WO2023106256A1 - 改変型アデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents

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    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14145—Special targeting system for viral vectors

Definitions

  • the present invention relates to modified adeno-associated virus vectors.
  • AAV1-10 adeno-associated virus
  • AAV adeno-associated virus
  • AAV greatly differs in infection tropism depending on the type of serotype, and it is necessary to select an optimal vector according to target cells for target gene therapy or genome editing therapy.
  • existing AAV vectors do not always exhibit optimal tropism for infection of target cells. Since the infection tropism of AAV varies depending on the amino acid sequence of the capsid region, it is possible to develop a vector with optimal infection tropism by modifying the same sequence. From this point of view, modified adeno-associated virus vectors for gene therapy and genome editing therapy for various diseases are being studied.
  • Wild serotypes such as AAV1 and AAV2 have been used as candidates for gene therapy for the inner ear, but recently capsid-modified vectors such as AAV-ANC80L65 (Patent Document 1) have also been developed. These strains allow gene transfer to the inner ear, but have different infection tropisms.
  • AAV1 has the ability to infect cochlear outer cells (external spiral groove cells), but has weak ability to infect other epithelial cells.
  • AAV2 has a high ability to infect cochlear hair cells, but a weak ability to infect other epithelial cells.
  • the AAV-ANC80L65 vector which enhances the ability of AAV2 to infect the inner ear, has the ability to infect some outer hair cells in addition to the ability of AAV2 to infect inner hair cells.
  • Application to gene therapy for GJB2 mutant deafness (characterized by defective formation of gap junctions), which is the most common type of hereditary deafness, due to its low ability to infect external and cochlear internal cells (inner spiral groove cells) is difficult.
  • infection is directed to epithelial cells represented by inner ear cells, interstitial cells, nerve cells, retinal cells, lens cells, cancer cells, skin cells, and cells expressing gap junctions and constituent connexin molecules.
  • a modified AAV vector with excellent performance has not yet been developed. Therefore, the object of the present invention is to infect epithelial cells typified by inner ear cells, interstitial cells, nerve cells, retinal cells, lens cells, cancer cells, skin cells, and cells expressing gap junctions and connexin molecules.
  • An object of the present invention is to provide a modified AAV vector with excellent directivity.
  • the present inventors first examined the infection tropism of AAV serotypes to inner ear epithelial cells, and found that AAV1, AAV6, AAV7, and AAV8 attack inner ear epithelial cells, particularly supporting cells that form inner ear gap junctions. It was found that the tropism of infection was high.
  • Patent Document 1 It has a different infection tropism from the described AAV-ANC80L65 vector and other wild-type AAVs, and found that it becomes a vector with high infection tropism to epithelial cells typified by inner ear epithelial cells, and completed the present invention. .
  • a modified adeno-associated virus vector in which some amino acid residues of the adeno-associated virus capsid sequence are substituted with other amino acid residues, and alignment with the amino acid sequence of the AAV1 capsid sequence of SEQ ID NO: 1 at (1) position 129 (Leu), (2) position 268 (Ser), (3) position 447 (Asn), (4) position 470 (Gly), (5) position 472 (Ser), (6) 473
  • One or more amino acid residues selected from position (Val), (7) position 502 (Thr) and (8) position 531 (Glu) or the amino acid residue at a position corresponding thereto is replaced with another amino acid residue modified adeno-associated virus vector.
  • the epithelial cells are epithelial cells selected from inner ear epithelial cells, intestinal epithelial cells, retinal cells, skin cells, renal cells, airway epithelial cells, nerve cells, myocardial cells, and cancer cells in which Connexin expression is involved.
  • a gene selected from GJB2 gene, SLC26A4 gene, TMC1 gene, TMC2 gene and Atoh1 gene which can be applied to gene therapy or genome editing therapy for hereditary diseases, tissue damage and cancer
  • [7] A gene therapy drug or genome editing drug for treatment of genetic disease, tissue damage or cancer in target cells, containing the modified adeno-associated virus vector of [6].
  • [8] Use of the modified adenovirus-associated vector of [6] for the production of a gene therapy drug or genome editing drug for treatment of genetic disease, tissue damage or cancer in target cells.
  • the modified adenovirus-associated vector of [6] for use in treating genetic diseases, tissue damage or cancer in target cells.
  • a method for treating a genetic disease, tissue damage or cancer in a target cell which comprises administering the modified adeno-associated virus vector of [6].
  • a candidate modified adeno-associated virus vector is obtained by substituting any one or more amino acid residues selected from (a) below with other amino acid residues in the amino acid sequence of the capsid sequence of the reference adeno-associated virus vector.
  • the amino acid substitution is Leu129Phe, Ser268Thr, Asn447Ser, Gly470Thr, Ser472Ala, Val473Asn, Thr502Ala and Glu531Lys
  • the production method according to [12] which is one or more selected from [15] The production method of [12], wherein the target cells are inner ear, skin, heart, eye, brain, upper gastrointestinal tract, lower gastrointestinal tract or kidney cells.
  • Target cells are inner ear epithelial cells, intestinal epithelial cells, airway epithelial cells, retinal cells, lens cells, skin cells, kidney cells, airway epithelial cells, nerve cells, cardiomyocytes, stromal cells, and involved in Connexin expression
  • the production method according to [12] which is a cell selected from cancer cells that cause cancer.
  • the production method of [12], wherein the target cells are inner ear epithelial cells.
  • the present invention also provides the following inventions [1] to [17].
  • [1] A modified adeno-associated virus vector that exhibits improved tropism for infectivity to target cells, A modified adeno-associated virus vector in which substitution of one or more amino acid residues selected from the following (1) to (8) is introduced into the amino acid sequence of the capsid sequence.
  • the substitution of the amino acid residue is (1) substitution of phenylalanine for leucine present at the position corresponding to position 129 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in alignment with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (2) substitution of threonine for serine present at the position corresponding to position 268 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in alignment with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (3) substitution of asparagine to serine at a position corresponding to position 447 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in alignment with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (4) substitution of threonine for glycine present at the position corresponding to position 470 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in alignment with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (5) substitution of serine with alanine at the position corresponding to position 472 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in alignment with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
  • [3-2] The modified adeno-associated virus vector of [3], which has a capsid sequence consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • [4] The modified adeno-associated virus vector of [3], further comprising the substitution of the amino acid residue of (1) or (8).
  • [4-2] The modified adeno-associated virus vector of [4], which has a capsid sequence consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17.
  • [4-3] The modified adeno-associated virus vector of [1] or [2], which has a combination of the amino acid residue substitutions of (3) to (7).
  • [4-4] The modified adeno-associated virus vector of [4-3], which has a capsid sequence consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:18.
  • [5] The modified adeno-associated virus vector of any one of [1] to [4], wherein the target cells are epithelial cells, stromal cells, lens cells or cancer cells.
  • [6] The modified adeno-associated virus vector of [5], wherein the epithelial cells are inner ear epithelial cells, intestinal epithelial cells, retinal cells, skin cells, renal cells, airway epithelial cells, nerve cells or uterine cells.
  • [7] The modified adeno-associated virus vector of [5] or [6], wherein the target cell has a gap junction or expresses a connexin molecule that constitutes a gap junction.
  • GJB2 connexin 26
  • SLC26A4 pendrin
  • TMC1 gene TMC1 gene
  • TMC2 gene voltage-gated potassium channel subfamily Q member 4)
  • KCNQ4 cadherin 23
  • PCDH15 protocadherin 15
  • OTOF otoferrin
  • Atoh1 gene protein atonal homolog 1
  • CDKN1B cyclin-dependent kinase inhibitor 1B
  • a pharmaceutical comprising the modified adeno-associated virus vector of any one of [1] to [9].
  • the drug of [10] which is used for treatment of genetic disease, tissue damage and/or cancer, or genome editing.
  • a genetic disease, tissue comprising the step of administering a therapeutically effective amount of the modified adeno-associated virus vector of any one of [1] to [9] to a subject having a genetic disease, tissue damage and/or cancer A method of treating injury and/or cancer.
  • a genome editing method comprising the step of administering an effective amount of the modified adeno-associated virus vector of any one of [1] to [9] to a subject.
  • a method for producing a modified adeno-associated virus vector exhibiting improved infectivity tropism for target cells comprising: introducing substitutions of one or more amino acid residues selected from (1) to (8) below into the amino acid sequence of the capsid sequence, Production method.
  • [16] creating a candidate adeno-associated virus vector by introducing substitutions of one or more amino acid residues selected from (1) to (8) above into the amino acid sequence of the capsid sequence of the reference adeno-associated virus vector; process and measuring the target cell infectious dose of the candidate adeno-associated viral vector; and selecting a candidate adeno-associated viral vector that has increased the target cell infectious dose compared to the reference adeno-associated viral vector;
  • the modified AAV vector of the present invention has a high infection tropism for epithelial cells typified by inner ear epithelial cells, gene therapy agents, genome editing therapeutic agents, and regenerative medicine for various diseases caused by abnormalities of these epithelial cells are used. It is useful as a vector for In particular, the modified AAV vector of the present invention, in which the GJB2 gene is integrated, is useful as a gene therapy agent for deafness.
  • FIG. 1 shows an alignment of AAV1-10 capsid sequences.
  • FIG. 1 shows an alignment of AAV1-10 capsid sequences.
  • FIG. 1 shows an alignment of AAV1-10 capsid sequences.
  • FIG. 1 shows an alignment of AAV1-10 capsid sequences.
  • FIG. 1 shows an alignment of AAV1-10 capsid sequences.
  • FIG. 1 shows an alignment of AAV1-10 capsid sequences.
  • FIG. 1 shows an alignment of AAV1-10 capsid sequences.
  • FIG. 1 shows an alignment of AAV1-10 capsid sequences.
  • FIG. 2 shows the infection tropism of various AAV serotypes to inner ear cells.
  • FIG. 2 is a diagram quantifying the infection tropism of various AAV serotypes to inner ear cells.
  • FIG. 2 shows stained images of tissue transfected with a modified adeno-associated virus vector in which GJB2 was transfected with AAV-sia1.8 into the inner ear epithelium of GJB2-deficient mice.
  • Red indicates the connexin 26 protein by the introduced GJB2 gene.
  • Green indicates the EGFP reporter.
  • FIG. 10 shows stained images of tissue into which a modified adeno-associated virus vector into which GJB2 was introduced with AAV-sia6.8 was introduced into the inner ear epithelium of a GJB2-deficient mouse. Red indicates gap junctions by the introduced GJB2 gene, and green indicates the EGFP reporter. The red lines between cells are gap junctions formed by gene therapy.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing cells that constitute the cochlear organ. The EGFP-positive area ratio in the outer spiral groove cell region (OSC) and the region containing outer hair cells and Ditellus cells (OHC+DC) is shown.
  • OSC outer spiral groove cell region
  • OPC+DC Ditellus cells
  • Inner ear epithelial cells induced from iPSCs of hearing-impaired patients were infected with AAV-sia6.8 carrying the wild-type GJB2 gene, and the expression of connexin 26 (CX26) protein and connexin 30 (CX30) protein was detected by immunostaining. indicate. The expression intensity ratio of CX26 protein to CX30 protein is shown.
  • Cultured cochlear organs of mice infected with AAV-sia6.8 carrying the protein atonal homolog 1 (Atohl) gene are shown. Thresholds of ABR before surgery, 1 week and 2 weeks after surgery in GJB2-deficient mice treated with AAV-sia6.8 carrying the wild-type GJB2 gene are shown.
  • FIG. 2 shows stained images of cultured cochlear organs of GJB2-deficient mice infected with AAV-sia6.8 containing promoter 2 and loaded with GJB2 gene and EGFP gene. Red indicates gap junctions by the introduced GJB2 gene, and green indicates the EGFP reporter. It is a stained image of cultured cochlear organs of mice infected with AAV-sia6.8 carrying an EGFP gene and its Thr268Ser variant. The EGFP-positive area ratio in the outer spiral groove cell region (OSC) and the region containing outer hair cells and Ditellus cells (OHC+DC) is shown.
  • OSC outer spiral groove cell region
  • OPC+DC Ditellus cells
  • Wild-type AAV includes AAV1 to AAV10 as serotypes.
  • the "reference AAV” to be introduced for substitution of amino acid residues is not particularly limited, but AAV1, AAV6, AAV7 and AAV8 are preferably used, AAV1, AAV6 or AAV8 are more preferably used, and AAV1 or AAV6 are more preferably used. is used, and AAV1 is even more preferably used.
  • FIGS. 2 and 3 our experiments with various AAV vectors show that AAV1, AAV6, AAV7 and AAV8 have different tropisms for infection of inner ear cells, especially supporting cells forming gap junctions. It was found to be higher than the serotype. Therefore, it is preferred to have reference AAV for AAV1, AAV6, AAV7 and AAV8 modifications.
  • the modified AAV vector of the present invention is a modified adeno-associated virus vector in which some amino acid residues of the capsid sequence of the wild adeno-associated virus are substituted with other amino acid residues, preferably AAV1, AAV6, AAV7 or A modified AAV vector in which some amino acid residues in the AAV8 capsid sequence are substituted with other amino acid residues is preferred. Further, modified AAV vectors in which some amino acid residues of the AAV1, AAV6 or AAV8 capsid sequence are substituted with other amino acid residues are more preferable, and some amino acid residues of the AAV1 or AAV6 capsid sequence are replaced with other amino acid residues.
  • AAV vector in which some amino acid residues of the AAV1 capsid sequence are substituted with other amino acid residues is even more preferred. More specifically, in alignment with the amino acid sequence of the AAV1 capsid sequence of SEQ ID NO: 1, (1) position 129 (Leu), (2) position 268 (Ser), (3) position 447 (Asn), ( 4) one or more amino acids selected from position 470 (Gly), (5) position 472 (Ser), (6) position 473 (Thr), (7) position 502 (Thr) and (8) position 531 (Gln) Modified adeno-associated virus vectors in which residues or amino acid residues at positions corresponding thereto are substituted with other amino acid residues are preferred.
  • the present invention provides a step of introducing a substitution of one or more amino acid residues selected from (1) to (8) above into the amino acid sequence of the capsid sequence of a reference AAV to create a candidate AAV (candidate AAV creation process) and a step of measuring the amount of infection of the target cells by the candidate AAV (measuring step); and a step of selecting a candidate AAV with an increased amount of infection of the target cells compared to the reference AAV (selection step); Also provided is a method for producing a modified AAV that exhibits improved tropism for infectivity to target cells, comprising:
  • the “position corresponding to position 129 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in alignment with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1” refers to the “reference AAV capsid sequence” to which substitution of amino acid residues is to be introduced. , means the position corresponding to position 129 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 when the amino acid sequence of the capsid sequence is aligned with the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
  • the “reference AAV” is not particularly limited, but may be wild-type AAV or wild-type AAV of serotype AAV1-10.
  • a “reference AAV capsid sequence” may be, for example, a wild-type AAV capsid sequence, such as a wild-type AAV capsid sequence of serotype AAV1-10. Alignment is performed by aligning the two amino acid sequences to be compared so that as many amino acid residues of the two amino acid sequences are identical as possible. When aligning, appropriate gaps are inserted into one or both of the two amino acid sequences being compared, if necessary. Such alignment of amino acid sequences can be performed using well-known programs such as BLAST, FASTA, and CLUSTALW.
  • amino acid residue at the position corresponding to the amino acid residue at the specific position may be an amino acid residue corresponding to the positions (1) to (8) of SEQ ID NO: 1 in AAV1 to AAV10.
  • AAV6, AAV7, and AAV8 are preferably amino acid residues corresponding to the positions (1) to (8) of SEQ ID NO: 1, and the amino acid residues of (1) to (8) of SEQ ID NO: 1 in AAV6 and AAV8 More preferably, it is the amino acid residue corresponding to the position.
  • the AAV1 capsid sequence is shown in SEQ ID NO:1.
  • the capsid sequences of AAV2-10 are shown in SEQ ID NOS:2-10. Alignments of capsid sequences of AAV1-10 are shown in FIGS. 1-1 to 1-8.
  • leucine present at the position corresponding to position 129 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (2) serine present at the position corresponding to position 268, and (3) corresponding to position 447.
  • (4) glycine at a position corresponding to position 470, (5) serine at a position corresponding to position 472, (6) valine at a position corresponding to position 473, ( 7) threonine present at the position corresponding to position 502, and (8) glutamic acid present at the position corresponding to position 531 are (2-1) leucine at position 129 in the AAV2 capsid sequence (SEQ ID NO: 2).
  • AAV4 capsid sequence (SEQ ID NO: 4), (4-1) leucine at position 128, (4-2) serine at position 257, (4-3) glutamine at position 450, (4-4 ) Asparagine at position 464, (4-5) Serine at position 466, (4-6) Asparagine at position 467, (4-7) Lysine at position 503, (4-8) 530 is aspartic acid present at the In the AAV5 capsid sequence (SEQ ID NO: 5), (5-1) phenylalanine at position 128, (5-2) serine at position 258, (5-3) valine at position 439, (5-4 ) there is no amino acid corresponding to position 470 of AAV1, (5-5) there is no amino acid corresponding to position 472 of AAV1, (5-6) there is no amino acid corresponding to position 473 of AAV1, (5- 7) Alanine at position 488, (5-8) Serine at position 518.
  • AAV6 capsid sequence (SEQ ID NO: 6), (6-1) phenylalanine at position 129, (6-2) serine at position 268, (6-3) asparagine at position 447, (6-4 ) glycine at position 470, (6-5) serine at position 472, (6-6) valine at position 473, (6-7) threonine at position 502, (6-8) 531 It is lysine present at the position.
  • AAV7 capsid sequence (SEQ ID NO: 7), (7-1) leucine at position 129, (7-2) threonine at position 269, (7-3) alanine at position 448, (7-4 (7-5) Alanine at 474; (7-6) Glutamic acid at 475; (7-7) Alanine at position 504; (7-8) Alanine at position 533. glutamic acid.
  • AAV8 capsid sequence (SEQ ID NO: 8), (8-1) leucine at position 129, (8-2) serine at position 268, (8-3) valine at position 448, (8-4 ) Serine at position 470, (8-5) Alanine at position 472, (8-6) Asparagine at position 473, (8-7) Alanine at position 502, (8-8) 531 glutamic acid present at the In the capsid sequence of AAV9 (SEQ ID NO: 9), (9-1) leucine at position 129, (9-2) serine at position 268, (9-3) serine at position 448, (9-4 ) asparagine at position 470, (9-5) alanine at position 472, (9-6) valine at position 473, (9-7) alanine at position 502, (9-8) 531 glutamic acid present at the In the AAV10 capsid sequence (SEQ ID NO: 10), (10-1) leucine at position 129, (10-2) serine at position 269, (10-3) serine at position 449, (10-4
  • a more preferred modified AAV vector of the present invention is one in which substitution of amino acid residues at the positions (1) to (8) of SEQ ID NO: 1 or positions corresponding thereto is , Thr502Ala and Glu531Lys.
  • the modified AAV vector of the present invention has a high ability to infect hair cells (inner hair cells, outer hair cells).
  • a modified AAV vector having a combination of substitutions of Ser268Thr, Asn447Ser, Gly470Thr, Ser472Ala, Val473Asn and Thr502Ala has a high ability to infect hair cells.
  • a modified AAV vector having a Leu129Phe or Glu531Lys substitution in combination with these substitutions also has a high ability to infect hair cells.
  • modified AAV vectors with combined substitutions of Asn447Ser, Gly470Thr, Ser472Ala, Val473Asn and Thr502Ala have a higher ability to infect hair cells and a significantly higher ability to infect outer spiral groove cells.
  • Usual gene targeting means can be used as the modification (recombination) means. Specifically, a gene targeting means that mutates PCR primers as described in Nat Methods 6, 343-345 (2009) can be employed.
  • any one or more amino acid residues selected from the following (a) are added to the amino acid sequence of the capsid sequence.
  • any one or more amino acid residues selected from the following (a) are substituted with other amino acid residues to create candidate modified adeno-associated creating a viral vector (candidate AAV creating step); (a) in alignment with the amino acid sequence of the AAV1 capsid sequence of SEQ ID NO: 1, (1) 129th (Leu), (2) 268th (Ser), (3) position 447 (Asn), (4) position 470 (Gly), (5) position 472 (Ser), (6) 473rd place (Val), (7) Position 502 (Thr) and (8) Position 531 (Glu) Amino acid residues at positions corresponding to; measuring the amount of infection of the candidate modified adeno-associated virus vector to the target cell (measuring step); and (selection step);
  • the reference adeno-associated virus vector is preferably AAV1, AAV6, AAV7 or AAV8, more preferably AAV1, AAV6 or AAV8.
  • the amino acid substitution is more preferably one or more selected from Leu129Phe, Ser268Thr, Asn447Ser, Gly470Thr, Ser472Ala, Val473Asn, Thr502Ala and Glu531Lys.
  • the amount of infection of target cells is measured by measuring the number of cells expressing the gene (gene encoding a protein such as a reporter protein) loaded on the candidate modified AAV or the intensity of expression of the protein in the cell. It can be carried out.
  • the target cells include epithelial cells, stromal cells, lens cells, corneal cells, retinal cells, skeletal muscle cells, cardiomyocytes, pancreatic cells, hepatocytes, nerve cells, glial cells, blood cells, chondrocytes, osteocytes, They may be fibroblasts, adipocytes, or cancer cells.
  • the epithelial cells may be inner ear epithelial cells, intestinal epithelial cells, retinal cells, skin cells, renal cells, airway epithelial cells, oral mucosal cells, nasal mucosal cells, glomerular cells, bladder cells, or uterine cells.
  • said target cell may in particular be a cell that has gap junctions or expresses connexin molecules that are components of gap junctions.
  • the resulting modified AAV vector has remarkably improved tropism for infection to target cells, for example, the epithelial cells.
  • a modified AAV vector having one or more substitutions selected from Ser268Thr, Asn447Ser, Gly470Thr, Ser472Ala, Val473Asn and Thr502Ala in the capsid sequence of AAV1 is used to convert wild-type AAV1 into hair cells (inner hair cells). , outer hair cells), but it is highly specific for outer hair cells, and among the inner ear epithelial cells, it has the highest ability to infect outer hair cells, with an infection rate of 80-100%. efficiency.
  • modified AAVs having infection tropism against various target cells.
  • a specific example of such a modified AAV vector is an AAV vector having a capsid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 (referred to as "AAV-sia1.8" in the present disclosure).
  • an AAV vector having a capsid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 (Glu531Lys variant of AAV-sia1.8) and an AAV having a capsid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17
  • the vector (Leu129Phe variant of AAV-sia1.8) has stronger infectivity to outer hair cells and supporting cells than AAV1, and forms many large-area gap junction complexes in supporting cells. It also infects some inner hair cells.
  • a modified AAV vector having one or more substitutions selected from Ser268Thr, Asn447Ser, Gly470Thr, Ser472Ala, Val473Asn and Thr502Ala in the AAV6 capsid sequence was subjected to similar substitutions in the AAV1 capsid sequence.
  • the modified AAV vector Like the modified AAV vector, it has a high ability to infect outer hair cells. It has weaker specificity to outer hair cells and infection tropism than the modified AAV1, but has the ability to infect a wider range than the modified AAV1. By arbitrarily combining these amino acid substitutions, it may be possible to create modified AAVs having infection tropism against various target cells.
  • a specific example of such a modified AAV vector is an AAV vector (AAV-sia6.8) having a capsid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO:14.
  • an AAV vector (Thr268Ser variant of AAV-sia6.8), which is a further variant of the same variant AAV vector and has a capsid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, is more effective than AAV-sia6.8. It has a higher ability to infect hair cells and a significantly higher ability to infect outer spiral groove cells.
  • the modified AAV vector of the present invention has improved tropism for infection of various epithelial cells, particularly epithelial cells forming gap junctions.
  • Specific epithelial cells include inner ear epithelial cells, intestinal epithelial cells, retinal cells, skin cells, renal cells, airway epithelial cells, nerve cells, myocardial cells, and epithelial cells selected from cancer cells involved in Connexin expression. be done. Therefore, the modified AAV vector of the present invention is useful for gene therapy and genome editing therapy for diseases in these epithelial cells.
  • the modified AAV vector of the present invention has improved infection tropism to the target cells
  • the modified AAV vector is applied to genetic diseases in target cells, tissue damage, gene therapy of cancer, and genome editing therapy. It is preferable to integrate the gene obtained.
  • genes include genetic disease-causing genes such as GJB2 gene, SLC26A4 gene, TMC1 gene, TMC2 gene, KCNQ4 gene, CHD23 gene, protocadherin 15 (PCDH15) gene, and otoferrin (OTOF) gene; Genes that are transcription factors such as CDKN1B gene and Hes1 gene and are involved in cell differentiation and proliferation.
  • genes specifically associated with hereditary hearing loss include: Actg1, Adcy1, Adcy1, AIFM1, BDP1, BDP1, BTD, CCDC50, CDC164, CDC14A, CDH23, CEACAM16, CIB2, CLDN16, CLDN14, CLRN1, CLN1, COL11A, COL11A1, COL11A1, COL11A1 2, COL2A1, COL4A3, COL4A4, COL4A5, Col4a6, COL9A1, COL9A2, COL9A3, DCDC2, DIAPH1, DMXL2, DSPP, EDN3, EDNRB, ELM0D3, EPS8, EPS8L2, ESPN, ESRRB, EYA1, EYA4, FAM189A2, GIPC3, GJB3, GJB6, GPSM2, GRHL2, GRXCR1, GRXCR2, GSDME, HARS1, HGF, H0MER2, ILDR1, KARS1, KCNE1, KCNQ1, LHFPL5, LOX
  • the modified AAV vector of the present invention can incorporate a promoter for expression of the genes described above.
  • Known promoters such as CMV and CAG can be used as promoters, and promoters for genes in GJB2-expressing cells such as inner ear supporting cells include any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 11 to 13.
  • a promoter comprising the above can be preferably used.
  • One of the promoters may be repeatedly arranged continuously multiple times (tandem of a single promoter), or two or more may be combined so that any or all of the promoters are arranged continuously or discontinuously repeatedly multiple times. (multi-promoter tandem).
  • the modified AAV vector of the present invention may incorporate an enhancer for enhancing promoter activity.
  • enhancers can be used as the enhancer.
  • an enhancer suitable for combination with a promoter comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 11 to 13 for example, an enhancer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 ("Characterization of GJB2 cis regulatory elements in the DFNB1 locus”, Human Genetics (2019) 138:1275-1286).
  • One enhancer may be arranged multiple times in a row (tandem of a single enhancer), or two or more may be combined so that any or all of the enhancers are arranged in a row with multiple repetitions, either continuously or discontinuously. (tandem of multiple enhancers).
  • a preferred specific example of gene therapy using the modified AAV vector of the present invention is gene therapy for GJB2 mutant deafness, which is the most common hereditary deafness. That is, GJB variant deafness is the most common hereditary deafness, accounting for approximately 45% of all cases of congenital deafness.
  • a gene therapeutic agent for hearing loss can be produced by inserting the normal GJB gene into the modified AAV vector of the present invention. This gene therapy drug is administered by local administration to the inner ear lymph from the floor plate of the inner ear or intravenous administration, and normalizes abnormal gene functions by efficiently expressing target genes in target cells.
  • Administration can be intravenous, intracerebroventricular, intracochlear, intrathecal, intramuscular, subcutaneous, or a combination thereof.
  • administration may be administration to the cochlea or vestibular system, and delivery may be injection into the cochlea or vestibular system via the round window membrane (RWM), oval window, or semicircular canal. good.
  • RWM round window membrane
  • the gene therapy drug and genome editing drug of the present invention are prepared by mixing, dissolving, emulsifying, encapsulating, freeze-drying, etc. the modified AAV vector with a pharmaceutically acceptable carrier well known in the art. Can be formulated.
  • Suitable preparations for oral administration include liquid preparations in which an effective amount of the modified AAV vector of the present invention is dissolved in a diluent such as water or physiological saline, and capsules and granules containing an effective amount in the form of solids or granules. formulations, powders or tablets, suspensions in which an effective amount is suspended in a suitable dispersion medium, emulsions in which a solution in which an effective amount is dissolved is dispersed and emulsified in a suitable dispersion medium, and the like.
  • the modified AAV vectors of the present invention are combined with pharmaceutically acceptable solvents, excipients, binders, stabilizers, dispersants and the like into injectable solutions, suspensions, emulsions, It can be formulated into dosage forms such as creams, ointments, inhalants, and suppositories.
  • the modified AAV vectors of the invention can be dissolved in aqueous solutions, preferably in physiologically compatible buffers such as Hank's solution, Ringer's solution, or physiological saline buffer.
  • the medicaments of the present invention can take such forms as suspensions, solutions, or emulsions in oily or aqueous vehicles.
  • the modified AAV vector of the present invention may be produced in the form of powder, and an aqueous solution or suspension may be prepared using sterilized water or the like before use.
  • the modified AAV vectors of the invention can be powdered and made into a powder mix with a suitable base such as lactose or starch.
  • Suppository formulations can be prepared by mixing the modified AAV vector of the present invention with a conventional suppository base such as cocoa butter.
  • the therapeutic agents of the invention can be formulated as sustained release formulations, such as by encapsulating them in polymer matrices and the like.
  • the dose of the modified AAV vector of the present invention varies depending on the patient's symptoms, route of administration, body weight, age, etc., it is preferably 0.5 ⁇ g to 100 mg per day for adults.
  • Example 1 Evaluation of infection tropism of reference AAV (cultured inner ear epithelial tissue) Using AAV vectors of various serotypes (GeneCapoeia, AAVPrime TM Adeno-associated virus (AAV) Serotype Testing Kit Plus, Cat. No. AA321), experiments were performed according to the experimental guide for gene transfer using viral vectors, Yodosha, Experimental Medicine Supplement, Definitive Edition, AAV. Infection tropism to inner ear epithelial cells was examined by the method described in Gene therapy to inner ear using vector Pages 159-166 (2020.11).
  • the GJB2 gene encoding connexin 26 was incorporated into the AAV vector under the control of promoters (referred to as promoter 1, promoter 2 and promoter 3, respectively) comprising any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 11-13.
  • the inner ear was removed from a 4-day-old mouse (C57BL/6J strain), and the tissue containing the sensory epithelium was cultured overnight in DMEM medium on an 8-well chamber slide (Matsunami, Cat. No. SCS-N38). Each serotype AAV (AAV1-10, 5 ⁇ 10 8 -5 ⁇ 10 9 GC) was added on the following day.
  • promoter 1 (gene sequence of 1065 bp upstream from the transcription initiation site of the human GJB2 gene), promoter 2 (gene sequence of 760 bp upstream from the transcription initiation site of the human GJB2 gene) and promoter 3 (transcription initiation site of the human GJB2 gene)
  • promoter activity was evaluated based on the expression intensity of connexin 26, promoter 1, promoter 2, and promoter 3 were found in descending order of activity.
  • Example 2 Creation of modified AAV by introducing amino acid substitutions into standard AAV and evaluation of infection tropism (cultured inner ear epithelial tissue) Using the gene targeting method of mutating the PCR primers described in Nat Methods 6, 343-345 (2009), vectors were constructed in which various amino acid substitutions were introduced into the amino acid sequence of the capsid sequence. note that. A GJB2 gene and a reporter gene (EGFP gene) were also introduced into the modified vector. Table 1 shows changes in transduction efficiency and infection tropism of the resulting modified vectors.
  • a modified AAV vector (AAV-sia1.8; It is highly specific to outer hair cells, and has the highest ability to infect outer hair cells among inner ear epithelial cells (80-100). % infection efficiency.
  • AAV-sia6.8 SEQ ID NO: 14
  • the AAV-sia1.8 and It also has a high ability to infect outer hair cells. Although it has weaker specificity to outer hair cells and infection tropism than AAV-sia1.8, it was found to have the ability to infect a wider range of inner ear epithelial cell groups than AAV-sia1.8.
  • Example 3 Introduction of further amino acid substitutions into modified AAV and evaluation of infection tropism
  • AAV-sia1.8 Glu531Lys variant and AAV-sia1.8 Leu129Phe variant were prepared. bottom.
  • the Glu531Lys variant of AAV-sia1.8 (SEQ ID NO: 16) has stronger infectivity to outer hair cells and supporting cells than AAV1, and forms many large-area gap junction complexes in supporting cells. . It also infects some inner hair cells.
  • the Leu129Phe variant of AAV-sia1.8 (SEQ ID NO: 17) also has a stronger infectivity to outer hair cells and supporting cells than AAV1, and a gap junction complex with a large area in supporting cells. form a large number of It also infects some inner hair cells.
  • FIG. 4 shows a stained image of GJB2 (GJB2 and EGFP introduced) introduced into the inner ear epithelium of a deafness model animal (GJB2-deficient mouse) with AAV sia1.8. show. Red indicates the connexin 26 protein by the introduced GJB2 gene. Green indicates the EGFP reporter. EGFP expression indicating infection is particularly strong in outer hair cells, and EGFP expression and connexin 26 expression indicating infection in other inner hair cells and supporting cells are low.
  • FIG. 5 shows a stained image of GJB2 (GJB2 and EGFP introduced) introduced into the inner ear epithelium of GJB2-deficient mice with AAV-sia6.8.
  • Red indicates a gap junction containing connexin 26 by the introduced GJB2 gene.
  • Green indicates the EGFP reporter.
  • the red lines between cells are gap junctions formed by gene therapy.
  • Example 5 Gene Transfer into Cultured Cochlear Organs Derived from Deafness Model Animals Using cultured cochlear organs of GJB2-deficient mice, wild-type AAV6 and AAV-sia6.8 carrying the GJB2 gene and the EGFP gene were infected.
  • mice Four-day-old mice were experimentally killed under anesthesia and the cochlea was removed from the temporal bone.
  • the cochlear shaft was removed from the cochlea and the stria vascularis stripped from the organ of Corti.
  • Organs of Corti were transferred to 8-well chamber slides and cultured overnight (5% CO2 atmosphere, 37°C). The medium was then changed to medium containing 4 ⁇ l of AAV solution per 100 ⁇ l (2.05 ⁇ 10 13 GC/mL). After an additional 5 days of culture, the organ of Corti was treated with 4% paraformaldehyde and fixed.
  • FIG. 8 shows the results of image analysis of the EGFP-positive area ratio in the outer spiral groove cell region (OSC) and the region containing outer hair cells and Ditellus cells (OHC+DC).
  • AAV-sia6.8 has a higher positive area rate than wild-type AAV6 in both the outer spiral groove cell region (OSC) and the region containing outer hair cells and Ditellus cells (OHC + DC). , showed that gene transfer was possible in a wide range of inner ear epithelial cells with high efficiency.
  • Example 6 Gene therapy (repair of gap junctions in inner ear epithelial cells induced from iPSC cells derived from hearing impaired patients) Differentiation of inner ear epithelial cells was induced from induced pluripotent stem cells (iPSCs) established from patients with severe hearing loss due to abnormalities in the GJB2 gene and subjects with normal hearing. Inner ear epithelial cells were infected with AAV-sia6.8 carrying the wild-type GJB2 gene, and gap junction repair was performed by expression of connexin 26 (CX26).
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • iPSC strain (201B7) derived from a normal hearing subject was obtained from the RIKEN BioResource Center Cell Bank.
  • the iPSC line (cell line name: JUFMDOi005-A) derived from a patient with hearing loss is described in the present inventors' academic paper ("Generation of two induced pluripotent stem cell lines from PBMCs of siblings carrying c.235delC mutation in the GJB2 gene associated with sensorineural hearing loss”, Stem Cell Research, Volume 47, August 2020, 101910).
  • iPSCs were suspended in Stem Fit medium supplemented with 20 ⁇ m Y27632 and seeded in 96-well plates at 9000 cells/well. After 2 days of incubation (37°C, 5% CO 2 ), gfCDM medium supplemented with 2% matrigel (Ham's F12 GlutaMax/IMDM GlutaMax (1:1) (Gibco), 1 % Chemically defined lipid concentrate (Gibco), 0.5 Cell aggregates were transferred to 96-well plates containing 100 ⁇ l of % BSA (Sigma), 15 ⁇ g/ml Transferin (Sigma), 450 ⁇ M 1-Thioglycerol (Sigma)) and further incubated.
  • Stem Fit medium supplemented with 20 ⁇ m Y27632 and seeded in 96-well plates at 9000 cells/well.
  • gfCDM medium supplemented with 2% matrigel (Ham's F12 GlutaMax/IMDM GlutaMax (1:1) (G
  • TRIC inner ear-derived feeder cells
  • Cochlear tissue consists of the organ of Corti, the basement membrane, and the lateral wall, and is mainly composed of supporting cells, hair cells, cochlear nerve fiber cells, and other cells of the basement membrane.
  • TRICs were obtained by exposing cochlear tissue to trypsin and screening for trypsin-resistant cells. These cells were maintained under growth medium (DMEM-GlutaMax (Gibco), 10% FBS (Gibco)).
  • CX26 connexin 26
  • CX30 GJB6 gene product
  • inner ear gap junctions were unclear and insufficiently formed, and the expression intensity of CX26 relative to CX30 was reduced to about 25%.
  • the expression intensity of CX26 relative to CX30 was restored to about 50% (GJB2-235delC + AAV-GJB2WT), and gap junctions were repaired. I was able to confirm that there is.
  • Example 7 Gene therapy (regeneration of hair cells) Infection experiments with AAV-sia6.8 harboring the protein atonal homolog 1 (Atoh1) gene were carried out using mouse cultured cochlear organs. It is known that the transcription factor Atoh1 induces the differentiation of supporting cells into hair cells when the gene is introduced into the supporting cells. As shown in FIG. 11, hair cell-like cells appeared in a region different from the hair cell region (the region surrounded by the dotted line in FIG. 11 (A)) (FIG. 11 (B) (C ) arrow). FIG. 11(B) is an enlarged view of the region enclosed by the dotted line in FIG. 11(A). It was demonstrated that AAV-sia6.8 can be effectively used to regenerate hair cells that have been lost due to noise-induced deafness or the like.
  • Example 8 Gene therapy (hearing recovery in deafness model animals) Hearing ability of GJB2-deficient mice (3-4 weeks old) was measured based on auditory brainstem response (ABR) (preoperative hearing ability). Under anesthesia, two small holes were made in the lateral semicircular canal of mice using a dental drill. A capillary tube was inserted into one of the holes, and 10-12 ⁇ l of AAV-sia6.8 solution (about 1 ⁇ 10 13 GC/ml) loaded with the wild-type GJB2 gene was added to the endolymph at a rate of 3 ⁇ l/min. injected. One and two weeks after surgery, hearing was measured based on the auditory brainstem response (ABR) (post-operative hearing).
  • ABR auditory brainstem response
  • ABR was measured by placing stainless steel needle electrodes at the apex and ventrolateral side of the left and right ears, using waveform storage and stimulation control of the Scope software of the Power Laboratory system (PowerLab 4/25; AD Instruments). Electroencephalography was performed with an extracellular amplifier AC PreAmplifier (model P-55; Astro-Med). Acoustic stimulation was provided by a coupler-type speaker (model ES1spc; Bio Research Center). Thresholds were determined based on a series of responses with varying intensity at 5 dB intervals at frequencies of 8, 20, and 40 kHz.
  • Preoperative and postoperative ABR thresholds and waveforms are shown in Figures 12 and 13, respectively.
  • Two weeks after the operation (AAV-Sia6.8-CX26 2W), the threshold of ABR at high wavelengths (20kHz, 40kHz) decreased compared to before the operation (Pre-operation), and a significant improvement in hearing was observed. (See FIG. 12).
  • 2 weeks after the operation (2W post-infection) a response was confirmed even to weak sound pressure, which was not responsive before the operation (CX26cKO pre-injection) (see Fig. 13).
  • Example 9 Cell-targeted gene transfer using a promoter Promoter 2 (gene sequence of 760 bp upstream from the transcription initiation point of the human GJB2 gene, SEQ ID NO: 12) was introduced into AAV-sia6.8, and the GJB2 gene and the EGFP gene were introduced. was loaded to infect cultured cochlear organs of GJB2-deficient mice. As shown in FIG. 14, the formation of gap junctions accompanied by the expression of EGPF (green) and the expression of connexin 26 (red) was confirmed in outer spiral groove cells (OSC), which are supporting cells. No infection of outer and inner hair cells (OHC and IHC) was observed. This result indicated that AAV-sia6.8 can be effectively used for cell-targeted gene transfer (gene transfer targeting supporting cells in this example) by introducing an appropriate promoter. .
  • promoter Promoter 2 gene sequence of 760 bp upstream from the transcription initiation point of the human GJB2 gene, SEQ ID NO:
  • Example 10 Introduction of additional amino acid substitutions into modified AAV and evaluation of infection tropism 2 Similar to Example 2, a Thr268Ser variant of AAV-sia6.8 was constructed. At amino acid position 268 of AAV-sia6.8, Ser in wild-type AAV6 is replaced with Thr. Therefore, the Thr268Ser variant of AAV-sia6.8 is a modification that restores the wild-type Ser to the amino acid at position 268.
  • FIG. 15 and FIG. 16 show the fluorescence images of EGFP and the results of calculating the EGFP-positive area ratio by image analysis.
  • the Thr268Ser variant of AAV-sia6.8 (AAV-Sia-T268S) has improved infection tropism to inner ear cells compared to AAV-sia6.8, especially in outer spiral groove cells (OSC). improvement was remarkable.
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence of capsid sequence of AAV1 SEQ ID NO: 2: amino acid sequence of capsid sequence of AAV2 SEQ ID NO: 3: amino acid sequence of capsid sequence of AAV3 SEQ ID NO: 4: amino acid sequence of capsid sequence of AAV4 SEQ ID NO: 5: of AAV5 Amino acid sequence of capsid sequence SEQ ID NO: 6: amino acid sequence of capsid sequence of AAV6 SEQ ID NO: 7: amino acid sequence of capsid sequence of AAV7 SEQ ID NO: 8: amino acid sequence of capsid sequence of AAV8 SEQ ID NO: 9: amino acid sequence of capsid sequence of AAV9 SEQ ID NO: 10: amino acid sequence of capsid sequence of AAV10 SEQ ID NO: 11: nucleic acid sequence of promoter 1 SEQ ID NO: 12: nucleic acid sequence of promoter 2 SEQ ID NO: 13: nucleic acid sequence of promoter 3 SEQ ID NO: 14: capsid sequence of AAV-

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Abstract

内耳上皮細胞に代表される上皮細胞への感染指向性に優れた改変型ＡＡＶベクターとして、野生アデノ随伴ウイルスのカプシド配列の一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された改変型アデノ随伴ウイルスベクターであって、配列番号１のＡＡＶ１のカプシド配列の（１）１２９位（Ｌｅｕ）、（２）２６８位（Ｓｅｒ）、（３）４４７位（Ａｓｎ）、（４）４７０位（Ｇｌｙ）、（５）４７２位（Ｓｅｒ）、（６）４７３位（Ｔｈｒ）、（７）５０２位（Ｔｈｒ）及び（８）５３１位（Ｇｌｕ）から選ばれる１以上のアミノ酸残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に置換した改変型アデノ随伴ウイルスベクターを提供する。

Description

改変型アデノ随伴ウイルスベクター
　本発明は、改変型アデノ随伴ウイルスベクターに関する。
　遺伝子治療ベクターとして用いられるアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）には様々な血清型（ＡＡＶ１－１０など）が存在する。ＡＡＶは血清型の種類よって感染指向性が大きく異なり、対象とする遺伝子治療やゲノム編集治療の標的細胞によって最適なベクターを選択することが必要である。しかし現存するＡＡＶベクターが必ずしも標的細胞への最適な感染指向性を示すとは限らない。ＡＡＶの感染指向性はカプシド領域のアミノ酸配列によって変化するため、同配列を改変することによって最適な感染指向性を持つベクターの開発が可能となる。かかる観点から、種々の疾患に対する遺伝子治療用およびゲノム編集治療用の改変型アデノ随伴ウイルスベクターが研究されている。
　これまで内耳への遺伝子治療の候補としてＡＡＶ１、ＡＡＶ２などの野生血清型が用いられてきたが、最近になってＡＡＶ－ＡＮＣ８０Ｌ６５（特許文献１）等のカプシド改変型ベクターも開発されている。これらは内耳への遺伝子導入が可能であるが感染指向性が異なる。例えばＡＡＶ１は蝸牛外構細胞（外らせん溝細胞）への感染能を持つがその他の上皮細胞への感染能は弱い。ＡＡＶ２は蝸牛内有毛細胞への感染能は高いがその他の上皮細胞への感染能は弱い。ＡＡＶ２の内耳への感染能を高めたＡＡＶ－ＡＮＣ８０Ｌ６５ベクターはＡＡＶ２が持つ内有毛細胞への感染能に加えて外有毛細胞の一部への感染能を持つが、ギャップ結合ネットワークを持つ蝸牛外構細胞及び蝸牛内構細胞（内らせん溝細胞）への感染能は低いため、遺伝性難聴で最多のＧＪＢ２変異型難聴（ギャップ結合の形成不全を特徴とする）への遺伝子治療への適用は難しい。
国際公開第２００７／０１９９９４号
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１６，９０（１１）：５２１９－５２３０
　前記のように内耳細胞に代表される上皮細胞や、間質細胞、神経細胞、網膜細胞、水晶体細胞、癌細胞、皮膚細胞、並びにギャップ結合や構成要素のコネキシン分子を発現する細胞への感染指向性に優れた改変型ＡＡＶベクターは未だ開発されていない。
　従って、本発明の課題は、内耳細胞に代表される上皮細胞や、間質細胞、神経細胞、網膜細胞、水晶体細胞、癌細胞、皮膚細胞、並びにギャップ結合やコネキシン分子を発現する細胞への感染指向性に優れた改変型ＡＡＶベクターを提供することにある。
　そこで、本発明者は、まず、ＡＡＶの血清型の内耳上皮細胞への感染指向性について検討したところ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８が内耳上皮細胞、特に内耳ギャップ結合を形成する支持細胞への感染指向性が高いことを見出した。そこで、これらの野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８などに対してアミノ酸配列の一部の改変を行ったところ、特定の位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換すれば、特許文献１記載のＡＡＶ－ＡＮＣ８０Ｌ６５ベクターや他の野生型ＡＡＶとは異なる感染指向性を有し、内耳上皮細胞に代表される上皮細胞への感染指向性の高いベクターになることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、下記の発明［１］～［１７］を提供するものである。
［１］アデノ随伴ウイルスのカプシド配列の一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された改変型アデノ随伴ウイルスベクターであって、配列番号１のＡＡＶ１のカプシド配列のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて（１）１２９位（Ｌｅｕ）、（２）２６８位（Ｓｅｒ）、（３）４４７位（Ａｓｎ）、（４）４７０位（Ｇｌｙ）、（５）４７２位（Ｓｅｒ）、（６）４７３位（Ｖａｌ）、（７）５０２位（Ｔｈｒ）及び（８）５３１位（Ｇｌｕ）から選ばれる１以上のアミノ酸残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に置換した改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
［２］前記アミノ酸残基の置換が、Ｌｅｕ１２９Ｐｈｅ、Ｓｅｒ２６８Ｔｈｒ、Ａｓｎ４４７Ｓｅｒ、Ｇｌｙ４７０Ｔｈｒ、Ｓｅｒ４７２Ａｌａ、Ｖａｌ４７３Ａｓｎ、Ｔｈｒ５０２Ａｌａ及びＧｌｕ５３１Ｌｙｓから選ばれる１以上である［１］記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
［３］上皮細胞の標的細胞への感染指向性が向上したベクターである［１］又は［２］記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
［４］前記上皮細胞が、内耳上皮細胞、腸上皮細胞、網膜細胞、皮膚細胞、腎細胞、気道上皮細胞、神経細胞、心筋細胞、及びＣｏｎｎｅｘｉｎ発現が関与する癌細胞から選ばれる上皮細胞である［３］記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
［５］前記上皮細胞が、内耳上皮細胞である［３］又は［４］記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
［６］さらにＧＪＢ２遺伝子、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子、ＴＭＣ１遺伝子、ＴＭＣ２遺伝子及びＡｔｏｈ１遺伝子から選ばれる遺伝性疾患、組織損傷、癌への遺伝子治療又はゲノム編集治療に適用され得る遺伝子が組み込まれている［１］～［５］のいずれかに記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
［７］［６］記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクターを含有する、標的細胞における遺伝性疾患、組織損傷、癌の治療用の遺伝子治療薬又はゲノム編集治療薬。
［８］標的細胞における遺伝性疾患、組織損傷、癌の治療用の遺伝子治療薬又はゲノム編集治療薬の製造のための、［６］記載の改変型アデノウイルス随伴ベクターの使用。
［９］標的細胞における遺伝性疾患、組織損傷又は癌の治療に用いるための、［６］記載の改変型アデノウイルス随伴ベクター。
［１０］［６］記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクターを投与することを特徴とする、標的細胞における遺伝性疾患、組織損傷又は癌の治療方法。
［１１］カプシド配列のアミノ酸配列に、以下の（ａ）から選択されるいずれか一以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する工程を含む、標的細胞に対する感染指向性が改善された改変型アデノ随伴ウイルスベクターの製造方法。
　（ａ）配列番号１のＡＡＶ１のカプシド配列のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、
（１）１２９位（Ｌｅｕ）、
（２）２６８位（Ｓｅｒ）、
（３）４４７位（Ａｓｎ）、
（４）４７０位（Ｇｌｙ）、
（５）４７２位（Ｓｅｒ）、
（６）４７３位（Ｖａｌ）、
（７）５０２位（Ｔｈｒ）及び
（８）５３１位（Ｇｌｕ）
に相当する位置のアミノ酸残基。
［１２］基準アデノ随伴ウイルスベクターのカプシド配列のアミノ酸配列に、以下の（ａ）から選択されるいずれか一以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換して候補改変アデノ随伴ウイルスベクターを作成する工程、
　（ａ）配列番号１のＡＡＶ１のカプシド配列のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、
（１）１２９位（Ｌｅｕ）、
（２）２６８位（Ｓｅｒ）、
（３）４４７位（Ａｓｎ）、
（４）４７０位（Ｇｌｙ）、
（５）４７２位（Ｓｅｒ）、
（６）４７３位（Ｖａｌ）、
（７）５０２位（Ｔｈｒ）及び
（８）５３１位（Ｇｌｕ）
に相当する位置のアミノ酸残基；
　前記候補改変アデノ随伴ウイルスベクターの前記標的細胞への感染量をレポーター遺伝子の陽性細胞又は発現タンパク質の陽性細胞数により感染細胞数又は遺伝子導入効率を測定・評価する工程；及び
　前記標的細胞への感染量が、前記アミノ酸置換を導入する前の前記基準アデノ随伴ウイルスベクターに比して増加した候補改変アデノ随伴ウイルスベクターを選択する工程；
を含む［１１］記載の製造方法。
［１３］前記基準アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７又はＡＡＶ８である［１２］記載の製造方法。
［１４］前記アミノ酸置換が、
Ｌｅｕ１２９Ｐｈｅ、
Ｓｅｒ２６８Ｔｈｒ、
Ａｓｎ４４７Ｓｅｒ、
Ｇｌｙ４７０Ｔｈｒ、
Ｓｅｒ４７２Ａｌａ、
Ｖａｌ４７３Ａｓｎ、
Ｔｈｒ５０２Ａｌａ及び
Ｇｌｕ５３１Ｌｙｓ
から選ばれる１以上である、［１２］記載の製造方法。
［１５］標的細胞が、内耳、皮膚、心臓、眼、脳、上部消化管、下部消化管又は腎臓の細胞である［１２］記載の製造方法。
［１６］標的細胞が、内耳上皮細胞、腸上皮細胞、気道上皮細胞、網膜細胞、水晶体細胞、皮膚細胞、腎細胞、気道上皮細胞、神経細胞、心筋細胞、間質系細胞及びＣｏｎｎｅｘｉｎ発現が関与する癌細胞から選ばれる細胞である［１２］記載の製造方法。
［１７］標的細胞が、内耳上皮細胞である［１２］記載の製造方法。
　また、本発明は、他の一側面において、下記の発明〔１〕～〔１７〕をも提供する。
〔１〕標的細胞に対する改善された感染性指向性を示す改変型アデノ随伴ウイルスベクターであって、
カプシド配列のアミノ酸配列に、以下の（１）～（８）から選択される１又は２以上のアミノ酸残基の置換が導入された、改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
（１）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の１２９位に相当する位置に存在するロイシンの他のアミノ酸残基への置換、
（２）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の２６８位に相当する位置に存在するセリンの他のアミノ酸残基への置換、
（３）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４４７位に相当する位置に存在するアスパラギンの他のアミノ酸残基への置換、
（４）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７０位に相当する位置に存在するグリシンの他のアミノ酸残基への置換、
（５）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７２位に相当する位置に存在するセリンの他のアミノ酸残基への置換、
（６）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７３位に相当する位置に存在するバリンの他のアミノ酸残基への置換、
（７）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の５０２位に相当する位置に存在するトレオニンの他のアミノ酸残基への置換、及び
（８）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の５３１位に相当する位置に存在するグルタミン酸の他のアミノ酸残基への置換。
〔２〕前記アミノ酸残基の置換が、
（１）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の１２９位に相当する位置に存在するロイシンのフェニルアラニンへの置換、
（２）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の２６８位に相当する位置に存在するセリンのトレオニンへの置換、
（３）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４４７位に相当する位置に存在するアスパラギンのセリンへの置換、
（４）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７０位に相当する位置に存在するグリシンのトレオニンへの置換、
（５）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７２位に相当する位置に存在するセリンのアラニンへの置換、
（６）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７３位に相当する位置に存在するバリンのアスパラギンへの置換、
（７）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の５０２位に相当する位置に存在するトレオニンのアラニンへの置換、又は
（８）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の５３１位に相当する位置に存在するグルタミン酸のロイシンへの置換、
である、〔１〕に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
〔３〕前記（２）～（７）のアミノ酸残基の置換を組み合わせて有する、〔１〕又は〔２〕の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
〔３－２〕配列番号１４又は配列番号１５のアミノ酸配列からなるカプシド配列を有する、〔３〕の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
〔４〕前記（１）又は（８）のアミノ酸残基の置換をさらに有する、〔３〕の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
〔４－２〕配列番号１６又は配列番号１７のアミノ酸配列からなるカプシド配列を有する、〔４〕の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
〔４－３〕前記（３）～（７）のアミノ酸残基の置換を組み合わせて有する、〔１〕又は〔２〕の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
〔４－４〕配列番号１８のアミノ酸配列からなるカプシド配列を有する、〔４－３〕の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
〔５〕前記標的細胞が、上皮細胞、間質細胞、水晶体細胞又は癌細胞である、〔１〕－〔４〕のいずれかの改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
〔６〕前記上皮細胞が、内耳上皮細胞、腸上皮細胞、網膜細胞、皮膚細胞、腎細胞、気道上皮細胞、神経細胞又は子宮細胞である、〔５〕の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
〔７〕前記標的細胞が、ギャップ結合を有するか、あるいはギャップ結合の構成要素となるコネキシン分子を発現する、〔５〕又は〔６〕の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
〔８〕コネキシン２６（ＧＪＢ２）遺伝子、ペンドリン（ＳＬＣ２６Ａ４）遺伝子、ＴＭＣ１遺伝子、ＴＭＣ２遺伝子、電位依存性カリウムチャネルサブファミリーＱメンバー４）（ＫＣＮＱ４）、カドヘリン２３（ＣＨＤ２３）遺伝子、プロトカドヘリン１５（ＰＣＤＨ１５）遺伝子及びオトフェリン（ＯＴＯＦ）遺伝子から選ばれる遺伝性疾患の原因遺伝子、それらのゲノム編集のための遺伝子配列、プロテインアトナールホモログ１（Ａｔｏｈ１）遺伝子、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ｂ（ＣＤＫＮ１Ｂ）遺伝子及び塩基性ヘリックスループヘリックス型転写因子（Ｈｅｓ１）遺伝子選ばれる細胞分化・増殖のための遺伝子が組み込まれている、〔７〕の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
〔９〕ＧＪＢ２遺伝子の上流に、配列番号１１～１３のいずれかの塩基配列を含んでなるプロモーターがＧＪＢ２遺伝子を発現可能に組み込まれている、〔８〕の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
〔９－２〕ＧＪＢ２遺伝子の上流に、配列番号１９の塩基配列を含んでなるエンハンサーが前記プロモーターを活性化可能に組み込まれている、〔９〕の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
〔１０〕〔１〕～〔９〕のいずれかの改変型アデノ随伴ウイルスベクターを含む、医薬。
〔１１〕遺伝性疾患、組織損傷及び／又は癌の治療、あるいはゲノム編集に用いられる、〔１０〕の医薬。
〔１２〕遺伝性疾患、組織損傷及び／又は癌の治療、あるいはゲノム編集用の医薬の製造のための、〔１〕～〔９〕のいずれかの改変型アデノ随伴ウイルスベクターの使用。
〔１３〕遺伝性疾患、組織損傷及び／又は癌を有する対象に〔１〕～〔９〕のいずれかの改変型アデノ随伴ウイルスベクターの治療有効量を投与するステップを含む、遺伝性疾患、組織損傷及び／又は癌の治療方法。
〔１４〕対象に〔１〕～〔９〕のいずれかの改変型アデノ随伴ウイルスベクターの有効量を投与するステップを含む、ゲノム編集方法。
〔１５〕標的細胞に対する改善された感染性指向性を示す改変型アデノ随伴ウイルスベクターの製造方法であって、
カプシド配列のアミノ酸配列に、下記の（１）～（８）から選択される１又は２以上のアミノ酸残基の置換を導入する工程を含む、
製造方法。
（１）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の１２９位に相当する位置に存在するロイシンの他のアミノ酸残基への置換、
（２）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の２６８位に相当する位置に存在するセリンの他のアミノ酸残基への置換、
（３）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４４７位に相当する位置に存在するアスパラギンの他のアミノ酸残基への置換、
（４）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７０位に相当する位置に存在するグリシンの他のアミノ酸残基への置換、
（５）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７２位に相当する位置に存在するセリンの他のアミノ酸残基への置換、
（６）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７３位に相当する位置に存在するバリンの他のアミノ酸残基への置換、
（７）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の５０２位に相当する位置に存在するトレオニンの他のアミノ酸残基への置換、及び
（８）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の５３１位に相当する位置に存在するグルタミン酸の他のアミノ酸残基への置換。
〔１６〕基準アデノ随伴ウイルスベクターのカプシド配列のアミノ酸配列に、前記（１）～（８）から選択される１又は２以上のアミノ酸残基の置換を導入して候補アデノ随伴ウイルスベクターを作成する工程と、
　前記候補アデノ随伴ウイルスベクターの前記標的細胞の感染量を測定する工程；及び
　前記標的細胞の感染量が、前記基準アデノ随伴ウイルスベクターに比して増加した候補アデノ随伴ウイルスベクターを選択する工程；
を含む、〔１５〕の製造方法。
〔１７〕前記基準アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１０、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、より好ましくはＡＡＶ１又はＡＡＶ６、特に好ましくはＡＡＶ１である、〔１５〕の製造方法。
　本発明の改変型ＡＡＶベクターは、内耳上皮細胞に代表される上皮細胞に対する感染指向性が高いので、これらの上皮細胞の異常に起因する種々の疾患の遺伝子治療薬やゲノム編集治療薬や再生医療用のベクターとして有用である。特に、ＧＪＢ２遺伝子が組み込まれている本発明の改変型ＡＡＶベクターは、難聴遺伝子治療薬として有用である。
ＡＡＶ１－１０のカプシド配列のアラインメントを示す図である。 ＡＡＶ１－１０のカプシド配列のアラインメントを示す図である。 ＡＡＶ１－１０のカプシド配列のアラインメントを示す図である。 ＡＡＶ１－１０のカプシド配列のアラインメントを示す図である。 ＡＡＶ１－１０のカプシド配列のアラインメントを示す図である。 ＡＡＶ１－１０のカプシド配列のアラインメントを示す図である。 ＡＡＶ１－１０のカプシド配列のアラインメントを示す図である。 ＡＡＶ１－１０のカプシド配列のアラインメントを示す図である。 ＡＡＶの各種血清型の内耳細胞への感染指向性を示す図である。 ＡＡＶの各種血清型の内耳細胞への感染指向性を数値化した図である。 ＧＪＢ２欠損マウスの内耳上皮にＡＡＶ－ｓｉａ１．８でＧＪＢ２を導入した改変型アデノ随伴ウイルスベクターを導入した組織の染色像を示す。赤が導入したＧＪＢ２遺伝子によるコネキシン２６タンパク質を示す。緑がＥＧＦＰのレポーターを示す。 ＧＪＢ２欠損マウスの内耳上皮にＡＡＶ－ｓｉａ６．８でＧＪＢ２を導入した改変型アデノ随伴ウイルスベクターを導入した組織の染色像を示す。赤が導入したＧＪＢ２遺伝子によるギャップ結合を示し、緑がＥＧＦＰのレポーターを示す。細胞間に赤い線が入っている部分が遺伝子治療により形成されたギャップ結合である。 ＧＪＢ２遺伝子とＥＧＦＰ遺伝子を搭載した野生型ＡＡＶ６及びＡＡＶ－ｓｉａ６．８を感染させたＧＪＢ２欠損マウスの培養蝸牛器官の染色像である。赤がＧＪＢ２遺伝子の発現産物であるコネキシン２６タンパク質を示す。緑がＥＧＦＰのレポーターを示す。 蝸牛器官を構成する細胞を示す模式図である。 外らせん溝細胞の領域（OSC）と、外有毛細胞とダイテルス細胞を含む領域（OHC+DC）におけるＥＧＦＰ陽性面積率を示す。 難聴患者のｉＰＳＣから誘導した内耳上皮細胞に、野生型ＧＪＢ２遺伝子を搭載したＡＡＶ－ｓｉａ６．８を感染させ、コネキシン２６（ＣＸ２６）タンパク質及びコネキシン３０（ＣＸ３０）タンパク質の発現を免疫染色により検出した結果を示す。 ＣＸ３０タンパク質に対するＣＸ２６タンパク質の発現強度比を示す。 プロテインアトナールホモログ１（Ａｔｏｈ１）遺伝子を搭載したＡＡＶ－ｓｉａ６．８を感染させたマウスの培養蝸牛器官を示す。 野生型ＧＪＢ２遺伝子を搭載したＡＡＶ－ｓｉａ６．８により治療したＧＪＢ２欠損マウスの術前、術後１週間及び２週間のＡＢＲの閾値を示す。 野生型ＧＪＢ２遺伝子を搭載したＡＡＶ－ｓｉａ６．８により治療したＧＪＢ２欠損マウスの術前、術後１週間及び２週間のＡＢＲの波形を示す。 プロモーター２を導入し、ＧＪＢ２遺伝子とＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＡＡＶ－ｓｉａ６．８を感染させたＧＪＢ２欠損マウスの培養蝸牛器官の染色像である。赤が導入したＧＪＢ２遺伝子によるギャップ結合を示し、緑がＥＧＦＰのレポーターを示す。 ＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＡＡＶ－ｓｉａ６．８とそのＴｈｒ２６８Ｓｅｒ改変体を感染させたマウスの培養蝸牛器官の染色像である。 外らせん溝細胞の領域（OSC）と、外有毛細胞とダイテルス細胞を含む領域（OHC+DC）におけるＥＧＦＰ陽性面積率を示す。
　野生型ＡＡＶは、血清型としてＡＡＶ１～ＡＡＶ１０が存在する。
　アミノ酸残基の置換導入対象とする「基準ＡＡＶ」には、特に限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８が好ましく用いられ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６又はＡＡＶ８がより好ましく用いられ、ＡＡＶ１又はＡＡＶ６がさらに好ましく用いられ、ＡＡＶ１がよりさらに好ましく用いられる。
　図２及び３に示すように、本発明者の各種ＡＡＶベクターを用いた試験により、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７及びＡＡＶ８は、内耳細胞、特にギャップ結合を形成する支持細胞への感染指向性が他の血清型に比べて高いことが判明した。従って、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７及びＡＡＶ８改変のための基準ＡＡＶにするのが好ましい。
　本発明の改変型ＡＡＶベクターは、野生アデノ随伴ウイルスのカプシド配列の一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された改変型アデノ随伴ウイルスベクターであり、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７又はＡＡＶ８のカプシド配列の一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された改変型ＡＡＶベクターが好ましい。また、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６又はＡＡＶ８のカプシド配列の一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された改変型ＡＡＶベクターがより好ましく、ＡＡＶ１又はＡＡＶ６のカプシド配列の一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された改変型ＡＡＶベクターがさらに好ましく、ＡＡＶ１のカプシド配列の一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された改変型ＡＡＶベクターがよりさらに好ましい。
　より具体的には、配列番号１のＡＡＶ１のカプシド配列のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、（１）１２９位（Ｌｅｕ）、（２）２６８位（Ｓｅｒ）、（３）４４７位（Ａｓｎ）、（４）４７０位（Ｇｌｙ）、（５）４７２位（Ｓｅｒ）、（６）４７３位（Ｔｈｒ）、（７）５０２位（Ｔｈｒ）及び（８）５３１位（Ｇｌｎ）から選ばれる１以上のアミノ酸残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に置換した改変型アデノ随伴ウイルスベクターが好ましい。
　上記（１）～（８）に規定する位置に存在するアミノ酸残基は、ＡＡＶの標的細胞に対する感染性指向性の決定に重要な役割を有していることが明らかとなった。したがって、これらの位置に存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基への置換することによりＡＡＶの標的細胞に対する感染性指向性を変化させることができ、目的とする標的細胞に対して改善された感染性指向性を示す改変型ＡＡＶを得られると期待できる。
　従って、本発明は、基準ＡＡＶのカプシド配列のアミノ酸配列に、上記（１）～（８）から選択される１又は２以上のアミノ酸残基の置換を導入して候補ＡＡＶを作成する工程（候補ＡＡＶ作成工程）と、
　前記候補ＡＡＶの前記標的細胞の感染量を測定する工程（測定工程）；及び
　前記標的細胞の感染量が、前記基準ＡＡＶに比して増加した候補ＡＡＶを選択する工程（選択工程）；
を含む、標的細胞に対する改善された感染性指向性を示す改変型ＡＡＶの製造方法をも提供する。
　ここで、「配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の１２９位に相当する位置」とは、アミノ酸残基の置換の導入対象とする「基準ＡＡＶのカプシド配列」において、当該カプシド配列のアミノ酸配列を配列番号１のアミノ酸配列とアラインメントさせた場合に、配列番号１のアミノ酸配列の１２９位に対応する位置を意味する。上述のとおり「基準ＡＡＶ」は、特に限定されないが、野生型ＡＡＶであってよく、血清型ＡＡＶ１－１０の野生型ＡＡＶであってよい。従って、「基準ＡＡＶのカプシド配列」は、例えば野生型ＡＡＶのカプシド配列であって、血清型ＡＡＶ１－１０の野生型ＡＡＶのカプシド配列であってよい。
　アラインメントは、比較すべき２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列を整列させることにより行われる。整列の際には、必要に応じ、比較する２つのアミノ酸配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このようなアミノ酸配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。
　また、前記特定の位置のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基とは、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１０における配列番号１の前記（１）～（８）の位置に相当するアミノ酸残基であればよいが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８における配列番号１の前記（１）～（８）の位置に相当するアミノ酸残基であることが好ましく、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８における配列番号１の前記（１）～（８）の位置に相当するアミノ酸残基であることがより好ましい。ＡＡＶ１のカプシド配列は配列番号１で示される。ＡＡＶ２－１０のカプシド配列を配列番号２－１０に示す。また、ＡＡＶ１－１０のカプシド配列のアラインメントを図１－１～図１－８に示す。
　図１に示されるように、（１）配列番号１のアミノ酸配列の１２９位に相当する位置に存在するロイシン、（２）２６８位に相当する位置に存在するセリン、（３）４４７位に相当する位置に存在するアスパラギン、（４）４７０位に相当する位置に存在するグリシン、（５）４７２位に相当する位置に存在するセリン、（６）４７３位に相当する位置に存在するバリン、（７）５０２位に相当する位置に存在するトレオニン、（８）５３１位に相当する位置に存在するグルタミン酸は、ＡＡＶ２のカプシド配列（配列番号２）では、それぞれ（２－１）１２９位のロイシン、（２－２）２６８位に存在するアスパラギン、（２－３）４４６位に存在するセリン、（２－４）４６９位に存在するアスパラギン酸、（２－５）４７１位に存在するアルギニン、（２－６）４７２位に存在するアスパラギン酸、（２－７）５０１位に存在するセリン、（２－８）５３０位に存在するグルタミン酸である。
　また、ＡＡＶ３のカプシド配列（配列番号３）では、それぞれ（３－１）１２９位のロイシン、（３－２）２６８位に存在するアスパラギン、（３－３）４４６位に存在するアスパラギン、（３－４）４７０位に存在するセリン、（３－５）４７２位に存在するセリン、（３－６）４７３位に存在するロイシン、（３－７）５０２位に存在するプロリン、（３－８）５３１位に存在するグルタミン酸である。
　ＡＡＶ４のカプシド配列（配列番号４）では、それぞれ（４－１）１２８位のロイシン、（４－２）２５７位に存在するセリン、（４－３）４５０位に存在するグルタミン、（４－４）４６４位に存在するアスパラギン、（４－５）４６６位に存在するセリン、（４－６）４６７位に存在するアスパラギン、（４－７）５０３位に存在するリシン、（４－８）５３０位に存在するアスパラギン酸である。
　ＡＡＶ５のカプシド配列（配列番号５）では、それぞれ（５－１）１２８位のフェニルアラニン、（５－２）２５８位に存在するセリン、（５－３）４３９位に存在するバリン、（５－４）ＡＡＶ１の４７０位に相当するアミノ酸が存在しない、（５－５）ＡＡＶ１の４７２位に相当するアミノ酸が存在しない、（５－６）ＡＡＶ１の４７３位に相当するアミノ酸が存在しない、（５－７）４８８位に存在するアラニン、（５－８）５１８位に存在するセリンである。
　ＡＡＶ６のカプシド配列（配列番号６）では、それぞれ（６－１）１２９位のフェニルアラニン、（６－２）２６８位に存在するセリン、（６－３）４４７位に存在するアスパラギン、（６－４）４７０位に存在するグリシン、（６－５）４７２位に存在するセリン、（６－６）４７３位に存在するバリン、（６－７）５０２位に存在するトレオニン、（６－８）５３１位に存在するリシンである。
　ＡＡＶ７のカプシド配列（配列番号７）では、それぞれ（７－１）１２９位のロイシン、（７－２）２６９位に存在するトレオニン、（７－３）４４８位に存在するアラニン、（７－４）４７２に存在するトレオニン、（７－５）４７４に存在するアラニン、（７－６）４７５に存在するグルタミン酸、（７－７）５０４位に存在するアラニン、（７－８）５３３位に存在するグルタミン酸である。
　ＡＡＶ８のカプシド配列（配列番号８）では、それぞれ（８－１）１２９位のロイシン、（８－２）２６８位に存在するセリン、（８－３）４４８位に存在するバリン、（８－４）４７０位に存在するセリン、（８－５）４７２位に存在するアラニン、（８－６）４７３位に存在するアスパラギン、（８－７）５０２位に存在するアラニン、（８－８）５３１位に存在するグルタミン酸である。
　ＡＡＶ９のカプシド配列（配列番号９）では、それぞれ（９－１）１２９位のロイシン、（９－２）２６８位に存在するセリン、（９－３）４４８位に存在するセリン、（９－４）４７０位に存在するアスパラギン、（９－５）４７２位に存在するアラニン、（９－６）４７３位に存在するバリン、（９－７）５０２位に存在するアラニン、（９－８）５３１位に存在するグルタミン酸である。
　ＡＡＶ１０のカプシド配列（配列番号１０）では、それぞれ（１０－１）１２９位のロイシン、（１０－２）２６９位に存在するセリン、（１０－３）４４９位に存在するセリン、（１０－４）４７２位に存在するアスパラギン、（１０－５）４７４位に存在するセリン、（１０－６）４７５位に存在するアラニン、（１０－７）５０４位に存在するアラニン、（１０－８）５３３位に存在するグルタミン酸である。
　「基準ＡＡＶ」としてＡＡＶ１－１０以外のＡＡＶを用いる場合にも、同様に当該ＡＡＶのカプシド配列のアミノ酸配列を配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントをとることによって、（１）配列番号１のアミノ酸配列の１２９位に相当する位置に存在するロイシン、（２）２６８位に相当する位置に存在するセリン、（３）４４７位に相当する位置に存在するアスパラギン、（４）４７０位に相当する位置に存在するグリシン、（５）４７２位に相当する位置に存在するセリン、（６）４７３位に相当する位置に存在するバリン、（７）５０２位に相当する位置に存在するトレオニン、（８）５３１位に相当する位置に存在するグルタミン酸を決定できる。
　さらに好ましい本発明の改変型ＡＡＶベクターは、配列番号１の前記（１）～（８）の位置又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の置換が、Ｌｅｕ１２９Ｐｈｅ、Ｓｅｒ２６８Ｔｈｒ、Ａｓｎ４４７Ｓｅｒ、Ｇｌｙ４７０Ｔｈｒ、Ｓｅｒ４７２Ａｌａ、Ｖａｌ４７３Ａｓｎ、Ｔｈｒ５０２Ａｌａ及びＧｌｕ５３１Ｌｙｓから選ばれる１以上であるベクターである。
　本発明の改変型ＡＡＶベクターは、有毛細胞（内有毛細胞、外有毛細胞）への感染能が高い。特に、Ｓｅｒ２６８Ｔｈｒ、Ａｓｎ４４７Ｓｅｒ、Ｇｌｙ４７０Ｔｈｒ、Ｓｅｒ４７２Ａｌａ、Ｖａｌ４７３Ａｓｎ及びＴｈｒ５０２Ａｌａの置換を組み合わせて有する改変型ＡＡＶベクターは、有毛細胞への感染能が高い。また、これらの置換に組み合わせてさらにＬｅｕ１２９Ｐｈｅ又はＧｌｕ５３１Ｌｙｓの置換を有する改変型ＡＡＶベクターも有毛細胞への感染能が高い。さらに、Ａｓｎ４４７Ｓｅｒ、Ｇｌｙ４７０Ｔｈｒ、Ｓｅｒ４７２Ａｌａ、Ｖａｌ４７３Ａｓｎ及びＴｈｒ５０２Ａｌａの置換を組み合わせて有する改変型ＡＡＶベクターは、有毛細胞へのさらに高い感染能と、外らせん溝細胞への顕著に高い感染能とを有する。
　前記改変（組み換え）手段としては、通常のジーンターゲティング手段を用いることができる。具体的には、Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　６，３４３－３４５（２００９）に記載のようなＰＣＲプライマーに変異を加えるジーンターゲティング手段を採用することができる。
　本発明の標的細胞に対する感染指向性が改善された改変型アデノ随伴ウイルスベクターの製造方法は、カプシド配列のアミノ酸配列に、以下の（ａ）から選択されるいずれか一以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する工程を含む方法であるのが好ましい。
　（ａ）配列番号１のＡＡＶ１のカプシド配列のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、
（１）１２９位（Ｌｅｕ）、
（２）２６８位（Ｓｅｒ）、
（３）４４７位（Ａｓｎ）、
（４）４７０位（Ｇｌｙ）、
（５）４７２位（Ｓｅｒ）、
（６）４７３位（Ｖａｌ）、
（７）５０２位（Ｔｈｒ）及び
（８）５３１位（Ｇｌｕ）
に相当する位置のアミノ酸残基。
　より具体的には、基準アデノ随伴ウイルスベクターのカプシド配列のアミノ酸配列に、以下の（ａ）から選択されるいずれか一以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換して候補改変アデノ随伴ウイルスベクターを作成する工程（候補ＡＡＶ作成工程）、
　（ａ）配列番号１のＡＡＶ１のカプシド配列のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、
（１）１２９位（Ｌｅｕ）、
（２）２６８位（Ｓｅｒ）、
（３）４４７位（Ａｓｎ）、
（４）４７０位（Ｇｌｙ）、
（５）４７２位（Ｓｅｒ）、
（６）４７３位（Ｖａｌ）、
（７）５０２位（Ｔｈｒ）及び
（８）５３１位（Ｇｌｕ）
に相当する位置のアミノ酸残基；
　前記候補改変アデノ随伴ウイルスベクターの前記標的細胞への感染量を測定する工程（測定工程）；及び
　前記標的細胞への感染量が、前記アミノ酸置換を導入する前の前記基準アデノ随伴ウイルスベクターに比して増加した候補改変アデノ随伴ウイルスベクターを選択する工程（選択工程）；を含む製造方法が好ましい。
　前記基準アデノ随伴ウイルスベクターとしては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７又はＡＡＶ８であるのが好ましく、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６又はＡＡＶ８であるのがより好ましい。
　前記アミノ酸置換は、Ｌｅｕ１２９Ｐｈｅ、Ｓｅｒ２６８Ｔｈｒ、Ａｓｎ４４７Ｓｅｒ、Ｇｌｙ４７０Ｔｈｒ、Ｓｅｒ４７２Ａｌａ、Ｖａｌ４７３Ａｓｎ、Ｔｈｒ５０２Ａｌａ及びＧｌｕ５３１Ｌｙｓから選ばれる１以上であるのがより好ましい。
　測定工程における標的細胞への感染量の測定は、候補改変ＡＡＶに搭載した遺伝子（レポータータンパク質等のタンパク質をコードする遺伝子）を発現する細胞の数又は当該細胞におけるタンパク質の発現強度を計測することにより行うことができる。
　前記標的細胞は、上皮細胞、間質細胞、水晶体細胞、角膜細胞、網膜細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、膵細胞、肝細胞、神経細胞、神経膠細胞、血液細胞、軟骨細胞、骨細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、又は癌細胞であってよい。
　上皮細胞は、内耳上皮細胞、腸上皮細胞、網膜細胞、皮膚細胞、腎細胞、気道上皮細胞、口腔粘膜細胞、鼻粘膜細胞、糸球体細胞、膀胱細胞、又は子宮細胞であってよい。
　さらに、前記標的細胞は、特に、ギャップ結合を有するか、あるいはギャップ結合の構成要素となるコネキシン分子を発現する細胞であってよい。
　得られた改変型ＡＡＶベクターは、標的細胞、例えば前記上皮細胞への感染指向性が顕著に向上している。
　例えば、ＡＡＶ１のカプシド配列に対して、Ｓｅｒ２６８Ｔｈｒ、Ａｓｎ４４７Ｓｅｒ、Ｇｌｙ４７０Ｔｈｒ、Ｓｅｒ４７２Ａｌａ、Ｖａｌ４７３Ａｓｎ及びＴｈｒ５０２Ａｌａから選ばれる１又は２以上の置換を有する改変型ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ１が有毛細胞（内有毛細胞、外有毛細胞）にはほぼ感染しないのに対し、外有毛細胞への特異性が高く、内耳上皮細胞群の中で外有毛細胞への感染能が最も高く８０～１００％の感染効率となる。
　これらのアミノ酸置換を任意に組み合わせることで様々な標的細胞に対して感染指向性を有する改変ＡＡＶを創出し得る可能性がある。
　このような改変型ＡＡＶベクターの具体例として、配列番号１５のアミノ酸配列のカプシド配列を有するＡＡＶベクター（本開示において「ＡＡＶ－ｓｉａ１．８」と称される）が挙げられる。
　また、同改変型ＡＡＶベクターさらなる改変体であり、配列番号１６のアミノ酸配列のカプシド配列を有するＡＡＶベクター（ＡＡＶ－ｓｉａ１．８のＧｌｕ５３１Ｌｙｓ改変体）及び配列番号１７のアミノ酸配列のカプシド配列を有するＡＡＶベクター（ＡＡＶ－ｓｉａ１．８のＬｅｕ１２９Ｐｈｅ改変体）は、ＡＡＶ１と比して外有毛細胞と支持細胞への感染性が強く、支持細胞においては面積の大きいギャップ結合複合体を多数形成する。一部の内有毛細胞へも感染する。
　また、ＡＡＶ６のカプシド配列に対してＳｅｒ２６８Ｔｈｒ、Ａｓｎ４４７Ｓｅｒ、Ｇｌｙ４７０Ｔｈｒ、Ｓｅｒ４７２Ａｌａ、Ｖａｌ４７３Ａｓｎ及びＴｈｒ５０２Ａｌａから選ばれる１又は２以上の置換を有する改変型ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１のカプシド配列に対して同様の置換を行った改変型ＡＡＶベクターと同様に外有毛細胞への高い感染能を持つ。外有毛細胞への特異性、感染指向性はＡＡＶ１の改変型より弱いが、ＡＡＶ１の改変型より広範囲に感染する能力を持つ。
　これらのアミノ酸置換を任意に組み合わせることで様々な標的細胞に対して感染指向性を有する改変ＡＡＶを創出し得る可能性がある。
　このような改変型ＡＡＶベクターの具体例として、配列番号１４のアミノ酸配列のカプシド配列を有するＡＡＶベクター（ＡＡＶ－ｓｉａ６．８）が挙げられる。
　また、同改変型ＡＡＶベクターのさらなる改変体であり、配列番号１８のアミノ酸配列のカプシド配列を有するＡＡＶベクター（ＡＡＶ－ｓｉａ６．８のＴｈｒ２６８Ｓｅｒ改変体）は、ＡＡＶ－ｓｉａ６．８に比して有毛細胞へのさらに高い感染能と、外らせん溝細胞への顕著に高い感染能とを有する。
　本発明の改変型ＡＡＶベクターは、種々の上皮細胞、特にギャップジャンクションを形成する上皮細胞に対する感染指向性が向上している。具体的な上皮細胞としては、内耳上皮細胞、腸上皮細胞、網膜細胞、皮膚細胞、腎細胞、気道上皮細胞、神経細胞、心筋細胞、及びＣｏｎｎｅｘｉｎ発現が関与する癌細胞から選ばれる上皮細胞が挙げられる。
　従って、本発明の改変型ＡＡＶベクターは、これらの上皮細胞における疾患に対する遺伝子治療、ゲノム編集治療に有用である。
　本発明の改変型ＡＡＶベクターは、前記標的細胞に対する感染指向性が向上しているので、改変型ＡＡＶベクターに、標的細胞における遺伝性疾患、組織損傷、癌の遺伝子治療、ゲノム編集治療に適用され得る遺伝子を組み込むのが好ましい。このような遺伝子としては、例えば、ＧＪＢ２遺伝子、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子、ＴＭＣ１遺伝子、ＴＭＣ２遺伝子、ＫＣＮＱ４遺伝子、ＣＨＤ２３遺伝子、プロトカドヘリン１５（ＰＣＤＨ１５）遺伝子、オトフェリン（ＯＴＯＦ）遺伝子等の遺伝性疾患の原因遺伝子；Ａｔｏｈ１遺伝子、ＣＤＫＮ１Ｂ遺伝子及びＨｅｓ１遺伝子などの転写因子であって細胞の分化や増殖に関与する遺伝子等が挙げられる。
　特に遺伝性難聴に関連する遺伝子のさらなる例として以下が挙げられる。
　ACTG1、ADCY1、ADGRV1、AIFM1、BDP1、BSND、BTD、CABP2、CCDC50、CD164、CDC14A、CDH23、CEACAM16、CIB2、CLDN14、CLIC5、CLRN1、COCH、COL11A1、COL11A2、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL9A1、COL9A2、COL9A3、DCDC2、DIAPH1、DMXL2、DSPP、EDN3、EDNRB、ELM0D3、EPS8、EPS8L2、 ESPN、ESRRB、EYA1、EYA4、FAM189A2、GIPC3、GJB3、GJB6、GPSM2、GRHL2、GRXCR1、GRXCR2、GSDME、HARS1、HGF、H0MER2、ILDR1、KARS1、KCNE1、KCNQ1、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、 MARVELD2、MCM2、MET、MIR96、MITF、MSRB3、MT-C01、MT-RNR1、MT-TS1、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO3A、MYO6、MYO7A、MYO7A、NARS2、NF2、0SBPL2、OTOA、OTOG、OTOGL、P2RX2、PAX3、PEX7、PHYH、PJVK、PNPT1、POU3F4、POU4F3、PRPS1、PTPRQ、RDX、RIPOR2、ROR1、S1PR2、SERPINB6、SIX1、SIX5、SLC17A8、SLC22A4、SLC26A5、SMPX、SOX10、STRC、SYNE4、TBC1D24、TECTA、TIMM8A、TJP2、TMEM132E、TMIE、TMPRSS3、TPRN、TRIO、 TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、WBP2、WFS1、およびWHRN。
　本発明の改変型ＡＡＶベクターには、上述の遺伝子の発現のためのプロモーターが組み込まれ得る。プロモーターには、ＣＭＶやＣＡＧなどの既知のプロモーターを用いることができるが、内耳支持細胞等のＧＪＢ２発現細胞での遺伝子のためのプロモーターには、特に配列番号１１～１３のいずれかの塩基配列を含んでなるプロモーターが好適に用いられ得る。プロモーターは１つを複数回連続して繰り返し配列させてもよく（単一プロモーターのタンデム）、２つ以上を組み合わせていずれか又は全てのプロモーターが連続又は不連続に複数回数繰り返して配列されるようにしてもよい（複数プロモーターのタンデム）。
　また、本発明の改変型ＡＡＶベクターには、プロモーターの活性を増強するためのエンハンサーが組み込まれ得る。エンハンサーには、既知のエンハンサーを用いることができるが、配列番号１１～１３の塩基配列を含んでなるプロモーターと好適に組み合わせるエンハンサーとして例えば配列番号１９の塩基配列を含んでなるエンハンサー（”Characterization of GJB2 cis regulatory elements in the DFNB1 locus”, Human Genetics (2019) 138:1275-1286）が挙げられる。エンハンサーは１つを複数回連続して繰り返し配列させてもよく（単一エンハンサーのタンデム）、２つ以上を組み合わせていずれか又は全てのエンハンサーが連続又は不連続に複数回数繰り返して配列されるようにしてもよい（複数エンハンサーのタンデム）。
　本発明の改変型ＡＡＶベクターを用いる遺伝子治療の好ましい具体例としては、遺伝性難聴で最多のＧＪＢ２変異型難聴への遺伝子治療が挙げられる。すなわち、遺伝性難聴で最も多いのがＧＪＢ変異型難聴であり、先天性難聴の全症例の約４５％を占める。本発明の改変型ＡＡＶベクターに正常ＧＪＢ遺伝子を組み込んだ難聴遺伝子治療薬を製造することができる。この遺伝子治療薬は内耳アブミ骨底板からの内耳リンパ液への局所投与や静脈投与などへの投与により投与され、標的遺伝子を標的細胞へ効率よく発現させることにより異常な遺伝子機能を正常化する。
　投与は、静脈内、脳室内、蝸牛内、髄腔内、筋肉内、皮下、またはそれらの組み合わせであり得る。特に、投与は、蝸牛または前庭系への投与であってよく、そのたの送達は、正円窓膜（ＲＷＭ）、卵円窓、または半規管を介した蝸牛または前庭系への注射であってよい。
　本発明の遺伝子治療薬、ゲノム編集治療薬は、前記改変型ＡＡＶベクターを、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。
　経口投与用の好適な製剤は、本発明の改変型ＡＡＶベクターを、水、生理食塩水のような希釈剤に有効量溶解させた液剤、有効量を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量を懸濁させた懸濁液剤、有効量を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
　非経口投与用には、本発明の改変型ＡＡＶベクターを、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、坐剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、本発明の改変型ＡＡＶベクターを水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、本発明の医薬は、油性又は水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、又は乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、本発明の改変型ＡＡＶベクターを粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液又は懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、本発明の改変型ＡＡＶベクターを粉末化し、ラクトース又はデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、本発明改変型ＡＡＶベクターをカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
　本発明の改変型ＡＡＶベクターの投与量は、患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば成人１日あたり０．５μｇ～１００ｍｇであるのが好ましい。
　次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１：基準ＡＡＶの感染指向性の評価（培養内耳上皮組織）
　各種血清型のＡＡＶベクター（ＧｅｎｅＣａｐｏｅｉａ社、ＡＡＶＰｒｉｍｅTM　Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）　Ｓｅｒｏｔｙｐｅ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　Ｋｉｔ　Ｐｌｕｓ，Ｃａｔ．　Ｎｏ．ＡＡ３２１）を用いて、羊土社　実験医学別冊　決定版　ウイルスベクターによる遺伝子導入実験ガイド　ＡＡＶベクターを用いた内耳への遺伝子治療　Ｐａｇｅ１５９－１６６（２０２０．１１）に記載の方法によって、内耳上皮細胞への感染指向性について検討した。
　ＡＡＶベクターには、コネキシン２６をコードするＧＪＢ２遺伝子を配列番号１１－１３のいずれかの塩基配列を含んでなるプロモーター（それぞれプロモーター１、プロモーター２、プロモーター３と称する）の制御下に組み込んだ。
　生後４日齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系）より内耳を摘出し、感覚上皮を含む組織を８ウェルチャンバースライド（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ，　Ｃａｔ．　Ｎｏ．ＳＣＳ－Ｎ３８）上でＤＭＥＭ培地中で１晩培養した。翌日に各血清型ＡＡＶ（ＡＡＶ１－１０、５×１０8－５×１０9ＧＣ）を添加した。４－６日間培養し、４％パラホルムアルデヒドで固定後に抗コネキシン２６抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．　Ｃａｔ．　Ｎｏ．５１－２８００）による免疫蛍光染色を行い、ＡＡＶのレポーター遺伝子であるＥＧＦＰの緑色蛍光と共に蛍光顕微鏡で観察し、ＥＧＦＰ陽性細胞とコネキシン２６によるギャップ結合を形成する細胞を計測した。
　その結果、図２及び図３に示すように、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７及びＡＡＶ８は、内耳細胞、特にギャップ結合を形成する支持細胞への感染指向性が他の血清型に比べて高いことが判明した。
　また、プロモーター１（ヒトＧＪＢ２遺伝子の転写開始点から上流の１０６５ｂｐの遺伝子配列）、プロモーター２（ヒトＧＪＢ２遺伝子の転写開始点から上流の７６０ｂｐの遺伝子配列）及びプロモーター３（ヒトＧＪＢ２遺伝子の転写開始点から上流の２６０ｂｐの遺伝子配列）は、内耳支持細胞及び内耳線維細胞での各種タンパク質発現に適していた。コネキシン２６の発現強度に基づいてプロモーター活性を評価したところ、活性が高い順にプロモーター１、プロモーター２、プロモーター３であった。
実施例２：基準ＡＡＶへのアミノ酸置換の導入による改変型ＡＡＶの作成と感染指向性の評価（培養内耳上皮組織）
　Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　６，３４３－３４５（２００９）に記載のＰＣＲプライマーに変異を加えるジーンターゲティング手段を用いて、カプシド配列のアミノ酸配列に種々のアミノ酸置換を導入したベクターを作成した。なお。改変ベクターには、ＧＪＢ２遺伝子とレポーター遺伝子（ＥＧＦＰ遺伝子）も導入した。
　得られた改変ベクターの形質導入効率、感染指向性の変化を表１に示す。
　その結果、ＡＡＶ１のカプシド配列に対して、Ｓｅｒ２６８Ｔｈｒ、Ａｓｎ４４７Ｓｅｒ、Ｇｌｙ４７０Ｔｈｒ、Ｓｅｒ４７２Ａｌａ、Ｖａｌ４７３Ａｓｎ及びＴｈｒ５０２Ａｌａの置換を有する改変型ＡＡＶベクター（ＡＡＶ－ｓｉａ１．８：配列番号１５）は、ＡＡＶ１が有毛細胞（内有毛細胞、外有毛細胞）にはほぼ感染しないのに対し、外有毛細胞への特異性が高く、内耳上皮細胞群の中で外有毛細胞への感染能が最も高く８０～１００％の感染効率となることがわかった。
　また、ＡＡＶ６のカプシド配列に対して、Ｓｅｒ２６８Ｔｈｒ、Ａｓｎ４４７Ｓｅｒ、Ｇｌｙ４７０Ｔｈｒ、Ｓｅｒ４７２Ａｌａ、Ｖａｌ４７３Ａｓｎ及びＴｈｒ５０２Ａｌａの置換を有する改変型ＡＡＶベクター（ＡＡＶ－ｓｉａ６．８：配列番号１４）においては、前記ＡＡＶ－ｓｉａ１．８と同様に外有毛細胞への高い感染能を持つ。外有毛細胞への特異性、感染指向性はＡＡＶ－ｓｉａ１．８より弱いが、前記ＡＡＶ－ｓｉａ１．８より広範囲の内耳上皮細胞群に感染する能力を持つことがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
「↑↑」：５０％以上増加
「↑」：１－５０％未満増加
「↓」：１－５０％未満減少
「↓↓」：５０％以上増加
「ＯＳＣ」：外らせん溝細胞（Ｏｕｔｅｒ　Ｓｕｌｃｕｓ　Ｃｅｌｌ）
「ＯＨＣ」：外有毛細胞（Ｏｕｔｅｒ　Ｈａｉｒ　Ｃｅｌｌ）
「ＩＨＣ」：内有毛細胞（（Ｉｎｎｅｒ　Ｈａｉｒ　Ｃｅｌｌ）
実施例３：改変型ＡＡＶへのさらなるアミノ酸置換の導入と感染指向性の評価
　実施例２と同様にして、ＡＡＶ－ｓｉａ１．８のＧｌｕ５３１Ｌｙｓ改変体、及びＡＡＶ－ｓｉａ１．８のＬｅｕ１２９Ｐｈｅ改変体を作成した。
　ＡＡＶ－ｓｉａ１．８のＧｌｕ５３１Ｌｙｓ改変体（配列番号１６）は、ＡＡＶ１と比して外有毛細胞と支持細胞への感染性が強く、支持細胞においては面積の大きいギャップ結合複合体を多数形成する。一部の内有毛細胞へも感染する。
　また、ＡＡＶ－ｓｉａ１．８のＬｅｕ１２９Ｐｈｅ改変体（配列番号１７）も同様に、ＡＡＶ１と比して外有毛細胞と支持細胞への感染性が強く、支持細胞においては面積の大きいギャップ結合複合体を多数形成する。一部の内有毛細胞へも感染する。
実施例４：難聴モデル動物由来培養内耳上皮組織への遺伝子導入
　難聴モデル動物（ＧＪＢ２欠損マウス）の内耳上皮にＡＡＶ　ｓｉａ１．８でＧＪＢ２（ＧＪＢ２及びＥＧＦＰ導入済み）を導入した染色像を図４に示す。赤が導入したＧＪＢ２遺伝子によるコネキシン２６タンパク質を示す。緑がＥＧＦＰのレポーターを示す。外有毛細胞において感染を示すＥＧＦＰ発現が特異的に強く、その他の内有毛細胞や支持細胞などへの感染を示すＥＧＦＰ発現およびコネキシン２６の発現が少ない。
　また、ＧＪＢ２欠損マウスの内耳上皮にＡＡＶ－ｓｉａ６．８でＧＪＢ２（ＧＪＢ２及びＥＧＦＰ導入済み）を導入した染色像を図５に示す。赤が導入したＧＪＢ２遺伝子によるコネキシン２６を含むギャップ結合を示す。緑がＥＧＦＰのレポーターを示す。細胞間に赤い線が入っている部分が遺伝子治療により形成されたギャップ結合である。
実施例５：難聴モデル動物由来培養蝸牛器官への遺伝子導入
　ＧＪＢ２欠損マウスの培養蝸牛器官を用いて、ＧＪＢ２遺伝子とＥＧＦＰ遺伝子を搭載した野生型ＡＡＶ６及びＡＡＶ－ｓｉａ６．８の感染実験を行った。
　生後４日のマウスを麻酔下で実験殺し、側頭骨から蝸牛を取り出した。蝸牛から蝸牛軸を取り除き、コルチ器官から血管条を剥がした。コルチ器官を８ウェルチャンバースライドに移し、ダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース、ピルビン酸ナトリウム、GlutaMAXTM Supplement、ウシ胎児血清、N2 Supplement、ペニシリンGカリウムを添加）中で一晩培養（5% CO2雰囲気、37℃）した。その後、培地を、１００μｌあたり４μｌのＡＡＶ溶液（2.05×1013GC/mL）を含む培地に交換した。さらに５日間培養を行った後、コルチ器官を４％パラホルムアルデヒドで処理して固定した。
　結果を図６に示す。野生型ＡＡＶ６では、ＥＧＦＰシグナルは主に外らせん溝細胞（OSC）で検出された。一方、ＡＡＶ－ｓｉａ６．８では、内耳上皮全体（OSC, OHC, IHC, DC, ISC）で広範囲にＥＧＦＰシグナルが検出された（図７も参照）。
　外らせん溝細胞の領域（OSC）と、外有毛細胞とダイテルス細胞を含む領域（OHC+DC）におけるＥＧＦＰ陽性面積率を画像解析した結果を図８に示す。ＡＡＶ－ｓｉａ６．８は、野生型ＡＡＶ６に比して、外らせん溝細胞の領域（OSC）と、外有毛細胞とダイテルス細胞を含む領域（OHC+DC）のいずれにおいても陽性面積率が高く、内耳上皮細胞の広範囲の細胞に高い効率で遺伝子導入が可能であることが示された。
実施例６：遺伝子治療（難聴患者由来iPSC細胞から誘導した内耳上皮細胞におけるギャップ結合の修復）
　ＧＪＢ２遺伝子の異常による重度難聴患者と健聴者から樹立された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から内耳上皮細胞を分化誘導した。内耳上皮細胞に対して、野生型ＧＪＢ２遺伝子を搭載したＡＡＶ－ｓｉａ６．８を感染させ、コネキシン２６（CX26）の発現によるギャップ結合の修復を行った。
　健聴者由来のｉＰＳＣ株（201B7）は、理化学研究所バイオリソースセンターセルバンクから入手した。
　難聴患者由来のｉＰＳＣ株（細胞株名：JUFMDOi005-A）は、本発明者らの学術論文（”Generation of two induced pluripotent stem cell lines from PBMCs of siblings carrying c.235delC mutation in the GJB2 gene associated with sensorineural hearing loss”, Stem Cell Research, Volume 47, August 2020, 101910）に記載の方法によって作成された。
　ｉＰＳＣを、２０μｍ　Ｙ２７６３２を添加したＳｔｅｍ　Ｆｉｔ培地に懸濁し、９０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。２日間インキュベーション（37℃、5% CO2）した後、２％マトリゲルを添加したｇｆＣＤＭ培地（Ham’s F12 GlutaMax/IMDM GlutaMax (1:1) (Gibco), 1 % Chemically defined lipid concentrate (Gibco), 0.5 % BSA (Sigma), 15 μg/ml Transferin (Sigma), 450 μM 1-Thioglycerol (Sigma)）１００μｌを入れた９６ウェルプレートに細胞凝集体を移し、さらにインキュベーションした。７－１１日後に、鉗子を使用して細胞凝集体を半分割した。分割した細胞凝集体を、DFNB培地（DMEM/F12 (1:1) (Gibco), 1% N2 supplement (Gibco), 1% B27 supplement (Gibco)）中のマイトマイシンＣ処理した内耳由来フィーダー細胞（トリプシン耐性内耳細胞：TRIC）上に移した。ＴＲＩＣ上に細胞凝集体を移してから２０－２５日後に、内耳上皮細胞が分化誘導される。
　ＴＲＩＣは、１０週齢のマウスから採取した蝸牛組織から調製した。蝸牛組織は、コルチ器官、基底膜、側壁からなり、主に支持細胞、有毛細胞、蝸牛神経線維細胞、その他の基底膜の細胞から構成される。蝸牛組織をトリプシンに曝露し、トリプシン耐性細胞をスクリーニングすることによってＴＲＩＣを得た。これらの細胞を増殖培地（DMEM-GlutaMax (Gibco), 10% FBS (Gibco)）下で維持した。
　コネキシン２６（ＣＸ２６）と比較対象のコネキシン３０（ＣＸ３０：ＧＪＢ６遺伝子産物）の内耳上皮細胞における発現を免疫染色により検出した。また、ＣＸ３０及びＣＸ２６の発現強度を画像解析し、ＣＸ３０に対するＣＸ２６の発現強度比を算出した。結果を図９及び図１０に示す。健聴者（201B7）の内耳上皮細胞では、ＣＸ３０及びＣＸ２６が陽性のギャップ結合が明瞭に観察され、ＣＸ３０に対して４０％程度の強度でＣＸ２６が発現していた。難聴患者（GJB2-235delC）の内耳上皮細胞では、内耳ギャップ結合は不明瞭で形成が不十分であり、ＣＸ３０に対するＣＸ２６の発現強度も２５％程度に低下していた。ＡＡＶ－ｓｉａ６．８により野生型ＧＪＢ２遺伝子を導入した難聴患者の内耳上皮細胞では、ＣＸ３０に対するＣＸ２６の発現強度が５０％程度に回復し（GJB2-235delC + AAV-GJB2WT）、ギャップ結合が修復されていることが確認できた。
実施例７：遺伝子治療（有毛細胞の再生）
　マウスの培養蝸牛器官を用いて、プロテインアトナールホモログ１（Ａｔｏｈ１）遺伝子を搭載したＡＡＶ－ｓｉａ６．８の感染実験を行った。転写因子Ａｔｏｈ１は、支持細胞に遺伝子導入されると、支持細胞を有毛細胞へ分化誘導させることが知られている。図１１に示すように、有毛細胞（Hair cells）領域とは異なる領域（図１１（Ａ）において点線で囲った領域）に、有毛細胞様細胞が出現した（図１１（Ｂ）（Ｃ）の矢印参照）。図１１（Ｂ）は、図１１（Ａ）において点線で囲った領域を拡大したものである。騒音性難聴等によって有毛細胞が欠損した場合に有毛細胞を再生するために、ＡＡＶ－ｓｉａ６．８を有効に利用できる可能性が示された。
実施例８：遺伝子治療（難聴モデル動物の聴力回復）
　ＧＪＢ２欠損マウス（3-4週齢）の聴力を聴性脳幹反応（ABR）に基づき測定した（術前聴力）。麻酔下でマウスの外側半規管（lateral semicircular canal）の２箇所に歯科用ドリルを用いて小孔を設けた。一方の孔にキャピラリーチューブを挿入して外リンパ液（endolymph）へ１０－１２μｌの野生型ＧＪＢ２遺伝子を搭載したＡＡＶ－ｓｉａ６．８溶液（約1×1013GC/ml）を３μｌ／ｍｉｎの速度で注入した。手術後１週間及び２週間後に、聴力を聴性脳幹反応（ABR）に基づき測定した（術後聴力）。
　ＡＢＲの測定は、ステンレス鋼の針電極を左右の耳の頂点と腹外側に配置し、Ｐｏｗｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙシステム（PowerLab 4/25; AD Instruments）のＳｃｏｐｅソフトウェアの波形保存及び刺激制御を使用して測定した。脳波記録は、細胞外増幅器ＡＣ　ＰｒｅＡｍｐｌｉｆｉｅｒ（モデルP-55; Astro-Med）で行った。音響刺激は、カプラー型スピーカー（モデル ES1spc; Bio Research Center）により行った。閾値は、８、２０、及び４０ｋＨｚの周波数にて５ｄＢ間隔で強度を変化させながら一連の応答に基づき決定した。
　術前及び術後のＡＢＲの閾値と波形をそれぞれ図１２及び図１３に示す。術後２週間（AAV-Sia6.8-CX26 2W）では、術前（Pre-operation）に比して高波長（20kHz, 40kHz）でのＡＢＲの閾値が低下し、聴力の有意な改善が認められた（図１２参照）。また、術後２週間（2W post-infection）では、術前（CX26cKO pre-injection）では反応がなかった弱い音圧に対しても反応が確認できた（図１３参照）。
実施例９：プロモーターを用いた細胞標的化遺伝子導入
　プロモーター２（ヒトＧＪＢ２遺伝子の転写開始点から上流の７６０ｂｐの遺伝子配列、配列番号１２）をＡＡＶ－ｓｉａ６．８に導入し、ＧＪＢ２遺伝子とＥＧＦＰ遺伝子を搭載して、ＧＪＢ２欠損マウスの培養蝸牛器官に感染させた。図１４に示すように、支持細胞である外らせん溝細胞（OSC）でＥＧＰＦの発現（緑）と、コネキシン２６の発現（赤）を伴うギャップ結合の形成が確認できた。外有毛細胞及び内有毛細胞（ＯＨＣ及びＩＨＣ）への感染はみられなかった。この結果により、ＡＡＶ－ｓｉａ６．８は、適切なプロモーターを導入することによって、細胞標的化遺伝子導入（本実施例では支持細胞を標的とした遺伝子導入）に有効に用いられ得ることが示された。
実施例１０：改変型ＡＡＶへのさらなるアミノ酸置換の導入と感染指向性の評価２
　実施例２と同様にして、ＡＡＶ－ｓｉａ６．８のＴｈｒ２６８Ｓｅｒ改変体を作成した。
　ＡＡＶ－ｓｉａ６．８の２６８位のアミノ酸は、野生型ＡＡＶ６でのＳｅｒがＴｈｒに置換されている。したがって、ＡＡＶ－ｓｉａ６．８のＴｈｒ２６８Ｓｅｒ改変体は、２６８位のアミノ酸を野生型のＳｅｒに戻す改変となる。
　マウスの培養蝸牛器官を用いて、ＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＡＡＶ－ｓｉａ６．８のＴｈｒ２６８Ｓｅｒ改変体の感染実験を行った。ＥＧＦＰの蛍光像と、画像解析によりＥＧＦＰ陽性面積率を算出した結果を、それぞれ図１５及び図１６に示す。ＡＡＶ－ｓｉａ６．８のＴｈｒ２６８Ｓｅｒ改変体（AAV-Sia-T268S）では、ＡＡＶ－ｓｉａ６．８に比して、内耳細胞への感染指向性が向上し、特に外らせん溝細胞（OSC）において感染効率の向上が顕著であった。
配列番号１：ＡＡＶ１のカプシド配列のアミノ酸配列
配列番号２：ＡＡＶ２のカプシド配列のアミノ酸配列
配列番号３：ＡＡＶ３のカプシド配列のアミノ酸配列
配列番号４：ＡＡＶ４のカプシド配列のアミノ酸配列
配列番号５：ＡＡＶ５のカプシド配列のアミノ酸配列
配列番号６：ＡＡＶ６のカプシド配列のアミノ酸配列
配列番号７：ＡＡＶ７のカプシド配列のアミノ酸配列
配列番号８：ＡＡＶ８のカプシド配列のアミノ酸配列
配列番号９：ＡＡＶ９のカプシド配列のアミノ酸配列
配列番号１０：ＡＡＶ１０のカプシド配列のアミノ酸配列
配列番号１１：プロモーター１の核酸配列
配列番号１２：プロモーター２の核酸配列
配列番号１３：プロモーター３の核酸配列
配列番号１４：ＡＡＶ－ｓｉａ６．８のカプシド配列のアミノ酸配列
配列番号１５：ＡＡＶ－ｓｉａ１．８のカプシド配列のアミノ酸配列
配列番号１６：ＡＡＶ－ｓｉａ１．８のＧｌｕ５３１Ｌｙｓ改変体のカプシド配列のアミノ酸配列
配列番号１７：ＡＡＶ－ｓｉａ１．８のＬｅｕ１２９Ｐｈｅ改変体のカプシド配列のアミノ酸配列
配列番号１８：ＡＡＶ－ｓｉａ６．８のＴｈｒ２６８Ｓｅｒ改変体のカプシド配列のアミノ酸配列
配列番号１９：エンハンサー１の核酸配列

Claims (23)

  1. 　標的細胞に対する改善された感染性指向性を示す改変型アデノ随伴ウイルスベクターであって、
    カプシド配列のアミノ酸配列に、以下の（１）～（８）から選択される１又は２以上のアミノ酸残基の置換が導入された、改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
    （１）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の１２９位に相当する位置に存在するロイシンの他のアミノ酸残基への置換、
    （２）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の２６８位に相当する位置に存在するセリンの他のアミノ酸残基への置換、
    （３）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４４７位に相当する位置に存在するアスパラギンの他のアミノ酸残基への置換、
    （４）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７０位に相当する位置に存在するグリシンの他のアミノ酸残基への置換、
    （５）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７２位に相当する位置に存在するセリンの他のアミノ酸残基への置換、
    （６）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７３位に相当する位置に存在するバリンの他のアミノ酸残基への置換、
    （７）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の５０２位に相当する位置に存在するトレオニンの他のアミノ酸残基への置換、及び
    （８）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の５３１位に相当する位置に存在するグルタミン酸の他のアミノ酸残基への置換。
  2. 　前記アミノ酸残基の置換が、
    （１）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の１２９位に相当する位置に存在するロイシンのフェニルアラニンへの置換、
    （２）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の２６８位に相当する位置に存在するセリンのトレオニンへの置換、
    （３）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４４７位に相当する位置に存在するアスパラギンのセリンへの置換、
    （４）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７０位に相当する位置に存在するグリシンのトレオニンへの置換、
    （５）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７２位に相当する位置に存在するセリンのアラニンへの置換、
    （６）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７３位に相当する位置に存在するバリンのアスパラギンへの置換、
    （７）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の５０２位に相当する位置に存在するトレオニンのアラニンへの置換、又は
    （８）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の５３１位に相当する位置に存在するグルタミン酸のロイシンへの置換、
    である、請求項１に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
  3. 　前記（２）～（７）のアミノ酸残基の置換を組み合わせて有する、請求項１又は２に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
  4. 　配列番号１４又は配列番号１５のアミノ酸配列からなるカプシド配列を有する、請求項３に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
  5. 　前記（１）又は（８）のアミノ酸残基の置換をさらに有する、請求項３に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
  6. 　配列番号１６又は配列番号１７のアミノ酸配列からなるカプシド配列を有する、請求項５に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
  7. 　前記（３）～（７）のアミノ酸残基の置換を組み合わせて有する、請求項１又は２に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
  8. 　配列番号１８のアミノ酸配列からなるカプシド配列を有する、請求項７に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
  9. 　前記標的細胞が、上皮細胞、間質細胞、水晶体細胞又は癌細胞である、請求項１－６のいずれか一項に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
  10. 　前記上皮細胞が、内耳上皮細胞、腸上皮細胞、網膜細胞、皮膚細胞、腎細胞、気道上皮細胞、神経細胞又は子宮細胞である、請求項９に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
  11. 　前記標的細胞が、ギャップ結合を有するか、あるいはギャップ結合の構成要素となるコネキシン分子を発現する、請求項９又は１０に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
  12. 　遺伝性疾患の原因となる遺伝子、細胞の分化及び／又は増殖に関与する遺伝子、あるいはこれらの遺伝子をゲノム編集するための遺伝子が発現可能に搭載された、請求項１１に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
  13. 　前記遺伝性疾患の原因となる遺伝子が、コネキシン２６（ＧＪＢ２）遺伝子、ペンドリン（ＳＬＣ２６Ａ４）遺伝子、ＴＭＣ１遺伝子、ＴＭＣ２遺伝子、電位依存性カリウムチャネルサブファミリーＱメンバー４（ＫＣＮＱ４）遺伝子、カドヘリン２３（ＣＨＤ２３）遺伝子、プロトカドヘリン１５（ＰＣＤＨ１５）遺伝子及びオトフェリン（ＯＴＯＦ）遺伝子からなる群より選択される、請求項１２に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
  14. 　前記細胞の分化及び／又は増殖に関与する遺伝子が、プロテインアトナールホモログ１（Ａｔｏｈ１）遺伝子、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ｂ（ＣＤＫＮ１Ｂ）遺伝子及び塩基性ヘリックスループヘリックス型転写因子（Ｈｅｓ１）遺伝子からなる群より選択される、請求項１２に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
  15. 　ＧＪＢ２遺伝子の上流に、配列番号１１～１３のいずれかの塩基配列を含んでなるプロモーターが、任意に配列番号１９のエンハンサーとともに、ＧＪＢ２遺伝子の発現を制御可能に組み込まれている、請求項１３に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクター。
  16. 　請求項１－１５のいずれか一項に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクターを含む、医薬。
  17. 　遺伝性疾患、組織損傷及び／又は癌の治療、あるいはゲノム編集に用いるための、請求項１６に記載の医薬。
  18. 　遺伝性疾患、組織損傷及び／又は癌の治療、あるいはゲノム編集用の医薬の製造のための、請求項１－１５のいずれか一項に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクターの使用。
  19. 　遺伝性疾患、組織損傷及び／又は癌を有する対象に請求項１－１５のいずれか一項に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクターの治療有効量を投与するステップを含む、遺伝性疾患、組織損傷及び／又は癌の治療方法。
  20. 　対象に請求項１－１５のいずれか一項に記載の改変型アデノ随伴ウイルスベクターの有効量を投与するステップを含む、ゲノム編集方法。
  21. 　標的細胞に対する改善された感染性指向性を示す改変型アデノ随伴ウイルスベクターの製造方法であって、
    カプシド配列のアミノ酸配列に、下記の（１）～（８）から選択される１又は２以上のアミノ酸残基の置換を導入する工程を含む、
    製造方法。
    （１）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の１２９位に相当する位置に存在するロイシンの他のアミノ酸残基への置換、
    （２）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の２６８位に相当する位置に存在するセリンの他のアミノ酸残基への置換、
    （３）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４４７位に相当する位置に存在するアスパラギンの他のアミノ酸残基への置換、
    （４）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７０位に相当する位置に存在するグリシンの他のアミノ酸残基への置換、
    （５）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７２位に相当する位置に存在するセリンの他のアミノ酸残基への置換、
    （６）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の４７３位に相当する位置に存在するバリンの他のアミノ酸残基への置換、
    （７）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の５０２位に相当する位置に存在するトレオニンの他のアミノ酸残基への置換、及び
    （８）配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の５３１位に相当する位置に存在するグルタミン酸の他のアミノ酸残基への置換。
  22. 　基準アデノ随伴ウイルスベクターのカプシド配列のアミノ酸配列に、前記（１）～（８）から選択される１又は２以上のアミノ酸残基の置換を導入して候補アデノ随伴ウイルスベクターを作成する工程と、
    　前記候補アデノ随伴ウイルスベクターの前記標的細胞の感染量を測定する工程；及び
    　前記標的細胞の感染量が、前記基準アデノ随伴ウイルスベクターに比して増加した候補アデノ随伴ウイルスベクターを選択する工程；
    を含む、請求項２１に記載の製造方法。
  23. 　前記基準アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１０、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、より好ましくはＡＡＶ１又はＡＡＶ６、特に好ましくはＡＡＶ１である、請求項２１に記載の製造方法。
     
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