KR102234930B1 - 아데노-관련 바이러스 변이체 캡시드 및 그 용도 - Google Patents

아데노-관련 바이러스 변이체 캡시드 및 그 용도 Download PDF

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4디 몰레큘러 테라퓨틱스 아이엔씨.
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Abstract

본원에서 모 AAV 캡시드 단백질에 대해 아미노산 서열에서 하나 이상의 변형을 갖는 변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질이 제공되며, 이때 상기 변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질은 AAV 비리온에 존재할 때 변형되지 않은 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 막망 세포의 감염성과 비교하여 하나 이상의 유형의 망막 세포의 증가된 감염성을 부여한다. 또한, 재조합 AAV 비리온 및 본원에 개시된 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 이의 약학 조성물, rAAV 캡시드 단백질 및 비리온의 제조 방법, 및 연구 및 임상 실습에서, 예를 들어 망막 질환 및 질병의 치료를 위한 망막의 하나 이상의 세포로 핵산 서열의 전달에서 이들 rAAV 캡시드 단백질 및 비리온을 사용하는 방법이 제공된다.

Description

아데노-관련 바이러스 변이체 캡시드 및 그 용도
35 USC에 준하여 §119 (e)에서, 본 출원은 2016 년 5 월 13 일에 출원 된 미국 가출원 제 62/336,441 호의 출원일에 우선권을 주장하며; 2016 년 8 월 22 일자로 제출 된 미국 임시 특허 출원 일련 번호 62 / 378,106; 2016 년 9 월 7 일자로 제출 된 미국 특허 가출원 일련 번호 62 / 384,590; 2017 년 2 월 3 일자로 출원 된 미국 가출원 제 62 / 454,612 호; 이들의 전체 개시 내용은 본원에 참고로 포함된다.
텍스트파일로 제공되는 서열목록 참조에 의한 통합
서열 목록은 2017 년 5 월 12 일에 작성되고 크기가 198KB 인 텍스트 파일 "4D_ST25.txt"로 제공된다. 텍스트 파일의 내용은 본원에서 참조로서 포함된다.
본원에 개시된 발명은 일반적으로 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 비리온의 분야 및 유도 진화 기술을 이용한 이 같은 변이체 캡시드의 생성에 관한 것이다.
유전성 망막 질환은 3000 명 중 1 명 (전 세계적으로 2 백만 명을 초과함)에 영향을 미치고 심각한 시력 상실 또는 실명의 주요 원인인 매우 다양한 이종성 유전 질환을 포함한다. 습식 나이 관련 황반변성 (wAMD)과 당뇨병성 망막증 (DR)과 같은 복합 다중 인자성 망막 질환은 더 많은 개인에게 영향을 미치며, 이때 170 만명의 미국인이 현재 wAMD와 관련된 심각한 중부 시력 상실을 앓고 있으며, 당뇨병에 걸린 40 세 이상의 성인의 거의 1/3이 시각 장애가 갖고 있다. 이 질환은 전형적으로 일부 경우에 핵심 단백질 (예를 들어, LCA2의 RPE65)의 발현 또는 기능의 부재로 인해, 다른 경우에는 독성 유전자 산물을 생성하기 위한 유전자 돌연변이,예를 들어 로돕신 단백질 폴딩(rhodopsin protein folding)에 영향을 미치는 우성 돌연변이로 인해, 또는 또 다른 경우에 wAMD에서의 VEGF와 같은 단백질의 이소성 발현에 의해 유발된 망막 생리학의 변화로 인한 망막 세포의 하나 이상의 유형의 기능 장애 또는 사망과 관련이 있다.
이러한 큰 비의학적 필요성을 해결하기 위한 한 가지 방법은 망막의 하나 이상의 세포 유형에 유전자를 전달하기 위해, 예를 들어 누락 유전자를 대체하거나, 우성 결손 유전자를 보정하거나, 연속 단백질 치료를 위한 주형을 제공기 위해 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 사용하는 유전자 기반 아데노 관련 바이러스 (AAV) 매개 치료법이다. AAV 기반 임상 유전자 치료법이 점점 성공적으로 진행되고는 있지만, 바이러스 벡터 특성과 관련하여, 예를 들어 망막의 원하는 세포를 고효율로 표적화하는 것과 관련하여 여전히 단점이 많다. 예를 들어, 여러 상동성 영장류 AAV 혈청형 및 수많은 비인간 영장류 혈청형이 확인되고 특징 지어졌으며, AAV2가 AAV 혈청형 중에서 가장 잘 특징 지어지져 있으며, 눈에서의 유전자 전달 비히클로서 최초로 채택되었다. 그러나, 이러한 AAV(AAV2를 포함함)는 유리 체강 내 투여를 통해 전달될 때 망막의 더 깊은 세포 유형을 형질 전환하는데 효과적인 것으로 보고된 바 없다. 따라서, 안구 질환의 치료를 위해 망막 세포에보다 효과적인 유전자-기반 전달을 제공할, 우수한 형질 도입 능력을 갖는 신규한 AAV 변이체가 당업계에서 필요하다. 당해 분야에 공지된 바와 같은 야생형 AAV 및 AAV 변이체에 비해 향상된 망막 형질 도입 프로파일(일부 경우에 광범위하게, 다른 경우에는 특정 망막 세포 유형에 우선적으로)을 나타내는 이 같은 AAV 변이체에 대한 필요성이 당업계에 존재한다.
자연적으로 발생하는 AAV는 3 개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)인 rep, cap 및 aap 를 함유하는 단일 가닥 DNA 바이러스이다. 첫 번째 유전자인 rep 는 게놈 복제에 필요한 4 개의 단백질 (Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)을 암호화하고, 두 번째 cap 은 바이러스 캡시드를 형성하기 위해 조립되는 3 개의 구조 단백질 (VP1-3)을 발현하고, 세 번째는 캡시드 조립에 필수적인 조립 활성화 단백질 (AAP)을 발현한다. AAV는 활성 복제를 위한 아데노바이러스(adenovirus) 또는 헤르페스바이러스(herpesvirus)와 같은 헬퍼 바이러스(helper virus)의 존재에 의존한다. 헬퍼 바이러스의 부재 하에 AAV는 게놈이 에피솜(episome)적으로 유지되거나 AAVS1 유전자좌 내의 숙주 염색체에 통합되는잠복 상태를 확립한다.
시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 유도 진화 기술은 현재의 AAV 기반 유전자 전달 벡터보다 개선 된 AAV 변이체을 선택하는데 사용될 수 있다. 이 같은 유도 진화 기술은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 PCT 공보 WO 2014/194132 및 Kotterman ＆ Schaffer ((Nature Review Genetics, AOP, published online 20 May 2014; doi: 10.1038/nrg3742)에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 유도 진화는 반복적인 유전적 다양화 및 선택 과정을 통해 자연적 진화를 모방하는 캡시드 공학 접근법으로, AAV 기반 비리온과 같은 생체 분자의 기능을 점진적으로 개선시키는 유익한 돌연변이의 축적을 가능하게 한다. 이 접근법에서 야생형 AAV cap 유전자는 바이러스 입자의 라이브러리를 생성하기 위해 일괄 처리되는 대형 유전자 라이브러리를 만들기 위해 다양화되고, 유전자 전달 장벽을 극복할 수 있는 우수한 표현형을 가진 독특한 변이체를 분리하기 위해 선택 압력이 가해진다.
AAV 변이체는, 예를 들어 미국 특허 제 9,193,956 호; 제 9,186,419 호; 제 8,632,764 호; 제 8,663,624 호; 제 8,927,514 호; 제 8,628,966 호; 제 8,263,396 호; 제 8,734,809 호; 제 8,889,641 호; 제 8,632,764 호; 제 8,691,948 호; 제 8,299,295 호; 제 8,802,440 호; 제 8,445,267 호; 제 8,906,307 호; 제 8,574,583 호; 제 8,067,015 호; 제 7,588,772 호; 제 7,867,484 호; 제 8,163,543 호; 제 8,283,151 호; 제 8,999,678 호; 제 7,892,809 호; 제 7,906,111 호; 제 7,259,151 호; 제 7,629,322 호; 제 7,220,577 호; 제 8,802,080 호; 제 7,198,951 호; 제 8,318,480 호; 제 8,962,332 호; 제 7,790,449 호; 제 7,282,199 호; 제 8,906,675 호; 제 8,524,446 호; 제 7,712,893 호; 제 6,491,907 호; 제 8,637,255 호; 제 7,186,522 호; 제 7,105,345 호; 제 6,759,237 호; 제 6,984,517 호; 제 6,962,815 호; 제 7,749,492 호; 제 7,259,151 호; 및 제 6,156,303 호; 미국 공개공보 제 2013/0295614 호; 제 2015/0065562 호; 제 2014/0364338 호; 제 2013/0323226 호; 제 2014/0359799 호; 제 2013/0059732 호; 제 2014/0037585 호; 제 2014/0056854 호; 제 2013/0296409 호; 제 2014/0335054 호; 제 2013/0195801 호; 제 2012/0070899 호; 제 2011/0275529 호; 제 2011/0171262 호; 제 2009/0215879 호; 제 2010/0297177 호; 제 2010/0203083 호; 제 2009/0317417 호; 제 2009/0202490 호; 제 2012/0220492 호; 제 2006/0292117 호; 제 및 2004/0002159 호; 제 유럽 공개공조 제 2692731 A1 호; 제 2383346 B1 호; 제 2359865 B1 호; 제 2359866 B1 호; 제 2359867 B1 호; 및 제 2357010 B1 호; 제 1791858 B1 호; 제 1668143 B1 호; 제 1660678 B1 호; 제 1664314 B1 호; 제 1496944 B1 호; 제 1456383 B1 호; 제 2341068 B1 호; 제 2338900 B1 호; 제 1456419 B1 호; 제 1310571 B1 호; 제 1456383 B1 호; 제 1633772 B1 호; 및 제 1135468 B1 호; 및 국제 (PCT) 공개공보 제 WO 2014/124282 호; 제 WO 2013/170078 호; 제 WO 2014/160092 호; 제 WO 2014/103957 호; 제 WO 2014/052789 호; 제 WO 2013/174760 호; 제 WO 2013/123503 호; 제 WO 2011/038187 호; 및 제 WO 2008/124015 호; 제 WO 2003/054197 호에 개시되어 있지만; 이러한 참고 문헌들 중 어느 것도 본원에 개시된 AAV 변이체의 실시형태 및/또는 특징 및/또는 조성물 및/또는 물질 구조가 개시되어 있지 않다.
본 명세서 및 인용된 특허 문헌에 인용된 모든 문헌 및 참고 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
본원에서는 모 AAV 캡시드 단백질에 대해 아미노산 서열에서 하나 이상의 변형을 갖는 변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질이 본원에 제공되며, 이때 상기 변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질은 AAV 비리온에 존재할 때 변형되지 않은 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 막망 세포의 감염성과 비교하여 하나 이상의 유형의 망막 세포의 증가된 감염성을 부여한다. 또한, 재조합 AAV 비리온 및 본원에 개시된 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 이의 약학 조성물, 변이체 rAAV 캡시드 단백질 및 비리온의 제조 방법, 및 연구 및 임상 실습에서, 예를 들어 망막 질환 및 질병의 치료를 위한 망막의 하나 이상의 세포로의 핵산 서열의 전달에서 이들 rAAV 캡시드 단백질 및 비리온을 사용하는 방법이 제공된다
본원의 일부 양태에서, 변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질이 제공되며, 이러한 변이체 AAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드에 비해 아미노산 서열에서 하나 이상의 변형을 가지며, 이때 상기 모 AAV 캡시드는 AAV 비리온에 존재하는 경우에 아미노산 서열 변형을 포함하지 않는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포의 감염성과 비교하여 하나 이상의 유형의 망막 세포 (예를 들어, 광 수용체 세포 (예를 들어, 로드형; 원추형)), 망막 신경절 세포 (RGC), 교질 세포 (예를 들어, 뮐러 교질 l 세포(Muller glial cell), 소교 세포), 양극 세포, 무축삭 세포, 수평 세포 및/또는 망막 색소 상피세포 (RPE) 세포) 의 증가된 감염성을 부여한다.
본원의 일부 양태에서, 재조합 AAV (rAAV) 비리온이 제공되며, 상기 rAAV 비리온은 본원에 기재된 바와 같은 변이체 캡시드 단백질을 포함하며, 여기서 rAAV 비리온은 상응하는 변형되지 않은 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포의 감염성과 비교하여 하나 이상의 유형의 망막 세포 (예를 들어, 광 수용체 세포(예를 들어, 로드형, 원추형), 망막 신경절 세포 (RGC), 교질 세포 (예를 들어, 뮐러 교질 l 세포, 소교 세포), 양극 세포, 무축삭 세포, 수평 세포 및/또는 망막 색소 상피세포 (RPE) 세포) 의 증가된 감염성을 부여한다. 일부 실시형태에서, rAAV 비리온은 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 비해 모든 망막 세포의 증가된 감염성을 나타낸다. 다른 실시형태에서, rAAV 비리온은 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 비해 망막의 특정 세포 유형만의 증가된 감염성을 나타낸다. 달리 말하면, rAAV는 망막의 특정 세포 유형에 대해만 우선적인 증가된 감염성을 나타내지만, 예를 들어 rAAV는 광 수용체 세포, 망막 신경절 세포, 교질 세포, 양극 세포, 무축삭 세포, 수평 세포 및/또는 망막 색소 상피세포 (RPE)로부터 선택되는 하나 이상의 유형의 우선적으로 증가된 감염성을 입증하였지만, 모든 세포 유형의 증가된 감염성을 입증하지 못하였다.
일부 실시형태에서, rAAV 비리온은 이종성 핵산을 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 이종성 핵산은 폴리펩티드를 코딩하는 RNA를 코딩한다. 이 같은 다른 실시형태에서, 이종성 핵산 서열은 폴리펩티드를 코딩하지 않는 RNA, 예를 들어, 이종성 핵산 서열, RNA 간섭 제, 핵산 분해 효소에 대한 가이드 RNA 등을 코딩한다.
또한, 본 발명의 감염성 rAAV 비리온 및 약학 적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
또한 표적 세포를 rAAV 비리온과 접촉시킴으로써 이종성 핵산을 표적 세포 (예를 들어 망막 세포)에 전달하는 방법에 본원에 기재된 바와 같은 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온의 용도가 제공된다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 안구 질환 치료를 필요로 하는 개인의 눈에서와 같이 생체 내 에서 존재한다. 다른 실시형태에서, 표적 세포는 시험관 내에 존재한다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 유효량의 rAAV 비리온 또는 유효량의 rAAV 비리온을 포함하는 약학 조성물을 이 같은 치료를 필요로 하는 대상에 투여함으로써 안구 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 변이체 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산, 및 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 단리된 핵산 및/또는 단리된 숙주 세포는 rAAV를 포함한다.
일부 양태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질에 비해 캡시드 단백질의 GH-루프에는 약 5 개의 아미노산 내지 약 20 개의 아미노산 ( "이종 펩티드" 또는 "펩티드 삽입물")의 삽입물을 포함하며, 여기서 상기 변이체 캡시드 단백질은 AAV 비리온에 존재하는 경우 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포의 감염성과 비교하여 망막 세포의 증가된 감염성을 부여한다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 QADTTKN (서열 번호 13), ISDQTKH (서열 번호 14), ASDSTKA (서열 번호 15), NQDYTKT (서열 번호 16) , HDITKNI (서열 번호 17), HPDTTKN (서열 번호 18), HQDTTKN (서열 번호 19), NKTTNKD (서열 번호 20), ISNENEH (서열 번호 21), QANANEN (서열 번호 22), GKSKVID (서열 번호 23), TNRTSPD (서열 번호 24), PNSTHGS (서열 번호 25), KDRAPST (서열 번호 26), LAQADTTKNA (서열 번호 27) LAISDQTKHA (서열 번호 28), LGISDQTKHA (서열 번호 29), LAASDSTKAA (서열 번호 30), LANQDYTKTA (서열 번호 31), LAHDITKNIA (서열 번호 32), LAHPDTTKNA (서열 번호 : 33), LAHQDTTKNA (서열 번호 34), LANKTTNKDA (서열 번호 35), LPISNENEHA (서열 번호 36), LPQANANENA (서열 번호 37), LAGKSKVIDA (서열 번호 38), LATNRTSPDA (서열 번호 39), LAPNSTHGSA (서열 번호 40) 및 LAKDRAPSTA (서열 번호 41)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 본질적으로 QADTTKN (서열 번호 13), ISDQTKH (서열 번호 14), ASDSTKA (서열 번호 15), NQDYTKT (서열 번호 16), HDITKNI (서열 번호 17), HPDTTKN (서열 번호 18), HQDTTKN (서열 번호 19), NKTTNKD (서열 번호 20), ISNENEH (서열 번호 21), QANANEN (서열 번호 22), GKSKVID (서열 번호 23), TNRTSPD (서열 번호 24), PNSTHGS (서열 번호 25), KDRAPST (서열 번호 26), LAQADTTKNA (서열 번호 27 ), LAISDQTKHA (서열 번호 28), LGISDQTKHA (서열 번호 29), LAASDSTKAA (서열 번호 30), LANQDYTKTA (서열 번호 31), LAHDITKNIA (서열 번호 32), LAHPDTTKNA (SEQ (서열 번호 : 33), LAHQDTTKNA (서열 번호 34), LANKTTNKDA (서열 번호 35), LPISNENEHA (서열 번호 36), LPQANANENA (서열 번호 37), LAGKSKVIDA (서열 번호 38) , LATNRTSPDA (서열 번호 39), LAPNSTHGSA (서열 번호 40) 및 LAKDRAPSTA (서열 번호 41)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어져 있다. 일부 양태에서, AAV 캡시드 단백질은 대응하는 모 AAV 캡시드 단백질에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 이때 상기 변이체 캡시드 단백질은 AAV 비리온에 존재하는 경우에 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포의 감염성과 비교하여 망막 세포의 증가된 감염성을 부여한다.
관련 양태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질에 비해 펩티드 삽입 및 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 이때 상기 변이체 캡시드 단백질은 AAV 비리온에 존재하는 경우에 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포의 감염성과 비교하여 망막 세포의 증가된 감염성을 부여한다.
또한, 이종성 펩티드 LAISDQTKHA (서열 번호 28) 및 AAV2에 대한 P34A 치환을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질이 본원에 개시된다.
AAV2에 대하여 이종성 펩티드 LAISDQTKHA (서열 번호 28) 및 N312K, N449D, N551S, I698V 및 L735Q 아미노산 치환을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질이 또한 본원에 개시되어 있다.
또한 본원에 개시된 바와 같은 변이체 AAV 캡시드를 포함하는 rAAV의 제조 및/또는 전달 방법이 본원에 개시되어 있다. 또한, 본원에 개시된 바와 같은 변이체 AAV 캡시드를 포함하는 rAAV를 포함하는, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트가 본원에서 제공된다.
다른 실시형태에서, 이전 단락에서 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온은 이전 또는 이후에 개시된 임의의 실시형태를 포함할 수 있다. 사실상, 명확한 설명을 위해 별도의 실시형태들의 문맥에 설명되어 있는 본 발명의 특정 특징부는 단일 실시형태로 함께 제공될 수도 있다. 반대로, 간략화를 위해, 단일 실시형태의 문맥에 설명되어 있는 본 발명의 다양한 특징부가 또한 개별적으로 제공되거나, 임의의 적합한 하위 조합으로 제공될 수 있다. 본 발명에 속하는 실시형태의 모든 조합은 본 발명에 구체적으로 포함되며, 거의 모든 조합이 개별적 및 명시적으로 개시되는 바와 같이 본원에 개시된다. 또한, 다양한 실시형태의 모든 하위 조합 및 이의 성분은 본 발명에 구체적으로 포함되며, 거의 모든 하위 조합이 본원에서 개별적 및 명시적으로 개시되는 바와 같이 본원에 개시된다.
본 발명의 요약은 특허청구범위를 한정하고자 하는 것이 아니며, 임의의 방식으로 본 발명의 범위를 제한하려는 것도 아니다.
본원에 개시된 본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 도면, 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백하게 될 것이다.
본 발명은 첨부된 도면과 함께 해석되는 경우에 하기 상세한 설명으로부터 가장 잘 이해되 것이다. 특허 또는 출원 파일에는 색으로 표시된 하나 이사의 도면이 포함되어 있다. 컬러 도면이 있는 이러한 특허 또는 특허 출원 공개공보의 사본은 요청에 따라 필요한 수수료의 지불과 함께 특허청이 제공할 것이다. 통상적인 실시에 따르면, 도면의 다양한 특징부는 척도에 맞게 도시되지 않는다는 것이 강조된다. 반대로, 다양한 특징부의 치수는 명확성을 이해 임의로 확장되거나 축소된다. 도면에는 하기 도가 포함된다.
도 1 은 유도 진화 방법의 실시형태를 나타낸다. 단계 (a)는 DNA 돌연변이 기술과 cap 유전자의 조합을 포함하는 바이러스 캡시드 라이브러리의 생성을 나타낸다. 단계 (b)는 각 바이러스 입자가 캡시드를 코딩하는 cap 유전자를 둘러싸고 있는 돌연변이 캡시드로 구성되고 정제되도록 바이러스를 패키징하는 것을 나타낸다. 그 후, 캡시드 라이브러리는 시험관 내 또는 생체 내에서 선택적 압력을 받게 된다. 유도 진화 기술의 이러한 양태에서, 관심있는 조직 또는 세포 물질은 그 표적을 성공적으로 감염시켰던 AAV 변이체의 단리를 위해 수확되고, 바이러스가 성공적으로 회수된다. 단계 (c)는 반복 선택을 통한 성공적인 클론의 단계 1 농축(enrichment)을 나타낸다. 단계 (d)는 바이러스 적합성을 반복적으로 증가시키기 위해 재다양화 및 추가의 선택 단계를 거치는 선택된 cap 유전자의 단계 2 농축을 나타낸다. 단계 (e)는 재조합 AAV 벡터로서 제조되고 다양한 세포 유형 및 조직 표적의 형질 도입 수준에대해 특성 분석된 벡터 선별 단계 1 및 2 동안 히트(hit)로 확인된 변이체를 나타낸다. AAV 유도 진화 과정의 본질에 의해, 본원에 개시된 변이체는 선별 과정 도중에 망막 세포를 형질 도입하고 게놈 (변이체 cap 유전자를 코딩하는 게놈)을 전달하는 능력이 이미 입증되어 있다.
도 2 는 바이러스 게놈이 증폭되는 샘플이 망막의 넓은 영역에 수집되는 위치를 보여주는 망막 평면 마운트(retinal flat mount)의 개략도를제공한다.
도 3 은 대표적인 선택 라운드에서 신경절 세포층 (GCL), 내핵층 (INL), 광 수용체/외핵층 (ONL) 및 망막 색소 상피층 (RPE) 망막 조직으로부터 바이러스 게놈의 PCR 증폭을 보여준다. 우안 (상단 이미지)과 좌안 (하단 이미지)은 둘 모두 라이브러리에 부가되었다. 내측 망막 (in), 중앙 망막 (mid), 외측/말초 망막(out)을 채취하였다. 적색 박스 내의 밴드는 바이러스 게놈의 성공적인 증폭을 나타낸다.
도 4A 내지 도 4D 는 서열 분석에서의 모티프의 빈도를 나타낸다. 그림 4A는 라운드 3 시퀀싱 분석을 제공한다. 그림 4B는 라운드 4 시퀀싱 분석을 제공한다. 그림 4C는 라운드 5 시퀀싱 분석을 제공한다. 그림 4D는 라운드 6 시퀀싱 분석을 제공한다.
도 5 는 587번째 아미노산 다음에 랜덤 7 량체를 함유하는 AAV2의 대표적인 3 차원 모델을 제공한다.
도 6 은 야생형(자연 발생) AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B 및 AAV4-10 혈청형 사이 및 그 내부의 아미노산 위치를 나타내는 야생형 AAV의 서열 번호 1 내지 서열 번호 11의 배열을 제공한다.
도 7은 AAV2는 CMV 프로모터 (AAV2.CMV.GFP)의 제어 하에 GFP 이식 유전자를 전달하는 AAV2의 2 × 1011개의 벡터 게놈 (vg)의 유리체강 내 투여 이후에 아프리카 녹색 원숭이의 망막에 대해 하이델베르크 스펙트랄리스 TM(Heidelberg SpectralisTM)로 촬영한 안저 형광 이미지를 제공한다. 주입 후 기준선 (A) 및 14 일 (B), 28 일 (C) 및 42 일 (D)째 날에 이미지를 촬영하였다.
도 8은 CMV 프로모터(LAISDQTKHA+P34A.CMV.GFP)의 제어 하에 GFP 이식 유전자를 전달하는 신규한 AAV 변이체 LAISDQTKHA+P34A의 2 × 1011개의 벡터 게놈 (vg)의 유리체강 내 투여 이후에 아프리카 녹색 원숭이의 망막에 대해 하이델베르크 스펙트랄리스 TM로 촬영한 안저 형광 이미지를 제공한다. 주입 후 기준선 (A) 및 14 일 (B), 28 일 (C) 및 42 일 (D)째 날에 이미지를 촬영하였다.
도 9 는 CAG 프로모터(LAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP)의 제어 하에 GFP 이식 유전자를 전달하는 신규한 AAV 변이체 LAISDQTKHA+P34A의 유리체강 내 투여 이후에 시노몰구스 원숭이(Cynomolgus monkey)의 망막에 대해 하이델베르크 스펙트랄리스 TM로 촬영한 안저 형광 이미지를 제공한다. (A) 벡터의 2 × 1011개의 vg로 유리체강 내로 주입된 원숭이의 망막으로서, 주입 후 14 일 (A1), 21일 (A2) 및 28일 (A3)째 날에 촬영되었다. (B) 벡터의 1 × 1012개의 vg로 유리체강 내로 주입된 원숭이의 망막으로서, 주입 후 14 일 (B1) 및 21일 (B2)째 날에 촬영되었다.
도 10A 내지 도 10E는 CAG 프로모터의 제어 하에 GFP 이식 유전자를 전달하는 신규한 AAV 변이체 LAISDQTKHA+P34A의 1 × 1012개의 vg로 유리체강 내 주입되고 주입 3주 후에 분석된 원숭이의 망막에 대한 면역 조직화학적 분석 결과를 제공한다. 모든 면역 조직화학법에서는 망막에서 분석이 수행되는 대략적인 위치를 나타내기 위해 해당하는 안저 형광 이미지와 함께 적색 박스가 제공된다. 도 10A : 강력한 망막 색소 상피세포 (RPE) 및 광 수용체의 형질 도입은 GFP 특이적 항체 (적색)를 사용하여 관찰되었다. M/L 옵신 항체(M/L opsin antibody)를 사용한 원추형 광 수용체의 면역 염색은 백색으로 나타나 있다. 도 10B 및 도 10C: 직접 EGFP 형광 (녹색)에 의해, 그리고 GFP 특정 항체 (적색)를 이용한 면역 조직화학법에 의해 강력한 로드형 및 원추형 광 수용체 (도 10B) 및 RPE (도 10C)의 형질 도입이 관찰되었다. RPE 내의 멜라노좀은 이미지 상에서 흑색으로 보이다. 도 10D : 직접 EGFP 형광 (녹색)에 의해, 그리고 GFP 특이적 항체 (적색)를 사용하는 면역 조직화학법에 의해 안와 내부 및 주위의 원주형 광 수용체 (M/L 옵신에 의해 백색으로 확인됨) 및 망막 신경절 세포 (RGC)의 형질 도입. 중앙 패널의 이미지는 좌측 패널에서 백색 박스로 표시된 영역의 배율(63X)이 더 높다. 도 10E : 망막 신경절 세포 (RGC) 및 망막 신경절 세포층의 형질 도입은 직접 EGFP 형광에 의해 관찰되었다 (우측 패널, 녹색; 하단 우측 패널은 상단 우측 패널의 63 배의 배율임); 상단 좌측 패널은 명시야 조명 하의 영역을 나타낸다.
도 11A 내지 도 11F는 CAG 프로모터의 제어 하에 신규한 AAV 변이체 LAISDQTKHA+P34A 캡시드 및 GFP 이식 유전자를 포함하는 재조합 AAV 바이러스에 의한 인간 망막 색소 상피세포 (RPE)의 형질 도입에 대한 데이터를 제공한다. 인간 배아 줄기 세포주 (도 11A 및 도 11C) 또는 인간 섬유 아세포 유래 유도된 다능성 줄기 세포 (FB-iPSC) (도 11B 및 도 11D)로부터 RPE 세포로 분화되는 세포를 신규한 AAV 변이체 LAISDQTKHA+P34A.CAG.GFP 또는 야생형 대조군 AAV2.CAG.GFP로 감염시켰다. 도 11A 및 도 11B : 500 MOI에서 감염 7일 후에 세포 배양액의 면역 형광 이미징에 따르면 신규한 AAV 변이체 캡시드 (좌측 패널)가 야생형 AAV2 캡시드 (우측 패널)보다 RPE 세포를 더 잘 형질 도입시킨다는 것이 입증된다. 도 11C 및 도 11D : 유동 세포 분석법에 의한 각각의 배양액에서 GFP-양성 RPE 세포의 비율(%)의 정량화에 따르면 신규한 AAV 변이체 캡시드가 세포 공급원과는 무관하게 야생형 AAV2 캡시드에 대해 형질 도입된 세포수에 상당한 용량 의존적 개선을 제공하는 것으로 나타나 있다. 도 11E 및 도 %11F : 웨스턴 블랏에 의한 각 배양 물에서의 GFP 양의 정량화는 신규한 AAV 변이체이 세포 공급원에 관계없이 야생형 캡시드에 비해 이식 유전자의 발현에서 유의 한 개선을 제공함을 나타낸다.
본 발명의 방법 및 조성물이 개시되기 전에, 본 발명은 개시되고 상이할 수 있는 특정 방법 또는 조성물에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 특정 실시형태만을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한될 것이므로 제한적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시된 본 발명은 도면 및 설명에 예시되어 있다. 그러나, 특정 실시형태가 도면에 도시되어 있지만, 본 발명을 도시 및/또는 개시된 특정 실시형태에 제한하기 위함은 아니다. 오히려, 본원에 개시된 본 발명은 본 발명의 사상 및 범위 내에 속하는 모든 변경, 대안적인 구성 및 등가물을 포함하도록 의도된다. 이와 같이, 도면은 예시적인 것이며 제한적인 것은 아니다.
값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한 및 하한 사이의, 문맥 상 명확히 달리 지시하지 않는 한 하한의 단위의 십분의 일까지의, 각 중간 값(intervening value)이 구체적으로 개시되는 것으로 이해된다. 명시된 범위 내에서 임의의 명시된 값 또는 중간 값 사이의 보다 작은 범위, 및 그러한 명시된 범위 내의 다른 명시된 중간 값이 본 발명에 포함된다. 이들 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로는 범위에 포함 또는 배제될 수 있고, 상한 및 하한 중 어느 하나 또는 둘 모두가 작은 범위에 포함되는 범위 각각이 또한 본 발명에 포함된다. 명시된 범위가 상한 및 하한 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 이들 포함된 상한 및 하한 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 개시된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 일부 잠재적이고 바람직한 방법 및 재료가 이하에 개시된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용되는 방법 및/또는 재료를 개시하고 설명하기 위해 본원에 참고으로 포함된다. 본 개시내용은 모순이 있는 범위까지 포함된 간행물의 임의의 개시내용을 대체하는 것으로 이해된다.
본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 개시되고 예시된 개별 실시형태 각각은 본 발명의 범위 또는 사상에서 벗어나지 않는 한 임의의 다른 몇몇 실시형태로부터 용이하게 분리되거나 이들 실시형태와 조합될 수 있는 개별 성분 및 특징을 갖는다. 인용된 모든 방법은 열거된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
본원 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나", "일" 및 "그"는 문맥 상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "재조합 AAV 비리온"에 대한 인용은 복수의 이 같은 비리온을 포함하고, "광 수용체 세포"에 대한 인용은 하나 이상의 광 수용체 세포 및 당업자에게 공지된 이의 등가물에 대한 인용을 포함한다. 특허청구범위는 임의의 선택적인 성분을 배제하도록 작성될 수 있는 것으로 추가로 주지된다. 이와 같이, 이러한 진술은 특허청구범위의 성분의 인용 또는 "부정적인" 제한의 사용과 관련하여 "단독으로", "오직" 등과 같은 배타적인 용어의 사용을 위한 선행 기준으로서 역할을 하기 위한 것이다.
본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 그들의 공개를 위해서만 제공된다. 본원에서는 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명으로 인해 이 같은 간행물보다 시기를 선행할 자격을 갖지 않는다는 인정으로 해석되어서는 안 된다. 또한 제공된 간행물의 날짜는 실제 공개일과 다를 수 있으며, 이는 독립으로 확인해야 할 수도 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 과학적 및 기술적 용어는이 기술이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
아데노-관련 바이러스는 비-외피성 20 면체 캡시드 내에 4.7 kb 길이의 단일 가닥 DNA 게놈으로 구성된 비병원성 파보바이러스(parvovirus)이다. 게놈은 복제 및 포장 신호의 바이러스 기점으로 기능하는 역전 된 말단 반복 (ITR)에 의해 측면에 놓인 3 개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함한다. rep ORF는 바이러스 복제, 전사 조절, 부위 특이적 통합 및 비리온 조립에서 역할을 하는 4 개의 비구조적 단백질을 코딩한다. cap ORF는 3 개의 구조 단백질(VP 1-3)을 암호화하고, 이들 단백질은 조립되어 60-머의 바이러스 캡시드를 형성한다. 마지막으로, cap 유전자 내에서 대체 리딩 프레임으로서 존재하는 ORF는 AAV 캡시드 단백질을 핵소체(nucleolus)에 국한시키고 캡시드 조립 과정에서 기능을 하는 바이러스 단백질인 조립-활성화 단백질 (AAP)을 생성한다.
자연적으로 발생하는 ("야생형") 혈청형 및 100 종 이상의 공지된 AAV 변이체가 존재하며,이들 각각은 특히 캡시드 단백질의 초가변 영역 내에서 아미노산 서열이 다르며, 따라서 유전자 전달 특성이 다르다. 어떠한 AAV도 인간 질병과 관련이 없었으며, 그 결과 재조합 AAV가 임상 적용에 매력적인 것이 되었다.
본원의 목적 상, "AAV"라는 용어는 바이러스 자체 및 그의 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 아데노-관련 바이러스의 약어이다. 달리 명시된 경우를 제외하고, 상기 용어는 모든 아형 또는 혈청형 및 복제 가능 형태 및 재조합 형태 모두를 지칭한다. 용어 "AAV"는 AAV 타입 1 (AAV-1 또는 AAV1), AAV 타입 2 (AAV-2 또는 AAV2), AAV 타입 3A (AAV-3A 또는 AAV3A), AAV 타입 3B (AAV-3B 또는 AAV3B), AAV 타입 4 (AAV-4 또는 AAV4), AAV 타입 5 (AAV-5 또는 AAV5), AAV 타입 6 (AAV-6 또는 AAV6), AAV 타입 7 (AAV-7 또는 AAV7), AAV 타입 8 (AAV-8 또는 AAV8), AAV 타입 9 (AAV-9 또는 AAV9), AAV 타입 10 (AAV-10 또는 AAV10 또는 AAVrh10), 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 염소 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV , 비영장류 AAV 및 양 AAV를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "영장류 AAV"는 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하며, "비영장류 AAV"는 비영장류 포유동물을 감염시키는 AAV를 지치하며, "소 AAV"는 소 포유동물을 감염시키는 AAV를 지칭한다.
AAV의 다양한 혈청형의 게놈 서열뿐만 아니라 천연 말단 반복서열 (TR), Rep 단백질 및 캡시드 서브유닛의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 이 같은 서열은 문헌 또는 유전자 은행(GenBank)와 같은 공공 데이터베이스에서 찾아 볼 수 있다. 예를 들어, 유전자 은행 등록 번호: NC_002077.1 (AAV1), AF063497.1 (AAV1), NC_001401.2 (AAV2), AF043303.1 (AAV2), J01901.1 (AAV2), U48704.1 (AAV3A), NC_001729.1 (AAV3A), AF028705.1 (AAV3B), NC_001829.1 (AAV4), U89790.1 (AAV4), NC_006152.1 (AA5), AF085716.1 (AAV-5), AF028704.1 (AAV6), NC_006260.1 (AAV7), AF513851.1 (AAV7), AF513852.1 (AAV8) NC_006261.1 (AAV-8), AY530579.1 (AAV9), AAT46337 (AAV10) 및 AAO88208 (AAVrh10)을 참고하며, 이의 전문은 AAV 핵산 및 아미노산 서열을 교시하기 위해 본원에 참고로 포함된다. 예를 들어, Srivistava et al. (1983) J. Virology 45 : 555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71 : 6823; Chiorini et al. (1999) J. Virology 73 : 1309; Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73 : 939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73 : 3994; Muramatsu et al. (1996) Virology 221 : 208; Shade et. al. (1986) J. Virol. 58 : 921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99 : 11854; Moris et al. (2004) Virology 33 : 375-383; 국제 특허 공보 제 WO 00/28061 호, 제 WO 99/61601 호, 제 WO 98/11244 호; 및 미국 특허 제 6,156,303 호를 또한 참고한다.
AAV 혈청형과 관련된 자연적으로 존재하는 캡 (캡시드) 단백질의 서열은 당업계에 공지되어 있으며, AAV1 (서열 번호 1), AAV2 (서열 번호 2), AAV3A (서열 번호 3), AAV3B (서열 번호 4), AAV4 (서열 번호 5), AAV5 (서열 번호 6), AAV6 (서열 번호 7), AAV7 (서열 번호 8), AAV8 (서열 번호 9), AAV9 (서열 번호 10), AAV10 (서열 번호 11) 및 AAVrh10 (서열 번호 12)으로서 본원에 개시된 단백질을 포함한다. 용어 "변이체 AAV 캡시드 단백질" 또는 "AAV 변이체"는 자연적으로 존재하거나 "야생형"의 AAV 캡시드 단백질 서열, 예를 들어 본원에서 서열 번호 1 내지 서열번호 12에 개시된 바와 같은 서열에 대해 적어도 하나의 변형 또는 치환 (결실, 삽입, 점 돌연변이 등을 포함힘)을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 지칭한다. 변이체 AAV 캡시드 단백질은 야생형 캡시드 단백질의 아미노산 서열에 대해 약 80 % 이상의 동일성, 예를 들어 야생형 캡시드 단백질의 아미노산 서열에 대해85 % 이상의 동일성, 90 % 이상의 동일성 또는 95 % 이상의 동일성, 예를 들어 야생형 캡시드 단백질에 대해 98 % 또는 99 %의 동일성을 가질 수 있다. 변이체 AAV 캡시드 단백질은 야생형 캡시드 단백질이 아닐 수 있다.
본원의 목적 상, "AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 AAV 폴리뉴클레오티드로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다.
본원의 목적 상, 용어 "rAAV"는 재조합 아데노-관련 바이러스를 지칭하는 약어이다. 폴리뉴클레오티드에 적용되는 "재조합체"는 클로닝, 제한 또는 연결 단계 및 기타 과정의 다양한 조합 산물을 의미하며, 이때 상기 산물은 폴리뉴클레오티드가 자연계에서 발견되는 폴리뉴클레오티드와 구별되는 구조체을 생성한다. 재조합 바이러스는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자이다. 상기 용어는 각각 원래의 폴리뉴클레오티드 구조체의 복제물 및 원래의 바이러스 구조체의 자손을 포함한다.
용어 "rAAV 벡터"는 정의 상 rAAV 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV 비리온 (즉, rAAV 바이러스 입자) (예를 들어, 전염성 rAAV 비리온)을 포함하고; 또한 rAAV (예를 들어, rAAV를 코딩하는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드(ss-rAAV)), rAAV를 코딩하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드(ds-rAAV), 예를 들어 rAAV를 코딩하는 플라스미드 등을 포함한다.
AAV 비리온이 이종성 폴리뉴클레오티드 (즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 표적 세포로 전달되는 이식 유전자, 표적 세포로 전달되는 RNAi 작용제 또는 CRISPR 작용제 등)를 포함하는 경우 , 이는 전형적으로 "재조합 AAV (rAAV) 비리온" 또는 "rAAV 바이러스 입자"로서 지칭된다. 일반적으로, 이종성 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나, 일반적으로 2개의 AAV 전위 말단 반복서열(ITR) 옆에 위치한다.
용어 "패키징"은 AAV 입자의 조립 및 캡슐화를 초래하는 일련의 세포 내 사건을 지칭한다. AAV " rep " 및 " cap " 유전자는 아데노-관련 바이러스의 복제 및 캡시드화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. AAV rep 및 cap은 본원에서 AAV "패지징 유전자"로서 지칭된다.
AAV에 대한 용어 "헬퍼 바이러스"는 AAV (예를 들어, 야생형 AAV)가 포유동물 세포에 의해 복제되고 패키징될 수 있도록 하는 바이러스를 지칭한다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 및 우두 바이러스(vaccinia)와 같은 수두 바이러스를 비롯하여 AAV에 대한 이 같은 다양한 헬퍼 바이러스가 당업계에 공지되어 있다. 하위그룹 C의 아데노바이러스 5 형이 가장 보편적으로 사용되지만, 아데노바이러스는 다수의 상이한 하위그룹을 포함한다. 인간, 비인간 포유류 및 조류 기원의 수많은 아데노바이러스가 공지되어 있으며 ATCC와 같은 기탁소에서 그입 가능하다. 헤르페스 부류의 바이러스에는, 예를 들어 헤르페스 심플 렉스 바이러스 (HSV) 및 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus; EBV), 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus; CMV) 및 슈도레이비스 바이러스 (pseudorabies virus; PRV)를 들 수 있으며, 이들은 또한 ATCC와 같은 기탁소에서 구입 가능하다.
용어 "헬퍼 바이러스 기능(들)"은 (본원에서 개시된 복제 및 패키징에 대한 기타 요건과 함께) AAV 복제 및 패키징을 허용하는 헬퍼 바이러스 게놈에서 코딩된 기능(들)을 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같이, "헬퍼 바이러스 기능"은 헬퍼 바이러스를 제공하거나, 예를 들어 필수 기능을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 생산자 세포에 트랜스 방식으로 제공하는 것을 포함하는 많은 방법으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아데노바이러스 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 또는 다른 발현 벡터는 rAAV 벡터와 함께 생산자 세포 내로 형질 감염된다.
용어 "감염성" 바이러스 또는 바이러스 입자는 만능적으로 조립된 바이러스 캡시드를 포함하는 것이며, 바이러스종이 주성(tropism)이 있는 세포 내로 폴리뉴클레오티드 성분을 전달할 수 있다. 상기 용어는 반드시 바이러스의 복제 용량을 의미하는 것은 아니다. 감염성 바이러스 입자를 계수하기 위한 분석은 본 개시내용 및 당업계의 다른 부분에서 개시되어 있다. 바이러스 감염성은 전체 바이러스 입자에 대한 감염성 바이러스 입자의 비율로 나타낼 수 있다. 전체 바이러스 입자에 대한 감염성 바이러스 입자의 비율을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Grainger et al. (2005) Mol. Ther. 11 : S337 (여기에는 TCID50 전염성 역가 분석이 개시되어 있음); 및 Zolotukhin et al. (1999) Gene Ther. 6 : 973을 참고한다. 또한 실시예를 참고한다.
본원에 사용된 용어 "주성"은 특정 숙주 종의 세포 또는 숙주 종 내의 특정 세포 유형의 바이러스 (예를 들어, AAV)에 의한 우선적 표적화를 의미한다. 예를 들어, 심장, 폐, 간 및 근육의 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스는 폐 및 근육 세포만을 감염시킬 수 있는 바이러스에 비해 더 넓은 (즉, 증가된) 주성을 갖는다. 주성은 또한 숙주의 특정 세포 표면 분자에 대한 바이러스의 의존성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 바이러스는 표면 글리코사미노글리칸이 있는 세포만을 감염시킬 수 있는 반면, 다른 바이러스는 시알산이 있는 세포만을 감염시킬 수 있다 (이 같은 의존성은 바이러스 감염에 대한 잠재적인 숙주 세포로서 특정 종류의 분자가 결핍된 다양한 세포주를 사용하여 시험할 수 있음). 경우에 따라, 바이러스의 주성은 바이러스의 상대적 선호도를 설명한다. 예를 들어, 첫 번째 바이러스는 모든 세포 유형을 감염시킬 수 있지만 표면 글리코사미노글리칸으로 이들 세포를 감염시키는데 훨씬 성공적이다. 두 번째 바이러스가 동일한 특성을 선호한다면 비록 절대 형질 도입 효율이 유사하지 않을지라도 두 번째 바이러스는 첫 번째 바이러스와 유사 (또는 동일)한 주성을 가진 것으로 간주될 수 있다 (예를 들어, 두 번째 바이러스도 표면 글리코사미노글리칸으로 이들 세포를 감염시키는데 보다 성공적임). 예를 들어, 두 번째 바이러스는 테스트한 모든 소정의 세포 유형을 감염시킬 때 첫 번째 바이러스보다 더 효율적일 수 있지만, 상대 선호도가 유사(동일)하면 두 번째 바이러스는 여전히 첫 번째 바이러스와 유사(또는 동일)한 주성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 비리온의 주성은 자연적으로 발생하는 비리온에 비해 변경되지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 비리온의 주성은 자연적으로 발생하는 비리온에 비해 확대된다 (즉, 넓어진다). 일부 실시형태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 비리온의 주성은 자연적으로 발생하는 비리온에 비해 감소된다.
"복제 가능(replication-competent)" 바이러스 (예를 들어, 복제 가능 AAV)는 감염성이고 감염 세포에서 (즉, 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 바이러스 기능의 존재 하에) 복제될 수 있는 표현형적으로 야생형인 바이러스를 지칭한다. AAV의 경우, 복제 가능성은 일반적으로 기능적 AAV 패키징 유전자의 존재를 필요로 한다. 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 패키징 유전자가 없기 때문에 포유동물 세포(특히 인간 세포)에서 복제 불가능하다. 전형적으로, 이 같은 rAAV 벡터에는 AAV 패키징 유전자와 유입되는 rAAV 벡터 사이의 재조합에 의해 복제 가능 AAV가 생성될 가능성을 최소화하기 위해 임의의 AAV 패키징 유전자 서열이 결여되어 있다. 다수의 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 rAAV 벡터 제제는 복제 가능 AAV (rcAAV; RCA로도 지칭됨)를 거의 함유하지 않는 제제(예를 들어, 102개의 rAAV 입자 당 약 1개 미만의 rcAAV, 104개의 rAAV 입자 당 약 1개 미만의 rcAAV, 10개의 rAAV 입자 당 약 1개 미만의 rcAAV, 1012개의 rAAV 입자 당 약 1개 미만의 rcAAV 또는 rcAAV 없음)이다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이의 유사체를 비롯하여 임의의 길이를 갖는 중합체 형태의 뉴클레오티드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 비뉴클레오티드 성분에 의해 중단되어 있을 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 이전 또는 이후에 이루어질 수 있다. 본원에 사용된 용어 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 및 단일 가닥 분자를 지칭하며, 이들은 상호 교환 가능하다. 달리 특정되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본원의 임의의 실시형태는 이중 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되거나 예측되는 2개의 상보적인 단일 가닥 형태의 각각을 둘 모두 포함한다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 다른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 일정 비율의 "서열 동일성"을 가지며, 이는 정렬 시에 2 개의 서열을 비교할 때의 염기 또는 아미노산의 비율이 동일하다는 것을 의미한다. 서열 유사성은 다수의 상이한 방식으로 결정될 수 있다. 서열 동일성을 결정하기 위해, BLAST를 포함한 방법 및 컴퓨터 프로그램을 사용하여 서열을 배열할 수 있으며, 이는 월드와이드웹 (ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에서 구입 가능하다. 또 다른 배열 알고리즘은 옥스포드 몰레큘러 그룹 인코포레이티드(Oxford Molecular Group, Inc)의 자회사인 미국 위스콘신 주 매디슨 소재의 유전학 컴퓨팅 그룹(Genetics Computing Group; GCG) 패키지에서 이용 가능한 FASTA이다. 배열를 위한 기타 기법은 문헌[Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace ＆ Co., San Diego, California, USA]에 개시되어 있다. 특히 흥미로운 것은 서열에서 갭을 허용하는 배열 프로그램이다. 스미스-워터먼(Smith-Waterman)은 서열 배열에서 갭을 허용하는 알고리즘의 한 유형이다. 문헌[Meth. Mol. Biol. 70 : 173-187 (1997)]을 참고한다. 또한 니들맨(Needleman) 및 분쉬(Wunsch) 배열 방법을 사용하는 GAP 프로그램을 이용하여 서열을 배열할 수 있다. 문헌[J. Mol. Biol. 48: 443- 453 (1970)]을 참고한다.
용어 "유전자"는 세포에서 일부 종류의 기능을 수행하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들어, 유전자는 유전자 산물을 코딩할 수 있는 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있다. 유전자 산물의 한 예는 유전자로부터 전사되고 번역되는 단백질이다. 유전자 산물의 다른 예로는 RNA, 예를 들어 기능성 RNA 산물, 예를 들어 앱타머(aptamer), 간섭 RNA, 리보솜 RNA (rRNA), 전달 RNA (tRNA), 비-코팅 RNA (ncRNA), 뉴클레아제용 가이드 RNA(전사는 되지만 번역되지는 않음) 등이 있다.
용어 "유전자 발현 산물" 또는 "유전자 산물"은 상기에서 정의된 바와 같은 특정 유전자의 발현으로부터 얻어진 분자이다. 유전자 발현 산물은, 예를 들어 폴리펩티드, 앱타머, 간섭 RNA, 메신저 RNA (mRNA), rRNA, tRNA, 비-코딩 RNA (ncRNA) 등을 포함한다.
용어 "siRNA 작용제"( "소형 간섭" 또는 "짧은 간섭 RNA"(또는 siRNA))는 관심 있는 유전자 ("표적 유전자")로 표적화하는 뉴클레오티드의 RNA 이중 가닥이다. "RNA 이중체"는 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 영역을 형성하는 RNA 분자의 2개의 영역 사이의 상보적인 쌍형성으로 형성된 구조를 지칭한다. siRNA는 siRNA의 이중체 부분의 뉴클레오티드 서열이 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적이라는 점에서 유전자에 "표적화"된다. 일부 실시형태에서, siRNA의 이중체는 30개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 이중체는 29개, 28개, 27개, 26개, 25개, 24개, 23개, 22개, 21개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개 또는 10개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 이중체는 19개 내지 25개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, siRNA는 매개 유전자 표적화는 동물 세포의 내생성 RNA 간섭 (RNAi) 경로를 활성화하기 위해 이용하는 유전자 사일런싱 기법(gene-silencing technique)인 RNA 간섭을 사용하여 수행된다. 이 같은 DNA 구조체는 자기- 상보적인 이중 가닥 RNA, 전형적으로는 짧은 헤어핀 RNA(short-hairpin RNA)(shRNA)를 발현하기 위해 설계된 것이며, 이는 일단 가공되면 표적 유전자(들)의 사일런싱을 초래한다. 내생성 mRNA 또는 바이러스 RNA를 포함하는 임의의 RNA는 목적하는 표적에 상보적인 이중 가닥 RNA를 발현하는 구조체를 설계함으로써 사일런싱될 수 있다. 이와 같이, siRNA 작용제의 RNA 이중체 부분은 shRNA로서 지칭되는 짧은 헤어핀 구조의 일부일 수 있다. 이중체 부분 이외에도, 헤어핀 구조는 이중체를 형성하는 2개의 서열 사이에 위치한 루프 부분을 함유할 수 있다. 루프는 길이가 다를 수 있다. 일부 실시형태에서, 루프는 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 13개의 뉴클레오티드 길이이다. 상기 헤어핀 구조는 또한 3' 또는 5' 돌출 부분을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌출부는 0개, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 3' 또는 5' 돌출부이다. 일반적으로, 표적 유전자의 발현 산물 (예를 들어, mRNA, 폴리펩티드 등)의 수준은 5' 비번역 (UT) 영역, ORF 또는 3' UT 영역을 포함하는 표적 유전자 전사체의 적어도 19개 내지 25개의 뉴클레오티드 길이의 분절 (예를 들어, 20개 내지 21개의 뉴클레오티드 서열)에 대해 상보적인 특정 이중 가닥 뉴클레오티드 서열을 함유하는 siRNA 작용제 (예를 들어, siRNA, shRNA 등)에 의해 감소된다. 일부 실시형태에서, 짧은 간섭 RNA는 약 19개 내지 25개의뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어, siRNA 기술에 대한 설명에 대해서는 PCT 출원 제 WOO/44895 호, 제 WO 99/32619 호, 제 WO 01/75164 호, 제 WO 01/92513 호, 제 WO 01/29058 호, 제 WO 01/89304 호, 제 WO 02/16620 호 및 제 WO 02/29858 호; 및 미국 특허 공개공보 제 20040023390 호를 참고한다. siRNA 및/또는 shRNA는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있고, 핵산 서열은 또한 프로모터를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 또한 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리아데닐화 신호는 최소 합성 폴리아데닐화 신호이다.
용어 "안티센스 RNA"는 유전자 발현 산물에 대해 상보적인 RNA를 포함한다. 예를 들어, 특정 mRNA에 표적화되는 안티센스 RNA는 mRNA에 대해 상보적인 RNA 기반 작용제(또는 변형된 RNA 일 수 있음)이며, 여기서 mRNA에 대한 안티센스 RNA의 혼성화는 (예를 들어, RNA의 안정성의 변경, RNA의 번역의 변경 등을 통해) mRNA의 발현을 변경시킨다. 또한 "안티센스 RNA"에는 안티센스 RNA를 코딩하는 핵산이 포함된다.
"CRISPR/Cas9 작용제"과 관련하여 용어 "CRISPR"은 CRISPR RNA(crRNA)를 사용하여 박테리아와 고세균(archaea)에 바이러스 및 플라스미드에 대한 적응성 면역력을 제공하도록 진화한 군집형의 일정하게 분포하는 짧은 회문구조 반복 서열(clustered regularly interspaced short palindromic repeats; CRISPR) 연관 (Cas) ) 시스템을 포함한다. Cas9 단백질 (또는 이의 기능적 등가물 및/또는 변이체, 즉 Cas9-유사 단백질)은 당연히 crRNA 및 tracrRNA (가이드 RNA로도 지칭됨)로 지칭되는 2 개의 자연적으로 발생하거나 합성인 RNA 분자와 단백질의 결합에 의존하는 DNA 엔도뉴클레아제 활성을 포함한다. 일부 경우, 2개의 분자가 공유 결합되어 단일 분자를 형성한다 (단일 가이드 RNA ( "sgRNA")로도 지칭됨). 따라서, Cas9 또는 Cas9-유사 단백질은 DNA-표적화 RNA (이의 용어는 2분자 가이드 RNA 구성 및 단일 분자 가이드 RNA 구성 둘 모두를 포함함)와 결합하며, 이는 Cas9 또는 Cas9-유사 단백질을 활성화시키고, 상기 단백질을 표적 핵산 서열로 유도한다.
Cas9 또는 Cas9-유사 단백질이 이의 천연 효소 기능을 유지하면, 이는 표적 DNA를 개열하여 이중 가닥 절단부를 생성하고, 이는 게놈 변경 (즉, 편집: 결실, 삽입 (공여체 폴리 누클레오티드가 존재하는 경우))을 야기할 수 있으며, 그 결과 유전자 발현을 변경할 수 있다. Cas9의 일부 변이체 (이의 변이체는 Cas9-유사라는 용어에 의해 확장됨)는 DNA 개열 활성이 감소하도록 변경되었다 (일부 경우에 이들은 표적 DNA의 두 가닥 대신 단일 가닥을 개열하는 반면, 다른 경우에는 DNA 개열 활성이 없을 때까지 심각하게 감소하였다). DNA 개열 활성이 감소된 Cas9-유사 단백질 (심지어 DNA 개열 활성이 없음)은 여전히 RNA 중합효소 활성을 차단하기 위해 표적 DNA로 유도될 수 있다. 대안적으로, Cas9 또는 Cas9-유사 단백질은 VP64 전사 활성화 도메인을 Cas9 단백질에 융합시키고 테트라루프(tetraloop) 및 스텝-루프(stem-loop)에서 융합 단백질을 MS2-P65-HSF1 헬퍼 단백질 및 단일 가이드 RNA(MS2 RNA 앱타머를 포함함)와 함께 동시 전달하여 전사를 활성화시키는 세포에서 협주적 활성화 매개인자(synergistic activation mediator; Cas9-SAM) 복합체를 형성함으로써 변형될 수 있다. 따라서 효소적 불활성 Cas9-유사 단백질은 표적 DNA의 전사를 차단하거나 활성화하기 위해 DNA-표적화 RNA에 의해 표적 DNA의 특정 위치에 표적화될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "CRISPR/Cas9 작용제"는 상기에서 개시된 바와 같거나 당업계에 공지된 모든 형태의 CRISPR/Cas9를 포함한다.
CRISPR 작용제에 대한 자세한 정보는, 예를 들어 (a) 문헌[Jinek et. al., Science. 2012 Aug 17; 337 (6096) : 816-21 : "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity"]; (b) 문헌[Qi et al., Cell. 2013 Feb 28; 152(5): 1173-83: "Repurposing CRISPR as an RNA- guided platform for sequence- specific control of gene expression"], 및 (c) 미국 특허 출원 제13/842,859 호 및 PCT 출원 번호 제 PCT/US13 / 32589 호에서 찾아볼 수 있으며, 이들 전문은 전체가 본원에 참고로 포함된다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "CRISPR 작용제"는 Cas9-기반 시스템 (예를 들어, Cas9 또는 Cas9-유사 단백질; DNA-표적화 RNA, 예를 들어 crRNA-유사 RNA, tracrRNA-유사 RNA, 단일 가이드 RNA 등의 임의의 성분; 공여체 폴리뉴클레오티드 등) 에서 사용될 수 있는 자연적으로 발생하고/하거나 합성인 서열을 포함하는 임의의 작용제(또는 이 같은 작용제를 코딩하는 핵산) 를 포함한다.
"아연-핑거 뉴클레아제"(ZFN)는 징크 핑거 DNA 결합 도메인을 DNA 개열 도메인에 융합시킴으로써 생성되는 인공 DNA 엔도뉴클레아제를 의미한다. ZFN은 목적하는 DNA 서열을 표적화하도록 가공될 수 있으며, 이는 아연-핑거 뉴클레아제가 독특한 표적 서열을 개열할 수 있도록 한다. 세포에 도입되면 ZFN은 이중 가닥 절단을 유도함으로써 세포 (예를 들어, 세포 게놈) 내의 표적 DNA를 편집(editing)하는 데 사용될 수 있다. ZFN 사용에 대한 추가의 정보를 얻기 위해, 예를 들어 문헌[Asuri et al., Mol Ther. 2012 Feb; 20(2): 329-38]; 문헌[Bibikova et al. Science. 2003 May 2; 300(5620): 764]; 문헌[Wood et al. Science. 2011 Jul 15; 333(6040): 307]; 문헌[Ochiai et al. Genes Cells. 2010 Aug; 15(8): 875-85]; 문헌[Takasu et. al., Insect Biochem Mol Biol. 2010 Oct; 40(10): 759-65]; 문헌[Ekker et al, Zebrafish 2008 Summer; 5(2): 121-3]; 문헌[Young et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 26; 108(17): 7052-7]; 문헌[Goldberg et al, Cell. 2010 Mar 5; 140(5): 678-91]; 문헌[Geurts et al, Science. 2009 Jul 24; 325(5939): 433]; 문헌[Flisikowska et al, PLoS One. 2011; 6(6): e21045. doi: 10.1371/journal.pone.0021045. Epub 2011 Jun 13]; 문헌[Hauschild et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jul 19; 108(29): 12013-7]; 및 문헌[Yu et al, Cell Res. 2011 Nov;21(l 1): 1638-40]을 참고하며; 이의 전문은 ZFN에 관한 이들의 교시를 위해 본원에서 참고로 포함된다. 용어 "ZFN 작용제"는 징크 핑커 뉴클레아제 및/또는 징크 핑거 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제" 또는 "TALEN" 작용제는 TAL (전사 활성화제-유사) 이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 개열 도메인에 융합시킴으로써 생성되는 인공 DNA 엔도뉴클레아제인 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)를 지칭한다. TALEN은 임의의 목적하는 DNA 서열에 실질적으로 결합하도록 신속하게 가공될 수 있으며, 세포에 도입되는 경우 TALEN은 이중 가닥 개열을 유도하함으로써 세포 (예를 들어, 세포 게놈)의 표적 DNA를 편집하기 위해 사용될 수 있다. TALEN 사용에 대한 추가의 정보를 얻기 위해, 예를 들어 문헌[Hockemeyer et al. Nat Biotechnol. 2011 Jul 7; 29(8): 731-4]; 문헌[Wood et al. Science. 2011 Jul 15; 333(6040): 307]; 문헌[Tesson et al. Nat Biotechnol. 2011 Aug 5; 29(8): 695-6]; 및 문헌[Huang et. al., Nat Biotechnol. 2011 Aug 5; 29(8): 699-700]을 참고하며; 이의 전문은 TALEN과 관련하여 그들의 교시를 위해 본원에서 참고로 포함된다. 용어 "TALEN 작용제"는 TALEN 및/또는 TALEN을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
용어 "제어 요소" 또는 "제어 서열"은 폴리뉴클레오티드의 복제, 복사, 전사, 스플라이싱(splicing), 번역 또는 분해를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 기능 조절에 기여하는 분자의 상호 작용에 관련된 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 상기 조설은 과정의 빈도, 속도 또는 특이성에 영향을 미칠 수 있으며, 특성상 강화되거나 억제 될 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 제어 요소는, 예를 들어 프로모터 및 인핸서(enhancer)와 같은 전사 조절 서열을 포함한다. 프로모터는 RNA 중합효소에 결합하고 일반적으로 프로모터로부터 하류(3' 방향)에 위치하는 코딩 영역의 전사를 개시하는 특정 조건 하에서 가능한 DNA 영역이다. 프로모터는 편재적으로 작동할 수 있으며, 예를 들어 CAG 또는 CMV 프로모터와 같이 많은 세포 유형에서 활성이거나; rho 프로모터(로드형에서 활성임) 또는 옵신 프로모터(원추형에서 활성임)과 같이 조직 또는 세포 특이적이다.
용어 "작동 가능하게 연결된" 또는 "작동성으로 연결된"은 유전 요소가 병치된 것을 지칭하며, 이때 상기 요소는 이들이 예상되는 방식으로 작동할 수 있도록 하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사를 개시하는 것을 돕는 경우, 프로모터는 코딩 영역에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한, 프로모터와 코딩 영역 사이에는 개재 잔기가 존재할 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역을 포함하는 벡터를 포함하고, 의도된 표적 세포에서 단백질의 발현을 수행하는데 사용된다. 발현 벡터는 또한 표적에서 단백질의 발현을 촉진하기 위해 코딩 영역에 작동 가능하게 연결된 제어 요소를 포함할 수 있다. 제어 요소와 이들이 발현을 위해 작동 가능하게 연결된 유전자(들)의 조합은 때때로 "발현 카세트(expression cassette)"로서 지칭되며, 이들 중 다수는 당업계에 공지되어 있고 이용 가능하거나, 당업계에서 이용 가능한 성분으로부터 용이하게 구성될 수 있다.
용어 "이종성"은 그것이 비교되는 나머지 독립체(entity)와 유전체적으로 별개인 독립체로부터 유래한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 유전 공학 기술에 의해 다른 종에서 유래한 플라스미드 또는 벡터에 도입된 폴리뉴클레오티드는 이종성 폴리뉴클레오티드이다. 천연의 코딩 서열로부터 제거되고 그것이 자연적으로 발견되지 않는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 이종성 프로모터이다. 따라서, 예를 들어 이종성 유전자 산물을 코딩하는 이종성 핵산 서열을 포함하는 rAAV는 자연적으로 발생적하는 야생형 AAV에 정상적으로 포함되지 않는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV이고, 코딩된 이종성 유전자 산물은 정상적으로는 자연적으로 발생하는 야생형 AAV에 의해 정상적으로 코딩되지 않은 유전자 산물이다.
용어 "유전적 변경" 및 "유전적 변형"(및 문법 상 이의 변이체)은 유전 요소 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드)가 유사 분열 또는 감수 분열이 아닌 방식으로 세포 내로 도입되는 과정을 지칭하기 위해 상호 교환 가능하게 사용된다. 상기 요소는 세포에 대해 이종성일 수도 있고, 이는 세포에 이미 존재하는 요소의 추가 사본 또는 개선된 버전일 수도 있다. 유전적 변경은, 예를 들어 전기 천공(electroporation), 인산칼슘 침전 또는 폴리뉴클레오티드-리포솜 복합체와의 접촉과 같은 당업계에 공지된 임의의 과정을 통해 세포를 재조합 플라스미드 또는 기타 폴리뉴클레오티드로 형질 감염시킴으로써 수행될 수 있다. 또한 유전적 변경은, 예를 들어 DNA 또는 RNA 바이러스 또는 바이러스 벡터에 의한 형질 도입 또는 감염에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로, 유전적 요소는 세포 내의 염색체 또는 미니-염색체에 도입되지만; 세포 및 이의 자손의 표현형 및/또는 유전자형을 변경시키는 임의의 변경도 이러한 용어에 포함된다.
세포 변형과 관련하여 외생성 DNA (예를 들어, 재조합 바이러스를 통해)에 의해 "유전적 변형" 또는 "형질 전환" 또는 "형질 감염" 또는 "형질 도입"이라는 용어는 이 같은 DNA가 세포 내로 도입되는 경우를 지칭한다. 외생성 DNA가 존재하면 영구적 또는 일시적인 유전적 변화가 일어난다. 형질 전환 DNA는 세포의 게놈 내에 통합(공유 결합)될 수 있거나 통합(공유 결합)되지 않을 수 있다. "클론(clone)"은 유사 분열에 의한 단일 세포 또는 공통 조상으로부터 유래하는 세포 집단이다. "세포주"는 여러 세대 동안 시험관 내에서 안정적으로 성장할 수 있는 일차 세포의 클론이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 서열일 시험관 내에서 장기간 세포 배양 도중에 및/또는 생체 내에서 장기간 동안 이의 기능을 수행할 수 있다면, 세포는 유전자 서열에 의해 "안정적으로"변경, 형질 도입, 유전적 변형 또는 형질 전환되는 것으로 간주된다. 일반적으로, 이 같은 세포는 유전적 변형이 도입되어 변경된 세포의 자손으로 유전될 수도 있다는 점에서 "유전적으로" 변경(유전적으로 변형)된다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 상호 교환 가능하게 사용된다. 또한 상기 용어는, 예를 들어 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 인산화, 또는 표지화 성분과의 접합과 같이 변형되어 있는 아미노산 중합체를 포함한다. 포유동물 대상에게 유전자 산물을 전달하는 것과 관련하여 논의되는 경우, 항-혈관 신생 폴리펩티드, 신경 보호 폴리펩티드 등과 같은 폴리펩티드 및 이에 대한 조성물은 개개의 온전한 폴리펩티드 또는 이의 임의의 단편 또는 유전적으로 조작된 유도체을 지칭하며, 이때 이들은 온전한 단백질의 목적하는 생화학적 기능을 유지한다. 유사하게, 항-혈관 신생 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 신경 보호 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 포유류 대상에 대한 유전자 산물의 전달에 사용하기 위한 기타 이 같은 핵산(수용체 세포에 전달될 "이식 유전자"로도 지칭될 수 있음)에 대한 이용은 온전한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 목적하는 생화학적 기능을 보유하는 임의의 단편 또는 유전적으로 조작된 유도체에 대한 인용을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단리된" 플라스미드, 핵산, 벡터, 바이러스, 비리온, 숙주 세포, 단백질 또는 다른 물질은 물질 또는 유사한 물질이 자연적으로 발생하거나 초기에 제조되는 곳에 또한 존재할 수 있는 적어도 일부의 기타 성분이 없는 물질의 제제를 지칭한다. 따라서, 예를 들어 단된 물질은 정제 기술을 사용하여 원료 혼합물로부터 농축시킴으로써 제조될 수 있다. 농축은 용액의 부피 당 중량과 같은 절대 기준으로 측정될 수 있거나, 원료 혼합물에 존재하는 제2의 잠재적 간섭 물질과 관련하여 측정될 수 있다. 본 개시내용에서 실시형태의 농축의 증가는 점점 더 단리되게 된다. 단리된 플라스미드, 핵산, 벡터, 바이러스, 숙주 세포 또는 다른 물질은 일부 실시형태에서, 예를 들어 약 80 % 내지 약 90 % 순도, 적어도 약 90 % 순도, 적어도 약 95 % 순도, 최소 약 98 % 순도, 또는 적어도 약 99 % 이상의 순도로 정제된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하기" 등은 목적하는 약리학적 및/또는 생리 학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 상기 효과는 질병 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 관점에서 예방적일 수 있고/있거나 질병 및/또는 질병에 기인하는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치료의 관점에서는 치료적일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "치료"는 포유동물, 특히 사람에서의 질병의 임의의 치료를 포함하며, (a) 질병에 걸리기 쉽거나, 질병에 걸릴 위험이 있지만 아직 질병에 걸린 것으로 진단받은 적이 없는 대상에서 질병 (및/또는 질병에 의해 유발된 증상)이 발생하지 않도록 예방하는 단계; (b) 질병(및/또는 질병에 의해 유발된 증상)을 억제하는 단계, 즉 이의 발달을 중지시키는 단계; (c) 질병 (및/또는 질병에 의해 유발된 증상)을 완화시키는 단계, 즉 질병 (및/또는 질병에 의해 유발된 증상)의 퇴행을 야기하는 단계, 즉 질병 및/또는 질병의 하나 이상의 증상을 완화시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 대상 조성물 및 방법은 망막 질환의 치료에 관한 것일 수 있다. 망막 질환 및 이의 치료를 평가하기 위한 비제한적인 방법은 망막 기능 및 이의 변화, 즉 시력의 변화 (예를 들어, 최대 교정 시력(BCVA), 보행, 항법, 대상물 탐지 및 차별), 시야의 변화 (예를 들어, 정적 및 운동 시야 측정), 임상적 검사 (예를 들어, 눈의 전 안부 및 후부의 슬릿 램프 검사), 모든 파장의 명암에 대한 전기 생리학적 반응성 (예를 들어, 모든 형태의 전자 망막 조영제 (전 분야, 다초점 및 패턴), 모든 형태의 시각 유발 전위 (VEP), 안전도 기록 (electrooculography, EOG), 색각 (color vision), 암순응 (dark adaptation) 및/또는 대비 감도 (contrast sensitivity))를 측정하는 단계를 포함한다. 분석 및/또는 사진 척도, 예를 들어 광학 단층 촬열 (OCT), 안저 촬영, 적응성 광학 스캐닝 레이저 검안경측정, 형광 및/또는 자가형광을 이용하여 해부 또는 건강 상 변화를 측정하는 단계; 시각 운동성 및 눈 움직임(예를 들어, 안진증(nystagmus), 주시 선호(fixation preference) 및 안정성)을 측정하는 단계; 및 보고 결과(시각 유도 및 비시각적 유도 거동 및 활성에서의 환자-보고 변화, 환자-보고 결과 [PRO], 삶의 질, 1일 활동 및 신경 기능의 척도에 대한 설문지 기반 평가(예를 들어, 기능성 자기 공명 영상 (MRI))를 평가하는 단계를 포함한다.
용어 "개인", "숙주", "대상" 및 "환자"는 본원에서 본질적으로 상호 교환 가능하게 사용되며, 인간을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 포유류; 유인원을 포함한 비인간 영장류; 스포츠 포유동물 (예를 들어, 말); 농장 포유동물 (예를 들어, 양, 염소 등); 포유류 애완 동물 (개, 고양이 등); 설치류 (예를 들어, 생쥐, 쥐 등)을 지칭한다.
일부 실시형태에서, 개체는 이전에 자연적으로 AAV에 노출되었으며, 그 결과 항-AAV 항체 (즉, AAV 중화 항체)를 함유하게 된 인간이다. 일부 실시형태에서, 개체는 이전에 AAV 벡터가 투여었던 (그 결과, 항-AAV 항체를 함유할 수 있는) 사람이고, 다른 병태의 치료 또는 동일한 병태의 추가적인 치료를 위해 벡터의 재투여가 필구된다. 예를 들어, 간, 근육 및 망막 (이러한 비히클에 대한 중화 항체에 의해 영향을 받는 모든 조직)에 대한 AAV 유전자의 전달을 포함하는 임상 시험에서의 양설 결과에 기초하여, 다수의 이 같은 치료 응용/질병 표적이 존재한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 유익하거나 목적하는 임상 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 투여분으로 투여될 수 있다. 본 개시내용의 목적 상, 화합물 (예를 들어, 감염성 rAAV 비리온)의 유효량은 특정 질병 상태(예를 들어, 망막 질환) (및/또는 이와 연관된 증상)의 완화, 개선, 안정화, 반전, 예방, 감속 또는 진행을 지연시키기에 충분한 양이다. 따라서, 감염성 rAAV 비리온의 유효량은 개체의 표적 세포 (또는 표적 세포들)에 이종성 핵산을 효과적으로 전달할 수있는 감염성 rAAV 비리온의 양이다. 유효량은, 예를 들어 RT-PCR, 웨스턴 블 랏팅 (Western blotting), ELISA, 형광 또는 다른 리포터 판독 등과 같은 당업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 이종성 핵산 서열에 의해 코딩되는 유전자 산물 (RNA, 단백질)을 세포 또는 조직에서 검출함으로써 전임상으로 결정될 수 있다. 유효량은, 예를 들어 본원에 개시되고 당업계에 공지된 바와 같이, 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 안저 자기형광, 형광 안저 혈관 조영술, OCT, 미세 시야측정술(microperimetry), 적응성 광학 등을 사용하여 질병의 발병 또는 진행의 변화를 검출함으로써 임상적으로 결정될 수 있다.
용어 "망막 세포"는 본원에서 망막 신경절 (RG) 세포, 무축삭 세포, 수평 세포, 양극 세포, 광 수용체 세포, 뮐러 교질 세포, 소교 세포 및 망막 색소 상피세포 (retinal pigmented epithelium; RPE)와 같은 망막을 포함하는 임의의 세포 유형을 지칭한다. 용어 "광 수용체 세포"는 본원에서 로드형 세포 또는 "로드형" 및 원추형 세포 또는 "원추형"을 지칭하지만, 이에 제한되지 않는다. 용어 "뮐러 세포" 또는 "뮐러 교질세포"는 척추 망막에서 뉴런을 지지하는 교질 세포를 지칭한다.
용어 "유도 진화"는 반복적인 유전적 다양화 및 선택 과정을 통해 자연적 진화를 모방하여 생체 분자의 기능을 점진적으로 개선시키는 유익한 돌연변이를 축적하는 시험관 내 및/또는 생체 내 캡시드 공학 방법을 지칭한다. 유도 진화는 종종 변이체가 관심 있는 세포 또는 조직 유형의 감염성의 보다 효율적인 수준을 갖는 라이브러리로부터 AAV 변이체의 선별을 위해 "바이오 패닝 (biopanning)"으로도 지칭되는 생체 내 방법을 포함한다.
상세한설명
아데노-관련 바이러스 (AAVs)는 비외피성 캡시드 내에 함유된 4.7 kb 길이의 단일 가닥 DNA 게놈을 갖는 파보바이러스의 부류이다. 자연적으로 발생하는 AAV의 바이러스 게놈은 2개의 역위 말단 반복서열 (ITR)(바이러스 복제 원점(origin of replication) 및 패키징 신호(packaging signal)로 작용을 함)을 가지며, 이는 2 개의 오픈 리딩 프레임 (ORF), 즉 rep (바이러스 복제, 전사 조절, 부위-특이적 통합 및 비리온 조립에 작용하는 단백질을 코딩함) 및 cap에 인접해 있다. cap ORF는 3 개의 구조 단백질을 코딩하고, 이들 단백질은 조립되어 60-머(60-mer)의 바이러스 캡시드를 형성한다. 다수의 자연적으로 발생하는 AAV 변이체 및 혈청형이 분리되었으며, 어떠한 것도 인간 질병과 연관되어 있지 않았다.
AAV의 재조합 버전(recombinant version)은 rep 및 cap 대신에 ITRs 사이에 관심있는 마커 또는 치료용 유전자가 삽입되는 유전자 전달 벡터로 사용될 수 있다. 이들 벡터는 시험관 내 및 생체 내 분열 및 비-분할 세포 모두를 전달하는 것으로 나타났으며, 사후 유사 분열 조직에서 수년간 안정한 형질 전환 유전자의 발현을 초래할 수 있다. 예를 들어 , 문헌[Knipe DM, Howley PM. Fields’ Virology. Lippincott Williams ＆ Wilkins, Philadelphia, PA, USA, 2007; Gao G-P, Alvira MR, Wang L, Calcedo R, Johnston J, Wilson JM]을 참고한다. 인간 유전자 치료를 위한 벡터로서 붉은털 원숭이에서 유래된 새로운 아데노-관련 바이러스. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99 : 11854-9, Atchison RW, Casto BC, Hammon WM. 아데노바이러스 관련 결함 바이러스 입자. Science 1965; 149: 754-6; Hoggan MD, Blacklow NR, Rowe WP. 다양한 아데노바이러스 조제에서 발견되는 작은 DNA 바이러스 연구 : 물리적, 생물학적 및 면역학적 특성. Proc Natl Acad Sci USA 1966; 55 : 1467-74; Blacklow NR, Hoggan MD, Rowe WP. 사람으로부터 아데노바이러스-관련 바이러스의 분리. Proc Natl Acad Sci USA 1967; 58 : 1410-5; Bantel-Schaal U, zur Hausen H. 생식기 부위로부터 분리된 결함있는 사람 파보바이러스의 DNA 특성 분석. Virology 1984; 134 : 52-63; Mayor HD, Melnick JL. 작은 데옥시리보핵산 함유 바이러스 (피코나 바이러스 그룹). Nature 1966; 210 : 331-2; Mori S, Wang L, Takeuchi T, Kanda T. 게잡이 원숭이에서 두 개의 새로운 아데노-관련 바이러스 : 캡시드 단백질의 슈도타입 특성. Virology 2004; 330 : 375-83; Flotte TR. 유전자 치료 과정 및 전망 : 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV) 벡터. Gene Ther 2004; 11 : 805-10.
재조합 AAV (본 명세서에서 간단히 "AAV"로 언급 됨)는 증가하는 임상 시험에서 유망한 결과를 가져왔다. 그러나, 항-캡시드 면역 반응, 특정 조직의 낮은 형질 도입, 특정 세포 유형에 표적화 전달에 대한 무능력 및 상대적으로 낮은 운반 능력과 같은 AAV의 유용성을 제한할 수 있는 유전자 전달에 장애가 있다. 많은 경우 AAV를 향상시키는 능력을 가진 합리적인 설계에 효과적으로 힘을 실어 줄 수있는 충분한 기작 지식이 부족하다. 대안으로, 유도 진화는 특정 생물의학적 요구를 충족시키는 새로운 AAV 변이체를 만드는 전략으로 부상했다. 유도 진화 전략은 생체 분자의 기능을 점진적으로 향상시키는 유익한 돌연변이의 축적을 가능하게 하는 유전적 다양화 및 선택 과정을 활용한다. 이 과정에서 야생형 AAV cap 유전자는 바이러스 입자의 라이브러리를 생성하기 위해 패키징되는 대형 유전자 라이브러리를 만들기 위한 여러 접근법에 의해 다양화되고, 선택적인 압력이 유전자 전달 장벽을 극복할 수있는 새로운 변이체를 분리하기 위해 적용된다. 중요하게, 유전자 전달 문제의 기초가 되는 기작 근거는 기능의 유도 진화에 대해 알려질 필요가 없으므로 향상된 벡터의 개발을 가속화할 수 있다.
전형적으로, 본원에 개시된 변이체는 AAV 라이브러리 및/또는 라이브러리들의 사용을 통해 생성되었다. AAV 캡시드의 구조 단백질을 암호화하는 유전자인 cap 유전자를 바이러스 게놈 공학 분야에서 숙련된 기술자에 알려지고 쉽게 이용 가능한 일련의 유도 진화 기술에 의해 돌연변이시킴으로써 이러한 AAV 라이브러리가 생성된다. 예를 들어 Bartel et al. Am. Soc. Gene Cell Ther. 15th Annu. Meet. 20, S140 (2012); Bowles, D. et al. J. Virol. 77, 423-432 (2003); Gray et al. Mol. Ther. 18, 570-578 (2010); Grimm, D. et al. J. Virol. 82, 5887-5911; Koerber, J. T. et al. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008); Li W. et al. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008); Koerber, J. T. et al. Methods Mol. Biol. 434, 161-170 (2008); Koerber, J. T. et al. Hum. Gene Ther. 18, 367-378 (2007); and Koerber, J. T. et al. Mol. Ther. 17, 2088-2095 (2009) 참고. 이 같은 기술은, 제한되지 않지만, 다음과 같다 : i) 실수유발 PCR으로 미리 정해진 수정 가능한 속도로 무작위 포인트 돌연변이를 AAV cap 오픈 리딩 프레임 (ORF)에 도입한다. ii) 다중 AAV 혈청형으로 유전자 라이브러리를 생성하기 위해 AAV cap 유전자의 무작위 키메라를 생성하는 시험관내 또는 생체 내 바이러스 재조합 또는 "DNA 셔플링"; iii) cap ORF 내의 퇴화된 올리고뉴클레오티드의 연결에 의한 캡시드의 한정된 부위에서의 무작위 펩티드 삽입; iv) 트랜스포존 돌연변이 유발을 이용한 AAV cap ORF의 임의의 위치로의 펩티드-코딩 서열의 한정된 삽입; v) "루프 스왑 (loop-swap)"라이브러리를 생성하기 위해 천연 AAV 혈청형 및 변이체 중 각 아미노산 위치의 보존 수준에 기초하여 생체 정보로 설계된 펩티드 서열의 라이브러리로 AAV 캡시드의 표면 루프를 대체; vi) 조상 변이체의 라이브러리를 생성하기 위해 AAV 혈청형 사이의 퇴행성 위치에서 무작위 아미노산 치환 (Santiago-Ortiz et al., 2015); 및 이러한 기술들의 조합을 포함한다.
DNA 셔플링은 키메라를 생성하고, 이 키메라는 부모의 속성을 독특하고 종종 유익한 방식으로 결합한다; 그러나 일부는 패키징할 수 없으므로 사실상 라이브러리의 다양성을 감소시킬 수 있다. 라이브러리의 다양성 정도는 제한되지 않지만 상기 iii-iv)와 같은 펩티드 삽입 기술을 통해 달성된다. 라이브러리의 다양성은 상기 v)와 같은 기술에도 집중되어 있으며 이러한 집중은 AAV 캡시드의 표면 노출 루프에 있는 다중 초가변 영역으로 지향된다. 많은 기술들이 캡시드의 작은 면적만이 변이되는 변이체 캡시드를 생성하지만, 이들 기술은 추가의 돌연변이 유발 전략과 쌍을 이루어 완전한 캡시드를 변형시킨다.
일단 AAV 라이브러리 또는 라이브러리들이 생성되면, 각 AAV 입자는 캡시드를 코딩하는 cap 유전자를 둘러싸는 돌연변이 캡시드로 구성되도록 패키징되고 정제된다. 라이브러리의 변이체는 AAV 분야에서 숙련된 당업자에 의해 공지되어 쉽게 활용할 수 있는 시험관 내 및/또는 생체 내 선택압 기술에 적용된다. 예를 들어, Maheshri, N. et al. Nature Biotech. 24, 198-204 (2006); Dalkara, D. et al. Sci. Transl. Med. 5, 189ra76 (2013); Lisowski, L. et al. Nature. 506, 382-286 (2013); Yang, L. et al. PNAS. 106, 3946-3951 (2009); Gao, G. et al. Mol. Ther. 13, 77-87 (2006); and Bell, P. et al. Hum. Gene. Ther. 22, 985-997 (2011) 참고. 예를 들어, 제한없이, AAV 변이체는 i) 상이한 분획의 용출이 변경된 결합 특성을 갖는 변이체를 생성하는 친화성 컬럼; ii) 1 차 세포 - 증가 된 효율 및 / 또는 조직 특이성을 갖는 AAV 변이체를 생산하는 인체 세포의 행동을 모방하는 조직 표본 또는 불멸 세포주로부터 분리; iii) 표적 조직을 성공적으로 감염시킨 AAV 변이체을 생산하는 임상 유전자 치료 환경을 모방한 동물 모델; iv) 이식된 인간 세포를 감염하는 AAV 변이체를 생산하는 이종 이식 모델; 및/또는 이들의 선택 기술의 조합을 포함할 수 있다.
일단 바이러스가 선택되면, 제한없이 아데노바이러스 - 매개 복제, PCR 증폭, 차세대 시퀀싱 및 클로닝 등과 같은 공지된 기술에 의해 회수될 수 있다. 그런 다음 선택 기법을 반복하여 바이러스 복제를 풍부하게 하고 AAV DNA를 분리하여 관심있는 특정 변이체 cap 유전자를 회수한다. 이 같은 선택된 변이체는 추가 변형 또는 돌연변이를 받아 AAV 바이러스 적합성을 반복적으로 증가시키기위한 추가 선별 단계의 새로운 출발점으로 작용할 수 있다. 그러나 어떤 경우에는 성공적인 돌연변이가 추가 돌연변이 없이 생성되었다.
본원에 개시된 AAV 변이체는 적어도 부분적으로 생체내 유도 진화 방법론, 예를 들어 유리체 내 투여 후 영장류 망막 스크린의 사용을 포함하는 전술한 기술의 사용을 통해 생성되었다. 이와 같이, 본원에 개시된 AAV 변이체 캡시드는 상응하는 모 (parental) AAV 캡시드 단백질보다 영장류 망막 세포의 보다 효율적인 형질 도입을 부여하는 아미노산 서열의 하나 이상의 변형을 포함한다. 본원에 사용된 "상응하는 모 AAV 캡시드 단백질"은 본 발명의 변이체 AAV 캡시드 단백질과 동일한 야생형 또는 변이체 AAV 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 지칭 하나, 본 발명 변이체 AAV 캡시드 단백질의 하나 이상의 아미노산 서열 변형을 포함하지 않는다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 변이체 AAV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질에 비해 AAV 캡시드 단백질 GH 루프 또는 루프 IV에 공유 결합에 의해 삽입된 약 5 개 아미노산 내지 약 20 개 아미노산의 이종성 펩티드를 포함한다. AAV 캡시드 단백질의 "GH 루프" 또는 루프 IV는 당업계에서 AAV 캡시드 단백질의 GH 루프 또는 루프 IV로 언급되는 용매 - 접근 가능한 부분을 의미한다. AAV 캡시드의 GH 루프 / 루프 IV에 대해서는, 예를 들어, van Vliet et al. (2006) Mol. Ther. 14 : 809; Padron et al. (2005) J. 바이롤. 79 : 5047; 및 Shen 등. (2007) Mol. Ther. 15 : 1955 참고. 따라서, 예를 들어 삽입 부위는 AAV VP1 캡시드 단백질의 약 아미노산 411-650 내에 있을 수 있다. 예를 들어, 삽입 부위는 AAV1 VP1의 아미노산 571-612, AAV2 VP1의 아미노산 570-611 내, AAV3A VP1의 아미노산 571-612 내, AAV3B VP1의 아미노산 571-612 내, AAV4 VP1의 아미노산 569-610 내, AAV5 VP1의 아미노산 560-601 내, AAV6 VP1의 아미노산 571 내지 612 내, AAV7 VP1의 아미노산 572 내지 613 내, AAV8 VP1의 아미노산 573 내지 614 내, AAV9 VP1의 571 내지 612 또는 AAV10 VP1의 아미노산 573 내지 614 또는 그의 임의의 변이체의 상응하는 아미노산을 포함한다. 당업자는 다양한 AAV 혈청형의 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 비교에 기초하여, "AAV2의 아미노산에 상응하는" 삽입 부위가 임의의 주어진 AAV 혈청형의 캡시드 단백질에 존재할 것이라는 것을 알 것이다. 야생형 (자연 발생) 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B 및 AAV4-10 사이의 아미노산 위치를 제공하는 야생형 AAV 서열 번호 1-11의 정렬에 대해서는 도 6을 또한 참조한다.
특정 구현 예에서, 삽입 부위는 임의의 야생형 AAV 혈청형 또는 AAV 변이체의 VP1의 아미노산 570-614 사이에 위치한 2 개의 인접한 아미노산 사이의 단일 삽입 부위이며, 예를 들어 삽입 부위는 임의의 AAV 혈청형 또는 변이체의 VP1의 아미노산 570-610, 아미노산 580-600, 아미노산 570-575, 아미노산 575-580, 아미노산 580-585, 아미노산 585-590, 아미노산 590-600 또는 아미노산 600-614에 위치한 2 개의 인접한 아미노산 사이이다. 예를 들어, 삽입 부위는 아미노산 580 및 581, 아미노산 581 및 582, 아미노산 583 및 584, 아미노산 584 및 585, 아미노산 585 및 586, 아미노산 586 및 587, 아미노산 587 및 588 , 아미노산 588 및 589, 또는 아미노산 589 및 590 사이일 수 있다. 삽입 부위는 아미노산 575와 576, 아미노산 576과 577, 아미노산 577과 578, 아미노산 578과 579, 또는 아미노산 579와 580 사이일 수 있다. 삽입 부위는 아미노산 590 및 591, 아미노산 591 및 592, 아미노산 592 및 593, 아미노산 593 및 594, 아미노산 594 및 595, 아미노산 595 및 596, 아미노산 596 및 597, 아미노산 597 및 598, 아미노산 598 및 599, 또는 아미노산 599 및 600 사이일 수 있다. 예를 들어, 삽입 부위는 AAV2의 아미노산 587과 588 사이, AAV1의 아미노산 590과 591 사이, AAV3A의 아미노산 588과 589 사이, AAV3B의 아미노산 588과 589 사이, 아미노산 584와 585 사이 AAV5의 아미노산 575와 576 사이, AAV6의 아미노산 590과 591 사이, AAV7의 아미노산 589와 590 사이, AAV8의 아미노산 590과 591 사이, AAV9의 아미노산 588과 589 사이, 또는 AAV10의 아미노산 588과 589 사이일 수 있다
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 펩티드 삽입은 5 개의 아미노산, 6 개의 아미노산, 7 개의 아미노산, 8 개의 아미노산, 9 개의 아미노산, 10 개의 아미노산, 11 개의 아미노산, 12 개의 아미노산, 13 개의 아미노산, 14 아미노산, 15 개의 아미노산, 16 개의 아미노산, 17 개의 아미노산, 18 개의 아미노산, 19 개의 아미노산 또는 20 개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 본원에 개시된 펩티드 삽입은 본원에 개시된 펩티드 삽입 중 어느 하나의 아미노 말단 (N- 말단) 및 / 또는 카르복실 말단 (C- 말단)에서 1~4 개의 스페이서 아미노산을 포함한다. 예시적인 스페이서 아미노산은 루신 (L), 알라닌 (A), 글리신 (G), 세린 (S), 트레오닌 (T) 및 프롤린 (P)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 펩티드 삽입물은 N- 말단에 2 개의 스페이서 아미노산 및 C- 말단에 2 개의 스페이서 아미노산을 포함한다. 다른 실시양태에서, 펩티드 삽입물은 N- 말단에 2 개의 스페이서 아미노산 및 C- 말단에 1 개의 스페이서 아미노산을 포함한다.
본원에 개시된 펩티드 삽입물은 이전에 기재되지 않았거나 AAV 캡시드에 삽입되지 않았다. 이론에 구속되기를 바라지 않고, 개시된 펩티드 삽입물의 존재는 영장류 망막의 전방에서 세포 외 기질에 대한 결합을 감소시키는 헤파린 황산염에 대한 변이체 캡시드의 친화성을 낮추도록 작용할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 펩티드 삽입 모티프는 세포 표면 수용체 결합 도메인의 첨가를 통한 영장류 망막 세포의 향상된 형질 도입을 부여 할 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, 삽입 펩티드는 하기 화학식의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 삽입 펩티드는 화학식 1a의 7 내지 10 개의 아미노산 길이의 펩티드일 수 있다 :
Y 1 Y 2 X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 X 7 Y 3
여기서 각각의 Y1-Y3은, 존재하는 경우, 독립적으로 Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro로부터 선택되고
X 1 은 Gln, Asn, His, Ile, 및 Ala에서 선택되고
X 2는 Ala, Gln, Asp, Ser, Lys, 및 Pro에서 선택되고
X 3은 Asp, Ile, Thr 및 Asn에서 선택되고
X4 는 Thr, Ser, Tyr, Gln, Glu, 및 Ala에서 선택되고
X5 는 iThr, Lys, 및 Asn에서 선택되고
X6 은 Lys, Asn, 및 Glu에서 선택되고
X7 은 Asn, Thr, Ile, His, Asp, 및 Ala에서 선택된다.
특정 구현 예에서, 화학식 1a의 삽입 펩티드는 QADTTKN (서열 번호 13), ISDQTKH (서열 번호 14), ASDSTKA (서열 번호 15), NQDYTKT (서열 번호 16) ), HDITKNI (서열 번호 17), HPDTTKN (서열 번호 18), HQDTTKN (서열 번호 19), NKTTNKD (서열 번호 20), ISNENEH (서열 번호 21) 및 QANANEN 서열 번호 (22)이다.
다른 측면에서, 삽입 펩티드는 화학식 1b의 7-10 아미노산 길이의 펩티드일 수 있다 :
Y 1 Y 2 X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 X 7 Y 3
여기서 각각의 Y1-Y3은, 존재하는 경우, 독립적으로 Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro로부터 선택되고
X1 은 Gln, Asn, His, 및 Ile에서 선택되고
X2 는 Ala, Gln, Asp, 및 Ser에서 선택되고
X3 은 Asp 및 Ile에서 선택되고
X4 는 Thr, Tyr, 및 Gln에서 선택되고
X5 는 Thr 및 Lys에서 선택되고
X6 은 Lys 및 Asn에서 선태되고
X7은 Asn, Thr, Ile 및 His 중에서 선택된다.
특정 구현 예에서, 화학식 1b의 삽입 펩티드는 QADTTKN (서열 번호 13), ISDQTKH (서열 번호 14), NQDYTKT (서열 번호 16), HDITKNI (서열 번호 17) ) 및 HQDTTKN (서열 번호 19)을 포함한다.
다른 측면에서, 삽입 펩티드는 화학식 1c의 7 내지 10 개의 아미노산 길이의 펩티드일 수 있다
Y 1 Y 2 X 1 X 2 AspX 3 ThrLysX 4 Y 3
여기서 각각의 Y1-Y3은, 존재하는 경우, 독립적으로 Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro로부터 선택되고
X1 은 Gln, Asn, His, 및 Ile에서 선택되고
X2 는 Ala, Gln, 및 Ser에서 선택되고
X3 은 Thr, Tyr, 및 Gln에서 선택되고
X4 는 Asn, Thr 및 His로부터 선택된다.
특정 구현 예에서, 화학식 1c의 삽입 펩티드는 QADTTKN (서열 번호 13), ISDQTKH (서열 번호 14), NQDYTKT (서열 번호 16) 및 HQDTTKN (서열 번호 19).
다른 측면에서, 삽입 펩티드는 화학식 1d의 길이가 7 내지 10 개의 아미노산인 펩티드일 수 있다 :
Y1Y2X1X2AspX3ThrThrX4Y3
여기서 각각의 Y1-Y3은, 존재하는 경우, 독립적으로 Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro로부터 선택되고
X1 은 Gln 및 Ile에서 선택되고
X2 는 Ala 및 Ser에서 선택되고
X3 은 Thr 및 Gln에서 선택되고
X4 는 Asn 및 His에서 선택된다
특정 실시형태에서, 화학식 1d의 삽입 펩티드는 QADTTKN (서열 번호 13) 및 ISDQTKH (서열 번호 14)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 측면에서, 삽입 펩티드는 화학식 Ie의 7 내지 11 개의 아미노산 길이의 펩티드 일 수 있다
Y1Y2X1X2AsnX3AsnGluX4Y3
여기서 각각의 Y1-Y3은, 존재하는 경우, 독립적으로 Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro로부터 선택되고
X1 은 Gln 및 Ile에서 선택되고
X2 는 Ala 및 Ser에서 선택되고
X3 은 Glu 및 Ala로부터 선택되고
X4 는 Asn 및 His로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 화학식 1e의 삽입 펩티드는 ISNENEH (서열 번호 21) 및 QANANEN (서열 번호 22)으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시 양태에서, 삽입 펩티드는 화학식 IIa의 7 내지 11 개의 아미노산 길이의 펩티드일 수 있다 :
Y1Y2X1X2DX3TKX4Y3.
여기서 각각의 Y1-Y3은, 존재하는 경우, 독립적으로 Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro로부터 선택되고
X 1은 Q, N, A, H, 및 I로부터 선택되며;
X 2는 Q, A, P, 및 S로부터 선택되고;
X 3은 T, Y, S, 및 Q로부터 선택되고;
X 4는 T, N, A 및 H 중에서 선택된다.
화학식 X1X2DX3TKX4인 아미노산 서열의 펩티드 삽입의 추가 실시양태에서, 펩티드 삽입은 QADTTKN (서열 번호 13), ISDQTKH (서열 번호 14), ASDSTKA, NQDYTKT (서열 번호 16), HQDTTKN (서열 번호 19), 및 HPDTTKN (서열 번호 18)로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 이러한 실시 양태에서, 삽입 펩티드는 화학식 IIb의 길이가 7 내지 11 개의 아미노산인 펩티드일 수 있다 :
Y1Y2X1X2DX3TKX4Y3
여기서 각각의 Y1-Y3은, 존재하는 경우, 독립적으로 Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro로부터 선택되고
X 1은 N, A, 및 H로부터 선택되고;
X 2는 Q, P, 및 S로부터 선택되고;
X 3은 T, Y, 및 S로부터 선택되고;
X 4는 T, N 및 A에서 선택된다.
화학식 X1X2DX3TKX4의 아미노산 서열 펩티드 삽입의 다른 실시예에서, 펩티드 삽입은 ASDSTKA, NQDYTKT (서열 번호 16), HQDTTKN (서열 번호 19) 및 HPDTTKN (서열 번호 18)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 삽입 펩티드는 KDRAPST (서열 번호 26), TNRTSPD (서열 번호 24), PNSTHGS (서열 번호 25) 및 GKSKVID (서열 번호 23)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 삽입 펩티드는 ASDSTKA (서열 번호 15), QANANEN (서열 번호 22), QADTTKN (서열 번호 13), ISDQTKH (서열 번호 14), NQDYTKT (서열 번호 16), HDITKNI (서열 번호 17), HPDTTKN (서열 번호 18), HQDTTKN (서열 번호 19), NKTTNKD (서열 번호 20), ISNENEH : 21), GKSKVID (서열 번호 23), TNRTSPD (서열 번호 24), PNSTHGS (서열 번호 25) 및 KDRAPST (서열 번호 26)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 삽입 펩티드는 QADTTKN (서열 번호 13), ISDQTKH (SEQ (서열 번호 : 14), ASDSTKA (서열 번호 15), NQDYTKT (서열 번호 16), HDITKNI (서열 번호 17), HPDTTKN (서열 번호 18), HQDTTKN (서열 번호 19) , NKTTNKD (서열 번호 20), ISNENEH (서열 번호 21), QANANEN (서열 번호 22), GKSKVID (서열 번호 23), TNRTSPD (서열 번호 24), PNSTHGS (서열 번호 25) 및 KDRAPST (서열 번호: 26)에서 선택되는 아미노산 서열의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 1-3 개의 스페이서 아미노산 (Y 1 -Y 3)을 갖는다. 이러한 특정 구현 예에서, 삽입 펩티드는 LAQADTTKNA (서열 번호 27), LAISDQTKHA (서열 번호 28), LGISDQTKHA (서열 번호 29), LAASDSTKAA (서열 번호 30), LANQDYTKTA (서열 번호 31), LAHDITKNIA (서열 번호 32), LAHPDTTKNA (서열 번호 33), LAHQDTTKNA (서열 번호 34), LANKTTNKDA (서열 번호 35), LPISNENEHA (서열 번호 36), LPQANANENA (서열 번호 37), LAGKSKVIDA (서열 번호 38), LATNRTSPDA (서열 번호 : 39), LAPNSTHGSA (서열 번호 : 40) 및 LAKDRAPSTA (서열 번호 : 41)로 루어진 군에서 선택된다.
일부 실시형태에있어서, 본 변이체 AAV 캡시드 단백질은 GH 루프 또는 루프 IV에서 약 5 개 아미노산 내지 약 20 개 아미노산의 펩티드 삽입 이외의 다른 아미노산 서열 변형을 포함하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명의 변이체 AAV 캡시드 단백질은 QADTTKN (서열 번호13), ISDQTKH (서열 번호14), ASDSTKA (서열 번호15), NQDYTKT (서열 번호16), HDITKNI (서열 번호17), HPDTTKN (서열 번호18), HQDTTKN (서열 번호19), NKTTNKD (서열 번호20), ISNENEH (서열 번호21), QANANEN (서열 번호22), GKSKVID (서열 번호23), TNRTSPD (서열 번호24), PNSTHGS (서열 번호25), KDRAPST (서열 번호26), LAQADTTKNA (서열 번호27), LAISDQTKHA (서열 번호28), LGISDQTKHA (서열 번호29), LAASDSTKAA (서열 번호30), LANQDYTKTA (서열 번호31), LAHDITKNIA (서열 번호32), LAHPDTTKNA (서열 번호33), LAHQDTTKNA (서열 번호34), LANKTTNKDA (서열 번호35), LPISNENEHA (서열 번호36), LPQANANENA (서열 번호37), LAGKSKVIDA (서열 번호38), LATNRTSPDA (서열 번호39), LAPNSTHGSA (서열 번호40) 및 LAKDRAPSTA (서열 번호41)로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 삽입물을 포함하고, 변이체 AAV 캡시드는 다른 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 포함하지 않는다 (즉, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 상기 삽입물을 포함하고, 그렇지 않으면 상응하는 AAV 캡시드 단백질과 동일하다). 달리 말하면, 상기 삽입을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질은 펩티드가 삽입 된 어버이 AAV 캡시드 단백질과 동일하다. 또 다른 예로서, 본 변이체 AAV 캡시드 단백질은 QADTTKN (서열 번호13), ISDQTKH (서열 번호14), ASDSTKA (서열 번호15), NQDYTKT (서열 번호16), HDITKNI (서열 번호17), HPDTTKN (서열 번호18), HQDTTKN (서열 번호19), NKTTNKD (서열 번호20), ISNENEH (서열 번호21), QANANEN (서열 번호22), GKSKVID (서열 번호23), TNRTSPD (서열 번호24), PNSTHGS (서열 번호25), KDRAPST (서열 번호26), LAQADTTKNA (서열 번호27), LAISDQTKHA (서열 번호28), LGISDQTKHA (서열 번호29), LAASDSTKAA (서열 번호30), LANQDYTKTA (서열 번호31), LAHDITKNIA (서열 번호32), LAHPDTTKNA (서열 번호33), LAHQDTTKNA (서열 번호34), LANKTTNKDA (서열 번호35), LPISNENEHA (서열 번호36), LPQANANENA (서열 번호37), LAGKSKVIDA (서열 번호38), LATNRTSPDA (서열 번호39), LAPNSTHGSA (서열 번호40) 및 LAKDRAPSTA (서열 번호41)에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드 삽입물을 포함하고, 펩티드 삽입이 AAV2의 VP1의 아미노산 587과 588 또는 다른 모 AAV의 VP1의 상응하는 아미노산들, 예를들면 AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 또는 AAV9의 VP1의 아미노산 588 내지 589 사이, AAV4의 VP1의 아미노산 586 내지 587 사이, AAV5의 VP1의 아미노산 577 및 578 사이, AAV7의 VP1의 아미노산 589 내지 590 사이, AAV8 또는 AAV10의 VP1의 아미노산 590 내지 591 등의 아미노산 사이에 위치하고, 달리 변이체 AAV 캡시드 단백질 서열은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질 서열, 예를 들어, 서열 번호 1-12의 임의의 아미노산 서열과 동일하다.
다른 실시형태에서, 예를 들어 본원에 또는 당업계에 공지된 바와 같이 펩티드 삽입을 GH 루프에 포함하는 것 이외에 본 발명의 변이체 AAV 캡시드 단백질은 약 1 내지 약 100 개의 아미노산 치환 또는 결실, 예를들면 1 내지 약 5, 약 2 내지 약 4, 약 2 내지 약 5, 약 5 내지 약 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 약 20 내지 약 25, 약 25 -50, 약 50-100 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 변이체 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 예를 들어 서열 번호 1-12에 기재된 바와 같은 야생형 캡시드 단백질과 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 또는 98 % 이상, 또는 99 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다,
추가의 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 팝타이드 삽입 이전에 번호가 매겨진 AAV2 VP1 캡시드 단백질의 아미노산 잔기 1, 15, 34, 57, 66, 81, 101, 109, 144, 164, 176, 188, 196, 226, 236, 240, 250, 312, 363, 368, 449, 456, 463, 472, 484, 524, 535, 551, 593, 698, 708, 719, 721 및/또는 735, 또는 다른 AAV 캡시드 단백질의 상응하는 아미노산 잔기 (들)에 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 펩티드 삽입 이전에 번호가 매겨진 AAV2 VP1 캡시드 단백질의 M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L 및 L735Q로 이루어진 군에서 선택되거나 다른 AAV 캡시드 단백질의 상응하는 아미노산 잔기 (들)에서 선택된다.
바람직한 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는a) 캡시드 단백질의 GH-루프에 있고, ISDQTKH (서열 번호 14), LGISDQTKHA (서열 번호 29) 및 LAISDQTKHA (서열 번호 28)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 삽입물, 및 b) AAV2 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 다음의 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외)에서의 상응하는 치환 중 하나 이상을 포함하고, 치환된 아미노산(들)은 상응하는 위치에 자연적으로 발생되지 않는다: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q 및 이들의 조합. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 M1L + L15P + P535S, P34A, P34A + S721L, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, Q164K + V708I , T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, N312K, N312K + N449D + D472N + N551S + I698V + L735Q, P363L, R484C + V708I, T456K 및 V708I로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는, 펩티드 삽입 부위는 AAV2 캡시드의 아미노산 587 내지 588 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 위치한다.
특히 바람직한 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 AAV2의 VP1의 587과 588 사이 또는 다른 AAV 캡시드의 상응하는 아미노산 사이에 아미노산 서열 ISDQTKH (서열 번호 14)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LAISDQTKHA (서열 번호 28) 또는 LGISDQTKHA (서열 번호 29)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, AAV2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열에 대한 잔기 34 또는 다른 AAV 캡시드의 상응하는 잔기에서의 P34A 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 변이체 AAV 캡시드는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이 또는 상응하는 모 AAV 캡시드와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 하기 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %의 서열 동일성 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKAAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAISDQTKHARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (서열 번호42)
특히 또 다른 바람직한 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 AAV2 캡시드 단백질의 587과 588 사이 또는 다른 AAV 혈청형 캡시드 단백질에 상응하는 위치에 아미노산 서열 ISDQTKH (서열 번호 14)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LAISDQTKHA (서열 번호 28) 또는 LGISDQTKHA (서열 번호 29)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, AAV2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산과 비교하여 N312K 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형에서 상응하는 치환을 포함하고, AAV2 캡시드의 아미노산 서열과 비교하여 N449D, D472N, N551S, I698V 및/또는 L735Q 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형에서 상응하는 치환을 추가로 포함한다. 특히 또 다른 바람직한 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 AAV2 캡시드의 587과 588 사이 또는 다른 AAV 혈청형 캡시드 단백질에 상응하는 위치에 아미노산 서열 ISDQTKH (서열 번호 14)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LAISDQTKHA (서열 번호 28) 또는 LGISDQTKHA (서열 번호 29)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, AAV2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산과 비교하여 N312K, N449D, D472N, N551S, I698V 및 L735Q 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형에서 상응하는 잔기에서 치환을 포함한다. 변이체 AAV 캡시드는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 하기 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %의 서열 동일성 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLKFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTDTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRNQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTSVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAISDQTKHARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNQ (서열 번호43)
또 다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는 a) AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 또는 AAV9의 VP1의 아미노산 588 및 589 사이, AAV4의 아미노산 586 및 587 사이, AAV5의 아미노산 577 및 578 사이, AAV7의 아미노산 589 및 590 사이, 또는 AAV8 또는 AAV10의 아미노산 590 내지 591 사이에 위치하는 펩티드 삽입물을 포함하되, 펩티드 삽입물은 ISDQTKH (서열 번호 14), LGISDQTKHA (서열 번호 29) 및 LAISDQTKHA (서열 번호 28)에서 선택되는 아미노산을 포함하고, 및 b) AAV3A 또는 AAV3B의 아미노산 709에서 발린에서 이소루이신 치환, AAV1 또는 AAV6의 709 위치에서 알라닌에서 이소루이신 치환, AAV4의 아미노산 707 또는 AAV9의 아미노산 709에서 아스파라긴에서 이소루이신 치환 또는 AAV7의 아미노산 710 또는 AAV8 또는 AAV10의 아미노산 711에서의 트레오닌에서 이소루이신 치환 또는 AAV5의 아미노산 697에서 글루타민에서 이소 루이신치환을 포함하며, 달리 임의의 서열번호 1 및 3-12와 동일하다. 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 ISDQTKH (서열 번호 14)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LAISDQTKHA (서열 번호 28) 또는 LGISDQTKHA (서열 번호 29)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, b) AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 708에 발린에서 이소루이신 아미노산 치환을 포함하고, 변이체 캡시드 단백질은 2 내지 5, 5 내지 10, 또는 10 내지 15개의 아미노산 치환을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 ISDQTKH (서열 번호 14)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LAISDQTKHA (서열 번호 28) 또는 LGISDQTKHA (서열 번호 29)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, b) AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 708에 발린에서 이소루이신 아미노산 치환을 포함하고, 달리 서열 번호 2의 아미노산과 동일하다.
또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 ISDQTKH (서열 번호 14)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LAISDQTKHA (서열 번호 28) 또는 LGISDQTKHA (서열 번호 29)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, 달리 서열 번호 2의 아미노산과 동일하다. 일부 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 하기 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %의 서열 동일성 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLGISDQTKHARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (서열 번호44)
바람직한 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는a) 캡시드 단백질의 GH-루프에 있고, QADTTKN (서열 번호 13) 및 LAQADTTKNA (서열 번호 27)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 삽입물, 및 b) AAV2 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 다음의 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외)에서의 상응하는 치환 중 하나 이상을 포함하고, 치환된 아미노산(들)은 상응하는 위치에 자연적으로 발생되지 않는다: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V719M, S721L, L735Q 및 이들의 조합, 바람직하게는 S109T, P250S, A524T, A593E, I698V, V708I, 및/또는 V719M에서 선택. 펩티드 삽입 부위는 바람직하게는 AAV2 캡시드의 아미노산 587 내지 588 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 위치한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 AAV2 캡시드 단백질의 587과 588 사이 또는 다른 AAV 혈청형 캡시드 단백질에 상응하는 위치에 아미노산 서열 QADTTKN (서열 번호 13)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LAQADTTKNA (서열 번호 27)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, AAV2의 아미노산과 비교하여 I698V 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형에서 상응하는 치환을 포함하고, 치환된 아미노산(들)은 상응하는 위치에서 자연적으로 발생하지 않는다. 변이체 AAV 캡시드는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 상응하는 아미노산 치환은 AAV3A, AAV3B 또는 AAV9 캡시드의 아미노산 서열에 비해 I699V 아미노산 치환, AAV5 캡시드의 아미노산 서열에 비교하여 I687V 치환, AAV7의 아미노산 서열에 비해 I700V 치환, AAV8 또는 AAV10의 아미노산 서열과 비교하여 I701V 치환을 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 하기 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %의 서열 동일성 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAQADTTKNARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (서열 번호45)
바람직한 다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 AAV2 캡시드 단백질의 587과 588 사이 또는 다른 AAV 혈청형 캡시드 단백질에 상응하는 위치에 아미노산 서열 QADTTKN (서열 번호 13)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LAQADTTKNA (서열 번호 27)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, AAV2의 아미노산과 비교하여V719M 아미노산 치환 및 선택적으로 V708I 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형에서 상응하는 치환을 포함하고, 치환된 아미노산(들)은 상응하는 위치에서 자연적으로 발생하지 않는다.
또 다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는 a) AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 또는 AAV9의 VP1의 아미노산 588 및 589 사이, AAV4의 아미노산 586 및 587 사이, AAV5의 아미노산 577 및 578 사이, AAV7의 아미노산 589 및 590 사이, 또는 AAV8 또는 AAV10의 아미노산 590 내지 591 사이에 위치하는 펩티드 삽입물을 포함하되, 펩티드 삽입물은 QADTTKN (서열 번호 13) 및 LAQADTTKNA (서열 번호 27)에서 선택되는 아미노산을 포함하고, 및 b) AAV3A 또는 AAV3B의 아미노산 709에서 발린에서 이소루이신 치환, AAV1 또는 AAV6의 709 위치에서 알라닌에서 이소루이신 치환, AAV4의 아미노산 707 또는 AAV9의 아미노산 709에서 아스파라긴에서 이소루이신 치환 또는 AAV7의 아미노산 710 또는 AAV8 또는 AAV10의 아미노산 711에서의 트레오닌에서 이소루이신 치환 또는 AAV5의 아미노산 697에서 글루타민에서 이소 루이신치환을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는 a) AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 또는 AAV9의 VP1의 아미노산 588 및 589 사이, AAV4의 아미노산 586 및 587 사이, AAV5의 아미노산 577 및 578 사이, AAV7의 아미노산 589 및 590 사이, 또는 AAV8 또는 AAV10의 아미노산 590 내지 591 사이에 위치하는 펩티드 삽입물을 포함하되, 펩티드 삽입물은 QADTTKN (서열 번호 13) 및 LAQADTTKNA (서열 번호 27)에서 선택되는 아미노산을 포함하고, 및 b) AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9, 또는 AAV10의 아미노산 서열과 비교하여 109 위치에서 또는 AAV5 또는 AAV6의 아미노산 서열과 비교하여 108 위치에 세린에서 트레오닌 아미노산 치환을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 변형 AAV 캡시드는 아미노산 서열 QADTTKN (서열 번호 13)을 포함하거나 또는 아미노산 서열 LAQADTTKNA (서열 번호 27)를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 구성되거나, 587 및 588을 포함하고 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 109 (S109T)에서의 세린에서 트레오닌으로 치환 또는 아미노산 708 (V708I)에서의 발린 대 이소 루이 신 아미노산 치환을 포함하며, 상기 변이체 캡시드 단백질은 1 내지 5 개, 5 내지 10 개 또는 10 내지 15 개 아미노산 치환을 가지며, 바람직하게는 약 85 % 이상, 약 90 % 이상, 약 95 % 이상, 약 98 % 이상, 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 상동성을 갖는다. 바람직한 다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 AAV2 캡시드 단백질의 587과 588 사이 또는 다른 AAV 혈청형 캡시드 단백질에 상응하는 위치에 아미노산 서열 QADTTKN (서열 번호 13)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LAQADTTKNA (서열 번호 27)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 109에서 세린에서 트레오닌 치환 및 아미노산 708에서 발린에서 이소루이신으로 치환을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 QADTTKN (서열 번호 13)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LAQADTTKNA (서열 번호 27)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, b) 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 변이체 캡시드의 아미노산 서열은 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 708에서 발린에서 이소루이신 아미노산 치환을 포함하지 않고, AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 109에서 세린에서 트레오닌 아미노산 치환을 포함하지 않는다.
또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 QADTTKN (서열 번호 13)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LAISDQTKHA (서열 번호 28) 또는 LAQADTTKNAA (서열 번호 27)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, 달리 서열 번호 2의 아미노산과 동일하다.
바람직한 다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는a) 캡시드 단백질의 GH-루프에 있고, HDITKNI (서열 번호 17), IAHDITKNIA (서열 번호 60) 및 LAHDITKNIA (서열 번호 32)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 삽입물, 및 b) AAV2 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 다음의 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외)에서의 상응하는 치환 중 하나 이상을 포함하고, 치환된 아미노산(들)은 상응하는 위치에 자연적으로 발생되지 않는다: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, R389S, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q 및 이들의 조합. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드 단백질은 S109T, R389S, A593E 및/또는 V708I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 바람직하게는, 펩티드 삽입 부위는 AAV2 캡시드의 아미노산 587 내지 588 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 위치한다. 바람직한 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 AAV2 캡시드 단백질의 587과 588 사이 또는 다른 AAV 혈청형 캡시드 단백질에 상응하는 위치에 아미노산 서열 HDITKNI (서열 번호 17)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 IAHDITKNIA (서열 번호 60) 또는 LAHDITKNIA (서열 번호 32)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, AAV2의 아미노산과 비교하여 S109T 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형에서 상응하는 치환을 포함한다. 변이체 AAV 캡시드는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 HDITKNI (서열 번호 17)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 IAHDITKNIA (서열 번호 60) 또는 LAHDITKNIA (서열 번호 32)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, 달리 서열 번호 2의 아미노산과 동일하다. 일부 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 하기 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %의 서열 동일성 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAHDITKNIARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (서열 번호46)
또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드는 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 LAHDITKNIA을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, b) 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 변이체 캡시드의 아미노산 서열은 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 708에서 발린에서 이소루이신 아미노산 치환을 포함하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열DITKNIA (서열 번호 61)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 IAHDITKNIA (서열 번호 60) 또는 LAHDITKNIA (서열 번호 32)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, b) AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 V708I 치환을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드는 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 LAHDITKNIA (서열 번호 32)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, b) 둘 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 변이체 캡시드의 아미노산 서열은 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 708에서 발린에서 이소루이신 아미노산 치환을 포함한다.
바람직한 다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는a) 캡시드 단백질의 GH-루프에 있고, NQDYTKT (서열 번호 16) 및 LANQDYTKTA (서열 번호 31)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 삽입물, 및 b) AAV2 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 다음의 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외)에서의 상응하는 치환 중 하나 이상을 포함하고, 치환된 아미노산(들)은 상응하는 위치에 자연적으로 발생되지 않는다: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q 및 이들의 조합. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드 단백질은 S109T, S109T + S463Y, D368H 및 V708I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 바람직하게는, 펩티드 삽입 부위는 AAV2 캡시드의 아미노산 587 내지 588 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 위치한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 AAV2 캡시드 단백질의 587과 588 사이 또는 다른 AAV 혈청형 캡시드 단백질에 상응하는 위치에 아미노산 서열 NQDYTKT (서열 번호 16)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LANQDYTKTA (서열 번호 31)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, AAV2의 아미노산과 비교하여 V708I 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형에서 상응하는 치환을 포함한다. 변이체 AAV 캡시드는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 NQDYTKT (서열 번호 16)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LANQDYTKTA (서열 번호 31)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, 달리 서열 번호 2의 아미노산과 동일하다. 일부 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 하기 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %의 서열 동일성 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLANQDYTKTARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (서열 번호 47)
또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 NQDYTKT (서열 번호 16)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LANQDYTKTA (서열 번호 31)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, b) 선택적으로 S109T 아미노산 치환을 포함하고, 변이체 캡시드는 서열 번호 2의 아미노산 서열의 전체 길이와 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 동일하다. 또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 NQDYTKT (서열 번호 16)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LANQDYTKTA (서열 번호 31)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, b) 서열 번호 2의 아미노산 서열과 비교하여 S109T 아미노산 치환을 포함하고, 달리 서열 번호 2의 아미노산 서열과 동일하다.
또 다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는 a) AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 또는 AAV9의 VP1의 아미노산 588 및 589 사이, AAV4의 아미노산 586 및 587 사이, AAV5의 아미노산 577 및 578 사이, AAV7의 아미노산 589 및 590 사이, 또는 AAV8 또는 AAV10의 아미노산 590 내지 591 사이에 위치하는 펩티드 삽입물을 포함하되, 펩티드 삽입물은 NQDYTKT (서열 번호 16) 및 LANQDYTKTA (서열 번호 31)에서 선택되는 아미노산을 포함하고, 및 b) AAV1 또는 AAV6의 아미노산 서열과 비교하여 위치 313에서, 또는 AAV9의 아미노산 서열과 비교하여 위치 314에서 아스파라긴에서 리신 아미노산 치환, AAV3A 또는 AAV3B의 위치 312에서, AAV8 또는 AAV10의 위치 315에서 세린에서 리신 치환, AAV4 또는 AAV5의 위치 303에서, 또는 AAV7의 위치 314에서 아르기닌에서 리신 치환을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열NQDYTKT (서열 번호 16)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LANQDYTKTA (서열 번호 31)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, b) N312K 아미노산 치환을 포함하고, 변이체 캡시드 단백질은 1 내지 5, 5 내지 10, 또는 10 내지 15개의 아미노산 치환을 포함한다.
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는a) 캡시드 단백질의 GH-루프에 있고, PNSTHGS (서열 번호 25) 및 LAPNSTHGSA (서열 번호 40)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 삽입물, 및 b) AAV2 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 다음의 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외)에서의 상응하는 치환 중 하나 이상을 포함하고, 치환된 아미노산(들)은 상응하는 위치에 자연적으로 발생되지 않는다: MM1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q 및 이들의 조합. 바람직하게는, 펩티드 삽입 부위는 AAV2 캡시드의 아미노산 587 내지 588 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 위치한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 AAV2 캡시드 단백질의 587과 588 사이 또는 다른 AAV 혈청형 캡시드 단백질에 상응하는 위치에 아미노산 서열 PNSTHGS (서열 번호 25)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LAPNSTHGSA (서열 번호 40)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, AAV2의 아미노산과 비교하여 V708I 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형에서 상응하는 치환을 포함한다. 변이체 AAV 캡시드는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 PNSTHGS (서열 번호 25)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 아미노산 서열 LAPNSTHGSA (서열 번호 40)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, 달리 서열 번호 2의 아미노산과 동일하다. 일부 실시형태에서, 변형 AAV 캡시드는하기 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %의 서열 동일성 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다 :
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAPNSTHGSARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (서열 번호 48)
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는a) 캡시드 단백질의 GH-루프에 있고, NKTTNKDA (서열 번호 62) 및 LANKTTNKDA (서열 번호 35)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 삽입물, 및 b) AAV2 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 다음의 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외)에서의 상응하는 치환 중 하나 이상을 포함하고, 치환된 아미노산(들)은 상응하는 위치에 자연적으로 발생되지 않는다: MM1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q 및 이들의 조합. 바람직하게는, 펩티드 삽입 부위는 AAV2 캡시드의 아미노산 587 내지 588 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 위치한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 AAV2 캡시드 단백질의 587과 588 사이 또는 다른 AAV 혈청형 캡시드 단백질에 상응하는 위치에 아미노산 서열 NKTTNKDA (서열 번호 62)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LANKTTNKDA (서열 번호 35)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, AAV2의 아미노산과 비교하여 N449D 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형에서 상응하는 치환을 포함한다. 변이체 AAV 캡시드는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 NKTTNKDA (서열 번호 62)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 아미노산 서열 LANKTTNKDA (서열 번호 35)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, 달리 서열 번호 2의 아미노산과 동일하다. 일부 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 하기 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %의 서열 동일성 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLANKTTNKDARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (서열 번호49)
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는 a) 캡시드 단백질의 GH-루프에 있고, TNRTSPD (서열 번호 24) 및 LATNRTSPDA (서열 번호 39)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 삽입물, 및 b) AAV2 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 다음의 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외)에서의 상응하는 치환 중 하나 이상을 포함하고, 치환된 아미노산(들)은 상응하는 위치에 자연적으로 발생되지 않는다: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V719M, S721L, L735Q 및 이들의 조합. 바람직하게는, 펩티드 삽입 부위는 AAV2 캡시드의 아미노산 587 내지 588 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 위치한다. 관련된 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는 a) AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 또는 AAV9의 VP1의 아미노산 588 및 589 사이, AAV4의 아미노산 586 및 587 사이, AAV5의 아미노산 577 및 578 사이, AAV7의 아미노산 589 및 590 사이, 또는 AAV8 또는 AAV10의 아미노산 590 내지 591 사이에 위치하는 펩티드 삽입물을 포함하되, 펩티드 삽입물은 TNRTSPD (서열 번호 24) 및 LATNRTSPDA (서열 번호 39)에서 선택되는 아미노산을 포함하고, 및 b) AAV3A 또는 AAV3B의 아미노산 709에서 발린에서 이소루이신 치환, AAV1 또는 AAV6의 709 위치에서 알라닌에서 이소루이신 치환, AAV4의 아미노산 707 또는 AAV9의 아미노산 709에서 아스파라긴에서 이소루이신 치환 또는 AAV7의 아미노산 710 또는 AAV8 또는 AAV10의 아미노산 711에서의 트레오닌에서 이소루이신 치환 또는 AAV5의 아미노산 697에서 글루타민에서 이소 루이신 치환을 포함한다. 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 LATNRTSPDA (서열 번호 39)를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, b) AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 708에 발린에서 이소루이신 아미노산 치환을 포함하고, 변이체 캡시드 단백질은 1 내지 5, 5 내지 10, 또는 10 내지 15개의 아미노산 치환을 포함한다. 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 TNRTSPD (서열 번호 24)를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, b) AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 708에 발린에서 이소루이신 아미노산 치환을 포함한다. 변이체 AAV 캡시드는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 TNRTSPD (서열 번호 24)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LATNRTSPDA (서열 번호 39)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, 달리 서열 번호 2의 아미노산과 동일하다. 일부 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 하기 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %의 서열 동일성 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLATNRTSPDARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (서열 번호50)
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는a) 캡시드 단백질의 GH-루프에 있고, GKSKVID (서열 번호 23) 및 LAGKSKVIDA (서열 번호 38)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 삽입물, 및 b) AAV2 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 다음의 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외)에서의 상응하는 치환 중 하나 이상을 포함하고, 치환된 아미노산(들)은 상응하는 위치에 자연적으로 발생되지 않는다: MM1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q 및 이들의 조합. 바람직하게는, 펩티드 삽입 부위는 AAV2 캡시드의 아미노산 587 내지 588 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 위치한다. 변이체 AAV 캡시드는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체 캡시드는 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 GKSKVID (서열 번호 23)를 포함하거나 또는 아미노산 서열LAGKSKVIDA (서열 번호 38)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, 달리 서열 번호 2의 아미노산과 동일하다. 일부 실시형태에서, 변이체 캡시드는 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 LAGKSKVIDA (서열 번호 38)를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 하기 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %의 서열 동일성 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다:
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다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는a) 캡시드 단백질의 GH-루프에 있고, ASDSTKA (서열 번호 15) 및 LAASDSTKAA (서열 번호 30)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 삽입물, 및 b) AAV2 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 다음의 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외)에서의 상응하는 치환 중 하나 이상을 포함하고, 치환된 아미노산(들)은 상응하는 위치에 자연적으로 발생되지 않는다: MM1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q 및 이들의 조합. 바람직하게는, 펩티드 삽입 부위는 AAV2 캡시드의 아미노산 587 내지 588 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 위치한다. 변이체 AAV 캡시드는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 ASDSTKA (서열 번호 15)를 포함하거나 또는 아미노산 서열LAASDSTKAA (서열 번호 30)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, 달리 서열 번호 2의 아미노산과 동일하다. 일부 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 하기 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %의 서열 동일성 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAASDSTKAARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (서열 번호52)
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는a) 캡시드 단백질의 GH-루프에 있고, KDRAPST (서열 번호 26) 및 LAKDRAPTSA (서열 번호 41)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 삽입물, 및 b) AAV2 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 다음의 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외)에서의 상응하는 치환 중 하나 이상을 포함하고, 치환된 아미노산(들)은 상응하는 위치에 자연적으로 발생되지 않는다: MM1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q 및 이들의 조합. 바람직하게는, 펩티드 삽입 부위는 AAV2 캡시드의 아미노산 587 내지 588 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 위치한다. 변이체 AAV 캡시드는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 KDRAPST (서열 번호 26)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LAKDRAPTSA (서열 번호 41)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, 달리 서열 번호 2의 아미노산과 동일하다. 일부 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 하기 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %의 서열 동일성 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAKDRAPSTARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (서열 번호53)
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는a) 캡시드 단백질의 GH-루프에 있고, HQDTTKN (서열 번호 19) 및 LAHQDTTKNA (서열 번호 34)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 삽입물, 및 b) AAV2 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 다음의 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외)에서의 상응하는 치환 중 하나 이상을 포함하고, 치환된 아미노산(들)은 하나 이상의 상응하는 위치에 자연적으로 발생되지 않는다: MM1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q 및 이들의 조합. 바람직하게는, 펩티드 삽입 부위는 AAV2 캡시드의 아미노산 587 내지 588 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 위치한다. 변이체 AAV 캡시드는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 HQDTTKN (서열 번호 19)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LAHQDTTKNA (서열 번호 34)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, 달리 서열 번호 2의 아미노산과 동일하다. 일부 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 하기 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %의 서열 동일성 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAHQDTTKNARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (서열 번호54)
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는a) 캡시드 단백질의 GH-루프에 있고, ISNENEH (서열 번호 21) 및 LPISNENEHA (서열 번호 36)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 삽입물, 및 b) AAV2 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 다음의 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외)에서의 상응하는 치환 중 하나 이상을 포함하고, 치환된 아미노산(들)은 하나 이상의 상응하는 위치에 자연적으로 발생되지 않는다: MM1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q 및 이들의 조합. 바람직하게는, 펩티드 삽입 부위는 AAV2 캡시드의 아미노산 587 내지 588 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 위치한다. 변이체 AAV 캡시드는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 ISNENEH (서열 번호 21)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LPISNENEHA (서열 번호 36)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, 달리 서열 번호 2의 아미노산과 동일하다. 일부 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 하기 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %의 서열 동일성 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLPISNENEHARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (서열 번호55)
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는 a) 캡시드 단백질의 GH-루프에 있고, QANANEN (서열 번호 22) 및 LPQANANENA (서열 번호 37)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 삽입물, 및 b) AAV2 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 다음의 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외)에서의 상응하는 치환 중 하나 이상을 포함하고, 치환된 아미노산(들)은 상응하는 위치에 자연적으로 발생되지 않는다: MM1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q 및 이들의 조합. 바람직하게는, 펩티드 삽입 부위는 AAV2 캡시드의 아미노산 587 내지 588 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 위치한다. 변이체 AAV 캡시드는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 QANANEN (서열 번호 22)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LPQANANENA (서열 번호 37)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, 달리 서열 번호 2의 아미노산과 동일하다. 일부 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 하기 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %의 서열 동일성 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLPQANANENARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (서열 번호 56)
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질이 제공되고, 이는 a) 캡시드 단백질의 GH-루프에 있고, HPDTTKN (서열 번호 18) 및 LAHPDTTKNA (서열 번호 33)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 삽입물, 및 b) AAV2 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 다음의 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외)에서의 상응하는 치환 중 하나 이상을 포함하고, 치환된 아미노산(들)은 상응하는 위치에 자연적으로 발생되지 않는다: MM1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q 및 이들의 조합. 바람직하게는, 펩티드 삽입 부위는 AAV2 캡시드의 아미노산 587 내지 588 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 위치한다. 변이체 AAV 캡시드는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 a) AAV2 캡시드의 아미노산 587과 588 사이에 아미노산 서열 HPDTTKN (서열 번호 18)를 포함하거나 또는 아미노산 서열 LAHPDTTKNA (서열 번호 33)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 펩티드 삽입물을 포함하고, 달리 서열 번호 2의 아미노산과 동일하다. 일부 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드는 하기 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %의 서열 동일성 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAHPDTTKNARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (서열 번호 57).
여러 양태에서, AAV 캡시드 단백질이 제공되고 이는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 이때 상기 변이체 캡시드 단백질은 AAV 비리온에 존재하는 경우에 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포의 감염성과 비교하여 망막 세포의 증가된 감염성을 부여한다.
일부 실시형태에있어서, AAV 캡시드 단백질 변이체는 AAV5 캡시드 (서열 번호 6)의 아미노산 서열과 비교하여 AAV2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열 또는 P33A 아미노산 치환과 비교하여 P34A 아미노산 치환을 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이 또는 상응하는 모 AAV 캡시드와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있고, AAV2 또는 AAV5의 아미노산 서열 각각과 비교할 때 P34A 또는 P33A 아미노산 치환을 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 비교하여 P34A 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 달리 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 동일하다. 관련된 양태에서, 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열과 비교하여 P34A 아미노산 치환을 포함하며, 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 제시된 AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 5 개, 5 내지 10 개 또는 10 내지 15 개의 아미노산 치환을 포함한다.
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열 또는 다른 AAV 부모 혈청형 (즉, AAV2 이외의)의 상응하는 위치와 비교하여 아미노산 164에서의 아미노산 치환을 포함하며, 치환 된 아미노산은 상응하는 위치에서 자연 발생하지 않는다. 일부 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이 또는 상응하는 모 AAV 캡시드와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있고, AAV2 캡시드의 아미노산 서열 (서열 번호 2)와 비교하여 아미노산 164에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 비리온은 AAV1, AAV2 또는 AAV6의 아미노산 서열아미노산 164에서 또는 AAV7, AAV8 또는 AAV10의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 165에서 글루타민에서 리신 아미노산 치환을 포함하고; 또는 AAV5의 아미노산 160에서 세린에서 리신 치환을 포함하거나 AAV9의 아미노산 164에서 알라닌에서 리신 치환을 포함한다. 관련된 양태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAC2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 164에서 치환을 포함하며 (예를들면, Q164K), 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 제시된 AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 5 개, 5 내지 10 개 또는 10 내지 15 개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 비교하여 Q164K 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 달리 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 동일하다. 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 Q164K 및 V708I 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (예를들면, AAV2 외)에서 상응하는 치환을 포함하고, 서열 번호 2에서 제시된 아미노산 서열의 전체 길이와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다.
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열 또는 다른 AAV 부모 혈청형 (즉, AAV2 이외의)의 상응하는 위치와 비교하여 아미노산 698에서의 아미노산 치환을 포함하며, 치환 된 아미노산은 상응하는 위치에서 자연 발생하지 않는다. 일부 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이 또는 상응하는 모 AAV 캡시드와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있고, AAV2 캡시드의 아미노산 서열 (서열 번호 2)와 비교하여 아미노산 698에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 비리온은 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 698에서, 또는 AAV3A, AAV3B 또는 AAV9의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 699에서, 또는 AAV5의 아미노산 687에서, 또는 AAV7의 아미노산 700에서 또는 AAV8 또는 AAV10의 아미노산 701에서의 이소루이신에서 발린 아미노산 치환을 포함한다. 관련된 양태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAC2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 699에서 치환을 포함하며 (예를들면, I698V), 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 제시된 AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 5 개, 5 내지 10 개 또는 10 내지 15 개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 비교하여 I698V 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 달리 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 동일하다.
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열 또는 다른 AAV 부모 혈청형 (즉, AAV2 이외의)의 상응하는 위치와 비교하여 아미노산 109에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이 또는 상응하는 모 AAV 캡시드와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있고, AAV2 캡시드의 아미노산 서열 (서열 번호 2)와 비교하여 아미노산 109에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9, 또는 AAV10의 아미노산 서열과 비교하여 위치 109에서 또는 AAV5 또는 AAV6의 아미노산 서열과 비교하여 위치 108에서 세린에서 트레오닌 아미노산 치환을 포함한다. 관련된 양태에서, 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열과 비교하여 P34A 아미노산 치환을 포함하며, 변이체 캡시드 단백질은 아미노산 서열 AAV2와 비교하여 1 내지 5 개, 5 내지 10 개 또는 10 내지 15 개의 아미노산 치환을 포함한다. 다른 관련 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 S109T 아미노산 치환 및 A593E 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 S109T 및 A493V 및 선택적으로 A593E 및/또는 V708I아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (예를들면, AAV2 외)에서 상응하는 치환을 포함하고, 서열 번호 2에서 제시된 아미노산 서열의 전체 길이와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 S109T, A493V, A593E 및 V708I 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형 (예를들면, AAV2 외)에서 상응하는 치환을 포함하고, 서열 번호 2에서 제시된 아미노산 서열의 전체 길이와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 S109T 및 V708I 아미노산 치환을 포함하고, 서열 번호 2에서 제시된 아미노산 서열의 전체 길이와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있거나 달리 서열 번호 2의 아미노산 서열과 동일하다.
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 (서열 번호 2)과 비교하여 아미노산 593에서 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외의)의 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이 또는 상응하는 모 AAV 캡시드와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있고, AAV2 캡시드의 아미노산 서열 (서열 번호 2)와 비교하여 아미노산 593에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAV1, AAV3A, AAV6 또는 AAV9의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 594에서 또는 AAV5의 아미노산 583에서 또는 AAV8 또는 AAV10의 아미노산 596에서 아미노산 치환을 글루타메이트하기 위한 글리신을 포함한다. 또는 AAV3B의 아미노산 594에서 글루타메이트 아미노산 치환을 위한 아르기닌, 또는 AAV4의 아미노산 592에서 글루탐산 아미노산 치환을위한 아스파 테이트 또는 AAV7의 595 위치에서 글루타메이트 아미노산 치환을위한 글루타민을 포함한다. 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 A593E 아미노산 치환을 포함하고 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 하기 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하지 않는다: I19V, V369A, K26R, N215D, G355S, V46A 및 S196P. 관련 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 A593E 및 N596D 아미노산 치환을 포함하고, 서열 번호 2에서 제시된 아미노산 서열의 전체 길이와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 %의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드는 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 A593E 및 N596D 아미노산 치환을 포함하고 AAV2의 아미노산 서열과 동일하다. 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드는 AAV2 캡시드의 아미노산 서열과 비교하여 A593E 및 V708I 아미노산 치환을 포함하고, 서열 번호 2에서 제시된 아미노산 서열의 전체 길이와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 %의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드는 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 A593E 및 V708I 아미노산 치환을 포함하고 AAV2의 아미노산 서열과 동일하다.
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열 또는 다른 AAV 부모 혈청형 (즉, AAV2 이외의)의 상응하는 위치와 비교하여 아미노산 708에서의 아미노산 치환을 포함하며, 치환 된 아미노산은 상응하는 위치에서 자연적으로 발생하지 않는다. 바람직하게는, rAAV 비리온은 AAV2와 비교하여 아미노산 250에서 프롤린에서 세린 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형의 상응하는 아미노산을 포함하지 않는다. 일부 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이 또는 상응하는 모 AAV 캡시드와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있고, AAV2 캡시드의 아미노산 서열 (서열 번호 2)와 비교하여 아미노산 708에서 아미노산 치환을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 708에서 발린에서 이소루이신 (V708I) 아미노산 치환을 포함하고, 서열 번호 2에서 제시된 아미노산 서열의 전체 길이와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있거나 달리 서열 번호 2의 아미노산 서열과 동일하고, 변이체 캡시드 단백질을 P250S 아미노산 치환을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAV3A 또는 AAV3B의 아미노산 709에서 발린에서 이소루이신 치환, AAV1 또는 AAV6의 709 위치에서 알라닌에서 이소루이신 치환, AAV4의 아미노산 707 또는 AAV9의 아미노산 709에서 아스파라긴에서 이소루이신 치환 또는 AAV7의 아미노산 710 또는 AAV8 또는 AAV10의 아미노산 711에서의 트레오닌에서 이소루이신 치환 또는 AAV5의 아미노산 697에서 글루타민에서 이소 루이신 치환을 포함한다. 관련된 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 V708I 아미노산 치환을 포함하며, 변이체 캡시드 단백질은 2 내지 5 개, 5 내지 10 개, 또는 10 내지 15 개 아미노산 치환을 포함하고, 변이체 캡시드 단백질은 P250S 아미노산 치환을 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 V708I 아미노산 치환을 포함하고 또한 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 A593E 및/또는 S109T 아미노산 치환을 포함한다. 다른 관련 실시형태에서, 변이체 캡시드는 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 V708I 및 A593E 아미노산 치환을 포함하며, 변이체 캡시드 단백질은 달리 AAV2의 아미노산 서열과 동일하다. 다른 관련 실시형태에서, 변이체 캡시드는 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 V708I 및 S109T 아미노산 치환을 포함하며, 변이체 캡시드 단백질은 달리 AAV2의 아미노산 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 V708I 및 V719M 아미노산 치환을 포함하고, 서열 번호 2에서 제시된 아미노산 서열의 전체 길이와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있거나 달리 서열 번호 2의 아미노산 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 V708I 및 R733C 아미노산 치환을 포함하고, 서열 번호 2에서 제시된 아미노산 서열의 전체 길이와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있거나 달리 서열 번호 2의 아미노산 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 V708I 및 G727D 아미노산 치환을 포함하고, 서열 번호 2에서 제시된 아미노산 서열의 전체 길이와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있거나 달리 서열 번호 2의 아미노산 서열과 동일하다.
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열 또는 다른 AAV 부모 혈청형 (즉, AAV2 이외의)의 상응하는 위치와 비교하여 아미노산 196에서의 아미노산 치환을 포함하며, 치환 된 아미노산은 상응하는 위치에서 자연적으로 발생하지 않으며, 선택적으로 프롤린 이외의 것이다. 일부 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이 또는 상응하는 모 AAV 캡시드와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있고, AAV2 캡시드의 아미노산 서열 (서열 번호 2)와 비교하여 아미노산 196에서 아미노산 치환을 포함하고 선택적으로 S196P 치환이 아니다. 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAV2 또는 AAV9의 아미노산 196에서 또는 AAV7, AAV8 또는 AAV10의 아미노산 197에서 또는 AAV5의 아미노산 186에서의 세린에서 티로신 아미노산 치환; AAV1 또는 AAV6의 아미노산 196에서의 알라닌에서 티로신 치환; AAV4의 아미노산 191에서 메티오닌에서 티로신 치환; 또는 AAV3A 또는 AAV3B의 아미노산 196에서 트레오닌에서 티로신 치환을 포함하다. 관련된 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 비교하여 S196Y 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 달리 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 동일하다. 관련된 양태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAC2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 S196P 치환이 아닌 아미노산 196에서 치환을 포함하며 (예를들면, S196Y 치환 포함), 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 제시된 AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 5 개, 5 내지 10 개 또는 10 내지 15 개의 아미노산 치환을 포함한다.
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 (서열 번호 2)과 비교하여 아미노산 175에서 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외의)의 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하고, 치환된 아미노산은 상응하는 위치에서 자연 발생하지 않는다. 일부 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이 또는 상응하는 모 AAV 캡시드와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있고, AAV2 캡시드의 아미노산 서열 (서열 번호 2)와 비교하여 아미노산 175에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 캡시드는 서열 번호 2에 기재된 바와 같은 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 Q175H 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형의 상응하는 위치에서의 글루타민에서 히스티딘 치환을 포함한다. 관련된 양태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAC2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 175에서 치환을 포함하며 (예를들면, Q175H), 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 제시된 AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 5 개, 5 내지 10 개 또는 10 내지 15 개의 아미노산 치환을 포함한다.
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 (서열 번호 2)과 비교하여 아미노산 64에서 또는 다른 AAV 모 혈청형 (즉, AAV2 이외의)의 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하고, 치환된 아미노산은 상응하는 위치에서 자연 발생하지 않는다. 일부 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이 또는 상응하는 모 AAV 캡시드와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있고, AAV2 캡시드의 아미노산 서열 (서열 번호 2)와 비교하여 아미노산 64에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 비리온은 서열 번호 2에 기재된 바와 같은 AAV2의 아미노산 서열과 비교하여 P64S 아미노산 치환 또는 다른 AAV 모 혈청형의 상응하는 위치에서의 프롤린에서 세린 치환을 포함한다. 관련된 양태에서, 변이체 캡시드 단백질은 AAC2 캡시드 (서열 번호 2)의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 64에서 치환을 포함하며 (예를들면, P64S), 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 제시된 AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 5 개, 5 내지 10 개 또는 10 내지 15 개의 아미노산 치환을 포함한다.
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 및 12로 구성되는 군으로부터 선택된 야생형 AAV 캡시드 서열과 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 % 또는 적어도 98 % 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 또한 i) P34A, S109T+V708I, A593E+N596D, V708I+V719M, V708I+G727D, S109T+A493V+A593E+V708I, V708I+R733C, Q164K, 및 I698V로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 (ii) QADTTKN (서열 번호13), ISDQTKH (서열 번호14), ASDSTKA (서열 번호15), NQDYTKT (서열 번호16), HDITKNI (서열 번호17), PQANANEN (서열 번호63), TNRTSPD (서열 번호24), PNSTHGS (서열 번호25), KDRAPST (서열 번호26), HQDTTKN (서열 번호19), HPDTTKN (서열 번호18), NKTTNKD (서열 번호20), GKSKVID (서열 번호23), PISNENEH (서열 번호64), LAQADTTKNA (서열 번호27), LAISDQTKHA (서열 번호28), LGISDQTKHA (서열 번호29), LAASDSTKAA (서열 번호30), LAHDITKNIA (서열 번호32), LPQANANENA (서열 번호37), LANQDYTKTA (서열 번호31), LATNRTSPDA (서열 번호39), LAPNSTHGSA (서열 번호40), LAKDRAPSTA (서열 번호41), LAHQDTTKNA (서열 번호34), LAHPDTTKNA (서열 번호33), LANKTTNKDA (서열 번호35), LAGKSKVIDA (서열 번호38), and LPISNENEHA (서열 번호36)로 이루어진 군에서 선택되는 펩티드 삽입물을 포함한다. 일부 실시형태에있어서, 변이체 AAV 캡시드는 특정 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 펩티드 삽입을 포함하고, 그렇지 않으면 서열 번호 1-12로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 조상 (ancestral) 캡시드 단백질이다. 조상 캡시드 단백질은 오늘날 자연에서 발견되는 캡시드 단백질의 진화론적 조상를 의미한다. 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV13 는 오늘날 자연에서 발견되는 AAV 캡시드 단백질 간의 축퇴 (degeneracy) 위치에서 무작위 아미노산 치환에 의해 실리코 (silico)에서 생성된다. 조상 캡시드의 하나의 비-제한적 예시가 하기에 제공되며, 여기서 축퇴 위치 (잔기 264, 266, 268, 448, 459, 460, 467, 470, 471, 474, 495, 516, 533, 547, 551, 555, 557, 561, 563, 577, 583, 593, 596, 661, 662, 664, 665, 710, 717, 718, 719, 723)는 "X"로 표시된다.
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSXSXGXTNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLXRTQSTGGTAGXXELLFSQXGPXXMSXQAKNWLPGPCYRQQRVSKTLXQNNNSNFAWTGATKYHLNGRXSLVNPGVAMATHKDDEXRFFPSSGVLIFGKXGAGXNNTXLXNVMXTXEEEIKTTNPVATEXYGVVAXNLQSSNTAPXTGXVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPXXFXXAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYAKSXNVDFAVXXXGVYXEPRPIGTRYLTRNL (서열 번호58)
일부 바람직한 실시형태에서, 조상 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 58에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이 또는 상응하는 모 AAV 캡시드와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 조상 변이체 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 기재된 바와 같이 AAV2의 아미노산 서열의 전체 길이 또는 상응하는 모 AAV 캡시드와 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 조상 캡시드 단백질은 서열 번호 58 또는 서열 번호 2에 개시된 조상 서열의 아미노산 서열의 전체 길이에 대한 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 % 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지고 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다: 264에서의 알라닌 (A), 266의 알라닌 (A), 268의 세린 (S), 448의 알라닌 (A), 459의 트레오닌 (T), 460의 아르기닌 (R), 467의 알라닌 (A), 470의 세린 (S), 471의 아스파라긴 (N), 474의 알라닌 (A), 495의 세린 (S), 516의 아스파라긴 (D), 533의 아스파라긴 (D), 547의 글루타민 (Q), 551의 알라닌 (A), 555의 알라닌 (A), 557에서 글루탐산 (E), 561에서 메티오닌 (M), 563에서 세린 (S), 577에서 글루타민 (Q), 583에서 세린 (S), 593에서 발린 (V), 트레오닌 596의 알라닌 (A), 661의 알라닌 (A), 662의 발린 (V), 664의 트레오닌 (T), 665의 프롤린 (P) 710의 트레오닌 (T), 717의 아스파르트 산 (D), 718의 아스파라긴 (N), 719의 글루탐산 (E) 및 723의 세린 (S). 일부 바람직한 실시형태에서, 변이체 캡시드 단백질은 다음의 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 %, 일부 경우 100 %의 아미노산 서열 동일성을 가지고 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다: 264에서의 알라닌 (A), 266에서의 알라닌 (A), 268에서의 세린 (S), 448의 알라닌 (A), 459의 트레오닌 (T), 460의 아르기닌 (R), 467의 알라닌 (A), 470의 세린 (S), 471의 아스파라긴 (N), 474의 알라닌 (A) 495의 세린 (S), 516의 아스파라긴 (D), 533의 아스파라긴 (D), 547의 글루타민 (Q), 551의 알라닌 (A), 555의 알라닌 (A), 557의 글루탐산 (E) 561의 메티오닌 (M), 563의 세린 (S), 577의 글루타민 (Q), 583의 세린 (S), 593의 발린 (V), 596의 트레오닌 (T), 661의 알라닌, 662의 발린 (V), 664의 트레오닌 (T), 665의 프롤린 (P), 710의 트레오닌 (T), 710의 트레오닌 (T), 717의 아스파트산 (D), 718의 아스파라긴 (N), 719의 글루탐산 (E), 723의 세린 (S).
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASAGSTNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLARTQSTGGTAGTRELLFSQAGPSNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSKTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSSGVLIFGKQGAGANNTALENVMMTSEEEIKTTNPVATEQYGVVASNLQSSNTAPVTGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAVFTPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYAKSTNVDFAVDNEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (서열 번호59).
다른 실시형태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 서열 번호 58의 조상 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 야생형 AAV 캡시드 서열과 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 % 또는 적어도 98 % 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고: 264에서의 알라닌 (A), 266에서의 알라닌 (A), 268에서의 세린 (S), 448에서의 알라닌 (A), 459에서의 트레오닌 (T), 460에서의 아르기닌 (R), 467에서의 알라닌 (A), 470에서의 세린 (S), 471에서의 아스파라긴 (N), 474에서의 알라닌 (A), 495에서의 세린 (S) (D) 533, 글루타민 (Q) 547, 알라닌 (A) 551, 알라닌 (A) 555, 글루탐산 (E) 557, 메티오닌 (M) 561 563의 세린 (S), 577의 글루타민 (Q), 583의 세린 (S), 593의 발린 (V), 596의 트레오닌 (T), 661의 알라닌 (A), 662의 발린 (V) 664의 트레오닌 (T), 665의 프롤린 (P), 710의 트레오닌 (T), 717의 아스파르트산 (D), 718의 아스파라긴 (N), 719의 글루탐산 (E), 723의 세린 (S); 또한 다음을 포함한다: i) P34A, S109T+V708I, A593E+N596D, V708I+V719M, V708I+G727D, S109T+A493V+A593E+V708I, V708I+R733C, Q164K, and I698V로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 (ii) 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 펩티드 삽입물 QADTTKN (서열 번호13), ISDQTKH (서열 번호14), ASDSTKA (서열 번호15), NQDYTKT (서열 번호16), HDITKNI (서열 번호17), PQANANEN (서열 번호63), TNRTSPD (서열 번호24), PNSTHGS (서열 번호25), KDRAPST (서열 번호26), HQDTTKN (서열 번호19), HPDTTKN (서열 번호18), NKTTNKD (서열 번호20), GKSKVID (서열 번호23), PISNENEH (서열 번호64), LAQADTTKNA (서열 번호27), LAISDQTKHA (서열 번호28), LGISDQTKHA (서열 번호29), LAASDSTKAA (서열 번호30), LAHDITKNIA (서열 번호32), LPQANANENA (서열 번호37), LANQDYTKTA (서열 번호31), LATNRTSPDA (서열 번호39), LAPNSTHGSA (서열 번호40), LAKDRAPSTA (서열 번호41), LAHQDTTKNA (서열 번호34), LAHPDTTKNA (서열 번호33), LANKTTNKDA (서열 번호35), LAGKSKVIDA (서열 번호38), and LPISNENEHA (서열 번호36). 일부 실시형태에있어서, 변이체 AAV 캡시드는 특정 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 펩티드 삽입을 포함하고, 그렇지 않으면 서열 번호 59와 동일하다.
본원에 개시된 AAV 변이체는 생체 내 투여 후 영장류 망막 스크린의 사용을 포함하는 생체 내 유도 진화로 생성되었다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 변이체 캡시드 단백질은 AAV 비리온에 존재할 때 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질 또는 야생형 AAV를 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포의 형질 도입과 비교하여 망막 세포의 증가된 형질 도입을 부여한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 변이체 캡시드 단백질은 AAV 비리온에 존재할 때 상응하는 모체 AAV 캡시드 단백질 또는 야생형 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온보다 더욱 효과적인 형질 도입을 부여하고, 예를 들어 망막 세포는 모 AAV 캡시드 단백질 또는 야생형 AAV를 포함하는 AAV 비리온보다 본 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온을 더 많이 취한다. 일부 이러한 실시형태에서, AAV 변이체 비리온 또는 변이체 rAAV는 야생형 AAV 비리온 또는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV에 의한 망막 세포의 형질 도입과 비교하여, 망막 세포의 형질 도입이 적어도 2 배, 적어도 5 배, 적어도 10 배, 적어도 15 배, 적어도 20 배, 적어도 25 배, 적어도 50 배, 또는 50 배 이상의 증가를 보인다. 이러한 특정 양태에서, 본원에 개시된 변이체 캡시드 단백질은 AAV 비리온에 존재할 때, 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질 또는 야생형 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온보다 광범위한 영장류 망막 세포의 형질 도입을 부여한다. 즉, 변이체 AAV 비리온은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 비리온에 의해 형질 도입되지 않는 세포형을 형질 도입시키고 이에 따라 대응하는 모 AAV 비리온보다 망막에서 더 많은 유형의 세포를 형질 도입시킨다. 일부 실시형태에서, AAV 변이체 비리온은 우선적으로 망막 세포를 형질 전환시키고, 예를 들어 본 rAAV 비리온은다른 망막 세포 또는 비 망막 세포, 예를 들어 눈 밖에있는 세포보다 망막 세포를 2 배, 5 배, 10 배, 15 배, 20 배, 25 배, 50 배, 50 배 이상 특이적으로 감염시킨다. 일부 실시형태에서, 형질 감염된 망막 세포는 광 수용체 세포 (예를 들어, 로드형, 원추형)이다. 일부 실시형태에서, 망막 세포는 망막 신경절 세포 (RGC)이다. 일부 실시형태에서, 망막 세포는 망막 상피세포 (RPE 세포)이다. 일부 실시형태에서, 망막 세포는 뮐러 (Muller) 교세포이다. 일부 실시형태에서, 망막 세포는 소교 세포이다. 일부 실시형태에서, 망막 세포는 무축삭 세포이다. 일부 실시형태에서, 망막 세포는 양극성 세포이다. 일부 실시형태에서, 망막 세포는 수평 세포이다. 망막 세포의 형질 도입의 증가, 예를 들어, 형질 도입의 증가된 효율,보다 광범위한 형질 도입,보다 특이적인 형질 도입 등은 유전자 발현 측정 기술의 임의의 수의 방법에 의해 시험관 내 또는 생체 내에서 용이하게 평가 될 수 있다. 예를 들어, AAV는 유비쿼터스 또는 조직 특이적 프로모터의 제어 하에 리포터 유전자, 예를 들어 형광 단백질을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 게놈으로 패키징될 수 있으며, 형질 전환의 정도는 예를 들어 형광 현미경에 의한 형광 단백질을 검출함으로써 평가된다. 또 다른 예로서, AAV는 바 코딩 된 핵산 서열을 포함하는 게놈으로 패키징 될 수 있고, 형질 전환의 정도는 예를 들어 PCR에 의해 핵산 서열을 검출함으로써 평가 될 수 있다. 또 다른 예로서, AAV는 망막 질환의 치료를 위한 치료 학적 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 게놈으로 패키징 될 수 있고, 형질 감염의 정도는 환자의 망막 질환의 치료를 검출함으로써 평가 될 수 있다 AAV.
본원에 개시된 변이체 rAAV 벡터 또는 비리온 및/또는 방법을 사용하여 치료할 수 있는 안구 질환은 단발성 질환, 복합 유전 질환, 후천성 질환 및 외상성 상해를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 단발성 질환의 예로는 Bardet-Biedl 증후군; 배튼 질환; Bietti의 결정 이상증 (Crystalline Dystrophy); 범맥락막위축 (choroideremia); 맥락 망막 위축; 맥락 망막 변성; 콘 또는 원추형 근이영양증 (상 염색체 우성, 상 염색체 열성 및 X 연관); 선천성 고정 야간 실명 (상 염색체 우성, 상 염색체 열성 및 X 연관); 색전 장애 (ACHM2, ACHM3, ACHM4 및 ACHM5 포함), 망막증, 중두근증 및 삼투압증을 포함한 색맹 장애; 프리드리히 운동 실조증; LCA1, LCA2, LCA3, LCA4, LCA6, LCA7, LCA8, LCA12 및 LCA15를 포함하되 이에 국한되지 않는 Leber의 선천적 흑암시 (amaurosis) (상 염색체 우성 및 상 염색체 열성); Leber의 유전성 시신경 병증; 급성 황반 변성, 베스트 노란자모양 황반변성 (Best vitelliform macular dystrophy), 패턴 영양 장애, 노스캐롤라이나 황반변성, 유전적 드루젠 (drusen), Sorsby의 안저 이영양증, 말라티아 레반타네제 (malattia levantanese) 및 유전적으로 결정된 망막 병증을 포함하는 (그러나 이에 국한되지는 않음) 황반 수축 (상 염색체 우성 및 상 염색체 열성) 조산; 안구 망막 발달 질환; 안구 건조증; 시신경 위축 (상 염색체 우성, 상 염색체 열성 및 X 연관); RP2, RP3, RP10, RP20, RP38, RP40 및 RP43을 포함하는 망막염 색소 상피 (상 염색체 우성, 상 염색체 열성, X- 연결된 및 미토콘드리아 계승 형질); X- 연결된 망막증; 스타가르트 (Stargardt) 병; USH1B, USH1C, USH1D, USH1F, USH1G, USH2A, USH2C, USH2D 및 USH3를 포함하지만 이에 한정되지 않는 어셔 증후군을 포함한다. 복잡한 유전 질환의 예로는 제한되지는 않지만 녹내장 (개방각, 폐쇄각, 저압, 정상-긴장, 선천성, 신생 혈관, 색소성, 거짓 각화증); 급성 황반변성, 난 형성 황반변성과 같은 연령 관련 및 기타 형태의 황반변성, 삼출성 및 비 삼출성 형태 (상 염색체 우성 및 상 염색체 열성); 미숙아 망막 병증; Vogh Koyanagi-Harada (VKH) 증후군을 포함한다. 후천성 질환의 예로는 제한되지는 않지만 급성 황반신 망막 병증; 전 허혈성 시신경 병증 및 후 허혈성 시신경 병증; 베체트 병; 망막 정맥 폐쇄; 맥락막 혈관 신생; 증식 성 당뇨 망막 병증 및 관련 합병증을 포함하는 당뇨병성 망막증; 당뇨병 포도막염; 부종, 예컨대 황반 부종, 낭포 성 황반 부종 및 당뇨병성 황반 부종; 망막 전막 질환; 황반 모세 혈관 확장증; 다 병성 맥락막염; 비 망막 병증 당뇨병성 망막 기능 장애; 안구 종양; 시신경 위축; 망막 박리; 중심 망막 정맥 폐쇄, 증식 성 유리체 망막 병증 (PVR), 망막 동맥 및 정맥 폐쇄 질환, 혈관 폐색, 폐색 성 망막 질환과 같은 망막 장애; 유문 삼출; 망막 감염 및 침윤성 질환; 후천성 시신경 위축과 같은 시신경 질환을 포함한다. 외상성 부상의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만 히스토플라스마 증; 시신경 외상; 후 안과 부위 또는 위치에 영향을 미치는 안 외상; 망막 외상; 눈의 바이러스 성 감염; 시신경의 바이러스 감염; 안구 레이저 치료에 의해 유발되거나 영향을받은 후 안과 질환; 광 역학 치료에 의해 유발되거나 영향을받은 후 안과 질환; 광응고술, 방사선 망막증; 및 교감 신경 안과를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본원에 개시된 변이체 캡시드는 유전자 제품 (예를 들어, 간섭 RNA, 긴 비 - 코딩 RNA, 짧은 비 - 코딩 RNA, 안티센스 RNA 등)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함한다. 단일 사슬 항체, VHH 도메인, 가용성 수용체, 결합체, knottin, DARPin, 센추린, 샤페론, 부위 특이적 뉴클레오티드를 제공하는 부위 특이적 뉴클레아제를 포함할 수 있다. 유전자 기능의 넉 - 다운 (knock-down) 또는 전사의 유전자 특이적 활성화를 제공하는 변형된 부위 특이적 뉴클레아제 (nuclease)를 포함한다.
본원에 개시된 rAAV 변이체는 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 간섭 RNA이다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 긴 비-코딩 RNA이다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 짧은 비-코딩 RNA이다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 안티센스 RNA이다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 앱타머이다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 분비된 항체이다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 단일 사슬 항체이다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 VHH 도메인이다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 가용성 수용체이다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 결합체이다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 노틴이다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 DARPin이다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 센투린이다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 샤페론이다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 부위 특이적 뉴클레오티드로서 유전자 기능의 부위 특이적 녹다운을 제공한다.
유전자 산물의 용도는 세포에서 인자 (factor)의 수준을 높이는 것, 인자의 분비를 통해 이웃 세포에서 인자의 수준을 높이는 것, 세포에서 인자의 수준을 줄이는 것, 또는 인자의 분비를 통해 이웃 세포에서 인자의 레벨을 감소시키는 것을 포함한다. 유전자 산물은 누락 유전자 산물의 결함 수준을 보충하고, 누락 유전자 산물의 결함 수준을 감소 시키며, 새로운 지지 유전자 산물을 도입하고, 지지 유전자 산물의 수준을 보충하고, 장애 유전자 생성물의 수준을 감소시키고, 지지 유전자 생성물의 수준을 도입하거나 보충한다.
대상 AAV 변이체에 의해 전달 된 유전자 산물은 망막 질환 및 외상에 직접 또는 간접적으로 연결된 유전자 산물 또는 유전자 산물의 활성을 변화 시키는데 사용될 수 있다. 유전자 생성물이 유전적 질병과 직접 또는 간접적으로 관련되어있는 유전자는 예를 들어 ADP- 리보실 레이션 인자 유사 6 (ARL6); BBSome 상호 작용 단백질 1 (BBIP1); BBSome 단백질 1 (BBS1); BBSome 단백질 2 (BBS2); BBSome 단백질 4 (BBS4); BBSome 단백질 5 (BBS5); BBSome 단백질 7 (BBS7); BBSome 단백질 9 (BBS9); BBSome 단백질 10 (BBS10); BBSome 단백질 12 (BBS12); 중심 아미노산 단백질 290 kDa (CEP290); 편모내 수송 단백질 172 (IFT172); 편모내 (intraflagellar) 수송 단백질 27 (IFT27); 이노시톨 폴리포스페이트-5-포스파타제 E (INPP5E); 내향 정류형 칼륨 채널 서브 패밀리 J 멤버 13 (KCNJ13); 루신 지퍼 전사 인자-1 (LZTFL1); McKusick-Kaufman 증후군 단백질 (MKKS); 메켈 증후군 유형 1 단백질 (MKS1); 네프로 포프티시스 (nephronophthisis) 3 단백질 (NPHP1); 혈청학적으로 정의된 결장암 항원 8 (SDCCAG8); 삼중 항체 모티프 - 함유 단백질 32 (TRIM32); 테트라 트리 코펩티드 반복 도메인 8 (TTC8); 배튼 질병 단백질 (CLN3); 시토크롬 P450 4V2 (CYP4V2); 랩 호위 단백질 1 (CHM); PR (양성 조절) 도메인 함유 13 단백질 (PRDM13); RPE- 망막 G 단백질 결합 수용체 (RGR); TEA 도메인 패밀리 멤버 1 (TEAD1); 아릴 탄화수소 상호 작용 수용체 단백질 유사 1 (AIPL1); 원뿔 - 막대 otx-유사 광 수용체 호메오박스(homeobox) 전사 인자 (CRX); 구아닐산 시클라제 활성화 단백질 1A (GUCA1A); 망막 - 특이적 구아닐레이트 사이클라제 (GUCY2D); 포스파티딜 이노시톨 전달 막-관련 패밀리 멤버 3 (PITPNM3); 프로타민 1 (PROM1); 페리페린(PRPH); 페리페린 2 (PRPH2); 시냅스 막 엑소 사이토킨 단백질 1 (RIMS1) 조절; 세마 포린 4A (SEMA4A); C. 엘레강스 (elegans) unc119 단백질 (UNC119)의 인간 상동체; ATP 결합 카세트 운반자 - 망막 (ABCA4); ADAM 메탈 펩티다아제 도메인 9 (ADAM9); 활성화 전사 인자 6 (ATF6); 21 번 염색체 리딩 프레임 2 (C21orf2); 제 8 염색체 리딩 프레임 37 (C8orf37); 칼슘 채널; 전압 의존; 알파 2 / 델타 서브 유닛 4 (CACNA2D4); 커들린 관련 패밀리 멤버 1 (프로토 커들린 21) (CDHR1); 세라미드 키나아제 유사 단백질 (CERKL); 콘 광 수용체 cGMP- 게이트 양이온 채널 알파 서브 유닛 (CNGA3); 원뿔 고리형 뉴클레오티드-게이티드 양이온 채널 베타 3 서브 유니트 (CNGB3); 사이클린 M4 (CNNM4); 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 (G 단백질); α 형질 전환 활성 폴리펩티드 2 (GNAT2); 포타슘 채널 서브 패밀리 V 멤버 2 (KCNV2); 포스포 디에스테라제 6C (PDE6C); 포스포 디에스테라제 6H (PDE6H); 중심체 1 중심체 단백질 B (POC1B)의 프로테옴; RAB 암 유전자 패밀리 (RAB28)의 RAB28 멤버; 망막 및 전방 신경 접합체 호메오박스 2 전사 인자 (RAX2); 11-시스 레티놀 탈수소효소 5 (RDH5); RP GTPase 조절자-상호 작용 단백질 1 (RPGRIP1); 튜불린 티로신 리가아제 유사 멤버 5 (TTLL5); L형 전압 의존 칼슘 채널 알파 -1 서브 유닛 (CACNA1F); 망막 색소성 GTPase 조절 자 (RPGR); 로드 트랜스듀신 알파 소단위 (GNAT1); 막대 cGMP 포스포 디에스테라제 베타 서브 유닛 (PDE6B); 로돕신 (RHO); 칼슘 결합 단백질 4 (CABP4); G 단백질 결합 수용체 179 (GPR179); 로돕신 키나제 (GRK1); 대사성 글루타메이트 수용체 6 (GRM6); 류신이 풍부한 반복 면역 글로불린과 같은 막 통로 단백질 3 (LRIT3); 아레스틴n (s-항원) (SAG); 용질 캐리어 패밀리 24 (SLC24A1); 일과성 수용체 전위 양이온 채널 서브패밀리의 M 1 멤버(TRPM1); 니크타로핀 (nyctalopin)(NYX); 초록색 콘 옵신 (OPN1LW); 붉은 콘 옵신 (OPN1MW); 블루 콘 옵신 (OPN1SW); 프라탁신 (FXN); 이노신 모노 포스페이트 탈수소효소 1 IMPDH1); 오르토덴티클 호메오박스 2 단백질 (OTX2); 클러스터 동족체 1 (CRB1); 단백질이 포함된 사멸 도메인 1 (DTHD1); 성장 분화 인자 6 (GDF6); 내막 수송 (intraflagellar transport) 140 클라미도모나스 (Chlamydomonas) 동소체 단백질 (IFT140); IQ 모티프 함유 B1 단백질 (IQCB1); 레베리 린 (LCA5); 레시틴 레티놀 아실 전이효소 (LRAT); κ 니코틴 아미드 뉴클레오티드 아데닐릴 트랜스퍼라제 1 (NMNAT1); RD3 단백질 ( RD3); 레티놀 탈수소 효소 12 (RDH12); 망막 색소 상피세포 특이적 65 kD 단백질 (RPE65); 정자 형성 관련 단백질 7 (SPATA7); 투비-유사 단백질 1 (TULP1); 미토콘드리아 유전자 (KSS, LHON, MT-ATP6, MT-TH, MT-TL1, MT-TP, MT-TS2, 미토콘드리아성 코팅 NADH 탈수소효소 [MT-ND]); 베스트로핀 1 (BEST1); C1q 및 종양 괴사 관련 단백질 5 콜라겐 (C1QTNF5); EGF- 함유 피브릴-유사 세포외 기질 단백질 1 (EFEMP1); 매우 긴 지방산 단백질의 연신 (ELOVL4); 망막 파신 동족체 2 번들링 액틴 단백질 (FSCN2); 구아닐산 시클라제 활성화 단백질 1B (GUCA1B); 헤미센틴 1 (HMCN1); 세포내 수용체 매트릭스 프로테오글리칸 1 (IMPG1); 망막염 색소성 1 형 단백질 1 (RP1L1); 메탈 메탈로프로테이나제-3 (TIMP3)의 조직 억제제; 보체 인자 H (CFH); 보체 인자 D (CFD); 보체 성분 2 (C2); 보체 성분 3 (C3); 보체 인자 B (CFB); DNA 손상 조절 자가포식 변환기 2 (DRAM2); 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 2 (VCAN); 미토푸신 2(MFN2); 핵 수용체 서브 패밀리 2 그룹 F 멤버 (1) (NR2F1); 시신경 위축 1 (OPA1); 막통과 단백질 126A (TMEM126A); 내부 미토콘드리아 막 트랜스 코카아제 8 동족체 A (TIMM8A); 탄산 탈수 IV (CA4); 헥소키나제 1 (HK1); KELCH 유사 7 단백질(KLHL7); 핵 수용체 서브 패밀리 2 그룹 E3 (NR2E3); 신경 망막 루신 지퍼 (NRL); 후각 수용체 그룹 2 서브 패밀리 W 멤버 3 (OR2W3); 전 mRNA의 프로세싱 인자 3 (PRPF3); 전 mRNA의 프로세싱 인자 4 (PRPF4); 전 mRNA의 프로세싱 인자 6 (PRPF6); pre-mRNA 프로세싱 인자 8 (PRPF8); 전 mRNA의 프로세싱 인자 31 (PRPF31); 망막 외측 막 단백질 1 (ROM1); 망막 색소성 단백질 1 (RP1); PIM1- 키나아제 관련 단백질 1 (RP9); 작은 핵 리보 핵 단백질 200kDa (SNRNP200); 분비된 인산화 단백질 2 (SPP2); 토포이소머라제 I 결합 아르기닌 / 세린이 풍부한 단백질 (TOPORS); ADP-리보실화 계수형 결합 단백질 2 (ARL2BP); 염색체 2 오픈 리딩 프레임 71 (C2orf71); 클라린-1 (CLRN1); 막대 cGMP- 게이트 채널 알파 서브 유닛 (CNGA1); 막대 cGMP-게이트 채널 베타 서브 유닛 (CNGB1); 시토크롬 P450 4V2 (CYP4V2); 데히드로도리실 포스페이트 신타제 (DHDDS); DEAH 박스 폴리펩티드 38 (DHX38); ER 멤브레인 단백질 복합체 서브 유니트 1 ( EMC1); 눈 유전자 생성물이 유전적 질병과 직접 또는 간접적으로 관련되어있는 유전자는 예를 들어 ADP- 리보실 레이션 인자 유사 6 (ARL6); BBSome 상호 작용 단백질 1 (BBIP1); BBSome 단백질 1 (BBS1); BBSome 단백질 2 (BBS2); BBSome 단백질 4 (BBS4); BBSome 단백질 5 (BBS5); BBSome 단백질 7 (BBS7); BBSome 단백질 9 (BBS9); BBSome 단백질 10 (BBS10); BBSome 단백질 12 (BBS12); 중심 아미노산 단백질 290 kDa (CEP290); 편모내 수송 단백질 172 (IFT172); 편모내 (intraflagellar) 수송 단백질 27 (IFT27); 이노시톨 폴리포스페이트-5-포스파타제 E (INPP5E); 내향 정류형 칼륨 채널 서브 패밀리 J 멤버 13 (KCNJ13); 루신 지퍼 전사 인자 -1 (LZTFL1); McKusick-Kaufman 증후군 단백질 (MKKS); 메켈 증후군 유형 1 단백질 (MKS1); 네프로 포프티시스 (nephronophthisis) 3 단백질 (NPHP1); 혈청학적으로 정의된 결장암 항원 8 (SDCCAG8); 삼중 항체 모티프 - 함유 단백질 32 (TRIM32); 테트라 트리 코펩티드 반복 도메인 8 (TTC8); 배튼 질병 단백질 (CLN3); 시토크롬 P450 4V2 (CYP4V2); 랩 호위 단백질 1 (CHM); PR (양성 조절) 도메인 함유 13 단백질 (PRDM13); RPE- 망막 G 단백질 결합 수용체 (RGR); TEA 도메인 패밀리 멤버 1 (TEAD1); 아릴 탄화수소 상호 작용 수용체 단백질 유사 1 (AIPL1); 원뿔 - 막대 otx-유사 광 수용체 호메오박스(homeobox) 전사 인자 (CRX); 구아닐산 시클라제 활성화 단백질 1A (GUCA1A); 망막 - 특이적 구아닐레이트 사이클라제 (GUCY2D); 포스파티딜 이노시톨 전달 막-관련 패밀리 멤버 3 (PITPNM3); 프로타민 1 (PROM1); 페리페린(PRPH); 페리페린 2 (PRPH2); 시냅스 막 엑소 사이토킨 단백질 1 (RIMS1) 조절; 세마 포린 4A (SEMA4A); C. 엘레강스 (elegans) unc119 단백질 (UNC119)의 인간 상동체; ATP 결합 카세트 운반자 - 망막 (ABCA4); ADAM 메탈 펩티다아제 도메인 9 (ADAM9); 활성화 전사 인자 6 (ATF6); 21 번 염색체 리딩 프레임 2 (C21orf2); 제 8 염색체 리딩 프레임 37 (C8orf37); 칼슘 채널; 전압 의존; 알파 2 / 델타 서브 유닛 4 (CACNA2D4); 커들린 관련 패밀리 멤버 1 (프로토 커들린 21) (CDHR1); 세라미드 키나아제 유사 단백질 (CERKL); 콘 광 수용체 cGMP- 게이트 양이온 채널 알파 서브 유닛 (CNGA3); 원뿔 고리형 뉴클레오티드-게이티드 양이온 채널 베타 3 서브 유니트 (CNGB3); 사이클린 M4 (CNNM4); 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 (G 단백질); α 형질 전환 활성 폴리펩티드 2 (GNAT2); 포타슘 채널 서브 패밀리 V 멤버 2 (KCNV2); 포스포 디에스테라제 6C (PDE6C); 포스포 디에스테라제 6H (PDE6H); 중심체 1 중심체 단백질 B (POC1B)의 프로테옴; RAB 암 유전자 패밀리 (RAB28)의 RAB28 멤버; 망막 및 전방 신경 접합체 호메오박스 2 전사 인자 (RAX2); 11-시스 레티놀 탈수소효소 5 (RDH5); RP GTPase 조절자-상호 작용 단백질 1 (RPGRIP1); 튜불린 티로신 리가아제 유사 멤버 5 (TTLL5); L형 전압 의존 칼슘 채널 알파 -1 서브 유닛 (CACNA1F); 망막 색소성 GTPase 조절 자 (RPGR); 로드 트랜스듀신 알파 소단위 (GNAT1); 막대 cGMP 포스포 디에스테라제 베타 서브 유닛 (PDE6B); 로돕신 (RHO); 칼슘 결합 단백질 4 (CABP4); G 단백질 결합 수용체 179 (GPR179); 로돕신 키나제 (GRK1); 대사성 글루타메이트 수용체 6 (GRM6); 류신이 풍부한 반복 면역 글로불린과 같은 막 통로 단백질 3 (LRIT3); 아레스틴n (s-항원) (SAG); 용질 캐리어 패밀리 24 (SLC24A1); 일과성 수용체 전위 양이온 채널 서브패밀리의 M 1 멤버(TRPM1); 니크타로핀 (nyctalopin)(NYX); 초록색 콘 옵신 (OPN1LW); 붉은 콘 옵신 (OPN1MW); 블루 콘 옵신 (OPN1SW); 프라탁신 (FXN); 이노신 모노 포스페이트 탈수소효소 1 IMPDH1); 오르토덴티클 호메오박스 2 단백질 (OTX2); 클러스터 동족체 1 (CRB1); 단백질이 포함된 사멸 도메인 1 (DTHD1); 성장 분화 인자 6 (GDF6); 내막 수송 (intraflagellar transport) 140 클라미도모나스 (Chlamydomonas) 동소체 단백질 (IFT140); IQ 모티프 함유 B1 단백질 (IQCB1); 레베리 린 (LCA5); 레시틴 레티놀 아실 전이효소 (LRAT); κ 니코틴 아미드 뉴클레오티드 아데닐릴 트랜스퍼라제 1 (NMNAT1); RD3 단백질 (RD3); 레티놀 탈수소 효소 12 (RDH12); 망막 색소 상피세포 특이적 65 kD 단백질 (RPE65); 정자 형성 관련 단백질 7 (SPATA7); 투비-유사 단백질 1 (TULP1); 미토콘드리아 유전자 (KSS, LHON, MT-ATP6, MT-TH, MT-TL1, MT-TP, MT-TS2, 미토콘드리아성 코팅 NADH 탈수소효소 [MT-ND]); 베스트로핀 1 (BEST1); C1q 및 종양 괴사 관련 단백질 5 콜라겐 (C1QTNF5); EGF- 함유 피브릴-유사 세포외 기질 단백질 1 (EFEMP1); 매우 긴 지방산 단백질의 연신 (ELOVL4); 망막 파신 동족체 2 번들링 액틴 단백질 (FSCN2); 구아닐산 시클라제 활성화 단백질 1B (GUCA1B); 헤미센틴 1 (HMCN1); 세포내 수용체 매트릭스 프로테오글리칸 1 (IMPG1); 망막염 색소성 1 형 단백질 1 (RP1L1); 메탈 메탈로프로테이나제-3 (TIMP3)의 조직 억제제; 보체 인자 H (CFH); 보체 인자 D (CFD); 보체 성분 2 (C2); 보체 성분 3 (C3); 보체 인자 B (CFB); DNA 손상 조절 자가포식 변환기 2 (DRAM2); 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 2 (VCAN); 미토푸신 2(MFN2); 핵 수용체 서브 패밀리 2 그룹 F 멤버 (1) (NR2F1); 시신경 위축 1 (OPA1); 막통과 단백질 126A (TMEM126A); 내부 미토콘드리아 막 트랜스 코카아제 8 동족체 A (TIMM8A); 탄산 탈수 IV (CA4); 헥소키나제 1 (HK1); KELCH 유사 7 단백질(KLHL7); 핵 수용체 서브 패밀리 2 그룹 E3 (NR2E3); 신경 망막 루신 지퍼 ( NRL); 후각 수용체 그룹 2 서브 패밀리 W 멤버 3 (OR2W3); 전 mRNA의 프로세싱 인자 3 (PRPF3); 전 mRNA의 프로세싱 인자 4 (PRPF4); 전 mRNA의 프로세싱 인자 6 (PRPF6); pre-mRNA 프로세싱 인자 8 (PRPF8); 전 mRNA의 프로세싱 인자 31 (PRPF31); 망막 외측 막 단백질 1 (ROM1); 망막 색소성 단백질 1 (RP1); PIM1- 키나아제 관련 단백질 1 (RP9); 작은 핵 리보 핵 단백질 200kDa (SNRNP200); 분비된 인산화 단백질 2 (SPP2); 토포이소머라제 I 결합 아르기닌 / 세린이 풍부한 단백질 (TOPORS); ADP-리보실화 계수형 결합 단백질 2 (ARL2BP); 염색체 2 오픈 리딩 프레임 71 (C2orf71); 클라린-1 (CLRN1); 막대 cGMP- 게이트 채널 알파 서브 유닛 (CNGA1); 막대 cGMP-게이트 채널 베타 서브 유닛 (CNGB1); 시토크롬 P450 4V2 (CYP4V2); 데히드로도리실 포스페이트 신타제 (DHDDS); DEAH 박스 폴리펩티드 38 (DHX38); ER 멤브레인 단백질 복합체 서브 유니트 1 ( EMC1); 눈 셔트 /스페이스메이커 동족체 (EYS); 서열 유사성을 지닌 패밀리 161 멤버 A (FAM161A); G 단백질 결합 수용체 (125) (GPR125); 헤파란 알파 글루코 N 아세틸 트랜스퍼라제 (HGSNAT); NAD (+) - 특이적 이소시토틴 탈수소 효소 3 베타 (IDH3B); 세포내 수용체 매트릭스 프로테오글리칸 2 (IMPG2); KIAA1549 단백질 (KIAA1549); 키즈나 중심체 돌연변이 단백질 (KIZ); 수컷 생식 세포 관련 키나아제 (MAK); c-mer 프로테오온코진 수용체 티로신 키나아제 (MERTK); 메발론산 염기 (MVK); (네버 인 분열 유전자 A) NIMA 키나제 2 (NEK2)-관련; 신경 세포 분화 단백질 1 (뉴로디드 1); cGMP 포스포 디에스테라제 알파 소단위 (PDE6A); 포스 6G cGMP의 특정 로드 감마 (PDE6G); 프로그레시브로드 콘 변성 단백질 (PRCD); 레티놀 결합 단백질 3 (RBP3); 레티놀 결합 단백질 1(RLBP1); 용질 캐리어 패밀리 14 (7) 멤버(SLC7A14); 유서린 (USH2A); 징크 핑거 단백질 408 (ZNF408); 징크 핑거 단백질 513 (ZNF513); 구강 안면 디지털 증후군 1 단백질 (OFD1); 망막 색소 변이체 2 ( RP2); 레티노사이트신 (RS1); 단백질을 함유하는 아브 하이드롤라제 도메인 12 (ABHD12); 캐더린 유사유전자 23 (CDH23); 중심체 아미노산 단백질 250 kDa (CEP250); 칼슘과 인테그린 결합 패밀리 멤버 2 (CIB2); 헐린 (DFNB31); 독성 유발성 발작 감수성 1 동족체 (GPR98); 히스 티딜의 tRNA 합성 효소 (HARS); 마이오신 VIIA (MYO7A); 프로토캐들린 15 ( PCDH15); 하모닌 (USH1C); 안키린 반복 및 SAM 도메인 (USH1G)를 함유하는 마우스 골격 단백질의 인간 동족체; 디스트로핀 (DMD); 노린(NDP); 포스포 키나아제 (PGK1); 칼파인 5 ( CAPN5); 프리질리드-4 Wnt 수용체 상동체 (FZD4); 내장 막 단백질 2B (ITM2B); 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질 5 (LRP5); 마이크로 RNA 204 (MIR204); 망막 단백질 1(RB1); 12 테트라스파닌 (TSPAN12); 염색체 12 오픈 리딩 프레임 65 (C12orf65); 캐들린 3 (CDH3); 막 유형 프리질리드 관련 단백질 (MFRP); 오르니틴 아미노 트랜스퍼라아제 (OAT); 포스포 리파아제 A2 그룹 V (PLA2G5); 레티놀 결합 단백질 4 (RBP4); 신호링 G 단백질의 시그널링 9 조절기 (RGS9); G 단백질의 조절기 9 - 결합 단백질 (RGS9BP); ARMS2; 절개 회복 교차 보완 설치류 회복 부족 보체 그룹 6 단백질 (ERCC6); 피블린 5 (FBLN5); HtrA 세린 티다 1 (HTRA1); 톨-유사 수용체 3 (TLR3); 및 톨-유사 수용체 4 (TLR4).
유전자 산물이 세포 사멸을 유도하거나 촉진시키는 유전자는 본래 "아폽토시스-촉진 (pro-apoptotic) 유전자"라고하며, 이들 유전자 (mRNA, 단백질)의 산물은 "아폽토시스-촉진 산물s"라고 불린다. 아폽토시스-촉진 목표는 예를 들어 Bax 유전자 산물; 비드 유전자 산물; 박 (Bak) 유전자 산물; 바드 (Bad) 유전자 산물; Bcl-2; Bcl-X1을 포함한다. 항-세포 사멸 유전자 산물은 X- 결합된 아폽토시스 억제제를 포함한다.
(mRNA의 단백질)의 유전자, 그 제품 또는 유도 혈관 신생을 촉진 "프로 - 혈관 신생 유전자" 및 그 유전자의 산물로 지칭되는 유전자 . "프로 - 혈관 신생 유전자 산물"라고도을 혈관 신생-촉진 타겟은 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자 (VEGFa, VEGFb, VEGFc, VEGFd); 혈관 내피 성장 인자 수용체 1 (VEGFR1); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); Fms 관련 티로신 키나아제 1 (Flt1); 태반 성장 인자 (PGF); 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF); 안지 오포이에틴; 소닉 헤지호그를 포함한다. 유전자 생성물이 혈관 신생을 억제하는 유전자는 본원에서 "항-혈관 형성 유전자"로 지칭되고, 이들 유전자 (mRNA; 단백질)의 생성물은 "항-혈관 형성 유전자 산물"로 언급된다. 항-혈관 신생 유전자 생성물은 엔도스타틴; 텀스타틴; 안지오스타틴; VEGF 융합 단백질 sFLT1 또는 Eylea, VEGF 특이적 항체 LucentisTM 및 AvastinTM 과 같은 전구 혈관 형성 표적 및/또는 그들의 수용체에 특이적인 융합 단백질 또는 항체,
유전자 산물이 면역 조절제, 예를 들어 보체 인자, 톨-유사 수용체 (toll-like receptors)로서 기능하는 유전자를 "면역 조절 유전자 (immunomodulatory genes)"라고 부른다. 예시적인 면역 조절 유전자는 사이토카인, 케모카인, 및 이들 및/또는 이들의 수용체, 예를 들면 항 IL-6 융합 단백질 Rilonacept TM , 보체 인자 H 특이 항체 람파미주맙 등, 신경 보호 인자로서 기능하는 유전자 산물을 가진 유전자, 예를 들어 혈소판 유도 성장 인자 수용체 (PDGFR); 교질 세포 신경 영양 인자 (GDNF); 로드 유래 생존 능력 인자 (RdCVF); 섬유 아세포 성장 인자 (FGF); 뉴투린 (neurturin, NTN); 섬모낭 신경 영양 인자 (ciliary neurotrophic factor; CNTF); 신경 성장 인자 (NGF); 뉴로트로핀-4 (NT4); 뇌 유도 신경영 인자 (BDNF); 표피 성장 인자를 포함한다. 이들 유전자 산물은 광 반응 옵신, 예를 들면, 옵신 ; 로돕신; 채널 로돕신; 할로 로돕신으로 기능한다.
일부의 경우, 목적 유전자 생산물은 부위 특이적 엔도뉴클레아제이며, 예를 들어, 엔도뉴클레아제스트가 망막 질환과 관련된 대립 유전자를 노크하는 경우와 같이, 유전자 기능의 부위 특이적 노크 다운을 제공한다. 예를 들어, 지배적 인 대립 유전자가 야생형 일 때 망막 구조 단백질이거나 정상 망막 기능을 제공하는 결함이있는 유전자를 코딩하는 경우, 부위 특이적 엔도 누 클레아 제가 결함있는 대립 유전자를 표적으로 삼아 노크 아웃 할 수 있다 결함있는 대립 유전자.
결함있는 대립 형질을 노크하는 것 이외에도, 부위 특이적 뉴클레아제를 사용하여 결함이있는 대립 형질에 의해 코딩되는 단백질의 기능적 복제를 코딩하는 공여자 DNA와 동종 재조합을 자극할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 대상 rAAV 비리온은 결함이있는 대립 유전자를 노크하는 부위 특이적 엔도뉴클레아제를 전달하는 데 사용될 수 있으며, 결함이있는 대립 유전자의 기능적 복제를 전달하여 결함이있는 대립 유전자의 수리를 유도함으로써, 기능성 망막 단백질 (예를 들어, 기능성 레티노 키신, 기능성 RPE65, 기능성 peripheral 등)의 생산에 사용됩니다. 예를 들어, Li et al. (2011) Nature 475 : 217 참고. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 rAAV 비리온은 부위 특이적 엔도뉴클레아제를 코딩하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다; 및 기능적 복제가 기능성 망막 단백질을 암호화하는 결함있는 대립 유전자의 기능적 복제를 암호화하는 이종 누클레오티드 서열을 포함한다. 기능성 망막 단백질은 예를 들어, 레티노시신, RPE65, 망막 색소성 GTPase 조절 인자 (RGPR)-상호 작용 단백질 -1, 페리페린, 페리페린-2 등을 포함한다.
use 사용에 적합한 부위 특이적 엔도뉴클레아제에는 예를 들어 메가 누이 아제; 징크 핑커 뉴클레아제 (ZFN); 전사 활성제 - 유사체 뉴클레아제 (TALEN); regularly 이러한 부위 특이적 엔도 핵산이 자연 발생적이지 않고 특정 유전자를 표적으로하도록 변형된, 정기적으로 간격을 둔 짧은 회문색 반복 / CRISPR 연관 (Cas) 을 클러스터링 한다. 이러한 부위 특이성 뉴클레아제는 게놈 내의 특정 부위를 절단하도록 조작 될 수 있으며, 비 동종 말단 결합은 뉴클레오티드를 삽입 또는 삭제하는 동안 브레이크를 수리할 수 있다. 그런 다음 해당 부위 특이적 엔도뉴클레아제 ("INDEL"이라고도 함)는 단백질을 프레임 밖으로 던져 효과적으로 유전자를 녹아웃시킵니다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 제 2011/0301073 호를 참고.
본원에 개시된 변이체 rAAV 벡터의 일부 실시형태에서, 관심있는 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 구조 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 적절한 구조 프로모터는 예를 들어 거대 세포 바이러스 프로모터 (CMV) (Stinski et al. (1985) Journal of Virology 55 (2) : 431-441), CMV 조기 증강 인자 / 닭 β- 액틴 (CBA) 프로모터 / 토끼 β- 글로빈 인트론 (CAG) (Miyazaki et al. (1989) Gene 79 (2) : 269-277, CBSB (Jacobson et al. (2006) Molecular Therapy 13 (6) : 1074-1084), 인간 신장 인자 1α 프로모터 (EF1α) (Kim et al. (1990) Gene 91 (2) : 217-223), 인간 포스포 글리세 레이트 키나아제 프로모터 (PGK) (Singer-Sam et al. (1984) Gene 32 (3) : 409-417, 미토콘드리아 중쇄 가닥 프로모터 (Loderio et al. (2012) PNAS 109 (17) : 6513-6518), 유비퀴틴 프로모터 (Wulff et al. (1990) FEBS Letters 261 : 101-105) 참고. 다른 실시형태에서, 관심 유전자 제품을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 유도 성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 예에서, 관심 유전자 제품을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 조직 특이적 또는 세포 유형 특이적 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 일부 예에서, 관심 유전자 생산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 광 수용체 - 특이적 조절 요소 (예를 들어, 광 수용체 - 특이적 프로모터), 예를 들어 작동 가능하게 연결된 유전자의 선택적 발현을주는 조절 요소 광 수용체 세포에서. 적합한 광 수용체 - 특이적 조절 요소는 예를 들어, 로돕신 프로모터; 로돕신 키나아제 프로모터 (Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci.44 : 4076); 베타 포스 포 디에스 테라 제 유전자 프로모터 (Nicoud et al. (2007) J. Gene Med. 9 : 1015); 망막 색소 성 유전자 프로모터 (Nicoud et al. (2007) 상기 참조); inter광 수용체 레티노이드 결합 단백질 (IRBP) 유전자 증강 인자 (Nicoud et al. (2007) 상기 참조); IRBP 유전자 프로모터 (Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res.55 : 225), 옵신 유전자 프로모터 (Tucker et al. (1994) PNAS 91 : 2611-2615), 레티노 시신 유전자 프로모터 (Park et al. (2009) Gene Therapy 16 (7) : 916-926), CRX homeodomain 단백질 유전자 프로모터 (Furukawa et al. (2002) The Journal of Neuroscience 22 (5) : 1640-1647), 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 알파 형질 전환 활성 폴리펩티드 1 (GNAT1) 유전자 프로모터 (Lee et al. (2010) Gene Therapy 17 : 1390-1399), 신경 망막 - 특수 루신 지퍼 단백질 (NRL) 유전자 프로모터 (Akimoto et al. (2006) PNAS 103 (10) : 3890-3895), 인간 콘 알레스틴 (hCAR) 프로모터 (Li et al. (2002) Biochemistry and Molecular Biology 43 : 1375-1383) 및 PR2.1, PR1.7, PR1.5 및 PR1.1 프로모터 (Ye et al. (2016) Human Gene Therapy 27 (1) : 72-82)) 참고. 어떤 경우에는, 당해 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능 망막 색소 상피 (RPE) 세포 특이 조절 요소 (예, RPE 특정 프로모터), 예를 들면, 선택적으로 발현을 수여 규제 요소에 연결된 RPE 세포에서 작동 가능하게 연결된 유전자. 적합한 RPE-특이적 조절 요소는 예를 들어, RPE65 유전자 프로모터 (Meur et al. (2007) Gene Therapy 14 : 292-303), 세포 레티 날 알데히드 - 결합 단백질 (CRALBP) 유전자 프로모터 (Kennedy et al. (1998) Journal of Biological Chemistry 273 : 5591-5598), 색소 상피 - 유도 인자 (PEDF 일명, 세르 핀 F1) 유전자 프로모터 (Kojima et al. (2006) Molecular and Cellular Biochemistry 293 (1-2) : 63-69) 및 비늘 모양의 황반 이영양증 (VMD2) 프로모터 (Esumi et al. (2004) The Journal of Biological Chemistry 279(18): 19064-19073) 참고 . 일부 예에서, 관심 유전자 생산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 뮐러 글 리아 세포 - 특이적 조절 요소 (예를 들어, 교질 세포 특이적 프로모터), 예를 들어 작동 가능하게 연결된 유전자의 선택적 발현을 부여하는 조절 요소 망막 교질 세포. 적절한 글리아 특이적 조절 요소는 예를 들어, 교질 세포 산성 단백질 (GFAP) 프로모터 (Besnard et al. (1991) Journal of Biological Chemistry 266 (28) : 18877-18883) 참고. 일부 예에서, 목적 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 양극성 세포 - 특이적 조절 요소 (예를 들어, 양극성 특이적 프로모터), 예를 들어 작동 가능하게 연결된 유전자의 선택적 발현을 양극성 세포. 적합한 양극-특이적 조절 요소는 예를 들어, GRM6 프로모터 (Cronin et al. (2014) EMBO Molecular Medicine 6 (9) : 1175-1190) 참고.
본 발명의 목적을 위해, 본원의 개시는 전술한 바와 같은 변이체 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 단리된 핵산은 AAV 벡터, 예를 들어, 재조합 AAV 벡터 일 수 있다.
본원의 개시는 또한 망막 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술되고 본원에 개시된 바와 같은 관심있는 도입 유전자를 포함하는 유효량의 rAAV 변이 비리온을 그것을 필요로 하는 개인에게 투여하는 것을 포함한다. 당업자는 본 rAAV 비리온의 유효량을 용이하게 결정할 수 있고, 하나 이상의 기능적 또는 해부학적 파라미터, 예를 들어 시력, 시야, 전기 생리학적 명암 대비, 해부학, 망막 건강 및 혈관 계통, 안구 운동성, 고정 선호도 및 안정성의 변화를 시험함으로써 질환이 치료된다.
망막 기능과 그 변화를 평가하기 위한 비제한적인 방법은 시력 평가 (예를 들어, BCVA, 보행, 항법, 대상물 탐지 및 차별), 시야 평가 (예를 들어, 정적 및 운동 시야 측정), 임상 수행 검사 (예를 들어, 전 안부 및 후부의 슬릿 램프 검사), 모든 파장의 명암에 대한 전기 생리학적 반응성 평가 (예를 들어, 모든 형태의 전자 망막 조영제 (전 분야, 다초점 및 패턴), 모든 형태의 시각적 (VEP), 안전도 기록 (electrooculography, EOG), 색각 (color vision), 암순응 (dark adaptation) 및/또는 대비 감도 (contrast sensitivity))를 포함한다. 해부학 및 망막 건강 및 그 변화를 평가하기 위한 비제한적인 방법으로는 OCT (Optical Conherence Tomography), 안저 사진 촬영, 적응 형 광학 주사 레이저 안검 내시경 (AO-SLO), 형광 및/또는자가 형광 등이 있다. (예를 들어, 안진, 고정 선호도, 안정성), 측정 결과 (시각적 및 비 시각적 행동의 행동 변화, 환자보고 결과, 환자보고 결과, 설문지 기반 평가) 등을 측정한다. 삶의 질, 일상 활동 및 신경 기능 측정 (예를 들어, 기능성 자기 공명 영상 (MRI)).
일부 실시형태에서, 유효량의 본 rAAV 비리온은 망막 기능, 해부학적 완전성 또는 망막 건강의 손실 속도를, 예를 들어 손실 속도의 감소, 따라서 질병의 진행의 감소를 2 배, 3 배, 4 배 또는 5 배 줄이고, 예를 들어 손실 속도의 감소 및 따라서 질병의 진행 속도의 10 배 이상 줄일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 rAAV 비리온의 유효량은 시각 기능, 망막 기능, 망막 해부학 또는 건강의 개선, 및/또는 안구 운동성 및/또는 신경 기능의 개선을, 예를 들어 망막 기능, 망막 해부학 또는 건강 및/또는 안구 운동성의 개선에서 2배, 3 배, 4 배 또는 5 배 개선 이상, 망막 기능, 망막 해부학 또는 건강에서 및/또는 안구 운동성의 개선에서 10 배 이상의 개선을 달성한다. 당업자가 용이하게 이해할 수 있는 바와 같이, 바람직한 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 투여량은 전형적으로 1 x 108 내지 약 1 x 1015 재조합 비리온의 범위일 것이며, 일반적으로 당업자에 의해 1 x 108 내지 약 1 x 1015 "벡터 게놈"으로 지칭된다.
대상 rAAV 비리온은 intravitreal 주입, subretinal 주입, 맥락 막 주입에 의한 안구 주입 또는 rAAV 비리온의 눈으로의 전달을 초래할 임의의 다른 편리한 모드 또는 투여 경로에 의해 투여 될 수 있다. 다른 편리한 투여 경로 또는 투여 경로로는 정맥 내, 동맥 내, 안구 주위, 전방내, 결막 아래 및 서브 테톤 주입 및 국소 투여 및 비내 투여가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 유리체내 주입을 통해 투여될 때, 본 rAAV 비리온은 유리질을 통해 이동할 수 있고, 내부 제한 막 (본원에서는 내부 제한 막, 또는 "ILM"으로 지칭되고 망막 표면상의 얇고 투명한 무 세포 막으로, 성상교세포 및 뮐러 세포의 단부 피트로 형성)을 통과하고 및/또는 상응하는 모 (parental) AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온의 능력과 비교하여 보다 효율적으로 망막 층을 통과하여 이동한다.
본원에 개시된 변이체 캡시드 단백질은 단리, 예를 들어 정제된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 변이체 캡시드 단백질은 AAV 벡터 또는 재조합 AAV (rAAV) 비리온에 포함된다. 다른 실시형태에서, 이러한 AAV 변이체 벡터 및/또는 AAV 변이체 비리온은 영장류 망막에서 안 질환을 치료하는 생체내 또는 생체 외 방법에 사용된다.
본원의 개시는 추가로, 제한없이, 대상 핵산을 포함하는 단리된 (유 전적으로 변형된) 숙주 세포와 같은 숙주 세포를 제공한다. 본원에 개시된 본 발명에 따른 숙주 세포 는 인 비트로 세포 배양으로부터의 세포와 같은 분리 된 세포 일 수 있다. 이러한 숙주 세포는 본원에 개시된 바와 같이 본 발명의 rAAV 변이체 비리온을 생산하는데 유용하다. 실시형태에서, 이러한 숙주 세포는 핵산으로 안정적으로 유 전적으로 변형된다. 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 핵산으로 일시적으로 유전자 변형된다. 이러한 핵산은 전기 천공법, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포솜 매개 형질 전환 등을 포함하는 확립된 기술을 사용하여 숙주 세포 내로 안정적으로 또는 일시적으로 도입된다. 안정한 형질 전환을 위해, 핵산은 일반적으로 선별 마커, 예를 들어 네오마이신 저항성과 같은 여러 가지 잘 알려진 선별 마커 중 임의의 것을 포함할 것이다. 이러한 숙주 세포는 임의의 다양한 세포, 예를 들어, 쥐 세포 및 영장류 세포 (예를 들어, 인간 세포)를 비롯한 포유류 세포 중 임의의 세포에 핵산을 도입함으로써 생성된다. 예시적인 포유동물 세포는 1 차 세포 및 세포주를 포함하고, 예시적 세포주는 293 세포, COS 세포, HeLa 세포, Vero 세포, 3T3 마우스 섬유 아세포, C3H10T1/2 섬유 아세포, CHO 세포 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 예시적인 숙주 세포로는 제한적이지 않지만 HeLa 세포 (예를 들어, American Type Culture Collection (ATCC) No. CCL-2), CHO 세포 (예컨대, ATCC Nos. CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포 (ATCC No. CRL-1573), 베로 세포, NIH 3T3 세포 (예를 들어, ATCC No. CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포 (예를 들어, ATCC No. CCL10), PC12 세포 (ATCC No. CRL1721), COS 세포, COS-7 세포 (ATCC No. CRL1651), RAT1 세포, 마우스 L 세포 (ATCC No. CCLI.3), 인간 배아 신장 (HEK) 세포 (ATCC No. CRL1573), HLHepG2 세포 등을 포함한다. 숙주 세포는 AAV를 생성하는 Sf9 세포와 같은 곤충 세포를 감염시키기 위해 바큘로 바이러스 (baculovirus)를 사용하여 제조될 수있다 (예를 들어, 미국 특허 제 7,271,002 호; 미국 특허 출원. 12/297,958). 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 전술 한 바와 같은 변이체 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 이외에, 하나 이상의 AAV rep 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 rAAV 변이체 벡터를 추가로 포함한다. 이러한 숙주 세포를 사용하여 rAAV 변이체 바이러스를 생성할 수 있다. rAAV 비리온을 생성하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 공개 제 2005/0053922 호 및 미국 특허 공개 제 2009/0202490 호에 기재되어 있다.
본원의 개시는 추가로 a) rAAV 변이체 비리온, 상기에서 개시된 바와 같이; 및 b) 약학 적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 완충액. 일부 실시형태에서, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 완충액은 인간 또는 비인간 환자에서의 사용에 적합하다. 이러한 부형제, 담체, 희석제 및 완충제는 과도한 독성없이 투여될 수있는 임의의 약제를 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 약학적으로 허용되는 염, 예를 들어 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염 등과 같은 광물산염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산의 염이 포함된다. 부가 적으로, 습윤제 또는 유화제, 계면 활성제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 이러한 비히클에 존재할 수 있다. 매우 다양한 약학적으로 허용 가능한 부형제가 당업계에 공지되어 있으며 여기에서 상세히 논의 할 필요는 없다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 예를 들어 A. Gennaro (2000) “Remington: The Science and Practice of Pharmacy,” 20th edition, Lippincott, Williams, ＆ Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, ＆ Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc를 포함하는 다양한 출판물에 충분하게 기술되어 있다. 본 발명의 일부 양태에서, 본 발명은 약 1 x 108 내지 약 1 x 1015 재조합 바이러스 또는 1 x 108 내지 약 1 x 1015 벡터 게놈을 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 각각의 상기 재조합 바이러스는 하나 이상의 유전자 산물을 암호화하는 게놈을 포함한다.
하기 실시형태는 본원에 개시된 변이체 AAV 캡시드를 제조하고 사용하는 방법에 대한 지침에 대한 완전한 개시 및 설명을 통상의 숙련자에게 제공하기 위해 제시되며, 본원에 개시된 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 또한, 하기 실시형태는 하기 실험이 전부 또는 수행된 유일한 실험임을 나타내기 위한 것은 아니다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 구성하고 이용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 개시되며, 본 발명자가 이러한 발명으로 간주하는 범위를 제한하기 위한 것이 나이며, 하기 실험이 전부이거나 수행된 유일한 실험임을 나타내기 위한 것도 아니다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하려고 하였지만, 일부 실험적 오류 및 편차는 설명되어야 한다. 달리 언급되지 않는 한, 부(part)는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대략적인 대기압이다.
분자 및 세포 생화학의 일반적인 방법은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001)]; 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley ＆ Sons 1999)]; 문헌[Protein Methods (Bollag et al., John Wiley ＆ Sons 1996)]; 문헌[Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999)]; 문헌[Viral Vectors (Kaplift ＆ Loewy eds., Academic Press 1995)]; 문헌[Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997)]; 및 문헌[Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle ＆ Griffiths, John Wiley ＆ Sons 1998)]과 같은 표준 교제에서 찾아볼 수 있으며, 이의 전문은 본원에 참고로 포함된다. 본 개시내용서 언급 된 유전자 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터 및 키트는 BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich 및 ClonTech와 같은 상업적 공급자로부터 입수 가능하다.
실시예 1
유리 체강 내 주입 및 조직 수확 . 체중이 4kg 이상인 4세 내지 10세의 단일 시노몰구스 마카퀴(macaca fascicularis)를 공막(sclera)을 통한 유리 체강 내 주입 (인체 사용에 적합한 절차 및 전달 장치를 사용하여 연곽(limbus) 후방 약 3mm)을 통해 투여하였다. 동물에 국소 마취제를 투입하여 마취시키고, 100 μL의 라이브러리를 각 눈에 투여하였다
안락사는 14 일째에 3 mg/kg의 펜토바르비탈 나트륨(pentobarbital sodium) 정맥 주사액을 사용하여 숙련된 수의사가 수행하였다. 눈은 핵 형성하고, 해부할 때까지 4 °C에 보관하였다.
조직 해부 메스(scalpel)로 망막 거상연(ora serrata)을 따라 눈을 절개하고, 전 안부를 제거했다. 망막이 편평하게 장착 될 수 있도록 안와(fovea) 주위의 망막에 릴리프 컷(relief cut)을 실시하고 유리체를 제거하였다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 각 사분면 (상부, 하부, 비강, 이측)으로부터의 6개의 망막 샘플을 수집하고, RPE 세포, 광 수용체, 양극 세포, 무축삭 세포, 수평 세포 및/또는 신경절 세포에 상응하는 세포 물질을 단리하였다.
유도 진화. 유도 진화 과정은 도 1A 내지 도 1E에 나타나 있다. 간단히 말해, DNA 돌연변이 기법과 cap 유전자의 20개 이상의 독점적인 조합을 포함하는 바이러스성 캡시드 라이브러리가 생성된다 (도 1A). 이어서, 이 같은 입자가 이러한 캡시드를 코딩하는 cap 유전자를 둘러싸고 있는 돌연변이 캡시드로 구성되도록 바이러스를 패키징하고 (도 1B) 정제한다. 캡시드 라이브러리는 생체 내 에서 선택적 압력을 받게 한다. 관심있는 조직 또는 세포 물질을 그 표적을 성공적으로 감염시켰던 AAV 변이체를 단리하기 위해 수확하고, 바이러스를 성공적으로 회수한다.성공적인 클론은 반복된 선택을 통해 농축된다 (1 단계 - 도 1D). 이어서, 선택된 cap 유전자는 독점적인 재다양화를 거치게 되고, 바이러스 적합성을 반복적으로 증가시키기 위해 추가의 선택 단계를 통해 농축된다(2 단계 - 도 1D). 벡터 선택 단계 1 및 2 도중에 확인된 변이체는 영장류 망막 세포를 형질 도입시키는 능력이 입증된다 (도 1E).
AAV 캡시드 게놈의 성공적인 회수 : 라운드 1 내지 6. 각 선택 라운드에서 회수된 캡시드를 사용하여 후속적인 선택 라운드를 개시하기 위해 주입되는 라이브러리를 패키징하였다. 조직으로부터의 캡시드 유전자의 회수는 관심있는 조직 내로의 라이브러리 벡터의 성공적인 내재화를 나타낸다. 라운드 4 이후, 라운드 5를 위한 라이브러리 패키징 및 주입 이전에 라이브러리의 부가적인 재다양화가 혼입되었다. 대표적인 선택 라운드에서 RPE, PR, 내핵층 (INL) 및 신경절 세포층 (GCL) 망막 조직으로부터의 바이러스 게놈의 회수가 도 3에 나타나 있다. 박스 내의 밴드는 바이러스 게놈의 성공적인 회구를 나타낸다.
시퀀싱 분석 : 라운드 3 내지 6. 라운드 3 내지 6 도중에 라이브러리 내의 개별 클론에 대해 시퀀싱을 수행하여 모집단 내의 변이체의 빈도를 결정하였다. 시퀀 데이터 내에 모티프의 존재에 대해 변이체를 평가하였다. 변이체는 다중 서열에서 발생하는 단일화 변경 (예를 들어, 캡시드 내의 일정한 위치에 있는 특정 점 돌연변이 또는 특정 펩티드 삽입 서열)의 존재에 기초하여 모티프로 분류되었다. 2회 이상의 선택 라운드에서 시퀀싱딘 모집단의 적어도 5 % 또는 1회 이사의 선택 라운드에서 시퀀싱딘 모집단의 적어도 10%를 나타내는 모티프가 도 4A (라운드 3 시퀀싱 분석), 도 4B (라운드 4 시퀀싱 분석), 도 4C (라운드 5 시퀀싱 분석) 및 도 4D (라운드 6 시퀀싱 분석)에 나타나 있다.
망막 세포의 증가된 감염성을 부여하는 것으로 확인된 몇몇 대표적인 클론은 하기 표 1에 나타나 있다 (각 클론은 확인된 치환(들) 및/또는 펩티드 삽입을 함유하고, 그렇지 않은 경우 서열 번호 2와 동일하고; 선택 라운드, 서열 및 빈도 횟수 (괄호 안)가 각 클론별로 나열되어 있다.
표 1 망막의 하나 이상의 세포의 증가된 감염성을 부여하는 AAV VP1 캡시드 단백질에 대한 아미노산 서열 변형. 컬럼 2에 나열된 치환은 야생형 AAV2에 대한 아미노산 서열, 즉 삽입된 펩티드의 부재 하의 아미노산 서열에 기초한 것이다.
삽입 치환 범망막성 RPE 광 수용체
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) 없음 라운드 4, 5, 6 라운드 3, 5, 6 라운드 4, 5
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +M1L + L15P + P535S 라운드 6
1 (1.61 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +P34A 라운드 5
1 (1.89 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +P34A + S731L 라운드 5
1 (1.82 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +N57D 라운드 4
1 (1.33 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +N66K 라운드 5
1 (1.82 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +R81Q 라운드 6
1 (1.61 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +Q101R 라운드 4
1 (2.27 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +S109T 라운드 3
1 (1.85 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +R144K 라운드 5
1 (1.82 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +R144M 라운드 5
1 (1.82 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +Q164K 라운드 4
1 (2.27 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +Q164K + V708I 라운드 3 및 4
2 (3.7 %)
1 (1.33 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +T176P 라운드 4
1 (1.33 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +L188I 라운드 5
1 (2.27 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +S196Y 라운드 4
1 (1.33 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +G226E 라운드 4
1 (2.27 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +G236V 라운드 4
1 (1.33 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +I240T 라운드 3
1 (1.85 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +N312K 라운드 4
1 (1.33 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +P363L 라운드 6
1 (1.61 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +T456K 라운드 6
1 (1.61 %)
588-LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +I698V 라운드 5
1 (1.89 %)
588-LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +V708I 라운드 4, 5, 6 라운드 3, 4, 5 라운드 4, 5
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) +V708I + R484C 라운드 5
1 (2.27 %)
588 ~ LAISDQTKHA ~ (서열 번호 28) N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q 조작됨 조작됨
588 ~ LGISDQTKHA ~ (서열 번호 29) 없음 라운드 5
1 (1.89 %)
588 ~ LAQADTTNANA ~ (서열 번호 27) 없음 라운드 3, 4, 5, 6 라운드 3, 4, 5 라운드 4, 5
588 ~ LAQADTTNANA ~ (서열 번호 27) +E36D 라운드 5
1 (2.27 %)
588 ~ LAQADTTNANA ~ (서열 번호 27) +P250S 라운드 6
1 (1.61 %)
588 ~ LAQADTTNANA ~ (서열 번호 27) +A524T 라운드 3
1 (1.85 %)
588 ~ LAQADTTNANA ~ (서열 번호 27) +A593E 라운드 4
1 (1.33 %)
588 ~ LAQADTTNANA ~ (서열 번호 27) +I698V 라운드 5 및 6
1 (1.61 %)
1 (1.89 %)
588 ~ LAQADTTNANA ~ (서열 번호 27) +V708I 라운드 3, 4, 5, 6 라운드 3, 4, 5
588 ~ LAQADTTNANA ~ (서열 번호 27) +V708I+V719M 라운드 3 및 4
1 (2.08 %)
2 (4.55 %)

588 ~ LAQADTTNANA ~ (서열 번호 27)
+V719M
라운드 4
1 (2.27 %)
588 ~ LAHQDTTKNA ~ (서열 번호 34) 없음 라운드 5
2 (3.77 %)
588 ~ LANQDYTKTA ~ (서열 번호 31) 없음 라운드 3, 4 및 5
5 명 (9.26 %)
1 (1.33 %)
3 (5.66 %)		 라운드 3, 4 및 5
2 (4.17 %)
2 (4.55 %)
2 (2.27 %)		 라운드 5
1 (1.82 %)
588 ~ LANQDYTKTA ~ (서열 번호 31) +S109T+S463Y 라운드 3
1 (1.85 %)
588 ~ LANQDYTKTA ~ (서열 번호 31) +D368H 라운드 3
1 (1.85 %)
588 ~ LANQDYTKTA ~ (서열 번호 31) +V708I 라운드 4
1 (1.33 %)		 라운드 3
1 (2.08 %)
588 ~ LAHDITKNIA ~ (서열 번호 32) 없음 라운드 3, 4, 5 및 6
1 (1.85 %)
1 (1.33 %)
1 (1.89 %)
2 (3.23 %)
588~ LAHDITKNIA ~ (서열 번호 32) +S109T 라운드 4
1 (1.33 %)
588 ~ LAHDITKNIA ~ (서열 번호 32) +R389S 라운드 5
1 (1.89 %)
588 ~ LAHDITKNIA ~ (서열 번호 32) +A593E 라운드 3
1 (1.85 %)
588 ~ LAHDITKNIA ~ (서열 번호 32) +V708I 라운드 4, 5
588 ~ IAHDITKNIA ~ (SEQ ID NO : 60) +V708I 라운드 3
1 (2.08 %)
588~ LAPNSTHGSA ~ (서열 번호 40) +V708I 라운드 3
1 (1.85 %)
588 ~ LANKTTNKDA ~ (서열 번호 35) 없음 라운드 5
1 (2.27 %)
588 ~ LANKTTNKDA ~ (서열 번호 35) +N449D 라운드 4
1 (2.17 %)
588 ~ LAHPDTTKNA ~ (서열 번호 33) 라운드 6
1 (1.61 %)
588 ~ LATNRTSPDA ~ (서열 번호 39) 라운드 6
1 (1.61 %)
588 ~ LPQANANENA ~ (서열 번호 37) 라운드 5
1 (1.89 %)
588 ~ LAASDSTKAA ~ (서열 번호 30) 라운드 3 및 4
1 (1.85 %)
1 (1.33 %)
588 ~ LAKDRAPSTA ~ (서열 번호 41) 라운드 3
1 (1.85 %)
588 ~ LPISNENEHA ~ (서열 번호 36) 라운드 4
1 (2.17 %)
588 ~ LAGKSKVIDA ~ (서열 번호 38) 라운드 5
1 (1.82 %)
없음 P34A 라운드 5
1 (1.89 %)		 라운드 4, 5
3 (6.82 %)
1 (2.27 %)		 라운드 4
1 (2.17 %)
없음 P64S 라운드 3
1 (1.85 %)		 라운드 4
1 (2.27 %)
없음 S109T 라운드 4
2 (2.67 %)		 라운드 3, 4, 5
4 (8.33 %)
1 (2.27 %)
1 (2.27 %)
없음 S109T+P8L 라운드 3
1 (2.08 %)
없음 S109T+Q120R 라운드 3
1 (2.08 %)
없음 S109T+A493V
+A593E+V708I		 라운드 3
1 (1.85 %)
없음 Q164K 라운드 4 및 5
2 (2.67 %)
1 (1.89 %)		 라운드 4
1 (2.27 %)
없음 Q175H 라운드 3
1 (1.85 %)		 라운드 4
1 (2.17 %)
없음 S196Y 라운드 3
1 (1.85 %)		 라운드 4
1 (2.27 %)
없음 A593E 라운드 3, 4, 5
3 (5.56 %)
7 (9.33 %)
1 (1.89 %)		 라운드 3, 4, 5
12 (25 %)
7 (15.9 %)
14 (31.8 %)		 라운드 4
1 (2.17 %)
없음 A593E+Q464R 라운드 3
1 (2.08 %)
없음 A593E+N596D 라운드 4
1 (2.27 %)
없음 A593E+N596D
+T491A		 라운드 3
2 (4.17 %)
없음 A593E+V708I 라운드 3, 4
2 (3.7 %)
2 (2.67 %)		 라운드 3, 4, 5
4 (8.33 %)
1 (2.27 %)
1 (2.27 %)
없음 I698V 라운드 5
1 (1.89 %)		 라운드 5
1 (2.27 %)
없음 V708I 라운드 3, 4,
2 (3.7 %)
5 (6.67 %)		 라운드 3, 4, 5
1 (2.08 %)
4 (9.09 %)
4 (9.09 %)
없음 V708I+V719M 라운드 4
2 (4.55 %)
없음 V708I+G727D 라운드 5
1 (2.27 %)
없음 V708I+R733C 라운드 4
1 (2.17 %)
망막의 하나 이상의 세포의 증가된 감염성을 갖는 캡시드로 또한 확인된 것은 다음과 같은 조상 VP1 캡시드 서열을 갖는 클론이었다 :
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASAGSTNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLARTQSTGGTAGTRELLFSQAGPSNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSKTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSSGVLIFGKQGAGANNTALENVMMTSEEEIKTTNPVATEQYGVVASNLQSSNTAPVTGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAVFTPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYAKSTNVDFAVDNEGVYSEPRPIGTRYLTRNL. (서열 번호 59)
이러한 조상 캡시드 변이체는 조상 캡시드인 서열 번호 58로부터 진화한 것이며, 여기서 축퇴성(degeneracy)의 위치(264번, 266번, 268번, 448번, 459번, 460번, 467번, 470번, 471번, 474번, 495번, 516번, 533번, 547번, 551번, 555번, 557번, 561번, 563번, 577번, 583번, 593번, 596번, 661번, 662번, 664번, 665번, 710번, 717번, 718번, 719번, 723번째 잔기) 는 264번에 알라닌 (A), 266번에 알라닌 (A), 268번에 세린 (S), 448번에 알라닌 (A), 459번에 트레오닌 (T), 460번에 아르기닌(R), 467번에 알라닌 (A), 470번에 세린 (S), 471번dp 아스파라긴 (N), 474번에 알라닌 (A), 495번에 세린 (S), 516번에 아스파라긴 (D), 533번에 아스파라긴 (D), 547번에 글루타민 (Q), 551번에 알라닌 (A), 555번에 알라닌 (A), 557번에 글루탐산 (E), 561번에 메티오닌 (M), 563번에 세린 (S), 577번에 글루타민 (Q), 583번에 세린 (S), 593번에 발린 (V), 596번에 트레오닌 (T), 661번에 알라닌 (A), 662번에 발린 (V), 664번에 트레오닌 (T), 665번에 프롤린 (P), 710번에 트레오닌 (T), 717번에 아스파르트 산 (D), 718번에 아스파라긴 (N), 719번에 글루탐산 (E) 및 723번에 세린(S)를 포함하도록 진화하였다.ㅣ
본원에 개시된 AAV 변이체 비리온은 유전 공학적 AAV 바이러스 벡터 분야에서 당업자에게 매우 자명한, 이성적이고 합리적인 설계 매개 변수, 특징, 변형, 이점 및 변경을 포함할 수 있다.
실시예 2
유도 진화는 인간의 눈에 대한 다른 유전자 전달 방법에 비해 현저한 이점을 가진 투여 경로인 유리 체강 내 (IVT) 투여 이후에 망막 세포에 대한 유전자 전달이 우수한 신규한 아데노-관련 바이러스 (AAV) 변이체를 발견하는데 사용되었다 (실시예 1). 588번째 아미노산 (LAISDQTKHA+P34A)에 삽입되는 P34A 치환체 및 펩티드 LAISDQTKHA (서열 번호 28)를 포함하는 신규한 AAV 변이체의 유리 체강 내 투여 이후의 세포 주성은 망막 세포를 형질 도입하기 위한 ISDQTKH (서열 번호 14) 함유 AAV 변이체의 능력의 대표적인 예로서 비인간 영장류 (NHP)에서 생체 내 에서 평가되었다.
AAV2 캡시드 또는 신규 변이체 캡시드 LAISDQTKHA+P34A를 포함하는 재조합 AAV 비리온 및 CMV 프로모터 (AAV2.CMV.GFP 및 LAISDQTKHA+P34A.CMV.GFP 각각)에 작동 가능하게 연결된 녹색 형광 단백질 (GFP) 이식 유전자 또는 CAG 프로모터 (AAV2.CAG.EGFP 및 LAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP 각가)를 포함하는 게놈을 표준 방법을 사용하여 제조하였다. 아프리카 녹색 원숭이 (도 7, 도 8) 또는 시노몰거스 원숭이 (도 9)는 한쪽 눈 당 4 × 1010개의 vg 내지 1 × 1012개의 1e12 vg의 범위에 이르는 다양한 투여량의 벡터로 강유리 체강 내 주입하고, 망막 세포의 형질 도입은 하이델베르크 스펙트랄리스TM를 이용한 안저 형광 이미징에 의해 일생 동안 평가하였다.
신규한 변이체 LAISDQTKHA+P34A를 포함하는 AAV의 유리 체강 내 전달은 AAV2보다 NHP 망막에 걸쳐 보다 광범위하고 보다 강력한 이직 유전자의 발현을 초래하였다 (도 7 내지 도 9). 이미지에따르면 신규한 AAV 변이체 캡시드는 안와 (원추형이 풍부한 영역)의 중심, 안와주변 고리(parafoveal ring; 망막 신경절 세포가 풍부한 영역), 및 주변부 (로드형, 뮐러 교질세포, 무축삭 세포, 양극 세포를 포함한 여러 유형의 세포가 풍부한 영역)에서 강력한 발현을 제공하는 것으로 나타났다. 대조적으로, 다른 사람들에 의해 보고된 결과와 일치하게도, 야생형 AAV2는 주로 안와주변 고리에 있고 추후 시점에만 검출될 수 있는 보다 약한 발현을 제공한다. 주입 3주 후에 수행된 망막의 다양한 부위에 대한 면역 조직화학적 분석에 따르면 망막 색소 상피세포, 로드형 및 원추형 광 수용체 및 망막 신경절 세포를 포함하는 다수 유형의 망막 세포가 망막 전체에 성공적으로 형질 도입되는 것으로 확인되었다(도 10A 내지 도 10E) .
이 연구에 따르면 임상적으로 관련된 AAV2와 비교하여 임상적으로 바람직한 투여 경로를 따라 ISDQTKH-포함 변이체에 의한 유전자 전달이 우수한 것으로 나타났다. 유사한 효능이 이러한 펩티드 삽입 모티프를 포함하는 기타 변이체에 의해 달성 가능하다. 유사하게, 유사한 효능은 동일한 유도 진화 접근법을 사용하여 확인된 본원에 개시된 기타 변이체에 의해 달성 가능하다.
실시예 3
망막 색소 상피세포 (RPE) 및 광 수용체 (PR) 세포에 대한 신규한 AAV 변이체 LAISDQTKHA+P34A의 세포 주성은 섬유 아세포 유래 인간 유도 다능성 줄기 세포 (FB-iPSC) 또는 인간 배아 줄기 세포 (ESC)에서 생성된 RPE 세포 및 PR 세포의 사용 시에 시험관 내에서 평가되었다.
AAV2 캡시드 또는 신규한 변이체 캡시드 LAISDQTKHA+P34A를 포함하는 AAV 비리온 및 CAG 프로모터 (AAV2.CAG.EGFP 및 LAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP 각각)에 작동 가능하게 연결된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 이식 유전자를 포함하는 게놈을 표준 방법을 사용하여 제조하였다. 45일간 분화 프로토콜을 사용하여 인간 배아 줄기 세포주 ESI-017 또는 인간 섬유 아세포 유래 유도성 다능성 줄기 세포 ("FB-iPSC")로부터 인간 RPE 세포 배양액을 생성하였다. RPE 세포로의 성숙은 RPE65 및 BEST1을 포함하는 성숙한 RPE 마커의 발현; VEGF 및 PEDF의 합성; 및 로드형 외부 절편을 식균하는 능력을 검출함으로써 확인되었다. PR 배양액은 다단계 세안컵 형성 패러다임에 의해 생성되었으며, 배양 179일 이후에 리코베린(Recoverin) 및 에스 옵신(S Opsin)의 발현을 검출함으로써 PR를 포함하는 것으로 확인되었다.
AAV2에 비해 LAISDQTKHA+P34A는 면역 형광법 (도 11A 및 도 11B), 유동 세포 분석법 (2.7배 증가, 도 11C 및 도 11D) 및 웨스턴 블랏 분석 (도 11E 및 도 11F)에 의해 결정할 때 감염 후 7 일 동안 인간 RPE 배양액에서 상당히 높은 형질 도입 및 이식 유전자 발현효율을 제공하였다. 강력한 형질 도입 및 발현은 감염 후 32일 정도에 인간 PR 배양액에서 LAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP를 사용하여 유사하게 달성되었다. 이러한 연구에 따르면 망막 세포에 유전자를 전달하는 ISDQTKH (서열 번호 14)-포함 변이체의 우수한 능력이 나타나 있다.
상기는 단지 본 발명의 원리를 설명하기 위해 예시한 것이다. 당업자라면 본원에 명시적으로 기재되거나 도시되지는 않았지만 본 발명의 원리를 구현하고 본 발명의 진의 및 범위 내에 포함되는 다양한 배치를 고안할 수 있는 것으로 인지될 것이다. 또한, 본원에 인용된 모든 실시예 및 조건 언어는 주로 독자가 본 발명의 원리 및 발명자가 기술을 발전시키는데 기여한 개념을 이해하는데 도움을 주기 위한 것이며, 이 같은 특별히 인용된 실시예 및 조건에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 본 발명의 원리, 양태 및 실시형태뿐만 아니라 이의 특정 실시예를 인용하는 본원에서의 모든 설명은 이의 구조적 및 기능적 균등물 둘모두를 포함시키기 위한 것이다. 또한, 이 같은 등가물에는 현재 알려진 등가물 및 향후 개발되는 등가물, 즉 구조와 관계없이 동일한 기능을 수행하는 개발 된 요소가 모두 포함됩니다. 따라서, 본 발명의 범위는 여기에 도시되고 설명 된 예시적인 실시형태들에 한정되도록 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범위 및 사상은 첨부된 청구 범위에 의해 구체화된다.
SEQUENCE LISTING <110> 4D Molecular Therapeutics, Inc. <120> Adeno-associated virus variant capsids and methods of use thereof <130> 090400-5001 WO <150> US 62/336,441 <151> 2016-05-13 <150> US 62/378,106 <151> 2016-08-22 <150> US 62/384,590 <151> 2016-09-07 <150> US 62/454,612 <151> 2017-02-03 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 736 <212> PRT <213> Adeno-associated virus 1 <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly 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Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr 405 410 415 Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ala 435 440 445 Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Arg Glu Leu Leu Phe 450 455 460 Ser Gln Ala Gly Pro Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp Leu 465 470 475 480 Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Leu Ser Gln 485 490 495 Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu 500 505 510 Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr His 515 520 525 Lys Asp Asp Glu Asp Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Ile Phe 530 535 540 Gly Lys Gln Gly Ala Gly Ala Asn Asn Thr Ala Leu Glu Asn Val Met 545 550 555 560 Met Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu 565 570 575 Gln Tyr Gly Val Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro 580 585 590 Val Thr Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp 595 600 605 Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro 610 615 620 His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly 625 630 635 640 Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro 645 650 655 Ala Asn Pro Pro Ala Val Phe Thr Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile 660 665 670 Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu 675 680 685 Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser 690 695 700 Asn Tyr Ala Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asp Asn Glu Gly 705 710 715 720 Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn 725 730 735 Leu <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterologous peptide insertion <400> 60 Ile Ala His Asp Ile Thr Lys Asn Ile Ala 1 5 10 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterologous peptide insertion <400> 61 Asp Ile Thr Lys Asn Ile Ala 1 5 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterologous peptide insertion <400> 62 Asn Lys Thr Thr Asn Lys Asp Ala 1 5 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterologous peptide insertion <400> 63 Pro Gln Ala Asn Ala Asn Glu Asn 1 5 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterologous peptide insertion <400> 64 Pro Ile Ser Asn Glu Asn Glu His 1 5

Claims (66)

  1. 변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질로서, 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질에 대해 캡시드 단백질의 GH-루프에 공유 결합으로 삽입된 길이 7, 8, 9, 10 또는 11개의 아미노산을 가지는 이종성 펩티드를 포함하며, 펩티드 삽입물은 아미노산 서열 LAISDQTKHA (서열 번호 28) 또는 아미노산 서열 LGISDQTKHA (서열 번호 29)로 이루어지고, 삽입 위치는 서열 번호 2로 이루어진 AAV2의 VP1의 아미노산 587 및 588 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질에서 상응하는 위치에 상응하는 아미노산 사이에 위치하는, 변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서,
    캡시드 단백질은 서열 번호 2로 이루어진 AAV2의 VP1에 대해 M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L 및 L735Q의 아미노산 치환 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질에서 상응하는 치환(들) 중 하나 이상을 포함하는, 변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질.
  7. 제 6항에 있어서,
    캡시드 단백질은 서열 번호 2로 이루어진 AAV2의 VP1에 대해 P34A 아미노산 치환 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질에서 상응하는 치환을 포함하는, 변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질.
  8. 제 7항에 있어서,
    캡시드 단백질은 서열 번호 42로 표시된 아미노산 서열의 전체 길이와 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 또는 서열 번호 42로 표시된 아미노산 서열의 전체 길이와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질.
  9. 제 8항에 있어서,
    캡시드 단백질은 서열 번호 42로 표시된 아미노산 서열로 이루어지는, 변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질.
  10. 제 1항에 있어서,
    캡시드 단백질은 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온에 대해 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포의 감염성과 비교하여 망막 세포의 증가된 감염성을 부여하는, 변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질.
  11. 제 1항 또는 제 6항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 핵산.
  12. 제 1항 또는 제 6항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질을 포함하는, 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온.
  13. 제 12항에 있어서,
    유전자 산물을 인코딩하는 이종성 핵산을 더 포함하는, 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 유전자 산물이 단백질 또는 짧은 간섭 RNA인, 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온.
  15. 제 14항에 있어서,
    변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질은 서열 번호 42로 표시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 이종성 핵산은 랩 호위 단백질-1(Rab escort protein-1, REP-1) 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온.
  16. 제 15항에 있어서,
    변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질은 서열 번호 42로 표시된 아미노산 서열로 이루어지며, 랩 호위 단백질-1 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 CAG 프로모터와 작동 가능하게 연결된, 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온.
  17. 제 14항에 있어서,
    변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질은 서열 번호 42로 표시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 이종성 핵산은 색소성 망막염(retinitis pigmentosa) GTPase 조절 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온.
  18. 제 17항에 있어서,
    변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질은 서열 번호 42로 표시된 아미노산 서열로 이루어지거나 포함하는, 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온.
  19. 제 18항에 있어서,
    색소성 망막염 GTPase 조절 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 로돕신 키나제 프로모터와 작동 가능하게 연결된, 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온.
  20. 제 14항에 있어서,
    변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질은 서열 번호 42로 표시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 이종성 핵산은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 활성을 억제하는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온.
  21. 제 20항에 있어서,
    변이체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질은 서열 번호 42로 표시된 아미노산 서열로 이루어지거나 포함하는, 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온.
  22. 제 21항에 있어서,
    폴리펩티드는 융합 단백질 또는 항체인, 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온.
  23. 제 14항의 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 망막 질환의 치료를 위한, 약학적 조성물.
  24. 제 16항의 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 망막 질환의 치료를 위한, 약학적 조성물.
  25. 제 19항의 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 망막 질환의 치료를 위한, 약학적 조성물.
  26. 제 21항의 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 망막 질환의 치료를 위한, 약학적 조성물.
  27. 제 14항의 감염성 재조합 AVV (rAAV) 비리온과 망막 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 이종성 핵산을 망막 세포에 전달하는 시험관 내(in vitro) 방법.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 망막 세포는 망막 신경절 세포, 무축삭 세포, 수평 세포, 양극 세포, 광 수용체 세포, 뮐러 교질 세포, 소교 세포 및 망막 색소 상피세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 제 24항에 있어서,
    필요로 하는 대상에서 범맥락막위축(choroideremia)을 치료하는 방법의 용도인, 약학적 조성물.
  32. 삭제
  33. 제 25항에 있어서,
    필요로 하는 대상에서 X-연관(X-linked) 색소성 망막염을 치료하는 방법의 용도인, 약학적 조성물.
  34. 삭제
  35. 제 26항에 있어서,
    필요로 하는 대상에서 습식 나이 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 황반 부종 또는 맥락막 혈관 신생을 치료하는 방법의 용도인, 약학적 조성물,
  36. 제 31항에 있어서,
    범맥락막위축을 치료하는 방법은 약학적 조성물을 유리체 내 주사에 의해 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 약학적 조성물.
  37. 제 33항에 있어서,
    X-연관(X-linked) 색소성 망막염을 치료하는 방법은 약학적 조성물을 유리체 내 주사에 의해 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 약학적 조성물.
  38. 제 35항에 있어서,
    습식 나이 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 황반 부종 또는 맥락막 혈관 신생을 치료하는 방법은 약학적 조성물을 유리체 내 주사에 의해 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 약학적 조성물.
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