JP7121086B2 - 脂肪組織に形質導入するのに有用なアデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents

Description

本発明は、脂肪組織に形質導入するのに有用なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。ベクターは、組織特異的に白色または褐色脂肪組織に形質導入し得る。

脂肪組織は、脂肪貯蔵所およびエネルギーホメオスタシスのモジュレーターとしてのそのすでに知られている役割に加えて、主要な代謝および内分泌臓器として最近認識された。障害のある白色脂肪組織（ＷＡＴ）機能ならびに低下した褐色脂肪組織（ＢＡＴ）活性またはＢＡＴ質量が、肥満症の発生の主な原因であると提案されている。この関連で、ヒトにおける脂肪細胞およびＷＡＴ機能障害が記載されている。さらに、ＢＡＴ活性と肥満度指数（ＢＭＩ）の間の逆相関も報告されている（非特許文献１～５）。

肥満症の罹患率は、過去１０年の間に著しく増大し、多発することとなった。５億人を超える人が肥満であると推測される。肥満症は、今日、主要な公衆衛生問題である（非特許文献６）。肥満症は、それ自体、死亡率の危険を高め、インスリン抵抗性および２型糖尿病を長い間強力に伴ってきた（非特許文献７および８）。さらに、脂肪細胞機能障害および肥満症はまた、特定の種類の癌の、および心疾患、免疫機能障害、高血圧症、関節炎および神経変性性疾患などの多数のその他の重篤疾病の重大な危険因子である（非特許文献９～１１）。

食事および運動が、肥満症の治療の中心であるが、体重を減少および維持するために、ますます多くの患者が薬物療法介入も必要としている。しかし、薬物療法が、意図的でない体重減少も、実質的な体重減少も誘導せず、さらに、抗肥満症薬が、その全身作用のために重要な副作用を示すことも多い。したがって、現在の肥満症蔓延を防ぎ、これと闘うための新規の安全なアプローチが緊急に必要である。これに関連して、肥満症を実証する病理学的事象を解き明かすことは、新規抗肥満症治療の開発にとって重大である。白色および褐色脂肪組織への候補遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入は、肥満症の発生および発達の根底にある分子機序を見抜くための大きな可能性を提供し得る。さらに、脂肪細胞を標的とする遺伝子療法アプローチは、全身効果を最小にしながら、肥満症およびその関連障害のさらなる治療の新しい機会を開き得る。しかし、今日まで、白色および褐色脂肪組織への有効な、特異的遺伝子導入は、捉えどころがないままである。

最近、血清型１のＡＡＶ（ＡＡＶｌ）は、非イオン性界面活性剤またはセラストロールと組み合わせた場合に、ｉｎ ｖｉｖｏでマウスＷＡＴに中程度に感染することがわかった（非特許文献１２および１３）。ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９などのその他のＡＡＶ血清型は、高度に感染性であると報告されたが、その脂肪形質導入効率は不明確である（非特許文献１４～２１）。

Ｙｅｅ Ｊら、Ｌｉｐｉｄｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｓ．２０１２年、第１１巻：１９～３０頁 Ｉｃｈｉｍｕｒａ Ａら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１２年；第４８３巻：３５０～３５４頁 Ｍａｚｚａｔｔｉ Ｄら、Ａｒｃｈ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２年；第１１８巻（３）：１１２～１２０頁 Ｃｙｐｅｓｓ Ａら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００９年；第３６０巻：１５０９～１５１７頁 ｖａｎ Ｍａｒｋｅｎ Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｌｔ Ｗら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００９年；第３６０巻：１５００～１５０８頁 ＩＡＳＯ、「Ｇｌｏｂａｌ Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｏｂｅｓｉｔｙ， Ｒｅｐｏｒｔ ＩＯＴＦ ２００８」（ＩＡＳＯ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＧＢ， ２００９年） Ｐｅｅｔｅｒｓ Ａら、Ａｎｎ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． ２００３年；第１３８号：２４～３２頁 Ｍｏｌｌｅｒ Ｄら、Ｎ． Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９１年；第３２５号：９３８～９４８頁 Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｄら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．２０１０年；第６１巻：３０１～３１６頁 Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ Ｂら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３年；第２６８巻（１０号）：６８２３～６８２６頁 Ｗｈｉｔｍｅｒ Ｒら、Ｃｕｒｒ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｒｅｓ．２００７年；第４巻（２号）：１１７～１２２頁 Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｈら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００６年；第１７号：９２１～９２８頁 Ｚｈａｎｇ Ｆら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１年；第１８号：１２８～１３４頁 Ｇａｏ Ｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２年；第９９号：１１８５４～１１８５９頁 Ｎａｋａｉ Ｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５年；第７９号：２１４～２２４頁 Ｐａｃａｋ Ｃら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２００６年；第９９号：ｅ３～ｅ９ Ｂｒｏｅｋｍａｎ Ｍら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００６年；第１３８号：５０１～５１０頁 Ｗａｎｇ Ｚら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００６年；第５５号：８７５～８８４頁 Ｔａｙｍａｎｓ Ｊら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００７年；第１８号：１９５～２０６頁 Ｂｉｓｈ Ｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８年；第１９号：１３５９～１３６８頁 Ｌｅｂｈｅｒｚ Ｃら、Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２００８年；第１０号：３７５～３８２頁

したがって、当技術分野では、脂肪組織の特異的形質導入、さらに、特定の種類の脂肪細胞の形質導入を可能にするベクターの開発が必要である。

本発明は、特定の種類の脂肪細胞への目的のポリヌクレオチド送達およびその発現を可能にするアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を指す。本発明の脂肪組織特異的調節エレメントの使用は、目的のポリヌクレオチドの発現を白色脂肪組織または褐色脂肪組織いずれかへ制限する。さらに、本発明のベクターは、脂肪組織関連疾患、例えば、２型糖尿病などの治療にとって有用であると証明された。本発明の態様は、特許請求の範囲に開示されている。

微生物の寄託
プラスミドｐＡＡＶ－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ヌルおよびｐＡＡＶ－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ヌルは、それぞれ、受託番号ＤＳＭ２６０５７およびＤＳＭ２６０５８のもと、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）、ＩｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａＢｅ ７Ｂ、Ｄ－３８１２４ ブラウンシュワイク、ドイツ連邦共和国に２０１２年６月８日に寄託された。

図１は、ＡＡＶのｅＷＡＴ内投与による白色脂肪細胞の形質導入を示す図である。図１Ａ～Ｂは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ８８ととものまたはＰｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ８８を伴わない血清型１、２、４および５のＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ（Ａ）および血清型６、７、８および９のＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ（Ｂ）で処理されたｅＷＡＴの切片における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、緑色の）に対する免疫染色。青色、核。矢印は、形質導入された脂肪細胞を示す。原倍率１００Ｘ（Ｂ、左パネル）および２００Ｘ（Ａ；Ｂ、右パネル）。図１Ｃ．血清型１、６、７、８または９のＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰで処理されたｅＷＡＴ中のＧＦＰ含量（群あたりｎ＝５）。示される値は、平均±ＳＥＭである。ＲＬＵ、相対光単位。図１Ｄ．ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＬａｃＺを与えたｅＷＡＴの全体のＸ－ｇａｌ染色。Ｘ－ｇａｌ染色は、形質導入されたｅＷＡＴ全体に分布していた。対照的に、生理食塩水溶液で処理した動物から得られたｅＷＡＴでは、Ｘ－ｇａｌ染色は検出されなかった。図１Ｅ．ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＨＫＩＩまたはＡＡＶ９－ＣＭＶ－ヌルベクターで処理された動物のｅＷＡＴから得られた単離された脂肪細胞における相対ｍＨＫＩＩ発現レベル。図１Ｆ．ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ヌルおよびＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＨＫＩＩを注射されたマウスから得られた単離された脂肪細胞による基礎およびインスリン刺激された２－［１－^３Ｈ］デオキシ－Ｄ－グルコース取り込み。脂肪細胞は、少なくとも５匹のマウス／群から得た。図１Ｇ．２×１０^１１ｖｇのＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰベクターのｉＷＡＴ内投与の２週間後の、鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）の切片におけるＧＦＰ（褐色）に対する免疫染色。原倍率×１００。図１Ｈ：２×１０^１１ｖｇのＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰの注射の２週間後のｉＷＡＴにおけるＧＦＰ発現レベル（ｎ＝６）。示される値は、平均±ＳＥＭである。同一インスリン濃度でのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ヌルに対して、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１および^＊＊＊ｐ＜０．００１；＃ｐ＜０．０５。すべての解析は、２×１０^１１ｖｇ／ｅＷＡＴのｅＷＡＴ内投与の２週間後に実施した。 図２は、ｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域によるＡＡＶのｅＷＡＴ内投与後の白色脂肪細胞の特異的形質導入を示す図である。図２Ａ．１０^１２ｖｇ／ｅＷＡＴのＡＡＶ８およびＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ＧＦＰベクターを与えたｅＷＡＴにおけるＧＦＰに対する免疫染色（褐色で）。解析は、注射の２週間後に実施した。原倍率×４００。図２Ｂ．循環ｈＳｅＡＰレベル。４×ｌ０^１２ｖｇ／マウスの用量のＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ｈＳｅＡＰベクターを、ｅＷＡＴに両側性に注射し、注射後いくつかの時点で循環ｈＳｅＡＰレベルの測定を実施した。ＲＬＵ、相対光単位。示される値は、平均±ＳＥＭである。ｎ＝３（生理食塩水）およびｎ＝４（ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ＳｅＡＰ）。図２Ｃ．４×ｌ０^１２ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ｈＳｅＡＰのｅＷＡＴ内投与の１年後の肝臓およびｅＷＡＴにおける相対ｈＳｅＡＰ発現レベル。図２Ｄ．ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ヌルおよびＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ｍＨＫＩＩベクター（１．４．×ｌ０^１２ｖｇ／マウス）のｅＷＡＴ内投与の２週間後に、ｅＷＡＴ、ｉＢＡＴおよび心臓によるｉｎ ｖｉｖｏ ２－［１－^３Ｈ］デオキシ－Ｄ－グルコース取り込みを評価した。示される値は、平均±ＳＥＭである。ｎ＝群あたり７匹のマウス。^＊ｐ＜０．０５。 図３は、ＡＡＶのｉＢＡＴ内投与による褐色脂肪細胞の形質導入を示す図である。図３Ａ．２×１０^９ｖｇ／マウスのＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰで処理したｉＢＡＴの切片におけるＧＦＰに対する免疫染色（褐色で）。原倍率×２００および×４００（差し込み図）。図３Ｂ．２×ｌ０^９ｖｇ／マウスのＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰを与えたｉＢＡＴにおける相対ＧＦＰ発現レベル。示される値は、平均±ＳＥＭである。ｎ＝群あたり５匹のマウス。^＊ｐ＜０．０５。図３Ｃ．２×１０^１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ４もしくはＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＲＦＰまたは２×ｌ０^１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＲＦＰを与えたｉＢＡＴにおける相対赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）発現レベル。形質導入パターンは、ｅＷＡＴと同様である。図１を参照のこと。ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９は、ｉＢＡＴに形質導入するのに最も効率的な血清型である。図３Ｄ．１０^１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＲＦＰで処理したｉＢＡＴの切片におけるＲＦＰに対する免疫染色（褐色で）。原倍率×２００および×４００（挿入図）。解析は、ＡＡＶの投与の２週間後に実施した。 図４は、ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１調節領域によるＡＡＶのｉＢＡＴ内投与後の褐色脂肪細胞の特異的形質導入を示す図である。図４Ａ．褐色脂肪細胞の形質導入を、２×１０^１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ＧＦＰベクターの注射の２週間後にＧＦＰに対する免疫染色（褐色で）によって評価した。原倍率×２００および×４００（挿入図）。図４Ｂ．ＡＡＶ８－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ヌルおよびＡＡＶ８－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ｍＨＫＩＩベクター（７×ｌ０^１０ｖｇ／マウス）の投与の２週間後のｉＢＡＴ、ｅＷＡＴおよび心臓によるｉｎ ｖｉｖｏ ２－［１－^３Ｈ］デオキシ－Ｄ－グルコース取り込み。ｎ＝群あたり６（ＡＡＶ８－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ｍＨＫＩＩ）およびｎ＝１０（ＡＡＶ８－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ヌル）匹のマウス。図４Ｃ～Ｅ．２×１０^１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ｍＶＥＧＦ_１６４またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ヌルベクターの送達の２週間後のｉＢＡＴにおける、相対ｍＶＥＧＦｉ_６４（Ｃ）、総ｍＶＥＧＦ（Ｄ）およびｍＰＥＣＡＭｌ（Ｅ）発現レベル。ｎ＝群あたり５匹のマウス。図４Ｆ．２×１０^１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ｍＶＥＧＦ_１６４またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ヌルベクターの注射の２週間後のｉＢＡＴにおけるα－ＳＭＡに対する免疫染色（褐色で）。原倍率×４００。示される値は、平均±ＳＥＭである。^＊ｐ＜０．０５。赤色の矢印は、毛細血管構造を示す。 図５は、痩せたマウスへのＡＡＶベクターの全身送達による白色および褐色脂肪細胞の形質導入を示す図である。図５Ａ．ｅＷＡＴ切片におけるＧＦＰに対する免疫染色（緑色で）。青色、核。原倍率×１００（左側パネル）および×２００（右側パネル）。図５Ｂ．ｅＷＡＴにおける相対ＧＦＰ発現レベル。図５Ｃ．ｅＷＡＴにおけるＧＦＰ含量。図５Ｄ．ｉＢＡＴ切片におけるＧＦＰに対する免疫染色（褐色で）。原倍率×２００および×４００（挿入図）。図５Ｅ．ｉＢＡＴにおける相対ＧＦＰ発現レベル。図５Ｆ．ｉＢＡＴにおけるＧＦＰ含量。図５Ｇ～Ｈ．ＩＣＲマウスへの（Ｇ）およびＣ５７Ｂ１６マウスへの（Ｈ）ベクターのｉｖ投与後の鼠径部（ｉＷＡＴ）、後腹膜（ｒＷＡＴ）、腸間膜（ｍＷＡＴ）、ｅＷＡＴおよびｉＢＡＴにおける相対ＧＦＰ発現レベル（ＩＣＲ：ＡＡＶ８についてｎ＝３およびＡＡＶ９についてｎ＝５；Ｃ５７Ｂ１６：ｎ＝４）。すべての解析は、５×１０^１２ｖｇ／マウスのＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰベクターの尾静脈投与の２週間後に実施した。ＡＵ、任意単位。ＲＬＵ、相対光単位。 図６は、ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１調節領域によるＡＡＶの全身投与後の褐色脂肪細胞の特異的形質導入を示す図である。図６Ａ．ＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ＧＦＰベクターを与えたｉＢＡＴにおけるＧＦＰに対する免疫染色（褐色で）。原倍率×２００および×４００（挿入図）。図６Ｂ～Ｃ．注射の２ヶ月後の２×ｌ０^１２ｖｇ／マウスＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ｍＶＥＧＦ_１６４またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１－ヌルベクターで処理したｉＢＡＴにおける相対ｍＶＥＧＦ_１６４（Ｂ）および総ｍＶＥＧＦ（Ｃ）発現レベル。図６Ｄ～Ｅ．８×ｌ０^１２ｖｇのＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ＶＥＧＦ_１６４またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ヌルベクターのｉｖ投与の１カ月後のｉＢＡＴにおけるＶＥＧＦ_１６４（Ｂ）およびＰＥＣＡＭ１（Ｃ）発現レベル（ｎ＝５）。図６Ｆ～Ｇ．Ｂ～Ｃにおいてと同一コホートにおけるＣＤ１０５（褐色）（Ｄ）およびα－ＳＭＡ（褐色）（Ｅ）に対する免疫染色。赤色矢印は、血管を示す。原倍率×４００および×１０００（挿入図）。示される値は、平均＋ＳＥＭである。ｎ＝群あたり５匹のマウス^＊ｐ＜０．０５。 図７は、ｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域による脂肪細胞の形質導入およびＡＡＶの全身投与後の脂肪に制限された導入遺伝子発現を示す図である。図７Ａ．褐色脂肪細胞の形質導入を、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ＧＦＰベクターを与えた動物から得たｉＢＡＴ切片におけるＧＦＰに対する免疫染色（褐色で）によって評価した。原倍率×２００および×４００（挿入図）。図７Ｂ～Ｃ．非脂肪組織の形質導入は、注射の２週間後のＧＦＰに対する免疫染色（褐色で）によって評価した。ＧＦＰ発現は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ＧＦＰ（Ｂ）およびＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ＧＦＰ（Ｃ）で処理した動物の肝臓において最小であり、心臓には存在しなかった。原倍率×１００および×４００（挿入図）。すべての解析は、２×ｌ０^１２ｖｇ／マウスの全身注射の２週間後に実施した。 図８は、ＡＡＶのｅＷＡＴ内投与後のオフターゲットの導入遺伝子発現を示す図である。図８Ａ．ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰを与えた動物から得られたｉＢＡＴにおけるＧＦＰに対する免疫染色（褐色で）。原倍率×２００および×４００（挿入図）。図８Ｂ．ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰで処理した動物から得られたｉＢＡＴおよびｅＷＡＴにおける相対ＧＦＰ発現レベル。示される値は、平均±ＳＥＭである。ｎ＝群あたり５匹のマウス。^＊ｐ＜０．０５。図８Ｃ．非脂肪臓器の形質導入を、ＧＦＰに対する免疫染色（緑色で）によって評価した。ＧＦＰ発現は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９を注射された動物から得られた心臓および肝臓において明らかであった。原倍率×１００。解析は、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰベクター（４×１０^１１ｖｇ／マウス）のｅＷＡＴ内投与の２週間後に実施した。 図９は、ｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域による脂肪組織に制限されたＡＡＶ媒介性導入遺伝子発現を示す図である。１０^１２ｖｇのＡＡＶ８およびＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ＧＦＰベクターの局所ｅＷＡＴ内投与の２週間後に肝臓および心臓では、ＧＦＰに対する免疫染色によってＧＦＰ発現は検出されなかった。原倍率×１００。 図１０は、ＡＡＶベクターのｉＢＡＴ内投与による非脂肪臓器の形質導入を示す図である。非脂肪臓器の形質導入は、注射の２週間後にＧＦＰに対する免疫染色（褐色で）によって評価した。２×１０^９ｖｇ／マウスのＡＡＶ８およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰベクターをｉＢＡＴ内に注射した動物から得られた心臓および肝臓において、ＧＦＰ発現が明らかであった。原倍率×２００。 図１１は、ｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域による褐色脂肪細胞の形質導入およびＡＡＶのｉＢＡＴ内投与後の脂肪に制限された導入遺伝子発現を示す図である。図１１Ａ．２×１０^１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ＧＦＰベクターのｉＢＡＴ内送達の２週間後の褐色脂肪細胞の形質導入を、ＧＦＰに対する免疫染色（褐色で）によって評価した。原倍率×２００および×４００（挿入図）。図１１Ｂ．ｉＢＡＴへの局所的なＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１－ＧＦＰベクター（２×１０^１１ｖｇ／マウス）の注射の２週間後に、非脂肪臓器の形質導入をＧＦＰに対する免疫染色（褐色で）によって評価した。ＧＦＰ発現は、肝臓においてわずかであった。原倍率×１００および×４００（挿入図）。 図１２は、ＡＡＶの尾静脈送達後の広範な導入遺伝子発現を示す図である。尾静脈を介した５×ｌ０^１２ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰベクターの注射の２週間後のＧＦＰに対する免疫染色（緑色で）は、肝臓、心臓、骨格筋、精巣および腎臓の形質導入を示した。青色、核。原倍率×２００。 図１３は、肥満－糖尿病マウスへのＡＡＶベクターの全身投与後のＷＡＴおよびＢＡＴの形質導入を示す図である。図１３Ａ～Ｂ．ｏｂ／ｏｂ（Ａ）およびｄｂ／ｄｂマウス（Ｂ）への３×ｌ０^１２ｖｇのＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰベクターのｉｖ投与後の精巣上体白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）、鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）および肩甲骨間褐色脂肪組織（ｉＢＡＴ）切片におけるＧＦＰに対する免疫染色（褐色）。原倍率×２００。（ｏｂ／ｏｂ：ｎ＝４；ｄｂ／ｄｂ：ｎ＝４）。図１３Ｃ～Ｄ．ｏｂ／ｏｂ（Ｃ）およびｄｂ／ｄｂマウス（Ｄ）の同一コホートから得られた、鼠径部（ｉＷＡＴ）、後腹膜（ｒＷＡＴ）、腸間膜（ｍＷＡＴ）、ｅＷＡＴおよびｉＢＡＴ貯蔵所におけるＧＦＰ発現。ＡＵ、任意単位。すべての解析は、ベクター送達の２週間後に実施した。示される値は、平均±ＳＥＭである。^＊ＡＡＶ９に対してｐ＜０．０５。 図１４は、効率的な脂肪細胞形質導入およびｍｉｒＴ配列を用いる肝臓および心臓からの導入遺伝子発現の標的化解除（ｄｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）を示す図である。１０^１２ｖｇのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ－ｍｉＲＴ１２２、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ－ｍｉＲＴ１またはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ－ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターのｉｖ投与の２週間後の、精巣上体白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）、鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）、肩甲骨間褐色脂肪組織（ｉＢＡＴ）、肝臓および心臓におけるＧＦＰ免疫染色（褐色）。原倍率×１００（肝臓および心臓）、×２００（ｅＷＡＴおよびｉＷＡＴ）および×４００（ｉＢＡＴおよび挿入図）。

本発明は、局所投与された場合にＷＡＴまたはＢＡＴへの効率的な遺伝子導入を媒介可能なアデノ随伴ウイルスのＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９血清型をベースとするベクターを開示する。図１Ｂおよび１Ｃおよび３Ａ～３Ｄを参照のこと。これらのベクターの全身投与はまた、ＷＡＴおよびＢＡＴ両方における効率的な遺伝子送達につながる。図５Ａおよび５Ｄを参照のこと。ＡＡＶ８およびＡＡＶ９ベクターによって媒介される遺伝子送達は効率的であるが、脂肪組織に制限されない。本発明は、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９ベクターの、脂肪組織特異的プロモーター領域との組合せが、脂肪組織における目的のポリヌクレオチドの特異的発現を可能にすることを開示する。特に、異種遺伝子（例えば、ＧＦＰ）がｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域の制御下にある発現カセットを含むＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターの局所投与は、ＷＡＴにおけるその発現につながり、肝臓および心臓では発現はない。図２Ａおよび９を参照のこと。さらに、異種遺伝子（例えば、ＧＦＰ）がｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ調節領域の制御下にある発現カセットを含むＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターの局所投与は、ＢＡＴにおけるその発現につながり、心臓発現はなく、わずかな肝臓発現のみがある。図４Ａおよび１１Ｂを参照のこと。したがって、本発明のベクターおよびプロモーターによって形成される組合せの局所投与は、ｉｎ ｖｉｖｏでの脂肪細胞の形質導入に基づいた多数の疾患を治療するための安全な機序を提供する。

さらに、本発明の組合せの全身投与は、脂肪細胞の形質導入のための代替アプローチとなる。これに関連して、本発明は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１およびＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２の組合せの全身投与が、それぞれ、ＢＡＴおよびＷＡＴに形質導入するのに有効であることを開示する。図６Ａおよび７Ａを参照のこと。２つの調節領域のいずれが使用されようとも、本発明の組合せの全身投与は、脂肪組織における目的のポリヌクレオチドの高度に制限された発現につながり、心臓では発現はなく、肝臓におけるわずかな発現のみがある。図７Ｂおよび７Ｃを参照のこと。

１．一般用語および表現の定義
本明細書において同義的に使用されるような、用語「アデノ随伴ウイルス」、「ＡＡＶウイルス」、「ＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶウイルス粒子」および「ＡＡＶ粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシッドタンパク質（好ましくは、特定のＡＡＶ血清型のキャプシッドタンパク質のすべてによる）と、キャプシド形成されたポリヌクレオチドＡＡＶゲノムとから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が、ＡＡＶ逆方向末端反復配列がそれぞれの両端に位置する、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合には、通常、「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶベクター」と呼ばれる。ＡＡＶとは、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属するウイルスを指す。ＡＡＶゲノムは、およそ４．７キロベースの長さであり、プラスまたはマイナスセンスのいずれであってもよい一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）からなる。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両末端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）ならびに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐおよびｃａｐを含む。ｒｅｐフレームは、ＡＡＶ生活環に必要なＲｅｐタンパク質をコードする４種の重複遺伝子からできている。ｃａｐフレームは、一緒に相互作用して、正二十面体対称のキャプシッドを形成するキャプシッドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の重複するヌクレオチド配列を含有する。Ｃａｒｔｅｒ Ｂ、Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｌａｓｓｉｃ Ｄら編、「Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳ、２０００年）およびＧａｏ Ｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４年；第７８巻（第１２号）：６３８１～６３８８頁を参照のこと。

本明細書において、用語「アデノ随伴ウイルスＩＴＲ」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、アデノ随伴ウイルスのゲノムのＤＮＡ鎖の両末端に存在する逆方向末端反復配列を指す。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶゲノムの効率的な増殖に必要である。これらの配列の別の特性は、ヘアピンを形成するその能力である。この特徴は、第２のＤＮＡ鎖のプライマーゼ独立性合成を可能にするその自己誘導の一因となる。ＩＴＲはまた、野生型ＡＡＶ ＤＮＡの宿主細胞ゲノム（すなわち、ヒトにおける１９番染色体）への組み込みおよびそれからのレスキューにとって、ならびに十分にアセンブルされた、デオキシリボヌクレアーゼ耐性ＡＡＶ粒子の作製と組み合わせた、ＡＡＶ ＤＮＡの効率的なキャプシド形成にとって必要であると示された。

用語「ＡＡＶ２」とは、本明細書において、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１４０１で定義されるようなゲノム配列を有するアデノ随伴ウイルスの血清型を指す。

用語「ＡＡＶベクター」とは、本明細書においてさらに、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）が両端に位置する１種以上の目的のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含むベクターを指す。このようなＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）をコードし、発現するベクターでトランスフェクトされている宿主細胞中に存在し、宿主細胞が、アデノウイルスオープンリーディングフレームＥ４ｏｒｆ６をコードし、それからタンパク質を発現するベクターでトランスフェクトされている場合に、複製され、感染性ウイルス粒子中にパッケージングされ得る。ＡＡＶベクターが、より大きなポリヌクレオチドに（例えば、染色体中に、またはクローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの別のベクター中に）組み込まれる場合には、次いで、ＡＡＶベクターは、通常、「プロ－ベクター」と呼ばれる。プロ－ベクターは、ＡＡＶパッケージング機能およびＥ４ｏｒｆ６によって提供される必須のヘルパー機能の存在下で、複製およびキャプシド形成によって「レスキュー」され得る。

用語「脂肪組織」とは、本明細書において、成熟脂肪細胞（すなわち、脂肪細胞）ならびに小血管、神経組織、リンパ節および間質血管細胞群（ＳＶＦ）の組合せから構成される組織を指す。ＳＶＦは、内皮細胞、線維芽細胞、脂肪細胞前駆体細胞（すなわち、前脂肪細胞）ならびにマクロファージおよびＴ細胞などの未熟細胞から構成される。哺乳動物では、２種の異なる種類の脂肪組織が伝統的に区別されている：白色脂肪組織（ＷＡＴ）および褐色脂肪組織（ＢＡＴ）。脂肪組織は、主に、脂肪の形態でエネルギーを貯蔵するよう、震えなし熱発生によって熱を生じるよう、アディポカインを分泌するよう機能する。

用語「脂肪組織細胞」または「脂肪細胞」とは、本明細書において、脂肪組織を含み、脂肪としてのエネルギーの貯蔵または震えなし熱発生による熱の生成およびアディポカインの分泌を専門とする細胞型を指す。脂肪組織細胞は、白色脂肪細胞および褐色脂肪細胞を含む。

用語「脂肪組織特異的転写調節領域」とは、本明細書において、プロモーターとして働き（すなわち、プロモーターと作動可能に連結している選択された核酸配列の発現を調節し）、脂肪細胞などの特定の組織細胞において選択された核酸配列の発現に影響を及ぼす核酸配列を指す。脂肪組織特異的転写調節領域は、構成的または誘導可能であり得る。

用語「アルカリホスファターゼ」または「ＡＰ」とは、本明細書において、ヌクレオチド、タンパク質およびアルカロイドを含めた多数の種類の分子からのリン酸基の加水分解を触媒する酵素（ＥＣ３．１．３．１）を指す。

用語「血管新生」とは、本明細書において、その他の予め存在していたものから新規血管を形成するプロセスを指し、脈管形成および動脈形成のプロセスを含む。

用語「動脈形成」とは、本明細書において、平滑筋中層を有する血管の形成、成長または発達を指す。

用語「褐色脂肪組織細胞」または「褐色脂肪細胞」とは、本明細書において、多角形であり、複数のより小さい「多胞性の」液滴への脂質の蓄積および細胞質内のひだ状クリステがつまった大きなミトコンドリアの高含量を特徴とする脂肪細胞の種類を指す。白色脂肪細胞とは異なり、これらの細胞は、相当な細胞質を有する。核は、円形であり、偏在するが、細胞の末梢にではない。褐色脂肪細胞の多数のミトコンドリアおよび褐色脂肪貯蔵所の豊富な血管分布が、ＢＡＴの褐色の主な理由である。褐色脂肪細胞は、古典的なＢＡＴ貯蔵所に位置し、震えなし熱発生による熱の生成に関与している。Ｅｎｅｒｂａｃｋ Ｓ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００９年；第３６０巻：２０２１～２０２３頁を参照のこと。

用語「ＣＡＧ調節領域」とは、本明細書において、サイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメントおよびニワトリβ－アクチンプロモーターによって形成される組合せを指す。Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ Ａら、ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００８年；第９巻（２号）：１～１１頁を参照のこと。

用語「ｃａｐ遺伝子」または「ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子」とは、本明細書において、Ｃａｐタンパク質をコードする遺伝子を指す。用語「Ｃａｐタンパク質」とは、本明細書において、天然ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の少なくとも１つの機能活性（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）を有するポリペプチドを指す。Ｃａｐタンパク質の機能的活性（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の例として、キャプシッドの形成を誘導し、一本鎖ＤＮＡの蓄積を促進し、キャプシドへのＡＡＶ ＤＮＡパッケージング（すなわち、キャプシド形成）を促進し、細胞受容体と結合し、宿主へのビリオンの侵入を促進する能力が挙げられる。

用語「キャプシッド」とは、本明細書において、ウイルスのゲノムがパッケージングされる構造を指す。キャプシッドは、タンパク質でできたいくつかのオリゴマー構造サブユニットからなる。例えば、ＡＡＶは、３種のキャプシッドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の相互作用によって形成される正二十面体のキャプシッドを有する。

用語「細胞組成物」とは、本明細書において、本発明の脂肪細胞および少なくとも別の成分を含む複合材料を指す。組成物は、単一製剤として製剤され得るか、または各成分の別個の製剤として提示され得、これを、組み合わせ調製物として共同使用のために組み合わせてもよい。組成物は、各成分が個別に製剤され、パッケージングされるパーツキットであり得る。

用語「構成的プロモーター」とは、本明細書において、その活性が、細胞環境条件にほとんどまたは全くかかわらず、生物の細胞において、またはほとんどの発達段階に、比較的一定レベルで維持されるプロモーターを指す。

用語「エンハンサー」とは、本明細書において、転写因子が結合して遺伝子転写を増大するＤＮＡ配列エレメントを指す。

用語「発現カセット」とは、本明細書において、標的細胞における特定の核酸の転写を可能にする、一連の特定の核酸エレメントを用いて組換えによってまたは合成によって作製された核酸構築物を指す。

用語「ヘルパー機能を提供する遺伝子」とは、本明細書において、ＡＡＶが複製を依存している機能（すなわち、「ヘルパー機能」）を果たすポリペプチドをコードする遺伝子を指す。ヘルパー機能は、制限するものではないが、ＡＡＶ遺伝子転写、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成およびＡＡＶキャプシッドアセンブリーの活性化に関与している部分を含めたＡＡＶ複製に必要な機能を含む。ウイルスベースの補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）およびワクシニアウイルスなどの既知ヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。ヘルパー機能は、それだけには限らないが、アデノウイルスＥｌ、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２およびＵＬ２９ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼを含む。

用語「ヘキソキナーゼ」または「ＨＫ」とは、本明細書において、ヘキソースのリン酸化を触媒して、リン酸ヘキソースを形成する酵素を指す。ほとんどの生物において、グルコースは、ＨＫの主な基質であり、グルコース－６リン酸は最も重要な産物である。

用語「高血圧症」または「動脈高血圧症」とは、本明細書において、動脈の血圧が上昇している医学的状態を指す。血圧は、２つの測定値、心臓筋肉が、拍動間で収縮している（収縮期）か、または弛緩している（心臓拡張期）かどうかに依存して、収縮期および拡張期を含む。安静時正常血圧は、１００～１４０ｍｍＨｇ収縮期（上の読み取り）および６０～９０ｍｍＨｇ拡張期（下の読み取り）の範囲内にある。高血圧症は、持続的に１４０／９０ｍｍＨｇ以上である場合に存在するといわれる。高血圧症は、原発性（本態性）高血圧症または続発性高血圧症のいずれかとして分類され、症例の約９０～９５％が、明白な根底にある医学的原因がない高血圧症を意味する「原発性高血圧症」として分類される。症例の残りの５～１０％（すなわち、続発性高血圧症）は、腎臓、動脈、心臓または内分泌系に影響を及ぼすその他の条件によって引き起こされる。肥満症でよく見られるインスリン抵抗性も、高血圧症の一因であると考えられている。高血圧症は、卒中、心筋梗塞（すなわち、心臓発作）、心不全、動脈の瘤（例えば、大動脈動脈瘤）、末梢動脈疾患の主要な危険因子であり、慢性腎臓疾患の原因である。動脈血圧の中程度の上昇でさえ、平均余命の短縮と関連している。

用語「高血糖症」とは、本明細書において、異常に高い血糖レベルが、空腹時ベースラインレベルと関連して現れる状態を指す。特に、高血糖症は、空腹時血糖レベルが、１２６ｍｇ／ｄＬよりも一貫して高く、食後グルコースレベルが１４０ｍｇ／ｄＬより高いか、または体重１キログラムにつき１．７５グラムのグルコースの容量の投与の２時間後の静脈血漿中のグルコースレベルが、２００ｍｇ／ｄＬを上回る場合に起こると理解される。

用語「インスリン抵抗性」とは、本明細書において、細胞がインスリンに対して正しく応答しない障害を指す。結果として、身体は、高血糖レベルに応じてより多くのインスリンを産生する。インスリン抵抗性を有する患者は、高いグルコースレベルおよび高い循環インスリンレベルを示すことが多い。インスリン抵抗性は、肥満症、高血圧症および高脂血症と関連していることが多い。さらに、インスリン抵抗性は、２型糖尿病を有する患者において現れることが多い。

用語「局所投与された」とは、本明細書において、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチドまたは医薬組成物が、特定の部位でまたはその付近で対象に投与されることを意味する。

用語「肥満症」とは、本発明において使用されるように、肥満度指数（ＢＭＩ）に基づいてＷＨＯによって提供される肥満症の定義に関し、ヒトの体重（ｋｇで）とメートルでの身長の二乗の間の比からなる。この判定基準によれば、１８．５ｋｇ／ｍ^２より小さいＢＭＩは、不十分な体重または痩せていると考えられ、１８．５～２４．９ｋｇ／ｍ^２のＢＭＩは、正常体重と考えられ、２５．０～２９．９ｋｇ／ｍ^２のＢＭＩは、グレード１の過体重と考えられ、３０．０～３９．０ｋｇ／ｍ^２のＢＭＩは、グレード２の過体重と考えられ、４０．０ｋｇ／ｍ^２以上のＢＭＩは、病的な肥満症と考えられる。あるいは、肋骨の下限と骨盤の上限の間の中点で測定した腰の直径（ｃｍで）、皮膚のひだの厚みおよび除脂肪塊は脂肪塊よりも良好に電気を伝達するという原則に基づく生体インピーダンスなど、対象の肥満症の程度を規定するためのその他の方法がある。

用語「作動可能に連結している」とは、本明細書において、目的のポリヌクレオチドに関するプロモーター配列の機能的関連および位置を指す（例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合にコード配列と作動可能に連結している）。一般に、作動可能に連結しているプロモーターは、目的の配列と隣接している。しかし、エンハンサーは、その発現を制御するために目的の配列と隣接していなくてもよい。

本明細書において同義的に使用される、用語「医薬上許容される担体」、「医薬上許容される希釈剤」、「医薬上許容される賦形剤」または「医薬上許容される媒体」は、非毒性固体、半固体または液体増量剤、希釈剤、カプセル化剤または任意の従来の種類の製剤助剤を指す。医薬上許容される担体は、使用される投与量および濃度でレシピエントにとって本質的に非毒性であり、製剤のその他の成分と適合している。医薬上許容される担体の数および性質は、所望の投与形に応じて変わる。医薬上許容される担体は、公知であり、当技術分野で周知の方法によって調製され得る。Ｆａｕｌｉ ｉ Ｔｒｉｌｌｏ Ｃ、「Ｔｒａｔａｄｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ Ｇａｌｅｎｉｃａ」（Ｅｄ．Ｌｕｚａｎ ５、Ｓ．Ａ．、Ｍａｄｒｉｄ、ＥＳ、１９９３年）およびＧｅｎｎａｒｏ Ａ編、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」第２０版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、ＵＳ、２００３年）を参照のこと。

用語「プロモーター」とは、本明細書において、ポリヌクレオチド配列（複数可）の上流に位置する１種以上のポリヌクレオチドの転写を制御するよう機能し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位ならびにそれだけには限らないが、転写因子結合部位、レプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位を含めた任意のその他のＤＮＡ配列ならびに直接的または間接的に作用してプロモーターからの転写量を調節する当技術分野で公知の任意のその他のヌクレオチドの配列の存在によって構造的に同定されている核酸断片を指す。「組織特異的」プロモーターは、特定の種類の分化細胞または組織においてのみ活性である。

用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書において、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有する核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを指す。核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよく、または二本鎖もしくは一本鎖配列の両方の部分を含有する。用語「ポリヌクレオチド」は、それだけには限らないが、ポリペプチドをコードする能力を有する核酸配列および細胞または目的の内因性ポリヌクレオチドと部分的または完全に相補的であり、その結果、その転写後に、内因性ポリヌクレオチドとハイブリダイズし、その発現を阻害可能なＲＮＡ分子（例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）を生成する核酸配列を含む。

用語「転写後調節領域」とは、本明細書において、カセット中に含有される配列または得られた遺伝子産物の発現、安定化または局在性を促進する任意のポリヌクレオチドを指す。

用語「防ぐ」、「防ぐこと」および「防止」とは、本明細書において、対象において疾患の発端を阻害することまたは疾患の出現を低減することを指す。防止は完全である場合も（例えば、対象において病理学的細胞が全くないこと）、部分的である場合もある。防止はまた、臨床状態に対する感受性の低下を指す。

用語「組換えウイルスゲノム」とは、本明細書において、少なくとも１つの外来発現カセットポリヌクレオチドが、天然に存在するＡＡＶゲノム中に挿入されているＡＡＶゲノムを指す。

用語「ｒｅｐ遺伝子」または「ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子」とは、本明細書において、Ｒｅｐタンパク質をコードする遺伝子を指す。用語「Ｒｅｐタンパク質」とは、本明細書において、天然ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ４０、５２、６８、７８）の少なくとも１つの機能活性を有するポリペプチドを指す。Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ４０、５２、６８、７８）の「機能活性」は、ＤＮＡ複製のＡＡＶ開始点の認識、結合およびニッキングによるＤＮＡの複製の促進ならびにＤＮＡヘリカーゼ活性を含む、タンパク質の生理学的機能と関連する任意の活性である。さらなる機能として、ＡＡＶ（またはその他の異種）プロモーターからの転写の調節および宿主染色体へのＡＡＶ ＤＮＡの部位特異的組み込みが挙げられる。

用語「対象」とは、本明細書において、個体、植物またはヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよびその他の類人猿およびサル種）などの動物、家畜（例えば、トリ、魚、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）、家畜哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）または実験動物（例えば、マウス、ラットおよびモルモットなどのげっ歯類）を指す。この用語は、特定の年齢または性別は示さない。用語「対象」は、胚および胎児を包含する。

用語「全身に投与された」および「全身投与」とは、本明細書において、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチドまたは医薬組成物が局在化されていない方法で対象に投与されることを意味する。本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチドまたは医薬組成物の全身投与は、対象の身体全体のいくつかの臓器または組織に到達し得るか、対象の特定の臓器または組織に到達し得る。例えば、本発明の医薬組成物の静脈内投与は、対象中の２種以上の組織または臓器の形質導入をもたらし得る。

用語「転写調節領域」とは、本明細書において、多くの遺伝子のうち１種の発現を調節可能な核酸断片を指す。本発明のポリヌクレオチドの調節領域は、プロモーターおよびエンハンサーを含む。

用語「形質導入する」または「形質導入」とは、本明細書において、外来ヌクレオチド配列がウイルスベクターを介して細胞中に導入されるプロセスを指す。

用語「トランスフェクション」とは、本明細書において、レシピエント真核細胞へのＤＮＡの導入を指す。

用語「治療する」または「治療」とは、本明細書において、その臨床徴候が現れた後に疾患の進行を制御するための本発明の化合物または組成物の投与を指す。疾患進行の制御は、それだけには限らないが、症状の低減、疾患期間の低減、病理学的状態の安定化（具体的には、さらなる増悪を避けるための）、疾患の進行の遅延、病理学的状態の改善および緩解（部分的および完全の両方）を含む、有益なまたは所望の臨床結果を意味すると理解される。疾患の進行の制御はまた、治療が適用されない場合に予測される生存と比較した生存の延長も含む。

用語「２型糖尿病」とは、本明細書において、血糖レベルの不適当な増大を特徴とする疾患を指す。糖尿病の慢性高血糖症は、種々の臓器の長期の損傷、機能障害および不全を伴い、網膜症、腎症および末梢神経障害などのさまざまな合併症につながる。２型糖尿病は、低減したβ－細胞量および機能の組合せによる、末梢組織（主に、骨格筋、脂肪組織および肝臓）におけるインスリン抵抗性および不適当な代償的インスリン分泌応答によって引き起こされる。グルコース濃度の増大に加えて、不完全なインスリン作用は、コレステロールまたはトリグリセリドレベルの増大になることが多い。

用語「脈管形成」とは、本明細書において、未分化または低分化細胞に由来する血管の形成、成長、発生または増殖を指す。

用語「ベクター」とは、本明細書において、宿主細胞中に送達し、任意選択で、１種以上の目的のポリヌクレオチドを発現することが可能な構築物を指す。ベクターの例として、それだけには限らないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と会合しているＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中にカプセル化されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターおよびプロデューサー細胞などの特定の真核細胞が挙げられる。ベクターは、安定であり得、自己複製可能である。使用可能なベクターの種類に関して制限はない。ベクターは、いくつかの異種生物に組み込まれたポリヌクレオチド、遺伝子構築物または発現ベクターを増幅させ、入手するのに適したクローニングベクターであり得る。適したベクターとして、原核生物の発現ベクター（例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびその誘導体）、ｍｐｌ８、ｍｐｌ９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏＩＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージおよびシャトルベクター（例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８）ならびにウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスならびにレトロウイルスおよびレンチウイルス）ならびに非ウイルスベクター、例えば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ４．１－ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ、ＵＳ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ－ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ－１０、ｐＢＰＶ－ｌ、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴ１をベースとする真核生物の発現ベクターが挙げられる。

用語「ＶＥＧＦ」とは、本明細書において、血管内皮細胞増殖因子を意味する。「ＶＥＧＦ」として、それだけには限らないが、ＶＥＧＦ変異体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦが挙げられる。Ｈａｍａｗｙ Ａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９９年；第１４巻：５１５～５２２頁、Ｎｅｕｆｅｌｄ Ｇら、Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ．１９９４年；第５巻：８９～９７頁、Ｏｌｏｆｓｓｏｎ Ｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９６年；第９３巻：２５７６～２５８１頁、Ｃｈｉｌｏｖ Ｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７年；第２７２巻：２５１７６～２５１８３頁およびＯｌｏｆｓｓｏｎ Ｂら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９９年；第１０巻：５２８～５３５頁を参照のこと。ＶＥＧＦ Ａ変異体として、それだけには限らないが、アイソフォームＶＥＧＦ_１６４、ＶＥＧＦ_１２１、ＶＥＧＦ_１４５、ＶＥＧＦ_１６７、ＶＥＧＦ_１６５、ＶＥＧＦ_１８９およびＶＥＧＦ_２０６が挙げられる。Ｔｉｓｃｈｅｒ Ｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１年；第２６６巻：１１９４７～１１９５４頁およびＰｏｌｔｏｒａｋ Ｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７年；第２７２巻：７１５１～７１５８頁を参照のこと。用語「ＶＥＧＦ」はまた、血管透過性因子またはバスキュロトロピン（ＶＰＦ）を含む。Ｋｅｃｋ Ｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９年；第２４６巻：１３０９～１３１２頁およびＳｅｎｇｅｒ Ｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８３年；第２１９巻：９８３～９８５頁を参照のこと。ＶＰＦは、ＶＥＧＦ Ａとして現在当技術分野で公知である。胎盤増殖因子ＰＩＧＦ ＩおよびＩＩを含め、ＶＥＧＦファミリーのその他のメンバーもまた使用できる。適したＶＥＧＦの配列は、容易に入手可能である（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｊｕｎｅ ２０１２年）。例えば、ヒトＶＥＧＦファミリーメンバーの遺伝子座として、ＶＥＧＦ－Ａ－Ｐ１５６９２およびＮＰ００３３６７；ＶＥＧＦ－Ｂ－ＮＰ００３３６８、Ｐ４９７６５、ＡＡＬ７９００１、ＡＡＬ７９０００、ＡＡＣ５０７２１、ＡＡＢ０６２７４およびＡＡＨ０８８１８；ＶＥＧＦ－Ｃ－ＮＰ００５４２０、Ｐ４９７６７、Ｓ６９２０７、ＡＡＢ３６４２５およびＣＡＡ６３９０７；ＶＥＧＦ－Ｄ－ＮＰ００４４６０、ＡＡＨ２７９４８、Ｏ４３９１５、ＣＡＡ０３９４２およびＢＡＡ２４２６４；ＶＥＧＦ－Ｅ－ＡＡＱ８８８５７；ＶＥＧＦ－Ｆ－２ＶＰＦＦ；ＰＩＧＦ－１－ＮＰ００２６２３、ＡＡＨ０７７８９、ＡＡＨ０７２５５、ＡＡＨ０１４２２、Ｐ４９７６３、ＣＡＡ３８６９８およびＣＡＡ７０４６３；ＰＩＧＦ－１の鎖Ａ－１ＦＺＶＡおよび鎖Ｂ－ＩＦＺＶＢの合成構築物；ならびにＰＩＧＦ－２－ＡＡＢ２５８３２およびＡＡＢ３０４６２が挙げられる。好ましくは、ＶＥＧＦは、ヒト起源のものである。しかし、本発明に従って、マウスなどのその他の種由来のＶＥＧＦを使用してもよい。

用語「白色脂肪組織細胞」または「白色脂肪細胞」とは、本明細書において、多面体から球状であり、細胞質の薄層によって囲まれた大きな「単房性」脂質液滴を含有する脂肪細胞の種類を指す。前記細胞の核は、平板化され、末梢に局在する。白色脂肪細胞の直径は、可変性であり、貯蔵所部位に従って３０から７０μｍの間の範囲である。貯蔵された脂肪は、半液体状態であり、主に、トリグリセリドおよびコレステリルエステルからなる。白色脂肪細胞は、まとめてアディポカインとして知られる多数のペプチドおよびタンパク質、例えば、レジスチン、アディポネクチンおよびレプチンを分泌する。

用語「ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント」または「ＷＰＲＥ」は、本明細書において、転写されると、遺伝子の発現を増強可能な三次構造を作製するＤＮＡ配列を指す。Ｌｅｅ Ｙら、Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００５年；第９０巻（ｌ号）：３３～３７頁およびＤｏｎｅｌｌｏ Ｊら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８年；第７２巻（６号）：５０８５～５０９２頁を参照のこと。

用語「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」とは、本明細書において、転写後レベルでのＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシングに関与する、小さい（約２２－ｎｔ）、進化的に保存された調節ＲＮＡである。Ｂａｒｒｅｌ ＤＰ．Ｃｅｌｌ ２００４年；第１１６巻：２８１～２９７頁を参照のこと。ｍｉＲＮＡは、相補的領域（細胞メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）中であることが最も多い）との塩基対形成によって、ｍＲＮＡ翻訳を抑制するよう作用し得るか、高い配列相同性の際には、ｍＲＮＡの触媒分解を引き起こす。多数のｍｉＲＮＡの高度に異なる組織発現のために、細胞ｍｉＲＮＡを利用して、遺伝子療法ベクターの組織特異的ターゲッティングを媒介できる。ウイルスベクター内の組織特異的ｍｉＲＮＡと完全に相補的である標的エレメント（ｍｉＲＴ）のタンデムコピーを遺伝子操作することによって、望ましくない組織における導入遺伝子発現を効率的に阻害できる。

２．脂肪組織特異的発現を提供するアデノ随伴ウイルスベクター
第１の態様では、本発明は、前記組換えウイルスゲノムが、目的のポリヌクレオチドと作動可能に連結している脂肪組織特異的転写調節領域を含む発現カセットを含む組換えウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。

本発明のＡＡＶは、公知のＡＡＶの４２種の血清型のうち任意の血清型を含む。一般に、ＡＡＶの血清型は、アミノ酸および核酸のレベルで相当な相同性を有するゲノム配列を有し、同一の一連の遺伝子機能を提供し、生理学的および機能的に本質的に同等であるビリオンを産生し、事実上同一の機序によって複製し、アセンブルする。特に、本発明のＡＡＶは、ＡＡＶの血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａおよび３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶおよび任意のその他のＡＡＶに属し得る。異なるＡＡＶ血清型のゲノムの配列の例は、文献またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースにおいて見出され得る。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ００６２６０（ＡＡＶ７）、ＮＣ００６２６１（ＡＡＶ８）およびＡＸ７５３２５０．１（ＡＡＶ９）を参照のこと。好ましい実施形態では、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９血清型からなる群から選択される血清型のものである。

本発明のＡＡＶのゲノムは、通常、シス作用性５’および３’逆方向末端反復配列および発現カセットを含む。Ｔｉｊｓｓｅｒ Ｐ編「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、ＵＳ、１９９０年、１５５～１６８頁）を参照のこと。ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐの長さである。分子においてＩＴＲをコードする実質的に全配列が使用されることが好ましいが、これらの配列のある程度の微小な修飾は許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾するための手順は、当技術分野で公知である。ＢｒｏｗｎＴ、「Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｃｈａｐｍａｎ
＆ Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＧＢ、１９９５年）、Ｗａｔｓｏｎ Ｒら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、第２版（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳ、１９９２年）、Ａｌｂｅｒｔｓ Ｂら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ」（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳ、２００８年）、Ｉｎｎｉｓ Ｍら編、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳ、１９９０年）、Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ編「ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳ、１９８９年）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳ、１９８９年）、Ｂｉｓｈｏｐ Ｔら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＧＢ、１９８７年）、Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ Ｗ編、「Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、ＭＡ、ＵＳ、１９８７年）、Ｄａｖｉｓ Ｌら「Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳ、１９８６年）およびＳｃｈｌｅｅｆ Ｍ編、「Ｐｌａｓｍｉｄ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ」（Ｗｉｌｅｙ－ ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、ＤＥ、２００１年）を参照のこと。好ましい実施形態では、ＡＡＶ組換えゲノムは、５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲを含む。別の実施形態では、５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来する。さらにより好ましい実施形態では、ＡＡＶ組換えゲノムは、ｒｅｐオープンリーディングフレームまたはｃａｐオープンリーディングフレームを欠く。一実施形態では、ＡＡＶ２ ＩＴＲは、偽型ＡＡＶ（すなわち、異なる血清型に由来するキャプシッドおよびＩＴＲを有するＡＡＶ）を生成するよう選択される。

本発明のポリヌクレオチドは、ＡＡＶ血清型のうち任意の１種に由来するＩＴＲを含み得る。好ましい実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２血清型に由来する。

本発明のＡＡＶは、任意の血清型に由来するキャプシッドを含む。特定の実施形態では、キャプシッドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群のＡＡＶに由来する。好ましい実施形態では、本発明のＡＡＶは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型に由来するキャプシッドを含む。さらに好ましい実施形態では、ＡＡＶキャプシッドのＶＰ１配列は、配列番号１８を有する。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５７９を参照のこと。

いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用するためのＡＡＶ Ｃａｐを、上記のＡＡＶ Ｃａｐのうち１種またはそのコード核酸の突然変異誘発によって（すなわち、挿入、欠失または置換によって）作製してもよい。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃａｐは、上記のＡＡＶ Ｃａｐのうち１種以上と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％またはそれ以上類似している。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃａｐは、前記のＡＡＶ Ｃａｐのうち２、３、４種またはそれ以上に由来するドメインを含むキメラである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃａｐは、２または３種の異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶに由来するＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３単量体のモザイクである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、上記のＣａｐのうち２種以上を含む。

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物において使用するためのＡＡＶ Ｃａｐは、異種配列またはその他の修飾を含有するよう遺伝子操作される。例えば、選択的ターゲッティングまたは免疫回避を付与するペプチドまたはタンパク質配列が、Ｃａｐタンパク質に遺伝子操作され得る。あるいは、またはさらに、Ｃａｐは、ｒＡＡＶの表面がポリエチレングリコール付加される（すなわち、ペグ化される）よう化学的に修飾され得、これは、免疫回避を促進し得る。Ｃａｐタンパク質はまた、突然変異誘発され得る（例えば、その天然受容体結合を除去するよう、または免疫原性エピトープをマスクするよう）。

別の特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、偽型ＡＡＶベクターである（すなわち、ベクターは、少なくとも２種の別個のＡＡＶ血清型を起源とする配列または成分を含む）。特定の実施形態では、偽型ＡＡＶベクターは、１種のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）に由来するＡＡＶゲノムおよび別個のＡＡＶ血清型に少なくとも幾分か由来するキャプシッドを含む。このような偽型ＡＡＶベクターの具体例として、限定するものではないが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９由来キャプシッド中に、任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１１）に由来するゲノムを含むベクターが挙げられる。

一実施形態では、ＡＡＶベクターは、以下の一覧から選択され得る少なくとも１種のｍｉＲＮＡの少なくとも１種の標的配列：ｍｉＲ１２２（ｍｉＲＢａｓｅデータベース受託番号ＭＩ００００４４２）、ｍｉＲ１５２（ＭＩ００００４６２）、ｍｉＲ１９９（ＭＩ００００２４２）、ｍｉＲ２１５（ＭＩ００００２９１）、ｍｉＲ１９２（ＭＩ００００２３４）、ｍｉＲ１４８ａ（ＭＩ００００２５３）、ｍｉＲ１９４（ＭＩ００００４８８）、ｍｉＲ１（ＭＩ００００６５１）、ｍｉＲＴ１３３（ＭＩ００００４５０）、ｍｉＲ２０６（ＭＩ００００４９０）、ｍｉＲ２０８（ＭＩ００００２５１）、ｍｉＲ１２４（ＭＩ００００４４３）、ｍｉＲ１２５（ＭＩ００００４６９）、ｍｉＲ２１６（ＭＩ００００２９２）、ｍｉＲ１３０（ＭＩ００００４４８）を付加した１種のプロモーターを含有する。配列参照は、ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／、３１／０７／２０１３としてのバージョンに従って）から得た。

一実施形態では、ＡＡＶベクターは、以下の一覧から選択され得る少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列を付加した１種のプロモーターを含有する：
一覧１
ｍｉＲＴ１２２ａ（５’ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ３’）、
ｍｉＲＴ１５２（５’ＡＧＴＣＡＣＧＴＡＣＴＧＴＣＴＴＧＡＡＣＣ３’）、
ｍｉＲ１９９ａ－５ｐ（５’ＧＧＧＴＣＡＣＡＡＧＴＣＴＧＡＴＧＧＡＣＡＡＧ３’）、
ｍｉＲ９９ａ－３ｐ（５’ＴＧＴＣＡＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＡＡＣＣＡＡＴ３’）、
ｍｉＲＴ２１５（５’ＴＡＣＴＧＧＡＴＡＣＴＴＡＡＣＴＧＴＣＴＧ３’）、
ｍｉＲＴ１９２（５’ＧＧＣＴＧＴＣＡＡＴＴＣＡＴＡＧＧＴＣＡＧ３’）、
ｍｉＲＴ１９４（５’ＡＣＡＴＴＧＴＣＧＴＴＧＡＧＧＴＡＣＡＣＣＴ３’）、
ｍｉＲＴ１（５’ＴＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ３’）、
ｍｉｒＴ１４８（５’ＡＧＴＣＡＣＧＴＧＡＴＧＴＣＴＴＧＡＡＡＣＡ３’）、
ｍｉＲＴ１３３ａ（５’ＡＡＡＣＣＡＧＧＧＧＡＡＧＴＴＧＧＴＣＧＡＣ３’）、
ｍｉＲＴ２０６（５’ＡＣＣＴＴＡＣＡＴＴＣＣＴＴＣＡＣＡＣＡＣＣ３’）、
ｍｉＲＴ１２４（５’ＡＴＴＣＣＧＴＧＣＧＣＣＡＣＴＴＡＣＧＧ３’）、
ｍｉＲＴ１２５（５’ＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＧＡＣＡＣＴ３’）、
ｍｉＲＴ２１６（５’ＡＴＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＧＴＴＧＡＣＡＣＴ３’）、
ｍｉＲＴ１３０（５’ＧＴＣＡＣＧＴＴＡＣＡＡＴＴＴＴＣＣＣＧＴＡ３’）。

一実施形態では、ＡＡＶベクターは、上記の一覧１から選択されたｍｉＲＮＡ標的配列と８５％の相同性を有する少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列を付加した１種のプロモーターを含有する。

一実施形態では、ＡＡＶベクターは、上記の一覧１から選択されるｍｉＲＮＡ標的配列と機能的に同等である少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列を付加した１種のプロモーターを含有する。この場合には、用語機能的に同等とは、元の配列と結合する同一ｍｉＲＮＡと結合可能な任意のヌクレオチド配列を意味する。例えば、ｍｉＲＴ１２２ａの機能的に同等物は、ｍｉＲＴ１２２ａとハイブリダイズするであろう同数のｍｉＲＮＡとハイブリダイズする任意の配列である。

機能的に同等なヌクレオチド配列は、参照ｍｉｒＴ配列の相対生物活性を保持する。それは、ｍｉｒＴの機能的同等物は、参照ｍｉｒＴ配列が行うのと同一方法で望ましくない組織における導入遺伝子発現を阻害する能力を有するということを意味する。

別の特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、配列番号１９と呼ばれるｍｉｒＴ１２２ａ（５’ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ３’）または配列番号２０と呼ばれるｍｉｒＴ１（５’ＴＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ３’）から選択され得る。

転写調節領域は、プロモーターと、任意選択で、エンハンサー領域を含み得る。プロモーターは、脂肪組織に特異的であることが好ましい。エンハンサーは、脂肪組織に特異的である必要はない。あるいは、転写調節領域は、脂肪組織特異的プロモーターおよび脂肪組織特異的エンハンサーを含み得る。

一実施形態では、組織特異的プロモーターは、例えば、脂肪細胞タンパク質２（ａＰ２、脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）としても知られる）、ＰＰＡＲｙプロモーター、アディポネクチンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、ヒトアロマターゼシトクロムｐ４５０に由来するプロモーター（ｐ４５０ａｒｏｍ）またはＦｏｘａ－２プロモーターなどの脂肪細胞特異的プロモーターである。Ｇｒａｖｅｓ Ｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９１年；第５巻：４２８～４３７頁、Ｒｏｓｓ Ｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９０年；第８７巻：９５９０～９５９４頁、Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｅら、米国特許第５，４４６，１４３号明細書、Ｍａｈｅｎｄｒｏｏ Ｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３年；第２６８巻：１９４６３～１９４７０頁、Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９３年；第３９巻：３１７～３２４頁およびＳａｓａｋｉ Ｈら、Ｃｅｌｌ １９９４年；第７６巻：１０３～１１５頁を参照のこと。好ましい実施形態では、エンハンサー領域は、脂肪特異的ａＰ２エンハンサーおよび脂肪特異的ＵＣＰ１エンハンサーからなる群から選択される。

好ましい実施形態では、本発明のＡＡＶの脂肪組織特異的調節領域は、脂肪特異的ａＰ２エンハンサーおよび基礎ａＰ２プロモーターを含む。Ｒｉｖａｌ Ｙら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００４年：第３１１巻（２号）：４６７～４７５頁を参照のこと。脂肪特異的ａＰ２エンハンサーおよび基礎ａＰ２プロモーターを含む領域はまた、「ｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域」としても知られ、ａＰ２遺伝子の基礎プロモーターおよび前記ａＰ２遺伝子の脂肪特異的エンハンサーによって形成される。好ましくは、ａＰ２プロモーターは、マウスである。Ｇｒａｖｅｓ Ｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２年；第１２巻（３号）：１２０２～１２０８頁およびＲｏｓｓ Ｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９０年；第８７巻：９５９０～９５９４頁を参照のこと。特定の実施形態では、ｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域は、配列番号２を有する。

別の好ましい実施形態では、本発明のＡＡＶの脂肪組織特異的調節領域は、脂肪特異的ＵＣＰ１エンハンサーおよび基礎ＵＣＰ１プロモーターを含む。ｄｅｌ Ｍａｒ Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｂａｒｒｏｓｏ Ｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００年；第２７５巻（４１号）：３１７２２～３１７３２頁およびＲｉｍ Ｊら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年；第２７７巻（３７号）：３４５８９～３４６００頁を参照のこと。脂肪特異的ＵＣＰ１エンハンサーおよび基礎ＵＣＰ１プロモーターを含む領域は、「ｍｉｎｉ／ＵＣＰ調節領域」としても知られ、ＵＣＰ１遺伝子の基礎プロモーターおよび前記ＵＣＰ１遺伝子の脂肪特異的エンハンサーの組合せを指す。ラットＵＣＰ１プロモーターが使用されることが好ましい。Ｌａｒｏｓｅ Ｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６年；第２７１巻（４９号）：３１５３３～３１５４２頁およびＣａｓｓａｒｄ－Ｄｏｕｌｃｉｅｒ
Ａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９８年；第３３３巻：２４３～２４６頁を参照のこと。特定の実施形態では、ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１調節領域は、配列番号３を有する。

別の実施形態では、本発明のＡＡＶの一部を形成する発現カセットは、それだけには限らないが、適当な転写配列（すなわち、開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー）、効率的なＲＮＡプロセシングシグナル（例えば、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル）、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、タンパク質安定性を増強する配列および、望ましい場合には、コードされる産物の分泌を増強する配列を含めた発現制御配列をさらに含む。天然、構成的、誘導可能または組織特異的であるプロモーターを含めた多数の発現制御配列が、当技術分野で公知であり、本発明に従って利用され得る。

別の実施形態では、本発明のＡＡＶの一部を形成する発現カセットは、転写後調節領域をさらに含む。好ましい実施形態では、転写後調節領域は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後領域（ＷＰＲＥ）またはその機能的変異体および断片ならびにＰＰＴ－ＣＴＳまたはその機能的変異体および断片である。Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９年；第７３巻：２８８６～２８９２頁およびＫａｐｐｅｓ Ｊら、国際公開第２００１／０４４４８１号を参照のこと。特定の実施形態では、転写後調節領域は、ＷＰＲＥである。

本発明のＡＡＶの一部を形成する発現カセットは、「目的のポリヌクレオチド」を含む。好ましい実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、全身に作用するタンパク質をコードする。別の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、脂肪細胞でまたはその付近で作用するタンパク質をコードする。好ましい実施形態では、前記脂肪細胞でまたはその付近で作用するタンパク質は、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）であり、細胞内位置および種々の基質に関する動態学の点で変わる４種の哺乳動物ＨＫアイソザイム（ＥＣ２．７．１．１）のいずれも含む。例として、ＨＫは、ＨＫ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ０００１７９、ＮＰ２７７０３１、ＮＰ２７７０３２、ＮＰ２７７０３３、ＮＰ２７７０３５）、ＨＫ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ０００１８０）、ＨＫ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ００２１０６）およびＨＫ４またはグルコキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ０００１５３、ＮＰ２７７０４２、ＮＰ２７７０４３）を含む。別の好ましい実施形態では、ＨＫは、本明細書においてヘキソキナーゼ４またはＨＫ４と同義的に使用されるグルコキナーゼであり、グルコースについてＨＫ１、ＨＫ２またはＨＫ３よりも１００倍高いＫｍを有するヘキソキナーゼのアイソフォームを指す。

一実施形態では、前記脂肪細胞でまたはその付近で作用するタンパク質は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）であり、それだけには限らないが、腸型またはＩＡＰ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ００１６２２）、胎盤型またはＰＬＡＰ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ００１６２３）および組織非特異的アイソザイムまたはＡＬＰＬ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ０００４６９、ＮＰ００１１２０９７３．２およびＮＰ００１１７０９９１．１）を含む。別の実施形態では、前記脂肪細胞でまたはその付近で作用するタンパク質は、ＶＥＧＦであり、それだけには限らないが、ＶＥＧＦ変異体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦを含む。

別の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、普通、脂肪細胞によって産生され、分泌されるポリペプチドをコードする。別の実施形態では、脂肪細胞によって産生され、分泌されるポリペプチドは、アディプシン（例えば、特に、セリンプロテアーゼ相同体であるアディプシン）、アディポネクチン、レプチン、レジスチンまたはｏｂ遺伝子のタンパク質産物である。

さらにその他の有用な目的のポリヌクレオチドとして、それだけには限らないが、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、アンギオポエチン、アンギオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＴＧＦ－ＩＩ）、ＴＧＦａを含めたトランスフォーミング増殖因子ａスーパーファミリーのいずれか１種、アクチビン、インヒビンまたは骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１～１５のいずれか、ヘレグルイン（ｈｅｒｅｇｌｕｉｎ）／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／増殖因子のｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１種、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３およびＮＴ－４／５、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのいずれか１種、ネトリン－１およびネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグおよびチロシンヒドロキシラーゼを含めたコーディングホルモンならびに成長および分化因子が挙げられる。

その他の有用な目的のポリヌクレオチドとして、それだけには限らないが、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ－１からＩＬ－２５（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８）、単球走化性タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンドなどのサイトカインおよびリンホカインを含めた免疫系を調節するコーディングタンパク質が挙げられる。免疫系によって産生される遺伝子産物もまた、本発明において有用である。これらとして、それだけには限らないが、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣおよびＨＬＡ分子並びに遺伝子操作された免疫グロブリンおよびＭＨＣおよびＨＬＡ分子が挙げられる。有用な遺伝子産物としてまた、補体調節タンパク質、補体調節タンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９などの補体調節タンパク質が挙げられる。

さらにその他の有用な目的のポリヌクレオチドとして、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質の受容体のいずれか１種をコードするものが挙げられる。本発明は、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、極低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体およびスカベンジャー受容体を含めた、コレステロール調節または脂質調節のための受容体を包含する。本発明はまた、グルココルチコイド受容体およびエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体およびその他の核受容体を含めた、ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーなどの遺伝子産物も包含する。さらに、有用な遺伝子産物として、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰＩ、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニン、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ－４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ－１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質（例えば、ＧＡＴＡ－３）およびウィングドヘリックスタンパク質のフォークヘッドファミリーなどの転写因子が挙げられる。

その他の有用な目的のポリヌクレオチドとして、カルバモイルシンセターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネート（ａｒｇｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ）シンセターゼ、アルギノスクシネート（ａｒｇｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ）リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテート（ｆｕｍａｒｙｌａｃｅｔａｃｅｔａｔｅ）ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α－１アンチトリプシン、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、シスタチオン（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）β－シンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル－ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、β－グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節（ＣＦＴＲ）配列およびジストロフィン遺伝子産物（例えば、ミニ－またはマイクロ－ジストロフィン）などの酵素をコードするものが挙げられる。さらにその他の有用な遺伝子産物として、補充療法において有用な酵素、例えば、リソソーム貯蔵疾患の治療のためのマンノース－６－リン酸を含有する酵素（例えば、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードするのに適した遺伝子）などが挙げられる。

ＡＡＶベクターのパッケージングサイズの限界は、親の野生型ＡＡＶゲノムの大きさに制限され、ＡＡＶ血清型に基づいて大きさに幅がある（すなわち、４，０８７～４，７６７）。Ｗｕ Ｚら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０年；第７巻（１号）：８０～８６頁を参照のこと。例えば、野生型ＡＡＶ－２は、４，６７９のゲノムの大きさを有し、野生型ＡＡＶ－６は、４，６８３のゲノムの大きさを有する。いくつかの実施形態では、組換えＲＮＡベクターのクローニング能力は、制限され得、所望のコード配列は、ウイルスの４．８キロベースのゲノムの完全な置換を含み得る。したがって、いくつかの場合には、大きな遺伝子は、標準組換えＡＡＶベクターにおいて使用するには適していないことがある。当業者ならば、制限されたコーディング能力を克服するための選択肢が、当技術分野において利用可能であるということは理解するであろう。例えば、２つのゲノムのＡＡＶ ＩＴＲは、アニールして、ヘッドトゥーテールコンカテマーを形成し、ベクターの能力を倍増し得る。スプライス部位の挿入によって、転写物からのＩＴＲの除去が可能となる。制限されたクローニング能力を克服するためのその他の選択肢は、当業者には明らかとなろう。

３．ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９の脂肪組織に対する指向性に基づく治療法
第２の態様において、本発明は、脂肪組織細胞を効率的に形質導入可能なＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９血清型のアデノ随伴ウイルスベクターを開示する。この特徴によって、脂肪細胞における目的のポリヌクレオチドの発現を必要とするか、またはそれから恩恵を受け得る疾患の治療方法の開発が可能となる。特に、この知見は、患者に本発明のＡＡＶベクターを投与することによる、目的のポリペプチドの、それを必要とする対象への送達を促進し、従って、ｉｎ ｖｉｖｏで、目的のポリヌクレオチドを発現可能な脂肪細胞およびそのコードされるポリペプチドを作製する。コードされるポリペプチドが分泌型ポリペプチドである場合には、脂肪細胞によって分泌され得、このような方法でポリペプチドの全身送達が可能になる。

したがって、別の実施形態では、本発明は、組換えウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルスベクターを提供し、前記組換えウイルスゲノムは、目的のポリヌクレオチドと作動可能に連結している転写調節領域を含む発現カセットを含み、ＡＡＶの血清型は、目的のポリヌクレオチドの発現を必要とする疾患の治療または予防において使用するために、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される。

別の実施形態では、本発明は、組換えウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルスベクターを提供し、前記組換えウイルスゲノムは、目的の前記ポリヌクレオチドの発現を必要とする疾患の治療または予防において使用するために、目的のポリヌクレオチドと作動可能に連結している脂肪組織特異的転写調節領域を含む発現カセットを含む。

別の実施形態では、本発明は、組換えウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルスのベクターの前記対象への投与を含む、対象における目的のポリヌクレオチドの発現を必要とする疾患の治療または予防のための方法を提供し、前記組換えウイルスゲノムは、目的のポリヌクレオチドと作動可能に連結している転写調節領域を含む発現カセットを含み、ＡＡＶの血清型は、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される。

別の実施形態では、本発明は、組換えウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルスベクターの前記対象への投与を含む、対象における目的のポリヌクレオチドの発現を必要とする疾患の治療または予防のための方法を提供し、前記組換えウイルスゲノムは、目的のポリヌクレオチドと作動可能に連結している脂肪組織特異的転写調節領域を含む発現カセットを含む。

本発明の治療法において使用するためのＡＡＶは、目的のポリヌクレオチドおよび転写調節領域を含む発現カセットを含む。転写調節領域は、プロモーターと、任意選択で、エンハンサー領域を含み得る。

一実施形態では、転写調節領域は、目的のポリヌクレオチドの構成的発現を可能にする。構成的プロモーターの例として、制限するものではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択で、ＲＳＶエンハンサーとともに）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択で、ＣＭＶエンハンサーとともに）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１ａプロモーターが挙げられる。Ｂｏｓｈａｒｔ Ｍら、Ｃｅｌｌ １９８５年；第４１巻：５２１～５３０頁を参照のこと。

別の実施形態では、転写調節領域は、β－アクチンプロモーターを含む。β－アクチンプロモーターは、ヒトおよびげっ歯類を含めた任意の哺乳動物またはニワトリを含めたトリに由来するものであり得る。ニワトリβ－アクチンが使用されることが好ましい。

さらに別の実施形態では、転写調節領域は、エンハンサー領域をさらに含む。エンハンサー領域は、ＣＭＶエンハンサー領域であることが好ましい。

特定の実施形態では、調節領域は、ＣＡＧ調節領域である。好ましい実施形態では、ＣＡＧ調節領域は、配列番号１を有する。

別の実施形態では、転写調節領域は、脂肪組織特異的転写調節領域である。

プロモーターが、脂肪組織に特異的であり、そのためエンハンサーは、同様に脂肪組織に特異的でなくてもよい。あるいは、転写調節領域は、脂肪組織特異的プロモーターおよび脂肪組織特異的エンハンサーを含み得る。

一実施形態では、組織特異的プロモーターは、脂肪細胞特異的プロモーター、例えば、脂肪細胞タンパク質２（ａＰ２、脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）としても知られる）プロモーター、ＰＰＡＲｙプロモーター、アディポネクチンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、ヒトアロマターゼシトクロムｐ４５０（ｐ４５０ａｒｏｍ）由来のプロモーターおよびＦｏｘａ－２プロモーターなどである。Ｇｒａｖｅｓ（１９９１年）、Ｒｏｓｓ（１９９０年）、Ｓｉｍｐｓｏｎ（米国特許第５，４４６，１４３号明細書）、Ｍａｈｅｎｄｒｏｏ（１９９３年）、Ｓｉｍｐｓｏｎ（１９９３年）およびＳａｓａｋｉ（１９９４年）、前掲を参照のこと。

一実施形態では、エンハンサー領域は、脂肪特異的ａＰ２エンハンサーおよび脂肪特異的ＵＣＰ１エンハンサーからなる群から選択される。

好ましい実施形態では、本発明のＡＡＶの脂肪組織特異的調節領域は、脂肪特異的ａＰ２エンハンサーおよび基礎マウスａＰ２プロモーターを含む。特定の実施形態では、ｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域は、配列番号２を有する。

別の好ましい実施形態では、本発明のＡＡＶの脂肪組織特異的調節領域は、脂肪特異的ＵＣＰ１エンハンサーおよび基礎ラットＵＣＰ１プロモーターを含む。特定の実施形態では、ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１調節領域は、配列番号３を有する。

別の実施形態では、発現カセットは、転写後調節領域をさらに含む。好ましい実施形態では、転写後調節領域は、ＷＰＲＥまたはその機能的変異体および断片ならびにＰＰＴ－ＣＴＳまたはその機能的変異体および断片である。

その他の適した目的のポリヌクレオチドは、本発明のＡＡＶを用いて運ばれ（ｖｅｃｔｏｒｉｚｅｄ）、疾患の治療または予防のために使用され得る。表１を参照のこと。

用語「目的のポリヌクレオチドの発現を必要とする疾患」とは、本明細書において、目的のポリヌクレオチドの発現が望ましい任意の疾患を指す。目的のポリヌクレオチドとは、本明細書において、目的のポリペプチドをコードする遺伝子、あるいは、転写されると、細胞において内因性ポリヌクレオチドの発現を調節可能な分子を生成する核酸配列であり得る。したがって、目的のポリヌクレオチドの発現を必要とする疾患は、遺伝子の発現レベルを増大または低減することが望ましい疾患であり得る。

さらに、目的のポリヌクレオチドは、分泌され、全身に作用するタンパク質または前記脂肪細胞でまたはその付近で作用するタンパク質をコードし得る。特定の実施形態では、目的のポリヌクレオチドの発現を必要とする疾患は、脂肪組織における、より好ましくは、白色脂肪組織または褐色脂肪組織における目的のポリヌクレオチドの発現を必要とする疾患である。

目的のポリヌクレオチドの発現を必要とする疾患の例として、それだけには限らないが、肥満症、高血糖症、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高血圧症、癌、心疾患、免疫疾患、関節炎、中枢神経系の疾患および加齢関連疾患が挙げられる。

本発明のＡＡＶは、基礎グルコース取り込みを増大させるためのＷＡＴおよびＢＡＴの両方における本発明のＡＡＶによって媒介されるヘキソキナーゼの送達などの脂肪組織関連疾患の遺伝子療法にとって有用であると証明された。図２Ｄおよび４Ｂを参照のこと。したがって、特定の実施形態では、目的のポリヌクレオチドの発現の調節を必要とする疾患は、肥満症、高血糖症、インスリン抵抗性、２型糖尿病および高血圧症からなる群から選択される疾患である。

例示的遺伝子および関連疾患として、それだけには限らないが、糖尿病の治療のためのインスリン、嚢胞性線維症の治療のためのＣＦＴＲ、血友病Ｂの治療のための第ＩＸ因子、血友病Ａの治療のための第ＶＩＩＩ因子、グリコーゲン貯蔵欠乏症１Ａ型と関連しているグルコース－６－ホスファターゼ、Ｐｅｐｃｋ欠乏症と関連しているホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ガラクトース血症と関連しているガラクトース－１リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルケトン尿症と関連しているフェニルアラニンヒドロキシラーゼ、メープルシロップ尿症と関連している分枝鎖α－ケト酸デヒドロゲナーゼ、チロシン血症１型と関連しているフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、メチルマロン酸血症と関連しているメチルマロニル－ＣｏＡムターゼ、中鎖アセチルＣｏＡ欠乏症と関連している中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症と関連しているオルニチントランスカルバミラーゼ、シトルリン血症と関連しているアルギニノコハク酸シンセターゼ、家族性高コレステロール血症と関連している低比重リポタンパク質受容体タンパク質、クリグラー・ナジャー病と関連しているＵＤＰ－グルコウロノシルトランスフェラーゼ、重症複合免疫不全症と関連しているアデノシンデアミナーゼ、痛風およびレッシュ・ナイハン（Ｌｅｓｃｈ－Ｎｙａｎ）症候群と関連しているヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ビオチミダーゼ（ｂｉｏｔｉｍｉｄａｓｅ）欠乏症と関連しているビオチミダーゼ（ｂｉｏｔｉｍｉｄａｓｅ）、ゴーシェ病と関連しているβ－グルコセレブロシダーゼ、スライ症候群と関連しているβ－グルクロニダーゼ、ツェルウェーガー症候群と関連しているペルオキシソーム膜タンパク質７０ｋＤａ、急性間欠性ポルフィリン症と関連しているポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、α－１アンチトリプシン欠乏症（肺気腫）の治療のためのα－１アンチトリプシン、地中海貧血症または腎不全による貧血の治療のためのエリスロポエチン、虚血性疾患の治療のための血管内皮細胞増殖因子、アンジオポエチン－１および線維芽細胞増殖因子、例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症または塞栓症において見られるような閉塞血管の治療のためのトロンボモジュリンおよび組織因子経路阻害薬、パーキンソン病の治療のための芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、うっ血性心不全の治療のためのβ－アドレナリン受容体、ホスホランバンのアンチセンスまたはその突然変異体形態、筋小胞体（小胞体）アデノシントリホスファターゼ－２（ＳＥＲＣＡ２）および心臓アデニリルシクラーゼ、種々の癌の治療のためのｐ５３などの腫瘍サプレッサー遺伝子、炎症性および免疫性障害および癌の治療のための種々のインターロイキンの１種などのサイトカイン、筋ジストロフィーの治療のためのジストロフィンまたはミニジストロフィンおよびユートロフィンまたはミニユートロフィン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠乏症の治療のためのアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ハンチントン舞踏病を治療する為のハンチンジン（ｈｕｎｔｉｎｇｉｎ）（ＨＴＴ）、家族性高コレステロール血症を治療するための低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）またはアポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）、フェニルケトン尿症を治療するためのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、多発性嚢胞腎疾患を治療するための多発性嚢胞腎疾患１（ＰＫＤ１）および多発性嚢胞腎疾患２（ＰＫＤ２）、関節炎を治療するためのＴＮＦＲ：Ｆｃ、遺伝性肺気腫の治療ためのＡＡＴ、筋ジストロフィーの治療のためのサルコグリカン、パーキンソン病の治療のためのＧＡＤ６５またはＧＡＤ６７、カナバン病の治療のためのＡＡＣ、バッテン病の治療のためのＣＬＮ２、アルツハイマー病の治療のためのＮＧＦ、黄斑変性症の治療のためのＶＥＧＦアンタゴニスト、うっ血性心不全の治療のためのＩＧＦ／ＨＧＦ、中枢神経系障害の疾患の治療のためのＮＧＦおよびＨＩＶ、ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳを治療するためのＨＩＶに対する中和抗体が挙げられる。

本発明のＡＡＶによって送達され得る目的のポリヌクレオチドの例として、それだけには限らないが、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３、ＰＰＡＲ－α、レプチン、レプチン受容体ＯＢ－ＲｂおよびＧＬＰ－１が挙げられる。特定の実施形態では、目的の遺伝子は、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）、グルコキナーゼ（ＧＫ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）からなる群から選択される。１つのさらなる実施形態では、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼを発現するポリヌクレオチドを含む本発明のＡＡＶは、２型糖尿病の治療または予防のためにそれを必要とする対象に投与される。別のさらなる実施形態では、血管内皮細胞増殖因子を発現するポリヌクレオチドを含む本発明のＡＡＶは、肥満症の治療または予防のためにそれを必要とする対象に投与される。

本発明の方法を用いて治療可能な疾患の例示的であるが、限定されない例として、肥満症、高血糖症、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高血圧症および動脈高血圧症が挙げられる。２型糖尿病は、レプチンを脂肪細胞の近くで、または全身のいずれかで発現させ、その結果、それが視床下部に到達することによって治療され得ることが好ましい。

さらに、ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１によるＶＥＧＦ_１６４のｉＢＡＴ内投与が、総ＶＥＧＦの発現レベルの増大に、およびｉＢＡＴにおける血管数の増大につながるので、本発明のＡＡＶは、ＢＡＴの遺伝子操作にとって有用であると証明された。図４Ｃ～４Ｆを参照のこと。したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦの発現を必要とする疾患、例えば、その管理が血管新生、動脈形成または脈管形成の誘導から恩恵を受け得る疾患などの治療または予防において使用するための本発明のＡＡＶまたは医薬組成物に関する。ＶＥＧＦの発現を必要とする疾患の例として、それだけには限らないが、急性手術創および外傷性創傷、火傷、熱傷、静脈性潰瘍、動脈性潰瘍、褥瘡（ａｋａ褥瘡性潰瘍）、糖尿病性潰瘍、照射後創傷、皮膚移植、混合病因論の潰瘍およびその他の慢性または壊死性創傷が挙げられる。

さらに、ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２ウイルスベクターを用いるｈＳｅＡＰ遺伝子（すなわち、ヒト胎盤由来分泌型アルカリホスファターゼ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｓｅ））のｅＷＡＴ内投与は、ｈＳｅＡＰの循環レベルの持続した増大につながる。したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＡＰの発現を必要とする疾患、例えば、ＬＰＳ（すなわち、リポ多糖類）媒介性または増悪性疾患などの治療または予防において使用するための本発明のＡＡＶまたは医薬組成物に関する。ＡＰの発現を必要とする疾患の例として、それだけには限らないが、炎症性腸疾患、敗血症または敗血性ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、髄膜炎菌血症、外傷性出血性ショック、ｈｕｍ傷害、心臓血管手術または心肺バイパス術、肝臓手術または移植、肝臓疾患、膵炎、壊死性腸炎、歯周病、肺炎、嚢胞性線維症、喘息、冠動脈心疾患、うっ血性心不全、腎疾患、溶血性尿毒症症候群、腎臓透析、癌、アルツハイマー病ならびに関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患が挙げられる。

４．ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に形質導入する方法
第３の態様では、本発明は、本発明のＡＡＶベクターを使用することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に形質導入する方法に関する。したがって、本発明は、前記細胞を、組換えウイルスゲノムを含むＡＡＶと接触させることを含み、前記組換えウイルスゲノムが、目的のポリヌクレオチドと作動可能に連結している脂肪組織特異的転写調節領域を含む発現カセットを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に形質導入する方法に関する。

好ましい実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に形質導入する方法において使用されるアデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される血清型を有する。別の実施形態では、アデノ随伴ウイルスＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

別の実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクターは、脂肪組織特異的転写調節領域を含む。さらに別の実施形態では、脂肪組織特異的転写調節領域は、基礎マウスａＰ２プロモーターおよび基礎ラットＵＣＰ１プロモーターからなる群から選択されるプロモーター領域を含む。さらに別の実施形態では、脂肪組織特異的転写調節領域は、プロモーター領域と作動可能に連結しているエンハンサー領域をさらに含む。さらに別の実施形態では、エンハンサー領域は、脂肪特異的ａＰ２エンハンサーおよび脂肪特異的ＵＣＰ１エンハンサーからなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、脂肪組織特異的転写調節領域は、
ｉ）脂肪特異的ａＰ２エンハンサーおよび基礎マウスａＰ２プロモーターを含むポリヌクレオチド、
ｉｉ）脂肪特異的ＵＣＰ１エンハンサーおよび基礎ラットＵＣＰ１プロモーターを含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される。

別の実施形態では、発現カセットは、転写後調節領域をさらに含む。さらに別の実施形態では、転写後調節領域は、ＷＰＲＥである。

別の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、全身に作用する分泌型タンパク質および前記脂肪細胞でまたはその付近で作用するタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする。さらにより好ましい実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、アルカリホスファターゼおよび血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択されるタンパク質をコードする。

別の実施形態では、本発明は、組換えウイルスゲノムを含むＡＡＶを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に形質導入し、前記組換えウイルスゲノムが、目的のポリヌクレオチドと作動可能に連結している転写調節領域を含む発現カセットを含み、ＡＡＶの血清型が、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される方法に関する。

一実施形態では、アデノ随伴ウイルスＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

別の実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクターは、転写調節領域を含有する組換えゲノムを含む。一実施形態では、転写調節領域は、構成的プロモーターである。好ましい実施形態では、構成的転写調節領域は、アクチンプロモーターを含む。さらに別の実施形態では、構成的転写調節領域は、プロモーター領域と作動可能に連結しているエンハンサー領域をさらに含む。さらにより好ましい実施形態では、エンハンサー領域は、サイトメガロウイルスエンハンサーである。

一実施形態では、転写調節領域は、脂肪組織特異的転写調節領域である。さらに別の実施形態では、脂肪組織特異的転写調節領域は、基礎マウスａＰ２プロモーターおよび基礎ラットＵＣＰ１プロモーターからなる群から選択されるプロモーター領域を含む。さらに別の実施形態では、脂肪組織特異的転写調節領域は、プロモーター領域と作動可能に連結しているエンハンサー領域をさらに含む。さらに別の実施形態では、エンハンサー領域は、脂肪特異的ａＰ２エンハンサーおよび脂肪特異的ＵＣＰ１エンハンサーからなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、脂肪組織特異的転写調節領域は、
ｉ）脂肪特異的ａＰ２エンハンサーおよび基礎マウスａＰ２プロモーターを含むポリヌクレオチドおよび
ｉｉ）脂肪特異的ＵＣＰ１エンハンサーおよび基礎ラットＵＣＰ１プロモーターを含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される。

別の実施形態では、発現カセットは、転写後調節領域をさらに含む。さらに別の実施形態では、転写後調節領域は、ＷＰＲＥである。

別の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、全身に作用する分泌型タンパク質および前記脂肪細胞でまたはその付近で作用するタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする。さらにより好ましい実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、アルカリホスファターゼおよび血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択されるタンパク質をコードする。

本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ法を使用して、任意の細胞が形質導入され得る。特定の実施形態では、脂肪組織細胞に形質導入するためにＡＡＶが使用される。さらにより好ましい実施形態では、脂肪組織細胞は、褐色脂肪細胞または白色脂肪細胞である。

白色脂肪細胞に形質導入するために、本発明に従って、細胞に形質導入するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法が実施される場合には、ＡＡＶ内の転写調節領域は、好ましくは、ｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域を含む。別の実施形態では、褐色脂肪細胞に形質導入するために、本発明に従って、細胞に形質導入するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法が実施される場合には、ＡＡＶ内の転写調節領域は、好ましくは、ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１調節領域を含む発現カセットを含む。

本発明の別の態様では、ｍｉｎｉ／ａＰ２およびｍｉｎｉ／ＵＣＰ１プロモーターによって得られる導入遺伝子発現を改善するために、脂肪組織において高い発現レベルを得、オフターゲット臓器から導入遺伝子発現を標的化解除しようとして、ＣＡＧプロモーターは組織特異的ｍｉＲＮＡ標的配列とともに使用される。これは、局所または全身投与された場合に、ＡＡＶベクターが脂肪組織を遺伝子修飾する可能性のさらなる強化をもたらした。

さらなる実施形態では、本発明は、本発明のＡＡＶベクターを使用することおよびｉｎ
ｖｉｔｒｏでそれらを培養することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで形質導入された細胞を単離する方法に関する。別の実施形態では、本発明は、前記の単離された形質導入された細胞ならびにそれらを含む細胞および医薬組成物に関する。

５．形質導入された脂肪細胞および脂肪細胞組成物、ｅｘ－ｖｉｖｏ治療法
第４の態様では、本発明は、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって得られた脂肪細胞に関する。別の実施形態では、本発明は、本発明の方法に従って得られた脂肪細胞を含む細胞組成物に関する。さらに、本発明はまた、本発明のＡＡＶのゲノムを含む脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）または脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ）組成物に関する。好ましくは、細胞組成物の少なくとも５０％は、本発明の脂肪細胞からなる。より好ましくは、細胞組成物の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％および１００％は、本発明の脂肪細胞からなる。

上記のように、目的のポリヌクレオチドを前記細胞に導入するために、本発明のＡＡＶをｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に形質導入するために使用できる。続いて、形質導入された細胞を、所望の治療効果を得るためにヒトまたは動物の身体に埋め込み可能である。

したがって、別の実施形態では、本発明は、医薬において使用するために本発明の方法に従って得られた、脂肪細胞に、または脂肪細胞を含む細胞組成物に関する。

別の実施形態では、本発明は、目的のポリヌクレオチドの発現を必要とする疾患の治療において使用するために本発明の方法に従って得られた、脂肪細胞に、または脂肪細胞を含む細胞組成物に関する。

別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に本発明の方法に従って得られた脂肪細胞または細胞組成物を投与することを含む、疾患を治療または予防するための方法に関する。このアプローチを用いて対処可能な疾患の例は、本発明のＡＡＶとの関連で上記に定義されている。

６．ポリヌクレオチド、ベクターおよびプラスミド
第５の態様では、本発明は、本発明のＡＡＶを製造するために有用であるポリヌクレオチドに関する。したがって、別の実施形態では、本発明は、アデノ随伴ウイルスＩＴＲがそれぞれの両端に位置する発現カセットを含むポリヌクレオチド（「本発明のポリヌクレオチド」）に関し、前記発現カセットは、目的のポリヌクレオチドと作動可能に連結している脂肪組織特異的調節領域を含む。

好ましい実施形態では、脂肪組織特異的調節領域は、基礎マウスａＰ２プロモーターおよび基礎ラットＵＣＰ１プロモーターからなる群から選択されるプロモーター領域を含む。

別の実施形態では、脂肪組織特異的調節領域は、プロモーター領域と作動可能に連結しているエンハンサー領域をさらに含む。さらにより好ましい実施形態では、エンハンサー領域は、脂肪特異的ａＰ２エンハンサーおよび脂肪特異的ＵＣＰ１エンハンサーからなる群から選択される。

別の実施形態では、調節領域は、
ｉ）脂肪特異的ａＰ２エンハンサーおよび基礎マウスａＰ２プロモーターを含むポリヌクレオチドおよび
ｉｉ）脂肪特異的ＵＣＰ１エンハンサーおよび基礎ラットＵＣＰ１プロモーターを含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される。

別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの発現カセットは、転写後調節エレメントをさらに含む。さらに別の実施形態では、転写後調節領域は、ＷＰＲＥである。

別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド中に含まれる目的のポリヌクレオチドは、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、アルカリホスファターゼおよび血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択されるタンパク質をコードする。

本発明のポリヌクレオチドは、ベクター、例えば、プラスミドなど中に組み込まれ得る。したがって、さらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミドに関する。本発明によれば、用語「ベクター」および「プラスミド」は、互換的である。

特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルスベクターまたはプラスミドに組み込まれる。アデノ随伴ウイルスの製造にとって必要なすべてのその他の構造および非構造コード配列は、ウイルスベクター中に存在しないことが好ましいが、それらはプラスミドなどの別のベクターによってトランスに、またはパッケージング細胞株中に配列を安定に組み込むことによって提供され得るからである。

本発明のポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の分子生物学の技術を使用して得ることが可能である。Ｂｒｏｗｎ（１９９５年）、Ｗａｔｓｏｎ（１９９２年）、Ａｌｂｅｒｔｓ（２００８年）、Ｉｎｎｉｓ（１９９０年）、Ｅｒｌｉｃｈ（１９８９年）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９年）、Ｂｉｓｈｏｐ（１９８７年）、Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９８７年）、Ｄａｖｉｓ（１９８６年）およびＳｃｈｌｅｅｆ（２００１年）、前掲を参照のこと。別の実施形態では、本発明は、ゲノムが本発明のポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターに関する。

７．ＡＡＶを得る方法
第６の態様では、本発明は、本発明のＡＡＶを得る方法に関する。前記ＡＡＶは、本発明のポリヌクレオチドを、ｒｅｐおよびｃａｐを構成的に発現する細胞中に導入することによって得ることが可能である。したがって、別の実施形態では、本発明は、
ｉ）ＡＡＶ ＩＴＲがそれぞれの両端に位置する本発明のポリヌクレオチド、ＡＡＶ ｃａｐタンパク質、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶが複製のために依存するウイルス性または細胞性タンパク質を含む細胞を提供するステップと
ｉｉ）ＡＡＶのアセンブリーにとって適切な条件下で細胞を維持するステップと
ｉｉｉ）細胞によって製造されたアデノ随伴ウイルスベクターを精製するステップとを含むアデノ随伴ウイルスベクターを得る方法に関する。

好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの一部を形成する脂肪組織特異的調節領域は、基礎マウスａＰ２プロモーターおよび基礎ラットＵＣＰ１プロモーターからなる群から選択されるプロモーター領域を含む。

別の実施形態では、脂肪組織特異的調節領域は、プロモーター領域と作動可能に連結しているエンハンサー領域をさらに含む。さらにより好ましい実施形態では、エンハンサー領域は、脂肪特異的ａＰ２エンハンサーおよび脂肪特異的ＵＣＰ１エンハンサーからなる群から選択される。

別の実施形態では、調節領域は、
ｉ）脂肪特異的ａＰ２エンハンサーおよび基礎マウスａＰ２プロモーターを含むポリヌクレオチドおよび
ｉｉ）脂肪特異的ＵＣＰ１エンハンサーおよび基礎ラットＵＣＰ１プロモーターを含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される：

別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの発現カセットは、転写後調節エレメントをさらに含む。さらに別の実施形態では、転写後調節領域は、ＷＰＲＥである。

別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド中に含まれる目的のポリヌクレオチドは、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、アルカリホスファターゼおよび血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択されるタンパク質をコードする。

導入遺伝子を運ぶ（ｖｅｃｔｏｒｉｎｇ）ための組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の製造は、これまでに記載されている。Ａｙｕｓｏ Ｅら、Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０年；第１０巻：４２３～４３６頁、Ｏｋａｄａ Ｔら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９年；第２０巻：１０１３～１０２１頁、Ｚｈａｎｇ Ｈら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９年；第２０巻：９２２～９２９頁およびＶｉｒａｇ Ｔら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９年；第２０巻：８０７～８１７頁を参照のこと。これらのプロトコールを、本発明のＡＡＶを作製するために使用または適用できる。一実施形態では、プロデューサー細胞株は、本発明のポリヌクレオチド（ＩＴＲがそれぞれの両端に位置する発現カセットを含む）を用いて、ならびにｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードし、ヘルパー機能を提供する構築物（複数可）を用いて一過性にトランスフェクトされる。別の実施形態では、細胞株は、ヘルパー機能を安定に供給し、本発明のポリヌクレオチド（ＩＴＲがそれぞれの両端に位置する発現カセットを含む）を用いて、ならびにｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードする構築物（複数可）を用いて一過性にトランスフェクトされる。別の実施形態では、細胞株は、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質およびヘルパー機能を安定に供給し、本発明のポリヌクレオチドを用いて一過性にトランスフェクトされる。別の実施形態では、細胞株は、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質を安定に供給し、本発明のポリヌクレオチドおよびヘルパー機能をコードするポリヌクレオチドを用いて一過性にトランスフェクトされる。さらに別の実施形態では、細胞株は、本発明のポリヌクレオチド、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質およびヘルパー機能を安定に供給する。これらおよびその他のＡＡＶ製造系を製造し、使用する方法は、当技術分野で記載されている。Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎら、米国特許第５，１３９，９４１号明細書、Ｚｈｏｕ Ｘら、米国特許第５，７４１，６８３号明細書、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒら、米国特許第６，０５７，１５２号明細書、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒら、米国特許第６，２０４，０５９号明細書、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒら、米国特許第６，２６８，２１３号明細書、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊら、米国特許第６，４９１，９０７号明細書、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ Ｓら、米国特許第６，６６０，５１４号明細書、Ｓｈｅｎｋ Ｔら、米国特許第６，９５１，７５３号明細書、Ｓｎｙｄｅｒ Ｒら、米国特許第７，０９４，６０４号明細書、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊら、米国特許第７，１７２，８９３号明細書、Ｍｏｎａｈａｎ Ｐら、米国特許第７，２０１，８９８号明細書、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒら、米国特許第７，２２９，８２３号明細書およびＦｅｒｒａｒｉ Ｆら、米国特許第７，４３９，０６５号明細書を参照のこと。

別の実施形態では、アニールして、ヘッドトゥーテールコンカテマーを形成可能な２種のゲノムのＡＡＶ ＩＴＲを提供することによって、ＡＡＶの導入遺伝子送達能力を増大できる。一般に、ＡＡＶが宿主細胞中に侵入すると、導入遺伝子を含有する一本鎖ＤＮＡが、宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体によって二本鎖ＤＮＡに変換され、その後、ＩＴＲが、核におけるコンカテマー形成に役立つ。代替法として、ＡＡＶを、自己相補性（ｓｃ）ＡＡＶであるよう遺伝子操作してもよく、これによって、標的細胞への侵入時に、ウイルスベクターが第２鎖合成のステップを回避し、より迅速な、潜在的に、より高い（例えば、最大１００倍）導入遺伝子発現を有するｓｃＡＡＶウイルスベクターを提供することが可能となる。例えば、ＡＡＶを、それぞれ導入遺伝子ユニットおよびその補体をコードする２つの接続している一本鎖ＤＮＡを含むゲノムを有するよう遺伝子操作してもよく、これは、以下の標的細胞への送達、目的の導入遺伝子ユニットをコードする二本鎖ＤＮＡを得ることとかみ合い得る。自己相補性ＡＡＶは、当技術分野で記載されている。Ｃａｒｔｅｒ Ｂ、米国特許第６，５９６，５３５号明細書、Ｃａｒｔｅｒ Ｂ、米国特許第７，１２５，７１７号明細書およびＴａｋａｎｏ Ｈら、米国特許第７，４５６，６８３号明細書を参照のこと。

Ｃａｐタンパク質は、宿主指向性、細胞、組織または臓器特異性、受容体使用、感染効率およびＡＡＶウイルスの免疫原性に対して効果を有すると報告されている。したがって、ｒＡＡＶにおいて使用するためのＡＡＶ Ｃａｐは、例えば、対象の種（例えば、ヒトまたは非ヒト）、対象の免疫学的状態、長期または短期治療に対する対象の適合性または特定の治療適用（例えば、特定の疾患もしくは障害の治療または特定の細胞、組織もしくは臓器への送達）を考慮して選択され得る。別の実施形態では、ｒＡＡＶ Ｃａｐは、２または３種のまたはそれ以上のＡＡＶ血清型に由来するＣａｐに基づいている。特定の実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に由来する。好ましい実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、血清型ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９に由来する。

いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用するためのＡＡＶ Ｃａｐは、 上記のＡＡＶ Ｃａｐまたはそのコーディング核酸の１種の突然変異誘発によって（すなわち、挿入、欠失または置換によって）作製できる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃａｐは、上記のＡＡＶ Ｃａｐのうち１種以上と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％またはそれ以上類似している。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃａｐは、上記のＡＡＶ Ｃａｐのうち少なくとも２種に由来するドメインを含むキメラである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃａｐは、２または３種の異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶに由来するＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３単量体のモザイクである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、上記のＣａｐのうち２種以上を含む。

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物において使用するためのＡＡＶ Ｃａｐは、異種配列またはその他の修飾を含有するよう遺伝子操作される。例えば、選択的ターゲッティングまたは免疫回避を付与するペプチドまたはタンパク質配列が、Ｃａｐタンパク質中に遺伝子操作され得る。あるいはまたはさらに、Ｃａｐは、ｒＡＡＶの表面がポリエチレングリコール付加される（すなわち、ペグ化される）よう化学的に修飾され得、これは、免疫回避を促進し得る。Ｃａｐタンパク質はまた、突然変異誘発され得る（例えば、その天然受容体結合を除去するよう、または免疫原性エピトープをマスクするよう）。

特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、血清型ＡＡＶｌ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に由来する。好ましい実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、血清型ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９に由来する。

遺伝子ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐおよびヘルパー機能を提供する遺伝子を、前記遺伝子をベクター、例えば、プラスミドなどの中に組み込むことおよび前記ベクターを細胞中に導入することによって細胞中に導入できる。遺伝子を、同一プラスミド中にまたは異なるプラスミド中に組み込むことが可能である。好ましい実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、１種のプラスミド中に組み込まれ、ヘルパー機能を提供する遺伝子は、別のプラスミド中に組み込まれる。本発明の方法とともに使用するのに適したＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むプラスミドの例として、ｐＨＬＰ１９およびｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターが挙げられる。Ｃｏｌｉｓｉ Ｐ、米国特許第６，００１，６５０号明細書およびＲｕｓｓｅｌｌ Ｄら、米国特許第６，１５６，３０３号明細書を参照のこと。好ましい実施形態では、ヘルパー機能を提供する遺伝子は、アデノウイルスに由来する。

本発明のポリヌクレオチドならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子またはヘルパー機能を提供する遺伝子を含むポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の任意の適した方法を使用することによって細胞中に導入できる。Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆら編、「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第４版（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳ、１９９７年）、Ｂｒｏｗｎ（１９９５年）、Ｗａｔｓｏｎ（１９９２年）、Ａｌｂｅｒｔｓ（２００８年）、Ｉｎｎｉｓ（１９９０年）、Ｅｒｌｉｃｈ（１９８９年）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９年）、Ｂｉｓｈｏｐ（１９８７年）、Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９８７年）、Ｄａｖｉｓ（１９８６年）およびＳｃｈｌｅｅｆ（２００１年）、前掲を参照のこと。トランスフェクション法の例として、それだけには限らないが、リン酸カルシウムを用いる共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリブレン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム媒介性融合、リポフェクション、レトロウイルス感染および微粒子銃トランスフェクションが挙げられる。特定の実施形態では、トランスフェクションは、リン酸カルシウムを用いる共沈によって実施される。細胞が、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子およびアデノウイルスヘルパー機能を提供する遺伝子のいずれかの発現を欠く場合には、前記遺伝子を、本発明の第１の態様のポリヌクレオチドと同時に細胞中に導入してもよい。あるいは、前記遺伝子を、本発明の第１の態様のポリヌクレオチドの導入の前後に導入してもよい。特定の実施形態では、細胞は、３種のプラスミド：
１）本発明のポリヌクレオチドを含むプラスミド
２）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むプラスミド
３）ヘルパー機能を提供する遺伝子を含むプラスミドと同時にトランスフェクトされる。

パッケージング細胞を培養する方法および細胞溶解物の製造などのＡＡＶベクター粒子の放出を促進する例示的条件は、本明細書において実施例に記載されるように実施すればよい。プロデューサー細胞は、ウイルスベクターの培地への放出を促進するために適した期間増殖される。一般に、細胞を、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、最大約１０日間増殖すればよい。約１０日後（または、培養条件および使用される特定のプロデューサー細胞に応じてより早く）、製造のレベルは、一般に、大幅に低下する。一般に、培養の時間は、ウイルス製造の時点から測定される。例えば、ＡＡＶの場合には、ウイルスの製造は、一般に、本明細書において記載されるような適当なプロデューサー細胞においてヘルパーウイルス機能を供給すると始まる。一般に、細胞を、ヘルパーウイルス感染後（またはウイルス製造開始後）、約４８～約１００、好ましくは、約４８～約９６、好ましくは、約７２～約９６、好ましくは、約６８～約７２時間で回収する。

本発明のＡＡＶは、ｉ）本発明のポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞およびｉｉ）トランスフェクション後一定期間後の、好ましくは、７２時間後の前記細胞の培養培地の両方から得ることが可能である。本発明のＡＡＶを得るために、前記細胞または前記培養培地からのＡＡＶの精製のための任意の方法を使用できる。特定の実施形態では、本発明のＡＡＶは、ポリエチレングリコール沈殿ステップおよび２種の連続塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配に基づいて最適化された方法に従って精製される。Ａｙｕｓｏ、２０１０年、前掲を参照のこと。本発明の精製されたＡＡＶをＰＢＳに対して透析し、濾過し、－８０℃で保存してもよい。ウイルスゲノムの力価は、標準曲線として線形化プラスミドＤＮＡを使用し、ＡＡＶ２参照標準材料について記載されたプロトコールに従って定量的ＰＣＲによって決定できる。Ｌｏｃｋ Ｍら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１０年；第２１巻：１２７３～１２８５頁を参照のこと。

いくつかの実施形態では、方法は、ベンゾナーゼを用いる細胞溶解物の処理、ＣｓＣｌ勾配にわたる細胞溶解物の精製または硫酸ヘパリンクロマトグラフィーの使用による細胞溶解物の精製などの精製ステップをさらに含む。Ｈａｌｂｅｒｔ Ｃら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００４年；第２４６巻：２０１～２１２頁を参照のこと。

種々の天然に存在するＡＡＶおよび組換えＡＡＶ、そのコーディング核酸、ＡＡＶ ＣａｐおよびＲｅｐタンパク質およびその配列ならびにこのようなＡＡＶ、特に、ＡＡＶの製造において使用するのに適したそのキャプシドを単離または作製、増殖および精製するための方法は、当技術分野で公知である。Ｇａｏ、２００４年、前掲、Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄら、米国特許第６，１５６，３０３号明細書、Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒ Ｍら、米国特許第７，０５６，５０２号明細書、Ｇａｏ Ｇら、米国特許第７，１９８，９５１号明細書、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ Ｓ、米国特許第７，２２０，５７７号明細書、Ｇａｏ Ｇら、米国特許第７，２３５，３９３号明細書、Ｇａｏ Ｇら、米国特許第７，２８２，１９９号明細書、Ｗｉｌｓｏｎ Ｊら、米国特許第７，３１９，００２号明細書、Ｇａｏ Ｇら、米国特許第７，７９０，４４９号明細書、Ｇａｏ Ｇら、米国特許出願公開第２００３／０１３８７７２号明細書、Ｇａｏ Ｇら、米国特許出願公開第２００８／００７５７４０号明細書、Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒ Ｍら、国際公開第２００１／０８３６９２号、Ｗｉｌｓｏｎ Ｊら、国際公開第２００３／０１４３６７号、Ｇａｏ Ｇら、国際公開第２００３／０４２３９７号、Ｇａｏ Ｇら、国際公開第２００３／０５２０５２号、Ｗｉｌｓｏｎ
Ｊら、国際公開第２００５／０３３３２１号、Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ Ｌら、国際公開第２００６／１１０６８９号、Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ Ｌら、国際公開第２００７／１２７２６４号およびＶａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ Ｌら、国際公開第２００８／０２７０８４号を参照のこと。

８．医薬組成物
本発明のＡＡＶは、ヒトまたは動物身体に従来法によって投与してもよく、これは、前記ベクターの医薬組成物への製剤化を必要とする。したがって、第７の態様では、本発明は、ＡＡＶを含む医薬組成物（本明細書において以下、「本発明の医薬組成物」と呼ばれる）に関し、前記ＡＡＶは、組換えウイルスゲノムを含み、前記組換えウイルスゲノムは、目的のポリヌクレオチドと作動可能に連結している脂肪組織特異的転写調節領域を含む発現カセットを含む。あるいは、本発明の医薬組成物は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含み得る。

前記医薬組成物は、治療上有効な量の本発明のＡＡＶおよび医薬上許容される担体を含み得る。

本発明の組成物は、獣医学目的での動物（例えば、家畜（ウシ、ブタ、その他））およびその他の非ヒト哺乳動物対象への、ならびにヒト対象への送達のために製剤化され得る。ＡＡＶは、遺伝子導入および遺伝子療法適用において使用するための生理学的に許容される担体とともに製剤化され得る。製剤の投与量は、ウイルス粒子として、またはゲノムコピー（「ＧＣ」）／ウイルスゲノム（「ｖｇ」）として測定または算出され得る。

当技術分野で公知の任意の方法を使用して、本発明のウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定できる。ＡＡＶ ＧＣ数設定を実施するための１つの方法は、以下の通りである。まず、精製されたＡＡＶベクターサンプルを、ＤＮアーゼで処理して、製造プロセスからキャプシド形成されていないＡＡＶゲノムＤＮＡまたは混入プラスミドＤＮＡを排除する。次いで、ＤＮアーゼ耐性粒子を熱処理に付して、ゲノムをキャプシッドから放出する。次いで、放出されたゲノムを、ウイルスゲノムの特定の領域を標的とするプライマー／プローブセットを使用するリアルタイムＰＣＲによって定量化する。

また、ウイルス組成物を、ヒト患者に対して、約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１５ＧＣ（体重７０ｋｇの平均対象を治療するために）、好ましくは、１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣの範囲である一定量のウイルスベクターを含有するよう投与量単位に製剤化してもよい。好ましくは、製剤中のウイルスの用量は、１．０×１０^９ＧＣ、５．０×１０^９ＧＣ、１．０×１０^１０ＧＣ、５．０×１０^１０ＧＣ、１．０×１０^１１ＧＣ、５．０×１０^１１ＧＣ、１．０×１０^１２ＧＣ、５．０×１０^１２ＧＣまたは１．０×１０^１３ＧＣ、５．０×１０^１３ＧＣ、１．０×１０^１４ＧＣ、５．０×１０^１４ＧＣまたは１．０×ｌ０^１５ＧＣである。

ウイルスベクターは、１種以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して従来法で製剤してもよい。ＡＡＶは、注射による（例えば、ボーラス注射または連続注入による）非経口投与のために製剤化してもよい。注射のための製剤は、防腐剤を添加した単位投与形で（例えば、アンプルでまたは複数回用量容器で）提示され得る。ウイルス組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとり得、懸濁剤、安定化剤または分散剤などの製剤化物質（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ）を含有し得る。ＡＡＶ製剤の液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアガム）、非水性媒体（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）および保存料（例えば、メチルまたはプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの医薬上許容される添加剤を用いて従来手段によって調製してもよい。調製物はまた、バッファー塩を含有し得る。あるいは、組成物は、使用前に適した媒体（例えば、滅菌パイロジェンフリー水）を用いて構成するための粉末形態であってもよい。

また、本発明のＡＡＶと組み合わせた、または本発明のＡＡＶとの混合物でのアジュバントの使用も包含される。考慮されるアジュバントとして、それだけには限らないが、無機塩アジュバントまたは無機塩ゲルアジュバント、粒子状アジュバント、微粒子状アジュバント、粘膜アジュバントおよび免疫賦活性アジュバントが挙げられる。

アジュバントは、本発明のＡＡＶとの混合物として対象に投与されてもよく、または組合せＡＡＶで使用されてもよい。

本発明の医薬組成物は、局所的にまたは全身に投与されてもよい。好ましい実施形態では、医薬組成物は、その細胞が形質導入される予定の組織または臓器の近くに投与される。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ＷＡＴ内またはＢＡＴ内注射によって白色脂肪組織（ＷＡＴ）または褐色脂肪組織（ＢＡＴ）中に局所投与される。別の好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は全身に投与される。

医薬組成物は、ヒトへの静脈内、皮下または筋肉内投与に適応している医薬組成物として常法に従って製剤化できる。注射用物質は、液体溶液または懸濁液、注射に先立って液体中の溶液もしくは懸濁液に適した固体形態またはエマルジョンのいずれかとして従来形態で調製してもよい。必要な場合には、組成物はまた、注射部位の疼痛を軽減するためにリドカインなどの局所麻酔薬も含み得る。組成物が浸潤によって投与される場合には、製薬品質の水または生理食塩水溶液を含有する浸潤瓶を用いて分配され得る。組成物が、注射によって投与される場合には、投与の前に成分が混合され得るように、注射または滅菌生理食塩水溶液のために水バイアルが提供され得る。

用語「治療上有効な量」とは、所望の効果をもたらすよう算出された本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチドまたは医薬組成物の量を指し、一般に、その他の理由の中でも、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチドおよび医薬組成物自身の特徴および得られる治療効果によって決定される。疾患の治療において有効となる、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチドまたは医薬組成物の量は、本明細書において記載されるか、そうでなければ当技術分野で公知の標準臨床技術によって決定できる。さらに、最適投与量範囲を同定するのを補助するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験も任意選択で使用してもよい。製剤化において使用するための正確な用量は、投与経路および状態の重症度に応じて変わり、医師の判断で各患者の状況に応じて決定されなくてはならない。有効な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系における、または動物におけるモデルに由来する用量に対する反応曲線の対から推定できる。全身投与のために、治療上有効な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイから最初に推定できる。例えば、用量は、細胞培養において決定されたＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するよう動物モデルにおいて処方できる。前記情報を使用して、ヒトにおける有用な用量を正確に決定できる。初期用量は、公知の技術における周知の技術を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏデータ（例えば、動物モデル）から推定できる。公知の技術において通常の経験を有する人であれば、動物におけるデータに基づいてヒトへの投与を容易に最適化できる。

このような全身投与は、制限するものではないが、脂肪組織への直接注射を意味しない任意の投与経路を含む。より詳しくは、全身投与は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチドおよび医薬組成物の、筋肉内（ｉｍ）、血管内（ｉｅ）、動脈内（ｉａ）、静脈内（ｉｖ）、腹膜内（ｉｐ）、皮下または経皮注射などの全身注射を含む。末梢投与はまた、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチドおよび医薬組成物の経口投与、埋込錠を使用する送達またはスプレー、エアゾールもしくは任意のその他の適当な製剤を使用する呼吸系による滴下注入による投与（例えば、鼻腔内）も含む。好ましくは、全身投与は、ｉｍ、ｉｐ、ｉａまたはｉｖ注射によってである。最も好ましくは、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチドおよび医薬組成物は、ｉｖ注射によって投与される。Ｄｕｒｉｎｇ Ｍ、国際公開第１９９６／０４０９５４号およびＭｏｎａｈａｎ Ｐら、国際公開第２００１／０９１８０３号を参照のこと。

本発明の医薬組成物は、単回用量で投与されてもよく、または本発明の特定の実施形態では、治療効果を達成するために複数回用量（例えば、２、３、４回またはそれ以上の投与）が使用されてもよい。複数回用量が必要である場合には、本発明の医薬組成物中に含まれるＡＡＶは、異なる血清型に由来することが好ましい。

本明細書において上記で記載されたすべての刊行物は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。

前記の発明は、明確さおよび理解を目的として幾分か詳細に記載したが、本発明の真の範囲および添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の種々の変更が可能であることは、この開示の読み取りから当業者に理解される。

一般手順
１．対象特徴
雄のＩＣＲマウス８～１２週齢、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウス９～１３週齢およびＢ６．Ｖ－Ｌｅｐ^ｏｂ／ＯｌａＨｓｄ（ｏｂ／ｏｂ）およびＢＫＳ．Ｃｇ－＋Ｌｅｐｒ^ｄｂ／＋Ｌｅｐｒ^ｄｂ／ＯｌａＵｓｄ（ｄｂ／ｄｂ）マウス８週齢を使用した。マウスに、標準食（Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｄｉｅｔｓ（登録商標）、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｓ．、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳ）を自由に給餌し、１２時間の明暗周期（８：００ａ．ｍ．に点灯）下で維持した。組織サンプリングのために、マウスに吸入麻酔薬イソフラン（ＩｓｏＦｌｏ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ、ＵＳ）によって麻酔し、断頭した。目的の組織を切り出し、－８０℃で、またはホルマリンを用いて解析まで維持した。

２．組換えＡＡＶベクター
標準法にしたがって、ＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションによってベクターを作製した。Ａｙｕｓｏ、２０１０年、前掲を参照のこと。細胞をＤＭＥＭ １０％ ＦＢＳ中、１０個のローラーボトル（８５０ｃｍ^２、ｆｌａｔ；Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳ）中で８０％コンフルエンスまで培養し、ＡＡＶ２ ＩＴＲがそれぞれ両端に位置する発現カセットを保持するプラスミド、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子および血清型１、２、４、５、６、７、８または９ ｃａｐ遺伝子のＡＡＶを保持するヘルパープラスミドおよびアデノウイルスヘルパー機能を保持するプラスミドを用い、リン酸カルシウム法によって同時トランスフェクトした。使用した導入遺伝子は以下であった：ａ）ａ１）ハイブリッドサイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン構成的プロモーター（ＣＡＧ）およびＷＰＲＥ調節エレメント、ａ２）マウスｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域またはａ３）ラットｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ調節領域によって駆動されるｅＧＦＰ；ｂ）ｂ１）ＣＭＶ偏在性プロモーターおよびＷＰＲＥ、ｂ２）マウスｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域またはｂ３）ラットｍｉｎｉ／ＵＣＰ１調節領域によって駆動されるマウスヘキソキナーゼＩＩ（ｍＨｋＩＩ）ｃＤＮＡ、ｃ）マウスｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域およびＷＰＲＥによって駆動されるヒト胎盤由来分泌型アルカリホスファターゼ（ｈＳｅＡＰ）、ｄ）ラットｍｉｎｉ／ＵＣＰ１調節領域によって駆動されるマウスＶＥＧＦ１６４およびｅ）ＣＭＶ偏在性プロモーターによって駆動されるＲＦＰ。Ｒｏｓｓ、１９９０年、Ｇｒａｖｅｓ、１９９２年およびＣａｓｓａｒｄ－Ｄｏｕｌｃｉｅｒ、１９９８年、前掲を参照のこと。ＣＭＶプロモーター（ｐＡＡＶ－ＭＣＳ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（商標）、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳ）、ｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域またはｍｉｎｉ／ＵＣＰ１調節領域およびマルチクローニング部位を保持する非コーディングプラスミドを使用して、ヌル粒子を製造した。ＡＡＶは、ポリエチレングリコール沈殿ステップおよび２種の連続塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配に基づく最適化された方法で精製した。この第２世代ＣｓＣｌベースのプロトコールは、空のＡＡＶキャプシドならびにＤＮＡおよびタンパク質不純度を著しく低減した。Ａｙｕｓｏ、２０１０年、前掲を参照のこと。精製されたＡＡＶベクターを、ＰＢＳに対して透析し、濾過し、－８０℃で保存した。ウイルスゲノムの力価は、標準曲線として線形化プラスミドＤＮＡを使用し、ＡＡＶ２参照標準材料について記載されたプロトコールに従って定量的ＰＣＲによって決定した。Ｌｏｃｋ Ｍら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０年；第２１巻：１２７３～１２８５頁を参照のこと。ベクターは、当技術分野で公知の分子生物学の技術に従って構築した。Ｂｒｏｗｎ（１９９５年）、Ｗａｔｓｏｎ（１９９２年）、Ａｌｂｅｒｔｓ（２００８年）、Ｉｎｎｉｓ（１９９０年）、Ｅｒｌｉｃｈ（１９８９年）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９年）、Ｂｉｓｈｏｐ（１９８７年）、Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９８７年）、Ｄａｖｉｓ（１９８６年）およびＳｃｈｌｅｅｆ（２００１年）、前掲参照のこと。

３．ＡＡＶベクターのｉｎ ｖｉｖｏ ｅＷＡＴ内投与
マウスを、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹膜内注射を用いて麻酔した。精巣上体白色脂肪組織を露出させるために開腹手術を実施した。ＡＡＶベクターを、２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ８８（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．、Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ、ＮＪ、ＵＳ）を含むか含まない生理食塩水溶液に再懸濁し、精巣上体脂肪パッド中に直接注射した。５０μＬのＡＡＶ溶液を用いて各精巣上体脂肪パッドに２回注射した（一方の注射は精巣に近接して、もう一方は脂肪パッドの中央に）。腹部を滅菌生理食塩水溶液ですすぎ、２層アプローチを用いて閉じた。

４．ＡＡＶベクターのｉｎ ｖｉｖｏ ｉＢＡＴ内およびｉＷＡＴ内投与
マウスをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹膜内注射を用いて麻酔した。それぞれｉＢＡＴまたはｉＷＡＴを露出させるために、肩甲骨間または鼠径部領域で長軸方向の１．５～２ｃｍの長さの切開を実施した。貯蔵所全体にベクターを分布させるために、各ｉＢＡＴまたはｉＷＡＴに、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して１０μｌのＡＡＶ溶液の４回の注射を施した。１層アプローチを使用して皮膚を閉じた。

５．ＡＡＶベクターの全身投与
適当な量のＡＡＶ溶液を２００μＬの生理食塩水溶液に希釈し、送達の瞬間の行使圧を伴わずに片側尾静脈に手作業で注射した。注射の前に、動物を２５０Ｗの赤外線加熱ランプ（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＮＶ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ＮＬ）下に数分おいて、血管を拡張させ、尾静脈を見ることおよび容易に接近することを容易にした。プラスチック抑制器（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳ）を使用して、注射のために動物を固定した。適当な抑制装置が使用されたので麻酔は使用しなかった。３０ゲージのニードルを使用して動物に注射した。

６．免疫組織化学
ＧＦＰ、ＲＦＰおよびα－ＳＭＡを検出するために、組織を１０％ホルマリン中で１２～２４時間固定し、パラフィンに包埋し、切片にした。切片を、１：３００希釈したヤギ抗ＧＦＰ抗体（Ａｂｃａｍ ｐｌｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳ）とともに、１／４００希釈したウサギ抗ＲＦＰ抗体（Ａｂｃａｍ ｐｌｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳ）または１／３００希釈したマウス抗α－ＳＭＡ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳ）とともに４℃で一晩インキュベートした。二次抗体として、１：３００希釈したビオチン化ロバ抗ヤギ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳ）または１：３００希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳ）または１／３００希釈したビオチン化ウマ抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳ）を使用した。蛍光色素として、１：３００希釈したストレプトアビジンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ、ＵＳ）を使用し、核対比染色のためにＨｏｅｓｃｈｔビスベンズイミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳ）を使用した。あるいは、１：５０希釈したＡＢＣペルオキシダーゼキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳ）を使用し、切片をＭａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色した。

７．ｅＷＡＴサンプルにおけるβ－ガラクトシダーゼ発現の解析
全体としてｅＷＡＴにおけるβ－ガラクトシダーゼの存在を検出するために、組織サンプルを４％パラホルムアルデヒド中で１時間固定し、ＰＢＳ溶液で２回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の、５ｍＭ Ｋ_３Ｆｅ（ＣＮ）_５、５ｍＭ Ｋ_４Ｆｅ（ＣＮ）_６および１ｍＭ ＭｇＣｌ_２中のＸ－Ｇａｌ（５－ブロモ－４－クロロ－３－β－Ｄ－ガラクトピラノシド）中、３７℃暗所で６～８時間インキュベートした。

８．ＧＦＰ含量
ＧＦＰ含量を決定するために、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）型組織ホモジナイザーを用いて、組織を１ｍＬの溶解バッファー（ＰＢＳ中の、５０ｍＭ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍＭ／Ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、滅菌濾過）中で機械的に破壊し、ＲＴで１０分間インキュベートした。インキュベートした後、サンプルを１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を新規試験管に移し、１００μＬのこの溶液中のＧＦＰ含量を、４８８ｎｍの励起波長および５１２ｎｍの発光波長を用い発光分光計Ｆｌｘ８００（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳ）を用いて測定した。総ＧＦＰ含量値はサンプルのタンパク質含量（ｃｏｎｔａｉｎ）によって補正した。

９．精巣上体脂肪パッドからの脂肪細胞の単離
Ｒｏｄｂｅｌｌの方法の改変を使用してＡＡＶ－形質導入された脂肪細胞を単離した。Ｒｏｄｂｅｌｌ Ｍ、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６４年；第２３９巻：３７５～３８０頁を参照のこと。イソフルオラン（Ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）麻酔したマウスを、断頭によって屠殺し、精巣上体ＷＡＴを細かく刻み、３７℃で４％ ＢＳＡ（脂肪酸不含）、０．５ｍＭ／Ｌグルコースおよび０．５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＩ型（Ｃ６８８５；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳ）を含有するＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸ＨＥＰＥＳバッファー（ＫＲＢＨ）中で３５～４５分間消化した。脂肪細胞を穏やかな遠心分離によって単離し、グルコースを含まない新鮮なコラゲナーゼ不含ＫＲＢＨで３回洗浄した。脂肪細胞をグルコースを含まない新鮮なＫＲＢＨに再懸濁し、これまでに記載されたように細胞数を推定した。ＤｉＧｉｒｏｌａｍｏ
Ｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ １９７１年；第２２１巻：８５０～８５８頁を参照のこと。

１０．ＲＮＡ解析
全ＲＮＡは、それぞれＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ試薬（Ｑｉａｇｅｎ ＮＶ、Ｖｅｎｌｏ、ＮＬ）またはｔｒｉｐｕｒｅ単離試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳ）およびＲＮｅａｓｙ脂質組織ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ ＮＶ、Ｖｅｎｌｏ、ＮＬ）を使用することによって単離された脂肪細胞および脂肪貯蔵所または肝臓から得た。残存するウイルスゲノムを排除するために、全ＲＮＡをＤＮＡｓｅｌ（Ｑｉａｇｅｎ ＮＶ、Ｖｅｎｌｏ、ＮＬ）で処理した。ＲＴ－ＰＣＲのために、１μｇのＲＮＡサンプルをスーパースクリプトＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ、ＵＳ）を使用して逆転写した。リアルタイム定量的ＰＣＲは、ＥＸＰＲＥＳＳ ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｓｕｐｅｒｍｉｘ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ、ＵＳ）を使用してＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒｌｌ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＵＳＡ）で実施した。センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーの配列は以下である：

データを３６Ｂ４値を用いて正規化し、これまでに記載されたように解析した。Ｐｆａｆｆｌ Ｍ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００１年；第２９巻（９号）：ｅ４５を参照のこと。

１１．単離された脂肪細胞におけるｅｘ ｖｉｖｏでのグルコース取り込み
マウスからの単離された脂肪細胞について、これまでに記載されたように種々のインスリン濃度で２－［１－^３Ｈ］デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳ）取り込みを測定した。Ｔｒａｘｉｎｇｅｒ Ｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９年；第２６４巻：８１５６～８１６３頁を参照のこと。手短には、単離された脂肪細胞を、先に記載したように給餌したマウスから得た精巣上体ＷＡＴのコラゲナーゼ消化によって得た。２５０μＬの脂肪細胞懸濁液を、ＫＲＢＨ＋４％ ＢＳＡ（脂肪酸不含）、１０ｍＭ／Ｌデオキシ－グルコース、０．４μＣｉの２－［１－^３Ｈ］デオキシ－Ｄ－グルコースおよび種々のインスリン濃度とともに５分間インキュベートした。最後に脂肪細胞およびインキュベーション培地を、ポリプロピレンチューブ中でシリコンオイル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳ）によって分離し、脂肪細胞サンプル中の放射能を液体シンチレーション計数によって評価した。結果は、１分あたり１０^６個細胞あたりの２－［^３Ｈ］－ＤＧのｐｍｏｌとして表した。

１２．ｉｎ ｖｉｖｏでのグルコース取り込み
ｉｎ ｖｉｖｏ基礎グルコース利用指数をこれまでに記載されたように決定した。Ｆｒａｎｃｋｈａｕｓｅｒ Ｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００２年；第５１巻：６２４～６３０頁を参照のこと。手短には、１４８ＧＢｑ（４μＣｉ）の非代謝可能グルコース類似体デオキシ－Ｄ－［１，２－^３Ｈ］グルコース（２－ＤＧ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳ）を、ＢＳＡ－クエン酸バッファー中で混合した。放射標識した混合物のフラッシュ注射を、時間ゼロで麻酔した（ケタミン＋キシラジン）給餌したマウスの頸動脈中に投与した。注射後１、１５および３０分で得られた血液サンプル（尾静脈）２５μＬを用いて特定の血液２－ＤＧクリアランスを、これまでに記載したように決定した。Ｓｏｍｏｇｙｉ Ｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９４５年；第１６０巻：６９～７３頁を参照のこと。注射後３０分で組織サンプルを採取した。放射標識した化合物の蓄積を測定することによってグルコース利用指数を決定した。Ｆｅｒｒｅ Ｐら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９８５年；第２２８巻：１０３～１１０頁を参照のこと。タンパク質１ミリグラムあたりの２－ＤＧ－６リン酸の量を、測定された未標識グルコースに対する２－ＤＧの濃度比の積分で除した。値は、グルコース代謝経路中の２－ＤＧの「識別定数」によって補正されないので、結果は、１分あたりのタンパク質１ミリグラムあたりのピコモルでグルコース利用の指数として表される。

１３．血液ｈＳｅＡＰレベルの測定
循環ｈＳｅＡＰレベルを、Ｔｒｏｐｉｘ（登録商標）Ｐｈｏｓｐｈａ－Ｌｉｇｈｔ（商標）システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ、ＵＳ）を使用して５μＬの血清から決定した。

１４．統計解析
すべての値は、平均±ＳＥＭとして表される。群間の相違を、スチューデントのｔ検定によって比較した。相違は、ｐ＜０．０５で有意と考えた。

［実施例１］
ＡＡＶの局所投与による白色脂肪細胞のｉｎ ｖｉｖｏ形質導入
ＡＡＶベクターを用いる白色脂肪組織（ＷＡＴ）のｉｎ ｖｉｖｏ形質導入効率を評価するために、４×１０^１１のウイルスゲノム（ｖｇ）／偏在性プロモーターＣＡＧ（ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ）の制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードする血清型１、２、４、５、６、７、８および９のＡＡＶのマウスを、非イオン性界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ８８とともにまたは伴わずにマウスの精巣上体白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）に両側性に注射した。Ｃｒｏｙｌｅ Ｍら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００１年；第４巻：２２～２８頁、Ｇｅｂｈａｒｔ Ｃら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００１年；第７３巻：４０１～４１６頁、Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００６年；第１７巻：９２１～９２８頁およびＳｏｍｍｅｒ Ｊら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３年；第７巻：１２２～１２８頁を参照のこと。Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ８８を伴わないＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４およびＡＡＶ５の投与は、ｅＷＡＴにおけるＧＦＰに対する免疫染色によって評価されるように、注射の２週間後に極めて低いパーセンテージの形質導入された白色脂肪細胞をもたらした。さらに、試験したＡＡＶ血清型のいずれかによって媒介される脂肪形質導入効率の改善は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ８８添加によって達成されなかった。図１Ａを参照のこと。したがって、この非イオン性界面活性剤の使用は、その後の実験に対しては破棄した。Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ８８の添加とは独立に、ＡＡＶｌは、ｉｎ ｖｉｖｏでのｅＷＡＴの形質導入においてＡＡＶ２、ＡＡＶ４およびＡＡＶ５よりも効率的であった。Ｍｉｚｕｋａｍｉ、２００６年、前掲を参照のこと。ＡＡＶｌによって形質導入された脂肪細胞がわずかに散在し、脂肪細胞の群がほとんどないこととは対照的に、ＡＡＶ６およびＡＡＶ７を用いて注射された動物は、ＧＦＰ^＋白色脂肪細胞の複数の大きな群を提示した。さらに、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９を用いて処理した動物は、ｅＷＡＴのかなり多くの形質導入を示し、ｅＷＡＴ領域あたりの脂肪細胞の大部分が形質導入された。図１Ｂを参照のこと。投与の２週間後のｅＷＡＴ中のＧＦＰ含量の蛍光定量的解析による定量から、ｉｎ ｖｉｖｏでのｅＷＡＴの形質導入においてＡＡＶ１よりも血清型６、７、８および９のＡＡＶは、より効率的であるということがさらに確認された。図１Ｃを参照のこと。ＡＡＶ８およびＡＡＶ９を用いて注射された精巣上体脂肪パッドが、最高ＧＦＰ含量を示し、それらの間に有意な統計上の相違はないということは注目に値する。図１Ｃを参照のこと。ＬａｃＺ基質５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（Ｘ－ｇａｌ）を用いる染色は、２×１０^１１ｖｇ／マウスの偏在性ＣＭＶプロモーターの制御下にＬａｃＺ遺伝子をコードするＡＡＶ８（ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＬａｃＺ）の片側性ｅＷＡＴ内投与の２週間後に、ｅＷＡＴのいたるところでの形質導入された脂肪細胞の広範な分布を示した。図１Ｄを参照のこと。ＡＡＶ８およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰベクターの鼠径部ＷＡＴ（ｉＷＡＴ）への局所投与は、この貯蔵所における白色およびベージュ脂肪細胞の広範な形質導入を媒介した。図１ＧおよびＨを参照のこと。結局、これらの結果は、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９は、ｉｎ ｖｉｖｏでＷＡＴを遺伝子操作するのに最も適したベクターであったと示す。

さらに、ＡＡＶベクターのｅＷＡＴ内投与は、ｅＷＡＴに実質的に制限された形質導入をもたらした。注射の２週間後に、ＡＡＶｌ、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰを用いて処理した動物は、腸間膜、後腹膜および鼠径部貯蔵所の形質導入を示さなかったが、わずかなＧＦＰ^＋褐色脂肪細胞が、ＡＡＶ９を用いてｅＷＡＴ内注射されたマウスのｉＢＡＴ中に存在した。図８Ａを参照のこと。しかし、ＢＡＴにおける導入遺伝子発現は、ｅＷＡＴにおいて検出されたものと比較して最小であった。図８Ｂを参照のこと。非脂肪組織の形質導入に関して、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰのｅＷＡＴ内投与はまた、肝臓および心臓への相当な遺伝子導入を、およびわずかな数の膵臓の外分泌細胞への遺伝子導入をもたらした。図８Ｃを参照のこと。

ｉｎ ｖｉｖｏでＡＡＶ－形質導入された脂肪細胞は、脂肪機能を研究するための生存モデルであり得るかどうかを評価する考えの証しとして、４×１０^１１ｖｇ／マウスの偏在性プロモーターＣＭＶ（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＨＫＩＩ）の制御下にマウス酵素ヘキソキナーゼＩＩ（ｍＨＫＩＩ）をコードするＡＡＶ９ベクターまたは等用量のＡＡＶ９－ＣＭＶ－ヌルベクターを、健康なマウスのｅＷＡＴに両側性に注射した。注射の２週間後、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＨＫＩＩを用いて処理した動物から得られた単離された脂肪細胞は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ヌルを注射したマウスから得られた脂肪細胞と比較してｍＨＫＩＩの発現の３倍の増大を示した。図１Ｅを参照のこと。脂肪細胞におけるｍＨＫＩＩのＡＡＶ媒介性過剰発現の効果を解析するために、単離された脂肪細胞へのｅｘ ｖｉｖｏ基礎およびインスリン刺激された２－［１－^３Ｈ］デオキシ－Ｄ－グルコース取り込みを調べた。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＨＫＩＩ－形質導入された脂肪細胞では、基礎２－［１－^３Ｈ］デオキシ－Ｄ－グルコース取り込みは、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ヌル－形質導入された脂肪細胞と比較してわずかに増大した。対照的に、インスリン刺激は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ヌルベクターを用いて処理した動物から得られた脂肪細胞と比較して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＨＫＩＩ－形質導入された脂肪細胞による２－［ｌ－^３Ｈ］デオキシ－Ｄ－グルコース取り込みの大幅な増大につながった。図１Ｆを参照のこと。

［実施例２］
白色脂肪細胞のｉｎ ｖｉｖｏ ＡＡＶ媒介性特異的遺伝子操作
ａＰ２基礎プロモーターとともに単に脂肪細胞特異的エンハンサーからなるマウス脂肪細胞タンパク質２（ｍｉｎｉ／ａＰ２）プロモーターの短い型の使用を評価した。Ｒｏｓｓ、１９９０年およびＧｒａｖｅｓ、１９９２年、前掲を参照のこと。このアッセイの目的は、ＡＡＶ媒介性導入遺伝子発現を脂肪細胞に制限することであった。１０^１２ｖｇ／マウスのｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域の制御下にＧＦＰをコードするＡＡＶ８およびＡＡＶ９の片側性ｅＷＡＴ内投与は、白色脂肪細胞の制限された形質導入を媒介し、注射の２週間後に肝臓および心臓では検出可能なＧＦＰ発現はなかった。図２Ａおよび９を参照のこと。

マウスにおいてｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域によって媒介される導入遺伝子発現の時間的経過を評価するために、４×１０^１２ｖｇ／マウスの用量のｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域の制御下にヒト胎盤由来分泌型アルカリホスファターゼ（ｈＳｅＡＰ）ｃＤＮＡをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ＳｅＡＰ）または生理食塩水溶液を、ｅＷＡＴ中に両側性に注射し、ＡＡＶ投与後の種々の時点で循環ｈＳｅＡＰレベルを測定した。ＡＡＶ送達の２週間後すぐに血液において高レベルのｈＳｅＡＰが検出され、最大４０日目まで漸増した。その後、循環ｈＳｅＡＰレベルは、フォローアップの期間、注射後少なくとも１年間持続した。ｑＰＣＲによる肝臓およびｅＷＡＴにおけるｈＳｅＡＰ発現レベルの定量化によって、ｅＷＡＴが、ｈＳｅＡＰの主要な製造に関与している組織であることが確認された。図２Ｂ～２Ｃを参照のこと。

白色脂肪細胞のＡＡＶ媒介性特異的遺伝子操作が、マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで脂肪細胞機能、分化および代謝を研究するための新規ツールとなり得るかどうかを評価するために、１．４×ｌ０^１２ｖｇ／マウスのｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域の制御下にｍＨＫＩＩをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ｍＨＩＩ）または等用量のＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ヌルベクターをｅＷＡＴに投与した。注射の２週間後、ｉｎ ｖｉｖｏ基礎２－［１－^３Ｈ］デオキシ－Ｄ－グルコース取り込みを調べた。ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ｍＨＫＩＩベクターを投与された動物は、ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ヌルベクターを用いて処理された動物と比較して、ｅＷＡＴによる基礎２－［ｌ－^３Ｈ］デオキシ－Ｄ－グルコース取り込みの増大を示した。基礎条件下では２－［ｌ－^３Ｈ］デオキシ－Ｄ－グルコース取り込みにおいて、ｉＢＡＴにおいて、およびｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域の使用が導入遺伝子発現を妨害した心臓のような組織において群間で相違は見られなかった。図２Ｄを参照のこと。

［実施例３］
ＡＡＶベクターの局所送達による褐色脂肪細胞のｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子操作
ＡＡＶ８およびＡＡＶ９は、白色脂肪細胞の遺伝子操作を媒介する最も効率的なベクターであったということを考慮して、同一血清型による褐色脂肪細胞の形質導入を評価した。肩甲骨間褐色脂肪組織（ｉＢＡＴ）への２×１０^９ｖｇ／マウスのＡＡＶ８およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰベクターの投与の２週間後、多数のＧＦＰ^＋褐色脂肪細胞が検出された。図３Ａを参照のこと。ｑＰＣＲによるＧＦＰ発現レベルの評価は、２×ｌ０^９ｖｇ／マウスの用量でのＡＡＶ９との比較において、ＡＡＶ８によるｉＢＡＴの高い形質導入効率を示した。図３Ｂを参照のこと。ＡＡＶ８およびＡＡＶ９ベクターを使用する褐色脂肪細胞の形質導入が実証されると、本発明者らは、血清型１、２、４、５、６、７、８および９のＡＡＶを用いる褐色脂肪組織（ＢＡＴ）のｉｎ ｖｉｖｏ形質導入効率を特性決定した。この目的を達成するために、偏在性プロモーターＣＭＶの制御下にマーカータンパク質ＲＦＰをコードする、１．２×ｌ０^１０ｖｇ／マウスの用量の血清型４および８のＡＡＶまたは１０^１１ｖｇ／マウスの用量の血清型１、２、５、６、７、８および９のＡＡＶ（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＦＰ）をマウスのｉＢＡＴに注射した。ｉＢＡＴ内投与の２週間後、ｑＰＣＲによるＲＦＰ発現レベルの定量化によって、ＡＡＶｌ、２、４、５および６との比較においてＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９によるｉＢＡＴの高い形質導入効率が示された。図３Ｃを参照のこと。一致して、ＡＡＶ９ベクターを与えた動物のｉＢＡＴにおいて、ＲＦＰ^＋褐色脂肪細胞の広範な分布が検出された。図３Ｄを参照のこと。

さらに、ＡＡＶのｉＢＡＴ内投与は、この貯蔵所の制限された形質導入をもたらし、精巣上体、腸間膜、後腹膜および鼠径部貯蔵所では、導入遺伝子発現は検出不能であった。非脂肪組織の形質導入に関して、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９ベクターを用いてｉＢＡＴ内で処理された動物は、心臓および肝臓の形質導入を示したのに対し、膵臓、腸、脾臓、肺、腎臓、骨格筋、精巣、精巣上体および脳では、ＧＦＰ発現は、検出不能であった。図１０を参照のこと。

［実施例４］
褐色脂肪細胞のｉｎ ｖｉｖｏ ＡＡＶ媒介性特異的遺伝子操作
褐色脂肪細胞特異的発現を付与するエンハンサーおよびラットＵＣＰ１遺伝子の基礎プロモーターから構成されるｍｉｎｉ ＵＣＰ１（ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ）調節領域を利用して、褐色脂肪組織における目的の遺伝子の発現を特異的に媒介した。Ｂｏｙｅｒ Ｂら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９１年；第１１巻：４１４７～４１５６頁、Ｋｏｚａｋ Ｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９４年；第１４巻：５９～６７頁、Ｃａｓｓａｒｄ－Ｄｏｕｌｃｉｅｒ、１９９８年およびＬａｒｏｓｅ、１９９６年、前掲を参照のこと。２×１０^１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ＧＦＰベクターのｉＢＡＴ内投与の２週間後、褐色脂肪細胞の効率的な形質導入が達成された。図４Ａを参照のこと。同様に、２×１０^１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ８およびＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ＧＦＰのｉＢＡＴ内送達はまた、褐色脂肪細胞に形質導入した。図１１Ａを参照のこと。さらに、ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ調節領域は、高度に脂肪細胞特異的なＧＦＰ発現を果たし、心臓におけるＡＡＶ媒介性導入遺伝子発現を完全に消失させ、わずかな肝臓形質導入のみを媒介した。図１１Ｂを参照のこと。

ｉＢＡＴのＡＡＶ媒介性形質導入が、褐色脂肪細胞機能を研究するための新規モデルであり得るかどうかを調べるために、７×１０^１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ｍＨＫＩＩベクターをｉＢＡＴに投与した。ＡＡＶ８－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ｍＨＫＩＩベクターを与えた動物は、ＡＡＶ８－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ヌルベクターを用いて処理した動物と比較して、ｉＢＡＴによる基礎２－［１－^３Ｈ］デオキシ－Ｄ－グルコース取り込みの増大を示し、基礎条件下で２－［１－^３Ｈ］デオキシ－Ｄ－グルコース取り込みにおいて、ｅＷＡＴおよび心臓において群間で相違は見られなかった。図４Ｂを参照のこと。次いで、２×１０^１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ＶＥＧＦ_１６４ベクターまたはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１－ヌルベクターをｉＢＡＴ内に送達した。注射の２週間後、ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ＶＥＧＦ_１６４ベクターを与えた動物は、ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ヌルベクターを用いて処理した動物と比較して、ｉＢＡＴにおいてＶＥＧＦ_１６４の過剰発現および総ＶＥＧＦのレベルの増大を示した。さらに、ＶＥＧＦ_１６４を過剰発現する動物において、ＰＥＣＡＭ１（よく使用される内皮細胞マーカー）の過剰発現が得られた。ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ＶＥＧＦ_１６４ベクターを用いて処理した動物は、ｉＢＡＴにおけるα－ＳＭＡに対する免疫染色によって実証されるように、ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ヌルベクターを与えた動物と比較して、血管数の増大を示した。図４Ｃ～４Ｆを参照のこと。

［実施例５］
ＡＡＶ８およびＡＡＶ９の全身投与による白色および褐色脂肪細胞のｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子操作
５×１０^１２ｖｇ／マウスの用量のＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰベクターを、痩せたマウスに尾静脈を介して投与した。注射の２週間後に、脂肪貯蔵所の形質導入を評価した。ｅＷＡＴ切片のＧＦＰに対する免疫染色は、白色脂肪細胞のＡＡＶ８－およびＡＡＶ９－媒介性形質導入を示した。さらに、ＧＦＰ発現レベルおよびＧＦＰ含量の測定は、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９両方について同様の形質導入効率を実証した。さらに、５×１０^１２ｖｇ／マウスのＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターの全身送達は、ｉＢＡＴの褐色脂肪細胞の形質導入を効率的に媒介した。ｑＰＣＲによるＧＦＰ発現レベルおよび蛍光定量解析によるＧＦＰ含量の測定は、ＡＡＶ８は、ＡＡＶ９よりも優れたｉＢＡＴ形質導入効率を示す傾向を提示することを示唆した。さらに、ｑＰＣＲによるＧＦＰ発現レベルの測定は、鼠径部、後腹膜および腸間膜貯蔵所への遺伝子導入を実証した。しかし、貯蔵所間での形質導入効率の顕著な相違は観察された。図５Ａ～５Ｈを参照のこと。糖尿病－肥満症ｏｂ／ｏｂマウスまたはｄｂ／ｄｂマウスへのＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターのｉｖ投与もまた、ＷＡＴおよびＢＡＴの遺伝子操作をもたらし、痩せたマウスにおいて果たされたものと同様の効率を有していたことは重要である。図１３を参照のこと。ＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰベクターの全身投与は、多様な非脂肪組織を形質導入した。図１２を参照のこと。

［実施例６］
ＡＡＶ－ｍｉｎｉ／ａＰ２およびＡＡＶ－ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１ベクターを用いる白色および褐色脂肪細胞のｉｎ ｖｉｖｏ特異的遺伝子操作
２×１０^１２ｖｇ／マウスのＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ＧＦＰの全身送達は、白色および褐色脂肪細胞の形質導入をもたらした、低レベルの導入遺伝子発現も提供された。図７Ａを参照のこと。対照的に、２×１０^１２ｖｇ／マウスのＡＡＶ８またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ＧＦＰベクターの全身投与は、褐色脂肪細胞の相当な形質導入を媒介した。図６Ａを参照のこと。さらに、静脈内に送達されたＡＡＶ－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ＧＦＰおよびＡＡＶ－ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１－ＧＦＰベクターは、高度に脂肪細胞特異的ＧＦＰ発現を果たし、心臓では検出可能な導入遺伝子発現はなく、肝臓のわずかな形質導入があり、これは、わずかな散在するＧＦＰ^＋肝細胞を示したに過ぎない。図７Ｂ～７Ｃを参照のこと。

ＡＡＶの全身投与による脂肪細胞の遺伝子操作をさらに実証するために、２×１０^１２ｖｇのＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ＶＥＧＦ_１６４またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１－ヌルベクターを、尾静脈を介して送達した。注射の２か月後、ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ＶＥＧＦ_１６４ベクターを与えた動物は、ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ヌルベクターを用いて処理した動物と比較して、ＶＥＧＦ_１６４および総ＶＥＧＦの発現の増大を示した。図６Ｂ～６Ｃを参照のこと。さらに、８×ｌ０^１２ｖｇの用量のＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ＶＥＧＦ_１６４またはＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ヌルベクターも尾静脈を介して送達した。注射の１カ月後、８×１０^１２ｖｇのＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ＵＣＰｌ－ＶＥＧＦ_１６４ベクターを与えた動物は、ＶＥＧＦ_１６４およびＰＥＣＡＭ１の発現の増大ならびに血管密度の増大を示した。図６Ｄ～６Ｇを参照のこと。

［実施例７］
ＡＡＶ－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ＧＫを用いる褐色脂肪細胞のｉｎ ｖｉｖｏ特異的遺伝子操作
２×１０^１１ｖｇ／マウスの用量のｍｉｎｉ／ａＰ２調節領域の制御下にラットグルコキナーゼ酵素をコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ｒＧＫ）または等用量のＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ヌルベクターのいずれかを、マウスのｉＢＡＴに局所投与する。注射の２週間／１ヶ月後、ｉｎ ｖｉｖｏ基礎およびインスリン刺激された２－［１－^３Ｈ］デオキシ－Ｄ－グルコース取り込みを調べて、ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ヌルベクターを用いて処理した動物と比較して、ＡＡＶ９－ｍｉｎｉ／ａＰ２－ｒＧＫベクターを与えた動物が、ｉＢＡＴによる基礎２－［ｌ－^３Ｈ］デオキシ－Ｄ－グルコース取り込みの増大を特異的に示すかどうかを評価する。

［実施例８］
ＡＡＶベクターの全身投与後のｍｉｒＴ配列を用いる、効率的な脂肪細胞形質導入ならびに肝臓および心臓からの導入遺伝子発現の標的化解除
１０^１２ｖｇ／マウスの用量の、偏在性ＣＡＧプロモーターまたは肝臓特異的ｍｉＲ１２２ａ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ－ｍｉＲＴ１２２）、心臓特異的ｍｉＲ１（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ－ｍｉＲＴ１）もしくは両方（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ－ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ）の４つのタンデム標的部位を付加したＣＡＧプロモーターの制御下に、発現カセットの３’ＵＴＲにクローニングされたＧＦＰマーカータンパク質をコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ）を全身投与した。注射の２週間後、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ－ｍｉＲＴ１２２、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ－ｍｉＲＴ１またはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ－ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターを与えたマウスから得られた白色および褐色脂肪細胞において高レベルのＧＦＰ発現が観察された。対照的に、肝臓または心臓におけるＧＦＰ製造は、それぞれ、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ－ｍｉＲＴ１２２またはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ－ｍｉＲＴ１ベクターを用いて処理したマウスでほぼ完全に消失した。ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ－ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処理されたマウスから得られた肝臓および心臓の両方においてＧＦＰ製造は大幅に阻害されたことは顕著である。図１４を参照のこと。

Claims (31)

1. 脂肪組織の形質導入が可能なアデノ随伴ウイルスベクターであって、組換えウイルスゲノムを含み、前記組換えウイルスゲノムが、目的のポリヌクレオチドと作動可能に連結している転写調節領域を含む発現カセットを含み、前記転写調節領域が構成的プロモーターを含み、前記ベクターは少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含む、アデノ随伴ウイルスベクターであって、
   少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列が、ｍｉｒＴ１２２ａ（配列番号１９）またはｍｉｒＴ１（配列番号２０）であり、
   ＡＡＶの血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される、アデノ随伴ウイルスベクター。
2. 構成的プロモーターが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１ａプロモーターから選択される、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
3. 構成的プロモーターがβ－アクチンプロモーターである、請求項２に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
4. 転写調節領域が、プロモーター領域と作動可能に連結しているエンハンサー領域をさらに含む、請求項２または３に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
5. 転写調節領域が、ＣＡＧ調節領域である、請求項４に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
6. 転写調節領域が、プロモーター領域と作動可能に連結しているエンハンサー領域をさらに含み、エンハンサー領域が、脂肪特異的ａＰ２エンハンサーおよび脂肪特異的ＵＣＰ１エンハンサーからなる群から選択される、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
7. 少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列が、ｍｉｒＴ１２２ａである、請求項１～６のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
8. 少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列が、ｍｉｒＴ１である、請求項１～６のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
9. 少なくともｍｉｒＴ１の１つのコピーおよびｍｉｒＴ１２２ａの１つのコピーを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
10. ＡＡＶの血清型が、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
11. ＡＡＶの血清型が、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９である、請求項１０に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
12. 発現カセットが転写後調節領域をさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
13. 転写後調節領域が、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、請求項１２に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
14. 目的のポリヌクレオチドが、全身に作用する分泌型タンパク質および前記脂肪細胞でまたはその付近で作用するタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１～１３のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
15. 目的のポリヌクレオチドが、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、アルカリホスファターゼおよび血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１～１４のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
16. 組換えウイルスゲノムが、ＡＡＶ２血清型に由来するインバーテッド・ターミナル・リピート（ＩＴＲ）を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
17. 請求項１～１６のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクターを含む医薬組成物。
18. 脂肪組織における目的のポリヌクレオチド発現を必要とする疾患の治療または予防のための医薬品の調製における、請求項１～１６のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクターまたは請求項１７に記載の医薬組成物の使用。
19. 脂肪組織が、白色脂肪組織を含む、請求項１８に記載のアデノ随伴ウイルスベクターの使用。
20. 脂肪組織が、褐色脂肪組織を含む、請求項１８に記載のアデノ随伴ウイルスベクターの使用。
21. アデノ随伴ウイルスベクターまたは医薬組成物が、全身または局所投与される、請求項１８に記載のアデノ随伴ウイルスベクターまたは医薬組成物の使用。
22. 脂肪組織における目的のポリヌクレオチドの発現を必要とする疾患の治療または予防に使用するための、請求項１から１６のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクターまたは請求項１７に記載の医薬組成物。
23. 前記細胞を、請求項１～１６のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクターと接触させるステップを含む、細胞に形質導入するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
24. 細胞が、脂肪細胞である、請求項２３に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
25. 脂肪細胞が、白色脂肪細胞または褐色脂肪細胞である、請求項２３に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
26. 請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法によって得られた脂肪細胞。
27. 請求項１～１６のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクターを得る方法であって、
    （ｉ）アデノ随伴ウイルスＩＴＲがそれぞれの両端に位置する発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記発現カセットが、目的のポリヌクレオチドと作動可能に連結している転写調節領域を含む、ポリヌクレオチド、ＡＡＶ ｃａｐタンパク質、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶが複製のために依存するウイルスタンパク質を含む細胞を提供するステップであって、
    前記転写調節領域が、構成的プロモーターを含み、前記ベクターは少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含み、
    ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ ｃａｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９血清型からなる群から選択されるＡＡＶ血清型に由来し、
    少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列が、ｍｉｒＴ１２２ａ（配列番号１９）またはｍｉｒＴ１（配列番号２０）であり、
    （ｉｉ）ＡＡＶのアセンブリーに適切な条件下で細胞を維持するステップと、
    （ｉｉｉ）細胞によって製造されたアデノ随伴ウイルスベクターを精製するステップと
    、を含む方法。
28. ＡＡＶが複製のために依存するタンパク質が、アデノウイルスに由来する、請求項２７に記載の方法。
29. アデノ随伴ウイルスｒｅｐおよびｃａｐタンパク質が、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９血清型からなる群から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項２７または２８に記載の方法。
30. ＡＡＶの血清型が、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９である、請求項２９に記載の方法。
31. ポリエチレングリコール沈殿ステップまたは塩化セシウム勾配分画によって、ステップ（ｉｉｉ）がさらに実施される、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の方法。

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