KR20210102209A - 알파-1 항트립신 결핍증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

알파-1 항트립신 결핍증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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혼-렌 황
안토니 퍼겟
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Abstract

숙주 세포에서 알파 1 항트립신 (AAT)를 발현시키는 조성물 및 방법들이 제공된다. 또한 알파 1 항트립신 결핍증 (AATD)을 가지는 대상체들을 치료하기 위한 조성물 및 방법들이 제공된다.

Description

알파-1 항트립신 결핍증을 치료하기 위한 조성물 및 방법
본원은 2018년 10월 18일 출원된 미국 가특허출원 제 62/747,522의 우선권의 이익을 주장한다. 전술한 출원의 내용은 전부 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
알파 -1 항트립신 (AAT 또는 A1AT) 또는 혈청 트립신 억제제는 SERPINA1 유전자에 의해 인코딩되는 세린 프로테아제 억제제 (세르핀이라고도 함)의 한 유형이다. AAT는 주로 헤파토사이트에 의해 합성 및 분비되며 폐에서 호중구 엘라스타제의 활성을 억제하는 기능을 한다. 충분한 양의 기능 AAT가 없으면 호중구 엘라스타제가 조절되지 않고 폐의 폐포를 손상시킨다. 따라서 SERPINA1의 돌연변이로 인해 AAT 수준이 감소하거나 제대로 기능하는 AAT 수준이 감소하면 폐 병리가 발생한다. 또한, 잘못형성된 AAT를 생성하는 SERPINA1의 돌연변이는 헤파토사이트에서 AAT의 축적으로 인한 간 병리를 초래한다. 따라서 SERPINA1 돌연변이로 인해 불충분하고 부적절하게 형성된 AAT는 폐 및 간 병리로 이어질 수 있다.
SERPINA1 유전자에 대한 100개 이상의 대립유전자 변이체들이 설명된 바 있다. 변이체는 일반적으로 AAT의 혈청 수준에 대한 이의 효과에 따라 분류된다. 예를 들어, M 대립유전자는 정상 혈청 AAT 수준과 관련된 정상 변이체인 반면, Z 및 S 대립유전자는 감소된 AAT 수준과 관련된 돌연변이 변이체이다. Z 및 S 대립유전자의 존재는 비정상 AAT를 생성하는 SERPINA1 유전자의 돌연변이를 특징으로 하는 유전 질환인 α1-항트립신 결핍증 (AATD 또는 A1AD)과 관련이 있다.
많은 형태 및 정도의 AATD가 존재한다. “Z-변이체”는 가장 흔하며 간과 폐 모두에서 심각한 임상 질환을 유발한다. Z-변이체는 5번째 엑손의 5' 말단에서의 단일 뉴클레오티드 변화를 특징으로 하며, 이러한 변화는 아미노산 위치 342 (E342K)에서 글루탐산의 리신으로의 미스센스 돌연변이를 생성한다. Z 대립유전자에서 동형접합 (ZZ) 및 이형접합 (MZ 또는 SZ)인 환자들에서 증상이 발생한다. 1개 또는 2 개의 Z 대립유전자들이 존재하면 SERPINA1 mRNA가 불안정해지고 간 헤파토사이트에서 AAT 단백질 중합 및 응집이 발생한다. 하나 이상의 Z 대립유전자가 있는 환자는 간에서 응집된 AAT 단백질의 축적으로 인해 간암 발병률이 증가한다. 간 병리 이외에도, 하나 이상의 Z 대립유전자를 특징으로 하는 AATD는 폐포에서 AAT의 감소 및 그에 따른 호중구 엘라스타제의 억제 감소로 인한 폐 질환을 특징으로 한다. 중증 ZZ-형태 (즉, Z-변이체의 동형접합성 발현)의 유병률은 북유럽 인구에서 1: 2,000이고 미국에서 1: 4,500이다. 다른 일반적인 돌연변이는, 분비 전 세포내에서 분해되는 단백질을 생성하는 S- 변이체이다. Z-변이체에 비해 S-변이체는 혈청 AAT를 경미하게 감소시키고 폐 질환 위험을 낮춘다. 간과 폐 모두에서 AATD의 부정적인 영향을 개선 할 필요가 있다.
본 발명은 알부민 세이프 하버 부위와 같은 인간 게놈 유전자좌에서 이종 AAT를 발현하여 이종 AAT의 분비를 가능하게 하고 폐에서 AATD의 부정적인 영향을 완화시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 내인성 SERPINA1 유전자를 녹아웃시킴으로써 AATD 환자에서 간 증상과 관련된 AAT의 돌연변이체 형태의 생성을 제거하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 내인성 SERPINA1 대립유전자의 녹아웃과 세이프 하버 부위에서 이종 AAT의 삽입을 결합하여, 세포 또는 유기체에서 AAT 기능을 복원한다.
특히, 본원은 AAT를 인코딩하는 핵산 서열을 인간 세이프 하버 부위, 가령, 알부민 세이프 하버 부위의 인트론 1에 표적화 삽입함에 사용하기 위한 가이드 RNA를 제공한다. 또한 세이프 하버 부위 내부에, 가령, 알부민 세이프 하버 부위의 인트론 1에 표적화 삽입함에 사용하기 위한, AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는, 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체)가 제공된다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 가이드 RNA는 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제) 및 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체)와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체)는 하나 이상의 유전자 편집 시스템 (예를 들어, CRISPR/Cas 시스템; 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템; 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 시스템)와 함께 사용될 수 있다. 다음 구체예들이 제공된다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 다음을 투여하는 단계를 포함하고 이에 의해 세포 또는 세포들의 집단에 SERPINA1 핵산을 도입하는, 세포 또는 세포들의 집단에 SERPINA1 핵산을 도입하는 방법을 제공한다: i) 이종 AAT 단백질 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조체; ii) RNA-가이드된 DNA 결합제; 및 iii) 다음에서 선택된 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA (gRNA): a) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; b) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드; c) 서열 번호: 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 및 97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; d) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; e) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드; f) 서열 번호: 34-97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; 및 g) 서열 번호: 2-33에 열거된 게놈 좌표들의 15개 연속 뉴클레오티드 +/- 10개 뉴클레오티드에 상보적인 서열.
일부 구체예들에서, 본 발명은 다음을 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 필요로 하는 대상체에서 AAT를 발현시키는, 필요로 하는 대상체에서 AAT를 발현시키는 방법을 제공한다: i) 이종 AAT 단백질 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조체; ii) RNA-가이드된 DNA 결합제; 및 iii) 다음에서 선택된 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA (gRNA): a) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; b) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드; c) 서열 번호: 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 및 97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; d) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; e) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드; f) 서열 번호: 34-97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; 및 g) 서열 번호: 2-33에 열거된 게놈 좌표들의 15개 연속 뉴클레오티드 +/- 10개 뉴클레오티드에 상보적인 서열.
일부 구체예들에서, 본 발명은 다음을 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 AAT 단백질을 필요로 하는 대상체에서 알파-1 항트립신 결핍증 (AATD)을 치료하는, 대상체에서 AATD를 치료하는 방법을 제공한다: i) 이종 AAT 단백질 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조체; ii) RNA-가이드된 DNA 결합제; 및 iii) 다음에서 선택된 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA (gRNA): a) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; b) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드; c) 서열 번호: 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 및 97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; d) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; e) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드; f) 서열 번호: 34-97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; 및 g) 서열 번호: 2-33에 열거된 게놈 좌표들의 15개 연속 뉴클레오티드 +/- 10개 뉴클레오티드에 상보적인 서열.
일부 구체예들에서, 본 발명은 다음을 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 간 세포 또는 세포들의 집단으로부터 AAT 분비를 증가시키는, 간 세포 또는 세포들의 집단으로부터 AAT 분비를 증가시키는 방법을 제공한다: i) 이종 AAT 단백질 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조체; ii) RNA-가이드된 DNA 결합제; 및 iii) 다음에서 선택된 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA (gRNA): a) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; b) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드; c) 서열 번호: 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 및 97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; d) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; e) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드; f) 서열 번호: 34-97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; 및 g) 서열 번호: 2-33에 열거된 게놈 좌표들의 15개 연속 뉴클레오티드 +/- 10개 뉴클레오티드에 상보적인 서열.
도면의 간단한 설명
도 1A-1C는 일차 마우스 헤파토사이트에서 표적 부위들 전반에 걸친 양방향 구조체의 시험관내 스크리닝 결과를 보여준다. 도 1A는 테스트 벡터의 개략도를 보여준다. 도 1B는 다양한 테스트 gRNA들을 사용한 다양한 편집 수준을 보여준다 (가이드 ID는 x-축에 나타냄). 도 1C는 높은 수준의 편집이 반드시 보다 효율적인 트랜스진 발현을 가져오는 것은 아님을 보여준다.
도 2A-2C는 일차 사이노몰구스 헤파토사이트에서 표적 부위들 전반에 걸친 양방향 구조체들의 시험관내 스크리닝 결과를 보여준다. 도 2A는 테스트된 조합들 각각에 대하여 검출된 다양한 편집 수준을 보여준다. 도 2B 및 도 2C는 유의한 수준의 편집 (특정 표적 부위에서의 인델 정보로서)이 반드시 트랜스진의 더 효율적인 삽입 또는 발현을 가져오는 것은 아니었음을 보여준다.
도 3A-3C는 일차 인간 헤파토사이트에서 표적 부위들 전반에 걸친 양방향 구조체들의 시험관내 스크리닝 결과를 보여준다. 도 3A는 테스트 조합들 각각에 대하여 검출된 다양한 편집 수준을 보여준다. 도 3B 및 도 3C는 유의한 수준의 편집 (특정 표적 부위에서의 인델 정보로서)이 반드시 트랜스진의 더 효율적인 삽입 또는 발현을 가져오는 것은 아니었음을 보여준다.
도 4A-4C는 m알부민 유전자좌로의 hSERPINA1 삽입의 생체내 연구로부터 얻은 결과를 보여준다. 도 4A는 테스트된 gRNA들을 사용한 편집 결과를 보여준다 (x-축에 나타냄). 도 4B는 투약 후 1, 2, 및 4 주차의 혈청 hA1AT 수준을 보여준다. 도 4C는 시험관내 실험으로부터 주어진 가이드에 대하여 RLU로 측정된 발현 수준과 생체내 hA1AT 트랜스진 발현 수준 사이의 양의 상관관계를 보여준다.
도 5A-5D는 hSERPINA1 PiZ 트랜스진의 생체내 녹다운 및 hSERPINA1의 m알부민 유전자좌로의 삽입으로부터 얻은 결과를 보여준다. 도 5A는 각 테스트 그룹에 대해 사용된 편집 조건을 요약한다. 도 5B는 단계 1에서 표적화되었던 hSERPINA1 PiZ 변이체의 인델 정보를 보여준다. 도 5C는 단계 2에서 표적화된 알부민 유전자좌의 인델 정보를 보여준다. 도 5D는 ELISA에 의해 측정된 다양한 시점에서의 혈청 내 hA1AT 단백질 수준과 인간 혈장에서 측정된 hA1AT 수준을 보여준다.
도 6은 루시퍼라제-기반 형광 검출 분석으로부터 얻은 상대 루시퍼라제 단위를 보여준다.
도 7은 일차 마우스 헤파토사이트에서 다양한 sgRNA들을 사용하여 표적 부위들 전반에 걸친 양방향 구조체의 시험관내 스크리닝 결과를 보여준다. 도 7은 다양한 sgRNA들을 사용하여 다양한 발현 수준이 검출되었음을 보여준다.
도 8은 일차 랫트 헤파토사이트에서 표적 부위들 전반에 걸친 양방향 구조체의 시험관내 스크리닝 결과를 보여준다. 도 8은 특정 가이드 RNA들을 사용한 삽입을 보여준다 (상대 루시퍼라제 단위).
도 9는 다양한 가이드 RNA 농도를 사용한 삽입을 보여준다.
도 10은 다양한 AAV 구조체들을 사용한 AAT 수준을 보여준다.
도 11은 ELISA로 측정한 다양한 시점들에서의 AAT 수준을 보여준다.
도 12는 알부민 유전자좌에서 인델 형성을 보여준다.
도 13A는 ELISA로 측정한 다양한 시점들에서의 AAT 수준을 보여준다. 도 13B는 LC-MS/MS로 측정한 다양한 시점들에서의 AAT 수준을 보여준다.
도 14A 및 도 14B는 다양한 LNP 또는 AAV 농도에 따른 AAT 발현 수준을 보여준다. 도 14C 및 도 14D는 다양한 LNP 및 AAV 농도를 사용한 인델 형성을 보여준다.
도 15는 2개의 양방향 AAT AAV 구조체들의 개략도를 보여준다.
상세한 설명
이제 본 발명의 특정 구체예에 대해 상세히 언급 할 것이며, 이의 예는 첨부된 도면에서 설명된다. 본 발명의 내용을 다양한 구체예들과 연관시켜 설명하지만, 본 발명을 이들 구체예로 제한하고자 하는 것은 아니다. 대조적으로, 본 발명은 당업자가 이해하는 바와 같이, 다양한 대안예, 변형 및 균등예를 포함한다.
본 발명의 내용을 상세하게 설명하기 전에, 본원의개시된 내용이 특정 조성물 또는 공정 단계에 제한되지 않고, 변화할 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 구체예에서 사용되는, 단수형 “하나” 및 “그것”은 문맥에서 달리 언급이 없는 한 복수형을 포함함을 유념하여야 한다. 따라서, 예를 들어, “접합체”에 대한 언급은 복수의 접합체를 포함하고 “세포”에 대한 언급은 복수의 세포들 등을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 “포함하다” 및 이의 문법적 변화형은 비-제한적인 것으로, 목록에 있는 항목들의 언급은 열거된 항목들에 대해 치환 또는 추가될 수 있는 다른 유사 항목들을 제외시키는 것이 아니다.
수치 범위는 범위를 정의하는 수치를 포함한다. 측정 및 측정가능한 값은 유효 숫자 및 측정과 관련된 오류를 고려하여 근사치로 이해된다. 또한, “포함하다 (comprise, comprises)”, “포함하는”, “함유하다 (contain, contains)”, “함유하는”, “비롯하다 (include, includes)”, 및 “비롯하는”의 사용은 제한을 의도하는 것은 아니다. 전술한 일반적인 설명 및 상세한 설명 모두는 단지 예시 및 설명을 위한 것이며 발명의 내용을 제한하고자 하지 않음을 이해하여야 한다.
명세서에서 구체적으로 언급되지 않는 한, 다양한 구성요소들을 “포함하는” 것을 언급하는 명세서의 구체예들은 또한 언급한 구성요소들로 “구성되는” 또는 “실질적으로 구성되는” 것으로 간주되고; 다양한 구성요소들로 “구성되는” 것을 언급하는 명세서의 구체예들은 또한 언급된 구성요소들을 “포함하는” 또는 이들로 “실질적으로 구성되는” 것으로 간주되고; 그리고 다양한 구성성분들로 “실질적으로 구성되는” 것을 언급하는 명세서의 구체예들은 또한 언급된 구성성분들로 “구성되는” 또는 이들을 “포함하는” 것으로 간주된다 (이러한 호환가능성은 구체예들에서의 이들 용어의 사용에는 적용되지 않는다). 용어 “또는”은 포괄적인 의미로, 즉 문맥상 달리 명시하지 않는 한 “및/또는”과 동등한 의미로 사용된다.
열거된 것 앞에 사용될 경우 용어 “약”은 목록의 각 구성원을 변화시킨다. 용어 “약” 또는 “대략”은 해당 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 결정된 특정 수치에 대해 허용가능한 오차를 의미하며, 이는 부분적으로 그 수치가 어떻게 측정 또는 결정되는지에 따라 달라진다.
본 출원에서 사용되는 구획 제목은 단지 구성을 위한 것이며 원하는 주제를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 참고로 포함된 자료가 본 명세서에 정의된 용어 또는 본 명세서의 다른 표현 내용과 모순되는 경우, 본 명세서가 우선한다.
I. 정의
달리 명시되지 않는 한, 여기에 사용 된 다음 용어 및 문구는 다음과 같은 의미를 갖는다:
“폴리뉴클레오티드” 및 “핵산”은 골격을 따라 함께 연결된 질소 헤테로사이클릭 염기 또는 염기 유사체를 갖는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 다량체 화합물을 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 이는 통상적인 RNA, DNA, 혼합 RNA-DNA 및 이의 유사체인 중합체를 포함한다. 핵산 “골격”은 하나 이상의 당-포스포디에스터 링키지, 펩티드-핵산 결합 (“펩티드 핵산” 또는 PNA; PCT 번호 WO 95/32305), 포스포로티오에이트 링키지, 메틸포스포네이트 링키지, 또는 이들의 조합을 비롯한 다양한 링키지들로 구성 될 수 있다. 핵산의 당 모이어티는 리보스, 데옥시리보스 또는 선택적 치환, 예를 들어 2' 메톡시 또는 2' 할라이드 치환을 갖는 유사한 화합물 일 수 있다. 질소 염기는 통상적인 염기 (A, G, C, T, U), 이의 유사체 (예를 들어, 변형된 우리딘, 예를 들어, 5-메톡시우리딘, 슈도우리딘, 또는 N1-메틸슈도우리딘, 또는 기타); 이노신; 퓨린 또는 피리미딘의 유도체 (예를 들어, N4-메틸 데옥시구아노신, 데아자- 또는 아자-퓨린, 데아자- 또는 아자-피리미딘, 5 또는 6 위치에 치환기가 있는 피리미딘 염기 (예를 들어, 5-메틸시토신), 2, 6 또는 8 위치에 치환기가 있는 퓨린 염기, 2-아미노-6-메틸아미노퓨린, O6-메틸구아닌, 4-티오-피리미딘, 4-아미노-피리미딘, 4-디메틸하이드라진-피리미딘 및 O4-알킬-피리미딘; US 특허 5,378,825 및 PCT 제 WO 93/13121) 일 수 있다. 일반적인 논의는 The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams 등, ed., 11th ed., 1992)를 참고하라. 핵산은 하나 이상의 “비 염기성” 잔기를 포함 할 수 있으며, 여기서 골격은 중합체의 위치(들)에 대하여 질소 염기를 포함하지 않는다. (US 특허 제 5,585,481). 핵산은 통상적인 RNA 또는 DNA 당, 염기 및 링키지만을 포함 할 수 있거나, 통상적인 성분 및 치환 (예를 들어, 2' 메톡시 치환기들을 갖는 통상적인 뉴클레오시드, 또는 통상적인 뉴클레오티드 및 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체들을 모두 함유하는 중합체)을 모두 포함 할 수 있다. 핵산은 당 형태를 모방하는 RNA에 잠금된 바이사이클릭 퓨라노스 단위를 가지는 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드 단량체를 함유하는 유사체인 “잠금 핵산” (LNA)을 포함하는데, 이는 상보적 RNA 및 DNA 서열들에 대한 혼성화 친화도를 향상시킨다 (Vester and Wengel, 2004, Biochemistry 43(42):13233-41). RNA와 DNA는 상이한 당 모이어티를 가지며 RNA에서 우라실 또는 이의 유사체 그리고 DNA에서 티민 또는 이의 유사체의 존재에 의해 다를 수 있다.
“가이드 RNA”, “gRNA” 및 간단히 “가이드”는 가이드 서열을 포함하는 가이드, 예를 들어, crRNA (CRISPR RNA로도 공지) 또는 crRNA와 trRNA의 조합 (tracrRNA로도 공지)을 지칭하기 위해 본원에서 호환적으로 사용된다. crRNA 및 trRNA는 단일 RNA 분자 (단일 가이드 RNA, sgRNA)로 결합되거나, 또는, 예를 들어, 2개의 개별 RNA 분자 (이중 가이드 RNA, dgRNA)로 존재할 수 있다. “가이드 RNA” 또는 “gRNA”는 각 유형을 지칭한다. trRNA는 자연 발생 서열, 또는 자연 발생 서열과 비교하여 변형 또는 변이가 있는 trRNA 서열 일 수 있다. 가이드 RNA, sgRNA 또는 dgRNA는 본원에 기재된 변형된 RNA를 포함 할 수 있다.
본원에 사용된 “가이드 서열”은 표적 서열에 상보적이고 RNA-가이드 DNA 결합제에 의한 결합 또는 변형 (예를 들어, 절단)을 위해 가이드 RNA를 표적 서열로 안내하는 기능을 하는 가이드 RNA 내부의 서열을 지칭한다. “가이드 서열”은 또한 “표적화 서열”또는 “스페이서 서열”로 지칭 될 수 있다. 가이드 서열은, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) (즉, Spy Cas9) 및 관련 Cas9 동족체/오쏠로그의 경우 20개 염기쌍 길이 일 수 있다. 보다 짧은 또는 긴 서열들, 예를 들어, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 21-, 22-, 23-, 24-, 또는 25-뉴클레오티드 길이 또한 가이드로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 가이드 서열은 서열 번호: 2-33에서 선택된 알부민 가이드 서열 또는 서열 번호: 1000-1128에서 선택된 SERPINA1 가이드 서열의 최소한 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 표적 서열은 유전자 또는 염색체에 존재하고 예를 들어 가이드 서열에 상보적이다. 일부 구체예들에서, 가이드 서열과 이의 대응 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성 정도는 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 가이드 서열은 서열 번호: 2-33에서 선택된 알부민 가이드 서열 또는 서열 번호: 1000-1128에서 선택된 SERPINA1 가이드 서열의 최소한 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드에 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 표적 영역의 가이드 서열은 100% 상보적 또는 동일할 수 있다. 다른 구체예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 최소한 하나의 미스매치를 포함 할 수 있다. 예를 들어, 가이드 서열 및 표적 서열은 1, 2, 3, 또는 4개 미스매치를 함유할 수 있으며, 이 때 표적 서열의 총 길이는 최소한 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 염기쌍이다. 일부 구체예들에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1-4개 미스매치를 함유할 수 있으며 이 때 가이드 서열은 최소한 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1, 2, 3, 또는 4개 미스매치를 함유할 수 있으며 이 때 가이드 서열은 20개 뉴클레오티드를 포함한다.
RNA-가이드 DNA 결합제에 대한 핵산 기질이 이중-가닥 핵산이므로 RNA-가이드 DNA 결합제들의 표적 서열들은 게놈 DNA의 양성 및 음성 가닥들 모두 (즉, 주어진 서열 및 이 서열의 역 상보체)를 포함한다. 따라서, 가이드 서열이 “표적 서열에 상보적”이라고 말하는 경우, 가이드 서열은 가이드 RNA가 표적 서열의 센스 또는 안티센스 가닥 (예를 들어, 역 상보체)에 결합하도록 안내할 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 가이드 서열이 표적 서열의 역 상보체에 결합하는 일부 구체예에서, 가이드 서열은 가이드 서열에서 T에 대한 U의 치환을 제외하고 표적 서열 (예를 들어, PAM을 포함하지 않는 표적 서열)의 특정 뉴클레오티드와 동일하다.
본원에 사용된 “RNA-가이드 DNA 결합제”는 RNA 및 DNA 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 복합체, 또는 이러한 복합체의 DNA-결합 서브유닛을 의미하며, 이 때 DNA 결합 활성은 서열 특이적이고 RNA의 서열에 의존적이다. 용어 RNA-가이드 DNA 결합제는 또한 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 예시적인 RNA-가이드 DNA 결합제는 Cas 클리브아제/닉카제를 포함한다. 예시적인 RNA-가이드 DNA 결합제는, 예를 들어, 이들 제제들이 DNA 절단을 허용하도록 예를 들어, FokI 클리브아제 도메인과의 융합을 통해 변형된 경우, 이의 비활성화 형태들 (“dCas DNA 결합제”)을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 “Cas 뉴클레아제”는 Cas 클리브아제 및 Cas 닉카제를 포함한다. Cas 클리브아제 및 Cas 닉카제는 유형 III CRISPR 시스템의 Csm 또는 Cmr 복합체, Cas10, 이의 Csm1, 또는 Cmr2 서브유닛, 유형 I CRISPR 시스템의 캐스케이드 복합체, 이의 Cas3 서브유닛, 및 클래스 2 Cas 뉴클레아제를 포함한다. 본원에서 사용되는 “클래스 2 Cas 뉴클레아제”는 RNA-가이드 DNA 결합 활성을 가지는 단일-사슬 폴리펩티드이다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제는 RNA-가이드 DNA 클리브아제 또는 닉카제 활성을 추가로 가지는 클래스 2 Cas 클리브아제/닉카제 (예를 들어, H840A, D10A, 또는 N863A 변이체), 그리고, 이들 제제들이 DNA 절단을 허용하도록 변형된 경우, 클리브아제/닉카제 활성이 비활성화되어 있는 클래스 2 dCas DNA 결합제를 포함한다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제는, 예를 들어, Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, HF Cas9 (예를 들어, N497A, R661A, Q695A, Q926A 변이체), HypaCas9 (예를 들어, N692A, M694A, Q695A, H698A 변이체), eSPCas9(1.0) (예를 들어, K810A, K1003A, R1060A 변이체), 및 eSPCas9(1.1) (예를 들어, K848A, K1003A, R1060A 변이체) 단백질 및 이의 변형을 포함한다. Cpf1 단백질, Zetsche 등, Cell, 163: 1-13 (2015)은, 또한 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유한다. Zetsche의 Cpf1 서열들은 그 전체가 참고로 포함된다. 예를 들어, Zetsche, 표 S1 및 S3를 참고하라. 예를 들어, Makarova 등, Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015); Shmakov 등, Molecular Cell, 60:385-397 (2015)를 참고하라. 본원에서 사용되는 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제, Cas9 뉴클레아제, 또는 S. 피오게네스 Cas9 뉴클레아제)의 전달은 폴리펩티드 또는 mRNA의 전달을 포함한다.
본원에서 사용되는 “리보핵단백질” (RNP) 또는 “RNP 복합체”는 RNA-가이드 DNA 결합제, 가령, Cas 뉴클레아제, 예를 들어, Cas 클리브아제, Cas 닉카제, 또는 dCas DNA 결합제 (예를 들어, Cas9)와 함께 가이드 RNA를 지칭한다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA는 RNA-가이드 DNA 결합제, 가령, Cas9를 표적 서열로 가이드하고, 가이드 RNA는 표적 서열과 혼성화하여 제제가 표적 서열에 결합한다; 제제가 클리브아제 또는 닉카제인 경우, 결합 후 절단 또는 닉킹이 수반될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 제 2 서열에 대한 제 1 서열의 정렬이, 그 전체에서 제 2 서열의 위치들의 X% 또는 그 이상이 제 1 서열과 매치됨을 보여주는 경우, 제 1 서열은 제 2 서열에 대해 “최소한 X% 동일성을 가지는 서열을 포함하는” 것으로 간주된다. 예를 들어, 서열 AAGA는 서열 AAG에 대해 100% 동일성을 가지는 서열을 포함하는데, 제 2 서열의 3개 위치들 모두에 대해 매치된다는 점에서 정렬이 100% 동일성을 제공하기 때문이다. RNA와 DNA 간의 차이 (일반적으로 우리딘을 티미딘으로 또는 그 역으로 교환) 및 뉴클레오시드 유사체, 가령, 변형된 우리딘의 존재는 관련 뉴클레오티드 (가령, 티미딘, 우리딘, 또는 변형된 우리딘)가 동일한 상보체 (예를 들어, 모든 티미딘, 우리딘 또는 변형된 우리딘에 대해 아데노신; 또 다른 예는 시토신 및 5-메틸시토신, 이들 둘 모두 상보체로서 구아노신 또는 변형된 구아노신을 가진다)를 가지는 한 폴리뉴클레오티드에서의 동일성 또는 상보성에서 차이를 유발하지 않는다. 그러므로, 예를 들어, X가 임의의 변형된 우리딘, 가령, 슈도우리딘, N1-메틸 슈도우리딘, 또는 5-메톡시우리딘인 서열 5'-AXG는, AUG에 100% 동일한 것으로 간주되는데, 이들 둘 모두가 동일한 서열 (5'-CAU)에 완벽하게 상보적이기 때문이다. 예시적인 정렬 알고리즘은 당업계에 잘 공지된 Smith-Waterman 및 Needleman-Wunsch 알고리즘이다. 당업자는 주어진 정렬될 서열들 쌍에 대해 어떠한 알고리즘의 선택 및 매개변수 설정이 적절한지를 잘 이해할 것이다; 일반적으로 유사한 길이 그리고 아미노산의 경우 >50% 또는 뉴클레오티드의 경우 >75%의 동일성이 예상되는 서열들에 대하여, www.ebi.ac.uk 웹 서버에서 EBI가 제공하는 Needleman-Wunsch 알고리즘 인터페이스의 기본 설정을 사용하는 Needleman-Wunsch 알고리즘이 일반적으로 적절하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 제 1 서열 염기의 X% 염기들이 제 2 서열과 쌍을 이루는 경우 제 1 서열은 제 2 서열에 “X% 상보적인” 것으로 간주된다. 예를 들어, 제 1 서열 5'AAGA3'은 제 2 서열 3'TTCT5'에 100% 상보적이며, 제 2 서열은 제 1 서열에 100% 상보적이다. 일부 구체예들에서, 제 1 서열 5'AAGA3'은 제 2 서열 3'TTCTGTGA5'에 100% 상보적인 반면, 제 2 서열은 제 1 서열에 50% 상보적이다.
본원에 사용된 “mRNA”는 전체적으로 또는 주로 RNA 또는 변형된 RNA이고 폴리펩티드로 번역 될 수 있는 (즉, 리보솜 및 아미노-아실화 tRNA에 의한 번역을 위한 기질로서 기능할 수 있는) 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. mRNA는 리보스 잔기 또는 이의 유사체, 예를 들어, 2'-메톡시 리보스 잔기를 포함하는 포스페이트-당 골격을 포함 할 수 있다. 일부 구체예들에서, mRNA 포스페이트-당 골격의 당은 본질적으로 리보스 잔기, 2'-메톡시 리보스 잔기 또는 이들의 조합으로 구성된다.
본원에 기재된 가이드 RNA 조성물 및 방법에 유용한 예시적인 가이드 서열은 표 1, 표 2 및 본원 전반에 걸쳐 제시되어 있다.
본원에 사용된 “인델”은 표적 핵산의 이중-가닥 절단 (DSB) 부위에 삽입되거나 결실된 다수의 뉴클레오티드로 구성된 삽입/결실 돌연변이를 지칭한다.
본원에 사용된 “이종 알파-1 항트립신”은 “이종 AAT”또는 “이종 A1AT”또는 “AAT/A1AT 트랜스진”과 호환적으로 사용되며, 이는 그 삽입 부위에 대하여 이종인 SERPINA1 유전자의 유전자 산물이다. 일부 구체예들에서, SERPINA1 유전자는 외인성이다. 인간 야생형 AAT 단백질 서열은 NCBI NP_000286으로 이용가능하며; 유전자 서열은 NCBI NM_000295로 이용가능하다. 인간 야생형 AAT cDNA는 시퀀싱된 바 있으며 (예를 들어, Long 등, “Complete sequence of the cDNA for human alpha 1-antitrypsin and the gene for the S variant,” Biochemistry 1984 참조) 단일 펩티드 및 성숙 AAT 펩티드를 포함하는 전구체 분자를 인코딩한다. 세포내 표적화, 탄수화물 부착, 촉매 기능, 프로테아제 억제 활성 등의 원인이 되는 펩티드 도메인들이 특성화된 바 있다 (예를 들어, Kalsheker, “Alpha 1-antitrypsin: structure, function and molecular biology of the gene,” Biosci Rep. 1989; Matamala 등, “Identification of Novel Short C-Terminal Transcripts of Human SERPINA1 Gene,” PLoS One 2017; Niemann 등, “Isolation and serine protease inhibitory activity of the 44-residue, C-terminal fragment of alpha 1-antitrypsin from human placenta,” Matrix 1992 참조). 본원에서 사용되는 이종 AAT는 전구체 AAT, 성숙 AAT, 및 이의 변이체 및 단편들, 예를 들어, 기능적 단편들, 예를 들어, 프로테아제 억제 활성을 유지하는 단편들 (예를 들어, 상업적으로 이용가능한 프로테아제 억제 분석 또는 인간 호중구 엘라스타제 (HNE) 억제 분석으로 분석시, 야생형 AAT에 비해, 예를 들어, 최소한 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 또는 100%)을 포함한다. 일부 구체예에서, 기능적 단편은 자연 발생, 예를 들어, 짧은 C-말단 단편이다. 일부 구체예에서, 기능적 단편, 예를 들어, 과활성 기능적 단편은 유전자 조작된다. AAT 단백질 서열의 예들이 본원에 기재되어 있다 (예를 들어, 서열 번호: 700 또는 서열 번호: 702). 본원에서 사용되는 이종 AAT는 또한 AAT의 변이체, 예를 들어, 야생형 AAT에 비해 증가된 프로테아제 억제제 활성을 보유하는 변이체를 포함한다. 본원에서 사용되는 이종 AAT는 또한 예를 들어, HNE 억제로 분석시, 야생형 AAT와 비교하여, 기능적 활성-예를 들어, 최소한 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100%, 또는 그 이상의 활성을 가지는, 서열 번호: 700에 대해 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99% 동일한 변이체를 포함한다. 본원에서 사용되는 이종 AAT는 또한 예를 들어, HNE 억제로 분석시, 기능적 활성-예를 들어, 야생형 AAT와 비교하여, 예를 들어, 최소한 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100%, 또는 그 이상의 활성을 가지는 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 이종 AAT는 AAT, 예를 들어, AATD 치료에 유용한 기능적 AAT를 지칭하며, 이는 AATD 치료에 유용한 야생형 AAT 또는 이의 변이체일 수 있다.
본원에 사용된 “이종 유전자”는 숙주 세포 게놈 내의 부위 (예를 들어, 알부민 인트론 1 부위를 포함하는 세이프 하버 유전자좌와 같은 게놈 유전자좌)에 외인성 공급원으로서 도입된 유전자를 지칭한다. 이러한 이종 유전자로부터 발현된 폴리펩티드를 “이종 폴리펩티드”라 한다. 이종 유전자는 자연적으로 발생하거나 조작 될 수 있으며 야생형 또는 변이체 일 수 있다. 이종 유전자는 이종 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 이외의 뉴클레오티드 서열을 포함 할 수 있다. 이종 유전자는 야생형 또는 변이체 (예를 들어, 돌연변이체)로서 숙주 게놈에서 자연적으로 발생하는 유전자 일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 관심있는 유전자 (야생형 또는 변이체)를 포함한다 하더라도, 동일한 유전자 또는 이의 변이체가 예를 들어 고도로 발현되는 유전자좌에서의 발현을 위해 외인성 공급원으로서 도입 될 수 있다. 이종 유전자는 또한 숙주 게놈에서 자연적으로 발생하지 않거나 숙주 게놈에서 자연적으로 발생하지 않는 이종 폴리펩티드를 발현하는 유전자 일 수 있다. “이종 유전자”, “외인성 유전자” 및 “트랜스진”은 호환적으로 사용된다. 일부 구체예들에서, 이종 유전자 또는 트랜스진은 외인성 핵산 서열을 포함한다, 예를 들어, 핵산 서열은 수용 세포에 대해 내인성이 아니다. 특정 구체예들에서, 이종 유전자는 수용자 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 AAT 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, AAT는 삽입 부위에 대해 및 수용 세포에 대해 이종일 수 있다.
본원에서 사용되는 “돌연변이 SERPINA1” 또는 “돌연변이 SERPINA1 대립유전자”는 야생형 서열 (NCBI 유전자 ID: 5265; NCBI NM_000295; Ensembl: Ensembl:ENSG00000197249)에 비해 SERPINA1의 뉴클레오티드 서열에 변화가 있는 SERPINA1 서열을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 돌연변이 SERPINA1 대립유전자는 비-기능적 및/또는 비-분비형 AAT 단백질을 인코딩한다.
본원에서 사용되는 “AATD” 또는 “A1AD”는 알파-1 항트립신 결핍증을 지칭한다. AATD는 SERPINA1의 여러 서로 다른 유전자 돌연변이로 인한 질병 및 장애를 포함한다. AATD는 감소된 수준의 기능적 AAT가 발현되는 (예를 들어, 혼탁측정법 (nephelometry) 또는 면역혼탁측정법 (immunoturbidimetry)으로 측정시, 예를 들어, 대조 샘플에 비해 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, or 5% 미만의 AAT 유전자 또는 단백질 발현, 예를 들어, 혈청에서 약 100 mg/dL, 90 mg/dL, 80 mg/dL, 70 mg/dL, 60 mg/dL, 50 mg/dL, 40 mg/dL, 30 mg/dL, 20 mg/dL, 10 mg/dL, 또는 5 mg/dL 미만의 AAT), 기능적 AAT가 발현되지 않는, 또는 돌연변이 또는 비-기능적 AAT가 발현되는 (예를 들어, 응집을 형성 및/또는 프로테아제 억제제가 분비될 수 없는 및/또는 프로테아제 억제제 활성이 감소된) 질병을 지칭할 수 있다. 예를 들어, Greulich 및 Vogelmeier, Ther Adv Respir Dis 2016을 참고하라. 일부 구체예에서, AATD는 AAT가 세포내, 예를 들어, 헤파토사이트에서 응집 및/또는 축적되고, 예를 들어, 폐로 전달되어 프로테아제 억제제로서 기능할 수 있는 순환으로 분비되지 않는 질병을 지칭한다. 일부 구체예들에서, AATD는 예를 들어 응집을 측정하기 위해 간 조직 절편을 PASD 염색하여 검출 될 수 있다. 일부 구체예들에서, AATD는 예를 들어 폐에서 호중구 엘라스타제의 억제 감소에 의해 검출 될 수 있다.
본원에서 사용되는 “표적 서열”은 gRNA의 가이드 서열에 상보성을 갖는 표적 유전자의 핵산 서열을 지칭한다. 표적 서열과 가이드 서열의 상호작용은 RNA-가이드 DNA 결합제가 표적 서열 내부에 결합하고 잠재적으로 (제제의 활성에 따라) 닉 또는 절단하도록 안내한다.
본원에 사용된 “정상” 또는 “건강한”개체는 AATD-관련 대립유전자가 없는 개체를 포함한다- 예를 들어 AATD-관련 대립유전자는 ZZ, MZ 또는 SZ이다.
본원에서 사용되는 “치료”는 대상체에서 질환 또는 장애에 대한 치료제의 임의의 투여 또는 적용을 지칭하고, 질환 억제, 발병 억제, 질환의 하나 이상의 증상 완화, 질환 치유 또는 질병의 하나 이상의 증상의 재발 방지를 포함한다. AATD는 폐 질환 및/또는 간 질환; 쌕쌕거림 또는 숨가쁨; 폐 감염 위험 증가; 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD); 기관지염, 천식, 호흡 곤란; 경화증; 신생아 황달; 지방층염; 만성 기침 및/또는 가래; 반복되는 흉부 감기; 피부 또는 눈의 흰 부분의 황변; 배 또는 다리의 부종과 연관 될 수 있다. 예를 들어, AATD의 치료는 AATD의 증상, 예를 들어 간 및/또는 폐 증상을 완화하는 것을 포함 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어 보호 수준까지 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어, 정상 범위 이내로 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어, 혼탁측정법 또는 면역혼탁측정법을 사용하여 측정시,예를 들어, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/dL, 및 정제된 표준 이상으로 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 치료는 예를 들어 치료 전후에 대조군과 비교하여, 기준선 혈청 AAT의 개선을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 치료는 예를 들어 치료 전후에 대조군과 비교하여, AATD 관련 간 질병의 조직학적 등급에 있어서, 예를 들어, 1, 2, 3, 또는 그 이상의 점수만큼의 개선을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 치료는 예를 들어 치료 전후에 대조군과 비교하여, Ishak 섬유화 점수의 개선을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 치료는 유전자형 혈청 수준, AAT 폐 기능, 폐활량 측정 검사, 폐 흉부 X-레이, 폐 CT 스캔, 간 기능 혈액 검사 및/또는 간 초음파의 개선을 지칭한다.
본원에서 사용된 “녹다운”은 특정 유전자 산물 (예를 들어, 단백질, mRNA 또는 둘 모두)의 발현 감소를 지칭한다. 단백질의 녹다운은 예를 들어 조직 또는 세포 집단 (예를 들어, 혈청 또는 세포 배지내)에 의해 분비된 단백질을 검출하거나 관심 조직 또는 세포 집단으로부터 단백질의 총 세포 양을 검출함으로써 측정 될 수 있다. mRNA의 녹다운을 측정하는 방법은 공지이며, 관심 조직 또는 세포 집단에서 단리된 mRNA의 시퀀싱을 포함한다. 일부 구체예들에서, “녹다운”은 특정 유전자 산물 발현의 일부 소실, 예를 들어 전사되는 mRNA 양의 감소 또는 세포 집단 (생체내 집단, 가령, 조직에서 발견되는 집단 포함)에 의해 발현되거나 분비되는 단백질 양의 감소를 지칭 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 세포들 (예를 들어, 생체내 집단을 비롯한 세포들의 집단, 가령, 조직에서 발견되는 집단)에서 내인성 AAT를 “녹다운” 시킨다. 관련 세포들은 AAT를 생성할 수 있는 세포들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법은 내인성 돌연변이 SERPINA1 대립유전자, 및/또는 내인성 야생형 SERPINA1 대립유전자 (예를 들어, 이형접합 MZ 개체에서)를 녹다운시킨다.
본원에서 사용되는 “녹아웃”은 세포 내 특정 단백질의 발현 소실을 지칭한다. 녹아웃은 조직 또는 세포 집단 (예를 들어, 혈청 또는 세포 배지 내)으로부터의 단백질 분비량을 검출하거나 조직 또는 세포 집단의 단백질 총 세포량을 검출하여 측정 할 수 있다. 관련 세포들은 AAT를 생성할 수 있는 세포들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 세포들 (예를 들어, 생체내 집단을 비롯한 세포들의 집단, 가령, 조직에서 발견되는 집단)에서 내인성 AAT를 “녹아웃” 시킨다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법은 내인성 돌연변이 SERPINA1 대립유전자, 및/또는 내인성 야생형 SERPINA1 대립유전자 (예를 들어, 이형접합 MZ 개체에서)를 녹아웃시킨다. 일부 구체예들에서, 녹아웃은 세포에서 내인성 AAT 단백질의 완전한 발현 소실이다.
본원에서 사용되는, “폴리펩티드”는 야생형 또는 변이체 단백질 (예를 들어, 돌연변이체, 단편, 융합, 또는 이들의 조합)을 지칭한다. 변이체 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드의 최소한 또는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 기능적 활성을 보유할 수 있다. 일부 구체예들에서, 변이체는 야생형 폴리펩티드 서열에 대해 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 일부 구체예들에서, 변이체 폴리펩티드는 과활성 변이체 일 수 있다. 특정 사례에서, 변이체는 야생형 폴리펩티드의 약 80% 내지 약 120%, 140%, 160%, 180%, 200%의 기능적 활성을 보유한다.
본원에서 사용되는 “양방향 핵산 구조체” (본원에서 호환적으로 “양방향 구조체”로 지칭됨)는 최소한 2개의 핵산 세그먼트를 포함하고, 이 때 하나의 세그먼트 (제 1 세그먼트)는 관심 폴리펩티드를 인코드하는 코딩 서열 (이러한 코딩 서열은 본원에서 “트랜스진” 또는 제 1 트랜스진으로 지칭될 수 있음)을 포함하고, 다른 하나의 세그먼트 (제 2 세그먼트)는, 그 서열의 상보체가 관심 폴리펩티드를 인코드하는 서열 또는 제 2 트랜스진을 포함한다. 즉, 최소한 2개의 세그먼트들은 동일 또는 상이한 폴리펩티드를 인코드할 수 있다. 두 세그먼트가 동일한 폴리펩티드를 인코드 할 때, 제 1 세그먼트의 코딩 서열은 제 2 세그먼트의 서열의 상보체와 동일할 필요는 없다. 일부 구체예들에서, 제 2 세그먼트의 서열은 제 1 세그먼트의 코딩 서열의 역 상보체이다. 양방향 구조체는 단일-가닥 또는 이중-가닥 일 수 있다. 본원에 개시된 양방향 구조체는 임의의 관심 폴리펩티드를 발현 할 수 있는 구조체를 포함한다.
본원에 사용된 “역 상보체”는 참조 서열의 상보 서열인 서열을 지칭하며, 이 때 상보 서열은 역 방향으로 기재된다. 예를 들어, 가정 서열 5' CTGGACCGA 3' (서열 번호: 500)에 있어서, “완전” 상보 서열은 3' GACCTGGCT 5' (서열 번호: 501)이고, “완전” 역 상보체는 5' TCGGTCCAG 3' (서열 번호: 502)로 기재된다. 역 상보체 서열은 “완전”일 필요는 없으며 여전히 참조 서열과 동일한 폴리펩티드 또는 유사한 폴리펩티드를 인코드 할 수 있다. 코돈 사용빈도 중복 (codon usage redundancy)으로 인해 역 상보체는 동일한 폴리펩티드를 인코드하는 참조 서열과 다를 수 있다. 본원에서 사용되는 “역 상보체”는 또한 참조 서열의 역 상보체 서열에 예를 들어, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열들을 포함한다.
일부 구체예들에서, 양방향 핵산 구조체는 제 1 폴리펩티드를 인코드하는 코딩 서열 (제 1 트랜스진)을 포함하는 제 1 세그먼트, 및 그 서열의 상보체가 제 2 폴리펩티드를 인코드하는 서열 (제 2 트랜스진)을 포함하는 제 2 세그먼트를 포함한다. 일부 구체예들에서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 최소한 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다. 일부 구체예들에서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 예를 들어, 50, 100, 200, 500, 1000개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들에 걸쳐 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
“세이프 하버” 유전자좌는 유전자가 숙주 세포, 예를 들어, 헤파토사이트에 유의하게 유해한 영향을 주지 않고, 예를 들어, 아폽토시스, 괴사, 및/또는 노화를 유발하지 않고, 또는 대조군 세포에 비해 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 또는 40% 이상의 아폽토시스, 괴사, 및/또는 노화를 유발하지 않고 삽입될 수 있는 게놈 내 유전자좌이다. 예를 들어, Hsin 등, “Hepatocyte death in liver inflammation, fibrosis, and tumorigenesis,” 2017을 참고하라. 일부 구체예들에서, 세이프 하버 유전자좌는 숙주 세포, 예를 들어, 헤파토사이트에 유의하게 유해한 영향을 주지 않고, 아폽토시스, 괴사, 및/또는 노화를 유발하지 않고, 또는 대조군 세포에 비해 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 또는 40% 이상의 아폽토시스, 괴사, 및/또는 노화를 유발하지 않고 외인성 유전자의 과발현을 가능하게 한다. 일부 구체예들에서, 바람직한 세이프 하버 유전자좌는 삽입된 유전자 서열의 발현이 인접 유전자로부터의 리드-쓰루 (read-through) 발현에 의해 교란되지 않는 것일 수 있다. 세이프 하버는 알부민 유전자, 가령, 인간 알부민 유전자 내부에 존재할 수 있다. 세이프 하버는 알부민 인트론 1 영역, 예를 들어, 인간 알부민 인트론 1에 존재할 수 있다. 세이프 하버는, 예를 들어, 간 조직 또는 헤파토사이트 숙주 세포를 위한 인간 세이프 하버 일 수 있다. 일부 구체예들에서, 세이프 하버는 숙주 세포 또는 세포들의 집단, 가령, 헤파토사이트 또는 간 세포에 유의하게 유해한 영향을 주지 않고, 예를 들어, 아폽토시스, 괴사, 및/또는 노화를 유발하지 않고, 또는 대조군 세포에 비해 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 또는 40% 이상의 아폽토시스, 괴사, 및/또는 노화를 유발하지 않고 외인성 유전자의 과발현을 가능하게 한다.
일부 구체예들에서, 유전자는 세이프 하버 유전자좌에 삽입되고 세이프 하버 유전자좌의 내인성 신호 서열, 예를 들어, 엑손 1에 의해 인코딩된 알부민 신호 서열을 사용할 수 있다. 예를 들어, AAT 코딩 서열은 인간 알부민 인트론 1에 삽입되어, 인간 알부민 엑손 1의 신호 서열의 하류에 존재하게 되고 이에 융합될 수 있다.
일부 구체예들에서, 유전자는 그 자체의 신호 서열을 포함 할 수 있고, 세이프 하버 유전자좌에 삽입 될 수 있으며, 추가로 세이프 하버 유전자좌의 내인성 신호 서열을 사용할 수 있다. 예를 들어, AAT 신호 서열을 포함하는 AAT 코딩 서열은 인간 알부민 인트론 1에 삽입되어, 엑손 1에 의해 인코딩된 인간 알부민의 신호 서열의 하류에 존재하게 되고 이에 융합될 수 있다.
일부 구체예들에서, 유전자는 그 자체의 신호 서열 및 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 포함 할 수 있고, 세이프 하버 유전자좌에 삽입 될 수 있으며, 추가로 세이프 하버 유전자좌의 내인성 신호 서열을 사용할 수 있다. 예를 들어, AAT 신호 서열 및 IRES 서열을 포함하는 AAT 코딩 서열은 인간 알부민 인트론 1에 삽입되어, 엑손 1에 의해 인코딩된 인간 알부민의 신호 서열의 하류에 존재하게 되고 이에 융합될 수 있다.
일부 구체예들에서, 유전자는 그 자체의 신호 서열 및 IRES를 포함 할 수 있고, 세이프 하버 유전자좌에 삽입 될 수 있으며, 세이프 하버 유전자좌의 내인성 신호 서열을 사용하지 않는다. 예를 들어, AAT 신호 서열 및 IRES 서열을 포함하는 AAT 코딩 서열은 인간 알부민 인트론 1에 삽입되어, 엑손 1에 의해 인코딩된 인간 알부민의 신호 서열에 융합되지 않는다. 이들 구체예에서, 단백질은 IRES 부위로부터 번역되고 키메라 (예를 들어, AAT 단백질에 융합된 알부민 신호 펩티드)가 아니며, 이는 유리하게 비- 또는 저-면역원성일 수 있다. 일부 구체예들에서, 단백질은 분비 및/또는 세포외로 수송되지 않는다.
일부 구체예들에서, 유전자는 세이프 하버 유전자좌에 삽입 될 수 있으며 IRES를 포함 할 수 있으며 신호 서열을 사용하지 않는다. 예를 들어, AAT 신호 서열 및 IRES 서열을 포함하는 AAT 코딩 서열은 인간 알부민 인트론 1에 삽입되어, 엑손 1에 의해 인코딩된 인간 알부민의 신호 서열에 융합되지 않는다. 일부 구체예들에서, 단백질은 신호 서열을 필요로 하지 않고 IRES 부위로부터 번역된다. 일부 구체예들에서, 단백질은 세포외로 수송되지 않는다.
본원에서 사용되는 유사분열기 세포 분열을 거치지 않는 세포는 “비-분열” 세포로 지칭된다. “비-분열” 세포는 유사분열기 세포 분열을 전혀 또는 거의 거치지 않는 세포 유형, 예를 들어, 많은 유형의 뉴런을 포함한다. “비-분열” 세포는 또한 유사분열기 세포 분열을 거칠 수 있지만 거치지 않는 또는 거치지 않게 될 세포, 예를 들어, 정지 세포를 포함한다. 예를 들어, 간 세포는 분열 능력을 유지하지만 (예를 들어, 부상을 입거나 절제시) 일반적으로 분열하지 않는다. 유사분열기 세포 분열 동안 상동성 재조합은 게놈을 보호하고 이중-가닥 절단을 복구하는 메커니즘이다. 일부 구체예들에서, “비-분열” 세포는, 예를 들어 대조군 분열 세포와 비교하여, 세포에서 이중-가닥 DNA 절단을 복구하는 1차 메커니즘이 상동성 재조합 (HR)이 아닌 세포를 의미한다. 일부 구체예들에서, “비-분열” 세포는, 예를 들어 대조군 분열 세포와 비교하여, 세포에서 이중-가닥 DNA 절단을 복구하는 1차 메커니즘이 비-상동성 말단 연결 (non-homologous end joining, NHEJ)인 세포를 의미한다.
비-분열 세포 유형들은 문헌에, 예를 들어, 능동적 NHEJ 이중-가닥 DNA 절단 복구 메커니즘으로 기재되어 있다. 예를 들어, Iyama, DNA Repair (Amst.) 2013, 12(8): 620-636을 참고하라. 일부 구체예들에서, 숙주 세포는 간 세포, 근육 세포 또는 신경 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 숙주 세포는 헤파토사이트, 가령, 마우스, 사이노, 또는 인간헤파토사이트이다. 일부 구체예들에서, 숙주 세포는 근세포, 가령, 마우스, 사이노, 또는 인간 근세포이다. 일부 구체예들에서, 본원에는 본원에 개시된 양방향 구조체를 포함하는 상기 기재된 숙주 세포가 제공된다. 일부 구체예들에서, 숙주 세포는 본원에 개시된 양방향 구조체에 의해 인코드된 트랜스진 폴리펩티드를 발현한다. 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 숙주 세포가 본원에 제공된다. 특정 구체예들에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 양방향 핵산 구조체, 및 유전자 편집 시스템, 가령, ZFN, TALEN, 또는 CRISPR/Cas9 시스템을 숙주 세포에 투여하거나 전달함으로써 제조된다.
II. 조성물
A. 세이프 하버 알부민 가이드 RNA (gRNAs) 및/또는 SERPINA1 가이드 RNA (gRNAs)를 포함하는 조성물
이종 AAT 유전자 (예를 들어, 기능적 또는 야생형 AAT)를 숙주 세포의 세이프 하버 유전자와 같은 게놈 유전자좌 내에 삽입하고 발현하는데 유용한 알부민 가이드 RNA 조성물, AAT 템플릿 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 특히, 본원에 예시된 바와 같이, 알부민 유전자좌 (예를 들어, 인트론 1)에서 이종 AAT 유전자를 표적화하고 삽입하는 것은 알부민의 내인성 프로모터를 사용하여 이종 AAT 유전자의 강력한 발현을 구동시킬 수 있게 한다. 본 발명은 부분적으로 알부민 유전자의 인트론 1 내의 부위들을 특이적으로 표적화하고 이종 AAT 유전자의 효율적인 삽입 및 발현을 제공하는 알부민 가이드 RNA의 식별에 기초한다. 실시예에 제시된 바와 같이 그리고 본원에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 인델 형성 활성을 통해 측정된 높은 수준의 편집을 매개하는 식별된 gRNA의 능력은, 예상외로, AAT 트랜스진의 발현으로 측정시 동일한 gRNA들을 사용하여 이종 유전자들의 효율적인 삽입을 매개하는 것과 반드시 상관관계가 있는 것은 아니다. 즉, 높은 수준의 편집을 구현 할 수 있는 특정 gRNA가 반드시 효율적인 삽입을 매개 할 수 있는 것은 아니며, 반대로 낮은 수준의 편집을 구현하는 것으로 나타난 일부 gRNA가 트랜스진의 효율적인 삽입 및 발현을 매개 할 수 있다.
일부 구체예들에서, 예를 들어, 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA를 RNA 유도 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제) 및 이종 AAT 핵산 (“AAT 트랜스진”)을 포함하는 구조체 (예를 들어, 공여자 구조체 또는 템플릿)와 함께 사용하여, 숙주 세포의 유전자좌, 가령, 알부민 유전자좌 (예를 들어, 인트론 1) 내에 이종 AAT 유전자 (예를 들어, 기능적 또는 야생형 AAT)를 도입하거나 삽입하는데 유용한 조성물이 본원에 개시되어 있다. 일부 구체예들에서, 본원은 숙주 세포의 알부민 유전자좌에서, 예를 들어, RNA-가이드 DNA 결합제, 및 이종 AAT 핵산을 포함하는 구조체 (예를 들어, 공여자)와 함께 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA를 사용하여 이종 AAT 유전자를 발현하는데 유용한 조성물을 개시한다. 일부 구체예들에서, 본원은 숙주 세포의 알부민 유전자좌에서, 예를 들어, RNA-가이드 DNA 결합제, 및 이종 AAT 핵산을 포함하는 양방향 구조체와 함께 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA를 사용하여 이종 AAT를 발현하는데 유용한 조성물을 개시한다. 일부 구체예들에서, 본원은, 예를 들어, RNA-가이드 DNA 결합제와 함께 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA (예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)를 사용하여 숙주 세포의 알부민 유전자 내부에서 절단 (예를 들어, 이중-가닥 절단 (DSB) 또는 단일-가닥 절단 (SSB 또는 닉))을 유도함에 유용한 조성물을 개시한다. 이러한 조성물은 예를 들어, AATD 치료를 위해 시험관내 또는 생체내에서 사용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA는 알부민 유전자좌의 인트론 내부에 결합하는 또는 결합할 수 있는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA는 서열 번호: 1의 인간 알부민 유전자의 인트론 1 영역 내부에 결합한다. 알부민 가이드 서열의 모든 염기가 상기 언급된 영역들 내부에서 결합해야 하는 것은 아니라는 것이 이해 될 것이다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 알부민 가이드 RNA 서열의 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 이상의 염기들이 상기 언급된 영역들 내부에 결합한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 가이드 RNA 서열의 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 이상의 연속 염기들이 상기 언급된 영역들과 결합한다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA는 인간 알부민의 인트론 1 (서열 번호: 1) 내부 부위에서 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제)에 의한 표적-특이적 절단을 매개한다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA는 상기 영역들에 결합하거나 결합 할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 것으로 이해 될 것이다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA들은 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89% 또는 88% 동일한 가이드 서열을 포함한다.
알부민일부 구체예들에서, 본원에 개시된 가이드 RNA는 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드를 가지는 알부민 가이드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 알부민 가이드 RNA (gRNA)는 다음에서 선택된 가이드 서열을 포함한다: a) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; b) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드; c) 서열 번호: 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 및 97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; d) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; e) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드; f) 서열 번호: 34-97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; 및 g) 서열 번호: 2-33에 열거된 게놈 좌표들의 15개 연속 뉴클레오티드 +/- 10개 뉴클레오티드에 상보적인 서열. 일부 구체예들에서, 알부민 가이드 RNA는 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열을 포함한다. 표 1 참고.
표 1: 알부민 표적된 인간 가이드 RNA 서열 및 염색체 좌표
Figure pct00001
본원에 개시된 알부민 가이드 RNA는 이중-가닥 절단 (DSB)을 초래하는 표적-특이적 절단을 매개한다. 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA는 단일-가닥 절단 (SSB 또는 닉)을 초래하는 표적-특이적 절단을 매개한다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)의 상류 영역에 결합한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, PAM 서열은 표적 서열을 포함하는 가닥의 반대 가닥에서 발생한다. 즉, PAM 서열은 표적 가닥 (가이드 RNA가 결합하는 표적 서열을 포함하는 가닥)의 상보 가닥에 존재한다. 일부 구체예들에서, PAM은 NGG, NNGRRT, NNGRR(N), NNAGAAW, NNNNG(A/C)TT, 및 NNNNRYAC로 구성된 그룹에서 선택된다. 일부 구체예들에서, PAM은 NGG이다.
일부 구체예들에서, 본원에 제공된 가이드 RNA 서열들은 PAM 서열에 인접한 서열에 상보적이다.
일부 구체예들에서, 가이드 RNA 서열은 인간 참조 게놈 hg38의 좌표에 따라 본원의 표로부터 선택된 게놈 영역 내부의 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA 서열은 본원의 표들에서 선택된 게놈 영역 내부의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA 서열은 본원의 표들에서 선택된 게놈 영역에 걸쳐 있는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
본원에 개시된 가이드 RNA는 이중-가닥 절단 (DSB)을 초래하는 표적-특이적 절단을 매개한다. 본원에 개시된 가이드 RNA는 단일-가닥 절단 (SSB 또는 닉)을 초래하는 표적-특이적 절단을 매개한다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA는 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, 본원에 개시된 Cas 뉴클레아제)에 의한 표적-특이적 절단을 매개하며, 이 때 생성된 절단 부위는 알부민 유전자의 인트론 1 내부에 이종 AAT 핵산 (예를 들어, 기능적 또는 야생형 AAT)의 삽입을 가능하게 한다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA 및/또는 절단 부위는 이종 AAT 유전자의 1 내지 5%, 5 내지 10%, 15 내지 20%, 20 내지 25%, 25 내지 30%, 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 또는 95 내지 99%의 삽입을 가능하게 한다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA 및/또는 절단 부위는 이종 AAT 핵산의 최소한 1%, 최소한 5%, 최소한 10%, 최소한 15%, 최소한 20%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 80%, 최소한 90% 삽입을 가능하게 한다. 삽입율은 시험관내 또는 생체내에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 삽입율은 세포들의 집단 내에서 삽입된 이종 AAT 핵산을 검출 및 측정하고 삽입된 이종 AAT 핵산을 포함하는 집단의 백분율을 계산함으로써 결정될 수 있다. 삽입율을 측정하는 방법은 공지되어 있으며 당업계에서 이용가능하다. 이러한 방법은 예를 들어, 삽입 부위의 시퀀싱 또는 관심 조직 또는 세포 집단으로부터 단리된 mRNA 시퀀싱을 포함한다.
일부 구체예들에서, 가이드 RNA는 5 내지 10%, 10 내지 15%, 15 내지 20%, 20 내지 25%, 25 내지 30%, 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 95 내지 99% 또는 그 이상의 이종 AAT 유전자 발현 및/또는 분비 증가를 가능하게 한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 발현 및/또는 분비 증가는 AAT 폴리펩티드 수준을 검출 및 측정하고, 이 수준을, 예를 들어, 세포를 처리하거나 대상체에 투여하기 전 AAT 폴리펩티드 수준과 비교함으로써 결정될 수 있다. 이종 AAT 유전자의 발현 및/또는 분비 증가는 시험관내 또는 생체내에서 측정될 수 있다. 일부 구체예들에서, AAT의 분비 및/또는 발현은, 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA), HPLC, 질량 분석법 (예를 들어, 액체 질량 분석법 (예를 들어 LC-MS, LC-MS/MS) 또는 배양 배지 및/또는 세포 또는 조직 (예를 들어 간) 추출물을 사용한 웨스턴 블롯 분석 사용)을 사용하여, 조직 또는 세포 집단 (예를 들어, 혈청 또는 세포 배지 내)에 의해 분비된 단백질을 검출함으로써 또는 관심 조직 또는 세포 집단으로부터 단백질의 총 세포량을 검출함으로써 측정된다. 일부 구체예들에서, AAT의 분비 및/또는 발현은 일차 인간 헤파토사이트, 예를 들어, 배지 또는 세포 샘플에서 측정된다. 일부 구체예들에서, AAT의 분비는 HUH7 세포, 예를 들어, 배지 샘플에서 측정된다. 일부 구체예들에서, 사용되는 세포는 HUH7 세포이다. 일부 구체예들에서, AAT의 양을 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제 GAPDH (하우스키핑 유전자)의 양과 비교하여, 세포 수의 변화를 제어한다. 일부 구체에들에서, AAT는 예를 들어 응집을 측정하기 위해 간 조직 절편을 PASD 염색하여 평가될 수 있다. 일부 구체예들에서, AAT는 예를 들어, 폐에서 호중구 엘라스타제의 억제를 측정하여 평가될 수 있다.
일부 구체예들에서, 가이드 RNA는 이종 AAT 유전자 (예를 들어, 기능적 또는 야생형 AAT) 발현으로 인한 5 내지 10%, 10 내지 15%, 15 내지 20%, 20 내지 25%, 25 내지 30%, 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 95 내지 99% 또는 그 이상의 활성 증가를 가능하게 한다. 예를 들어, 활성 증가는 프로테아제 억제제 활성 수준을 검출 및 측정하고, 이 수준을, 예를 들어, 세포를 처리하거나 대상체에 투여하기 전 활성 수준에 대하여 비교함으로써 결정될 수 있다. 이러한 방법은 해당 분야에서 이용가능하며 공지이다. 예를 들어, Mullins 등, “Standardized automated assay for functional alpha 1-antitrypsin,” 1984; Eckfeldt 등, “Automated assay for alpha-1-antitiypsin with N-a-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide astrypsin substrate and standardized with p-nitrophenyl-p'-guanidinobenzoateastitrant fortrypsinactivesites,” 1982를 참고하라.
일부 구체예들에서, 인간 알부민 유전자좌의 인트론 1 (서열 번호: 1) 내부의 표적 서열 또는 영역은 알부민 가이드 RNA의 가이드 서열에 상보적일 수 있다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA의 가이드 서열과 이의 대응 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성 정도는 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일 수 있다. 일부 구체예들에서, gRNA의 가이드 서열 및 표적 서열은 100% 상보적이거나 동일할 수 있다. 다른 구체예에서, gRNA의 가이드 서열 및 표적 서열은 최소한 하나의 미스매치를 포함 할 수 있다. 예를 들어, gRNA의 가이드 서열 및 표적 서열은 1, 2, 3, 또는 4개 미스매치를 포함할 수 있으며, 이 때 가이드 서열의 총 길이는 약 20개, 또는 20개이다. 일부 구체예들에서, gRNA의 가이드 서열 및 표적 서열은 1-4개 미스매치를 포함할 수 있으며, 이 때 가이드 서열은 약 20개, 또는 20개 뉴클레오티드이다.
본원에 설명 및 예시된 바와 같이, 내인성 SERPINA1 유전자 (예를 들어, 돌연변이 SERPINA1 유전자)를 녹다운 또는 녹아웃시키는 SERPINA1 가이드 RNA와 알부민 가이드 RNA들을 조합하여 사용하여 알부민 유전자의 인트론 1에 이종 AAT 유전자 (예를 들어, 기능적 또는 야생형 AAT)를 삽입 및 발현시킬 수 있다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 본 발명은 RNA-가이드된 DNA 결합제 (예를 들어, Cas9)를 SERPINA1 내 표적 DNA 서열로 유도하는 가이드 서열들을 포함하는 하나 이상의 SERPINA1 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 조성물을 포함한다. gRNA는 표 2에 제시된 가이드 서열들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원은 서열 번호: 1000-1128 중 어느 하나의 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 SERPINA1 가이드 RNA들을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 서열 번호: 1000-1128에서 선택된 서열에 최소한 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 또는 88% 동일한 가이드 서열을 포함하는 SERPINA1 gRNA를 제공한다.
다른 구체예들에서, 조성물은 서열 번호: 1000-1128의 가이드 서열들 중 둘 이상에서 선택된 가이드 서열들을 포함하는 최소한 2개의 SERPINA1 gRNA들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 조성물은 각각이 서열 번호: 1000-1128 중 어느 하나의 핵산에 최소한 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 또는 88% 동일한 최소한 2개의 gRNA들을 포함한다.
본 발명의 SERPINA1 가이드 RNA 조성물은 SERPINA1 유전자 내 표적 서열을 인식하도록 설계된다. 예를 들어, SERPINA1 표적 서열은 제공된 RNA-가이드된 DNA 결합제에 의해 인식 및 절단될 수 있다. 일부 구체예들에서, Cas 단백질은 SERPINA1 가이드 RNA에 의해 SERPINA1 유전자의 표적 서열로 유도될 수 있으며, 이 때 가이드 RNA의 가이드 서열은 표적 서열에 혼성화하고 Cas 단백질은 표적 서열을 절단한다.
일부 구체예들에서, 하나 이상의 SERPINA1 가이드 RNA들의 선택은 SERPINA1 유전자 내부의 표적 서열들에 기초하여 결정된다.
특정 이론에 얽매이지 않고, 유전자의 중요 영역에서의 돌연변이는 유전자의 중요하지 않은 영역에서의 돌연변이보다 덜 관용 될 수 있으므로 DSB의 위치는 생성될 수 있는 단백질 녹다운 또는 녹아웃의 양 또는 유형에서 중요한 요소이다. 일부 구체예들에서, SERPINA1 내부의 표적 서열에 상보적인 또는 상보성을 가지는 SERPINA1 gRNA를 사용하여 Cas 단백질을 SERPINA1 유전자 내 특정 위치로 유도한다. 일부 구체예들에서, SERPINA1 gRNA들은 SERPINA1의 엑손 2, 3, 4, 또는 5의 표적 서열들에 상보적인 또는 상보성을 가지는 가이드 서열들을 가지도록 설계된다.
일부 구체예들에서, SERPINA1 gRNA들은 AAT의 N-말단 영역을 코딩하는 SERPINA1의 엑손들 내 표적 서열들에 상보적이도록 또는 상보성을 가지도록 설계된다.
표 2: 표적된 SERPINA1 그리고 대조 가이드 서열 명명법, 염색체 좌표, 및 서열
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
각각 표 1의 서열 번호: 2-33에 그리고 표 2의 서열 번호: 1000-1128에 제시된 알부민 가이드 서열 및 SERPINA1 가이드 서열 각각은, 예를 들어, 다음과 같은 예시적인 뉴클레오티드 서열이 3' 말단에서 5' 에서 3' 방향으로 가이드 서열에 이어지는, crRNA 및/또는 가이드 RNA를 형성하기 위한 추가 뉴클레오티드들을 추가로 포함 할 수 있다: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (서열 번호: 900). sgRNA의 경우, 상기 가이드 서열들 (각각 표 1의 서열 번호:2-33 및 표 2의 서열 번호: 1000-1128에 제시된 알부민 가이드 서열 및 SERPINA1 가이드 서열)은, 예를 들어, 가이드 서열의 3' 말단에서 5'에서 3' 방향으로 다음과 같은 예시적 뉴클레오티드 서열이 이어지는 sgRNA를 형성하기 위한 추가 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다: GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (서열 번호: 901).
알부민 및/또는 SERPINA1 가이드 RNA는 trRNA를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 각각의 조성물 및 방법 구체예에서, crRNA 및 trRNA는 단일 RNA (sgRNA)로서 결합 될 수 있거나 별개의 RNA (dgRNA) 상에 존재할 수 있다. sgRNA와 관련하여, crRNA 및 trRNA 구성요소들은 예를 들어, 포스포디에스터 결합 또는 기타 공유 결합을 통해 공유 연결될 수 있다. 일부 구체예들에서, sgRNA는 뉴클레오티드들 사이에 포스포디에스터 링키지 (linkage)가 아닌 하나 이상의 링키지를 포함한다.
본원에 기재된 조성물, 용도 및 방법 구체예 각각에서, 가이드 RNA는 2개의 RNA 분자를 “이중 가이드 RNA”또는 “dgRNA”로서 포함 할 수 있다. dgRNA는, 예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 제시된 가이드 서열을 포함하는 crRNA를 포함하는 제 1 RNA 분자 및 trRNA를 포함하는 제 2 RNA 분자를 포함한다. 제 1 및 제 2 RNA 분자는 공유적으로 연결되지 않을 수 있지만, crRNA와 trRNA의 부분들 사이의 염기 페어링을 통해 RNA 듀플렉스를 형성 할 수 있다.
본원에 기재된 조성물, 용도 및 방법 구체예 각각에서, 가이드 RNA (알부민 gRNA 및/또는 SERPINA1 gRNA)는 단일 RNA 분자를 “단일 가이드 RNA”또는 “ sgRNA”로서 포함 할 수 있다. sgRNA는 trRNA에 공유적으로 연결된 표 1 또는 표 2에 제시된 가이드 서열을 포함하는 crRNA (또는 이의 일부)를 포함 할 수 있다. sgRNA는 표 1 또는 표 2에 제시된 가이드 서열의 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, crRNA 및 trRNA는 링커를 통해 공유적으로 연결된다. 일부 구체예들에서, sgRNA는 crRNA와 trRNA의 부분들 사이의 염기 페어링을 통해 스템-루프 구조를 형성한다. 일부 구체예들에서, crRNA 및 trRNA는 포스포디에스터 결합이 아닌 하나 이상의 결합을 통해 공유적으로 연결된다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA는 서열 번호: 34-67 또는 120-163 중 어느 하나에 제시된 sgRNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA는 서열 번호: 2-33, 98-119, 165-170, 172, 174-176, 182-185, 189-193, 195-193, 195, 또는 196의 가이드 서열 및 서열 번호: 901의 뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하는 sgRNA를 포함하며, 이 때 서열 번호: 901의 뉴클레오티드는 가이드 서열의 3' 말단 상에 존재하고, sgRNA는, 표 9, 11 또는 13 또는 서열 번호: 300에 제시된 바와 같이 변형될 수 있다.
일부 구체예들에서, trRNA는 자연 발생 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된 trRNA 서열의 전부 또는 일부를 포함 할 수 있다. 일부 구체예들에서, trRNA는 절두되거나 변형된 야생형 trRNA를 포함한다. trRNA의 길이는 사용된 CRISPR/Cas 시스템에 따라 다르다. 일부 구체예들에서, trRNA는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개, 또는 100개 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된다. 일부 구체예들에서, trRNA는 특정한 이차 구조, 가령, 예를 들어, 하나 이상의 헤어핀 또는 스템-루프 구조, 또는 하나 이상의 돌출 구조를 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 조성물 또는 제제는 본원에 기재된 Cas 뉴클레아제와 같은 RNA-가이드 DNA 결합제를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 mRNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제와 같은 RNA-가이드 DNA 결합제를 인코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA가 제공, 사용 또는 투여된다.
C. 변형된 gRNA 및 mRNA
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 gRNA (예를 들어, 알부민 또는 SERPINA1 gRNA)는 화학적으로 변형된다. 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함하는 gRNA는 “변형된” gRNA 또는 “화학적으로 변형된” gRNA라 불리며, 표준 A, G, C, 및 U 잔기들 대신 또는 이들 이외에 사용되는 하나 이상의 비-자연 및/또는 자연 발생 구성성분들 또는 구조들의 존재를 설명한다. 일부 구체예들에서, 변형된 gRNA는 비-표준 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 사용하여 합성되며, 본원에서 “변형된”이라 불린다. 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 다음 중 하나 이상을 포함 할 수 있다: (i) 포스포디에스터 골격 링키지에서 하나 이상의 비-연결 포스페이트 산소 및/또는 하나 이상의 연결 포스페이트 산소의 변경, 예를 들어, 대체 (예시적 골격 변형); (ii) 리보스 당의 구성성분, 예를 들어, 리보스 당 상의 2' 하이드록실의 변경, 예를 들어, 대체 (예시적 당 변형); (iii) “데포스포” 링커로 포스페이트 모이어티를 전부 대체 (예시적 골격 변형); (iv) 비-표준 핵염기를 포함하는 자연 발생 핵염기의 변형 또는 대체 (예시적 염기 변형); (v) 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형 (예시적 골격 변형); (vi) 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어, 말단 포스페이트기의 제거, 변형 또는 대체, 또는 모이어티, 캡 또는 링커의 접합 (이러한 3' 또는 5' 캡 변형은 당 및/또는 골격 변형을 포함 할 수 있음); 및 (vii) 당의 변형 또는 대체 (예시적 당 변형).
상기 열거된 것과 같은 화학적 변형을 조합하여 2 개, 3 개, 4 개 또는 그 이상의 변형을 가질 수 있는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드들 (집합적으로 “잔기”)을 포함하는 변형된 gRNA 및/또는 mRNA를 제공 할 수 있다. 예를 들어, 변형된 잔기는 변형된 당 및 변형된 핵 염기를 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, gRNA의 모든 염기는 변형된다, 예를 들어, 모든 염기는 변형된 포스페이트 그룹, 가령, 포스포로티오에이트 그룹을 갖는다. 특정 구체예에서, gRNA 분자의 포스페이트 그룹의 전부 또는 실질적으로 전부는 포스포로티오에이트 그룹으로 대체된다. 일부 구체예들에서, 변형된 gRNA는 RNA의 5' 말단 또는 그 근처에 최소한 하나의 변형된 잔기를 포함한다. 일부 구체예들에서, 변형된 gRNA는 RNA의 3' 말단 또는 그 근처에 최소한 하나의 변형된 잔기를 포함한다.
일부 구체예들에서, gRNA는, 1, 2, 3개 또는 그 이상의 변형된 잔기들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 변형된 gRNA의 위치들 중 최소한 5% (예를 들어, 최소한 5%, 최소한 10%, 최소한 15%, 최소한 20%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 35%, 최소한 40%, 최소한 45%, 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 또는 100%)는 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드이다.
변형되지 않은 핵산은 예를 들어, 세포내 뉴클레아제 또는 혈청에서 발견되는 뉴클레아제들에 의해 분해되기 쉽다. 예를 들어, 뉴클레아제는 핵산 포스포디에스터 결합을 가수분해 할 수 있다. 따라서, 한 양상에서 본원에 기재된 gRNA는, 예를 들어, 세포내 또는 혈청-기반 뉴클레아제에 대한 안정성을 도입하기 위해 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 함유 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에 기재된 변형된 gRNA 분자는 생체내 및 생체외 모두에서 세포들의 집단에 도입 될 때 감소된 선천 면역 반응을 나타낼 수 있다. 용어 “선천 면역 반응”은 단일 가닥 핵산을 비롯한 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함하며, 이는 사이토카인 발현 및 방출, 특히, 인터페론 및 세포 사멸의 유도를 포함한다.
골격 변형의 일부 구체예들에서, 변형된 잔기의 포스페이트 그룹은 하나 이상의 산소를 상이한 치환기로 대체함으로써 변형 될 수 있다. 추가로, 변형된 잔기, 예를 들어, 변형된 핵산에 존재하는 변형된 잔기는 변형되지 않은 포스페이트 모이어티를 본원에 기재된 변형된 포스페이트 그룹으로 전부 대체하는 것을 포함 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 포스페이트 골격의 골격 변형은 하전되지 않은 링커 또는 비대칭 전하 분포를 갖는 하전된 링커를 초래하는 변경을 포함 할 수 있다.
변형된 포스페이트 그룹의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스터, 하이드로젠 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트라이에스터를 포함한다. 변형되지 않은 포스페이트 그룹에서 인 원자는 아키랄 (achiral)이다. 그러나, 가교되지 않은 산소 중 하나를 상기 원자들 또는 원자들의 그룹들 중 하나로 대체하면 인 원자가 키랄이 될 수 있다. 입체 인 원자는 “R” 구조 (본원에서 Rp) 또는 “S” 구조 (본원에서 Sp)을 가질 수 있다. 골격은 또한 가교 산소 (즉, 포스페이트를 뉴클레오시드에 연결하는 산소), 질소 (가교화 포스포로아미데이트), 황 (가교화 포스포로티오에이트) 및 탄소 (가교화 메틸렌포스포네이트)의 대체에 의해 변형 될 수 있다. 대체는 하나의 연결 산소에서 또는 두 연결 산소들 모두에서 발생 할 수 있다.
포스페이트 그룹은 특정 골격 변형에서 인을 포함하지 않는 연결기(connector)로 대체 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 하전된 포스페이트 그룹은 중성 모이어티로 대체 될 수 있다. 포스페이트 그룹을 대체 할 수 있는 모이어티의 예는 제한없이, 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 하이드록실아미노, 실록산, 카보네이트, 카르복시메틸, 카바메이트, 아미드, 티오에터, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌디메틸하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함한다.
핵산을 모방 할 수 있는 스캐폴드 또한 제작될 수 있는데, 이 때 포스페이트 링커 및 리보스 당은 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 대체물로 대체된다. 이러한 변형은 골격 및 당 변형을 포함 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 핵염기는 대체 골격에 의해 테더링 될 수 있다. 예에는 제한없이, 모르폴리노, 시클로부틸, 피롤리딘 및 펩티드 핵산 (PNA) 뉴클레오시드 대체물이 포함 될 수 있다.
변형된 뉴클레오시드 및 변형된 뉴클레오티드는 당 그룹에 대한 하나 이상의 변형, 즉, 당 변형을 포함 할 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실 그룹 (OH)은 변형, 다수의 상이한 “옥시” 또는 “데옥시”치환기로 대체 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 2' 하이드록실 그룹에 대한 변형은 하이드 록실이 더 이상 탈양성자화 되어 2'-알콕사이드 이온을 형성할 수 없기 때문에 핵산의 안정성을 향상시킬 수 있다.
2' 하이드록실 그룹 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시 (OR, 이 때 “R”은 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당 일 수 있음); 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR, 이 때, R은, 예를 들어, H 이거나 또는 선택적으로 치환된 알킬 일 수 있고, n은 0 내지 20 (예를 들어, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20)의 정수 일 수 있다. 일부 구체예들에서, 2' 하이드록실 그룹 변형은 2'-O-Me 일 수 있다. 일부 구체예들에서, 2' 하이드록실 그룹 변형은 2' 하이드록실 그룹을 불소로 대체하는 2'-플루오로 변형일 수 있다. 일부 구체예들에서, 2' 하이드록실 그룹 변형은, 2' 하이드록실이, 예를 들어, C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 가교에 의해 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있는 “잠금된” 핵산 (LNA) (이 때 예시적인 가교에는 메틸렌, 프로필렌, 에터, 또는 아미노 가교가 포함될 수 있음); O-아미노 (이 때 아미노는 예를 들어, NH2 일 수 있음); 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 다이헤테로아릴아미노, 에틸렌다이아민, 또는 폴리아미노) 및 아미노알콕시, O(CH2)n-아미노, (이 때 아미노는, 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 다이헤테로아릴아미노, 에틸렌다이아민, 또는 폴리아미노 일 수 있음)를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 2' 하이드록실 그룹 변형은 리보스 고리에 C2'-C3' 결합이 없는 “잠금해제된” 핵산 (UNA)을 포함 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 2' 하이드록실 그룹 변형은 메톡시에틸 그룹 (MOE), (OCH2CH2OCH3, 예를 들어, PEG 유도체)을 포함할 수 있다.
“데옥시” 2' 변형은 수소 (즉, 예를 들어, 부분적으로 dsRNA의 오버행 부분에서 데옥시리보스 당); 할로 (예를 들어, 브로모, 클로로, 플루오로, 또는 아이오도); 아미노 (이 때 아미노는, 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 다이헤테로아릴아미노, 또는 아미노산 일 수 있음); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2- 아미노 (이 때 아미노는, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같을 수 있음), -NHC(O)R (이 때 R은, 예를 들어, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 시아노; 머캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐 (이는 선택적으로, 예를 들어, 본원에 기재된 아미노로 치환될 수 있음)을 포함할 수 있다.
당 변형은, 리보스에서의 대응 탄소와 반대되는 입체화학적 구조를 갖는 하나 이상의 탄소를 또한 함유 할 수 있는 당 그룹을 포함 할 수 있다. 따라서, 변형된 핵산은 당으로서, 예를 들어, 아라비노스를 함유하는 뉴클레오티드를 포함 할 수 있다. 변형된 핵산은 또한 무염기 당을 포함 할 수 있다. 이들 무염기 당은 또한 하나 이상의 구성성분 당 원자들에서 추가로 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 또한 L 형태인 하나 이상의 당, 예를 들어, L-뉴클레오시드을 포함 할 수 있다.
변형된 핵산에 통합 될 수 있는 본원에 기재된 변형된 뉴클레오시드 및 변형된 뉴클레오티드는 핵 염기로도 불리는 변형된 염기를 포함 할 수 있다. 핵 염기의 예는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 핵 염기는 변형된 핵산에 통합 될 수 있는 변형된 잔기를 제공하기 위해 변형되거나 전부 대체 될 수 있다. 뉴클레오티드의 핵 염기는 퓨린, 피리미딘, 퓨린 유사체 또는 피리미딘 유사체로부터 독립적으로 선택 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 핵 염기는, 예를 들어, 염기의 자연 발생 및 합성 유도체를 포함 할 수 있다.
이중 가이드 RNA를 사용하는 구체예에서, 각각의 crRNA 및 tracr RNA는 변형을 포함 할 수 있다. 이러한 변형들은 crRNA 및/또는 tracr RNA 중 하나 또는 둘 모두의 말단에 존재할 수 있다. sgRNA를 포함하는 구체예에서, sgRNA의 한 쪽 또는 양 쪽 말단에 있는 하나 이상의 잔기가 화학적으로 변형 될 수 있고 및/또는 내부 뉴클레오사이드가 변형 될 수 있고 및/또는 전체 sgRNA가 화학적으로 변형 될 수 있다. 특정 구체예는 5' 말단 변형을 포함한다. 특정 구체예는 3' 말단 변형을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 가이드 RNA는 2017년 12월 8일에 발명의 명칭 “Chemically Modified Guide RNAs”로 출원된 WO2018/107028 A1에 개시된 변형 패턴들 중 하나를 포함하며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 가이드 RNA는 US20170114334에 개시된 구조/변형 패턴들 중 하나를 포함하며, 이의 내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다. 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 가이드 RNA는 WO2017/136794, WO2017004279, US2018187186, US2019048338에 개시된 구조/변형 패턴들 중 하나를 포함하며, 이의 내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 구체예들에서, 변형된 sgRNA는 다음 서열을 포함하고: mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (서열 번호: 300), 이 때 “N”은 임의의 자연 또는 비-자연 뉴클레오티드 일 수 있으며, 여기서 N 전체는 표 1, 10, 및 12에 기재된 알부민 인트론 1 가이드 서열을 포함하고; SERPINA1 가이드 서열들은 표 2에 기재되어 있다.　예를 들어, 서열 번호: 300이 이에 포함되며, 이 때 N'들은 본원 표 1 (서열 번호: 2-33) 및/또는 표 2 (서열 번호: 1000-1128)에 개시된 가이드 서열들 중 어느 하나로 대체된다.
아래에 기재된 임의의 변형이 본원에 기재된 gRNA 및 mRNA에 존재할 수 있다.
용어 “mA,” “mC,” “mU,” 또는 “mG”는 2'-O-Me로 변형된 뉴클레오티드를 표시하기 위해 사용될 수 있다.
2'-O-메틸의 변형은 다음과 같이 도시될 수 있다:
Figure pct00006
뉴클레오티드 당 고리에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 또 다른 화학적 변형은 할로겐 치환이다. 예를 들어, 뉴클레오티드 당 고리에 대한 2'-플루오로 (2'-F) 치환은 올리고뉴클레오티드 결합 친화도와 뉴클레아제 안정성을 증가시킬 수 있다.
본 출원에서 용어 “fA”, “fC”, “fU” 또는 “fG”는 2'-F로 치환된 뉴클레오티드를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
2'-F의 치환은 다음과 같이 도시될 수 있다:
Figure pct00007
포스포로티오에이트 (PS) 링키지 또는 결합은 포스포다이에스터 링키지에서, 예를 들어, 뉴클레오티드 염기들 사이의 결합들에서 하나의 비가교 포스페이트 산소 대신 황이 치환되는 결합을 지칭한다. 포스포로티오에이트가 올리고뉴클레오티드를 생성하는데 사용되는 경우, 변형된 올리고 뉴클레오티드는 또한 S-올리고로 지칭 될 수 있다.
“*”는 PS 변형을 표시하기 위해 사용될 수 있다. 본 출원에서 용어 A*, C*, U* 또는 G*는 다음 (예를 들어, 3') 뉴클레오티드에 PS 결합으로 연결된 뉴클레오티드를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 “mA*,” “mC*,” “mU*,” 또는 “mG*”는 2'-O-Me로 치환되어 있고 그리고 다음 (예를 들어, 3') 뉴클레오티드에 PS 결합으로 연결되는 뉴클레오티드를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
아래 다이어그램은 S-가 비가교 포스페이트 산소로 치환되어 포스포다이에스터 결합 대신 PS 결합을 생성하는 것을 보여준다:
Figure pct00008
무염기(Abasic) 뉴클레오티드는 질소성 염기가 없는 뉴클레오티드를 지칭한다. 아래 그림은 염기가 없는 무염기 (무퓨린으로도 공지) 부위가 있는 올리고뉴클레오티드를 도시한다:
Figure pct00009
역위(Inverted) 염기들은 일반적인 5' 에서 3' 으로의 링키지로부터 역위된 링키지들 (즉, 5' 에서 5'으로의 링키지 또는 3' 에서 3'으로의 링키지)이 있는 염기들을 지칭한다. 예를 들어:
Figure pct00010
무염기 뉴클레오티드는 역위 링키지로 부착 될 수 있다. 예를 들어, 무염기 뉴클레오티드는 5' 에서 5' 링키지를 통해 말단 5'뉴클레오티드에 부착 될 수 있거나, 무염기 뉴클레오티드는 3' 에서 3' 링키지를 통해 말단 3' 뉴클레오티드에 부착 될 수 있다. 말단 5' 또는 3' 뉴클레오티드에 있는 역위 무염기성 뉴클레오티드는 또한 역위 무염기성 말단 캡으로 불릴 수 있다.
일부 구체예들에서, 5' 말단에서 처음 3개, 4개 또는 5개 뉴클레오티드 중 하나 이상 및 3' 말단에서 마지막 3개, 4개 또는 5개 뉴클레오티드 중 하나 이상이 변형된다. 일부 구체예들에서, 변형은 2'-O-Me, 2'-F, 역위 무염기성 뉴클레오티드, PS 결합, 또는 안정성 및/또는 성능을 증가시키기 위해 당업계에 잘 알려진 다른 뉴클레오티드 변형이다.
일부 구체예들에서, 5' 말단의 처음 4개 뉴클레오티드, 및 3' 말단의 마지막 4개 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 (PS) 결합으로 연결된다.
일부 구체예들에서, 5' 말단의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 (2'-O-Me) 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 5' 말단의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 (2'-F) 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 5' 말단의 처음 3개의 뉴클레오티드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오티드는 역위 무염기 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 가이드 RNA는 변형된 sgRNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, sgRNA는 서열 번호: 200에 제시된 변형 패턴을 포함하고, 여기서 N은 임의의 자연 또는 비 자연 뉴클레오티드이고, N의 전체는 뉴클레아제를 표적 서열 (예를 들어, 인간 알부민 인트론 1 또는 SERPINA1)로 안내하는 가이드 서열 (예를 들어, 표 1 또는 표 2에 제시)을 포함한다.
상기 언급한 바와 같이, 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 조성물 또는 제제는 본원에 기재된 Cas 뉴클레아제와 같은 RNA-가이드 DNA 결합제를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 mRNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제와 같은 RNA-가이드 DNA 결합제를 인코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA가 제공, 사용 또는 투여된다. 하기 설명하는 바와 같이, Cas 뉴클레아제를 포함하는 mRNA는 Cas9 뉴클레아제, 가령, 클리브아제, 닉카제 및/또는 부위-특이적 DNA 결합 활성을 갖는 S. 피오게네스 Cas9 뉴클레아제를 포함 할 수 있다. 일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 뉴클레아제를 인코딩하는 ORF는 “변형된 RNA-가이드 DNA 결합제 ORF” 또는 단순히 “변형된 ORF”이며, 이는 ORF가 변형되어 있음을 나타내는 약어로 사용된다.
변형된 Cas9 ORF를 포함하는 Cas9 ORF가 본원에 제공되며 당업계에 공지되어 있다. 한 예로서, Cas9 ORF는 코딩 서열이 하나 이상의 아미노산에 대한 하나 이상의 대체 코돈을 포함하도록 코돈 최적화 될 수 있다. 본원에서 사용된 “대체 코돈”은 주어진 아미노산에 대한 코돈 사용빈도의 변화를 지칭하고, 주어진 발현 시스템에 대해 바람직한 또는 최적화된 코돈 (코돈 최적화) 일 수도 있고 아닐 수도 있다. 바람직한 코돈 사용빈도, 또는 주어진 발현 시스템에서 내성이 우수한 코돈은 당업계에 공지되어 있다. WO2013/176772, WO2014/065596, WO2016/106121, 및 WO2019/067910의 Cas9 코딩 서열, Cas9 mRNA, 및 Cas9 단백질 서열은 본원에 참고로 포함된다. 특히, WO2019/067910 단락 [0449] 표의 ORF들 및 Cas9 아미노산 서열들, 그리고 WO2019/067910 단락 [0214] - [0234]의 Cas9 mRNA들 및 ORF들이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구체예들에서, 변형된 ORF는 우리딘 위치들 중 최소한 하나, 다수, 또는 모두에서 변형된 우리딘을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 변형된 우리딘은 5 위치에서, 예를 들어, 할로겐, 메틸 또는 에틸로 변형된 우리딘이다. 일부 구체예들에서, 변형된 우리딘은 1 위치에서, 예를 들어, 할로겐, 메틸 또는 에틸로 변형된 우리딘이다. 변형된 우리딘은 예를 들어, 슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 5-메톡시우리딘, 5-아이오도우리딘, 또는 이들의 조합 일 수 있다. 일부 구체예들에서, 변형된 우리딘은 5-메톡시우리딘이다. 일부 구체예들에서, 변형된 우리딘은 5-아이오도우리딘이다. 일부 구체예들에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘이다. 일부 구체예들에서, 변형된 우리딘은 N1-메틸-슈도우리딘이다. 일부 구체예들에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘 및 N1-메틸-슈도우리딘의 조합이다. 일부 구체예들에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘 및 5-메톡시우리딘의 조합이다. 일부 구체예들에서, 변형된 우리딘은 N1-메틸 슈도우리딘 및 5-메톡시우리딘의 조합이다. 일부 구체예들에서, 변형된 우리딘은 5-아이오도우리딘 및 N1-메틸-슈도우리딘의 조합이다. 일부 구체예들에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘 및 5-아이오도우리딘의 조합이다. 일부 구체예들에서, 변형된 우리딘은 5-아이오도우리딘 및 5-메톡시우리딘의 조합이다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 mRNA는 5' 캡, 가령, Cap0, Cap1, 또는 Cap2를 포함한다. 5' 캡은 일반적으로 5'-트라이포스페이트를 통해 mRNA의 5' 에서 3' 으로의 첫 번째 뉴클레오티드, 즉, 첫 번째 캡-근위 뉴클레오티드의 5' 위치에 연결된 7-메틸구아닌 리보뉴클레오티드 (이는 예를 들어 ARCA와 관련하여 아래에서 논의된 바와 같이 추가로 변형 될 수 있음)이다. Cap0에서, mRNA의 첫 번째 및 두 번째 캡-근위 뉴클레오티드의 리보스들은 모두 2'-하이드록실을 포함한다. Cap1에서, mRNA의 첫 번째 및 두 번째 전사된 뉴클레오티드의 리보스들은 각각 2'-메톡시 및 2'-하이드록실을 포함한다. Cap2에서, mRNA의 첫 번째 및 두 번째 캡-근위 뉴클레오티드의 리보스들은 모두 2'-메톡시를 포함한다. 예를 들어, Katibah 등, (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30; Abbas 등, (2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115를 참고하라. 인간 mRNA와 같은 포유류 mRNA를 비롯하여 대부분의 내인성 고등 진핵 mRNA는 Cap1 또는 Cap2를 포함한다. Cap0 그리고 Cap1 및 Cap2와 상이한 기타 캡 구조는 IFIT-1 및 IFIT-5와 같은 선천성 면역 시스템의 구성요소들에 의해 “비 자기”로 인식되어 인간과 같은 포유류에서 면역원성일 수 있으며, 이는 I형 인터페론을 비롯한 사이토카인의 수준 상승을 가져올 수 있다. 선천성 면역 시스템의 구성요소들, 가령, IFIT-1 및 IFIT-5는 또한 mRNA의 결합에 있어서 Cap1 또는 Cap2 이외의, mRNA의 번역을 잠재적으로 억제하는 캡을 가지는 eIF4E와 경쟁할 수 있다.
캡은 공동전사적으로 포함될 수 있다. 예를 들어, ARCA (항-역 캡 유사체; Thermo Fisher Scientific 카탈로그 번호 AM8045)는 구아닌 리보뉴클레오티드의 5' 위치에 연결된 7-메틸구아닌 3'-메톡시-5'-트라이포스페이트를 포함하는 캡 유사체로서, 초기에 시험관내에서 전사체로 통합될 수 있다. ARCA는 첫 번째 캡-근위 뉴클레오티드의 2' 위치가 하이드록실인 Cap0 캡을 생성한다. 예를 들어, Stepinski 등, (2001) “Synthesis and properties of mRNAs containing the novel 'anti-reverse' cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG,” RNA 7: 1486-1495 참고. ARCA 구조는 아래 제시된다.
Figure pct00011
CleanCapTM AG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG; TriLink Biotechnologies 카탈로그 번호 N-7113) 또는 CleanCapTM GG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG; TriLink Biotechnologies 카탈로그 번호 N-7133)을 사용하여 Cap1 구조를 공동-전사적으로 제공할 수 있다. CleanCapTM AG 및 CleanCapTM GG의 3'-O-메틸화 형태들은 또한 각각 TriLink Biotechnologie사로부터 카탈로그 번호 N-7413 및 N-7433으로 이용가능하다. CleanCapTM AG 구조를 아래 제시한다.
Figure pct00012
대안적으로 캡을 전사 후 RNA에 첨가 할 수 있다. 예를 들어, 백시니아 캡핑 효소는 시판되고 있으며 (New England Biolabs 카탈로그 번호 M2080S) 이의 D1 서브유닛에 의해 제공되는 RNA 트라이포스파타제 및 구아닐릴트랜스퍼라제 활성과 D12 서브유닛에 의해 제공되는 구아닌메틸트랜스퍼라제를 가지고 있다. 이와 같이, RNA에 7-메틸구아닌을 첨가하여 S-아데노실 메티오닌과 GTP의 존재하에 Cap0을 제공 할 수 있다. 예를 들어, Guo, P. and Moss, B. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4023-4027; Mao, X. and Shuman, S. (1994) J. Biol. Chem. 269, 24472-24479를 참고하라.
일부 구체예들에서, mRNA는 폴리-아데닐화 (폴리-A) 꼬리를 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 폴리-A 꼬리는 최소한 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 아데닌, 선택적으로 최대 300개 아데닌을 포함한다. 일부 구체예들에서, 폴리-A 꼬리는 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 아데닌 뉴클레오티드를 포함한다.
D.공여자 구조체
본원에 기재된 조성물 및 방법은 본 발명의 가이드 RNA 및 RNA-가이드 DNA 결합제에 의해 생성된 절단 부위에 삽입될 이종 AAT 유전자 (예를 들어, 기능적 또는 야생형 AAT)를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 구조체의 사용을 포함한다. 본원에서 사용시, 이러한 구조체는 때때로 “공여자 구조체/템플릿”으로 지칭된다. 일부 구체예들에서, 이러한 구조체는 DNA 구조체이다. 공여자 구조체에 대한 다양한 기능적/구조적 변형을 설계하고 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구체예들에서, 구조체는 폴리아데닐화 꼬리 서열, 폴리아데닐화 신호 서열, 스플라이스 수용 부위 또는 선별 마커 중 임의의 하나 이상을 포함 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 폴리아데닐화 꼬리 서열은 코딩 서열의 3' 말단에서, 예를 들어, “폴리-A” 스트레치로서 인코드된다. 적합한 폴리아데닐화 꼬리 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열을 설계하는 방법은 당업계에 공지이다. 예를 들어, 폴리아데닐화 신호 서열 AAUAAA (서열 번호: 800)는 포유류 시스템에서 일반적으로 사용되지만 UAUAAA (서열 번호: 801) 또는 AU/GUAAA (서열 번호: 802)와 같은 변이체가 확인된 바 있다. 예를 들어, NJ Proudfoot, Genes & Dev. 25(17):1770-82, 2011을 참고하라.
구조체의 길이는 삽입될 유전자의 크기에 따라 다양 할 수 있으며, 예를 들어 200 염기쌍 (bp) 내지 약 5000 bp, 예를 들어 약 200 bp 내지 약 2000 bp, 예를 들어 약 500 bp 내지 약 1500 bp 일 수 있다. 일부 구체예들에서, DNA 공여자 템플릿의 길이는 약 200bp, 또는 약 500bp, 또는 약 800bp, 또는 약 1000 염기쌍, 또는 약 1500 염기쌍이다. 다른 구체예들에서, 공여자 템플릿의 길이는 최소한 200 bp, 또는 최소한 500 bp, 또는 최소한 800 bp, 또는 최소한 1000 bp, 또는 최소한 1500 bp, 또는 최소한 2000 bp, 또는 최소한 2500 bp, 또는 최소한 3000 bp, 또는 최소한 3500 bp, 또는 최소한 4000 bp, 또는 최소한 4500 bp, 또는 최소한 5000 bp이다.
구조체는 DNA 또는 RNA, 단일 가닥, 이중-가닥 또는 부분 단일 가닥 및 부분 이중-가닥 일 수 있으며 선형 또는 원형 (예를 들어, 미니서클) 형태로 숙주 세포에 도입 될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개공보 제 2010/0047805, 2011/0281361, 2011/0207221을 참고하라. 선형 형태로 도입되는 경우, 공여자 서열의 말단은 당업자에게 공지된 방법에 의해 (예를 들어, 외부핵분해성 분해 (exonucleolytic degradation)로부터) 보호 될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 다이데옥시뉴클레오티드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 첨가되고 및/또는 자기-상보성 올리고뉴클레오티드가 한쪽 또는 양쪽 말단에 결찰된다. 예를 들어, Chang 등, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls 등, (1996) Science 272:886-889를 참고하라. 외인성 폴리뉴클레오티드를 분해로부터 보호하기 위한 또 다른 방법은 말단 아미노기 (들)의 첨가 및, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오티드 간 링키지의 사용을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 구조체는 예를 들어, 복제 기점, 프로모터 및 항생제 내성을 인코딩하는 유전자와 같은 추가 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포에 도입 될 수 있다. 구조체는 바이러스 요소들을 생략할 수 있다. 더욱이, 공여자 구조체는 리포솜 또는 폴록사머와 같은 물질과 복합된 핵산과 같은 네이키드 핵산으로 도입 될 수 있거나 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스)에 의해 전달 될 수 있다.
일부 구체예들에서, 구조체는 그 발현이 삽입 부위에서 내인성 프로모터 (예를 들어, 공여자가 숙주 세포의 알부민 유전자좌에 통합되는 경우 내인성 알부민 프로모터)에 의해 구동되도록 삽입 될 수 있다. 그러한 경우에, 트랜스진은 이의 발현을 구동시키는 제어 요소 (예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서)가 결핍될 수 있다 (예를 들어, 무 프로모터 구조체). 그럼에도 불구하고, 다른 경우에서 구조체는 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 통합시 기능적 단백질의 발현을 구동시키는 항시성 프로모터 또는 유도성 또는 조직 특이적 (예를 들어, 간 또는 혈소판 특이적) 프로모터를 포함 할 수 있음이 명백 할 것이다. 이러한 구조체는 신호 펩티드를 인코딩하는 신호 서열에 작동가능하게 연결되고 이의 하류에서 이종 AAT 단백질을 인코딩하는 서열을 포함 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 신호 펩티드는 헤파토사이트 분비된 단백질로부터 얻은 신호 펩티드이다. 일부 구체예들에서, 신호 펩티드는 AAT 신호 펩티드이다. 일부 구체예들에서, 신호 펩티드는 알부민 신호 펩티드이다. 일부 구체예들에서, 신호 펩티드는 인자 IX 신호 펩티드이다. 이러한 구조체는 AAT 신호 펩티드를 인코딩하는 신호 서열, 예를 들어, 서열 번호: 700에 작동가능하게 연결되고 이의 하류에 이종 AAT 단백질을 인코딩하는 서열을 포함 할 수 있다. 이러한 구조체는 이종 신호 펩티드를 인코딩하는 신호 서열에 작동가능하게 연결되고 이의 하류에서 이종 AAT 단백질을 인코딩하는 서열을 포함 할 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 방법은 알부민 신호 펩티드 (예를 들어, 서열 번호: 2000)을 인코딩하는 신호 서열에 작동가능하게 연결되고 이의 하류에서 이종 AAT 단백질을 인코딩하는 서열을 포함 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 핵산 구조체는 AAT 단백질을 인코딩하는 핵산의 상동성-독립적 삽입으로 작동한다. 일부 구체예들에서, 이러한 핵산 구조체는 비-분열 세포, 예를 들어, 이중-가닥 DNA 절단을 복구하는 주요 메커니즘이 HR이 아닌 NHEJ인 세포에서 작동한다. 핵산은 상동성-독립적 공여자 구조체 일 수 있다.
일부 구체예들에서, 공여자 구조체는 기능적 AAT 단백질을 인코딩하는 이종 AAT 유전자를 포함한다. 일부 구체예들에서, 기능적 AAT 단백질은 서열 번호: 700에 따른 인간 야생형 AAT 단백질 서열이다. 일부 구체예들에서, 기능적 AAT 단백질은 서열 번호: 702에 따른 인간 야생형 AAT 단백질 서열이다. AAT를 인코딩하는 핵산 또한 본원에 예시 및 개시되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 구조체는 AAT의 기능적 변이체, 예를 들어, 야생형 AAT에 비해 증가된 프로테아제 억제제 활성을 보유하는 변이체를 인코딩하는 이종 AAT 유전자를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 구조체는 야생형 AAT에 비해 최소한 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100%, 또는 그 이상 활성인 기능적 활성을 가지는, 서열 번호: 700에 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99% 동일한 기능적 변이체를 인코딩하는 이종 AAT 유전자를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 구조체는 야생형 AAT에 비해 최소한 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100%, 또는 그 이상 활성인 기능적 활성을 가지는, 서열 번호: 702에 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99% 동일한 기능적 변이체를 인코딩하는 이종 AAT 유전자를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 구조체는 야생형 AAT에 비해 최소한 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100%, 또는 그 이상 활성인 기능적 활성을 가지는, AAT 단백질의 단편을 인코딩하는 이종 AAT 유전자를 포함한다.
또한 본 발명은 이종 AAT 유전자의 삽입 및 발현 향상을 가능하게 하는 양방향 핵산 구조체들을 기재한다. 요약하면, 본원에 개시된 다양한 양방향 구조체는 최소한 2 개의 핵산 세그먼트를 포함하고, 여기서 하나의 세그먼트 (제 1 세그먼트)는 이종 AAT를 인코딩하는 코딩 서열 (본원에서 “트랜스진”으로 호환적으로 지칭됨)을 포함하는 반면, 다른 세그먼트 (제 2 세그먼트)는 서열의 상보체가 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함한다. 양방향 구조체들은 최소한 2개의 핵산 세그먼트들을 시스로 포함할 수 있으며, 이 때 하나의 세그먼트 (제 1 세그먼트)는 이종 AAT를 한 방향으로 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 반면, 다른 세그먼트 (제 2 세그먼트)는 그 상보체가 이종 AAT를 다른 방향으로 인코딩하는 서열을 포함한다. 즉, 제 1 세그먼트는 제 2 세그먼트의 상보체이고 (반드시 완벽한 상보체는 아님); 제 2 세그먼트의 상보체는 제 1 세그먼트의 역 상보체이다 (둘 다 이종 AAT를 인코드하는 한 반드시 완벽한 역 상보체일 필요는 없음). 양방향 구조체는 스플라이스 수용체에 연결된 이종 AAT를 인코딩하는 제 1 코딩 서열 그리고, 상보체가 다른 방향으로 이종 AAT를 인코딩하고 스플라이스 수용체에 또한 연결된 제 2 코딩 서열을 포함 할 수 있다. 본원에 기재된 유전자 편집 시스템 (예를 들어, CRISPR/Cas 시스템; 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템; 전사 활성화-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 시스템)과 조합하여 사용되는 경우, 핵산 구조체들의 양방향성은 구조체가 표적 삽입 부위 내부에 어느 하나의 방향으로 삽입되게 (한 방향의 삽입에만 제한되는 것은 아님) 하여, 본원에 예시된 바와 같이 a) 하나의 세그먼트의 코딩 서열 (예를 들어, 도 1에서 “GFP”를 인코딩하는 왼쪽 세그먼트, 상부 왼쪽 ssAAV 구조체), 또는 2) 다른 세그먼트의 상보체 (예를 들어, “GFP”를 인코딩하는 오른쪽 세그먼트의 상보체, 도 1의 상부 왼쪽 ssAAV 구조체에서 거꾸로 표시됨)로부터 이종 AAT를 발현시킴으로써, 삽입 및 발현 효율성을 향상시킬 수 있다. 다양한 공지의 유전자 편집 시스템들, 예를 들어, CRISPR/Cas 시스템; 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템; 전사 활성화-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 시스템이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다.
본원에 개시된 양방향 구조체는 임의의 특정 용도에 필요하고 및/또는 하나 이상의 원하는 기능을 부여하는 임의의 적합한 구조적 특징을 포함하도록 변형 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 양방향 핵산 구조체는 상동성 아암을 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 양방향 핵산 구조체는 상동성-독립적 공여자 구조체이다. 일부 구체예들에서, 부분적으로 핵산 구조체의 양방향 기능으로 인해, 양방향 구조체는 본원에 기재된 바와 같이 어느 방향 (배향)으로든 게놈 유전자좌 내부에 삽입되어, 관심 폴리펩티드 (예를 들어, 이종 AAT)를 효율적으로 삽입 및/또는 발현시킬 수 있다.
일부 구체예들에서, 양방향 핵산은 이종 AAT 유전자의 발현을 구동시키는 프로모터를 포함하지 않는다. 예를 들어, 폴리펩티드의 발현은 숙주 세포의 프로모터 (예를 들어, 트랜스진이 숙주 세포의 알부민 유전자좌에 통합 될 때 내인성 알부민 프로모터)에 의해 구동된다. 일부 구체예들에서, 양방향 핵산 구조체는 제 1 세그먼트 및 제 2 세그먼트를 포함하며, 각각은 트랜스진의 상류에 스플라이스 수용체를 가진다. 특정 구체예들에서, 스플라이스 수용체는 숙주 세포들의 세이프 하버 부위의 스플라이스 공여자 서열, 예를 들어, 인간 알부민 유전자의 인트론 1의 스플라이스 공여자와 양립가능하다.
일부 구체예들에서, 양방향 핵산 구조체는 이종 AAT에 대한 코딩 서열을 포함하는 제 1 세그먼트 및 이종 AAT의 코딩 서열의 역 상보체를 포함하는 제 2 세그먼트를 포함한다. 그러므로, 제 1 세그먼트의 코딩 서열은 이종 AAT를 발현할 수 있는 반면, 제 2 세그먼트의 역 상보체의 상보체 또한 이종 AAT를 발현할 수 있다. 본원에서 사용되는 “코딩 서열”은, 역 상보 서열을 포함하는 제 2 세그먼트를 지칭할 때, 제 2 세그먼트의 상보적 (코딩) 가닥 (즉, 제 2 세그먼트의 역 상보 서열의 상보적 코딩 서열)을 지칭한다.
일부 구체예들에서, 제 1 세그먼트에서 이종 AAT를 인코드하는 코딩 서열은 이종 AAT를 또한 인코드하는 코딩 서열의 역 상보체에 100% 미만 상보적이다. 즉, 일부 구체예들에서, 제 1 세그먼트는 이종 AAT에 대한 코딩 서열 (1)을 포함하고, 제 2 세그먼트는 이종 AAT에 대한 코딩 서열 (2)의 역 상보체이고, 이 때 코딩 서열 (1)은 코딩 서열 (2)와 동일하지 않다. 예를 들어, 이종 AAT를 인코딩하는 코딩 서열 (1) 및/또는 코딩 서열 (2)은 코딩 서열 (1) 및 코딩 서열 (2)의 역 상보체가 100% 미만의 상보성을 갖도록 코돈 최적화 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 제 2 세그먼트의 코딩 서열은 제 1 세그먼트의 코딩 서열에 의해 인코딩되는 동일한 (즉, 동일한 아미노산 서열) 이종 AAT의 하나 이상의 아미노산에 대해 하나 이상의 대체 코돈을 사용하여 이종 AAT를 인코딩한다. 본원에서 사용된 “대체 코돈”은 주어진 아미노산에 대한 코돈 사용빈도의 변화를 지칭하고, 주어진 발현 시스템에 대해 바람직한 또는 최적화된 코돈 (코돈 최적화) 일 수도 있고 아닐 수도 있다. 바람직한 코돈 사용빈도, 또는 주어진 발현 시스템에서 내성이 우수한 코돈은 당업계에 공지되어 있다.
일부 구체예들에서, 제 2 세그먼트는 헤어핀 형성을 줄이기 위해 제 1 세그먼트의 코딩 서열과 상이한 코돈 사용빈도를 채택하는 역 상보체 서열을 포함한다. 이러한 역 상보체는 재 1 세그먼트 내 코딩 서열의 모든 뉴클레오티드보다 적은 염기쌍을 형성하지만, 선택적으로 동일한 폴리펩티드를 인코딩한다. 이러한 사례에서, 제 1 세그먼트의, 예를 들어, 폴리펩티드 A에 대한 코딩 서열 대부분은 양방향 구조체의 제 2의 절반의, 예를 들어, 폴리펩티드 A에 대한, 코딩 서열에 상동성이지만 이와 동일하지는 않다. 일부 구체예들에서, 제 2 세그먼트는 제 1 세그먼트의 코딩 서열에 대해 실질적으로 상보적이지 않은 (예를 들어, 70% 이하의 상보적인) 역 상보체 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 제 2 세그먼트는 제 1 세그먼트의 코딩 서열에 대해 매우 상보적인 (예를 들어, 최소한 90% 상보적인) 역 상보체 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 제 2 세그먼트는 제 1 세그먼트의 코딩 서열에 최소한 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 또는 약 99% 상보성을 가지는 역 상보 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 제 2 세그먼트는 제 1 세그먼트의 코딩 서열에 100% 상보성을 가지는 역 상보 서열을 포함한다. 즉, 제 2 세그먼트의 서열은 제 1 세그먼트의 코딩 서열의 완벽한 역 상보체이다. 예로서, 제 1 세그먼트는 가정 서열 5' CTGGACCGA 3' (서열 번호: 500)을 포함하고 제 2 세그먼트는 서열 번호: 500의 역 상보체 - 즉, 5' TCGGTCCAG 3' (서열 번호: 502)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 양방향 핵산 구조체는 폴리펩티드 또는 물질 (예를 들어, 제 1 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열을 포함하는 제 1 세그먼트 및 폴리펩티드 또는 물질 (예를 들어, 제 2 폴리펩티드)의 코딩 서열의 역 상보체를 포함하는 제 2 세그먼트를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 기재된 바와 같이, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 동일하다. 일부 구체예들에서, 상기 기재된 바와 같이, 제 1 치료제 및 제 2 치료제는 동일하다. 일부 구체예들에서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 상이하다. 일부 구체예들에서, 제 1 치료제 및 제 2 치료제는 상이하다. 예를 들어, 제 1 폴리펩티드는 폴리펩티드 A이고 제 2 폴리펩티드는 폴리펩티드 B이다. 한 추가 예에서, 제 1 폴리펩티드는 폴리펩티드 A이고 제 2 폴리펩티드는 폴리펩티드 A의 변이체 (예를 들어, 단편 (가령, 기능적 단편), 돌연변이체, 융합 (폴리펩티드 말단에 하나의 아미노산만큼 적은 부가를 포함), 또는 이의 조합이다.
폴리펩티드를 인코딩하는 코딩 서열은 폴리펩티드에 연결된 하나 이상의 추가 서열들, 가령, 아미노- 또는 카르복시- 말단 아미노산 서열들을 인코딩하는 서열들, 가령, 신호 서열, 라벨 서열, 또는 이종 기능 서열 (예를 들어, 핵 국재화 서열 (NLS))을 선택적으로 포함할 수 있다. 폴리펩티드를 인코딩하는 코딩 서열은 하나 이상의 아미노- 말단 신호 펩티드 서열들을 인코딩하는 서열들을 선택적으로 포함할 수 있다. 이들 추가 서열들 각각은 구조체의 제 1 세그먼트 및 제 2 세그먼트에서 동일 또는 상이할 수 있다.
본원에 기재된 양방향 구조체는 본원에 기재된 AAT를 발현하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 양방향 핵산 구조체는 선형이다. 예를 들어, 제 1 및 제 2 세그먼트들은 링커 서열을 통해 선형 방식으로 결합된다. 일부 구체예들에서, 역 상보 서열을 포함하는 제 2 세그먼트의 5' 말단은 제 1 세그먼트의 3' 말단에 연결된다. 일부 구체예들에서, 제 1 세그먼트의 5' 말단은 역 상보 서열을 포함하는 제 2 세그먼트의 3' 말단에 연결된다. 일부 구체예들에서, 링커 서열은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 1000, 1500, 2000 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 링커 서열에 추가로 또는 대신에 다른 구조적 요소가 제 1 및 제 2 세그먼트 사이에 삽입 될 수 있다.
본원에 개시된 구조체는 임의의 특정 용도에 필요하고 및/또는 하나 이상의 원하는 기능을 부여하는 임의의 적합한 구조적 특징을 포함하도록 변형 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 양방향 핵산 구조체는 상동성 아암을 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 부분적으로 핵산 구조체의 양방향 기능으로 인해, 양방향 구조체는 본원에 기재된 바와 같이 어느 방향으로든 게놈 유전자좌 내부에 삽입되어, 관심 폴리펩티드를 효율적으로 삽입 및/또는 발현시킬 수 있다.
일부 구체예들에서, 제 1 및 제 2 세그먼트 중 하나 또는 둘 모두는 오픈 리딩 프레임의 하류에 폴리아데닐화 꼬리 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 폴리아데닐화 꼬리 서열은 제 1 및/또는 제 2 세그먼트의 3' 말단에서, 예를 들어, “폴리-A” 스트레치로서 인코드된다. 일부 구체예들에서, 폴리아데닐화 꼬리 서열은 제 1 및/또는 제 2 세그먼트의 3' 말단 또는 그 근처에서 인코딩되는 폴리아데닐화 신호 서열의 결과로서 공동-전사적으로 제공된다. 적합한 폴리아데닐화 꼬리 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열을 설계하는 방법은 당업계에 공지이다. 마우스 알부민 및 인간 FIX 스플라이스 수용체 부위들을 포함하는 적합한 스플라이스 수용체 서열들이 본원에 개시되고 예시된다. 일부 구체예들에서, 폴리아데닐화 신호 서열 AAUAAA (서열 번호: 800)는 포유류 시스템에서 일반적으로 사용되지만 UAUAAA (서열 번호: 801) 또는 AU/GUAAA (서열 번호: 802)와 같은 변이체가 확인된 바 있다. 예를 들어, NJ Proudfoot, Genes & Dev. 25(17):1770-82,2011을 참고하라. 일부 구체예들에서, 폴리A 꼬리 서열이 포함된다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 구조체들은 DNA 또는 RNA, 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 부분적 단일- 및 부분적 이중-가닥 일 수 있다. 예를 들어, 구조체들은 단일- 또는 이중-가닥 DNA 일 수 있다. 일부 구체예들에서, 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 (예를 들어, 뉴클레오시드 유사체들을 사용하여) 변형될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 구조체들은 구조체의 한쪽 또는 양쪽 말단에, 예를 들어, 제 1 및/또는 제 2 세그먼트들의 오픈 리딩 프레임의 5'에, 또는 하나 또는 둘 모두의 트랜스진 서열들의 5'에 스플라이스 수용체 부위를 포함한다. 일부 구체예들에서, 스플라이스 수용체 부위는 NAG를 포함한다. 추가 구체예들에서, 스플라이스 수용체 부위는 NAG로 구성된다. 일부 구체예들에서, 스플라이스 수용체는 알부민 스플라이스 수용체, 예를 들어, 알부민의 엑손 1 및 2의 스플라이싱에 함께 사용되는 알부민 스플라이스 수용체이다. 일부 구체예들에서, 스플라이스 수용체는 인간 알부민 유전자에서 유래된다. 일부 구체예들에서, 스플라이스 수용체는 마우스 알부민 유전자에서 유래된다. 일부 구체예들에서, 스플라이스 수용체는 마우스 알부민 스플라이스 수용체, 예를 들어, 알부민의 엑손 1 및 2의 스플라이싱에 함께 사용되는 마우스 알부민 스플라이스 수용체이다. 일부 구체예들에서, 스플라이스 수용체는 인간 알부민 유전자에서 유래된다. 인공 스플라이스 수용체들을 비롯하여, 진핵세포에서 유용한 또 다른 적합한 스플라이스 수용체 부위들은 공지이며 해당 분야에서 유래될 수 있다. 예를 들어, Shapiro, 등, 1987, Nucleic Acids Res., 15, 7155-7174, Burset, 등, 2001, Nucleic Acids Res., 29, 255-259를 참고하라.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 구조체는 필요에 따라 하나 이상의 적합한 구조적 특징을 포함하고 및/또는 하나 이상의 기능적 이점을 부여하도록 한쪽 또는 양쪽 말단에서 변형 될 수 있다. 예를 들어, 구조적 변형은 본원에 개시된 구조체들을 숙주 세포에 전달하는 데 사용되는 방법- 예를 들어, 바이러스 벡터 전달의 사용 또는 전달용 지질 나노입자로의 패키징-에 따라 달라질 수 있다. 이러한 변형들에는, 제한 없이, 예를 들어, 말단 구조들, 가령, 역위 말단 반복서열들 (ITR), 헤어핀, 루프, 및 다른 구조들, 가령, 토로이드(toroid)가 포함된다. 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 구조체들은 1, 2, 또는 3개의 ITR들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 구조체들은 2개 이하의 ITR들을 포함한다. 다양한 구조적 변형 방법들은 해당 분야에 공지이다.
일부 구체예들에서, 구조체의 한쪽 또는 양쪽 말단들은 해당 분야에 공지된 방법에 의해 (예를 들어, 외부핵분해성 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 다이데옥시뉴클레오티드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 첨가되고 및/또는 자기-상보성 올리고뉴클레오티드가 한쪽 또는 양쪽 말단에 결찰된다. 예를 들어, Chang 등, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls 등, (1996) Science 272:886-889를 참고하라. 구조체들을 분해로부터 보호하기 위한 또 다른 방법은 말단 아미노기 (들)의 첨가 및, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오티드 간 링키지의 사용을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 구조체들은 예를 들어, 복제 기점, 프로모터 및 항생제 내성을 인 코딩하는 유전자와 같은 추가 서열을 갖는 벡터의 일부로서 세포에 도입 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 구조체들은 리포솜, 폴리머, 또는 폴록사머와 같은 물질과 복합된 핵산과 같은 네이키드 핵산으로 도입 될 수 있거나 바이러스 벡터들 (예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스)에 의해 전달 될 수 있다.
일부 구체예들에서, 발현에 필요하지는 않지만, 본원에 개시된 구조체들은 또한 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 절연체, 내부 리보솜 진입 부위, 펩티드를 인코딩하는 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함 할 수 있다.
일부 구체예들에서, 관심 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함하는 구조체는 다음 변형 중 하나 이상을 포함 할 수 있다: 코돈 최적화 (예를 들어, 인간 코돈에 대한) 및/또는 하나 이상의 당화 부위의 추가. 예를 들어, McIntosh 등, (2013) Blood (17):3335-44를 참고하라.
E.유전자 편집 시스템
다양한 공지의 유전자 편집 시스템들, 예를 들어, CRISPR/Cas 시스템; 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템; 및 전사 활성화-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 시스템이 본 발명의 실시에서 이종 AAT 유전자의 표적화 삽입을 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 유전자 편집 시스템은 표적 DNA 서열에서 이중-가닥 절단 (DSB) 또는 닉 (예를 들어, 단일 가닥 절단 또는 SSB)을 유도하기 위하여 조작된 절단 시스템의 사용을 포함한다. 절단 또는 닉킹은 표적 DNA 서열의 특이적 절단 또는 닉킹을 가이드하도록 조작된 가이드 RNA를 가지는 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 또는 특정 뉴클레아제, 가령, 조작된 ZFN, TALEN을 사용하여 발생할 수 있다. 또한, 표적화된 뉴클레아제를 개발하여왔으며, 또 다른 뉴클레아제들은, 예를 들면, Argonaute 시스템을 기반으로 개발 중에 있으며 (예를 들어, 'TtAgo'로 알려진 T. 써모필루스, Swarts 등 (2014) Nature 507(7491): 258-261 참조), 이 또한 게놈 편집 및 유전자 치료에 사용될 가능성이 있을 수 있다.
본원에 개시된 Cas 뉴클레아제, 가령, Cas9 뉴클레아제에 대한 가이드 RNA를 사용하는 방법의 경우, 이 방법은 CRISPR/Cas 시스템 (및 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 본원에 개시된 임의의 공여자 구조체)의 사용을 포함함이 이해될 것이다. 또한, 본 발명은 본원에 개시된 양방향 구조체를 사용하는 이종 AAT의 표적화 삽입 및 발현 방법을 고려하고 있음이 이해될 것이며, 이 방법은 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA의 유무에 관계없이 수행 될 수 있다 (예를 들어, ZFN 시스템을 사용하여 표적 DNA 서열에 절단을 유발하여 양방향 구조체의 삽입 부위를 생성함).
일부 구체예들에서, CRISPR/Cas 시스템 (예를 들어, 가이드 RNA 및 RNA-가이드 DNA 결합제)을 사용하여 숙주 게놈 내의 원하는 유전자좌에 삽입 부위를 생성 할 수 있으며, 이 부위에 본원에 개시된 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체)가 삽입되어, 이종 AAT를 발현할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이종 AAT 트랜스진은 예를 들어, 본원에 기재된 세이프 하버 유전자좌에 삽입되는 이의 삽입 부위에 대해 이종일 수 있다. 일부 구체예들에서, 인간 알부민 유전자좌 (예를 들어, 인트론 1)를 표적하는 본원에 기재된 가이드 RNA (서열 번호: 2-33)를 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제)와 함께 본 발명의 방법에 따라 사용하여, 삽입 부위를 생성 할 수 있으며, 이 부위에서 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체)가 삽입되어, 이종 AAT를 발현할 수 있다. 인간 알부민 유전자좌의 인트론 1 내부로 이종 AAT 유전자를 표적화 삽입하기 위한 가이드 서열들을 포함하는 가이드 RNA가 본원에 예시 및 기재된다 (예를 들어, 표 1 참고).
다양한 RNA-가이드 DNA 결합제, 예를 들어, 뉴클레아제, 가령, Cas 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9의 사용 방법은 또한 해당 분야에 널리 공지되어 있다. 문맥에 따라, RNA-가이드 DNA 결합제는 핵산 (예를 들어, DNA 또는 mRNA) 또는 단백질로 제공 될 수 있음이 이해될 것이다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법은 RNA-가이드 DNA 결합제를 발현하는 숙주 세포에서 실행될 수 있다.
일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제, 가령, Cas9 뉴클레아제는 클리브아제 활성을 가지며, 이는 또한 이중-가닥 엔도뉴클레아제 활성으로도 지칭될 수 있다. 일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제, 가령, Cas9 뉴클레아제는 닉카제 활성을 가지며, 이는 또한 단일-가닥 엔도뉴클레아제 활성으로도 지칭될 수 있다. 일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 Cas 뉴클레아제를 포함한다. Cas9 뉴클레아제의 예들에는 S. 피오게네스, S. 아우레우스, 및 기타 원핵 생물의 유형 II CRISPR 시스템 (예를 들어, 다음 단락의 목록 참조) 및 이의 돌연변이체 (예를 들어, 조작된 또는 기타 변이체) 형태를 포함한다. 예를 들어, US2016/0312198 A1; US 2016/0312199 A1을 참고하라.
Cas 뉴클레아제가 유도될 수 있는 비-제한적 예시 종들에는 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코쿠스 종, 스타필로코쿠스 아우레우스, 리스테리아 이노쿠아, 락토바실루스 가세리, 프란시셀라 노비시다, 볼리넬라 숙시노게네스, 수테렐라 와즈워텐시스, 감마프로테오박테리움, 네이세리아 메닌기티디스, 캄필로박터 제주니, 파스퇴렐라 물토시다, 피브로박터 숙시노겐, 로도스피릴룸 루브룸, 노카르디옵시스 다쏜빌레이, 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스, 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토스포란지움 로세움, 스트렙토스포란지움 로세움, 알리사이클로바실루스 아시도칼다리우스, 바실루스 슈도마이코이데스, 바실루스 셀레니티레두센스, 엑시구오박테리움 시비리쿰, 락토바실루스 델브루엑키이, 락토바실루스 살리바리우스, 락토바실루스 부크네리, 트레포네마 덴티콜라, 마이크로실라 마리나, 부르크홀데리알레스 박테리움, 폴라로모나스 나프탈레니보란스, 폴라로모나스 종, 크로코스파에라 왓소니이, 시아노테세 종, 마이크로시스티스 아에루기노사, 시네코코쿠스 종, 아세토할로비움 아라바티쿰, 암모니펙스 데겐시이, 칼디세룰로시룹토르 벡스치이, 칸디다투스 데술포루디스, 클로스트리디움 보툴리눔, 클로스트리디움 디피실레, 피네골디아 마그나, 나트라나에로비우스 써모필루스, 펠로토마쿨룸 테르모프로피오니쿰, 아시디티오바실루스 칼두스, 아시디티오바실루스 페로옥시단스, 알로크로마티움 비노숨, 마리노박터 종, 니트로소코쿠스 할로필루스, 니트로소코쿠스 왓소니, 슈도알테로모나스 할로플란크티스, 크테도노박터 라세미페르, 메타노할로비움 에베스티가툼, 아나바에나 바리아빌리스, 노둘라리아 스푸미게나, 노스톡 종, 아르쓰로스피라 맥시마, 아르쓰로스피라 플라텐시스, 아르쓰로스피라 종, 링비아 종, 마이크로콜레우스 크토노플라스테스, 오실라토리아 종, 페트로토가 모빌리스, 써모시포 아프리카누스, 스트렙토코쿠스 파스퇴리아누스, 네이세리아 시네레아, 캄필로박터 라리, 파르비바쿨룸 라바멘티보란스, 코리네박테리움 디프테리아, 아시다미노코쿠스 종, 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006, 및 아카리오클로리스 마리나가 포함된다.
일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 스트렙토코쿠스 피오게네스의 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 스트렙토코쿠스 써모필루스의 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 스타필로코쿠스 아우레우스의 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 프란시셀라 노비시다의 Cpf1 뉴클레아제이다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 아시다미노코쿠스 종의 Cpf1 뉴클레아제이다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006의 Cpf1 뉴클레아제이다. 추가 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 프란시셀라 툴라렌시스, 라크노스피라세아에 박테리움, 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스, 페레그리니박테리아 박테리움, 파르쿠박테리아 박테리움, 스미텔라, 아시다미노코쿠스, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼, 에우박테리움 엘리겐스, 모락셀라 보보쿨리, 렙토스피라 이나다이, 포르피로모나스 크레비오리카리스, 프레보텔라 디시엔스, 또는 포르피로모나스 마카카에의 Cpf1 뉴클레아제이다. 특정 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 아시다미노코쿠스 또는 라크노스피라세아에의 Cpf1 뉴클레아제이다.
일부 구체예들에서, gRNA는 RNA-가이드 DNA 결합제와 함께 리보핵단백질 복합체 (RNP)라 불린다. 일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 Cas 뉴클레아제이다. 일부 구체예들에서, gRNA는 Cas 뉴클레아제와 함께 Cas RNP라 불린다. 일부 구체예들에서, RNP는 유형-I, 유형-II, 또는 유형-III 요소들을 포함한다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 유형-II CRISPR/Cas 시스템의 Cas9 단백질이다. 일부 구체예들에서, gRNA는 Cas9와 함께 Cas9 RNP라 불린다.
야생형 Cas9는 2개의 뉴클레아제 도메인: RuvC 및 HNH를 가진다. RuvC 도메인은 비-표적 DNA 가닥을 절단하고, HNH 도메인은 DNA의 표적 가닥을 절단한다. 일부 구체예들에서, Cas9 단백질은 하나 이상의 RuvC 도메인 및/또는 하나 이상의 HNH 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9이다. 조성물, 용도 및 방법 구체예들 각각에서, Cas는 표적 DNA에서 이중-가닥 절단을 유도한다.
일부 구체예들에서, 키메라 Cas 뉴클레아제들이 사용되며, 여기서 단백질의 하나의 도메인 또는 영역은 상이한 단백질의 일부분으로 대체된다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제 도메인은 Fok1과 같은 상이한 뉴클레아제의 도메인으로 대체 될 수 있다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 변형된 뉴클레아제 일 수 있다.
다른 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 유형-I CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래할 수 있다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 유형-I CRISPR/Cas 시스템의 캐스케이드 복합체의 구성성분일 수 있다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 Cas3 단백질 일 수 있다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 유형-III CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래할 수 있다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 RNA 절단 활성을 가질 수 있다.
일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 단일-가닥 닉카제 활성을 가지고 있다, 즉, 하나의 DNA 가닥을 절단하여 “닉 (nick)”으로도 공지된 단일-가닥 절단을 생성 할 수 있다. 일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 Cas 닉카제를 포함한다. 닉카제는 dsDNA에서 닉을 생성하는 효소이다, 즉, DNA 이중 나선의 한 가닥은 자르지만 다른 가닥은 자르지 않는 것이다. 일부 구체예들에서, Cas 닉카제는 예를 들어 촉매 도메인에서 하나 이상의 변형 (예를 들어, 점 돌연변이)에 의해 내부핵분해성 활성 부위가 비활성화되는 Cas 뉴클레아제 형태 (예를 들어, 상기 논의된 Cas 뉴클레아제)이다. 예를 들어, Cas 닉카제 및 예시적 촉매 도메인 변형들에 관한 논의에 대한 미국 특허 제 8,889,356호를 참고하라. 일부 구체예들에서, Cas 닉카제, 가령, Cas9 닉카제는 비활성화된 RuvC 또는 HNH 도메인을 가진다.
일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 단 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인을 포함하도록 변형된다. 예를 들어, 작용제 단백질은 핵산 절단 활성을 감소시키기 위해 뉴클레아제 도메인 중 하나가 돌연변이되거나 완전히 또는 부분적으로 결실되도록 변형 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 활성이 감소된 RuvC 도메인을 갖는 닉카제가 사용된다. 일부 구체예들에서, 비활성 RuvC 도메인을 갖는 닉카제가 사용된다. 일부 구체예들에서, 활성이 감소된 HNH 도메인을 갖는 닉카제가 사용된다. 일부 구체예들에서, 비활성 HNH 도메인을 갖는 닉카제가 사용된다.
일부 구체예들에서, 뉴클레아제 활성을 감소 또는 변경하기 위해 Cas 단백질 뉴클레아제 도메인 내의 보존된 아미노산이 치환된다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인에 아미노산 치환을 포함 할 수 있다. RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인에서 예시적인 아미노산 치환들은 D10A (S. 피오게네스 Cas9 단백질 기준)를 포함한다. 예를 들어, Zetsche 등, (2015) Cell Oct 22:163(3): 759-771을 참고하라. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 HNH 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인에 아미노산 치환을 포함 할 수 있다. HNH 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인에서 예시적인 아미노산 치환은 E762A, H840A, N863A, H983A, 및 D986A (S. 피오게네스 Cas9 단백질 기준)를 포함한다. 예를 들어, Zetsche 등, (2015)을 참고하라. 추가의 예시적인 아미노산 치환에는 D917A, E1006A, 및 D1255A가 포함된다 (프란시셀라 노비시다 U112 Cpf1 (FnCpf1) 서열 (UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN) 기준).
일부 구체예들에서, 닉카제는 표적 서열의 센스 및 안티센스 가닥 각각에 상보적인 한 쌍의 가이드 RNA와 조합하여 제공된다. 이 구체예에서, 가이드 RNA는 닉카제를 표적 서열로 안내하고 표적 서열의 반대 가닥에 닉을 생성함으로써 DSB를 도입한다 (즉, 이중 닉킹). 일부 구체예에서, 닉카제는 DNA의 반대 가닥들을 표적화하는 2 개의 개별 가이드 RNA와 함께 사용되어, 표적 DNA에서 이중 닉을 생성한다. 일부 구체예들에서, 닉카제는 매우 근접하도록 선택된 두 개의 개별 가이드 RNA와 함께 사용되어, 표적 DNA에서 이중 닉을 생성한다.
일부 구체예들에서,RNA-가이드 DNA 결합제는 하나 이상의 이종 기능적 도메인들을 포함한다 (예를 들어, 융합 폴리펩티드이거나 이를 포함함).
일부 구체예들에서, 이종 기능적 도메인은 RNA-가이드 DNA 결합제의 세포 핵으로의 수송을 촉진 할 수 있다. 예를 들어, 이종 기능적 도메인은 핵 국재화 신호 (NLS) 일 수 있다. 일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 1-10 NLS(들)과 융합될 수 있다. 일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 1-5 NLS(들)과 융합될 수 있다. 일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 하나의 NLS와 융합될 수 있다. 하나의 NLS가 사용될 경우, NLS는 RNA-가이드 DNA 결합제 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 연결될 수 있다. 이는 또한 RNA-가이드 DNA 결합제 서열 내부에 삽입될 수 있다. 다른 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 하나 이상의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 2, 3, 4, 또는 5개 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 2개의 NLS와 융합될 수 있다. 특정 상황에서, 2개의 NLS는 동일하거나 (예를 들어, 2개의 SV40 NLS) 다를 수 있다. 일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 카르복시 말단에 연결된 2개의 SV40 NLS 서열에 융합된다. 일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 2개의 NLS들과 융합될 수 있는데, 하나는 N-말단에서 그리고 하나는 C-말단에서 연결된다. 일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 3개의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 NLS와 융합되지 않을 수 있다. 일부 구체예들에서, NLS는 단립형 (monopartite) 서열, 가령, 예를 들어, SV40 NLS, PKKKRKV (서열 번호: 600) 또는 PKKKRRV (서열 번호: 601) 일 수 있다. 일부 구체예들에서, NLS는 양립형 서열 (bipartite), 가령, 핵플라스민의 NLS, KRPAATKKAGQAKKKK (서열 번호: 602) 일 수 있다. 한 특정 구체예에서, 단일 PKKKRKV (서열 번호: 600) NLS는 RNA-가이드 DNA 결합제의 C-말단에 연결될 수 있다. 하나 이상의 링커들은 선택적으로 융합 부위에 포함된다.
III. 전달 방법
본원에 개시된 가이드 RNA (알부민 gRNA; SERPINA1 gRNA), RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제) 및 핵산 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체)는 당업계에서 이용가능한 다양한 공지의 적합한 방법을 사용하여 생체내 또는 생체외에서 숙주 세포 또는 대상체에 전달 될 수 있다. 가이드 RNA, RNA-가이드 DNA 결합제 및 핵산 구조체는 동일하거나 다른 전달 방법을 사용하여 적절히 개별적으로 또는 임의의 조합으로 함께 전달 될 수 있다.
통상적인 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법을 사용하여 세포 (예를 들어, 포유동물 세포) 및 표적 조직에 본원에 개시된 가이드 RNA, 뿐만 아니라 RNA-가이드 DNA 결합제 및 공여자 구조체를 도입할 수 있다. 본원은 또한, 핵산, 가령, 비-바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 및 예를 들어, 네이키드 핵산, 및 리포좀, 지질 나노입자 (LNP), 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합된 핵산을 포함하는 비-바이러스 벡터 전달 시스템이 제공된다. 바이러스 벡터 전달 시스템들은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다.
핵산의 비-바이러스 전달을 위한 방법 및 조성물은 전기천공, 리포펙션, 미세주입, 유전자총, 비로좀, 리포좀, 면역리포좀, LNP, 다중 양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 핵산 (예를 들어, 네이키드 DNA/RNA), 인공 비리온, 및 DNA의 작용제-개선된 흡수를 포함한다. 핵산의 전달을 위해, 예를 들어, Sonitron 2000 시스템 (Rich-Mar)을 사용한 초음파천공 (Sonoporation) 또한 사용될 수 있다.
추가적인 예시적 핵산 전달 시스템들에는, AmaxaBiosystems (Cologne, 독일), Maxcyte, Inc. (Rockville, Md.), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) 및 Copernicus Therapeutics Inc.에 의해 공급되는 시스템들이 포함된다 (예를 들면 미국 특허 제 6,008,336 참고). 리포펙틴은 예를 들어, 미국 특허 제 5,049,386; 4,946,787; 및 4,897,355에 기재되어 있으며 리포펙틴 시약들은 시판되고 있다 (예를 들어, Transfectam™및 Lipofectin™면역지질 복합체와 같은 표적화된 리포좀을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조는 당업계에 잘 알려져 있고 본원에 기재된 바와 같다.
가이드 RNA, RNA-가이드 DNA 결합제 및 공여자 구조체를 단독으로 또는 조합하여 포함하는 다양한 전달 시스템 (예를 들어, 벡터, 리포좀, LNP)은 생체내 세포로의 전달을 위해 유기체에 투여되거나 생체외 세포 또는 세포 배양물에 투여될 수 있다. 투여는 분자를 도입하여 혈액, 체액 또는 분자들과 궁극적으로 접촉시키기 위해 통상적으로 사용되는, 주사, 주입, 국소적용 및 전기천공을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) 임의의 경로들에 의해 의한다. 이러한 핵산을 투여하는 적절한 방법을 이용할 수 있으며 당업자에게 잘 알려져 있다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 본원에 개시된 조성물- 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 가이드 서열들을 포함하는 가이드 RNA (알부민 gRNA; 및/또는 SERPINA1 gRNA); 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체); 또는 RNA-가이드 DNA 결합제를 인코딩하는 서열 중 하나 이상을 인코딩하는 DNA 또는 RNA 벡터를 제공한다. 특정 구체예들에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 조성물들을 인코딩하는 DNA 또는 RNA 벡터들 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 벡터는, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 및 조절 서열들을 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체를 포함하는 벡터는 이종 AAT 발현을 구동시키는 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본원에 기재된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 가이드 RNA (알부민 gRNA; 및/또는 SERPINA1 gRNA)를 포함하는 벡터는 또한 본원에 기재된 바와 같은 crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 (들)을 포함한다.
일부 구체예들에서, 벡터는 본원에 기재된 가이드 RNA (알부민 gRNA; 및/또는 SERPINA1 gRNA)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 벡터는 가이드 RNA의 하나의 사본을 포함한다. 다른 구체예들에서, 벡터는 하나 이상의 가이드 RNA 사본을 포함한다. 하나 이상의 가이드 RNA가 있는 구체예들에서, 가이드 RNA가 동일하지 않아서 상이한 표적 서열들을 표적할 수 있거나, 또는 동일하여 동일한 표적 서열을 표적할 수 있다. 벡터가 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 일부 구체예들에서, 각 가이드 RNA는 RNA-가이드 DNA 뉴클레아제와의 복합체, 가령, Cas RNP 복합체 내부에서 다른 상이한 성질들, 가령, 활성 또는 안정성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 최소한 하나의 전사 또는 번역 조절 서열, 가령, 프로모터, 3' UTR 또는 5' UTR에 작동가능하게 연결될 수 있다. 한 구체 예에서, 프로모터는 tRNA 프로모터, 예를 들어, tRNALys3, 또는 tRNA 키메라 일 수 있다. Mefferd 등, RNA. 2015 21:1683-9; Scherer 등, Nucleic Acids Res. 2007 35: 2620-2628을 참고하라. 일부 구체예들에서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 III (Pol III)에 의해 인식 될 수 있다. Pol III 프로모터의 비-제한적 예는 U6 및 H1 프로모터를 포함한다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 마우스 또는 인간 U6 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다른 구체예들에서, 가이드 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 마우스 또는 인간 H1 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 하나 이상의 가이드 RNA가 있는 구체예에서, 발현을 구동시키는데 사용되는 프로모터는 동일하거나 상이 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA의 crRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드와 가이드 RNA의 trRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드가 동일한 벡터에 제공 될 수 있다. 일부 구체예들에서, crRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 및 trRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드는 동일한 프로모터에 의해 구동 될 수 있다. 일부 구체예들에서, crRNA 및 trRNA는 단일 전사체로 전사 될 수 있다. 예를 들어, crRNA 및 trRNA는 단일 전사체로부터 가공되어 이중-분자 가이드 RNA를 형성 할 수 있다. 대안적으로, crRNA 및 trRNA는 단일-분자 가이드 RNA (sgRNA)로 전사 될 수 있다. 다른 구체예들에서, crRNA 및 trRNA는 동일한 벡터상의 상응하는 프로모터에 의해 구동 될 수 있다. 또 다른 구체예에서, crRNA 및 trRNA는 상이한 벡터에 의해 인코딩 될 수 있다.
일부 구체예들에서, 가이드 RNA (알부민 gRNA; 및/또는 SERPINA1 gRNA)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Cas 단백질과 같은 RNA-가이드 DNA 결합제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 동일한 벡터 상에 위치 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 알부민 gRNA 및/또는 하나 이상의 SERPINA1 gRNA는 동일한 벡터 상에 위치할 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 알부민 gRNA 및/또는 하나 이상의 SERPINA1 gRNA는 RNA-가이드 DNA 결합제, 가령, Cas 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 동일한 벡터 상에 위치할 수 있다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA 및 Cas 단백질과 같은 RNA-가이드 DNA 결합제의 발현은 그들 자신의 상응하는 프로모터에 의해 구동 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA의 발현은 Cas 단백질과 같은 RNA-가이드 DNA 결합제의 발현을 구동시키는 동일한 프로모터에 의해 구동 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA 및 RNA-가이드 DNA 결합제, 가령, Cas 단백질 전사체는 단일 전사체 내부에 포함될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 RNA 가이드 DNA 결합제, 가령, Cas 단백질 전사체의 비 번역 영역 (UTR) 내에 있을 수 있다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA는 전사체의 5' UTR 내부에 있을 수 있다. 다른 구체예들에서, 가이드 RNA는 전사체의 3' UTR 내부에 있을 수 있다. 일부 구체예들에서, 전사체의 세포내 반감기는 3' UTR 내부에 가이드 RNA를 포함시켜 3' UTR의 길이를 단축시킴으로써 감소 될 수 있다. 추가 구체예에서, 가이드 RNA는 전사체의 인트론 내부에 있을 수 있다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA가 전사체로부터 적절하게 스플라이싱 되도록 가이드 RNA가 위치하는 인트론에 적합한 스플라이스 부위가 추가 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 동일한 벡터로부터 Cas 단백질과 같은 RNA-가이드 DNA 결합제 및 가이드 RNA를 시간상으로 가깝게 발현시키면 보다 효율적인 CRISPR RNP 복합체 형성을 촉진 할 수 있다.
일부 구체예들에서, RNA-가이드 DNA 결합제 및/또는 가이드 RNA (알부민 gRNA; 및/또는 SERPINA1 gRNA)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 이종 AAT 유전자를 포함하는 구조체를 포함하는 동일한 벡터 상에 위치 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 동일한 벡터상에서 AAT 유전자를 포함하는 구조체 및 가이드 RNA (및/또는 RNA-가이드 DNA 결합제)의 근접성은 이러한 구조체가 가이드 RNA/RNA-가이드 DNA 결합제에 의해 생성되는 삽입 부위 내부로 보다 효율적으로 삽입되게 촉진할 수 있다.
일부 구체예들에서, 벡터는 Cas 단백질, 가령, Cas9 또는 Cpf1 일 수 있는 RNA-가이드 DNA 결합제를 인코딩하는 mRNA 및 sgRNA (알부민 gRNA; 및/또는 SERPINA1 gRNA)를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)을 포함한다. 일부 구체예들에서, 벡터는 Cas 단백질, 가령, Cas9 또는 Cpf1 일 수 있는 RNA-가이드 DNA 결합제를 인코딩하는 mRNA, trRNA 및 crRNA를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)을 포함한다. 한 구체예에서, Cas9는 스트렙토코쿠스 피오게네스에서 유래된다 (즉, Spy Cas9). 일부 구체예들에서, crRNA, trRNA 또는 crRNA 및 trRNA (sgRNA 일 수 있음)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 반복 서열들의 전부 또는 일부가 연접된 가이드 서열을 포함하거나 이들로 구성된다. crRNA, trRNA 또는 crRNA 및 trRNA를 포함하거나 이들로 구성된 핵산은, crRNA, trRNA 또는 crRNA 및 trRNA와 함께 자연적으로 발견되지 않는 핵산들을 포함하거나 이들로 구성된 벡터 서열을 추가로 포함 할 수 있다.
일부 구체예들에서, crRNA 및 trRNA는 하나의 벡터 내에서 비-연속 핵산에 의해 인코딩된다. 다른 구체예들에서, crRNA 및 trRNA는 연속 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 구체예들에서, crRNA 및 trRNA는 단일 핵산의 반대 가닥들에 의해 인코딩된다. 다른 구체예들에서, crRNA 및 trRNA는 단일 핵산의 동일한 가닥에 의해 인코딩된다.
일부 구체예들에서, 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 핵산 구조체)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 벡터는 본원에 개시된 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 핵산 구조체) 이외에도, 본원에 기재된 알부민 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산 및/또는 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제, 가령, Cas9)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 알부민 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산 및/또는 RNA-가이드 DNA 결합제를 인코딩하는 핵산은 본원에 개시된 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체)를 포함하는 벡터와는 별개의 벡터 상에 각각 또는 둘 모두 존재한다. 임의의 구체예들에서, 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 프로모터, 인핸서, 조절 서열을 포함하는 (그러나 이에 제한되지 않음) 다른 서열을 포함 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 프로모터는 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체)의 이종 AAT의 발현을 구동시키지 않는다. 일부 구체예들에서, 벡터는 crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)을 포함한다. 일부 구체예들에서, 벡터는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9) 일 수 있는 RNA-가이드 DNA 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 및 sgRNA를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)을 포함한다. 일부 구체예들에서, 벡터는 Cas 뉴클레아제, 가령, Cas9 일 수 있는 RNA-가이드 DNA 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA, trRNA 및 crRNA를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)을 포함한다. 일부 구체예들에서, Cas9는 스트렙토코쿠스 피오게네스에서 유래된다 (즉, Spy Cas9). 일부 구체예들에서, crRNA, trRNA 또는 crRNA 및 trRNA (sgRNA 일 수 있음)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 반복 서열들의 전부 또는 일부가 연접된 가이드 서열을 포함하거나 이들로 구성된다. crRNA, trRNA 또는 crRNA 및 trRNA를 포함하거나 이들로 구성된 핵산은, crRNA, trRNA 또는 crRNA 및 trRNA와 함께 자연적으로 발견되지 않는 핵산들을 포함하거나 이들로 구성된 벡터 서열을 추가로 포함 할 수 있다.
일부 구체예들에서, 벡터는 원형일 수 있다. 다른 구체예들에서, 벡터는 선형일 수 있다. 일부 구체예들에서, 벡터는 지질 나노입자, 리포솜, 비-지질 나노입자 또는 바이러스 캡시드로 둘러싸일 수 있다. 비 제한적인 예시적인 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 미니염색체, 트랜스포존, 바이러스 벡터 및 발현 벡터를 포함한다.
일부 구체예들에서, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 일부 구체예들에서, 바이러스 벡터는 이의 야생형 대응물로부터 유전자 변형 될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 클로닝을 용이하게 하기 위해 또는 벡터의 하나 이상의 특성들을 변화시키는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있다. 이러한 특성에는 패키징 용량, 형질도입 효율, 면역원성, 게놈 통합, 복제, 전사 및 번역이 포함될 수 있다. 일부 구체예들에서, 바이러스가 더 큰 크기를 갖는 외인성 서열을 패키징 할 수 있도록 바이러스 게놈의 일부가 결실 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 바이러스 벡터는 향상된 형질도입 효율을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 숙주에서 바이러스에 의해 유도된 면역 반응이 감소 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 바이러스가 통합되지 않도록, 바이러스 서열의 숙주 게놈으로의 통합을 촉진하는 바이러스 유전자 (예를 들어, 인테그라제)가 돌연변이 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 바이러스 벡터는 복제 결함 일 수 있다. 일부 구체예들에서, 바이러스 벡터는 벡터에서 코딩 서열들의 발현을 구동시키기 위해 외인성 전사 또는 번역 제어 서열을 포함 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 바이러스는 헬퍼-의존성 일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 벡터를 증폭하고 바이러스 입자로 패키징하는데 필요한 바이러스 성분들 (예를 들어, 바이러스 단백질)을 공급하기 위해 하나 이상의 헬퍼 바이러스가 필요할 수 있다. 이러한 경우, 바이러스 성분들을 인코딩하는 하나 이상의 벡터들을 포함하는 하나 이상의 헬퍼 성분들은 본원에 기재된 벡터 시스템과 함께 숙주 세포에 도입 될 수 있다. 다른 구체예들에서, 바이러스는 헬퍼가 없을 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 헬퍼 바이러스 없이 벡터를 증폭 및 패키징 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에 기재된 벡터 시스템은 또한 바이러스 증폭 및 패키징에 필요한 바이러스 성분들을 인코딩 할 수 있다.
비-제한적인 예시적인 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헬퍼 의존성 아데노바이러스 벡터 (HDAd), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV-1) 벡터, 박테리오파지 T4, 배큘로바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구체예들에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터 일 수 있다. 다른 구체예들에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 일 수 있다.
일부 구체예들에서, “AAV”는 모든 혈청형, 아형 및 자연 발생 AAV, 뿐만 아니라 재조합 AAV를 지칭한다. “AAV”는 바이러스 자체 또는 이의 유도체를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 용어 “AAV”는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV2/8, AAVrh10, AAVLK03, AV10, AAV11, AAV12, rh10, 및 이의 하이브리드, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비영장류 AAV, 및 양 AAV를 포함한다. AAV의 다양한 혈청형의 게놈 서열, 뿐만 아니라 천연 말단 반복서열 (TR), Rep 단백질 및 캡시드 서브유닛의 서열들은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 서열은 문헌 또는 GenBank와 같은 공개 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 본원에 사용된 “AAV 벡터”는 AAV 기원이 아닌 이종성 서열 (즉, AAV에 이종성인 핵산 서열)을 포함하는 AAV 벡터를 지칭하며, 일반적으로 관심 이종성 폴리펩티드 (예를 들어, AAT)를 인코딩하는 서열을 포함한다. 구조체는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV2/8, AAVrh10, AAVLK03, AV10, AAV11, AAV12, rh10, 및 이의 하이브리드, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비영장류 AAV, 및 양 AAV 캡시드 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이종 핵산 서열 (트랜스진)은 최소한 1, 최소한 2, 최소한 3개의 AAV 반전된 말단 반복 서열 (ITRs)에 의해 연접된다. AAV 벡터는 단일 가닥 (ssAAV) 또는 자기 상보성 (scAAV) 일 수 있다.
일부 구체예들에서, 렌티바이러스는 통합되지 않을 수 있다. 일부 구체예들에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터 일 수 있다. 일부 구체예들에서, 아데노바이러스는 고-클로닝 용량 또는 “유전자미함유(gutless)” 아데노바이러스 일 수 있으며, 여기서 5' 및 3' 역위 말단 반복서열 (ITR) 및 패키징 신호 ('I')를 제외한 모든 코딩 바이러스 영역들은 패키징 용량을 증가시키기 위해 바이러스로부터 제거되어 있다. 또 다른 구체예에서, 바이러스 벡터는 HSV-1 벡터 일 수 있다. 일부 구체예들에서, HSV-1-기반 벡터는 헬퍼 의존적이며, 다른 구체예에서는 헬퍼 독립적이다. 예를 들어, 패키징 서열만 유지하는 앰플리콘 벡터는 패키징을 위한 구조적 구성요소들을 가지는 헬퍼 바이러스가 필요한 반면, 비-필수 바이러스 기능들을 제거하는 30kb-결실된 HSV-1 벡터는 헬퍼 바이러스를 필요로 하지 않는다. 또 다른 구체예들에서, 바이러스 벡터는 박테리오파지 T4 일 수 있다. 일부 구체예들에서, 박테리오파지 T4는 바이러스 헤드가 비워 질 때 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자를 패키징 할 수 있다. 추가 구체예들에서, 바이러스 벡터는 배큘로바이러스 벡터 일 수 있다. 추가 구체예들에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 일 수 있다. 더 작은 클로닝 용량을 갖는 AAV 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 구체예에서, 본원에 개시된 벡터 시스템의 모든 구성요소들을 전달하기 위해 하나 이상의 벡터를 사용하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 하나의 AAV 벡터는 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9)과 같은 RNA-가이드 DNA 결합제를 인코딩하는 서열을 포함 할 수 있는 반면, 제 2 AAV 벡터는 하나 이상의 가이드 서열을 포함 할 수 있다.
일부 구체예들에서, 벡터 시스템은 세포에서 하나 이상의 코딩 서열들의 발현을 구동 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 벡터는 일단 세포에 통합되면 하나 이상의 코딩 서열들의 발현을 구동시키는 프로모터를 포함하지 않는다 (예를 들어, 본원에 예시된 바와 같은 알부민 유전자좌가 인트론 1에 삽입되는 경우와 같이 숙주 세포의 내인성 프로모터를 사용함). 일부 구체예들에서, 세포는 원핵 세포, 가령, 예를 들어, 박테리아 세포 일 수 있다. 일부 구체예들에서, 세포는 진핵 세포, 가령, 예를 들어, 효모, 식물, 곤충 또는 포유류 세포일 수 있다. 일부 구체예들에서, 진핵 세포는 포유류 세포 일 수 있다. 일부 구체예들에서, 진핵 세포는 설치류 세포 일 수 있다. 일부 구체예들에서, 진핵 세포는 인간 세포 일 수 있다. 상이한 유형의 세포에서 발현을 구동시키는 적합한 프로모터는 당업계에 공지되어있다. 일부 구체예들에서, 프로모터는 야생형 일 수 있다. 다른 구체예들에서, 프로모터는 보다 효율적이거나 효과적인 발현을 위해 변형 될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 프로모터는 절두 될 수 있지만 그 기능을 유지한다. 예를 들어, 프로모터는 벡터를 바이러스로 적절하게 패키징하기에 적합한 정상 크기 또는 감소된 크기를 가질 수 있다.
일부 구체예들에서, 벡터는 본원에 기재된 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9)과 같은 RNA-가이드 DNA 결합제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 벡터에 의해 인코딩된 뉴클레아제는 Cas 단백질 일 수 있다. 일부 구체예들에서, 벡터 시스템은 뉴클레아제를 인코딩하는 하나의 뉴클레오티드 서열 사본을 포함 할 수 있다. 다른 구체예들에서, 벡터 시스템은 뉴클레아제를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 사본을 포함 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 최소한 하나의 전사 또는 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구체예들에서, 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 최소한 하나의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 구체예들에서, 벡터는 본원에 기재된 이종 AAT 유전자를 포함하는 임의의 하나 이상의 구조체를 포함 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이종 AAT 유전자는 최소한 하나의 전사 또는 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구체예들에서, 이종 AAT 유전자는 최소한 하나의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구체예들에서, 이종 유전자는 이종 유전자의 발현을 구동시키는 프로모터에 연결되지 않는다.
일부 구체예들에서, 프로모터는 항시성, 유도성 또는 조직 특이성 일 수 있다. 일부 구체예들에서, 프로모터는 항시성 프로모터 일 수 있다. 비-제한적인 예시적인 항시성 프로모터에는 거대세포 바이러스 즉시 초기 프로모터 (CMV), 유인원 바이러스 (SV40) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 (MLP) 프로모터, Rous 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 연장 인자-알파 (EF1a) 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 튜불린 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 이의 기능적 단편, 또는 전술한 것들의 임의의 조합이 포함된다. 일부 구체예들에서, 프로모터는 CMV 프로모터 일 수 있다. 일부 구체예들에서, 프로모터는 절두된 CMV 프로모터 일 수 있다. 다른 구체예들에서, 프로모터는 EF1a 프로모터 일 수 있다. 일부 구체예들에서, 프로모터는 유도성 프로모터 일 수 있다. 비 제한적인 예시적인 유도성 프로모터는 열 충격, 빛, 화학 물질, 펩티드, 금속, 스테로이드, 항생제 또는 알코올에 의해 유도 될 수 있는 것들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 유도성 프로모터는 예를 들어 Tet-On® 프로모터 (Clontech)와 같이 낮은 기저 (비-유도) 발현 수준을 갖는 것일 수 있다.
일부 구체예들에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터, 예를 들어 간에서의 발현에 특이적인 프로모터 일 수 있다.
일부 구체예들에서, 조성물은 벡터 시스템을 포함한다. 일부 구체예들에서, 벡터 시스템은 하나의 단일 벡터를 포함 할 수 있다. 다른 구체예들에서, 벡터 시스템은 2 개의 벡터를 포함 할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 벡터 시스템은 3 개의 벡터를 포함 할 수 있다. 다중화에 서로 다른 가이드 RNA가 사용되거나 다수의 가이드 RNA 사본이 사용되는 경우 벡터 시스템은 3개 이상의 벡터를 포함 할 수 있다.
일부 구체예들에서, 벡터 시스템은 표적 세포로 전달된 후에만 발현을 시작하는 유도성 프로모터를 포함 할 수 있다. 비 제한적인 예시적인 유도성 프로모터는 열 충격, 빛, 화학 물질, 펩티드, 금속, 스테로이드, 항생제 또는 알코올에 의해 유도 될 수 있는 것들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 유도성 프로모터는 예를 들어 Tet-On® 프로모터 (Clontech)와 같이 낮은 기저 (비-유도) 발현 수준을 갖는 것일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 벡터 시스템은 특정 조직으로 전달된 후에만 발현을 시작하는 조직-특이적 프로모터를 포함 할 수 있다.
벡터는 다음을 포함한다: 개별적으로 또는 임의의 조합으로 이종 AAT 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA (알부민 gRNA 및/또는 SERPINA1 gRNA), RNA-결합 DNA 결합제 또는 공여자 구조체는 리포좀, 나노입자, 엑소좀 또는 미세소포에 의해 전달 될 수 있다. 벡터는 지질 나노입자 (LNP)에 의해 전달 될 수도 있다. 개별적으로 또는 임의의 조합으로 이종 AAT 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA (알부민 gRNA 및/또는 SERPINA1 gRNA), RNA-결합 DNA 결합제 (예를 들어, mRNA) 또는 공여자 구조체는 리포좀, 나노입자, 엑소좀 또는 미세소포에 의해 전달 될 수 있다. 개별적으로 또는 임의의 조합으로 이종 AAT 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA (알부민 gRNA 및/또는 SERPINA1 gRNA), RNA-결합 DNA 결합제 (예를 들어, mRNA) 또는 공여자 구조체는 LNP에 의해 전달 될 수 있다.
지질 나노입자 (LNPs)는 뉴클레오티드 및 단백질 카고의 전달에 있어서 잘 알려진 수단이며, 본원에 개시된 임의의 가이드 RNA (알부민 gRNA; 및/또는 SERPINA1 gRNA), RNA-가이드 DNA 결합제 및/또는 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체)의 전달에 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, LNP는 적절하게 핵산 (예를 들어, DNA 또는 mRNA), 또는 단백질 (예를 들어, Cas 뉴클레아제), 또는 단백질과 함께하는 핵산의 형태로 조성물을 전달한다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 가이드 RNA (알부민 gRNA; 및/또는 SERPINA1 gRNA) 및/또는 본원에 개시된 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체)를, 단독으로 또는 조합하여, 숙주 세포 또는 대상체에 전달하는 방법을 제공하며, 이 때 상기 구성요소들 중 임의의 하나 이상은 LNP와 결합된다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas9 또는 Cas9를 인코딩하는 서열)를 추가로 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 가이드 RNA (알부민 gRNA; 및/또는 SERPINA1 gRNA) 및/또는 본원에 개시된 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체)를, 단독으로 또는 조합하여, LNP와 함께 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas9 또는 Cas9를 인코딩하는 핵산 서열)를 추가로 포함한다.
일부 구체예들에서, LNP는 생분해성, 이온화가능한 지질을 포함한다. 일부 구체예들에서, LNP는 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트)로도 불리는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트, 또는 또 다른 이온화가능한 지질을 포함한다. 예를 들어, PCT/US2018/053559 (2018년 9월 28일 출원), WO/2017/173054, WO2015/095340, 및 WO2014/136086의 지질, 뿐만 아니라 이 문헌들에 제공된 참고문헌을 참고하라. 일부 구체예들에서, LNP 지질과 관련하여 용어 양이온성 및 이온화가능한은 상호교환 가능하며, 예를 들어, 이온화가능한 지질은 pH에 따라 양이온성이다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 양방향 구조체와 관련된 LNP는 질병 또는 장애를 치료하기 위한 약제를 제조하는데 사용하기 위한 것이다. 질병 또는 장애는 α1-항트립신 결핍증 (AATD)과 관련된 질병일 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에 기재된 임의의 가이드 RNA, 본원에 기재된 RNA-가이드 DNA 결합제, 및/또는 본원에 개시된 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체)는, 단독으로 또는 조합으로, 네이키드 또는 벡터의 일부분으로서 지질 나노입자에서 제제화되거나 지질 나노입자를 통해 투여된다; 예를 들어, 본원에 그 내용 전문이 참고문헌으로 포함된 WO/2017/173054를 참고하라.
본원에 개시된 하나 이상의 가이드 RNA (알부민 gRNA; 및/또는 SERPINA1 gRNA), RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산), 및 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 공여자 구조물 (예를 들어, 양방향 구조물)이 동일하거나 상이한 시스템을 사용하여 전달될 수 있음이 명백할 것이다. 예를 들어, 가이드 RNA, RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제), 및 구조체는 동일한 벡터 (예를 들어, AAV)에 의해 운반될 수 있다. 대안적으로, RNA-가이드 DNA 결합제, 가령, Cas 뉴클레아제 (단백질 또는 mRNA)및/또는 gRNA (알부민 gRNA; 및/또는 SERPINA1 gRNA)는 플라스미드 또는 LNP에 의해 운반 될 수 있는 반면, 공여자 구조체는 AAV와 같은 벡터에 의해 운반 될 수 있다. 다양한 조합의 사용은 예를 들어 사용의 실용성과 효율성에 의해 가이드된다. 또한, 상이한 전달 시스템은 동일하거나 상이한 경로에 의해 (예를 들어, 주입에 의해; 근육내 주사, 꼬리 정맥 주사 또는 다른 정맥내 주사와 같은 주사에 의해; 복강내 투여 및/또는 근육내 주사에 의해) 투여 될 수 있다.
상이한 전달 시스템은 시험관내 또는 생체내에서 동시에 또는 임의의 순차적 순서로 전달 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 공여자 구조체, 가이드 RNA (알부민 gRNA; 및/또는 SERPINA1 gRNA), 및 Cas 뉴클레아제는 시험관내 또는 생체내에서 동시에, 예를 들어, 하나의 벡터, 두 개의 벡터, 세 개의 벡터, 개별 벡터, 하나의 LNP, 두 개의 LNP, 세 개의 LNP, 개별 LNP, 또는 이들의 조합으로 전달 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 공여자 구조체는 알부민 가이드 RNA 및/또는 Cas 뉴클레아제를, 벡터로서 및/또는 LNP 단독과 결합하여 또는 리보핵단백질 (RNP)로서 함께 전달하기 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일, 또는 그 이상) 이전에, 벡터로서 및/또는 LNP와 결합되어 생체내 또는 시험관내 전달될 수 있다. 일부 구체예들에서, 공여자 구조체는 예를 들어 매일, 2일 마다, 3일 마다, 4일 마다, 매주, 2주 마다, 3주 마다 또는 4주 마다 다회 투여로 전달 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 공여자 구조체는 1 주 간격으로, 예를 들어, 1 주차, 2 주차 및 3 주차 등으로 전달 될 수 있다. 추가 예로서, 구조체를, 벡터로서 및/또는 LNP와 결합하여 전달하기 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일, 또는 그 이상) 이전에 알부민 가이드 RNA 및 Cas 뉴클레아제는, 벡터로서 및/또는 LNP 단독과 결합하여 또는 리보핵단백질 (RNP)로서 함께, 생체내 또는 시험관내 전달될 수 있다. 일부 구체예들에서, 알부민 가이드 RNA는 예를 들어 매일, 2일 마다, 3일 마다, 4일 마다, 매주, 2주 마다, 3주 마다 또는 4주 마다 다회 투여로 전달 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 알부민 가이드 RNA는 1 주 간격으로, 예를 들어, 1 주차, 2 주차 및 3 주차 등으로 전달 될 수 있다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 다회 투여로 전달 될 수 있다, 예를 들어, 매일, 2일 마다, 3일 마다, 4일 마다, 매주, 2주 마다, 3주 마다 또는 4주 마다 전달 될 수 있다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제는 1 주 간격으로, 예를 들어, 1 주차, 2 주차 및 3 주차 등으로 전달 될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 또한 본원에 개시된 임의의 가이드 RNA (알부민 gRNA; 및/또는 SERPINA1 gRNA)를 투여하기 위한 약학 제제를 제공한다. 일부 구체예들에서, 약학 제제는 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제) 및 본원에 개시된 바와 같은 이종 AAT의 코딩 서열을 포함하는 공여자 구조체를 포함한다. 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)로의 전달에 적합한 약학 제제는 당업계에 잘 알려져 있다.
IV. 사용 방법
AAT를 인코딩하는 유전자는 염색체 14q32.1과 프로테아제 억제제 (Pi) 유전자좌의 일부에 위치한다. 정상 AAT는 PiM으로 지칭될 수 있다. PiZ 돌연변이는 동형접합 (ZZ) 및 이형접합 (MZ 또는 SZ) 개체들에서를 포함하여, 간 및/또는 폐 증상을 유발할 수 있다. PiS 돌연변이는 혈청 AAT에서 보다 경미한 감소를 유발하고 폐 질병 위험을 낮출 수 있다. 수많은 다른 대립유전자 돌연변이들은 해당 분야에 공지이다. 예를 들어, Greulich 등 “Alpha-1-antitrypsin deficiency: increasing awareness and improving diagnosis,” Ther Adv Respir Dis. 2016을 참고하라.
AATD는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 현재까지 보고된 150+의 공지된 AAT 돌연변이들 중 하나 이상에 대한 하나 이상의 생리학적 증상, 혈액 검사 및/또는 유전 검사의 존재에 의해 진단 될 수 있다. 예를 들어, 상기 참조. 혈액 및/또는 검사의 예에는 혈청 AAT 수준에 대한 분석, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및/또는 차세대 시퀀싱 (NGS)에 의한 돌연변이 검출, 면역블롯법을 포함하거나 포함하지 않는 등전 초점법 (IEF), AAT 유전자 좌위 시퀀싱 및 혈청 분리기 카드 (Z 단백질을 검출하기위한 측면 흐름 분석)이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예들에서, AAT 혈청 수준은 면역확산법을 사용하여 150-350 mg/dL 범위내에서 정상으로 간주 될 수 있다 (혈청 수준을 과대평가할 수 있음). 이들 구체예에서, 80 mg/dL의 수준은 정상 범위보다 낮음에도 불구하고 보호적인 것으로, 예를 들어, 하나 이상의 증상, 예를 들어, 폐기종 위험이 감소된 것으로 간주 될 수 있다.
일부 구체예들에서, AAT 혈청 수준은 혼탁측정법 또는 면역혼탁측정법 및 정제된 표준을 사용하여 90-200 mg/dL에 속하는 경우 정상으로 간주될 수 있다. 이들 구체예에서, 50 mg/dL의 수준은 정상 범위보다 낮음에도 불구하고 보호적인 것으로, 예를 들어, 하나 이상의 증상, 예를 들어, 폐기종 위험이 감소된 것으로 간주 될 수 있다.
일부 구체예들에서, 약 130 mg/dL, 125 mg/dL, 120 mg/dL, 115 mg/dL, 110 mg/dL, 105 mg/dL, 또는 100 mg/dL 미만의 AAT 혈청 수준은 동형접합 AAT 돌연변이의 가능성이 낮음을 나타내며 추가 유전자 검사가 필요하지 않을 수 있다. 일부 구체예들에서, 약 104 mg/dL의 AAT 혈청 수준은 낮은 동형접합 PiS 가능성을 나타내고, 113 mg/dL는 낮은 동형접합 PiZ 가능성을 나타낸다. 일부 구체예들에서, AAT 혈청 수준은 이형접합 담체들에 관한 제한된 배제 정보를 제공할 수 있으며, 또 다른 유전자 검사가 필요할 수 있는데, 왜냐하면, 약 150 mg/dL의 AAT 혈청 수준은 낮은 이형접합 담체 PiMZ 가능성을 나타내고, 약 220 mg/dL의 AAT 혈청 수준은 낮은 이형접합 담체 piMS 가능성을 나타낸다.
검출가능한 생리학적 증상들의 예에는, 폐 질환 및/또는 간 질환; 쌕쌕거림 또는 숨가쁨; 폐 감염 위험 증가; 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD); 기관지염, 천식, 호흡 곤란; 경화증; 신생아 황달; 지방층염; 만성 기침 및/또는 가래; 반복되는 흉부 감기; 피부 또는 눈의 흰 부분의 황변; 배 또는 다리의 부종이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구체예들에서, 개체들이 COPD 환자, 비반응성 천식 환자, 병인이 알려지지 않은 기관지 확장증 환자, 크립토겐성 간경변/간 질환이 있는 개체, 다발혈관염을 동반한 육아종증, 괴사성 지방층염 및/또는 AATD 환자/보균자의 1차 직계가족인 경우 혈액 및/또는 유전 검사를 받을 수 있다. 일부 구체예들에서, 폐 기능 검사 (PFT), 기능적 잔기 용량 (RFC) 및/또는 총 폐 용량에서 폐 밀도 손실 (TLC)을 수행 할 수 있다.
일부 구체예들에서, 치료 대상체에는 AAT 혈청이 정상 범위 미만인 개체들이 포함된다. 일부 구체예들에서, 치료 대상체에는 임의의 대립유전자 돌연변이 조합, 예를 들어, ZZ, MZ, MS를 가지는 개체들이 포함된다. 일부 구체예들에서, 치료 대상체에는 예상 정상 값의 최소한 30%, 40%, 50%, 60%의, 기관지확장제 후 FEV1을 가지는 개체들이 포함된다. 일부 구체예들에서, 치료 대상체에는 기관지경술 적격인 개체들이 포함된다. 일부 구체예들에서, 치료 대상체에는 적절한 간 및 신장 기능을 가진 개체, 비 흡연자, 폐 또는 간엽 절제술을 받지 않은 개체, 이식, 폐 부피 감소 수술을 받지 않은 개체, 치료 직전 COPD 악화 또는 급성 호흡기 감염이 없는 개체, 및/또는 불안정한 폐심장증이 없는 개체가 포함된다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 단백질의 분비를 가능하게 하기 위해 인간 세이프 하버 부위, 가령, 알부민 세이프 하버 부위에서 이종 AAT (예를 들어, 기능적 또는 야생형 AAT) 를 발현시켜 단백질의 분비를 가능하게 하는 조성물 및 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 그에 따라 폐에서 AATD의 부정적 효과를 완화시킨다. 본 발명은 또한 내인성 SERPINA1 유전자를 녹아웃시킴으로써, AATD 환자에서 간 증상을 초래하는, 간 헤파토사이트에서 응집 및 AAT 단백질 중합과 관련된 AAT의 돌연변이체 형태의 생성을 제거하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 그 전문이 참고문헌으로 포함된 WO/2018/119182를 참고하라. 따라서, 본원에 개시된 조성물 및 방법들은 간 뿐만 아니라 폐에서 장애의 부정적 효과를 완화시킴으로써 AATD를 치료한다.
AAT는 주로 헤파토사이트에 의해 합성 및 분비되며 폐에서 호중구 엘라스타제의 활성을 억제하는 기능을 한다. 충분한 양의 기능 AAT가 없으면 호중구 엘라스타제가 조절되지 않고 폐의 폐포를 손상시킨다. 따라서 SERPINA1의 돌연변이로 인해 AAT 수준이 감소하거나 제대로 기능하는 AAT 수준이 감소하면 예를 들어, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 기관지염, 또는 천식을 비롯한 폐 병리가 발생한다.
본원에 기재된 알부민 gRNAs, 공여자 구조체 (예를 들어, 기능적 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체), 및 RNA-가이드 DNA 결합제는 생체내 또는 시험관내에서 숙주 세포에 이종 AAT 핵산을 도입함에 유용하다. 일부 구체예들에서, 본원에 기재된 알부민 gRNA, 공여자 구조체 (예를 들어, 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체), 및 RNA-가이드 DNA 결합제는 숙주 세포에서, 또는 필요로 하는 대상체에서 기능적 이종 AAT를 발현시킴에 유용하다. 일부 구체예들에서, 본원에 기재된 알부민 gRNA, 공여자 구조체 (예를 들어, 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체), 및 RNA-가이드 DNA 결합제는 필요로 하는 대상체에서 AATD를 치료함에 유용하다. 일부 구체예들에서, 알부민 유전자좌에서 이종 AAT를 발현시킴에 의한 AATD의 치료는 기능적 (예를 들어, 야생형) AAT의 분비를 개선하고, AATD의 하나 이상의 증상들, 예를 들어, 폐에 대한 부정적 효과들을 완화시킨다. 예를 들어, 이종 AAT 발현은 폐 질환 및/또는 간 질환; 쌕쌕거림 또는 숨가쁨; 폐 감염 위험 증가; COPD; 기관지염, 천식, 호흡 곤란; 경화증; 신생아 황달; 지방층염; 만성 기침 및/또는 가래; 반복되는 흉부 감기; 피부 또는 눈의 흰 부분의 황변; 배 또는 다리의 부종을 완화시킬 수 있다. 본원에 기재된 알부민 gRNAs, 공여자 구조체 (예를 들어, 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체), 및 RNA-가이드된 DNA 결합제 중 하나 이상의 투여는 기능적 (예를 들어, 야생형) AAT 유전자 발현, AAT 단백질 수준 (예를 들어, 순환, 혈청, 또는 혈장 수준) 및/또는 AAT 활성 수준 (예를 들어, 트립신 억제)을 증가시킨다 (예를 들어, 예를 들어, 혼탁측정법 또는 면역혼탁측정법으로, 비처리 대조에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 초과의 AAT 유전자 발현 또는 단백질 수준, 예를 들어, 혈청 내 약 40 mg/dL, 45 mg/dL, 50 mg/dL, 60 mg/dL, 70 mg/dL, 80 mg/dL, 90 mg/dL, 100 mg/dL, 또는 110 mg/dL 초과의 AAT). 일부 구체예들에서, 치료의 효율성은 혈청 또는 혈장 AAT 활성을 측정하여 평가할 수 있으며, 여기서 대상체의 혈청 또는 혈장 수준 및/또는 AAT의 활성의 증가는 치료의 효율성을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 치료의 효율성은 혈청 또는 혈장 AAT 단백질 및/또는 활성 수준을 측정하여 평가할 수 있으며, 여기서 대상체의 혈청 또는 혈장 수준 및/또는 AAT의 활성의 증가는 치료의 효율성을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 치료 효율성은 예를 들어 응집을 측정하기 위해 간 조직 절편을 PASD 염색하여 평가될 수 있다. 일부 구체예들에서, 치료 효율성은 예를 들어, 폐에서 호중구 엘라스타제의 억제를 측정하여 평가될 수 있다. 　일부 구체예들에서, 치료 효율성은 유전자형 혈청 수준, AAT 폐 기능, 폐활량 측정 검사, 폐 흉부 X-레이, 폐 CT 스캔, 간 기능 혈액 검사 및/또는 간 초음파에 의해 평가될 수 있다.
일부 구체예들에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어 보호 수준까지 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어, 정상 범위 이내로 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어, 혼탁측정법 또는 면역혼탁측정법을 사용하여 측정시,예를 들어, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/dL, 및 정제된 표준 이상으로 증가시키는 것을 지칭한다.
일부 구체예들에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어 보호 수준까지 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어, 정상 범위 이내로 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어, 혼탁측정법 또는 면역혼탁측정법을 사용하여 측정시,예를 들어, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/dL, 및 정제된 표준 이상으로 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 치료는 예를 들어 치료 전후에 대조군과 비교하여, 기준선 혈청 AAT의 개선을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 치료는 예를 들어 치료 전후에 대조군과 비교하여, AATD 관련 간 질병의 조직학적 등급에 있어서, 예를 들어, 1, 2, 3, 또는 그 이상의 점수만큼의 개선을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 치료는 예를 들어 치료 전후에 대조군과 비교하여, Ishak 섬유화 점수의 개선을 지칭한다.
정상 또는 건강한 개체 (예를 들어, ZZ, MZ 또는 SZ 대립유전자가 없는 개체)에서 AAT 수준은 혈청에서 약 500 μg/ml 내지 약 3000 μg/ml 사이에서 변화한다. 임상적으로, 순환 AAT의 수준은 효소적 및/또는 면역학적 분석 (예를 들어, ELISA)에 의해 측정될 수 있으며, 이 방법들은 해당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Stoller, J. and Aboussouan, L. (2005) Alpha1-antitrypsin deficiency. Lancet 365: 2225-2236; Kanakoudi F, Drossou V, Tzimouli V, et al: Serum concentrations of 10 acute-phase proteins in healthy term and pre-term infants from birth to age 6 months. Clin Chem 1995;41:605-608; Morse JO: Alpha-1-antitrypsin deficiency. N Engl J Med 1978;299:1045-1048, 1099-1105; Cox DW: Alpha-1-antitrypsin deficiency. In The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease. Vol 3. Seventh edition. Edited by CR Scriver, AL Beaudet, WS Sly, D Valle. New York, McGraw-Hill Book Company, 1995, pp 4125-4158을 참고하라.
따라서, 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법들은 AATD가 있는 대상체 (예를 들어, ZZ, MZ, 또는 SZ 대립유전자를 보유한 개체들) 또는 AATD 발병 위험이 있는 대상체 (예를 들어, ZZ, MZ, 또는 SZ 대립유전자를 보유한 개체들)에서 AAT (예를 들어, 기능적 AAT 또는 야생형 AAT)의 혈청 또는 혈장 수준을 약 500 μg/ml, 또는 그 이상까지 증가시킴에 유용하다. 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법들은 AAT 단백질 수준을 약 1500 μg/ml까지 증가시킴에 유용하다. 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법들은 AAT 단백질 수준을 약 1000 μg/ml 내지 약 1500 μg/ml, 약 1500 μg/ml 내지 약 2000 μg/ml, 약 2000 μg/ml 내지 약 2500 μg/ml, 약 2500 μg/ml 내지 약 3000 μg/ml, 또는 그 이상까지 증가시킴에 유용하다. 예를 들어, 본원에 개시된 조성물 및 방법들은 AATD가 있는 대상체에서 AAT의 혈청 또는 혈장 수준을 약 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, μg/ml, 또는 그 이상까지 증가시킴에 유용하다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법들은 AATD가 있는 대상체 (예를 들어, ZZ, MZ, 또는 SZ 대립유전자를 보유한 개체들) 또는 AATD 발병 위험이 있는 대상체 (예를 들어, ZZ, MZ, 또는 SZ 대립유전자를 보유한 개체들)에서 AAT의 혈청 또는 혈장 수준을 투여 전 대상체의 AAT 혈청 또는 혈장 수준에 비해 약 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 또는 그 이상만큼 증가시킴에 유용하다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법들은 숙주 세포에서 이종 기능적 AAT 단백질 및/또는 AAT 활성을 숙주 세포에 투여 전 AAT 수준, 예를 들어, 정상 수준에 비해 약 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 또는 그 이상만큼 증가시킴에 유용하다. 일부 구체예들에서, 세포는 간 세포이다.
일부 구체예들에서, 세포 (숙주 세포), 예를 들어, 간, 폐, 소화 기관, 신장, 위, 근위 및 원위 소장, 췌장, 부신 또는 뇌 중 어느 하나 이상의 조직에서 유래하는 세포, 또는 세포들의 집단은 AAT를 발현 할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 LNP 중의 가이드 RNA 및 RNA-가이드 DNA 결합제 (가령, Cas9 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA)를 투여하는 단계를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 방법은 인자 AAT 단백질을 인코딩하는 AAV 핵산 구조체, 가령, 양방향 AAT 구조체를 투여하는 단계를 포함한다. 가이드 RNA 및 Cas9를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 CRISPR/Cas9 LNP는 정맥내 투여될 수 있다. AAV AAT 공여자 구조체는 정맥내 투여될 수 있다. CRISPR/Cas9 LNP 용량의 예시에는 약 0.1, 0.25, 0.3, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 또는 10 mpk (RNA)가 포함된다. 단위 mg/kg 및 mpk는 본원에서 호환적으로 사용된다. AAT 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 AAV의 예시 용량은 약 1011, 1012, 1013, 및 1014 vg/kg의 MOI를 포함하며, 선택적으로 MOI는 약 1x 1013 내지 1x 1014 vg/kg 일 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 치료적 유효량의 AAT 단백질을 발현시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 개체에서 순환 AAT 활성의 치료적 유효 수준을 구현하는 것을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 정상의 최소한 약 5% 내지 약 50%의 AAT 활성을 구현하는 것을 포함한다. 상기 방법은 정상의 최소한 약 50% 내지 약 150%의 AAT 활성을 구현하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 환자의 기준 AAT 활성에 비해 정상 AAT 활성의 최소한 약 1% 내지 약 50%, 또는 정상 AAT 활성의 최소한 약 5% 내지 약 50%, 또는 정상 AAT 활성의 최소한 약 50% 내지 약 150%의 AAT 활성 증가를 구현하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 지속 효과, 예를 들어, 최소한 1 개월, 2 개월, 6 개월, 1 년, 또는 2 년 효과를 구현하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 치료 효과를 지속적이고 계속적인 방식으로, 예를 들어, 최소한 1 개월, 2 개월, 6 개월, 1 년, 또는 2 년 효과를 구현하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 순환 AAT 활성 및/또는 수준은 최소한 1 개월, 2 개월, 6 개월, 1 년, 또는 그 이상 동안 안정하다. 일부 구체예들에서 정상-상태 활성 및/또는 AAT 단백질 수준은 최소한 7 일, 최소한 14 일, 또는 최소한 28 일까지 구현된다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 단회 투약 후 AAT 활성 및/또는 수준을 최소한 1, 2, 4, 또는 6 개월, 또는 최소한 1, 2, 3, 4, 또는 5 년 동안 유지하는 것을 포함한다.
알부민 유전자좌로의 삽입을 포함하는 추가 구체예에서, 개체의 순환 알부민 수준은 정상이다. 이 방법은 개체의 순환 알부민 수준을 정상 순환 알부민 수준의 ±5%, ±10%, ±15%, ±20%, 또는 ±50% 내로 유지하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 개체의 알부민 수준은 치료되지 않은 개체의 알부민 수준과 비교하여 최소한 4 주, 8 주, 12 주 또는 20 주까지 변하지 않는다. 특정 구체예들에서, 개체의 알부민 수치는 일시적으로 떨어진 다음 정상 수준으로 되돌아간다. 특히, 상기 방법은 혈장 알부민 수준의 유의한 변화를 검출하지 않는 것을 포함 할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명은, 숙주 세포 또는 숙주 세포들의 집단에 본원에 기재된 하나 이상의 gRNA, 공여자 구조체 (예를 들어, AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체), 및 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 투여 또는 전달하는 단계를 포함하는, 알부민 유전자, 예를 들어 인간 알부민 유전자를 변형 (예를 들어, 이중-가닥 절단 생성)시키는 방법 또는 변형의 사용을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명은, 숙주 세포 또는 숙주 세포들의 집단에 본원에 기재된 하나 이상의 gRNA, 공여자 구조체 (예를 들어, AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체), 및 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 투여 또는 전달하는 단계를 포함하는, 알부민 인트론 1 영역, 예를 들어 인간 알부민 인트론 1을 변형 (예를 들어, 이중-가닥 절단 생성)시키는 방법 또는 변형의 사용을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명은, 숙주 세포 또는 숙주 세포들의 집단에 본원에 기재된 하나 이상의 gRNA, 공여자 구조체 (예를 들어, AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체), 및 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 투여 또는 전달하는 단계를 포함하는, 인간 세이프 하버, 예를 들어, 간 조질 또는 헤파토사이트 숙주 세포를 변형 (예를 들어, 이중-가닥 절단 생성)시키는 방법 또는 변형의 사용을 포함한다. 세이프 하버 유전자좌, 가령, 알부민 유전자좌 내부에의 삽입은, 숙주 세포 또는 세포들의 집단, 가령, 헤파토사이트 또는 간 세포들에 심각한 유해한 영향을 주지 않고 SERPINA1 유전자가 과발현될 수 있게 한다.
일부 구체예들에서, 본 발명은, 숙주 세포에 본원에 기재된 하나 이상의 알부민 gRNA, 공여자 구조체 (예를 들어, 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체), 및 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 투여 또는 전달하는 단계를 포함하는, 인간 알부민 유전자좌의 인트론 1을 변형 (예를 들어, 이중-가닥 절단 생성)시키는 방법 또는 변형의 사용을 제공한다. 일부 구체예들에서, 알부민 가이드 RNA는 인간 알부민 유전자좌의 인트론 1 (서열 번호: 1) 내부의 영역에 결합할 수 있는 최소한 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 가이드 RNA는 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 가이드 RNA는 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89% 또는 88% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 서열 번호: 4, 13, 17, 19, 27, 28, 30, 또는 31 중 어느 하나의 서열을 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 투여는 시험관내이다. 일부 구체예들에서, 투여는 생체내이다. 일부 구체예들에서, 공여자 구조체는 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체이다. 일부 구체예들에서, 숙주 세포는 간 세포이다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 본원에 기재된 알부민 gRNA, 공여자 구조체 (예를 들어, 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체), 및 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제) 중 어느 하나 이상을 투여 또는 전달하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에 이종 AAT 핵산 (예를 들어, 기능적 또는 야생형 AAT)을 도입하는 방법 또는 용도를 제공한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 인간 알부민 유전자좌의 인트론 1 (서열 번호: 1) 내부의 영역에 결합할 수 있는 최소한 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 가이드 RNA는 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 가이드 RNA는 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89% 또는 88% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 서열 번호: 4, 13, 17, 19, 27, 28, 30, 또는 31 중 어느 하나의 서열을 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 다음에서 선택된 서열을 포함한다: a) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 또는 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; b) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 또는 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드; c) 서열 번호: 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 또는 97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; d) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; e) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드; f) 서열 번호: 34-97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; 및 g) 서열 번호: 2-33에 열거된 게놈 좌표들의 15개 연속 뉴클레오티드 +/- 10개 뉴클레오티드에 상보적인 서열. 일부 구체예들에서, 투여는 시험관내이다. 일부 구체예들에서, 투여는 생체내이다. 일부 구체예들에서, 공여자 구조체는 이종 AAT (예를 들어, 기능적 또는 야생형 AAT)를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체이다. 일부 구체예들에서, 숙주 세포는 간 세포이다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 본원에 기재된 알부민 gRNA, 공여자 구조체 (예를 들어, 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체), 및 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제) 중 어느 하나 이상을 투여 또는 전달하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 이종 AAT (예를 들어, 기능적 또는 야생형 AAT)을 발현하는 방법 또는 용도를 제공한다. 일부 구체예들에서, 필요로 하는 대상체는 신생아 내지 2세 연령; 2 내지 12세 연령; 또는 12 내지 21세 연령이다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 인간 알부민 유전자좌의 인트론 1 (서열 번호: 1) 내부의 영역에 결합할 수 있는 최소한 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89% 또는 88% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 서열 번호: 4, 13, 17, 19, 27, 28, 30, 또는 31 중 어느 하나의 서열을 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 다음에서 선택된 서열을 포함한다: a) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 또는 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; b) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 또는 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드; c) 서열 번호: 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 또는 97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; d) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; e) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드; f) 서열 번호: 34-97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; 및 g) 서열 번호: 2-33에 열거된 게놈 좌표들 내부의 또는 이에 걸친 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 연속 뉴클레오티드에 상보적인 서열. 일부 구체예들에서, 투여는 시험관내이다. 일부 구체예들에서, 투여는 생체내이다. 일부 구체예들에서, 공여자 구조체는 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체이다. 일부 구체예들에서, 숙주 세포는 간 세포이다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 알부민 gRNA, 공여자 구조체 (예를 들어, 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체), 및 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제) 중 어느 하나 이상을 투여 또는 전달하는 단계를 포함하는, AATD 치료 방법 또는 용도를 제공한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 마우스 또는 인간 알부민 유전자좌의 인트론 1 (서열 번호: 1) 내부의 영역에 결합할 수 있는 최소한 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89% 또는 88% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 서열 번호: 4, 13, 17, 19, 27, 28, 30, 또는 31 중 어느 하나의 서열을 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 다음에서 선택된 서열을 포함한다: a) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; b) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드; c) 서열 번호: 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 및 97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; d) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; e) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드; f) 서열 번호: 34-97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; 및 g) 서열 번호: 2-33에 열거된 게놈 좌표들의 15개 연속 뉴클레오티드 +/- 10개 뉴클레오티드에 상보적인 서열. 일부 구체예들에서, 공여자 구조체는 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체이다. 일부 구체예들에서, 숙주 세포는 간 세포이다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 본원에 기재된 알부민 gRNA, 공여자 구조체 (예를 들어, 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체), 및 RNA-가이드 DNA 결합제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제) 중 어느 하나 이상을 투여 또는 전달하는 단계를 포함하는, 간 세포로부터 기능적 AAT의 분비를 증가시키는 방법 또는 용도를 제공한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 마우스 또는 인간 알부민 유전자좌의 인트론 1 (서열 번호: 1) 내부의 영역에 결합할 수 있는 최소한 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89% 또는 88% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 알부민 gRNA는 서열 번호: 4, 13, 17, 19, 27, 28, 30, 또는 31 중 어느 하나의 서열을 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 투여는 시험관내이다. 일부 구체예들에서, 투여는 생체내이다. 일부 구체예들에서, 공여자 구조체는 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 양방향 구조체이다. 일부 구체예들에서, 숙주 세포는 간 세포이다.
본원에 기재된, 이종 AAT를 인코딩하는 서열, 알부민 gRNA, 및 RNA-가이드 DNA 결합제를 포함하는 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체)는 해당 분야에 공지된 임의의 적합한 전달 시스템 및 방법을 사용하여 전달될 수 있다. 조성물은 시험관내 또는 생체내에서 동시에 또는 임의의 순차적 순서로 전달될 수 있다. 일부 구체예들에서, 공여자 구조체, 알부민 gRNA 및 Cas 뉴클레아제는 시험관내 또는 생체내에서 동시에, 예를 들어, 하나의 벡터, 두 개의 벡터, 개별 벡터, 하나의 LNP, 두 개의 LNP, 개별 LNP, 또는 이들의 조합으로 전달 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 공여자 구조체는 알부민 gRNA 및/또는 Cas 뉴클레아제를, 벡터로서 및/또는 LNP 단독과 결합하여 또는 리보핵단백질 (RNP)로서 함께 전달하기 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일, 또는 그 이상) 이전에, 벡터로서 및/또는 LNP와 결합되어 생체내 또는 시험관내 전달될 수 있다. 추가 예로서, 구조체를, 벡터로서 및/또는 LNP와 결합하여 전달하기 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일, 또는 그 이상) 이전에 가이드 RNA 및 Cas 뉴클레아제는, 벡터로서 및/또는 LNP 단독과 결합하여 또는 리보핵단백질 (RNP)로서 함께, 생체내 또는 시험관내 전달될 수 있다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA 및 Cas 뉴클레아제는 공여자 구조체를 전달하기 전에 LNP와 결합되어 숙주 세포에 전달된다.
일부 구체예들에서, 공여자 구조체는 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하고, 이 때 AAT 서열은 야생형 AAT, 예를 들어 서열 번호: 700 또는 702이다. 일부 구체예들에서, 서열은 AAT의 기능적 변이체를 인코딩한다. 예를 들어, 이러한 변이체는 야생형 AAT보다 증가된 트립신 억제 활성을 보유한다. 일부 구체예들에서, 서열은 서열 번호: 702에 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99% 동일하고, 야생형 AAT에 비해 최소한 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100%, 또는 그 이상의 활성을 가지는 AAT 변이체를 인코딩한다. 일부 구체예들에서, 서열은 AAT의 기능적 단편을 인코딩하며, 이 때 이러한 단편은 야생형 AAT에 비해 최소한 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100%, 또는 그 이상의 활성을 보유한다.
일부 구체예들에서, 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체)는 핵산 벡터로, 가령, AAV 벡터, 예를 들어, AAV8로 투여된다. 일부 구체예들에서, 공여자 구조체는 상동성 아암을 포함하지 않는다.
일부 구체예들에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 구체예들에서, 대상체는 인간이다. 일부 구체예들에서, 대상체는 소, 돼지, 원숭이, 양, 개, 고양이, 물고기 또는 가금류이다.
일부 구체예들에서, 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체), 알부민 gRNA, 및 RNA-가이드 DNA 결합제는 정맥내 투여된다. 일부 구체예들에서, 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체), 알부민 gRNA, 및 RNA-가이드 DNA 결합제는 간 순환으로 투여된다.
일부 구체예들에서, 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체), 알부민 gRNA, 및 RNA-가이드 DNA 결합제의 단회 투여는 AAT의 발현 및 분비를 원하는 수준으로 증가시키기에 충분하다. 다른 구체예들에서, 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체), 알부민 gRNA, 및 RNA-가이드 DNA 결합제를 포함하는 조성물의 1회 이상의 투여는 치료 효과를 최대화함에 유익할 수 있다.
일부 구체예들에서, 이종 AAT를 인코딩하는 서열을 포함하는 공여자 구조체 (예를 들어, 양방향 구조체), 알부민 gRNA, 및 RNA-가이드 DNA 결합제의 다회 투여는 AAT의 발현 및 분비를 원하는 수준으로 증가시키고 및/또는 축적 효과를 통해 편집을 최대화하기 위해 사용된다. 일부 구체예들에서, 알부민 가이드 RNA의 다회 투여는 AAT의 발현 및 분비를 원하는 수준으로 증가시키고 및/또는 축적 효과를 통해 편집을 최대화하기 위해 사용된다. 일부 구체예들에서, Cas 뉴클레아제의 다회 투여는 AAT의 발현 및 분비를 원하는 수준으로 증가시키고 및/또는 축적 효과를 통해 편집을 최대화하기 위해 사용된다. 일부 구체예들에서, 공여자 구조체, 알부민 가이드 RNA, 및/또는 Cas 뉴클레아제는 예를 들어 매일, 2일 마다, 3일 마다, 4일 마다, 매주, 2주 마다, 3주 마다 또는 4주 마다 다회 투여로 전달 될 수 있다. 일부 구체예들에서, AATD 치료 방법은 서열 번호: 1000-1128의 가이드 서열 중 하나 이상을 포함하는 SERPINA1 가이드 RNA를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 1000-1128의 가이드 서열 중 하나 이상을 포함하는 SERPINA1 gRNA들이 AATD를 치료하기 위해 투여된다. SERPINA1 가이드 RNA들은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질, 가령, 예를 들어, Cas9를 인코딩하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다.
일부 구체예들에서, 서열 번호: 1000-1128의 가이드 서열들 중 하나 이상을 포함하는 SERPINA1 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함하는 AATD 치료 방법은, 대상체의 혈청, 간, 간 조직, 간 세포, 및/또는 헤파토사이트에서 AAT (예를 들어, 돌연변이체, 비-기능적 AAT)의 축적을 감소 또는 방지하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 1000-1128의 가이드 서열들 중 하나 이상을 포함하는 SERPINA1 gRNA들은 간, 간 조직, 간 세포, 및/또는 헤파토사이트에서 AAT (예를 들어, 돌연변이체, 비-기능적 AAT)의 축적을 감소 또는 방지하기 위해 투여된다. gRNA들은 RNA-가이드 DNA 결합제, 가령, Cas 단백질 또는 Cas 단백질, 가령, 예를 들어, Cas9를 인코딩하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다.
일부 구체예들에서, Cas 단백질과 함께 표 3의 가이드 서열들을 포함하는 SERPINA1 gRNA들은 DSB를 유도하고, 복구 중 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)은 SERPINA1 유전자에서 돌연변이를 초래한다. 일부 구체예들에서, NHEJ는 뉴클레오티드(들)의 결실 또는 삽입을 초래하고, 이는 SERPINA1 유전자에서 프레임 이동 또는 넌센스 돌연변이를 유도한다. 일부 구체예들에서, Cas 단백질과 함께 표 2의 가이드 서열들을 포함하는 gRNA들은 DSBs를 유도하며, NHEJ 복구는 템플릿 핵산 구조체의 삽입을 매개한다. 일부 구체예들에서, 템플릿 핵산의 삽입은 분비된 AAT 단백질 수준을 증가시킨다. 일부 구체예들에서, 템플릿 핵산의 삽입은 분비된 이종 AAT 단백질 수준을 증가시킨다. 일부 구체예들에서, 템플릿 핵산의 삽입은 혈액, 혈청, 및/또는 혈장 AAT 단백질 수준을 증가시킨다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 SERPINA1 가이드 RNA들을 투여하는 것은 대상체에 의해 생성된 돌연변이된 알파-1 항트립신 (AAT) 수준을 감소시키므로, 간에서 AAT의 축적 및 응집을 방지한다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 SERPINA1 가이드 RNA의 단회 투여는 돌연변이 단백질의 발현을 녹다운 시키기에 충분하다. 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 SERPINA1 가이드 RNA의 단회 투여는 돌연변이 단백질의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키기에 충분하다. 다른 구체예들에서, 본원에 개시된 SERPINA1 가이드 RNA 중 하나 초과의 투여는 축적 효과를 통한 편집을 최대화하기에 유익할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 삽입 가이드 RNA를 투여하면 대상체에 의해 생성된 순환 알파-1 항트립신 (AAT)의 수준이 증가하고, 따라서 높은 호중구 엘라스타제 활성과 관련된 손상을 방지한다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 삽입 가이드 RNA의 단회 투여 또는 다회 투여는 기능적 AAT 단백질의 발현을 증가시키기에 충분하다. 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 삽입 가이드 RNA의 단회 투여 또는 다회 투여는 AAT 단백질 활성의 발현을 보충 또는 복원시키기에 충분하다. 일부 구체예들에서, 삽입 가이드 RNA는 AAT 혈청 수준을, 예를 들어, 보호 수준 (예를 들어, 면역확산법으로 측정시 80 mg/dL 또는 그 이상, 혼탁측정법 또는 면역혼탁측정법 및 정제된 표준을 사용하여 측정시 50 mg/dL 또는 그 이상)까지 증가시킨다. 일부 구체예들에서, 삽입 가이드 RNA는 AAT 혈청 수준을, 예를 들어, 정상 수준 (예를 들어, 면역확산법으로 측정시 150-350 mg/dL, 혼탁측정법 또는 면역혼탁측정법 및 정제된 표준을 사용하여 측정시 90-200 mg/dL)까지 증가시킨다. 일부 구체예들에서, 삽입 가이드 RNA는 예를 들어 치료 전후에 대조군과 비교하여, AATD 관련 간 질병의 조직학적 등급을, 예를 들어, 1, 2, 3, 또는 그 이상의 점수만큼 개선한다. 일부 구체예들에서, 삽입 가이드 RNA는 예를 들어 치료 전후에 대조군과 비교하여, Ishak 섬유화 점수를 개선한다. 일부 구체예들에서, 단회 투여는, 예를 들어, 폐 기능 검사 (PFT), 기능적 잔기 용량 (RFC) 및/또는 총 폐 용량에서 폐 밀도 손실 (TLC)로 분석시 폐 질병 측정값을 개선한다. 다른 구체예들에서, 본원에 개시된 삽입 가이드 RNA 중 하나 초과의 투여는 축적 효과를 통한 편집을 최대화하기에 유익할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에 제공된 조성물을 사용한 치료의 효능은 전달 후 1 년, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년 또는 10 년에 나타난다.
일부 구체예들에서, 치료는 AATD와 연관된 폐 질병 진행을 둔화 또는 중단시킨다. 일부 구체예들에서, 치료는 폐 질병 측정값을 개선한다. 일부 구체예들에서, 폐 질병은 대상체의 폐 구조, 폐 기능 또는 증상의 변화에 의해 측정됩니다. 일부 구체예들에서, 치료 효능은 대상체의 생존 시간 증가에 의해 측정된다.
일부 구체예들에서, 치료 효능은 폐 징후 발달의 둔화에 의해 측정된다. 일부 구체예들에서, 치료 효능은 하나 이상의 COPD, 폐기종 또는 호흡 곤란의 임상적 개선으로 측정된다. 일부 구체예들에서, 치료의 효능은 기침, 가래 생성 또는 쌕쌕거림 중 하나 이상의 개선으로 측정된다.
일부 구체예들에서, 치료는 간 질병 진행을 둔화 또는 중단시킨다. 일부 구체예들에서, 치료는 간 질병 측정값을 개선한다. 일부 구체예들에서, 간 질병은 대상체의 간 구조, 간 기능 또는 증상의 변화에 의해 측정됩니다.
일부 구체예들에서, 치료 효능은 대상체에서 간 이식을 지연시키거나 피하게 하는 능력에 의해 측정된다. 일부 구체예들에서, 치료 효능은 대상체의 생존 시간 증가에 의해 측정된다.
일부 구체예들에서, 혈액 내 간 효소 감소로 측정된다. 일부 구체예들에서, 간 효소는 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 또는 아스파테이트 트랜스아미나제 (AST)이다.
일부 구체예들에서, 치료 효능은 생검 결과에 기초하여 흉터 조직 발달의 둔화 또는 간에서 흉터 조직 감소에 의해 측정된다.
일부 구체예들에서, 치료 효능은 피로, 허약, 가려움, 식욕 부진, 식욕 부진, 체중 감소, 메스꺼움 또는 팽만감과 같은 환자보고 결과를 사용하여 측정된다. 일부 구체예들에서, 치료 효능은 부종, 복수 또는 황달의 감소로 측정된다. 일부 구체예들에서, 치료 효능은 문맥 고혈압의 감소로 측정된다. 일부 구체예들에서, 치료 효능은 간암 비율의 감소로 측정된다.
일부 구체예들에서, 치료 효능은 영상화 방법들을 사용하여 측정된다. 일부 구체예들에서, 영상화 방법들은 초음파, 컴퓨터 단층촬영, 자기 공명 영상 또는 탄성검사이다.
일부 구체예들에서, 혈청 및/또는 간 AAT 수준 (예를 들어, 돌연변이체, 비-기능적 AAT)은, 조성물 투여 전 혈청 및/또는 간 AAT 수준 (예를 들어, 돌연변이체, 비-기능적 AAT)에 비해 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 95-98%, 98-99%, 또는 99-100% 만큼 감소된다.
일부 구체예들에서, SERPINA1 유전자의 편집 퍼센트는 30 내지 99%이다. 일부 구체예들에서, 편집 퍼센트는 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 또는 95 내지 99%이다.
일부 구체예들에서, AATD가 있는 인간 대상체를 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한, (예를 들어, 본원에 제공된 조성물에서) 표 1 또는 표 2, 또는 표 3의 가이드 서열들 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA (알부민 gRNA; 및/또는 SERPINA1 gRNA)의 용도가 제공된다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 표 1 또는 표 2에 개시된 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 gRNA들을, AATD의 폐 증상 완화에 적합한 증강 치료제와 함께 포함하는 조합 치료제를 제공한다. 일부 구체예들에서, 폐 질병을 위한 증강 치료제는 Turner, BioDrugs 2013 Dec;27(6):547-58에 기재된 바와 같은 인간 혈장으로부터 정제된 AAT를 가지는 정맥내 치료제이다. 일부 구체예들에서, 증강 치료제는 Prolastin®, Zemaira®, Aralast®, 또는 Kamada®이다.
일부 구체예들에서, 조합 치료제는 표 1 또는 표 2에 개시된 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 gRNA들을, ATT 또는 돌연변이 ATT를 표적하는 siRNA와 함께 포함한다. 일부 구체예들에서, siRNA는 야생형 또는 돌연변이 AAT의 발현을 추가로 감소 또는 제거할 수 있는 siRNA이다. 일부 구체예들에서, siRNA는 표 1 또는 표 2에 개시된 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 gRNA들 이후에 투여된다. 일부 구체예들에서, siRNA는 본원에 제공된 gRNA 조성물들로 치료 후 규칙적으로 투여된다.
일부 구체예들에서, 조합 치료제는 표 1 또는 표 2에 개시된 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 gRNA들을, 금연, 예방 백신, 기관지 확장제, 지시된 경우 산소 보충, 및 흡연-관련 COPD 환자를 위해 고안된 것과 유사한 프로그램에서 신체 재활을 위한 하나 이상의 치료제와 함께 포함한다.
이러한 설명 및 예시적인 구체예들은 제한적인 것으로 간주되어서는 안된다. 본 명세서 및 첨부된 실시예에 있어서, 달리 표시되지 않는 한, 명세서 및 실시예에서 사용되는 수량, 백분율 또는 비율, 및 기타 수치를 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 “약”에 의해 이들이 그렇게 이미 변형되지 않은 정도로 변형된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대의 언급이 없는 한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 파라미터들은 근사치로서 얻고자 하는 성질에 따라 달라질 수 있다. 최소한으로, 그리고 본 발명의 구체예들의 범위에 대한 균등론 적용을 제한하고자 하는 시도로서가 아니라, 각 수치 변수는 최소한 기록된 유효 자리수의 수를 고려하여 그리고 통상의 올림법을 적용하여 해석되어어야 한다.
인간 AAT 단백질 서열 (서열 번호: 700) NCBI 참조번호: NP_000286:
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLAEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK
인간 AAT 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 701) NCBI 참조번호: NM_000295):
ACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATCGACAATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTGCCTGGTCCCTGTCTCCCTGGCTGAGGATCCCCAGGGAGATGCTGCCCAGAAGACAGATACATCCCACCATGATCAGGATCACCCAACCTTCAACAAGATCACCCCCAACCTGGCTGAGTTCGCCTTCAGCCTATACCGCCAGCTGGCACACCAGTCCAACAGCACCAATATCTTCTTCTCCCCAGTGAGCATCGCTACAGCCTTTGCAATGCTCTCCCTGGGGACCAAGGCTGACACTCACGATGAAATCCTGGAGGGCCTGAATTTCAACCTCACGGAGATTCCGGAGGCTCAGATCCATGAAGGCTTCCAGGAACTCCTCCGTACCCTCAACCAGCCAGACAGCCAGCTCCAGCTGACCACCGGCAATGGCCTGTTCCTCAGCGAGGGCCTGAAGCTAGTGGATAAGTTTTTGGAGGATGTTAAAAAGTTGTACCACTCAGAAGCCTTCACTGTCAACTTCGGGGACACCGAAGAGGCCAAGAAACAGATCAACGATTACGTGGAGAAGGGTACTCAAGGGAAAATTGTGGATTTGGTCAAGGAGCTTGACAGAGACACAGTTTTTGCTCTGGTGAATTACATCTTCTTTAAAGGCAAATGGGAGAGACCCTTTGAAGTCAAGGACACCGAGGAAGAGGACTTCCACGTGGACCAGGTGACCACCGTGAAGGTGCCTATGATGAAGCGTTTAGGCATGTTTAACATCCAGCACTGTAAGAAGCTGTCCAGCTGGGTGCTGCTGATGAAATACCTGGGCAATGCCACCGCCATCTTCTTCCTGCCTGATGAGGGGAAACTACAGCACCTGGAAAATGAACTCACCCACGATATCATCACCAAGTTCCTGGAAAATGAAGACAGAAGGTCTGCCAGCTTACATTTACCCAAACTGTCCATTACTGGAACCTATGATCTGAAGAGCGTCCTGGGTCAACTGGGCATCACTAAGGTCTTCAGCAATGGGGCTGACCTCTCCGGGGTCACAGAGGAGGCACCCCTGAAGCTCTCCAAGGCCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACGAGAAAGGGACTGAAGCTGCTGGGGCCATGTTTTTAGAGGCCATACCCATGTCTATCCCCCCCGAGGTCAAGTTCAACAAACCCTTTGTCTTCTTAATGATTGAACAAAATACCAAGTCTCCCCTCTTCATGGGAAAAGTGGTGAATCCCACCCAAAAATAACTGCCTCTCGCTCCTCAACCCCTCCCCTCCATCCCTGGCCCCCTCCCTGGATGACATTAAAGAAGGGTTGAGCTGGTCCCTGCCTGCATGTGACTGTAAATCCCTCCCATGTTTTCTCTGAGTCTCCCTTTGCCTGCTGAGGCTGTATGTGGGCTCCAGGTAACAGTGCTGTCTTCGGGCCCCCTGAACTGTGTTCATGGAGCATCTGGCTGGGTAGGCACATGCTGGGCTTGAATCCAGGGGGGACTGAATCCTCAGCTTACGGACCTGGGCCCATCTGTTTCTGGAGGGCTCCAGTCTTCCTTGTCCTGTCTTGGAGTCCCCAAGAAGGAATCACAGGGGAGGAACCAGATACCAGCCATGACCCCAGGCTCCACCAAGCATCTTCATGTCCCCCTGCTCATCCCCCACTCCCCCCCACCCAGAGTTGCTCATCCTGCCAGGGCTGGCTGTGCCCACCCCAAGGCTGCCCTCCTGGGGGCCCCAGAACTGCCTGATCGTGCCGTGGCCCAGTTTTGTGGCATCTGCAGCAACACAAGAGAGAGGACAATGTCCTCCTCTTGACCCGCTGTCACCTAACCAGACTCGGGCCCTGCACCTCTCAGGCACTTCTGGAAAATGACTGAGGCAGATTCTTCCTGAAGCCCATTCTCCATGGGGCAACAAGGACACCTATTCTGTCCTTGTCCTTCCATCGCTGCCCCAGAAAGCCTCACATATCTCCGTTTAGAATCAGGTCCCTTCTCCCCAGATGAAGAGGAGGGTCTCTGCTTTGTTTTCTCTATCTCCTCCTCAGACTTGACCAGGCCCAGCAGGCCCCAGAAGACCATTACCCTATATCCCTTCTCCTCCCTAGTCACATGGCCATAGGCCTGCTGATGGCTCAGGAAGGCCATTGCAAGGACTCCTCAGCTATGGGAGAGGAAGCACATCACCCATTGACCCCCGCAACCCCTCCCTTTCCTCCTCTGAGTCCCGACTGGGGCCACATGCAGCCTGACTTCTTTGTGCCTGTTGCTGTCCCTGCAGTCTTCAGAGGGCCACCGCAGCTCCAGTGCCACGGCAGGAGGCTGTTCCTGAATAGCCCCTGTGGTAAGGGCCAGGAGAGTCCTTCCATCCTCCAAGGCCCTGCTAAAGGACACAGCAGCCAGGAAGTCCCCTGGGCCCCTAGCTGAAGGACAGCCTGCTCCCTCCGTCTCTACCAGGAATGGCCTTGTCCTATGGAAGGCACTGCCCCATCCCAAACTAATCTAGGAATCACTGTCTAACCACTCACTGTCATGAATGTGTACTTAAAGGATGAGGTTGAGTCATACCAAATAGTGATTTCGATAGTTCAAAATGGTGAAATTAGCAATTCTACATGATTCAGTCTAATCAATGGATACCGACTGTTTCCCACACAAGTCTCCTGTTCTCTTAAGCTTACTCACTGACAGCCTTTCACTCTCCACAAATACATTAAAGATATGGCCATCACCAAGCCCCCTAGGATGACACCAGACCTGAGAGTCTGAAGACCTGGATCCAAGTTCTGACTTTTCCCCCTGACAGCTGTGTGACCTTCGTGAAGTCGCCAAACCTCTCTGAGCCCCAGTCATTGCTAGTAAGACCTGCCTTTGAGTTGGTATGATGTTCAAGTTAGATAACAAAATGTTTATACCCATTAGAACAGAGAATAAATAGAACTACATTTCTTGCA
P00450에 의해 인코딩되는 알파 1-항트립신 폴리펩티드 (서열 번호: 702):
EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK
인간 AAT 단백질 신호 서열 (서열 번호: 1129)
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA
실시예
하기 실시예는 개시된 특정 구체예들을 예시하기 위해 제공되며 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1- 재료 및 방법
클로닝 및 플라스미드 준비
상업상의 공급업체가 AAV2 ITR들이 연접된 양방향 삽입 구조체를 합성하고 pUC57-Kan로 클로닝하였다. 생성된 구조체 (P00147)를 다른 벡터들에 대한 모체 클로닝 벡터로 사용하였다. 다른 삽입 구조체들 (ITR 없음) 또한 상업적으로 합성하고 pUC57로 클로닝하였다. 정제된 플라스미드를 BglII 제한 효소 (New England BioLabs, 카탈로그# R0144S)로 분해하고 삽입 구조체들을 모체 벡터에 클로닝했다. 플라스미드를 Stbl3TM 화학적 반응능 대장균 (Thermo Fisher, 카탈로그# C737303)에서 번식시켰다.
AAV 제조
HEK293 세포에서 삼중 형질감염을 사용하여 AAV8 및 AAV-DJ 제조를 위한 관심 구조체를 가진 게놈들을 패키징하고 생성된 벡터를 아이오딕산올 구배 초원심분리 방법을 통해 용해된 세포 및 배양 배지 모두로부터 정제하였다 (예를 들어, Lock 등, Hum 유전자 Ther.　2010 Oct;21(10):1259-71 참고). 관심 구조체들을 갖는 게놈을 포함하는 삼중 형질감염에 사용된 플라스미드는 실시예에서 “PXXXX” 번호로 참조되며, 또한 예를 들어, 표 14를 참고하라. 단리된 AAV를 저장 완충액 (0.001% Pluronic F68을 보유한 PBS)에서 투석하였다. AAV 역가는 ITR 영역 내에 위치한 프라이머/프로브를 사용하여 qPCR에 의해 결정되었다.
뉴클레아제 mRNA의 시험관내 전사 (“IVT”)
N1-메틸 슈도-U를 포함하는, 캡핑 및 폴리아데닐화 스트렙토코쿠스 피오게네스 (“Spy”) Cas9 mRNA를 선형화 플라스미드 DNA 템플릿 및 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 생성하였다. 일반적으로 T7 프로모터와 100 nt 폴리 (A/T) 영역을 포함하는 플라스미드 DNA는 37°C에서 XbaI와 함께 배양하여 분해를 완료한 다음 65°C에서 20분 동안 XbaI의 열 비활성화에 의해 선형화되었다. 선형화된 플라스미드는 효소 및 완충 염으로부터 정제되었다. Cas9 변형된 mRNA를 생성하기 위한 IVT 반응물은 다음 조건에서 37°C에서 4시간 동안 배양되었다: 50 ng/μL 선형화된 플라스미드; GTP, ATP, CTP, 및 N1-메틸 슈도-UTP (Trilink) 각 2 mM; 10 mM ARCA (Trilink); 5 U/μL T7 RNA 폴리머라제 (NEB); 1 U/μL 뮤린 RNase 억제제 (NEB); 0.004 U/μL 무기 대장균 파이로포스파타제 (NEB); 및 1x 반응 완충액. TURBO DNase (ThermoFisher)를 최종 농도 0.01 U/μL까지 첨가하고 반응물을 추가로 30분 동안 배양하여 DNA 템플릿을 제거했다. Cas9 mRNA는 제조업체 (ThermoFisher)의 프로토콜에 따라 MegaClear 전사 클린-업 키트를 사용하여 정제되었다. 대안적으로, Cas9 mRNA를 LiCl 침전, 암모늄 아세테이트 침전 및 소듐 아세테이트 침전을 사용하거나 LiCl 침전 방법을 사용하여 정제한 다음 후속하여 접선 유동 여과에 의해 추가 정제하였다. 전사체 농도는 260nm에서 흡광도를 측정하여 (Nanodrop사) 결정했으며, 전사체는 바이오분석장치 (Bioanlayzer) (Agilent사)에 의한 모세관 전기 영동으로 분석했다.
하기 Cas9 mRNA는 Cas9 ORF 서열 번호: 288 또는 PCT/US2019/053423 (본원에 참고로 포함됨)의 표 24의 서열을 포함한다.
서열 번호: 288:
ATGGATAAGAAGTACTCAATCGGGCTGGATATCGGAACTAATTCCGTGGGTTGGGCAGTGATCACGGATGAATACAAAGTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGGAACACCGATAGACACAGCATCAAGAAAAATCTCATCGGAGCCCTGCTGTTTGACTCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCTCAAACGTACCGCGAGGCGACGCTACACCCGGCGGAAGAATCGCATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTTTCGAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACCGCCTGGAAGAATCTTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCATGAACGGCATCCTATCTTTGGAAACATCGTCGACGAAGTGGCGTACCACGAAAAGTACCCGACCATCTACCATCTGCGGAAGAAGTTGGTTGACTCAACTGACAAGGCCGACCTCAGATTGATCTACTTGGCCCTCGCCCATATGATCAAATTCCGCGGACACTTCCTGATCGAAGGCGATCTGAACCCTGATAACTCCGACGTGGATAAGCTTTTCATTCAACTGGTGCAGACCTACAACCAACTGTTCGAAGAAAACCCAATCAATGCTAGCGGCGTCGATGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGTCGCGGCGCCTCGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACTTTTCGGCAACTTGATCGCTCTCTCACTGGGACTCACTCCCAATTTCAAGTCCAATTTTGACCTGGCCGAGGACGCGAAGCTGCAACTCTCAAAGGACACCTACGACGACGACTTGGACAATTTGCTGGCACAAATTGGCGATCAGTACGCGGATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACCTTTCGGACGCAATCTTGCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAACACCGAAATAACCAAAGCGCCGCTTAGCGCCTCGATGATTAAGCGGTACGACGAGCATCACCAGGATCTCACGCTGCTCAAAGCGCTCGTGAGACAGCAACTGCCTGAAAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAATGGGTACGCAGGGTACATCGATGGAGGCGCTAGCCAGGAAGAGTTCTATAAGTTCATCAAGCCAATCCTGGAAAAGATGGACGGAACCGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGGGAGGATCTGCTCCGGAAACAGAGAACCTTTGACAACGGATCCATTCCCCACCAGATCCATCTGGGTGAGCTGCACGCCATCTTGCGGCGCCAGGAGGACTTTTACCCATTCCTCAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATTCTGACGTTCCGCATCCCGTATTACGTGGGCCCACTGGCGCGCGGCAATTCGCGCTTCGCGTGGATGACTAGAAAATCAGAGGAAACCATCACTCCTTGGAATTTCGAGGAAGTTGTGGATAAGGGAGCTTCGGCACAAAGCTTCATCGAACGAATGACCAACTTCGACAAGAATCTCCCAAACGAGAAGGTGCTTCCTAAGCACAGCCTCCTTTACGAATACTTCACTGTCTACAACGAACTGACTAAAGTGAAATACGTTACTGAAGGAATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGTCCGGAGAACAGAAGAAAGCAATTGTCGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGCAAGGTGACCGTCAAGCAGCTTAAAGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGAAATCAGCGGGGTGGAGGACAGATTCAACGCTTCGCTGGGAACCTATCATGATCTCCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTTGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAAGATATCGTCCTGACCTTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAGATGATCGAGGAGAGGCTTAAGACCTACGCTCATCTCTTCGACGATAAGGTCATGAAACAACTCAAGCGCCGCCGGTACACTGGTTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGGTATTCGCGATAAACAGAGCGGTAAAACTATCCTGGATTTCCTCAAATCGGATGGCTTCGCTAATCGTAACTTCATGCAATTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAGGAGGACATCCAAAAAGCACAAGTGTCCGGACAGGGAGACTCACTCCATGAACACATCGCGAATCTGGCCGGTTCGCCGGCGATTAAGAAGGGAATTCTGCAAACTGTGAAGGTGGTCGACGAGCTGGTGAAGGTCATGGGACGGCACAAACCGGAGAATATCGTGATTGAAATGGCCCGAGAAAACCAGACTACCCAGAAGGGCCAGAAAAACTCCCGCGAAAGGATGAAGCGGATCGAAGAAGGAATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAGCACCCGGTGGAAAACACGCAGCTGCAGAACGAGAAGCTCTACCTGTACTATTTGCAAAATGGACGGGACATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATTACGACGTGGACCACATCGTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGATGACTCGATCGATAACAAGGTGTTGACTCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGTCAGATAATGTGCCATCGGAGGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCTGAATGCGAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTTGACAATCTCACTAAAGCCGAGCGCGGCGGACTCTCAGAGCTGGATAAGGCTGGATTCATCAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGCAGATTACCAAGCACGTGGCGCAGATCTTGGACTCCCGCATGAACACTAAATACGACGAGAACGATAAGCTCATCCGGGAAGTGAAGGTGATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGTCGGACTTTCGGAAGGACTTTCAGTTTTACAAAGTGAGAGAAATCAACAACTACCATCACGCGCATGACGCATACCTCAACGCTGTGGTCGGTACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAACTTGAATCGGAGTTTGTGTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTGAGGAAGATGATAGCCAAGTCCGAACAGGAAATCGGGAAAGCAACTGCGAAATACTTCTTTTACTCAAACATCATGAACTTTTTCAAGACTGAAATTACGCTGGCCAATGGAGAAATCAGGAAGAGGCCACTGATCGAAACTAACGGAGAAACGGGCGAAATCGTGTGGGACAAGGGCAGGGACTTCGCAACTGTTCGCAAAGTGCTCTCTATGCCGCAAGTCAATATTGTGAAGAAAACCGAAGTGCAAACCGGCGGATTTTCAAAGGAATCGATCCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAAGCTCATTGCACGCAAGAAAGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGATTCGCCGACTGTCGCATACTCCGTCCTCGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCTCAAATCCGTCAAAGAGCTGCTGGGGATTACCATCATGGAACGATCCTCGTTCGAGAAGAACCCGATTGATTTCCTCGAGGCGAAGGGTTACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGATCATCAAACTCCCCAAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAATGGTCGGAAGCGCATGCTGGCTTCGGCCGGAGAACTCCAAAAAGGAAATGAGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCAACTTCCTCTATCTTGCTTCGCACTACGAAAAACTCAAAGGGTCACCGGAAGATAACGAACAGAAGCAGCTTTTCGTGGAGCAGCACAAGCATTATCTGGATGAAATCATCGAACAAATCTCCGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAAGTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGAGATAAGCCGATCAGAGAACAGGCCGAGAACATTATCCACTTGTTCACCCTGACTAACCTGGGAGCCCCAGCCGCCTTCAAGTACTTCGATACTACTATCGATCGCAAAAGATACACGTCCACCAAGGAAGTTCTGGACGCGACCCTGATCCACCAAAGCATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCTGTCGCAGCTGGGTGGCGAT
Cas9 mRNA 및 gRNA 전달을 위한 지질 제제
3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트)라고도 불리는 이온화가능한 지질 ((9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 제제를 이용하여 Cas9 mRNA 및 gRNA를 세포 및 동물들에게 전달하였다.
사전-혼합된 지질 제제 (본원에서 “지질 패킷”이라고 함)을 사용하는 실험의 경우, 성분들은 100% 에탄올에서 50:38:9:3의 이온화가능한 지질:콜레스테롤:DSPC:PEG2k-DMG의 몰비로 재구성된 다음, 본원에 추가로 기재된 바와 같이 약 6.0의 지질 아민 대 RNA 포스페이트 (N:P) 몰비로 RNA 카고 (예를 들어, Cas9 mRNA 및 gRNA)와 혼합되었다.
지질 나노입자 (LNP)로 제제화된 성분들을 이용한 실험들의 경우, 이 성분들은 100% 에탄올에 다양한 몰비로 용해되었다. RNA 카고 (예를 들어, Cas9 mRNA 및 gRNA)들을 25 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, pH 5.0에 용해시켜, 대략 0.45 mg/mL의 RNA 카고 농도를 생성하였다.
LNP들은 2 부피의 RNA 용액 및 1 부피의 물과 에탄올 중의 지질의 충돌 제트 혼합을 이용하는 교차-흐름 기술을 사용하여 제조되었다. 에탄올 중의 지질은 혼합 교차를 통해 2 부피의 RNA 용액과 혼합되었다. 네 번째 물 스트림은 인라인 T를 통해 교차부의 출구 스트림과 혼합되었다 (WO2016010840 도 2 참고.). LNP를 실온에서 1시간 동안 유지시키고 물로 추가 희석하였다 (약 1:1 v/v). 희석시킨 LNP들을 접선 유동 여과를 사용하여 플랫 쉬트 카트리지 (Sartorius, 100kD MWCO) 상에서 농축시킨 다음 정용여과에 의해 50 mM Tris, 45 mM NaCl, 5% (w/v) 수크로스, pH 7.5 (TSS)로 완충액 교환하였다. 대안적으로, TSS로의 최종 완충액 교환은 PD-10 탈염 컬럼 (GE)을 사용하여 완료되었다. 필요한 경우, Amicon 100kDa 원심분리 필터 (Millipore)로 원심분리하여 제제를 농축시켰다. 이어서 생성된 혼합물을 0.2μm 멸균 필터를 사용하여 여과하였다. 최종 LNP는 차후 사용할 때까지 4°C 또는 -80°C에서 보관되었다. LNP는 50:38:9:3 몰비의 이온화가능한 지질:콜레스테롤:DSPC:PEG2k-DMG에서, 약 6.0의 지질 아민 대 RNA 포스페이트 (N:P) 몰비, 및 1:1의 gRNA 대 mRNA 중량비로 제조되었다.
Cas9 mRNA, gRNA 및 삽입 구조체들의 세포 배양 및 시험관내 전달
일차 헤파토사이트
일차 마우스 헤파토사이트 (PMH), 일차 랫트 헤파토사이트 (PRH) 및 일차 인간 헤파토사이트 (PHH)를 해동하고 보충제 (ThermoFisher)와 함께 헤파토사이트 해동 배지에 재현탁한 다음 원심분리했다. 상청액을 버리고, 펠릿화된 세포를 헤파토사이트 플레이팅 배지 및 보충제 팩 (ThermoFisher)에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고 PHH의 경우 33,000 세포/웰, PCH의 경우 50,000 세포/웰, PRH의 경우 35,000 세포/웰, 및 PMH의 경우 15,000 세포/웰의 밀도로 Bio-coat 콜라겐 I 코팅된 96-웰 플레이트에 플레이팅했다. 플레이팅된 세포를 37°C 및 5% CO2 분위기의 조직 배양 인큐베이터에서 6시간 동안 침강시키고 부착시켰다. 배양 후 세포들을 단층 형성에 대해 확인하고, 먼저 헤파토사이트 유지 배지로 2회 세척한 다음 37°C에서 배양하였다.
MessengerMax 전달을 활용한 실험을 위해 100ng Cas9 mRNA와 25nM gRNA를 각각 Opti-MEM 배지에서 별도로 희석했다. MessengerMAX 시약을 Opti-MEM에 희석하고 10분 동안 배양 한 후 Cas9 mRNA 또는 gRNA를 포함하는 각 튜브에 추가했다. 5분 배양 후, 헤파토사이트 유지 배지로 50ul로 조정하였다. 50ul의 MessengerMAX/Cas9 mRNA 혼합물 및 MessengerMAX/gRNA 혼합물을 세포에 형질감염시키기 전에 배지를 세포로부터 흡인한 다음, PMH의 경우 1e5 또는 PRH의 경우 1e6의 MOI로 AAV (유지 배지에서 희석됨)를 첨가했다. 처리 72 시간 후에 분석을 위해 배지를 수집하고 본원에 기재된 바와 같은 추가 분석을 위해 세포를 수확하였다.
LNP 전달을 활용한 실험을 위해 원하는 농도의 Cas9/sgRNA를 포함하는 다양한 부피의 LNP를 3% FBS가 보충된 헤파토사이트 유지 배지로 희석하고 37에서 10분 동안 배양했다. 세포에 100ul의 LNP/배지 혼합물을 첨가하기 전에 배지를 세포로부터 흡인한 다음, PMH의 경우 1e5 또는 PRH의 경우 1e6의 MOI로 AAV (유지 배지에서 희석됨)를 첨가하였다. 처리 72 시간 후에 분석을 위해 배지를 수집하고 본원에 기재된 바와 같은 추가 분석을 위해 세포를 수확하였다. 지질 패킷 전달을 이용한 실험의 경우, Cas9 mRNA 및 gRNA를 각각 유지 배지에서 2mg/ml로 개별적으로 희석하고, 각 2.9 μl를, 12.5 μl의 50mM 소듐 시트레이트, pH 5의 200mM 소듐 클로라이드 및 6.9 μl의 물을 함유하는 웰들 (96-웰 Eppendorf 플레이트)에 첨가하였다. 이어서 12.5 μl의 지질 패킷 제제, 다음으로 12.5 μl의 물과 150 μl의 TSS를 첨가하였다. 각 웰을 헤파토사이트 유지 배지를 사용하여 20 ng/μl (총 RNA 함량에 대해)까지 희석시킨 다음, 6% 새로운 마우스 혈청으로 10 ng/μl (총 RNA 함량에 대해)까지 희석시켰다. 형질감염 전에 세포로부터 배지를 흡인하고 지질 패킷/RNA 혼합물 40 μl를 세포에 첨가한 다음, 1e5의 MOI로 AAV (유지 배지에서 희석)를 첨가하였다. 처리 72 시간 후에 분석을 위해 배지를 수집하고 본원에 기재된 바와 같은 추가 분석을 위해 세포를 수확하였다.
루시퍼라제 분석
세포 배지에서 NanoLuc 검출을 포함하는 실험을 위해, Nano-Glo® 루시퍼라제 분석 기질 1 부피를 Nano-Glo® 루시퍼라제 분석 완충액 50 부피와 조합하였다. 분석은 50ul의 샘플들 또는 1:10 희석 샘플들 (50 μl 시약 + 40 μl 물 + 10 μl 세포 배지)을 사용하여 0.5초의 통합 시간으로 Promega Glomax 러너에서 수행되었다.세포 배지에서 HiBit 태그의 검출을 포함하는 실험을 위해, LgBiT 단백질 및 Nano-GloR HiBiT 세포외 기질을 실온 Nano-GloR HiBiT 세포외 완충액에서 각각 1:100 및 1:50으로 희석했다. 분석은 1:10 희석 샘플들 (50 μl 시약 + 40 μl 물 + 10 μl 세포 배지)을 사용하여 1.0초의 통합 시간으로 Promega Glomax 러너에서 수행되었다.
LNP 및/또는 AAV의 생체내 전달
측면 꼬리 정맥을 통해 마우스 및 랫트들에게 AAV, LNP, AAV 및 LNP 모두, 또는 비히클 (AAV 비히클의 경우 PBS + 0.001% Pluronic, LNP 비히클의 경우 TSS)을 투약하였다. AAV는 본원에 기재된 양 (벡터 게놈/마우스, “vg/ms”)으로 동물 당 0.1 mL의 부피로 투여되었다. LNP를 TSS로 희석하고, 본원에 표시된 양으로 약 5 μl/체중 g으로 투여하였다. 일반적으로 마우스에 AAV를 먼저 주사한 다음, 적용가능한 경우 LNP를 주사했다. 치료 후 다양한 시점에서, 아래에 추가로 설명하는 바와 같은 특정 분석을 위해 혈청 및/또는 간 조직을 수집하였다.
차세대 시퀀싱 (“NGS”) 및 온-타겟 절단 효율 분석
예를 들어, 알부민의 인트론 1 내부에 유전자 편집에 의해 도입된 삽입 및 결실의 존재를 확인하기 위해 딥 시퀀싱을 사용하였다. PCR 프라이머가 표적 부위 주변에 설계되었고 관심 게놈 영역을 증폭시켰다. 프라이머 서열 설계는 해당 분야의 표준과 같이 수행되었다.
제조업체의 프로토콜 (Illumina)에 따라 추가 PCR을 수행하여 시퀀싱을 위한 화학 물질을 첨가했다. 앰플리콘들은 Illumina MiSeq 기기에서 시퀀싱되었다. 리드들은 품질 점수가 낮은 것을 제거한 후 참조 게놈에 대해 정렬되었다. 리드들을 포함하는 생성된 파일들을 참조 게놈에 매핑하였으며 (BAM 파일), 여기서 관심 표적 영역과 중첩되는 리드들이 선택되고 야생형 리드의 수 대 삽입 또는 결실 (“인델”)을 내포하는 리드들의 수가 계산되었다.
편집 백분율 (예를 들어, “편집 효율성” 또는 “퍼센트 편집”)은 야생형을 포함하는 서열 리드들의 총 수에 대한 삽입 또는 결실 (“인델”)이 있는 서열 리드들의 총 수로 정의된다.
인간 알파 1-항트립신 ( hA1AT ) ELISA 분석
생체내 연구를 위해 혈액을 수집하고 표시된 바와 같이 혈청을 단리하였다. 총 인간 알파 1-항트립신 수준은 제조업체의 프로토콜에 따라 알파 1-항트립신 ELISA 키트 (인간) (Aviva Biosystems, 카탈로그# OKIA00048 또는 Abcam, 카탈로그# ab108799)를 사용하여 결정되었다. 혈청 hA1AT 수준을 4 매개변수 로지스틱 적합을 사용하여 표준 곡선에서 정량하고 μg/혈청 mL로 표현하였다.
인간 알파 1-항트립신 ( hA1AT ) LC-MS/MS 분석
생체내 연구를 위해 혈액을 수집하고 표시된 바와 같이 혈청을 단리하였다. 총 hA1AT 수준은 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법 (LC-MS/MS)을 사용하여 결정되었다. 인간 혈장에서 유래한 정제된 동결건조 고유 hA1AT는 Athens Research & Technology에서 입수했다. 동결건조된 hA1AT를 표준물질 및 품질 대조에 적절한 농도로 우 태아 혈청에 용해시켰다. 혈청 샘플은 우 태아 혈청에 10배 희석되었다. 10 μL의 1900 ng/mL 안정화 표지된 내부 표준물질들을 10 μL의 우 태아 혈청 샘플, 표준물질, 및 품질 대조에 첨가하였다. 그런 다음 샘플을 25μL 트리플루오로에탄올로 변성시키고, 5μL의 200mM DTT를 첨가하기 직전에 25μL의 50mM 암모늄 바이카보네이트로 희석하고 55 °C에서 30분 동안 배양했다. 환원된 샘플을 10 μL의 200 mM 아이오드아세트아미드로 처리하고 흔들면서 실온의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양하였다. 샘플을 400μL의 50mM 암모늄 바이카보네이트로 희석하고 20μL의 1g/L 트립신으로 처리하고 37 °C에서 밤새 배양했다. 10 μL의 포름산으로 소화를 종료시켰다.
야생형 또는 돌연변이 hA1AT 펩티드의 식별:
순수한 A1AT 소화물을 LC-MS/MS로 분석하고 돌연변이 및 야생형 대립유전자를 포함하는 시그니처 펩티드를 식별하였다. 구체적으로, 돌연변이 hA1AT (Glu342Lys)는 무거운 동위원소 표지된 돌연변이 특이적 펩티드 (AV L TIDK (서열 번호: 1130))를 사용하여 검출하고, 야생형 hA1AT는 상이한 무거운 동위원소 표지된 야생형 특이적 펩티드 (AV L TIDEK (서열 번호: 1131))를 사용하여 검출하였다. 조합된 야생형 및 돌연변이 hA1AT 농도를 제 3의 무거운 동위원소 표지된 펩티드 (SAS L HLPK (서열 번호: 1132))를 사용하여 검출하였다. 이들 펩티드 각각은 서열 번호: 1130-1132에서 볼드체 밑줄로 표시한 위치에 하나의 13C6 15N-류신을 통합시켜 합성되었다.
질량 분석법을 사용한 혈청 hA1AT의 수준 결정:
상기 설명한 방법에 따라 혈청을 소화시켰다. 소화 후, 소화된 혈청을 컬럼에 로딩하고 아래 설명하는 바와 같이 LC-MS/MS로 분석했다. 보정 곡선과 비교하여 야생형 및 조합된 야생형 + 돌연변이 hA1AT 수준을 식별하였다. 단일 지점 내부 보정에 의해 돌연변이 hA1AT 수준들을 수득하였다.
LC-MS/MS 조건:
2.1 x 50 mm C8 컬럼을 사용하여 LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 이동상 A는 물에서 0.1% 포름산으로 구성되고 이동상 B는 아세토니트릴에서 0.1% 포름산으로 구성되었다. 바늘 세척은 메탄올: 물 (35:65) 중 1% 디메틸설폭사이드, 0.1% 포름산으로 구성되었다. A1AT 소화물의 분석은 다음 파라미터들을 사용하는 질량 분석계에서 수행되었다: (a) 이온 소스: 터보 스프레이 이온드라이브; (b) 커튼 기체: 35.0; (c) 충돌 기체: 배지; (d) 이온스프레이 전압: 5500; (e) 온도: 500˚(f) 이온 소스 기체 1: 50; 및 (g) 이온 소스 기체 2: 50.
실시예 2- 일차 마우스 헤파토사이트에서 표적 부위들 전반에 걸친 양방향 구조체의 시험관내 스크리닝
본 실시예에 기재된 실험은 일차 마우스 헤파토사이트 (PMH)에서 뮤린 알부민의 인트론 1을 표적으로 하는 20개의 상이한 gRNA를 이용하여 표적 부위의 패널에서 hSERPINA1의 삽입을 테스트했다.
본 실시예에서 테스트된 ssAAV 및 지질 패킷 전달 물질은 1e5 MOI의 AAV를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조되고 PMH에 전달되었다. 처리 후, 단리된 게놈 DNA 및 세포 배지를 각각 편집 및 트랜스진 발현 분석을 위해 수집하였다. 리포터 벡터는 실시예 1에 기재되고 도 1C에 상대 루시퍼라제 단위 (“RLU”)로 도시된 바와 같이, 루시퍼라제-기반 형광 검출을 통해 측정될 수 있는 NanoLuc ORF (GFP 이외에)를 포함하였다. 테스트 벡터의 개략도를 도 1A에 제공한다. 테스트 gRNA들은 표 11에 열거된 것들에 대한 축약된 숫자를 사용하여 (예를 들어, 선행하는 0들이 생략되는 경우, 예를 들어, “G551”은 표 11의 “G000551”에 해당함) 도 1B 및 1C에 도시되어 있다.
도 1B 및 표 31에서 보는 바와 같이, 다양한 편집 수준이 검출되었다. 그러나, 도 1C 및 표 31에서 보는 바와 같이, 높은 수준의 편집이 반드시 보다 효율적인 트랜스진 발현을 가져오는 것은 아니다.
표 31- m알부민 유전자좌에서 인델 형성 및 NanoLuc GFP 발현
Figure pct00013
실시예 3- 일차 사이노몰구스 및 일차 인간 헤파토사이트에서 표적 부위들 전반에 걸친 양방향 구조체들의 시험관내 스크리닝
본 실시예에서, 양방향 구조체를 포함하는 ssAAV 벡터들을 각각 사이노몰구스의 인트론 1 (“사이노”) 및 일차 사이노 (PCH) 및 일차 인간 헤파토사이트 (PHH)에서 인간 알부민을 표적하는 gRNA들을 이용하여 표적 부위들의 패널에 걸쳐 테스트하였다.
본 실시예에서 테스트된 ssAAV 및 지질 패킷 전달 물질은 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조되고 PCH 및 PHH에 전달되었다. 처리 후, 단리된 게놈 DNA 및 세포 배지를 각각 편집 및 트랜스진 발현 분석을 위해 수집하였다. 벡터들 각각은, 실시예 1에 기재되고 (플라스미드 P00415로부터 유래) 도 2B 및 3B에 상대 루시퍼라제 단위 (“RLU”)로 도시된 바와 같이, 루시퍼라제-기반 형광 검출을 통해 측정될 수 있는 리포터를 포함하였다. 예를 들어, AAV 벡터들은 (GFP 이외에) NanoLuc ORF를 내포하였다. 테스트된 벡터들의 개략도는 도 2B 및 3B에 제공되어 있다. 테스트된 gRNA들을 표 9 및 표 13에 열거된 것들에 대한 축약된 숫자를 사용하여 도면 각각에 도시한다.
PCH의 경우 도 2A에 그리고 PHH의 경우 도 3A에 도시된 바와 같이, 테스트된 조합들 각각에 대해 다양한 수준의 편집이 검출되었다 (PCH 실험에서 테스트된 일부 조합들에 대한 편집 데이터는 앰플리콘 기반 시퀀싱에 사용된 특정 프라이머 쌍들의 실패로 인해 도 2A 및 표 3에 보고되어 있지 않음). 도 2A 및 3A에 그래프로 도시된 편집 데이터를 하기 표 3 및 표 4에 수치로 재현하였다. 그러나, 도 2B, 2C 및 도 3B 및 3C에서 보는 바와 같이, 높은 수준의 편집이 반드시 보다 효율적인 트랜스진 발현을 가져오는 것은 아니었는데, 이는 PCH 및 PHH 각각에서 양방향 구조체들의 편집과 삽입/발현 간에 상관관계가 거의 없음을 나타낸다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예 4 - m알부민 유전자좌로 hSERPINA1 의 생체내 삽입
마우스 알부민 유전자좌로의 hSERPINA1 삽입을 촉진시킴에 있어서 다양한 가이드 서열의 효율성을 테스트하였다. 본 실시예에서 테스트된 ssAAV 및 LNP를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고 마우스에 전달하였다. 투여 후 1주 및 2주에 수집된 혈청을 취하여 인간 알파1 항트립신 (hA1AT) 혈청 발현을 측정하였다. 투여 4주 후, 동물을 안락사시키고 간 조직 및 혈청을 각각 편집 및 hA1AT 혈청 발현을 위해 수집하였다. 혈청 내 인간 A1AT 수준을 ELISA (Aviva Biosystems, 카탈로그# OKIA00048)로 결정하였다.
알부민의 인트론 1을 표적으로 하는 8개의 서로 다른 gRNA를 포함하는 8개의 서로 다른 LNP 제제들을 P00450에서 유래된 ssAAV와 함께 마우스에 전달하였다. AAV 및 LNP를 각각 1e12 vg/마우스 및 1.0 mg/kg (총 RNA 카고 함량에 대해)으로 전달하였다. 본 실시예에서 테스트된 gRNA들을 표 11에 열거된 것들에 대한 축약된 숫자를 사용하여 도 4A 및 도 4B에 도시한다. 마우스 알부민 유전자좌에서의 편집 결과를 도 4A 및 표 5에 나타낸다. 투약 후 1, 2, 및 4주차 혈청 hA1AT 수준을 도 4B 및 표 6에 나타낸다. 도 4C는 실시예 1의 시험관내 실험으로부터 주어진 가이드에 대해 RLU로 측정된 발현 수준을 본 실험에서 동일한 가이드를 사용하여 검출된 생체내 hA1AT 트랜스진 발현 수준과 비교하는 상관관계 플롯을 보여준다. 0.71의 R2 값은 일차 세포 스크리닝과 생체내 처리들 사이의 양의 상관관계를 나타낸다.
표 5: 마우스 알부민 유전자좌에서의 편집
Figure pct00018
표 6: 혈청 내 hA1AT 수준
Figure pct00019
실시예 5 - hSERPINA1 PiZ 트랜스진의 생체내 녹다운 및 hSERPINA1의 m알부민 유전자좌로의 삽입
본 실시예에서, hSERPINA PiZ 변이체 트랜스진으로부터 A1AT의 녹-다운 발현에 대한 1차 편집 (단계 1) 후에 hSERPINA1을 마우스 알부민 유전자좌에 삽입하기 위한 2차 편집 (단계 2)이 이어진다. 본 실시예에서 테스트된 ssAAV 및 LNP들을 실시예 1에 기재한 바와 같이 제조하여 수컷 NSG-PiZ 마우스 (그룹 A, B, 및 C) 및 C57Bl/6 수컷 마우스 (그룹 D) (Jackson Laboratory)에 전달하였다. NSG-PiZ 마우스는 면역결핍 NOD scid 감마 (NSG) 배경에 인간 SERPINA1 PiZ 변이체 (Glu342Lys)의 사본을 보유한 트랜스제닉 마우스이다.
본 실험의 단계 1에서, 마우스에 hSERPINA1 트랜스진을 표적하는 sgRNA G000409 및 Cas9 mRNA를 운반하는 LNP를 0.3 mg/kg (총 RNA 카고 함량에 대해) 투약하였다. 단계 1-투약 후 2주차에, 혈청 hA1AT 수준을 측정하기 위해 혈청을 수집하였다. 본 실시예에서 단계 2 편집은 단계 1 투약 후 3주후에 수행되었다. 단계 2 투약에서, 단계 1의 마우스들에게 Cas9 mRNA 및 sgRNA G000668 (마우스 알부민을 표적)을 운반하는 LNP 1 mg/kg (총 RNA 카고 함량에 대해)을 P00450로부터 유래한 ssAAV 1e12 vg/마우스와 함께 투여하였다. 도 5A는 본 실험에서 각 테스트 그룹에 대해 사용된 편집 조건들을 요약한다. 단계 2 투약 후 1, 2 및 3주차에 혈청 내 인간 A1AT 수준을 ELISA (Aviva Biosystems, 카탈로그# OKIA00048)로 결정하였다. 단계 2 투약 후 5주차에, 동물을 안락사시키고 간 조직 및 혈청을 각각 편집 및 hA1AT 혈청 발현을 위해 수집하였다.
도 5B 및 표 7은 단계 1에서 표적화되었던 hSERPINA1 PiZ 변이체의 인델 정보를 보여준다. 도 5C 및 표 7은 단계 2에서 표적화된 알부민 유전자좌의 인델 정보를 보여준다. 도 5D 및 표 8은 ELISA에 의해 측정된 다양한 시점에서의 혈청 내 hA1AT 단백질 수준과 인간 혈장에서 측정된 hA1AT 수준을 보여준다.
표 7 - hSERPINA1에서 인델 형성
Figure pct00020
표 8 - 혈청 내 hA1AT 수준
Figure pct00021
실시예 6- 다양한 dgRNA 또는 sgRNA들을 이용한 일차 마우스 헤파토사이트에서 표적 부위들 전반에 걸친 양방향 구조체의 시험관내 스크리닝
본 실시예에 기재된 실험은 일차 마우스 헤파토사이트 (PMH)에서 뮤린 알부민의 인트론 1을 표적으로 하는 41개의 상이한 이중 가이드 RNA들 (dgRNA) 또는 4개의 단일 가이드 RNA들 (sgRNA)을 이용하여 표적 부위들의 패널에서 양방향 ssAAV 구조체 (P00415)의 삽입을 테스트하였다.
본 실시예에서 테스트된 ssAAV (P00415) 및 MessengerMAX 또는 LNP 전달 물질은 1e5 MOI의 AAV를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조되고 PMH에 전달되었다. 처리 후, 단리된 게놈 DNA 및 세포 배지를 각각 편집 및 트랜스진 발현 분석을 위해 수집하였다. 리포터 벡터는 실시예 1에 기재되고 도 6에 상대 루시퍼라제 단위 (“RLU”)로 도시된 바와 같이, 루시퍼라제-기반 형광 검출을 통해 측정될 수 있는 NanoLuc ORF (GFP 이외에)를 포함하였다. 테스트 벡터의 개략도를 도 1A에 제공한다. 테스트 dgRNA들은 표 15에 열거된 것들에 대한 축약된 숫자를 사용하여 (예를 들어, 선행하는 0들이 생략되는 경우, 예를 들어, “CR5545”는 표 15의 “CR005545”에 해당함) 도 6에 도시되어 있다. 특정 dgRNA들은 괄호에 열거된 상응하는 sgRNA를 가진다 (예를 들어, G551은 dgRNA CR5542의 trRNA 및 crRNA를 포함하는 sgRNA이다). sgRNA 구조체는 도 6에서 테스트되지 않는다.
도 6 및 표 32에서 보는 바와 같이, 다양한 발현 수준이 검출되었다.
높은 트랜스진 발현을 가져오는 특정 dgRNA들 (예를 들어, CR5574, CR5580, CR5576, 및 CR5579)을 PMH에서 뮤린 알부민 인트론 1에 hSERPINA1을 삽입하는 이들의 능력에 대하여 sgRNA과 같이 테스트하였다. 구체적으로, dgRNA CR5574, dgRNA CR5580, dgRNA CR5576, 및 dgRNA CR5579는 각각 sgRNA G013018, sgRNA G013018, sgRNA G667, 및 sgRNA G670에 상응한다. 50ng 또는 100ng Cas9 mRNA 및 15 nM 또는 30 nM의 각 sgRNA가 PMH에 전달되었다. 도 7의 데이터를 CellTiter-Glo®(CTG)로 정규화시킨 RLU로서 플롯하였다. 테스트된 sgRNA들을 도 7에 나타내고, 표 11에 추가로 기재하였다. 도 7 및 표 33에서 보는 바와 같이, 다양한 발현 수준이 검출되었다.
표 32- AAV-P00415를 이용한 NanoLuc 발현
Figure pct00022
Figure pct00023
표 33: m알부민 SERPINA1 삽입
Figure pct00024
표 15. 마우스 알부민 가이드 dgRNA 및 변형 패턴
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
실시예 7- 일차 랫트 헤파토사이트에서 표적 부위들 전반에 걸친 양방향 구조체의 시험관내 스크리닝
본 실시예에 기재된 실험은 일차 랫트 헤파토사이트 (PRH)에서 랫트 알부민의 인트론 1을 표적으로 하는 32개의 상이한 gRNA를 이용하여 표적 부위의 패널에서 양방향 ssAAV 구조체 (P00415)의 삽입을 테스트했다.
본 실시예에서 테스트된 ssAAV (P00415) 및 MessengerMAX 물질은 1e6 MOI의 AAV, 샘플 당 100ng의 Cas9 mRNA, 및 25nM 농도의 sgRNA를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조되고 PRH에 전달되었다. 처리 후, 단리된 게놈 DNA 및 세포 배지를 각각 편집 및 트랜스진 발현 분석을 위해 수집하였다. 리포터 벡터는 실시예 1에 기재된 바와 같이, 루시퍼라제-기반 형광 검출을 통해 측정될 수 있는 NanoLuc ORF (GFP 이외에)를 포함하였다. 데이터를 CellTiter-Glo®로 정규화시킨 상대 루시퍼라제 단위 (“NanoLuc/CTG”)로 도 8에 플롯한다. 테스트 벡터의 개략도를 도 1A에 제공한다.
도 8에서 보는 바와 같이, 다양한 편집 수준 (인델 형성)을 검출하였다. 그러나, 높은 수준의 편집이 반드시 보다 효율적인 트랜스진 발현을 가져오는 것은 아니었다.
도 8에서 테스트된 구체적 gRNA들을 이용한 다양한 표적 부위들에서의 양방향 ssAAV 구조체 (P00415)의 삽입을 일정 범위 농도에 걸쳐 평가하였다 (Cas9: 3.125ng, 6.25ng, 12.5ng, 25ng, 50ng, 또는 100ng; sgRNA:0.78 nM, 1.56 nM, 3.125 nM, 6.25 nM, 12.5 nM, 또는 25 nM). 도 9에서 보는 바와 같이, 랫트 알부민 유전자좌에서 양방향 ssAAV 구조체 (P00415)의 삽입은 용량 의존적이다, 즉, 삽입율은 Cas9/sgRNA 용량 증가에 따라 조절된다.
표 16. 랫트 알부민 가이드 sgRNA 및 변형 패턴
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
실시예 8- 다양한 gRNA들을 이용한 일차 사이노몰구스 헤파토사이트에서 표적 부위들 전반에 걸친 양방향 구조체의 시험관내 스크리닝
본 실시예에 기재된 실험은 일차 사이노몰구스 (“사이노”) 헤파토사이트 (PCH)에서 사이노 알부민의 인트론 1을 표적으로 하는 34개의 상이한 gRNA를 이용하여 표적 부위의 패널에서 양방향 ssAAV 구조체 (P00415)의 삽입을 테스트했다. 개별 실험들 간의 가변성을 평가하기 위해 34 개의 서로 다른 gRNA를 이용하는 스크린을 두 번 수행하였다.
본 실시예에서 테스트된 ssAAV 및 지질 패킷 전달 물질은 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조되고 PCH에 전달되었다. 처리 후, 단리된 게놈 DNA 및 세포 배지를 각각 편집 및 트랜스진 발현 분석을 위해 수집하였다. 벡터들 각각은 실시예 1에 기재된 바와 같이 (플라스미드 P00415로부터 유래된)루시퍼라제-기반 형광 검출을 통해 측정될 수 있는 리포터를 포함하였다. 본 실시예에서, AAV 벡터들은 (GFP 이외에) NanoLuc ORF를 내포하였다. 테스트된 gRNA들 및 이에 상응하는 편집 데이터 및 트랜스진의 발현 각각을 표 17 및 표 18에 나타낸다. 트랜스진의 발현은 CellTiter-Glo®(CTG)로 정규화시킨 RLU로 측정한다.
표 17에서 보는 바와 같이, 다양한 편집 수준들이 테스트된 조합들 각각에 대해 검출되었다. 그러나, 표 18에서 보는 바와 같이, 높은 수준의 편집이 반드시 보다 효율적인 트랜스진 발현을 가져오는 것은 아니었는데, 이는 PCH에서 양방향 구조체들의 편집과 삽입/발현 간에 상관관계가 거의 없음을 나타낸다.
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
실시예 9 - P2A 서열을 포함하는 양방향 구조체를 사용한 m알부민 유전자좌로의 hSERPINA1 생체내 삽입
마우스 알부민 유전자좌로의 hSERPINA1 삽입을 촉진시킴에 있어서 P2A 서열 유무에 따른 다양한 양방향 구조체들의 효율성을 테스트하였다. 본 실시예에서 테스트된 ssAAV 및 LNP를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고 마우스에 전달하였다 (그룹 당 n=5). 투여 후 1, 2, 4 및 5주차에 수집된 혈청을 취하여 인간 알파1 항트립신 (hA1AT) 혈청 발현을 측정하였다.
2가지 상이한 구조체들, P00450 및 P00451을, 알부민의 인트론 1을 표적으로 하는 G000670을 포함하는 LNP 제제와 함께 마우스에 전달하였다. P00450 및 P00451 구조체들에 대한 벡터 구성성분들 및 서열들을 표 19에 나타낸다. AAV 및 LNP를 각각 1e12 vg/마우스 및 1.0 mg/kg (총 RNA 카고 함량에 대해)으로 전달하였다. 투약 후 1, 2, 4, 및 5주차 혈청 hA1AT 수준을 도 10 및 표 20 및 표 21에 나타낸다. 표 20 및 표 21에서 보는 바와 같이, P2A의 포함이 반드시 보다 효율적인 트랜스진 발현을 가져오는 것은 아니었으며, 이는 hA1AT가 2A 자기 절단 펩티드, 가령, P2A의 포함여부에 관계없이 발현될 수 있음을 나타낸다.
표 19: 벡터 구성성분들 및 서열들
Figure pct00038
표 20: 혈청 내 hA1AT 수준 (1 및 2주차)
Figure pct00039
표 21: 혈청 내 hA1AT 수준 (3 및 4주차)
Figure pct00040
실시예 10 - hSERPINA1 PiZ 트랜스진의 생체내 녹다운 및 hSERPINA1의 m알부민 유전자좌로의 삽입
본 실시예에서, hSERPINA1 트랜스진을 녹다운시키고 hSERPINA1을 마우스 알부민 유전자좌로 삽입하는 능력을 평가하였다. 이 실험에 대해 두 단계가 존재한다: (1) hSERPINA PiZ 변이체 트랜스진으로부터 A1AT의 녹-다운 발현에 대한 1차 편집 (단계 1); 및 (2) hSERPINA1을 마우스 알부민 유전자좌에 삽입하기 위한 2차 편집 (단계 2). 본 실시예에서 테스트된 ssAAV 및 LNP를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고 수컷 NSG-PiZ 마우스 (그룹 1, 2, 및 3) (Jackson Laboratory)에 전달하였다.
본 실험의 단계 1에서, 마우스에 hSERPINA1 트랜스진을 표적하는 sgRNA G000409 및 Cas9 mRNA를 운반하는 LNP를 0.3 mg/kg (총 RNA 카고 함량에 대해) 또는 비히클 대조를 투약하였다. 단계 1-투약 후 2주차에, 혈청 hA1AT 수준을 측정하기 위해 혈청을 수집하였다. 본 실시예에서 단계 2 투약은 단계 1 투약 후 3주후에 수행되었다. 단계 2 투약에서, 단계 1의 마우스들에게 Cas9 mRNA 및 sgRNA G000668 (마우스 알부민을 표적)을 운반하는 LNP 1 mg/kg (총 RNA 카고 함량에 대해)을 단독으로 또는 P00450로부터 유래한 ssAAV 1e12 vg/마우스와 함께 투여하였으며, 대조 그룹은 비히클을 단독 투여받았다. 표 22는 본 실험에서 각 테스트 그룹의 편집 조건들을 요약한다. 단계 2 투약 후 1, 2 및 3주차에 혈청 내 인간 A1AT 수준을 ELISA로 결정하였다. 단계 2 투약 후 5주차에, 동물을 안락사시키고 hA1AT 혈청 발현 수준을 결정하기 위해 간 조직 및 혈청을 수집하였다.
도 11 및 표 23은 ELISA로 측정한, 다양한 시점들에서의 혈청 내 hA1AT 단백질 수준을 보여준다.
표 22: 각 테스트 그룹에 대한 편집 조건
Figure pct00041
표 23 - 혈청 내 hA1AT 수준
Figure pct00042
실시예 11 - hSERPINA1 PiZ 트랜스진의 녹다운 및 hSERPINA1의 m알부민 유전자좌로의 삽입 후 생체내 hA1AT 발현의 지속성
처리된 동물에서 시간에 따른 hA1AT 발현의 지속성을 본 실시예에서 평가하였다. 이를 위해 15-주 지속성 연구의 일환으로 투여 후 처리된 동물의 혈청에서 hA1AT를 측정했다.
본 실시예에서, hSERPINA PiZ 변이체 트랜스진으로부터 A1AT의 녹-다운 발현에 대한 1차 편집 (단계 1) 후에 hSERPINA1을 마우스 알부민 유전자좌에 삽입하기 위한 2차 편집 (단계 2)이 이어진다. 본 실시예에서 테스트된 ssAAV, LNPs, 및 대조들을 실시예 1에 기재한 바와 같이 제조하여 수컷 NSG-PiZ 마우스 (그룹 1, 2, 3, 4, 5, 및 6)에 전달하였다.
본 실험의 단계 1에서, 그룹 2, 3, 4, 및 6 마우스에 hSERPINA1 트랜스진을 표적하는 sgRNA G000409 및 Cas9 mRNA를 운반하는 LNP를 0.3 mg/kg (총 RNA 카고 함량에 대해) 투약하였다. 본 실시예에서 단계 2 편집은 단계 1 투약 후 3주후에 수행되었다. 단계 2 투약에서, 그룹 4, 5, 및 6의 마우스들에게 Cas9 mRNA 및 sgRNA G000666 또는 sgRNA G13019 (모두 마우스 알부민을 표적)을 운반하는 LNP 1 mg/kg (총 RNA 카고 함량에 대해)을 P00450로부터 유래한 1e12 vg/마우스의 ssAAV와 함께 투여하였다. 표 24는 본 실험에서 각 테스트 그룹에 대해 사용된 편집 조건들을 요약한다. 단계 2 투약 후 4, 8 및 12주차에 혈청 내 인간 A1AT 수준을 ELISA로 결정하였다. 단계 2 투약 후 2, 4, 8 및 12주차에 혈청 내 인간 A1AT (야생형 및 돌연변이) 수준을 또한 LC-MS/MS로 결정하였다. 단계 2 투약 후 12주차에, 동물을 안락사시키고 간 조직 및 혈청을 각각 편집 및 hA1AT 혈청 발현을 위해 수집하였다.
도 12 및 표 25는 단계 2에서 표적화된 알부민 유전자좌의 인델 정보를 보여준다. 도 13A 및 표 26은 ELISA (Abcam, 카탈로그# ab108799)로 측정한, 다양한 시점들에서의 혈청 내 hA1AT 단백질 수준을 보여준다. 도 13A에서 보는 바와 같이, hA1AT 발현은 그룹 1, 4, 5, 6, 및 7에 대해 평가된 각 시점에서 단계 2 투약 후 12 주차까지 지속되었다. 도 13B 및 표 29는 LC-MS/MS으로 측정한, 다양한 시점들에서의 혈청 내 hA1AT (야생형 및 돌연변이) 단백질 수준을 보여준다. 도 13B에서 보는 바와 같이, 단계 1 투약 동안 hSERPINA1 트랜스진을 표적하는 sgRNA G000409 및 Cas9 mRNA를 운반하는 LNP를 투약받았던 각 그룹들 (예를 들어, 그룹 2, 3, 4, 및 6)에서 hA1AT 수준은 감소하였다. 한편, 단계 2 동안 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 운반하는 LNP를 ssAAV와 함께 투약받은 그룹들 각각은 후속하여 혈청 hA1AT 수준의 증가를 보여주었다.
표 24: 각 테스트 그룹에 대한 편집 조건
Figure pct00043
표 25- m알부민에서 인델 형성
Figure pct00044
표 26 - ELISA로 측정한 혈청 내 hA1AT 수준
Figure pct00045
표 29 - LC-MS/MS로 측정한 혈청 내 hA1AT 수준
Figure pct00046
BQL=정량 한계 25 μg/mL 미만
BQL 값들은 평균 및 표준 편차 계산에서 무시하였음
실시예 12- 다양한 LNP 또는 AAV 용량에 따른 생체내 hA1AT의 발현 수준
본 실시예에서 다양한 용량의 LNP 또는 AAV로 처리된 마우스에서 hA1AT 발현 수준을 평가하였다. 본 실시예에서 테스트된 ssAAV 및 LNP를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고 마우스에 전달하였다. 투여 2주 후, 동물을 안락사시키고 간 조직 및 혈청을 각각 편집 및 hA1AT 혈청 발현을 위해 수집하였다.
마우스들에게 (1) Cas9 mRNA 및 sgRNA G000666 (마우스 알부민을 표적)을 운반하는 LNP의 다양한 용량 (예를 들어, 총 RNA 카고 함량에 대해 1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 또는 0.1 mg/kg) 또는 (2) P00450에서 유래한 ssAAV의 다양한 용량 (예를 들어, 3e12 vg/마우스, 1e12 vg/마우스, 3e11 vg/마우스, 또는 1e11 vg/마우스)을 투약하였다.
투약 후 1주차에 혈청 내 인간 A1AT 수준을 ELISA (Aviva Biosystems, 카탈로그# OKIA00048) 로 결정하였다. 도 14A, 도 14B, 및 표 27은 ELISA로 측정한, 다양한 농도의 LNP 및 AAV에 따른 혈청 내 hA1AT 단백질 수준을 보여준다. 참고로, 인간 혈장 내 hA1AT 수준은 대략 3450.9 ug/ml이다. 마우스 알부민 유전자좌에서의 편집 결과를 도 14C, 도 14D, 및 표 28에 나타낸다. 도 14, 도 14B, 도 14C, 및 도 14D hA1AT에서 보는 바와 같이, 발현 및 인델 형성은 LNP 또는 AAV 용량 증가에 따라 각각 용량 의존적 방식으로 증가하였다. 또한, Cas9 mRNA 및 sgRNA G013019 (랫트 알부민을 표적)를 운반하는 다양한 용량의 LNP (예를 들어, 총 RNA 카고 함량에 대한 3 mg/kg, 1 mg/kg, 또는 0.3 mg/kg) 및 ssAAV를 사용한 Wistar 랫트에서의 hSERPINA1 삽입은 LNP 용량 증가가 2주에 걸쳐 혈청 내 hA1AT의 발현을 증가시킴을 보여주었다 (데이터 도시되지 않음).
표 27: 혈청 내 hA1AT 수준
Figure pct00047
표 28: 마우스 알부민 유전자좌에서의 편집
Figure pct00048
실시예 13 - 알부민 인간 가이드들의 오프-타겟 분석
생화학적 방법 (예를 들어, Cameron 등, Nature Methods. 6, 600-606; 2017 참조)을 사용하여 Cas9 표적화 알부민에 의해 절단된 잠재적인 오프-타겟 게놈 부위들을 결정하였다. 본 실험에서는 인간 알부민을 표적으로하는 13개의 sgRNA와 공지된 오프-타겟 프로파일들을 가진 2개의 대조군 가이드를 단리된 HEK293 게놈 DNA를 사용하여 스크리닝했다. 생화학적 분석에서 16 nM의 가이드 농도를 사용하여 검출된 잠재적인 오프-타겟 부위의 수를 표 30에 나타내었다. 본 분석은 테스트 sgRNA들에 대한 잠재적인 오프-타겟 부위들을 식별하였다.
표 30- 오프-타겟 분석
Figure pct00049
상기 사용된 생화학적 방법과 같은 공지된 오프-타겟 검출 분석에서, 많은 수의 잠재적 오프-타겟 부위들은 통상적으로, 다른 내용에서, 예를 들어, 관심 일차 세포에서 검증될 수 있는 잠재적 부위들에 대하여 “넓은 그물을 던지도록” 하는 설계에 의해 복구된다. 예를 들어, 생화학적 방법은 통상적으로 잠재적 오프-타겟 부위들의 수를 과도하게 제시하는데, 이러한 분석이 정제된 고 분자량 게놈 DNA가 없는 세포 환경을 이용하고 사용된 Cas9 RNP의 용량에 의존하기 때문이다. 따라서, 이들 방법들에 의해 식별된 잠재적 오프-타겟 부위들은 식별된 잠재적 오프-타겟 부위들의 표적화된 시퀀싱을 사용하여 검증될 수 있다.
인간 알부민 인트론 1: (서열 번호: 1)
Figure pct00050
표 9: 인간 sgRNA 및 변형 패턴
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
표 10. 마우스 알부민 가이드 RNA
*
Figure pct00056
표 11. 마우스 알부민 가이드 sgRNA 및 변형 패턴
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
표 12. 사이노 알부민 가이드 RNA
Figure pct00060
Figure pct00061
상부에 “*”로 표시된 서열 번호는 표시된 gRNA가 사이노 및 인간 모두에 적용가능함을 나타낸다.
표 13: 사이노 sgRNA 및 변형 패턴
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
상부에 “*”로 표시된 서열 번호는 표시된 sgRNA가 사이노 및 인간 모두에 적용가능함을 나타낸다.
표 14: 벡터 구성성분들 및 서열들
Figure pct00066
5' ITR 서열 (서열 번호: 263):
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
마우스 알부민 스플라이스 수용체 (제 1 방향) (서열 번호: 264):
TAGGTCAGTGAAGAGAAGAACAAAAAGCAGCATATTACAGTTAGTTGTCTTCATCAATCTTTAAATATGTTGTGTGGTTTTTCTCTCCCTGTTTCCACAG
인간 SERPINA1, 제 1 방향 (서열 번호: 265):
GAGGACCCCCAGGGCGACGCCGCCCAGAAGACCGACACCAGCCACCACGACCAGGACCACCCCACCTTCAACAAGATCACCCCCAACCTGGCCGAGTTCGCCTTCAGCCTGTACAGGCAGCTGGCCCACCAGAGCAACAGCACCAACATCTTCTTCAGCCCCGTGAGCATCGCCACCGCCTTCGCCATGCTGAGCCTGGGCACCAAGGCCGACACCCACGACGAGATCCTGGAGGGCCTGAACTTCAACCTGACCGAGATCCCCGAGGCCCAGATCCACGAGGGCTTCCAGGAGCTGCTGAGGACCCTGAACCAGCCCGACAGCCAGCTGCAGCTGACCACCGGCAACGGCCTGTTCCTGAGCGAGGGCCTGAAGCTGGTGGACAAGTTCCTGGAGGACGTGAAGAAGCTGTACCACAGCGAGGCCTTCACCGTGAACTTCGGCGACACCGAGGAGGCCAAGAAGCAGATCAACGACTACGTGGAGAAGGGCACCCAGGGCAAGATCGTGGACCTGGTGAAGGAGCTGGACAGGGACACCGTGTTCGCCCTGGTGAACTACATCTTCTTCAAGGGCAAGTGGGAGAGGCCCTTCGAGGTGAAGGACACCGAGGAGGAGGACTTCCACGTGGACCAGGTGACCACCGTGAAGGTGCCCATGATGAAGAGGCTGGGCATGTTCAACATCCAGCACTGCAAGAAGCTGAGCAGCTGGGTGCTGCTGATGAAGTACCTGGGCAACGCCACCGCCATCTTCTTCCTGCCCGACGAGGGCAAGCTGCAGCACCTGGAGAACGAGCTGACCCACGACATCATCACCAAGTTCCTGGAGAACGAGGACAGGAGGAGCGCCAGCCTGCACCTGCCCAAGCTGAGCATCACCGGCACCTACGACCTGAAGAGCGTGCTGGGCCAGCTGGGCATCACCAAGGTGTTCAGCAACGGCGCCGACCTGAGCGGCGTGACCGAGGAGGCCCCCCTGAAGCTGAGCAAGGCCGTGCACAAGGCCGTGCTGACCATCGACGAGAAGGGCACCGAGGCCGCCGGCGCCATGTTCCTGGAGGCCATCCCCATGAGCATCCCCCCCGAGGTGAAGTTCAACAAGCCCTTCGTGTTCCTGATGATCGAGCAGAACACCAAGAGCCCCCTGTTCATGGGCAAGGTGGTGAACCCCACCCAGAAGTAA
bGH 폴리-A (제 1 방향) (서열 번호: 266):
CCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCC
SV40 폴리-A (제 2 방향) (서열 번호: 267):
AAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTG
인간 SERPINA1, 제 2 방향 (서열 번호: 268):
GAGGATCCCCAGGGAGATGCTGCCCAGAAGACAGATACATCCCACCATGATCAGGATCACCCAACCTTCAACAAGATCACCCCCAACCTGGCTGAGTTCGCCTTCAGCCTATACCGCCAGCTGGCACACCAGTCCAACAGCACCAATATCTTCTTCTCCCCAGTGAGCATCGCTACAGCCTTTGCAATGCTCTCCCTGGGGACCAAGGCTGACACTCACGATGAAATCCTGGAGGGCCTGAATTTCAACCTCACGGAGATTCCGGAGGCTCAGATCCATGAAGGCTTCCAGGAACTCCTCCGTACCCTCAACCAGCCAGACAGCCAGCTCCAGCTGACCACCGGCAATGGCCTGTTCCTCAGCGAGGGCCTGAAGCTAGTGGATAAGTTTTTGGAGGATGTTAAAAAGTTGTACCACTCAGAAGCCTTCACTGTCAACTTCGGGGACACCGAAGAGGCCAAGAAACAGATCAACGATTACGTGGAGAAGGGTACTCAAGGGAAAATTGTGGATTTGGTCAAGGAGCTTGACAGAGACACAGTTTTTGCTCTGGTGAATTACATCTTCTTTAAAGGCAAATGGGAGAGACCCTTTGAAGTCAAGGACACCGAGGAAGAGGACTTCCACGTGGACCAGGTGACCACCGTGAAGGTGCCTATGATGAAGCGTTTAGGCATGTTTAACATCCAGCACTGTAAGAAGCTGTCCAGCTGGGTGCTGCTGATGAAATACCTGGGCAATGCCACCGCCATCTTCTTCCTGCCTGATGAGGGGAAACTACAGCACCTGGAAAATGAACTCACCCACGATATCATCACCAAGTTCCTGGAAAATGAAGACAGAAGGTCTGCCAGCTTACATTTACCCAAACTGTCCATTACTGGAACCTATGATCTGAAGAGCGTCCTGGGTCAACTGGGCATCACTAAGGTCTTCAGCAATGGGGCTGACCTCTCCGGGGTCACAGAGGAGGCACCCCTGAAGCTCTCCAAGGCCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACGAGAAAGGGACTGAAGCTGCTGGGGCCATGTTTTTAGAGGCCATACCCATGTCTATCCCCCCCGAGGTCAAGTTCAACAAACCCTTTGTCTTCTTAATGATTGAACAAAATACCAAGTCTCCCCTCTTCATGGGAAAAGTGGTGAATCCCACCCAAAAAtaa
마우스 알부민 스플라이스 수용체 (제 2 방향) (서열 번호: 269):
CTGTGGAAACAGGGAGAGAAAAACCACACAACATATTTAAAGATTGATGAAGACAACTAACTGTAATATGCTGCTTTTTGTTCTTCTCTTCACTGACCTA
3' ITR 서열 (서열 번호: 270):
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
Nluc-P2A-GFP (제 1 방향) (서열 번호: 275):
TTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCAGTATTCACTTTGGAGGACTTTGTCGGTGACTGGAGGCAAACCGCTGGTTATAATCTCGACCAAGTACTGGAACAGGGCGGGGTAAGTTCCCTCTTTCAGAATTTGGGTGTAAGCGTCACACCAATCCAGCGGATTGTGTTGTCTGGAGAGAACGGACTCAAAATTGACATCCATGTTATCATTCCATATGAAGGTCTCAGTGGAGACCAAATGGGGCAGATCGAGAAGATTTTCAAGGTAGTTTACCCAGTCGACGATCACCACTTCAAAGTCATTCTCCACTATGGCACACTTGTTATCGACGGAGTAACTCCTAATATGATTGATTACTTTGGTCGCCCGTATGAGGGCATCGCAGTGTTTGATGGCAAAAAGATCACCGTAACAGGAACGTTGTGGAATGGGAACAAGATAATCGACGAGAGATTGATAAATCCAGACGGGTCACTCCTGTTCAGGGTTACAATTAACGGCGTCACAGGATGGAGACTCTGTGAACGAATACTGGCCACAAATTTTTCACTCCTGAAGCAGGCCGGAGACGTGGAGGAAAACCCAGGGCCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAA
Nluc-P2A-GFP (제 2 방향) (서열 번호: 276):
TTACACCTTCCTCTTCTTCTTGGGGCTGCCGCCGCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCCAGGGTGATGCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGCACCATGTGGTCCCTCTTCTCGTTGGGGTCCTTGCTCAGGGCGCTCTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCCAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGCCTGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATGTACACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGGCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATCCTGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCCCTGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTCCTCTCCTGCACGTAGCCCTCGGGCATGGCGCTCTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTACCTGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACCAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCGTCGCCCTCGCCCTCGCCGCTCACGCTGAACTTGTGGCCGTTCACGTCGCCGTCCAGCTCCACCAGGATGGGCACCACGCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACGGGGCCGGGGTTCTCCTCCACGTCGCCGGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTGGTGGCCAGGATCCTCTCGCACAGCCTCCAGCCGGTCACGCCGTTGATGGTCACCCTGAACAGCAGGCTGCCGTCGGGGTTGATCAGCCTCTCGTCGATGATCTTGTTGCCGTTCCACAGGGTGCCGGTCACGGTGATCTTCTTGCCGTCGAACACGGCGATGCCCTCGTAGGGCCTGCCGAAGTAGTCGATCATGTTGGGGGTCACGCCGTCGATCACCAGGGTGCCGTAGTGCAGGATCACCTTGAAGTGGTGGTCGTCCACGGGGTACACCACCTTGAAAATCTTCTCGATCTGGCCCATCTGGTCGCCGCTCAGGCCCTCGTAGGGGATGATCACGTGGATGTCGATCTTCAGGCCGTTCTCGCCGCTCAGCACGATCCTCTGGATGGGGGTCACGCTCACGCCCAGGTTCTGGAACAGGCTGCTCACGCCGCCCTGCTCCAGCACCTGGTCCAGGTTGTAGCCGGCGGTCTGCCTCCAGTCGCCCACGAAGTCCTCCAGGGTGAACACGGCCTCCTCGAAGCTGCACTTCTCCTCCATGCACTCCCTCTCCAGGTTGCCCTGCACGAACTCCTCCAGCTTGCCGCTGTTGTACCTCTTGGGCCTGTTCAGGATCTTGTTGGCGTTCTCGTGGTCCAGGAA
P00415 전체 서열 (ITR로부터 ITR까지): (서열 번호: 279)
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTAGATCTCTTAGGTCAGTGAAGAGAAGAACAAAAAGCAGCATATTACAGTTAGTTGTCTTCATCAATCTTTAAATATGTTGTGTGGTTTTTCTCTCCCTGTTTCCACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCAGTATTCACTTTGGAGGACTTTGTCGGTGACTGGAGGCAAACCGCTGGTTATAATCTCGACCAAGTACTGGAACAGGGCGGGGTAAGTTCCCTCTTTCAGAATTTGGGTGTAAGCGTCACACCAATCCAGCGGATTGTGTTGTCTGGAGAGAACGGACTCAAAATTGACATCCATGTTATCATTCCATATGAAGGTCTCAGTGGAGACCAAATGGGGCAGATCGAGAAGATTTTCAAGGTAGTTTACCCAGTCGACGATCACCACTTCAAAGTCATTCTCCACTATGGCACACTTGTTATCGACGGAGTAACTCCTAATATGATTGATTACTTTGGTCGCCCGTATGAGGGCATCGCAGTGTTTGATGGCAAAAAGATCACCGTAACAGGAACGTTGTGGAATGGGAACAAGATAATCGACGAGAGATTGATAAATCCAGACGGGTCACTCCTGTTCAGGGTTACAATTAACGGCGTCACAGGATGGAGACTCTGTGAACGAATACTGGCCACAAATTTTTCACTCCTGAAGCAGGCCGGAGACGTGGAGGAAAACCCAGGGCCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAACCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTTACACCTTCCTCTTCTTCTTGGGGCTGCCGCCGCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCCAGGGTGATGCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGCACCATGTGGTCCCTCTTCTCGTTGGGGTCCTTGCTCAGGGCGCTCTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCCAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGCCTGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATGTACACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGGCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATCCTGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCCCTGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTCCTCTCCTGCACGTAGCCCTCGGGCATGGCGCTCTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTACCTGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACCAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCGTCGCCCTCGCCCTCGCCGCTCACGCTGAACTTGTGGCCGTTCACGTCGCCGTCCAGCTCCACCAGGATGGGCACCACGCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACGGGGCCGGGGTTCTCCTCCACGTCGCCGGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTGGTGGCCAGGATCCTCTCGCACAGCCTCCAGCCGGTCACGCCGTTGATGGTCACCCTGAACAGCAGGCTGCCGTCGGGGTTGATCAGCCTCTCGTCGATGATCTTGTTGCCGTTCCACAGGGTGCCGGTCACGGTGATCTTCTTGCCGTCGAACACGGCGATGCCCTCGTAGGGCCTGCCGAAGTAGTCGATCATGTTGGGGGTCACGCCGTCGATCACCAGGGTGCCGTAGTGCAGGATCACCTTGAAGTGGTGGTCGTCCACGGGGTACACCACCTTGAAAATCTTCTCGATCTGGCCCATCTGGTCGCCGCTCAGGCCCTCGTAGGGGATGATCACGTGGATGTCGATCTTCAGGCCGTTCTCGCCGCTCAGCACGATCCTCTGGATGGGGGTCACGCTCACGCCCAGGTTCTGGAACAGGCTGCTCACGCCGCCCTGCTCCAGCACCTGGTCCAGGTTGTAGCCGGCGGTCTGCCTCCAGTCGCCCACGAAGTCCTCCAGGGTGAACACGGCCTCCTCGAAGCTGCACTTCTCCTCCATGCACTCCCTCTCCAGGTTGCCCTGCACGAACTCCTCCAGCTTGCCGCTGTTGTACCTCTTGGGCCTGTTCAGGATCTTGTTGGCGTTCTCGTGGTCCAGGAA
P00450 서열 번호: 289
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTAGATCTACTAGTtaggtcagtgaagagaagaacaaaaagcagcatattacagttagttgtcttcatcaatctttaaatatgttgtgtggtttttctctccctgtttccacagttGAGGACCCCCAGGGCGACGCCGCCCAGAAGACCGACACCAGCCACCACGACCAGGACCACCCCACCTTCAACAAGATCACCCCCAACCTGGCCGAGTTCGCCTTCAGCCTGTACAGGCAGCTGGCCCACCAGAGCAACAGCACCAACATCTTCTTCAGCCCCGTGAGCATCGCCACCGCCTTCGCCATGCTGAGCCTGGGCACCAAGGCCGACACCCACGACGAGATCCTGGAGGGCCTGAACTTCAACCTGACCGAGATCCCCGAGGCCCAGATCCACGAGGGCTTCCAGGAGCTGCTGAGGACCCTGAACCAGCCCGACAGCCAGCTGCAGCTGACCACCGGCAACGGCCTGTTCCTGAGCGAGGGCCTGAAGCTGGTGGACAAGTTCCTGGAGGACGTGAAGAAGCTGTACCACAGCGAGGCCTTCACCGTGAACTTCGGCGACACCGAGGAGGCCAAGAAGCAGATCAACGACTACGTGGAGAAGGGCACCCAGGGCAAGATCGTGGACCTGGTGAAGGAGCTGGACAGGGACACCGTGTTCGCCCTGGTGAACTACATCTTCTTCAAGGGCAAGTGGGAGAGGCCCTTCGAGGTGAAGGACACCGAGGAGGAGGACTTCCACGTGGACCAGGTGACCACCGTGAAGGTGCCCATGATGAAGAGGCTGGGCATGTTCAACATCCAGCACTGCAAGAAGCTGAGCAGCTGGGTGCTGCTGATGAAGTACCTGGGCAACGCCACCGCCATCTTCTTCCTGCCCGACGAGGGCAAGCTGCAGCACCTGGAGAACGAGCTGACCCACGACATCATCACCAAGTTCCTGGAGAACGAGGACAGGAGGAGCGCCAGCCTGCACCTGCCCAAGCTGAGCATCACCGGCACCTACGACCTGAAGAGCGTGCTGGGCCAGCTGGGCATCACCAAGGTGTTCAGCAACGGCGCCGACCTGAGCGGCGTGACCGAGGAGGCCCCCCTGAAGCTGAGCAAGGCCGTGCACAAGGCCGTGCTGACCATCGACGAGAAGGGCACCGAGGCCGCCGGCGCCATGTTCCTGGAGGCCATCCCCATGAGCATCCCCCCCGAGGTGAAGTTCAACAAGCCCTTCGTGTTCCTGATGATCGAGCAGAACACCAAGAGCCCCCTGTTCATGGGCAAGGTGGTGAACCCCACCCAGAAGTAACAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTggggataccccctagagccccagctggttctttccgcctcagaagccatagagcccaccgcatccccagcatgcctgctattgtcttcccaatcctcccccttgctgtcctgccccaccccaccccccagaatagaatgacacctactcagacaatgcgatgcaatttcctcattttattaggaaaggacagtgggagtggcaccttccagggtcaaggaaggcacgggggaggggcaaacaacagatggctggcaactagaaggcacagtcgaggttaTTTTTGGGTGGGATTCACCACTTTTCCCATGAAGAGGGGAGACTTGGTATTTTGTTCAATCATTAAGAAGACAAAGGGTTTGTTGAACTTGACCTCGGGGGGGATAGACATGGGTATGGCCTCTAAAAACATGGCCCCAGCAGCTTCAGTCCCTTTCTCGTCGATGGTCAGCACAGCCTTATGCACGGCCTTGGAGAGCTTCAGGGGTGCCTCCTCTGTGACCCCGGAGAGGTCAGCCCCATTGCTGAAGACCTTAGTGATGCCCAGTTGACCCAGGACGCTCTTCAGATCATAGGTTCCAGTAATGGACAGTTTGGGTAAATGTAAGCTGGCAGACCTTCTGTCTTCATTTTCCAGGAACTTGGTGATGATATCGTGGGTGAGTTCATTTTCCAGGTGCTGTAGTTTCCCCTCATCAGGCAGGAAGAAGATGGCGGTGGCATTGCCCAGGTATTTCATCAGCAGCACCCAGCTGGACAGCTTCTTACAGTGCTGGATGTTAAACATGCCTAAACGCTTCATCATAGGCACCTTCACGGTGGTCACCTGGTCCACGTGGAAGTCCTCTTCCTCGGTGTCCTTGACTTCAAAGGGTCTCTCCCATTTGCCTTTAAAGAAGATGTAATTCACCAGAGCAAAAACTGTGTCTCTGTCAAGCTCCTTGACCAAATCCACAATTTTCCCTTGAGTACCCTTCTCCACGTAATCGTTGATCTGTTTCTTGGCCTCTTCGGTGTCCCCGAAGTTGACAGTGAAGGCTTCTGAGTGGTACAACTTTTTAACATCCTCCAAAAACTTATCCACTAGCTTCAGGCCCTCGCTGAGGAACAGGCCATTGCCGGTGGTCAGCTGGAGCTGGCTGTCTGGCTGGTTGAGGGTACGGAGGAGTTCCTGGAAGCCTTCATGGATCTGAGCCTCCGGAATCTCCGTGAGGTTGAAATTCAGGCCCTCCAGGATTTCATCGTGAGTGTCAGCCTTGGTCCCCAGGGAGAGCATTGCAAAGGCTGTAGCGATGCTCACTGGGGAGAAGAAGATATTGGTGCTGTTGGACTGGTGTGCCAGCTGGCGGTATAGGCTGAAGGCGAACTCAGCCAGGTTGGGGGTGATCTTGTTGAAGGTTGGGTGATCCTGATCATGGTGGGATGTATCTGTCTTCTGGGCAGCATCTCCCTGGGGATCCTCaactgtggaaacagggagagaaaaaccacacaacatatttaaagattgatgaagacaactaactgtaatatgctgctttttgttcttctcttcactgacctaACTAGTAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
알부민 신호 펩티드 서열 서열 번호: 2000
MKWVTFISLLFLFSSAYS
SEQUENCE LISTING <110> INTELLIA THERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING ALPHA-1 ANTITRYPSIN DEFICIENCY <130> 1861884-0002-005-WO1 <140> PCT/US2019/057092 <141> 2019-10-18 <150> 62/747,522 <151> 2018-10-18 <160> 2002 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 709 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gtaagaaatc catttttcta ttgttcaact tttattctat tttcccagta aaataaagtt 60 ttagtaaact ctgcatcttt aaagaattat tttggcattt atttctaaaa tggcatagta 120 ttttgtattt gtgaagtctt acaaggttat cttattaata aaattcaaac atcctaggta 180 aaaaaaaaaa aaggtcagaa ttgtttagtg actgtaattt tcttttgcgc actaaggaaa 240 gtgcaaagta acttagagtg actgaaactt cacagaatag ggttgaagat tgaattcata 300 actatcccaa agacctatcc attgcactat gctttattta aaaaccacaa aacctgtgct 360 gttgatctca taaatagaac ttgtatttat atttattttc attttagtct gtcttcttgg 420 ttgctgttga tagacactaa aagagtatta gatattatct aagtttgaat ataaggctat 480 aaatatttaa taatttttaa aatagtattc ttggtaattg aattattctt ctgtttaaag 540 gcagaagaaa taattgaaca tcatcctgag tttttctgta 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uugucaugua uuucuaaaau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 262 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 262 uuugucaugu auuucuaaaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 263 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 263 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcct 145 <210> 264 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 264 taggtcagtg aagagaagaa caaaaagcag catattacag ttagttgtct tcatcaatct 60 ttaaatatgt tgtgtggttt ttctctccct gtttccacag 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1042 gagccuccgg aaucuccgug 20 <210> 1043 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1043 ccggaggcuc agauccauga 20 <210> 1044 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1044 ugaggguacg gaggaguucc 20 <210> 1045 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1045 cuggcugguu gaggguacgg 20 <210> 1046 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1046 cuggcugucu ggcugguuga 20 <210> 1047 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1047 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1074 uccccucucu ccaggcaaau 20 <210> 1075 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1075 cucggugucc uugacuucaa 20 <210> 1076 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1076 cuuugaaguc aaggacaccg 20 <210> 1077 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1077 cacguggaag uccucuuccu 20 <210> 1078 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1078 cgaggaagag gacuuccacg 20 <210> 1079 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1079 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<400> 1990 000 <210> 1991 <400> 1991 000 <210> 1992 <400> 1992 000 <210> 1993 <400> 1993 000 <210> 1994 <400> 1994 000 <210> 1995 <400> 1995 000 <210> 1996 <400> 1996 000 <210> 1997 <400> 1997 000 <210> 1998 <400> 1998 000 <210> 1999 <400> 1999 000 <210> 2000 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2000 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser <210> 2001 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2001 gaguccgagc agaagaagaa 20 <210> 2002 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2002 gacccccucc accccgccuc 20

Claims (123)

  1. 다음을 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 SERPINA1 핵산을 세포 또는 세포들의 집단에 도입시키는, SERPINA1 핵산을 세포 또는 세포들의 집단에 도입하는 방법:
    i) 이종 AAT 단백질 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조체;
    ii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및
    iii) 다음에서 선택된 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA (gRNA):
    a) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열;
    b) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드;
    c) 서열 번호: 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 및 97로 구성된 그룹에서 선택된 서열;
    d) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열;
    e) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드;
    f) 서열 번호: 34-97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; 및
    g) 서열 번호: 2-33에 대해 열거된 게놈 좌표들의 15개 연속 뉴클레오티드 +/- 10개 뉴클레오티드에 상보적인 서열.
  2. 다음을 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 필요로 하는 대상체에서 AAT를 발현시키는, 필요로 하는 대상체에서 AAT를 발현시키는 방법:
    i) 이종 AAT 단백질 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조체;
    ii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및
    iii) 다음에서 선택된 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA (gRNA):
    a) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열;
    b) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드;
    c) 서열 번호: 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 및 97로 구성된 그룹에서 선택된 서열;
    d) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열;
    e) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드;
    f) 서열 번호: 34-97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; 및
    g) 서열 번호: 2-33에 대해 열거된 게놈 좌표들의 15개 연속 뉴클레오티드 +/- 10개 뉴클레오티드에 상보적인 서열.
  3. 다음을 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 대상체에서 알파-1 항트립신 결핍증 (AATD)을 치료하는, AAT 단백질을 필요로 하는 대상체에서 AATD를 치료하는 방법:
    i) 이종 AAT 단백질 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조체;
    ii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및
    iii) 다음에서 선택된 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA (gRNA):
    a) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열;
    b) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드;
    c) 서열 번호: 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 및 97로 구성된 그룹에서 선택된 서열;
    d) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열;
    e) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드;
    f) 서열 번호: 34-97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; 및
    g) 서열 번호: 2-33에 대해 열거된 게놈 좌표들의 15개 연속 뉴클레오티드 +/- 10개 뉴클레오티드에 상보적인 서열.
  4. 다음을 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 간 세포 또는 세포들의 집단으로부터 AAT 분비를 증가시키는, 간 세포 또는 세포들의 집단으로부터 AAT 분비를 증가시키는 방법:
    i) 이종 AAT 단백질 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조체;
    ii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및
    iii) 다음에서 선택된 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA (gRNA):
    a) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열;
    b) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드;
    c) 서열 번호: 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 및 97로 구성된 그룹에서 선택된 서열;
    d) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열;
    e) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드;
    f) 서열 번호: 34-97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; 및
    g) 서열 번호: 2-33에 대해 열거된 게놈 좌표들의 15개 연속 뉴클레오티드 +/- 10개 뉴클레오티드에 상보적인 서열.
  5. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 내인성 SERPINA1 유전자 내부에서 이중-가닥 절단 (DSB)을 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 내인성 SERPINA1 유전자를 변형시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 청구항 5 또는 6에 있어서, DSB는 내인성 SERPINA1 유전자 내부에서 유도되며 및/또는 내인성 SERPINA1 유전자는 이종 AAT 단백질 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조체, RNA-가이드 DNA 결합제, 및 알부민 gRNA를 투여하기 전 또는 후에 변형되는, 방법.
  8. 청구항 1-7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 내인성 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 2, 3, 4, 또는 5에 존재하는 표적 서열에 최소한 부분적으로 상보적인 SERPINA1 가이드 RNA를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, SERPINA1 가이드 RNA는 서열 번호: 1000-1128에서 선택된 가이드 서열 또는 서열 번호: 1000-1128에서 선택된 서열의 17, 18, 19, 및/또는 20개 연속 뉴클레오티드에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 가이드 서열을 포함하는, 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 방법은 RNA-가이드 DNA 결합제를 SERPINA1 가이드 RNA와 함께 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, 비-상동 말단 연결 (NHEJ)은 내인성 SERPINA1 유전자에서 DSB의 복구 중 돌연변이를 초래하는, 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, NHEJ는 내인성 SERPINA1 유전자에서 DSB의 복구 중 뉴클레오티드(들)의 결실 또는 삽입을 초래하는, 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 뉴클레오티드(들)의 삽입 또는 결실은 내인성 SERPINA1 유전자에서 프레임 이동 또는 넌센스 돌연변이를 유도하는, 방법.
  14. 청구항 1-13 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 시험관내인, 방법.
  15. 청구항 1-13 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 생체내인, 방법.
  16. 청구항 1-15 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 gRNA는 다음에서 선택된 서열을 포함하는 가이드 서열을 포함하는, 방법:
    a) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열;
    b) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드;
    c) 서열 번호: 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 및 97로 구성된 그룹에서 선택된 서열.
  17. 청구항 1-16 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구조체는 핵산 벡터 및/또는 지질 나노입자로 투여되는, 방법.
  18. 청구항 1-17 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드 DNA 결합제 및/또는 알부민 gRNA는 핵산 벡터 및/또는 지질 나노입자로 투여되는, 방법.
  19. 청구항 1-18 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드 DNA 결합제 및/또는 SERPINA1 gRNA는 핵산 벡터 및/또는 지질 나노입자로 투여되는, 방법.
  20. 청구항 17-19 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 벡터는 바이러스 벡터인, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로 구성된 그룹에서 선택되는, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV2/8, AAVrh10, AAVLK03, AV10, AAV11, AAV12, rh10, 및 이의 하이브리드로 구성된 그룹에서 선택되는, 방법.
  23. 청구항 1-22 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구조체, RNA-가이드 DNA 결합제, 알부민 gRNA, 및 SERPINA1 gRNA는 순차적으로, 임의의 순서로 및/또는 임의의 조합으로 투여되는, 방법.
  24. 청구항 1-23 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구조체, RNA-가이드 DNA 결합제, 알부민 gRNA, 및 SERPINA1 gRNA는, 개별적으로 또는 임의의 조합으로, 동시에 투여되는, 방법.
  25. 청구항 1-24 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드 DNA 결합제, 또는 조합된 RNA-가이드 DNA 결합제 및 알부민 gRNA는, 핵산 구조체 투여 이전에 투여되는, 방법.
  26. 청구항 1-25 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구조체는 알부민 gRNA 및/또는 RNA-가이드 DNA 결합제 투여 이전에 투여되는, 방법.
  27. 청구항 1-26 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드 DNA 결합제는 클래스 2 Cas 뉴클레아제인, 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제인, 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, Cas9 뉴클레아제는 S. 피오게네스 Cas9 뉴클레아제인, 방법.
  30. 청구항 28-30 중 어느 한 항에 있어서, Cas 뉴클레아제는 클리브아제인, 방법.
  31. 청구항 28-30 중 어느 한 항에 있어서, Cas 뉴클레아제는 닉카제인, 방법.
  32. 청구항 1-31 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구조체는 양방향 핵산 구조체인, 방법.
  33. 청구항 1-32 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구조체는 단일-가닥 또는 이중-가닥인, 방법.
  34. 청구항 1-33 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구조체는 단일-가닥 DNA 또는 이중-가닥 DNA인, 방법.
  35. 청구항 1-34 중 어느 한 항에 있어서, 양방향 구조체는 이종 AAT 단백질의 발현을 구동시키는 프로모터를 포함하지 않는, 방법.
  36. 청구항 21-35에 있어서, 대상체의 기능적 AAT 수준은 최소한 약 500 μg/ml까지 증가되는, 방법.
  37. 청구항 1-35 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 기능적 AAT 수준은 투여 전 대상체의 기능적 AAT 수준에 비해, 최소한 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 그 이상만큼 증가되는, 방법.
  38. 청구항 36 또는 37에 있어서, AAT 수준은 혈청, 혈장, 혈액, 대뇌척수액, 및/또는 가래에서 측정되는, 방법.
  39. 청구항 1-38 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 세포들의 집단은 기능적 AAT를 투여 전 수준에 비해 최소한 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 그 이상만큼 증가된 수준으로 발현시키는, 방법.
  40. 청구항 1-39 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 세포들의 집단은 AAT를 발현시킬 수 있는, 방법.
  41. 청구항 40에 있어서, AAT를 발현할 수 있는 세포 또는 세포들의 집단은, 간, 폐, 소화 기관, 신장, 위, 근위 및 원위 소장, 췌장, 부신 또는 뇌 중 어느 하나 이상의 조직에서 유래하는, 방법.
  42. 청구항 4, 5, 8-37, 또는 41 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 세포들의 집단은 간 세포 (예를 들어, 헤파토사이트) 또는 폐 세포를 포함하는, 방법.
  43. 청구항 42에 있어서, 간 세포는 헤파토사이트인, 방법.
  44. 청구항 1-43 중 어느 한 항에 있어서, 간에서 AAT 축적은 감소되는, 방법.
  45. 청구항 1-44 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구조체는 야생형 AAT 단백질을 인코딩하는 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 방법.
  46. 이종 AAT 단백질 코딩 서열을 포함하는 양방향 핵산 구조체를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함함으로써, 대상체에서 AAT를 발현시키는, 대상체에서 AAT를 발현시키는 방법.
  47. 이종 AAT 단백질 코딩 서열을 포함하는 양방향 핵산 구조체를 투여하는 단계를 포함함으로써, AAT 단백질을 필요로 하는 대상체에서 알파-1 항트립신 결핍증 (AATD)를 치료하는, 대상체에서 AATD를 치료하는 방법.
  48. 이종 AAT 단백질 코딩 서열을 포함하는 양방향 핵산 구조체를 세포 또는 세포들의 집단에 투여하는 단계를 포함함으로써, 세포 또는 세포들의 집단에서 AAT를 발현시키는, AAT를 세포 또는 세포들의 집단에서 발현시키는 방법.
  49. 이종 AAT 단백질 코딩 서열을 포함하는 양방향 핵산 구조체를 간 세포 또는 세포들의 집단에 투여하는 단계를 포함함으로써, 상기 세포 또는 세포들의 집단으로부터 AAT 분비를 증가시키는, 간 세포 또는 세포들의 집단으로부터 AAT 분비를 증가시키는 방법.
  50. 청구항 46-49 중 어느 한 항에 있어서, 양방향 핵산 구조체는 다음을 포함하는, 방법:
    a) 이종 AAT에 대한 코딩 서열을 포함하는 제 1 세그먼트; 및
    b) 상기 이종 AAT의 코딩 서열의 역 상보체를 포함하는 제 2 세그먼트,
    이 때 구조체는 이종 AAT의 발현을 구동시키는 프로모터를 포함하지 않음.
  51. 청구항 46-49 중 어느 한 항에 있어서, 양방향 핵산 구조체는 다음을 포함하는, 방법:
    a) 이종 AAT에 대한 코딩 서열을 포함하는 제 1 세그먼트; 및
    b) 제 2 폴리펩티드의 코딩 서열의 역 상보체를 포함하는 제 2 세그먼트,
    이 때 구조체는 이종 AAT 및/또는 제 2 폴리펩티드의 발현을 구동시키는 프로모터를 포함하지 않음.
  52. 청구항 46-51 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드 DNA 결합제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  53. 청구항 46-52 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 gRNA를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  54. 청구항 46-53 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 내인성 SERPINA1 유전자 내부에서 이중-가닥 절단 (DSB)을 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  55. 청구항 46-54 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 내인성 SERPINA1 유전자를 변형시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  56. 청구항 46-55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 내인성 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 2, 3, 4, 또는 5에 존재하는 표적 서열에 최소한 부분적으로 상보적인 SERPINA1 가이드 RNA를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  57. 청구항 56에 있어서, SERPINA1 가이드 RNA는 서열 번호: 1000-1128에서 선택된 가이드 서열 또는 서열 번호: 1000-1128에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 가이드 서열을 포함하는, 방법.
  58. 청구항 54-57 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 RNA-가이드 DNA 결합제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  59. 청구항 54-58 중 어느 한 항에 있어서, 비-상동 말단 연결 (NHEJ)은 내인성 SERPINA1 유전자에서 DSB의 복구 중 돌연변이를 초래하는, 방법.
  60. 청구항 59에 있어서, NHEJ는 내인성 SERPINA1 유전자에서 DSB의 복구 중 뉴클레오티드(들)의 결실 또는 삽입을 초래하는, 방법.
  61. 청구항 60에 있어서, 뉴클레오티드(들)의 결실 또는 삽입은 내인성 SERPINA1 유전자에서 프레임 이동 또는 넌센스 돌연변이를 유도하는, 방법.
  62. 청구항 46-61 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 시험관내인, 방법.
  63. 청구항 46-61 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 생체내인, 방법.
  64. 청구항 46-63 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 gRNA는 다음에서 선택된 서열을 포함하는 가이드 서열을 포함하는, 방법:
    a) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열;
    b) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드;
    c) 서열 번호: 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 및 97로 구성된 그룹에서 선택된 서열.
  65. 청구항 46-64 중 어느 한 항에 있어서, 양방향 구조체는 핵산 벡터 및/또는 지질 나노입자로 투여되는, 방법.
  66. 청구항 46-65 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드 DNA 결합제 및/또는 알부민 gRNA는 핵산 벡터 및/또는 지질 나노입자로 투여되는, 방법.
  67. 청구항 46-66 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드 DNA 결합제 및/또는 SERPINA1 gRNA는 핵산 벡터 및/또는 지질 나노입자로 투여되는, 방법.
  68. 청구항 46-67 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 벡터는 바이러스 벡터인, 방법.
  69. 청구항 68에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로 구성된 그룹에서 선택되는, 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV2/8, AAVrh10, AAVLK03, AV10, AAV11, AAV12, rh10, 및 이의 하이브리드로 구성된 그룹에서 선택되는, 방법.
  71. 청구항 46-70 중 어느 한 항에 있어서, 양방향 구조체, RNA-가이드 DNA 결합제, 알부민 gRNA, 및 SERPINA1 gRNA는 순차적으로, 임의의 순서로 및/또는 임의의 조합으로 투여되는, 방법.
  72. 청구항 46-70 중 어느 한 항에 있어서, 양방향 구조체, RNA-가이드 DNA 결합제, 알부민 gRNA, 및 SERPINA1 gRNA는, 개별적으로 또는 임의의 조합으로, 동시에 투여되는, 방법.
  73. 청구항 46-70 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드 DNA 결합제, 또는 조합된 RNA-가이드 DNA 결합제 및 알부민 gRNA는, 핵산 구조체 투여 이전에 투여되는, 방법.
  74. 청구항 46-70 중 어느 한 항에 있어서, 양방향 구조체는 알부민 gRNA 및/또는 RNA-가이드 DNA 결합제 투여 이전에 투여되는, 방법.
  75. 청구항 46-74 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드 DNA 결합제는 클래스 2 Cas 뉴클레아제인, 방법.
  76. 청구항 75에 있어서, Cas 뉴클레아제는 Cas9인, 방법.
  77. 청구항 76에 있어서, Cas 뉴클레아제는 S. 피오게네스 Cas9 뉴클레아제인, 방법.
  78. 청구항 75-77 중 어느 한 항에 있어서, Cas 뉴클레아제는 클리브아제인, 방법.
  79. 청구항 75-77 중 어느 한 항에 있어서, Cas 뉴클레아제는 닉카제인, 방법.
  80. 청구항 46-79 중 어느 한 항에 있어서, 양방향 구조체는 단일-가닥 DNA인, 방법.
  81. 청구항 46-80 중 어느 한 항에 있어서, 양방향 구조체는 이중-가닥 DNA인, 방법.
  82. 청구항 46, 47, 또는 50-81 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 기능적 AAT 수준은 최소한 약 500 ug/ml까지 증가되는, 방법.
  83. 청구항 46, 47, 또는 50-81 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 기능적 AAT 수준은 투여 전 대상체의 기능적 AAT 수준에 비해, 최소한 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 그 이상만큼 증가되는, 방법.
  84. 청구항 82 또는 83에 있어서, AAT 수준은 혈청, 혈장, 혈액, 대뇌척수액, 및/또는 가래에서 측정되는, 방법.
  85. 청구항 48-81 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 세포들의 집단은 기능적 AAT를 투여 전 수준에 비해 최소한 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 그 이상만큼 증가된 수준으로 발현시키는, 방법.
  86. 청구항 48-81 또는 85 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 세포들의 집단은 간 세포를 포함하는, 방법.
  87. 청구항 46-86 중 어느 한 항에 있어서, 간에서 AAT 축적은 감소되는, 방법.
  88. 청구항 46-87 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구조체는 야생형 AAT 단백질을 인코딩하는 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 방법.
  89. 다음을 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 대상체에서 알파-1 항트립신 결핍증 (AATD)을 치료하는, AAT 단백질을 필요로 하는 대상체에서 AATD를 치료하는 방법:
    i) SERPINA1의 내인성 발현을 감소시킬 수 있는 유전자 편집 시스템;
    ii) 이종 AAT 단백질 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조체;
    iii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및
    iv) 다음에서 선택된 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA (gRNA):
    a) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 및 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열;
    b) 서열 번호: 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 및 33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드;
    c) 서열 번호: 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 및 97로 구성된 그룹에서 선택된 서열;
    d) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열;
    e) 서열 번호: 2-33으로 구성된 그룹에서 선택된 서열의 최소한 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드;
    f) 서열 번호: 34-97로 구성된 그룹에서 선택된 서열; 및
    g) 서열 번호: 2-33에 대해 열거된 게놈 좌표들의 15개 연속 뉴클레오티드 +/- 10개 뉴클레오티드에 상보적인 서열.
  90. 청구항 88에 있어서, 유전자 편집 시스템은 서열 번호: 1000-1128에서 선택된 가이드 서열 또는 서열 번호: 1000-1128에서 선택된 서열에 최소한 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 가이드 서열을 포함하는 SERPINA1 가이드 RNA를 포함하는, 방법.
  91. 다음을 포함하는 양방향 핵산 구조체:
    a) AAT 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함하는 제 1 세그먼트; 및
    b) 상기 AAT 폴리펩티드의 코딩 서열의 역 상보체를 포함하는 제 2 세그먼트,
    이 때 구조체는 상기 AAT 폴리펩티드의 발현을 구동시키는 프로모터를 포함하지 않음.
  92. 청구항 91에 있어서, 제 2 세그먼트는 제 1 세그먼트의 3'에 존재하는, 양방향 핵산 구조체.
  93. 청구항 91-92 중 어느 한 항에 있어서, 헤어핀 형성을 감소시키기 위하여 제 2 세그먼트 내 역 상보체의 코딩 서열은 제 1 세그먼트의 코딩 서열과 상이한 코돈 사용빈도를 채택하는, 양방향 핵산 구조체.
  94. 역 상보체가 다음과 같은, 양방향 구조체:
    a. 제 1 세그먼트의 코딩 서열에 실질적으로 상보적이지 않음;
    b. 제 1 세그먼트의 코딩 서열의 단편에 실질적으로 상보적이지 않음;
    c. 제 1 세그먼트의 코딩 서열에 매우 상보적임;
    d. 제 1 세그먼트의 코딩 서열의 단편에 매우 상보적임;
    e. 제 1 세그먼트의 코딩 서열의 역 상보체에 최소한 60% 동일함;
    f. 제 1 세그먼트의 코딩 서열의 역 상보체에 최소한 70% 동일함;
    f. 제 1 세그먼트의 코딩 서열의 역 상보체에 최소한 90% 동일함;
    g. 제 1 세그먼트의 코딩 서열의 역 상보체에 50-80% 동일함; 및/또는
    h. 제 1 세그먼트의 코딩 서열의 역 상보체에 60-100% 동일함.
  95. 청구항 91-93 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 세그먼트는 제 1 세그먼트의 코딩 서열에 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 또는 약 99% 상보성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 양방향 핵산 구조체.
  96. 청구항 91-94 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 세그먼트의 코딩 서열은 제 1 세그먼트의 코딩 서열에 의해 인코딩되는 하나 이상의 아미노산에 대한 하나 이상의 대체 코돈을 사용하여 AAT 폴리펩티드를 인코딩하는, 양방향 핵산 구조체.
  97. 청구항 91-96 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 세그먼트의 서열은 제 1 세그먼트의 코딩 서열의 역 상보체인, 양방향 핵산 구조체.
  98. 청구항 91-97 중 어느 한 항에 있어서, 구조체는 상동성 아암을 포함하지 않는, 양방향 핵산 구조체.
  99. 청구항 91-98 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 세그먼트는 링커에 의해 제 2 세그먼트에 연결되는, 양방향 핵산 구조체.
  100. 청구항 99에 있어서, 링커는 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 1000, 1500, 2000 뉴클레오티드 길이인, 양방향 핵산 구조체.
  101. 청구항 91-100 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및 제 2 세그먼트 각각은 폴리아데닐화 꼬리 서열을 포함하는, 양방향 핵산 구조체.
  102. 청구항 91-101 중 어느 한 항에 있어서, 구조체는 스플라이스 수용체 부위를 포함하는, 양방향 핵산 구조체.
  103. 청구항 102에 있어서, 구조체는 제 1 세그먼트의 상류에 제 1 스플라이스 수용체 부위 및 제 2 세그먼트의 하류에 제 2 (역) 스플라이스 수용체 부위를 포함하는, 양방향 핵산 구조체.
  104. 청구항 1-103 중 어느 한 항에 있어서, 구조체는 이중-가닥, 선택적으로 이중-가닥 DNA인, 양방향 핵산 구조체.
  105. 청구항 1-104 중 어느 한 항에 있어서, 구조체는 단일-가닥, 선택적으로 단일-가닥 DNA인, 양방향 핵산 구조체.
  106. 청구항 1-105 중 어느 한 항에 있어서, AAT 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 코돈-최적화된, 양방향 핵산 구조체.
  107. 청구항 1-106 중 어느 한 항에 있어서, 구조체는 다음 말단 구조들 중 하나 이상을 포함하는, 양방향 핵산 구조체: 헤어핀, 루프, 역위 말단 반복서열들 (ITR), 또는 토로이드.
  108. 청구항 1-107 중 어느 한 항에 있어서, 구조체는 1, 2, 또는 3개의 역위 말단 반복서열들 (ITR)을 포함하는, 양방향 핵산 구조체.
  109. 청구항 1-108 중 어느 한 항에 있어서, 구조체는 2개 이하의 ITR을 포함하는, 양방향 핵산 구조체.
  110. 청구항 91-109 중 어느 한 항의 구조체를 포함하는 벡터.
  111. 청구항 110에 있어서, 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터인, 벡터.
  112. 청구항 110에 있어서, AAV는 단일-가닥 게놈 (ssAAV) 또는 자기-상보성 게놈 (scAAV)을 포함하는, 벡터.
  113. 청구항 112에 있어서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV2/8, AAVrh10, AAVLK03, AV10, AAV11, AAV12, rh10, 및 이의 하이브리드로 구성된 그룹에서 선택되는, 벡터.
  114. AAT 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 자기-상보성 (또는 이중-가닥) 핵산 구조체를 포함하는 바이러스 벡터로서, 이러한 벡터는 상기 AAT 폴리펩티드의 발현을 구동시키는 프로모터를 포함하지 않는, 바이러스 벡터.
  115. 청구항 114에 있어서, 벡터는 상동성 아암을 포함하지 않는, 벡터.
  116. 청구항 91-109 중 어느 한 항의 구조체를 포함하는 지질 나노입자.
  117. 청구항 91-109 중 어느 한 항의 구조체를 포함하는 숙주 세포.
  118. 전술한 청구항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 숙주 세포.
  119. 청구항 117에 있어서, 숙주 세포는 간 세포인, 숙주 세포.
  120. 청구항 117-119 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 비-분열 세포 유형인, 숙주 세포.
  121. 청구항 117-120 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 양방향 구조체에 의해 인코딩되는 AAT 폴리펩티드를 발현하는, 숙주 세포.
  122. 청구항 117-121 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 헤파토사이트인, 숙주 세포.
  123. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA는 서열 번호: 901을 포함하는, 방법, 구조체 또는 숙주 세포.
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