skupiny, která má od tří do šesti uhlíkových atomů a jeden nebo více heteroatomů ze skupiny N, O,S, a které má ještě navíc jednu dvojnou vazbu. Tento termín zahrnuje například dihydropyranyl.

Termín „aryl“ znamená popřípadě substituovanou fenylovou nebo naftylovou skupinu substituentem vybraným například ze skupin halogen, trifluormethyl, alkyl Cj ₆, alkoxy skupina, fenyl a podobně.

Termín „heteroaryl“ se týká aromatické prstencové soustavy tvořené pěti až deseti atomu, z nichž alespoň jeden je vybrán ze skupiny O, N a S, a zahrnuje například furanyl, thiofenyl, pyridyl, indoly, chinolyl a podobně.

-4CZ 297278 B6

Termín „alkoxy skupina“ se týká přímého nebo větveného řetězce alkoxy skupiny obsahující maximálně šest uhlíkových atomů, jako je metoxy, etoxy, propoxy, izopropoxy, butoxy, tercbutoxy skupiny a podobně.

Termín „halogen“ znamená fluor, chlor, brom a jod.

Termíny „chráněná amino“ nebo „chráněná karboxy“ skupina znamenají amino nebo karboxy skupinu, která je chráněna způsobem důvěrně známým těm, kteří jsou odborníky v oboru. Například, aminoskupinu chrání benzyloxykarbonyl, terc-butoxykarbonyl, acetyl nebo podobné skupiny, nebo je ve formě skupiny ftalimidové nebo podobných skupin. Karboxylová skupina je chráněna ve formě snadno štěpitelného esteru jako je ester methylu, ethylu, butylu nebo tert-butylu.

Soli látky podle vzorce I zahrnují farmaceuticky přijatelné soli, například kyselinami přidávané soli odvozené od anorganických nebo organických kyselin, jako jsou hydrochloridy, hydrobromidy, p-tokluensulfonáty, fosfáty, sulfáty, perchloráty, acetáty, trifluoracetáty, propionáty, citráty, malonáty, sukcináty, laktáty, oxaláty, tartáty a benzoáty.

Soli jsou také tvořeny při reakci se zásadami. Takové soli zahrnují soli odvozené od anorganických nebo organických zásad, například alkalické soli kovů jako jsou magnesiové či kalciové soli, a organické aminové soli jako jsou morfolinové, piperidinové, dimethylaminové nebo diethylaminové soli.

Pokud je „chráněná karboxy“ skupina v látce podle vynálezu esterifikovaná karboxy skupina, jedná se o metabolicky labilní ester podle vzorce CO2R¹⁰, kde R¹⁰ znamená ethyl, benzyl, fenethyl, fenylpropyl, a- nebo β-naftyl, 2,4-dimethylfenyl, 4-tert-butylfenyl, 2,2,2-trifluorethyl, 1(benzyloxy)benzyl, l-(benzyloxy)ethyl, 2-naftyl-l~propionyloxypropyl, 2,4,6-trimethylbenzyloxymethyl nebo pivaloymethylová skupina.

Látky podle obecného vzorce I jsou připravovány jakýmkoliv vhodnými metodami, které jsou známy v oboru a/nebo následujícími způsoby.

Je třeba si uvědomit, že pokud je vyžadován určitý stereoizomer podle vzorce I, bude zde popisovaný syntetický proces použit s příslušným hemochirálním počátečním materiálem a/nebo budou izomery získány ze směsí využitím konvenčních separačních technik (například HPLC).

Látky podle vynálezu budou připraveny následujícími pochody. V popisu a vzorcích uvedených níže jsou skupiny R¹, R², R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰, Β, X a Y definovány stejně, jak bylo uvedeno výše s výjimkou toho, kdy je uvedeno jinak. Je třeba si uvědomit, že funkční skupiny jako jsou amino skupina, hydroxylová či karboxylová skupina, které se vyskytují v různých látkách popisovaných níže a které mají být zachovány, je nutné mít v chráněné podobě ještě před tím, než začne jakákoliv reakce. V takových případech bude odstranění chránící skupiny poslední krok v příslušné reakci. Vhodné chránící skupiny pro takovou funkčnost jsou zřejmé odborníkům Pro specifické detaily viz Green a spol, „Protective Groups in Organic Synthesis“, Wiley Interscience.

Proces přípravy látek podle obecného vzorce l zahrnuje alkylaci sloučeniny obecného vzorce II

B-XH (II), kde B a Y jsou již dříve definovány, s alkylačním látkou podle vzorce III

Z-ýCHijn-CHR^CHijm-COY (III)

-5CZ 297278 B6 nebo (je-li m = 0) akrylátem podle vzorce IV

CH₂=CR'-COY (IV), kde R¹ je jak již dříve definován, Y je skupina OR² nebo NHOH a Z představuje odstupující skupinu (například halogen jako je brom nebo alkylsulfonátový ester jako je metansulfonát).

Alkylační činidlo vzorce III je získáváno v chirální nebo racemické formě. Mnohé z těchto derivátů se snadno získávají z komerčně dostupných počátečních materiálů při využití metod známých odborníkům (viz WO-A-90/05719).

Akryláty podle vzorce IV se připravují Mannichovou reakcí (tzn. s paraformaldehydem apiperidinem ve vhodném organickém rozpouštědle jako je 1,4—dioxan) s dikarboxylovou kyselinou podle obecného vzorce V

HO₂C-CHR'-CO₂H (V).

Tato reakce zahrnuje eliminační dekarboxylační krok, jehož výsledkem je přímý vznik nesaturované α,β-karboxylové kyseliny (tzn. kde Y je OH). Tato karboxylová kyselina je přeměněna standardními chemickými postupy, které jsou známy odborníkům na ester (Y je OR²) nebo hydroxamidy (NHOR¹¹), kde R¹¹ je vhodná chránící skupina jako je benzyl, tórc-butyl nebo /erc-butyldimethylsilyl (TBDMS).

Dikarboxyiové kyseliny podle vzorce V jsou připraveny například alkylací diethyl malonátu alkylační látkou podle vzorce IV

R'-Z (VI), kde Z již bylo dříve definováno, při následné hydrolýze v zásaditém prostředí.

Látky podle vzorce II, ve kterém B zahrnuje aryl, heteroaryl, funkční nebo jinou skupinu jako substituent střední části téže látky (B'), jsou připraveny paladiem katalyzovanou vazbou arylu, heteroarylu, funkční či jiné skupiny s látkou podle obecného vzorce VII

A-B'-XR¹² (VII), kde R¹² je vhodná chránící skupina jako je methyl, tert-butyl, benzyl nebo trityl, a kde A je halogenid jako jodid, bromid nebo v některých případech chlorid. Po tom následuje odstranění všech chránících skupin.

Mnoho takových reakcí katalyzovaných paladiem je známých odborníkům, a poskytuje látky podle vzorce II, nesoucí substituenty popisované R⁵ jako jsou COR⁶, CO2R² nebo CON(R⁶)2 stejně jako arylová, heteroarylová, alkenylová nebo alkylová skupina popřípadě substituované R⁵. Viz například Syn. Comm. (1981) 11:513; Tet. Lett (1987) 28:5093; a J. Org. Chem. (1994) 59:6502. Jiné skupiny popisované u B a/nebo R⁵ jsou připojeny standardními chemickými přeměnami známými odborníkům.

Mnoho látek podle obecných vzorců Π, VI a Vlije komerčně dostupných a jsou připraveny standardními aromatickými, heteroaromatickými nebo jinými chemickými reakcemi známými odborníkům z komerčně dostupných materiálů.

-6CZ 297278 B6

Je-li to nezbytné, meziprodukty podle obecného vzorce Vlil a IX

jsou připraveny Friedel-Craftsovou acy laď jednoduchého aromatického systému podle vzorce X

Ph-XH (X) s ftaleinanhydridem nebo maleinanhydridem, následované působením hydrazinu podle obecného vzorce XI

H₂N-NHR² (XI).

Látky podle vzorce I jsou připraveny také interkonverzí jiných látek podle vzorce 1. Tak například látka podle vzorce I, kde R¹ je alkylová C|. 6 skupina je připravena hydrogenací (při použití paladia na uhlíku ve vhodném rozpouštědle jako je alkohol, tzn. etanol) látky podle vzorce I, kde R¹ je alkenylová C2 6 skupina. Dále látka podle vzorce I, kde X je S(O)i_₂ je připravena oxidací látky podle vzorce I, kde X je S.

Karboxylové kyseliny (Y je OH) jsou přeměněny na estery (Y je OR²) nebo hydroxamové kyseliny (Y = NHOH) použitím metod známých odborníkům.

Jakákoliv získaná směs konečných produktů nebo jejich meziproduktů může být separována na základě fyzikálně-chemických rozdílů základních složek známým způsobem na čisté konečné produkty nebo meziprodukty, například chromatografií, destilací, částečnou krystalizací nebo tvorbou solí, jako je vhodné nebo možné za daných podmínek.

Látky podle vynálezu vykazují in vitro inhibiční aktivitu pokud jde o stromelysiny, kolagenázy a gelatinázy. Látky podle vynálezu vykazují také in vitro inhibiční aktivitu pokud jde o uvolnění TNF, odvrhování receptoru pro TNF, odvrhování receptoru pro IL-6 a odvrhování L-selektinu.

kDa receptor pro TNF (TNFRgo) je proteolyticky štěpitelný na buněčném povrchu (odvrhnutí), čímž je uvolněn rozpustný ligand-vázající fragment receptoru. Zájem vzbudilo, když se ukázalo, že ke zpracování TNFa a odvržení TNFR₈₀ dochází současné u aktivovaných T buněk, což vyvolalo spekulace o tom, že se toho účastní běžná proteáza. Crowe a spol. J. Exp. Med., (1995), 181:1205, ukázali, že syntetický inhibitor zpracování TNF také blokuje odvržení TNFR₈₀, což předpokládá, že tyto procesy jsou během aktivace T buněk koordinovaně regulovány. Zejména se ukázalo, že místo(Ala-Val), kde proteáza štěpí pro-TNF, je přítomno také v extracelulámí doméně TNFR₈₀ (Ala^2l3-Val²¹⁴) na místě shodném s pozorovanou molekulovou váhou odvrženého fragmentu receptoru. Tak tedy inhibitory metaloproteináz nabízejí ochranu před škodlivým systemickým působením TNFa současně na dvou úrovních, za prvé tím že zabrání uvolnění rozpustného TNFa a za druhé blokádou nahromadění se odvržených TNFR₈₀.

Synergicky sTNF inhibitory metaloproteináz blokují uvolnění APO-l/Fas (CD95) ligandu (APO-1L), který u senzitivních cílových buněk indukuje apoptózu. Odvržení APO-l/Fas (CD95), transmembránového glykoproteinu typu I patřícího do podrodu odvozeného od receptorů pro nervový růstový faktor/FNT, je také blokováno známými inhibitory metaloproteináz, a ne obecnými inhibitory serinových/cystěnových proteináz; viz Mariani a spol Eur. J. Immunol, (1995) 25:2303. Ukázalo se, že několik dalších důležitých receptorů exprimovaných na aktivovaných T a B buňkách je také odvrhováno z buněčného povrchu působením metaloproteináz. Tyto enzymy, souhrnně označované jako odvrhovací enzymy, představují nový cíl pro inhibitory metaloproteináz, včetně látek tohoto vynálezu.

Aktivita a selektivita látek může být determinována použitím vhodných enzymových inhibičních testů, například v Případech A-M uvedených níže. Určité látky tohoto vynálezu mají selektivní inhibiční aktivitu, obzvláště pak silně inhibují MMP bez inhibičního účinku na uvolnění TNF a s tím souvisejících aktivit, jak bylo definováno výše. To může mít zvláštní význam tam, kde jsou tyto aktivity zodpovědné za snížení nepříznivých účinků.

Tento vynález souvisí také s metodami léčby pacientů (včetně člověka a/nebo savců chovaných pro mléko, maso nebo průmysl či jako domácí zvířata), trpících potížemi nebo nemocemi, které jsou připisovány stromelyzinu, jak bylo již dříve popsáno, a ještě specifičtěji s metodami léčby, které zahrnují podání inhibitorů matrixových metaloproteináz podle vzorce I jako účinné složky.

Podobně, látky podle vzorce I jsou používány spolu s jinými způsoby k léčbě osteoartritidy a revmatoidní artritidy a u chorob a indikací, které jsou způsobeny nadměrnou expresí těchto matrixových metalproteináz, jak se objevuje u některých metastatických nádorových linií.

Jak bylo zmiňováno výše, látky podle vzorce I jsou užitečné v humánní nebo veterinární medicíně, protože jsou účinné jako inhibitory TNF a MMP. Podobně se, ale v jiném ohledu, týká tento vynález:

metod kontroly (čímž je míněna léčba nebo prevence) chorob nebo stavů vyvolaných u savců působením TNF a/nebo MMP, obzvláště u lidí, kdy metoda v sobě zahrnuje podávání efektivní dávky výše uvedené látky podle vzorce I savcům, nebo farmaceuticky akceptovatelnou sůl této látky;

látky podle vzorce I pro použití v humánní nebo veterinární medicíně, obzvláště při kontrole (čímž je míněna léčba nebo prevence) chorob nebo stavů vyvolaných působením TNF a/nebo MMP; a použití látek podle vzorce 1 při přípravě léčiv pro kontrolu (čímž je míněna léčba nebo prevence) chorob nebo stavů vyvolaných působením TNF a/nebo MMP.

Choroby nebo stavy zmiňované výše zahrnují zánětlivé choroby, autoimunitní choroby, nádorová onemocnění, kardiovaskulární choroby, choroby zahrnující destrukci tkáně, jako jsou revmatoidní artritida, osteartritida, osteoporóza, neurodegenerace, Alzheimerova choroba, mrtvice, vaskulitida, Crohnova choroba, ulcerativní kolitida, roztroušená skleróza, peroidontitida, zánět dásní, a ty choroby týkající se destrukce tkáně, jako je resorpce tkáně, hemoragie, koagulace, odpověď akutní fáze, kachexie a anorexie, akutní infekce, HIV infekce, horečka, šokové stavy, reakce štěpu proti hostiteli, dermatologické stavy, hojení ran po chirurgickém zákroku, psoriáza, atopická dermatitida, epidermolytická bulóza, nádorový růst, angeiogeneze a invazivita sekundárních metastáz, ofitalmologické choroby, retinopatie, komeální ulcerace, reperfúzní zranění, migréna, meningitida, astma, rinitida, alergická konjuktivitida, ekzémy, anafylaxe, restenóza, městnavé srdeční selhání, endometrióza, ateroskleóza, endoskleróza a na aspirinu-nezávislá antitrombóza.

Pro léčbu revmatoidní artritidy, osteoartritidy a u chorob a stavů vyplývajících ze zvýšené exprese matrixových mataloproteináz, jak je nalézáno u určitých metastatických nádorových

-8CZ 297278 B6 buněčných linií nebo jiných chorob způsobených matrixovými metaloproteinázami nebo zvýšenou tvorbou TNF, látky podle vzorce 1 jsou podávány orálně, místně, parenterálně inhalaci sprejů nebo rektálně v dávkovačích formulacích, které obsahují netoxické, farmaceuticky akceptovatelné nosiče, adjuvans a přenáŠeče. Termín parenterální, jak je zde používáno, zahrnuje subkutánní injekce, intravenózní, intramuskulární, intrasternální injekce nebo infúzní techniky. Navíc spolu s léčbou teplokrevných živočichů jako jsou myši, krysy, koně, krávy, ovce, psi, kočky apod., látky tohoto vynálezu jsou účinné při léčbě lidí.

Farmaceutické přípravky obsahující účinnou složku jsou ve formě vhodné pro orální použití, například jako tablety, pastilky, vodní nebo olejovité suspenze, rozpustné prášky nebo granule, emulze, tvrdé nebo měkké kapsle, nebo sirupy či léčebné nápoje. Přípravky určené pro orální použití jsou připravovány jakýmikoliv metodami známými v oblasti výroby farmaceutických přípravků a takové přípravky obsahují jednu nebo více látek vybraných ze skupiny sestávající se ze sladidel, látek dodávajících aroma, barvu a ochranných látek, aby byly získány farmaceuticky elegantní a chutné přípravky. Tablety obsahují aktivní látku smíšenou snetoxickým farmaceuticky akceptovatelným přenášečem, který je vhodný pro výrobu tablet. Takové přenášeče jsou například inertní ředicí roztoky uhličitan vápenatý, uhličitan sodný, laktóza, fosforečnan vápenatý nebo sodný, granulační nebo rozvolňovací látky, například kukuřičný škrob nebo alginátová kyselina; vazebné látky, například škrob, želatina nebo arabská guma, a lubrikační látky, například stearát hořečnatý, kyselina stearová nebo mastek. Tablety jsou buď nepotažené, nebo potažené známými způsoby, aby se zpozdila jejich absence v gastrointestinálním traktu, a tím bylo dosaženo udržitelného působení po delší dobu. Například jsou použity materiály prodlužující čas potřebný k rozpuštění jako je glyceryl monostearát nebo glyceryl distearát. Aby byly vytvořeny osmotické léčebné tablety pro kontrolované uvolňování, jsou k potažení využity techniky popsané v Patentech US 4 256 108; US 4 166 452; US 4 265 874.

Přípravky pro orální použití jsou vyráběny jako tvrdé želatinové kapsle, kde je aktivní látka smíšena s inertní pevnou ředicí látkou, například uhličitanem vápenatým, fosforečnanem vápenatým nebo kaolinem, nebo jako měkké želatinové kapsle ve kterých je aktivní látka smíšena s vodou nebo olejovitým médiem, například olejem z burských oříšků, kapalným parafínem nebo olivovým olejem.

Vodné suspenze obsahující aktivní materiál smíšený s přenašeči vhodnými pro výrobu vodních suspenzí. Takové přenášeče jsou suspenzní látky, například sodná karboxymethylcelulóza, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, sodný alginátový polyvinyl-pyrrolidon alginátu sodného, tragacantová nebo arabská guma; disperzní nebo zvlhčující látky jsou přirozeně se vyskytující fosfatidy, například lecitin nebo kondenzační produkty reakce alkylenoxidu s mastnými kyselinami, například polyoxyethylen-stearát, nebo kondenzační produkty reakce ethylenoxidu s alifatickými alkoholy s dlouhým řetězcem, například s heptadekaethylenoxycetanolem, nebo kondenzační produkty ethylenoxidu s částečnými estery odvozenými z mastných kyselin a hexitol anhydridů, například polyoxyethylen-sorbitan-monooleátem. Vodné suspenze obsahují jednu nebo více ochranných látek, například ethyl, n-propyl, p-hydroxybenzoát, jednu nebo více barvicích látek, jednu nebo více látek dodávajících aroma a jedno nebo více sladidel, jako je sacharóza nebo sacharin.

Olejnaté suspenze jsou formulovány rozpuštěním aktivní látky v rostlinných olejích, například arašídový olej, olivový olej, sezamový olej nebo kokosový olej, nebo v minerálních olejích jako je kapalný parafín. Olejovité suspenze obsahují zahušťování látky, například včelí vosk, tuhý parafín nebo acetylalkohol. Sladidla, jako jsou ta uvedená výše, a látky dodávají aroma jsou přidány aby bylo dosaženo chutného přípravku pro orální použití. Tyto přípravky jsou chráněny přidáním antioxidačních látek jako je kyselina askorbová. Disperzní prášky a granule vhodné pro přípravu vodných suspenzí přidáním vody poskytují aktivní látky ve směsi s disperzní nebo zvlhčující látkou, suspenzní látkou a jednou nebo více ochrannými látkami. Přítomny jsou také vhodné disperzní nebo zvlhčující látky a suspenzní látky, které jsou uvedeny, například sladící, barvicí látky a látky dodávající aroma.

-9CZ 297278 B6

Farmaceutické přípravy vynálezu existují také ve formě olejnato-vodné emulze. Olejová fáze je tvořena rostlinným olejem, například olivovým olejem nebo arašídovým olejem, nebo minerálním olejem, například kapalným parafínem nebo jejich směsí. Vhodné emulzní látky jsou přirozeně se vyskytující fosfatidy, například sojové boby, lecitin, a estery nebo částečné estery odvozené z mastných kyselin nebo hexitol anhydridů, například sorbitan monooleát a kondenzační produkt reakcí uvedených částečných esterů s ethylenoxidem, například polyoxyethylen sorbitan monooleát. Emulze obsahují také sladící a barvicí látky.

Sirupy a léčebné nápoje jsou vyráběny spolu se sladícími látkami, například glycerolem, propylenglykole, sorbitalem nebo sacharózou. Takové přípravky také obsahují uklidňující, ochranné, barvicí látky a látky dodávající aroma. Farmaceutické přípravky jsou ve formě sterilních injikovatelných vodních nebo olejovitých suspenzí. Tyto suspenze jsou formulovány podle znalostí v oboru, při použití takových vhodných disperzních nebo zvlhčujících látek a suspenzních látek, které byly zmiňovány výše. Sterilní injikovatelné přípravky jsou také ve sterilním injikovatelném roztoku nebo suspenzi v netoxické parenterálně akceptovatelné rozpouštěcí látce nebo rozpouštědle, například jako roztok v 1,3-butandiolu. Mezi akceptovatelné přenášeče a rozpouštědla, která mohou být použita, patří voda, Ringierův roztok a isotonický roztok chloridu sodného. Kromě toho jsou jako rozpouštěcí a suspenzní média konvenčně používány sterilní stabilní oleje. Pro tyto účely mohou být použity jakékoliv mírné stabilní oleje včetně syntetických mono- či diglyceridů. Kromě toho při přípravě injekcí nacházejí použití mastné kyseliny jako je kyselina olejová.

Látky podle vzorce I jsou také aplikovány ve formě čípků pro rektální podání léčiva. Tyto přípravky jsou připraveny smíšením léčiva s vhodným neiritujícim přenášečem, který je pevný za běžných teplot, ale kapalný při rektální teplotě a bude se proto v konečníku rozpouštět za uvolnění léčiva. Takovými materiál jsou kakaové máslo a polyethylenglykol.

Pro místní použití jsou použity krémy, masti, gely, roztoky nebo suspenze, které obsahují látku podle vzorce I. Pro účely této specifikace zahrnuje místní aplikace ústní vody a kloktadla.

Nařízené stupně dávkování od 0,05 mg do 140 mg na kilogram tělní vázy za den jsou užitečné při léčbě výše uvedených stavů (od 2,5 mg do 7 g na pacienta za den). Například záněty jsou účinně léčeny podáním látky v dávce od 0,01 mg do 50 mg na kilogram tělesné vázy za den (0,5 mg až 3,5 g na pacienta za den).

Množství aktivní látky, které je kombinováno s nosičovým materiálem, aby byla vytvořena jednoduchá dávkovači forma, se bude měnit v závislosti na léčeném pacientovi a konkrétním způsobu podání. Například formulace zamýšlená pro orální podání u lidí se bude měnit od 5 do 95 % celkového množství přípravku. Jednotlivé dávkovači jednotky budou obecně obsahovat mezi 1 mg až 500 mg aktivní látky.

Je však třeba si uvědomit, že specifické dávkovači úrovně pro jakékoliv konkrétního pacienta budou záviset na rozmanitých faktorech, včetně účinnosti specifické látky, která byla použita, na věku, tělesné váze, obecném zdraví, pohlaví, dietě při podávání, způsobu podání, rychlosti vylučování, kombinaci léčiv a závažnosti konkrétní choroby, která se léčí.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady objasňují vynález. V příkladech jsou používány tyto zkratky:

TN Fa Túmory nekrotizuj íc í faktor a

LPS Lipopolysachari

ELISA ELISA technika (Enzymy linked immunosorbant assay)

EDC l-ethyl-2-dimethylaminopropylkarbodiimid

RT laboratorní teplota

-10CZ 297278 B6

Meziprodukt 1 l-(2-bromethyl)-3,4,4-trimethylhydantoin

Hydrid sodný (60% disperze v minerálním oleji, 1,7 g) se přidá k roztoku 3,4,4-trimethylhydantoin (5,5 g) v DMF (20 ml) za laboratorní teploty. Směs se třepe 30 minut, pak se po kapkách přidá dibrometan (3,5 ml) a směs se třepe přes noc. Směs se přidá do vody (200 1) a extrahuje se diethyléterem. Éterová vrstva se promyje vodou, vysuší (MgSO₄) a odpaří. Reziduum se purifikuje na chromatografické koloně, eluuje se diethyléterem za vzniku látky uvedené v názvu jako bezbarvá pevná látka (4,2 g, 50 %).

TLC Rf 0,5 (diethyléter)

Meziprodukt 2 4-acetylsulfanyltetrahydropyran

Diethylazodikarboxylát (7,24 ml) se přidá k třepanému roztoku trifenylfosfinu (12,1 g) v THF (80 ml), a třepe se za laboratorní teploty 10 min. Přidá se kyselina thioloctová (3,29 ml) a tetrahydro-4/f-pyran-4-ol (2,3 g) (VÝSTRAHA: exotermická reakce) a směs se za laboratorní teploty třepe 18 h. Po odstranění THF při sníženém tlaku se směs třepe s hexanem (50 ml) a vodou (50 ml) za vzniku precipitátu, který se odstraní filtrací. Bifázický filtrát se oddělí a vodná fáze se jednou extrahuje hexanem (50 ml). Sebraný hexanový extrakt se promyje vodou (30 ml), slanou vodou (10 ml), vysuší (MgSO₄) a odpaří za vzniku žluté kapaliny (2,73 g). Po purifikaci na chromatografické koloně a eluaci hexanem/diethyléterem (10:1) vzniká látka uvedená v názvu jako světle žlutá kapalina (0,98 g, 27 %).

TLC Rf 0,20 (hexan/diethyléter (10:1))

Meziprodukt 3 tetrahydropyran-4-thiol

Borohydrid sodný (0,278 g) se přidá do třepaného roztoku meziproduktu 2 v metanolu (15 ml) při 0 °C za dusíkaté atmosféry. Po 2 h je přidán další borohydrid sodný (0,370 g) a směs se nechá zahřát na laboratorní teplotu a třepe se dalších 18 h. Reakce je pak zastavena přidáním 1M kyseliny chlorovodíkové (50 ml) a směs se extrahuje diethyléterem (2 x 30 ml). Slité organické extrakty jsou promyty slanou vodou (10 ml), vysušeny (MgSO₄) a koncentrovány in vacuo za vzniku látky uvedené v názvu jako bezbarvá tekutina (0,472 g, 60 %).

TLC Rf0,7 (3:1 hexan-ethylacetát)

Meziprodukt 4 l-benzoyl-4-brompiperidin

Benzoyl chlorid (1,41 g) se přidá k roztoku 4-brompiperidin hydrobromidu (2,45 g) v THF (30 ml) při 0 °C a pak následuje triethylamin (2,2 g, 2,2 ekv.). Roztok se třepe za laboratorní teploty 1 a odpaří se. Reziduum se rozředí v dichlormetanu (100 ml), promyje se vodou, 1 M HC1 a nasyceným dihydrogenuhličitanem sodným, vysuší se a odpaří se za vzniku látky uvedené v názvu jako bezbarvý olej (2,76 g, 100 %).

TLC Rf0,55 (éter)

Meziprodukt 5 l-benzoyl-4-(acetylsulfatyl)piperidin

Thioacetát draselný (2,3 g) se přidá k roztoku meziproduktu 4 v DMF (50 ml) za laboratorní teploty. Směs se 3 dny třepe za laboratorní teploty, pak se přidá voda a extrahuje se éterem. Rozpouštědlo se promyje vodou a roztok dihydrogenuhliěitanu sodného, vysuší se a odpaří za vzniku látky uvedené v názvu jako světle jantarový olej (2,6 g, 100 %).

TLC R_f0,45(éter)

-11 CZ 297278 B6

Meziprodukt 6 l-benzoylpiperidin-4-thiol

Na roztok thioacetátového meziproduktu 5 (2,6 g) v metanolu (100 ml) se působí borohydridem sodným (1,2 g) a směs se třepe za laboratorní teploty 4 h, pak se odpaří a reziduum se rozpustí ve vodě. Roztok se okyselí pevnou kyselinou citrónovou a extrahuje se dichlormethanem (2 x 100 ml). Rozpouštědlo se promyje slanou vodou, vysuší se a odpaří se za vzniku látky uvedené v názvu jako hnědý olej (2,0 g).

TLC R_f0,3 (éter)

Meziprodukt 7 l-terc-butyloxycarbonyl-4-brompiperidin

Roztok di-terc-butyldikarbonátu (4,4 g) v dichlormetanu se přidá k suspenzi hydrobromidu 4-brompiperidinu (5,0 g) v dichlormetanu (100 ml) při 0 °C, pak následuje triethylamin (5,1 g). Roztok se třepe 3 h za laboratorní teploty, pak se promyje vodou, 0,5 M HCI a nasyceným roztokem dihydrogenuhličitanu sodného, vysuší se a odpaří se za vzniku látky uvedené v názvu jako bezbarvý olej. (5,3 g, 99 %).

TLC R_f0,70 (éter)

Meziprodukt 8 l-terc-butyloxycarbonyl-4-(acetylsulfanyl)piperidin

Thioacetát draselný (4,4 g) se přidá k roztoku meziproduktu 7 (5,3 g) v DMF (100 ml) a směs se zahřeje na 100 °C po dobu 4 h, pak se ochladí a přidá se do vody. Směs se extrahuje éterem a rozpouštědlo se promyje vodou a dihydrogenuhličitanem sodným, vysuší se a odpaří za vzniku látky uvedené v názvu (5,1 g, 96 %).

TLC R_f0,60 (éter)

Meziprodukt 9 Dibenzyl-2-(3-ftalímidopropyl)malonát

Na roztok dibenzylmalonátu (20 g) v bezvodém THF (200 ml) se při 0 °C působí hydridem sodným (60% disperze v minerálním oleji, 3,1 g). Směs se nechá zahřát na laboratorní teplotu a za dusíkové atmosféry se třepe 30 min. Na směs se pak působí roztokem iV-(3-brompropyl)ftalimidu (20,5 g) v THF (100 ml) a zahřeje se krefluxu na 12 h. Reakce se pak ochladí, filtruje a filtrát se odpaří in vacuo. Reziduum se rozdělí mezi ethylacetát (200 ml) a nasycený vodný chlorid amonný (150 ml). Organická vrstva se promyje vodou (100 ml), slanou vodou (100 ml), vysuší se (MgSO₄), filtruje se a filtrát se odpaří in vacuo. Reziduum se pročistí na chromatografícké koloně se silika-gelem a eluuje se 20% ethylacetátem v hexanu za vzniku látky uvedené v názvu jako bílá pevná látka (17,5 g, 50 %).

TLC Rf 0,16 (20% ethylacetát-hexan)

Podobně byl připraven:

Meziprodukt 12 2-methylen-5-ftalimidopentanová kyselina

Na roztok meziproduktu 9 (16,75 g) v dioxanu (200 1) se působí 10% paladiem na dřevěném uhlí (1,7 g) a hydrogenace probíhá za atmosférického tlaku, dokud se spotřeba vodíku nezastavila. Katalyzátor se odstraní filtrací přes Celite^<R) a na filtrát se působí piperidinem (3,2 g) za laboratorní teploty. Po 30 min. se na reakci působí formaldehydem (37% roztok ve vodě, 15 ml), třepe se 2 h za laboratorní teploty a pak se zahřeje na 80 °C po dobu 2 h. Směs je pak ochlazena, rozpouštědlo se odstraní in vacuo a reziduum se rozdělí mezi ethylacetát (200 ml) a vodnou kyselinu citrónovou (100 ml). Organická vrstva se promyje vodou (100 ml), slanou vodou (100 ml), vysuší se přes síran hořečnatý, filtruje se filtrát a odpaří in vacuo. Reziduum se přečistí přes

- 12CZ 297278 B6 chromatografickou kolonu na silika-gelu za eluce 40% ethylacetátem v hexanu za vzniku látky uvedené v názvu jako bílá pevná látka (12,2 g, 70 %).

TLC Rf 0,44 (50% ethylacetát-hexan).

Podobně byly připraveny:

Meziprodukt 13 2-methylen-4-(3,4,4-trimethylhydantoin-l-yl)butanová kyselina

Z meziproduktu 10 (7,2 g) jako bezbarvá pevná látka (1,5 g, 37 %).

TLC Rf0,35 (ethylacetát)

Meziprodukt 14 2-methyl-5-fenylpentanová kyselina

Z meziproduktu 11 (17,6 g) jako bezbarvý olej (5 g, 60 %).

TLC Rf 0,31 (20% ethylacetát-hexan)

Meziprodukt 15 2-bromethyl-5-ftalimidopentanová kyselina

Na meziprodukt 12 (1,0 g) se působí 45% hydrogen bromidem v kyselině octové (30 ml) za laboratorní teploty. Po 3 h se roztok nalije do vody (300 ml) a produkt se extrahuje ethylacetátem (3 x 100 ml). Extrakty se slijí, promyjí se vodou (100 ml), slanou vodou (100 ml), vysuší se přes MgSO₄, zfiltruje se a filtrát se odpaří in vacuo. Reziduum se vysuší azeotropně toluenem (2x10 ml) za vzniku látky uvedené v názvu jako bílá pevná látka (1,3 g, 100 %).

TLC Rf 0,34 (50% ethylacetát-hexan).

Podobně byly připraveny

Meziprodukt 16 2-brommethyl-5-fenylpentanová kyselina

Z meziproduktu 14 (3,4 g) jako bezbarvý olej (4,2 g, 87%).

TLC Rf 0,32 (20% ethylacetát-hexan).

Meziprodukt 17 Methyl-2-(brommethyl)-5-fenylpentanoát

Na meziprodukt 16 (5,0 g) se působí roztokem diazometanu v dietyléteru. Odstranění rozpouštědla in vacuo dává vznikl látce uvedené v názvu jako bezbarvý olej (5,2 g, 100 %).

TLC Rf 0,31 (5% ethylacetát - hexan).

Meziprodukt 18 Methyl-2-acetylsulfanylmethyl-5-fenylpentanoát

Na roztok meziproduktu 17 v DMF se působí thioacetátem draselným (6 g) při 60 °C po dobu 18 h. Směs se pak přidá k vodě a extrahuje se éterem. Rozpouštědlo se promyje vodou, slanou vodou, vysuší se a odpaří se za vzniku látky uvedené v názvu jako hnědý olej (8,5 g, 90 %).

TLC R_f 0,8 (éter).

- 13 CZ 297278 B6

Meziprodukt 19 Methyl-2-chlorsulfonylmethyl-5-fenylpenanoát

Chlor se nechá procházet přes suspenzi meziproduktu 18 (0,7 g) v ledové vodě (20 ml) po dobu 30 min. Žlutá suspenze se pak extrahuje dichlormethan a rozpouštědlo se promyje vodu, metabisiřiČitanem sodným a slanou vodou, pak se vysuší a odpaří se za vzniku látky uvedené v názvu jako bezbarvý olej (0,7 g, 100 %).

TLC R_t 0,45 (éter).

Meziprodukt 20 l-tert-butoxykarbonylpiperidin-4-thiol

Borohydrid sodný (5,0 g) se přidá k roztoku meziproduktu 8 (5,1 g) v metanolu (200 ml). Roztok se třepe 2 h při laboratorní teplotě a pak s odpaří in vacuo. Reziduum se pečlivě rozpustí ve vodě a přidá se kyselina citrónová (5,0 g). Produkt se extrahuje dichlormethanem (2 x 100 ml), extrakty se slijí, vysuší přes síran hořečnatý, zfiltrují a filtrát se odpaří in vacuo za vzniku látky uvedené v názvu jako světle žlutý olej (4,70 g, 98 %).

TLC R_f 0,40 (éter).

Meziprodukt 21 2-(4-benzoylfenylsulfanylmethyl)-5-ftalimidopentanová kyselina

Roztok meziproduktu 15 (1,0 g) v THF (20 ml) se přečistí dusíkem 5 min. a pak se na něj působí meziproduktem 15 (0,7 g) a triethylaminem (1,0 ml). Směs se za laboratorní teploty třepe 24 h a pak se odstraní rozpouštědlo in vacuo. Reziduum se rozdělí mezi ethylacetát (100 ml) a vodu (10 ml). Vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem (50 ml), extrakty se slijí, promyjí slanou vodou, vysuší přes síran hořečnatý a zfiltrují. Filtrát se odpaří in vacuo a reziduum se pročistí na chromatografické koloně se silika-gelem, eluuje se 50% ethylacetátem v hexanu za vzniku látky uvedené v názvu jako průhledná guma (0,5 g, 35 %).

TLC R_f 0,33 (50% ethylacetát-hexan).

Meziprodukt 22 2-(furan-2-ylmethylsulfanyl)methyl-5-fenylpentanová kyselina

Terc-butoxid draselný (415 mg) se přidá do třepaného roztoku furfuryl thiolu (0,186 ml) v dichlormethanu (20 ml) při 0 °C za dusíkové atmosféry. Směs se třepe než se přidá roztok meziproduktu 37 (500 mg) v dichlormetanu (5 ml). Směs se nechá zahřát na laboratorní teplotu a třepe se 6 h než se nalije do HCL (0,5 M, 100 ml). Směs se extrahuje ethylacetátem (2 x 100 ml). Slité organické fáze se promyje slanou vodou a vysuší se (MgSO₄). Rozpouštědlo se odstraní in vacuo za vzniku látky uvedené v názvu jako žlutý olej (560 mg, 99 %).

TLC Rf0,3 (4:1 hexan-ethylacetát)

Podobně se připravil:

Meziprodukt 23 5-fenyl-2-[(tetrahydropyran-4-ylsulfanyl)methyl]-pentanová kyselina

Z meziproduktu 3 (0,4 g) a meziproduktu 16 (0,700 g) jako světle žlutý olej (0,99 g, 94 %).

TLC R_f 0,50 (hexan/diethyléter (1:1))

MS 373 [M+NH₄ ⁺]

- 14CZ 297278 B6

Meziprodukt 24 2-(2-fenylethylsulfanylmethyl)-5-fenylpentanová kyselina

Hexamethyldisalizid draselný (0,5 M v toluenu, 20 ml) se přidá k roztoku fenethyl-merkaptanu (0,7 g) v THF (50 ml) při -78 °C a roztok se třepe 10 min., pak se po kapkách přidá roztok meziproduktu 16 (1,4 g) v THF (10 ml) a směs se třepe 3 h a nechá se zahřát na laboratorní teplotu. Směs se pak přidá kvodě a roztok se promyje diethyléterem, okyselí se kyselinou octovou a extrahuje se éterem. Éterová vrstva se promyje vodou a slanou vodou, vysuší se a odpaří a reziduum se pročistí na chromatografické koloně a eluuje se 20% ethylacetátem v hexanu za vzniku látky uvedené v názvu jako bezbarvý olej (1,30 g, 78 %).

TLC R_f 0,3 (20% ethylacetát-hexan).

Podobně byly připraveny:

Meziprodukt 25 2-( l-benzoylpiperidin^4-yl)sulfanylmethyl-5-fenylpentanová kyselina

Z meziproduktu 6 (2,0 g) a meziproduktu 16 (2,0 g) jako bezbarvý olej (1,6 g, 50 %).

TLC R_t 0,34 (éter

Meziprodukt 26 2-(l-tert-butyloxykarbonyl)piperidin^4-yl)sulfanylmethyl-5-fenylpentanová kyselina

Z meziproduktu 20 (4,2 g) a meziproduktu 16 (5,2 g) jako bezbarvý olej (4,5 g, 53 %).

TLC R_f 0,3 (1:1 éter/hexan)

Meziprodukt 27 2-(4-benzoylsulfonylmethyl)-5-ftalimidopentanová kyselina

Na roztok meziproduktu 62 (0,4 g) v metanolu (50ml) se působí za laboratorní teploty roztokem Oxonu^(R> (0,52 g) ve vodě (10 ml). Směs se třepe 24 h a organické rozpouštědlo se odstraní in vacuo. Reziduum se rozředí vodou (100 ml) a extrahuje se ethylacetátem (3 x 100 ml). Organické extrakty se slijí, promyjí slanou vodou (40 ml), vysuší se přes síran hořečnatý a zfiltruje se. Filtrát se odpaří in vacuo a reziduum se pročistí na chromatografické koloně se silika-gelem eluovaným 2% metanolem v dichlormetanu za vzniku látky uvedené v názvu jako bílá pevné látka (0,37 g, 87 %).

TLD Rf 0,24 (2% metanol-dichlormetan).

MS 506 MH⁺

Podobně byly připraveny:

Meziprodukt 28 5-fenyl-2-((tetrahydropyran-4-ylsulfonyl)methyl)pentanová kyselina

Z meziproduktu 23 (0,99 g) jako voskovitá bílá pevná látka (0,62 g, 57 %).

TLC Rf 0,10 (ethylacetát/hexan/kyselina octová (49:49:2)).

Meziprodukt 29 2-((l-benzoylpiperidin-4-yl)sulfonylmethyl)-5-fenylpentanová kyselina

Z meziproduktu 25 (1,6 g) jako bílá pevná látka (1,05 g, 26 %).

TLC R_f 0,57 (EtOAc).

MS 443 (M⁺)

- 15 CZ 297278 B6

Meziprodukt 30 2-((l-terc-butoxykarbonylpiperidin-4-yl)sulfonylmethyl)5-fenylpentanová kyselina

Oxone^(R) (13 g) se přidá k roztoku meziproduktu 269 (4,5 g) a acetátu sodného (5 g) v metanolu (200 ml) a vodě (50 ml) za laboratorní teploty a směs se třepe 18 h, pak se odpaří, zředí vodou a produkt se sebere filtrací za vzniku látky uvedené v názvu jako bílá pevná látka (3,50 g, 75 %).

TLC R_f0,35 (EtOAc).

MS 439 (M⁺)

Meziprodukt 31 Methyl 2-((pyrrolidin-l-yI)sulfonylmethyl)-5-fenylpentanoát

Pyrrolidin (0,2 ml) se přidá k roztoku meziproduktu 19 (0,7 g) a triethylaminu (0,5 ml) v dichlormetanu (20 ml) při -10 °C a roztok se třepe 18 h, pak se promyje vodou, k hydrogenuhličitanem sodným a 0,5 M HC1. Rozpouštědlo se vysuší a odpaří a reziduum se pročistí mžikovou chromatografií na koloně a eluuje se 40% éterem v hexanu za vzniku látky uvedené v názvu jako bezbarvý olej (0,16 g, 25 %).

TLC Rf 0,28 (40% éter/hexan).

Meziprodukt 32 2-((pyrrolidin-l-yl)sulfonylmethyl)-5-fenylpentanová kyselina

Hydroxid lithný (100 mg) se přidá k roztoku esteru meziproduktu 31 (0,16 g) v metanolu (5 ml), THF (10 ml) a vody (5 ml) a roztok se třepe 6 h, pak se odpaří in vacuo a reziduum se rozpustí ve vodě. Vodný roztok se promyje éterem, pak se okyselí kyselinou citrónovou a extrahuje se dichlormetanem. Dichlormetanové extrakty se slijí a promyjí vodou, vysuší se a odpaří za vzniku surového produktu. Tento materiál se pročistí mžikovou chromatografií na koloně a eluuje se 60% éterem v hexanu za vzniku látky uvedené v názvu jako bezbarvý olej (60 mg, 40 %).

TLC Rf 0,40 (60% éter/hexan).

Meziprodukt 33 V-hydroxyamid 2-(4-benzoylfenylsulfonylmethyl)-5-ftalimidopentanové kyseliny

Na roztok podle meziproduktu 27 2 (0,1 g) v bezvodém THF (10 ml) se působí za laboratorní teploty O-(terc-butyldimethylsilyl)hydroxylamÍn (0,032 g) a hydrochloridem l-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu (0,042 g). Směs se třepe 24 h a organické rozpouštědlo se odstraní in vacuo. Rezidum se rozdělí mezi vodu (30 ml) a ethylacetát (50 ml) Organický extrakt se promyje slanou vodou (40 ml), vysuší se přes síran hořečnatý a zfiltruje se. Filtrát se odpaří in vacuo a reziduum se rozpustí v THF (10 ml). Na roztok se při 0 °C působí l,0M roztokem fluoridu tetrabutylamonného v THF (1,0 ml) a třepe se 1 h. Rozpouštědlo se odstraní in vacuo a reziduum se rozdělí mezi ethylacetát (50 ml) a vodu (40 ml). Organická vrstva se promyje slanou vodou (20 ml), vysuší se přes síran hořečnatý, zfiltruje a filtrát se odpaří in vacuo. Reziduum se pročistí na chromatografické koloně se silikagelem a eluuje se 2 % metanolem v dichlormetanu za vzniku látky uvedené v názvu jako bílá pevná látka (0,06 g, 58 %).

TLC Rf 0,74 (ethylacetát).

MS 521 MH⁺

Podobně byly připraveny:

- 16CZ 297278 B6

Příklad 1 /V-hydroxyamid 5-fenyl-2-((tetrahydropyran—4-ylsulfonyl)methyl)pentanové kyseliny

Z meziproduktu 28 (0,60 g) jako bílá pevná látka (0,40 g, 65 %).

TLC Rf 0,20 (ethylacetát/hexan (5:1) s kapkou kyseliny octové).

MS 373 (M+NH/)

Příklad 2 .V-hydroxyamid 2-((1 -benzoylpiperidin-4-yl)sulfonylmethyl)-5-fenylpentanové kyseliny

Z meziproduktu 29 (1,05 g) jako bílá pevná látka (0,85 g, 80 %).

TLC Rf0,43 (7% MeOH/dichlormetan)

MS 458 (M')

Příklad 3 /V-hydroxyamid 2-((1-terc-bityloxykarbonylpiperidin-4-y[)sulfonylmethyl)-5fenylpentanové kyseliny

Z meziproduktu 30 (3,5 g) jako bílá pěna (2,40 g, 66 %).

TLC R_t 0,7 (7% MeOH/dichlormethan)

MS 454 (M⁺)

Příklad 4 V-hydroxyamid 2-((pyrrolidin-l -yl)sulfonylmethyl)-5-fenylpentanové kyseliny

Z meziproduktu 32 (60 mg) jako bezbarvá pevná látka (30 mg, 50 %).

TLC R_f 0,40 (7% MeOH/dichlormetan)

MS 340 (M⁺)

Příklad 5 Trifluoracetát V-hydroxyamid 2-((piperidin-4-yl)sulfonylmethyl)-5-fenylpentanová kyselina

Kyselina trifluoroctová (20 ml) se přidá k roztoku kyseliny podle příkladu 3 (2,4 g) v dichlormetanu (20 ml) za laboratorní teploty a roztok se třepe 2 h, pak se odpaří in vacuo a reziduum azeotropně toluenem (2 x 50 ml). Vzniklá pevná látka se pak vysráží z methanolu přidáním éteru za vzniku látky uvedené v názvu (1,54 g, 65 %).

TLC Rf0,25 (10% MeOH/dichlormetan 2%NH₄OH)

MS 323 (MH*)

Příklad 6 N-hydroxyamid 2-((1 -benzylpiperidin-4-yl)sulfonylmethyl)-5-fenylpentanové kyseliny

- 17CZ 297278 B6

Triacetoxyborohydrid sodný (0,22 g) se přidá k roztoku látky podle příkladu 5 (0,23 g), triethylaminu (60 mg) a benzaldehydu (106 mg) ve směsi dichlormetanu (10 ml) a metanolu (2 ml). Směs se třepe při laboratorní teplotě 6 h, pak se odpaří in vacuo a reziduum se rozdělí mezi vodu a dichlormetan. Organické rozpouštědlo se promyje vodou, vysuší se a odpaří a reziduum se pročistí chromatografií a eluuje se 6% MeOH v dichlormetanu a 1% NH₄OH za vzniku látky uvedené v názvu jako bílá pevná látka (60 mg, 25 %).

TLC R_f0,35 (6% MeOH/dichlormetan 1%NH₄OH)

MS 445 (MH⁺)

Podobně bylo připraveno:

Příklad 7 N-hydroxyamid 2-((1-(4-kyanobenzyl)piperidin-4-yl)sulfonylmethyl)-5-fenylpentanové kyseliny

Z produktu podle příkladu 5 (0,23 g) a 4-kyanobenzaldehydu (65 mg) jako bílá pevná látka (35 mg, 14%).

TLC R_t 0,40 (6% MeOH/dichlormetan)

MS 470 (MH⁺)

Příklad A

Inhibice aktivity kolagenázy

Účinnost látek podle vzorce I při inhibici kolagenázy se určovala postupem podle Cawstona a Barretta (Anal. Biochem., 99:340-345, 1979), kde se lmM roztok testovaného inhibitoru nebo jeho ředění inkubují při 37 °C po dobu 16 h s kolagenem a kolagenázou (pufrováno 50mM Trs, pH 7,6 obsahujícím 5mM CaCl₂, 0,05% Brij 35, 60mM NaCl a 0,02% NaN₃). Kolagen se acetyluje ³H nebo se připraví ^l4C kolagen podle Cawstona a Murphyho (Methods in Enzymology, 80:711, 1981). Výběr radioaktivní značky nezmění schopnost kolagenázy degradovat kolagenní substrát. Vzorky se zcentrifugují, aby se usadil nenatrávený kolagen, a alikvotní část radioaktivního supematantu se dá stranou pro změření na scintilačním přístroji jako míra hydrolýzy. Aktivita kolagenázy v přítomnosti lmM koncentrace inhibitoru nebo jeho ředěním se porovná s aktivitou kontroly, která je bez inhibitoru, a vyjádří se jako koncentrace inhibitoru, která má 50 % inhibiční aktivitu pro kolagenázu (IC₅₀).

Příklad B

Inhibice aktivity stromelyzinu

Účinnost látek podle vzorce 1 při inhibici stromelyzinu se určovala postupem podle Nagese aspol. (Methods in Enzymology Vol 254, 1994), kde se 0,lmM roztok testovaného inhibitoru nebo jeho ředění inkubují při 37 °C po dobu 16 h se stromelyzinem a ³H-transferinnem (pufrováno 50mM Tris, pH 7,6 obsahujícím lOmM CaCl2, 150mM NaCl, 0,05% Brij 35 a 0,02% NaN3). Transferin se karboxymethyluje ³H jodoctovou kyselinou. Aktivita stromelyzinu v přítomnosti lmM koncentrace inhibitoru nebo jeho ředěních se porovná s aktivitou kontroly, která je bez inhibitoru, a vyjádří se jako koncentrace inhibitoru, která má 50 % inhibiční aktivitu pro stromelyzin (IC50).

-18CZ 297278 B6

Příklad C

Inhibice aktivity gelatinázy

Účinnost látek podle vzorce I při inhibici stromelyzinu se určovala postupem podle Harrise a Kraneho (Biochem. Biophys. Acta, 258:566-576, 1972), kde se lmM roztok testovaného inhibitoru nebo jeho ředění inkubují při 37 °C po dobu 16 h s gelatinázou a teplem denaturovaným ³H nebo ¹⁴C-acetyl ováným kolagenem (pufrováno 50mM Tris, pH 7,6 obsahujícím 5mM CaCl2, 0,05% Brij 35 a 0,02% NaN3). ³H nebo ^l4C gelatin se připraví denaturací ³H nebo ^l4C-kolagenu připraveného podle metody Cawstona a Murphyho (Methods in Enzymology, 80:711, 1981) 30 min inkubací při 60 °C. Nenatrávený gelatin se vysráží přidáním kyseliny trichloroctové a centrigurací. Aktivita gelatinázy v přítomnosti lmM koncentrace inhibitoru nebo jeho ředěním se porovná s aktivitou kontroly, která je bez inhibitoru, a vyjádří se jako koncentrace inhibitoru, která má 50 % inhibiční aktivitu pro gelatinázu (IC50).

Příklad D

Fluorometrické měření inhibice aktivity MMP

Účinnost látek podle vzorce I při inhibici kolagenázy-1 (MMP-1), kolagenázy-2 (MMP-8), kolagenázy-3 (MMP-13) gelatinázy-A (MMP-2), gelatinázy-B (MMP-9) a stromelyzinu-1 (MMP-3) se určovala podle následujícího postupu:

Inhibitory se rozředí v dimethylsulfoxidu obsahujícím 0,02% β-merkaptoetanol, a připraví se jejich seriální ředění. Aktivovaný enzym se inkubuje v pufru obsahujícím 50mM Tris, pH 7,4, 5mM CaCl₂, 0,002 % NaN₃ a Brij 35 v přítomnosti či nepřítomnosti inhibitoru. Vzorky se preinkubují při 37 °C po dobu 15 min. před přidáním fluorometrického substrátu (Mca-Pro-LueGly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH₂) do konečné koncentrace 10 μΜ. Pro měření se inkubuje 20 až 30 min. při 37 °C a pak se metoda odečítá na Fluorescenu II při X_ex (340 nm) a X_em (405 nm).

Aktivita enzymu se porovná s aktivitou kontroly, která je bez inhibitoru, a vyjádří se jako koncentrace inhibitoru, která má 50% inhibiční aktivitu pro stromelyzin (IC50).

Příklad E

Inhibice tvorby TNFa

Účinnost látek podle vzorce I při inhibici tvorby TNFa se určovala postupem podle následujících postupu. 100μΜ roztok testovaného inhibitoru nebo jeho ředění se inkubuje při 37 °C v 5% atmosféře CO₂ sTHP-1 buňkami (lidské monocyty) resuspendovanými v médiu RPM1 1640 s 20μΜ β-merkaptoetanolem při hustotě 1 χ 10⁶ buněk/ml, a stimulovanými LPS. Po 18 h se změří hladina TNFa pomocí komerčně dostupného ELISA kitu (R & D Systems).

Aktivita v přítomnosti 0,1 mM koncentrace inhibitoru nebo jeho ředění se porovná s aktivitou kontroly, která je bez inhibitoru, a vyjádří se jako koncentrace inhibitoru, která z 50 % inhibuje tvorbu TNFa.

Příklad F

Inhibice odvrhování L-selektinu

- 19CZ 297278 B6

Látky podle vzorce 1 jsou posuzovány při měření odvrhování L-selektinu mononukleámími buňkami periferní krve (PBMC). PBMC se izoluje standardní procedurou při využití Ficollu. ΙΟΟμΜ roztok testovaného inhibitoru nebo jeho ředění se inkubují 20 min při 37 °C v 5 % atmosféře CO₂5 s 4 x 10⁶ PBMC/ml stimulovanými PMA. Buňky se zcentrifugují a supematant se testuje na sLselektin pomocí komerčně dostupného EL1SA kitu (R & D Systems).

Aktivita v přítomnosti 100 μΜ koncentrace inhibitoru nebo jeho ředěních se porovná s aktivitou kontroly, která je bez inhibitoru, a vyjádří se jako koncentrace inhibitoru, která z 50 % inhibuje io odvrhování L-selektinu.

Příklad G

Inhibice odvrhování s IL-1RII

Látky podle vzorce I jsou posuzovány při měření odvrhování sIL-lRII mononukleámími buňkami periferní krve (PBMC). PBMC se izolují standardní procedurou při využití Ficollu. ΙΟΟμΜ roztok testovaného inhibitoru nebo jeho ředění se inkubují 18 h při 37 °C a 5% atmosféře 20 CO₂ s 2 x 10⁶ PBMC/ml stimulovanými IL-13. Buňky se zcentrifugují a supematant se testuje na sIL-lRII pomocí komerčně dostupného ELISA kitu (R & D Systems).

Aktivita v přítomnosti ΙΟΟμΜ koncentrace inhibitoru nebo jeho ředění se porovná s aktivitou kontroly, která je bez inhibitoru, a vyjádří se jako koncentrace inhibitoru, která z 50 % inhibuje 25 odvrhování L-selektinu.

Příklad H

Inhibice odvrhování slL-6R

Látky podle vzorce 1 jsou posuzovány při měření odvrhování sIL-6R buňky HL-60. PBMC se izolují standardní procedurou při využití Ficollu. ΙΟΟμΜ roztok testovaného inhibitoru nebo jeho ředění se inkubují 24 h při 37 °C v 5% atmosféře CO₂ s 2 x 10⁶ HL-60 buňkami/ml stimulova35 nými PMA. Buňky se zcentrifugují a supematant se testuje na slL-6R pomocí komerčně dostupného ELISA kitu (R & D Systems).

Aktivita v přítomnosti ΙΟΟμΜ koncentrace inhibitoru nebo jeho ředěních se porovná s aktivitou kontroly, která je bez inhibitoru, a vyjádří se jako koncentrace inhibitoru, který z 50 % inhibuje 40 odvrhování IL-6R.

Příklad I

Inhibice odvrhování TNF-RII

Účinnost látek podle vzorce I při inhibici odvrhování TNF-RII se posuzuje následujícím postupem. ΙΟΟμΜ roztok testovaného inhibitoru nebo jeho ředění se inkubují při 37 °C v 5% atmosféře CO₂ s buňkami THP-1 (lidské monocyty) resuspendovanými v médiu RPMI 1640 s 20μΜ 50 β-merkaptoetanolem při hustotě 1 x 10⁶ buněk/ml, a stimulovanými LPS. Buňky se zcentrifugují a supematant se testuje na S TNF-RII pomocí komerčně dostupného ELISA kitu (R & D Systems).

-20CZ 297278 B6

Aktivita v přítomnosti 1 ΟΟμΜ koncentrace inhibitoru nebo jeho ředěních se porovná s aktivitou kontroly, která je bez inhibitoru, a vyjádří se jako koncentrace inhibitoru, která z 50 % inhibuje odvrhování TNF-R1I.

Příklad J

Model krysí adjuvantní artritidy

Látky podle obecného vzorce I se posuzovaly u krysího modelu adjuvantních artritidy způsobem popsaným B.B. Newbouldem (1963), Br. J. Pharmacol. 21, 127-136 a C.M. Pearsonem aF.D. Woodem (1959), Arthritis Rheum, 2, 440-459. V krátkosti, samcům krys kmene Wistar (180-200 g) se injikuje u základy ocasu Freundovo aduvans. Po dvanácti dnech se odpovídající zvířata rozdělí náhodně do experimentálních skupin. Látky podle obecného vzorce 1 jsou dávkovány ode dne 12 až do konce experimentu v den 22 buď orálně jako suspenze a 1% methylcelulóze, nebo intraperitoneálně v 0,2% karboxymethylcelulóze. Velikost zadní tlapky se měří každý druhý den ode dne 12 dále a na konci experimentu se pořídí rentgenové snímky zadní tlapky. Výsledky se vyjádří jako procentuální zvětšení velikosti tlapky v porovnání s hodnotami zde dne 12.

Příklad K

Model xenograftu myšího ovariálního karcinomu

Látky podle obecného vzorce 1 se posuzovaly u nádorového modelu xenograftu ovariálního karcinomu na základě způsobu popsaného B. Davisem a spol. (1993), Cancer Research, 53, 2087— 2091. VB krátkosti, u tohoto modelu se samicím nu/nu myši inokuluje do peritonea 10⁹ buněk OVCAR3-icr. Látky podle obecného vzorce I se podávají orální cestou jako suspenze v 1 % methylcelulóze nebo intraperitoneálně jako suspenze ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem v 0,01% Tweenu-20. Na konci experimentu se spočítají intraperitoneální buňky a zváží se jakékoliv vzniklé pevné nádory. V některých pokusech je vývoj nádoru sledován měřením nádorově specifických antigenů.

Příklad L

Krysí model karcinomu prsní žlázy

Látky podle obecného vzorce I se posuzovaly vHOSP.l krysího karcinomu prsní žlázy jako nádorového modelu (S. Eccles a spol. (1995), Cancer Research, v tisku). U tohoto modelu se samicím krys kmene CBH/cbi inokuluje 2 x 10⁴ nádorových buněk do krční žíly. Látky podle obecného vzorce 1 jsou podávány orální cestou jako suspenze v 1% methylcelulóze nebo intraperitoneálně jako suspenze ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem v 0,01% Tweenu-20. Na konci experimentu (4 až 5 týdnů) se krysy usmrtí, odstraní se jim plíce a po 20 h fixaci v Mathacamu se jednotlivé nádory spočítají.

Příklad M

Myší B16 model melanomu

Anti-metastatický potenciál látek podle obecného vzorce I se posuzuje na myším modelu B16 melanomu na C57BL/6 myších. Myším se intravenózně injikuje 2 x 10⁵ myších nádorových buněk B16/F10 sebraných z in vitro kultury. Inhibitory jsou podávány orální cestou jako sus-21 CZ 297278 B6 penze v 1% methylcelulóze nebo intraperitoneálně jako suspenze ve fyziologickém roztoku pH 7,2 pufrovaném fosfátem v 0,01% Tweenu-20. Myši se 14. den po inokulaci usmrtí, odstraní se jim plíce a zváží se před fixací v Bouinově roztoku. Počet kolonií přítomných na povrchu každé plíce se spočítá okem.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Deriváty hydroxamové a karboxylové kyseliny obecného vzorce 1

B-X-(CH₂)_n-CHR¹-(CH₂)_m-CONHOH (I), kde m je 0 a n je 1 nebo m a 1 a n je 0;

X je O nebo S(0)o_₂;

20 R¹ je H nebo skupina vybraná ze skupiny zahrnující C|_6 alkyl, C₂_6 alkenyl, aryl, arylC|_6 alkyl, heteroaryl, heteroaryl Ci_6 alkyl, heterocykloalkyl, heterocykloalkyl, alkyl, cykloalkyl a cykloalkyl Ci._6 alkyl, a uvedená skupina je popřípadě substituována R⁹;

R² je H nebo C| ₆ alkyl;

B je cykloalkenyl, heterocykloalkenyl, heterocykloalkyl nebo heterocykloalkyl Ci_6 alkyl, jejichž jakékoliv skupiny jsou popřípadě substituovány substituentem vybraným z R⁵, R⁵ C,_6 alkylu, R⁵ C2_6 alkenylu, arylu (popřípadě substituovaného R⁵), R⁵ Ct.« alkylarylu, aryl alkylu (popřípadě substituovaného R⁵), heteroaryl Ct_6 alkylu (popřípadě

30 substituovaného R⁵), R⁷ C_{2 6} alkenyl-arylu heteroarylu (popřípadě substituovaného R⁵), R⁵

Ci alkylheteroarylu, cykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵), benzo-fůzovaného cykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵), heterocykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵), benzo-fúzovaného heterocykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵) a skupin

35 a předpokladu, že B není benzhydryl, pokud X je SO a R¹ je H;

R⁵ je Ci -b alkyl, R⁷ C2^ alkenyl, atom halogenu, CN, NO2, N(R⁶)2, OR⁶, COR⁶, CO2R², CON(R⁶)2, NR⁶R⁷, S(O)0 2R⁸ nebo SO2N(R⁶)₂;

40 R⁶ je H nebo skupina vybraná ze skupiny C| 6 alkyl, aryl, aryl Cj_6 alkyl, heteroaryl, heteroaryl Cj_6 alkyl, cykloalkyl, cykloalkyl Ci_6 alkyl, heterocykloalkyl a heterocykloalkyl C|_6 alkyl, kde je uvedená skupina popřípadě substituována R⁸, COR⁸, SOo~2R⁸, CO2R⁸, OR⁸, CONR²R⁸, NR²R⁸, atomem halogenu, CN, SO2NR²R⁸ nebo NO2 a pro každý případ N(R⁶)2 jsou skupiny R⁶ stejné nebo rozdílné nebo N(R⁶)₂ je heterocykloalkyl, popřípadě

-22CZ 297278 B6 substituovaný R⁸, COR⁸, SO0_2R⁸, CO2R⁸, OR⁸, CONR², NR²R⁸, atomem halogenu, CN, SO2NR²R⁸ nebo NO2;

R⁷ je COR⁶, NOC(R⁶)2, CO2R⁸ nebo SO2R⁸;

R je Ci 6 alkyl, aryl, aryl Cj 6 alkyl, heteroaryl nebo heteroaryl C|_₆ alkyl; a

R⁹ je OR⁶, COR⁶, CO2R², NR²R⁷, S(0)o_2R⁸, SO2N(R⁶)2, ftalimidová, sukcinimidová skupina nebo skupina a jejich soli, soldáty, hydráty, chráněné aminoderiváty a chráněné karboxy deriváty.
2. Deriváty hydroxamové a karboxylové kyseliny podle nároku 1, obecného vzorce I, kde

R¹ je H nebo skupina popřípadě alkyl, alkenyl, aryl, arylalkyl, heteroaryl nebo alkyl-heteroaryl;

B je heterocykloalkyl, popřípadě substituovaný substituentem vybraným z R⁵, R⁵ C|^6 alkylu, R⁵ C2 6 alkenylu, arylu (popřípadě substituovaného R⁵), R⁵ C|_6 alkylu, R⁷ C2_6 alkenylarylu, heteroarylu (popřípadě substituovaného R⁵), cykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵), benzo-fúzovaného C6.6 cykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵), heterocykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵), benzo-fúzovaného C5_6 heterocykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵) a skupin:

R₅ je C_w alkyl, R⁵ C2_6 alkenyl, atom halogenu, CN, NO2, N(R⁶)2, OR⁶, R⁷, OC^ alkyl, COR⁶, CO2R², CON(R⁶)2 NR⁶R⁷, S(O)d_2 nebo SO2N(R⁶)2; a

R⁶ je H, alkyl, aryl, arylalkyl, heteroaryl nebo heteroarylalkyl.
3. Deriváty hydroxamové a karboxylové kyseliny podle nároku 1 nebo 2, obecného vzorce I, kde X je S(O)₀ .₂.
4. Deriváty hydroxamové a karboxylové kyseliny podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 3, obecného vzorce I, kde

R¹ je H nebo skupina (popřípadě substituovaná R⁹) vybraná ze skupiny Ci_6 alkyl, C_{2 6} alkenyl, aryl C_r6 alkyl, heteroaryl C]_6 alkyl, heterocykloalkyl Ci_6 alkyl a cykloalkyl Cj_6 alkyl.

-23 CZ 297278 B6
5. Deriváty hydroxamové a karboxylové kyseliny podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 4, obecného vzorce I, kde

5 B je cykloalkenyl nebo heterocykloakenyl, jejichž kterákoliv skupina je popřípadě substituována substituentem vybraným z R^s, R⁵ Ci_6 alkylu, arylu (popřípadě substituovaného R⁵), R⁵ Ci_6 alkylaíýlu, aryl, C|_6 alkylu (popřípadě substituovaného R⁵), heteroaryl C| 6 alkylu (popřípadě substituovaného R⁵), heteroarylu (popřípadě substituovaného R⁵), R⁵ Ci_$ alkylheteroarylu, cykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵), benzofúzovaného cykloalkylu (popřípadě substituo10 váného R⁵), heterocykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵), benzo-fúzovaného heterocykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵) a skupin:
6. Deriváty hydroxamové a karboxylové kyseliny podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 5, obecného vzorce I,

R⁵ je atom halogenu, CN, NO2, N(R⁶)2, OR⁶, COR⁶, CO2R², CON(R⁶)2, NR⁶R⁷ nebo S(O)₀_₂R⁸.
7. Deriváty hydroxamové a karboxylové kyseliny podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 6, obecného vzorce I, kde R⁷ je COR⁶.
8. Deriváty hydroxamové a karboxylové kyseliny podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 7, obecného vzorce I, kde R⁹ je OR⁶, CO₂R² ftalimidová, sukcinimidová skupina nebo uvedená skupina.

25
9. Deriváty hydroxamové a karboxylové kyseliny podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 8, obecného vzorce I, kde m je 0;

30 R⁵ je C]_6 alkyl, C2_6 alkenyl, atom halogenu, CN, NO2, N(R⁶)2, OR⁶, COR⁶, CO2R⁶, CON(R⁶)2, NR⁶R⁷, S(O)0 2R^s nebo SO2N(R⁶)₂ a

R⁹ je OR⁶, COR⁶, CO2R², CON(R⁶)2, NR⁶R⁷, S(0)o_₂R⁸, SO2N(R⁶)2, ftalimidová nebo sukcinimidová skupina.
10. Deriváty hydroxamové a karboxylové kyseliny podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 9, obecného vzorce 1, kde

X je SO₂ a

R⁵ je COR⁶.
11. Deriváty hydroxamové a karboxylové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, obecného vzorce I, kde

-24CZ 297278 B6

X je SO₂ a

B je cykloaíkenyl, heterocykloalkenyl, heterocykloalkyl nebo heterocykloalkyl Ci_6 alkyl, jejichž jakákoliv skupina je popřípadě substituována substituentem vybraným z R⁵ Cj_6 alkylu, R⁵ C2_6 alkenylu (popřípadě substituovaného R⁵), R⁵ C|_<, alkylarylu, aryl C|_6 alkylu (popřípadě substituovaného R⁵), heteroaryl Ci_6 alkylu (popřípadě substituovaného R⁵), R⁷C2 6 alkenylarylu heteroarylu (popřípadě substituovaného R⁵), R⁵ Ci ₆ alkylheteroarylu, cykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵, benzofúzovaného cykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵), heterocykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵), a benzofúzovaného heterocykloalkylu (popřípadě substituovaného R⁵) za předpokladu, že B neznamená nesubstituovaný cykloalkyl.
12. Derivát hydroxamové a karboxylové kyseliny, kterým je 4-[4-(hydroxyaminokarbonyl)methoxy-3,5-dimethylfenyl]-2-methyl-l(2H)-ftaIazinon.
13. Derivát hydroxamové a karboxylové kyseliny, který je vybrán z

N-hydroxyamidu 5-fenyl-2-((tetrahydropyran-4--ylsulfonyl)methyl)pentanové kyseliny, N-hydroxyamidu 2-(( l-benzoylpiperidin-4-yl)sulfonylmethyl)-5-fenylpentanové kyseliny, N-hydroxyamidu 2-((l-/íjrc-butyloxykarbonylpiperidin^-yl)sulfonylmethyl)-5-fenylpentanové kyseliny,

N-hydroxyamidu 2-((pyrrolidin-l-yl)sulfonylmethyl)-5-fenylpentanové kyseliny, trifluoracetát N-hydroxyamidu 2-((piperidinM-yl)sulfonylmethyl)-5-fenylpentanové kyseliny, N-hydroxyamidu 2-((1 -benzylpiperidin-4-yl)sulfonylmethyl)-5-fenylpentanové kyseliny a N-hydroxyamidu 2-((l-(4-kyanobenzyl)piperidin-4—yl)sulfonylmethyl)-5-fenylpentanové kyseliny.
14. Derivát hydroxamové a karboxylové kyseliny obecného vzorce I, podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 13 ve formě jediného enantiomeru nebo diastereomeru.
15. Farmaceutický přípravek pro použití v terapii, vyznačující se tím, že obsahuje jakýkoliv derivát hydroxamové a karboxylové kyseliny obecného vzorce I, podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 14 a farmaceuticky přijatelné ředidlo nebo nosič.
16. Použití derivátů hydroxamové a karboxylové kyseliny, obecného vzorce I, podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13 pro výrobu medikamentů pro léčbu nebo prevenci stavu souvisejícího s matrixovými metaloproteinázami nebo způsobených TNF-α nebo enzymy účastnícími se odvrhování L-selektinu, TNF receptorů nebo 1L-6 receptorů.
17. Použití podle nároku 16, kde je stav vybrán z rakoviny, zánětu a zánětlivých chorob, tkáňové degenerace, periodontální choroby, oftalmologické choroby, dermatologických poruch, horečky, kardiovaskulárních následků, hemoragie, koagulace a odpovědi akutní fáze, kachexie, anorexie, akutní infekce, HIV infekce, šokových stavů, reakcí štěpu vůči hostiteli, autoimunitních chorob, reperfuzních poškození, meningitidy, migrény a na aspirinu-nezávislé anti-trombóze.
18. Použití podle nároku 16, kde je stav vybrán z růstu nádoru, angiogeneze, invaze a šíření nádoru, metastáze, maligních ascitů a maligních pleurálních výpotků.
19. Použití podle nároku 16, kde je stav vybrán z mozkové ischémie, ischemické choroby srdeční, revmatoidní artritidy, osteoartritidy, osteoporózy, astma, roztroušené sklerózy, neurodegenerace, Alzheimerovy choroby, aterosklerózy, mrtvice, vaskulitidy, Crohnovy choroby a ulcerativní kolitidy.

-25CZ 297278 B6
20. Použití podle nároku 16, kde je stav vybrán ze komeální ulcetrace, retinopatie a hojení ran po chirurgickém zákroku.
21. Použití podle nároku 16, kde je stav vybrán zpsoriázy, atopické dermatidy, chronických 5 vředů a epidermolytické bulózy.
22. Použití podle nároku 16, kde je stav vybrán z periodontitidy a zánětu dásní.
23. Použití podle nároku 16, kde je stav vybrán zrinitidy, alergické konjuktivitidy, ekzému io aanafylaxie.
24. Použití podle nároku 16, kde je stav vybrán zrestenózy, městnavého srdečního selhání, endometriózy, aterosklerózy a endosklerózy.