KR20230029891A - 전이유전자 발현 시스템 - Google Patents
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Abstract
과발현 독성을 일으키지 않으면서 질환-유발 유전적 결핍을 완화하는 용량범위 내에서 벡터 유래 전이유전자의 발현을 제한하는 시스템이 기재된다. 이는, 더 많은 벡터 유래 전이유전자를 수용하는 세포 또는 조직이 적응적으로 조절할 수 있는 내장된 단일 유전자 회로를 통해 불균형적으로 억제되도록 하는 '용량 무감응'을 제공한다.
Description
유전자 요법은 유전 질환의 교정에 영향을 미치기 위해 치료적 전이유전자를 전달하는 것을 목표로 한다. 본 발명은 상이한 수준의 벡터 유래 전이유전자를 수용하는 세포에 걸쳐 비교적 고정된 수준의 전이유전자 발현을 생성하기 위한 작제물을 제공한다. 또한, 유전자 발현을 제어하는 방법으로서, 제어가 기재된 유전자 회로를 사용하여 제공되는 방법이 본원에서 기재된다.
유전 질환의 교정에 영향을 미치기 위해 치료적 전이유전자를 전달하는 유전자 요법의 개념이 알려져 있지만, 많은 유전자는 매우 용량 민감성이여서 유전자 산물의 너무 적거나 너무 많은 발현은 해로운 효과를 미칠 수 있다. 바이러스-매개 유전자 전달은 신경계의 세포를 포함하는 표적 조직 및 세포에 치료적 전이유전자를 전달하는 강력한 수단이다. 높은 바이러스 역가는 전형적으로 최대 치료 영향을 위해 효과적인 시스템-전체 전달을 가능하게 하는 데 필요하다. 그러나, 동일한 높은 역가는 일부 세포에서 달성된 초생리학적 수준의 전이유전자 발현으로 인해 과발현 독성을 유발할 수 있다. 과발현 독성을 일으키지 않으면서 질환-유발 유전적 결핍을 완화하는 용량범위(window) 내에서 벡터 유래 전이유전자의 발현을 제한하는 효과적인 시스템이 요구된다.
WO2016040395는 유전자 전달을 위한 합성 RNA 회로의 사용에 대해 논의하고 있다. 상기 회로는 하나의 세포 유형에서 특이적으로 발현되는 제1 마이크로RNA에 의해 인식되는 적어도 하나의 서열 및 RNA 모티프에 특이적으로 결합하고 단백질 생산을 억제하는 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 제1 RNA 분자를 포함한다. 제1 마이크로RNA는 miR-21로서 기재되어 있다. 상기 세포 유형에서 발현되지 않는 제2 마이크로RNA에 의해 RNA 모티프에서 인식되는 서열 및 출력 분자를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 RNA 분자가 또한 제공된다. 제2 마이크로RNA는 miR-141, miR-142 및 miR-146으로서 기재되어 있다. 상기 출원은 상이한 세포(암 및 비-암 세포)에 의해 제공되는 내인성 miR에 의존적인 이들 세포에 의한 출력 단백질의 차등 발현을 기재하고 있다.
문헌[Strovas TJ, Rosenberg AB, Kuypers BE, Muscat RA, Seelig G. MicroRNA-based single-gene circuits buffer protein synthesis rates against perturbations. ACS Synth Biol. 2014;3(5):324-331]에는 단일-유전자 마이크로RNA(miRNA)-기반 피드포워드 루프(feed-forward loop)의 사용이 논의되어 있다. 이는 그 자체의 전사체를 표적화하는 인트론 miRNA를 제공한다. Strovas는 포유동물 세포에서 조작된 유전자 프로그램의 장기간 안정한 발현의 어려움을 고려하고 있다. 이 연구는 마우스 mir-124-3 유전자를 함유하는 인트론이 적색 형광 리포터(mCherry)에 삽입된 유전자 회로를 이용하였다. 프리(pre)-mRNA는 독시사이클린 유도성 프로모터로부터 전사되어 mir-124와 mCherry의 공동발현을 야기한다. miRNA와 mCherry 전사체 사이의 억제 조절성 연결은 mRNA에 대한 Vamp3 유전자의 mir-124-조절된 3'UTR의 절두된(truncated) 버전에 의해 제공되었다.
WO2016040395는 발현을 제공하기 위한 정상 세포 및 암 세포에서 상이하게 발현된 내인성 miR의 사용을 논의하고 있지만, 이러한 miR의 사용은 비-암 질환의 치료에 제한적으로 사용되었다. 본 발명자들은 또한 Stovas에 의한 기존의 방법이 이 논문에서 사용된 miR124와 같은 내인성 miRNA에 의해 조절되는 것으로 알려진 다양한 유전자에 대해 다수의 표적외 효과(off-target effect)를 가질 수 있다는 것을 밝혀냈다. 실제로, miR124는 다수의 암과 연관되어 있는 것으로 알려져 있고, 따라서 유전자 요법에서 사용하기에 적합하지 않다. 따라서, 내인성 마이크로 RNA를 제공하는 것은 전이유전자 이외에도 내인성 표적이 제공될 수 있기 때문에 문제가 될 수 있다.
본 발명자들은 당업계에 제공된 작제물에 비해 장점을 갖는 대안적인 작제물을 제공하고자 하였다.
본 발명자들은, 과발현 독성을 일으키지 않으면서 질환-유발 유전적 결핍을 완화하는 용량범위 내에서 벡터 유래 전이유전자의 발현을 제한하는 시스템이 본 발명자들이 '용량-무감응(dosage-insensitivity)'이라고 명명한 것을 가능하게 하고, 이에 의해 더 많은 벡터 유래 전이유전자를 수용하는 세포 또는 조직은 적응적으로 조절할 수 있는 내장된 단일 유전자 회로를 통해 불균형적으로 억제된다는 것을 밝혀냈다. 즉, 벡터 유래 전이유전자가 높은 벡터 용량에서는 하향조절되어 회로는 다양한 벡터 용량에 걸쳐 비교적 안정한 발현 수준을 유지하고, 그 결과 전체 세포 집단은 보다 균일하고 제어된 수준의 벡터 유래 전이유전자를 발현하게 된다. 벡터 용량을 증가시키는 것은 종래의 유전자 요법 카세트와 비교하여 과발현의 동반 증가 없이 세포 집단 내에서 전이유전자를 발현하는 더 많은 세포를 초래할 것이다. 또한, 심장, 간 및 후근 신경절과 같이 종종 높은 벡터 부하를 받는 민감한 세포 유형은 이러한 메커니즘에 의한 중복감염-매개 과발현에 덜 민감할 것이다.
본 발명자들은 표적외 효과의 위험을 나타내는 포유동물-기반 miRNA 작제물과 관련된 단점을 극복하는 합성 또는 비-포유동물 miRNA 작제물(들)을 설계하였다. 본 발명자들은 숙주(인간 게놈) 내에 표적의 부재를 보장하기 위한 비-포유동물 또는 완전 합성(자연에는 알려지지 않음) miRNA의 유용성을 입증하였다.
또한, 본 발명자들은 이러한 합성 성분을 사용하여 시스템의 미세-조정(부위 수 및 효율적인 인트론 배제)을 가능하게 함으로써 적절한 용량-무감응을 달성할 수 있는 방법을 밝혀냈다.
따라서, 본 발명의 제1 양상은
- 프로모터
- 인트론 내에서 발현되는 적어도 하나의 비-포유동물 또는 합성 miRNA로서, 상기 합성 miRNA가 자연적으로 발생하지 않는 서열인, 적어도 하나의 비-포유동물 또는 합성 miRNA;
- 전이유전자;
- 전이유전자의 발현 제어를 제공하는 하나 이상의 비-포유동물 또는 합성 miRNA 결합 부위(들)로서, 상기 합성 miRNA 결합 부위(들)가 자연적으로 발생하지 않는, 하나 이상의 비-포유동물 또는 합성 miRNA 결합 부위(들); 및
- 폴리아데닐화 신호
를 포함하는 작제물을 제공한다.
본원에 논의된 miRNA 결합 부위는 포유동물 세포에 존재하는 포유동물 서열과 상이하도록 합성에 의해 유도되거나 다른 비-포유동물 종, 예를 들어 곤충으로부터 제공된다. miRNA 결합 부위가 포유동물 서열에 존재하지 않는 곤충으로부터의 것, 예를 들어 ffluc1인 경우, 비-포유동물 시스템이 사용될 수 있다. miRNA 결합 부위와 비-포유동물 또는 합성 miRNA의 조합은 작제물의 표적외 조절 효과를 최소화한다. 이는 전이유전자의 발현을 조절할 수 있도록 하여 전이유전자의 원하는 용량(발현)을 제공할 수 있다.
적합하게는, 전이유전자의 발현 제어를 제공하는 miRNA 결합 부위는 3' UTR, 5' UTR 및/또는 전이유전자 내에 제공될 수 있다. 적합하게는, 전이유전자에 제공될 때, miRNA 결합 부위는, 합성 또는 비-포유동물 결합 부위를 제공하지만 전이유전자 단백질의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않도록 코돈-최적화될 수 있다. 작제물은 발현 제어를 가능하게 하는 피드 포워드 루프를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
적합하게는, 전이유전자 발현을 증가시키기 위한 안정성 요소가 포함될 수 있다. 적합하게는, 안정성 요소는 3' UTR에 위치할 수 있다. 적합하게는, 이 안정성 요소는 우드척 간염 바이러스(Woodchuck Hepatitis Virus: WHV) 전사 후 조절 요소(WPRE)(서열번호 74)일 수 있다. WPRE는 감마, 알파 및 베타 요소를 함유하는 3자 조절 요소이다. 적합하게는, 안정성 요소는 안정성 요소를 보유하지만 X-단백질 서열이 생략된 WPRE의 절두된 버전 또는 리보자임 안정성 서열(WPRE3)(서열번호 75)일 수 있다. WPRE3은 WPRE의 3가지 조절 요소 중 2가지(최소 감마 및 알파 요소)를 함유하는 단축된 WPRE 서열이다. 적합하게는, WPRE3 안정성 요소는 프로세싱된 전사체에서 전이유전자 발현을 향상시키는 3차 구조를 생성하는 DNA 서열을 제공한다.
적합하게, 상이한 프로모터가 다양한 전이유전자와 함께 사용될 수 있다. 본 발명에서, 피드 포워드 루프의 강도는 전이유전자의 발현 수준의 제어가 가능하도록 조정될 수 있다. 이는 용량 민감성을 제공한다. 또한, 단일 유전자 회로의 마이크로 RNA 결합 부위의 수를 조정하고 상이한 효율로 스플라이싱되는 합성 인트론을 사용함으로써 회로의 미세-조정이 가능할 수 있다.
작제물(들)은 포유동물 세포에서 전이유전자를 발현하도록 개조될 수 있다. 적합하게는, 작제물(들)은 포유동물 세포, 적합하게는 전이유전자의 발현이 달성되는 특정 포유동물 세포 또는 세포 유형에 제공되도록 개조될 수 있다.
유리하게는, 상이한 수준의 벡터 유래 전이유전자를 수용하는 세포에 걸쳐 비교적 고정된 수준의 발현을 생성하기 위해, 인트론 유래 마이크로RNA를 사용하는 단일 유전자 회로가 제공될 수 있다.
당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 작제물의 특징(프로모터, 인트론 내에서 발현되는 합성 miRNA, 전이유전자, 전이유전자의 발현 제어를 제공하는 miRNA 결합 부위, 폴리아데닐화 신호)은 전이유전자의 기능적 발현을 가능하게 하기 위해 서로 상대적으로 제공되어야 한다.
작제물은 변형된 코작(Kozak) 서열을 포함하도록 개조될 수 있다. 적합하게는, 변형된 코작 서열은 단백질 번역 개시 부위로서 기능하는 임의의 핵산 모티프를 포함하는 임의의 코작 서열일 수 있다. 적합하게는, 변형된 코작 서열은 번역 개시의 증가를 촉진하는 임의의 변형된 서열일 수 있다. 적합하게는, 코작 서열은 GCCACCATGG(서열번호 73)일 수 있다.
구현예에서, 작제물은 (5'에서 3'으로):
- 프로모터
- 인트론 내에서 발현되는 적어도 하나의 비-포유동물 또는 합성 miRNA로서, 상기 합성 miRNA이 자연적으로 발생하지 않는 서열인, 적어도 하나의 비-포유동물 또는 합성 miRNA;
- 전이유전자;
- 전이유전자 내에서 전이유전자의 발현 제어를 제공하는 하나 이상의 합성 또는 비-포유동물 miRNA 결합 부위(들)로서, 상기 합성 miRNA 결합 부위(들)가 자연적으로 발생하지 않는, 하나 이상의 합성 또는 비-포유동물 miRNA 결합 부위(들); 및
- 폴리아데닐화 신호
를 포함한다.
구현예에서, 작제물은 (5'에서 3'으로):
- 프로모터
- 인트론 내에서 발현되는 적어도 하나의 비-포유동물 또는 합성 miRNA,
- 합성 miRNA가 자연적으로 발생하지 않는 서열인 전이유전자;
- 3'UTR 내에서 전이유전자의 발현 제어를 제공하는 하나 이상의 합성 또는 비-포유동물 miRNA 결합 부위(들)로서, 상기 합성 miRNA 결합 부위(들)가 자연적으로 발생하지 않는, 하나 이상의 합성 또는 비-포유동물 miRNA 결합 부위(들); 및
- 폴리아데닐화 신호
를 포함한다.
구현예에서, 작제물은 (5'에서 3'으로):
- 프로모터
- 인트론 내에서 발현되는 적어도 하나의 비-포유동물 또는 합성 miRNA로서, 상기 합성 miRNA가 자연적으로 발생하지 않는 서열인, 적어도 하나의 비-포유동물 또는 합성 miRNA;
- 전이유전자의 전사를 향상시킬 수 있는 변형된 코작 서열;
- 전이유전자;
- 전이유전자 또는 3' UTR 내에서 전이유전자의 발현 제어를 제공하는 하나 이상의 합성 또는 비-포유동물 miRNA 결합 부위(들)로서, 상기 합성 miRNA 결합 부위(들)가 자연적으로 발생하지 않는, 하나 이상의 합성 또는 비-포유동물 miRNA 결합 부위(들); 및
- 폴리아데닐화 신호
를 포함한다.
구현예에서, 작제물은 (5'에서 3'으로):
- 프로모터
- 인트론 내에서 발현되는 적어도 하나의 비-포유동물 또는 합성 miRNA로서, 상기 합성 miRNA가 자연적으로 발생하지 않는 서열인, 적어도 하나의 비-포유동물 또는 합성 miRNA;
- 전이유전자;
- 전이유전자 또는 3'UTR 내에서 전이유전자의 발현 제어를 제공하는 하나 이상의 합성 또는 비-포유동물 miRNA 결합 부위로서, 합성 miRNA 결합 부위(들)가 자연적으로 발생하지 않고 하나 이상의 합성 또는 비-포유동물 miRNA 결합 부위(들)가 miRNA 결합을 부분적으로 개선하도록 설계되는, 하나 이상의 합성 또는 비-포유동물 miRNA 결합 부위;
- 폴리아데닐화 신호
를 포함한다.
구현예에서, 작제물은 (5'에서 3'으로)
- 프로모터
- 인트론 내에서 발현되는 적어도 하나의 비-포유동물 또는 합성 miRNA로서, 상기 합성 miRNA가 자연적으로 발생하지 않는 서열인, 적어도 하나의 비-포유동물 또는 합성 miRNA;
- 전이유전자;
- 전이유전자 또는 3'UTR 내에서 전이유전자의 발현 제어를 제공하는 하나 이상의 miRNA 결합 부위(들)로서, 합성 miRNA 결합 부위(들)가 자연적으로 발생하지 않는, 하나 이상의 miRNA 결합 부위(들);
- 3' UTR 내의 안정성 요소; 및
- 폴리아데닐화 신호
를 포함한다.
일부 구현예에서, 작제물은 프로모터, 인트론 내에서 발현되는 적어도 하나의 비-포유동물 또는 합성 miRNA, 전이유전자, 전이유전자 또는 3'UTR 내에서 전이유전자의 발현 제어를 제공하는 하나 이상의 결합 부위, 폴리아데닐화 신호 및, 임의로 상기 구현예에서 언급된 임의의 하나 이상의 특징을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 특징들이 언급된 순서대로 상기 언급된 하나 이상의 특징들을 포함할 수 있다.
적합하게는, 작제물은 향상된 발현, 조절 및 안정성을 제공하도록 변형될 수 있다. 적합하게는, 작제물은 리포터 전이유전자를 함유할 수 있다. 적합하게는, 작제물은 강력한 발현을 촉진하는 코작 서열을 함유할 수 있다. 적합하게는, 작제물은 3'UTR 내의 안정성 요소를 함유할 수 있다. 적합하게는, 작제물은 miRNA 결합의 효능을 감소시키도록(그러나 완전히 개선하지는 않도록) 조작된 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 결합 부위를 함유할 수 있다.
적합하게는, 관심대상 유전자는 MECP2일 수 있다. 대안적으로, 관심대상 유전자는 다음 관심대상 유전자 중 어느 하나일 수 있다: FMR1, UBE3A, CDKL5, FXN, SMN1 또는 INS. 관심대상 유전자는 유전적 병태 또는 발달 장애의 치료를 위한 유전자 요법을 사용하여 공급될 필요가 있는 임의의 유전자일 수 있다. 관심대상 유전자는 유전적 병태 또는 발달 장애를 치료하기 위해 대상체에게 전달될 때 제어된 발현을 필요로 하는 임의의 유전자일 수 있다.
전이유전자
적합하게는, 전이유전자는 표적 세포 내로 인공적으로 도입되는 단백질-코딩 유전자이다. 이는 선택된 프로모터의 제어 하에 본 발명의 제1 양상의 작제물의 일부로서, 예를 들어 유전자 요법 카세트의 일부로서 제공된다. 전이유전자의 DNA 서열은 특정 유전자의 특정 이소형을 나타낼 수 있다. 전이유전자 DNA 서열은 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 특정하고 독특한 DNA 서열을 제공할 수 있지만, DNA 및 후속적인 mRNA 변경은 단백질의 코딩 서열에 영향을 주지 않는다; 즉, 야생형 아미노산 서열이 유지된다.
적합하게는, 전이유전자는
>인간 MECP2 -e1 이소형(서열번호 1)
인간 UBE3A (서열번호 2)
>인간 FMR1 - 이소형 7 (서열번호 3)
>인간 SYNGAP1 (서열번호 4)
로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, 이들 전이유전자의 기능적 변이체가 제공될 수 있으며, 여기서 상기 기능적 변이체는 전이유전자에 의해 제공된 기능을 유지하고 적어도 60% 서열 동일성, 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 적합하게는, 기능적 변이체는 전이유전자의 기능을 제공하는 전이유전자의 단편일 수 있다. 적합하게는, 전이유전자의 발현 제어를 제공하는 miRNA 결합 부위가 전이유전자 내에 제공되는 경우, 상기 miRNA 결합 부위는, miRNA가 결합하여 전이유전자의 발현을 제어할 수 있도록 기능적 변이체 내에 제공된다.
서열 동일성은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 적합하게는, 서열 동일성은 전이유전자의 전체 길이에 걸쳐 결정될 수 있다.
적합한 전이유전자는 전이유전자의 제어된 발현이 요망되는 임의의 단일 유전자 장애에 기초한 것들을 포함한다. 적합한 전이유전자는 전이유전자의 제어된 발현이 요망되는 임의의 단일유전자 장애에 기초한 것들을 포함한다. 추가의 예시적인 전이유전자는 전이유전자의 제어된 발현이 요망되는 단일 유전자 CNS 장애에 기초한 것들을 포함한다. 신경계는 과발현될 때 신경계 기능에 해로운 것으로 알려진 많은 유전자를 발현한다. 그러나, 본 발명은 비-CNS 장애를 위한 유전자 요법을 포함하는, 전이유전자 과발현이 해로운 임의의 상황에 적용될 수 있다. 예로는 중간정도의 과발현은 해로운 유해효과(adverse effect)를 유발하지 않지만 매우 높은 수준의 과발현은 중증 심장 독성을 야기하게 되는 근육 세포의 디스트로핀 유전자 대체가 포함될 수 있다.
인트론 내에서 miRNA 발현
마이크로 RNA(miRNA)는 약 22개 뉴클레오티드 길이의 작은 단일-가닥 비코딩 RNA의 부류이다. 대부분의 miRNA는 RNA 폴리머라제 II에 의해 독립적인 전사체로서 또는 mRNA의 인트론 내에 매립된(embedded) RNA로서 전사된다. 1차 miRNA 전사체는 2가지 RNase III 효소(드로샤(Drosha) 및 다이서(Dicer))에 의해 약 70 nt 헤어핀 전구체 miRNA로 프로세싱된 다음, 최종적으로 약 22 nt 성숙한 miRNA로 프로세싱된다. miRNA는 번역 억제 및/또는 메신저 RNA(mRNA) 분해를 위해 mRNA를 표적화하여 단백질 수준을 조절함으로써 기능한다.
본 발명자들은 각각의 결합 영역을 함유하는 전사체를 녹다운 발현을 할 수 있는 본 발명의 비-포유동물 또는 합성 miRNA를 개발하였다. 본 발명의 일부 예에서, 이들은 원래 반딧불이 루시페라제 단백질을 표적화하도록 설계된 곤충 유래 miRNA 서열이다. 다른 예에서, 이들은 자연 발생 miRNA에 대한 오르톨로지(orthology)를 갖지 않는 합성 miRNA 서열이다. 일부 예에서, 합성 miRNA 서열은 코돈 최적화된 코딩 서열을 표적화하도록 설계되며, 여기서 상기 코딩 서열은 동일한 아미노산 서열을 유지하면서 DNA 수준에서 변경된다. 유전자 요법의 맥락에서 이것은 내인성 유전자는 영향을 받지 않는 반면에 외인성으로 전달된 전이유전자만이 합성 miRNA에 의해 독점적으로 표적화될 수 있도록 한다. 본 발명의 마지막 예에서, mRNA 표적화에 적합한 서열을 식별하기 위해 기존의 miRNA 설계 도구와 함께 사용된 대형 DNA 서열의 인 실리코(in silico) 생성에 의해 완전히 신규한 합성 miRNA 서열이 생성되었다. 적합하게는, 이러한 모든 miRNA는 비-포유동물 또는 합성이기 때문에, 이들은 포유동물 전사체 내에 예측된 내인성 표적을 갖지 않는다.
적합하게는, miRNA는 상이한 인트론 내에 삽입될 수 있다. 이러한 인트론의 예는 하기에 제공된다. 인간 EF1a 인트론은 통상적으로 사용되는 EF1a 프로모터에 존재하는 인트론이며 효율적으로 스플라이싱하는 것으로 알려져 있다. MINIX 인트론도 효율적으로 스플라이싱하는 것으로 알려져 있으며 이의 짧은 서열 때문에 유전자 요법 맥락에서 유용하다. 본 발명자들은 EF1a 프로모터와 MINIX 인트론이 함께 작용할 수 있다는 것을 보여주었다. 본 발명자들은 또한 JeT 프로모터와 MINIX 인트론이 함께 작용한다는 것을 보여주었다.
적합하게는, 인트론은
>인간_EF1a_인트론_A(서열번호 5)
>MINIX_인공_인트론 (서열번호 6)
로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, miRNA는 원래 반딧불이 루시페라제에 대해 표적화된 비-포유동물 miRNA(ffluc1)에 의해 제공될 수 있다.
비-포유동물 miRNA: (루시페라제)
> ffluc1_전체_miRNA_서열 (서열번호 7)
5' -AACGATATGGGCTGAATACAA-3'
>ffluc1_시드_서열
5' -ACGATA-3'
BLAST 검색은 인간 세포에서 생성된 임의의 RNA 전사체에서 이 RNA와 동일한(21bp) 매치(match)가 없다고 결정하였다(따라서, 이것은 "비-포유동물" 서열이다). 연구는 시드 서열에 대한 정확한 상보성이 있는 경우 miRNA가 표적 부위 내의 미스매치를 용인할 수 있음을 보여주었다. 시드 서열은 일반적으로 miRNA의 5' 영역 내의 위치 2번 내지 7번에 위치하며 miRNA 결합에 필수적이다. 그러나, 잠재적인 표적외 RNA는 정확한 시드 서열 매치를 함유하지 않았다.
miRNA는 올바른 인식 및 프로세싱이 가능하도록 하기 위해 헤어핀 루프 구조에 매립된다. 적합하게는, 매립된 비-포유동물 miRNA는
>ffluc1 (서열번호 9)
>ffluc9 (서열번호 10)
>ffluc18 (서열번호 11)
>ffluc22 (서열번호 12)
로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, miRNA는 포유동물, 곤충 또는 식물 miRNA에 대한 오르톨로지를 갖지 않는, 무작위로 생성된 서열에 대해 원래 표적화된 신규 합성 miRNA에 의해 제공될 수 있다.
적합하게는, 매립된 합성 miRNA는
>신규_seq_1 (서열번호 13)
>신규_seq_2 (서열번호 14)
>신규_seq_3 (서열번호 15)
>신규_seq_4 (서열번호 16)
>신규_seq_5 (ran1g) (서열번호 17)
>신규_seq_6 (ran2g) (서열번호 18)
>신규_seq_7 (서열번호 19)
>신규_seq_8 (서열번호 20)
로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, 매립된 합성 miRNA는 표적 유전자(즉, 치료적 전이유전자)의 코딩 서열에 대해 표적화될 수 있다.
표적 유전자는 동일한 유전자의 내인성 전사체를 표적화하지 않으면서 코돈 최적화된 전이유전자를 표적화하는 능력에 대해 스크리닝된, 포유동물, 곤충 또는 식물 miRNA에 대한 오르톨로지를 갖지 않는 코돈 최적화된 합성 miRNA일 수 있다. : 적합하게는, 코딩 최적화된 서열을 표적화하는 매립된 합성 miRNA는
>MECP2_코딩_1 (서열번호 21)
>MECP2_코딩_2 (서열번호 22)
>MECP2_코딩_3 (서열번호 23)
>MECP2_코딩_4 (서열번호 24)
> MECP2_코딩_5 (서열번호 25)
> MECP2_코딩_6 (서열번호 26)
>SYNGAP1_코딩_1 (서열번호 27 )
> SYNGAP1_코딩_2 (서열번호 28)
> SYNGAP1_코딩_3 (서열번호 29)
> SYNGAP1_코딩_4 (서열번호 30)
> SYNGAP1_코딩_5 (서열번호 31)
> SYNGAP1_코딩_6 (서열번호 32)
로부터 선택될 수 있다.
miRNA는 성숙한 miRNA 서열에 상보적인 특정 서열에 결합함으로써 작동한다. 이들 결합 부위는 내인성 mRNA의 3' 비번역 영역(3'UTR)에 위치할 수 있다. 결합 부위는 대안적으로 5'UTR, 엑손 및 인트론에 위치할 수 있다. 추가의 대안적인 구현예에서, 결합 부위는 코돈 최적화된 전이유전자 서열 내에 위치할 수 있다. 적합하게는, 전이유전자의 발현 제어를 제공하는 miRNA 결합 부위는 3' UTR, 5' UTR 또는 전이유전자 내에 제공될 수 있다.
적합하게는, 결합 부위 내의 '시드' 서열은 위치 2번 내지 7/8번까지 miRNA의 5' 말단에서 염기와 함께 왓슨-크릭 쌍을 형성한다. 그러나, 당업자는, 예를 들어, 서열 보존, miRNA의 3' 말단에서의 강력한 염기쌍 형성, 국소 AU 함량, 및 3' UTR 내 miRNA 결합 부위의 위치에 기반한 결합 특이성 및 강도가 변경될 수 있는 방식을 이해할 것이다.
적합하게는, 상이한 수의 결합 부위를 사용하여 전이유전자 제어의 강도를 변경할 수 있다. 또한, 결합 부위 내로 도입된 미스매치를 사용하여 전이유전자 제어 수준을 저하시킬 수 있다. 이러한 변화는 용량 무감응의 수준을 설정할 수 있도록 한다.
적합하게는, miRNA-표적 결합을 완전히 억제하지는 않지만 감소시키기 위해 결합 부위를 돌연변이시킬 수 있다. 적합하게는, 이들 돌연변이를 사용하여, 일부 표적 miRNA가 여전히 결합 부위에 결합하도록 함으로써 전이유전자 발현의 조절성 제어를 여전히 유지하면서 전이유전자의 발현을 향상시킬 수 있다.
성공적인 miRNA-표적 결합은 일반적으로 번역 억제 또는 mRNA 분해 메커니즘을 통해 단백질 수준의 녹다운을 초래한다.
적합하게는, 비-포유동물 또는 합성 miRNA 결합 부위는
>ffluc1_x1_결합_부위 (서열번호 33)
>ffluc1_x 3_결합_부위 (서열번호 34)
>ffluc1_x6_결합_부위 (서열번호 35)
>ffluc1_x3_결합_부위_1bp_중심_미스매치 (서열번호 36)
> ffluc1_x3_결합_부위_3bp_중심_미스매치 (서열번호 37)
>ffluc1_x3_결합_부위_3'_미스매치 (서열번호 38)
>ffluc1_x3_결합_부위_돌연변이체_1 (서열번호 39)
>ffluc1_결합_부위_돌연변이체_2 (서열번호 40)
>ffluc1_x3_결합_부위_돌연변이체_3 (서열번호 41)
>ffluc1_x3_결합_부위_돌연변이체_4 (서열번호 42)
>ffluc1_x3_결합_부위_돌연변이체_5 (서열번호 43)
>ffluc1_x3_결합_부위_돌연변이체_6 (서열번호 44)
>ffluc9_x3_결합_부위 (서열번호 45)
>ffluc18_x3_결합_부위 (서열번호 46)
>ffluc22_x3_결합_부위 (서열번호 47)
로부터 선택될 수 있다.
하기 합성 서열을 코딩 서열이 최적화되도록 설계하고 이들을 표적화하는 miRNA를 포유동물 내인성 서열과 상이한 서열의 일부를 표적화하도록 설계하였다.
>신규_seq_1_3x_결합_부위 (서열번호 48)
>신규_seq_2_3x_결합_부위 (서열번호 49)
>신규_seq_3_3x_결합_부위 (서열번호 50)
>신규_seq_4_3x_결합_부위 (서열번호 51)
>신규_seq_5_3x_결합_부위 (서열번호 52)
>신규_seq_6_3x_결합_부위 (서열번호 53)
>신규_seq_7_3x_결합_부위 (서열번호 54)
>신규_seq_8_3x_결합_부위 (서열번호 55)
>MECP2_코딩_1_결합_부위 (서열번호 56)
aagtacgatgtttacttgatc
> MECP2_코딩_2_결합_부위 (서열번호 57)
aagccgctcttggtctctacc
> MECP2_코딩_3_결합_부위 (서열번호 58)
aagtccgaagatcaagacctg
> MECP2_코딩_4_결합_부위 (서열번호 59)
gagtccagtatacgcagtgta
> MECP2_코딩_5_결합_부위 (서열번호 60)
gtccagtatacgcagtgtaca
> MECP2_코딩_6_결합_부위 (서열번호 61)
gactcgggaaaccgttagtat
>SYNGAP1_코딩_1_결합_부위 (서열번호 62)
gcgccttaagtccagcataaa
> SYNGAP1_코딩_2_결합_부위 (서열번호 63)
gagttctgtttcgaagttact
> SYNGAP1_코딩_3_결합_부위 (서열번호 64)
ggcgagcacttcgagttcaat
> SYNGAP1_코딩_4_결합_부위 (서열번호 65)
Aagatccgaatctagcagaaa
> SYNGAP1_코딩_5_결합_부위 (서열번호 66)
aaggtcgtaaacagccactgt
> SYNGAP1_코딩_6_결합_부위 (서열번호 67)
aagaggaaatacactctctga
프로모터
임의의 적합한 프로모터, 항시적(constitutive) 또는 조건적 프로모터를 사용하여 전이유전자의 발현을 구동할 수 있다. 적합하게는, 프로모터는 Ef1a 프로모터, CAG 프로모터, Jet 프로모터, CMV 프로모터, CBA 프로모터, CBH 프로모터, 시냅신1(Synapsin1) 프로모터, Mecp2 프로모터, U1a 프로모터, U6 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 뉴런-특이적 에놀라제 프로모터, 희소돌기아교세포 전사 인자 1 또는 GFAP 프로모터를 포함할 수 있다.
구현예에서, 피드포워드 miRNA는 적합한, 예를 들어 임의의 상기 프로모터에 커플링된 인트론 서열 내로 혼입될 수 있다.
사용되는 정확한 프로모터는 필요한 발현 강도 및, 더 큰 유전자의 경우, 예를 들어 AAV 전달 벡터에서 이용가능한 패키징 성능의 양에 의존할 것이다. 적합한 프로모터는
>EF1a_프로모터 (서열번호 68)
>Jet_프로모터 (서열번호 69)
>CMV-CBA 프로모터 (서열번호 76)
에 의해 제공될 수 있다.
폴리아데닐화 신호
본 접근법은 합성 폴리A 서열 또는 천연 폴리A 서열의 절두된 단편과 함께 사용될 수 있다. 구현예에서 피드 포워드 miRNA 결합 부위는 3'UTR 내에 혼입될 수 있다. 적합하게는, miRNA 결합 부위는 전이유전자 서열 내에 매립되지 않는 한 3'UTR 내에 혼입될 수 있다.
당업계에 알려진 임의의 적합한 폴리아데닐화 신호가 사용될 수 있다. 적합하게는, 폴리A 신호는
>sv40 폴리A 신호 (서열번호 70)
>BGH 폴리A 신호 (서열번호 71)
>SpA (서열번호 72)
일 수 있다.
안정성 요소
적합하게는, 전이유전자 발현을 증가시키기 위한 안정성 요소가 포함될 수 있다. 적합하게는, 안정성 요소는 3' UTR 내에 위치할 수 있다. 적합하게는, 안정성 요소는
> WPRE(서열번호 74)
> WPRE3 (서열번호 75)
일 수 있다.
벡터
본 발명의 miRNA 피드포워드 작제물은 생체내에서 작동하도록 설계된다. 이들 작제물을 필요한 조직/기관에 전달하기 위해, 임의의 적합한 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 레트로바이러스, 알파바이러스, 플라비바이러스, 라드보바이러스, 홍역 바이러스, 피코르나바이러스 및 폭스바이러스를 포함하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 전달 시스템 또는 다른 치료적 바이러스 벡터 시스템일 수 있다. AAV의 경우, 전체 작제물(프로모터, miRNA, 전이유전자, 결합 부위, 폴리A)을 AAV-호환성 플라스미드 내로 클로닝할 수 있으며, 여기에는 역 말단 반복(ITR) 서열이 측접되어 있다. AAV 생산에는 엄격한 크기 제한이 있고, 따라서 전체 작제물은 4.4kb(ITR 제외)를 초과하지 않아야 한다. 이러한 크기 제한은 이용가능한 공간의 대부분을 차지하는 특정 전이유전자의 사용을 제한할 수 있다. 대안적인 더 작은 프로모터 및 폴리A를 사용하여 더 큰 전이유전자를 수용할 수 있다. 적합하게는, 작제물에서, 3'UTR 영역이 제거될 수 있으며 합성 miRNA는 전이유전자의 코돈 최적화된 서열에 대해 표적화될 수 있다. 코돈 최적화된 전이유전자는 상이한 DNA/mRNA 서열을 가지므로, 관심대상 유전자(GOI)로부터의 내인성 mRNA는 표적화되지 않을 수 있다.
본 발명의 제2 양상에 따르면, 본 발명의 제1 양상의 작제물을 포함하는 벡터가 제공된다. 적합하게는, 표적 세포로의 작제물의 전달을 가능하게 하기 위해 작제물은 바이러스 벡터 내에 제공될 수 있다. 표적 세포는 뉴런, 뉴런 하위유형, 희소돌기아교세포, 성상세포, 슈반 세포를 포함하는 중추신경계 및 말초신경계의 세포일 수 있다. 유리하게는, 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV), 특히 AAV9, AAV1, 2, 4, 5, 6, 6.2, 8, 9, rh10으로부터 선택될 수 있으며, PHP.B, PHP.S, PHP.eB 벡터가 사용될 수 있다.
본 발명의 제3 양상에 따르면, 제1 양상의 작제물을 사용하여 전이유전자를 발현시키는 방법이 제공된다. 적합하게는, 제2 양상은 대상체에게 제공될 수 있는 세포에서 전이유전자를 발현시키는 방법을 포함한다. 적합하게는, 작제물은 요구되는 용량 조절 수준을 평가하기 위해 시험관내에서 효과적으로 스크리닝될 수 있다. 시험관내에서, 전이유전자는 플라스미드 내에 함유되어 지질-매개 형질감염을 통해 세포주 내로 도입될 수 있다. 강력한 전이유전자 발현은 24시간 후에 볼 수 있다. 그후, 피드포워드 전이유전자 카세트는 rAAV 발현 벡터에 삽입됨으로써 적합하게 벡터화될 수 있으며, 이는 이후 AAV 입자를 생성하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 제4 양상에 따르면, 개체에서 유전자의 불충분한 발현에 의해 유발되는 장애를 치료하는 방법이 있으며, 상기 방법은 대상체에서 발현될 전이유전자의 야생형 또는 코돈 최적화된 또는 변형된 카피를 갖는 본 발명의 제1 양상의 작제물 또는 제2 양상의 벡터를 제공하여 대상체에서 유전자의 불충분한 발현에 의해 유발된 병태를 치료하는 단계를 포함한다. 적합하게는, 전이유전자로 패키징된 AAV 바이러스 벡터는 전신 정맥내 주사를 포함하는 다양한 방법에 의해 또는 척수강내 요추, 뇌실내, 대수조내 주사를 포함하는 CSF내 투여 경로에 의해 또는 신경망 내로의 주사에 의해 대상체에게 도입될 것이다.
적합하게는, 전이유전자는 신경계 장애 레트 증후군(Rett syndrome)을 갖는 대상체에서 과소발현되는 유전자일 수 있다. 전형적으로, 레트 증후군은 유전자 X-연관된 유전자 MECP2의 기능상실 돌연변이에 의해 유발된다. 적합하게는, 전이유전자는 MECP2 유전자의 기능적 카피 또는 카피들일 수 있다. 적합하게는, 작제물은 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 사용한 신경계로의 전이유전자 전달을 제공한다.
작제물은 표적 세포에서 좁은/원하는 범위 내에서 전이유전자의 발현을 제공한다. 예를 들어, 전이유전자가 MECP2 유전자의 단백질 코딩 서열의 야생형 또는 코돈 최적화된 카피인 경우, 작제물은 적합한 치료 효과를 제공하지만 유해효과가 관찰되는 수준 미만인 발현 수준으로 전이유전자를 제공할 수 있는 것으로 고려된다. MECP2, FMR1, UBE3A의 경우에, 유전자의 과발현은 해로운 것으로 알려져 있다.
예를 들어, 레트 증후군에서, 본 발명자들은 이전에 낮은 수준의 발현이 마우스에서 질환 표현형을 개선할 수 있음을 보여주었다. 반대로, 환자뿐만 아니라 실험 동물에서 과발현(유전자좌의 중복)(2X 이상)은 불리한 신경학적 결과를 초래한다. 이는 피드 포워드 기술이 매우 적합한 유전자 요법에 대한 좁은 치료 용량범위를 정의한다. FMR1, UBE3A 및 SYNGAP1 유전자도 용량 민감성인 것으로 고려된다. 이러한 상황에서, 본 발명을 사용하여, 질환을 개선하지만 유해효과를 최소화하는 전이유전자의 발현 수준을 결정하고 그 다음 환자에게 발현 수준을 적합하게 제공할 수 있었다.
단일유전자 장애와 관련된 많은 다른 유전자는 용량 민감성이고 이러한 외인성 전이유전자의 발현을 조절하기 위한 본 발명의 작제물 및 시스템의 사용으로부터 이익을 얻을 것이다. 인간 카피수 변이체(CNV)는 용량 민감성 유전자를 나타내는 지표일 수 있으며, 연구는 개별 유전자의 용량 민감성이 CNV 병원성의 공통 원인임을 보여주었다. 문헌[Gu W & Lupski JR. CNV and nervous system diseases - what's new? Cytogenet Genome Res. 2008;123:54-64]은 용량 민감성 유전자의 몇 가지 예 및 이들과 신경발달 장애와의 연관성을 인용하고 있다. 예로는 MECP2 중복 증후군(MECP2 유전자가 관여함), 성인-발병 상염색체 우성 백질이영양증(ADLD, LMNB1 유전자가 관여함), 고립성 뇌회결손 서열(isolated lissencephaly sequence: ILS, PAFAH1B1/LIS1 유전자가 관여함), 밀러-디커 증후군(MDS, YWHAE 유전자가 관여함)가 포함된다.
문헌[Rice AM & McLysaght. Dosage sensitivity is a major determinant of human copy number variant pathogenicity. Nature Communications. 2017; 8:14366 | DOI: 10.1038]은 질환과 관련된 CNV에 관여하는 단일 병원성 유전자가 신경발달에서의 역할에 대해 강화되어 있음을 보여주고 많은 용량 민감성 유전자, 예를 들어: PRKCZ, TTC34, PRDM16, ARHGEF16, PARK7, PRDM2, IGSF21, PTCH2, NFIA, ST6GALNAC3, DPYD, COL11A1, PDZK1, GPR89A, NBPF11, GPR89B, KCNT2, CFHR2, ASPM, PTPRC, GPATCH2, DUSP10, GPR137B, RYR2, CHRM3, RGS7, AKT3, KIF26B, SMYD3, LPIN1, EPCAM, MSH2, NRXN1, XPO1, LRP1B, ZEB2, ACVR2A, MBD5, KIF5C, SCN1A, COL3A1, PMS1, PLCL1, SATB2, PARD3B, EPHA4, SPHKAP, CHL1, GRM7, TRANK1, DOCK3, FAM19A1, FOXP1, ROBO1, CADM2, FOXL2, SOX2, LPP, RASGEF1B, GRID2, FAT4, NR3C2, LRBA, FGA, GALNTL6, WWC2, TLR3, IRX2, IRX1, CDH12, CDH9, NIPBL, HEXB, MEF2C, GRAMD3, FBN2, PRELID2, TCOF1, GABRG2, MSX2, NSD1, FOXC1, CDYL, TBC1D7, RUNX2, MUT, RIMS1, NKAIN2, LAMA2, ARID1B, PARK2, PACRG, QKI, TNRC18, FBXL18, SUGCT, GLI3, AUTS2, MLXIPL, COL1A2, PPP1R9A, CFTR, TSPAN12, GRM8, CNTNAP2, MNX1, CSMD1, MCPH1, LPL, ANK1, IMPAD1, CHD7, VCPIP1, TRPS1, PARP10, DOCK8, KANK1, GLIS3, PTPRD, MLLT3, ROR2, PTCH1, AL162389.1, ARRDC1, EHMT1, PCDH15, CTNNA3, ADK, BMPR1A, PAX2, BTRC, INPP5A, MRPL23, ELP4, PAX6, CPT1A, DYNC2H1, KIRREL3, WNK1, CACNA1C, PPFIBP1, TBX5, MED13L, NALCN, CHD8, MYH7, TTC6, DAAM1, NRXN3, MTA1, SNRPN, UBE3A, OCA2, HERC2, CHRFAM7A, ARHGAP11B, OTUD7A, FBN1, HEXA, SNUPN, NRG4, AC112693.2, IGF1R, LRRC28, HBA2, HBQ1, CREBBP, RBFOX1, CDR2, CDH13, CYBA, NXN, YWHAE, SMG6, METTL16, PAFAH1B1, ADORA2B, NT5M, RAI1, NF1, C17orf67, PITPNC1, ACOX1, TCF4, DOCK6, CACNA1A, LPHN1, ZSCAN5A, BMP2, MYT1, PEX26, USP18, DGCR6L, USP41, UBE2L3, NF2, LARGE, BRD1, SHANK3을 식별하고 있다.
본 발명자들은 임의의 적합한 유전자, 특히 예를 들어 상기 논의된 바와 같은 임의의 용량 민감성 유전자가 요구에 따라 본 발명에서 적합하게 사용될 수 있다고 고려한다. 예를 들어, 당업계에서 이해될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 작제물 및 시스템은 특히 제공되는 단백질의 발현 수준의 제어가 중요한 질환 또는 병태의 치료를 위한 임의의 적합한 단백질의 발현에 사용될 수 있다.
본 발명자들은 임의의 다른 임상적으로 관련된 용량 민감성 유전자에 적용될 수 있는 개념, 그 내부에 적합한 전이유전자를 갖는 작제물 및 전이유전자를 발현하는 방법을 고려한다.
적합하게는, 작제물은 취약 X 증후군(FMR1 전이유전자를 사용), 엔젤만 증후군(예를 들어, UBE3A 전이유전자를 사용) 또는 Syngap-관련 지적 장애(SYNGAP1을 사용)를 포함하는 다른 유전자 요법 프로그램에서 사용될 수 있다.
질환에 의존하는 특정 세포 유형에 벡터를 제공하기 위해 특정 벡터가 사용될 수 있다고 예상될 수 있다.
예를 들어, SYNGAP1은 뉴런 유전자이며 뉴런에서만 발현되지만, UBE3A, MECP2 및 FMR1은 다수의 조직에서 편재적으로 발현된다. 그러나, 우세한 질환 특징은 신경계에서 발현 손실 시에 발생하고, 따라서 신경계는 치료적 피드포워드 전이유전자의 우세한 표적이다.
본 발명자들은, 합성 성분들이 시스템을 미세-조정(부위의 수 및 효율적인 인트론 배제)하여 적절한 용량-무감응을 달성하는 것으로 고려된 작제물을 개발하였다. 본 발명의 맥락에서 용량-무감응은 치료적 전이유전자의 너무 많은 발현이 있을 때 관찰되는 원치않는 효과를 초래하지 않는 단백질 발현의 범위를 추론하기 위한 것이며, 예를 들어 개체에서 MECP2 유전자의 2개 카피는 MeCP2 수준이 급격히 감소되거나 부재하는 레트 증후군만큼 중증 증상이 있는 중증 MECP2 중복 증후군을 초래하는 것으로 알려져 있다.
구현예에서, 작제물은 전이유전자 수준이 제어될 수 있도록 하는 2가지 요소를 함유할 수 있다. 적합하게는, 제1 요소는 프로모터와 전이유전자 사이에 위치한 인트론 내에 함유된 마이크로 RNA 서열일 수 있다. 이러한 마이크로 RNA 함유 인트론은 프리-mRNA 프로세싱 동안 스플라이싱될 것이다. 그 다음, miRNA는 프로세싱되어, 표적 전사체를 분해할 수 있는 성숙한 miRNA를 생성할 것이다. 본 설계의 중요한 요소는 표적외 효과를 방지하기 위해 miRNA가 포유동물 게놈을 표적화하지 않도록 설계되었다는 것이다. 일부 예에서, miRNA는 곤충 유래일 수 있다(예를 들어, 람피리대(Lampyridae) 그룹으로부터의 한 가지가 있지만, 임의의 적합한 곤충 또는 기타 적합한 비-포유동물 miRNA가 이러한 용도를 위해 최적화될 수 있다). 대안적인 예에서, 서열은 완전히 합성될 수 있고(포유동물 게놈에 결합하지 않고 자연 발생 서열이 아니도록 설계됨), 따라서 포유동물 게놈 내에 알려진 표적외 효과가 없다. 제2 요소는 인트론으로부터 생산된 miRNA와 매치되는 작제물의 3'UTR 내의 다수의 비-포유동물 또는 합성 miRNA 결합 부위일 수 있다. 이들 결합 부위의 존재는 전이유전자가 전달된 마이크로 RNA의 표적이 되도록 한다. 이는 전이유전자 수준 감소를 야기하고 과발현을 방지하여 시스템의 원하는 용량 무감응 효과를 제공한다.
피드포워드 원리의 별개의 구현예에서, 합성 마이크로 RNA는 유전자 요법 합성 카세트 인트론 내에서 전달되지만, 3'UTR 내에 함유된 miRNA 결합 부위를 표적화하는 대신에 전이유전자의 코딩 서열 자체에 대해 표적화된다. 결정적으로, 이러한 구현예에서 전이유전자 서열은 그 서열이 아미노산 수준에서 동일하게 유지되면서 DNA 수준에서 변경되도록 코돈 최적화된다. 이것은 합성 miRNA가 내인성 포유동물 서열을 표적화하지 않고 전이유전자에 독특하게 표적화될 수 있도록 하는 신규 DNA 서열을 생성한다. 보다 컴팩트한 이 버전의 피드포워드 시스템은 바이러스 벡터의 패키징 성능에 접근하는 더 큰 유전자(예를 들어, Syngap1)에 유리하다. 전반적으로, 단일 유전자 루프는 일정한 수준의 발현을 가능하게 하고, 이에 의해 회로는 광범위한 유전자 용량에 걸쳐 비교적 고정된 수준의 발현을 유지할 수 있다(즉, 이러한 비교적 고정되거나 일정한 발현 수준은 원하는 용량 무감응을 초래하는 것이다). 실험 시스템은 유전자 용량의 변화가 유전자 발현의 상대적인 변화를 훨씬 더 작게 만드는 용법(regimen)을 생성한다. 이는 형질도입된 세포 집단에 걸쳐 광범위하고 균일한 발현을 달성하는 것을 목표로 하는 유전자 요법에 적용될 때 중요한 특징이며, 증가된 바이러스 벡터 투여를 가능하게 하여 동반 과발현 효과 없이 더 높은 형질도입률을 달성할 수 있게 한다.
구현예에서, 작제물은 AAV 유전자 요법에 민감한 세포 및/또는 조직에서의 발현에 적합하다. 구현예에서, 작제물은 전형적으로 AAV 벡터를 사용하여 전달된 전이유전자를 과발현하는 세포에서 전이유전자 발현을 제어할 수 있도록 한다. 구현예에서, 작제물은 이들 세포 및/또는 조직에서 세포 독성을 예방한다. 구현예에서, 작제물은 후근 신경절에서 세포 독성을 예방할 수 있다. 구현예에서, 작제물은 간 세포에서 세포 독성을 예방할 수 있다. 구현예에서, 작제물은 심장 세포에서 세포 독성을 예방할 수 있다. 구현예에서, 비론(viron) 내 작제물의 패키징은 작제물의 품질에 영향을 미치지 않거나 최소한으로만 영향을 미친다.
구현예에서, 작제물은 특정 유전적 병태 또는 발달 장애에 의해 유발된 임상 증상의 중증도를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 구현예에서, 작제물은 특정 유전적 병태 또는 발달 장애에 의해 유발된 임상 증상을 완전히 역전시키기 위해 사용될 수 있다. 구현예에서, 작제물은 특정 유전적 병태 또는 발달 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 구현예에서, 작제물은 레트 증후군을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 구현예에서, 작제물은 레트 증후군의 임상적 제시를 감소시키기 위해 생체내 투여될 수 있다.
구현예에서, 작제물은 유전자 요법의 독성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 구현예에서, 피드포워드 메커니즘은 전이유전자 발현을 조절하여 세포에 대한 독성을 감소시킨다. 구현예에서, 작제물은 유해한 건강 효과 없이 생체내 투여될 수 있다.
본 발명의 구현예는 이제 첨부된 도면을 참조하여 단지 예로서 설명될 것이며, 여기서:
도 1은 유전자 요법에서 용량 민감성의 문제를 예시한다.
도 2는 유전자 용량이 유전자 요법의 문제이며 매우 좁은 안전 용량범위(safety window)를 초래할 수 있음을 예시한다. 유전자 용량은 유전자 요법의 문제이며 매우 좁은 안전 용량범위를 초래할 수 있다. 예를 들어, 레트 증후군을 모델링하는 마우스는 생존기간 중간값이 약 11주이다. 치료적 유전자 요법 벡터를 이용한 치료는 체중을 정상화하고 40주 생존율을 100%로 증가시킬 수 있다(좌측 상자). 그러나, 이러한 치료 용량의 배가는 치사성을 초래하고(우측), 이는 용량 민감성 및 좁은 안전역(safety margin)을 강조한다.
도 3은 단일 유전자 피드 포워드 유전자 요법 회로가 유세포분석을 사용한 전이유전자 수준의 정량적 평가로 입증된 바와 같이 용량 민감성을 감소시킬 수 있음을 예시한다.
도 4는 임의의 소정 세포에 전달된 전이유전자의 바이러스 수준에 의해 제공되는 전이유전자 발현과 관련된 피드백을 예시하며, 예를 들어 여기서 세포는 차등적으로 감염되고 그렇지 않으면 매우 상이한 수준의 전이유전자를 발현할 것이다. 임의의 소정 세포에 전달된 전이유전자의 바이러스 수준에 의해 제공되는 전이유전자 발현과 관련된 피드백. MECP2는 그 양이 너무 적거나 너무 많으면 질환을 유발하는 용량 민감성 유전자의 일례이다. 유전자 요법에서, 상이한 수준의 형질도입을 수용하는 세포는 상이한 수준의 피드포워드 제어(선의 두께로 표시됨)를 경험할 것이다. 단일 유전자 회로 내에서, 치료적 전이유전자뿐만 아니라 이의 음성 조절인자(합성 miRNA)의 발현은 동일한 입력물(세포에 진입하는 치료적 벡터의 수준)에 의해 구동된다. 증가하는 입력 수준(벡터 수준) 내에서, 회로는 더 높은 수준의 miRNA 매개 하향조절을 달성한다. 결과는 회로가 세포 집단에 걸쳐 보다 고정된 수준의 전이유전자 발현을 유지할 수 있다는 것이다. 이러한 조절의 부제 하에(비-조절된 유전자 요법 카세트), 세포는 음영으로 나타낸 바와 같이 보다 다양한 수준의 벡터 유래 단백질을 발현한다.
도 5는 작제물(카세트)이 상이한 전이유전자를 사용하여 상이한 병태를 치료하거나 전이유전자 발현의 상이한 치료적 수준을 제공하기 위해 최적화될 수 있는 방식을 예시한다 - (A) 피드포워드 작제물의 핵심 성분. (B) 전이유전자 성분은 교체되었지만, 나머지 카세트 성분은 유지되었다. (C) 새로운 인트론/miRNA 및 3'UTR/miRNA-결합 부위(점선)가 도입되었지만, 나머지 카세트 성분은 유지되었다. (D) 비-포유동물 또는 합성 miRNA의 2개 카피는 동일한 인트론으로부터 또는 2개의 상이한 인트론으로부터 발현될 수 있다. 인트론은 5'UTR 내 및/또는 전이유전자의 오픈-리딩-프레임 내에 위치할 수 있다. (E) 3'UTR은 비-포유동물 또는 합성 miRNA 결합 부위의 1개, 3개 또는 6개 카피 또는 그 사이의 임의의 수를 함유할 수 있다.
도 6은 합성 miRNA가 코돈 최적화된 전이유전자 내의 서열은 표적화하지만 UTR 내의 서열은 그렇지 않은 작제물을 예시한다.
도 7a 내지 7b는 FACS에 의해 평가된 MeCP2-NeonGreen 단백질 수준에 미치는 비-포유동물 miRNA 발현의 효과를 예시한다. (A) 천연 miRNA뿐만 아니라 (B) 포유동물 게놈 내의 예측된 결합 부위가 없는 비-포유동물 또는 합성 miRNA를 사용한 피드포워드의 입증. 피드포워드 작제물(최하단 선)을 스크램블된 miRNA 결합 부위를 함유하므로 miRNA 조절이 없는 대조군 작제물(최상단 선)과 비교하였다(모든 후속 실험은 이러한 동일한 구조를 따른다). 피드포워드 작제물은 3'UTR 내에 3개의 비-포유동물 miRNA 결합 부위를 함유하였다. 그래프는 mRuby 수준(x축 - 세포에 대한 플라스미드 양의 측정값이며 miRNA 조절의 영향을 받지 않음) 대 MeCP2-NeonGreen(y축 - miRNA에 의해 조절되는 단백질)을 도시한다. 상단 그래프는 당업계의 Strovas 간행물에 설명된 피드포워드 회로에서 사용된 내인성 포유동물 miRNA인 miR124-3에 대한 결과를 도시한다. 하단 그래프는 원래 반딧불이 루시페라제 형광 단백질을 녹다운하도록 설계된 비-포유동물 miRNA인 ffluc1에 대한 결과를 도시한다. 결과는 두 miRNA 모두가, 선형 회귀선의 기울기 차이로 나타나는 바와 같이, 대조군과 비교하여 피드포워드 샘플에서 MeCP2 발현을 조절하는 데 효과적임을 보여준다.
도 8a 내지 8b는 비-포유동물 miRNA를 예시한다. 유전자 요법 카세트에 혼입될 수 있고 비-포유동물 또는 합성 miRNA를 보유하여 피드포워드 제어를 달성할 수 있는 컴팩트 인트론의 예(본 실험 및 후속 실험에서 miRNA는 이전 도면에서 설명된 합성 반딧불이 루시페라제(ffluc1)이다)는 프로모터와 MECP2 코딩 서열 사이에 위치한 인트론으로부터 발현된다. 비-포유동물 miRNA의 강력한 발현은 이 인트론의 효율적인 스플라이싱에 의존하며 상이한 인트론의 사용은 상이한 수준의 단백질 조절을 가능하게 한다. 비-포유동물 miRNA가 인간 EF1a 유전자의 인트론 1로부터 또는 작은 합성 인트론(MINIX)으로부터 발현되는 피드포워드 분자를 만들었다. 작제물은 3'UTR 내에 3개의 비포유동물 miRNA 결합 부위를 함유하였다. 두 인트론 모두는 MeCP2 수준의 강력한 조절을 나타내는 반면, 선형 회귀선의 감소된 기울기에서 볼 수 있는 바와 같이, MINIX 인트론은 더 낮은 수준의 플라스미드 발현에서 대조군과 유사한 수준의 MeCP2 발현을 나타낸다. 이는 더 낮은 플라스미드 수준에서는 치료적 수준의 단백질을 전달하지만 더 높은 수준의 플라스미드 전달에서는 단백질 독성을 방지할 것이기 때문에, 이것은 치료적으로 유익한 것으로 고려된다.
도 9a 내지 9c는 3'UTR 내의 비-포유동물 miRNA 결합 부위의 수 변화를 예시한다. 3'UTR 내의 1개, 3개 또는 6개의 비포유동물 miRNA 결합 부위를 갖는 3가지 상이한 작제물을 제조하고 FACS로 평가하였다. 3개 또는 6개의 결합 부위를 갖는 작제물은 선형 회귀선의 감소된 기울기에 의해 나타난 바와 같이 MeCP2 수준의 보다 유의한 억제를 보여주었다. 피드포워드 제어의 강도 및 이에 따른 용량 무감응은 비-포유동물 또는 합성 miRNA 결합 부위의 수를 변경함으로써 미세-조정될 수 있다.
도 10a 내지 10d는 결합 부위 내에 1bp 중앙 벌지(bulge), 3bp 중앙 벌지, 또는 miRNA 시드 서열만이 존재하는 3'미스매치를 갖는 3가지 상이한 작제물을 이용하여 비-포유동물 miRNA 결합 부위 내의 미스매치의 효과를 예시한다. 비변형된 결합 부위를 갖는 작제물과 비교하여, 이들 작제물은 단백질 수준의 현저하게 적은 억제를 나타냈으며, 3가지 모두 유사한 수준의 억제를 나타냈다. 피드포워드 제어의 강도 및 이에 따른 용량 무감응은 비-포유동물 또는 합성 miRNA 결합 부위 내에 미스매치를 혼입함으로써 미세-조정될 수 있다.
도 11은 비-포유동물 miRNA 피드포워드 메커니즘이 다른 관련 뇌 장애에서도 효과적인지 여부를 예시하며, 여기서 작제물은 MECP2를 UBE3A 단백질(이 유전자의 돌연변이는 엔젤만 증후군을 야기한다)에 대한 코딩 서열로 대체함으로써 제조되었다. 3'UTR은 이전 실험에서 사용된 것과 동일한 ffluc1 miRNA에 대한 3개의 비-포유동물 miRNA 결합 부위를 함유하였다. 다시 한 번, 비-포유동물 miRNA 결합 부위를 갖는 플라스미드는 스크램블된 miRNA 결합 부위 서열을 갖는 플라스미드에 비해 감소된 단백질 발현을 나타냈다. UBE3A 단백질 수준은 피드포워드 비-포유동물 miRNA 메커니즘과 독립적으로, 내인성 세포 메커니즘에 의해 부분적으로 조절될 수 있다고 가정되었다. 용량 민감성의 피드포워드 제어는 다른 용량 민감성 유전자, 이 경우에는 엔젤만 증후군 및 프라더-윌리 증후군에서 파괴된 UBE3A 유전자에 걸쳐 달성될 수 있다.
도 12는 피드포워드 유전자 요법 기술의 혼입에서 작업흐름을 예시하며, 여기서 피드포워드 작제물은 기능적 요소의 적절한 조립체를 혼입하도록 설계되고(예를 들어, 본원의 표 1 참조), DNA 합성에 의해 제조된 다음, AAV 패키징 플라스미드 내로 클로닝된다. 그 다음, 피드포워드 카세트-보유 플라스미드는 Rep/cap 및 헬퍼 플라스미드와 함께 형질감염되어 유전자 전달 요법을 위한 AAV 입자가 생성된다.
도 13은 온전한 신경계 내에 조절된 카세트가 투여된 후 MeCP2의 발현을 예시한다. 도 13a는 AAV 벡터-전달된 단백질 발현의 예측된 분포를 도시한다. 야생형 분포는 천연 MeCP2 단백질의 엄격하게 조절된 발현으로 표현된다. 빗금친 영역을 갖는 벡터 유래(비조절) 분포는 초생리학적 수준의 단백질을 발현하는 세포의 상당 비율을 포함하는, 비-조절된 카세트에 의해 제공되는 발현의 광범위한 분포를 보여준다. 벡터 유래(피드포워드) 작제물은 조절된 카세트에서 제약된 발현에 해당하는 천연 분포와 크게 중첩되는 빗금친 영역을 보여준다. 도 13b(관찰된 결과)는 직접적인 뇌 주사에 의한 대조군 또는 피드포워드 조절된 벡터의 AAV 투여 후 12일차의 마우스 뇌 체감각 피질로부터의 형광 강도 영상화 데이터(세포 단백질 수준의 대리지표)를 도시한다. 처리군당 3마리 마우스의 평균 데이터는 좌측에 도시되며 개별 동물 데이터는 플롯에서 가장 우측에 도시된다. 도 13c는 실험에 사용된 조절된 및 비조절된 피드포워드 AAV 카세트의 개략도를 도시한다.
도 14는 조절된 및 비조절된 AAV 카세트로부터의 벡터 유래 단백질의 뇌 전체 발현을 예시한다. 본 도면은 AAV 주사 후 5주차에 시상주위 마우스 뇌 절편의 항-플래그 태그 면역표지(벡터 유래 단백질을 검출하기 위한)를 보여주는 경사진 공초점 영상을 도시한다.
도 15a 내지 15c는 피드포워드 회로의 결과로서 제약된 전이유전자 발현을 보여주는 형광 영상을 도시한다. 상기 영상은 AAV 주사 후 5주차에 마우스 체감각 피질의 항-MeCP2 전이유전자 면역표지(벡터 유래 전이유전자 생성물을 검출하기 위한)를 보여주는 대표적인 공초점 영상이다. MeCP2 발현의 천연 수준은 도 15a에 도시된다. 도 15b는 조절된 작제물로 처리된 야생형(WT) 마우스에서의 MeCP2 면역반응성을 도시한다. 도 15c는 비조절된 작제물로 처리된 WT 마우스에서의 MECP2 면역반응성을 도시한다. 하단의 개략도는 피드포워드 조절된 및 비조절된 작제물을 도시한다. 도 15d는 정량적 항-Mecp2 면역표지에 의해 측정된 벡터 유래 단백질 발현의 정량화를 도시한다. 발현은 상대적 빈도 분포(마우스/코호트당 1265 내지 2082개 세포의 분석)로 표시된다. 마우스에 1x1011vg/마우스의 용량으로 P1에서 AAV 벡터를 주사하였다. 도 15e는 마우스에 전달된 조절된 및 비조절된 피드포워드 작제물의 개략도를 도시한다.
도 16은 WT 마우스가 4Ex1011 vg/마우스의 AAV9 용량을 투여받은 독성 연구를 도시한다. 시험된 조절된 및 비조절된 작제물은 16a에 도시되어 있다. 생존 및 표현형을 15주 동안 추적하였다. 조절된 작제물은 비조절된 카세트에 비해 안전성 이점을 부여한다. 본 도면은 야생형 마우스에 고용량 벡터(4x1011vg/마우스; P1에서 직접 뇌 주사)를 투여한 생체내 실험을 도시한다. 비조절된 MECP2 카세트를 갖는 용량은 독성 점수 및 치사성의 발달을 초래하였다. 대조적으로, 조절된 카세트는 검출가능한 명백히 해로운 표현형 없이 완전히 용인되었다(tolerated)(16b).
도 17은 조절된 피드 포워드 카세트의 투여가 레트 증후군을 모델링하는 마우스에서 용인되고 치료 효과를 나타냈음을 보여주는 연구를 입증한다. Mepc2-/y 마우스에 고용량의 AAV9 벡터(3x1011vg/마우스; P1에서 직접 뇌 주사)를 투여한 생체내 실험. 생존 및 표현형(RTT 점수)을 15주 동안 추적하였다(17b).
도 18은 조절된 피드 포워드 카세트가 레트 증후군을 모델링하는 마우스에서 특정 임상 특징을 정상화한다는 것을 예시한다. 본 도면은 Mepc2-/y 마우스에 고용량의 피드포워드 카세트(3x1011vg/마우스; P1에서 직접 뇌 주사)를 투여한 생체내 실험을 도시한다. 비히클 처리된 Mecp2-/y 마우스 및 비히클 처리된 야생형에 대한 점수는 비교 목적으로 도시된다. 동일한 용량의 비조절된 카세트로 처리된 마우스는 이들이 모니터링 기간 동안 생존하지 않았기 때문에 도시되지 않았다.
도 19는 피드 포워드 작제물에 사용된 miRNA ffluc1에 대한 가장 가능성 있는 표적외 상호작용 서열을 함유하는 것으로 고려되는 20개 유전자의 RNAseq 발현을 예시한다. ffluc1 miRNA 및 mNeonGreen 리포터 전이유전자를 발현하거나 mNeonGreen 리포터만을 발현하는 플라스미드(19a). 상위 20개의 예측된 인간 표적 mRNA 전사체의 발현 수준을 mRNAseq를 사용하여 측정하였다(19b). FPKM은 리드(read) 백만개당 전사체 킬로베이스를 의미한다. 낮은 FPKM 값은 인간 HEK 293 세포에서 낮은 수준의 전사체 존재비(abundance)를 시사한다.
도 20은 추가 요소(실시예 8에 상세히 설명됨)가 피드 포워드 카세트에 첨가될 때 전이유전자 발현의 효과를 예시한다.
도 21은 염색된 요추 후근 신경절(DRG) 절편으로부터 취한 대표적인 평탄화된 공초점 영상을 상세하게 도시한다. 절편을 10㎛ 두께로 절단하고 항MeCP2 항체 및 DAPI로 염색하고 동일한 공초점 설정을 사용하여 영상화하였다. 도 21a는 마우스에 투여된 카세트를 입증한다. 도 21b는 조절된 및 비조절된 작제물로 처리된 WT 및 Mecp2 녹아웃 마우스로부터의 DRG 절편의 염색을 입증한다. 도 21c는 형광 현미경으로 측정된 MeCP2 수준의 정량화를 도시한다. 도 21d는 각 샘플에서 벡터의 카피 수의 정량화를 도시한다.
도 22는 Mecp2 KO 마우스가 AAV9(22a)의 1Ex1011 vg/마우스의 AAV9 용량을 투여받은 효능 연구를 도시한다. 생존 및 표현형(RTT 점수)을 15주 동안 추적하였다(22b). 상이한 뇌 영역의 웨스턴 블롯 분석은 피드포워드 회로로 제약된 MeCP2 발현을 입증한다(22c).
도 23은 염색된 간 절편으로부터 취한 대표적인 평탄화된 공초점 영상을 상세하게 도시한다. 절편을 10㎛ 두께로 절단하고 항-MeCP2 항체 및 DAPI로 염색하고 동일한 공초점 설정을 사용하여 영상화하였다. 도 23a는 마우스에 투여된 카세트를 입증한다. 도 23b는 비조절된 및 조절된 작제물로 처리된 WT 마우스로부터의 간 절편의 염색을 입증한다. 조절된 작제물은 비조절된 카세트에 비해 벡터 유래 전이유전자의 발현을 제약한다는 것을 유의한다. 도 23c는 형광 신호의 강도에 의해 측정된 MeCP2 수준의 정량화를 도시한다. 도 23d는 각 샘플에서 벡터의 카피 수의 정량화를 도시한다.
도 24는 피드 포워드 작제물에서 사용된 miRNA ffluc1, ran1g 및 ran2g에 대한 가장 가능성 있는 표적외 상호작용 서열인 것으로 고려되는 mRNA의 qRT-PCR 발현을 예시한다. ffluc1, ran1g 또는 ran2g miRNA를 발현하는 플라스미드(24a). hsa-miR-132-3p, hsa-miR-34a-5p 또는 hsa-miR-644a miRNA를 발현하는 대조군 플라스미드(24b). 상위 3개의 예측된 인간 표적 mRNA 전사체의 발현 수준을 qRT-PCR을 사용하여 측정하였다(24c). 양성 대조군 인간 표적 mRNA 전사체의 발현 수준을 qRT-PCR을 사용하여 측정하였다(24d).
도 25a 내지 25c는 용량 민감성의 피드포워드 제어가 다른 용량 민감성 유전자, 이 경우에는 엔젤만 증후군 및 프라더-윌리 증후군에서 파괴된 UBE3A 유전자(25b) 및 CDKL5 결핍 장에서 파괴된 CDKL5 유전자(25c)에 걸쳐 달성될 수 있음을 도시한다.
도 26a 내지 26b는 용량 민감성의 피드포워드 제어가 코돈 최적화된 전이유전자 내의 서열은 표적화하지만 UTR 내의 서열은 그렇지 않는 합성 miRNA에 의해 다른 용량 민감성 유전자, 이 경우에는 SYNGAP1 관련 지적 장애에서 파괴된 SYNGAP1 유전자에 걸쳐 달성될 수 있음을 도시한다.
도 27a 내지 27d 용량 민감성의 피드포워드 제어는 다른 용량 민감성 유전자, 이 경우에는 척수성 근위축증에서 파괴된 SMN1 유전자(27b), 1형 당뇨병에서 파괴된 INS 유전자(27c) 및 프리드라이히 운동실조증에서 파괴된 FXN 유전자(27d)에 걸쳐 달성될 수 있다.
도 28a 내지 28b는 용량 민감성의 피드포워드 제어가 생체내에서 다른 용량 민감성 유전자, 이 경우에는 엔젤만 증후군에서 파괴된 UBE3A 유전자에 걸쳐 달성될 수 있음을 예시한다.
도 29는 ssAAV9에 패키징된 피드포워드 MECP2 작제물의 CDMS 데이터를 도시한다. 전체 길이 피드포워드 생성물은 낮은 수준의 비정상적 또는 부분적인 패키징으로 예상대로 패키징된다. 헤어핀과 같은 2차 DNA 구조는 AAV 입자에서의 효율적인 패키징을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 분석된 피드포워드 작제물에서, (EF1a 또는 MINIX 인트론 내) miRNA 헤어핀의 존재는 예상보다 더 작은 입자의 유의한 패키징/부분적으로 패키징된 입자를 유발하지 않으며, AAV 제제 비론 조성물의 품질에 영향을 미치지 않는다. 완전히 패키징된 MECP2 피드포워드 카세트에 해당하는 우세한 피크는 비어있는(empty) 입자 및 부분적으로 패키징된 게놈의 분포를 나타내는 훨씬 더 작은 피크와 대조된다.
RTT253 작제물:
CMV/CBA 프로모터(서열번호 76)
인간 EF1a 인트론 A(서열번호 5)
ffluc1(서열번호 9)
코작(서열번호 73)
인간 MECP2_e1(서열번호 1)
ffluc1 x3 결합 부위(서열번호 34)
WPRE3(서열번호 75)
SV40pA(서열번호 70)
도 1은 유전자 요법에서 용량 민감성의 문제를 예시한다.
도 2는 유전자 용량이 유전자 요법의 문제이며 매우 좁은 안전 용량범위(safety window)를 초래할 수 있음을 예시한다. 유전자 용량은 유전자 요법의 문제이며 매우 좁은 안전 용량범위를 초래할 수 있다. 예를 들어, 레트 증후군을 모델링하는 마우스는 생존기간 중간값이 약 11주이다. 치료적 유전자 요법 벡터를 이용한 치료는 체중을 정상화하고 40주 생존율을 100%로 증가시킬 수 있다(좌측 상자). 그러나, 이러한 치료 용량의 배가는 치사성을 초래하고(우측), 이는 용량 민감성 및 좁은 안전역(safety margin)을 강조한다.
도 3은 단일 유전자 피드 포워드 유전자 요법 회로가 유세포분석을 사용한 전이유전자 수준의 정량적 평가로 입증된 바와 같이 용량 민감성을 감소시킬 수 있음을 예시한다.
도 4는 임의의 소정 세포에 전달된 전이유전자의 바이러스 수준에 의해 제공되는 전이유전자 발현과 관련된 피드백을 예시하며, 예를 들어 여기서 세포는 차등적으로 감염되고 그렇지 않으면 매우 상이한 수준의 전이유전자를 발현할 것이다. 임의의 소정 세포에 전달된 전이유전자의 바이러스 수준에 의해 제공되는 전이유전자 발현과 관련된 피드백. MECP2는 그 양이 너무 적거나 너무 많으면 질환을 유발하는 용량 민감성 유전자의 일례이다. 유전자 요법에서, 상이한 수준의 형질도입을 수용하는 세포는 상이한 수준의 피드포워드 제어(선의 두께로 표시됨)를 경험할 것이다. 단일 유전자 회로 내에서, 치료적 전이유전자뿐만 아니라 이의 음성 조절인자(합성 miRNA)의 발현은 동일한 입력물(세포에 진입하는 치료적 벡터의 수준)에 의해 구동된다. 증가하는 입력 수준(벡터 수준) 내에서, 회로는 더 높은 수준의 miRNA 매개 하향조절을 달성한다. 결과는 회로가 세포 집단에 걸쳐 보다 고정된 수준의 전이유전자 발현을 유지할 수 있다는 것이다. 이러한 조절의 부제 하에(비-조절된 유전자 요법 카세트), 세포는 음영으로 나타낸 바와 같이 보다 다양한 수준의 벡터 유래 단백질을 발현한다.
도 5는 작제물(카세트)이 상이한 전이유전자를 사용하여 상이한 병태를 치료하거나 전이유전자 발현의 상이한 치료적 수준을 제공하기 위해 최적화될 수 있는 방식을 예시한다 - (A) 피드포워드 작제물의 핵심 성분. (B) 전이유전자 성분은 교체되었지만, 나머지 카세트 성분은 유지되었다. (C) 새로운 인트론/miRNA 및 3'UTR/miRNA-결합 부위(점선)가 도입되었지만, 나머지 카세트 성분은 유지되었다. (D) 비-포유동물 또는 합성 miRNA의 2개 카피는 동일한 인트론으로부터 또는 2개의 상이한 인트론으로부터 발현될 수 있다. 인트론은 5'UTR 내 및/또는 전이유전자의 오픈-리딩-프레임 내에 위치할 수 있다. (E) 3'UTR은 비-포유동물 또는 합성 miRNA 결합 부위의 1개, 3개 또는 6개 카피 또는 그 사이의 임의의 수를 함유할 수 있다.
도 6은 합성 miRNA가 코돈 최적화된 전이유전자 내의 서열은 표적화하지만 UTR 내의 서열은 그렇지 않은 작제물을 예시한다.
도 7a 내지 7b는 FACS에 의해 평가된 MeCP2-NeonGreen 단백질 수준에 미치는 비-포유동물 miRNA 발현의 효과를 예시한다. (A) 천연 miRNA뿐만 아니라 (B) 포유동물 게놈 내의 예측된 결합 부위가 없는 비-포유동물 또는 합성 miRNA를 사용한 피드포워드의 입증. 피드포워드 작제물(최하단 선)을 스크램블된 miRNA 결합 부위를 함유하므로 miRNA 조절이 없는 대조군 작제물(최상단 선)과 비교하였다(모든 후속 실험은 이러한 동일한 구조를 따른다). 피드포워드 작제물은 3'UTR 내에 3개의 비-포유동물 miRNA 결합 부위를 함유하였다. 그래프는 mRuby 수준(x축 - 세포에 대한 플라스미드 양의 측정값이며 miRNA 조절의 영향을 받지 않음) 대 MeCP2-NeonGreen(y축 - miRNA에 의해 조절되는 단백질)을 도시한다. 상단 그래프는 당업계의 Strovas 간행물에 설명된 피드포워드 회로에서 사용된 내인성 포유동물 miRNA인 miR124-3에 대한 결과를 도시한다. 하단 그래프는 원래 반딧불이 루시페라제 형광 단백질을 녹다운하도록 설계된 비-포유동물 miRNA인 ffluc1에 대한 결과를 도시한다. 결과는 두 miRNA 모두가, 선형 회귀선의 기울기 차이로 나타나는 바와 같이, 대조군과 비교하여 피드포워드 샘플에서 MeCP2 발현을 조절하는 데 효과적임을 보여준다.
도 8a 내지 8b는 비-포유동물 miRNA를 예시한다. 유전자 요법 카세트에 혼입될 수 있고 비-포유동물 또는 합성 miRNA를 보유하여 피드포워드 제어를 달성할 수 있는 컴팩트 인트론의 예(본 실험 및 후속 실험에서 miRNA는 이전 도면에서 설명된 합성 반딧불이 루시페라제(ffluc1)이다)는 프로모터와 MECP2 코딩 서열 사이에 위치한 인트론으로부터 발현된다. 비-포유동물 miRNA의 강력한 발현은 이 인트론의 효율적인 스플라이싱에 의존하며 상이한 인트론의 사용은 상이한 수준의 단백질 조절을 가능하게 한다. 비-포유동물 miRNA가 인간 EF1a 유전자의 인트론 1로부터 또는 작은 합성 인트론(MINIX)으로부터 발현되는 피드포워드 분자를 만들었다. 작제물은 3'UTR 내에 3개의 비포유동물 miRNA 결합 부위를 함유하였다. 두 인트론 모두는 MeCP2 수준의 강력한 조절을 나타내는 반면, 선형 회귀선의 감소된 기울기에서 볼 수 있는 바와 같이, MINIX 인트론은 더 낮은 수준의 플라스미드 발현에서 대조군과 유사한 수준의 MeCP2 발현을 나타낸다. 이는 더 낮은 플라스미드 수준에서는 치료적 수준의 단백질을 전달하지만 더 높은 수준의 플라스미드 전달에서는 단백질 독성을 방지할 것이기 때문에, 이것은 치료적으로 유익한 것으로 고려된다.
도 9a 내지 9c는 3'UTR 내의 비-포유동물 miRNA 결합 부위의 수 변화를 예시한다. 3'UTR 내의 1개, 3개 또는 6개의 비포유동물 miRNA 결합 부위를 갖는 3가지 상이한 작제물을 제조하고 FACS로 평가하였다. 3개 또는 6개의 결합 부위를 갖는 작제물은 선형 회귀선의 감소된 기울기에 의해 나타난 바와 같이 MeCP2 수준의 보다 유의한 억제를 보여주었다. 피드포워드 제어의 강도 및 이에 따른 용량 무감응은 비-포유동물 또는 합성 miRNA 결합 부위의 수를 변경함으로써 미세-조정될 수 있다.
도 10a 내지 10d는 결합 부위 내에 1bp 중앙 벌지(bulge), 3bp 중앙 벌지, 또는 miRNA 시드 서열만이 존재하는 3'미스매치를 갖는 3가지 상이한 작제물을 이용하여 비-포유동물 miRNA 결합 부위 내의 미스매치의 효과를 예시한다. 비변형된 결합 부위를 갖는 작제물과 비교하여, 이들 작제물은 단백질 수준의 현저하게 적은 억제를 나타냈으며, 3가지 모두 유사한 수준의 억제를 나타냈다. 피드포워드 제어의 강도 및 이에 따른 용량 무감응은 비-포유동물 또는 합성 miRNA 결합 부위 내에 미스매치를 혼입함으로써 미세-조정될 수 있다.
도 11은 비-포유동물 miRNA 피드포워드 메커니즘이 다른 관련 뇌 장애에서도 효과적인지 여부를 예시하며, 여기서 작제물은 MECP2를 UBE3A 단백질(이 유전자의 돌연변이는 엔젤만 증후군을 야기한다)에 대한 코딩 서열로 대체함으로써 제조되었다. 3'UTR은 이전 실험에서 사용된 것과 동일한 ffluc1 miRNA에 대한 3개의 비-포유동물 miRNA 결합 부위를 함유하였다. 다시 한 번, 비-포유동물 miRNA 결합 부위를 갖는 플라스미드는 스크램블된 miRNA 결합 부위 서열을 갖는 플라스미드에 비해 감소된 단백질 발현을 나타냈다. UBE3A 단백질 수준은 피드포워드 비-포유동물 miRNA 메커니즘과 독립적으로, 내인성 세포 메커니즘에 의해 부분적으로 조절될 수 있다고 가정되었다. 용량 민감성의 피드포워드 제어는 다른 용량 민감성 유전자, 이 경우에는 엔젤만 증후군 및 프라더-윌리 증후군에서 파괴된 UBE3A 유전자에 걸쳐 달성될 수 있다.
도 12는 피드포워드 유전자 요법 기술의 혼입에서 작업흐름을 예시하며, 여기서 피드포워드 작제물은 기능적 요소의 적절한 조립체를 혼입하도록 설계되고(예를 들어, 본원의 표 1 참조), DNA 합성에 의해 제조된 다음, AAV 패키징 플라스미드 내로 클로닝된다. 그 다음, 피드포워드 카세트-보유 플라스미드는 Rep/cap 및 헬퍼 플라스미드와 함께 형질감염되어 유전자 전달 요법을 위한 AAV 입자가 생성된다.
도 13은 온전한 신경계 내에 조절된 카세트가 투여된 후 MeCP2의 발현을 예시한다. 도 13a는 AAV 벡터-전달된 단백질 발현의 예측된 분포를 도시한다. 야생형 분포는 천연 MeCP2 단백질의 엄격하게 조절된 발현으로 표현된다. 빗금친 영역을 갖는 벡터 유래(비조절) 분포는 초생리학적 수준의 단백질을 발현하는 세포의 상당 비율을 포함하는, 비-조절된 카세트에 의해 제공되는 발현의 광범위한 분포를 보여준다. 벡터 유래(피드포워드) 작제물은 조절된 카세트에서 제약된 발현에 해당하는 천연 분포와 크게 중첩되는 빗금친 영역을 보여준다. 도 13b(관찰된 결과)는 직접적인 뇌 주사에 의한 대조군 또는 피드포워드 조절된 벡터의 AAV 투여 후 12일차의 마우스 뇌 체감각 피질로부터의 형광 강도 영상화 데이터(세포 단백질 수준의 대리지표)를 도시한다. 처리군당 3마리 마우스의 평균 데이터는 좌측에 도시되며 개별 동물 데이터는 플롯에서 가장 우측에 도시된다. 도 13c는 실험에 사용된 조절된 및 비조절된 피드포워드 AAV 카세트의 개략도를 도시한다.
도 14는 조절된 및 비조절된 AAV 카세트로부터의 벡터 유래 단백질의 뇌 전체 발현을 예시한다. 본 도면은 AAV 주사 후 5주차에 시상주위 마우스 뇌 절편의 항-플래그 태그 면역표지(벡터 유래 단백질을 검출하기 위한)를 보여주는 경사진 공초점 영상을 도시한다.
도 15a 내지 15c는 피드포워드 회로의 결과로서 제약된 전이유전자 발현을 보여주는 형광 영상을 도시한다. 상기 영상은 AAV 주사 후 5주차에 마우스 체감각 피질의 항-MeCP2 전이유전자 면역표지(벡터 유래 전이유전자 생성물을 검출하기 위한)를 보여주는 대표적인 공초점 영상이다. MeCP2 발현의 천연 수준은 도 15a에 도시된다. 도 15b는 조절된 작제물로 처리된 야생형(WT) 마우스에서의 MeCP2 면역반응성을 도시한다. 도 15c는 비조절된 작제물로 처리된 WT 마우스에서의 MECP2 면역반응성을 도시한다. 하단의 개략도는 피드포워드 조절된 및 비조절된 작제물을 도시한다. 도 15d는 정량적 항-Mecp2 면역표지에 의해 측정된 벡터 유래 단백질 발현의 정량화를 도시한다. 발현은 상대적 빈도 분포(마우스/코호트당 1265 내지 2082개 세포의 분석)로 표시된다. 마우스에 1x1011vg/마우스의 용량으로 P1에서 AAV 벡터를 주사하였다. 도 15e는 마우스에 전달된 조절된 및 비조절된 피드포워드 작제물의 개략도를 도시한다.
도 16은 WT 마우스가 4Ex1011 vg/마우스의 AAV9 용량을 투여받은 독성 연구를 도시한다. 시험된 조절된 및 비조절된 작제물은 16a에 도시되어 있다. 생존 및 표현형을 15주 동안 추적하였다. 조절된 작제물은 비조절된 카세트에 비해 안전성 이점을 부여한다. 본 도면은 야생형 마우스에 고용량 벡터(4x1011vg/마우스; P1에서 직접 뇌 주사)를 투여한 생체내 실험을 도시한다. 비조절된 MECP2 카세트를 갖는 용량은 독성 점수 및 치사성의 발달을 초래하였다. 대조적으로, 조절된 카세트는 검출가능한 명백히 해로운 표현형 없이 완전히 용인되었다(tolerated)(16b).
도 17은 조절된 피드 포워드 카세트의 투여가 레트 증후군을 모델링하는 마우스에서 용인되고 치료 효과를 나타냈음을 보여주는 연구를 입증한다. Mepc2-/y 마우스에 고용량의 AAV9 벡터(3x1011vg/마우스; P1에서 직접 뇌 주사)를 투여한 생체내 실험. 생존 및 표현형(RTT 점수)을 15주 동안 추적하였다(17b).
도 18은 조절된 피드 포워드 카세트가 레트 증후군을 모델링하는 마우스에서 특정 임상 특징을 정상화한다는 것을 예시한다. 본 도면은 Mepc2-/y 마우스에 고용량의 피드포워드 카세트(3x1011vg/마우스; P1에서 직접 뇌 주사)를 투여한 생체내 실험을 도시한다. 비히클 처리된 Mecp2-/y 마우스 및 비히클 처리된 야생형에 대한 점수는 비교 목적으로 도시된다. 동일한 용량의 비조절된 카세트로 처리된 마우스는 이들이 모니터링 기간 동안 생존하지 않았기 때문에 도시되지 않았다.
도 19는 피드 포워드 작제물에 사용된 miRNA ffluc1에 대한 가장 가능성 있는 표적외 상호작용 서열을 함유하는 것으로 고려되는 20개 유전자의 RNAseq 발현을 예시한다. ffluc1 miRNA 및 mNeonGreen 리포터 전이유전자를 발현하거나 mNeonGreen 리포터만을 발현하는 플라스미드(19a). 상위 20개의 예측된 인간 표적 mRNA 전사체의 발현 수준을 mRNAseq를 사용하여 측정하였다(19b). FPKM은 리드(read) 백만개당 전사체 킬로베이스를 의미한다. 낮은 FPKM 값은 인간 HEK 293 세포에서 낮은 수준의 전사체 존재비(abundance)를 시사한다.
도 20은 추가 요소(실시예 8에 상세히 설명됨)가 피드 포워드 카세트에 첨가될 때 전이유전자 발현의 효과를 예시한다.
도 21은 염색된 요추 후근 신경절(DRG) 절편으로부터 취한 대표적인 평탄화된 공초점 영상을 상세하게 도시한다. 절편을 10㎛ 두께로 절단하고 항MeCP2 항체 및 DAPI로 염색하고 동일한 공초점 설정을 사용하여 영상화하였다. 도 21a는 마우스에 투여된 카세트를 입증한다. 도 21b는 조절된 및 비조절된 작제물로 처리된 WT 및 Mecp2 녹아웃 마우스로부터의 DRG 절편의 염색을 입증한다. 도 21c는 형광 현미경으로 측정된 MeCP2 수준의 정량화를 도시한다. 도 21d는 각 샘플에서 벡터의 카피 수의 정량화를 도시한다.
도 22는 Mecp2 KO 마우스가 AAV9(22a)의 1Ex1011 vg/마우스의 AAV9 용량을 투여받은 효능 연구를 도시한다. 생존 및 표현형(RTT 점수)을 15주 동안 추적하였다(22b). 상이한 뇌 영역의 웨스턴 블롯 분석은 피드포워드 회로로 제약된 MeCP2 발현을 입증한다(22c).
도 23은 염색된 간 절편으로부터 취한 대표적인 평탄화된 공초점 영상을 상세하게 도시한다. 절편을 10㎛ 두께로 절단하고 항-MeCP2 항체 및 DAPI로 염색하고 동일한 공초점 설정을 사용하여 영상화하였다. 도 23a는 마우스에 투여된 카세트를 입증한다. 도 23b는 비조절된 및 조절된 작제물로 처리된 WT 마우스로부터의 간 절편의 염색을 입증한다. 조절된 작제물은 비조절된 카세트에 비해 벡터 유래 전이유전자의 발현을 제약한다는 것을 유의한다. 도 23c는 형광 신호의 강도에 의해 측정된 MeCP2 수준의 정량화를 도시한다. 도 23d는 각 샘플에서 벡터의 카피 수의 정량화를 도시한다.
도 24는 피드 포워드 작제물에서 사용된 miRNA ffluc1, ran1g 및 ran2g에 대한 가장 가능성 있는 표적외 상호작용 서열인 것으로 고려되는 mRNA의 qRT-PCR 발현을 예시한다. ffluc1, ran1g 또는 ran2g miRNA를 발현하는 플라스미드(24a). hsa-miR-132-3p, hsa-miR-34a-5p 또는 hsa-miR-644a miRNA를 발현하는 대조군 플라스미드(24b). 상위 3개의 예측된 인간 표적 mRNA 전사체의 발현 수준을 qRT-PCR을 사용하여 측정하였다(24c). 양성 대조군 인간 표적 mRNA 전사체의 발현 수준을 qRT-PCR을 사용하여 측정하였다(24d).
도 25a 내지 25c는 용량 민감성의 피드포워드 제어가 다른 용량 민감성 유전자, 이 경우에는 엔젤만 증후군 및 프라더-윌리 증후군에서 파괴된 UBE3A 유전자(25b) 및 CDKL5 결핍 장에서 파괴된 CDKL5 유전자(25c)에 걸쳐 달성될 수 있음을 도시한다.
도 26a 내지 26b는 용량 민감성의 피드포워드 제어가 코돈 최적화된 전이유전자 내의 서열은 표적화하지만 UTR 내의 서열은 그렇지 않는 합성 miRNA에 의해 다른 용량 민감성 유전자, 이 경우에는 SYNGAP1 관련 지적 장애에서 파괴된 SYNGAP1 유전자에 걸쳐 달성될 수 있음을 도시한다.
도 27a 내지 27d 용량 민감성의 피드포워드 제어는 다른 용량 민감성 유전자, 이 경우에는 척수성 근위축증에서 파괴된 SMN1 유전자(27b), 1형 당뇨병에서 파괴된 INS 유전자(27c) 및 프리드라이히 운동실조증에서 파괴된 FXN 유전자(27d)에 걸쳐 달성될 수 있다.
도 28a 내지 28b는 용량 민감성의 피드포워드 제어가 생체내에서 다른 용량 민감성 유전자, 이 경우에는 엔젤만 증후군에서 파괴된 UBE3A 유전자에 걸쳐 달성될 수 있음을 예시한다.
도 29는 ssAAV9에 패키징된 피드포워드 MECP2 작제물의 CDMS 데이터를 도시한다. 전체 길이 피드포워드 생성물은 낮은 수준의 비정상적 또는 부분적인 패키징으로 예상대로 패키징된다. 헤어핀과 같은 2차 DNA 구조는 AAV 입자에서의 효율적인 패키징을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 분석된 피드포워드 작제물에서, (EF1a 또는 MINIX 인트론 내) miRNA 헤어핀의 존재는 예상보다 더 작은 입자의 유의한 패키징/부분적으로 패키징된 입자를 유발하지 않으며, AAV 제제 비론 조성물의 품질에 영향을 미치지 않는다. 완전히 패키징된 MECP2 피드포워드 카세트에 해당하는 우세한 피크는 비어있는(empty) 입자 및 부분적으로 패키징된 게놈의 분포를 나타내는 훨씬 더 작은 피크와 대조된다.
RTT253 작제물:
CMV/CBA 프로모터(서열번호 76)
인간 EF1a 인트론 A(서열번호 5)
ffluc1(서열번호 9)
코작(서열번호 73)
인간 MECP2_e1(서열번호 1)
ffluc1 x3 결합 부위(서열번호 34)
WPRE3(서열번호 75)
SV40pA(서열번호 70)
본 발명의 전이유전자 표적화 작제물에서의 개념 증명은 신경계 장애 레트 증후군과 관련하여 생성되었다. 레트 증후군은 X-연관 유전자 MECP2의 기능 상실 돌연변이에 의해 유발된다. 이 장애에 대한 매력적인 치료 접근법은 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 사용하여 MECP2 유전자의 기능적 카피를 신경계에 전달하는 것이지만, 이 접근법의 주요 장애물은 세포가 바이러스 벡터의 다수 카피로 감염되어 MECP2 유전자의 과발현을 야기할 수 있다는 것이다. 본 발명자들은 이전에 MECP2 유전자의 과발현이 심각한 독성을 야기할 수 있음을 밝혀냈다. 임상적으로, 인간에서 MECP2 유전자의 중복은 뚜렷하고 심각한 신경계 장애인 MECP2 과발현 증후군을 야기하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 의해 설명된 작제물을 사용함으로써, 세포가 바이러스 벡터의 다수 카피로 감염된 경우에도 세포에서 발현되는 MECP2의 수준을 제한할 수 있다. 이것은 MECP2 유전자 요법 개입의 안전성 용량범위를 크게 증가시키고 더 높은 바이러스 용량이 투여될 수 있게 하여, 더 많은 수의 세포가 감염되고 보다 강력한 질환 역전이 달성될 수 있도록 한다.
이러한 예에서, 전이유전자는 신경계 장애 레트 증후군에서 돌연변이된 유전자인 MECP2 유전자의 단백질 코딩 서열의 WT 또는 코돈 최적화된 카피이다. 작제물은 전이유전자 수준을 제어할 수 있는 2가지 요소를 함유한다. 제1 요소는 프로모터와 전이유전자 사이에 위치한 인트론 내에 함유된 비-포유동물 또는 합성 마이크로 RNA 서열이다. 이러한 비-포유동물 또는 합성 마이크로 RNA 함유 인트론은 프리-mRNA 프로세싱 동안 스플라이싱될 것이다. 그 다음, 포유동물 또는 합성 miRNA는 프로세싱되어, 표적 전사체를 분해할 수 있는 성숙한 miRNA를 생성할 것이다. 따라서, miRNA는 합성이거나 비-포유동물, 곤충 공급원으로부터 유래되기 때문에, 포유동물 게놈 내에 알려진 표적외 효과가 없다. 작제물의 제2 요소는 인트론으로부터 생산된 비-포유동물 또는 합성 miRNA와 매치되는 작제물의 3'UTR 내의 다수의 비-포유동물 또는 miRNA 결합 부위이다. 이들 결합 부위의 존재는 전이유전자가 전달된 마이크로 RNA에 대한 표적이 되도록 한다. 이는 전이유전자의 수준 감소를 야기하고 과발현을 방지한다.
피드포워드 원리의 대안적인 구현예에서, 비-포유동물 또는 합성 마이크로 RNA는 유전자 요법 합성 카세트 인트론 내에서 전달될 수 있다. 3'UTR 내의 마이크로 RNA 결합을 표적화하는 대신에, 비-포유동물 또는 합성 마이크로 RNA는 대신 전이유전자의 코돈 최적화된 단백질 코딩 서열 내에서 생성되는 독특한(포유동물 게놈 내) 마이크로 RNA 결합 영역에 결합하고, 포유동물 게놈 내에 상응하는 결합 부위를 갖지 않는다; 즉, 상기 miRNA 결합 영역은 독특한 합성 결합 영역이다). 이 버전의 피드포워드 시스템은 더 콤팩트하게 만들 수 있다. 이는 바이러스 벡터의 패키징 성능에 접근하는 더 큰 유전자에 특히 유리할 수 있다.
단일 유전자 루프는 일정한 수준의 발현을 가능하게 하고, 이에 의해 회로는 광범위한 유전자 용량에 걸쳐 비교적 고정된 수준의 발현을 유지할 수 있다(즉, 원하는 용량 무감응을 나타낸다). 실험 시스템은 유전자 용량의 변화가 유전자 발현의 상대적인 변화를 훨씬 더 작게 만드는 용법을 생성한다. 이는 형질도입된 세포 집단 전체에 걸쳐 광범위하고 균일한 발현을 달성하는 것을 목표로 하는 유전자 요법에 적용될 때 중요한 특징이며, 증가된 바이러스 벡터 투여를 가능하게 하여 동반 과발현 효과 없이 더 높은 형질도입률을 달성할 수 있게 한다.
실시예
실시예 1
전이유전자 발현의 조절을 가능하게 하면서 표적외 효과의 결여를 보장하기 위해, 포유동물 게놈에 결합할 수 없는 합성 비포유동물 miRNA(ffluc1) 또는 합성 miRNA와 조합된 비포유동물 miRNA 결합 부위 또는 합성 miRNA 결합 부위를 사용할 수 있다. 적합하게는 표 1에 의해 기재된 작제물이 제공될 수 있다.
* 3'UTR 내의 결합 부위, ** 코돈 최적화된 전이유전자 서열 내의 결합 부위.
표 1. 주요 적응증에 대한 유전자 요법 작제물의 요약 및 경험적 테스트와 설계 제약에 기반한 피드포워드 성분의 선택. 이들 구현예는 핵심적인 용량 민감성 유전자에 관한 것이지만, 당업자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 동일한 피드 포워드 설계가, 공지되어 있을 수 있거나 특정 조건과 관련하여 결정된 다른 용량 민감성 유전자에도 적용될 수 있다.
본원에 논의된 바와 같이, 피드포워드 시스템은 CAG, UBC, SV40, PGK, 시냅신1, 뉴런-특이적 에놀라제, U6, GFAP, MAG, MPZ를 포함하는 대안적인 편재하는 세포 유형-특이적 프로모터를 사용하여 작제할 수 있다. 인트론은 비-포유동물 또는 합성 miRNA 서열을 수용할 수 있는 임의의 합성 또는 내인성 인트론을 포함할 수 있고, 단백질 코딩 서열의 상류일 수 있거나, 단백질 코딩 서열 내의 인트론, 또는 하나 초과의 비-포유동물 또는 합성 miRNA이 단일 전이유전자 카세트로부터 생성되는 조합일 수 있다. 비-포유동물 또는 합성 miRNA는 번역된 및 비번역된 영역을 포함하는 전이유전자 카세트 내의 인식 부위를 표적화하는 임의의 비-포유동물 또는 합성 miRNA일 수 있다. 유전자는 유전자 용량이 유전자 전달의 효과를 혼란스럽게 만드는 임의의 용량 민감성 유전자일 수 있다. 결합 부위의 수는 원하는 용량 무감응 수준으로 미세-조정될 수 있고 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 전이유전자 카세트의 성능 내의 임의의 수의 범위일 수 있다. 폴리A 신호는 적합하게는 예를 들어 SV40, BGH 또는 통상적으로 사용되는 임의의 천연 또는 합성 폴리A 신호일 수 있다.
Neuro2a 세포를 내장된 피드포워드 메커니즘이 있거나 없는 다양한 작제물로 형질감염시켰고, MECP2 전이유전자 발현 수준을 유세포분석으로 평가하였다. 작제물 상의 별도의 형광 마커를 사용하여 각 세포에 전달된 작제물의 수준을 모니터링하였다(용량의 대리지표). 피드포워드 제어 요소가 포함된 작제물은 이러한 요소를 포함하지 않은 것보다 훨씬 더 좁은 범위의 MECP2 전이유전자 발현을 보여주었다. 전도 유망하게, 전달된 작제물의 양이 증가함에 따라 이들 요소의 감쇠 효과가 증가하였고, 이는 제어 요소가 치료적 수준에서 유전자의 발현을 방해하지 않으면서 독성을 완화할 수 있음을 시사한다. 따라서, 용량 민감성의 미세 조정이 제공될 수 있다.
실시예 2
피드포워드 카세트를 마우스에게 투여하여 세포에서 제약된 전이유전자 발현을 제공할 수 있다. 야생형 마우스에게 전이유전자 플래그 태그 부착된 Mecp2를 투여하였고 전이유전자 발현을 체감각 피질 뉴런에서 모니터링하였다. 전이유전자는 피드포워드 조절 시스템을 함유하거나 함유하지 않는 AAV 벡터로 전달하였다. 피드포워드 조절 시스템은 miRNA ffluc1(서열번호 9) 및 EF1a 프로모터를 이용하였다. 3개의 ffluc1 결합 부위(서열번호 34)는 Mecp2 서열 뒤에 제공하였다. 도 13c는 마우스에 투여된 바이러스 벡터의 도식적 표현을 나타낸다. 조절된(피드 포워드) 카세트로 처리된 마우스 및 비조절된(피드 포워드 메커니즘 없음) 카세트로 처리된 마우스에서 관찰된 MeCP2 발현. 조절된 카세트는 지속적으로 제약된 발현(단백질 수준)을 초래하고 매우 높은 수준의 벡터 유래 단백질을 발현하는 세포의 꼬리를 방지한다. 삽도는 비조절된(밝지만 가변적임) 및 조절된(세포에 걸쳐 보다 균일한 발현)을 발현하는 마우스 뇌의 대표적인 현미경 사진을 도시한다. 적합하게는, 피드 포워드 메커니즘을 사용함으로써, 바이러스 벡터를 사용하여 투여된 전이유전자에 대한 제약된 단백질 발현을 보장할 수 있다.
실시예 3
피드포워드 조절 메커니즘을 사용하여 조직 전반에 걸친 전이유전자 발현의 적절한 분포를 보장할 수 있다. 도 14는 조절된 샘플에서 보다 일관된 MeCP2-FLAG 발현 수준을 입증한다. 벡터 유래 단백질의 분포는 두 샘플 모두에 걸쳐 광범위하지만, 조절된 카세트에는 비조절된 버전에 비해 핫스팟(hotspot) 및 발현의 구배가 대체로 없다. 따라서, 적합하게는, 피드포워드 메카니즘을 사용하여 세포, 조직 또는 기관의 집합체에 걸쳐 적절한 농도에서 전이유전자의 단백질 발현을 제어할 수 있다.
실시예 4
피드포워드 조절 메커니즘을 사용하여 신피질 전반에 걸쳐 전이유전자의 제약된 발현을 보장할 수 있다. 도 15는 피드포워드 조절 메커니즘이 있거나 없는 AAV 카세트에서 마우스에 전달된 외인성 MeCP2와 비교한 천연 MeCP2의 발현을 입증한다.
AAV9 캡시드에 패키징된 AAV2 ITR에 의해 측접된 작제물을 포함하는 단일 가닥 AAV(ssAAV) 입자는 UPV Viral Vector Production Unit(Universitat Autonoma de Barcelona)에서 HEK293 세포의 형질감염에 의해 생산되었다.
이용된 miRNA는 ffluc1(서열번호 9)이었고, 3 x ffluc1 결합 부위(서열번호 34)는 Mecp2 유전자 서열 뒤에 제공하였다. 발현은 조절된 영상(15b)에서 세포에 걸쳐 균일하며(그러나 조합된 천연 신호와 벡터 유래 신호로 인해 약간 더 높다), 이는 제약된 발현을 입증한다. 대조적으로, 비조절된 카세트 샘플(15c)은 매우 높은 수준의 MeCP2를 발현하는 세포 집단을 포함하는 세포 집단에 걸쳐 가변적인 수준의 면역반응성을 나타낸다. 이들 샘플의 정량화(15d)는 피드 포워드 카세트를 사용할 때의 좁게 제약된 발현을 보여준다.
실시예 5
적합하게는, 피드포워드 카세트는 유해한 건강 효과 없이 생체내 투여될 수 있다. 표현형 평가를 피드포워드 조절된 카세트가 투여된 야생형 마우스에서 수행하였다. ffluc1(서열번호 9) miRNA 및 코돈-최적화된 인간 MECP2 전이유전자를 발현하는 조절된 작제물을 투여하였다. 비조절된 작제물은 코돈-최적화된 인간 MECP2 전이유전자만을 발현하였다. MeP426 비조절된 작제물은 이전에 문헌[Gadalla KKE, Vudhironarit T, Hector RD, Sinnett S, Bahey NG, Bailey MES, Gray SJ, Cobb SR. Development of a Novel AAV Gene Therapy Cassette with Improved Safety Features and Efficacy in a Mouse Model of Rett Syndrome. Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Jun 16;5:180-190]에 의해 설명된 내인성 마우스 Mecp2 프로모터의 제어 하에 야생형 인간 MECP2를 발현하였다.
도 16은 피드포워드 회로를 사용할 때 제약된 전이유전자 발현이 있음을 보여주는 고용량 연구를 도시한다. 이러한 제약된 전이유전자 발현은 비조절된 카세트에 비해 안전성 이점을 부여한다. 본 도면은 야생형 마우스에 고용량 벡터(4x1011 vg/마우스; P1에서 직접 뇌 주입)를 투여한 생체내 실험을 도시한다. 비조절된 MECP2 카세트(16a)를 사용한 용량은 독성 점수 및 치사성의 발달을 초래하였다(16b). 대조적으로, 조절된 카세트는 검출가능한 명백히 해로운 표현형 없이 완전히 용인되었다.
실시예 6
적합하게는, 피드 포워드 메커니즘은 포유동물 게놈의 다른 서열과 상호작용하지 않는다.
곤충 유래 miRNA 서열(ffluc1; 서열번호 9) 또는 신규 합성 miRNA 서열(ran1g; 서열번호 17 및 ran2g; 서열번호 18) 중 하나인, 피드포워드 작제물에서 발현되는 miRNA는 포유동물 전사체 내에 예측된 내인성 표적을 갖지 않는다.
이를 검증하기 위해, mirDB 표적외 예측 도구를 사용하여 miRNA 서열 ffluc1, ran1g 및 ran2g의 가장 가능성이 있는 인간 mRNA 표적을 예측하였다. 잠재적인 인간 표적 유전자/전사체는 miRNA의 시드 서열과 매치되는 유전자/전사체 서열 내의 표적 부위 수에 기반하여 등급화하였다.
ffluc1 miRNA 및 리포터 전이유전자를 발현하는 플라스미드를 생성하였다(도 19a). 상기 플라스미드는 mNeonGreen 리포터 전이유전자의 발현을 유도하는 hEF1a 프로모터를 함유하였다. ffluc1 miRNA는 hEF1a 프로모터와 전이유전자 사이에 위치한 EF1a 인트론 내에서 발현되었다. HEK 293 세포는 리포펙타민을 사용하여 100㎍의 각 플라스미드로 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 용해시키고 MagMAX-96 총 RNA 단리 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 총 RNA를 단리하였다. 샘플을 풀링하여 각 테스트 플라스미드에 대해 3개의 생물학적 복제물을 생성하였다. 각각의 생물학적 복제물에서 RNAseq를 수행하고 리드 계수(FPKM: 리드 백만개당 전사체 킬로베이스당 단편)를 사용하여 개별 인간 표적 전사체의 발현 수준을 비교하였다.
도 19는 ffluc1의 상위 20개의 예측된 인간 mRNA 표적의 분석을 도시하며, 이는 샘플 세트와 대조군 사이의 발현 수준에 유의차가 없었음을 보여준다. 결과는 ffluc1의 과발현이 임의의 예측된 인간 표적 유전자에서 표적외 효과를 갖지 않는다는 것을 확인시켜준다.
따라서, 적합하게는 본 발명은 포유동물 숙주 세포에서 내인성 유전자 발현에 영향을 미치지 않으면서 전이유전자 발현을 조절하는 방법을 제공한다.
실시예 7
적합하게는, 피드 포워드 메커니즘을 사용하여, 임상 병태의 표현형을 개선하기 위한 안전하고 효과적인 치료를 제공할 수 있다.
피드포워드 MECP2 작제물을 발현하는 AAV 벡터를 혼합 CBA/C57 배경에서 유지된 야생형(WT) 및 Mecp2 녹아웃(KO) 마우스에서 테스트하였다. 조절된(ffluc1; 서열번호 9) 또는 비조절된 MECP2를 발현하는 ssAAV를 뇌실내(ICV) 투여에 의해 생후 (P)0/1일 수컷의 뇌에 양측 주사하였다. 대조군 주사는 벡터 없이 동일한 희석제를 사용하였다(비히클 대조군). 주사된 새끼들을 홈 케이지로 되돌려 놓고 4주령부터 매주 평가하였다. 마우스는 생후 15주령까지 또는 이들의 인도적인 종점에 도달할 때까지 모니터링하였다. 도 17b는 모든 처리 조건 하에서 WT 및 KO 마우스의 임상 점수 및 생존을 도시한다. 비조절된 MECP2 카세트를 사용한 용량은 독성을 유발하고 생존율을 감소시켰다. 대조적으로, 조절된 카세트를 사용한 용량은 완전히 용인되었고 마우스는 비조절된 피드포워드 카세트 또는 비히클로 처리된 마우스와 비교하여 덜 중증의 임상 점수(레트-유사 표현형에 대해)를 나타냈다. 따라서, 조절된 메커니즘은 KO 마우스에서 안전한 투여 및 표현형의 임상 중증도의 교정 둘 다를 보여준다.
도 18은 상기 데이터를 더욱 확장하여, RETT 증후군을 모델링하는 마우스에서 나타난 특정 임상 특징을 측정한다. Mecp2 -/y 마우스(KO)에서 ffluc1 조절된 카세트의 투여는 레트-유사 표현형의 범위에 걸쳐 부분적인 개선을 초래하였다. 이는 비조절된 작제물로 처리된 KO 마우스에서는 나타나지 않았는데, 마우스가 표현형 테스트를 받을 수 있는 단계까지 생존하지 않았기 때문이다.
실시예 8
작제물이 제공될 수 있으며, 여기서 상기 작제물은 향상된 발현, 조절 및 안정성을 제공하도록 변형된다. 작제물은 이들이 리포터 전이유전자를 함유하도록 제공될 수 있다. 작제물은 강력한 발현을 촉진하는 코작 서열을 함유할 수 있다. 작제물은 3'UTR 내에 안정성 요소를 추가로 함유할 수 있다. 작제물은 miRNA 결합의 효능을 감소시키도록(그러나 완전히 개선하지는 않도록) 조작된 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 결합 부위를 추가로 포함할 수 있다. 일부 예시적인 작제물은 하기 표 2에 상세히 설명되어 있다.
표 2: 발현 수준의 엄격한 조절을 유지하면서 전이유전자 발현을 향상시키도록 설계된 유전자 요법 작제물의 요약. 경험적 테스트 및 설계 제약에 기반한 피드포워드 메커니즘의 요소. 이들 구현에는 핵심적인 용량 민감성 MeCP2에 관한 것이지만, 당업자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 동일한 피드 포워드 설계가, 공지되어 있을 수 있거나 특정 조건과 관련하여 결정된 다른 용량 민감성 유전자에도 적용될 수 있다. 상기 언급한 특징의 임의의 조합이 피드 포워드 작제물의 생성에 사용될 수 있음을 이해해야 하다. 또한, 이들 작제물은 예시적이며 상기 언급된 특징 중 임의의 것은 피드 포워드 카세트를 생성하기 위해 표 3 및 표 4에 언급된 임의의 요소와 결합될 수 있음을 인식해야 한다.
도 20은 조절된 카세트에서 MeCP2 발현에 대해 상기 기재된 추가 요소들의 효과가 있음을 입증한다. 분류된 특징은 HEK293T 세포에 투여된 카세트의 용량에 비례하는 전이유전자 발현 수준에 대한 영향을 입증한다.
임의의 적합한 프로모터, 항시적 또는 조건적 프로모터를 사용하여 전이유전자의 발현을 구동할 수 있다. 적합하게는, 프로모터는 Ef1a 프로모터, CAG 프로모터, Jet 프로모터, CMV 프로모터, CBA 프로모터, CBH 프로모터, 시냅신1 프로모터, Mecp2 프로모터, U1a 프로모터, U6 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 뉴런-특이적 에놀라제 프로모터, 희소돌기아교세포 전사 인자 1 또는 GFAP 프로모터를 포함할 수 있다. 표 2의 작제물에 대해, 임의의 적합한 프로모터가 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
사용된 miRNA는 포유동물 게놈에 결합하지 않는 임의의 적합한 합성 miRNA일 수 있다. 적합하게는, 사용된 miRNA는 포유동물 miRNA에 대한 오르톨로지를 갖지 않는 합성 서열 또는 비-포유동물 게놈으로부터 유래될 수 있다. 적합하게는, 사용된 miRNA는 곤충 게놈으로부터 유래될 수 있다. 예시적인 miRNA는 하기 표 3에 제공된다.)
표 3: 전이유전자 발현을 조절하기 위해 피드 포워드 작제물에 사용될 수 있는 miRNA 요소의 서열. 결합 부위에 결합할 수 있지만 포유동물 게놈에는 결합하지 않는 임의의 합성 또는 비-포유동물 miRNA가 사용될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 전이유전자 발현에 미치는 다양한 miRNA의 효과는 도 20에 입증되어 있다.
작제물은 변형된 코작 서열을 포함하도록 개조될 수 있다: 적합하게는, 변형된 코작 서열은 단백질 번역 개시 부위로서 기능하는 핵산 모티프를 포함하는 임의의 코작 서열일 수 있다. 적합하게는, 변형된 코작 서열은 번역의 증가를 촉진하는 임의의 변형된 서열일 수 있다. 적합하게는, 코작 서열은 GCCACCATGG(서열번호 73)일 수 있다. 도 20은 코작 서열로서 서열번호 73의 사용이 전이유전자 발현에 미치는 효과를 나타낸다.
구현예에서, 관심대상 유전자는 다음 관심대상 유전자 중 어느 하나일 수 있다: MECP2, FMR1, UBE3A, CDKL5, FXN, SMN1, 또는 INS, 또는 유전적 병태 또는 발달 장애의 치료를 위한 유전자 요법을 사용하여 공급될 필요가 있는 유전자. 특히, 관심대상 유전자는 유전적 병태 또는 발달 장애를 치료하기 위해 대상체에게 전달될 때 제어된 발현을 필요로 하는 임의의 유전자일 수 있다.
결합 돌연변이의 예는 하기 표 4에서 볼 수 있다.
표 4: miRNA 결합을 부분적으로 개선하기 위해 결합 부위 내로 도입될 수 있는 예시적인 결합 돌연변이체의 서열. 도 20은 다양한 돌연변이 miRNA 결합 부위가 전이유전자 발현에 미치는 영향을 입증한다.
적합하게는, 전이유전자 발현을 증가시키기 위한 안정성 요소가 포함될 수 있다. 적합하게는, 안정성 요소는 3' UTR에 위치할 수 있다. 적합하게는, 이 안정성 요소는 우드척 간염 바이러스(WHV) 전사 후 조절 요소(WPRE)(서열번호 74)일 수 있다. 적합하게는, 안정성 요소는 안정성 요소를 보유하지만 X-단백질 서열이 생략된 WPRE의 절두된 버전 또는 리보자임 안정성 서열(WPRE3)(서열번호 75)일 수 있다. 도 20은 안정성 요소 WPRE3(서열번호 75)이 전이유전자 발현에 미치는 영향을 도시한다.
실시예 9
AAV-감수성 조직에서 제약된 유전자 발현의 평가
후근 신경절
후근 신경절(DRG)은 AAV에 매우 감수성이다. DRG는 AAV 전달 후 고도로 형질도입되어 독성을 초래할 수 있다. 피드포워드 회로가 이들 조직에서 발현을 감쇠시키는지를 테스트하기 위해, 4x1011 vg/마우스의 용량에서 CBE-조절된 및 CBE-비조절된 MECP2 피드포워드 ssAAV로 처리된 야생형 마우스로부터 DRG를 절개하였다. 요추 DRG를 벡터 유래 MeCP2 발현(n=마우스당 3, 군당 3마리 마우스) 및 벡터 생체분포(마우스당 1DRG, 군당 3마리)를 위해 가공처리하였다. CBE-비조절된 MECP2로 처리된 마우스는 독성/인도적인 종점으로 인해 3 내지 4주령에 종료하였다. CBE-조절된 MECP2로 처리된 마우스는 20주에 종료하였다. DRG는 또한 대조군으로서 연령-매치된 WT 및 KO 마우스로부터 단리하였다.
종료 시, 마우스를 4% 파라포름알데히드(PFA)로 관류한 다음, 조직을 절개하고 4℃에서 밤새 4% PFA에 사후-고정시킨 다음, 가공처리 시까지 30% 수크로스에 보관하였다. 조직을 드라이아이스 상의 혼합물 30% 수크로스와 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 포매하였다. 동결된 조직 블록을 절단할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 크라이오스탯(cryostat) 절편을 12 ㎛로 절단하고 코팅된 조직학적 슬라이드에 마운팅하고, 실온에서 30분 동안 공기 건조시킨 다음, 염색할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 동결된 슬라이드를 0.1MPBS에서 헹구어 조직-동결 매트릭스를 제거한 다음, 항원 복구(antigen retrieval)를 10 mM 나트륨 시트레이트 완충액, 0.05% Tween-20, pH 6.0)에서 30분 동안 85℃의 수조에서 수행하였다. 슬라이드를 동일한 완충액 중에서 실온에서 30분 동안 냉각시킨 후, 슬라이드를 0.3M PBS/Triton X-100 용액으로 헹군 다음, 실온에서 가습된 챔버에서 1시간 동안 0.3M PBS/T 용액 중 5% 염소 혈청과 함께 인큐베이션하여 비특이적 결합을 차단하였다. 그 다음, 슬라이드를 가습된 챔버에서 4℃에서 완충 용액 중 1차 항체(단클론, 마우스 항-MECP2, M7443, Sigma, 1:500)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 헹군 후(0.3M PBS/T 용액), 슬라이드를 실온에서 가습된 챔버에서 2시간 동안 2차 항체(Alexa Fluor® 488 염소 항-마우스(H+L), 세포 신호전달, 1:500)와 함께 인큐베이션하였다. 0.3M PBS/T 용액으로 추가로 헹군 후, 슬라이드를 실온에서 Hoechst 33342, DNA 염료 염색 용액(0.1M PBS 중 1:2000) 중에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 색바램방지 마운팅 용액 및 매니큐어를 사용하여 슬라이드를 커버슬립에 밀봉한 다음, 공초점 현미경으로 영상화하였다.
도 21은 피드포워드 회로를 사용할 때 DRG에서 제약된 전이유전자 발현이 있음을 보여주는 고용량 연구를 도시한다. 이러한 제약된 전이유전자 발현은 비조절된 카세트에 비해 안전성 이점을 부여한다. 본 도면은 야생형 마우스에 고용량 벡터(4x1011 vg/마우스; P1에서 직접 뇌 주사)를 투여한 생체내 실험을 도시한다. 비조절된 MECP2 카세트를 사용한 용량(21a)은 DRG에서 유의한 MeCP2 과발현 및 독성과 치사성의 발달을 초래하였다. 대조적으로, 조절된 카세트는 완전히 용인되었고 DRG에서 유의하게 낮은 수준의 MeCP2 발현을 나타냈다. 벡터 생체분포 분석은 DRG가 CBE-조절된- 및 CBE-비조절된-처리된 마우스에서 유사한 수준의 AAV로 형질도입되었음을 보여주었고(도 21d), 이는 DRG에서 관찰된 MeCP2 수준의 차이가 피드포워드 회로의 감쇠 작용으로 인한 것임을 확인시켜 준다(도 21b 내지 21c).
간
간도 AAV에 매우 감수성이다. 간 세포는 AAV 전달 후 고도로 형질도입되고 독성을 초래할 수 있다. 피드포워드 회로가 이들 조직에서 발현을 감쇠시키는지를 테스트하기 위해, 1x1012 vg/마우스의 용량에서 CBE-조절된 또는 CBE-비조절된 MECP2 피드포워드 ssAAV로 전신(정맥내) 처리된 야생형 마우스로부터 간을 절개하였다. 벡터 유래 MeCP2 발현(n=마우스당 3개 절편, 군당 3마리) 및 벡터 생체분포(군당 3마리 마우스)를 위해 간을 가공처리하였다. CBE-조절된 및 CBE-비조절된 MECP2로 처리된 마우스는 주사 후 4주차에 종료하였다. 간은 또한 대조군으로서 비주사된 연령-매치된 WT 마우스로부터 단리하였다.
종료 시, 마우스를 4% 파라포름알데히드(PFA)로 관류한 다음, 조직을 절개하고 4℃에서 밤새 4% PFA에 사후-고정시킨 다음, 가공처리 시까지 30% 수크로스에 보관하였다. 조직을 드라이아이스 상의 혼합물 30% 수크로스와 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 포매하였다. 동결된 조직 블록을 절단할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 크라이오스탯 절편을 12 ㎛로 절단하고 코팅된 조직학적 슬라이드에 마운팅하고, 실온(RT)에서 30분 동안 공기 건조시킨 다음, 염색할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 동결된 슬라이드를 0.1MPBS로 헹구어 조직-동결 매트릭스를 제거한 다음, 항원 복구를 10 mM 나트륨 시트레이트 완충액, 0.05% Tween-20, pH 6.0에서 30분 동안 85℃의 수조에서 수행하였다. 슬라이드를 동일한 완충액 중에서 RT에서 30분 동안 냉각시킨 후, 슬라이드를 0.3M PBS/Triton X-100 용액으로 헹군 다음, 실온에서 가습된 챔버에서 1시간 동안 0.3M PBS/T 용액 중 5% 염소 혈청과 함께 인큐베이션하여 비특이적 결합을 차단하였다. 그 다음, 슬라이드를 가습된 챔버에서 4℃에서 완충 용액 중 1차 항체(마우스 항-MECP2, 1:500)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 헹군 후(0.3M PBS/T 용액), 슬라이드를 실온에서 가습된 챔버에서 2시간 동안 2차 항체(Alexa Fluor® 488 염소 항-마우스(H+L), 1:500)와 함께 인큐베이션하였다. 0.3M PBS/T 용액으로 추가로 헹군 후, 슬라이드를 Hoechst 33342, DNA 염료 염색 용액(0.1M PBS 중 1:2000) 중에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 색바램방지 마운팅 용액 및 매니큐어를 사용하여 슬라이드를 커버슬립에 밀봉한 다음, 공초점 현미경으로 영상화하였다.
도 23은 피드포워드 회로를 사용할 때 간에서 제약된 전이유전자 발현이 있음을 보여주는 고용량 연구를 도시한다. 이러한 제약된 전이유전자 발현은 비조절된 카세트에 비해 안전성 이점을 부여한다. 본 도면은 야생형 마우스에 고용량 벡터(2x1012 vg/마우스; 5.5 내지 6.5주령에 정맥내 주사)를 투여한 생체내 실험을 도시한다. 비조절된 MECP2 카세트(23a)를 사용한 이러한 용량은 간에서 유의한 MeCP2 과발현을 초래하였다. 대조적으로, 조절된 카세트는 간에서 유의하게 낮은 수준의 MeCP2 발현을 나타냈다. 벡터 생체분포 분석은 간이 CBE 조절된 및 CBE 비조절된-처리된 마우스에서 유사한 수준의 AAV로 형질도입되었음을 보여주었으며, 이는 간에서 관찰된 MeCP2 수준의 차이가 피드포워드 회로의 감쇠 작용으로 인한 것임을 확인시켜 준다.
이것은 피드포워드 작제물이 AAV에 매우 감수성인 조직에서도 전이유전자 과발현을 제약하여, 조직 손상/독성의 가능성을 감소시키고 따라서 종래의 유전자 요법 작제물에 비해서 이점을 제공할 수 있음을 추가로 입증한다.
적합하게는, 피드포워드 작제물을 사용하여 AAV에 매우 감수성 조직에서도 전이유전자 과발현을 제약하여, 조직 손상/독성의 가능성을 감소시키고 따라서 종래의 유전자 요법 작제물에 비해서 이점을 제공할 수 있다.
실시예 10
AAV9 캡시드에 패키징된 AAV2 ITR에 의해 측접된 작제물을 포함하는 단일 가닥 AAV(ssAAV) 입자는 Virovek(미국 캘리포니아주 헤이워드)에서 배큘로바이러스 형질감염 시스템에 의해 생산되었다.
변형된 피드포워드 MECP2 작제물을 발현하는 AAV 벡터를 혼합 CBA/C57 배경에서 유지된 Mecp2 녹아웃(KO) 마우스에서 테스트하였다. 조절된 또는 비조절된 MECP2를 발현하는 ssAAV를 뇌실내(ICV) 투여에 의해 생후 (P)0/1일 수컷의 뇌에 양측 주사하였다. 대조군 주사는 벡터 없이 동일한 희석제를 사용하였다(비히클 대조군). 주사된 새끼들을 홈 케이지로 되돌려 놓고 4주령부터 매주 평가하였다. 마우스는 15주령까지 또는 이들의 인도적인 종점에 도달할 때까지 모니터링하였다.
도 22는 변형된 조절된 피드 포워드 카세트의 투여가 용인되고 레트 증후군을 모델링하는 마우스(Mecp2 KO 마우스)에서 치료 효과를 나타낸다는 것을 보여주는 연구를 입증한다. 생체내 연구에 사용된 변형된 AAV-패키징된 작제물(카세트) 설계가 예시되어 있다(도 22a). 조절된 작제물은 ffluc1 miRNA(서열번호 9) 및 야생형 인간 MECP2 전이유전자를 발현하였다. 비조절된 작제물은 야생형 인간 MECP2 전이유전자만을 발현하였다. MeCP2 단백질 발현은 3'UTR 내의 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE3)(서열 번호 74)의 존재에 의해 향상되었다. Mecp2 KO 마우스에 벡터(1x1011 vg/마우스; P1에서 직접 뇌 주사)를 투여한 다음, 4주령부터 매주 평가하였다. 생존 및 RTT 점수 데이터는 조절된 피드 포워드 카세트의 투여가 용인되고 레트 증후군을 모델링하는 마우스(Mecp2 KO 마우스)에서 치료 효과를 나타냈음을 입증하였다. CBE-비조절된+WPRE3 작제물을 투여받는 마우스는 중증 과발현 독성으로 인해 주사 후 2 내지 3주차에 도태시켜야 했다.
웨스턴 블롯 분석을 상이한 뇌 영역(피질, 해마, 시상 및 뇌간)에서 수행하였다(도 22c). 동결된 조직 샘플을 300μl의 완충액 NE1과 함께 비드 밀에서 균질화한 다음, 얼음 위에서 보관하였다. 각 샘플에 250U 벤조나제 뉴클레아제를 첨가한 후, 샘플을 진탕하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, 얼음 위에서 보관하였다. 샘플을 단백질용 NE1 완충액에 1:20 희석시켰다. 100μl 4x Laemmli 샘플 완충액을 각 비드 밀 튜브에 첨가하고, 샘플을 10분 동안 비등시킨 다음, -80℃에서 보관하였다. 샘플을 해동하고 각 샘플의 25㎍ 양을 염료 전면이 겔의 바닥에 도달할 때까지 150 V에서 10% 아크릴아미드 겔에서 이동시켰다. 그 다음, 겔을 85 V에서 2시간 동안 니트로셀룰로오스 막으로 이전시켰다. 총 단백질을 측정하였다. 총 단백질 염색을 제거하고, 막을 실온에서 1시간 동안 진탕 인큐베이터에서 LI-COR 차단 완충액과 함께 인큐베이션하였다. 그 다음, 막을 1:1000의 희석율에서 1차 항체 항-MECP2와 함께 20ml의 LI-COR 차단 완충액 중에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 막을 10분(x3) 동안 TBS-T 완충액으로 세척한 다음, 실온에서 1:10000 희석율에서 2차 항체와 함께 20ml의 LI-COR® 차단 완충액 중에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 막을 10분 동안(x3) TBS-T 완충액으로 세척하고 TBS 완충액으로 헹군 다음, 영상화하였다.
결과는 피드포워드 회로를 사용할 때의 제약된 MeCP2 발현을 입증하였다. 향상된 생존 및 낮은 RTT 표현형 점수와 조합하면, 이러한 제약된 전이유전자 발현은 비조절된 카세트에 비해서 안전성 이점을 추가로 입증한다.
실시예 11
곤충 유래 miRNA 서열(ffluc1; 서열번호 9) 또는 신규 합성 miRNA 서열(ran1g; 서열번호 17 및 ran2g; 서열번호 18)이 포유동물 전사체 내의 예측된 내인성 표적을 갖지 않는다는 것을 추가로 검증하기 위해, 예측된 mRNA 표적의 정량적 RT-PCR을 수행하였다.
hEF1a 프로모터의 인트론 하류로부터 ffluc1(서열번호 9), ran1g(서열번호 18) 또는 ran2g(서열번호 18) miRNA를 발현하는 플라스미드를 생성하였다(도 24a). hEF1a 프로모터의 인트론 하류로부터 hsa-miR-132-3p, hsa-miR-34a-5p 또는 hsa-miR-644a miRNA를 발현하는 대조군 플라스미드를 또한 생성하였다(도 24b). 대조군 플라스미드에 의해 발현된 miRNA는 인식된 인간 mRNA 표적(각각 MECP2, HSPA1B 및 ACTB)을 갖는 내인성 인간 miRNA이다.
인간 배아 신장 293 세포(HEK 293)를 Lipofectamine®을 사용하여 100㎍의 각 플라스미드로 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 용해시키고 총 RNA를 단리하였다. 단리된 RNA의 품질 및 양을 분석하였다. 500ng의 총 RNA 주형과 500nM 무작위 육량체를 함유하는 20μl 반응물에서 첫 번째 가닥 합성을 수행하였다. SYBR Green PCR 반응을 첫 번째 가닥 합성 반응물의 1/10과 300nM 유전자-특이적 프라이머를 사용하여 20μl 반응물에서 수행하였다. PCR은 다음과 같은 순환 조건 하에 수행하였다: 95℃에서 3분 동안 초기 변성에 이어서 95℃에서 10초 동안, 55℃에서 30초 동안 및 60℃에서 30초 동안의 40회 주기 후에 해리 곡선. 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 결과를 분석하여, 리포펙타민-단독 대조군 샘플에 대한 샘플의 상대적 배수 유전자 발현을 계산하였다.
정량적 RT-PCR(qRT-PCR)을 사용하여 ffluc1(IRF2BP2, HNRNPH1 및 RPP30), ran1g(FASN, ETAA1 및 MAIP1) 및 ran2g(MCFD2, SLC38A2 및 FZD6)의 상위 예측 인간 mRNA 표적 중 3가지의 전사체 수준을 정량화하였다. qRT-PCR을 또한 사용하여 대조군 플라스미드에 의해 발현되는 miRNA의 인식된 내인성 mRNA 표적의 전사체 수준을 정량화하였다: hsa-miR-132-3p(MECP2), hsa-miR-34a-5p(HSPA1B) 또는 hsa-miR-644a(ACTB).
qRT-PCR 평가는 ffluc1, ran1g 또는 ran2g가 매우 높은 수준으로 발현되는 경우에도 최소한의 검출 가능한 표적외 효과가 있음을 보여준다(도 24c). 유일한 예외는 ran2g에 의해 강력하게 하향조절되는 FZD6이다. 대조적으로, 표적-적중(on-target) 양성 대조군은 표적의 현저한 억제를 부여하며, 이는 분석의 견고성을 보여준다(도 24d).
실시예 12
다른 CNS 적응증에서 피드포워드의 시험관내 평가.
본 발명자들은, 본 발명이 중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 다른 장애의 치료에서도 효과적임을 확인하였다. MECP2를 UBE3A 유전자(이 유전자의 돌연변이는 엔젤만 증후군 및 프라더-윌리 증후군를 야기한다) 및 CDKL5 유전자(이 유전자의 돌연변이는 CDKL5 결핍 장애를 야기한다)로 대체하여 작제물을 제조하였다.
mNeonGreen 리포터 유전자에 융합된 ffluc1 miRNA(서열번호 9) 및 관심대상 유전자(GOI)를 발현하는 플라스미드를 생성하였다. 각 GOI에 대해, 피드포워드 메커니즘을 갖는 작제물 및 피드포워드 메커니즘을 갖지 않는 작제물을 생성하였다(도 25a). 조절된 작제물에서, 3'UTR은 이전 실험에서 사용된 것과 동일한 ffluc1 miRNA에 대한 3개의 비-포유동물 miRNA 결합 부위(서열번호 34)를 함유하였다. 비조절된 작제물에서, 3'UTR은 ffluc1 miRNA 결합과 비호환성인 스크램블된(scr) 서열을 함유하였다. 인간 배아 신장 293 세포(HEK 293)를 리포펙타민 3000을 사용하여 100㎍의 각 플라스미드로 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 수집하고, 전이유전자 발현의 수준을 유세포분석기로 평가하였다. 작제물 상의 별도의 형광 마커(mRuby)를 사용하여 각 세포에 전달된 작제물의 수준을 모니터링하였다(용량의 대리지표).
도 25b 내지 25c는 용량 민감성의 피드포워드 제어가 다른 용량 민감성 유전자에 걸쳐 달성될 수 있음을 예시한다. UBE3A 유전자(25b)(엔젤만 증후군 및 프라더-윌리 증후군에서 파괴됨) 및 CDKL5 유전자(25c)(CDKL5 결핍 장애에서 파괴됨) 둘 다에 대해 피드포워드 제어가 나타났다.
이들 단백질(UBE3A 및 CDKL5)의 발현은 유세포분석으로 평가된 NeonGreen 단백질 수준에 의해 결정한다. 조절된 피드포워드 작제물을 miRNA 조절이 없는 비조절된 대조군 작제물과 비교하였다(도 25a 내지 25c). 그래프는 mRuby의 수준(x축 - 세포에 대한 플라스미드 양의 측정값이며 miRNA 조절의 영향을 받지 않음) 대 UBE3A-NeonGreen 또는 CDKL5-mNeonGreen(y축 - miRNA에 의해 조절된 단백질)을 도시한다. 결과는 ffluc1 miRNA가, 선형 회귀선의 기울기 차이로 나타나는 바와 같이, 대조군과 비교하여 피드포워드 샘플에서 UBE3A 및 CDKL5 발현을 조절하는 데 효과적임을 보여준다.
MECP2에서 볼 수 있는 바와 같이, 피드포워드 요소의 감쇠 효과는 전달된 작제물의 양이 증가함에 따라 증가하였으며, 이는 제어 요소가 치료 수준에서 유전자의 발현을 방해하지 않으면서 독성을 완화할 수 있음을 시사한다.
실시예 13
다른 CNS 적응증에서 피드포워드의 시험관내 평가 - 코돈-최적화된 전이유전자를 표적화
본 발명자들은 코돈-최적화된 단백질 코딩 서열이 miRNA 결합 부위로서 이용될 수 있다는 것을 밝혀냈다. 합성 miRNA는 3'UTR 내의 miRNA 결합 부위를 표적화하는 대신에, 전이유전자의 코돈 최적화된 단백질 코딩 서열 내에서 생성된 독특한 miRNA 결합 영역을 표적화하기 위해 유전자 요법 카세트 내에서 전달되었다. 합성 miRNA는 포유동물 게놈 내에 상응하는 결합 부위를 갖지 않는다. 이러한 접근법은 바이러스 벡터의 패키징 성능에 접근하는 더 큰 유전자에 특히 유리할 수 있다.
도 26a 내지 26b는 miRNA 결합 부위가 전이유전자 단백질 코딩 서열 내에 있을 때 용량 민감성의 피드포워드 제어가 달성될 수 있음을 예시한다. 본 도면은 이러한 접근법을 사용한 SYNGAP1 유전자(SYNGAP1-관련 지적 장애에서 파괴됨)의 조절을 도시한다. mNeonGreen 리포터 유전자에 융합된 코돈 최적화된 SYNGAP1 전이유전자 및 합성 syn3i miRNA를 발현하거나(서열번호 29 조절된 작제물) miRNA를 발현하지 않는(비조절된 작제물) 플라스미드를 생성하였다(도 26a). 인간 배아 신장 293 세포(HEK 293)를 리포펙타민 3000을 사용하여 100㎍의 각 플라스미드로 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 수집하고, 전이유전자 발현의 수준을 유세포분석기로 평가하였다. 작제물 상의 별도의 형광 마커(mRuby)를 사용하여 각 세포에 전달된 작제물의 수준을 모니터링하였다(용량의 대리지표).
SynGAP 단백질의 발현을 유세포분석으로 평가된 NeonGreen 단백질 수준에 의해 결정하였다. 조절된 피드포워드 작제물을 miRNA 조절이 없는 비조절된 대조군 작제물과 비교하였다(도 26a 내지 26b). 그래프는 mRuby의 수준(x축 - 세포에 대한 플라스미드 양의 측정값이며 miRNA 조절의 영향을 받지 않음) 대 SynGAP-NeonGreen(y축 - miRNA에 의해 조절된 단백질)을 도시한다. 결과는 syn3i miRNA(서열 번호 29)가 선형 회귀선의 기울기 차이로 나타나는 바와 같이, 대조군과 비교하여 피드포워드 샘플에서 SynGAP 발현을 조절하는 데 효과적임을 보여준다.
피드포워드 요소의 감쇠 효과는 전달된 작제물의 양이 증가함에 따라 증가하였으며, 이는 피드포워드 원리의 이러한 대안적 구현예도 치료 수준에서 유전자의 발현을 방해하지 않으면서 독성을 완화할 수 있음을 시사한다.
실시예 14
다른 비-CNS 적응증에서 피드포워드의 시험관내 평가
비-포유동물 miRNA 피드포워드 메커니즘은 1차 표현형이 중추신경계(CNS)가 아닌 말초인 다른 장애에서도 효과적이었다. MECP2를 다른 단백질에 대한 코딩 서열로 대체시켜 작제물을 제조하였다: SMN1 유전자(이 유전자의 돌연변이는 척수성 근위축증를 야기한다), INS 유전자(이 유전자의 돌연변이는 제1형 당뇨병을 야기한다) 및 FXN 유전자(이 유전자의 돌연변이는 프리드라이히 운동실조증을 야기한다). 3'UTR은 이전 실험에서 사용된 동일한 ffluc1 miRNA(서열번호 9)에 대한 3개의 비-포유동물 miRNA 결합 부위(서열번호 34)를 함유하였다.
상기 관심대상 유전자(GOI) 중 하나와 ffluc1 miRNA를 발현하는 플라스미드를 생성하였다. GOI는 mNeonGreen 리포터 유전자에 융합시켰다. 각 GOI에 대해, 피드포워드 메커니즘을 갖는 작제물 및 피드포워드 메커니즘을 갖지 않는 작제물을 생성하였다(도 27a). 조절된 작제물에서, 3'UTR은 서열번호 34의 miRNA 결합 부위를 함유하였다. 비조절된 작제물에서, 3'UTR은 ffluc1 miRNA 결합과 비호환성인 스크램블된(scr) 서열을 함유하였다. 인간 배아 신장 293 세포(HEK 293)를 리포펙타민 3000을 사용하여 100㎍의 각 플라스미드로 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 수집하고, 전이유전자 발현의 수준을 유세포분석기로 평가하였다. 작제물 상의 별도의 형광 마커(mRuby)를 사용하여 각 세포에 전달된 작제물의 수준을 모니터링하였다(용량의 대리지표).
도 27b 내지 27d는 용량 민감성의 피드포워드 제어가 다른 용량 민감성 유전자, 이 경우에는 (27b) 척수성 근위축증에서 파괴된 SMN1 유전자, (27c) 1형 당뇨병에서 파괴된 INS 유전자, (27c) 프리드라이히 운동실조증에서 파괴된 FXN 유전자에 걸쳐 달성될 수 있음을 예시한다.
이들 단백질(SMN1, 인슐린 및 프라탁신)의 발현은 유세포분석으로 평가된 NeonGreen 단백질 수준에 의해 결정된다. 조절된 피드포워드 작제물을 miRNA 조절이 없는 비조절된 대조군 작제물과 비교하였다(도 27a 내지 27d). 그래프는 mRuby의 수준(x축 - 세포에 대한 플라스미드 양의 측정값이며 miRNA 조절의 영향을 받지 않음) 대 SMN1-NeonGreen, 인슐린-mNeonGreen 또는 프라탁신-mNeonGreen(y축 - miRNA에 의해 조절된 단백질)을 도시한다. 결과는 ffluc1 miRNA가 선형 회귀선의 기울기 차이로 나타나는 바와 같이, 대조군과 비교하여 피드포워드 샘플에서 SMN1, 인슐린 및 프라탁신 발현을 조절하는 데 효과적임을 보여준다.
MECP2에서 볼 수 있는 바와 같이, 피드포워드 요소의 감쇠 효과는 전달된 작제물의 양이 증가함에 따라 증가하였으며, 이는 제어 요소가 치료 수준에서 유전자의 발현을 방해하지 않으면서 독성을 완화할 수 있음을 시사한다.
실시예 15
생체내 UBE3A 조절
본 발명자들은 중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 다른 용량 민감성 장애를 치료하는 데 있어 비-포유동물 miRNA 피드포워드 메카니즘의 사용을 추가로 입증하였다. 엔젤만 증후군 및 프라더-윌리 증후군에서 파괴된 UBE3A 유전자는 피드포워드 메커니즘에 의해 생체내에서 조절되는 것으로 나타났다.
3xFLAG 태그에 융합된 ffluc1 miRNA(서열번호 9) 및 인간 UBE3A를 발현하는 작제물을 생성하였다. 피드포워드 메커니즘을 갖는 작제물 및 피드포워드 메커니즘을 갖지 않는 작제물을 생성하였다(도 28a). 조절된 작제물에서, 3'UTR은 miRNA 결합 부위 서열번호 34를 함유하였다. AAV9 캡시드에 패키징된 AAV2 ITR에 의해 측접된 작제물을 포함하는 조절된 및 비조절된 UBE3A 작제물의 단일 가닥 AAV(ssAAV) 입자는 Virovek(미국 캘리포니아주 헤이워드)에서 배큘로바이러스 형질감염 시스템에 의해 생산하였다.
도 28b는 UBE3A 조절된 피드 포워드 카세트가 비조절된 UBE3A 카세트와 비교했을 때 생체내에서 조절을 제공한다는 것을 입증한다. 항-FLAG 항체를 사용한 면역블롯 분석은 세포에서 UBE3A 발현 수준의 판독값을 제공한다. 피드포워드 UBE3A 작제물을 발현하는 AAV 벡터를 혼합 CBA/C57 배경에서 유지되는 야생형 마우스에서 테스트하였다. 조절된 또는 비조절된 UBE3A를 발현하는 ssAAV를 뇌실내(ICV) 투여에 의해 생후 (P)1일 수컷의 뇌에 양측 주사하였다. 대조군 주사는 PBS를 사용하였다(비히클 대조군). 주사된 새끼들을 주사 후 7일차에 도태시키고 분석을 위해 조직을 수집하였다. 신선한 조직 샘플을 300μl의 완충액 NE1과 함께 비드 밀에서 균질화한 다음, 얼음 위에서 보관하였다. 각 샘플에 250U 벤조나제 뉴클레아제를 첨가한 후, 샘플을 진탕하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, 얼음 위에서 보관하였다. 샘플을 단백질 정량화를 위해 NE1 완충액에 1:20 희석시켰다. 100μl 4x Laemmli 샘플 완충액을 각 비드 밀 튜브에 첨가하고, 샘플을 10분 동안 비등시킨 다음, -80℃에서 보관하였다. 샘플을 해동하고 각 샘플의 25㎍ 양을 염료 전면이 겔의 바닥에 도달할 때까지 150 V에서 10% 아크릴아미드 겔에서 이동시켰다. 그 다음, 겔을 85V에서 2시간 동안 니트로셀룰로오스 막으로 이전시켰다. 총 단백질을 측정하였다. 총 단백질 염색을 제거하고, 막을 실온에서 1시간 동안 진탕 인큐베이터에서 LI-COR® 차단 완충액과 함께 인큐베이션하였다. 그 다음, 막을 1:2000 희석율에서 1차 항체 항-FLAG와 함께 20 ml의 LI-COR® 차단 완충액 중에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 막을 10분(x3) 동안 TBS-T 완충액으로 세척한 다음, 실온에서 1:10000 희석율에서 2차 항체 IRDye 800CW 당나귀 항-마우스와 함께 20ml의 LI-COR® 차단 완충액 중에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 막을 10분 동안(x3) TBS-T 완충액으로 세척하고 TBS 완충액으로 헹군 다음, 영상화하였다.
이는 UBE3A(즉, MECP2 이외의 전이유전자)가 비-포유동물 miRNA 피드포워드 메커니즘의 제어 하에 생체내에서 조절될 수 있음을 입증한다. 이는 유전자/장애가 용량 민감성인 것으로 알려진 전이유전자 과발현으로 인한 조직 손상/독성의 가능성을 감소시킨다.
실시예 16
피드포워드 작제물은 ssAAV에 효율적으로 패키징된다
MECP2 전이유전자를 발현하는 피드포워드 작제물을 AAV9 캡시드에 패키징된 AAV2 ITR에 의해 측접된 작제물을 포함하는 단일 가닥 AAV(ssAAV) 입자로서 생성하고 HEK293 공정(Viral Vector Production Unit, Universitat Autonoma Barcelona, 스페인)에 의해 또는 Virovek(미국 캘리포니아주 헤이워드)에서 배큘로바이러스 기반 감염 시스템에 의해 생산하였다. 두 공정 모두를 사용하여, 본 발명자들은 피드포워드 유전자 요법 작제물이 규모에 따라 그리고 매우 높은 역가(최대 1.94x1014 바이러스 게놈/ml)로 효율적으로 생산될 수 있음을 입증한다. 따라서, 본 발명자들은 피드포워드 조절된 유전자 요법 기술이 효율적인 제조를 위해 구성되었음을 확인하였다. 중요하게도, 본 발명자들은 피드포워드 합성 회로 작제물이 AAV에 효율적으로 패키징된다는 것을 입증한다.
AAV 생산 후, CDMS(전하 검출 질량 분광분석) 분석을 수행하여 전하 및 질량에 기반하여 AAV 입자의 크기를 결정하였다. 이 도구는 패키징의 품질을 결정하고 AAV 생성물의 효능에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 임의의 부분적으로 패키징된 종이 있는지 여부를 결정하는 데 도움이 된다.
도 29는 ssAAV9에 패키징된 피드포워드 MECP2 작제물의 대표적인 CDMS 분석을 도시한다. 전체 길이 피드포워드 생성물은 예측대로 낮은 수준의 비정상적 또는 부분적 패키징으로 패키징된다. 헤어핀과 같은 2차 DNA 구조는 AAV 입자의 효율적인 패키징을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 분석된 피드포워드 작제물에서, (EF1a 또는 MINIX 인트론 내) miRNA 헤어핀의 존재는 예상보다 더 작은 입자의 유의한 패키징/부분적으로 패키징된 입자를 유발하지 않으며, AAV 제제의 품질에 영향을 미치지 않는다.
스템 루프, 헤어핀 및 miRNA 생성 서열과 같은 2차 구조를 함유하는 유전자 서열은 생성물 순도를 불리하게 손상시키는 비정상적인 패키징 및 불균질한 종들의 캡슐화를 매우 흔하게 초래하는 것으로 알려져 있다(Xie et al., 2017). 도 29는 최신 기술 내에서 매우 명확한 프로파일로 고려되는 프로파일을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 고순도 생성물로 대규모 제조가 가능한 피드포워드 AAV 작제물을 개발함으로써 순도 문제에 대한 해결책을 제공하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> The University Court of the University of Edinburgh
<120> TRANSGENE EXPRESSION SYSTEM
<130> P222552.WO.01
<160> 76
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1494
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggccgccg ccgccgccgc cgcgccgagc ggaggaggag gaggaggcga ggaggagaga 60
ctggaagaaa agtcagaaga ccaggacctc cagggcctca aggacaaacc cctcaagttt 120
aaaaaggtga agaaagataa gaaagaagag aaagagggca agcatgagcc cgtgcagcca 180
tcagcccacc actctgctga gcccgcagag gcaggcaaag cagagacatc agaagggtca 240
ggctccgccc cggctgtgcc ggaagcttct gcctccccca aacagcggcg ctccatcatc 300
cgtgaccggg gacccatgta tgatgacccc accctgcctg aaggctggac acggaagctt 360
aagcaaagga aatctggccg ctctgctggg aagtatgatg tgtatttgat caatccccag 420
ggaaaagcct ttcgctctaa agtggagttg attgcgtact tcgaaaaggt aggcgacaca 480
tccctggacc ctaatgattt tgacttcacg gtaactggga gagggagccc ctcccggcga 540
gagcagaaac cacctaagaa gcccaaatct cccaaagctc caggaactgg cagaggccgg 600
ggacgcccca aagggagcgg caccacgaga cccaaggcgg ccacgtcaga gggtgtgcag 660
gtgaaaaggg tcctggagaa aagtcctggg aagctccttg tcaagatgcc ttttcaaact 720
tcgccagggg gcaaggctga ggggggtggg gccaccacat ccacccaggt catggtgatc 780
aaacgccccg gcaggaagcg aaaagctgag gccgaccctc aggccattcc caagaaacgg 840
ggccgaaagc cggggagtgt ggtggcagcc gctgccgccg aggccaaaaa gaaagccgtg 900
aaggagtctt ctatccgatc tgtgcaggag accgtactcc ccatcaagaa gcgcaagacc 960
cgggaaacgg tcagcatcga ggtcaaggaa gtggtgaagc ccctgctggt gtccaccctc 1020
ggtgagaaga gcgggaaagg actgaagacc tgtaagagcc ctgggcggaa aagcaaggag 1080
agcagcccca aggggcgcag cagcagcgcc tcctcacccc ccaagaagga gcaccaccac 1140
catcaccacc actcagagtc cccaaaggcc cccgtgccac tgctcccacc cctgccccca 1200
cctccacctg agcccgagag ctccgaggac cccaccagcc cccctgagcc ccaggacttg 1260
agcagcagcg tctgcaaaga ggagaagatg cccagaggag gctcactgga gagcgacggc 1320
tgccccaagg agccagctaa gactcagccc gcggttgcca ccgccgccac ggccgcagaa 1380
aagtacaaac accgagggga gggagagcgc aaagacattg tttcatcctc catgccaagg 1440
ccaaacagag aggagcctgt ggacagccgg acgcccgtga ccgagagagt tagc 1494
<210> 2
<211> 2556
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atgaagcgag cagctgcaaa gcatctaata gaacgctact accaccagtt aactgagggc 60
tgtggaaatg aagcctgcac gaatgagttt tgtgcttcct gtccaacttt tcttcgtatg 120
gataataatg cagcagctat taaagccctc gagctttata agattaatgc aaaactctgt 180
gatcctcatc cctccaagaa aggagcaagc tcagcttacc ttgagaactc gaaaggtgcc 240
cccaacaact cctgctctga gataaaaatg aacaagaaag gcgctagaat tgattttaaa 300
gatgtgactt acttaacaga agagaaggta tatgaaattc ttgaattatg tagagaaaga 360
gaggattatt cccctttaat ccgtgttatt ggaagagttt tttctagtgc tgaggcattg 420
gtacagagct tccggaaagt taaacaacac accaaggaag aactgaaatc tcttcaagca 480
aaagatgaag acaaagatga agatgaaaag gaaaaagctg catgttctgc tgctgctatg 540
gaagaagact cagaagcatc ttcctcaagg ataggtgata gctcacaggg agacaacaat 600
ttgcaaaaat taggccctga tgatgtgtct gtggatattg atgccattag aagggtctac 660
accagattgc tctctaatga aaaaattgaa actgcctttc tcaatgcact tgtatatttg 720
tcacctaacg tggaatgtga cttgacgtat cacaatgtat actctcgaga tcctaattat 780
ctgaatttgt tcattatcgt aatggagaat agaaatctcc acagtcctga atatctggaa 840
atggctttgc cattattttg caaagcgatg agcaagctac cccttgcagc ccaaggaaaa 900
ctgatcagac tgtggtctaa atacaatgca gaccagattc ggagaatgat ggagacattt 960
cagcaactta ttacttataa agtcataagc aatgaattta acagtcgaaa tctagtgaat 1020
gatgatgatg ccattgttgc tgcttcgaag tgcttgaaaa tggtttacta tgcaaatgta 1080
gtgggagggg aagtggacac aaatcacaat gaagaagatg atgaagagcc catccctgag 1140
tccagcgagc tgacacttca ggaacttttg ggagaagaaa gaagaaacaa gaaaggtcct 1200
cgagtggacc ccctggaaac tgaacttggt gttaaaaccc tggattgtcg aaaaccactt 1260
atcccttttg aagagtttat taatgaacca ctgaatgagg ttctagaaat ggataaagat 1320
tatacttttt tcaaagtaga aacagagaac aaattctctt ttatgacatg tccctttata 1380
ttgaatgctg tcacaaagaa tttgggatta tattatgaca atagaattcg catgtacagt 1440
gaacgaagaa tcactgttct ctacagctta gttcaaggac agcagttgaa tccatatttg 1500
agactcaaag ttagacgtga ccatatcata gatgatgcac ttgtccggct agagatgatc 1560
gctatggaaa atcctgcaga cttgaagaag cagttgtatg tggaatttga aggagaacaa 1620
ggagttgatg agggaggtgt ttccaaagaa ttttttcagc tggttgtgga ggaaatcttc 1680
aatccagata ttggtatgtt cacatacgat gaatctacaa aattgttttg gtttaatcca 1740
tcttcttttg aaactgaggg tcagtttact ctgattggca tagtactggg tctggctatt 1800
tacaataact gtatactgga tgtacatttt cccatggttg tctacaggaa gctaatgggg 1860
aaaaaaggaa cttttcgtga cttgggagac tctcacccag ttctatatca gagtttaaaa 1920
gatttattgg agtatgaagg gaatgtggaa gatgacatga tgatcacttt ccagatatca 1980
cagacagatc tttttggtaa cccaatgatg tatgatctaa aggaaaatgg tgataaaatt 2040
ccaattacaa atgaaaacag gaaggaattt gtcaatcttt attctgacta cattctcaat 2100
aaatcagtag aaaaacagtt caaggctttt cggagaggtt ttcatatggt gaccaatgaa 2160
tctcccttaa agtacttatt cagaccagaa gaaattgaat tgcttatatg tggaagccgg 2220
aatctagatt tccaagcact agaagaaact acagaatatg acggtggcta taccagggac 2280
tctgttctga ttagggagtt ctgggaaatc gttcattcat ttacagatga acagaaaaga 2340
ctcttcttgc agtttacaac gggcacagac agagcacctg tgggaggact aggaaaatta 2400
aagatgatta tagccaaaaa tggcccagac acagaaaggt tacctacatc tcatacttgc 2460
tttaatgtgc ttttacttcc ggaatactca agcaaagaaa aacttaaaga gagattgttg 2520
aaggccatca cgtatgccaa aggatttggc atgctg 2556
<210> 3
<211> 1833
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atggaggagc tggtggtgga agtgcggggc tccaatggcg ctttctacaa ggcatttgta 60
aaggatgttc atgaagattc aataacagtt gcatttgaaa acaactggca gcctgatagg 120
cagattccat ttcatgatgt cagattccca cctcctgtag gttataataa agatataaat 180
gaaagtgatg aagttgaggt gtattccaga gcaaatgaaa aagagccttg ctgttggtgg 240
ttagctaaag tgaggatgat aaagggtgag ttttatgtga tagaatatgc agcatgtgat 300
gcaacttaca atgaaattgt cacaattgaa cgtctaagat ctgttaatcc caacaaacct 360
gccacaaaag atactttcca taagatcaag ctggatgtgc cagaagactt acggcaaatg 420
tgtgccaaag aggcggcaca taaggatttt aaaaaggcag ttggtgcctt ttctgtaact 480
tatgatccag aaaattatca gcttgtcatt ttgtccatca atgaagtcac ctcaaagcga 540
gcacatatgc tgattgacat gcactttcgg agtctgcgca ctaagttgtc tctgataatg 600
agaaatgaag aagctagtaa gcagctggag agttcaaggc agcttgcctc gagatttcat 660
gaacagttta tcgtaagaga agatctgatg ggtctagcta ttggtactca tggtgctaat 720
attcagcaag ctagaaaagt acctggggtc actgctattg atctagatga agatacctgc 780
acatttcata tttatggaga ggatcaggat gcagtgaaaa aagctagaag ttttctcgaa 840
tttgctgaag atgtaataca agttccaagg aacttagtag gcaaagtaat aggaaaaaat 900
ggaaagctga ttcaggagat tgtggacaag tcaggagttg tgagggtgag gattgaggct 960
gaaaatgaga aaaatgttcc acaagaagag gaaattatgc caccaaattc ccttccttcc 1020
aataattcaa gggttggacc taatgcccca gaagaaaaaa aacatttaga tataaaggaa 1080
aacagcaccc atttttctca acctaacagt acaaaagtcc agaggggtat ggtaccattt 1140
gtttttgtgg gaacaaagga cagcatcgct aatgccactg ttcttttgga ttatcacctg 1200
aactatttaa aggaagtaga ccagttgcgt ttggagagat tacaaattga tgagcagttg 1260
cgacagattg gagctagttc tagaccacca ccaaatcgta cagataagga aaaaagctat 1320
gtgactgatg atggtcaagg aatgggtcga ggtagtagac cttacagaaa tagggggcac 1380
ggcagacgcg gtcctggata tacttcagga actaattctg aagcatcaaa tgcttctgaa 1440
acagaatctg accacagaga tgaactcagt gattggtcat tagctccaac agaggaagag 1500
agggagagct tcctgcgcag aggagatgga cggcggcgtg gagggggagg aagaggacaa 1560
ggaggaagag gacgtggagg aggcttcaaa ggaaacgacg atcactcccg aacagataat 1620
cgtccacgta atccaagaga ggctaaagga agaacaacag atggatcgct tcagatcaga 1680
gttgactgca ataatgaaag gagtgtccac actaaaacat tacagaatac ctccagtgaa 1740
ggtagtcggc tgcgcacggg taaagatcgt aaccagaaga aagagaagcc agacagcgtg 1800
gatggtcagc aaccactcgt gaatggagta ccc 1833
<210> 4
<211> 3924
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
atgagcagga gccgagccag catacataga gggagcatcc cagctatgag ttacgcacca 60
tttcgggatg tccgcgggcc cagtatgcac cgaactcaat acgtgcactc cccatatgac 120
cgaccaggat ggaaccctag gttttgtatc atatctggca accaactgct catgctcgac 180
gaagatgaga tccacccact cttgataagg gaccgaagat ccgaatctag cagaaacaag 240
ctcttgcgaa ggaccgtcag tgttccagtg gaaggacggc cccatggaga acacgagtac 300
catttgggtc ggagcagaag gaaaagcgtg ccaggaggta agcaatacag tatggaaggt 360
gccccagccg caccatttag gcccagtcag ggtttcttga gtcggcgcct taagtccagc 420
ataaaacgga caaagtccca gcccaaactc gatcgcacca gtagcttccg ccagatactc 480
ccacgatttc gctccgcaga tcacgatagg gctaggttga tgcaatcctt caaagaatct 540
cactcacatg agtcactgct tagcccctcc agcgcagcag aagctctgga gcttaacctc 600
gatgaggatt ctataatcaa gcccgttcat tcaagcatcc tgggtcaaga gttctgtttc 660
gaagttacta caagcagtgg gactaagtgt ttcgcctgca ggtcagccgc cgagcgcgat 720
aagtggatcg aaaaccttca gcgggccgtt aaaccaaaca aggacaattc taggagggtg 780
gataacgtac ttaaattgtg gataatcgaa gctcgcgaac tccctcccaa gaagagatac 840
tactgcgaac tttgtctcga cgacatgctg tatgcccgaa caactagtaa accccgcagt 900
gcctctggag acaccgtgtt ttggggcgag cacttcgagt tcaataactt gcctgccgtc 960
agggctctga gacttcacct ttacagggac agtgacaaga agcgaaaaaa agacaaagca 1020
gggtatgtgg gtcttgtcac cgtaccagtt gccacactcg ctggacgcca cttcaccgaa 1080
cagtggtacc ccgtcaccct tcccaccggt tccggcggct ccggtgggat gggatccggg 1140
ggaggtggag ggtccggagg tggtagcgga ggaaaaggca agggaggttg ccccgctgtt 1200
cggctcaaag caaggtatca gactatgagt attctgccaa tggagctcta caaagagttc 1260
gctgagtacg taacaaatca ctatagaatg ctctgtgcag tactggaacc tgctctcaat 1320
gtaaaaggca aggaagaggt agctagcgca ctcgttcaca ttctgcagtc aactggaaaa 1380
gcaaaggatt ttctcagtga catggctatg agcgaagtgg atagattcat ggagagagag 1440
catttgatat tccgcgaaaa cacattggca accaaagcca tagaagaata catgagactg 1500
atagggcaaa aatatctcaa ggatgccata ggagaattta tacgcgccct ctatgaaagt 1560
gaggaaaatt gtgaggttga tcccataaag tgcacagcat catctctggc agagcaccag 1620
gccaatctgc gaatgtgctg tgagctggca ctctgcaagg tcgtaaacag ccactgtgtc 1680
tttcctcgcg aactgaagga agtttttgct tcctggcgct tgcggtgcgc tgaacggggt 1740
cgcgaggaca tagccgaccg actcatctct gccagtttgt ttttgaggtt cctctgtcct 1800
gccatcatgt ctccctccct ctttggcctc atgcaggagt atcccgacga acaaacttca 1860
agaacattga ccctcattgc taaagtgatc cagaaccttg ctaatttttc taaattcact 1920
tcaaaggagg atttcttggg atttatgaac gaattcttgg aactggaatg ggggagcatg 1980
caacaatttc tttacgagat tagcaacctt gatactttga ctaacagcag cagtttcgaa 2040
ggctatattg atttgggccg ggagctctca acccttcatg ccctcctctg ggaagttctt 2100
cctcagcttt ccaaggaagc acttcttaag ttgggtcccc tcccacgcct tttgaacgac 2160
atatctactg cccttcgaaa tcccaatatt caacgccagc cttctcgaca gtccgaacgc 2220
ccccgccccc agcccgtcgt cctcagaggg cccagtgccg aaatgcaagg atatatgatg 2280
cgagacctga actcttcaat agaccttcag tcttttatgg ctcgcggtct gaatagttct 2340
atggatatgg ccagacttcc ttcccctact aaagagaaac ctccacctcc ccctccagga 2400
gggggtaagg acctgttcta tgtatcaaga cccccactgg cccgctcctc acctgcatat 2460
tgtacatcca gctccgacat aactgaaccc gagcaaaaaa tgcttagtgt gaacaaaagc 2520
gtcagtatgc ttgaccttca gggtgacgga cctggaggaa ggcttaacag ttccagtgta 2580
tccaatctgg ctgcagtagg cgatctgctg cacagtagcc aagcctccct taccgcagct 2640
cttggtctca ggcccgcacc cgctggacgc ctgtcacagg gctcagggtc cagcatcacc 2700
gcagctggta tgaggctctc ccaaatgggg gtcaccacag acggcgtccc tgcacagcaa 2760
ctccgcattc ctctttcctt ccaaaaccca ctttttcaca tggcagctga cggtcctggt 2820
cccccaggag gtcacggtgg gggcggcgga cacgggccac cctcaagcca ccaccatcat 2880
caccaccatc accatcacag ggggggagaa cctcctgggg acaccttcgc tccctttcac 2940
ggttactcaa aatctgagga tttgtcaagt ggagttccca agccacctgc tgcaagcatc 3000
ttgcatagtc acagctattc agatgagttc gggccctctg gaaccgactt tactcgcagg 3060
cagttgtcac ttcaggataa tttgcagcat atgctctctc caccccaaat cacaattggg 3120
ccccagaggc ccgcaccaag cggccctgga ggtgggtccg gtgggggcag cggtggcgga 3180
ggcggaggac aacctcctcc acttcaaaga ggtaagtccc agcaactcac agtcagtgct 3240
gctcaaaagc caagacccag ctctggcaac cttctccaga gcccagagcc cagttacggg 3300
cctgccagac cacggcaaca gagcctgtct aaagaaggca gtataggcgg ttctgggggg 3360
agcggaggtg ggggaggggg tggcctcaaa ccaagtatca ccaagcagca tagtcagaca 3420
cccagcacat tgaatcctac catgcctgct tccgagagaa cagttgcttg ggtctctaat 3480
atgccacatc tcagtgcaga tatcgagagt gctcacatcg agagggagga atacaaactg 3540
aaagagtact caaagtctat ggatgaaagt cgcctcgaca gggtcaagga gtacgaagag 3600
gaaatacact ctctgaagga acgactgcac atgtccaatc ggaagttgga agaatatgag 3660
agaagattgt tgagccaaga ggaacaaact tcaaaaattt tgatgcaata ccaagcaagg 3720
ttggaacaga gcgaaaagcg gttgcgacaa cagcaggccg aaaaagactc ccagattaag 3780
tcaatcatcg gacgccttat gctggtagaa gaagagctgc gccgggacca tcccgcaatg 3840
gctgagccac ttcccgagcc aaaaaaaaga ctcttggacg ctcagcgggg gtcattccct 3900
ccctgggttc agcagaccag ggtg 3924
<210> 5
<211> 943
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg 60
ccttgaatta cttccacgcc cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt 120
tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg 180
agttgaggcc tggcttgggc gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc 240
ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac 300
gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc 360
ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag 420
gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc 480
tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc 540
ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag 600
ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa 660
aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc 720
caggcacctc gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg 780
gttttatgcg atggagtttc cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg 840
gcacttgatg taattctcct tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct 900
caagcctcag acagtggttc aaagtttttt tcttccattt cag 943
<210> 6
<211> 119
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MINIX artificial intron
<400> 6
gtaagagcct agcatgtaga actggttacc tgcagcccaa gcttgctgca cgtctagggc 60
tcaccgggtt tccttgatga ggtaccgaca tacttatcct gtcccttttt tttccacag 119
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 7
aacgatatgg gctgaataca a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ffluc1_full_miRNA_sequence
<400> 8
aacgatatgg gctgaataca a 21
<210> 9
<211> 321
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 9
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgaa acgatatggg ctgaatacaa tagtgaagcc acagatgtat tgtattcagc 180
ccatatcgtt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 10
<211> 321
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 10
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgaa acgtgaattg ctcaacagta tagtgaagcc acagatgtat actgttgagc 180
aattcacgtt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 11
<211> 321
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 11
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgac ccgacgatga cgccggtgaa tagtgaagcc acagatgtat tcaccggcgt 180
catcgtcggg gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 12
<211> 321
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 12
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgat tcgataggga caagacaatt tagtgaagcc acagatgtaa attgtcttgt 180
ccctatcgaa gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 13
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> novel seq1
<400> 13
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgag catgttacgg gacttcttat tagtgaagcc acagatgtaa taagaagtcc 180
cgtaacatgc gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 14
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> novel seq2
<400> 14
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgag tgaggagcag cggatcttaa tagtgaagcc acagatgtat taagatccgc 180
tgctcctcac gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 15
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> novel seq3
<400> 15
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgag tcatgtcgtc acggaactta tagtgaagcc acagatgtat aagttccgtg 180
acgacatgac gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 16
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> novel seq4
<400> 16
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgag agaagtgcgg atttcgtatt tagtgaagcc acagatgtaa atacgaaatc 180
cgcacttctc gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 17
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> novel seq5
<400> 17
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgaa agcgccaaag gagtctgtga tagtgaagcc acagatgtat cacagactcc 180
tttggcgctt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 18
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> novel seq6
<400> 18
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgaa agtgcggatt tcgtatttgc tagtgaagcc acagatgtag caaatacgaa 180
atccgcactt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 19
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> novel seq7
<400> 19
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgaa agtggatgcg atgcgattgc tagtgaagcc acagatgtag caatcgcatc 180
gcatccactt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 20
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> novel Seq8
<400> 20
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgaa acggtatccg caacttgcga tagtgaagcc acagatgtat cgcaagttgc 180
ggataccgtt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 21
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgaa agtacgatgt ttacttgatc tagtgaagcc acagatgtag atcaagtaaa 180
catcgtactt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 22
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgaa agccgctctt ggtctctacc tagtgaagcc acagatgtag gtagagacca 180
agagcggctt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 23
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgaa agtccgaaga tcaagacctg tagtgaagcc acagatgtac aggtcttgat 180
cttcggactt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 24
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 24
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgag agtccagtat acgcagtgta tagtgaagcc acagatgtat acactgcgta 180
tactggactc gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 25
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgag tccagtatac gcagtgtaca tagtgaagcc acagatgtat gtacactgcg 180
tatactggac gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 26
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 26
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgag actcgggaaa ccgttagtat tagtgaagcc acagatgtaa tactaacggt 180
ttcccgagtc gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 27
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 27
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgag cgccttaagt ccagcataaa tagtgaagcc acagatgtat ttatgctgga 180
cttaaggcgc gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 28
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 28
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgag agttctgttt cgaagttact tagtgaagcc acagatgtaa gtaacttcga 180
aacagaactc gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 29
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgag gcgagcactt cgagttcaat tagtgaagcc acagatgtaa ttgaactcga 180
agtgctcgcc gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 30
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 30
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgaa agatccgaat ctagcagaaa tagtgaagcc acagatgtat ttctgctaga 180
ttcggatctt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 31
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgaa aggtcgtaaa cagccactgt tagtgaagcc acagatgtaa cagtggctgt 180
ttacgacctt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 32
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60
ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120
agtgagcgaa agaggaaata cactctctga tagtgaagcc acagatgtat cagagagtgt 180
atttcctctt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240
tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300
tggtataaat taaatcactt t 321
<210> 33
<211> 35
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 33
gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacag 35
<210> 34
<211> 105
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 34
gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacaggctat gaaacgatat gggctgaata 60
caaatcacag gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacag 105
<210> 35
<211> 210
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacaggctat gaaacgatat gggctgaata 60
caaatcacag gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacaggctat gaaacgatat 120
gggctgaata caaatcacag gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacaggctat 180
gaaacgatat gggctgaata caaatcacag 210
<210> 36
<211> 105
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 36
gctatgaaac gatatgggcg gaatacaaat cacaggctat gaaacgatat gggcggaata 60
caaatcacag gctatgaaac gatatgggcg gaatacaaat cacag 105
<210> 37
<211> 105
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 37
gctatgaaac gatatgttat gaatacaaat cacaggctat gaaacgatat gttatgaata 60
caaatcacag gctatgaaac gatatgttat gaatacaaat cacag 105
<210> 38
<211> 105
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 38
gctatgaccc aaactgtgaa gaatacaaat cacaggctat gagtgtctat cacccgaata 60
caaatcacag gctatgacta ggcccgtttc gaatacaaat cacag 105
<210> 39
<211> 105
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 39
gctatgaaac gatatgcgct gaatacaaat cacaggctat gaaacgatat gcgctgaata 60
caaatcacag gctatgaaac gatatgcgct gaatacaaat cacag 105
<210> 40
<211> 105
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 40
gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacaggctat gaaacgatat gggctgaata 60
caaatcacag gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacag 105
<210> 41
<211> 105
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 41
gctatgaaac gatatgggct caatacaaat cacaggctat gaaacgatat gggctcaata 60
caaatcacag gctatgaaac gatatgggct caatacaaat cacag 105
<210> 42
<211> 105
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 42
gctatgaaac gatatgggct gattacaaat cacaggctat gaaacgatat gggctgatta 60
caaatcacag gctatgaaac gatatgggct gattacaaat cacag 105
<210> 43
<211> 105
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 43
gctatgaaac gatatgggct gaattcaaat cacaggctat gaaacgatat gggctgaatt 60
caaatcacag gctatgaaac gatatgggct gaattcaaat cacag 105
<210> 44
<211> 105
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 44
gctatgaaac gatatgggct gaatactaat cacaggctat gaaacgatat gggctgaata 60
ctaatcacag gctatgaaac gatatgggct gaatactaat cacag 105
<210> 45
<211> 105
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 45
gctatgaaac gtgaattgct caacagtaat cacaggctat gaaacgtgaa ttgctcaaca 60
gtaatcacag gctatgaaac gtgaattgct caacagtaat cacag 105
<210> 46
<211> 105
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 46
gctatgaccc gacgatgacg ccggtgaaat cacaggctat gacccgacga tgacgccggt 60
gaaatcacag gctatgaccc gacgatgacg ccggtgaaat cacag 105
<210> 47
<211> 105
<212> DNA
<213> Phonitus pyralis
<400> 47
gctatgattc gatagggaca agacaattat cacaggctat gattcgatag ggacaagaca 60
attatcacag gctatgattc gatagggaca agacaattat cacag 105
<210> 48
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Novel seq1 3x binding sites
<400> 48
gctatgagca tgttacggga cttcttatat cacaggctat gagcatgtta cgggacttct 60
tatatcacag gctatgagca tgttacggga cttcttatat cacag 105
<210> 49
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Novel seq2 3x binding sites
<400> 49
gctatgagtg aggagcagcg gatcttaaat cacaggctat gagtgaggag cagcggatct 60
taaatcacag gctatgagtg aggagcagcg gatcttaaat cacag 105
<210> 50
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Novel seq3 3x binding sites
<400> 50
gctatgagtc atgtcgtcac ggaacttaat cacaggctat gagtcatgtc gtcacggaac 60
ttaatcacag gctatgagtc atgtcgtcac ggaacttaat cacag 105
<210> 51
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Novel seq4 3x binding sites
<400> 51
gctatgagag aagtgcggat ttcgtattat cacaggctat gagagaagtg cggatttcgt 60
attatcacag gctatgagag aagtgcggat ttcgtattat cacag 105
<210> 52
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Novel seq5 3x binding sites
<400> 52
gctatgaaag cgccaaagga gtctgtgaat cacaggctat gaaagcgcca aaggagtctg 60
tgaatcacag gctatgaaag cgccaaagga gtctgtgaat cacag 105
<210> 53
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Novel seq6 3x binding sites
<400> 53
gctatgaaag tgcggatttc gtatttgcat cacaggctat gaaagtgcgg atttcgtatt 60
tgcatcacag gctatgaaag tgcggatttc gtatttgcat cacag 105
<210> 54
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Novel seq7 3x binding sites
<400> 54
gctatgaaag tggatgcgat gcgattgcat cacaggctat gaaagtggat gcgatgcgat 60
tgcatcacag gctatgaaag tggatgcgat gcgattgcat cacag 105
<210> 55
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Novel seq8 3x binding sites
<400> 55
gctatgaaac ggtatccgca acttgcgaat cacaggctat gaaacggtat ccgcaacttg 60
cgaatcacag gctatgaaac ggtatccgca acttgcgaat cacag 105
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MECP2 coding 1 binding site
<400> 56
aagtacgatg tttacttgat c 21
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MECP2 coding 2 binding site
<400> 57
aagccgctct tggtctctac c 21
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MECP2 coding 3 binding site
<400> 58
aagtccgaag atcaagacct g 21
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MECP2 coding 4 binding site
<400> 59
gagtccagta tacgcagtgt a 21
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MECP2 coding 5 binding site
<400> 60
gtccagtata cgcagtgtac a 21
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MECP2 coding 6 binding site
<400> 61
gactcgggaa accgttagta t 21
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SYNGAP1 coding 1 binding site
<400> 62
gcgccttaag tccagcataa a 21
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SYNGAP1 coding 2 binding site
<400> 63
gagttctgtt tcgaagttac t 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SYNGAP1 coding 3 binding site
<400> 64
ggcgagcact tcgagttcaa t 21
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SYNGAP1 coding 4 binding site
<400> 65
aagatccgaa tctagcagaa a 21
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SYNGAP1 coding 5 binding site
<400> 66
aaggtcgtaa acagccactg t 21
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SYNGAP1 coding 6 binding site
<400> 67
aagaggaaat acactctctg a 21
<210> 68
<211> 382
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 68
agtaattcat acaaaaggac tcgcccctgc cttggggaat cccagggacc gtcgttaaac 60
tcccactaac gtagaaccca gagatcgctg cgttcccgcc ccctcacccg cccgctctcg 120
tcatcactga ggtggagaag agcatgcgtg aggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg 180
cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta 240
gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc 300
cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa 360
cgggtttgcc gccagaacac ag 382
<210> 69
<211> 164
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Jet promoter
<400> 69
gggcggagtt agggcggagc caatcagcgt gcgccgttcc gaaagttgcc ttttatggct 60
gggcggagaa tgggcggtga acgccgatga ttatataagg acgcgccggg tgtggcacag 120
ctagttccgt cgcagccggg atttgggtcg cggttcttgt ttgt 164
<210> 70
<211> 122
<212> DNA
<213> Simian virus 40
<400> 70
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
ta 122
<210> 71
<211> 225
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 71
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 72
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SpA
<400> 72
aataaagagc tcagatgcat cgatcagagt gtgttggttt tttgtgtg 48
<210> 73
<211> 10
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 73
gccaccatgg 10
<210> 74
<211> 589
<212> DNA
<213> Woodchuck hepatitis virus
<400> 74
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589
<210> 75
<211> 247
<212> DNA
<213> Woodchuck hepatitis virus
<400> 75
ataatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg 60
ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc 120
gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt agttcttgcc acggcggaac 180
tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt 240
ccgtggt 247
<210> 76
<211> 644
<212> DNA
<213> Cytomegalovirus
<400> 76
ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 60
gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 120
tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 180
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 240
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 300
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 360
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 420
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 480
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 540
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 600
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcg 644
Claims (30)
- - 프로모터
- 인트론 내에서 발현되는 적어도 하나의 비-포유동물 또는 합성 miRNA로서, 상기 합성 miRNA가 자연적으로 발생하지 않는 서열인, 적어도 하나의 비-포유동물 또는 합성 miRNA;
- 전이유전자;
- 전이유전자의 발현 제어를 제공하는 적어도 하나의 비-포유동물 또는 합성 miRNA 결합 부위(들)로서, 상기 합성 miRNA 결합 부위(들)가 자연적으로 발생하지 않는 서열인, 비-포유동물 또는 합성 miRNA 결합 부위(들); 및
- 폴리아데닐화 신호
를 포함하는 작제물. - 제1항에 있어서, 전이유전자의 발현 제어를 제공하는 miRNA 결합 부위(들)가 3' UTR 또는 5' UTR 내에 제공되는, 작제물.
- 제1항에 있어서, 비-포유동물 또는 합성 miRNA 결합 부위(들)가 전이유전자 내에 제공되는, 작제물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물이 상이한 수준의 벡터 유래 전이유전자를 수용하는 세포에 걸쳐 비교적 고정된 수준의 전이유전자 발현을 제공하는(즉, 용량-무감응(dosage-insensitivity)) 단일 유전자 회로를 제공하는, 작제물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 합성 또는 비-포유동물 miRNA가 표적외 결합 효과(off-target binding effects)를 나타내지 않는, 작제물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 비-포유동물 또는 합성 miRNA가
>인간_EF1a_인트론_A(서열번호 5)
>MINIX_인공_인트론 (서열번호 6)
에 의해 제공된 인트론에서 발현되는, 작제물. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA가 곤충 miRNA로부터 유래된 비-포유동물 miRNA이고, 임의로 miRNA가 반딧불이 루시페라제(ffluc1) miRNA 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는, 작제물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물에 복수의 miRNA 결합 부위, 임의로 3개의 miRNA 결합 부위, 적어도 4개의 miRNA 결합 부위, 적어도 5개의 miRNA 결합 부위, 적어도 6개의 miRNA 결합 부위가 제공되는, 작제물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 작제물에서 발현되는 복수의 비-포유동물 또는 합성 miRNA가 존재하는, 작제물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 비-포유동물 반딧불이 루시페라제 miRNA가
>ffluc1 (서열번호 9)
>ffluc9 (서열번호 10)
>ffluc18 (서열번호 11)
>ffluc22 (서열번호 12)
로부터 선택되는 서열인, 작제물. - 제1항 내지 제6항 또는 제8항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 miRNA가
>신규_seq_1 (서열번호 13)
>신규_seq_2 (서열번호 14)
>신규_seq_3 (서열번호 15)
>신규_seq_4 (서열번호 16)
>신규_seq_5 (ran1g) (서열번호 17)
>신규_seq_6 (ran2g) (서열번호 18)
>신규_seq_7 (서열번호 19)
>신규_seq_8 (서열번호 20)
로부터 선택되는 서열인, 작제물. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 miRNA가 표적 유전자의 코딩 서열에 대해 표적화되고
>MECP2_코딩_1 (서열번호 21)
>MECP2_코딩_2 (서열번호 22)
>MECP2_코딩_3 (서열번호 23)
>MECP2_코딩_4 (서열번호 24)
> MECP2_코딩_5 (서열번호 25)
> MECP2_코딩_6 (서열번호 26)
>SYNGAP1_코딩_1 (서열번호 27)
> SYNGAP1_코딩_2 (서열번호 28)
> SYNGAP1_코딩_3 (서열번호 29)
> SYNGAP1_코딩_4 (서열번호 30)
> SYNGAP1_코딩_5 (서열번호 31)
> SYNGAP1_코딩_6 (서열번호 32)
로부터 선택되는, 작제물. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 비-포유동물 또는 합성 miRNA 결합 부위가
>ffluc1_x1_결합_부위(서열번호 33)
>ffluc1_x 3_결합_부위 (서열번호 34)
>ffluc1_x6_결합_부위 (서열번호 35)
>ffluc1_x3_결합_부위_1bp_중심_미스매치 (서열번호 36)
> ffluc1_x3_결합_부위_3bp_중심_미스매치 (서열번호 37)
>ffluc1_x3_결합_부위_3'_미스매치 (서열번호 38)
>ffluc1_x3_결합_부위_돌연변이체_1 (서열번호 39)
>ffluc1_결합_부위_돌연변이체_2 (서열번호 40)
>ffluc1_x3_결합_부위_돌연변이체_3 (서열번호 41)
>ffluc1_x3_결합_부위_돌연변이체_4 (서열번호 42)
>ffluc1_x3_결합_부위_돌연변이체_5 (서열번호 43)
>ffluc1_x3_결합_부위_돌연변이체_6 (서열번호 44)
>ffluc9_x3_결합_부위 (서열번호 45)
>ffluc18_x3_결합_부위 (서열번호 46)
>ffluc22_x3_결합_부위 (서열번호 47)
>신규_seq_1_3x_결합_부위 (서열번호 48)
>신규_seq_2_3x_결합_부위 (서열번호 49)
>신규_seq_3_3x_결합_부위 (서열번호 50)
>신규_seq_4_3x_결합_부위 (서열번호 51)
>신규_seq_5_3x_결합_부위 (ran1g 결합 부위) (서열번호 52)
>신규_seq_6_3x_결합_부위 (ran2g 결합 부위) (서열번호 53)
>신규_seq_7_3x_결합_부위 (서열번호 54)
>신규_seq_8_3x_결합_부위 (서열번호 55)
로부터 선택되는, 작제물. - 제12항에 있어서, 합성 miRNA가 표적 유전자의 코딩 서열에 대해 표적화되고 합성 miRNA 결합 부위가
>MECP2_코딩_1_결합_부위 (서열번호 56)
aagtacgatgtttacttgatc
> MECP2_코딩_2_결합_부위 (서열번호 57)
aagccgctcttggtctctacc
> MECP2_코딩_3_결합_부위 (서열번호 58)
aagtccgaagatcaagacctg
> MECP2_코딩_4_결합_부위 (서열번호 59)
gagtccagtatacgcagtgta
> MECP2_코딩_5_결합_부위 (서열번호 60)
gtccagtatacgcagtgtaca
> MECP2_코딩_6_결합_부위 (서열번호 61)
gactcgggaaaccgttagtat
>SYNGAP1_코딩_1_결합_부위 (서열번호 62)
gcgccttaagtccagcataaa
> SYNGAP1_코딩_2_결합_부위 (서열번호 63)
gagttctgtttcgaagttact
> SYNGAP1_코딩_3_결합_부위 (서열번호 64)
ggcgagcacttcgagttcaat
> SYNGAP1_코딩_4_결합_부위 (서열번호 65)
Aagatccgaatctagcagaaa
> SYNGAP1_코딩_5_결합_부위 (서열번호 66)
aaggtcgtaaacagccactgt
> SYNGAP1_코딩_6_결합_부위 (서열번호 67)
aagaggaaatacactctctga
로부터 선택되는, 작제물. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 항시적(constitutive) 또는 조건적 프로모터로부터 선택되고, 임의로 상기 프로모터가 조직 특이적인, 작제물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가
>EF1a_프로모터 (서열번호 68)
>Jet_프로모터 (서열번호 69)
로부터 선택되는, 작제물. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리A 서열이
>sv40 폴리A 신호 (서열번호 70)
>BGH 폴리A 신호 (서열번호 71)
및
>SpA (서열번호 72)
로부터 선택되는, 작제물. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물이 안정성 요소를 추가로 포함하고, 상기 안정성 요소가 3'UTR 내에 위치하는, 작제물.
- 제18항에 있어서, 안정성 요소가
>우드척 간염 바이러스(WHV) 전사 후 조절 요소(WPRE)(서열번호 74)
> WPRE의 절두된 버젼 (WPRE3) (서열번호 75)
로부터 선택되는, 작제물. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물이 코작(Kozak) 서열 GCCACCATGG(서열번호 73)를 추가로 포함하는, 작제물.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA 결합 부위가 miRNA 결합을 부분적으로 개선하도록 설계된, 작제물.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 작제물을 포함하는 벡터.
- 제22항에 있어서, 벡터가 AAV 또는 렌티바이러스 벡터이고, 임의로 상기 벡터가 AAV 벡터이고, 임의로 상기 작제물이 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결되고, 상기 발현 제어 요소와 상기 작제물이 함께 5' 및 3' AAV 역 말단 반복부(ITR)에 의해 측접되어 있는, 벡터.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 벡터가 비리온에 패키징되고, 임의로 상기 벡터가 비론(viron)에 패키징될 때 작제물의 품질에 영향을 미치지 않는, 벡터.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 나노입자에 제형화된 벡터.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 작제물 또는 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항의 벡터를 사용하여 전이유전자를 발현하고, 임의로 특정 포유동물 세포 유형 또는 유형들인 전이유전자를 발현하는 방법.
- 대상체에서 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 작제물 또는 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항의 벡터를 대상체에게 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
- 개체에서 유전자의 불충분한 발현에 의해 유발되는 장애의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 작제물 또는 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 조성물.
- 장애가 교정 유전자의 제어된 발현이 요망되는 임의의 단일유전자 장애이고, 임의로 상기 단일유전자 장애가 레트 증후군, 취약 X 증후군, 엔젤만 증후군, Syngap-관련 지적 장애, CDK15 결핍증, 프리드라이히 운동실조증, 척수성 근이영양증, 혈우병 및 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제27항의 방법 또는 제28항의 조성물.
- 장애가 PRKCZ, TTC34, PRDM16, ARHGEF16, PARK7, PRDM2, IGSF21, PTCH2, NFIA, ST6GALNAC3, DPYD, COL11A1, PDZK1, GPR89A, NBPF11, GPR89B, KCNT2, CFHR2, ASPM, PTPRC, GPATCH2, DUSP10, GPR137B, RYR2, CHRM3, RGS7, AKT3, KIF26B, SMYD3, LPIN1, EPCAM, MSH2, NRXN1, XPO1, LRP1B, ZEB2, ACVR2A, MBD5, KIF5C, SCN1A, COL3A1, PMS1, PLCL1, SATB2, PARD3B, EPHA4, SPHKAP, CHL1, GRM7, TRANK1, DOCK3, FAM19A1, FOXP1, ROBO1, CADM2, FOXL2, SOX2, LPP, RASGEF1B, GRID2, FAT4, NR3C2, LRBA, FGA, GALNTL6, WWC2, TLR3, IRX2, IRX1, CDH12, CDH9, NIPBL, HEXB, MEF2C, GRAMD3, FBN2, PRELID2, TCOF1, GABRG2, MSX2, NSD1, FOXC1, CDYL, TBC1D7, RUNX2, MUT, RIMS1, NKAIN2, LAMA2, ARID1B, PARK2, PACRG, QKI, TNRC18, FBXL18, SUGCT, GLI3, AUTS2, MLXIPL, COL1A2, PPP1R9A, CFTR, TSPAN12, GRM8, CNTNAP2, MNX1, CSMD1, MCPH1, LPL, ANK1, IMPAD1, CHD7, VCPIP1, TRPS1, PARP10, DOCK8, KANK1, GLIS3, PTPRD, MLLT3, ROR2, PTCH1, AL162389.1, ARRDC1, EHMT1, PCDH15, CTNNA3, ADK, BMPR1A, PAX2, BTRC, INPP5A, MRPL23, ELP4, PAX6, CPT1A, DYNC2H1, KIRREL3, WNK1, CACNA1C, PPFIBP1, TBX5, MED13L, NALCN, CHD8, MYH7, TTC6, DAAM1, NRXN3, MTA1, SNRPN, UBE3A, OCA2, HERC2, CHRFAM7A, ARHGAP11B, OTUD7A, FBN1, HEXA, SNUPN, NRG4, AC112693.2, IGF1R, LRRC28, HBA2, HBQ1, CREBBP, RBFOX1, CDR2, CDH13, CYBA, NXN, YWHAE, SMG6, METTL16, PAFAH1B1, ADORA2B, NT5M, RAI1, NF1, C17orf67, PITPNC1, ACOX1, TCF4, DOCK6, CACNA1A, LPHN1, ZSCAN5A, BMP2, MYT1, PEX26, USP18, DGCR6L, USP41, UBE2L3, NF2, LARGE, BRD1, SHANK3 CDKL5, FXN, SMN1, F8 및 INS를 포함하는 목록으로부터 선택된 유전자의 발현에 의해 치료되는, 제27항의 방법 또는 제28항의 조성물.
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