JP2022517174A - 導入遺伝子発現のｄｒｇ特異的低減のための組成物 - Google Patents

Abstract

ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムとを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が本明細書に提供され、当該ベクターゲノムは、ＡＡＶの５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、標的細胞における発現のための遺伝子産物をコードする操作核酸配列、および後根神経節（ＤＲＧ）細胞における発現を選択的に抑制するｍｉＲＮＡ標的配列を含む。また、製剤緩衝液中に本明細書で記載されるｒＡＡＶを含む医薬組成物、ならびにＤＲＧ細胞における発現を選択的に防止しながら、ＣＮＳ標的遺伝子療法でヒト対象を治療する方法も提供される。【選択図】図１Ａ

Description

インビボ遺伝子療法のために選択されるベクタープラットフォームは、霊長類由来のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。１９６０年代、遺伝子療法産物は、アデノウイルスの調製物から単離されたＡＡＶに由来した（Ｈｏｇｇａｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ５５：１４６７－１４７４，１９６６）。これらのベクターは安全であったが、不十分な形質導入のために、臨床では、多くのプログラムが失敗した。世紀の変わり目に、研究者らは、内因性ＡＡＶのファミリーを発見し、これは、ベクターとして好ましい安全プロファイルを保持しながら、はるかに高い形質導入効率を達成した（Ｇａｏ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８：６３８１－６３８８，２００４）。

ＡＡＶベクターに対する宿主の有害な応答は、最小限であった。激しい急性炎症応答を引き起こす非ウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターとは対照的に（Ｒａｐｅｒ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ８０：１４８－１５８，２００３、Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ３：６９７－７０７，２００１）、ＡＡＶベクターは炎症促進性ではない。ＡＡＶベクターの投与後、細胞傷害性Ｔ細胞などのベクター形質導入細胞に対する破壊的な適応免疫応答は、最小限であった。動物およびヒトにおいて、ＡＡＶが、血清型、用量、投与経路、および免疫抑制レジメンに応じて、特定の状況下では、カプシドまたは導入遺伝子産物に対する耐性を誘導し得るという証拠がある（Ｇｅｒｎｏｕｘ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２８：３３８－３４９，２０１７、Ｍａｙｓ，Ｌ．Ｅ．＆Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９：１６－２７，２０１１、Ｍａｎｎｏ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １２：３４２－３４７，２００６、Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １１０：２３３４－２３４１，２００７）。しかしながら、ＡＡＶ遺伝子療法の臨床応用の最近の拡大を考慮すると、この技術の臨床的な影響を制限し得る毒性が見え始める。

最も重度の毒性は、ＣＮＳおよび筋骨格系を標的とする高用量ＡＡＶの静脈内投与後に発生した。非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における研究では、血小板減少症および高トランスアミナーゼ血症の急性発症を示し、これは、場合によっては、出血およびショックの致死的症候群に発展した（Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２６：６６４－６６８，２０１８、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９（３）：２８５－２９８，２０１８）。また、ほとんどの高用量ＡＡＶ臨床試験において、肝臓酵素の急性上昇および／または血小板の減少も観察されている（ＡｖｅＸｉｓ，Ｉ．ＺＯＬＧＥＮＳＭＡ Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２０１９、Ｓｏｌｉｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ ＳＧＴ－００１
Ｐｒｏｇｒａｍ Ｕｐｄａｔｅ，２０１９、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｐｆｉｚｅｒ Ｐｒｅｓｅｎｔｓ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄａｔａ ｏｎ Ｐｈａｓｅ １ｂ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｔｕｄｙ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＤＭＤ），２０１９、Ｆｌａｎｉｇａｎ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １２６：Ｓ５４，２０１９）。まれではあるが、重度の毒性は、貧血、腎不全、および補体活性化によって特徴付けられた（Ｓｏｌｉｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１９、Ｐｆｉｚｅｒ，２０１９）。

より最近では、脳脊髄液（ＣＳＦ）中に、または高用量で血液中にのいずれかでＡＡＶベクターを受けたＮＨＰおよびブタでは、後根神経節（ＤＲＧ）のニューロンが変性する
問題が観察されている（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９（３）：２８５－２９８，２０１８、Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：６８－７８，２０１８、Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：７９－８８，２０１８）。この神経毒性は、末梢神経における末梢軸索と、脊髄の後柱を通って上行する中枢軸索との両方の変性に関連する。

当該技術分野では、毒性に対してより感受性の高い細胞において遺伝子産物の発現を最小限に抑える遺伝子療法のための組成物および方法が必要である。

特定の実施形態では、ＤＲＧニューロンにおける導入遺伝子の発現を抑制する組成物および方法が提供される。有利なことに、これらの組成物は、髄腔内または全身的遺伝子療法投与後の過剰発現および／または免疫媒介毒性によって引き起こされ得る、神経変性を減少させる、および／または二次的な背側脊髄（ｄｏｒｓａｌ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ）軸索変性を減少させる。

特定の実施形態では、遺伝子送達のための組成物が提供され、発現カセットを含む後根神経節（ＤＲＧ）における遺伝子産物の発現を特異的に抑制する。特定の実施形態では、発現カセットは、核酸配列であり、（ａ）遺伝子産物のコード配列であって、発現カセットを含む細胞において遺伝子産物の発現を導く調節配列の制御下にある、遺伝子産物のコード配列と、（ｂ）ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、またはｍｉＲ－９６のうちの少なくとも１つに特異的な、少なくとも１つの標的配列であって、少なくとも１つの標的配列が、コード配列（ａ）の３’末端で作動可能に連結されている、標的配列と、を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、非ウイルスベクター、ウイルスベクター、または非ベクターベースの送達系によって担持される。特定の実施形態では、組成物は、少なくとも２つの標的配列のタンデムリピートを含み、同じまたは異なり得る、少なくとも１つの第１のｍｉＲＮＡ標的配列と、少なくとも１つの第２のｍｉＲＮＡ標的配列とを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、３’ＵＴＲに位置する少なくとも２つのｍｉＲＮＡタンデムリピートを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、３つのｍｉＲＮＡタンデムリピートを有する３’ＵＴＲを含む。特定の実施形態では、少なくとも２つのＤＲＧ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列は、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方に位置する。特定の実施形態では、発現カセットは、組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えアデノウイルスから選択されるウイルスベクターによって担持される。特定の実施形態では、発現カセットは、非ウイルスベクターまたは送達系によって担持され、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質粒子、ポリマーベースのベクター、またはキトサンベースの製剤から選択される。

特定の実施形態では、発現カセットを含む組成物が提供され、少なくとも２つのｍｉＲＮＡタンデムリピートのうちの第１の開始は、遺伝子コード配列の３’末端から２０ヌクレオチド以内である。特定の実施形態では、組成物は、発現カセットを含み、少なくとも２つのｍｉＲＮＡタンデムリピートのうちの第１の開始は、遺伝子コード配列の３’末端から少なくとも１００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、発現カセットを含む組成物が提供され、３’ＵＴＲおよびｍｉＲＮＡタンデムリピートは、２００～１２００ヌクレオチド長を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、３’ＵＴＲに位置する４つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、組成物が提供され、発現カセットは、５’ＵＴＲ中のｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、またはｍｉＲ－９６に特異的な少なくとも１つの標的配列をさらに含む。特定の実施形態では、発現カセットは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方に位置する少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、５’ＵＴＲに、ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、また
はｍｉＲ－９６に特異的な少なくとも１つの標的配列を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方に位置する少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。

特定の実施形態では、発現カセットを含む組成物が提供され、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であり、スペーサーによって分離されない。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上は、スペーサーによって分離され、各スペーサーは異なる。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列の間に位置するスペーサーは、第１のｍｉＲＮＡ標的配列の３’および／または最後のｍｉＲＮＡ標的配列の５’に位置する。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列の間のスペーサーは、同じである。

特定の実施形態では、ＤＲＧの遺伝子産物の発現を特異的に抑制する遺伝子産物を、それを必要とする患者に送達するための組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が提供され、ｒＡＡＶは、その中にＡＡＶベクターゲノムがパッケージングされるウイルスカプシドを含み、ベクターゲノムは、（ａ）遺伝子産物のコード配列であって、ベクターゲノムを含む細胞において遺伝子産物の発現を導く調節配列の制御下にある、遺伝子産物のコード配列と、（ｂ）ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、またはｍｉＲ－９６のうちの少なくとも１つに特異的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列と、を含む。

特定の実施形態では、組成物は、発現カセットまたはｒＡＡＶと、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、大槽内、または静脈内（ＩＶ）注入を介した送達に好適な製剤緩衝液とを含む。

特定の実施形態では、ＤＲＧニューロンにおける導入遺伝子の発現を抑制するための方法が提供される。本方法は、発現カセットおよび／またはｒＡＡＶを含む組成物を、患者に送達することを含む。特定の実施形態では、本方法は、ｍｉＲＮＡタンデムリピートを含まない遺伝子療法と比較して、免疫抑制療法の用量または持続時間の短縮を可能にする。

特定の実施形態では、髄腔内または全身的遺伝子療法投与後の神経変性を調節する、および／または二次背側脊髄軸索変性を低減するための方法が提供される。本方法は、発現カセットおよび／またはｒＡＡＶを含む組成物を、患者に送達することを含む。特定の実施形態では、本方法は、ｍｉＲＮＡタンデムリピートを含まない遺伝子療法と比較して、免疫抑制療法の用量または持続時間の短縮を可能にする。

特定の実施形態では、髄腔内または全身的遺伝子療法の投与後に、中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞における導入遺伝子の発現を増強するための方法が提供される。本方法は、発現カセットおよび／またはｒＡＡＶを含む組成物を、患者に送達することを含む。特定の実施形態では、発現カセットまたはｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのｍｉＲ１８３標的配列を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子発現は、ＣＮＳの細胞で増強され、錐体ニューロン、プルキンエニューロン、顆粒細胞、紡錘ニューロン、介在神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、および上衣細胞のうちの１つ以上を含む。

本発明の他の態様および利点は、以下の本発明の詳細な説明から、容易に明らかとなるであろう。

ＡＡＶのＩＣＭ投与後の、ＤＲＧ毒性および二次軸索障害を示す。（図１Ａ）ＤＲＧは、感覚偽単極ニューロンの細胞体を含有し、これらは、末梢神経に位置する末梢軸索と、脊髄の上行性背側白質路に位置する中枢軸索とを介して、感覚メッセージを末梢からＣＮＳに中継する。（図１Ｂ）軸索障害およびＤＲＧ神経変性。軸索障害（左上）は、空であるか（欠損軸索）、またはミエリンを消化するマクロファージおよび細胞デブリ（矢印）で満たされているかのいずれかである明らかな空胞として現れる。ＤＲＧ病変（右上および左下）は、単核細胞の浸潤（丸）を伴うニューロン細胞体の変性（矢印）からなる。ニッスル小体の溶解（中心性色質融解）に起因する好酸球性（ピンク）細胞質は、変性ニューロンを特徴とする。細胞型の増加は、衛星細胞の増殖（衛星病変）および炎症性細胞浸潤に起因する。一部の単核細胞は、浸潤し、神経細胞体を貪食する（神経貪食）。右下の写真は、ＡＡＶ（この場合、ＧＦＰ）によってコードされる導入遺伝子の免疫染色を示す。変性変化および単核細胞浸潤を示すニューロンは、最も強いタンパク質発現を示すニューロンである（ＩＨＣの濃褐色染色によって証明される）。（図１Ｃ）グレード１～グレード５のＤＲＧ病変およびグレード１～グレード４の背側脊髄軸索障害の例。重症度のグレードは、以下のように定義される：１．最小（１０％未満）、２．軽度（１０～２５％）、３．中等度（２５～５０％）、４．顕著（５０～９５％）、および５．重度（９５％超）。グレード５は、脊髄では全く観察されなかった。矢印および丸印は、ＤＲＧへの単核細胞の浸潤を伴う神経変性（左カラム）および軸索障害（右カラム）を描写する。 ｍｉＲＮＡ誘導サイレンシングを使用した過剰発現関連毒性モデルおよび緩和戦略を示す。（図２Ａ）擬単極感覚ニューロンの細胞体は、ＤＲＧ内に位置し、衛星細胞および有窓型毛細血管に囲まれる。偽単極感覚ニューロンの末梢軸索は、末梢神経に位置し、中枢軸索は、脊髄の背側路に位置する。ＡＡＶベクターは、転写およびタンパク質合成機構をハイジャックおよび過負荷し、したがって、ＥＲストレスおよび遠位軸索を維持する二次的な不全をもたらす。衛星細胞は反応性増殖を経て、サイトカインを分泌することによって、リンパ球などの炎症性細胞を引き寄せる。これらの可逆的な変化は、細胞死をもたらす可能性がある。その後、グリア細胞およびマクロファージは、浸潤し、神経細胞体を貪食する。（図２Ｂ）ＤＲＧ特異的サイレンシングのための例示的なＡＡＶ発現カセット設計。ｍｉＲＮＡ逆相補配列（ｍｉＲ標的または標的配列）の４つの短いタンデムリピートを、終止コドンとポリ－Ａとの間に導入する。ＤＲＧニューロンにおいて、ｍｉＲＮＡ１８３などのｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に結合し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を動員し、次いでｍＲＮＡ切断によるサイレンシングをもたらす。ｍｉＲＮＡ１８３を発現しない他の細胞型では、３’ＵＴＲ領域からの影響なしに、翻訳およびタンパク質合成が起こる。 インビトロおよびマウスのＤＲＧニューロンにおける導入遺伝子の発現を特異的にサイレンシングするｍｉＲ１８３標的を示す。（図３Ａ）ｍｉＲ１８３またはｍｉＲ１４５の標的を保有するＧＦＰ発現ＡＡＶプラスミド、ならびに対照またはｍｉＲ１８３の発現ベクターにより、２９３細胞を一過的に共トランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後にＧＦＰタンパク質レベルを検出し、ウェスタンブロッティングでそのレベルを定量化した。実験は、３重で実施した。エラーバーは、標準偏差を示す。（図３Ｂ）４×１０１2ｇｃの用量で、Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスＩＶにＡＡＶ９．ＣＢ７．ＧＦＰ対照ベクターまたはＡＡＶ９．ＣＢ７．ＧＦＰ－ｍｉＲベクターを注入した。本発明者らは、ｍｉＲ１８３、ｍｉＲ１４５、およびｍｉＲ１８２の３つのＤＲＧ濃縮ｍｉＲをスクリーニングした。注入から２週間後にＤＲＧを採取し、ＩＨＣを使用してＧＦＰについて染色した。ＩｍａｇｅＪ細胞計数ツールを使用して、総ＤＲＧニューロンに対するＧＦＰ発現ニューロンのパーセンテージをカウントした。ウィルコクソン検定：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。（図３Ｃ）ここでは、パネル図３Ｂで定量化されたＤＲＧ由来のＧＦＰ免疫染色の代表的な写真を示す。（図３ｄ）Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、ＩＶでＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ＣＢ７．ＧＦＰ対照ベクターまたはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ＣＢ７．ＧＦＰ－ｍｉＲ（ｍｉＲ１８３、ｍｉＲ１４５、ｍｉＲ１８２）を注入した。注入の３週間後、蛍光顕微鏡を使用して直接ＧＦＰ観察のために、ＣＮＳおよび肝臓を回収した。ここでは、小脳、皮質、および肝臓の代表的な写真を示す。 ＮＨＰへのＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰのＩＣＭ投与後、ＤＲＧにおけるＧＦＰ発現を特異的にサイレンシングし、毒性を低減するｍｉＲ１８３標的を示す。本発明者らは、成体アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）に、ＩＣＭで、３．５×１０^１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＧＦＰ対照ベクター（ｎ＝２）またはＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＧＦＰ－ｍｉＲ１８３（ｎ＝４）を注入した。注入の２週間後、半数の動物を、ＧＦＰ発現分析のために犠牲にし、注入の２ヶ月後、残りの半数を、ＧＦＰ発現および組織病理学のために犠牲にした。（図４Ａ）ベクター投与の２週間後の、ＤＲＧ、脊髄運動ニューロン、小脳、皮質、心臓、および肝臓のＧＦＰ免疫染色切片の代表的な写真。（図４Ｂ）ＮＨＰのＤＲＧ（感覚ニューロン）、脊髄（下位運動ニューロン）、小脳、および皮質におけるＧＦＰ陽性細胞の定量化（ｎ＝２：ＡＡＶ．ＧＦＰ、ｎ＝４：ＡＡＶ．ＧＦＰ－ｍｉＲ１８３）。ＩｍａｇｅＪ細胞計数ツールを使用して、動物あたりの領域あたり少なくとも５箇所の倍率２０倍の視野を定量化した。エラーバーは、標準偏差を示す。ウィルコクソン検定：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。（図４Ｃ）注入の２ヶ月後の組織病理では、背側脊髄軸索障害、末梢神経軸索障害（正中神経、腓骨神経および橈骨神経）、ならびにＤＲＧ神経変性および単核浸潤の重症度グレードを示す。ベクター群に対して盲検化された委員会認定の獣医病理学者が、重症度グレードを確立し、以下の定義がなされた：１．最小（１０％未満）、２．軽度（１０～２５％）、３．中等度（２５～５０％）、４．顕著（５０～９５％）、および５．重度（９５％超、観察されなかった）。各バーは、１匹の動物を表す。０は、病変の不在を表す。 ＮＨＰへのＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡのＩＣＭ投与後の、ＤＲＧにおけるｈＩＤＵＡの発現を特異的にサイレンシングするｍｉＲ１８３標的を示す。成体アカゲザルに、ＩＣＭで、１）１×１０１3 ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ対照ベクター（ｎ＝３）、２）予防的ステロイド処置（－７日目～３０日目まで１ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾロン、続いて漸進的な漸減）を伴う、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ対照ベクター（ｎ＝３）、または３）ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ－ｍｉＲ１８３（ｎ＝３）のいずれかを注入した。動物は、注入の３ヶ月後、導入遺伝子の発現および組織病理を分析するために犠牲にされた。代表的な写真は、抗ｈＩＤＵＡ抗体免疫蛍光（ＤＲＧ、最初の行）、抗ｈＩＤＵＡのＩＨＣ（下位運動ニューロン、小脳、皮質）、および抗ＩＤＵＡのＩＳＨ（ＤＲＧ、最後の行）によるｈＩＤＵＡ発現の分析を示す。ｈＩＤＵＡのＩＳＨ：曝露時間は、ステロイドの有無にかかわらず、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡに対して２００ｍｓである。感覚ニューロンは、大量の導入遺伝子ｍＲＮＡの発現を示す。ＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ－ｍｉＲ１８３に対する曝露時間は、１秒である。感覚ニューロンは、核および細胞質において、低いＩＳＨシグナル（ｍＲＮＡ）を有する。ｍＲＮＡは、このより長い曝露時間で、ニューロンを取り囲む衛星細胞において見ることができる。 ｍｉＲ１８３媒介性サイレンシングがＤＲＧニューロンに特異的であり、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡによりＩＣＭで処置されたＮＨＰにおけるＤＲＧ毒性を、完全に阻止することを示す。（図６Ａ）ＮＨＰのＤＲＧ（感覚ニューロン）、脊髄（下位運動ニューロン）、小脳、および皮質における、ｈＩＤＵＡ陽性細胞の定量化（群あたりｎ＝３）。動物毎に、領域あたり最小５箇所の２０倍の倍率視野を定量化した。エラーバーは、標準偏差を表す。ウィルコクソン検定：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。（図６Ｂ）注入３ヶ月後の組織病理スコアリング：背側軸索障害累積スコア（頸髄、胸髄、および腰髄セグメントからの重症度グレードの合計－最大可能スコアは１５）、ＤＲＧ累積スコア（頸髄、胸髄、および腰髄セグメントからの重症度グレードの合計－最大可能スコアは１５）、ならびに中央値神経スコア（軸索障害および線維症の重症度グレードの合計－最大可能スコアは１０）。ベクター群に対して盲検化された委員会認定の獣医病理学者が、重症度グレードを確立し、以下の定義がなされた：１．最小（１０％未満）、２．軽度（１０～２５％）、３．中等度（２５～５０％）、４．顕著（５０～９５％）、および５．重度（９５％超、観察されなかった）。０は、病変の不在を表す。エラーバーは、標準偏差を表す。（図６Ｃ）ｈＩＤＵＡ導入遺伝子特異的プローブ、高倍率のＤＲＧ感覚ニューロンおよび衛星細胞を使用するＩＳＨ、青色ＤＡＰＩでの核の対比染色による１秒の曝露時間。矢印：ＤＲＧ感覚ニューロン、矢じり：衛星細胞。 ＮＨＰのｈＩＤＵＡに対するＴ細胞および抗体応答を示す。成体アカゲザルに、ＩＣＭで、１）１×１０^１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ対照ベクター（ｎ＝３）、２）予防的ステロイド処置（－７日目～３０日目まで１ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾロン、続いて漸進的な漸減）を伴う、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ対照ベクター（ｎ＝３）、または３）ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ－ｍｉＲ１８３（ｎ＝３）のいずれかを注入した。（図７Ａ～図７Ｃ）注入の９０日後に、ＰＢＭＣ、脾臓、肝臓、および深部頸部リンパ節から単離されたリンパ球におけるインターフェロンγのＥＬＩＳＰＯＴ応答。各動物は、異なるペプチドプールを表す３つの値を有する（ｈＩＤＵＡ配列全体をカバーする３つの重複ペプチドプール）。赤色は、陽性ＥＬＩＳＰＯＴ応答を示し、スポット形成単位が１０６個のリンパ球あたり５５超、および未刺激時の培地陰性対照の３倍として定義される。（図７Ｄ）抗ｈＩＤＵＡ抗体のＥＬＩＳＡアッセイ、血清希釈は１：１，０００。 ＣＳＦにおけるサイトカイン／ケモカインの濃度を示す。試料は、ベクターの投与時点（Ｄ０）、ならびにベクターの投与後２４時間（２４時間）、２１日目（Ｄ２１）および３５日目（Ｄ３５）に回収された。 ＮＨＰの脳、脊髄、およびＤＲＧにおけるベクターの生体分布を示す。成体アカゲザルに、ＩＣＭで、１）１×１０^１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ対照ベクター（ｎ＝３）、２）予防的ステロイド処置（－７日目～３０日目まで１ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾロン、続いて漸進的な漸減）を伴う、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ対照ベクター（ｎ＝３）、または３）ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ－ｍｉＲ１８３（ｎ＝３）のいずれかを注入した。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＭｉｎｉキットでＮＨＰ組織ＤＮＡを抽出した。本発明者らは、Ｔａｑｍａｎ試薬およびベクターのｒＢＧポリアデニル化配列を標的とするプライマー／プローブを使用して、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によってベクターゲノムを定量化した。結果は、二倍体ゲノムあたりのゲノムコピーで表現される。エラーバーは、標準偏差を表す。

本明細書に提供される組成物および方法は、ｍｉＲＮＡの使用によってＤＲＧニューロンにおける導入遺伝子の発現を抑制するための、遺伝子送達の療法に有用である。本明細書で使用される場合、「抑制」という用語は、導入遺伝子発現の部分的な低減、または完全な消滅、またはサイレンシングを含む。導入遺伝子発現は、選択された導入遺伝子に好適なアッセイを使用して評価されてもよい。提供される組成物および方法は、神経変性、二次背側脊髄軸索変性、および／または単核細胞浸潤によって特徴付けられるＤＲＧの毒性を減少させる。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、遺伝子産物コード配列の３’側の非翻訳領域（ＵＴＲ）に、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含む。好適には、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列がタンデムで提供され、任意選択的に、スペーサー配列によって分離される。特定の実施形態では、４つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列がタンデムで提供され、任意選択的に、スペーサー配列によって分離される。特定の実施形態では、３つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列がタンデムで提供され、任意選択的に、スペーサー配列によって分離される。様々な送達システムは、対象（例えば、ヒト患者）に発現カセットを送達するために使用され得る。かかる送達系は、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、または非ベクターベースの系（例えば、リポソーム、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡなど）であってもよい。これらの送達系は、中枢神経系（ＣＮＳ）、末梢神経系（ＰＮＳ）、または静脈内もしくは代替の送達経路に直接送達するために使用され得る。他の実施形態では、これらの組成物および方法は、遺伝子療法ベクター（例えば、ｒＡＡＶ）の全身送達のために使用される。特定の実施形態では、これらの組成物および方法は、高用量
のベクター（例えば、ｒＡＡＶ）が送達される場合に有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法は、低減された用量、低減された長さ、および／または低減された数の免疫調節物質が、遺伝子療法ベクター（例えば、ｒＡＡＶ媒介性遺伝子療法）と同時投与されることを可能にする。特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法は、ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ）の投与前、投与時、および／または投与後に、免疫抑制剤または免疫調節療法を同時投与する必要性を排除する。

「５’ＵＴＲ」は、遺伝子産物のコード配列の開始コドンの上流にある。５’ＵＴＲは、一般に、３’ＵＴＲよりも短い。一般に、５’ＵＴＲは、約３ヌクレオチド長～約２００ヌクレオチド長であるが、任意選択的に、より長くてもよい。

「３’ＵＴＲ」は、遺伝子産物のコード配列の下流にあり、一般に、５’ＵＴＲよりも長い。特定の実施形態では、３’ＵＴＲは、約２００ヌクレオチド長～約８００ヌクレオチド長であるが、任意選択的に、より長くても、またはより短くてもよい。

本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ」は、マイクロＲＮＡを指し、それは、ｍＲＮＡを調節し、タンパク質への翻訳を停止させる小さな非コードＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、ヌクレオチドの領域である「シード配列」を含み、相補的な塩基対形成によってｍＲＮＡに特異的に結合し、ｍＲＮＡの破壊またはサイレンシングをもたらす。特定の実施形態では、シード配列は、成熟ｍｉＲＮＡに位置し（５’から３’へ）、一般に、ｍｉＲＮＡの２～７位または２～８位（センス（＋）鎖の５’末端から）に位置するが、鎖長よりも長くてもよい。特定の実施形態では、シード配列の長さは、ｍｉＲＮＡ配列の長さの約３０％以上であり、少なくとも７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、７ヌクレオチド～２８ヌクレオチド長、８ヌクレオチド～１８ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド～２８ヌクレオチド長、約２０～約２６ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、または約２６ヌクレオチドであり得る。

本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ標的配列」は、ＤＮＡプラス鎖上に位置する配列（５’から３’）であり、ｍｉＲＮＡシード配列を含むｍｉＲＮＡ配列に少なくとも部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡ標的配列は、コードされた導入遺伝子産物の非翻訳領域に対して外因性であり、導入遺伝子発現の抑制が所望される細胞で、ｍｉＲＮＡによって特異的に標的化されるように設計される。「ｍｉＲ１８３クラスター標的配列」という用語は、ｍｉＲ－１８３、－９６および－１８２（Ｄａｍｂａｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４３：７１７３－７１８８，２０１５によって記載されている、参照により本明細書に援用される）を含む、ｍｉＲ１８３クラスター（あるいはファミリーと称される）のうちの１つ以上のメンバーに応答する標的配列を指す。理論に束縛されることを意図するものではないが、導入遺伝子（遺伝子産物をコードする）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、ｍｉＲＮＡを含有する発現カセットが送達される細胞型に存在し、その結果、３’ＵＴＲ ｍｉＲＮＡの標的配列に対するｍｉＲＮＡの特異的結合が、ｍＲＮＡのサイレンシングおよび切断をもたらし、それによって、ｍｉＲＮＡを発現する細胞においてのみ、導入遺伝子の発現が低減または排除される。

典型的には、ｍｉＲＮＡ標的配列は、少なくとも７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、７ヌクレオチド～２８ヌクレオチド、８ヌクレオチド～１８ヌクレオチド長、約１２～約２８ヌクレオチド長、約２０～約２６ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、または約２６ヌクレオチドであり、ｍｉＲＮＡシード配列に相補的である少なくとも１つの連続領域（例えば、７または８ヌクレオチド）を含有する。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシ
ード配列と正確な相補性（１００％）を有する配列、またはｍｉＲＮＡシード配列といくつかのミスマッチを含む部分的な相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である少なくとも７～８個のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である配列からなる。特定の実施形態では、標的配列は、シード配列と１００％相補的である配列を複数コピー（例えば、２または３コピー）含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、標的配列の残部は、ｍｉＲＮＡに対して少なくとも約８０％～約９９％の相補性を有する。特定の実施形態では、ＤＮＡプラス鎖を含む発現カセットでは、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡの逆相補である。

特定の実施形態では、操作された発現カセットまたはベクターゲノムが、本明細書で提供され、ＤＲＧにおける導入遺伝子の発現を抑制するために、ならびに／またはＤＲＧ毒性および／もしくは軸索障害を低減もしくは排除するために、導入遺伝子に作動可能に連結されたｍｉＲ－１８３ファミリーまたはクラスターのうちの１つ以上のメンバーを対象とする少なくとも１つのコピーのｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、操作された発現カセットまたはベクターゲノムは、複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、ｍｉＲＮＡ標的配列の数が、ＤＲＧ毒性および／または軸索障害を低減および／または排除するために、ＤＲＧにおける導入遺伝子の発現を低減または最小化するのに十分であるようにする。発現カセットまたはベクターゲノムは、任意の好適な担体系、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを介して、任意の経路を介して送達され得るが、髄腔内投与に特に有用である。

本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」または「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への、より詳細には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔空間内への注入を介した、投与経路を指す。髄腔内送達は、腰椎穿刺、脳室内（側脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／大槽内、および／またはＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰椎穿刺により、クモ膜下腔空間にわたって拡散させるために導入され得る。別の実施例では、注入は、大槽内であり得る。

本明細書で使用される場合、「槽内送達」または「槽内投与」という用語は、大槽小脳延髄（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｍｅｄｕｌａｒｉｓ）の脳脊髄液内への直接的な投与経路、より詳細には、後頭下穿刺を介した、または大槽内への直接的な注入による、または永久的に配置されたチューブを介した、投与経路を指す。

意外にも、ＤＲＧにおける発現を抑制するための本明細書に記載のｍｉＲ－１８３標的配列を含む組成物は、これらに限定されないが、ニューロン（例えば、錐体細胞、プルキンエ細胞、顆粒細胞、紡錘細胞、および介在神経細胞を含む）、またはグリア細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、および上衣細胞を含む）を含む、中枢神経系内の１つ以上の異なる細胞型（ＤＲＧ以外）において強化された導入遺伝子発現を提供することが観察されている。この観察は髄腔内送達経路後に行われたが、このＣＮＳ増強効果は、ＣＮＳ送達経路に限定されず、他の経路（例えば、高用量静脈内送達経路、高用量筋肉内送達経路、または他の全身送達経路）を使用して達成され得る。

特定の実施形態では、導入遺伝子のＣＮＳ発現の増強を回避するために（ＤＲＧ発現を抑制しながら）、ＣＮＳを標的としない導入遺伝子を含む発現カセット用のｍｉＲ－１８２標的配列および／またはｍｉＲ－９６標的配列を選択したい場合がある。例えば、骨格筋または肝臓への送達のための導入遺伝子を含む発現カセットは、ＣＮＳ発現のいかなる増強も避けたいが、必要とされ得る高用量と関連し得るＤＲＧ毒性および／または軸索障害を防止し得る。

特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８３の標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、

を含むｍｉＲ－１８３標的配列を含む（ｍｉＲ－１８３シード配列に相補的な配列には、下線が引かれている）。特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８３シード配列に１００％相補的な配列を、２コピー以上（例えば、２または３コピー）含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８３シード配列に少なくとも１００％相補的な領域を、少なくとも１つ含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１に部分的に相補的な配列を含み、したがって、配列番号１に整列させた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１に整列させた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、１００％相補的な領域を含み、また、ｍｉＲ－１８３標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８３シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８３と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３標的配列を含み、切断された配列番号１（すなわち、配列番号１の５’末端もしくは３’末端のいずれかまたは両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを欠く配列）を含む。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８３標的配列とを含む。さらに他の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、または４つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。

特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、ｍｉＲＮＡ標的配列の組み合わせを含む。特定の実施形態では、標的配列の組み合わせは、同じｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１８３など）と少なくとも部分的な相補性を有する異なる標的配列を含む。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、ｍｉＲＮＡ標的配列の組み合わせを含み、本明細書で提供されるｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、および／またはｍｉＲ－９６の標的配列から選択される。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、導入遺伝子と、２つ、３つ、または４つのｍｉＲ－９６標的配列とを含む。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、導入遺伝子と、２つ、３つ、または４つのｍｉＲ－１８２標的配列とを含む。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つのｍｉＲ－１８３標的配列を含み、任意選択的に、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つのｍｉＲ－１８２標的配列との組み合わせ、および／または任意選択的に、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つのｍｉＲ－９６標的配列との組み合わせを含む。

導入遺伝子およびｍｉＲ－１８２を含む組成物は、後根神経節毒性を最小化または排除し、および／または軸索障害を防止することが観察されている。しかしながら、ｍｉＲ－１８２標的配列を含む発現カセットまたはベクターゲノムは、この目的には有効であるが、意外にもｍｉＲ－１８３標的配列を有した複合体で見出されたように、ＣＮＳ発現を増強することが観察されていない。したがって、これらの組成物は、遺伝子がＣＮＳ以外を標的とすることが望ましい場合がある。

特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムが、本明細書で提供され、１つ以上のｍｉＲ－１８３ファミリーの標的配列を含み、導入遺伝子を欠く（すなわち、ｍｉＲ－１８３ファミリーの標的配列（複数可）が、異種遺伝子産物をコードする配列に作動可能に連結されていない）。

特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８２の標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８２標的配列を含み、ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号３）を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８２シード配列に１００％相補的である配列を、２コピー以上（例えば、２または３コピー）含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８２シード配列に少なくとも１００％相補的な少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、配列番号３に部分的に相補的な配列を含み、したがって、配列番号３と整列させた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号３と整列させた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、１００％相補的な領域を含み、また、ｍｉＲ－１８２標的配列の長さの少なくとも３０％も含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８２シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８２と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８２標的配列を含み、ｍｉＲ－１８２標的配列は、切断された配列番号３（すなわち、配列番号３の５’末端もしくは３’末端のいずれかまたは両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを欠く配列）を含む。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８２標的配列とを含む。さらに他の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、または４つのｍｉＲ－１８２標的配列を含む。

特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列を有し、連続的であり、スペーサーによって分離されていない。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上は、スペーサーによって分離されている。特定の実施形態では、スペーサーは、約１～約１２ヌクレオチド、または約２～約１０ヌクレオチド長、または約３～約１０ヌクレオチド、約４～約６ヌクレオチド長、または３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１ヌクレオチド長の非コード配列である。任意選択的に、単一の発現カセットは、３つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよく、任意選択的に、それらの間に異なるスペーサー配列を有する。特定の実施形態では、１つ以上のスペーサーは、独立して、（ｉ）ＧＧＡＴ（配列番号５）、（ｉｉ）ＣＡＣＧＴＧ（配列番号６）、または（ｉｉｉ）ＧＣＡＴＧＣ（配列番号７）から選択される。特定の実施形態では、スペーサーは、第１のｍｉＲＮＡ標的配列の３’および／または最後のｍｉＲＮＡ標的配列の５’に位置する。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列の間のスペーサーは、同じである。

特定の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８３標的配列と、１つ以上の異なるｍｉＲＮＡ標的配列とを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、ｍｉＲ－９６標的配列：ｍＲＮＡおよびＤＮＡプラス鎖（５’から３’へ）ＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号２）、ｍｉＲ－１８２標的配列：ｍＲＮＡおよびＤＮＡプラス鎖（５’から３’へ）：および／またはＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号３）を含む。

ｍｉＲ－１４５は、文献では、脳に関連しているが、これまでの研究では、ｍｉＲ－１４５標的配列は、後根神経節における導入遺伝子の発現の低減には効果がないことが示されている。ｍｉＲ－１４５標的配列：ｍＲＮＡおよびＤＮＡプラス鎖（５’から３’へ）ＡＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＡＣ（配列番号４）

本明細書に提供されるように、発現カセットおよびベクターゲノムは、導入遺伝子を含み、標的細胞における導入遺伝子産物の発現を導く調節配列に作動可能に連結されるか、またはその制御下にある。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、導入遺伝子を含み、本明細書で提供される１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含むように設計される。ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子のＵＴＲに組み込まれる（すなわち、遺伝子のオープンリーディングフレームの３’または下流）。

「タンデムリピート」という用語は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の存在を指すように本明細書で使用される。これらのｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であってもよい。すなわち、ある配列の３’末端が、介在配列なしで、次の配列の５’末端の直ぐ上流にあるように、またはその逆でもよく、次々と直に位置している。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、短いスペーサー配列によって分離されている。

本明細書で使用される場合、「スペーサー」としては、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長の任意の選択された核酸配列であり、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の間に位置する。特定の実施形態では、スペーサーは、１～８ヌクレオチド長、２～７ヌクレオチド長、３～６ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、４～９ヌクレオチド、３～７ヌクレオチド、またはより長い値である。好適には、スペーサーは、非コード配列である。特定の実施形態では、スペーサーは、４つの（４）ヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、スペーサーは、ＧＧＡＴである。特定の実施形態では、スペーサーは、６つの（６）ヌクレオチドである。特定の実施形態では、スペーサーは、ＣＡＣＧＴＧまたはＧＣＡＴＧＣである。

特定の実施形態では、タンデムリピートは、２つ、３つ、４つ以上の同じｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、タンデムリピートは、少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、または少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列などを含む。特定の実施形態では、タンデムリピートは、２つまたは３つの同じｍｉＲＮＡ標的配列、および異なる第４のｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。

特定の実施形態では、発現カセットには、少なくとも２つの異なるセットのタンデムリピートが存在し得る。例えば、３’ＵＴＲは、導入遺伝子、ＵＴＲ配列のすぐ下流にタンデムリピート、およびＵＴＲの３’末端の近くに２つ以上のタンデムリピートを含み得る。別の例では、５’ＵＴＲは、１つ、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。別の例では、３’は、タンデムリピートを含んでもよく、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。

特定の実施形態では、発現カセットは、２つ、３つ、４つ以上のタンデムリピートを含み、導入遺伝子の終止コドンの約０～２０ヌクレオチド以内に開始する。他の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンから少なくとも１００～約４０００ヌクレオチドのｍｉＲＮＡタンデムリピートを含む。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、他の構成要素または方法ステップを含む用語を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、関連する実施形態は
、他の構成要素または方法ステップを除外する「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語、および実施形態または発明の性質を実質的に変化させるいずれの構成要素または方法ステップを除外する「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語を使用する説明が含まれることを理解されたい。本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて示されているが、様々な状況下では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を使用して記載されることも理解されるべきである。

「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「ベクター（ａ ｖｅｃｔｏｒ）」は、１つ以上のベクターを表すと理解されることを留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照からプラスまたはマイナス１０％の可変性を意味する。

１．発現カセット
本明細書に記載される「発現カセット」は、標的細胞におけるその発現を誘導する調節配列およびＵＴＲのｍｉＲＮＡ標的配列に作動可能に連結された機能的な遺伝子産物をコードする核酸配列を含む。本明細書に記載されるように、ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子の発現が望ましくないおよび／または導入遺伝子の発現レベルの低下が所望される細胞に存在するｍｉＲＮＡによって、特異的に認識されるように設計される。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、後根神経節における導入遺伝子の発現を特異的に低減する。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、および／または３’ＵＴＲと５’ＵＴＲの両方に位置する。本明細書に見出されるｍｉＲＮＡ標的配列の考察は、参照により本明細書に援用される。

一実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子産物のＤＲＧ発現を低減または排除しながら、ヒト対象における発現のために設計される。一実施形態では、発現カセットは、脳脊髄液および脳を含む中枢神経系（ＣＮＳ）における発現のために設計される。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、神経細胞（錐体細胞、プルキンエ細胞、顆粒細胞、紡錘細胞、および介在神経細胞など）ならびにグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、および上衣細胞など）を含む、ＣＮＳに存在する１つ以上の細胞型（後根神経節を除く）における導入遺伝子の発現または増強された発現のために設計される。特定の実施形態では、導入遺伝子の発現の増強は、１つ以上の細胞型で達成され、ＣＮＳの別の細胞型における導入遺伝子の発現がほとんどまたは全くない。特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＮＳの細胞以外の細胞での発現に有用である。

本明細書で使用される場合、「発現」または「遺伝子発現」という用語は、遺伝子からの情報が、機能的な遺伝子産物の合成に使用されるプロセスを指す。遺伝子産物は、タンパク質、ペプチド、または核酸ポリマー（ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＰＮＡなど）であり得る。

本明細書で使用される場合、「調節配列」または「発現制御配列」という用語は、イニシエーター配列、エンハンサー配列、およびプロモーター配列などの核酸配列を指し、それらが作動可能に連結しているタンパク質をコードする核酸配列の転写を誘導するか、抑制するか、またはその他制御する。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、遺伝子産物をコードする核酸配列に連続している発現制御配列、および／またはその転写および発現をトランスでもしくは離れて作用する発現制御配列の両方を指す。

核酸配列またはタンパク質を説明するために使用される「外因性」という用語は、核酸またはタンパク質が、染色体または宿主細胞に存在する位置では、天然に存在しないことを意味する。外因性核酸配列はまた、同じ宿主細胞または対象に由来し、それらに挿入されるが、非天然状態（例えば、異なるコピー数、または異なる調節エレメントの制御下）で存在する配列を指す。

核酸配列またはタンパク質を説明するために使用される場合、「異種」という用語は、核酸またはタンパク質が、それが発現される宿主細胞または対象とは異なる生物または同じ生物の異なる種に由来したことを意味する。タンパク質、またはプラスミド、発現カセット、もしくはベクターの核酸を参照して使用される場合、「異種」という用語は、タンパク質または核酸が、問題のタンパク質または核酸が天然には互いに同じ関係で見出されないタンパク質または核酸とは別の配列もしくはサブ配列と共に存在することを示す。

一実施形態では、調節配列は、プロモーターを含む。一実施形態では、プロモーターは、ニワトリβアクチンプロモーターである。さらなる実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーおよびニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢ７プロモーター）のハイブリッドである。別の実施形態では、好適なプロモーターとしては、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター（例えば、Ｋｉｍ ＤＷ ｅｔ ａｌ，Ｕｓｅ
ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ．１９９０ Ｊｕｌ １６；９１（２）：２１７－２３を参照されたい）、シナプシン１プロモーター（例えば、Ｋｕｇｌｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｓｉｎ １ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｅｒｓ ｈｉｇｈｌｙ ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ
ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ａｒｅａ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００３ Ｆｅｂ；１０（４）：３３７－４７を参照されたい）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、Ｋｉｍ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｒｉｃｈ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＮＣａＰ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００４ Ｆｅｂ；１４５（２）：６１３－９．Ｅｐｕｂ ２００３ Ｏｃｔ １６を参照されたい）、またはＣＢ６プロモーター（例えば、Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ－９ Ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｅｎｅ，Ｍｏｌ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．２０１６
Ｊａｎ；５８（１）：３０－６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０３３－０１５－９８９９－５を参照されたい）が挙げられ得るが、これらに限定されない。

好適なプロモーターを選択することができ、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、または誘導性／調節性プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。構成的プロモーターの例は、ニワトリβアクチンプロモーターである。様々なニワトリβアクチンプロモーターが単独で、または様々なエンハンサーエレメントと組み合わせて記載されている（例えば、ＣＢ７：サイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを有するニワ
トリβアクチンプロモーターである、ＣＡＧプロモーター：ニワトリβアクチンの最初のエキソンおよび最初のイントロンとウサギβグロビン遺伝子のスプライスアクセプターとを含む、ＣＢｈプロモーター：ＳＪ Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１１ Ｓｅｐ；２２（９）：１１４３－１１５３）。組織特異的であるプロモーターの例は、肝臓（アルブミン：Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４－３２、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター：Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）：Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４）、ニューロン（ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター：Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．ＮｅｕｒｏＢｉｏｌ．，１３：５０３－１５、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子：Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子：Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ
ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４など）、ならびに他の組織について周知である。代替的には、調節可能なプロモーターが選択されてもよい。例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８Ｂ２を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。

一実施形態では、調節配列は、エンハンサーをさらに含む。一実施形態では、調節配列は、１つのエンハンサーを含む。別の実施形態では、調節配列は、２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは、同じであっても、異なってもよい。例えば、エンハンサーは、αｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、またはＣＭＶエンハンサーを含んでもよい。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーに存在し得る。代替的には、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列により分離され得る。

一実施形態では、調節配列は、イントロンをさらに含む。さらなる実施形態では、イントロンは、ニワトリβアクチンイントロンである。他の好適なイントロンには、当該技術分野で既知のものが含まれ、ヒトβグロブリンイントロン、および／または市販のＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）のイントロン、ならびにＷＯ２０１１／１２６８０８に記載のものであってもよい。

一実施形態では、調節配列は、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）をさらに含む。さらなる実施形態では、ポリＡは、ウサギグロビンポリＡである。例えば、ＷＯ２０１４／１５１３４１を参照されたい。あるいは、別のポリＡ（例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリＡ、または合成ポリＡ）が、発現カセットに含まれ得る。

本明細書に記載の発現カセットにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

発現カセットは、任意の好適な非ウイルスベクター送達系を介して、または好適なウイルスベクターによって送達され得る。好適な非ウイルスベクター送達系は、当該技術分野において既知であり（例えば、Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈ ａｎｄ Ｎａｒｖｅｋａｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｒｅｓ．２０１５ Ｊａｎ；９（１）：ＧＥ０１－ＧＥ０６、参照により本明細書に援用される）、当業者によって容易に選択され得、例えば、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、デンドリマー、ＰＬＧＡ、ポリメタクリレート、無機粒子、脂質粒子、ポリマーベースのベクター、またはキトサンベースの製剤を含み得る。

２．ベクター
本明細書で使用される「ベクター」は、核酸配列を含む生物学的または化学的部分であ
り、上記の核酸配列の複製または発現のために適切な標的細胞に導入され得る。ベクターの例としては、組換えウイルス、プラスミド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）コンジュゲート、磁性粒子、またはナノ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ベクターは、核酸分子であり、機能的な遺伝子産物をコードする外因性核酸もしくは異種核酸または操作された核酸を含み、その後、適切な標的細胞に導入され得る。かかるベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点と、組換えＤＮＡが挿入され得る１つ以上の部位とを有する。ベクターは、しばしば、ベクターを有する細胞が、ベクターを有しない細胞から選択され得る手段を有する（例えば、それらが薬物耐性遺伝子をコードする）。一般的なベクターは、プラスミド、ウイルスゲノム、および「人工染色体」を含む。ベクターの生成、産生、特徴付け、または定量化の従来の方法は、当業者に利用可能である。

一実施形態では、ベクターは、非ウイルスプラスミドであり、その記載される発現カセット（例えば、「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）を含み、様々な組成物およびナノ粒子（例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物、および他のポリマー、脂質および／またはコレステロール系－核酸コンジュゲート、ならびに本明細書に記載されるような他の構築物を含む）と結合される。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７；ｗｅｂ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ：Ｍａｒｃｈ ２１，２０１１、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２、およびＷＯ２０１２／１７０９３０を参照されたい（これらのすべては、参照により本明細書に援用される）。

特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、「複製欠陥ウイルス」または「ウイルスベクター」は、合成または人工のウイルス粒子を指し、機能的な遺伝子産物をコードする核酸配列と、ＤＲＧ脱標的化（ｄｅｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ）ｍｉＲＮＡ標的配列とを含む発現カセットが、ウイルスのカプシドもしくはエンベロープにパッケージングされ、同様に、ウイルスのカプシドもしくはエンベロープ内にパッケージングされるいずれのウイルスゲノム配列も、複製欠陥である（つまり、標的細胞に感染する能力を保持するが、子孫ビリオンを生成することはできない）。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅およびパッケージングに必要とされるシグナルに隣接するコードする核酸配列のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製および感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。

本明細書で使用される場合、組換えウイルスベクターは、任意の好適なウイルスベクターである。実施例は、例示的な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。他の好適なウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス、ボカウイルス、ハイブリッドＡＡＶ／ボカウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはレンチウイルスが挙げられ得る。好ましい実施形態では、これらの組換えウイルスは、複製不能である。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ）が産生されるパッケージング細胞株を指し得る。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞（例えば、ヒト、昆虫、または酵母）であり得、任意の手段で（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合）、細胞に導入される外因性ＤＮＡま
たは異種ＤＮＡを含む。宿主細胞の例としては、限定されないが、単離された細胞、細胞培養物、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、非哺乳類細胞、昆虫細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、中枢神経系の細胞、ニューロン、グリア細胞、または幹細胞が挙げられ得る。

本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、機能的な遺伝子産物の発現が所望される任意の標的細胞を指す。標的細胞の例としては、限定されないが、肝臓細胞、腎臓細胞、中枢神経系の細胞、ニューロン、グリア細胞、および幹細胞が挙げられ得る。特定の実施形態では、ベクターは、エクスビボで標的細胞に送達される。特定の実施形態では、ベクターは、インビボで標的細胞に送達される。

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルスベクターの中にパッケージングされる核酸配列を指す。一実施例では、「ベクターゲノム」は、少なくとも、５’から３’へ、ベクター特異的配列と、標的細胞でその発現を導く調節制御配列に作動可能に連結された機能的な遺伝子産物をコードする核酸配列と、非翻訳領域（複数可）のｍｉＲＮＡ標的配列と、ベクター特異的配列と、を含む。例えば、ＡＡＶベクターゲノムは、逆位末端反復配列と、発現カセットとを含み、発現カセットは、例えば、標的細胞において発現を導く調節制御配列に作動可能に連結された機能的な遺伝子産物をコードする核酸配列と、非翻訳領域（複数可）のｍｉＲＮＡ標的配列とを含む。本明細書に記載されるように、ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子の発現が望ましくない（例えば、後根神経節）および／または導入遺伝子の発現レベルの低下が所望される細胞において、ｍｉＲＮＡ配列によって特異的に認識されるように設計される。

本明細書に記載のベクターの組成物は、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

３．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
一態様では、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が、本明細書で提供され、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む。

一実施形態では、調節配列は、上に記載の通りである。一実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶの５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、本明細書に記載の発現カセット、およびＡＡＶの３’ＩＴＲを含む。一実施形態では、ベクターゲノムは、ｒＡＡＶベクターを形成するｒＡＡＶカプシドの中にパッケージングされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、発現カセットに隣接するＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。一実施例では、「ベクターゲノム」は、少なくとも、５’から３’へ、ＡＡＶの５’ＩＴＲと、標的細胞でその発現を導く調節制御配列に作動可能に連結された機能的な遺伝子産物をコードする核酸配列と、非翻訳領域（複数可）のｍｉＲＮＡ標的配列と、ＡＡＶの３’ＩＴＲと、を含む。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来であり、カプシドは、異なるＡＡＶ由来である。あるいは、他のＩＴＲが使用され得る。本明細書に記載されるように、ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子の発現が望ましくない、および／または導入遺伝子の発現レベルの低下が所望される細胞のｍｉＲＮＡ配列によって、特異的に認識されるように設計される。

ＩＴＲは、ベクター産生の際のゲノムの複製およびパッケージングに関与する遺伝要素であり、ｒＡＡＶを生成するために必要とされる唯一のウイルス性シス要素である。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ由来である。好ましい実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、またはその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）が、利便性のため、および規制当局の承認を加速させるために使用され得る。しかしながら、
他のＡＡＶ起源からのＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの起源がＡＡＶ２からであり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ起源からのものである場合、得られたベクターは、疑似型であると称され得る。典型的には、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶの５’ＩＴＲ、ＮＡＧＬＵコード配列および任意の調節配列、ならびにＡＡＶの３’ＩＴＲを含む。しかしながら、これらの要素の他の構造も好適であり得る。Ｄ配列および最終的な末端解離部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。他の実施形態では、完全長ＡＡＶ５’および３’ＩＴＲが使用される。

本明細書で使用される「ＡＡＶ」という用語は、天然に存在するアデノ随伴ウイルス、当業者に利用可能なアデノ随伴ウイルス、および／または、本明細書に記載の組成物（複数可）および方法（複数可）に照らして、ならびに人工ＡＡＶを指す。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、ＡＡＶタンパク質カプシドを有するＡＡＶ ＤＮａｓｅ耐性粒子であり、その中にパッケージングされる発現カセットは、標的細胞に送達するためのＡＡＶの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。ＡＡＶカプシドは、６０個のカプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニットＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３からなり、選択されるＡＡＶに応じて、およそ１：１：１０～１：１：２０の比で二十面体対称に配置される。上記で特定されたＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として、様々なＡＡＶが選択されてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０－Ａ１号、米国特許出願公開第２００９／０１９７３３８－Ａ１号、ＥＰ１３１０５７１を参照されたい。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７および他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号および米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１、およびＵＳ７，９０６，１１１（ＡＡＶ９）、およびＷＯ２００６／１１０６８９、ならびにＷＯ２００３／０４２３９７（ｒｈ１０）も参照されたい。また、これらの文書には、他のＡＡＶも記載されており、ＡＡＶを生成するために選択され得る（参照により援用される）。ヒトまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され、または操作され、十分に特徴付けられたＡＡＶのうち、ヒトＡＡＶ２が、遺伝子導入ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり、それは、異なる標的組織および動物モデルにおいて、効率的な遺伝子導入実験に広く使用されている。別途指定されない限り、本明細書に記載のＡＡＶカプシド、ＩＴＲ、および他の選択されるＡＡＶ成分は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶ７Ｍ８、およびＡＡＶＡｎｃ８０として一般に同定されているＡＡＶ、既知のもしくは言及されたＡＡＶのうちのいずれかのバリアント、または未だ発見されていないＡＡＶもしくはバリアント、あるいはそれらの混合物を含む、任意のＡＡＶの中から容易に選択され得る。例えば、ＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９カプシドまたはそのバリアントである。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ｒＡＡＶベクターの名前で「ＡＡＶ」という用語の後の数値または数値および文字の組み合わせによって指定される。

本明細書で使用される場合、ＡＡＶに関して「バリアント」という用語は、既知のＡＡＶ配列に由来する任意のＡＡＶ配列を意味し、保存的アミノ酸置換を有するＡＡＶ配列、およびアミノ酸配列または核酸配列にわたって、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％以上の配列同一性を共有するＡＡＶ配列を含む。別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、任意の記載または既知のＡＡＶカプシド配列から最大約１０％のバリエーションを含み得るバリアントを含む。すなわち、ＡＡＶカプシドは、本明細書に提供され、かつ／または当該技術分野で既知のＡＡＶカプシドと、約９０％の同一性～約９９．９％の同一性、約９５％～約９９％の同一性、または約９７％～約９８％の同一性を共有する。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶカプシドのパーセント同一性を決定する場合、比較は、可
変タンパク質（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）のうちのいずれかにわたって行われ得る。

ＩＴＲまたは他のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な技術を使用して、ＡＡＶから容易に単離または操作され得る。かかるＡＡＶは、学術的、商業的、または公的資源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離、操作、または入手することができる。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献またはデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなど）で利用可能であるような公開された配列を参照することによって、合成または他の好適な手段を通して操作され得る。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学的な技術によって操作することができ、これらの粒子を、核酸配列の細胞特異的送達のため、免疫原性を最小限に抑えるため、安定性および粒子寿命を調整するため、効率的な分解のため、核への正確な送達のためなどに最適化することが可能になる。

本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶ」および「人工ＡＡＶ」という用語は、限定されないが、互換的に、カプシドタンパク質と、その中にパッケージングされるベクターゲノムとを含むＡＡＶを意味し、ベクターゲノムは、ＡＡＶとは異種の核酸を含む。一実施形態では、カプシドタンパク質は、天然に存在しないカプシドである。かかる人工カプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を使用して、異種配列（異なる選択されたＡＡＶ、同じＡＡＶの非連続部分、非ＡＡＶウイルス源、または非ウイルス源から得ることができる）と組み合わせて、任意の好適な技術によって生成され得る。人工ＡＡＶは、疑似型ＡＡＶカプシド、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、または「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得るが、これらに限定されない。１つのＡＡＶのカプシドタンパク質が異種カプシドタンパク質に置き換えられている擬似型ベクターは、本発明に有用である。一実施形態では、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／８は、例示的な擬似型ベクターである。選択される遺伝要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９カプシド」は、（ａ）ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＳ９９２６４（参照により本明細書に援用される）（ＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質は、配列番号１７に再現される）のアミノ酸配列、および／または（ｂ）ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＹ５３０５７９．１：（ｎｔ１．．．２２１１）（配列番号１６に再現される）のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＡＡＶ９を指す。このコード配列からのいくつかのバリエーションは、本発明に包含され、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＳ９９２６４およびＵＳ７９０６１１１（同様に、ＷＯ２００５／０３３３２１）における参照アミノ酸配列と約９９％同一性を有する配列を含み得る（すなわち、参照配列からの約１％未満のバリエーション）。かかるＡＡＶは、例えば、天然単離物（例えば、ｈｕ６８、ｈｕ３１もしくはｈｕ３２）、またはアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するＡＡＶ９のバリアントを含み得る（例えば、ＡＡＶ９カプシドと整列される任意の他のＡＡＶカプシド、例えば、ＵＳ９，１０２，９４９、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／３４９９１１、ＷＯ２０１６／０４９２３０Ａ１ｌ、ＵＳ９，６２３，１２０、ＵＳ９，５８５，９７１に記載されているものなどの、対応する位置から「動員される（ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ）」代替的な残基から選択されたアミノ酸置換を含むが、これらに限定されない）。しかしながら、他の実施形態では、ＡＡＶ９の他のバリア
ント、または上記の参照配列と少なくとも約９５％の同一性を有するＡＡＶ９カプシドが選択されてもよい。例えば、米国特許出願公開第２０１５／００７９０３８号を参照されたい。カプシド、そのコード配列を生成する方法、およびｒＡＡＶウイルスベクターの産生のための方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）およびＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。

ＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１（配列番号９）の６７位および１５７位の２つのコードされたアミノ酸により、別の系統群ＦのウイルスであるＡＡＶ９とは異なる。対照的に、他の系統群ＦのＡＡＶ（ＡＡＶ９、ｈｕ３１、ｈｕ３１）は、６７位にＡｌａおよび１５７位にＡｌａを有する。新規のＡＡＶｈｕ６８カプシドおよび／または操作されたＡＡＶカプシドが提供され、配列番号９の番号付けに基づいて、１５７位にバリン（ＶａｌまたはＶ）を有し、任意選択的に、６７位にグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）を有する。また、ＷＯ２０１８／１６０５８２も参照されたい（配列表を含めて）、その全体が参照により本明細書に援用される）。

本明細書で使用される場合、ＡＡＶの群に関連する「系統群（ｃｌａｄｅ）」という用語は、互いに系統学的に関連するＡＡＶの群を指し、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列の整列に基づいて、少なくとも７５％のブートストラップ値（少なくとも１０００反復のうち）および０．０５以下のポアソン補正距離測定値によって、隣接結合アルゴリズム（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して決定される。隣接結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実装するのに使用され得るコンピュータプログラムが利用可能である。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、修正Ｎｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装する。これらの技術およびコンピュータプログラム、ならびにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書で特定された系統群（クレード）のうちの１つに含まれるか、またはこれらの系統群以外の別の系統群に含まれるかを、容易に決定することができる。例えば、Ｇ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ
Ｖｉｒｏｌ ２００４ Ｊｕｎ；７８（１０：６３８１－６３８８）を参照されたい。これは、系統群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦを同定し、新規ＡＡＶの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９）を提供する。また、ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。

特定の実施形態では、ＡＡＶ６８カプシドは、さらに、以下のうちの１つ以上を特徴とする。ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質は、配列番号８の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されたＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、配列番号９から産生されたｖｐ１タンパク質、もしくは配列番号９の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されたｖｐ１タンパク質、配列番号９の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されたＡＡＶｈｕ６８
ｖｐ２タンパク質、配列番号８の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されたｖｐ２タンパク質、もしくは配列番号９の少なくともアミノ酸約１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号８の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されたｖｐ２タンパク質、および／または配列番号９の少なくともアミノ酸約２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されたＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質、配列番号８の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されたｖｐ３タンパク質、または配列番号９の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミ
ノ酸配列をコードする配列番号８の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されたｖｐ３タンパク質を含む。

ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、典型的には、配列番号９（アミノ酸１～７３６）の全長ｖｐ１アミノ酸配列をコードする同じ核酸配列によってコードされる選択的スプライシングバリアントとして発現される。任意選択的に、ｖｐ１コード配列は、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質を発現するために、単独で使用される。あるいは、この配列は、ｖｐ１固有領域（約１～約１３７）および／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しない配列番号９のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列、またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号８の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）、または配列番号９のａａ２０３～７３６をコードする配列番号８と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％）同一の配列のうちの１つ以上と共発現され得る。追加的に、または代替的に、ｖｐ１コード配列および／またはｖｐ２コード配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を有しない配列番号９のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列、またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号８のｎｔ４１２～２２１２１）、または配列番号９の約ａａ１３８～７３６をコードする配列番号８と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％）同一の配列と共発現され得る。

本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶｈｕ６８は、配列番号９のｖｐ１アミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８核酸配列、および任意選択的に、追加の核酸配列（例えば、ｖｐ１および／またはｖｐ２固有領域を含まないｖｐ３タンパク質をコードする配列）由来のカプシドを発現する産生システムで産生されたｒＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。単一の核酸配列ｖｐ１を使用した産生から得られたｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、およびｖｐ３タンパク質の異種集団を産生する。より具体的には、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含み、配列番号９の予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団には、少なくとも、脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基が含まれる。例えば、アスパラギン－グリシン対のアスパラギンは、高度に脱アミド化されている。

一実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１核酸配列は、配列番号８の配列、またはそれに相補的な鎖、例えば、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡを有する。特定の実施形態では、ｖｐ２および／またはｖｐ３タンパク質は、追加的または代替的に、例えば、選択された発現系においてｖｐタンパク質の比を変化させるために、ｖｐ１とは異なる核酸配列から発現され得る。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）および／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しない配列番号９のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）、またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号８の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）をコードする核酸配列も提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）を有しない配列番号９のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）、またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号８のｎｔ４１２～２２１１）をコードする核酸配列も提供される。

しかしながら、配列番号９のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、
配列番号８の核酸配列、または配列番号８と少なくとも７０％～９９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号９をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号８の核酸配列、または配列番号８の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１１と少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号９のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号８の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１の核酸配列、または配列番号８のｎｔと少なくともと少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号９のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）をコードする。

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号８の核酸配列、または本明細書に記載の修飾（例えば、脱アミド化アミノ酸）を含む配列番号９のｖｐ１アミノ酸配列をコードする少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列、少なくとも９９％を使用して産生される。特定の実施形態では、ｖｐ１アミノ酸配列は、配列番号９に再現される。

本明細書で使用される場合、ｖｐカプシドタンパク質を参照するために使用される場合、「異種」という用語またはその任意の文法的変形は、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない要素からなる集団を指す。配列番号９は、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質のコードされたアミノ酸配列を提供する。ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質（代替的にアイソフォームと称される）に関連して使用される「異種」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。ＡＡＶカプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含み、予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基が含まれる。例えば、特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対中の少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸変化および他の任意の修飾をもたらす。

本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから参照群のすべてのメンバーよりも少ないメンバーからなるｖｐタンパク質の群を指す。

例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシド中の少なくとも１つの（１）ｖｐ１タンパク質であり、すべてのｖｐ１タンパク質未満である。ｖｐ３タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシド中のすべてのｖｐ３タンパク質よりも少ない１つの（１）ｖｐ３タンパク質であり得る。例えば、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別個の亜集団であり得、ｖｐ３は、組み立てられたＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質のさらなる亜集団であり得る。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有するサブ集団を含み得る。

別途指定されない限り、高度脱アミド化は、参照アミノ酸位置での予測されたアミノ酸
配列と比較して、参照アミノ酸位置での少なくとも４５％の脱アミド化、少なくとも５０％の脱アミド化、少なくとも６０％の脱アミド化、少なくとも６５％の脱アミド化、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または最大約１００％の脱アミド化を指す（例えば、配列番号９の番号付けに基づくアミノ酸５７［ＡＡＶＨｕ６８］のアスパラギンの少なくとも８０％が、総ｖｐ１タンパク質に基づいて脱アミド化され得るか、または総ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質に基づいて脱アミド化され得る）。かかるパーセンテージは、２Ｄゲル、質量分析技術、または他の好適な技術を使用して決定され得る。

ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質において、４個の残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は、様々なロットにわたって７０％超の脱アミド化レベルを日常的に示し、ほとんどの場合、９０％超である。追加的なアスパラギン残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７、およびＱ５９９）も、様々なロットにわたって最大約２０％の脱アミドレベルを示す。脱アミド化レベルは、最初に、トリプシン消化を使用して特定され、キモトリプシン消化で検証された。

ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含み、配列番号９の予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、配列番号９のアスパラギン－グリシン対中の少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸変化および他の任意の修飾をもたらす。

他の実施形態では、本方法は、ｒＡＡＶの収率を増加させること、したがって、細胞溶解の前に、または細胞溶解を必要とせずに、上清中に存在するｒＡＡＶの量を増加させることを伴う。この方法は、ＡＡＶｈｕ６８ｖｐ１カプシドタンパク質のアミノ酸番号を有する整列に基づいて、ＡＡＶ ＶＰ１カプシド遺伝子を操作して、６７位にＧｌｕ、１５７位にＶａｌ、または両方を有するカプシドタンパク質を発現させることを伴う。他の実施形態では、本方法は、ＶＰ２カプシド遺伝子を操作して、１５７位にＶａｌを有するカプシドタンパク質を発現することを伴う。さらに他の実施形態では、ｒＡＡＶは、修飾カプシドを有し、６７位にＧｌｕおよび１５７位にＶａｌの、ｖｐ１およびｖｐ２のカプシドタンパク質の両方を含む。

特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、自己相補的なＡＡＶである。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列が保有するコーディング領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染時には、第２の鎖の細胞介在合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的半体が会合して、即時の複製および転写に備えのある１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成する。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ｓｃＡＡＶ） ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照されたい。自己相補的なＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、および同第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。

特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、ヌクレアーゼ耐性である。か
かるヌクレアーゼは、単一のヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼの混合物であり得、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであり得る。ヌクレアーゼ耐性ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドが完全に組み立てられたことを示し、産生プロセスから存在し得る汚染核酸を除去するために設計されたヌクレアーゼインキュベーションステップ中の分解（消化）から、これらのパッケージングされたゲノム配列を保護する。多くの場合、本明細書に記載のｒＡＡＶは、ＤＮａｓｅ耐性である。

本明細書に記載される組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技術を使用して生成され得る。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９；ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、宿主細胞を培養することを含み、宿主細胞は、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列、機能的なｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接する本明細書に記載される発現カセット、および発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを可能にする十分なヘルパー機能を含む。また、宿主細胞も本明細書に提供され、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列、機能的なｒｅｐ遺伝子、記載されるベクターゲノム、およびベクターゲノムをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングすることを可能にする十分なヘルパー機能を含む。一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。これらの方法は、ＷＯ２０１７／１６０３６０Ａ２にさらに詳細に記載されている（参照により本明細書に援用される）。

当業者に利用可能なｒＡＡＶの他の産生方法も利用することができる。好適な方法は、バキュロウイルス発現系または酵母を介した産生を含み得るが、これらに限定されない。例えば、Ｒｏｂｅｒｔ Ｍ．Ｋｏｔｉｎ，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ
Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２－Ｒ６．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１１ Ａｐｒ ２９．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１、Ａｕｃｏｉｎ ＭＧ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒｉｐｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００６ Ｄｅｃ ２０；９５（６）：１０８１－９２、ＳＡＭＩ Ｓ．ＴＨＡＫＵＲ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｔｈｅｓｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ，２０１２、Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ Ｏ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｅａｄ－ｔｏ－Ｈｅａｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｖｅｒｓｕｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７ Ａｕｇ １０．ｐｉｉ：Ｓ１５２５－００１６（１７）３０３６２－３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０８．００３．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］、Ｍｉｅｔｚｓｃｈ Ｍ ｅｔ ａｌ，ＯｎｅＢａｃ ２．０：Ｓｆ９ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ１，ＡＡＶ２，ａｎｄ ＡＡＶ８ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｆｅｂ；２８（１）：１５－２２．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１６．１６４．、Ｌｉ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ
ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ－ｆｏｒｍ ｇｅｎｏｍｅｓ：ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ＤＮＡ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．
２０１３ Ａｕｇ １；８（８）：ｅ６９８７９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６９８７９．Ｐｒｉｎｔ ２０１３、Ｇａｌｉｂｅｒｔ Ｌ ｅｔ
ａｌ，Ｌａｔｅｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ Ｐａｔｈｏｌ．２０１１ Ｊｕｌ；１０７ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８０－９３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｐ．２０１１．０５．００８、およびＫｏｔｉｎ ＲＭ，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２－６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ ２９を参照されたい。

２ステップの高塩濃度でのアフィニティクロマトグラフィー精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィーを使用して、ベクター薬物製品を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ＡＡＶ９」と題するＷＯ２０１７／１６０３６０にさらに詳細に記載されている（参照により本明細書に援用される）。簡潔には、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ９粒子を、ゲノム欠損ＡＡＶ９中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶ９ウイルス粒子およびＡＡＶ９カプシド中間体を含む懸濁液を、高性能液体クロマトグラフィーに供することを伴い、ＡＡＶ９ウイルス粒子およびＡＡＶ９中間体を、１０．２のｐＨで平衡化された強アニオン交換樹脂に結合させ、約２６０および約２８０での紫外吸光度について溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供する。ｒＡＡＶ９にはあまり最適ではないが、ｐＨは、約１０．０～１０．４の範囲であってもよい。この方法では、ＡＡＶ９完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が感染ポイントに到達した場合に溶出する画分から回収される。一実施例では、アフィニティクロマトグラフィーステップのために、ダイアフィルトレーションされた産物を、ＡＡＶ２／９血清型を効率的に捕捉するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン条件下、残留細胞ＤＮＡおよびタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は効率的に捕捉される。

ｒＡＡＶの特徴付けまたは定量化のための従来の方法は、当業者に利用可能である。空のおよび完全粒子含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配－精製された調製物、ここで、ＧＣの数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド容量が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた直線等式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を使用して、試験品目ピークのバンド容量中の粒子の数を算出する。次いで、負荷した２０μＬあたりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで除算して、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ～ＧＣ／ｍＬは、空のｐｔ／ｍＬを与える。空のｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで除算して、次いで、１００をかけることにより、空の粒子のパーセンテージを得る。一般に、空のカプシドおよびパッケージされたゲノムを伴うＡＡＶベクター粒子のためのアッセイ方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性したカプシドについて試験するために、方法は、３つのカプシドタンパク質を分離可能な任意のゲル、例えば、緩衝液中３～８％のＴｒｉｓ－アセテートを含有する勾配ゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処理済みＡＡＶストックを供すること、次いで、試料材料が分離するまでゲルを泳動させること、およびナイロンまたはニトロセルロース膜、好ましくは、ナイロン上でゲルをブロットすることを含む。抗－Ａ
ＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質、好ましくは、抗－ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗－ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する主要な抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗－ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗－マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次および二次抗体との間の結合を半定量的に測定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、または発色変化を検出可能な検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのために、カラムフラクションからの試料が、採集され、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥロード用緩衝液中で加熱されてもよく、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）上で分解される。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って用いて、銀染色を実施してもよく、または他の好適な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビーもしくはクーマシー染色を実施してもよい。一実施形態では、カラムフラクション中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）により測定されることができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅ Ｉ（または別の好適なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活化後、試料はさらに希釈され、プライマーおよびプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを用いて、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を使用して、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することにより、ベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用され得る。

一態様では、広域スペクトルセリンプロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅ Ｉ消化の後に、試料をプロテアーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテアーゼＫで処理し、続いて、熱失活させることを除き、標準的なアッセイと同様である。好適には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテアーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテアーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮されてもよい。典型的に、プロテアーゼＫ治療は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間実施されるが、より低い温度（例えば、約３７℃～約５０℃）でより長時間（例えば、約２０分間～約３０分間）、またはより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短時間（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱失活は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準アッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。

追加的に、または代替的には、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用されてもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖および自己相補的なＡＡＶベクターゲノム力価を測定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。

また、カプシドタンパク質のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３の比を決定する方法も利用可能である。例えば、Ｖａｍｓｅｅｄｈａｒ Ｒａｙａｐｒｏｌｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１３ Ｄｅｃ；８７（２４）：１３１５０－１３１６０、Ｂｕｌｌｅｒ ＲＭ，Ｒｏｓｅ ＪＡ．１９７８．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ＫＢ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２５：３３１－３３８、およびＲｏｓｅ
ＪＡ，Ｍａｉｚｅｌ ＪＶ，Ｉｎｍａｎ ＪＫ，Ｓｈａｔｋｉｎ ＡＪ．１９７１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８：７６６－７７０を参照されたい。

本明細書に記載のｒＡＡＶにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

４．医薬組成物
導入遺伝子およびｍｉＲＮＡ標的配列を含む発現カセットを含む医薬組成物は、液体懸濁液、凍結乾燥または凍結組成物、または別の好適な製剤であってもよい。特定の実施形態では、組成物は、発現カセットと、懸濁液を形成する生理学的に適合する液体（例えば、溶液、希釈剤、担体）とを含む。かかる液体は、好ましくは水性であり、緩衝剤（複数可）、界面活性剤（複数可）、ｐＨ調整剤（複数可）、防腐剤（複数可）、または他の好適な賦形剤（複数可）を１つ以上含み得る。好適な成分が以下でより詳細に考察される。医薬組成物は、水性懸濁液および任意の選択された賦形剤、ならびに発現カセットを含む。

導入遺伝子およびｍｉＲＮＡ標的配列を含む発現カセットは、本明細書全体に記載されている通りである。例えば、発現カセットは、核酸配列であり得、（ａ）組換えウイルスを含む細胞において遺伝子産物の発現を導く調節配列の制御下にある遺伝子産物のコード配列と、（ｂ）細胞において遺伝子産物の発現を導く調節配列と、（ｃ）コード配列の５’にある５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列と、（ｄ）コード配列の３’にある３’ＵＴＲ配列と、ｅ）少なくとも２つのタンデム後根神経節（ＤＲＧ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列とを含み、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列は、少なくとも１つの第１のｍｉＲＮＡ標的配列と、同じかまたは異なり得る少なくとも１つの第２のｍｉＲＮＡ標的配列とを含む。

特定の実施形態では、医薬組成物は、発現カセットを含み、発現カセットは、導入遺伝子、およびｍｉＲＮＡ標的配列、ならびに非ウイルス送達系を含む。これには、例えば、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質または脂質様粒子、キトサンベースの製剤、ならびに当該技術分野で既知で、記載されている他のもの（例えば、上に引用されたＲａｍａｍｏｏｒｔｈおよびＮａｒｖｅｋａｒに例示される）が含まれ得る。

他の実施形態では、医薬組成物は、発現カセット（導入遺伝子およびｍｉＲＮＡ標的配列を含む）を含む懸濁液であり、非ウイルスベクター系またはウイルスベクター系において操作されている。かかる非ウイルスベクター系は、例えば、プラスミドもしくは非ウイルス遺伝要素、またはタンパク質ベースのベクターを含み得る。

特定の実施形態では、医薬組成物は、非複製ウイルスベクターを含む。好適なウイルスベクターは、任意の好適な送達ベクター、例えば、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えボカウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または別の組換
えパルボウイルスなど、を含み得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、それを必要とする患者に遺伝子産物を送達するための組換えＡＡＶである。

一実施形態では、医薬組成物は、発現カセットを含み、導入遺伝子およびｍｉＲＮＡ標的配列、ならびに脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、大槽内、または静脈内（ＩＶ）注入を介した送達に好適な製剤緩衝液を含む。一実施形態では、導入遺伝子およびｍｉＲＮＡ標的配列を含む発現カセットは、組換えＡＡＶにパッケージングされる。

一実施形態では、本明細書で提供される組成物は、水性懸濁液中に溶解した界面活性剤、防腐剤、賦形剤、および／または緩衝剤を含む。一実施形態では、緩衝液は、ＰＢＳである。別の実施形態では、緩衝液は、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）、例えば、エリオット製剤緩衝液、またはハーバード装置灌流液（最終イオン濃度（ｍＭ）：Ｎａ １５０、Ｋ ３．０、Ｃａ １．４、Ｍｇ ０．８、Ｐ １．０、Ｃｌ １５５での人口ＣＳＦ）である。様々な好適な溶液が既知であり、緩衝食塩水、界面活性剤、および生理学的に適合する塩、もしくは塩の混合物（イオン強度が約１００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）～約２５０ｍＭの塩化ナトリウム相当に調整されたもの）、または同等のイオン濃度に調整された生理学的に適合する塩のうちの１つ以上を含む溶液を含む。

好適には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～８、またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、またはｐＨ７．２～７．８の範囲で調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であるので、髄腔内送達のためには、この範囲内のｐＨが望ましいが、静脈内送達のためには、６．８～約７．２のｐＨが望ましい可能性がある。しかしながら、より広範囲にある他のｐＨ、およびこれらの下位範囲が、他の送達経路のために選択され得る。

好適な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン界面活性剤のうちから選択され得る。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８としても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８ ［ＢＡＳＦ］などの、一級ヒドロキシル基末端の二機能的ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーについて）に続いて、３桁数字を用いて命名され、初めの２桁数字×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し得る。

一実施例では、製剤は、例えば、水中に塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム、およびそれらの混合物のうちの１つ以上を含む、緩衝化食塩水溶液を含有することができる。好適には、髄腔内送達のためには、モル浸透圧濃度は、脳脊髄液と適合する範囲内（例えば、約２７５～約２９０）である、例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。任意選択的に、髄腔内送達のために、商業的に入手可能な希釈剤は、懸濁化剤として使用され得るか、
または別の懸濁化剤および他の任意の賦形剤と組み合わせて使用され得る。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照されたい。

他の実施形態では、製剤は、１つ以上の浸透促進剤を含有し得る。好適な浸透促進剤の例には、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、またはＥＤＴＡが挙げられ得る。

さらに、医薬組成物が提供され、薬学的に許容される担体と、本明細書に記載される核酸配列を含むベクターとを含む。本明細書で使用される場合、「担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足有効成分を組成物中に組み込むこともできる。リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。特に、ｒＡＡＶベクターは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子などに封入化された送達のいずれかのために製剤化され得る。一実施形態では、治療有効量の当該ベクターが、医薬組成物に含まれる。担体の選択は、本発明を限定しない。防腐剤または化学的安定剤などの他の従来の薬学的に許容される担体。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが挙げられる。好適な化学安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。

「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギーまたは類似の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。

本明細書で使用される場合、「投薬量」または「量」という用語は、治療の過程で対象に送達される総投薬量もしくは総量、あるいは単一の単位（または複数の単位もしくは分割投薬量）投与で送達される投薬量もしくは量を指し得る。

本明細書に記載の水性懸濁液または医薬組成物は、任意の好適な経路または異なる経路の組み合わせによって、それを必要とする対象に送達されるように設計される。

一実施形態では、医薬組成物は、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、または大槽内注入を介した送達用に製剤化される。一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、静脈内注入によって、それを必要とする対象に送達するために設計される。あるいは、他の投与経路（例えば、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、筋肉内、および他の非経口経路）を選択してもよい。

本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」または「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への、より詳細には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔空間内への注入を介した、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰椎穿刺、脳室内、後頭下／大槽内、および／またはＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰椎穿刺により、クモ膜下腔空間にわたって拡散させるために導入され得る。別の実施例では、注入は、大槽内であり得る。大槽内送達は、ベクター拡散を増加させ、および／または投与によって引き起こされる毒性および炎症を低減し得る。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕ
ｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１４；１：１４０５１．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１４ Ｄｅｃ １０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１４．５１を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「大槽内送達」または「大槽内投与」という用語は、脳室の脳脊髄液への、又は大槽内での直接的な薬物の投与経路、より詳細には、後頭下穿刺による、または大槽内への直接注入による、または永続的に配置されたチューブによる、薬物の投与経路を指す。

一態様では、医薬組成物が、本明細書で提供され、製剤緩衝液中に本明細書に記載されるベクターを含む。特定の実施形態では、複製欠陥ウイルス組成物は、ヒト患者にとって、範囲内のすべての整数または分数量を含む約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１６ＧＣ（体重７０ｋｇの平均対象を治療するため）、好ましくは１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣの範囲にある一定量の複製欠陥ウイルスを含むように投薬量単位で製剤化され得る。一実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む用量あたり少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、または９×１０^９ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む用量あたり少なくとも１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、または９×１０^１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む用量あたり少なくとも１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、または９×１０^１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む用量あたり少なくとも１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、または９×１０^１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む用量あたり少なくとも１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、または９×１０^１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む用量あたり少なくとも１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、または９×１０^１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む用量あたり少なくとも１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、または９×１０^１５ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒト適用のために、用量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む用量あたり１×１０^１０～約１×１０^１２ＧＣの範囲であり得る。

一実施形態では、医薬組成物が提供され、製剤緩衝液中に本明細書に記載されるｒＡＡＶを含む。一実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ～約１×１０^１４ＧＣ／ｍＬで製剤化される。さらなる一実施形態では、ｒＡＡＶは、約３×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約３×１０^１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。またさらなる一実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約１×１０^１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、少なくとも約１×１０^１１ＧＣ／ｍＬで製剤化される。一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む医薬組成物は、脳質量１グラムあたり約１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラムあたり約１×１０^１４ＧＣの用量で投与される。

特定の実施形態では、組成物は、任意の好適な経路による送達のために、好適な水性懸
濁媒体（例えば、緩衝生理食塩水）中に製剤化され得る。本明細書で提供される組成物は、高用量のウイルスベクターの全身送達に有用である。ｒＡＡＶの場合、高用量は、少なくとも１×１０^１３ＧＣ、または少なくとも１×１０^１４ＧＣであり得る。しかしながら、改善された安全性のために、本明細書に提供されるｍｉＲＮＡ配列は、他のより低い用量で送達される発現カセットおよび／またはベクターゲノムに含まれ得る。

特定の実施形態では、組成物は、本質的に同時に２つの異なる経路によって送達される。

本明細書に記載の医薬組成物中の組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるよう意図されることを理解されたい。

５．治療方法
特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、所望の導入遺伝子産物を、患者に送達するのに有用であり、一方で、後根神経節ニューロンにおける導入遺伝子発現を抑制するのに有用である。本方法は、導入遺伝子およびｍｉＲＮＡ標的配列を含む発現カセットを含む組成物を、患者に送達することを伴う。

好適な導入遺伝子の例は、１つ以上の神経変性障害の治療に有用である。かかる障害としては、限定されないが、伝染性海綿状脳症（例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病）、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、筋細管ミオパシーおよび他のミオパシー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、アルツハイマー病、ハンチントン病、カナバン病、外傷性脳損傷、脊髄損傷（ＡＴＩ３３５、Ｎｏｖａｒｔｉｓによる抗ｎｏｇｏ１）、片頭痛（Ａｌｄｅｒ ＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによるＡＬＤ４０３、ＥｌｉによるＬＹ２９５１７４２、Ｌａｂｒｙｓ ＢｉｏｌｏｇｉｃｓによるＲＮ３０７）、リソソーム蓄積症、脳卒中、中枢神経系に影響を及ぼす感染症が挙げられ得る。リソソーム蓄積症の例としては、例えば、ゴーシェ病、ファブリー病、ニーマン・ピック病、ハンター症候群、糖原病ＩＩ（ポンペ病）、またはテイ・サックス病が挙げられる。これらの病態（例えば、ＤＭＤおよびミオパシー）のいくつかに対して、本明細書に提供される組成物は、骨格筋および心筋の形質導入または発明のための高用量の発現カセット（例えば、ウイルスベクターによって運ばれる）に関連する軸索障害を低減または排除するのに有用である。

さらに他の核酸は、Ｎｏｇｏ受容体の機能成分であり、多発性硬化症、パーキンソン病または本態性振戦を有する患者における本態性振戦に関連する、ロイシンリッチリピートおよび免疫グロブリン様ドメイン含有タンパク質１（ＬＩＮＧＯ－１）を対象とする免疫グロブリンをコードし得る。かかる市販の抗体の１つは、オクレリズマブ（Ｂｉｏｇｅｎ，ＢＩＩＢ０３３）である。例えば、米国特許第８，４２５，９１０号を参照されたい。一実施形態では、核酸構築物は、ＡＬＳを有する患者に有用な免疫グロブリン構築物をコードする。好適な抗体の例としては、ＡＬＳ酵素スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）およびそのバリアントに対する抗体（例えば、ＡＬＳバリアントＧ９３Ａ、Ｃ４Ｆ６ ＳＯＤ１抗体）、ＭＳ７８５（ダーリン－１結合領域を対象とする）、神経突起伸長インヒビター（ＮＯＧＯ－Ａまたはレチキュロン４）に対する抗体（例えば、ＧＳＫ１２２３２４９、オザネズマブ（ヒト化、ＧＳＫ、多発性硬化症に有用とも記載されている）が挙げられる。核酸配列は、アルツハイマー病を有する患者において有用な免疫グロブリンをコードするように設計または選択され得る。かかる抗体構築物は、例えば、アデュマヌカブ（Ｂｉｏｇｅｎ）、バピニューズマブ（Ｅｌａｎ、Ａβのアミノ末端を対象とするヒト化ｍＡｂ）、ソラネズマブ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、可溶性Ａβの中央部分に対するヒト化ｍＡｂ）、ガンテネルマブ（ＣｈｕｇａｉおよびＨｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈ
ｅ、Ａβのアミノ末端および中央部分の両方を対象とする完全ヒトｍＡｂである）、クレネズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、単量体エピトープおよび構造エピトープに作用するヒト化ｍＡｂ、Ａβのオリゴマー形態およびプロトフィブリル形態を含む）、ＢＡＮ２４０１（Ｅｓａｉ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、Ａβプロトフィブリルに選択的に結合するヒト化免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）ｍＡｂ、Ａβプロトフィブリルのクリアランスを促進する、および／または脳のニューロンに対するそれらの毒性効果を中和すると考えられている）、ＧＳＫ９３３７７６（Ａβのアミノ末端を対象とするヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体）、ＡＡＢ－００１，ＡＡＢ－００２，ＡＡＢ－００３（Ｆｃ操作バピニューズマブ）、ＳＡＲ２２８８１０（プロトフィブリルおよび低分子量Ａβを対象とするヒト化ｍＡｂ）、ＢＩＩＢ０３７／ＢＡＲＴ（不溶性線維ヒトＡβに対する完全ヒトＩｇＧ１、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、ｍ２６６、ｔｇ２５７６などの抗Ａβ抗体（Ａβオリゴマーに対して相対的特異性）［Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｈｏｌｔｚｍａｎ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００８；３１：１７５－１９３］を含む。他の抗体は、βアミロイドタンパク質、Ａβ、βセクレターゼ、および／またはｔａｕタンパク質を標的としてもよい。さらに他の実施形態では、抗β－アミロイド抗体は、エフェクター機能を最小限に抑えるためにβ－アミロイドを標的とするＩｇＧ４モノクローナル抗体に由来するか、またはアミロイド関連造影異常（ＡＲＩＡ）および炎症応答を回避するためにＦｃ領域を欠くｓｃＦｖ以外の構築物が選択される。これらの実施形態のいくつかにおいて、ｓｃＦｖ構築物の１つ以上の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域は、本明細書に提供される別の好適な免疫グロブリン構築物において使用される。これらのｓｃＦＶおよび他の操作された免疫グロブリンは、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンと比較して、血清中の免疫グロブリンの半減期を減少させ得る。抗アミロイド分子の血清中濃度を減少させることは、血清中の非常に高いレベルの抗アミロイド抗体が、高負荷のアミロイドプラークを伴う脳血管を不安定化させ、血管透過性を引き起こす可能性があるため、ＡＲＩＡのリスクをさらに減少させ得る。パーキンソン病を有する患者の治療のための他の免疫グロブリン構築物をコードする核酸は、例えば、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、ダーダリン（ＬＲＲＫ２）抗体、抗シヌクレイン抗体およびα－シヌクレイン抗体、ならびにＤＪ－１（ＰＡＲＫ７）抗体を含む構築物を発現するように操作または設計され得る。他の抗体としては、ＰＲＸ００２（ＰｒｏｔｈｅｎａおよびＲｏｃｈｅ）パーキンソン病ならびに関連するシヌクレイン病が含まれ得る。これらの抗体、具体的には、抗シヌクレイン抗体は、１つ以上のリソソーム蓄積症の治療にも有用であり得る。

多発性硬化症を治療するための免疫グロブリン構築物をコードする核酸構築物を操作または選択することができる。かかる免疫グロブリンとしては、ナタリズマブ（ヒト化抗ａ４－インテグリン、ｉＮＡＴＡ、タイサブリ、Ｂｉｏｇｅｎ ＩｄｅｃおよびＥｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、２００６年に承認）、アレムツズマブ（キャンパス－１Ｈ、ヒト化抗ＣＤ５２）、リツキシマブ（リツジン、キメラ抗ＣＤ２０）、ダクリズマブ（ゼナパックス、ヒト化抗ＣＤ２５）、オクレリズマブ（ヒト化、抗ＣＤ２０、Ｒｏｃｈｅ）、ウステキヌマブ（ＣＮＴＯ－１２７５、ヒト抗ＩＬ１２ｐ４０＋ＩＬ２３ｐ４０）、抗ＬＩＮＧＯ－１およびｃｈ５Ｄ１２（キメラ抗ＣＤ４０）、ならびにｒＨＩｇＭ２２（再ミエリン化モノクローナル抗体、ＡｃｏｒｄａおよびＭａｙｏ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）などを含み得るか、またはそれに由来し得る。さらに他の抗α４－インテグリン抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＩＬ１７抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体、および抗ＣＤ４０抗体は、本明細書に記載のＡＡＶベクターを介して送達され得る。

中枢神経系の様々な感染症に対する抗体も、本発明によって企図される。かかる感染性疾患としては、真菌性疾患（例えば、クリプトコッカス髄膜炎、脳膿瘍、脊髄硬膜外感染症、例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ目、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、およびＣａ
ｎｄｉｄａ種によって引き起こされる）、原虫性疾患（トキソプラズマ症、マラリア、および原発性アメーバ性髄膜脳炎、例えば、病原体Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｓ、Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａ ｍａｎｓｏｎｏｉｄｅｓ（孤虫症）、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種（神経包虫症の病因）によって引き起こされる、ならびに脳アメーバ症など）、細菌性疾患（例えば、結核、ハンセン病、神経梅毒、細菌性髄膜炎、ライム病（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ロッキー山紅斑熱（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ＣＮＳノカルジア症（Ｎｏｃａｒｄｉａ種）、ＣＮＳ結核（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ＣＮＳリステリア症（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、脳膿瘍、および神経ボレリア症）、ウイルス感染（例えば、ウイルス性髄膜炎、東部ウマ脳炎（ＥＥＥ）、セントルイス脳炎、ウエストナイルウイルスおよび／または脳炎、狂犬病、カリフォルニア脳炎ウイルス、ラクロス脳炎、麻疹脳炎、灰白髄炎など、これらは、例えば、ヘルペスファミリーウイルス（ＨＳＶ）、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２（新生児単純ヘルペス脳炎）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ビッカースタッフ脳炎、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ、ＴＣＮ－２０２などがＴｈｅｒａｃｌｏｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって開発中）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）、Ｂウイルス（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓｉｍｉａｅ）、フラビウイルス脳炎、日本脳炎、マレーバレー熱、ＪＣウイルス（進行性多巣性白質脳症）、ニパウイルス（ＮｉＶ）、麻疹ウイルス（亜急性硬化性全脳炎）によって引き起こされ得る）、および他の感染症（例えば、亜急性硬化性全脳炎、進行性多巣性白質脳症、ヒト免疫不全ウイルス（後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ））、化膿性連鎖球菌、および他のβ溶血性連鎖球菌（例えば、小児自己免疫性連鎖球菌感染関連精神神経障害（ＰＡＮＤＡＳ））および／またはシデナム舞踏病、ならびにギラン・バレー症候群、ならびにプリオン）が挙げられ得る。

好適な抗体構築物の例としては、例えば、ＷＯ２００７／０１２９２４Ａ２（２０１５年１月２９日）に記載されているものが挙げられ得る（参照により本明細書に援用される）。

例えば、他の核酸配列は、抗プリオン免疫グロブリン構築物をコードし得る。かかる免疫グロブリンは、ＣＤ２３０（表面抗原分類２３０）としても知られている、主要なプリオンタンパク質（ＰｒＰ、プリオンタンパク質またはプロテアーゼ耐性タンパク質に関して）を対象とし得る。ＰｒＰのアミノ酸配列は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ＿０００３０２に提供されている（参照により本明細書に援用される）。タンパク質は、複数のアイソフォーム（正常なＰｒＰＣ、疾患を引き起こすＰｒＰＳｃ、およびミトコンドリアに位置するアイソフォーム）で存在し得る。ミスフォールドしたバージョンのＰｒＰＳｃは、様々な認知障害および神経変性疾患（例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病、ウシ海綿状脳症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、およびクールー病）に関連している。

好適な遺伝子産物の例としては、家族性高コレステロール血症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、および希少疾患または孤児疾患に関連するものが含まれ得る。かかる希少疾患の例としては、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン病、レット症候群（例えば、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５１６０８）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症（例えば、フラタキシン）、プログラニュリン（ＰＲＧＮ）（前頭部認知症（ＦＴＤ）、進行性非流暢性失語症（ＰＮＦＡ）、および意味認知症を含む非アルツハイマー性脳変性に関連する）などが挙げられ得る。他の有用な遺伝子産物としては、カルバモイルシンセターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、アルギノコハク酸シ
ンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ欠乏症の治療のためのアルギノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ、フマル酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ－１アンチトリプシン、アカゲザルアルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アカゲザル絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、シスタチオニンベータ－シンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル－ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィン遺伝子産物［例えば、ミニまたはマイクロジストロフィン］が挙げられる。さらに他の有用な遺伝子産物は、酵素補充療法に有用であり得るような酵素を含み、これは酵素の不十分な活性に起因する様々な状態において有用である。例えば、マンノース－６－リン酸を含む酵素は、リソソーム蓄積症の治療に利用され得る（例えば、好適な遺伝子は、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードする遺伝子を含む）。

ｒＡＡＶを介して送達され得るさらなる例示的な遺伝子としては、限定されないが、グルコース－６－ホスファターゼ（糖原病または１Ａ型欠損症（ＧＳＤ１）に関連する）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ、ＰＥＰＣＫ欠損症に関連する、サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５、発作および重度神経発達障害に関連するセリン／スレオニンキナーゼ９（ＳＴＫ９）としても知られる、ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ガラクトース血症に関連する）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に関連する）、分岐鎖αケト酸脱水素酵素（メープルシロップ尿症に関連する）、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（チロシン血症１型に関連する）、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（メチルマロン酸血症に関連する）、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（中鎖アセチルＣｏＡ欠損症に関連する）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症に関連する）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１、シトルリン血症に関連する）、レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ、欠乏症）、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、ニーマン・ピック病、Ｃ１型）、プロピオン酸血症（ＰＡ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質（家族性高コレステロール血症（ＦＨ）に関連する）、ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ（クリグラー・ナジャー病に関連する）、アデノシンデアミナーゼ（重症複合免疫不全症に関連する）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（痛風およびレッシュ・ナイハン症候群に関連する）、ビオチミダーゼ（ビオチミダーゼ欠損症に関連する）、αガラクトシダーゼＡ（ａ－Ｇａｌ Ａ、ファブリー病に関連する）、ＡＴＰ７Ｂ（ウィルソン病に関連する）、βグルコセレブロシダーゼ（ゴーシェ病２型および３型に関連する）、ペルオキシソーム膜タンパク質７０ｋＤａ（ツェルウェーガー症候群に関連する）、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ、異染性白質ジストロフィーに関連する）、ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ、クラッベ病に関連する酵素）、αグルコシダーゼ（ＧＡＡ、ポンペ病に関連する）、スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１、ニーマン・ピック病Ａ型に関連する遺伝子）、アルギニノコハク酸シンターゼ（成人発症ＩＩ型シトルリン血症（ＣＴＬＮ２）に関連する）、カルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳ１、尿素サイクル異常症に関連する）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質（脊髄性筋萎縮症に関連する）、セラミダーゼ（ファーバー脂肪肉芽腫症に関連する）、β－ヘキソサミニダーゼ（ＧＭ２ガングリオシドーシスおよびテイ・サックス病およびサンドホフ病に関連する）、アスパルチルグルコサミニダーゼ（アスパルチルグルコサミン尿症に関連する）、ａフコシダーゼ（フコシドーシスに関連する）、αマンノシダーゼ（αマンノシドーシスに関連する）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）に関連する）、α１アンチトリプシン（α１アンチトリプシン欠損症（肺気腫）の治療用）、エリスロポエチ
ン（サラセミアまたは腎不全による貧血の治療用）、血管内皮増殖因子、アンジオポエチン－１、および線維芽細胞増殖因子（虚血性疾患の治療用）、トロンボモジュリンおよび組織因子経路阻害因子（例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症、または塞栓症で見られる閉塞した血管の治療用）、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（パーキンソン病の治療用）、βアドレナリン受容体、ホスホランバンに対するアンチセンスもしくはその変異体、筋（小胞体）アデノシントリホスファターゼ－２（ＳＥＲＣＡ２）、および心臓アデニル酸シクラーゼ（うっ血性心不全の治療用）、腫瘍抑制因子遺伝子（ｐ５３など、様々な癌の治療用）、サイトカイン（様々なインターロイキンのうちの炎症性および免疫障害および癌の治療用のものなど）、ジストロフィンもしくはミニジストロフィンおよびユートロフィンもしくはミニユートロフィン（筋ジストロフィーの治療用）、ならびにインスリンまたはＧＬＰ－１（糖尿病の治療用）が挙げられる。さらなる目的の遺伝子および疾患としては、例えば、遺伝性感覚および自律神経失調症ＶＩ型などのジストニン遺伝子関連疾患（ＤＳＴ遺伝子はジストニンをコードする、タンパク質のサイズ（約７５７０ａａ）により必要とされ得るデュアルＡＡＶベクター、痛みを感じることができなくなる機能変異体の欠失、および肢端紅痛症などの痛み状態を引き起こす機能変異体の獲得などのＳＣＮ９Ａ関連疾患を含む。別の状態は、ＮＥＦＬ遺伝子（ニューロフィラメント軽鎖）における変異によるＣｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ １Ｆ型および２Ｅ型である。可変性の臨床的および電気生理学的発現を伴う進行性末梢運動および感覚性ニューロパシーを特徴とする。特定の実施形態では、本明細書に記載されるベクターは、ムコ多糖症（ＭＰＳ）障害の治療において使用され得る。かかるベクターは、ＭＰＳ Ｉ（ハーラー、ハーラー・シャイエおよびシャイエ症候群）を治療するためのα－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードする核酸配列、ＭＰＳ ＩＩ（ハンター症候群）を治療するためのイズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードする核酸配列、ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ（サンフィリッポ症候群）を治療するためのスルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）をコードする核酸配列、ＭＰＳ ＩＶ ＡおよびＢ（モルキオ症候群）を治療するためのＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）をコードする核酸配列、ＭＰＳ ＶＩ（マロトー・ラミー症候群）を治療するためのアリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）をコードする核酸配列、ＭＰＳＩ ＩＸ（ヒアルロニダーゼ欠損症）を治療するためのヒアルロニダーゼをコードする核酸配列、ならびにＭＰＳ ＶＩＩ（スライ症候群）を治療するためのベータグルクロニダーゼをコードする核酸配列を運ぶことを含み得る。例えば、ｗｗｗ．ｏｒｐｈａ．ｎｅｔ／ｃｏｎｓｏｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／Ｄｉｓｅａｓｅ＿Ｓｅａｒｃｈ＿Ｌｉｓｔ．ｐｈｐ；ｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｓｅａｓｅｓを参照されたい。

他の好適な遺伝子の例としては、例えば、ホルモンならびに増殖因子および分化因子を挙げることができ、限定されないが、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）（例えば、ヒト、イヌ、またはネコＥＰＯを含む）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、神経栄養因子、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ）、トランスフォーミング増殖因子αスーパーファミリーのうちのいずれか１つ（ＴＧＦα、アクチビン、インヒビンを含む）、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１～１５のうちのいずれか、成長因子のヘレグリン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーの増殖因子のうちのいずれか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３およびＮＴ－４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリ
ア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのうちのいずれか１つ、ネトリン１およびネトリン２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ、およびチロシンヒドロキシラーゼが含まれる。

他の有用な導入遺伝子産物としては、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ－１～ＩＬ－３６（例えば、ヒトインターロイキンＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、ＩＬ－３１、ＩＬ－３５）、単球走化性タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、β、およびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンドなどのサイトカインならびにリンホカインを含むがこれらに限定されない免疫系を制御するタンパク質が含まれる。免疫系によって産生される遺伝子産物も本発明において有用である。これらには、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子、ならびに操作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子が含まれるがこれらに限定されない。例えば、特定の実施形態では、ｒＡＡＶ抗体は、例えば、抗ＩｇＥ、抗ＩＬ３１、抗ＣＤ２０、抗ＮＧＦ、抗ＧｎＲＨなどのイヌまたはネコ抗体を送達するように設計され得る。有用な遺伝子産物としては、補体調節タンパク質、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２、ＣＤ５９、およびＣ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）などの補体制御性タンパク質も含まれる。さらに他の有用な遺伝子産物としては、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、制御性タンパク質、および免疫系タンパク質の受容体のうちのいずれか１つが含まれる。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体、およびスカベンジャー受容体を含む、コレステロール制御および／または脂質調節のための受容体を包含する。本発明はまた、糖質コルチコイド受容体およびエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体および他の核受容体を含むステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーなどの遺伝子産物を包含する。加えて、有用な遺伝子産物としては、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ－１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニンなどの転写因子、タンパク質を含むＥＴＳボックス、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ－４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ－１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ－３、ならびに翼状螺旋タンパク質のフォークヘッドファミリーが含まれる。

タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド（例えば、免疫グロブリンとして）の配列決定方法は、当業者に既知である。タンパク質の配列が分ると、ウェブベースおよび市販のコンピュータプログラム、ならびにアミノ酸配列を核酸コード配列に逆翻訳するサービスベースの企業が存在する。例えば、ＥＭＢＯＳＳ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／で利用可能）、Ｇｅｎｅ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌで利用可能）、ＥｘＰａｓｙ（ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／で利用可能）による逆翻訳配列を参照されたい。一実施形態では、ＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡコード配列は、ヒト細胞における最適な発現のために設計される。

特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、髄腔内または全身的遺伝子療法投与後の神経変性を調節する、および／または二次背側脊髄軸索変性を低減するための方法に有用である。したがって、本明細書で提供される組成物は、ＣＮＳへの遺伝子療法の
送達に特に有用であるが、それらは、例えば、高用量の遺伝子療法がＤＲＧ形質導入および毒性をもたらし得る全身ＩＶ送達を含む、他の送達経路にも有用であり得る。本方法は、導入遺伝子およびｍｉＲＮＡ標的（複数可）を含む発現カセットまたはベクターゲノムを含む組成物を患者に送達することを伴う。

特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、ＤＲＧにおける導入遺伝子発現を抑制する方法に有用である。特定の実施形態では、本方法は、ＤＲＧにおける導入遺伝子の発現レベルを抑制するために、ｍｉＲ－１８３標的配列を含む発現カセットまたはベクターゲノムを送達することを含む。特定の実施形態では、本方法は、錐体ニューロン、プルキンエニューロン、顆粒細胞、紡錘ニューロン、介在神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、および／または上衣細胞のうちの１つ以上から選択される、ＣＮＳに存在する１つ以上の細胞における発現を増強する。

特定の実施形態では、網膜、内耳、および嗅覚受容器の下位運動ニューロンにおける導入遺伝子の発現を送達および／または増強するのに有用な方法が提供され、１つ以上のｍｉＲ－１８３標的配列および／または複数のｍｉＲ－１８３標的配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含む発現カセットまたはベクターゲノムを送達することを含む。特定の実施形態では、細胞または組織は、肝臓または心臓のうちの１つ以上であり得る。

さらに別の実施形態では、ＣＮＳに存在する細胞に発現カセットまたはベクターゲノムを送達することを含む方法が提供され、発現カセットまたはベクターゲノムは、１つ以上のｍｉＲ－１８３標的配列を含み、導入遺伝子（すなわち、異種遺伝子産物をコードする配列）を欠く。かかる実施形態では、ＣＮＳの細胞へのｍｉＲ－１８３の送達が達成される。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３配列を含む発現カセットまたはベクターゲノムの送達は、ＤＲＧ発現の抑制およびＣＮＳに存在する特定の他の細胞における遺伝子発現の増強をもたらす。

特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、ＣＮＳ以外の細胞における導入遺伝子の発現を増強するための方法に有用である。特定の実施形態では、ＣＮＳ以外の細胞における発現を増強する方法は、ｍｉＲ－１８２標的配列を含む発現カセットまたはベクターゲノムを患者に送達することを含む。

一実施形態では、懸濁液は、約６．８～約７．３２のｐＨを有する。

これらの用量の送達に好適な容量および濃度は、当業者により決定されることができる。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容量が選択されてもよいが、より高容量が、成人のために選択され得る。典型的に、新生児のために、好適な容量は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年齢の高い乳幼児のためには、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択され得る。幼児のために、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容量が選択され得る。小児のために、最大約３０ｍＬの容量が選択され得る。プレティーンおよびティーン世代のために、最大約５０ｍＬの容量が選択され得る。さらに他の実施形態では、患者は、選択された約５ｍＬ～約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容量で髄腔内投与を受けることができる。他の好適な容量および投薬量が決定され得る。任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。

一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む組成物は、脳質量１グラムあたり約１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラムあたり約１×１０^１４ＧＣの用量で投与される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、体重１ｋｇあたり約１×１０^９ＧＣ～体重１ｋｇあたり約１×１０^１３ＧＣの用量で全身に同時投与される。

一実施形態では、対象は、治療有効量の本明細書に記載の発現カセットを送達される。本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、標的細胞に送達し、標的細胞で発現させ、ＤＲＧ発現を特異的に脱標的化する遺伝子産物およびｍｉＲＮＡ標的配列をコードする核酸配列を含む発現カセットの量を指す。

様々な病態の治療のために送達するためのｒＡＡＶの使用は、以前に記載されている。これらのｒＡＡＶの発現カセットは、例えば、ＤＲＧにおける導入遺伝子の発現を低減する、ならびに／またはＤＲＧ毒性および／もしくは軸索障害を低減もしくは排除するように、本明細書に記載のｍｉＲＮＡ標的配列（例えば、ｍｉＲ－１８３標的配列、ｍｉＲ－１８２標的配列およびｍｉＲ－９６標的配列、またはそれらの組み合わせを含む）を含むように修飾され得る。ｍｉＲＮＡ標的配列を含むように修飾され得るｒＡＡＶベクターゲノムの例としては、ＷＯ２０１７／１３６５００（ＭＰＳＩ）、ＷＯ２０１７／１８１１１３（ＭＰＳ ＩＩ）、ＷＯ２０１９／１０８８５７（ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ）、ＷＯ２０１９／１０８８５６（ＭＰＳ ＩＩＩ Ｂ）、ＷＯ２０１７／１０６３５４（ＳＭＮ１）、ＷＯ２０１８／１６０５８５（ＳＭＮ１）、ＷＯ２０１８／２０９２０５（バッテン病）、ＷＯ２０１５／１６４７２３（抗ＨＥＲ２抗体のＡＡＶ媒介性送達）、ＷＯ２０１５／１３８３４８（ＯＴＣ）、ＷＯ２０１５／１６４７７８（ＦＨのＬＤＬＲバリアント）、ＷＯ２０１７／１０６３４５（クリグラー・ナジャー）、ＷＯ２０１７／１０６３２６（抗ＰＣＳＫ９抗体）、ＷＯ２０１７／１８０８５７（血友病Ａ、第ＶＩＩＩ因子）、ＷＯ２０１７／１８０８６１（血友病Ｂ、第ＩＸ因子）に記載される遺伝子、ならびに筋細管ミオパシー（ＡＴ１３２、ＡＡＶ８、Ａｕｄｅｎｔｅｓなど）の治療のための治験におけるベクターが挙げられる。

特定の実施形態では、ＡＡＶ．α－Ｌ－イズロニダーゼ（ＡＡＶ．ＩＤＵＡ）遺伝子療法ベクターは、ＩＤＵＡ遺伝子のコード配列（例えば、配列番号１５のｎｔ１９３８～３９０８を参照されたい）に作動可能に連結されたｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、およびｍｉＲ１８３標的配列、またはそれらの組み合わせを含む）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、複数コピーの同じｍｉＲ標的配列を含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、または互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、３～６コピーのｍｉＲ１８３クラスター標的配列を含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３標的配列を、１、２、３、または４コピー含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。

特定の実施形態では、ＡＡＶ．イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）（ＡＡＶ．ＩＤＳ）遺伝子療法ベクターは、ＩＤＳ遺伝子のコード配列に作動可能に連結されるｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、およびｍｉＲ１８３の標的配列、またはそれらの組み合わせを含む）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特
定の実施形態では、ベクターゲノムは、複数コピーの同じｍｉＲ標的配列を含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、または互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、３～６コピーのｍｉＲ１８３クラスター標的配列を含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３標的配列を、１、２、３、または４コピー含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。

特定の実施形態では、ＡＡＶ．Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＡＡＶ．ＳＧＳＨ）遺伝子療法ベクターは、ＳＧＳＨ遺伝子のコード配列に作動可能に連結されるｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－９６、ｍｉＲ－１８２、およびｍｉＲ１８３の標的配列、またはそれらの組み合わせを含む）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、複数コピーの同じｍｉＲ標的配列を含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、または互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、３～６コピーのｍｉＲ１８３クラスター標的配列を含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３標的配列を、１、２、３、または４コピー含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。

特定の実施形態では、ＡＡＶ．Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミニダーゼ（ＡＡＶ．ＮＡＧＬＵ）遺伝子療法ベクターは、ＮＡＧＬＵ遺伝子のコード配列に作動可能に連結されるｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、およびｍｉＲ１８３の標的配列、またはそれらの組み合わせを含む）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、複数コピーの同じｍｉＲ標的配列を含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、または互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、３～６コピーのｍｉＲ１８３クラスター標的配列を含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３標的配列を、１、２、３、または４コピー含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバー
の単一のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。

特定の実施形態では、ＡＡＶ．生存運動ニューロン１（ＡＡＶ．ＳＭＮ１）遺伝子療法ベクターは、ＳＭＮ１遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、およびｍｉＲ１８３の標的配列、またはそれらの組み合わせを含む）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、複数コピーの同じｍｉＲ標的配列を含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、または互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、３～６コピーのｍｉＲ１８３クラスター標的配列を含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３標的配列を、１、２、３、または４コピー含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。

特定の実施形態では、ＡＡＶ．トリペプチジルペプチダーゼ１（ＡＡＶ．ＴＰＰ１）遺伝子療法ベクターは、ＴＰＰ１遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、およびｍｉＲ１８３の標的配列、またはそれらの組み合わせを含む）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、複数コピーの同じｍｉＲ標的配列を含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、または互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、３～６コピーのｍｉＲ１８３クラスター標的配列を含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３標的配列を、１、２、３、または４コピー含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。

特定の実施形態では、ＡＡＶ．抗ヒト上皮増殖因子受容体２抗体（ＡＡＶ．抗ＨＥＲ２）遺伝子療法ベクターは、抗ＨＥＲ２抗体のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、およびｍｉＲ１８３の標的配列、またはそれらの組み合わせを含む）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、複数コピーの同じｍｉＲ標的配列を含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、または互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、３～６コピーのｍｉＲ１８３クラスター標的配列を含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３標的配列を、１、２、３、または４コピー含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。

特定の実施形態では、ＡＡＶ．オルニチントランスカルバミラーゼ（ＡＡＶ．ＯＴＣ）遺伝子療法ベクターは、ＯＴＣ遺伝子のコード配列に作動可能に連結されるｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、およびｍｉＲ１８３の標的配列、またはそれらの組み合わせを含む）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、複数コピーの同じｍｉＲ標的配列を含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、または互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、３～６コピーのｍｉＲ１８３クラスター標的配列を含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３標的配列を、１、２、３、または４コピー含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。

特定の実施形態では、ＡＡＶ．低密度リポタンパク質受容体（ＡＡＶ．ＬＤＬＲ）遺伝子療法ベクターは、ＬＤＬＲ遺伝子のコード配列に作動可能に連結されるｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、およびｍｉＲ１８３の標的配列、またはそれらの組み合わせを含む）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、複数コピーの同じｍｉＲ標的配列を含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、または互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、３～６コピーのｍｉＲ１８３クラスター標的配列を含
み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３標的配列を、１、２、３、または４コピー含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。

特定の実施形態では、ＡＡＶ．ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＡＡＶ．ＵＧＴ１Ａ１）遺伝子療法ベクターは、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子のコード配列に作動可能に連結されるｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、およびｍｉＲ１８３の標的配列、またはそれらの組み合わせを含む）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、複数コピーの同じｍｉＲ標的配列を含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、または互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、３～６コピーのｍｉＲ１８３クラスター標的配列を含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３標的配列を、１、２、３、または４コピー含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。

特定の実施形態では、ＡＡＶ．抗プロタンパク質転換酵素サブチリシン．／ケキシン９型抗体（ＡＡＶ．抗ＰＣＳＫ９Ａｂ）遺伝子療法ベクターは、抗ＰＣＳＫ９Ａｂのコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、およびｍｉＲ１８３の標的配列、またはそれらの組み合わせを含む）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、複数コピーの同じｍｉＲ標的配列を含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、または互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、３～６コピーのｍｉＲ１８３クラスター標的配列を含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３標的配列を、１、２、３、または４コピー含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８
３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。

特定の実施形態では、ＡＡＶ．因子ＶＩＩＩ（ＡＡＶ．ＦＶＩＩＩ）遺伝子療法ベクターは、ＦＶＩＩＩ遺伝子のコード配列に作動可能に連結されるｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、およびｍｉＲ１８３の標的配列、またはそれらの組み合わせを含む）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、複数コピーの同じｍｉＲ標的配列を含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、または互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、３～６コピーのｍｉＲ１８３クラスター標的配列を含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３標的配列を、１、２、３、または４コピー含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。

特定の実施形態では、ＡＡＶ．因子ＩＸ（ＡＡＶ．ＩＸ）遺伝子療法ベクターは、ＦＩＸ遺伝子のコード配列に作動可能に連結されるｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、およびｍｉＲ１８３の標的配列、またはそれらの組み合わせを含む）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、複数コピーの同じｍｉＲ標的配列を含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、または互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、３～６コピーのｍｉＲ１８３クラスター標的配列を含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３標的配列を、１、２、３、または４コピー含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。

特定の実施形態では、ＡＡＶ．ミオチューブラリン１（ＡＡＶ．ＭＴＭ１）遺伝子療法ベクターは、ＭＴＭ１遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、およびｍｉＲ１８３の標的配列、またはそれらの組み合わせを含む）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、ま
たは少なくとも４つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、複数コピーの同じｍｉＲ標的配列を含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、または互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、３～６コピーのｍｉＲ１８３クラスター標的配列を含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３標的配列を、１、２、３、または４コピー含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、および任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。

一実施形態では、発現カセットは、ベクターゲノム中、範囲内およびエンドポイントのすべての整数または小数を含み、脳質量１グラムあたり約１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラムあたり約１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）の量で送達される。別の実施形態では、投薬量は、脳質量１グラムあたり１×１０^１０ＧＣ～脳質量１グラムあたり約１×１０^１３ＧＣである。特定の実施形態では、患者に投与されるベクターの用量は、少なくとも約１．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約５．５×１
０^１３ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、または約１．０×１０^１４ＧＣ／ｇ脳質量である。

特定の実施形態では、本明細書に提供されるｍｉＲ標的配列含有組成物は、患者が必要とする免疫抑制性併用療法の用量、持続時間、および／または量を最小限に抑える。現在、そのような併用療法のための免疫抑制剤としては、グルココルチコイド、ステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシンもしくはラパログ）、および細胞分裂阻害剤（アルキル化剤を含む）、代謝拮抗剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、イムノフィリンに対して活性のある物質が挙げられるが、これらに限定されない。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）特異的抗体またはＣＤ３特異的抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、またはＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤が挙げられ得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子療法投与の０、１、２、７日以上前に開始されてもよい。かかる療法は、同じ日に２つ以上の薬物（例えば、プレドニゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）および／またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の同時投与を伴い得る。これらの薬物のうちの１つ以上が、同じ用量または調整された用量で、遺伝子療法投与後に継続されてもよい。かかる療法は、約１週間（７日間）、約６０日間であり得る。特定の実施形態では、本明細書に提供されるｍｉＲ標的配列含有組成物は、遺伝子療法（例えば、ｒＡＡＶ）ベクターの送達前、送達中、または送達後の免疫抑制療法の必要性を排除する。

一実施形態では、本明細書に記載される発現カセットを含む組成物は、必要な対象に１回投与される。特定の実施形態では、発現カセットは、ｒＡＡＶを介して送達される。

本明細書に記載の方法における組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

６．キット
特定の実施形態では、キットが提供され、製剤（任意選択的に、凍結される）中に懸濁された濃縮された発現カセット（例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターで）を含み、任意選択的な希釈緩衝液、ならびに髄腔内、脳室内、または大槽内投与に必要とされるデバイスおよび構成要素が提供される。別の実施形態では、キットは、追加的にまたは代替的に、静脈内送達のための構成要素を含み得る。一実施形態では、キットは、注入を可能にするために、十分な緩衝液を提供する。そのような緩衝液は、濃縮されたベクターの約１：１～１：５希釈、またはそれ超の希釈を可能にし得る。他の実施形態では、より多量もしくはより少量の緩衝液または滅菌水が含まれ、治療を行う医師により、用量滴定および他の調整が可能になる。さらに他の実施形態では、キットには、デバイスの１つ以上の構成要素が含まれる。好適な希釈緩衝液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはグリセロール／ＰＢＳが利用可能である。

本明細書に記載のキットにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

７．デバイス
一態様では、本明細書に提供される組成物は、例えば、ＷＯ２０１７／１３６５００（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている方法および／またはデバイスを介して髄腔内投与され得る。代替的には、他のデバイスおよび方法が選択され得る。要約すると、本方法は、脊椎針を患者の大槽内に前進するステップと、１本の可撓性チューブを脊椎針の近位ハブに連結し、バルブの出口ポートを可撓性チューブの近位端に連結するステップと、当該前進ステップおよび連結ステップ後、チューブを患者の脳脊髄液で自吸させた後で、一定量の等張溶液を含む第１の容器をバルブのフラッシュ入口ポートに連結するステップと、その後、一定量の医薬組成物を含む第２の容器をバルブのベクター入口ポートに連結するステップと、を含む。第１および第２容器をバルブに連結した後、流体流れのための通路は、ベクター入口ポートとバルブの出口ポートとの間に開かれ、医薬組成物は脊椎針を通して患者に注入され、医薬組成物の注入後、流体流れのための通路は、フラッシュ入口ポートとバルブの出口ポートを通って開かれ、等張溶液は、医薬組成物を患者にフラッシュするために脊椎針中に注入される。この方法およびこのデバイスは、各々任意選択的に、本明細書で提供される組成物の髄腔内送達のために使用され得る。代替的には、他の方法およびデバイスが、かかる髄腔内送達のために使用され得る。

本明細書に記載のデバイスにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

ここで、以下の実施例を参照しながら、本発明を説明する。これらの実施例は例示のみを目的として提供され、本発明がこれらの実施例に限定されるものとして決して解釈されるべきではなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形例を包含すると解釈されるべきである。

実施例１：方法
動物
動物手順はすべて、ペンシルベニア大学の施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ／Ｍａｃａｃａ Ｍｕｌａｔｔａ）は、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ（Ａｌｉｃｅ，ＴＸ）およびＰｒｉｍｇｅｎ／Ｐｒｅｌａｂｓ Ｐｒｉｍａｔｅｓ（Ｈｉｎｅｓ，ＩＬ）から調達した。動物は、国際実験動物管理評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）認定のペンシルベニア大学の非ヒト霊長類研究プログラム施設内に、ステンレス鋼製スクイーズバックケージ内に収容された。動物は、給餌、視覚および聴覚刺激、操作、および社会的相互作用などの様々な豊かさ（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｓ）を享受した。

Ｃ５６ＢＬ／６Ｊマウス（ストック＃０００６６４）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。動物を、豊かさを伴う１ケージあたり２～５匹の標準的なケージで、ペンシルベニア大学の遺伝子療法プログラムでＡＡＡＬＡＣ国際認定のマウス用バリアビバリウムに収容した（Ｎｅｓｔｌｅｔｓ巣材）。バリア施設のケージ、給水瓶、および床敷は、オートクレーブ処理し、ケージは、週に１回交換された。自動制御の１２時間の明暗サイクルが維持された。各暗期は、１，９００時間（±３０分）で開始した。放射線照射された実験用げっ歯類の餌は、自由摂食で提供された。

ベクター
ＡＡＶ９．ＰＨＰ．Ｂトランスプラスミド（ｐＡＡＶ２／ＰＨＰ．Ｂ）は、製造元のマニュアルに従って、ｐＡＡＶ２／９（Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ）を鋳型として使用して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的変異導入キット（Ａｇ
ｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，Ｃａｔ＃２１０５１５）で生成した。ｐＡＡＶ２／９およびｐＡＡＶ２／ｈｕ６８は、Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって提供された。ＡＡＶベクターを作製し、以前に記載されているように、Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって滴定した（Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔ
ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１：１２５９－１２７１，２０１０）。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を三重でトランスフェクトし、培養上清を回収し、濃縮し、イオジキサノール勾配で精製した。精製したベクターを、以前に記載されているように、ウサギβグロビンポリＡ配列を標的とするプライマーを使用して、デジタルドロップレットＰＣＲで滴定した（Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：１１５－１２５，２０１４）。ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）配列は、ｈＩＤＵＡアイソフォームの前駆タンパク質配列ＮＰ＿０００１９４．２の逆翻訳およびコドン最適化を通して取得し、ＣＢ７プロモーター（Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ）下でクローニングした。後根神経節（ＤＲＧ）濃縮マイクロＲＮＡ配列を、ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ．において入手可能な公開データベースから選択した。ＤＲＧ濃縮ｍｉＲの標的の４つのタンデムリピートを、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはｈＩＤＵＡシスプラスミドの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）にクローニングした。

インビボ試験
マウスは、ｍｉＲ標的の有無にかかわらず、０．１ｍＬ中、１×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ、５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）のＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ，、または４×１０^１２ＧＣ（２×１０^１４ＧＣ／ｋｇ）の強化ＧＦＰ（Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ）をコードするＡＡＶ９ベクターを、外側尾静脈を介して受け、注入の２１日後、ＣＯ_２の吸入によって安楽死させた。組織を、脳から始めて迅速に収集し、１０％の中性緩衝ホルマリンで約２４時間浸漬固定し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で短時間洗浄し、４℃でＰＢＳ中の１５％および３０％スクロースで順次平衡化した。次いで、組織を最適な切断温度の包埋媒体で凍結し、ＧＦＰを直接可視化するために凍結切片を作製した（脳は、３０μｍ厚で切片化し、他の組織は、８μｍ厚で切片化した）。画像は、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｅ蛍光顕微鏡を用いて取得した。ＤＲＧにおけるＧＦＰ発現を、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって分析した。ＤＲＧを含む脊柱をホルマリン中で２４時間固定し、軟質になるまで１０％のエチレンジアミン四酢酸（ｐＨ７．５）中で脱灰し、標準プロトコルに従ってパラフィン包埋した。切片を、エタノールおよびキシレンシリーズを通して脱パラフィン化し、１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で６分間沸騰し、抗原賦活化を行い、２％のＨ_２Ｏ_２（１５分間）、アビジン／ビオチンブロッキング試薬（各１５分間、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、およびブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中に１％のロバ血清＋０．２％のＴｒｉｔｏｎ、１０分間）で順次ブロッキングした後、ブロッキング緩衝液に希釈された一次抗体（３７℃で１時間）およびビオチン化二次抗体（１：５００希釈、４５分間；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）でインキュベーションした。ＧＦＰに対するウサギ抗体を一次抗体として使用した（ＮＢ６００－３０８，Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ，ＣＯ、１：５００希釈）。ＤＡＢを基質として用いるＶｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）は、結合した抗体を、褐色沈殿物として可視化することを可能にした。

非ヒト霊長類（ＮＨＰ）は、透視ガイド下で、３．５×１０^１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰベクター、または１×１０^１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡベクターを受け、１ｍＬの総容量で大槽内に注入された（Ｋａｔｚ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９：２１２－２１９，２０１８によって、以前に記載されているように）。安全性の読み取りのために、定期的な採血および脳脊髄液（ＣＳＦ）タップを行った。血清化学、血液学、凝固、およびＣＳＦの分析は、契約施設のＡｎ
ｔｅｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ）によって行われた。動物を、静脈内ペントバルビタール過剰投与で安楽死させ、剖検した。次いで、網羅的な組織病理学的検査用に、組織を採取した。回収した組織を直ちにホルマリンに固定し、パラフィン包埋した。組織病理学的検査の場合、組織切片を、標準プロトコルに従って、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ＧＦＰ発現のためのＩＨＣは、マウスの研究で記載されているように行ったが、ＧＦＰに対して異なる抗体を使用した（ヤギ抗体、ＮＢ１００－１７７０、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１：５００希釈、４℃で一晩のインキュベーション）。ｈＩＤＵＡに対する免疫染色は、ＩＨＣに関する上記のプロトコルに従って、ｈＩＤＵＡに対するヒツジ抗体（ＡＦ４１１９，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、１：２００希釈）を使用して行った。加えて、切片を、同じ一次抗体を使用して、免疫蛍光（ＩＦ）によってｈＩＤＵＡに対して染色した。ＩＦの場合、切片を、上に記載のように脱パラフィン化し、抗原賦活化用に処理し、次いで、ＰＢＳ中１％のロバ血清＋０．２％のＴｒｉｔｏｎで１５分間ブロッキングした後、ブロッキング緩衝液に希釈された一次抗体（室温で２時間、１：５０希釈）およびＦＩＴＣ標識二次抗体（４５分間、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：１００希釈）を用いて、順次インキュベーションした。ＤＡＰＩを核の対比染色に用い、切片を、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ中でマウントした。

インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、内因性サルＩＤＵＡのＲＮＡに結合しないベクターゲノムから転写されたコドン最適化ＲＮＡに特異的なプローブを使用して行った。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によってＺ字型プローブ対を合成し、製造元のプロトコルに従って、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＶｉｅｗＲＮＡ ＩＳＨ組織アッセイキットを使用して、パラフィン切片上でＩＳＨを行った。陽性シグナルを示すＦａｓｔ Ｒｅｄ沈殿物の析出を、ローダミンフィルターセットを使用した蛍光顕微鏡によって画像化した。ＩＤＵＡのＩＨＣを用いた組織切片を、Ａｐｅｒｉｏ Ｖｅｒｓａスライドスキャナー（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を使用して定量化の目的でスキャンした。

組織病理学および形態測定
ベクター群に対して盲検化された委員会認定獣医が、重症度グレードを確立し、以下の定義がなされた：０．病変の不在、１．最小（１０％未満）、２．軽度（１０～２５％）、３．中等度（２５～５０％）、４．顕著（５０～９５％）、および５．重度（９５％超）。背側軸索障害スコアは、各動物において、少なくとも３つの頸髄背切片、３つの胸髄切片、および３つの腰髄切片から確立された。ＤＲＧ重症度グレードは、少なくとも３つの頸髄切片、３つの胸髄切片、および３つの腰髄切片から確立された。中央値神経スコアは、軸索障害および線維症の重症度グレードの合計であり、最大可能スコアが１０で、左および右の神経の遠位部および近位部で確立された。導入遺伝子発現の定量化のために、委員会認定獣医病理学者は、未処置の動物から得られた対照スライドからのシグナルと比較することによって、抗ＧＦＰ抗体または抗ｈＩＤＵＡ抗体で免疫染色された細胞をカウントした。２０の倍率視野（ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｉｅｌｄ）あたりの陽性細胞の総数を、ＩｍａｇｅＪ細胞計数ツールを使用して、構造あたりおよび動物あたりで、少なくとも５つの視野上でカウントした。

ベクター生体分布
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号５１３０６）でＮＨＰ組織ＤＮＡを抽出し、ベクターゲノムを、Ｔａｑｍａｎ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）およびベクターのｒＢＧポリアデニル化配列を標的とするプライマー／プローブを使用して、リアルタイムＰＣＲによって定量化した。

免疫学
ｈＩＤＵＡに対する末梢血Ｔ細胞応答を、ｈＩＤＵＡ導入遺伝子に特異的なペプチドライブラリを使用して、以前に公開された方法に従ってインターフェロンγ酵素結合免疫吸着スポットアッセイによって測定した（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２００９）。陽性応答の基準は、１０^６リンパ球あたり＞５５スポット形成単位、かつ未刺激時の培地陰性対照の３倍であった。加えて、Ｔ細胞応答を、試験９０日目に、剖検後、脾臓、肝臓、および深部頸部リンパ節から抽出したリンパ球においてアッセイした。血清中のｈＩＤＵＡに対する抗体を測定した（１：１，０００試料希釈）（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２３：１２９８－１３０７，２０１５によって以前に記載されているように）。

サイトカイン／ケモカイン分析：ＣＳＦ試料を回収し、分析時まで－８０℃で貯蔵した。ＣＳＦ試料を、以下の分析物を含むＭｉｌｌｉｐｌｅｘ ＭＡＰキットを使用して分析した：ｓＣＤ１３７、エオタキシン、ｓＦａｓＬ、ＦＧＦ－２、フラクタルカイン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｅ／ＩＬ－２５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２８Ａ、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３、ＩＰ－１０、ＭＩＰ－３α、パーフォリン、ＴＮＦβ。ＣＳＦ試料は、二重で評価し、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＰＯＮＥＮＴ（登録商標）４．２、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ（商標）ソフトウェア６．１を使用して、ＦＬＥＸＭＡＰ ３Ｄ機器で分析した。分析には、２０％未満の％ＣＶを有する試料のみが含まれた。

インビトロ研究
ｍｉＲ１８３ヒトマイクロＲＮＡ発現プラスミドは、ＯｒｉｇｅｎｅのＭＩ００００２７３ベクターから、ＧＦＰと部分的な内部リボソーム進入部位をコードするＫｐｎＩ－ＰｓｔＩ断片を欠失させることによって修飾された。我々は、一過性トランスフェクションおよび抗ＧＦＰ免疫ブロットによって、修飾ベクターからのＧＦＰ発現が欠如していることを確認した。ＧＦＰ発現カセットの３’－ＵＴＲに位置するマイクロＲＮＡ結合部位を有するＧＦＰシスプラスミドを用いて、ＨＥＫ２９３細胞でポリエチレンイミン媒介性の一過性トランスフェクションを行った。トランスフェクションの７２時間後、細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で溶解した。合計１３μｇの細胞溶解物を、抗ＧＦＰ免疫ブロット、続いて電気化学発光に基づくシグナル検出および定量化に使用した。統計解析用に三重で実験を行った。

統計解析
群間の統計学的差異を、ウィルコクソン順位和検定を使用して評価した。

実施例２：導入遺伝子発現のマイクロＲＮＡ媒介性阻害は、ＡＡＶによる後根神経節の毒性を低減する
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを血液または脳脊髄液を介して非ヒト霊長類（ＮＨＰ）のＣＮＳに送達することは、後根神経節（ＤＲＧ）の毒性と関連する。これは、高効率の形質導入によって引き起こされる可能性があり、導入遺伝子産物の過剰産生から、小胞体ストレスが引き起こされ得る。本発明者らは、対応する導入遺伝子ｍＲＮＡの３’非翻訳領域内のベクターゲノムに、ｍｉＲＮＡ標的配列を導入することによって、ＣＮＳ特異的ＡＡＶ遺伝子療法に関連する毒性を排除するアプローチを開発した。ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ１４５（４コピー）．ウサギβグロビン、３’ＩＴＲの発現カセットは、配列番号１０に提供される。ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＦＰ．ｍｉＲ１８２（４コピー）．ウサギβグロビン、３’ＩＴＲの発現カセットは、配列番号１１に提供される。ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＦＰ．ｍｉＲＮＡ９６（４コピー）．ウサギβグロビ
ン、３’ＩＴＲの発現カセットは、配列番号１２に提供される。ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＦＰ．ｍｉＲ１８３（４コピー）．ウサギβグロビン、３’ＩＴＲの発現カセットは、配列番号１３に提供される。

ＡＡＶベクターは、ＮＨＰでＤＲＧ変性を引き起こす
ＮＨＰでのＤＲＧ毒性における経験に基づいて、毒性の重症度を定量化するシステムを開発した。本発明者らは、ＤＲＧの脊髄に沿って位置する細胞体、末梢神経内の軸索、および背側白質路を上行する軸索を評価する（図１Ｂ）。原発性病変は、ＤＲＧに位置する感覚ニューロン細胞体の変性であると考えられる。病変は、組織学的に、好酸球増加症、不規則な細胞形状、ニッスル物質の破壊（中心性色質融解）、および単核細胞浸潤と共に核境界の喪失によって特徴付けられる（図１Ｂ）。高レベルの導入遺伝子タンパク質を発現している細胞は、変性を受ける可能性が高くなり、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、図１Ｂ）を発現するＡＡＶベクターのＩＣＭ投与を受けた動物で、導入遺伝子産物を免疫染色することによって証明される。細胞体の死の二次的なものとして、軸索障害があり、それは、遠位軸索および近位軸索の変性である。軸索障害は、軸索の欠損、細胞デブリを取り囲む膨張したミエリン鞘、およびマクロファージによって特徴付けられる（図１Ｂ）。図１Ｃは、異なるレベルのＤＲＧ毒性および脊髄軸索障害の例を示す。グレードは、高倍率視野組織病理学的検査における罹患組織の割合に基づく：１．最小（１０％未満）、２．軽度（１０～２５％）、３．中等度（２５～５０％）、４．顕著（５０～９５％）、および５．重度（９５％超）。

本発明者らのこれまでの経験では、ＩＣＭまたは腰椎穿刺（ＬＰ）経路を介してＣＳＦにＡＡＶベクターを投与された幼若／成体ＮＨＰは、２１件の研究にわたって総計で１０１匹のサルになり、これは、以前に公開された毒性試験（Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ
ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：６８－７８，２０１８、Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：７９－８８，２０１８）および以下の実施例に記載される２つのＮＨＰ実験、ならびにいくつかの未公開研究を包含している。この経験には、７つのカプシド、１２個の導入遺伝子、３つのプロモーター（ＣＢ７、ＵＢＣ、ｈＳｙｎ）、１×１０^１２ＧＣ～５．７×１０^１３ＧＣの用量、勾配またはカラムで精製されたベクター、３つの製剤（リン酸緩衝食塩水および２つの異なる人工ＣＳＦ）、ならびに様々な発達段階のカニクイザルおよびマカクが含まれる。すべての実験群において、ＤＲＧ毒性および軸索障害が観察された。病理は、注入後約１ヶ月でピークに達し、最長６ヶ月間（成熟マカクで評価された最長期間である）進行しない。ほとんどの場合、病理は軽度から中等度である。しかしながら、ＧＦＰを発現するベクターを高用量でＩＣＭ注入すると、失調症に関連する重篤な病理を引き起こし得る。

ＤＲＧニューロンで特異的に発現されたｍｉＲＮＡは、ＡＡＶ導入遺伝子の発現を除去することができる。
ＤＲＧ毒性を軽減する方法を検討する際、いくつかのメカニズムを評価した。以前の研究では、ヒトＩＤＵＡまたはヒトＩＤを発現するＡＡＶ９ベクターをＩＣＭ投与されたＮＨＰを免疫抑制することによって、形質導入されたＤＲＧに対する破壊的な適応免疫応答の役割を分析した。ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）およびラパマイシンでの処置は、ベクターおよび導入遺伝子産物に対する適応免疫応答を鈍化させたが、ＤＲＧ毒性および軸索障害に有意な影響を与えなかった（Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：６８－７８，２０１８、Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：７９－８８，２０１８）。

以前に調査されていない１つの可能性は、高度に形質導入されたＤＲＧにおける導入遺
伝子産物の過剰発現が、細胞体および関連する軸索の神経傷害および変性、それに続く反応性炎症応答の原因であるかどうかである（図２Ａ）。したがって、ＤＲＧにおける導入遺伝子の発現を特異的に除去するために、ＤＲＧニューロンでのみ発現されるｍｉＲＮＡ標的を、導入遺伝子の３’非翻訳領域にクローニングした（図２Ｂ）。ベクターから発現される任意のｍＲＮＡは、内因的に発現されるｍｉＲＮＡによって破壊されるであろう。

ｍｉＲＮＡ戦略の活性および特異性を評価するために、インビトロアッセイを使用した。発現カセットの３’非翻訳領域に標的ｍｉＲＮＡ配列の４反復（リピート）コンカテマーを含むようにＡＡＶシスプラスミドを構築した（図２Ｂ）。ＡＡＶシスプラスミドを、ｍｉＲ１８３を発現するプラスミドと共に、ＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクションした。導入遺伝子であるＧＦＰの発現は、それが同種の認識配列を含む場合にのみ、ｍｉＲ１８３の存在下で低減された（図３Ａ）。

ＡＡＶベクター内の潜在的なｍｉＲＮＡ標的のインビボ活性および特異性を、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおいてスクリーニングした。本発明者らは、ｍｉＲＮＡ１８３複合体（ｍｉＲ１８２およびｍｉＲ１８３）ならびにｍｉＲ１４５のうちの２つのメンバー由来のｍｉＲＮＡ標的の有無で、ＧＦＰ発現ベクターを評価した。最初、１８３複合体の別のメンバーであるｍｉＲ９６を試験したが、マウス皮質で導入遺伝子の発現が減少することから、それを排除した（未掲載）。動物は、標的ＤＲＧへのＡＡＶ９の高用量静脈内（ＩＶ）注入、およびＣＮＳを標的とする高用量のＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ（ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂ．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＦＰ．ｒＢＧ）注入を受けた。動物を２１日目に剖検し、免疫組織化学（ＩＨＣ）および脳および肝臓における直接蛍光顕微鏡法によって、ＤＲＧにおけるＧＦＰの発現について分析した。ＤＲＧニューロンにおけるＧＦＰの発現は、ｍｉＲ１８３標的およびｍｉＲ１８２標的を含むベクターにより実質的に低下したが、ｍｉＲ１４５標的は効果を有さなかった（図３Ｂおよび図３Ｃ）。ｍｉＲ標的のいずれかを含むベクターによる肝臓または他のＣＮＳ区画における発現の明らかな低下はなかった。発現は、ｍｉＲ１８３ベクターによりＣＮＳでわずかに増強されたようであった（図３Ｄ）。このマウス実験では、ベクター誘発性のＤＲＧ毒性がＮＨＰでのみ観察されたため、病理におけるｍｉＲ１８３導入遺伝子の抑制の影響を評価することができなかった。

ｍｉＲ１８３による限定された導入遺伝子の発現は、ＮＨＰにおけるＤＲＧ毒性を低減する。
マウスの有望なデータに基づいて、ＮＨＰでＧＦＰ ｍｉＲ１８３発現カセットを評価した。本発明者らは、アカゲザルのＣＢ７プロモーター（３．５×１０^１３ＧＣ）から、ＧＦＰ（ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＦＰ．ｒＢＧ）（Ｎ＝２）またはＧＦＰ ｍｉＲ１８３（ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＦＰ．ｍｉＲ１８３．ｒＢＧ）（Ｎ＝４）を発現するＡＡＶｈｕ６８ベクターを注入した。１４日目に、動物の半数を、ＧＦＰ発現について剖検した（図４Ｂ－ＧＦＰ発現についての代表的なＩＨＣ、図４Ｂ－発現の定量化）。残りの動物は６０日目に剖検して、発現およびＤＲＧ毒性を評価した（図４Ｃ－ＤＲＧ変性、背側脊髄軸索障害、および末梢神経の軸索障害）。動物は、臨床的続発症を伴うことなく、ＩＣＭ投与ベクターに耐性を示した。ｍｉＲ１８３ベクターを用いたＤＲＧにおけるＧＦＰ発現の統計学的に有意な減少、ならびに他の箇所（腰髄運動ニューロン、小脳、皮質、心臓、および肝臓を含む）での増強または同様の発現があった（図４Ａおよび図４Ｂ）。これは、９つの領域にわたる病理の著しい低減と関連した（頸髄、胸髄、および腰髄におけるＤＲＧならびに背側脊髄軸索障害、ならびに正中神経、腓骨神経および橈骨神経の軸索障害、図４Ｃ）。ベクターにｍｉＲ１８３標的がない場合、すべての領域で病理が存在し、グレード４、グレード２、およびグレード１の間で均等に分布した。ｍｉＲ１８３ベクターの場合、最大の病理はグレード２であり、領域のわずか１１％に存在し、残りの領域はグレード１（７２％）または病理なし（１６％）のいずれかであった。

これらの研究で、ｍｉＲ１８３標的を含むベクターにより、ＤＲＧ感覚ニューロンにおけるＧＦＰの発現が選択的に抑制されることが実証された。他のＣＮＳニューロンおよび末梢臓器は影響を受けなかった。したがって、ＤＲＧ毒性および二次軸索障害は、高度免疫原性／毒性導入遺伝子（ＧＦＰ）の文脈で、顕著／重度レベルから最小レベルに低減された。

実施例３：ｍｉＲＮＡ標的配列を有するベクターゲノムを含むＡＡＶを介した送達後の、後根神経節における治療用タンパク質の発現の特異的抑制
本発明者らは、ヒトＩＤＵＡ（Ｉ型ムコ多糖症を有する患者において欠損している酵素）を発現するベクターを使用して、ＮＨＰにおいて、ｍｉＲ１８３標的配列をさらに評価した。このヒト導入遺伝子を用いた研究が、ＮＨＰにおけるＤＲＧ毒性に初めて光を当てた（Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：７９－８８，２０１８）。実験には、３つの群が含まれた（Ｎ＝３／群）：１）群１－ｍｉＲ１８３標的を含まない対照ベクター単独（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏＶ１．ｒＢＧ）、２）群２－ステロイドで処置（－７日目～３０日目までプレドニゾロン１ｍｇ／ｋｇ／日、続いて漸進的な漸減）された動物におけるｍｉＲ１８３標的を含まない対照ベクター（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏＶ１．ｒＢＧ）、および３）群３－ｍｉＲ１８３標的を有するベクター（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏＶ１．ｍｉＲ１８３．ｒＢＧ）。すべてのベクターゲノムには、ニワトリβアクチンプロモーターおよびＣＭＶエンハンサーエレメント（ＣＢ７プロモーターと称する）の制御下のｈＩＤＵＡコード配列、ニワトリβアクチンスプライスドナーからなるキメライントロン（ＣＩ）（９７３ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ００１８２．１）、およびウサギβ－グロビンスプライスアクセプターエレメント、ならびにウサギβグロビンポリアデニル化シグナル（ｒＢＧ、１２７ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｖ００８８２．１）が含まれた。ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏＶ１．ｒＢＧ．ＩＴＲのベクターゲノムは、配列番号１４に提供されている。ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏＶ１．ｍｉＲＮＡ１８３．ｒＢＧ．ＩＴＲのベクターゲノムは、配列番号１５提供されている。すべての動物は、構成的プロモーターであるＣＢ７からｈＩＤＵＡを発現するＡＡＶｈｕ６８ベクター（１×１０^１３ＧＣ）のＩＣＭ注入を受けた。９０日目に剖検を行い、導入遺伝子の発現およびＤＲＧ関連の毒性を評価した。

すべての群由来の動物が、ベクター関連の臨床所見または臨床病理学的な異常を有さず、ＩＣＭベクターに耐容性を示した（表１および表２）。ＣＳＦ中の髄液細胞増多は非常に低く、第２群で１匹、第３群で１匹に限定された（表３）。Ｔ細胞応答（ＥＬＩＳＰＯＴによる測定）およびｈＩＤＵＡに対する抗体の両方が、３つの群すべてにおいて検出された（図７Ａ～図７Ｄ）。ＣＳＦサイトカインは、注入後２１日目および３５日目、群１と比較して群３で減少したが、一方、群２（ステロイド）では、２４時間でレベルが減少した（図８）。２１～３５日目が導入遺伝子のピーク発現に対応し、過剰発現誘発性のストレスが予想される時点である。

直接蛍光およびインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を使用して、対照ベクター（ｍｉＲ１８３標的を含まない）を使用した群１および群２では、ＤＲＧにおいて高発現のｈＩＤＵＡが観察された（図５および図６Ａ）。他のＣＮＳ区画では（脊髄の下位運動ニューロンならびに小脳および皮質のニューロンを含む）、中程度のｈＩＤＵＡの発現が検出された（図５および図６Ａ）。ｍｉＲ１８３標的をベクター（群３）に含めると、ＣＮＳにおける発現が減少することなく、ＤＲＧニューロンにおけるｈＩＤＵＡの発現が除去された（図５および図６Ａ）。ＣＮＳおよびＤＲＧ全体にわたるベクターの生体分布が、すべての群にわたって本質的に同じであったことから、ｍｉＲ１８３によるＤＲＧにおけるｈＩＤＵＡ発現の低減は、遺伝子導入が低減したためではなかった（図９）。ステロイドは、群１と比較して、ＤＲＧにおける発現を中程度に減少させ、下位運動ニューロ
ンにおける発現を増加させた（図５および図６Ａ）。予想通り、群１は、ＤＲＧ、後柱および末梢神経で病理を呈した。しかしながら、ｍｉＲ１８３標的を有するベクターを使用した場合、これらの所見は、全く不在であった（群３、図６Ｂ）。興味深いことに、ステロイド（グループ２）による共処理は、親ベクター（すなわち、ｍｉＲ１８３を含有しない）の毒性を低減しなかった。実際、毒性が悪化する傾向が観察された（図６Ｂ）。

ＤＲＧの毒性は、高全身用量のベクターまたはＣＳＦへのベクターの直接送達に依存する任意の療法において生じる可能性が高い。この安全上の懸念は、霊長類に限定され、通常は無症候性であった。しかしながら、ＤＲＧ毒性は、自己受容の欠損（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９（３）：２８５－２９８，２０１８）または難治性神経障害性疼痛に起因する失調症などの実質的な罹患を引き起こす可能性がある。米国食品医薬品局は最近、ＮＨＰでのＤＲＧ毒性のために、遅発性ＳＭＡに対する髄腔内ＡＡＶ９の臨床試験を一時停止したが、このリスクがＡＡＶ療法の開発をどのように制限し得るかを強調している（Ｎｏｖａｒｔｉｓ．Ｎｏｖａｒｔｉｓ ａｎｎｏｕｎｃｅｓ ＡＶＸＳ－１０１ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｕｐｄａｔｅ，２０１９）。

もともと、この毒性は、外来カプシドまたは導入遺伝子のエピトープを対象として、ＤＲＧ形質導入ニューロンに対する破壊的なＴ細胞免疫によって引き起こされると仮定された。しかしながら、ＭＭＦおよびラパマイシンなどの強力な免疫抑制レジメンは、毒性試験における毒性を防ぐことができず（Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：６８－７８，２０１８、Ｈｏｒｄｅ
ａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：７９－８８，２０１８）、また、この研究でも、ステロイドで毒性を防ぐことはできなかった。進行性ではないが、遅発性のＤＲＧ変性の時間経過は、適応免疫が役割を果たしたという考えを支持しなかった。もし細胞傷害性Ｔ細胞が関与していたならば、ＤＲＧの変性および単核細胞の浸潤が、早期に始まり、経時的に進行することが観察されていたであろう。

高レベルのＤＲＧ形質導入で、細胞ストレスが生み出され、これが高度に形質導入されたＤＲＧニューロンにおける変性をもたらす可能性がある。毒性は、導入遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を抑制することによって、防止され得るため、カプシドまたはベクターＤＮＡが、細胞のストレッサーとはなり得ない。組織学的分析では、変性が、最高レベルの導入遺伝子タンパク質を発現するＤＲＧニューロンに限定されることが実証された。自己限定的ではないが、遅延したＤＲＧ神経変性の時間経過は、非免疫毒性が、高度に形質導入されたサブセットの細胞に限定されるという考えと一致する。ＤＲＧ毒性および軸索障害が可逆的であるかどうかは不明である。成体動物を６ヶ月追跡した結果、病理における一貫した減少は観察されなかった。ＩＣＭ注入後、ＮＨＰでＤＲＧ毒性が観察された唯一の実験は、ベクターが１ヶ月齢のマカクに投与され、４年後に剖検された場合であった（Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。乳児霊長類がＤＲＧ毒性に耐性を有するか、またはそのＤＲＧニューロンが再生能を有するか、または病変がこの長期間にわたって退縮する可能性がある。

所見は、ＤＲＧ毒性が導入遺伝子の過剰発現によって引き起こされるという支持を示した。したがって、ＤＲＧ毒性の重症度は、用量、プロモーター強度、および導入遺伝子の性質に影響されるはずである。霊長類において、感覚ニューロンが最も効率的に形質導入される細胞の１つである理由は、まだ理解されていない。ＤＲＧは、ＣＮＳの外側に存在し、多孔質で有窓の毛細血管を有するため、全身投与ベクターによって容易にアクセスされる。全身ベクターは、末梢軸索からの取り込まれた後、逆行性輸送を介してＤＲＧニューロンにアクセスすることもできる。髄腔内（クモ膜下腔内）空間に存在する感覚神経区画の解剖学的構造により、ＣＳＦに送達されるベクターの高い形質導入が促進され得る。後根のＤＲＧニューロンの軸索は、ＣＳＦに曝され、ＩＣＭ／ＬＰ投与後に、ベクターへの容易なアクセスが提供される。ＤＲＧの細胞外液へのクモ膜下腔の開放的なアクセスにより、ＤＲＧの神経細胞体および他の細胞へのＩＣＭ／ＬＰベクターの直接接触が可能になるはずである。ｍｉＲ１８３によるＤＲＧニューロン内の導入遺伝子発現の抑制は、このｍｉＲの影響を受けるはずがないＤＲＧの他の細胞における導入遺伝子発現の分析を容易にした。ＩＳＨで、周囲のグリア衛星細胞における導入遺伝子のｍＲＮＡが明らかになり、直接的な形質導入を示唆し得る（図６Ｃ）。グリア細胞における導入遺伝子のｍＲＮＡの機能的意義は未知である。

ベクター導入遺伝子の発現を選択的に阻害すると、ＤＲＧ毒性が低減され、潜在的に排除されるはずである。これを達成するための鍵は、他の場所における発現に影響を与えることなく、ＤＲＧニューロンにおける発現を特異的に消滅させるための戦略である。現在、カプシド修飾または組織特異的プロモーターを介してこの特異性を達成する方法は存在しない。ｍｉＲ１８３の標的をベクターに含めることで、ベクターの製造、効力、または生体分布に影響を与えることなく、ＤＲＧ毒性を低減／排除する所望の結果が達成された。上記のｈＩＤＵＡのＮＨＰ研究では、併用ステロイドと共に非ｍｉＲ１８３ベクターを受けた群が含まれた（ＡＡＶ試験における免疫介在性の毒性を緩和するための標準的なアプローチである）。ステロイド治療群では、ＤＲＧ毒性が低減されず、実際、毒性を悪化させる傾向があった。この実験は、ＡＡＶ遺伝子療法試験における予防的ステロイドの限界を実証する。

ＤＲＧ毒性を減少させるためのこのアプローチのモジュール性は、ＡＡＶ誘発性のＤＲＧ毒性を軽減することが望まれる場合に、ＣＮＳ遺伝子療法に関して考慮されるいずれのＡＡＶベクターにおけるその使用を示唆する。このアプローチは、治療用途で、幅広いＡＡＶベクターにわたって使用することができる。

実施例４：ｍｉＲ１８３クラスター標的配列を有する発現構築物のインビトロ評価
インビトロアッセイを使用して、ｍｉＲＮＡ標的配列を有する構築物の活性および特異性を評価する。上の実施例２に記載されるように、ＨＥＫ２９３細胞（または別の好適な細胞株）を、ＧＦＰ導入遺伝子を有するシスプラスミド、ならびにｍｉＲ－１８２およびｍｉＲ－１８３などの１つ以上のｍｉＲＮＡを発現するプラスミドで共トランスフェクトする。シスプラスミドは、発現カセットの３’ＵＴＲ中の様々な数の対応する標的ｍｉＲＮＡ配列で設計され、代替的なスペーサー配列が導入される。トランスフェクションの７２時間後、ＧＦＰの発現を定量化して、相対的な発現レベルを決定する。

例えば、標的ｍｉＲ１８３配列を、１、２、３、または４コピー保有する構築物を試験する。個々の標的配列は、配列番号５～７に提供されるものなど、直接連結されているか、またはスペーサー配列によって分離されている。インビトロ研究の結果に基づいて、ＧＦＰの発現を低減または排除する配列（反復数を含む）およびスペーサーの好適な組み合わせが特定される。次いで、この研究からの候補を、標的ｍｉＲＮＡ配列およびスペーサー配列が同じ配置または類似の配置である発現構築物を有するＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ９またはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ）を送達することによって、インビボでスクリーニングする。例えば、ＤＲＧの脱標的化（すなわち、ＧＦＰ発現の低減）を含む、ＣＮＳでの発現レベルを評価するための例示的なインビボマウス研究が、実施例２に提供されている。

また、様々なスペーサー配列を含むかまたは含まない、１、２、３、または４コピーのｍｉＲ１８２の標的配列の組み合わせを有する構築物を使用して、同様の研究が行われる。加えて、ｍｉＲ１８２およびｍｉＲ１８３の認識配列の組み合わせおよび異なる配置を有する構築物が生成される。次いで、インビトロで好ましい減少した発現レベルを示すｍｉＲ１８２標的配列のみ、ならびにｍｉＲ１８２およびｍｉＲ１８３標的配列の組み合わせを有する構築物を、例えば、ＡＡＶベクターの投与後にインビボで評価して、ＣＮＳおよびＤＲＧの細胞における毒性および導入遺伝子発現のレベル（脱標的化の程度）を決定する。

あるいは、ｍｉＲ１８２標的配列および／または他のｍｉｒ１８３クラスター標的配列（すなわち、ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－９６、またはｍｉＲ－１８２に対応する標的配列）の組み合わせを１、２、３、または４コピー有する構築物を生成する。上記の実施例２に記載されるようなＧＦＰ発現アッセイを使用して、組み合わせのｍｉＲ１８２－ｍｉＲ１８３クラスター標的配列を保有する構築物をインビトロで試験する。上述のように、試験した発現カセットは、スペーサー配列によって分離されているか、または分離されていない様々な数のｍｉＲＮＡ標的配列を有する。次いで、ｍｉＲ１８２標的配列および他のｍｉｒ１８３クラスター標的配列の組み合わせを有する特定の構築物の活性を、次いで高用量でＩＶ投与されるＡＶＶベクターを生成することによってインビボで評価する。上記のように、ＡＡＶベクター導入遺伝子の発現は、ＤＲＧを含む様々な細胞および組織、特に肝臓組織において評価される。

さらに、導入遺伝子発現の１、２、３、または４コピーのｍｉＲ１８２標的配列の効果を評価する。上述のように、インビトロ試験のための実験的構築物を生成し、ｍｉＲ１８２標的配列を発現カセットの３’ＵＴＲに導入する。複数のｍｉＲ１８２配列が導入される場合、配列は連続的であってもよく、または代替的に、様々な介在スペーサー配列のう
ちのいずれかによって分離されてもよい。任意の組み合わせのｍｉＲ１８２標的配列、およびスペーサー配列（適用可能な場合）を含む発現カセットを有するＡＡＶベクターを生成し、インビボで試験する。特に、ｍｉＲ１８２標的配列を有する発現カセットの場合、導入遺伝子発現は、ＡＡＶベクターの高用量ＩＶ投与後の筋肉組織において評価される。

実施例５：ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩ）の治療のためのヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（ｈＩＤＳ）導入遺伝子の脱標的化
ＭＰＳ ＩＩ（ハンター症候群）の治療のための１つの戦略は、ｒＡＡＶベースのＣＮＳ特異的遺伝子療法を介して、患者の欠陥イズロン酸－２－スルファターゼを機能的に置換することである（例えば、参照により本明細書に援用される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７７７０号を参照されたい）。ＤＲＧ毒性を低減するために、ＭＰＳ ＩＩの治療のためのＡＡＶベクターゲノムは、ｍｉＲ標的配列を導入することによって修飾される。したがって、ｈＩＤＳコード配列を含むＡＡＶベクターゲノムは、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲ１８３標的配列を用いて設計される。インビボでのＤＲＧ脱標的化の有効性は、例えば、ｈＩＤＳをコードするＡＶＶベクターをＮＨＰに髄腔内投与した後で測定される。

実施例６：脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の治療のためのＳＭＮ１導入遺伝子の脱標的化
ＳＭＡは、ｈＳＭＮ１遺伝子の変異または欠失によって引き起こされる常染色体劣性障害である。ｒＡＡＶベクターを介した機能的なＳＭＮタンパク質の送達は、ＳＭＡの治療に有効であるものの、ＤＲＧ毒性が観察されている。好適なベクターとしては、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１９９９６号（参照により本明細書に援用される）に記載されているもの、およびＡＡＶ９ベースの遺伝子療法であるＺｏｌｇｅｎｓｍａ（登録商標）が挙げられる。ヒトＳＭＮ１をコードするＡＡＶベクターの送達後のＤＲＧ毒性の低減または排除は、ｍｉＲＮＡ標的配列（ｍｉＲ１８２およびｍｉＲ１８３によって認識されるものなど）をベクターゲノムに組み込むことによって達成される。したがって、ｈＳＭＮ１転写産物をコードする核酸配列を、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲＮＡ標的配列と組み合わせて有する、ＡＡＶベクター（ＡＡＶ９またはＡＡＶｈｕ６８カプシドを有するものを含む）が生成される。標的配列は、例えば、ｍｉＲ１８２およびｍｉＲ１８３標的配列、またはそれらの組み合わせから選択される。ｈＳＭＮ１発現ＡＡＶベクターのＩＶ投与または髄腔内投与後のＤＲＧ毒性は、ＮＨＰモデルで評価される。

実施例７：ｍｉＲＮＡ標的配列を有する肝臓特異的遺伝子療法ベクター
遺伝子療法に関して、肝臓組織における導入遺伝子の発現の改善が望まれる場合、ＡＡＶベクターゲノムは、ｍｉＲＮＡ標的配列を含むように修飾され得る。例えば、機能性低密度リポタンパク質受容体（ｈＬＤＬＲ）遺伝子を発現し、ＡＡＶ８カプシドを有するように設計されたｒＡＡＶは、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）の治療に好適である（例えば、参照により本明細書に援用される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９８４号を参照されたい）。肝臓組織におけるｈＬＤＬＲ導入遺伝子の発現の増強は、ｈＬＤＬＲコード配列を、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲ１８２標的配列と組み合わせて有するベクターゲノムを含むｒＡＡＶを使用して達成される。同様に、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）および血友病Ｂ（第ＩＸ因子）の治療のための遺伝子療法としては、肝臓に対して指向性を有するベクターが挙げられる（例えば、参照により本明細書に援用される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７３９６号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４００号を参照されたい。）。肝臓におけるヒト第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子のより効果的な送達および発現は、導入遺伝子と組み合わせて、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲ１８２標的配列を有するベクターゲノムを含むｒＡＡＶを送達することによって達成される。

（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、識別数字＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列を提供する。

本明細書に引用されるすべての刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。２０１８年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７８３，９５６号、２０１９年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／９２４，９７０号、および
２０１９年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９３４，９１５号は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。同様に、本明細書に参照され、添付の配列表に表示される配列番号は、参照により援用される。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内に収まることが意図される。

Claims (25)

1. 後根神経節（ＤＲＧ）における遺伝子産物の発現を特異的に抑制する遺伝子送達のための組成物であって、前記ＤＲＧは、核酸配列である発現カセットを含み、前記核酸配列は、
   （ａ）遺伝子産物のコード配列であって、前記発現カセットを含む細胞において前記遺伝子産物の発現を導く調節配列の制御下にある、遺伝子産物のコード配列と、
   （ｂ）ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、またはｍｉＲ－９６のうちの少なくとも１つに特異的な、少なくとも１つの標的配列であって、前記コード配列（ａ）の３’末端で作動可能に連結されている、少なくとも１つの標的配列と、を含む、組成物。
2. 前記組成物が、前記標的配列の少なくとも２つのタンデムリピートを含み、前記タンデムリピートは、同じかまたは異なり得る、少なくとも１つの第１のｍｉＲＮＡ標的配列と、少なくとも１つの第２のｍｉＲＮＡ標的配列と、を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡタンデムリピートが、３’ＵＴＲに位置する、請求項２に記載の組成物。
4. 前記発現カセットが、３つのｍｉＲＮＡタンデムリピートを有する３’ＵＴＲを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記タンデムｍｉＲＮＡ標的配列が、連続的であるか、または１～１０個の核酸のスペーサーによって分離され、前記スペーサーが、ｍｉＲＮＡ標的配列ではない、請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記３’ＵＴＲに位置する少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の２つのセットが存在する、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡタンデムリピートの第１の開始が、前記遺伝子コード配列の前記３’末端から２０ヌクレオチド以内である、請求項２～６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡタンデムリピートの前記第１の開始が、前記遺伝子コード配列の前記３’末端から少なくとも１００ヌクレオチドである、請求項２～６のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記３’ＵＴＲおよび前記ｍｉＲＮＡタンデムリピートが、２００～１２００ヌクレオチド長を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記発現カセットが、前記３’ＵＴＲに位置する４つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記発現カセットが、５’ＵＴＲ中のｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、またはｍｉＲ－９６に特異的な少なくとも１つの標的配列をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
12. 前記発現カセットが、前記５’ＵＴＲおよび前記３’ＵＴＲの両方に位置する少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記発現カセットのｍＲＮＡまたはＤＮＡプラス鎖の前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡ
    標的配列が、
    （ａ）ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（配列番号１）、
    （ｂ）ＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号２）、
    （ｃ）ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号３）、または
    （ｄ）ＡＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＡＣ（配列番号４）である、
    請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. ２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列が、連続的であり、スペーサーによって分離されていない、請求項２～１３のいずれか一項に記載の組成物。
15. 前記ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、スペーサーによって分離され、各スペーサーが、独立して、（ｉ）ＧＧＡＴ（配列番号５）、（ｉｉ）ＣＡＣＧＴＧ（配列番号６）、または（ｉｉｉ）ＧＣＡＴＧＣ（配列番号７）のうちの１つ以上から選択される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
16. 前記ｍｉＲＮＡ標的配列間に位置する前記スペーサーが、前記第１のｍｉＲＮＡ標的配列の３’および／または最後のｍｉＲＮＡ標的配列の５’に位置する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
17. 前記ｍｉＲＮＡ標的配列間の前記スペーサーが、同じである、請求項１５または１６に記載の組成物。
18. 前記発現カセットが、組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、および組換えアデノウイルスから選択されるウイルスベクターによって担持される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
19. 前記発現カセットが、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質粒子、ポリマーベースのベクター、およびキトサンベースの製剤から選択される非ウイルスベクターによって担持される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
20. 後根神経節における遺伝子産物の発現を特異的に抑制する遺伝子産物を、それを必要とする患者に送達するための組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが、ウイルスカプシドを含み、前記ウイルスカプシドの中にＡＡＶベクターゲノムがパッケージングされ、前記ベクターゲノムが、
    （ａ）前記遺伝子産物のコード配列であって、前記ベクターゲノムを含む細胞において前記遺伝子産物の発現を導く調節配列の制御下にある、遺伝子産物のコード配列と、
    （ｂ）ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、またはｍｉＲ－９６のうちの少なくとも１つに特異的な、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列と、を含む、組換えＡＡＶ。
21. 請求項２０に記載のｒＡＡＶと、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、大槽内、または静脈内（ＩＶ）注入を介した送達に好適な製剤緩衝液と、を含む、医薬組成物。
22. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物、請求項２０に記載のｒＡＡＶ、または請求項２１に記載の組成物を、患者に送達することを含む、ＤＲＧニューロンにおける導入遺伝子の発現を抑制するための方法。
23. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物、請求項２０に記載のｒＡＡＶ、または請求項２１に記載の組成物を、患者に送達することを含む、髄腔内または全身的遺伝子療法投与後の神経変性を調節する、および／または二次背側脊髄軸索変性を低減するための方法。
24. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物、請求項２０に記載のｒＡＡＶ、または請求項２１に記載の組成物を、患者に送達することを含み、前記ｍｉＲＮＡ標的配列が、少なくとも１つのｍｉＲ１８３標的配列を含む、中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞における導入遺伝子の発現を増強する方法。
25. 前記ＣＮＳの前記細胞が、錐体ニューロン、プルキンエニューロン、顆粒細胞、紡錘ニューロン、介在神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、および上衣細胞のうちの１つ以上を含む、請求項２４に記載の方法。

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