CN117402875A - 利用rna剪接调节剂调控基因表达的核酸分子 - Google Patents

利用rna剪接调节剂调控基因表达的核酸分子 Download PDF

Info

Publication number
CN117402875A
CN117402875A CN202311275787.8A CN202311275787A CN117402875A CN 117402875 A CN117402875 A CN 117402875A CN 202311275787 A CN202311275787 A CN 202311275787A CN 117402875 A CN117402875 A CN 117402875A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
alternative splicing
gene
intron
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311275787.8A
Other languages
English (en)
Inventor
郭宇轩
陈展
杨璐梓
杨科
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Jiyu Medical Technology Co ltd
Peking University
Original Assignee
Beijing Jiyu Medical Technology Co ltd
Peking University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Jiyu Medical Technology Co ltd, Peking University filed Critical Beijing Jiyu Medical Technology Co ltd
Priority to CN202311275787.8A priority Critical patent/CN117402875A/zh
Publication of CN117402875A publication Critical patent/CN117402875A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1767—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Abstract

本公开提供了利用RNA剪接调节剂调控基因表达的核酸分子，包含可变剪接调节元件和位于该可变剪接调节元件3'端的目的基因的核酸构建体，该核酸构建体在不同条件下的转录物，以及包含该核酸构建体或转录物的载体、重组病毒、细胞、药物组合物，及其用于调节目的基因表达量的方法和在基因治疗中的用途。

Description

利用RNA剪接调节剂调控基因表达的核酸分子
技术领域
本公开总体上涉及分子生物学和医学领域，具体涉及一种利用RNA剪接调节剂调控基因表达的核酸分子。
背景技术
人类的多种疾病和基因缺陷相关。治疗这些疾病的一种有前景的方式是基因治疗。基因治疗中，人们将外源性遗传物质转移到靶细胞中，实现在核酸水平上对细胞生理机能进行干预，从而最终治疗疾病。例如，基因治疗可通过导入正常基因以替代缺失或异常突变的致病基因，或者通过基因沉默技术抑制有害的内源性基因的功能，达到治疗疾病的目的。基因治疗在过去20年的研究重点主要集中于开发和优化基因的递送系统。例如，工程化改造腺相关病毒(AAV)衣壳可以提高其对特定器官的基因递送效率和靶向性。然而，基因治疗对被运载的治疗基因本身却研究较少。这些研究主要关注启动子技术、基因表达调控技术、以及限制特定细胞类型表达的3'调节元件等。
基因的表达水平是影响基因治疗效果的重要因素。如果治疗基因表达水平不足或不表达，则基因治疗无法获得预期的效果；另一方面，如果治疗基因的表达水平过高，即过表达，则基因治疗很可能对患者造成不期望的毒副作用。如何在基因被递送到体内后调节基因的表达水平是基因治疗研究中的难点和痛点问题。目前，相关的基因表达调控技术极为有限，其中一种思路是通过药物诱导RNA剪接变化来调控基因表达。
目前已知可用于基因表达调控的RNA剪接调节药物仅限于LMI070，种类单一。另一方面，目前已使用的RNA剪接调节药物的调节能力也有限，有必要进一步提高。此外，可供选择的RNA剪接变化的检测方法有限，需要开发更有效的检测技术。再者，现有技术核酸序列较长，且其中具有关键功能的内含子序列不清楚，需要开发更小的核酸序列，并且通过实验明确序列中起到关键作用的序列。另一个缺陷在于，现有文献报导的可变剪接调节元件来源于体外培养的细胞，而非体内器官，缺乏针对体内生理病理环境的适应和优化。
发明内容
为解决现有技术中存在的上述问题，提供了本公开的技术方案。
在本公开的第一方面，提供了一种可变剪接调节元件。所述可变剪接调节元件从5'端至3'端依次包含第一外显子、第一内含子、假外显子、第二内含子和第二外显子；所述假外显子含有与SEQ ID NO:1所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；所述假外显子和所述第二内含子的交界处含有可变剪接调节小分子药物结合位点；所述可变剪接调节元件仅在假外显子中含有唯一起始密码子。所述起始密码子可以选自ATG、GTG、ACG、CTG、ATA或TTG，优选为ATG。
在一个实施例中，所述可变剪接调节小分子药物结合位点包含核苷酸序列ATGAGTA，其中ATGA属于假外显子，GTA属于第二内含子；或者，所述可变剪接调节小分子药物结合位点包含核苷酸序列AGAGTA，其中AGA属于假外显子，GTA属于第二内含子。所述第一外显子的序列紧接所述第一内含子的序列为CAG，所述第一内含子的序列紧接所述第一外显子的序列为GTA；和/或，所述第一内含子的序列紧接所述假外显子的序列为TAG，所述假外显子的序列紧接所述第一内含子的序列为GTT；和/或，所述第二内含子的序列紧接所述第二外显子的序列为CAG，所述第二外显子的序列紧接所述第二内含子的序列为TTT。
在一个实施例中，所述第一内含子含有与SEQ ID NO:19和20所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与SEQ ID NO:21所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
在一个实施例中，所述第一内含子的核苷酸长度为41～500bp，优选为41～410bp，优选为41～140bp，优选为41～110bp；所述第二内含子的核苷酸长度为60～569bp，优选为60～479bp，优选为60～209bp，优选为60～129bp。
在一个实施例中，所述第一内含子含有与SEQ ID NO:3～5、22～25中任一项所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与SEQ ID No:6～8、26～32中任一项所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列。
优选的组合包括：
(a)第一内含子含有与SEQ ID NO:5所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与SEQ ID NO:8所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列；或者，
(b)第一内含子含有与SEQ ID NO:4所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与SEQ ID NO:7所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列；或者，
(c)第一内含子含有与SEQ ID NO:3所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与SEQ ID NO:6所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列。
在一个实施例中，所述第一外显子含有与SEQ ID NO:2所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列；和/或，所述第二外显子含有与SEQ ID NO:9所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列。
在结合上述第一外显子和第二外显子核苷酸序列后，所述可变剪接调节元件进一步优选含有与SEQ ID NO:10～12任一项所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列。
在本公开的第二方面，本公开提供一种核酸分子，所述核酸分子包含本公开第一方面所述的可变剪接调节元件和位于本公开所述可变剪接调节元件3'端的目的基因；其中所述目的基因为一个或多个编码蛋白的基因和/或编码非编码RNA的基因，并且所述编码蛋白的基因的第一个起始密码子ATG被删除。
在一个实施例中，所述可变剪接调节元件的3'端与所述目的基因的5'端之间不存在任何核酸序列。
在一个实施例中，所述可变剪接调节元件的3'端与所述目的基因的5'端之间存在编码蛋白酶切割位点的序列，其中所述蛋白酶切割位点被哺乳动物蛋白酶切割或被自切割，例如2A肽，包括但不限于P2A(porcine teschovirus-1)、T2A(thosea asignavirus)、F2A(foot-and-mouth disease virus)、E2A(equine rhinitis Avirus)，优选为P2A(SEQID NO:13)。本领域技术人员将理解，在该实施例中，可变剪接调节元件的3'端与目的基因的5'端之间存在的编码蛋白酶切割位点的序列的碱基数应该是3n个，n为大于等于1的整数，以保持目的基因的阅读框没有被改变或移动。
在一个实施例中，所述可变剪接调节元件的5'端可操作地连接有启动子序列。
在一个实施例中，所述启动子序列为哺乳动物细胞组成型启动子、哺乳动物细胞的特异性启动子、哺乳动物非编码RNA启动子或原核细胞启动子。
在一个实施例中，所述启动子序列为哺乳动物细胞组成型启动子。优选地，所述启动子为CMV(巨细胞病毒)、CAG(巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子组成)、CBG、EF1a(延伸因子-1α)、PGK1(磷酸甘油酸激酶1)或Ubc(泛素C)。
在一个实施例中，所述启动子序列为哺乳动物细胞的特异性启动子。优选地，所述启动子为Tnnt2(心肌细胞)、Nppa(心房心肌细胞)、Myl2(心室心肌细胞)、Mck(骨骼肌细胞)、Nkx2.5(心肌祖细胞)、Syn(神经元)、Mecp2(神经元)、TBG(肝细胞)、Pdx1(胰细胞)、K14(皮肤角质细胞)、Rpe65(视网膜细胞)或SP-C(肺上皮细胞)。
在一个实施例中，所述启动子序列为哺乳动物非编码RNA启动子。优选地，所述启动子为U6或H1(真核生物RNA聚合酶III依赖的启动子)。
在一个实施例中，所述启动子序列为原核细胞启动子。优选地，所述启动子为T7(T7噬菌体)、T3(T3噬菌体)、SP6(SP6噬菌体)。
在一个实施例中，本公开的核酸分子进一步包含转录后调节元件和/或微小RNA的靶序列。优选地，所述转录后调节元件(PRE)包含衍生自乙型肝炎(HPRE)、蝙蝠(BPRE)、地松鼠(GSPRE)、北极松鼠(ASPRE)、鸭(DPRE)、黑猩猩(CPRE)、长毛猴(WMPRE)或土拨鼠(WPRE)的转录后调节元件。所述微小RNA的靶序列选自miR122、miR199、miR7、miR148、miR1或miR208的靶序列。任选地其中所述转录后调节元件和/或微小RNA的靶序列设置在所述目的基因的3'端。
在一个实施例中，本公开的核酸分子进一步包含多腺苷酸化信号(polyA)，任选地其中所述polyA设置在所述目的基因的3'端。优选地，所述polyA信号是SV40polyA、人生长激素(HGH)polyA、牛生长激素(BGH)polyA、β-珠蛋白polyA、α-珠蛋白polyA、卵清蛋白polyA、κ-轻链polyA或合成polyA。
在一个实施例中，所述可变剪接调节元件能够与可变剪接调节小分子药物结合。优选地，所述可变剪接调节小分子药物为LMI070、与LMI070在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物或LMI070药学上可接受的盐，或者，所述可变剪接调节小分子药物为Risdiplam、与Risdiplam在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物或Risdiplam药学上可接受的盐。
在一个实施例中，所述编码蛋白的基因为编码核酸酶的基因，和/或编码治疗蛋白的基因，和/或编码报告或标记蛋白的基因，和/或编码非编码RNA的基因。优选地，所述核酸酶包括转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)或者CRISPR associated蛋白(Cas蛋白)或其相同功能衍生物，进一步优选地，所述Cas蛋白包括Cas9蛋白、Cas12蛋白或Cas13蛋白。优选地，所述治疗蛋白包括YAP(Yes相关蛋白)、LMNA(核纤层蛋白)、RPE65(全反式视黄醇酯异构酶)、SMN1(运动神经元存活基因1蛋白)、FVIII(凝血因子VIII)、FIX(凝血因子IX)或其相同功能衍生物。优选地，所述标记蛋白包括eGFP(增强绿色荧光蛋白)、tdTomato(红色荧光蛋白变体)、mCherry(樱桃红荧光蛋白)、Luciferase(萤光(素)酶)、SEAP(分泌型胎盘碱性磷酸酶)、CAT(过氧化氢酶)、GST(谷胱甘肽巯基转移酶)、β-GUS(β-葡萄糖苷酸酶)、β-Gal(β-半乳糖苷酶)或其相同功能衍生物。优选地，所述非编码RNA包括具有基因抑制功能的miRNA、shRNA或LncRNA中的至少一种。
在一个实施例中，本公开所述核酸分子的构建方法包括将去除5’端起始密码子的目的基因连接于本公开所述可变剪接调节元件的3'端，使所述目的基因与可变剪接调节元件中的起始密码子使用同一个读码框。
在本公开的第三方面，提供了根据本公开第二方面所述的核酸分子在可变剪接调节小分子药物存在时的转录物；在另一个实施例中，提供了根据本公开所述的核酸分子在可变剪接调节小分子药物不存在时的转录物；其中，可变剪接调节小分子药物为LMI070、或与LMI070在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物、或LMI070药学上可接受的盐；或者可变剪接调节小分子药物为Risdiplam、或与Risdiplam在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物、或Risdiplam药学上可接受的盐。
在一个实施例中，所述核酸分子为DNA分子，所述转录物为RNA分子。
在一个实施例中，所述转录物为从5'端至3'端依次包含第一外显子和第二外显子的mRNA，核苷酸序列为SEQ ID NO:14，或包含SEQ ID NO:14。
在另一个实施例中，所述转录物为从5'端至3'端依次包含第一外显子、假外显子和第二外显子的mRNA，所述假外显子和所述第二外显子的交界处序列优选为TGATTT，其中TGA属于所述假外显子，TTT属于所述第二外显子，进一步所述mRNA的核苷酸序列为SEQ IDNO:15，或包含SEQ ID NO:15。
在本公开的第四方面，本公开提供了一种载体，包含根据本公开所述的核酸分子或者根据本公开所述的转录物。
在一个实施例中，所述载体是DNA或RNA载体。优选地，所述载体是环状载体。更优选地，所述载体是质粒。
在一个实施例中，所述载体是双链的或单链的；优选地，所述载体是双链的。
在一个实施例中，所述载体是病毒载体。优选地，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体、嵌合AAV载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杆状病毒载体或其任何突变体或衍生物。优选地，所述病毒载体是重组AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、或单链AAV(ssAAV)载体。优选地，所述重组AAV载体包括一个或多个反向末端重复(ITR)，可选地其中所述ITR是AAV2 ITR，可选地其中所述AAV载体包括两个ITR。
在本公开的第五方面，本公开提供了一种重组病毒，所述重组病毒包含根据本公开第一方面所述的可变剪接调节元件、本公开第二方面所述的核酸分子、本公开第三方面所述的转录物或本公开第四方面所述的载体。
在一个实施例中，所述重组病毒是腺相关病毒(AAV)、嵌合AAV、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、杆状病毒、或其任何突变体或衍生物。优选地，所述重组病毒是AAV。更优选地，所述AAV包含以下的一种或多种：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh36、AAVrh37、AAVrh74、AAVrh79、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV-PHP.B、AAV-PHP.B2、AAV-PHP.B3、AAV-PHP.A、AAV-PHP.eB、AAV-PHP.S、AAV2i8、MyoAAV、AAVMYO、AAV.CPP.16衣壳血清型或其变体，例如来自一个以上AAV血清型的衣壳的组合。在一个实施例中，所述AAV是AAV9。
在本公开的第六方面，本公开提供了一种细胞，所述细胞包含一种或多种本公开第一方面所述的可变剪接调节元件、或者包含一种或多种本公开第二方面所述的核酸分子、或者包含一种或多种本公开第三方面所述的转录物、或者包含一种或多种本公开第四方面所述的载体、或者包含一种或多种根据本公开第五方面所述的重组病毒。
在一个实施例中，所述细胞为人细胞。其中，所述人细胞可以为体内的细胞，也可以是从体内分离的细胞；还可以是永生化的细胞系或癌细胞。
优选地，所述人细胞为心脏细胞、肌肉细胞、神经元、肝细胞、脾细胞、肺细胞或肾细胞。
在一个实施例中，当所述细胞中存在可变剪接调节小分子药物时，所述目的基因的表达水平比当所述细胞中不存在所述可变剪接调节小分子药物时的目的基因表达水平高1～2000倍，例如高1～100倍、1～300倍、1～500倍、1～700倍、1～900倍、1～1100倍、1～1300倍、1～1500倍、1～1700倍、1～1900倍、1～2000倍；任选地，当所述细胞中不存在所述可变剪接调节小分子药物时，无法检测到目的基因表达水平。
在本公开的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本公开第一方面所述的可变剪接调节元件、或者包含一种或多种本公开第二方面所述的核酸分子、或者包含一种或多种本公开第三方面所述的转录物、或者包含一种或多种本公开第四方面所述的载体、或者包含一种或多种根据本公开第五方面所述的重组病毒、或者一种或多种根据本公开第六方面所述的细胞。
在本公开的第八方面，提供了一种基于可变剪接调节小分子药物调节目的基因的表达量的方法，所述方法包括：使一种或多种本公开第一方面所述的可变剪接调节元件、或者一种或多种本公开第二方面所述的核酸分子、或者一种或多种本公开第三方面所述的转录物、或者一种或多种本公开第四方面所述的载体、或者一种或多种本公开第五方面所述的重组病毒、或者一种或多种本公开第六方面所述的细胞与一种或多种可变剪接调节小分子药物接触，其中，当存在可变剪接调节小分子药物时，所述目的基因的表达水平比当不存在所述可变剪接调节小分子药物时的目的基因表达水平高1～2000倍，例如高1～100倍、1～300倍、1～500倍、1～700倍、1～900倍、1～1100倍、1～1300倍、1～1500倍、1～1700倍、1～1900倍、1～2000倍；任选地，当不存在所述可变剪接调节小分子药物时，无法检测到目的基因表达水平。
在本公开的第九方面，提供了一种治疗有需要的受试者的基因治疗方法，所述基因治疗方法包括向所述受试者施用一种或多种本公开第一方面所述的可变剪接调节元件、或者一种或多种本公开第二方面所述的核酸分子、或者一种或多种本公开第三方面所述的转录物、或者一种或多种本公开第四方面所述的载体、或者一种或多种本公开第五方面所述的重组病毒、或者一种或多种本公开第六方面所述的细胞、或者一种或多种本公开第七方面所述的药物组合物，以及一种或多种可变剪接调节小分子药物；其中，当存在可变剪接调节小分子药物时，所述目的基因的表达水平比当不存在所述可变剪接调节小分子药物时的目的基因表达水平高1～2000倍，例如高1～100倍、1～300倍、1～500倍、1～700倍、1～900倍、1～1100倍、1～1300倍、1～1500倍、1～1700倍、1～1900倍、1～2000倍；任选地，当不存在所述可变剪接调节小分子药物时，无法检测到目的基因表达水平。
在本公开的第十方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含：(1)一种或多种本公开第一方面所述的可变剪接调节元件、或者一种或多种本公开第二方面所述的核酸分子、或者一种或多种本公开第三方面所述的转录物、或者一种或多种本公开第四方面所述的载体、或者一种或多种本公开第五方面所述的重组病毒、或者一种或多种本公开第六方面所述的细胞、或者一种或多种本公开第七方面所述的药物组合物；和/或(2)一种或多种可变剪接调节小分子药物。
在本公开的第十一方面，提供了(a)和(b)用于调节目的基因表达量或者用于制备基因治疗药物的用途，其中(a)选自一种或多种本公开第一方面所述的可变剪接调节元件、或者一种或多种本公开第二方面所述的核酸分子、或者一种或多种本公开第三方面所述的转录物、或者一种或多种本公开第四方面所述的载体、或者一种或多种本公开第五方面所述的重组病毒、或者一种或多种本公开第六方面所述的细胞、或者一种或多种本公开第七方面所述的药物组合物，以及(b)为可变剪接调节小分子药物。
优选地，所述基因治疗药物能够治疗的适应症包括缺血性心脏病及心肌病等心脏疾病、肌营养不良、神经肌肉性疾病、早衰症、视网膜色素变性(又称色素性视网膜炎，Retinitis Pigmentosa)、先天性黑蒙症(Leber’s congenital amaurosis,LCA)、老年黄斑变性、脊髓型肌萎缩症(SMA)、血友病等。
在本公开的第十二方面，提供一种探针，所述探针靶向本公开第三方面中在可变剪接调节小分子药物存在时的转录物中假外显子和第二外显子交界处。
在一个实施例中，所述探针含有与SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
在一个实施例中，所述探针的5’端包含荧光基团修饰，探针的3’端包含非荧光淬灭基团修饰；其中，荧光基团包括但不限于HEX、VIC、FAM或TET，非荧光淬灭基团包括但不限于MGB、TAMRA或BHQ。
在本公开的第十三方面，提供了一种用于检测根据本公开第一方面所述的可变剪接调节元件、或者一种或多种本公开第二方面所述的核酸分子、或者一种或多种本公开第三方面所述的转录物、或者一种或多种本公开第四方面所述的载体、或者一种或多种本公开第五方面所述的重组病毒、或者一种或多种本公开第六方面所述的细胞、或者一种或多种本公开第七方面所述的药物组合物的方法，其中所述方法包括qPCR扩增步骤，所述qPCR扩增步骤中使用本公开第十二方面所述的探针。所述qPCR扩增步骤包括，使本公开所述转录物中的mRNA或其PCR扩增产物与一种或多种本公开所述的探针接触，而后定量检测其反应程度，当所述探针携带荧光基团时，所述反应程度可以通过荧光信号强度来表征。
在一个实施例中，所述qPCR扩增步骤中使用的上游引物选自SEQ ID NO:17。
在一个实施例中，所述方法在qPCR扩增步骤之前还包括RT-PCR扩增步骤，优选地，所述RT-PCR扩增步骤中使用的上游引物选自SEQ ID NO:18。
本公开取得的有益效果包括：
(1)现有技术使用的RNA剪接调节药物限于LMI070，而本公开提供的可变剪接调节元件能够被多种可变剪接调节小分子药物调节，例如RISDIPLAM和LMI070。其中，RISDIPLAM是FDA获批上市的药物，可用于临床治疗，而LMI070尚未获得FDA批准上市，因此本公开提供的可变剪接调节元件具有更大的应用价值和更广的应用前景。
(2)现有技术中响应RNA剪接调节药物调节基因表达的能力有限，通常不超过200倍，而本公开提供的可变剪接调节元件能够取得至高2000倍的调节倍数。
(3)现有技术的RNA剪接变化的检测方法有限，本公开针对多个不同组成的可变剪接调节元件设计了能够准确检测RNA剪接的探针，并构建了准确的检测方法。
(4)现有技术核酸序列较长，不小于560bp，且其中具有关键功能的内含子序列不清楚。本公开通过对初始获得的可变剪接调节元件进行逐段截短测试，明确了其中关键的内含子序列，从而获得了既载荷低，又具有高调节能力的可变剪接调节元件。例如从可变剪接调节元件Zf1出发经过优化得到与Zf1功能相近的Zf2序列和Zf3序列，其中Zf3序列仅403bp。
(5)现有技术来源于体外培养的细胞，是否在体内心脏、骨骼肌、肝脏等器官中也能起作用并不清楚。本公开提供的可变剪接调节元件序列来源于心脏组织，已经确定其在心脏、骨骼肌、肝脏等器官中具有功能。
(6)现有技术会在下游表达的目的基因上增加额外的未知功能的氨基酸序列，如何无痕地表达目的基因的技术尚不明确。本公开提供的可变剪接调节元件和下游目的基因之间不存在多余序列，或者存在仅起连接作用，不具备表达功能的序列(例如P2A序列)，移除了现有技术可变剪接调节元件表达的额外氨基酸，实现了无痕的目的基因表达。
附图说明
为了更清楚地说明本公开具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本公开的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为小鼠心脏中受Risdiplam(RIS)调控的可变剪接片段的发现过程；
图2为改造备选序列并筛选出基因表达调控开关Zfr的过程；
图3为基因表达调控开关Zfr的体外验证与评估结果；
图4为基因表达调控开关Zfr的体内验证与评估结果；
图5为LMI070(LMI)和RIS分别作用在Xon或者Zfr上的对比分析；
图6为Zfr控制YAP基因表达的研究和验证；
图7为Zfr控制CRISPR/Cas9基因编辑的研究和验证；
图8为通过删除部分内含子序列降低Zf元件体积的研究。
具体实施方式
(Ⅰ)定义或术语
本公开涉及的相关定义或术语，应用以下缩写。除非另有定义，否则本文所用的全部科技术语都具有本领域普通技术人员通常理解的含义。以下术语在下文提供。
在本文中，单数形式“一个/种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数形式，除非上下文另外明确地指示。如技术人员从本文包含的教导中显而易见的是，当在数值和范围的语境中使用时，术语“约”或“大约”是指近似或接近所指定的值或范围的值或范围，使得实施例可以按照预期执行。在一些实施例中，“约”意指数值量±10％。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式。它们可以包括一种或多种核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA，基因组DNA，cDNA，DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生化修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物，例如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白或肽典型地含有至少两个氨基酸或氨基酸变体，并且对可包含蛋白或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸或变体的任何肽或蛋白。这些术语包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“同一性”和“同源性”在本文中可互换使用，其在用于描述多核苷酸或多肽序列时是指当比较或比对多肽或多核苷酸的两个序列时，相同且处于相同相对位置的碱基或氨基酸的百分比。序列同一性可以以多种不同的方式确定。例如，可以使用各种方法和计算机程序(例如，BLAST、T-COFFEE、MUSCLE、MAFFT等)比对序列。
本公开描述的核酸分子例如可以是一种分离的核酸分子。术语“分离的”在用于核酸分子或蛋白分子时是指已与在自然环境中通常存在的与其相关的一种或多种组分分开的核酸或蛋白。分开可以包括从较大的核酸(例如，从基因或染色体)或从通常与所述核酸或蛋白接触的其他蛋白或分子脱离。所述术语涵盖但不要求完全分离。
本公开提供的核酸分子包含可变剪接调节元件和编码目的分子(例如目的蛋白)的目的基因，其中所述目的基因可操作地连接于所述可变剪接调节元件的3'端。本领域技术人员将理解，所述目的基因与所述可变剪接调节元件之间的连接可以是紧密连接的，即所述目的基因与所述可变剪接调节元件之间不存在任何核酸序列；所述目的基因与所述可变剪接调节元件之间的连接也可以是非紧密连接的，即所述目的基因与所述可变剪接调节元件之间存在其他核酸序列，只要所述其他核酸序列不影响目的基因的表达并且不影响所述可变剪接调节元件的功能即可满足本发明的目的，例如所述其他核酸序列内不含有终止密码子，也不含有起始密码子(例如ATG)，同时所述其他核酸序列的核苷酸数目为3的倍数，从而不会影响目的基因的读码框。
本公开提供的核酸分子可以是任何类型的核酸分子，只要所述核酸分子能够实现本发明的目的。例如，本发明的核酸分子可以是单链或双链的脱氧核糖核酸分子(即DNA分子)，也可以是单链或双链的核糖核酸分子(即RNA分子)；本发明的核酸分子可以是线性或环状的。
术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能性关系。典型地，该术语是指转录调节序列与待转录序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列例如在适当的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则启动子或增强子序列与编码序列可操作地连接。通常，与序列可操作地连接的启动子转录调节序列与该序列邻接或由短间隔子序列分开，即他们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列如增强子不需要在物理上邻接或位于极为接近这些转录调节序列增强其转录的编码序列的位置。
术语“DreAM”为Drug-elicitableAlternative-splicing Modulator的缩写，即利用RNA剪接调节剂调控基因表达的核酸分子。
下面将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。对示例性实施例的描述仅仅是说明性的，并不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。本发明可以以许多不同的形式实现，不限于这里所述的实施例。提供这些实施例是为了使本发明透彻且完整，并且向本领域技术人员充分表达本发明的范围。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中描述的技术手段应被解释为仅是示例性的，而非限制性的。
可变剪接调节元件
本发明提供的可变剪接调节元件包含多个内含子和外显子以及至少一个可变剪接调节小分子药物结合位点的核酸序列。在实施例中，所述可变剪接调节元件与所述目的基因可操作地连接，所述目的基因位于所述可变剪接调节元件的下游位置。本公开提供的可变剪接调节元件与一种或多种可变剪接调节小分子药物结合使用，能够调节(例如打开)所述目的基因的表达。本公开提供的基于可变剪接调节元件与一种或多种可变剪接调节小分子药物的结合使用的调节呈现出剂量相关性，即能够通过施用不同剂量的可变剪接调节小分子药物来控制目的基因表达水平。另外，本公开提供的基于可变剪接调节元件与一种或多种可变剪接调节小分子药物的结合使用的调节呈现出时间相关性，即能够通过不同时间施用可变剪接调节小分子药物来控制目的基因表达水平。
在多个方面，可变剪接调节元件从5'至3'端至少依次包含：第一外显子、第一内含子、假外显子、第二内含子、第二外显子。其中一种或多种可变剪接调节小分子药物结合于所述假外显子和所述第二内含子的交界处的序列。其中，在所述可变剪接调节小分子药物存在的情况下，所述假外显子包括在所述核酸的mRNA产物中；并且在所述可变剪接调节小分子药物不存在的情况下，所述假外显子不包括在所述核酸的mRNA产物中。
在本公开中，可变剪接调节元件的假外显子具有唯一的起始密码子(例如ATG序列)。
可变剪接调节小分子药物
本公开所使用的可变剪接调节小分子药物是指能够介导可变剪接的化合物。在一些实施方式中，所述可变剪接调节小分子药物调节(特别是增加)mRNA产物包含所述假外显子。在一些实施方式中，所述可变剪接调节小分子药物结合所述可变剪接调节元件中的特定位置的序列。优选地，在一些实施方式中，所述可变剪接调节小分子药物结合的可变剪接调节元件中的特定位置位于所述假外显子的3'端与第二外显子5'端的接合处。更优选地，在一些实施方式中，所述可变剪接调节小分子药物结合的可变剪接调节元件中的特定位置位于所述假外显子的3'端与第二外显子5'端的接合处的AGAGTA序列，其中AGA为所述假外显子3'端的最后3个核苷酸残基，GTA为所述第二内含子5'端的第1～3个核苷酸残基。
在可变剪接调节小分子药物的第一个方面，本公开使用的可变剪接调节小分子药物为LMI070或与LMI070在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物或LMI070药学上可接受的盐，其中LMI070又名Branaplam或NVS-SM1，是具有如下式(1)所示结构的化合物。
与LMI070在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物是指在式(1)化合物的基础上通过本领域常规使用的基团替换所得到的衍生化合物，并且衍生化合物与LMI070在所述可变剪接调节元件上结合相同的序列片段；作为是否属于本公开限定的衍生物的检验手段，本领域技术人员可通过简单的试验加以确定，例如针对本公开所述的可变剪接调节元件是否也能够产生和LMI070相同的效果，即如果加入LMI070的某种衍生物后也可以使生成的mRNA包含所述假外显子，则该种衍生物即属于本公开所述的与LMI070在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物。
LMI070药学上可接受的盐的例子包括但不限于无机和有机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐和草酸盐；以及与碱例如钠羟基、三(羟基甲基)胺基甲烷(TRIS，胺丁三醇)和N-甲基葡糖胺形成的无机和有机碱盐。
在可变剪接调节小分子药物的第二个方面，本公开使用的可变剪接调节小分子药物为Risdiplam或与Risdiplam在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物或Risdiplam药学上可接受的盐，其中Risdiplam是具有如下式(2)所示结构的化合物。
与Risdiplam在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物是指在式(2)化合物的基础上通过本领域常规使用的基团替换所得到的衍生化合物，并且衍生化合物与Risdiplam在所述可变剪接调节元件上结合相同的序列片段；作为是否属于本公开限定的衍生物的检验手段，本领域技术人员可通过简单的试验加以确定，例如针对本公开所述的可变剪接调节元件是否也能够产生和Risdiplam相同的效果，即如果加入Risdiplam的某种衍生物后也可以使生成的mRNA包含所述假外显子，则该种衍生物即属于本公开所述的与Risdiplam在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物。
Risdiplam药学上可接受的盐的例子包括但不限于无机和有机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐和草酸盐；以及与碱例如钠羟基、三(羟基甲基)胺基甲烷(TRIS，胺丁三醇)和N-甲基葡糖胺形成的无机和有机碱盐。
切割位点
在一些实施方案中，本公开的核酸分子可选地包括一个或多个编码切割位点的序列，所述编码切割位点的序列位于所述可变剪接调节元件和所述目的基因之间，用于实现将所述可变剪接调节元件和所述目的基因切割分离的目的。所述切割位点可以是自切割位点、蛋白酶切割位点或二者的组合。
2A肽
2A肽是来源于病毒的短肽(个氨基酸)，它们通常被称为“自我剪切”肽，能使一条转录产物产生多种蛋白。2A肽并不是完全的“自我剪切”，而是通过使核糖体跳过2A元件C-末端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。其中，上游蛋白的C端将会添加一些额外的2A残基，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。目前有四种常用的2A肽，分别是P2A，T2A，E2A和F2A，来源于四种不同的病毒。
目的基因
本公开通过提供的可变剪接调节元件控制目的基因的表达。目的基因是出于基因治疗或者其他目的需要在体内或细胞内希望增加或减少或受控表达的蛋白质或核酸的编码基因。不受理论的限制，技术人员可使用本公开的可变剪接调节元件构建包含任何目的基因的核酸分子。在一些实施方案中，目的基因可以是编码蛋白的基因，如编码抗体或功能性结合片段、受体、酶等的基因。在一些实施方案中，目的基因可以是编码转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)或者Cas9蛋白的基因。在一些实施方案中，目的基因可以是转录产生RNA的基因，例如转录产生抑制性RNA的基因，例如miRNA、shRNA、LncRNA等。本公开提供的核酸分子中所包含的目的基因的数量可多于一种或多种。
包含可变剪接调节元件的核酸分子的检测
本公开提供的核酸分子包括可变剪接调节元件和目的基因，其中可变剪接调节元件的组成具有如本公开所述的限制性条件，但本领域技术人员能够理解的是，目的基因的选择范围是广泛且不固定的，可根据使用本公开核酸分子的目的不同而选择不同的目的基因。基于此，出于确定本公开所述的核酸分子存在的定性或定量检测的目的，能够使用例如RT-PCR的方法进行检测，其中所用引物对的上游引物(或称为正向引物，forward primer)根据可变剪接调节元件设计，但下游引物(或称为反向引物，reverse primer)需要根据目的基因的不同而进行设计。可采用本领域已知的引物设计的原则、工具、方法进行下游引物的设计和筛选。
荧光探针
荧光探针(例如Taqman探针)为一寡核苷酸，两端分别标记一个发射基团和一个淬灭基团。当探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；当PCR扩增时，Taq酶的5’～3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光发射基团荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而实现定量。目前常用的荧光基团有FAM、TET、VIC、HEX等，常用的荧光淬灭基团有MGB、TAMRA、BHQ等。
Zfr基因
Zfr编码锌指RNA结合蛋白(zinc finger RNA binding protein)，该基因编码一种RNA结合蛋白，其特征在于其DZF(与锌指相关的结构域)结构域。编码的蛋白质可能在神经元中另一种RNA结合蛋白Staufen同系物2的核质穿梭中发挥作用。该基因的表达通过介导差异MicroRNA靶向的替代聚腺苷酸化来调节。已在患有胰腺癌的人类患者中观察到该基因的表达升高，并且该基因的敲低可能导致胰腺癌细胞的活力和侵袭性降低。
Tlk2基因
TLK2(Tousled样激酶2)是一种蛋白质编码基因。与TLK2相关的疾病包括智力发育障碍、常染色体显性57型和异食癖。其相关途径包括miRNA对DNA损伤反应的调节和Chks在检查点调节中的作用。
Agrn基因
AGRN(Agrin)是一种蛋白质编码基因。与AGRN相关的疾病包括肌无力综合征、先天性、8和突触前先天性肌无力综合征。其相关途径包括硫酸软骨素/硫酸皮肤素代谢和糖胺聚糖代谢。
Ubap2l基因
UBAP2L(泛素相关蛋白2类似物)是一种蛋白质编码基因。与UBAP2L相关的疾病包括脊髓神经母细胞瘤和脊髓原始神经外胚层肿瘤。其相关途径包括VEGFA-VEGFR2信号传导。
Angel2基因
ANGEL2(Angel同源基因2)是一种蛋白质编码基因。与ANGEL2相关的疾病包括桥小脑发育不良、7型和类风湿性关节炎间质性肺病。
E030003E18Rik基因
来源于小鼠第19染色体的20495496～20495544(NCBI Gene ID:320092)，目前没有该基因的相关研究报道。
(Ⅱ)示例性实施例
以下实施例说明性地例示了本公开的技术方案，但不构成对本公开保护范围的任何限制。
本公开相关实验采用野生型C57BL/6小鼠作为动物模型。动物生产、繁育和实验在北京大学医学部实验动物科学部完成。涉及到的相关实验操作获得北京大学生物医学伦理委员会批准(批准号：2022412)。
实施例1响应Risdiplam的剪接调节元件的发现
发现小鼠心脏中受Risdiplam调控的可变剪接片段的过程参见图1中的A。选用Risdiplam(T16757，TargetMol)作为小分子剪接调节剂，以粉末状固体于-80℃冰箱长期保存备用，每次实验前配置成1mg/ml的溶液以用于动物给药。溶液的溶剂配方为10％DMSO+40％PEG300+5％TWEEN 80+45％生理盐水。
称量小鼠体重，并按照10mg/kg的剂量给药，6～10周龄成年小鼠在清醒状态下灌胃施用小分子剪接调节剂，对照组给予等量的溶剂(SOL)，每组n＝5，给药48小时后，将小鼠异氟烷麻醉处死后迅速取心尖组织冻于-80℃，用于RNA测序实验。
通过以下方法提取RNA，小鼠组织首先使用匀浆机(DREMEL F6/10)破碎组织，然后使用Trizol(TransGen，ER501-01)提取RNA，分装并保存于-80℃。提取的RNA质检后取1mg反转录cDNA，使用KAPA Hyper Prep Kits文库构建试剂盒(KAPA，KK8504)完成Bulk转录组文库构建，经过Fragment Analyzer 1.0.2.9质检、qPCR定量之后，通过Illumina Nova-seq测序平台进行PE150双末端测序(二代测序)，返回的测序数据使用生物信息学技术进行分析。
将上述二代测序结果使用Trim Galore软件做预处理，并用FastQC软件对处理后数据进行质量控制，随后通过STAR软件将质控后的测序结果与小鼠mm10参考基因组比对，结合统计学分析结果进行筛选，然后使用CASH软件进行可变剪接分析，筛选得到潜在的6个可变剪接候选位点(包括Tlk2、Agrn、Ubap2l、Zfr、Angel2和E030003E18Rik基因位点，图1中的B～C，其中C显示了备选序列所在的小鼠基因组中的位置，包括包含该序列的基因名称，以及在小鼠mm10参考基因组中的具体坐标)，筛选阈值包括：False Discovery Rate(FDR)<0.05；在溶剂对照组中，Percent Spliced-In(PSI)<0.05；在RIS处理组中，PercentSpliced-In(PSI)>0.4；可变剪接类型为“cassette exon”；RNA-seq数据中可变剪接相关的reads数量>400。并确定包含假外显子的可变剪接片段(图1中的D，备选序列RNA剪接的sashimi图，弧线和数字标注跨外显子的测序序列的reads数量，黑色方框标出假外显子(PSE))。
实施例2筛选获得Zfr剪接调节元件
为获得响应Risdiplam的最优剪接调节元件，需要对基因位点的序列片段进行修改后，对实施例1中潜在的可变剪接候选位点进行体外验证和对比：
发明人保留每个基因位点mRNA剪接所必需的序列(如图2中的A中标注的圆点位置所示)，包括第一外显子-第一内含子的连接序列、第一内含子中剪接所需的分支点序列、第一内含子-假外显子的连接序列、假外显子-第二内含子的连接序列、第二内含子中剪接所需的分支点序列、第二内含子-第二外显子的连接序列。同时在各个假外显子上设置唯一的ATG作为起始密码子，删减其他组分中的ATG和CTG等起始密码子序列，并且删除其他非必须的序列，将体积缩小以用于体外验证。
为了验证工程改造后来自不同基因的各个剪接调节元件序列的功能，发明人以已发表论文(Guo Y等，Analysis of Cardiac Myocyte Maturation Using CASAAV,aPlatform for Rapid Dissection of Cardiac Myocyte Gene Function In Vivo.CircRes.,120(12):1874-1888,2017)中公开的AAV-U6sgRNA-U6sgRNA-Tnnt2-Cre质粒载体为基础，构建了报告质粒CMV-DreAM-GFP(如图2中的B所示)，其中DreAM对应来源于不同基因位点的工程改造后的起始/初始剪接调节元件分别命名为DreAM-Tl(Tlk2)、DreAM-Ag(Agrn)、DreAM-Ub(Ubap2l)、DreAM-Zf1(Zfr)、DreAM-An(Angel2)、DreAM-E03(E030003E18Rik)，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:33～35、10、36～37所示。其中CMV为组成型表达启动子，GFP基因删除自身的ATG，并且与DreAM-Tl/DreAM-Ag/DreAM-Ub/DreAM-Zf1/DreAM-An/DreAM-E03中的ATG使用同一个读码框。同时，作为阳性对照组(positive control group,PC)，发明人构建了CMV-GFP报告质粒，GFP基因保留自身的ATG，作为阴性对照组(negative controlgroup,NC)构建了CMV-(ATG)GFP报告质粒，GFP基因删除自身的ATG。
为筛选获得响应Risdiplam的最优剪接调节元件，发明人将报告质粒CMV-DreAM-Tl-GFP、CMV-DreAM-Ag-GFP、CMV-DreAM-Ub-GFP、CMV-DreAM-Zf1-GFP、CMV-DreAM-An-GFP、CMV-DreAM-E03-GFP转染HEK293T细胞，转染CMV-(ATG)GFP质粒的为阴性对照组，1μM的Risdiplam处理24h后，使用荧光显微镜拍摄细胞荧光信号，并对荧光信号强度进行定量分析(图2中的B～D，其中C为各组GFP荧光显微成像图片，D为采用酶标仪对GFP荧光强度进行定量(n＝4))结果显示，加Risdiplam后，转染含有剪接元件报告质粒的细胞表达GFP荧光信号，Risdiplam具有诱导可变剪接调控的功能。且在给药前后，DreAM-Zf元件GFP荧光信号的表达差异最为显著(图2中的E，RIS处理相对SOL对照组的荧光强度倍数)。
本发明发现的起始/初始DreAM-Zf1剪接调节序列长1234bp，包括第一外显子-第一内含子的连接序列(CAGGTA)、第一内含子中剪接所需的分支点序列(CTTAACAT，第五位A为分支位点)、第一内含子-假外显子的连接序列(TAGGTT)、假外显子-第二内含子的连接序列(ATGAGTA)、第二内含子中剪接所需的分支点序列(TCTAACTC，第五位A为分支位点)、第二内含子-第二外显子的连接序列(CAGTTT)。该起始/初始的DreAM-Zf1的核苷酸序列如下：
ACTGACCAACAGCGTGAAGACATTACATCCAGTGCACAGGTAATTGAATTCTTGTTGGATTACTGTCTCTAAGGCCTGGGAGTTTTATAATTGTTTCTTTATGTGTAATAATAACCGTACTAGTCATTGTGATACTTATTTGGGAAGTAAGCCTTTAAAGAGGTTATTAAAAAGATTTACTGATTCCCACACCGGAAGTTGCTCTTCTAGCCGTGAAAGAAGGACGGCGTGGTCTTCAGTTTGCTATGTCCACTAACAATATGTCCGACCCACGAAGGCCCACCAAAGTTATACTTGTGGCACATATAAACCTTTGGAATCAAGGGACCTGATACTGGATTATTAAATATTTAAGAGAATTTATATTTAATAAACTTGATACTTCAGTGAGAAAGGACAAATCATCAGTAGAATGGTTTTGAGATAGCTGATGATTCTATTAAAAGTAGATATGTGTGTGGGTTAAATGACTTAAGCATACATCAAAAGACTGAGAAAGGCTCTTAACATTAAAAGATGGGCCtttttttttCTTTTAGGTTAAAGGATTACATATTAAAAATATTGTATAGACTCTTTAAGGCCAAAGAAGTGTGCTCATTTCTCCCGATTAAAAGTTATGAGTAAGAATTGGGTATTTTGCCTTTTGGGGGTGGGAGAtttgaaacagggtttctccttacagctctggctttcctggagcagtgaattgagcctggctcctctgtaggagtaacgagttgctttaaccactgacatctttccaccaccaccaccaccCCTTATGAATAGACTAAATTTATTTAAAGATTGATATTTTCTAGCTTAATTATTTGGAAAGCAAATAAGCACACAGAAAAGCCTCCTCCCCaaaaaaatataaataaaaaaGTCTATCAGGACATAGTATATGTCCCTTCTGATTAATCATTGGTGGTGAAACAACCCATTCAGGGTGTCTCTTCCATCACAGTGGAtttttttCATATTGTTACATGGAGAAGTTAACTTAGTAAGAATTGATGTGCTTCTGTGCCAGTGAGATAGCTCTGCAGGTAAAAGGGAGACTGACCCCCAACTTGTACTCTGGCCGTGGCAGTCATGTGCACACAAGTAAACTGAATAAATATAAAGAGCAGATTTTAGAGTGTTTTGGCTTTAAATTAATTCTATATTCTAACTCTATTTGCAGTTTGCATTGAGACTCCTTGCATTCCGTCAGATACACAAAGTT(Zf1,SEQ ID NO:10)；
其中，所述可变剪接调节元件的各区域划分如表1所示。
表1可变剪接调节元件的各区域序列
注：假外显子3'端与第二内含子5'端紧接的序列TGAGTA(本表中下划线标示的序列)为Risdiplam的结合位点。
实施例3构建Zfr剪接调节元件的质粒
为了精确定量核酸调节元件的可变剪接调控假外显子的产生，发明人设计了Taqman探针qPCR法进行检测，其中，上游引物设计在假外显子上，Taqman探针设计在剪接发生后的假外显子与第二号外显子连接出，探针为HEX激活，MGB淬灭方式，下游引物设计在目的基因(GFP)上(图3中的A)。将CMV-DreAM-Zf1-GFP质粒转染HEK293T细胞，然后用1μM的Risdiplam处理，用DMSO处理作为溶剂对照组，分别在0，3，6，12，18，24，36，48小时后，收集细胞进行Taqman-qPCR检测并定量分析(图3中的B，每组n＝3，t检验对比RIS和SOL的差别，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。灰色数值标记每个时间点RIS对比SOL的倍数)。结果显示，Risdiplam具有改变DreAM的剪接产物，诱发含有假外显子的转录物高表达的功能，并且这种功能呈现出与给药时间的正相关性。为了进一步验证核酸调节元件的可变剪接调控，发明人同时用RT-PCR法进行检测。RT-PCR的上游引物设计在第一号外显子上，序列：CGTGAAGACATTACATCCAGTGCA(SEQ ID NO:18)；下游引物设计在目的基因上(图3中的C)序列：TGAACTTGTGGCCGTTTACGT(SEQ ID NO:42)，用来测量包含PSE(243bp条带)与不含PSE(159bp条带)的mRNA的相对含量。结果显示Risdiplam诱导可变剪接调控的功能在加药3h即发生作用，在6h时趋向饱和(图3中的D，底部是RT-PCR电泳图，上部是定量图(n＝3))。
为了探索Risdiplam给药浓度与核酸调节元件的可变剪接调控之间的关系，发明人将CMV-DreAM-Zf1-GFP的质粒转染HEK293T细胞，然后分别用0，0.05，0.5，3，10μM的Risdiplam处理，转染CMV-GFP质粒的为阳性对照组，转染CMV-(ATG)GFP质粒的为阴性对照组，Risdiplam处理24h后，观察荧光信号强度并进行定量分析，同时收集细胞，分别用Taqman探针qPCR法和RT-PCR法对Risidiplam诱导核酸调节元件产生的假外显子和可变剪接调控进行定量检测(图中的3中的E～G，其中E和F分别为加入不同浓度的RIS处理，在处理24h后收样，通过qPCR(E)和RT-PCR(F)分析RIS浓度和RNA剪接的关系。G为不同浓度的RIS处理24h后GFP荧光信号的定量分析，不含DreAM-Zf1的常规报告基因质粒作为正对照，柱状图上的数值反映相对于正对照的相对荧光强度)。结果显示，加Risdiplam后，细胞表达GFP荧光信号，Risdiplam具有诱导可变剪接调控的功能，并且这种功能呈现出与给药浓度的正相关性。
实施例4构建Zf1元件控制的AAV载体
为验证DreAM-Zf1元件在体内是否有效，发明人包装了含CMV-DreAM-Zf1-GFP的AAV9病毒载体。其中，AAV质粒构建的方法如下：DreAM-Zf1序列在保留部分野生型小鼠基因组序列的基础上重新设计，通过设计引物、使用小鼠基因组进行多个片段的扩增与无缝克隆拼接构建，如图4中的A所示。CMV和GFP序列来自Addgene等公开的数据源。DNA拼接和质粒构建通过无缝克隆反应构造。
AAV包装方法如下：AAV包装使用的质粒为70μgAAV质粒(含CMV-DreAM-Zf1-GFP元件)、70μg AAV9 Rep/Cap质粒和160μg pHelper辅助质粒。这些质粒通过PEI转染试剂(Yeasen，40816ES03)转染到15cm皿培养的HEK293T细胞中，转染60小时后，刮下细胞并重悬于裂解缓冲液(20mM Tris pH＝8，150mM NaCl，1mM MgCl2，50μg/ml苯甲酸酶(Yeasen，20156ES60))中，三次反复冻融裂解细胞，将AAV9释放到溶液中。同时，用40％PEG8000(Sigma，P2139)在2.5M NaCl溶液中沉淀细胞培养基中的AAV9，再用裂解缓冲液重悬，并与细胞裂解液混合。裂解液中的AAV在Optiprep(Sigma，D1556-250ML)密度梯度中通过70Ti转子超速离心(Beckman，XPN-100)纯化，接下来使用100kDa离心过滤管(Millipore，UFC910096)，将AAV换入0.001％pluronic F68/PBS(Caisson，PFL01-100ML)溶液中并浓缩。利用识别GFP序列的引物AAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGC(SEQ ID NO:45)和CTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA(SEQ ID NO:46)，通过qPCR技术测量AAV滴度。
在小鼠出生后一天(P1)，将小鼠用异氟烷麻醉后，通过皮下注射，将包含DreAM-Zf1元件的AAV9病毒载体(AAV-CMV-DreAM-Zf1-GFP)注入体内。7天后对小鼠腹腔注射10mg/kg Risdiplam，分别在给药1，2，3，4，5天后取心脏、肝脏、骨骼肌组织进行Taqman探针法qPCR，RT-PCR及Westernblot分析，共聚焦显微镜观察GFP荧光信号(图4中的B～D所示，B:以RIS注射当天的样品为对照，通过Taqman探针法，检测含PSE的mRNA随时间的变化。C:RT-PCR分析含PSE和不含PSE的可变剪接后的mRNA的相对含量。D～E:Western blot分析GFP蛋白随时间的变化，以RIS注射当天的样品为对照，进行定量分析)，评估Zf1元件的工作能力(n＝2/组)。
Taqman-qPCR和RT-PCR的操作方法为：新鲜取下的组织在预冷PBS中冲洗干净后，置入无RNA酶的EP管中加入1mL Trizol裂解液进行研磨，磨碎至无明显组织块。室温静置5min后，置于4℃离心机12000g离心5min，上清转移至新的无酶EP管中。加入200uL氯仿，剧烈振荡混匀。冰上静置5min，12000g 4℃离心15min。将上清液转移至新的EP管中，加入与上清液等量的无水乙醇，轻轻摇晃混匀后转入市售的RNA提取Kit的吸附柱中，按照说明书操作进行进一步洗脱(TransZol Up Plus RNA Kit，TranGene，ER501)。对于提取的RNA使用NanoDrop2000(Thermofish)进行浓度测定后，利用市售的逆转录试剂(III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR，Vazyme，R333)按照说明书操作，进行逆转录，得到cDNA进行进一步的Taqman-qPCR和RT-PCR。
Taqman-qPCR：
1.在qPCR管中配制如下混合液
2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10μl
GAPDH-Primer-F(10μM) 0.2μl
GAPDH-Primer-R(10μM) 0.2μl
GAPDH-TaqMan Probe(10μM) 0.2μl
Zf1-Primer-F(10μM) 0.2μl
Zf1-Primer-R(10μM) 0.2μl
Zf1-TaqMan Probe(10μM) 0.2μl
50×ROX Reference Dye 2 0.4μl
cDNA 1μl
ddH2O Up to 20μl
其中，引物序列如下：
2.按下列条件进行qPCR反应
3.反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量计算及统计分析。
RT-PCR：
1.在qPCR管中配制如下混合液
其中引物序列如下：
2.按下列条件进行qPCR反应
3.PCR产物以1.5％琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，在凝胶成像仪系统中进行显像。
结果显示，在Risdiplam腹腔注射后，假外显子剪接入mRNA的程度，通过qPCR检测在注射后1天达到顶峰，RT-PCR检测到此时目的条带最明显，从第二天开始逐渐减弱(图4中的B～C)。因此，单次Risdiplam注射增强DreAM-Zf1元件的作用最佳时间为1天。
Western Blot的操作方法为：用冷PBS清洗新鲜组织后，在RIPA缓冲液(25mM TrisPH7.0～8.0，150mMNaCl，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸钠，1％TritonX-100，蛋白酶抑制剂(Solarbio，A8260))中使用匀浆机充分破碎组织。冰上裂解10分钟后，裂解液在4℃以12000rpm离心15分钟，收集上清液，使用BCA方法(TransGen，DQ111-01)测定蛋白质浓度。
测定样品蛋白浓度后，用RIPA缓冲液将裂解液中的蛋白浓度调节至相同水平，并在4×SDS样品缓冲液中稀释(Solarbio，P1016)。稀释液煮沸10分钟后，准备好4％～15％梯度凝胶(TransGen，DG101-01)，从每个样品中取20μg蛋白上样跑胶，之后转移到PVDF膜上。在含5％脱脂牛奶的TBST中室温孵育一小时后，孵一抗(Ms-Anti-GAPDH，1:10000，TransGen，HC301；Ms-Anti-GFP，1:5000，TransGen，HT801)4℃过夜。次日，使用TBST漂洗三次，每次五分钟后，孵二抗(HRP-Gt-Anti-Ms,1:5000,BBI,D110087-0100)1小时。再使用TBST同样漂洗三次，每次五分钟后，在膜上均匀孵育ECL底物(Solarbio，PE0010)，使用iBright CL1500成像系统(Thermo Fisher Scientific))拍摄图像。
Westernblot结果显示，Risdiplam存在时DreAM-Zf1元件在心脏、肝脏、骨骼肌组织中均能增强报告基因GFP的表达，在心脏和骨骼肌中的特异性程度优于肝脏组织(图4中的D～E)。
对小鼠心脏、肝脏、骨骼肌组织进行OCT包埋，冰冻切片，WGA标记细胞膜，共聚焦显微镜拍照检查注射Risdiplam前后DreAM-Zf1元件调控GFP荧光蛋白表达的情况。结果显示，注射Risdiplam后，心脏、肝脏、骨骼肌各个组织报告基因GFP表达信号均明显增强(图4中的F)。
进一步，发明人用不同剂量(0，2，10，50mg/kg)的Risdiplam处理注射AAV-CMV-DreAM-Zf1-GFP的小鼠，通过Taqman-qPCR，RT-PCR和Westernblot实验检测CMV-DreAM-Zf1活性的动态变化。结果显示，小鼠体内假外显子剪接入mRNA的程度及GFP蛋白水平在给药后明显增强，并且与给药剂量呈正相关。
本实施例的结果显示，本发明的DreAM-Zf1元件可通过给药Risdiplam的方式控制目的基因表达，且这种调控方式具有时间和剂量依赖性。
实施例5对比CMV-DreAM-Zf1和Xon元件
已发表的Xon元件与本发明的CMV-DreAM-Zf1元件具有相似的药物识别基序(图5中的A)，两者仅相差一个碱基。因此，发明人构建了CMV-Xon-GFP(构建方法参见Monteys,A.M等,Regulated control ofgene therapies by drug-induced splicing.Nature 596,291–295(2021))和CMV-DreAM-Zf1-GFP两种质粒，转染293T细胞，分别用1μM的LMI070和Risdiplam两种药物进行调控诱导目的基因GFP的表达，Westernblot实验分析和荧光显微镜观察GFP信号，结果显示CMV-DreAM-Zf1和Xon两种系统种，与不给药的对照组(Sol)相比，给药LMI070和Risdiplam后GFP均明显表达升高(图5中的B～C，B为对比GFP荧光信号，C为Westernblot对比结果)。这表明这两种系统都可以用LMI070和Risdiplam两种药物进行调控。
此外，用AAV-CMV-DreAM-Zf1-GFP注射新生小鼠(P1)，7天后对小鼠分别腹腔注射10mg/kg Risdiplam和LMI070，2天后取心脏组织进行Westernblot分析(图5中的D和E)。结果显示，给药Risdiplam和LMI070后均可使小鼠心脏GFP表达明显增强。这表明在体内，DreAM-Zf1系统受LMI070和Risdiplam两种药物的调控。
本实施例的结果显示，本发明的DreAM-Zf1元件可响应的RNA剪接调节剂可选择LMI070和Risdiplam两种药物中的任意一种。
实施例6 DreAM-Zf1元件调控Yap基因的激活
Yap基因是调控心肌细胞增殖和心肌再生的重要基因。Yap激活对于治疗心肌梗死等涉及心肌细胞死亡的心脏疾病有重要意义。为验证DreAM-Zf1元件可以调控下游的用于基因治疗的基因如Yap基因，发明人首先构建了CMV-DreAM-Zf1-HA-Yap1S127A的质粒。这个质粒中，Yap1S127A指在127号氨基酸发生S>A突变的YAP突变体(SEQ ID NO:42)。HA作为标签蛋白用于检测Zf1控制表达的YAP蛋白。为了避免DreAM-Zf1在YAP1蛋白的N端加入功能未知的额外氨基酸，发明人同时构建了质粒CMV-DreAM-Zf1-2A-HA-Yap1S127A。在这个质粒中，发明人增加了P2A短肽，可以在DreAM-Zf1编码的氨基酸和YAP1的氨基酸之间发生自切割，从而无痕地表达完整的Yap1S127A蛋白。具体的工作原理和过程见图6中的A。作为正对照，发明人构建了CMV-HA-Yap1S127A质粒。
质粒构建的方法如下：DreAM-Zf1序列源于实施例3中构建的载体质粒，Yap1S127ADNA片段委托苏州金唯智生物科技有限公司(GENEWIZ，中国，江苏苏州)进行基因合成。CMV和HA源于Addgene公开发表的质粒序列。DNA拼接和质粒构建通过无缝克隆反应构造。
以上三种质粒转染293T细胞后，6h后进行换液加药，24h后收集细胞进行Westernblot分析。CMV-DreAM-Zf1-HA-Yap1S127A和CMV-DreAM-Zf1-2A-HA-Yap1S127A组加1μMRisdiplam处理，负对照组为不进行质粒转染组(NC)。结果显示，图6中的B所示的A条带为HA-YAP条带，B条带为DreAM-Zf1-HA-YAP条带，C条带为2A未发生自切割的DreAM-Zf1-2A-HA-YAP条带。这些结果表明，P2A短肽可以发生自切割作用，去除DreAM-Zf1编码的氨基酸，从而无痕地表达完整的Yap1S127A蛋白。
YAP15SA(指在YAP蛋白五处氨基酸发生S>A突变的YAP突变体，SEQ ID NO:43)相较于Yap1S127A具有更少的磷酸化修饰和更强的促进心肌增殖的能力。发明人于是又构建了CMV-DreAM-Zf1-2A-HA-Yap15SA质粒和CMV-HA-Yap15SA质粒(阳性对照)。这两个质粒分别转染293T细胞，6h后进行换液并进行1μM Risdiplam处理或者SOL对照处理。负对照组为不进行质粒转染组(NC)。处理24h后，收集细胞进行Western blot分析及免疫荧光染色，共聚焦显微镜观察HA阳性细胞。
结果显示，经Risdiplam处理后，转染了DreAM-Zf1-2A-HA-YAP的细胞表达两条带，分别为2A自切割前(图6C中的条带C)和自切割后的HA-YAP蛋白(图6C中的条带A)。共聚焦显微镜成像显示经Risdiplam处理后293T细胞中表达YAP1S127A和YAP15SA，且YAP蛋白有明显的细胞核定位(图6中的D，其中WGA标记细胞核，HA标记Zf控制表达的YAP蛋白，高放大图像确认YAP突变体的细胞核内定位)。这些结果表明DreAM-Zf1元件在体外可以通过Risdiplam激活，调控多种下游目的基因的表达。
为进一步验证DreAM-Zf1在体内调控YAP基因表达是否有效，发明人串联心肌细胞特异性表达的Tnnt2启动子、DreAM-Zf1元件和YAP1S127A,YAP15SA报告基因，包装了新的AAV9载体，进行小鼠体内研究。
AAV质粒构建的方法如下：DreAM-Zf1序列DNA片段委托苏州金唯智生物科技有限公司(GENEWIZ，中国，江苏苏州)进行基因合成。cTnnt2/hTnnt2,YAP1S127A和YAP15SA基因源于公开发表的Addgene上的质粒序列。DNA拼接和质粒构建通过无缝克隆反应构造。
发明人将上述质粒进行AAV包装。对新生小鼠(P1)进行AAV注射，7天后腹腔注射Risdiplam(10mg/kg)，1天后取小鼠心脏组织进行Taqman-qPCR，Western blot及免疫荧光染色共聚焦成像分析。Taqman-qPCR结果显示，在mRNA剪接水平，Risdiplam在心脏中提高Zf1元件假外显子剪入程度约40倍(图6中的E)。Western blot结果显示，在蛋白水平，Risdiplam在心脏中明显提高YAP1S127A和YAP15SA的表达(图6中的F)。Western blot只能检测到2A自切割之后的条带(图6中的A带)，并不能检测到自切割之前的条带(图6中的C带)，表明自剪切肽在体内的工作效率较高。免疫荧光染色结果显示，Risdiplam在心肌细胞中明显增加YAP1S127A和YAP15SA的表达且YAP定位于细胞核内(图6中的G)。
实施例7 DreAM-Zf1元件调控基因编辑系统的应用
在本实施例中，发明人研究DreAM-Zf1元件是否能够调节Cas9基因编辑。为此，发明人串联CMV或EFS启动子、DreAM-Zf1元件和SaCas9，构建了用于基因编辑的质粒，作用于Neuro2a细胞进行验证。EFS和CMV均为可以激活全身转录的启动子。EFS的活性弱于CMV。上述质粒中同时含有靶向Camk2d基因的sgRNA(SEQ ID NO:44，图7中的A)的表达元件。Camk2d是编码CaMKIIδ的基因，是心脏疾病的一个关键的治疗靶点。
质粒构建的方法如下：DreAM-Zf1和sgRNA序列DNA片段委托苏州金唯智生物科技有限公司(GENEWIZ，中国，江苏苏州)进行基因合成。CMV，EFS，SaCas9，U6源于Addgene公开发表的质粒。DNA拼接和质粒构建通过无缝克隆反应构造。构建出U6-sgRNA-CMV-SaCas9-HA，U6-sgRNA-CMV-DreAM-Zf1-SaCas9-HA和U6-sgRNA-EFS-DreAM-Zf1-SaCas9-HA三种质粒。
将上述质粒分别转染Neuro2a细胞，6h后换液，加入Risdiplam(1μM)或者溶剂处理36h后，收集细胞进行Taqman-qPCR，RT-PCR，Westernblot，免疫荧光及扩增子测序分析(图7中的B)。qPCR结果显示Risdiplam诱导的mRNA假外显子剪入水平在CMV启动子下明显高于EFS启动子，最高可达2000倍(图7中的C)。经Risdiplam诱导的SaCas9 mRNA水平的表达升高约2.6倍，EFS启动子激活SaCas9转录能力在给药或不给药情况下，均明显低于CMV启动子，约为CMV启动子转录激活的30％(图7中的D)，验证了CMV启动子活性高于EFS的事实。
RT-PCR显示两种不同启动子激活的DreAM-Zf1元件，在Risdiplam处理后，假外显子剪接入mRNA的程度明显升高(图7中的E)。Westernblot和免疫荧光染色结果显示，在CMV和EFS两种不同的启动子激活的DreAM-Zf1元件中，经Risdiplam诱导，SaCas9的蛋白表达水平也明显升高(图7中的F和G)。扩增子测序结果显示，CMV启动子激活的DreAM-Zf1元件，在Risdiplam处理后，碱基插入/缺失突变(indels)发生率提高不明显，而在EFS启动子激活下的DreAM-Zf1元件，经Risdiplam处理后碱基插入/缺失突变(indels)发生率提高2.1倍。在未经Risdiplam处理时，EFS启动子激活的DreAM-Zf1元件，诱导SaCas9基因编辑系统产生indels的发生率明显低于CMV启动子组(图7中的H)。
以上结果说明，DreAM-Zf1元件适用于控制基因编辑系统的应用场景，但由于基因编辑是一个高度灵敏的系统，对低表达Cas9敏感，因此，DreAM-Zf1元件需要配合一个转录激活能力较弱的启动子实现对基因编辑的控制。
实施例8 DreAM-Zf1元件的进一步截短
截短DreAM-Zf1元件的方法如下：
发明人认为DreAM-Zf1元件的(假)外显子及其邻近的内含子片段对于DreAM的功能是必要的，但是两个内含子的中段可能存在非必须的核酸片段。因此，发明人将DreAM-Zf1元件一、二号内含子中段分为若干小片段，分别删减并检测其对DreAM功能的影响。在已有DreAM-Zf1元件的基础上，通过设计引物，对含有DreAM-Zf1元件的载体质粒进行多个片段的扩增与无缝克隆拼接，构建含有截短元件(Zf1a-i)的载体质粒(图8中的A)。
随后，发明人将含有截短元件的载体质粒分别转染HEK293T细胞，Risdiplam处理24h后，用Western Blot方法检测Risidiplam造成的GFP蛋白表达差异(图8中的A)。转染CMV-GFP质粒的为阳性对照组，转染CMV-(ATG)GFP质粒的为阴性对照组。
数据表明，Zf1a-i元件中，除Zf1i以外，其他的截短片段对DreAM的功能没有显著影响。发明人将这些不影响DreAM-Zf1元件特性的小片段一并删除，获得DreAM-Zf2元件(图8中的A)。
在DreAM-Zf2元件的基础上，发明人进一步进行小片段的删减实验。同样通过设计引物，对含有DreAM-Zf2元件的载体质粒进行多个片段的扩增与无缝克隆拼接，构建含有截短元件的载体质粒。将含有截短元件的载体质粒分别转染HEK293T细胞，转染CMV-GFP质粒的为阳性对照组，转染CMV-(ATG)GFP质粒的为阴性对照组，Risdiplam处理24h后，用WesternBlot方法检测Risidiplam造成的GFP蛋白表达差异(图8中的B)。
数据表明，DreAM-Zf2元件中，若干小片段的删除不会对DreAM的功能产生显著影响。发明人将这些不影响DreAM-Zf2元件特性的小片段一并删除，获得DreAM-Zf3元件(图8中的B)。
将含有DreAM-Zf1、DreAM-Zf2、DreAM-Zf3元件的载体质粒分别转染HEK293T细胞，转染CMV-GFP质粒的为阳性对照组，转染CMV-(ATG)GFP质粒的为阴性对照组，Risdiplam处理24h后，观察荧光信号强度并进行定量分析，同时收集细胞，用RT-PCR法对Risidiplam诱导核酸调节元件产生的假外显子和可变剪接调控进行定量检测(图8中的C和D)。数据显示，截短后的DreAM-Zf2和DreAM-Zf3元件仍具有与DreAM-Zf1元件相似的性质，同时长度大幅度缩短。
DreAM-Zf2元件的核苷酸序列为：
ACTGACCAACAGCGTGAAGACATTACATCCAGTGCACAGGTAATTGAATTCTTGTTGGATTACTGTCTCTAAGGCCTGGGAGTTAGTAGATATGTGTGTGGGTTAAATGACTTAAGCATACATCAAAAGACTGAGAAAGGCTCTTAACATTAAAAGATGGGCCtttttttttCTTTTAGGTTAAAGGATTACATATTAAAAATATTGTATAGACTCTTTAAGGCCAAAGAAGTGTGCTCATTTCTCCCGATTAAAAGTTATGAGTAAGAATTGGGTATTTTGCCTTTTGGGGGTGGGAGAtttgaaacagggtttcCAGTGAGATAGCTCTGCAGGTAAAAGGGAGACTGACCCCCAACTTGTACTCTGGCCGTGGCAGTCATGTGCACACAAGTAAACTGAATAAATATAAAGAGCAGATTTTAGAGTGTTTTGGCTTTAAATTAATTCTATATTCTAACTCTATTTGCAGTTTGCATTGAGACTCCTTGCATTCCGTCAGATACACAAAGTT(Zf2,SEQ IDNO:11)。
DreAM-Zf2元件的第一内含子的核苷酸序列为：
GTAATTGAATTCTTGTTGGATTACTGTCTCTAAGGCCTGGGAGTTAGTAGATATGTGTGTGGGTTAAATGACTTAAGCATACATCAAAAGACTGAGAAAGGCTCTTAACATTAAAAGATGGGCCtttttttttCTTTTAG(SEQID NO:4)。
DreAM-Zf2元件的第二内含子的核苷酸序列为：
GTAAGAATTGGGTATTTTGCCTTTTGGGGGTGGGAGAtttgaaacagggtttcCAGTGAGATAGCTCTGCAGGTAAAAGGGAGACTGACCCCCAACTTGTACTCTGGCCGTGGCAGTCATGTGCACACAAGTAAACTGAATAAATATAAAGAGCAGATTTTAGAGTGTTTTGGCTTTAAATTAATTCTATATTCTAACTCTATTTGCAG(SEQ ID NO:7)。
DreAM-Zf3元件的核苷酸序列为：
ACTGACCAACAGCGTGAAGACATTACATCCAGTGCACAGGTAATTGAATTCTTGTTGGATTACTGTCTCTAAGGCCTGGGAGTTAGCATACATCAAAAGACTGAGAAAGGCTCTTAACATTAAAAGATGGGCCtttttttttCTTTTAGGTTAAAGGATTACATATTAAAAATATTGTATAGACTCTTTAAGGCCAAAGAAGTGTGCTCATTTCTCCCGATTAAAAGTTATGAGTAAGAATTGGGTATTTTGCCTTTTGGGGGTGGGAGTGAGATAGCTCTGCAGGTAAAAGGGAGACTGACCCCCAACTTGTACTCTGGCCGTGGCTTTAAATTAATTCTATATTCTAACTCTATTTGCAGTTTGCATTGAGACTCCTTGCATTCCGTCAGATACACAAAGTT(Zf3,SEQ ID NO:12)。
DreAM-Zf3元件的第一内含子的核苷酸序列为：
GTAATTGAATTCTTGTTGGATTACTGTCTCTAAGGCCTGGGAGTTAGCATACATCAAAAGACTGAGAAAGGCTCTTAACATTAAAAGATGGGCCtttttttttCTTTTAG(SEQ ID NO:5)。
DreAM-Zf3元件的第二内含子的核苷酸序列为：
GTAAGAATTGGGTATTTTGCCTTTTGGGGGTGGGAGTGAGATAGCTCTGCAGGTAAAAGGGAGACTGACCCCCAACTTGTACTCTGGCCGTGGCTTTAAATTAATTCTATATTCTAACTCTATTTGCAG(SEQ ID NO:8)
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本公开进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各实施例技术方案的范围。

Claims (42)

1.一种可变剪接调节元件，所述可变剪接调节元件从5'端至3'端依次包含第一外显子、第一内含子、假外显子、第二内含子和第二外显子；所述假外显子含有与SEQ ID NO:1所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；所述假外显子和所述第二内含子的交界处含有可变剪接调节小分子药物结合位点；所述可变剪接调节元件仅在假外显子中含有唯一起始密码子。
2.根据权利要求1所述的可变剪接调节元件，其中，所述可变剪接调节小分子药物结合位点包含核苷酸序列ATGAGTA，其中ATGA属于假外显子，GTA属于第二内含子；或者，
所述可变剪接调节小分子药物结合位点包含核苷酸序列AGAGTA，其中AGA属于假外显子，GTA属于第二内含子。
3.根据权利要求1或2所述的可变剪接调节元件，其中，所述第一外显子的序列紧接所述第一内含子的序列为CAG，所述第一内含子的序列紧接所述第一外显子的序列为GTA；和/或，
所述第一内含子的序列紧接所述假外显子的序列为TAG，所述假外显子的序列紧接所述第一内含子的序列为GTT；和/或，
所述第二内含子的序列紧接所述第二外显子的序列为CAG，所述第二外显子的序列紧接所述第二内含子的序列为TTT。
4.根据权利要求1～3任一项所述的可变剪接调节元件，其中，所述第一内含子含有与SEQ ID NO:19和20所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与SEQ ID No:21所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
5.根据权利要求1～4任一项所述的可变剪接调节元件，其中，所述第一内含子的核苷酸长度为41～500bp，优选为41～410bp，优选为41～140bp，优选为41～110bp；所述第二内含子的核苷酸长度为60～569bp，优选为60～479bp，优选为60～209bp，优选为60～129bp。
6.根据权利要求1～5任一项所述的可变剪接调节元件，其中，所述第一内含子含有与SEQ ID NO:3～5、22～25中任一项所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与SEQ ID No:6～8、26～32中任一项所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
7.根据权利要求1～6任一项所述的可变剪接调节元件，其中，
(a)第一内含子含有与SEQ ID NO:5所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与SEQ ID NO:8所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；或者，
(b)第一内含子含有与SEQ ID NO:4所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与SEQ ID NO:7所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；或者，
(c)第一内含子含有与SEQ ID NO:3所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与SEQ ID NO:6所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
8.根据权利要求1～7任一项所述的可变剪接调节元件，其中，所述第一外显子含有与SEQ ID NO:2所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；和/或，所述第二外显子含有与SEQ ID NO:9所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
9.根据权利要求1～8任一项所述的可变剪接调节元件，其中，所述可变剪接调节元件含有与SEQ ID NO:10～12任一项所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
10.一种核酸分子，包含权利要求1～9任一项所述可变剪接调节元件和位于所述可变剪接调节元件3'端的目的基因。
11.根据权利要求10所述的核酸分子，其中，所述可变剪接调节元件的3'端与所述目的基因的5'端之间不存在任何核酸序列。
12.根据权利要求10所述的核酸分子，其中，所述可变剪接调节元件的3'端与所述目的基因的5'端之间存在编码蛋白酶切割位点的序列，其中所述蛋白酶切割位点被哺乳动物蛋白酶切割或被自切割，并且所述编码蛋白酶切割位点的序列的碱基数是3的整数倍。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的核酸分子，其中，所述可变剪接调节元件的5'端可操作地连接有启动子序列。
14.根据权利要求13所述的核酸分子，其中，所述启动子序列为哺乳动物细胞组成型启动子、哺乳动物细胞的特异性启动子、哺乳动物非编码RNA启动子或原核细胞启动子。
15.根据权利要求14所述的核酸分子，其中，所述哺乳动物细胞组成型启动子为CMV、CAG、CBG、EF1a、PGK1或Ubc；所述哺乳动物细胞的特异性启动子为Tnnt2、Nppa、Myl2、Mck、Nkx2.5、Syn、Mecp2、TBG、Pdx1、K14、Rpe65或SP-C；所述哺乳动物非编码RNA启动子为U6或H1；所述原核细胞启动子为T7、T3或SP6。
16.根据权利要求10～15中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子进一步包含转录后调节元件和/或微小RNA的靶序列。
17.根据权利要求16所述的核酸分子，其中，所述转录后调节元件(PRE)包含衍生自乙型肝炎(HPRE)、蝙蝠(BPRE)、地松鼠(GSPRE)、北极松鼠(ASPRE)、鸭(DPRE)、黑猩猩(CPRE)、长毛猴(WMPRE)或土拨鼠(WPRE)的转录后调节元件；
所述微小RNA选自miR122、miR199、miR7、miR148、miR1或miR208；
任选地，其中所述转录后调节元件和/或微小RNA的靶序列设置在所述目的基因的3'端。
18.根据权利要求10～17中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子进一步包含多腺苷酸化信号(polyA)，任选地其中所述polyA设置在所述目的基因的3'端。
19.根据权利要求18所述的核酸分子，其中，所述polyA信号是SV40polyA、人生长激素(HGH)polyA、牛生长激素(BGH)polyA、β-珠蛋白polyA、α-珠蛋白polyA、卵清蛋白polyA、κ-轻链polyA或合成polyA。
20.根据权利要求10～19中任一项所述的核酸分子，其中，所述可变剪接调节元件能够与可变剪接调节小分子药物结合，所述可变剪接调节小分子药物为LMI070、与LMI070在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物或LMI070药学上可接受的盐；或者，所述可变剪接调节小分子药物为Risdiplam、与Risdiplam在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物或Risdiplam药学上可接受的盐。
21.根据权利要求10～20中任一项所述的核酸分子，其中，所述编码蛋白的基因为编码核酸酶的基因，和/或编码治疗蛋白的基因，和/或编码报告或标记蛋白的基因，和/或编码非编码RNA的基因；
优选地，所述核酸酶包括转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)或者CRISPR associated蛋白(Cas蛋白)或其相同功能衍生物，进一步优选地，所述Cas蛋白包括Cas9蛋白、Cas12蛋白或Cas13蛋白；
优选地，所述治疗蛋白包括YAP、LMNA、RPE65、SMN1、FVIII、FIX或其相同功能衍生物；
优选地，所述标记蛋白包括eGFP、tdTomato、mCherry、Luciferase、SEAP、CAT、GST、β-GUS、β-Gal或其相同功能衍生物；
优选地，所述非编码RNA包括具有基因抑制功能的miRNA、shRNA或LncRNA中的至少一种。
22.权利要求10～21任一项所述核酸分子的构建方法，包括将去除5’端起始密码子的目的基因连接于权利要求1～9任一项所述可变剪接调节元件的3'端，使所述目的基因与可变剪接调节元件中的起始密码子使用同一个读码框。
23.一种转录物，其为根据权利要求10～21中任一项所述的核酸分子或采用权利要求22所述构建方法得到的核酸分子，在可变剪接调节小分子药物存在时的转录物；或者为根据权利要求10～21中任一项所述的核酸分子或采用权利要求22所述构建方法得到的核酸分子，在可变剪接调节小分子药物不存在时的转录物；
所述可变剪接调节小分子药物为LMI070、与LMI070在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物或LMI070药学上可接受的盐；或者，所述可变剪接调节小分子药物为Risdiplam、与Risdiplam在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物或Risdiplam药学上可接受的盐。
24.一种载体，包含根据权利要求1～9中任一项所述的可变剪接调节元件，权利要求10～21任一项所述的核酸分子，采用权利要求22所述构建方法得到的核酸分子，或者，权利要求23所述的转录物。
25.根据权利要求24所述的载体，其中，所述载体是DNA或RNA载体，或者，所述载体是双链的或单链的。
26.根据权利要求24所述的载体，其中，所述载体是病毒载体。
27.根据权利要求26所述的载体，其中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体、嵌合AAV载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杆状病毒载体或其任何突变体或衍生物。
28.一种重组病毒，包含根据权利要求1～9任一项所述的可变剪接调节元件，权利要求10～21任一项所述的核酸分子，采用权利要求22所述构建方法得到的核酸分子，权利要求23所述的转录物，或者，权利要求24～27任一项所述的载体。
29.根据权利要求28所述的重组病毒，其中，所述重组病毒是腺相关病毒(AAV)、嵌合AAV、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、杆状病毒或其任何突变体或衍生物。
30.根据权利要求29所述的重组病毒，其中，所述腺相关病毒为以下的一种或多种：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh36、AAVrh37、AAVrh74、AAVrh79、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV-PHP.B、AAV-PHP.B2、AAV-PHP.B3、AAV-PHP.A、AAV-PHP.eB、AAV-PHP.S、AAV2i8、MyoAAV、AAVMYO、AAV.CPP.16衣壳血清型或其变体。
31.一种细胞，包含一种或多种权利要求1～9任一项所述的可变剪接调节元件，一种或多种权利要求10～21任一项所述的核酸分子，采用权利要求22所述构建方法得到的核酸分子，权利要求23所述的转录物，一种或多种权利要求24～27任一项所述的载体，或者，一种或多种权利要求28～30任一项所述的重组病毒。
32.根据权利要求31所述的细胞，其中，所述细胞为人细胞；
优选地，所述人细胞为从体内分离的细胞；
优选地，所述人细胞为永生化的细胞系或癌细胞。
33.根据权利要求32所述的细胞，其中，所述人细胞为心脏细胞、肌肉细胞、神经元、肝细胞、脾细胞、肺细胞或肾细胞。
34.一种药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种权利要求1～9任一项所述的可变剪接调节元件，一种或多种权利要求10～21任一项所述的核酸分子，采用权利要求22所述构建方法得到的核酸分子，权利要求23所述的转录物，一种或多种权利要求24～27任一项所述的载体，或者，一种或多种权利要求28～30任一项所述的重组病毒，或者，一种或多种权利要求31～33中任一项所述的细胞。
35.一种基于可变剪接调节小分子药物调节目的基因的表达量的方法，包括：使一种或多种权利要求10～21任一项所述的核酸分子、采用权利要求22所述构建方法得到的核酸分子、权利要求23所述的转录物、一种或多种权利要求24～27任一项所述的载体、一种或多种权利要求28～30任一项所述的重组病毒、一种或多种权利要求31～33中任一项所述的细胞、一种或多种权利要求34所述的药物组合物与一种或多种可变剪接调节小分子药物接触；
其中，所述可变剪接调节小分子药物为LMI070、与LMI070在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物或LMI070药学上可接受的盐；或者，所述可变剪接调节小分子药物为Risdiplam、与Risdiplam在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物或Risdiplam药学上可接受的盐。
36.一种试剂盒，包含：
(1)一种或多种权利要求10～21任一项所述的核酸分子、采用权利要求22所述构建方法得到的核酸分子、权利要求23所述的转录物、一种或多种权利要求24～27任一项所述的载体、一种或多种权利要求28～30任一项所述的重组病毒、一种或多种权利要求31～33中任一项所述的细胞、一种或多种权利要求34所述的药物组合物；和/或，
(2)一种或多种可变剪接调节小分子药物；其中，所述可变剪接调节小分子药物为LMI070、与LMI070在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物或LMI070药学上可接受的盐；或者，所述可变剪接调节小分子药物为Risdiplam、与Risdiplam在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物或Risdiplam药学上可接受的盐。
37.(a)和(b)用于调节目的基因表达量或者用于制备基因治疗药物的用途；
其中(a)选自一种或多种权利要求1～9任一项所述的可变剪接调节元件，一种或多种权利要求10～21任一项所述的核酸分子、采用权利要求22所述构建方法得到的核酸分子、权利要求23所述的转录物、一种或多种权利要求24～27任一项所述的载体、一种或多种权利要求28～30任一项所述的重组病毒、一种或多种权利要求31～33中任一项所述的细胞、一种或多种权利要求34所述的药物组合物，或者，权利要求36所述的试剂盒；
(b)为可变剪接调节小分子药物；其中所述可变剪接调节小分子药物为LMI070、与LMI070在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物、或LMI070药学上可接受的盐，或者，所述可变剪接调节小分子药物为Risdiplam、与Risdiplam在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物或Risdiplam药学上可接受的盐；
优选地，所述基因治疗药物能够治疗的适应症包括缺血性心脏病、心肌病、肌营养不良、神经肌肉性疾病、早衰症、视网膜色素变性、先天性黑蒙症、老年黄斑变性、脊髓型肌萎缩症或者血友病。
38.一种探针，所述探针靶向权利要求23中在可变剪接调节小分子药物存在时的转录物中假外显子和第二外显子交界处。
39.根据权利要求38所述的探针，其中，所述探针含有与SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
40.一种用于检测根据权利要求1～9任一项所述的可变剪接调节元件，一种或多种权利要求10～21任一项所述的核酸分子、采用权利要求22所述构建方法得到的核酸分子、权利要求23所述的转录物、一种或多种权利要求24～27任一项所述的载体、一种或多种权利要求28～30任一项所述的重组病毒、一种或多种权利要求31～33中任一项所述的细胞、一种或多种权利要求34所述的药物组合物的方法，其中，所述方法包括qPCR扩增步骤，所述qPCR扩增步骤中使用权利要求38或39所述的探针。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述qPCR扩增步骤中使用的上游引物选自SEQID NO:17。
42.根据权利要求40所述的方法，所述方法在qPCR扩增步骤之前还包括RT-PCR扩增步骤，优选地，所述RT-PCR扩增步骤中使用的上游引物选自SEQ ID NO:18。
CN202311275787.8A 2023-09-28 2023-09-28 利用rna剪接调节剂调控基因表达的核酸分子 Pending CN117402875A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311275787.8A CN117402875A (zh) 2023-09-28 2023-09-28 利用rna剪接调节剂调控基因表达的核酸分子

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311275787.8A CN117402875A (zh) 2023-09-28 2023-09-28 利用rna剪接调节剂调控基因表达的核酸分子

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117402875A true CN117402875A (zh) 2024-01-16

Family

ID=89499173

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311275787.8A Pending CN117402875A (zh) 2023-09-28 2023-09-28 利用rna剪接调节剂调控基因表达的核酸分子

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117402875A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210017509A1 (en) Gene Editing for Autosomal Dominant Diseases
KR20210102882A (ko) 핵산 구조체 및 사용 방법
US20220154213A1 (en) Bocaparvovirus small noncoding rna and uses thereof
US20190203229A1 (en) cis AND trans REQUIREMENTS FOR TERMINAL RESOLUTION OF HUMAN BOCAVIRUS 1
KR20210102209A (ko) 알파-1 항트립신 결핍증을 치료하기 위한 조성물 및 방법
CN113330115A (zh) 肝特异性的病毒启动子及使用其的方法
CN111718420B (zh) 一种用于基因治疗的融合蛋白及其应用
US20220411819A1 (en) Nucleic acid molecules containing spacers and methods of use thereof
JP2022513376A (ja) レトロウイルスインテグラーゼ－Ｃａｓ９融合タンパク質を使用した指向性非相同ＤＮＡ挿入によるゲノム編集
KR20230029891A (ko) 전이유전자 발현 시스템
US20230173036A1 (en) Method for treating muscular dystrophy by targeting lama1 gene
US20230045478A1 (en) Liver-specific promoter and application thereof
CN117402875A (zh) 利用rna剪接调节剂调控基因表达的核酸分子
WO2023039440A9 (en) Hbb-modulating compositions and methods
WO2024060205A1 (zh) 包含基于小分子药物的可变剪接调节元件的核酸分子
US20240026324A1 (en) Methods and compositions for modulating a genome
WO2023147558A2 (en) Crispr methods for correcting bag3 gene mutations in vivo
WO2020187272A1 (zh) 一种用于基因治疗的融合蛋白及其应用
WO2024054864A1 (en) Cardioprotective heart disease therapies
JP2024521063A (ja) Ｔｅｒｔをコードする組換えウイルスゲノム及びウイルスベクター
WO2023042104A1 (en) Novel transcription factors
WO2022232442A2 (en) Multiplex crispr/cas9-mediated target gene activation system
WO2022238556A1 (en) Vector system
WO2023028058A2 (en) Compositions and methods for high efficiency genome editing
WO2024069144A1 (en) Rna editing vector

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication