JP5956709B2 - 遺伝子ベクター - Google Patents
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Description
本発明の一態様に従って、遺伝子治療、遺伝子導入および/またはmiRNA配列標的を含むトランスジーンの発現の調節などの遺伝子操作手法にとって好適な遺伝子導入ベクターが提供される。このmiRNAを、前記トランスジーンに「機能し得る形で連結する」。用語「機能し得る形で連結された」とは、記載の成分が、その意図される様式でそれらが機能することを可能にする関係にあることを意味する。
遺伝子導入および治療のためのトランスジーン発現のために、レンチウイルスベクターを含むウイルスなどのベクターを、miRNA標的配列と共に工学的に操作して、細胞型特異的な内因性miRNAにより認識されるようにし、かくして、細胞のサブセット中でのトランスジーン発現を制御することができる。さらに、miRNA標的配列の組合せを用いて、高度に特異的な細胞発現パターンを有するベクターを取得することができる。
本発明を、添付の図面に例示されるような好ましい実施形態を参照して、例のみを用いて、さらに説明する(図面の簡単な説明については別節を参照)。
miRNAは、植物および動物のゲノム中にコードされる小さいRNA分子である。これらの高度に保存された約21マーのRNAは、特定のmRNAに結合することにより、遺伝子の発現を調節する(HeおよびHannon, 2004)。
・マイクロRNA(miRNA)は、転写後レベルで遺伝子発現を負に調節する約21〜25ヌクレオチドの小さいRNAのファミリーである。
・miRNAファミリーの基本メンバーであるlin-4およびlet-7は、シノラブディス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)幼虫発達の一時的調節の欠損についての遺伝子スクリーニングを介して同定された。
・ゲノム規模でのクローニングの努力のため、現在では数百のmiRNAが、ハエなどのほとんど全ての後生動物、植物および哺乳動物において同定された。
・miRNAは、多様な発達および生理学的プロセスの間に一時的かつ空間的に調節される発現パターンを示す。
・特性評価された動物のmiRNAの大多数は、今までのところ、それらの標的mRNAからのタンパク質合成に影響する。一方、研究された多くの植物のmiRNAは、今までのところ、それらの標的の切断を指令する。
・miRNAとその標的の間の相補性の程度は、少なくとも部分的には、調節機構を決定する。
・動物においては、miRNAの一次転写物は2つのRNase-III酵素、DroshaおよびDicerにより、成熟miRNA鎖とその相補鎖(miRNA*)の両方を含む小さい、不完全なdsRNA二本鎖(miRNA:miRNA*)に連続的に加工される。成熟miRNAの5'末端での相対的不安定性は、エフェクター複合体であるRNA誘導性サイレンシング複合体(RISC)への成熟miRNAの非対称的集合体を誘導する。
・Agoタンパク質は、RISCの重要な成分である。種々の後生動物ゲノムにおいて相同な複数のAgoは、関連するが特異的である生物学的機能を実行する複数のRISCの存在を示唆する。
・miRNA標的の生物情報学的予測は、miRNAの機能を研究するための重要な道具を提供してきた。
過去10年の間、遺伝子治療は数百の臨床試験において疾患の治療に適用されてきた。遺伝子をヒト細胞に送達するための様々な道具が開発されてきた;特に、レンチウイルスなどの遺伝子操作されたレトロウイルスは、現在、遺伝子送達のための最もよく知られている道具である。多くの系は、目的の遺伝子を受け入れることができるベクターならびにウイルス構造タンパク質およびベクターを含む感染性ウイルス粒子の生成を可能にする酵素を提供することができるヘルパー細胞を含む。レトロウイルス科は、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ゲノム構造、病原性、ならびに宿主範囲において異なるレトロウイルスのファミリーである。この多様性は、様々な治療適用を開発するために様々な生物学的特性を有するウイルスを使用する機会を提供する。任意の送達道具と同様、効率、特定の組織または細胞型を標的化する能力、目的の遺伝子の発現、およびレトロウイルスに基づく系の安全性が、遺伝子治療の適用の成功にとって重要である。近年、これらの研究領域には多大な努力が捧げられてきた。遺伝子発現を変化させ、送達を標的化し、ウイルス力価を改善し、および安全性を増加させるための様々な改変が、レトロウイルスに基づくベクターおよびヘルパー細胞に行われてきた。本発明は、この設計プロセスが目的の遺伝子をそのようなウイルスベクターに効率的に送達するように働くという点で該プロセスにおける改善を示す。
最初に開発されたヘルパー細胞系においては、全てのウイルス遺伝子を、1個のヘルパー構築物から発現させた。これらのヘルパー細胞の例は、C3A2および-2である。これらの細胞系のためのヘルパー構築物は、パッケージングシグナルを欠いたクローン化されたプロウイルスDNAであった。これらのヘルパー細胞は、レトロウイルスベクターの効率的な増殖を支援することができる。しかしながら、これらのヘルパー細胞に関する主要な問題は、複製可能ウイルスがウイルスベクターの増殖の間に頻繁に生成され得るということである。このヘルパー構築物は、多くのウイルスゲノムを含み、かくして、レトロウイルスベクターと有意な配列相同性を有する。配列相同性は、ヘルパー構築物とレトロウイルスベクターの間の組換えを容易にして、複製可能ウイルスを生成することができる。ヘルパーRNAはパッケージングシグナルを欠くが、それでも低い効率(RNAを含有するものよりも約100〜1,000倍低い)でビリオン中にパッケージングすることができる。レトロウイルスの組換えは、両親からの遺伝子情報を含むDNAコピーを生成する2個の同時パッケージングされたウイルスRNAの間で頻繁に起こる。ヘルパーRNAおよびベクターRNAを同じビリオンにパッケージングする場合、2個のRNA間の配列相同性の大きい領域は、逆転写の間の相同組換えを容易にして、複製可能ウイルスを生成することができる。同様の組換え事象は、より低い効率で、ヘルパーRNAと、内因性ウイルスに由来するRNAとの間でも起こり、複製可能ウイルスを生成することができる。
複製可能ウイルスの生成に関連する安全性の懸案事項は、CRIP、GP+envAm12、およびDSNなどの「スプリットゲノム」を用いる多くのヘルパー細胞系の設計を誘発してきた。これらのヘルパー細胞においては、ウイルスのGag/Gag-Polポリタンパク質は一方のプラスミドから発現され、Envタンパク質は他方のプラスミドから発現される。さらに、2個のヘルパー構築物は、レトロウイルスベクターとの配列相同性を減少させるか、または排除するウイルスのシス作用エレメントの欠失も含む。これらのヘルパー細胞においては、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子は2個の異なる構築物に別れ、ウイルスのシス作用エレメントは該ベクター中に位置する。従って、いくつかの組換え事象は、ウイルスゲノムを再構成するように起こらなければならない。さらに、相同性の領域を減少させることにより、これらの組換え事象が起こる確率が低下する。従って、スプリットゲノムヘルパー構築物を含むヘルパー細胞は、1ゲノムヘルパー構築物を含むヘルパー細胞よりも安全であると考えられる。
ウイルスタンパク質を構成的に発現する上記のヘルパー細胞系と対照的に、誘導性様式でウイルスタンパク質を発現するいくつかのヘルパー細胞系が設計されてきた。誘導性ヘルパー細胞系の生成に関する1つの論理的根拠は、いくつかのウイルスタンパク質が細胞傷害性であり、高レベルで容易に発現させることができないことである。誘導性の系を用いることにより、細胞傷害性タンパク質の発現を、ウイルスが増殖する段階に限定することができる。細胞傷害性タンパク質の発現を制御することにより、高いウイルス力価を達成することができる。誘導性ヘルパー細胞の例としては、293GPG細胞およびHIV-1ヘルパー細胞系が挙げられる。
効率的なトランスフェクション方法の開発と共に、一過性トランスフェクション系もレトロウイルスベクターの増殖のために開発されてきた。これらの系においては、一般的には、ヘルパー機能は、一方はgag-polを発現し、他方はenvを発現する2個の異なる構築物から発現される。これらの2個の構築物は、一般的には、わずかな配列相同性を有する。レトロウイルスベクターとヘルパー構築物を、細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの数日後にウイルスを収穫する。
偽型とは、1つのウイルスに由来するウイルスゲノムおよび異なるウイルスに由来するウイルスタンパク質の一部(または全部)を含むウイルス粒子を指す。偽型の最も一般的な形態は、別のウイルスのエンベロープタンパク質を用いる1つのウイルスを含む。いくつかのヘルパー細胞系は、1つのウイルスに由来するgag-polおよび別のウイルスに由来するenvを発現するヘルパー構築物を含む。Gagポリタンパク質はウイルスRNAを選択するため、増殖させようとするウイルスベクターは、これらの細胞中で発現されるGagポリタンパク質により認識されるRNAを含む。しかしながら、産生されるウイルス粒子は、別のウイルスに由来するEnvタンパク質を含む。従って、これらのウイルス粒子は、異種エンベロープタンパク質と相互作用することができる受容体を発現する細胞にのみ感染することができる。例えば、ヘルパー細胞系PG13は、MLVに由来するgag-polおよびテナガザル白血病ウイルス(GaLV)に由来するenvを発現する。PG13細胞系はMLV Gagポリタンパク質を発現するため、MLVに基づくレトロウイルスベクターを効率的にパッケージングすることができる。異なるファミリーのウイルスに由来するいくつかのエンベロープがレトロウイルスを偽型化し、感染性ウイルス粒子を生成することができることも示された。例えば、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、ラブドウイルスのGタンパク質を用いて、偽型レトロウイルスベクターを作成することができる。これらのVSV G偽型ウイルスは、非常に広範な宿主範囲を示し、通常はレトロウイルスに感染することができない様々な細胞に感染することができる。ベクターの偽型化に用いることができる他のエンベロープは、以下のウイルスのものである:造血細胞を効率的に標的化するRD114内因性ネコレトロウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、狂犬病ウイルス、エボラおよびモコラウイルス、ロスリバーおよびセムリキ森林熱ウイルス、ならびにバキュロウイルスgp64エンベロープ。
ウイルスエンベロープタンパク質と細胞受容体との相互作用は、ウイルスの宿主範囲を決定する。ウイルスEnvを改変することにより、特定の細胞型にウイルス送達を標的化するための戦略が開発されてきた。翻訳および改変後、EnvのSU部分は細胞受容体と相互作用する。EnvのSU部分の改変は、SUのコード領域の一部を欠失させること、およびそれを他のタンパク質の領域で置換することにより達成されることが多い。EnvのSU部分を改変するのに用いられてきたタンパク質としては、エリスロポエチン、ヘレグリン、インスリン様増殖因子I、および種々のタンパク質に対する一本鎖可変フラグメント抗体が挙げられる。
いくつかの最近開発された系は、レトロウイルスベクターの増殖のためのハイブリッド手法を使用する。ヘルパー細胞系を用いて、いくつかのウイルスタンパク質を構成的に発現させるが、他のウイルスタンパク質を一過性トランスフェクションによりヘルパー細胞系に導入する。例えば、レトロウイルスベクターを、MLV gag-polを構成的に発現するヘルパー細胞系に導入することができる。レトロウイルスベクターを増殖させるために、VSV Gを発現するように設計されたプラスミドを、一過性トランスフェクションにより前記系に導入することができる。このテーマ上の別のバリエーションとして、レトロウイルスベクター自身は、いくつかのウイルスタンパク質(例えば、Gag/Gag-Pol)をコードしてもよく、またヘルパー細胞系は他のウイルスタンパク質(Env)を提供してもよい(Boerkoelら、1993)。レトロウイルスヘルパー構築物を送達するために他のウイルスを使用する手法を用いることもできる。例えば、ヘルパー機能に役立つレトロウイルスのgag、pol、およびenvを含むように改変された単純ヘルペスウイルスを作製した。同様に、アデノウイルスベクターおよびセムリキ森林熱ウイルスに由来する発現ベクターも用いて、MLVウイルスタンパク質をコードする遺伝子をヘルパー細胞に送達してきた。
目的の遺伝子(トランスジーン)を担持することができるベクターを作成するために、多くのレトロウイルスが改変されてきた。一般的には、ウイルスベクターは、ウイルスの複製および遺伝子発現に必要とされるシス作用エレメントの全部を含む。遺伝子送達の成功を確保するには、いくつかのウイルスに由来するベクター中に、さらなるエレメントも必要である。これらのシス作用エレメントのための要件は、これらのウイルスの生物学のより優れた理解から明らかとなったことが多い。さらに、細菌細胞中での操作を容易にするために、多くのレトロウイルスベクターは、プラスミドの形態にあり、細菌の複製起点および抗生物質耐性遺伝子を含む主鎖を有する。典型的には、以下の工程を実行して、レトロウイルスベクターからウイルス粒子を産生する。最初に、ベクターDNAを、トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリポフェクションによりヘルパー細胞に導入する。ヘルパー細胞にDNAを導入した後、ベクターDNAはヘルパー細胞に組込まれ、発現される。ウイルスRNAは5'LTRから発現され、2つのR領域間の配列の全部からなる。このウイルスRNAは、パッケージングシグナルを含み、ウイルス粒子中に効率的にパッケージングされる。レトロウイルス複製の間に、2個のLTRの外側のプラスミド主鎖配列は、標的細胞に移らない。種々のレトロウイルスに由来するいくつかのレトロウイルスベクターの基本的構造を、以下に記載する。
いくつかの最も広く用いられるレトロウイルスベクターを説明するために、3つの異なる癌ウイルスに由来するベクターを本明細書で説明する。癌ウイルスは、分裂している細胞にのみ感染することができる;従って、癌ウイルスに由来するベクターのみを用いて、分裂する細胞中に遺伝子を効率的に送達することができる。時には、細胞増殖のための要件を、迅速に分裂する細胞(例えば、癌細胞)を選択的に標的化するための利点として用いることができる。
癌ウイルスとは対照的に、いくつかのレンチウイルスは、分裂していない、休止状態の細胞に感染することが示されている。レンチウイルスは、その複製周期の調節のために補助タンパク質を発現する必要がある複雑なレトロウイルスである。これらの補助タンパク質のいくつかは、ウイルスゲノムの領域に結合して、遺伝子発現を調節する。従って、レンチウイルスに基づくベクターは、効率的なウイルス複製および遺伝子発現が起こり得るように、さらなるシス作用エレメントを組込む必要がある。レンチウイルスに基づくベクターの例として、HIV-1およびHIV-2に基づくベクターを以下に記載する。HIV-1ベクターは、単純なレトロウイルス中にも認められるシス作用エレメントを含む。gagオープンリーディングフレーム中に伸長する配列は、HIV-1のパッケージングにとって重要であることが示された。従って、HIV-1ベクターは、翻訳開始コドンを突然変異させたgagの関連部分を含むことが多い。さらに、多くのHIV-1ベクターは、RREを含むenv遺伝子の一部も含む。RevはRREに結合し、核から細胞質への完全長mRNAまたは1回スプライシングされたmRNAの輸送を許容する。Revおよび/またはRREの非存在下では、完全長HIV-1のRNAは核に蓄積する。あるいは、Mason-Pfizerサルウイルスなどの特定の単純なレトロウイルスに由来する構成的輸送エレメントを用いて、RevおよびRREの要求を軽減することができる。HIV-1のLTRプロモーターからの効率的な転写には、ウイルスタンパク質Tatが必要である。従って、HIV-1のLTRからの効率的な転写が必要である場合には、Tatが標的細胞中で発現されることが重要である。Tat発現の必要性を、レトロウイルスベクターからTat遺伝子を発現させることにより満たすことができる。あるいは、異種内部プロモーターから目的の遺伝子を発現させることにより、Tat発現の必要性を回避することができる。
泡沫状ウイルスは、その複製周期における多くの特徴が、癌ウイルスおよびレンチウイルスのものと異なる点で、異例のレトロウイルスである。これらのウイルスは培養細胞にとって毒性的であり得るが、泡沫状ウイルスはいずれも宿主において疾患を引き起こさないことが知られている。
レトロウイルスベクターは、遺伝子治療専門家にとって様々な目的に役立つ多くの異なる改変を含んでもよい。これらの改変を、2個以上の遺伝子の発現を許容し、遺伝子発現を調節し、ウイルスベクターを活性化または不活性化し、ウイルス配列を排除して、複製可能ウイルスの生成を回避するために導入することができる。これらの改変のいくつかの例を、以下に記載する。
1.U3プロモーターにより駆動される遺伝子発現。完全長ウイルスRNAを、5'LTRのU3領域中に位置するレトロウイルスプロモーターから発現させる。ウイルスRNAは、R、U5、5'非翻訳領域、目的の遺伝子、3'非翻訳領域、U3、およびRを含む。5'および3'非翻訳領域の間に挿入された遺伝子を、U3プロモーターから転写される完全長RNAから翻訳することができる。
LTR配列がレトロウイルスベクター中で複製されるという事実を活用して、2コピーの目的の遺伝子を含むベクターを構築してきた。例えば、2コピーベクターの第1のセットは、ウイルスの上流のU3領域中に目的の遺伝子を含む。これらの遺伝子を、RNAポリメラーゼIIプロモーターまたはRNAポリメラーゼIIIプロモーターを用いて発現させる。この戦略は、遺伝子発現のレベルを首尾よく増加させることが示された。2コピーベクターの別の例においては、前記ベクターはR領域の中央に目的の遺伝子を含む。
遺伝子治療のためにレトロウイルスベクターを用いることに関する1つの安全性の懸案事項は、非標的組織への治療用ベクターの不注意な拡散を誘導し得る複製可能ウイルスが、ベクターの増殖の間に生成され得ることである。この懸案事項に取り組むために、1クラスのベクターを、自己不活性化を受けるように設計した。その原理は、遺伝子送達後、このベクターは別の周回の複製を完了させるのに必要とされるいくつかのシス作用エレメントを欠失するであろうということである。従って、複製可能ウイルスの存在下でさえ、これらのベクターを他の標的細胞に効率的に導入することができない。複製可能ウイルスの生成は、時に欠損ヘルパープラスミドと目的の遺伝子をコードするベクターとの組換えを含む。従って、自己不活性化ベクターの別の可能性のある利益は、それが複製可能ウイルスを生成する確率を低下させ得ることである。
遺伝子産物の特性および効果に応じて、目的の遺伝子をヘルパー細胞中で不活性化し、それを標的細胞に送達した後、この遺伝子を活性化するのが望ましい。例えば、目的の遺伝子からの産物が毒性的である場合、ヘルパー細胞中での該遺伝子の発現は、毒性をもたらし、ウイルス産生を十中八九低下させるか、または排除するであろう。一連のベクターを作製して、遺伝子を同時に活性化し、遺伝子送達の間に該ベクターを不活性化した。これは、逆転写の間に直接反復される配列の頻繁な欠失により達成される。直接反復される配列がウイルス中に存在する場合、1コピーの直接反復物および2個の反復物の間の配列の全部を、逆転写の間に高頻度で欠失させることができる。逆転写酵素のこの特性を活用して、自己活性化および自己不活性化レトロウイルスベクターを作製した。
遺伝子治療専門家の重要な目標は、遺伝子送達を特定の細胞型または組織に標的化するための手段を開発することである。レトロウイルスベクターを用いて遺伝子送達を標的化する努力においては、少なくとも2つの戦略が用いられてきた。1つの戦略を、細胞型特異的受容体と相互作用する天然または遺伝子操作されたエンベロープタンパク質を用いることにより、宿主細胞中へのウイルス進入の時点で遺伝子送達を制御するように設計する。別の戦略を、組織特異的プロモーターを用いることにより特定の細胞型における治療用遺伝子の発現を制御するように設計する。
特定の組織において活性であるか、または特定の試薬に応答するプロモーターを用いて、目的の遺伝子の発現を調節することができる。これらのプロモーターを、レトロウイルスベクターのLTRの間に挿入することができる。あるいは、調節されたプロモーターを用いて、U3領域中のウイルスプロモーターを置換することができる。内部組織特異的プロモーターを有するレトロウイルスベクターの設計は、内部プロモーターを含む他のレトロウイルスベクターのものと類似している。
1.エンベロープ選択およびウイルスの宿主範囲に関する考慮。ウイルスエンベロープタンパク質の性質は、特定のウイルスが標的細胞に進入することができるかどうかを決定する。従って、ウイルス産生に用いられるであろうエンベロープタンパク質の選択の前に、標的細胞が正しい細胞表面受容体を有するかどうかを考慮することが重要である(上記で考察されたように)。
アデノウイルスは、RNA中間体を通過しない二本鎖の線状DNAウイルスである。全て比較可能な遺伝子組織化を示す遺伝子配列相同性に基づいて6つの亜群に分割される、50種を超えるアデノウイルスの異なるヒト血清型が存在する。ヒトアデノウイルスC群血清型2および5(95%の配列相同性を有する)は、アデノウイルスベクター系において最も一般的に用いられ、通常、若年者における上気道感染と関連している。
1. ウイルス株
本発明のHSVベクターは、例えば、HSV1もしくはHSV2株、またはその誘導体、好ましくはHSV1に由来するものであってよい。誘導体としては、HSV1およびHSV2株に由来するDNAを含む型間組換え体が挙げられる。誘導体は、HSV1またはHSV2ゲノムに対して少なくとも70%の配列相同性を有するのが好ましく、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは95%の配列相同性を有する。
ICP27が欠損したHSVウイルスを、ICP27を発現する細胞系、例えば、V27細胞(RiceおよびKnipe, 1990, J. Virol 64: 1704-1715)または2-2細胞(Smithら、1992, Virology 186: 74-86)中で増殖させる。ICP27を発現する細胞系を、哺乳動物細胞、例えば、Vero細胞もしくはBHK細胞を、該細胞中で発現させることができる機能的HSV ICP27遺伝子を含む、ベクター、好ましくは、プラスミドベクター、および選択マーカー、例えば、ネオマイシン耐性をコードするベクター、好ましくは、プラスミドベクターで同時トランスフェクトすることにより作製することができる。次いで、選択マーカーを有するクローンをスクリーニングして、当業者には公知の方法(例えば、RiceおよびKnipe, 1990に記載のもの)を用いて、例えば、ICP27-突然変異HSV株の増殖を支援する能力に基づいて、どのクローンが機能的ICP27も発現することができるかを決定する。
HSV遺伝子を、当業界でよく知られたいくつかの技術により機能的に不活性にすることができる。例えば、欠失、置換または挿入、好ましくは、欠失により、それらを機能的に不活性にすることができる。欠失は、遺伝子の一部または遺伝子全部を除去してもよい。挿入された配列は、上記の発現カセットを含んでもよい。
本発明のトランスジーンおよびマイクロRNAを、NOIを必須遺伝子に挿入する場合、別のHSV必須遺伝子(2.に記載)を担持する細胞系の使用を必要とし得るウイルスを依然として増殖させることができる限り、HSVゲノム中の任意の位置に挿入することができる。
本発明において用いることができる他のウイルスベクターとしては、アデノ関連ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ワクシニアウイルスおよびSV40に基づくウイルスベクターが挙げられる。
miRNAおよびトランスジーンを患者に投与するか、またはこれを用いて、トランスジェニック植物もしくは非ヒト動物を作製することができる。用語「投与された」は、ウイルスまたは非ウイルス技術による送達を含む。ウイルス送達機構としては、限定されるものではないが、上記のアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターなどが挙げられる。非ウイルス送達機構としては、脂質媒介性トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクション、陽イオン顔面性両親媒性物質(CFA)およびそれらの組合せが挙げられる。
本発明に従うベクター系による1個以上の治療用遺伝子の送達を、単独で、または他の治療もしくは治療の成分と組合わせて用いることができる。
ここで用いた全てのmiRNAの配列は、miRNAレジストリ(Griffiths-Jonesら、2006) (http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml)から取得した 。miRNA Target(mirT)配列を、以下のように構築した:
4x.mir-142-3p.Target(mir-142-3pT)に対しては、以下のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。
pCCL.sin.cPPT.PGK.GFP.WPRE.mirTを作製するためのpCCL.sin.cPPT.PGK.GFP.WPRE、
pCCL.sin.cPPT.PGKas.GFPas.mirTas.CTEas.polyAasを作製するためのpCCL.sin.cPPT.PGKas.GFPas.CTEas.polyAas、
pCCL.sin.cPPT.PGK.ΔLNGFR.mirT.WPREを作製するためのpCCL.sin.cPPT.PGK.ΔLNGFR.WPRE、
pRRL.sin.cPPT.CMV.hFIX.WPRE.mirTを作製するためのpRRL.sin.cPPT.CMV.hFIX.WPRE、
pRRL.sin.cPPT.ET.hFIX.WPRE.mirTを作製するためのpRRL.sin.cPPT.ET.hFIX.WPRE、
pCCL.sin.cPPT.polyA.CTE.mirT.eGFP.minhCMV.hPGK.deltaNGFR.Wpreを作製するためのpCCL.sin.cPPT.polyA.CTE.eGFP.minhCMV.hPGK.deltaNGFR.Wpre。
DNAの大規模調製を、Marlingen Biosciences内毒素不含高純度プラスミドマキシプレップ系を用いて行った。
VSV偽型第3世代LVを、293T細胞への一過性4プラスミド同時トランスフェクションにより作製し、記載のようにして(De PalmaおよびNaldini, 2002)超遠心により精製した。GFPの発現力価を、限界希釈により293T細胞上で算出した。ベクター粒子を、HIV-1 gag p24抗原イムノキャプチャー(NEN Life Science Products)により測定した。濃縮されたベクター発現力価は、全てのベクターについて、0.15〜1.5 x 1010形質導入ユニット293T(TU)/mlであった。
293T細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS;Gibco)およびペニシリン-ストレプトマイシンおよびグルタミンの組合せを補給したIscoveの改変ダルベッコ培地(IMDM;Sigma)中で維持した。U937単球細胞系を、上記のものを補給したRPMI(完全RPMI)中で維持した。ヒト樹状細胞の一次培養物を、以前に記載のようにして末梢血から単離し、GM-CSFおよびIL-4を補給した完全RPMI中で維持した(Benderら、1996)。
「Blood & Cell Culture DNA Midi Kit」(Qiagen, Hilden, Germany)を製造業者の説明書に従って用いることにより、細胞および組織からDNAを抽出した。「Tri Reagent」(Sigma, Saint Louis, Missouri)を製造業者の説明書に従って用いることにより、細胞からRNAを抽出した。
ノーザンブロットを、以前に記載のようにして(De PalmaおよびNaldini, 2002)実施した。20マイクログラムの全RNAをローディングし、100 ngの32P標識されたGFPプローブを用いた。
マウス組織から抽出された100 ngの鋳型DNAまたは細胞系から抽出された200 ngの鋳型DNAから出発するリアルタイムPCRにより、ベクターのC/Gを定量した。分析に用いたプライマーとプローブのセットは以下のものである:
LV主鎖:750 nmolのフォワードプライマー(F):5'TGAAAGCGAAAGGGAAACCA3'、200 nmolのリバースプライマー(R):5'-CCGTGCGCGCTTCAG-3'、200 nmolのプローブ(P):5'-VIC-CTCTCTCGACGCAGGACT-MGB-3';マウスゲノムDNA:β-アクチン:300 nmolのF:5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'、750 nmolのR:5'-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3'、200 nmolのP:5'-VIC-CACTGCCGCATCCTCTTCCTCCC-MGB-3';ヒトゲノムDNA:hTERT:200 nmolのF:5'-GGCACACGTGGCTTTTCG-3'、600 nmolのR:5'-GGTGAACCTCGTAAGTTTATGCAA-3'、200 nmolのP:5'-6FAM-TCAGGACGTCGAGTGGACACGGTG-TAMRA-3'。
RT-PCRのためのSuperscript III First-Strand Synthesis System(Invitrogen, Carlsbad, CA)のランダムヘキサマープロトコルを用いて、2μgの全RNAに対して逆転写を実行した。定量的PCR分析を実施して、GFP mRNAの濃度を定量し、正規化のためにGAPDH発現を用いた。2セットのプライマーおよびプローブを用いた:
GFPについては、20X Assay on Demand(Applied Biosystems)、F:5'-CAGCTCGCCGACCACTA-3'、R: 5'-GGGCCGTCGCCGAT-3'およびP: 5'-6FAM-CCAGCAGAACACCCCC-MGB-3'、およびGAPDHについては: 200nmolのF: 5-ACCACAGTCCATGCCATCACT-3'、900nmolのR: 5'-GGCCATCACGCCACAGSTT-3'および200nmolのP: 5'-TET-CCACCCAGAAGACTGTGGATGGCC-TAMRA-3'。ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System(Applied Biosystems)において、反応を3重に実行した。
製造業者の説明書に従って、Applied Biosystems Taqman microRNA Assay系を用いて、miRNA検出を行った。結果をhas-mir-16に対して正規化し、let-7aを較正物質として用いた。le-7aの発現と比較して値を報告する。
形質導入した293T細胞を、安定状態のGFP発現に到達させるため、そして偽形質導入を除外するために、FACS分析の前の少なくとも14日間増殖させた。FACS分析の前に、接着細胞を、0.05%トリプシン-EDTAを用いて分離し、洗浄し、2%FBSを含むPBS中に再懸濁した。懸濁液中で増殖させた細胞を洗浄し、2%FBSを含むPBS中に再懸濁した。免疫染色のために、105個の細胞を、PBS、5%ヒト血清、2%FBS中、4℃で15分間ブロッキングした。ブロッキング後、R-フィコエリトリン(RPE)結合抗体(抗ΔLNGFRもしくは抗CD45、BD Pharmingen, San Diego, CA)を添加し、細胞を4℃で30分間インキュベートし、洗浄し、Beckman Coulter Cytomics FC500 (Beckman Couler, Miami, FL)上での2色フローサイトメトリーにより分析した。
6〜8週齢のヌードマウスおよびBalb/cマウスを、Charles Rivers Laboratories (Milan, Italy)から購入し、特定病原体未感染の条件で維持した。B型血友病(第IX凝固因子ノックアウト)マウスは、Salk Institute (La Jolla, CA)から獲得したものであり、特定病原体未感染の条件で繁殖させ、維持した。ベクター投与を、マウスへの尾静脈注入により行った。全ての動物への手順は、San Raffaele病院の機関内動物管理使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)により承認されたプロトコルに従って実施した。
トランスジェニックマウスを、記載のように(Loisら、2002)LVを用いて作製した。簡単に述べると、雌のFVBマウスを、妊馬の血清とヒト絨毛性ゴナドトロピンの組合せを用いて過剰排卵させた。1匹の雌当たり平均20〜30個の胚を回収し、それを、同じ日に10〜100 plの5 x 107TU/mlのLVストックを用いて囲卵腔にマイクロインジェクションした。操作した胚を、偽妊娠したCD1マウスの卵管にすぐに埋め込んだ。子犬を、PCRによるGFP配列の存在について遺伝子型決定した。陽性マウスを繁殖させて、トランスジーンの生殖細胞系伝達を試験した。尾からDNAを抽出し、これを用いて創始マウスおよびF1子孫マウスにおいてリアルタイムPCRによりベクターコピー数を定量した。
免疫蛍光分析のために、組織を、4%パラホルムアルデヒド中で固定し、20%スクロースを含むPBS中、4℃にて48時間にわたり平衡化し、最適の切断温度(OCT)で包埋し、そして凍結させた。クリオスタット切片(5μm厚)を、パラホルムアルデヒドで後固定し、5%ヤギ血清(Vector Laboratories, Burlingame, CA)、1%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1%Tritonを含むPBS中でブロックし、そしてラット抗マウスF4/80 (Serotec, Raleigh, NC)または抗マウスCD45、CD31もしくはCD8(BD Pharmingen)と共にインキュベートした。単一の光学切片に由来する蛍光シグナルを、3-レーザー共焦点顕微鏡(Radiance 2000; Bio-Rad, Hercules, CA)により獲得した。
hF.IX濃度を、以前に記載のように(Brownら、2004b)、第IX因子:Ag(Roche, Milan, Italy)については、酵素免疫アッセイにより、FIX活性については、活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)アッセイにより、マウスクエン酸血漿中で測定した。
脱標的化された発現プロフィールを有する組込みベクター系を作製するために、本発明者らは、最近同定されたmiRNAを介する転写後サイレンシング系を利用した。本発明者らは、mir-30a、mir-142-5pまたはmir-142-3pのいずれかに対する完全な相補性を有する23 bp配列(mirT)の4個の直列コピーを、普遍的に発現されるホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターにより駆動されるGFP発現カセットの3'非翻訳領域(3'UTR)中に挿入することにより、miRNA調節型レンチウイルスベクター(LV)を構築した(図1a)。複数コピーの完全に相補的な標的を用いるこの設計は、miRNAの存在下でトランスジーンの抑制を最適化することが意図されており、かつmiRNA媒介性調節を支配する規則の新たな理解に基づく(BartelおよびChen, 2004; Doenchら、2003)。ノーザンブロットおよびマイクロアレイ分析を用いる最近の報告は、これらのmiRNAが造血細胞において富化されていることを示していることから(BaskervilleおよびBartel, 2005; Chenら、2004)、mir-142-5pおよびmir-142-3pを選択した。本発明者らは、定量的リアルタイムPCR分析を行って、本発明者らの標的細胞における特定のmiRNAの濃度を決定することにより、これらの以前の知見を確認した(図2a)。図2aに示されるように、mir-142-3pおよびmir-142-5pは、U937細胞において高度に発現されるが、293T細胞においては低レベルで検出されるに過ぎなかった。mir-30aは、293T細胞およびU937細胞の両方において少ないことが見出され、従って本発明者らの研究のための対照として役立つ。
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Claims (24)
- 細胞型特異的な内因性miRNAにより認識されるmiRNA標的配列および治療用トランスジーン(LacZ遺伝子を除く)を含む、遺伝子治療における内因性miRNAによる前記治療用トランスジーンの発現の制御に使用するための遺伝子ベクターであって、前記内因性miRNAを含む細胞中では前記治療用トランスジーンの発現を抑制し、前記内因性miRNAを含まない細胞では前記治療用トランスジーンを発現する、遺伝子ベクター。
- 非ウイルス遺伝子ベクターの形態である、請求項1に記載の使用のための遺伝子ベクター。
- 非ウイルス遺伝子ベクターが、miRNA標的配列および少なくとも1個のトランスジーンを含む発現ベクターまたはプラスミドを含む、請求項2に記載の使用のための遺伝子ベクター。
- 前記miRNA標的配列を含むウイルスベクターの形態である、請求項1に記載の使用のための遺伝子ベクター。
- ゲノムが前記miRNA標的配列を含む、前記ウイルスベクターのゲノム(RNAまたはDNA)を含む請求項4に記載の使用のための遺伝子ベクター。
- ゲノムが、前記miRNA標的配列に機能し得る形で連結された少なくとも1個のトランスジーンを含む、ウイルスベクターのゲノムを含む請求項5に記載の使用のための遺伝子ベクター。
- ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス、およびアルファウイルスの群から選択される、請求項4〜6のいずれか1項に記載の使用のための遺伝子ベクター。
- ウイルスベクターがレンチウイルスから誘導可能である、請求項4〜6のいずれか1項に記載の使用のための遺伝子ベクター。
- ウイルスベクターがウイルスベクター粒子の形態である、請求項4〜8のいずれか1項に記載の使用のための遺伝子ベクター。
- miRNA標的配列が、標的細胞中のウイルスベクターの発現を制御する、請求項1および4〜9のいずれか1項に記載の使用のための遺伝子ベクター。
- 同じであっても異なっていてもよい2つ以上のmiRNA標的配列を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の使用のための遺伝子ベクター。
- miRNA標的配列が、has-mir-142as(has-mir-142-3pとも呼ばれる) miRNA、let-7a、mir-15a、mir-16、mir-19、および/またはmir-145 miRNAにより標的化されるものである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の使用のための遺伝子ベクター。
- トランスジーンが、腫瘍抑制タンパク質、酵素、プロドラッグ活性化酵素、免疫調節分子、抗体、操作された免疫グロブリン様分子、融合タンパク質、ホルモン、膜タンパク質、血管作用タンパク質もしくはペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗ウイルスタンパク質、アンチセンスRNAおよびリボザイムをコードするトランスジーンからなる群から選択される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の使用のための遺伝子ベクター。
- ベクターが組織特異的プロモーターを含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の使用のための遺伝子ベクター。
- 遺伝子治療における内因性miRNAによる治療用トランスジーン(LacZ遺伝子を除く)の発現の制御に使用するための医薬組成物であって、請求項1〜14のいずれか1項に規定された遺伝子ベクターを含む、医薬組成物。
- 遺伝子治療における内因性miRNAによる治療用トランスジーン(LacZ遺伝子を除く)の発現の制御に使用するための、請求項1〜14のいずれか1項に規定された遺伝子ベクターを用いて感染または形質導入された細胞。
- 造血細胞、腎臓細胞、神経細胞、肺細胞、肝臓細胞、脾臓細胞、心臓細胞、腫瘍細胞または胚性幹細胞である、請求項16に記載の使用のための細胞。
- 請求項1〜14のいずれか1項に規定された遺伝子ベクターまたは請求項15に記載の医薬組成物の、癌治療用の医薬の製造のための使用。
- 請求項1〜14のいずれか1項に規定された遺伝子ベクターまたは請求項15に記載の医薬組成物の、血友病治療用の医薬の製造のための使用。
- 前記トランスジーンの免疫拒絶の予防用の医薬の製造のための、請求項1〜14のいずれか1項に規定された遺伝子ベクターまたは請求項15に記載の医薬組成物の使用。
- 循環抗原に対する免疫応答の予防用の医薬の製造のための、請求項1〜14のいずれか1項に記載の遺伝子ベクターまたは請求項15に記載の医薬組成物の使用。
- 癌、神経疾患、遺伝病、心疾患、卒中、関節炎、ウイルス感染および免疫系の疾患から選択される疾患の治療用の医薬の製造のための、請求項1〜14のいずれか1項に記載の遺伝子ベクターまたは請求項15に記載の医薬組成物の使用。
- 遺伝子治療における内因性miRNAによる治療用トランスジーン(LacZ遺伝子を除く)の発現の制御に使用するための遺伝子治療用の医薬の製造のための、請求項1〜14のいずれか1項に記載の遺伝子ベクターまたは請求項15に記載の医薬組成物の使用。
- 前記医薬が、前記内因性miRNAを含む細胞中でトランスジーンの発現を防止または減少させる、請求項18〜23のいずれか1項に記載の使用。
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