CN114672516A - 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体和其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了具有改变的衣壳蛋白的腺相关病毒(AAV)病毒体，其中与野生型AAV相比，所述AAV病毒体展现对视网膜细胞更大的感染性。本公开还提供了将基因产物递送至个体中的视网膜细胞的方法，以及治疗眼病的方法。

Description

具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体和其使用方法
本申请是分案申请，其相应母案申请是申请号为201780050806.3的中国发明专利申请，申请日为2017年7月27日，发明名称为“具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体和其使用方法”。
交叉引用
本申请要求2016年7月29日提交的美国临时专利申请No.62/368,929的权益，该申请以引用的方式整体并入本文中。
关于联邦政府资助的研究的声明
本发明是在政府支持下根据美国国家卫生研究院颁发的合同/许可No.EY022975、EY018241和EY06855进行的。政府在本发明中具有一定的权利。
背景技术
光感受器是视网膜中接收和加工视觉信息的第一神经元，其将可见的电磁辐射通过光转换转变成超极化反应。绝大多数遗传性视网膜疾病引起这些细胞的丧失，直接引起，例如在影响视紫红蛋白折叠的显性突变中；或间接引起，例如在影响视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)中的视网膜再循环通路的隐性突变中。
腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)属于成员需要与例如腺病毒等辅助病毒协同感染来促进复制的细小病毒科(Parvoviridae)和依赖性病毒(Dependovirus)属，且AAV在缺少辅助剂时建立潜伏性感染。病毒体由25nm二十面体衣壳环绕4.9kb单链DNA基因组与两个开放阅读框rep和cap构成。非结构性rep基因编码四种对病毒复制来说不可或缺的调节蛋白，而cap编码三种装配成60聚体衣壳的结构蛋白(VP1-3)。此病毒衣壳介导AAV载体克服病毒转导的许多生物障碍的能力，所述生物障碍包括细胞表面受体结合、胞吞作用、胞内运输和核中拆包。
发明内容
本公开提供了具有改变的衣壳蛋白的重组腺相关病毒(AAV)病毒体，其中与野生型AAV相比，所述重组AAV(rAAV)病毒体展现更大的对视网膜细胞的感染性，且其中rAAV病毒体包含异源核酸。本公开还提供了将基因产物递送至个体中的视网膜细胞的方法，和治疗眼病的方法。本公开提供了一种rAAV病毒体，其中与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体定位至内核层、外核层、光感受器层、神经节细胞层或视网膜色素上皮细胞的程度相比，所述rAAV病毒体展现增加至少5倍的至内核层、外核层、光感受器层、神经节细胞层和视网膜色素上皮细胞中的一个或多个的定位。
附图说明
图1是用于研发与亲本AAV相比，展现增加的对眼细胞(例如视网膜细胞)的感染性的AAV变体的定向进化法的示意图。
图2是含有绿色荧光蛋白(GFP)-条型码构建体的AAV变体的深度测序的示意图。
图3描绘18成员AAV变体库对神经节细胞层、内核层、光感受器层和视网膜色素上皮细胞(RPE)层中细胞的感染。
图4提供AAV2衣壳蛋白VP1的氨基酸序列。氨基酸587和588(NP)呈粗体且加下划线。
图5提供与多种AAV血清型的AAV衣壳蛋白VP1的氨基酸570-610对应的氨基酸序列。
图6A-6C提供AAV衣壳蛋白环IV(GH环)区的氨基酸序列的比对。插入位点以粗体和下划线显示。AAV1：SEQ ID NO:35；AAV6：SEQ ID NO:36；AAV3：SEQ ID NO:37；AAV2：SEQ IDNO:38；AAV8：SEQ ID NO:39；AAV8.1：SEQ ID NO:40；AAV8 rh8：SEQ ID NO:41；AAV10：SEQID NO:42；AAV7：SEQ ID NO:43；AAV9：SEQ ID NO:44；AAV 9.1：SEQ ID NO:45；AAV5：SEQ IDNO:46。
图7A-7V提供例示性异源基因产物的氨基酸序列。
图8A-8C提供例示性向导-RNA指导的核酸内切酶的氨基酸序列。
定义
术语“视网膜细胞”在本文中可以指包含视网膜的细胞类型中的任一种，例如视网膜神经节细胞；无长突细胞；水平细胞；双极细胞；包括视杆和视锥的感光细胞；米勒胶质细胞(Müller glial cell)；星形细胞(例如视网膜星形细胞)；和视网膜色素上皮细胞。
“AAV”是腺相关病毒的缩写，且可以用于指病毒本身或其衍生物。除非另外需要，否则该术语涵盖所有亚型和天然存在的形式与重组形式两者。缩写“rAAV”是指重组腺相关病毒，又称为重组AAV载体(或“rAAV载体”)。术语“AAV”包括AAV 1型(AAV-1)、AAV 2型(AAV-2)、AAV 3型(AAV-3)、AAV 4型(AAV-4)、AAV 5型(AAV-5)、AAV 6型(AAV-6)、AAV 7型(AAV-7)、AAV 8型(AAV-8)、AAV 9型(AAV-9)、鸟类AAV、牛类AAV、犬科AAV、马科AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV和绵羊科AAV。“灵长类AAV”是指从灵长类动物分离的AAV，“非灵长类AAV”是指从非灵长类哺乳动物分离的AAV，“牛类AAV”是指从牛类哺乳动物(例如母牛)分离的AAV等等。
如本文所用的“rAAV载体”是指包含非AAV来源的多核苷酸序列(即对AAV来说异源的多核苷酸)，典型地用于细胞的遗传转化的所关注的序列的AAV载体。一般说来，异源多核苷酸侧接至少一个且一般侧接两个AAV反向末端重复序列(ITR)。术语rAAV载体涵盖rAAV载体粒子与rAAV载体质粒两者。
“AAV病毒”或“AAV病毒粒子”或“rAAV载体粒子”是指由至少一种AAV衣壳蛋白(典型地野生型AAV的全部衣壳蛋白)和包壳的多核苷酸rAAV载体构成的病毒粒子。如果粒子包含异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如有待递送至哺乳动物细胞的转基因)，那么其典型地称为“rAAV载体粒子”或简称为“rAAV载体”。因此，rAAV粒子的产生当然包括rAAV载体的产生，因为此类载体含于rAAV粒子内。
“包装”是指引起AAV粒子的装配和包壳的一系列细胞内事件。
AAV“rep”和“cap”基因是指编码腺相关病毒的复制和包壳蛋白的多核苷酸序列。AAV rep和cap在本文中称为AAV“包装基因”。
AAV“辅助病毒”是指允许哺乳动物细胞复制和包装AAV(例如野生型AAV)的病毒。多种此类AAV辅助病毒是本领域中已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒，例如牛痘。腺病毒涵盖许多不同的亚类，不过亚类C的腺病毒5型最常使用。已知人类、非人类哺乳动物和鸟类来源的许多腺病毒，且可以从例如ATCC等保藏中心获得。疱疹科病毒包括例如单纯疱疹病毒(herpes simplex viruses，HSV)和埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)以及巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)和假狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)；其也可以从例如ATCC等保藏中心获得。
“辅助病毒功能”是指在辅助病毒基因组中编码的允许AAV复制和包装(结合对本文所述的复制和包装的其它需求)的功能。如本文所述，“辅助病毒功能”可以呈许多方式提供，包括通过提供辅助病毒或提供例如编码必需功能的多核苷酸序列至在转运中的生产细胞。
“感染”病毒或病毒粒子是包含能够递送至病毒物种向性的细胞中的多核苷酸组分的病毒或病毒粒子。该术语不一定暗示病毒的任何复制能力。如本文所用，“感染性”病毒或病毒粒子是可以接近靶细胞，可以感染靶细胞，且可以在靶细胞中表达异源核酸的病毒或病毒粒子。因此，“感染性”是指病毒粒子接近靶细胞、感染靶细胞和在靶细胞中表达异源核酸的能力。感染性可以指体外感染性或体内感染性。用于计数感染性病毒粒子的测定在本公开中和本领域中别处进行描述。病毒感染性可以表示为感染性病毒粒子与总病毒粒子的比率。总病毒粒子可以表示为病毒基因组(vg)拷贝的数目。病毒粒子在细胞中表达异源核酸的能力可以称为“转导”。病毒粒子在细胞中表达异源核酸的能力可以使用许多技术测定，所述技术包括评定标志物基因，例如绿色荧光蛋白(GFP)测定(例如其中病毒包含编码GFP的核苷酸序列)，其中GFP在感染病毒粒子的细胞中产生且检测和/或测量；或例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量所产生的蛋白质。病毒感染性可以表示为感染性病毒粒子与总病毒粒子的比率。本领域中已知测定感染性病毒粒子与总病毒粒子的比率的方法。参见例如Grainger等人(2005)Mol.Ther.11:S337(描述TCID50感染滴度测定)；和Zolotukhin等人(1999)Gene Ther.6:973。
“有复制能力”的病毒(例如有复制能力的AAV)是指具有感染性的表型野生型病毒，且在受感染细胞中也能够复制(即在辅助病毒或辅助病毒功能存在下)。在AAV情况下，复制能力一般需要功能性AAV包装基因的存在。一般说来，由于缺乏一种或多种AAV包装基因，如本文所述的rAAV载体在哺乳动物细胞(特别是人类细胞中)是不能复制的。典型地，此类rAAV载体缺乏任何AAV基因序列，从而使通过AAV包装基因与引入的rAAV载体之间的重组产生有复制能力的AAV的可能性降至最低。在许多实施方案中，如本文所述的rAAV载体制剂为含有即使有也极少数的有复制能力的AAV(rcAAV，又称为RCA)(例如每102rAAV粒子少于约1rcAAV、每104rAAV粒子少于约1rcAAV、每108rAAV粒子少于约1rcAAV、每1012rAAV粒子少于约1rcAAV或无rcAAV)的制剂。
术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，且可以间杂有非核苷酸组分。如果存在，那么可以在聚合物装配之前或之后给予核苷酸结构修饰。如本文所用的术语多核苷酸可互换地指双链和单链分子。除非另作说明或需要，作为多核苷酸的本文所述的本发明的任何实施方案涵盖双链形式和已知或预测组成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
多核苷酸或多肽具有一定百分比的与另一多核苷酸或多肽的“序列一致性”，意指在比对时，当比较两种序列时该百分数的碱基或氨基酸相同。序列相似性可以用许多不同的方式测定。为了测定序列一致性，可以使用包括可以在万维网的ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/BLAST获得的BLAST在内的方法和计算机程序，比对序列。另一比对算法为FASTA，可以在来自Madison,Wisconsin,USA的Genetics Computing Group(GCG)程序包(OxfordMolecular Group公司的全资附属公司)获得。其它比对技术描述于Methods inEnzymology,第266卷:Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996),编辑Doolittle,Academic Press公司,Harcourt Brace&Co.分公司,San Diego,California,USA。尤其关注允许序列中缺口的比对程序。Smith-Waterman为在序列比对中允许缺口的一类算法。参见Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997)。此外，使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序可以用于比对序列。参见J.Mol.Biol.48:443-453(1970)。
关注BestFit程序，其使用Smith Waterman的局部同源性算法(Advances inApplied Mathematics 2:482-489(1981)来测定序列一致性。缺口产生罚分一般在1至5范围内，通常2至4且在许多实施方案中将为3。缺口延伸罚分一般在约0.01至0.20范围内，且在许多情况下将为0.10。程序具有由所输入的待比较的序列决定的缺省参数。优选地，使用由程序决定的缺省参数确定序列一致性。此程序也可以从来自Madison,Wisconsin,USA的Genetics Computing Group(GCG)程序包获得。
另一所关注的程序为FastDB算法。FastDB描述于Current Methods in SequenceComparison and Analysis,Macromolecule Sequencing and Synthesis,SelectedMethods and Applications,第127-149页,1988,Alan R.Liss公司。序列一致性百分比通过FastDB基于以下参数计算：
错配罚分：1.00；
缺口罚分：1.00；
缺口尺寸罚分：0.33；以及
接合罚分：30.0。
“基因”是指含有至少一个能够在转录和翻译后编码特定蛋白质的开放阅读框的多核苷酸。
如本文所用的术语“向导RNA”是指包含以下的RNA：i)结合于向导RNA指导的核酸内切酶(例如2类CRISPR/Cas核酸内切酶，例如II型、V型或VI型CRISPR/Cas核酸内切酶)且活化RNA指导的核酸内切酶的“活化”核苷酸序列；和ii)包含与靶核酸杂交的核苷酸序列的“靶”核苷酸序列。“活化”核苷酸序列和“靶”核苷酸序列可以在分开的RNA分子(例如“双向导RNA”)上；或可以在相同的RNA分子(“单向导RNA”)上。
“小干扰”或“短干扰RNA”或siRNA为靶向所关注的基因(“靶基因”)的核苷酸的RNA双链体。“RNA双链体”是指由RNA分子的两个区域之间的互补配对所形成的结构。siRNA由于siRNA的双链体部分的核苷酸序列与所靶向基因的核苷酸序列互补而“靶向”基因。在一些实施方案中，siRNA的双链体的长度少于30个核苷酸。在一些实施方案中，双链体长度可以为29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个或10个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为19-25个核苷酸长。siRNA的RNA双链体部分可以为发夹结构的一部分。除双链体部分外，发夹结构可以含有环部分，该环部分位于形成双链体的两个序列之间。环的长度可以变化。在一些实施方案中，环长度为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个核苷酸。发夹结构还可以含有3'或5'悬垂部分。
在一些实施方案中，悬垂物为0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸长的3'或5'悬垂物。
如本文所用，术语“微型RNA”是指任何类型的干扰RNA，包括但不限于内源性微型RNA和人工微型RNA(例如合成miRNA)。内源性微型RNA为在基因组中天然编码的能够调节mRNA的生产性利用的小型RNA。人工微型RNA可以为除内源性微型RNA以外的能够调节mRNA的活性的任何类型的RNA序列。微型RNA序列可以为由这些序列中的任一种或多种构成的RNA分子。微型RNA(或“miRNA”)序列已经描述于例如以下的出版物中：Lim等人,2003,Genes&Development,17,991-1008；Lim等人,2003,Science,299,1540；Lee和Ambrose,2001,Science,294,862；Lau等人,2001,Science294,858-861；Lagos-Quintana等人,2002,Current Biology,12,735-739；Lagos-Quintana等人,2001,Science,294,853-857；和Lagos-Quintana等人,2003,RNA,9,175-179。微型RNA的实例包括作为较大RNA的片段的任何RNA，或为miRNA、siRNA、stRNA、sncRNA、tncRNA、snoRNA、smRNA、shRNA、snRNA或其它小型非编码RNA。参见例如美国专利申请20050272923、20050266552、20050142581和20050075492。“微型RNA前体”(或“前驱miRNA”)是指微型RNA序列并入其中的具有茎环结构的核酸。“成熟微型RNA”(或“成熟miRNA”)包括已经从微型RNA前体(“前驱miRNA”)裂解或已经合成(例如在实验室中通过无细胞合成而合成)的微型RNA，且具有约19个核苷酸至约27个核苷酸的长度，例如成熟微型RNA可以具有19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt或27nt的长度。成熟微型RNA可以结合于靶mRNA且抑制靶mRNA的翻译。
如应用于多核苷酸的“重组”意指多核苷酸为克隆、限制或连接步骤和产生与在自然界中发现的多核苷酸不同的构建体的其它程序的多种组合的产物。重组病毒为包含重组多核苷酸的病毒粒子。所述术语分别包括原始多核苷酸构建体的复制物和原始病毒构建体的后代。
“控制元件”或“控制序列”为参与促进多核苷酸的功能调控的分子的相互作用，包括多核苷酸的复制、重复、转录、剪接、翻译或降解的核苷酸序列。调控可以影响过程的频率、速度或特异性，且可以为增强性或抑制性的。本领域中已知的控制元件包括例如转录调控序列，例如启动子和增强子。启动子为在一定条件下能够结合核糖核酸聚合酶且开始通常位于启动子下游(在3'方向上)的编码区的转录的DNA区域。
“可操作地连接(Operatively linked)”或“可操作地连接(operably linked)”是指遗传元件的并置，其中所述元件处于允许其以预期方式操作的关系中。举例来说，如果启动子帮助开始编码序列的转录，那么启动子可操作地连接于编码区。在启动子与编码区之间可能有插入残基，只要维持此功能关系即可。
“表达载体”为包含编码所关注的多肽的区域的载体，且用于实现蛋白质在预期靶细胞中的表达。表达载体还包含可操作地连接于编码区以促进蛋白质在靶中的表达的控制元件。控制元件与其可操作地连接以求表达的基因的组合有时称为“表达盒”，本领域中已知和可获得许多表达盒，或容易由本领域中可获得的组分构建。
“异源”意指衍生自一种实体，该实体在基因型上截然不同于正被比较实体的其余部分。举例来说，通过遗传工程技术引入源自于不同物种的质粒或载体中的多核苷酸为异源多核苷酸。从天然编码序列去除且可操作地连接于在自然界中未发现连接的编码序列的启动子为异源启动子。因此，举例来说，包括编码异源基因产物的异源核酸的rAAV为包括天然存在的野生型AAV中通常不包括的核酸的rAAV，且编码的异源基因产物为天然存在的野生型AAV通常不编码的基因产物。作为另一实例，包含插入衣壳蛋白的GH环中的异源肽的变异AAV衣壳蛋白为包括天然存在的野生型AAV中通常不包括的肽插入的变异AAV衣壳蛋白。
术语“遗传改变”和“遗传修饰”(和其语法变体)在本文中可互换使用，是指其中不通过有丝分裂或减数分裂，将遗传元件(例如多核苷酸)引入细胞的过程。所述元件可以与细胞异源，或其可能为细胞中已经存在的元件的额外拷贝或改进型式。遗传改变可以例如通过用重组质粒或其它多核苷酸通过本领域中已知的任何方法，例如电穿孔、磷酸钙沉淀或接触多核苷酸-脂质粒复合物转染细胞来实现。遗传改变还可以例如通过用DNA或RNA病毒或病毒载体转导或感染来实现。一般地，遗传元件被引入细胞中的染色体或极微染色体中；但改变细胞和其后代的表型和/或基因型的任何改变都包括在此术语中。
如果在细胞的体外长期培养期间序列可以用来执行其功能，那么称细胞经遗传序列“稳定地”改变、转导、基因修饰或转化。一般地，此类细胞为“遗传上”改变(遗传上修饰)，因为引入了所改变的细胞的后代也能够遗传的遗传改变。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。所述术语还涵盖已经修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、磷酸化或与标记组分偶联。在基因产物递送至哺乳动物受试者的背景下论述时例如抗血管生成多肽、神经保护多肽等多肽和其组合物是指相应的完整多肽或保留完整蛋白质的所需生物化学功能的其任何片段或基因工程衍生物。类似地，提及编码抗血管生成多肽的核酸、编码神经保护多肽的核酸和用于基因产物递送至哺乳动物受试者中的其它此类核酸(可以称为递送至受体细胞的“转基因”)包括编码完整多肽或具有所需生物化学功能的任何片段或基因工程衍生物的多核苷酸。
“分离”的质粒、核酸、载体、病毒、病毒体、宿主细胞或其它物质是指缺乏物质或类似物质天然存在或最初制备时也可能存在的其它组分中的至少一些的物质制剂。因此，举例来说，分离的物质可以通过使用纯化技术将其从来源混合物富集来制备。富集可以在绝对基础上测量，例如每体积溶液的重量，或其可以相对于来源混合物中存在的可能干扰的第二物质测量。本发明的实施方案的日益富集，日益更多地分离。在一些实施方案中，分离的质粒、核酸、载体、病毒、宿主细胞或其它物质经纯化，例如约80％至约90％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯或至少约99％纯或更纯。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等等是指获得所需药理学和/或生理学作用。就完全或部分预防疾病或其症状而言，作用可以为预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于所述疾病的不利影响而言，作用可以为治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物、尤其人类中疾病的任何治疗，且包括：(a)预防疾病在易感染疾病或处于得病的风险中但尚未被诊断为患病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即抑制其发展；和(c)减轻疾病，即引起疾病消退。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，且是指哺乳动物，包括(但不限于)人类和非人类灵长类动物，包括猿和人类；哺乳动物运动动物(例如马、骆驼等)；哺乳动物农畜(例如绵羊、山羊、母牛等)；哺乳动物宠物(犬、猫等)；和啮齿类动物(例如小鼠、大鼠等)。在一些情况下，个体为人类。
在进一步描述本发明前，应了解本发明不局限于所述的具体实施方案，因而当然可以变化。还应了解本文中使用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的，且不意图限制，因为本发明的范围仅仅受随附权利要求书限制。
在提供值的范围的情况下，应了解除非上下文另外清楚地规定，否则本发明内涵盖该范围的上下限之间的每个中间值，至下限的单位的十分之一，和所说明范围内的任何其它所说明或中间值。这些较小范围的上下限可以独立地包括在较小范围中，且也涵盖于本发明内，服从于所说明范围中的任何特别排除的界限。在所说明的范围包括界限中的一个或两个的情况下，排除那些包括的界限中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解的含义相同的含义。虽然与本文所述的方法和材料类似或同等的任何方法和材料也可以用于实践或测试本发明，但是现在描述优选的方法和材料。本文中提到的所有出版物都以引用的方式并入本文中以公开和描述引用出版物所相关的方法和/或材料。
必须指出如本文和随附权利要求书中所用，除非上下文另外清楚规定，否则单数形式“一种(a/an)”、“或”和“所述”包括多个指示物。因此，举例来说，提及“一种AAV衣壳”包括多个此类衣壳，且提及“所述AAV病毒体”包括提及一种或多种AAV病毒体和本领域的技术人员已知的其同等物等等。进一步指出，权利要求书可以被撰写成排除任何任选的要素。因而，此陈述意图作为与权利要求要素的叙述一起使用排他性术语如“单独地”、“仅”等，或采用“负面”限制的先前基础。
应了解，为清楚起见，在分开实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可能组合提供于单个实施方案。相反地，为简便起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的多种特征也可以分开或呈任何合适的子组合提供。本发明特别涵盖关于本发明的实施方案的所有组合且在本文中公开，如同每个组合个别且明确地公开一般。另外，本发明也特别涵盖多种实施方案和其要素的所有子组合，且在本文中公开，如同每个此类子组合个别且明确地在本文中公开一般。
本文中论述的出版物仅仅针对其在本申请的提交日期前的公开内容提供。本文中不应有内容解释为承认本发明无权借助在先发明而先于此类出版物。此外，所提供的公布日期可以与实际公布日期不同，实际公布日期可以独立地证实。
具体实施方式
本公开提供了具有改变的衣壳蛋白的重组腺相关病毒(AAV)病毒体，其中与野生型AAV相比，所述重组AAV(rAAV)病毒体展现更大的对视网膜细胞的感染性；且其中rAAV病毒体包含异源核酸。与对应的野生型AAV对视网膜细胞的感染性相比，rAAV病毒体展现更大的对视网膜细胞的感染性。视网膜细胞可以为光感受器(例如视杆；视锥)、视网膜神经节细胞(RGC)、米勒细胞(米勒胶质细胞)、星形细胞(例如视网膜星形细胞)、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色素上皮细胞(RPE)。本公开还提供了将基因产物递送至个体中的视网膜细胞的方法，和治疗眼病的方法。本公开提供了一种具有改变的衣壳蛋白的rAAV病毒体，其中与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体定位至内核层、外核层、光感受器层、神经节细胞层或视网膜色素上皮细胞的程度相比，所述rAAV病毒体展现增加至少5倍的至内核层、外核层、光感受器层、神经节细胞层和视网膜色素上皮细胞中的一个或多个的定位；且其中所述rAAV病毒体包含异源核酸。
变异AAV衣壳多肽
本公开提供了一种变异AAV衣壳蛋白。本公开的变异AAV衣壳蛋白在亲本AAV衣壳蛋白的表面可及(例如溶剂可及)部分中的插入位点中包含5个氨基酸至20个氨基酸长的异源肽的插入，使得与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比，所述变异衣壳蛋白在存在于AAV病毒体中时赋予增加的对视网膜细胞的感染性。在其它情况下，视网膜细胞为米勒细胞。其它视网膜细胞包括无长突细胞、双极细胞和水平细胞。“约5个氨基酸至约20个氨基酸的插入”在本文中也称为“肽插入”(例如异源肽插入)。“对应的亲本AAV衣壳蛋白”是指没有肽插入的相同AAV血清型的AAV衣壳蛋白。在许多情况下，变异AAV衣壳包含5个氨基酸至20个氨基酸(例如5至7个、7至10个、10至12个、12至15个或15至20个氨基酸)长的单一异源肽插入。
插入位点在AAV衣壳蛋白的GH环或环IV中，例如AAV衣壳蛋白的GH环或环IV的溶剂可及部分中。关于AAV衣壳的GH环/环IV，参见例如van Vliet等人(2006)Mol.Ther.14:809；Padron等人(2005)J.Virol.79:5047；和Shen等人(2007)Mol.Ther.15:1955。举例来说，插入位点可以在AAV衣壳蛋白的氨基酸411-650内，如图6A-6C中所描绘。举例来说，插入位点可以在AAV2的氨基酸570-611内，AAV1的氨基酸571-612内，AAV5的氨基酸560-601内，AAV6的氨基酸571至612内，AAV7的氨基酸572至613内，AAV8的氨基酸573至614内，AAV9的氨基酸571至612内，或AAV10的氨基酸573至614内，如图5中所描绘。在一些情况下，插入位点介于AAV2衣壳蛋白的氨基酸588与589之间，或不同血清型的AAV中的对应插入位点。在一些情况下，插入位点介于AAV2衣壳蛋白的氨基酸587与588之间，或不同血清型的AAV中的对应插入位点。
在一些情况下，相对于对应的亲本AAV衣壳蛋白，约5个氨基酸至约20个氨基酸(例如5至7个、7至10个、10至12个、12至15个或15至20个氨基酸)长的异源肽插入衣壳蛋白的GH环或环IV中的插入位点中。举例来说，插入位点可以介于AAV2的氨基酸587与588之间，或另一AAV血清型的衣壳子单元的对应位置。应注意到，插入位点587/588是基于AAV2衣壳蛋白。5个氨基酸至约20个氨基酸(例如5至7个、7至10个、10至12个、12至15个或15至20个氨基酸)长的异源肽可以插入除AAV2以外的AAV血清型(例如AAV8、AAV9等)中的对应位点中。基于多种AAV血清型的衣壳蛋白的氨基酸序列的比较，本领域的技术人员将知道“与AAV2的氨基酸587-588对应”的插入位点在任何既定的AAV血清型的衣壳蛋白中的位置。多种AAV血清型中与AAV2的衣壳蛋白VP1的氨基酸570-611(参见图4)对应的序列展示于图5中。参见例如GenBank登记号NP_049542，AAV1；GenBank登记号AAD13756，AAV5；GenBank登记号AAB95459，AAV6；GenBank登记号YP_077178，AAV7；GenBank登记号YP_077180，AAV8；GenBank登记号AAS99264，AAV9；和GenBank登记号AAT46337，AAV10。
举例来说，插入位点可以介于AAV2的氨基酸587与588之间，AAV1的氨基酸590与591之间，AAV5的氨基酸575与576之间，AAV6的氨基酸590与591之间，AAV7的氨基酸589与590之间，AAV8的氨基酸590与591之间，AAV9的氨基酸588与589之间，或AAV10的氨基酸588与589之间。图5中插入位点加下划线；氨基酸编号是基于图5中描绘的编号。
在一些实施方案中，主题衣壳蛋白包括氨基酸序列与图6A-6C中阐述的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性且插入5至20个氨基酸(例如5至7个、7至10个、10至12个、12至15个或15至20个氨基酸)长的异源肽的GH环。
插入肽
如上所述，将约5个氨基酸至约20个氨基酸长的异源肽插入AAV衣壳的GH环中。在一些情况下，插入肽具有5个氨基酸至20个氨基酸的长度。在一些情况下，插入肽具有7个氨基酸至15个氨基酸的长度。在一些情况下，插入肽具有9个氨基酸至15个氨基酸的长度。在一些情况下，插入肽具有9个氨基酸至12个氨基酸的长度。插入肽具有5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸或20个氨基酸的长度。在一些情况下，插入肽具有7个氨基酸的长度。在一些情况下，插入肽具有8个氨基酸的长度。在一些情况下，插入肽具有9个氨基酸的长度。在一些情况下，插入肽具有10个氨基酸的长度。在一些情况下，插入肽具有11个氨基酸的长度。在一些情况下，插入肽具有12个氨基酸的长度。在一些情况下，插入肽具有13个氨基酸的长度。在一些情况下，插入肽具有14个氨基酸的长度。在一些情况下，插入肽具有15个氨基酸的长度。
在一些情况下，肽插入物为式I的肽：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，其中：
X1为Leu、Ile、Pro或Gln；
X2为Ala、Pro、Ser、Asp、Gly、Thr或Val；
X3为Lys、His、Thr、Ile、Pro、Val、Arg、Ala、Asp、Glu、Asn、Gln或Tyr；
X4(如果存在)为Gln、Asp、Ser、Gly、Thr、Ile、Asn、Glu、Lys或Arg；
X5为Asp、Ser、Gln、Val、Thr、Gly、Ala、Asn、Lys或Tyr；
X6为Thr、Ala、Gln、Ser、Glu、Pro或Ile；
X7为Thr、Ser、Asn、Pro、Leu、Gln、Lys、Ala或Cys；
X8为Lys、Ser、Arg、Thr、Ala、Glu、Ile或Asn；
X9为Asn、Pro、Ser、Lys、His、Ile、Thr或Ala；且
X10为Ala、Phe、Asp、Thr、Val或Met。
式I的肽插入物包括(但不限于)(1)LAKDATKNA(SEQ ID NO:47)；(2)PAHQDTTKNA(SEQ ID NO:48)；(3)LAHQDTTKNA(SEQ ID NO:49)；(4)LATTSQNKPA(SEQ ID NO:50)；(5)LAISDQTKHA(SEQ ID NO:51)；(6)IARGVAPSSA(SEQ ID NO:52)；(7)LAPDSTTRSA(SEQ ID NO:53)；(8)LAKGTELKPA(SEQ ID NO:54)；(9)LAIIDATKNA(SEQ ID NO:55)；(10)LAVDGAQRSA(SEQ ID NO:56)；(11)PAPQDTTKKA(SEQ ID NO:57)；(12)LPHQDTTKNA(SEQ ID NO:58)；(13)LAKDATKTIA(SEQ ID NO:59)；(14)LAKQQSASTA(SEQ ID NO:60)；(15)LAKSDQSKPA(SEQ IDNO:61)；(16)LSHQDTTKNA(SEQ ID NO:62)；(17)LAANQPSKPA(SEQ ID NO:63)；(18)LAVSDSTKAA(SEQ ID NO:64)；(19)LAAQGTAKKPA(SEQ ID NO:65)；(20)LAPDQTTRNA(SEQ IDNO:66)；(21)LAASDSTKAA(SEQ ID NO:67)；(22)LAPQDTTKNA(SEQ ID NO:68)；(23)LAKADETRPA(SEQ ID NO:69)；(24)LAHQDTAKNA(SEQ ID NO:70)；(25)LAHQDTKKNA(SEQ IDNO:71)；(26)LAHQDTTKHA(SEQ ID NO:72)；(27)LAHQDTTKKA(SEQ ID NO:73)；(28)LAHQDTTRNA(SEQ ID NO:74)；(29)LAHQDTTNA(SEQ ID NO:75)；(30)LAHQGTTKNA(SEQ IDNO:76)；(31)LAHQVTTKNA(SEQ ID NO:77)；(32)LAISDQSKPA(SEQ ID NO:78)；(33)LADATKTA(SEQ ID NO:79)；(34)LAKDTTKNA(SEQ ID NO:80)；(35)LAKSDQSRPA(SEQ ID NO:81)；(36)LAPQDTKKNA(SEQ ID NO:82)；(37)LATSDSTKAA(SEQ ID NO:83)；(38)LAVDGSQRSA(SEQ IDNO:84)；(39)LPISDQTKHA(SEQ ID NO:85)；(40)LPKDATKTIA(SEQ ID NO:86)；(41)LPPQDTTKNA(SEQ ID NO:87)；(42)PAPQDTTKNA(SEQ ID NO:88)；(43)QAHQDTTKNA(SEQ IDNO:89)；(44)LAHETSPRPA(SEQ ID NO:90)；(45)LAKSTSTAPA(SEQ ID NO:91)；(46)LADQDTTKNA(SEQ ID NO:92)；(47)LAESDQSKPA(SEQ ID NO:93)；(48)LAHKDTTKNA(SEQ IDNO:94)；(49)LAHKTQQKM(SEQ ID NO:95)；(50)LAHQDTTENA(SEQ ID NO:96)；(51)LAHQDTTINA(SEQ ID NO:97)；(52)LAHQDTTKKT(SEQ ID NO:98)；(53)LAHQDTTKND(SEQ IDNO:99)；(54)LAHQDTTKNT(SEQ ID NO:100)；(55)LAHQDTTKNV(SEQ ID NO:101)；(56)LAHQDTTKTM(SEQ ID NO:102)；(57)LAHQNTTKNA(SEQ ID NO:103)；(58)LAHRDTTKNA(SEQ IDNO:104)；(59)LAISDQTNHA(SEQ ID NO:105)；(60)LAKQKSASTA(SEQ ID NO:106)；(61)LAKSDQCKPA(SEQ ID NO:107)；(62)LAKSDQSKPD(SEQ ID NO:108)；(63)LAKSDQSNPA(SEQ IDNO:109)；(64)LAKSYQSKPA(SEQ ID NO:110)；(65)LANQDTTKNA(SEQ ID NO:111)；(66)LAPQNTTKNA(SEQ ID NO:112)；(67)LAPSSIQKPA(SEQ ID NO:113)；(68)LAQQDTTKNA(SEQ IDNO:114)；(69)LAYQDTTKNA(SEQ ID NO:115)；(70)LDHQDTTKNA(SEQ ID NO:116)；(71)LDHQDTTKSA(SEQ ID NO:117)；(72)LGHQDTTKNA(SEQ ID NO:118)；(73)LPHQDTTKND(SEQ IDNO:119)；(74)LPHQDTTKNT(SEQ ID NO:120)；(75)LPHQDTTNNA(SEQ ID NO:121)；(76)LTHQDTTKNA(SEQ ID NO:122)；(77)LTKDATKTIA(SEQ ID NO:123)；(78)LTPQDTTKNA(SEQ IDNO:124)；和(79)LVHQDTTKNA(SEQ ID NO:125)。
在一些情况下，肽插入物为式II的肽：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，其中：
X1为Leu、Ile或Pro；
X2为Ala、Pro或Ser；
X3为Lys、His、Thr、Ile、Pro、Val、Arg或Ala；
X4(如果存在)为Gln、Asp、Ser、Gly、Thr、Ile或Asn；
X5为Asp、Ser、Gln、Val、Thr、Gly或Ala；
X6为Thr、Ala、Gln、Ser、Glu或Pro；
X7为Thr、Ser、Asn、Pro、Leu、Gln、Lys或Ala；
X8为Lys、Ser、Arg或Thr；
X9为Asn、Pro、Ser、Lys、His、Ile、Thr或Ala；且
X10为Ala。
式II的肽插入物包括(但不限于)(1)LAKDATKNA(SEQ ID NO:47)；(2)PAHQDTTKNA(SEQ ID NO:48)；(3)LAHQDTTKNA(SEQ ID NO:49)；(4)LATTSQNKPA(SEQ ID NO:50)；(5)LAISDQTKHA(SEQ ID NO:51)；(6)IARGVAPSSA(SEQ ID NO:52)；(7)LAPDSTTRSA(SEQ ID NO:53)；(8)LAKGTELKPA(SEQ ID NO:54)；(9)LAIIDATKNA(SEQ ID NO:55)；(10)LAVDGAQRSA(SEQ ID NO:56)；(11)PAPQDTTKKA(SEQ ID NO:57)；(12)LPHQDTTKNA(SEQ ID NO:58)；(13)LAKDATKTIA(SEQ ID NO:59)；(14)LAKQQSASTA(SEQ ID NO:60)；(15)LAKSDQSKPA(SEQ IDNO:61)；(16)LSHQDTTKNA(SEQ ID NO:62)；(17)LAANQPSKPA(SEQ ID NO:63)；(18)LAVSDSTKAA(SEQ ID NO:64)；(19)LAAQGTAKKPA(SEQ ID NO:65)；(20)LAPDQTTRNA(SEQ IDNO:66)；(21)LAASDSTKAA(SEQ ID NO:67)；(22)LAPQDTTKNA(SEQ ID NO:68)；(23)LAKADETRPA(SEQ ID NO:69)；(24)LAHQDTAKNA(SEQ ID NO:70)；(25)LAHQDTKKNA(SEQ IDNO:71)；(26)LAHQDTTKHA(SEQ ID NO:72)；(27)LAHQDTTKKA(SEQ ID NO:73)；(28)LAHQDTTRNA(SEQ ID NO:74)；(29)LAHQDTTNA(SEQ ID NO:75)；(30)LAHQGTTKNA(SEQ IDNO:76)；(31)LAHQVTTKNA(SEQ ID NO:77)；(32)LAISDQSKPA(SEQ ID NO:78)；(33)LADATKTA(SEQ ID NO:79)；(34)LAKDTTKNA(SEQ ID NO:80)；(35)LAKSDQSRPA(SEQ ID NO:81)；(36)LAPQDTKKNA(SEQ ID NO:82)；(37)LATSDSTKAA(SEQ ID NO:83)；(38)LAVDGSQRSA(SEQ IDNO:84)；(39)LPISDQTKHA(SEQ ID NO:85)；(40)LPKDATKTIA(SEQ ID NO:86)；(41)LPPQDTTKNA(SEQ ID NO:87)；和(42)PAPQDTTKNA(SEQ ID NO:88)。
式II的肽包括(但不限于)：(1)LAKDATKNA(SEQ ID NO:47)；(2)PAHQDTTKNA(SEQID NO:48)；(3)LAHQDTTKNA(SEQ ID NO:49)；(4)LATTSQNKPA(SEQ ID NO:50)；(5)LAISDQTKHA(SEQ ID NO:51)；(6)IARGVAPSSA(SEQ ID NO:52)；(7)LAPDSTTRSA(SEQ ID NO:53)；(8)LAKGTELKPA(SEQ ID NO:54)；(9)LAIIDATKNA(SEQ ID NO:55)；(10)LAVDGAQRSA(SEQ ID NO:56)；(11)PAPQDTTKKA(SEQ ID NO:57)；(12)LPHQDTTKNA(SEQ ID NO:58)；(13)LAKDATKTIA(SEQ ID NO:59)；(14)LAKQQSASTA(SEQ ID NO:60)；(15)LAKSDQSKPA(SEQ IDNO:61)；(16)LSHQDTTKNA(SEQ ID NO:62)；(17)LAANQPSKPA(SEQ ID NO:63)；和(18)LAVSDSTKAA(SEQ ID NO:64)。在一些情况下，肽插入物为(1)LAKDATKNA(SEQ ID NO:47)。在一些情况下，肽插入物为(2)PAHQDTTKNA(SEQ ID NO:48)。在一些情况下，肽插入物为(3)LAHQDTTKNA(SEQ ID NO:49)。在一些情况下，肽插入物为(4)LATTSQNKPA(SEQ ID NO:50)。在一些情况下，肽插入物为(5)LAISDQTKHA(SEQ ID NO:51)。在一些情况下，肽插入物为(6)IARGVAPSSA(SEQ ID NO:52)。在一些情况下，肽插入物为(7)LAPDSTTRSA(SEQ ID NO:53)。在一些情况下，肽插入物为(8)LAKGTELKPA(SEQ ID NO:54)。在一些情况下，肽插入物为(9)LAIIDATKNA(SEQ ID NO:55)。在一些情况下，肽插入物为(10)LAVDGAQRSA(SEQ ID NO:56)。在一些情况下，肽插入物为(11)PAPQDTTKKA(SEQ ID NO:57)。在一些情况下，肽插入物为(12)LPHQDTTKNA(SEQ ID NO:58)。在一些情况下，肽插入物为(13)LAKDATKTIA(SEQ ID NO:59)。在一些情况下，肽插入物为(14)LAKQQSASTA(SEQ ID NO:60)。在一些情况下，肽插入物为(15)LAKSDQSKPA(SEQ ID NO:61)。在一些情况下，肽插入物为(16)LSHQDTTKNA(SEQ IDNO:62)。在一些情况下，肽插入物为(17)LAANQPSKPA(SEQ ID NO:63)。在一些情况下，肽插入物为(18)LAVSDSTKAA(SEQ ID NO:64)。
在一些情况下，肽插入物为式III的肽：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，其中：
X1为Leu、Ile或Pro；
X2为Ala、Pro或Ser；
X3为Lys、His、Thr、Ile、Pro、Val、Arg或Ala；
X4(如果存在)为Gln、Asp、Ser、Gly、Thr、Ile或Asn；
X5为Asp、Ser、Gln、Val、Thr、Gly或Ala；
X6为Thr、Ala、Gln、Ser、Glu或Pro；
X7为Thr、Ser、Asn、Pro、Leu、Gln、Lys或Ala；
X8为Lys、Ser、Arg或Thr；
X9为Asn、Pro、Ser、Lys、His、Ile、Thr或Ala；且
X10为Ala、Thr、Asp Val或Met。
式III的肽插入物包括(但不限于)(1)LAKDATKNA(SEQ ID NO:47)；(2)PAHQDTTKNA(SEQ ID NO:48)；(3)LAHQDTTKNA(SEQ ID NO:49)；(6)IARGVAPSSA(SEQ ID NO:52)；(7)LAPDSTTRSA(SEQ ID NO:53)；(8)LAKGTELKPA(SEQ ID NO:54)；(9)LAIIDATKNA(SEQ ID NO:55)；(10)LAVDGAQRSA(SEQ ID NO:56)；(11)PAPQDTTKKA(SEQ ID NO:57)；(12)LPHQDTTKNA(SEQ ID NO:58)；(13)LAKDATKTIA(SEQ ID NO:59)；(14)LAKQQSASTA(SEQ ID NO:60)；(16)LSHQDTTKNA(SEQ ID NO:62)；(17)LAANQPSKPA(SEQ ID NO:63)；(18)LAVSDSTKAA(SEQ IDNO:64)；(19)LAAQGTAKPA(SEQ ID NO:65)；(20)LAPDQTTRNA(SEQ ID NO:66)；(24)LAHQDTAKNA(SEQ ID NO:70)；(25)LAHQDTKKNA(SEQ ID NO:71)；(26)LAHQDTTKHA(SEQ IDNO:72)；(27)LAHQDTTKKA(SEQ ID NO:73)；(28)LAHQDTTRNA(SEQ ID NO:74)；(29)LAHQDTTTNA(SEQ ID NO:75)；(30)LAHQGTTKNA(SEQ ID NO:76)；(21)LAASDSTKAA(SEQ IDNO:67)；(22)LAPQDTTKNA(SEQ ID NO:68)；(31)LAHQVTTKNA(SEQ ID NO:77)；(33)LAKDATKTA(SEQ ID NO:79)；(34)LAKDTTKNA(SEQ ID NO:80)；(36)LAPQDTKKNA(SEQ ID NO:82)；(37)LATSDSTKAA(SEQ ID NO:83)；(38)LAVDGSQRSA(SEQ ID NO:84)；(41)LPPQDTTKNA(SEQ ID NO:87)；(42)PAPQDTTKNA(SEQ ID NO:88)；(52)LAHQDTTKKT(SEQ ID NO:98)；(53)LAHQDTTKND(SEQ ID NO:99)；(54)LAHQDTTKNT(SEQ ID NO:100)；(55)LAHQDTTKNV(SEQ IDNO:101)；(56)LAHQDTTKTM(SEQ ID NO:102)；(73)LPHQDTTKND(SEQ ID NO:119)；和(74)LPHQDTTKNT(SEQ ID NO:120)。
在一些情况下，肽插入物为式IV的肽：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，其中：
X1为Leu；
X2为Ala；
X3为Lys、His、Thr、Ile、Pro或Val；
X4(如果存在)为Gln、Asp、Ser或Gly；
X5为Asp、Ser或Gln；
X6为Thr、Ala、Gln或Ser；
X7为Thr或Ser；
X8为Lys、Ser或Arg；
X9为Asn、Pro或Ser；且
X10为Ala。
式IV的肽插入物包括(但不限于)(1)LAKDATKNA(SEQ ID NO:47)；(3)LAHQDTTKNA(SEQ ID NO:49)；(7)LAPDSTTRSA(SEQ ID NO:53)；(15)LAKSDQSKPA(SEQ ID NO:61)；(20)LAPDQTTRNA(SEQ ID NO:66)；(22)LAPQDTTKNA(SEQ ID NO:68)；(28)LAHQDTTRNA(SEQ IDNO:74)；(32)LAISDQSKPA(SEQ ID NO:78)；(34)LAKDTTKNA(SEQ ID NO:80)；和(35)LAKSDQSRPA(SEQ ID NO:81)。
在一些情况下，肽插入物为式V的肽：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，其中：
X1为Leu；
X2为Ala；
X3为Lys或His；
X4(如果存在)为Gln、Asp、Ser或Gly；
X5为Asp、Ser或Gln；
X6为Thr、Ala、Gln或Ser；
X7为Thr或Ser；
X8为Lys、Ser或Arg；
X9为Asn、Pro或Ser；且
X10为Ala。
式V的肽插入物包括(但不限于)(1)LAKDATKNA(SEQ ID NO:47)；(15)LAKSDQSKPA(SEQ ID NO:51)；(34)LAKDTTKNA(SEQ ID NO:80)；和(35)LAKSDQSRPA(SEQ ID NO:81)。
在一些情况下，肽插入物为式VI的肽：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，其中：
X1为Leu；
X2为Ala；
X3为Asn、Lys、Thr、Gln、Ser、Ile或Leu；
X4为Ser、Ala、Thr、Glu、Gln、Gly、Lys或Pro；
X5为Asp、Pro、Glu、Thr、Asn或Arg；
X6为Ile、His、Thr、Gln、Asn、Tyr、Asp或Glu；
X7为Gln、Thr、Asn、Ala或Lys；
X8为Lys、Thr、Arg或Asp；
X9为Pro、Asn、Thr、Arg、Lys或Ser；且
X10为Ala。
式VI的肽包括(但不限于)：(80)LAKANQNTPA(SEQ ID NO:126)；(81)LATTPITKPA(SEQ ID NO:127)；(82)LATTPIAKPA(SEQ ID NO:128)；(83)LAIEDHTKSA(SEQ ID NO:129)；(84)LAQSEHQRPA(SEQ ID NO:130)；(85)LAKSPNKDNA(SEQ ID NO:131)；(86)LANQDYTKTA(SEQ ID NO:132)；(87)LANSTDQTRA(SEQ ID NO:133)；(88)LALGETTRPA(SEQ ID NO:134)；(89)LANSTEQTRA(SEQ ID NO:135)；(90)LAQADTTKNA(SEQ ID NO:136)；(91)LASKDITKTA(SEQ ID NO:137)；和(92)LASPRHNKKC(SEQ ID NO:138)。
在一些情况下，肽插入物为式VII的肽：LAHQDTTKX1X2X3(SEQ ID NO:148)，其中X1为Lys、Thr、Asn或His；X2为Ala、Thr、Val、Ile、Met或Asp；且X3如果存在，那么为Ala。式VII的肽包括(但不限于)：(26)LAHQDTTKHA(SEQ ID NO:72)；(27)LAHQDTTKKA(SEQ ID NO:73)；(52)LAHQDTTKKT(SEQ ID NO:98)；(53)LAHQDTTKND(SEQ ID NO:99)；(54)LAHQDTTKNT(SEQID NO:100)；(55)LAHQDTTKNV(SEQ ID NO:101)；(56)LAHQDTTKTM(SEQ ID NO:102)；和(93)LAHQDTTKTIA(SEQ ID NO:139)。
在一些情况下，肽插入物为式VIII的肽：LAX1QX2TX3X4X5X6(SEQ ID NO:149)，其中X1为Ala、Pro、Asp或His；X2为Gly或Asp；X3为Ala、Thr或Lys；X4为Asn、Glu、Lys、Arg或Thr；X5为Leu、Asn、Lys或Thr；且X6如果存在，那么为Ala、Thr、Asp、Val或Met。式VIII的肽包括(但不限于)(94)LAAQGTANL(SEQ ID NO:140)；(22)LAPQDTTKNA(SEQ ID NO:68)；(46)LADQDTTKNA(SEQ ID NO:92)；(24)LAHQDTAKNA(SEQ ID NO:70)；(25)LAHQDTKKNA(SEQ IDNO:71)；(26)LAHQDTTKHA(SEQ ID NO:72)；(27)LAHQDTTKKA(SEQ ID NO:73)；(28)LAHQDTTRNA(SEQ ID NO:74)；(29)LAHQDTTTNA(SEQ ID NO:75)；(50)LAHQDTTENA(SEQ IDNO:96)；(51)LAHQDTTINA(SEQ ID NO:97)；(52)LAHQDTTKKT(SEQ ID NO:98)；(53)LAHQDTTKND(SEQ ID NO:99)；(54)LAHQDTTKNT(SEQ ID NO:100)；(55)LAHQDTTKNV(SEQ IDNO:101)；和(56)LAHQDTTKTM(SEQ ID NO:102)。
在一些情况下，肽插入物为式IX的肽：X1AX2X3DX4TKX5A(SEQ ID NO:150)，其中X1为Val或Leu；X2为Ile、Val、His或Asp；X3为Glu、Ser、Lys或Gln；X4为His、Ser或Thr；且X5为Ser、Ala、Asn、His或Lys。式IX的肽包括(但不限于)(95)VAIEDHTKSA(SEQ ID NO:141)；(18)LAVSDSTKAA(SEQ ID NO:64)；(46)LADQDTTKNA(SEQ ID NO:92)；(48)LAHKDTTKNA(SEQ IDNO:94)；(26)LAHQDTTKHA(SEQ ID NO:72)；和(27)LAHQDTTKKA(SEQ ID NO:73)。
在一些情况下，肽插入物为式X的肽：X1X2X3AX4QX5TX6KNA(SEQ ID NO:151)，其中X1如果存在，那么为Leu；X2如果存在，那么为Ala；X3为Lys、Leu或Pro；X4为Asn、His、Pro或Tyr；X5为Asn、Gly、Val或Asp；且X6为Pro或Thr。式X的肽包括(但不限于)(96)LAKANQNTPKNA(SEQID NO:142)；(57)LAHQNTTKNA(SEQ ID NO:103)；(66)LAPQNTTKNA(SEQ ID NO:112)；(69)LAYQDTTKNA(SEQ ID NO:115)；(30)LAHQGTTKNA(SEQ ID NO:76)；(31)LAHQVTTKNA(SEQ IDNO:77)；和(42)PAPQDTTKNA(SEQ ID NO:88)。
在一些情况下，肽插入物为LAHQDTTKKX(SEQ ID NO:143)，其中X为任何氨基酸。在一些情况下，肽插入物为LAHQDTTKKX(SEQ ID NO:143)，其中X为Ala、Thr、Asp、Val或Met。在一些情况下，肽插入物为(27)LAHQDTTKKA(SEQ ID NO:73)。在一些情况下，肽插入物为(52)LAHQDTTKKT(SEQ ID NO:98)。在一些情况下，肽插入物为LAHQDTTKKD(SEQ ID NO:144)。在一些情况下，肽插入物为LAHQDTTKKV(SEQ ID NO:145)。在一些情况下，肽插入物为LAHQDTTKKM(SEQ ID NO:146)。
在一些情况下，肽插入物不为(88)LALGETTRPA(SEQ ID NO:134)。在一些情况下，肽插入物不为LGETTRP(SEQ ID NO:147)。
合适的肽插入物包括(但不限于)(1)LAKDATKNA(SEQ ID NO:47)；(2)PAHQDTTKNA(SEQ ID NO:48)；(3)LAHQDTTKNA(SEQ ID NO:49)；(4)LATTSQNKPA(SEQ ID NO:50)；(5)LAISDQTKHA(SEQ ID NO:51)；(6)IARGVAPSSA(SEQ ID NO:52)；(7)LAPDSTTRSA(SEQ ID NO:53)；(8)LAKGTELKPA(SEQ ID NO:54)；(9)LAIIDATKNA(SEQ ID NO:55)；(10)LAVDGAQRSA(SEQ ID NO:56)；(11)PAPQDTTKKA(SEQ ID NO:57)；(12)LPHQDTTKNA(SEQ ID NO:58)；(13)LAKDATKTIA(SEQ ID NO:59)；(14)LAKQQSASTA(SEQ ID NO:60)；(15)LAKSDQSKPA(SEQ IDNO:61)；(16)LSHQDTTKNA(SEQ ID NO:62)；(17)LAANQPSKPA(SEQ ID NO:63)；(18)LAVSDSTKAA(SEQ ID NO:64)；(19)LAAQGTAKKPA(SEQ ID NO:65)；(20)LAPDQTTRNA(SEQ IDNO:66)；(21)LAASDSTKAA(SEQ ID NO:67)；(22)LAPQDTTKNA(SEQ ID NO:68)；(23)LAKADETRPA(SEQ ID NO:69)；(24)LAHQDTAKNA(SEQ ID NO:70)；(25)LAHQDTKKNA(SEQ IDNO:71)；(26)LAHQDTTKHA(SEQ ID NO:72)；(27)LAHQDTTKKA(SEQ ID NO:73)；(28)LAHQDTTRNA(SEQ ID NO:74)；(29)LAHQDTTNA(SEQ ID NO:75)；(30)LAHQGTTKNA(SEQ IDNO:76)；(31)LAHQVTTKNA(SEQ ID NO:77)；(32)LAISDQSKPA(SEQ ID NO:78)；(33)LADATKTA(SEQ ID NO:79)；(34)LAKDTTKNA(SEQ ID NO:80)；(35)LAKSDQSRPA(SEQ ID NO:81)；(36)LAPQDTKKNA(SEQ ID NO:82)；(37)LATSDSTKAA(SEQ ID NO:83)；(38)LAVDGSQRSA(SEQ IDNO:84)；(39)LPISDQTKHA(SEQ ID NO:85)；(40)LPKDATKTIA(SEQ ID NO:86)；(41)LPPQDTTKNA(SEQ ID NO:87)；(42)PAPQDTTKNA(SEQ ID NO:88)；(43)QAHQDTTKNA(SEQ IDNO:89)；(44)LAHETSPRPA(SEQ ID NO:90)；(45)LAKSTSTAPA(SEQ ID NO:91)；(46)LADQDTTKNA(SEQ ID NO:92)；(47)LAESDQSKPA(SEQ ID NO:93)；(48)LAHKDTTKNA(SEQ IDNO:94)；(49)LAHKTQQKM(SEQ ID NO:95)；(50)LAHQDTTENA(SEQ ID NO:96)；(51)LAHQDTTINA(SEQ ID NO:97)；(52)LAHQDTTKKT(SEQ ID NO:98)；(53)LAHQDTTKND(SEQ IDNO:99)；(54)LAHQDTTKNT(SEQ ID NO:100)；(55)LAHQDTTKNV(SEQ ID NO:101)；(56)LAHQDTTKTM(SEQ ID NO:102)；(57)LAHQNTTKNA(SEQ ID NO:103)；(58)LAHRDTTKNA(SEQ IDNO:104)；(59)LAISDQTNHA(SEQ ID NO:105)；(60)LAKQKSASTA(SEQ ID NO:106)；(61)LAKSDQCKPA(SEQ ID NO:107)；(62)LAKSDQSKPD(SEQ ID NO:108)；(63)LAKSDQSNPA(SEQ IDNO:109)；(64)LAKSYQSKPA(SEQ ID NO:110)；(65)LANQDTTKNA(SEQ ID NO:111)；(66)LAPQNTTKNA(SEQ ID NO:112)；(67)LAPSSIQKPA(SEQ ID NO:113)；(68)LAQQDTTKNA(SEQ IDNO:114)；(69)LAYQDTTKNA(SEQ ID NO:115)；(70)LDHQDTTKNA(SEQ ID NO:116)；(71)LDHQDTTKSA(SEQ ID NO:117)；(72)LGHQDTTKNA(SEQ ID NO:118)；(73)LPHQDTTKND(SEQ IDNO:119)；(74)LPHQDTTKNT(SEQ ID NO:120)；(75)LPHQDTTNNA(SEQ ID NO:121)；(76)LTHQDTTKNA(SEQ ID NO:122)；(77)LTKDATKTIA(SEQ ID NO:123)；(78)LTPQDTTKNA(SEQ IDNO:124)；(79)LVHQDTTKNA(SEQ ID NO:125)；(80)LAKANQNTPA(SEQ ID NO:126)；(81)LATTPITKPA(SEQ ID NO:127)；(82)LATTPIAKPA(SEQ ID NO:128)；(83)LAIEDHTKSA(SEQ IDNO:129)；(84)LAQSEHQRPA(SEQ ID NO:130)；(85)LAKSPNKDNA(SEQ ID NO:131)；(86)LANQDYTKTA(SEQ ID NO:132)；(87)LANSTDQTRA(SEQ ID NO:133)；(88)LALGETTRPA(SEQ IDNO:134)；(89)LANSTEQTRA(SEQ ID NO:135)；(90)LAQADTTKNA(SEQ ID NO:136)；(91)LASKDITKTA(SEQ ID NO:137)；(92)LASPRHNKKC(SEQ ID NO:138)；(93)LAHQDTTKTIA(SEQID NO:139)；(94)LAAQGTANL(SEQ ID NO:140)；(95)VAIEDHTKSA(SEQ ID NO:141)；和(96)LAKANQNTPKNA(SEQ ID NO:142)。
在一些情况下，肽插入物为(11)PAPQDTTKKA(SEQ ID NO:57)。在一些情况下，肽插入物为(7)LAPDSTTRSA(SEQ ID NO:53)。
在一些实施方案中，除相对于对应的亲本AAV衣壳蛋白，GH环或环IV中约5个氨基酸至约20个氨基酸(例如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸；例如9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸或12个氨基酸)的插入外，主题rAAV病毒体衣壳不包括任何其它的氨基酸取代、插入或缺失。在其它实施方案中，除相对于对应的亲本AAV衣壳蛋白，GH环或环IV中约5个氨基酸至约20个氨基酸(例如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸；例如9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸或12个氨基酸)的插入外，与亲本AAV衣壳蛋白相比，主题rAAV病毒体衣壳包括1至约25个氨基酸插入、缺失或取代。举例来说，在一些实施方案中，除相对于对应的亲本AAV衣壳蛋白，GH环或环IV中的约5个氨基酸至约20个氨基酸(例如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸；例如9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸或12个氨基酸)的插入外，与亲本AAV衣壳蛋白相比，主题rAAV病毒体衣壳包括1至约5个、约5至约10个、约10至约15个、约15至约20个或约20至约25个氨基酸插入、缺失或取代。
在一些情况下，主题rAAV病毒体衣壳不包括以下氨基酸取代中的一个、两个、三个或四个：Y273F、Y444F、Y500F和Y730F。
在一些情况下，除如上所述的插入肽外，主题变异衣壳多肽包含以下氨基酸取代中的一个、两个、三个或四个：Y273F、Y444F、Y500F和Y730F。
在一些情况下，主题rAAV病毒体衣壳为嵌合衣壳，例如衣壳包含第一AAV血清型的AAV衣壳的一部分和第二血清型的AAV衣壳的一部分；且相对于对应的亲本AAV衣壳蛋白，在GH环或环IV中包含约5个氨基酸至约20个氨基酸(例如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸；例如9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸或12个氨基酸)。
在一些实施方案中，主题rAAV病毒体包含如下衣壳蛋白，其氨基酸序列具有与图4中提供的氨基酸序列至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列一致性；且相对于对应的亲本AAV衣壳蛋白，在GH环或环IV中包含约5个氨基酸至约20个氨基酸(例如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸；例如9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸或12个氨基酸)的插入。在一些实施方案中，主题rAAV病毒体包含如下衣壳蛋白，其氨基酸序列具有与图4中提供的氨基酸序列至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列一致性；且相对于图4中描绘的氨基酸序列，在氨基酸587与588之间，或在相对于对应的亲本AAV衣壳蛋白的对应位点，包含约5个氨基酸至约20个氨基酸(例如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸；例如9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸或12个氨基酸)的插入。
在一些实施方案中，主题rAAV病毒体包含包括如下GH环的衣壳蛋白，所述GH环包含与图5中阐述的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列，且在粗体与加下划线的氨基酸之间包含约5个氨基酸至约20个氨基酸(例如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸；例如9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸或12个氨基酸)的插入。
在一些实施方案中，主题rAAV病毒体包含如下衣壳蛋白，其氨基酸序列具有与图6A-6C中提供的任一氨基酸序列至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列一致性；且在AAV2的氨基酸587与588之间，或在相对于另一AAV基因型的对应位点，包含约5个氨基酸至约20个氨基酸(例如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸；例如9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸或12个氨基酸)的插入。在一些情况下，对应插入位点为如图6B中粗体文字和下划线所指示的位点。
与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对视网膜细胞的感染性。
在一些情况下，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时对视网膜细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对视网膜细胞的感染性。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对感光细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对感光(视杆或视锥)细胞的感染性。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时对感光细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时，展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对感光(视杆或视锥)细胞的感染性。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对RGC的感染性相比，主题rAAV病毒体展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对RGC的感染性。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时对RGC的感染性相比，主题rAAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对RGC的感染性。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对RPE细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对RPE细胞的感染性。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时对RPE细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对RPE细胞的感染性。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对米勒细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对米勒细胞的感染性。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时对米勒细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对米勒细胞的感染性。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对双极细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对双极细胞的感染性。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时对双极细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对双极细胞的感染性。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对无长突细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对无长突细胞的感染性。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时对无长突细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对无长突细胞的感染性。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对水平细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对水平细胞的感染性。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时对水平细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对水平细胞的感染性。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对视网膜星形细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对视网膜星形细胞的感染性。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时对视网膜星形细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对视网膜星形细胞的感染性。
在一些情况下，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体跨越内界膜(ILM)的能力相比，主题rAAV病毒体展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的跨越ILM的能力。
在一些情况下，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时跨越ILM的能力相比，主题rAAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时，展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的跨越ILM的能力。
主题rAAV病毒体可以跨越ILM，且还可以横越细胞层，包括米勒细胞、无长突细胞等等，到达感光细胞和或RPE细胞。举例来说，主题rAAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时可以跨越ILM，且还可以横越细胞层，包括米勒细胞、无长突细胞等等，到达感光细胞和或RPE细胞。
在一些情况下，与经玻璃体内注射的包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体经过ILM定位的程度相比，主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射时，展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的经过ILM的定位。举例来说，在一些情况下，与经玻璃体内注射的包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体定位至视网膜色素上皮细胞(RPE)层的程度相比，主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射时，展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的至RPE的定位。作为另一实例，在一些情况下，与经玻璃体内注射的包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体定位至光感受器(PR)层的程度相比，主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射时，展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的至PR层的定位。作为另一实例，在一些情况下，与经玻璃体内注射的包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体定位至内核层的程度相比，主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射时，展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的至内核层的定位。作为另一实例，在一些情况下，与经玻璃体内注射的包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体定位至外核层的程度相比，主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射时，展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的至外核层的定位。作为另一实例，在一些情况下，与经玻璃体内注射的包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体定位至神经节细胞层的程度相比，主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射时，展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的至神经节细胞层的定位。
在一些实施方案中，主题rAAV病毒体选择性地感染视网膜细胞，例如主题rAAV病毒体以比非视网膜细胞(例如在眼睛外的细胞)大10倍、15倍、20倍、25倍、50倍或超过50倍的特异性感染视网膜细胞。举例来说，在一些实施方案中，主题rAAV病毒体选择性地感染视网膜细胞，例如主题rAAV病毒体以比非视网膜细胞(例如在眼睛外的细胞)大10倍、15倍、20倍、25倍、50倍或超过50倍的特异性感染感光细胞。
在一些实施方案中，主题rAAV病毒体选择性地感染感光细胞，例如主题rAAV病毒体以比眼睛中存在的非感光细胞(例如视网膜神经节细胞、米勒细胞等)大10倍、15倍、20倍、25倍、50倍或超过50倍的特异性感染感光细胞。
在一些实施方案中，与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时对感光细胞的感染性相比，主题rAAV病毒体在经由玻璃体内注射进行施用时展现增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或超过50倍的对感光细胞的感染性。
基因产物
主题rAAV病毒体包含异源核酸，所述异源核酸包含编码基因产物(异源基因产物)的核苷酸序列。在一些情况下，基因产物为多肽。
在一些情况下，基因产物为RNA。在基因产物为RNA的情况下，在一些情况下，RNA基因产物编码多肽。在一些情况下，本公开的rAAV病毒体包含单个异源核酸，该单个异源核酸包含编码单个异源基因产物的核苷酸序列。在一些情况下，本公开的rAAV病毒体包含单个异源核酸，该单个异源核酸包含编码两个异源基因产物的核苷酸序列。在一些情况下，本公开的rAAV病毒体包含两个异源核酸，每个异源核酸包含编码异源基因产物的核苷酸序列。
在一些实施方案中，基因产物为干扰RNA。在一些实施方案中，基因产物为适体。在一些实施方案中，基因产物为多肽。在一些实施方案中，基因产物为提供基因功能的位点特异性敲低的位点特异性核酸酶。在一些实施方案中，基因产物为提供靶核酸的修饰的RNA引导的核酸内切酶。
干扰RNA
在基因产物为干扰RNA(RNAi)的情况下，合适的RNAi包括降低细胞中细胞凋亡或血管生成因子的水平的RNAi。举例来说，RNAi可以为降低细胞中诱发或促进细胞凋亡的基因产物的水平的shRNA或siRNA。基因产物诱发或促进细胞凋亡的基因在本文中称为“促细胞凋亡基因”，且那些基因的产物(mRNA；蛋白质)称为“促细胞凋亡基因产物”。促细胞凋亡基因产物包括例如Bax、Bid、Bak和Bad基因产物。参见例如美国专利No.7,846,730。
干扰RNA还可以针对血管生成产物，例如血管内皮生长因子(VEGF)(例如Cand5；参见例如美国专利公布No.2011/0143400；美国专利公布No.2008/0188437；和Reich等人(2003)Mol.Vis.9:210)；VEGF受体-1(VEGFR1)(例如Sirna-027；参见例如Kaiser等人(2010)Am.J.Ophthalmol.150:33；和Shen等人(2006)Gene Ther.13:225)；或VEGF受体-2(VEGFR2)(Kou等人(2005)Biochem.44:15064)。又参见美国专利No.6,649,596、6,399,586、5,661,135、5,639,872和5,639,736；和美国专利No.7,947,659和7,919,473。
适体
在基因产物为适体的情况下，所关注的例示性适体包括针对VE GF的适体。参见例如Ng等人(2006)Nat.Rev.Drug Discovery 5:123；和Lee等人(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:18902。举例来说，VEGF适体可以包含核苷酸序列5’-cgcaaucagugaaugcuuauacau ccg-3’(SEQ ID NO://)。血小板源性生长因子(PDGF)特异性适体，例如E10030也是适用的；参见例如Ni和Hui(2009)Ophthalmologica223:401；和Akiyama等人(2006)J.Cell Physiol.207:407)。
多肽
在基因产物为多肽的情况下，多肽一般为增强视网膜细胞的功能，例如视杆或视锥感光细胞、视网膜神经节细胞、米勒细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色素上皮细胞的功能的多肽。例示性多肽包括神经保护多肽(例如胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经营养素-4(NT4)、神经生长因子(NGF)和神经秩蛋白(neurturin，NTN))；抗血管生成多肽(例如可溶性VEGF受体；VEGF结合抗体；VEGF结合抗体片段(例如单链抗VEGF抗体)；内皮抑素(endostatin)；肿瘤抑素(tumstatin)；血管抑素(angiostatin)；可溶性Flt多肽(Lai等人(2005)Mol.Ther.12:659)；包含可溶性Flt多肽的Fc融合蛋白(参见例如Pechan等人(2009)Gene Ther.16:10)；色素上皮衍生因子(PEDF)；可溶性Tie-2受体等)；组织金属蛋白酶抑制因子-3(TIMP-3)；光反应性视蛋白，例如视紫红质；抗细胞凋亡多肽(例如Bcl-2、Bcl-Xl；XIAP)等等。合适的多肽包括(但不限于)神经胶质源性神经营养因子(GDNF)；成纤维细胞生长因子；成纤维细胞生长因子2；神经秩蛋白(NTN)；睫状神经营养因子(CNTF)；神经生长因子(NGF)；神经营养素-4(NT4)；脑源性神经营养因子(BDNF；例如氨基酸序列具有与图7B中描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)的约200个氨基酸至247个氨基酸的相邻延伸至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的多肽)；表皮生长因子；视紫红质；X连锁凋亡抑制因子；和音猬因子。
合适的光反应性视蛋白包括例如如以下中所述的光反应性视蛋白：美国专利公布No.2007/0261127(例如光敏感通道-2；ChR2；Chop2)；美国专利公布No.2001/0086421；美国专利公布No.2010/0015095；美国专利公布No.2016/0002302；美国专利公布No.2013/0347137；美国专利公布No.2013/0019325；和Diester等人(2011)Nat.Neurosci.14:387。参见Thyagarajan等人(2010)J Neurosci.30(26):8745-8758；Lagali等人(2008)NatNeurosci.11(6):667-675；Doroudchi等人(2011)Mol Ther.19(7):1220-1229；Henriksen等人(2014)J.Ophthalmic Vis.Res.9:374；Tomita等人(2014)Mol.Ther.22:1434。
合适的多肽包括光门控离子通道多肽。参见例如Gaub等人(2014)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111:E5574。举例来说，合适的多肽为光门控离子型谷氨酸受体(LiGluR)。在可光异构化化合物存在下LiGluR在视网膜神经节细胞和ON-双极细胞中的表达使细胞对光起反应。LiGluR包含L439C取代；参见Caporale等人(2011)Mol Ther.19:1212-1219；Volgraf等人(2006)Nat Chem Biol.2:47-52；和Gorostiza等人(2007)ProcNatl Acad Sci USA.104:10865-10870。可光异构化化合物包括例如在460nm下具有峰值效率的顺丁烯二酰亚胺-偶氮苯-谷氨酸酯0(MAG0460)。MAG0460具有以下结构：
Figure BDA0003635296510000391
合适的多肽还包括视网膜劈裂蛋白(例如氨基酸序列具有与图7A中描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)的约200个氨基酸至224个氨基酸的相邻延伸至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的多肽)。合适的多肽包括例如视网膜色素变性GTP酶调控因子(RPGR)相互作用蛋白-1(参见例如GenBank登记号Q96KN7、Q9EPQ2和Q9GLM3)(例如氨基酸序列具有与图7F中描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)的约1150个氨基酸至1200个氨基酸或约1200个氨基酸至1286个氨基酸的相邻延伸至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的多肽)；外周蛋白-2(Prph2)(参见例如GenBank登记号NP_000313(例如氨基酸序列具有与图7D中描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)的约300个氨基酸至346个氨基酸的相邻延伸至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的多肽；和Travis等人(1991)Genomics 10:733)；外周蛋白(例如氨基酸序列具有与图7E中描绘的氨基酸序列(SEQ IDNO:14)的约400个氨基酸至约470个氨基酸的相邻延伸至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的多肽；视网膜色素上皮细胞特异性蛋白(RPE65)(例如氨基酸序列具有与图7C中描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)的约200个氨基酸至247个氨基酸的相邻延伸至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的多肽)(参见例如GenBank AAC39660；和Morimura等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:3088)；视杆源性视锥细胞活力因子(RdCVF)(例如氨基酸序列具有与图7H、7I和7J中的任一个中描绘的氨基酸序列至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的多肽；无脉络膜(例如氨基酸序列具有与图7G中描绘的氨基酸序列至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的多肽)；视网膜色素变性GTP酶调控因子(RPGR)(例如氨基酸序列具有与图7S-7V中的一个中描绘的氨基酸序列至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的多肽)等等。举例来说，在一些情况下，合适的RPGR多肽包含具有与图7S中描绘的氨基酸序列至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。作为另一实例，在一些情况下，合适的RPGR多肽包含具有与图7T中描绘的氨基酸序列至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。举例来说，在一些情况下，合适的RPGR多肽包含具有与图7U中描绘的氨基酸序列至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。举例来说，在一些情况下，合适的RPGR多肽包含具有与图7V中描绘的氨基酸序列至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
合适的多肽还包括：CHM(无脉络膜(Rab护送蛋白1(REP1)))，一种在有缺陷或缺失时引起无脉络膜的多肽(参见例如Donnelly等人(1994)Hum.Mol.Genet.3:1017；和vanBokhoven等人(1994)Hum.Mol.Genet.3:1041)；和Crumbs同源物1(CRB1)，一种在有缺陷或缺失时引起利伯氏先天性黑朦和色素性视网膜炎的多肽(参见例如den Hollander等人(1999)Nat.Genet.23:217；和GenBank登记号CAM23328)。举例来说，合适的REP1多肽可以包含具有与图7G中描绘的氨基酸序列组至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
合适的多肽包括视杆cGMP特异性3’,5’-环状磷酸二酯酶子单元α(PDE6α)、视杆cGMP特异性3’,5’-环状磷酸二酯酶子单元β同种型1(PDE6β同种型1)、视杆cGMP特异性3’,5’-环状磷酸二酯酶子单元β同种型2(PDE6β同种型2)、视杆cGMP特异性3’,5’-环状磷酸二酯酶子单元β同种型3(PDE6β同种型3)。举例来说，合适的PDE6α多肽可以包含具有与图7K中描绘的氨基酸序列组至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。作为另一实例，合适的PDE6β6同种型1多肽可以包含具有与图7L中描绘的氨基酸序列组至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。作为另一实例，合适的PDE6β6同种型2多肽可以包含具有与图7M中描绘的氨基酸序列组至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。作为另一实例，合适的PDE6β6同种型3多肽可以包含具有与图7N中描绘的氨基酸序列组至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
合适的多肽还包括当有缺陷或缺失时引起全色盲的多肽，其中此类多肽包括例如视锥光感受器cGMP门控通道子单元α(CNGA3)(参见例如GenBank登记号NP_001289；和Booij等人(2011)Ophthalmology 118:160-167)；视锥光感受器cGMP门控阳离子通道β-子单元(CNGB3)(参见例如Kohl等人(2005)Eur J Hum Genet.13(3):302)；鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)、α转导活性多肽2(GNAT2)(ACHM4)；和ACHM5；和当有缺陷或缺乏时引起色盲的多种形式的多肽(例如L-视蛋白、M-视蛋白和S-视蛋白)。参见Mancuso等人(2009)Nature 461(7265):784-787。
举例来说，合适的CNGA3(又名ACHM2)同种型1多肽可以包含具有与图7O中描绘的氨基酸序列组至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。作为另一实例，合适的CNGA3(又名ACHM2)同种型2多肽可以包含具有与图7P中描绘的氨基酸序列组至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
作为另一实例，合适的CNGB3(又名ACHM3)多肽可以包含具有与图7Q中描绘的氨基酸序列组至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。作为另一实例，GNAT2(又名ACHM4)可以包含具有与图7R中描绘的氨基酸序列组至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
位点特异性核酸内切酶
在一些情况下，所关注的基因产物为提供基因功能的位点特异性敲低的位点特异性核酸内切酶，例如其中核酸内切酶敲除与视网膜疾病有关的等位基因。举例来说，在显性等位基因编码当野生型时为视网膜结构蛋白和/或提供正常的视网膜功能的基因的缺陷拷贝的情况下，位点特异性核酸内切酶可以靶向缺陷等位基因且敲出缺陷等位基因。在一些情况下，位点特异性核酸内切酶为RNA引导的核酸内切酶。
除敲除缺陷等位基因外，位点特异性核酸酶还可以用于刺激与编码由缺陷等位基因编码的蛋白质的功能性拷贝的供体DNA的同源重组。因此，例如，主题rAAV病毒体可以用于递送敲除缺陷等位基因的位点特异性核酸内切酶，且可以用于递送缺陷等位基因的功能性拷贝，引起缺陷等位基因的修复，从而产生功能性视网膜蛋白(例如功能性视网膜劈裂蛋白、功能性RPE65、功能性外周蛋白等等)。参见例如Li等人(2011)Nature 475:217。在一些实施方案中，主题rAAV病毒体包含编码位点特异性核酸内切酶的异源核苷酸序列；和编码缺陷等位基因的功能性拷贝的异源核苷酸序列，其中功能性拷贝编码功能性视网膜蛋白。功能性视网膜蛋白包括例如视网膜劈裂蛋白、RPE65、视网膜色素变性GTP酶调控因子(RGPR)相互作用蛋白-1、外周蛋白、外周蛋白-2、RdCVF等等。
适用的位点特异性核酸内切酶包括例如锌指核酸酶(ZFN)；大范围核酸酶；和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，其中此类位点特异性核酸内切酶并非天然存在的且经修饰以靶向特定基因。此类位点特异性核酸酶可以进行工程化以切割基因组内的特定位置，且接着非同源性末端接合可以在插入或缺失若干核苷酸时修复断裂。接着此类位点特异性核酸内切酶(又称为“INDEL”)将蛋白质抛出框，且有效地敲除基因。参见例如美国专利公布No.2011/0301073。合适的位点特异性核酸内切酶包括工程化的大范围核苷酸、再次工程化的归巢核酸内切酶。合适的核酸内切酶包括I-Tevl核酸酶。合适的大范围核酸酶包括I-Sce1(参见例如Bellaiche等人(1999)Genetics 152:1037)；和I-Cre1(参见例如Heath等人(1997)Nature Sructural Biology 4:468)。
RNA引导的核酸内切酶
在一些情况下，基因产物为RNA引导的核酸内切酶。在一些情况下，基因产物为包含编码RNA引导的核酸内切酶的核苷酸序列的RNA。在一些情况下，基因产物为向导RNA，例如单向导RNA。在一些情况下，基因产物为：1)向导RNA；和2)RNA引导的核酸内切酶。向导RNA可以包含：a)结合于RNA引导的核酸内切酶的蛋白结合区；和b)结合于靶核酸的区域。RNA引导的核酸内切酶在本文中又称为“基因组编辑核酸酶”。
合适的基因组编辑核酸酶的实例为CRISPR/Cas核酸内切酶(例如2类CRISPR/Cas核酸内切酶，例如II型、V型或VI型CRISPR/Cas核酸内切酶)。因此，基因组靶向组合物可以包括CRISPR/Cas核酸内切酶(例如2类CRISPR/Cas核酸内切酶，例如II型、V型或VI型CRISPR/Cas核酸内切酶)。在一些情况下，基因组靶向组合物包括2类CRISPR/Cas核酸内切酶。在一些情况下，基因组靶向组合物包括2类II型CRISPR/Cas核酸内切酶(例如Cas9蛋白)。在一些情况下，基因组靶向组合物包括2类V型CRISPR/Cas核酸内切酶(例如Cpf1蛋白、C2c1蛋白或C2c3蛋白)。在一些情况下，基因组靶向组合物包括2类VI型CRISPR/Cas核酸内切酶(例如C2c2蛋白)。
在一些情况下，基因组编辑核酸酶为与异源多肽(又称为“融合搭配物”)融合的融合蛋白。在一些情况下，基因组编辑核酸酶与提供亚细胞定位的氨基酸序列(融合搭配物)融合，即融合搭配物为亚细胞定位序列(例如一种或多种用于靶向核的核定位信号(NLS)、两种或更多种NLS、三种或更多种NLS等)。
在一些情况下，基因组编辑核酸内切酶为II型CRISPR/Case核酸内切酶。在一些情况下，基因组编辑核酸内切酶为Cas9多肽。Cas9蛋白由于与Cas9向导RNA的蛋白结合区段缔合而被引导至靶核酸序列(例如染色体序列或染色体外序列，例如游离体序列、微环序列、线粒体序列、叶绿体序列等)内的靶位点(例如稳定在靶位点)。在一些情况下，Cas9多肽包含具有与图8A中描绘的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或超过99％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。在一些情况下，用于本公开的组合物或方法中的Cas9多肽为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(saCas9)多肽。在一些情况下，saCas9多肽包含具有与图8B中描绘的saCas9氨基酸序列至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
在一些情况下，合适的Cas9多肽为高保真度(HF)Cas9多肽。Kleinstiver等人(2016)Nature 529:490。举例来说，图8A中描绘的氨基酸序列的氨基酸N497、R661、Q695和Q926经例如丙氨酸取代。举例来说，HF Cas9多肽可以包含具有与图8A中描绘的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列，其中氨基酸N497、R661、Q695和Q926经例如丙氨酸取代。
在一些情况下，合适的Cas9多肽展现改变的PAM特异性。参见例如Kleinstiver等人(2015)Nature 523:481。
在一些情况下，基因组编辑核酸内切酶为V型CRISPR/Cas核酸内切酶。在一些情况下，V型CRISPR/Cas核酸内切酶为Cpf1蛋白。在一些情况下，Cpf1蛋白包含具有与图8C中描绘的Cpf1氨基酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少90％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
结合于2类CRISPR/Cas核酸内切酶(例如Cas9蛋白；V型或VI型CRISPR/Cas蛋白；Cpf1蛋白等)且将复合物靶向靶核酸内的特定位置的核酸在本文中称为“向导RNA”或“CRISPR/Cas向导核酸”或“CRISPR/Cas向导RNA”。向导RNA通过包括靶向区段提供对复合物(RNP复合物)的特异性，所述靶向区段包括向导序列(在本文中又称为靶向序列)，向导序列为与靶核酸的序列互补的核苷酸序列。
在一些情况下，向导RNA包括两个分开的核酸分子：“活化子”和“靶向子”，且在本文中称为“双向导RNA”、“双分子向导RNA”、“两分子向导RNA”或“dgRNA”。在一些情况下，向导RNA为一个分子(例如对于一些2类CRISPR/Cas蛋白，对应的向导RNA为单一分子；且在一些情况下，活化子和靶向子彼此例如经由插入核苷酸而共价连接)，且向导RNA称为“单向导RNA”、“单分子向导RNA”、“一分子向导RNA”或简称为“sgRNA”。
在基因产物为RNA引导的核酸内切酶或为RNA引导的核酸内切酶与向导RNA的情况下，基因产物可以修饰靶核酸。在一些情况下，例如在靶核酸包含缺陷等位基因中的有害突变(例如视网膜细胞靶核酸中的有害突变)的情况下，RNA引导的核酸内切酶/向导RNA复合物与包含校正有害突变的核苷酸序列的供体核酸(例如包含编码由缺陷等位基因编码的蛋白质的功能性拷贝的核苷酸序列的供体核酸)一起可以用于例如经由同源性定向修复(HDR)校正有害突变。
在一些情况下，基因产物为RNA引导的核酸内切酶和2个分开的sgRNA，其中2个分开的sgRNA经由非同源性末端接合(NHEJ)提供靶核酸的缺失。
本公开提供了一种修饰个体中的视网膜细胞中的靶核酸的方法，其中靶核酸包含有害突变，所述方法包括向所述个体施用(例如通过眼内、玻璃体内等施用)本公开的rAAV病毒体，其中所述rAAV病毒体包含含有以下的异源核酸：i)编码RNA引导的核酸内切酶(例如Cas9核酸内切酶)的核苷酸序列；ii)编码包含与靶核酸互补的核苷酸序列的sgRNA的核苷酸序列；和iii)编码包含校正有害突变的核苷酸序列的供体DNA模板的核苷酸序列。rAAV病毒体的施用通过HDR校正靶核酸中的有害突变。
本公开提供了一种修饰个体中的视网膜细胞中的靶核酸的方法，其中靶核酸包含有害突变，所述方法包括向所述个体施用(例如通过眼内、玻璃体内等施用)本公开的rAAV病毒体，其中所述rAAV病毒体包含含有以下的异源核酸：i)编码RNA引导的核酸内切酶(例如Cas9核酸内切酶)的核苷酸序列；ii)编码包含与靶核酸中的第一序列互补的核苷酸序列的第一sgRNA的核苷酸序列；和iii)编码包含与靶核酸中的第二序列互补的核苷酸序列的第二sgRNA的核苷酸序列。rAAV病毒体的施用通过NHEJ切除靶核酸中的有害突变。
调控序列
在一些情况下，编码所关注的基因产物的核苷酸序列可操作地连接于转录控制元件。举例来说，在一些情况下，编码所关注的基因产物的核苷酸序列可操作地连接于组成型启动子。在其它情况下，编码所关注的基因产物的核苷酸序列可操作地连接于诱导型启动子。在一些情况下，编码所关注的基因产物的核苷酸序列可操作地连接于组织特异性或细胞类型特异性调控元件。举例来说，在一些情况下，编码所关注的基因产物的核苷酸序列可操作地连接于视网膜细胞特异性启动子。举例来说，在一些情况下，编码所关注的基因产物的核苷酸序列可操作地连接于光感受器特异性调控元件(例如光感受器特异性启动子)，例如赋予可操作地连接的基因在感光细胞中选择性表达的调控元件。合适的光感受器特异性调控元件包括例如视紫红质启动子；视紫红质激酶启动子(Young等人(2003)Ophthalmol.Vis.Sci.44:4076)；β磷酸二酯酶基因启动子(Nicoud等人(2007)J.GeneMed.9:1015)；视网膜色素变性基因启动子(Nicoud等人(2007)上述)；光感受器间类维生素A结合蛋白(IRBP)基因增强子(Nicoud等人(2007)上述)；IRBP基因启动子(Yokoyama等人(1992)Exp Eye Res.55:225)。
药物组合物
本公开提供了一种药物组合物，其包含：a)如上所述的主题rAAV病毒体；和b)药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或缓冲剂。在一些实施方案中，药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或缓冲剂适合用于人类。
此类赋形剂、载剂、稀释剂和缓冲剂包括可以施用而无过度毒性的任何制药剂。药学上可接受的赋形剂包括(但不限于)例如水、盐水、丙三醇和乙醇等液体。其中可以包括药学上可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等；和有机酸盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。另外，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等等辅助物质可以存在于此类媒剂中。本领域中已知多种药学上可接受的赋形剂且本文中无需详细地论述。药学上可接受的赋形剂已经在多个公布中充分描述，所述公布包括例如A.Gennaro(2000)“Remington:The Science and Practice of Pharmacy,”第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems(1999)H.C.Ansel等人编辑,第7版,Lippincott,Williams,&Wilkins；和Handbookof Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人编辑,第3版Amer.PharmaceuticalAssoc。
将基因产物递送至视网膜细胞的方法和治疗方法
本公开提供了一种将基因产物递送至个体中的视网膜细胞的方法，所述方法包括向所述个体施用如上所述的主题rAAV病毒体。如上所述，基因产物可以是多肽或干扰RNA(例如shRNA、siRNA等等)、适体或位点特异性核酸内切酶(例如RNA引导的核酸内切酶)。基因产物递送至视网膜细胞可以治疗视网膜疾病。视网膜细胞可以是光感受器、视网膜神经节细胞、米勒细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色素上皮细胞。在一些情况下，视网膜细胞为感光细胞，例如视杆或视锥细胞。
本公开提供了一种修饰视网膜细胞中的靶核酸的方法，所述方法包括使视网膜细胞接触：1)本公开的rAAV病毒体，其中所述rAAV病毒体包含异源核酸，所述异源核酸包含编码结合向导RNA的RNA引导的核酸内切酶的核苷酸序列；和2)向导RNA。本公开提供了一种修饰视网膜细胞中的靶核酸的方法，所述方法包括使视网膜细胞接触本公开的rAAV病毒体，其中所述rAAV病毒体包含异源核酸，所述异源核酸包含编码以下的核苷酸序列：i)结合向导RNA的RNA引导的核酸内切酶；和ii)向导RNA。在一些情况下，所述方法包括使视网膜细胞与供体DNA模板接触。在一些情况下，RNA引导的核酸内切酶为Cas9多肽。在一些情况下，向导RNA为单向导RNA。
本公开提供了一种治疗眼病(例如视网膜疾病)的方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的如上所述的主题rAAV病毒体。主题rAAV病毒体可以经由眼球内注射、通过玻璃体内注射或通过任何其它合宜的施用模式或途径施用。其它合宜的施用模式或途径包括例如静脉内、鼻内等等。
“治疗有效量”将在可以通过实验和/或临床试验测定的相对广泛的范围内。举例来说，对于体内注射，即直接注射至眼中，治疗有效剂量将大约为约106至约1015rAAV病毒体，例如约108至1012rAAV病毒体。对于体外转导，待递送至细胞的rAAV病毒体的有效量将大约为约108至约1013rAAV病毒体。其它有效剂量容易由本领域的一般技术人员通过常规试验，确定剂量反应曲线来确定。
在一些实施方案中，超过一次施用(例如两次、三次、四次或更多次施用)可以用以实现所需的基因表达水平。在一些情况下，超过一次施用以多个时间间隔施用，例如每日、每周、半月、每月、每3个月、每6个月、每年施用等等。在一些情况下，多次施用在1个月至2个月、2个月至4个月、4个月至8个月、8个月至12个月、1年至2年、2年至5年或超过5年的时期内施用。
可以使用主题方法治疗的眼病包括(但不限于)急性黄斑神经视网膜病变；白塞氏病(Behcet's disease)；脉络膜新生血管；糖尿病性葡萄膜炎；组织胞浆菌病；黄斑变性，例如急性黄斑变性、非渗出性年龄相关性黄斑变性和渗出性年龄相关性黄斑变性；水肿，例如黄斑水肿、黄斑囊样水肿和糖尿病性黄斑水肿；多灶性脉络膜炎；影响后眼位点或位置的眼外伤；眼肿瘤；视网膜病症，例如视网膜中央静脉阻塞、糖尿病性视网膜病(包括增生性糖尿病性视网膜病)、增生性玻璃体视网膜病变(PVR)、视网膜动脉阻塞性疾病、视网膜剥离、葡萄膜炎视网膜病；交感性眼炎；伏格特-小柳-原田(Vogt Koyanagi-Harada，VKH)综合征；葡萄膜扩散；由眼睛激光治疗引起或受其影响的后眼病状；由光动力学疗法引起或受其影响的后眼病状；光凝、辐射性视网膜病变；视网膜外膜病症；视网膜分支静脉阻塞；前部缺血性视神经病变；非视网膜病变的糖尿病性视网膜功能障碍；视网膜劈裂；视网膜色素变性；青光眼；尤塞氏综合征(Usher syndrome)、视锥-视杆营养不良；斯特格氏病(Stargardtdisease)(眼底黄色斑点症)；遗传性黄斑变性；脉络膜视网膜变性；利伯氏先天性黑朦；先天性静止性夜盲；无脉络膜；巴德-毕德氏综合征(Bardet-Biedl syndrome)；黄斑毛细血管扩张；利伯氏遗传性视神经病变；早产儿视网膜病；色觉障碍，包括全色盲、红色盲、绿色盲和蓝色盲；和比蒂氏结晶样视网膜营养不良(Bietti’s crystalline dystrophy)。
核酸和宿主细胞
本公开提供了一种分离的核酸，其包含编码如上所述的主题变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列，其中相对于对应的亲本AAV衣壳蛋白，所述变异AAV衣壳蛋白在GH环或环IV中包含约5个氨基酸至约20个氨基酸的插入，且其中与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比，所述变异衣壳蛋白在存在于AAV病毒体中时对视网膜细胞的感染性增加。主题分离的核酸可以为AAV载体，例如重组AAV载体。
插入肽
由主题核酸编码的变异AAV衣壳蛋白具有约5个氨基酸至约20个氨基酸长的插入肽，所述插入肽插入AAV衣壳的GH环中。插入肽具有5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸或20个氨基酸的长度。合适的插入肽如上所述。合适的插入肽包括如上所述的式I-X中的任一个的肽。
主题重组AAV载体可以用于产生如上所述的主题重组AAV病毒体。因此，本公开提供一种重组AAV载体，其在引入合适的细胞中时，可以产生主题重组AAV病毒体。
本发明还提供了宿主细胞，例如分离(经遗传修饰)的宿主细胞，其包含主题核酸。主题宿主细胞可以为分离的细胞，例如体外培养的细胞。主题宿主细胞可如下所述用于产生主题rAAV病毒体。在主题宿主细胞用于产生主题rAAV病毒体的情况下，其称为“包装细胞”。在一些实施方案中，主题宿主细胞稳定地经主题核酸遗传修饰。在其它实施方案中，主题宿主细胞短暂地经主题核酸遗传修饰。
使用建立的技术，包括(但不限于)电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质粒介导的转染等等将主题核酸稳定或短暂地引入宿主细胞中。为稳定转化，主题核酸一般还包括可选择的标志物，例如若干众所周知的可选择的标志物中的任一种，例如新霉素抗性等等。
主题宿主细胞通过将主题核酸引入多种细胞中的任一种，例如哺乳动物细胞，包括例如鼠科细胞和灵长类动物细胞(例如人类细胞)中而产生。合适的哺乳动物细胞包括(但不限于)初级细胞和细胞系，其中合适的细胞系包括(但不限于)293细胞、COS细胞、HeLa细胞、Vero细胞、3T3小鼠成纤维细胞、C3H10T1/2成纤维细胞、CHO细胞等等。合适的宿主细胞的非限制性实例包括例如HeLa细胞(例如美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)No.CCL-2)、CHO细胞(例如ATCC No.CRL9618、CCL61、CRL9096)、293细胞(例如ATCC No.CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如ATCC No.CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如ATCC No.CCL10)、PC12细胞(ATCC No.CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCCNo.CRL1651)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCC No.CCLI.3)、人类胚肾(HEK)细胞(ATCCNo.CRL1573)、HLHepG2细胞等等。主题宿主细胞还可以使用杆状病毒感染昆虫细胞如Sf9细胞，产生AAV来制成(参见例如美国专利No.7,271,002；美国专利申请12/297,958)。
在一些实施方案中，除包含编码如上所述的变异AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸外，主题经遗传修饰的宿主细胞还包括包含编码一种或多种AAV rep蛋白的核苷酸序列的核酸。在其它实施方案中，主题宿主细胞还包含rAAV载体。rAAV病毒体可以使用主题宿主细胞产生。产生rAAV病毒体的方法描述于例如美国专利公布No.2005/0053922和美国专利公布No.2009/0202490中。
本公开的非限制性方面的实例
包括实施方案在内的上述本发明的主题的方面在单独或与一个或多个其它方面或实施方案组合下可以为有益的。不限制以上描述，下文提供本公开编号1-34的某些非限制性方面。如本领域的技术人员在阅读本公开后将显而易见，可以使用每个个别编号的方面或与前面或后面个别编号的方面中的任一个组合。此意图为方面的所有此类组合提供支持且不局限于以下明确提供的方面的组合：
方面1.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，其包含：a)变异AAV衣壳蛋白，其中相对于对应的亲本AAV衣壳蛋白，所述变异AAV衣壳蛋白在衣壳蛋白GH环中包含具有5个氨基酸至约20个氨基酸长度的异源肽的插入，且其中与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比，所述变异衣壳蛋白对视网膜细胞的感染性增加；和b)包含编码异源基因产物的核苷酸序列的异源核酸。
方面2.方面1的rAAV病毒体，其中与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比，所述rAAV病毒体展现增加5倍的对视网膜细胞的感染性。
方面3.方面1的rAAV病毒体，其中与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比，所述rAAV病毒体展现增加至少10倍的对视网膜细胞的感染性。
方面4.方面1至3中任一项的rAAV病毒体，其中与包含对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体定位至内核层、外核层、光感受器层、神经节细胞层或视网膜色素上皮细胞的程度相比，所述rAAV病毒体展现增加至少5倍的至内核层、外核层、光感受器层、神经节细胞层和视网膜色素上皮细胞中的一个或多个的定位。
方面5.方面1至4中任一项的rAAV病毒体，其中插入位点介于与AAV2的VP1的氨基酸570和611对应的氨基酸之间，或另一AAV血清型的衣壳蛋白中的对应位置。
方面6.方面1至5中任一项的rAAV病毒体，其中插入位点位于与AAV2的VP1的氨基酸587和588对应的氨基酸之间，或另一AAV血清型的衣壳蛋白中的对应位置。
方面7.方面1至6中任一项的rAAV病毒体，其中基因产物为干扰RNA或适体。
方面8.方面1至6中任一项的rAAV病毒体，其中所述基因产物为多肽。
方面9.方面8的rAAV病毒体，其中所述多肽为神经保护多肽、抗血管生成多肽或增强视网膜细胞的功能的多肽。
方面10.方面8的rAAV病毒体，其中所述多肽为RNA引导的核酸内切酶。
方面11.方面10的rAAV病毒体，其中所述RNA引导的核酸内切酶为Cas9多肽。
方面12.方面10的rAAV病毒体，其中所述基因产物为RNA引导的核酸内切酶和向导RNA。
方面13.方面1至12中任一项的rAAV病毒体，其中插入GH环中的所述异源肽具有式I-X中的任一个。
方面14.方面1至12中任一项的rAAV病毒体，其中所述异源肽为式I的肽：X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，
其中：
X1为Leu、Ile、Pro或Gln；
X2为Ala、Pro、Ser、Asp、Gly、Thr或Val；
X3为Lys、His、Thr、Ile、Pro、Val、Arg、Ala、Asp、Glu、Asn、Gln或Tyr；
X4如果存在，那么为Gln、Asp、Ser、Gly、Thr、Ile、Asn、Glu、Lys或Arg；
X5为Asp、Ser、Gln、Val、Thr、Gly、Ala、Asn、Lys或Tyr；
X6为Thr、Ala、Gln、Ser、Glu、Pro或Ile；
X7为Thr、Ser、Asn、Pro、Leu、Gln、Lys、Ala或Cys；
X8为Lys、Ser、Arg、Thr、Ala、Glu、Ile或Asn；
X9为Asn、Pro、Ser、Lys、His、Ile、Thr或Ala；且
X10为Ala、Phe、Asp、Thr、Val或Met。
方面15.方面14的rAAV病毒体，其中所述异源肽包含以下氨基酸序列中的一种：(1)LAKDATKNA(SEQ ID NO:47)；(2)PAHQDTTKNA(SEQ ID NO:48)；(3)LAHQDTTKNA(SEQ IDNO:49)；(4)LATTSQNKPA(SEQ ID NO:50)；(5)LAISDQTKHA(SEQ ID NO:51)；(6)IARGVAPSSA(SEQ ID NO:52)；(7)LAPDSTTRSA(SEQ ID NO:53)；(8)LAKGTELKPA(SEQ ID NO:54)；(9)LAIIDATKNA(SEQ ID NO:55)；(10)LAVDGAQRSA(SEQ ID NO:56)；(11)PAPQDTTKKA(SEQ IDNO:57)；(12)LPHQDTTKNA(SEQ ID NO:58)；(13)LAKDATKTIA(SEQ ID NO:59)；(14)LAKQQSASTA(SEQ ID NO:60)；(15)LAKSDQSKPA(SEQ ID NO:61)；(16)LSHQDTTKNA(SEQ IDNO:62)；(17)LAANQPSKPA(SEQ ID NO:63)；(18)LAVSDSTKAA(SEQ ID NO:64)；(19)LAAQGTAKKPA(SEQ ID NO:65)；(20)LAPDQTTRNA(SEQ ID NO:66)；(21)LAASDSTKAA(SEQ IDNO:67)；(22)LAPQDTTKNA(SEQ ID NO:68)；(23)LAKADETRPA(SEQ ID NO:69)；(24)LAHQDTAKNA(SEQ ID NO:70)；(25)LAHQDTKKNA(SEQ ID NO:71)；(26)LAHQDTTKHA(SEQ IDNO:72)；(27)LAHQDTTKKA(SEQ ID NO:73)；(28)LAHQDTTRNA(SEQ ID NO:74)；(29)LAHQDTTNA(SEQ ID NO:75)；(30)LAHQGTTKNA(SEQ ID NO:76)；(31)LAHQVTTKNA(SEQ IDNO:77)；(32)LAISDQSKPA(SEQ ID NO:78)；(33)LADATKTA(SEQ ID NO:79)；(34)LAKDTTKNA(SEQ ID NO:80)；(35)LAKSDQSRPA(SEQ ID NO:81)；(36)LAPQDTKKNA(SEQ ID NO:82)；(37)LATSDSTKAA(SEQ ID NO:83)；(38)LAVDGSQRSA(SEQ ID NO:84)；(39)LPISDQTKHA(SEQ IDNO:85)；(40)LPKDATKTIA(SEQ ID NO:86)；(41)LPPQDTTKNA(SEQ ID NO:87)；(42)PAPQDTTKNA(SEQ ID NO:88)；(43)QAHQDTTKNA(SEQ ID NO:89)；(44)LAHETSPRPA(SEQ IDNO:90)；(45)LAKSTSTAPA(SEQ ID NO:91)；(46)LADQDTTKNA(SEQ ID NO:92)；(47)LAESDQSKPA(SEQ ID NO:93)；(48)LAHKDTTKNA(SEQ ID NO:94)；(49)LAHKTQQKM(SEQ IDNO:95)；(50)LAHQDTTENA(SEQ ID NO:96)；(51)LAHQDTTINA(SEQ ID NO:97)；(52)LAHQDTTKKT(SEQ ID NO:98)；(53)LAHQDTTKND(SEQ ID NO:99)；(54)LAHQDTTKNT(SEQ IDNO:100)；(55)LAHQDTTKNV(SEQ ID NO:101)；(56)LAHQDTTKTM(SEQ ID NO:102)；(57)LAHQNTTKNA(SEQ ID NO:103)；(58)LAHRDTTKNA(SEQ ID NO:104)；(59)LAISDQTNHA(SEQ IDNO:105)；(60)LAKQKSASTA(SEQ ID NO:106)；(61)LAKSDQCKPA(SEQ ID NO:107)；(62)LAKSDQSKPD(SEQ ID NO:108)；(63)LAKSDQSNPA(SEQ ID NO:109)；(64)LAKSYQSKPA(SEQ IDNO:110)；(65)LANQDTTKNA(SEQ ID NO:111)；(66)LAPQNTTKNA(SEQ ID NO:112)；(67)LAPSSIQKPA(SEQ ID NO:113)；(68)LAQQDTTKNA(SEQ ID NO:114)；(69)LAYQDTTKNA(SEQ IDNO:115)；(70)LDHQDTTKNA(SEQ ID NO:116)；(71)LDHQDTTKSA(SEQ ID NO:117)；(72)LGHQDTTKNA(SEQ ID NO:118)；(73)LPHQDTTKND(SEQ ID NO:119)；(74)LPHQDTTKNT(SEQ IDNO:120)；(75)LPHQDTTNNA(SEQ ID NO:121)；(76)LTHQDTTKNA(SEQ ID NO:122)；(77)LTKDATKTIA(SEQ ID NO:123)；(78)LTPQDTTKNA(SEQ ID NO:124)；和(79)LVHQDTTKNA(SEQID NO:125)。
方面16.方面1至12中任一项的rAAV病毒体，其中所述异源肽为式II的肽：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，其中：
X1为Leu、Ile或Pro；
X2为Ala、Pro或Ser；
X3为Lys、His、Thr、Ile、Pro、Val、Arg或Ala；
X4(如果存在)为Gln、Asp、Ser、Gly、Thr、Ile或Asn；
X5为Asp、Ser、Gln、Val、Thr、Gly或Ala；
X6为Thr、Ala、Gln、Ser、Glu或Pro；
X7为Thr、Ser、Asn、Pro、Leu、Gln、Lys或Ala；
X8为Lys、Ser、Arg或Thr；
X9为Asn、Pro、Ser、Lys、His、Ile、Thr或Ala；且
X10为Ala。
方面17.方面16的rAAV病毒体，其中所述肽包含以下氨基酸序列中的一种：(1)LAKDATKNA(SEQ ID NO:47)；(2)PAHQDTTKNA(SEQ ID NO:48)；(3)LAHQDTTKNA(SEQ ID NO:49)；(4)LATTSQNKPA(SEQ ID NO:50)；(5)LAISDQTKHA(SEQ ID NO:51)；(6)IARGVAPSSA(SEQID NO:52)；(7)LAPDSTTRSA(SEQ ID NO:53)；(8)LAKGTELKPA(SEQ ID NO:54)；(9)LAIIDATKNA(SEQ ID NO:55)；(10)LAVDGAQRSA(SEQ ID NO:56)；(11)PAPQDTTKKA(SEQ IDNO:57)；(12)LPHQDTTKNA(SEQ ID NO:58)；(13)LAKDATKTIA(SEQ ID NO:59)；(14)LAKQQSASTA(SEQ ID NO:60)；(15)LAKSDQSKPA(SEQ ID NO:61)；(16)LSHQDTTKNA(SEQ IDNO:62)；(17)LAANQPSKPA(SEQ ID NO:63)；(18)LAVSDSTKAA(SEQ ID NO:64)；(19)LAAQGTAKKPA(SEQ ID NO:65)；(20)LAPDQTTRNA(SEQ ID NO:66)；(21)LAASDSTKAA(SEQ IDNO:67)；(22)LAPQDTTKNA(SEQ ID NO:68)；(23)LAKADETRPA(SEQ ID NO:69)；(24)LAHQDTAKNA(SEQ ID NO:70)；(25)LAHQDTKKNA(SEQ ID NO:71)；(26)LAHQDTTKHA(SEQ IDNO:72)；(27)LAHQDTTKKA(SEQ ID NO:73)；(28)LAHQDTTRNA(SEQ ID NO:74)；(29)LAHQDTTNA(SEQ ID NO:75)；(30)LAHQGTTKNA(SEQ ID NO:76)；(31)LAHQVTTKNA(SEQ IDNO:77)；(32)LAISDQSKPA(SEQ ID NO:78)；(33)LADATKTA(SEQ ID NO:79)；(34)LAKDTTKNA(SEQ ID NO:80)；(35)LAKSDQSRPA(SEQ ID NO:81)；(36)LAPQDTKKNA(SEQ ID NO:82)；(37)LATSDSTKAA(SEQ ID NO:83)；(38)LAVDGSQRSA(SEQ ID NO:84)；(39)LPISDQTKHA(SEQ IDNO:85)；(40)LPKDATKTIA(SEQ ID NO:86)；(41)LPPQDTTKNA(SEQ ID NO:87)；和(42)PAPQDTTKNA(SEQ ID NO:88)。
方面18.方面16的rAAV病毒体，其中所述肽包含以下氨基酸序列中的一种：(1)LAKDATKNA(SEQ ID NO:47)；(2)PAHQDTTKNA(SEQ ID NO:48)；(3)LAHQDTTKNA(SEQ ID NO:49)；(4)LATTSQNKPA(SEQ ID NO:50)；(5)LAISDQTKHA(SEQ ID NO:51)；(6)IARGVAPSSA(SEQID NO:52)；(7)LAPDSTTRSA(SEQ ID NO:53)；(8)LAKGTELKPA(SEQ ID NO:54)；(9)LAIIDATKNA(SEQ ID NO:55)；(10)LAVDGAQRSA(SEQ ID NO:56)；(11)PAPQDTTKKA(SEQ IDNO:57)；(12)LPHQDTTKNA(SEQ ID NO:58)；(13)LAKDATKTIA(SEQ ID NO:59)；(14)LAKQQSASTA(SEQ ID NO:60)；(15)LAKSDQSKPA(SEQ ID NO:61)；(16)LSHQDTTKNA(SEQ IDNO:62)；(17)LAANQPSKPA(SEQ ID NO:63)；和(18)LAVSDSTKAA(SEQ ID NO:64)。
方面19.一种药物组合物，其包含：a)方面1至18中任一项的重组腺相关病毒病毒体；和b)药学上可接受的赋形剂。
方面20.一种将基因产物递送至个体中的视网膜细胞的方法，所述方法包括向所述个体施用方面1至18中任一项的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体。
方面21.方面20的方法，其中所述基因产物为多肽。
方面22.方面20的方法，其中所述基因产物为短干扰RNA或适体。
方面23.方面21的方法，其中所述多肽为神经保护因子、抗血管生成多肽、抗细胞凋亡因子或增强视网膜细胞的功能的多肽。
方面24.方面21的方法，其中所述多肽为神经胶质源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子2、神经秩蛋白、睫状神经营养因子、神经生长因子、脑源性神经营养因子、表皮生长因子、视紫红质、X连锁凋亡抑制因子、视网膜劈裂蛋白、RPE65、视网膜色素变性GTP酶相互作用蛋白-1、外周蛋白、外周蛋白-2、视紫红质、RdCVF、视网膜色素变性GTP酶调控因子(RPGR)或音猬因子。
方面25.方面21的方法，其中所述多肽为RNA引导的核酸内切酶。
方面26.一种治疗眼病的方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的方面1至18中任一项所述的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体。
方面27.方面26的方法，其中所述施用是通过眼球内注射。
方面28.方面26的方法，其中所述施用是通过玻璃体内注射。
方面29.方面26的方法，其中所述眼病为青光眼、视网膜色素变性、黄斑变性、视网膜劈裂症、利伯氏先天性黑朦(Leber’s Congenital Amaurosis)、糖尿病性视网膜病、全色盲或色盲。
方面30.一种分离的核酸，其包含编码变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列，其中所述变异AAV衣壳蛋白相对于对应的亲本AAV衣壳蛋白，在衣壳蛋白GH环中包含约5个氨基酸至约20个氨基酸的插入，且其中所述变异衣壳蛋白在存在于AAV病毒体中时，增加所述AAV病毒体对视网膜细胞的感染性，且其中所述氨基酸插入在天然AAV衣壳的GH环中，其中所述插入为具有式I-X中的任一个的肽。
方面31.方面30的分离的核酸，其中所述插入位点介于AAV2的氨基酸587与588之间、AAV1的氨基酸590与591之间、AAV5的氨基酸575与576之间、AAV6的氨基酸590与591之间、AAV7的氨基酸589与590之间、AAV8的氨基酸590与591之间、AAV9的氨基酸588与589之间或AAV10的氨基酸588与589之间。
方面32.一种分离的经遗传修饰的宿主细胞，其包含方面30或方面31的核酸。
方面33.一种变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述变异AAV衣壳蛋白包含约5个氨基酸至约20个氨基酸的插入，其中所述氨基酸插入在天然AAV衣壳的GH环中，其中所述插入为具有式I-X中的任一个的肽。
方面34.在方面1至33中的任一项中，插入GH环中的所述异源肽可以具有式I-X中的一个，其中：
式I为X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，其中：
X1为Leu、Ile、Pro或Gln；
X2为Ala、Pro、Ser、Asp、Gly、Thr或Val；
X3为Lys、His、Thr、Ile、Pro、Val、Arg、Ala、Asp、Glu、Asn、Gln或Tyr；
X4(如果存在)为Gln、Asp、Ser、Gly、Thr、Ile、Asn、Glu、Lys或Arg；
X5为Asp、Ser、Gln、Val、Thr、Gly、Ala、Asn、Lys或Tyr；
X6为Thr、Ala、Gln、Ser、Glu、Pro或Ile；
X7为Thr、Ser、Asn、Pro、Leu、Gln、Lys、Ala或Cys；
X8为Lys、Ser、Arg、Thr、Ala、Glu、Ile或Asn；
X9为Asn、Pro、Ser、Lys、His、Ile、Thr或Ala；且
X10为Ala、Phe、Asp、Thr、Val或Met；
式II为X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，其中：
X1为Leu、Ile或Pro；
X2为Ala、Pro或Ser；
X3为Lys、His、Thr、Ile、Pro、Val、Arg或Ala；
X4(如果存在)为Gln、Asp、Ser、Gly、Thr、Ile或Asn；
X5为Asp、Ser、Gln、Val、Thr、Gly或Ala；
X6为Thr、Ala、Gln、Ser、Glu或Pro；
X7为Thr、Ser、Asn、Pro、Leu、Gln、Lys或Ala；
X8为Lys、Ser、Arg或Thr；
X9为Asn、Pro、Ser、Lys、His、Ile、Thr或Ala；且
X10为Ala；
式III为X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，其中：
X1为Leu、Ile或Pro；
X2为Ala、Pro或Ser；
X3为Lys、His、Thr、Ile、Pro、Val、Arg或Ala；
X4(如果存在)为Gln、Asp、Ser、Gly、Thr、Ile或Asn；
X5为Asp、Ser、Gln、Val、Thr、Gly或Ala；
X6为Thr、Ala、Gln、Ser、Glu或Pro；
X7为Thr、Ser、Asn、Pro、Leu、Gln、Lys或Ala；
X8为Lys、Ser、Arg或Thr；
X9为Asn、Pro、Ser、Lys、His、Ile、Thr或Ala；且
X10为Ala、Thr、Asp Val或Met；
式IV为X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，其中：
X1为Leu；
X2为Ala；
X3为Lys、His、Thr、Ile、Pro或Val；
X4(如果存在)为Gln、Asp、Ser或Gly；
X5为Asp、Ser或Gln；
X6为Thr、Ala、Gln或Ser；
X7为Thr或Ser；
X8为Lys、Ser或Arg；
X9为Asn、Pro或Ser；且
X10为Ala；
式V为X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，其中：
X1为Leu；
X2为Ala；
X3为Lys或His；
X4(如果存在)为Gln、Asp、Ser或Gly；
X5为Asp、Ser或Gln；
X6为Thr、Ala、Gln或Ser；
X7为Thr或Ser；
X8为Lys、Ser或Arg；
X9为Asn、Pro或Ser；且
X10为Ala；
式VI为X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，其中：
X1为Leu；
X2为Ala；
X3为Asn、Lys、Thr、Gln、Ser、Ile或Leu；
X4为Ser、Ala、Thr、Glu、Gln、Gly、Lys或Pro；
X5为Asp、Pro、Glu、Thr、Asn或Arg；
X6为Ile、His、Thr、Gln、Asn、Tyr、Asp或Glu；
X7为Gln、Thr、Asn、Ala或Lys；
X8为Lys、Thr、Arg或Asp；
X9为Pro、Asn、Thr、Arg、Lys或Ser；且
X10为Ala；
式VII为LAHQDTTKX1X2X3(SEQ ID NO:148)，其中X1为Lys、Thr、Asn或His；X2为Ala、Thr、Val、Ile、Met或Asp；且X3如果存在，那么为Ala；
式VIII为LAX1QX2TX3X4X5X6(SEQ ID NO:149)，其中X1为Ala、Pro、Asp或His；X2为Gly或Asp；X3为Ala、Thr或Lys；X4为Asn、Glu、Lys、Arg或Thr；X5为Leu、Asn、Lys或Thr；且X6如果存在，那么为Ala、Thr、Asp、Val或Met；
式IX为X1AX2X3DX4TKX5A(SEQ ID NO:150)，其中X1为Val或Leu；X2为Ile、Val、His或Asp；X3为Glu、Ser、Lys或Gln；X4为His、Ser或Thr；且X5为Ser、Ala、Asn、His或Lys；且
式X为X1X2X3AX4QX5TX6KNA(SEQ ID NO:151)，其中X1如果存在，那么为Leu；X2如果存在，那么为Ala；X3为Lys、Leu或Pro；X4为Asn、His、Pro或Tyr；X5为Asn、Gly、Val或Asp；且X6为Pro或Thr。
实施例
提出以下实施例以便为一般技术者提供关于如何进行和使用本发明的完整公开和描述，且既不意图限制本发明人视为其发明的范围，也不意图表示以下实验是所执行的全部或唯一实验。虽然努力确保关于所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指示，否则份为重量份，分子量为重量平均分子量，温度为摄氏温度，且压力为大气压或接近大气压。可能使用标准缩写，例如bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌肉内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下等等。
实施例1：具有AAV衣壳变体的AAV病毒体的产生和表征
迭代体内筛选方法用于产生具有能克服显著和复杂障碍的衣壳变体的AAV，预防大型动物眼睛中的全视网膜AAV感染。犬为视网膜变性疾病重要的临床前模型，其眼睛尺寸和结构类似于人类，且视网膜疾病的许多形式在多种犬品种中是天然存在的。筛选法用于鉴别96种能够在犬科视网膜中进行全视网膜感染的AAV变体。深度测序用于定量来自筛选的AAV变体池的这些变体中的18种在犬科视网膜中的性能。基于玻璃体内注射后视网膜细胞中的病毒DNA和mRNA的水平定量感染性。这些变体可以用于大型动物和人眼中的多种基因递送策略。
产生在AAV衣壳上的表面暴露位置含有随机21核苷酸插入(被5’6-核苷酸连接子和3’3-核苷酸连接子围绕)的肽呈现库。包装病毒，使得每个病毒基因组被包壳在该基因组编码的衣壳蛋白壳内。因此，通过选择而鉴别的功能改善可以连接于病毒衣壳内所含有的基因组序列。由此库，使用迭代体内筛选选择过程鉴别能够从玻璃体感染犬科视网膜的变体(图1)。每轮向犬科眼睛注射约250μL 10E+13-10E+14病毒基因组/mL(vg/mL)滴度病毒。注射三周后，摘出眼睛，且从视网膜的中央和边缘区域取出视网膜穿孔。将RPE细胞从视网膜组织分离，并将组织冷冻。接着从视网膜细胞收集DNA，且将cap基因从分离的样品进行聚合酶链反应(PCR)扩增。cap基因用于随后的AAV包装。
图1.定向进化法的例示，用于研发犬科视网膜AAV变体。产生肽呈现库，包装成AAV载体，并经由玻璃体内注射来注射至犬科眼睛中。迭代数轮的选择用于从载体池阳性选择AAV变体。三轮选择后为一轮易错PCR，接着为额外的数轮选择。
在5轮选择后，Illumina深度测序用于鉴别AAV变体库中相对表示在数轮中增加的变体。病毒库中表示的增加表明阳性选择和从玻璃体感染犬科视网膜的能力。从约10E+7变体的库中，在体内筛选中选择的最高96种变体提供于表1中。
表1
Figure BDA0003635296510000661
Figure BDA0003635296510000671
Figure BDA0003635296510000681
使用高通量测序进一步定量表1中描绘的96种变体中的最高18种变体感染犬科视网膜的能力。表2描绘选择用于进一步定量的最高18种变体。
表2
Figure BDA0003635296510000682
用驱动GFP表达的普遍CAG启动子，包装十八种变体。GFP cDNA与独特的25碱基对条形码标识符融合。18种变体中的每一种用独特的GFP条型码包装。将包装的变体以同等比率混合，且与对照的基于AAV2的载体(代表天然存在的亲本血清型的阴性对照)一起注射至视网膜中。注射后，从光感受器和RPE细胞收集DNA和mRNA。对DNA和mRNA水平进行定量以测定犬科来源的载体递送DNA至视网膜和引起转基因表达的能力(图2)。
图2.含有GFP-条型码构建体的变体的深度测序。犬科来源的变体对犬科视网膜的感染通过标记GFP cDNA和mRNA的深度测序来定量。
使用冷冻的视网膜切片的共焦显微术将18成员库的表达成像。GFP表达表明18成员库靶向内视网膜中的视网膜细胞和外视网膜中的光感受器(图3)。
图3.18成员犬科来源的AAV变体库感染神经节细胞层、内核层、光感受器层和RPE层中的细胞。
在测试的最高18种变体中，2种变体引起最高水平的DNA和mRNA恢复。引起最高水平的DNA恢复的变体具有插入序列～588-PAPQDTTKKA(SEQ ID NO:57)。引起最高水平的mRNA表达的变体具有插入序列～588-LAPDSTTRSA(SEQ ID NO:53)。
虽然本发明已经参考其特定的实施方案描述，但应了解本领域的技术人员可以进行多种改变且可以在不脱离本发明真实的精神和范围下用同等物替代。另外，可以进行许多改变以使具体的情况、材料、物质组合物、方法、方法步骤适应本发明的目标、精神和范围。所有这类的改变意图在这里附上的权利要求书的范围内。
序列表
<110> 加利福尼亚大学董事会
宾夕法尼亚州大学理事会
<120> 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体和其使用方法
<130> BERK-335WO
<150> 62/368,929
<151> 2016-07-29
<160> 152
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 733
<212> PRT
<213> 腺相关病毒-2
<400> 1
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435 440 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450 455 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485 490 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500 505 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515 520 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530 535 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545 550 555 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565 570 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr
580 585 590
Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp
595 600 605
Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr
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Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys
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His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn
645 650 655
Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln
660 665 670
Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys
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Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr
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Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr
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Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
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<211> 42
<212> PRT
<213> 腺相关病毒-2
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Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu
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Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val
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<213> 腺相关病毒-1
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Ser Ser Thr Asp Pro Ala Thr Gly Asp Val His Ala Met Gly Ala Leu
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Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val
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<212> PRT
<213> 腺相关病毒-5
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Ser Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val
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Pro Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val
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<211> 42
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<213> 腺相关病毒-6
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Ser Ser Thr Asp Pro Ala Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu
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<213> 腺相关病毒-8
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<213> 智人
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Met Ser Arg Lys Ile Glu Gly Phe Leu Leu Leu Leu Leu Phe Gly Tyr
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<212> PRT
<213> 智人
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Asn Ser Thr Glu Ala Ala Asp Ser Ala Phe Leu Pro Thr Glu Asp Glu
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Ser Leu Ser Thr Met Ser Cys Glu Met Leu Thr Glu Gln Thr Pro Ser
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Ser Asp Pro Glu Asn Ala Leu Glu Val Asn Gly Ala Glu Val Thr Gly
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Glu Lys Glu Asn His Cys Asp Asp Lys Thr Cys Val Pro Ser Thr Ser
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Gln Pro Lys Lys Asn Arg Ile Thr Tyr Ser Gln Ile Ile Lys Glu Gly
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Arg Arg Phe Asn Ile Asp Leu Val Ser Lys Leu Leu Tyr Ser Arg Gly
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Leu Leu Ile Asp Leu Leu Ile Lys Ser Asn Val Ser Arg Tyr Ala Glu
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Phe Lys Asn Ile Thr Arg Ile Leu Ala Phe Arg Glu Gly Arg Val Glu
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
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1295 1300 1305
Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320
Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
<210> 33
<211> 1053
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 33
Met Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly
20 25 30
Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg
35 40 45
Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile
50 55 60
Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His
65 70 75 80
Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu
85 90 95
Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu
100 105 110
Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr
115 120 125
Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala
130 135 140
Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys
145 150 155 160
Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr
165 170 175
Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln
180 185 190
Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg
195 200 205
Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys
210 215 220
Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe
225 230 235 240
Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr
245 250 255
Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn
260 265 270
Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe
275 280 285
Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu
290 295 300
Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys
305 310 315 320
Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr
325 330 335
Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala
340 345 350
Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu
355 360 365
Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser
370 375 380
Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile
385 390 395 400
Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala
405 410 415
Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln
420 425 430
Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro
435 440 445
Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile
450 455 460
Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg
465 470 475 480
Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys
485 490 495
Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr
500 505 510
Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp
515 520 525
Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu
530 535 540
Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro
545 550 555 560
Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys
565 570 575
Gln Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu
580 585 590
Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile
595 600 605
Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu
610 615 620
Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp
625 630 635 640
Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu
645 650 655
Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys
660 665 670
Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp
675 680 685
Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp
690 695 700
Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys
705 710 715 720
Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys
725 730 735
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755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu
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Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile
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Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp
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900 905 910
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915 920 925
Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser
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Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala
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965 970 975
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980 985 990
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Thr Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn Leu
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Tyr Glu Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys Gly
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<210> 34
<211> 1300
<212> PRT
<213> 土拉热弗朗西丝菌
<400> 34
Met Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys
20 25 30
Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys
35 40 45
Lys Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu
50 55 60
Ile Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser
65 70 75 80
Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys
85 90 95
Asp Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr
100 105 110
Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile
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Ser Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr
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Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr
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Thr Tyr Phe Lys Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Asn Val Tyr Ser Ser
180 185 190
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Pro Lys Phe Leu Glu Asn Lys Ala Lys Tyr Glu Ser Leu Lys Asp Lys
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260 265 270
Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys
275 280 285
Phe Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile
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Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys
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Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser
325 330 335
Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met
340 345 350
Gln Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys
355 360 365
Ser Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln
370 375 380
Lys Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr
385 390 395 400
Asp Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Val Ile Gly Thr Ala
405 410 415
Val Leu Glu Tyr Ile Thr Gln Gln Ile Ala Pro Lys Asn Leu Asp Asn
420 425 430
Pro Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala
435 440 445
Lys Tyr Leu Ser Leu Glu Thr Ile Lys Leu Ala Leu Glu Glu Phe Asn
450 455 460
Lys His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala
465 470 475 480
Asn Phe Ala Ala Ile Pro Met Ile Phe Asp Glu Ile Ala Gln Asn Lys
485 490 495
Asp Asn Leu Ala Gln Ile Ser Ile Lys Tyr Gln Asn Gln Gly Lys Lys
500 505 510
Asp Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Asp Asp Val Lys Ala Ile Lys Asp
515 520 525
Leu Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His
530 535 540
Ile Ser Gln Ser Glu Asp Lys Ala Asn Ile Leu Asp Lys Asp Glu His
545 550 555 560
Phe Tyr Leu Val Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Leu Ala Asn Ile Val
565 570 575
Pro Leu Tyr Asn Lys Ile Arg Asn Tyr Ile Thr Gln Lys Pro Tyr Ser
580 585 590
Asp Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn Ser Thr Leu Ala Asn Gly
595 600 605
Trp Asp Lys Asn Lys Glu Pro Asp Asn Thr Ala Ile Leu Phe Ile Lys
610 615 620
Asp Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ile
625 630 635 640
Phe Asp Asp Lys Ala Ile Lys Glu Asn Lys Gly Glu Gly Tyr Lys Lys
645 650 655
Ile Val Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val
660 665 670
Phe Phe Ser Ala Lys Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Pro Ser Glu Asp Ile
675 680 685
Leu Arg Ile Arg Asn His Ser Thr His Thr Lys Asn Gly Ser Pro Gln
690 695 700
Lys Gly Tyr Glu Lys Phe Glu Phe Asn Ile Glu Asp Cys Arg Lys Phe
705 710 715 720
Ile Asp Phe Tyr Lys Gln Ser Ile Ser Lys His Pro Glu Trp Lys Asp
725 730 735
Phe Gly Phe Arg Phe Ser Asp Thr Gln Arg Tyr Asn Ser Ile Asp Glu
740 745 750
Phe Tyr Arg Glu Val Glu Asn Gln Gly Tyr Lys Leu Thr Phe Glu Asn
755 760 765
Ile Ser Glu Ser Tyr Ile Asp Ser Val Val Asn Gln Gly Lys Leu Tyr
770 775 780
Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ala Tyr Ser Lys Gly Arg
785 790 795 800
Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn
805 810 815
Leu Gln Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr
820 825 830
Arg Lys Gln Ser Ile Pro Lys Lys Ile Thr His Pro Ala Lys Glu Ala
835 840 845
Ile Ala Asn Lys Asn Lys Asp Asn Pro Lys Lys Glu Ser Val Phe Glu
850 855 860
Tyr Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe
865 870 875 880
His Cys Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe
885 890 895
Asn Asp Glu Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His
900 905 910
Ile Leu Ser Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu
915 920 925
Val Asp Gly Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile
930 935 940
Gly Asn Asp Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile
945 950 955 960
Glu Lys Asp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Asp Trp Lys Lys Ile Asn Asn
965 970 975
Ile Lys Glu Met Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val His Glu Ile
980 985 990
Ala Lys Leu Val Ile Glu Tyr Asn Ala Ile Val Val Phe Glu Asp Leu
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Asn Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Val
1010 1015 1020
Tyr Gln Lys Leu Glu Lys Met Leu Ile Glu Lys Leu Asn Tyr Leu
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Val Phe Lys Asp Asn Glu Phe Asp Lys Thr Gly Gly Val Leu Arg
1040 1045 1050
Ala Tyr Gln Leu Thr Ala Pro Phe Glu Thr Phe Lys Lys Met Gly
1055 1060 1065
Lys Gln Thr Gly Ile Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Gly Phe Thr Ser
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Lys Ile Cys Pro Val Thr Gly Phe Val Asn Gln Leu Tyr Pro Lys
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Tyr Glu Ser Val Ser Lys Ser Gln Glu Phe Phe Ser Lys Phe Asp
1100 1105 1110
Lys Ile Cys Tyr Asn Leu Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Ser Phe
1115 1120 1125
Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Asp Lys Ala Ala Lys Gly Lys Trp Thr
1130 1135 1140
Ile Ala Ser Phe Gly Ser Arg Leu Ile Asn Phe Arg Asn Ser Asp
1145 1150 1155
Lys Asn His Asn Trp Asp Thr Arg Glu Val Tyr Pro Thr Lys Glu
1160 1165 1170
Leu Glu Lys Leu Leu Lys Asp Tyr Ser Ile Glu Tyr Gly His Gly
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Glu Cys Ile Lys Ala Ala Ile Cys Gly Glu Ser Asp Lys Lys Phe
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Phe Ala Lys Leu Thr Ser Val Leu Asn Thr Ile Leu Gln Met Arg
1205 1210 1215
Asn Ser Lys Thr Gly Thr Glu Leu Asp Tyr Leu Ile Ser Pro Val
1220 1225 1230
Ala Asp Val Asn Gly Asn Phe Phe Asp Ser Arg Gln Ala Pro Lys
1235 1240 1245
Asn Met Pro Gln Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Gly
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Leu Met Leu Leu Gly Arg Ile Lys Asn Asn Gln Glu
1265 1270 1275
Gly Lys Lys Leu Asn Leu Val Ile Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Glu
1280 1285 1290
Phe Val Gln Asn Arg Asn Asn
1295 1300
<210> 35
<211> 297
<212> PRT
<213> 腺相关病毒-1
<400> 35
Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala
1 5 10 15
His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr
20 25 30
Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn
35 40 45
Lys Asp Leu Leu Phe Ser Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln
50 55 60
Pro Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser
65 70 75 80
Lys Thr Lys Thr Asp Asn Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala
85 90 95
Ser Lys Tyr Asn Leu Asn Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr
100 105 110
Ala Met Ala Ser His Lys Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser
115 120 125
Gly Val Met Ile Phe Gly Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala
130 135 140
Leu Asp Asn Val Met Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn
145 150 155 160
Pro Val Ala Thr Glu Arg Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Phe Lys Asp
165 170 175
Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly Lys
180 185 190
Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile Thr
195 200 205
Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg Phe
210 215 220
Gly Thr Val Ala Val Asn Phe Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala Thr
225 230 235 240
Gly Asp Val His Ala Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp
245 250 255
Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr
260 265 270
Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys
275 280 285
Asn Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys
290 295
<210> 36
<211> 240
<212> PRT
<213> 腺相关病毒-6
<400> 36
Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala
1 5 10 15
His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr
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Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn
35 40 45
Lys Asp Leu Leu Phe Ser Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln
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Pro Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser
65 70 75 80
Lys Thr Lys Thr Asp Asn Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala
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Ser Lys Tyr Asn Leu Asn Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr
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Ala Met Ala Ser His Lys Asp Asp Lys Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser
115 120 125
Gly Val Met Ile Phe Gly Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala
130 135 140
Leu Asp Asn Val Met Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn
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Pro Val Ala Thr Glu Arg Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Ser Thr Asp Pro Ala Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu
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Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile
195 200 205
Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu
210 215 220
Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys
225 230 235 240
<210> 37
<211> 240
<212> PRT
<213> 腺相关病毒-3
<400> 37
Phe Ser Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His
1 5 10 15
Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu
20 25 30
Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln
35 40 45
Ser Arg Leu Leu Phe Ser Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln
50 55 60
Ala Arg Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser
65 70 75 80
Lys Thr Ala Asn Asp Asn Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala
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Ser Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro
100 105 110
Ala Met Ala Ser His Lys Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His
115 120 125
Gly Asn Leu Ile Phe Gly Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu
130 135 140
Leu Asp Asn Val Met Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn
145 150 155 160
Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser
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Ser Asn Thr Ala Pro Thr Thr Gly Thr Val Asn His Gln Gly Ala Leu
180 185 190
Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile
195 200 205
Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu
210 215 220
Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys
225 230 235 240
<210> 38
<211> 240
<212> PRT
<213> 腺相关病毒-2
<400> 38
Phe Ser Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His
1 5 10 15
Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu
20 25 30
Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser
35 40 45
Arg Leu Gln Phe Ser Gln Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser
50 55 60
Arg Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys
65 70 75 80
Thr Ser Ala Asp Asn Asn Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr
85 90 95
Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala
100 105 110
Met Ala Ser His Lys Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly
115 120 125
Val Leu Ile Phe Gly Lys Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile
130 135 140
Glu Lys Val Met Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro
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Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly
165 170 175
Asn Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro
180 185 190
Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp
195 200 205
Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met
210 215 220
Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn
225 230 235 240
<210> 39
<211> 243
<212> PRT
<213> 腺相关病毒-8
<400> 39
Asn Phe Gln Phe Thr Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser
1 5 10 15
Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp
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Asn Thr Gln Thr Leu Gly Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala
50 55 60
Asn Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg
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Ala Gly Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro
100 105 110
Gly Ile Ala Met Ala Thr His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro
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Ser Asn Gly Ile Leu Ile Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn
130 135 140
Ala Asp Tyr Ser Asp Val Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr
145 150 155 160
Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu
165 170 175
Gln Gln Gln Asn Thr Ala Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly
180 185 190
Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly
195 200 205
Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser
210 215 220
Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu
225 230 235 240
Ile Lys Asn
<210> 40
<211> 243
<212> PRT
<213> 腺相关病毒-8.1
<400> 40
Asn Phe Gln Phe Thr Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser
1 5 10 15
Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp
20 25 30
Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala
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Gly Ile Ala Met Ala Thr His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro
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Ser Asn Gly Ile Leu Ile Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn
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Ala Asp Tyr Ser Asp Val Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr
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Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu
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Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser
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Ile Lys Asn
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100 105 110
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115 120 125
Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Asn Asp Gly Val Asp
130 135 140
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Asn
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<213> 腺相关病毒-10
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Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Val
1 5 10
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 102
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Thr Met
1 5 10
<210> 103
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 103
Leu Ala His Gln Asn Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 104
Leu Ala His Arg Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 105
Leu Ala Ile Ser Asp Gln Thr Asn His Ala
1 5 10
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 106
Leu Ala Lys Gln Lys Ser Ala Ser Thr Ala
1 5 10
<210> 107
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 107
Leu Ala Lys Ser Asp Gln Cys Lys Pro Ala
1 5 10
<210> 108
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 108
Leu Ala Lys Ser Asp Gln Ser Lys Pro Asp
1 5 10
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 109
Leu Ala Lys Ser Asp Gln Ser Asn Pro Ala
1 5 10
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 110
Leu Ala Lys Ser Tyr Gln Ser Lys Pro Ala
1 5 10
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 111
Leu Ala Asn Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 112
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 112
Leu Ala Pro Gln Asn Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 113
Leu Ala Pro Ser Ser Ile Gln Lys Pro Ala
1 5 10
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 114
Leu Ala Gln Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 115
Leu Ala Tyr Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 116
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 116
Leu Asp His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 117
Leu Asp His Gln Asp Thr Thr Lys Ser Ala
1 5 10
<210> 118
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 118
Leu Gly His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 119
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 119
Leu Pro His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Asp
1 5 10
<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 120
Leu Pro His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Thr
1 5 10
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 121
Leu Pro His Gln Asp Thr Thr Asn Asn Ala
1 5 10
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 122
Leu Thr His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 123
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 123
Leu Thr Lys Asp Ala Thr Lys Thr Ile Ala
1 5 10
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 124
Leu Thr Pro Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 125
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 125
Leu Val His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 126
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 126
Leu Ala Lys Ala Asn Gln Asn Thr Pro Ala
1 5 10
<210> 127
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 127
Leu Ala Thr Thr Pro Ile Thr Lys Pro Ala
1 5 10
<210> 128
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 128
Leu Ala Thr Thr Pro Ile Ala Lys Pro Ala
1 5 10
<210> 129
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 129
Leu Ala Ile Glu Asp His Thr Lys Ser Ala
1 5 10
<210> 130
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 130
Leu Ala Gln Ser Glu His Gln Arg Pro Ala
1 5 10
<210> 131
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 131
Leu Ala Lys Ser Pro Asn Lys Asp Asn Ala
1 5 10
<210> 132
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 132
Leu Ala Asn Gln Asp Tyr Thr Lys Thr Ala
1 5 10
<210> 133
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 133
Leu Ala Asn Ser Thr Asp Gln Thr Arg Ala
1 5 10
<210> 134
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 134
Leu Ala Leu Gly Glu Thr Thr Arg Pro Ala
1 5 10
<210> 135
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 135
Leu Ala Asn Ser Thr Glu Gln Thr Arg Ala
1 5 10
<210> 136
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 136
Leu Ala Gln Ala Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 137
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 137
Leu Ala Ser Lys Asp Ile Thr Lys Thr Ala
1 5 10
<210> 138
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 138
Leu Ala Ser Pro Arg His Asn Lys Lys Cys
1 5 10
<210> 139
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 139
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Thr Ile Ala
1 5 10
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 140
Leu Ala Ala Gln Gly Thr Ala Asn Leu
1 5
<210> 141
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 141
Val Ala Ile Glu Asp His Thr Lys Ser Ala
1 5 10
<210> 142
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 142
Leu Ala Lys Ala Asn Gln Asn Thr Pro Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 143
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa为任何氨基酸
<400> 143
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Lys Xaa
1 5 10
<210> 144
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 144
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Lys Asp
1 5 10
<210> 145
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 145
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Lys Val
1 5 10
<210> 146
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 146
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Lys Met
1 5 10
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 147
Leu Gly Glu Thr Thr Arg Pro
1 5
<210> 148
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa为Lys、Thr、Asn或His
<220>
<221> Misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa为Ala、Thr、Val、Ile、Met或Asp
<220>
<221> Misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa为Ala
<400> 148
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为Ala、Pro、Asp或His
<220>
<221> Misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa为Gly或Asp
<220>
<221> Misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa为Ala、Thr或Lys
<220>
<221> Misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为Asn、Glu、Lys、Arg或Thr
<220>
<221> Misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa为Leu、Asn、Lys或Thr
<220>
<221> Misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa为Ala、Thr、Asp、Val或Met
<400> 149
Leu Ala Xaa Gln Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 150
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa为Val或Leu
<220>
<221> Misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为Ile、Val、His或Asp
<220>
<221> Misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa为Glu、Ser、Lys或Gln
<220>
<221> Misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa为His、Ser或Thr
<220>
<221> Misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa为Ser、Ala、Asn、His或Lys
<400> 150
Xaa Ala Xaa Xaa Asp Xaa Thr Lys Xaa Ala
1 5 10
<210> 151
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa为Leu
<220>
<221> Misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Ala
<220>
<221> Misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为 Lys、Leu或Pro
<220>
<221> Misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa为 Asn、His、Pro或Tyr
<220>
<221> Misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa为 Asn、Gly、Val或Asp
<220>
<221> Misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa为 Pro或Thr
<400> 151
Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Gln Xaa Thr Xaa Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 152
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 152
cgcaaucagu gaaugcuuau acauccg 27

Claims (25)

1.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，其包含：
a)变异AAV衣壳蛋白，其中相对于对应的亲本AAV衣壳蛋白，所述变异AAV衣壳蛋白在衣壳蛋白GH环中包含具有10个氨基酸至20个氨基酸长度的异源肽的插入，
其中所述异源肽包含下式I所示的氨基酸序列：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，
其中：
X1为Leu、Ile、Pro或Gln；
X2为Ala；
X3为Pro；
X4为Asp；
X5为Ser；
X6为Thr；
X7为Thr；
X8为Arg；
X9为Asn、Pro、Ser、Lys、His、Ile、Thr或Ala；且
X10为Ala、Phe、Asp、Thr、Val或Met，并且
其中与包含所述对应的亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比，所述变异衣壳蛋白赋予增加的对视网膜细胞的感染性；以及
b)异源核酸，所述异源核酸包含编码异源基因产物的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的rAAV病毒体，其中与包含所述对应的亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比，所述rAAV病毒体展现增加至少5倍的对视网膜细胞的感染性，和/或其中与包含所述对应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体定位至内核层、外核层、光感受器层、神经节细胞层或视网膜色素上皮细胞的程度相比，所述rAAV病毒体展现增加至少5倍的至内核层、外核层、光感受器层、神经节细胞层和视网膜色素上皮细胞中的一个或多个的定位。
3.根据权利要求1或2所述的rAAV病毒体，其中插入位点介于与AAV2的VP1的氨基酸570和611对应的氨基酸之间，或另一AAV血清型的衣壳蛋白中的对应位置。
4.根据权利要求3所述的rAAV病毒体，其中所述插入位点位于与AAV2的VP1的氨基酸587和588对应的氨基酸之间，或另一AAV血清型的衣壳蛋白中的对应位置。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述基因产物是：
a)短干扰RNA或适体；
b)多肽，任选地其中所述多肽为神经保护多肽、抗血管生成多肽、抗细胞凋亡因子、或增强视网膜细胞的功能的多肽、或RNA引导的核酸内切酶；或
c)RNA引导的核酸内切酶和向导RNA。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述异源基因产物为神经胶质源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子2、神经秩蛋白、睫状神经营养因子、神经生长因子、脑源性神经营养因子、表皮生长因子、视紫红质、X连锁凋亡抑制因子、视网膜劈裂蛋白、RPE65、视网膜色素变性GTP酶相互作用蛋白-1、外周蛋白、外周蛋白-2、视紫红质、RdCVF、视网膜色素变性GTP酶调控因子(RPGR)或音猬因子。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述异源肽包含氨基酸序列LAPDSTTRSA(SEQ ID NO:53)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述异源肽具有约12-20个氨基酸的长度。
9.一种药物组合物，其包含：
a)权利要求1至8中任一项所述的重组腺相关病毒病毒体；和
b)药学上可接受的赋形剂。
10.权利要求1至8中任一项所述的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体在制备用于将基因产物递送至个体中的视网膜细胞的方法的药物组合物中的用途，其中所述方法包括向所述个体施用权利要求1至8中任一项所述的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体。
11.权利要求1至8中任一项所述的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体在制备用于治疗眼病的方法的药物组合物的用途，其中所述方法包括向有需要的个体施用有效量的权利要求1至8中任一项所述的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述施用是通过眼内注射进行。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述施用是通过玻璃体内注射进行。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的用途，其中所述眼病为青光眼、视网膜色素变性、黄斑变性、视网膜劈裂症、利伯氏先天性黑朦、糖尿病性视网膜病、全色盲或色盲。
15.一种分离的核酸，其包含编码变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列，其中相对于对应的亲本AAV衣壳蛋白，所述变异AAV衣壳蛋白在衣壳蛋白GH环中包含异源肽的插入，
其中所述异源肽包含下式II所示的氨基酸序列：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，
其中：
X1为Leu、Ile、Pro或Gln；
X2为Ala；
X3为Pro；
X4为Asp；
X5为Ser；
X6为Thr；
X7为Thr；
X8为Arg；
X9为Asn、Pro、Ser、Lys、His、Ile、Thr或Ala；且
X10为Ala、Phe、Asp、Thr、Val或Met；并且
其中所述变异衣壳蛋白在存在于AAV病毒体中时，提供所述AAV病毒体增加的对视网膜细胞的感染性。
16.根据权利要求15所述的分离的核酸，其中插入位点介于AAV2的VP1的氨基酸570与611之间，或另一AAV血清型的衣壳蛋白中的对应位置。
17.根据权利要求16所述的分离的核酸，其中所述插入位点介于AAV2的氨基酸587与588之间、AAV1的氨基酸590与591之间、AAV5的氨基酸575与576之间、AAV6的氨基酸590与591之间、AAV7的氨基酸589与590之间、AAV8的氨基酸590与591之间、AAV9的氨基酸588与589之间或AAV10的氨基酸588与589之间。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的分离的核酸，其中所述异源肽包含氨基酸序列LAPDSTTRSA(SEQ ID NO:53)。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的分离的核酸，其中所述异源肽具有约12-20个氨基酸的长度。
20.一种分离的经遗传修饰的宿主细胞，其包含权利要求15至19中任一项所述的核酸。
21.一种变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中相对于对应的亲本AAV衣壳蛋白，所述变异AAV衣壳蛋白在GH环中包含异源肽的插入，其中所述异源肽包含下式II所示的氨基酸序列：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10，
其中：
X1为Leu、Ile、Pro或Gln；
X2为Ala；
X3为Pro；
X4为Asp；
X5为Ser；
X6为Thr；
X7为Thr；
X8为Arg；
X9为Asn、Pro、Ser、Lys、His、Ile、Thr或Ala；且
X10为Ala、Phe、Asp、Thr、Val或Met。
22.根据权利要求21所述的变异AAV衣壳蛋白，其中插入位点介于AAV2的氨基酸587与588之间、AAV1的氨基酸590与591之间、AAV5的氨基酸575与576之间、AAV6的氨基酸590与591之间、AAV7的氨基酸589与590之间、AAV8的氨基酸590与591之间、AAV9的氨基酸588与589之间或AAV10的氨基酸588与589之间。
23.根据权利要求22所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述插入位点介于AAV2的VP1的氨基酸570与611之间，或另一AAV血清型的衣壳蛋白中的对应位置。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述异源肽包含氨基酸序列LAPDSTTRSA(SEQ ID NO:53)。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述异源肽具有约12-20个氨基酸的长度。
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