JP2021500863A - ゲノム編集用のポリヌクレオチド、組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
別段の記載がない限り、本明細書において使用される場合、以下の用語および文言は、以下の意味を有することが意図される。
1.低ウリジン含有量のmRNAおよびORF
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量から、最小ウリジン含有量の約150%の範囲のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、ORFのウリジン含有量は、その最小ウリジン含有量の約145%、140%、135%、130%、125%、120%、115%、110%、105%、104%、103%、102%または101%以下である。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量と等しいウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約150%以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約145%以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約140%以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約135%以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約130%以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約125%以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約120%以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約115%以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約110%以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約105%以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約104%以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約103%以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約102%以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約101%以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量から、最小アデニン含有量の約150%の範囲のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、ORFのアデニン含有量は、その最小アデニン含有量の約145%、140%、135%、130%、125%、120%、115%、110%、105%、104%、103%、102%または101%以下である。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量と等しいアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約150%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約145%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約140%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約135%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約130%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約125%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約120%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約115%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約110%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約105%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約104%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約103%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約102%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約101%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。
実現可能な程度に、低アデニン含有量に関する上述の特性のいずれかを、低ウリジン含有量に関する上述の特性のいずれかと組み合わせることができる。例えばRNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供されてもよく、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量から、最小ウリジン含有量の約150%の範囲のウリジン含有量(例えば、ORFのウリジン含有量は、その最小ウリジン含有量の約145%、140%、135%、130%、125%、120%、115%、110%、105%、104%、103%、102%または101%以下である)、およびその最小アデニン含有量から、最小アデニン含有量の約150%の範囲のアデニン含有量(例えば、その最小アデニン含有量の約145%、140%、135%、130%、125%、120%、115%、110%、105%、104%、103%、102%または101%以下)、を有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。ウリジンジヌクレオチドおよびアデニンジヌクレオチドに関しても同じである。同様に、ORF中のウリジンヌクレオチドおよびアデニンジヌクレオチドの含有量も、上述のとおりであってもよい。同様に、ORF中のウリジンジヌクレオチドおよびアデニンヌクレオチドの含有量も、上述のとおりであってもよい。
一部の実施形態では、mRNAは、例えばヒトなどの哺乳動物において翻訳を増加させるコドンを有するORFを含む。さらなる実施形態では、mRNAは、例えばヒトなどの哺乳動物の例えば肝臓などの器官において翻訳を増加させるコドンを有するORFを含む。さらなる実施形態では、mRNAは、例えばヒトなどの哺乳動物の例えば肝細胞などの細胞型において翻訳を増加させるコドンを有するORFを含む。哺乳動物、細胞型、哺乳動物の器官、ヒト、ヒトの器官などにおける翻訳の増加は、当該ORFの野生型配列の翻訳の程度との比較で決定されることができ、または当該ORFが由来する生物体のコドン分布またはアミノ酸レベルで最も類似したORFを含有する生物体、例えば化膿連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、または原核細胞由来のCasヌクレアーゼ、例えば以下に記載される他の原核細胞由来のCasヌクレアーゼなどの場合に対しては別の原核細胞などのコドン分布に合致するコドン分布を有するORFとの比較で決定されることができる。あるいは一部の実施形態では、哺乳動物、細胞型、哺乳動物の器官、ヒト、ヒトの器官などのCas9配列に対する翻訳の増加は、任意の適用可能な点変異、異種ドメインなどを含む、その他の条件が同じである、配列番号5の配列を有するORFの配列と比較して決定される。ヒトの肝臓およびヒトの肝細胞を含む、ヒトにおける発現の増加に有用なコドンは、ヒトの肝臓/肝細胞において高度に発現されるtRNAに相当するコドンであってもよく、Dittmar KA, PLos Genetics 2(12): e221 (2006)に検討されている。一部の実施形態では、ORF中のコドンの少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%が、例えばヒトなどの哺乳動物において高度に発現されるtRNAに相当するコドンである(例えば各アミノ酸に関し最も高く発現されるtRNA)。一部の実施形態では、ORF中のコドンの少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%が、例えばヒトの器官などの哺乳動物の器官において高度に発現されるtRNAに相当するコドンである(例えば各アミノ酸に関し最も高く発現されるtRNA)。一部の実施形態では、ORF中のコドンの少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%が、例えばヒトの肝臓などの哺乳動物の肝臓において高度に発現されるtRNAに相当するコドンである(例えば各アミノ酸に関し最も高く発現されるtRNA)。一部の実施形態では、ORF中のコドンの少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%が、例えばヒトの肝細胞などの哺乳動物の肝細胞において高度に発現されるtRNAに相当するコドンである(例えば各アミノ酸に関し最も高く発現されるtRNA)。
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、クラス2のCasヌクレアーゼである。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、クリベース活性を有しており、この活性は二本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも呼称され得る。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、例えばクラス2のCasヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼを含む(例えばII型、V型またはVI型のCasヌクレアーゼであってもよい)。クラス2のCasヌクレアーゼとしては例えば、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2およびC2c3タンパク質ならびにそれらの改変型が挙げられる。Cas9ヌクレアーゼの例としては、化膿連鎖球菌、黄色ブドウ球菌および他の原核細胞(例えば次のパラグラフのリストを参照)およびそれらの改変型(例えば遺伝子操作型または変異体)のII型CRISPRシステムのものが挙げられる。例えば、US2016/0312198 A1;US 2016/0312199 A1を参照のこと。Casヌクレアーゼの他の例としては、III型CRISPRシステムのCsmもしくはCmr複合体、またはそのCas10、Csm1もしくはCmr2サブユニット、およびI型CRISPRシステムのCascade複合体、またはそのCas3サブユニットが挙げられる。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、IIA型、IIB型またはIIC型のシステム由来であってもよい。様々なCRISPRシステムおよびCasヌクレアーゼの検討に関しては、例えばMakarova et al., Nat. Rev. Microbiol. 9:467-477 (2011); Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol, 13: 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell,60:385-397 (2015)を参照のこと。
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、1つまたは複数の異種機能性ドメインを含む(例えば、融合ポリペプチドであるか、または融合ポリペプチドを含む)。
7.UTR;コザック配列
一部の実施形態では、mRNAは、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含み、当該ORFは、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90%の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、mRNAは、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含み、当該RNA誘導型DNA結合剤は、配列番号3、6、8、13、16、19、22、25、28、68または186〜196のいずれか1つに対し少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ORFは、その最小ウリジン含有量から、最小ウリジン含有量の150%の範囲のウリジン含有量を有し、および/またはその最小ウリジンジヌクレオチド含有量から、最少ウリジンジヌクレオチド含有量の150%の範囲のウリジンジヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、mRNAは、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含み、当該RNA誘導型DNA結合剤は、配列番号3、6、8、13、16、19、22、25、28、68または186〜196のいずれか1つに対し少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ORFは、その最小アデニン含有量から、最小アデニン含有量の150%の範囲のアデニン含有量を有し、および/またはその最小アデニンジヌクレオチド含有量から、最少アデニンジヌクレオチド含有量の150%の範囲のアデニンジヌクレオチド含有量を有する。一部のそうした実施形態では、アデニンヌクレオチド含有量とウリジンヌクレオチド含有量の両方が、その各最小量の150%以下である。一部の実施形態では、アデニンジヌクレオチド含有量とウリジンジヌクレオチド含有量の両方が、その各最小量の150%以下である。一部の実施形態では、mRNAは、配列番号43、44、51、53、55〜61または67のいずれか1つに対し少なくとも90%の同一性を有する配列を含み、当該配列は、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含む。一部の実施形態では、mRNAは、配列番号43、44、51、53、55〜61または67のいずれか1つに対し少なくとも90%の同一性を有する配列を含み、当該配列は、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含み、当該配列番号43、44、51、53、55〜61または67の最初の3ヌクレオチドは、削除される。一部の実施形態では、前述の同一性レベルのいずれかは、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%である。
一部の実施形態では、mRNAは、ポリ-アデニル化(ポリA)尾部をさらに含む。一部の例では、ポリ-A尾部は、当該ポリ-A尾部内の1つまたは複数の場所で、1つまたは複数の非アデニンヌクレオチド「アンカー」で「中断」される。ポリ-A尾部は、少なくとも8個の連続したアデニンヌクレオチドを含み得るが、1つまたは複数の非アデニンヌクレオチドも含み得る。本明細書において使用される場合、「非アデニンヌクレオチド」とは、アデニンを含まない任意の天然または非天然のヌクレオチドを指す。グアニン、チミンおよびシトシンヌクレオチドが、非アデニンヌクレオチドの例である。したがって本明細書に記載されるmRNA上のポリ-A尾部は、RNA誘導型DNA結合剤または対象配列をコードするヌクレオチドに対し3’に位置する連続的アデニンヌクレオチドを含み得る。一部の例では、mRNA上のポリ-A尾部は、RNA誘導型DNA結合剤または対象配列をコードするヌクレオチドに対し3’に位置する非連続的アデニンヌクレオチドを含み、この場合において当該非アデニンヌクレオチドは、均一、または不均一な間隔でアデニンヌクレオチドを中断する。
一部の実施形態では、mRNAは、一部またはすべてのウリジン位置で改変ウリジンを含む。一部の実施形態では、改変ウリジンは、5位で改変されたウリジンであり、例えばハロゲンまたはC1-C3アルコキシで改変されたウリジンである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、1位で改変されたシュードウリジンであり、例えばC1-C3アルキルで改変されたシュードウリジンである。改変ウリジンは、例えばシュードウリジン、N1-メチル-シュードウリジン、5-メトキシウリジン、5-ヨードウリジンまたはそれらの組み合わせであってもよい。一部の実施形態では、改変ウリジンは、5-メトキシウリジンである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、5-ヨードウリジンである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、シュードウリジンである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、N1-メチル-シュードウリジンである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、シュードウリジンとN1-メチル-シュードウリジンの組み合わせである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、シュードウリジンと5-メトキシウリジンの組み合わせである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、N1-メチルシュードウリジンと5-メトキシウリジンの組み合わせである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、5-ヨードウリジンとN1-メチル-シュードウリジンの組み合わせである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、シュードウリジンと5-ヨードウリジンの組み合わせである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、5-ヨードウリジンと5-メトキシウリジンの組み合わせである。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるmRNAは、例えばCap0、Cap1またはCap2などの5’キャップを含む。5’キャップは通常、7-メチルグアニンリボヌクレオチド(以下に検討されるように例えばARCAに関してさらに改変され得る)であり、5’三リン酸を介して、mRNAの5’-3’方向の鎖の最初のヌクレオチド、すなわち最初のキャップ近接ヌクレオチドの5’位に結合される。Cap0では、mRNAの最初と2番目のキャップ近接ヌクレオチドのリボースは両方とも2’-ヒドロキシルを含む。Cap1では、mRNAの最初と2番目の転写されるヌクレオチドのリボースはそれぞれ2'-メトキシおよび2'-ヒドロキシルを含む。Cap2では、mRNAの最初と2番目のキャップ近接ヌクレオチドのリボースは両方とも2’-メトキシを含む。例えば、Katibah et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30; Abbas et al. (2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115を参照のこと。例えばヒトmRNAなどの哺乳動物mRNAをはじめとする高度な真核細胞生物の内因性mRNAの大部分は、Cap1またはCap2を含む。Cap0と他のキャップの構造はCap1およびCap2とは異なっており、そのために例えばIFIT-1およびIFIT-5などの自然免疫系の構成要素により「非自己」として認識され、I型インターフェロンを含むサイトカインのレベル上昇が生じる可能性があるため、例えばヒトなどの哺乳動物において免疫原性があり得る。例えばIFIT-1およびIFIT-5などの自然免疫系の構成要素は、Cap1またはCap2以外のキャップを有するmRNAの結合に関してeIF4Eと競合し、mRNAの翻訳を阻害する可能性もある。
一部の実施形態では、少なくとも1つのガイドRNAは、本明細書に開示されるmRNAと組み合わされて提供される。一部の実施形態では、ガイドRNAは、mRNAとは別個の分子として提供される。一部の実施形態では、ガイドRNAは、本明細書に開示されるmRNAの一部として、例えばUTRの一部として提供される。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイドRNAがTTRを標的とする。
13.脂質;製剤;送達
CRISPR/Cas mRNAおよびガイドRNA構成要素の肝臓の細胞への送達用の脂質組成物は、CCD脂質を含む。
本開示の脂質組成物における使用に適した「中性脂質」としては、様々な中性脂質、非荷電脂質または両性イオン脂質が挙げられる。本開示での使用に適した中性リン脂質の例としては限定されないが、5-ヘプタデシルベンゼン-1,3-ジオール(レソルシノール)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ホスホコリン(DOPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ホスファチジルコリン(PLPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DAPC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、卵ホスファチジルコリン(EPC)、ジラウリロイルホスファチジルコリン(DLPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、1-ミリストイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン(MPPC)、1-パルミトイル-2-ミリストイル ホスファチジルコリン(PMPC)、1-パルミトイル-2-ステアロイルホスファチジルコリン(PSPC)、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DBPC)、1-ステアロイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン(SPPC)、1,2-ジエイコセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DEPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、リゾホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)が挙げられる。1つの実施形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)からなる群から選択されてもよい。別の実施形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)であってもよい。
C.mRNAの有効性の決定
一部の実施形態では、mRNA、LNPまたは医薬組成物は、例えば標的遺伝子の編集などのゲノム編集における使用のためである。一部の実施形態では、mRNA、LNPまたは医薬組成物は、例えばその配列またはエピジェネティックの状態を変えるなど、標的遺伝子の改変における使用のためである。一部の実施形態では、mRNA、LNPまたは医薬組成物は、標的遺伝子内への二本鎖切断(DSB)の導入における使用のためである。一部の実施形態では、mRNA、LNPまたは医薬組成物は、標的遺伝子内へのindelの導入における使用のためである。一部の実施形態では、例えば標的遺伝子の編集などのゲノム編集のための医薬の調製のための、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物の使用が提供される。一部の実施形態では、例えばその配列またはエピジェネティックの状態を変えるなど、標的遺伝子の改変のための医薬の調製のための、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物の使用が提供される。一部の実施形態では、標的遺伝子内への二本鎖切断(DSB)の導入のための医薬の調製のための、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物の使用が提供される。一部の実施形態では、標的遺伝子内へのindelの導入のための医薬の調製のための、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物の使用が提供される。一部の実施形態では、標的遺伝子は、例えばヒトなどの哺乳動物といった対象中にある。一部の実施形態では、標的遺伝子は、例えばヒトの肝臓など、哺乳動物の肝臓などの器官中にある。一部の実施形態では、標的遺伝子は、例えばヒトの肝臓の細胞など、哺乳動物の肝臓の細胞などの肝臓の細胞中にある。一部の実施形態では、標的遺伝子は、例えばヒト肝細胞など、哺乳動物肝細胞などの肝細胞中にある。一部の実施形態では、肝臓の細胞または肝細胞は、原位置(in situ)にある。一部の実施形態では、肝臓の細胞または肝細胞は、例えば初代培養中など、培養中に単離される。本明細書に開示される用途に対応する方法も提供され、当該方法は、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物を対象に投与する工程、または上述の細胞などの細胞と、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物を接触させる工程を含む。
ある実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるRNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAのいずれかをコードする配列を含むDNA分子を提供する。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤の配列に加えて、DNA分子は、RNA誘導型DNA結合剤をコードしない核酸分子もさらに含む。RNA誘導型DNA結合剤をコードしない核酸としては限定されないが、プロモーター、エンハンサー、制御配列、およびガイドRNAをコードする核酸が挙げられる。
概して、脂質ナノ粒子の構成要素は、様々なモル比の脂質構成要素で100%エタノール中に溶解された。RNAカーゴを、25mMクエン酸塩、100mM NaCl、pH5.0中に溶解させ、およそ0.45mg/mLの濃度のRNAカーゴを得た。脂質アミンとRNAリン酸塩(N:P)のモル比が約4.5または6、mRNAとgRNAが1:1の重量比で、LNPを製剤化した。
直交流法を使用して調製されたLNPに関しては、LNPは、2体積のRNA溶液と、1体積の水を用いて、エタノール中、脂質を衝突噴流混合することにより形成させた。脂質のエタノール溶液は、直交混合を介して2体積のRNA溶液と混合させた。4番目の水流は、インラインティー(inline tee)を介して、出口の直交流と混合される。(WO2016010840の図2を参照)。LNPは1時間室温で保持され、水でさらに希釈された(およそ1:1のv/v)。希釈されたLNPは、flat sheet cartridge (Sartorius社、100kD MWCO)上の接線流ろ過を使用して濃縮され、次いで50mM Tris、45mM NaCl、5%(w/v)スクロース、pH7.5(TSS)へと透析ろ過を行うことにより緩衝液交換された。あるいはTSSへの最終緩衝液交換は、PD-10脱塩カラム(GE社)を用いて完了された。必要な場合には、Amicon 100 kDa centrifugal filters(Millipore社)を用いた遠心分離により製剤を濃縮した。次いで得られた混合液を、0.2μmの滅菌フィルターを使用してろ過した。最終LNPは、次に使用するまで4℃または-80℃で保存した。
製剤分析
別段の記載がない限り、6〜10週齢のメスのCD-1マウスを各試験で使用した。動物の体重を測定し、体重に従って集団を分け、集団の平均体重に基づいて投与溶液を調製した。動物1匹当たり0.2mLの体積で、外側尾静脈からLNPを投与した(体重1キログラム当たり、およそ10mL)。有害作用に関し、投与後およそ6時間で動物を観察した。投与後24時間で体重を計測した。様々な時点で、イソフルラン麻酔下での心穿刺による放血で動物を安楽死させた。本明細書に記載されるように、血清分離チューブまたは血漿用の緩衝クエン酸ナトリウムを含有するチューブに、血液を採取した。インビボ編集を含む試験に関しては、各動物の中葉または3つの独立した葉(例えば右中葉、左中葉および左側葉)から肝臓組織を採取し、DNA抽出と分析を行った。
指定されるように血液を採取し、血清を単離させた。Mouse Prealbumin (Transthyretin) ELISA Kit (Aviva Systems Biology社、カタログ番号OKIA00111)を使用して総マウスTTR血清レベルを決定した。ラットTTR血清レベルは、ラット特異的なELISAキット(Aviva Systems Biology社、カタログ番号OKIA00159)をメーカーのプロトコールに従い使用して測定した。簡潔に述べると、キットのサンプル希釈液を用いてサンプルを連続希釈して10,000倍の最終希釈とした。次いでこの希釈サンプルをELISAプレートに添加し、その後、指示書に従いアッセイを実施した。
簡潔に述べると、ゲノムの標的位置での編集効率を定量的に決定するために、ゲノムDNAを単離し、ディープシーケンシングを利用して遺伝子編集により導入された挿入と欠失の存在を特定した。
配列番号5に記載されるORFを含むmRNAは、以下の表5に示されるように様々な改変ヌクレオチド含有量で調製された。mRNAは、トランスサイレチン遺伝子(TTR)を標的とするガイドRNA(G282、配列番号42)と混合され、LNP内に組み込まれた。LNP420を除くすべてのLNPで、非改変のシチジンが使用された。
Cas9配列(配列番号1)を設計し、肝臓発現を改善し、ウリジンを最小化した。最小可能性ウリジン含有量を有すること、および肝臓で対応するtRNAの最大発現を有することに基づきコドンを選択した。肝臓tRNA発現に関しては、Dittmar KA, PLos Genetics 2(12): e221 (2006)を参照のこと。Cas9 mRNAのウリジン含有量の低下は、当該mRNAに対する自然免疫反応を減少させること、および/または他の利益をもたらすことが目的であった。表6は、tRNAレベルに基づく最適肝臓コドン、および最小可能性ウリジン数を有するコドンを示す。最小ウリジンコドンが、最適肝臓コドンと異なっている例は、太字の斜体となっている。表は、化膿連鎖球菌Cas9のアミノ酸配列(配列番号3)中の各アミノ酸数も示している。
配列番号5を含むCas9 mRNA配列と比較した、配列番号4を含むCas9 mRNA配列のインビボ有効性、および非改変UTP、N1-メチル-シュード-UTP、40% 5-メトキシ-UTP+60%非改変UTP、または100% 5-メトキシ-UTPの存在下での配列番号4を含むCas9 mRNA配列の転写物の効果を評価した。表7は、これらインビボ試験群に関する情報を提示する。各mRNAは、脂質ナノ粒子(LNP)製剤として投与された。
様々なLNPの有効性が、初代マウス肝細胞(PMH:primary mouse hepatocyte)においてインビトロで評価された。
配列番号4を含むCas9 mRNA配列のインビボ有効性を、配列番号5を含むCas9 mRNA配列と対比させて、ラットにおいて評価した。表12は、これらインビボ試験群に関する情報を提示する。標準Cas9 mRNAとは配列番号5のことを指し、一方でU削減(U-dep)mRNAとは配列番号4を指す。各mRNAは、脂質ナノ粒子(LNP)製剤として投与された。
表15に示されるように、UTRおよび±ヘマグルチニン(HA)タグを伴うCas9をコードするmRNAを、TTRを標的とするガイドRNA(G282;配列番号42)とともにLNPとして製剤化した。LNPは、Nano Assemblr(商標)を使用して組み立てられ、45%Lipid A、9% DSPC、44%コレステロール、および2%PEG2k-DMGを含有した。これをAmicon PD10フィルターを使用して精製し、0.5mg/mlの濃度で使用した(LNP濃度)。CD-1メスマウス(1群当たりn=5)に、0.5または1.0mpkで静脈内投与した。投与後7日目に動物を殺処分し、血液と肝臓を採取して、血清TTRと肝臓編集を測定した。
配列番号4または配列番号5のORFを含むmRNAは、TTRを標的とするガイドRNAを含むLNPとして、図16に示されるようにガイド:Cas9 mRNAの重量比を変えて製剤化された。Cas9 mRNAは、上述のようにIVT合成により、ウリジン三リン酸塩の代わりにN1-メチルシュードウリジン三リン酸塩、そしてHSD 5’UTR、ヒトアルブミン3’UTR、およびポリA尾部を用いて作製された。
表21に示されるように、Cas9をコードし、改変ヌクレオチドを含有するmRNAを、TTRを標的とするガイドRNA(G282;配列番号42)とともにLNPとして製剤化した。LNP1034は、Trilink Biotechnologies, LLCから市販されているCas9 mRNAを含有し、CleanCap(商標)(7-メチルグアニンキャップ後の最初のヌクレオチドが2’-O-メチル化されているCap1構造)を含んだ。LNP1027-LNP1033は、配列番号4のORFと、ARCA(抗リバースキャップアナログ)Cap0を含むmRNAを含有した。LNPは、Nano Assemblr(商標)を使用して組み立てられ、45% Lipid A、9% DSPC、44%コレステロール、および2%PEG2k-DMGを含有した。これをAmicon PD10フィルターを使用して精製し、TSS緩衝液中に懸濁させた。LNP中のN:P(窒素とリン酸塩)の比率は、4.5であり、製剤のRNA濃度は、0.4mg/mlであった。メスのCD-1マウス(1群当たりn=5)に、0.1または0.3mpkで静脈内投与した。投与後7日目に動物を殺処分し、血液と肝臓を採取して、血清TTRと肝臓編集を測定した。
本試験は、ラットにおける、HBB(ヒトベータグロビン)5’および3’-UTR;XBG(アフリカツメガエルベータグロビン)5’および3’-UTR;またはヒトHSD17B4(HSD)5’UTRおよびアルブミン(ALB)3’UTRを有する、ARCAキャップ化Cas9 mRNAのインビボ有効性を評価した。
本試験は、マウスにおける、様々な比率のgRNAとmRNAのインビボ有効性を評価した。CleanCap(商標)でキャップ化された、配列番号 4のORF、HSD 5’UTR、ヒトアルブミン3’UTR、コザック配列、およびポリA尾部を有するCas9 mRNAは、実施例1に示されるように、ウリジン三リン酸塩の代わりにN1-メチルシュードウリジン三リン酸塩を用いてIVT合成により作製された。
様々なコドンスキームを使用したCas9配列を設計して、タンパク質発現の改善に関して検証した。各配列は、配列番号3のCas9アミノ酸を異なるコドンセットを使用してコードするよう設計された。各オープンリーディングフレーム配列においては、単一コドンを使用して、各アミノ酸をコードした。配列は、NCBI-GenBank Flat File Release 160.0 (Nakamura et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28, 292; Benson et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34(データベース公表)、D16-20)に基づく、ホモサピエンスでの完全タンパク質コード遺伝子においてコドンが存在する頻度、およびコドン間の特定のヌクレオチドの存在度に基づいて変化する。表4に示されるコドンスキームに基づき、Cas9に対する7つの異なるオープンリーディングフレーム(配列番号52、54および108〜112)が構築され、配列番号3のCas9タンパク質をコードした。これらを、HSD 5’UTR、(配列番号41)、アルブミン3’UTR、T7プロモーターおよびポリA尾部をさらに含有する構築物内に組み込んだ。アルブミン3’UTR、およびポリA尾部を含有する配列例は、配列番号53であり、HSD 5’UTR、および配列番号52のORFの後に、3’UTRとポリA尾部が続く。さらにこれらの評価には、Presnyakら(2015)が報告しているmRNA半減期を改善する最適コドンに基づいたコドンスキームを使用して配列番号3のCas9タンパク質をコードした、同様の構成の構築物が含まれた(配列番号107、表4の長半減期コドンセットを使用)。
表30に示されるように、Cas9をコードし、キャップ、UTRおよびポリA尾部を含有するmRNAを、TTRを標的とするガイドRNA(G282;配列番号42)とともにLNPとして製剤化した。直交流法を使用してLNPは組み立てられ、50% Lipid A、9% DSPC、38%コレステロール、および3% PEG2k-DMGをそれぞれ50:38:9:3のモル比で含有し、6.0のN:P比を有した。LNPは、Amicon PD-10フィルター(GE Healthcare社)を使用して精製され、0.06mg/mlの濃度で使用された(LNP濃度)。メスのCD-1マウス(1群当たりn=5)に、0.1または0.3mpkで静脈内投与した。投与後7日目に動物を殺処分し、血液と肝臓を採取して、血清TTRと肝臓編集を測定した。
図31および表30は、Cap1を有するmRNAが、Cap0のmRNAよりも、0.1mpkの投与量で約10%高い平均編集を有することを示す。0.3mpkの投与量では、XBG UTRを有するmRNAが、酵素的Cap0の場合を除き、HSD UTRを有するmRNAよりも若干高い平均編集を有している。血清TTRの結果を、図32(血清TTRの結果はそれぞれ、μg/mL、およびTSS対照の%で表される)、図31(肝臓編集)および表30に示す。
いくつかの核局在シグナル(NLS)を使用したCas9配列を設計し、検証して、有効性を決定した。様々な強度の11個の非標準NLSを、Kosugi et al. (2009) Journal of Biological Chemistry, 284(1), 478-485により特定されたNLSから、表31に示されるように選択した。これらのアミノ酸配列は、Cas9アミノ酸配列(配列番号13)のカルボキシ末端に付加された。対照配列は、配列番号4をコードする。
表33および図36は、様々な5’UTRを有する転写物からのCas9発現を示す。すべての構築物が、3’ヒトアルブミンUTRを使用した。IVTにより各構築物に対するメッセンジャーRNAが作製された。配列番号179のメッセンジャーRNAは、直線化プラスミドを使用して作製された。その他すべては、PCR産物を鋳型として使用して作製された。HepG2細胞に、100ngの各Cas9 mRNAとトランスサイレチン(TTR)を標的とするガイド(G502、配列番号70)25nM最終濃度を用いて、Lipofectamine(商標)MessengerMAX(商標)Transfection Reagent (ThermoFisher社)を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの6時間後、細胞は、Nano-Glo(登録商標)HiBiT Lytic Assay (Promega社)により溶解された。Cas9タンパク質レベルは、Nano-Glo(登録商標)Nano-Glo HiBiT Extracellular Detection System (Promega社、カタログ番号N2420)を使用することにより決定された。表33および図36は、様々な5’UTRを有する転写物からのCas9発現を示す。
X-フロー/TFFプロセスを使用して上述のように調製されたLNP製剤を用いた3回の実験が実施された。個別のモル量およびカーゴは、表34〜36に提示されている。Cas9 mRNAおよびガイドRNA(gRNA)を含有する各製剤は、1:1の重量比のmRNA:gRNAを有した。LNPの投与量(mg/kg単位、総RNA含有量)、投与経路、および動物がデキサメタゾン前処置を受けたかどうかを、表に示す。デキサメタゾン(Dex)前処置を受けた動物について、Dexは、LNPまたはビヒクルの投与の1時間前に、IVボーラス注射により2mg/kgで投与された。
Cas9発現は、Cas9をコードする様々なmRNAの投与後にインビボで測定された。表49に指定されるメッセンジャーRNAは、マウスTTR遺伝子を標的とするマウスsgRNAとともにLNPとして製剤化された(sgRNA:mRNAの重量比は1:2)。直交流法を使用してLNPは組み立てられ、50% Lipid A、9% DSPC、38%コレステロール、および3% PEG2k-DMGを含み、6.0のN:P比を有した。LNPは、Sartocon Slice 200 (Sartorius社)を使用して精製され、1.53mg/mlの濃度で使用された(RNA濃度)。LNP製剤は、上述のように平均粒子サイズ、多分散指数(pdi)、総RNA含有量およびRNAの封入効率に対して分析された(データ示さず)。
Cas9をコードする様々なmRNAの投与反応曲線をインビボで比較した。LNP製剤は、配列番号43および配列番号177のmRNA、ならびにsg502(配列番号70、G502)とともに調製され、実施例16に記載されるように製剤化された。脂質ナノ粒子成分は、脂質成分のモル比が50/9/38/3(LP01/DSPC/コレステロール/PEG-DMG)で、100%エタノール中に溶解された。脂質アミンとRNAリン酸塩(N:P)のモル比が約6、gRNAとmRNAが1:2の重量比で、LNPを製剤化した。LNP製剤は、上述のように平均粒子サイズ、多分散指数(pdi)、総RNA含有量およびRNAの封入効率に対して分析された(データは示さず)。
以下の配列表は、本明細書に開示される配列のリストを提供する。DNA配列(Tを含む)が、RNAに関して参照される場合、Tは、U(状況に応じて、改変または非改変であり得る)と置き換えられるものとし、逆もまた然りであることを理解されたい。
Claims (98)
- RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含むmRNAであって、前記オープンリーディングフレームは、その最小ウリジン含有量から、前記最小ウリジン含有量の150%の範囲のウリジン含有量を有する、mRNA。
- RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含むmRNAであって、前記オープンリーディングフレームは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量から、前記最小ウリジンジヌクレオチド含有量の150%の範囲のウリジンジヌクレオチド含有量を有する、mRNA。
- RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含むmRNAであって、前記オープンリーディングフレームは、その最小ウリジン含有量から、最小アデニン含有量の150%の範囲のアデニン含有量を有する、mRNA。
- RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含むmRNAであって、前記オープンリーディングフレームは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量から、前記最小アデニンジヌクレオチド含有量の150%の範囲のアデニンジヌクレオチド含有量を有する、mRNA。
- 配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90%の同一性を有する配列を含むmRNAであって、前記mRNAは、RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含む、mRNA。
- RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含むmRNAであって、前記オープンリーディングフレームは、少なくともその最初の30、50、70、100、150、200、250または300ヌクレオチドにわたり、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90%の同一性を有する、mRNA。
- 前記オープンリーディングフレームが、コドンのセットからなり、前記コドンの少なくとも75%は、(i)表1、表2または表3に列記されるコドン、または(ii)表4に列記されるコドンのセット、である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のmRNA。
- RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含む、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAであって、前記オープンリーディングフレームは、コドンのセットからなり、前記コドンの少なくとも75%は、表1、表2または表3に列記されるコドン、または(ii)表4に列記されるコドンのセットである、前記mRNA。
- 前記オープンリーディングフレームが、コドンのセットからなり、前記コドンの少なくとも75%は、表4の低U1セットのコドンである、請求項7または8に記載のmRNA。
- 前記オープンリーディングフレームが、コドンのセットからなり、前記コドンの少なくとも75%は、表4の低Aセットのコドンである、請求項7または8に記載のmRNA。
- 前記オープンリーディングフレームが、コドンのセットからなり、前記コドンの少なくとも75%は、表4の低A/Uセットのコドンである、請求項7または8に記載のmRNA。
- 前記オープンリーディングフレームが、コドンのセットからなり、前記コドンの少なくとも75%は、表4の長半減期セットのコドンである、請求項7または8に記載のmRNA。
- 前記コドンの少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%が、(i)表1、表2または表3に列記されるコドン、または(ii)表4に列記されるコドンのセットである、請求項7〜12のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記オープンリーディングフレームが、少なくともその最初の30、50、70、100、150、200、250または300ヌクレオチドにわたり、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90%の同一性を有する、請求項1〜5または7〜13のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記オープンリーディングフレームが、その配列の少なくとも最初の10%、12%、15%、20%、25%、30%または35%にわたり、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90%の同一性を有する、請求項1〜14のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65または66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項1〜4または6〜15のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記オープンリーディングフレームが、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量から、前記最小ウリジンジヌクレオチド含有量の101%、102%、103%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%または150%の範囲のウリジンジヌクレオチド含有量を有する、請求項1〜16のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記オープンリーディングフレームが、その最小ウリジン含有量から、前記最小ウリジン含有量の101%、102%、103%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%または150%の範囲のウリジン含有量を有する、請求項1〜17のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記オープンリーディングフレームが、その最小ウリジン含有量から、最小アデニン含有量の101%、102%、103%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%または150%の範囲のアデニン含有量を有する、請求項1〜18のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記オープンリーディングフレームが、その最小アデニンジヌクレオチド含有量から、前記最小アデニンジヌクレオチド含有量の101%、102%、103%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%または150%の範囲のアデニンジヌクレオチド含有量を有する、請求項1〜19のいずれか1項に記載のmRNA。
- 配列番号32、34、36、38、41または75-77のいずれか1つに対し、少なくとも90%の同一性を有する5’UTRを含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載のmRNA。
- 配列番号33、35、37、39または40のいずれか1つに対し、少なくとも90%の同一性を有する3’UTRを含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、同じ源に由来する5’UTRと3’UTRを含む、請求項21または22に記載のmRNA。
- Cap0、Cap1およびCap2から選択される5’キャップを含む、請求項1〜23のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記オープンリーディングフレームが、哺乳動物におけるmRNAの翻訳を増加させるコドンを有する、請求項1〜24のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記オープンリーディングフレームが、哺乳動物の特定の器官におけるmRNAの翻訳を増加させるコドンを有する、請求項25に記載のmRNA。
- 前記器官が、肝臓である、請求項26に記載のmRNA。
- 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項25〜27のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記コドンが、配列番号5からなる配列を有するORFを含むmRNAの翻訳と比較して、前記哺乳動物におけるmRNAの翻訳を増加させる、請求項25〜28のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、医薬組成物中で哺乳動物に投与されたときに、前記哺乳動物が、最小ウリジン含有量の150%よりも高い、Cas9ヌクレアーゼをコードするORFを含むmRNAを投与された哺乳動物よりも少なくとも5倍低いサイトカイン反応を呈する、請求項1〜29のいずれか1項に記載のmRNA。
- 最小ウリジン含有量の150%よりも高い、Cas9ヌクレアーゼをコードする前記ORFを含む前記mRNAが、配列番号5からなる配列を有する、請求項30に記載のmRNA。
- 前記RNA誘導型DNA結合剤が、二本鎖エンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項1〜31のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記RNA誘導型DNA結合剤が、Casクリベースを含む、請求項32に記載のmRNA。
- 前記RNA誘導型DNA結合剤が、ニッカーゼ活性を有する、請求項1〜33のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記RNA誘導型DNA結合剤が、Casニッカーゼを含む、請求項34に記載のmRNA。
- 前記RNA誘導型DNA結合剤が、dCas DNA結合ドメインを含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記Casクリベース、CasニッカーゼまたはdCas DNA結合ドメインが、Cas9クリベース、Cas9ニッカーゼまたはdCas9 DNA結合ドメインである、請求項33または35〜36のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記コードされるRNA誘導型DNA結合剤が、核局在シグナル(NLS)を含む、請求項1〜37のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記NLSが、前記RNA誘導型DNA結合剤のC末端に結合されている、請求項38に記載のmRNA。
- 前記NLSが、前記RNA誘導型DNA結合剤のN末端に結合されている、請求項38に記載のmRNA。
- 前記NLSが、配列番号78〜91のいずれか1つに対し、少なくとも80%、85%、90%または95%の同一性を有する配列を含む、請求項38〜40のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記NLSが、配列番号78〜91のいずれか1つの配列を含む、請求項38〜40のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記NLSが、配列番号92〜104のいずれか1つの配列に対し、少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または100%の同一性を有する配列によりコードされる、請求項38〜42のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号4、7または9に対し、少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号4、7または9に対し、少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号4、7または9に対し、少なくとも98%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号4、7または9に対し、100%同一の配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号111、114または117に対し、少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号111、114または117に対し、少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号111、114または117に対し、少なくとも98%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号112、122または125に対し、100%同一の配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号112、122または125に対し、少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号112、122または125に対し、少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175に対し少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175に対し少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175に対し少なくとも98%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107-175に対し100%同一の配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号3、6、8または186〜196のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項37〜57のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記RNA誘導型DNA結合剤が、異種機能性ドメインをさらに含む、請求項1〜58のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記異種機能性ドメインが、Foklヌクレアーゼである、請求項59に記載のmRNA。
- 前記異種機能性ドメインが、転写制御ドメインである、請求項59に記載のmRNA。
- 前記mRNAの有効量が、脂質ナノ粒子を含有する医薬組成物中で哺乳動物のTTR遺伝子を標的とするガイドRNAとともに前記哺乳動物に投与されたときに、前記哺乳動物の肝細胞から取得されたゲノムDNAの少なくとも50%において、TTR座位中にindelが形成される、請求項1〜61のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAの有効量が、脂質ナノ粒子を含有する医薬組成物中で哺乳動物のTTR遺伝子を標的とするガイドRNAとともに前記哺乳動物に投与されたときに、前記哺乳動物の血清中のTTR濃度が少なくとも50%減少する、請求項1〜62のいずれか1項に記載のmRNA。
- ウリジンの少なくとも10%が、改変ウリジンで置換される、請求項1〜63のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記改変ウリジンが、N1-メチル-シュードウリジン、シュードウリジン、5-メトキシウリジン、または5-ヨードウリジンのうちの1つまたは複数である、請求項64に記載のmRNA。
- 前記改変ウリジンが、N1-メチル-シュードウリジンまたは5-メトキシウリジンのうちの1つまたは両方である、請求項64に記載のmRNA。
- 前記改変ウリジンが、N1-メチル-シュードウリジンである、請求項64に記載のmRNA。
- 前記改変ウリジンが、5-メトキシウリジンである、請求項64に記載のmRNA。
- ウリジンの15%〜45%が、前記改変ウリジンで置換される、請求項64〜68のいずれか1項に記載のmRNA。
- ウリジンの少なくとも20%または少なくとも30%が、前記改変ウリジンで置換される、請求項64〜68のいずれか1項に記載のmRNA。
- ウリジンの少なくとも80%または少なくとも90%が、前記改変ウリジンで置換される、請求項70に記載のmRNA。
- 100%のウリジンが、前記改変ウリジンで置換される、請求項70に記載のmRNA。
- 前記mRNAの有効量が、脂質ナノ粒子を含有する医薬組成物中で哺乳動物のTTR遺伝子を標的とするガイドRNAとともに前記哺乳動物に投与されたときに、前記哺乳動物の肝細胞から取得されたゲノムDNAの少なくとも70%または少なくとも90%において、TTR座位中にindelが形成される、請求項64〜72のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、脂質ナノ粒子を含有する医薬組成物中で哺乳動物のTTR遺伝子を標的とするガイドRNAとともに前記哺乳動物に投与されたときに、前記哺乳動物の血清中のTTR濃度が少なくとも70%または少なくとも90%減少する、請求項64〜73のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記動物が、マウスであり、前記ガイドRNAが、配列番号42からなる配列を有する、請求項62、63、71または72に記載のmRNA。
- 前記動物が、ラットであり、前記ガイドRNAが、配列番号69からなる配列を有する、請求項62、63、71または72に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号43、44、51、53、55〜61または176〜185のいずれか1つに対し、少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項1〜76のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号43、44、51、53、55〜61または176〜185のいずれか1つに対し、少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項1〜77のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号43、44、51、53、55〜61または176〜185のいずれか1つに対し、少なくとも98%の同一性を有する配列を含む、請求項1〜78のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号43、44、51、53、55〜61または176〜185のいずれか1つに対し、少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項1〜79のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号43、44、51、53、55〜61または176〜185のいずれか1つに対し、100%の同一性を有する配列を含む、請求項1〜80のいずれか1項に記載のmRNA。
- 請求項1〜81のいずれか1項に記載のmRNAをコードする配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物。
- 請求項82に記載の発現構築物を含むプラスミド。
- 請求項82に記載の発現構築物または請求項83に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
- 請求項82に記載の発現構築物または請求項83に記載のプラスミドと、RNAポリメラーゼを、mRNAの転写が許容可能な条件下で接触させることを含む、前記mRNAを調製する方法。
- 前記接触工程が、インビトロで実施される、請求項85に記載の方法。
- 請求項1〜81のいずれか1項に記載のmRNAと、少なくとも1つのガイドRNAを含む組成物。
- 請求項1〜81のいずれか1項に記載のmRNAを含む脂質ナノ粒子。
- 請求項1〜81のいずれか1つに記載のmRNAと、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
- 少なくとも1つのガイドRNAをさらに含む、請求項88に記載の脂質ナノ粒子、または請求項89に記載の医薬組成物。
- 前記少なくとも1つのガイドRNAが、TTRを標的とする、請求項87〜90のいずれか1項に記載の組成物または脂質ナノ粒子。
- 請求項1〜83または87〜91のいずれか1項に記載のmRNA、発現構築物、組成物、または脂質ナノ粒子と、細胞を接触させることを含む、ゲノムを編集する方法または標的遺伝子を改変する方法。
- ゲノム編集のため、または標的遺伝子の改変のための、請求項1〜83または87〜91のいずれか1項に記載のmRNA、発現構築物、組成物、または脂質ナノ粒子の使用。
- ゲノム編集のため、または標的遺伝子の改変のための医薬品の製造のための、請求項1〜83または87〜91のいずれか1項に記載のmRNA、発現構築物、組成物、または脂質ナノ粒子の使用。
- 前記ゲノム編集または前記標的遺伝子の改変が、肝臓の細胞で発生する、請求項92〜94のいずれか1項に記載の方法または使用。
- 前記肝臓の細胞が、肝細胞である、請求項95に記載の方法または使用。
- 前記ゲノム編集または前記標的遺伝子の改変が、インビボである、請求項92〜96のいずれか1項に記載の方法または使用。
- 前記ゲノム編集または前記標的遺伝子の改変が、単離細胞中または培養細胞中である、請求項92〜97のいずれか1項に記載の方法または使用。
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