CN103561774A - 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法 - Google Patents

具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103561774A
CN103561774A CN201280024852.3A CN201280024852A CN103561774A CN 103561774 A CN103561774 A CN 103561774A CN 201280024852 A CN201280024852 A CN 201280024852A CN 103561774 A CN103561774 A CN 103561774A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acids
seq
aav
cells
capsid protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201280024852.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103561774B (zh
Inventor
D·V·谢弗
R·R·克利姆扎克
J·T·柯伯
J·G·弗兰纳里
D·达尔卡拉穆罗
M·菲泽尔
L·C·T·伯恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California San Diego UCSD
Original Assignee
University of California San Diego UCSD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California San Diego UCSD filed Critical University of California San Diego UCSD
Priority to CN201611072467.2A priority Critical patent/CN107012171B/zh
Publication of CN103561774A publication Critical patent/CN103561774A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103561774B publication Critical patent/CN103561774B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86Viral vectors
    • C12N15/861Adenoviral vectors
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701Specific hybridization probes
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048Eye, e.g. artificial tears
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02Ophthalmic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02Ophthalmic agents
    • A61P27/06Antiglaucoma agents or miotics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86Viral vectors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86Viral vectors
    • C12N15/864Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058Neurological cells
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/33Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10Type of nucleic acid
    • C12N2310/14Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10Type of nucleic acid
    • C12N2310/16Aptamers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00Applications; Uses
    • C12N2320/30Special therapeutic applications
    • C12N2320/32Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011Details
    • C12N2750/14011Parvoviridae
    • C12N2750/14021Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011Details
    • C12N2750/14011Parvoviridae
    • C12N2750/14111Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14121Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011Details
    • C12N2750/14011Parvoviridae
    • C12N2750/14111Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011Details
    • C12N2750/14011Parvoviridae
    • C12N2750/14111Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14142Use of virus, viral particle or viral elements as a vector virus or viral particle as vehicle, e.g. encapsulating small organic molecule
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011Details
    • C12N2750/14011Parvoviridae
    • C12N2750/14111Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011Details
    • C12N2750/14011Parvoviridae
    • C12N2750/14111Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14145Special targeting system for viral vectors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011Details
    • C12N2750/14011Parvoviridae
    • C12N2750/14111Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/14152Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/40Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158Expression markers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Abstract

本公开提供了衣壳蛋白改变的腺相关病毒(AAV)病毒体,其中所述AAV病毒体在经玻璃体内注射施用时,与野生型AAV相比,表现出更强的视网膜细胞感染性。本公开进一步提供了将基因产物递送至个体的视网膜细胞的方法和治疗眼病的方法。

Description

具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法
交叉引用
本申请要求2011年4月22日提交的美国临时专利申请No.61/478,355的权益,所述申请通过引用整体并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明通过由国立卫生研究院的国立眼科研究所授予的批准号EY016994-02和EY1018241在政府支持下进行。政府具有本发明的某些权利。
背景
光感受器是视网膜中接收和处理视觉信息,通过光转导将可见电磁辐射转换为超极化反应的第一个神经元。绝大多数遗传视网膜疾病直接导致这些细胞丢失,例如影响视紫红质蛋白折叠的显性突变,或间接导致这些细胞丢失,例如视网膜色素上皮细胞(RPE)中影响视网膜再循环途径的隐性突变。
AAV属于细小病毒科(Parvoviridae)和依赖病毒属(Dependovirus),其成员需要与辅助病毒例如腺病毒一起协同感染以启动复制,并且AAV在没有辅助病毒时建立了潜伏性感染。病毒体由涵盖具有两个开放阅读框:rep和cap的4.9kb单链DNA基因组的25nm二十面体外壳构成。非结构rep基因编码病毒复制所必需的4种调节蛋白,而cap编码装配成60-mer衣壳外壳的3种结构蛋白(VP1-3)。这种病毒衣壳介导AAV载体克服病毒转导的许多生物屏障的能力—包括细胞表面受体结合、胞吞作用、胞内运输和细胞核中的解包装。
文献
美国专利公布No.2005/0053922;美国专利公布No.2009/0202490;Allocca等(2007)J.Virol.81:11372;Boucas等(2009)J.Gene Med.11:1103。
发明概述
本公开提供了衣壳蛋白改变的腺相关病毒(AAV)病毒体,其中所述AAV病毒体在经玻璃体内注射施用时,与野生型AAV相比,表现出更强的视网膜细胞感染性。本公开进一步提供了将基因产物递送至个体的视网膜细胞的方法和治疗眼病的方法。
附图简述
图1提供了在氨基酸587之后含有无规七聚物的AAV2的代表性三维模型。
图2描绘了相对于AAV2(左),AAV27M8变异体(右)的更高水平的玻璃体内转导。
图3提供了视网膜低温切片的代表性荧光图像,显示出由携带GFP基因的7M8,在普遍存在的CAG启动子(左)或光感受器特异性Rho启动子(右)的控制下产生的绿色荧光蛋白(GFP)表达。
图4描绘了在经7M8或载有4个酪氨酸突变(7m8.4YF)的7M8转导后,通过流式细胞术计数的每一百万个视网膜细胞的GFP+光感受器细胞。
图5提供了AAV2VP1的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
图6提供了与不同AAV血清型的AAV衣壳蛋白VP1的AAV2(图5)的氨基酸570-610相对应的氨基酸序列。
图7A-I描绘了基因转移后,Rs1h-/-小鼠视网膜中的结构改进。
图8A-D描绘了RS1基因递送后,视网膜电流图A和B波的功能性救援。
图9A-E描绘了7m8-rho-RS1治疗后10个月时测量的视网膜厚度持续增加。
图10提供了视网膜劈裂蛋白(retinoschisin)的氨基酸序列。
图11提供了脑源性神经营养因子的氨基酸序列。
图12提供了RPE65的氨基酸序列。
图13A-C提供了7m8-rho-RS1构建体的核苷酸序列。
图14提供了外周蛋白-2的氨基酸序列。
图15提供了外周蛋白的氨基酸序列。
图16提供了色素性视网膜炎GTP酶调节因子相互作用蛋白-1的氨基酸序列。
图17A-C提供了AAV衣壳蛋白环IV(GH环)区域的氨基酸序列的比对。插入位点用粗体和下划线示出。
图18A-C提供了具有异源肽插入的AAV衣壳蛋白GH环区域的氨基酸序列的比对。
图19提供了荧光眼底图像,显示在施用携带受连接蛋白36启动子控制的GFP的7m8后9周,灵长类动物中央视网膜中的GFP表达。
定义
术语“视网膜细胞”在本文中可指任何细胞类型,包括视网膜,例如视网膜神经节细胞、无长突细胞、水平细胞、双极细胞和光感受器细胞(包括杆状和锥状细胞)、缪勒胶质细胞和视网膜色素上皮细胞。
“AAV”是腺相关病毒的缩写,并且可用于指病毒本身或其衍生物。除非另有需要时,所述术语包括亚型及自然存在和重组形式。缩写“rAAV”指重组腺相关病毒,也称为重组AAV载体(或“rAAV载体”)。术语“AAV”包括1型AAV(AAV-1)、2型AAV(AAV-2)、3型AAV(AAV-3)、4型AAV(AAV-4)、5型AAV(AAV-5)、6型AAV(AAV-6)、7型AAV(AAV-7)、8型AAV(AAV-8)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV和羊AAV。“灵长类AAV”指感染灵长类动物的AAV,“非灵长类AAV”指感染非灵长类哺乳动物的AAV,“牛AAV”指感染牛哺乳动物的AAV等。
不同亚型AAV的基因组序列,以及天然末端重复序列(TR)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列在本领域中已知。此类序列可在文献或公用数据库例如基因库中找到。见,例如,基因库登记号NC_002077(AAV-1)、AF063497(AAV-1)、NC_001401(AAV-2)、AF043303(AAV-2)、NC_001729(AAV-3)、NC_001829(AAV-4)、U89790(AAV-4)、NC_006152(AAV-5)、AF513851(AAV-7)、AF513852(AAV-8)和NC_006261(AAV-8);其公开内容通过引用并入本文,以讲授AAV核酸和氨基酸序列。同样见,例如,Srivistava等(1983)J.Virology45:555;Chiorini等(1998)J.Virology71:6823;Chiorini等(1999)J.Virology73:1309;Bantel-Schaal等(1999)J.Virology73:939;Xiao等(1999)J.Virology73:3994;Muramatsu等(1996)Virology221:208;Shade等,(1986)J.Virol.58:921;Gao等(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA99:11854;Moris等(2004)Virology33:375-383;国际专利公布WO00/28061、WO99/61601、WO98/11244;和美国专利No.6,156,303。
如本文所使用,“rAAV载体”指包含非AAV起源的多核苷酸序列(即,与AAV异源的多核苷酸),通常是细胞遗传转化的目标序列的AAV载体。一般而言,异源多核苷酸两侧有至少一个,而通常有两个AAV反向末端重复序列(ITR)。术语rAAV载体涵盖rAAV载体颗粒和rAAV载体质粒。rAAV载体可为单链(ssAAV)或自身互补(scAAV)。
“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“rAAV载体颗粒”指由至少一种AAV衣壳蛋白(通常为野生型AAV的所有衣壳蛋白)和壳体化多核苷酸rAAV载体构成的病毒颗粒。如果所述颗粒包含异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组外的多核苷酸,例如递送至哺乳动物细胞的转基因),通常将其称为“rAAV载体颗粒”或简称为“rAAV载体”。因此,rAAV颗粒的生成必定包括rAAV载体的生成,因为在rAAV颗粒中含有这种载体。
“包装”指导致AAV颗粒装配和壳体化的一系列胞内事件。
AAV“rep”和“cap”基因指编码腺相关病毒的复制和壳体化蛋白的多核苷酸序列。本文将AAV rep和cap称为AAV“包装基因”。
AAV的“辅助病毒”指允许哺乳动物细胞复制并包装AAV(例如野生型AAV)的病毒。在本领域中已知AAV的多种此类辅助病毒,包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(例如牛痘)。虽然C亚类的5型腺病毒最常用,但是腺病毒涵盖许多不同亚类。已知人、非人类哺乳动物和禽类来源的许多腺病毒并且可从贮藏所例如ATCC获得。疱疹家族的病毒包括(例如)单纯疱疹病毒(HSV)和埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrviruses)(EBV)以及巨细胞病毒(CMV)和假狂犬病病毒(PRV);也可从贮藏所例如ATCC获得。
“辅助病毒功能”指辅助病毒基因组中编码的允许AAV复制和包装(连同对本文所述复制和包装的其它要求)的功能。如本文所述,可以多种方式提供“辅助病毒功能”,包括通过提供辅助病毒或为生产细胞提供(例如)编码必需功能的反式多核苷酸序列。例如,将包含编码一种或多种腺病毒蛋白的核苷酸序列的质粒或其它表达载体连同rAAV载体一起转染至生产细胞中。
“传染性”病毒或病毒颗粒是包含适当装配的病毒衣壳并且能够将多核苷酸组分递送至对其而言病毒物种是向性的细胞中的病毒或病毒颗粒。所述术语不一定暗指病毒的任何复制能力。在本公开和本领域的其它地方描述了为传染性病毒颗粒计数的测定法。可用传染性病毒颗粒与总病毒颗粒之比表示病毒感染性。在本领域中已知测定传染性病毒颗粒与总病毒颗粒之比的方法。见,例如,Grainger等(2005)Mol.Ther.11:S337(描述了TCID50传染性滴度测定);和Zolotukhin等(1999)Gene Ther.6:973。同样见实施例。
“有复制能力的”病毒(例如有复制能力的AAV)指有传染性,并且也能够在受感染细胞中(即,在辅助病毒或辅助病毒功能的存在下)复制的野生表现型病毒。在AAV的情况下,复制能力通常需要功能AAV包装基因的存在。一般而言,在哺乳动物细胞中(尤其在人类细胞中),由于缺乏一个或多个AAV包装基因,如本文所述的rAAV载体无复制能力。通常,为了将通过AAV包装基因和引入rAAV载体之间重组产生有复制能力的AAV的可能性降到最低,此类rAAV载体缺乏任何AAV包装基因。在许多实施方案中,如本文所述的rAAV载体制剂是含有很少(如果有)有复制能力的AAV(rcAAV,也称为RCA)的rAAV载体制剂(例如,每102个rAAV颗粒小于约1个rcAAV,每104个rAAV颗粒小于约1个rcAAV,每108个rAAV颗粒小于约1个rcAAV,每1012个rAAV颗粒小于约1个rcAAV或没有rcAAV)。
术语“多核苷酸”指任何长度的核苷酸聚合形式,包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸,例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物,并且可被非核苷酸组分中断。若存在,可在聚合物装配之前或之后给予对核苷酸结构的修饰。如本文所使用,术语多核苷酸可交替地指双链和单链分子。除非另有说明或要求,本文所述为多核苷酸的本发明任何实施方案涵盖双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式的每一种。
核酸杂交反应可在不同“严格性”的条件下进行。增强杂交反应的严格性的条件众所周知并且在本领域中公开。见,例如,通过引用并入本文的Sambrook等Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。例如,见Sambrook等的第7.52页。相关条件的实例包括(按增强严格性的顺序):25℃、37℃、50℃和68℃的孵育温度;10×SSC、6×SSC、1×SSC、0.1×SSC的缓冲液浓度(其中1×SSC为0.15MNaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)及其使用其它缓冲系统的等效物;0%、25%、50%和75%的甲酰胺浓度;从5min至24h的孵育时间;1个、2个或更多个洗涤步骤;1、2或15min的洗涤孵育时间;和6×SSC、1×SSC、0.1×SSC的洗液,或去离子水。严格杂交条件的实例为在50℃或更高温度和0.1×SSC(15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠)下杂交。严格杂交条件的另一实例是在42℃下于溶液:50%甲酰胺、1×SSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×登哈特溶液(Denhardt's solution)、10%硫酸葡聚糖和20μg/ml变性、剪切鲑鱼精DNA中过夜孵育,接着在约65℃下于0.1XSSC中洗涤过滤器。再如,严格杂交条件包括:在65℃下于包含6X单一强度柠檬酸盐(SSC)(1XSSC为0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠;pH7.0)、5×登哈特溶液、0.05%焦磷酸钠和100μg/ml鲱鱼精DNA的溶液中预杂交8h至过夜;在65℃下于含有6XSSC、1X登哈特溶液、100μg/ml酵母tRNA和0.05%焦磷酸钠的溶液中杂交18-20h;并且在65℃下于含有0.2XSSC和0.1%SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液中洗涤过滤器1h。
严格杂交条件是至少与以上代表性条件一样严格的杂交条件。其它严格杂交条件在本领域中已知并且也可用于鉴定本发明这个特定实施方案的核酸。
“Tm”是按摄氏度计,在实验条件下,由在反向平行方向通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对氢键结合的互补链构成的50%多核苷酸双链体解离成单链的温度。可根据标准公式预测Tm,例如:
Tm=81.5+16.6log[X+]+0.41(%G/C)-0.61(%F)-600/L。
其中[X+]是以mol/L计的阳离子浓度(通常为钠离子,Na+);(%G/C)是按双链体中总残基的百分比计,G和C残基的数量;(%F)是溶液中的甲酰胺百分比(wt/vol);并且L是双链体每条链中核苷酸的数量。
多核苷酸或多肽与另一多核苷酸或多肽具有一定百分比的“序列同一性”,意味着,比对时,碱基或氨基酸的百分比在比较两个序列时相同。可以许多不同方式测定序列相似性。为测定序列同一性,可使用所述方法和计算机程序,包括万维网上在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/可用的BLAST比对序列。另一比对算法为FASTA,在来自Oxford Molecular Group,Inc.的全资子公司Madison,Wisconsin,USA的遗传学计算机组(GCG)包中可用。在Enzymology,第266卷:美国加利福尼亚圣地亚哥Harcourt Brace&Co.的分公司Academic Press,Inc.,Doolittle编辑,Computer Methods forMacromolecular Sequence Analysis(1996)中的Methods中描述了其它比对技术。特别感兴趣的是在序列中允许有空位的比对程序。Smith-Waterman是在序列比对中允许有空位的一类算法。见Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997)。同样,可利用使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序比对序列。见J.Mol.Biol.48:443-453(1970)。
感兴趣的是使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advancesin Applied Mathematics2:482-489(1981)测定序列同一性的BestFit程序。空位生成罚分范围通常将从1到5,一般从2到4并且在许多实施方案中将为3。空位拓展罚分范围通常将从约0.01到0.20并且在许多情况下将为0.10。程序具有由输入以待比较的序列确定的缺省参数。优选地,使用由程序确定的缺省参数测定序列同一性。该程序也可从来自Madison,Wisconsin,USA的遗传学计算机组(GCG)包中获得。
另一个感兴趣的程序是FastDB算法。在Sequence Comparison andAnalysis、Macromolecule Sequencing and Synthesis、SelectedMethods and Applications中的Current Methods中,第127-149页,1988,Alan R.Liss,Inc.描述了FastDB。基于下列参数通过FastDB计算序列同一性百分比:
错配罚分:1.00;
空位罚分:1.00;
空位大小罚分:0.33;和
连接罚分:30.0。
“基因”指含有至少一个能够在转录和翻译后编码特定蛋白的开放阅读框的多核苷酸。
“基因产物”是由特定基因表达产生的分子。基因产物包括(例如)多肽、适配体、干扰RNA、mRNA等。
“小干扰”或“短干扰RNA”或siRNA是靶向基因目标(“靶基因”)的核苷酸的RNA双链体。“RNA双链体”指通过RNA分子的两个区域之间互补配对形成的结构。siRNA“靶向”基因,因为siRNA的双链体部分的核苷酸序列与靶基因的核苷酸序列互补。在一些实施方案中,siRNA双链体的长度小于30个核苷酸。在一些实施方案中,双链体的长度可为29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸。在一些实施方案中,双链体的长度为19-25个核苷酸。siRNA的RNA双链体部分可为发夹结构的一部分。除双链体部分外,发夹结构可含有位于形成双链体的两个序列之间的环部分。所述环的长度可改变。在一些实施方案中,所述环的长度为5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。发夹结构也可含有3'或5'突出部分。在一些实施方案中,所述突出的长度为3'或5'突出0、1、2、3、4或5个核苷酸。
“短发夹RNA”或shRNA是可使其表达干扰RNA例如siRNA的多核苷酸构建体。
如应用于多核苷酸,“重组”意指多核苷酸是克隆、限制或连接步骤的不同组合和产生不同于在自然界中发现的多核苷酸的构建体的其它程序的产物。重组病毒是包含重组多核苷酸的病毒颗粒。所述术语分别包括原多核苷酸构建体和原病毒构建体子代的复制品。
“控制元件”或“控制序列”是牵涉于分子相互作用,有助于多核苷酸的功能调控,包括多核苷酸的复制、重复、转录、剪接、翻译或降解的核苷酸序列。调控可影响所述过程的频率、速度或特异性,并且实际上可为增强性或抑制性。本领域已知的控制元件包括(例如)转录调控序列例如启动子和增强子。启动子是在某些条件下能够结合RNA聚合酶并且引发通常位于启动子下游(3'方向)的编码区域转录的DNA区域。
“操作性连接”或“可操作地连接”指遗传元件的并列,其中所述元件呈允许其以预期方式操作的关系。例如,如果启动子帮助引发编码序列的转录,则启动子与编码区操作性连接。只要维持这种功能关系,在启动子和编码区域之间可能有插入残基。
“表达载体”是包含编码目标多肽的区域的载体,并且用于在预定靶细胞中实现蛋白质的表达。表达载体还包含与编码区域操作性连接以促进蛋白质在靶标中的表达的控制元件。控制元件和与之可操作地连接以便表达的基因的组合有时称为“表达盒”,许多表达盒在本领域中已知并且可用或可易于由在本领域中可用的组分构建体。
“异源”指源自和与之比较的其余实体基因型不同的实体。例如,通过基因工程技术引入源自不同物种的质粒或载体中的多核苷酸为异源多核苷酸。取自其天然编码序列并且与并非发现与之天然连接的编码序列操作性连接的启动子为异源启动子。因此,例如,包括编码异源基因产物的异源核酸的rAAV是包括在自然存在的野生型AAV中一般不包括的核酸的rAAV,并且编码的异源基因产物是一般并非自然存在的野生型AAV编码的基因产物。
术语“遗传改变”和“遗传修饰”(及其语法变型)在本文中可交换用于指其中除通过有丝分裂或减数分裂外,将遗传元件(例如,多核苷酸)引入细胞的过程。所述元件可与细胞异源,或可为细胞中已经存在的元件的另一拷贝或改良形式。例如,可通过本领域已知的任何过程,例如电穿孔、磷酸钙沉淀用重组质粒或其它多核苷酸转染细胞,或使细胞与多核苷酸-脂质体复合物接触,而实现遗传改变。例如,也可通过用DNA或RNA病毒或病毒载体转导或感染实现遗传改变。一般地,将遗传元件引入细胞内的染色体或微型染色体中;但是改变细胞及其子代的表现型和/或基因型的任何改变均包括在该术语中。
如果在细胞体外扩大培养期间,序列可用于执行其功能,则将细胞称为经基因序列“稳定”改变、转导、遗传修饰或转化。一般地,此类细胞经“可遗传性”改变(遗传修饰),因为引入了受改变细胞的子代也可遗传的遗传改变。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可交换用于指任何长度的氨基酸聚合物。所述术语还涵盖已经修饰的氨基酸聚合物;例如,二硫键形成、糖基化、脂化、磷酸化或与标记组分结合。多肽例如抗血管生成多肽、神经保护多肽等,当在将基因产物递送至哺乳动物受试者的上下文中讨论时,及其组合物,指各个完整多肽或其保留了完整蛋白质的所需生物化学功能的任何片段或基因工程衍生物。类似地,提到编码抗血管生成多肽的核酸、编码神经保护多肽的核酸和用于将基因产物递送至哺乳动物受试者的其它此类氨基酸(也可称为待递送至受体细胞的“转基因”),包括编码完整多肽或其具有所需生物化学功能的任何片段或基因工程衍生物的多核苷酸。
“分离的”质粒、核酸、载体、病毒、病毒体、宿主细胞或其它物质指没有在所述物质或类似物质自然存在或最初制备时也可能存在的至少一些其它组分的物质的制剂。因此,例如,可使用纯化计数制备分离物质以使其从源混合物中富集。可绝对地测量富集物,例如每体积溶液的重量,或可相对于源混合物中存在的第二潜在干扰物质测量。逐渐多次分离本公开实施方案越来越多的富集物。在一些实施方案中纯化分离的质粒、核酸、载体、病毒、宿主细胞或其它物质,例如从约80%至约90%纯度,至少约90%纯度,至少约95%纯度,至少约98%纯度,或至少约99%纯度或更高纯度。
如本文所使用,术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等指获得所需药理学和/或生理学作用。所述作用在完全或部分预防疾病或其症状方面可为预防性和/或在对疾病和/或可归因于所述疾病的副作用的部分或完全治愈方面可为治疗性。如本文所使用,“治疗”包括对哺乳动物(特别是人类)疾病的任何治疗,并且包括:(a)预防疾病在可能易患病或有患病风险但尚未诊断为患病的受试者中出现;(b)抑制疾病,即阻止其发展;和(c)缓解疾病,即引起疾病消退。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可交换使用,并且指哺乳动物,包括但不限于人和非人灵长类动物,包括猿和人;哺乳类运动动物(例如,马);哺乳类家畜(例如,绵羊、山羊等);哺乳类宠物(狗、猫等);和啮齿动物(例如,小鼠、大鼠等)。
在进一步描述本发明之前,应理解本发明不限于描述的特定实施方案,当然,同样可能变化。还应理解,本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案,并非旨在限制,因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限制。
提供值的范围时,应理解,介于该范围的上下限之间的每个居间数值(至下限单位的十分之一,除非上下文另外明确指出)以及所述范围内的任意其它规定或居间的数值涵盖在本发明内。这些较小范围的上下限可独立地包括在较小范围内,并且也涵盖在本发明内,以规定范围内明确排除的任何限值为限。规定范围包括一个或两个限值时,将那些包括的限值的任一个或两个排除在外的范围也包括在本发明中。
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然在本发明的实践和教学中也可使用与本文所述类似或等效的任何方法和材料,但现在描述优选方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用并入本文以公开和描述连同出版物一起引用的方法和/或材料。
必须指出的是,如本文和所附权利要求中所使用,除非上下文另外明确指出,否则单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括多个指示物。因此,例如,提到“一种重组AAV病毒体”包括多个此类病毒体而提到“所述光感受器细胞”包括提到一个或多个光感受器细胞及其本领域技术人员已知的等效物,等等。应进一步指出,权利要求可起草为排除任何任选要素。同样,该声明旨在用作使用诸如“只是”、“仅仅”等专有术语连同对权利要求要素的叙述,或使用“消极”限制的前提基础。
应了解,为清楚起见,在独立实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。相反,为简洁起见,在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征,也可单独地或以任何适合的子组合提供。本发明明确包括关于本发明的实施方案的所有组合并且在本文中公开,正如单独明确地公开每个和每种组合一样。另外,本发明还明确包括各实施方案及其要素的所有子组合并且在本文中公开,正如在本文单独明确地公开每个和每种此类子组合一样。
本文讨论的出版物只是为了在本申请的提交日期之前公开而提供。不得将本文任何内容解释为承认无权凭借先前发明使本发明先于此出版物。进一步地,提供的出版日期可能与实际出版日期不同,可能需要单独确认。
发明详述
本公开提供了衣壳蛋白改变的腺相关病毒(AAV)病毒体,其中所述AAV病毒体在经玻璃体内注射施用时,与野生型AAV在经玻璃体内注射施用时相比,表现出更强的视网膜细胞感染性。本公开进一步提供了将基因产物递送至个体的视网膜细胞的方法和治疗眼病的方法。
视网膜细胞可为光感受器(例如,杆状细胞、锥状细胞)、视网膜神经节细胞(RGC)、缪勒细胞(Müller cell)(缪勒胶质细胞)、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色素上皮(RPE)细胞。
变异AAV衣壳多肽
本公开提供了一种变异AAV衣壳蛋白,其中相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,所述变异AAV衣壳蛋白在衣壳蛋白GH环或IV环中的插入位点中包含约5个氨基酸至约11个氨基酸的插入,并且其中与包含所述相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比,所述变异衣壳蛋白,当存在于AAV病毒体中时,赋予增强的视网膜细胞感染性。在一些情况下,视网膜细胞为光感受器细胞(例如,杆状细胞、锥状细胞)。在其它情况下,视网膜细胞为RGC。在其它情况下,视网膜细胞为RPE细胞。在其它情况下,视网膜细胞为缪勒细胞。其它视网膜细胞包括无长突细胞、双极细胞和水平细胞。“约5个氨基酸至约11个氨基酸的插入”本文也称为“肽插入”(例如异源肽插入)。“相应亲本AAV衣壳蛋白”指无肽插入的相同AAV血清型的AAV衣壳蛋白。
插入位点在AAV衣壳蛋白的GH环或IV环中,例如在AAV衣壳蛋白的GH环或IV环的溶剂可及部分。对于AAV衣壳的GH环/IV环,见,例如,van Vliet等(2006)Mol.Ther.14:809;Padron等(2005)J.Virol.79:5047;和Shen等(2007)Mol.Ther.15:1955。例如,如图17A和17B所描绘,插入位点可在AAV衣壳蛋白的氨基酸411-650内。例如,如图6所描绘,插入位点可在AAV2的氨基酸570-611内,AAV1的氨基酸571-612内,AAV5的氨基酸560-601内,AAV6的氨基酸571-612内,AAV7的氨基酸572-613内,AAV8的氨基酸573-614内,AAV9的氨基酸571-612内,或AAV10的氨基酸573-614内。
在一些情况下,相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,在所述衣壳蛋白的GH环或IV环中的插入位点插入约5个氨基酸至约11个氨基酸。例如,插入位点可介于AAV2的氨基酸587和588之间,或另一AAV血清型的衣壳亚基的相应位置之间。应指出的是,插入位点587/588基于AAV2衣壳蛋白。可在除AAV2外的AAV血清型(例如,AAV8、AAV9等)中的相应位点插入约5个氨基酸至约11个氨基酸。本领域的技术人员将了解,基于对不同AAV血清型的衣壳蛋白的氨基酸序列的比较,其中“与AAV2的氨基酸587-588相对应的”插入位点将在任何指定AAV血清型的衣壳蛋白中。图6中示出了不同AAV血清型中与AAV2(见图5)的衣壳蛋白VP1的氨基酸570-611相对应的序列。见,例如,基因库登记号NP_049542的AAV1;基因库登记号AAD13756的AAV5;基因库登记号AAB95459的AAV6;基因库登记号YP_077178的AAV7;基因库登记号YP_077180的AAV8;基因库登记号AAS99264的AAV9和基因库登记号AAT46337的AAV10。
在一些实施方案中,插入位点是介于位于任何AAV血清型的VP1的氨基酸570-614之间的两个相邻氨基酸之间的单个插入位点,例如,插入位点介于位于任何AAV血清型或变异体的VP1的氨基酸570-610、氨基酸580-600、氨基酸570-575、氨基酸575-580、氨基酸580-585、氨基酸585-590、氨基酸590-600或氨基酸600-614中的两个相邻氨基酸之间。例如,插入位点可介于氨基酸580和581、氨基酸581和582、氨基酸583和584、氨基酸584和585、氨基酸585和586、氨基酸586和587、氨基酸587和588、氨基酸588和589或氨基酸589和590之间。插入位点可介于氨基酸575和576、氨基酸576和577、氨基酸577和578、氨基酸578和579或氨基酸579和580之间。插入位点可介于氨基酸590和591、氨基酸591和592、氨基酸592和593、氨基酸593和594、氨基酸594和595、氨基酸595和596、氨基酸596和597、氨基酸597和598、氨基酸598和599或氨基酸599和600之间。
例如,插入位点可介于AAV2的氨基酸587和588之间,介于AAV1的氨基酸590和591之间,介于AAV5的氨基酸575和576之间,介于AAV6的氨基酸590和591之间,介于AAV7的氨基酸589和590之间,介于AAV8的氨基酸590和591之间,介于AAV9的氨基酸588和589之间,或介于AAV10的氨基酸588和589之间。
再如,如图17A所示,插入位点可介于AAV衣壳蛋白的氨基酸450和460之间。例如,如图17A所示,插入位点可在AAV2的氨基酸453、AAV1的氨基酸454、AAV6的氨基酸454、AAV7的氨基酸456、AAV8的氨基酸456、AAV9的氨基酸454或AAV10的氨基酸456处(例如,直接在其N端)。
在一些实施方案中,主题衣壳蛋白包括包含与图18A-C所示的氨基酸有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的GH环。
插入肽
如上所述,长度约5个氨基酸至约11个氨基酸的肽插入AAV衣壳的GH环中。插入肽的长度为5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸或11个氨基酸。
插入肽可包含以下提出的任一公式的氨基酸序列。
例如,插入肽可为长度为5-11个氨基酸的肽,其中所述插入肽是式I的插入肽:
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
其中:
Y1-Y4(若存在)的每一个独立选自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr;
X1(若存在)选自Leu、Asn和Lys;
X2选自Gly、Glu、Ala和Asp;
X3选自Glu、Thr、Gly和Pro;
X4选自Thr、Ile、Gln和Lys;
X5选自Thr和Ala;
X6选自Arg、Asn和Thr;
X7(若存在)选自Pro和Asn。
再如,插入肽可为长度为5-11个氨基酸的肽,其中所述插入肽是式IIa的插入肽:
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
其中:
Y1-Y4(若存在)的每一个独立选自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr;
X1-X4的每一个为任何氨基酸;
X5为Thr;
X6为Arg;并且
X7为Pro。
再如,插入肽可为长度为5-11个氨基酸的肽,其中所述插入肽是式IIb的插入肽:
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
其中:
Y1-Y4(若存在)的每一个独立选自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr;
X1(若存在)选自Leu和Asn;
X2(若存在)选自Gly和Glu;
X3选自Glu和Thr;
X4选自Thr和Ile;
X5为Thr;
X6为Arg;并且
X7为Pro。
再如,插入肽可为长度为5-11个氨基酸的肽,其中所述插入肽是式III的插入肽:
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
其中:
Y1-Y4(若存在)的每一个独立选自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr;
X1(若存在)为Lys;
X2选自Ala和Asp;
X3选自Gly和Pro;
X4选自Gln和Lys;
X5选自Thr和Ala;
X6选自Asn和Thr;
X7(若存在)为Asn。
再如,插入肽可为长度为5-11个氨基酸的肽,其中所述插入肽是式IV的插入肽:
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
其中:
Y1-Y4(若存在)的每一个独立选自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr;
X1(若存在)为带正电的氨基酸或不带电的氨基酸;或选自Leu、Asn、Arg、Ala、Ser和Lys;
X2为带负电的氨基酸或不带电的氨基酸;或选自Gly、Glu、Ala、Val、Thr和Asp;
X3为带负电的氨基酸或不带电的氨基酸;或选自Glu、Thr、Gly、Asp或Pro;
X4选自Thr、Ile、Gly、Lys、Asp和Gln;
X5为极性氨基酸、醇(具有游离羟基的氨基酸)或疏水氨基酸;或选自Thr、Ser、Val和Ala;
X6为带正电的氨基酸或不带电的氨基酸;或选自Arg、Val、Lys、Pro、Thr和Asn;并且
X7(若存在)为带正电的氨基酸或不带电的氨基酸;或选自Pro、Gly、Phe、Asn和Arg。
作为非限制性实例,插入肽可包含选自LGETTRP(SEQ ID NO:13)、NETITRP(SEQ ID NO:14)、KAGQANN(SEQ ID NO:15)、KDPKTTN(SEQID NO:16)、KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQ ID NO:59)和STGKVPN(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列。
在一些情况下,插入肽在LGETTRP(SEQ ID NO:13)、NETITRP(SEQID NO:14)、KAGQANN(SEQ ID NO:15)、KDPKTTN(SEQ ID NO:16)、KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQID NO:59)和STGKVPN(SEQ ID NO:60)的任一个的氨基末端和/或羧基末端具有1-4个间隔氨基酸(Y1-Y4)。适合的间隔氨基酸包括但不限于亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸。
例如,在一些情况下,插入肽具有下列氨基酸序列之一:LALGETTRPA(SEQ ID NO:45)、LANETITRPA(SEQ ID NO:46)、LAKAGQANNA(SEQ ID NO:47)、LAKDPKTTNA(SEQ ID NO:48)、LAKDTDTTRA(SEQ IDNO:61)、LARAGGSVGA(SEQ ID NO:62)、LAAVDTTKFA(SEQ ID NO:63)和LASTGKVPNA(SEQ ID NO:64)。再如,在一些情况下,插入肽具有下列氨基酸序列之一:AALGETTRPA(SEQ ID NO:49)、AANETITRPA(SEQID NO:50)、AAKAGQANNA(SEQ ID NO:51)和AAKDPKTTNA(SEQ ID NO:52)。又如,在一些情况下,插入肽具有下列氨基酸序列之一:GLGETTRPA(SEQ ID NO:53)、GNETITRPA(SEQ ID NO:54)、GKAGQANNA(SEQ ID NO:55)和GKDPKTTNA(SEQ ID NO:56)。再如,在一些情况下,插入肽包含在C端一侧为AA而在N端一侧为A的KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQ ID NO:59)和STGKVPN(SEQ ID NO:60)的其中一个;或包含在C端一侧为G而在N端一侧为A的KDTDTTR(SEQID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQ ID NO:59)和STGKVPN(SEQ ID NO:60)的其中一个。
在一些实施方案中,除相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,GH环或IV环中约5个氨基酸至约11个氨基酸的插入外,主题变异AAV衣壳不包括任何其它氨基酸取代、插入或缺失。在其它实施方案中,与亲本AAV衣壳蛋白相比,除相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,GH环或IV环中约5个氨基酸至约11个氨基酸的插入外,主题变异AAV衣壳包括1个至约25个氨基酸插入、缺失或取代。例如,在一些实施方案中,与亲本AAV衣壳蛋白相比,除相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,GH环或IV环中约5个氨基酸至约11个氨基酸的插入外,主题变异AAV衣壳包括1个至约5个、约5个至约10个,约10个至约15个,约15个至约20个或约20个至约25个氨基酸插入、缺失或取代。
在一些实施方案中,主题变异衣壳多肽不包括以下1、2、3或4个氨基酸取代:Y273F、Y444F、Y500F和Y730F。
在一些实施方案中,除如上所述的插入肽外,主题变异衣壳多肽包含以下1、2、3或4个氨基酸取代:Y273F、Y444F、Y500F和Y730F。
在一些实施方案中,变异AAV衣壳多肽为嵌合衣壳,例如,衣壳包含第一AAV血清型的AAV衣壳的一部分和第二血清型的AAV衣壳的一部分;并且相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,在GH环或IV环中包含约5个氨基酸至约11个氨基酸的插入。
在一些实施方案中,主题变异衣壳蛋白包含与图5中提供的氨基酸序列有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%或至少约99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;和相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,在GH环或IV环中约5个氨基酸至约11个氨基酸的插入。
在一些实施方案中,主题变异衣壳蛋白经分离,例如纯化。在一些情况下,在同样提供的AAV载体中包括主题变异衣壳蛋白。如以下所详细描述,在重组AAV病毒体中可包括主题变异衣壳蛋白。
重组AAV病毒体
本公开提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒体,包含:a)变异AAV衣壳蛋白,其中相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,所述变异AAV衣壳蛋白在衣壳蛋白GH环或IV环中的插入位点中包含约5个氨基酸至约11个氨基酸的插入,并且其中与包含所述相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比,所述变异衣壳蛋白赋予增强的视网膜细胞感染性;和b)包含编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。在一些情况下,视网膜细胞为光感受器细胞(例如,杆状和/或锥状细胞)。在其它情况下,视网膜细胞为RGC细胞。在其它情况下,视网膜细胞为RPE细胞。在其它情况下,视网膜细胞为缪勒细胞。在其它情况下,视网膜细胞可包括无长突细胞、双极细胞和水平细胞。“约5个氨基酸至约11个氨基酸的插入”本文也称为“肽插入”(例如,异源肽插入)。“相应亲本AAV衣壳蛋白”指无肽插入的相同AAV血清型的AAV衣壳蛋白。
插入位点在AAV衣壳蛋白的GH环或IV环中,例如在AAV衣壳蛋白的GH环或IV环的溶剂可及部分。对于GH环,见,例如,van Vliet等(2006)Mol.Ther.14:809;Padron等(2005)J.Virol.79:5047;和Shen等(2007)Mol.Ther.15:1955。例如,插入位点在AAV2的氨基酸570-611内,AAV1的氨基酸571-612内,AAV5氨基酸的560-601内,AAV6的氨基酸571-612内,AAV7的氨基酸572-613内,AAV8的氨基酸573-614内,AAV9的氨基酸571-612内,或AAV10的氨基酸573-614内。
相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,在所述衣壳蛋白的GH环或IV环中的插入位点插入约5个氨基酸至约11个氨基酸。例如,插入位点可介于AAV2的氨基酸587和588之间,或另一AAV血清型的衣壳亚基的相应位置之间。应指出的是,插入位点587/588基于AAV2衣壳蛋白。可在除AAV2外的AAV血清型(例如,AAV8、AAV9等)中的相应位点插入约5个氨基酸至约11个氨基酸。本领域的技术人员将了解,基于对不同AAV血清型的衣壳蛋白的氨基酸序列的比较,其中“与AAV2的氨基酸587-588相对应的”插入位点将在任何指定AAV血清型的衣壳蛋白中。图6中示出了不同AAV血清型中与AAV2(见图5)的衣壳蛋白VP1的氨基酸570-611相对应的序列。
在一些实施方案中,插入位点是介于位于任何AAV血清型的VP1的氨基酸570-614之间的两个相邻氨基酸之间的单个插入位点,例如,插入位点介于位于任何AAV血清型或变异体的VP1的氨基酸570-614、氨基酸580-600、氨基酸570-575、氨基酸575-580、氨基酸580-585、氨基酸585-590、氨基酸590-600或氨基酸600-610中的两个相邻氨基酸之间。例如,插入位点可介于氨基酸580和581、氨基酸581和582、氨基酸583和584、氨基酸584和585、氨基酸585和586、氨基酸586和587、氨基酸587和588、氨基酸588和589或氨基酸589和590之间。插入位点可介于氨基酸575和576、氨基酸576和577、氨基酸577和578、氨基酸578和579或氨基酸579和580之间。插入位点可介于氨基酸590和591、氨基酸591和592、氨基酸592和593、氨基酸593和594、氨基酸594和595、氨基酸595和596、氨基酸596和597、氨基酸597和598、氨基酸598和599或氨基酸599和600之间。
例如,插入位点可介于AAV2的氨基酸587和588之间,介于AAV1的氨基酸590和591之间,介于AAV5的氨基酸575和576之间,介于AAV6的氨基酸590和591之间,介于AAV7的氨基酸589和590之间,介于AAV8的氨基酸590和591之间,介于AAV9的氨基酸588和589之间,或介于AAV10的氨基酸589和590之间。
插入肽
如上所述,主题rAAV病毒体包含插入AAV衣壳的GH环中的长度约5个氨基酸至约11个氨基酸的肽。插入肽的长度为5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸或11个氨基酸。
插入肽可包含以下提出的任一公式的氨基酸序列。
例如,插入肽可为长度为5-11个氨基酸的肽,其中所述插入肽是式I的插入肽:
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
其中:
Y1-Y4(若存在)的每一个独立选自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr;
X1(若存在)选自Leu、Asn和Lys;
X2选自Gly、Glu、Ala和Asp;
X3选自Glu、Thr、Gly和Pro;
X4选自Thr、Ile、Gln和Lys;
X5选自Thr和Ala;
X6选自Arg、Asn和Thr;
X7(若存在)选自Pro和Asn。
再如,插入肽可为长度为5-11个氨基酸的肽,其中所述插入肽是式IIa的插入肽:
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
其中:
Y1-Y4(若存在)的每一个独立选自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr;
X1-X4的每一个为任何氨基酸;
X5为Thr;
X6为Arg;并且
X7为Pro。
再如,插入肽可为长度为5-11个氨基酸的肽,其中所述插入肽是式IIb的插入肽:
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
其中:
Y1-Y4(若存在)的每一个独立选自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr;
X1(若存在)选自Leu和Asn;
X2(若存在)选自Gly和Glu;
X3选自Glu和Thr;
X4选自Thr和Ile;
X5为Thr;
X6为Arg;并且
X7为Pro。
再如,插入肽可为长度为5-11个氨基酸的肽,其中所述插入肽是式III的插入肽:
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
其中:
Y1-Y4(若存在)的每一个独立选自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr;
X1(若存在)为Lys;
X2选自Ala和Asp;
X3选自Gly和Pro;
X4选自Gln和Lys;
X5选自Thr和Ala;
X6选自Asn和Thr;
若存在,X7为Asn。
再如,插入肽可为长度为5-11个氨基酸的肽,其中所述插入肽是式IV的插入肽:
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
其中:
Y1-Y4(若存在)的每一个独立选自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr;
X1(若存在)为带正电的氨基酸或不带电的氨基酸;或选自Leu、Asn、Arg、Ala、Ser和Lys;
X2为带负电的氨基酸或不带电的氨基酸;或选自Gly、Glu、Ala、Val、Thr和Asp;
X3为带负电的氨基酸或不带电的氨基酸;或选自Glu、Thr、Gly、Asp或Pro;
X4选自Thr、Ile、Gly、Lys、Asp和Gln;
X5为极性氨基酸、醇(具有游离羟基的氨基酸)或疏水氨基酸;或选自Thr、Ser、Val和Ala;
X6为带正电的氨基酸或不带电的氨基酸;或选自Arg、Val、Lys、Pro、Thr和Asn;并且
X7(若存在)为带正电的氨基酸或不带电的氨基酸;或选自Pro、Gly、Phe、Asn和Arg。
作为非限制性实例,插入肽可包含选自LGETTRP(SEQ ID NO:13)、NETITRP(SEQ ID NO:14)、KAGQANN(SEQ ID NO:15)、KDPKTTN(SEQID NO:16)、KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQ ID NO:59)和STGKVPN(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列。
在一些情况下,插入肽在LGETTRP(SEQ ID NO:13)、NETITRP(SEQID NO:14)、KAGQANN(SEQ ID NO:15)、KDPKTTN(SEQ ID NO:16)、KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQID NO:59)和STGKVPN(SEQ ID NO:60)的任一个的氨基末端和/或羧基末端具有1-4个间隔氨基酸(Y1-Y4)。适合的间隔氨基酸包括但不限于亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸。
例如,在一些情况下,插入肽具有下列氨基酸序列之一:LALGETTRPA(SEQ ID NO:45)、LANETITRPA(SEQ ID NO:46)、LAKAGQANNA(SEQ ID NO:47)、LAKDPKTTNA(SEQ ID NO:48)、LAKDTDTTRA(SEQ IDNO:61)、LARAGGSVGA(SEQ ID NO:62)、LAAVDTTKFA(SEQ ID NO:63)和LASTGKVPNA(SEQ ID NO:64)。再如,在一些情况下,插入肽具有下列氨基酸序列之一:AALGETTRPA(SEQ ID NO:49)、AANETITRPA(SEQID NO:50)、AAKAGQANNA(SEQ ID NO:51)和AAKDPKTTNA(SEQ ID NO:52)。又如,在一些情况下,插入肽具有下列氨基酸序列之一:GLGETTRPA(SEQ ID NO:53)、GNETITRPA(SEQ ID NO:54)、GKAGQANNA(SEQ ID NO:55)和GKDPKTTNA(SEQ ID NO:56)。再如,在一些情况下,插入肽包含在C端一侧为AA而在N端一侧为A的KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQ ID NO:59)和STGKVPN(SEQ ID NO:60)的其中一个;或包含在C端一侧为G而在N端一侧为A的KDTDTTR(SEQID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQ ID NO:59)和STGKVPN(SEQ ID NO:60)的其中一个。
在一些实施方案中,除相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,GH环或IV环中约7个氨基酸至约10个氨基酸的插入外,主题rAAV病毒体衣壳不包括任何其它氨基酸取代、插入或缺失。在其它实施方案中,与亲本AAV衣壳蛋白相比,除相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,GH环或IV环中约7个氨基酸至约10个氨基酸的插入外,主题rAAV病毒体衣壳包括1个至约25个氨基酸插入、缺失或取代。例如,在一些实施方案中,与亲本AAV衣壳蛋白相比,除相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,GH环或IV环中约7个氨基酸至约10个氨基酸的插入外,主题rAAV病毒体衣壳包括1个至约5个、约5个至约10个,约10个至约15个,约15个至约20个或约20个至约25个氨基酸插入、缺失或取代。
在一些实施方案中,主题rAAV病毒体衣壳不包括以下1、2、3或4个氨基酸取代:Y273F、Y444F、Y500F和Y730F。
在一些实施方案中,除如上所述的插入肽外,主题变异衣壳多肽包含以下1、2、3或4个氨基酸取代:Y273F、Y444F、Y500F和Y730F。
在一些实施方案中,主题rAAV病毒体衣壳为嵌合衣壳,例如,衣壳包含第一AAV血清型的AAV衣壳的一部分和第二血清型的AAV衣壳的一部分;并且相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,在GH环或IV环中包含约5个氨基酸至约11个氨基酸的插入。
在一些实施方案中,主题rAAV病毒体包含含与图5中提供的氨基酸序列有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%或至少约99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白;和相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,在GH环或IV环中约5个氨基酸至约11个氨基酸的插入。
在一些实施方案中,主题rAAV病毒体包含衣壳蛋白,所述衣壳蛋白包括包含与图18A-C中提出的氨基酸序列有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的GH环。
与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比,主题rAAV病毒体表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的视网膜细胞感染性。
在一些情况下,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经玻璃体内注射施用时对视网膜细胞的感染性相比,主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射施用时表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的视网膜细胞感染性。
在一些实施方案中,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对光感受器细胞的感染性相比,主题rAAV病毒体表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的光感受器(杆状或锥状)细胞感染性。
在一些实施方案中,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经玻璃体内注射施用时对光感受器细胞的感染性相比,主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射施用时表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的光感受器(杆状或锥状)细胞感染性。
在一些实施方案中,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对RGC的感染性相比,主题rAAV病毒体表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的RGC感染性。
在一些实施方案中,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经玻璃体内注射施用时对RGC的感染性相比,主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射施用时表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的RGC感染性。
在一些实施方案中,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对RPE细胞的感染性相比,主题rAAV病毒体表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的RPE细胞感染性。
在一些实施方案中,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经玻璃体内注射施用时对RPE细胞的感染性相比,主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射施用时表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的RPE细胞感染性。
在一些实施方案中,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对缪勒细胞的感染性相比,主题rAAV病毒体表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的缪勒细胞感染性。
在一些实施方案中,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经玻璃体内注射施用时对缪勒细胞的感染性相比,主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射施用时表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的缪勒细胞感染性。
在一些实施方案中,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对双极细胞的感染性相比,主题rAAV病毒体表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的双极细胞感染性。
在一些实施方案中,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经玻璃体内注射施用时对双极细胞的感染性相比,主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射施用时表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的双极细胞感染性。
在一些实施方案中,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对无长突细胞的感染性相比,主题rAAV病毒体表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的无长突细胞感染性。
在一些实施方案中,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经玻璃体内注射施用时对无长突细胞的感染性相比,主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射施用时表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的无长突细胞感染性。
在一些实施方案中,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对水平细胞的感染性相比,主题rAAV病毒体表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的水平细胞感染性。
在一些实施方案中,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经玻璃体内注射施用时对水平细胞的感染性相比,主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射施用时表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的水平细胞感染性。
在一些情况下,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体穿过ILM的能力相比,主题rAAV病毒体表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的穿过内界膜(ILM)的能力。
在一些情况下,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经玻璃体内注射施用时穿过ILM的能力相比,主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射施用时表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的穿过内界膜(ILM)的能力。
主题rAAV病毒体可穿过ILM,并且也可经过细胞层,包括缪勒细胞、无长突细胞等,以达到光感受器细胞或RPE细胞。例如,主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射施用时可穿过ILM,并且也可经过细胞层,包括缪勒细胞、无长突细胞等,以达到光感受器细胞或RPE细胞。
在一些实施方案中,主题rAAV病毒体选择性感染视网膜细胞,例如,主题rAAV病毒体以比非视网膜细胞,例如眼睛外部的细胞强10倍、15倍、20倍、25倍、50倍或50倍以上的特异性感染视网膜细胞。例如,在一些实施方案中,主题rAAV病毒体选择性感染视网膜细胞,例如,主题rAAV病毒体以比非视网膜细胞,例如眼睛外部的细胞强10倍、15倍、20倍、25倍、50倍或50倍以上的特异性感染光感受器细胞。
在一些实施方案中,主题rAAV病毒体选择性感染光感受器细胞,例如,主题rAAV病毒体以比眼部存在的非光感受器细胞,例如视网膜神经节细胞、缪勒细胞等强10倍、15倍、20倍、25倍、50倍或50倍以上的特异性感染光感受器细胞。
在一些实施方案中,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体在经玻璃体内注射施用时对光感受器细胞的感染性相比,主题rAAV病毒体在经玻璃体内注射施用时表现出增强至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的光感受器细胞感染性。
基因产物
主题rAAV病毒体包含含编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中,基因产物为干扰RNA。在一些实施方案中,基因产物为适配体。在一些实施方案中,基因产物为多肽。在一些实施方案中,基因产物为提供对基因功能的位点特异性敲除的位点特异性核酸酶。
干扰RNA
基因产物为干扰RNA(RNAi)时,适合的RNAi包括降低细胞内凋亡或血管生成因子的水平的RNAi。例如,RNAi可为降低细胞内诱导或促进凋亡的基因产物水平的shRNA或siRNA。本文将基因产物诱导或促进凋亡的基因称为“促凋亡基因”而将那些基因的产物(mRNA;蛋白质)称为“促凋亡基因产物”。促凋亡基因产物包括(例如)Bax、Bid、Bak和Bad基因产物。见,例如,美国专利No.7,846,730。
干扰RNA也可抗血管生成产物,例如VEGF(例如,Cand5;见,例如,美国专利公布No.2011/0143400;美国专利公布No.2008/0188437;和Reich等(2003)Mol.Vis.9:210)、VEGFR1(例如,Sirna-027;见,例如,Kaiser等(2010)Am.J.Ophthalmol.150:33;和Shen等(2006)Gene Ther.13:225)或VEGFR2(Kou等(2005)Biochem.44:15064)。同样见,美国专利No.6,649,596、6,399,586、5,661,135、5,639,872和5,639,736;和美国专利No.7,947,659和7,919,473。
适配体
基因产物为适配体时,示例性目标适配体包括对血管内皮生长因子(VEGF)的适配体。见,例如,Ng等(2006)Nat.Rev.Drug Discovery5:123;和Lee等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:18902。例如,VEGF适配体可包含核苷酸序列5'-cgcaaucagugaaugcuuauacauccg-3'(SEQ ID NO:17)。PDGF特异性适配体也适合使用,例如E10030;见,例如,Ni和Hui(2009)Ophthalmologica223:401;和Akiyama等(2006)J.Cell Physiol.207:407)。
多肽
基因产物为多肽时,多肽通常为增强视网膜细胞功能,例如杆状或锥状光感受器细胞、视网膜神经节细胞、缪勒细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色素上皮细胞的功能的多肽。示例性多肽包括神经保护多肽(例如,GDNF、CNTF、NT4、NGF和NTN);抗血管生成多肽(例如,可溶性血管内皮生长因子(VEGF)受体;VEGF结合抗体;VEGF结合抗体片段(例如,单链抗VEGF抗体);内皮抑素(endostatin);肿瘤抑素(tumstatin);血管抑素(angiostatin);可溶性Flt多肽(Lai等(2005)Mol.Ther.12:659);包含可溶性Flt多肽的Fc融合蛋白(见,例如,Pechan等(2009)Gene Ther.16:10);色素上皮源性因子(PEDF);可溶性Tie-2受体等);金属蛋白酶-3的组织抑制剂(TIMP-3);光反应性视蛋白(opsin),例如视紫红质;抗凋亡多肽(例如,Bcl-2、Bcl-X1)等。适合多肽包括但不限于胶质源性神经营养因子(GDNF);成纤维细胞生长因子2;神经营养因子(neurturin)(NTN);睫状神经营养因子(CNTF);神经生长因子(NGF);神经营养蛋白-4(NT4);源性神经营养因子(BDNF;例如,包含与图11所示氨基酸序列(SEQ ID NO:11)的约200个氨基酸至247个氨基酸的连续段有至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽);表皮生长因子;视紫红质;X连锁凋亡抑制蛋白;和音猬因子(Sonic hedgehog)。
适合的光反应性视蛋白包括(例如)如美国专利公布No.2007/0261127(例如,ChR2;Chop2);美国专利公布No.2001/0086421;美国专利公布No.2010/0015095;和Diester等(2011)Nat.Neurosci.14:387中描述的光反应性视蛋白。
适合多肽还包括视网膜劈裂蛋白(例如,包含与图10所示氨基酸序列(SEQ ID NO:10)的约200个氨基酸至224个氨基酸的连续段有至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽)。适合多肽包括(例如)色素性视网膜炎GTP酶调节因子(RGPR)-相互作用蛋白-1(见,例如,基因库登记号Q96KN7、Q9EPQ2和Q9GLM3)(例如,包含与图16所示氨基酸序列(SEQ ID NO:21)的约1150个氨基酸至约1200个氨基酸或约1200个氨基酸至约1286个氨基酸的连续段有至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽);外周蛋白-2(Prph2)(见,例如,基因库登记号NP_000313(例如,包含与图14所示氨基酸序列(SEQ ID NO:19)的约300个氨基酸至346个氨基酸的连续段有至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽);和Travis等(1991)Genomics10:733);外周蛋白(例如,包含与图15所示氨基酸序列(SEQ ID NO:20)的约400个氨基酸至470个氨基酸的连续段有至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽);视网膜色素上皮特异性蛋白(RPE65),(例如,包含与图12所示氨基酸序列(SEQ ID NO:12)的约200个氨基酸至247个氨基酸的连续段有至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽)(见,例如,基因库AAC39660;和Morimura等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:3088)等。
适合多肽还包括:CHM(脉络膜缺损(choroidermia)(Rab护送蛋白1)),当缺损或缺失时,引起无脉络膜的一种多肽(见,例如,Donnelly等(1994)Hum.Mol.Genet.3:1017;和van Bokhoven等(1994)Hum.Mol.Genet.3:1041);和碎屑同源物1(CRB1),当缺损或缺失时,引起利伯氏先天性黑内障(Leber congenital amaurosis)和色素性视网膜炎的一种多肽(见,例如,den Hollander等(1999)Nat.Genet.23:217;和基因库登记号CAM23328)。
适合多肽还包括当缺损或缺失时,导致全色盲的多肽,其中此类多肽包括(例如)杆状光感受器cGMP-门控通道亚基α(CNGA3)(见,例如,基因库登记号NP_001289;和Booij等(2011)Ophthalmology118:160-167);杆状光感受器cGMP-门控通道β亚基(CNGB3)(见,例如,Kohl等(2005)Eur J Hum Genet.13(3):302);鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)、α转导活性多肽2(GNAT2)(ACHM4);和ACHM5;和缺损或缺乏时,导致各种形式的色盲的多肽(例如,L-视蛋白、M-视蛋白和S-视蛋白)。见Mancuso等(2009)Nature461(7265):784-787。
位点特异性核酸内切酶
在一些情况下,目标基因产物为提供对基因功能的位点特异性敲除的位点特异性核酸内切酶,例如,其中核酸内切酶敲除与视网膜疾病相关的等位基因。例如,若显性等位基因编码,野生型时,为视网膜结构蛋白和/或提供正常的视网膜功能的缺陷基因拷贝,则位点特异性核酸内切酶可靶向缺陷等位基因并敲除缺陷等位基因。
除敲除缺陷等位基因外,位点特异性核酸酶也可用于刺激与编码缺陷等位基因编码的蛋白质的功能拷贝的供体DNA的同源重组。因此,例如,主题rAAV病毒体可用于递送敲除缺陷等位基因的位点特异性核酸内切酶,并且可用于递送缺陷等位基因的功能拷贝,引起功能拷贝修复,从而提供功能性视网膜蛋白(例如,功能性视网膜劈裂蛋白、功能性RPE65、功能性外周蛋白等)的生成。见,例如,Li等(2011)Nature475:217。在一些实施方案中,主题rAAV病毒体包含编码位点特异性核酸内切酶的异源核苷酸序列;和编码缺陷等位基因的功能拷贝的异源核苷酸序列,其中所述功能拷贝编码功能性视网膜蛋白。功能性视网膜蛋白包括(例如)视网膜劈裂蛋白、RPE65、色素性视网膜炎GTP酶调节因子(RGPR)-相互作用蛋白-1、外周蛋白、外周蛋白-2等。
适合使用的位点特异性核酸内切酶包括(例如)锌指核酸酶(ZFN);和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN),其中此类位点特异性核酸内切酶并非自然存在并且经修饰为靶向特定基因。此类位点特异性核酸酶可经工程化以切割基因组内的特定位置,然后非同源末端连接可在插入或消去几个核苷酸的同时修复断裂处。然后此类位点特异性核酸内切酶(也称为“INDEL”)将蛋白质抛出框外并有效敲除基因。见,例如,美国专利公布No.2011/0301073。
调控序列
在一些实施方案中,编码目标基因产物的核苷酸序列与组成型启动子可操作地连接。在其它实施方案中,编码目标基因产物的核苷酸序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些情况下,编码目标基因产物的核苷酸序列与组织特异性或细胞类型特异性调控元件可操作地连接。例如,在一些情况下,编码目标基因产物的核苷酸序列与光感受器特异性调控元件(例如,光感受器特异性启动子)可操作地连接,例如赋予光感受器细胞内可操作地连接的基因选择性表达的调控元件。适合的光感受器特异性调控元件包括(例如)视紫红质启动子;视紫红质激酶启动子(Young等(2003)Ophthalmol.Vis.Sci.44:4076);β磷酸二酯酶基因启动子(Nicoud等(2007)J.Gene Med.9:1015);色素性视网膜炎基因启动子(Nicoud等(2007)同上);和光感受器间维甲酸结合蛋白(IRBP)基因增强子(Nicoud等(2007)同上);IRBP基因启动子(Yokoyama等(1992)Exp Eye Res.55:225)。
药物组合物
本公开提供了一种药物组合物,包含:a)如上所述的主题rAAV病毒体;和b)药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲液。在一些实施方案中,药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲液适合用于人类。
此类赋形剂、载体、稀释剂和缓冲液包括可施用而无异常毒性的任何药剂。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体,例如水、盐水、甘油和乙醇。其中可包括药学上可接受的盐,例如矿物酸盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等;和有机酸的盐例如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外,在此类媒介物中可存在辅助物质,例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。在本领域中已知多种多样的药学上可接受的赋形剂而不需要在本文中详细讨论。在多种出版物中已经详尽地描述了药学上可接受的赋形剂,包括(例如)A.Gennaro(2000)"Remington:The Science and Practice of Pharmacy,"第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins;Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等编辑,第7版,Lippincott,Williams,&Wilkins;和Handbook ofPharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等编辑,第3版,Amer.Pharmaceutical Assoc。
将基因产物递送至视网膜细胞的方法和治疗方法
本公开提供了一种将基因产物递送至个体的视网膜细胞的方法,所述方法包括向所述个体施用如上所述的主题rAAV病毒体。基因产物可为如上所述的多肽或干扰RNA(例如,shRNA、siRNA等)、适配体、位点特异性核酸内切酶。将基因产物递送至视网膜细胞可提供对视网膜疾病的治疗。视网膜细胞可为光感受器、视网膜神经节细胞、缪勒细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色素上皮细胞。在一些情况下,视网膜细胞为光感受器细胞,例如杆状或锥状细胞。
本公开提供了一种治疗视网膜疾病的方法,所述方法包括向有需要的个体施用有效量的如上所述的主题rAAV病毒体。主题rAAV病毒体可经眼内注射、通过玻璃体内注射或通过其它方便的施用模式或途径施用。其它方便的施用模式或途径包括(例如)静脉内、鼻内等。
“治疗有效量”将落在通过实验和/或临床试验确定的相对较宽的范围内。例如,对于体内注射,即直接注射至眼内而言,治疗有效剂量将相当于约106至约1015个rAAV病毒体,例如约108至约1012个rAAV病毒体。对于体外转导而言,待递送至细胞的rAAV病毒体的有效量将相当于约108至约1013个rAAV病毒体。其它有效剂量可易于由本领域的普通技术人员通过确定剂量反应曲线的常规试验确定。
在一些实施方案中,可在不同间隔期内,例如每天、每周、每月、每年采用一次以上施用(例如,2、3、4次或更多次施用),以达到所需水平的基因表达。
可施用主题方法治疗的眼病包括但不限于急性黄斑区神经视网膜病变;白塞氏病(Behcet's disease);脉络膜新生血管;糖尿病性葡萄膜炎;组织胞浆菌病;黄斑变性,例如急性黄斑变性、非渗出性老年性黄斑变性和渗出性老年性黄斑变性;水肿,例如黄斑水肿、黄斑囊样水肿和糖尿病性黄斑水肿;多灶性脉络膜炎;影响后眼部或位置的眼外伤;眼部肿瘤;视网膜病症,例如视网膜中央静脉阻塞、糖尿病性视网膜病(包括增生性糖尿病性视网膜病)、增生性玻璃体视网膜病变(PVR)、视网膜动脉阻塞性疾病、视网膜脱离、色素层炎视网膜疾病;交感性眼炎;VogtKoyanagi-Harada(VKH)综合征;眼色素层弥散;由眼部激光治疗引起或影响的眼后部病状;光动力疗法引起或影响的眼后部病状;光凝固法、辐射性视网膜病变;视网膜前膜病症;视网膜静脉分枝阻塞;前部缺血性视神经病变;非视网膜病变糖尿病性视网膜功能障碍;视网膜劈裂症;色素性视网膜炎;青光眼;尤塞氏综合征(Usher syndrome);视锥-视杆细胞营养不良;斯特格氏病(Stargardt disease)(眼底黄色斑点症);遗传性黄斑变性;脉络膜视网膜变性;利伯氏先天性黑内障;先天性静止性夜盲;无脉络膜;巴比二氏综合征(Bardet-Biedl syndrome);黄斑毛细管扩张;利伯氏遗传性视神经病;早产儿视网膜病;和色觉障碍,包括全色盲、红色盲、绿色盲和蓝色盲。
核酸和宿主细胞
本公开提供了包含编码如上所述的主题变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列的分离核酸,其中相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,所述变异AAV衣壳蛋白在GH环或IV环中包含约5个氨基酸至约11个氨基酸的插入,并且其中当存在于AAV病毒体中时,与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比,所述变异衣壳蛋白提供增强的视网膜细胞感染性。主题分离核酸可为AAV载体,例如重组AAV载体。
插入肽
主题核酸编码的变异AAV衣壳蛋白具有插入AAV衣壳的GH环中,长度约5个氨基酸至约11个氨基酸的插入肽。插入肽的长度为5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸或11个氨基酸。
插入肽可包含以下提出的任一公式的氨基酸序列。
例如,插入肽可为长度为5-11个氨基酸的肽,其中所述插入肽是式I的插入肽:
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
其中:
Y1-Y4(若存在)的每一个独立选自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr;
X1(若存在)选自Leu、Asn和Lys;
X2选自Gly、Glu、Ala和Asp;
X3选自Glu、Thr、Gly和Pro;
X4选自Thr、Ile、Gln和Lys;
X5选自Thr和Ala;
X6选自Arg、Asn和Thr;
X7(若存在)选自Pro和Asn。
再如,插入肽可为长度为5-11个氨基酸的肽,其中所述插入肽是式IIa的插入肽:
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
其中:
Y1-Y4(若存在)的每一个独立选自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr;
X1-X4的每一个为任何氨基酸;
X5为Thr;
X6为Arg;并且
X7为Pro。
再如,插入肽可为长度为5-11个氨基酸的肽,其中所述插入肽是式IIb的插入肽:
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
其中:
Y1-Y4(若存在)的每一个独立选自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr;
X1(若存在)选自Leu和Asn;
X2(若存在)选自Gly和Glu;
X3选自Glu和Thr;
X4选自Thr和Ile;
X5为Thr;
X6为Arg;并且
X7为Pro。
再如,插入肽可为长度为5-11个氨基酸的肽,其中所述插入肽是式III的插入肽:
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
其中:
Y1-Y4(若存在)的每一个独立选自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr;
X1(若存在)为Lys;
X2选自Ala和Asp;
X3选自Gly和Pro;
X4选自Gln和Lys;
X5选自Thr和Ala;
X6选自Asn和Thr;
X7(若存在)为Asn。
再如,插入肽可为长度为5-11个氨基酸的肽,其中所述插入肽是式IV的插入肽:
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
其中:
Y1-Y4(若存在)的每一个独立选自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr;
X1(若存在)为带正电的氨基酸或不带电的氨基酸;或选自Leu、Asn、Arg、Ala、Ser和Lys;
X2为带负电的氨基酸或不带电的氨基酸;或选自Gly、Glu、Ala、Val、Thr和Asp;
X3为带负电的氨基酸或不带电的氨基酸;或选自Glu、Thr、Gly、Asp或Pro;
X4选自Thr、Ile、Gly、Lys、Asp和Gln;
X5为极性氨基酸、醇(具有游离羟基的氨基酸)或疏水氨基酸;或选自Thr、Ser、Val和Ala;
X6为带正电的氨基酸或不带电的氨基酸;或选自Arg、Val、Lys、Pro、Thr和Asn;并且
X7(若存在)为带正电的氨基酸或不带电的氨基酸;或选自Pro、Gly、Phe、Asn和Arg。
作为非限制性实例,插入肽可包含选自LGETTRP(SEQ D NO:13)、NETITRP(SEQ ID NO:14)、KAGQANN(SEQ ID NO:15)、KDPKTTN(SEQID NO:16)、KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQ ID NO:59)和STGKVPN(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列。
在一些情况下,插入肽在LGETTRP(SEQ ID NO:13)、NETITRP(SEQID NO:14)、KAGQANN(SEQ ID NO:15)、KDPKTTN(SEQ ID NO:16)、KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQID NO:59)和STGKVPN(SEQ ID NO:60)的任一个的氨基末端和/或羧基末端具有1-4个间隔氨基酸(Y1-Y4)。适合的间隔氨基酸包括但不限于亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸。
例如,在一些情况下,插入肽具有下列氨基酸序列之一:LALGETTRPA(SEQ ID NO:45)、LANETITRPA(SEQ ID NO:46)、LAKAGQANNA(SEQ ID NO:47)、LAKDPKTTNA(SEQ ID NO:48)、LAKDTDTTRA(SEQ IDNO:61)、LARAGGSVGA(SEQ ID NO:62)、LAAVDTTKFA(SEQ ID NO:63)和LASTGKVPNA(SEQ ID NO:64)。再如,在一些情况下,插入肽具有下列氨基酸序列之一:AALGETTRPA(SEQ ID NO:49)、AANETITRPA(SEQID NO:50)、AAKAGQANNA(SEQ ID NO:51)和AAKDPKTTNA(SEQ ID NO:52)。又如,在一些情况下,插入肽具有下列氨基酸序列之一:GLGETTRPA(SEQ ID NO:53)、GNETITRPA(SEQ ID NO:54)、GKAGQANNA(SEQ ID NO:55)和GKDPKTTNA(SEQ ID NO:56)。再如,在一些情况下,插入肽包含在C端一侧为AA而在N端一侧为A的KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQ ID NO:59)和STGKVPN(SEQ ID NO:60)的其中一个;或包含在C端一侧为G而在N端一侧为A的KDTDTTR(SEQID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQ ID NO:59)和STGKVPN(SEQ ID NO:60)的其中一个。
主题重组AAV载体可用于生成如上所述的主题重组AAV病毒体。因此,本公开提供了当引入适合细胞内,可提供主题重组AAV病毒体的生成的重组AAV载体。
本公开进一步提供了包含主题核酸的宿主细胞,例如经分离(经遗传修饰的)宿主细胞。主题宿主细胞可为分离细胞,例如体外培养的细胞。如下所述,主题宿主细胞可用于生成主题rAAV病毒体。主题宿主细胞用于生成主题rAAV病毒体时,将其称为“包装细胞”。在一些实施方案中,主题宿主细胞经主题核酸稳定地遗传修饰。在其它实施方案中,主题宿主细胞经主题核酸暂时地遗传修饰。
使用确定技术,包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染等,稳定或暂时地将主题核酸引入宿主细胞中。为了稳定转化,主题核酸通常将进一步包括可选标记,例如几种众所周知的可选标记的任一种,例如新霉素抗性等。
通过将主题核酸引入多种细胞的任一种,例如哺乳动物细胞,包括(例如)鼠科动物细胞和灵长类动物细胞(例如,人类细胞)中生成主题宿主细胞。适合的哺乳动物细胞包括但不限于原代细胞和细胞系,其中适合的细胞系包括但不限于293细胞、COS细胞、HeLa细胞、Vero细胞、3T3小鼠成纤维细胞、C3H10T1/2成纤维细胞、CHO细胞等。适合宿主细胞的非限制性实例包括(例如)HeLa细胞(例如美国模式培养物保藏所(ATCC)No.CCL-2)、CHO细胞(例如,ATCC No.CRL9618、CCL61、CRL9096)、293细胞(例如,ATCC No.CRL-1573)、Vero细胞、NIH3T3细胞(例如,ATCC No.CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如,ATCC No.CCL10)、PC12细胞(ATCC No.CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC No.CRL1651)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCC No.CCLI.3)、人胚肾(HEK)细胞(ATCC No.CRL1573)、HLHepG2细胞等。也可使用杆状病毒感染产生AAV的昆虫细胞例如Sf9细胞制备主题宿主细胞(见,例如,美国专利No.7,271,002;美国专利公布12/297,958)。
在一些实施方案中,除包含如上所述编码变异AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸外,经遗传修饰的主题宿主细胞还包括包含编码一种或多种AAV rep蛋白的核苷酸序列的核酸。在其它实施方案中,主题宿主细胞进一步包含rAAV载体。可使用主题宿主细胞生成rAAV病毒体。例如,在美国专利公布No.2005/0053922和美国专利公布No.2009/0202490中描述了生成rAAV病毒体的方法。
实施例
提出下列实施例以便为本领域的普通技术人员提供如何制备和使用本发明的全面公开和描述,并非旨在限制发明人视为其发明的范围,也并非旨在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已经努力确保关于所用数字(例如,数量、温度等)的精确性,但是应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指出,份为重量份,分子量为重均分子量,温度按摄氏度计,而压力为或接近大气压。可使用标准偏差,例如bp,碱基对;kb,千碱基对;pl,皮升;s或sec,秒;min,分;h或hr,小时;aa,氨基酸;kb,千碱基对;bp,碱基对;nt,核苷酸;i.m.,肌肉内;i.p.,腹膜内;s.c.,皮下等等。
实施例1:视网膜细胞转导增强的AAV变异体
所用方法是通过聚合酶链反应(PCR)诱变将独特AvrII位点引入野生型AAV2基因组介于氨基酸587和588之间产生肽展示库。使用随机21核苷酸插入,7mer For,连同反义引物7mer Rev一起合成dsDNA插入。用NheI消化后将所得dsDNA插入克隆至基因组的AvrII位点,生成不同的7mer展示库,然后包装7mer展示库(Perabo等,2003;Muller等,2003)。生成病毒,以致将每个病毒基因组包装或壳体化于该基因组编码的衣壳蛋白变异体中。在这点上,通过选择鉴定的功能改进可能与编码病毒衣壳中所含的这种改进功能的基因组序列有关联。
使这个库在rho-GFP小鼠体内经受阳性选择(Wensel等(2005)Vision Res.45:3445)。简言之,在第一轮选择中,为成年rho-GFP小鼠玻璃体内注射2μL经磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析的碘克沙醇(iodixanol)纯化库,基因组滴度为约1×1012个病毒基因组(vg)/mL。超细30 1/2-规一次性针头穿过动物眼睛的巩膜,在中纬线处并且靠近边缘,进入玻璃体腔。通过直接观察在玻璃体腔中央的针头注射2μ1病毒。注射1周后,摘出眼睛并使用光、木瓜蛋白酶处理解离视网膜,接着荧光激活细胞分选仪(FACS)分离光感受器群体。然后由后续基因组萃取PCR扩增成功的病毒体并进一步克隆和重新包装用于注射。
进一步进行这种选择的重复,使变异体库缩小为具有大多数允许突变的亚类。重复3次后,进行一轮易错PCR以引起变异体的进一步生成以便选择。总计,重复这个过程两代。在这点上,与自然进化相似,这个定向进化过程通过应用阳性选择和诱变产生光感受器允许型AAV变异体。
随后,为50种变异体的空位基因测序以确定最显著和成功的变异体具有供玻璃体内光感受器转导的允许突变。50个克隆中,46个产生7mer插入的可读序列。显著地,近三分之二的克隆含有同一个不同的7mer基序(~588LGETTRP~;SEQ ID NO:13)。有趣的是,次显著变异体(~588NETITRP~;SEQ ID NO:14)也含有由介于极性苏氨酸和非极性脯氨酸残基之间带正电的精氨酸残基组成的类似侧面基序(TRP)。
表1
克隆 近似频率(%) 频率
588LGETTRP~;SEQ ID NO:13 64 31
588NETITRP~;SEQ ID NO:14 12 5
588KAGQANN~;SEQ ID NO:15 6 3
588KDPKTTN~;SEQ ID NO:16 4 2
588KDTDTTR~;SEQ ID NO:57 2
588RAGGSVG~;SEQ ID NO:58 1
588AVDTTKF~;SEQ ID NO:59 1
588STGKVPN~;SEQ ID NO:60 1
表1来自定向进化的分离变异体的测序显示了病毒库中高度收敛。所有变异体源自AAV27mer库,大约64%的变异体含有同一7mer基序(~588LGETTRP~(SEQ ID NO:13))。
在7mer插入序列中,对特定位置有适度优先,例如位置1处带正电的氨基酸;位置2处带负电的氨基酸;位置5处的醇(例如,具有醇基(游离羟基)的氨基酸,例如Thr或Ser)。
如表2所示,7mer插入两侧为间隔区:
克隆 频率
588LALGETTRPA~(SEQ ID NO:45) 31
588LANETTRPA~(SEQ ID NO:46) 5
588LAKAGQANNA~(SEQ ID NO:47) 3
588LAKDPKTTNA~(SEQ ID NO:48) 2
588LAKDTDTTRA~(SEQ ID NO:61) 2
588LARAGGSVGA~(SEQ ID NO:62) 1
588LAAVDTTKFA~(SEQ ID NO:63) 1
588LASTGKVPNA~(SEQ ID NO:64) 1
图1.在氨基酸587之后含有无规七聚物(橙色所示)的AAV2的代表性三维模型。AAV2衣壳的这个区域很可能参与细胞表面受体结合。
根据来自上述选择的高度库收敛,克隆重组形式的AAV2~588LGETTRP~(SEQ ID NO:13;昵称7M8)并且包装具有scCAG-GFP转基因的载体以使其转导性质显现。成年小鼠玻璃体内注射3周后,观察到在许多细胞类型中稳健表达,包括视网膜神经节细胞(RGC)和缪勒细胞。重要的是,观察到正如通过外核层(ONL)细胞核(红色箭头)和外节(图2,蓝色箭头)中的GFP表达所见,注射了7M8的视网膜中光感受器转导,而AAV2未显示出可辩别的光感受器表达。
图2.相对于AAV2(左),AAV27M8变异体(右)展现出更高水平的玻璃体内光感受器转导。成年小鼠玻璃体内注射2μL的1×1012vg/mL的AAV27M8和AAV2scCAG GFP3周后视网膜横切面的共聚焦显微镜检查。红色箭头(上)指示光感受器细胞核而蓝色箭头(上)指示光感受器外节。
根据视网膜细胞中的这些增益,试图通过使用含有光感受器特异性视紫红质启动子的ssRho-eGFP转基因增加表达的特异性,以更好地解决特别是在光感受器中的转导效率(图3)。实际上,光感受器特异性Rho启动子的使用将GFP表达限于光感受器。试图通过使合理的设计方法与先前的定向进化方法结合提高7M8转导效率。因此,将7M8衣壳上4个表面暴露的酪氨酸残基诱变为苯丙氨酸(Y273F、Y444F、Y500F和Y730F),这先前已经证实提高了光感受器感染性(Petrs-Silva等,2009)。有趣的是,正如对来自受7m8或7m8-4YF感染的视网膜的GFP(+)光感受器的FAC分选(图4)所示,与原病毒相比,突变的增加使转导的光感受器数量减少。
图3.视网膜低温切片的代表性荧光图像,显示出由携带GFP基因的7m8,在普遍存在的CAG启动子(左)或光感受器特异性Rho启动子(右)的控制下产生的GFP表达。
图4.通过流式细胞术计数的每一百万个视网膜细胞的GFP(+)光感受器细胞。与携带4个酪氨酸突变(上)的7m8相比,7m8转导超过2×量的光感受器。
实施例2:视网膜劈裂症的治疗
使用表达构建体7m8-rho-RS1,将功能性网膜劈裂蛋白(RS1)递送至视网膜劈裂蛋白缺陷型小鼠(Rs1h缺陷型小鼠;Rs1h为人RS1的小鼠同源物)。载体包含在视紫红质启动子的转录控制下编码功能性视网膜劈裂蛋白的核苷酸序列。见图13A-C,其中粗体和加下划线的核苷酸序列(核苷酸4013-4851)为视紫红质启动子;并且核苷酸4866-5540(起始atg和终止tga序列以粗体显示)编码人RS1蛋白。
在P15时,经玻璃体内向Rs1h-/-小鼠施用7m8-rho-RS1构建体。如所述,通过靶向破坏Rs1h基因的外显子3产生Rs1h-/-小鼠(Weber等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:6222)。Rs1h-/-小鼠缺乏Rs1h蛋白产物,具有负电性ERG(例如,约化b波,而a波相对保存)和与在人类视网膜劈裂症患者中所见类似的视网膜层裂开。向Rs1h-/-注射7m8-rho-RS1载体导致视网膜内来自光感受器的高水平全视网膜RS1表达。RS1表达导致视网膜形态改进,如频域光学相干断层(SD-OCT)成像(图7A-I)中所见视网膜内腔的数量和尺寸减小,ERG b波救援(图8A-D)和视网膜的结构长期保存(图9A-E)。
图7A-I.注射了7m8-rho-GFP(左列)、7m8-rho-RS1(中间列)或未注射的野生型动物(右列)视网膜的代表性高分辨率SD-OCT图像。通过上视网膜的内核层得到眼底图像并且将其它层排除在外(a-c)。使用视神经乳头作为标志得到上视网膜(d-f)和下视网膜(g-i)的横向图像。
因为病理由于使内视网膜裂开的劈裂而进展,当从内界膜(ILM)到光感受器测量时,未经治疗的RS1视网膜的总厚度增加。这个过程与在不形成劈裂,但是表现出INL中进行性光感受器细胞死亡及伴随视网膜变薄和ERG振幅减小的大多数视网膜退行性疾病(RDD)中所观察到的过程不同。在RS1中,当光感受器因疾病而死时ONL变薄,但是这不同于视网膜总厚度变化。通常认为,对RS1的成功治疗将使视网膜总厚度恢复为野生型并且改善ONL中的光感受器损失。在除Rs1的大多数RDD中,以ONL变薄为特征的光感受器损失伴有通过ERG振幅测量的视网膜生理输出减少。RS1是病理使视网膜厚度增加,而伴随erg振幅减小的视网膜疾病的很少几个实例之一。总之,恢复RS1基因产物,细胞外视网膜“胶”使视网膜变薄回野生型厚度并且因为劈裂消退,erg振幅恢复至接近正常水平。
图8a示出了未经治疗的Rs1-/-眼与注射了AAV2-rho-RS1、7m8-rho-GFP和7m8-rho-RS1的眼在注射后1个月(左)和4个月(右)功能性救援的比较。注射后1个月,7m8-rho-RS1导致大量援救ERG b波振幅,而AAV2-rho.RS1与未经治疗的眼在统计上无区别。
4个月后,7m8-rho-RS1振幅增大至野生型振幅(右)。图8b示出了注射了7m8-rho-RS1的眼的代表性ERG轨迹,显示与注射了7m8-rho-GFP的眼相比,a波和b波振幅增大并且波形接近于野生型眼。图8c示出了从注射后1个月开始按月在每种情况的P15时记录的由高强度(1log cd×s/m2)刺激产生的全视野暗视b波的振幅。记录了3次反应并计算每只眼在每个时间点的平均值。
根据注射后的时间绘制平均ERG b波振幅。n=7用于两种情况。图8d示出了对暗视(上轨迹,刺激范围从-3到1log cd×s/m2)和明视(下轨迹,范围从-0.9到1.4log cd×s/m2)条件下ERG反应的分析,显示在一定刺激强度范围内杆状和锥状细胞功能改善。
图9A-E.7m8-rho-RS1治疗后10个月测量的视网膜厚度持续增加。集中在视神经乳头注射后10个月经a)7m8-rho-RS1或b)或7m8-rho-GFP治疗的视网膜的代表性横向SD-OCT图像。作为与视神经乳头的距离的函数绘制c)视网膜厚度、d)ONL厚度和e)内外节厚度的测量值。
实施例3:用于将蛋白质递送至猕猴视网膜细胞的AAV变异体
生成重组AAV2病毒体(携带受连接蛋白36启动子控制的GFP的7m8)。重组AAV2病毒体包括在AAV2衣壳的氨基酸587和588之间有LALGETTRPA肽插入的AAV2衣壳变异体,和受连接蛋白36启动子的转录控制的在中间神经元中表达的GFP。将rAAV2病毒体经玻璃体内注射至猕猴眼内。图18中示出了数据。
图18提供了荧光眼底图像,显示在施用携带受连接蛋白36启动子控制的GFP的7m8后9周,在视网膜后部的GFP表达。与亲本AAV2血清型(Yin等,IO VS52(5);2775)相比,在视网膜中央凹环中看到更高水平的表达,并且在视网膜中央凹外的中央视网膜中看到可见荧光。
参考文献
Daiger SP,Bowne SJ,Sullivan LS(2007)Perspective on genesand mutations causing retinitis pigmentosa.Arch Ophthalmol125:151-158.
Dalkara D,Kolstad KD,Caporale N,Visel M,Klimczak RR等人(2009)Inner Limiting Membrane Barriers to AAV MediatedRetinal Transduction from the Vitreous.Mol Ther.
den Hollander AI,Roepman R,Koenekoop RK,Cremers FP(2008)Leber congenital amaurosis:genes,proteins and diseasemechanisms.Prog Retin Eye Res27:391-419.
Gruter O,Kostic C,Crippa SV,Perez MT,Zografos L等人(2005)Lentiviral vector-mediated gene transfer in adult mousephotoreceptors is impaired by the presence of a physical barrier.Gene Ther12:942-947.
Maguire AM,Simonelli F,Pierce EA,Pugh EN,Jr.,MingozziF等人(2008)Safety and efficacy of gene transfer for Leber’s congenital amaurosis.N Engl J Med358:2240-2248.
Mancuso K,Hauswirth WW,Li Q,Connor TB,Kuchenbecker JA等人(2009)Gene therapy for red-green colour blindness in adultprimates.Nature461:784-787.
McGee Sanftner LH,Abel H,Hauswirth WW,Flannery JG(2001)Glial cell line derived neurotrophic factor delaysphotoreceptor degeneration in a transgenic rat model ofretinitis pigmentosa.Mol Ther4:622-629.
Muller OJ,Kaul F,Weitzman MD,Pasqualini R,Arap W等人(2003)Random peptide libraries displayed on adeno-associatedvirus to select for targeted gene therapy vectors.NatBiotechnol21:1040-1046.
Nakazawa T.等人(2007)Attenuated glial reactions andphotoreceptor degeneration after retinal detachment in micedeficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin.Invest Ophthamol Vis Sci48:2760-8.
Nakazawa T.等人(2006)Characterization of cytokineresponses to retinal detachment in rats.Mol Vis12:867-78.
Perabo L,Buning H,Kofler DM,Ried MU,Girod A等人(2003)In vitro selection of viral vectors with modified tropism:theadeno-associated virus display.Mol Ther8:151-157.
Petrs-Silva H,Dinculescu A,Li Q,Min SH,Chiodo V等人(2009)High-efficiency transduction of the mouse retina bytyrosine-mutant AAV serotype vectors.Mol Ther17:463-471.
Reme CE,Grimm C,Hafezi F,Wenzel A,Williams TP(2000)Apoptosis in the Retina:The Silent Death of Vision.NewsPhysiol Sci15:120-124.
Rolling F(2004)Recombinant AAV-mediated gene transfer tothe retina:gene therapy perspectives.Gene Ther11Suppl 1:S26-32.
Wensel TG,Gross AK,Chan F,Sykoudis K,Wilson JH(2005)Rhodopsin-EGFP knock-ins for imaging quantal gene alterations.Vision Res45:3445-3453.
Zhong L,Li B,Mah CS,Govindasamy L,Agbandje-McKenna M等人(2008)Next generation of adeno-associated virus2vectors:point mutations in tyrosines lead to high-efficiencytransduction at lower doses.Proc Natl Acad Sci U S A105:7827-7832.
虽然已经参考其特定实施方案描述了本发明,但是本领域的普通技术人员应理解,在不背离本发明的精神和范围的前提下,可做各种变化并代替等效方案。另外,可做许多修改以适应特殊情况、材料、物质组合物、工艺、一种或多种工序,对本发明的目的、精神和范围可做许多修改。旨在使所有此类修改均属于所附权利要求的范围之内。
Figure IDA0000419751440000011
Figure IDA0000419751440000021
Figure IDA0000419751440000031
Figure IDA0000419751440000041
Figure IDA0000419751440000051
Figure IDA0000419751440000061
Figure IDA0000419751440000071
Figure IDA0000419751440000081
Figure IDA0000419751440000091
Figure IDA0000419751440000101
Figure IDA0000419751440000121
Figure IDA0000419751440000141
Figure IDA0000419751440000151
Figure IDA0000419751440000161
Figure IDA0000419751440000171
Figure IDA0000419751440000181
Figure IDA0000419751440000191
Figure IDA0000419751440000221
Figure IDA0000419751440000241
Figure IDA0000419751440000251
Figure IDA0000419751440000261
Figure IDA0000419751440000271
Figure IDA0000419751440000281
Figure IDA0000419751440000301
Figure IDA0000419751440000311
Figure IDA0000419751440000321
Figure IDA0000419751440000341
Figure IDA0000419751440000361
Figure IDA0000419751440000381
Figure IDA0000419751440000391
Figure IDA0000419751440000401
Figure IDA0000419751440000411
Figure IDA0000419751440000421
Figure IDA0000419751440000461
Figure IDA0000419751440000471
Figure IDA0000419751440000481
Figure IDA0000419751440000491
Figure IDA0000419751440000501
Figure IDA0000419751440000511
Figure IDA0000419751440000521
Figure IDA0000419751440000531
Figure IDA0000419751440000541
Figure IDA0000419751440000551
Figure IDA0000419751440000561
Figure IDA0000419751440000571
Figure IDA0000419751440000581
Figure IDA0000419751440000591
Figure IDA0000419751440000601
Figure IDA0000419751440000611
Figure IDA0000419751440000621
Figure IDA0000419751440000641
Figure IDA0000419751440000651
Figure IDA0000419751440000661
Figure IDA0000419751440000671
Figure IDA0000419751440000681
Figure IDA0000419751440000691
Figure IDA0000419751440000701
Figure IDA0000419751440000711
Figure IDA0000419751440000721
Figure IDA0000419751440000731
Figure IDA0000419751440000741
Figure IDA0000419751440000751
Figure IDA0000419751440000761
Figure IDA0000419751440000771

Claims (27)

1.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒体,包含:
a)变异AAV衣壳蛋白,其中相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,所述变异AAV衣壳蛋白在衣壳蛋白GH环中包含约5个氨基酸至约11个氨基酸的插入,并且其中与包含所述相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比,所述变异衣壳蛋白赋予增强的视网膜细胞感染性;和
b)包含编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。
2.根据权利要求1所述的rAAV病毒体,其中所述插入为式I、式IIa、式III或式IV的肽。
3.根据权利要求2所述的rAAV病毒体,其中所述插入包含选自LGETTRP(SEQ ID NO:13)、NETITRP(SEQ ID NO:14)、KAGQANN(SEQID NO:15)、KDPKTTN(SEQ ID NO:16)、KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQ ID NO:59)和STGKVPN(SEQID NO:60)的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的rAAV病毒体,其中所述视网膜细胞为光感受器、视网膜神经节细胞、缪勒细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色素上皮细胞。
5.根据权利要求1所述的rAAV病毒体,其中所述插入位点介于AAV2的氨基酸587和588之间,介于AAV1的氨基酸590和591之间,介于AAV5的氨基酸575和576之间,介于AAV6的氨基酸590和591之间,介于AAV7的氨基酸589和590之间,介于AAV8的氨基酸590和591之间,介于AAV9的氨基酸588和589之间,或介于AAV10的氨基酸588和589之间。
6.根据权利要求1所述的rAAV病毒体,其中与包含所述相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比,所述rAAV病毒体表现出增强至少10倍的视网膜感染性。
7.根据权利要求1所述的rAAV病毒体,其中与包含所述相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比,所述rAAV病毒体表现出增强至少50倍的视网膜感染性。
8.根据权利要求1所述的rAAV病毒体,其中所述基因产物为干扰RNA或适配体。
9.根据权利要求1所述的rAAV病毒体,其中所述基因产物为多肽。
10.根据权利要求7所述的rAAV病毒体,其中所述多肽为神经保护多肽、抗血管生成多肽或增强视网膜细胞功能的多肽。
11.一种药物组合物,包含:
a)权利要求1的重组腺相关病毒病毒体;和
b)药学上可接受的赋形剂。
12.一种将基因产物递送至个体的视网膜细胞的方法,所述方法包括向所述个体施用根据权利要求1所述的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体。
13.根据权利要求11所述的方法,其中所述基因产物为多肽。
14.根据权利要求11所述的方法,其中所述基因产物为短干扰RNA或适配体。
15.根据权利要求13所述的方法,其中所述多肽为神经保护因子、抗血管生成多肽、抗凋亡因子或增强视网膜细胞功能的多肽。
16.根据权利要求13所述的方法,其中所述多肽为胶质源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子2、神经营养因子、睫状神经营养因子、神经生长因子、脑源性神经营养因子、表皮生长因子、视紫红质、X连锁凋亡抑制蛋白、视网膜劈裂蛋白、RPE65、色素性视网膜炎GTP酶相互作用蛋白-1、外周蛋白、外周蛋白-2、视紫红质或音猬因子。
17.一种治疗视网膜疾病的方法,所述方法包括向有需要的个体施用有效量的根据权利要求1所述的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述施用是通过眼内注射。
19.根据权利要求17所述的方法,其中所述施用是通过玻璃体内注射。
20.根据权利要求17所述的方法,其中所述眼病为青光眼、色素性视网膜炎、黄斑变性、视网膜劈裂症、利伯氏先天性黑内障、糖尿病性视网膜病、全色盲或色盲。
21.一种包含编码变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列的分离核酸,其中相对于相应亲本AAV衣壳蛋白,所述变异AAV衣壳蛋白在衣壳蛋白GH环中包含约5个氨基酸至约11个氨基酸的插入,并且其中当存在于AAV病毒体中时,所述变异衣壳蛋白提供增强的视网膜细胞AAV病毒体感染性。
22.根据权利要求21所述的分离核酸,其中所述插入位点介于AAV2的氨基酸587和588之间,介于AAV1的氨基酸590和591之间,介于AAV5的氨基酸575和576之间,介于AAV6的氨基酸590和591之间,介于AAV7的氨基酸589和590之间,介于AAV8的氨基酸590和591之间,介于AAV9的氨基酸588和589之间,或介于AAV10的氨基酸588和589之间。
23.一种包含根据权利要求21所述的核酸的经分离、遗传修饰的宿主细胞。
24.一种变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白,其中所述变异AAV衣壳蛋白包含约5个氨基酸至约11个氨基酸的插入,其中所述氨基酸插入在天然AAV衣壳的GH环中,其中所述插入为式I、式IIa、式III或式IV的肽。
25.根据权利要求24所述的变异AAV衣壳蛋白,其中所述插入包含选自LGETTRP(SEQ ID NO:13)、NETITRP(SEQ ID NO:14)、KAGQANN(SEQ ID NO:15)、KDPKTTN(SEQ ID NO:16)、KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQ ID NO:59)和STGKVPN(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列。
26.根据权利要求24所述的变异AAV衣壳蛋白,其中所述插入位点介于AAV2的氨基酸587和588之间,介于AAV1的氨基酸590和591之间,介于AAV5的氨基酸575和576之间,介于AAV6的氨基酸590和591之间,介于AAV7的氨基酸589和590之间,介于AAV8的氨基酸590和591之间,介于AAV9的氨基酸588和589之间,或介于AAV10的氨基酸588和589之间。
27.一种包含编码根据权利要求24所述的变异AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸。
CN201280024852.3A 2011-04-22 2012-04-20 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法 Active CN103561774B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611072467.2A CN107012171B (zh) 2011-04-22 2012-04-20 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161478355P 2011-04-22 2011-04-22
US61/478,355 2011-04-22
PCT/US2012/034413 WO2012145601A2 (en) 2011-04-22 2012-04-20 Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610137255.1A Division CN105755044A (zh) 2011-04-22 2012-04-20 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法
CN201611072467.2A Division CN107012171B (zh) 2011-04-22 2012-04-20 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103561774A true CN103561774A (zh) 2014-02-05
CN103561774B CN103561774B (zh) 2016-12-14

Family

ID=47042176

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611072467.2A Active CN107012171B (zh) 2011-04-22 2012-04-20 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法
CN201610137255.1A Pending CN105755044A (zh) 2011-04-22 2012-04-20 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法
CN201280024852.3A Active CN103561774B (zh) 2011-04-22 2012-04-20 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611072467.2A Active CN107012171B (zh) 2011-04-22 2012-04-20 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法
CN201610137255.1A Pending CN105755044A (zh) 2011-04-22 2012-04-20 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法

Country Status (26)

Country Link
US (9) US9193956B2 (zh)
EP (5) EP4471424A3 (zh)
JP (6) JP6072772B2 (zh)
KR (4) KR102202908B1 (zh)
CN (3) CN107012171B (zh)
AU (4) AU2012245328B2 (zh)
BR (1) BR112013027120B1 (zh)
CA (2) CA2833870C (zh)
CY (3) CY1119765T1 (zh)
DK (4) DK3254703T3 (zh)
ES (4) ES2904638T3 (zh)
FI (1) FI4005603T3 (zh)
HR (4) HRP20220036T1 (zh)
HU (4) HUE034510T2 (zh)
IL (2) IL280819B2 (zh)
LT (4) LT3254703T (zh)
MX (1) MX349138B (zh)
PL (4) PL4005603T3 (zh)
PT (4) PT2699270T (zh)
RS (4) RS56246B1 (zh)
RU (2) RU2611202C2 (zh)
SG (3) SG10201800873WA (zh)
SI (4) SI4005603T1 (zh)
SM (4) SMT202200036T1 (zh)
WO (1) WO2012145601A2 (zh)
ZA (2) ZA201307968B (zh)

Cited By (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106062200A (zh) * 2014-02-17 2016-10-26 伦敦国王学院 腺相关病毒载体
CN107405507A (zh) * 2015-03-02 2017-11-28 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 用于将多核苷酸玻璃体内递送到视网膜视锥的组合物和方法
CN107532177A (zh) * 2015-03-24 2018-01-02 加利福尼亚大学董事会 腺相关病毒变体及其使用方法
CN109476707A (zh) * 2016-05-13 2019-03-15 4D分子治疗有限公司 腺相关病毒变体衣壳和其使用方法
CN109640949A (zh) * 2016-07-29 2019-04-16 加利福尼亚大学董事会 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体和其使用方法
CN109641065A (zh) * 2016-06-16 2019-04-16 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 使用aav2变体和阿柏西普治疗amd
CN109661471A (zh) * 2015-12-04 2019-04-19 索邦大学 启动子及其用途
CN110267972A (zh) * 2016-11-06 2019-09-20 纳秒示波器科技有限公司 由多特征视蛋白进行的用于视力恢复的光学调制以及其其他应用
CN110461368A (zh) * 2017-06-30 2019-11-15 加利福尼亚大学董事会 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法
CN110650733A (zh) * 2017-02-28 2020-01-03 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 经过修饰的aav衣壳和其用途
CN111621502A (zh) * 2019-02-28 2020-09-04 武汉纽福斯生物科技有限公司 视网膜劈裂蛋白的编码序列、其表达载体构建及其应用
CN111850042A (zh) * 2019-04-27 2020-10-30 奥古根有限公司 用于眼科疾病的腺相关病毒载体介导的基因治疗
CN112368391A (zh) * 2018-05-11 2021-02-12 马萨诸塞眼科耳科诊所 腺相关病毒的肝脏特异性嗜性
US11136557B2 (en) 2013-05-31 2021-10-05 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
US11192925B2 (en) 2016-10-19 2021-12-07 Adverum Biotechnologies, Inc. Modified AAV capsids and uses thereof
CN113766934A (zh) * 2019-04-26 2021-12-07 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 用于玻璃体内递送的变体aav衣壳
US11236402B2 (en) 2011-04-22 2022-02-01 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid
US11248214B2 (en) 2014-03-17 2022-02-15 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells
CN114231563A (zh) * 2014-05-02 2022-03-25 建新公司 用于视网膜及cns基因疗法的aav载体
CN114729384A (zh) * 2019-09-12 2022-07-08 博德研究所 工程化腺相关病毒衣壳
CN114729331A (zh) * 2019-07-11 2022-07-08 法国国家科学研究中心 化学修饰的腺相关病毒
CN114729009A (zh) * 2019-10-31 2022-07-08 伯尔尼大学 用于眼部基因递送的aav载体变体
WO2022247917A1 (zh) * 2021-05-28 2022-12-01 上海瑞宏迪医药有限公司 衣壳变异的重组腺相关病毒及其应用
US11680249B2 (en) 2017-08-28 2023-06-20 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus capsid variants and methods of use thereof
WO2023108507A1 (en) * 2021-12-15 2023-06-22 National Institute Of Biological Sciences, Beijing Recombinant aav vectors and use thereof
CN116925192A (zh) * 2022-04-12 2023-10-24 合肥星眸生物科技有限公司 一种融合型腺相关病毒及其应用
WO2024153075A1 (zh) * 2023-01-18 2024-07-25 上海朗昇生物科技有限公司 一种新衣壳蛋白变体以及其用途
WO2024240113A1 (zh) * 2023-05-23 2024-11-28 北京因诺惟康医药科技有限公司 一种腺相关病毒衣壳蛋白、包含其的腺相关病毒、载体及应用
CN119080889A (zh) * 2024-09-18 2024-12-06 广州译码基因科技有限公司 提高aav对眼组织感染能力的衣壳蛋白突变体及应用
WO2025030728A1 (zh) * 2023-08-04 2025-02-13 中国科学院深圳先进技术研究院 重组腺相关病毒包装质粒、突变体及其制备方法和应用
WO2025098512A1 (zh) * 2023-11-10 2025-05-15 上海朗昇生物科技有限公司 衣壳修饰型病毒载体及其制备和用途

Families Citing this family (246)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9233131B2 (en) 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
TWI775096B (zh) 2012-05-15 2022-08-21 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
IL239317B (en) 2012-12-12 2022-07-01 Broad Inst Inc Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
US10266845B2 (en) * 2013-02-08 2019-04-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Enhanced AAV-mediated gene transfer for retinal therapies
WO2014124282A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Enhanced aav-mediated gene transfer for retinal therapies
LT2984166T (lt) 2013-03-15 2020-08-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Kompozicijos, skirtos mpsi gydymui
CA2912525A1 (en) * 2013-05-16 2014-11-20 Applied Genetic Technologies Corporation Promoters, expression cassettes, vectors, kits, and methods for the treatment of achromatopsia and other diseases
WO2014204726A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
WO2014204729A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components
CN106062197A (zh) 2013-06-17 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的串联指导系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
JP6665088B2 (ja) 2013-06-17 2020-03-13 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作のための最適化されたCRISPR−Cas二重ニッカーゼ系、方法および組成物
ES2716615T3 (es) 2013-06-28 2019-06-13 Inst Nat Sante Rech Med Métodos para expresar un polinucleótido de interés en la retina de un sujeto
WO2015004133A1 (en) 2013-07-08 2015-01-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for performing antisense oligonucleotide-mediated exon skipping in the retina of a subject in need thereof
WO2015038958A1 (en) 2013-09-13 2015-03-19 California Institute Of Technology Selective recovery
SG10201804975PA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Delivery, Use and Therapeutic Applications of the Crispr-Cas Systems and Compositions for HBV and Viral Diseases and Disorders
AU2014361781B2 (en) * 2013-12-12 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR -Cas systems and compositions for genome editing
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能CRISPR−Cas系による配列操作のための系、方法および組成物
CA2932436A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
US20170007720A1 (en) * 2014-02-21 2017-01-12 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods and compositions for gene delivery to on bipolar cells
WO2015134643A1 (en) * 2014-03-04 2015-09-11 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved raav vectors and methods for transduction of photoreceptors and rpe cells
EP3114227B1 (en) 2014-03-05 2021-07-21 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
EP3116997B1 (en) * 2014-03-10 2019-05-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10)
WO2015148863A2 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
US10577627B2 (en) 2014-06-09 2020-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
BR112017001909A2 (pt) * 2014-07-31 2019-09-17 Univ Oklahoma proteínas, composição farmacêutica, ácido nucleico, vetores, célula, método de terapia gênica, método para tratar uma condição, uso de um vetor e uso de uma proteína de um mamífero mutante
SG10201902285SA (en) * 2014-09-16 2019-04-29 Genzyme Corp Adeno-associated viral vectors for treating myocilin (myoc) glaucoma
CA2966620A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Voyager Therapeutics, Inc. Aadc polynucleotides for the treatment of parkinson's disease
KR102599909B1 (ko) 2014-11-14 2023-11-09 보이저 테라퓨틱스, 인크. 근위축성 측삭 경화증(als)을 치료하는 조성물 및 방법
EP3907287A1 (en) 2014-11-14 2021-11-10 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
HK1245326A1 (zh) 2014-12-12 2018-08-24 Voyager Therapeutics, Inc. 用於生產scaav的組合物和方法
EP3230451B1 (en) 2014-12-12 2021-04-07 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016131009A1 (en) * 2015-02-13 2016-08-18 University Of Massachusetts Compositions and methods for transient delivery of nucleases
US10648000B2 (en) 2015-02-16 2020-05-12 University Of Florida Research Foundation, Incorporated rAAV vector compositions, methods for targeting vascular endothelial cells and use in treatment of type I diabetes
US10472650B2 (en) * 2015-02-20 2019-11-12 University Of Iowa Research Foundation Methods and compositions for treating genetic eye diseases
US10081659B2 (en) 2015-04-06 2018-09-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Adeno-associated vectors for enhanced transduction and reduced immunogenicity
US11180793B2 (en) 2015-04-24 2021-11-23 Editas Medicine, Inc. Evaluation of Cas9 molecule/guide RNA molecule complexes
US20180140626A1 (en) * 2015-05-14 2018-05-24 Joslin Diabetes Center, Inc. Retinol-binding protein 3 (rbp3) as a protective factor in non-diabetic retinal degeneration
SG10201912329YA (en) 2015-06-18 2020-02-27 Broad Inst Inc Crispr Enzyme Mutations Reducing Off-Target Effects
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
WO2017099838A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Gene therapy for combined methylmalonic acidemia/aciduria and hyperhomocysteinemia/homocystinuria, cobalamin c type, and deficiency of mmachc
CO2018007203A2 (es) * 2015-12-11 2018-09-20 California Inst Of Techn Focalización de péptidos para dirigir virus adenoasociados (aavs)
GB2545763A (en) 2015-12-23 2017-06-28 Adverum Biotechnologies Inc Mutant viral capsid libraries and related systems and methods
CA3012195A1 (en) 2016-02-03 2017-08-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type i
US11512311B2 (en) 2016-03-25 2022-11-29 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency
MA44873A (fr) 2016-04-15 2019-03-13 Univ Pennsylvania Composition pour le traitement de la dégénérescence maculaire liée a l'âge exsudative
EP3448411A1 (en) 2016-04-29 2019-03-06 Gensight Biologics SA Optogenetic visual restoration using chrimson
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
WO2017190125A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Adverum Biotechnologies, Inc. Evasion of neutralizing antibodies by a recombinant adeno-associated virus
US11866462B2 (en) 2016-05-04 2024-01-09 Oregon Health & Science University Recombinant adeno-associated viral vectors
SG11201809643UA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
EP3458588A4 (en) 2016-05-18 2020-01-15 Voyager Therapeutics, Inc. MODULATING POLYNUCLEOTIDES
MA44546B1 (fr) * 2016-06-15 2021-03-31 Univ California Virus adéno-associés variants et procédés d'utilisation
SG11201811230RA (en) * 2016-06-16 2019-01-30 Adverum Biotechnologies Inc Compositions and methods for reducing ocular neovascularization
AU2017305404B2 (en) 2016-08-02 2023-11-30 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290 associated disease
BR112019003950A2 (pt) 2016-08-29 2019-06-25 Univ Wayne State identificação de mutações em variantes de canalopsina que têm sensibilidade à luz melhorada e métodos de uso da mesma
EP3831281A1 (en) 2016-08-30 2021-06-09 The Regents of The University of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
US11236360B2 (en) 2016-12-09 2022-02-01 Regents Of The University Of Minnesota Adeno-associated viruses engineered for selectable tropism
EP3596217A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
KR102616820B1 (ko) 2017-03-17 2023-12-21 애드베룸 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 향상된 유전자 발현을 위한 조성물 및 방법
US20200370039A1 (en) * 2017-04-11 2020-11-26 Ruprecht-Karls-Universitat Heidelberg Adeno-associated virus library
UY37679A (es) 2017-04-14 2018-11-30 Regenxbio Inc Tratamiento de mucopolisacaridosis ii con iduronato-2-sulfatasa (ids) humana recombinante producida por células neurales o gliales humanas
AU2018261003A1 (en) 2017-05-05 2019-11-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating Huntington's Disease
US11603542B2 (en) 2017-05-05 2023-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
JP2020526514A (ja) 2017-07-06 2020-08-31 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア ムコ多糖症i型を治療するための遺伝子治療
US11497576B2 (en) 2017-07-17 2022-11-15 Voyager Therapeutics, Inc. Trajectory array guide system
KR20250011726A (ko) * 2017-09-20 2025-01-21 4디 몰레큘러 테라퓨틱스 아이엔씨. 아데노-관련 바이러스 변이체 캡시드 및 그 용도
AU2018338728B2 (en) 2017-09-29 2025-01-02 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Rescue of central and peripheral neurological phenotype of Friedreich's Ataxia by intravenous delivery
TW202413649A (zh) 2017-10-16 2024-04-01 美商航海家醫療公司 肌萎縮性脊髓側索硬化症(als)之治療
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
CA3078277A1 (en) * 2017-10-16 2019-04-25 Vigeneron Gmbh Aav vectors
AU2018350992A1 (en) 2017-10-18 2020-05-21 Regenxbio Inc. Fully-human post-translationally modified antibody therapeutics
CA3079565A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Regenxbio Inc. Treatment of ocular diseases and metastatic colon cancer with human post-translationally modified vegf-trap
EP3697448A1 (en) * 2017-10-20 2020-08-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of expressing a polynucleotide of interest in the cone photoreceptors of a subject comprising the subretinal delivery of a therapeutically effective amount of a recombinant aav9-derived vector
US11851671B2 (en) 2017-10-23 2023-12-26 Regents Of The University Of Minnesota Programmable assembly of virus composites for receptor-targeted gene delivery
EP3717636B1 (en) 2017-11-27 2023-03-08 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and use for inhibiting angiogenesis
US10610606B2 (en) 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
AU2019215152A1 (en) 2018-02-01 2020-08-20 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for restoring PAH gene function and methods of use thereof
US12291706B2 (en) 2018-02-08 2025-05-06 Applied Stemcell, Inc. Methods for screening variant of target gene
EP3755795A4 (en) 2018-02-19 2022-07-20 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for restoring f8 gene function and methods of use thereof
MX2020009487A (es) 2018-03-14 2020-12-10 Editas Medicine Inc Sistemas y metodos para el tratamiento de hemoglobinopatias.
MX2020010465A (es) * 2018-04-03 2021-01-08 Vectores de virus para direccionamiento a tejidos oftalmicos.
US20210231560A1 (en) 2018-04-29 2021-07-29 Regenxbio Inc. Systems and methods of spectrophotometry for the determination of genome content, capsid content and full/empty ratios of adeno-associated virus particles
WO2019212921A1 (en) 2018-04-29 2019-11-07 Regenxbio Inc. Scalable clarification process for recombinant aav production
US11821009B2 (en) 2018-05-15 2023-11-21 Cornell University Genetic modification of the AAV capsid resulting in altered tropism and enhanced vector delivery
US12319929B2 (en) 2018-05-15 2025-06-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of Parkinson's disease
US12070702B2 (en) 2018-06-14 2024-08-27 Regenxbio Inc. Anion exchange chromatography for recombinant AAV production
EP3808840A4 (en) * 2018-06-14 2022-03-23 Avixgen Inc. Pharmaceutical composition comprising fusion protein of cell-penetrating peptide and rpe65 for treatment of leber's congenital amaurosis
WO2020014471A1 (en) 2018-07-11 2020-01-16 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and compositions for delivery of agents across the blood-brain barrier
EP3833745A1 (en) 2018-08-10 2021-06-16 REGENXBIO Inc. Scalable method for recombinant aav production
US11149256B2 (en) 2018-09-26 2021-10-19 California Institute Of Technology Adeno-associated virus compositions for targeted gene therapy
EP3856762A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Voyager Therapeutics, Inc. Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
KR20210075994A (ko) 2018-10-15 2021-06-23 리젠엑스바이오 인크. 복제 결함 바이러스 벡터 및 바이러스의 감염성을 측정하는 방법
AU2019391042A1 (en) * 2018-12-05 2021-06-10 Abeona Therapeutics Inc. Recombinant adeno-associated viral vector for gene delivery
KR20210137988A (ko) 2018-12-12 2021-11-18 테서렉트 헬스, 인코포레이티드 생체 식별 및 건강 상태 결정을 위한 광학 장치 및 관련 디바이스
US20220096658A1 (en) 2018-12-21 2022-03-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Svcs. Adeno-associated viruses and their uses for inner ear therapy
CN110437317B (zh) * 2019-01-30 2023-05-02 上海科技大学 具有变异衣壳蛋白的腺相关病毒及其用途
SG11202108614QA (en) 2019-02-15 2021-09-29 Sangamo Therapeutics Inc Compositions and methods for producing recombinant aav
CN113677801A (zh) 2019-02-25 2021-11-19 诺华股份有限公司 治疗bietti晶体营养不良的组合物和方法
JP2022520875A (ja) 2019-02-25 2022-04-01 ノバルティス アーゲー Biettiクリスタリン網膜症を治療するための組成物及び方法
AU2020229871B2 (en) 2019-02-28 2023-05-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Adeno-associated virus vectors for the delivery of therapeutics
AU2020231505A1 (en) 2019-03-04 2021-08-19 Adverum Biotechnologies, Inc. Sequential intravitreal administration of AAV gene therapy to contralateral eyes
EP3715358A1 (en) * 2019-03-28 2020-09-30 Universität zu Köln Mutated adeno-associated virus capsid proteins, aav particle comprising the same and liver directed aav vector gene therapy
EP3947700A4 (en) 2019-04-01 2023-01-04 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
AU2020253462A1 (en) 2019-04-03 2021-10-28 Regenxbio Inc. Gene therapy for eye pathologies
TW202102526A (zh) * 2019-04-04 2021-01-16 美商銳進科斯生物股份有限公司 重組腺相關病毒及其用途
HUE064411T2 (hu) 2019-04-11 2024-03-28 Regenxbio Inc Méretkizárásos kromatográfiás módszerek rekombináns adeno-asszociált víruskészítmények jellemzésére
WO2020214929A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 Regenxbio Inc. Adeno-associated virus vector formulations and methods
CN114144197A (zh) 2019-04-24 2022-03-04 再生生物股份有限公司 完全人类翻译后修饰的抗体治疗剂
US11737665B2 (en) 2019-06-21 2023-08-29 Tesseract Health, Inc. Multi-modal eye imaging with shared optical path
MX2021016014A (es) * 2019-06-27 2022-04-06 Univ Florida Mejora de la transducción mediada por aav en los tejidos oculares con ácido hialurónico.
WO2021005223A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of epilepsy
US10801042B1 (en) 2019-07-15 2020-10-13 Vigene Biosciences, Inc. Use of ion concentrations to increase the packaging efficiency of recombinant adeno-associated virus
US10653731B1 (en) 2019-07-15 2020-05-19 Vigene Biosciences Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus (rAAV) having improved packaging efficiency
US10557149B1 (en) 2019-07-15 2020-02-11 Vigene Biosciences, Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus helper vectors and their use to improve the packaging efficiency of recombinantly-modified adeno-associated virus
JP2022544004A (ja) 2019-07-26 2022-10-17 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド 操作された核酸調節エレメントならびにその使用方法
RU2751592C2 (ru) 2019-08-22 2021-07-15 Общество С Ограниченной Ответственностью "Анабион" Выделенный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе
US20220280608A1 (en) 2019-08-26 2022-09-08 Regenxbio Inc. Treatment of diabetic retinopathy with fully-human post-translationally modified anti-vegf fab
EP4027983A1 (en) 2019-09-11 2022-07-20 Adverum Biotechnologies, Inc. Methods of treating ocular neovascular diseases using aav2 variants encoding aflibercept
GB201913974D0 (en) 2019-09-27 2019-11-13 King S College London Vector
JP2022550435A (ja) 2019-10-04 2022-12-01 ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド 組換えaavの改善された治療的使用のための方法
JP2022552262A (ja) 2019-10-07 2022-12-15 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド アデノ随伴ウイルスベクター医薬組成物および方法
CN113518824B (zh) * 2019-10-16 2024-02-23 上海药明康德新药开发有限公司 新的aav变体
EP4054651A1 (en) * 2019-11-08 2022-09-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr and aav strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy
EP4061943A1 (en) 2019-11-19 2022-09-28 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of cancer
US20230057380A1 (en) * 2019-11-26 2023-02-23 University Of Massachusetts Recombinant adeno-associated virus for delivery of kh902 (conbercept) and uses thereof
BR112022009895A2 (pt) 2019-11-28 2022-08-09 Regenxbio Inc Construtos de terapia de gene de microdistrofina e usos dos mesmos
JP2023510784A (ja) * 2020-01-10 2023-03-15 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド 脳腫瘍を処置するための血液脳関門を横断する免疫療法剤を送達するための方法および組成物
TW202140791A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商霍蒙拉奇醫藥公司 治療苯酮尿症之方法
EP4093428A1 (en) 2020-01-22 2022-11-30 RegenxBio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis i with fully-human glycosylated human alpha-l-iduronidase (idua)
AU2021212749A1 (en) 2020-01-29 2022-08-18 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis IVA
KR20220148162A (ko) 2020-01-29 2022-11-04 리젠엑스바이오 인크. 인간 신경 또는 신경아교 세포에 의해 생성된 재조합 인간 이두로네이트-2-설파타아제 (ids)를 사용한 점액다당류증 ii의 치료
MX2022009982A (es) 2020-02-14 2022-09-12 Ultragenyx Pharmaceutical Inc Terapia genica para el tratamiento de transtorno por deficiencia de cdkl5.
JP2023518415A (ja) 2020-03-19 2023-05-01 ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド 組換えaavにおいてcapおよびrep配列の逆パッケージングを低減するための組成物および方法
JP2023520402A (ja) 2020-03-31 2023-05-17 ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド プロピオン酸血症を処置するための遺伝子治療
WO2021204407A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Sorbonne Université G-protein-gated-k+ channel-mediated enhancements in light sensitivity in rod-cone dystrophy (rcd)
EP4138929A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods for preventing induction of immune responses to the transduced cells expressing a transgene product after ocular gene therapy
KR20230026986A (ko) 2020-04-27 2023-02-27 4디 몰레큘러 테라퓨틱스 아이엔씨. 코돈 최적화된 gla 유전자 및 이의 용도
PE20230767A1 (es) 2020-05-13 2023-05-09 Voyager Therapeutics Inc Redireccion del tropismo de las capsides de aav
TW202208632A (zh) 2020-05-27 2022-03-01 美商同源醫藥公司 用於恢復pah基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法
KR20230043794A (ko) 2020-05-29 2023-03-31 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 변이체 캡시드를 갖는 아데노-연관 바이러스 비리온 및 이의 사용 방법
AU2021305665A1 (en) 2020-07-10 2023-02-23 Centre National De La Recherche Scientifique Methods and compositions for treating epilepsy
CA3192600A1 (en) * 2020-08-21 2022-02-24 Capsida, Inc. Adeno-associated virus compositions having preferred expression levels
CN112226461B (zh) * 2020-08-21 2022-04-22 华侨大学 Cd4阳性细胞特异性基因传递载体及其应用
US12129287B2 (en) 2020-09-14 2024-10-29 President And Fellows Of Harvard College Recombinant adeno associated virus encoding clarin-1 and uses thereof
WO2022060915A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Regenxbio Inc. Vectorized lanadelumab and administration thereof
WO2022060916A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Regenxbio Inc. Vectorized antibodies for anti-viral therapy
CN112194706B (zh) * 2020-09-30 2022-03-08 广州派真生物技术有限公司 腺相关病毒突变体及其应用
WO2022076595A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Regenxbio Inc. Formulations for suprachoroidal administration such as gel formulations
TW202228649A (zh) 2020-10-07 2022-08-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 諸如形成聚集體之調配物之用於脈絡膜上投與之調配物
WO2022076750A2 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns or muscle delivery
IL301647A (en) 2020-10-07 2023-05-01 Regenxbio Inc Adeno-associated viruses for ocular delivery of gene therapy
EP4225270A1 (en) 2020-10-07 2023-08-16 RegenxBio Inc. Formulations for suprachoroidal administration such as high viscosity formulations
WO2022094157A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Regenxbio Inc. Vectorized anti-cgrp and anti-cgrpr antibodies and administration thereof
AU2021371307A1 (en) 2020-10-28 2023-06-01 Regenxbio, Inc. VECTORIZED ANTI-TNF-α ANTIBODIES FOR OCULAR INDICATIONS
US20230390418A1 (en) 2020-10-29 2023-12-07 Regenxbio Inc. Vectorized factor xii antibodies and administration thereof
AU2021369833A1 (en) 2020-10-29 2023-06-08 Regenxbio Inc. Vectorized tnf-alpha antagonists for ocular indications
WO2022120022A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
US20240067678A1 (en) * 2020-12-16 2024-02-29 Children's Medical Research Institute Adeno-associated virus capsids and vectors
EP4263841A1 (en) 2020-12-16 2023-10-25 REGENXBIO Inc. Method of producing a recombinant adeno-associated virus particle
WO2022147087A1 (en) 2020-12-29 2022-07-07 Regenxbio Inc. Tau-specific antibody gene therapy compositions, methods and uses thereof
KR20230133314A (ko) 2021-01-21 2023-09-19 리젠엑스바이오 인크. 재조합 폴리펩티드 및 바이러스의 개선된 생산
BR112023016075A2 (pt) 2021-02-10 2023-11-21 Regenxbio Inc Método para tratar hepatoesplenomegalia, método de distribuição de um raav que codifica hids, método para tratar um sujeito humano, método de tratamento de um sujeito humano, método para determinar a eficácia do tratamento, método para identificar um sujeito como tendo mps ii
CN113121651B (zh) * 2021-04-19 2023-11-17 信念医药科技(上海)有限公司 低中和抗体腺相关病毒衣壳蛋白
CN113121652B (zh) * 2021-04-19 2022-10-11 上海信致医药科技有限公司 视网膜和肌肉高亲和性腺相关病毒衣壳蛋白及相关应用
EP4326339B1 (en) 2021-04-20 2025-04-02 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Compositions and methods for treating retinal degenerative disorders
WO2022232141A1 (en) 2021-04-26 2022-11-03 Regenxbio Inc. Microdystrophin gene therapy administration for treatment of dystrophinopathies
KR20240005764A (ko) 2021-04-27 2024-01-12 애드베룸 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 아플리베르셉트를 코딩하는 aav2 변이체를 사용하여 안구 질환을 치료하는 방법
EP4334454A2 (en) 2021-05-04 2024-03-13 RegenxBio Inc. Novel aav vectors and methods and uses thereof
EP4337267A1 (en) 2021-05-11 2024-03-20 RegenxBio Inc. Treatment of duchenne muscular dystrophy and combinations thereof
EP4347848A1 (en) 2021-05-26 2024-04-10 Sparingvision G-protein-gated-k+ channel-mediated enhancements in light sensitivity in rod-cone dystrophy (rcd)
AU2022283898A1 (en) * 2021-06-03 2024-01-04 Dyno Therapeutics, Inc. Capsid variants and methods of using the same
WO2023280926A1 (en) 2021-07-07 2023-01-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Synergistic combination of rdcfv2 and rdcvf2l for the treatment of tauopathies
CA3224488A1 (en) 2021-07-08 2023-01-12 Tenaya Therapeutics, Inc. Optimized expression cassettes for gene therapy
EP4373947A1 (en) 2021-07-19 2024-05-29 New York University Auf1 combination therapies for treatment of muscle degenerative disease
EP4384196A1 (en) 2021-08-11 2024-06-19 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Compositions and methods for treating a muscular dystrophy
CR20240137A (es) 2021-08-20 2024-07-29 Biocad Joint Stock Co Método para obtener una cápside de virus adenoasociado modificada
AR126840A1 (es) 2021-08-20 2023-11-22 Llc «Anabion» Proteína de la cápside vp1 modificada aislada del virus adeno-asociado de serotipo 5 (aav5), cápside y vector basado en esta
AR126839A1 (es) 2021-08-20 2023-11-22 Llc «Anabion» Proteína de la cápside vp1 modificada aislada del virus adeno-asociado de serotipo 9 (aav9), cápside y vector basado en esta
WO2023060113A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
CN118202060A (zh) 2021-10-05 2024-06-14 再生生物股份有限公司 用于重组aav生产的组合物和方法
WO2023060272A2 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery
US20250001006A1 (en) 2021-10-07 2025-01-02 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for targeted delivery
KR20240095539A (ko) 2021-10-08 2024-06-25 디노 테라퓨틱스, 인코포레이티드 캡시드 변이체 및 이의 사용 방법
EP4163296A1 (en) 2021-10-11 2023-04-12 Sparingvision G-protein-gated-k+ channel-mediated enhancements in light sensitivity in patients with rod-cone dystrophy (rcd)
EP4423285A1 (en) 2021-10-28 2024-09-04 RegenxBio Inc. Engineered nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof
CA3235632A1 (en) 2021-11-02 2023-05-11 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
KR20240145489A (ko) 2022-02-02 2024-10-07 애드베룸 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 아플리베르셉트를 코딩하는 aav2 변이체를 사용하여 안구 신생혈관 질환을 치료하는 방법
JP2025506681A (ja) 2022-02-16 2025-03-13 アドヴェラム バイオテクノロジーズ, インコーポレイテッド 組み換えアデノ随伴ウイルスによる血管新生amdにおけるcst変動の低減方法
KR20240152351A (ko) 2022-02-17 2024-10-21 스카이라인 테라퓨틱스 리미티드 변형된 aav 캡시드 폴리펩티드를 갖는 재조합 아데노-연관 바이러스
TW202342740A (zh) 2022-03-07 2023-11-01 美商奧崔基尼克斯製藥公司 改良的批量aav生產系統和方法
WO2023178053A1 (en) 2022-03-13 2023-09-21 Regenxbio Inc. Modified muscle-specific promoters
WO2023183623A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Regenxbio Inc. Dominant-negative tumor necrosis factor alpha adeno-associated virus gene therapy
TW202404651A (zh) 2022-04-06 2024-02-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 用於脈絡膜上投與之調配物諸如形成聚集體之調配物
AU2023250660A1 (en) 2022-04-06 2024-10-24 Regenxbio Inc. Pharmaceutical composition comprising a recombinant adenoassociated virus vector with an expression cassette encoding a transgene for suprachoroidal administration
TW202345913A (zh) 2022-04-06 2023-12-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 用於脈絡膜上投與之調配物諸如凝膠調配物
TW202404993A (zh) 2022-04-11 2024-02-01 美商特納亞治療股份有限公司 具經工程化蛋白殼之腺相關病毒
EP4507741A1 (en) 2022-04-14 2025-02-19 RegenxBio Inc. Gene therapy for treating an ocular disease
WO2023201277A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery
CN116970648A (zh) * 2022-04-24 2023-10-31 上海朗昇生物科技有限公司 新型aav衣壳改造株及其用途
WO2023215807A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Regenxbio Inc. VECTORIZED ANTI-TNF-α INHIBITORS FOR OCULAR INDICATIONS
TW202400803A (zh) 2022-05-03 2024-01-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 載體化抗補體抗體與補體劑及其投與
WO2023240062A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Adverum Biotechnologies, Inc. Melanopsin variants for vision restoration
WO2023239627A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Regenxbio Inc. Methods for recombinant aav production
EP4558149A1 (en) 2022-07-21 2025-05-28 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating chronic pain disorders
KR20250051697A (ko) 2022-08-11 2025-04-17 인스티튜트 오브 몰레큘러 앤드 클리니컬 오프탈몰로지 바젤 (아이오비) 인간 원추형 광수용체 광유전학 작제물
WO2024044725A2 (en) 2022-08-24 2024-02-29 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses and uses thereof
IL319873A (en) 2022-09-30 2025-05-01 Regenxbio Inc Treatment of eye diseases with recombinant viral vectors containing anti-VEGF FAB
WO2024081746A2 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Regenxbio Inc. Engineered nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof
EP4357359A1 (en) 2022-10-20 2024-04-24 Sparingvision G-protein-gated-k+ channel-mediated enhancements in light sensitivity in rod-cone dystrophy (rcd)
CN120303405A (zh) 2022-10-20 2025-07-11 节约视觉公司 用于治疗视网膜退行性疾病的组合物和方法
WO2024107670A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric proteins comprising membrane bound il-12 with protease cleavable linkers
WO2024146935A1 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Intravenous administration of antisense oligonucleotides for the treatment of pain
WO2024161142A1 (en) 2023-02-02 2024-08-08 Quethera Limited Recombinant adeno-associated virus vector
WO2024191778A1 (en) 2023-03-10 2024-09-19 Dyno Therapeutics, Inc. Capsid polypeptides and methods of use thereof
WO2024192281A2 (en) 2023-03-15 2024-09-19 Regenxbio Inc. Exon skipping gene therapy constructs, vectors and uses thereof
WO2024211831A1 (en) 2023-04-05 2024-10-10 Adverum Biotechnologies, Inc. Immune landscape signatures for ocular inflammation
WO2024211780A1 (en) 2023-04-07 2024-10-10 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
WO2024215653A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Guide rnas, vectors, and virions for targeting mutations in the pln gene
WO2024215655A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardioprotective bag3 therapies
WO2024216244A2 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Regenxbio Inc. Targeting aav capsids, methods of manufacturing and using same
WO2024229389A1 (en) * 2023-05-03 2024-11-07 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
TW202444917A (zh) * 2023-05-04 2024-11-16 美商航海家醫療公司 Aav衣殼變異體及其用途
WO2024233529A2 (en) 2023-05-07 2024-11-14 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
WO2024238867A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 Regenxbio Inc. Vectorized anti-complement antibodies and administration thereof
WO2024238859A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 Regenxbio Inc. Vectorized c5 inhibitor agents and administration thereof
WO2024238853A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 Regenxbio Inc. Adeno-associated viruses for ocular delivery of gene therapy
WO2025008406A1 (en) 2023-07-04 2025-01-09 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of cancer
WO2025015317A2 (en) 2023-07-13 2025-01-16 Kriya Therapeutics, Inc. Complement pathway inhibitor fusions and methods of using the same
WO2025049993A1 (en) 2023-08-31 2025-03-06 Dyno Therapeutics, Inc. Capsid polypeptides and methods of use thereof
WO2025075963A1 (en) 2023-10-02 2025-04-10 Regenxbio Inc. Methods and formulations for treating mucopolysaccharidosis ii-associated hearing loss with recombinant human iduronate-2-sulfatase
WO2025090962A1 (en) 2023-10-25 2025-05-01 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
WO2025106374A1 (en) 2023-11-13 2025-05-22 Juno Therapeutics, Inc. Aav production method
WO2025108407A2 (en) 2023-11-23 2025-05-30 Neuexcell Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Gene therapy compositions and methods for treating glioma
WO2025113676A1 (en) 2023-11-29 2025-06-05 Neuexcell Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treating stroke in primates
WO2025129085A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Port Therapeutics, Inc. Use of thermal bioswitches in aav-based gene therapy
CN118955654B (zh) * 2024-10-15 2025-05-16 朗信启昇(苏州)生物制药有限公司 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1834255A (zh) * 2005-12-23 2006-09-20 上海交通大学附属第一人民医院 加快并提高腺相关病毒介导的基因在视网膜细胞内表达的方法
US20070020624A1 (en) * 1998-02-18 2007-01-25 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
US20090202490A1 (en) * 2003-06-30 2009-08-13 Schaffer David V Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof

Family Cites Families (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9206016D0 (en) 1992-03-19 1992-04-29 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US6306829B1 (en) 1995-12-08 2001-10-23 Hybridon, Inc. Modified VEGF oligonucleotides for treatment of skin disorders
US5639872A (en) 1993-07-27 1997-06-17 Hybridon, Inc. Human VEGF-specific oligonucleotides
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US6001650A (en) * 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
EP0927044A4 (en) 1996-04-16 1999-09-08 Immusol Inc DEFINED TARGET VIRAL VECTORS
US20030215422A1 (en) 1996-09-11 2003-11-20 John A. Chiorini Aav4 vector and uses thereof
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US6710036B2 (en) 1997-07-25 2004-03-23 Avigen, Inc. Induction of immune response to antigens expressed by recombinant adeno-associated virus
CA2303768C (en) 1997-09-19 2009-11-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
WO1999023107A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Maxygen, Incorporated Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling
US6410300B1 (en) 1998-01-12 2002-06-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and formulations for mediating adeno-associated virus (AAV) attachment and infection and methods for purifying AAV
WO1999061601A2 (en) 1998-05-28 1999-12-02 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Aav5 vector and uses thereof
DE19827457C1 (de) 1998-06-19 2000-03-02 Medigene Ag Strukturprotein von AAV, seine Herstellung und Verwendung
WO2000015821A1 (en) * 1998-09-11 2000-03-23 The Regents Of The University Of California Recombinant adenovirus for tissue specific expression in heart
WO2000028061A2 (en) 1998-11-05 2000-05-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
AU780231B2 (en) 1998-11-10 2005-03-10 University Of North Carolina At Chapel Hill, The Virus vectors and methods of making and administering the same
US6943153B1 (en) 1999-03-15 2005-09-13 The Regents Of The University Of California Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye
US6498244B1 (en) 1999-05-28 2002-12-24 Cell Genesys, Inc. Adeno-associated virus capsid immunologic determinants
US7314912B1 (en) 1999-06-21 2008-01-01 Medigene Aktiengesellschaft AAv scleroprotein, production and use thereof
DE19933288A1 (de) 1999-07-15 2001-01-18 Medigene Ag Strukturprotein von Adeno-assoziiertem Virus mit veränderter Antigenität, seine Herstellung und Verwendung
DE19933719A1 (de) 1999-07-19 2001-01-25 Medigene Ag Strukturprotein in Adeno-assoziiertem Virus mit veränderten chromatographischen Eigenschaften, seine Herstellung und Verwendung
US8232081B2 (en) 1999-09-21 2012-07-31 Basf Se Methods and microorganisms for production of panto-compounds
DE10001363A1 (de) 2000-01-14 2001-07-26 Windmoeller & Hoelscher Extruderdüsenkopf
US20070026394A1 (en) 2000-02-11 2007-02-01 Lawrence Blatt Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies
US6855314B1 (en) 2000-03-22 2005-02-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services AAV5 vector for transducing brain cells and lung cells
CA2422544A1 (en) * 2000-09-22 2002-03-28 Virxsys Conditionally replicating viral vectors and their use
US6962815B2 (en) * 2001-01-05 2005-11-08 Children's Hopital Inc. AAV2 vectors and methods
US7749492B2 (en) * 2001-01-05 2010-07-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. AAV vectors and methods
US20030144221A1 (en) 2001-07-17 2003-07-31 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of BCL2-associated X protein expression
US7647184B2 (en) 2001-08-27 2010-01-12 Hanall Pharmaceuticals, Co. Ltd High throughput directed evolution by rational mutagenesis
US20030129203A1 (en) * 2001-08-27 2003-07-10 Nautilus Biotech S.A. Mutant recombinant adeno-associated viruses
EP1572893B1 (en) 2001-11-09 2009-01-07 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY of the DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Production of adeno-associated virus in insect cells
JP3958191B2 (ja) 2001-11-13 2007-08-15 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア アデノ随伴ウィルス(aav)配列の検出及び/又は同定の方法ならびにそれにより同定される新規な配列の単離
US20050106558A1 (en) 2001-12-21 2005-05-19 Luca Perabo Library of modified structural genes or capsid modified particles useful for the identification of viral clones with desired cell tropism
DE10216005A1 (de) 2002-04-11 2003-10-30 Max Planck Gesellschaft Verwendung von biologischen Photorezeptoren als direkt lichtgesteuerte Ionenkanäle
US20060292117A1 (en) 2002-04-17 2006-12-28 Loiler Scott A Improved rAAv vectors
US20040142416A1 (en) 2002-04-30 2004-07-22 Laipis Philip J. Treatment for phenylketonuria
WO2003092594A2 (en) 2002-04-30 2003-11-13 Duke University Adeno-associated viral vectors and methods for their production from hybrid adenovirus and for their use
US7254489B2 (en) 2002-05-31 2007-08-07 Microsoft Corporation Systems, methods and apparatus for reconstructing phylogentic trees
US7148342B2 (en) 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
AU2003265855A1 (en) 2002-08-28 2004-03-19 University Of Florida Modified aav
EP1576001A2 (en) * 2002-12-18 2005-09-21 Novartis AG Endothelial cell specifically binding peptides
WO2004083441A2 (en) 2003-03-19 2004-09-30 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Random peptide library displayed on aav vectors
WO2004108922A2 (en) 2003-04-25 2004-12-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of aav comprising a capsid protein from aav7 or aav8 for the delivery of genes encoding apoprotein a or e genes to the liver
WO2004101799A2 (en) * 2003-05-14 2004-11-25 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Broadening adenovirus tropism
EP1486567A1 (en) 2003-06-11 2004-12-15 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Improved adeno-associated virus (AAV) vector for gene therapy
PL3235827T3 (pl) 2003-06-19 2021-07-05 Genzyme Corporation Wiriony AAV o zmniejszonej immunoreaktywności i ich zastosowania
JP2007524622A (ja) 2003-06-23 2007-08-30 エイアンドジー ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド 抗癌治療に対する腫瘍細胞の感受性を回復させてアポトーシスを誘導するための組成物及び方法
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
CA2539947A1 (en) 2003-09-24 2005-04-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Igf-1 instructs multipotent adult cns neural stem cells to an oligodendroglial lineage
ES2874298T3 (es) 2003-09-30 2021-11-04 Univ Pennsylvania Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos
KR100550967B1 (ko) 2003-12-03 2006-02-13 주식회사 엘지생활건강 유중수형 화장료 조성물
EP2365077B1 (en) 2004-03-12 2013-05-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. iRNA agents targeting VEGF
US7427396B2 (en) 2004-06-03 2008-09-23 Genzyme Corporation AAV vectors for gene delivery to the lung
EP1828390B1 (en) 2004-12-15 2012-06-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric vectors
US20060211650A1 (en) 2004-12-16 2006-09-21 Forest Laboratories, Inc. Reducing carbohydrate derivatives of adamantane amines, and synthesis and methods of use thereof
WO2006101634A1 (en) 2005-02-17 2006-09-28 The Regents Of The University Of California Müller cell specific gene therapy
EP2359865B1 (en) 2005-04-07 2013-10-02 The Trustees of The University of Pennsylvania Method of increasing the function of an AAV vector
JP2009502140A (ja) 2005-07-22 2009-01-29 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 光活性化陽イオンチャネルおよびその使用
WO2007089632A2 (en) 2006-01-27 2007-08-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Heparin and heparan sulfate binding chimeric vectors
EP2007795B1 (en) 2006-03-30 2016-11-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid proteins
AU2007247929A1 (en) * 2006-05-04 2007-11-15 Pennsylvania College Of Optometry Restoration of visual responses by In Vivo delivery of rhodopsin nucleic acids
CN101506369B (zh) * 2006-06-21 2014-02-12 尤尼克尔生物制药股份有限公司 具有经修饰的用于在昆虫细胞中产生aav的aav-rep78翻译起始密码子的载体
US7872118B2 (en) 2006-09-08 2011-01-18 Opko Ophthalmics, Llc siRNA and methods of manufacture
CN1966082B (zh) * 2006-11-03 2010-06-30 许瑞安 一种防治结直肠癌的基因药物及其制备方法和用途
US9725485B2 (en) 2012-05-15 2017-08-08 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV vectors with high transduction efficiency and uses thereof for gene therapy
PT2147096E (pt) 2007-04-13 2015-07-21 Catalyst Biosciences Inc Polipéptidos do factor vii modificados e suas utilizações
EP1985708B1 (en) * 2007-04-27 2015-04-15 Universität Rostock Selective targeting of viruses to neural precursor cells
WO2009137006A2 (en) 2008-04-30 2009-11-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Directed evolution and in vivo panning of virus vectors
AU2009274482A1 (en) 2008-05-20 2010-01-28 Eos Neuroscience, Inc. Vectors for delivery of light-sensitive proteins and methods of use
EP2297185A1 (en) 2008-06-17 2011-03-23 Amsterdam Molecular Therapeutics (AMT) B.V. Parvoviral capsid with incorporated gly-ala repeat region
US8889641B2 (en) * 2009-02-11 2014-11-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
CN101532024A (zh) * 2009-04-30 2009-09-16 许瑞安 一种用于基因治疗的新型细胞特异性内含microRNA结合序列的基因HAAVmir
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
WO2011117258A2 (en) 2010-03-22 2011-09-29 Association Institut De Myologie Methods of increasing efficiency of vector penetration of target tissue
CN103025344B (zh) 2010-05-17 2016-06-29 桑格摩生物科学股份有限公司 新型dna-结合蛋白及其用途
US8663624B2 (en) * 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
CA2826273C (en) * 2011-02-10 2021-11-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Viral vectors with modified transduction profiles and methods of making and using the same
HRP20220036T1 (hr) 2011-04-22 2022-04-01 The Regents Of The University Of California Virioni adeno-povezanog virusa s varijantom kapsida i postupci njihove upotrebe
EP3795581A3 (en) 2011-08-24 2021-06-09 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University New avv capsid proteins for nucleic acid transfer
WO2013170078A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Oregon Health & Science University Adeno associated virus plasmids and vectors
TWI775096B (zh) 2012-05-15 2022-08-21 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
US9938541B2 (en) 2012-12-25 2018-04-10 Takara Bio Inc. AAV variant
WO2014124282A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Enhanced aav-mediated gene transfer for retinal therapies
WO2014191521A2 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Cellectis New compact scaffold of cas9 in the type ii crispr system
CN105247044B (zh) 2013-05-31 2021-05-07 加利福尼亚大学董事会 腺相关病毒变体及其使用方法
WO2015048534A1 (en) 2013-09-26 2015-04-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Synthetic combinatorial aav capsid library for targeted gene therapy
HUE052676T2 (hu) 2013-10-11 2021-05-28 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Eljárások õsi vírusszekvenciák elõrejelzésére és alkalmazásaik
WO2015142941A1 (en) 2014-03-17 2015-09-24 Avalanche Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells
AU2015252797C1 (en) 2014-05-02 2021-04-22 Genzyme Corporation AAV vectors for retinal and CNS gene therapy
EP3155116A4 (en) 2014-06-10 2017-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
MY187898A (en) 2015-03-02 2021-10-27 Adverum Biotechnologies Inc Compositions and methods for intravitreal delivery of polynucleotides to retinal cones
LT3265568T (lt) 2015-03-06 2020-08-25 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Genų augmentacijos terapijos, skirtos paveldimai tinklainės degeneracijai, sukeltai prpf31 geno mutacijos
US20190000940A1 (en) 2015-07-31 2019-01-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of aadc deficiency
KR102234930B1 (ko) 2016-05-13 2021-04-02 4디 몰레큘러 테라퓨틱스 아이엔씨. 아데노-관련 바이러스 변이체 캡시드 및 그 용도
MA44546B1 (fr) * 2016-06-15 2021-03-31 Univ California Virus adéno-associés variants et procédés d'utilisation
AU2018324477A1 (en) 2017-08-28 2019-10-17 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus capsid variants and methods of use thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070020624A1 (en) * 1998-02-18 2007-01-25 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
US20090202490A1 (en) * 2003-06-30 2009-08-13 Schaffer David V Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
CN1834255A (zh) * 2005-12-23 2006-09-20 上海交通大学附属第一人民医院 加快并提高腺相关病毒介导的基因在视网膜细胞内表达的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CANDACE BICHSEL等: "Bacterial Delivery of Nuclear Proteins into Pluripotent and Differentiated Cells", 《PLOS ONE》 *
JAE-HYUNG JANG等: "An Evolved Adeno-associated Viral Variant Enhances Gene Delivery and Gene Targeting in Neural Stem Cells", 《MOLECULAR THERAPY》 *
RYAN R. KLIMCZAK等: "A Novel Adeno-Associated Viral Variant for Efficient and Selective Intravitreal Transduction of Rat Muller Cells", 《PLOS ONE》 *

Cited By (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11236402B2 (en) 2011-04-22 2022-02-01 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid
US11634691B2 (en) 2013-05-31 2023-04-25 The Regents Of The University Of California Compositions and methods of treatment
US11136557B2 (en) 2013-05-31 2021-10-05 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
CN106062200A (zh) * 2014-02-17 2016-10-26 伦敦国王学院 腺相关病毒载体
US11802293B2 (en) 2014-02-17 2023-10-31 King's College London Adeno-associated virus vector
CN106062200B (zh) * 2014-02-17 2020-06-23 伦敦国王学院 腺相关病毒载体
US12275959B2 (en) 2014-03-17 2025-04-15 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells
US11248214B2 (en) 2014-03-17 2022-02-15 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells
US12241078B2 (en) 2014-05-02 2025-03-04 Genzyme Corporation AAV vectors for retinal and CNS gene therapy
CN114231563B (zh) * 2014-05-02 2024-08-16 建新公司 用于视网膜及cns基因疗法的aav载体
CN114231563A (zh) * 2014-05-02 2022-03-25 建新公司 用于视网膜及cns基因疗法的aav载体
CN107405507A (zh) * 2015-03-02 2017-11-28 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 用于将多核苷酸玻璃体内递送到视网膜视锥的组合物和方法
CN114480502A (zh) * 2015-03-02 2022-05-13 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 用于将多核苷酸玻璃体内递送到视网膜视锥的组合物和方法
CN107532177A (zh) * 2015-03-24 2018-01-02 加利福尼亚大学董事会 腺相关病毒变体及其使用方法
US10883117B2 (en) 2015-03-24 2021-01-05 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
CN109661471B (zh) * 2015-12-04 2023-02-10 索邦大学 启动子及其用途
CN109661471A (zh) * 2015-12-04 2019-04-19 索邦大学 启动子及其用途
CN109476707A (zh) * 2016-05-13 2019-03-15 4D分子治疗有限公司 腺相关病毒变体衣壳和其使用方法
CN109641065A (zh) * 2016-06-16 2019-04-16 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 使用aav2变体和阿柏西普治疗amd
US11565000B2 (en) 2016-07-29 2023-01-31 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
CN114672516B (zh) * 2016-07-29 2024-11-26 加利福尼亚大学董事会 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体和其使用方法
US11554180B2 (en) 2016-07-29 2023-01-17 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
CN114672516A (zh) * 2016-07-29 2022-06-28 加利福尼亚大学董事会 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体和其使用方法
CN109640949A (zh) * 2016-07-29 2019-04-16 加利福尼亚大学董事会 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体和其使用方法
CN109640949B (zh) * 2016-07-29 2022-11-25 加利福尼亚大学董事会 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体和其使用方法
US11565001B2 (en) 2016-07-29 2023-01-31 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
US12030914B2 (en) 2016-10-19 2024-07-09 Adverum Biotechnologies, Inc. Modified AAV capsids and uses thereof
US11192925B2 (en) 2016-10-19 2021-12-07 Adverum Biotechnologies, Inc. Modified AAV capsids and uses thereof
CN110267972A (zh) * 2016-11-06 2019-09-20 纳秒示波器科技有限公司 由多特征视蛋白进行的用于视力恢复的光学调制以及其其他应用
CN110650733A (zh) * 2017-02-28 2020-01-03 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 经过修饰的aav衣壳和其用途
US12310997B2 (en) 2017-06-30 2025-05-27 The Regents Of The University Of California Compositions and methods of treating ocular diseases
CN110461368A (zh) * 2017-06-30 2019-11-15 加利福尼亚大学董事会 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法
US11680249B2 (en) 2017-08-28 2023-06-20 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus capsid variants and methods of use thereof
US11987801B2 (en) 2018-05-11 2024-05-21 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Altering tissue tropism of adeno-associated viruses
CN112368391A (zh) * 2018-05-11 2021-02-12 马萨诸塞眼科耳科诊所 腺相关病毒的肝脏特异性嗜性
CN111621502B (zh) * 2019-02-28 2023-05-02 武汉纽福斯生物科技有限公司 视网膜劈裂蛋白的编码序列、其表达载体构建及其应用
CN111621502A (zh) * 2019-02-28 2020-09-04 武汉纽福斯生物科技有限公司 视网膜劈裂蛋白的编码序列、其表达载体构建及其应用
CN113766934A (zh) * 2019-04-26 2021-12-07 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 用于玻璃体内递送的变体aav衣壳
CN111850042A (zh) * 2019-04-27 2020-10-30 奥古根有限公司 用于眼科疾病的腺相关病毒载体介导的基因治疗
CN114729331A (zh) * 2019-07-11 2022-07-08 法国国家科学研究中心 化学修饰的腺相关病毒
CN114729384A (zh) * 2019-09-12 2022-07-08 博德研究所 工程化腺相关病毒衣壳
CN114729009A (zh) * 2019-10-31 2022-07-08 伯尔尼大学 用于眼部基因递送的aav载体变体
WO2022247917A1 (zh) * 2021-05-28 2022-12-01 上海瑞宏迪医药有限公司 衣壳变异的重组腺相关病毒及其应用
WO2023108507A1 (en) * 2021-12-15 2023-06-22 National Institute Of Biological Sciences, Beijing Recombinant aav vectors and use thereof
CN116925192A (zh) * 2022-04-12 2023-10-24 合肥星眸生物科技有限公司 一种融合型腺相关病毒及其应用
CN116925192B (zh) * 2022-04-12 2025-04-29 合肥星眸生物科技有限公司 一种融合型腺相关病毒及其应用
WO2024153075A1 (zh) * 2023-01-18 2024-07-25 上海朗昇生物科技有限公司 一种新衣壳蛋白变体以及其用途
WO2024240113A1 (zh) * 2023-05-23 2024-11-28 北京因诺惟康医药科技有限公司 一种腺相关病毒衣壳蛋白、包含其的腺相关病毒、载体及应用
WO2025030728A1 (zh) * 2023-08-04 2025-02-13 中国科学院深圳先进技术研究院 重组腺相关病毒包装质粒、突变体及其制备方法和应用
WO2025098512A1 (zh) * 2023-11-10 2025-05-15 上海朗昇生物科技有限公司 衣壳修饰型病毒载体及其制备和用途
CN119080889A (zh) * 2024-09-18 2024-12-06 广州译码基因科技有限公司 提高aav对眼组织感染能力的衣壳蛋白突变体及应用
CN119080889B (zh) * 2024-09-18 2025-06-24 广州译码基因科技有限公司 提高aav对眼组织感染能力的衣壳蛋白突变体及应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2012245328A1 (en) 2013-11-07
LT4005603T (lt) 2025-01-10
CN103561774B (zh) 2016-12-14
KR102202908B1 (ko) 2021-01-15
AU2018236725A1 (en) 2018-10-18
PT3693025T (pt) 2022-01-20
SG194583A1 (en) 2013-12-30
SG10202110919YA (en) 2021-11-29
PL2699270T3 (pl) 2017-12-29
US11236402B2 (en) 2022-02-01
EP3254703B1 (en) 2020-02-19
US20140364338A1 (en) 2014-12-11
WO2012145601A3 (en) 2012-12-20
US20160375151A1 (en) 2016-12-29
ES2904638T3 (es) 2022-04-05
IL280819B2 (en) 2024-06-01
JP2020028308A (ja) 2020-02-27
EP4471424A2 (en) 2024-12-04
IL228976B (en) 2021-02-28
AU2016273850B2 (en) 2018-11-01
JP2014518614A (ja) 2014-08-07
KR20200016988A (ko) 2020-02-17
HUE049629T2 (hu) 2020-09-28
HUE034510T2 (en) 2018-02-28
SI2699270T1 (sl) 2017-11-30
KR20140024395A (ko) 2014-02-28
MX2013012384A (es) 2014-11-10
DK3693025T3 (da) 2022-01-10
AU2020244399B2 (en) 2024-01-25
LT2699270T (lt) 2017-10-10
HRP20171334T1 (hr) 2017-11-17
EP4471424A3 (en) 2025-03-05
RU2742724C1 (ru) 2021-02-10
US10202657B2 (en) 2019-02-12
CY1124905T1 (el) 2023-01-05
MX349138B (es) 2017-07-13
US9587282B2 (en) 2017-03-07
AU2012245328B2 (en) 2016-09-29
LT3254703T (lt) 2020-05-25
AU2018236725B2 (en) 2020-07-02
PL4005603T3 (pl) 2025-02-24
HK1247855A1 (zh) 2018-10-05
PT2699270T (pt) 2017-08-30
AU2016273850A1 (en) 2017-01-12
CA2833870C (en) 2020-03-10
HRP20220036T1 (hr) 2022-04-01
IL280819B1 (en) 2024-02-01
DK4005603T3 (da) 2024-11-25
JP2017113002A (ja) 2017-06-29
BR112013027120B1 (pt) 2022-02-01
RS66184B1 (sr) 2024-12-31
LT3693025T (lt) 2022-02-10
PT3254703T (pt) 2020-05-20
SMT202000386T1 (it) 2020-09-10
KR102121355B1 (ko) 2020-06-11
WO2012145601A2 (en) 2012-10-26
US20160184394A1 (en) 2016-06-30
US20150225702A1 (en) 2015-08-13
EP3254703A1 (en) 2017-12-13
ES2638342T3 (es) 2017-10-19
US9458517B2 (en) 2016-10-04
RU2611202C2 (ru) 2017-02-21
US20220243291A1 (en) 2022-08-04
US20190218627A1 (en) 2019-07-18
CY1119765T1 (el) 2018-06-27
CN105755044A (zh) 2016-07-13
EP2699270B1 (en) 2017-06-21
RU2013151885A (ru) 2015-05-27
RU2742724C9 (ru) 2021-04-26
CA3069946A1 (en) 2012-10-26
ES2994914T3 (en) 2025-02-04
CN107012171B (zh) 2021-07-13
SG10201800873WA (en) 2018-03-28
US9193956B2 (en) 2015-11-24
RS56246B1 (sr) 2017-11-30
US10214785B2 (en) 2019-02-26
SMT201700443T1 (it) 2017-11-15
CY1122902T1 (el) 2021-10-29
ES2791499T3 (es) 2020-11-04
PL3693025T3 (pl) 2022-03-14
CN107012171A (zh) 2017-08-04
AU2020244399A1 (en) 2020-10-29
SI3254703T1 (sl) 2020-07-31
HUE069642T2 (hu) 2025-03-28
DK3254703T3 (da) 2020-05-11
BR112013027120A2 (pt) 2017-08-01
CA3069946C (en) 2023-10-24
FI4005603T3 (fi) 2024-11-25
SI3693025T1 (sl) 2022-04-29
DK2699270T3 (en) 2017-10-02
SMT202200036T1 (it) 2022-03-21
EP4005603B1 (en) 2024-09-25
JP2021121638A (ja) 2021-08-26
PL3254703T3 (pl) 2020-10-05
HRP20200762T1 (hr) 2020-07-24
JP2025039615A (ja) 2025-03-21
HUE057102T2 (hu) 2022-04-28
SI4005603T1 (sl) 2025-03-31
EP2699270A4 (en) 2014-12-10
JP6072772B2 (ja) 2017-02-01
US20150232953A1 (en) 2015-08-20
US20140294771A1 (en) 2014-10-02
SMT202400520T1 (it) 2025-01-14
ZA201409129B (en) 2016-09-28
KR20210006514A (ko) 2021-01-18
RS60207B1 (sr) 2020-06-30
EP4005603A1 (en) 2022-06-01
CA2833870A1 (en) 2012-10-26
HRP20241577T1 (hr) 2025-01-31
IL280819A (en) 2021-04-29
IL228976A0 (en) 2013-12-31
ZA201307968B (en) 2015-03-25
KR102391725B1 (ko) 2022-04-28
EP3693025B1 (en) 2021-10-13
JP2022125201A (ja) 2022-08-26
EP3693025A1 (en) 2020-08-12
RS62795B1 (sr) 2022-02-28
KR20220056884A (ko) 2022-05-06
US20160376323A1 (en) 2016-12-29
PT4005603T (pt) 2024-12-02
US9856539B2 (en) 2018-01-02
EP2699270A2 (en) 2014-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220243291A1 (en) Adeno-Associated Virus Virions with Variant Capsid and Methods of Use Thereof
HK40035863B (zh) 具有變異衣殼的腺相關病毒病毒體及其使用方法
HK40035863A (zh) 具有變異衣殼的腺相關病毒病毒體及其使用方法
HK1247855B (zh) 具有變異衣殼的腺相關病毒病毒體及其使用方法
HK1194982A (zh) 具有變異衣殼的腺相關病毒病毒體及其使用方法
HK1194982B (zh) 具有變異衣殼的腺相關病毒病毒體及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant