JP2023532864A - 導入遺伝子発現系 - Google Patents

Abstract

ベクター由来の導入遺伝子の発現を、過剰発現による毒性を生じることなく、疾患の原因となる遺伝子の欠損を緩和するウィンドウ内に制限するシステムについて記載する。これは、より多くのベクター由来導入遺伝子を受け取る細胞または組織が、適応的にコントロール可能な生来の単一遺伝子回路によって不均衡に抑制される、「用量不感受性」を提供するものである。【選択図】図１

Description

遺伝子治療は、治療用の導入遺伝子を導入して、遺伝性疾患の矯正に影響を与えることを目的とする。本発明は、異なるレベルのベクター由来の導入遺伝子を受け取る細胞間で、導入遺伝子の比較的固定されたレベルの発現を生み出すためのコンストラクトを提供する。また、本明細書では、遺伝子発現をコントロールする方法であって、該コントロールは記載の遺伝子回路を使用して提供される方法も記載する。

治療用遺伝子を導入して遺伝性疾患の矯正に影響を与えるという遺伝子治療の概念が知られているが、多くの遺伝子は投与量感受性が高いことから、遺伝子産物の発現が少なすぎたり多すぎたりすると、有害な影響を与えることがある。ウイルスに媒介される遺伝子導入は、神経系を含む標的組織および細胞に治療用導入遺伝子を送達するための強力な手段である。治療上の影響を最大にするために全身への効果的な形質導入を可能にするには、通常、高いウイルス力価が必要である。しかし、このような高い力価は、一部の細胞で達成される導入遺伝子発現が超生理学的レベルであるために、過剰発現の毒性を引き起こす可能性がある。ベクター由来の導入遺伝子の発現を、過剰発現の毒性を生じさせることなく、疾患の原因となる遺伝的欠損を緩和するウィンドウ内に制限する効果的な系が必要である。

国際公開第２０１６０４０３９５号は、遺伝子導入のための合成ＲＮＡ回路の使用について述べている。この回路は、細胞型に特異的に発現する第１のマイクロＲＮＡによって認識される少なくとも１つの配列と、ＲＮＡモチーフに特異的に結合してタンパク質生成を阻害するタンパク質をコードしている配列とを含む、第１のＲＮＡ分子を含む。第１のマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－２１と記載されている。また、ＲＮＡモチーフの細胞型では発現しない第２のマイクロＲＮＡによって認識される配列と、出力分子をコードしている配列とを含む第２のＲＮＡ分子も提供される。第２のマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１４１、ｍｉＲ－１４２およびｍｉＲ－１４６と記載されている。同出願では、異なる細胞（がん細胞および非がん細胞）による出力タンパク質の発現が、これらの細胞が提供する内在性ｍｉＲに依存することが記載されている。

Strovas TJ, Rosenberg AB, Kuypers BE, Muscat RA, Seelig G.のマイクロＲＮＡベースの単一遺伝子回路は、摂動に対してタンパク質合成速度を緩衝する。ACS Synth Biol. 2014;3(5):324-331は、単一遺伝子のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ベースのフィードフォワードループの使用について論じている。それは、自身の転写物を標的とするイントロンｍｉＲＮＡを提供する。Ｓｔｒｏｖａｓは、哺乳類細胞における操作された遺伝子プログラムの長期的で安定的な発現の難しさについて考察している。この研究では、イントロンを含むマウスのｍｉｒ－１２４－３遺伝子を赤色蛍光レポーター（ｍＣｈｅｒｒｙ）に挿入した遺伝子回路を利用した。このプレｍＲＮＡは、ドキシサイクリン誘導性プロモータから転写され、ｍｉｒ－１２４とｍＣｈｅｒｒｙの共発現につながる。ｍｉＲＮＡとｍＣｈｅｒｒｙ転写物の間の抑圧的制御リンクは、Ｖａｍｐ３遺伝子のｍｉｒ－１２４制御３’ＵＴＲが切断されたｍＲＮＡによりもたらされた。

国際公開第２０１６０４０３９５号は、正常細胞およびがん細胞において発現を提供するために、異なる発現の内在性ｍｉＲの使用について論じているが、このｍｉＲの使用は、非がん疾患の治療において限定的に使用されるものである。また、本発明者らは、Ｓｔｏｖａｓによる既存の方法は、本稿で使用するｍｉＲ１２４のような内在性ｍｉＲＮＡによって制御されることが知られている様々な遺伝子に複数の標的外影響を及ぼすと判断した。実際、ｍｉＲ１２４はいくつかのがんに関連していることが知られているため、遺伝子治療に用いるには不適切であろう。このように、内在性のマイクロＲＮＡを提供することは、導入遺伝子に加えて内在性標的が提供される可能性があるため、問題がある。

本発明者らは、当該技術分野で提供されているコンストラクトよりも有利な代替コンストラクトを提供することを目的とした。

本発明者らは、ベクター由来の導入遺伝子の発現を、過剰発現の毒性を生じさせることなく、疾患の原因となる遺伝的欠損を緩和するウィンドウ内に制限する系を決定し、本発明者らが「投与量不感受性」と呼ぶ、より多くのベクター由来の導入遺伝子を受け取る細胞または組織が、適応的に調節可能な生来の単一遺伝子回路によって、不均衡に抑制されることを可能とした。すなわち、ベクター由来の導入遺伝子を高ベクター投与量で下方制御し、その結果、回路がベクター投与量の範囲にわたって比較的安定した発現レベルを維持し、その結果、細胞集団全体がより均一でコントロールされたレベルでベクター由来の導入遺伝子を発現するようにする。ベクターの用量を増やすと、細胞集団内でより多くの細胞が導入遺伝子を発現するようになるが、従来の遺伝子治療カセットと比較して過剰発現が同時に増加することはない。心臓、肝臓、後根神経節など、ベクターの負荷が高くなることが多い敏感な細胞型は、このメカニズムにより、重複感染に媒介される過剰発現の影響を受けにくくなる。

本発明者らは、オフターゲット効果のリスクを示す哺乳類ベースのｍｉＲＮＡコンストラクトに関連する欠点を克服する、合成または非哺乳類ｍｉＲＮＡのコンストラクトを設計した。本発明者らは、宿主（ヒトゲノム）内に標的が存在しないことを保証するため、非哺乳類または完全合成（自然界では知られていない）ｍｉＲＮＡの有用性を実証した。

さらに、本発明者らは、このような合成コンポーネントを用いて、如何に適切な投与量不感受性を達成するための系の微調整（部位数および効率的なイントロン排除）を可能にするかを見出した。

従って、本発明の第１の態様は：
－プロモータと；
－イントロン内で発現する少なくとも１つの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡであって、前記合成ｍｉＲＮＡは天然に存在しない配列である、少なくとも１つの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡと；
－導入遺伝子と；
－導入遺伝子の発現のコントロールを提供する１つまたは複数の非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡの結合部位であって、前記合成ｍｉＲＮＡの結合部位は天然には存在しない、１つまたは複数の非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡの結合部位と；
－ポリアデニル化シグナルとを含む、コンストラクトを提供する。

本明細書で議論するｍｉＲＮＡの結合部位は、哺乳類細胞内に存在する哺乳類配列と異なるように合成的に誘導されるか、または別の非哺乳類種、例えば昆虫から提供される。ｍｉＲＮＡの結合部位が、例えばｆｆｌｕｃ１のような哺乳類配列に存在しない昆虫由来である場合、非哺乳類系が使用され得る。ｍｉＲＮＡの結合部位と非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡの組み合わせは、コンストラクトのオフターゲット制御効果を最小化する。これにより、導入遺伝子の発現を調節して、導入遺伝子の所望の投与量（発現量）を提供することができる。

好適には、導入遺伝子の発現のコントロールを提供するｍｉＲＮＡの結合部位は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲおよび／または導入遺伝子内で提供され得る。好適には、導入遺伝子内に提供される場合、ｍｉＲＮＡの結合部位は、合成または非哺乳類結合部位を提供するが導入遺伝子タンパク質のアミノ酸配列には影響を与えないように、コドン最適化されてもよい。このコンストラクトは、発現のコントロールを可能にするフィードフォワードループを提供するために使用することができる。

好適には、導入遺伝子の発現を増加させるための安定性エレメントを含んでもよい。好適には、安定性エレメントは、３’ＵＴＲに位置してもよい。好適には、この安定性エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）であってもよい。ＷＰＲＥは、ガンマ、アルファ、およびベータエレメントを含む三要素調節エレメントである。好適には、安定性エレメントは、安定性エレメントを保持するがＸタンパク質配列を省略したＷＰＲＥの切断バージョン、またはリボザイム安定性配列（ＷＰＲＥ３）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）であってよい。ＷＰＲＥ３は、ＷＰＲＥの３つの調節エレメントのうちの２つ（最小限のガンマおよびアルファエレメント）を含む短縮されたＷＰＲＥ配列である。好適には、ＷＰＲＥ３安定性エレメントは、処理された転写物において三次構造を作るＤＮＡ配列を提供し、これが導入遺伝子発現を高める。

好適には、異なるプロモータを様々な導入遺伝子と共に使用することができる。本発明では、フィードフォワードループの強さを調整して、導入遺伝子の発現レベルのコントロールを可能にすることができる。これにより、投与量感受性が得られる。単一遺伝子回路におけるマイクロＲＮＡ結合部位の数を調整し、異なる効率でスプライシングされる合成イントロンを使用することによっても、回路の微調整が可能である。

コンストラクトは、哺乳類細胞において導入遺伝子を発現するように適合されてもよい。好適には、コンストラクトは、哺乳動物細胞、好適には、導入遺伝子の発現が行われるべき特定の哺乳動物細胞または細胞型に提供されるように適合されてもよい。

有利には、異なるレベルのベクター由来の導入遺伝子を受け取った細胞間で比較的一定の発現レベルを生成するために、イントロン由来のマイクロＲＮＡを用いた単一遺伝子回路を提供することができる。

当業者には理解されるように、コンストラクトの特徴（プロモータ、イントロン内で発現する合成ｍｉＲＮＡ、導入遺伝子、導入遺伝子の発現のコントロールを提供するｍｉＲＮＡの結合部位、ポリアデニル化シグナル）は、導入遺伝子の機能的発現を可能にするために互いに関連して提供される必要がある。

コンストラクトは、修飾コザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含むように適合されてもよい。好適には、修飾コザック配列は、タンパク質翻訳開始部位として機能する任意の核酸モチーフを含む、任意のコザック配列であってもよい。好適には、修飾コザック配列は、翻訳開始の増加を促進する任意の修飾配列であってもよい。好適には、コザック配列は、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）であってもよい。

実施形態では、コンストラクトは、（５’から３’へ）：
－プロモータと；
－イントロン内で発現する少なくとも１つの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡであって、前記合成ｍｉＲＮＡは天然に存在しない配列である、少なくとも１つの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡと；
－導入遺伝子と；
－導入遺伝子内の、導入遺伝子の発現のコントロールを提供する１つまたは複数の合成または非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位であって、前記合成ｍｉＲＮＡの結合部位は天然には存在しない、１つまたは複数の合成または非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位と；
－ポリアデニル化シグナルとを含む。

実施形態では、コンストラクトは、（５’から３’へ）：
－プロモータと；
－イントロン内で発現する少なくとも１つの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡと；
－導入遺伝子であって、合成ｍｉＲＮＡが天然には存在しない配列である、導入遺伝子と；
－３’ＵＴＲ内の、導入遺伝子の発現のコントロールを提供する１つまたは複数の合成または非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位であって、前記合成ｍｉＲＮＡの結合部位は天然には存在しない、１つまたは複数の合成または非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位と；
－ポリアデニル化シグナルとを含む。

実施形態では、コンストラクトは、（５’から３’へ）：
－プロモータと；
－イントロン内で発現する少なくとも１つの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡであって、前記合成ｍｉＲＮＡは天然には存在しない配列である、少なくとも１つの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡと；
－導入遺伝子の転写を促進することができる修飾コザック配列と；
－導入遺伝子と；
－導入遺伝子または３’ＵＴＲ内の、導入遺伝子の発現のコントロールを提供する１つまたは複数の合成または非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位であって、前記合成ｍｉＲＮＡの結合部位は天然には存在しない、１つまたは複数の合成または非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位と；
－ポリアデニル化シグナルとを含む。

実施形態では、コンストラクトは、（５’から３’へ）：
－プロモータと；
－イントロン内で発現する少なくとも１つの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡであって、前記合成ｍｉＲＮＡは天然には存在しない配列である、少なくとも１つの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡと；
－導入遺伝子と；
－導入遺伝子または３’ＵＴＲ内の、導入遺伝子の発現のコントロールを提供する１つまたは複数の合成または非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位であって、前記合成ｍｉＲＮＡの結合部位は天然には存在せず、前記１つまたは複数の合成または非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位は、ｍｉＲＮＡ結合を部分的に軽減するように設計されている、１つまたは複数の合成または非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位と；
－ポリアデニル化シグナルとを含む。

実施形態では、コンストラクトは、（５’から３’へ）：
－プロモータと；
－イントロン内で発現する少なくとも１つの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡであって、前記合成ｍｉＲＮＡは天然には存在しない配列である、少なくとも１つの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡと；
－導入遺伝子と；
－導入遺伝子または３’ＵＴＲ内の、導入遺伝子の発現のコントロールを提供する１つまたは複数のｍｉＲＮＡの結合部位であって、前記合成ｍｉＲＮＡの結合部位は天然には存在しない、１つまたは複数のｍｉＲＮＡの結合部位と；
－３’ＵＴＲ内の安定性エレメントと；
－ポリアデニル化シグナルとを含む。

いくつかの実施形態では、コンストラクトは、プロモータと、イントロン内で発現する少なくとも１つの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡと、導入遺伝子と、導入遺伝子または３’ＵＴＲ内の、導入遺伝子の発現のコントロールを提供する１つまたは複数の結合部位と、ポリアデニル化シグナルと、任意で、上記の実施形態に記載されている任意の１つまたは複数の特徴を含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記で言及した１つまたは複数の特徴を、斯かる特徴が言及される順序で含んでもよい。

好適には、コンストラクトは、強化された発現、制御および安定性を提供するように修飾されてもよい。好適には、コンストラクトは、レポーター導入遺伝子を含んでもよい。好適には、コンストラクトは、強力な発現を促進するコザック配列を含んでもよい。好適には、コンストラクトは、３’ＵＴＲに安定性エレメントを含んでもよい。好適には、コンストラクトは、ｍｉＲＮＡ結合の効力を低下させる（しかし完全に軽減するわけではない）ように操作された変異を含んだ１つまたは複数の結合部位を含んでもよい。

好適には、目的遺伝子はＭＥＣＰ２であってもよい。あるいは、目的遺伝子は、以下の目的遺伝子のいずれか１つであってもよい：ＦＭＲ１、ＵＢＥ３Ａ、ＣＤＫＬ５、ＦＸＮ、ＳＭＮ１、またはＩＮＳ。目的遺伝子は、遺伝的疾患または発達障害の治療のために遺伝子治療を用いて供給されることが要求される任意の遺伝子であってもよい。目的遺伝子は、遺伝的状態または発達障害を治療するために対象に送達される際に、発現がコントロールされることが要求される任意の遺伝子であってもよい。

導入遺伝子
好適には、導入遺伝子は、標的細胞に人為的に導入されるタンパク質コード化遺伝子である。それは、選択されたプロモータのコントロール下で、例えば、遺伝子治療カセットの一部として、本発明の第１の態様のコンストラクトの一部として提供される。導入遺伝子のＤＮＡ配列は、特定の遺伝子の特定のアイソフォームを表し得る。導入遺伝子ＤＮＡ配列は、コドン最適化されていてもよい。コドン最適化は、特異的でユニークなＤＮＡ配列を提供することができるが、ＤＮＡおよびその後のｍＲＮＡの変化は、タンパク質のコード配列に影響を与えない；すなわち、野生型のアミノ酸配列が維持される。

好適には、導入遺伝子は、以下から選択され得る
［配列１］

［配列2－1］

［配列2－2］

［配列3－1］

［配列3－２］

［配列4－1］

［配列4－２］

好適には、これらの導入遺伝子の機能的変異体が提供され得、ここで機能的変異体は、導入遺伝子によって提供される機能を保持し、少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有している。好適には、機能的変異体は、導入遺伝子の機能を提供する導入遺伝子の断片であってよい。好適には、導入遺伝子の発現のコントロールを提供するｍｉＲＮＡの結合部位が導入遺伝子内に設けられている場合、ｍｉＲＮＡの結合部位は、ｍｉＲＮＡが導入遺伝子に結合して発現をコントロールできるように機能的変異体中に設けられる。

配列の同一性は、当技術分野で知られている任意の方法によって決定することができる。好適には、配列の同一性は導入遺伝子の全長にわたって決定され得る。

適切な導入遺伝子には、導入遺伝子の発現がコントロールされることが望まれる任意の単一遺伝子障害に基づくものが含まれる。好適な導入遺伝子には、導入遺伝子の発現がコントロールされることが望まれる任意の一遺伝子性障害に基づくものが含まれる。さらに例示的な導入遺伝子には、導入遺伝子の発現がコントロールされることが望まれる単一遺伝子のＣＮＳ障害に基づくものが含まれる。神経系は、過剰発現されると神経系機能に有害であることが知られている多くの遺伝子を発現している。しかし、本発明は、非ＣＮＳ障害に対する遺伝子治療を含む、導入遺伝子の過剰発現が有害であるあらゆる状況に適用可能である。例えば、筋肉細胞におけるジストロフィン遺伝子の置換では、適度な過剰発現は有害な副作用をもたらさないが、非常に高いレベルの過剰発現は重度の心毒性を引き起こす。

イントロン内からのｍｉＲＮＡの発現
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、長さ～２２ヌクレオチドの小さな一本鎖の非コードＲＮＡの一種である。ｍｉＲＮＡの多くは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって、独立した転写産物として、またはｍＲＮＡのイントロンに組み込まれたＲＮＡとして転写される。ｍｉＲＮＡの一次転写産物は、２つのＲＮａｓｅＩＩＩ酵素により、～７０ｎｔのヘアピン前駆体ｍｉＲＮＡに、そして最終的に～２２ｎｔの成熟ｍｉＲＮＡに加工される（Drosha and Dicer）。ｍｉＲＮＡはタンパク質レベルの制御、翻訳抑制および／またはｍＲＮＡの分解のためにメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を標的とすることにより機能している。

本発明者らは、それぞれの結合領域を含む転写産物の発現をノックダウンすることができる、本発明の非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡを開発した。本発明のいくつかの例では、これらは、ホタルルシフェラーゼタンパク質を標的とするように元々設計された昆虫由来のｍｉＲＮＡ配列である。他の例では、これらは合成ｍｉＲＮＡ配列であり、天然に存在するｍｉＲＮＡとの相同性はない。いくつかの例では、合成ｍｉＲＮＡ配列は、コドン最適化されたコード配列を標的するように設計されており、コード配列は同じアミノ酸配列を保持したままＤＮＡレベルで変更されている。遺伝子治療の文脈では、これにより、外因的に導入された導入遺伝子が合成ｍｉＲＮＡによって独占的に標的にされる一方、内在性遺伝子は影響を受けないようにすることが可能になる。本発明の最終的な例では、完全に新規な合成ｍｉＲＮＡ配列を大きなＤＮＡ配列のインシリコ生成によって作成し、これを既存のｍｉＲＮＡ設計ツールと共に使用して、ｍｉＲＮＡの標的化に適した配列を同定した。好適には、これらのｍｉＲＮＡはすべて非哺乳類または合成であるため、哺乳類のトランスクリプトーム内に予測される内在性標的を持たない。

好適には、ｍｉＲＮＡは、異なるイントロン内に組み込まれていてもよい。そのようなイントロンの例を、以下に提供する。ヒトＥＦ１ａイントロンは、一般的に使用されるＥＦ１ａプロモータに存在するイントロンであり、効率的にスプライシングすることが知られている。ＭＩＮＩＸイントロンもまた、効率的にスプライシングすることが知られており、その短い配列のために遺伝子治療の文脈で有用である。本発明者らは、ＥＦ１ａプロモータとＭＩＮＩＸイントロンが組み合わさって機能し得ることを示した。本発明者らは、ＪｅＴプロモータとＭＩＮＩＸイントロンが組み合わさって機能することも示している。

好適には、イントロンは、以下から選択され得る：
［配列５］

［配列６］

好適には、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ１）を本来の標的とする非哺乳類ｍｉＲＮＡが提供され得る。

［配列７］

ＢＬＡＳＴ検索の結果、このＲＮＡとマッチする同一（２１ｂｐ）のものは、ヒト細胞で作られるどのＲＮＡ転写物にも存在しない（したがって、これは「非哺乳類」配列である）ことが判明した。研究により、ｍｉＲＮＡは、シード配列と完全に相補的であれば、標的部位のミスマッチを許容することが示されている。シード配列は通常、ｍｉＲＮＡの５’領域の２－７位に位置し、ｍｉＲＮＡの結合には不可欠である。しかし、オフターゲットＲＮＡの候補で、シード配列と完全に一致する配列を含むものはなかった。

ｍｉＲＮＡは、正しい認識と処理を可能にするためにヘアピンループ構造で組み込まれる。好適には、組み込み非哺乳類ｍｉＲＮＡは、以下から選択され得る
［配列９－１２］

好適には、ｍｉＲＮＡは、哺乳類、昆虫または植物のｍｉＲＮＡと相同性がなく、ランダムに生成された配列を元々標的にする新規合成ｍｉＲＮＡによって提供され得る。

好適には、組み込み合成ｍｉＲＮＡは、以下から選択され得る：
［配列１３－２０］

好適には、組み込み合成ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子（すなわち、治療用導入遺伝子）のコード配列を標的にし得る。

標的遺伝子はコドン最適化され、哺乳類、昆虫または植物のｍｉＲＮＡと相同性のない合成ｍｉＲＮＡは、同じ遺伝子の内在性転写物を標的とせずにコドン最適化された導入遺伝子を標的とする能力についてスクリーニングされてもよい。

好適には、コドン最適化された配列を標的とする組み込み合成ｍｉＲＮＡは、以下から選択され得る：
［配列21－３２］

ｍｉＲＮＡは、成熟したｍｉＲＮＡの配列と相補的な特定の配列に結合することで機能する。これらの結合部位は、内在性ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に存在し得る。結合部位は、代替的に、５’ＵＴＲ、エクソン、およびイントロンに位置する場合もある。さらなる代替的な実施形態では、結合部位は、コドン最適化された導入遺伝子配列内に位置していてもよい。好適には、導入遺伝子の発現のコントロールを提供するｍｉＲＮＡの結合部位は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲまたは導入遺伝子内に提供され得る。

好適には、結合部位の「シード」配列は、ｍｉＲＮＡの５’末端の、２位から７／８位の塩基とワトソン－クリック対を形成する。しかしながら、当業者は、例えば配列保存、ｍｉＲＮＡの３’末端での強い塩基対形成、局所ＡＵ含量および３’ＵＴＲ内のｍｉＲＮＡの結合部位の位置に基づく結合特異性および強度を変化させ得る方法を理解するであろう。

好適には、異なる数の結合部位を用いて、導入遺伝子のコントロールの強さを変えることができる。さらに、結合部位に導入されるミスマッチを使用して、導入遺伝子のコントロールレベルを下げることができる。このような変更により、投与量不感受性のレベルを設定することができる。

好適には、結合部位は、ｍｉＲＮＡの標的結合を完全に阻害するのではなく、減少させるように変異させることができる。好適には、これらの変異は、いくつかの標的ｍｉＲＮＡが依然として結合部位に結合することにより、導入遺伝子発現の制御的なコントロールを維持しながら、導入遺伝子の発現を増強するために使用することができる。

ｍｉＲＮＡ標的結合に成功すると、通常、翻訳抑制あるいはｍＲＮＡ分解機構により、タンパク質レベルのノックダウンが起こる。

好適には、非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡの結合部位は、以下から選択され得る。
［配列３３－４７］

以下の合成配列は、コード配列を最適化するように設計されており、それらを標的とするｍｉＲＮＡは、哺乳類内在性配列とは異なる配列部分を標的とするように設計されている。
［配列４８－６７］

プロモータ
構成的または条件付の任意の適切なプロモータを使用して、導入遺伝子の発現を駆動することができる。好適には、プロモータには、Ｅｆ１ａプロモータ、ＣＡＧプロモータ、Ｊｅｔプロモータ、ＣＭＶプロモータ、ＣＢＡプロモータ、ＣＢＨプロモータ、シナプシン１プロモータ、Ｍｅｃｐ２プロモータ、Ｕ１ａプロモータ、Ｕ６プロモータ、ユビキチンＣプロモータ、ニューロン特異的エノラーゼプロモータ、オリゴデンドロサイト転写因子１またはＧＦＡＰプロモータが含まれ得る。

実施形態では、フィードフォワードｍｉＲＮＡは、好適な、例えば上記のプロモータのいずれかに結合したイントロン配列に組み込まれ得る。

使用される正確なプロモータは、必要とされる発現の強さ、および、より大きな遺伝子の場合には、例えばＡＡＶ送達ベクターにおいて利用可能なパッケージング容量に依存することになる。適切なプロモータは、以下によって提供され得る：
［配列６８－６９］

［配列７６］

ポリアデニル化シグナル
このアプローチは、合成ポリＡ配列または天然ポリＡ配列の切断断片と共に使用することができる。実施形態では、フィードフォワードｍｉＲＮＡの結合部位は、３’ＵＴＲ内に組み込むことができる。好適には、ｍｉＲＮＡの結合部位は、導入遺伝子配列内に埋め込まれない限り、３’ＵＴＲ内に組み込まれ得る。

当技術分野で知られているような任意の適切なポリアデニル化シグナルを利用することができる。好適には、ポリＡシグナルは、以下のものであってもよい。
［配列７０－７２］

安定性エレメント
好適には、導入遺伝子の発現を増加させるための安定性エレメントを含んでもよい。好適には、安定性エレメントは、３’ＵＴＲに位置してもよい。好適には、安定性エレメントは、以下のものであってもよい。

［配列７４－７５］

ベクター
本発明のｍｉＲＮＡフィードフォワードコンストラクトは、ｉｎ ｖｉｖｏで機能するように設計されている。これらのコンストラクトを必要な組織／臓器に送達するために、任意の適切なウイルスベクターを利用することができる。実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達系、またはレンチウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、ラドボウイルス、麻疹ウイルス、ピコルナウイルスおよびポックスウイルスなどの他の治療ウイルスベクター系であり得る。ＡＡＶの場合、コンストラクト全体（プロモータ、ｍｉＲＮＡ、導入遺伝子、結合部位、ｐｏｌｙＡ）をＡＡＶ互換プラスミドにクローニングし、末端逆位配列（ＩＴＲ）で挟み込むことが可能である。ＡＡＶの製造には厳しいサイズ制限があるため、コンストラクト全体は４．４ｋｂ以下でなければならない（ＩＴＲを除く）。このサイズ制限により、利用可能なスペースの大部分を占めるような特定の導入遺伝子の使用が制限されることがある。あるいは、より大きな導入遺伝子を収容するために、より小さなプロモータおよびｐｏｌｙＡを使用することもできる。好適には、コンストラクトにおいて、３’ＵＴＲ領域を除去し、導入遺伝子のコドン最適化配列を合成ｍｉＲＮＡの標的とすることができる。コドン最適化された導入遺伝子は異なるＤＮＡ／ｍＲＮＡ配列を有するので、目的遺伝子（ＧＯＩ）由来の内在性ｍＲＮＡは標的にならない。

本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様のコンストラクトを含むベクターが提供される。

好適には、コンストラクトは、標的細胞へのコンストラクトの送達を可能にするために、ウイルスベクター内で提供され得る。標的細胞は、ニューロン、ニューロンサブタイプ、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、シュワン細胞などの中枢神経系および末梢神経系の細胞であり得る。有利には、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、特にＡＡＶ９、ＡＡＶ１、２、４、５、６、６．２、８、９、ｒｈ１０、ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．Ｓ、ＰＨＰ．ｅＢベクターから選択することができる。

本発明の第３の態様によれば、導入遺伝子を発現させるために第１の態様のコンストラクトを使用する方法が提供される。好適には、第２の態様は、対象に提供され得る細胞において導入遺伝子を発現させる方法を包含する。好適には、必要な投与量調節レベルを評価するために、コンストラクトをｉｎ ｖｉｔｒｏで効果的にスクリーニングすることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、導入遺伝子はプラスミド内に含まれ、脂質媒介遺伝子導入を介して細胞株に導入することができる。２４時間後には強固な導入遺伝子の発現が確認できる。その後、フィードフォワード導入遺伝子カセットは、好適には、ｒＡＡＶ発現ベクターに挿入することによりベクター化することができ、これを用いてＡＡＶ粒子を生成することが可能である。

本発明の第４の態様によれば、対象における遺伝子の不十分な発現によって引き起こされる障害を治療する方法であって、対象における遺伝子の不十分な発現によって引き起こされる状態を治療するために、対象において発現する導入遺伝子の野生型またはコドン最適化または修飾されたコピーを有する本発明の第１の態様のコンストラクトまたは第２の態様のベクターを提供するステップを含む方法が提供される。好適には、導入遺伝子をパッケージングしたＡＡＶウイルスベクターは、全身静脈内注射を含む種々の方法、または髄腔内腰椎、脳室内、大槽内注射を含むＣＳＦ内投与経路、または神経突起への注射によって対象に導入されよう。

好適には、導入遺伝子は、神経疾患であるレット症候群を有する対象において発現が低下している遺伝子であってよい。典型的には、レット症候群は、Ｘ連鎖遺伝子ＭＥＣＰ２における機能喪失型変異によって引き起こされる。好適には、導入遺伝子は、ＭＥＣＰ２遺伝子の機能的コピーであってよい。好適には、コンストラクトは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いて神経系に導入遺伝子を送達することを提供する。

コンストラクトは、標的細胞において狭い／所望の範囲内での導入遺伝子の発現を提供するものである。例えば、導入遺伝子がＭＥＣＰ２遺伝子のタンパク質コード配列の野生型またはコドン最適化コピーである場合、コンストラクトは、適切な治療効果を提供するが、副作用が観察されるレベルよりも低い発現レベルで導入遺伝子を提供することができると考えられている。ＭＥＣＰ２、ＦＭＲ１およびＵＢＥ３Ａの場合、遺伝子の過剰発現は有害であることが知られている。

例えば、レット症候群では、低レベルの発現がマウスの疾患表現型を改善することが、本発明者らによって以前示されている。逆に、患者および実験動物で過剰発現（遺伝子座の重複）させると（２倍以上）、有害な神経学的転帰をもたらす。これにより遺伝子治療の治療領域は狭く限定されるが、これに対してフィードフォワード技術は適している。また、ＦＭＲ１、ＵＢＥ３Ａ、ＳＹＮＧＡＰ１遺伝子は、投与量感受性を有すると考えられている。このような状況では、疾患を改善し、副作用を最小限に抑えるための導入遺伝子の発現レベルをもとめ、その発現レベルを、本発明を用いて患者に好適に提供することが可能である。

単発性障害に関連する他の多くの遺伝子は、投与量感受性を有しており、そのような外因性導入遺伝子の発現を調節する本発明のコンストラクトおよび系の使用から利益を得るであろう。ヒトのコピー数多型（ＣＮＶ）が投与量感受性遺伝子の指標となり得、複数の研究が、個々の遺伝子の投与量感受性をＣＮＶ病原性の共通の原因として意味づけている。Gu W & Lupski JR.CNV and nervous system diseases - What's new? Cytogenet Genome Res. 2008; 123:54-64は、投与量感受性遺伝子とその神経発達障害との関連についていくつかの例を挙げている。例えば、ＭＥＣＰ２重複症候群（ＭＥＣＰ２遺伝子が関与）、成人発症型常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ、ＬＭＮＢ１遺伝子が関与）、孤立性脳無脳症候群（ＩＬＳ、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１／ＬＩＳ１遺伝子が関与）、ミラー－ディーカー症候群（ＭＤＳ、ＹＷＨＡＥ遺伝子が関与）などが挙げられる。

Rice AM & McLysaght. Dosage sensitivity is a major determinant of human copy number variant pathogenicity. Nature Communications. 2017; 8:14366 | DOI: 10.1038は、疾患に関連するＣＮＶに関与する孤立性の病原性遺伝子が神経発達における役割に富むことを示しており、多くの投与量感受性遺伝子、例えば、ＰＲＫＣＺ、ＴＴＣ３４、ＰＲＤＭ１６、ＡＲＨＧＥＦ１６、ＰＡＲＫ７、ＰＲＤＭ２、ＩＧＳＦ２１、ＰＴＣＨ２、ＮＦＩＡ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ３、ＤＰＹＤ、ＣＯＬ１１Ａ１、ＰＤＺＫ１、ＧＰＲ８９Ａ、ＮＢＰＦ１１、ＧＰＲ８９Ｂ、ＫＣＮＴ２、ＣＦＨＲ２、ＡＳＰＭ、ＰＴＰＲＣ、ＧＰＡＴＣＨ２、ＤＵＳＰ１０、ＧＰＲ１３７Ｂ、ＲＹＲ２、ＣＨＲＭ３、ＲＧＳ７、ＡＫＴ３、ＫＩＦ２６Ｂ、ＳＭＹＤ３、ＬＰＩＮ１、ＥＰＣＡＭ、ＭＳＨ２、ＮＲＸＮ１、ＸＰＯ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＺＥＢ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＭＢＤ５、ＫＩＦ５Ｃ、ＳＣＮ１Ａ、ＣＯＬ３Ａ１、ＰＭＳ１、ＰＬＣＬ１、ＳＡＴＢ２、ＰＡＲＤ３Ｂ、ＥＰＨＡ４、ＳＰＨＫＡＰ、ＣＨＬ１、ＧＲＭ７、ＴＲＡＮＫ１、ＤＯＣＫ３、ＦＡＭ１９Ａ１、ＦＯＸＰ１、ＲＯＢＯ１、ＣＡＤＭ２、ＦＯＸＬ２、ＳＯＸ２、ＬＰＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＧＲＩＤ２、ＦＡＴ４、ＮＲ３Ｃ２、ＬＲＢＡ、ＦＧＡ、ＧＡＬＮＴＬ６、ＷＷＣ２、ＴＬＲ３、ＩＲＸ２、ＩＲＸ１、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ９、ＮＩＰＢＬ、ＨＥＸＢ、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＲＡＭＤ３、ＦＢＮ２、ＰＲＥＬＩＤ２、ＴＣＯＦ１、ＧＡＢＲＧ２、ＭＳＸ２、ＮＳＤ１、ＦＯＸＣ１、ＣＤＹＬ、ＴＢＣ１Ｄ７、ＲＵＮＸ２、ＭＵＴ、ＲＩＭＳ１、ＮＫＡＩＮ２、ＬＡＭＡ２、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＰＡＲＫ２、ＰＡＣＲＧ、ＱＫＩ、ＴＮＲＣ１８、ＦＢＸＬ１８、ＳＵＧＣＴ、ＧＬＩ３、ＡＵＴＳ２、ＭＬＸＩＰＬ、ＣＯＬ１Ａ２、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＣＦＴＲ、ＴＳＰＡＮ１２、ＧＲＭ８、ＣＮＴＮＡＰ２、ＭＮＸ１、ＣＳＭＤ１、ＭＣＰＨ１、ＬＰＬ、ＡＮＫ１、ＩＭＰＡＤ１、ＣＨＤ７、ＶＣＰＩＰ１、ＴＲＰＳ１、ＰＡＲＰ１０、ＤＯＣＫ８、ＫＡＮＫ１、ＧＬＩＳ３、ＰＴＰＲＤ、ＭＬＬＴ３、ＲＯＲ２、ＰＴＣＨ１、ＡＬ１６２３８９．１、ＡＲＲＤＣ１、ＥＨＭＴ１、ＰＣＤＨ１５、ＣＴＮＮＡ３、ＡＤＫ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＰＡＸ２、ＢＴＲＣ、ＩＮＰＰ５Ａ、ＭＲＰＬ２３、ＥＬＰ４、ＰＡＸ６、ＣＰＴ１Ａ、ＤＹＮＣ２Ｈ１、ＫＩＲＲＥＬ３、ＷＮＫ１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＰＰＦＩＢＰ１、ＴＢＸ５、ＭＥＤ１３Ｌ、ＮＡＬＣＮ、ＣＨＤ８、ＭＹＨ７、ＴＴＣ６、ＤＡＡＭ１、ＮＲＸＮ３、ＭＴＡ１、ＳＮＲＰＮ、ＵＢＥ３Ａ、ＯＣＡ２、ＨＥＲＣ２、ＣＨＲＦＡＭ７Ａ、ＡＲＨＧＡＰ１１Ｂ、ＯＴＵＤ７Ａ、ＦＢＮ１、ＨＥＸＡ、ＳＮＵＰＮ、ＮＲＧ４、ＡＣ１１２６９３．２、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＲＲＣ２８、ＨＢＡ２、ＨＢＱ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＲＢＦＯＸ１、ＣＤＲ２、ＣＤＨ１３、ＣＹＢＡ、ＮＸＮ、ＹＷＨＡＥ、ＳＭＧ６、ＭＥＴＴＬ１６、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１、ＡＤＯＲＡ２Ｂ、ＮＴ５Ｍ、ＲＡＩ１、ＮＦ１、Ｃ１７ｏｒｆ６７、ＰＩＴＰＮＣ１、ＡＣＯＸ１、ＴＣＦ４、ＤＯＣＫ６、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＬＰＨＮ１、ＺＳＣＡＮ５Ａ、ＢＭＰ２、ＭＹＴ１、ＰＥＸ２６、ＵＳＰ１８、ＤＧＣＲ６Ｌ、ＵＳＰ４１、ＵＢＥ２Ｌ３、ＮＦ２、ＬＡＲＧＥ、ＢＲＤ１、ＳＨＡＮＫ３を同定している。

本発明者らは、任意の適切な遺伝子、特に、例えば上述したような任意の投与量感受性遺伝子が、必要に応じて本発明において好適に利用され得ると考える。例えば、当技術分野で理解されるように、本発明のコンストラクトおよび系は、疾患または状態の治療のための任意の適切なタンパク質の発現、特に提供されるタンパク質の発現レベルのコントロールが重要である場合に、使用され得る。

本発明者らは、この概念と、内部に適切な導入遺伝子を有するコンストラクトと、導入遺伝子を発現させる方法は、臨床的に関連し投与量感受性を持つ他のあらゆる遺伝子に適用可能であると考えている。

好適には、このコンストラクトは、脆弱Ｘ症候群（ＦＭＲ１導入遺伝子を使用）、アンジェルマン症候群（例えばＵＢＥ３Ａ導入遺伝子を使用）、またはＳｙｎｇａｐ関連知的障害（ＳＹＮＧＡＰ１を使用）を含む他の遺伝子治療プログラムに使用することができる。

特定のベクターを使用して、疾患によって決まる特定の細胞型にベクターを提供することが想定され得る。

例えば、ＳＹＮＧＡＰ１は神経系遺伝子であり、神経細胞でのみ発現しているが、ＵＢＥ３Ａ、ＭＥＣＰ２、ＦＭＲ１は複数の組織にわたって遍在的に発現している。しかし、疾患の顕性的な特徴は神経系における発現の消失において生じるため、治療用フィードフォワード遺伝子の標的は神経系が支配的である。

本発明者らは、適切な投与量不感受性を達成するために、合成コンポーネントが系の微調整（部位数および効率的なイントロン排除）を行うと考えられるコンストラクトを開発した。本発明の文脈における投与量不感性とは、治療用導入遺伝子の発現量が多すぎる場合に観察される望ましくない効果（例えば、個体にＭＥＣＰ２遺伝子が２コピーあると、ＭｅＣＰ２レベルが激減、あるいはなくなるレット症候群並みの重い症状を呈する重症ＭＥＣＰ２重複症候群に至ることが知られている）をもたらさないようなタンパク質発現の範囲を推測することを意図している。

実施形態では、コンストラクトは、導入遺伝子レベルをコントロールすることを可能にする２つのエレメントを含むことができる。好適には、第１のエレメントは、プロモータと導入遺伝子の間に位置するイントロン内に含まれるマイクロＲＮＡ配列であり得る。このイントロンを含むマイクロＲＮＡは、プレｍＲＮＡ処理中にスプライシングされる。その後、ｍｉＲＮＡは処理されて、標的転写物を分解することができる成熟ｍｉＲＮＡを生成する。設計の重要な要素は、オフターゲット効果を防ぐために、ｍｉＲＮＡが哺乳類ゲノムを標的としないように設計されることである。いくつかの例では、ｍｉＲＮＡは昆虫由来であり得る（例えばホタル科からのものであるが、任意の適切な昆虫または他の適切な非哺乳類ｍｉＲＮＡが、この使用のために最適化され得る）。代替例では、配列は完全に合成（哺乳類ゲノムに結合しないように設計され、天然に存在する配列ではない）であり得、したがって、哺乳類ゲノム内の既知のオフターゲット効果を有しない。第二のエレメントは、イントロンから産生されるｍｉＲＮＡと一致する、コンストラクトの３’ＵＴＲにおけるいくつかの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡの結合部位であり得る。これらの結合部位が存在することで、導入遺伝子が送達されたマイクロＲＮＡの標的となる。これにより、導入遺伝子のレベルが低下し、過剰発現が防止され、系の望ましい投与量不感受性効果がもたらされる。

フィードフォワード原理の別の実施形態では、合成マイクロＲＮＡは遺伝子治療合成カセットイントロン内に送達されるが、３’ＵＴＲ内に含まれるｍｉＲＮＡの結合部位を標的とするのではなく、導入遺伝子のコード配列そのものを標的とする。重要なことは、このような実施形態では、導入遺伝子の配列は、アミノ酸レベルでは同じままで、ＤＮＡレベルで配列が変更されるようにコドン最適化されていることである。これにより、内在性哺乳類配列を標的とすることなく、合成ｍｉＲＮＡが導入遺伝子を唯一標的できる新規ＤＮＡ配列が創り出される。このバージョンのフィードフォワード系は、よりコンパクトであるため、ウイルスベクターのパッケージング容量に近い大きな遺伝子（例えばＳｙｎｇａｐ１）にとって有利である。全体として、単一遺伝子ループは、一定のレベルの発現を可能にし、これにより回路は広い範囲の遺伝子投与量にわたって比較的固定されたレベルの発現を維持することが可能になる（すなわち、この比較的固定されたまたは一定の発現レベルは、望ましい投与量不感受性をもたらすものである）。この実験系により、遺伝子投与量が変化しても遺伝子発現の相対的な変化が非常に小さいレジメンができた。これは、遺伝子導入された細胞集団全体に広く均等に発現させることを目的とする遺伝子治療に適用する場合に重要な特徴であり、ウイルスベクターの用量を増やして、過剰発現の影響を伴わずに高い導入率を達成することができる。

実施形態において、コンストラクトは、ＡＡＶ遺伝子治療に対して感受性を有する細胞および／または組織における発現に適している。実施形態において、このコンストラクトは、ＡＡＶベクターを使用して送達された導入遺伝子を典型的には過剰発現させる細胞において、導入遺伝子の発現のコントロールを可能にする。実施形態において、コンストラクトは、これらの細胞および／または組織における細胞毒性を防止する。実施形態において、コンストラクトは、後根神経節における細胞毒性を防止し得る。実施形態において、コンストラクトは、肝細胞における細胞毒性を防止し得る。実施形態において、コンストラクトは、心筋細胞における細胞毒性を防止し得る。実施形態では、ビリオンにおけるコンストラクトのパッケージングは、コンストラクトの質に影響を与えないか、または影響しても最小限である。

実施形態において、コンストラクトは、特定の遺伝的状態または発達障害によって引き起こされる臨床症状の重症度を低減するために使用することができる。実施形態において、コンストラクトは、特定の遺伝的状態または発達障害によって引き起こされる臨床症状を完全に逆転させるために使用することができる。実施形態において、コンストラクトは、特定の遺伝的状態または発達障害を治療するために使用することができる。実施形態において、コンストラクトは、レット症候群を治療するために使用することができる。実施形態において、コンストラクトは、レット症候群の臨床症状を軽減するためにｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。

実施形態において、コンストラクトは、遺伝子治療の毒性を低減するために使用することができる。実施形態において、フィードフォワード機構は、導入遺伝子発現を調節し、細胞に対する毒性を低減する。実施形態において、コンストラクトは、健康への悪影響を及ぼすことなく、ｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。

以下、本発明の実施形態について、添付の図を参照しながら例示的にのみ説明する。

遺伝子治療における投与量感受性の課題を示す図である。 図２Ａは、遺伝子治療において遺伝子用量が課題となり、安全域が非常に狭くなることを示す図である。遺伝子の投与量は遺伝子治療における課題であり、安全域が非常に狭くなる可能性がある。例として、レット症候群のモデルマウスの生存期間中央値は～１１週間である。治療用遺伝子治療ベクターを用いた治療により、体重が正常化し、４０週生存率が１００％に高めることが可能である（左のボックス）。しかし、この治療用量を２倍にすると致死となり（右）、用量感受性と安全域の狭さが浮き彫りになっている。図２Ｂは、遺伝子治療において遺伝子用量が課題となり、安全域が非常に狭くなることを示す図である。 フローサイトメトリーを用いた導入遺伝子レベルの定量評価によって示されるように、単一遺伝子のフィードフォワード遺伝子治療回路が、投与量感受性を低減することができることを示す図である。 例えば、細胞が異なって感染する場合、そうでなければ非常に異なるレベルの導入遺伝子を発現するような場合に任意の所与の細胞に送達された導入遺伝子のウイルスレベルによってもたらされる、導入遺伝子発現に関連するフィードバックを示す図である。任意の所与の細胞に導入された導入遺伝子のウイルスレベルによってもたらされる、導入遺伝子の発現に関するフィードバック。ＭＥＣＰ２は、少なすぎても多すぎても疾患を引き起こす、投与量感受性を有する遺伝子の一例である。遺伝子治療では、異なるレベルの形質導入を受け取った細胞は、フィードフォワードのコントロールレベルが異なる（線の太さで示す）。単一遺伝子回路では、治療用導入遺伝子とその負の制御因子（合成ｍｉＲＮＡ）の発現は、同じ入力（細胞に入る治療用ベクターのレベル）により駆動される。入力レベル（ベクターレベル）が上がるにつれて、回路はｍｉＲＮＡを介した下方制御をより高いレベルで達成する。その結果、この回路は、細胞集団全体にわたって、より固定されたレベルの導入遺伝子発現を維持することができる。このような制御がない場合（非制御型遺伝子治療カセット）、細胞は網掛けで示すように、ベクター由来のタンパク質をより多様なレベルで発現する。 図５Ａは、コンストラクト（カセット）を最適化して、異なる導入遺伝子を利用した異なる状態の治療、または、導入遺伝子の異なる治療レベルの発現を可能にする方法を示す図である。フィードフォワードコンストラクトの重要なコンポーネントを示している。図５Ｂは、コンストラクト（カセット）を最適化して、異なる導入遺伝子を利用した異なる状態の治療、または、導入遺伝子の異なる治療レベルの発現を可能にする方法を示す図である。導入遺伝子コンポーネントは置換されているが、カセットの残りのコンポーネントは維持されている。図５Ｃは、コンストラクト（カセット）を最適化して、異なる導入遺伝子を利用した異なる状態の治療、または、導入遺伝子の異なる治療レベルの発現を可能にする方法を示す図である。新しいイントロン／ｍｉＲＮＡと３’ＵＴＲ／ｍｉＲＮＡの結合部位（破線）が導入されているが、カセットの残りのコンポーネントは維持されている。図５Ｄは、コンストラクト（カセット）を最適化して、異なる導入遺伝子を利用した異なる状態の治療、または、導入遺伝子の異なる治療レベルの発現を可能にする方法を示す図である。非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡのコピー２つが、同じイントロン内から、または２つの異なるイントロンから発現することができる。イントロンは、導入遺伝子の５’ＵＴＲ内および／またはオープンリーディングフレーム内に配置されてもよい。図５Ｅは、コンストラクト（カセット）を最適化して、異なる導入遺伝子を利用した異なる状態の治療、または、導入遺伝子の異なる治療レベルの発現を可能にする方法を示す図である。３’ＵＴＲは、非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡの結合部位のコピーを１つ、３つもしくは６つ、またはその間の任意の数を含むことができる。 合成ｍｉＲＮＡがＵＴＲではなく、コドン最適化された導入遺伝子の配列を標的とするコンストラクトを示す図である。 図７Ａは、ＦＡＣＳによって評価されるＭｅＣＰ２－ＮｅｏｎＧｒｅｅｎタンパク質レベルに対する非哺乳類ｍｉＲＮＡの発現の効果を示す図である。哺乳類ゲノム内で予測される結合部位を欠く天然のｍｉＲＮＡを用いたフィードフォワードの実証。フィードフォワードコンストラクト（下の線）を、スクランブルされたｍｉＲＮＡの結合部位を含むためにｍｉＲＮＡの制御がない対照コンストラクト（上の線）と比較した（以下の実験はすべてこの同じ構造に従っている）。フィードフォワードコンストラクトには、３’ＵＴＲに３つの非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位を含ませた。グラフは、ｍＲｕｂｙ（ｘ軸－細胞に対するプラスミドの量の尺度であり、ｍｉＲＮＡ制御の影響を受けない）対ＭｅＣＰ２－ＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（ｙ軸－ｍｉＲＮＡによって制御されるタンパク質）のレベルを示す。上のグラフは、当技術分野のＳｔｒｏｖａｓ出版物に記載されたフィードフォワード回路で使用される内在性哺乳類ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ１２４－３についての結果を示す。結果は、線形回帰線の傾きの違いによって示されるように、ｍｉＲＮＡが、対照と比較してフィードフォワードサンプルにおけるＭｅＣＰ２発現を制御するのに有効であることを示す。図７Ｂは、ＦＡＣＳによって評価されるＭｅＣＰ２－ＮｅｏｎＧｒｅｅｎタンパク質レベルに対する非哺乳類ｍｉＲＮＡの発現の効果を示す図である。哺乳類ゲノム内で予測される結合部位を欠く天然のｍｉＲＮＡを用いたフィードフォワードの実証。フィードフォワードコンストラクト（下の線）を、スクランブルされたｍｉＲＮＡの結合部位を含むためｍｉＲＮＡの制御がない対照コンストラクト（上の線）と比較した（以下の実験はすべてこの同じ構造に従っている）。フィードフォワードコンストラクトには、３’ＵＴＲに３つの非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位を含ませた。グラフは、ｍＲｕｂｙ（ｘ軸－細胞に対するプラスミドの量の尺度であり、ｍｉＲＮＡ制御の影響を受けない）対ＭｅＣＰ２－ＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（ｙ軸－ｍｉＲＮＡによって制御されるタンパク質）のレベルを示す。下のグラフは、ホタルルルシフェラーゼ蛍光タンパク質をノックダウンするために元々設計された非哺乳類ｍｉＲＮＡであるｆｆｌｕｃ１についての結果である。結果は、線形回帰線の傾きの違いによって示されるように、ｍｉＲＮＡが、対照と比較してフィードフォワードサンプルにおけるＭｅＣＰ２発現を制御するのに有効であることを示す。 図８Ａは、非哺乳類ｍｉＲＮＡを示す図である。遺伝子治療カセットに組み込むことができ、フィードフォワードコントロールを実現するために非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡ（この実験では、ｍｉＲＮＡは前の図に記載した合成ホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ１）である）を保持するために使用されるコンパクトイントロンの例を、プロモータとＭＥＣＰ２コード配列の間に位置するイントロンから発現させる。非哺乳類ｍｉＲＮＡの頑健な発現は、このイントロンの効率的なスプライシングに依存しており、異なるイントロンを用いれば、異なるレベルのタンパク質制御を可能にすることができよう。ヒトＥＦ１ａ遺伝子のイントロン１から非哺乳類ｍｉＲＮＡを発現させる、フィードフォワード分子を作製した。コンストラクトには、３’ＵＴＲに３つの非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位を含ませた。このイントロンはＭｅＣＰ２レベルの強固な制御を示している。図８Ｂは、非哺乳類ｍｉＲＮＡを示す図である。遺伝子治療カセットに組み込むことができ、フィードフォワードコントロールを実現するために非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡ（この実験では、ｍｉＲＮＡは前の図に記載した合成ホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ１）である）を保持するために使用されるコンパクトイントロンの例を、プロモータとＭＥＣＰ２コード配列の間に位置するイントロンから発現させる。非哺乳類ｍｉＲＮＡの頑健な発現は、このイントロンの効率的なスプライシングに依存しており、異なるイントロンを用いることで、異なるレベルのタンパク質制御を可能にすることができる。小さな合成イントロン（ＭＩＮＩＸ）から非哺乳類ｍｉＲＮＡを発現させたフィードフォワード分子を作製した。コンストラクトには、３’ＵＴＲに３つの非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位を含ませた。このイントロンはＭｅＣＰ２レベルの強固な制御を示しているが、線形回帰線の傾きが減少していることからわかるように、ＭＩＮＩＸイントロンはプラスミド発現レベルが低くても対照と同レベルのＭｅＣＰ２発現を示す。このことは、低いプラスミドレベルでは治療レベルのタンパク質を送達し、高いプラスミド送達レベルではタンパク質の毒性を防ぐことができるため、治療上有益であると考えられる。 図９Ａは、３’ＵＴＲの非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位の数の変更を示す図である。３’ＵＴＲに非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位を１つ有するコンストラクトを作製し、ＦＡＣＳによって評価した。図９Ｂは、３’ＵＴＲの非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位の数の変更を示す図である。３’ＵＴＲに非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位を３つ有するコンストラクトを作製し、ＦＡＣＳによって評価した。３つの結合部位を持つコンストラクトは、線形回帰線の勾配の減少によって示されるように、ＭｅＣＰ２レベルのより顕著な抑制を示した。フィードフォワード制御の強さ、つまり投与量感受性は、非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡの結合部位の数を変えることで微調整できる。図９Ｃは、３’ＵＴＲの非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位の数の変更を示す図である。３’ＵＴＲに非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位を６つ有するコンストラクトを作製し、ＦＡＣＳによって評価した。６つの結合部位を持つコンストラクトは、線形回帰線の勾配の減少によって示されるように、ＭｅＣＰ２レベルのより顕著な抑制を示した。フィードフォワードコントロールの強さ、つまり投与量感受性は、非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡの結合部位の数を変えることで微調整できる。 図１０Ａは、結合部位が変更されていないコンストラクトを示す図である。図１０Ｂは、１ｂｐの中央バルジ、３ｂｐの中央バルジ、またはｍｉＲＮＡシード配列のみが結合部位に存在する３’ミスマッチのいずれかを有する３つの異なるコンストラクトのうち、１ｂｐの中央バルジを有するコンストラクトの非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位のミスマッチの影響を示している。結合部位が変更されていないコンストラクトと比較して、このコンストラクトはタンパク質レベルの抑制が著しく少なく、３つとも同レベルの抑制を示した。フィードフォワードコントロールの強さ、つまり投与量感受性は、非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡの結合部位にミスマッチを組み込むことで微調整が可能であることが示された。図１０Ｃは、１ｂｐの中央バルジ、３ｂｐの中央バルジ、またはｍｉＲＮＡシード配列のみが結合部位に存在する３’ミスマッチのいずれかを有する３つの異なるコンストラクトのうち、３ｂｐの中央バルジを有する非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位のミスマッチの影響を示している。結合部位が変更されていないコンストラクトと比較して、このコンストラクトはタンパク質レベルの抑制が著しく少なく、３つとも同レベルの抑制を示した。フィードフォワードコントロールの強さ、つまり投与量感受性は、非哺乳類あるいは合成ｍｉＲＮＡの結合部位にミスマッチを組み込むことで微調整が可能であることが示された。図１０Ｄは、１ｂｐの中央バルジ、３ｂｐの中央バルジ、またはｍｉＲＮＡシード配列のみが結合部位に存在する３’ミスマッチのいずれかを有する３つの異なるコンストラクトのうち、ｍｉＲＮＡシード配列のみが結合部位に存在する３’ミスマッチを有するコンストラクトの非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位のミスマッチの影響を示している。結合部位が変更されていないコンストラクトと比較して、このコンストラクトはタンパク質レベルの抑制が著しく少なく、３つとも同レベルの抑制を示した。フィードフォワードコントロールの強さ、つまり投与量感受性は、非哺乳類あるいは合成ｍｉＲＮＡの結合部位にミスマッチを組み込むことで微調整が可能であることが示された。 非哺乳類ｍｉＲＮＡフィードフォワード機構が他の関連する脳疾患にも有効か否かを示す図であり、ここでは、ＭＥＣＰ２をＵＢＥ３Ａタンパク質（この遺伝子の変異はアンジェルマン症候群を引き起こす）のコード配列に置換したコンストラクトを作製した。３’ＵＴＲには、以前の実験で使用したのと同じｆｆｌｕｃ１ ｍｉＲＮＡのための３つの非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位を含ませた。今回も、非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位を持つプラスミドは、スクランブルされたｍｉＲＮＡの結合部位配列を持つプラスミドと比較して、タンパク質の発現が減少していることが示された。ＵＢＥ３Ａタンパク質レベルは、我々のフィードフォワード非哺乳類ｍｉＲＮＡ機構とは別に、内在性の細胞内機構によって部分的に制御されている可能性が推測された。投与量感受性のフィードフォワードコントロールは、他の投与量感受性遺伝子、この場合はアンジェルマン症候群やプラダーウィリー症候群で破壊されるＵＢＥ３Ａ遺伝子でも達成可能である。 フィードフォワード遺伝子治療技術を組み込む際のワークフローを示す図であり、ここにおいて、フィードフォワードコンストラクトは、機能エレメントの適切な組合せ（例えば本明細書の表１を参照）を組み込んで設計され、ＤＮＡ合成によって作製され、次にＡＡＶパッケージングプラスミドにクローン化される。フィードフォワードカセットを持つプラスミドは、その後、Ｒｅｐ／ｃａｐおよびヘルパープラスミドと一緒に遺伝子導入され、遺伝子導入治療用のＡＡＶ粒子が生成される。 １３Ａは、無傷の神経系内での、制御カセット投与後のＭｅＣＰ２の発現を示す図である。ＡＡＶベクター送達タンパク質発現の予測される分布を示す。野生型の分布は、緊密に制御された天然ＭｅＣＰ２タンパク質の発現として表される。ベクター由来（非制御）の分布は、ハッチング領域で、非制御カセットによってもたらされる広い発現分布を示し、これには生理学的レベルを超えるタンパク質を発現する細胞がかなりの割合で含まれた。ベクター由来の（フィードフォワード）コンストラクトは、制御カセットにおける制限された発現に対応して、天然の分布に大きく重なるハッチング領域を示している。図１３Ｂ（観察結果）は、脳への直接注射による対照またはフィードフォワード制御ベクターのＡＡＶ投与後１２日目のマウス脳体性感覚野からの蛍光強度イメージングデータ（細胞タンパク質レベルの代替物）を示す図である。各治療群３匹のマウスの平均データを左側に、個々の動物のデータを右端のプロットに示す。図１３Ｃは、実験に使用された制御および非制御フィードフォワードＡＡＶカセットの模式図である。 図１４Ａは、脳における制御ＡＡＶカセットからのベクター由来タンパク質の発現を示す図である。ＡＡＶ注射後５週目での、傍矢状のマウス脳切片の抗ｆｌａｇ ｔａｇ免疫標識（ベクター由来タンパク質を検出するため）を示す傾斜共焦点画像である。図１４Ｂは、脳における、非制御ＡＡＶカセットからのベクター由来タンパク質の発現を示す図である。ＡＡＶ注射後５週目での、傍矢状のマウス脳切片の抗ｆｌａｇ ｔａｇ免疫標識（ベクター由来タンパク質を検出するため）を示す傾斜共焦点画像である。 図１５Ａは、フィードフォワード回路の結果としての、制限された導入遺伝子の発現を示す蛍光画像である。画像は、ＡＡＶ注射後５週目におけるマウス体性感覚皮質の抗ＭｅＣＰ２導入遺伝子免疫標識（ベクター由来の導入遺伝子産物を検出するため）を示す代表的な共焦点画像である。ＭｅＣＰ２発現の天然レベルを示す。１５Ｂは、フィードフォワード回路の結果としての、制限された導入遺伝子の発現を示す蛍光画像である。画像は、ＡＡＶ注射後５週目におけるマウス体性感覚皮質の抗ＭｅＣＰ２導入遺伝子免疫標識（ベクター由来の導入遺伝子産物を検出するため）を示す代表的な共焦点画像である。同図は、制御コンストラクトで治療した野生型（ＷＴ）マウスにおけるＭｅＣＰ２免疫反応性を示す。図１５Ｃは、フィードフォワード回路の結果としての、制限された導入遺伝子の発現を示す蛍光画像である。画像は、ＡＡＶ注射後５週目におけるマウス体性感覚皮質の抗ＭｅＣＰ２導入遺伝子免疫標識（ベクター由来の導入遺伝子産物を検出するため）を示す代表的な共焦点画像である。非制御コンストラクトで治療したＷＴマウスにおけるＭＥＣＰ２免疫反応性を示す。下部の模式図は、フィードフォワード制御されたコンストラクトおよび非制御コンストラクトを示す。図１５Ｄは、定量的抗Ｍｅｃｐ２免疫標識によって測定された、ベクター由来のタンパク質発現の定量化を示す図である。発現は、相対頻度分布として表示される（マウス／コホートあたり１２６５～２０８２細胞の分析）。マウスには、１ｘ１０^１１ｖｇ／マウスの用量で、Ｐ１にＡＡＶベクターを注射した。図１５Ｅは、マウスに送達した、制御フィードフォワードコンストラクトおよび非制御フィードフォワードコンストラクトの模式図である。 図１６Ａは、ＷＴマウスに４Ｅ×１０^１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ９用量を与えた毒性試験を示す図である。試験した制御コンストラクトおよび非制御コンストラクトが、図１６Ａに描かれている。図１６Ｂは、ＷＴマウスに４Ｅ×１０^１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ９用量を与えた毒性試験を示す図である。生存率および表現型を、１５週間の期間にわたって追跡した。制御コンストラクトは、非制御カセットよりも安全性の利点を与える。同図は、野生型マウスに高用量ベクター（４×１０^１１ｖｇ／マウス；Ｐ１で直接脳注射）を投与したｉｎ ｖｉｖｏ実験を示す。非制御ＭＥＣＰ２カセットを用いた投与では、毒性スコアが発生し、致死となった。対照的に、制御カセットは、検出可能で明白な、有害な表現型がなく、完全に耐性があった。 図１７Ａは、レット症候群モデルマウスにおいて、制御フィードフォワードカセットの投与が許容され、治療効果があったことを示す研究の図である。図１７Ｂは、レット症候群モデルマウスにおいて、制御フィードフォワードカセットの投与が許容され、治療効果があったことを示す研究の図である。Ｍｅｐｃ２^－／ｙマウスに高投与量のＡＡＶ９ベクターを投与したｉｎ ｖｉｖｏ実験（３×１０^１１ｖｇ／マウス；Ｐ１での直接脳注射）。生存率と表現型（ＲＴＴスコア）を、１５週間にわたって追跡した。 図１８Ａは、制御フィードフォワードカセットが、レット症候群モデルマウスにおいて特定の臨床的特徴を正常化することを示す図である。同図は、Ｍｅｐｃ２^－／ｙマウスに高用量のフィードフォワードカセット（３×１０^１１ｖｇ／マウス；Ｐ１で脳に直接注射）を投与したｉｎ ｖｉｖｏ実験を示している。比較のため、ビヒクル処置したＭｅｃｐ２^－／ｙマウスとビヒクル処置した野生型のスコアリングを示す。同じ要領の非制御カセットで治療したマウスは、モニタリング期間を生き残れなかったため、示していない。図１８Ｂは、制御フィードフォワードカセットが、レット症候群モデルマウスにおいて特定の臨床的特徴を正常化することを示す図である。同図は、Ｍｅｐｃ２^－／ｙマウスに高用量のフィードフォワードカセット（３×１０^１１ｖｇ／マウス；Ｐ１で脳に直接注射）を投与したｉｎ ｖｉｖｏ実験を示している。比較のため、ビヒクル処置したＭｅｃｐ２^－／ｙマウスとビヒクル処置した野生型のスコアリングを示す。同じ要領の非制御カセットで治療したマウスは、モニタリング期間を生き残れなかったため、示していない。図１８Ｃは、制御フィードフォワードカセットが、レット症候群モデルマウスにおいて特定の臨床的特徴を正常化することを示す図である。同図は、Ｍｅｐｃ２^－／ｙマウスに高用量のフィードフォワードカセット（３×１０^１１ｖｇ／マウス；Ｐ１で脳に直接注射）を投与したｉｎ ｖｉｖｏ実験を示している。比較のため、ビヒクル処置したＭｅｃｐ２^－／ｙマウスとビヒクル処置した野生型のスコアリングを示す。同じ要領の非制御カセットで治療したマウスは、モニタリング期間を生き残れなかったため、示していない。図１８Ｄは、制御フィードフォワードカセットが、レット症候群モデルマウスにおいて特定の臨床的特徴を正常化することを示す図である。同図は、Ｍｅｐｃ２^－／ｙマウスに高用量のフィードフォワードカセット（３×１０^１１ｖｇ／マウス；Ｐ１で脳に直接注射）を投与したｉｎ ｖｉｖｏ実験を示している。比較のため、ビヒクル処置したＭｅｃｐ２^－／ｙマウスとビヒクル処置した野生型のスコアリングを示す。同じ要領の非制御カセットで治療したマウスは、モニタリング期間を生き残れなかったため、示していない。図１８Ｅは、制御フィードフォワードカセットが、レット症候群モデルマウスにおいて特定の臨床的特徴を正常化することを示す図である。同図は、Ｍｅｐｃ２^－／ｙマウスに高用量のフィードフォワードカセット（３×１０^１１ｖｇ／マウス；Ｐ１で脳に直接注射）を投与したｉｎ ｖｉｖｏ実験を示している。比較のため、ビヒクル処置したＭｅｃｐ２^－／ｙマウスとビヒクル処置した野生型のスコアリングを示す。同じ要領の非制御カセットで治療したマウスは、モニタリング期間を生き残れなかったため、示していない。図１８Ｆは、制御フィードフォワードカセットが、レット症候群モデルマウスにおいて特定の臨床的特徴を正常化することを示す図である。同図は、Ｍｅｐｃ２^－／ｙマウスに高用量のフィードフォワードカセット（３×１０^１１ｖｇ／マウス；Ｐ１で脳に直接注射）を投与したｉｎ ｖｉｖｏ実験を示している。比較のため、ビヒクル処置したＭｅｃｐ２^－／ｙマウスとビヒクル処置した野生型のスコアリングを示す。同じ要領の非制御カセットで治療したマウスは、モニタリング期間を生き残れなかったため、示していない。図１８Ｇは、制御フィードフォワードカセットが、レット症候群モデルマウスにおいて特定の臨床的特徴を正常化することを示す図である。同図は、Ｍｅｐｃ２^－／ｙマウスに高用量のフィードフォワードカセット（３×１０^１１ｖｇ／マウス；Ｐ１で脳に直接注射）を投与したｉｎ ｖｉｖｏ実験を示している。比較のため、ビヒクル処置したＭｅｃｐ２^－／ｙマウスとビヒクル処置した野生型のスコアリングを示す。同じ要領の非制御カセットで治療したマウスは、モニタリング期間を生き残れなかったため、示していない。図１８Ｈは、制御フィードフォワードカセットが、レット症候群モデルマウスにおいて特定の臨床的特徴を正常化することを示す図である。同図は、Ｍｅｐｃ２^－／ｙマウスに高用量のフィードフォワードカセット（３×１０^１１ｖｇ／マウス；Ｐ１で脳に直接注射）を投与したｉｎ ｖｉｖｏ実験を示している。比較のため、ビヒクル処置したＭｅｃｐ２^－／ｙマウスとビヒクル処置した野生型のスコアリングを示す。同じ要領の非制御カセットで治療したマウスは、モニタリング期間を生き残れなかったため、示していない。 図１９Ａは、ｆｆｌｕｃ１ ｍｉＲＮＡとｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎレポーター導入遺伝子を発現するプラスミド、またはｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎレポーターのみを発現するプラスミドを示す図である。図１９Ｂは、フィードフォワードコンストラクトで使用したｍｉＲＮＡ ｆｆｌｕｃ１の最も可能性の高いオフターゲット相互作用配列を含むと考えられる２０遺伝子のＲＮＡｓｅｑ発現を示す図である。ｍＲＮＡｓｅｑを用いて、上位２０個と予測されるヒト標的ｍＲＮＡ転写物の発現レベルを測定した。ＦＰＫＭは、百万リードあたりの転写産物キロベースあたりの断片数を意味する。ＦＰＫＭ値が低い場合、ヒトＨＥＫ２９３細胞における転写物の存在量が低いことを示す。 図２０は、フィードフォワードカセットに追加エレメント（実施例８で詳述）を加えた場合の導入遺伝子発現の効果を示す図である。 図２１Ａは、染色した腰部後根神経節（ＤＲＧ）切片から撮影した代表的な平坦化共焦点画像の詳細を示す図である。切片を１０μｍ厚に切断し、抗ＭｅＣＰ２抗体およびＤＡＰＩで染色し、同一の共焦点設定を用いて画像化した。同図は、マウスに投与したカセットを示す。図２１Ｂは、染色した腰部後根神経節（ＤＲＧ）切片から撮影した代表的な平坦化共焦点画像の詳細を示す図である。切片を１０μｍ厚に切断し、抗ＭｅＣＰ２抗体およびＤＡＰＩで染色し、同一の共焦点設定を用いて画像化した。同図は、制御コンストラクトおよび非制御コンストラクトで治療したＷＴマウスおよびＭｅｃｐ２ノックアウトマウスからのＤＲＧ切片の染色を実証している。図２１Ｃは、染色した腰部後根神経節（ＤＲＧ）切片から撮影した代表的な平坦化共焦点画像の詳細を示す図である。切片を１０μｍ厚に切断し、抗ＭｅＣＰ２抗体およびＤＡＰＩで染色し、同一の共焦点設定を用いて画像化した。同図は、蛍光顕微鏡で測定したＭｅＣＰ２のレベルの定量化を示す。図２１Ｄは、染色した腰部後根神経節（ＤＲＧ）切片から撮影した代表的な平坦化共焦点画像の詳細を示す図である。切片を１０μｍ厚に切断し、抗ＭｅＣＰ２抗体およびＤＡＰＩで染色し、同一の共焦点設定を用いて画像化した。同図は、各サンプルにおけるベクターのコピー数の定量化を示す。 図２２Ａは、Ｍｅｃｐ２ ＫＯマウスに１Ｅ×１０^１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ９用量を与えた有効性試験を示す図である。図２２Ｂは、生存率および表現型（ＲＴＴスコア）を、１５週間にわたって追跡した図である。図２２Ｃは、異なる脳領域のウェスタンブロット解析により、フィードフォワード回路でＭｅＣＰ２発現が制限されたことを実証する図である。 図２３Ａは、染色した肝臓切片から採取した代表的な平坦化共焦点画像の詳細を示すである。切片を１０μｍ厚に切断し、抗ＭｅＣＰ２抗体およびＤＡＰＩで染色し、同一の共焦点設定を使用して画像化した。同図は、マウスに投与したカセットを示す。図２３Ｂは、染色した肝臓切片から採取した代表的な平坦化共焦点画像の詳細を示すである。切片を１０μｍ厚に切断し、抗ＭｅＣＰ２抗体およびＤＡＰＩで染色し、同一の共焦点設定を使用して画像化した。同図は、非制御コンストラクトおよび制御コンストラクトで治療したＷＴマウスからの肝臓切片の染色を実証する図である。成業したコンストラクトは、非制御のカセットと比較して、ベクター由来の導入遺伝子の発現を制限することに留意されたい。図２３Ｃは、染色した肝臓切片から採取した代表的な平坦化共焦点画像の詳細を示すである。切片を１０μｍ厚に切断し、抗ＭｅＣＰ２抗体およびＤＡＰＩで染色し、同一の共焦点設定を使用して画像化した。同図は、蛍光シグナルの強度によって測定されるＭｅＣＰ２レベルの定量化を示す。図２３Ｄは、染色した肝臓切片から採取した代表的な平坦化共焦点画像の詳細を示すである。切片を１０μｍ厚に切断し、抗ＭｅＣＰ２抗体およびＤＡＰＩで染色し、同一の共焦点設定を使用して画像化した。同図は、各サンプル中のベクターのコピー数の定量化を示す。 図２４Ａは、フィードフォワードコンストラクトで使用したｍｉＲＮＡであるｆｆｌｕｃ１、ｒａｎ１ｇおよびｒａｎ２ｇの、オフターゲット相互作用配列の可能性が最も高いと考えられるｍＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲ発現を示す図である。同図は、ｆｆｌｕｃ１、ｒａｎ１ｇまたはｒａｎ２ｇ ｍｉＲＮＡを発現するプラスミドを示す。図２４Ｂは、フィードフォワードコンストラクトで使用したｍｉＲＮＡであるｆｆｌｕｃ１、ｒａｎ１ｇおよびｒａｎ２ｇの、オフターゲット相互作用配列の可能性が最も高いと考えられるｍＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲ発現を示す図である。同図は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、またはｈｓａ－ｍｉＲ－６４４ａ ｍｉＲＮＡを発現する対照プラスミドを示す。図２４Ｃは、フィードフォワードコンストラクトで使用したｍｉＲＮＡであるｆｆｌｕｃ１、ｒａｎ１ｇおよびｒａｎ２ｇの、オフターゲット相互作用配列の可能性が最も高いと考えられるｍＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲ発現を示す図である。同図では、上位３つと予測されるヒト標的ｍＲＮＡ転写物の発現レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて測定した。図２４Ｄは、フィードフォワードコンストラクトで使用したｍｉＲＮＡであるｆｆｌｕｃ１、ｒａｎ１ｇおよびｒａｎ２ｇの、オフターゲット相互作用配列の可能性が最も高いと考えられるｍＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲ発現を示す図である。同図は、陽性対照のヒト標的ｍＲＮＡ転写物の発現レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して測定した。 図２５Ａは、他の投与量感受性遺伝子にわたって投与量感受性のフィードフォワードコントロールが実現できることを示す図である。図２５Ｂは、他の投与量感受性遺伝子、アンジェルマン症候群およびプラダーウィリー症候群で破壊されるＵＢＥ３Ａ遺伝子にわたって投与量感受性のフィードフォワードコントロールが実現できることを示す図である。図２５Ｃは、他の投与量感受性遺伝子、ＣＤＫＬ５欠損症で破壊されるＣＤＫＬ５遺伝子にわたって投与量感受性のフィードフォワードコントロールが実現できることを示す図である。 図２６Ａは、コドン最適化された導入遺伝子の配列を標的とし、ＵＴＲにはない合成ｍｉＲＮＡによって、他の投与量感受性遺伝子、この場合はＳＹＮＧＡＰ１関連知的障害で破壊されるＳＹＮＧＡＰ１遺伝子にわたって投与量感受性のフィードフォワードコントロールが実現できることを示す図である。図２６Ｂは、コドン最適化された導入遺伝子の配列を標的とし、ＵＴＲにはない合成ｍｉＲＮＡによって、他の投与量感受性遺伝子、この場合はＳＹＮＧＡＰ１関連知的障害で破壊されるＳＹＮＧＡＰ１遺伝子にわたって投与量感受性のフィードフォワードコントロールが実現できることを示す図である。 図２７Ａは、投与量感受性のフィードフォワードコントロールが、他の投与量感受性遺伝子でも達成され得ることを示す図である。図２７Ｂは、投与量感受性のフィードフォワードコントロールが、他の投与量感受性遺伝子、この場合は脊髄性筋萎縮症で破壊されるＳＭＮ１遺伝子でも達成され得ることを示す図である。図２７Ｃは、投与量感受性のフィードフォワードコントロールが、他の投与量感受性遺伝子、この場合は１型糖尿病で破壊されるＩＮＳ遺伝子でも達成され得ることを示す図である。図２７Ｄは、投与量感受性のフィードフォワードコントロールが、他の投与量感受性遺伝子、この場合はフリードライヒ失調症で破壊されるＦＸＮ遺伝子破壊でも達成され得ることを示す図である。 図２８Ａは、投与量感受性のフィードフォワードコントロールが、ｉｎ ｖｉｖｏの他の投与量感受性遺伝子でも達成され得ることを示す図である。図２８Ｂは、投与量感受性のフィードフォワードコントロールが、ｉｎ ｖｉｖｏの他の投与量感受性遺伝子、この場合、アンジェルマン症候群で破壊されるＵＢＥ３Ａ遺伝子でも達成できることを示している。 ｓｓＡＡＶ９にパッケージングされたフィードフォワードＭＥＣＰ２コンストラクトのＣＤＭＳデータを示す図である。全長のフィードフォワード生成物は、異常なまたは部分的なパッケージングが少なく、希望通りにパッケージングされている。ヘアピンのような二次ＤＮＡ構造は、ＡＡＶ粒子における効率的なパッケージングを阻害することが知られている。しかし、分析したフィードフォワードコンストラクトでは、（ＥＦ１ａまたはＭＩＮＩＸイントロンにおける）ｍｉＲＮＡヘアピンの存在は、予想より小さい有意なパッケージング／部分的にパッケージングされた粒子の原因とならず、ＡＡＶプレップビリオン組成の質にも影響を及ぼさない。完全にパッケージングされたＭＥＣＰ２フィードフォワードカセットに対応する支配的なピークは、空の粒子および部分的にパッケージングされたゲノムの分布を表すはるかに小さなピークとは対照的である。

ＲＴＴ２５３のコンストラクト：
ＣＭＶ／ＣＢＡプロモート（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）
ヒトＥＦ１ａイントロンＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
ｆｆｌｕｃ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
コザック（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）
ヒトＭＥＣＰ２＿ｅ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ｆｆｌｕｃ１ ｘ３結合部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）
ＷＰＲＥ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）
ＳＶ４０ｐＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０）

本発明の導入遺伝子標的化コンストラクトにおける概念実証は、神経疾患であるレット症候群に関連して生成した。レット症候群は、Ｘ連鎖遺伝子ＭＥＣＰ２における機能喪失型突然変異によって引き起こされる。この疾患に対する魅力的な治療アプローチは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いてＭＥＣＰ２遺伝子の機能的コピーを神経系に送達することであるが、このアプローチの大きな障害は、細胞がウイルスベクターの複数のコピーに感染し、ＭＥＣＰ２遺伝子の過剰発現をもたらす可能性があることである。本発明者らは、ＭＥＣＰ２遺伝子の過剰発現が重篤な毒性を引き起こす可能性があることを以前に明らかにしている。臨床的には、ヒトにおけるＭＥＣＰ２遺伝子の重複は、ＭＥＣＰ２過剰発現症候群という明確かつ重篤な神経障害を引き起こすことが知られている。

本発明によって記載されるコンストラクトを使用すると、細胞がウイルスベクターの複数のコピーに感染した場合でさえ、細胞内で発現されるＭＥＣＰ２のレベルを制限することができる。これにより、ＭＥＣＰ２遺伝子治療介入の安全ウィンドウが大幅に拡大し、より多くのウイルス用量を投与することが可能となり、より多くの細胞を感染させ、より強固な疾患回復を達成することができる。

この例では、導入遺伝子は、神経疾患であるレット症候群で変異した遺伝子であるＭＥＣＰ２遺伝子のタンパク質コード配列のＷＴコピーまたはコドン最適化コピーである。コンストラクトには、導入遺伝子のレベルをコントロールするための２つのエレメントが含まれている。第１のエレメントは、プロモータと導入遺伝子の間に位置するイントロン内に含まれる非哺乳類または合成のマイクロＲＮＡ配列である。この非哺乳類または合成のマイクロＲＮＡを含むイントロンは、プレｍＲＮＡの処理中にスプライシングされる。哺乳類または合成ｍｉＲＮＡは、その後処理されて、その標的転写物を分解することができる成熟ｍｉＲＮＡを生成する。ｍｉＲＮＡは合成されたものであるか、または非哺乳類、昆虫源に由来するため、哺乳類ゲノム内で既知のオフターゲット効果はない。コンストラクトの第２のエレメントは、コンストラクトの３’ＵＴＲにある、イントロンから産生される非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡに一致する、いくつかの非哺乳類またはｍｉＲＮＡの結合部位である。これらの結合部位の存在により、導入遺伝子が送達されたマイクロＲＮＡの標的となる。これは導入遺伝子のレベルを下げ、過剰発現を防ぐことにつながる。

フィードフォワード原理の代替実施形態では、非哺乳類または合成マイクロＲＮＡは、遺伝子治療合成カセットイントロン内に送達することができる。３’ＵＴＲ内のマイクロＲＮＡ結合を標的とする代わりに、非哺乳類または合成のマイクロＲＮＡは、導入遺伝子のコドン最適化タンパク質コード配列内に作られ、哺乳類ゲノム内に対応する結合部位がないユニークな（哺乳類ゲノム内の）マイクロＲＮＡ結合領域に結合する；すなわち、ｍｉＲＮＡ結合領域はユニークな合成結合領域となる）。このバージョンのフィードフォワード系は、よりコンパクトにすることができる。これは、ウイルスベクターのパッケージング容量に近い大きな遺伝子に特に有利である。

単一遺伝子ループは一定レベルの発現を可能にし、それによって回路は幅広い遺伝子投与量にわたって比較的一定の発現レベルを維持することができる（すなわち、望ましい投与量非感受性を示す）。この実験系は、遺伝子投与量の変化による遺伝子発現の相対的な変化をより小さくするレジメンを作り出す。このことは、遺伝子治療において、導入された細胞集団全体に広く均等に発現させることを目指す場合に重要な特徴であり、不随する過剰発現の影響を伴わずに高い形質導入率を達成するために用量を増やすことが可能になる。

実施例１
哺乳類ゲノムに結合できない合成非哺乳類ｍｉＲＮＡ（ｆｆｌｕｃ１）または合成ｍｉＲＮＡと組み合わせた非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位または合成ｍｉＲＮＡの結合部位を利用して、導入遺伝子発現のコントロールを可能にしながらも、オフターゲット効果を確実に欠如させることができる。好適には、表１によって記載されるようなコンストラクトが提供され得る。

表１．主要適応症のための遺伝子治療コンストラクトの概要と、実証試験と設計上の制限に基づくフィードフォワードコンポーネントの選択。

これらの実施形態は、主要な投与量感受性遺伝子に関するものであるが、当業者には理解されるように、同じフィードフォワード設計を、既知の、または特定の条件に関連して決定されるであろう他の投与量感受性遺伝子にも適用することが可能である。

本明細書で議論するように、フィードフォワード系は、ＣＡＧ、ＵＢＣ、ＳＶ４０、ＰＧＫ、シナプシン１、ニューロン特異的エノラーゼ、Ｕ６、ＧＦＡＰ、ＭＡＧ、ＭＰＺなどの代替となる遍在性の細胞型特異的プロモータを用いて構築することができる。イントロンは、非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡ配列を宿すことができる任意の合成または内在性イントロンを含んでもよく、タンパク質コード配列の上流またはタンパク質コード配列内のイントロンであってもよく、または単一の導入遺伝子カセットから単一より多くの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡが生成される組み合わせでもよい。非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡは、翻訳および非翻訳領域を含む導入遺伝子カセット内の認識部位を標的する任意の非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡであってもよい。遺伝子は、遺伝子投与量が遺伝子導入の有効性に交絡する、任意の投与量感受性遺伝子であってもよい。結合部位の数は、所望の投与量不感受性のレベルに合わせて微調整することができ、１、２、３、４、５、６または導入遺伝子カセットの容量内の任意の数の範囲であってよい。ポリＡシグナルは、好適には、例えば、ＳＶ４０、ＢＧＨ、または一般に使用される天然または合成のポリＡシグナルであってもよい。

Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞に、フィードフォワード機構を組み込んだ、あるいは組み込んでいない様々なコンストラクトを遺伝子導入し、ＭＥＣＰ２導入遺伝子の発現レベルをフローサイトメトリーで評価した。各細胞に送達されたコンストラクトのレベルをモニターするために、コンストラクト上の別の蛍光マーカーを使用した（用量の代用）。フィードフォワードコントロールエレメントを含むコンストラクトは、該エレメントを含まないコンストラクトに比べてＭＥＣＰ２導入遺伝子発現の範囲が非常に狭かった。有望なことに、送達されるコンストラクトの量が増えるにつれてこれらのエレメントの減衰効果が増し、これは、コントロールエレメントが治療レベルの遺伝子発現を妨げることなく毒性を緩和することができることを示唆する。したがって、投与量感受性のレベルの微調整を提供することができる。

実施例２
フィードフォワードカセットをマウスに投与して、細胞内で導入遺伝子の発現を制限することができる。野生型マウスに導入遺伝子フラグタグ付きＭｅｃｐ２を投与し、体性感覚野のニューロンにおける導入遺伝子の発現をモニターした。導入遺伝子は、フィードフォワード制御系を含むまたは含まないＡＡＶベクターで投与した。フィードフォワード制御系は、ｍｉＲＮＡ ｆｆｌｕｃ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）とＥＦ１ａプロモータを利用した。３つのｆｆｌｕｃ１結合部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）を、Ｍｅｃｐ２配列の後に提供した。図１３Ｃは、マウスに投与したウイルスベクターの模式図を示す。制御（フィードフォワード）カセットおよび非制御（フィードフォワード機構なし）カセットで治療したマウスにおけるＭｅＣＰ２の観察された発現。制御カセットは一貫して発現量（タンパク質レベル）の制限をもたらし、ベクター由来のタンパク質を非常に高いレベルで発現する細胞の尾を防いでいる。挿入図は、発現が制御されないマウス脳（明るいがばらつきがある）と発現が制御されるマウス脳（細胞間でより均一な発現）からの代表的な顕微鏡写真である。好適には、このフィードフォワード機構は、ウイルスベクターを用いて投与された導入遺伝子のタンパク質発現を確実に制限するために利用することができる。

実施例３
フィードフォワード制御機構を使用して、組織全体における導入遺伝子の発現の適切な分布を確保できる。図１４は、制御されたサンプルでのより一貫したＭｅＣＰ２－ＦＬＡＧ発現レベルを実証するものである。ベクター由来のタンパク質の分布は両方のサンプルで広いが、制御カセットは、非制御バージョンと比較して、発現のホットスポットおよび勾配がほとんどないことを示している。したがって、好適には、フィードフォワード機構は、細胞の集合体、組織または器官にわたって適切な濃度で導入遺伝子のタンパク質発現をコントロールするために使用することができる。

実施例４
フィードフォワード制御機構は、大脳新皮質全体で導入遺伝子の発現の制限を確実にするために使用することができる。図１５は、ＡＡＶカセットでマウスに投与した外因性ＭｅＣＰ２と比較した、フィードフォワード制御機構を用いた場合と用いなかった場合の天然ＭｅＣＰ２の発現を示している。

一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）粒子は、ＡＡＶ９カプシドにパッケージングされたＡＡＶ２ ＩＴＲで挟まれたコンストラクトを含み、ＵＰＶウイルスベクター生成ユニット（Universitat Autonoma de Barcelona）で、ＨＥＫ２９３細胞の遺伝子導入により生産した。

利用したｍｉＲＮＡはｆｆｌｕｃ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）であり、３ｘ ｆｆｌｕｃ１結合部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）をＭｅｃｐ２遺伝子配列の後に提供した。発現は、制御された画像（１５Ｂ）において細胞間で均一であり（ただし、天然＋ベクター由来のシグナルを組み合わせたため若干高い）、発現の制限を実証している。対照的に、非制御カセットサンプル（１５Ｃ）は、非常に高レベルのＭｅＣＰ２を発現する細胞集団を含む、細胞集団全体にわたる可変レベルの免疫反応性を示す。これらのサンプルの定量（１５Ｄ）は、フィードフォワードカセットによる狭い範囲での発現の制限を示す。

実施例５
好適には、フィードフォワード制御カセットは、健康に悪影響を及ぼすことなく生体内に投与され得る。フィードフォワード制御カセットを投与した野生型マウスで表現型評価を行った。ｆｆｌｕｃ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）ｍｉＲＮＡおよびコドン最適化されたヒトＭＥＣＰ２導入遺伝子を発現する、制御コンストラクトを投与した。非制御コンストラクトは、コドン最適化されたヒトＭＥＣＰ２導入遺伝子のみを発現するものであった。ＭｅＰ４２６非制御コンストラクトは、Gadalla KKE, Vudhironarit T, Hector RD, Sinnett S, Bahey NG, Bailey MES, Gray SJ, Cobb SR. Development of a Novel AAV Gene Therapy Cassette with Improved Safety Features and Efficacy in a Mouse Model of Ｒｅｔｔ Syndrome. Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Jun 16;5:180-190によって以前に記載された内在性マウスＭｅｃｐ２プロモータのコントロール下で野生型ヒトＭＥＣＰ２を発現させた。

図１６は、高投与量試験を描いており、フィードフォワード回路を用いて導入遺伝子の発現が制限されることを示している。この導入遺伝子の発現の制限は、非制御カセットよりも安全性の点で有利である。この図は、野生型マウスに高用量ベクター（４ｘ１０^１１ｖｇ／マウス；Ｐ１での脳への直接注射）を投与したｉｎ ｖｉｖｏ実験を示している。非制御のＭＥＣＰ２カセットを用いた投与（１６Ａ）では、毒性スコアが発現し、致死となった（１６Ｂ）。対照的に、制御カセットは、検出可能で明白な、有害な表現型がなく、完全に許容された。

実施例６
好適には、フィードフォワード機構は、哺乳類ゲノムの他の配列と相互作用しない。

フィードフォワードコンストラクトで発現するｍｉＲＮＡは、昆虫由来のｍｉＲＮＡ配列（ｆｆｌｕｃ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）または新規合成ｍｉＲＮＡ配列（ｒａｎ１ｇ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７およびｒａｎ２ｇ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）のいずれも、哺乳類の転写産物内に予測される内在性標的が存在しない。

これを検証するために、ｍｉｒＤＢのオフターゲット予測ツールを用いて、ｍｉＲＮＡの配列ｆｆｌｕｃ１、ｒａｎ１ｇ、ｒａｎ２ｇの最も可能性の高いヒトｍＲＮＡ標的を予測した。ヒト標的遺伝子／転写産物の候補を、ｍｉＲＮＡのシード配列と一致する遺伝子／転写産物の標的部位の数に基づいてランク付けした。

ｆｆｌｕｃ１ ｍｉＲＮＡとレポーター導入遺伝子を発現するプラスミドを作製した（図１９Ａ）。プラスミドには、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎレポーター導入遺伝子の発現を駆動するｈＥＦ１ａプロモータを含ませた。ｆｆｌｕｃ１ ｍｉＲＮＡを、ｈＥＦ１ａプロモータと導入遺伝子の間に位置するＥＦ１ａイントロン内で発現させた。ＨＥＫ ２９３細胞に、リポフェクタミンを用いて各プラスミド１００μｇを遺伝子導入した。４８時間後、細胞を溶解し、ＭａｇＭＡＸ－９６全ＲＮＡ単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて全ＲＮＡを単離した。サンプルをプールし、各テストプラスミドについて３つの生物学的複製を作成した。各生物学的複製についてＲＮＡｓｅｑを行い、リードカウント（ＦＰＫＭ：百万リードあたりの転写産物キロベースあたりの断片数）を用いて、個々のヒト標的転写物の発現レベルを比較した。

図１９は、ｆｆｌｕｃ１の予測されるヒトｍＲＮＡ標的上位２０個の解析を示しており、サンプルセットと対照の間で発現量に有意な差がないことがわかる。この結果から、ｆｆｌｕｃ１の過剰発現は、予測されるヒトの標的遺伝子においてオフターゲット効果を持たないことが確認された。

したがって、好適には、本発明は、哺乳動物宿主細胞における内在性遺伝子発現に影響を与えることなく、導入遺伝子の発現を制御する方法を提供する。

実施例７
好適には、フィードフォワード機構を使用して、臨床状態の表現型を改善するための安全かつ効果的な治療を提供することができる。

フィードフォワードＭＥＣＰ２コンストラクトを発現するＡＡＶベクターを、ＣＢＡ／Ｃ５７混合バックグラウンドで維持した野生型（ＷＴ）およびＭｅｃｐ２ノックアウト（ＫＯ）マウスで試験した。制御型（ｆｆｌｕｃ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）または非制御型ＭＥＣＰ２を発現するｓｓＡＡＶを出生後（Ｐ）０／１のオスの脳に脳室内投与（ＩＣＶ）で両側から注射した。対照注射では、ベクターを含まない同じ希釈液を使用した（ビヒクル対照）。注射した仔マウスはホームケージに戻し、４週齢から毎週評価した。マウスは、１５週齢まで、またはヒトエンドポイントに達するまでモニターした。図１７Ｂは、すべての治療条件下でのＷＴおよびＫＯマウスの臨床スコアおよび生存を示す。非制御ＭＥＣＰ２カセットを用いた投与は、毒性をもたらし生存を減少させた。対照的に、制御カセットを用いた投与は完全に許容され、マウスは、非制御フィードフォワードカセットまたはビヒクルで治療したマウスと比較して、重症度の低い臨床スコア（Ｒｅｔｔ様表現型について）を呈した。したがって、制御機構は、安全な投与とＫＯマウスの表現型の臨床的重症度の矯正の両方を示している。

図１８は、このデータをさらに発展させ、レット症候群のモデルマウスに見られる特異的な臨床的特徴を測定したものである。Ｍｅｃｐ２^－／ｙマウス（ＫＯ）にｆｆｌｕｃ１制御カセットを投与すると、レット様表現型の範囲で部分的な改善が見られた。これは、非制御型コンストラクトで治療したＫＯマウスでは見られなかった。なぜなら、マウスは表現型を調べることができる段階まで生存しなかったからである。

実施例８
強化された発現、制御、および安定性を提供するように改変されたコンストラクトが提供され得る。コンストラクトは、レポーター導入遺伝子を含むように提供され得る。コンストラクトは、強力な発現を促進するコザック配列を含むことができる。コンストラクトは、３’ＵＴＲに安定性エレメントをさらに含むことができる。コンストラクトは、ｍｉＲＮＡ結合の効力を低下させる（しかし完全に軽減するわけではない）ように操作された変異を含む１つまたは複数の結合部位をさらに含むことが可能である。いくつかの例示的なコンストラクトは、表２において以下に詳述する。

表２：発現レベルの厳密な制御を維持しつつ、導入遺伝子の発現を増強するように設計した遺伝子治療用コンストラクトの概要。実証試験および設計上の制限に基づくフィードフォワード機構のエレメント。これらの実施形態は、重要な投与量感受性ＭｅＣＰ２に関するものであるが、当業者には理解されるように、同じフィードフォワード設計を、既知のまたは特定の条件に関連して決定されるであろう他の投与量感受性遺伝子に適用することが可能である。フィードフォワードコンストラクトの生成において、上記で言及した特徴の任意の組み合わせが使用され得ることが理解されるべきである。さらに、これらのコンストラクトは例示的なものであり、上記で言及した特徴のいずれかを表３および表４で言及したエレメントのいずれかと組み合わせて、フィードフォワードカセットを生成してもよいことを理解すべきである。

図２０は、上記の追加エレメントが制御カセットのＭｅＣＰ２発現に及ぼす影響を示している。盛り込まれた特徴は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に投与されたカセットの投与量に対する導入遺伝子発現レベルへの影響を示している。

構成的または条件付の任意の適切なプロモータが、導入遺伝子の発現を駆動するために使用され得る。好適には、プロモータは、Ｅｆ１ａプロモータ、ＣＡＧプロモータ、Ｊｅｔプロモータ、ＣＭＶプロモータ、ＣＢＡプロモータ、ＣＢＨプロモータ、シナプシン１プロモータ、Ｍｅｃｐ２プロモータ、Ｕ１ａプロモータ、Ｕ６プロモータ、ユビキチンＣプロモータ、ニューロン特異的エノラーゼプロモータ、オリゴデンドロサイト転写因子１またはＧＦＡＰプロモータを含み得る。表２のコンストラクトについては、任意の適切なプロモータを使用できることが理解されるべきである。

使用されるｍｉＲＮＡは、哺乳類ゲノムに結合しない、任意の適切な合成ｍｉＲＮＡであってもよい。好適には、使用されるｍｉＲＮＡは、合成配列または哺乳類ｍｉＲＮＡと相同性のない非哺乳類ゲノムに由来するものであってもよい。好適には、使用されるｍｉＲＮＡは、昆虫ゲノムに由来するものであってもよい。例示的なｍｉＲＮＡは、以下の表３に記載されている）。

表３：導入遺伝子発現を制御するフィードフォワードコンストラクトに使用され得るｍｉＲＮＡエレメントの配列。結合部位に結合することができるが、哺乳動物ゲノムに結合しない任意の合成または非哺乳類ｍｉＲＮＡが使用され得ることは、当業者には理解されよう。導入遺伝子発現に及ぼす様々なｍｉＲＮＡの影響を、図２０に示す。

コンストラクトは、修飾コザック配列を含むように適合されてもよい。好適には、修飾コザック配列は、タンパク質翻訳開始部位として機能する核酸モチーフを含む、任意のコザック配列であってもよい。好適には、修飾コザック配列は、翻訳の増加を促進する任意の修飾配列であってもよい。好適には、コザック配列は、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）であってもよい。図２０は、コザック配列としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３を使用することが導入遺伝子の発現に与える影響を示す。

実施形態において、目的遺伝子は、以下の目的遺伝子のうちのいずれか１つであってよい：ＭＥＣＰ２、ＦＭＲ１、ＵＢＥ３Ａ、ＣＤＫＬ５、ＦＸＮ、ＳＭＮ１、またはＩＮＳ、または遺伝的状態もしくは発達障害の治療のために遺伝子治療を使用して供給されることが要求される遺伝子。特に、目的遺伝子は、遺伝的状態または発達障害の治療のために対象に送達される際に、発現が制御されることが要求される任意の遺伝子であってよい。

結合変異の例は、以下の表４で分かる。

表４：結合部位に導入してｍｉＲＮＡの結合を部分的に軽減することができる、例示的な結合変異体の配列。図２０は、変異ｍｉＲＮＡ結合部位を変化させることが導入遺伝子発現に及ぼす影響を示している。

好適には、導入遺伝子の発現を増加させるための安定性エレメントを含んでもよい。好適には、安定性エレメントは、３’ＵＴＲに位置してもよい。好適には、この安定性エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）であってもよい。好適には、安定性エレメントは、安定性エレメントを保持するがＸタンパク質配列を省略したＷＰＲＥの切断バージョン、またはリボザイム安定性配列（ＷＰＲＥ３）であってもよい。図２０は、安定性エレメントＷＰＲＥ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）が導入遺伝子の発現に及ぼす影響を示す。

実施例９
ＡＡＶ感受性組織における遺伝子発現の制限の評価

後根神経節
後根神経節（ＤＲＧ）はＡＡＶに対し高い感受性を有する。ＤＲＧはＡＡＶ送達後、高度に形質導入され、毒性をもたらす可能性がある。フィードフォワード回路がこれらの組織における発現を弱めるかどうかを調べるために、ＤＲＧを、４×１０^１１ｖｇ／マウスの用量で、ＣＢＥ制御およびＣＢＥ非制御ＭＥＣＰ２フィードフォワードｓｓＡＡＶで治療した野生型マウスから解離させた。腰部ＤＲＧを、ベクター由来のＭｅＣＰ２発現（マウスあたりｎ＝３、１群あたり３マウス）およびベクターの生体内分布（マウスあたり１ＤＲＧ、１群あたり３マウス）用に処理した。ＣＢＥ非制御ＭＥＣＰ２で処置したマウスは、毒性／人道的エンドポイントのために３～４週齢で終了させた。ＣＢＥ制御ＭＥＣＰ２で処置したマウスは、２０週齢で終了させた。ＤＲＧは、対照として年齢をマッチさせたＷＴおよびＫＯマウスからも単離した。

終了後、マウスを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流した後、組織を切り離し、４％ＰＦＡで４℃で一晩後固定してから処理時まで３０％スクロースで保存した。組織は、ドライアイス上で３０％スクロースと最適切削温度（ＯＣＴ）化合物の混合物に包埋した。凍結した組織ブロックは、切片作成時まで－２０℃で保存した。凍結切片は１２μｍに切断し、コーティングされたスライドにのせ、室温で３０分間風乾した後、染色時まで－２０℃で保存した。凍結したスライドを０．１ＭＰＢＳですすぎ、組織凍結マトリックスを除去した後、８５℃の水槽において、１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．０）中で３０分間抗原賦活を行った。同じ緩衝液で３０分間スライドを室温で冷却した後、０．３Ｍ ＰＢＳ／ＴｒｉｔｏｎＸ－１００溶液ですすぎ、０．３Ｍ ＰＢＳ／Ｔ溶液中で５％ヤギ血清とともに加湿器内で室温で１時間インキュベートし、非特異的結合を阻害した。その後スライドを、一次抗体（モノクローナル、マウス抗ＭＥＣＰ２、Ｍ７４４３、シグマ、１：５００）と緩衝液中で４℃、加湿器中で一晩インキュベートした。すすいだ後（０．３Ｍ ＰＢＳ／Ｔ溶液）、スライドを二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗マウス（Ｈ＋Ｌ）、ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、１：５００）と共に加湿器内で室温で２時間インキュベートした。０．３Ｍ ＰＢＳ／Ｔ溶液でさらにすすいだ後、スライドをＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２、ＤＮＡ色素染色溶液（０．１Ｍ ＰＢＳ中１：２０００）で３０分間、室温でインキュベートした。スライドは褪色防止マウント液とマニキュア液を用いてカバースリップに封入し、共焦点顕微鏡で画像化した。

図２１は、フィードフォワード回路を持つＤＲＧにおいて、抑制された導入遺伝子の発現が制限されることを示す高投与量試験の図である。この導入遺伝子発現の制限は、非制御カセットよりも安全性の点で有利である。図は、野生型マウスに高用量ベクター（４×１０１１ｖｇ／マウス；Ｐ１での直接脳注射）を投与したｉｎ ｖｉｖｏ実験を示す。非制御ＭＥＣＰ２カセットを投与した場合（２１Ａ）、ＤＲＧでＭｅＣＰ２が著しく過剰発現し、毒性および致死がもたらされた。対照的に、制御カセットは完全に許容され、ＤＲＧにおけるＭｅＣＰ２発現レベルは有意に低かった。ベクターの生体内分布解析は、ＤＲＧが、ＣＢＥ制御マウスおよびＣＢＥ非制御マウスにおいて同レベルのＡＡＶが形質導入されたことを示し（図２１Ｄ）、ＤＲＧにおけるＭｅＣＰ２レベルで観察される差がフィードフォワード回路の減衰作用によることを確認した（図２１Ｂ～Ｃ）。

肝臓
肝臓もＡＡＶに対し高い感受性を有する。肝臓細胞はＡＡＶ投与後に高度に形質導入され、毒性をもたらす可能性がある。フィードフォワード回路がこれらの組織での発現を減衰させるかどうかを調べるために、１×１０^１２ｖｇ／マウスの用量でＣＢＥ制御またはＣＢＥ非制御ＭＥＣＰ２フィードフォワードｓｓＡＡＶを全身投与（静脈内）した野生型マウスから肝臓を切り出した。肝臓を、ベクター由来のＭｅＣＰ２発現（マウスあたりｎ＝３切片、１群あたり３マウス）およびベクターの生体内分布（１群あたり３マウス）のために処理した。ＣＢＥ制御およびＣＢＥ非制御ＭＥＣＰ２で処置したマウスは、注射後４週間で終了させた。また、対照として、年齢をマッチさせた非注射のＷＴマウスから肝臓を単離した。

終了後、マウスを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流した後、組織を切り離し、４％ＰＦＡで４℃で一晩後固定してから、処理時まで３０％スクロースで保存した。組織は、ドライアイス上で３０％スクロースと最適切削温度（ＯＣＴ）化合物の混合物に包埋した。凍結した組織ブロックは、切片作成時まで－２０℃で保存した。凍結切片を１２μｍに切断し、コーティングされたスライドにのせ、室温（ＲＴ）で３０分間風乾した後、染色時まで－２０℃で保存した。凍結したスライドを０．１ＭＰＢＳですすぎ、組織凍結マトリックスを除去した後、８５℃の水槽において、１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．０で３０分間抗原賦活を行った。スライドを同じバッファーで３０分間冷却した後、０．３Ｍ ＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液ですすぎ、０．３Ｍ ＰＢＳ／Ｔ溶液中の５％ヤギ血清とともに加湿室内で１時間インキュベートし、非特異的結合を阻害した。その後、一次抗体（マウス抗ＭｅＣＰ２、１：５００）と共に４℃、加湿器内で一晩インキュベートした。すすいだ後（０．３Ｍ ＰＢＳ／Ｔ溶液）、スライドは二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗マウス（Ｈ＋Ｌ）、１：５００）と共に、室温で２時間、加湿室でインキュベートされた。０．３Ｍ ＰＢＳ／Ｔ溶液でさらにすすいだ後、スライドをＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、ＤＮＡ色素染色溶液（０．１Ｍ ＰＢＳ中１：２０００）で３０分間、室温でインキュベートした。スライドは褪色防止マウント液とマニキュア液を用いてカバースリップに封入し、共焦点顕微鏡で画像化した。

図２３は、フィードフォワード回路によって肝臓での遺伝子発現が制限されることを示す高投与量試験の図である。この導入遺伝子発現の制限は、非制御カセットよりも安全性の面で有利である。図は、野生型マウスに高用量のベクター（２×１０^１２ｖｇ／マウス；５．５～６．５週齢で静脈内注射）を投与したｉｎ ｖｉｖｏ実験である。この投与量では、非制御ＭＥＣＰ２カセット（２３Ａ）を用いた場合、肝臓でＭｅＣＰ２が顕著に過剰発現した。対照的に、制御カセットは、肝臓におけるＭｅＣＰ２の発現レベルが有意に低いことが示された。ベクターの生体内分布解析により、肝臓はＣＢＥ制御およびＣＢＥ非制御処置マウスにおいて同レベルのＡＡＶが形質導入されたことが示され、肝臓で観察されたＭｅＣＰ２レベルの差はフィードフォワード回路の減衰作用によることが確認される。

このことは、フィードフォワードコンストラクトが、ＡＡＶに対し高い感受性を有する組織においても導入遺伝子の過剰発現を抑制し、組織損傷／毒性の可能性を低減することができるため、従来の遺伝子治療用構造体よりも有利であることを実証している。

好適には、フィードフォワードコンストラクトは、ＡＡＶに対し非常に感受性の高い組織においても導入遺伝子の過剰発現を抑制するために使用することができ、組織損傷／毒性の可能性を低減するため、従来の遺伝子治療コンストラクトよりも有利である。

実施例１０
ＡＡＶ９カプシドにパッケージングされたＡＡＶ２ ＩＴＲに挟まれたコンストラクトを含む、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）粒子を、Ｖｉｒｏｖｅｋ（米国カリフォルニア州ヘイワード）のバキュロウイルス導入系によって製造した。

修飾フィードフォワードＭＥＣＰ２コンストラクトを発現するＡＡＶベクターについて、ＣＢＡ／Ｃ５７混合バックグラウンドで維持したＭｅｃｐ２ノックアウト（ＫＯ）マウスで試験した。制御または非制御のＭＥＣＰ２を発現するｓｓＡＡＶを出生後（Ｐ）０／１のオスの脳に脳室内投与（ＩＣＶ）で両側に注射した。対照注射では、ベクターを含まない同じ希釈液を使用した（ビヒクル対照）。注射した仔マウスはホームケージに戻し、４週齢から毎週評価した。マウスは１５週齢まで、またはヒトのエンドポイントに達するまでモニターした。

図２２は、修飾した制御フィードフォワードカセットの投与が許容され、レット症候群のモデルマウス（Ｍｅｃｐ２ ＫＯマウス）において治療効果があることを示す研究を示す図である。ｉｎ ｖｉｖｏ研究で使用される修飾ＡＡＶ－パッケージ化コンストラクト（カセット）設計を図示する（図２２Ａ）。制御コンストラクトは、ｆｆｌｕｃ１ ｍｉＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）および野生型ヒトＭＥＣＰ２導入遺伝子を発現した。非制御コンストラクトは、野生型ヒトＭＥＣＰ２導入遺伝子のみを発現した。ＭｅＣＰ２タンパク質の発現は、３’ＵＴＲにウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ３）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）が存在することにより促進された。Ｍｅｃｐ２ ＫＯマウスにベクターを投与し（１×１０^１１ｖｇ／マウス；Ｐ１で脳に直接注射）、その後４週齢から毎週評価を行った。生存率とＲＴＴスコアのデータから、レット症候群モデルマウス（Ｍｅｃｐ２ ＫＯマウス）において、制御フィードフォワードカセットの投与は許容され、治療効果を示すことが実証された。ＣＢＥ非制御＋ＷＰＲＥ３コンストラクトを投与したマウスは、重度の過剰発現の毒性のため、注射後２－３週間で淘汰されなければならなかった。

ウェスタンブロット解析を、異なる脳領域（皮質、海馬、視床、脳幹）で実施した（図２２Ｃ）。凍結した組織サンプルを、３００μＬのＮＥ１緩衝液とともにビーズミルでホモジナイズし、氷上で保存した。各サンプルに２５０Ｕのｂｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼを添加した後、サンプルを振盪し、室温で１５分間インキュベートし、氷上で保存した。サンプルは、ＮＥ１緩衝液中で１：２０に希釈し、タンパク質とした。１００μＬの４ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒを各ビーズミルチューブに加え、サンプルを１０分間沸騰させた後、－８０℃で保存した。サンプルを解凍し、各サンプル２５μｇを１０％アクリルアミドゲル上で色素がゲルの底に達するまで１５０Ｖで泳動した。その後、ゲルをニトロセルロース膜に移し、８５Ｖで２時間保持した。総タンパク質を測定した。総タンパク質の染色を除去し、膜をＬＩ－ＣＯＲブロッキングバッファーと共に振盪インキュベーター上で室温で１時間インキュベートした。次に、膜を、１：１０００の希釈度の一次抗体抗ＭＥＣＰ２とともに、２０ｍＬのＬＩ－ＣＯＲブロッキングバッファー中で４℃にて一晩インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔバッファーで１０分間洗浄（ｘ３）した後、２０ｍｌのＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）ブロッキングバッファー中、１：１００００の希釈率の二次と共に室温で２時間インキュベートした。膜はＴＢＳ－Ｔバッファーで１０分間洗浄し（×３）、ＴＢＳバッファーですすいだ後、画像化した。

その結果、フィードフォワード回路によってＭｅＣＰ２の発現が制限されることが実証された。生存率の向上とＲＴＴ表現型スコアの低下と合わせて、この導入遺伝子の発現の制限は、非制御カセットよりも安全性の面で優れていることがさらに実証された。

実施例１１
昆虫由来のｍｉＲＮＡ配列（ｆｆｌｕｃ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）または新規合成ｍｉＲＮＡ配列（ｒａｎ１ｇ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７およびｒａｎ２ｇ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）が、哺乳類トランスクリプトーム内に予測される内在性標的を持たないことをさらに検証するために、予測ｍＲＮＡ標的の定量ＲＴ－ＰＣＲを行った。

ｆｆｌｕｃ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ｒａｎ１ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）またはｒａｎ２ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）ｍｉＲＮＡをｈＥＦ１ａプロモータの下流のイントロンから発現させるプラスミドを作製した（図２４Ａ）。ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐまたはｈｓａ－ｍｉＲ－６４４ａ ｍｉＲＮＡをｈＥＦ１ａプロモータの下流のイントロンから発現させる対照プラスミドも作製した（図２４Ｂ）。対照プラスミドによって発現されたｍｉＲＮＡは、認識されたヒトｍＲＮＡ標的（それぞれ、ＭＥＣＰ２、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＡＣＴＢ）を有する内在性ヒトｍｉＲＮＡである。

ヒト胚性腎臓２９３細胞（ＨＥＫ ２９３）に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）を用いて各プラスミド１００μｇを遺伝子導入し、４８時間後に細胞を溶解し、全ＲＮＡを単離した。単離したＲＮＡの品質と量を分析した。５００ｎｇの全ＲＮＡテンプレートと５００ｎＭのランダムヘキサマーを含む２０μＬの反応液で、一本鎖合成を実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ反応は、第一鎖合成反応の１／１０と３００ｎＭの遺伝子特異的プライマーを用いて、２０μＬの反応物において行った。ＰＣＲは以下のサイクリング条件で行った：９５℃での初期変性３分、その後９５℃１０秒、５５℃３０秒、６０℃３０秒を４０サイクル行い、解離曲線を続けた。結果は、２^{－ΔΔＣｔ}法を用いて解析し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみの対照サンプルに対するサンプルの相対的な遺伝子発現倍率を算出した。

定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、ｆｆｌｕｃ１（ＩＲＦ２ＢＰ２、ＨＮＲＮＰＨ１およびＲＰＰ３０）、ｒａｎ１ｇ（ＦＡＳＮ、ＥＴＡＡ１およびＭＡＩＰ１）ならびにｒａｎ２ｇ（ＭＣＦＤ２、ＳＬＣ３８Ａ２およびＦＺＤ６）のヒトｍＲＮＡ標的候補上位３つの転写レベルを定量した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、対照プラスミド：ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２－３ｐ（ＭＥＣＰ２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ（ＨＳＰＡ１Ｂ）、またはｈｓａ－ｍｉＲ－６４４ａ（ＡＣＴＢ）によって発現されるｍｉＲＮＡの認識された内在性ｍＲＮＡ標的の転写レベルを定量するためにも使用した。

ｑＲＴ－ＰＣＲによる評価では、ｆｆｌｕｃ１、ｒａｎ１ｇまたはｒａｎ２ｇが非常に高いレベルで発現している場合でさえ、検出可能なオフターゲット効果は最小限であることが示された（図２４Ｃ）。唯一の例外はＦＺＤ６であり、これはｒａｎ２ｇによって強固に下方制御された。対照的に、オンターゲット陽性対照は標的を深く抑制し、アッセイの頑健性を示す（図２４Ｄ）。

実施例１２
他のＣＮＳ徴候におけるフィードフォワードのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価。

本発明者らは、本発明が中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を与える他の疾患の治療にも有効であることを特定した。ＭＥＣＰ２をＵＢＥ３Ａ遺伝子（この遺伝子の変異はアンジェルマン症候群およびプラダーウィリー症候群につながる）、およびＣＤＫＬ５遺伝子（この遺伝子の変異はＣＤＫＬ５欠損障害につながる）に置き換えたコンストラクトを作製した。

ｆｆｌｕｃ１ ｍｉＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）およびｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎレポーター遺伝子に融合した目的遺伝子（ＧＯＩ）を発現するプラスミドを作製した。各ＧＯＩについて、フィードフォワード機構を有するコンストラクトと有しないコンストラクトを生成した（図２５Ａ）。制御コンストラクトにおいて、３’ＵＴＲに、以前の実験で使用したのと同じｆｆｌｕｃ１ ｍｉＲＮＡ（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３４）に対する３つの非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位を含ませた。非制御コンストラクトでは、３’ＵＴＲに、ｆｆｌｕｃ１ ｍｉＲＮＡの結合に不適合なスクランブル（ｓｃｒ）配列を含ませた。ヒト胚性腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いて、１００μｇの各プラスミドを遺伝子導入した。４８時間後、細胞を回収し、導入遺伝子の発現レベルをフローサイトメトリーで評価した。コンストラクト上の別の蛍光マーカー（ｍＲｕｂｙ）を用いて、各細胞に送達されたコンストラクトのレベル（用量の代用）をモニターした。

図２５Ｂ～Ｃは、投与量感受性のフィードフォワードコントロールが、他の投与量感受性遺伝子でも達成され得ることを示す図である。フィードフォワードコントロールは、ＵＢＥ３Ａ遺伝子（２５Ｂ）（アンジェルマン症候群およびプラダーウィリー症候群において破壊される）およびＣＤＫＬ５遺伝子（２５Ｃ）（ＣＤＫＬ５欠損障害において破壊される）の両方において見られた。

これらのタンパク質（ＵＢＥ３ＡおよびＣＤＫＬ５）の発現は、フローサイトメトリーによって評価されるＮｅｏｎＧｒｅｅｎタンパク質レベルによって決定される。制御されたフィードフォワードコンストラクトを、ｍｉＲＮＡの制御を欠く非制御対照コンストラクトに対して比較した（図２５Ａ～Ｃ）。グラフは、ｍＲｕｂｙ（ｘ軸－細胞へのプラスミド量の尺度であり、ｍｉＲＮＡ制御によって影響を受けない）対ＵＢＥ３Ａ－ＮｅｏｎＧｒｅｅｎまたはＣＤＫＬ５－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（ｙ軸－ｍｉＲＮＡによって制御されるタンパク質）のレベルを示す。結果は、線形回帰線の傾きの違いによって示されるように、ｆｆｌｕｃ１ ｍｉＲＮＡは、対照と比較して、フィードフォワードサンプルにおけるＵＢＥ３ＡおよびＣＤＫＬ５の発現を制御するのに有効であることを示している。

ＭＥＣＰ２で見られたように、フィードフォワードエレメントの減衰効果は、送達されるコンストラクトの量が増えるにつれて増加し、これは、コントロールエレメントが治療レベルの遺伝子発現を妨げることなく毒性を緩和することができることを示唆する。

実施例１３
他のＣＮＳ徴候におけるフィードフォワードのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価－コドン最適化された導入遺伝子を対象として

本発明者らは、コドン最適化されたタンパク質コード配列がｍｉＲＮＡの結合部位として利用できることを突き止めた。遺伝子治療カセット内の合成ｍｉＲＮＡを送達して、３’ＵＴＲ内のｍｉＲＮＡの結合部位を標的とするのではなく、導入遺伝子のコドン最適化タンパク質コード配列内に作成された固有のｍｉＲＮＡ結合領域を標的とした。この合成ｍｉＲＮＡは、哺乳類ゲノム内に対応する結合部位を持たない。この方法は、ウイルスベクターのパッケージング容量に近い、より大きな遺伝子に特に有利である。

図２６Ａ－Ｂは、ｍｉＲＮＡの結合部位が導入遺伝子タンパク質コード配列にある場合にも、投与量感受性のフィードフォワードコントロールが達成できることを示す図である。図は、この方法を用いたＳＹＮＧＡＰ１遺伝子（ＳＹＮＧＡＰ１関連知的障害で破壊される）の制御を示す。ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎレポーター遺伝子に融合したコドン最適化ＳＹＮＧＡＰ１導入遺伝子と、合成ｓｙｎ３ｉ ｍｉＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９制御コンストラクト）またはｍｉＲＮＡなし（非制御コンストラクト）を発現するプラスミドを作製した（図２６Ａ）。ヒト胚性腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いて、１００μｇの各プラスミドを遺伝子導入した。４８時間後、細胞を回収し、導入遺伝子発現のレベルをフローサイトメトリーで評価した。コンストラクト上の別の蛍光マーカー（ｍＣｈｅｒｒｙ）を用いて、各細胞に送達されたコンストラクトのレベル（用量の代用）をモニターした。

ＳｙｎＧＡＰタンパク質の発現は、フローサイトメトリーで評価したＮｅｏｎＧｒｅｅｎタンパク質レベルによって決定した。制御されたフィードフォワードコンストラクトを、ｍｉＲＮＡの制御を欠く非制御対照コンストラクトに対して比較した（図２６Ａ～Ｂ）。グラフは、ｍＲｕｂｙ（ｘ軸－細胞へのプラスミドの量の尺度であり、ｍｉＲＮＡ制御によって影響されない）対ＳｙｎＧＡＰ－ＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（ｙ軸－ｍｉＲＮＡによって制御されるタンパク質）のレベルを示す。結果は、線形回帰線の傾きの差によって示されるように、ｓｙｎ３ｉ ｍｉＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）が、対照と比較してフィードフォワードサンプルにおけるＳｙｎＧＡＰ発現を制御するのに有効であることを示す。

フィードフォワード要素の減衰効果は、送達されるコンストラクトの量が増えるにつれて増加し、これは、このフィードフォワード原理の代替実施形態が、治療レベルでの遺伝子の発現を妨げることなく毒性を緩和することもできることを示唆している。

実施例１４
他の非ＣＮＳ徴候におけるフィードフォワードのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価

非哺乳類ｍｉＲＮＡのフィードフォワード機構は、中枢神経系（ＣＮＳ）ではなく末梢神経系が主な表現型の他の障害でも有効であった。ＭＥＣＰ２を他のタンパク質のコード配列：ＳＭＮ１遺伝子（この遺伝子の変異は脊髄性筋萎縮症につながる）、ＩＮＳ遺伝子（この遺伝子の変異は１型糖尿病につながる）、ＦＸＮ遺伝子（この遺伝子の変異はフリードライヒ失調症につながる）に置き換えたコンストラクトを作成した。３’ＵＴＲには、以前の実験で使用したのと同じｆｆｌｕｃ１ ｍｉＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）用の３つの非哺乳類ｍｉＲＮＡの結合部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）を含ませた。

ｆｆｌｕｃ１ ｍｉＲＮＡと上記の目的遺伝子（ＧＯＩ）の１つを発現するプラスミドを作製した。ＧＯＩは、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎレポーター遺伝子と融合させた。各ＧＯＩについて、フィードフォワード機構を有するコンストラクトと有しないコンストラクトを生成した（図２７Ａ）。制御コンストラクトでは、３’ＵＴＲに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４ ｍｉＲＮＡの結合部位を含ませた。非制御コンストラクトでは、３’ＵＴＲに、ｆｆｌｕｃ１ ｍｉＲＮＡ結合に不適合なスクランブル（ｓｃｒ）配列を含ませた。ヒト胚性腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いて各プラスミド１００μｇを遺伝子導入した。４８時間後、細胞を回収し、導入遺伝子の発現レベルをフローサイトメトリーで評価した。コンストラクト上の別の蛍光マーカー（ｍＲｕｂｙ）を用いて、各細胞に送達されたコンストラクトのレベル（用量の代用）をモニターした。

図２７Ｂ－Ｄは、他の投与量感受性遺伝子（この場合、（２７Ｂ）脊髄性筋萎縮症で破壊されるＳＭＮ１遺伝子、（２７Ｃ）１型糖尿病で破壊されるＩＮＳ遺伝子、（２７Ｄ）フリードライヒ失調症で破壊されるＦＸＮ遺伝子）にわたって、投与量感受性のフィードフォワードコントロールが達成できることを示す図である。

これらのタンパク質（ＳＭＮ１、インスリンおよびフラタキシン）の発現は、フローサイトメトリーによって評価されるＮｅｏｎＧｒｅｅｎタンパク質レベルによって決定される。制御されたフィードフォワードコンストラクトを、ｍｉＲＮＡの制御を欠く非制御対照コンストラクトに対して比較した（図２７Ａ～Ｄ）。グラフは、ｍＲｕｂｙ（ｘ軸－細胞へのプラスミドの量の尺度であり、ｍｉＲＮＡ調節によって影響を受けない）対ＳＭＮ１－ＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、インスリン－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎまたはＦｒａｔａｘｉｎ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（ｙ軸－ｍｉＲＮＡによって制御されるタンパク質）のレベルを示している。結果は、線形回帰線の傾きの違いによって示されるように、ｆｆｌｕｃ１ ｍｉＲＮＡは、対照と比較して、フィードフォワードサンプルにおけるＳＭＮ１、インスリンおよびＦｒａｔａｘｉｎの発現を制御するのに有効であることを示している。

ＭＥＣＰ２で見られたように、フィードフォワード要素の減衰効果は、送達されるコンストラクトの量が増えるにつれて増加し、これは、コントロールエレメントが、治療レベルでの遺伝子の発現を妨げることなく毒性を緩和することができることを示唆している。

実施例１５
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＵＢＥ３Ａの制御

本発明者らはさらに、中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を与える他の投与量感受性障害の治療において、非哺乳類ｍｉＲＮＡフィードフォワード機構を用いることを実証した。アンジェルマン症候群およびプラダーウィリー症候群で破壊されるＵＢＥ３Ａ遺伝子が、フィードフォワード機構によってｉｎ ｖｉｖｏで制御されることが示された。

ｆｆｌｕｃ１ ｍｉＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）および３ｘＦＬＡＧタグに融合したヒトＵＢＥ３Ａを発現するコンストラクトを生成した。フィードフォワード機構を有するコンストラクトと有しないコンストラクトを生成した（図２８Ａ）。制御コンストラクトでは、３’ＵＴＲには、ｍｉＲＮＡの結合部位ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４を含ませた。ＡＡＶ９カプシドにパッケージングされたＡＡＶ２ ＩＴＲに挟まれたコンストラクトを含む、制御および非制御のＵＢＥ３Ａコンストラクトの一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）粒子を、Ｖｉｒｏｖｅｋ（ヘイワード、カリフォルニア、米国）のバキュロウイルス導入系によって生成した。

図２８Ｂは、ＵＢＥ３Ａ制御フィードフォワードカセットが、非制御ＵＢＥ３Ａカセットと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏでの制御を提供することを実証している。抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロット解析は、細胞におけるＵＢＥ３Ａ発現レベルの読み出しを提供する。フィードフォワードＵＢＥ３Ａコンストラクトを発現するＡＡＶベクターを、ＣＢＡ／Ｃ５７混合バックグラウンドで維持された野生型マウスで試験した。制御されたまたは非制御のＵＢＥ３Ａを発現するｓｓＡＡＶを、出生後（Ｐ）１日の雄の脳に脳内（ＩＣＶ）投与により両側に注射した。対照注射はＰＢＳ（ビヒクルコントロール）を用いた。注射した仔マウスは注射後７日目に淘汰し、解析のために組織を採取した。新鮮な組織サンプルを、３００μＬの緩衝液ＮＥ１とともにビーズミルでホモジナイズし、氷上で保存した。各サンプルに２５０Ｕのｂｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼを添加した後、サンプルを振盪し、室温で１５分間インキュベートし、氷上で保存した。サンプルは、タンパク質定量用にＮＥ１バッファーで１：２０に希釈した。各ビーズミルチューブに１００μＬの４ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒを加え、サンプルを１０分間沸騰させた後、－８０℃で保存した。サンプルを解凍し、各サンプル２５μｇを１０％アクリルアミドゲル上で色素がゲルの底に達するまで１５０Ｖで泳動した。ゲルをニトロセルロース膜に移し、８５Ｖで２時間保持した後、総タンパク質を測定した。総タンパク質の染色を除去し、メンブレンをＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）ブロッキングバッファーとともに振盪インキュベーターで室温で１時間インキュベートした。次に、膜を２０ｍＬのＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）ブロッキングバッファーと１：２０００の希釈度の一次抗体抗ＦＬＡＧで４℃にて一晩インキュベートした。膜をＴＢＳ－Ｔバッファーで１０分間洗浄し（ｘ３）、２０ｍＬのＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）ブロッキングバッファーで室温で２時間インキュベートし、１：１００００の希釈度で二次抗体ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷロバ抗マウスを添加した。膜をＴＢＳ－Ｔバッファーで１０分間洗浄し（×３）、ＴＢＳバッファーですすいだ後、画像化した。

これは、ＵＢＥ３Ａ（すなわち、ＭＥＣＰ２以外の導入遺伝子）が、非哺乳類ｍｉＲＮＡのフィードフォワード機構の制御下でｉｎ ｖｉｖｏで制御されうることを示すものである。これにより、投与量感受性があることが知られている遺伝子／障害において、導入遺伝子の過剰発現による組織障害／毒性の可能性を低減することができる。

実施例１６
フィードフォワードコンストラクトのｓｓＡＡＶにおける効率的なパッケージ

ＭＥＣＰ２導入遺伝子を発現するフィードフォワードコンストラクトを、ＡＡＶ９カプシドにパッケージングされたＡＡＶ２ ＩＴＲで挟まれたコンストラクトを含む一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）粒子として調製し、ＨＥＫ２９３プロセス（Viral Vector Production Unit, Universitat Autonoma Barcelona, Spain）またはＶｉｒｏｖｅｋ（Hayward, CA, USA）におけるバキュロウイルスに基づく感染系によって生成した。両方のプロセスを用いて、本発明者らは、フィードフォワード遺伝子治療コンストラクトが効率的に、ある規模で、非常に高い力価（最大１．９４×１０^１４ウイルスゲノム／ｍｌ）で生産できることを実証している。したがって、本発明者らは、フィードフォワード制御遺伝子治療技術が効率的な製造のために構成されていることを確認した。重要なことに、本発明者らは、フィードフォワード合成回路コンストラクトがＡＡＶに効率的にパッケージされることを実証している。

ＡＡＶ製造後、ＣＤＭＳ（電荷検出質量分析）分析を行い、電荷と質量に基づいてＡＡＶ粒子の大きさをもとめた。このツールは、パッケージングの質と、ＡＡＶ産物の効力に影響を与える可能性のある部分的にパッケージングされた種があるかどうかを判断するために役立つ。

図２９は、ｓｓＡＡＶ９でパッケージングされたフィードフォワードＭＥＣＰ２コンストラクトの代表的なＣＤＭＳ分析である。全長のフィードフォワード産物は予想通りパッケージングされ、異常なパッケージングまたは部分的なパッケージングが少ない。ヘアピンのような二次ＤＮＡ構造は、ＡＡＶ粒子における効率的なパッケージングを阻害することが知られている。しかし、分析したフィードフォワードコンストラクトでは、ｍｉＲＮＡヘアピン（ＥＦ１ａまたはＭＩＮＩＸイントロン中の）の存在が、予想より小さい有意なパッケージング／部分的にパッケージングされた粒子の原因とはならず、ＡＡＶ調製物の質には影響を与えない。

ステムループ、ヘアピン、およびｍｉＲＮＡ生成配列などの二次構造を含む遺伝子配列は、非常に一般的に、異常なパッケージングおよび製品の純度を逆に損なう異質な種のカプセル化をもたらすことが知られている（Xie et al., 2017）。図２９は、当技術分野の中で非常にクリーンなプロファイルとみなされるプロファイルを表示する。したがって、本発明者らは、高純度製品への大規模製造が可能なフィードフォワードＡＡＶコンストラクトを開発することによって、純度の問題に対する解決策を提供した。

Claims (30)

1. プロモータと；
   イントロン内で発現する少なくとも１つの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡであって、前記合成ｍｉＲＮＡは天然には存在しない配列である、少なくとも１つの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡと；
   導入遺伝子と；
   前記導入遺伝子の発現のコントロールを提供する少なくとも１つの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡの結合部位であって、前記合成ｍｉＲＮＡの結合部位は、天然に存在しない配列である、少なくとも１つの非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡの結合部位と；
   ポリアデニル化シグナルとを含む、コンストラクト。
2. 前記導入遺伝子の発現のコントロールを提供するｍｉＲＮＡの結合部位が、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲ内に提供される、請求項１に記載のコンストラクト。
3. 前記非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡの結合部位が、前記導入遺伝子内に提供される、請求項１に記載のコンストラクト。
4. 異なるレベルのベクター由来導入遺伝子を受け取る細胞間で、前記導入遺伝子の比較的固定されたレベルの発現を提供する（すなわち、投与量不感応性）ための単一遺伝子回路を提供する、請求項1～３の何れかに記載のコンストラクト。
5. 前記少なくとも１つの合成または非哺乳類ｍｉＲＮＡが、オフターゲット結合効果を示さない、請求項１～４の何れかに記載のコンストラクト。
6. 前記非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡが、以下の
   [配列5-6]
   

   

   

   によって提供されるイントロンで発現する、請求項１～５の何れかに記載のコンストラクト。
7. 前記ｍｉＲＮＡが昆虫ｍｉＲＮＡに由来する非哺乳類ｍｉＲＮＡであり、任意で、前記ｍｉＲＮＡはホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ１）ｍｉＲＮＡの結合部位に特異的に結合できる、請求項１～６の何れかに記載されたコンストラクト。
8. 前記コンストラクト中に複数のｍｉＲＮＡの結合部位、任意で３つのｍｉＲＮＡの結合部位、少なくとも４つのｍｉＲＮＡの結合部位、少なくとも５つのｍｉＲＮＡの結合部位、少なくとも６つのｍｉＲＮＡの結合部位が提供される、請求項１～７の何れかに記載されたコンストラクト。
9. 前記コンストラクトにおいて発現する非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡが複数存在する、請求項１～８の何れかに記載のコンストラクト。
10. 前記非哺乳類ホタルルシフェラーゼｍｉＲＮＡが、以下の
    [配列9-12]
    

    

    から選択される配列である、請求項１～９の何れかに記載のコンストラクト。
11. 前記合成ｍｉＲＮＡが、以下の
    [配列13-20]
    

    

    から選択される配列である、請求項１～６または８～９の何れかに記載のコンストラクト。
12. 前記合成ｍｉＲＮＡが、標的遺伝子のコード配列を標的とし、以下の
    [配列21-32]
    

    

    

    

    から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載のコンストラクト。
13. 前記非哺乳類または合成ｍｉＲＮＡの結合部位が以下の
    [配列33-55]
    

    

    

    

    から選択される、請求項１～１２の何れか一項に記載のコンストラクト。
14. 前記合成ｍｉＲＮＡが標的遺伝子のコード配列を標的とし、該合成ｍｉＲＮＡの結合部位が以下の
    [配列56-67]
    

    

    から選択される、請求項１２に記載のコンストラクト。
15. 前記プロモータが構成的または条件付きプロモータから選択され、任意で前記プロモータが組織特異的である、請求項１～１４の何れかに記載のコンストラクト。
16. 前記プロモータが、以下の
    [配列68-69]
    

    

    から選択される、請求項１～１５の何れかに記載のコンストラクト。
17. 前記ポリＡ配列が、以下の
    [配列70-72]
    

    

    から選択される、請求項１～１６の何れかに記載のコンストラクト。
18. 安定性エレメントをさらに含み、前記安定性エレメントは３’ＵＴＲに位置する、請求項１～１６に記載のコンストラクト。
19. 前記安定性エレメントが、以下の
    [配列74-75]
    

    

    から選択される、請求項１７に記載のコンストラクト。
20. [配列73]
    

    

    をさらに含む、請求項１～１９の何れかに記載のコンストラクト。
21. 前記ｍｉＲＮＡの結合部位が、ｍｉＲＮＡ結合を部分的に軽減するように設計されている、請求項１～２０の何れかに記載のコンストラクト。
22. 請求項１～２０の何れか一項に記載のコンストラクトを含むベクター。
23. 前記ベクターがＡＡＶまたはレンチウイルスベクターであり、任意で、前記ベクターがＡＡＶベクターであり、任意で前記コンストラクトが発現コントロールエレメントに作動可能に連結し、前記発現コントロールエレメントと前記コンストラクトが一緒に５’および３’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）によって挟まれている、請求項２１に記載のベクター。
24. ビリオンにパッケージングされた請求項２１～２２の何れか一項に記載のベクターであって、任意で、前記ビリオンにパッケージングされた場合のベクターは前記コンストラクトの質に影響を及ぼさない、ベクター。
25. ナノ粒子に製剤化された、請求項２１～２２の何れか一項に記載のベクター。
26. 請求項１～２０の何れか一項に記載のコンストラクトまたは請求項２１～２４に記載のベクターを使用して導入遺伝子を発現させる方法であって、任意で導入遺伝子を特定の哺乳類細胞型で発現させる、方法。
27. 対象における障害を治療する方法であって、請求項１～２０の何れか一項に記載のコンストラクト、または請求項２１～２４に記載のベクターを前記対象に提供するステップを含む、方法。
28. 対象における遺伝子の不十分な発現によって引き起こされる障害の治療に使用するための、請求項１～２０の何れか一項に記載のコンストラクトまたは請求項２１～２４に記載のベクターを含む、組成物。
29. 前記障害が、矯正遺伝子の発現のコントロールが望まれる任意の一遺伝子性障害であって、任意で、前記一遺伝子性障害が、レット症候群、脆弱Ｘ症候群、アンジェルマン症候群、Ｓｙｎｇａｐ関連知的障害、ＣＤＫｌ５欠損症、フレドリッチ失調症、脊髄性筋ジストロフィー、血友病および糖尿病からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法または請求項２７に記載の組成物。
30. 前記障害が、以下の：ＰＲＫＣＺ、ＴＴＣ３４、ＰＲＤＭ１６、ＡＲＨＧＥＦ１６、ＰＡＲＫ７、ＰＲＤＭ２、ＩＧＳＦ２１、ＰＴＣＨ２、ＮＦＩＡ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ３、ＤＰＹＤ、ＣＯＬ１１Ａ１、ＰＤＺＫ１、ＧＰＲ８９Ａ、ＮＢＰＦ１１、ＧＰＲ８９Ｂ、ＫＣＮＴ２、ＣＦＨＲ２、ＡＳＰＭ、ＰＴＰＲＣ、ＧＰＡＴＣＨ２、ＤＵＳＰ１０、ＧＰＲ１３７Ｂ、ＲＹＲ２、ＣＨＲＭ３、ＲＧＳ７、ＡＫＴ３、ＫＩＦ２６Ｂ、ＳＭＹＤ３、ＬＰＩＮ１、ＥＰＣＡＭ、ＭＳＨ２、ＮＲＸＮ１、ＸＰＯ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＺＥＢ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＭＢＤ５、ＫＩＦ５Ｃ、ＳＣＮ１Ａ、ＣＯＬ３Ａ１、ＰＭＳ１、ＰＬＣＬ１、ＳＡＴＢ２、ＰＡＲＤ３Ｂ、ＥＰＨＡ４、ＳＰＨＫＡＰ、ＣＨＬ１、ＧＲＭ７、ＴＲＡＮＫ１、ＤＯＣＫ３、ＦＡＭ１９Ａ１、ＦＯＸＰ１、ＲＯＢＯ１、ＣＡＤＭ２、ＦＯＸＬ２、ＳＯＸ２、ＬＰＰ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＧＲＩＤ２、ＦＡＴ４、ＮＲ３Ｃ２、ＬＲＢＡ、ＦＧＡ、ＧＡＬＮＴＬ６、ＷＷＣ２、ＴＬＲ３、ＩＲＸ２、ＩＲＸ１、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ９、ＮＩＰＢＬ、ＨＥＸＢ、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＲＡＭＤ３、ＦＢＮ２、ＰＲＥＬＩＤ２、ＴＣＯＦ１、ＧＡＢＲＧ２、ＭＳＸ２、ＮＳＤ１、ＦＯＸＣ１、ＣＤＹＬ、ＴＢＣ１Ｄ７、ＲＵＮＸ２、ＭＵＴ、ＲＩＭＳ１、ＮＫＡＩＮ２、ＬＡＭＡ２、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＰＡＲＫ２、ＰＡＣＲＧ、ＱＫＩ、ＴＮＲＣ１８、ＦＢＸＬ１８、ＳＵＧＣＴ、ＧＬＩ３、ＡＵＴＳ２、ＭＬＸＩＰＬ、ＣＯＬ１Ａ２、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＣＦＴＲ、ＴＳＰＡＮ１２、ＧＲＭ８、ＣＮＴＮＡＰ２、ＭＮＸ１、ＣＳＭＤ１、ＭＣＰＨ１、ＬＰＬ、ＡＮＫ１、ＩＭＰＡＤ１、ＣＨＤ７、ＶＣＰＩＰ１、ＴＲＰＳ１、ＰＡＲＰ１０、ＤＯＣＫ８、ＫＡＮＫ１、ＧＬＩＳ３、ＰＴＰＲＤ、ＭＬＬＴ３、ＲＯＲ２、ＰＴＣＨ１、ＡＬ１６２３８９．１、ＡＲＲＤＣ１、ＥＨＭＴ１、ＰＣＤＨ１５、ＣＴＮＮＡ３、ＡＤＫ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＰＡＸ２、ＢＴＲＣ、ＩＮＰＰ５Ａ、ＭＲＰＬ２３、ＥＬＰ４、ＰＡＸ６、ＣＰＴ１Ａ、ＤＹＮＣ２Ｈ１、ＫＩＲＲＥＬ３、ＷＮＫ１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＰＰＦＩＢＰ１、ＴＢＸ５、ＭＥＤ１３Ｌ、ＮＡＬＣＮ、ＣＨＤ８、ＭＹＨ７、ＴＴＣ６、ＤＡＡＭ１、ＮＲＸＮ３、ＭＴＡ１、ＳＮＲＰＮ、ＵＢＥ３Ａ、ＯＣＡ２、ＨＥＲＣ２、ＣＨＲＦＡＭ７Ａ、ＡＲＨＧＡＰ１１Ｂ、ＯＴＵＤ７Ａ、ＦＢＮ１、ＨＥＸＡ、ＳＮＵＰＮ、ＮＲＧ４、ＡＣ１１２６９３．２、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＲＲＣ２８、ＨＢＡ２、ＨＢＱ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＲＢＦＯＸ１、ＣＤＲ２、ＣＤＨ１３、ＣＹＢＡ、ＮＸＮ、ＹＷＨＡＥ、ＳＭＧ６、ＭＥＴＴＬ１６、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１、ＡＤＯＲＡ２Ｂ、ＮＴ５Ｍ、ＲＡＩ１、ＮＦ１、Ｃ１７ｏｒｆ６７、ＰＩＴＰＮＣ１、ＡＣＯＸ１、ＴＣＦ４、ＤＯＣＫ６、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＬＰＨＮ１、ＺＳＣＡＮ５Ａ、ＢＭＰ２、ＭＹＴ１、ＰＥＸ２６、ＵＳＰ１８、ＤＧＣＲ６Ｌ、ＵＳＰ４１、ＵＢＥ２Ｌ３、ＮＦ２、ＬＡＲＧＥ、ＢＲＤ１、ＳＨＡＮＫ３ ＣＤＫＬ５、ＦＸＮ、ＳＭＮ１、Ｆ８、およびＩＮＳを含むリストから選択される遺伝子の発現により治療される、請求項２６に記載の方法または請求項２７に記載の組成物。
    

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