JP2017500061A - ゲノム操作のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年12月9日に出願された米国仮特許出願第61/913,838号および2014年2月24日に出願された米国仮特許出願第61/943,884号の利益を主張し、その開示はそれらの全体が本明細書に参考として援用される。
該当なし。
本開示は、遺伝子改変および血友病の処置の分野にある。
遺伝子療法の特に魅力的な適用は、分泌された遺伝子産物の不全が原因の障害、または治療タンパク質の分泌によって処置可能な障害の処置に関与する。このような障害は、中程度の数の細胞への治療用導入遺伝子の送達により取り組むことができる可能性があるが、これは各レシピエント細胞が、高レベルの治療用遺伝子産物を発現することを条件とする。このようなシナリオにおいて、多数の細胞への遺伝子送達の必要からの解放は、他の方法では難治性の適応症に対する遺伝子療法の開発成功を可能にし得る。このような適用は、永続的で安全かつ非常に高レベルの導入遺伝子発現を必要とすると予想される。よって、これらの特性を提示するセーフハーバー(safe harbor)の開発は、遺伝子療法の分野において実質的な有用性をもたらすと予想される。
このヌクレアーゼ媒介性標的化導入遺伝子挿入アプローチは、遺伝子サイレンシングまたは近隣の癌遺伝子活性化の最小リスクのための正確な導入遺伝子配置を可能にするため、古典的組込みアプローチと比較して、改善された導入遺伝子発現、高められた安全性および発現耐久性の見込みをもたらす。
導入遺伝子の標的化組込みは、その同族遺伝子座への、例えば、変異体遺伝子を補正するための内在性遺伝子座への野生型導入遺伝子の挿入であり得る。あるいは、導入遺伝子は、非同族遺伝子座、例えば、「セーフハーバー」遺伝子座に挿入することができる。CCR5、HPRT、AAVS1、Rosaおよびアルブミンを含む、数種類のセーフハーバー遺伝子座が記載されている。例えば、米国特許第7,951,925号および同第8,110,379号;米国出願公開第20080159996号;同第201000218264号;同第20120017290号;同第20110265198号;同第20130137104号;同第20130122591号;同第20130177983号および同第20130177960号、ならびに米国出願第14/278,903号を参照されたい。例えば、米国特許出願公開第20110027235号は、単離された幹細胞への機能的タンパク質の標的化組込みに関し、米国特許出願公開第20120128635号は、血友病Bを処置する方法について記載する。加えて、米国特許出願公開第2014−0017212号および同第2014−0112896号は、リソソーム蓄積症を処置する方法について記載する。Liら(2011年)Nature 475巻(7355号):217〜221頁およびAnguelaら(2013年)Blood 122巻:3283〜3287頁も参照されたい。
in vivoでのアルブミンプロモーター(例えば、内在性または外来性アルブミンプロモーター)の制御下における導入遺伝子の発現に使用することができる方法および組成物が、本明細書に開示されている。一部の態様において、導入遺伝子は、目的の治療タンパク質をコードすることができる。本発明の方法を、欠損または欠如しているタンパク質の産生(例えば、「タンパク質補充」)に使用することができるように、導入遺伝子は、タンパク質をコードすることができる。一部の事例では、タンパク質は、リソソーム蓄積症の処置に関与し得る。表皮水疱症、糖尿病、がん、凝固障害またはAAT欠損肺気腫と同様に多様な状態に対するタンパク質療法を含む、他の治療タンパク質を発現させることができる。他の態様において、発現されたタンパク質が新規かつ望ましい特色(半減期の延長、血漿クリアランス特徴の変化等)をもたらす特徴を有するように、導入遺伝子は、配列(例えば、操作された配列)を含むことができる。操作された配列は、アルブミン配列に由来するアミノ酸を含むこともできる。一部の態様において、導入遺伝子は、治療タンパク質、治療ホルモン、血漿タンパク質、および抗体などをコードする。一部の態様において、導入遺伝子は、凝固障害等の血液障害に関与するタンパク質をコードすることができる。一部の態様において、導入遺伝子は、構造核酸(shRNA、RNAi、およびmiRNAなど)をコードする。
改変前のその発現または遺伝子配列が異常であり、疾患または障害、例えば、血友病またはリソソーム蓄積症(LSD)に関連する1種または複数種のタンパク質を産生するように細胞を改変するための組成物および方法が、本明細書に開示されている。細胞は、細胞のセーフハーバー遺伝子(例えば、アルブミン)への、1種または複数種の機能的タンパク質をコードする導入遺伝子の標的化挿入により改変される。一部の実施形態において、導入遺伝子は、内在性アルブミン遺伝子に挿入される。導入遺伝子は、血友病に関与するいずれかのタンパク質またはペプチド、例えば、第VII因子、F8、F.IX、第X因子、GBA、GLA、IDS、IDUA、SMPD1および/またはこれらの機能的断片をコードすることができる。本明細書に記載されている細胞を使用して、および/または本明細書に記載されている通りに細胞を改変することにより(ex vivoまたはin vivo)、1種または複数種のタンパク質が欠如または欠損する障害(例えば、血友病またはリソソーム蓄積症)を処置する方法も開示される。細胞を改変するためのヌクレアーゼおよびドナー分子をコードする核酸を含む組成物と、in vivoまたはex vivoで細胞を改変するための方法がさらに記載される。その上、本発明の方法および組成物によって改変された細胞を含む組成物が記載される。
本明細書に開示される方法、ならびに組成物の調製および使用の実施は、特に示さない限り、本技術分野の技術範囲内の、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えDNAならびに関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、SambrookらMOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年および第3版、2001年;Ausubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John Wiley & Sons、New York、1987年および定期的更新;シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY、Academic Press、San Diego;Wolffe、CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION、第3版、Academic Press、San Diego、1998年;METHODS IN ENZYMOLOGY、304巻、「Chromatin」(P.M. WassarmanおよびA. P. Wolffe編)、Academic Press、San Diego、1999年;ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY、119巻、「Chromatin Protocols」(P.B. Becker編)Humana Press、Totowa、1999年を参照されたい。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用され、直鎖状または環状コンフォメーションの、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的のため、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈すべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および/またはリン酸部分(例えば、ホスホロチオエート骨格)において修飾されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有する;即ち、Aのアナログは、Tと塩基対合する。
疾患または障害を有する被験体において欠如する、欠損するまたは異常に発現される機能的タンパク質(例えば、LSDの被験体において欠如または欠損するタンパク質および/または血友病AまたはBの被験体由来のまたは被験体中の細胞のゲノムにおける凝固因子(例えば、F8および/またはF.IX)タンパク質)をコードする配列の組込みにおいて有用な組成物、特に、ヌクレアーゼが、本明細書に記載されている。ある特定の実施形態では、このヌクレアーゼは、天然起源である。他の実施形態では、このヌクレアーゼは、非天然起源である、即ち、DNA結合ドメインおよび/または開裂ドメインにおいて操作されている。例えば、天然起源のヌクレアーゼのDNA結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように変更され得る(例えば、同族結合部位とは異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ)。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のDNA結合ドメインおよび開裂ドメイン(例えば、異種開裂ドメインを有する、ジンクフィンガーヌクレアーゼ;TALエフェクタードメインDNA結合タンパク質;メガヌクレアーゼDNA結合ドメイン)ならびに/または操作された単一ガイドRNAを利用するCRISPR/Cas系などの系を含む。
本明細書に開示されている組成物および方法において、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、TALE DNA結合ドメイン、CRISPR/CasヌクレアーゼのDNA結合部分またはメガヌクレアーゼ由来のDNA結合ドメインが挙げられるがこれらに限定されない、いかなるDNA結合ドメインを使用することもできる。
いずれか適した開裂ドメインをDNA結合ドメインに操作可能に連結して、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALENまたはCRISPR/Casヌクレアーゼ系等、ヌクレアーゼを形成することができる。例えば、米国特許第7,951,925号;同第8,110,379号および同第8,586,526号;米国特許出願公開第20080159996号;同第201000218264号;同第20120017290号;同第20110265198号;同第20130137104号;同第20130122591号;同第20130177983号および同第20130177960号ならびに米国仮特許出願第61/823,689号を参照されたい。
上に詳細に記載したように、DNA結合ドメインは、(例えば、アルブミンなどのセーフハーバー遺伝子座における)選択された任意の配列に結合するように操作され得る。操作されたDNA結合ドメインは、天然起源のDNA結合ドメインと比較して、新規結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、トリプレット(またはクアドルプレット)ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各トリプレットまたはクアドルプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの1種または複数種のアミノ酸配列と関連する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有に係る米国特許第6,453,242号および同第6,534,261号を参照されたい。TALエフェクタードメインの合理的設計もまた実施され得る。例えば、米国特許第8,586,526号を参照されたい。
本明細書に記載されているヌクレアーゼ媒介性標的化組込みによりいかなるドナーを挿入し得る。ある特定の実施形態において、ドナーは、治療タンパク質、例えば、疾患または障害の被験体において欠如する、欠損するおよび/または異常に発現されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド(導入遺伝子)を含む。このような障害の非限定例として、表皮水疱症、糖尿病、がん、凝固障害またはAAT欠損肺気腫、凝固障害および/またはリソソーム蓄積症が挙げられる。
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されているタンパク質および/またはポリヌクレオチドを含む組成物を、任意の適当な手段によってin vivoまたはex vivoで送達してもよい。
本発明の方法および組成物は、標的化された細胞からタンパク質(複数可)が分泌されるように、1種または複数種のタンパク質をコードする導入遺伝子を供給することが望ましいいずれかの状況において使用することができる。よって、本技術は、患者が、問題(例えば、発現レベルにおける問題または正常機能に満たないもしくは機能しない状態で発現されるタンパク質に伴う問題)のせいで、あるタンパク質を欠損する状態に有用である。その上、分泌性器官による外来性タンパク質の供給によって緩和され得る、COPDもしくは肝臓損傷等、A1AT欠損障害または他の障害、状態もしくは疾患は、本発明の方法および組成物により処置成功させることができる。リソソーム蓄積症は、糖尿病等の代謝性疾患と同様に、本発明の方法および組成物によって処置することができる。
in vivoにおけるF8導入遺伝子の標的化組込み
HA/CD4−/−マウスに、米国特許出願公開第20120128635号に記載されている通り、(1)対照AAV2/8ベクターおよびF8をコードするAAV2/8ドナー導入遺伝子(「Mock+ドナー」)または(2)アルブミン遺伝子座を標的化するZFN対をコードするAAVベクター(米国特許出願公開第20130177983号ならびに図10Aおよび図10Bに記載)およびF8をコードするAAVドナー導入遺伝子(「ZFN+ドナー」)のいずれかを、両者共に尾静脈への注射により投与した。ドナーは、図1および図2に模式的に示す通りに使用され、およそ4.4〜4.7kbのサイズのプロモーターなしB−ドメイン欠失第VIII因子(BDD−F8)cDNAを含む。2種の投薬レベル、AAV8−ZFN(1e11vg/マウス)+AAV8−ドナー(1e11vg/マウス)を含む「低」投薬レベル:図3B;およびAAV8−ZFN(5e11vg/マウス)+AAV8−ドナー(5e11vg/マウス)を含む「高」投薬レベル:図3Cで、用量をマウスに投与した。
in vivoにおけるF9導入遺伝子の標的化組込み
A.ヒト肝細胞
本発明者らは先ず、ヒトアルブミンの第1のイントロン内の部位を標的とするZFN対をコードするmRNAのトランスフェクションと共に、F9ドナーを含有するAAV6ベクターをヒト初代肝細胞に形質導入した。
本発明者らは次に、マウスにおけるin vivoでのこのアプローチを実証しようと努力した。これを達成するために、本発明者らは先ず、後述する通り、マウスアルブミンイントロン1(図12に示す)における類似の位置を標的とするZFN対を操作し(下の表1に示す)、マウスヘパトーマ細胞におけるin vitroでの対の活性を確認した。
より大型の動物におけるZFN駆動されたゲノム改変および導入遺伝子挿入を検査するため、2種の試験を行った。使用したZFNを下の表2に示す。標的配列における大文字は、結合されるヌクレオチドを表示し、小文字は、結合されないヌクレオチドを表示する。
ヒトアルブミン特異的ヌクレアーゼの設計、構築および全般的特徴付け
アルブミンに標的化されたヌクレアーゼ(例えば、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas)は、米国特許出願公開第20130177983号および同第20130177960号ならびに米国特許出願第14/278,903号に記載されている。これらの実験のため、ZFPを含むZFN(操作された開裂ドメインに作動可能に連結した)を使用して、ヒト細胞における内在性アルブミン遺伝子座を開裂した。ヒトアルブミン特異的対を下の表5に示す。表5におけるあらゆるヌクレアーゼは、その標的に結合した。
ヒトアルブミン特異的ZFNを使用したLSDドナーの組込み
これらの実験のため、AAV2/8粒子によりIDS cDNAドナーまたはIDUA cDNAドナーを送達し、このcDNA導入遺伝子は、カット部位を挟むアルブミン領域の相同性アームを含んだ。これらのドナー構築物において、治療用遺伝子は、アルブミン遺伝子に相同な配列に挟まれていた。導入遺伝子の5’、ドナー構築物は全て、マウスアルブミンイントロン1に相同な配列を含有する一方、遺伝子の3’、構築物は、マウスアルブミンイントロン1−エクソン2境界に相同な配列を含有する(米国特許出願公開第2014−0017212号に記載)。
Claims (17)
- 表1、2または5の単一の行に示す通りのF1からF5またはF1からF6と命名されて並べられた5または6個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質。
- 請求項1に記載のジンクフィンガータンパク質と、野生型または操作された開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインとを含む融合タンパク質。
- 請求項1または請求項2に記載の1種または複数種のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 前記ベクターが、AAVベクターである、請求項4に記載の発現ベクター。
- 前記AAVベクターが、AAV2/8ベクターである、請求項5に記載の発現ベクター。
- 請求項4〜6のいずれかに記載の発現ベクターを含む医薬組成物。
- 細胞におけるアルブミン遺伝子を開裂する方法であって、
前記1種または複数種のタンパク質が発現され、該アルブミン遺伝子が開裂されるような条件下で、請求項4〜6のいずれかに記載の1種または複数種の発現ベクターを該細胞に導入するステップ
を含む方法。 - 改変が、開裂された前記アルブミン遺伝子へのドナー配列の組み込みを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記ドナー配列が、AAVベクターを使用して導入される、請求項9に記載の方法。
- 前記AAVベクターが、AAV2/8ベクターである、請求項10に記載の方法。
- 前記ドナー配列が、リソソーム蓄積症(LSD)において欠如または欠損するタンパク質をコードする、請求項8〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞が、肝臓細胞である、請求項8〜12のいずれかに記載の方法。
- リソソーム蓄積症の患者を処置する方法であって、リソソーム蓄積症の被験体において欠如する機能的タンパク質をコードする導入遺伝子の、内在性アルブミン遺伝子への標的化組込みを媒介する、請求項4〜6のいずれかに記載の発現ベクターまたは請求項7に記載の医薬組成物を該患者に投与するステップを含む方法。
- 系が、
(i)ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第1のポリヌクレオチドであって、該ジンクフィンガーヌクレアーゼが、FokI開裂ドメインと、F1からF5またはF1からF6に並べられた5または6個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質とを含み、各ジンクフィンガードメインが、認識ヘリックス領域を含み、該ジンクフィンガータンパク質の該認識ヘリックス領域が、表1、2または5の単一の行に示される第1のポリヌクレオチドと、
(ii)ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第2のポリヌクレオチドであって、該ジンクフィンガーヌクレアーゼが、FokI開裂ドメインと、F1からF5またはF1からF6に並べられた5または6個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質とを含み、各ジンクフィンガードメインが、認識ヘリックス領域を含み、該ジンクフィンガータンパク質の該認識ヘリックス領域が、表1、2または5の単一の行に示される第2のポリヌクレオチドと、
(iii)リソソーム蓄積症の被験体において欠如するタンパク質をコードするドナーを含む発現ベクターと
を含む、請求項14に記載の方法。 - 前記発現ベクター(複数可)または医薬組成物および導入遺伝子が、静脈内投与される、請求項14または請求項15に記載の方法。
- 請求項4〜6のいずれかに記載の発現ベクターを含むキット。
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