CN116322789A - 转基因表达系统 - Google Patents

Abstract

描述了将载体衍生转基因的表达限制在减轻致病的遗传缺陷而不产生过表达毒性的窗口内的系统。这提供了“剂量不敏感性”，由此接受更多载体衍生转基因的细胞或组织通过可以适应性调节的内置单个基因回路受不成比例地抑制。

Description

转基因表达系统

发明领域

基因疗法的目标在于递送治疗性转基因以影响遗传疾病的矫正。本发明提供了构建体以在接受不同水平的载体衍生转基因的细胞间生成相对固定水平的表达。本文还描述了控制基因表达的方法，其中使用所描述的基因回路提供控制。

发明背景

虽然已知递送治疗性转基因以影响遗传疾病的矫正的基因疗法概念，但许多基因是高度剂量敏感的，由此基因产物的表达过少或过多都可以产生有害的影响。病毒介导的基因转移是向靶组织和靶细胞(包括神经系统的细胞)递送治疗性转基因的有力的手段。高病毒滴度通常是实现有效的系统范围的转导以获得最佳的治疗效果所必需的。然而，在一些细胞中同样高的滴度可能由于超生理的转基因表达水平而造成过表达毒性。需要有效的系统以将载体衍生转基因的表达限制在减轻致病的遗传缺陷而不产生过表达毒性的窗口内。

WO2016040395讨论了合成RNA回路用于基因转移的用途。该回路包括包含由在细胞类型中特异性表达的第一microRNA识别的至少一个序列和编码特异性结合于RNA基序并抑制蛋白质产生的蛋白质的序列的第一RNA分子。将第一microRNA描述为miR-21。还提供了包含在RNA基序处由不在该细胞类型中表达的第二microRNA识别的序列和编码输出分子的序列的第二RNA分子。将第二microRNA描述为miR-141、miR-142和miR-146。该申请描述了不同细胞(癌细胞或非癌细胞)的输出蛋白的差异表达依赖于这些细胞提供的内源性miR。

Strovas TJ,Rosenberg AB,Kuypers BE,Muscat RA,Seelig G.MicroRNA-basedsingle-gene circuits buffer protein synthesis rates against perturbations.ACSSynth Biol.2014；3(5):324-331讨论了基于单个基因microRNA(miRNA)的前馈环路的用途。它提供了靶向其自身转录本的内含子miRNA。Strovas考虑了哺乳动物细胞中工程化的遗传程序的长期稳定表达的困难。该工作利用了基因回路，其中将含有小鼠mir-124-3基因的内含子插入红色荧光报告物(mCherry)中。前mRNA从多西环素诱导型启动子转录，导致mir-124和mCherry的共表达。miRNA和mCherry转录本之间的阻遏性调节联系由mir-124调节的Vamp3基因的3’UTR的截短型式提供给mRNA。

虽然WO2016040395讨论了在正常细胞和癌细胞中使用不同表达的内源性miR来提供表达，但这种miR的使用在非癌症疾病的治疗中的用途受限。发明人还已经确定，Stovas的现有方法将对已知受到内源性miRNA(如本文中使用的miR124)调节的多种基因具有多重脱靶效应。事实上，已知miR124与多种癌症相关，因此其将不适用于基因疗法。因此，提供内源性microRNA可能存在问题，因为除了转基因外还可能提供内源性靶标。

本发明的发明人已寻求提供比本领域提供的构建体更具优势的替代构建体。

发明概述

发明人已经确定了将载体衍生转基因的表达限制在减轻致病的遗传缺陷而不产生过表达毒性的窗口内的系统，以实现发明人所称的“剂量不敏感性”，由此接受更多载体衍生转基因的细胞或组织通过可以适应性调节的内置单个基因回路受不成比例地抑制。也就是说，载体衍生转基因在高载体剂量情况下被下调使得该回路在一系列载体剂量间维持相对稳定的表达水平，结果是整个细胞群体表达更均匀和更受控的载体衍生转基因的水平。与常规的基因疗法盒相比，提高载体剂量将导致细胞群体内更多的细胞表达转基因但不伴随过表达的增加。，通常接受高载体负载(如心脏、肝脏和背根神经节中)的敏感细胞类型也将不容易受到通过这种机制的超感染介导的过表达的影响。

本申请的发明人已经设计了合成或非哺乳动物miRNA构建体，其克服与基于哺乳动物的miRNA构建体相关联的展现出脱靶效应风险的缺点。发明人已经证明非哺乳动物或完全合成的(自然界中未知的)miRNA以确保宿主(人基因组)内不存在靶标的效用。

此外，发明人已经确定可以如何使用此类合成的组分以容许对系统进行微调(位点数量和高效的内含子排除)以实现适当的剂量不敏感性。

因此，本发明的第一方面提供了构建体，其包含：

-启动子；

-在内含子内表达的至少一个非哺乳动物或合成miRNA，其中该合成miRNA是非天然存在的序列；

-转基因；

-一个或多个非哺乳动物或合成miRNA结合位点，其提供对转基因的表达的控制，其中该合成miRNA结合位点不天然存在；和

-多腺苷酸化信号。

本文讨论的mRNA结合位点是合成衍生的以与哺乳动物细胞中存在的哺乳动物序列不同，或是由另一种非哺乳动物物种(例如昆虫)提供。当miRNA结合位点来自昆虫而不存在于哺乳动物序列中(例如ffluc1)时，可以使用非哺乳动物系统。miRNA结合位点和非哺乳动物或合成miRNA的组合使构建体的脱靶调节效应最小化。这容许调节转基因的表达以提供期望的转基因剂量(表达)。

合适地，提供对转基因的表达的控制的miRNA结合位点可以在3’UTR、5’UTR和/或转基因内提供。合适地，当在转基因中提供时，miRNA结合位点可以是密码子优化的使得其提供合成或非哺乳动物结合位点但不影响转基因蛋白的氨基酸序列。该构建体可以用于提供容许表达控制的前馈环路。

合适地，可以包括增加转基因表达的稳定性元件。合适地，稳定性元件可y位于3’UTR中。合适地，该稳定性元件可以是土拨鼠肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)(SEQ IDNO:74)。WPRE是含有γ、α和β元件的三方调节元件。合适地，稳定性元件可以是保留稳定性元件但省略X蛋白序列或核酶稳定性序列的WPRE的截短型式(WPRE3)(SEQ ID NO:75)。WPRE3是缩短的WPRE序列，其含有WPRE的三个调节元件中的两个(最小的γ和α元件)。合适地，WPRE3稳定性元件提供了在经加工的转录本中产生三级结构的DNA序列，这增强了转基因表达。

合适地，可以将不同的启动子与一系列转基因一起使用。在本发明中，可以调整前馈回路的强度以容许控制转基因的表达水平。这提供了剂量敏感性。调整单个基因回路中micro RNA结合位点的数量以及通过使用以不同效率被剪接出的合成内含子也容许对回路进行微调。

构建体可以适合于在哺乳动物细胞中表达转基因。合适地，构建体可以适合于提供给哺乳动物细胞，合适地提供给特定的哺乳动物细胞或将要影响转基因表达的细胞类型。

有利地，可以提供使用内含子衍生的microRNA的单个基因回路，以便在接受不同水平的载体衍生转基因的细胞间生成相对固定的表达水平。

如本领域技术人员所理解的，构建体的特征(启动子、在内含子内表达的合成miRNA、转基因、提供对转基因的表达的控制的miRNA结合位点、多腺苷酸化信号)应该相对于彼此提供，以容许转基因的功能性表达。

构建体可以适合于包括经修饰的Kozak序列。合适地，经修饰的Kozak序列可以是任何Kozak序列，其包含充当蛋白质翻译起始位点的任何核酸基序。合适地，经修饰的Kozak序列可以是促进翻译起始增加的任何经修饰的序列。合适地，Kozak序列可以是GCCACCATGG(SEQ ID NO:73)。

在实施方案中，构建体包含(5’至3’)：

-启动子；

-在内含子内表达的至少一个非哺乳动物或合成miRNA，其中该合成miRNA是非天然存在的序列；

-转基因；

-一个或多个合成或非哺乳动物miRNA结合位点，其在转基因内提供对转基因的表达的控制，其中该合成miRNA结合位点不天然存在；和

-多腺苷酸化信号。

在实施方案中，构建体包含(5’至3’)：

-启动子；

-在内含子内表达的至少一个非哺乳动物或合成miRNA，

-转基因，其中该合成miRNA是非天然存在的序列；

-一个或多个合成或非哺乳动物miRNA结合位点，其在3’UTR内提供对转基因的表达的控制，其中该合成miRNA结合位点不天然存在；和

-多腺苷酸化信号。

在实施方案中，构建体包含(5’至3’)：

-启动子；

-在内含子内表达的至少一个非哺乳动物或合成miRNA，其中该合成miRNA是非天然存在的序列；

-能够增强转基因的转录的经修饰的Kozak序列；

-转基因；

-一个或多个合成或非哺乳动物miRNA结合位点，其在转基因内或3’UTR内提供对转基因的表达的控制，其中该合成miRNA结合位点不天然存在；和

-多腺苷酸化信号。

在实施方案中，构建体包含(5’至3’)：

-启动子；

-在内含子内表达的至少一个非哺乳动物或合成miRNA，其中该合成miRNA是非天然存在的序列；

-转基因；

-一个或多个合成或非哺乳动物miRNA结合位点，其在转基因内或3’UTR内提供对转基因的表达的控制，其中该合成miRNA结合位点不天然存在，其中该一个或多个合成或非哺乳动物miRNA结合位点经设计以部分改善miRNA结合；

-多腺苷酸化信号。

在实施方案中，构建体包含(5’至3’)：

-启动子；

-在内含子内表达的至少一个非哺乳动物或合成miRNA，其中该合成miRNA是非天然存在的序列；

-转基因；

-一个或多个miRNA结合位点，其在转基因内或3’UTR内提供对转基因的表达的控制，其中该合成miRNA结合位点不天然存在；

-3’UTR中的稳定性元件；和

-多腺苷酸化信号。

在一些实施方案中，构建体可以包含启动子、在内含子内表达的至少一个非哺乳动物或合成miRNA、转基因、在转基因内或3’UTR内提供对转基因的表达的控制的一个或多个结合位点、多腺苷酸化信号以及，任选地，上述实施方案中记载的任何一个或多个特征。在一些实施方案中可以包含以记载的此类特征的顺序排列的一个或多个上文记载的特征。

合适地，可以修饰构建体以提供增强的表达、调节和稳定性。合适地，构建体可以含有报告转基因。合适地，构建体可以含有促进强表达的Kozak序列。合适地，构建体可以在3’UTR中含有稳定性元件。合适地，构建体可以含有一个或多个结合位点，其包括经工程化以降低miRNA结合功效(但不完全改善)的突变。

合适地，感兴趣的基因可以是MECP2。替代性地，感兴趣的基因可以是以下感兴趣的基因中的任何一种：FMR1、UBE3A、CDKL5、FXN、SMN1或INS。感兴趣的基因可以是需要使用基因疗法提供以治疗遗传病况或发育病症的任何基因。感兴趣的基因可以是在递送给受试者以治疗遗传病况或发育病症时需要受控表达的任何基因。

转基因

合适地，转基因是人工引入靶细胞在的蛋白质编码基因。它作为在所选择的启动子的控制下的本发明第一方面的构建体的部分，例如作为基因疗法盒的部分提供。转基因的DNA序列可以代表特定基因的特定同等型。转基因DNA序列可以是密码子优化的。密码子优化可以提供特定的和独特的DNA序列，但该DNA和随后的mRNA的变化不影响蛋白质的编码序列；即维持野生型氨基酸序列。

合适地，转基因可以选自：

>人MECP2-e1同等型(SEQ ID NO:1)

人UBE3A(SEQ ID NO:2)

>人FMR1–同等型7(SEQ ID NO:3)

>人SYNGAP1(SEQ ID NO:4)

合适地，可以提供这些转基因的功能变体，其中功能变体保留由转基因提供的功能并且具有至少60％的序列同一性、至少70％的序列同一性、至少80％的序列同一性、至少90％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少97％的序列同一性、至少99％的序列同一性。合适地，功能变体可以是提供转基因的功能的转基因的片段。合适地，在提供对转基因的表达的控制的miRNA结合位点在转基因内提供的情况下，在功能变体中提供miRNA结合位点，使得miRNA可以结合转基因并控制转基因的表达。

可以通过本领域已知的任何方法确定序列同一性。合适地，可以在转基因的全长上确定序列同一性。

合适的转基因包括那些基于任何单个基因病症的转基因，对于这些病症期望转基因受控表达。合适的转基因包括那些基于任何单基因病症的转基因，对于这些病症期望转基因受控表达。另外的示例性转基因包括那些基于单个基因CNS病症的转基因，对于这些病症期望转基因受控表达。神经系统表达许多已知在过表达时对神经系统功能有害的基因。然而，本发明适用于转基因过表达有害的任何情况，包括用于非CNS病症的基因疗法。示例将包括肌肉细胞中的抗肌萎缩蛋白基因置换，由此中等的过表达不引起有害的不良作用，但当过表达水平非常高时导致严重的心脏毒性。

从内含子内的miRNA表达

micro RNA(miRNA)是一类小的单链非编码RNA，长度为约22个核苷酸。大多数miRNA由RNA聚合酶II转录，作为独立的转录本或作为嵌入mRNA的内含子内的RNA。初级miRNA转录本被两种RNase III酶(Drosha和Dicer)加工成约70nt的发夹前体miRNA，然后最终加工成约22nt的成熟miRNA。miRNA通过调节蛋白质水平、靶向信使RNA(mRNA)进行翻译阻遏和/或mRNA降解来发挥功能。

发明人已经开发了本发明的非哺乳动物或合成miRNA，其能够敲低含有相应结合区的转录本的表达。在本发明的一些情况下，这些是最初经设计以靶向萤火虫萤光素酶蛋白的昆虫衍生miRNA序列。在其他情况下，它们是合成miRNA序列，与天然存在的miRNA没有直系同源性。在一些情况下，合成miRNA序列经设计以靶向密码子优化的编码序列，其中编码序列在DNA水平上发生改变，同时保留相同的氨基酸序列。在基因疗法的背景下，这容许外源性递送的转基因由合成miRNA专门靶向，而内源性基因不受影响。在本发明的最后的情况中，通过计算机生成大的DNA序列来创建全新的合成miRNA序列，这些DNA序列与现有的miRNA设计工具一起使用以鉴定适合miRNA靶向的序列。合适地，由于所有这些miRNA都是非哺乳动物或合成的，它们在哺乳动物转录组中没有预测的内源性靶标。

合适地，可以将miRNA嵌入不同的内含子内。下面提供了此类内含子的示例。人EF1a内含子是存在于常用的EF1a启动子中的内含子，并且已知可以高效剪接。已知MINIX内含子也可以高效剪接，并且因其短的序列而在基因疗法方面是有用的。发明人已经证明了EF1a启动子和MINIX内含子可以组合工作。发明人还证明了JeT启动子和MINIX内含子组合工作。

合适地，内含子可以选自：

>人_EF1a_内含子_A(SEQ ID NO:5)

>MINIX_人工_内含子(SEQ ID NO:6)

合适地，miRNA可以由最初靶向萤火虫萤光素酶(ffluc1)的非哺乳动物miRNA提供。

非哺乳动物miRNA：(萤光素酶)

>ffluc1_全_miRNA_序列(SEQ ID NO:7)

5’-AACGATATGGGCTGAATACAA-3’

>ffluc1_种子_序列

5’-ACGATA-3’

BLAST搜索确定了在人细胞中产生的任何RNA转录本中没有与该RNA相同的(21bp)匹配(因此，它是“非哺乳动物”序列)。研究显示，如果与种子序列存在精确互补性，则miRNA可以耐受靶位点的错配。种子序列通常位于miRNA5’区的2-7位，并且对于miRNA结合至关重要。然而，没有潜在的脱靶RNA含有精确的种子序列匹配。

将miRNA嵌入发夹环结构中以容许正确识别和加工。合适地，嵌入的非哺乳动物miRNA可以选自

>ffluc1(SEQ ID NO:9)

>ffluc9(SEQ ID NO:10)

>ffluc18(SEQ ID NO:11)

>ffluc22(SEQ ID NO:12)

合适地，miRNA可以由最初靶向随机生成的序列的新的合成miRNA提供，其与哺乳动物、昆虫或植物miRNA没有直系同源性。

合适地，嵌入的合成miRNA可以选自：

>新的_序列_1(SEQ ID NO:13)

>新的_序列_2(SEQ ID NO:14)

>新的_序列_3(SEQ ID NO:15)

>新的_序列_4(SEQ ID NO:16)

>新的_序列_5(ran1g)(SEQ ID NO:17)

>新的_序列_6(ran2g)(SEQ ID NO:18)

>新的_序列_7(SEQ ID NO:19)

>新的_序列_8(SEQ ID NO:20)

合适地，嵌入的合成miRNA可以靶向靶基因的编码序列(即治疗性转基因)。

靶基因可以是密码子优化的，并且对于与哺乳动物、昆虫或植物miRNA没有直系同源性的合成miRNA，对靶向密码子优化的转基因而不靶向相同基因的内源性转录本的能力进行筛选。合适地，靶向密码子优化的序列的嵌入的合成miRNA可以选自：

>MECP2_编码_1(SEQ ID NO:21)

>MECP2_编码_2(SEQ ID NO:22)

>MECP2_编码_3(SEQ ID NO:23)

>MECP2_编码_4(SEQ ID NO:24)

>MECP2_编码_5(SEQ ID NO:25)

>MECP2_编码_6(SEQ ID NO:26)

>SYNGAP1_编码_1(SEQ ID NO:27)

>SYNGAP1_编码_2(SEQ ID NO:28)

>SYNGAP1_编码_3(SEQ ID NO:29)

>SYNGAP1_编码_4(SEQ ID NO:30)

>SYNGAP1_编码_5(SEQ ID NO:31)

>SYNGAP1_编码_6(SEQ ID NO:32)

miRNA通过结合至与成熟miRNA序列互补的特定序列工作。这些结合位点可以位于内源性mRNA的3’非翻译区(3’UTR)中。结合位点可以替代性地位于5’UTR、外显子和内含子中。在进一步替代性实施方案中，结合位点可以位于密码子优化的转基因序列内。合适地，提供对转基因表达的控制的miRNA结合位点可以在3’UTR、5’UTR内或转基因内提供。

合适地，结合位点中的“种子”序列与miRNA5’末端的碱基在位置2到7/8处形成Watson-Crick对。然而，技术人员将会理解，结合特异性和强度，例如基于序列保守性、miRNA3’末端的强碱基配对、局部AU含量和3’UTR内miRNA结合位点的位置的方式可以被改变。

合适地，可以使用不同数量的结合位点来改变转基因控制的强度。此外，可以使用引入结合位点中的错配来降低转基因控制的水平。此类变化使得能够设置剂量不敏感性的水平。

合适地，可以对结合位点进行突变以减少但不完全抑制miRNA-靶标结合。合适地，可以使用这些突变来增强转基因的表达，同时通过使一些靶miRNA仍然与结合位点结合而仍然维持转基因表达的调节控制。

成功的miRNA-靶标结合通常经由翻译阻遏或mRNA降解机制导致蛋白质水平的敲低。

合适地，非哺乳动物或合成miRNA结合位点可以选自

>ffluc1_x1_结合_位点(SEQ ID NO:33)

>ffluc1_x 3_结合_位点(SEQ ID NO:34)

>ffluc1_x6_结合_位点(SEQ ID NO:35)

>ffluc1_x3_结合_位点_1bp_中央_错配(SEQ ID NO:36)

>ffluc1_x3_结合_位点_3bp_中央_错配(SEQ ID NO:37)

>ffluc1_x3_结合_位点_3’_错配(SEQ ID NO:38)

>ffluc1_x3_结合_位点_突变体_1(SEQ ID NO:39)

>ffluc1_结合_位点_突变体_2(SEQ ID NO:40)

>ffluc1_x3_结合_位点_突变体_3(SEQ ID NO:41)

>ffluc1_x3_结合_位点_突变体_4(SEQ ID NO:42)

>ffluc1_x3_结合_位点_突变体_5(SEQ ID NO:43)

>ffluc1_x3_结合_位点_突变体_6(SEQ ID NO:44)

>ffluc9_x3_结合_位点(SEQ ID NO:45)

>ffluc18_x3_结合_位点(SEQ ID NO:46)

>ffluc22_x3_结合_位点(SEQ ID NO:47)

下列合成序列经设计使得编码序列是优化的并且靶向它们的miRNA经设计以靶向与哺乳动物内源性序列不同的序列的部分。

>新的_序列_1_3x_结合_位点(SEQ ID NO:48)

>新的_序列_2_3x_结合_位点(SEQ ID NO:49)

>新的_序列_3_3x_结合_位点(SEQ ID NO:50)

>新的_序列_4_3x_结合_位点(SEQ ID NO:51)

>新的_序列_5_3x_结合_位点(SEQ ID NO:52)

>新的_序列_6_3x_结合_位点(SEQ ID NO:53)

>新的_序列_7_3x_结合_位点(SEQ ID NO:54)

>新的_序列_8_3x_结合_位点(SEQ ID NO:55)

>MECP2_编码_1_结合_位点(SEQ ID NO:56)

>MECP2_编码_2_结合_位点(SEQ ID NO:57)

>MECP2_编码_3_结合_位点(SEQ ID NO:58)

>MECP2_编码_4_结合_位点(SEQ ID NO:59)

>MECP2_编码_5_结合_位点(SEQ ID NO:60)

>MECP2_编码_6_结合_位点(SEQ ID NO:61)

>SYNGAP1_编码_1_结合_位点(SEQ ID NO:62)

>SYNGAP1_编码_2_结合_位点(SEQ ID NO:63)

>SYNGAP1_编码_3_结合_位点(SEQ ID NO:64)

>SYNGAP1_编码_4_结合_位点(SEQ ID NO:65)

>SYNGAP1_编码_5_结合_位点(SEQ ID NO:66)

>SYNGAP1_编码_6_结合_位点(SEQ ID NO:67)

启动子

可以使用任何合适的启动子(组成型或条件型)来驱动转基因的表达。合适地，启动子可以包括Efla启动子、CAG启动子、Jet启动子、CMV启动子、CBA启动子、CBH启动子、突触蛋白1启动子、Mecp2启动子、U1a启动子、U6启动子、泛素C启动子、神经元特异性烯醇化酶启动子、少突胶质细胞转录因子1或GFAP启动子。

在实施方案中，可以将前馈miRNA掺入与合适的启动子(例如上述启动子中的任一者)偶联的内含子序列中。

所使用的确切的启动子将取决于所需的表达强度，并且在较大的基因的情况下，取决于可用的包装容量(例如AAV递送载体中)的量。合适的启动子可以由以下提供：

>EF1a_启动子(SEQ ID NO:68)

>Jet_启动子(SEQ ID NO:69)

>CMV-CBA启动子(SEQ ID NO:76)

多腺苷酸化信号

可以与合成polyA序列或天然polyA序列的截短片段一起使用该方法。在实施方案中，可以将前馈miRNA结合位点掺入3’UTR内。合适地，可以将miRNA结合位点掺入3’UTR内，除非将其嵌入转基因序列内。

可以利用本领域已知的任何合适的多腺苷酸化信号。合适地，polyA信号可以是

>sv40 polyA信号(SEQ ID NO:70)

>BGH polyA信号(SEQ ID NO:71)

>SpA(SEQ ID NO:72)

稳定性元件

合适地，可以包括稳定性元件以提高转基因表达。合适地，稳定性元件可以位于3’UTR中。合适地，稳定性元件可以是

>WPRE(SEQ ID NO:74)

>WPRE3(SEQ ID NO:75)

载体

本发明的miRNA前馈构建体经设计以在体内工作。为了将这些构建体递送至必需的组织/器官，可以利用任何合适的病毒载体。在实施方案中，病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)递送系统或其他治疗性病毒载体系统，包括慢病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒、甲病毒、黄病毒、弹状病毒、麻疹病毒、小核糖核酸病毒和痘病毒。对于AAV，可以将整个构建体(启动子、miRNA、转基因、结合位点、polyA)克隆到AAV相容性质粒中，该质粒侧接反向末端重复(ITR)序列。AAV生产有严格的大小限制，因此整个构建体必须不超过4.4kb(不包括ITR)。这种大小限制可以限制某些会占据大量可用空间的转基因的使用。可以使用替代性的、较小的启动子和polyA以容纳较大的转基因。合适地，在构建体中，可以去除3’UTR区，并且合成miRNA靶向转基因的密码子优化序列。由于密码子优化的转基因具有不同的DNA/mRNA序列，因此不会靶向来自感兴趣基因(GOI)的内源性mRNA。

根据本发明的第二方面，提供了包含本发明第一方面的构建体的载体。

合适地，可以在病毒载体中提供构建体以容许将构建体递送至靶细胞。靶细胞可以是中枢神经系统和周围神经系统的细胞，包括神经元、神经元亚型、少突胶质细胞、星形胶质细胞、施旺细胞。有利地，病毒载体可以选自；腺相关病毒(AAV)，特别是AAV9、AAV1、2、4、5、6、6.2、8、9、rh10、PHP.B、PHP.S、PHP.eB载体可以使用。

根据本发明的第三方面，提供了使用第一方面的构建体以表达转基因的方法。合适地，第二方面涵盖了在可以提供给受试者的细胞中表达转基因的方法。合适地，可以在体外有效筛选构建体以评估所需的剂量调节的水平。在体外，转基因可以包含在质粒中并经由脂质介导的转染引入细胞系中。24小时后可以看到稳健的转基因表达。此后，可以合适地通过插入到rAAV表达载体上将前馈转基因盒载体化，然后该载体可以用于生成AAV颗粒。

根据本发明的第四方面，存在治疗受试者的由基因表达不足引起的病症的方法，该方法包括以下步骤：提供具有在受试者中待表达的转基因的野生型或密码子优化的或经修饰的拷贝的本发明第一方面的构建体或第二方面的载体，以治疗受试者的由基因表达不足引起的病症。合适地，包装有转基因的AAV病毒载体将通过各种方法，包括全身性静脉内注射或通过CSF内施用途径，包括腰椎鞘内、脑室内、枕大池内(intra cisterna magna)注射或通过注射到神经毡中来引入受试者。

合适地，转基因可以是在患有神经学病症雷特综合征的受试者中表达不足的基因。通常，雷特综合征是由基因X连锁基因MECP2中的功能丧失突变引起的。合适地，转基因可以是MECP2基因的一个或多个功能拷贝。合适地，构建体使用腺相关病毒(AAV)载体提供转基因向神经系统的递送。

构建体提供转基因在靶细胞中的狭窄/期望范围内的表达。例如，当转基因是MECP2基因的蛋白质编码序列的野生型或密码子优化的拷贝时，认为该构建体可以以表达水平提供转基因，该表达水平提供合适的治疗效果但其低于观察到的不良作用的水平。在MECP2、FMR1和UBE3A的情况下，已知该基因的过表达是有害的。

例如，在雷特综合征中，发明人先前已经证明低水平的表达可以改善小鼠的疾病表型。相反，在患者中以及实验动物中的过表达(基因座的重复)(2X或更多)导致不良的神经学结果。这为前馈技术非常适合的基因疗法定义了狭窄的治疗窗口。FMR1、UBE3A和SYNGAP1基因也被认为是剂量敏感的。在此类情况下，可以确定改善疾病但使不良作用最小化的转基因的表达水平，然后使用本发明将该表达水平合适地提供给患者。

与单基因病症相关联的许多其他基因是剂量敏感的并且将受益于使用本发明的构建体和系统来调节此类外源性转基因的表达。人拷贝数变体(CNV)可以是剂量敏感基因的指示，并且研究已经表明个体基因的剂量敏感性是CNV致病性的常见原因。Gu W&LupskiJR.CNV and nervous system diseases–what’s new？Cytogenet Genome Res.2008；123:54–64引用了剂量敏感基因的若干示例及其与神经发育病症的关联。示例包括MECP2重复综合征(涉及MECP2基因)、成人发病的常染色体显性脑白质营养不良(ADLD，涉及LMNB1基因)、孤立性无脑回畸形序列(ILS，涉及PAFAH1B1/LIS1基因)、Miller-Dieker综合征(MDS，涉及YWHAE基因)。

Rice AM&McLysaght.Dosage sensitivity is a major determinant of humancopy number variant pathogenicity.Nature Communications.2017；8:14366|DOI:10.1038显示涉及与疾病相关联的CNV的孤立致病性基因在神经发育中的作用得到丰富，并且鉴定了许多剂量敏感基因，例如：PRKCZ、TTC34、PRDM16、ARHGEF16、PARK7、PRDM2、IGSF21、PTCH2、NFIA、ST6GALNAC3、DPYD、COL11A1、PDZK1、GPR89A、NBPF11、GPR89B、KCNT2、CFHR2、ASPM、PTPRC、GPATCH2、DUSP10、GPR137B、RYR2、CHRM3、RGS7、AKT3、KIF26B、SMYD3、LPIN1、EPCAM、MSH2、NRXN1、XPO1、LRP1B、ZEB2、ACVR2A、MBD5、KIF5C、SCN1A、COL3A1、PMS1、PLCL1、SATB2、PARD3B、EPHA4、SPHKAP、CHL1、GRM7、TRANK1、DOCK3、FAM19A1、FOXP1、ROBO1、CADM2、FOXL2、SOX2、LPP、RASGEF1B、GRID2、FAT4、NR3C2、LRBA、FGA、GALNTL6、WWC2、TLR3、IRX2、IRX1、CDH12、CDH9、NIPBL、HEXB、MEF2C、GRAMD3、FBN2、PRELID2、TCOF1、GABRG2、MSX2、NSD1、FOXC1、CDYL、TBC1D7、RUNX2、MUT、RIMS1、NKAIN2、LAMA2、ARID1B、PARK2、PACRG、QKI、TNRC18、FBXL18、SUGCT、GLI3、AUTS2、MLXIPL、COL1A2、PPP1R9A、CFTR、TSPAN12、GRM8、CNTNAP2、MNX1、CSMD1、MCPH1、LPL、ANK1、IMPAD1、CHD7、VCPIP1、TRPS1、PARP10、DOCK8、KANK1、GLIS3、PTPRD、MLLT3、ROR2、PTCH1、AL162389.1、ARRDC1、EHMT1、PCDH15、CTNNA3、ADK、BMPR1A、PAX2、BTRC、INPP5A、MRPL23、ELP4、PAX6、CPT1A、DYNC2H1、KIRREL3、WNK1、CACNA1C、PPFIBP1、TBX5、MED13L、NALCN、CHD8、MYH7、TTC6、DAAM1、NRXN3、MTA1、SNRPN、UBE3A、OCA2、HERC2、CHRFAM7A、ARHGAP11B、OTUD7A、FBN1、HEXA、SNUPN、NRG4、AC112693.2、IGF1R、LRRC28、HBA2、HBQ1、CREBBP、RBFOX1、CDR2、CDH13、CYBA、NXN、YWHAE、SMG6、METTL16、PAFAH1B1、ADORA2B、NT5M、RAI1、NF1、C17orf67、PITPNC1、ACOX1、TCF4、DOCK6、CACNA1A、LPHN1、ZSCAN5A、BMP2、MYT1、PEX26、USP18、DGCR6L、USP41、UBE2L3、NF2、LARGE、BRD1、SHANK3。

发明人认为任何合适的基因，特别是任何剂量敏感基因，例如如上文所讨论的，可以根据需要合适地用于本发明。例如，如本领域所理解的，本发明的构建体和系统可以用于表达任何合适的蛋白质来治疗疾病或病况，特别是在其中对所提供的蛋白质的表达水平的控制很重要的情况。

发明人认为概念、其中具有合适的转基因的构建体和表达转基因的方法适用于任何其他临床相关的和剂量敏感的基因。

合适地，构建体可以用于其他基因疗法程序，包括脆性X综合征(使用FMR1转基因)、天使综合征(Angelman syndrome)(使用例如UBE3A转基因)或Syngap相关智力残疾(使用SYNGAP1)。

可以设想，取决于疾病，可以使用特定的载体来向特定的细胞类型提供载体。

例如，SYNGAP1是神经元基因并且仅在神经元中表达，但UBE3A、MECP2和FMR1在多个组织中普遍存在地表达。然而，主要的疾病特征发生在神经系统中的表达缺失，因此神经系统是治疗性前馈转基因的主要靶标。

发明人已经开发了构建体，其中已认为合成的组分微调系统(位点数量和高效的内含子排除)以实现适当的剂量敏感性。在本发明的上下文中，剂量不敏感旨在推断出当治疗性转基因表达过多时不导致观察到不希望的影响的蛋白质表达范围，例如，已知个体中两个拷贝的MECP2基因导致严重的MECP2重复综合征，其症状与雷特综合征一样严重，其中MeCP2水平急剧降低或不存在。

在实施方案中，构建体可以含有容许转基因水平受控的两个元件。合适地，第一元件可以是包含在位于启动子和转基因之间的内含子内的micro RNA序列。这种含有microRNA的内含子将在前mRNA加工过程中被剪接出来。然后将加工miRNA以产生能够降解其靶转录本的成熟miRNA。该设计的重要元素是miRNA经设计以不靶向哺乳动物基因组，以防止脱靶效应。在一些示例中，miRNA可以是昆虫衍生的(例如来自萤科(Lampyridae)组的miRNA，但任何合适的昆虫或其他合适的非哺乳动物miRNA都可以优化用于此用途)。在替代的示例中，序列可以是完全合成的(经设计使得其不结合哺乳动物基因组并且不是天然存在的序列)并且因此在哺乳动物基因组内缺乏已知的脱靶效应。第二元件可以是构建体的3’UTR中的一些非哺乳动物或合成miRNA结合位点，这些位点与从内含子产生的miRNA相匹配。这些结合位点的存在导致转基因成为递送的micro RNA的靶标。这导致转基因的水平降低并防止过表达，提供了系统的期望的剂量不敏感性效应。

在前馈原理的单独的实施方案中，合成micro RNA在基因疗法合成盒内含子内被递送，但并非靶向3’UTR内包含的miRNA结合位点，其靶向转基因本身的编码序列。重要的是，在此类实施方案中，转基因序列是密码子优化的，使得序列在DNA水平上改变同时在氨基酸水平上保持相同。这创建了容许合成miRNA独特地靶向转基因而不靶向内源性哺乳动物序列的新的DNA序列。此型式的前馈系统更紧凑，有利于接近病毒载体包装能力的较大基因(例如Syngap1)。总体来说，单个基因环路能够实现恒定的表达水平，由此该回路可以在广泛的基因剂量范围内维持相对固定的表达水平(即这种相对固定的或恒定的表达水平是导致期望的剂量不敏感性的原因)。实验系统产生其中基因剂量的变化导致基因表达的相对变化小得多的方案。当应用于基因疗法时这是重要的特征，其中目标是在转导的细胞群体间实现广泛的均匀表达，并且能够增加病毒载体的剂量以实现较高的转导率而不伴随过表达效应。

在实施方案中，构建体适合于在对AAV基因疗法敏感的细胞和/或组织中表达。在实施方案中，构建体容许控制细胞中转基因的表达，该细胞通常过表达使用AAV载体递送的转基因。在实施方案中，构建体防止这些细胞和/或组织中的细胞毒性。在实施方案中，构建体可以防止背根神经节中的细胞毒性。在实施方案中，构建体可以防止肝细胞中的细胞毒性。在实施方案中，构建体可以防止心脏细胞中的细胞毒性。在实施方案中，构建体在病毒粒子中的包装不影响或仅最低限度地影响构建体的质量。

在实施方案中，可以使用构建体以降低由某些遗传病况或发育病症引起的临床症状的严重程度。在实施方案中，可以使用构建体以完全逆转由某些遗传病况或发育病症引起的临床症状。在实施方案中，可以使用构建体以治疗某些遗传病况或发育病症。在实施方案中，可以使用构建体以治疗雷特综合征。在实施方案中，可以在体内施用构建体以减少雷特综合征的临床表现。

在实施方案中，可以使用构建体以降低基因疗法的毒性。在实施方案中，前馈机制调节转基因表达，降低对细胞的毒性。在实施方案中，可以在体内施用构建体而没有不利的健康影响。

现在将仅通过示例方式并参考附图描述本发明的实施方案，其中：

图1例示了基因疗法中剂量敏感性的挑战。

图2例示了基因剂量是基因疗法中的挑战并且可以导致非常窄的安全窗口。基因剂量是基因疗法中的挑战并且可以导致非常窄的安全窗口。作为示例，模拟雷特综合征的小鼠具有约11周的中位生存。用治疗性基因疗法载体治疗可以使体重正常化并将40周存活提高到100％(左框)。然而，将此治疗剂量加倍导致致死性(右)，突出了剂量敏感性和狭窄的安全范围。

图3例示了如使用流式细胞术对转基因水平的量化评估所证明的单个基因前馈基因疗法回路可以降低剂量敏感性。

图4例示了由向任何给定细胞递送转基因的病毒的水平提供的转基因表达相关的反馈，例如在细胞经差异化转染并将另外地表达非常不同的水平的转基因的地方。由向任何给定细胞递送转基因的病毒的水平提供的转基因表达相关的反馈。MECP2是剂量敏感基因的示例，其过少或过多均导致疾病。在基因疗法中，接受不同水平转导的细胞将经历不同水平的前馈控制(由线的粗细表示)。在单个基因回路中，治疗性转基因及其负调节物(合成miRNA)的表达由相同的输入(进入细胞的治疗性载体的水平)驱动。在渐增的输入水平(载体的水平)内，回路实现了更高水平的miRNA介导的下调。结果是该回路可以在细胞群体中维持更固定的转基因表达水平。在没有此类调节(非调节的基因疗法盒)的情况下，细胞表达更多样的载体衍生蛋白的水平，如阴影所示。

图5例示了可以优化构建体(盒)以利用不同的转基因来治疗不同的病况或提供不同的治疗水平的转基因的表达的方式-(A)前馈构建体的关键组分。(B)已经替换转基因组分，但已经维持盒组分的剩余部分。(C)已经引入新的内含子/mRNA和3’UTR/miRNA结合位点(虚线)，但已经维持盒组分的剩余部分，(D)两个拷贝的非哺乳动物或合成miRNA可以从相同的内含子内表达，或从两个不同的内含子表达。内含子可以置于5’UTR内和/或转基因的开放阅读框内。(E)3’UTR可以含有一个、三个或六个拷贝的非哺乳动物或合成miRNA结合位点，或者它们之间的任何数量。

图6例示了构建体，其中合成miRNA靶向在密码子优化的转基因中而非UTR中的序列。

图7A-B例示了如由FACS所评估的非哺乳动物miRNA表达对MeCP2-NeonGreen蛋白水平的影响。使用(A)天然miRNA以及(B)在哺乳动物基因组内缺乏预测的结合位点的非哺乳动物或合成miRNA来证明前馈。将前馈构建体(上方线)与对照构建体(下方线)进行比较，该对照构建体含有加扰miRNA结合位点，并因此不具有miRNA调节(所有以下的实验遵循这个相同的结构)。前馈构建体在3’UTR中含有3个非哺乳动物miRNA结合位点。图表显示了mRuby的水平(x轴——质粒到细胞的量的测量，不受miRNA调节的影响)与MeCP2-NeonGreen(y轴——受miRNA调节的蛋白质)的水平。顶部图表显示了miR124-3的结果，miR124-3是用于本领域Strovas出版物中描述的前馈回路中的内源性哺乳动物miRNA。底部图表显示了ffluc1的结果，ffluc1是最初设计以敲低萤火虫萤光素酶荧光蛋白的非哺乳动物miRNA。结果显示，与对照相比，两种miRNA均有效调节前馈样品中的MeCP2表达，如线性回归线的斜率的差异所示。

图8A-B例示了非哺乳动物miRNA。可以掺入基因疗法盒中并用于容纳非哺乳动物或合成miRNA以实现前馈控制(在本实验和下文实验中，miRNA是先前的图中描述的合成萤火虫萤光素酶(ffluc1))的紧凑型内含子的示例从位于启动子和MECP2编码序列之间的内含子表达。非哺乳动物miRNA的稳健表达依赖于该内含子的高效剪接，并且使用不同的内含子可以容许不同水平的蛋白质调节。制备了前馈分子，其中非哺乳动物miRNA从人EF1a基因的内含子1或从小的合成内含子(MINIX)表达。构建体在3’UTR中含有3个非哺乳动物miRNA结合位点。虽然两个内含子都显示出对MeCP2水平的稳健调节，如降低的线性回归线的斜率所见，但MINIX内含子在质粒表达水平较低时显示出与对照类似的MeCP2表达水平。认为这在治疗上是有益的，因为它将在较低的质粒水平下递送治疗水平的蛋白质，而在较高的质粒递送水平下防止蛋白质毒性。

图9A-C例示了改变3’UTR中非哺乳动物miRNA结合位点的数量。制备了在3’UTR中具有1、3或6个非哺乳动物miRNA结合位点的三种不同的构建体并通过FACS进行评估。具有3或6个结合位点的构建体显示出更显著的MeCP2水平的阻遏，如降低的线性回归线的斜率所示。可以通过改变非哺乳动物或合成miRNA结合位点的数量来微调前馈控制的强度和因此的剂量不敏感性。

图10A-D例示了非哺乳动物miRNA结合位点中错配的影响，其中三种不同的构建体具有1bp中央凸起、3bp中央凸起或3’错配，3’错配中仅miRNA种子序列存在于结合位点。与具有未修饰的结合位点的构建体相比，这些构建体显示出明显较少的蛋白质水平的阻遏，所有三种构建体都显示出类似的阻遏水平。可以通过在非哺乳动物或合成miRNA结合位点内掺入错配来微调前馈控制的强度和因此的剂量不敏感性。

图11例示了非哺乳动物miRNA前馈机制是否在其他相关的脑部病症中也有效，其中用UBE3A蛋白的编码序列(该基因中的突变导致天使综合征)替换MECP2来制备构建体。对于先前实验中使用的相同的ffluc1 miRNA，3’UTR含有3个非哺乳动物miRNA结合位点。再一次，与具有加扰miRNA结合位点序列的质粒相比，具有非哺乳动物miRNA结合位点的质粒显示出降低的蛋白质表达。据推测，UBE3A蛋白水平可能部分地受内源性细胞机制调节，与我们的前馈非哺乳动物miRNA机制无关。在其他剂量敏感性基因间可以实现剂量敏感性的前馈控制，在此情况下UBE3A基因在天使综合征和普拉德-威利(Prader-Willi)综合征中被破坏。

图12例示了并入前馈基因疗法技术的工作流程，其中经设计掺入功能元件的适当组装(参见例如本文表1)的前馈构建体通过DNA合成制造，然后克隆到AAV包装质粒中。然后将携带前馈盒的质粒与Rep/cap和辅助质粒一起转染以生成用于基因转移疗法的AAV颗粒。

图13例示了在完整神经系统内用受调节的盒施用后MeCP2的表达。13A显示了AAV载体递送的蛋白质表达的预测分布。野生型分布表示为天然MeCP2蛋白的严格受调节表达。具有阴影区域的载体衍生的(未经调节的)分布显示了由非调节的盒提供的广泛表达分布，包括表达超生理水平的蛋白质的相当大比例的细胞。载体衍生(前馈)构建体显示了阴影区域，该区域在很大程度上与对应于受调节的盒中的受限表达的天然分布重叠。13B(观察到的结果)显示了在通过直接脑注射进行对照或前馈调节载体的AAV施用后12天，来自小鼠脑躯体感觉皮层的荧光强度成像数据(细胞蛋白水平的替代品)。左侧显示了来自每个治疗组3只小鼠的平均数据，并且最右侧的绘图显示了个体动物数据。13C显示了实验中使用的受调节的和未经调节的前馈AAV盒的示意图。

图14例示了来自受调节的和非调节的AAV盒的载体衍生蛋白的全脑范围表达。该图描绘了倾斜的共聚焦图像，显示了AAV注射后5周的旁矢状面的小鼠脑切片的抗flag标签免疫标记(以检测载体衍生蛋白)。

图15A-C例示了前馈回路导致的受限的转基因表达的荧光图像。这些图像是代表性的共聚焦图像，显示了AAV注射后5周小鼠躯体感觉皮层的抗MeCP2转基因免疫标记(以检测载体衍生转基因产物)。MeCP2表达的天然水平显示在15A中。15B显示了用受调节的构建体处理的野生型(WT)小鼠中的MeCP2免疫反应性。15C显示了用未经调节的构建体处理的WT小鼠中的MECP2免疫反应性。底部示意图显示了前馈调节和非调节的构建体。15D显示了通过量化抗Mecp2免疫标记测量的载体衍生蛋白表达的量化。表达以相对频率分布(每只小鼠/队列分析1265-2082个细胞)展示。在P1以1x10¹¹ vg/小鼠的剂量用AAV载体注射小鼠。15E显示了递送至小鼠的受调节的和未经调节的前馈构建体的示意图。

图16描绘了毒性研究，其中WT小鼠接受4Ex10¹¹ vg/小鼠的AAV9剂量。16A中描绘了经过测试的受调节的和未经调节的构建体。在15周的时期内追踪存活和表型。受调节的构建体相比于未经调节的盒更具有安全优势。该图显示了用高剂量载体(4x10¹¹ vg/小鼠；在P1直接脑注射)给药的野生型小鼠的体内实验。未经调节的MECP2盒的剂量导致毒性评分和致死率的发展。比较而言，受调节的盒是完全耐受的，没有可检测到的明显有害的表型(16B)。

图17展示了显示受调节的前馈盒的施用是耐受的并且在模拟雷特综合征的小鼠中显示出治疗效果的研究。用高剂量的AAV9载体(3x10¹¹ vg/小鼠；在P1直接脑注射)给药的Mepc2^-/y小鼠的体内实验。在15周的时期内追踪存活和表型(RTT评分)(17B)。

图18例示了受调节的前馈盒使模拟雷特综合征的小鼠的某些临床特征正常化。该图显示了用高剂量的前馈盒(3x10¹¹ vg/小鼠；在P1直接脑注射)给药的Mepc2^-/y小鼠的体内实验。出于比较目的，显示了媒介物处理的Mecp2^-/y小鼠和媒介物处理的野生型的评分。未显示用相同剂量的非调节的盒处理的小鼠，因为它们没有在监测期存活下来。

图19例示了20个基因的RNAseq表达，认为这些基因含有前馈构建体中使用的miRNAffluc1的最可能的脱靶相互作用序列。表达ffluc1 miRNA和mNeonGreen报告物转基因的质粒，或仅表达mNeonGreen报告物(19A)的质粒。使用mRNAseq测量前20个预测的人靶mRNA转录本的表达水平(19B)。FPKM是指每百万个读段中转录本的每千碱基的片段。低FPKM值指示人HEK 293细胞中低水平的转录本丰度。

图20例示了在前馈盒中添加额外的元件(在实施例8中详述)时对转基因表达的影响。

图21详述了从染色的腰背根神经节(DRG)切片中获取的代表性平面共焦图像。将切片切成10μm厚并用抗MeCP2抗体和DAPI染色，并且使用相同的共聚焦设置成像。21A展示了施用于小鼠的盒。21B展示了来自用受调节的和未经调节的构建体处理的WT和Mecp2敲除小鼠的DRG切片的染色。21C显示了通过荧光显微术测量的MeCP2水平的量化。21D显示了每个样品中载体拷贝数的量化。

图22显示了接受1Ex10¹¹ vg/小鼠的AAV9剂量的AAV9的Mecp2 KO小鼠中的功效研究(22A)。在15周的时期内追踪存活和表型(RTT评分)(22B)。不同脑区的蛋白质印迹分析证明了具有前馈回路的受限的MeCP2表达(22C)。

图23详述了从染色的肝切片获取的代表性平面共聚焦图像。将切片切成10μm厚并用抗MeCP2抗体和DAPI染色，并且使用相同的共聚焦设置成像。23A展示了施用于小鼠的盒。23B展示了来自用未经调节的和受调节的构建体处理的WT小鼠的肝切片的染色。注意，相对于未经调节的盒，受调节的构建体限制载体衍生转基因的表达。23C显示了如通过荧光信号强度测量的MeCP2水平的量化。23D显示了每个样品中载体拷贝数的量化。

图24例示了mRNA的qRT-PCR表达，认为这些mRNA是前馈构建体中使用的miRNAffluc1、ran1g和ran2g的最可能的脱靶相互作用序列。表达ffluc1、ran1g或ran2g miRNA的质粒(24A)。表达hsa-miR-132-3p、hsa-miR-34a-5p或hsa-miR-644a miRNA的对照质粒(24B)。使用qRT-PCR测量前三个预测的人靶mRNA转录本的表达水平(24C)。使用qRT-PCR测量阳性对照人靶mRNA转录本的表达水平(24D)。

图25A-C显示了可以在其他剂量敏感基因间实现剂量敏感性的前馈控制，在此情况下UBE3A基因在天使综合征和普拉德-威利综合征中被破坏(25B)，而CDKL5基因在CDKL5缺陷病症中被破坏(25C)。

图26A-B显示了可以通过靶向密码子优化的转基因中而非UTR中的序列的合成miRNA，在其他剂量敏感基因间实现剂量敏感性的前馈控制，在此情况下SYNGAP1基因在SYNGAP1相关智力残疾中被破坏。

图27A-D可以在其他剂量敏感基因间实现剂量敏感性的前馈控制，在此情况下SMN1基因在脊髓性肌萎缩症中被破坏(27B)、INS基因在1型糖尿病中被破坏(27C)以及FXN基因在弗里德赖希共济失调(Friedreich's ataxia)中被破坏(27D)。

图28A-B例示了可以在其他剂量敏感基因间实现体内剂量敏感性的前馈控制，在此情况下UBE3A基因在在天使综合征中被破坏。

图29显示了在ssAAV9中包装的前馈MECP2构建体的CDMS数据。全长前馈产物包装如期望，具有低水平的异常或部分包装。已知二级DNA结构(如发夹)抑制AAV颗粒的高效包装。然而，在所分析的前馈构建体中，miRNA发夹的存在(在EF1a或MINIX内含子中)不导致小于预期/部分包装的颗粒的显著包装，并且不影响AAV预备病毒粒子组合物的质量。对应于完全包装的MECP2前馈盒的优势峰与代表空颗粒和部分包装的基因组的分布的小得多的峰形成对比。

RTT253构建体：

CMV/CBA启动子(no SEQ ID 76)

人EF1a内含子A(SEQ ID NO:5)

ffluc1(SEQ ID NO:9)

Kozak(SEQ ID NO:73)

人MECP2_e1(SEQ ID NO:1)

ffluc1 x3结合位点(SEQ ID NO:34)

WPRE3(SEQ ID NO:75)

SV40pA(SEQ ID NO:70)

发明详述

已经关于神经系统病症雷特综合征生成了本发明的转基因靶向构建体的概念验证。雷特综合征是由X连锁基因MECP2中的功能丧失突变引起的。尽管这种病症的有吸引力的治疗方法是使用腺相关病毒(AAV)载体将MECP2基因的功能拷贝递送至神经系统，但这种方法的主要障碍是细胞可以被病毒载体的多个拷贝感染导致MECP2基因的过表达。发明人先前已经确定MECP2基因的过表达可能导致严重的毒性。在临床上，已知人的MECP2基因的复制导致MECP2过表达综合征，这是不同的且严重的神经学病症。

使用如本发明所述的构建体，即使当细胞已被病毒载体的多个拷贝感染时，也可以限制细胞中表达的MECP2的水平。这极大地增加了MECP2基因疗法干预的安全窗口，并且容许施用较高的病毒剂量，从而使更多的细胞被感染并实现更稳健的疾病逆转。

在这个示例中，转基因是MECP2基因(神经学病症雷特综合征中突变的基因)的蛋白质编码序列的WT或密码子优化的拷贝。构建体含有容许控制转基因水平的两个元件。第一元件是包含在位于启动子和转基因之间的内含子内的非哺乳动物或合成micro RNA序列。这种含有非哺乳动物或合成micro RNA的内含子将在pre-mRNA加工过程中被剪接出来。然后将加工哺乳动物或合成miRNA以产生能够降解其靶转录本的成熟miRNA。由于miRNA是合成的或衍生自非哺乳动物、昆虫来源，因此其在哺乳动物基因组内缺乏已知的脱靶效应。构建体的第二元件是构建体的3’UTR中的许多非哺乳动物或miRNA结合位点，这些结合位点与从内含子产生的非哺乳动物或合成miRNA相匹配。这些结合位点的存在导致转基因成为递送的micro RNA的靶标。这导致转基因的水平降低并防止过表达。

在前馈原理的替代性实施方案中，非哺乳动物或合成micro RNA可以在基因疗法合成盒内含子内被递送。非哺乳动物或合成micro RNA并非靶向3’UTR内的micro RNA结合处，而是结合在密码子优化的转基因的蛋白质编码序列内创建的独特的(在哺乳动物基因组内)micro RNA结合区，并且在哺乳动物基因组内不具有相应的结合位点；即miRNA结合区是独特的合成结合区)。可以将这个型式的前馈系统制备得更紧凑。这对于接近病毒载体的包装能力的较大的基因特别有利。

单个基因环路能够实现恒定的表达水平，由此该回路可以在广泛的基因剂量范围内维持相对固定的表达水平(即展现出期望的剂量不敏感性)。实验系统产生其中基因剂量的变化导致基因表达的相对变化小得多的方案。当应用于基因疗法时这是重要的特征，其中目标是在转导的细胞群体间实现广泛的均匀表达，并且能够增加剂量以实现较高的转导率而不伴随过表达效应。

实施例

实施例1

可以利用与不能与哺乳动物基因组结合的合成非哺乳动物miRNA(ffluc1)或合成miRNA组合的非哺乳动物miRNA结合位点或合成miRNA结合位点，以确保缺乏脱靶效应，同时能够实现对转基因表达的调节，合适地，可以提供如表1所描述的构建体。

*3’UTR内的结合位点，**密码子优化的转基因序列内的结合位点

表1.先导适应症的基因疗法构建体的汇总以及基于实证检验和设计限制的前馈组分的选择。

这些实施方案涉及关键的剂量敏感基因，但是，如本领域技术人员将会理解的，相同的前馈设计可以应用于其他已知的或已确定与特定病况有关的剂量敏感基因。

如本文所讨论的，可以使用替代的普遍存在的和细胞类型特异性启动子来构建前馈系统，这些启动子包括CAG、UBC、SV40、PGK、Synapsin1、神经元特异性烯醇化酶、U6、GFAP、MAG、MPZ。内含子可以包括能够容纳非哺乳动物或合成miRNA序列的任何合成或内源性内含子，并且可以是蛋白质编码序列的上游或者是蛋白质编码序列内的内含子或组合，其中超过单个非哺乳动物或合成miRNA是从单个转基因盒生成的。非哺乳动物或合成miRNA可以是靶向转基因盒内的识别位点(包括翻译区和非翻译区)的任何非哺乳动物或合成miRNA。基因可以是任何剂量敏感基因，其中基因剂量使基因转移的有效性混淆。可以微调结合位点的数量至期望的剂量不敏感性水平，并且范围可以是1、2、3、4、5、6或转基因盒能力之内的任何数量。polyA信号可以合适地，例如为SV40、BGH或任何常用的天然或合成polyA信号。

用具有或不具有内置的前馈机制的各种构建体转染Neuro2a细胞，并且通过流式细胞术评估MECP2转基因表达的水平。使用构建体上单独的荧光标志物以监测递送至每个细胞的构建体的水平(剂量的替代品)。包含前馈控制元件的构建体比不包含这些元件的那些构建体显示出更狭窄的MECP2转基因表达范围。令人鼓舞的是，这些元件的抑制作用随着递送的构建体的量的增加而增加，这表明控制元件可以减轻毒性而不阻碍基因在治疗水平上的表达。因此可以提供剂量敏感性水平的微调。

实施例2

前馈盒可以施用于小鼠以在细胞中提供受限的转基因表达。野生型小鼠已经施用转基因flag标签化Mecp2，并且在躯体感觉皮层神经元中监测转基因表达。在AAV载体中递送转基因，该载体含有或不含有前馈调节系统。前馈调节系统利用miRNA ffluc1(SEQ IDNO:9)和EF1a启动子。在Mecp2序列之后提供了三个ffluc1结合位点(SEQ ID NO:34)。图13C展示了施用于小鼠的病毒载体的示意图代表。在用受调节的(前馈)和未经调节的(无前馈机制)盒处理的小鼠中观察到MeCP2的表达。受调节的盒始终导致受限的表达(蛋白质水平)并且阻止细胞的尾部表达非常高水平的载体衍生蛋白。插图显示了来自表达未经调节的(明亮但多变)和受调节的(细胞间更均匀表达)小鼠脑的代表性显微照片。合适地，可以使用前馈机制以确保使用病毒载体施用的转基因的受限的蛋白质表达。

实施例3

可以使用前馈调节机制以确保转基因表达在整个组织中的适当分布。图14展示了在受调节的样品中更一致的MeCP2-FLAG表达水平。载体衍生蛋白的分布在两种样品中都很广泛，但相对于未经调节的型式，受调节的盒在很大程度上缺乏表达的热点和梯度。因此，合适地，可以使用前馈机制以在一堆细胞、组织或器官中以适当的浓度控制转基因的蛋白质表达。

实施例4

可以使用前馈调节机制以确保转基因在整个新皮质中的受限表达。图15展示了与在AAV盒中递送至小鼠的外源性MeCP2(具有和不具有前馈调节机制)相比的天然MeCP2的表达。

在UPV病毒载体生产单位(巴塞罗那自治大学)通过转染HEK293细胞产生单链AAV(ssAAV)颗粒，该颗粒包含包装在AAV9衣壳中的侧接AAV2ITR的构建体。

所利用的miRNA是ffluc1(SEQ ID NO:9)，并且在Mecp2基因序列之后提供了3xffluc1结合位点(SEQ ID NO:34)。在受调节的图像(15B)中，表达在细胞间是均匀的(但由于组合的天然加载体衍生信号而略高)，表明受限的表达。比较而言，未经调节的盒样品(15C)显示出包括表达非常高水平的MeCP2的细胞群体的细胞群体间可变水平的免疫反应性。这些样品的量化(15D)显示前馈盒的狭窄受限的表达。

实施例5

合适地，可以将前馈盒在体内施用而不对健康产生不利影响。对施用前馈调节盒的野生型小鼠进行了表型评估。施用了表达ffluc1(SEQ ID NO:9)miRNA和密码子优化的人MECP2转基因的受调节的构建体。未经调节的构建体仅表达密码子优化的人MECP2转基因。MeP426未经调节的构建体表达在内源性小鼠Mecp2启动子控制下的野生型人MECP2，先前由Gadalla KKE,Vudhironarit T,Hector RD,Sinnett S,Bahey NG,Bailey MES,Gray SJ,Cobb SR.Development of a Novel AAV Gene Therapy Cassette with Improved SafetyFeatures and Efficacy in a Mouse Model of Rett Syndrome.Mol Ther Methods ClinDev.2017Jun 16；5:180-190描述。

图16描绘了高剂量研究，显示存在具有前馈回路的受限的转基因表达。这种受限的转基因表达相比于未经调节的盒更具有安全优势。该图显示了用高剂量载体(4x10¹¹ vg/小鼠；在P1直接脑注射)给药的野生型小鼠的体内实验。未经调节的MECP2盒(16A)的剂量导致毒性评分和致死率(16B)的发展。比较而言，受调节的盒是完全耐受的，没有可检测到的明显有害的表型。

实施例6

合适地，前馈机制不与哺乳动物基因组中的其他序列相互作用。

在前馈构建体中表达的miRNA，无论是昆虫衍生miRNA序列(ffluc1；SEQ ID NO:9)还是新的合成miRNA序列(ran1g；SEQ ID NO:17和ran2g；SEQ ID NO:18)，在哺乳动物转录组内都不具有预测的内源性靶标。

为了验证这一点，使用了mirDB脱靶预测工具以预测miRNA序列ffluc1、ran1g和ran2g的最可能的人mRNA靶标。基于与miRNA的种子序列匹配的基因/转录本序列中的靶位点的数量，对潜在的人靶基因/转录本进行排序。

生成了表达ffluc1 miRNA和报告物转基因的质粒(图19A)。质粒含有驱动mNeonGreen报告物转基因表达的hEF1a启动子。ffluc1 miRNA在EF1a内含子内表达，位于hEF1a启动子和转基因之间。使用Lipofectamine用100μg的每种质粒转染HEK 293细胞。48小时后，使用MagMAX-96总RNA分离试剂盒(Thermo Fisher)裂解细胞并分离总RNA。合并样品以对每个测试质粒生成三个生物学重复。对每个生物学重复进行RNAseq并使用读段计数(FPKM：每百万个读段中转录本的每千碱基的片段数)来比较个体人靶转录本的表达水平。

图19描绘了对fluc1的前20个预测的人mRNA靶标的分析，显示出在样品组和对照之间的表达水平没有显著差异。结果证实，ffluc1的过表达在任何预测的人靶基因中没有脱靶效应。

因此，合适地，本发明提供了在不影响哺乳动物宿主细胞中的内源性基因表达的情况下调节转基因表达的方法。

实施例7

合适地，可以使用前馈机制来提供安全且有效的治疗以改善临床病况的表型。

在野生型(WT)和在混合CBA/C57背景上维持的Mecp2敲除(KO)小鼠中测试了表达前馈MECP2构建体的AAV载体。通过脑室内(ICV)施用，将表达受调节的(ffluc1；SEQ ID NO:9)或未经调节的MECP2的ssAAV双侧注射到出生后(P)0/1天的雄性的脑中。对照注射使用不含载体的相同稀释剂(媒介物对照)。将经注射的幼崽放回居住笼中，并从4周龄开始进行每周一次评估。对小鼠监测直到15周龄，或者直到达到它们的人道终点。图17B显示了WT和KO小鼠在所有处理条件下的临床评分和存活。未经调节的MECP2盒的剂量导致毒性和降低的存活。相反，与用未经调节的前馈盒或媒介物处理的小鼠相比，受调节的盒的剂量是完全耐受的，并且小鼠表现出较不严重的临床评分(对于雷特样表型)。因此，受调节的机制显示了在KO小鼠中的安全施用和表型的临床严重程度的矫正。

图18进一步扩展了该数据，测量了在模拟雷特综合征的小鼠中看到的特定临床特征。在Mecp2^-/y小鼠(KO)中施用ffluc1调节盒导致雷特样表型范围内的部分改善。这在用未经调节的构建体处理的KO小鼠中没有看到，因为小鼠没有存活到可以对其进行表型测试的阶段。

实施例8

可以提供构建体，其中该构建体经修饰以提供增强的表达、调节和稳定性。可以提供构建体，使得它们含有报告物转基因。构建体可以含有促进强表达的Kozak序列。构建体可以进一步在3’UTR中含有稳定性元件。构建体可以进一步含有一个或多个结合位点，这些位点包括经工程化以降低miRNA结合的功效(但不完全减轻)的突变。下表2中详述了一些示例性构建体。

表2：经设计以增强转基因表达同时维持对表达水平的严格调节的基因疗法构建体的汇总。基于实证检验和设计限制的前馈机制的元件。这些实施方案涉及关键的剂量敏感的MeCP2，但是，如本领域技术人员将会理解的，相同的前馈设计可以应用于其他已知的或已确定与特定病况有关的剂量敏感基因。应当理解，上文记载的特征的任何组合都可以用于生成前馈构建体。此外，应当理解，这些构建体是示例性的并且任何上文记载的特征都可以与表3和表4中记载的元件中的任一者组合以生成前馈盒。

图20展示了上文所述的额外的元件对受调节的盒中的MeCP2表达所具有的影响。各种各样的特征证明相对于施用于HEK293T细胞的盒的剂量对转基因表达的水平的影响。

任何合适的组成型或条件型启动子均可以用于驱动转基因的表达。合适地，启动子可以包括Efla启动子、CAG启动子、Jet启动子、CMV启动子、CBA启动子、CBH启动子、突触蛋白1启动子、Mecp2启动子、U1a启动子、U6启动子、泛素C启动子、神经元特异性烯醇化酶启动子、少突胶质细胞转录因子1或GFAP启动子。应当理解，对于表2的构建体，可以使用任何合适的启动子。

所使用的miRNA可以是不与哺乳动物基因组结合的任何合适的合成miRNA。合适地，所使用的miRNA可以衍生自与哺乳动物miRNA没有直系同源性的合成序列或非哺乳动物基因组。合适地，所使用的miRNA可以衍生自昆虫基因组。下文表3中提供了示例性miRNA。

表3：可以用于前馈构建体以调节转基因表达的miRNA元件序列。技术人员将会理解，可以使用可以与结合位点结合但不与哺乳动物基因组结合的任何合成或非哺乳动物miRNA。图20中展示了不同miRNA对转基因表达的影响。

构建体可以适于包括经修饰的Kozak序列：合适地，经修饰的Kozak序列可以是任何Kozak序列，其包含起始位点的核酸基序。合适地，经修饰的Kozak序列可以是促进翻译增加的任何经修饰的序列。合适地，Kozak序列可以是GCCACCATGG(SEQ ID NO:73)。图20呈现了使用SEQ ID NO:73作为Kozak序列对转基因表达所具有的影响。

在实施方案中，感兴趣的基因可以是以下感兴趣的基因中的任何一种：MECP2、FMR1、UBE3A、CDKL5、FXN、SMN1或INS或需要使用基因疗法来供应以用于治疗遗传病况或发育病症的基因。特别地，感兴趣的基因可以是在递送给受试者以治疗遗传病况或发育病症时需要受控表达的任何基因。

结合突变的示例可以参见下文表4。

结合位点突变	SEQ ID NO:
		Mut 1	39
Mut 2	40
		Mut 3	41
Mut 4	42
		Mut 5	43
Mut 6	44

表4：可以引入结合位点中以部分改善miRNA结合的示例性结合突变体的序列。图20展示了不同的突变体miRNA结合位点对转基因表达所具有的影响。

合适地，可以包括增加转基因表达的稳定性元件。合适地，稳定性元件可以位于3’UTR中。合适地，该稳定性元件可以是土拨鼠肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)(SEQ IDNO:74)。合适地，稳定性元件可以是保留稳定性元件但省略X蛋白序列或核酶稳定性序列的WPRE的截短型式(WPRE3)。图20显示了稳定性元件WPRE3(SEQ ID NO:75)对转基因表达所具有的影响。

实施例9

AAV易感组织中受限的基因表达的评估。

背根神经节

背根神经节(DRG)对AAV高度易感。在AAV递送后DRG被高度转导并且可以导致毒性。为了测试前馈回路是否抑制了这些组织中的表达，从以4x10¹¹ vg/小鼠的剂量用CBE-受调节的和CBE-未经调节的MECP2前馈ssAAV处理的野生型小鼠中解剖DRG。处理腰DRG以获得载体衍生MeCP2表达(每只小鼠n＝3，每组3只小鼠)和载体生物分布(每只小鼠1个DRG，每组3只小鼠)。由于毒性/人道终点，用CBE-未经调节的MECP2处理的小鼠在3-4周龄时被终止。用CBE-受调节的MECP2处理的小鼠在20周时被终止。从年龄匹配的WT和KO小鼠中同样分离出DRG作为对照。

终止后，用4％多聚甲醛(PFA)灌注小鼠，然后解剖组织并在4℃下在4％的PFA中后固定过夜，然后储存在30％的蔗糖中直至处理时。干冰上将组织包埋在30％的蔗糖和最佳切割温度(OCT)化合物的混合物中。将冷冻组织块储存在-20℃直至切片时。将冷冻切片切成12μm并安装在包被的组织学载玻片上，在室温下风干30分钟，然后在-20℃下储存直至染色时。在0.1M PBS中冲洗冷冻载玻片以去除冷冻组织基质，然后在10mM柠檬酸钠缓冲液、0.05％Tween-20、pH 6.0)中在85℃水浴中进行抗原恢复30分钟。在室温下在相同的缓冲液中冷却载玻片30分钟后，在0.3M PBS/Triton X-100溶液中冲洗载玻片，然后在加湿室中在室温下用0.3M PBS/T溶液中的5％山羊血清温育1小时以封闭非特异性结合。然后在加湿室中将载玻片与缓冲溶液中的一抗(单克隆、小鼠抗MECP2、M7443、Sigma，1:500)在4℃下温育过夜。冲洗后(0.3M PBS/T溶液)，在加湿室中将载玻片与二抗(Alexa

488山羊抗小鼠(H+L)，细胞信号传导，1:500)在室温下温育2小时。在0.3M PBS/T溶液中进一步冲洗后，将载玻片在Hoechst 33342、DNA染料染色溶液(1:2000于0.1M PBS)中在室温下温育30分钟。使用抗褪色封片溶液(anti-fade mounting solution)和指甲油将载玻片密封到盖玻片上，然后通过共聚焦显微镜成像。

图21描绘了高剂量研究，显示了在具有前馈回路的DRG中存在受限的转基因表达。这种受限的转基因表达相比于未经调节的盒更具有安全优势。该图显示了用高剂量载体(4x10¹¹ vg/小鼠；在P1直接脑注射)给药野生型小鼠的体内实验。未经调节的MECP2盒的剂量(21A)导致DRG中显著的MeCP2过表达，以及毒性评分和致死率的发展。相反，受调节的盒是完全耐受的，并且在DRG中显示出显著较低水平的MeCP2表达。载体生物分布分析显示，在CBE-受调节的和CBE-未经调节的处理的小鼠中，DRG被相似水平的AAV转导(图21D)，证实了在DRG中观察到的MeCP2水平差异是由于前馈回路的抑制作用(图21B-C)。

肝脏

肝脏也对AAV高度敏感。在AAV递送后肝细胞被高度转导并且可以导致毒性。为了测试前馈回路是否抑制了这些组织中的表达，从以1x10¹² vg/小鼠的剂量用CBE-受调节的或CBE-未经调节的MECP2前馈ssAAV全身性(静脉内)处理的野生型小鼠中解剖肝脏。处理肝脏以获得载体衍生MeCP2表达(每只小鼠n＝3个切片，每组3只小鼠)和载体生物分布(每组3只小鼠)。用CBE-受调节的和CBE-未经调节的MECP2处理的小鼠在注射后4周时被终止。从非注射的年龄匹配的WT小鼠中同样分离出肝脏作为对照。

终止后，用4％多聚甲醛(PFA)灌注小鼠，然后解剖组织并在4℃下在4％的PFA中后固定过夜，然后储存在30％的蔗糖中直至处理时。干冰上将组织包埋在30％的蔗糖和最佳切割温度(OCT)化合物的混合物中。将冷冻组织块储存在-20℃直至切片时。将冷冻切片切成12μm并安装在包被的组织学载玻片上，在室温下(RT)风干30分钟，然后在-20℃下储存直至染色时。在0.1M PBS中冲洗冷冻载玻片以去除冷冻组织基质，然后在10mM柠檬酸钠缓冲液、0.05％Tween-20、pH 6.0中在85℃水浴中进行抗原修复30分钟。在RT下在相同的缓冲液中冷却载玻片30分钟后，在0.3M PBS/Triton X-100溶液中冲洗载玻片，然后在加湿室中在室温下用0.3M PBS/T溶液中的5％山羊血清温育1小时以封闭非特异性结合。然后在加湿室中将载玻片与缓冲溶液中的一抗(小鼠抗MeCP2，1:500)在4℃下温育过夜。冲洗后(0.3MPBS/T溶液)，在加湿室中将载玻片与二抗(Alexa

488山羊抗小鼠(H+L)，1:500)在室温下温育2小时。在0.3M PBS/T溶液中进一步冲洗后，将载玻片在Hoechst 33342、DNA染料染色溶液(1:2000于0.1M PBS)中在室温下温育30分钟。使用抗褪色封片溶液和指甲油将载玻片密封到盖玻片上，然后通过共聚焦显微镜成像。

图23描绘了高剂量研究，显示了在具有前馈回路的肝脏中存在受限的转基因表达。这种受限的转基因表达相比于未经调节的盒更具有安全优势。该图显示了用高剂量载体(2x10¹² vg/小鼠；在5.5至6.5周龄时静脉内注射)给药野生型小鼠的体内实验。这种未经调节的MECP2盒的剂量(23A)导致肝脏中显著的MeCP2过表达。相反，受调节的盒在肝脏中显示出显著较低水平的MeCP2表达。载体生物分布分析显示，在CBE-受调节的和CBE-未经调节的处理的小鼠中，肝脏被相似水平的AAV转导，证实了在肝脏中观察到的MeCP2水平差异是由于前馈回路的抑制作用。

这进一步证明了即使在对AAV高度易感的组织中前馈构建体也可以限制转基因过表达，降低组织损伤/毒性的可能性，因此提供了优于常规的基因疗法构建体的优势。

合适地，即使在对AAV高度易感的组织中也可以使用前馈构建体来限制转基因过表达，降低组织损伤/毒性的可能性，因此提供了优于常规的基因疗法构建体的优势。

实施例10

由Virovek(Hayward，加利福尼亚州，美国)的杆状病毒转染系统产生单链AAV(ssAAV)颗粒，该颗粒包含包装在AAV9衣壳中的侧接AAV2 ITR的构建体。

在混合CBA/C57背景上维持的Mecp2敲除(KO)小鼠中测试了表达经修饰的前馈MECP2构建体的AAV载体。通过脑室内(ICV)施用，将表达受调节的或未经调节的MECP2的ssAAV双侧注射到出生后(P)0/1天的雄性的脑中。对照注射使用不含载体的相同稀释剂(媒介物对照)。将经注射的幼崽放回居住笼中，并从4周龄开始进行每周一次评估。对小鼠监测直到15周龄，或者直到达到它们的人道终点。

图22展示了显示经修饰的受调节的前馈盒的施用是耐受的并且在模拟雷特综合征的小鼠(Mecp2 KO小鼠)中显示出治疗效果的研究。例示了体内研究中使用的经修饰的AAV包装的构建体(盒)设计(图22A)。受调节的构建体表达了ffluc1 miRNA(SEQ ID NO:9)和野生型人MECP2转基因。未经调节的构建体仅表达野生型人MECP2转基因。在3’UTR中土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE3)(SEQ ID NO:74)的存在增强了MeCP2蛋白表达。用载体(1x10¹¹ vg/小鼠；在P1直接脑注射)对Mecp2 KO小鼠进行给药，然后从4周龄开始进行每周一次评估。存活和RTT评分数据证明，受调节的前馈盒的施用是可耐受的，并且在模拟雷特综合征的小鼠(Mecp2 KO小鼠)中显示出治疗效果。由于严重的过表达毒性，接受CBE-受调节的+WPRE3构建体的小鼠必须在注射后2-3周被剔除。

对不同的脑区(皮质、海马体、丘脑和脑干)进行了蛋白质印迹分析(图22C)。冷冻组织样品与300μl缓冲液NE1在珠磨机中均质化，然后储存在冰上。向每个样品中加入250U全能核酸酶(benzonase nuclease)后，摇动样品，在室温下温育15分钟，然后储存在冰上。样品在NE1蛋白质缓冲液中按1:20稀释。向每个珠磨管中加入100μl 4x Laemmli样品缓冲液，将样品煮沸10分钟，然后在-80℃储存。解冻样品，在150V下每个样品的25μg量在10％丙烯酰胺凝胶上迁移，直到染料前沿到达凝胶底部。然后在85V，2小时条件下将凝胶转移到硝酸纤维素膜上。测量总蛋白。去除总蛋白染色剂，将膜与LI-COR封闭缓冲液在振荡培养箱中室温温育1小时。然后在4℃下将膜在含有按1:1000稀释的一抗抗MECP2的20ml LI-COR封闭缓冲液中温育过夜。将膜在TBS-T缓冲液中洗涤10分钟(x3)，然后在含有按1:10000稀释的二抗的20ml

封闭缓冲液中室温温育2小时。将膜在TBS-T缓冲液中清洗10分钟(x3)，用TBS缓冲液冲洗，然后成像。

结果证明了前馈回路的受限的MeCP2的表达。结合提高的存活和较低的RTT表型评分，这种受限的转基因表达进一步证明了相比于未经调节的盒更具安全优势。

实施例11

为进一步证实昆虫衍生miRNA序列(ffluc1；SEQ ID NO:9)或新的合成miRNA序列(ran1g；SEQ ID NO:17和ran2g；SEQ ID NO:18)在哺乳动物转录组中没有预测的内源性靶标，对预测的mRNA靶标进行了定量RT-PCR。

生成了表达来自hEF1a启动子下游内含子的ffluc1(SEQ ID NO:9)、ran1g(SEQ IDNO:18)或ran2g(SEQ ID NO:18)miRNA的质粒(图24A)。还生成了表达来自hEF1a启动子下游内含子的hsa-miR-132-3p、hsa-miR-34a-5p或hsa-miR-644a miRNA的对照质粒(图24B)。对照质粒表达的miRNA是具有公认的人mRNA靶标(分别为MECP2、HSPA1B和ACTB)的内源性人miRNA。

使用

用100μg的每种质粒转染人胚肾293细胞(HEK 293)。48小时后，裂解细胞并分离总RNA。分析了分离的RNA的质量和数量。在含有500ng的总RNA模板和500nM随机六聚体的20μl反应物中进行第一链合成。使用1/10的第一链合成反应物和300nM基因特异性引物，在20μl反应物中进行SYBR Green PCR反应。在以下循环条件下进行PCR：在95℃下初始变性3分钟，然后按95℃ 10秒、55℃ 30秒以及60℃ 30秒进行40个循环，然后是解离曲线。使用2^–ΔΔCt方法分析结果以计算相对于仅有lipofectamine的对照样品的样品的基因表达相对倍数。

使用定量RT-PCR(qRT-PCR)以量化ffluc1(IRF2BP2、HNRNPH1和RPP30)、ran1g(FASN、ETAA1和MAIP1)和ran2g(MCFD2、SLC38A2和FZD6)的最高预测的人mRNA靶标中的三个的转录水平。还使用qRT-PCR以量化由对照质粒(hsa-miR-132-3p(MECP2)、hsa-miR-34a-5p(HSPA1B)或hsa-miR-644a(ACTB))表达的miRNA的公认的内源性mRNA靶标的转录本水平。

qRT-PCR评估显示，即使当ffluc1、ran1g或ran2g以非常高的水平表达时，也存在最低的可检测到的脱靶效应(图24C)。唯一的例外是FZD6，它由ran2g稳健地下调。比较而言，中靶阳性对照赋予靶标极大的抑制，显示了测定的稳健性(图24D)。

实施例12

在其他CNS适应症中对前馈进行体外评估

发明人发现，本发明在治疗影响中枢神经系统(CNS)的其他病症方面也有效。用UBE3A基因(该基因的突变导致天使综合征和普拉德-威利综合征)和CDKL5基因(该基因的突变导致CDKL5缺陷病症)替换MECP2，制备了构建体。

生成表达ffluc1 miRNA(SEQ ID NO:9)和与mNeonGreen报告物基因融合的感兴趣的基因(GOI)的质粒。对于每个GOI，生成了具有和不具有前馈机制的构建体(图25A)。在受调节的构建体中，3’UTR含有先前实验中使用的相同ffluc1 miRNA的三个非哺乳动物miRNA结合位点(SEQ ID NO:34)。在未经调节的构建体中，3’UTR含有与ffluc1 miRNA结合不相容的加扰(scr)序列。使用Lipofectamine 3000用100μg的每种质粒转染人胚肾293细胞(HEK293)。48小时后，收集细胞，并通过流式细胞术评估转基因表达的水平。使用构建体上单独的荧光标志物(mRuby)以监测递送至每个细胞的构建体的水平(剂量的替代品)。

图25B-C例示了可以在其他剂量敏感基因中实现剂量敏感性的前馈控制。对于UBE3A基因(25B)(在天使综合征和普拉德-威利综合征中被破坏)和CDKL5基因(25C)(在CDKL5缺陷病症中被破坏)均看见前馈控制。

通过流式细胞术评估的NeonGreen蛋白水平确定这些蛋白(UBE3A和CDKL5)的表达。将受调节的前馈构建体与不存在miRNA调节的未经调节的对照构建体进行比较(图25A-C)。图表显示了mRuby的水平(x轴–质粒到细胞的量的测量并且不受miRNA调节的影响)与UBE3A-NeonGreen或CDKL5-mNeonGreen(y轴–受miRNA调节的蛋白)的水平。结果表明，与对照相比，ffluc1 miRNA有效调节前馈样品中UBE3A和CDKL5表达，如线性回归线的斜率的差异所示。

正如对MECP2的所见，前馈元件的抑制作用随着递送的构建体的量的增加而增加，表明控制元件可以减轻毒性而不阻碍基因在治疗水平上的表达。

实施例13

在其他CNS适应症中对前馈进行体外评估–靶向密码子优化的转基因

发明人确定，密码子优化的蛋白质编码序列可以用作miRNA结合位点。将合成miRNA在基因疗法盒内递送，以靶向在转基因的密码子优化的蛋白质编码序列内创建的独特的miRNA结合区，而不是靶向3’UTR内的miRNA结合位点。合成miRNA在哺乳动物基因组中没有相应的结合位点。这种方法对于接近病毒载体包装能力的较大的基因特别有利。

图26A-B例示了当miRNA结合位点位于转基因蛋白质编码序列中时，可以实现剂量敏感性的前馈控制。该图显示了使用这种方法对SYNGAP1基因(在SYNGAP1相关智力残疾中被破坏)的调节。生成了表达与mNeonGreen报告物基因融合的密码子优化的SYNGAP1转基因以及合成的syn3i miRNA(SEQ ID NO:29受调节的构建体)或无miRNA(未经调节的构建体)的质粒(图26A)。使用Lipofectamine 3000用100μg的每种质粒转染人胚肾293细胞(HEK293)。48小时后，收集细胞，并通过流式细胞术评估转基因表达的水平。使用构建体上单独的荧光标志物(mRuby)以监测递送至每个细胞的构建体的水平(剂量的替代品)。

通过流式细胞术评估的NeonGreen蛋白水平来确定SynGAP蛋白的表达。将受调节的前馈构建体与不存在miRNA调节的未经调节的对照构建体进行比较(图26A-B)。图表显示了mRuby的水平(x轴–质粒到细胞的量的测量并且不受miRNA调节的影响)与SynGAP-NeonGreen(y轴–受miRNA调节的蛋白)的水平。结果表明，与对照相比，syn3i miRNA(SEQ IDNO:29)有效调节前馈样品中SynGAP表达，如线性回归线的斜率的差异所示。

前馈元件的抑制作用随着递送的构建体的量的增加而增加，表明前馈原理的此类替代性实施方案也可以减轻毒性而不阻碍基因在治疗水平上的表达。

实施例14

在其他非CNS适应症中对前馈进行体外评估

非哺乳动物miRNA前馈机制在主要表型是周围神经系统而非中枢神经系统(CNS)的其他病症中也是有效的。用其他蛋白的编码序列替换MECP2来制备构建体：SMN1基因(该基因的突变导致脊髓性肌萎缩症)、INS基因(该基因的突变导致1型糖尿病)和FXN基因(该基因的突变导致弗里德赖希共济失调)。3’UTR含有先前实验中使用的相同ffluc1 miRNA(SEQ ID NO:9)的3个非哺乳动物miRNA结合位点(SEQ ID NO:34)。

生成了表达ffluc1 miRNA和上述感兴趣的基因(GOI)中的一种的质粒。将GOI与mNeonGreen报告物基因融合。对于每个GOI，生成了具有和不具有前馈机制的结构(图27A)。在受调节的构建体中，3’UTR含有SEQ ID NO:34miRNA结合位点。在未经调节的构建体中，3’UTR含有与ffluc1 miRNA结合不相容的加扰(scr)序列。使用Lipofectamine 3000用100μg的每种质粒转染人胚肾293细胞(HEK 293)。48小时后，收集细胞，并通过流式细胞术评估转基因表达的水平。使用构建体上单独的荧光标志物(mRuby)以监测递送至每个细胞的构建体的水平(剂量的替代品)。

图27B-D例示了可以在其他剂量敏感基因中实现剂量敏感性的前馈控制，在此情况下(27B)SMN1基因在脊髓性肌萎缩症中被破坏、(27C)INS基因在1型糖尿病中被破坏、(27D)FXN基因在弗里德赖希共济失调中被破坏。

通过流式细胞术评估的NeonGreen蛋白水平确定这些蛋白(SMN1、胰岛素和共济蛋白)的表达。将受调节的前馈构建体与不存在miRNA调节的未经调节的对照构建体进行比较(图27A-D)。图表显示了mRuby的水平(x轴–质粒到细胞的量的测量并且不受miRNA调节的影响)与SMN1-NeonGreen、胰岛素-mNeonGreen或共济蛋白-mNeonGreen(y轴–受miRNA调节的蛋白)的水平。结果表明，与对照相比，ffluc1 miRNA有效调节前馈样品中SMN1、胰岛素和共济蛋白表达，如线性回归线斜率的差异所示。

正如对MECP2的所见，前馈元件的抑制作用随着递送的构建体的量的增加而增加，表明控制元件可以减轻毒性而不阻碍基因在治疗水平上的表达。

实施例15

UBE3A体内调节

发明人进一步证明了非哺乳动物miRNA前馈机制在治疗影响中枢神经系统(CNS)的其他剂量敏感性病症中的用途。显示出在天使综合征和普拉德-威利综合征中被破坏的UBE3A基因在体内受到前馈机制的调节。

生成了表达ffluc1 miRNA(SEQ ID NO:9)和与3xFLAG标签融合的人UBE3A的构建体。生成了具有和不具有前馈机制的构建体(图28A)。在受调节的构建体中，3’UTR含有miRNA结合位点SEQ ID NO:34。由Virovek(Hayward，加利福尼亚州，美国)的杆状病毒转染系统产生受调节的和非调节的UBE3A构建体的单链AAV(ssAAV)颗粒，该颗粒包含包装在AAV9衣壳中的侧接AAV2 ITR的构建体。

图28B证明，当与未经调节的UBE3A盒相比时，UBE3A受调节的前馈盒提供了体内调节。使用抗FLAG抗体的免疫印迹分析提供了细胞中UBE3A表达水平的读出。在混合CBA/C57背景上维持的野生型小鼠中测试了表达前馈UBE3A构建体的AAV载体。通过脑室内(ICV)施用，将表达受调节的或未经调节的UBE3A的ssAAV双侧注射到出生后(P)1天的雄性的脑中。对照注射使用了PBS(媒介物对照)。注射后7天剔除注射的幼崽并收集组织用于分析。新鲜组织样品与300μl缓冲液NE1在珠磨机中均质化，然后储存在冰上。向每个样品中加入250U全能核酸酶后，摇动样品，在室温下温育15分钟，然后储存在冰上。样品在NE1缓冲液中按1:20稀释用于蛋白质量化。向每个珠磨管中加入100μl 4x Laemmli样品缓冲液，将样品煮沸10分钟，然后在-80℃储存。解冻样品，在150V下每个样品的25μg量在10％丙烯酰胺凝胶上迁移，直到染料前沿到达凝胶底部。然后在85V，2小时条件下将凝胶转移到硝酸纤维素膜上。测量总蛋白。去除总蛋白染色剂，将膜与

封闭缓冲液在振荡培养箱中室温温育1小时。然后在4℃下将膜在含有按1:2000稀释的一抗抗FLAG的20ml/>

封闭缓冲液中温育过夜。将膜在TBS-T缓冲液中洗涤10分钟(x3)，然后在含有按1:10000稀释的二抗IRDye 800CW猴抗小鼠的20ml的/>

封闭缓冲液中室温温育2小时。将膜在TBS-T缓冲液中清洗10分钟(x3)，用TBS缓冲液冲洗，然后成像。

这证明了UBE3A(即，除MECP2之外的转基因)可以在非哺乳动物miRNA前馈机制的控制下在体内受到调节。这降低了在已知的剂量敏感基因/病症的情况中转基因过表达导致组织损伤/毒性的可能性。

实施例16

前馈构建体高效地包装在ssAAV中

将表达MECP2转基因的前馈构建体制备为单链AAV(ssAAV)颗粒，该颗粒包含包装在AAV9衣壳中的侧接AAV2 ITR的构建体，并且通过HEK293过程(病毒载体生产单位，巴塞罗那自治大学，西班牙)生产或通过Virovek(Hayward，加利福尼亚州，美国)的基于杆状病毒的感染系统生产。使用这两种过程，发明人证明了可以高效地大规模生产前馈基因疗法构建体并达到非常高的滴度(高达1.94x10¹⁴病毒基因组/ml)。因此，发明人已经确定，前馈调节的基因疗法技术已经配置用于高效制备。重要的是，发明人证明了前馈合成回路构建体有效地包装在AAV中。

在AAV生产之后，进行CDMS(电荷检测质谱)分析以基于电荷和质量确定AAV颗粒的大小。该工具有助于确定包装的质量以及是否存在可能潜在地影响AAV产物的效力的任何部分包装的种类。

图29描绘了在ssAAV9中包装的前馈MECP2构建体的代表性CDMS分析。全长前馈产物包装如期望，具有低水平的异常或部分包装。已知二级DNA结构(如发夹)抑制AAV颗粒的高效包装。然而，在所分析的前馈构建体中，miRNA发夹的存在(在EF1a或MINIX内含子中)不导致小于预期/部分包装的颗粒的显著包装，并且不影响AAV制备物的质量。

众所周知，含有二级结构(如茎环、发夹和miRNA生成序列)的遗传序列通常导致不良地损害产品纯度的异常包装和异质种类的封装(Xie et al.,2017)。图29展示了被认为是现有技术中非常干净的概况的概况。因此，发明人已通过开发能够大规模制备成高纯度产物的前馈AAV构建体来提供纯度问题的解决方案。

序列表

<110> 爱丁堡大学理事会

<120> 转基因表达系统

<130> P222552.WO.01

<160> 76

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1494

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

atggccgccg ccgccgccgc cgcgccgagc ggaggaggag gaggaggcga ggaggagaga 60

ctggaagaaa agtcagaaga ccaggacctc cagggcctca aggacaaacc cctcaagttt 120

aaaaaggtga agaaagataa gaaagaagag aaagagggca agcatgagcc cgtgcagcca 180

tcagcccacc actctgctga gcccgcagag gcaggcaaag cagagacatc agaagggtca 240

ggctccgccc cggctgtgcc ggaagcttct gcctccccca aacagcggcg ctccatcatc 300

cgtgaccggg gacccatgta tgatgacccc accctgcctg aaggctggac acggaagctt 360

aagcaaagga aatctggccg ctctgctggg aagtatgatg tgtatttgat caatccccag 420

ggaaaagcct ttcgctctaa agtggagttg attgcgtact tcgaaaaggt aggcgacaca 480

tccctggacc ctaatgattt tgacttcacg gtaactggga gagggagccc ctcccggcga 540

gagcagaaac cacctaagaa gcccaaatct cccaaagctc caggaactgg cagaggccgg 600

ggacgcccca aagggagcgg caccacgaga cccaaggcgg ccacgtcaga gggtgtgcag 660

gtgaaaaggg tcctggagaa aagtcctggg aagctccttg tcaagatgcc ttttcaaact 720

tcgccagggg gcaaggctga ggggggtggg gccaccacat ccacccaggt catggtgatc 780

aaacgccccg gcaggaagcg aaaagctgag gccgaccctc aggccattcc caagaaacgg 840

ggccgaaagc cggggagtgt ggtggcagcc gctgccgccg aggccaaaaa gaaagccgtg 900

aaggagtctt ctatccgatc tgtgcaggag accgtactcc ccatcaagaa gcgcaagacc 960

cgggaaacgg tcagcatcga ggtcaaggaa gtggtgaagc ccctgctggt gtccaccctc 1020

ggtgagaaga gcgggaaagg actgaagacc tgtaagagcc ctgggcggaa aagcaaggag 1080

agcagcccca aggggcgcag cagcagcgcc tcctcacccc ccaagaagga gcaccaccac 1140

catcaccacc actcagagtc cccaaaggcc cccgtgccac tgctcccacc cctgccccca 1200

cctccacctg agcccgagag ctccgaggac cccaccagcc cccctgagcc ccaggacttg 1260

agcagcagcg tctgcaaaga ggagaagatg cccagaggag gctcactgga gagcgacggc 1320

tgccccaagg agccagctaa gactcagccc gcggttgcca ccgccgccac ggccgcagaa 1380

aagtacaaac accgagggga gggagagcgc aaagacattg tttcatcctc catgccaagg 1440

ccaaacagag aggagcctgt ggacagccgg acgcccgtga ccgagagagt tagc 1494

<210> 2

<211> 2556

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

atgaagcgag cagctgcaaa gcatctaata gaacgctact accaccagtt aactgagggc 60

tgtggaaatg aagcctgcac gaatgagttt tgtgcttcct gtccaacttt tcttcgtatg 120

gataataatg cagcagctat taaagccctc gagctttata agattaatgc aaaactctgt 180

gatcctcatc cctccaagaa aggagcaagc tcagcttacc ttgagaactc gaaaggtgcc 240

cccaacaact cctgctctga gataaaaatg aacaagaaag gcgctagaat tgattttaaa 300

gatgtgactt acttaacaga agagaaggta tatgaaattc ttgaattatg tagagaaaga 360

gaggattatt cccctttaat ccgtgttatt ggaagagttt tttctagtgc tgaggcattg 420

gtacagagct tccggaaagt taaacaacac accaaggaag aactgaaatc tcttcaagca 480

aaagatgaag acaaagatga agatgaaaag gaaaaagctg catgttctgc tgctgctatg 540

gaagaagact cagaagcatc ttcctcaagg ataggtgata gctcacaggg agacaacaat 600

ttgcaaaaat taggccctga tgatgtgtct gtggatattg atgccattag aagggtctac 660

accagattgc tctctaatga aaaaattgaa actgcctttc tcaatgcact tgtatatttg 720

tcacctaacg tggaatgtga cttgacgtat cacaatgtat actctcgaga tcctaattat 780

ctgaatttgt tcattatcgt aatggagaat agaaatctcc acagtcctga atatctggaa 840

atggctttgc cattattttg caaagcgatg agcaagctac cccttgcagc ccaaggaaaa 900

ctgatcagac tgtggtctaa atacaatgca gaccagattc ggagaatgat ggagacattt 960

cagcaactta ttacttataa agtcataagc aatgaattta acagtcgaaa tctagtgaat 1020

gatgatgatg ccattgttgc tgcttcgaag tgcttgaaaa tggtttacta tgcaaatgta 1080

gtgggagggg aagtggacac aaatcacaat gaagaagatg atgaagagcc catccctgag 1140

tccagcgagc tgacacttca ggaacttttg ggagaagaaa gaagaaacaa gaaaggtcct 1200

cgagtggacc ccctggaaac tgaacttggt gttaaaaccc tggattgtcg aaaaccactt 1260

atcccttttg aagagtttat taatgaacca ctgaatgagg ttctagaaat ggataaagat 1320

tatacttttt tcaaagtaga aacagagaac aaattctctt ttatgacatg tccctttata 1380

ttgaatgctg tcacaaagaa tttgggatta tattatgaca atagaattcg catgtacagt 1440

gaacgaagaa tcactgttct ctacagctta gttcaaggac agcagttgaa tccatatttg 1500

agactcaaag ttagacgtga ccatatcata gatgatgcac ttgtccggct agagatgatc 1560

gctatggaaa atcctgcaga cttgaagaag cagttgtatg tggaatttga aggagaacaa 1620

ggagttgatg agggaggtgt ttccaaagaa ttttttcagc tggttgtgga ggaaatcttc 1680

aatccagata ttggtatgtt cacatacgat gaatctacaa aattgttttg gtttaatcca 1740

tcttcttttg aaactgaggg tcagtttact ctgattggca tagtactggg tctggctatt 1800

tacaataact gtatactgga tgtacatttt cccatggttg tctacaggaa gctaatgggg 1860

aaaaaaggaa cttttcgtga cttgggagac tctcacccag ttctatatca gagtttaaaa 1920

gatttattgg agtatgaagg gaatgtggaa gatgacatga tgatcacttt ccagatatca 1980

cagacagatc tttttggtaa cccaatgatg tatgatctaa aggaaaatgg tgataaaatt 2040

ccaattacaa atgaaaacag gaaggaattt gtcaatcttt attctgacta cattctcaat 2100

aaatcagtag aaaaacagtt caaggctttt cggagaggtt ttcatatggt gaccaatgaa 2160

tctcccttaa agtacttatt cagaccagaa gaaattgaat tgcttatatg tggaagccgg 2220

aatctagatt tccaagcact agaagaaact acagaatatg acggtggcta taccagggac 2280

tctgttctga ttagggagtt ctgggaaatc gttcattcat ttacagatga acagaaaaga 2340

ctcttcttgc agtttacaac gggcacagac agagcacctg tgggaggact aggaaaatta 2400

aagatgatta tagccaaaaa tggcccagac acagaaaggt tacctacatc tcatacttgc 2460

tttaatgtgc ttttacttcc ggaatactca agcaaagaaa aacttaaaga gagattgttg 2520

aaggccatca cgtatgccaa aggatttggc atgctg 2556

<210> 3

<211> 1833

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

atggaggagc tggtggtgga agtgcggggc tccaatggcg ctttctacaa ggcatttgta 60

aaggatgttc atgaagattc aataacagtt gcatttgaaa acaactggca gcctgatagg 120

cagattccat ttcatgatgt cagattccca cctcctgtag gttataataa agatataaat 180

gaaagtgatg aagttgaggt gtattccaga gcaaatgaaa aagagccttg ctgttggtgg 240

ttagctaaag tgaggatgat aaagggtgag ttttatgtga tagaatatgc agcatgtgat 300

gcaacttaca atgaaattgt cacaattgaa cgtctaagat ctgttaatcc caacaaacct 360

gccacaaaag atactttcca taagatcaag ctggatgtgc cagaagactt acggcaaatg 420

tgtgccaaag aggcggcaca taaggatttt aaaaaggcag ttggtgcctt ttctgtaact 480

tatgatccag aaaattatca gcttgtcatt ttgtccatca atgaagtcac ctcaaagcga 540

gcacatatgc tgattgacat gcactttcgg agtctgcgca ctaagttgtc tctgataatg 600

agaaatgaag aagctagtaa gcagctggag agttcaaggc agcttgcctc gagatttcat 660

gaacagttta tcgtaagaga agatctgatg ggtctagcta ttggtactca tggtgctaat 720

attcagcaag ctagaaaagt acctggggtc actgctattg atctagatga agatacctgc 780

acatttcata tttatggaga ggatcaggat gcagtgaaaa aagctagaag ttttctcgaa 840

tttgctgaag atgtaataca agttccaagg aacttagtag gcaaagtaat aggaaaaaat 900

ggaaagctga ttcaggagat tgtggacaag tcaggagttg tgagggtgag gattgaggct 960

gaaaatgaga aaaatgttcc acaagaagag gaaattatgc caccaaattc ccttccttcc 1020

aataattcaa gggttggacc taatgcccca gaagaaaaaa aacatttaga tataaaggaa 1080

aacagcaccc atttttctca acctaacagt acaaaagtcc agaggggtat ggtaccattt 1140

gtttttgtgg gaacaaagga cagcatcgct aatgccactg ttcttttgga ttatcacctg 1200

aactatttaa aggaagtaga ccagttgcgt ttggagagat tacaaattga tgagcagttg 1260

cgacagattg gagctagttc tagaccacca ccaaatcgta cagataagga aaaaagctat 1320

gtgactgatg atggtcaagg aatgggtcga ggtagtagac cttacagaaa tagggggcac 1380

ggcagacgcg gtcctggata tacttcagga actaattctg aagcatcaaa tgcttctgaa 1440

acagaatctg accacagaga tgaactcagt gattggtcat tagctccaac agaggaagag 1500

agggagagct tcctgcgcag aggagatgga cggcggcgtg gagggggagg aagaggacaa 1560

ggaggaagag gacgtggagg aggcttcaaa ggaaacgacg atcactcccg aacagataat 1620

cgtccacgta atccaagaga ggctaaagga agaacaacag atggatcgct tcagatcaga 1680

gttgactgca ataatgaaag gagtgtccac actaaaacat tacagaatac ctccagtgaa 1740

ggtagtcggc tgcgcacggg taaagatcgt aaccagaaga aagagaagcc agacagcgtg 1800

gatggtcagc aaccactcgt gaatggagta ccc 1833

<210> 4

<211> 3924

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

atgagcagga gccgagccag catacataga gggagcatcc cagctatgag ttacgcacca 60

tttcgggatg tccgcgggcc cagtatgcac cgaactcaat acgtgcactc cccatatgac 120

cgaccaggat ggaaccctag gttttgtatc atatctggca accaactgct catgctcgac 180

gaagatgaga tccacccact cttgataagg gaccgaagat ccgaatctag cagaaacaag 240

ctcttgcgaa ggaccgtcag tgttccagtg gaaggacggc cccatggaga acacgagtac 300

catttgggtc ggagcagaag gaaaagcgtg ccaggaggta agcaatacag tatggaaggt 360

gccccagccg caccatttag gcccagtcag ggtttcttga gtcggcgcct taagtccagc 420

ataaaacgga caaagtccca gcccaaactc gatcgcacca gtagcttccg ccagatactc 480

ccacgatttc gctccgcaga tcacgatagg gctaggttga tgcaatcctt caaagaatct 540

cactcacatg agtcactgct tagcccctcc agcgcagcag aagctctgga gcttaacctc 600

gatgaggatt ctataatcaa gcccgttcat tcaagcatcc tgggtcaaga gttctgtttc 660

gaagttacta caagcagtgg gactaagtgt ttcgcctgca ggtcagccgc cgagcgcgat 720

aagtggatcg aaaaccttca gcgggccgtt aaaccaaaca aggacaattc taggagggtg 780

gataacgtac ttaaattgtg gataatcgaa gctcgcgaac tccctcccaa gaagagatac 840

tactgcgaac tttgtctcga cgacatgctg tatgcccgaa caactagtaa accccgcagt 900

gcctctggag acaccgtgtt ttggggcgag cacttcgagt tcaataactt gcctgccgtc 960

agggctctga gacttcacct ttacagggac agtgacaaga agcgaaaaaa agacaaagca 1020

gggtatgtgg gtcttgtcac cgtaccagtt gccacactcg ctggacgcca cttcaccgaa 1080

cagtggtacc ccgtcaccct tcccaccggt tccggcggct ccggtgggat gggatccggg 1140

ggaggtggag ggtccggagg tggtagcgga ggaaaaggca agggaggttg ccccgctgtt 1200

cggctcaaag caaggtatca gactatgagt attctgccaa tggagctcta caaagagttc 1260

gctgagtacg taacaaatca ctatagaatg ctctgtgcag tactggaacc tgctctcaat 1320

gtaaaaggca aggaagaggt agctagcgca ctcgttcaca ttctgcagtc aactggaaaa 1380

gcaaaggatt ttctcagtga catggctatg agcgaagtgg atagattcat ggagagagag 1440

catttgatat tccgcgaaaa cacattggca accaaagcca tagaagaata catgagactg 1500

atagggcaaa aatatctcaa ggatgccata ggagaattta tacgcgccct ctatgaaagt 1560

gaggaaaatt gtgaggttga tcccataaag tgcacagcat catctctggc agagcaccag 1620

gccaatctgc gaatgtgctg tgagctggca ctctgcaagg tcgtaaacag ccactgtgtc 1680

tttcctcgcg aactgaagga agtttttgct tcctggcgct tgcggtgcgc tgaacggggt 1740

cgcgaggaca tagccgaccg actcatctct gccagtttgt ttttgaggtt cctctgtcct 1800

gccatcatgt ctccctccct ctttggcctc atgcaggagt atcccgacga acaaacttca 1860

agaacattga ccctcattgc taaagtgatc cagaaccttg ctaatttttc taaattcact 1920

tcaaaggagg atttcttggg atttatgaac gaattcttgg aactggaatg ggggagcatg 1980

caacaatttc tttacgagat tagcaacctt gatactttga ctaacagcag cagtttcgaa 2040

ggctatattg atttgggccg ggagctctca acccttcatg ccctcctctg ggaagttctt 2100

cctcagcttt ccaaggaagc acttcttaag ttgggtcccc tcccacgcct tttgaacgac 2160

atatctactg cccttcgaaa tcccaatatt caacgccagc cttctcgaca gtccgaacgc 2220

ccccgccccc agcccgtcgt cctcagaggg cccagtgccg aaatgcaagg atatatgatg 2280

cgagacctga actcttcaat agaccttcag tcttttatgg ctcgcggtct gaatagttct 2340

atggatatgg ccagacttcc ttcccctact aaagagaaac ctccacctcc ccctccagga 2400

gggggtaagg acctgttcta tgtatcaaga cccccactgg cccgctcctc acctgcatat 2460

tgtacatcca gctccgacat aactgaaccc gagcaaaaaa tgcttagtgt gaacaaaagc 2520

gtcagtatgc ttgaccttca gggtgacgga cctggaggaa ggcttaacag ttccagtgta 2580

tccaatctgg ctgcagtagg cgatctgctg cacagtagcc aagcctccct taccgcagct 2640

cttggtctca ggcccgcacc cgctggacgc ctgtcacagg gctcagggtc cagcatcacc 2700

gcagctggta tgaggctctc ccaaatgggg gtcaccacag acggcgtccc tgcacagcaa 2760

ctccgcattc ctctttcctt ccaaaaccca ctttttcaca tggcagctga cggtcctggt 2820

cccccaggag gtcacggtgg gggcggcgga cacgggccac cctcaagcca ccaccatcat 2880

caccaccatc accatcacag ggggggagaa cctcctgggg acaccttcgc tccctttcac 2940

ggttactcaa aatctgagga tttgtcaagt ggagttccca agccacctgc tgcaagcatc 3000

ttgcatagtc acagctattc agatgagttc gggccctctg gaaccgactt tactcgcagg 3060

cagttgtcac ttcaggataa tttgcagcat atgctctctc caccccaaat cacaattggg 3120

ccccagaggc ccgcaccaag cggccctgga ggtgggtccg gtgggggcag cggtggcgga 3180

ggcggaggac aacctcctcc acttcaaaga ggtaagtccc agcaactcac agtcagtgct 3240

gctcaaaagc caagacccag ctctggcaac cttctccaga gcccagagcc cagttacggg 3300

cctgccagac cacggcaaca gagcctgtct aaagaaggca gtataggcgg ttctgggggg 3360

agcggaggtg ggggaggggg tggcctcaaa ccaagtatca ccaagcagca tagtcagaca 3420

cccagcacat tgaatcctac catgcctgct tccgagagaa cagttgcttg ggtctctaat 3480

atgccacatc tcagtgcaga tatcgagagt gctcacatcg agagggagga atacaaactg 3540

aaagagtact caaagtctat ggatgaaagt cgcctcgaca gggtcaagga gtacgaagag 3600

gaaatacact ctctgaagga acgactgcac atgtccaatc ggaagttgga agaatatgag 3660

agaagattgt tgagccaaga ggaacaaact tcaaaaattt tgatgcaata ccaagcaagg 3720

ttggaacaga gcgaaaagcg gttgcgacaa cagcaggccg aaaaagactc ccagattaag 3780

tcaatcatcg gacgccttat gctggtagaa gaagagctgc gccgggacca tcccgcaatg 3840

gctgagccac ttcccgagcc aaaaaaaaga ctcttggacg ctcagcgggg gtcattccct 3900

ccctgggttc agcagaccag ggtg 3924

<210> 5

<211> 943

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg 60

ccttgaatta cttccacgcc cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt 120

tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg 180

agttgaggcc tggcttgggc gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc 240

ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac 300

gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc 360

ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag 420

gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc 480

tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc 540

ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag 600

ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa 660

aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc 720

caggcacctc gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg 780

gttttatgcg atggagtttc cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg 840

gcacttgatg taattctcct tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct 900

caagcctcag acagtggttc aaagtttttt tcttccattt cag 943

<210> 6

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MINIX人工内含子

<400> 6

gtaagagcct agcatgtaga actggttacc tgcagcccaa gcttgctgca cgtctagggc 60

tcaccgggtt tccttgatga ggtaccgaca tacttatcct gtcccttttt tttccacag 119

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 东部萤火虫(Phonitus pyralis)

<400> 7

aacgatatgg gctgaataca a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ffluc1_全_miRNA_序列

<400> 8

aacgatatgg gctgaataca a 21

<210> 9

<211> 321

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 9

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgaa acgatatggg ctgaatacaa tagtgaagcc acagatgtat tgtattcagc 180

ccatatcgtt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 10

<211> 321

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 10

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgaa acgtgaattg ctcaacagta tagtgaagcc acagatgtat actgttgagc 180

aattcacgtt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 11

<211> 321

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 11

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgac ccgacgatga cgccggtgaa tagtgaagcc acagatgtat tcaccggcgt 180

catcgtcggg gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 12

<211> 321

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 12

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgat tcgataggga caagacaatt tagtgaagcc acagatgtaa attgtcttgt 180

ccctatcgaa gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 13

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 新的序列1

<400> 13

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgag catgttacgg gacttcttat tagtgaagcc acagatgtaa taagaagtcc 180

cgtaacatgc gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 14

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 新的序列2

<400> 14

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgag tgaggagcag cggatcttaa tagtgaagcc acagatgtat taagatccgc 180

tgctcctcac gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 15

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 新的序列3

<400> 15

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgag tcatgtcgtc acggaactta tagtgaagcc acagatgtat aagttccgtg 180

acgacatgac gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 16

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 新的序列4

<400> 16

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgag agaagtgcgg atttcgtatt tagtgaagcc acagatgtaa atacgaaatc 180

cgcacttctc gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 17

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 新的序列5

<400> 17

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgaa agcgccaaag gagtctgtga tagtgaagcc acagatgtat cacagactcc 180

tttggcgctt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 18

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 新的序列6

<400> 18

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgaa agtgcggatt tcgtatttgc tagtgaagcc acagatgtag caaatacgaa 180

atccgcactt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 19

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 新的序列7

<400> 19

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgaa agtggatgcg atgcgattgc tagtgaagcc acagatgtag caatcgcatc 180

gcatccactt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 20

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 新的序列8

<400> 20

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgaa acggtatccg caacttgcga tagtgaagcc acagatgtat cgcaagttgc 180

ggataccgtt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 21

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人

<400> 21

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgaa agtacgatgt ttacttgatc tagtgaagcc acagatgtag atcaagtaaa 180

catcgtactt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 22

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人

<400> 22

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgaa agccgctctt ggtctctacc tagtgaagcc acagatgtag gtagagacca 180

agagcggctt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 23

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人

<400> 23

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgaa agtccgaaga tcaagacctg tagtgaagcc acagatgtac aggtcttgat 180

cttcggactt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 24

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人

<400> 24

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgag agtccagtat acgcagtgta tagtgaagcc acagatgtat acactgcgta 180

tactggactc gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 25

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人

<400> 25

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgag tccagtatac gcagtgtaca tagtgaagcc acagatgtat gtacactgcg 180

tatactggac gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 26

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人

<400> 26

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgag actcgggaaa ccgttagtat tagtgaagcc acagatgtaa tactaacggt 180

ttcccgagtc gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 27

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人

<400> 27

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgag cgccttaagt ccagcataaa tagtgaagcc acagatgtat ttatgctgga 180

cttaaggcgc gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 28

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人

<400> 28

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgag agttctgttt cgaagttact tagtgaagcc acagatgtaa gtaacttcga 180

aacagaactc gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 29

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人

<400> 29

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgag gcgagcactt cgagttcaat tagtgaagcc acagatgtaa ttgaactcga 180

agtgctcgcc gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 30

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人

<400> 30

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgaa agatccgaat ctagcagaaa tagtgaagcc acagatgtat ttctgctaga 180

ttcggatctt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 31

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人

<400> 31

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgaa aggtcgtaaa cagccactgt tagtgaagcc acagatgtaa cagtggctgt 180

ttacgacctt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 32

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人

<400> 32

tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60

ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120

agtgagcgaa agaggaaata cactctctga tagtgaagcc acagatgtat cagagagtgt 180

atttcctctt gtgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240

tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300

tggtataaat taaatcactt t 321

<210> 33

<211> 35

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 33

gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacag 35

<210> 34

<211> 105

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 34

gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacaggctat gaaacgatat gggctgaata 60

caaatcacag gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacag 105

<210> 35

<211> 210

<212> DNA

<213> 智人

<400> 35

gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacaggctat gaaacgatat gggctgaata 60

caaatcacag gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacaggctat gaaacgatat 120

gggctgaata caaatcacag gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacaggctat 180

gaaacgatat gggctgaata caaatcacag 210

<210> 36

<211> 105

<212> DNA

<213> 智人

<400> 36

gctatgaaac gatatgggcg gaatacaaat cacaggctat gaaacgatat gggcggaata 60

caaatcacag gctatgaaac gatatgggcg gaatacaaat cacag 105

<210> 37

<211> 105

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 37

gctatgaaac gatatgttat gaatacaaat cacaggctat gaaacgatat gttatgaata 60

caaatcacag gctatgaaac gatatgttat gaatacaaat cacag 105

<210> 38

<211> 105

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 38

gctatgaccc aaactgtgaa gaatacaaat cacaggctat gagtgtctat cacccgaata 60

caaatcacag gctatgacta ggcccgtttc gaatacaaat cacag 105

<210> 39

<211> 105

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 39

gctatgaaac gatatgcgct gaatacaaat cacaggctat gaaacgatat gcgctgaata 60

caaatcacag gctatgaaac gatatgcgct gaatacaaat cacag 105

<210> 40

<211> 105

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 40

gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacaggctat gaaacgatat gggctgaata 60

caaatcacag gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacag 105

<210> 41

<211> 105

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 41

gctatgaaac gatatgggct caatacaaat cacaggctat gaaacgatat gggctcaata 60

caaatcacag gctatgaaac gatatgggct caatacaaat cacag 105

<210> 42

<211> 105

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 42

gctatgaaac gatatgggct gattacaaat cacaggctat gaaacgatat gggctgatta 60

caaatcacag gctatgaaac gatatgggct gattacaaat cacag 105

<210> 43

<211> 105

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 43

gctatgaaac gatatgggct gaattcaaat cacaggctat gaaacgatat gggctgaatt 60

caaatcacag gctatgaaac gatatgggct gaattcaaat cacag 105

<210> 44

<211> 105

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 44

gctatgaaac gatatgggct gaatactaat cacaggctat gaaacgatat gggctgaata 60

ctaatcacag gctatgaaac gatatgggct gaatactaat cacag 105

<210> 45

<211> 105

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 45

gctatgaaac gtgaattgct caacagtaat cacaggctat gaaacgtgaa ttgctcaaca 60

gtaatcacag gctatgaaac gtgaattgct caacagtaat cacag 105

<210> 46

<211> 105

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 46

gctatgaccc gacgatgacg ccggtgaaat cacaggctat gacccgacga tgacgccggt 60

gaaatcacag gctatgaccc gacgatgacg ccggtgaaat cacag 105

<210> 47

<211> 105

<212> DNA

<213> 东部萤火虫

<400> 47

gctatgattc gatagggaca agacaattat cacaggctat gattcgatag ggacaagaca 60

attatcacag gctatgattc gatagggaca agacaattat cacag 105

<210> 48

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 新的序列1 3x 结合位点

<400> 48

gctatgagca tgttacggga cttcttatat cacaggctat gagcatgtta cgggacttct 60

tatatcacag gctatgagca tgttacggga cttcttatat cacag 105

<210> 49

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 新的序列2 3x 结合位点

<400> 49

gctatgagtg aggagcagcg gatcttaaat cacaggctat gagtgaggag cagcggatct 60

taaatcacag gctatgagtg aggagcagcg gatcttaaat cacag 105

<210> 50

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 新的序列3 3x 结合位点

<400> 50

gctatgagtc atgtcgtcac ggaacttaat cacaggctat gagtcatgtc gtcacggaac 60

ttaatcacag gctatgagtc atgtcgtcac ggaacttaat cacag 105

<210> 51

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 新的序列4 3x 结合位点

<400> 51

gctatgagag aagtgcggat ttcgtattat cacaggctat gagagaagtg cggatttcgt 60

attatcacag gctatgagag aagtgcggat ttcgtattat cacag 105

<210> 52

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 新的序列5 3x 结合位点

<400> 52

gctatgaaag cgccaaagga gtctgtgaat cacaggctat gaaagcgcca aaggagtctg 60

tgaatcacag gctatgaaag cgccaaagga gtctgtgaat cacag 105

<210> 53

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 新的序列6 3x 结合位点

<400> 53

gctatgaaag tgcggatttc gtatttgcat cacaggctat gaaagtgcgg atttcgtatt 60

tgcatcacag gctatgaaag tgcggatttc gtatttgcat cacag 105

<210> 54

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 新的序列7 3x 结合位点

<400> 54

gctatgaaag tggatgcgat gcgattgcat cacaggctat gaaagtggat gcgatgcgat 60

tgcatcacag gctatgaaag tggatgcgat gcgattgcat cacag 105

<210> 55

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 新的序列8 3x 结合位点

<400> 55

gctatgaaac ggtatccgca acttgcgaat cacaggctat gaaacggtat ccgcaacttg 60

cgaatcacag gctatgaaac ggtatccgca acttgcgaat cacag 105

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MECP2编码1结合位点

<400> 56

aagtacgatg tttacttgat c 21

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MECP2编码2结合位点

<400> 57

aagccgctct tggtctctac c 21

<210> 58

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MECP2编码3结合位点

<400> 58

aagtccgaag atcaagacct g 21

<210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MECP2编码4结合位点

<400> 59

gagtccagta tacgcagtgt a 21

<210> 60

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MECP2编码5结合位点

<400> 60

gtccagtata cgcagtgtac a 21

<210> 61

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MECP2编码6结合位点

<400> 61

gactcgggaa accgttagta t 21

<210> 62

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SYNGAP1编码1结合位点

<400> 62

gcgccttaag tccagcataa a 21

<210> 63

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SYNGAP1编码2结合位点

<400> 63

gagttctgtt tcgaagttac t 21

<210> 64

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SYNGAP1编码3结合位点

<400> 64

ggcgagcact tcgagttcaa t 21

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SYNGAP1编码4结合位点

<400> 65

aagatccgaa tctagcagaa a 21

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SYNGAP1编码5结合位点

<400> 66

aaggtcgtaa acagccactg t 21

<210> 67

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SYNGAP1编码6结合位点

<400> 67

aagaggaaat acactctctg a 21

<210> 68

<211> 382

<212> DNA

<213> 智人

<400> 68

agtaattcat acaaaaggac tcgcccctgc cttggggaat cccagggacc gtcgttaaac 60

tcccactaac gtagaaccca gagatcgctg cgttcccgcc ccctcacccg cccgctctcg 120

tcatcactga ggtggagaag agcatgcgtg aggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg 180

cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta 240

gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc 300

cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa 360

cgggtttgcc gccagaacac ag 382

<210> 69

<211> 164

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Jet启动子

<400> 69

gggcggagtt agggcggagc caatcagcgt gcgccgttcc gaaagttgcc ttttatggct 60

gggcggagaa tgggcggtga acgccgatga ttatataagg acgcgccggg tgtggcacag 120

ctagttccgt cgcagccggg atttgggtcg cggttcttgt ttgt 164

<210> 70

<211> 122

<212> DNA

<213> 猿猴病毒40

<400> 70

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60

aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120

ta 122

<210> 71

<211> 225

<212> DNA

<213> 家牛

<400> 71

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225

<210> 72

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SpA

<400> 72

aataaagagc tcagatgcat cgatcagagt gtgttggttt tttgtgtg 48

<210> 73

<211> 10

<212> DNA

<213> 智人

<400> 73

gccaccatgg 10

<210> 74

<211> 589

<212> DNA

<213> 土拨鼠肝炎病毒

<400> 74

aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60

ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120

atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180

tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240

ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300

attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360

ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420

gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480

aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540

cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589

<210> 75

<211> 247

<212> DNA

<213> 土拨鼠肝炎病毒

<400> 75

ataatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg 60

ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc 120

gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt agttcttgcc acggcggaac 180

tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt 240

ccgtggt 247

<210> 76

<211> 644

<212> DNA

<213> 巨细胞病毒

<400> 76

ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 60

gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 120

tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 180

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 240

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 300

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 360

ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 420

ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 480

ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 540

gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 600

ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcg 644

Claims (30)

1.构建体，其包含：

-启动子；

-在内含子内表达的至少一个非哺乳动物或合成miRNA，其中所述合成miRNA是非天然存在的序列；

-转基因；

-至少一个非哺乳动物或合成miRNA结合位点，其提供对所述转基因的表达的控制，其中所述合成miRNA结合位点是非天然存在的序列；和

-多腺苷酸化信号。

2.权利要求1的构建体，其中提供对所述转基因的表达的控制的所述miRNA结合位点在3’UTR或5’UTR内提供。

3.权利要求1的构建体，其中所述非哺乳动物或合成miRNA结合位点在所述转基因内提供。

4.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述构建体提供单个基因回路以在接受不同水平的载体衍生转基因的细胞间提供相对固定的所述转基因的表达水平(即剂量不敏感性)。

5.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述至少一个合成或非哺乳动物miRNA不表现出脱靶结合效应。

6.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述非哺乳动物或合成miRNA在由以下提供的内含子中表达

人_EF1a_内含子_A(SEQ ID NO:5)

gtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcttgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcag

>MINIX_人工_内含子(SEQ ID NO:6)

Gtaagagcctagcatgtagaactggttacctgcagcccaagcttgctgcacgtctagggctcaccgggtttccttgatgaggtaccgacatacttatcctgtcccttttttttccacag。

7.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述miRNA是衍生自昆虫miRNA的非哺乳动物miRNA，任选地，其中所述miRNA能够与萤火虫萤光素酶(ffluc1)miRNA结合位点特异性结合。

8.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中在所述构建体中提供多个miRNA结合位点，任选地，三个miRNA结合位点、至少四个miRNA结合位点、至少五个miRNA结合位点、至少六个miRNA结合位点。

9.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中在构建体中表达多个非哺乳动物或合成miRNA。

10.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述非哺乳动物萤火虫萤光素酶miRNA是选自以下的序列

>ffluc1(SEQ ID NO:9)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaacgatatgggctgaatacaatagtgaagccacagatgtattgtattcagcccatatcgttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>ffluc9(SEQ ID NO:10)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaacgtgaattgctcaacagtatagtgaagccacagatgtatactgttgagcaattcacgttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>ffluc18(SEQ ID NO:11)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgacccgacgatgacgccggtgaatagtgaagccacagatgtattcaccggcgtcatcgtcggggtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>ffluc22(SEQ ID NO:12)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgattcgatagggacaagacaatttagtgaagccacagatgtaaattgtcttgtccctatcgaagtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt。

11.如权利要求1至6或8至9中任一项所述的构建体，其中所述合成miRNA是选自以下的序列

>新的_序列_1(SEQ ID NO:13)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagcatgttacgggacttcttattagtgaagccacagatgtaataagaagtcccgtaacatgcgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>新的_序列_2(SEQ ID NO:14)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagtgaggagcagcggatcttaatagtgaagccacagatgtattaagatccgctgctcctcacgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>新的_序列_3(SEQ ID NO:15)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagtcatgtcgtcacggaacttatagtgaagccacagatgtataagttccgtgacgacatgacgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>新的_序列_4(SEQ ID NO:16)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagagaagtgcggatttcgtatttagtgaagccacagatgtaaatacgaaatccgcacttctcgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>新的_序列_5(ran1g)(SEQ ID NO:17)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaagcgccaaaggagtctgtgatagtgaagccacagatgtatcacagactcctttggcgcttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>新的_序列_6(ran2g)(SEQ ID NO:18)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaagtgcggatttcgtatttgctagtgaagccacagatgtagcaaatacgaaatccgcacttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>新的_序列_7(SEQ ID NO:19)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaagtggatgcgatgcgattgctagtgaagccacagatgtagcaatcgcatcgcatccacttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>新的_序列_8(SEQ ID NO:20)

Tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaacggtatccgcaacttgcgatagtgaagccacagatgtatcgcaagttgcggataccgttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt。

12.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述合成miRNA靶向靶基因的编码序列并且选自

>MECP2_编码_1(SEQ ID NO:21)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaagtacgatgtttacttgatctagtgaagccacagatgtagatcaagtaaacatcgtacttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>MECP2_编码_2(SEQ ID NO:22)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaagccgctcttggtctctacctagtgaagccacagatgtaggtagagaccaagagcggcttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>MECP2_编码_3(SEQ ID NO:23)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaagtccgaagatcaagacctgtagtgaagccacagatgtacaggtcttgatcttcggacttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>MECP2_编码_4(SEQ ID NO:24)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagagtccagtatacgcagtgtatagtgaagccacagatgtatacactgcgtatactggactcgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>MECP2_编码_5(SEQ ID NO:25)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagtccagtatacgcagtgtacatagtgaagccacagatgtatgtacactgcgtatactggacgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>MECP2_编码_6(SEQ ID NO:26)

Tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagactcgggaaaccgttagtattagtgaagccacagatgtaatactaacggtttcccgagtcgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>SYNGAP1_编码_1(SEQ ID NO:27)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagcgccttaagtccagcataaatagtgaagccacagatgtatttatgctggacttaaggcgcgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>SYNGAP1_编码_2(SEQ ID NO:28)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgagagttctgtttcgaagttacttagtgaagccacagatgtaagtaacttcgaaacagaactcgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>SYNGAP1_编码_3(SEQ ID NO:29)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaggcgagcacttcgagttcaattagtgaagccacagatgtaattgaactcgaagtgctcgccgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>SYNGAP1_编码_4(SEQ ID NO:30)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaagatccgaatctagcagaaatagtgaagccacagatgtatttctgctagattcggatcttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>SYNGAP1_编码_5(SEQ ID NO:31)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaaggtcgtaaacagccactgttagtgaagccacagatgtaacagtggctgtttacgaccttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt

>SYNGAP1_编码_6(SEQ ID NO:32)

tgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgaaagaggaaatacactctctgatagtgaagccacagatgtatcagagagtgtatttcctcttgtgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatcacttt。

13.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述非哺乳动物或合成miRNA结合位点选自

>ffluc1_x1_结合_位点(SEQ ID NO:33)

gctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacag

>ffluc1_x 3_结合_位点(SEQ ID NO:34)

gctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacag

>ffluc1_x6_结合_位点(SEQ ID NO:35)

gctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacag

>ffluc1_x3_结合_位点_1bp_中央_错配(SEQ ID NO:36)

gctatgaaacgatatgggcggaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgggcggaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgggcggaatacaaatcacag

>ffluc1_x3_结合_位点_3bp_中央_错配(SEQ ID NO:37)

gctatgaaacgatatgttatgaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgttatgaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgttatgaatacaaatcacag

>ffluc1_x3_结合_位点_3’_错配(SEQ ID NO:38)

gctatgacccaaactgtgaagaatacaaatcacaggctatgagtgtctatcacccgaatacaaatcacaggctatgactaggcccgtttcgaatacaaatcacag

>ffluc1_x3_结合_位点_突变体_1(SEQ ID NO:39)

gctatgaaacgatatgcgctgaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgcgctgaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgcgctgaatacaaatcacag

>ffluc1_结合_位点_突变体_2(SEQ ID NO:40)

gctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacag

>ffluc1_x3_结合_位点_突变体_3(SEQ ID NO:41)

gctatgaaacgatatgggctcaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgggctcaatacaaatcacaggctatgaaacgatatgggctcaatacaaatcacag

>ffluc1_x3_结合_位点_突变体_4(SEQ ID NO:42)

gctatgaaacgatatgggctgattacaaatcacaggctatgaaacgatatgggctgattacaaatcacaggctatgaaacgatatgggctgattacaaatcacag

>ffluc1_x3_结合_位点_突变体_5(SEQ ID NO:43)

gctatgaaacgatatgggctgaattcaaatcacaggctatgaaacgatatgggctgaattcaaatcacaggctatgaaacgatatgggctgaattcaaatcacag

>ffluc1_x3_结合_位点_突变体_6(SEQ ID NO:44)

Gctatgaaacgatatgggctgaatactaatcacaggctatgaaacgatatgggctgaatactaatcacaggctatgaaacgatatgggctgaatactaatcacag

>ffluc9_x3_结合_位点(SEQ ID NO:45)

gctatgaaacgtgaattgctcaacagtaatcacaggctatgaaacgtgaattgctcaacagtaatcacaggctatgaaacgtgaattgctcaacagtaatcacag

>ffluc18_x3_结合_位点(SEQ ID NO:46)

gctatgacccgacgatgacgccggtgaaatcacaggctatgacccgacgatgacgccggtgaaatcacaggctatgacccgacgatgacgccggtgaaatcacag

>ffluc22_x3_结合_位点(SEQ ID NO:47)

gctatgattcgatagggacaagacaattatcacaggctatgattcgatagggacaagacaattatcacaggctatgattcgatagggacaagacaattatcacag

>新的_序列_1_3x_结合_位点(SEQ ID NO:48)

gctatgagcatgttacgggacttcttatatcacaggctatgagcatgttacgggacttcttatatcacaggctatgagcatgttacgggacttcttatatcacag

>新的_序列_2_3x_结合_位点(SEQ ID NO:49)

gctatgagtgaggagcagcggatcttaaatcacaggctatgagtgaggagcagcggatcttaaatcacaggctatgagtgaggagcagcggatcttaaatcacag

>新的_序列_3_3x_结合_位点(SEQ ID NO:50)

gctatgagtcatgtcgtcacggaacttaatcacaggctatgagtcatgtcgtcacggaacttaatcacaggctatgagtcatgtcgtcacggaacttaatcacag

>新的_序列_4_3x_结合_位点(SEQ ID NO:51)

gctatgagagaagtgcggatttcgtattatcacaggctatgagagaagtgcggatttcgtattatcacaggctatgagagaagtgcggatttcgtattatcacag

>新的_序列_5_3x_结合_位点(ran1g结合位点)(SEQ ID NO:52)

gctatgaaagcgccaaaggagtctgtgaatcacaggctatgaaagcgccaaaggagtctgtgaatcacaggctatgaaagcgccaaaggagtctgtgaatcacag

>新的_序列_6_3x_结合_位点(ran2g结合位点)(SEQ ID NO:53)

gctatgaaagtgcggatttcgtatttgcatcacaggctatgaaagtgcggatttcgtatttgcatcacaggctatgaaagtgcggatttcgtatttgcatcacag

>新的_序列_7_3x_结合_位点(SEQ ID NO:54)

gctatgaaagtggatgcgatgcgattgcatcacaggctatgaaagtggatgcgatgcgattgcatcacaggctatgaaagtggatgcgatgcgattgcatcacag

>新的_序列_8_3x_结合_位点(SEQ ID NO:55)

gctatgaaacggtatccgcaacttgcgaatcacaggctatgaaacggtatccgcaacttgcgaatcacaggctatgaaacggtatccgcaacttgcgaatcacag。

14.如权利要求12所述的构建体，其中所述合成miRNA靶向靶基因的编码序列并且所述合成miRNA结合位点选自

>MECP2_编码_1_结合_位点(SEQ ID NO:56)

aagtacgatgtttacttgatc

>MECP2_编码_2_结合_位点(SEQ ID NO:57)

aagccgctcttggtctctacc

>MECP2_编码_3_结合_位点(SEQ ID NO:58)

aagtccgaagatcaagacctg

>MECP2_编码_4_结合_位点(SEQ ID NO:59)

gagtccagtatacgcagtgta

>MECP2_编码_5_结合_位点(SEQ ID NO:60)

gtccagtatacgcagtgtaca

>MECP2_编码_6_结合_位点(SEQ ID NO:61)

gactcgggaaaccgttagtat

>SYNGAP1_编码_1_结合_位点(SEQ ID NO:62)

gcgccttaagtccagcataaa

>SYNGAP1_编码_2_结合_位点(SEQ ID NO:63)

gagttctgtttcgaagttact

>SYNGAP1_编码_3_结合_位点(SEQ ID NO:64)

ggcgagcacttcgagttcaat

>SYNGAP1_编码_4_结合_位点(SEQ ID NO:65)

Aagatccgaatctagcagaaa

>SYNGAP1_编码_5_结合_位点(SEQ ID NO:66)

aaggtcgtaaacagccactgt

>SYNGAP1_编码_6_结合_位点(SEQ ID NO:67)

aagaggaaatacactctctga。

15.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述启动子选自组成型或条件型启动子，任选地，其中所述启动子是组织特异性的。

16.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述启动子选自

>EF1a_启动子(SEQ ID NO:68)

Agtaattcatacaaaaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtagaacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtggagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacag

>Jet_启动子(SEQ ID NO:69)

gggcggagttagggcggagccaatcagcgtgcgccgttccgaaagttgccttttatggctgggcggagaatgggcggtgaacgccgatgattatataaggacgcgccgggtgtggcacagctagttccgtcgcagccgggatttgggtcgcggttcttgtttgt。

17.如前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述polyA序列选自

>sv40 polyA信号(SEQ ID NO:70)

Aacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatctta

>BGH polyA信号(SEQ ID NO:71)

Ctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgg，和

>SpA(SEQ ID NO:72)

Aataaagagctcagatgcatcgatcagagtgtgttggttttttgtgtg。

18.权利要求1-16所述的构建体，其进一步包含稳定性元件，其中所述稳定性元件位于3’UTR中。

19.权利要求17所述的构建体，其中所述稳定性元件选自

>土拨鼠肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)(SEQ ID NO:74)

AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGC

>WPRE的截短型式(WPRE3)(SEQ ID NO:75)

ATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGT。

20.前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述构建体进一步包含Kozak序列GCCACCATGG(SEQ ID NO:73)。

21.前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述miRNA结合位点已经设计以部分改善miRNA结合。

22.载体，其包含权利要求1至20中任一项的构建体。

23.权利要求21所述的载体，其中所述载体是AAV或慢病毒载体，任选地，其中所述载体是AAV载体，任选地，其中所述构建体与表达控制元件可操作地连接，并且所述表达控制元件和所述构建体在一起由5’和3’AAV反向末端重复(ITR)侧接。

24.权利要求21-22中任一项所述的载体，其包装到病毒粒子中，任选地，其中所述载体在包装到所述病毒粒子中时不影响所述构建体的质量。

25.权利要求21-22中任一项所述的载体，其配制成纳米颗粒。

26.使用权利要求1至20中任一项的构建体或权利要求21至24中任一项的载体以表达转基因，任选地以在一种或多种特定的哺乳动物细胞类型中表达转基因的方法。

27.治疗受试者的病症的方法，所述方法包括向所述受试者提供权利要求1至20中任一项的构建体或权利要求21至24中任一项的载体的步骤。

28.组合物，其包含权利要求1至20中任一项的构建体或权利要求21至24中任一项的载体，所述组合物用于治疗受试者的由基因表达不足引起的病症。

29.权利要求26的方法或权利要求27的组合物，其中所述病症是期望矫正基因的受控表达的任何单基因病症，任选地，其中所述单基因病症选自由以下组成的组：雷特综合征、脆性X综合征、天使综合征、Syngap相关智力残疾、CDKl5缺陷、弗里德赖希共济失调、脊髓性肌萎缩症、血友病和糖尿病。

30.权利要求26的方法或权利要求27的组合物，其中所述病症通过选自包括以下的列表的基因的表达来治疗：PRKCZ、TTC34、PRDM16、ARHGEF16、PARK7、PRDM2、IGSF21、PTCH2、NFIA、ST6GALNAC3、DPYD、COL11A1、PDZK1、GPR89A、NBPF11、GPR89B、KCNT2、CFHR2、ASPM、PTPRC、GPATCH2、DUSP10、GPR137B、RYR2、CHRM3、RGS7、AKT3、KIF26B、SMYD3、LPIN1、EPCAM、MSH2、NRXN1、XPO1、LRP1B、ZEB2、ACVR2A、MBD5、KIF5C、SCN1A、COL3A1、PMS1、PLCL1、SATB2、PARD3B、EPHA4、SPHKAP、CHL1、GRM7、TRANK1、DOCK3、FAM19A1、FOXP1、ROBO1、CADM2、FOXL2、SOX2、LPP、RASGEF1B、GRID2、FAT4、NR3C2、LRBA、FGA、GALNTL6、WWC2、TLR3、IRX2、IRX1、CDH12、CDH9、NIPBL、HEXB、MEF2C、GRAMD3、FBN2、PRELID2、TCOF1、GABRG2、MSX2、NSD1、FOXC1、CDYL、TBC1D7、RUNX2、MUT、RIMS1、NKAIN2、LAMA2、ARID1B、PARK2、PACRG、QKI、TNRC18、FBXL18、SUGCT、GLI3、AUTS2、MLXIPL、COL1A2、PPP1R9A、CFTR、TSPAN12、GRM8、CNTNAP2、MNX1、CSMD1、MCPH1、LPL、ANK1、IMPAD1、CHD7、VCPIP1、TRPS1、PARP10、DOCK8、KANK1、GLIS3、PTPRD、MLLT3、ROR2、PTCH1、AL162389.1、ARRDC1、EHMT1、PCDH15、CTNNA3、ADK、BMPR1A、PAX2、BTRC、INPP5A、MRPL23、ELP4、PAX6、CPT1A、DYNC2H1、KIRREL3、WNK1、CACNA1C、PPFIBP1、TBX5、MED13L、NALCN、CHD8、MYH7、TTC6、DAAM1、NRXN3、MTA1、SNRPN、UBE3A、OCA2、HERC2、CHRFAM7A、ARHGAP11B、OTUD7A、FBN1、HEXA、SNUPN、NRG4、AC112693.2、IGF1R、LRRC28、HBA2、HBQ1、CREBBP、RBFOX1、CDR2、CDH13、CYBA、NXN、YWHAE、SMG6、METTL16、PAFAH1B1、ADORA2B、NT5M、RAI1、NF1、C17orf67、PITPNC1、ACOX1、TCF4、DOCK6、CACNA1A、LPHN1、ZSCAN5A、BMP2、MYT1、PEX26、USP18、DGCR6L、USP41、UBE2L3、NF2、LARGE、BRD1、SHANK3CDKL5、FXN、SMN1、F8和INS。

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