JP7472121B2 - アルブミン遺伝子座からの導入遺伝子発現のための組成物及び方法 - Google Patents
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Description
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語及び句は、以下の意味を有することを意図する。
A.ガイドRNA(gRNA)を含む組成物
ゲノム遺伝子座、例えば、宿主細胞のセーフハーバー部位内に異種(外因性)遺伝子を挿入及び発現するのに有用な組成物及び方法が本明細書に提供される。特に、本明細書に例示されるように、アルブミン遺伝子座(例えば、イントロン1)における外因性遺伝子の標的化及び挿入は、アルブミンの内因性プロモーターを使用して、外因性遺伝子のロバストな発現を駆動することを可能にする。本開示は、アルブミン遺伝子のイントロン1内の部位を特異的に標的とし、かつ外因性遺伝子の効率的な挿入及び発現を提供するガイドRNAの同定に部分的に基づく。実施例に示され、本明細書にさらに記載されるように、同定されたgRNAが、インデル形成活性により測定された高レベルの編集を媒介する能力は、意外に、例えば、導入遺伝子の発現により測定された導入遺伝子の効率的な挿入を媒介するための同じgRNAの使用と必ずしも相関するものではない。すなわち、著しいレベルのインデル形成を達成することができるある特定のgRNAは、必ずしも効率的な挿入を媒介することができるわけではなく、逆に、低レベルのインデル形成を達成することが示されるいくつかのgRNAは、導入遺伝子の効率的な挿入及び発現を媒介し得る。具体的には、実施例のデータは、インデル形成(編集%とも呼ばれる)を効果的に媒介するgRNAが、挿入編集活性と相関するインデル編集活性を有さなかったことを示す。
表1:ヒトガイドRNA配列及び染色体座標
いくつかの実施形態では、gRNAは、化学修飾されている。1つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むgRNAは、標準的なA、G、C、及びU残基の代わりに、またはそれらに加えて使用される1つ以上の非天然及び/または天然に存在する構成要素または配置の存在を記載するために、「修飾」gRNAまたは「化学修飾」gRNAと呼ばれる。いくつかの実施形態では、修飾gRNAは、非標準的なヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いて合成され、本明細書では「修飾された」と呼ばれる。修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、(i)ホスホジエステル骨格結合における改変、例えば、非架橋のリン酸酸素の1つもしくは両方、及び/または、架橋リン酸酸素の1つ以上の置き換え(例示的な骨格修飾)、(ii)リボース糖の成分、例えば、リボース糖の2’ヒドロキシルの改変、例えば、置き換え(例示的な糖修飾)、(iii)リン酸部分の「脱リン酸型」リンカーによる大規模な置き換え(例示的な骨格修飾)、(iv)非標準的な核酸塩基によるものを含め、天然に存在する核酸塩基の修飾または置き換え(例示的な塩基修飾)、(v)リボースリン酸骨格の置き換えまたは修飾(例示的な骨格修飾)、(vi)オリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置き換え、または部分、キャップ、またはリンカーのコンジュゲーション(そのような3’または5’のキャップ修飾は、糖及び/または骨格の修飾を含み得る)、ならびに(vii)糖の修飾または置き換え(例示的な糖修飾)の1つ以上を含み得る。
表2:sgRNA及びヒトアルブミンガイド配列のsgRNAへの修飾パターン
本明細書に記載されるように、本開示のガイドRNAは、宿主細胞の、セーフハーバー部位などのゲノム遺伝子座内に異種(外因性)遺伝子を挿入及び発現するためのRNAガイドDNA結合剤と組み合わせて使用される。RNAガイドDNA結合剤は、タンパク質、またはmRNAなどのタンパク質をコードする核酸であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、表1からのガイド配列と、RNAガイドDNA結合剤、例えば、Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)などのヌクレアーゼとを含むガイドRNAを含み、リボ核タンパク質複合体を形成する組成物の使用を含む。
本明細書に記載の組成物及び方法は、本開示のガイドRNA及びRNAガイドDNA結合剤によって作成される切断部位に挿入される異種遺伝子をコードする配列を含む核酸構築物の使用を含む。本明細書で使用される場合、そのような構築物は、時に、「ドナー構築物/テンプレート」と称される。構築物は、任意の発現される核酸(すなわち、発現され得る核酸)、例えば、DNA、メッセンジャーRNA(mRNA)、機能性RNA、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、一本鎖RNA(ssRNA)、長鎖非コードRNA、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードし得る。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、野生型ポリペプチドである。
本明細書に開示されるガイドRNAは、当該技術分野で利用可能な様々な既知の好適な方法を使用して、宿主細胞または対象に、インビボまたはエクスビボで送達され得る。ガイドRNAは、本明細書に記載されるように、CasまたはCas9をコードする核酸(例えば、Cas9またはCas9をコードする核酸)などのRNAガイドDNA結合剤、ならびに本開示のガイドRNAによって作成される切断部位に挿入される異種遺伝子をコードする配列を含む構築物と一緒に(個々にまたは組み合わせて)送達され得る。
本明細書に開示されるgRNAならびに関連方法及び組成物は、宿主細胞のヒトアルブミン遺伝子座のイントロン1内に異種(外因性)遺伝子を効率的に挿入するのに有用である。いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞のヒトアルブミン遺伝子座のイントロン1内に異種遺伝子を挿入する方法を提供し、本明細書に記載されるガイドRNA(配列番号2~33のうちのいずれか1つ)、RNAガイドDNA結合剤(例えば、本明細書に記載されるCasヌクレアーゼ)、及び目的の異種ポリペプチドをコードする配列を含むドナー構築物を宿主細胞に(インビボまたはインビトロで)投与することを含む。
本発明はまた、以下に関する。
[項目1]
宿主細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座に異種ポリペプチドをコードする核酸を挿入する方法であって、
i)gRNAであって、
a)配列番号2、8、13、19、28、29、31、32、及び33からなる群から選択される配列と少なくとも95%、90%、85%、80%、または75%同一である配列、
b)配列番号2、8、13、19、28、29、31、32、及び33からなる群から選択される配列の少なくとも17、18、19、または20個の連続ヌクレオチド、
c)配列番号34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96、及び97からなる群から選択される配列、
d)配列番号2~33からなる群から選択される配列と少なくとも95%、90%、85%、80%、または75%同一である配列、
e)配列番号2~33からなる群から選択される配列の少なくとも17、18、19、または20個の連続ヌクレオチド、
f)配列番号34~97からなる群から選択される配列、
g)配列番号2~33について列挙されるゲノム座標の15個の連続ヌクレオチド±10個のヌクレオチドに対して相補的である配列、
h)配列番号98~119からなる群から選択される配列と少なくとも95%、90%、85%、80%、または75%同一である配列、
i)配列番号98~119からなる群から選択される配列の少なくとも17、18、19、または20個の連続ヌクレオチド、ならびに
j)配列番号120~163からなる群から選択される配列
から選択される配列を含む、前記gRNAと、
ii)RNAガイドDNA結合剤と、
iii)前記異種ポリペプチドをコードする核酸を含む構築物と、を投与することを含み、
それにより、前記宿主細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座に前記異種ポリペプチドをコードする核酸を挿入する、
前記方法。
[項目2]
宿主細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座由来の異種ポリペプチドを発現する方法であって、
i)gRNAであって、
a)配列番号2、8、13、19、28、29、31、32、及び33からなる群から選択される配列と少なくとも95%、90%、85%、80%、または75%同一である配列、
b)配列番号2、8、13、19、28、29、31、32、及び33からなる群から選択される配列の少なくとも17、18、19、または20個の連続ヌクレオチド、
c)配列番号34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96、及び97からなる群から選択される配列、
d)配列番号2~33からなる群から選択される配列と少なくとも95%、90%、85%、80%、または75%同一である配列、
e)配列番号2~33からなる群から選択される配列の少なくとも17、18、19、または20個の連続ヌクレオチド、
f)配列番号34~97からなる群から選択される配列、ならびに
g)配列番号2~33について列挙されるゲノム座標の15個の連続ヌクレオチド±10個のヌクレオチドを含む配列
から選択される配列を含む、前記gRNAと、
ii)RNAガイドDNA結合剤と、
iii)前記異種ポリペプチドのコード配列を含む構築物と、を投与することを含み、 それにより、前記宿主細胞または細胞集団において前記異種ポリペプチドを発現する、前記方法。
[項目3]
非分裂細胞型または細胞集団において治療用薬剤を発現する方法であって、
i)gRNAであって、
a)配列番号2、8、13、19、28、29、31、32、及び33からなる群から選択される配列と少なくとも95%、90%、85%、80%、または75%同一である配列、
b)配列番号2、8、13、19、28、29、31、32、及び33からなる群から選択される配列の少なくとも17、18、19、または20個の連続ヌクレオチド、
c)配列番号34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96、及び97からなる群から選択される配列、
d)配列番号2~33からなる群から選択される配列と少なくとも95%、90%、85%、80%、または75%同一である配列、
e)配列番号2~33からなる群から選択される配列の少なくとも17、18、19、または20個の連続ヌクレオチド、
f)配列番号34~97からなる群から選択される配列、ならびに
g)配列番号2~33について列挙されるゲノム座標の15個の連続ヌクレオチド±10個のヌクレオチドを含む配列
から選択される配列を含む、前記gRNAと、
ii)RNAガイドDNA結合剤と、
iii)前記異種ポリペプチドのコード配列を含む構築物と、を投与することを含み、 それにより、前記非分裂細胞型または細胞集団において前記治療用薬剤を発現する、
前記方法。
[項目4]
前記gRNAが、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、及び配列番号33からなる群から選択されるガイド配列を含む、項目1~3のいずれか1項に記載の方法。
[項目5]
前記方法が、インビボで行われる、項目1~4のいずれかに記載の方法。
[項目6]
前記方法が、インビトロで行われる、項目1~4のいずれかに記載の方法。
[項目7]
前記gRNAが、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の上流の領域と結合する、項目1~6のいずれか1項に記載の方法。
[項目8]
前記PAMが、NGG、NNGRRT、NNGRR(N)、NNAGAAW、NNNNG(A/C)TT、及びNNNNRYACから選択される、項目7に記載の方法。
[項目9]
前記gRNAが、デュアルgRNA(dgRNA)である、項目1~8のいずれか1項に記載の方法。
[項目10]
前記gRNAが、シングルgRNA(sgRNA)である、項目1~8のいずれかに記載の方法。
[項目11]
前記sgRNAが、1つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、項目10に記載の方法。
[項目12]
前記RNAガイドDNA結合剤が、Cas9またはCas9をコードする核酸である、項目1~11のいずれか1項に記載の方法。
[項目13]
前記RNAガイドDNA結合剤が、前記RNAガイドDNA結合剤をコードする核酸である、項目1~12のいずれか1項に記載の方法。
[項目14]
前記RNAガイドDNA結合剤をコードする前記核酸が、mRNAである、項目13に記載の方法。
[項目15]
前記mRNAが、修飾mRNAである、項目14に記載の方法。
[項目16]
前記RNAガイドDNA結合剤が、Casヌクレアーゼまたは前記Casヌクレアーゼをコードする核酸である、項目1~15のいずれか1項に記載の方法。
[項目17]
前記Casヌクレアーゼが、クラス2のCasヌクレアーゼである、項目16に記載の方法。
[項目18]
前記Casヌクレアーゼが、S.pyogenesヌクレアーゼ、S.aureusヌクレアーゼ、C.jejuniヌクレアーゼ、S.thermophilusヌクレアーゼ、N.meningitidisヌクレアーゼ、及びそれらのバリアントからなる群から選択される、項目16または17に記載の方法。
[項目19]
前記Casヌクレアーゼが、Cas9である、項目16~18のいずれか1項に記載の方法。
[項目20]
前記Casヌクレアーゼが、S.pyogenes Cas9ヌクレアーゼである、項目19に記載の方法。
[項目21]
前記Casヌクレアーゼが、部位特異的DNA結合活性を有する、項目16~20のいずれか1項に記載の方法。
[項目22]
前記Casヌクレアーゼが、ニッカーゼである、項目16~21のいずれか1項に記載の方法。
[項目23]
前記Casヌクレアーゼが、クリベースである、項目16~21のいずれか1項に記載の方法。
[項目24]
前記Casヌクレアーゼが、ニッカーゼまたはクリベース活性を有しない、項目19~21のいずれか1項に記載の方法。
[項目25]
前記核酸構築物が、相同性非依存性ドナー構築物である、項目19~24のいずれか1項に記載の方法。
[項目26]
前記構築物が、双方向性核酸構築物である、項目1~25のいずれか1項に記載の方法。
[項目27]
前記構築物が、
i.異種ポリペプチドのコード配列を含む第1のセグメント、及び
ii.前記異種ポリペプチドのコード配列の逆相補体を含む第2のセグメント
を含む、項目26に記載の方法。
[項目28]
前記構築物が、ポリアデニル化シグナル配列を含む、項目1~27のいずれか1項に記載の方法。
[項目29]
前記構築物が、スプライスアクセプター部位を含む、項目1~28のいずれか1項に記載の方法。
[項目30]
前記構築物が、相同性アームを含まない、項目1~29のいずれか1項に記載の方法。
[項目31]
前記gRNAが、ベクター及び/または脂質ナノ粒子で投与される、項目1~30のいずれか1項に記載の方法。
[項目32]
前記RNAガイドDNA結合剤が、ベクター及び/または脂質ナノ粒子で投与される、項目1~31のいずれか1項に記載の方法。
[項目33]
前記異種遺伝子を含む前記構築物が、ベクター及び/または脂質ナノ粒子で投与される、項目1~32のいずれか1項に記載の方法。
[項目34]
前記ベクターが、ウイルスベクターである、項目31~33のいずれか1項に記載の方法。
[項目35]
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、項目34に記載の方法。
[項目36]
前記AAVベクターが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV12、rh10、及びそれらのハイブリッドからなる群から選択される、項目35に記載のベクター。
[項目37]
前記gRNA、前記RNAガイドDNA結合剤、及び前記異種ポリペプチドのコード配列を含む前記構築物が、個々にまたは任意の組み合わせで、同時に投与される、項目1~36のいずれか1項に記載の方法。
[項目38]
前記gRNA、前記RNAガイドDNA結合剤、及び前記異種ポリペプチドのコード配列を含む前記構築物が、任意の順序及び/または任意の組み合わせで逐次的に投与される、項目1~36のいずれか1項に記載の方法。
[項目39]
前記RNAガイドDNA結合剤、または組み合わせたRNAガイドDNA結合剤及びgRNAが、前記構築物を提供する前に投与される、項目1~36及び38のいずれか1項に記載の方法。
[項目40]
前記異種ポリペプチドのコード配列を含む前記構築物が、前記gRNA及び/またはRNAガイドDNA結合剤の前に投与される、項目1~36及び38のいずれか1項に記載の方法。
[項目41]
前記双方向性核酸構築物、RNAガイドDNA結合剤、及びgRNAが、任意の組み合わせで、互いに1時間以内に投与される、項目1~40のいずれか1項に記載の方法。
[項目42]
前記異種ポリペプチドが、分泌ポリペプチドである、項目1~41のいずれか1項に記載の方法。
[項目43]
前記遺異種ポリペプチドが、細胞内ポリペプチドである、項目1~41のいずれか1項に記載の方法。
[項目44]
前記細胞が、肝臓細胞である、項目1~43のいずれか1項に記載の方法。
[項目45]
前記肝臓細胞が、肝細胞である、項目44に記載の方法。
[項目46]
前記宿主細胞における前記異種ポリペプチドの発現が、前記gRNA、RNAガイドDNA結合剤、及び前記異種ポリペプチドのコード配列を含む構築物を投与する前に、前記細胞におけるレベルに対して、少なくとも約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、またはそれ以上増加される、項目1~45のいずれか1項に記載の方法。
[項目47]
前記gRNAが、配列番号301または配列番号302を含む、項目1~46のいずれかに記載の方法。
[項目48]
前記gRNAが、RNAガイドDNA結合剤による標的特異的切断を媒介し、アルブミン遺伝子のイントロン1内に前記異種ポリペプチドの前記コード配列の挿入をもたらす、項目1~47のいずれか1項に記載の方法。
[項目49]
前記切断が、前記細胞集団における異種核酸の少なくとも約2%、約5%、または約10%の挿入速度をもたらす、項目1~48のいずれか1項に記載の方法。
[項目50]
前記切断が、前記異種ポリペプチドの前記コード配列の約30~35%、約35~40%、約40~45%、約45~50%、約50~55%、約55~60%、約60~65%、約65~70%、約70~75%、約75~80%、約80~85%、約85~90%、約90~95%、または約95~99%の挿入速度をもたらす、項目49に記載の方法。
[項目51]
RNAガイドDNA結合タンパク質が、S.pyogenes Cas9ヌクレアーゼである、項目1~50のいずれか1項に記載の方法。
[項目52]
前記ヌクレアーゼが、クリバーゼまたはニッカーゼである、項目51に記載の方法。
[項目53]
前記gRNAを含むLNPを投与することをさらに含む、項目1~52のいずれか1項に記載の方法。
[項目54]
前記RNAガイドDNA結合剤をコードするmRNAを含むLNPを投与することをさらに含む、項目1~53のいずれか1項に記載の方法。
[項目55]
前記LNPが、前記gRNAと、前記RNAガイドDNA結合剤をコードする前記mRNAとを含む、項目54に記載の方法。
[項目56]
前記gRNA及び前記RNAガイドDNA結合タンパク質が、RNPとして投与される、項目1~55のいずれか1項に記載の方法。
[項目57]
前記構築物が、ベクターを介して投与される、項目53~56のいずれか1項に記載の方法。
[項目58]
項目1~57のいずれか1項に記載の方法によって作製される宿主細胞。
[項目59]
宿主細胞のアルブミン遺伝子座のイントロン1内に組み込まれた異種ポリペプチドをコードする双方向性核酸構築物を含む宿主細胞。
[項目60]
前記宿主細胞が、肝臓細胞である、項目58または59に記載の宿主細胞。
[項目61]
前記肝臓細胞が、肝細胞である、項目58~60のいずれか1項に記載の宿主細胞。
[項目62]
前記RNAガイドDNA結合剤が、RNAガイドDNA結合剤をコードする核酸である、項目1~61のいずれか1項に記載の方法または宿主細胞。
[項目63]
前記RNAガイドDNA結合剤が、Casヌクレアーゼである、項目1~62のいずれか1項に記載の方法または宿主細胞。
[項目64]
前記RNAガイドDNA結合剤が、Casヌクレアーゼをコードする核酸である、項目1~63のいずれか1項に記載の方法または宿主細胞。
[項目65]
前記RNAガイドDNA結合剤が、CasヌクレアーゼをコードするmRNAである、項目1~64のいずれか1項に記載の方法または宿主細胞。
[項目66]
前記mRNAが、修飾mRNAである、項目65に記載の方法または宿主細胞。
[項目67]
前記Casヌクレアーゼが、クラス2のCasヌクレアーゼである、項目63~66のいずれか1項に記載の方法または宿主細胞。
[項目68]
前記Casヌクレアーゼが、Cas9である、項目63~67のいずれか1項に記載の方法または組成物。
[項目69]
前記Casヌクレアーゼが、S.pyogenesヌクレアーゼ、S.aureusヌクレアーゼ、C.jejuniヌクレアーゼ、S.thermophilusヌクレアーゼ、N.meningitidisヌクレアーゼ、及びそれらのバリアントからなる群から選択される、項目63~68のいずれか1項に記載の方法または組成物。
[項目70]
前記Casヌクレアーゼが、S.pyogenes Cas9ヌクレアーゼまたはそのバリアントである、項目69に記載の方法または組成物。
[項目71]
前記Casヌクレアーゼが、部位特異的DNA結合活性を有する、項目63~70のいずれか1項に記載の方法または組成物。
[項目72]
前記Casヌクレアーゼが、ニッカーゼである、項目63~71のいずれか1項に記載の方法または組成物。
[項目73]
前記Casヌクレアーゼが、クリベースである、項目63~72のいずれか1項に記載の方法または組成物。
[項目74]
前記Casヌクレアーゼが、ニッカーゼまたはクリベース活性を有しない、項目63~73のいずれか1項に記載の方法。
[項目75]
異種ポリペプチド活性または異種ポリペプチドレベルの正常に対して少なくとも約1%、例えば、正常に対して少なくとも約5%を達成することをさらに含む、項目1~74のいずれか1項に記載の方法。
[項目76]
前記異種ポリペプチド活性または異種ポリペプチドレベルが、正常に対して約500%未満である、項目1~75のいずれか1項に記載の方法。
[項目77]
異種ポリペプチド活性または異種ポリペプチドレベルの正常に対して少なくとも約1%~300%を達成することをさらに含む、項目1~76のいずれか1項に記載の方法。
[項目78]
長期的な効果、例えば、個体において少なくとも1ヶ月、2ヶ月、6ヶ月、1年、または2年の効果を達成することをさらに含む、項目5~77のいずれか1項に記載のインビボ方法。
[項目79]
前記個体の循環アルブミンレベルが、前記核酸構築物の投与から少なくとも1ヶ月、2ヶ月、6ヶ月、または1年後に正常である、項目5~78のいずれか1項に記載のインビボ方法。
[項目80]
前記個体の循環アルブミンレベルが、前記双方向性核酸構築物の投与から4週間後で維持される、項目5~79のいずれか1項に記載のインビボ方法。
[項目81]
前記個体の循環アルブミンレベルが一時的に低下し、次いで、正常に戻る、項目5~80のいずれか1項に記載のインビボ方法。
[項目82]
前記ガイドRNAが、配列番号2~33からなる群から選択される配列の少なくとも17、18、19、または20個の連続ヌクレオチドを含む、項目1~81のいずれか1項に記載の方法。
[項目83]
前記ガイドRNAが、配列番号2~33からなる群から選択される配列と少なくとも95%、90%、85%、80%、または75%同一である配列を含む、項目1~82のいずれか1項に記載の方法。
[項目84]
前記ガイドRNAが、配列番号2~33からなる群から選択される配列を含む、項目1~83のいずれか1項に記載の方法。
[項目85]
前記ガイドRNAが、配列番号301または302を含む、項目1~84のいずれか1項に記載の方法または宿主細胞。
[項目86]
前記ガイドRNAが、配列番号2の核酸配列を含む、項目1~85のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目87]
前記ガイドRNAが、配列番号3の核酸配列を含む、項目1~86のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目88]
前記ガイドRNAが、配列番号4の核酸配列を含む、項目1~87のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目89]
前記ガイドRNAが、配列番号5の核酸配列を含む、項目1~88のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目90]
前記ガイドRNAが、配列番号6の核酸配列を含む、項目1~89のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目91]
前記ガイドRNAが、配列番号7の核酸配列を含む、項目1~90のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目92]
前記ガイドRNAが、配列番号8の核酸配列を含む、項目1~91のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目93]
前記ガイドRNAが、配列番号9の核酸配列を含む、項目1~92のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目94]
前記ガイドRNAが、配列番号10の核酸配列を含む、項目1~93のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目95]
前記ガイドRNAが、配列番号11の核酸配列を含む、項目1~94のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目96]
前記ガイドRNAが、配列番号12の核酸配列を含む、項目1~95のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目97]
前記ガイドRNAが、配列番号13の核酸配列を含む、項目1~96のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目98]
前記ガイドRNAが、配列番号14の核酸配列を含む、項目1~97のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目99]
前記ガイドRNAが、配列番号15の核酸配列を含む、項目1~98のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目100]
前記ガイドRNAが、配列番号16の核酸配列を含む、項目1~99のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目101]
前記ガイドRNAが、配列番号17の核酸配列を含む、項目1~100のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目102]
前記ガイドRNAが、配列番号18の核酸配列を含む、項目1~101のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目103]
前記ガイドRNAが、配列番号19の核酸配列を含む、項目1~102のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目104]
前記ガイドRNAが、配列番号20の核酸配列を含む、項目1~103のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目105]
前記ガイドRNAが、配列番号21の核酸配列を含む、項目1~104のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目106]
前記ガイドRNAが、配列番号22の核酸配列を含む、項目1~105のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目107]
前記ガイドRNAが、配列番号23の核酸配列を含む、項目1~106のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目108]
前記ガイドRNAが、配列番号24の核酸配列を含む、項目1~107のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目109]
前記ガイドRNAが、配列番号25の核酸配列を含む、項目1~108のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目110]
前記ガイドRNAが、配列番号26の核酸配列を含む、項目1~109のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目111]
前記ガイドRNAが、配列番号27の核酸配列を含む、項目1~110のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目112]
前記ガイドRNAが、配列番号28の核酸配列を含む、項目1~111のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目113]
前記ガイドRNAが、配列番号29の核酸配列を含む、項目1~112のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目114]
前記ガイドRNAが、配列番号30の核酸配列を含む、項目1~113のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目115]
前記ガイドRNAが、配列番号31の核酸配列を含む、項目1~114のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目116]
前記ガイドRNAが、配列番号32の核酸配列を含む、項目1~115のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
[項目117]
前記ガイドRNAが、配列番号33の核酸配列を含む、項目1~116のいずれか1項に記載の方法及び組成物。
クローニング及びプラスミド調製
AAV2 ITRに隣接する双方向性挿入構築物を合成し、商業的ベンダーによってpUC57-Kanにクローニングした。得られた構築物(P00147)を、他のベクターの親クローニングベクターとして使用した。他の挿入構築物(ITRを含まない)も商業的に合成し、pUC57にクローニングした。精製したプラスミドをBglII制限酵素(New England BioLabs、カタログ番号R0144S)で消化し、挿入構築物を親ベクターにクローニングした。プラスミドをStbl3(商標)Chemically Competent E.coli(Thermo Fisher、カタログ番号C737303)中で増殖させた。
HEK293細胞におけるトリプルトランスフェクションを使用して、AAV8及びAAV-DJ生成のための目的の構築物と共にゲノムをパッケージングし、得られたベクターを、イオジキサノール勾配超遠心分離法により溶解細胞及び培養培地の両方から精製した(例えば、Lock et al.,Hum Gene Ther.2010 Oct;21(10):1259-71を参照されたい)。目的の構築物を有するゲノムを含んだトリプルトランスフェクションで使用されるプラスミドは、実施例において「PXXXX」数で参照され、例えば、表9も参照されたい。単離したAAVを貯蔵緩衝液(0.001%Pluronic F68を含むPBS)中で透析した。ITR領域内に位置するプライマー/プローブを使用して、qPCRによってAAV力価を決定した。
N1-メチルプソイド-Uを含むキャップされたポリアデニル化Streptococcus pyogenes(「Spy」)Cas9 mRNAを、直鎖状化プラスミドDNAテンプレート及びT7 RNAポリメラーゼを使用してインビトロ転写によって生成した。一般に、T7プロモーター及び100ntポリ(A/T)領域を含むプラスミドDNAを、37℃でXbaIと共にインキュベートし、消化を完了させ、続いて、65℃でXbaIの熱不活性化を完了させることによって直鎖状化した。直鎖状化プラスミドを、酵素及び緩衝塩から精製した。Cas9修飾mRNAを生成するためのIVT反応物を、37℃で4時間、以下の条件でインキュベートした:50ng/μLの直鎖状化プラスミド、各2mMのGTP、ATP、CTP、及びN1-メチルシュードUTP(Trilink)、10mMのARCA(Trilink)、5U/μLのT7 RNAポリメラーゼ(NEB)、1U/μLのマウスRnase阻害剤(NEB)、0.004U/μLの無機E.coliピロホスファターゼ(NEB、ならびに1倍反応緩衝液。TURBO Dnase(ThermoFisher)を、最終濃度が0.01U/μLになるように添加し、反応物をさらに30分間インキュベートしてDNAテンプレートを除去した。MegaClear Transcription Clean-upキットを使用し、製造者のプロトコル(ThermoFisher)に従って、Cas9 mRNAを精製した。あるいは、Cas9 mRNAをLiCl沈殿、酢酸アンモニウム沈殿、及び酢酸ナトリウム沈殿を使用して、またはLiCl沈殿法を使用して精製し、続いて、タンジェント流濾過によりさらなる精製を行った。転写物濃度を、260nmでの光吸光度を測定することによって決定し(Nanodrop)、転写物をBioanlayzer(Agilent)によるキャピラリー電気泳動によって分析した。
Cas9 mRNA及びgRNAを、3-((4,4-ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)-2-((((3-(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピル(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノエート)とも呼ばれる、イオン性脂質((9Z,12Z)-3-((4,4-ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)-2-((((3-(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピルオクタデカ-9,12-ジエノエート、コレステロール、DSPC、及びPEG2k-DMGを含む脂質製剤を利用して、細胞及び動物に送達した。
Hepa1-6細胞
Hepa1-6細胞を、96ウェルプレート中に10,000細胞/ウェルの密度で播種した。24時間後、細胞をLNP及びAAVで処理した。処理前に、培地をウェルから吸引した。LNPを、DMEM+10%FBS培地中で4ng/ulに希釈し、さらに、10%FBS(DMEM中)中で2ng/ulに希釈し、37℃で10分間(5%FBSの最終濃度で)インキュベートした。AAVの標的MOIは1e6であり、DMEM+10%FBS培地中で希釈した。2ng/ulで50μlの上記希釈LNPを細胞に添加し(合計100ngのRNAカーゴを送達する)、続いて、50μlのAAVを添加した。LNP及びAAVの処理は、数分間隔であった。細胞中の培地の総体積は100μlであった。処理後72時間及び処理後30日後、これらの処理した細胞からの上清を、以下に記載されるように、ヒトFIX ELISA分析のために収集した。
初代マウス肝細胞(PMH)、初代カニクイザル肝細胞(PCH)、及び初代ヒト肝細胞(PHH)を解凍し、追加物質(ThermoFisher)を含む肝細胞解凍培地に再懸濁させ、続いて、遠心分離した。上清を廃棄し、ペレット化細胞を肝細胞播種培地及びサプリメントパック(ThermoFisher)に再懸濁した。細胞を計数し、PHHについては33,000細胞/ウェル、PCHについては50,000細胞/ウェル、及びPMHについては15,000細胞/ウェルの密度でBio-coat collagen Iでコーティングした96ウェルプレート上に播種した。播種した細胞を、37℃及び5%CO2雰囲気での組織培養インキュベーター中で5時間放置し、接着させた。インキュベーション後、細胞を単層形成について調べ、肝細胞維持で3回洗浄し、37℃でインキュベートした。
細胞培地におけるNanoLuc検出を伴う実験では、1体積のNano-Glo(登録商標)ルシフェラーゼアッセイ基質を、50体積のNano-Glo(登録商標)ルシフェラーゼアッセイ緩衝液と組み合わせた。試料の1:10希釈(50μlの試薬+40μlの水+10μlの細胞培地)を使用して、0.5秒の積分時間でPromega Glomaxランナー上でアッセイを実行した。
マウスに、AAV、LNP、AAV及びLNPの両方、またはビヒクル(AAVビヒクルについてはPBS+0.001%Pluronic、LNPビヒクルについてはTSS)を、外側尾静脈を介して投与した。AAVを、本明細書に記載される量(ベクターゲノム/マウス、「vg/ms」)で、1匹あたり0.1mLの体積で投与した。LNPをTSS中で希釈し、本明細書に示される量で、約5μl/グラム体重で投与した。典型的には、マウスに、まずAAVを注射し、次いで、適用可能な場合、LNPを注射した。治療後の様々な時点で、以下にさらに説明されるように、ある特定の分析のために血清及び/または肝臓組織を収集した。
インビトロ研究では、細胞培地中に分泌される総ヒト第IX因子レベルを、製造者のプロトコルに従って、ヒト第IX因子ELISAキット(Abcam、カタログ番号ab188393)を使用して決定した。分泌hFIXレベルを、4パラメータロジスティックフィットを使用して標準曲線から定量化し、ng/mlの培地として表した。
ディープシーケンシングを利用して、遺伝子編集によって導入された挿入及び欠失(例えば、アルブミンのイントロン1内)の存在を同定した。標的部位の周りのPCRプライマーを設計し、目的のゲノム領域を増幅した。プライマー配列設計は、この分野で標準的に行われているように実施した。
BaseScope(ACDbio、Newark,CA)は、例えば、挿入導入遺伝子(hFIX)及び挿入部位からのコード配列(アルブミンのエクソン1)を含むハイブリッドmRNA転写産物において、エクソン接合部の特異的検出を提供することができる、特殊なRNA in situハイブリダイゼーション技術である。BaseScopeを使用して、ハイブリッドmRNAを発現する肝臓細胞のパーセンテージを測定した。
この実施例では、Hepa1-6細胞を培養し、Cas9 mRNA及びG000551を送達するLNPの存在下または不在下で、例えば、実施例1(n=3)に記載されるように、様々な形態のAAVを有する挿入テンプレート(例えば、一本鎖ゲノム(「ssAAV」)または自己相補性ゲノム(「scAAV」)のいずれかを有する)で処理した。AAV及びLNPを実施例1に記載されるように調製した。処理後、実施例1に記載されるように、培地をヒト第IX因子レベルについて収集した。
この実施例では、マウスを、実施例2でインビトロで試験されるのと同じプラスミド(P00123、P00204、及びP00147)に由来するAAVで処置した。投与物質を調製し、実施例1に記載されるように投与した。C57Bl/6マウスに、各々、3e11ベクターゲノム(vg/ms)、続いてG000551(「G551」)を含むLNPを4mg/kgの用量(総RNAカーゴ含有量に関して)で投与した(各群についてn=5)。投与後4週間で、動物を安楽死させ、それぞれ、編集及びhFIX発現のために、肝臓組織及び血清を収集した。
表12:インデル%
表13:第IX因子レベル(ug/mL)
この実施例に記載される実験では、インビボで相同性アームをssAAVベクターに組み込む効果を調査した。
表14:hFIX
表15:hFIX血清レベル
相同性アームを欠く双方向性構築物が、アルブミンのイントロン1への挿入について他の配置を有するベクターを上回ることを実証したことにより、この実施例に記載される実験は、スプライスアクセプターを改変する効果を調査した。これらの多様な双方向性構築物を、初代マウス肝細胞(PMH)におけるマウスアルブミンのイントロン1を標的とする20個の異なるgRNAを利用して、標的部位のパネルにわたって試験した。
表16:インデル%
表17:ルシフェラーゼ発現
この実施例で試験したssAAV及びLNPを調製し、実施例1に記載されるようにC57Bl/6マウスに送達して、インビボで標的部位にわたる双方向性構築物の性能を評価した。投与後4週間で、動物を安楽死させ、それぞれ、編集及びhFIX発現のために、肝臓組織及び血清を収集した。
表18:hFIX血清レベル及びインデル%
表19 肝臓における編集
表20:血清hFIXレベル
この実施例では、アルブミンのイントロン1への標的挿入のための双方向性hFIX構築物を含むssAAVの送達とLNPの送達との間のタイミングを調査した。
この実施例では、アルブミンのイントロン1への標的挿入のためのssAAVの投与後のLNPの反復投与の効果を調査した。
この実施例では、処置された動物における経時的なアルブミンのイントロン1への標的挿入後のhFIX発現の耐久性を評価した。この目的のために、1年間の耐久性研究の一部として、処置された動物の血清においてhFIXを測定した。
表21:FIXレベル
表22:hFIXレベル
この実施例では、アルブミンのイントロン1への標的挿入後のhFIXの発現を調節するためのAAV及びLNPの両方の用量を変化させる効果をC57Bl/6マウスにおいて評価した。
表23:血清hFIX
この実施例では、双方向性構築物を含むssAAVベクターを、それぞれ、初代カニクイザル(PCH)及び初代ヒト肝細胞(PHH)におけるカニクイザル(「cyno」)及びヒトアルブミンのイントロン1を標的とするgRNAを利用して、標的部位のパネルにわたって試験した。
表3:初代カニクイザル肝細胞に送達されたsgRNAについてのアルブミンイントロン1編集及び導入遺伝子発現データ
表4:初代ヒト肝細胞に送達されたsgRNAについてのアルブミンイントロン1編集及び導入遺伝子発現データ
表24:初代カニクイザル肝細胞に送達されたsgRNAについてのアルブミンイントロン1導入遺伝子発現データ
この実施例では、様々なガイドを含むアデノ随伴ウイルス(AAV)及び/または脂質ナノ粒子(LNP)の投与によるカニクイザルにおけるヒト第9因子遺伝子挿入及びhFIXタンパク質発現を評価するために、8週間の研究を行った。この研究は、上述のように調製されたLNP製剤及びAAV製剤で実施された。各LNP製剤は、2:1のmRNA:gRNAの重量比で、Cas9 mRNA及びガイドRNA(gRNA)を含んでいた。ssAAVは、P00147に由来した。
表5:肝臓における編集
表6:hFIX発現
この実施例では、P00147に由来するssAAV及び/またはG009860を含む様々なガイド及び様々なLNP成分を含むCRISPR/Cas9脂質ナノ粒子(LNP)の投与後の、カニクイザルにおける第9因子遺伝子挿入及びhFIXタンパク質発現を評価するための研究を行った。
表25:実施例13の血清ヒト第IX因子タンパク質レベル-ELISA方法
表26:血清ヒト第IX因子タンパク質レベル
生化学的方法(例えば、Cameron et al.,Nature Methods.6,600-606;2017を参照されたい)を使用して、アルブミンを標的とするCas9によって切断される潜在的なオフターゲットゲノム部位を決定した。この実験では、ヒトアルブミンを標的とする13個のsgRNAと、既知のオフターゲットプロファイルを有する2個の対照ガイドを、単離されたHEK293ゲノムDNAを使用してスクリーニングした。生化学アッセイにおいて16nMのガイド濃度を使用して検出される潜在的なオフターゲット部位の数を表27に示した。このアッセイは、試験したsgRNAについての潜在的なオフターゲット部位を特定した。
表27:オフターゲット分析
双方向性構築物などの構築物は、それらが分泌タンパク質または非分泌タンパク質を発現するように設計され得る。分泌タンパク質の生成のために、構築物は、ポリペプチドをER内腔に転座するのを補助するシグナル配列を含み得る。あるいは、構築物は、宿主細胞の内因性シグナル配列(例えば、導入遺伝子が宿主細胞のアルブミン遺伝子座に組み込まれるときの内因性アルブミンシグナル配列)を利用し得る。
ヒトアルブミン遺伝子座へのhF9挿入のための効果的なガイドRNAを同定することを目的とした。この目的のために、マウスアルブミン遺伝子座が第1のイントロンを含む対応するヒトアルブミンゲノム配列で置き換えられたマウスを利用した(ALBhu/huマウス)。これにより、インビボでの成人肝臓の状況におけるヒトアルブミンの第1のイントロンを標的とするガイドRNAの挿入効率を試験することが可能になった。ALBhu/huマウスを使用して、合計11個のガイドRNAをスクリーニングするために、各々がヒトアルブミン遺伝子座の第1のイントロンを標的とする、2個の別々のマウス実験を設定した。全てのマウスを体重測定し、実験の0日目に尾静脈を介して注射した。1週目、3週目、4週目、及び6週目に尾部出血を介して血液を収集し、血漿を分離した。マウスを7週目に屠殺した。大静脈を介して血液を収集し、血漿を分離した。肝臓及び脾臓も解剖した。
表29.7週目のhFIX及びBASESCOPE(商標)データ。
ヒトアルブミンイントロン1:(配列番号1)
GTAAGAAATCCATTTTTCTATTGTTCAACTTTTATTCTATTTTCCCAGTAAAATAAAGTTTTAGTAAACTCTGCATCTTTAAAGAATTATTTTGGCATTTATTTCTAAAATGGCATAGTATTTTGTATTTGTGAAGTCTTACAAGGTTATCTTATTAATAAAATTCAAACATCCTAGGTAAAAAAAAAAAAAGGTCAGAATTGTTTAGTGACTGTAATTTTCTTTTGCGCACTAAGGAAAGTGCAAAGTAACTTAGAGTGACTGAAACTTCACAGAATAGGGTTGAAGATTGAATTCATAACTATCCCAAAGACCTATCCATTGCACTATGCTTTATTTAAAAACCACAAAACCTGTGCTGTTGATCTCATAAATAGAACTTGTATTTATATTTATTTTCATTTTAGTCTGTCTTCTTGGTTGCTGTTGATAGACACTAAAAGAGTATTAGATATTATCTAAGTTTGAATATAAGGCTATAAATATTTAATAATTTTTAAAATAGTATTCTTGGTAATTGAATTATTCTTCTGTTTAAAGGCAGAAGAAATAATTGAACATCATCCTGAGTTTTTCTGTAGGAATCAGAGCCCAATATTTTGAAACAAATGCATAATCTAAGTCAAATGGAAAGAAATATAAAAAGTAACATTATTACTTCTTGTTTTCTTCAGTATTTAACAATCCTTTTTTTTCTTCCCTTGCCCAG
表7.マウスアルブミンガイドRNA
表8.マウスアルブミンsgRNA及び修飾パターン
表9.カニクイザルアルブミンガイドRNA
表10:カニクイザルsgRNA及び修飾パターン
表11:ベクター成分及び配列
5’ITR配列(配列番号263):
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
マウスアルブミンスプライスアクセプター(第1の配向)(配列番号264):
TAGGTCAGTGAAGAGAAGAACAAAAAGCAGCATATTACAGTTAGTTGTCTTCATCAATCTTTAAATATGTTGTGTGGTTTTTCTCTCCCTGTTTCCACAG
ヒト第IX因子(R338L)、第1の配向(配列番号265):
TTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCTATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTAA
ポリA(第1の配向)(配列番号266):
CCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCC
ポリA(第2の配向)(配列番号267):
AAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTG
ヒト第IX因子(R338L)、第2の配向(配列番号268):
TTAGGTGAGCTTAGTCTTTTCTTTTATCCAATTCACGTAGCGAGAGACCTTCGTATAGATGCCATATTTCCCCTTCATCGCACATTCCTCCCCCCAACTTATTATCCCGGTCAAGAAACTTGTTCCTTCGACTTCAGTGACGTGTGGTCCACCTGAATCACCTTGGCATGAGTCGCGACCGCCCTCGTGAAACCCAGCACAAAACATGTTATTGTAAATCGTAAATTTCGTGGACAGAAGACAGGTCGCTCTATCGACCAACGGGACGCGCAAATATTGCAGAACGAGGGCTGATCGACCTTTGTGGAAGACCCGCCCCCACCCACTCACATATCCGCTCCCAAATTTCAAGAAGATATTTGTATATTCTTTATCGGCTATACAAATCGGGGTAACATAGGAGTTAAGTACGAGTGGCTCGTCCAGCTCCAGGAGGGCTATATCATGGTTGTACTTGTTTATAGCGGCATTATAATTGTGATGGGGTATGATCCTGATAACATTCCTTTTCTGTTCAGTATGCTCAGTTTCTTCAATGTTGTGTTCGCCAGCCACGACCGTAATCTTAACCCCCGTCTCGACACAGTGTGCGGCCGTTACAATCCACTTTTCATTGACTATGGAGCCCCCACAAAACGCGTCGACTTTTCCGTTGAGCACCACCTGCCATGGAAATTGGCCAGGTTTAGCGTCCTCGCCCCCGACAACCCTAGTAAAGTCATTAAATGACTGTGTGGATTGTGTTATATTATCAAGAATCGTTTCGGCTTCAGTAGAGTTAACGTAGTCCACATCGGGAAAAACTGTCTCGGCCCTTGTCAACTTTGATGTCTGGGACACACTTACCCGACCGCACGGGAAGGGCACCGCCGGTTCACAGCTCTTTTGATTCTCAGCGAGCCGGTAGCCCTCAGTGCAACTACACACAACTTTGTTGTCGGCGGAATTTTTACAGAATTGCTCGCATCGTCCATTTTTAATGTTGCAGGTGACGTCCAACTCGCAGTTTTTTCCTTCAAAACCAAAAGGGCACCAACACTCGTAGGAATTTATATCGTCTTTACAACTCCCCCCATTCAGACATGGATTAGATTCGCATTGGTCCCCATCGACATATTGCTTCCAGAACTCAGTGGTCCGTTCTGTATTCTCAAACACCTCGCGCGCTTCTTCAAAACTGCATTTTTCCTCCATACACTCTCGCTCCAAGTTCCCTTGCACGAATTCTTCAAGCTTTCCTGAGTTATACCTTTTAGGCCGGTTAAGTATCTTATTCGCGTTTTCGTGGTCCAGAAA
マウスアルブミンスプライスアクセプター(第2の配向)(配列番号269):
CTGTGGAAACAGGGAGAGAAAAACCACACAACATATTTAAAGATTGATGAAGACAACTAACTGTAATATGCTGCTTTTTGTTCTTCTCTTCACTGACCTA
3’ITR配列(配列番号270):
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
ヒト第IX因子スプライスアクセプター(第1の配向)(配列番号271):
GATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAG
ヒト第IX因子(R338L)-HiBit(第1の配向)(配列番号272):
TTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCTATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTCTCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTGTCAGCGGATGGAGACTGTTCAAGAAGATCAGCTAA
ヒト第IX因子(R338L)-HiBit(第2の配向)(配列番号273):
TTAGGAAATCTTCTTAAACAGCCGCCAGCCGCTCACGGTGAGCTTAGTCTTTTCTTTTATCCAATTCACGTAGCGAGAGACCTTCGTATAGATGCCATATTTCCCCTTCATCGCACATTCCTCCCCCCAACTTATTATCCCGGTCAAGAAACTTGTTCCTTCGACTTCAGTGACGTGTGGTCCACCTGAATCACCTTGGCATGAGTCGCGACCGCCCTCGTGAAACCCAGCACAAAACATGTTATTGTAAATCGTAAATTTCGTGGACAGAAGACAGGTCGCTCTATCGACCAACGGGACGCGCAAATATTGCAGAACGAGGGCTGATCGACCTTTGTGGAAGACCCGCCCCCACCCACTCACATATCCGCTCCCAAATTTCAAGAAGATATTTGTATATTCTTTATCGGCTATACAAATCGGGGTAACATAGGAGTTAAGTACGAGTGGCTCGTCCAGCTCCAGGAGGGCTATATCATGGTTGTACTTGTTTATAGCGGCATTATAATTGTGATGGGGTATGATCCTGATAACATTCCTTTTCTGTTCAGTATGCTCAGTTTCTTCAATGTTGTGTTCGCCAGCCACGACCGTAATCTTAACCCCCGTCTCGACACAGTGTGCGGCCGTTACAATCCACTTTTCATTGACTATGGAGCCCCCACAAAACGCGTCGACTTTTCCGTTGAGCACCACCTGCCATGGAAATTGGCCAGGTTTAGCGTCCTCGCCCCCGACAACCCTAGTAAAGTCATTAAATGACTGTGTGGATTGTGTTATATTATCAAGAATCGTTTCGGCTTCAGTAGAGTTAACGTAGTCCACATCGGGAAAAACTGTCTCGGCCCTTGTCAACTTTGATGTCTGGGACACACTTACCCGACCGCACGGGAAGGGCACCGCCGGTTCACAGCTCTTTTGATTCTCAGCGAGCCGGTAGCCCTCAGTGCAACTACACACAACTTTGTTGTCGGCGGAATTTTTACAGAATTGCTCGCATCGTCCATTTTTAATGTTGCAGGTGACGTCCAACTCGCAGTTTTTTCCTTCAAAACCAAAAGGGCACCAACACTCGTAGGAATTTATATCGTCTTTACAACTCCCCCCATTCAGACATGGATTAGATTCGCATTGGTCCCCATCGACATATTGCTTCCAGAACTCAGTGGTCCGTTCTGTATTCTCAAACACCTCGCGCGCTTCTTCAAAACTGCATTTTTCCTCCATACACTCTCGCTCCAAGTTCCCTTGCACGAATTCTTCAAGCTTTCCTGAGTTATACCTTTTAGGCCGGTTAAGTATCTTATTCGCGTTTTCGTGGTCCAGAAA
ヒト第IX因子スプライスアクセプター(第2の配向)(配列番号274):
CTGAAATGTAAAAGAATAATTCTTTAGTTTTAGCAAAAAAGAAAACATCATGAAAATTTTACATCTCTTAAGAAAGTCTTTGTTTTTAATCCAAATAATC
Nluc-P2A-GFP(第1の配向)(配列番号275):
TTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCAGTATTCACTTTGGAGGACTTTGTCGGTGACTGGAGGCAAACCGCTGGTTATAATCTCGACCAAGTACTGGAACAGGGCGGGGTAAGTTCCCTCTTTCAGAATTTGGGTGTAAGCGTCACACCAATCCAGCGGATTGTGTTGTCTGGAGAGAACGGACTCAAAATTGACATCCATGTTATCATTCCATATGAAGGTCTCAGTGGAGACCAAATGGGGCAGATCGAGAAGATTTTCAAGGTAGTTTACCCAGTCGACGATCACCACTTCAAAGTCATTCTCCACTATGGCACACTTGTTATCGACGGAGTAACTCCTAATATGATTGATTACTTTGGTCGCCCGTATGAGGGCATCGCAGTGTTTGATGGCAAAAAGATCACCGTAACAGGAACGTTGTGGAATGGGAACAAGATAATCGACGAGAGATTGATAAATCCAGACGGGTCACTCCTGTTCAGGGTTACAATTAACGGCGTCACAGGATGGAGACTCTGTGAACGAATACTGGCCACAAATTTTTCACTCCTGAAGCAGGCCGGAGACGTGGAGGAAAACCCAGGGCCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAA
Nluc-P2A-GFP(第2の配向)(配列番号276):
TTACACCTTCCTCTTCTTCTTGGGGCTGCCGCCGCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCCAGGGTGATGCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGCACCATGTGGTCCCTCTTCTCGTTGGGGTCCTTGCTCAGGGCGCTCTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCCAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGCCTGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATGTACACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGGCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATCCTGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCCCTGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTCCTCTCCTGCACGTAGCCCTCGGGCATGGCGCTCTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTACCTGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACCAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCGTCGCCCTCGCCCTCGCCGCTCACGCTGAACTTGTGGCCGTTCACGTCGCCGTCCAGCTCCACCAGGATGGGCACCACGCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACGGGGCCGGGGTTCTCCTCCACGTCGCCGGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTGGTGGCCAGGATCCTCTCGCACAGCCTCCAGCCGGTCACGCCGTTGATGGTCACCCTGAACAGCAGGCTGCCGTCGGGGTTGATCAGCCTCTCGTCGATGATCTTGTTGCCGTTCCACAGGGTGCCGGTCACGGTGATCTTCTTGCCGTCGAACACGGCGATGCCCTCGTAGGGCCTGCCGAAGTAGTCGATCATGTTGGGGGTCACGCCGTCGATCACCAGGGTGCCGTAGTGCAGGATCACCTTGAAGTGGTGGTCGTCCACGGGGTACACCACCTTGAAAATCTTCTCGATCTGGCCCATCTGGTCGCCGCTCAGGCCCTCGTAGGGGATGATCACGTGGATGTCGATCTTCAGGCCGTTCTCGCCGCTCAGCACGATCCTCTGGATGGGGGTCACGCTCACGCCCAGGTTCTGGAACAGGCTGCTCACGCCGCCCTGCTCCAGCACCTGGTCCAGGTTGTAGCCGGCGGTCTGCCTCCAGTCGCCCACGAAGTCCTCCAGGGTGAACACGGCCTCCTCGAAGCTGCACTTCTCCTCCATGCACTCCCTCTCCAGGTTGCCCTGCACGAACTCCTCCAGCTTGCCGCTGTTGTACCTCTTGGGCCTGTTCAGGATCTTGTTGGCGTTCTCGTGGTCCAGGAA
P00147完全配列(ITRからITR):(配列番号277)
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTAGATCTCTTAGGTCAGTGAAGAGAAGAACAAAAAGCAGCATATTACAGTTAGTTGTCTTCATCAATCTTTAAATATGTTGTGTGGTTTTTCTCTCCCTGTTTCCACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCTATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTAACCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAA
TGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTTAGGTGAGCTTAGTCTTTTCTTTTATCCAATTCACGTAGCGAGAGACCTTCGTATAGATGCCATATTTCCCCTTCATCGCACATTCCTCCCCCCAACTTATTATCCCGGTCAAGAAACTTGTTCCTTCGACTTCAGTGACGTGTGGTCCACCTGAATCACCTTGGCATGAGTCGCGACCGCCCTCGTGAAACCCAGCACAAAACATGTTATTGTAAATCGTAAATTTCGTGGACAGAAGACAGGTCGCTCTATCGACCAACGGGACGCGCAAATATTGCAGAACGAGGGCTGATCGACCTTTGTGGAAGACCCGCCCCCACCCACTCACATATCCGCTCCCAAATTTCAAGAAGATATTTGTATATTCTTTATCGGCTATACAAATCGGGGTAACATAGGAGTTAAGTACGAGTGGCTCGTCCAGCTCCAGGAGGGCTATATCATGGTTGTACTTGTTTATAGCGGCATTATAATTGTGATGGGGTATGATCCTGATAACATTCCTTTTCTGTTCAGTATGCTCAGTTTCTTCAATGTTGTGTTCGCCAGCCACGACCGTAATCTTAACCCCCGTCTCGACACAGTGTGCGGCCGTTACAATCCACTTTTCATTGACTATGGAGCCCCCACAAAACGCGTCGACTTTTCCGTTGAGCACCACCTGCCATGGAAATTGGCCAGGTTTAGCGTCCTCGCCCCCGACAACCCTAGTAAAGTCATTAAATGACTGTGTGGATTGTGTTATATTATCAAGAATCGTTTCGGCTTCAGTAGAGTTAACGTAGTCCACATCGGGAAAAACTGTCTCGGCCCTTGTCAACTTTGATGTCTGGGACACACTTACCCGACCGCACGGGAAGGGCACCGCCGGTTCACAGCTCTTTTGATTCTCAGCGAGCCGGTAGCCCTCAGTGCAACTACACACAACTTTGTTGTCGGCGGAATTTTTACAGAATTGCTCGCATCGTCCATTTTTAATGTTGCAGGTGACGTCCAACTCGCAGTTTTTTCCTTCAAAACCAAAAGGGCACCAACACTCGTAGGAATTTATATCGTCTTTACAACTCCCCCCATTCAGACATGGATTAGATTCGCATTGGTCCCCATCGACATATTGCTTCCAGAACTCAGTGGTCCGTTCTGTATTCTCAAACACCTCGCGCGCTTCTTCAAAACTGCATTTTTCCTCCATACACTCTCGCTCCAAGTTCCCTTGCACGAATTCTTCAAGCTTTCCTGAGTTATACCTTTTAGGCCGGTTAAGTATCTTATTCGCGTTTTCGTGGTCCAGAAAAACTGTGGAAACAGGGAGAGAAAAACCACACAACATATTTAAAGATTGATGAAGACAACTAACTGTAATATGCTGCTTTTTGTTCTTCTCTTCACTGACCTAAGAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
P00411完全配列(ITRからITR):(配列番号278)
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTAGATCTCTGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCTATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTCTCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTGTCAGCGGATGGAGACTGTTCAAGAAGATCAGCTAACCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAA
CCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTTAGGAAATCTTCTTAAACAGCCGCCAGCCGCTCACGGTGAGCTTAGTCTTTTCTTTTATCCAATTCACGTAGCGAGAGACCTTCGTATAGATGCCATATTTCCCCTTCATCGCACATTCCTCCCCCCAACTTATTATCCCGGTCAAGAAACTTGTTCCTTCGACTTCAGTGACGTGTGGTCCACCTGAATCACCTTGGCATGAGTCGCGACCGCCCTCGTGAAACCCAGCACAAAACATGTTATTGTAAATCGTAAATTTCGTGGACAGAAGACAGGTCGCTCTATCGACCAACGGGACGCGCAAATATTGCAGAACGAGGGCTGATCGACCTTTGTGGAAGACCCGCCCCCACCCACTCACATATCCGCTCCCAAATTTCAAGAAGATATTTGTATATTCTTTATCGGCTATACAAATCGGGGTAACATAGGAGTTAAGTACGAGTGGCTCGTCCAGCTCCAGGAGGGCTATATCATGGTTGTACTTGTTTATAGCGGCATTATAATTGTGATGGGGTATGATCCTGATAACATTCCTTTTCTGTTCAGTATGCTCAGTTTCTTCAATGTTGTGTTCGCCAGCCACGACCGTAATCTTAACCCCCGTCTCGACACAGTGTGCGGCCGTTACAATCCACTTTTCATTGACTATGGAGCCCCCACAAAACGCGTCGACTTTTCCGTTGAGCACCACCTGCCATGGAAATTGGCCAGGTTTAGCGTCCTCGCCCCCGACAACCCTAGTAAAGTCATTAAATGACTGTGTGGATTGTGTTATATTATCAAGAATCGTTTCGGCTTCAGTAGAGTTAACGTAGTCCACATCGGGAAAAACTGTCTCGGCCCTTGTCAACTTTGATGTCTGGGACACACTTACCCGACCGCACGGGAAGGGCACCGCCGGTTCACAGCTCTTTTGATTCTCAGCGAGCCGGTAGCCCTCAGTGCAACTACACACAACTTTGTTGTCGGCGGAATTTTTACAGAATTGCTCGCATCGTCCATTTTTAATGTTGCAGGTGACGTCCAACTCGCAGTTTTTTCCTTCAAAACCAAAAGGGCACCAACACTCGTAGGAATTTATATCGTCTTTACAACTCCCCCCATTCAGACATGGATTAGATTCGCATTGGTCCCCATCGACATATTGCTTCCAGAACTCAGTGGTCCGTTCTGTATTCTCAAACACCTCGCGCGCTTCTTCAAAACTGCATTTTTCCTCCATACACTCTCGCTCCAAGTTCCCTTGCACGAATTCTTCAAGCTTTCCTGAGTTATACCTTTTAGGCCGGTTAAGTATCTTATTCGCGTTTTCGTGGTCCAGAAAAACTGAAATGTAAAAGAATAATTCTTTAGTTTTAGCAAAAAAGAAAACATCATGAAAATTTTACATCTCTTAAGAAAGTCTTTGTTTTTAATCCAAATAATCAGAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
P00415完全配列(ITRからITR):(配列番号279)
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTAGATCTCTTAGGTCAGTGAAGAGAAGAACAAAAAGCAGCATATTACAGTTAGTTGTCTTCATCAATCTTTAAATATGTTGTGTGGTTTTTCTCTCCCTGTTTCCACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCAGTATTCACTTTGGAGGACTTTGTCGGTGACTGGAGGCAAACCGCTGGTTATAATCTCGACCAAGTACTGGAACAGGGCGGGGTAAGTTCCCTCTTTCAGAATTTGGGTGTAAGCGTCACACCAATCCAGCGGATTGTGTTGTCTGGAGAGAACGGACTCAAAATTGACATCCATGTTATCATTCCATATGAAGGTCTCAGTGGAGACCAAATGGGGCAGATCGAGAAGATTTTCAAGGTAGTTTACCCAGTCGACGATCACCACTTCAAAGTCATTCTCCACTATGGCACACTTGTTATCGACGGAGTAACTCCTAATATGATTGATTACTTTGGTCGCCCGTATGAGGGCATCGCAGTGTTTGATGGCAAAAAGATCACCGTAACAGGAACGTTGTGGAATGGGAACAAGATAATCGACGAGAGATTGATAAATCCAGACGGGTCACTCCTGTTCAGGGTTACAATTAACGGCGTCACAGGATGGAGACTCTGTGAACGAATACTGGCCACAAATTTTTCACTCCTGAAGCAGGCCGGAGACGTGGAGGAAAACCCAGGGCCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAACCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACA
GCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTTACACCTTCCTCTTCTTCTTGGGGCTGCCGCCGCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCCAGGGTGATGCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGCACCATGTGGTCCCTCTTCTCGTTGGGGTCCTTGCTCAGGGCGCTCTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCCAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGCCTGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATGTACACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGGCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATCCTGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCCCTGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTCCTCTCCTGCACGTAGCCCTCGGGCATGGCGCTCTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTACCTGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACCAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCGTCGCCCTCGCCCTCGCCGCTCACGCTGAACTTGTGGCCGTTCACGTCGCCGTCCAGCTCCACCAGGATGGGCACCACGCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACGGGGCCGGGGTTCTCCTCCACGTCGCCGGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTGGTGGCCAGGATCCTCTCGCACAGCCTCCAGCCGGTCACGCCGTTGATGGTCACCCTGAACAGCAGGCTGCCGTCGGGGTTGATCAGCCTCTCGTCGATGATCTTGTTGCCGTTCCACAGGGTGCCGGTCACGGTGATCTTCTTGCCGTCGAACACGGCGATGCCCTCGTAGGGCCTGCCGAAGTAGTCGATCATGTTGGGGGTCACGCCGTCGATCACCAGGGTGCCGTAGTGCAGGATCACCTTGAAGTGGTGGTCGTCCACGGGGTACACCACCTTGAAAATCTTCTCGATCTGGCCCATCTGGTCGCCGCTCAGGCCCTCGTAGGGGATGATCACGTGGATGTCGATCTTCAGGCCGTTCTCGCCGCTCAGCACGATCCTCTGGATGGGGGTCACGCTCACGCCCAGGTTCTGGAACAGGCTGCTCACGCCGCCCTGCTCCAGCACCTGGTCCAGGTTGTAGCCGGCGGTCTGCCTCCAGTCGCCCACGAAGTCCTCCAGGGTGAACACGGCCTCCTCGAAGCTGCACTTCTCCTCCATGCACTCCCTCTCCAGGTTGCCCTGCACGAACTCCTCCAGCTTGCCGCTGTTGTACCTCTTGGGCCTGTTCAGGATCTTGTTGGCGTTCTCGTGGTCCAGGAA
P00418完全配列(ITRからITR):(配列番号280)
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTAGATCTCTTAGGTCAGTGAAGAGAAGAACAAAAAGCAGCATATTACAGTTAGTTGTCTTCATCAATCTTTAAATATGTTGTGTGGTTTTTCTCTCCCTGTTTCCACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCTATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTCTCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTGTCAGCGGATGGAGACTGTTCAAGAAGATCAGCTAACCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAA
CCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTTAGGAAATCTTCTTAAACAGCCGCCAGCCGCTCACGGTGAGCTTAGTCTTTTCTTTTATCCAATTCACGTAGCGAGAGACCTTCGTATAGATGCCATATTTCCCCTTCATCGCACATTCCTCCCCCCAACTTATTATCCCGGTCAAGAAACTTGTTCCTTCGACTTCAGTGACGTGTGGTCCACCTGAATCACCTTGGCATGAGTCGCGACCGCCCTCGTGAAACCCAGCACAAAACATGTTATTGTAAATCGTAAATTTCGTGGACAGAAGACAGGTCGCTCTATCGACCAACGGGACGCGCAAATATTGCAGAACGAGGGCTGATCGACCTTTGTGGAAGACCCGCCCCCACCCACTCACATATCCGCTCCCAAATTTCAAGAAGATATTTGTATATTCTTTATCGGCTATACAAATCGGGGTAACATAGGAGTTAAGTACGAGTGGCTCGTCCAGCTCCAGGAGGGCTATATCATGGTTGTACTTGTTTATAGCGGCATTATAATTGTGATGGGGTATGATCCTGATAACATTCCTTTTCTGTTCAGTATGCTCAGTTTCTTCAATGTTGTGTTCGCCAGCCACGACCGTAATCTTAACCCCCGTCTCGACACAGTGTGCGGCCGTTACAATCCACTTTTCATTGACTATGGAGCCCCCACAAAACGCGTCGACTTTTCCGTTGAGCACCACCTGCCATGGAAATTGGCCAGGTTTAGCGTCCTCGCCCCCGACAACCCTAGTAAAGTCATTAAATGACTGTGTGGATTGTGTTATATTATCAAGAATCGTTTCGGCTTCAGTAGAGTTAACGTAGTCCACATCGGGAAAAACTGTCTCGGCCCTTGTCAACTTTGATGTCTGGGACACACTTACCCGACCGCACGGGAAGGGCACCGCCGGTTCACAGCTCTTTTGATTCTCAGCGAGCCGGTAGCCCTCAGTGCAACTACACACAACTTTGTTGTCGGCGGAATTTTTACAGAATTGCTCGCATCGTCCATTTTTAATGTTGCAGGTGACGTCCAACTCGCAGTTTTTTCCTTCAAAACCAAAAGGGCACCAACACTCGTAGGAATTTATATCGTCTTTACAACTCCCCCCATTCAGACATGGATTAGATTCGCATTGGTCCCCATCGACATATTGCTTCCAGAACTCAGTGGTCCGTTCTGTATTCTCAAACACCTCGCGCGCTTCTTCAAAACTGCATTTTTCCTCCATACACTCTCGCTCCAAGTTCCCTTGCACGAATTCTTCAAGCTTTCCTGAGTTATACCTTTTAGGCCGGTTAAGTATCTTATTCGCGTTTTCGTGGTCCAGAAAAACTGTGGAAACAGGGAGAGAAAAACCACACAACATATTTAAAGATTGATGAAGACAACTAACTGTAATATGCTGCTTTTTGTTCTTCTCTTCACTGACCTAAGAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
P00123完全配列(ITRからITR):(配列番号281)
GGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGGAGGGGTGGAGTCGTGATAGGTCAGTGAAGAGAAGAACAAAAAGCAGCATATTACAGTTAGTTGTCTTCATCAATCTTTAAATATGTTGTGTGGTTTTTCTCTCCCTGTTTCCACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCTATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTAACCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAA
TAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACTAGTCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGA
P00204完全配列(ITRからITR):(配列番号282)
GGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGGAGGGGTGGAGTCGTGACCTAGGTCGTCTCCGGCTCTGCTTTTTCCAGGGGTGTGTTTCGCCGAGAAGCACGTAAGAGTTTTATGTTTTTTCATCTCTGCTTGTATTTTTCTAGTAATGGAAGCCTGGTATTTTAAAATAGTTAAATTTTCCTTTAGTGCTGATTTCTAGATTATTATTACTGTTGTTGTTGTTATTATTGTCATTATTTGCATCTGAGAACTAGGTCAGTGAAGAGAAGAACAAAAAGCAGCATATTACAGTTAGTTGTCTTCATCAATCTTTAAATATGTTGTGTGGTTTTTCTCTCCCTGTTTCCACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCTATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTAACCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCAT
CTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCCTTAGGTGGTTATATTATTGATATATTTTTGGTATCTTTGATGACAATAATGGGGGATTTTGAAAGCTTAGCTTTAAATTTCTTTTAATTAAAAAAAAATGCTAGGCAGAATGACTCAAATTACGTTGGATACAGTTGAATTTATTACGGTCTCATAGGGCCTGCCTGCTCGACCATGCTATACTAAAAATTAAAAGTGTACTAGTCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGA
P00353完全配列(ITRからITR):(配列番号283)
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTAGATCTGATTTTGAAAGCTTAGCTTTAAATTTCTTTTAATTAAAAAAAAATGCTAGGCAGAATGACTCAAATTACGTTGGATACAGTTGAATTTATTACGGTCTCATAGGGCCTGCCTGCTCGACCATGCTATACTAAAAATTAAAAGTGTGTGTTACTAATTTTATAAATGGAGTTTCCATTTATATTTACCTTTATTTCTTATTTACCATTGTCTTAGTAGATATTTACAAACATGACAGAAACACTAAATCTTGAGTTTGAATGCACAGATATAAACACTTAACGGGTTTTAAAAATAATAATGTTGGTGAAAAAATATAACTTTGAGTGTAGCAGAGAGGAACCATTGCCACCTTCAGATTTTCCTGTAACGATCGGGAACTGGCATCTTCAGGGAGTAGCTTAGGTCAGTGAAGAGAAGAACAAAAAGCAGCATATTACAGTTAGTTGTCTTCATCAATCTTTAAATATGTTGTGTGGTTTTTCTCTCCCTGTTTCCACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCTATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAG
GGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTAACCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCGTGAGATCGCCCATCGGTATAATGATTTGGGAGAACAACATTTCAAAGGCCTGTAAGTTATAATGCTGAAAGCCCACTTAATATTTCTGGTAGTATTAGTTAAAGTTTTAAAACACCTTTTTCCACCTTGAGTGTGAGAATTGTAGAGCAGTGCTGTCCAGTAGAAATGTGTGCATTGACAGAAAGACTGTGGATCTGTGCTGAGCAATGTGGCAGCCAGAGATCACAAGGCTATCAAGCACTTTGCACATGGCAAGTGTAACTGAGAAGCACACATTCAAATAATAGTTAATTTTAATTGAATGTATCTAGCCATGTGTGGCTAGTAGCTCCTTTCCTGGAGAGAGAATCTGGAGCCCACATCTAACTTGTTAAGTCTGGAATCTTATTTTTTATTTCTGGAAAGGTCTATGAACTATAGTTTTGGGGGCAGCTCACTTACTAACTTTTAATGCAATAAGAATCTCATGGTATCTTGAGAACATTATTTTGTCTCTTTGTAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
P00354完全配列(ITRからITR):(配列番号284)
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTAGATCTTAGCCTCTGGCAAAATGAAGTGGGTAACCTTTCTCCTCCTCCTCTTCGTCTCCGGCTCTGCTTTTTCCAGGGGTGTGTTTCGCCGAGAAGCACGTAAGAGTTTTATGTTTTTTCATCTCTGCTTGTATTTTTCTAGTAATGGAAGCCTGGTATTTTAAAATAGTTAAATTTTCCTTTAGTGCTGATTTCTAGATTATTATTACTGTTGTTGTTGTTATTATTGTCATTATTTGCATCTGAGAACCCTTAGGTGGTTATATTATTGATATATTTTTGGTATCTTTGATGACAATAATGGGGGATTTTGAAAGCTTAGCTTTAAATTTCTTTTAATTAAAAAAAAATGCTAGGCAGAATGACTCAAATTACGTTGGATACAGTTGAATTTATTACGGTCTCATAGGGCCTGCCTGCTCGACCATGCTATACTAAAAATTAAAAGTGTGTGTTACTAATTTTATAAATGGAGTTTCCATTTATATTTACCTTTATTTCTTATTTACCATTGTCTTAGTAGATATTTACAAACATGACAGAAACACTAAATCTTGAGTTTGAATGCACAGATATAAACACTTAACGGGTTTTAAAAATAATAATGTTGGTGAAAAAATATAACTTTGAGTGTAGCAGAGAGGAACCATTGCCACCTTCAGATTTTCCTGTAACGATCGGGAACTGGCATCTTCAGGGAGTAGCTTAGGTCAGTGAAGAGAAGAACAAAAAGCAGCATATTACAGTTAGTTGTCTTCATCAATCTTTAAATATGTTGTGTGGTTTTTCTCTCCCTGTTTCCACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAAC
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P00350:300/600bpのHA F9構築物(G551について)(配列番号285)
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTAGATCTAAGTATATTAGAGCGAGTCTTTCTGCACACAGATCACCTTTCCTATCAACCCCACTAGCCTCTGGCAAAATGAAGTGGGTAACCTTTCTCCTCCTCCTCTTCGTCTCCGGCTCTGCTTTTTCCAGGGGTGTGTTTCGCCGAGAAGCACGTAAGAGTTTTATGTTTTTTCATCTCTGCTTGTATTTTTCTAGTAATGGAAGCCTGGTATTTTAAAATAGTTAAATTTTCCTTTAGTGCTGATTTCTAGATTATTATTACTGTTGTTGTTGTTATTATTGTCATTATTTGCATCTGAGAACCTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCTATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTAACCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCA
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P00356:300/2000bpのHA F9構築物(G551について)(配列番号286)
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTAGATCTAAGTATATTAGAGCGAGTCTTTCTGCACACAGATCACCTTTCCTATCAACCCCACTAGCCTCTGGCAAAATGAAGTGGGTAACCTTTCTCCTCCTCCTCTTCGTCTCCGGCTCTGCTTTTTCCAGGGGTGTGTTTCGCCGAGAAGCACGTAAGAGTTTTATGTTTTTTCATCTCTGCTTGTATTTTTCTAGTAATGGAAGCCTGGTATTTTAAAATAGTTAAATTTTCCTTTAGTGCTGATTTCTAGATTATTATTACTGTTGTTGTTGTTATTATTGTCATTATTTGCATCTGAGAACCTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCTATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTAACCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCA
CTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCCTTAGGTGGTTATATTATTGATATATTTTTGGTATCTTTGATGACAATAATGGGGGATTTTGAAAGCTTAGCTTTAAATTTCTTTTAATTAAAAAAAAATGCTAGGCAGAATGACTCAAATTACGTTGGATACAGTTGAATTTATTACGGTCTCATAGGGCCTGCCTGCTCGACCATGCTATACTAAAAATTAAAAGTGTGTGTTACTAATTTTATAAATGGAGTTTCCATTTATATTTACCTTTATTTCTTATTTACCATTGTCTTAGTAGATATTTACAAACATGACAGAAACACTAAATCTTGAGTTTGAATGCACAGATATAAACACTTAACGGGTTTTAAAAATAATAATGTTGGTGAAAAAATATAACTTTGAGTGTAGCAGAGAGGAACCATTGCCACCTTCAGATTTTCCTGTAACGATCGGGAACTGGCATCTTCAGGGAGTAGCTTAGGTCAGTGAAGAGAAGAACAAAAAGCAGCATATTACAGTTAGTTGTCTTCATCAATCTTTAAATATGTTGTGTGGTTTTTCTCTCCCTGTTTCCACAGACAAGAGTGAGATCGCCCATCGGTATAATGATTTGGGAGAACAACATTTCAAAGGCCTGTAAGTTATAATGCTGAAAGCCCACTTAATATTTCTGGTAGTATTAGTTAAAGTTTTAAAACACCTTTTTCCACCTTGAGTGTGAGAATTGTAGAGCAGTGCTGTCCAGTAGAAATGTGTGCATTGACAGAAAGACTGTGGATCTGTGCTGAGCAATGTGGCAGCCAGAGATCACAAGGCTATCAAGCACTTTGCACATGGCAAGTGTAACTGAGAAGCACACATTCAAATAATAGTTAATTTTAATTGAATGTATCTAGCCATGTGTGGCTAGTAGCTCCTTTCCTGGAGAGAGAATCTGGAGCCCACATCTAACTTGTTAAGTCTGGAATCTTATTTTTTATTTCTGGAAAGGTCTATGAACTATAGTTTTGGGGGCAGCTCACTTACTAACTTTTAATGCAATAAGATCCATGGTATCTTGAGAACATTATTTTGTCTCTTTGTAGTACTGAAACCTTATACATGTGAAGTAAGGGGTCTATACTTAAGTCACATCTCCAACCTTAGTAATGTTTTAATGTAGTAAAAAAATGAGTAATTAATTTATTTTTAGAAGGTCAATAGTATCATGTATTCCAAATAACAGAGGTATATGGTTAGAAAAGAAACAATTCAAAGGACTTATATAATATCTAGCCTTGACAATGAATAAATTTAGAGAGTAGTTTGCCTGTTTGCCTCATGTTCATAAATCTATTGACACATATGTGCATCTGCACTTCAGCATGGTAGAAGTCCATATTCCTTTGCTTGGAAAGGCAGGTGTTCCCATTACGCCTCAGAGAATAGCTGACGGGAAGAGGCTTTCTAGATAGTTGTATGAAAGATATACAAAATCTCGCAGGTATACACAGGCATGATTTGCTGGTTGGGAGAGCCACTTGCCTCATACTGAGGTTTTTGTGTCTGCTTTTCAGAGTCCTGATTGCCTTTTCCCAGTATCTCCAGAAATGCTCATACGATGAGCATGCCAAATTAGTGCAGGAAGTAACAGACTTTGCAAAGACGTGTGTTGCCGATGAGTCTGCCGCCAACTGTGACAAATCCCTTGTGAGTACCTTCTGATTTTGTGGATCTACTTTCCTGCTTTCTGGAACTCTGTT
TCAAAGCCAATCATGACTCCATCACTTAAGGCCCCGGGAACACTGTGGCAGAGGGCAGCAGAGAGATTGATAAAGCCAGGGTGATGGGAATTTTCTGTGGGACTCCATTTCATAGTAATTGCAGAAGCTACAATACACTCAAAAAGTCTCACCACATGACTGCCCAAATGGGAGCTTGACAGTGACAGTGACAGTAGATATGCCAAAGTGGATGAGGGAAAGACCACAAGAGCTAAACCCTGTAAAAAGAACTGTAGGCAACTAAGGAATGCAGAGAGAAAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
P00362:300/1500bpのHA F9構築物(G551について)(配列番号287)
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTAGATCTAAGTATATTAGAGCGAGTCTTTCTGCACACAGATCACCTTTCCTATCAACCCCACTAGCCTCTGGCAAAATGAAGTGGGTAACCTTTCTCCTCCTCCTCTTCGTCTCCGGCTCTGCTTTTTCCAGGGGTGTGTTTCGCCGAGAAGCACGTAAGAGTTTTATGTTTTTTCATCTCTGCTTGTATTTTTCTAGTAATGGAAGCCTGGTATTTTAAAATAGTTAAATTTTCCTTTAGTGCTGATTTCTAGATTATTATTACTGTTGTTGTTGTTATTATTGTCATTATTTGCATCTGAGAACCTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCTATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTAACCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATT
GTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCCTTAGGTGGTTATATTATTGATATATTTTTGGTATCTTTGATGACAATAATGGGGGATTTTGAAAGCTTAGCTTTAAATTTCTTTTAATTAAAAAAAAATGCTAGGCAGAATGACTCAAATTACGTTGGATACAGTTGAATTTATTACGGTCTCATAGGGCCTGCCTGCTCGACCATGCTATACTAAAAATTAAAAGTGTGTGTTACTAATTTTATAAATGGAGTTTCCATTTATATTTACCTTTATTTCTTATTTACCATTGTCTTAGTAGATATTTACAAACATGACAGAAACACTAAATCTTGAGTTTGAATGCACAGATATAAACACTTAACGGGTTTTAAAAATAATAATGTTGGTGAAAAAATATAACTTTGAGTGTAGCAGAGAGGAACCATTGCCACCTTCAGATTTTCCTGTAACGATCGGGAACTGGCATCTTCAGGGAGTAGCTTAGGTCAGTGAAGAGAAGAACAAAAAGCAGCATATTACAGTTAGTTGTCTTCATCAATCTTTAAATATGTTGTGTGGTTTTTCTCTCCCTGTTTCCACAGACAAGAGTGAGATCGCCCATCGGTATAATGATTTGGGAGAACAACATTTCAAAGGCCTGTAAGTTATAATGCTGAAAGCCCACTTAATATTTCTGGTAGTATTAGTTAAAGTTTTAAAACACCTTTTTCCACCTTGAGTGTGAGAATTGTAGAGCAGTGCTGTCCAGTAGAAATGTGTGCATTGACAGAAAGACTGTGGATCTGTGCTGAGCAATGTGGCAGCCAGAGATCACAAGGCTATCAAGCACTTTGCACATGGCAAGTGTAACTGAGAAGCACACATTCAAATAATAGTTAATTTTAATTGAATGTATCTAGCCATGTGTGGCTAGTAGCTCCTTTCCTGGAGAGAGAATCTGGAGCCCACATCTAACTTGTTAAGTCTGGAATCTTATTTTTTATTTCTGGAAAGGTCTATGAACTATAGTTTTGGGGGCAGCTCACTTACTAACTTTTAATGCAATAAGATCCATGGTATCTTGAGAACATTATTTTGTCTCTTTGTAGTACTGAAACCTTATACATGTGAAGTAAGGGGTCTATACTTAAGTCACATCTCCAACCTTAGTAATGTTTTAATGTAGTAAAAAAATGAGTAATTAATTTATTTTTAGAAGGTCAATAGTATCATGTATTCCAAATAACAGAGGTATATGGTTAGAAAAGAAACAATTCAAAGGACTTATATAATATCTAGCCTTGACAATGAATAAATTTAGAGAGTAGTTTGCCTGTTTGCCTCATGTTCATAAATCTATTGACACATATGTGCATCTGCACTTCAGCATGGTAGAAGTCCATATTCCTTTGCTTGGAAAGGCAGGTGTTCCCATTACGCCTCAGAGAATAGCTGACGGGAAGAGGCTTTCTAGATAGTTGTATGAAAGATATACAAAATCTCGCAGGTATACACAGGCATGATTTGCTGGTTGGGAGAGCCACTTAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
Cas9 ORF(配列番号703)
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CCGGAAGATAACGAACAGAAGCAGCTTTTCGTGGAGCAGCACAAGCATTATCTGGATGAAATCATCGAACAAATCTCCGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAAGTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGAGATAAGCCGATCAGAGAACAGGCCGAGAACATTATCCACTTGTTCACCCTGACTAACCTGGGAGCCCCAGCCGCCTTCAAGTACTTCGATACTACTATCGATCGCAAAAGATACACGTCCACCAAGGAAGTTCTGGACGCGACCCTGATCCACCAAAGCATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCTGTCGCAGCTGGGTGGCGAT
U-dep Cas9 ORF(配列番号704)
ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACA
CTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGA
AGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAG
U dep Cas9(配列番号705)を含むmRNA
GGGUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUGUGUGUCGUUGCAGGCCUUAUUCGGAUCCGCCACCAUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAA
GAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCU
GUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAGCUAGCCAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGCUUAUUCAUCUCUUUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAACCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Claims (42)
- 配列mU*mA*mA*AGCAUAGUGCAAUGGAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(配列番号72)を含むシングルガイドRNA(sgRNA)であって、「mA」、「mC」、「mU」、及び「mG」は、2’-O-Meで置換されたヌクレオチドを表し、*はホスホロチオエート(PS)結合を示す、前記sgRNA。
- 細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座に異種ポリペプチドをコードする核酸を挿入する方法における使用のための、請求項1に記載のsgRNAを含む組成物であって、前記方法は、
i)請求項1に記載のsgRNA、
ii)RNAガイドDNA結合剤、及び
iii)前記異種ポリペプチドをコードする前記核酸を含む構築物
を前記細胞または細胞集団に送達し、それによって前記細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座に前記異種ポリペプチドをコードする前記核酸を挿入することを含む、前記組成物。 - 前記RNAガイドDNA結合剤が、Casヌクレアーゼ、または前記Casヌクレアーゼをコードする核酸である、請求項2に記載の使用のための組成物。
- 前記Casヌクレアーゼが、クラス2のCasヌクレアーゼである、請求項3に記載の使用のための組成物。
- 前記Casヌクレアーゼが、Cas9である、請求項3または4に記載の使用のための組成物。
- 前記構築物が、ポリアデニル化シグナル配列を含む、請求項2~5のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記構築物が、スプライスアクセプター部位を含む、請求項2~6のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記異種ポリペプチドが、分泌ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチドである、請求項2~7のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記RNAガイドDNA結合剤が、前記RNAガイドDNA結合剤をコードする核酸として送達される、請求項2~8のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記sgRNA、前記RNAガイドDNA結合剤、及び/または前記異種ポリペプチドをコードする前記核酸を含む前記構築物が、ベクター及び/または脂質ナノ粒子で送達される、請求項2~9のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項10に記載の使用のための組成物。
- 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項11に記載の使用のための組成物。
- 前記sgRNAが、前記RNAガイドDNA結合剤による標的特異的切断を媒介し、アルブミン遺伝子のイントロン1内に前記異種ポリペプチドをコードする前記核酸の挿入をもたらす、請求項2~12のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 標的特異的切断により前記細胞集団における前記異種ポリペプチドをコードする前記核酸の少なくとも2%の挿入率をもたらすための、請求項13に記載の使用のための組成物。
- 前記細胞または細胞集団が、肝臓の細胞または細胞集団である、請求項2~14のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 対象における細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座に異種ポリペプチドをコードする核酸を挿入する方法における使用のための、配列mU*mA*mA*AGCAUAGUGCAAUGGAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(配列番号72)を含むシングルガイドRNA(sgRNA)を含む組成物であって、
「mA」、「mC」、「mU」、及び「mG」は、2’-O-Meで置換されたヌクレオチドを表し、*はホスホロチオエート(PS)結合を示し、
前記方法は、
i)前記シングルガイドRNA(sgRNA)、
ii)RNAガイドDNA結合剤、及び
iii)前記異種ポリペプチドをコードする前記核酸を含む構築物
を前記対象に投与し、それにより、前記細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座に前記異種ポリペプチドをコードする前記核酸を挿入することを含む、前記組成物。 - 前記RNAガイドDNA結合剤が、Cas9またはCas9をコードする核酸である、請求項16に記載の使用のための組成物。
- 前記RNAガイドDNA結合剤が、前記RNAガイドDNA結合剤をコードする核酸として投与される、請求項16または17に記載の使用のための組成物。
- 前記RNAガイドDNA結合剤をコードする前記核酸が、mRNAである、請求項18に記載の使用のための組成物。
- 前記mRNAが、修飾mRNAである、請求項19に記載の使用のための組成物。
- 前記RNAガイドDNA結合剤が、Casヌクレアーゼまたは前記Casヌクレアーゼをコードする核酸である、請求項16~20のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記Casヌクレアーゼが、Cas9である、請求項21に記載の使用のための組成物。
- 前記Casヌクレアーゼが、S.pyogenes Cas9ヌクレアーゼである、請求項21または22に記載の使用のための組成物。
- 前記構築物が、ポリアデニル化シグナル配列を含む、請求項16~23のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記構築物が、スプライスアクセプター部位を含む、請求項16~24のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記構築物が、相同性アームを含まない、請求項16~25のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記sgRNAが、ベクター及び/または脂質ナノ粒子で投与される、請求項16~26のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記RNAガイドDNA結合剤が、ベクター及び/または脂質ナノ粒子で投与される、請求項16~27のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記異種ポリペプチドをコードする前記核酸を含む前記構築物が、ベクター及び/または脂質ナノ粒子で投与される、請求項16~28のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項27~29のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項30に記載の使用のための組成物。
- 前記sgRNAが、前記RNAガイドDNA結合剤による標的特異的切断を媒介し、アルブミン遺伝子のイントロン1内に前記異種ポリペプチドをコードする前記核酸の挿入をもたらす、請求項16~31のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 標的特異的切断により前記細胞集団における前記異種ポリペプチドをコードする前記核酸の少なくとも2%の挿入率をもたらすための、請求項32に記載の使用のための組成物。
- 前記sgRNA及び/または前記RNAガイドDNA結合剤が、脂質ナノ粒子で投与される、請求項16~33のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記sgRNA及び前記RNAガイドDNA結合剤が、リボ核タンパク質(RNP)として投与される、請求項16~34のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 請求項1に記載のsgRNAを含むベクター。
- 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項36に記載のベクター。
- 請求項1に記載のsgRNAを含む、脂質ナノ粒子。
- 請求項1に記載のsgRNAを含む、細胞。
- 細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座に異種ポリペプチドをコードする核酸を挿入する方法における使用のための、請求項1に記載のsgRNAを含む組成物。
- 対象において細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座に異種ポリペプチドをコードする核酸を挿入する方法における使用のための、請求項1に記載のsgRNAを含む組成物。
- i)請求項1に記載のsgRNA、
ii)RNAガイドDNA結合剤、及び
iii)異種ポリペプチドをコードする核酸を含む構築物
を含む、キット又は組成物。
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US20240182561A1 (en) | 2022-11-04 | 2024-06-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle |
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Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014526279A (ja) | 2011-09-21 | 2014-10-06 | サンガモ バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | 導入遺伝子発現を制御するための方法および組成物 |
US20150203872A1 (en) | 2012-12-12 | 2015-07-23 | The Broad Institute Inc. | Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products |
JP2015527881A (ja) | 2012-07-11 | 2015-09-24 | サンガモ バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | リソソーム貯蔵疾患の処置のための方法および組成物 |
JP2016521994A (ja) | 2013-06-17 | 2016-07-28 | ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド | 配列操作のための最適化されたCRISPR−Cas二重ニッカーゼ系、方法および組成物 |
CN105950626A (zh) | 2016-06-17 | 2016-09-21 | 新疆畜牧科学院生物技术研究所 | 基于CRISPR/Cas9获得不同毛色绵羊的方法及靶向ASIP基因的sgRNA |
WO2017091512A1 (en) | 2015-11-23 | 2017-06-01 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for engineering immunity |
WO2017109757A1 (en) | 2015-12-23 | 2017-06-29 | Crispr Therapeutics Ag | Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis and/or frontal temporal lobular degeneration |
US20170342118A1 (en) | 2013-12-09 | 2017-11-30 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for treating hemophilia |
WO2018007871A1 (en) | 2016-07-08 | 2018-01-11 | Crispr Therapeutics Ag | Materials and methods for treatment of transthyretin amyloidosis |
WO2018075736A1 (en) | 2016-10-20 | 2018-04-26 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for the treatment of fabry disease |
Family Cites Families (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4946787A (en) | 1985-01-07 | 1990-08-07 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4897355A (en) | 1985-01-07 | 1990-01-30 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US5049386A (en) | 1985-01-07 | 1991-09-17 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US5585481A (en) | 1987-09-21 | 1996-12-17 | Gen-Probe Incorporated | Linking reagents for nucleotide probes |
US5378825A (en) | 1990-07-27 | 1995-01-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
EP0618925B2 (en) | 1991-12-24 | 2012-04-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides |
EP0752005B1 (en) | 1994-03-23 | 2008-10-08 | Ohio University | Compacted nucleic acids and their delivery to cells |
JPH10500310A (ja) | 1994-05-19 | 1998-01-13 | ダコ アクティーゼルスカブ | 淋菌及びトラコーマ クラミジアの検出のためのpna プローブ |
EP2281050B1 (en) | 2008-04-14 | 2014-04-02 | Sangamo BioSciences, Inc. | Linear donor constructs for targeted integration |
KR101759586B1 (ko) | 2008-08-22 | 2017-07-19 | 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | 표적화된 단일가닥 분할 및 표적화된 통합을 위한 방법 및 조성물 |
EP2660318A1 (en) | 2010-02-09 | 2013-11-06 | Sangamo BioSciences, Inc. | Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules |
PT2800811T (pt) | 2012-05-25 | 2017-08-17 | Univ California | Métodos e composições para modificação de adn alvo dirigida por arn e para modulação dirigida por arn de transcrição |
CN110643600A (zh) | 2012-10-23 | 2020-01-03 | 基因工具股份有限公司 | 用于切割靶dna的系统及其用途 |
US20140310830A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-10-16 | Feng Zhang | CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes |
BR112015021791B1 (pt) | 2013-03-08 | 2022-08-30 | Novartis Ag | Compostos de lipídio catiônico e composições de lipídios e farmacêuticas |
CN116083487A (zh) * | 2013-05-15 | 2023-05-09 | 桑格摩生物治疗股份有限公司 | 用于治疗遗传病状的方法和组合物 |
EP3872066A1 (en) | 2013-12-19 | 2021-09-01 | Novartis AG | Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents |
US20150376587A1 (en) | 2014-06-25 | 2015-12-31 | Caribou Biosciences, Inc. | RNA Modification to Engineer Cas9 Activity |
US10342761B2 (en) | 2014-07-16 | 2019-07-09 | Novartis Ag | Method of encapsulating a nucleic acid in a lipid nanoparticle host |
CN113337533A (zh) | 2014-12-23 | 2021-09-03 | 先正达参股股份有限公司 | 用于鉴定和富集包含位点特异性基因组修饰的细胞的方法和组合物 |
EP3265559B1 (en) | 2015-03-03 | 2021-01-06 | The General Hospital Corporation | Engineered crispr-cas9 nucleases with altered pam specificity |
EP3967758A1 (en) * | 2015-12-01 | 2022-03-16 | CRISPR Therapeutics AG | Materials and methods for treatment of alpha-1 antitrypsin deficiency |
WO2017136794A1 (en) | 2016-02-03 | 2017-08-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications |
WO2017158422A1 (en) | 2016-03-16 | 2017-09-21 | Crispr Therapeutics Ag | Materials and methods for treatment of hereditary haemochromatosis |
JP7245651B2 (ja) | 2016-03-30 | 2023-03-24 | インテリア セラピューティクス,インコーポレイテッド | Crispr/cas構成成分のための脂質ナノ粒子製剤 |
EA201991369A1 (ru) | 2016-12-08 | 2019-12-30 | Интеллиа Терапьютикс, Инк. | Модифицированные направляющие рнк |
CN117737062A (zh) * | 2016-12-22 | 2024-03-22 | 因特利亚治疗公司 | 用于治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的组合物及方法 |
US11597947B2 (en) * | 2016-12-29 | 2023-03-07 | Asc Therapeutics Inc. | Gene editing method using virus |
JP2021500863A (ja) | 2017-09-29 | 2021-01-14 | インテリア セラピューティクス,インコーポレイテッド | ゲノム編集用のポリヌクレオチド、組成物および方法 |
WO2019079527A1 (en) * | 2017-10-17 | 2019-04-25 | Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership | COMPOSITIONS AND METHODS FOR GENETIC EDITION FOR HEMOPHILIA A |
DE112019005166T5 (de) * | 2018-10-16 | 2021-07-29 | Blueallele, Llc | Verfahren zur gezielten insertion von dna in gene |
-
2019
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-
2021
- 2021-04-11 IL IL282236A patent/IL282236A/en unknown
- 2021-04-15 PH PH12021550844A patent/PH12021550844A1/en unknown
- 2021-04-16 US US17/233,373 patent/US20220354967A1/en active Pending
- 2021-05-18 CO CONC2021/0006363A patent/CO2021006363A2/es unknown
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014526279A (ja) | 2011-09-21 | 2014-10-06 | サンガモ バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | 導入遺伝子発現を制御するための方法および組成物 |
JP2015527881A (ja) | 2012-07-11 | 2015-09-24 | サンガモ バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | リソソーム貯蔵疾患の処置のための方法および組成物 |
US20150203872A1 (en) | 2012-12-12 | 2015-07-23 | The Broad Institute Inc. | Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products |
JP2016521994A (ja) | 2013-06-17 | 2016-07-28 | ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド | 配列操作のための最適化されたCRISPR−Cas二重ニッカーゼ系、方法および組成物 |
US20170342118A1 (en) | 2013-12-09 | 2017-11-30 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for treating hemophilia |
WO2017091512A1 (en) | 2015-11-23 | 2017-06-01 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for engineering immunity |
WO2017109757A1 (en) | 2015-12-23 | 2017-06-29 | Crispr Therapeutics Ag | Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis and/or frontal temporal lobular degeneration |
CN105950626A (zh) | 2016-06-17 | 2016-09-21 | 新疆畜牧科学院生物技术研究所 | 基于CRISPR/Cas9获得不同毛色绵羊的方法及靶向ASIP基因的sgRNA |
WO2018007871A1 (en) | 2016-07-08 | 2018-01-11 | Crispr Therapeutics Ag | Materials and methods for treatment of transthyretin amyloidosis |
WO2018075736A1 (en) | 2016-10-20 | 2018-04-26 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for the treatment of fabry disease |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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