ES2564823T3 - Vector génico que comprende miARN - Google Patents

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ES2564823T3
ES2564823T3 ES06795291.1T ES06795291T ES2564823T3 ES 2564823 T3 ES2564823 T3 ES 2564823T3 ES 06795291 T ES06795291 T ES 06795291T ES 2564823 T3 ES2564823 T3 ES 2564823T3
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mir
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cells
viral
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Luigi Naldini
Brian David Brown
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Fondazione Telethon
Ospedale San Raffaele SRL
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Fondazione Telethon
Ospedale San Raffaele SRL
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    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6072—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses
    • C12N2810/6081—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses rhabdoviridae, e.g. VSV

Abstract

Un vector génico para su uso en terapia que comprende una secuencia diana de miARN y un transgén operativamente unido a dicha secuencia diana de miARN, en el que la secuencia diana de miARN sirve para prevenir o reducir la expresión del transgén en una célula que comprende un miARN endógeno correspondiente.

Description

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DESCRIPCION
Vector genico que comprende miARN Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a vectores genicos para su uso en transferencia y aplicaciones de terapia genica, a metodos para producirlos, y sus usos.
Antecedentes de la invencion
Los vectores lentivirales (LVs) y otros vectores virales son una herramienta fascinante de la terapia genica (Thomas et al., 2003). Los LVs pueden transducir un amplio intervalo de tejidos, incluyendo celulas que no se dividen tales como hepatocitos, neuronas y celulas madre hematopoyeticas. Ademas, los LVs se integran en los genomas de las celulas diana y proporcionan una expresion transgenica duradera.
Aunque los LVs pueden proporcionar una transferencia genica eficiente y estable, sigue siendo diflcil orientar selectivamente una expresion a, o desorientar selectivamente una expresion de un tipo celular especlfico. Este problema es particularmente relevante despues de la administracion in vivo del vector, en el que la expresion transgenica puede contenerse unicamente en una poblacion celular especlfica, tal como celulas tumorales o hepatocitos, aunque se transduce un amplio espectro de tipos celulares. Asimismo, es importante desorientar selectivamente la expresion cuando se transducen celulas progenitoras o madre, pero es necesario tener la expresion transgenica restringida a un unico linaje particular de la poblacion diferenciada. Hasta la fecha, la mayorla de los esfuerzos por abordar este problema se han basado en orientar selectivamente la envoltura del vector o desarrollar por ingenierla genetica los promotores especlficos de tejido. Sin embargo, persisten limitaciones en ambos metodos.
Las envolturas dirigidas pueden reducir el tltulo del vector y causar una disminucion en la infectividad del vector (Sandrin et al., 2003). Los promotores especlficos de tejido, construidos en base a, pero no identicos a, elementos promotores/potenciadores de origen natural, se expresan a menudo debilmente en tejidos diana en comparacion con los promotores expresados ubicuamente. Ademas, estos promotores especlficos de tejido no siempre obtienen una especificidad celular absoluta (Follenzi et al., 2002). La expresion transgenica en las celulas no diana puede producirse por diversas razones, incluyendo actividad "parcial" del promotor y captura del promotor/potenciador (De Palma et al., 2005). El fenomeno de captura se produce debido a que el vector se integra preferentemente en los sitios de transcripcion activa, que a su vez, pueden mover la transcripcion del transgen independientemente del promotor del vector.
A fin de eludir estos problemas y crear un vector que puede mantener una elevada infectividad y una expresion resistente, mientras permite al mismo tiempo la severa restriccion de la expresion transgenica de tipos celulares particulares, se desarrollo un vector regulado por un microARN (miARN) expresado de forma endogena.
El documento WO03/020931 describe un sistema de analisis de un sistema indicador que muestra un miARN que proporciona un metodo de medicion de la atenuacion genica de un gen analizado sin problemas. El sistema se utiliza para determinar si los ARNips y los ARNs quimericos pueden disminuir la expresion del gen luciferasa analizado sin problemas.
La Solicitud de la patente de Estados Unidos 20050266552 describe la construction de un constructo indicador apropiado para la introduction en celulas de mamlferos para crear llneas celulares que pueden utilizarse para la identification de genes implicados en las vlas de represion de la traduction de miARN y/o en moduladores qulmicos de dichas vlas.
Mansfield JH et al (2004) Nat Genet 36(10):1079-83 Epub, fe de erratas en Nat Genet (2004) 36(11):1238; y Brennecke J et al (2005) PloS Biol 3(3):e85 describen plasmidos que contienen un gen indicador con secuencias diana de miARN. En los dos informes, los constructos se concibieron para controlar la expresion de los miARNs endogenos y no con el fin de regular un transgen y/o restringir la expresion en tipos celulares particulares.
Una importante caracterlstica de la presente invencion que habrla que destacar es que se describe como pueden concebirse los vectores a regular mediante miARNs endogenos para controlar la expresion transgenica para obtener los perfiles de expresion especlficos del vector. Aunque ya existen informes que demuestran que las secuencias diana de miARN pueden incluirse en un constructo indicador (un plasmido que expresa un gen marcador tal como luciferasa) para seguir la expresion de un miARN, estos no describen la explotacion de miARN especlficamente para la regulation del vector. En particular, no describen el uso de los vectores de la presente invencion para los enfoques con terapia genica que evitan el rechazo mediado por el sistema inmunitario de un transgen de interes o fabrican enfoques para aumentar el tltulo de partlculas virales que expresan genes toxicos que son generalmente toxicos para la celula en la que se produce la partlcula viral.
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Declaraciones de la invencion
En el presente documento se describe un vector de transferencia genica apropiado para enfoques de ingenierla genetica, tales como terapia genica, transferencia genica y/o regulacion de la expresion de un transgen que comprende una secuencia diana de miARN. El miARN se "une operativamente" al transgen. El termino "operativamente unido" significa que los componentes descritos se encuentran en una relacion que les permite funcionar de la manera prevista.
Segun un primer aspecto de la presente invencion, se proporciona un vector genico para su uso en terapia que comprende una secuencia diana de miARN y un transgen operativamente unido a dicha secuencia diana de miARN, en el que la secuencia diana de miARN sirve para prevenir o reducir la expresion del transgen en una celula que comprende un miARN endogeno correspondiente.
En una realizacion, el vector es una partlcula de vector viral que comprende una secuencia diana de miARN.
En una realizacion, la partlcula comprende el genoma (ADN o ARN) de la partlcula de vector, cuyo genoma comprende la secuencia diana de miARN.
En una realizacion, la partlcula comprende el genoma de la partlcula de vector, cuyo genoma de ARN comprende la secuencia diana de miARN.
En una realizacion, la partlcula comprende el genoma de ARN de la partlcula de vector, cuyo genoma de ARN comprende multiples secuencias diana de miARN, que pueden encontrarse en tandem.
En una realizacion, la partlcula comprende el genoma de ARN de la partlcula de vector, cuyo genoma de ARN comprende multiples secuencias diana de miARN diferentes, que pueden encontrarse en tandem.
Mas de una copia de una secuencia diana de miARN incluida en el vector puede aumentar la eficacia del sistema. Se visualiza asimismo que podrlan incluirse secuencias diana de miARN diferentes. Por ejemplo, los vectores que expresan mas de un transgen pueden mantener el transgen controlado en mas de una secuencia diana de miARN, que puede ser o no diferente. Las secuencias diana de miARN pueden encontrarse en tandem, aunque se conciben otras disposiciones, como el uso de orientaciones antisentido. Las orientaciones antisentido pueden ser utiles en la produccion de partlculas virales para evitar la expresion de productos genicos que, de lo contrario, pueden ser toxicos para las celulas productoras.
En otra realizacion, la partlcula comprende el genoma de la partlcula de vector, cuyo genoma de ARN comprende un transgen.
Preferentemente, la partlcula se obtiene a partir de un lentivirus.
En otra realizacion, el vector de transferencia genica se encuentra en forma de un vector de transferencia genica no viral. En la presente realizacion, el vector de transferencia genica puede comprender, o encontrarse en forma de, un vector o plasmido de expresion que comprende la secuencia diana de miARN y opcionalmente un transgen.
Como se describe en el presente documento, los vectores de expresion comprenden regiones de acido nucleico que contienen secuencias que pueden transcribirse. Por consiguiente, se incluyen dentro de esta definicion las secuencias codificantes de ARNm, ARNt y ARNr.
El vector genico o vector de transferencia genica de la presente invencion puede utilizarse para administrar un transgen a un sitio o celula de interes. El vector de la presente invencion puede administrarse a un sitio diana mediante un vector viral o no viral.
Un vector es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un entorno a otro. A modo de ejemplo, algunos vectores utilizados en tecnicas de ADN recombinado permiten transferir entidades, tales como un segmento de ADN (tal como un segmento de ADN heterologo, tal como un segmento de ADNc heterologo), a una celula diana. De manera opcional, una vez dentro de la celula diana, el vector puede utilizarse para mantener el ADN heterologo en la celula o puede actuar como una unidad de replicacion de ADN. Ejemplos de vectores utilizados en tecnicas de ADN recombinado incluyen plasmidos, cromosomas, cromosomas artificiales o virus.
Los sistemas de administracion no virales incluyen, entre otros, metodos de transfeccion de ADN. En este caso, la transfeccion incluye un proceso que utiliza un vector no viral para administrar un gen a una celula diana de mamlfero.
Los metodos de transfeccion normales incluyen electroporacion, bioballstica de ADN, transfeccion mediada por llpidos, transfeccion mediada por ADN compactado, liposomas, inmunoliposomas, lipofectina, anflfilos faciales
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cationicos (CFAs) mediados por agentes cationicos (Nature biotechnology 1996 14; 556), y combinaciones de los mismos.
Los sistemas de administracion viral incluyen, entre otros, un vector de adenovirus, un vector viral adeno-asociado (AAV), un vector viral de herpes, un vector retroviral, un vector lentiviral, un vector baculoviral. Otros ejemplos de vectores incluyen sistemas de administracion ex vivo que incluyen, entre otros, metodos de transfeccion de ADN tales como electroporacion, bioballstica de ADN, transfeccion mediada por llpidos, transfeccion mediada por ADN compactado.
El termino "partlcula de vector" se refiere al vector retroviral encapsidado, que puede unirse preferentemente a y entrar en celulas diana. Los componentes de la partlcula, como ya se ha senalado para el vector, pueden modificarse con respecto al retrovirus de tipo natural. Por ejemplo, las protelnas Env en la cubierta proteica de la partlcula pueden modificarse geneticamente para alterar su especificidad de orientacion selectiva o lograr alguna otra funcion deseada.
Preferentemente, el vector viral transduce preferentemente un cierto tipo celular o tipos celulares.
Mas preferentemente, el vector viral es un vector dirigido, es decir, presenta un tropismo tisular que se altera en comparacion con el virus nativo, de modo que el vector se orienta selectivamente a celulas particulares.
En otra realizacion, la partlcula que comprende que la secuencia diana es aquella dirigida por los miARN mir-142as (tambien llamado hsa-mir-142-3p), let-7a, mir-15a, mir-16, mir-17-5p, mir-19, mir-142-5p, mir-145, mir-218.
Se describe ademas en el presente documento un conjunto de constructos de ADN para la production de la partlcula de vector viral que comprende un constructo de ADN codificante de un genoma del vector de encapsidacion que comprende una secuencia diana de miARN, y un transgen. Por genoma del vector de encapsidacion se refiere a que el genoma del vector se encuentra en un entorno en el que puede encapsidarse en una partlcula de vector viral. En general requiere los genes presentes de Gag-Pol y Env.
Se describe ademas en el presente documento un proceso para la preparation de una partlcula de vector viral que comprende introducir el conjunto de constructos de ADN de la revindication en una celula huesped, y obtener la partlcula de vector viral.
Se describe ademas en el presente documento una partlcula de vector viral producida por el proceso de la presente invencion.
Segun otro aspecto de la presente invention, se proporciona una composition farmaceutica que comprende el vector genico o partlcula de vector segun la presente invencion junto con un diluyente, excipiente o transportador farmaceuticamente aceptable.
Segun un aspecto adicional de la presente invencion, se proporciona una celula infectada o transducida con la partlcula de vector de la presente invencion. En una realizacion, la celula comprende el miARN correspondiente. La celula puede transducirse o infectarse en un escenario in vivo o in vitro. La celula puede obtenerse a partir de o formar parte de un animal, preferentemente un mamlfero, tal como un humano o un raton. Por consiguiente, ha de reconocerse que la presente invencion es util para proporcionar animales transgenicos, p. ej., para su uso como modelos de enfermedad. En una realizacion, el mamlfero es un mamlfero no humano.
Los enfoques actuales para el control de vectores de transcription dependen fundamentalmente de la administracion de elementos potenciadores-promotores obtenidos de genes endogenos (Thomas et al., 2003; Verma y Weitzman, 2005). El uso de estos enfoques, la reconstitution de patrones de expresion genica altamente especlficos, como se requiere a menudo en las aplicaciones de terapia y transferencia genica, se limita por el sistema de administracion, la capacidad del vector, y los efectos posicionales por insertion (para la integration de vectores). Desarrollando nuevos vectores que hacen uso de miARN expresados de forma endogena para su regulation, los inventores han anadido una capa de control a los vectores que no existla previamente. Este nuevo enfoque permite la represion especlfica de la expresion genica en los tipos celulares y linajes seleccionados.
Con este sistema se puede alcanzar un control mucho mas riguroso de la expresion transgenica que es posible actualmente con las tecnologlas existentes.
Cuando se aplica a vectores de integracion, puede eludirse los problemas de desregulacion transgenica, que pueden producirse como resultado de los efectos de position insercional (integracion junto a secuencias promotoras/potenciadoras solidas que anulan el control transcripcional del vector-promotor interno) y permiten patrones altamente especlficos de celulas de la expresion transgenica.
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Algunas ventajas clave adicionales de la invencion
Los vectores, tales como virales que incluyen vectores lentivirales, para la expresion transgenica de la transferencia y la terapia genica pueden desarrollarse por ingenierla genetica con una secuencia diana de miARN con el fin de reconocerse por miARNs endogenos especlficos de tipo celular, regulando, por consiguiente, la expresion transgenica en un subconjunto de celulas. Ademas, pueden utilizarse las combinaciones de las secuencias diana de miARN para obtener vectores con patrones de expresion celular altamente especlficos.
Los inventores demuestran esto con 9 miARNs diferentes, incluyendo let-7a, mir-15a, mir-16, mir-17-5p, mir-19, mir- 142-3p, mir-142-5p, mir-145 y mir-218. Muestran que la concentracion de un miARN dentro de una celula puede utilizarse para predecir el perfil de expresion de un vector. Por consiguiente, el metodo descrito por la presente patente proporciona un metodo simple para el diseno de vectores con patrones de expresion celular altamente especlficos.
Pueden considerarse numerosos usos de la presente invencion.
De hecho, como ejemplo, los inventores han demostrado que la expresion transgenica de un promotor expresado ubicuamente puede evitarse precisamente en una llnea celular hematopoyetica utilizando un vector que muestra la secuencia diana de mir-142-3p en la region 3'UTR del transgen, como se muestra a continuation en la figura, ya que miR-142-3p presenta un patron de expresion especlfico de tipo celular en los tejidos hematopoyeticos. De este modo, este sistema no reduce la expresion transgenica en otros tipos celulares.
Los inventores tambien demuestran que al incorporar una secuencia diana de mir-19a en el vector, la expresion transgenica puede suprimirse en las celulas productoras 293T, que expresan mir-19a a niveles elevados, y esto no afecta negativamente a la production del vector. Esta estrategia proporciona un medio importante y hasta la fecha no disponible para producir vectores de alto tltulo que transportan un transgen toxico.
Un uso adicional de la presente invencion es el diseno de un sistema de vector que expresa dos transgenes con distintos perfiles de expresion. Los inventores demuestran esto mediante la incorporation de una secuencia diana de mir-142-3p en uno de los dos genes de un vector lentiviral bidireccional. En celulas renales se expresan ambos transgenes puesto que mir-142-3p no esta presente. No obstante, en celulas hematopoyeticas, solo se expresa uno de los dos transgenes. Este constructo proporciona un estudio demostrativo preliminar cuya regulation de miARN puede utilizarse para regular de forma divergente dos transgenes a partir de un unico constructo de vector. Los usos de este diseno de vector incluyen situaciones en las que se transducira una poblacion heterogenea de celulas, y para ello se requiere la expresion del gen 1 en uno de los tipos celulares presentes, y la expresion del gen 2 se requiere en otro tipo celular. Este diseno podrla utilizarse en aplicaciones terapeuticas que requieren la selection tanto negativa como positiva de celulas particulares.
Los inventores muestran que la transferencia de una secuencia diana de miARN en una celula, incluso a alta copia, no perturba la actividad o expresion natural del miARN endogeno, que se orienta selectivamente a la secuencia del vector.
Asimismo, se pueden anadir combinaciones de secuencias diana de miARN para obtener vectores con patrones de expresion celular altamente especlficos.
El enfoque mediado por miARN para restringir la expresion genica presenta varias ventajas sobre otras estrategias de regulacion de transgenes. Hasta la fecha, la mayorla de los esfuerzos para limitar la expresion a partir de celulas presentadoras de antlgeno profesionales (APCs) se basan en promotores especlficos de tejido (Brown et al., 2004b; Follenzi et al., 2004; Mingozzi et al., 2003). Aunque este enfoque puede limitar exitosamente la expresion en las celulas diana, se observa una expresion "parcial" en una fraction de las celulas no diana. Esto sucede debido al promotor reconstituido, modificado para la inclusion en un sistema de vector, que pierde a menudo parte de su especificidad celular y sucede ademas debido a que la integration del vector cercano a promotores y potenciadores activos puede activar el promotor especlfico de tejido e impulsar la expresion transgenica. Debido a que se produce el silenciamiento mediado por miARN a nivel post-transcripcional, la captura del promotor y del potenciador es irrelevante. Como tal, la regulacion de miARN puede utilizarse para desorientar selectivamente de forma eficaz la expresion transgenica de un tipo celular particular, mientras permite al mismo tiempo una amplia expresion tisular, como se ha descrito en el presente documento. La regulacion de miARN tambien puede utilizarse como un enfoque complementario para la regulacion de un transgen mediante promotores/potenciadores. Incluyendo la secuencia diana de miARN en casetes de expresion ya bajo el control de un promotor especlfico de tejido, se anade una capa de regulacion adicional que eliminara la expresion inespeclfica.
Segun un estudio demostrativo preliminar en el que puede utilizarse miARN para desorientar selectivamente la expresion transgenica de tipos celulares particulares, se desarrollo un LV que puede proporcionar una expresion solida en hepatocitos y otras celulas no hematopoyeticas, mientras evita al mismo tiempo la expresion de celulas hematopoyeticas. Este diseno es particularmente relevante para la terapia genica sistemica en la que la respuesta inmunitaria del huesped contra el transgen limita la eficacia terapeutica (Brown y Lillicrap, 2002). Estudios realizados
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en nuestro laboratorio y otros indican que un factor importante contribuye a la induction de una respuesta inmunitaria especlfica de transgen despues de relacionar la transferencia genica al sitio de expresion transgenica (Brown et al., 2004b; Follenzi et al., 2004). Los vectores que se expresan en APCs del sistema hematopoyetico, tales como macrofagos y celulas dendrlticas, se conocen por desencadenar eficazmente respuestas inmunitarias antitransgenicas (De Geest et al., 2003).
En efecto, la administration sistemica de LV, que expresa un transgen bajo el control del promotor CMV, condujo a una alta incidencia de la expresion transgenica en APCs del hlgado y el bazo, traduciendose en la elimination mediada por el sistema inmunitario de celulas que expresan el transgen (Follenzi et al., 2004). En cambio, cuando el promotor CMV se sustituyo con el promotor de la albumina especlfico de hlgado, se produjo una reduction en la frecuencia y la resistencia de la respuesta inmunitaria. Aunque la incidencia de la inmunidad se redujo mediante el uso del promotor de la albumina, aun se observo cierto nivel de respuestas inmunitarias. Es probable que ello se deba al bajo nivel de la expresion transgenica en APCs del promotor de la albumina, como consecuencia de la actividad transcripcional parcial y la captura del promotor/potenciador. Por consiguiente, el problema de la expresion transgenica en las celulas no diana, causado por eventos que ocurren a nivel de regulation transcripcional, puede superarse utilizando el sistema de miARN de la regulacion genica que actua post-transcripcionalmente. La restriction de la expresion transgenica a un tipo celular particular tambien puede disminuir la eficacia potencial de la transferencia genica limitando el agregado de celulas que expresan el transgen.
De este modo, se hipotetiza que la regulacion de miARN, que desorienta selectivamente en lugar de orientar selectivamente la expresion genica y las funciones a nivel post-transcripcional, puede proporcionar un medio unico para superar las limitaciones de los sistemas de administracion genica actuales. Al impedir la expresion transgenica en linajes hematopoyeticos, mientras permite al mismo tiempo altos niveles de expresion en celulas no hematopoyeticas, se senalo que la regulacion de miARN podrla permitir una transferencia genica fuerte y estable en ausencia de una respuesta inmunitaria.
Se modifico un LV preexistente, que contiene el indicador de la protelna verde fluorescente (GFP) bajo control transcripcional del promotor PGK expresado ubicuamente, para incluir la secuencia diana de un miARN conocida por expresarse en las celulas de origen hematopoyetico. Despues de la administracion sistemica del vector de nuestro LV regulado por miARN, la expresion genica se detecto casi exclusivamente en hepatocitos y celulas endoteliales del hlgado. La expresion en celulas de Kupffer, y en macrofagos residentes hepaticos, era practicamente indetectable. Estos eran resultados en marcado contraste con la administracion de un LV que no contenla la secuencia diana de miARN, en los que la mayorla de la expresion transgenica se produjo en celulas de Kupffer.
En un experimento posterior, en el que los vectores se inyectaron en ratones Balb/c immunocompetentes, durante dos semanas posterior a la inyeccion no se observo ninguna celula positiva para GFP en el hlgado de ratones tratados con LV.PGK.GFP. En contraposition, los ratones tratados con LV.PGK.GFP.142-3pT presentaron una frecuencia significativa de hepatocitos positivos para GFP 2 semanas tras la administracion del vector. Ademas, se descubrio que la expresion de GFP persiste durante mas de 120 dlas posteriores a la inyeccion (el ultimo intervalo de tiempo analizado). Del mismo modo, la estrategia de regulacion por miARN tambien fue eficaz para prevenir una respuesta inmunitaria en un antlgeno circulante. Especlficamente, se trataron ratones con hemofilia B con un vector lentiviral que expresa Factor IX humano (hFIX), y se hallo que cuando se incluyo la secuencia de mir-142-3pT en el vector, la expresion de hFIX se mantuvo estable, mientras que en ratones tratados con un vector similar sin la secuencia de mir-142-3pT, la expresion de hFIX no se detecto tras 3 semanas posteriores a la inyeccion.
Estos resultados proporcionan la primera demostracion que el miARN puede utilizarse para reorientar selectivamente la expresion de un vector viral, y da lugar a un tratamiento prolongado para una enfermedad. Tambien estos proporcionan pruebas que la regulacion de miARN del vector puede reducir la respuesta inmunitaria antitransgenica. Este LV regulado por miARN, el primero de su tipo, tendra importantes implicaciones en la terapia genica dirigida al hlgado, en la que la expresion genica en las celulas hematopoyeticas puede ser perjudicial para objetivos terapeuticos. Por tanto, la presente invention puede emplearse para prevenir el rechazo mediado por el sistema inmunitario del gen transferido.
Tras la administracion in vivo del vector, la presente invencion evitara la expresion del vector en las celulas presentadoras de antlgeno del sistema inmunitario, que son parte del sistema hematopoyetico, y de ese modo se previene el inicio de una respuesta inmunitaria contra el transgen. Posiblemente, cuando se aplica a un promotor especlfico de tejido que orienta selectivamente la expresion a hepatocitos, se permitirla suprimir la expresion ectopica en una APC transducida. Ello podrla resolver un obstaculo importante y un problema existente desde hace tiempo en la transferencia genica; concretamente, el rechazo mediado por el sistema inmunitario del gen transferido.
Otros aspectos particulares y preferentes de la presente invencion se exponen en las reivindicaciones independientes y dependientes adjuntas. Las caracterlsticas de las reivindicaciones dependientes pueden combinarse con las caracterlsticas de las reivindicaciones independientes, segun proceda, y en combinaciones distintas de las expuestas expllcitamente en las reivindicaciones.
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La practica de la presente invencion empleara, salvo que se especifique lo contrario, tecnicas convencionales de qulmica, biologla molecular, microbiologla, ADN recombinado e inmunologla, que estan dentro de las capacidades de un experto en la materia. Dichas tecnicas se explican en la literatura. Veanse, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edicion, Libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 y suplementos periodicos; Current Protocols in Molecular Biology, cap. 9, 13, y 16, John Wiley y Sons, Nueva York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, y A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley y Sons; J. M. Polak y James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol n.° I de Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual de Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855. Handbook of Drug Screening, editado por Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, Nueva York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); y Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, editado por Jane Roskams y Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3. Cada uno de estos textos generales se incorpora en el presente documento por referencia.
Breve descripcion de los dibujos
La presente invencion se describira adicionalmente, a modo de unico ejemplo, con referencia a sus realizaciones preferentes como se ilustra en los dibujos adjuntos, en los que:
Figura 1a. Representacion esquematica de un sistema de vector lentiviral regulado por miARN. En este caso se muestra el vector lentiviral original codificante de la protelna verde fluorescente potenciada (eGFP) bajo el control transcripcional del promotor PGK humano expresado ubicuamente (LV.PGK.gFp), y un vector modificado, que contiene 4 copias en tandem de una secuencia orientada selectivamente por un miARN endogeno (LV.PGK.GFP.mirT).
Figura 1b. Representacion esquematica de un sistema de vector lentiviral regulado de manera divergente que utiliza la regulacion de miARN. En este caso se muestra el vector lentiviral bidireccional original codificante de la eGFP y el receptor de baja afinidad del factor de crecimiento nervioso (ALNGFR) mutado bajo el control transcripcional de un constructo promotor bidireccional (Bd.LV), que permite coordinar la transcripcion de dos transgenes como transcritos distintos. Se modificaron Bd.LVs para incluir secuencias de mirT en la region no traducida 3' (3'UTR) del casete de expresion de eGFP.
Figura 1c. Representacion esquematica de un sistema de vector lentiviral regulado por miARN especlfico de hepatocitos. En este caso se muestra el vector lentiviral original codificante del factor IX de coagulacion humano (hFIX) bajo el control transcripcional de un elemento sintetico del promotor/potenciador especlfico de hlgado. (LV.ET.hFIX), y un vector modificado, que contiene 4 copias en tandem de una secuencia orientada selectivamente por un miARN endogeno (LV.ET.hFIX.mirT).
Figura 2a. Analisis de perfil de miARN. Analisis de la expresion de miARNs seleccionados en las celulas 293T y U937 por PCR en tiempo real. Los niveles de expresion se indican en relacion con let-7a, un miARN "de mantenimiento" expresado de forma constitutiva.
Figura 2b. La regulacion de miARN puede utilizarse para desorientar selectivamente la expresion de linajes hematopoyeticos. El analisis por FACS de las celulas 293T (origen renal), U937 (origen monocitario) y dendrlticas primarias (derivadas de la sangre periferica) se transdujo con concentraciones similares a la dosis de LV indicada a los 14 dlas posteriores a la transduccion. Un LV que contiene un promotor de la albumina especlfico de hlgado (LV.ALB.GFP), se muestra para comparar la actividad inespeclfica de este promotor. Los histogramas son representativos de tres experimentos independientes. Las copias de vector por genoma (C/G) se determinaron por el analisis de Taqman. En gris se muestran las celulas no transducidas.
Figura 2c. La regulacion de miARN puede explotarse para construir un vector para la regulacion divergente de dos transgenes. El analisis por FACS de la expresion de GFP y ALNGFR de celulas 293T y U937 se transdujo con concentraciones estrechamente similares de Bd.LV que expresa GFP, con o sin mir-142-3pT y ALNGFR, 14 dlas posteriores a la transduccion. Los diagramas de puntos son representativos de dos experimentos independientes.
Figura 2d. El diseno del vector regulado por miARN puede utilizarse para construir numerosos vectores que se regulan por diferentes miARNs endogenos, y median diversos perfiles de expresion del vector. El analisis por FACS de la expresion de GFP y ALNGFR de las celulas 293T y U937 se transdujo con concentraciones estrechamente similares de Bd.LV que expresa GFP, con o sin las secuencias mirT indicadas, y ALNGFR, a los 14 dlas posteriores a la transduccion.
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Figura 3a. El analisis en RT-PCR cuantitativa de la expresion de GFP de las celulas 293T y U937 se transdujo por LV.PGK.GFP o LV.PGK.GFP.142-3pT. El ADNc de las celulas se presenta en la Figura 1b. Todas las muestras se normalizaron con la expresion de GAPDH y los valores se indican en relacion a los transcritos detectados de las celulas 293T transducidas con 105 UT/ml de LV.PGK.GFP, establecido como el calibrador.
Figura 3b. El analisis en RT-PCR cuantitativa de la expresion de GFP y ALNGFR de las celulas U937 se transdujo por el Bd.LV indicado. El ADNc se recogio de las celulas presentadas en la Figura 1c. Todos los valores se indicaron en relacion al nivel de los transcritos de ALNGFR detectados en las celulas transducidas con 105 UT/ml de Bd.LV.
Figura 3c. Analisis de la membrana de Northern de las celulas transducidas por LV y BDd.LV con o sin mir-142-3pT (se muestra en la Figura 1b y 1c, respectivamente). Se cargaron veinte microgramos de ARN total para cada muestra y se hibridan para GFP. El tamano esperado del transcrito se indica con flechas para el LV (parte superior) y Bd.LV (parte inferior).
Figura 3d. Celulas U937 infectadas repetidamente con LV.PGK.GFP.142-3pT para obtener un aumento del contenido de vector. Se midio GFP mediante el analisis por FACS. Se indica la media del vector C/G para la poblacion celular. Se incluye un analisis de regresion que muestra la relacion entre el aumento de la dosis del vector y la expresion del transgen para LV.PGK.GFP.142-3pT (derecha). Tenga en cuenta que en las celulas U937 una sola copia de LV.PGK.GFP (panel inferior izquierdo) expresa GFP a niveles mas altos que 175 C/G de LV.PGK.GFP.142-3pT.
Figura 3e. La robustez de la interferencia por ARN mediado por mir-142-3p se midio mediante la superinfeccion de las celulas U937 que contienen 4 C/G de LV.PGK.GFP.mir-142-3pT con concentraciones crecientes de LV.PGK.ALNGFR.mir-142- 3pT. Se utilizo el analisis de Taqman para detectar el numero de copias del vector de las celulas superinfectadas, y se midieron los cambios en la expresion de GFP y ALNGFR mediante analisis por FACS.
Figura 4. La regulation por miARN puede explotarse para evitar la expresion transgenica en las celulas productoras sin reducir el tltulo del vector. Se compararon la expresion transgenica y el tltulo de production de tres constructos diferentes de vector lentiviral. Los histogramas muestran la expresion de GFP en celulas 293T durante la produccion del vector. Los diagramas de puntos presentan la expresion de GFP en celulas 293T despues de la transduction con los vectores producidos. Los constructos pLV.PGKas.GFPas.CTEas.polyAas y pLV.PGKas.GFPas.19aT.CTEas.polyAas presentan los casetes de expresion en orientation antisentido. Como se muestra, cuando el casete de expresion se coloca en antisentido (pLV.PGKas.GFPas.CTEas.polyAas) existe una reduction de hasta un multiplo de 10 en el tltulo del vector cuando se compara con el vector pLV.PGK.GFP canonico. Sin embargo, la inclusion de la secuencia de mir-19aT en el casete de expresion antisentido restaura el tltulo al del constructo canonico.
Figura 5a. Los vectores regulados por miARN pueden concebirse para lograr desorientar selectivamente la expresion de un linaje celular particular in vivo. Analisis de microscopla confocal del hlgado de ratones desnudos inyectados con LV indicado en la vena de la cola 2 semanas antes. Las imagenes son representativas de 3 ratones. Se visualizo GFP por fluorescencia directa. Se immunotineron secciones del hlgado para el marcador F4/80 especlfico de macrofagos (izquierda) y para el marcador de celulas endoteliales CD31 (derecha). Practicamente ninguna de las celulas de Kupffer F4/80+ expreso GFP a niveles detectables cuando se utilizo el vector de mir-142- 3pT, mientras que muchas de estas celulas expresaban GFP cuando se transduclan por los otros vectores. Tenga en cuenta que las celulas endoteliales sinusoidales hepaticas CD31+ expresaron GFP tras la transduccion por todos los vectores, incluyendo LV.PGK.GFP.142-3pT (flechas).
Figura 5b. Los vectores regulados por miARN pueden concebirse para lograr desorientar selectivamente la expresion de un linaje celular particular in vivo. Se inmunotineron secciones del bazo de los mismos ratones indicados previamente para el marcador CD45 pan-leucocitario. LV.PGK.GFP.142-5pT desoriento eficazmente la expresion de GFP de los leucocitos CD45+, pero permitio una fuerte expresion de GFP en las celulas estromales no hematopoyeticas (CD45-negativo) de la zona marginal sinusal.
Figura 5c. Los vectores lentivirales regulados por miARN pueden concebirse para evitar la expresion transgenica en celulas hematopoyeticas tras la inyeccion intravenosa del vector. Analisis por FACS de la expresion de GFP de esplenocitos de animales tratados con LV.PGK.GFP y LV.PGK.GFP.142-3pT.
Figura 6a. Los vectores regulados por miARN pueden concebirse para evitar la expresion transgenica en celulas de linaje hematopoyetico in vivo, incluso a alta copia del vector. El analisis por FACS de la expresion de GFP en la sangre periferica y la medula osea de ratones transgenicos representativos de TgN.PGK.GFP.142-3pT (24 C/G) y TgN.PGK.GFP (4 C/G) muestra una expresion transgenica practicamente indetectable a pesar del elevado numero de copias del vector transportadas por estos ratones.
Figura 6b. Los vectores regulados por miARN pueden concebirse para segregar la expresion genica entre los linajes hematopoyeticos y no hematopoyeticos de ratones transgenicos. Inmunofluorescencia de los organos indicados de los ratones previos. Se visualizo GFP por fluorescencia directa. Las celulas de linaje hematopoyetico se marcaron
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por inmunotincion de CD45 en todos los organos analizados excepto en el timo, en el que se utilizo CD3 para marcar los timocitos. En ratones con TgN.PGK.GFP, se detecto la expresion de GFP pan-celular en el parenquima y estroma de todos los organos. Las celulas de linaje hematopoyetico aparecen de color amarillo debido a la superposicion entre la tincion de CD45 y la expresion de gFp. En cambio, la expresion de GFP en ratones transgenicos con PGK.GFP.142-3pT se suprimio selectivamente en las celulas de Kupffer CD45+ (hlgado), en el macrofago alveolar (pulmon) y de la lamina propia (intestino), que aparecen de color rojo y se indican con flechas. En el bazo y el timo, la expresion de GFP tambien era negativa en todas las celulas de linaje hematopoyetico, a pesar de una fuerte expresion en el estroma de estos organos.
Figura 7a. El LV regulado por miARN permite la transferencia genica estable en ratones inmunocompetentes. Se administro el LV indicado por analisis de inmunofluorescencia confocal en las secciones del hlgado y bazo de ratones Balb/c. Se visualizo GFP en el hlgado por fluorescencia directa; se detectaron las celulas de Kupffer, los linfocitos T CD8+, o las celulas endoteliales por tincion con anti-F4/80, anti-CD8, o anti-CD31, respectivamente. Las celulas GFP+ de ratones con LV.PGK.GFP y LV.ALB.GFP se eliminaron del hlgado durante 2 semanas, que se correlacionaban con la presencia de infiltrados de linfocitos T CD8+. Por el contrario, la abundancia de hepatocitos GFP+ y celulas endoteliales persistio durante >120 dlas (intervalo de tiempo analizado mas duradero) en ratones inyectados con LV.PGK.GFP.142-3pT.
Figura 7b. Las celulas GFP+ en el hlgado de los ratones tratados con LV.PGK.GFP.142-3pT del dla 70 presentaban la morfologla tlpica de los hepatocitos o eran celulas endoteliales CD31+ (flechas). Esto demuestra un aspecto novedoso de este enfoque, que desorienta selectivamente la expresion de un tipo celular particular, mientras permite al mismo tiempo la expresion transgenica en un amplio intervalo de linajes celulares.
Figura 7c. La tincion de hematoxilina y eosina (H y E) muestra histologla normal y ausencia de infiltracion de celulas mononucleares en ratones con LV.PGK.GFP.142-3pT a los 42 dlas posteriores a la inyeccion.
Figura 7d. Analisis del bazo de ratones inmunocompetentes inyectados con el vector indicado 5 dlas antes. Se observo principalmente la expresion de GFP del vector de mir-142-3pT en la zona marginal sinusal (MS); algunas de estas celulas GFP+ expresaron a-actina de musculo liso (a-SML) y se identificaron como celulas estromales similares a fibroblastos (flechas). Tenga en cuenta que estaban presentes celulas GFP+ dispersas, incluyendo algunas celulas hematopoyeticas CD45+, en el bazo de los ratones con LV.ALB.GFP (flecha). Esto demuestra ademas que la estrategia de regulation por miARN puede proporcionar un medio mejorado de regulation transgenica en promotores especlficos de tejido.
Figura 8a. Los vectores lentivirales regulados por miARN median la correction estable de la hemofilia B en un modelo murino. A los ratones con hemofilia B se les inyecto (inactivation del factor IX) a traves de la cola un vector lentiviral de codification de hFIX bajo el control del promotor ET especlfico de hepatocitos (LV.ET.hFIX) o un LV.ET.hFIX modificado que contiene la secuencia de mir-142-3pT en la region 3'UTR del transgen (LV.ET.hFIX.142- 3pT). La concentration plasmatica de antlgeno de hFIX se determino mediante ELISA especlfico de hFIX (parte superior), mientras que la actividad de coagulation de FIX se determino midiendo el tiempo de tromboplastina parcial activada (parte inferior). Los resultados se presentan como la media mas o menos del error estandar de tres ratones tratados por vector.
La Figura 9A muestra la secuencia horquilla de hsa-mir-142 maduro.
La Figura 9B muestra la secuencia de mir-142 como diana.
MicroARNs (miARNs)
Los miARNs son pequenas moleculas de ARN codificadas en los genomas de plantas y animales. Estos ARNs altamente conservados de ~21-mer regulan la expresion de los genes uniendose a ARNms especlficos (He y Hannon, 2004).
Los miARNs son una familia de pequenos ARN no codificantes que regulan la expresion genica de una manera especlfica en una secuencia.
Resumen de microARNs: ARNS PEQUENOS CON UN IMPORTANTE PAPEL EN LA REGULACION GENICA, Lin He y Gregory J. Hannon Nature Reviews Genetics 5, 522-531 (2004): •
• Los microARNs (miARNs) son una familia de pequenos ARNs de ~21-25 nucleotidos que regulan negativamente la expresion genica a nivel post-transcripcional.
• Los miembros fundadores de la familia miARN, lin-4 y let-7, se identificaron a traves de exploraciones geneticas para hallar defectos en la regulacion temporal del desarrollo larvario de Caenorhabditis elegans.
• Debido a los esfuerzos de donation del genoma completo, hoy en dla se han identificado cientos de miARNs en casi todos los metazoos, incluyendo moscas, plantas y mamlferos.
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• Los miARNs exhiben patrones de expresion regulada temporal y espacialmente durante diversos procesos de desarrollo y fisiologicos.
• La mayorla de los miARNs de animales caracterizados hasta el momento afectan a la slntesis proteica de sus ARNms diana. Por otra parte, la mayorla de los miARNs vegetales estudiados hasta la fecha dirigen la escision de sus dianas.
• El grado de complementariedad entre un miARN y su diana, determina, al menos en parte, el mecanismo de regulacion.
• En animales, los transcritos primarios de miARNs se procesan de forma secuencial por dos enzimas RNasa III, Drosha y Dicer, en un hlbrido pequeno e imperfecto de ARNbc (miARN:miARN*) que contiene tanto la cadena de miARN maduro como su cadena complementaria (ARNm*). La relativa inestabilidad en el extremo 5' del miARN madura conlleva al ensamblaje asimetrico del miARN maduro en el complejo efector, el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC).
• Las protelnas Ago son un componente clave del RISC. Multiples homologos de Ago en varios genomas de metazoos indican la existencia de multiples RISCs que llevan a cabo funciones biologicas relacionadas pero especlficas.
• La prediccion bioinformatica de las dianas de miARN ha proporcionado una importante herramienta para explorar las funciones de los miARNs.
Se han clonado y secuenciado varios cientos de miARNs de ratones, humanos, Drosphila, C. elegans y Arabidopsis. Ejemplos de dichas secuencias pueden hallarse en
www.sanger.ac.uk (Griffiths-Jones et al., 2006). Secuencias adicionales de miARN diana pueden buscarse en
www.miRNA.org.
Al igual que los ARNms, los perfiles de expresion de miARN parecen variar de tejido a tejido pero uno es similar para tejidos identicos en diferentes individuos (Baskerville y Bartel, 2005). La determinacion de un miARN con el perfil de expresion deseado puede conseguirse utilizando tecnicas conocidas por los expertos en la materia. Una vez identificado el miARN, la secuencia diana correspondiente puede determinarse facilmente utilizando, por ejemplo, las bases de datos indicadas previamente.
Por ejemplo, el conjunto de sondas miTNA de mirVana™ y el kit de etiquetado miTNA de m/Wana™ disponibles de Ambion, Inc. pueden utilizarse para comparar los perfiles de expresion de miARN en tejidos humanos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Otra forma comun de identificar miARNs especlficos de tejido es utilizar la membrana de Northern. Un ejemplo de dicha tecnica se describe en Lagos-Quintana M et al, Current Biol (2002) 12:735-739 en el que se identifican 34 nuevos miARNs por clonacion especlfica de tejido de ARNs de aproximadamente 21 nucleotidos de raton (Lagos- Quintana et al., 2002).
Del mismo modo, Michael M et al, Mol Can Res (2003) 1:882-891 describe la identificacion de 28 secuencias diferentes de miARN en adenocarcinomas de colon y en la mucosa normal.
Chen C-Z et al, Science (2004) 303:83-86 describe tres miARNs, miR-181, miR-142 y miR-223 que se expresan especlficamente en las celulas hematopoyeticas (Chen et al., 2004).
Sempere L et al, Genome Biology (2004) 5:R13 desvela un total de 17 miARNs detectados exclusivamente en un organo particular de raton; entre estos: siete miARNs especlficos en el cerebro (miR-9, -124a, -124b, -135, -153, - 183, -219), seis miARNs especlficos en el pulmon (miR-18, -19a, -24, -32 , -130, -213), dos miARNs especlficos en el bazo (miR-189, -212), un miARN especlfico en el hlgado (miR-122a), y un miARN especlfico en el corazon (miR- 208). Todos los miARNs especlficos en el cerebro, hlgado y corazon de raton indicados tambien se detectaron en los organos de contrapartida humanos (no se evaluo la expresion de miARN en el rinon, pulmon o bazo humano), con la excepcion de miR-183 en el cerebro humano. Entre los 75 miARNs que se detectaron en dos o mas organos de raton, se detectaron niveles de 14 de estos en un organo particular del raton a niveles al menos duplicados mayores que en cualquier otro organo; entre estos: siete miARNs enriquecidos en el cerebro (miR-9*, -125a, -125b, - 128, -132, -137, -139), tres miARNs enriquecidos en el musculo esqueletico (miR-1d, -133, -206), dos miARNs enriquecidos en el rinon (miR-30b, -30c), y un miARN enriquecido en el bazo (miR-99a). Todos los miARNs enriquecidos en el cerebro y enriquecidos en el musculo esqueletico presentaban niveles elevados similares a los organos de contrapartida humanos. La elevada conservacion de la expresion de estos miARNs enriquecidos en organos y especlficos de organo entre raton y humano sugiere que estos pueden desempenar un papel conservado en el establecimiento y/o el mantenimiento de un tipo de celula o tejido de ese organo en particular (Sempere et al., 2004).
Baskerville y Bartel, RNA (2005) 11:241-247 desvela un estudio de perfiles de micromatrices y patrones de expresion de 175 miARNs humanos entre 24 organos humanos diferentes. Los resultados muestran que los pares proximales de miARNs se coexpresan generalmente (Baskerville y Bartel, 2005). Ademas, una transicion abrupta en la correlacion entre pares de miARNs expresados se produce a una distancia de 50 kb, lo que implica que los miARNs separados por <50 kb se obtienen normalmente a partir de un transcrito comun. Algunos miARNs estan
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dentro de los intrones de los genes huesped. Los miARNs intronicos se expresan por lo general de forma coordinada con su ARNm del gen huesped, lo que implica que tambien se obtienen en general a parti r de un transcrito comun, y que pueden utilizarse analisis in situ de la expresion genica del huesped para hibridar la localization espacial y temporal de los miARNs intronicos.
Barad et al, Genome Research (2004) 14:2486-2494 establece un sistema de micromatrices de oligonucleotidos especlficos de miARN que permite el analisis eficiente de la expresion de los miARNs humanos identificados hasta el momento. Esto demuestra que las sondas de oligonucleotidos de 60-mer en las micromatrices se hibridan con ARNc marcado de miARNs, pero no con sus ARNs precursores de horquilla obtenidos a partir de ARN amplificado, fraccionado en clases de tamano, total de origen humano. La intensidad de la senal se relaciona con la ubicacion de las secuencias de miARN en las sondas de 60- mer, ubicadas en la region 5' que proporciona las senales mas altas, y en el extremo 3', que proporciona las senales mas bajas. Por consiguiente, las sondas de 60-mer que albergan una unica copia de miARN en el extremo 5' proporcionaron senales de intensidad similar a las sondas que contienen dos o tres copias de miARN. El analisis de malapareamiento muestra que las mutaciones en la secuencia de miARN reducen o eliminan significativamente la senal, lo que sugiere que las senales observadas reflejan fielmente la abundancia de miARNs equivalentes en el ARNc marcado. El perfil de expresion de 150 miARNs en cinco tejidos humanos y en celulas HeLa revelo una buena concordancia general con los resultados publicados previamente, aunque tambien con algunas diferencias. Se presentan los datos en la expresion de miARN en el timo, los testlculos, y la placenta, y se han identificado miARNs altamente enriquecidos en estos tejidos. En conjunto, estos resultados ponen de manifiesto el aumento de la sensibilidad de la micromatriz de ADN en otros metodos para la detection y el estudio de miARNs, y el inmenso potencial en la aplicacion de este tipo de micromatrices para el estudio de miARNs en la salud y la enfermedad (Barad et al., 2004).
Kasashima K et al, Biochem Biophys Res Commun (2004) 322(2):403-10 describe la identification de tres miARNs novedosos y 38 conocidos expresados en celulas de leucemia humanas (HL-60) (Kasashima et al., 2004).
Mansfield J et al, Nature Genetics (2004) 36:1079-1083 desvela la expresion especlfica de tejido de varios miARNs durante la embriogenesis, incluyendo miR-10a y miR-196a (Mansfield et al., 2004).
Chen C-Z y Lodish H, Seminars in Immunology (2005) 17(2):155-165 desvela miR-181, un miARN expresado especlficamente en las celulas B en la medula osea de raton (Chen y Lodish, 2005). Se describe ademas que algunos miARNs humanos se relacionan con leucemias; el locus miR-15a/miR-16 se elimina con frecuencia o se disminuye en pacientes que padecen leucemia linfocltica cronica de celulas B y miR-142 se encuentra en un sitio de translocation hallado en un caso de leucemia de celulas B agresiva. Se senala que estos resultados indican que los miARNs pueden ser importantes reguladores de la hematopoyesis en mamlferos.
Los metodos para identificar nuevos miARNs y sus secuencias diana utilizando un enfoque computacional se desvelan en el documento WO2004/066183 y Brennecke J et al, PLoS Biology (2005) 3(3):0404-0418 (Brennecke et al., 2005).
La siguiente tabla 1 resume los miARN que pueden encontrar aplicabilidad en la presente invention.
Tabla 1 Estudios de expresion en miARNs de mamlfero
Patron de expresion miARN Referencias
Patrones de expresion especlficos de tejido de miARNs de mamlfero
Celula especlfica ES
miR-296 a
Expresado en celulas ES, pero aumentado en la diferenciacion
miR-21 y miR-22 a
Expresado tanto en celulas ES como en varios tejidos adultos
miR-15a, miR-16, miR-19b, miR-92, miR-93 miR-96, miR-130 y miR-130b a
Enriquecido durante el miR-128, miR-19b, miR-9, miR-125b, miR-131 miR-178, miR- b,c
desarrollo cerebral del raton 124a, miR-266 y miR-103_____________________________________
Enriquecido en cerebro miR-9*, miR-125a, miR-125b, miR-128, miR-132 miR-137, miR- b
adulto 139, miR-7, miR-9, miR124a, miR-124b, miR-135, miR-153, miR 149, miR- 183, miR-190, y miR-219____________________________
Enriquecido en pulmon miR-18, miR-19a, miR-24, miR-32, miR-130 miR-213, miR-20, b
_________________________miR-141, miR-193 y miR-200b________________________________
Enriquecido en bazo miR-99a, miR-127, miR-142-a, miR-142-s, miR-151, miR-189b y b
miR-212
Tejidos hematopoyeticos miR-181, miR-223 y miR-142 b
Enriquecido en hlgado miR-122a, miR-152, miR-194, miR-199 y miR-215 b
Enriquecido en corazon miR-1b, miR-1d, miR-133, miR-206, miR-208 y miR-143 b
Enriquecido en rinon miR-30b, miR-30c, miR-18, miR-20, miR-24 miR-32, miR-141, b
_________________________miR-193 y miR-200b________________________________________
Expresado ubicuamente miR-16, miR-26a, miR-27a, miR-143a, miR-21 let-7a, miR-7b, b
_________________________miR-30b y miR-30c_________________________________________
Expresion de miARN anormal durante la tumorigenesis
Disminuida en leucemias miR-15 y miR-16 d
linfoclticas cronicas
Disminuida en llneas miR-26a y miR-99a e
celulares de cancer de
pulmon____________________________________________________________________________
Disminuida en canceres de grupo miR143/miR-145 f
colon_____________________________________________________________________________
Aumentada en linfoma de miR-155 g
Burkitt
Celulas ES, celulas madre
embrionarias__________________________________________
a - Houbavy et al, Dev. Cell (2003) 5:351-358.
b - Sempere et al, Genome Biol. (2004) 5, R13.
c - Krichevsky et al, RNA (2003), 9:1274-1281.
d - Calin et al, Proc Natl Acad Sci (2002) 99:15524-15529.
e - Calin et al, Proc Natl Acad Sci (2004) 101:2999-3004.
f - Michael et al, Mol Cancer Res (2003) 1:882-891
g - Metzier et al, Genes Chromosomes Cancer (2004) 39:167-169.
Aunque nuestros datos demuestran la utilidad de este enfoque para restringir la expresion de las celulas hematopoyeticas, la red de regulacion del miARN endogeno permitira muchas mas posibilidades para restringir severamente la expresion transgenica. Los estudios de expresion ya han revelado miARNs especlficos para muchos 5 tipos celulares diferentes, incluyendo neuronas, islotes pancreaticos, y tejido adiposo. Utilizando el presente diseno,
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podrla crearse un vector que incluye secuencias diana de miR-21 y miR-22, dos miARNs aumentados tras la diferenciacion de celulas madre embrionarias (ESCs) (Houbaviy et al., 2003), unidos a un gen suicida tal como la timidina quinasa.
Otro uso posible del diseno del vector regulado por miARN serla para el tratamiento contra el cancer. Varios informes han indicado que los miARNs especlficos se reducen en ciertos tumores. miR-15 y miR-45, por ejemplo, disminuyen en leucemias linfoclticas cronicas y en el cancer de mama (Calin et al, 2004a; Calin et al, 2004b; lorio et al., 2005). La secuencia diana de miR-15 o mir-145 podrla incluirse en un vector que expresa un transgen toxico. Las celulas normales que expresan miR-15 o mir-145, incluyendo las celulas productoras del vector, suprimirlan la produccion de la toxina y as! sobrevivir, mientras que las celulas tumorales transducidas, que ya no expresan miR- 15 o mir-145, podrlan producir facilmente el gen de la toxina y morir.
Otro uso posible del diseno del vector regulado por miARN impedirla la movilizacion del vector de las celulas hematopoyeticas transducidas que se superinfectan con un virus de tipo natural. La secuencia diana de miARN tambien podrla incluirse en una region del vector distinta de la casete de expresion para el transgen.
El vector de miARN puede utilizarse en conjuncion con un promotor bidireccional (Amendola et al., 2005). Estos vectores, que presentan la propiedad unica de producir dos transcritos de ARNm distintos de un unico promotor, pueden modificarse para incluir secuencias diana de miARN en uno o ambos de los casetes de expresion. Por consiguiente, la adicion de miR-142-3pT al transgen 1, pero no al transgen 2, permitirla la expresion ubicua del transgen 2, mientras previene al mismo tiempo la expresion de transgen 1 en celulas hematopoyeticas. Este diseno permitira la regulacion divergente de dos transgenes, una caracterlstica no posible con las tecnologlas actuales.
El miARN puede utilizarse con un vector genico apropiado, es decir, un vector adecuado para la administracion de un gen (transgen) de interes, tal como un vector viral. Ejemplos de estos se describen a continuacion.
Retrovirus
Durante la ultima decada, la terapia genica se ha aplicado al tratamiento de la enfermedad en cientos de ensayos cllnicos. Se han desarrollado varias herramientas para administrar genes en celulas humanas; entre ellos, los retrovirus modificados geneticamente, incluyendo lentivirus, se encuentran actualmente entre la herramienta mas popular para la administracion de genes. La mayorla de los sistemas contienen vectores que son capaces de acomodar genes de celulas de interes y celulas auxiliares que pueden proporcionar las protelnas y las enzimas estructurales virales para permitir la generation de partlculas virales infecciosas que contienen el vector. Los retrovirus son una familia de retrovirus que difiere en la secuencia de nucleotidos y de aminoacidos, la estructura genomica, la patogenicidad, y el rango de huesped. Esta diversidad proporciona oportunidades para utilizar virus con diferentes caracterlsticas biologicas para desarrollar diferentes aplicaciones terapeuticas. Como con cualquier herramienta de administracion, la eficacia, la capacidad para orientarse selectivamente a cierto tejido o tipo celular, la expresion del gen de interes, y la seguridad de los sistemas basados en retrovirus son importantes para la aplicacion exitosa de la terapia genica. En los ultimos anos se han dedicado importantes esfuerzos a estas areas de investigation. Se han realizado diversas modificaciones a los vectores basados en retrovirus y en celulas auxiliares para alterar la expresion genica, la administracion diana, mejorar los tltulos virales, y aumentar la seguridad. La presente invention representa una mejora en este proceso de diseno que actua para administrar eficazmente genes de interes en dichos vectores virales.
Los virus son herramientas logicas para la administracion genica. Se replican dentro de las celulas y, por tanto, presentan mecanismos evolucionados para entrar en las celulas y utilizan la maquinaria celular para expresar sus genes. El concepto de la administracion genica basado en virus es desarrollar por ingenierla genetica el virus para que pueda expresar el gen de interes. En funcion de la aplicacion especlfica y el tipo de virus, la mayorla de los vectores virales contienen mutaciones que dificultan su capacidad para replicarse libremente como virus de tipo natural en el huesped.
Se han modificado virus de varias familias diferentes para generar vectores virales para la administracion genica. Estos virus incluyen retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus del herpes simple, picornavirus y alfavirus. La presente invencion emplea preferentemente retrovirus, incluyendo lentivirus.
Un vector retroviral ideal para la administracion genica debe ser eficiente, especlfico para las celulas, regulado y seguro. La eficacia de la administracion es importante puesto que puede determinar la eficacia de la terapia. Los esfuerzos actuales se orientan a la consecution de la infection especlfica de tipo celular y la expresion genica con vectores retrovirales. Ademas, se estan desarrollando vectores retrovirales para regular la expresion del gen de interes, ya que la terapia puede requerir una expresion de larga duration o regulada. La seguridad es un tema importante para la administracion de genes virales puesto que la mayorla de los virus son o patogenos o tienen un potencial patogenico. Es importante que durante la administracion genica, el paciente no reciba tambien de manera inadvertida un virus patogeno con potencial de replication completo.
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Los retrovirus son virus de ARN que se replican a traves de un intermedio de ADN integrado. Las partlculas retrovirales encapsidan dos copias del ARN viral completo, cada copia contiene la information genetica completa necesaria para la replication del virus. Los retrovirus poseen una envoltura lipldica y utilizan interacciones entre la protelna de la envoltura viralmente codificada que se incrusta en la membrana y un receptor celular para entrar en las celulas huesped. Utilizando la transcriptasa inversa de la enzima viralmente codificada, que esta presente en el virion, el ARN viral se transcribe de forma inversa en una copia de ADN. Esta copia de ADN se integra en el genoma huesped mediante la integrasa, otra enzima viralmente codificada. El ADN viral integrado se refiere como un provirus y una parte del genoma del huesped se vuelve permanente. La maquinaria transcripcional y traduccional celular lleva a cabo la expresion de los genes virales. La ARN polimerasa II huesped transcribe el provirus para generar ARN, y otros procesos celulares modifican y transportan el ARN fuera del nucleo. Una fraction de ARNs virales se corta y empalma para permitir la expresion de algunos genes, mientras que otros ARNs virales permanecen completos. La maquinaria traduccional huesped sintetiza y modifica las protelnas virales. Las protelnas virales recientemente sintetizadas y los ARNs virales completos recientemente sintetizados se ensamblan entre si para formar nuevos virus que brotan de las celulas huesped.
En base a sus estructuras genomicas, los retrovirus pueden clasificarse en retrovirus simples y complejos. Los retrovirus simples y complejos codifican los genes gag (antlgeno especlfico de grupo), pro (proteasa), pol (polimerasa), y env (envoltura). Ademas de estos genes, los retrovirus complejos tambien codifican varios genes accesorios.
Los retrovirus tambien pueden clasificarse en oncovirus, lentivirus, y espumavirus. La mayorla de los oncovirus son retrovirus simples. Los lentivirus, espumavirus, y algunos oncovirus son retrovirus complejos. Actualmente, los tres tipos de virus estan siendo explotados como herramientas de terapia genica. A continuation se discutiran ejemplos de cada tipo.
El virus de leucemia murina (MLV) es un ejemplo de oncovirus, el virus de la inmunodeficiencia humana 1 (HIV-1) es un ejemplo de lentivirus, y el virus espumoso humano es un ejemplo de espumavirus.
Cuando un retrovirus competente para la replicacion infecta una celula huesped natural, puede formar un provirus en el genoma huesped, expresar genes virales, y liberar nuevas partlculas infecciosas para infectar otros huespedes. En la mayorla de las aplicaciones de terapia genica, no es deseable administrar un virus competente para la replicacion a un paciente debido a que el virus puede propagarse mas alla del tejido dirigido y causar efectos adversos patogenos. Por consiguiente, en la mayorla de sistemas retrovirales disenados para la administration genica, los componentes virales se dividen en un vector y un constructo auxiliar que limita la capacidad del virus para replicarse libremente.
El termino vector se refiere generalmente a un virus modificado que contiene el(los) gen(es) de interes (o transgen) y elementos que actuan en cis necesarios para la expresion y la replicacion genica. La mayorla de los vectores contienen una delecion(es) de algunas o todas las secuencias codificantes de las protelnas virales de modo que no son competentes para la replicacion. Los constructos auxiliares se conciben para expresar genes virales que carecen de los vectores y apoyar la replicacion de los vectores. La funcion auxiliar proporciona mas a menudo un formato celular auxiliar aunque tambien puede proporcionarse como un virus auxiliar o como plasmidos cotransfectados.
Las celulas auxiliares son celulas de cultivo desarrolladas por ingenierla genetica que expresan protelnas virales necesarias para propagar vectores retrovirales; esto se consigue generalmente mediante la transfection de plasmidos que expresan las protelnas virales en las celulas de cultivo. La mayorla de llneas celulares auxiliares se obtienen a partir de clones celulares para garantizar la uniformidad en el apoyo a la replicacion del vector retroviral. Los virus auxiliares no se utilizan a menudo debido a la probabilidad que podrla generarse un virus competente para la replicacion a traves de la recombination de alta frecuencia. Las funciones auxiliares tambien pueden proporcionarse por transfeccion transitoria de los constructos auxiliares para lograr una rapida propagation de los vectores retrovirales.
La mayorla de los vectores retrovirales se mantienen como plasmidos bacterianos para facilitar la manipulation y la propagacion del ADN del vector. Estos vectores de ADN bicatenario pueden introducirse en celulas auxiliares por metodos convencionales tales como transfeccion de ADN, lipofeccion, o electroporation. La celula auxiliar mostrada expresa todas las protelnas virales (Gag, Gag-Pol, y Env), pero carece de ARN que contiene la senal de encapsidacion. El aRn viral es necesario para la formation y liberation de partlculas virales infecciosas, pero no es necesario para la formacion de partlculas virales no infecciosas "vaclas". Cuando se introduce el ADN vector en las celulas auxiliares, el ARN vector que contiene una senal de encapsidacion se transcribe y se encapsida eficazmente en partlculas virales. Las partlculas virales contienen protelnas virales expresadas a partir de constructos auxiliares y ARN transcrito a partir del vector. Estas partlculas virales pueden infectar celulas diana, transcribir de forma inversa el vector de ARN para formar una copia de ADN bicatenario, e integrar la copia de ADN en el genoma huesped para formar un provirus. Este provirus codifica el(los) gen(es) de interes, y se expresa por la maquinaria celular huesped. Sin embargo, debido a que el vector no expresa protelnas virales, no puede generar partlculas virales infecciosas que pueden propagarse a otras celulas diana.
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Las celulas auxiliares se conciben para soportar la propagacion de vectores retrovirales. Las protelnas virales en las celulas auxiliares se expresan a partir de constructos auxiliares que se transfectan a celulas de mamlfero. Los constructos auxiliares varlan en su modo de expresion y en los genes que codifican.
Constructos auxiliares de un genoma
En las llneas celulares auxiliares que se desarrollaron inicialmente, todos los genes virales se expresaron a partir de un constructo auxiliar. Ejemplos de estas celulas auxiliares son C3A2 y -2. Los constructos auxiliares para estas llneas celulares clonaron ADNs provirales que careclan de las senales de encapsidacion. Estas celulas auxiliares pueden soportar la propagacion eficaz de vectores retrovirales. Sin embargo, un problema importante con estas celulas auxiliares es que los virus competentes para la replicacion pueden generarse con frecuencia durante la propagacion del vector viral. El constructo auxiliar contiene la mayor parte del genoma viral y por lo tanto comparte homologla de secuencia significativa con el vector retroviral. La homologla de secuencia puede facilitar la recombinacion entre el constructo auxiliar y el vector retroviral para generar virus competentes para la replicacion. Aunque el ARN auxiliar carece de la senal de encapsidacion, todavla puede encapsidarse en un virion con una baja eficacia (aproximadamente 100 a 1.000 veces menos que contienen ARNs). La recombinacion retroviral se produce con frecuencia entre los dos ARNs virales coencapsidados para generar una copia de ADN que contiene la informacion genetica de ambos originales. Si el ARN auxiliar y el ARN vector se encapsidan en el mismo virion, las grandes regiones de homologla de secuencia entre los dos ARNs pueden facilitar la recombinacion homologa durante la transcription inversa para generar un virus competente para la replicacion. Un evento de recombinacion similar puede producirse entre el ARN auxiliar y el ARN obtenido a partir de un virus endogeno en una menor eficacia para generar virus competentes para la replicacion.
Constructos auxiliares de genoma fragmentado
El problema de seguridad asociado a la generation de virus competentes para la replicacion ha provocado el diseno de muchas llneas celulares auxiliares que utilizan "genomas fragmentados", incluyendo CRIP, GP+envAm12, y DSN. En estas celulas auxiliares, las poliprotelnas virales Gag/Gag-Pol se expresan a partir de un plasmido y las protelnas Env se expresan a partir de otro plasmido. Ademas, los dos constructos auxiliares tambien contienen deleciones de elementos virales que actuan en cis para reducir o eliminar homologla de secuencia con el vector retroviral. En estas celulas auxiliares, los genes codificantes de las protelnas virales se separan en dos constructos diferentes y los elementos virales que actuan en cis se encuentran en el vector. Por lo tanto, tienen que producirse varios eventos de recombinacion para reconstituir el genoma viral. Ademas, la reduction de las regiones de homologla disminuye la probabilidad que se produzcan estos eventos de recombinacion. Por lo tanto, las celulas auxiliares que contienen constructos auxiliares de genoma fragmentado se consideran mas seguros que las celulas auxiliares que contienen constructos auxiliares de un genoma.
Constructos auxiliares inducibles
A diferencia de las llneas celulares auxiliares descritas previamente que expresan las protelnas virales constitutivamente, se han concebido algunas llneas celulares auxiliares para expresar las protelnas virales de una manera inducible. Una de las razones para la generacion de una llnea celular auxiliar inducible es que algunas protelnas virales son citotoxicas y no pueden expresarse facilmente a niveles elevados. Utilizando un sistema inducible, la expresion de las protelnas citotoxicas puede limitarse en la etapa en la que se propaga el virus. Controlando la expresion de las protelnas citotoxicas, pueden alcanzarse altos tltulos virales. Ejemplos de las celulas auxiliares inducibles incluyen las celulas 293GPG y llneas celulares auxiliares de VIH-1.
Sistemas de transfection transitoria
Con el desarrollo de metodos de transfeccion eficientes, tambien se han desarrollado sistemas de transfeccion transitoria para la propagacion de vectores retrovirales. En estos sistemas, las funciones auxiliares se expresan generalmente a partir de dos constructos diferentes, uno expresa gag-pol y otro expresa env. Estos dos constructos comparten generalmente poca homologla de secuencia. El vector retroviral y los constructos auxiliares se transfectan en las celulas, y los virus se recogen unos pocos dlas despues de la transfeccion.
Sistemas que generan virus pseudotipados
Pseudotipaje se refiere a partlculas virales que contienen un genoma viral de un virus y parte (o la totalidad) de las protelnas virales de un virus diferente. La forma mas comun de pseudotipaje implica un virus que utiliza la protelna de la envoltura de otro virus. Algunas de las llneas celulares auxiliares contienen constructos auxiliares que expresan gag-pol de un virus y env de otro virus. Puesto que las poliprotelnas Gag seleccionan el ARN viral, el vector viral que se propaga contiene un ARN reconocido por la poliprotelna Gag expresada en estas celulas. Sin embargo, las partlculas virales producidas contienen la protelna Env obtenida a partir de otro virus. Por lo tanto, estas partlculas virales solo pueden infectar celulas que expresan un receptor que puede interactuar con la protelna de la envoltura heterologa. Por ejemplo, la llnea celular auxiliar PG13 expresa gag-pol de MLV y env del virus de la leucemia del mono gibon (GaLV). Debido a que la llnea celular PG13 expresa la poliprotelna Gag MLV, pueden
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encapsidarse eficazmente vectores retrovirales basados en MLV. Tambien se ha demostrado que algunas envolturas obtenidas a partir de virus de una familia diferente tambien pueden pseudotipar retrovirus y generar partlculas virales infecciosas. Por ejemplo, la protelna G del virus de la estomatitis vesicular (VSV), un rabdovirus, puede utilizarse para generar vectores retrovirales pseudotipados. Estos virus pseudotipados G VSV exhiben un rango de huesped muy amplio y pueden infectar a numerosas celulas que normalmente no pueden infectarse con los retrovirus. Otras envolturas que pueden utilizarse para pseudotipar el vector son las de los siguientes virus: el retrovirus endogeno felino RD114, que se dirige con eficacia a las celulas hematopoyeticas, el virus de la coriomeningitis linfocltica (LCMV), el virus de la rabia, los virus del Ebola y Mokola, el virus del rlo de Ross y el virus del bosque de Semliki, y la envoltura gp64 de baculovirus.
El pseudotipaje puede implicar, por ejemplo, un genoma retroviral basado en un lentivirus tal como un VIH o virus de la anemia infecciosa equina (EIAV) y la protelna de la envoltura puede ser por ejemplo la protelna de la envoltura anfotropica designada 4070A. Alternativamente, la protelna de la envoltura puede ser una protelna de otro virus tal como una hemaglutinina de la gripe. En otra alternativa, la protelna de la envoltura puede ser una protelna de la envoltura modificada tal como una protelna de la envoltura mutante, truncada o desarrollada por ingenierla genetica (como la envoltura RD114 desarrollada por ingenierla genetica). Se pueden realizar o seleccionar modificaciones para introducir la capacidad de orientacion selectiva o para reducir la toxicidad o para otro fin.
Los sistemas que contienen env geneticamente modificados por celula o interacciones orientadas selectivamente al tejido entre las protelnas de la envoltura viral y los receptores celulares determinan el rango de huesped del virus. Se han desarrollado estrategias para orientar selectivamente la administracion del virus en ciertos tipos celulares mediante la modificacion de Env viral. Tras la traduccion y la modificacion, la parte SU de Env interactua con un receptor celular. La modificacion de la parte SU de Env se logra a menudo mediante la delecion de una parte de la region codificante de SU y se reemplaza con regiones de otras protelnas. Las protelnas utilizadas para modificar la parte SU de Env incluyen eritropoyetina, heregulina, factor I de crecimiento similar a la insulina, y anticuerpos de fragmentos variables de cadena sencilla contra diversas protelnas.
Sistemas hlbridos
Algunos sistemas recientemente desarrollados utilizan un enfoque hlbrido para la propagation de vectores retrovirales. Se utiliza una llnea celular auxiliar para expresar constitutivamente algunas de las protelnas virales, mientras que otras protelnas virales se introducen en la llnea celular auxiliar mediante transfection transitoria. Por ejemplo, un vector retroviral puede introducirse en una llnea celular auxiliar que expresa constitutivamente gag-pol MLV. Para propagar el vector retroviral, puede introducirse un plasmido concebido para expresar G VSV en el sistema mediante transfeccion transitoria. Como otra variation de este tema, el propio vector retroviral puede codificar algunas de las protelnas virales (por ejemplo, Gag/Gag-Pol), y una llnea celular auxiliar puede proporcionar otras protelnas virales (Env) (Boerkoel et al., 1993). Tambien pueden utilizarse enfoques que utilizan otros virus para administrar los constructos auxiliares retrovirales. Por ejemplo, se genero un virus del herpes simple modificado para contener gag, pol, y env retrovirales y para servir la funcion auxiliar. Del mismo modo, tambien se han utilizado vectores de adenovirus y vectores de expresion derivados del virus del bosque de Semliki para administrar genes codificantes de las protelnas virales de mLv a celulas auxiliares.
Vectores basados en diferentes retrovirus
Se han modificado muchos retrovirus para generar vectores que pueden transportar gen(es) de interes (transgen). Los vectores virales contienen generalmente todos los elementos que actuan en cis necesarios para la replication viral y la expresion genica. Tambien pueden ser necesarios elementos adicionales en vectores obtenidos a partir de algunos virus para garantizar la administracion exitosa de genes. El requisito de estos elementos que actuan en cis a menudo pone manifiesto una mayor comprension de la biologla de estos virus. Ademas, para permitir una facil manipulation de celulas bacterianas, la mayorla de los vectores retrovirales se encuentran en forma de plasmido y presentan una estructura que contiene el origen bacteriano de replicacion y un gen resistente a antibioticos. Se realizan normalmente las siguientes etapas para producir partlculas virales de vectores retrovirales. El ADN vector se introduce en primer lugar en las celulas auxiliares mediante transfeccion, electroporation, o lipofeccion. Tras la introduction del ADN en las celulas auxiliares, el ADN vector se integra en la celula auxiliar y se expresa. El ARN viral se expresa a partir de LTR 5' y consiste en todas las secuencias entre las dos regiones R. Este ARN viral contiene la senal de encapsidacion y se encapsida en las partlculas virales de manera eficiente. Durante la replicacion retroviral, las secuencias de estructura del plasmido salen de las dos LTRs que no se transfieren a las celulas diana. Se describen a continuation las estructuras basicas de algunos vectores retrovirales obtenidos a partir de diferentes retrovirus.
Vectores obtenidos a partir de oncovirus
Los vectores obtenidos a partir de tres oncovirus diferentes se describiran en este caso para representar algunos de los vectores retrovirales utilizados mas ampliamente. Los oncovirus solo pueden infectar celulas en division; por lo tanto, los vectores que se obtienen a partir de oncovirus solo pueden utilizarse para administrar eficazmente genes
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en celulas en division. El requisito para la proliferacion celular puede utilizarse a veces como una ventaja para orientar selectivamente celulas que se dividen rapidamente (por ejemplo, celulas cancerosas).
1. Vectores basados en virus de la leucemia murina. Actualmente, los vectores retrovirales basados en MLV y las celulas auxiliares son el sistema frecuentemente mas utilizado para la administracion genica. El desarrollo y la disponibilidad de los vectores desarrollados por ingenierla genetica y las llneas celulares auxiliares han impulsado la popularidad de los vectores basados en MLV. Los vectores contienen secuencias virales que actuan en cis que son necesarias para la expresion genica y la replicacion viral, tales como LTRs, PBS, PPT, y att. La senal de encapsidacion puede ser una senal minima o una senal mas larga que se extiende en el marco de lectura abierto de gag (+). Cuando la + esta presente en el vector, es necesario mutar el codon de iniciacion de la traduccion de gag para prevenir la expresion de la protelna Gag truncada. Se han concebido varios vectores para contener multiples sitios de enzimas de restriccion entre la senal de encapsidacion y la region no traducida 3'. La presencia de estos sitios de clonacion facilita la construccion de vectores que pueden expresar el gen de interes.
Los vectores basados en MLV pueden propagarse eficazmente en todas las llneas celulares auxiliares de MLV. Existen varias protelnas de la envoltura de MLV que dictan el rango de huesped de los vectores de MLV. Los virus que utilizan la envoltura ecotropica pueden infectar celulas de raton pero no las celulas obtenidas a partir de otras especies. Los virus que utilizan la envoltura anfotropica pueden infectar tanto a celulas de raton como celulas obtenidas a partir de otras especies, incluyendo celulas humanas. Los virus que utilizan la envoltura xenotropica no pueden infectar celulas de raton pero pueden infectar celulas obtenidas a partir de otras especies. Ademas, los vectores de MLV tambien pueden propagarse en llneas celulares auxiliares basadas en el virus de la necrosis del bazo (SNV). El SNV es un virus aviar que se relaciona vagamente con MLV. Sorprendentemente, las protelnas de SNV conservan la capacidad para interactuar con secuencias que actuan en cis de MLV y encapsidan ARN de MLV, transcriben de forma inversa el genoma de MLV, e integran el ARN de MLV en el huesped.
2. Vectores basados en el virus de la necrosis del bazo. Las secuencias virales requeridas en estos vectores son muy similares a los de los vectores de MLV. La senal de encapsidacion de SNV, denotada E, no se extiende en el marco de lectura abierto de gag; por lo tanto, la mayorla de los vectores basados en SNV no contienen las regiones codificantes de gag. Similar a los vectores de MLV, los genes de interes se insertan en una region conectora que contiene multiples sitios de restriccion entre la senal de encapsidacion y la region no traducida 3'. Los vectores basados en SNV pueden propagarse en llneas celulares auxiliares basadas en SNV, tales como C3A2, DSDH, DSH134G y DSN.
3. Vectores basados en el virus del sarcoma de Rous y en el virus de la leucosis aviar. El RSV es el unico retrovirus oncogenico agudo conocido que es competente para la replicacion. Ademas de gag-pol y env, RSV tambien codifica el oncogen v-src entre env y la LTR 3'. Un sitio aceptor de corte y empalme corriente arriba del v-src permite que el gen se exprese como cortado y empalmado. RSV posee la capacidad para codificar un gen adicional. Se han realizado diversas modificaciones para generar un vector viral competente para la replicacion, ejemplo del cual es el reemplazo de v-src por un sitio aceptor de corte y empalme y varios sitios de enzimas de restriccion. Los fragmentos de ADN pueden insertarse en los sitios de restriccion para generar un vector competente para la replicacion que expresa el gen de interes.
Tambien se ha modificado ALV para generar vectores que requieren celulas auxiliares para su propagacion. Similar a los vectores de MLV y SNV descritos previamente, la estructura basica de un vector de ALV tambien contiene las LTRs 5' y 3', att, PBS, PPT, y una senal de encapsidacion. La senal de encapsidacion de ALV se extiende en el marco de lectura abierto de gag, y las partes pertinentes de gag se incluyen en vectores basados en ALV para lograr una encapsidacion eficaz.
Vectores obtenidos a partir de lentivirus
A diferencia de los oncovirus, se ha demostrado que algunos lentivirus infectan las celulas quiescentes que no se dividen. Los lentivirus son retrovirus complejos que pueden requerirse para expresar protelnas accesorias para la regulacion de su ciclo de replicacion. Algunas de estas protelnas accesorias se unen a regiones del genoma viral para regular la expresion genica. Por lo tanto, los vectores basados en lentivirus necesitan incorporar elementos adicionales que actuan en cis de manera que pueda producirse la replicacion viral y la expresion genica eficaz. Como ejemplos de vectores basados en lentivirus, se describen a continuation vectores basados en VIH-1 y VIH-2.
El vector de VIH-1 contiene elementos que actuan en cis que tambien se encuentran en los retrovirus simples. Se ha demostrado que las secuencias que se extienden en el marco de lectura abierto de gag son importantes para la encapsidacion de VIH-1. Por lo tanto, los vectores de VIH-1 contienen a menudo la parte pertinente de gag en la que se ha mutado el codon de iniciacion de la traduccion. Ademas, la mayorla de los vectores de VIH-1 tambien contiene una parte del gen env que incluye RRE. Rev se une a RRE, que permite el transporte de ARNms empalmados y cortados individualmente o completos del nucleo al citoplasma. En ausencia de Rev y/o RRE, se acumulan en el nucleo ARNs de VIH-1 completos. Alternativamente, un elemento de transporte constitutivo de ciertos retrovirus simples, tales como el virus del mono Mason-Pfizer, puede utilizarse para atenuar el requisito de Rev y RRE. La transcription eficiente del promotor de LTR de VIH-1 requiere la protelna viral Tat. Por lo tanto, es importante que Tat se exprese en las celulas diana si se requiere una transcripcion eficiente de LTR de VIH-1. La necesidad para la
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expresion de Tat puede satisfacerse expresando el gen Tat del vector retroviral. Alternativamente, expresando el gen de interes a partir de un promotor interno heterologo puede eludirse la necesidad de expresion de Tat.
La mayorla de los vectores basados en VIH-2 es estructuralmente muy similar a los vectores de VIH-1. Similar a los vectores basados en VIH-1, los vectores VIH-2 tambien requieren RRE para el transporte eficaz de ARNs virales empalmados y cortados individualmente o completos.
Se ha demostrado tambien que el vector de VIH-1 puede propagarse a altos tltulos virales utilizando protelnas virales del virus de inmunodeficiencia en simios. En un sistema, el vector y los constructos auxiliares provienen de dos virus diferentes, y la homologla reducida de nucleotidos puede disminuir la probabilidad de recombinacion. Ademas de los vectores basados en lentivirus de primates, tambien se han desarrollado vectores basados en el virus de la inmunodeficiencia felina como alternativa a los vectores obtenidos a partir del genoma patogeno del VIH-
1. Las estructuras de estos vectores tambien son similares a los vectores basados en VIH-1.
Vectores obtenidos a partir de espumavirus
Los virus espumosos son retrovirus no convencionales cuyas muchas caracterlsticas en su ciclo de replicacion son diferentes de las de los oncovirus y lentivirus. Aunque estos virus pueden ser toxicos para las celulas cultivadas, no se tiene conocimiento alguno que los virus espumosos causen cualquier enfermedad en los huespedes.
Un ejemplo de un vector de virus espumoso contiene las secuencias retrovirales tlpicas que actuan en cis. Ademas de las secuencias en la region no traducida 5', la parte 5' del marco de lectura abierto de gag y las secuencias en la parte 3' del marco de lectura abierto de pol son importantes para la encapsidacion eficaz. Similar a los lentivirus, la expresion del promotor del virus espumoso humano se activa por la protelna viral Tas.
Diseno de vectores retrovirales
Los vectores retrovirales pueden contener muchas modificaciones diferentes que pueden tener varios fines para el terapeuta genico. Estas modificaciones pueden introducirse para permitir la expresion de mas de un gen, regular la expresion genica, activar o inactivar los vectores virales, y eliminar las secuencias virales para evitar la generation de un virus competente para la replicacion. Se describen a continuation algunos ejemplos de estas modificaciones.
A. Vectores convencionales
1. Expresion Genica dirigida por el promotor U3. El ARN viral completo se expresa a partir del promotor retroviral situado en la region U3 de LTR 5'. El ARN viral contiene R, U5, la region no traducida 5', un gen de interes, la region no traducida 3', U3, y R. El gen insertado entre las regiones no traducidas 5' y 3' puede traducirse a partir del ARN completo que se transcribe a partir del promotor U3.
Durante la propagation de las soluciones concentradas virales, es deseable a menudo expresar un gen marcador seleccionable en el vector de modo que puedan seleccionarse celulas auxiliares transfectadas o infectadas por los vectores virales. Por lo tanto, a menudo es necesario concebir vectores retrovirales que expresan un gen marcador seleccionable as! como un gen de interes. Los genes de resistencia a farmacos se utilizan frecuentemente como marcadores seleccionables, pero otros genes marcadores, tales como el gen de la protelna verde fluorescente, tambien pueden utilizarse para seleccionar celulas transfectadas o infectadas. La expresion de dos genes en un vector retroviral puede obtenerse mediante la expresion del gen 3' al utilizar un promotor interno, corte y empalme de ARN, o sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
2. Vectores que utilizan un promotor interno para expresar genes adicionales. Un ejemplo de la expresion genica de un vector retroviral contiene un promotor interno, en el que, p. ej., el ARN completo que se expresa a partir del promotor U3 viral se utiliza para traducir un primer gen(es) de interes. El ARN subgenomico que se expresa a partir del promotor interno se utiliza para traducir un segundo gen(es) de interes.
3. Vectores que utilizan corte y empalme para expresar genes adicionales. Los retrovirus expresan env mediante corte y empalme regulado. El sitio donador de corte y empalme utilizado para expresar env se encuentra en la region no traducida 5' de los retrovirus. Durante la replicacion, algunos ARNs virales completos se cortan y empalman para producir ARNs virales subgenomicos utilizados para expresar las protelnas Env. Los vectores de corte y empalme se desarrollaron utilizando el mismo principio para expresar dos genes diferentes utilizando los sitios aceptores de corte y empalme y donadores de corte y empalme virales. La ventaja de los vectores de corte y empalme es que solo se requiere un promotor, y cualquier potencial de interferencia del promotor se elimina.
4. Vectores que utilizan senales de control de traduction para expresar genes adicionales. Se demostro por primera vez en picornavirus que las secuencias en el ARNm pueden utilizarse como senales que permiten al ribosoma unirse al centro de un ARNm y traducir un gen lejos del extremo 5' del ARNm. Estas secuencias (llamadas IRES), se emplean comunmente en vectores retrovirales. Ademas de las secuencias IRES identificadas en picornavirus, las secuencias IRES tambien se han identificado en las regiones no traducidas 5' de algunos retrovirus tales como MLV, SNV, y un virus endogeno similar a la partlcula (LV30). Por lo tanto, tambien es posible utilizar estas secuencias
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retrovirales IRES para expresar un segundo gen. Otras secuencias que permiten la expresion de multiples protelnas a partir de una unica transcripcion son peptidos similares a autoescision 2A (tambien llamados CHYSEl, elementos hidrolasa que actuan en cis) obtenidos a partir del virus de la enfermedad del pie y boca y otros picornavirus. Alternativamente, pueden utilizarse promotores bidireccionales para expresar dos genes del mismo promotor.
B. Vectores de doble copia
El hecho de que se dupliquen las secuencias de LTR en vectores retrovirales se ha explotado para construir vectores que contienen dos copias del gen de interes. Por ejemplo, el primer conjunto de vectores de doble copia contiene el gen de interes en la region U3 corriente arriba del viral. Estos genes se expresan utilizando ya sea un promotor de la ARN polimerasa II o un promotor de la ARN polimerasa III. Se ha demostrado que esta estrategia aumenta con exito el nivel de la expresion genica. En otro ejemplo de un vector de doble copia, el vector contiene el gen de interes en el centro de la region R.
C. Vectores de autoinactivacion
Uno de los problemas de seguridad asociados con el uso de vectores retrovirales para la terapia genica es que un virus competente para la replicacion puede generarse durante la propagacion de los vectores, que pueden conducir a la propagacion accidental del vector terapeutico en los tejidos no diana. Para hacer frente a este problema, se concibio una clase de vectores para someterse a autoinactivacion. El principio es que tras la administracion genica, el vector eliminara algunos de los elementos que actuan en cis necesarios para completar otra serie de replicacion. Por lo tanto, incluso en presencia de un virus competente para la replicacion, estos vectores no pueden transferirse a otras celulas diana de manera eficiente. La generacion de un virus competente para la replicacion a veces implica la recombinacion entre el plasmido auxiliar defectuoso y el vector codificante del gen de interes. Por lo tanto, otro posible beneficio del vector de autoinactivacion es que puede disminuir la probabilidad de generar un virus competente para la replicacion.
1. Vectores sin U3. Los vectores sin U3 fueron los primeros vectores retrovirales de autoinactivacion en desarrollarse. Estos vectores se conciben para eliminar el promotor U3 viral durante la transcripcion inversa de modo que el provirus en la celula diana carece de un promotor viral. En estos vectores, el U3 de la LTR 5' esta intacto, mientras que el U3 de la LTR 3' se inactiva por un gran delecion. El ARN generado a partir de este vector contiene R, U5, region no traducida 5', gen(es) de interes, region no traducida 3', U3 eliminado, y R. Durante la transcripcion inversa, U3 en el extremo 3' del ARN viral se utiliza normalmente como una plantilla para generar la LTR. Por lo tanto, el ADN viral sintetizado a partir del vector sin U3 a traves de la transcripcion inversa contiene secuencias U3 eliminadas en ambas LTRs. Dado que el promotor viral se elimina durante la transcripcion inversa, el gen de interes esta bajo el control de un promotor interno. La ventaja del vector sin U3 es que es potencialmente mas segura, ya que se reduce la probabilidad de generacion de un virus competente para la replicacion. Sin embargo, a una baja frecuencia, puede producirse que la recombinacion durante la transfeccion de ADN regenere el U3 en la LTR 3'. Si esto sucede, el vector resultante seguira conteniendo el promotor en el U3 y por consiguiente retiene dos LTRs completas. Se han realizado modificaciones adicionales en algunos vectores sin U3 para disminuir la homologla entre las LTR 5' y 3', reduciendo la probabilidad de recombinacion y regeneration de una LTR intacta durante la transfeccion de ADN.
2. Vectores Cre/loxP. La recombinasa Cre, una recombinasa especlfica de sitio de origen natural del bacteriofago P1, reconoce una secuencia de 32 pb denominada loxP. Cre puede mediar de manera eficiente en la recombinacion especlfica del sitio utilizando dos sitios loxP separados por secuencias de longitudes variables. Los eventos de recombinacion incluyen delecion, insertion, e inversion de las secuencias entre los sitios loxP. Este sistema se ha explotado para desarrollar vectores retrovirales de autoinactivacion (Choulika et al., 1996; Russ et al., 1996). Un ejemplo de dicho vector contiene una LTR 5' intacta y todos los elementos que actuan en cis necesarios para la replicacion retroviral. El vector contiene el gen de la recombinasa cre que se expresa utilizando un promotor interno. La LTR 3' se ha modificado mediante la insercion de varias secuencias en el U3, incluyendo un sitio loxP, un promotor, y un gen de interes; ademas, el U3 3' contiene a menudo una delecion para reducir la actividad del promotor. El ARN viral completo se encapsida en viriones, y tras la infection de las celulas diana, el ARN viral se transcribe de forma inversa. La secuencia U3 3' se utiliza como una plantilla para sintetizar ambas LTRs; por consiguiente, las secuencias en ambas LTRs contienen una copia del sitio loxP, un promotor, y un gen de interes. El gen cre se expresa, y la recombinasa Cre se sintetiza en las celulas diana infectadas. La recombinasa Cre media a continuation la delecion de secuencias entre los dos sitios loxP en el ADN viral, traduciendose en la supresion de la LTR 5', de la region no traducida 5', del promotor interno, y cre. Como resultado, el provirus en las celulas diana contiene solo una LTR que expresa el gen de interes.
Utilizando el mismo principio, el sistema Cre/loxP puede utilizarse para eliminar diferentes secuencias en el vector retroviral as! como eliminar partes del constructo auxiliar en las celulas de encapsidacion. Otra aplicacion del sistema Cre/loxP es que puede utilizarse para eliminar el marcador seleccionable de un vector retroviral despues de integrar el ADN viral en el cromosoma de las celulas diana. El marcador seleccionable se incluye en el vector de modo que puedan seleccionarse las celulas auxiliares transfectadas con el vector de ADN. La delecion del marcador seleccionable es deseable debido a que la presencia del marcador seleccionable puede conducir a la interferencia
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del promotor o a una respuesta inmunitaria contra las celulas transducidas. La delecion del marcador seleccionable se realiza mediante la insercion de dos sitios loxP que flanquean el gen marcador seleccionable. Despues de introducirse el vector en las celulas diana por infeccion, las celulas diana se infectan con otro vector que expresa la recombinasa Cre. La recombinasa Cre elimina a continuacion las secuencias entre los dos sitios loxP, que incluyen el marcador seleccionable. Como resultado, el provirus definitivo solo expresa el gen de interes.
D. Vectores de autoinactivacion y de autoactivacion
En funcion de las propiedades y los efectos de los productos genicos, puede desearse tener un gen inactivado de interes en las celulas auxiliares y activar este gen tras la administracion a las celulas diana. Por ejemplo, si el producto del gen de interes es citotoxico, expresar el gen en celulas auxiliares podrla dar lugar a la toxicidad y lo mas probable reducir o eliminar la produccion viral. Se han generado una serie de vectores para activar simultaneamente un gen e inactivar el vector durante la administracion genica. Esto se logra mediante la delecion frecuente de las secuencias directamente repetidas durante la transcripcion inversa. Si las secuencias directamente repetidas se encuentran en un virus, puede eliminarse una copia de repeticion directa y todas las secuencias entre las dos repeticiones a altas frecuencias durante la transcripcion inversa. Se ha explotado esta propiedad de transcriptasas inversas para generar vectores retrovirales de autoactivacion y de autoinactivacion.
E. Vectores orientados selectivamente a celulas especlficas
Un objetivo importante para los terapeutas genicos es desarrollar un medio para orientar selectivamente la administracion genica a tipos celulares o tisulares especlficos. Al menos se han utilizado dos estrategias en un esfuerzo para orientar selectivamente la administracion genica utilizando vectores retrovirales. Se concibe una estrategia para controlar la administracion genica en el punto de entrada del virus a la celula huesped utilizando protelnas modificadas o naturales de la envoltura geneticamente que interaction con los receptores especlficos de tipo celular. Se concibe otra estrategia para controlar la expresion del gen terapeutico en tipos celulares especlficos utilizando promotores especlficos de tejido.
F. Vectores que utilizan promotores especlficos de tipo celular
Los promotores que son activos en ciertos tejidos o responden a ciertos reactivos pueden utilizarse para regular la expresion de un gen de interes. Estos promotores pueden insertarse entre las LTRs de un vector retroviral. Alternativamente, el promotor regulado puede utilizarse para reemplazar el promotor viral en la region U3. El diseno de un vector retroviral con un promotor especlfico de tejido interno es similar al de otros vectores retrovirales que contienen promotores internos.
Virus con rango de huesped
1. Consideraciones para la selection de la envoltura y virus de rango de huesped. La naturaleza de la protelna de la envoltura viral determina si un cierto virus puede entrar en una celula diana. Por lo tanto, es importante considerar si las celulas diana poseen el receptor de superficie celular apropiado antes de la seleccion de una protelna de la envoltura que se utilizara para la produccion de virus (como ya se ha discutido previamente).
La partlcula del vector retroviral segun la invention tambien podra transducir celulas que se dividen gradualmente, y cuyos no lentivirus tales como MLV no son capaces de transducirse eficazmente. Las celulas que se dividen gradualmente se dividen aproximadamente una vez cada tres o cuatro dlas incluyendo ciertas celulas tumorales. Aunque los tumores contienen celulas que se dividen rapidamente, algunas celulas tumorales, especialmente aquellas en el centro del tumor, rara vez se dividen. Alternativamente, la celula diana puede ser una celula de crecimiento detenido capaz de experimentar la division celular tal como una celula en una parte central de una masa tumoral o una celula madre tal como una celula madre hematopoyetica o una celula CD34 positiva. Como alternativa adicional, la celula diana puede ser un precursor de una celula diferenciada tal como un precursor monocitario, una celula CD33 positiva, o un precursor mieloide. Como alternativa adicional, la celula diana puede ser una celula diferenciada, tal como neuronas, astrocitos, celulas gliales, celulas microgliales, macrofagos, monocitos, celulas epiteliales, celulas endoteliales o hepatocitos. Las celulas diana pueden transducirse bien in vitro tras el aislamiento de un individuo humano o bien pueden transducirse directamente in vivo.
Vectores obtenidos a partir de adenovirus
El adenovirus es un virus de ADN bicatenario lineal que no pasa a traves de un intermedio de ARN. Hay mas de 50 serotipos diferentes de adenovirus humanos divididos en 6 subgrupos basados en la homologla de secuencia genetica, todos ellos exhiben una organization genetica comparable. Los serotipos 2 y 5 del grupo C de adenovirus humano (con una homologla de secuencia al 95 %) son los mas utilizados en sistemas de vectores adenovirales y se asocian normalmente con infecciones del tracto respiratorio superior en los jovenes.
Los adenovirus/vectores adenovirales de la invencion pueden tener origen humano o animal. Con respecto a los adenovirus de origen humano, los adenovirus preferentes son los clasificados en el grupo C, en particular, los
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adenovirus de tipo 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) o 12 (Ad12). Mas preferentemente, es un adenovirus Ad2 o Ad5. Entre los diferentes adenovirus de origen animal, pueden utilizarse adenovirus canino, adenovirus murino o un adenovirus aviar, tales como el virus CELO (Cotton et al., 1993, J Virol 67:3777-3785). Con respecto a los adenovirus de origen animal se prefiere utilizar los adenovirus de origen canino, y especialmente las cepas de los adenovirus CAV2 [cepa manhattan o A26/61 (por ejemplo, ATCC VR-800)]. Otros adenovirus de origen animal incluyen los citados en la solicitud del documento WO-A-94/26914 incorporado en el presente documento por referencia.
Como se ha mencionado previamente, la organizacion del genoma del adenovirus es similar en todos los grupos de adenovirus y las funciones especlficas se situan generalmente en lugares identicos para cada serotipo estudiado. El genoma de los adenovirus comprende una repeticion terminal invertida (ITR) en cada extremo, una secuencia de encapsidacion (Psi), genes tempranos y genes tardlos. Los principales genes tempranos se han clasificado en una serie de intermedios tempranos (Ela), temprano retrasado (Elb, E2a, E2b, E3 y E4), y regiones intermedias. Entre estos, los genes contenidos en la region E1, en particular, son necesarios para la propagacion viral. Los principales genes tardlos se contienen en las regiones L1 a L5. El genoma del adenovirus Ad5 se ha secuenciado completamente y se dispone en una base de datos (vease, en particular, acceso a Genbank n.° M73260). Del mismo modo, tambien se han secuenciado las partes, o incluso la totalidad de otros genomas adenovirales (tales como Ad2, Ad7, Ad12).
Para su uso como vectores recombinantes, normalmente se modifica un adenovirus para que no sea capaz de replicarse en una celula infectada.
Por consiguiente, las construcciones descritas en la tecnica anterior incluyen adenovirus eliminados de la region E1, esenciales para la replication viral, en los que se insertan las secuencias de ADN heterologo (Levrero et al., 1991, Gene 101:195; Gosh-Choudhury et al., 1986, Gene 50:161). Ademas, para mejorar las propiedades del vector, se ha propuesto crear otras deleciones o modificaciones en el genoma del adenovirus. Por consiguiente, se ha introducido una mutation puntual sensible al calor en el mutante ts125, por lo que es posible inactivar la protelna de union a ADN de 72 kDa (DBP). Preferentemente, un vector adenoviral recombinante utilizado en la invention comprende una deletion en la region E1 de su genoma. Mas particularmente, comprende una deletion en las regiones E1a y Elb. Segun un modo particularmente preferente, la region E1 se inactiva por delecion de un fragmento Pvull-Bgl 11 que se extiende desde el nucleotido 454 hasta el nucleotido 3328, en la secuencia del adenovirus Ad5 (acceso a Genbank n.° M73260). En otra realization preferente, la region E1 se inactiva por delecion de un fragmento Hinfll- Sau3A que se extiende desde el nucleotido 382 al nucleotido 3446.
Otros vectores adenovirales comprenden una delecion de otra region esencial para la replicacion viral y/o la propagacion, la region E4. La region E4 se implica en la regulation de la expresion de los genes tardlos, en la estabilidad de los ARNs nucleares tardlos, en la disminucion de la expresion de protelnas de la celula huesped y en la eficiencia de la replicacion del ADN viral. Los vectores adenovirales en los que se eliminan las regiones E1 y E4, poseen, por lo tanto, una expresion genica viral y un ruido de fondo transcripcional reducidos. Dichos vectores se han descrito por ejemplo en las solicitudes de los documentos WO-A-94/28152, WO-A-95/02697, WO-A-96/22378. Ademas, tambien se han descrito los vectores que transportan una modification del gen lVa2 (documento WO-A- 96/10088).
Segun una variante preferente, un vector adenoviral recombinante utilizado en la invencion comprende, ademas, una delecion en la region E4 de su genoma. Mas particularmente, la delecion en la region E4 afecta a todos los marcos de lectura abiertos. Se pueden citar, a modo de ejemplo preciso, deleciones de nucleotidos 33466-35535 o 3309335535. En particular, los vectores preferentes comprenden una delecion de toda la region E4. Esto puede llevar a cabo la elimination o la escision de un fragmento Maell-Mscl correspondiente a los nucleotidos 35835-32720. Otros tipos de deleciones en la region E4 se describen en las solicitudes de los documentos WO-A-95/02697 y WO-A- 96/22378, que se incorporan en el presente documento por referencia.
Alternativamente, solo se elimina una parte funcional de E4. Esta parte comprende, al menos, los marcos ORF3 y ORF6. A modo de ejemplo, estos marcos codificantes pueden eliminarse del genoma en forma de fragmentos Pvull- Alul y Bglll-Pvull, respectivamente, correspondientes a los nucleotidos 34801-34329 y 34115-33126, respectivamente. Las deleciones de la region E4 del virus Ad2 dl808 o de los virus Ad5 dl1004, Ad5 dl1007, Ad5 dl1011 o Ad5 dl1014 tambien pueden utilizarse en el marco de la invencion.
Las posiciones proporcionadas previamente se refieren a la secuencia del adenovirus Ad5 de tipo natural como se publico y es accesible en una base de datos. Aunque pueden existir variaciones menores entre los diversos serotipos de adenovirus, estas posiciones se aplican generalmente a la construction de adenovirus recombinantes segun la invencion a partir de cualquier serotipo, y especialmente los adenovirus Ad2 y Ad7.
Ademas, los adenovirus producidos pueden poseer otras alteraciones en su genoma. En particular, pueden eliminarse otras regiones para aumentar la capacidad del virus y reducir sus efectos secundarios relacionados con la expresion de genes virales. De este modo, en particular, puede eliminarse la totalidad o parte de la region E3 o lVa2. En cuanto a la region E3, sin embargo, puede ser particularmente preferente conservar la parte codificante de la protelna gp19K. De hecho, esta protelna permite evitar que el vector adenoviral convierta el sujeto de una reaction
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inmunitaria que (i) limitarla su accion y (ii) podrla tener efectos secundarios indeseables. Segun un modo especifico, la region E3 se elimina y la secuencia codificante de la protelna gp19K se reintroduce bajo el control de un promotor heterologo.
El polinucleotido de la invencion/NOI puede insertarse en diversos sitios del genoma recombinado. Se puede insertar en la region E1, E3 o E4, como un reemplazo para las secuencias eliminadas o excedentes. Tambien puede insertarse en cualquier otro sitio, fuera de las secuencias necesarias en cis para la produccion de los virus (secuencias ITR y secuencia de encapsidacion).
La region E2 es esencial, ya que codifica la protelna de union a ADN de 72 kDa, la ADN polimerasa y el precursor de 80 kDa de la protelna terminal (TP) de 55 kDa necesaria para el cebado de protelnas que inician la slntesis del ADN.
Un enfoque alternativo para realizar un virus mas defectuoso ha sido "replicar" manteniendo completamente solo las repeticiones terminales necesarias para la replicacion viral. Los virus "replicantes" o virus "no replicantes" pueden cultivarse en tltulos altos con un virus auxiliar de primera generation en la llnea celular 293.
Los adenovirus recombinados se producen normalmente en una llnea celular de encapsidacion, que es una llnea celular capaz de complementar en trans una o mas de las funciones carentes del genoma adenoviral recombinado. Una de estas llneas es, por ejemplo la llnea 293, en la que se ha integrado parte del genoma del adenovirus. Mas precisamente, la llnea 293 es una llnea celular embrionaria renal humana que contiene el extremo izquierdo (aproximadamente 11-12 %) del genoma del adenovirus de serotipo 5 (Ad5), que comprende la ITR izquierda, la region de encapsidacion, la region E1, incluyendo E1a y Elb, la protelna pIX codificante de la region y parte de la protelna pIVa2 codificante de la region. Esta llnea es capaz de transcomplementar adenovirus recombinados defectuosos para la region E1, es decir, carecen de toda o una parte de la region E1, y producir soluciones concentradas virales que presentan altos tltulos. Esta llnea tambien es capaz de producir, a una temperatura permisiva (32 °C), las soluciones concentradas de virus que comprenden, ademas, la mutation E2 sensible al calor.
Se han descrito otras llneas celulares capaces de complementar la region E1, basadas en particular, en celulas de carcinoma de pulmon humano A549 (documento WO-A-94/28152) o en retinoblastos humanos (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Ademas, se han descrito tambien llneas celulares capaces de transcomplementar varias funciones de adenovirus, por ejemplo, llneas celulares que complementan las regiones E1 y E4 (Yeh et al., 1996, J. Virol 70:559; Krougliak et al., 1995, Hum Gen. Ther. 6:1575) y llneas que complementan las regiones E1 y E2 (documentos WO- A-94/28152, WO-A-95/02697, WO-A-95/27071).
Los adenovirus recombinantes se producen generalmente mediante la introduction del ADN viral en la llnea de encapsidacion, seguido por la lisis de las celulas despues de aproximadamente 2 o 3 dlas (la cinetica de ciclo adenoviral es de 24 a 36 horas). Para realizar el proceso, el ADN viral introducido puede ser el genoma viral recombinado completo, construido opcionalmente en una bacteria (documento WO-A-96/25506) o en una levadura (documento WO-A-95/03400), transfectado a las celulas. Tambien puede ser un virus recombinado utilizado para infectar la llnea de encapsidacion. El ADN viral tambien puede introducirse en forma de fragmentos que transportan cada parte del genoma viral recombinado y una region de homologla que hace que sea posible, tras la introduccion en la celula de encapsidacion, reconstituir el genoma viral recombinado por recombination homologa entre los diversos fragmentos.
Los adenovirus competentes para la replicacion tambien pueden utilizarse en la terapia genica. Por ejemplo, el gen E1a puede introducirse en un virus de primera generacion bajo la regulation de un promotor especifico de tumor. En teoria, tras la inyeccion del virus en un tumor, podria replicarse especificamente en el tumor pero no en las celulas normales circundantes. Este tipo de vector podria utilizarse ya sea para matar las celulas tumorales directamente por lisis o para administrar un "gen suicida", tal como el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV tk), que puede matar las celulas infectadas y de activation inespecifica despues del tratamiento con ganciclovir.
Por consiguiente, dado que el constructo HRE de la presente invention puede estar preferentemente activo en cierto tejido tumoral en virtud de las condiciones hipoxicas que existen en muchas masas tumorales solidas, la presente invencion proporciona un vector de adenovirus que comprende un polinucleotido de la invencion operativamente unido a una secuencia de acido nucleico codificante de un polipeptido E1a adenoviral. El polipeptido E1a bajo el control del potenciador HRE solo se expresaria en condiciones hipoxicas y, por tanto, el adenovirus solo seria competente para la replicacion en condiciones hipoxicas. El adenovirus carece de un gen E1 endogeno, y preferentemente tambien carece de un gen E3 endogeno. Se han descrito previamente otras regiones que pueden eliminarse del genoma del adenovirus. Tambien puede ser deseable incluir la totalidad o parte del gen E3 bajo el control de un elemento de respuesta a la hipoxia de tal manera que la modulation inmunitaria de la celula huesped se equilibra para obtener la propagation viral correcta en el tumor y la respuesta inmunitaria en las celulas infectadas.
Se ha utilizado especificamente un adenovirus defectuoso solo para EIb para el tratamiento antitumoral de ensayos clinicos en fase 1. Los polipeptidos codificados por EIb son capaces de bloquear la apoptosis mediada por p53,
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impidiendo que la celula se mate a si misma en respuesta a la infeccion viral. Por consiguiente, en las celulas normales no tumorales, en ausencia de EIb, el virus es incapaz de bloquear la apoptosis y por consiguiente es incapaz de producir y propagar un virus infeccioso. En las celulas tumorales carentes de p53, el virus defectuoso Elb puede crecer y propagarse en las celulas tumorales defectuosas de p53 adyacentes pero no a las celulas normales. Una vez mas, este tipo de vector tambien podrla utilizarse para administrar un gen terapeutico tal como HSV tk.
Por consiguiente, se prefiere que los adenovirus que expresan E1a de la presente invencion carezcan de un gen Elb funcional.
Otros genes virales esenciales tambien pueden ponerse bajo el control de un elemento regulador sensible a la hipoxia.
Vectores obtenidos a partir de virus del herpes simple
1. Cepas virales
Los vectores del HSV de la invencion pueden obtenerse a partir de, por ejemplo, cepas HSV1 o HSV2, o derivados de los mismos, preferentemente HSV1. Los derivados incluyen recombinantes inter-tipo que contienen ADN de cepas HSV1 y HSV2. Los derivados tienen preferentemente al menos una homologla de secuencia al 70 % en cualquiera de los genomas HSV1 o HSV2, mas preferentemente al menos 90 %, incluso mas preferentemente 95 %.
El uso de cepas de HSV en procedimientos terapeuticos requerira que las cepas se atenuen de modo que no pueden establecer un ciclo lltico. En particular, si los vectores de HSV se van a utilizar para la terapia genica en seres humanos el polinucleotido debe insertarse preferentemente en un gen esencial. Esto se debe a que podrla producirse por recombinacion si un virus del vector encuentra una transferencia de virus de tipo natural de un gen heterologo al virus de tipo natural. Sin embargo, siempre que el polinucleotido se inserte en un gen esencial, esta transferencia recombinacional eliminarla tambien el gen esencial en el virus receptor y evitarla el "escape" del gen heterologo en la poblacion de virus de tipo natural competente para la replicacion.
Las cepas atenuadas pueden utilizarse para producir la cepa de HSV de la presente invencion, en este caso se proporcionan solo como ejemplos, incluyendo cepas que tienen mutaciones en ICP34.5 o ICP27, por ejemplo, la cepa 1716 (MacLean et al., 1991, J Gen Virol 72: 632-639), las cepas R3616 y R4009 (Chou y Roizman, 1992, PNAS 89: 3266-3270) y R930 (Chou et al., 1994, J. Virol 68: 8304-8311) todas las cuales tienen mutaciones en ICP34.5, y d27-1 (Rice y Knipe, 1990, J. Virol64: 1704-1715) que tiene una delecion en ICP27. Alternativamente, las cepas eliminadas de ICP4, lPC0, ICP22, ICP6, ICP47, vhs o gH, con una mutacion de inactivacion en VMW65, o con cualquier combinacion de los anteriores tambien pueden utilizarse para producir cepas de HSV de la invencion.
La terminologla utilizada en la descripcion de los diversos genes de HSV es tal como se halla en Coffm y Latchman, 1996. Herpes simple virus-based vectors. En: Latchman DS (ed). Genetic manipulation of the nervous system. Academic Press: Londres, pags. 99-114.
2. Lineas celulares de complementacion
Los virus de HSV defectuosos en ICP27 se propagan en una llnea celular que expresa ICP27, por ejemplo, celulas V27 (Rice y Knipe, 1990, J. Virol 64: 1704-1715) o celulas 2-2 (Smith et al., 1992, Virology 186: 74-86). Las lineas celulares que expresan ICP27 pueden producirse por cotransfeccion de celulas de mamlfero, por ejemplo, las celulas Vero o bHk, con un vector, preferentemente un vector plasmldico, que comprende un gen ICP27 de HSV funcional capaz de expresarse en dichas celulas, y un vector, preferentemente un vector plasmldico, que codifica un marcador seleccionable, por ejemplo de resistencia a neomicina. Los clones que poseen el marcador seleccionable se exploran adicionalmente para determinar que clones expresan tambien ICP27 funcional, por ejemplo a partir de su capacidad para soportar el crecimiento de las cepas de HSV mutante ICP27-, utilizando metodos conocidos por los expertos en la materia (por ejemplo, como se describe en Rice y Knipe, 1990).
Las lineas celulares que no permiten la reversion de una cepa de HSV mutante ICP27- a un cepa con ICP27 funcional se producen como se han descrito previamente, garantizando que el vector que comprende un gen ICP27 funcional no contenga secuencias que se superpongan con (es decir, son homologas a) las secuencias restantes en el virus mutante ICP27-.
Cuando las cepas de HSV de la invencion comprenden modificaciones de inactivacion en otros genes esenciales, por ejemplo ICP4, las lineas celulares de complementacion comprenderan ademas un gen de HSV funcional que complementa el gen esencial modificado de la misma manera como se describe para ICP27.
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3. Metodos de mutacion
Los genes de HSV pueden volverse funcionalmente inactivos mediante varias tecnicas bien conocidas en la materia. Por ejemplo, pueden volverse funcionalmente inactivos mediante deleciones, sustituciones o inserciones, preferentemente por delecion. Las deleciones pueden eliminar partes de los genes o el gen completo. Las secuencias insertadas pueden incluir el casete de expresion que se ha descrito previamente.
Las mutaciones se realizan en las cepas de HSV por metodos de recombinacion homologa bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, el ADN genomico de HSV se transfecta junto con un vector, preferentemente un vector plasmldico, que comprende la secuencia mutada flanqueada por secuencias homologas de HSV. La secuencia mutada puede comprender deleciones, inserciones o sustituciones, todas ellas pueden construirse por tecnicas rutinarias. Las inserciones pueden incluir genes marcadores seleccionables, por ejemplo lacZ, para la exploracion de virus recombinados mediante, por ejemplo, la actividad de p-galactosidasa.
Las mutaciones tambien pueden realizarse en otros genes de HSV, por ejemplo, genes, tales como ICP0, ICP4, ICP6, ICP22, ICP47, VMW65, gH o vhs. En el caso del gen VMW65, no se elimina todo el gen ya que codifica una protelna estructural esencial, pero se realiza una pequena insercion de inactivacion que suprime la capacidad de VMW65 para activar transcripcionalmente genes IE (Ace et al., 1989, J Virol 63: 2260-2269).
4. Cepas de HSV que comprenden un transgen y miARN de la invencion
Un transgen y un microARN de la invencion pueden insertarse en el genoma de HSV en cualquier ubicacion siempre que el virus se pueda propagar aun, que puede requerir el uso de una llnea celular que transporta otro gen esencial de HSV (segun se describe en 2.) si NOI se inserta en un gen esencial.
Las secuencias de la invencion pueden insertarse en el genoma de HSV por recombinacion homologa de cepas de HSV con, por ejemplo, vectores plasmldicos que transportan el casete de expresion flanqueado por secuencias de HSV, como se ha descrito previamente para la introduccion de mutaciones. El polinucleotido puede introducirse en un vector plasmldico adecuado que comprende secuencias de HSV utilizando tecnicas de clonacion bien conocidas en la materia.
Otros vectores virales
Otros vectores virales que pueden utilizarse en la presente invencion incluyen virus adeno-asociados, virus de estomatitis vesicular, virus vacuna y vectores virales basados en SV-40.
Administration
El miARN y el transgen pueden administrarse a un paciente o utilizarse para producir una planta transgenica o un animal no humano. El termino "administrado" incluye la administracion por tecnicas virales o no virales. Como se ha descrito previamente, los mecanismos de administracion viral incluyen, entre otros, vectores adenovirales, virales adeno-asociados (AVV), vectores virales del herpes, vectores retrovirales, vectores lentivirales y vectores de baculovirus, etc. Los mecanismos de administracion no virales incluyen la transfection mediada por llpidos, liposomas, inmunoliposomas, lipofectina, anflfilos faciales cationicos (CFAs) y combinaciones de los mismos.
Enfermedades
La administracion de uno o mas genes terapeuticos mediante un sistema de vector segun la presente invencion puede utilizarse solo o en combination con otros tratamientos o componentes del tratamiento.
Por ejemplo, el vector de la presente invencion puede utilizarse para administrar uno o mas transgen(es) util(es) en el tratamiento de los trastornos enumerados en el documento WO-A-98/05635. Para facilitar la referencia, parte de este listado se proporciona a continuation: cancer, inflamacion o enfermedad inflamatoria, trastornos dermatologicos, fiebre, efectos cardiovasculares, hemorragia, coagulation y respuesta de fase aguda, caquexia, anorexia, infecciones agudas, infection por VIH, estados de choque, reacciones de injerto contra huesped, enfermedad autoinmune, lesion por reperfusion, meningitis, migrana y antitrombosis dependiente de aspirina; crecimiento, invasion y extension tumorales, angiogenesis, metastasis, ascitis maligna y derrame pleural maligno; isquemia cerebral, cardiopatla isquemica, osteoartritis, artritis reumatoide, osteoporosis, asma, esclerosis multiple, neurodegeneracion, enfermedad de Alzheimer, ateroesclerosis, ictus, vasculitis, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa; periodontitis, gingivitis; psoriasis, dermatitis atopica, ulceras cronicas, epidermolisis bullosa; ulceration corneal, retinopatla y cicatrization quirurgica; rinitis, conjuntivitis alergica, eczema, anafilaxis; restenosis, insuficiencia cardlaca congestiva, endometriosis, ateroesclerosis o endoesclerosis.
Ademas, o alternativamente, el vector de la presente invencion puede utilizarse para administrar uno o mas transgen(es) util(es) en el tratamiento de los trastornos enumerados en el documento WO-A-98/07859. Para facilitar la referencia, parte de este listado se proporciona a continuacion: actividad de proliferacion/diferenciacion de citocina
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y celular; actividad inmunosupresora o inmunoestimulante (p. ej., para tratar una inmunodeficiencia, incluyendo la infeccion por virus de inmunodeficiencia humana; regulation del crecimiento de linfocitos; tratamiento del cancer y de muchas enfermedades autoinmunes, y para prevenir el rechazo del trasplante o inducir la inmunidad tumoral); regulacion de la hematopoyesis, p. ej., el tratamiento de las enfermedades mieloides o linfoides; favorecer el crecimiento de hueso, cartllago, tendon, ligamento y tejido nervioso, p. ej., para cicatrizar heridas, el tratamiento de quemaduras, ulceras y enfermedad periodontal y neurodegeneracion; inhibition o activation de la hormona estimulante del follculo (modulation de la fertilidad); actividad quimiotactica/quimiocinetica (p. ej., para movilizar tipos celulares especlficos de los sitios de lesion o de infeccion); actividad hemostatica y trombolltica (p. ej., para tratar la hemofilia y el ictus); actividad antiinflamatoria (para tratar, p. ej., el choque septico o la enfermedad de Crohn); como antimicrobianos; moduladores de, p. ej., el metabolismo o el comportamiento; como analgesicos; en el tratamiento de trastornos de deficiencia especlficos; en el tratamiento de, p. ej., la psoriasis en medicina humana o veterinaria.
Ademas, o alternativamente, el vector retroviral de la presente invention puede utilizarse para administrar uno o mas transgen(es) util(es) en el tratamiento de los trastornos enumerados en el documento WO-A-98/09985. Para facilitar la referencia, parte de este listado se proporciona a continuation: actividad inhibidora de macrofagos y/o de linfocitos T y, de este modo, la actividad antiinflamatoria; actividad antiinmunitaria, es decir, efectos inhibidores contra una respuesta inmunitaria celular y/o humoral, incluyendo una respuesta no asociada con la inflamacion; inhibicion de la capacidad de los macrofagos y de los linfocitos T para adherirse a componentes de la matriz extracelular y la fibronectina, as! como de regular la expresion del receptor fas por el aumento en linfocitos T; inhibicion de una reaction inmunitaria no deseada y de la inflamacion, incluyendo artritis, incluyendo artritis reumatoide, inflamacion asociada a hipersensibilidad, reacciones alergicas, asma, lupus sistemico eritematoso, enfermedades del colageno y otras enfermedades autoinmunes, inflamacion asociada con ateroesclerosis, arterioesclerosis, enfermedad cardlaca ateroesclerotica, lesion por reperfusion, paro cardlaco, infarto de miocardio, trastornos inflamatorios vasculares, slndrome de distres respiratorio u otras enfermedades cardiopulmonares, inflamacion asociada a ulcera peptica, colitis ulcerosa y otras enfermedades del tracto gastrointestinal, fibrosis hepatica, cirrosis hepatica u otras enfermedades hepaticas, tiroiditis u otras enfermedades glandulares, glomerulonefritis u otras enfermedades renales y urologicas, otitis u otras enfermedades otorrinolaringologicas, dermatitis u otras enfermedades dermicas, enfermedades periodontales u otras enfermedades dentales, orquitis o epidldimo-orquitis, infertilidad, traumatismo orquidal u otras enfermedades testiculares relacionadas por el sistema inmunitario, disfuncion placentaria, insuficiencia placentaria, aborto habitual, eclampsia, preeclampsia y otras enfermedades ginecologicas inmunitarias y/o relacionadas con inflamacion, uveitis posterior, uveitis intermedia, uveitis anterior, conjuntivitis, coriorretinitis, uveorretinitis, neuritis optica, inflamacion intraocular, p. ej., retinitis o edema macular cistoide, oftalmia simpatica, escleritis, retinitis pigmentosa, componentes inmunitarios e inflamatorios de la enfermedad degenerativa del fondus, componentes inflamatorios del traumatismo ocular, inflamacion ocular causada por infeccion, vitreo-retinopatias proliferativas, neuropatia optica isquemica aguda, cicatrization excesiva, p. ej., tras una operation de filtration de glaucoma, reaccion inmunitaria y/o de inflamacion contra implantes oculares y otras enfermedades oftalmicas inmunitarias y relacionadas con inflamacion, inflamacion asociada con enfermedades o afecciones o trastornos autoinmunitarios en los que, tanto en el sistema nervioso central (SNC) como en cualquier otro organo, la supresion inmunitaria y/o de inflamacion resultaria beneficiosa, enfermedad de Parkinson, complicaciones y/o efectos secundarios del tratamiento de la enfermedad de Parkinson, complejo de demencia relacionada con el SIDA- encefalopatia relacionada con el VIH, enfermedad de Devic, corea de Sydenham, enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades afecciones o trastornos degenerativos del SNC, componentes inflamatorios del ictus, slndrome postpolio, componentes inmunitarios e inflamatorios de trastornos psiquiatricos, mielitis, encefalitis, panencefalitis esclerosante subaguda, encefalomielitis, neuropatia aguda, neuropatia subaguda, neuropatia cronica, slndrome de Guillaim-Barre, corea de Sydenham, miastenia grave, pseudotumores cerebrales, slndrome de Down, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrofica, componentes inflamatorios de la compresion del SNC o traumatismo del SNC o infecciones del SNC, componentes inflamatorios de las atrofias y distrofias musculares, y enfermedades relacionadas inmunitarias e inflamatorias, afecciones o trastornos de los sistemas nervioso central y periferico, inflamacion postraumatica, choque septico, enfermedades infecciosas, complicaciones o efectos secundarios inflamatorios de la cirugla, trasplante de medula osea u otras complicaciones y/o efectos secundarios del trasplante, complicaciones y efectos secundarios inflamatorios y/o inmunitarios de la terapia genica, p. ej., debidos a la infeccion por un transportador viral, o inflamacion asociada a SIDA, para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria humoral y/o celular, para tratar o mejorar las enfermedades proliferativas de monocitos o de leucocitos, p. ej., leucemia, mediante la reduction de la cantidad de monocitos o de linfocitos, para la prevention y/o tratamiento del rechazo del injerto en casos de trasplante de celulas naturales o artificiales, de tejido y de organos, tales como cornea, medula osea, organos, lentes, marcapasos, tejido de piel natural o artificial.
La presente invencion tambien proporciona una composition farmaceutica para tratar a un individuo mediante terapia genica, comprendiendo la composicion una cantidad terapeuticamente eficaz del vector de la presente invencion que comprende uno o mas o transgen(es) administrables de diagnostico y/o terapeutico o una particula viral producida por u obtenida del mismo. La composicion farmaceutica puede utilizarse para uso humano o animal. Normalmente, un medico determinara la dosificacion real que sera la mas adecuada para un sujeto individual y variara con la edad, el peso y la respuesta del individuo particular.
La composicion puede comprender opcionalmente un transportador, diluyente, excipiente o adyuvante farmaceuticamente aceptable. La election del transportador, excipiente o diluyente farmaceutico puede
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seleccionarse con respecto a la via de administracion y la practica farmaceutica convencional pretendidas. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender como, o ademas de, el transportador, excipiente o diluyente cualquier aglutinante(s), lubricante(s), agente(s) de suspension, agente(s) de revestimiento, agente(s) solubilizantes apropiados, y otros agentes transportadores que pueden ayudar o aumentar la entrada viral en el sitio diana (tal como, por ejemplo, un sistema de administracion de llpidos).
Cuando sea apropiado, las composiciones farmaceuticas pueden administrarse mediante uno cualquiera o mas de: inhalacion, en forma de un supositorio o pesario, por via topica en forma de una locion, solucion, crema, pomada o polvo, mediante el uso de un parche cutaneo, por via oral en forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidon o lactosa, o en capsulas u ovulos, o bien solos o mezclados con excipientes, o en forma de elixires, soluciones o suspensiones que contienen agentes aromatizantes o colorantes, o pueden inyectarse por via parenteral, por ejemplo por vlas intracavernosa, intravenosa, intramuscular o subcutanea. Para la administracion parenteral, las composiciones pueden utilizarse de la mejor manera en forma de una solucion acuosa esteril que puede contener otras sustancias, por ejemplo bastantes sales o monosacaridos para hacer que la disolucion sea isotonica con la sangre. Para la administracion bucal o sublingual, las composiciones pueden administrarse en forma de comprimidos o plldoras que pueden formularse de manera convencional.
La administracion de uno o mas genes terapeuticos mediante un sistema de vector segun la invencion puede utilizarse solo o en combinacion con otros tratamientos o componentes de tratamiento. Las enfermedades que pueden tratarse incluyen, entre otras: cancer, enfermedades neurologicas, enfermedades hereditarias, enfermedades cardlacas, ictus, artritis, infecciones virales y enfermedades del sistema inmunitario. Los genes terapeuticos adecuados incluyen los que codifican las protelnas supresoras tumorales, enzimas, enzimas activadoras de profarmacos, moleculas inmunomoduladoras, anticuerpos, moleculas similares a inmunoglobulina desarrolladas por ingenierla genetica, protelnas de fusion, hormonas, protelnas de membrana, protelnas o peptidos vasoactivos, citocinas, quimiocinas, protelnas antivirales, ARN antisentido y ribozimas.
Ejemplos
Construccion del plasmido
Las secuencias de todos los miARNs utilizados en este caso se obtuvieron a partir del Registro del miARN (Griffiths- Jones et al., 2006) (
http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml). Las secuencias diana de miARN (mirT) se construyeron de la siguiente manera:
Para la diana 4x.mir-142-3p. (mir-142-3pT) se hibridaron los siguientes oligonucleotidos:
5' CTA G AGTCG A CTCCATA A AGT AGG A A A C A CTA C A CG ATTCC ATA A A OTA OG A A A C ACT AC AA C CCGT(Sl)
3' TGT A GT GTTTCCTACTTTAT G G AAT CGTGTAGTG TTTCCT ACTTTA TG GAGTCGA CT (AS!),
S'TrCATA AAGTAGG AA ACACTAGATGAGTrC ATA A AGTAGGAAACACTACAC (S2),
5’TCG AGTGTAGTGTTTCCTACTTT ATG G AGTG ATGTAGTGTTTCCT ACTTTATG G AACCGGT (AS2).
El ligamento de estos oligonucleotidos creo un fragmento de ADN bicatenario con extremos cohesivos Xbal y Xhol. Las secuencias subrayadas se disenan para ser perfectamente complementarias a un miARN especlfico. Los oligonucleotidos hibridados se subclonaron en los sitios Xbal y Xhol de pBluescriptll.KS. Los vectores resultantes se digerieron posteriormente con Sacll y Kpnl, Nhel y Agel, o Sall, y el fragmento de mirT se aislo del ligamento en los sitios apropiados de los vectores receptores: pCCL.sin.cPPT.PGK.GFP.WPRE para crear
pCCL.sin.cPPT.PGK.GFP.WPRE.mirT pCCL.sin.cPPT-PGKaS-GFPas-CTEas-polyAas para crear pCCL.sin.cPPT.PGKas.GFPas.mirTas.CTEas.polyAas pCCL.sin.cPPT.PGK.ALNGFR.WPRE para crear
pCCL.sin.cPPT.PGK.ALNGFR.mirT.WPRE pRRL.sin.cPPT.CMV.hFlX.WPRE para crear pRRL.sin.cPPT.CMV.hFlX. WPRE.mirT. pRRL.sin.cPPT.ET.hFlX.WPRE para crear pRRL.sin.cPPT.ET.hFlX.WPRE.mirT. pCCL.sin.cPPT.polyA.CTE.eGFP.minhCMV.hPGK.deltaNGFR.Wpre para crear
pCCL.sin.cPPT.polyA.CTE.mirT.eGFP.minhCMV.hPGK.deltaNGFR.Wpre. La preparacion a gran escala de ADN se llevo a cabo utilizando el sistema maxi preparacion del plasmido de elevada pureza libre de endotoxinas de Marlingen Biosciences.
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Produccion y titulacion del vector
Los LVs de tercera generacion pseudotipados de VSV se produjeron como se describe por la cotransfeccion transitoria de cuatro plasmidos en las celulas 293T y se purificaron mediante ultracentrifugacion (De Palma y Naldini, 2002). El tltulo de expresion de GFP se estimo en celulas 293T por dilucion limitante. Las partlculas de vector se midieron por la inmunocaptura del antlgeno p24 de gag del VIH-1 (NEN Life Science Products). El tltulo de expresion del vector concentrado oscilo entre 0,15-1,5 X 1010 unidades293T transducidas (UT)/ml para todos los vectores.
Cultivos celulares
Las celulas 293T se mantuvieron en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM; Sigma) suplementado con suero fetal bovino al 10 % (SFB; Gibco) y una combinacion de penicilina-estreptomicina y glutamina. La llnea celular de monocitos U937 se mantuvo en RPMI suplementado como se ha indicado previamente (RPMI completo). Los cultivos primarios de celulas dendrlticas humanas se aislaron de la sangre periferica como se ha descrito previamente y se mantuvieron en RPMI completo suplementado con GM-CSF e IL-4 (Bender et al., 1996).
Extraccion de ADN y ARN
Se extrajo ADN a partir de celulas y tejidos utilizando el "Midi kit de extraccion de ADN a partir de sangre y cultivo celular" (Qiagen, Hilden, Alemania), segun las instrucciones del fabricante. Se extrajo ARN de las celulas utilizando "reactivo Tri" (Sigma, San Luis, Missouri), segun las instrucciones del fabricante.
Membrana de Northern
La membrana de Northern se llevo a cabo como se ha descrito previamente (De Palma y Naldini, 2002). Se cargaron veinte microgramos de ARN total y se utilizaron 100 ng de la sonda de GFP etiquetada con 32P.
Cuantificacion del numero de copias del vector
Se cuantifico el vector C/G mediante PCR en tiempo real, a partir de 100 ng de plantilla de ADN extraldo de tejidos de raton o 200 ng de plantilla de ADN extraldo de llneas celulares. Los conjuntos de cebadores y sondas utilizados para el analisis son los siguientes:
Estructura del LV: 750 nmol de cebador directo (F): 5'TGAAAGCGAAAGGGAAACCA3, 200 nmol de cebador inverso (R): 5'-CCGTGCGCGCTTCAG-3', 200 nmol de sonda (P): 5'-VIC-CTCTCTCGACGCAGGACT-MGB-3'; ADN genomico murino: 13-actina: 300nmol F: 5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3', 750 nmol R:
5'CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3', 200nmol P: 5'-VIC-CACTGCCGCATCCTCTTCCTCCC-MGB-3'; ADN genomico humano: hTERT: 200nmol F: 5'-GGCACACGTGGCTTTTCG-3', 600 nmol R: 5'-
GGTGAACCTCGTAAGTTTATGCAA-3', 200nmol P: 5'-6FAM-TCAGGACGTCGAGTGGACACGGTG-TAMRA-3'.
Se utilizaron diluciones en serie de las curvas convencionales de ADN de un raton transgenico o una llnea celular humana con una serie de integraciones de LV conocidas (determinadas por membrana de Southern). Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado en un sistema de deteccion de secuencias ABI Prism 7900 HT (Applied Biosystems). Se calculo C/G por: (ng de LV/ng de ADN endogeno) X (n.° de integraciones de LV en la curva convencional).
Analisis de la Expresion Genica
La transcription inversa se llevo a cabo en 2 |jg de ARN total utilizando el protocolo de hexameros aleatorios del sistema de slntesis Superscript III First-Strand de RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se realizo un analisis por PCR cuantitativa para cuantificar la concentration de ARNm de GFP, y la expresion de GAPDH se utilizo para la normalization. Se utilizaron dos conjuntos de cebadores y sonda:
Para GFP, 20X ensayo a demanda (Applied Biosystems), F: 5'-CAGCTCGCCGACCACTA-3', R: 5'- GGGCCGTCGCCGAT-3' y P: 5'-6FAM-CCAGCAGAACACCCCC-MGB-3', y para GAPDH: 200 nmol F: 5- ACCACAGTCCATGCCATCACT-3', 900 nmol R: 5'GGCCATCACGCCACAGSTT-3' y 200 nmol P: 5'-TET- CCACCCAGAAGACTGTGGATGGCC-TAMRA-3'.
Las reacciones se realizaron por triplicado en un sistema de deteccion de secuencias ABI Prism 7900 HT (Applied Biosystems).
Analisis de la expresion de miARN
La deteccion de miARN se llevo a cabo utilizando el sistema de ensayo de microARN de Taqman de Applied Biosystems segun las instrucciones del fabricante. Los resultados se normalizaron para has-mir-16 y let-7a se utilizo como calibrador. Los valores se expresan con relacion a la expresion de let-7a.
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Citometrla de flujo
Se cultivaron celulas 293T transducidas durante al menos 14 dlas antes del analisis por FACS para alcanzar un estado constante de la expresion de GFP y descartar la pseudotransduccion. Antes del analisis por FACS, las celulas adherentes se separaron con tripsina-EDTA al 0,05 %, se lavaron y se volvieron a suspender en TFS que contenla SFB al 2 %. Las celulas cultivadas en suspension se lavaron y se volvieron a suspender en TFS que contenla SFB al 2 %. Para la inmunotincion, se bloquearon 105 celulas en TFS, suero humano al 5 %, SFB al 2 % durante 15 min a 4 °C. Despues del bloqueo, se anadieron anticuerpos conjugados con R-ficoeritrina (RPE) (anti- ALNGFR o anti-CD45, BD Pharmingen, San Diego, CA) y las celulas se incubaron durante 30 min a 4 °C, se lavaron y se analizaron por citometrla de flujo de dos colores en un Beckman Coulter Cytomics FC500 (Beckman Couler, Miami, FL).
Administration in vivo del vector
Se adquirieron ratones desnudos y Balb/c de 6-8 semanas de vida de Charles Rivers Laboratories (Milan, Italia) y se mantuvieron en condiciones libres de patogenos especlficos. Los ratones con hemofilia B (inactivation del factor IX de la coagulation) se adquirieron en el Instituto Salk (La Jolla, CA) y se criaron y mantuvieron en condiciones libres de patogenos especlficos. La administracion del vector se llevo a cabo por inyeccion en la vena de la cola de los ratones. Todos los procedimientos con animales se realizaron segun los protocolos aprobados por el Comite institucional de Uso y Cuidado Animal del hospital San Raffaele.
Transgenesis
Los ratones transgenicos se generaron utilizando LVs como se ha descrito (Lois et al., 2002). En pocas palabras, los ratones FVB hembra se superovularon con una combination de suero de yegua prenada y gonadotropina corionica humana. En promedio, se recogieron entre 20 y 30 embriones por hembra y se microinyectaron en el espacio perivitelino con 10-100 pl de 5 X 107 UT/ml de soluciones concentradas de Lv en el mismo dla. Los embriones manipulados se implantaron inmediatamente en el oviducto de ratones CD1 pseudoprenados. Las crlas se genotiparon para la presencia de la secuencia de GFP por PCR. Los ratones positivos se criaron para ensayar la transmision de la llnea germinal del transgen. Se extrajo ADN de la cola y se utilizo para cuantificar el numero de copias del vector por PCR en tiempo real en los ratones fundadores y de progenie F1.
Inmunohistoqulmica
Para la inmunofluorescencia, los tejidos se fijaron en paraformaldehldo al 4 %, se equilibraron en sacarosa al 20 % en TFS durante 48 horas a 4 °C, se incrustaron en la temperatura optima de corte (TOC) y se congelaron. Las secciones del criostato (5 pm de grosor) se fijaron posteriormente con paraformaldehldo, se bloquearon en suero de cabra al 5 % (Vector Laboratories, Burlingame, CA), en seroalbumina bovina al 1 % (SAB), en Triton al 0,1 % en TFS y se incubaron con anticuerpos de rata anti-raton F4/80 (Serotec, Raleigh, NC) o anti-raton CD45, CD31 o CD8 (BD Pharmingen). Las senales fluorescentes de las secciones opticas individuales se adquirieron por 3 microscopios laser confocales (Radiance 2100; Bio-Rad, Hercules, CA).
Cuantificacion del factor IX (hFIX)
La concentration de hF.IX se determino en plasma citratado de raton mediante un enzimoinmunoensayo para el factor IX:Ag (Roche, Milan, Italia), y para la actividad de FIX mediante el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), como se ha descrito previamente (Brown et al., 2004b).
Resultados
Con el fin de crear un sistema de vector de integration con el perfil de expresion desorientado selectivamente, se aprovecho el sistema de silenciamiento post-transcripcional mediado por miARN recientemente identificado. Se construyo un vector lentiviral (LV) regulado por miARN insertando cuatro copias en tandem de una secuencia de 23 pb (mirT) con una complementariedad perfecta para mir-30a, mir-142-5p o mir-142-3p en la region no traducida 3' (3'UTR) de un casete de expresion de GFP impulsado por el promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK) expresada ubicuamente (Fig. 1a). Este diseno, al utilizar multiples copias de una diana perfectamente complementaria, pretende optimizar la represion del transgen en presencia del miARN, y se basa en un entendimiento emergente de las normas que rigen la regulation mediada por miARN (Bartel y Chen, 2004; Doench et al., 2003). Se seleccionaron mir-142-5p y mir-142-3p por informes recientes, utilizando membrana de Northern y analisis de micromatrices, indicando que estos miARNs se enriquecen en celulas hematopoyeticas (Baskerville y Bartel, 2005; Chen et al., 2004). Se confirmo estos hallazgos previos mediante la realization del analisis de PCR cuantitativa en tiempo real para determinar la concentracion de miARNs especlficos en nuestras celulas diana (Figura 2a). Como se muestra en la Figura 2a, mir-142-3p y mir-142-5p se expresan altamente en celulas U937, pero solo se detectan a niveles bajos en celulas 293T. Se descubrio que mir-30a era bajo tanto en las celulas 293T como U937, y por consiguiente se utiliza como un control para nuestros estudios.
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Los vectores se prepararon y se concentraron como se ha descrito previamente. La titulacion del LV regulado por miARN indico que la inclusion de la secuencia diana no afecto negativamente a la infectividad del vector o a los niveles de expresion transgenica en celulas no hematopoyeticas (Figura 2b). Se obtuvieron niveles de transduccion y expresion transgenica comparables al vector original sin la secuencia diana de miARN (LV.PGK.GFP). En cambio, la transduccion tanto de la llnea celular de monocitos U937 humanos o las celulas dendrlticas primarias humanas dio lugar a perfiles de expresion drasticamente diferentes entre los dos vectores, LV.PGK.GFP y LV.PGK.GFP.142- 3pT. En las celulas U937, la intensidad media de fluorescencia era 50-100 veces mayor en celulas transducidas con LV.PGK.GFP a pesar de que el analisis de Taqman revelo copias similares del vector por genoma (C/G). Tambien se observo un hallazgo similar en las celulas dendrlticas, en el que incluso despues de la transduccion en una concentracion elevada del vector (>50 MOI), se produjo una supresion casi completa de la expresion transgenica en las celulas que reciben al vector LV.PGK.GFP.142-3pT. Como control del vector, la secuencia diana de mir-30a se clono en LV.PGK.GFP para crear LV.PGK.GFP.mir-30aT. mir-30a no se expresa en las celulas hematopoyeticas (Zeng et al., 2002), y, como era de esperar, no se vio reduccion alguna en la expresion de GFP tras la transduccion celular. Por consiguiente, nuestros resultados demuestran claramente que en las celulas humanas nuestro diseno del vector mantiene una alta infectividad del vector, mientras previene al mismo tiempo la expresion genica en tipos celulares particulares.
Se describio previamente un sistema de vector que aprovecho la actividad bidireccional de un unico elemento promotor para expresar de forma coordinada dos transcripciones distintas (Amendola et al., 2005). Este sistema permite que dos transgenes se expresen en una celula tras la transduccion con un unico vector. Si bien este sistema es util para muchas aplicaciones de terapia genica, tambien hay circunstancias en las que puede ser necesario expresar solamente uno de los dos transgenes. Desafortunadamente, no existe un sistema de transferencia genica disponible en la actualidad que permita la regulacion divergente de dos transgenes de un unico vector.
Con el fin de desarrollar un sistema de vector regulado de forma divergente, se modifico un LV bidireccional (Bd.LV) para incluir el mir-142-3pT en la 3'UTR del casete indicador de GFP (Fig. 1b). Este vector explota la actividad bidireccional intrlnseca del promotor PGK para impulsar la transcripcion divergente de dos transgenes. La transduccion de las celulas 293T no revelo diferencias en GFP o en la expresion del receptor de baja afinidad del factor de crecimiento nervioso (ALNGFR) entre Bd.LV con o sin el mirT (Fig. 2c). Sin embargo, en los monocitos transducidos, el Bd.LV sin el mirT expresa tanto GFP como ALNGFR, mientras que el vector etiquetado solo expreso ALNGFR. Esto indica que la represion del transgen etiquetado se esta produciendo a nivel post-transcripcional, y no por el silenciamiento transcripcional, ya que el silenciamiento del promotor habrla impedido la expresion de ambos transgenes. Estos resultados tambien demuestran la utilidad de nuestra estrategia de regulacion por miARN, en combinacion con el sistema del vector bidireccional, para proporcionar un diseno del vector, que puede utilizarse de forma divergente para regular dos transgenes de un unico vector.
Para demostrar aun mas la versatilidad de este enfoque, se selecciono un grupo de miARNs en funcion de su expresion diferencial en las celulas 293T y U937 (Figura 2a) y se clonaron las secuencias diana de estos miARNs en el casete de expresion de GFP del vector Bd.LV. Como se muestra en la Figura 2d., la transduccion de las dos poblaciones de celulas revelo patrones de expresion muy diversos entre cada uno de los vectores. De manera importante, la concentracion del miARN, segun se determino por PCR en tiempo real, mostro una fuerte correlacion con el grado de supresion observado. Por ejemplo, la expresion de GFP de 218T.GFP.mCMV.PGK.ANGFR se redujo mas de 10 veces en celulas 293T, pero se observo poca o ninguna supresion en las celulas U937, en el que mir-218 se expresa solo a niveles bajos. Por consiguiente, estos datos extienden la utilidad potencial de nuestro enfoque a otros miARNs, y demuestran que el perfil de expresion puede proporcionar un medio simple para concebir un sistema de vector con un patron de expresion tisular deseado.
Puesto que se sabe poco acerca de la solidez de la actividad de miARN, se propuso determinar si existla un umbral de regulacion que podrla superarse aumentando las copias del vector que transportan mirTs en las celulas diana. Tras multiples series de transduccion de celulas U937 solo se produjo un aumento gradual en la expresion transgenica, que se relaciono linealmente con el vector C/G (Fig. 3d). Estos resultados indican que la supresion se mantuvo en la misma medida para todas las dosis del vector ensayadas, y que la saturacion no se alcanza incluso en el vector 175 C/G. Se pregunto a continuacion si expresar secuencias exogenas que transportan mirTs podrla suprimir el miARN endogeno de sus dianas naturales. Debido a que no se han identificado ARNms para mir-142-3p, se sobrecargo celulas con un segundo vector que transporta el mismo mirT en un casete de expresion diferente. Las celulas U937 que transportan 4 C/G de LV.PGK.GFP.142-3pT se superinfectaron con LV.PGK.ALNGFR.142-3pT, y como se muestra en la Figura 3e, incluso despues de la introduccion de 30 copias de un nuevo vector, no se produjo un aumento en la expresion de GFP. Ademas, la expresion de ALNGFR se suprimio por mir-142-3p (Fig. 3e). En general, nuestros datos sugieren que mir-142-3p no se limita en la reaccion en la via de interferencia de ARN, y que la introduccion de nuevo material genetico, que contiene el mir-142-3pT, no debe perturbar la actividad natural de este miARN.
La novedad de la estrategia de regulacion de miARN proporciona la posibilidad de desarrollar por ingenierla genetica vectores de manera que antes no era posible. Ademas de su utilidad para la prevencion de la expresion en celulas hematopoyeticas, se deseo utilizar la regulacion de miARN para evitar selectivamente la expresion transgenica en celulas productoras de vector. Normalmente, durante el proceso de produccion de vectores, ademas de la expresion
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del genoma del vector del plasmido de transferencia, tambien persiste la expresion transgenica. En el caso de vectores codificantes de moleculas toxicas, esto puede ser particularmente problematico, ya que la expresion de la protelna toxica mata las celulas productoras y conlleva una reduccion total en el tltulo del vector. Por consiguiente, la capacidad de prevenir selectivamente la expresion transgenica en celulas productoras serla un gran avance para la produccion de vectores especlficos, tales como los que codifican moleculas toxicas.
Nuestros datos de perfiles de miARN revelaron que mir-19a se expresa altamente en celulas 293T. Se ha demostrado previamente que este miARN se asocia con el cancer, pero no se encuentra en el tejido normal, y puede ser la causa de su alta expresion en llneas celulares transformadas y tumorales. Se razono que la inclusion de la secuencia de mir-19aT impedirla la expresion transgenica en las celulas 293T productoras. A fin de no disminuir el tltulo del vector, se construyo el vector de modo que el casete de expresion, incluyendo la secuencia de 19aT, se encontrarla en antisentido. En esta configuracion, el genoma del vector puede transcribirse, y debido a que la secuencia de 19aT se encuentra en orientacion antisentido, el transcrito no se sometera a la degradacion de ARNi mediado por mir-19a.
Como se muestra en la Figura 4, tras la transfeccion transitoria de 293T, se produjo una reduccion de mas de 100 y 10 veces en la expresion de GFP entre pLV.PGKas.GFPas.19aT.CTEas.polyAas, pLV.PGK.GFP y pLV.PGKas. GFPas.CTEas.polyAas, respectivamente. Por consiguiente, se indica que la inclusion de la secuencia de mir-19aT puede prevenir la expresion genica en celulas 293T. Es importante destacar que, a diferencia de pLV.PGKas.GFPas.CTEas.polyAas, lo que resulto en una reduccion de 10 veces en el tltulo del vector en comparacion con el plasmido canonico, que se debe al antisentido afectivo de transcritos complementarios producidos por el plasmido, pLV.PGKas.GFPas.19aT.CTEas.polyAas no produjo un vector con el tltulo mas bajo que el constructo de pLV.PGK.GFP. Por consiguiente, nuestros datos demuestran que la regulacion de miARN puede utilizarse para prevenir la expresion de un transgen durante la produccion de vectores sin afectar negativamente al tltulo del vector.
Siguiendo la caracterizacion in vitro de nuestro LV regulado por miARN en las celulas humanas, se amplio nuestros estudios en el raton. Los ratones expresan homologos exactos de cada uno de los miARNs humanos que se ensayo in vitro, aunque no se han establecido sus patrones de expresion tisular in situ (Lagos-Quintana et al., 2002). Se administraron 2x108 partlculas de LV a ratones desnudos. El analisis por PCR cuantitativa (Q-PCR) del bazo y el hlgado revelo el contenido del vector similar para todos los grupos de tratamiento (los datos no se muestran). Sin embargo, los perfiles de expresion difieren dramaticamente. Los animales tratados con LV.PGK.GFP y LV.PGK.GFP.30aT mostraron un patron generalizado de expresion celular en el hlgado, incluyendo celulas de Kupffer, hepatocitos y celulas endoteliales (Fig. 5a). En cambio, los animales tratados con LV.PGK.GFP.142-3pT- presentaban una expresion de GFP casi indetectable en las celulas de Kupffer, pero mantuvo altos niveles de GFP en los hepatocitos y las celulas endoteliales.
Se observaron hallazgos consistentes en el bazo de los animales tratados. En los ratones que recibieron el vector LV.PGK.GFP habla una alta frecuencia de esplenocitos GFP+ (> 5 %), con fuertes niveles de expresion, como se indica por el analisis por FACS (Fig. 5c). En comparacion, menos del 1 % de los esplenocitos de los animales tratados con LV.PGK.GFP.142-3pT eran GFP+ y solo a baja intensidad. El analisis inmunohistoqulmico de estos ratones revelo que la presencia de celulas GFP+ se encuentra casi exclusivamente en la zona marginal. Estas celulas no tenlan linaje hematopoyetico, como se indica por la cotincion negativa para el marcador CD45 pan- leucocitario (Fig. 5b), pero eran probablemente fibroblastos reticulares (Steiniger et al., 2003), parte del estroma de soporte del bazo. Esto demuestra un aspecto novedoso de este enfoque, en el que la expresion genica puede mantenerse en una amplia variedad de tipos celulares, mientras restringe al mismo tiempo la expresion de un linaje celular particular.
Para una mejor caracterizacion del perfil de expresion de nuestro vector, y por consecuencia, la actividad reguladora de mir-142-3p, se generaron ratones transgenicos utilizando el vector LV.PGK.GFP.142-3pT. Se analizo la sangre periferica de la progenie F1 que transporta un intervalo del vector C/G (de 4 a 24), y la expresion de GFP era practicamente indetectable en todos los linajes hematopoyeticos (n=26; Fig. 6a). Ademas, a pesar de la fluorescencia brillante pan-celular durante el parenquima del hlgado, intestino y pulmon, as! como la arquitectura estromal del bazo, el timo y la medula osea, no se observo expresion alguna de GFP en las celulas de linaje hematopoyetico de estos organos (Fig. 6b). Estos resultados demuestran que mir-142-3p endogeno restringe brusca y robustamente la expresion transgenica a partir de linajes hematopoyeticos.
Por ultimo, se evaluo la utilidad de nuestro LV regulado por miARN para la transferencia genica sistemica en ratones Balb/c adultos inmunocompetentes. Se administraron 5x108 unidades de transduccion (UT)/raton de LV.PGK.GFP, LV.PGK.GFP.142-3pT o un LV que expresa GFP bajo el control del promotor de la albumina (LV.ALB.GFP). Se analizaron ratones en varios tiempos para la expresion de GFP, un neo-antlgeno fuerte (Stripecke et al., 1999), en el bazo e hlgado. En los ratones tratados con LV.PGK.GFP, se detectaron celulas de GFP+ en el dla 5, pero coherentes con nuestros hallazgos previos (Follenzi et al., 2004), durante el dla 14 se observaron pocas o ninguna celulas de GFP+ y el contenido del vector habla disminuido a niveles casi indetectables (Fig. 7a). La eliminacion de celulas de GFP+ tambien se produjo con LV.ALB.GFP, a pesar de que la expresion se limita predominantemente a los hepatocitos. Sin embargo, cabe destacar, que se detecto la expresion inespeclfica de este vector en el bazo,
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incluyendose en una pequena fraccion de las celulas hematopoyeticas, y puede haber tenido un papel en el inicio de la eliminacion del vector mediado por mecanismos inmunitarios (Fig. 7d).
A diferencia de nuestros hallazgos con LV.PGK.GFP y LV.ALB.GFP, los hepatocitos de GFP+ y las celulas endoteliales se presentaron con alta frecuencia en el hlgado de todos los ratones tratados con LV.PGK.GFP.142- 3pT en todos los intervalos de tiempo analizados (> 120 dlas, Fig. 7a,b). El analisis morfometrico indico que entre el 10 y 20 % de los hepatocitos eran GFP+ (n=10), y de manera importante, la frecuencia de celulas positivas permanecio estable. El vector C/G era inicialmente similar a todos los grupos de tratamiento, pero durante el dla 14 disminuyo rapidamente en ratones con LV.PGK.GFP y LV.ALB.GFP, y se mantuvo a niveles muy detectables en animales tratados con LV.PGK.GFP.142-3pT. Se observo una lenta disminucion en C/G en el seguimiento mas duradero, pero debido a que esta disminucion no coincidio con una disminucion en los hepatocitos de GFP+, era probablemente debido a la sustitucion de las celulas de Kupffer transducidas durante el recambio de celulas hematopoyeticas normales.
A pesar de una amplia expresion de GFP en el hlgado, no se detectaron celulas de Kupffer de GFP+. Ademas, mientras se observaron fibroblastos reticulares de GFP+ en la zona marginal del bazo, no se detecto la expresion transgenica en las celulas de linaje hematopoyetico. De acuerdo con la expresion de GFP sostenida, no se observo una infiltracion CD8+ significativa o signos de patologla en el hlgado (Fig. 7c).
Como muestra adicional de la utilidad de nuestro enfoque para el establecimiento de la expresion transgenica a largo plazo, se establece utilizar nuestro sistema para el tratamiento de la hemofilia B. Los ratones con hemofilia B son completamente carentes de FIX de coagulacion, y, como tal, tienen < 1 % de actividad normal de coagulacion. Ademas, puesto que no expresan FIX de forma natural, son altamente propensos a desarrollar inmunidad anti-FIX, despues de la introduccion de antlgenos de FIX. Para evitar este problema, muchos grupos, incluido el nuestro, han construido vectores de expresion de FIX especlficos de hepatocitos, con el fin de evitar la expresion genica en APCs, y evitar la induccion de la inmunidad anti-FIX (Brown y et al., 2004a; Brown et al., 2004b; Follenzi et al., 2004; Mingozzi et al., 2003). Sin embargo, como se muestra en la Figura 8, el vector de LV.ET.hFIX especlfico de hepatocitos fue incapaz de proporcionar la expresion de FIX a largo plazo en ratones con hemofilia B despues de la administracion intravenosa. En cambio, la inyeccion del vector de LV.ET.hFIX.142-3pT, que contenla la secuencia de mir-142-3pT en la 3'UTR del casete de expresion de FIX, dio lugar a la expresion de FIX a largo plazo, y restauro la actividad de coagulacion a > 40 % de los niveles normales.
En general, estos resultados indican que el uso de la expresion estable a alto nivel de un de LV regulado por miARN de un neo-antlgeno, ya sea intracelular o extracelular, puede establecerse con exito en ratones inmunocompetentes, e incluso puede utilizarse para corregir el fenotipo de una enfermedad, como se ha demostrado en los ratones con hemofilia B.
En este caso, se describe el primer sistema de transferencia genica viral, que explota la maquinaria de miARN endogeno para la regulation transgenica. Mediante el uso de la administracion mediada por LV, la transferencia genica in vivo era posible, y, como tal, se proporciona algunos de los primeros datos in situ de la actividad de miARN en un mamlfero adulto. Al igual que en los estudios en los metazoos inferiores (Brennecke et al., 2005; Reinhart et al., 2000), se observo que la regulacion de miARN era extremadamente eficaz. En ratones transgenicos, as! como en ratones administrados con LV por via intravenosa, se observo actividad de mir-142-3p consistente en todas las celulas hematopoyeticas. Mediante la adicion de la secuencia de mir-142-3pT a un transgen, se produjo una reduction de hasta 100 veces en la expresion transgenica en los linajes hematopoyeticos, sin efecto sobre la expresion en celulas no hematopoyeticas.
En nuestro sistema, la regulacion de miARN endogeno proporciono un mejor medio para prevenir la expresion del vector en celulas de linaje hematopoyetico despues del uso del promotor de la albumina especlfico de hepatocitos. Esto se produjo probablemente ya que la regulacion post-transcripcional puede superar la expresion inespeclfica debido a los efectos posicionales de insertion y/o reconstitution imperfecta de un promotor especlfico de tejido. Este fenomeno puede ser similar a una de las funciones naturales propuestas de la regulacion de miARN, que se utiliza para prevenir la traduction de los ARNms que se transcribieron en un estado celular previo o que surgen debido a la transcription parcial (Bartel y Chen, 2004; Farh et al., 2005). Como tal, la incorporation de la regulacion de miARN en un vector puede proporcionar una importante capa de control sobre la expresion transgenica, tanto si se utiliza con los promotores ubicuos o en conjuncion con elementos de transcripcion especlficos de tejido.
Mediante el uso de la regulacion de miARN para desorientar selectivamente la expresion transgenica de linajes hematopoyeticos, se fue capaz de prevenir la eliminacion del vector mediada por el sistema inmunitario y permitir la transferencia genica estable, superando de esta manera una de las barreras mas significativas para la terapia genica cllnica (Thomas et al., 2003). De particular relevancia, se demuestra la utilidad de este enfoque de antlgenos circulantes tanto intracelulares como extracelulares. Utilizando la estrategia de regulacion de miARN, se fue capaz de alcanzar niveles estables y elevados de correction del fenotipo de coagulacion de ratones con hemofilia B. Segun nuestro conocimiento, este es la primera demostracion de una aplicacion terapeutica para explotar la regulacion de miARN endogeno.
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Los estudios descritos en este caso tambien proporcionan la primera prueba cuya regulacion mediada por miARN es un medio robusto y altamente eficaz que abroga practicamente la expresion de un promotor del vector fuerte, constitutivamente activo, o incluso para mejorar el rendimiento de un promotor especlfico de tejido. En general, resulta evidente en este trabajo que los miARNs pueden proporcionar una poderosa manera de regular un transgen, y mediante la utilizacion de esta red compleja, se fue pionero en un nuevo paradigma en el diseno del vector que presenta importantes implicaciones para la transferencia genica terapeutica.
A traves de nuestro enfoque, que permite disposiciones de mirT combinatorias, pueden crearse numerosos constructos de administracion genica, utilizados in vitro o in vivo, para la terapia genica o para la transgenesis animal, para lograr patrones sofisticados de la expresion genica, incluyendo la capacidad para regular de forma divergente dos transgenes diferentes. A medida que se intenta descubrir nuevos miARNs especlficos de tejido, as! como especlficos en el desarrollo y en el tumor, sera posible construir vectores que son de forma condicional sensibles al crecimiento o a la diferenciacion e incluso a la tumorigenesis.
Se incorporan en el presente documento por referencia, cada una de las solicitudes y patentes mencionadas en el presente documento, y cada documento citado o mencionado en cada una de las solicitudes y patentes previas, incluidas durante la tramitacion de cada una de las solicitudes y patentes ("documentos citados en la solicitud") y cualquier instruccion o catalogo del fabricante de cualquier producto citado o mencionado en cada una de las solicitudes y patentes y en cualquier documento citado en la solicitud. Es mas, se incorporan en el presente documento por referencia todos los documentos citados en el presente texto, y todos los documentos citados o mencionados en los documentos citados en el presente texto, y cualquier instruccion o catalogo del fabricante de cualquier producto citado o mencionado en el presente texto.
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    REIVINDICACIONES
    1. Un vector genico para su uso en terapia que comprende una secuencia diana de miARN y un transgen operativamente unido a dicha secuencia diana de miARN, en el que la secuencia diana de miARN sirve para prevenir o reducir la expresion del transgen en una celula que comprende un miARN endogeno correspondiente.
  2. 2. El vector genico para su uso segun la reivindicacion 1, en forma de un vector genico no viral.
  3. 3. El vector genico para su uso segun la reivindicacion 2, en el que el vector genico no viral comprende un vector o plasmido de expresion.
  4. 4. El vector genico para su uso segun la reivindicacion 1, en forma de un vector viral.
  5. 5. El vector genico para su uso segun la reivindicacion 4 que comprende el genoma (ARN o ADN) del vector viral, cuyo genoma comprende la secuencia diana de miARN.
  6. 6. El vector genico para su uso segun la reivindicacion 5 que comprende el genoma del vector viral, cuyo genoma comprende al menos un transgen operativamente unido a la secuencia diana de miARN.
  7. 7. El vector genico para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el vector viral se selecciona entre el grupo de retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus del herpes simple, picornavirus, y alfavirus.
  8. 8. El vector genico para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que el vector viral puede obtenerse a partir de un lentivirus.
  9. 9. El vector genico para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que el vector viral se encuentra en forma de una partlcula de vector viral.
  10. 10. El vector genico para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que la secuencia diana de miARN controla la expresion del vector viral en una celula diana.
  11. 11. El vector genico para su uso segun cualquier reivindicacion precedente que comprende mas de una secuencia diana de miARN, que puede ser identica o diferente, en tandem y/o en orientaciones diferentes.
  12. 12. El vector genico para su uso segun cualquier reivindicacion precedente, en el que la secuencia diana de miARN es una secuencia dirigida por el miARN hsa-mir-142as (tambien llamado hsa-mir-142-3p), los miARN let-7a, mir-15a, mir-16, mir-17-5p, mir-19, mir-142-5p, mir-145 y/o mir-218.
  13. 13. El vector genico para su uso segun cualquier reivindicacion precedente, en el que el transgen codifica los genes terapeuticos adecuados que incluyen aquellos que codifican protelnas supresoras tumorales, enzimas, enzimas activadoras de profarmacos, moleculas inmunomoduladoras, anticuerpos, moleculas similares a inmunoglobulina modificadas, protelnas de fusion, hormonas, protelnas de membrana, protelnas o peptidos vasoactivos, citocinas, quimiocinas, protelnas antivirales, ARN antisentido y ribozimas.
  14. 14. Un vector genico para su uso segun cualquier reivindicacion precedente, en el que el vector comprende un promotor especlfico de tejido.
  15. 15. Una composicion farmaceutica para su uso en terapia que comprende el vector genico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
  16. 16. Una celula para su uso en terapia infectada o transducida con el vector genico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en la que dicha celula no es una celula embrionaria humana.
  17. 17. Una celula para su uso segun la reivindicacion 16 que es una celula madre hematopoyetica, renal, neuronal, pulmonar, hepatica, esplenica, cardlaca, tumoral o embrionaria.
  18. 18. Uso del vector genico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 o una composicion farmaceutica como se define en la reivindicacion 15 que comprende un transgen operativamente unido a la secuencia diana de miARN para la fabricacion de un medicamento para tratar un cancer.
  19. 19. Uso del vector genico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 o una composicion farmaceutica como se define en la reivindicacion 15 que comprende un transgen operativamente unido a la secuencia diana de miARN para la fabricacion de un medicamento para tratar la hemofilia.
  20. 20. Uso del vector genico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o una composicion
    farmaceutica como se define en la reivindicacion 15 para la fabricacion de un medicamento para prevenir el rechazo mediado por el sistema inmunitario del gen transferido.
  21. 21. Uso del vector genico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o una composicion 5 farmaceutica como se define en la reivindicacion 15 para la fabricacion de un medicamento para prevenir la
    respuesta inmunitaria a un antlgeno circulante.
  22. 22. Uso del vector genico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o una composicion farmaceutica como se define en la reivindicacion 15 para la fabricacion de un medicamento para tratar una
    10 enfermedad seleccionada entre cancer, enfermedades neurologicas, enfermedades hereditarias, enfermedades cardlacas, ictus, artritis, infecciones virales y enfermedades del sistema inmunitario.
  23. 23. Uso del vector genico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o una composicion farmaceutica como se define en la reivindicacion 15 para la fabricacion de un medicamento para la terapia genica.
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ES06795291.1T 2005-05-27 2006-05-26 Vector génico que comprende miARN Active ES2564823T3 (es)

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