JP2022512731A - 第ｉｘ因子を発現するための組成物及び方法 - Google Patents

第ｉｘ因子を発現するための組成物及び方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022512731A
JP2022512731A JP2021521112A JP2021521112A JP2022512731A JP 2022512731 A JP2022512731 A JP 2022512731A JP 2021521112 A JP2021521112 A JP 2021521112A JP 2021521112 A JP2021521112 A JP 2021521112A JP 2022512731 A JP2022512731 A JP 2022512731A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
factor
nucleic acid
seq
sequence
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021521112A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020082046A5 (ja
Inventor
ダグラス フィン，ジョナサン
フアン，ホン－レン
ロイ，モイトリ
ライ，ケーディー
サットラー，レイチェル
カイラトサウス，クリストス
ワン，チェン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Publication of JP2022512731A publication Critical patent/JP2022512731A/ja
Publication of JPWO2020082046A5 publication Critical patent/JPWO2020082046A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

宿主細胞または宿主細胞集団において第ＩＸ因子を発現するための組成物及び方法が提供される。第ＩＸ因子を発現する操作された宿主細胞もまた提供される。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１８年１０月１８日に出願された米国仮出願第６２／７４７，５０９号、２０１９年４月３日に出願された米国仮出願第６２／８２９，００９号、２０１９年４月４日に出願された米国仮出願第６２／８２９，６２１号、及び２０１９年４月２９日に出願された米国仮出願第６２／８４０，３５２号から優先権の利益を主張する。前述の出願の各々の明細書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
出血障害は、不十分な血液凝固によって引き起こされる。この欠乏症は、先天性凝固障害、後天性凝固障害、または外傷によって誘発される出血状態によって引き起こされ得る。出血は、疾患の最も深刻で重大な症状のうちの１つであり、局所部位から発生し得るか、または全身に広がり得る。局所的な出血は、病変と関連付けられ得、欠陥のある止血機序によってさらに複雑になり得る。凝固因子のうちのいずれかの先天性または後天性欠乏症は、出血傾向と関連付けられ得る。出血障害の典型的な例としては、第ＶＩＩＩ因子の欠乏症から生じる血友病Ａ、または第ＩＸ因子の欠乏症から生じる血友病Ｂ（クリスマス病）などの血友病が挙げられる。血友病は全ての人種及び民族で発生し、アメリカ及び世界中の多くの人々に影響する。
出血障害の従来の療法には、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、または第ＩＸ因子などの欠乏する凝固因子の非経口置換が含まれる。例えば、血友病Ｂの現在の治療は、精製された組換え第ＩＸ因子の慢性的かつ反復的な静脈内注入に依存する。しかしながら、これらの治療には、反復的な静脈内注入の必要性、阻害剤形成と関連していること、及び概して治癒的というよりも予防的であることを含むいくつかの欠点がある。例えば、Ｐｅｔｒｉｎｉ ２００１，Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ７：９９、Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｂｌｏｏｄ ９９（７）：２３３７を参照されたい。
喪失または欠損遺伝子のコピーを患者に導入することを含む遺伝子療法は、第ＩＸ因子を患者により長期間導入する１つの可能な方法を提供する。しかしながら、第ＩＸ因子の改善された長期発現を提供する追加の組成物及び方法が必要とされている。
本開示は、宿主細胞または宿主細胞集団（インビトロまたはインビボ）において第ＩＸ因子を発現するため、及び血友病（例えば、血友病Ｂ）を治療するために有用な組成物及び方法を提供する。第ＩＸ因子をコードする配列のヒトゲノム遺伝子座、例えば、アルブミンセーフハーバー部位などのセーフハーバー部位への標的挿入で使用するためのガイドＲＮＡが本明細書に提供される。アルブミンセーフハーバー部位のイントロン１などのセーフハーバー部位への標的挿入で使用するための、第ＩＸ因子をコードする配列を含むドナー構築物（例えば、双方向性構築物）もまた提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）及び第ＩＸ因子導入遺伝子を含むドナー構築物（例えば、双方向性構築物）と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、ドナー構築物（例えば、双方向性構築物）は、遺伝子編集系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系）と共に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）及び第ＩＸ因子導入遺伝子を含むドナー構築物（例えば、双方向性構築物）と組み合わせて使用することができる。以下の実施形態が提供される。
いくつかの態様では、ｉ）第ＩＸ因子タンパク質コード配列を含む核酸構築物と、ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、ｉｉｉ）配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを投与することを含む、第ＩＸ因子核酸を細胞または細胞集団に導入する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドである配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択される配列である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドである配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３４～９７からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号９８～１１９からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号９８～１１９からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドである配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１２０～１６３からなる群から選択される配列である配列を含む。
いくつかの態様では、ｉ）第ＩＸ因子タンパク質コード配列を含む核酸構築物と、ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、ｉｉｉ）配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを投与することを含む、細胞または細胞集団において第ＩＸ因子を発現する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドである配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドである配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３４～９７からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号９８～１１９からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号９８～１１９からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドである配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１２０～１６３からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの態様では、ｉ）第ＩＸ因子タンパク質コード配列を含む核酸構築物と、ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、ｉｉｉ）配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを投与することを含む、細胞または細胞集団において第ＩＸ因子を導入または発現する方法が本明細書に提供され、投与は、インビトロである。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３４～９７からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、核酸ベクター及び／または脂質ナノ粒子中で投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤及び／またはｇＲＮＡは、核酸ベクター及び／または脂質ナノ粒子中で投与される。いくつかの実施形態では、核酸ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ２／８からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、核酸構築物、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及びｇＲＮＡは、任意の順序及び／または任意の組み合わせで逐次的に投与される。いくつかの実施形態では、核酸構築物、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及びｇＲＮＡは、個々にまたは任意の組み合わせで、同時に投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または組み合わせたＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤及びｇＲＮＡは、核酸構築物を投与する前に投与される。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、ｇＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を投与する前に投与される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、クラス２のＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ニッカーゼである。
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、双方向性核酸構築物である。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、一本鎖または二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、双方向性構築物は、第ＩＸ因子タンパク質の発現を促進するプロモーターを含まない。いくつかの実施形態では、細胞または細胞集団は、アルブミンシグナルペプチドなどの異種ペプチドで第ＩＸ因子を発現する。
いくつかの実施形態では、細胞または細胞集団は、肝臓細胞を含む。いくつかの実施形態では、肝臓細胞は、肝細胞である。
いくつかの実施形態では、核酸は、野生型第ＩＸ因子タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、変異体第ＩＸ因子タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、変異Ｒ３３８Ｌを有する第ＩＸ因子タンパク質をコードする。
いくつかの態様では、第ＩＸ因子タンパク質コード配列を含む双方向性核酸構築物を細胞または細胞集団に投与することを含み、それにより、細胞または細胞集団において第ＩＸ因子を発現する、第ＩＸ因子核酸を細胞または細胞集団に導入する方法が本明細書に提供される。第ＩＸ因子タンパク質コード配列を含む双方向性核酸構築物を細胞または細胞集団に投与することを含み、それにより、細胞または細胞集団において第ＩＸ因子発現を発現する、細胞または細胞集団において第ＩＸ因子を発現する方法が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、ａ）第ＩＸ因子のコード配列を含む第１のセグメント、及びｂ）第ＩＸ因子のコード配列の逆相補体を含む第２のセグメントを含み、構築物は、第ＩＸ因子の発現を促進するプロモーターを含まない。いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、ａ）第ＩＸ因子のコード配列を含む第１のセグメント、及びｂ）第２のポリペプチドのコード配列の逆相補体を含む第２のセグメントを含み、構築物は、ポリペプチドの発現を促進するプロモーターを含まない。
いくつかの実施形態では、第ＩＸ因子核酸を細胞または細胞集団に導入する方法は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ｇＲＮＡを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、核酸ベクター及び／または脂質ナノ粒子中で投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、核酸ベクター及び／または脂質ナノ粒子中で投与される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、核酸ベクター及び／または脂質ナノ粒子中で投与される。いくつかの実施形態では、核酸ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ２／８からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及びｇＲＮＡは、任意の順序及び／または任意の組み合わせで逐次的に投与される。いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及びｇＲＮＡは、任意の組み合わせで、同時に投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または組み合わせたＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤及びｇＲＮＡは、双方向性核酸構築物を投与する前に投与される。いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、ｇＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を投与する前に投与される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、クラス２のＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓヌクレアーゼ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉヌクレアーゼ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓヌクレアーゼ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレアーゼ、及びそれらのバリアントからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ニッカーゼである。
いくつかの実施形態では、双方向性構築物は、第ＩＸ因子タンパク質の発現を促進するプロモーターを含まない。いくつかの実施形態では、双方向性構築物は、一本鎖または二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、もしくは７５％同一である配列を含む。
いくつかの態様では、細胞において第ＩＸ因子を発現するのに使用するための組成物が本明細書に提供され、組成物は、ｉ）第ＩＸ因子タンパク質コード配列を含む核酸構築物と、ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、ｉｉｉ）配列番号２～３３からなる群から選択されるガイド配列、または配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む。細胞または細胞集団において第ＩＸ因子を発現するのに使用するための組成物が本明細書に提供され、組成物は、第ＩＸ因子タンパク質コード配列を含む双方向性核酸構築物を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、先行実施形態のいずれかに記載の方法によって作製される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、肝臓細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、非分裂細胞型である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、双方向性構築物によってコードされる第ＩＸ因子ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、肝細胞である。
任意の上記方法の方法、構築物、または宿主細胞のいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号４０１を含む。
ＡＡＶゲノムに表される構築物フォーマットを示す。ＳＡ＝スプライスアクセプター、ｐＡ＝ポリＡシグナル配列、ＨＡ＝相同性アーム、ＬＨＡ＝左相同性アーム、ＲＨＡ＝右相同性アーム 相同性アームを有さないベクターが、不死化肝臓細胞株（Ｈｅｐａ１－６）において有効ではないことを示す。２００ｂｐの相同性アームを含むプラスミドＰ００２０４に由来するｓｃＡＡＶは、分裂細胞においてｈＦＩＸの発現をもたらした。Ｐ００１２３（相同性アームを欠くｓｃＡＡＶ）及びＰ００１４７（相同性アームを欠くｓｓＡＡＶ双方向性構築物）に由来するＡＡＶベクターの使用は、ｈＦＩＸの検出可能な発現をもたらさなかった。 Ａ及びＢは、Ｐ００１２３、Ｐ００１４７、またはＰ００２０４に由来するベクターを使用した相同性アームあり及びなしの挿入テンプレートのインビボ試験の結果を示す。Ａは、約６０％のインデル形成によって測定した肝臓編集レベルが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を含むＬＮＰで処置した動物の各群において検出されたことを示す。Ｂは、ＬＮＰ処置と組み合わせた相同性アーム（Ｐ００１４７に由来する）なしでｓｓＡＡＶベクターを受けている動物が、血清において最高レベルのｈＦＩＸ発現をもたらしたことを示す。 相同性アームあり及びなしのｓｓＡＡＶ挿入テンプレートのインビボ試験の結果を示す。標的挿入を、プラスミドＰ００３５０、Ｐ００３５６、Ｐ００３６２（示されるような非対称相同性アームを有する）、及びＰ００１４７（図４Ｂに示されるような双方向性構築物）に由来するベクターと比較する。 相同性アームあり及びなしのｓｓＡＡＶ挿入テンプレートのインビボ試験の結果を示す。標的化された第２の部位への挿入を、プラスミドＰ００３５３、Ｐ００３５４（示されるような対称相同性アームを有する）、及びＰ００１４７に由来するベクターと比較する。 初代マウス肝細胞における２０個の標的部位にわたる双方向性構築物の標的挿入の結果を示す。試験されたベクターの各々の概略図を示す。 初代マウス肝細胞における２０個の標的部位にわたる双方向性構築物の標的挿入の結果を示す。試験された各組み合わせにわたる処置群の各々について、インデル形成によって測定された編集を示す。 初代マウス肝細胞における２０個の標的部位にわたる双方向性構築物の標的挿入の結果を示す。有意なレベルの編集（特定の標的部位でのインデル形成として）が、必ずしも導入遺伝子のより効率的な挿入または発現をもたらさなかったことを示す。ｈＳＡ＝ヒトＦ９スプライスアクセプター、ｍＳＡ＝マウスアルブミンスプライスアクセプター、ＨｉＢｉｔ＝ルシフェラーゼに基づく検出のためのタグ、ｐＡ＝ポリＡシグナル配列、Ｎｌｕｃ＝ナノルシフェラーゼレポーター、ＧＦＰ＝緑色蛍光レポーター。 初代マウス肝細胞における２０個の標的部位にわたる双方向性構築物の標的挿入の結果を示す。有意なレベルの編集（特定の標的部位でのインデル形成として）が、必ずしも導入遺伝子のより効率的な挿入または発現をもたらさなかったことを示す。ｈＳＡ＝ヒトＦ９スプライスアクセプター、ｍＳＡ＝マウスアルブミンスプライスアクセプター、ＨｉＢｉｔ＝ルシフェラーゼに基づく検出のためのタグ、ｐＡ＝ポリＡシグナル配列、Ｎｌｕｃ＝ナノルシフェラーゼレポーター、ＧＦＰ＝緑色蛍光レポーター。 Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶを用いる１０の標的部位にわたる双方向性構築物による標的挿入のインビボスクリーニングの結果を示す。示されるように、著しいレベルのインデル形成は、必ずしも高レベルの導入遺伝子発現をもたらすものではない。 図７Ａ～７Ｄは、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶを使用した２０の標的部位にわたる双方向性構築物のインビボスクリーニングの結果を示す。Ａは、インデル形成によって測定される様々なレベルの編集が、試験した各ＬＮＰ／ベクターの組み合わせにわたって、処置群の各々について検出されたことを示す。 図７Ａ～７Ｄは、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶを使用した２０の標的部位にわたる双方向性構築物のインビボスクリーニングの結果を示す。Ｂは、対応する標的挿入データを提供する。結果は、インデル形成と双方向性構築物の挿入または発現との間の不十分な相関を示す。 図７Ａ～７Ｄは、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶを使用した２０の標的部位にわたる双方向性構築物のインビボスクリーニングの結果を示す。Ｃでは、結果は、インビトロ結果とインビボ結果との間の正の相関を示す。 図７Ａ～７Ｄは、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶを使用した２０の標的部位にわたる双方向性構築物のインビボスクリーニングの結果を示す。Ｄでは、結果は、インデル形成と双方向性構築物の挿入または発現との間の不十分な相関を示す。 ｈＦＩＸ導入遺伝子とマウスアルブミンエクソン１配列との間の接合部を検出することができるプローブを使用したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を使用した、細胞レベルでの双方向性構築物の挿入を示す。 循環ｈＦＩＸレベルは、ハイブリッド転写産物に対して陽性であった細胞の数と相関していた。 双方向性ｈＦＩＸ構築物を含むｓｓＡＡＶの送達とＬＮＰの送達との間の様々なタイミングの標的挿入に対する効果を示す。 双方向性ｈＦＩＸ構築物の送達後の、様々な回数（例えば、１、２、または３）のＬＮＰ投与の標的挿入に対する効果を示す。 インビボでのｈＦＩＸ発現の耐久性を示す。 アルブミンのイントロン１からの発現が維持されたことを示す。 ＡＡＶまたはＬＮＰ用量を変化させることにより、インビボでのアルブミン遺伝子のイントロン１からのｈＦＩＸの発現の量を調節することができることを示す。 ＡＡＶまたはＬＮＰ用量を変化させることにより、インビボでのアルブミン遺伝子のイントロン１からのｈＦＩＸの発現の量を調節することができることを示す。 初代カニクイザル肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。試料の各々について検出されたインデル形成によって測定された様々なレベルの編集を示す。 初代カニクイザル肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。著しいレベルのインデル形成が、アルブミンのイントロン１への双方向性構築物の挿入または発現について予測的でなかったことを示す。 初代カニクイザル肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。著しいレベルのインデル形成が、アルブミンのイントロン１への双方向性構築物の挿入または発現について予測的でなかったことを示す。 初代ヒト肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。試料の各々について検出されたインデル形成によって測定された編集を示す。 初代ヒト肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。著しいレベルのインデル形成が、アルブミン遺伝子のイントロン１への双方向性構築物の挿入または発現について予測的でなかったことを示す。 初代ヒト肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。著しいレベルのインデル形成が、アルブミン遺伝子のイントロン１への双方向性構築物の挿入または発現について予測的でなかったことを示す。 著しいレベルのインデル形成が、アルブミン遺伝子のイントロン１への双方向性構築物の挿入または発現について予測的でなかったことを示す。 非ヒト霊長類が双方向性ｈＦＩＸ挿入テンプレート（Ｐ００１４７に由来する）と共にＬＮＰを投与されたインビボ研究の結果を示す。全身ｈＦＩＸレベルは、ＬＮＰ及びＡＡＶの両方で処置された動物においてのみ達成され、ＡＡＶまたはＬＮＰ単独を使用して検出可能なｈＦＩＸはなかった。 注射後６週目の血漿試料中のヒト第ＩＸ因子発現レベルを示す。 注射後６週目の血漿試料中のヒト第ＩＸ因子発現レベルを示す。 各動物の複数の葉にわたる７週目の血清レベル及び陽性細胞％を示す。 注射後１、２、及び４週目での各群における血漿試料中のヒト第ＩＸ因子発現レベルを示す。 ａＰＴＴアッセイにおけるｈＦ９導入遺伝子の挿入及び凝固機能を示す。 Ａ及びＢは、ＴＧＡ－ＥＡ分析におけるｈＦ９導入遺伝子の挿入及びトロンビン生成を示す。 ｈＦ９導入遺伝子の挿入及びトロンビン生成を示す。
ここで、本発明の特定の実施形態を詳細に参照し、本発明の実施形態の例は添付の図面で例示される。本発明は例示される実施形態と併せて説明されるが、それらは、本発明をそれらの実施形態に限定することを意図するものではないことが理解されるであろう。逆に、本発明は、添付の実施形態によって定義される本発明内に含まれ得る全ての代替物、改変物、及び均等物を網羅することが意図される。
本教示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物またはプロセスステップに限定されるものではなく、したがって変化し得ると理解されるべきである。本明細書及び添付の実施形態で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の参照物を含めることに留意されたい。したがって、例えば、「複合体（ａ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」への言及は、複数の複合体を含み、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の細胞または細胞集団などを含む。本明細書で使用される「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語及びその文法上の変形は、リスト内の項目の列挙が、リストされた項目に置換または追加することができる他の同様の項目を除外しないように、非限定的であることを意図する。
数値範囲には、その範囲を定義する数値が含まれる。測定値及び測定可能な値は、有効桁及び測定に関連する誤差を考慮して、おおよその値であると理解される。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定することを意図するものではない。上述の概略的な説明と、詳細な説明はいずれも例示であり、単に説明するためのものであり、その教示を限定するものではないことが理解されるべきである。
本明細書に特に記載されていない限り、様々な構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、またはそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「からなる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」か、またはそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「から本質的になる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、またはそれらを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ものであると想定される（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。「または」という用語は、文脈が別途明確に示さない限り、包括的な意味で、すなわち、「及び／または」に等しい意味で使用される。「約」という用語は、リストの前に使用される場合、リストの各要素を修飾する。「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるかに部分的に依存する。
「約」という用語は、リストの前に使用される場合、リストの各要素を修飾する。「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるかに部分的に依存する。
本明細書で使用される章の見出しは、構成的な目的のみのためであり、所望の主題を決して限定するものとして解釈されるべきではない。参照により組み込まれる任意の資料が、本明細書で定義される任意の用語または本明細書の任意の他の明示的な内容と矛盾する場合、本明細書が優先する。
Ｉ．定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語及び句は、以下の意味を有することを意図する。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、骨格に沿って一緒に連結された窒素系複素環式塩基または塩基アナログを有するヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログ（従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ－ＤＮＡ、及びそれらのアナログであるポリマーを含む）を含む多量体化合物を指すために本明細書で使用される。核酸「骨格」は、糖ホスホジエステル連結、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ、ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、様々な連結から構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換、例えば、２’メトキシまたは２’ハロゲン化物置換を有する類似の化合物であり得る。窒素系塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、そのアナログ（例えば、５－メトキシウリジン、シュードウリジン、もしくはＮ１－メチルシュードウリジンなどの修飾ウリジン、またはその他のもの）、イノシン、プリンもしくはピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ４－メチルデオキシグアノシン、デアザ－もしくはアザ－プリン、デアザ－もしくはアザ－ピリミジン、５位もしくは６位に置換基を有するピリミジン塩基（例えば、５－メチルシトシン）、２、６、もしくは８位に置換基を有するプリン塩基、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、Ｏ６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、及びＯ４－アルキル－ピリミジン、米国特許第５，３７８，８２５号及びＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）であってもよい。一般的な考察については、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２を参照されたい）。核酸は、骨格がポリマーの位置（複数可）に窒素系塩基を含まない１つ以上の「脱塩基」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡもしくはＤＮＡ糖、塩基、及び連結のみを含んでもよく、または従来の構成要素及び置換の両方（例えば、２’メトキシ連結を有する従来の塩基、または従来の塩基及び１つ以上の塩基アナログの両方を含有するポリマー）を含むことができる。核酸は、ＲＮＡ模倣糖構造にロックされた二環式フラノース単位を有し、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性を高める、１つ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有するアナログである「ロックド核酸」（ＬＮＡ）を含む（Ｖｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（４２）：１３２３３－４１）。ＲＮＡ及びＤＮＡは異なる糖部分を有し、ＲＮＡ内のウラシルもしくはそのアナログ及びＤＮＡ内のチミンもしくはそのアナログの存在によって異なり得る。
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、及び単に「ガイド」は、ガイド配列、例えば、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとしても知られる）を含むガイド、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの組み合わせ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても知られる）のいずれかを指すために、本明細書で互換的に使用される。ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ分子（シングルガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）として会合し得るか、または例えば、２つの別々のＲＮＡ分子（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）において会合し得る。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、各種類を指す。ｔｒＲＮＡは、天然に存在する配列、または天然に存在する配列と比較して修飾もしくは変異を有するｔｒＲＮＡ配列であり得る。ＳｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡなどのガイドＲＮＡは、本明細書に記載されるような修飾ＲＮＡを含み得る。
本明細書で使用される場合、「ガイド配列」は、標的配列に対して相補的であり、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤による結合または修飾（例えば、切断）のための標的配列に対してガイドＲＮＡを指向させるように機能する、ガイドＲＮＡ内の配列を指す。「ガイド配列」は、「標的化配列」または「スペーサー配列」とも称され得る。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）及び関連するＣａｓ９ホモログ／オルソログの場合、２０塩基対の長さであり得る。例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長のような、より短い配列またはより長い配列もまたガイドとして使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ガイド配列は、配列番号２～３３から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、例えば、遺伝子内または染色体上にあり、ガイド配列に対して相補的である。いくつかの実施形態では、ガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、ガイド配列は、配列番号２～３３から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチドと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、１００％相補的または同一であり得る。他の実施形態では、ガイド配列及び標的領域とは、少なくとも１個のミスマッチを含んでもよい。例えば、ガイド配列及び標的配列は、１、２、３、または４個のミスマッチを含んでもよく、標的配列の全長は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の塩基対である。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的配列は、１～４個のミスマッチを含んでもよく、ガイド配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的配列は、１、２、３、または４個のミスマッチを含んでもよく、ガイド配列は、２０個のヌクレオチドを含む。
ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の核酸基質は二本鎖核酸であるので、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の標的配列は、ゲノムＤＮＡのプラス鎖とマイナス鎖（すなわち、与えられる配列と、配列の逆相補体）の両方を含む。したがって、ガイド配列が、「標的配列に対して相補的」であると言われる場合、ガイド配列は、標的配列の逆相補体に結合するようにガイドＲＮＡを指向させ得ると理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、ガイド配列が、標的配列の逆相補体に結合する場合、ガイド配列は、ガイド配列におけるＵのＴへの置換を除いて、標的配列の特定のヌクレオチド（例えばＰＡＭを含まない標的配列）と同一である。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤」は、ＲＮＡ及びＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体、またはそのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、ＤＮＡ結合活性は、配列特異的であり、ＲＮＡの配列に依存する。ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤という用語は、そのようなポリペプチドをコードする核酸も含む。例示的なＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤には、Ｃａｓクリベース／ニッカーゼが含まれる。例示的なＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤には、その不活性化形態（「ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤」）が含まれ得る（例えば、これらの薬剤が、例えば、ＦｏｋＩクリベースドメインとの融合を介して、ＤＮＡ切断を可能にするように修飾された場合）。本明細書で使用される「Ｃａｓヌクレアーゼ」は、Ｃａｓクリベース及びＣａｓニッカーゼを包含する。Ｃａｓクリベース及びＣａｓニッカーゼには、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣｓｍもしくはＣｍｒ複合体、そのＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、またはＣｍｒ２サブユニット、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系のカスケード複合体、そのＣａｓ３サブユニット、及びクラス２のＣａｓヌクレアーゼが含まれる。本明細書で使用される場合、「クラス２のＣａｓヌクレアーゼ」は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合活性を有する一本鎖ポリペプチドである。クラス２のＣａｓヌクレアーゼには、ＲＮＡガイドＤＮＡクリベースもしくはニッカーゼ活性をさらに有するクラス２のＣａｓクリベース／ニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａバリアント）、クリベース／ニッカーゼ活性が不活性化されたクラス２のｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤（それらの薬剤がＤＮＡ切断を可能にするように修飾される場合）が含まれる。クラス２のＣａｓヌクレアーゼには、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）タンパク質、ならびにそれらの修飾が含まれる。Ｃｐｆ１タンパク質（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１－１３（２０１５））もまた、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表Ｓ１及びＳ３を参照されたい。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２－３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照されたい。本明細書で使用する場合、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）の送達は、ポリペプチドまたはｍＲＮＡの送達を含む。
本明細書で使用される場合、「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）または「ＲＮＰ複合体」は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓクリベース、Ｃａｓニッカーゼ、またはｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）と合わせたガイドＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を標的配列へと誘導し、ガイドＲＮＡが標的配列とハイブリダイズし、薬剤が標的配列と結合し、薬剤がクリベースまたはニッカーゼである場合、結合後に切断またはニッキングを行うことができる。
本明細書で使用する場合、第２の配列に対する第１の配列のアライメントにより、第２の配列の位置の全体でのＸ％以上が第１の配列によって一致することが示される場合、第１の配列は、第２の配列と「少なくともＸ％の同一性を有する配列を含む」とみなされる。例えば、配列ＡＡＧＡは、配列ＡＡＧと１００％同一性を有する配列を含むが、その理由は、アラインメントが、第２の配列の３つの全ての位置において一致があるという点で１００％同一性を与えるからである。ＲＮＡとＤＮＡとの間の差（一般に、チミジンをウリジンに交換すること、またはその逆）、及び修飾ウリジンなどのヌクレオシドアナログの存在は、関連するヌクレオチド（チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンなど）が同じ相補体（例えば、チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンの全てについてのアデノシン、別の例は、シトシン及び５－メチルシトシンであり、これらの両方が相補体としてグアノシンまたは修飾グアノシンを有する）を有する限り、ポリヌクレオチド間の同一性または相補性の差に寄与しない。したがって、例えば、Ｘがいずれかの修飾ウリジン、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、または５－メトキシウリジンである配列５’－ＡＸＧは、両方とも同じ配列（５’－ＣＡＵ）に完全に相補的である点において、ＡＵＧと１００％同一であるとみなされる。例示的なアライメントアルゴリズムは、当該技術分野で周知である、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ及びＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムである。当業者は、アライメントされる配列の所与の対について、どのようなアルゴリズム及びパラメータ設定の選択が適切であることを理解するであろう。一般的に類似する長さ及び予想される同一性がアミノ酸については５０％超の配列、またはヌクレオチドについては７５％超の配列に関して、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋウェブサーバでＥＢＩによって提供されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムインターフェースのデフォルト設定を用いるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムが一般的に適切である。
本明細書で使用される場合、第１の配列は、第１の配列の塩基のＸ％が第２の配列と塩基対合する場合、第２の配列に対して「Ｘ％相補的」であるとみなされる。例えば、第１の配列５’ＡＡＧＡ３’は、第２の配列３’ＴＴＣＴ５’と１００％相補的であり、第２の配列は、第１の配列に対して１００％相補的である。いくつかの実施形態では、第１の配列５’ＡＡＧＡ３’は、第２の配列３’ＴＴＣＴＧＴＧＡ５’と１００％相補的であるが、一方、第２の配列は、第１の配列に対して５０％相補的である。
本明細書で使用される場合、「ｍＲＮＡ」は、全体的にまたは主にＲＮＡまたは修飾ＲＮＡであり、かつポリペプチドに翻訳することができる（すなわち、リボソーム及びアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として機能することができる）オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指すために本明細書で使用される。ｍＲＮＡは、リボース残基またはそのアナログ、例えば、２’－メトキシリボース残基を含む、リン酸糖骨格を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡリン酸糖骨格の糖は、リボース残基、２’－メトキシリボース残基、またはそれらの組み合わせから本質的になる。
本明細書に記載のガイドＲＮＡ組成物及び方法に有用なガイド配列を、本出願全体を通して表１に示す。
本明細書で使用される場合、「インデル」は、標的核酸内の二本鎖切断（ＤＳＢ）の部位において挿入されるか、または欠失するかのいずれかであるいくつかのヌクレオチドからなる挿入／欠失変異を指す。
本明細書で使用される場合、「第ＩＸ因子」は、「ＦＩＸ」または「Ｆ９」と互換的に使用され、クリスマス因子としても既知である。ヒト野生型第ＩＸ因子タンパク質配列は、ＮＣＢＩ ＮＰ＿０００１２４で入手可能であり、遺伝子配列は、ＮＣＢＩ ＮＭ＿０００１３３で入手可能である。第ＩＸ因子タンパク質配列の例は、本明細書に記載される（例えば、配列番号７００、配列番号７０１、及び／または配列番号７０２）。本明細書で使用される場合、第ＩＸ因子はまた、第ＩＸ因子のバリアント、例えば、野生型第ＩＸ因子と比較して増加した凝固活性を有するバリアントを包含する。第ＩＸ因子の活動亢進型バリアントは、Ｒ３３８の置換を含み得る。そのようなバリアント第ＩＸ因子の例には、配列番号７０１に対して変異Ｒ３３８Ｌを含む。活動亢進型及び機能亢進型という用語は、本明細書で互換的に使用される。バリアント第ＩＸ因子のさらなる例には、アラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、及びトレオニンから選択される残基３３８でのアミノ酸が含まれる。さらなる第ＩＸ因子バリアントには、ロイシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、またはチロシンから選択される残基３３８でのアミノ酸が含まれる。本明細書で使用される場合、第ＩＸ因子はまた、配列番号７００と８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％同一であり、かつ野生型第ＩＸ因子と比較して、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％以上の活性を有するバリアントを包含する。本明細書で使用される場合、第ＩＸ因子はまた、配列番号７００と８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％同一であり、かつ配列番号７０１または配列番号７０２と比較して、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％以上の活性を有するバリアントを包含する。本明細書で使用される場合、第ＩＸ因子はまた、野生型第ＩＸ因子と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％以上の活性を有する断片を包含する。いくつかの実施形態では、第ＩＸ因子バリアントは、活動亢進型第ＩＸ因子バリアントであり得る。ある特定の例では、第ＩＸ因子バリアントは、野生型第ＩＸ因子と比較して、約８０％～約１００％、１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、または２００％の活性を有する。第ＩＸ因子バリアントの特異的活性は、例えば、実施例１３に記載されるように、その機能的に正規化された活性を計算するために使用することができる。第ＩＸ因子バリアント、例えば、Ｒ３３８Ｌの特異的活性は、文献において既知であり、既知の方法を使用して計算することができる。機能亢進型第ＩＸ因子バリアントは、対応する野生型第ＩＸ因子タンパク質の約１．２、１．５、２、３、４、５、６、８、１０、１２、または１５倍の特異的活性を有し得る。一実施形態では、機能亢進型第ＩＸ因子は、対応する野生型第ＩＸ因子タンパク質の約８～１２倍の特異的活性を有し得る。別の実施形態では、機能亢進型第ＩＸ因子は、対応する野生型第ＩＸ因子タンパク質の１．２～５倍の特異的活性を有し得る。例示的な配列は、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第４，７７０，９９９号、同第４，９９４，３７１号、同第５，５２１，０７０号、同第６，０４６，３８０号、同第６，５３１，２９８号、及び同第８，３８３，３８８号の配列を含む。
本明細書で使用される場合、「標的配列」は、ｇＲＮＡのガイド配列に対して相補性を有する標的遺伝子内の核酸配列を指す。標的配列とガイド配列との相互作用により、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、標的配列内で結合し、潜在的に（薬剤の活性に応じて）ニッキングまたは切断するように指向される。
本明細書で使用される場合、「血友病」は、喪失または欠損第ＩＸ因子遺伝子またはポリペプチドによって引き起こされる障害を指す。障害は、遺伝性及び／または後天性（例えば、遺伝子における自発的変異によって引き起こされる）状態を含み、血友病Ｂを含む。いくつかの実施形態では、欠損第ＩＸ因子遺伝子またはポリペプチドは、血漿中の第ＩＸ因子レベルの低下及び／または第ＩＸ因子の凝固活性の低下をもたらす。本明細書で使用される場合、血友病は、軽度、中等度、及び重度の血友病を含む。例えば、約１％未満の活性因子を有する個体は、重度の血友病を有するとして分類され、約１～５％の活性因子を有する個体は、中等度の血友病を有し、軽度の血友病を有する個体は、活性凝固因子の正常レベルの約５～４０％を有するとして分類される。
本明細書で使用される場合、「正常」または「健康」である個体には、正常な第ＩＸ因子活性のプール血漿レベル及び抗原レベルの５０～１６０％を有する個体が含まれる。ヒト血漿からのその精製に基づいて、正常な成人における第ＩＸ因子の濃度（第ＩＸ因子の正常プール血漿レベル）は、血漿ｍｌあたり約３００～４００μｇである。いくつかの実施形態では、第ＩＸ因子、例えば、循環第ＩＸ因子のレベルは、凝固及び／または免疫学的アッセイ、例えば、サンドイッチ免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（例えば、実施例１３を参照されたい）、ＭＳＤ（例えば、実施例１４を参照されたい）によって測定され得る。第ＩＸ因子の凝固促進活性は、患者の血漿が第ＩＸ因子欠損血漿の凝固時間を補正する能力によって決定される。
本明細書で使用される場合、「治療」は、対象における疾患もしくは障害のための任意の投与または治療の適用を指し、疾患を阻害すること、その進行を止めること、疾患の１つ以上の症状を緩和すること、疾患を治癒させること、または疾患の１つ以上の症状の再発を予防することを含む。例えば、血友病の治療には、血友病の症状を緩和することを含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「双方向性核酸構築物」（本明細書では「双方向性構築物」と互換的に称される）は、少なくとも２つの核酸セグメントを含み、一方のセグメント（第１のセグメント）は、目的のポリペプチドをコードするコード配列（コード配列は、本明細書では「導入遺伝子」または第１の導入遺伝子と称され得る）を含むが、もう一方のセグメント（第２のセグメント）は、配列の相補体が目的のポリペプチドをコードする配列、つまり第２の導入遺伝子を含む。すなわち、少なくとも２つのセグメントは、同一または異なるポリペプチドをコードすることができる。２つのセグメントが同一のポリペプチドをコードする場合、第１のセグメントのコード配列は、第２のセグメントの配列の相補体と同一である必要はない。いくつかの実施形態では、第２のセグメントの配列は、第１のセグメントのコード配列の逆相補体である。双方向性構築物は、一本鎖または二本鎖であり得る。本明細書に開示される双方向性構築物は、目的の任意のポリペプチドを発現することができる構築物を包含する。
いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、第１のポリペプチドをコードするコード配列（第１の導入遺伝子）を含む第１のセグメントと、配列の相補体が第２のポリペプチドをコードする配列（第２の導入遺伝子）を含む第２のセグメントとを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリペプチドは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリペプチドは、例えば、５０、１００、２００、５００、１０００以上のアミノ酸残基にわたって、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書で使用される場合、「逆相補体」は、参照配列の相補配列である配列を指し、相補配列は、逆方向で書かれている。例えば、仮定配列５’ＣＴＧＧＡＣＣＧＡ３’（配列番号５００）について、「完璧な」相補配列は、３’ＧＡＣＣＴＧＧＣＴ５’（配列番号５０１）であり、「完璧な」逆相補配列は、５’ＴＣＧＧＴＣＣＡＧ３’（配列番号５０２）と書かれている。逆相補配列は、「完璧」である必要はなく、依然として、参照配列と同じポリペプチドまたは類似のポリペプチドをコードし得る。コドン使用頻度の冗長性のため、逆相補体は、同じポリペプチドをコードする参照配列から逸脱し得る。本明細書で使用される場合、「逆相補体」はまた、参照配列の逆相補体配列と、例えば、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、野生型タンパク質またはバリアントタンパク質（例えば、変異体、断片、融合、またはそれらの組み合わせ）を指す。バリアントポリペプチドは、野生型ポリペプチドの少なくともまたは約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の機能活性を有し得る。いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型ポリペプチドの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、活動亢進型バリアントであり得る。ある特定の例では、バリアントは、野生型ポリペプチドの機能活性の約８０％～約１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、２００％、３００％、４００％、５００％以上を有する。
本明細書で使用される場合、「異種遺伝子」は、宿主細胞ゲノム内の部位（例えば、アルブミンイントロン１部位を含むセーフハーバー遺伝子座などのゲノム遺伝子座において）への外因性源として導入されている遺伝子を指す。すなわち、導入された遺伝子は、その挿入部位に関して異種である。そのような異種遺伝子から発現されるポリペプチドは、「異種ポリペプチド」と称される。異種遺伝子は、天然に存在するか、または操作されることができ、野生型またはバリアントであり得る。異種遺伝子は、異種ポリペプチド（例えば、内部リボソーム侵入部位）をコードする配列以外のヌクレオチド配列を含み得る。異種遺伝子は、野生型またはバリアント（例えば、変異体）として宿主ゲノム内で天然に存在する遺伝子であり得る。例えば、宿主細胞は（野生型としてまたはバリアントとして）目的の遺伝子を含むが、同じ遺伝子またはそのバリアントは、例えば、高度に発現される遺伝子座での発現のための外因性源として導入され得る。異種遺伝子はまた、宿主ゲノムにおいて天然に存在しない、または宿主ゲノムにおいて天然に存在しない異種ポリペプチドを発現する遺伝子であり得る。「異種遺伝子」、「外因性遺伝子」、及び「導入遺伝子」は、互換的に使用される。いくつかの実施形態では、異種遺伝子または導入遺伝子は、外因性核酸配列を含み、例えば、核酸配列は、レシピエント細胞に対して内因性ではない。いくつかの実施形態では、異種遺伝子または導入遺伝子は、外因性核酸配列、例えば、レシピエント細胞において天然に存在しない核酸配列を含む。例えば、異種遺伝子は、その挿入部位に関して、及びそのレシピエント細胞に関して異種であり得る。
「セーフハーバー」遺伝子座は、ゲノム内の遺伝子座であり、遺伝子は、例えば、アポトーシス、壊死、及び／または老化を引き起こすことなく、または対照細胞と比較して５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、もしくは４０％を超えるアポトーシス、壊死、及び／または老化を引き起こすことなく、宿主細胞、例えば、肝細胞に対する著しい有害作用なく、挿入され得る。例えば、Ｈｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｆｉｂｒｏｓｉｓ，ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ，”２０１７を参照されたい。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、例えば、アポトーシス、壊死、及び／または老化を引き起こすことなく、または対照細胞と比較して５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、もしくは４０％を超えるアポトーシス、壊死、及び／または老化を引き起こすことなく、宿主細胞、例えば、肝細胞に対する著しい有害作用なく、外因性遺伝子の過剰発現を可能にする。いくつかの実施形態では、望ましいセーフハーバー遺伝子座は、挿入された遺伝子配列の発現が隣接する遺伝子からのリードスルー発現によって乱されない遺伝子座であり得る。セーフハーバーは、ヒトアルブミン遺伝子などのアルブミン遺伝子内にあり得る。セーフハーバーは、アルブミンイントロン１領域、例えば、ヒトアルブミンイントロン１内にあり得る。セーフハーバーは、例えば、肝組織または肝細胞宿主細胞のヒトセーフハーバーであり得る。いくつかの実施形態では、セーフハーバーは、例えば、アポトーシス、壊死、及び／または老化を引き起こすことなく、または対照細胞もしくは細胞集団と比較して５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、もしくは４０％を超えるアポトーシス、壊死、及び／または老化を引き起こすことなく、肝細胞または肝臓細胞などの、宿主細胞または細胞集団に対する著しい有害作用なく、外因性遺伝子の過剰発現を可能にする。
ＩＩ．組成物
Ａ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物
ゲノム遺伝子座、例えば、宿主細胞または宿主細胞集団のセーフハーバー部位内に第ＩＸ因子遺伝子を挿入及び発現するのに有用なガイドＲＮＡ組成物及び方法が本明細書に提供される。特に、本明細書に例示されるように、アルブミン遺伝子座（例えば、イントロン１）における外因性遺伝子の標的化及び挿入は、アルブミンの内因性プロモーターの使用を可能にし、外因性遺伝子のロバストな発現を促進する。本開示は、アルブミン遺伝子のイントロン１内の部位を特異的に標的とし、かつ第ＩＸ因子遺伝子の効率的な挿入及び発現を提供するガイドＲＮＡの同定に部分的に基づく。実施例に示され、本明細書にさらに記載されるように、インデル形成活性により測定された高レベルの編集を媒介する同定されたｇＲＮＡの能力は、意外に、例えば、導入遺伝子の発現により測定された導入遺伝子の効率的な挿入を媒介するための同じｇＲＮＡの使用と必ずしも相関するものではない。すなわち、高レベルのインデル形成を達成することができるある特定のｇＲＮＡは、必ずしも効率的な挿入を媒介することができるわけではなく、逆に、低レベルのインデル形成を達成することが示されるいくつかのｇＲＮＡは、導入遺伝子の効率的な挿入及び発現を媒介し得る。
いくつかの実施形態では、宿主細胞のアルブミン遺伝子座（例えば、イントロン１）の領域内に第ＩＸ因子遺伝子を挿入及び発現するのに有用な組成物及び方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び異種第ＩＸ因子核酸（「第ＩＸ因子導入遺伝子」）を含む構築物（例えば、ドナー構築物またはテンプレート）と共に本明細書に開示されるガイドＲＮＡを使用して、宿主細胞のアルブミン遺伝子座内に異種第ＩＸ因子核酸を導入または挿入するのに有用な組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤及び異種第ＩＸ因子核酸を含む構築物（例えば、ドナー）と共に本明細書に開示されるガイドＲＮＡを使用して、宿主細胞のアルブミン遺伝子座から異種第ＩＸ因子を発現するのに有用な組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤及び異種第ＩＸ因子核酸を含む双方向性構築物と共に本明細書に開示されるガイドＲＮＡを使用して、宿主細胞のアルブミン遺伝子座から異種第ＩＸ因子を発現するのに有用な組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）と共に本明細書に開示されるガイドＲＮＡを使用して、宿主細胞の血清アルブミン遺伝子内で切断（例えば、二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック））を誘導するのに有用な組成物が本明細書に開示される。組成物は、インビトロまたはインビボで、例えば、血友病を治療するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、アルブミン遺伝子座のイントロン内で結合するか、または結合することができるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、ヒトアルブミン遺伝子（配列番号１）のイントロン１の領域内で結合する。ガイド配列の全ての塩基が列挙された領域内で結合しなければならないわけではないことが理解されよう。例えば、いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列の１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の塩基は、列挙された領域と結合する。例えば、いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列の１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の連続塩基は、列挙された領域と結合する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、ヒトアルブミンイントロン１（配列番号１）内の部位におけるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）による標的特異的切断を媒介する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、当該領域に結合するか、または結合することができるガイド配列を含むことが理解されよう。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを有するガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを有するガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～３７、４２～４９、５３～５９、６１～６９、７４～８１、８５～９１、及び９３～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～３７、４２～４９、５３～５９、６１～６９、７４～８１、８５～９１、及び９３～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす標的特異的切断を媒介する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、一本鎖切断（ニック）をもたらす標的特異的切断を媒介する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流の領域に結合する。当業者によって理解されるように、ＰＡＭ配列は、標的配列を含む鎖の反対側の鎖上で生じる。すなわち、ＰＡＭ配列は、標的鎖（ガイドＲＮＡが結合する標的配列を含む鎖）の相補鎖上にある。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、ＮＧＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＧＲＲ（Ｎ）、ＮＮＡＧＡＡＷ、ＮＮＮＮＧ（Ａ／Ｃ）ＴＴ、及びＮＮＮＮＲＹＡＣからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるガイドＲＮＡ配列は、ＰＡＭ配列に隣接する配列に対して相補的である。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、ヒト参照ゲノムｈｇ３８内の座標に従って本明細書の表から選択されるゲノム領域内の配列に対して相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、本明細書の表から選択されるゲノム領域内から５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続ヌクレオチドを含む配列に対して相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、本明細書の表から選択されるゲノム領域にわたる５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続ヌクレオチドを含む配列に対して相補的である配列を含む。
本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす標的特異的切断を媒介する。本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、一本鎖切断（ＳＳＢまたはニック）をもたらす標的特異的切断を媒介する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、本明細書に開示されるようなＣａｓヌクレアーゼ）による標的特異的切断を媒介し、アルブミン遺伝子のイントロン１内に異種第ＩＸ因子核酸の挿入をもたらす。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及び／または切断は、異種第ＩＸ因子遺伝子の３０～３５％、３５～４０％、４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、または９５～９９％の挿入速度をもたらす。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及び／または切断は、異種第ＩＸ因子核酸の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の挿入速度をもたらす。挿入速度は、インビトロまたはインビボで測定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、挿入速度は、細胞集団内の挿入された第ＩＸ因子核酸を検出及び測定し、挿入された第ＩＸ因子核酸を含む集団のパーセンテージを計算することによって決定することができる。挿入速度を測定する方法は、当該技術分野で既知であり、利用可能である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、異種第ＩＸ因子遺伝子の５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３０％、３０～３５％、３５～４０％、４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９９％、またはそれを超える％増加した発現を可能にする。異種第ＩＸ因子遺伝子の発現の増加は、インビトロまたはインビボで測定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、増加した発現は、第ＩＸ因子ポリペプチドレベルを検出及び測定し、レベルを例えば、細胞を治療する前、または対象への投与の前の第ＩＸ因子ポリペプチドレベルと比較することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、異種第ＩＸ因子遺伝子の発現からもたらされる５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３０％、３０～３５％、３５～４０％、４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９９％、またはそれを超える％増加した活性を可能にする。例えば、増加した活性は、凝固活性を検出及び測定し、活性を例えば、細胞を治療する前、または対象への投与の前の凝固活性と比較することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、増加した活性は、ａＰＴＴアッセイにおける凝固機能及び／またはＴＧＡ－ＥＡアッセイにおけるトロンビン生成を評価することによって使用して決定され得る。そのような方法は利用可能であり、当該技術分野で既知である（例えば、Ｓｉｍｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ，ＮＥＪＭ ２００９）。
表１に配列番号２～３３で示されるガイド配列の各々は、ｃｒＲＮＡ及び／またはガイドＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでもよく、例えば、その３’末端で、ガイド配列に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号４００）。ゲノム座標は、ヒト参照ゲノムｈｇ３８に従う。ｓｇＲＮＡの場合、上述のガイド配列は、ｓｇＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでもよく、例えば、ガイド配列の３’末端に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号４０１）またはＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号４０２）。
表１の配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３のガイド配列の各々は、ｃｒＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでもよく、例えば、その３’末端で、ガイド配列に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号４００）。ｓｇＲＮＡの場合、上述のガイド配列は、ｓｇＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでもよく、例えば、ガイド配列の３’末端に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号４０１）またはＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号４０２）。
Figure 2022512731000001
ガイドＲＮＡは、ｔｒＲＮＡをさらに含み得る。本明細書に記載される各組成物及び方法の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、シングルＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として会合してもよく、または別個のＲＮＡ上にあってもよい（ｄｇＲＮＡ）。ｓｇＲＮＡの文脈において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの構成要素は、例えば、ホスホジエステル結合または他の共有結合を介して共有結合され得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合ではないヌクレオチド間の１つ以上の連結を含む。
本明細書に記載される組成物、使用、及び方法の実施形態の各々では、ガイドＲＮＡは、「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」として２つのＲＮＡ分子を含み得る。ｄｇＲＮＡは、例えば、表１に示されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子と、ｔｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子とを含む。第１のＲＮＡ分子及び第２のＲＮＡ分子は共有結合していなくてもよいが、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの部分の間の塩基対合を介してＲＮＡ二本鎖を形成してもよい。
本明細書に記載される組成物、使用、及び方法の実施形態の各々では、ガイドＲＮＡは、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」としてシングルＲＮＡ分子を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡに共有結合した表１に示されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡ（またはその一部分）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列のも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、リンカーを介して共有結合される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの部分の間の塩基対合によって、ステムループ構造を形成する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、ホスホジエステル結合ではない１つ以上の結合を介して共有結合される。
いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来のｔｒＲＮＡ配列の全てまたは一部分を含み得る。いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、先端切断または修飾された野生型ｔｒＲＮＡを含む。ｔｒＲＮＡの長さは、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に依存する。いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは１００個より多いヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、例えば、１つ以上のヘアピン構造もしくはステムループ構造、または１つ以上のバルジ構造などのある特定の二次構造を含み得る。
いくつかの実施形態では、標的配列またはヒトアルブミン遺伝子座（配列番号１）のイントロン１内の領域は、ガイドＲＮＡのガイド配列に対して相補的であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、１００％相補的であるか、または同一であり得る。他の実施形態では、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、少なくとも１個のミスマッチを含んでもよい。例えば、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、１、２、３、４、または５個のミスマッチを含んでもよく、ここで、ガイド配列の全長は、約２０または２０である。いくつかの実施形態において、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、１～４個のミスマッチを含んでもよく、ここで、ガイド配列は、約２０または２０ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物または製剤は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、ＣａｓヌクレアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡが提供されるか、使用されるか、または投与される。
Ｂ．修飾ｇＲＮＡ及びｍＲＮＡ
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、化学修飾される。１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡは、標準的なＡ、Ｇ、Ｃ、及びＵ残基の代わりに、またはそれらに加えて使用される１つ以上の非天然及び／または天然に存在する構成要素または配置の存在を記載するために、「修飾」ｇＲＮＡまたは「化学修飾」ｇＲＮＡと呼ばれる。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、非標準的なヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いて合成され、本明細書では「修飾された」と呼ばれる。修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、（ｉ）ホスホジエステル骨格結合における改変、例えば、非架橋のリン酸酸素の１つもしくは両方、及び／または、架橋リン酸酸素の１つ以上の置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｉ）リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの改変、例えば、置き換え（例示的な糖修飾）、（ｉｉｉ）リン酸部分の「脱リン酸型」リンカーによる大規模な置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｖ）非標準的な核酸塩基によるものを含め、天然に存在する核酸塩基の修飾または置き換え（例示的な塩基修飾）、（ｖ）リボースリン酸骨格の置き換えまたは修飾（例示的な骨格修飾）、（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置き換え、または部分、キャップ、またはリンカーのコンジュゲーション（そのような３’または５’のキャップ修飾は、糖及び／または骨格の修飾を含み得る）、ならびに（ｖｉｉ）糖の修飾または置き換え（例示的な糖修飾）の１つ以上を含み得る。
上に列挙されるものなどの化学修飾を組み合わせて、２、３、４以上の修飾を有し得るヌクレオシド及びヌクレオチド（まとめて「残基」）を含む修飾ｇＲＮＡ及び／またはｍＲＮＡを提供することができる。例えば、修飾残基は、修飾糖及び修飾核酸塩基を有し得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの各々の塩基は修飾され、例えば、全ての塩基がホスホロチオエート基などの修飾リン酸基を有する。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のリン酸基の全て、または実質的に全てがホスホロチオエート基によって置き換えられる。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端において、またはその近傍において少なくとも１つの修飾残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの３’末端において、またはその近傍において少なくとも１つの修飾残基を含む。ある特定のｇＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端及び３’末端において、またはその近傍において少なくとも１つの修飾残基を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１、２、３以上の修飾残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡ内の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％）は、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
非修飾核酸は、例えば、細胞内ヌクレアーゼまたは血清中に見られるものによる分解を受けやすい場合がある。例えば、ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、例えば、細胞内または血清に由来するヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡ分子は、インビボ及びエクスビボの両方において細胞集団に導入されるとき、低減した自然免疫応答を示し得る。「自然免疫応答」という用語は、サイトカイン（特にインターフェロン）発現及び放出の誘導ならびに細胞死を含む、一本鎖核酸を含む外因性核酸に対する細胞応答を含む。
骨格修飾のいくつかの実施形態では、修飾残基のリン酸基は、１つ以上の酸素を異なる置換基によって置き換えることによって修飾され得る。さらに、修飾残基、例えば、修飾核酸中に存在する修飾残基は、本明細書において記載されるように、非修飾リン酸部分の修飾リン酸基による大規模な置き換えを含み得る。いくつかの実施形態では、リン酸骨格の骨格修飾は、帯電していないリンカーまたは非対称な電荷分布を有する帯電したリンカーのいずれかをもたらす改変を含み得る。
修飾リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが含まれる。非修飾リン酸基中のリン酸原子は、アキラルである。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つの、上述の原子または原子群のうちの１つによる置き換えは、リン原子をキラルにすることができる。立体リン原子は、「Ｒ」配置（本明細書においてＲｐ）または「Ｓ」配置（本明細書においてＳｐ）のいずれかを有し得る。骨格はまた、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）の、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレンホスホネート）による置き換えによっても修飾され得る。置き換えは、いずれかの架橋酸素または両方の架橋酸素において生じ得る。
リン酸基は、ある特定の骨格修飾において、非リン含有連結基によって置き換えることができる。いくつかの実施形態では、帯電したリン酸基は、中性部分によって置き換えることができる。リン酸基を置き換えることのできる部分の例は、非限定的に、例えば、メチルホスホン酸、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｈｙｄｒａｚｏ）、メチレンジメチルヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒａｚｏ）、メチレンオキシメチルイミノ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏ）を含み得る。
核酸を模倣し得る足場もまた構築することができ、リン酸リンカー及びリボース糖はヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドの代替物によって置き換えられる。そのような修飾は、骨格及び糖修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、代替骨格によって係留され得る。例には、限定するものではないが、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代替物が含まれ得る。
修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、糖基に対する１つ以上の修飾、すなわち、糖修飾を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、修飾されてもよく、例えば、多くの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基によって置き換えることができる。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基に対する修飾は、ヒドロキシルが２’－アルコキシドイオンを形成するようにさらに脱プロトン化されることがもはや起こり得ないため、核酸の安定性を増強し得る。
２’ヒドロキシル基修飾の例には、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、式中、「Ｒ」は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲが挙げられ得、式中、Ｒは、例えば、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり得、ｎは、０～２０の整数であり得る（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、及び４～２０）。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅであり得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－ヒドロキシル基をフッ素で置き換える２’－フルオロ修飾であり得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－ヒドロキシル基を水素で置き換える２’－Ｈであり得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロキシルが、例えばＣ１－６アルキレンまたはＣ１－６ヘテロアルキレン架橋を介して同一のリボース糖の４’炭素へと接続し得る「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を含んでもよく、例示的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋、Ｏ－アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、もしくはポリアミノであり得る）、及びアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ－アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、もしくはポリアミノであり得る）を含み得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、リボース環がＣ２’－Ｃ３’結合を欠失している「アンロックド（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）」核酸（ＵＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は、メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えば、ＰＥＧ誘導体）を含み得る。
「デオキシ」２’修飾は、水素（すなわち、デオキシリボース糖、例えば、部分的なｄｓＲＮＡの突出部分）、ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）、アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２－アミノ（ここでアミノは、例えば、本明細書において記載されるようなものである）、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）、シアノ、メルカプト、アルキル－チオ－アルキル、チオアルコキシ、ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルを含み得、任意に、例えば、本明細書に記載されるようなアミノで置換されてもよい。
糖修飾は、リボースにおける対応する炭素のものとは反対の立体化学配置を有する１つ以上の炭素を含む糖基を含み得る。したがって、修飾核酸は、糖として、例えば、アラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。修飾核酸はまた、脱塩基糖をも含み得る。これらの脱塩基糖はまた、構成要素の糖原子の１つ以上においてさらに修飾され得る。修飾核酸はまた、Ｌ型である１つ以上の糖、例えば、Ｌ－ヌクレオシドを含み得る。
修飾核酸に組み込むことができる本明細書に記載される修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、核酸塩基とも呼ばれる修飾塩基を含み得る。核酸塩基の例は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含むが、これらに限定されない。これらの核酸塩基は、修飾されて、または完全に置き換えられて、修飾核酸に組み込むことができる修飾残基をもたらすことができる。ヌクレオチドの核酸塩基は独立して、プリン、ピリミジン、プリンアナログ、またはピリミジンアナログから選択することができる。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、例えば、天然に存在する塩基、及び塩基の合成誘導体を含み得る。
デュアルガイドＲＮＡを用いる実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの各々は、修飾を含み得る。このような修飾は、ｃｒＲＮＡ及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡの一方または両方の末端に存在してもよい。ｓｇＲＮＡを含む実施形態では、ｓｇＲＮＡの一方または両方の末端における１つ以上の残基は、化学修飾されてもよく、及び／または内部ヌクレオシドが修飾されてもよく、及び／またはｓｇＲＮＡ全体が化学修飾されてもよい。特定の実施形態は、５’末端修飾を含む。特定の実施形態は、３’末端修飾を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、２０１７年１２月８日に出願された「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ」という発明の名称のＷＯ２０１８／１０７０２８Ａ１に開示された修飾パターンのうちの１つを含み、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、ＵＳ２０１７０１１４３３４に開示された構造／修飾パターンのうちの１つを含み、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡはＷＯ２０１７／１３６７９４、ＷＯ２０１７００４２７９、ＵＳ２０１８１８７１８６、ＵＳ２０１９０４８３３８に開示された構造／修飾パターンのうちの１つを含み、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示のｓｇＲＮＡは、以下の表２に示される修飾パターンを含む。表２の「完全配列」は、表１に列挙されるガイドの各々のｓｇＲＮＡ配列を指す。「完全配列修飾」は、各ｓｇＲＮＡの修飾パターンを示す。
Figure 2022512731000002
Figure 2022512731000003
Figure 2022512731000004
Figure 2022512731000005
Figure 2022512731000006
いくつかの実施形態では、修飾ｓｇＲＮＡは、以下の配列：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号３００）を含み、「Ｎ」は、任意の天然または非天然ヌクレオチドであってもよく、Ｎの全体は、表１に記載されるアルブミンイントロン１ガイド配列を含む。例えば、配列番号３００が本明細書に包含され、Ｎは、表１に本明細書で開示されるガイド配列（配列番号２～３３）のうちのいずれかで置き換えられる。
例えば、配列番号３００が本明細書に包含され、Ｎは、表１に本明細書で開示されるガイド配列（配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３）のうちのいずれかで置き換えられる。
以下に記載される修飾のうちのいずれも、本明細書に記載されるｇＲＮＡ及びｍＲＮＡ内に存在し得る。
「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」、または「ｍＧ」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅによって修飾されているヌクレオチドを表すために使用され得る。
２’－Ｏ－メチルの修飾は、以下のように描写され得る。
Figure 2022512731000007
ヌクレオチド糖環に影響することが示されている別の化学修飾は、ハロゲン置換である。例えば、ヌクレオチド糖環上の２’－フルオロ（２’－Ｆ）置換は、オリゴヌクレオチド結合親和性及びヌクレアーゼ安定性を増加させることができる。
本出願において、「ｆＡ」、「ｆＣ」、「ｆＵ」、または「ｆＧ」という用語は、２’－Ｆで置換されているヌクレオチドを表すために使用され得る。
２’－Ｆの置換は、以下のように描写され得る。
Figure 2022512731000008
ホスホロチオエート（ＰＳ）連結または結合は、硫黄が、ホスホジエステル連結、例えば、ヌクレオチド塩基間の結合中の１つの非架橋リン酸酸素に置き換えられる結合を指す。ホスホロチオエートを使用してオリゴヌクレオチドを生成する場合、修飾オリゴヌクレオチドは、Ｓ－オリゴとも称され得る。
ＰＳ修飾を示すために、「＊」が使用され得る。本出願では、Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊、またはＧ＊という用語を使用して、ＰＳ結合で次の（例えば３’）ヌクレオチドに連結されるヌクレオチドを示すことができる。
本出願では、用語「ｍＡ＊」、「ｍＣ＊」、「ｍＵ＊」、または「ｍＧ＊」を使用して、２’－Ｏ－Ｍｅで置換され、かつＰＳ結合で次の（例えば、３’）ヌクレオチドに連結されるヌクレオチドを示すことができる。
以下の図は、非架橋リン酸酸素へのＳ－の置換を示し、ホスホジエステル結合の代わりにＰＳ結合を生じる。
Figure 2022512731000009
脱塩基ヌクレオチドは、窒素系塩基を欠くものを指す。以下の図は、塩基を欠いている脱塩基（脱プリンとしても知られる）部位を有するオリゴヌクレオチドを描写する。
Figure 2022512731000010
反転した塩基は、通常の５’から３’への連結とは反転した連結を有するものを指す（すなわち、５’から５’への連結または３’から３’への連結のいずれか）。例えば、
Figure 2022512731000011
脱塩基ヌクレオチドは、反転した連結と接続することができる。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、５’から５’への連結を介して末端部の５’ヌクレオチドに接続してもよく、または脱塩基ヌクレオチドは、３’から３’への連結を介して末端部の３’ヌクレオチドに接続してもよい。末端部の５’または３’ヌクレオチドのいずれかにおける反転した脱塩基ヌクレオチドはまた、反転した脱塩基末端キャップと称され得る。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３、４、または５個のヌクレオチドのうちの１つ以上、及び３’末端部における最後の３、４、または５個のヌクレオチドのうちの１つ以上が修飾される。いくつかの実施形態では、修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ、反転した脱塩基ヌクレオチド、ＰＳ結合、または安定性及び／または性能を増加させることが当該技術分野で既知の他のヌクレオチド修飾である。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の４個のヌクレオチド、及び３’末端部における最後の４個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を用いて連結される。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、及び３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、及び３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、及び３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、反転した脱塩基ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、修飾ｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、配列番号３００に示される修飾パターンを含み、Ｎは、任意の天然または非天然ヌクレオチドであり、Ｎの全体は、ヒトアルブミンイントロン１内の標的配列に対してヌクレアーゼを指向させるガイド配列（例えば、表１に示されるような）を含む。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３４～９７のうちのいずれか１つに示されるｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３のガイド配列のうちのいずれか１つと、配列番号３００のヌクレオチドとを含むｓｇＲＮＡを含み、配列番号３００のヌクレオチドは、ガイド配列の３’末端にあり、ｓｇＲＮＡは、例えば、配列番号３００に示されるように修飾され得る。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３４～３７、４２～４９、５３～５９、６１～６９、７４～８１、８５～９１、及び９３～９７のうちのいずれか１つに示されるｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３のガイド配列のうちのいずれか１つと、配列番号３００のヌクレオチドとを含むｓｇＲＮＡを含み、配列番号３００のヌクレオチドは、ガイド配列の３’末端にあり、ｓｇＲＮＡは、例えば、配列番号３００に示されるように修飾され得る。
上述のように、いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物または製剤は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、ＣａｓヌクレアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡが提供されるか、使用されるか、または投与される。以下に記載されるように、Ｃａｓヌクレアーゼを含むｍＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、クリベース、ニッカーゼ、及び／または部位特異的ＤＮＡ結合活性を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするＯＲＦは、「修飾ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤ＯＲＦ」または単に「修飾ＯＲＦ」であり、ＯＲＦが修飾されていることを示すための略語として使用される。
修飾Ｃａｓ９ ＯＲＦを含むＣａｓ９ ＯＲＦは、本明細書において提供され、当該技術分野で既知である。一例として、Ｃａｓ９ ＯＲＦは、コード配列が１つ以上のアミノ酸の１つ以上の代替コドンを含むように、コドン最適化することができる。本明細書で使用される「代替コドン」は、所与のアミノ酸についてのコドン使用頻度の変形を指し、所与の発現系に好ましいまたは最適化されたコドン（コドン最適化）であってもなくてもよい。好ましいコドン使用頻度、または所与の発現系において良好に耐容されるコドンは、当該技術分野で既知である。ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１６／１０６１２１、及びＷＯ２０１９／０６７９１０のＣａｓ９コード配列、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、及びＣａｓ９タンパク質配列は、参照により本明細書に組み込まれる。特に、ＷＯ２０１９／０６７９１０の段落［０４４９］の表のＯＲＦ及びＣａｓ９アミノ酸配列、ならびにＷＯ２０１９／０６７９１０の段落［０２１４］～［０２３４］のＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びＯＲＦは、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、修飾ＯＲＦは、少なくとも１つ、複数、または全てのウリジン位置に、修飾ウリジンを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで、５位で修飾されたウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで、１位で修飾されたシュードウリジンである。修飾ウリジンは、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヨードウリジン、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、シュードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチル－シュードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、シュードウリジン及びＮ１－メチル－シュードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、シュードウリジン及び５－メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチルシュードウリジン及び５－メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジン及びＮ１－メチル－シュードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、シュードウリジン及び５－ヨードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジン及び５－メトキシウリジンの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｍＲＮＡは、５’キャップ、例えば、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、またはＣａｐ２を含む。５’キャップは、一般に、ｍＲＮＡの５’－３’鎖の第１のヌクレオチド（すなわち、第１のキャップ近位のヌクレオチド）の５’位に対して５’－トリホスフェートを介して連結した７－メチルグアニンリボヌクレオチド（例えば、ＡＲＣＡに関して、以下で考察されるようにさらに修飾されてもよい）である。Ｃａｐ０において、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近位のヌクレオチドのリボースは、両方とも、２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ１において、ｍＲＮＡの第１及び第２の転写ヌクレオチドのリボースは、それぞれ、２’－メトキシ及び２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ２において、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近位のヌクレオチドのリボースは、両方とも、２’－メトキシを含む。例えば、Ｋａｔｉｂａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１（３３）：１２０２５－３０、Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１４（１１）：Ｅ２１０６－Ｅ２１１５を参照されたい。ヒトｍＲＮＡなどの哺乳動物ｍＲＮＡを含む、ほとんどの内因性の高級真核生物ｍＲＮＡは、Ｃａｐ１またはＣａｐ２を含む。Ｃａｐ０ならびにＣａｐ１及びＣａｐ２とは異なる他のキャップ構造は、ＩＦＩＴ－１及びＩＦＩＴ－５などの自然免疫系の構成要素によって「非自己」として認識されるため、ヒトなどの哺乳動物において免疫原性である場合があり、Ｉ型インターフェロンを含むサイトカインレベルの上昇を引き起こし得る。ＩＦＩＴ－１及びＩＦＩＴ－５などの自然免疫系の構成要素はまた、Ｃａｐ１またはＣａｐ２以外のキャップとのｍＲＮＡの結合についてｅＩＦ４Ｅと競合する場合があり、ｍＲＮＡの翻訳を潜在的に阻害する。
キャップは、共転写的に含めることができる。例えば、ＡＲＣＡ（抗逆キャップアナログ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＡＭ８０４５）は、グアニンリボヌクレオチドの５’位に連結する７－メチルグアニン３’－メトキシ－５’－トリホスフェートを含むキャップアナログであり、開始時にインビトロで転写物に組み込むことができる。ＡＲＣＡは、第１のキャップ近位のヌクレオチドの２’位がヒドロキシルであるＣａｐ０キャップをもたらす。例えば、Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００１）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ‘ａｎｔｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ’ ｃａｐ ａｎａｌｏｇｓ ７－ｍｅｔｈｙｌ（３’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ）ＧｐｐｐＧ ａｎｄ ７－ｍｅｔｈｙｌ（３’ｄｅｏｘｙ）ＧｐｐｐＧ，”ＲＮＡ ７：１４８６－１４９５を参照されたい。ＡＲＣＡの構造を以下に示す。
Figure 2022512731000012
ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１１３）またはＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１３３）を使用して、Ｃａｐ１構造を共転写的に提供することができる。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ及びＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧの３’－Ｏ－メチル化態様も、それぞれ、カタログ番号Ｎ－７４１３及びＮ－７４３３としてＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから利用可能である。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧの構造を以下に示す。
Figure 2022512731000013
あるいは、転写後に、キャップをＲＮＡに付加することができる。例えば、Ｖａｃｃｉｎｉａキャッピング酵素は市販されており（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ２０８０Ｓ）、そのＤ１サブユニットによって提供されるＲＮＡトリホスファターゼ及びグアニリルトランスフェラーゼ活性と、そのＤ１２サブユニットによって提供されるグアニンメチルトランスフェラーゼとを有する。したがって、Ｓ－アデノシルメチオニン及びＧＴＰの存在下で、Ｃａｐ０を与えるように、７－メチルグアニンをＲＮＡに付加することができる。例えば、Ｇｕｏ，Ｐ．ａｎｄ Ｍｏｓｓ，Ｂ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，４０２３－４０２７、Ｍａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２４４７２－２４４７９を参照されたい。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリアデニル化（ポリ－Ａ）テールをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリ－Ａテールは、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のアデニンを含み、任意に、３００個までのアデニンを含む。いくつかの実施形態では、ポリ－Ａテールは、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個のアデニンヌクレオチドを含む。
Ｃ．ドナー構築物
本明細書に記載の組成物及び方法は、本開示のガイドＲＮＡ及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤によって作成される切断部位に挿入される異種第ＩＸ因子遺伝子をコードする配列を含む核酸構築物の使用を含む。本明細書で使用される場合、そのような構築物は、時に、「ドナー構築物／テンプレート」と称される。いくつかの実施形態では、構築物は、ＤＮＡ構築物である。ドナー構築物に対する様々な機能的／構造的修飾を設計及び作製する方法は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、構築物は、ポリアデニル化テール配列、ポリアデニル化シグナル配列、スプライスアクセプター部位、または選択マーカーのうちのいずれか１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化テール配列は、コード配列の３’末端で、例えば、「ポリ－Ａ」ストレッチとしてコードされる。好適なポリアデニル化テール配列及び／またはポリアデニル化シグナル配列を設計する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ＵＡＵＡＡＡ（配列番号８０１）またはＡＵ／ＧＵＡＡＡ（配列番号８０２）などのバリアントが同定されているが、ポリアデニル化シグナル配列ＡＡＵＡＡＡ（配列番号８００）は、哺乳動物系で一般的に使用される。例えば、ＮＪ Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．２５（１７）：１７７０－８２，２０１１を参照されたい。
いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、第ＩＸ因子をコードする配列を含み、第ＩＸ因子配列は、野生型第ＩＸ因子、例えば、配列番号７００である。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、第ＩＸ因子をコードする配列を含み、第ＩＸ因子配列は、野生型第ＩＸ因子、例えば、配列番号７０１である。いくつかの実施形態では、配列は、第ＩＸ因子のバリアントをコードする。例えば、バリアントは、野生型第ＩＸ因子よりも増加した凝固活性を有し得る。例えば、バリアント第ＩＸ因子は、配列番号７０１に対してＲ３３８位（例えばＲ３３８Ｌ）にアミノ酸置換などの１つ以上の変異を含み得る。いくつかの実施形態では、配列は、配列番号７００、配列番号７０１、または配列番号７０２と８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％同一であり、野生型第ＩＸ因子と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％以上の活性を有する第ＩＸ因子バリアントをコードする。いくつかの実施形態では、配列は、第ＩＸ因子の断片をコードし、断片は、野生型第ＩＸ因子と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％以上の活性を有する。
いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、第ＩＸ因子バリアントをコードする配列を含み、第ＩＸ因子バリアントは、その補因子である第ＶＩＩＩ因子の不在下で凝固を活性化する。そのような第ＩＸ因子バリアントは、野生型第ＩＸ因子の活性をさらに維持することができる。そのような第ＩＸ因子バリアントは、血友病Ｂなどの血友病を治療するために使用され得る。例えば、そのような第ＩＸ因子バリアントは、野生型第ＩＸ因子に対して（例えば、配列番号７０１に対して）Ｌ６位、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、Ｉ３８３位、Ｅ１８５位、またはそれらの組み合わせにアミノ酸置換を含み得る。例えば、そのような第ＩＸ因子バリアントは、野生型第ＩＸ因子に対して（例えば、配列番号７０１に対して）Ｌ６Ｆ変異、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、Ｅ１８５Ｄ変異、またはそれらの組み合わせを含み得る。
一例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位及びＶ１８１位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位及びＫ２６５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位及びＫ２６５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｋ２６５位及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｋ２６５位及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｉ３８３位及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｖ１８１位、及びＫ２６５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｖ１８１位、及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｖ１８１位、及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｋ２６５位、及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｋ２６５位、及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｉ３８３位、及びＥ１８６位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位、Ｉ３８３位、及びＥ１８６位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｋ２６５位、Ｉ３８３位、及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｖ１８１位、Ｉ３８３位、及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｋ２６５位、Ｉ３８３位、及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、Ｉ３８３位、及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。
特定の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。別の特定の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、Ｉ３８３位、及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の特定の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。
一例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異及びＶ１８１Ｉ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異及びＫ２６５Ａ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異及びＫ２６５Ａ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｋ２６５Ａ変異及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｋ２６５Ａ変異及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｉ３８３Ｖ変異及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｖ１８１Ｉ変異、及びＫ２６５Ａ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｖ１８１Ｉ変異、及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｖ１８１Ｉ変異、及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｋ２６５Ａ変異、及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｋ２６５Ａ変異、及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、及びＥ１８６Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、及びＥ１８６Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｋ２６５Ａ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｋ２６５Ａ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。
特定の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。別の特定の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。いくつかの実施形態では、第ＩＸ因子バリアントは、配列番号７００と少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％同一であり、野生型第ＩＸ因子と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％以上の活性を有する。ある特定の実施形態では、第ＩＸ因子バリアントは、配列番号７００と８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％同一であり、野生型第ＩＸ因子と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％以上の活性を有し、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、及び／またはＥ１８５Ｄ変異を含む。別の特定の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。いくつかの実施形態では、第ＩＸ因子バリアントは、配列番号７００と少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％同一であり、野生型第ＩＸ因子と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％以上の活性を有し、Ｌ６Ｆ変異、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、及び／またはＩ３８３Ｖ変異を含む。
構築物の長さは、挿入される遺伝子のサイズに応じて変化することができ、例えば、２００塩基対（ｂｐ）～約５０００ｂｐ、例えば、約２００ｂｐ～約２０００ｂｐなど、約５００ｂｐ～約１５００ｂｐなどであり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡドナーテンプレートの長さは、約２００ｂｐであるか、または約５００ｂｐであるか、または約８００ｂｐであるか、または約１０００塩基対であるか、または約１５００塩基対である。他の実施形態では、ドナーテンプレートの長さは、少なくとも２００ｂｐであるか、または少なくとも５００ｂｐであるか、または少なくとも８００ｂｐであるか、または少なくとも１０００ｂｐであるか、または少なくとも１５００ｂｐである。他の実施形態では、ドナーテンプレートの長さは、少なくとも２００ｂｐであるか、または少なくとも５００ｂｐであるか、または少なくとも８００ｂｐであるか、または少なくとも１０００ｂｐであるか、または少なくとも１５００ｂｐ、または少なくとも２０００、または少なくとも２５００、または少なくとも３０００、または少なくとも３５００、または少なくとも４０００、または少なくとも４５００、または少なくとも５０００である。
構築物は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、または部分的に一本鎖及び部分的に二本鎖であり得、直鎖または環状（例えば、ミニサークル）形態で宿主細胞に導入され得る。例えば、米国特許公開第２０１０／００４７８０５号、同第２０１１／０２８１３６１号、同第２０１１／０２０７２２１号を参照されたい。直鎖形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基は、直鎖分子の３’末端に添加され、及び／または自己相補性オリゴヌクレオチドは、一方または両方の末端にライゲーションされる。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３、Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法は、限定されないが、末端アミノ基（複数可）の添加、ならびに例えば、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、及びＯ－メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間連結の使用を含む。構築物は、例えば、複製起源、プロモーター、及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞内に導入され得る。構築物は、ウイルス要素を取り除き得る。さらに、ドナー構築物は、裸の核酸として、リポソームもしくはポロキサマーなどの薬剤と複合体化した核酸として導入され得るか、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）によって送達され得る。
いくつかの実施形態では、構築物は、その発現が挿入部位における内因性プロモーター（例えば、ドナーが宿主細胞のアルブミン遺伝子座に組み込まれるときの内因性アルブミンプロモーター）によって促進されるように挿入され得る。そのような場合、導入遺伝子は、その発現を促進する制御エレメント（例えば、プロモーター及び／またはエンハンサー）を欠いてもよい（例えば、プロモーターレス構築物）。それにもかかわらず、他の場合において、構築物は、プロモーター及び／またはエンハンサー、例えば、組み込み時に機能性タンパク質の発現を促進する構成的プロモーター、または誘導性もしくは組織特異的（例えば、肝臓または血小板特異的）プロモーターを含み得ることが明らかであろう。構築物は、シグナルペプチドをコードするシグナル配列の下流にある異種第ＩＸ因子タンパク質をコードする配列を含み得、シグナルペプチドをコードするシグナル配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、第ＩＸ因子タンパク質をコードする核酸の相同性非依存挿入において作用する。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、非分裂細胞、例えば、ＨＲではなくＮＨＥＪが、二本鎖ＤＮＡ切断が修復される一次機序である細胞において作用する。核酸は、相同性非依存性ドナー構築物であり得る。
異種第ＩＸ因子核酸（第ＩＸ因子導入遺伝子）を含むいくつかのドナー構築物は、非相同末端結合によって、遺伝子編集系の標的ＤＮＡ配列の切断部位に挿入することができる（例えば、アルブミン遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子に挿入することができる）。いくつかの場合では、そのような構築物は、相同性アームを含まない。例えば、そのような構築物は、本明細書に開示される遺伝子編集系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）による切断後に平滑末端二本鎖切断に挿入され得る。特定の例では、構築物は、ＡＡＶを介して送達され得、非相同末端結合による挿入が可能であり得る（例えば、構築物は、相同性アームを含まないものであり得る）。
特定の例では、構築物は、相同性非依存性標的組み込みを介して挿入され得る。例えば、構築物中の異種第ＩＸ因子核酸は、遺伝子編集系の標的部位（例えば、標的挿入のための標的ＤＮＡ配列と同じ標的部位（例えば、セーフハーバー遺伝子内）、及び標的挿入のための標的ＤＮＡ配列を切断するために使用されている同じ遺伝子編集系）によって、各側に隣接し得る。次いで、遺伝子編集系は、異種第ＩＸ因子核酸に隣接する標的部位を切断することができる。特定の例では、構築物は、ＡＡＶ媒介性送達で送達され、異種第ＩＸ因子核酸に隣接する標的部位の切断は、ＡＡＶの逆位末端反復（ＩＴＲ）を除去することができる。いくつかの方法では、異種第ＩＸ因子核酸が正しい配向で切断部位または標的ＤＮＡ配列に挿入される場合、標的挿入のための標的ＤＮＡ配列（例えば、セーフハーバー遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列、例えば、隣接プロトスペーサー隣接モチーフを含むｇＲＮＡ標的配列）は、もはや存在しないが、異種第ＩＸ因子核酸が逆の配向で切断部位または標的ＤＮＡ配列に挿入される場合、それは再編成される。これは、異種第ＩＸ因子核酸が発現のために正しい配向で挿入されることを確実にするのに役立ち得る。
第ＩＸ因子遺伝子の増強された挿入及び発現を可能にする双方向性核酸構築物も本明細書に記載される。簡潔には、本明細書に開示される様々な双方向性構築物は、少なくとも２つの核酸セグメントを含み、一方のセグメント（第１のセグメント）は、第ＩＸ因子（本明細書において、時に「導入遺伝子」と互換的に称される）をコードするコード配列を含むが、他方のセグメント（第２のセグメント）は、配列の相補体が第ＩＸ因子をコードする配列を含む。
一実施形態では、双方向性構築物は、ｃｉｓに少なくとも２つの核酸セグメントを含み、一方のセグメント（第１のセグメント）は、コード配列（本明細書において、時に「導入遺伝子」と互換的に称される）を含むが、他方のセグメント（第２のセグメント）は、配列の相補体が導入遺伝子をコードする配列を含む。第１の導入遺伝子及び第２の導入遺伝子は、同一であっても異なってもよい。双方向性構築物は、ｃｉｓに少なくとも２つの核酸セグメントを含み得、一方のセグメント（第１のセグメント）は、一方の配向で異種遺伝子をコードするコード配列を含むが、他方のセグメント（第２のセグメント）は、相補体が他方の配向で異種遺伝子をコードする配列を含む。すなわち、第１のセグメントは、第２のセグメントの相補体であり（必ずしも完全な相補体ではない）、第２のセグメントの相補体は、第１のセグメントの逆相補体である（両方とも同じ異種タンパク質をコードするが、必ずしも完全な逆相補体ではない）。双方向性構築物は、スプライスアクセプターに連結した異種遺伝子をコードする第１のコード配列と、相補体が他方の配向で異種遺伝子をコードし、スプライスアクセプターにも連結した２のコード配列とを含み得る。
本明細書に記載の遺伝子編集系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系）と組み合わせて使用した場合、核酸構築物の双方向性は、構築物を標的挿入部位内のいずれかの方向（１つの方向への挿入に限定されない）で挿入することを可能にし、本明細書に例示されるように、ａ）１つのセグメントのコード配列（例えば、図１の左上のｓｓＡＡＶ構築物の「ヒトＦ９」をコードする左側セグメント）、またはｂ）他のセグメントの相補体（例えば、図１の左上のｓｓＡＡＶ構築物において逆さまに示される「ヒトＦ９」をコードする右側セグメントの相補体）のいずれかから第ＩＸ因子の発現を可能にし、それによって、挿入及び発現効率を向上させる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系を含む、様々な既知の遺伝子編集系が本開示の実施において使用され得る。
本明細書に開示される双方向性構築物は、任意の特定の使用に必要な、及び／または１つ以上の所望の機能を付与する任意の好適な構造特徴を含むように修飾され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性核酸構築物は、相同性アームを含まない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性核酸構築物は、相同性非依存性ドナー構築物である。いくつかの実施形態では、部分的には、核酸構築物の双方向性機能に起因して、双方向性構築物は、目的のポリペプチド（例えば、第ＩＸ因子）の効率的な挿入及び／または発現を可能にするために、本明細書に記載のいずれかの方向でゲノム遺伝子座に挿入され得る。
いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、第ＩＸ因子の発現を促進するプロモーターを含まない。例えば、第ＩＸ因子の発現は、宿主細胞のプロモーター（例えば、導入遺伝子が宿主細胞のアルブミン遺伝子座に組み込まれるときの内因性アルブミンプロモーター）によって促進される。
いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、第ＩＸ因子のコード配列を含む第１のセグメント、及び第ＩＸ因子のコード配列の逆相補体を含む第２のセグメントを含む。したがって、第１のセグメントにおけるコード配列は、第ＩＸ因子を発現することができるが、一方で、第２のセグメントにおける逆相補体の相補体もまた、第ＩＸ因子を発現することができる。本明細書で使用される場合、逆相補配列を含む第２のセグメントを指す場合、「コード配列」は、第２のセグメントの相補的（コード）鎖（すなわち、第２のセグメントにおける逆相補配列の相補的コード配列）を指す。
いくつかの実施形態では、第１のセグメントにおける第ＩＸ因子をコードするコード配列は、同じく第ＩＸ因子をコードするコード配列の逆相補体に対して１００％未満相補的である。すなわち、いくつかの実施形態では、第１のセグメントは、第ＩＸ因子のコード配列（１）を含み、第２のセグメントは、第ＩＸ因子のコード配列（２）の逆相補体であり、コード配列（１）は、コード配列（２）と同一ではない。例えば、第ＩＸ因子をコードするコード配列（１）及び／またはコード配列（２）は、コード配列（１）及びコード配列（２）の逆相補体が１００％未満の相補性を有するように、コドン最適化され得る。いくつかの実施形態では、第２のセグメントのコード配列は、第１のセグメントにおけるコード配列によってコードされる同じ（すなわち、同じアミノ酸配列）第ＩＸ因子の１つ以上のアミノ酸のための１つ以上の代替コドンを使用して、第ＩＸ因子をコードする。本明細書で使用される「代替コドン」は、所与のアミノ酸についてのコドン使用頻度の変形を指し、所与の発現系に好ましいまたは最適化されたコドン（コドン最適化）であってもなくてもよい。好ましいコドン使用頻度、または所与の発現系において良好に耐容されるコドンは、当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、ヘアピン形成を低減するために、第１のセグメントのコード配列とは異なるコドン使用頻度を採用する逆相補配列を含む。そのような逆相補体は、第１のセグメントにおけるコード配列の全てのヌクレオチドよりも少ない塩基対を形成するが、依然として、任意に同じポリペプチドをコードする。そのような場合では、例えば、ポリペプチドＡの、第１のセグメントのコード配列は、例えば、ポリペプチドＡの、双方向性構築物の後半のコード配列と相同であり得るが、同一ではない。いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、第１のセグメントにおけるコード配列に対して実質的に相補的ではない（例えば、７０％以下相補的である）逆相補配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、第１のセグメントにおけるコード配列に対して高度に相補的（例えば、少なくとも９０％相補的）である逆相補配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、第１のセグメントにおけるコード配列に対して少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、または約９９％相補性を有する逆相補配列を含む。
いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、第１のセグメントにおけるコード配列に対して１００％相補性を有する逆相補配列を含む。すなわち、第２のセグメント内の配列は、第１のセグメントにおけるコード配列の完全な逆相補体である。例として、第１のセグメントは、仮定配列５’ＣＴＧＧＡＣＣＧＡ３’（配列番号５００）を含み、第２のセグメントは、配列番号１の逆相補体、すなわち、５’ＴＣＧＧＴＣＣＡＧ３’（配列番号５０２）を含む。
いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、第ＩＸ因子（第１のポリペプチド）のコード配列を含む第１のセグメント、及び（第２の）ポリペプチドのコード配列の逆相補体を含む第２のセグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のセグメントは、各々上記のように、同じポリペプチド（例えば、第ＩＸ因子）をコードするコード配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のセグメントは、各々、異なるポリペプチドをコードするコード配列を含む。例えば、第１のポリペプチドは、第ＩＸ因子であり、第２のポリペプチドは、ポリペプチドＢである。さらなる例として、第１のポリペプチドは、第ＩＸ因子であり、第２のポリペプチドは、第ＩＸ因子のバリアント（例えば、断片、変異体、融合体）（例えば、本明細書に記載のＲ３３８Ｌ変異を有する）である。ポリペプチドをコードするコード配列は、任意に、ポリペプチドに連結されたシグナル配列、標識配列（例えば、ＨｉＢｉｔ）、または異種機能配列（例えば、核局在化配列（ＮＬＳ）または自己切断ペプチド）などのアミノ末端またはカルボキシ末端アミノ酸配列をコードする配列など１つ以上の追加の配列を含み得る。ポリペプチドをコードするコード配列は、任意に、１つ以上のアミノ末端シグナルペプチド配列をコードする配列を含み得る。これらの追加の配列の各々は、構築物の第１のセグメント及び第２のセグメントにおいて同じまたは異なってもよい。
いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、直鎖状である。例えば、第１及び第２のセグメントは、リンカー配列を通して直鎖様式で結合される。いくつかの実施形態では、逆相補配列を含む第２のセグメントの５’末端は、第１のセグメントの３’末端に連結される。いくつかの実施形態では、第１のセグメントの５’末端は、逆相補配列を含む第２のセグメントの３’末端に連結される。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、１０００、１５００、２０００以上のヌクレオチド長である。当業者によって理解されるように、リンカー配列に加えて、またはリンカー配列の代わりに他の構造要素が、第１のセグメントと第２のセグメントとの間に挿入され得る。
本明細書に開示される双方向性構築物は、任意の特定の使用に必要な、及び／または１つ以上の所望の機能を付与する任意の好適な構造特徴を含むように修飾され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性核酸構築物は、相同性アームを含まない。いくつかの実施形態では、部分的には、核酸構築物の双方向性機能に起因して、双方向性構築物は、目的のポリペプチド（例えば、異種第ＩＸ因子）の効率的な挿入及び／または発現を可能にするために、本明細書に記載のいずれかの方向（配向）でゲノム遺伝子座に挿入され得る。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のセグメントの一方または両方は、ポリアデニル化テール配列を含む。好適なポリアデニル化テール配列を設計する方法は、当該技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のセグメントの一方または両方は、オープンリーディングフレームの下流にポリアデニル化テール配列及び／またはポリアデニル化シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化テール配列は、第１及び／または第２のセグメントの３’末端で、例えば、「ポリ－Ａ」ストレッチとしてコードされる。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化テール配列は、第１及び／または第２のセグメントの３’末端で、またはその近傍においてコードされるポリアデニル化シグナル配列の結果として共転写的に提供される。いくつかの実施形態では、ポリ－Ａテールは、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のアデニンを含み、任意に、３００個までのアデニンを含む。いくつかの実施形態では、ポリ－Ａテールは、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個のアデニンヌクレオチドを含む。好適なポリアデニル化テール配列及び／またはポリアデニル化シグナル配列を設計する方法は、当該技術分野で周知である。マウスアルブミン及びヒトＦＩＸスプライスアクセプター部位を含む、好適なスプライスアクセプター配列が本明細書に開示され、例示される。いくつかの実施形態では、ＵＡＵＡＡＡ（配列番号８０１）またはＡＵ／ＧＵＡＡＡ（配列番号８０２）などのバリアントが同定されているが、ポリアデニル化シグナル配列ＡＡＵＡＡＡ（配列番号８００）は、哺乳動物系で一般的に使用される。例えば、ＮＪ Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．２５（１７）：１７７０－８２，２０１１を参照されたい。いくつかの実施形態では、ポリＡテール配列が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される構築物は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、または部分的に一本鎖及び部分的に二本鎖であり得る。例えば、構築物は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように（例えばヌクレオシドアナログを使用して）修飾され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される構築物は、構築物のいずれかまたは両方の末端、例えば、第１及び／または第２のセグメントにおけるオープンリーディングフレームの５’、または一方もしくは両方の導入遺伝子配列の５’上にスプライスアクセプター部位を含む。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプター部位は、ＮＡＧを含む。さらなる実施形態では、スプライスアクセプター部位は、ＮＡＧからなる。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、アルブミンスプライスアクセプター、例えば、アルブミンのエクソン１及び２の一緒のスプライシングで使用されるアルブミンスプライスアクセプターである。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、ヒトアルブミン遺伝子由来である。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、マウスアルブミン遺伝子由来である。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、Ｆ９（または「ＦＩＸ」）スプライスアクセプターであり、例えば、Ｆ９のエクソン１及び２の一緒のスプライシングで使用されるＦ９スプライスアクセプターである。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、ヒトＦ９遺伝子由来である。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、マウスＦ９遺伝子由来である。人工スプライスアクセプターを含む、真核生物において有用な追加の好適なスプライスアクセプター部位が既知であり、当該技術分野に由来し得る。例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５，７１５５－７１７４、Ｂｕｒｓｅｔ，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９，２５５－２５９を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性構築物は、必要に応じて１つ以上の好適な構造特徴を含むように、及び／または１つ以上の機能的利益を付与するように、いずれかまたは両方の末端で修飾され得る。例えば、構造修飾は、本明細書に開示される構築物を宿主細胞に送達するのに使用される方法（複数可）、例えば、ウイルスベクター送達の使用または送達のための脂質ナノ粒子へのパッケージングに応じて変化し得る。そのような修飾は、限定するものではないが、例えば、逆位末端反復（ＩＴＲ）、ヘアピン、ループ、及びトロイドなどの他の構造などの末端構造を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される構築物は、１、２、または３つのＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される構築物は、２つ以下のＩＴＲを含む。構造修飾の様々な方法は、当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態では、構築物の一方または両方の末端は、当該技術分野で既知の方法によって（例えば、エキソ核酸分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基は、直鎖分子の３’末端に添加され、及び／または自己相補性オリゴヌクレオチドは、一方または両方の末端にライゲーションされている。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３、Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。構築物を分解から保護するための追加の方法は、限定されないが、末端アミノ基（複数可）の添加、ならびに例えば、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、及びＯ－メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間連結の使用を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される構築物は、例えば、複製起源、プロモーター、及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクターの一部として細胞内に導入され得る。いくつかの実施形態では、構築物は、裸の核酸として、リポソーム、ポリマー、もしくはポロキサマーなどの薬剤と複合体化した核酸として導入され得るか、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）によって送達され得る。
いくつかの実施形態では、発現には必要ではないが、本明細書に開示される構築物はまた、転写または翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム侵入部位、ペプチドをコードする配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。
いくつかの実施形態では、第ＩＸ因子のコード配列を含む構築物は、以下の修飾：コドン最適化（例えば、ヒトコドンへ）及び／または１つ以上のグリコシル化部位の追加のうちの１つ以上を含み得る。例えば、ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｌｏｏｄ（１７）：３３３５－４４を参照されたい。
Ｄ．遺伝子編集系
例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系を含む、様々な既知の遺伝子編集系が、本開示の実施において第ＩＸ因子の標的挿入に使用され得る。一般に、遺伝子編集系は、標的ＤＮＡ配列において二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニック（例えば、一本鎖切断すなわちＳＳＢ）を誘導するために操作された切断系の使用を伴う。切断またはニッキングは、操作されたＺＦＮ、ＴＡＬＥＮなど特異的ヌクレアーゼの使用を通じて、または操作されたガイドＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、標的ＤＮＡ配列の特異的切断またはニッキングを誘導することによって生じ得る。さらに、標的ヌクレアーゼは、ゲノム編集及び遺伝子療法における使用の可能性も有し得る、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ系（例えば、「ＴｔＡｇｏ」として知られるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから、Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８－２６１を参照されたい）に基づいて開発されている。
本明細書に開示されるガイドＲＮＡを使用する方法に関して、方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（及び第ＩＸ因子をコードする配列を含む本明細書に開示されるドナー構築物のうちのいずれか）の使用を含むことが理解されよう。また、本開示は、本明細書に開示されるガイドＲＮＡありまたはなしで行われ得る（例えば、ＺＦＮ系を使用して標的ＤＮＡ配列の切断を引き起こし、双方向性構築物の挿入のための部位を作成する）、本明細書に開示される双方向性構築物を使用した第ＩＸ因子の標的挿入及び発現の方法を企図することが理解されよう。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、ガイドＲＮＡ及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤）を使用して、宿主ゲノム内の所望の遺伝子座に挿入部位を作成することができ、その部位で、本明細書に開示される第ＩＸ因子をコードする配列を含むドナー構築物（例えば、双方向性構築物）を挿入して、第ＩＸ因子を発現することができる。第ＩＸ因子は、本明細書に記載されるように、その挿入部位または遺伝子座、例えば、第ＩＸ因子が通常発現されないセーフハーバー遺伝子座に関して異種であり得る。あるいは、いくつかの実施形態では、第ＩＸ因子は、その挿入部位、例えば、欠損第ＩＸ因子遺伝子を補正するために野生型第ＩＸ因子を内因性遺伝子座に挿入することに関して非異種であり得る。セーフハーバーは、ヒトアルブミン遺伝子などのアルブミン遺伝子内にあり得る。セーフハーバーは、アルブミンイントロン１領域、例えば、ヒトアルブミンイントロン１内にあり得る。セーフハーバーは、例えば、肝組織または肝細胞宿主細胞のヒトセーフハーバーであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるガイドＲＮＡを、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）と共に本方法に従って使用して、挿入部位を作製することができ、その部位で、第ＩＸ因子をコードする配列を含むドナー構築物（例えば、双方向性構築物）を挿入して、第ＩＸ因子を発現することができる。ヒトアルブミン遺伝子座のイントロン１への第ＩＸ因子の標的挿入に有用なガイドＲＮＡが例示され、本明細書に記載される（例えば、表１を参照されたい）。
様々なＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼの使用方法もまた、当該技術分野で周知である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有する双方向性核酸の使用が本明細書に例示されるが、系に対する好適な変形も使用され得ることが理解されるであろう。文脈に応じて、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）としてまたはタンパク質として提供され得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を既に含む及び／または発現する宿主細胞で実施され得る。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、クリベース活性を有し、これは二本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも称され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ニッカーゼ活性を有し、これは一本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも称され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。Ｃａｓヌクレアーゼの例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及び他の原核生物のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のもの（例えば、次の段落のリストを参照されたい）、ならびにそれらのバリアントまたは変異体（例えば、操作型、非天然型、天然型、または他のバリアント）のバージョンが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０３１２１９８Ａ１、ＵＳ２０１６／０３１２１９９Ａ１を参照されたい。
Ｃａｓヌクレアーゼの由来となり得る非限定的な例示的な種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ細菌、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＮＤ２００６、及びＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらなる実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ細菌、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ細菌、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と合わせたｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼと合わせたｇＲＮＡは、Ｃａｓ ＲＮＰと呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来のＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９と合わせたｇＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰと呼ばれる。
野生型Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメイン：ＲｕｖＣ及びＨＮＨを有する。ＲｕｖＣドメインは、非標的ＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨドメインはＤＮＡの標的鎖を切断する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、１つを超えるＲｕｖＣドメイン及び／または１つを超えるＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９である。組成物、使用、及び方法の実施形態の各々では、Ｃａｓは、標的ＤＮＡにおける二本鎖切断を誘導する。
いくつかの実施形態では、キメラＣａｓヌクレアーゼが使用され、タンパク質の１つのドメインまたは領域が、異なるタンパク質の一部分によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１等の異なるヌクレアーゼ由来のドメインで置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、修飾ヌクレアーゼであってもよい。
他の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のカスケード複合体の構成要素であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ３タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲＮＡ切断活性を有し得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、一本鎖ニッカーゼ活性を有し、すなわち、１つのＤＮＡ鎖を切断して一本鎖切断（「ニック」としても知られる）を産生することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓニッカーゼを含む。ニッカーゼは、ｄｓＤＮＡ内でニックを作製する酵素であり、すなわち、ＤＮＡ二重らせんの一方の鎖を切断するが、他方の鎖を切断しない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、例えば、触媒ドメイン内の１つ以上の改変（例えば、点変異）によって、エンドヌクレオチド分解活性部位が不活性化されたＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上で考察されたＣａｓヌクレアーゼ）の一態様である。例えば、Ｃａｓニッカーゼ及び例示的な触媒ドメイン改変の考察については、米国特許第８，８８９，３５６号を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼなどのＣａｓニッカーゼは、不活性化されたＲｕｖＣまたはＨＮＨドメインを有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１つの機能的ヌクレアーゼドメインのみを含むように修飾される。例えば、薬剤タンパク質は、核酸切断活性を低下させるために、ヌクレアーゼドメインの１つが突然変異されるか、または完全もしくは部分的に欠失するように修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、活性が低下したＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、不活性なＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、活性が低下したＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、不活性なＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存アミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を低下させるか、または変化させるように置換される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含み得る。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｏｃｔ ２２：１６３（３）：７５９－７７１を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含み得る。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、及びＤ９８６Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい。さらなる例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、及びＤ１２５５Ａ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ）に基づく）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、それぞれ、標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖に対して相補的な一対のガイドＲＮＡと組み合わせて提供される。この実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的配列の反対側の鎖にニックを生成することによって（すなわち、二重ニッキング）、ニッカーゼを標的配列に指向させ、ＤＳＢを導入する。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、ＤＮＡの反対側の鎖を標的とする２つの別個のガイドＲＮＡと共に使用され、標的ＤＮＡ内に二重ニックを産生する。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、ごく接近した位置にあるように選択された２つの別個のガイドＲＮＡと共に使用され、標的ＤＮＡ内に二重ニックを産生する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１つ以上の異種機能ドメインを含む（例えば、融合ポリペプチドであるか、または融合ポリペプチドを含む）。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の細胞核への輸送を促進し得る。例えば、異種機能ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１～１０個のＮＬＳ（複数可）と融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１～５個のＮＬＳ（複数可）と融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１個のＮＬＳと融合され得る。１個のＮＬＳが使用される場合、ＮＬＳは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の配列のＮ末端部またはＣ末端部で連結され得る。これをＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の配列内に挿入することもできる。他の実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１個より多いＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２、３、４、または５個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合され得る。特定の状況では、２個のＮＬＳは、同じ（例えば、２個のＳＶ４０ ＮＬＳ）であってもよく、または異なってもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、カルボキシ末端部で連結された２個のＳＶ４０ ＮＬＳの配列に融合される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合してもよく、１つはＮ末端部に連結しており、１つはＣ末端部に連結する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、３個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ＮＬＳなしで融合され得る。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、単節型配列、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６００）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号６０１）であってもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、双節型配列、例えば、ヌクレオプラスミンのＮＬＳであるＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６０２）であってもよい。特定の実施形態では、単一のＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６００）ＮＬＳは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤のＣ末端部で連結され得る。１つ以上のリンカーは、任意に、融合部位に含まれる。
ＩＩＩ．送達方法
本明細書に開示されるガイドＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）、及び核酸構築物（例えば、双方向性構築物）は、当該技術分野で利用可能な様々な既知の好適な方法を使用して、宿主細胞もしくは宿主細胞集団または対象に、インビボまたはエクスビボで送達され得る。ガイドＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び核酸構築物は、適切な場合に同じまたは異なる送達方法を使用して、個別にまたは任意の組み合わせで一緒に送達することができる。
従来のウイルス及び非ウイルスベースの遺伝子送達方法を使用して、本明細書に開示されるガイドＲＮＡ、ならびに細胞（例えば、哺乳動物細胞）及び標的組織内にＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤及びドナー構築物を導入することができる。本明細書でさらに提供されるように、非ウイルスベクター、プラスミドベクターなどの非ウイルスベクター送達系核酸、ならびに例えば、裸の核酸、及びリポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、またはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸。ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれる。
核酸の非ウイルス送達のための方法及び組成物には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ウイルソソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ＬＮＰ、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、裸の核酸（例えば、裸のＤＮＡ／ＲＮＡ）、人工ビリオン、及びＤＮＡの薬剤強化取り込みが含まれる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００系（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションもまた、核酸の送達に使用され得る。
さらなる例示的な核酸送達系としては、ＡｍａｘａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，Ｍａ．）、及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）により提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、及び同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。免疫脂質複合体などの標的リポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当該技術分野で周知であり、本明細書に記載される通りである。
ガイドＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及びドナー構築物を含む様々な送達系（例えば、ベクター、リポソーム、ＬＮＰ）はまた、単独でまたは組み合わせて、インビボで細胞に送達するための生物に投与され得るか、またはエクスビボで細胞もしくは細胞培養物に投与され得る。投与は、限定されないが、注射、注入、局所適用、及びエレクトロポレーションを含む、血液、液体、または細胞との最終的な接触に分子を導入するために通常使用される経路のうちのいずれかによるものである。そのような核酸を投与する好適な方法が利用可能であり、当業者に周知である。
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される組成物のうちのいずれかをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡベクター、例えば、本明細書に記載されるガイド配列のいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡ、または第ＩＸ因子をコードする配列を含む構築物（例えば、双方向性構築物）を提供する。いくつかの実施形態では、ベクターはまた、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される組成物のうちのいずれか１つ以上を、または任意の組み合わせでコードするＤＮＡまたはＲＮＡベクターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、例えば、プロモーター、エンハンサー、及び制御配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物を含むベクターは、第ＩＸ因子発現を促進するプロモーターを含まない。例えば、第ＩＸ因子ポリペプチドの発現は、宿主細胞のプロモーター（例えば、導入遺伝子が宿主細胞のアルブミン遺伝子座に組み込まれるときの内因性アルブミンプロモーター）によって促進される。いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、各々が導入遺伝子の上流にスプライスアクセプターを有する第１のセグメント及び第２のセグメントを含む。ある特定の実施形態では、スプライスアクセプターは、宿主細胞のセーフハーバー部位のスプライスドナー配列、例えば、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１のスプライスドナーと適合性である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡを含むベクターは、本明細書に開示されるように、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）も含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ガイドＲＮＡの１つのコピーを含む。他の実施形態では、ベクターは、ガイドＲＮＡの１つを超えるコピーを含む。１つを超えるガイドＲＮＡを有する実施形態では、ガイドＲＮＡは、それらが非同一であり、異なる標的配列を標的化するようであってもよく、それらが同一の標的配列を標的化する点において同一であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターが、１つを超えるガイドＲＮＡを含む場合、各ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ ＲＮＰ複合体などのＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼとの複合体内の活性または安定性などの他の異なる特性を有し得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲなどの少なくとも１つの転写または翻訳の制御配列に作動可能に連結されてもよい。一実施形態では、プロモーターは、ｔＲＮＡプロモーター、例えば、ｔＲＮＡＬｙｓ３、またはｔＲＮＡキメラであってもよい。Ｍｅｆｆｅｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ．２０１５ ２１：１６８３－９、Ｓｃｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００７ ３５：２６２０－２６２８を参照されたい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）によって認識され得る。ＰｏｌＩＩＩプロモーターの非限定的な例は、Ｕ６及びＨ１プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＵ６プロモーターに作動可能に連結され得る。他の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＨ１プロモーターへと作動可能に連結され得る。１つを超えるガイドＲＮＡを有する実施形態では、発現を促進するために使用されるプロモーターは、同一または異なってもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド及びガイドＲＮＡのｔｒＲＮＡをコードするヌクレオチドは、同一のベクター上に提供され得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド及びｔｒＲＮＡをコードするヌクレオチドは、同一のプロモーターによって促進され得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一の転写産物へと転写され得る。例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、二重分子ガイドＲＮＡを形成するように単一の転写産物から加工され得る。代替的に、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）へと転写され得る。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、同一のベクター上のそれらの対応するプロモーターによって促進され得る。さらに他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、異なるベクターによってコードされ得る。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、Ｃａｓタンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするヌクレオチド配列を含む同一のベクター上に配置され得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の発現は、それら自体の対応するプロモーターによって促進され得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの発現は、Ｃａｓタンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の発現を促進する同一のプロモーターによって促進され得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質転写産物などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、単一の転写産物内に含まれ得る。例えば、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質転写産物などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の非翻訳領域（ＵＴＲ）内にあってもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、転写産物の５’ＵＴＲ内にあってもよい。他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、転写産物の３’ＵＴＲ内にあってもよい。いくつかの実施形態では、転写産物の細胞内半減期は、その３’ＵＴＲ内にガイドＲＮＡを含み、それによって３’ＵＴＲの長さを短縮することによって低減することができる。さらなる実施形態では、ガイドＲＮＡは、転写産物のイントロン内にあってもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡが転写産物から適切にスプライシング除去されるように、ガイドＲＮＡが内部に位置するイントロンにおいて、好適なスプライス部位が追加され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と側頭の近接した同じベクターからのガイドＲＮＡとの発現は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ複合体のより効率的な形成を促進し得る。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするヌクレオチド配列は、第ＩＸ因子遺伝子を含む構築物を含む同一のベクター上に配置され得る。いくつかの実施形態では、同一のベクター上の第ＩＸ因子遺伝子を含む構築物と、ガイドＲＮＡ（及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤）との近接性は、ガイドＲＮＡ／ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤によって作成される挿入部位への構築物のより効率的な挿入を促進し得る。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ｓｇＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）と、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡとを含み、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのＣａｓタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）と、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡとを含み、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのＣａｓタンパク質であり得る。一実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来である（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡであり得る）をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来の反復配列の全てまたは一部分が隣接するガイド配列を含むか、またはそれらからなる。ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを含むか、またはそれらからなる核酸は、ベクター配列をさらに含み得、ベクター配列は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡと共に自然に見出されない核酸配列を含むか、またはそれらからなる。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、１つのベクター内の非連続核酸によってコードされる。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、連続核酸によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一の核酸の反対側の鎖によってコードされる。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一の核酸の同一の鎖によってコードされる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に開示されるように、第ＩＸ因子をコードする配列を含むドナー構築物（例えば、双方向性核酸構築物）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるドナー構築物（例えば、双方向性核酸構築物）に加えて、ベクターは、本明細書に記載のガイドＲＮＡをコードする核酸、及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）をコードする核酸をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸は、本明細書に開示されるドナー構築物（例えば、双方向性構築物）を含むベクターとは別個のベクター上にそれぞれまたは両方にある。実施形態のうちのいずれかでは、ベクターは、本明細書に記載されるように、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、制御配列を含む他の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ドナー構築物（例えば、双方向性構築物）の第ＩＸ因子の発現を促進しない。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｓｇＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）と、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとを含み、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）であり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）と、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとを含み、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼであり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来である（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡであり得る）をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来の反復配列の全てまたは一部分が隣接するガイド配列を含むか、またはそれらからなる。ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを含むか、またはそれらからなる核酸は、ベクター配列を含み得、ベクター配列は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡと共に自然に見出されない核酸配列を含むか、またはそれらからなる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、環状であってもよい。他の実施形態では、ベクターは、直鎖状であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、脂質ナノ粒子、リポソーム、非脂質ナノ粒子、またはウイルスカプシド内に封入され得る。非限定的な例示的なベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、ミニ染色体、トランスポゾン、ウイルスベクター、及び発現ベクターを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、その野生型の対応物から遺伝子組換えされてもよい。例えば、ウイルスベクターは、クローニングを促進するため、またはベクターの１つ以上の特性を変更するようにするため、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。このような特性は、パッケージング能力、形質導入効率、免疫原性、ゲノム組み込み、複製、転写、及び翻訳を含み得る。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムの一部分は、ウイルスがより大きなサイズを有する外来性配列をパッケージングすることができるように、削除され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、増強した形質導入効率を有し得る。いくつかの実施形態では、宿主におけるウイルスによって誘発される免疫応答は低減され得る。いくつかの実施形態では、宿主ゲノムへのウイルス配列の組み込みを促進するウイルス遺伝子（例えば、インテグレースなど）は、ウイルスが非組み込み性になるように変異され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、複製欠損であってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ベクター上のコード配列の発現を促進する外来性の転写または翻訳の制御配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ヘルパー依存性であってもよい。例えば、ベクターを増幅し、ウイルス粒子にパッケージングするのに必要とされるウイルスの構成要素（例えば、ウイルスタンパク質など）を供給するための１つ以上のヘルパーウイルスを必要とし得る。このような場合、ウイルス構成要素をコードする１つ以上のベクターを含む１つ以上のヘルパー構成要素は、本明細書に記載されるベクター系と共に宿主細胞または宿主細胞集団に導入され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ヘルパーフリーであってもよい。例えば、ウイルスは、ヘルパーウイルスなしでベクターを増幅及びパッケージングすることが可能であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるベクター系はまた、ウイルス増幅及びパッケージングに必要なウイルスの構成要素をコードし得る。
非限定的な例示的なウイルスベクターには、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）ベクター、バクテリオファージＴ４、バキュロウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターが含まれる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであってもよい。
いくつかの実施形態では、「ＡＡＶ」は、全ての血清型、サブタイプ、及び天然に存在するＡＡＶ、ならびに組換えＡＡＶを指す。「ＡＡＶ」は、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用され得る。「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、及びそれらのハイブリッド、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶを含む。ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、ならびに天然末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、及びキャプシドサブユニットの配列は、当該技術分野で既知である。そのような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースに見出され得る。本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源ではない異種配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種の核酸配列）を含むＡＡＶベクターを指し、典型的には、目的の異種ポリペプチドをコードする配列を含む。構築物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、及びそれらのハイブリッド、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶキャプシド配列を含み得る。一般に、異種核酸配列（導入遺伝子）は、少なくとも１つ、及び一般に２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。ＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであってもよい。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスは、非組み込み性であってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、アデノウイルスは、全てのコードウイルス領域が、５’及び３’の末端逆位配列（ＩＴＲ）から離れており、パッケージングシグナル（「Ｉ」）がウイルスから削除されてそのパッケージング能力が増加している、高クローニング能、または「ガットレス」アデノウイルスであってもよい。さらに他の実施形態では、ウイルスベクターは、ＨＳＶ－１ベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ－１に基づいたベクターは、ヘルパー依存性であり、他の実施形態では、それはベクター非依存性である。例えば、パッケージング配列のみを保持するアンプリコンベクターは、パッケージングのために構造的な構成要素を有するヘルパーウイルスを必要とし、一方で、非必須のウイルス機能を除去した３０ｋｂ欠失ＨＳＶ－１ベクターは、ヘルパーウイルスを必要としない。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、バクテリオファージＴ４であってもよい。いくつかの実施形態では、バクテリオファージＴ４は、ウイルスの頭部が空であるとき、任意の直鎖状または環状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子をパッケージングすることができる。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、バキュロウイルスベクターであってもよい。なおもさらなる実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであってもよい。より小さいクローニング能力を有するＡＡＶまたはレンチウイルスベクターを使用する実施形態では、本明細書に開示されるようなベクター系の全ての構成要素を送達するために１つを超えるベクターを使用する必要がある場合がある。例えば、１つのＡＡＶベクターは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする配列を含み得、一方で、第２のＡＡＶベクターは、１つ以上のガイド配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、ベクター系は、細胞内で１つ以上のヌクレアーゼ構成要素の発現を促進することができる場合がある。いくつかの実施形態では、双方向性構築物は、任意にベクター系の一部として、細胞内でコード配列の発現を促進することができるプロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、細胞内に組み込まれると１つ以上のコード配列の発現を促進するプロモーターを含まない（例えば、本明細書で例示されるように、アルブミン遺伝子座のイントロン１で挿入されるときなどに宿主細胞の内因性プロモーターを使用する）。いくつかの実施形態では、細胞は、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物細胞などの真核生物細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、真核生物細胞は、哺乳動物細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、真核生物細胞は、げっ歯類細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、真核生物細胞は、ヒト細胞であってもよい。異なる種類の細胞における発現を促進するための好適なプロモーターは、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、野生型であってもよい。他の実施形態では、プロモーターは、より効率的または効果的な発現のために修飾されてもよい。さらに他の実施形態では、プロモーターは短縮されているが、依然としてその機能を維持し得る。例えば、プロモーターは、ウイルスへのベクターの適切なパッケージングに好適な通常のサイズまたは低減されたサイズを有し得る。
いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ベクターによってコードされるヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクター系は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の１つのコピーを含み得る。他の実施形態において、ベクター系は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の１つを超えるコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写または翻訳の制御配列へと作動可能に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つプロモーターへと作動可能に連結されてもよい。
いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載される異種第ＩＸ因子遺伝子を含む構築物のうちのいずれか１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、第ＩＸ因子遺伝子は、少なくとも１つの転写または翻訳の制御配列へと作動可能に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、第ＩＸ因子遺伝子は、少なくとも１つのプロモーターへと作動可能に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、第ＩＸ因子遺伝子は、異種遺伝子の発現を促進するプロモーターに連結されない。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的、誘導性、または組織特異的であってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターであってもよい。非限定的な例示的な構成的プロモーターには、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期（ＭＬＰ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリゼリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、それらの機能性断片、または先行するもののいずれかの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、短縮型ＣＭＶプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＥＦ１ａプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。非限定的な例示的な誘導性プロモーターは、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって誘導可能なものを含む。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、Ｔｅｔ－Ｏｎ（登録商標）プロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの、低い基底（非誘導）発現レベルを有するものであってよい。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、肝臓内での発現に特異的なプロモーターであってもよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、ベクター系を含む。いくつかの実施形態では、ベクター系は、１つの単一のベクターを含み得る。他の実施形態では、ベクター系は、２つのベクターを含み得る。さらなる実施形態では、ベクター系は、３つのベクターを含み得る。異なるガイドＲＮＡが多重化のために使用されるとき、またはガイドＲＮＡの複数のコピーが使用されるとき、ベクター系は、３つを超えるベクターを含み得る。
いくつかの実施形態では、ベクター系は、それが標的細胞に送達した後にのみ発現を開始するために、誘導性プロモーターを含み得る。非限定的な例示的な誘導性プロモーターは、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって誘導可能なものを含む。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、Ｔｅｔ－Ｏｎ（登録商標）プロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの、低い基底（非誘導）発現レベルを有するものであってよい。
さらなる実施形態では、ベクター系は、それが特異的な組織に送達した後にのみ発現を開始するために、組織特異的プロモーターを含み得る。
ガイドＲＮＡ、ＲＮＡ結合ＤＮＡ結合剤、または第ＩＸ因子をコードする配列を含むドナー構築物を含むベクターは、個別にまたは任意の組み合わせで、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、または微小胞によって送達され得る。ベクターはまた、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって送達され得る。１つ以上のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ結合ＤＮＡ結合剤（例えば、ｍＲＮＡ）、または異種タンパク質をコードする配列を含むドナー構築物は、個別にまたは任意の組み合わせで、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、または微小胞によって送達され得る。１つ以上のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ結合ＤＮＡ結合剤（例えば、ｍＲＮＡ）、または異種タンパク質をコードする配列を含むドナー構築物は、個別にまたは任意の組み合わせで、ＬＮＰによって送達され得る。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ヌクレオチド及びタンパク質カーゴの送達のための周知の手段であり、本明細書に開示されるガイドＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び／またはドナー構築物（例えば、双方向性構築物）のうちのいずれかの送達に使用され得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、組成物を核酸（例えば、ＤＮＡもしくはｍＲＮＡ）、またはタンパク質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）、または適切な場合タンパク質と共に核酸の形態で送達する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ及び／または本明細書に開示されるドナー構築物（例えば、双方向性構築物）のうちのいずれかを、単独でまたは組み合わせて、宿主細胞もしくは宿主細胞集団または対象に送達する方法が本明細書に提供され、構成要素のうちのいずれか１つ以上は、ＬＮＰと会合する。いくつかの実施形態では、方法は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードする配列）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ及び／または本明細書に開示されるドナー構築物（例えば、双方向性構築物）のうちのいずれかを、単独または組み合わせて、ＬＮＰと共に含む組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードする配列）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、陽イオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート）とも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート、または別のイオン性脂質を含む。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５３５５９（２０１８年９月２８日出願）、ＷＯ／２０１７／１７３０５４、ＷＯ２０１５／０９５３４０、及びＷＯ２０１４／１３６０８６の脂質、ならびにそこに提供される参照文献を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約４．５、５．０、５．５、６．０、または６．５の陽イオン性脂質アミン対ＲＮＡホスフェートのモル比（Ｎ：Ｐ）を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ脂質の文脈において、陽イオン性及びイオン化可能という用語は、互換的であり、例えば、イオン性脂質は、ｐＨに応じて陽イオン性である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性構築物と会合するＬＮＰは、疾患または障害を治療するための医薬品の調製において使用するためのものである。疾患または障害は、血友病Ｂなどの第ＩＸ因子欠乏症であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び／または本明細書に開示されるドナー構築物（例えば、双方向性構築物）のうちのいずれかは、単独でまたは組み合わせて、裸でまたはベクターの一部として、脂質ナノ粒子に製剤化されるか、または脂質ナノ粒子を介して投与され、例えば、ＷＯ／２０１７／１７３０５４を参照されたく、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ成分及び脂質成分を含むＬＮＰ組成物が包含され、脂質成分は、生分解性イオン性脂質などのアミン脂質を含む。いくつかの例では、脂質成分は、生分解性、イオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ－ＤＭＧを含む。
本明細書に開示されるガイドＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸）、及び第ＩＸ因子をコードする配列を含むドナー構築物（例えば、双方向性構築物）は、同じまたは異なる系を使用して送達され得ることが明らかであろう。例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓヌクレアーゼ、及び構築物は、同じベクター（例えば、ＡＡＶ）によって担持され得る。あるいは、Ｃａｓヌクレアーゼ（タンパク質またはｍＲＮＡとして）及び／またはｇＲＮＡは、プラスミドまたはＬＮＰによって担持され得、一方、ドナー構築物は、ＡＡＶなどのベクターによって担持され得る。さらに、異なる送達系は、同じまたは異なる経路によって（例えば、注入によって、筋肉内注射、尾静脈注射、または他の静脈内注射など注射によって、腹腔内投与及び／または筋肉内注射によって）投与され得る。
異なる送達系は、インビトロまたはインビボで、同時にまたは任意の逐次的順序で送達することができる。いくつかの実施形態では、ドナー構築物、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓヌクレアーゼは、インビトロまたはインビボで、同時に、例えば、１つのベクター、２つのベクター、個々のベクター、１つのＬＮＰ、２つのＬＮＰ、個々のＬＮＰ、またはそれらの組み合わせで送達され得る。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、ガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓヌクレアーゼをベクターとして及び／または単独でＬＮＰと会合してまたは合わせてリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）として送達する（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日以上）前に、ベクターとして及び／またはＬＮＰと会合してインビボまたはインビトロで送達され得る。さらなる例として、ガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼは、ベクターとして、及び／または単独でＬＮＰと会合してまたは合わせてリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）として、構築物をベクターとして及び／またはＬＮＰと会合して送達する（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日以上）前に、インビボまたはインビトロで送達され得る。
いくつかの実施形態では、本開示はまた、本明細書に開示されるガイドＲＮＡのうちのいずれかを投与するための医薬製剤も提供する。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、本明細書に開示されるように、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）と、治療用異種遺伝子のコード配列を含むドナー構築物とを含む。対象（例えば、ヒト対象）への送達に好適な医薬製剤は、当該技術分野で周知である。
ＩＶ．使用方法
本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、インビボまたはインビトロで、第ＩＸ因子核酸を宿主細胞または宿主細胞集団に導入するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、宿主細胞もしくは宿主細胞集団、またはそれを必要とする対象において第ＩＸ因子を発現するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、血友病（例えば、血友病Ｂ）を治療することを必要とする対象においてそれを治療するのに有用である。本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤のうちのいずれか１つ以上の投与は、第ＩＸ因子タンパク質レベル及び／または第ＩＸ因子活性レベル、例えば、循環、血清、または血漿レベルを増加させる。いくつかの実施形態では、治療の実効性は、血清または血漿第ＩＸ因子活性を測定することによって評価され得、対象の第ＩＸ因子の血漿レベル及び／または活性の増加は、治療の実効性を示す。いくつかの実施形態では、治療の実効性は、血清もしくは血漿第ＩＸ因子タンパク質及び／または活性レベルを測定することによって評価され得、対象の第ＩＸ因子の血漿レベル及び／または活性の増加は、治療の実効性を示す。いくつかの実施形態では、治療の実効性は、ａＰＴＴアッセイにおける凝固機能及び／またはＴＧＡ－ＥＡアッセイにおけるトロンビン生成を評価することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、治療の実効性は、第ＩＸ因子のレベルを評価することによって決定され得、例えば、循環第ＩＸ因子のレベルは、凝固及び／または免疫学的アッセイ、例えば、サンドイッチ免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（例えば、実施例１３を参照されたい）、ＭＳＤ（例えば、実施例１４を参照されたい）によって測定され得る。
正常または健康な個体において、第ＩＸ因子活性及び抗原レベルは、成人ヒト血漿からのその精製に基づいて、約３～５μｇ／ｍｌである正常プール血漿の５０～１６０％変化する。Ａｍｉｒａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３０（９），１５１２－１６，１９８４の表２、またＯｓｔｅｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，１９７８も参照されたい。第ＩＸ因子活性及び／または抗原レベルの正常血漿レベルの５０％未満を有する個体は、血友病を有するとして分類される。特に、約１％未満の活性因子を有する個体は、重度の血友病を有するとして分類され、一方、約１～５％の活性因子を有する個体は、中等度の血友病を有するとして分類される。軽度の血友病を有する個体は、活性凝固因子の正常レベルの約６～４９％を有する。いくつかの実施形態では、循環因子ＩＸのレベルは、凝固及び／または免疫学的アッセイによって測定することができ、これらの方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓｉｍｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ，ＮＥＪＭ ２００９、Ａｄｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｅｓｏｔｅｒｉｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，２００６）。ｈＦＩＸタンパク質を検出するための免疫学的方法、及び機能亢進型ｈＦＩＸバリアントの第ＩＸ因子活性を機能的に正規化する方法は、実施例１３に見出される。いくつかの実施形態では、第ＩＸ因子、例えば、循環第ＩＸ因子は、凝固及び／または免疫学的アッセイ、例えば、サンドイッチ免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（例えば、実施例１３を参照されたい）、ＭＳＤ（例えば、実施例１４を参照されたい）によって測定され得る。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法は、血友病を有する対象における第ＩＸ因子の血漿レベルまたは第ＩＸ因子活性レベルを、正常レベルの約２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％以上に増加させるのに有用である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法は、第ＩＸ因子活性及び／またはレベルを増加、例えば、循環ＦＩＸタンパク質レベルを約０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、または４μｇ／ｍｌに増加させるのに有用である。ＦＩＸタンパク質レベルは、約１５０μｇ／ｍｌまたはそれを超えるμｇ／ｍｌを達し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法は、第ＩＸ因子タンパク質レベルを約４μｇ／ｍｌに増加させるのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法は、第ＩＸ因子タンパク質レベルを約４μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ～６μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ～８μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ以上に増加させるのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法は、第ＩＸ因子タンパク質レベルを約０．１μｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約６μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約６μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌ、または約３μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌに増加させるのに有用である。例えば、本明細書に開示される組成物及び方法は、血友病を有する対象において第ＩＸ因子の血漿レベルを、約６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０μｇ／ｍｌ以上に増加させるのに有用である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法は、血友病を有する対象における第ＩＸ因子活性及び／またはレベルの血漿レベルを、投与前の対象の第ＩＸ因子の血漿レベル及び／または活性と比較して、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％以上増加させるのに有用である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び／方法は、宿主細胞または宿主細胞集団における第ＩＸ因子タンパク質及び／または第ＩＸ因子活性を、宿主細胞または宿主細胞集団への投与前の第ＩＸ因子レベル及び／または活性、例えば、正常レベルと比較して、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％以上増加させるのに有用である。いくつかの実施形態では、細胞は、肝臓細胞または肝臓細胞集団である。いくつかの実施形態では、肝臓細胞は、肝細胞であるか、または肝臓細胞集団は、肝細胞である。
いくつかの実施形態では、方法は、ガイドＲＮＡ及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなど）をＬＮＰで投与することを含む。さらなる実施形態では、方法は、双方向性ＦＩＸ構築物などの第ＩＸ因子タンパク質をコードするＡＡＶ核酸構築物を投与することを含む。ガイドＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＬＮＰを静脈内投与することができる。ＡＡＶ ＦＩＸドナー構築物を静脈内投与することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＬＮＰの例示的な投与は、約０．１、０．２５、０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、８、または１０ｍｐｋ（ＲＮＡ）を含む。ｍｇ／ｋｇ及びｍｐｋという単位は、本明細書で互換的に使用されている。ＦＩＸタンパク質をコードする核酸を含むＡＡＶの例示的な投与は、約１０１１、１０１２、１０１３、及び１０１４ｖｇ／ｋｇのＭＯＩを含み、任意に、ＭＯＩは、約１×１０１３～１×１０１４ｖｇ／ｋｇであり得る。
いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量の第ＩＸ因子タンパク質を発現することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、個体において治療有効レベルの循環第ＩＸ因子凝固活性を達成することを含む。特定の実施形態では、方法は、正常の少なくとも約５％～約５０％の第ＩＸ因子活性を達成することを含む。方法は、正常の少なくとも約５０％～約１５０％の第ＩＸ因子活性を達成することを含み得る。ある特定の実施形態では、方法は、患者のベースライン第ＩＸ因子活性を上回る、正常な第ＩＸ因子活性の少なくとも約１％～約５０％、または正常な第ＩＸ因子活性の少なくとも約５％～約５０％、または正常な第ＩＸ因子活性の少なくとも約５０％～約１５０％の第ＩＸ因子活性の増加を達成することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、長期的な効果、例えば、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年、または２年の効果を達成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、長期的かつ持続的な様式で、例えば、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年、または２年の効果で治療効果を達成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、循環第ＩＸ因子活性及び／またはレベルのレベルは、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年以上安定する。いくつかの実施形態では、ＦＩＸタンパク質の定常状態活性及び／またはレベルは、少なくとも７日、少なくとも１４日、または少なくとも２８日までに達成される。さらなる実施形態では、方法は、単回投与後、少なくとも１、２、４、もしくは６ヶ月、または少なくとも１、２、３、４、もしくは５年間、第ＩＸ因子活性及び／またはレベルを維持することを含む。
アルブミン遺伝子座への挿入を伴うさらなる実施形態では、個体の循環アルブミンレベルは、正常である。方法は、個体の循環アルブミンレベルを、正常な循環アルブミンレベルの±５％、±１０％、±１５％、±２０％、または±５０％以内に維持することを含み得る。ある特定の実施形態では、個体のアルブミンレベルは、少なくとも４週目、８週目、１２週目、または２０週目までに、未治療の個体のアルブミンレベルと比較して変化していない。ある特定の実施形態では、個体のアルブミンレベルは、一時的に低下し、次いで、正常レベルに戻る。特に、方法は、血漿アルブミンのレベルにおける有意な変化を検出しないことを含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）のうちのいずれか１つ以上を、宿主細胞または宿主細胞集団に投与または送達することを含む、ヒトアルブミン遺伝子などのアルブミン遺伝子を修飾する（例えば、二本鎖切断を作成する）方法または使用を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）のうちのいずれか１つ以上を、宿主細胞または宿主細胞集団に投与または送達することを含む、ヒトアルブミンイントロン１などのアルブミンイントロン１領域を修飾する（例えば、二本鎖切断を作成する）方法または使用を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）のうちのいずれか１つ以上を、宿主細胞または宿主細胞集団に投与または送達することを含む、肝組織または肝細胞宿主細胞などのヒトセーフハーバーを修飾する（例えば、二本鎖切断を作成する）方法または使用を含む。アルブミン遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座内への挿入は、肝細胞または肝臓細胞などの宿主細胞または細胞集団に著しい有害な影響を与えることなく、第ＩＸ因子遺伝子の過剰発現を可能にする。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）のうちのいずれか１つ以上を、宿主細胞または宿主細胞集団に投与または送達することを含む、ヒトアルブミン遺伝子座のイントロン１を修飾する（例えば、二本鎖切断を作成する）方法または使用を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ヒトアルブミン遺伝子座（配列番号１）のイントロン１内で結合する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含むガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～３７、４２～４９、５３～５９、６１～６９、７４～８１、８５～９１、及び９３～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～３７、４２～４９、５３～５９、６１～６９、７４～８１、８５～９１、及び９３～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、方法は、インビトロで行われる。いくつかの実施形態では、方法は、インビボで行われる。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、肝臓細胞などである。さらなる実施形態では、肝臓細胞は、肝細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）のうちのいずれか１つ以上を投与または送達することを含む、第ＩＸ因子核酸を宿主細胞または宿主細胞集団に導入する方法または使用を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ヒトアルブミン遺伝子座（配列番号１）のイントロン１内の領域に結合することができる少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含むガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～３７、４２～４９、５３～５９、６１～６９、７４～８１、８５～９１、及び９３～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～３７、４２～４９、５３～５９、６１～６９、７４～８１、８５～９１、及び９３～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、方法は、インビトロである。いくつかの実施形態では、方法は、インビボである。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、肝臓細胞であるか、または宿主細胞集団は、肝細胞などの肝臓細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）のうちのいずれか１つ以上を投与または送達することを含む、宿主細胞または宿主細胞集団において第ＩＸ因子を発現する方法または使用を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ヒトアルブミン遺伝子座（配列番号１）のイントロン１内の領域に結合することができる少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含むガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～３７、４２～４９、５３～５９、６１～６９、７４～８１、８５～９１、及び９３～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～３７、４２～４９、５３～５９、６１～６９、７４～８１、８５～９１、及び９３～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、方法は、インビトロである。いくつかの実施形態では、方法は、インビボである。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、肝臓細胞であるか、または宿主細胞集団は、肝細胞などの肝臓細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）のうちのいずれか１つ以上を、それを必要とする対象に投与または送達することを含む、血友病（例えば、血友病Ｂ）を治療する方法または使用を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ヒトアルブミン遺伝子座（配列番号１）のイントロン１内の領域に結合することができる少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含むガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～３７、４２～４９、５３～５９、６１～６９、７４～８１、８５～９１、及び９３～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～３７、４２～４９、５３～５９、６１～６９、７４～８１、８５～９１、及び９３～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、肝臓細胞であるか、または宿主細胞集団は、肝細胞などの肝臓細胞である。
本明細書に記載されるように、第ＩＸ因子をコードする配列を含むドナー構築物（例えば、双方向性構築物）、ガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、当該技術分野で既知の任意の好適な送達系及び方法を使用して送達され得る。組成物は、インビトロまたはインビボで、同時にまたは任意の逐次的順序で送達することができる。いくつかの実施形態では、ドナー構築物、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓヌクレアーゼは、インビトロまたはインビボで、同時に、例えば、１つのベクター、２つのベクター、個々のベクター、１つのＬＮＰ、２つのＬＮＰ、個々のＬＮＰ、またはそれらの組み合わせで送達され得る。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、ガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓヌクレアーゼをベクターとして及び／または単独でＬＮＰと会合してまたは合わせてリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）として送達する（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日以上）前に、ベクターとして及び／またはＬＮＰと会合してインビボまたはインビトロで送達され得る。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、例えば、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、毎週、２週間毎、３週間毎、または４週間毎に、複数回投与で送達され得る。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、例えば、１週目、２週目、及び３週目などの１週間間隔で送達され得る。さらなる例として、ガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼは、ベクターとして、及び／または単独でＬＮＰと会合してまたは合わせてリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）として、構築物をベクターとして及び／またはＬＮＰと会合して送達する前（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日以上）に、インビボまたはインビトロで送達され得る。いくつかの実施形態では、アルブミンガイドＲＮＡは、例えば、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、毎週、２週間毎、３週間毎、または４週間毎に、複数の投与で送達され得る。いくつかの実施形態では、アルブミンガイドＲＮＡは、例えば、１週目、２週目、及び３週目などの１週間間隔で送達され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、複数回投与で送達され得、例えば、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、毎週、２週間毎、３週間毎、または４週間毎に送達され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、例えば、１週目、２週目、及び３週目などの１週間間隔で送達され得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼは、ＬＮＰと会合し、第ＩＸ因子ドナー構築物を送達する前に宿主細胞または宿主細胞集団に送達される。
いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、第ＩＸ因子をコードする配列を含み、第ＩＸ因子配列は、野生型第ＩＸ因子、例えば、配列番号７００である。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、第ＩＸ因子をコードする配列を含み、第ＩＸ因子配列は、野生型第ＩＸ因子、例えば、配列番号７０１である。いくつかの実施形態では、配列は、第ＩＸ因子のバリアントをコードする。例えば、バリアントは、野生型第ＩＸ因子よりも増加した凝固活性を有する。例えば、バリアント第ＩＸ因子は、配列番号７０１に対してＲ３３８位（例えばＲ３３８Ｌ）にアミノ酸置換などの１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、配列は、配列番号７００、配列番号７０１、または配列番号７０２と８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％同一であり、野生型第ＩＸ因子と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％以上の活性を有する第ＩＸ因子バリアントをコードする。いくつかの実施形態では、配列は、第ＩＸ因子の断片をコードし、断片は、野生型第ＩＸ因子と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％以上の活性を有する。
一例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位及びＶ１８１位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位及びＫ２６５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位及びＫ２６５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｋ２６５位及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｋ２６５位及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｉ３８３位及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｖ１８１位、及びＫ２６５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｖ１８１位、及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｖ１８１位、及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｋ２６５位、及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｋ２６５位、及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｉ３８３位、及びＥ１８６位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位、Ｉ３８３位、及びＥ１８６位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｋ２６５位、Ｉ３８３位、及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｖ１８１位、Ｉ３８３位、及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｋ２６５位、Ｉ３８３位、及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、Ｉ３８３位、及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。
いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、第ＩＸ因子バリアントをコードする配列を含み、第ＩＸ因子バリアントは、その補因子である第ＶＩＩＩ因子の不在下で凝固を活性化する（発現は治療的に関係のあるＦＶＩＩＩ模倣活性をもたらす）。そのような第ＩＸ因子バリアントは、野生型第ＩＸ因子の活性をさらに維持することができる。例えば、そのような第ＩＸ因子バリアントは、野生型第ＩＸ因子に対して（例えば、配列番号７０１に対して）Ｌ６位、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、Ｉ３８３位、Ｅ１８５位、またはそれらの組み合わせにアミノ酸置換基を含み得る。例えば、そのような第ＩＸ因子バリアントは、野生型第ＩＸ因子に対して（例えば、配列番号７０１に対して）Ｌ６Ｆ変異、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、Ｅ１８５Ｄ変異、またはそれらの組み合わせを含み得る。
特定の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。別の特定の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、Ｉ３８３位、及びＥ１８５位にアミノ酸置換を含み得る。別の特定の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６位、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、及びＩ３８３位にアミノ酸置換を含み得る。
一例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異及びＶ１８１Ｉ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異及びＫ２６５Ａ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異及びＫ２６５Ａ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｋ２６５Ａ変異及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｋ２６５Ａ変異及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｉ３８３Ｖ変異及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｖ１８１Ｉ変異、及びＫ２６５Ａ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｖ１８１Ｉ変異、及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｖ１８１Ｉ変異、及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｋ２６５Ａ変異、及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｋ２６５Ａ変異、及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、及びＥ１８６Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、及びＥ１８６Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｋ２６５Ａ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｋ２６５Ａ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。別の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。
特定の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。別の特定の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、及びＥ１８５Ｄ変異を含み得る。いくつかの実施形態では、第ＩＸ因子タンパク質は、配列番号７００と少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％同一であり、野生型第ＩＸ因子と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％、またはそれ以上の活性を有する。ある特定の実施形態では、第ＩＸ因子バリアントは、配列番号７００と８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％同一であり、野生型第ＩＸ因子と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％、またはそれ以上の活性を有し、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、及び／またはＥ１８５Ｄ変異を含む。別の特定の例では、第ＩＸ因子タンパク質は、Ｌ６Ｆ変異、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、及びＩ３８３Ｖ変異を含み得る。ある特定の実施形態では、第ＩＸ因子バリアントは、配列番号７００と少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％同一であり、野生型第ＩＸ因子と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％、またはそれ以上の活性を有し、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、及びＩ３８３Ｖ変異を含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、肝臓細胞であるか、または宿主細胞集団は、肝臓細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞、または宿主細胞集団は、任意の好適な非分裂細胞である。本明細書で使用される場合、「非分裂細胞」は、末端分化され、分裂しない細胞、ならびに分裂しないが、細胞分裂及び増殖に再び入る能力を保持する静止細胞を指す。例えば、肝臓細胞は、（例えば、傷害または切除されたときに）分裂する能力を保持するが、典型的には分裂しない。有糸分裂細胞分裂中、相同組換えは、ゲノムが保護され、二本鎖切断が修復される機序である。いくつかの実施形態では、「非分裂」細胞は、相同組換え（ＨＲ）が、例えば、対照分裂細胞と比較して、細胞内で二本鎖ＤＮＡ切断が修復される一次機序ではない細胞を指す。いくつかの実施形態では、「非分裂」細胞は、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）が、例えば、対照分裂細胞と比較して、細胞内で二本鎖ＤＮＡ切断が修復される一次機序である細胞を指す。非分裂細胞型は、文献に記載されており、例えば、活性ＮＨＥＪ二本鎖ＤＮＡ切断修復機序により記載されている。例えば、Ｉｙａｍａ，ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ．）２０１３，１２（８）：６２０－６３６を参照されたい。いくつかの実施形態では、宿主細胞には、限定されないが、肝臓細胞、筋肉細胞、またはニューロン細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞、または宿主細胞集団は、マウス、カニクイザル、またはヒト肝細胞などの肝細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、マウス、カニクイザル、またはヒト筋細胞などの筋細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の１つ以上のガイドＲＮＡを、単独でまたはＲＮＡガイドＤＮＡ結合タンパク質と組み合わせて含む宿主細胞組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるベクターのうちのいずれか１つ以上を含む宿主細胞組成物が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、ドナー構築物（例えば、双方向性構築物）は、ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ８などの核酸ベクター中で投与される。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、相同性アームを含まない。
いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ウシ、ブタ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコ、魚、または家禽である。
いくつかの実施形態では、第ＩＸ因子をコードする配列を含むドナー構築物（例えば、双方向性構築物）、ガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、第ＩＸ因子をコードする配列を含むドナー構築物（例えば、双方向性構築物）、ガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、肝循環へと投与される。
いくつかの実施形態では、第ＩＸ因子をコードする配列を含むドナー構築物（例えば、双方向性構築物）、ガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の単回投与は、第ＩＸ因子の発現を望ましいレベルに増加させるのに十分である。他の実施形態では、第ＩＸ因子をコードする配列を含むドナー構築物（例えば、双方向性構築物）、ガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を含む組成物の１回を超える投与は、治療効果を最大化するのに有益であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、上述のように、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）のうちのいずれか１つ以上を、血友病を治療するのに好適な追加の療法と共に含む併用療法を含む。例えば、本開示の方法は、他の止血剤、血液因子、及び薬剤の使用と組み合わせることができる。例えば、対象は、治療有効量の、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、高分子量キニノゲン（ＨＭＷＫ）、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、及びフォンウィルブランド因子からなる群から選択される１つ以上の因子を投与され得る。
いくつかの実施形態では、治療は、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、及び第ＶＩＩＩａ因子、プレカレクレイン、ならびに高分子量キニノゲンを含む、内因性凝固経路の活性化因子、または組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、及び第Ｘａ因子を含む、外因性凝固経路の活性化因子などの凝固促進剤を投与することをさらに含み得る。この説明及び例示的な実施形態は、限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書及び添付の実施形態の目的について、特に明記しない限り、本明細書及び実施形態で使用される量、パーセンテージ、または割合、及び他の数値を表す全ての数字は、どの場合においても「約」という用語によって、まだそれほど修飾されていない程度まで修飾されていると理解されるべきである。したがって、そうでないことが示されない限り、以下の明細書及び添付の実施形態に示される数値パラメータは、得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。非常に少なくとも、及び均等論の適用を実施形態の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数を考慮して、通常の丸め手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
ヒト第ＩＸ因子タンパク質配列（配列番号７００）ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿０００１２４：
Figure 2022512731000014
Figure 2022512731000015
ヒト第ＩＸ因子ヌクレオチド配列（配列番号７０６）ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿０００１３３）：
Figure 2022512731000016
ヒト第ＩＸ因子ポリペプチド（配列番号７０１）
Figure 2022512731000017
Figure 2022512731000018
以下の実施例は、ある特定の開示された実施形態を例示するために提供され、本開示の範囲を決して限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１－材料及び方法
クローニング及びプラスミド調製
ＩＴＲに隣接する双方向性挿入構築物を合成し、商業的ベンダーによってｐＵＣ５７－Ｋａｎにクローニングした。得られた構築物（Ｐ００１４７）を、他のベクターの親クローニングベクターとして使用した。他の挿入構築物（ＩＴＲを含まない）も商業的に合成し、ｐＵＣ５７にクローニングした。精製したプラスミドをＢｇｌＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｒ０１４４Ｓ）で消化し、挿入構築物を親ベクターにクローニングした。プラスミドをＳｔｂｌ３（商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ７３７３０３）中で増殖させた。
ＡＡＶ生成
ＨＥＫ２９３細胞におけるトリプルトランスフェクションを使用して、ＡＡＶ８及びＡＡＶ－ＤＪ生成のための目的の構築物と共にゲノムをパッケージングし、得られたベクターを、イオジキサノール勾配超遠心分離法により溶解細胞及び培養培地の両方から精製した（例えば、Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｏｃｔ；２１（１０）：１２５９－７１を参照されたい）。目的の構築物を有するゲノムを含んだトリプルトランスフェクションで使用されるプラスミドは、実施例において「ＰＸＸＸＸ」数で参照され、例えば、表９も参照されたい。単離したＡＡＶを貯蔵緩衝液（０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含むＰＢＳ）中で透析した。ＩＴＲ領域内に位置するプライマー／プローブを使用して、ｑＰＣＲによってＡＡＶ力価を決定した。
ヌクレアーゼｍＲＮＡのインビトロ転写（「ＩＶＴ」）
Ｎ１－メチルプソイド－Ｕを含むキャップされたポリアデニル化Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（「Ｓｐｙ」）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、直鎖状化プラスミドＤＮＡテンプレート及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロ転写によって生成した。一般に、Ｔ７プロモーター及び１００ｎｔポリ（Ａ／Ｔ）領域を含むプラスミドＤＮＡを、３７℃でＸｂａＩと共にインキュベートし、消化を完了させ、続いて、６５℃でＸｂａＩの熱不活性化を完了させることによって直鎖状化した。直鎖状化プラスミドを、酵素及び緩衝塩から精製した。Ｃａｓ９修飾ｍＲＮＡを生成するためのＩＶＴ反応物を、３７℃で４時間、以下の条件でインキュベートした：５０ｎｇ／μＬの直鎖状化プラスミド、各２ｍＭのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＮ１－メチルシュードＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、１０ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１Ｕ／μＬのマウスＲｎａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、０．００４Ｕ／μＬの無機Ｅ．ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）、ならびに１倍反応緩衝液。ＴＵＲＢＯ Ｄｎａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、最終濃度が０．０１Ｕ／μＬになるように添加し、反応物をさらに３０分間インキュベートしてＤＮＡテンプレートを除去した。ＭｅｇａＣｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキットを使用し、製造者のプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に従って、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを精製した。あるいは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをＬｉＣｌ沈殿、酢酸アンモニウム沈殿、及び酢酸ナトリウム沈殿を使用して、またはＬｉＣｌ沈殿法を使用して精製し、続いて、タンジェント流濾過によりさらなる精製を行った。転写物濃度を、２６０ｎｍでの光吸光度を測定することによって決定し（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、転写物をＢｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動によって分析した。
以下のＣａｓ９ ｍＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＯＲＦ配列番号７０３もしくは配列番号７０４、またはＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５３４２３（参照により本明細書に組み込まれる）の表２４の配列を含む。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡの送達のための脂質製剤
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート）とも呼ばれる、イオン性脂質（（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む脂質製剤を利用して、細胞及び動物に送達した。
予め混合された脂質製剤（本明細書では「脂質パケット」と称される）を利用する実験について、本明細書にさらに記載されるように、構成要素を、約６．０の脂質アミン対ＲＮＡリンホスフェート（Ｎ：Ｐ）モル比でＲＮＡカーゴ（例えばＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ）と混合される前に、５０：３８：９：３のイオン性脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧのモル比で１００％エタノール中で再構成した。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化された構成要素を利用する実験について、構成要素を、様々なモル比で、１００％エタノール中に希釈した。ＲＮＡカーゴ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ）を２５ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）に溶解して、約０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴ濃度を得た。
実施例２に記載される実験について、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用し、製造者のプロトコルに従って、脂質及びＲＮＡ溶液をマイクロ流体混合することによって、ＬＮＰを形成した。差動流量を使用して、混合中、水性溶媒対有機溶媒の２：１の比を維持した。混合後、ＬＮＰを収集し、水中に希釈し（約１：１ｖ／ｖ）、室温で１時間保持し、さらに水で希釈した（約１：１ｖ／ｖ）後、最終緩衝液交換を行った。５０ｍＭのＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）への最終緩衝液交換を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いて完了した。必要な場合、Ａｍｉｃｏｎ １００ｋＤａ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で遠心分離することによって、製剤を濃縮した。次いで、得られた混合物を０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。最終ＬＮＰを、さらなる使用まで－８０℃で保存した。ＬＮＰを、約４．５の脂質アミン対ＲＮＡホスフェート（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：１のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で、４５：４４：９：２のイオン性脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧのモル比で製剤化した。
他の実施例に記載される実験について、クロスフロー技術を使用し、エタノール中の脂質を２体積のＲＮＡ溶液及び１体積の水と衝突噴流混合することによって、ＬＮＰを調製した。エタノール中の脂質を、混合交差部（ｍｉｘｉｎｇ ｃｒｏｓｓ）により、２体積のＲＮＡ溶液と混合した。第４の水の流れを、ライン内のティーを通る交差部の出口流と混合した（ＷＯ２０１６０１０８４０の図２を参照されたい）。ＬＮＰを室温で１時間保持し、さらに水で希釈した（約１：１ｖ／ｖ）。希釈したＬＮＰを、フラットシートカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１００ｋＤ ＭＷＣＯ）上でタンジェント流濾過を使用して濃縮し、次いで、透析濾過により、５０ｍＭのＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）へと緩衝液交換した。あるいは、ＴＳＳへの最終緩衝液交換をＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いて完了した。必要な場合、Ａｍｉｃｏｎ １００ｋＤａ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で遠心分離することによって、製剤を濃縮した。次いで、得られた混合物を０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。最終ＬＮＰを、さらなる使用まで４℃または－８０℃で保存した。ＬＮＰを、約６．０の脂質アミン対ＲＮＡホスフェート（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：１のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で、５０：３８：９：３のイオン性脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧのモル比で製剤化した。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及び挿入構築物の細胞培養及びインビトロ送達
Ｈｅｐａ１－６細胞
Ｈｅｐａ１－６細胞を、９６ウェルプレート中に１０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間後、細胞をＬＮＰ及びＡＡＶで処理した。処理前に、培地をウェルから吸引した。ＬＮＰを、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、さらに、１０％ＦＢＳ（ＤＭＥＭ中）中で２ｎｇ／ｕｌに希釈し、３７℃で１０分間（５％ＦＢＳの最終濃度で）インキュベートした。ＡＡＶの標的ＭＯＩは１ｅ６であり、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地中で希釈した。２ｎｇ／ｕｌで５０μｌの上記希釈ＬＮＰを細胞に添加し（合計１００ｎｇのＲＮＡカーゴを送達する）、続いて、５０μｌのＡＡＶを添加した。ＬＮＰ及びＡＡＶの処理は、数分間隔であった。細胞中の培地の総体積は１００μｌであった。処理後７２時間及び処理後３０日後、これらの処理した細胞からの上清を、以下に記載されるように、ヒトＦＩＸ ＥＬＩＳＡ分析のために収集した。
初代肝細胞
初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）、初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）、及び初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を解凍し、追加物質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む肝細胞解凍培地に再懸濁させ、続いて、遠心分離した。上清を廃棄し、ペレット化細胞を肝細胞播種培地及びサプリメントパック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に再懸濁した。細胞を計数し、ＰＨＨについては３３，０００細胞／ウェル、ＰＣＨについては５０，０００細胞／ウェル、及びＰＭＨについては１５，０００細胞／ウェルの密度でＢｉｏ－ｃｏａｔ ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉでコーティングした９６ウェルプレート上に播種した。播種した細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２雰囲気での組織培養インキュベーター中で５時間放置し、接着させた。インキュベーション後、細胞を単層形成について調べ、肝細胞維持で３回洗浄し、３７℃でインキュベートした。
脂質パケット送達を利用する実験では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを各々、維持培地中で２ｍｇ／ｍｌに別々に希釈し、各々の２．９μｌを、１２．５μｌの５０ｍＭクエン酸ナトリウム、２００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ５）、及び６．９μｌの水を含むウェル（９６ウェルのＥｐｐｅｎｄｏｒｆプレート中）に添加した。次いで、１２．５μｌの脂質パケット製剤、続いて１２．５μｌの水、及び１５０μｌのＴＳＳを添加した。各ウェルを、肝細胞維持培地を使用して２０ｎｇ／μｌ（総ＲＮＡ含有量に関して）に希釈し、次いで、６％の新鮮なマウス血清で１０ｎｇ／μｌ（総ＲＮＡ含有量に関して）に希釈した。培地をトランスフェクションの前に細胞から吸引し、４０μｌの脂質パケット／ＲＮＡ混合物を細胞に添加し、続いて、ＡＡＶ（維持培地中で希釈した）を１ｅ５のＭＯＩで添加した。培地を、本明細書に記載されるように、分析のために処理後７２時間に収集し、細胞をさらなる分析のために採取した。
ルシフェラーゼアッセイ
細胞培地におけるＮａｎｏＬｕｃ検出を伴う実験では、１体積のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質を、５０体積のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液と組み合わせた。試料の１：１０希釈（５０μｌの試薬＋４０μｌの水＋１０μｌの細胞培地）を使用して、０．５秒の積分時間でＰｒｏｍｅｇａ Ｇｌｏｍａｘランナー上でアッセイを実行した。
細胞培地中のＨｉＢｉｔタグの検出を伴う実験では、ＬｇＢｉＴタンパク質及びＮａｎｏ－ＧｌｏＲ ＨｉＢｉＴ細胞外基質を、室温のＮａｎｏ－ＧｌｏＲ ＨｉＢｉＴ細胞外緩衝液中で、それぞれ１：１００及び１：５０に希釈した。試料の１：１０希釈（５０μｌの試薬＋４０μｌの水＋１０μｌの細胞培地）を使用して、１．０秒の積分時間でＰｒｏｍｅｇａ Ｇｌｏｍａｘランナー上でアッセイを実行した。
ＬＮＰ及び／またはＡＡＶのインビボ送達
マウスに、ＡＡＶ、ＬＮＰ、ＡＡＶ及びＬＮＰの両方、またはビヒクル（ＡＡＶビヒクルについてはＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ＬＮＰビヒクルについてはＴＳＳ）を、外側尾静脈を介して投与した。ＡＡＶを、本明細書に記載される量（ベクターゲノム／マウス、「ｖｇ／ｍｓ」）で、１匹あたり０．１ｍＬの体積で投与した。ＬＮＰをＴＳＳ中で希釈し、本明細書に示される量で、約５μｌ／グラム体重で投与した。典型的には、マウスに、まずＡＡＶを注射し、次いで、適用可能な場合、ＬＮＰを注射した。治療後の様々な時点で、以下にさらに説明されるように、ある特定の分析のために血清及び／または肝臓組織を収集した。
ヒト第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）ＥＬＩＳＡ分析
インビトロ研究では、細胞培地中に分泌される総ヒト第ＩＸ因子レベルを、製造者のプロトコルに従って、ヒト第ＩＸ因子ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１８８３９３）を使用して決定した。分泌ｈＦＩＸレベルを、４パラメータロジスティックフィットを使用して標準曲線から定量化し、ｎｇ／ｍｌの培地として表した。
インビボ研究では、血液を収集し、示されるようにして血清または血漿を単離した。総ヒト第ＩＸ因子レベルを、製造者のプロトコルに従って、ヒト第ＩＸ因子ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１８８３９３）を使用して決定した。血清または血漿ｈＦＩＸレベルを、４パラメータロジスティックフィットを使用して標準曲線から定量化し、μｇ／ｍＬの血清として表した。
次世代シーケンシング（「ＮＧＳ」）及びオンターゲット切断効率の分析
ディープシーケンシングを利用して、遺伝子編集によって導入された挿入及び欠失（例えば、アルブミンのイントロン１内）の存在を同定した。標的部位の周りのＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム領域を増幅した。プライマー配列設計は、この分野で標準的に行われているように実施した。
シーケンシングのために必要な化学的性質を付加するために製造者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って追加のＰＣＲを行った。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置でシーケンシングした。低品質スコアを有する読み取り値を除去した後に、読み取り値を参照ゲノムにアラインメントした。読み取り値を含む得られたファイルを、参照ゲノムに対してマッピングし（ＢＡＭファイル）、目的の標的領域と重なり合った読み取り値を選択し、野生型の読み取り値の数対挿入または欠失（「インデル」）を含む読み取り値の数を計算した。
編集パーセンテージ（例えば、「編集効率」または「編集率」）は、野生型を含む配列読み取り値の総数に対する、挿入または欠失（「インデル」）を含む配列読み取り値の総数として定義される。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析
ＢａｓｅＳｃｏｐｅ（ＡＣＤｂｉｏ，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）は、例えば、挿入導入遺伝子（ｈＦＩＸ）及び挿入部位からのコード配列（例えば、アルブミンのエクソン１）を含むハイブリッドｍＲＮＡ転写産物において、エクソン接合部の特異的検出を提供することができる、特殊なＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術である。ＢａｓｅＳｃｏｐｅを使用して、ハイブリッドｍＲＮＡを発現する肝臓細胞のパーセンテージを測定した。
ハイブリッドｍＲＮＡを検出するために、双方向性構築物の挿入後に生じ得るハイブリッドｍＲＮＡに対する２つのプローブを、ＡＣＤｂｉｏ（Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）によって設計した。一方のプローブは、一方の配向での構築物の挿入から生じるハイブリッドｍＲＮＡを検出するように設計されたが、他方のプローブは、他方の配向での構築物の挿入から生じるハイブリッドｍＲＮＡを検出するように設計された。マウスの異なる群の肝臓を収集し、新鮮凍結して切片化した。製造者のプロトコルに従って、単一のプローブまたはプールされたプローブを使用して、ＢａｓｅＳｃｏｐｅアッセイを行った。スライドをスキャンし、ＨＡＬＯソフトウェアによって分析した。このアッセイの背景（生理食塩水処理群）は０．５８％であった。
実施例２－相同性アームのあり及びなしの挿入テンプレートのインビトロ試験
この実施例では、Ｈｅｐａ１－６細胞を培養し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＧ０００５５１を送達するＬＮＰの存在下または不在下で、例えば、実施例１（ｎ＝３）に記載されるように、様々な形態のＡＡＶを有する挿入テンプレート（例えば、一本鎖ゲノム（「ｓｓＡＡＶ」）または自己相補性ゲノム（「ｓｃＡＡＶ」）のいずれかを有する）で処理した。ＡＡＶ及びＬＮＰを実施例１に記載されるように調製した。処理後、実施例１に記載されるように、培地をヒト第ＩＸ因子レベルについて収集した。
Ｈｅｐａ１－６細胞は、培養物中で分裂し続ける不死化マウス肝臓細胞株である。図２（治療後７２時間の時点）に示されるように、２００ｂｐの相同性アームを含むベクター（プラスミドＰ００２０４に由来するｓｃＡＡＶ）のみが、ｈＦＩＸの検出可能な発現をもたらした。Ｐ００１２３（相同性アームを欠くｓｃＡＡＶ）及びＰ００１４７（相同性アームを欠くｓｓＡＡＶ双方向性構築物）に由来するＡＡＶベクターの使用は、この実験でｈＦＩＸのいかなる検出可能な発現ももたらさなかった。細胞を培養中に維持し、これらの結果は、処理後３０日で再アッセイしたときに確認された（データには示さず）。
実施例３－相同性アームのあり及びなしの挿入テンプレートのインビボ試験
この実施例では、マウスを、実施例２でインビトロで試験されるのと同じプラスミド（Ｐ００１２３、Ｐ００２０４、及びＰ００１４７）に由来するＡＡＶで処置した。投与物質を調製し、実施例１に記載されるように投与した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、各々、３ｅ１１ベクターゲノム（ｖｇ／ｍｓ）、続いてＧ０００５５１（「Ｇ５５１」）を含むＬＮＰを４ｍｇ／ｋｇの用量（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で投与した（各群についてｎ＝５）。投与後４週間で、動物を安楽死させ、それぞれ、編集及びｈＦＩＸ発現のために、肝臓組織及び血清を収集した。
図３Ａ及び表１２に示されるように、マウスアルブミンのイントロン１を標的とするｇＲＮＡを含むＬＮＰで処置した動物の各群において、約６０％の肝臓編集レベルを検出した。しかしながら、各処置群においてロバストで一貫したレベルの編集にもかかわらず、ＬＮＰ処置と組み合わせた相同性アームなしの双方向性ベクター（Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶベクター）を受けている動物は、血清中で最高レベルのｈＦＩＸ発現をもたらした（図３Ｂ及び表１３）。
Figure 2022512731000019
Figure 2022512731000020
実施例４－相同性アームのあり及びなしのｓｓＡＡＶ挿入テンプレートのインビボ試験
この実施例に記載される実験では、インビボで相同性アームをｓｓＡＡＶベクターに組み込む効果を調査した。
この実験で使用された投与物質を調製し、実施例１に記載されるように投与した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、３ｅ１１ｖｇ／ｍｓ、続いてＧ０００６６６（「Ｇ６６６」）またはＧ０００５５１（「Ｇ５５１」）を含むＬＮＰを０．５ｍｇ／ｋｇの用量（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で投与した（各群についてｎ＝５）。投与後４週間で、ｈＦＩＸ発現のために動物血清を収集した。
図４Ａ及び表１４に示されるように、Ｇ５５１によって標的化される部位への挿入のための、非対称相同性アーム（それぞれ、プラスミドＰ００３５０、Ｐ００３５６、及びＰ００３６２に由来するベクターについては、３００／６００ｂｐアーム、３００／２０００ｂｐアーム、及び３００／１５００ｂｐアーム）を有するｓｓＡＡＶベクターの使用により、アッセイのための検出下限を下回った循環ｈＦＩＸのレベルが得られた。しかしながら、相同性アームなしで、かつ２つのｈＦＩＸオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を双方向配向で有するｓｓＡＡＶベクター（Ｐ００１４７に由来する）の使用により、各動物における循環ｈＦＩＸの検出可能なレベルが得られた。
同様に、Ｇ６６６によって標的化される部位への挿入のための、非対称相同性アーム（それぞれ、プラスミドＰ００３５３及びＰ００３５４に由来するベクターについては５００ｂｐアーム及び８００ｂｐアーム）を有するｓｓＡＡＶベクターの使用により、相同性アーム（Ｐ００１４７に由来する）なしの双方向性ベクターの使用と比較して、より低いが検出可能なレベルが得られた（図４Ｂ及び表１５を参照されたい）。
Figure 2022512731000021
Figure 2022512731000022
実施例５－初代マウス肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物のインビトロスクリーニング
相同性アームを欠く双方向性構築物が他の配置を有するベクターを上回ることを実証したことにより、この実施例に記載される実験は、ｈＦＩＸとアルブミンのエクソン１との間のハイブリッド転写産物を形成するために使用されるスプライスアクセプターを改変し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性挿入を標的とするためのｇＲＮＡを改変する効果を調査した。これらの多様な双方向性構築物を、初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）におけるマウスアルブミンのイントロン１を標的とする２０個の異なるｇＲＮＡを利用して、標的部位のパネルにわたって試験した。
この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及び脂質パケット送達物質を調製し、実施例１に記載されるようにＰＭＨに送達し、１ｅ５のＭＯＩでＡＡＶと共に行った。処理後、単離されたゲノムＤＮＡ及び細胞培地を、それぞれ編集及び導入遺伝子発現分析のために収集した。ベクターの各々は、実施例１に記載されるように、ルシフェラーゼに基づく蛍光検出により測定することができるレポーターを含み、図５Ｃに相対ルシフェラーゼユニット（「ＲＬＵ」）としてプロットした。ベクターは、ｈＦＩＸ ＯＲＦの３’末端で融合したＨｉＢｉｔペプチドを含み、それは相対発現の感受性検出を可能にする。試験した各ベクターの概略図を図５Ａに提供する。試験したｇＲＮＡを、表５に列挙されるものについて短縮された数を使用して、図５Ｂ及び５Ｃに示す（例えば、先頭のゼロが省略されている、例えば、「Ｇ５５１」は表５の「Ｇ０００５５１」に対応する）。
図５Ｂ及び表１６に示されるように、試験した各組み合わせにわたって、処置群の各々について、一貫しているが様々なレベルの編集を検出した。テンプレート及びガイドＲＮＡの様々な組み合わせを使用する導入遺伝子発現を図５Ｃ及び表１７に示す。図５Ｄに示されるように、有意なレベルのインデル形成は、必ずしも導入遺伝子のより効率的な発現をもたらすものではなかった。Ｐ００４１１由来テンプレート及びＰ００４１８由来テンプレートを使用して、１０％未満の編集を含むガイドが含まれない場合、Ｒ２値は、それぞれ０．５４及び０．３７であった。マウスアルブミンスプライスアクセプター及びヒトＦＩＸスプライスアクセプターは、各々、有効な導入遺伝子発現をもたらした。
Figure 2022512731000023
Figure 2022512731000024
実施例６－標的部位にわたる双方向性構築物のインビボスクリーニング
この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及びＬＮＰを調製し、実施例１に記載されるようにＣ５７Ｂｌ／６マウスに送達して、インビボで標的部位にわたる双方向性構築物の性能を評価した。投与後４週間で、動物を安楽死させ、それぞれ、編集及びｈＦＩＸ発現のために、肝臓組織及び血清を収集した。
初期実験では、アルブミンのイントロン１を標的とする１０個の異なるｇＲＮＡを含む１０個の異なるＬＮＰ製剤を、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶと共にマウスに送達した。ＡＡＶ及びＬＮＰを、それぞれ、３ｅ１１ｖｇ／ｍｓ及び４ｍｇ／ｋｇ（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で送達した（各群についてｎ＝５）。この実験で試験したｇＲＮＡを図６に示し、表１８に作表する。図６に示され、インビトロで観察されるように、有意なレベルのインデル形成は、導入遺伝子の挿入または発現について予測的でなかった。
別の実験では、実施例５でインビトロで試験した２０個の異なる標的部位を標的とする２０個のｇＲＮＡのパネルをインビボで試験した。この目的のために、アルブミンのイントロン１を標的とする２０個のｇＲＮＡを含むＬＮＰ製剤を、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶと共にマウスに送達した。ＡＡＶ及びＬＮＰを、それぞれ、３ｅ１１ｖｇ／ｍｓ及び１ｍｇ／ｋｇ（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で送達した。この実験で試験したｇＲＮＡを図７Ａ及び７Ｂに示す。
図７Ａに示され、表１９に作表されるように、試験した各ＬＮＰ／ベクターの組み合わせにわたって、処置群の各々について、様々なレベルの編集を検出した。しかしながら、図７Ｂ及び表２０に示され、実施例５に記載されるインビトロデータと一致するように、より高いレベルの編集は、必ずしもインビボで導入遺伝子のより高いレベルの発現をもたらすわけではなく、双方向性ｈＦＩＸ構築物の編集と挿入／発現との間の相関性の欠如を示す。実際、達成された編集の量と、図７Ｄに提供されるプロットで見られるｈＦＩＸ発現の量との間には、ほとんど相関が存在しない。特に、１０％未満の編集を達成するｇＲＮＡが分析から除去されるとき、この実験の編集データセットと発現データセットとの間で０．３４のみのＲ２値を計算する。興味深いことに、図７Ｃに示されるように、実施例５のインビトロ実験からＲＬＵで測定される発現のレベルを、この実験で検出されたインビボでの導入遺伝子発現レベルと比較する相関プロットが提供され、Ｒ２値は０．７０であり、初代細胞スクリーニングとインビボ治療との間の正の相関を実証する。
細胞レベルでの双方向性構築物の挿入を評価するために、処置された動物由来の肝臓組織を、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＢａｓｅＳｃｏｐｅ）を使用して、例えば、実施例１に記載されるようにアッセイした。このアッセイは、ｈＦＩＸ導入遺伝子とマウスアルブミンエクソン１配列との間の接合部を検出することができるプローブをハイブリッド転写産物として利用した。図８Ａに示されるように、ハイブリッド転写産物に対して陽性の細胞を、ＡＡＶ及びＬＮＰの両方を受けた動物において検出した。具体的には、ＡＡＶのみを投与する場合、１．０％未満の細胞がハイブリッド転写産物に対して陽性であった。Ｇ０１１７２３、Ｇ０００５５１、またはＧ０００６６６を含むＬＮＰの投与では、４．９％、１９．８％、または５２．３％の細胞がハイブリッド転写産物に対して陽性であった。さらに、図８Ｂに示されるように、循環ｈＦＩＸレベルは、ハイブリッド転写産物に対して陽性であった細胞の数と相関していた。最後に、アッセイは、いずれかの配向での双方向性ｈＦＩＸ構築物の挿入を検出することができるプールされたプローブを利用した。しかしながら、単一の配向のみを検出する単一のプローブを使用した場合、ハイブリッド転写産物に対して陽性であった細胞の量は、プールされたプローブを使用して検出された細胞の約半分であり（一実施例では、４．４６％対９．６８％）、双方向性構築物がいずれかの配向で挿入することが実際に可能であり、タンパク質レベルでの導入遺伝子発現の量と相関する発現されたハイブリッド転写産物をもたらすことを示唆している。これらのデータは、達成された循環ｈＦＩＸレベルが挿入に使用されるガイドに依存していることを示す。
Figure 2022512731000025
Figure 2022512731000026
Figure 2022512731000027
実施例７－インビボでのＡＡＶ及びＬＮＰ送達のタイミング
この実施例では、双方向性ｈＦＩＸ構築物を含むｓｓＡＡＶの送達とＬＮＰの送達との間のタイミングを、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて調査した。
この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及びＬＮＰを調製し、実施例１に記載されるようにマウスに送達した。ＬＮＰ製剤は、Ｇ０００５５１を含み、双方向性テンプレートは、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶとして送達した。ＡＡＶ及びＬＮＰを、それぞれ、３ｅ１１ｖｇ／ｍｓ及び４ｍｇ／ｋｇ（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で送達した（各群についてｎ＝５）。「テンプレートのみ」コホートはＡＡＶのみを受け、「ＰＢＳ」コホートはＡＡＶまたはＬＮＰを受けなかった。１つのコホートは、０日目にＡＡＶ及びＬＮＰを順次（数分間隔で）受け（「テンプレート＋ＬＮＰ ０日目」）、別のコホートは、０日目にＡＡＶを受け、１日目にＬＮＰを受け（「テンプレート＋ＬＮＰ １日目」）、最終コホートは、０日目にＡＡＶを受け、７日目にＬＮＰを受けた（「テンプレート＋ＬＮＰ ７日目」）。１週間、２週間、及び６週間で、ｈＦＩＸ発現分析のために血漿を収集した。
図９に示されるように、ｈＦＩＸは、ＡＡＶ送達後７日目にＬＮＰを受けたコホートの１週間の時点を除いて、アッセイされた各時間に各コホートにおいて検出された。
実施例８－ＡＡＶの送達後のＬＮＰの複数回投与
この実施例では、ｓｓＡＡＶの投与後のＬＮＰの反復投与の効果を調査した。
この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及びＬＮＰを調製し、実施例１に記載されるようにＣ５７Ｂｌ／６マウスに送達した。ＬＮＰ製剤は、Ｇ０００５５１を含み、ｓｓＡＡＶは、Ｐ００１４７に由来した。ＡＡＶ及びＬＮＰを、それぞれ、３ｅ１１ｖｇ／ｍｓ及び０．５ｍｇ／ｋｇ（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で送達した（各群についてｎ＝５）。「テンプレートのみ」コホートはＡＡＶのみを受け、「ＰＢＳ」コホートはＡＡＶまたはＬＮＰを受けなかった。１つのコホートは、さらなる処置なしで０日目にＡＡＶ及びＬＮＰを順次（数分間隔で）受け（図１０では「テンプレート＋ＬＮＰ（１回）」）、別のコホートは、０日目にＡＡＶ及びＬＮＰを順次（数分間隔で）受け、７日目に２回目の用量を受け（図１０では「テンプレート＋ＬＮＰ（２回）」）、最終コホートは、０日目にＡＡＶ及びＬＮＰを順次（数分間隔で）受け、７日目にＬＮＰの２回目の用量及び１４日目にＬＮＰの３回目の用量を受けた（図１０では「テンプレート＋ＬＮＰ（３回）」）。ＡＡＶの投与後１、２、４、及び６週間で、ｈＦＩＸ発現分析のために血漿を収集した。
図１０に示されるように、ｈＦＩＸは、アッセイされた各時間に各コホートにおいて検出され、複数の後続用量のＬＮＰは、ｈＦＩＸ発現の量を著しく増加させなかった。
実施例９－インビボでのｈＦＩＸ発現の耐久性
この実施例では、処置された動物における経時的なｈＦＩＸ発現の耐久性を評価した。この目的のために、１年間の耐久性研究の一部として、投与後の処置された動物の血清においてｈＦＩＸを測定した。
この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及びＬＮＰを調製し、実施例１に記載されるようにＣ５７Ｂｌ／６マウスに送達した。ＬＮＰ製剤は、Ｇ０００５５１を含み、ｓｓＡＡＶは、Ｐ００１４７に由来した。ＡＡＶを３ｅ１１ｖｇ／ｍｓで送達し、ＬＮＰを０．２５または１．０ｍｇ／ｋｇ（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）のいずれかで送達した（各群についてｎ＝５）。
図１１Ａ及び表２１に示されるように、ｈＦＩＸ発現を、両群について評価した各時点で４１週間まで維持した。８週間で観察されるレベルの低下は、ＥＬＩＳＡアッセイの変動性に起因すると考えられる。ＥＬＩＳＡにより２週目及び４１週目に血清アルブミンレベルを測定し、研究全体にわたって循環アルブミンレベルが維持されることを示した。
図１１Ｂ及び表２２に示されるように、ｈＦＩＸ発現を、両群について評価した各時点で５２週間まで維持した。
Figure 2022512731000028
Figure 2022512731000029
実施例１０－インビボでｈＦＩＸ発現を調節するための様々な用量のＡＡＶ及びＬＮＰの効果
この実施例では、ｈＦＩＸの発現を調節するためのＡＡＶ及びＬＮＰの両方の用量を変化させる効果をＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて評価した。
この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及びＬＮＰを調製し、実施例１に記載されるようにマウスに送達した。ＬＮＰ製剤は、Ｇ０００５５３を含み、ｓｓＡＡＶは、Ｐ００１４７に由来した。ＡＡＶを１ｅ１１、３ｅ１１、１ｅ１２、または３ｅ１２ｖｇ／ｍｓで送達し、ＬＮＰを０．１、０．３、または１．０ｍｇ／ｋｇ（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で送達した（各群についてｎ＝５）。投与後２週間で、動物を安楽死させた。ｈＦＩＸ発現分析のために、２つの時点で血清を収集した。
図１２Ａ（１週間）、図１２Ｂ（２週間）、及び表２３に示されるように、ＡＡＶまたはＬＮＰのいずれかの用量を変化させることにより、インビボでのｈＦＩＸの発現の量を調節することができる。
Figure 2022512731000030
実施例１１－初代カニクイザル及び初代ヒト肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物のインビトロスクリーニング
この実施例では、双方向性構築物を含むｓｓＡＡＶベクターを、それぞれ、初代カニクイザル（ＰＣＨ）及び初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）におけるカニクイザル（「ｃｙｎｏ」）及びヒトアルブミンのイントロン１を標的とするｇＲＮＡを利用して、標的部位のパネルにわたって試験した。
この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及び脂質パケット送達物質を調製し、実施例１に記載されるようにＰＣＨ及びＰＨＨに送達した。処理後、単離されたゲノムＤＮＡ及び細胞培地を、それぞれ編集及び導入遺伝子発現分析のために収集した。ベクターの各々は、実施例１に記載されるように、ルシフェラーゼに基づく蛍光検出により測定することができるレポーターを含み（プラスミドＰ００４１５に由来）、図１３Ｂ及び１４Ｂに相対ルシフェラーゼユニット（「ＲＬＵ」）としてプロットした。例えば、ＡＡＶベクターは、ＮａｎｏＬｕｃ ＯＲＦを含んでいた（ＧＦＰに加えて）。試験したベクターの概略図を図１３Ｂ及び１４Ｂに提供する。試験したｇＲＮＡを、表１及び表７に列挙されるものについて短縮した数を使用して図の各々に示す。
ＰＣＨについては図１３Ａ、及びＰＨＨについては図１４Ａに示されるように、試験した組み合わせの各々について様々なレベルの編集を検出した（ＰＣＨ実験で試験したいくつかの組み合わせについての編集データは、アンプリコンに基づくシーケンシングに使用したある特定のプライマー対の不良に起因して図１３Ａ及び表３に報告されない）。図１３Ａ及び１４Ａに図表で示される編集データは、以下の表３及び表４に数値的に再現される。しかしながら、図１３Ｂ、１３Ｃ、ならびに図１４Ｂ及び１４Ｃに示されるように、導入遺伝子の挿入または発現について有意なレベルのインデル形成は予測的ではなく、それぞれ、ＰＣＨ及びＰＨＨにおける双方向性構築物の編集と挿入／発現との間の相関がほとんどないことを示している。一尺度として、図１３Ｃで算出したＲ２値は０．１３であり、図１４ＤのＲ２値は０．２２である。
加えて、双方向性構築物を含むｓｓＡＡＶベクターを、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）におけるヒトアルブミンのイントロン１を標的とする単一ガイドＲＮＡを利用して、標的部位のパネルにわたって試験した。
ｓｓＡＡＶ及びＬＮＰ物質を調製し、実施例１に記載されるようにＰＨＨに送達した。処理後、単離されたゲノムＤＮＡ及び細胞培地を、それぞれ編集及び導入遺伝子発現分析のために収集した。ベクターの各々は、実施例１に記載されるように、ルシフェラーゼに基づく蛍光検出により測定することができるレポーターを含み（プラスミドＰ００４１５に由来）、図１４Ｄに相対ルシフェラーゼユニット（「ＲＬＵ」）としてプロットし、以下の図２４に作表した。例えば、ＡＡＶベクターは、ＮａｎｏＬｕｃ ＯＲＦを含んでいた（ＧＦＰに加えて）。試験したベクターの概略図を図１３Ｂ及び１４Ｂに提供する。試験したｇＲＮＡを、表１及び表７に列挙されるものについて短縮した数を使用して図１４Ｄに示す。
Figure 2022512731000031
Figure 2022512731000032
Figure 2022512731000033
実施例１２－代替セーフハーバー遺伝子座からの第ＩＸ因子発現のインビボ試験
この実施例では、代替セーフハーバー遺伝子座における双方向性ｈＦＩＸ構築物を含むｓｓＡＡＶの挿入を評価した。代替セーフハーバー遺伝子座への挿入を試験するために、ＡＡＶを上述のように調製した。マウスに、３ｅ１１ｖｇ／マウスの用量でＡＡＶを投与した後、直ちにＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰを、０．３ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。投与後４週間で動物を屠殺し、肝臓及び血液試料を収集した。ＮＧＳにより、肝臓試料中の編集を決定した。血清中のヒトｈＦＩＸレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。ＮＧＳ及びＥＬＩＳＡデータは、代替セーフハーバー遺伝子座内のｈＦＩＸの効果的な挿入及び発現を示した。
実施例１３－非ヒト霊長類におけるヒト第ＩＸ因子遺伝子挿入のインビボ試験
この実施例では、様々なガイドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及び／または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の投与によるカニクイザルにおけるヒト第ＩＸ因子遺伝子挿入及びｈＦＩＸタンパク質発現を評価するために、８週間の研究を行った。この研究は、上述のように調製されたＬＮＰ製剤及びＡＡＶ製剤で実施された。各ＬＮＰ製剤は、２：１のｍＲＮＡ：ｇＲＮＡの重量比で、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含んでいた。ｓｓＡＡＶは、Ｐ００１４７に由来した。
雄のカニクイザルをｎ＝３のコホートで処置した。動物に、表１０に記載される用量でのゆっくりとしたボーラス注射または注入によってＡＡＶを投与した。ＡＡＶ処置後、動物は、ゆっくりとしたボーラスまたは注入によって、表１０に記載されるように緩衝液またはＬＮＰを受けた。
投与後２週間で、単一の超音波ガイド下経皮生検により肝臓検体を収集した。各生検検体を液体窒素中でフラッシュ凍結し、－８６～－６０℃で保存した。前述のように、肝臓検体の編集分析をＮＧＳシーケンシングによって行った。
第ＩＸ因子ＥＬＩＳＡ分析のために、投与後７日目、１４日目、２８日目、及び５６日目に動物から血液試料を収集した。採血後、血液試料を収集し、血漿に処理し、分析まで－８６～－６０℃で保存した。
ＥＬＩＳＡにより、全ヒト第ＩＸ因子レベルを血漿試料から決定した。簡潔には、Ｒｅａｃｔｉ－Ｂｉｎｄ９６ウェルマイクロプレート（ＶＷＲカタログ番号ＰＩ１５０４１）を、１μｇ／ｍｌの濃度で捕捉抗体（ヒト第ＩＸ因子抗体に対するマウスｍＡＢ（ＨＴＩ、カタログ番号ＡＨＩＸ－５０４１））でコーティングし、次いで、５％ウシ血清アルブミンを含む１倍ＰＢＳを使用してブロックした。次に、カニクイザル血漿中で希釈した精製ヒト第ＩＸ因子タンパク質（ＥＲＬ、カタログ番号ＨＦＩＸ １００９、ロット番号ＨＦＩＸ４８４０）の試験試料または標準物を、個々のウェル中でインキュベートした。検出抗体（ヒツジ抗ヒト第９因子ポリクローナル抗体、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１２８０４８）を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で吸着した。二次抗体（ＨＲＰを有するロバ抗ヒツジＩｇＧ ｐＡｂ、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９７１２５）を１００ｎｇ／ｍＬで使用した。ＴＭＢ基質試薬セット（ＢＤ ＯｐｔＥＩＡカタログ番号５５５２１４）を使用してプレートを現像した。光学密度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ｉ３システム）上で、４５０ｎｍで分光光度的に評価し、ＳｏｆｔＭａｘ ｐｒｏ ６．４を使用して分析した。
インデル形成が検出され、編集が生じたことを確認した。ＮＧＳデータは、効果的なインデル形成を示した。ＮＨＰにおけるアルブミン遺伝子座からのｈＦＩＸの発現を、ＥＬＩＳＡによって測定し、表１１及び図１５に示す。ｈＦＩＸの血漿レベルは、治療的に有効であると以前に記載されたレベルに達した（Ｇｅｏｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ ３７７（２３），２２１５－２７，２０１７）。
測定されるように、循環ｈＦＩＸタンパク質レベルを、８週間の研究にわたって維持し（それぞれ、７日目、１４日目、２８日目、及び５６日目の約１３５、約１４０、約１５０、及び約１１０ｎｇ／ｍＬの平均レベルを示す図１５を参照されたい）、約７５ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬの範囲のタンパク質レベルを達成した。Ｒ３３８Ｌ機能亢進型ｈＦＩＸバリアントについて約８倍高い特異的活性を使用して、血漿ｈＦＩＸレベルを計算した（Ｓｉｍｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ ３６１（１７），１６７１－７５，２００９）（１ミリグラムあたり３９０±２８ＵのｈＦＩＸ－Ｒ３３８Ｌのタンパク質特異的活性及び１ミリグラムあたり４５±２．４Ｕの野生型第ＩＸ因子に対するタンパク質特異的活性を報告する）。この実施例で試験した機能亢進型第ＩＸ因子バリアントの機能的に正規化された第ＩＸ因子活性を計算すると、実験は、野生型第ＩＸ因子活性の約２０～４０％に対応する８週間の研究にわたるＮＨＰにおける安定したレベルのヒト第ＩＸ因子タンパク質を達成した（野生型第ＩＸ因子活性の１２～６７％に及ぶ範囲）。
Figure 2022512731000034
Figure 2022512731000035
実施例１４ 非ヒト霊長類における第ＩＸ因子挿入のインビボ試験
この実施例では、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶ及び／またはＧ００９８６０を含む様々なガイド及び様々なＬＮＰ成分を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の投与後の、カニクイザルにおける第ＩＸ因子遺伝子挿入及びｈＦＩＸタンパク質発現を評価するための研究を行った。
インデル形成をＮＧＳによって測定し、編集が生じたことを確認した。実施例１３に記載されるように、ヒト第ＩＸ因子抗体（ＨＴＩ、カタログ番号ＡＨＩＸ－５０４１）、ヒツジ抗ヒト第９因子ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１２８０４８）、及びＨＲＰを有するロバ抗ヒツジＩｇＧ ｐＡｂ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９７１２５）に対するマウスｍＡＢを使用して、ＥＬＩＳＡによって、総ヒト第ＩＸ因子レベルを血漿試料から決定した。実施例１３の実験で達成されたものよりも３倍超高いヒトＦＩＸタンパク質レベルを、代替のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＬＮＰを使用して双方向性テンプレートから得た。この研究では、ＥＬＩＳＡアッセイ結果は、ヒトＦＩＸレベルの正常範囲（３～５ｕｇ／ｍＬ、Ａｍｉｒａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３０（９），１５１２－１６，１９８４）以上の循環ｈＦＩＸタンパク質レベルが、少なくとも１４日目及び２８日目の時点までにＮＨＰ中でＧ００９８６０を使用して達成されたことを示す。初期データは、単回用量後１４日目に約３～４μｇ／ｍＬの循環ヒトＦＩＸタンパク質レベルを示し、レベル（約３～５μｇ／ｍＬ）が研究の最初の２８日にわたって維持された。ヒトＦＩＸレベルを、同一方法によって研究の終了時に測定し、データを表２５に表す。追加のガイドＧ００９８４７、Ｇ００９８６２、及びＧ００９８６４もまた試験し、ＮＨＰ研究におけるＦＩＸ発現テンプレートの挿入を容易にすることが示された。
Figure 2022512731000036
ＥＬＩＳＡにより循環アルブミンレベルを測定し、ベースラインのアルブミンレベルが２８日の時点で維持されることを示した。研究において、未処置動物における試験されたアルブミンレベルは、±約１５％変化した。処置された動物において、循環アルブミンレベルはわずかに変化し、正常範囲から落ちることなく、レベルは１ヶ月以内にベースラインに回復した。
また、より大きなダイナミックレンジを有するサンドイッチ免疫アッセイによって、循環ヒトＦＩＸタンパク質レベルを決定した。簡潔には、ＭＳＤ ＧＯＬＤ ９６ウェルＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＳＥＣＴＯＲ Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号Ｌ１５ＳＡ－１）を、１％ＥＣＬブロッキング剤（Ｓｉｇｍａ、ＧＥＲＰＮ２１２５）でブロッキングした。ブロッキング溶液をタッピングして除いた後、ビオチン化捕捉抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１１５０３－Ｒ０４４）をプレート上に固定した。組換えヒトＦＩＸタンパク質（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＨＦＩＸ１００９）を使用して、０．５％ＥＣＬブロッキング剤中の較正標準物質を調製した。洗浄後、較正標準物質及び血漿試料をプレートに添加し、インキュベートした。洗浄後、スルホタグ標識と複合体化した検出抗体（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＨＩＸ－５０４１）をウェルに添加し、インキュベートした。あらゆる非結合検出抗体を洗い流した後、リードバッファーＴをウェルに適用した。いかなる追加のインキュベーションもなく、プレートをＭＳＤ Ｑｕｉｃｋ Ｐｌｅｘ ＳＱ１２０機器で撮像し、データをＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ４．０ソフトウェアパッケージ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で分析した。濃度は、平均計算濃度としてｕｇ／ｍで表される。試料については、アスタリスクで示されない限り、Ｎ＝３であり、アスタリスクで示される場合はＮ＝２である。ＭＳＤ ＥＬＩＳＡによって測定した場合の、処置した研究群におけるアルブミン遺伝子座からのｈＦＩＸの発現を表２６に示す。
Figure 2022512731000037
実施例１５－アルブミンヒトガイドのオフターゲット分析
生化学的方法（例えば、Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．６、６００－６０６；２０１７を参照されたい）を使用して、アルブミンを標的とするＣａｓ９によって切断される潜在的なオフターゲットゲノム部位を決定した。この実験では、ヒトアルブミンを標的とする１３個のｓｇＲＮＡと、既知のオフターゲットプロファイルを有する２個の対照ガイドを、単離されたＨＥＫ２９３ゲノムＤＮＡを使用してスクリーニングした。生化学アッセイにおいて１６ｎＭのガイド濃度を使用して検出される潜在的なオフターゲット部位の数を表２７に示した。このアッセイは、試験したｓｇＲＮＡについての潜在的なオフターゲット部位を特定した。
Figure 2022512731000038
上記で使用される生化学的方法などの既知のオフターゲット検出アッセイでは、多くの潜在的なオフターゲット部位は、典型的には、設計によって、他の状況、例えば、目的の初代細胞において検証され得る潜在的な部位について「広範囲のネットをキャストする」ように回収される。例えば、生化学的方法は、典型的には、アッセイが、細胞環境を含まない精製された高分子量ゲノムＤＮＡを利用し、かつ使用されるＣａｓ９ ＲＮＰの用量に依存するため、潜在的なオフターゲット部位の数を過剰に表す。したがって、これらの方法によって特定された潜在的なオフターゲット部位は、特定された潜在的なオフターゲット部位の標的シーケンシングを使用して検証され得る。
実施例１６．インビボでのヒトＦ９挿入のためのガイドＲＮＡをスクリーニングするためのヒト化アルブミンマウスの使用
ヒトアルブミン遺伝子座へのｈＦ９挿入のための効果的なガイドＲＮＡを同定することを目的とした。この目的のために、マウスアルブミン遺伝子座が第１のイントロンを含む対応するヒトアルブミンゲノム配列で置き換えられたマウスを利用した（ＡＬＢｈｕ／ｈｕマウス）。これにより、インビボでの成人肝臓の状況におけるヒトアルブミンの第１のイントロンを標的とするガイドＲＮＡの挿入効率を試験することが可能になった。ＡＬＢｈｕ／ｈｕマウスを使用して、合計１１個のガイドＲＮＡをスクリーニングするために、各々がヒトアルブミン遺伝子座の第１のイントロンを標的とする、２個の別々のマウス実験を設定した。全てのマウスを体重測定し、実験の０日目に尾静脈を介して注射した。１週目、３週目、４週目、及び６週目に尾部出血を介して血液を収集し、血漿を分離した。マウスを７週目に屠殺した。大静脈を介して血液を収集し、血漿を分離した。肝臓及び脾臓も解剖した。
第１の実験では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及び以下のガイドを含む６個のＬＮＰを、実施例１のように調製し、試験した：Ｇ００９８５２、Ｇ００９８５９、Ｇ００９８６０、Ｇ００９８６４、Ｇ００９８７４、及びＧ０１２７６４。ＬＮＰを０．３ｍｇ／ｋｇに希釈し（平均重量３０グラムを使用して）、マウスあたり３Ｅ１１ウイルスゲノムの用量で双方向性ｈＦ９挿入テンプレートでパッケージングしたＡＡＶ８と同時注射した。群あたり、１２～１４週齢の５匹のＡＬＢｈｕ／ｈｕ雄マウスに注射した。同じコホートの５匹のマウスに、ｈＦ９に作動可能に連結されたＣＡＧＧプロモーターをパッケージングしたＡＡＶ８を注射し、これは、ｈＦ９のエピソーム発現をもたらす（マウスあたり３Ｅ１１ウイルスゲノムで）。緩衝液単独、双方向性ｈＦ９挿入テンプレートでパッケージングしたＡＡＶ８単独、またはＬＮＰ－Ｇ００９８７４単独を注射された群あたり３匹のマウスを含む３つの陰性対照群が存在した。
実験では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及び以下のガイドを含む以下のＬＮＰを、実施例１のように調製し、試験した：Ｇ００９８６０、Ｇ０１２７６４、Ｇ００９８４４、Ｇ００９８５７、Ｇ０１２７５２、Ｇ０１２７５３、及びＧ０１２７６１。全てを０．３ｍｇ／ｋｇに希釈し（平均重量４０グラムを使用して）、マウスあたり３Ｅ１１ウイルスゲノムの用量で双方向性ｈＦ９挿入テンプレートでパッケージングしたＡＡＶ８と同時注射した。群あたり５匹の３０週齢のＡＬＢｈｕ／ｈｕ雄マウスに注射した。同じコホートの５匹のマウスに、ｈＦ９に作動可能に連結されたＣＡＧＧプロモーターをパッケージングしたＡＡＶ８を注射し、これは、ｈＦ９のエピソーム発現をもたらす（マウスあたり３Ｅ１１ウイルスゲノムで）。緩衝液単独、双方向性ｈＦ９挿入テンプレートでパッケージングしたＡＡＶ８単独、またはＬＮＰ－Ｇ００９８７４単独を注射された群あたり３匹のマウスを含む３つの陰性対照群が存在した。
分析について、各時点でマウスにおけるｈＦＩＸ循環のレベルを測定するためにＥＬＩＳＡを行った。この目的のためにヒト第ＩＸ因子ＥＬＩＳＡキット（ａｂ１８８３９３）を使用し、全てのプレートを陽性アッセイ対照としてＧｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌのヒトプール正常血漿で実行した。注射後６週目の各群における血漿試料中のヒト第ＩＸ因子発現レベルを、図１６Ａ及び図１６Ｂに示す。インビトロ挿入データと一貫して、ガイドＲＮＡ Ｇ００９８５２を使用した場合、検出された第ＩＸ因子血清レベルは低レベルから全くなしであった。ヒトアルブミン中の隣接ＰＡＭ配列の欠如と一貫して、ガイドＲＮＡ Ｇ００９８６４を使用した場合、第ＩＸ因子血清レベルは検出不可であった。ガイドＲＮＡ Ｇ００９８５９、Ｇ００９８６０、Ｇ００９８７４、及びＧ００１２７６４を使用して、群について血清中の第ＩＸ因子発現を観察した。
脾臓及び全ての肝臓の左外側葉の一部分を、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析のために提出した。ＮＧＳを使用して、ＡＡＶ－ｈＦ９ドナー及びＬＮＰ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を注射した後の７週目のヒト化アルブミン遺伝子座における挿入／欠失（インデル）を有する肝臓細胞のパーセンテージを評価した。ヒトアルブミン中の隣接ＰＡＭ配列の欠如と一貫して、ガイドＲＮＡ Ｇ００９８６４を使用した場合、肝臓において編集は検出不可であった。ガイドＲＮＡ Ｇ００９８５９、Ｇ００９８６０、Ｇ００９８７４、及びＧ０１２７６４を使用して、群について肝臓における編集を観察した（データには示さず）。
残りの肝臓を１０％中性緩衝ホルマリン中で２４時間固定し、次いで、７０％エタノールに移した。別個の葉由来の４～５個の試料を切断し、ＨｉｓｔｏＷｉｓｚに送り、処理され、パラフィンブロックに埋め込まれた。次いで、各パラフィンブロックから５ミクロン切片を切断し、一般的なＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）手順及びＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによる試薬、ならびに成功した組み込み及び転写が達成されたときにＡＬＢｈｕ／ｈｕアルブミン遺伝子座の第１のイントロンからのヒトアルブミンシグナル配列と、ｈＦ９導入遺伝子との間に形成される固有のｍＲＮＡ接合部を標的とするカスタム設計プローブを使用して、Ｖｅｎｔａｎａ Ｕｌｔｒａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｒｏｃｈｅ）上でＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）を行った。次いで、ＨＡＬＯイメージングソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）を使用して、各試料中の陽性細胞のパーセンテージを定量化した。次いで、各動物の複数の葉にわたる陽性細胞のパーセンテージの平均を、７週目の血清中のｈＦＩＸレベルと相関させた。結果を図１７及び表２８に示す。ｈＡＬＢ－ｈＦＩＸ ｍＲＮＡの７週目の血清レベル及び陽性細胞％は、強く相関していた（ｒ＝０．８９、Ｒ２＝０．７９）。
Figure 2022512731000039
実施例１７－インビボでの挿入ヒトＦ９の機能性を評価するためのＦ９ノックアウトマウスと交差したヒト化アルブミンマウスの使用
次の研究のために、挿入ｈＦ９の機能性を、雄ＡＬＢｍｓ／ｈｕ×Ｆ９－／－マウスで試験した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及び以下のガイドを含むＬＮＰを、実施例１のように調製し、試験した：Ｇ００９８６０（ヒトアルブミン遺伝子座の第１のイントロンを標的とする）、及びＧ０００６６６（マウスアルブミン遺伝子座の第１のイントロンを標的とする）。Ｇ００９８６０を０．３ｍｇ／ｋｇに希釈し、Ｇ０００６６６を１．０ｍｇ／ｋｇに希釈し（平均重量３１．２グラムを使用して）、その両方を、マウスあたり３Ｅ１１ウイルスゲノムの用量で双方向性ｈＦ９挿入テンプレートでパッケージングしたＡＡＶ８と同時注射した。群あたり、５匹のＡＬＢｍｓ／ｈｕ×Ｆ９－／－雄マウス（１６週齢）に注射した。同じコホートの５匹のマウスに、ｈＦ９に作動可能に連結されたＣＡＧＧプロモーターをパッケージングしたＡＡＶ８を注射し、これは、ｈＦ９のエピソーム発現をもたらす（マウスあたり３Ｅ１１ウイルスゲノムで）。緩衝液のみまたは双方向性ｈＦ９挿入テンプレートでパッケージングしたＡＡＶ８のみを注射された群あたり１匹のマウスと、それぞれ、０．３ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇでＬＮＰ－Ｇ００９８６０またはＬＮＰ－Ｇ０００６６６のみを注射された群あたり２匹のマウスとを含む６匹の陰性対照動物が存在した。
分析について、各時点でマウスにおけるｈＦＩＸ循環のレベルを測定するためにＥＬＩＳＡを行った。この目的のためにヒト第ＩＸ因子ＥＬＩＳＡキット（ａｂ１８８３９３）を使用し、全てのプレートを陽性アッセイ対照としてＧｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌのヒトプール正常血漿で実行した。脾臓及び全ての肝臓の左外側葉の一部分をＮＧＳ分析のために提出した。
注射後１週目、２週目、及び４週目での各群における血漿試料中のヒト第ＩＸ因子発現レベルを、図１８及び表２９に示す。加えて、肝臓及び脾臓におけるアルブミン遺伝子座での挿入及び欠失（インデル）レベルを示すＮＧＳ結果を表２９に示す。図１８及び表２９に示されるように、１週間、３週間、及び４週間で、処置したＡｌｂ＋／ｈｕ／Ｆ９－／－マウスの血漿中でｈＦＩＸを検出し、ＥＬＩＳＡでは、１週間、３週間、及び４週間で、０．５～１０μｇ／ｍＬの発現値を示す。
Figure 2022512731000040
残りの肝臓を１０％中性緩衝ホルマリン中で２４時間固定し、次いで、７０％エタノールに移した。別個の葉由来の４～５個の試料を切断し、ＨｉｓｔｏＷｉｚに送り、処理され、パラフィンブロックに埋め込まれた。次いで、一般的なＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）手順及びＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによる試薬、ならびに成功した組み込み及び転写が達成されたときにＡＬＢｍｓ／ｈｕマウスにおける各それぞれのアルブミン遺伝子座の第１のイントロンからのヒトまたはマウスアルブミンシグナル配列のいずれかと、ｈＦ９導入遺伝子との間に形成される固有のｍＲＮＡ接合部を標的とするカスタム設計プローブを使用して、Ｖｅｎｔａｎａ Ｕｌｔｒａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｒｏｃｈｅ）上でのＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）を介して、分析のために各パラフィンブロックから５ミクロン切片を切断した。ＨＡＬＯイメージングソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）を使用して、各試料中の陽性細胞のパーセンテージを定量化する。
次に、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）及びトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）による機能的凝固活性の評価のために、終末血液を使用した。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は、血漿中の固有経路凝固活性の臨床測定である。血漿は、エラグ酸またはカオリンの添加によって凝固するように誘導され、これらの両方は、凝固の固有経路（接触経路として知られる）中の凝固第ＸＩＩ因子を活性化し、その後、トロンビンが活性化されると、フィブリノーゲンからフィブリンの生成をもたらす。ａＰＴＴアッセイは、血栓を生成する個体の能力の推定を提供し、この情報は、出血または血栓症のリスクを決定するために使用することができる。ａＰＴＴを試験するために、電気機械的血栓検出法（粘度に基づく検出システム）を用いる半自動ベンチトップシステム（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ ＳＴａｒｔ ４）を使用して、血漿中の凝固を評価した。スチールボールを有する各キュベットに、５０μＬのクエン酸血漿を添加し、３７℃で５分間インキュベートし、次いで、５０μＬのエラグ酸（最終濃度３０μＭ）を３７℃で３００秒間添加して凝固を誘発した。各キュベットに５０μＬの０．０２５Ｍ塩化カルシウム（最終濃度８ｍＭ）を添加することによる凝固の最終活性化後、スチールボールは２つの駆動コイル間で前後に振動し始めた。ボールの動きはレシーバーコイルによって検出された。フィブリンの生成は、ボールが動かなくなるまで血漿粘度を増加させ、それを凝固時間として記録した。測定された唯一のパラメータは凝固時間であった。試験を２つ組で実施した。
トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）は、活性化血漿中のトロンビン生成の動態の非臨床的評価である。トロンビン生成は、トロンビンが他の凝固因子の活性化、及びフィブリノーゲンからフィブリンへの変換のための追加のトロンビンの増殖（ＦＸＩ活性化を介する）を担うため、凝固の不可欠なプロセスである。トロンビン生成アッセイは、トロンビンを生成する個体の能力の推定を提供し、この情報は、出血または血栓症のリスクを決定するために使用することができる。ＴＧＡを行うために、自動較正トロンボグラムを使用して、分光光度計（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｇｒａｐｈ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）におけるトロンビン生成レベルを評価した。高スループット実験のために、９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＩ ＨＢ）を使用した。各ウェルに、５５μＬのクエン酸血漿（マウス血漿のために生理食塩水で４倍希釈）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。トロンビン生成は、１５μＬの２μＭエラグ酸（最終濃度０．３３μＭ）を３７℃で４５分間添加することによって誘発される。１６ｍＭのＣａＣｌ２を含む１５μＬの蛍光発生基質（ＦｌｕＣａ、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ）の各ウェルへの自動注射後に、トロンビン生成を決定した。蛍光発生基質は、生成されたトロンビンと反応し、４６０ｎｍで９０分間、３３秒毎に血漿中で連続的に測定された。蛍光強度は、トロンビンのタンパク質分解活性に比例した。トレーシングにおいて測定された主なパラメータは、ラグ時間、トロンビン生成のピーク、トロンビン生成のピークまでの時間、及び内因性トロンビン電位（ＥＴＰ）であった。ラグ時間は、血漿中のトロンビンの初期検出に必要な時間の推定を提供する。ピークは、活性化後の所与の時間に生成されるトロンビンの最大量である。トロンビン生成のピークまでの時間は、凝固カスケードの開始からトロンビン生成のピークまでの時間である。ＥＴＰは、測定された６０分間に生成されたトロンビンの総量である。試験を２つ組で実施した。
図１９及び表３０に示されるように、例えば、Ｇ０００６６６を使用するｈＦ９導入遺伝子の挿入は、ａＰＴＴアッセイにおいて回復した凝固機能を示した。ＡＡＶのみ及びＬＮＰのみの陰性対照試料は、生理食塩水中で４５～６０秒の長時間のａＰＴＴ時間を示した。陽性対照ＣＡＧＧ及び試験試料ＡＡＶ８＋ＬＮＰは、２８～３４秒の正常なヒトａＰＴＴにより近かった。
Figure 2022512731000041
図２０Ａ、図２０Ｂ、及び図２１ならびに表３０に示されるように、例えば、Ｇ０００６６６を使用するｈＦ９導入遺伝子の挿入は、ＴＧＡ－ＥＡ分析におけるトロンビン生成の増加を示した。陽性対照ＣＡＧＧ及びＡＡＶ８＋ＬＮＰにおいて、トロンビン濃度は、陰性対照試料と比較してより高かった。
結論として、ｈＦＩＸは、１週間、３週間、及び４週間で、Ａｌｂ＋／ｈｕ／Ｆ９－／－マウスの血漿中で検出され、発現されたｈＦＩＸ－Ｒ３３８Ｌは、ＴＧＡアッセイにおいてトロンビンが生成され、ａＰＴＴ凝固時間が改善されたため、機能的であることが見出された。
ヒトアルブミンイントロン１：（配列番号１）
Figure 2022512731000042
Figure 2022512731000043
Figure 2022512731000044
Figure 2022512731000045
Figure 2022512731000046
Figure 2022512731000047
Figure 2022512731000048
Figure 2022512731000049
Figure 2022512731000050
Figure 2022512731000051
Figure 2022512731000052
Figure 2022512731000053
５’ＩＴＲ配列（配列番号２６３）：
Figure 2022512731000054
マウスアルブミンスプライスアクセプター（第１の配向）（配列番号２６４）：
Figure 2022512731000055
ヒト第ＩＸ因子（Ｒ３３８Ｌ）、第１の配向（配列番号２６５）：
Figure 2022512731000056
ポリＡ（第１の配向）（配列番号２６６）：
Figure 2022512731000057
ポリＡ（第２の配向）（配列番号２６７）：
Figure 2022512731000058
ヒト第ＩＸ因子（Ｒ３３８Ｌ）、第２の配向（配列番号２６８）：
Figure 2022512731000059
Figure 2022512731000060
マウスアルブミンスプライスアクセプター（第２の配向）（配列番号２６９）：
Figure 2022512731000061
３’ＩＴＲ配列（配列番号２７０）：
Figure 2022512731000062
ヒト第ＩＸ因子スプライスアクセプター（第１の配向）（配列番号２７１）：
Figure 2022512731000063
ヒト第ＩＸ因子（Ｒ３３８Ｌ）－ＨｉＢｉｔ（第１の配向）（配列番号２７２）：
Figure 2022512731000064
Figure 2022512731000065
ヒト第ＩＸ因子（Ｒ３３８Ｌ）－ＨｉＢｉｔ（第２の配向）（配列番号２７３）：
Figure 2022512731000066
ヒト第ＩＸ因子スプライスアクセプター（第２の配向）（配列番号２７４）：
Figure 2022512731000067
Ｎｌｕｃ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（第１の配向）（配列番号２７５）：
Figure 2022512731000068
Figure 2022512731000069
Ｎｌｕｃ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（第２の配向）（配列番号２７６）：
Figure 2022512731000070
Ｐ００１４７完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２７７）
Figure 2022512731000071
Figure 2022512731000072
Figure 2022512731000073
Ｐ００４１１完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２７８）
Figure 2022512731000074
Figure 2022512731000075
Ｐ００４１５完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２７９）
Figure 2022512731000076
Figure 2022512731000077
Ｐ００４１８完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２８０）
Figure 2022512731000078
Figure 2022512731000079
Ｐ００１２３完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２８１）
Figure 2022512731000080
Figure 2022512731000081
Ｐ００２０４完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２８２）
Figure 2022512731000082
Figure 2022512731000083
Ｐ００３５３完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２８３）
Figure 2022512731000084
Figure 2022512731000085
Ｐ００３５４完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２８４）
Figure 2022512731000086
Figure 2022512731000087
Ｐ００３５０：３００／６００ｂｐのＨＡ Ｆ９構築物（Ｇ５５１について）（配列番号２８５）
Figure 2022512731000088
Figure 2022512731000089
Ｐ００３５６：３００／２０００ｂｐのＨＡ Ｆ９構築物（Ｇ５５１について）（配列番号２８６）
Figure 2022512731000090
Figure 2022512731000091
Figure 2022512731000092
Ｐ００３６２：３００／１５００ｂｐのＨＡ Ｆ９構築物（Ｇ５５１について）（配列番号２８７）
Figure 2022512731000093
Figure 2022512731000094
Ｐ００１４７でコードされる第ＩＸ因子Ｒ３３８Ｌポリペプチド（配列番号７０２）
Figure 2022512731000095
Ｃａｓ９ ＯＲＦ（配列番号７０３）
Figure 2022512731000096
Figure 2022512731000097
Figure 2022512731000098
Ｕ－ｄｅｐ Ｃａｓ９ ＯＲＦ（配列番号７０４）
Figure 2022512731000099
Figure 2022512731000100
Ｕ ｄｅｐ Ｃａｓ９（配列番号７０５）を含むｍＲＮＡ
Figure 2022512731000101
Figure 2022512731000102
Figure 2022512731000103

Claims (143)

  1. 第ＩＸ因子核酸を細胞または細胞集団に導入する方法であって、
    ｉ）第ＩＸ因子タンパク質コード配列を含む核酸構築物と、
    ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、
    ｉｉｉ）
    ａ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
    ｂ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
    ｃ）配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択される配列、
    ｄ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
    ｅ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
    ｆ）配列番号３４～９７からなる群から選択される配列、
    ｇ）配列番号９８～１１９からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
    ｈ）配列番号９８～１１９からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、及び
    ｉ）配列番号１２０～１６３からなる群から選択される配列、ならびに
    ｊ）表２、表７、及び表８の配列番号からなる群から選択される配列、から選択される配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、を投与することを含み、
    それにより、前記第ＩＸ因子核酸を前記細胞または前記細胞集団に導入する、前記方法。
  2. 細胞または細胞集団において第ＩＸ因子を発現する方法であって、
    ｉ）第ＩＸ因子タンパク質コード配列を含む核酸構築物と、
    ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、
    ｉｉｉ）
    ａ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
    ｂ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
    ｃ）配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択される配列、
    ｄ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
    ｅ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
    ｆ）配列番号３４～９７からなる群から選択される配列、
    ｇ）配列番号９８～１１９からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
    ｈ）配列番号９８～１１９からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、ならびに
    ｉ）配列番号１２０～１６３からなる群から選択される配列、
    ｌ）表２、表７、及び表８の配列番号からなる群から選択される配列、から選択される配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、を投与することを含み、
    それにより、細胞または細胞集団において第ＩＸ因子を発現する、前記方法。
  3. 前記投与が、インビトロである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ｇＲＮＡが、
    ａ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
    ｂ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
    ｃ）配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択される配列、
    ｄ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
    ｅ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、及び
    ｆ）配列番号３４～９７からなる群から選択される配列、から選択される配列を含むガイド配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記核酸構築物が、核酸ベクター及び／または脂質ナノ粒子中で投与される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードする核酸である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする前記核酸が、ｍＲＮＡである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ｍＲＮＡが、修飾ｍＲＮＡである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び／またはｇＲＮＡが、核酸ベクター及び／または脂質ナノ粒子中で投与される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記核酸ベクターが、ウイルスベクターである、請求項５～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ２／８からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項１３または１４に記載の方法。
  15. 前記核酸構築物、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及びｇＲＮＡが、任意の順序及び／または任意の組み合わせで逐次的に投与される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記核酸構築物、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及びｇＲＮＡが、個々にまたは任意の組み合わせで、同時に投与される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または組み合わせたＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤及びｇＲＮＡが、前記核酸構築物を投与する前に投与される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記核酸構築物が、前記ｇＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を投与する前に投与される、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、クラス２のＣａｓヌクレアーゼである、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ニッカーゼである、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、クリベースである、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ニッカーゼまたはクリベース活性を有しない、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記核酸構築物が、双方向性核酸構築物である、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記核酸構築物が、相同性非依存性ドナー構築物である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  29. 前記核酸構築物が、一本鎖または二本鎖である、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記核酸構築物が、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡである、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記双方向性構築物が、前記第ＩＸ因子タンパク質の発現を促進するプロモーターを含まない、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記細胞または細胞集団が、異種シグナルペプチドで第ＩＸ因子を発現する、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記細胞または細胞集団が、アルブミンシグナルペプチドで第ＩＸ因子を発現する、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記細胞または細胞集団が、任意に異種ペプチドと組み合わせて、第ＩＸ因子シグナルペプチドで第ＩＸ因子を発現する、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記細胞または細胞集団が、肝臓細胞であるか、または肝臓細胞を含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記肝臓細胞が、肝細胞である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記核酸が、野生型第ＩＸ因子タンパク質をコードする、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記核酸が、変異体第ＩＸ因子タンパク質をコードする、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記核酸が、変異Ｒ３３８Ｌを有する第ＩＸ因子タンパク質をコードする、請求項３８に記載の方法。
  40. 第ＩＸ因子核酸を細胞または細胞集団に導入する方法であって、第ＩＸ因子タンパク質コード配列を含む双方向性核酸構築物を前記細胞または細胞集団に投与することを含み、それにより、前記細胞または細胞集団において第ＩＸ因子を発現する、前記方法。
  41. 細胞または細胞集団において第ＩＸ因子を発現する方法であって、第ＩＸ因子タンパク質コード配列を含む双方向性核酸構築物を前記細胞または細胞集団に投与することを含み、それにより、前記細胞または細胞集団において第ＩＸ因子を発現する、前記方法。
  42. 前記双方向性核酸構築物が、
    ａ）第ＩＸ因子のコード配列を含む第１のセグメント、及び
    ｂ）第ＩＸ因子のコード配列の逆相補体を含む第２のセグメントを含み、
    前記構築物が、前記第ＩＸ因子の発現を促進するプロモーターを含まない、請求項４０または４１に記載の方法。
  43. 前記双方向性核酸構築物が、前記第ＩＸ因子のコード配列の上流にスプライスアクセプターを含む、請求項２７～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸として、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を投与することをさらに含む、請求項４０～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. ｇＲＮＡを投与することをさらに含む、請求項４０～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記双方向性核酸構築物が、核酸ベクター及び／または脂質ナノ粒子中で投与される、請求項４０～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、核酸ベクター及び／または脂質ナノ粒子中で投与される、請求項４０～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記ｇＲＮＡが、核酸ベクター及び／または脂質ナノ粒子中で投与される、請求項４０～４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記核酸ベクターが、ウイルスベクターである、請求項４６～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ２／８からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項５０または５１に記載の方法。
  53. 前記双方向性核酸構築物、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及びｇＲＮＡが、任意の順序及び／または任意の組み合わせで逐次的に投与される、請求項４０～５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記双方向性核酸構築物、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及びｇＲＮＡが、任意の組み合わせで、同時に投与される、請求項４０～５２のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または組み合わせたＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤及びｇＲＮＡが、前記双方向性核酸構築物を投与する前に投与される、請求項４０～５３のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記双方向性核酸構築物が、前記ｇＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を投与する前に投与される、請求項４０～５３のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記双方向性核酸構築物、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及びｇＲＮＡが、任意の組み合わせで、互いに１時間以内に投与される、請求項４０～５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記双方向性構築物が、前記第ＩＸ因子タンパク質の発現を促進するプロモーターを含まない、請求項４０～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記双方向性構築物が、一本鎖または二本鎖である、請求項４０～５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記核酸構築物が、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡである、請求項４０～５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記ｇＲＮＡが、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、もしくは７５％同一である配列を含む、請求項４０～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 第ＩＸ因子核酸を細胞または細胞集団に導入する方法であって、
    ｉ）第ＩＸ因子タンパク質コード配列を含む双方向性核酸構築物と、
    ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、
    ｉｉｉ）セーフハーバー遺伝子座を標的とする配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、を投与することを含み、
    それにより、前記第ＩＸ因子核酸を前記細胞または前記細胞集団に導入する、前記方法。
  63. 細胞または細胞集団において第ＩＸ因子を発現する方法であって、
    ｉ）第ＩＸ因子タンパク質コード配列を含む双方向性核酸構築物と、
    ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、
    ｉｉｉ）前記細胞または細胞集団においてセーフハーバー遺伝子座を標的とする配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、を投与することを含み、
    それにより、前記細胞または細胞集団において第ＩＸ因子を発現する、前記方法。
  64. 前記投与が、インビトロである、請求項６２または６３に記載の方法。
  65. 前記投与が、インビボである、請求項６２または６３に記載の方法。
  66. 前記ｇＲＮＡが、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、もしくは７５％同一である配列を含む、請求項６２～６５のいずれか１項に記載の方法。
  67. 細胞において第ＩＸ因子を発現するのに使用するための組成物であって、
    ｉ）第ＩＸ因子タンパク質コード配列を含む核酸構築物と、
    ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、
    ｉｉｉ）配列番号２～３３からなる群から選択されるガイド配列、または配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、を含む、前記組成物。
  68. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸である、請求項４０～６７のいずれか１項に記載の方法または組成物。
  69. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項４０～６８のいずれか１項に記載の方法または組成物。
  70. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸である、請求項６９に記載の方法または組成物。
  71. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである、請求項４０～６９のいずれか１項に記載の方法または組成物。
  72. 前記ｍＲＮＡが、修飾ｍＲＮＡである、請求項７１に記載の方法または組成物。
  73. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、クラス２のＣａｓヌクレアーゼである、請求項６９～７２のいずれか１項に記載の方法または組成物。
  74. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項６９～７３のいずれか１項に記載の方法または組成物。
  75. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓヌクレアーゼ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉヌクレアーゼ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓヌクレアーゼ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレアーゼ、及びそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項６９～７４のいずれか１項に記載の方法または組成物。
  76. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはそのバリアントである、請求項７５に記載の方法または組成物。
  77. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する、請求項６９～７６のいずれか１項に記載の方法または組成物。
  78. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ニッカーゼである、請求項６９～７７のいずれか１項に記載の方法または組成物。
  79. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、クリベースである、請求項６９～７７のいずれか１項に記載の方法または組成物。
  80. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ニッカーゼまたはクリベース活性を有しない、請求項６９～７７のいずれか１項に記載の方法。
  81. 細胞または細胞集団において第ＩＸ因子を発現するのに使用するための組成物であって、第ＩＸ因子タンパク質コード配列を含む双方向性核酸構築物を含む、前記組成物。
  82. 先行請求項のいずれかに記載の方法によってまたは組成物を使用して作製された宿主細胞。
  83. 前記宿主細胞が、肝臓細胞である、請求項８２に記載の宿主細胞。
  84. 前記宿主細胞が、非分裂細胞型である、請求項８２または８３に記載の宿主細胞。
  85. 前記宿主細胞が、前記双方向性構築物によってコードされる前記第ＩＸ因子ポリペプチドを発現する、請求項８２～８４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  86. 前記宿主細胞が、肝細胞である、請求項８２～８５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  87. 前記ｇＲＮＡが、配列番号４０１を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法、組成物、または宿主細胞。
  88. 第ＩＸ因子欠乏症を治療する方法であって、前記第ＩＸ因子欠乏症を有する個体に、
    ｉ）第ＩＸ因子タンパク質コード配列を含む双方向性核酸構築物と、
    ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする配列と、
    ｉｉｉ）セーフハーバー遺伝子座を標的とする配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、を投与することを含み、
    それにより、前記個体において前記第ＩＸ因子タンパク質を発現する、前記方法。
  89. 治療有効量の前記第ＩＸ因子タンパク質を発現することを含む、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記個体において治療有効レベルの循環第ＩＸ因子凝固活性を達成することを含む、請求項８８または８９に記載の方法。
  91. 前記個体が、ヒトである、請求項８８～９０のいずれか１項に記載の方法。
  92. 正常の少なくとも約１％、例えば、正常の少なくとも約５％の循環ＦＩＸ活性またはＦＩＸタンパク質レベルを達成することをさらに含む、請求項８８～９１のいずれか１項に記載の方法。
  93. 前記循環ＦＩＸ活性またはＦＩＸタンパク質レベルが、正常の約１５０％未満である、請求項８８～９２のいずれか１項に記載の方法。
  94. 正常の少なくとも約１％～約１５０％の循環ＦＩＸ活性またはＦＩＸタンパク質レベルを達成することをさらに含む、請求項８８～９３のいずれか１項に記載の方法。
  95. 前記個体のベースラインＦＩＸ活性を上回る、正常ＦＩＸ活性の少なくとも約１％のＦＩＸ活性の増加を達成することをさらに含む、請求項８８～９４のいずれか１項に記載の方法。
  96. 前記個体のベースラインＦＩＸ活性を上回る、正常ＦＩＸ活性の少なくとも約５０％のＦＩＸ活性の増加を達成することをさらに含む、請求項８８～９５のいずれか１項に記載の方法。
  97. 前記個体において、持続的かつ長期的な効果、例えば、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年、または２年の効果を達成することをさらに含む、請求項８８～９６のいずれか１項に記載の方法。
  98. 前記個体の循環アルブミンレベルが、前記双方向性核酸構築物の投与から少なくとも１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、または１年後に正常である、請求項８８～９７のいずれか１項に記載の方法。
  99. 前記個体の循環アルブミンレベルが、前記双方向性核酸構築物の投与から４週間後で維持される、請求項８８～９９のいずれか１項に記載の方法。
  100. 前記個体の循環アルブミンレベルが一時的に低下し、次いで、正常に戻る、請求項８８～９９のいずれか１項に記載の方法。
  101. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む、請求項８８～１００のいずれか１項に記載の方法。
  102. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む、請求項８８～１０１のいずれか１項に記載の方法。
  103. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２～３３からなる群から選択される配列を含む、請求項８８～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  104. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号４０１または４０２を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法、組成物、または宿主細胞。
  105. 前記第ＩＸ因子が、ヒト第ＩＸ因子である、先行請求項のいずれかに記載の方法、組成物、または宿主細胞。
  106. 前記第ＩＸ因子が、組換えヒト第ＩＸ因子である、先行請求項のいずれかに記載の方法、組成物、または宿主細胞。
  107. 前記第ＩＸ因子が、第ＩＸ因子の機能亢進型バリアントである、先行請求項のいずれかに記載の方法、組成物、または宿主細胞。
  108. 前記第ＩＸ因子が、Ｒ３３８で置換を含むヒト第ＩＸ因子バリアントである、先行請求項のいずれかに記載の方法、組成物、または宿主細胞。
  109. 個体における第ＩＸ因子欠乏症の治療のための、先行請求項のいずれかに記載の組成物または構築物の使用。
  110. 個体における血友病Ｂの治療のための、先行請求項のいずれかに記載の組成物または構築物の使用。
  111. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  112. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号３の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  113. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号４の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  114. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号５の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  115. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号６の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  116. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号７の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  117. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号８の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  118. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号９の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  119. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号１０の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  120. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号１１の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  121. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号１２の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  122. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号１３の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  123. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号１４の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  124. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号１５の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  125. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号１６の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  126. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号１７の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  127. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号１８の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  128. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号１９の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  129. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２０の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  130. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２１の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  131. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２２の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  132. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２３の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  133. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２４の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  134. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２５の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  135. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２６の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  136. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２７の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  137. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２８の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  138. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２９の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  139. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号３０の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  140. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号３１の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  141. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号３２の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  142. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号３３の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
  143. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２～５、１０～１７、２１～２７、及び２９～３３からなる群からの核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
JP2021521112A 2018-10-18 2019-10-18 第ｉｘ因子を発現するための組成物及び方法 Pending JP2022512731A (ja)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862747509P 2018-10-18 2018-10-18
US62/747,509 2018-10-18
US201962829009P 2019-04-03 2019-04-03
US62/829,009 2019-04-03
US201962829621P 2019-04-04 2019-04-04
US62/829,621 2019-04-04
US201962840352P 2019-04-29 2019-04-29
US62/840,352 2019-04-29
PCT/US2019/057090 WO2020082046A2 (en) 2018-10-18 2019-10-18 Compositions and methods for expressing factor ix

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022512731A true JP2022512731A (ja) 2022-02-07
JPWO2020082046A5 JPWO2020082046A5 (ja) 2022-10-27

Family

ID=68732041

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021521112A Pending JP2022512731A (ja) 2018-10-18 2019-10-18 第ｉｘ因子を発現するための組成物及び方法

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20200289628A1 (ja)
EP (1) EP3867380A2 (ja)
JP (1) JP2022512731A (ja)
KR (1) KR20210102881A (ja)
CN (1) CN113260701A (ja)
AU (1) AU2019360270A1 (ja)
BR (1) BR112021007301A2 (ja)
CA (1) CA3116331A1 (ja)
CO (1) CO2021006365A2 (ja)
IL (1) IL282238A (ja)
MX (1) MX2021004277A (ja)
PH (1) PH12021550846A1 (ja)
SG (1) SG11202103734PA (ja)
TW (1) TW202027799A (ja)
WO (1) WO2020082046A2 (ja)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113166754A (zh) 2018-10-16 2021-07-23 蓝色等位基因有限责任公司 用于将dna靶向插入基因中的方法
KR20220017939A (ko) * 2019-06-07 2022-02-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 알부민 좌위를 포함하는 비-인간 동물
AU2022379633A1 (en) 2021-10-27 2024-04-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for expressing factor ix for hemophilia b therapy
WO2023077053A2 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5
TW202332767A (zh) 2022-02-02 2023-08-16 美商雷傑納榮製藥公司 用於治療龐貝氏症之抗ＴｆＲ：ＧＡＡ及抗ＣＤ６３：ＧＡＡ插入
WO2023212677A2 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
WO2023220603A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
WO2023235726A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr interference therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
WO2024040222A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Generation Bio Co. Cleavable closed-ended dna (cedna) and methods of use thereof
WO2024073606A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody resistant modified receptors to enhance cell-based therapies
WO2024098002A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
WO2024107765A2 (en) 2022-11-14 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016521975A (ja) * 2013-05-15 2016-07-28 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 遺伝的状態の処置のための方法および組成物
JP2017500061A (ja) * 2013-12-09 2017-01-05 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド ゲノム操作のための方法および組成物
WO2017091512A1 (en) * 2015-11-23 2017-06-01 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for engineering immunity
WO2017093804A2 (en) * 2015-12-01 2017-06-08 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of alpha-1 antitrypsin deficiency
JP2022513365A (ja) * 2018-10-16 2022-02-07 ブルーアレル， エルエルシー 遺伝子へのｄｎａの標的化挿入のための方法

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
ATE74164T1 (de) 1985-04-22 1992-04-15 Genetics Inst Herstellung mit hoher leistung des aktivfaktors ix.
US4994371A (en) 1987-08-28 1991-02-19 Davie Earl W DNA preparation of Christmas factor and use of DNA sequences
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
FR2638643B1 (fr) 1988-11-09 1991-04-12 Transgene Sa Sequence d'adn codant pour le facteur ix humain ou une proteine analogue, vecteur d'expression, cellules transformees, procede de preparation du facteur ix et produits obtenus correspondants
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
DK1695979T3 (da) 1991-12-24 2011-10-10 Isis Pharmaceuticals Inc Gappede modificerede oligonukleotider
AU696455C (en) 1994-03-23 2006-03-02 Case Western Reserve University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
GB9408717D0 (en) 1994-05-03 1994-06-22 Biotech & Biolog Scien Res DNA sequences
US6169169B1 (en) 1994-05-19 2001-01-02 Dako A/S PNA probes for detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis
US6531298B2 (en) 1997-07-21 2003-03-11 The University Of North Carolina At Chapel Hill Factor IX antihemophilic factor with increased clotting activity
EP2423305A1 (en) 2006-06-19 2012-02-29 Catalyst Biosciences, Inc. Modified coagulation factor IX polypeptides and use thereof for treatment
JP2011518555A (ja) 2008-04-14 2011-06-30 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 標的組込みのための線形ドナーコンストラクト
KR101759586B1 (ko) 2008-08-22 2017-07-19 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 표적화된 단일가닥 분할 및 표적화된 통합을 위한 방법 및 조성물
WO2011100058A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
DE202013012242U1 (de) 2012-05-25 2016-02-02 Emmanuelle Charpentier Zusammensetzungen für die durch RNA gesteuerte Modifikation einer Ziel-DNA und für die durch RNA gesteuerte Modulation der Transkription
DE202013012597U1 (de) 2012-10-23 2017-11-21 Toolgen, Inc. Zusammensetzung zum Spalten einer Ziel-DNA, umfassend eine für die Ziel-DNA spezifische guide-RNA und eine Cas-Protein-codierende Nukleinsäure oder ein Cas-Protein, sowie deren Verwendung
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
EA030650B1 (ru) 2013-03-08 2018-09-28 Новартис Аг Липиды и липидные композиции для доставки активных агентов
US10059655B2 (en) 2013-12-19 2018-08-28 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
US20150376586A1 (en) 2014-06-25 2015-12-31 Caribou Biosciences, Inc. RNA Modification to Engineer Cas9 Activity
US10342761B2 (en) 2014-07-16 2019-07-09 Novartis Ag Method of encapsulating a nucleic acid in a lipid nanoparticle host
CA2969151A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for identifying and enriching for cells comprising site specific genomic modifications
EP3858990A1 (en) 2015-03-03 2021-08-04 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases with altered pam specificity
WO2017004279A2 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Massachusetts Institute Of Technology Compositions comprising nucleic acids and methods of using the same
MX2018005332A (es) * 2015-11-06 2018-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materiales y metodos para tratamiento de la enfermedad de almacenamiento de glucogeno tipo 1a.
US11845933B2 (en) 2016-02-03 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide RNA and its applications
US20190136231A1 (en) 2016-03-30 2019-05-09 Intellia Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations for crispr/cas components
BR112019011509A2 (pt) 2016-12-08 2020-01-28 Intellia Therapeutics Inc rnas guias modificados
GB2566453B (en) 2017-09-12 2021-01-13 Univ Of Northumbria At Newcastle Impactor for aerosol component collection
SG11202002562QA (en) 2017-09-29 2020-04-29 Intellia Therapeutics Inc Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing
CN111727251A (zh) * 2017-11-21 2020-09-29 克里斯珀医疗股份公司 用于治疗常染色体显性色素性视网膜炎的材料和方法
CN113166748A (zh) * 2018-08-10 2021-07-23 逻辑生物治疗公司 用于治疗mma的非破坏性基因疗法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016521975A (ja) * 2013-05-15 2016-07-28 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 遺伝的状態の処置のための方法および組成物
JP2017500061A (ja) * 2013-12-09 2017-01-05 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド ゲノム操作のための方法および組成物
JP2017504354A (ja) * 2013-12-09 2017-02-09 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 血友病を処置するための方法および組成物
WO2017091512A1 (en) * 2015-11-23 2017-06-01 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for engineering immunity
WO2017093804A2 (en) * 2015-12-01 2017-06-08 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of alpha-1 antitrypsin deficiency
JP2022513365A (ja) * 2018-10-16 2022-02-07 ブルーアレル， エルエルシー 遺伝子へのｄｎａの標的化挿入のための方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLOOD, vol. 126, no. 15, JPN5022001112, 2015, pages 1777 - 1784, ISSN: 0005144827 *

Also Published As

Publication number Publication date
BR112021007301A2 (pt) 2021-07-27
CN113260701A (zh) 2021-08-13
CA3116331A1 (en) 2020-04-23
EP3867380A2 (en) 2021-08-25
WO2020082046A2 (en) 2020-04-23
AU2019360270A1 (en) 2021-05-27
SG11202103734PA (en) 2021-05-28
US20200289628A1 (en) 2020-09-17
IL282238A (en) 2021-05-31
KR20210102881A (ko) 2021-08-20
MX2021004277A (es) 2021-09-08
WO2020082046A3 (en) 2020-08-13
CO2021006365A2 (es) 2021-08-19
TW202027799A (zh) 2020-08-01
PH12021550846A1 (en) 2021-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2022512731A (ja) 第ｉｘ因子を発現するための組成物及び方法
JP7472121B2 (ja) アルブミン遺伝子座からの導入遺伝子発現のための組成物及び方法
US20240110179A1 (en) Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (a1at) deficiency
US20210316014A1 (en) Nucleic acid constructs and methods of use
EP3786294A1 (en) Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
EP3443088A1 (en) Grna fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
KR20180069054A (ko) 간-특이적 작제물인, 인자 viii 발현 카세트 및 이의 사용 방법
JP2022505381A (ja) アルファ１アンチトリプシン欠乏症を治療するための組成物及び方法
US20230149563A1 (en) Compositions and methods for expressing factor ix for hemophilia b therapy
WO2023064918A1 (en) Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiency

Legal Events

Date Code Title Description
RD01 Notification of change of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426

Effective date: 20220218

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20220218

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221018

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20221018

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230905

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20231205

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240304

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240423