JP7451497B2 - アデノ随伴ウイルスの形質導入効率を調節するための組成物および方法 - Google Patents
アデノ随伴ウイルスの形質導入効率を調節するための組成物および方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7451497B2 JP7451497B2 JP2021509223A JP2021509223A JP7451497B2 JP 7451497 B2 JP7451497 B2 JP 7451497B2 JP 2021509223 A JP2021509223 A JP 2021509223A JP 2021509223 A JP2021509223 A JP 2021509223A JP 7451497 B2 JP7451497 B2 JP 7451497B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gpr108
- cells
- aav
- cell
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000010361 transduction Methods 0.000 title claims description 116
- 230000026683 transduction Effects 0.000 title claims description 114
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 101
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 title claims description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 21
- 101001070470 Homo sapiens Protein GPR108 Proteins 0.000 claims description 229
- 102100034142 Protein GPR108 Human genes 0.000 claims description 229
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 80
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 78
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 78
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 51
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 claims description 47
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 44
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims description 33
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 claims description 32
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 claims description 16
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 claims description 15
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 claims description 15
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 claims description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 347
- 102100025907 Dyslexia-associated protein KIAA0319-like protein Human genes 0.000 description 58
- 101001076904 Homo sapiens Dyslexia-associated protein KIAA0319-like protein Proteins 0.000 description 58
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 description 52
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 description 52
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 43
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 39
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 39
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 38
- 101001123859 Homo sapiens Sialidase-1 Proteins 0.000 description 34
- 102100028760 Sialidase-1 Human genes 0.000 description 34
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 33
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 27
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 25
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 24
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 24
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 21
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 21
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 18
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 18
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 18
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 15
- 101001070474 Homo sapiens Protein GPR107 Proteins 0.000 description 15
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 15
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 10
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 10
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 102100034143 Protein GPR107 Human genes 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 9
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 9
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 9
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 9
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 101100449172 Homo sapiens GPR108 gene Proteins 0.000 description 8
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 8
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 8
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- ARAIBEBZBOPLMB-UFGQHTETSA-N zanamivir Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)C=C(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO ARAIBEBZBOPLMB-UFGQHTETSA-N 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 229960001028 zanamivir Drugs 0.000 description 7
- 229940125581 ImmunityBio COVID-19 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 101100449169 Mus musculus Gpr107 gene Proteins 0.000 description 6
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 6
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 5
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 5
- 101100449173 Mus musculus Gpr108 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 5
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 5
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 5
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 4
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 description 4
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002911 sialidase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- -1 BAC26961 Proteins 0.000 description 3
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 229940042406 direct acting antivirals neuraminidase inhibitors Drugs 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 3
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102100030044 Calcium-binding protein 8 Human genes 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 2
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 208000032007 Glycogen storage disease due to acid maltase deficiency Diseases 0.000 description 2
- 206010053185 Glycogen storage disease type II Diseases 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000704457 Homo sapiens Protein phosphatase Slingshot homolog 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000637932 Homo sapiens Transmembrane protein 125 Proteins 0.000 description 2
- 206010021602 Inborn errors of amino acid metabolism Diseases 0.000 description 2
- 102100038448 LETM1 domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108700000232 Medium chain acyl CoA dehydrogenase deficiency Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 102100031805 Protein phosphatase Slingshot homolog 3 Human genes 0.000 description 2
- 101100069090 Rattus norvegicus Gpr108 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102100032074 Transmembrane protein 125 Human genes 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 208000022877 amino acid metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 201000004502 glycogen storage disease II Diseases 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 102000046238 human GPR107 Human genes 0.000 description 2
- 208000014468 inherited amino acid metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 208000005548 medium chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency Diseases 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000017734 ADF/Cofilin Human genes 0.000 description 1
- 108050005951 ADF/Cofilin Proteins 0.000 description 1
- 208000036443 AIPL1-related retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 102100034452 Alternative prion protein Human genes 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 208000031277 Amaurotic familial idiocy Diseases 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 108700021236 Antiviral Restriction Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000054566 Antiviral Restriction Factors Human genes 0.000 description 1
- 206010003594 Ataxia telangiectasia Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710162258 Calcium-binding protein 8 Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 208000006992 Color Vision Defects Diseases 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032838 Hereditary amyloidosis with primary renal involvement Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000794470 Homo sapiens Calcium-binding protein 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000956778 Homo sapiens LETM1 domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000780202 Homo sapiens Long-chain-fatty-acid-CoA ligase 6 Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 208000000563 Hyperlipoproteinemia Type II Diseases 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 1
- 201000010538 Lactose Intolerance Diseases 0.000 description 1
- 201000003533 Leber congenital amaurosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 208000010557 Lipid storage disease Diseases 0.000 description 1
- 108091080011 Long-chain family Proteins 0.000 description 1
- 102100034337 Long-chain-fatty-acid-CoA ligase 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033448 Lysosomal alpha-glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001826 Marfan syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 101100011486 Mus musculus Elf4 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940123424 Neuraminidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000002537 Neuronal Ceroid-Lipofuscinoses Diseases 0.000 description 1
- 208000014060 Niemann-Pick disease Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 240000008881 Oenanthe javanica Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 201000011252 Phenylketonuria Diseases 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 101710146165 Protein GPR107 Proteins 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 description 1
- 101150093156 Rras gene Proteins 0.000 description 1
- 108091007596 SLC55A3 Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010045261 Type IIa hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014769 Usher Syndromes Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 230000005101 cell tropism Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 201000007254 color blindness Diseases 0.000 description 1
- 201000006754 cone-rod dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 210000003027 ear inner Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 201000001386 familial hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 201000007891 familial visceral amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 201000006061 fatal familial insomnia Diseases 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 description 1
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 description 1
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003532 hypothyroidism Diseases 0.000 description 1
- 230000002989 hypothyroidism Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004359 iodixanol Drugs 0.000 description 1
- 208000017476 juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis Diseases 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 208000014416 lysosomal lipid storage disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000007607 neuronal ceroid lipofuscinosis 3 Diseases 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 201000004012 propionic acidemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003946 protein process Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007502 viral entry Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本開示は全体として、改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびこのようなウイルスの形質導入効率を調節する方法に関する。
これまでの方法論は、主要なＡＡＶ侵入因子を同定するため、またはサブファミリーワイドの受容体および侵入因子の必要性を特徴付けするためには不十分であった。これまでの研究は、あまり許容状態ではない細胞系においてｃＤＮＡを過剰発現させて、最も多くはＡＡＶ２である（７４、７５、７７）特定の血清型の形質導入を増大させる因子を同定することに主に焦点を置いていた（７６、８０、８１）。これらの研究は、ＡＡＶの形質導入を増大させるいくつかのタンパク質を同定したが、これらのタンパク質が形質導入に影響するためのメカニズムは、過剰発現の際に細胞表面での付着の増大を多くの場合に示すことを除いて、あまり特徴付けされていない（７８）。しかし、データにずれが存在し、これらの因子のノックダウンおよびノックアウト研究はＡＡＶの形質導入において大きな欠陥を示さないことが多いため、これらの因子は、必要な侵入受容体として定義され得ない。
本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が細胞に形質導入するメカニズムに関する。このメカニズムを理解することで、当業者が、細胞内へのＡＡＶの侵入、ひいては形質導入効率を調節することが可能となる。
本明細書において記載されるように、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を調節する方法が提供される。このような方法は、典型的には、遺伝子改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を細胞に導入するステップを含み、ここで、ＡＡＶカプシドは異種ＶＰ１ポリペプチド配列を含むように遺伝子改変されており、また、異種ＶＰ１ポリペプチド配列は、細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要とするまたは形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要としない。
一部の実施形態において、異種ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分は、配列番号１で示される配列を含む。これらの場合において、異種ＶＰ１ポリペプチド配列は、細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要としない。配列番号１で示される配列を含むＶＰ１ポリペプチドの一例は、ＡＡＶ５ ＶＰ１タンパク質またはその一部分のアミノ酸配列である。
一部の実施形態において、異種ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分は、配列番号２で示される配列を含む。これらの場合において、異種ＶＰ１ポリペプチド配列は、形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要とする。配列番号２で示される配列を含むＶＰ１ポリペプチドの例は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ－Ｂ、８ＢＰＶ２、または７Ｍ８のＶＰ１タンパク質またはその一部分のアミノ酸配列である。
同様に本明細書において記載されるように、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の細胞侵入を改変する方法が提供される。このような方法は、ＡＡＶをＧＰＲ１０８非依存性となるように遺伝子操作するステップを典型的には含み、遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶは、配列ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ１～１２の各々は任意のアミノ酸である。あるいは、このような方法は、ＡＡＶをＧＰＲ１０８依存性とするように遺伝子操作するステップであって、遺伝子操作されたＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶは、配列ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ１～１２の各々は任意のアミノ酸である、ステップを含み、それによってＡＡＶの細胞指向性を改変する。
典型的な遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶは、配列
ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ１はＳもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ２はＦもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＷであり、Ｘ６はＬであり、Ｘ７はＥであり、Ｘ８はＥであり、Ｘ９はＧであり、Ｘ１０はＬもしくはＩもしくはＶであり、Ｘ１１はＲであり、かつ／またはＸ１２はＥもしくはＱである。一部の実施形態において、遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶは、ＡＡＶ５ ＶＰ１タンパク質に由来するＶＰ１ポリペプチド配列を含む。
ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ１はＳもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ２はＦもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＷであり、Ｘ６はＬであり、Ｘ７はＥであり、Ｘ８はＥであり、Ｘ９はＧであり、Ｘ１０はＬもしくはＩもしくはＶであり、Ｘ１１はＲであり、かつ／またはＸ１２はＥもしくはＱである。一部の実施形態において、遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶは、ＡＡＶ５ ＶＰ１タンパク質に由来するＶＰ１ポリペプチド配列を含む。
同様に、典型的な遺伝子操作されたＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶは、配列
ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ１はＳもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ２はＦもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＷであり、Ｘ６はＬであり、Ｘ７はＥであり、Ｘ８はＥであり、Ｘ９はＧであり、Ｘ１０はＬもしくはＩもしくはＶであり、Ｘ１１はＲであり、かつ／またはＸ１２はＥもしくはＱである。一部の実施形態において、遺伝子操作されたＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ－Ｂ、８ＢＰＶ２、または７Ｍ８のＶＰ１タンパク質に由来するＶＰ１ポリペプチド配列を含む。
ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ１はＳもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ２はＦもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＷであり、Ｘ６はＬであり、Ｘ７はＥであり、Ｘ８はＥであり、Ｘ９はＧであり、Ｘ１０はＬもしくはＩもしくはＶであり、Ｘ１１はＲであり、かつ／またはＸ１２はＥもしくはＱである。一部の実施形態において、遺伝子操作されたＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ－Ｂ、８ＢＰＶ２、または７Ｍ８のＶＰ１タンパク質に由来するＶＰ１ポリペプチド配列を含む。
さらに、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を増大させる方法が提供される。このような方法は、細胞を細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を増大させる化合物と接触させるステップを典型的には含み、それによって細胞内へのＡＡＶの形質導入効率を増大させる。
細胞におけるＧＰＲ１０８の発現を増大させるために使用され得る代表的な化合物は、ＧＰＲ１０８導入遺伝子を含む発現構築物である。一部の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ－Ｂ、８ＢＰＶ２、または７Ｍ８である。一部の実施形態において、ＡＡＶは、遺伝子操作されたＡＡＶである。
同様に本明細書において記載されるように、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を低下させる方法が提供される。このような方法は、細胞を細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を低下させる化合物と接触させるステップを典型的には含み、それによって細胞内へのＡＡＶの形質導入効率を低下させる。
細胞におけるＧＰＲ１０８の発現を低下させるために使用され得る代表的な化合物は、干渉ＲＮＡ分子である。一部の実施形態において、干渉ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉである。
本明細書において記載される方法のいずれかにおいて使用される細胞は、インビボであり得る。代表的な細胞としては、肝細胞、腎臓細胞、心臓細胞、肺細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨髄細胞（造血幹細胞を含む）が含まれる。
さらに、細胞内への治療作用物質の取り込みを増大させる方法が提供される。このような方法は、細胞をＡＡＶ ＶＰ１ポリペプチドに連結した治療作用物質と接触させるステップを典型的には含み、ここで、ＶＰ１ポリペプチドは、配列ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を含み、配列中、Ｘ１～１２の各々は任意のアミノ酸である。
代表的な治療作用物質としては、タンパク質またはタンパク質複合体が含まれる。一部の実施形態において、治療作用物質は、ＧＰＲ１０８に結合する結合因子にさらに連結している。ＧＰＲ１０８に結合する代表的な結合因子としては、限定はしないが、抗体、アプタマー、および抗体ドメインが含まれる。
さらに、配列番号１または配列番号２を含むＶＰ１ポリペプチドに連結している治療作用物質を含む組成物が提供される。一部の実施形態において、治療作用物質は、タンパク質またはタンパク質複合体である。
さらに、配列番号１を含む異種ＶＰ１配列を含むＡＡＶカプシド配列が提供される。代表的な異種ＶＰ１配列は、配列番号１８で示される配列を含む。
配列番号２を含む異種ＶＰ１配列を含むＡＡＶカプシド配列もまた提供される。代表的な異種ＶＰ１配列としては、配列番号１９で示される配列が含まれる。
一態様において、本開示は、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を調節する方法を提供する。このような方法は、遺伝子改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を細胞に導入するステップを含み、ここで、ＡＡＶカプシドは、異種ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分を含むように遺伝子改変されており、異種ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分は、ＶＰ１ポリペプチドの配列に応じて、細胞のＧＰＲ１０８依存性またはＧＰＲ１０８非依存性の形質導入に関与している。一部の実施形態において、異種ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分は、ＡＡＶ５のＶＰ１ポリペプチドまたはその部分であり、このケースにおいて、ＡＡＶはＧＰＲ１０８非依存性である。一部の実施形態において、遺伝子改変されたＡＡＶは、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）非依存性のＡＡＶである。
別の態様において、本開示は、細胞内への非ＡＡＶ化合物の取り込みを調節する方法を扱う。このような方法は、細胞をＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶのＶＰ１ポリペプチドまたはその部分に連結した非ＡＡＶ化合物と接触させるステップを含む。一部の実施形態において、非ＡＡＶ化合物は、タンパク質またはタンパク質複合体である。一部の実施形態において、ＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶのＶＰ１ポリペプチドまたはその部分は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ－Ｂ、８ＢＰＶ２、および７Ｍ８に由来する。一部の実施形態において、非ＡＡＶ化合物は、ＧＰＲ１０８を結合する結合因子にさらに連結している。ＧＰＲ１０８を結合する代表的な結合因子としては、限定はしないが、抗体、アプタマー、および抗体ドメインが含まれる。
さらに別の態様において、本開示は、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を増大させる方法を扱う。このような方法は、細胞を細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を増大させる化合物と接触させるステップを含み、それによって細胞内へのＡＡＶの形質導入効率を増大させる。一部の実施形態において、細胞におけるＧＰＲ１０８の発現を増大させる化合物は、ＧＰＲ１０８導入遺伝子を含む発現構築物である。
さらに別の態様において、本開示は、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を低下させる方法を提供する。このような方法は、細胞を細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を低下させる化合物と接触させるステップを含み、それによって細胞内へのＡＡＶの形質導入効率を低下させる。一部の実施形態において、細胞におけるＧＰＲ１０８の発現を低下させる化合物は、干渉ＲＮＡ分子である。代表的な干渉ＲＮＡ分子としては、限定はしないが、ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡｉが含まれる。一部の実施形態において、細胞におけるＧＰＲ１０８の活性を低下させる化合物は、ＧＰＲ１０８に特異的に結合する抗体（すなわち抗ＧＰＲ１０８抗体）である。
本明細書において記載される方法のいずれかにおける細胞は、インビボの細胞であり得る。代表的な細胞としては、限定はしないが、肝細胞、腎臓細胞、心臓細胞、肺細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨髄細胞（造血幹細胞を含む）が含まれる。
本開示は、現在使用されているＡＡＶ血清型にこれまで利用しにくかった新規な組織型または細胞型を標的化するために使用され得る、固有の細胞標的化特性および組織標的化特性を有する新規なカプシドの生成を可能にする。具体的には、本明細書において記載される方法および組成物は、ＡＡＶベクターを、細胞受容体であるＧＰＲ１０８を係合するように、またはＧＰＲ１０８の使用および必要性に対する依存性を失うように変更することを可能にし、これによって、ＡＡＶベクターは、ＧＰＲ１０８発現細胞へのアクセスを獲得するか、または標的細胞型におけるＧＰＲ１０８発現によって制限されないようになる。
本明細書において使用される場合、形質導入効率は、細胞への侵入および感染を獲得し得る複数のウイルスの割合を指す。
本明細書において使用される場合、ＶＰ１ポリペプチド配列の文脈における「由来する」は、ＶＰ１ポリペプチド配列が生じたまたは由来した元である血清型を指す。ＶＰ１ポリペプチドは、任意の様式で発現され得、生成され得、または合成され得る。
遺伝子操作されたウイルスは、核酸配列が変化しているウイルスを指す。ウイルスを遺伝子操作する方法は、当技術分野において知られており、また、本明細書においてさらに論じられる。
「異種」ポリペプチドまたはその部分は、ポリペプチドの残り部分に対してまたは異種ポリペプチドがその中に存在する生物に対してネイティブではない、ポリペプチドまたはその一部を指す。
「ＧＰＲ１０８依存性」ＡＡＶは、細胞内への形質導入のためにＧＰＲ１０８の存在を必要とするＡＡＶを指す。他方、「ＧＰＲ１０８非依存性」ＡＡＶは、細胞内への形質導入のためにＧＰＲ１０８の存在を必要としないＡＡＶを指す。
「ＶＰ１タンパク質」は、典型的には、ＧＰＲ１０８非依存性またはＧＰＲ１０８依存性のいずれかを示す特定のＡＡＶ血清型のＶＰ１タンパク質またはその一部である。「ＶＰ１ポリペプチド」は、ＡＡＶのカプシドに組み込まれてＧＰＲ１０８依存性をＡＡＶに付与するＶＰ１タンパク質またはその一部に由来する分子である。本明細書において記載されるように、ＶＰ１ポリペプチドによってＡＡＶに付与されるＧＰＲ１０８依存性は、通常、そのＡＡＶで通常見られる野生型ＶＰ１タンパク質のＧＰＲ１０８依存性と比較して異なる。代表的なＧＰＲ１０８非依存性配列は、ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１、式中、Ｘ１～１２の各々は任意のアミノ酸であり得る）であり、一方、代表的なＧＰＲ１０８依存性配列は、ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２、式中、Ｘ１～１２の各々は任意のアミノ酸であり得る）である。
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、方法および組成物が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書において記載されるものに類似のまたは同等の方法および材料が本方法および本組成物の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。さらに、材料、方法、および例は例示的なものにすぎず、限定することを意図したものではない。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によってその全体が組み込まれる。
本開示において記載されている研究は、遺伝子療法ベクターの侵入経路を理解するために使用されているウイルス侵入因子を同定するための高度にストリンジェントなゲノムワイドスクリーニングの最初の過程の１つである。３つの新規な宿主細胞侵入因子が同定され、特徴付けされ、そしてＡＡＶＲ非依存性ＡＡＶ血清型およびＡＡＶＲ依存性ＡＡＶ血清型の両方についての試験結果が記載されている。ＡＡＶＲおよびＧタンパク質結合型受容体１０８（ＧＰＲ１０８）という２つの侵入因子の、高度に保存されている利用は、ほとんどのＡＡＶが同一の侵入経路を共有していると考えられることを実証している。ほとんどのＡＡＶがＡＡＶＲを結合し、適正な輸送のためにＡＡＶＲを必要とし、その後、エンドソーム脱出のためにＧＰＲ１０８を必要とする、新規な多因子侵入メカニズムが提示されている（図１）。
図１は、ＡＡＶ細胞侵入受容体の、本明細書において記載される研究に基づく、モデルの略図である。例えば、ほとんどのＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ－Ｂ、８ＢＰＶ２、および７Ｍ８）は、（例えば、ヒトおよびマウスの両方における）細胞侵入のためにＡＡＶＲおよびＧＰＲ１０８の両方を必要とし、ＡＡＶＲおよびＧＰＲ１０８の両方は、遍在的に発現することが報告されている。その一方で、ＡＡＶ５は、ＡＡＶＲの代替ドメインを独自に使用し、ＧＰＲ１０８は使用せず、同様に、エンドソーム脱出のために、現在知られていない共受容体を使用し、また、ＡＡＶ４およびｒｈ３２．３３は、ノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）およびカテプシンＡ（ＣＴＳＡ）の最小受容体複合体を使用し、同様に、エンドソーム脱出のためにＧＰＲ１０８受容体を使用する。
本明細書において記載されるように、細胞侵入に関与するＡＡＶ配列は、固有の細胞標的化特性および組織標的化特性を有する新規なカプシドを生産するように操作することができ、現在のＡＡＶ血清型にこれまで利用しにくかった特定の組織または細胞型の標的化を可能にする。ＡＡＶは、あらゆるウイルスと同様に、宿主タンパク質ならびに侵入と増殖感染を可能にするいくつかの他のステップとのための他の共因子を係合する。ここで、本発明らは、ＡＡＶベクターをＧＰＲ１０８に依存するように改変することを可能にし、これによって、ＧＰＲ１０８を発現する細胞および組織へのアクセスを可能にする、または逆に、ＡＡＶベクターをＧＰＲ１０８依存性でないようにし、これによって、ベクターを標的細胞におけるＧＰＲ１０８発現の必要性によって制限されないようにする、一般化可能な方法を記載する。さらに、本明細書において記載される侵入のメカニズムに基づいて、細胞内へのＡＡＶの形質導入効率を、多くの異なる方法を使用して調節または変更することができる。例えば、本明細書において記載される方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の細胞侵入を変化させるために使用することができる。
細胞内へのＡＡＶの侵入を少なくとも部分的に操作または制御する能力は、広範囲に及ぶ治療的意義を有する。ＡＡＶは、多くの異なる疾患または欠陥を処置するために治療的に使用され得、また、本明細書において記載される方法は、これらのＡＡＶによる１つまたは複数の細胞の形質導入効率を調節するために使用され得る。例えば、ＡＡＶは、血友病、網膜色素変性症、嚢胞性線維症、レーバー先天性黒内障、リソソーム蓄積症、先天性代謝異常（例えば、フェニルケトン尿症を含む先天性アミノ酸代謝異常、プロピオン酸血症を含む先天性有機酸代謝異常、中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ＭＣＡＤ）を含む先天性脂肪酸代謝異常）、癌、色盲、錐体杆体ジストロフィー、黄斑変性（例えば、加齢性黄斑変性）、リポポリペプチドリパーゼ欠損症、家族性高コレステロール血症、脊髄性筋萎縮症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、アルツハイマー病、パーキンソン病、肥満、炎症性腸障害、糖尿病、鬱血性心不全、高コレステロール血症、難聴、冠動脈性心疾患、家族性腎アミロイドーシス、マルファン症候群、致死性家族性不眠症、クロイツフェルト・ヤコブ病、鎌状赤血球症、ハンチントン病、頭側頭葉変性症、アッシャー症候群、乳糖不耐性、脂質蓄積症（例えば、ニーマン・ピック病、Ｃ型）、バッテン病、先天性脈絡膜欠如、グリコーゲン蓄積症ＩＩ型（ポンペ病）、毛細血管拡張性運動失調症（ルイ・バー症候群）、先天性甲状腺機能低下症、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、および／または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む広範な障害を処置するために、治療法（例えば遺伝子療法）を細胞に送達するために使用することができる。
遺伝子操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
本明細書において記載されるように、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率は、非天然の遺伝子改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を生成することおよび複数の遺伝子改変されたＡＡＶを細胞内に導入することによって、調節または変更され得る。ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分は、ＡＡＶ配列内のＶＰ１固有のＮ末端部分を指す。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、オーバーラップしているＣ末端タンパク質であり、これは、ＶＰ１およびＶＰ２のＮ末端にあるＶＰ１２固有のドメイン（「ＶＰ１２ｕ」と呼ばれる）、ならびに固有のＶＰ１ドメイン（「ＶＰ１ｕ」と呼ばれる）を生じさせる。本明細書において実証されているように、ＧＰＲ１０８の係合は、ＶＰ１ｕドメインにマッピングされている。
本明細書において記載されるように、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率は、非天然の遺伝子改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を生成することおよび複数の遺伝子改変されたＡＡＶを細胞内に導入することによって、調節または変更され得る。ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分は、ＡＡＶ配列内のＶＰ１固有のＮ末端部分を指す。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、オーバーラップしているＣ末端タンパク質であり、これは、ＶＰ１およびＶＰ２のＮ末端にあるＶＰ１２固有のドメイン（「ＶＰ１２ｕ」と呼ばれる）、ならびに固有のＶＰ１ドメイン（「ＶＰ１ｕ」と呼ばれる）を生じさせる。本明細書において実証されているように、ＧＰＲ１０８の係合は、ＶＰ１ｕドメインにマッピングされている。
本明細書において記載されるように、ＡＡＶカプシドタンパク質は、遺伝子操作されていない形態では細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要としないＡＡＶを細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要とするようにする異種ＶＰ１ポリペプチド配列を含むように、遺伝子操作され得る。あるいは、ＡＡＶカプシドタンパク質は、遺伝子操作されていない形態では細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要とするＡＡＶを細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体を必要としないようにする異種ＶＰ１ポリペプチド配列を含むように、遺伝子操作され得る。
例えば、ＡＡＶは、ＡＡＶをＧＰＲ１０８非依存性にする（例えば、ＧＰＲ１０８を必要としないようにする）配列ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１、配列中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）を有するＶＰ１配列を導入するように遺伝子操作され得る。一部の実施形態において、Ｘ１はＳもしくはＡもしくはＴであり得、Ｘ２はＦもしくはＡもしくはＴであり得、Ｘ３はＰであり得、Ｘ４はＤであり得、Ｘ５はＷであり得、Ｘ６はＬであり得、Ｘ７はＥであり得、Ｘ８はＥであり得、Ｘ９はＧであり得、Ｘ１０はＬもしくはＩもしくはＶであり得、Ｘ１１はＲであり得、かつ／またはＸ１２はＥもしくはＱであり得る。
代表的なＧＰＲ１０８非依存性のＶＰ１配列は、
ＭＡＡＶＤＨＰＰＤＷＬＥＥＶＧＥＧＩＲＥＦＬＧＬＥＡ（配列番号１８）
である。
ＭＡＡＶＤＨＰＰＤＷＬＥＥＶＧＥＧＩＲＥＦＬＧＬＥＡ（配列番号１８）
である。
あるいは、ＡＡＶは、ＡＡＶをＧＰＲ１０８依存性にする（例えば、ＧＰＲ１０８の存在を必要とするようにする）配列
ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２、配列中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）
を有するＶＰ１配列を含むように遺伝子操作され得る。一部の実施形態において、Ｘ１はＳもしくはＡもしくはＴであり得、Ｘ２はＦもしくはＡもしくはＴであり得、Ｘ３はＰであり得、Ｘ４はＤであり得、Ｘ５はＷであり得、Ｘ６はＬであり得、Ｘ７はＥであり得、Ｘ８はＥであり得、Ｘ９はＧであり得、Ｘ１０はＬもしくはＩもしくはＶであり得、Ｘ１１はＲであり得、かつ／またはＸ１２はＥもしくはＱであり得る。
ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２、配列中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）
を有するＶＰ１配列を含むように遺伝子操作され得る。一部の実施形態において、Ｘ１はＳもしくはＡもしくはＴであり得、Ｘ２はＦもしくはＡもしくはＴであり得、Ｘ３はＰであり得、Ｘ４はＤであり得、Ｘ５はＷであり得、Ｘ６はＬであり得、Ｘ７はＥであり得、Ｘ８はＥであり得、Ｘ９はＧであり得、Ｘ１０はＬもしくはＩもしくはＶであり得、Ｘ１１はＲであり得、かつ／またはＸ１２はＥもしくはＱであり得る。
代表的なＧＰＲ１０８依存性のＶＰ１配列は、
ＭＳＦＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＬＲＥＷＷＫＬＫＰ（配列番号１９）
である。
ＭＳＦＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＬＲＥＷＷＫＬＫＰ（配列番号１９）
である。
他の実施形態において、配列番号８（図１６で示され、ＡＡＶ５のＶＰ１配列の一部分である）は、ＧＰＲ１０８非依存性配列の一例であり、一方、配列番号９～１７（図１６で示され、それぞれが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ｒｈ３２．３３、ＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ３、およびＡＡＶ９のＶＰ１配列の一部分にそれぞれ対応する）は、ＧＰＲ１０８依存性配列の例であるが、本明細書において示されるもの以外のＶＰ１配列がＧＰＲ１０８非依存性またはＧＰＲ１０８依存性を付与し得ることが理解される。例えば、ＡＡＶ７、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ－Ｂ、８ＢＰＶ２、または７Ｍ８の同種ＶＰ１ポリペプチド（例えば、ＶＰ１タンパク質の対応する部分）もまた、ＧＰＲ１０８依存性を付与し得る。
本明細書において記載されるように、ＶＰ１ポリペプチドは、ＶＰ１ポリペプチドが由来した元であるＡＡＶ血清型のＶＰ１タンパク質に基づいて、細胞のＧＰＲ１０８依存性またはＧＰＲ１０８非依存性の形質導入に関与する。したがって、ＡＡＶは、遺伝子操作されたＡＡＶの細胞侵入および最終形質導入効率を改変するための異種ＶＰ１ポリペプチドを含むように遺伝子操作され得る。
例えば、通常はＧＰＲ１０８依存性であるＡＡＶを、ＡＡＶが細胞内へのＧＰＲ１０８非依存性の形質導入を示すようにする異種ＶＰ１ポリペプチドを含むように遺伝子改変することができるか、または、通常はＧＰＲ１０８非依存性であるＡＡＶを、ＡＡＶが細胞内へのＧＰＲ１０８依存性の形質導入を示すようにする異種ＶＰ１ポリペプチドを含むように遺伝子改変することができる。
一部の場合において、異種ＶＰ１ポリペプチドは、ＡＡＶ５のＶＰ１タンパク質またはその部分に由来する。本明細書において実証されているように、ＡＡＶ５由来のＶＰ１ポリペプチドは、さもなければＧＰＲ１０８依存性であるＡＡＶに、ＧＰＲ１０８非依存性を付与し得る。一部の場合において、異種ＶＰ１ポリペプチドを含むように遺伝子改変されているＡＡＶは、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）非依存性のＡＡＶである。ＡＡＶＲ非依存性のＡＡＶは、当技術分野において知られており、これとしては、例えば、ＡＡＶ４およびｒｈ３２．３３が含まれる。例えば、ＡＡＶＲ非依存性のＡＡＶは、本明細書において記載される方法を使用して、ＧＰＲ１０８非依存性ともなるように遺伝子操作され得る。
ＡＡＶの形質導入効率を調節する方法
本開示によって提供されるＡＡＶの細胞侵入メカニズムの理解に基づいて、一部の場合において、細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を増大させることによって、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を増大させることが望ましい場合がある。同様に、本開示によって提供されるＡＡＶの細胞侵入メカニズムの理解に基づいて、一部の場合において、細胞を細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を低下させる化合物を接触させることによって、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を低下させることが望ましい場合がある。
本開示によって提供されるＡＡＶの細胞侵入メカニズムの理解に基づいて、一部の場合において、細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を増大させることによって、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を増大させることが望ましい場合がある。同様に、本開示によって提供されるＡＡＶの細胞侵入メカニズムの理解に基づいて、一部の場合において、細胞を細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を低下させる化合物を接触させることによって、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を低下させることが望ましい場合がある。
細胞におけるタンパク質の発現または活性を増大させる方法は一般に知られており、これとしては、例えば、細胞内への、所望のタンパク質をコードする導入遺伝子（例えばＧＰＲ１０８導入遺伝子）を発現するまたは過剰発現する発現構築物の導入が、典型的には含まれる。同様に、タンパク質の発現または活性を低下させる方法は一般に知られており、これとしては、例えば、細胞において干渉ＲＮＡを発現させることが典型的には含まれる。干渉ＲＮＡは当技術分野において知られており、これとしては、限定はしないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子が含まれる。
ヒトＧＰＲ１０８配列ならびにマウスおよびラットＧＰＲ１０８配列は、当技術分野において知られている。例えば、ＮＭ＿００１０８０４５２（ヒトＧＰＲ１０８転写産物バリアント１）、ＮＭ＿０２０１７１（ヒトＧＰＲ１０８転写産物バリアント２）、ＮＰ＿００１０７３９２１（ヒトＧＰＲ１０８タンパク質アイソフォーム１）、ＡＦ３７６７２６（マウスＧＰＲ１０８転写産物）、およびＢＣ０６１９９６（ラットＧＰＲ１０８転写産物）を参照されたい。このような配列は、ＧＰＲ１０８導入遺伝子を発現させるための発現構築物を生成するために使用され得るか、またはこのような配列は、１つもしくは複数の干渉ＲＮＡを生成するために使用され得る。ＧＰＲ１０８に対する代表的な干渉ＲＮＡ配列は、ＣＧＧ ＡＣＡ ＡＧＣ ＣＣＡ ＵＵＵ ＧＧＡ Ａ（配列番号２０）の配列（ワールド・ワイド・ウェブ上のｓｃｈｏｌａｒｂａｎｋ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｈａｎｄｌｅ／１０６３５／１４２８２８で入手可能な、Ｋａｕｒ、２０１８、シンガポール国立大学での博士論文における、指定されたｓｉＲＮＡ３）を有する。
発現構築物は当技術分野において知られており、市販されているかまたは当技術分野において通常の組換えＤＮＡ技術によって生産され得る。発現構築物は、導入遺伝子に作動可能に連結している１つまたは複数の調節エレメントを典型的には含み、選択マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）をコードする配列などの配列をさらに含み得る。核酸を発現するように設計された構築物は、キメラポリペプチドまたは融合ポリペプチド（すなわち、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかで異種ポリペプチドに作動的に連結しているポリペプチド）をコードし得る。代表的な異種ポリペプチドは、コードされるポリペプチドの精製において使用され得るもの（例えば、６×Ｈｉｓタグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））である。
調節エレメントとしては、核酸コード配列の発現を指示および調節する核酸配列が含まれる。調節エレメントの一例は、プロモーター配列である。調節エレメントとしてはまた、イントロン、エンハンサー配列、応答エレメント、または核酸（例えば導入遺伝子）の発現を調節する誘導性エレメントも含まれ得る。調節エレメントは、細菌由来、酵母由来、昆虫由来、哺乳動物由来、またはウイルス由来のものであり得、構築物は、異なる由来源から得られる調節エレメントの組み合わせを含有し得る。本明細書において使用される場合、作動可能に連結しているとは、発現のためのエレメントが、コード配列の発現を指示または調節するような様式で、構築物内でコード配列（例えば導入遺伝子）との相対的位置にあることを意味する。一部の場合において、作動可能に連結しているとは、インフレームを意味する。
本明細書において記載される構築物は、宿主細胞に導入され得る。本明細書において使用される場合、「宿主細胞」は、核酸が導入される特定の細胞を指し、またこれとしては、このような細胞の子孫または潜在的子孫が含まれる。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、核酸は、大腸菌（E. coli）などの細菌細胞において、あるいは昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）もしくはＣＯＳ細胞など）において発現させることができる。他の適切な宿主細胞は、当業者に知られている。
本明細書において記載される、（例えば、ＧＰＲ１０８の発現もしくは活性を増大もしくは低下させる化合物と、または遺伝子改変されたＡＡＶと）接触している細胞は、インビトロで培養された細胞、あるいは、例えば動物モデルにおけるまたはヒト対象もしくは動物対象における組織の一部分におけるインビボの細胞であり得る。代表的な細胞型としては、限定はしないが、肝細胞、腎臓細胞、心臓細胞、筋肉細胞、脳細胞、肺細胞、上皮細胞、内皮細胞、および骨髄細胞（造血幹細胞を含む）、または眼もしくは内耳における細胞が含まれる。本明細書において記載される、接触している細胞は、例えば、腫瘍細胞または操作された細胞であり得る。
インビボおよびインビトロの両方の、宿主細胞内に核酸を導入するための多くの方法が当業者に知られており、これとしては、限定はしないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）形質転換、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス介在性の核酸移入が含まれる。
治療作用物質の送達
本明細書において記載される方法および組成物はまた、細胞内への治療作用物質の取り込みを調節するために使用することができる。例えば、タンパク質（例えば抗体、例えばモノクローナル抗体）またはタンパク質複合体などの治療作用物質を、ＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶのＶＰ１ポリペプチドまたはその部分に連結させることができる。この様式で、治療作用物質を、ＡＡＶによって通常使用されるＧＰＲ１０８取り込みメカニズムを利用するように操作することができる。本明細書における開示に基づいて、ＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶのＶＰ１ポリペプチドが、配列番号２で示されるコンセンサス配列を含み得ること、または、ＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶのＶＰ１ポリペプチドが、取り込みのためにＧＰＲ１０８を必要とする任意のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ－Ｂ、８ＢＰＶ２、もしくは７Ｍ８）のＶＰ１タンパク質もしくはその部分に由来し得ることが理解される。
本明細書において記載される方法および組成物はまた、細胞内への治療作用物質の取り込みを調節するために使用することができる。例えば、タンパク質（例えば抗体、例えばモノクローナル抗体）またはタンパク質複合体などの治療作用物質を、ＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶのＶＰ１ポリペプチドまたはその部分に連結させることができる。この様式で、治療作用物質を、ＡＡＶによって通常使用されるＧＰＲ１０８取り込みメカニズムを利用するように操作することができる。本明細書における開示に基づいて、ＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶのＶＰ１ポリペプチドが、配列番号２で示されるコンセンサス配列を含み得ること、または、ＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶのＶＰ１ポリペプチドが、取り込みのためにＧＰＲ１０８を必要とする任意のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ－Ｂ、８ＢＰＶ２、もしくは７Ｍ８）のＶＰ１タンパク質もしくはその部分に由来し得ることが理解される。
一部の場合において、さらなる結合因子をＧＰＲ１０８に対する親和性を有する治療作用物質にさらに連結させることが望ましい場合がある。このような結合因子は、限定はしないが、抗体、抗体ドメイン、またはアプタマーを含む、ＧＰＲ１０８に結合する任意の分子または作用物質であり得る。例えば、治療作用物質のＮ末端は、コンセンサス配列を含むＶＰ１ポリペプチド
ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）に連結され得、細胞への治療作用物質の送達が可能となる。
ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）に連結され得、細胞への治療作用物質の送達が可能となる。
本開示に従って、当技術分野の技術の範囲内である従来の分子生物学、微生物学、生化学、および組換えＤＮＡ技術が利用され得る。このような技術は、文献において全て説明されている。本開示は以下の実施例においてさらに記載され、これらの実施例は、特許請求の範囲において記載されている方法および組成物の範囲を限定するものではない。
材料および方法
全ての細胞系は、５％ＣＯ２を有する３７℃の加湿インキュベーター内で、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を添加したダルベッコ改変イーグル最小培地ＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で維持した。全ての細胞系はＪａｎ Ｃａｒｒｅｔｔｅ ｌａｂから譲り受け、これまでに公開されている（Pillay et al., 2016, Nature, 530:108-12）。細胞を、標準的なプロトコルを使用して、ＰｏｌｙＪｅｔインビトロＤＮＡトランスフェクション試薬（ＳｉｇｎａＧｅｎ、カタログ番号ＳＬ１００６８８）を使用してトランスフェクトした。
全ての細胞系は、５％ＣＯ２を有する３７℃の加湿インキュベーター内で、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を添加したダルベッコ改変イーグル最小培地ＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で維持した。全ての細胞系はＪａｎ Ｃａｒｒｅｔｔｅ ｌａｂから譲り受け、これまでに公開されている（Pillay et al., 2016, Nature, 530:108-12）。細胞を、標準的なプロトコルを使用して、ＰｏｌｙＪｅｔインビトロＤＮＡトランスフェクション試薬（ＳｉｇｎａＧｅｎ、カタログ番号ＳＬ１００６８８）を使用してトランスフェクトした。
一次細胞ＭＥＦを、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、５５μＭのベータ－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１５μｇ／ｍＬの硫酸ゲンタマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、および非必須アミノ酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）内で培養した。ＷＴおよびＧＰＲ１０８ ＫＯ ＭＥＦはＢｒｉａｎ ＳｅｅｄおよびＧｕｏｌｉｎｇ Ｚｈｏｕから譲り受け、これまでに記載されている（Dong et al., 2018, Plos One, 13(10):e0205303）。
合成に使用したＮＣＢＩ配列は以下の通りであった：マウスＧＰＲ１０７、ＢＡＣ２６９６１、マウスＧＰＲ１０８、ＮＰ＿０８４３６０、ヒトＧＰＲ１０７、ＡＡＫ５７６９５、ヒトＧＰＲ１０８、ＸＰ＿２９０８５４。カプシドキメラを、（Excoffon et al., 2009, PNAS USA, 106:3865-70）において実証されているＶＰ１ジャンクションでＡＡＶ２およびＡＡＶ５のヌクレオチド配列から生成させた。カプシドキメラはＧｅｎｅｗｉｚによって合成され、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位およびＳｐｅＩ制限部位を使用してｐＡＡＶｅｃｔｏｒ２にサブクローニングした。
高力価ベクターはＭＥＥＩ／ＳＥＲＩ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ（ワールド・ワイド・ウェブ上のｖｅｃｔｏｒ．ｍｅｅｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ）によって生産され、精製され、および滴定された。大規模ベクター調製物を、ｐＨｅｌｐ導入遺伝子、ｐＡＡＶｅｃｔｏｒ２［Ｃａｐ］導入遺伝子、およびｐＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ、ｐＣＭＶ．ｅＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ導入遺伝子またはｐＣＭＶ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ導入遺伝子の２：１：１比でのポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２４７６５－２）トリプルトランスフェクションによって生成した。５２０μｇの全ＤＮＡを、１．３７５：１（ｗ／ｗ）のＰＥＩ Ｍａｘ：ＤＮＡ比を使用して、１０層のハイパーフラスコ内でトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、ベクターをタンジェンシャルフロー濾過によって濃縮し、以前に記載されているように（Lock et al., 2010, Hum. Gene Ther., 21:1259-71）イオジキサノール勾配超遠心分離によって精製した。
キメラウイルスベクターおよび点突然変異ウイルスベクターを、１０ｃｍの細胞培養物プレート内で、同一のトランスフェクション方法によって、小規模で粗ウイルス調製物として生産した。トランスフェクションの３日後、細胞および上清を回収し、３回の凍結融解サイクルにかけ、次いで、粗ウイルス調製物を、４℃のＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＦＩＢＥＲＬｉｔｅ Ｆ１５－８ｘ５０ｃｙローター内での１００００ＲＰＭで１０分間の遠心分離によって澄明化した。
全てのルシフェラーゼ形質導入アッセイは、底が黒い９６ウェルプレート内でウェル当たり１００００個の細胞を播種することによって一晩行った。示されている場合、細胞はＤ１０中の２００ｐｆｕ／細胞のＷＴ ｈＡｄ５（ペンシルベニア大学Ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｒｅ）と２時間プレインキュベートし、次いで、ｈＡｄ５を含有する培地を除去し、その後、形質導入を行った。細胞を、５０μＬの無血清ＤＭＥＭ中の１×１０４ＶＧ／細胞のいずれかのＡＡＶで、３７℃で１時間形質導入し（ＡＡＶＲ回復実験）、次いで、Ｄ１０を２００μＬの全容積まで添加したか、または、ウェル当たり１００μｌの粗ウイルス調製物（キメラカプシド実験および点突然変異カプシド実験）を３７℃で１時間添加し、除去し、次いで、Ｄ１０を添加した。形質導入レベルを、形質導入の４８時間後に、ルシフェラーゼアッセイによって分析した。
形質導入の２日後、細胞培養培地を除去し、細胞をウェル当たり２０μＬの１×レポーター溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号）中に溶解し、次いで、－８０℃で凍結した。解凍した後、ｆｆＬｕｃの発現を、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダーで、１００μＬのルシフェリンバッファー［２００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、３００μＭのＡＴＰ、１×ホタルルシフェラーゼシグナルエンハンサー（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号１６１８０）、および１５０μｇ／ｍＬのＤ－ルシフェリン］を使用して、相対発光量／ｓで測定した。
[実施例１]
侵入のスクリーニングおよび分析
レンチウイルスを、レンチウイルス生産のための製造者のプロトコルを使用して、ＰｏｌｙＪｅｔインビトロＤＮＡトランスフェクション試薬（ＳｉｇｎａＧｅｎ、カタログ番号ＳＬ１００６８８）を使用して、一過性トランスフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）から生産した。ＬｅｎｔｉＣａｓ９－ｂｌａｓｔおよび個々のｓｇＲＮＡ含有レンチウイルスを、１０ｃｍのディッシュ当たり４×１０６個細胞で一晩播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞において生産した。トランスフェクションの１時間前に、培地を、新鮮な事前に温めたＤ１０に交換し、その後、ｐｓＰＡＸ２、ｐＬｅｎｔｉＣａｓ９－ＢｌａｓｔまたはＬＶ０４、およびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇを１０：１０：１比でトランスフェクトした。培地をトランスフェクションの６時間後に新鮮なＤ１０に交換し、上清のウイルスを４８時間後に採取し、Ｓｏｒｖａｌｌ卓上型遠心分離機において２０００ＲＰＭで５分間遠心分離することによって澄明化し、そして、０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過した。大規模なＧｅＣ ＫＯレンチウイルスを以前に記載されているように生産した（Joung et al., 2017, Nat. Protoc., 12:828-63）。
侵入のスクリーニングおよび分析
レンチウイルスを、レンチウイルス生産のための製造者のプロトコルを使用して、ＰｏｌｙＪｅｔインビトロＤＮＡトランスフェクション試薬（ＳｉｇｎａＧｅｎ、カタログ番号ＳＬ１００６８８）を使用して、一過性トランスフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）から生産した。ＬｅｎｔｉＣａｓ９－ｂｌａｓｔおよび個々のｓｇＲＮＡ含有レンチウイルスを、１０ｃｍのディッシュ当たり４×１０６個細胞で一晩播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞において生産した。トランスフェクションの１時間前に、培地を、新鮮な事前に温めたＤ１０に交換し、その後、ｐｓＰＡＸ２、ｐＬｅｎｔｉＣａｓ９－ＢｌａｓｔまたはＬＶ０４、およびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇを１０：１０：１比でトランスフェクトした。培地をトランスフェクションの６時間後に新鮮なＤ１０に交換し、上清のウイルスを４８時間後に採取し、Ｓｏｒｖａｌｌ卓上型遠心分離機において２０００ＲＰＭで５分間遠心分離することによって澄明化し、そして、０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過した。大規模なＧｅＣ ＫＯレンチウイルスを以前に記載されているように生産した（Joung et al., 2017, Nat. Protoc., 12:828-63）。
簡潔に述べると、Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂを、本明細書において記載されるプロトコルの大規模トランスフェクションを使用して、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＨＹＰＥＲｆｌａｓｋ培養管において、個々のレンチウイルスライブラリー調製物として生産した。上清のウイルスを、トランスフェクション後２日目および３日目に回収し、０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過し、そして、ＳＷ－２８ローター内で２４０００ＰＲＭで２時間、４℃で超遠心分離することによって濃縮した。
細胞系を、形質導入の前の晩に、６ウェルプレートのウェル当たり１×１０６個細胞で播種した。細胞を、８μｇ／μＬのポリブレン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＴＲ１００３Ｇ）の存在下で、ウェル当たり１ｍＬの上清レンチウイルスを使用して、卓上型での２５℃および２５００ＲＰＭで３０分間のスピンフェクションによって形質導入した。スピンフェクションの後、培地を新鮮なＤ１０に交換し、翌日、安定的に形質導入された細胞を、５μｇ／μＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ９６２０）を使用して２日間選択した。
Ｃａｓ９細胞に、本明細書において記載される個々の標的化ｓｇＲＮＡを発現するレンチウイルス（ＬＶ０４構築物）で形質導入した。ピューロマイシン選択の少なくとも１週間後、個々の細胞クローンを、９６ウェルプレート内でＤＭＥＭ２０％ＦＢＳプラス非必須アミノ酸およびペニシリン／ストレプトマイシン中で限界希釈することによって平板培養し、細胞の生存を増大させた。平板培養の２～３週間後、単細胞クローンを増殖させ、ノックアウトについてスクリーニングした。
濃縮されたレンチＣＲＩＳＰＲライブラリーを、ピューロマイシン選択の２日後に、ピューロマイシンの不存在下で、形質導入されていないコントロール細胞と比較した、形質導入された細胞の生存の％を決定することによって、Ｈｕｈ７ ＡＡＶＲ ＫＯ Ｃａｓ９細胞について滴定した。
Ｈｕｈ７ ＡＡＶＲ ＫＯ Ｃａｓ９細胞に、８μｇ／μＬのポリブレンでの２５℃で３０分間の上記のようなスピンフェクションによって、６ウェルプレート内で、０．３のＭＯＩの濃縮されたＶ２ＡまたはＶ２Ｂレンチウイルスで形質導入し、その後、３７℃および５％ＣＯ２で１．５インキュベートし、その後、新鮮なＤ１０培地を添加した。ピューロマイシンを形質導入の２４時間後に５μｇ／μＬの濃度で添加して、ｓｇＲＮＡ発現細胞を選択した。細胞をピューロマイシンと１週間培養して選択を行い、ＡＡＶでの選択の前に編集を生じさせた。突然変異誘発されたライブラリーの各半分から得た３０００万個の細胞（Ｖ２Ａ細胞およびＶ２Ｂ細胞）に、１０００００ＶＧ／細胞のｒｈ３２．３３ＣＭＶ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥで形質導入した。細胞に、２つの１５ｃｍプレートのそれぞれにおける全容積が１０ｍＬの無血清ＤＭＥＭ中で１時間形質導入し、その後、１０ｍＬのＤＭＥＭ２０％ＦＢＳを添加し、そして翌日、細胞を分けた。
細胞をＦＡＣＳ選別のためにトリプシン処理によって回収し、卓上型遠心分離機で、２０００ＲＰＭで５分間回転させ、次いで、５ｍＭのＥＤＴＡを有するＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを有さない）中に再懸濁した。ＦＡＣＳ選別は、マサチューセッツ総合病院フローサイトメトリーコア（Ｓｉｍｃｈｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ）で、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ機器で行った。細胞を、２０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中に回収した。選択された細胞を増殖させ、ゲノムＤＮＡを、サンプル当たり全部で１０７個の細胞から抽出した。ライブラリーの各半分から得たＧＦＰネガティブ細胞を半分に分け、配列決定したか、または同一の形質導入プロトコルを使用して第２の形質導入およびＦＡＣＳ選別にかけた。
シーケンシングした後、生リードを、ＭａＧＥＣＫ分析パイプラインを使用して、既知のｓｇＲＮＡ配列にマッピングした。ライブラリーの各半分（Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂ）内のコントロール集団に対して正規化した後に、有意値をライブラリー全体について決定し、データは、多重検定補正を行わずに、生のｐ値として報告されている。
これらの遺伝子改変された細胞は、その遺伝子改変がＡＡＶの標的化効率に影響したかどうかについて次に調べた細胞のライブラリーとして機能した。ｓｇＲＮＡのシーケンシングはこうして、ＡＡＶの標的化効率を増大または低下させた遺伝子改変の追跡を可能とした。この相関を次いで、ロバスト性について統計的に調べた。有意なヒットを、ＡＡＶの形質導入におけるそれらの役割についてさらに検証した。さらに、実施例２において記載するように、第２ラウンドの選択をライブラリーに対して行って、所見のロバスト性をさらに増大させた。
[実施例２]
侵入のスクリーニングはｒｈ３２．３３の侵入因子を同定する
ＣＲＩＳＰＲに基づく侵入スクリーニングを、代替ＡＡＶ侵入経路に必要な細胞侵入因子を同定するように設計した。２ベクターレンチウイルスＧｅＣＫＯ系は、単一ベクター内のＣａｓ９を目的の細胞系に導入し、その後、ヒトゲノム全体に広がるｓｇＲＮＡおよびｍｉＲＮＡのライブラリーを導入した（図２Ａ）（Shalem et al., 2014, Science, 343:84-7）。簡潔に述べると、細胞にベクター１［ｌｅｎｔｉＣａｓ９－Ｂｌａｓｔ］で形質導入し、その後、Ｃａｓ９の安定な発現のためにブラストサイジン選択を行った。Ｃａｓ９に、次いで、ヒトゲノム全体を標的化するｓｇＲＮＡを含有するライブラリーフォーマットのベクター２（ｌｅｎｔｉＧｕｉｄｅ－Ｐｕｒｏ）で形質導入して、細胞系ノックアウトライブラリーを生成した。
侵入のスクリーニングはｒｈ３２．３３の侵入因子を同定する
ＣＲＩＳＰＲに基づく侵入スクリーニングを、代替ＡＡＶ侵入経路に必要な細胞侵入因子を同定するように設計した。２ベクターレンチウイルスＧｅＣＫＯ系は、単一ベクター内のＣａｓ９を目的の細胞系に導入し、その後、ヒトゲノム全体に広がるｓｇＲＮＡおよびｍｉＲＮＡのライブラリーを導入した（図２Ａ）（Shalem et al., 2014, Science, 343:84-7）。簡潔に述べると、細胞にベクター１［ｌｅｎｔｉＣａｓ９－Ｂｌａｓｔ］で形質導入し、その後、Ｃａｓ９の安定な発現のためにブラストサイジン選択を行った。Ｃａｓ９に、次いで、ヒトゲノム全体を標的化するｓｇＲＮＡを含有するライブラリーフォーマットのベクター２（ｌｅｎｔｉＧｕｉｄｅ－Ｐｕｒｏ）で形質導入して、細胞系ノックアウトライブラリーを生成した。
レンチウイルスプラスミドは、ＡｄｄｇｅｎｅまたはＳｉｇｍａから購入した。ＬｅｎｔｉＣａｓ９－ｂｌａｓｔ（５２９６２）、ｐｓＰＡＸ２（１２２６０）、ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ（８４５４）、ＧｅＣＫＯ Ｖ２ＡおよびＧｅＣＫＯ Ｖ２Ｂ（１０００００００４８および１０００００００４９）は、Ａｄｄｇｅｎｅから購入した。スクリーニングの検証およびノックアウト実験に使用される個々の遺伝子を標的化する個々のｓｇＲＮＡレンチウイルス構築物は、Ｓｉｇｍａ ＬＶ０４ベクター骨格内のＱｕｉｃｋＰｉｃｋグリセロールストッククローンとしてＳｉｇｍａから購入した。
レンチウイルスを、レンチウイルス生産のための製造者のプロトコルを使用して、ＰｏｌｙＪｅｔインビトロＤＮＡトランスフェクション試薬（ＳｉｇｎａＧｅｎ、カタログ番号ＳＬ１００６８８）を使用して、一過性トランスフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）から生産した。ＬｅｎｔｉＣａｓ９－ｂｌａｓｔおよび個々のｓｇＲＮＡ含有レンチウイルスを、１０ｃｍのディッシュ当たり４×１０６個細胞で一晩播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞において生産した。トランスフェクションの１時間前に、培地を、新鮮な事前に温めたＤ１０に交換し、その後、ｐｓＰＡＸ２、ｐＬｅｎｔｉＣａｓ９－ＢｌａｓｔまたはＬＶ０４、およびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇを１０：１０：１比でトランスフェクトした。培地をトランスフェクションの６時間後に新鮮なＤ１０に交換し、上清のウイルスを４８時間後に採取し、Ｓｏｒｖａｌｌ卓上型遠心分離機において２０００ＲＰＭで５分間遠心分離することによって澄明化し、そして、０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過した。大規模なＧｅＣ ＫＯレンチウイルスを以前に記載されているように生産した（Joung et al., 2017, Nat. Protoc., 12:828-63）。
簡潔に述べると、Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂを、上記のプロトコルの大規模トランスフェクションを使用して、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＨＹＰＥＲｆｌａｓｋ培養管において、個々のレンチウイルスライブラリー調製物として生産した。上清のウイルスを、トランスフェクション後２日目および３日目に回収し、０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過し、そして、ＳＷ－２８ローター内で２４０００ＰＲＭで２時間、４℃で超遠心分離することによって濃縮した。濃縮されたｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲライブラリーを、ピューロマイシン選択の２日後に、ピューロマイシンの不存在下で、形質導入されていないコントロール細胞と比較した、形質導入された細胞の生存の％を決定することによって、Ｈｕｈ７ ＡＡＶＲ ＫＯ Ｃａｓ９細胞について滴定した。
Ｈｕｈ７ ＡＡＶＲ ＫＯ細胞を、ＡＡＶＲ依存性の侵入でのいかなる考えられる冗長性もスクリーニングにおける偽陰性を生じさせないことを確実にするために、このスクリーニングに使用した。ｒｈ３２．３３．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥベクターで形質導入されたｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ突然変異誘発細胞の複数ラウンドの形質導入、ならびにＦＡＣＳ選別と、その後のｓｇＲＮＡ普及率のＩｌｌｕｍｉｎａディーブシーケンシングとを使用して、ＡＡＶの制限またはＡＡＶの侵入のいずれかに関与する細胞因子を同定した（図２Ｂ）。
コントロール（選択されていない）細胞または選択された細胞のゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（カタログ番号１３３４３）を使用して抽出した。バーコードの追加およびＩｌｌｕｍｉｎａアダプターの追加を、以前に記載されているように行った（Joung et al., 2017, Nat. Protoc., 12:828-63）。簡潔に述べると、２ステップのＰＣＲを、サンプル特異的なプライマーを使用して行って、ｓｇＲＮＡ配列を特異的に増幅させ、記載されているように、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機でのマルチプレックスシーケンシングの間にサンプルを区別した（Joung et al., 2017, Nat. Protoc., 12:828-63）。
ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ（ＧｅＣＫＯ）ライブラリー（Ｖ２Ａ細胞およびＶ２Ｂ細胞）の各半分で突然変異誘発された３０００万個の細胞（Sanjana et al., 2014, Nat. Methods, 11:783-4）に、高ＭＯＩのｒｈ３２．３３．ＣＭＶ．ｅＧＰＦ．ＷＰＲＥで形質導入した。最も高い≒１５％の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有する細胞を選択し、ｓｇＲＮＡの普及率をディープシーケンシングして、ＡＡＶの侵入または遺伝子発現を制限し得る細胞因子同定した（図３Ａ、図３Ｂ）。ＧＦＰネガティブであった細胞（図３Ａ、図３Ｂ）を選択し、半分に分け、そして、ディープシーケンシングしたかまたは別のラウンドの形質導入を行った。これらの細胞に同一ＭＯＩで形質導入し、ＧＦＰネガティブ細胞を選別し、そしてｒｈ３２．３３侵入因子がさらに強化されるようにシーケンシングした（図３Ｃ、図３Ｄ）。第２ラウンドの形質導入は、同一のＭＯＩで行ったが、第１ラウンドの形質導入（図３Ａ、図３Ｂ）と比較して、ＧＦＰネガティブなままであった細胞のパーセンテージが高く（図３Ｃ、図３Ｄ）、このことは、選択が、ｒｈ３２．３３の侵入に必要な欠失した遺伝子を強化させたことを示唆している。ゲノムＤＮＡを異なる選択された細胞集団から抽出し、ｓｇＲＮＡを、ディーブシーケンシングのために、サンプル特異的なバーコードおよびＩｌｌｕｍｉｎａアダプターを追加した２ステップのネステッドＰＣＲ戦略によって増幅した（Joung et al., 2017, Nat. Protoc., 12:828-63）。
サンプルをマルチプレックス化し、シーケンシングし、その後、Ｖ２ＡサンプルおよびＶ２Ｂサンプルを組み合わせて、ライブラリー全体におけるｓｇＲＮＡの普及率を分析し、そして、リードを、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ Ｖ２ライブラリー内の既知の配列に戻しマッピングした。２ステップのネステッドＰＣＲ戦略を使用して、選択されていない（コントロール）細胞集団または第１ラウンドのＧＦＰ＋またはＧＦＰ－細胞集団からのシーケンシングのためにｓｇＲＮＡを増幅し、ＮＧＳアンプリコンにおいて、固有のサンプルバーコードおよびＩｌｌｕｍｉｎａアダプターを追加した。各選択条件は、ｓｇＲＮＡライブラリーの３００倍を超える網羅を維持するために十分な、全部で７００万を超える生リード、および３７０万を超える、既知のインプットｓｇＲＮＡ配列に完全にマッピングされたリードを生じさせた。
遺伝的摂動によってＡＡＶ感染に対して不応性とされた細胞についてのこの第２ラウンドの選択において、このマルチプレックスライブラリーアプローチを介してさらに厳密な選択を行って、どの細胞因子がＡＡＶ感染の低減と関連しているかを同定した。宿主ゲノムにおけるｓｇＲＮＡマーカーのシーケンシングによって同定されたこれらの共因子は、こうして、ＡＡＶの形質導入に関与する潜在的な所要の遺伝子およびタンパク質として見なされる。
[実施例３]
潜在的ＡＡＶ制限因子の同定
ＧＦＰ陽性細胞のロバストランク凝集（ＲＲＡ）分析およびＭＡＧｅＣＫ分析（Li et al., 2014, Genome Biol., 15:554、およびLi et al., 2015, Genome Biol., 16:281）は、平均蛍光強度が高い、細胞において強化されているいくつかの因子を同定した（図４Ａ）：
－ ＡＣＳＬ６：Ａｃｙｌ－ＣｏＡ合成酵素長鎖ファミリーメンバー６は、脂肪酸からのＡｃｙｌ－ＣｏＡの形成を触媒し、脂質代謝において主要な役割を有し得る。
－ ＬＥＴＭＤ１：ＬＥＴＭ１ドメイン含有１は、ｐ５３の調節および腫瘍形成において役割を有することが示唆されている。
－ ＣＡＬＮ１：Ｃａｌｎｅｕｒｏｎ １は、ゴルジから原形質膜への運搬を負に調節し、その欠失は、核へのＡＡＶの運搬の際に輸送経路を変更する可能性があり得る。
－ ＳＳＨ３：Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔプロテインホスファターゼ３は、ＡＤＦ／コフィリンタンパク質を活性化させることによって、アクチンダイナミクスにおいて役割を有し、これはまた、ＡＡＶ侵入の輸送経路にも影響し得、これを変更し得る。
潜在的ＡＡＶ制限因子の同定
ＧＦＰ陽性細胞のロバストランク凝集（ＲＲＡ）分析およびＭＡＧｅＣＫ分析（Li et al., 2014, Genome Biol., 15:554、およびLi et al., 2015, Genome Biol., 16:281）は、平均蛍光強度が高い、細胞において強化されているいくつかの因子を同定した（図４Ａ）：
－ ＡＣＳＬ６：Ａｃｙｌ－ＣｏＡ合成酵素長鎖ファミリーメンバー６は、脂肪酸からのＡｃｙｌ－ＣｏＡの形成を触媒し、脂質代謝において主要な役割を有し得る。
－ ＬＥＴＭＤ１：ＬＥＴＭ１ドメイン含有１は、ｐ５３の調節および腫瘍形成において役割を有することが示唆されている。
－ ＣＡＬＮ１：Ｃａｌｎｅｕｒｏｎ １は、ゴルジから原形質膜への運搬を負に調節し、その欠失は、核へのＡＡＶの運搬の際に輸送経路を変更する可能性があり得る。
－ ＳＳＨ３：Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔプロテインホスファターゼ３は、ＡＤＦ／コフィリンタンパク質を活性化させることによって、アクチンダイナミクスにおいて役割を有し、これはまた、ＡＡＶ侵入の輸送経路にも影響し得、これを変更し得る。
ＧＦＰ陽性のサブセットにおける最も大きなヒットは、特徴付けされていない膜貫通タンパク質であるＴＭＥＭ１２５であった。ＧＦＰ陽性の選択からのトップヒットのいくつかを標的化する個々のｓｇＲＮＡを、レンチウイルスベクターを使用してＨｕｈ７ ＡＡＶＲ ＫＯ Ｃａｓ９細胞に導入し、次いで、ピューロマイシン選択された細胞を、ルシフェラーゼアッセイを使用してｒｈ３２．３３の形質導入レベルについて評価した。
提示されているデータは、親細胞系（Ｈｕｈ７ ＡＡＶＲ ＫＯ Ｃａｓ９）と比較した、ＣＲＩＳＰＲ編集されたポリクローナル細胞集団における、１００００ＶＧ／細胞のｒｈ３２．３３．ＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡでの形質導入から生じるＲＬＵの増加倍率である。ポリクローナル細胞系は、Ｈｕｈ７ ＡＡＶＲ ＫＯ Ｃａｓ９細胞に、ｒｈ３２．３３ ＧＦＰ＋細胞集団において同定された個々の遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡをコードするレンチウイルスで形質導入することによって生成させた。いくつかのｓｇＲＮＡ形質導入された細胞系は、親細胞系と比較して、最も顕著にはＴＭＥＭ１２５およびＧＭＥＢ２（グルココルチコイド調節エレメント結合タンパク質２）の形質導入の増大を示し、これらはそれぞれ、形質導入のおよそ１００倍の増大を示した（図４Ｂ）。
これらの結果は、ＧｅＣＫＯに基づく侵入スクリーニングが、ＡＡＶｒｈ３２．３３についての潜在的な細胞制限因子を同定し得ることを実証している。
[実施例４]
潜在的なＡＡＶの侵入因子の同定
ＧＦＰ－細胞集団の分析は、本明細書において記載されるように、ＧＦＰ－集団において強化されていた、同定されたいくつかの遺伝子を生産し、これらのうちの最も顕著なものの１つは、ＧＰＲ１０８であった（図５Ａ）。この遺伝子は、ノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）およびカテプシンＡ（ＣＴＳＡ）などの非常に強化されていた他の遺伝子と同様に、第２ラウンドの形質導入の分析においてさらに強化された（図５Ｂ）。Ｘ軸は、機能性によってグループ化されたＧｅＣＫＯライブラリー内の個々の遺伝子を示しており、Ｙ軸は、ＲＲＡ分析に基づく各ヒットの有意性を示している。バブルの直径は、選択されていないコントロールと比較して、選択された集団において強化されている、遺伝子当たりの個々のｓｇＲＮＡの数に対応する。重要なことに、トップヒットの有意性は１０６近くのｐ値まで増大したが、他の遺伝子は、１０３の有意値の辺りで変化しないままであった。このことは、第２ラウンドの形質導入がｒｈ３２．３３の侵入因子を強化するために非常に重要であったことを示唆している。ＧＰＲ１０８が侵入因子として同定されたことで、ＧＰＲ１０８依存性に関与するＶＰ１領域の研究およびマッピングが行われた。
潜在的なＡＡＶの侵入因子の同定
ＧＦＰ－細胞集団の分析は、本明細書において記載されるように、ＧＦＰ－集団において強化されていた、同定されたいくつかの遺伝子を生産し、これらのうちの最も顕著なものの１つは、ＧＰＲ１０８であった（図５Ａ）。この遺伝子は、ノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）およびカテプシンＡ（ＣＴＳＡ）などの非常に強化されていた他の遺伝子と同様に、第２ラウンドの形質導入の分析においてさらに強化された（図５Ｂ）。Ｘ軸は、機能性によってグループ化されたＧｅＣＫＯライブラリー内の個々の遺伝子を示しており、Ｙ軸は、ＲＲＡ分析に基づく各ヒットの有意性を示している。バブルの直径は、選択されていないコントロールと比較して、選択された集団において強化されている、遺伝子当たりの個々のｓｇＲＮＡの数に対応する。重要なことに、トップヒットの有意性は１０６近くのｐ値まで増大したが、他の遺伝子は、１０３の有意値の辺りで変化しないままであった。このことは、第２ラウンドの形質導入がｒｈ３２．３３の侵入因子を強化するために非常に重要であったことを示唆している。ＧＰＲ１０８が侵入因子として同定されたことで、ＧＰＲ１０８依存性に関与するＶＰ１領域の研究およびマッピングが行われた。
[実施例５]
ＮＥＵ１およびＣＴＳＡは、代替侵入経路血清型ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４の侵入に必要である
ＮＥＵ１およびＣＴＳＡは共に複合体内に存在するため、また、ＮＥＵ１の安定性および立体構造はＣＴＳＡに依存するため（Galijart et al., 1988, Cell, 54:755-64、およびBonten et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:26441-5）、これらのタンパク質を、双方が代替ＡＡＶ侵入経路に重要であるかどうかを決定するために試験した。ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４の２つのＡＡＶＲ非依存性血清型を、ＮＥＵ１ ＷＴマウスもしくはＮＥＵ１ ＫＯマウス、またはＣＴＳＡ ＷＴマウス、ＣＴＳＡヘテロ接合型（ＨＥＴ）マウス、もしくはＣＴＳＡ ＫＯマウスに由来する、以前に公開されているマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞系において試験した。ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４の両方は、ＮＥＵ１ ＫＯ細胞およびＣＴＳＡ ＫＯ細胞における形質導入の欠如を示し、ＣＴＳＡヘテロ接合型細胞における影響はほとんどまたは全く観察されなかった（図６Ａ、図６Ｂ）。
ＮＥＵ１およびＣＴＳＡは、代替侵入経路血清型ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４の侵入に必要である
ＮＥＵ１およびＣＴＳＡは共に複合体内に存在するため、また、ＮＥＵ１の安定性および立体構造はＣＴＳＡに依存するため（Galijart et al., 1988, Cell, 54:755-64、およびBonten et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:26441-5）、これらのタンパク質を、双方が代替ＡＡＶ侵入経路に重要であるかどうかを決定するために試験した。ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４の２つのＡＡＶＲ非依存性血清型を、ＮＥＵ１ ＷＴマウスもしくはＮＥＵ１ ＫＯマウス、またはＣＴＳＡ ＷＴマウス、ＣＴＳＡヘテロ接合型（ＨＥＴ）マウス、もしくはＣＴＳＡ ＫＯマウスに由来する、以前に公開されているマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞系において試験した。ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４の両方は、ＮＥＵ１ ＫＯ細胞およびＣＴＳＡ ＫＯ細胞における形質導入の欠如を示し、ＣＴＳＡヘテロ接合型細胞における影響はほとんどまたは全く観察されなかった（図６Ａ、図６Ｂ）。
シアル酸を付着因子として使用するＡＡＶ５を含む、いくつかの他のＡＡＶ血清型を試験した。ＮＥＵ１はシアル酸グリカンの生物学に関与するが、いずれのＡＡＶＲ依存性血清型の形質導入においても違いは観察されなかった（図６Ｃ～図６Ｆ）。このことは、ＮＥＵ１およびＣＴＳＡがＡＡＶＲ非依存性の侵入にとって特異的に必要であること、ならびにｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４が同一の代替侵入経路を使用すると思われることを実証している。ヒト細胞におけるＮＥＵ１の欠如の影響を、ＮＥＵ１特異的またはＣＴＳＡ特異的なｓｇＲＮＡを様々なＣａｓ９細胞系に導入することによって、さらに評価した。完全なＮＥＵ１ノックアウト機能性を有するモノクローナル細胞系は同定されなかったが、細胞をポリクローナル状況下でピューロマイシン選択を行った後に試験した場合、ｒｈ３２．３３形質導入の大きな低下が、複数のＮＥＵ１ ｓｇＲＮＡを形質導入された細胞系において観察されたが、いずれの他の試験された血清型でも、低下は観察されなかった（図６Ｇ）。このことは、ＮＥＵ１がヒト細胞およびマウス細胞の両方においてＡＡＶＲ非依存性の侵入に必要であることを示唆している。
[実施例６]
代替経路侵入に必要なＮＥＵ１の酵素活性
ＮＥＵ１は酵素であるため、侵入スクリーニングにおいて同様に同定されたＣＴＳＡ（図５Ｃ）は、ＮＥＵ１の触媒的に活性な立体構造の維持に必要であり（D’Azzo et al., 1982, PNAS USA, 79:4535-9、およびVinogradova et al., 1998, Biochem. J., 330(Pt 2):641-50）、ＮＥＵ１の酵素活性がその機能にとって必要であるかどうかを、ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４の侵入において試験した。２つの異なるシアル酸類似体ノイラミニダーゼ阻害剤化合物であるザナミビル（von Itzstein et al., 1993, Nature, 363:418-23）およびＤＡＮＡ（Meindl et al., 1974, Virology, 58:457-63）を使用して、Ｈｕｈ７細胞に対する用量応答を行い、異なるＡＡＶＲ依存性血清型およびＡＡＶＲ非依存性血清型の侵入に対する影響を評価した。２つの異なるＡＡＶＲ依存性血清型であるＡＡＶ５およびＡｎｃ８０、ならびに２つのＡＡＶＲ非依存性血清型であるｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４を試験した。重要なことに、ＡＡＶ４およびＡＡＶ５は共にシアル酸を付着因子として使用する（Kaludov et al., 2001, J. Virol., 75:6884-93、およびWalters et al., 2001, J. Biol. Chem., 276:20610-6）がそれらのＡＡＶＲ依存性は異なるため、これらＡＡＶを調べた。
代替経路侵入に必要なＮＥＵ１の酵素活性
ＮＥＵ１は酵素であるため、侵入スクリーニングにおいて同様に同定されたＣＴＳＡ（図５Ｃ）は、ＮＥＵ１の触媒的に活性な立体構造の維持に必要であり（D’Azzo et al., 1982, PNAS USA, 79:4535-9、およびVinogradova et al., 1998, Biochem. J., 330(Pt 2):641-50）、ＮＥＵ１の酵素活性がその機能にとって必要であるかどうかを、ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４の侵入において試験した。２つの異なるシアル酸類似体ノイラミニダーゼ阻害剤化合物であるザナミビル（von Itzstein et al., 1993, Nature, 363:418-23）およびＤＡＮＡ（Meindl et al., 1974, Virology, 58:457-63）を使用して、Ｈｕｈ７細胞に対する用量応答を行い、異なるＡＡＶＲ依存性血清型およびＡＡＶＲ非依存性血清型の侵入に対する影響を評価した。２つの異なるＡＡＶＲ依存性血清型であるＡＡＶ５およびＡｎｃ８０、ならびに２つのＡＡＶＲ非依存性血清型であるｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４を試験した。重要なことに、ＡＡＶ４およびＡＡＶ５は共にシアル酸を付着因子として使用する（Kaludov et al., 2001, J. Virol., 75:6884-93、およびWalters et al., 2001, J. Biol. Chem., 276:20610-6）がそれらのＡＡＶＲ依存性は異なるため、これらＡＡＶを調べた。
簡潔に述べると、ウェル当たり１００００個の細胞を、阻害剤処理の１日前に、９６ウェルプレート内で平板培養した。細胞を、示されている濃度のザナミビル（Ｓｉｇｍａ ＳＭＬ０４９２）またはＤＡＮＡ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ２５２９２６）と２４時間インキュベートし、その後、全容積が１００μＬのＤ１０中で形質導入した。示されている場合、コントロール細胞または阻害剤処理された細胞を、無血清ＤＭＥＭ中のコレラ菌（Vibrio cholera）ＩＩＩ型（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｎ７８８５）から得た５０ｍＵ／ｍＬのノイラミニダーゼで処理し、その後、記載されているようにＡＡＶの形質導入を行った。
細胞の、短い１時間の前処理は、形質導入の低下を全く示さなかった。しかし、示された濃度のノイラミニダーゼ阻害剤ザナミビル（図７Ａ）またはＤＡＮＡ（図７Ｂ）での、Ｈｕｈ７細胞の２４時間の前処理と、その後の、１００００ＶＧ／細胞の、ＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ導入遺伝子を包んでいる示されているカプシド血清型の形質導入とは、ｒｈ３２．３３の形質導入をおよそ１０倍、大きく低下させ、また、ＡＡＶ４の侵入をわずかに低下させた（黒：ＡＡＶＲ依存性血清型、緑：ＡＡＶＲ非依存性血清型、実線：未知のグリカン付着因子、点線：付着に使用されたシアル酸）。ＡＡＶＲ非依存性の侵入の低下を示すためにノイラミニダーゼ阻害剤との長時間のプレインキュベーションが必要であることは、ＮＥＵ１活性が侵入に必要な別のタンパク質プロセスまたは細胞プロセスの調節活性であり得るという意味で、侵入の欠陥がＮＥＵ１およびＣＴＳＡの機能の影響を受け得ることを示唆している。ＡＡＶＲ依存性血清型、ＡＡＶ５、またはＡｎｃ８０のいずれも、形質導入の低下を示さず、このことは、ＮＥＵ１の活性がＡＡＶＲ非依存性血清型の侵入に特異的に必要であることを実証している。
ＮＥＵ１およびＣＴＳＡは細胞のグリコシル化状態において役割を有するため、侵入の欠陥が、付着の欠陥をもたらす細胞表面でのグリコシル化の全体的な変更に起因するものではないことを確認することが求められた。これを行うために、細胞をまずザナミビルまたはＤＡＮＡで２４時間前処理し、その後、コレラ菌（Vibrio cholera）から得た組換えノイラミニダーゼで処理して、ＮＥＵ１阻害に起因して細胞表面に蓄積している可能性がある全てのシアル酸を除去した。
示されている事前に冷蔵されたベクターを次いで、氷上の細胞に添加し、１時間インキュベートしてベクターを付着させ、未結合のベクターを、氷冷したＰＢＳを使用して洗い流し、次いで、形質導入を進行させ、ベクターの形質導入を、ルシフェラーゼアッセイを介して、異なる処理条件において、未処理コントロール細胞と比較した増加倍率によって評価した。
図７で使用されているものと同一の４つのベクターを、これらの異なる血清型の付着と侵入に対するＮＥＵ１の機能を解明するために調べた。示されている細胞系を、２４ウェルプレートで、ウェル当たり５×１０４個細胞で一晩平板培養した。細胞を氷上に１０分間置き、次いで、ウェル当たり１０９ＶＧの事前に冷蔵されたベクターをウェル当たり全容積２００μＬで添加した。ベクターを、オービタルシェーカープラットフォーム上で氷上の細胞に１時間結合させた。結合の後、細胞を、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を有する氷冷したＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ウェル当たりいずれかの１００μＬのＰＢＳを添加し、プレートを－８０℃で凍結した。結合アッセイプレートを３回の凍結解凍サイクルにかけ、その後、再懸濁し、ＣＭＶプライマー／プローブを使用して、本明細書において記載されるようにｑＰＣＲによってウイルスゲノム定量を行った。
イオジキサノール精製したベクター調製物のＤＮａｓｅ１耐性ウイルスゲノムを、ＣＭＶプロモーターを検出するプライマーおよびプローブのセットを使用して、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４３０４４４９）によって定量した。ベクターの純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって評価した。
Ｈｕｈ７細胞を２ｍＭのザナミビルまたはＤＡＮＡで２４時間前処理し、その後、コレラ菌（Vibrio cholera）から得たノイラミニダーゼで２時間処理し、その後、ＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ導入遺伝子を包んでいるｒｈ３２．３３（図８Ａ）、ＡＡＶ４（図８Ｂ）、ＡＡＶ５（図８Ｃ）、またはＡｎｃ８０（図８Ｄ）で形質導入した。図８Ｅは、示された血清型についてのＷＴ細胞系および突然変異ＭＥＦ細胞系での、細胞に結合したウイルスゲノムのｑＰＣＲの結果である。
ザナミビルまたはＤＡＮＡで処理した細胞をノイラミニダーゼ処理した後、侵入阻害の逆転は観察されず（図８Ａ）、このことは、ｒｈ３２．３３の侵入の欠陥が、細胞表面にある変更されたグリカン構造に起因するものではないことを示唆している。逆に、ＡＡＶ４およびＡＡＶ５は共に、それらの好ましいグリカン付着因子である末端シアル酸部分が失われていることから予想されたように、外因性ノイラミニダーゼでの処理の後に形質導入の大きな低下を示した（図８Ｂ、図８Ｃ）。Ａｎｃ８０は付着因子が知られておらず、ＡＡＶＲを使用するため、ＮＥＵ１阻害またはノイラミニダーゼ処理の影響は、予想された通り、Ａｎｃ８０の全ての形質導入で観察されなかった（図８Ｄ）。これらのデータは、ＮＥＵ１およびＣＴＳＡの侵入の欠陥が、細胞表面上のグリカン構造の全体的な摂動に起因するものではない可能性が高いことを示唆している。ベクターの付着を直接的にアッセイするために、ｑＰＣＲに基づく細胞結合アッセイを使用して、ＮＥＵ１およびＣＴＳＡのＷＴ ＭＥＦ細胞またはＫＯ ＭＥＦ細胞へのベクターの付着を測定した。
異なるベクターの付着における違いが実証されたが（例えば、ｒｈ３２．３３と比較してＡＡＶ４ではおよそ１００倍の付着の増大（図８Ｅ））、ＷＴ細胞とＮＥＵ１ ＫＯ細胞またはＣＴＳＡ ＫＯ細胞との主な違いは、試験したベクターのいずれでも観察されなかった。この結合アッセイは、ＮＥＵ１ ＫＯ細胞およびＣＴＳＡ ＫＯ細胞における形質導入の喪失が、細胞表面でのベクターの付着の欠陥に起因しないこと、およびこれらのタンパク質が、侵入受容体としてまたは多タンパク質侵入受容体複合体の一部として付着後の役割を有する可能性が高いことを実証している。
[実施例７]
ＧＰＲ１０８は、複数の細胞型におけるＡＡＶＲ依存性血清型およびＡＡＶＲ非依存性血清型の侵入に必要である
このスクリーニングにおいて同定された、最も顕著に強化された遺伝子は、特徴付けされていない７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体様タンパク質であるＧＰＲ１０８であった（図５Ａ、図５Ｂ）。ＧＰＲ１０８は、ＡＡＶ５以外の全ての血清型の侵入に必要であり、ヘルパーウイルスに非依存性である。
ＧＰＲ１０８は、複数の細胞型におけるＡＡＶＲ依存性血清型およびＡＡＶＲ非依存性血清型の侵入に必要である
このスクリーニングにおいて同定された、最も顕著に強化された遺伝子は、特徴付けされていない７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体様タンパク質であるＧＰＲ１０８であった（図５Ａ、図５Ｂ）。ＧＰＲ１０８は、ＡＡＶ５以外の全ての血清型の侵入に必要であり、ヘルパーウイルスに非依存性である。
興味深いことに、このタンパク質はまた、ＡＡＶＲを同定した最初のハプロイドスクリーニングにおいて潜在的な侵入因子であると同定された（Pillay et al., 2016, Nature, 530:108-12）。このことは、ＧＰＲ１０８がｒｈ３２．３３の侵入に対してだけではなく、他のＡＡＶ血清型の侵入にも重要であり得ることを示唆した。ＧＰＲ１０８ ＫＯ Ｈｕｈ７細胞系を生成し、現存の血清型のパネルおよび推定上の祖先中間体カプシドを、ルシフェラーゼアッセイを介して、ＧＰＲ１０８の利用について試験した（図９Ａ）。
ＷＴ Ｈｕｈ７細胞またはＧＰＲ１０８ ＫＯ Ｈｕｈ７細胞における全ての試験した血清型（ＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ（ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ８、ＡＡＶＡｎｃ８２、ＡＡＶ９、ＡＡＶＡｎｃ８１、ＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶ３、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ１、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５）またはＣＭＶ．ｅＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ（ＡＡＶＡｎｃ８３、ＡＡＶＡｎｃ１１０、ＡＡＶ２））への、１００００ＶＧ／細胞での、ＡＡＶ５以外のｈＡｄ５ヘルパーウイルスでの形質導入は、ＷＴ Ｈｕｈ７細胞と比較して、ＧＲＰ１０８ ＫＯ細胞において、１０～１００倍以上低下した（図９Ｂ）。
ＡＡＶＲおよびＧＰＲ１０８の両方が欠失した細胞（すなわち、ヘルパーウイルスの存在下または不存在下における、ＷＴ Ｈｕｈ７細胞と比較した、ＡＡＶＲ ＫＯ細胞、ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞、またはダブルＫＯ細胞）において、細胞がヘルパーウイルスに事前に感染していてもいなくても、全ての血清型の形質導入が完全に喪失していた（図９Ｃ）。
ＧＰＲ１０８ ＫＯでの形質導入の喪失はまた、Ｈ１ ＨｅＬａ細胞においても観察され（図１０Ａ）、このことは、この細胞侵入因子の必要性が、ＡＡＶで形質導入可能な全ての細胞系において保存されていることを示唆している。
[実施例８]
ＡＡＶの侵入は、ＧＰＲ１０８の安定なまたは一過性のトランスフェクションによって回復し得る
ＧＰＲ１０８ ＫＯの欠陥がＧＰＲ１０８タンパク質発現の喪失に起因することを確認するために、ＧＲＰ１０８のｃＤＮＡを、レンチウイルスベクターを使用して、Ｈ１ ＨｅＬａ ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞に安定的に再導入した。
ＡＡＶの侵入は、ＧＰＲ１０８の安定なまたは一過性のトランスフェクションによって回復し得る
ＧＰＲ１０８ ＫＯの欠陥がＧＰＲ１０８タンパク質発現の喪失に起因することを確認するために、ＧＲＰ１０８のｃＤＮＡを、レンチウイルスベクターを使用して、Ｈ１ ＨｅＬａ ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞に安定的に再導入した。
ＧＰＲ１０８が欠失したＨ１ ＨｅＬａ細胞を生成し、次いで、ＫＯ細胞にＧＰＲ１０８レンチウイルスを安定的に形質導入し、その後、ヘルパーウイルスを伴っておよび伴わずに、示された血清型を１００００ＶＧ／細胞で形質導入した。安定な再導入によって、全ての試験したＧＰＲ１０８依存性ベクターの形質導入を回復させることができたが、ＫＯおよび回復は、ＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶ５の全体的な形質導入レベルに影響を有さなかった（図１０Ａ）。ＧＰＲ１０８の検出に利用可能な機能的抗体はなく、そのため、ｃ末端の３×アラニン－グリシンリンカーと、その後の、ＧＰＲ１０８タンパク質発現を検出するためのｆｌａｇタグとを含有する構築物を設計した。この構築物およびｆｌａｇタグ付けされたホモログであるＧＰＲ１０７を、ｐｃＤＮＡ３．１（－）にサブクローニングし、ＷＴ Ｈｕｈ７細胞またはＧＰＲ１０８ ＫＯ Ｈｕｈ７細胞に一過性トランスフェクトし、その後、様々なＧＰＲ１０８依存性血清型および非依存性血清型を形質導入した。ｆｌａｇタグ付けされた構築物の発現を、マウス抗ｆｌａｇクローンＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ Ｆ１８０４）およびウサギ抗ベータアクチンローディングコントロール（Ａｂｃａｍ ａｂ８２２７）を使用して、全細胞溶解物のウェスタンブロットによって決定した。隣接するＮｏｔＩ制限部位およびＢａｍＨＩ制限部位を有する、Ｆｌａｇタグ付けされたＧＰＲ１０７構築物およびＧＰＲ１０８構築物は、Ｇｅｎｅｗｉｚによって合成され、その後、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）制限部位を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１（－）プラスミドに制限酵素サブクローニングした。
Ｈｕｈ７ ＷＴ細胞またはＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞に、ｆｌａｇタグ付けされたヒトまたはマウスＧＰＲ１０７またはＧＰＲ１０８をトランスフェクトし、その後、ｈＡｄ５ヘルパーウイルスの存在下で、示された血清型を形質導入した（１００００ＶＧ／細胞のＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ導入遺伝子）。形質導入は野生型レベルまで完全には回復しなかったが、全てのＧＰＲ１０８依存性血清型で、ＧＰＲ１０８のトランスフェクションからは明らかな回復の表現型が見られ、しかし、ＧＰＲ１０７のトランスフェクションから見られなかった（図１０Ｂ、図１０Ｃ）。これらのデータは、ＧＰＲ１０８タンパク質の発現が、進化的に分岐している血清型であるＡＡＶ５以外のほとんどのＡＡＶの侵入経路に必要であることを実証している。
[実施例９]
ＧＰＲ１０８の利用はマウスにおいて保存されている
ヒトおよびマウスＧＰＲ１０７およびＧＰＲ１０８は非常に類似した配列であるため、本発明者らは、ＧＰＲ１０８がマウス細胞においてＡＡＶの侵入に同様に使用されたかどうかを判定したいと考えた。マウス肝臓癌細胞系であるＨｅｐａ細胞を、ヒトＨｕｈ７細胞に類似のマウスインビトロ系として使用した。ｆｌａｇタグ付けされたヒトまたはマウスＧＰＲ１０７またはＧＰＲ１０８をトランスフェクトされたＨｅｐａ ＷＴ細胞またはＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞における、ｒｈ３２．３３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、［図１１Ａ］、ならびにＡｎｃ８０、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ９．ＰＨＰ－Ｂ［図１１Ｂ］の形質導入（１００００ＶＧ／細胞のＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ導入遺伝子）。興味深いことに、ＡＡＶ５は高レベルまでＨｅｐａ細胞に形質導入し得るが、一方、ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４などの他の血清型はそうではない（図１１Ａ）。このことは、ＧＰＲ１０８の代わりの、代替因子であるＡＡＶ５の使用が、マウスにおいて高度に保存されている可能性が高いが、しかしマウスＧＰＲ１０８は一部の血清型ではヒトＧＰＲ１０８ほどには高度に機能的ではない可能性があることを示唆している。マウスＧＰＲ１０８に対するｓｇＲＮＡをさらに使用して、Ｈｅｐａ ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞系を生成した。Ｈｅｐａ細胞を形質導入された、試験したＧＰＲ１０８依存性血清型のうち、全てが、野生型と比較して、ｈｅｐａ ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞において、形質導入の１０～１００倍の低下を示した（図１１Ｂ）。ＧＰＲ１０８または相同タンパク質ＧＰＲ１０７のＦｌａｇタグ付けされたヒトまたはマウスｃＤＮＡ（Ｅｄｇａｒ、２００７、ＤＮＡ Ｓｅｑ．、１８：２３５～４１）をｈｅｐａ ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞に再導入し、ＡＡＶの形質導入のわずかな増大が観察された（図１１Ｂ）。
ＧＰＲ１０８の利用はマウスにおいて保存されている
ヒトおよびマウスＧＰＲ１０７およびＧＰＲ１０８は非常に類似した配列であるため、本発明者らは、ＧＰＲ１０８がマウス細胞においてＡＡＶの侵入に同様に使用されたかどうかを判定したいと考えた。マウス肝臓癌細胞系であるＨｅｐａ細胞を、ヒトＨｕｈ７細胞に類似のマウスインビトロ系として使用した。ｆｌａｇタグ付けされたヒトまたはマウスＧＰＲ１０７またはＧＰＲ１０８をトランスフェクトされたＨｅｐａ ＷＴ細胞またはＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞における、ｒｈ３２．３３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、［図１１Ａ］、ならびにＡｎｃ８０、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ９．ＰＨＰ－Ｂ［図１１Ｂ］の形質導入（１００００ＶＧ／細胞のＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ導入遺伝子）。興味深いことに、ＡＡＶ５は高レベルまでＨｅｐａ細胞に形質導入し得るが、一方、ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４などの他の血清型はそうではない（図１１Ａ）。このことは、ＧＰＲ１０８の代わりの、代替因子であるＡＡＶ５の使用が、マウスにおいて高度に保存されている可能性が高いが、しかしマウスＧＰＲ１０８は一部の血清型ではヒトＧＰＲ１０８ほどには高度に機能的ではない可能性があることを示唆している。マウスＧＰＲ１０８に対するｓｇＲＮＡをさらに使用して、Ｈｅｐａ ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞系を生成した。Ｈｅｐａ細胞を形質導入された、試験したＧＰＲ１０８依存性血清型のうち、全てが、野生型と比較して、ｈｅｐａ ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞において、形質導入の１０～１００倍の低下を示した（図１１Ｂ）。ＧＰＲ１０８または相同タンパク質ＧＰＲ１０７のＦｌａｇタグ付けされたヒトまたはマウスｃＤＮＡ（Ｅｄｇａｒ、２００７、ＤＮＡ Ｓｅｑ．、１８：２３５～４１）をｈｅｐａ ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞に再導入し、ＡＡＶの形質導入のわずかな増大が観察された（図１１Ｂ）。
興味深いことに、ヒト細胞において、マウスＧＰＲ１０８は形質導入をヒトＧＰＲ１０８構築物と類似のレベルまで回復させることができる（図１０Ｂ、図１０Ｃ）。これらのヒトＧＰＲ１０８構築物は、タンパク質発現レベルが低いことに起因して形質導入をうまく回復させることができなかった可能性がある。したがって、これらの構築物の各々の発現を、ヒト細胞およびマウス細胞において、トランスフェクトされた細胞の溶解物からの抗ｆｌａｇウェスタンブロットを使用して評価した。
ＧＰＲ１０７およびＧＰＲ１０８は共に、７つの膜貫通ドメインを有し、大きな内腔側Ｎ末端および短い細胞質側Ｃ末端を有することが予測される、あまり特徴付けされていないタンパク質である（図１２Ａ、図１２Ｂ）。ＧＰＲ１０７は、その機能に必要な、内腔側Ｎ末端ドメインにおけるジスルフィド結合およびフーリン切断部位の両方を有することが示されており（Tafesse et al., 2014, J. Biol. Chem., 289:24005-18）、アラニン－グリシンリンカーおよびｆｌａｇタグもまた示されている（図１２Ａ）。ＧＰＲ１０８のフーリン切断によって、およそ２８ｋＤａおよび３４ｋＤａの２つのペプチド断片が生じ、このうちの後者は、Ｈｕｈ７細胞において一過性トランスフェクションの後に抗ｆｌａｇウェスタンブロットによって視覚化されている（図１２Ｃ）。ベータアクチンローディングコントロールは（図１２Ｄ）に示されている。これらのデータは、ＧＰＲ１０８およびＧＰＲ１０７が、予想された通り発現し、翻訳後修飾を受けていることを実証している。
[実施例１０]
ＧＰＲ１０８はＡＡＶの付着を促進しない
ＡＡＶの形質導入に関与する因子についての現在の理解は主に、ＡＡＶの付着に関与する因子の周辺にあり、細胞内のＡＡＶ侵入受容体の存在およびメカニズムについてはほとんど分かっていない。したがって、本発明者らは、ＧＰＲ１０８がＡＡＶの付着または侵入経路のさらに下流において役割を有しているかどうかを試験したいと考えた。指向性または結合特性を変更されている２つの異なるカプシド表面突然変異体を、それらの親ＡＡＶカプシドと共に、Ｈｕｈ７ ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞およびＨ１ ＨｅＬａ ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞において試験した。
ＧＰＲ１０８はＡＡＶの付着を促進しない
ＡＡＶの形質導入に関与する因子についての現在の理解は主に、ＡＡＶの付着に関与する因子の周辺にあり、細胞内のＡＡＶ侵入受容体の存在およびメカニズムについてはほとんど分かっていない。したがって、本発明者らは、ＧＰＲ１０８がＡＡＶの付着または侵入経路のさらに下流において役割を有しているかどうかを試験したいと考えた。指向性または結合特性を変更されている２つの異なるカプシド表面突然変異体を、それらの親ＡＡＶカプシドと共に、Ｈｕｈ７ ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞およびＨ１ ＨｅＬａ ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞において試験した。
まず、ルシフェラーゼアッセイは、ＷＴ細胞またはＧＰＲ１０８ ＫＯ Ｈｕｈ７細胞またはＧＰＲ１０８ ＫＯ Ｈ１ ＨｅＬａ細胞に形質導入された、ＡＡＶ９のペプチド挿入バリアントであるＡＡＶ９．ＰＨＰ－Ｂ（Deverman et al., 2016, Nat. Biotechnol., 34:204-9）が、親カプシドであるＡＡＶ９と同様にＧＰＲ１０８に依存性であったことを実証した（図１３Ａ）。さらに、主要なＡＡＶ２付着因子であるヘパリン硫酸塩に結合し得る、点突然変異を有するＡＡＶ２バリアント（Vandenberghe et al., 2006, Nat. Med., 12:967-71）を試験した。ＨＳＰＧ－バリアント（グリカン結合欠損型ＡＡＶ２ＨＳＰＧ－または親カプシドであるＡＡＶ２）は、試験した全ての細胞系（ＷＴ細胞またはＧＰＲ１０８ ＫＯ Ｈｕｈ７細胞またはＧＰＲ１０８ ＫＯ Ｈ１ ＨｅＬａ細胞）において形質導入の全体的な低下を有していたが（図１３Ｂ）、ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞の形質導入は、それらの野生型対応物と比較して１０～１００倍低下し、このことは、ＧＰＲ１０８の利用がＡＡＶの付着に依存していないことを示唆している。これらのデータはＧＰＲ１０８が付着を促進しないことを示唆しているが、このことを直接試験することが望まれた。
したがって、結合アッセイを記載されているように利用して、ＧＰＲ１０８依存性血清型および非依存性血清型の付着を評価した。Ｈｕｈ７ ＷＴ細胞およびＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞を試験し、また、ＡＡＶＲは原形質膜で役割を有することが以前に示唆されていたため（Pillay et al., 2016, Nature, 530:108-12）、ＡＡＶＲ ＫＯ細胞およびダブルＫＯ細胞も試験した（図１３Ｃ）。試験した全てのベクターで、ノックアウト細胞系のいずれにおいても、細胞当たりの結合したウイルスゲノムの数に違いは見られなかったが、異なる血清型での結合したウイルスゲノムの数の違いは検出され、このことは、ＧＰＲ１０８が付着を促進していないことを実証している。
[実施例１１]
ＧＰＲ１０８の非依存性は伝わり得、ＡＡＶカプシドのホスホリパーゼ含有ＶＰ１ドメインに依存性である
侵入のためのＧＰＲ１０８の機能、およびいかにしてこれがカプシドを係合するかをさらに理解するために、キメラカプシドを使用して、ＧＰＲ１０８の利用を指示するカプシドドメインを同定した。ＡＡＶ５およびＡＡＶ２はＧＰＲ１０８の利用が異なるため、これら２つ血清型の間で生成されたキメラを使用した。類似の点突然変異を有するおよび有さない相反性キメラのセットを設計して、カプシドのどの領域がＧＰＲ１０８利用を指示するかを決定した（図１４Ａ）。これらのキメラを次いで、示されているＷＴカプシドまたはキメラカプシドで（１００μＬの粗ベクター調製物と、ｈＡｄ５ヘルパーウイルス、ＣＭＶ．ｅＧＰＦ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ導入遺伝子）、Ｈｕｈ７ ＷＴ細胞、ＡＡＶＲ ＫＯ細胞、ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞、またはダブルＫＯ細胞において試験した。ＡＡＶ２およびＡＡＶ５は共にＡＡＶＲを必要とするため、形質導入の予想された喪失が、ＡＡＶＲ ＫＯ細胞系およびダブルＫＯ細胞系において、全ての試験した血清型で観察された（図１４Ｂ）。興味深いことに、ＡＡＶ５のＶＰ１固有の領域を有するキメラの両方が、ＧＰＲ１０８ ＫＯ Ｈｕｈ７細胞をＷＴ細胞と類似のレベルまで形質導入し得た。残基５８１がＧＰＲ１０８利用において主要な役割を有することは分からなかったが、残基５８１は、全体的な形質導入レベルに対してわずかな影響を有していた。これらの実験は、ＡＡＶのＶＰ１固有の領域がＧＰＲ１０８の利用を指示すること、およびこの細胞機能性が他のＡＡＶ血清型に伝わり得ることを実証している。
ＧＰＲ１０８の非依存性は伝わり得、ＡＡＶカプシドのホスホリパーゼ含有ＶＰ１ドメインに依存性である
侵入のためのＧＰＲ１０８の機能、およびいかにしてこれがカプシドを係合するかをさらに理解するために、キメラカプシドを使用して、ＧＰＲ１０８の利用を指示するカプシドドメインを同定した。ＡＡＶ５およびＡＡＶ２はＧＰＲ１０８の利用が異なるため、これら２つ血清型の間で生成されたキメラを使用した。類似の点突然変異を有するおよび有さない相反性キメラのセットを設計して、カプシドのどの領域がＧＰＲ１０８利用を指示するかを決定した（図１４Ａ）。これらのキメラを次いで、示されているＷＴカプシドまたはキメラカプシドで（１００μＬの粗ベクター調製物と、ｈＡｄ５ヘルパーウイルス、ＣＭＶ．ｅＧＰＦ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ導入遺伝子）、Ｈｕｈ７ ＷＴ細胞、ＡＡＶＲ ＫＯ細胞、ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞、またはダブルＫＯ細胞において試験した。ＡＡＶ２およびＡＡＶ５は共にＡＡＶＲを必要とするため、形質導入の予想された喪失が、ＡＡＶＲ ＫＯ細胞系およびダブルＫＯ細胞系において、全ての試験した血清型で観察された（図１４Ｂ）。興味深いことに、ＡＡＶ５のＶＰ１固有の領域を有するキメラの両方が、ＧＰＲ１０８ ＫＯ Ｈｕｈ７細胞をＷＴ細胞と類似のレベルまで形質導入し得た。残基５８１がＧＰＲ１０８利用において主要な役割を有することは分からなかったが、残基５８１は、全体的な形質導入レベルに対してわずかな影響を有していた。これらの実験は、ＡＡＶのＶＰ１固有の領域がＧＰＲ１０８の利用を指示すること、およびこの細胞機能性が他のＡＡＶ血清型に伝わり得ることを実証している。
[実施例１２]
ＧＰＲ１０８ドメインのさらに精度の高いマッピング
ドメインスワッピング実験を行って、ＧＰＲ１０８ドメインをマッピングした。具体的には、ＡＡＶ５およびＡＡＶ２のＶＰ１内の示されているドメインを交換して、示されているキメラＡＡＶを生産した（図１５Ａ）。ＧＰＲ１０８依存性を付与すると以前に同定されている配列を、保存領域を破壊点として使用して３つの部分に分割してある、３つの異なるカプシドキメラを合成した。ＡＡＶ５カプシドのＧＰＲ１０８依存性領域をＡＡＶ２カプシドにスワッピングし、ベクターを生産した。
ＧＰＲ１０８ドメインのさらに精度の高いマッピング
ドメインスワッピング実験を行って、ＧＰＲ１０８ドメインをマッピングした。具体的には、ＡＡＶ５およびＡＡＶ２のＶＰ１内の示されているドメインを交換して、示されているキメラＡＡＶを生産した（図１５Ａ）。ＧＰＲ１０８依存性を付与すると以前に同定されている配列を、保存領域を破壊点として使用して３つの部分に分割してある、３つの異なるカプシドキメラを合成した。ＡＡＶ５カプシドのＧＰＲ１０８依存性領域をＡＡＶ２カプシドにスワッピングし、ベクターを生産した。
Ｈｕｈ７細胞に、野生型ＡＡＶ（すなわち、ＡＡＶ２もしくはＡＡＶ５）、または、本明細書において記載され、以下に示される、ＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ導入遺伝子を発現するキメラＡＡＶ（すなわち、ＡＡＶ５－２－２．２（配列番号５）、ＡＡＶ２－５－２．２（配列番号６）、もしくはＡＡＶ２－２－５．２（配列番号７））の等容量の粗ウイルス調製物で形質導入した。形質転換されたＨｕｈ７細胞におけるルシフェラーゼの量（ＲＬＵ／ｓ）を、形質導入の４８時間後に決定し、ＧＰＲ１０８がノックアウトされているＨｕｈ７細胞系（Ｈｕｈ７ ＧＰＲ１０８ ＫＯ）におけるルシフェラーゼ発現と比較した。結果を図１５Ｂに示す（５回の反復の平均±ＳＥＭ）。
Ｈｕｈ７およびＨｕｈ７ ＧＰＲ１０８ ＫＯにおける形質導入の分析は、新規なカプシドが野生型細胞を類似のレベルで形質導入し得ることを示したが、ＧＰＲ１０８ ＫＯ細胞を形質導入し得た唯一のキメラは、ＡＡＶ５の最初の４１アミノ酸を有するものであった。
ＡＡＶ２のカプシド配列の関連する領域とＡＡＶ５のカプシド配列の関連する領域との間のアラインメントを作成した。
ＧＰＲ１０８依存性に関与する領域を、ＡＡＶ５ならびにいくつかのＧＰＲ１０８依存性血清型（すなわち、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ３、およびＡＡＶ９）のアミノ酸配列を含む、いくつかの異なるＡＡＶからアラインした（図１６）。図１６に示すように、このＮ末端配列はＧＰＲ１０８依存性血清型の間で高度に保存されており、一方、ＡＡＶ５は、３つの主な領域が異なっている（囲まれている部分）。これらの領域はＧＰＲ１０８に対する依存性に関与している可能性が高く、ＧＰＲ１０８非依存性コンセンサス配列（配列番号１）およびＧＰＲ１０８依存性コンセンサス配列（配列番号２）を生じさせるために使用された。したがって、ＧＰＲ１０８非依存性のＡＡＶは、以下のＶＰ１コンセンサス配列を含み：
ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）
（式中、Ｘ１～１２の各々は任意のアミノ酸であり得る）、また
ＧＰＲ１０８依存性のＡＡＶは、以下のＶＰ１コンセンサス配列を含む：
ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）
（式中、Ｘ１～１２の各々は任意のアミノ酸であり得る）。
ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）
（式中、Ｘ１～１２の各々は任意のアミノ酸であり得る）、また
ＧＰＲ１０８依存性のＡＡＶは、以下のＶＰ１コンセンサス配列を含む：
ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）
（式中、Ｘ１～１２の各々は任意のアミノ酸であり得る）。
[実施例１３]
安定性および性能の実験
ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびこれら２つのキメラの安定性および性能を、インビボおよびインビトロで調べた。
安定性および性能の実験
ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびこれら２つのキメラの安定性および性能を、インビボおよびインビトロで調べた。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（群当たり５頭の動物）を、ＣＭＶ－ＥＧＰＦ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ導入遺伝子を有する１ｅ１１ｇｃ／マウスのＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ５．２、またはＰＢＳ（コントロール）で処理した。ルシフェラーゼの発現を、形質転換の後６週間にわたり、マウスにおいて調べた（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）。図１７Ａは、これらの実験の結果を示す（平均±ＳＥＭ）。
野生型ＭＥＦ細胞（ＷＴ ＭＥＦ）、またはＧＰＲ１０８ ＫＯマウスに由来するＭＥＦ細胞（ＣＰＲ１０８ ＫＯ ＭＥＦ）に、ＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ導入遺伝子を有するＡＡＶ２ウイルス、ＡＡＶ５ウイルス、ＡＡＶ２．５ウイルス、またはＡＡＶ５．２ウイルスで形質導入した。細胞を２００ｐｆｕ／細胞のＡｄ５で２時間処理し、その後、ＡＡＶに感染させた（ＭＯＩ＝１ｅ４）。ルシフェラーゼの量（ＲＬＵ／ｓ）を形質導入の４８時間後に調べた。図１７Ｂは、３つの独立した実験の結果を示す（平均±ＳＥＭ）。
Ｈｕｈ７、Ｈｕｈ７ ＡＡＶＲ ＫＯ、Ｈｕｈ７ ＧＰＲ１０８ ＫＯ、またはＨｕｈ７ダブルＫＯに、ＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ導入遺伝子を有するＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２．５、またはＡＡＶ５．２ウイルスで形質導入した。細胞のセットを２００ｐｆｕ／細胞のＡｄ５で２時間処理し、その後、ＡＡＶに感染させ（ＭＯＩ＝１ｅ４）、一方、残りは、ＡＡＶで直接処理した。ルシフェラーゼの量（ＲＬＵ／ｓ）を形質導入の４８時間後に測定した。図１７Ｃは、３つの独立した実験の結果を示す（平均±ＳＥＭ）。
これらの結果は、ＧＰＲ１０８依存性を変更するＶＰ１ポリペプチドを使用して生産されたＡＡＶが、マウスＭＥＦをインビトロでおよびマウス組織をインビボで親野生型ベクターと類似のレベルで形質導入し得る、安定な構造体であることを実証している。
[実施例１４]
ＧＰＲ１０８のインビボでの必要性
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＧＰＲ１０８ ＫＯマウス（群当たり３頭の動物）を、ＣＭＶ－ルシフェラーゼ導入遺伝子を有する１ｅ１１ｇｃ／マウスのＡＡＶ８ウイルス、ＡＡＶｒｈ３２．３３ウイルス、ＡＡＶ５ウイルス（またはコントロールとしてのＰＢＳ）で形質導入した。ルシフェラーゼの量を、形質導入後８週間の期間にわたり測定した（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ、平均±ＳＥＭ）（図１８Ａ）。各群の代表のマウスを、示されているベクターでの形質導入の１４日後に画像化した（図１８Ｂ）。図１８Ａおよび図１８Ｂで示す結果は、ＧＰＲ１０８がＡＡＶによるインビボでの形質導入に必要な侵入因子であることを実証している。
ＧＰＲ１０８のインビボでの必要性
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＧＰＲ１０８ ＫＯマウス（群当たり３頭の動物）を、ＣＭＶ－ルシフェラーゼ導入遺伝子を有する１ｅ１１ｇｃ／マウスのＡＡＶ８ウイルス、ＡＡＶｒｈ３２．３３ウイルス、ＡＡＶ５ウイルス（またはコントロールとしてのＰＢＳ）で形質導入した。ルシフェラーゼの量を、形質導入後８週間の期間にわたり測定した（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ、平均±ＳＥＭ）（図１８Ａ）。各群の代表のマウスを、示されているベクターでの形質導入の１４日後に画像化した（図１８Ｂ）。図１８Ａおよび図１８Ｂで示す結果は、ＧＰＲ１０８がＡＡＶによるインビボでの形質導入に必要な侵入因子であることを実証している。
他の実施形態
方法および組成物を多くの異なる態様と組み合わせて本明細書において記載してきたが、様々な態様についての先の記載は説明することを意図したものであり、方法および組成物の範囲を限定することを意図したものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
方法および組成物を多くの異なる態様と組み合わせて本明細書において記載してきたが、様々な態様についての先の記載は説明することを意図したものであり、方法および組成物の範囲を限定することを意図したものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本開示は、開示される方法および組成物に使用することができる、開示される方法および組成物と組み合わせて使用することができる、開示される方法および組成物の調製において使用することができる、ならびに開示される方法および組成物の産物である、方法および組成物を特徴付ける。これらのおよび他の材料は本明細書において開示されており、これらの方法および組成物の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されていることが理解される。すなわち、これらの組成物および方法のそれぞれの様々な個々のおよび集合的な組み合わせおよび順列についての具体的な言及は明確に開示されていないかもしれないが、それぞれが具体的に検討され、本明細書において記載される。例えば、特定の組成物または特定の方法が開示され、論じられていれば、別段のことが具体的に示されていない限り、いくつかの組成物または方法が論じられており、組成物および方法の各組み合わせおよび順列が具体的に検討されている。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた具体的に検討され、開示される。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載の発明を列挙する。
［発明１］
細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を調節する方法であって、遺伝子改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を前記細胞に導入するステップを含み、前記ＡＡＶのカプシドが、異種ＶＰ１ポリペプチド配列を含むように遺伝子改変されており、前記異種ＶＰ１ポリペプチド配列が、前記細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要とするまたは形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要としない、前記方法。
［発明２］
前記異種ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分が、配列番号１で示される配列を含む、発明１に記載の方法。
［発明３］
前記異種ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分が、配列番号２で示される配列を含む、発明１に記載の方法。
［発明４］
前記異種ＶＰ１ポリペプチドが、ＡＡＶ５ ＶＰ１タンパク質またはその一部分のアミノ酸配列を含む、発明１に記載の方法。
［発明５］
前記異種ＶＰ１ポリペプチドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ－Ｂ、８ＢＰＶ２、または７Ｍ８のＶＰ１タンパク質またはその一部分のアミノ酸配列を含む、発明１に記載の方法。
［発明６］
前記異種ＶＰ１ポリペプチド配列が、形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要とする、発明１に記載の方法。
［発明７］
前記異種ＶＰ１ポリペプチド配列が、前記細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要としない、発明１に記載の方法。
［発明８］
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の細胞侵入を改変する方法であって、
ＡＡＶをＧＰＲ１０８非依存性となるように遺伝子操作するステップであって、前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶは、配列ＭＸ １ Ｘ ２ ＶＤＨＰＸ ３ Ｘ ４ Ｘ ５ Ｘ ６ Ｘ ７ ＥＶＧＸ ８ Ｘ ９ Ｘ １０ Ｘ １１ Ｘ １２ ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ １～１２ の各々は任意のアミノ酸である、ステップ、または
ＡＡＶをＧＰＲ１０８依存性となるように遺伝子操作するステップであって、前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶは、配列ＭＸ １ Ｘ ２ ＤＧＹＬＸ ３ Ｘ ４ Ｘ ５ Ｘ ６ Ｘ ７ Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ ８ Ｘ ９ Ｘ １０ Ｘ １１ Ｘ １２ ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ １～１２ の各々は任意のアミノ酸である、ステップ
を含み、それによって前記ＡＡＶの細胞侵入を改変する、前記方法。
［発明９］
前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶが、配列ＭＸ １ Ｘ ２ ＶＤＨＰＸ ３ Ｘ ４ Ｘ ５ Ｘ ６ Ｘ ７ ＥＶＧＸ ８ Ｘ ９ Ｘ １０ Ｘ １１ Ｘ １２ ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ １ がＳもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ ２ がＦもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ ３ がＰであり、Ｘ ４ がＤであり、Ｘ ５ がＷであり、Ｘ ６ がＬであり、Ｘ ７ がＥであり、Ｘ ８ がＥであり、Ｘ ９ がＧであり、Ｘ １０ がＬもしくはＩもしくはＶであり、Ｘ １１ がＲであり、かつ／またはＸ １２ がＥもしくはＱである、発明８に記載の方法。
［発明１０］
前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶが、配列ＭＸ １ Ｘ ２ ＤＧＹＬＸ ３ Ｘ ４ Ｘ ５ Ｘ ６ Ｘ ７ Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ ８ Ｘ ９ Ｘ １０ Ｘ １１ Ｘ １２ ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ １ がＳもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ ２ がＦもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ ３ がＰであり、Ｘ ４ がＤであり、Ｘ ５ がＷであり、Ｘ ６ がＬであり、Ｘ ７ がＥであり、Ｘ ８ がＥであり、Ｘ ９ がＧであり、Ｘ １０ がＬもしくはＩもしくはＶであり、Ｘ １１ がＲであり、かつ／またはＸ １２ がＥもしくはＱである、発明８に記載の方法。
［発明１１］
前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶが、ＡＡＶ５ ＶＰ１タンパク質に由来するＶＰ１ポリペプチド配列を含む、発明８に記載の方法。
［発明１２］
前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ－Ｂ、８ＢＰＶ２、または７Ｍ８のＶＰ１タンパク質に由来するＶＰ１ポリペプチド配列を含む、発明８に記載の方法。
［発明１３］
細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を増大させる方法であって、前記細胞を前記細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を増大させる化合物と接触させるステップを含み、それによって前記細胞内への前記ＡＡＶの形質導入効率を増大させる、前記方法。
［発明１４］
前記細胞におけるＧＰＲ１０８の発現を増大させる前記化合物が、ＧＰＲ１０８導入遺伝子を含む発現構築物である、発明１３に記載の方法。
［発明１５］
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ－Ｂ、８ＢＰＶ２、および７Ｍ８からなる群から選択される、発明１３に記載の方法。
［発明１６］
前記ＡＡＶが、遺伝子操作されたＡＡＶである、発明１３に記載の方法。
［発明１７］
細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を低下させる方法であって、前記細胞を前記細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を低下させる化合物と接触させるステップを含み、それによって前記細胞内への前記ＡＡＶの形質導入効率を低下させる、前記方法。
［発明１８］
前記細胞におけるＧＰＲ１０８の発現を低下させる前記化合物が、干渉ＲＮＡ分子である、発明１７に記載の方法。
［発明１９］
前記干渉ＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡｉからなる群から選択される、発明１８に記載の方法。
［発明２０］
前記細胞がインビボである、発明１～１９のいずれか一つに記載の方法。
［発明２１］
前記細胞が、肝細胞、腎臓細胞、心臓細胞、肺細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨髄細胞（造血幹細胞を含む）である、発明１～１９のいずれか一つに記載の方法。
［発明２２］
細胞内への治療作用物質の取り込みを増大させる方法であって、前記細胞をＡＡＶ ＶＰ１ポリペプチドに連結した前記治療作用物質と接触させるステップを含み、前記ＶＰ１ポリペプチドが、配列ＭＸ １ Ｘ ２ ＶＤＨＰＸ ３ Ｘ ４ Ｘ ５ Ｘ ６ Ｘ ７ ＥＶＧＸ ８ Ｘ ９ Ｘ １０ Ｘ １１ Ｘ １２ ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を含み、配列中、Ｘ １～１２ の各々が任意のアミノ酸である、前記方法。
［発明２３］
前記治療作用物質が、タンパク質またはタンパク質複合体である、発明２２に記載の方法。
［発明２４］
前記治療作用物質が、ＧＰＲ１０８に結合する結合因子にさらに連結している、発明２２に記載の方法。
［発明２５］
ＧＰＲ１０８に結合する前記結合因子が、抗体、アプタマー、および抗体ドメインからなる群から選択される、発明２４に記載の方法。
［発明２６］
配列番号１または配列番号２を含むＶＰ１ポリペプチドに連結している治療作用物質を含む組成物。
［発明２７］
前記治療作用物質が、タンパク質またはタンパク質複合体である、発明２６に記載の組成物。
［発明２８］
配列番号１を含む異種ＶＰ１配列を含むＡＡＶカプシド配列。
［発明２９］
前記異種ＶＰ１配列が配列番号１８を含む、発明２８に記載のＡＡＶカプシド配列。
［発明３０］
配列番号２を含む異種ＶＰ１配列を含むＡＡＶカプシド配列。
［発明３１］
前記異種ＶＰ１配列が配列番号１９を含む、発明３０に記載のＡＡＶカプシド配列。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載の発明を列挙する。
［発明１］
細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を調節する方法であって、遺伝子改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を前記細胞に導入するステップを含み、前記ＡＡＶのカプシドが、異種ＶＰ１ポリペプチド配列を含むように遺伝子改変されており、前記異種ＶＰ１ポリペプチド配列が、前記細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要とするまたは形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要としない、前記方法。
［発明２］
前記異種ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分が、配列番号１で示される配列を含む、発明１に記載の方法。
［発明３］
前記異種ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分が、配列番号２で示される配列を含む、発明１に記載の方法。
［発明４］
前記異種ＶＰ１ポリペプチドが、ＡＡＶ５ ＶＰ１タンパク質またはその一部分のアミノ酸配列を含む、発明１に記載の方法。
［発明５］
前記異種ＶＰ１ポリペプチドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ－Ｂ、８ＢＰＶ２、または７Ｍ８のＶＰ１タンパク質またはその一部分のアミノ酸配列を含む、発明１に記載の方法。
［発明６］
前記異種ＶＰ１ポリペプチド配列が、形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要とする、発明１に記載の方法。
［発明７］
前記異種ＶＰ１ポリペプチド配列が、前記細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要としない、発明１に記載の方法。
［発明８］
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の細胞侵入を改変する方法であって、
ＡＡＶをＧＰＲ１０８非依存性となるように遺伝子操作するステップであって、前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶは、配列ＭＸ １ Ｘ ２ ＶＤＨＰＸ ３ Ｘ ４ Ｘ ５ Ｘ ６ Ｘ ７ ＥＶＧＸ ８ Ｘ ９ Ｘ １０ Ｘ １１ Ｘ １２ ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ １～１２ の各々は任意のアミノ酸である、ステップ、または
ＡＡＶをＧＰＲ１０８依存性となるように遺伝子操作するステップであって、前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶは、配列ＭＸ １ Ｘ ２ ＤＧＹＬＸ ３ Ｘ ４ Ｘ ５ Ｘ ６ Ｘ ７ Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ ８ Ｘ ９ Ｘ １０ Ｘ １１ Ｘ １２ ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ １～１２ の各々は任意のアミノ酸である、ステップ
を含み、それによって前記ＡＡＶの細胞侵入を改変する、前記方法。
［発明９］
前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶが、配列ＭＸ １ Ｘ ２ ＶＤＨＰＸ ３ Ｘ ４ Ｘ ５ Ｘ ６ Ｘ ７ ＥＶＧＸ ８ Ｘ ９ Ｘ １０ Ｘ １１ Ｘ １２ ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ １ がＳもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ ２ がＦもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ ３ がＰであり、Ｘ ４ がＤであり、Ｘ ５ がＷであり、Ｘ ６ がＬであり、Ｘ ７ がＥであり、Ｘ ８ がＥであり、Ｘ ９ がＧであり、Ｘ １０ がＬもしくはＩもしくはＶであり、Ｘ １１ がＲであり、かつ／またはＸ １２ がＥもしくはＱである、発明８に記載の方法。
［発明１０］
前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶが、配列ＭＸ １ Ｘ ２ ＤＧＹＬＸ ３ Ｘ ４ Ｘ ５ Ｘ ６ Ｘ ７ Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ ８ Ｘ ９ Ｘ １０ Ｘ １１ Ｘ １２ ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ １ がＳもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ ２ がＦもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ ３ がＰであり、Ｘ ４ がＤであり、Ｘ ５ がＷであり、Ｘ ６ がＬであり、Ｘ ７ がＥであり、Ｘ ８ がＥであり、Ｘ ９ がＧであり、Ｘ １０ がＬもしくはＩもしくはＶであり、Ｘ １１ がＲであり、かつ／またはＸ １２ がＥもしくはＱである、発明８に記載の方法。
［発明１１］
前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶが、ＡＡＶ５ ＶＰ１タンパク質に由来するＶＰ１ポリペプチド配列を含む、発明８に記載の方法。
［発明１２］
前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ－Ｂ、８ＢＰＶ２、または７Ｍ８のＶＰ１タンパク質に由来するＶＰ１ポリペプチド配列を含む、発明８に記載の方法。
［発明１３］
細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を増大させる方法であって、前記細胞を前記細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を増大させる化合物と接触させるステップを含み、それによって前記細胞内への前記ＡＡＶの形質導入効率を増大させる、前記方法。
［発明１４］
前記細胞におけるＧＰＲ１０８の発現を増大させる前記化合物が、ＧＰＲ１０８導入遺伝子を含む発現構築物である、発明１３に記載の方法。
［発明１５］
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ－Ｂ、８ＢＰＶ２、および７Ｍ８からなる群から選択される、発明１３に記載の方法。
［発明１６］
前記ＡＡＶが、遺伝子操作されたＡＡＶである、発明１３に記載の方法。
［発明１７］
細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を低下させる方法であって、前記細胞を前記細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を低下させる化合物と接触させるステップを含み、それによって前記細胞内への前記ＡＡＶの形質導入効率を低下させる、前記方法。
［発明１８］
前記細胞におけるＧＰＲ１０８の発現を低下させる前記化合物が、干渉ＲＮＡ分子である、発明１７に記載の方法。
［発明１９］
前記干渉ＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡｉからなる群から選択される、発明１８に記載の方法。
［発明２０］
前記細胞がインビボである、発明１～１９のいずれか一つに記載の方法。
［発明２１］
前記細胞が、肝細胞、腎臓細胞、心臓細胞、肺細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨髄細胞（造血幹細胞を含む）である、発明１～１９のいずれか一つに記載の方法。
［発明２２］
細胞内への治療作用物質の取り込みを増大させる方法であって、前記細胞をＡＡＶ ＶＰ１ポリペプチドに連結した前記治療作用物質と接触させるステップを含み、前記ＶＰ１ポリペプチドが、配列ＭＸ １ Ｘ ２ ＶＤＨＰＸ ３ Ｘ ４ Ｘ ５ Ｘ ６ Ｘ ７ ＥＶＧＸ ８ Ｘ ９ Ｘ １０ Ｘ １１ Ｘ １２ ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を含み、配列中、Ｘ １～１２ の各々が任意のアミノ酸である、前記方法。
［発明２３］
前記治療作用物質が、タンパク質またはタンパク質複合体である、発明２２に記載の方法。
［発明２４］
前記治療作用物質が、ＧＰＲ１０８に結合する結合因子にさらに連結している、発明２２に記載の方法。
［発明２５］
ＧＰＲ１０８に結合する前記結合因子が、抗体、アプタマー、および抗体ドメインからなる群から選択される、発明２４に記載の方法。
［発明２６］
配列番号１または配列番号２を含むＶＰ１ポリペプチドに連結している治療作用物質を含む組成物。
［発明２７］
前記治療作用物質が、タンパク質またはタンパク質複合体である、発明２６に記載の組成物。
［発明２８］
配列番号１を含む異種ＶＰ１配列を含むＡＡＶカプシド配列。
［発明２９］
前記異種ＶＰ１配列が配列番号１８を含む、発明２８に記載のＡＡＶカプシド配列。
［発明３０］
配列番号２を含む異種ＶＰ１配列を含むＡＡＶカプシド配列。
［発明３１］
前記異種ＶＰ１配列が配列番号１９を含む、発明３０に記載のＡＡＶカプシド配列。
Claims (7)
- 細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を調節するインビトロ方法であって、遺伝子改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を前記細胞に導入するステップを含み、前記ＡＡＶのカプシドが、異種ＶＰ１ポリペプチド配列を含むように遺伝子改変されており、前記異種ＶＰ１ポリペプチド配列は、配列番号１、８又は１８で示される配列であり、かつ、ＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶが前記細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８の存在を必要としないようにするものである、前記方法。
- 前記異種ＶＰ１ポリペプチドが、配列番号１で示される配列を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記異種ＶＰ１ポリペプチドが、ＡＡＶ５ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記異種ＶＰ１ポリペプチドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ－Ｂ、８ＢＰＶ２、または７Ｍ８のＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
- アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の細胞侵入を改変するインビトロ方法であって、
ＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶのＶＰ１ポリペプチド中のＮ末端アミノ酸を、配列番号１、８又は１８で示される配列で置換することにより、前記ＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶをＧＰＲ１０８非依存性となるように遺伝子操作するステップを含み、それによって前記ＡＡＶの細胞侵入を改変する、
前記方法。 - 前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶが、配列ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ１がＳもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ２がＦもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＤであり、Ｘ５がＷであり、Ｘ６がＬであり、Ｘ７がＥであり、Ｘ８がＥであり、Ｘ９がＧであり、Ｘ１０がＬもしくはＩもしくはＶであり、Ｘ１１がＲであり、かつ／またはＸ１２がＥもしくはＱである、請求項５に記載の方法。
- 前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶが、ＡＡＶ５ ＶＰ１タンパク質に由来するＶＰ１ポリペプチド配列を含む、請求項５に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862720859P | 2018-08-21 | 2018-08-21 | |
| US62/720,859 | 2018-08-21 | ||
| PCT/US2019/047546 WO2020041498A1 (en) | 2018-08-21 | 2019-08-21 | Compositions and methods for modulating transduction efficiency of adeno-associated viruses |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021533795A JP2021533795A (ja) | 2021-12-09 |
| JPWO2020041498A5 JPWO2020041498A5 (ja) | 2022-07-25 |
| JP7451497B2 true JP7451497B2 (ja) | 2024-03-18 |
Family
ID=69591093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021509223A Active JP7451497B2 (ja) | 2018-08-21 | 2019-08-21 | アデノ随伴ウイルスの形質導入効率を調節するための組成物および方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210317478A1 (ja) |
| EP (1) | EP3841109A4 (ja) |
| JP (1) | JP7451497B2 (ja) |
| AU (1) | AU2019325332A1 (ja) |
| WO (1) | WO2020041498A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7438981B2 (ja) | 2018-05-11 | 2024-02-27 | マサチューセッツ アイ アンド イヤー インファーマリー | アデノ随伴ウイルスの肝臓特異的向性 |
| EP4087391A1 (en) | 2020-04-09 | 2022-11-16 | University of Sheffield | Gene therapy treatment |
| WO2022103826A1 (en) * | 2020-11-10 | 2022-05-19 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositons and methods for in vivo gene transfer |
| GB202215198D0 (en) | 2022-10-14 | 2022-11-30 | Univ Sheffield | Gene therapy treatment |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005072364A3 (en) | 2004-01-27 | 2005-12-29 | Univ Florida | A modified baculovirus expression system for production of pseudotyped raav vector |
| US20150376240A1 (en) | 2013-02-08 | 2015-12-31 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Enhanced aav-mediated gene transfer for retinal therapies |
| WO2017083423A1 (en) | 2015-11-10 | 2017-05-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for modulating aav infection |
| WO2018022608A2 (en) | 2016-07-26 | 2018-02-01 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Novel adeno-associated virus capsid proteins |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6855314B1 (en) * | 2000-03-22 | 2005-02-15 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | AAV5 vector for transducing brain cells and lung cells |
| CA2467959C (en) * | 2001-11-09 | 2009-03-10 | Robert M. Kotin | Production of adeno-associated virus in insect cells |
| SI1496944T1 (sl) * | 2002-05-01 | 2009-02-28 | Univ Florida | Izboljšani sistemi ekspresije RAAV za genetsko modifikacijo specifičnih kapsidnih proteinov |
| CN107073051B (zh) * | 2014-10-21 | 2021-08-24 | 马萨诸塞大学 | 重组aav变体及其用途 |
| ES2941502T3 (es) * | 2016-05-13 | 2023-05-23 | 4D Molecular Therapeutics Inc | Variantes de cápsides de virus adenoasociado y procedimientos de utilización de las mismas |
| AU2017312951B2 (en) * | 2016-08-15 | 2024-02-08 | Genzyme Corporation | Methods for detecting AAV |
| WO2020014395A1 (en) * | 2018-07-10 | 2020-01-16 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Aav vp1u chimeras |
-
2019
- 2019-08-21 US US17/269,955 patent/US20210317478A1/en active Pending
- 2019-08-21 AU AU2019325332A patent/AU2019325332A1/en active Pending
- 2019-08-21 EP EP19851371.5A patent/EP3841109A4/en active Pending
- 2019-08-21 WO PCT/US2019/047546 patent/WO2020041498A1/en unknown
- 2019-08-21 JP JP2021509223A patent/JP7451497B2/ja active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005072364A3 (en) | 2004-01-27 | 2005-12-29 | Univ Florida | A modified baculovirus expression system for production of pseudotyped raav vector |
| US20150376240A1 (en) | 2013-02-08 | 2015-12-31 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Enhanced aav-mediated gene transfer for retinal therapies |
| WO2017083423A1 (en) | 2015-11-10 | 2017-05-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for modulating aav infection |
| WO2018022608A2 (en) | 2016-07-26 | 2018-02-01 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Novel adeno-associated virus capsid proteins |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3841109A1 (en) | 2021-06-30 |
| EP3841109A4 (en) | 2022-09-21 |
| US20210317478A1 (en) | 2021-10-14 |
| WO2020041498A1 (en) | 2020-02-27 |
| JP2021533795A (ja) | 2021-12-09 |
| AU2019325332A1 (en) | 2021-03-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7451497B2 (ja) | アデノ随伴ウイルスの形質導入効率を調節するための組成物および方法 | |
| US11371061B2 (en) | Compositions and methods for improving viral vector efficiency | |
| JP2022505402A (ja) | アルブミン遺伝子座からの導入遺伝子発現のための組成物及び方法 | |
| JP7081767B2 (ja) | アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）キャプシドタンパク質の変異体 | |
| JP2022512731A (ja) | 第ｉｘ因子を発現するための組成物及び方法 | |
| CA2934774A1 (en) | High titer production of adeno-associated viral vectors | |
| US20220169993A1 (en) | Destabilising domains for conditionally stabilising a protein | |
| KR20230002401A (ko) | C9orf72의 표적화를 위한 조성물 및 방법 | |
| Azibani et al. | Gene therapy via trans-splicing for LMNA-related congenital muscular dystrophy | |
| US20220143214A1 (en) | Systems for evolved adeno-associated viruses (aavs) for targeted delivery | |
| WO2017205739A1 (en) | cis AND trans REQUIREMENTS FOR TERMINAL RESOLUTION OF HUMAN BOCAVIRUS 1 | |
| JP2022505381A (ja) | アルファ１アンチトリプシン欠乏症を治療するための組成物及び方法 | |
| EP4013873A1 (en) | Targeted trans-splicing using crispr/cas13 | |
| WO2019041344A1 (en) | METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TRANSFECTION OF SINGLE STRANDED DNA | |
| KR20220054435A (ko) | 아데노-연관 바이러스 (aav)와 aav 수용체 (aavr) 사이의 상호작용을 조정하여 aav의 생체-분포를 변경시키는 방법 및 조성물 | |
| AU2022200678A1 (en) | Nucleic acid molecules containing spacers and methods of use thereof | |
| JP2022513376A (ja) | レトロウイルスインテグラーゼ－Ｃａｓ９融合タンパク質を使用した指向性非相同ＤＮＡ挿入によるゲノム編集 | |
| US11685932B2 (en) | Inducible AAV Rep genes | |
| KR20230029891A (ko) | 전이유전자 발현 시스템 | |
| Chen et al. | N-terminal serine/threonine motif has diverse and important effects on behavior of multiple AAV serotypes | |
| JP2023546113A (ja) | 同時遺伝子活性化のための核酸構築物 | |
| US20230293727A1 (en) | Overexpression of lemd2, lemd3, or chmp7 as a therapeutic modality for tauopathy | |
| WO2020187268A1 (zh) | 一种增强基因编辑的融合蛋白及其应用 | |
| Hao et al. | Identification of host essential factors for recombinant AAV transduction of the polarized human airway epithelium | |
| WO2024054864A1 (en) | Cardioprotective heart disease therapies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220714 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220714 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230627 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230926 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20231127 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231227 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240206 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240306 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7451497 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |