JP2023514204A - Ｃｄｋｌ５欠損障害を処置するための遺伝子治療 - Google Patents

Abstract

本開示は、アデノ随伴ウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、およびＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を処置するための遺伝子治療におけるそれらの使用法を提供する。本発明のｒＡＡＶおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む医薬組成物がまた、提供される。これらの医薬組成物は、ＣＤＫＬにおける変異によって引き起こされるＣＤＤの処置のための遺伝子治療において有用であり得る。本発明は、遺伝子治療における組成物およびそれらの使用法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年２月１４日出願の米国仮特許出願第６２／９７６，４８３号；および２０２０年１０月１２日出願の米国仮特許出願第６３／０９０，４９２号（これらの開示は、全ての目的のためにそれらの全体において本明細書に参考として援用される）の利益および優先権を主張する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式において電子提出され、その全体において参考として援用される配列表を含む。上記ＡＳＣＩＩコピー（作成日：２０２１年２月８日）は、名称ＵＬＰ－００７ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、大きさが８０，７６５バイトである。

発明の技術分野
本開示は一般に、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルス、およびＣＤＫＬ５欠損障害を処置するための遺伝子治療におけるそれらの使用法に関する。

発明の背景
ＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）は、広い範囲の臨床症状および重篤度において出現し得るＣＤＫＬ５遺伝子における変異によって引き起こされる希少神経発達性疾患である。ＣＤＤの特徴としては、乳児発症難治性てんかん、発達遅延、知的障害、視覚障害、失語、緊張低下、運動機能障害、睡眠障害、消化管機能障害、および呼吸困難が挙げられる。希少であるにもかかわらず、その発生は、４０，０００～６０，０００人の生児出生においておよそ１人であると考えられ、遺伝性のてんかんの最も一般的な形態のうちの１つになっている。

ＣＤＫＬ５遺伝子は、正常な脳の発生および機能に必須であるサイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）タンパク質をコードする。ＣＤＫＬ５タンパク質は、脳におけるニューロンの形成、成長、および移動に関与する。それは、脳において、主に、ニューロンおよび樹状突起において広く発現され、細胞増殖、ニューロン移動、軸索成長、樹状突起の形態形成、およびシナプス発生において役割を有する。

ＣＤＤは、欠失、短縮、スプライスバリアント、およびミスセンス変異を含むＣＤＫＬ５遺伝子における病原性のバリアントによって引き起こされる。Ｏｌｓｏｎら， ２０１９， Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ９７： １８－２５を参照のこと。これらのバリアントは、機能的ＣＤＫＬ５タンパク質の量を低減し得るおよび／またはニューロンにおけるその活性を減少させ得る。ＣＤＫＬ５遺伝子において１５０を超える変異が、ＣＤＤを引き起こすことが見出されている。Ｄｅｌ Ｒｏｓｓｏら， ２０１７， Ｔｈｅ ＥｕｒｏＢｉｏｔｅｃｈ Ｊｏｕｒｎａｌ １（２）： １２２－１２７を参照のこと。

今日までに、ＣＤＤの根底にある原因、すなわち、ＣＤＫＬ５の欠損症に対処する処置は存在しない。現在では、ＣＤＤ患者は、顕著な運動機能障害および知的障害に起因して、２４時間年中無休のケア（２４／７ ｃａｒｅ）を概して必要とする。さらに、ＣＤＤ患者が経験する発作は、代表的には、既存の抗てんかん薬で十分に制御されない。よって、上記疾患－機能的ＣＤＫＬ５の欠損症-の根底にある原因に対処する治療アプローチが至急必要である。
本発明は、ＣＤＤを有する患者への、機能的ＣＤＫＬ５をコードする遺伝子の移入を媒介するアデノ随伴ウイルスベクターの作製を介して、この必要性に対処する。本発明はまた、機能的ＣＤＫＬ５をコードする遺伝子を、ＣＤＤを有する患者に送達する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の作製を説明する。

Ｏｌｓｏｎら， ２０１９， Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ９７： １８－２５ Ｄｅｌ Ｒｏｓｓｏら， ２０１７， Ｔｈｅ ＥｕｒｏＢｉｏｔｅｃｈ Ｊｏｕｒｎａｌ １（２）： １２２－１２７

発明の要旨
本発明は、遺伝子治療における組成物およびそれらの使用法を提供する。より具体的には、ＣＤＤの処置に有用な、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、本明細書で提供される。

１つの局面において、本開示は、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、ここで上記ベクターゲノムは、（ａ）プロモーター配列および（ｂ）ＣＤＫＬ５もしくはそのアイソフォーム、またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントの部分的なまたは完全なコード配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。

別の局面において、本開示は、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、ここで上記ベクターゲノムは、（ａ）５’－逆方向末端反復配列（５’－ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター配列；（ｃ）ＣＤＫＬ５もしくはそのアイソフォーム、またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントの部分的なまたは完全なコード配列；および（ｄ）３’－逆方向末端反復配列（３’－ＩＴＲ）配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。

さらに別の局面において、本開示は、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶであって、ここで上記ベクターゲノムは、（ａ）５’－ＩＴＲ配列；（ｂ）プロモーター配列；（ｃ）ＣＤＫＬ５もしくはそのアイソフォーム、またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントの部分的なまたは完全なコード配列；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。

さらに別の局面において、本開示は、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶであって、ここで上記ベクターゲノムは、（ａ）５’－ＩＴＲ配列；（ｂ）エンハンサー配列；（ｃ）プロモーター配列；（ｄ）イントロン配列；（ｅ）ＣＤＫＬ５もしくはそのアイソフォーム、またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントの部分的なまたは完全なコード配列；（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｇ）３’－ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。

１つの実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記部分的なまたは完全なコード配列は、野生型コード配列である。代替の実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記部分的なまたは完全なコード配列は、コドン最適化されたコード配列である。１つの例示的な実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記部分的なまたは完全なコード配列は、ヒトにおける発現のためにコード最適化される。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記部分的なまたは完全なコード配列は、配列番号１～８から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはこれより高く同一である配列を含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶであって、ここで上記ベクターゲノムは、（ａ）プロモーター配列および（ｂ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含むＣＤＫＬ５のコード配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。

いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５は、配列番号１に示される野生型コード配列によってコードされる。別の実施形態において、ＣＤＫＬ５のバリアントまたは代替の天然のアイソフォームを発現するコード配列が使用され得る（例えば、配列番号２に示されるコード配列）。ある特定の実施形態において、ＣＤＫＬ５は、コドン最適化されたコード配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５は、配列番号１または配列番号２に示される野生型コード配列と８０％未満同一であるコドン最適化されたコード配列によってコードされる。いくつかの例示的な実施形態において、ＣＤＫＬ５は、配列番号３～８から選択されるコドン最適化されたコード配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５は、配列番号３～８から選択される配列と少なくとも８０％同一であるコドン最適化されたコード配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５は、配列番号３～８から選択される配列と少なくとも９０％同一であるコドン最適化されたコード配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５は、配列番号３～８から選択される配列と少なくとも９５％同一であるコドン最適化したコード配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、３’末端において終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、またはＴＡＧ）をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、その発現されるＣＤＫＬ５タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、その発現されるＣＤＫＬ５タンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、ニューロン特異的プロモーターである。１つの実施形態において、上記ニューロン特異的プロモーターは、ヒトシナプシン１（ＳＹＮ１）プロモーター、マウスカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、ラットチューブリンαＩ（Ｔａ１）プロモーター、ラットニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、ヒトニューロン特異的エノラーゼ（ＥＮＯ２）プロモーター、ヒト血小板由来成長因子β鎖（ＰＤＧＦ）プロモーター、ヒトＢＭ８８プロモーター、およびニューロンニコチン性受容体β２（ＣＨＲＮＢ２）プロモーターから選択される。

例示的な実施形態において、上記ニューロン特異的プロモーターは、ＳＹＮ１プロモーター（例えば、ヒトＳＹＮ１プロモーター）である。１つの実施形態において、上記ＳＹＮ１プロモーター（例えば、ヒトＳＹＮ１プロモーター）は、配列番号１２を含むかまたはそれからなる核酸配列を有する。

いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、およびα－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーターから選択される。

例示的な実施形態において、上記プロモーターは、上記ＣＢＡプロモーターである。１つの実施形態において、上記ＣＢＡプロモーターは、配列番号１３を含むかまたはそれからなる核酸配列を有する。

いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、遺伝子特異的内因性プロモーターである。１つの実施形態において、上記プロモーターは、天然の遺伝子プロモーターエレメントを含む。例示的な実施形態において、上記プロモーターは、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、配列番号１４の等しい長さの領域と少なくとも９５％同一である、ＣＤＫＬ５遺伝子特異的内因性プロモーターである。

いくつかの実施形態において、上記パッケージされたベクターゲノムは、５’－ＩＴＲ配列および／または３’－ＩＴＲ配列を含む。ある特定の実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、配列番号１１を含むかまたはそれからなる。他の実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、非ＡＡＶ２供給源に由来する。

いくつかの実施形態において、上記パッケージされたベクターゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列を含む。１つの実施形態において、上記ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、およびウサギβグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択される。例示的な実施形態において、上記ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である。１つの実施形態において、上記ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号１５を含むかまたはそれからなる。

いくつかの実施形態において、上記パッケージされたベクターゲノムは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を含む。１つの実施形態において、上記コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号１６）である。ある特定の実施形態において、上記コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、ＣＤＫＬ５のコード配列の上流に位置する。

いくつかの実施形態において、上記パッケージされたベクターゲノムは、１またはこれより多くのエンハンサー配列を含む。１つの実施形態において、上記エンハンサーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子エンハンサー、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサー、およびアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）エンハンサーから選択される。例示的な実施形態において、上記エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサー（例えば、上記ＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー）である。１つの実施形態において、上記ＣＭＶエンハンサー（例えば、上記ＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー）は、配列番号１７を含むかまたはそれからなる配列を有する。ある特定の実施形態において、上記エンハンサーは、上記プロモーター配列の上流に位置する。

いくつかの実施形態において、上記パッケージされたベクターゲノムは、１またはこれより多くのイントロン配列を含む。１つの実施形態において、上記イントロンは、ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットβ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトβグロビンＩＶＳ２イントロン、β－グロビン／ＩｇＧキメライントロン、およびｈＦＩＸイントロンから選択される。１つの例示的な実施形態において、上記イントロンは、上記ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロンである。１つの実施形態において、上記ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン配列は、配列番号１８を含むかまたはそれからなる。

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶキャプシドは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、ｈｕ３７のＡＡＶ（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７）、またはその操作されたバリアントに由来する。例示的な実施形態において、上記ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）キャプシド、ＡＡＶ９バリアントキャプシド、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）キャプシド、ＡＡＶ８バリアントキャプシド、またはＡＡＶ血清型ｈｕ３７（ＡＡＶｈｕ３７）キャプシドである。

いくつかの局面において、本開示は、ＣＤＫＬ５をコードする新規なコドン最適化した核酸配列を提供する。１つの実施形態において、ＣＤＫＬ５をコードするコドン最適化した核酸配列は、配列番号１または配列番号２に示される野生型コード配列と８０％未満同一である。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５をコードするコドン最適化した核酸配列は、配列番号３～８から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはこれより高く同一である。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１または配列番号２に示される野生型コード配列と８０％未満同一であり、配列番号３～８から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはこれより高く同一である核酸配列を提供する。例示的な実施形態において、本開示は、配列番号３～８から選択される配列から選択されるＣＤＫＬ５をコードする核酸配列を提供する。機能的ＣＤＫＬ５活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号３～８に示される核酸配列のフラグメントがさらに提供される。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５をコードする核酸配列は、３’末端に終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、またはＴＡＧ）をさらに含み得る。

いくつかの局面において、本開示は、ＣＤＤの処置において有用な新規なベクターゲノム構築物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１９～２０から選択される核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはこれより高く同一であるＣＤＫＬ５をコードするベクターゲノム構築物（すなわち、ポリヌクレオチド）を提供する。１つの実施形態において、本開示は、配列番号１９と少なくとも９５％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。１つの実施形態において、本開示は、核酸配列が、配列番号１９を含むかまたはそれからなるポリヌクレオチドを提供する。１つの実施形態において、本開示は、配列番号２０と少なくとも９５％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、本開示は、核酸配列が、配列番号２０を含むかまたはそれからなるポリヌクレオチドを提供する。

ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＤＤの処置における遺伝子治療のための薬剤として有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供し、ここで上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされる本明細書で記載されるとおりのベクターゲノムを含む。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶキャプシドは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、ｈｕ３７のＡＡＶ（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７）、またはその操作されたバリアントに由来する。例示的な実施形態において、上記ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）キャプシド、ＡＡＶ９バリアントキャプシド、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）キャプシド、ＡＡＶ８バリアントキャプシド、またはＡＡＶ血清型ｈｕ３７（ＡＡＶｈｕ３７）キャプシドである。

ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）の処置に有用なｒＡＡＶを提供し、ここで上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含み、ここで上記ベクターゲノムは、（ａ）プロモーター配列および（ｂ）ＣＤＫＬ５もしくはそのアイソフォーム、またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントの部分的なまたは完全なコード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号１～８から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む。

ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）の処置に有用なｒＡＡＶを提供し、ここで上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含み、ここで上記ベクターゲノムは、（ａ）５’－ＩＴＲ配列；（ｂ）プロモーター配列；（ｃ）配列番号１～８から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含むＣＤＫＬ５のコード配列；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－ＩＴＲ配列を含む。

ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）の処置に有用なｒＡＡＶを提供し、ここで上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９キャプシドおよび上記ＡＡＶ９キャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含み、ここで上記ベクターゲノムは、（ａ）５’－ＩＴＲ配列；（ｂ）プロモーター配列；（ｃ）配列番号１～８から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含むＣＤＫＬ５のコード配列；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－ＩＴＲ配列を含む。

ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）の処置に有用なｒＡＡＶを提供し、ここで上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９キャプシドおよび上記ＡＡＶ９キャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含み、ここで上記ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列；（ｂ）ＳＹＮ１プロモーター配列（例えば、ヒトＳＹＮ１プロモーター配列）；（ｃ）配列番号１～８から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含むＣＤＫＬ５のコード配列；（ｄ）ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）ＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲ配列を含む。例示的な実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号１を含むかまたはそれからなる。

ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）の処置に有用なｒＡＡＶを提供し、ここで上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９キャプシドおよび上記ＡＡＶ９キャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含み、ここで上記ベクターゲノムは、（ａ）５’－ＩＴＲ配列；（ｂ）エンハンサー配列；（ｃ）プロモーター配列；（ｄ）イントロン配列；（ｅ）配列番号１～８から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含むＣＤＫＬ５のコード配列；（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｇ）３’－ＩＴＲ配列を含む。

ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）の処置に有用なｒＡＡＶを提供し、ここで上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９キャプシドおよび上記ＡＡＶ９キャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含み、ここで上記ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列；（ｂ）ＣＭＶエンハンサー配列（例えば、ＣＭＶ最初期遺伝子配列）；（ｃ）ＣＢＡプロモーター配列；（ｄ）ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン配列；（ｅ）配列番号１～８から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含むＣＤＫＬ５のコード配列；（ｆ）ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列；および（ｇ）ＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲ配列を含む。例示的な実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号１を含むかまたはそれからなる。

いくつかの局面において、本開示は、ＣＤＤの処置のための本明細書で開示されるｒＡＡＶの使用を提供し、ここで上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含む。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ＣＤＫＬ５もしくはそのアイソフォーム、またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントの部分的なまたは完全なコード配列、および３’－ＩＴＲを、作動可能に連結された構成要素として含むパッケージされたゲノムを含む。いくつかの実施形態において、上記パッケージされたゲノムはまた、以下のエレメントのうちの少なくとも１つを含む：（ａ）上記プロモーター配列の上流にあるエンハンサー配列、（ｂ）上記プロモーターの下流にあるイントロン、および（ｃ）上記３’－ＩＴＲの上流にあるポリアデニル化配列。１つの例示的な実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列、ＳＹＮ１プロモーター（例えば、ヒトＳＹＮ１プロモーター）、ＣＤＫＬ５のコード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲを作動可能に連結された構成要素として含むパッケージされたゲノムを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号１～８から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。

本開示はさらに、本明細書で開示されるｒＡＡＶを含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態において、上記医薬組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶを含む上記医薬組成物は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、髄腔内、脳室内、静脈内投与するために製剤化される。例示的な実施形態において、上記医薬組成物は、髄腔内投与のために製剤化される。

さらに別の局面において、本開示は、ヒト被験体においてＣＤＤを処置する方法であって、上記方法は、上記ヒト被験体に、治療上有効な量の、少なくとも１種の本明細書で開示されるｒＡＡＶを投与することを包含する方法を提供する。１つの実施形態において、本開示は、ＣＤＤを処置する方法であって、上記方法は、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与することを包含し、ここで上記ベクターゲノムは、ＣＤＫＬ５またはそのアイソフォーム、またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントの部分的なまたは完全なコード配列を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記ｒＡＡＶを投与する前に、ＩｇＧ分解プロテアーゼ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＩｄｅＳまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ＩｄｅＺ）の投与をさらに包含し得る。いくつかの実施形態において、本開示は、ヒト被験体においてＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を処置する方法であって、上記方法は、治療上有効な量の、少なくとも１種の本明細書で開示されるｒＡＡＶを投与することを包含し、ここで上記ヒト被験体は、ＩｇＧ分解プロテアーゼを投与されている、方法を提供する。

さらに別の局面において、本開示は、ヒト被験体においてＣＮＳ障害を処置する方法であって、上記方法は、上記被験体に、コルチコステロイドを先ず投与すること、および次いで、治療上有効な量の、上記ＣＮＳの処置のために設計された少なくとも１種のｒＡＡＶを引き続いて投与することを包含し、ここで上記ｒＡＡＶは、髄腔内に、脳室内に、または大槽内（intracisterna magna）送達を介して投与される方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ヒト被験体においてＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を処置する方法であって、上記方法は、ヒト被験体に、治療上有効な量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを包含し、ここで上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含み、ここで上記ベクターゲノムは、プロモーター配列およびＣＤＫＬ５のコード配列を含み、ここで上記ヒト被験体は、コルチコステロイドを投与されている方法を提供する。１つの実施形態において、上記コルチコステロイドは、プレドニゾロン、プレドニゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、ブデソニド、ベタメタゾン、およびデフラザコートから選択される。例示的な実施形態において、上記コルチコステロイドは、プレドニゾロンである。１つの実施形態において、上記ＣＮＳ障害は、ＣＤＤ、アンジェルマン症候群、バッテン病、クラッベ病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型、Ｘ連鎖性ミオチュブラーミオパチー、フリードライヒ運動失調症、カナバン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、副腎白質ジストロフィー、ハンチントン病、レット症候群、ならびに脊髄小脳失調症から選択される。例示的な実施形態において、上記ＣＮＳ障害は、ＣＤＤであり、上記ｒＡＡＶは、本明細書で記載されるＣＤＤの処置のために有用なｒＡＡＶを含む。

ある特定の実施形態において、本開示は、ヒト被験体においてＣＤＤを処置する方法であって、上記方法は、ＣＤＫＬ５において少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト被験体に、治療上有効な量の少なくとも１種の本明細書で開示されるｒＡＡＶを投与することを包含する方法を提供する。１つの実施形態において、本開示は、ＣＤＫＬ５において少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト被験体においてＣＤＤを処置する方法であって、上記方法は、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与することを包含し、ここで上記ベクターゲノムは、ＣＤＫＬ５またはそのアイソフォーム、またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントの部分的なまたは完全なコード配列を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号１～８から選択される。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、皮下に、筋肉内に、皮内に、腹腔内に、髄腔内に、脳室内に、静脈内に、または大槽内送達を介して投与される。例示的な実施形態において、上記ｒＡＡＶは、髄腔内に投与される。別の例示的な実施形態において、上記ｒＡＡＶは、大槽を介して投与される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約１×１０^１１～約１×１０^１４ ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される。さらなる実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約１×１０^１２～約１×１０^１３ ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、単回用量のｒＡＡＶが投与される。他の実施形態において、複数回用量のｒＡＡＶが投与される。

いくつかの局面において、組換え核酸分子、ＡＡＶベクター、または本明細書で開示されるｒＡＡＶを含む宿主細胞が、本明細書で提供される。具体的実施形態において、上記宿主細胞は、ＡＡＶの増殖に適切であり得る。ある特定の実施形態において、上記宿主細胞は、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ－７細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＲＤ細胞、ＨＴ－１０８０細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞、およびＭＲＣ－５細胞から選択される。

本開示のこれらおよび他の局面ならびに特徴は、本出願の以下の節において記載される。

本発明は、以下の図面を参照してより完全に理解され得る。

図１は、ＳＹＮプロモーターの制御下でＣＤＫＬ５のコード配列を含む第１の例示的なパッケージされたベクターゲノム構築物を示す説明図である。図中で使用した略語： ＩＴＲ－ 逆方向末端反復； ｈＳｙｎ－ ヒトシナプシン１プロモーター； ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル－ ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル。

図２は、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターの制御下でＣＤＫＬ５のコード配列を含む第２の例示的なパッケージされたベクターゲノム構築物を示す説明図である。図中で使用した略語： ＩＴＲ－ 逆方向末端反復； ＣＭＶ－ サイトメガロウイルス； ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル－ ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル。

図３は、ヒトＣＤＫＬ５が、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞をプラスミドＤＮＡでトランスフェクションした後に過剰発現される場合のホスホ－ＥＢ２（ｐＥＢ２）レベルの変化を示す画像である。ＥＢ２（ＣＤＫＬ５の下流の標的）は、ヒトＣＤＫＬ５がこれらの細胞において過剰発現される場合に、リン酸化の増加を示す。左の２つのパネルは、非処理細胞を表す。右の２つのパネルは、ＣＢＡプロモーターの制御下で、ヒトＣＤＫＬ５でトランスフェクトした細胞を表す。

図４は、ｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰ（左のパネル）またはｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰ（右のパネル）を脳室内に投与したＣＤＫＬ５欠損マウスにおける増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の分布を示す画像である。両方のベクターは、海馬および線条体領域、ならびに皮質および小脳中の少数のｅＧＦＰ陽性細胞において高いｅＧＦＰレベルを生じた。

図５は、ＣＢＡおよびＳＹＮプロモーターに並んで、内因性ＣＤＫＬ５プロモーターを使用して、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびｈＣＤＫＬ５プラスミドの発現を示す画像である。上記内因性ＣＤＫＬ５プロモーターは、これらの細胞においてＣＢＡおよびＳＹＮプロモーターの中間のレベルでｈＣＤＫＬ５の発現を駆動する。上記画像は、左から右に以下のとおり示される（上の４つのパネル）： トランスフェクトされていない、ＣＢＡ－ＧＦＰでトランスフェクト、ＳＹＮ－ＧＦＰでトランスフェクト、および内因性ＣＤＫＬ５プロモーターおよびｅＧＦＰ（Ｅｎｄｏ－ｅＧＦＰ）でトランスフェクト。下の４つのパネルに関しては、その画像は、左から右に以下のとおり示される： トランスフェクトされていない、ＣＢＡ－ｈＣＤＫＬ５でトランスフェクト、ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５でトランスフェクト、および内因性ＣＤＫＬ５プロモーターおよびｈＣＤＫＬ５（Ｅｎｄｏ－ｈＣＤＫＬ５）でトランスフェクト。

図６Ａのパネルは、ｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｈＣＤＫＬ５（図６Ａの左のパネルの画像）またはｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５（図６Ａの右のパネルの画像）を、脳室内経路を介して投与したＣＤＫＬ５欠損マウスにおける蛍光ＲＮＡスコープによって検出される場合のｈＣＤＫＬ５ ｍＲＮＡの分布を示す画像である。図６Ｂのパネルは、脳室内経路を介してｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｈＣＤＫＬ５（四角５および６）またはｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５（四角７および８）を投与したＣＤＫＬ５欠損マウスにおける蛍光ＲＮＡスコープによって検出される場合のｈＣＤＫＬ５ ｍＲＮＡの分布を示すＲＮＡスコープインサチュハイブリダイゼーションからの代表的画像である。脳室内経路を介してビヒクルを投与したＣＤＫＬ５ノックアウト（ＫＯ）マウスは、四角３および４に示される。いかなるビヒクルもいずれのベクター（ナイーブ）も投与しなかったＣＤＫＬ５野生型（ＷＴ）マウスは、四角１および２に示される。 図６Ａのパネルは、ｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｈＣＤＫＬ５（図６Ａの左のパネルの画像）またはｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５（図６Ａの右のパネルの画像）を、脳室内経路を介して投与したＣＤＫＬ５欠損マウスにおける蛍光ＲＮＡスコープによって検出される場合のｈＣＤＫＬ５ ｍＲＮＡの分布を示す画像である。図６Ｂのパネルは、脳室内経路を介してｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｈＣＤＫＬ５（四角５および６）またはｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５（四角７および８）を投与したＣＤＫＬ５欠損マウスにおける蛍光ＲＮＡスコープによって検出される場合のｈＣＤＫＬ５ ｍＲＮＡの分布を示すＲＮＡスコープインサチュハイブリダイゼーションからの代表的画像である。脳室内経路を介してビヒクルを投与したＣＤＫＬ５ノックアウト（ＫＯ）マウスは、四角３および４に示される。いかなるビヒクルもいずれのベクター（ナイーブ）も投与しなかったＣＤＫＬ５野生型（ＷＴ）マウスは、四角１および２に示される。

図７は、Ｃｄｋｌ５ノックアウトマウスがｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５またはｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｈＣＤＫＬ５（１．６ｅ１２ ベクターゲノム（ｖｇ））の１回の脳室内注射を投与されて２週間後に該マウスの前頭皮質から単離されたＣＤＫＬ５タンパク質およびリン酸化ＥＢ２（ｐＥＢ２）のレベルを示すウェスタンブロットである。処置したマウスは、ビヒクル処置コントロールと比較して、ＣＤＫＬ５のレベルの増加を示す。ＣＤＫＬ５の下流の標的であるＥＢ２のリン酸化から、ＣＤＫＬ５が機能的キナーゼとして作用していることが確認される。

図８は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）被験体が腰椎髄腔内注射によってｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰ（ＣＢＡ－ｅＧＦＰ）またはｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰ（ＳＹＮ－ｅＧＦＰ）を投与されて２週間後の、該被験体からのＣＮＳおよび末梢組織中の組織ＤＮＡの１μｇあたりのベクターゲノムのコピー数の定量を示す棒グラフである。両方のベクターは、組織あたり、類似の量のベクターゲノムを生じた。棒の各セットにおいて、ＣＢＡ－ｅＧＦＰは、左側の棒として示される（または髄質の場合には、中央の棒）。その一方で、ＳＹＮ－ｅＧＦＰは、右側の棒として示される。

図９は、ＮＨＰ被験体が、腰椎髄腔内注射によって、ｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰ（左の３つのパネル）またはｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰ（右の３つのパネル）を投与された２週間後の、該被験体からのｅＧＦＰに関して免疫染色した脳組織の代表的明視野顕微鏡画像を示す画像である。ｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰを投与した被験体からのｅＧＦＰ陽性細胞は、星細胞／グリアの形態を有した（左下のパネル）。その一方で、ｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰを投与した被験体からのｅＧＦＰ陽性細胞は、ニューロンの形態を有した（右下のパネル）。

図１０Ａ～１０Ｃは、投与しておよそ３ヶ月後のウェスタンブロットを使用したＣＤＫＬ５欠損マウス脳の種々の領域（前頭皮質：図１０Ａ； 海馬：図１０Ｂ； および脳幹：図１０Ｃ）において定量されるＣＤＫＬ５の量を示すグラフを示す。処置したマウスの脳にわたるヒトＣＤＫＬ５タンパク質の中程度の長時間持続性の増加（前頭皮質および脳幹においてＷＴレベルの２０～３０％、海馬において３５～７０％）を、投与の３ヶ月後に観察した。

図１１Ａ～１１Ｄは、ｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５処置マウス（ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５）が、ビヒクル処置（ＣＤＤ－ＰＢＳ）コントロール同腹仔と比較して、学習、記憶、および運動機能の課題に対してより良好な成績であることを実証するグラフを示す。不安様行動（図１１Ａ）、運動機能（図１１Ｂ）、および協調（図１１Ｃ）における改善、ならびに学習および記憶における正常化（図１１Ｄ）が認められた。

図１２は、８．０６×１０^１３ ベクターゲノム（ｖｇ）の髄腔内（ＩＴ）送達（ＵＸ０５５－１８－０００１）または７．７６×１０^１３ ｖｇのｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰの大槽内（ＣＭ）送達（ＵＸ０５５－１９－０００２）のいずれかをトレンデレンブルグ体位において与えられた２週間後の、１～２歳齢の雌性非ヒト霊長類（ＮＨＰ）のＣＮＳにおいて１μｇのＤＮＡあたりのゲノムコピー（ＧＣ）を図示する棒グラフである。そのグラフは、大槽内送達が、種々の脳組織（頭頂葉（１０×）、線条体（１０×）、および視床（８×）を含む）におけるＮＨＰ ＣＮＳ中のベクターゲノムの数の増加を生じることを図示する。このグラフに示されるデータは、２回の独立した試験の一部として集めた。

図１３Ａは、７．９２×１０^１３ ｖｇのｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ＣＤＫＬ５の大槽内（ＣＭ）送達（ＵＸ０５５－１９－００３）を、－４日目から２８日目まで１ｍｇ／ｋｇ プレドニゾロン（経口胃管栄養法による）の投与ありおよびなしで、トレンデレンブルグ体位において与えて４週間後の、１歳齢の雌性非ヒト霊長類（ＮＨＰ）のＣＮＳ中のＤＮＡ１μｇあたりのゲノムコピー（ＧＣ）を図示する棒グラフである。そのグラフは、数が増加したベクターゲノム（ｑＰＣＲによって測定）が、プレドニゾロンを投与したＮＨＰの種々の脳組織（線条体（２０×）、海馬（５×）、髄質（６×）、および小脳（５×）における増加を含む）に存在したことを図示する。図１３Ｂは、上記ベクターに対するプローブでのＢａｓｅＳｃｏｐｅ分析（インサイチュハイブリダイゼーション）を使用して試験した同じＮＨＰに由来する後頭葉皮質および小脳を含む脳の大きな切片を示す。パネル１および３は、プレドニゾロンを投与しなかったＮＨＰに由来する切片を表す一方で、パネル２および４は、プレドニゾロンを投与したＮＨＰに由来する切片を表す。少なくとも１つのベクターゲノムを有する細胞の数を、各ＮＨＰに対して半分の冠状切片全体から計数し、矢印を画像に付け加えて、各陽性細胞に印を付け、可視化を補助した。図１３Ｃは、プレドニゾロンなしのものと比較して、プレドニゾロンで処置したＮＨＰにおいて少なくとも１つのベクターゲノムを含む細胞の数を示すグラフである。全体的に、プレドニゾロンなしのものと比較して、プレドニゾロンで処置したＮＨＰにおいて少なくとも１つのベクターゲノムを含む細胞の数が増加する傾向にあったが、動物間で有意な変動性があった。非常に多数のベクターゲノム陽性細胞を有する１匹のアウトライアーＮＨＰは、非プレドニゾロン群において認められた。 図１３Ａは、７．９２×１０^１３ ｖｇのｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ＣＤＫＬ５の大槽内（ＣＭ）送達（ＵＸ０５５－１９－００３）を、－４日目から２８日目まで１ｍｇ／ｋｇ プレドニゾロン（経口胃管栄養法による）の投与ありおよびなしで、トレンデレンブルグ体位において与えて４週間後の、１歳齢の雌性非ヒト霊長類（ＮＨＰ）のＣＮＳ中のＤＮＡ１μｇあたりのゲノムコピー（ＧＣ）を図示する棒グラフである。そのグラフは、数が増加したベクターゲノム（ｑＰＣＲによって測定）が、プレドニゾロンを投与したＮＨＰの種々の脳組織（線条体（２０×）、海馬（５×）、髄質（６×）、および小脳（５×）における増加を含む）に存在したことを図示する。図１３Ｂは、上記ベクターに対するプローブでのＢａｓｅＳｃｏｐｅ分析（インサイチュハイブリダイゼーション）を使用して試験した同じＮＨＰに由来する後頭葉皮質および小脳を含む脳の大きな切片を示す。パネル１および３は、プレドニゾロンを投与しなかったＮＨＰに由来する切片を表す一方で、パネル２および４は、プレドニゾロンを投与したＮＨＰに由来する切片を表す。少なくとも１つのベクターゲノムを有する細胞の数を、各ＮＨＰに対して半分の冠状切片全体から計数し、矢印を画像に付け加えて、各陽性細胞に印を付け、可視化を補助した。図１３Ｃは、プレドニゾロンなしのものと比較して、プレドニゾロンで処置したＮＨＰにおいて少なくとも１つのベクターゲノムを含む細胞の数を示すグラフである。全体的に、プレドニゾロンなしのものと比較して、プレドニゾロンで処置したＮＨＰにおいて少なくとも１つのベクターゲノムを含む細胞の数が増加する傾向にあったが、動物間で有意な変動性があった。非常に多数のベクターゲノム陽性細胞を有する１匹のアウトライアーＮＨＰは、非プレドニゾロン群において認められた。 図１３Ａは、７．９２×１０^１３ ｖｇのｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ＣＤＫＬ５の大槽内（ＣＭ）送達（ＵＸ０５５－１９－００３）を、－４日目から２８日目まで１ｍｇ／ｋｇ プレドニゾロン（経口胃管栄養法による）の投与ありおよびなしで、トレンデレンブルグ体位において与えて４週間後の、１歳齢の雌性非ヒト霊長類（ＮＨＰ）のＣＮＳ中のＤＮＡ１μｇあたりのゲノムコピー（ＧＣ）を図示する棒グラフである。そのグラフは、数が増加したベクターゲノム（ｑＰＣＲによって測定）が、プレドニゾロンを投与したＮＨＰの種々の脳組織（線条体（２０×）、海馬（５×）、髄質（６×）、および小脳（５×）における増加を含む）に存在したことを図示する。図１３Ｂは、上記ベクターに対するプローブでのＢａｓｅＳｃｏｐｅ分析（インサイチュハイブリダイゼーション）を使用して試験した同じＮＨＰに由来する後頭葉皮質および小脳を含む脳の大きな切片を示す。パネル１および３は、プレドニゾロンを投与しなかったＮＨＰに由来する切片を表す一方で、パネル２および４は、プレドニゾロンを投与したＮＨＰに由来する切片を表す。少なくとも１つのベクターゲノムを有する細胞の数を、各ＮＨＰに対して半分の冠状切片全体から計数し、矢印を画像に付け加えて、各陽性細胞に印を付け、可視化を補助した。図１３Ｃは、プレドニゾロンなしのものと比較して、プレドニゾロンで処置したＮＨＰにおいて少なくとも１つのベクターゲノムを含む細胞の数を示すグラフである。全体的に、プレドニゾロンなしのものと比較して、プレドニゾロンで処置したＮＨＰにおいて少なくとも１つのベクターゲノムを含む細胞の数が増加する傾向にあったが、動物間で有意な変動性があった。非常に多数のベクターゲノム陽性細胞を有する１匹のアウトライアーＮＨＰは、非プレドニゾロン群において認められた。

発明の詳細な説明
本発明は、治療適用のために使用されるべきある範囲の新規な薬剤および組成物を提供する。本発明の核酸配列、ベクター、組換えウイルス、および関連する組成物は、本明細書で記載されるとおりのＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を改善、防止、または処置するために使用され得る。

別段注記されなければ、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学において共通する用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｖ、発行 Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９４（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 発行 Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．， １９９４（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ（編）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， 発行 ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， １９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）において見出され得る。

本開示の種々の実施形態の検討を促進するために、具体的な用語の以下の説明が提供される：

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）： ヒトおよびいくらかの他の霊長類の種に感染する、小さな複製欠損性の、エンベロープのないウイルス。ＡＡＶは、疾患を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂中の細胞および休止細胞の両方に感染し得、宿主細胞のゲノムへと組み込まれることなく、染色体外状態で持続し得る。これらの特徴は、ＡＡＶを遺伝子治療のための魅力的なウイルスベクターにしている。現在では、１２の認識されているＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～１２）が存在する。

投与／投与する： 被験体に任意の効果的な経路によって薬剤（例えば、治療剤（例えば、組換えＡＡＶ））を提供するまたは与えること。例示的な投与経路としては、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、髄腔内、脳室内または静脈内での投与）、経口、管内、舌下、直腸、経皮、鼻内、膣および吸入経路が挙げられるが、これらに限定されない。

コード配列： 「コード配列」とは、適切な調節配列に作動可能に連結される場合に、インビトロまたはインビボでポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を意味する。コード配列は、そのコード領域の前および後ろの領域（例えば、５’非翻訳（５’ ＵＴＲ）配列および３’非翻訳（３’ ＵＴＲ）配列、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン））を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。

コドン最適化した： 「コドン最適化した」核酸とは、そのコドンが、特定のシステム（例えば、特定の種または種の群）における発現のために最適であるように変化させた核酸配列に言及する。例えば、核酸配列は、哺乳動物細胞または特定の哺乳動物種（例えば、ヒト細胞）における発現のために最適化され得る。コドン最適化は、そのコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない。

エンハンサー： プロモーターの活性を増大させることによって、転写速度を増大させる核酸配列。

イントロン： タンパク質のコード情報を含まない遺伝子内のＤＮＡの伸長部。イントロンは、メッセンジャーＲＮＡの翻訳前に除去される。

逆位末端反復配列（ＩＴＲ）： 効率的な複製のために必要とされるアデノ随伴ウイルスのゲノムにおける対称的な核酸配列。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ＤＮＡゲノムの各末端に位置する。ＩＴＲは、ウイルスＤＮＡ合成の複製起点として働き、ＡＡＶ組み込みベクターを生成するために必須のｃｉｓ構成要素である。

単離された： 「単離された」生物学的構成要素（例えば、核酸分子、タンパク質、ウイルスまたは細胞）は、その構成要素が天然に存在する生物の細胞もしくは組織、または生物自体における他の生物学的構成要素（例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに細胞）から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準的な精製法によって精製されたものを含む。上記用語はまた、宿主細胞において組換え発現によって調製された核酸分子およびタンパク、ならびに化学合成された核酸分子およびタンパク質を含む。

作動可能に連結された： 第１の核酸配列は、この第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的な関係性に配置されている場合に、この第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、このプロモーターが、コード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合に、そのコード配列に作動可能に連結されている。概して、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、同じリーディングフレームにある。

薬学的に受容可能なキャリア： 本開示において有用な薬学的に受容可能なキャリア（ビヒクル）は、従来どおりである。Ｅ． Ｗ． ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， 第１５版（１９７５））は、１またはこれより多くの治療用化合物、分子または薬剤の薬学的送達に適した組成物および製剤を記載する。

概して、上記キャリアの性質は、使用されている特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、薬学的におよび生理学的に受容可能な流体（例えば、水、生理食塩水、平衡化塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなど）をビヒクルとして含む注射用流体を含む。固形の組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセル剤の形態）に関しては、従来の非毒性固体キャリアは、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与されるべき医薬組成物は、微量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝化剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート））を含み得る。

疾患を防止する、処置する、または改善する： 疾患（例えば、ＣＤＤ）を「防止する」とは、疾患の完全な発生を阻害することをいう。「処置する」とは、疾患または病的状態（例えば、ＣＤＤ）が発生し始めた後の疾患または病的状態の徴候または症状を改善する、治療的介入をいう。「改善する」とは、疾患（例えば、ＣＤＤ）の徴候または症状の数または重篤度の低減をいう。

プロモーター： 核酸（例えば、遺伝子）の転写を指示する／開始するＤＮＡの領域。プロモーターは、転写開始部位の近くに必要な核酸配列を含む。多くのプロモーター配列は、当業者に公知であり、さらには、人工核酸分子中に異なるプロモーター配列の組み合わせが可能である。本明細書で使用される場合、遺伝子特異的内因性プロモーターとは、目的の内因性遺伝子の発現を調節する天然のプロモーターエレメントをいう。１つの実施形態において、ＣＤＫＬ５遺伝子特異的内因性プロモーターは、ＣＤＫＬ５遺伝子の発現を調節する。

精製された： 用語「精製された」は、絶対的な純度を要求しない；むしろ、それは相対的な用語として意図される。従って、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物は、天然に関連付けられたタンパク質および他の夾雑物から完全にまたは部分的に単離されているものである。ある特定の実施形態において、用語「実質的に精製された」とは、細胞、細胞培養培地、または他の粗製調製物から単離され、その最初の調製物の種々の構成要素（例えば、タンパク質、細胞デブリ、および他の構成要素）を除去するために分画に供された、ペプチド、タンパク質、ウイルスまたは他の活性化合物に言及する。

組換え： 組換え核酸分子は、天然に存在しない配列を有するか、または２つの別の方法で分離された配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製される配列を有するものである。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、または核酸分子の単離されたセグメントの人工的な操作によって（例えば、遺伝子工学技術によって）達成され得る。

同様に、組換えウイルスは、天然に存在しない配列（例えば、ゲノム配列）または異なる由来の少なくとも２つの配列の人工的組み合わせによって作製される配列を含むウイルスである。用語「組換え」はまた、天然の核酸分子、タンパク質またはウイルスの一部の付加、置換、または欠失によってのみ変更された核酸、タンパク質およびウイルスを含む。本明細書で使用される場合、「組換えＡＡＶ」とは、組換え核酸分子（例えば、ＣＤＫＬ５をコードする組換え核酸分子）がパッケージされたＡＡＶ粒子をいう。

配列同一性： ２もしくはこれより多くの核酸配列、または２もしくはこれより多くのアミノ酸配列の間の同一性または類似性は、その配列間の同一性または類似性に関して表される。配列同一性は、パーセンテージ同一性に関して測定され得る；パーセンテージが高いほど、配列はより同一である。配列類似性は、パーセンテージ類似性に関して測定され得る（保存的アミノ酸置換が考慮される）；パーセンテージが高いほど、配列はより類似である。核酸またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的方法を使用して整列される場合、比較的高い程度の配列同一性／類似性を有する。この相同性は、そのオルソログのタンパク質またはｃＤＮＡが、関係性がより遠い種（例えば、ヒト配列およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列）と比較して、関係性がより近い種（例えば、ヒト配列およびマウス配列）に由来する場合により顕著である。

比較のための配列のアラインメント法は、当該分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、以下に記載される： Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２， １９８１； Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３， １９７０： Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４， １９８８； Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ， Ｇｅｎｅ， ７３：２３７－４４， １９８８； Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ５：１５１－３， １９８９； Ｃｏｒｐｅｔら， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０８８１－９０， １９８８； Ｈｕａｎｇら Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｓ． ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８， １５５－６５， １９９２：およびＰｅａｒｓｏｎら， Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｒｉｏ． ２４：３０７－３１， １９９４。Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－１０， １９９０は、配列アラインメント法および相同性計算の詳細な考慮事項を示す。

ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－１０， １９９０）は、配列分析プログラム、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘとともに使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を含むいくつかの情報源から、およびインターネット上で入手可能である。さらなる情報は、ＮＣＢＩウェブサイトで見出され得る。

血清型： 抗原の特徴的なセットによって区別される、関連性が近い微生物（例えば、ウイルス）の群。

Ｓｔｕｆｆｅｒ配列： ２つの核酸特徴の間に（例えば、プロモーターとコード配列との間に）所望の間隔を作り出すために、または核酸分子が所望の長さのものであるように、核酸分子を伸長させるために代表的には使用されるより大きな核酸分子（例えば、ベクター）内部に含まれるヌクレオチドの配列をいう。Ｓｔｕｆｆｅｒ配列は、タンパク質コード情報を含まず、未知／合成由来／および／またはより大きな核酸分子の内部の他の核酸配列に関連しないものであり得る。

被験体： 生きている多細胞の脊椎のある生物（ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリー）。いくつかの実施形態において、上記被験体は、ヒトである。１つの実施形態において、上記ヒト被験体は、成人被験体、すなわち、１８歳齢を超えているヒト被験体である。１つの実施形態において、上記ヒト被験体は、小児被験体、すなわち、０～１８歳齢（両端を含む）のヒト被験体である。いくつかの実施形態において、上記被験体（例えば、ヒト被験体）は、コルチコステロイドを投与されている。いくつかの実施形態において、上記被験体（例えば、ヒト被験体）は、ＩｇＧ分解プロテアーゼを投与されている。いくつかの実施形態において、上記被験体（例えば、ヒト被験体）は、コルチコステロイド投与されており、ＩｇＧ分解プロテアーゼをも投与されている。

合成の： 実験室において人工的手段によって生成される。例えば、合成核酸は、実験室において化学合成され得る。

非翻訳領域（ＵＴＲ）： 代表的なｍＲＮＡは、上記コード配列の上流および下流に、それぞれ、５’非翻訳領域（５’ ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ ＵＴＲ）を含む（Ｍｉｇｎｏｎｅ Ｆ．ら， （２００２） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ３：ＲＥＶＩＥＷＳ０００４を参照のこと）。

治療上有効な量： 薬剤で処置される被験体において、または細胞において、所望の効果を達成するために十分な、特定の医薬または治療剤（例えば、組換えＡＡＶ）の量。上記薬剤の有効量は、処置されている被験体または細胞、および治療用組成物の投与様式が挙げられるが、これらに限定されないいくつかの要因に依存する。

ベクター： ベクターは、ベクターが宿主細胞において複製するおよび／または組み込まれる能力を破壊することなく、外来核酸の挿入を可能にする核酸分子である。ベクターは、宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列（例えば、複製起点）を含み得る。ベクターはまた、１またはこれより多くの選択マーカー遺伝子および他の遺伝的エレメントを含み得る。発現ベクターは、挿入された遺伝子の転写および翻訳を可能にするために必要な調節配列を含むベクターである。本明細書中のいくつかの実施形態において、上記ベクターは、ＡＡＶベクターである。

別段説明されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「その、この、上記（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明確に示さなければ、複数形への言及を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに関して与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値が、近似値であり、説明のために提供されることは、さらに理解されるべきである。本明細書で記載されるものに類似または等価な方法および材料が本開示の実施または試験において使用され得るものの、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体において参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（用語の説明を含む）が優先する、さらに、上記材料、方法および例は、例証に過ぎず、限定ではないことが意図される。

組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）：
本発明は、遺伝子治療における組成物およびその使用法を提供する。より具体的には、ＣＤＤの処置のために有用な、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、本明細書で提供される。

１つの局面において、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供し、ここで上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含み、ここで上記ベクターゲノムは、（ａ）プロモーター配列；および（ｂ）ＣＤＫＬ５もしくはそのアイソフォーム、またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントの部分的なまたは完全なコード配列を含む。例示的な実施形態において、上記コード配列は、配列番号１～８から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む。

いくつかの実施形態において、上記パッケージされたベクターゲノムは、本明細書で記載されるように、５’－ＩＴＲ配列、エンハンサー、イントロン、コンセンサスＫｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル、および／または３’－ＩＴＲ配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、上記組換えベクターは、１またはこれより多くのスタッファー核酸配列をさらに含み得る。１つの実施形態において、スタッファー核酸配列は、イントロンとＣＤＫＬ５の上記部分的なまたは完全なコード配列との間に位置される。

本明細書で記載される種々の実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドを含む。上記ＡＡＶキャプシドは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、ｈｕ３７のＡＡＶ（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７）、ならびにヒトおよび非ヒト霊長類組織から単離された１００を超えるバリアントのうちのいずれか１つに由来し得る。例えば、Ｃｈｏｉら， ２００５， Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５： ２９９－３１０， ２００５およびＧａｏら， ２００５， Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５： ２８５－２９７を参照のこと。

前述のキャプシドの他に、１またはこれより多くの有益な治療特性（例えば、選択された組織に対する改善された標的化、免疫応答を逃れる能力の増大、中和抗体の刺激の低減など）を有するように操作されているバリアントＡＡＶキャプシドが、本発明の範囲内に含まれる。このような操作されたバリアントキャプシドの非限定的な例は、米国特許第９，５０６，０８３号、同第９，５８５，９７１号、同第９，５８７，２８２号、同第９，６１１，３０２号、同第９，７２５，４８５号、同第９，８５６，５３９号、同第９，９０９，１４２号、同第９，９２０，０９７号、同第１０，０１１，６４０号、同第１０，０８１，６５９号、同第１０，１７９，１７６号、同第１０，２０２，６５７号、同第１０，２１４，５６６号、同第１０，２１４，７８５号、同第１０，２６６，８４５号、同第１０，２９４，２８１号、同第１０，３０１，６４８号、同第１０，３８５，３２０号、および同第１０，３９２，６３２号に、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１７／１６５８５９、ＷＯ／２０１８／０２２９０５、ＷＯ／２０１８／１５６６５４、ＷＯ／２０１８／２２２５０３、およびＷＯ／２０１８／２２６６０２（これらの開示は、本明細書に参考として援用される）に記載される。

ある特定の例示的な実施形態において、本発明に従って投与されるｒＡＡＶは、ＡＡＶ９キャプシドを含む。上記ＡＡＶ９キャプシドは、複数のＡＡＶ９ ｖｐタンパク質から構成される自己集合したＡＡＶキャプシドである。上記ＡＡＶ９ ｖｐタンパク質は、代表的には、配列番号２２のｖｐ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション： ＡＡＳ９９２６４）をコードする配列番号２１の核酸配列またはこれと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一である配列によってコードされる選択的スプライスバリアントとして発現される。これらのスプライスバリアントは、配列番号２２の異なる長さのタンパク質を生じる。本明細書で使用される場合、ＡＡＶ９バリアントは、例えば、ＷＯ／２０１６／０４９２３０、米国特許第８，９２７，５１４号、米国特許公開第２０１５／０３４４９１１号、および米国特許第８，７３４，８０９に記載されるものを含む。

本明細書で示されるように、本発明に従って投与されるｒＡＡＶは、いくつかの実施形態において、ＡＡＶ９キャプシドを含み得る。しかし、他の実施形態において、別のＡＡＶキャプシドが選択される。組織特異性は、キャプシドタイプによって決定される。適切な標的（例えば、肝臓、筋、肺、またはＣＮＳ）を形質導入するＡＡＶ血清型は、ＡＡＶウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒｌ、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ８が挙げられる）のキャプシドの供給源として選択され得る。例えば、米国特許公開第２００７／００３６７６０号；米国特許公開第２００９／０１９７３３８号；およびＥＰ１３１０５７１を参照のこと。ＷＯ ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７および他のシミアンＡＡＶ）、米国特許第７２８２１９９号および同第７７９０４４９号（ＡＡＶ８）も参照のこと。さらに、未だ発見されていないＡＡＶ、またはこれに基づく組換えＡＡＶが、ＡＡＶキャプシドの供給源として使用されてもよい。これらの文書はまた、ＡＡＶを生成するために選択され得る他のＡＡＶを説明し、参考として援用される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターにおける使用のためのＡＡＶキャプシドは、前述のＡＡＶキャプシドまたはそのコード核酸のうちの一方の変異誘発によって（すなわち、挿入、欠失、または置換によって）生成され得る。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶキャプシドは、前述のＡＡＶキャプシドタンパク質のうちの２つまたは３つまたは４つまたはこれより多くに由来するドメインを含む、キメラである。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶキャプシドは、２種または３種の異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶに由来するＶｐ１、Ｖｐ２、およびＶｐ３モノマーのモザイクである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、前述のキャプシドのうちの１つより多くを含む。

逆方向末端反復（ＩＴＲ）：
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むパッケージされたベクターゲノムを含み、これは、ＡＡＶおよびアデノウイルスヘルパー機能がｔｒａｎｓで提供される場合に、ベクターＤＮＡ複製起点およびベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。さらに、上記ＩＴＲは、大きなＲｅｐタンパク質による１本鎖ヌクレオチド内部ニック形成（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｔｉｃ ｎｉｃｋｉｎｇ）の標的として働き、個々のゲノムを複製中間体から分離する。

いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および上記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来し、配列番号１１を含むかまたはそれからなる。他の実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、非ＡＡＶ２供給源に由来する。

プロモーター：
本明細書で記載される種々の局面において、上記ｒＡＡＶは、ＣＤＫＬ５発現の駆動および調節を助けるプロモーター配列を含むパッケージされたベクターゲノムを含む。例示的な実施形態において、上記プロモーター配列は、５’－ＩＴＲ配列とＣＤＫＬ５の上記部分的なまたは完全なコード配列との間に位置する。いくつかの実施形態において、上記プロモーター配列は、エンハンサー配列の下流に位置する。いくつかの実施形態において、上記プロモーター配列は、イントロン配列の上流に位置する。

いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、ニューロン特異的プロモーターである。１つの実施形態において、上記ニューロン特異的プロモーターは、ヒトシナプシン１（ＳＹＮ１）プロモーター、マウスカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、ラットチューブリンαＩ（Ｔａ１）プロモーター、ラットニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、ヒトニューロン特異的エノラーゼ（ＥＮＯ２）プロモーター、ヒト血小板由来成長因子β鎖（ＰＤＧＦ）プロモーター、ヒトＢＭ８８プロモーター、およびニューロンニコチン性受容体β２（ＣＨＲＮＢ２）プロモーターから選択される。

例示的な実施形態において、上記ニューロン特異的プロモーターは、上記ＳＹＮ１プロモーター（例えば、ヒトＳＹＮ１プロモーター）である。１つの実施形態において、上記ＳＹＮ１プロモーター（例えば、ヒトＳＹＮ１プロモーター）は、配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはこれより高く同一である。例示的な実施形態において、上記ＳＹＮ１プロモーター（例えば、ヒトＳＹＮ１プロモーター）は、配列番号１２を含むかまたはそれからなる。

いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、およびα－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーターから選択される。

例示的な実施形態において、上記プロモーターは、ＣＢＡプロモーターである。１つの実施形態において、上記ＣＢＡプロモーターは、配列番号１３を含むかまたはそれからなる。

いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、遺伝子特異的内因性プロモーターである。１つの実施形態において、上記プロモーターは、天然の遺伝子プロモーターエレメントを含む。いくつかの例示的実施形態において、本明細書で記載されるパッケージされたゲノムは、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むＣＤＫＬ５遺伝子特異的内因性プロモーターであって、配列番号１４の等しい長さの領域と少なくとも９５％同一であるプロモーターを含む。ある特定の実施形態において、本明細書で記載されるパッケージされたゲノムは、少なくとも約１５個の連続するヌクレオチド（例えば、約３０個、約４５個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２７０個、約２８０個、約２９０個、約３００個、約３２５個、約３５０個、約３７５個、約４００個、約４２５個、約４５０個、約４７５個、約５００個、約５２５個、約５５０個、約５７５個、約６００個、約６２５個、約６５０個、約６７５個、約７００個、約８００個、約９００個、約１０００個、約１１００個、約１２００個、約１３００個、約１４００個、または約１５００個）のヌクレオチド配列を含むＣＤＫＬ５遺伝子特異的内因性プロモーターであって、配列番号１４の等しい長さの領域と少なくとも９５％同一であるプロモーターを含む。いくつかの例示的な実施形態において、本明細書で記載されるパッケージされたゲノムは、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むＣＤＫＬ５遺伝子特異的内因性プロモーターであって、配列番号１４の等しい長さの領域と１００％同一であるプロモーターを含む。

他のベクターエレメント：
プロモーターおよびＣＤＫＬ５のコード配列に加えて、パッケージされたゲノムは、他の適切な転写開始配列、終結配列、エンハンサー配列、および効率的ＲＮＡプロセシングシグナルを含み得る。以下でさらに詳細に記載されるように、このような配列は、スプライシングシグナルおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、発現を増強する調節エレメント、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を増強する（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、およびタンパク質安定性を増強する配列を含む。

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、１またはこれより多くのエンハンサー配列を含むパッケージされたベクターゲノムを含む。１つの実施形態において、上記エンハンサーは、サイトメガロウイルス最初期遺伝子（ＣＭＶ）エンハンサー、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサー、およびＡｐｏＥエンハンサーから選択される。例示的な実施形態において、上記エンハンサーは、上記ＣＭＶエンハンサー（例えば、ＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー）である。１つの実施形態において、上記ＣＭＶエンハンサー（例えば、ＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー）は、配列番号１７を含むかまたはそれからなる。

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、１またはこれより多くのイントロン配列を含むパッケージされたベクターゲノムを含む。１つの実施形態において、上記イントロンは、ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットβ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトβグロビンＩＶＳ２イントロン、β－グロビン／ＩｇＧキメライントロン、およびｈＦＩＸイントロンから選択される。１つの例示的な実施形態において、上記イントロンは、上記ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロンである。１つの実施形態において、上記ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン配列は、配列番号１８を含むかまたはそれからなる。

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を含むパッケージされたベクターゲノムを含む。いくつかの実施形態において、上記コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、イントロン配列の下流に位置する。１つの実施形態において、上記コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号１６）である。

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ポリアデニル化シグナル配列を含むパッケージされたベクターゲノムを含む。１つの実施形態において、上記ポリアデニル化シグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウサギβグロビンポリアデニル化シグナル配列、およびＣＤＫＬ５遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列から選択される。例示的な実施形態において、上記ポリアデニル化シグナル配列は、上記ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である。１つの実施形態において、上記ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号１５を含むかまたはそれからなる。

ＣＤＫＬ５ポリペプチドおよびポリヌクレオチド：
本明細書で記載されるように、本発明の局面は、プロモーター配列およびＣＤＫＬ５もしくはそのアイソフォーム、またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントの部分的なまたは完全なコード配列を含むパッケージされたゲノムを含む組換えベクターを提供する。

１つの実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記部分的なまたは完全なコード配列は、野生型コード配列である。本明細書で使用される場合、用語「野生型」とは、天然に存在する生体ポリマー（例えば、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列）と同じである生体ポリマー（例えば、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列）をいう。

代替の実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記部分的なまたは完全なコード配列は、コドン最適化したコード配列である。１つの実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記部分的なまたは完全なコード配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化される。

本明細書で記載される種々の実施形態において、ＣＤＫＬ５のコード配列を含むパッケージされたゲノムを含むベクターが、提供される。本明細書で記載されるベクターとともに送達されるポリペプチドは、哺乳動物（ヒトが挙げられる）の処置において有用であり得るＣＤＫＬ５ポリペプチドを包含する。

いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるベクターで発現されるポリペプチドは、ＣＤＫＬ５アイソフォーム２（配列番号９、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１３１０２１８．１、９６０アミノ酸）またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントである。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるベクターで発現されるポリペプチドは、ＣＤＫＬ５アイソフォーム２であり、配列番号９を含むかまたはそれからなる。１つの実施形態において、上記ＣＤＫＬ５アイソフォーム２ポリペプチドは、配列番号１に示される野生型コード配列によってコードされる。代替の実施形態において、上記ＣＤＫＬ５アイソフォーム２ポリペプチドは、コドン最適化したコード配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、上記ＣＤＫＬ５アイソフォーム２ポリペプチドは、配列番号１に示される野生型コード配列と８０％未満同一であるコドン最適化したコード配列によってコードされる。いくつかの例示的な実施形態において、上記ＣＤＫＬ５アイソフォーム２ポリペプチドは、配列番号３～５から選択されるコドン最適化したコード配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５アイソフォーム２の上記コード配列は、３’末端において終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、またはＴＡＧ）をさらに含み得る。

いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるベクターで発現されるポリペプチドは、ＣＤＫＬ５アイソフォーム１（配列番号１０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０３２４２０．１、１０３０アミノ酸）またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントである。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるベクターで発現されるポリペプチドは、ＣＤＫＬ５アイソフォーム１であり、配列番号１０を含むかまたはそれからなる。１つの実施形態において、上記ＣＤＫＬ５アイソフォーム１ポリペプチドは、配列番号２に示される野生型コード配列によってコードされる。代替の実施形態において、上記ＣＤＫＬ５アイソフォーム１ポリペプチドは、コドン最適化したコード配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、上記ＣＤＫＬ５アイソフォーム１ポリペプチドは、配列番号２に示される野生型コード配列と８０％未満同一であるコドン最適化したコード配列によってコードされる。いくつかの例示的な実施形態において、上記ＣＤＫＬ５アイソフォーム１ポリペプチドは、配列番号６～８から選択されるコドン最適化したコード配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５アイソフォーム１の上記コード配列は、３’末端において終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、またはＴＡＧ）をさらに含み得る。

種々の局面において、本発明は、本明細書で記載される上記ＣＤＫＬ５ポリペプチドのフラグメント、バリアント、アイソフォーム、または融合物を送達するために使用され得る。

いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＤＫＬ５ポリペプチドのフラグメント（これは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも３５０個、少なくとも４００個、少なくとも４５０個、少なくとも５００個、少なくとも５５０個、または少なくとも６００個のアミノ酸残基を含み、全長ポリペプチドと関連する１またはこれより多くの活性（例えば、ＣＤＫＬ５の場合にはキナーゼ活性）を保持する）を送達するために使用され得る。このようなフラグメントは、当該分野で慣用的かつ周知の組換え技術によって得られ得る。さらに、このようなフラグメントは、当業者に公知の慣用的なインビトロアッセイによって活性に関して試験され得る。例えば、ＣＤＫＬ５活性は、Ｌｉｎら， ２００５， Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １４（２４）： ３７７５－８６において記載されるとおりのインビトロ自己リン酸化キナーゼアッセイによってアッセイされ得る。簡潔には、５００μｇの異所性に発現されたＦＬＡＧタグ化ＣＤＫＬ５は、５μｇのＭ２結合アガロースとともに４時間インキュベートされ得る。ビーズは、ＴＬＢで３回、およびキナーゼ緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．２ｍＭ バナジン酸ナトリウムおよび１０ｍＭ ニトロ－フェニル－ホスフェート）で２回洗浄され得る。次いで、ＦＬＡＧペプチドは、ＣＤＫＬ５を溶離するために使用され得る。次いで、得られたビーズは、３０μｌのキナーゼ緩衝液中、１００μＭ ＡＴＰ、５μＣｉの［γ－^３２Ｐ］－ＡＴＰ（ＮＥＮ）および基質を添加して再懸濁され得る。キナーゼアッセイは、１５分間、３０℃において行われ得、ＳＤＳ-ＰＡＧＥタンパク質負荷緩衝液を添加することで終了され得る。

いくつかの局面において、本開示はまた、上記のポリペプチドフラグメントをコードする核酸分子を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＤＫＬ５ポリペプチドのバリアントを送達するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記バリアントポリペプチドは、野生型治療用ポリペプチド（例えば、配列番号９の野生型ＣＤＫＬ５アイソフォーム２ポリペプチドまたは配列番号１０の野生型ＣＤＫＬ５アイソフォーム１ポリペプチド）と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％）同一であり得る。いくつかの実施形態において、上記バリアント治療用ポリペプチドは、それぞれの野生型ポリペプチドと比較して、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも ３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、または少なくとも４０個の異なる残基を有し得る。このようなバリアントは、当該分野で慣用的かつ周知の組換え技術によって得られ得る。さらに、このようなバリアントは、当業者に公知の慣用的なインビトロアッセイによってキナーゼ活性に関して試験され得る。ＣＤＫＬ５キナーゼ活性アッセイの説明の関しては、例えば、Ｌｉｎら， ２００５， Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １４（２４）： ３７７５－８６を参照のこと。

いくつかの局面において、本開示はまた、上記の治療用ポリペプチドバリアントをコードする核酸分子を提供する。

新規なコドン最適化した配列：
いくつかの局面において、本開示は、ＣＤＫＬ５アイソフォーム２をコードする新規なコドン最適化した核酸配列を提供する。１つの実施形態において、ＣＤＫＬ５アイソフォーム２をコードする上記コドン最適化した核酸配列は、配列番号１に示される野生型コード配列と８０％未満同一である。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５アイソフォーム２をコードする上記コドン最適化した核酸配列は、配列番号３～５と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％）同一である。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５アイソフォーム２をコードする上記コドン最適化した核酸配列は、配列番号３～５から選択される配列と１００％同一である。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１に示される野生型コード配列と８０％未満同一であり、配列番号３～５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはこれより高く同一である核酸配列を提供する。例示的な実施形態において、本開示は、配列番号３～５から選択されるＣＤＫＬ５アイソフォーム２をコードする核酸配列を提供する。配列番号３～５に示され、機能的ＣＤＫＬ５活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列のフラグメントがさらに提供される。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５アイソフォーム２をコードする上記核酸配列は、３’末端において終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、またはＴＡＧ）をさらに含み得る。

いくつかの局面において、本開示は、ＣＤＫＬ５アイソフォーム１をコードする新規なコドン最適化した核酸配列を提供する。１つの実施形態において、ＣＤＫＬ５アイソフォーム１をコードする上記コドン最適化した核酸配列は、配列番号２に示される野生型コード配列と８０％未満同一である。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５アイソフォーム１をコードする上記コドン最適化した核酸配列は、配列番号６～８と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％）同一である。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５アイソフォーム１をコードする上記コドン最適化した核酸配列は、配列番号６～８から選択される配列と１００％同一である。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号２に示される野生型コード配列と８０％未満同一であり、配列番号６～８から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはこれより高く同一である核酸配列を提供する。例示的な実施形態において、本開示は、配列番号６～８から選択されるＣＤＫＬ５アイソフォーム１をコードする核酸配列を提供する。配列番号６～８に示され、機能的ＣＤＫＬ５活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列のフラグメントがさらに提供される。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５アイソフォーム１をコードする上記核酸配列は、３’末端において終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、またはＴＡＧ）をさらに含み得る。

組換え核酸分子を含む宿主細胞：
いくつかの局面において、組換え核酸分子、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター、または本明細書で開示されるｒＡＡＶを含む宿主細胞が、本明細書で提供される。具体的実施形態において、上記宿主細胞は、ＡＡＶの増殖に適切であり得る。

非常に広い範囲の宿主細胞が使用され得る（例えば、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物の細胞など）。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の生成に適した細胞（または細胞株）、例えば、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ－７、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＨＴ－１０８０、ＡＲＰＥ－１９、またはＭＲＣ－５細胞であり得る。

上記組換え核酸分子またはベクターは、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して、宿主細胞培養物に送達され得る。いくつかの実施形態において、ゲノムに挿入された上記組換え核酸分子またはベクターを有する適切な宿主細胞株が、生成される。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクターを含む適切な宿主細胞株が生成される。上記宿主培養物へのｒＡＡＶベクターのトランスフェクション後に、上記ｒＡＡＶの、上記宿主ゲノムへの組み込みは、Ｎａｋａｉら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （２００３） ３４， ２９７－３０２； Ｐｈｉｌｐｏｔｔら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （２００２） ７６（１１）：５４１１－５４２１、およびＨｏｗｄｅｎら， Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００８； １０：４２－５０によって記載されるように、種々の方法（例えば、抗生物質選択、蛍光活性化セルソーティング、サザンブロット、ＰＣＲベースの検出、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）によってアッセイされ得る。さらに、安定な細胞株が、当該分野で周知のプロトコール（例えば、Ｃｌａｒｋ， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｏｌ ６１ （２００２）：Ｓ９－Ｓ１５、およびＹｕａｎら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１１ Ｍａｙ；２２（５）：６１３－２４に記載されるもの）に従って樹立され得る。

遺伝子治療のための組換えＡＡＶ：
ＡＡＶは、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科およびＤｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属する。ＡＡＶは、直線状の１本鎖ＤＮＡゲノムをパッケージする、小さなエンベロープのないウイルスである。ＡＡＶ ＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方が、等しい頻度でＡＡＶキャプシドへとパッケージされる。

上記ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に隣接する２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）によって特徴づけられる。上記ＡＡＶ２ゲノムにおいて、例えば、上記ＩＴＲの最初の１２５ヌクレオチドは、パリンドロームであり、これは、塩基対合を最大にするようにそれら自体を折りたたんで、Ｔ字型ヘアピン構造を形成する。上記ＩＴＲの他の２０塩基（Ｄ配列といわれる）は、対合しないままである。上記ＩＴＲは、ＡＡＶ ＤＮＡ複製にとって重要なｃｉｓ作用性配列である；上記ＩＴＲは複製起点であり、ＤＮＡポリメラーゼによる第２鎖合成のプライマーとして働く。この合成の間に形成される２本鎖ＤＮＡ（これは、複製形態モノマーといわれる）は、第２回の自己感作複製のために使用され、複製形態ダイマーを形成する。これらの２本鎖中間体は、鎖置換機構を介して処理され、パッケージングに使用される１本鎖ＤＮＡおよび転写に使用される２本鎖ＤＮＡを生じる。Ｒｅｐ結合エレメントおよび末端分離部位（ＴＲＳ）が、ＩＴＲ内に位置する。これらの特徴は、２本鎖中間体を処理するために、ＡＡＶ複製の間にウイルス調節タンパク質Ｒｅｐによって使用される。ＡＡＶ複製におけるそれらの役割に加えて、上記ＩＴＲはまた、ＡＡＶゲノムパッケージング、転写、許容できない条件下での負の調節、および部位特異的組み込みにとって必須である（Ｄａｙｓ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ， Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２１（４）：５８３－５９３， ２００８）。

ＡＡＶの左側のＯＲＦは、４つのタンパク質－ Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードするＲｅｐ遺伝子を含む。右側のＯＲＦは、３つのウイルスキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）を生成するＣａｐ遺伝子を含む。そのＡＡＶキャプシドは、正二十面体対称へと配置される６０のウイルスキャプシドタンパク質を含む。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、１：１：１０モル比で存在する（Ｄａｙａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ， Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２１（４）：５８３－５９３， ２００８）。

ＡＡＶは、現在のところ、遺伝子治療のために最も頻繁に使用されるウイルスのうちの１つである。ＡＡＶは、ヒトおよび数種の他の霊長類種に感染するものの、疾患を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂中の細胞および休止細胞の両方に感染し得、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく、染色体外の状態で持続する。ＡＡＶの有利な特徴が原因で、本開示は、本明細書で開示される組換え核酸分子および方法のためのＡＡＶの使用を企図する。

ＡＡＶは、標的細胞に結合し、進入し、核に入る能力、長期間にわたって核において発現される能力、および低毒性を含め、遺伝子治療ベクターのいくつかの望ましい特徴を有する。しかし、ＡＡＶゲノムのサイズは小さいことから、組み込まれ得る異種ＤＮＡのサイズは制限がある。この問題を最小限にするために、Ｒｅｐおよび組み込み効率エレメント（ＩＥＥ）をコードしないＡＡＶベクターは、構築されている。上記ＩＴＲは、これらがパッキングに必要とされるｃｉｓシグナルであることから保持される（Ｄａｙａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ， Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ， ２１（４）：５８３－５９３， ２００８）。

遺伝子治療に適したｒＡＡＶを生成するための方法は、当該分野で周知であり（例えば、米国特許出願公開２０１２／０１００６０６；同第２０１２／０１３５５１５；同第２０１１／０２２９９７１；および同第２０１３／００７２５４８；ならびにＧｈｏｓｈら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３（４）：３２１－３２９， ２００６を参照のこと）、本明細書で開示される組換え核酸分子および方法とともに利用され得る。

いくつかの局面において、本開示は、ＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）の処置のための本明細書で開示されるｒＡＡＶの使用を提供し、ここで上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含む。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、作動可能に連結された構成要素として、５’から３’の順序において：５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ＣＤＫＬ５、またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントの部分的なまたは完全なコード配列、および３’－ＩＴＲを含むパッケージされたゲノムを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号１～８、またはこれらと少なくとも９５％同一の配列から選択される。

例示的な実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号１を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２～１４から選択される。例示的な実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ８キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９バリアントキャプシドである。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、配列番号１１を含むかまたはそれからなる。

例示的な実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号２を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２～１４から選択される。例示的な実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ８キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９バリアントキャプシドである。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、配列番号１１を含むかまたはそれからなる。

例示的な実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号３を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２～１４から選択される。例示的な実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ８キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９バリアントキャプシドである。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、配列番号１１を含むかまたはそれからなる。

例示的な実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号４を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２～１４から選択される。例示的な実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ８キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９バリアントキャプシドである。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、配列番号１１を含むかまたはそれからなる。

例示的な実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号５を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２～１４から選択される。例示的な実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ８キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９バリアントキャプシドである。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、配列番号１１を含むかまたはそれからなる。

例示的な実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号６を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２～１４から選択される。例示的な実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ８キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９バリアントキャプシドである。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、配列番号１１を含むかまたはそれからなる。

例示的な実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号７を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２～１４から選択される。例示的な実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ８キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９バリアントキャプシドである。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、配列番号１１を含むかまたはそれからなる。

例示的な実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号８を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２～１４から選択される。例示的な実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ８キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９バリアントキャプシドである。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、配列番号１１を含むかまたはそれからなる。

ＣＤＫＬ５の発現のための例示的なパッケージされたベクターゲノム構築物を示す説明図は、図１に提供される。上記構築物は、５’から３’の順番において：５’－ＩＴＲ、ＳＹＮ１プロモーター、ＣＤＫＬ５コード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、および３’－ＩＴＲを示す。この例示的なパッケージされたベクターゲノム構築物の３，８２８ｂｐの配列は、配列番号１９において提供される。

ＣＤＫＬ５の発現のための例示的なパッケージされたベクターゲノム構築物を示す別の説明図は、図２に提供される。上記構築物は、５’から３’の順番において：５’－ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー（例えば、ＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー）、ＣＢＡプロモーター、ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン、ＣＤＫＬ５コード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、および３’－ＩＴＲを示す。この例示的なパッケージされたベクターゲノム構築物の４，０５７ｂｐの配列は、配列番号２０に提供される。

医薬組成物：
いくつかの局面において、本開示は、本発明のｒＡＡＶ（例えば、ＣＤＫＬ５の送達のためのｒＡＡＶ）および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｒＡＡＶ（例えば、ＣＤＫＬ５の送達のためのｒＡＡＶ）を含む上記医薬組成物は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、髄腔内、脳室内、静脈内、または大槽内投与のために製剤化される。例示的な実施形態において、上記医薬組成物は、髄腔内投与のために製剤化される。別の例示的な実施形態において、上記医薬組成物は、大槽内投与のために製剤化される。

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ヒト被験体における注入に適した緩衝液／キャリア中に製剤化される。上記緩衝液／キャリアは、ｒＡＡＶが注入チューブに貼り付くことを防止するが、インビボでのｒＡＡＶ結合活性に干渉しない構成要素を含むべきである。種々の適切な溶液が、以下のうちの１またはこれより多くを含み得る：緩衝化食塩水、界面活性剤、および約１００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）～約２５０ｍＭ 塩化ナトリウムに等しいイオン強度に調節された生理学的に適合性の塩または塩の混合物、または等しいイオン濃度に調節された生理学的に適合性の塩。そのｐＨは、６．５～８．５、または７～８．５、または７．５～８の範囲にあり得る。適切な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは、ポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２本の親水性鎖が隣接したポリオキシプリピレン１０（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノールおよびポリエチレングリコールから選択され得る。

例示的な実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ＮａＣｌ（例えば、２００ｍＭ ＮａＣｌ）、ＭｇＣｌ_２（例えば、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、Ｔｒｉｓ（例えば、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ）、ｐＨ ８．０、およびポロキサマー１８８（例えば、０．００５％または０．０１％ ポロキサマー１８８）を含む溶液中に製剤化される。

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、少なくとも１種の二価アルコールまたは多価アルコールを含む医薬組成物中に製剤化される。１つの実施形態において、上記二価アルコールまたは多価アルコールは、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールおよびソルビトールからなる群より選択される１種またはこれより多くのアルコールである。

例示的な実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ソルビトールを含む医薬組成物中に製剤化される。１つの実施形態において、ソルビトールは、０．５重量％～２０重量％の範囲で上記製剤に存在する。１つの実施形態において、ソルビトールは、１重量％～１０重量％の範囲で上記製剤に存在する。１つの実施形態において、ソルビトールは、約１重量％、約２重量％、約３重量％、約４重量％、約５重量％、約６重量％、約７重量％、約８重量％、約９重量％、または約１０重量％で上記製剤に存在する。

例示的な実施形態において、上記ｒＡＡＶは、５重量％ ソルビトールおよびポロキサマー１８８（例えば、０．００５％または０．０１％ ポロキサマー１８８）を含む医薬組成物中に製剤化される。

ＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を処置する方法：
さらに別の局面において、本開示は、ヒト被験体においてＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を処置する方法であって、上記方法は、上記ヒト被験体に、治療上有効な量の、少なくとも１種の本明細書で開示されるｒＡＡＶを投与することを包含する方法を提供する。

１つの実施形態において、本開示は、ＣＤＤを処置する方法であって、上記方法は、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与することを包含し、ここで上記ベクターゲノムは、ＣＤＫＬ５、またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントの部分的なまたは完全なコード配列を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号１～８、またはこれらと少なくとも９５％同一な配列から選択される。例示的な実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号１を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２～１４から選択される。例示的な実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。

ある特定の実施形態において、本開示は、ヒト被験体においてＣＤＤを処置する方法であって、上記方法は、ＣＤＫＬ５において少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト被験体に、治療上有効な量の、少なくとも１種の本明細書で開示されるｒＡＡＶを投与することを包含する方法を提供する。ＣＤＫＬ５における病原性変異の非限定的なリストは、Ｈｅｃｔｏｒら， ２０１７， Ｎｅｕｒｏｌ Ｇｅｎｅｔ ３（６）： ｅ２００、Ｒｕｓｓｏら， ２００９， Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １０（３）： ２４１－５０、およびＬｅｉｄｅｎ Ｏｐｅｎ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＬＯＶＤ） Ｇｌｏｂａｌ Ｖａｒｉｏｍｅ ｆｏｒ ＣＤＫＬ５に記載される。

１つの実施形態において、本開示は、ＣＤＫＬ５において少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト被験体においてＣＤＤを処置する方法であって、上記方法は、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与することを包含し、ここで上記ベクターゲノムは、ＣＤＫＬ５、またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントの部分的なまたは完全なコード配列を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号１～８、またはこれらと少なくとも９５％同一な配列から選択される。例示的な実施形態において、ＣＤＫＬ５の上記コード配列は、配列番号１を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２～１４から選択される。例示的な実施形態において、上記プロモーター配列は、配列番号１２を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。

任意の適切な方補または経路は、本明細書で記載されるｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ含有組成物を投与するために使用され得る。投与経路としては、例えば、皮下に、皮内に、腹腔内に、髄腔内に、脳室内に、静脈内に、大槽内（intracisterna magna）、および他の非経口投与経路が挙げられる。例示的な実施形態において、上記ｒＡＡＶは、髄腔内に投与される。別の例示的な実施形態において、上記ｒＡＡＶは、大槽を介して投与される。

１つの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、大槽・髄腔内経路（ｃｉｓｔｅｒｎａｌ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｒｏｕｔｅ）を介して投与され得る。別の実施形態において、上記ｒＡＡＶは、腰椎髄腔内経路を介して投与され得る。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、自動髄腔内インジェクターを使用して投与され得る。例えば、ＣＳＦダイナミクス、生理学的拍動性、および容積変位（ｖｏｌｕｍｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）に対して影響力を与えるインジェクターが、ｒＡＡＶを髄腔内に送達するために利用され得る。本発明の方法において使用するための１つの可能なインジェクターの例は、Ａｌｃｙｏｎｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．が開発したＰｕｌｓａｒ^ＴＭ Ｓｍａｒｔ Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍである。

投与される具体的用量は、各患者に対して均一な用量、患者１名あたり例えば、１．０×１０^１１～１．０×１０^１４ ゲノムコピー（ＧＣ）のウイルスであり得る。あるいは、患者の用量は、上記患者のおおよその体重または表面積に合わせて調節され得る。適切な投与量を決定することにおける他の要因としては、処置または防止される疾患または状態、疾患の重篤度、投与経路、および上記患者の年齢、性別および医学的状態が挙げられ得る。処置に適切な投与量を決定するために必要な計算のさらなる改良は、当業者によって、特に、本明細書で開示される投与量情報およびアッセイに鑑みて慣用的に行われる。上記投与量はまた、適切な用量－応答データとともに使用される投与量を決定するために公知のアッセイの使用を通じて決定され得る。個々の患者の投与量はまた、上記疾患の進行がモニターされるにつれて調節され得る。

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ｑＰＣＲまたは液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定されるように、例えば、約１．０×１０^１１ ゲノムコピー／ｋｇ 患者体重（ＧＣ／ｋｇ）～約１×１０^１４ ＧＣ／ｋｇ、約５×１０^１１ ゲノムコピー／ｋｇ 患者体重（ＧＣ／ｋｇ）～約５×１０^１３ ＧＣ／ｋｇ、または約１×１０^１２～約１×１０^１３ ＧＣ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約１×１０^１２～約１×１０^１３ ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約１．１×１０^１１、約１．３×１０^１１、約１．６×１０^１１、約１．９×１０^１１、約２×１０^１１、約２．５×１０^１１、約３．０×１０^１１、約３．５×１０^１１、約４．０×１０^１１、約４．５×１０^１１、約５．０×１０^１１、約５．５×１０^１１、約６．０×１０^１１、約６．５×１０^１１、約７．０×１０^１１、約７．５×１０^１１、約８．０×１０^１１、約８．５×１０^１１、約９．０×１０^１１、約９．５×１０^１１、約１．０×１０^１２、約１．５×１０^１２、約２．０×１０^１２、約２．５×１０^１２、約３．０×１０^１２、約３．５×１０^１２、約４．０×１０^１２、約４．５×１０^１２、約５．０×１０^１２、約５．５×１０^１２、約６．０×１０^１２、約６．５×１０^１２、約７．０×１０^１２、約７．５×１０^１２、約８．０×１０^１２、約８．５×１０^１２、約９．０×１０^１２、約９．５×１０^１２、約１．０×１０^１３、約１．５×１０^１３、約２．０×１０^１３、約２．５×１０^１３、約３．０×１０^１３、約３．５×１０^１３、約４．０×１０^１３、約４．５×１０^１３、約５．０×１０^１３、約５．５×１０^１３、約６．０×１０^１３、約６．５×１０^１３、約７．０×１０^１３、約７．５×１０^１３、約８．０×１０^１３、約８．５×１０^１３、約９．０×１０^１３、約９．５×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される。上記ｒＡＡＶは、単回用量で、または所望の治療結果にとって必要とされる場合は、複数回用量（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはより多くの用量）で投与され得る。

いくつかの実施形態において、本発明に従うＣＤＤを処置する方法は、本明細書で記載されるｒＡＡＶを投与する前に、ＩｇＧ分解プロテアーゼの投与をさらに含み得る。よって、本開示は、ＣＤＤを処置する方法であって、上記方法は、ＩｇＧ分解プロテアーゼを先ず投与すること、および次いで、ＡＡＶキャプシドおよび上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを引き続いて投与することを包含し、ここで上記ベクターゲノムは、ＣＤＫＬ５、またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントの部分的なまたは完全なコード配列を含む方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明に従うＣＤＤを処置する方法は、ＩｇＧ分解プロテアーゼを投与されているヒト被験体に対して行われる。

本発明において使用され得るプロテアーゼの例としては、例えば、ＷＯ／２０２０／０１６３１８および／またはＷＯ／２０２０／１５９９７０に記載されるもの（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａに由来するシステインプロテーゼが挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態において、上記ＩｇＧ分解プロテアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＩｄｅＳ（配列番号２３）、または配列番号２３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼは、配列番号２３の操作されたバリアントである。操作されたＩｄｅＳプロテアーゼの例は、ＷＯ／２０２０／０１６３１８ならびに米国特許公開第２０１８００２３０７０号および同第２０１８００３７９６２号に記載される。いくつかの実施形態において、上記操作されたＩｄｅＳバリアントは、配列番号２０に対して１個、２個、３個、４個、５個、またはこれより多くのアミノ酸改変を有し得る。

ある特定の実施形態において、上記ＩｇＧ分解プロテアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉに由来するＩｄｅＺ（配列番号２４）または配列番号２４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼは、配列番号２４の操作されたバリアントである。操作されたＩｄｅＺプロテアーゼの例は、ＷＯ／２０２０／０１６３１８に記載される。いくつかの実施形態において、上記操作されたＩｄｅＺバリアントは、配列番号２１に対して１個、２個、３個、４個、５個、またはこれより多くのアミノ酸改変を有し得る。

本発明において使用され得る他のプロテアーゼとしては、例えば、ＷＯ／２０１７／１３４２７４に記載される、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｏｒｃｉｎｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉに由来するＩｇｄＥ酵素が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、上記ＩｇＧ分解プロテアーゼは、リポソーム、ナノ粒子、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリマー、微粒子、マイクロカプセル、ミセル、もしくは細胞外小胞の中に被包され得るか、またはこれらと複合体化され得る。

コルチコステロイドの使用を含むＣＮＳ障害を処置する方法：
本発明者らは驚くべきことに、ｒＡＡＶ投与の前にコルチコステロイド、プレドニゾロンを投与することが、種々の脳組織に存在するベクターゲノムの数の増加をもたらすことを観察した。理論によって拘束されないが、コルチコステロイドは、ＣＮＳ組織における炎症を低減するように作用し、これは、上記ｒＡＡＶが、コルチコステロイド投与が存在しない別の方法では到達しがたいであろう深部ＣＮＳ組織に透過することを可能にするという仮説が立てられる。よって、さらに別の局面において、本開示は、ヒト被験体においてＣＮＳ障害を処置する方法であって、上記方法は、上記被験体に、コルチコステロイドを先ず投与すること、および次いで、治療上有効な量の、上記ＣＮＳ障害の処置のために設計された少なくとも１種のｒＡＡＶを引き続いて投与することを包含し、ここで上記ｒＡＡＶは、髄腔内に、脳室内に、または大槽内送達を介して投与される方法を提供する。ヒト被験体においてＣＮＳ障害を処置する方法であって、上記方法は、治療上有効な量の、上記ＣＮＳ障害の処置のために設計された少なくとも１種のｒＡＡＶを投与することを包含し、ここで上記被験体は、コルチコステロイドを投与されており；必要に応じて、上記ｒＡＡＶは、髄腔内に、脳室内に、または大槽内送達を介して投与される方法がまた、提供される。

この局面に従う種々の実施形態において、上記コルチコステロイドは、プレドニゾロン、プレドニゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、ブデソニド、ベタメタゾン、およびデフラザコートから選択され得る。例示的な実施形態において、上記コルチコステロイドは、プレドニゾロンである。

この局面に従う種々の実施形態において、上記コルチコステロイドは、上記ｒＡＡＶの投与の少なくとも約１２時間前に、上記被験体に投与される。別の実施形態において、上記コルチコステロイドは、上記ｒＡＡＶの投与の少なくとも約２４時間前に、上記被験体に投与される。さらに別の実施形態において、上記コルチコステロイドは、上記ｒＡＡＶの投与の少なくとも約２日前に、上記被験体に投与される。さらに別の実施形態において、上記コルチコステロイドは、上記ｒＡＡＶの投与の少なくとも約３日前、４日前、５日前、６日前、７日前、または７日より前に、上記被験体に投与される。さらに別の実施形態において、上記コルチコステロイドは、上記ｒＡＡＶの投与の少なくとも約７日前、１４日前、２１日前、または２１日より前に、上記被験体に投与される。さらに別の実施形態において、上記コルチコステロイドは、上記ｒＡＡＶの投与の少なくとも約１ヶ月前、少なくとも約２ヶ月前、または少なくとも約３ヶ月前に、上記被験体に投与される。

１つの実施形態において、上記コルチコステロイドは、上記ｒＡＡＶを投与する前に１回投与される。別の実施形態において、上記コルチコステロイドは、上記ｒＡＡＶを投与する前に２回投与される。さらに別の実施形態において、上記コルチコステロイドは、上記ｒＡＡＶを投与する前に３回、４回、５回、またはそれより多くの回数、投与される。

ヒト被験体への上記コルチコステロイドの投与は、任意の経路によるものであり得る（経口、静脈内、皮内、経皮、皮下、筋肉内、吸入（例えば、エアロゾルを介する）、頬側（例えば、舌下）、局所（すなわち、皮膚および粘膜表面（気道表面を含む）の両方）、髄腔内、関節内、胸膜内（ｉｎｔｒａｐｌｕｒａｌ）、脳内、動脈内、腹腔内、または鼻内投与が挙げられるが、これらに限定されない）。例示的な実施形態において、上記コルチコステロイドは、経口投与される。

ある特定の実施形態において、コルチコステロイドの用量は、ｍｇ／ｋｇ 被験体体重の単位で測定される。他の実施形態において、コルチコステロイドの用量は、被験体に投与される用量あたりのｍｇ単位で測定される。本発明の組成物および方法とともに使用され得る用量の任意の測定値ならびに投与単位は、当該分野で標準的な手段によって変換され得る。

ある特定の実施形態において、上記コルチコステロイドは、約１ｍｇ～約１０００ｍｇの用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、上記コルチコステロイドは、約３ｍｇ～約３００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記コルチコステロイドは、約５ｍｇ～約１５０ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記コルチコステロイドは、約１０ｍｇ～約１００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記コルチコステロイドは、約１５ｍｇ～約８０ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記コルチコステロイドは、約２０ｍｇ～約６０ｍｇの用量で投与される。

ある特定の実施形態において、上記コルチコステロイドは、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ ｍｇ、約１０ｍｇ、約１１ｍｇ、約１２ｍｇ、約１３ｍｇ、約１４ｍｇ、約１５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１７ｍｇ、約１８ｍｇ、約１９ｍｇ、約２０ｍｇ、約２１ｍｇ、約２２ｍｇ、約２３ｍｇ、約２４ｍｇ、約２５ｍｇ、約２６ｍｇ、約２７ｍｇ、約２８ｍｇ、約２９ｍｇ、約３０ｍｇ、約３１ｍｇ、約３２ｍｇ、約３３ｍｇ、約３４ｍｇ、約３５ｍｇ、約３６ｍｇ、約３７ｍｇ、約３８ｍｇ、約３９ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、または約１０００ｍｇの用量で投与され得る。

ある特定の実施形態において、上記コルチコステロイドは、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ 被験体体重の用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記抗ＣＤ１９抗体は、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記抗ＣＤ１９抗体は、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．１ｍｇ／ｋｇ、約１．２ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ、約１．４ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ 被験体体重の用量で投与される。

いくつかの実施形態において、上記コルチコステロイドは、上記ｒＡＡＶの投与の前に、合計で少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、またはそれより多くの日数、投与され得る。例えば、ある特定の例示的な実施形態において、上記コルチコステロイドは、上記ｒＡＡＶを投与する前に５日間、１ｍｇ／ｋｇ／日で投与され得る。

いくつかの実施形態において、上記コルチコステロイドは、１ｍｇ／ｋｇ／日で４週間にわたって投与されてもよく、最初の投与は、上記ｒＡＡＶの投与の５日前に行う。いくつかの実施形態において、上記コルチコステロイドは、１ｍｇ／ｋｇ／日で４週間にわたって投与されてもよく、最初の投与は、上記ｒＡＡＶの投与の５日前に行い、続いて、さらに４週間にわたってコルチコステロイドの漸減を行う。

この局面に従う方法は、遺伝子治療が適切であり得る任意のＣＮＳ障害を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記ＣＮＳ障害は、ＣＤＤ、アンジェルマン症候群、バッテン病、クラッベ病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型、Ｘ連鎖性ミオチュブラーミオパチー、フリードライヒ運動失調症、カナバン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、副腎白質ジストロフィー、ハンチントン病、レット症候群、ならびに脊髄小脳失調症から選択される。例示的な実施形態において、上記ＣＮＳ障害は、ＣＤＤである。別の例示的な実施形態において、この局面に従う方法における使用のための上記ｒＡＡＶは、本明細書で記載されるＣＤＤの処置のために有用なｒＡＡＶを含む。例えば、ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ９キャプシド）および上記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含んでいてもよく、ここで上記ベクターゲノムは、（ａ）プロモーター配列（例えば、ＳＹＮ１プロモーター配列、例えば、ヒトＳＹＮ１プロモーター配列）；および（ｂ）ＣＤＫＬ５もしくはそのアイソフォーム、またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントの部分的なまたは完全なコード配列を含む。いくつかの実施形態において、上記コード配列は、配列番号１～８から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む。

詳細な説明全体を通じて、組成物が、特定の構成要素を有する、包含する、もしくは含むと記載される場合、またはプロセスおよび方法が、特定の工程を有する、包含する、もしくは含むと記載される場合、さらに、その記載される構成要素から本質的になるかまたはそれからなる本発明の組成物が存在すること、ならびにその記載される処理工程から本質的になるかまたはそれからなる本発明に従うプロセスおよび方法が存在することは、企図される。

本開示において、要素または構成要素が、記載される要素または構成要素のリストの中に含まれるおよび／またはリストから選択されるといわれる場合、その要素もしくは構成要素が、その記載される要素もしくは構成要素のうちのいずれか１つであり得るか、またはその要素もしくは構成要素が、その記載される要素もしくは構成要素のうちの２もしくはこれより多くからなる群より選択され得ることは、理解されるべきである。

さらに、本明細書で記載される組成物または方法の要素および／または特徴が、本明細書で明示的であろうと暗示的であろうと、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の方法において組み合わされ得ることは、理解されるべきである。例えば、特定の化合物に対して言及がなされる場合、その化合物は文脈から別段理解されなければ、本発明の組成物の種々の実施形態においておよび／または本発明の方法において使用され得る。言い換えると、本開示の中で、実施形態は、明確かつ簡潔な開示が書かれ、描かれることを可能にする方法で記載され、示されているが、実施形態が、本教示および本発明から切り離されることなく、種々に組み合わされてもよいし、分離されてもよいことは、意図され、認識される。例えば、本明細書で記載され、示される全ての特徴が、本明細書で記載され、示される本発明の全ての局面に適用可能であり得ることは、認識される。

表現「のうちの少なくとも１」が、文脈および用途から別段理解されなければ、その表現の後に来る記載される物体の各々、およびその記載される物体のうちの２またはこれより多くの種々の実施形態を個々に含むことは、理解されるべきである。３またはこれより多くの記載される物体に関連して、表現「および／または」は、文脈から別段理解されなければ、同じ意味を有することが理解されるべきである。

用語「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の使用は、これらの文法上等価なものを含め、概して制限がなくかつ非限定的である、例えば、別段具体的に述べられなければ、または文脈から理解されなければ、さらなる記載されない要素または工程を排除しないと概して理解されるべきである。

用語「約」が定量的値の前で使用される場合、本発明はまた、別段具体的に述べられなければ、その特定の定量的値自体を含む。本明細書で使用される場合、用語「約」とは、別段示されなければまたは推測されなければ、名目上の値からの±１０％ 変動に言及する。

工程の順序またはある特定の行為を行うための順序は、本発明が実施可能なままである限りにおいて、重要ではないことが理解されるべきである。さらに、２またはこれより多くの工程または行為は、同時と見做されてもよい。

任意のおよび全ての例、または例示的な文言、例えば、「のような、例えば（ｓｕｃｈ ａｓ）」または「が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の本明細書での使用は、本発明をよりよく例証することを意図するに過ぎず、別段特許請求されなければ、本発明の範囲に対する限定を課すものではない。本明細書中のいかなる文言も、任意の特許請求されていない要素を本発明の実施に必須として示すと解釈されるべきではない。

ここで一般的に記載されている開示は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。実施例は、本開示のある特定の局面および実施形態を例証する目的で含められるに過ぎず、いかなる方法によっても本開示の範囲を限定することは意図されない。

実施例１：
この実施例の目的は、Ｎｅｕｒｏ２ａ（マウス神経芽腫）細胞へのＣＢＡ－ｈＣＤＫＬ５プラスミドの送達が、ＣＤＫＬ５の発現の増加およびＣＤＫＬ５の下流の標的であるＥＢ２（微小管関連タンパク質ＲＰ／ＥＢファミリーメンバー２）のリン酸化の引き続く増加をもたらすことを実証することである。

この実施例では、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を、ヒトＣＤＫＬ５ ｃＤＮＡの上流にＣＢＡプロモーターを含むプラスミドで４８時間、一過性にトランスフェクトしたか、またはトランスフェクトせずに静置した。細胞を固定し、抗ＣＤＫＬ５抗体および抗ホスホ－ＥＢ２抗体を使用して免疫組織化学を行った。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２蛍光顕微鏡を使用して、画像化を行った。

図３に示されるように、高レベルのｈＣＤＫＬ５を発現するＮｅｕｒｏ２ａ細胞は、増強されたレベルのリン酸化ＥＢ２タンパク質（ＣＤＫＬ５の下流の標的）を示す。これは、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞へのＣＤＫＬ５の送達が、ＣＤＫＬ５標的（例えば、ＥＢ２）の活性に正の影響を及ぼし得ることを示す。

実施例２：
この実施例の目的は、ｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰまたはｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰで処置したＣｄｋｌ５ ＫＯマウスの種々のＣＮＳ組織における増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の発現を実証することである。

この実施例では、ＣＤＫＬ５欠損マウスに、（１）ＡＡＶ９キャプシドならびにＣＢＡプロモーターおよびｅＧＦＰコード配列を含むベクターゲノムを含むｒＡＡＶ［ｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰ］、または（２）ＡＡＶ９キャプシドならびにＳＹＮプロモーターおよびｅＧＦＰコード配列を含むベクターゲノムを含むｒＡＡＶ［ｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰ］を投与した。マウスに、脳室内（ＩＣＶ）注射によってｒＡＡＶを投与した。組織を、分析のために、投与の２～４週間後に回収した。脳を固定し、スライスし、ｅＧＦＰの検出のために免疫染色した。

図４に示されるように、ｅＧＦＰを、海馬、線条体、前頭皮質、および小脳を含め、投与したマウスの脳の多数の領域において検出した。全てのマウスは、海馬および線条体において最高濃度のｅＧＦＰを有した。ｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰを投与したマウスは、皮質においてわずかな細胞を有し、小脳においてわずかに多くの細胞を有した；ｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰを投与したマウスは、小脳においてわずかな細胞を有し、皮質においてわずかに多くの細胞を有した。

この実施例は、ＩＣＶ注射によるｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰおよびｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰの投与が、海馬および線条体の細胞において高レベルのｅＧＦＰタンパク質、ならびに皮質および小脳の細胞において低レベルのｅＧＦＰタンパク質を生じることを示す。

実施例３：
この実施例の目的は、ヒトシナプシン（ＳＹＮ）プロモーター、構成的プロモーター（ＣＢＡ）、または内因性ＣＤＫＬ５プロモーターが全て、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞におけるＣＤＫＬ５タンパク質発現を駆動し得ることを実証することである。

この実施例では、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を、ｅＧＦＰまたはｈＣＤＫＬ５を発現するプラスミドで４８時間、一過性にトランスフェクトした。形質導入しなかったＮｅｕｒｏ２ａ細胞を、コントロールとして供した。細胞を固定し、抗ＣＤＫＬ５抗体を使用して免疫細胞化学検査を行った。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２蛍光顕微鏡を使用して画像化を行った。

図５に示されるように、ｈＣＤＫＬ５およびｅＧＦＰは、ＣＢＡプロモーターでの最高の発現レベルおよびＳＹＮプロモーターからの低い発現レベルと比較して、内因性ＣＤＫＬ５プロモーター（それぞれ、Ｅｎｄｏ－ｈＣＤＫＬ５およびＥｎｄｏ－ｅＧＦＰ）を使用してトランスフェクトしたＮｅｕｒｏ２ａ細胞において中間のレベルで発現される。この実施例は、ヒトＣＤＫＬ５転写開始部位の上流にあるヌクレオチド（すなわち、内因性ＣＤＫＬ５プロモーター）が、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞においてｅＧＦＰならびにｈＣＤＫＬ５の発現を駆動し得ることを示す。

実施例４：
この実施例の目的は、ＣＤＫＬ５欠損マウスへのｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５およびｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｈＣＤＫＬ５のＣＳＦ送達が、脳全体にわたるｈＣＤＫＬ５ ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡの頑健な分布を生じることを実証することである。

この実施例では、ＣＤＫＬ５欠損マウスに、（１）ＡＡＶ９キャプシドならびにＣＢＡプロモーターおよびｈＣＤＫＬ５コード配列を含むベクターゲノムを含むｒＡＡＶ［ｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｈＣＤＫＬ５］または（２）ＡＡＶ９キャプシドならびにＳＹＮプロモーターおよびｈＣＤＫＬ５コード配列を含むベクターゲノムを含むｒＡＡＶ［ｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５］を投与した。脳室内（ＩＣＶ）注射によってマウスに投与した。投与の２週間後または３ヶ月後のいずれかに、組織を回収した。脳を固定し、スライスし、ＲＮＡスコープインサイチュハイブリダイゼーションによって処理して、ｈＣＤＫＬ５ ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ、ならびにＲｂｆｏｘ３ ｍＲＮＡ（ニューロンマーカー）を検出した。

図６Ａに示されるように、両方のベクターが、海馬および線条体領域において高いレベルのｈＣＤＫＬ５を生じた。両方のベクターはまた、皮質全体を通じてニューロンにおいてｈＣＤＫＬ５を発現させたことが、共標識から確認された（図６Ｂ）。図６Ｂに示されるように、ＩＣＶ注射によってｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｈＣＤＫＬ５（図６Ｂの四角５）またはｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５（図６Ｂの四角７）で処置したマウスは、海馬、線条体、および皮質においてｈＣＤＫＬ５ ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡを有した。上記２種のベクター間で、全体的な分布の類似性が認められ、両方のベクターが、ニューロンマーカーＲｂｆｏｘ３での共標識を示す図６Ｂによって示されるように、ニューロンにおいて発現を駆動した。図６Ｂの四角６は、ｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｈＣＤＫＬ５ベクターから発現したｈＣＤＫＬ５およびニューロンマーカーＲｂｆｏｘ３の共標識を示す。図６Ｂの四角８は、ｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５ベクターから発現したｈＣＤＫＬ５およびニューロンマーカーＲｂｆｏｘ３の共標識を示す。

この実施例において示されるデータは、ＩＣＶ注射によるｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｈＣＤＫＬ５およびｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５ベクターの投与が、海馬、線条体、および前頭皮質全体を通じてニューロンにおいてｈＣＤＫＬ５ ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡをもたらすことを示す。

実施例５：
この実施例の目的は、ＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５およびＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｈＣＤＫＬ５ ｒＡＡＶが、マウス脳へ機能的ＣＤＫＬ５タンパク質を送達し得ることを実証することである。

この実施例では、ＣＤＫＬ５欠損マウスに、脳室内（ＩＣＶ）注射によってｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｈＣＤＫＬ５またはｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５を投与し、投与の２週間後に組織を回収した。脳を顕微解剖し、前頭皮質をホモジネートし、ウェスタンブロットを行い、ＣＤＫＬ５、ｐＥＢ２およびβ－チューブリンに対する抗体でプローブした。

図７に示されるように、ｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５またはｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｈＣＤＫＬ５で処置したＣＤＫＬ５欠損マウスは、ビヒクルコントロールと比較して、増加したレベルのＣＤＫＬ５タンパク質およびリン酸化ＥＢ２（ｐＥＢ２）タンパク質を示した。ＣＤＫＬ５下流標的であるＥＢ２のリン酸化から、送達されたＣＤＫＬ５が、機能的キナーゼとして作用していることが確認される。

実施例６：
この実施例の目的は、ＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰおよびＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰが、腰椎髄腔内送達後に、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）脳にわたって細胞を形質導入し得ることを実証することである。

この実施例では、若年の雌性ＮＨＰ被験体（ｎ＝２／ベクター）に、腰椎髄腔内注射によって、ｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰまたはｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰを投与した。投与の２週間後に、定量的ＰＣＲによるベクターゲノム定量のために種々の組織を回収した。

１×１０^３～１×１０^７ コピーの間のｖｇ／μｇ 組織ＤＮＡが、処置されたＮＨＰからのＣＮＳおよび末梢組織において定量された。図８に示されるように、ｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰ投与およびｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰ投与の両方が、異なる組織間で類似のコピー数を生じた。

この実施例は、髄腔内送達によるｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰおよびｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰの投与が、ベクター間で広い生体分布の区別なしに、分析した全ての脳および末梢領域においてベクターゲノムを生じることを示す。

実施例７：
この実施例の目的は、ＮＨＰ皮質において、ＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰが、グリア形態を有する細胞において主に発現を駆動する一方で、ＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰが、ニューロン形態を有する細胞において主に発現を駆動することを実証することである。

この実施例では、若年の雌性ＮＨＰ被験体（ｎ＝２／ベクター）に、腰椎髄腔内注射によってｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰまたはｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰを投与した。投与の２週間後に、脳を回収し、固定し、切片化し、浮動性色素形成検出（ｆｒｅｅ－ｆｌｏａｔｉｎｇ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）によってｅＧＦＰに関して免疫染色した。

ｅＧＦＰ陽性細胞を、ｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰおよびｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰの両方を投与したＮＨＰ被験体に由来する脳切片において検出した。ｅＧＦＰ陽性細胞は、単独で最も一般に認められたが、ときおり、集団で認められた。図９に示されるように、ｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰを投与したＮＨＰ被験体に由来するｅＧＦＰ陽性細胞は、種々の形態を有したが、大部分は、広い分枝および小さな細胞体を有するグリア細胞の外見を有した。これは、ＣＢＡプロモーターが、星細胞様のグリア細胞（すなわち、非ニューロン細胞）においてｅＧＦＰペイロードを優先的に発現することを示唆する。一方で、ｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰを投与したＮＨＰ被験体に由来するｅＧＦＰ陽性細胞は、丸い細胞体および少ない分枝を有するニューロンの外見を有した。これは、ＳＹＮプロモーターが、所望の標的細胞タイプ（すなわち、ニューロン）においてｅＧＦＰペイロードを発現するにあたってより有効であることを示唆する。

髄腔内投与によるｒＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅＧＦＰの投与は、ｅＧＦＰ陽性の星細胞様のグリア細胞を主に生じる一方で、ｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰの投与は、ｅＧＦＰ陽性ニューロンを主に生じる。この実施例におけるデータは、非ヒト霊長類において、ＳＹＮプロモーターが、構成的ＣＢＡプロモーターと比較してニューロン細胞においてＣＤＫＬ５の送達および発現にとって有利であり得ることを示唆する。

実施例８：
この実施例の目的は、幼若ＣＤＫＬ５欠損マウスのＣＳＦへのｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５送達が、学習、記憶、および運動機能を改善し得ることを実証することである。

この実施例では、単一の高用量（１．６ｅ１２ ｖｇ／マウス）の、ＡＡＶ９キャプシドおよびＳＹＮプロモーターの制御下でヒトＣＤＫＬ５遺伝子を発現するベクターゲノム（図１に示されるパッケージされたゲノム、配列番号１９、３，８２８ｂｐ）を含む組換えＡＡＶを、脳室内（ＩＣＶ）注射によって３～５週齢の間の（早期症候性）幼若雄性および雌性ＣＤＫＬ５欠損マウスのＣＳＦに注射した。マウスがいったん２～３ヶ月齢（成体）に達したら、該マウスに一組の行動試験を受けさせた。行動試験後に、脳を、ＣＤＫＬ５タンパク質発現のウェスタンブロット分析のために採取した。

多数の脳領域からの顕微解剖した組織のウェスタンブロット分析によって、投与の約３ヶ月後に、処置したマウスの脳にわたってヒトＣＤＫＬ５タンパク質の中程度の長時間持続性の増加（前頭皮質および脳幹ではＷＴレベルの２０～３０％、海馬では３５～７０％）を示した。ＣＤＫＬ５欠損マウス脳の異なる領域（前頭皮質：図１０Ａ； 海馬：図１０Ｂ；および脳幹：図１０Ｃ）において定量されたＣＤＫＬ５の量を示すグラフを示す図１０Ａ～１０Ｃを参照のこと。図１１Ａ～１１Ｄに示されるように、ｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５処置した雄性および雌性のマウスは、不安様行動（図１１Ａ）、運動機能（図１１Ｂ）および協調（図１１Ｃ）における改善を、ならびに学習および記憶において正常化を（図１１Ｄ）示した。

この実施例において強調した所見は、機能的ＣＤＫＬ５の一様の中程度のレベルが、ｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５を介して、幼若の症候性ＣＤＫＬ５欠損マウスに送達された場合に、有意に改善された脳機能をもたらし得ることを示唆する。

実施例９：
この実施例の目的は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）のいくつかのＣＮＳ領域へのｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰ送達が、腰椎髄腔内投与と比較して、大槽内投与経路を経るベクター粒子の投与によって増加し得ることを示すことである。

この実施例では、若年の雌性ＮＨＰ被験体に、ｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰを、腰椎髄腔内（ＩＴ）注射（ｎ＝２）によって（上記の実施例６から抽出したデータ）、または大槽内（ＣＭ）投与（ｎ＝３）によって（この実施例９において新たに生成したデータ）投与した。全てのＮＨＰを、投与の間および投与完了後１５分間にわたって、トレンデレンブルグ体位に置いた。投与の２週間後に、定量的ＰＣＲによるベクターゲノム定量のために種々の組織を回収した。図１２は、トレンデレンブルグ体位において与えたｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰの８．０６×１０^１３ ベクターゲノム（ｖｇ）の髄腔内（ＩＴ）送達（ＵＸ０５５－１８－０００１）または７．７６×１０^１３ ｖｇの大槽内（ＣＭ）送達（ＵＸ０５５－１９－０００２）のいずれかの２週間後に、１～２歳齢の雌性非ヒト霊長類（ＮＨＰ）のＣＮＳにおいてＤＮＡ１μｇあたりのゲノムコピー（ＧＣ）を図示する棒グラフである。グラフは、大槽内送達が、頭頂葉（１０×）、線条体（１０×）、および視床（８×）を含め、種々の脳組織においてＮＨＰ ＣＮＳにおけるベクターゲノムの数の増加を生じることを図示する。このグラフに示されるデータは、２回の独立した試験の一部として集めた。

組織ＤＮＡ１μｇあたり１×１０^３～１×１０^６コピーの間のｖｇが、処置したＮＨＰからの脳および脊髄組織において定量された。図１２に示されるように、大槽へのｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｅＧＦＰ投与は、多くのＣＮＳ組織にわたって腰椎髄腔内送達より高いコピー数を生じた。

この実施例において強調した所見は、ＮＨＰにおけるいくつかのＣＮＳ領域へのｒＡＡＶ送達の増加が、大槽内投与経路を介して達成され得ることを示す。

実施例１０：
この実施例の目的は、プレドニゾロンが、驚くべきことに、大槽内注射後にＮＨＰにおける多くのＣＮＳ領域に送達されたｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５（ＵＸ０５５－１９－００３）ベクターゲノムの数を増加させることを実証することである。

この実施例では、若年の雌性ＮＨＰ被験体に、プレドニゾロンあり（ｎ＝３）またはなし（ｎ＝３）で、トレンデレンブルグ体位での大槽内（ＣＭ）投与によってｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５を投与した。プレドニゾロン処置群のＮＨＰは、経口胃管栄養法によってｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５投与の４日前に開始して１ｍｇ／ｋｇ プレドニゾロンの１回の１日用量を受け、試験の終了まで継続した。投与後４週間で、脳の半分から定量的ＰＣＲによるベクターゲノム定量のために種々の組織を回収し、その脳の残りの半分を、インサイチュハイブリダイゼーションを使用して、形質導入された細胞数を分析するために冠状に切片化した。プローブを設計して、ベクターＤＮＡに特異的に結合させ、ヘマトキシリン対比染色を使用して、個々の細胞を可視化した。

組織ＤＮＡ１μｇあたり１×１０^３～１×１０^６ コピーの間のｖｇを、処置したＮＨＰからのいくつかの脳領域、脊髄、および後根神経節（ＤＲＧ）において定量した。図１３Ａに示されるように、前処置および持続したプレドニゾロンは、大槽へのｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５投与と組み合わせた場合、驚くべきことに、ｒＡＡＶ９－ＳＹＮ－ｈＣＤＫＬ５単独と比較して、多くのＣＮＳ組織にわたってより高いコピー数をもたらした。これらの結果は、形質導入の増加が予測されなかったことから驚くべきことであった。

図１３Ｂに示されるように、後頭皮質および小脳を含む切片に対するＢａｓｅＳｃｏｐｅ（インサイチュハイブリダイゼーション）分析は、プレドニゾロンで処置したＮＨＰにおける形質導入した細胞の数の増加傾向を示した（パネル２および４）。しかし、動物間での有意な変動性が、非プレドニゾロン群にいて１匹のアウトライアーＮＨＰで認められた（パネル１および３）。図１３Ｃに示されるように、非常に多数のベクターゲノム陽性細胞を有する１匹のアウトライアーＮＨＰは、非プレドニゾロン群において認められた。

理論によって拘束されないが、プレドニゾロンが先天的免疫系を阻害する能力が、この所見に寄与し得る、および／またはプレドニゾロンが炎症を抑制する能力が脳の中へとより深部に上記ｒＡＡＶが透過することを可能にし得、ベクターゲノムコピー数によって測定される場合の形質導入の観察される増加を生じるという仮説が立てられる。

この実施例において強調される所見は、ＮＨＰにおけるいくつかのＣＮＳ領域へのｒＡＡＶ送達の増加が、コルチコステロイドであるプレドニゾロンがｒＡＡＶ投与の前および投与の間に与えられる場合に達成され得ることを示す。

番号付けした実施形態
本明細書で開示される実施形態は、本開示の番号付けした実施形態に提供されるとおりの実施形態Ｐ１～Ｐ５３を含む。

実施形態Ｐ１： 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、ここで前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよび前記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含み、ここで前記ベクターゲノムは、
（ａ）プロモーター配列；および
（ｂ）ＣＤＫＬ５のコード配列であって、ここで前記コード配列は、配列番号１～８と少なくとも９５％同一である配列を含むＣＤＫＬ５のコード配列、
を含む、ｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ２： 前記ＡＡＶキャプシドは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、またはｈｕ３７のＡＡＶに由来する、実施形態Ｐ１に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ３： 前記ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９に由来する、実施形態Ｐ２に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ４： 前記ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ８に由来する、実施形態Ｐ２に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ５： 前記ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９バリアントキャプシドである、実施形態Ｐ１に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ６： 前記プロモーターは、ニューロン特異的プロモーターである、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ７： 前記ニューロン特異的プロモーターは、ヒトシナプシン１（ＳＹＮ１）プロモーター、マウスカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、ラットチューブリンαＩ（Ｔａ１）プロモーター、ラットニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、ヒトニューロン特異的エノラーゼ（ＥＮＯ２）プロモーター、ヒト血小板由来成長因子β鎖（ＰＤＧＦ）プロモーター、ヒトＢＭ８８プロモーター、およびニューロンニコチン性受容体β２（ＣＨＲＮＢ２）プロモーターから選択される、実施形態Ｐ６に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ８： 前記ニューロン特異的プロモーターは、前記ＳＹＮ１プロモーターである、実施形態Ｐ７に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ９： 前記ＳＹＮ１プロモーター配列は、配列番号１２を含む、実施形態Ｐ８に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ１０： 前記ＳＹＮ１プロモーター配列は、配列番号１２からなる、実施形態Ｐ８に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ１１： 前記プロモーターは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、およびα－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーターから選択される、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ１２： 前記プロモーターは、前記ＣＢＡプロモーターである、実施形態Ｐ１１に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ１３： 前記ＣＢＡプロモーター配列は、配列番号１３を含む、実施形態Ｐ１２に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ１４： 前記ＣＢＡプロモーター配列は、配列番号１３からなる、実施形態Ｐ１２に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ１５： 前記プロモーターは、ＣＤＫＬ５遺伝子特異的内因性プロモーターである、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ１６： 前記ＣＤＫＬ５遺伝子特異的内因性プロモーターは、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列であって、配列番号１４の等しい長さの領域と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｐ１５に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ１７： 前記ベクターゲノムは、５’－ＩＴＲ配列をさらに含む、実施形態Ｐ１～Ｐ１６のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ１８： 前記ベクターゲノムは、３’－ＩＴＲ配列をさらに含む、実施形態Ｐ１～Ｐ１７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ１９： 前記５’－ＩＴＲ配列および／または前記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する、実施形態Ｐ１７～Ｐ１８のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ２０： 前記５’－ＩＴＲ配列および前記３’－ＩＴＲ配列は、配列番号１１を含むかまたはそれからなる、実施形態Ｐ１９に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ２１： 前記５’－ＩＴＲ配列および／または前記３’－ＩＴＲ配列は、非ＡＡＶ２供給源に由来する、実施形態Ｐ１７～Ｐ１８のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ２２： 前記ベクターゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列をさらに含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２１のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ２３： 前記ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、およびウサギβグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択される、実施形態Ｐ２２に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ２４： 前記ポリアデニル化シグナル配列は、前記ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である、実施形態Ｐ２３に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ２５： 前記ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号１５を含むかまたはそれからなる、実施形態Ｐ２４に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ２６： 前記ベクターゲノムは、１またはこれより多くのエンハンサー配列をさらに含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２５のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ２７： 前記エンハンサーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子エンハンサー、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサー、およびアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）エンハンサーから選択される、実施形態Ｐ２６に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ２８： 前記エンハンサーは、前記ＣＭＶエンハンサーである、実施形態Ｐ２７に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ２９： 前記エンハンサー配列は、配列番号１７を含むかまたはそれからなる、実施形態Ｐ２８に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ３０： 前記エンハンサーは、前記プロモーター配列の上流に位置する、実施形態Ｐ２６～Ｐ２９に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ３１： 前記ベクターゲノムは、１またはこれより多くのイントロン配列をさらに含む、実施形態Ｐ１～Ｐ３０のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ３２： 前記イントロンは、ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットβ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトβグロビンＩＶＳ２イントロン、β－グロビン／ＩｇＧキメライントロン、またはｈＦＩＸイントロンから選択される、実施形態Ｐ３１に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ３３： 前記イントロンは、前記ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロンである、実施形態Ｐ３２に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ３４： 前記ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン配列は、配列番号１８を含むかまたはそれからなる、実施形態Ｐ３３に記載のｒＡＡＶ。

実施形態Ｐ３５： 前記実施形態のいずれかに記載のｒＡＡＶおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物。

実施形態Ｐ３６： ヒト被験体においてＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を処置する方法であって、前記方法は、前記ヒト被験体に、治療上有効な量の、実施形態Ｐ１～Ｐ３４のいずれかに記載のｒＡＡＶまたは実施形態Ｐ３５に記載の組成物を投与することを包含する方法。

実施形態Ｐ３７： 前記ｒＡＡＶまたは前記組成物は、皮下に、筋肉内に、皮内に、腹腔内に、髄腔内に、脳室内に、静脈内に、または大槽内に投与される、実施形態Ｐ３６に記載の方法。

実施形態Ｐ３８： 前記ｒＡＡＶまたは前記組成物は、髄腔内に投与される、実施形態Ｐ３７に記載の方法。

実施形態Ｐ３９： 前記ｒＡＡＶまたは前記組成物は、大槽内に投与される、実施形態Ｐ３７に記載の方法。

実施形態Ｐ４０： 前記ｒＡＡＶは、約１×１０^１１～約１×１０^１４ ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される、実施形態Ｐ３７～Ｐ３９のいずれかに記載の方法。

実施形態Ｐ４１： ヒト被験体においてＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を処置する方法であって、前記方法は、前記ヒト被験体に、コルチコステロイドを先ず投与すること、および次いで、治療上有効な量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を引き続いて投与することを包含し、ここで前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよび前記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含み、ここで前記ベクターゲノムは、プロモーター配列およびＣＤＫＬ５のコード配列を含む、方法。

実施形態Ｐ４２： ヒト被験体においてＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を処置する方法であって、前記方法は、前記ヒト被験体に、コルチコステロイドを先ず投与すること、および次いで、治療上有効な量の実施形態Ｐ１～Ｐ３４のいずれかに記載のｒＡＡＶまたは実施形態Ｐ３５に記載の組成物を引き続いて投与することを包含する方法。

実施形態Ｐ４３： 前記コルチコステロイドは、プレドニゾロン、プレドニゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、ブデソニド、ベタメタゾン、およびデフラザコートから選択される、実施形態Ｐ４１～Ｐ４２のいずれかに記載の方法。

実施形態Ｐ４４： 前記コルチコステロイドは、プレドニゾロンである、実施形態Ｐ４３に記載の方法。

実施形態Ｐ４５： ヒト被験体においてＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を処置する方法であって、前記方法は、前記ヒト被験体に、ＩｇＧ分解プロテアーゼを先ず投与すること、および次いで、治療上有効な量の、実施形態Ｐ１～Ｐ３４のいずれかに記載のｒＡＡＶまたは実施形態Ｐ３５に記載の組成物を引き続いて投与することを包含する方法。

実施形態Ｐ４６： 前記ＩｇＧ分解プロテアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＩｄｅＳまたはその操作されたバリアントである、実施形態Ｐ４５に記載の方法。

実施形態Ｐ４７： 前記ＩｇＧ分解プロテアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉのＩｄｅＺまたはその操作されたバリアントである、実施形態Ｐ４５に記載の方法。

実施形態Ｐ４８： 配列番号１９と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。

実施形態Ｐ４９： 配列番号１９を含むポリヌクレオチド。

実施形態Ｐ５０： 配列番号１９からなるポリヌクレオチド。

実施形態Ｐ５１： 配列番号２０と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。

実施形態Ｐ５２： 配列番号２０を含むポリヌクレオチド。

実施形態Ｐ５３： 配列番号２０からなるポリヌクレオチド。

参照による援用
本明細書で言及される特許文書および科学論文の各々の開示全体は、全ての目的のために参照により援用される。

均等物
本開示は、その趣旨および本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的形態において具現化され得る。従って、前述の実施形態は、全ての点において、本明細書で記載される開示を限定するのではなく例証であるとみなされるべきである。異なる実施形態の種々の構造的要素および種々の開示される方法の工程は、種々の組み合わせおよび並べ替えにおいて利用され得、全てのこのような改変は、本開示の形態であるとみなされるべきである。本開示の範囲は、従って、前述の説明によるのではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味および均等の範囲内に入る全ての変更は、その中に包含されることが意図される。

Claims (57)

1. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、ここで前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよび前記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含み、ここで前記ベクターゲノムは、
   （ａ）プロモーター配列；および
   （ｂ）ＣＤＫＬ５のコード配列であって、ここで前記コード配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含むＣＤＫＬ５のコード配列、
   を含む、ｒＡＡＶ。
2. 前記ＡＡＶキャプシドは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、またはｈｕ３７のＡＡＶに由来する、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
3. 前記ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９に由来する、請求項２に記載のｒＡＡＶ。
4. 前記ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ８に由来する、請求項２に記載のｒＡＡＶ。
5. 前記ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９バリアントキャプシドである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
6. 前記プロモーターは、ニューロン特異的プロモーターである、請求項１～５のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
7. 前記ニューロン特異的プロモーターは、ヒトシナプシン１（ＳＹＮ１）プロモーター、マウスカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、ラットチューブリンαＩ（Ｔａ１）プロモーター、ラットニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、ヒトニューロン特異的エノラーゼ（ＥＮＯ２）プロモーター、ヒト血小板由来成長因子β鎖（ＰＤＧＦ）プロモーター、ヒトＢＭ８８プロモーター、およびニューロンニコチン性受容体β２（ＣＨＲＮＢ２）プロモーターから選択される、請求項６に記載のｒＡＡＶ。
8. 前記ニューロン特異的プロモーターは、前記ヒトＳＹＮ１プロモーターである、請求項７に記載のｒＡＡＶ。
9. 前記ヒトＳＹＮ１プロモーターは、配列番号１２を含む核酸配列を有する、請求項８に記載のｒＡＡＶ。
10. 前記ヒトＳＹＮ１プロモーターは、配列番号１２からなる核酸配列を有する、請求項８に記載のｒＡＡＶ。
11. 前記プロモーターは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、およびα－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーターから選択される、請求項１～５のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
12. 前記プロモーターは、前記ＣＢＡプロモーターである、請求項１１に記載のｒＡＡＶ。
13. 前記ＣＢＡプロモーターは、配列番号１３を含む核酸配列を有する、請求項１２に記載のｒＡＡＶ。
14. 前記ＣＢＡプロモーターは、配列番号１３からなる核酸配列を有する、請求項１２に記載のｒＡＡＶ。
15. 前記プロモーターは、ＣＤＫＬ５遺伝子特異的内因性プロモーターである、請求項１～５のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
16. 前記ＣＤＫＬ５遺伝子特異的内因性プロモーターは、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列であって、配列番号１４の等しい長さの領域と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載のｒＡＡＶ。
17. 前記ベクターゲノムは、５’－ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項１～１６のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
18. 前記ベクターゲノムは、３’－ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項１～１７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
19. 前記５’－ＩＴＲ配列および／または前記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する、請求項１７～１８のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
20. 前記５’－ＩＴＲ配列および前記３’－ＩＴＲ配列は、配列番号１１を含むかまたはそれからなる、請求項１９に記載のｒＡＡＶ。
21. 前記５’－ＩＴＲ配列および／または前記３’－ＩＴＲ配列は、非ＡＡＶ２供給源に由来する、請求項１７～１８のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
22. 前記ベクターゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列をさらに含む、請求項１～２１のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
23. 前記ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、およびウサギβグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択される、請求項２２に記載のｒＡＡＶ。
24. 前記ポリアデニル化シグナル配列は、前記ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である、請求項２３に記載のｒＡＡＶ。
25. 前記ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号１５を含むかまたはそれからなる、請求項２４に記載のｒＡＡＶ。
26. 前記ベクターゲノムは、１またはこれより多くのエンハンサー配列をさらに含む、請求項１～２５のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
27. 前記エンハンサーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子エンハンサー、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサー、およびアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）エンハンサーから選択される、請求項２６に記載のｒＡＡＶ。
28. 前記エンハンサーは、前記ＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサーである、請求項２７に記載のｒＡＡＶ。
29. 前記エンハンサーは、配列番号１７を含むかまたはそれからなる配列を有する、請求項２８に記載のｒＡＡＶ。
30. 前記エンハンサーは、前記プロモーター配列の上流に位置する、請求項２６～２９のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
31. 前記ベクターゲノムは、１またはこれより多くのイントロン配列をさらに含む、請求項１～３０のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
32. 前記イントロンは、ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットβ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトβグロビンＩＶＳ２イントロン、β－グロビン／ＩｇＧキメライントロン、およびｈＦＩＸイントロンから選択される、請求項３１に記載のｒＡＡＶ。
33. 前記イントロンは、前記ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロンである、請求項３２に記載のｒＡＡＶ。
34. 前記ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロンは、配列番号１８を含むかまたはそれからなる配列を有する、請求項３３に記載のｒＡＡＶ。
35. 前記請求項のいずれかに記載のｒＡＡＶおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物。
36. ヒト被験体においてＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を処置する方法であって、前記方法は、前記ヒト被験体に、治療上有効な量の、請求項１～３４のいずれかに記載のｒＡＡＶまたは請求項３５に記載の組成物を投与することを包含する方法。
37. 前記ｒＡＡＶまたは前記組成物は、皮下に、筋肉内に、皮内に、腹腔内に、髄腔内に、脳室内に、静脈内に、または大槽内送達を介して投与される、請求項３６に記載の方法。
38. 前記ｒＡＡＶまたは前記組成物は、髄腔内に投与される、請求項３７に記載の方法。
39. 前記ｒＡＡＶまたは前記組成物は、大槽内送達を介して投与される、請求項３７に記載の方法。
40. 前記ｒＡＡＶは、約１×１０^１１～約１×１０^１４ ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される、請求項３７～３９のいずれかに記載の方法。
41. ヒト被験体においてＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を処置する方法であって、前記方法は、前記ヒト被験体に、コルチコステロイドを先ず投与すること、および次いで、治療上有効な量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を引き続いて投与することを包含し、ここで前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよび前記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含み、ここで前記ベクターゲノムは、プロモーター配列およびＣＤＫＬ５のコード配列を含む、方法。
42. ヒト被験体においてＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を処置する方法であって、前記方法は、
    ヒト被験体に、治療上有効な量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与すること、
    を包含し、
    ここで前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよび前記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含み、
    ここで前記ベクターゲノムは、プロモーター配列およびＣＤＫＬ５のコード配列を含み、
    ここで前記ヒト被験体は、コルチコステロイドを投与されている、
    方法。
43. ヒト被験体においてＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を処置する方法であって、前記方法は、前記ヒト被験体に、コルチコステロイドを先ず投与すること、および次いで、治療上有効な量の請求項１～３４のいずれかに記載のｒＡＡＶまたは請求項３５に記載の組成物を引き続いて投与することを包含する方法。
44. ヒト被験体においてＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を処置する方法であって、前記方法は、治療上有効な量の、請求項１～３４のいずれかに記載のｒＡＡＶまたは請求項３５に記載の組成物を投与することを包含し、ここで前記ヒト被験体は、コルチコステロイドを投与されている、方法。
45. 前記コルチコステロイドは、プレドニゾロン、プレドニゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、ブデソニド、ベタメタゾン、およびデフラザコートから選択される、請求項４１～４４のいずれかに記載の方法。
46. 前記コルチコステロイドは、プレドニゾロンである、請求項４５に記載の方法。
47. ヒト被験体においてＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を処置する方法であって、前記方法は、前記ヒト被験体に、ＩｇＧ分解プロテアーゼを先ず投与すること、および次いで、治療上有効な量の、請求項１～３４のいずれかに記載のｒＡＡＶまたは請求項３５に記載の組成物を引き続いて投与することを包含する方法。
48. ヒト被験体においてＣＤＫＬ５欠損障害（ＣＤＤ）を処置する方法であって、前記方法は、治療上有効な量の、請求項１～３４のいずれかに記載のｒＡＡＶまたは請求項３５に記載の組成物を投与することを包含し、ここで前記ヒト被験体は、ＩｇＧ分解プロテアーゼを投与されている方法。
49. 前記ＩｇＧ分解プロテアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＩｄｅＳまたはその操作されたバリアントである、請求項４７または４８に記載の方法。
50. 前記ＩｇＧ分解プロテアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉのＩｄｅＺまたはその操作されたバリアントである、請求項４７または４８に記載の方法。
51. 配列番号１９の配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
52. 配列番号１９の配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
53. 核酸配列が配列番号１９を含むポリヌクレオチド。
54. 核酸配列が配列番号１９からなるポリヌクレオチド。
55. 配列番号２０と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
56. 核酸配列が配列番号２０を含むポリヌクレオチド。
57. 核酸配列が配列番号２０からなるポリヌクレオチド。

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