JP7432581B2 - ムコ多糖症ｉｉ型の処置のための方法 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１８年８月７日に出願した米国仮出願第６２／７１５，６９０号、２０１８年８月３１日に出願した米国仮出願第６２／７２５，８０３号、２０１８年９月４日に出願した米国仮出願第６２／７２６，７４５号、２０１８年９月５日に出願した米国仮出願第６２／７２７，４６５号、２０１９年２月６日に出願した米国仮出願第６２／８０２，１０４号、および２０１９年２月７日に出願した米国仮出願第６２／８０２，５５８号の利益を主張する。これらの出願の開示は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は、ハンター症候群としても公知のムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩ）を処置するための方法、および遺伝子療法に関する。
背景
リソソーム蓄積病（ＬＳＤ）は、通常、脂質、グリコサミノグリカン（glycosoaminoglycan）、即ち、ＧＡＧなどのムコ多糖を含む細胞老廃物の分解に関与する機能的な個々のリソソームタンパク質の欠如によって特徴付けされる、希少な代謝的単一遺伝子疾患の群である。ハンター症候群とも称されるムコ多糖症ＩＩ（ＭＰＳ ＩＩ）は、主に男性に見出されるＸ連鎖型劣性リソソーム蓄積障害である（Burton & Giugliani (2012) Eur J Pediatr. (2012) Apr;171(4):631-9）。この疾患は、尿、血漿および組織におけるＧＡＧの蓄積によって特徴付けされ、多系統進行性疾患を引き起こす（Muenzer (2014) Mol Gen Metabol 111:63-72）。重症型ハンター症候群を有する無処置対象の平均余命は、１０代半ばの年齢であり、神経学的増悪および／または心肺不全により死亡する（Sato et al. (2013) Pediatr Cardiol. 34(8): 2077-2079）。
ＭＰＳ ＩＩのために現在承認されている唯一の治療法は、酵素補充療法（ＥＲＴ）である。組換えイズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質（イデュルスルファーゼ；Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）、Ｓｈｉｒｅ）による静脈内（ＩＶ）ＥＲＴは、２００６年以来、体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇの用量での１週間毎に１回の投与についてＵＳ ＦＤＡ承認されており、５歳およびそれより年上のＭＰＳ ＩＩ対象における歩行能力を改善することが示された。ＥＲＴの限界は、生涯にわたる処置の必要、中和抗体の発生、酵素が血液脳関門を通過できないこと、および毎週の静脈内注入の不便を含む。まとめると、これらの限界は、ＭＰＳ ＩＩのためのより広範囲の治癒的療法を開発する緊急の必要性を強調する。
Burton & Giugliani (2012) Eur J Pediatr. (2012) Apr;171(4):631-9 Muenzer (2014) Mol Gen Metabol 111:63-72 Sato et al. (2013) Pediatr Cardiol. 34(8): 2077-2079
概要
対象におけるハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）を処置および／または予防するための組成物および方法が本明細書に開示される。本開示は、ゲノム編集および／または遺伝子移入のための方法および組成物を提供する。本開示は、ＭＰＳ ＩＩを有する対象を処置する方法であって、１種または複数種のポリヌクレオチドを対象に投与するステップを含み、対象が処置される、方法を提供する。本明細書に提供される処置方法は、追加の処置手順および／またはＭＰＳ ＩＩに関連する１つもしくは複数の症状の開始、進行もしくは重症度を低減、延期および／または排除する方法を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供される処置方法は、処置されている対象の尿におけるＧＡＧを低減、安定化または排除する方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、追加の処置手順の前、その間およびその後を含めて、対象における尿中ＧＡＧレベルを低減、安定化または排除する。一部の実施形態では、本明細書に提供される処置方法は、血漿におけるＩＤＳの濃度を増加または安定化する。一部の実施形態では、本明細書に提供される処置方法は、血漿におけるＩＤＳの濃度を増加または安定化しつつ、尿中ＧＡＧレベルの低減、安定化または排除をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に提供される処置方法は、尿中ＧＡＧレベルの低減、安定化または排除をもたらし、血漿におけるＩＤＳの濃度は、検出レベルを下回る。一部の実施形態では、総ＡＡＶ用量は、ＺＦＮコード配列を含む２種のベクター、およびＩＤＳドナー配列を含む１種のベクターを、１：１：８の固定比で含む。
一部の実施形態では、低減、延期および／または排除される追加の処置手順は、酵素補充療法（ＥＲＴ）ならびに／または骨髄移植ならびに／または整形外科的、心臓および／もしくは上気道閉塞に対する支持的外科手順を含む。一部の実施形態では、その開始、進行または重症度が低減、延期または排除される、ＭＰＳ ＩＩに関連する症状は、機能的能力の減退、神経学的増悪、関節硬直、車椅子に依存するようになること、身体障害の進行、強制空気陽圧換気（forced air positive ventilation）の要求（人工呼吸器の要求）、および寿命短縮を含む。
本明細書に提供される組成物および方法の目的および理論的根拠は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集を使用して、酵素補充療法の必要性を抑止または減少させることである。本明細書に提供される処置方法は、酵素ヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（ｈＩＤＳ）導入遺伝子の補正コピーをｉｎ ｖｉｖｏで対象自身の肝細胞のゲノムに部位特異的に組み込むことを含む、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の有効用量を用いる。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子の組込みは、アルブミン遺伝子座のイントロン１に標的化され、血液において測定可能な、イズロン酸－２－スルファターゼの安定した肝臓特異的発現および分泌をもたらす。一部の実施形態では、高度に発現される内因性アルブミン遺伝子座の制御下におけるｈＩＤＳ導入遺伝子の配置は、ＭＰＳ ＩＩを有する対象（a subject with MPS II subject）における永続的な肝臓特異的発現をもたらす。
３種のポリヌクレオチドを含む、ＭＰＳ ＩＩを有する対象を処置するための組成物および方法であって、２種のポリヌクレオチドが、ジンクフィンガーヌクレアーゼのパートナーの両半分（halves）（「ペアードＺＦＮ」または「左および右ＺＦＮ」とも称される）をコードし、第３のポリヌクレオチドが、機能的イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）酵素をコードする配列を含む、組成物および方法が本明細書に開示される。一部の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ヒトアルブミン遺伝子に結合しこれを切断する。必要に応じて、ヌクレアーゼコードポリヌクレオチドは、小型のペプチド（ペプチドタグおよび核局在化配列を含むがこれらに限定されない）をコードする配列をさらに含む、および／またはＤＮＡ結合ドメイン領域（例えば、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥの骨格）の１つもしくは複数における変異および／またはＦｏｋＩヌクレアーゼ切断ドメインもしくは切断ハーフドメインにおける１つもしくは複数の変異を含む。これらのポリヌクレオチド構成成分が、個々にまたはいずれかの組合せにおいて使用されると（例えば、いずれかの組合せにおけるＦＬＡＧ、ＮＬＳ、ＷＰＲＥなどのペプチド配列および／またはポリＡシグナル）、本発明の方法および組成物は、増加した効率（例えば、本明細書に記載される配列／改変がないヌクレアーゼと比較して２、３、４、５、６、１０、２０倍またはそれよりも多い切断）および／または標的化特異性を有する人工ヌクレアーゼの発現の驚くべきかつ予想外の増加をもたらす。さらなる実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるＳＢ－４７１７１（ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＬＥＦＴ）またはＳＢ－４７８９８（ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＲＩＧＨＴ）を含むことができる。さらなる実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ＳＢ－７１５５７（ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＬ２）またはＳＢ－７１７２８（ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＲ２）を含むことができる。組成物は、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）酵素をコードするいずれかのドナーヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをさらに含むことができる。一部の実施形態では、ドナーヌクレオチドは、本明細書に開示されるＳＢ－ＩＤＳ（ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＨＮＴ）を含むことができる。一部の実施形態では、３種のポリヌクレオチドは、対象において機能的ＩＤＳタンパク質が発現されるように、ＩＤＳ遺伝子を欠如するＭＰＳ ＩＩを有する対象に送達される。一部の実施形態では、外因性ＩＤＳ遺伝子は、アルブミン遺伝子中にＩＤＳ遺伝子が組み込まれる（挿入される）ように、アルブミン特異的ＺＦＮパートナーの両半分と共に、対象中の細胞に送達される。さらなる実施形態では、ＩＤＳ遺伝子は、ＭＰＳ ＩＩを有する対象が処置されるように、ＩＤＳタンパク質を発現する。一部の実施形態では、対象における尿におけるＧＡＧの濃度（例えば、尿中ＧＡＧレベル）は、本明細書に提供される方法に従った組成物および／または処置の投与後に、低減、安定化または排除される。本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、ＩＤＳレベルは、対象におけるＭＰＳ ＩＩ疾患（例えば、症状）を処置するレベル（例えば、ＩＤＳレベルの正常範囲）まで増加する。対象（肝臓、血漿、尿、白血球、ＣＮＳなど、いずれかの組織または臓器を含む）におけるＩＤＳレベル（例えば、総ＧＡＧを低減させる、デルマタン硫酸レベルを低減させる、ヘパラン硫酸レベルを低減させることにより、治療利益をもたらし、これらの低減は、組織および／または尿中においてなどのことである）は、本明細書に記載される組成物の投与後に、数日間、数週間、数ヶ月間、数年間またはそれよりも長く維持することができ、１～３６５日間（または１０、３０、５０、９０、１００、１５０、２００など、その間のいずれかの値）を含むがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、組成物は、有効用量の操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含んで、ｉｎ ｖｉｖｏで対象自身の肝細胞のアルブミン遺伝子座にヒト酵素イズロン酸－２－スルファターゼ（ｈＩＤＳ）導入遺伝子の補正コピーを部位特異的に組み込む。一部の実施形態では、組成物のポリヌクレオチドは、１種または複数種のＡＡＶ粒子で運ばれる（これにより送達される）。他の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２／６粒子である。ＩＤＳドナーＡＡＶ、左ＺＦＮ ＡＡＶおよび右ＺＦＮ ＡＡＶを含む３種のＡＡＶ２／６構成成分の組合せは、まとめて、本発明の組成物である。ＭＰＳ ＩＩを有する対象を処置するための組成物および方法は、尿におけるＧＡＧの濃度（例えば、尿中ＧＡＧレベル）が処置後に低減、安定化もしくは排除されるような、対象においてｉｎ ｖｉｖｏで活性があり（機能的であり）、ムコ多糖のグリコサミノグリカン、即ち、ＧＡＧを分解することができるｈＩＤＳを提供するのに有効である、および／または血漿における活性ＩＤＳの量の測定可能な増加をもたらす。アルブミン遺伝子座への導入遺伝子配列の挿入のための方法が本明細書に提供され、それによると、導入遺伝子は、発現される（例えば、体液および組織において検出可能である）ｈＩＤＳタンパク質（例えば、機能的な全長またはトランケート型ＩＤＳタンパク質）をコードし、発現されたＩＤＳタンパク質が、導入遺伝子を持たない他の細胞に影響を与えることができるもしくは該細胞によって取り入れられることができるように（バイスタンダー効果または交差補正（cross correction）とも称される）、ＩＤＳタンパク質は、導入遺伝子を含む肝細胞から発現され分泌もしくは放出される、および／または尿ＧＡＧ（例えば、総ＧＡＧ、ＤＳ－ＧＡＧおよび／またはＨＳ－ＧＡＧ）が、ベースラインから安定化もしくは減少するように、該ＩＤＳは、活性である。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物で処置されなかった対象と比較して、追加の処置手順を低減、延期および／または排除する処置方法であって、例えば、有効量のｈＩＤＳ導入遺伝子およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が、対象に投与され、対象は、処置後に追加の処置手順に対する必要性が低減、延期および／または排除される、処置方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、追加の処置手順は、骨髄移植、酵素補充療法および／またはＭＰＳ ＩＩに関連する心臓、気道もしくは整形外科的状態の支持的処置のための外科的手順を含むことができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法において有用なｈＩＤＳ導入遺伝子（例えば、配列番号１５）は、ＡＡＶ２／６送達により送達され（例えば、肝細胞に）、ｈＩＤＳ送達ベクターは、例えば、アルブミン遺伝子座におけるＺＦＮカット部位に隣接する領域に対する特異性を有する、ｈＩＤＳ導入遺伝子に隣接する相同性アーム（例えば、配列番号１３および配列番号１６）をさらに含む。一部の実施形態では、相同性の左アーム（ＬＡ）は、アルブミンイントロン１切断部位の上流の約２８０ヌクレオチド（例えば、配列番号１３）の同一配列を含有し、相同性の右アーム（ＲＡ）は、切断部位の下流の約１００ヌクレオチド（例えば、配列番号１６）の同一配列を含有する。一部の実施形態では、相同性のアームは、相同組換え修復による、アルブミンイントロン１遺伝子座におけるｈＩＤＳ導入遺伝子の標的化組込みを容易にするのに役立つように使用される。一部の実施形態では、相同性アームのサイズは、標的化組込みまたは導入遺伝子発現を阻害し得る、アルブミン遺伝子座における反復配列およびスプライシングエレメントを回避するように選ばれる。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来する。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子ドナーは、３’末端に停止コドンをさらに含んで、例えば、ＩＤＳ導入遺伝子が挿入される内因性アルブミン配列のさらなる転写を防止する。一部の実施形態では、ヒトＩＤＳ導入遺伝子を含有するｒＡＡＶ２／６ドナーベクター（例えば、ＳＢ－ＩＤＳドナー）は、エクソン１プラスエクソン２～９（配列番号１５）の部分を含む部分的ＩＤＳ ｃＤＮＡを含むプロモーターなし構築物である。一部の実施形態では、ｈＦ９エクソン２に由来するスプライスアクセプター部位（例えば、ＳＡ、配列番号１４）が存在して、例えば、アルブミン遺伝子座から成熟ｍＲＮＡへのｈＩＤＳ転写物の効率的スプライシングを可能にし、これは両方の種類のドナー組込み機構（例えば、ＮＨＥＪまたはＨＤＲ）で有効である。一部の実施形態では、ドナーは、ＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３；配列番号１７）と命名された配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法において有用なＺＦＮ（例えば、ＺＦＮ対のメンバー（左および右）ＺＦＮが、２種の別々のベクターにおいて送達されるＺＦＮ）は、それぞれ表１および２ならびにこれらの表に従った配列に示す通り、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶおよびＳＢ－４７８９８ ＡＡＶと命名されたＡＡＶベクターを含む。さらなる実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ＳＢ－７１５５７（ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＬ２）またはＳＢ－７１７２８（ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＲ２）を含むことができる。一部の実施形態では、アルブミン特異的対におけるＺＦＮは、ＡＡＶ２／６送達により送達され（例えば、肝細胞に）、例えば、一方のＡＡＶは、左ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７１７１；配列番号９）を含み、もう一方は、右ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７８９８；配列番号１２）を含む。さらなる実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ＳＢ－７１５５７（ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＬ２、配列番号３０）またはＳＢ－７１７２８（ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＲ２、配列番号３１）を含むことができる。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、例えば、ヒトＡｐｏＥエンハンサーおよびヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターで構成される、肝臓特異的エンハンサーおよびプロモーターの制御下にあるある（Miao CH et al. (2000) Mol. Ther. 1(6):522-532 (200)）。一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、１つまたは複数のＡｐｏＥエンハンサー配列を含む（例えば、１、２、３および／または４種；Okuyama et al. (1996) Hum Gen Ther 7(5):637-45を参照）。一部の実施形態では、プロモーターは、イントロンに連結される。一部の実施形態では、イントロンは、ヒトβ－グロビン遺伝子の第１のイントロン由来の５’ドナー部位ならびに免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロン由来の分枝および３’アクセプター部位を含む、ＨＧＧ－ＩＧＧキメライントロンである。一部の実施形態では、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーター（例えば、配列番号２）は、意図される標的組織である肝細胞において特異的にかつ高度に活性であるが、非肝臓細胞および組織型において不活性である；このことは、非標的組織におけるＺＦＮ発現および活性を防止する。一部の実施形態では、トランスサイレチン最小プロモーターが使用される（米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０６号を参照）。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（表１および表１に従った配列）；ＳＢ－４７８９８（表２および表２に従った配列）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（表３および表３に従った配列）を含む。さらなる実施形態では、組成物は、ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（表４およびそれに従った配列（例えば、配列番号３０））；ＳＢ－７１７２８ ＡＡＶ（表５およびそれに従った配列（例えば、配列番号３１））；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（表３および表３に従った配列（例えば、配列番号１７））を含む。
必要に応じて、ヌクレアーゼコードポリヌクレオチドは、小型のペプチド（ペプチドタグおよび核局在化配列を含むがこれらに限定されない）をコードする配列をさらに含む、および／またはＤＮＡ結合ドメイン領域（例えば、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥの骨格）のうち１つもしくは複数における変異および／またはＦｏｋＩヌクレアーゼ切断ドメインもしくは切断ハーフドメインにおける１つもしくは複数の変異を含む。これらのポリヌクレオチド構成成分が、個々にまたはいずれかの組合せにおいて使用される場合（例えば、いずれかの組合せにおけるＦＬＡＧ、ＮＬＳ、ＷＰＲＥなどのペプチド配列および／またはポリＡシグナル）、本発明の方法および組成物は、増加した効率（例えば、本明細書に記載される配列／改変がないヌクレアーゼと比較して２、３、４、５、６、１０、２０倍またはそれよりも多い切断）および／または標的化特異性を有する人工ヌクレアーゼの発現の驚くべきかつ予想外の増加をもたらす。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡによってコードされ、ｍＲＮＡは、必要に応じて、転写および翻訳効率を増加させるためのエレメントを含む。一部の実施形態では、エレメントは、天然または人工５’および／または３’ＵＴＲ配列などの非翻訳配列を含む。一部の態様では、５’ＵＴＲ配列が発現カセットに含まれるが、他の例では、３’ＵＴＲ配列が使用される。一部の実施形態では、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方を含む。一実施形態では、５’ＵＴＲは、Ｘｅｎｏｐｕｓβ－グロビンＵＴＲである（Krieg and Melton (1994) Nuc Acid Res 12(18):7057を参照）。一部の実施形態では、Ｘｅｎｏｐｕｓβ－グロビンＵＴＲをコードするＤＮＡ配列は、５’ＴＧＣＴＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＧＡＴ（配列番号１８）である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、３’ＷＰＲＥ配列を含む（米国特許出願公開第２０１６／０３２６５４８号を参照）。一部の実施形態では、ＷＰＲＥエレメントは、「Ｘ」領域において変異されて、タンパク質Ｘの発現を防止する（米国特許第７，４１９，８２９号を参照）。一部の実施形態では、変異したＷＰＲＥエレメントは、Zanta-Boussif et al. (2009) Gene Ther 16(5):605-619に記載されている変異を含む。一部の実施形態では、ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥ３バリアントである（Choi et al. (2014) Mol Brain 7:17）。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、ポリＡシグナル配列を含む。これらのエレメントが組み合わせて使用される場合、ポリＡシグナルは、ＷＰＲＥ配列に対し３’または５’となることができる。一部の実施形態では、ポリＡシグナル配列は、ウシ成長ホルモンシグナル配列である（Woychik et al. (1984) Proc Natl Acad Sci 81(13):3944-8を参照）。
本発明の方法および組成物は、ＤＮＡ骨格におけるリン酸と非特異的に相互作用し得る、標的配列のヌクレオチドを認識する残基の外側のＤＮＡ結合ドメイン内の１個または複数のアミノ酸に対する変異（例えば、「ＺＦＰ骨格」（ＤＮＡ認識ヘリックス領域の外側）に対する１個または複数の変異）を含むこともできる。よって、一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、ヌクレオチド標的特異性に要求されない、ＺＦＰ骨格におけるカチオン性アミノ酸残基の変異を含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格におけるこれらの変異は、カチオン性アミノ酸残基を中性またはアニオン性アミノ酸残基へと変異させることを含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格におけるこれらの変異は、極性アミノ酸残基を中性または非極性アミノ酸残基へと変異させることを含む。一部の実施形態では、変異は、ＤＮＡ結合ヘリックスと比べて、（－５）、（－９）位および／または（－１４）位において為される（at made）。一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、（－５）、（－９）および／または（－１４）に１個または複数の変異を含むことができる。一部の実施形態では、マルチフィンガー（multi-finger）ジンクフィンガータンパク質における１個または複数のジンクフィンガーは、（－５）、（－９）および／または（－１４）に変異を含むことができる。一部の実施形態では、（－５）、（－９）および／または（－１４）におけるアミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ））は、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｙｒ（Ｙ）および／またはグルタミン（Ｑ）へと変異される。例えば、米国特許出願公開第２０１８００８７０７２号を参照されたい。
一部の態様では、本発明の方法および組成物は、真核生物導入遺伝子配列に融合された外因性ペプチド配列をコードする配列の使用を含む。一部の実施形態では、外因性ペプチドは、翻訳後にタンパク質配列に融合され、他の実施形態では、外因性ペプチドをコードする配列は、人工ヌクレアーゼをコードする配列にインフレームで（３’および／または５’）連結される（例えば、融合タンパク質）。外因性ペプチドは、精製または標識、例えば、親和性精製または免疫組織化学的検査に有用な配列をコードすることができる。斯かるペプチドの例は、ポリヒスチジンタグ（「Ｈｉｓタグ」、Hochuli et al. (1988) Bio/Technol 6(11):1321-5）またはカチオン性ペプチドタグ、例えば、Ｆｌａｇタグ（Hopp et al. (1988) Bio/Technol 6(10):1204-10）である。これらのペプチドタグ配列のうち１つまたは複数（１、２、３、４、５つまたはそれよりも多く）は、いずれかの組合せにおいて使用することができる。一部の実施形態では、配列Ｎ末端ＤＹＫＤＤＤＫ（配列番号１９）を含む外因性Ｆｌａｇペプチドをコードする配列は、人工ヌクレアーゼをコードする配列のＣ末端またはＮ末端にインフレームで融合される。好まれる実施形態では、３個のＦＬＡＧ配列（３×ＦＬＡＧペプチド）をコードする配列が使用され（米国特許第６，３７９，９０３号を参照）、そのアミノ酸配列は、Ｎ末端ＤＹＫＤＨＤＧ－ＤＹＫＤＨＤＩ－ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２０）である。斯かるペプチド配列のうち１つまたは複数（例えば、３×ＦＬＡＧ）の包含は、そのペプチド配列がないヌクレアーゼと比較して、ヌクレアーゼ（切断）活性を２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１倍またはそれよりも多く増加させることができる。
一部の態様では、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、核局在化ペプチド配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＳＶ４０ウイルスラージＴ遺伝子（Kalderon et al. (1984) Nature 311(5981):33-8を参照）由来の配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２１）を含むが、他の実施形態では、ＮＬＳは、ｃ－ｍｙｃタンパク質（Dang and Lee (1988) Mol Cell Biol 8(10):4048-54を参照）由来の配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２２）を含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、デルタ肝炎ウイルス（Alves et al. (2008) Virology 370:12-21を参照）由来の配列ＥＧＡＰＰＡＫＲＡＲ（配列番号２３）またはポリオーマＴタンパク質由来（Richardson et al. (1986) Cell 44(1):77-85）のＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号２４）を含む。他の実施形態では、ＮＬＳは、ヌクレオプラスミンカルボキシテイル（Dingwall (1988) J Cell Biol 107:841-849およびRobbins et al. (1991) Cell 64(3):615-23を参照）に由来する配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号２５）を含むが、一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＳｉｏｍｉおよびＤｒｅｙｆｕｓｓ（Siomi and Dreyfus (1995) J Cell Biol 129(3):551-560）によって最初に記載された配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号２６）を含む。さらなる実施形態では、ＮＬＳは、ＨＴＬＶ－１におけるＲｅｘタンパク質（Siomi et al. (1988) Cell 55(2):197-209）由来の配列ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号２７）を含む。本明細書に記載されるＮＬＳ配列のうち１つまたは複数の包含は、そのペプチド配列がないヌクレアーゼと比較して、ヌクレアーゼ（切断）活性を２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１倍またはそれよりも多く増加させることができる。
一部の実施形態では、対象における骨髄移植、ＥＲＴ療法および／または支持的外科手順など、追加の治療手順の必要性は、処置後の対象において延期、低減または排除される。一部の実施形態では、追加の治療手順の必要性の延期、低減または排除は、血漿および／または白血球および／または組織（例えば、血液、肝臓組織およびＣＳＦを含む）におけるＩＤＳ活性および／またはレベルの変化によって測定される。一部の実施形態では、血漿ならびに／または白血球ならびに／または血液、肝臓組織およびＣＳＦにおけるＩＤＳの活性および／またはレベルは、処置後に増加する、同じ状態を保つまたは検出レベルを下回る。血漿および／または対象白血球におけるＩＤＳを検出する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Chuang et al. (2018) Orphanet J Rare Dis. 13:84を参照されたい。一部の実施形態では、対象における追加の治療手順の必要性の延期、低減または排除は、例えば、処置されている対象の尿において測定される、総ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧ（デルマタン硫酸を含むＧＡＧ）およびＨＳ ＧＡＧ（ヘパラン硫酸を含むＧＡＧ）レベル（例えば、クレアチニンに対する比として表現される）の変化によって測定される。一部の実施形態では、追加の治療手順の必要性の延期、低減または排除は、例えば、肺機能検査によって測定される努力肺活量のベースラインからの変化によって測定される。一部の実施形態では、追加の治療手順の必要性の延期、低減または排除は、例えば、対象の６分間歩行検査によって測定される歩行距離のベースラインからの変化によって測定される。一部の実施形態では、対象における追加の治療手順の必要性の延期、低減または排除は、例えば、関節可動域（ＪＲＯＭ）のベースラインからの変化によって測定される。一部の実施形態では、対象における追加の治療手順の必要性の延期、低減または排除は、例えば、ＭＲＩによって測定される例えば、脾臓および／または肝臓体積（処置の前および後）のベースラインからの変化によって測定される。一部の実施形態では、追加の治療手順の必要性の延期、低減または排除は、例えば、ＷＡＳＩ－ＩＩ（ウェクスラー短縮知能検査第２版（Wechsler Abbreviated Scale of Intelligence, Second Edition）（Shapiro et al. (2015) Mol Genet Metab 116(1-2):61-68）、ＷＰＰＳＩ－ＩＶ（ウェクスラー幼児用知能検査（Wechsler Preschool and Primary Scale of Intelligence））またはＢＳＩＤ－ＩＩＩ（ベイリー乳幼児発達検査（Bayley Scales of Infant Development））およびＶＡＢＳ－ＩＩ（ヴァインランド適応行動尺度（Vineland Adaptive Behavior Scales））によって測定される例えば、神経認知能力のベースラインからの変化によって測定される。一部の実施形態では、追加の治療手順の必要性の延期、低減または排除は、例えば、血液、肝臓組織およびＣＳＦにおいて例えば、測定される総ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧおよびＨＳ ＧＡＧレベルのベースラインからの変化によって測定される。
一部の実施形態では、対象は、ベースライン時にＥＲＴを受けた、または過去にＥＲＴを受けたことがあるが、他の実施形態では、対象は、ＥＲＴを受けていない。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、例えば、末梢静脈カテーテルによる、本発明の組成物の投与を含む。一部の実施形態では、組成物は、生理的食塩水（normal saline）（ＮＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）希釈剤に添加され、希釈剤は、例えば、ヒト血清アルブミンをさらに含むことができる。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１１ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６（例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶおよびＳＢ－４７８９８ ＡＡＶ、またはＳＢ－７１５５７ ＡＡＶおよびＳＢ－７１７２８ ＡＡＶ）、および４ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶ（例えば、ＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ）を含む、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１２ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。さらなる実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ、および４ｅ１３のｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１３ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。構成成分は、別々に投与することができる、または好ましくは、全構成成分（同じまたは異なるベクターにおけるペアードＺＦＮ、およびＩＤＳドナー）を含む組成物、例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（表１）、ＳＢ－４７８９８ ＡＡＶ（表２）およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（表３）を含む組成物として投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（表４、配列番号３０）、ＳＢ－７１７２８ ＡＡＶ（表５、配列番号３１）およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（表３、配列番号１７）を含む。
一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの組成物、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの組成物、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの組成物、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの組成物、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの組成物および／または１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの組成物の総用量を受けた後に、追加の治療手順の必要性が延期、低減または排除される。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間（例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間および／または５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間）の総用量を受けた後に、追加の治療手順の必要性が延期、低減または排除される。
別の態様では、本発明の方法および組成物で処置されていない対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有する対象における症状を低減、延期または排除する方法であって、例えば、有効量のｈＩＤＳ導入遺伝子およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を対象に投与するステップを含み、対象は、処置後に症状が低減、延期または排除される、方法が本明細書に開示される。一部の実施形態では、臓器腫大、機能亢進、攻撃性（aggressiveness）、神経学的増悪、関節硬直、骨格変形、心臓弁肥厚、難聴、ヘルニアおよび／または上気道感染症は、本明細書に開示される組成物および方法によって低減、延期または排除される。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子（例えば、配列番号１５）は、ＡＡＶ２／６送達により送達され（例えば、肝細胞に）、ｈＩＤＳ送達ベクター（例えば、ＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ、表３、例えば、配列番号１７に示す通り）は、例えば、アルブミン遺伝子座におけるＺＦＮカット部位に隣接する領域に対する特異性を有するｈＩＤＳ導入遺伝子に隣接する相同性アーム（例えば、配列番号１３および配列番号１６）をさらに含む。相同性の左アーム（ＬＡ）は、アルブミンイントロン１切断部位の上流の約２８０ヌクレオチド（例えば、配列番号１３）の同一配列を含有し、相同性の右アーム（ＲＡ）は、本明細書に開示される方法および組成物において有用なＺＦＮの切断部位の下流の約１００ヌクレオチド（例えば、配列番号１６）の同一配列を含有する。一部の実施形態では、相同性のアームは、例えば、アルブミンイントロン１遺伝子座におけるｈＩＤＳ導入遺伝子の標的化組込み（例えば、相同組換え修復による）を容易にするのに役立つように使用される。一部の実施形態では、相同性アームのサイズは、例えば、標的化組込みまたは導入遺伝子発現を阻害し得る、アルブミン遺伝子座における反復配列およびスプライシングエレメントを回避するように選ばれる。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来する。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子ドナーは、３’末端に停止コドンをさらに含んで、例えば、ＩＤＳ導入遺伝子が挿入されるアルブミン配列のさらなる転写を防止する。一部の実施形態では、ヒトＩＤＳ導入遺伝子を含有するｒＡＡＶ２／６ドナーベクター（例えば、ＳＢ－ＩＤＳドナー）は、エクソン１プラスエクソン２～９（配列番号１５）の部分を含む部分的ＩＤＳ ｃＤＮＡを含むプロモーターなし構築物である。ｈＦ９エクソン２に由来するスプライスアクセプター部位（ＳＡ、配列番号１４）が存在して、アルブミン遺伝子座から成熟ｍＲＮＡへのｈＩＤＳ転写物の効率的スプライシングを可能にし、これは両方の種類のドナー組込み機構（ＮＨＥＪまたはＨＤＲ）で有効である。
一部の実施形態では、アルブミン特異的対におけるＺＦＮは、ＡＡＶ２／６送達により肝細胞に同様に送達され、一方のＡＡＶは、左ＺＦＮ（ＳＢＳ－４７１７１；配列番号９）を含み、もう一方は、右ＺＦＮ（ＳＢＳ－４７８９８；配列番号１２）を含む。一部の実施形態では、アルブミン特異的対におけるＺＦＮは、ＡＡＶ２／６送達により肝細胞に送達され、一方のＡＡＶは、左ＺＦＮ（ＳＢＳ－７１５５７；配列番号３０）を含み、もう一方は、右ＺＦＮ（ＳＢＳ－７１７２８；配列番号３１）を含む。一部の実施形態では、ＺＦＮは、２種の別々のポリヌクレオチド（ＡＡＶベクターで運ばれる）：ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（例えば、表１、配列番号９）およびＳＢ－４７８９８（例えば、表２、配列番号１２）を含む。一部の実施形態では、ＺＦＮは、２種の別々のポリヌクレオチド（ＡＡＶベクターで運ばれる）：ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（例えば、表４、配列番号３０）およびＳＢ－７１７２８（例えば、表５、配列番号３１）を含む。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、例えば、ヒトＡｐｏＥエンハンサーおよびヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターで構成される肝臓特異的エンハンサーおよびプロモーターの制御下にある（Miao CH et al. (2000) Mol. Ther. 1(6):522-532 (200)）。一部の実施形態では、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーター（例えば、配列番号２）は、意図される標的組織である肝細胞において特異的にかつ高度に活性であるが、一部の実施形態では、非肝臓細胞および組織型において不活性である；このことは、非標的組織におけるＺＦＮ発現および活性を防止する。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、最小トランスサイレチンプロモーターの下にある。一部の実施形態では、ＺＦＮを含む発現カセットは、上に記載されている１つまたは複数のＦＬＡＧタグ、核局在化配列（ＮＬＳ）、ＷＰＲＥ配列、代替（alternate）ポリＡ配列、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（例えば、表１、配列番号９）；ＳＢ－４７８９８（例えば、表２、配列番号１２）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（例えば、表４、配列番号３０）；ＳＢ－７１７２８（例えば、表５、配列番号３１）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）を含む。
一部の実施形態では、処置後に対象において低減、延期または排除されたＭＰＳ ＩＩ症状は、処置の前および後の活性またはレベルを比較することにより、血漿におけるＩＤＳ活性またはレベルの変化によって測定される。一部の実施形態では、血漿におけるＩＤＳの活性および／またはレベルは、増加する、同じ状態を保つまたは検出レベルを下回る。一部の実施形態では、処置後に対象において低減、延期または排除されたＭＰＳ ＩＩ症状は、例えば、処置されている対象の尿において測定される総ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧ（例えば、デルマタン硫酸を含むＧＡＧ）およびＨＳ ＧＡＧ（例えば、ヘパラン硫酸を含むＧＡＧ）レベル（クレアチニンに対する比として表現される）の変化によって測定される。一部の実施形態では、処置後に対象において低減、延期または排除されたＭＰＳ ＩＩ症状は、例えば、肺機能検査によって測定される努力肺活量のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、処置後に対象において低減、延期または排除されたＭＰＳ ＩＩ症状は、例えば、処置の前および後に６分間歩行検査を行う対象によって測定される歩行距離のベースラインからの変化または安定化によって測定されて、処置により生じるベースラインからの変化を決定する。一部の実施形態では、処置後に対象において低減、延期または排除されたＭＰＳ ＩＩ症状は、例えば、関節可動域（ＪＲＯＭ）のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、処置後に対象において低減、延期または排除されたＭＰＳ ＩＩ症状は、例えば、ＭＲＩによって測定される脾臓および／または肝臓体積のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、処置後に対象において低減、延期または排除されたＭＰＳ ＩＩ症状は、例えば、ＷＡＳＩ－ＩＩ（ウェクスラー短縮知能検査第２版（Shapiro et al.、同書））、ＷＰＰＳＩ－ＩＶ（ウェクスラー幼児用知能検査）またはＢＳＩＤ－ＩＩＩ（ベイリー乳幼児発達検査）およびＶＡＢＳ－ＩＩ（ヴァインランド適応行動尺度）によって測定される神経認知能力のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、処置後に対象において低減、延期または排除されたＭＰＳ ＩＩ症状は、例えば、肝臓組織およびＣＳＦにおいて測定される総ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧおよびＨＳ ＧＡＧレベルのベースラインからの変化または安定化によって測定される。
一部の実施形態では、対象は、ベースライン時にＥＲＴを受けた、または過去にＥＲＴを受けたことがあるが、他の実施形態では、対象は、ＥＲＴを受けていない。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、例えば、末梢静脈カテーテルによる、組成物の投与を含む。一部の実施形態では、組成物は、生理的食塩水（ＮＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）希釈剤に添加され、希釈剤は、例えば、ヒト血清アルブミンをさらに含むことができる。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１１ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。他の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。さらなる実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ、および４ｅ１３のｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１３ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。本明細書に開示される方法および組成物は、別々に投与することができる、または好ましくは、全構成成分（例えば、同じまたは異なるベクターにおけるペアードＺＦＮ、およびＩＤＳドナー）を含む組成物、例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（例えば、表１）、ＳＢ－４７８９８ ＡＡＶ（例えば、表２）およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３）を含む組成物として投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（例えば、表４、配列番号３０）；ＳＢ－７１７２８（例えば、表５、配列番号３１）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）を含む。
一部の実施形態では、対象が、例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇおよび／または１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総用量を受けるときに、本発明の組成物とともに本明細書に開示される方法および組成物の使用後に対象において示される低減、延期または排除されたＭＰＳ ＩＩ症状が見られる。一部の実施形態では、対象は、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間（例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間および／または５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間）の総用量を受けた後に、ＭＰＳ ＩＩ症状が低減、延期または排除される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される本発明の方法および組成物で処置されていない対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有する対象におけるＥＲＴ開始の必要性を延期させる、本明細書に開示される方法および組成物であって、本方法は、例えば、本発明において有用な有効量のｈＩＤＳ導入遺伝子およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を対象に投与するステップを含み、対象におけるＥＲＴの必要性は、処置後に延期される。ｈＩＤＳ導入遺伝子（例えば、配列番号１５）は、ＡＡＶ２／６送達により送達され（例えば、肝細胞に）、ｈＩＤＳ送達ベクターは、例えば、アルブミン遺伝子座におけるＺＦＮカット部位に隣接する領域に対する特異性を有する、例えば、ｈＩＤＳ導入遺伝子に隣接する相同性アーム（例えば、配列番号１３および配列番号１６）をさらに含む。相同性の左アーム（ＬＡ）は、例えば、アルブミンイントロン１切断部位の上流の約２８０ヌクレオチド（例えば、配列番号１３）の同一配列を含有し、相同性の右アーム（ＲＡ）は、例えば、切断部位の下流の約１００ヌクレオチド（例えば、配列番号１６）の同一配列を含有する。一部の実施形態では、相同性のアームは、例えば、相同組換え修復による、アルブミンイントロン１遺伝子座におけるｈＩＤＳ導入遺伝子の標的化組込みを容易にするのに役立つように使用される。一部の実施形態では、相同性アームのサイズは、例えば、標的化組込みまたは導入遺伝子発現を阻害し得る、アルブミン遺伝子座における反復配列およびスプライシングエレメントを回避するように選ばれる。ポリＡ配列は、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来する。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子ドナーは、例えば、３’末端に停止コドンをさらに含んで、ＩＤＳ導入遺伝子が挿入されるアルブミン配列のさらなる転写を防止する。一部の実施形態では、ヒトＩＤＳ導入遺伝子を含有するｒＡＡＶ２／６ドナーベクター（例えば、ＳＢ－ＩＤＳドナー）は、エクソン１プラスエクソン２～９（例えば、配列番号１５）の部分を含む部分的ＩＤＳ ｃＤＮＡを含むプロモーターなし構築物である。一部の実施形態では、例えば、ｈＦ９エクソン２に由来するスプライスアクセプター部位（例えば、ＳＡ、配列番号１４）が存在して、アルブミン遺伝子座から成熟ｍＲＮＡへのｈＩＤＳ転写物の効率的スプライシングを可能にし、これは両方の種類のドナー組込み機構（例えば、ＮＨＥＪまたはＨＤＲ）で有効である。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に有用なＺＦＮは、ＡＡＶ２／６送達により同様に送達される（例えば、肝細胞に）。一部の実施形態では、ＺＦＮは、例えばアルブミン特異的であり、アルブミン特異的ＺＦＮの両半分（左および右構成成分）は、別々のＡＡＶベクターによって運ばれる。一部の実施形態では、一方のＡＡＶは、左ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７１７１；配列番号９）を含み、もう一方は、右ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７８９８；配列番号１２）を含む。一部の実施形態では、一方のＡＡＶは、左ＺＦＮ（例えば、ＳＢ－７１５５７、表４、配列番号３０）を含み；もう一方は、右ＺＦＮ（例えば、ＳＢ－７１７２８、表５、配列番号３１）を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物において有用なＺＦＮの発現は、例えば、ヒトＡｐｏＥエンハンサーおよびヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターで構成される、肝臓特異的エンハンサーおよびプロモーターの制御下にある（Miao CH et al. (2000) Mol. Ther. 1(6): 522-532 (200)）。一部の実施形態では、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーター（例えば、配列番号２）は、特異的にかつ高度に活性である（例えば、肝細胞および／または意図される標的組織において）が、非肝臓細胞および組織型において不活性である；このことは、非標的組織におけるＺＦＮ発現および活性を防止する。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（例えば、表１）およびＳＢ－４７８９８（例えば、表２）を含む。一部の実施形態では、投与される組成物は、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（例えば、表１、配列番号９）；ＳＢ－４７８９８（例えば、表２、配列番号１２）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（例えば、表４、配列番号３０）；ＳＢ－７１７２８（例えば、表５、配列番号３１）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）を含む。
一部の実施形態では、ＥＲＴの必要性の延期または低減は、例えば、処置後の対象において測定される。一部の実施形態では、ＥＲＴの必要性の延期は、例えば、血漿におけるＩＤＳ活性またはレベルの変化によって測定される。一部の実施形態では、血漿、ＣＳＦ、肝臓および／または白血球におけるＩＤＳの活性および／またはレベルは、増加する、同じ状態を保つまたは検出レベルを下回る。一部の実施形態では、ＥＲＴの必要性の延期は、例えば、処置されている対象の尿において測定される総ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧ（例えば、デルマタン硫酸を含むＧＡＧ）およびＨＳ ＧＡＧ（例えば、ヘパラン硫酸を含むＧＡＧ）レベル（例えば、クレアチニンに対する比として表現される）（例えば、尿ＧＡＧレベル）の変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、ＥＲＴの必要性の延期は、例えば、肺機能検査によって測定される努力肺活量のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、ＥＲＴの必要性の延期は、例えば、６分間歩行検査によって測定される歩行距離のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、ＥＲＴの必要性の延期は、例えば、関節可動域（ＪＲＯＭ）のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、ＥＲＴの必要性の延期は、例えば、ＭＲＩによって測定される脾臓および／または肝臓体積のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、ＥＲＴの必要性の延期は、例えば、ＷＡＳＩ－ＩＩ（ウェクスラー短縮知能検査第２版（Shapiro et al.、同書））、ＷＰＰＳＩ－ＩＶ（ウェクスラー幼児用知能検査）またはＢＳＩＤ－ＩＩＩ（ベイリー乳幼児発達検査）およびＶＡＢＳ－ＩＩ（ヴァインランド適応行動尺度）によって測定される神経認知能力のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、ＥＲＴの必要性の延期は、例えば、肝臓組織およびＣＳＦにおける総ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧおよびＨＳ ＧＡＧレベルのベースラインからの変化または安定化によって測定される。
一部の実施形態では、対象は、ベースライン時にＥＲＴを受けた、または過去にＥＲＴを受けたことがあるが、他の実施形態では、対象は、ＥＲＴを受けていない。
一部の実施形態では、処置は、例えば、末梢静脈カテーテルによる、組成物の投与を含む。一部の実施形態では、組成物は、生理的食塩水（ＮＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）希釈剤に添加される。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１１ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６（例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶおよびＳＢ－４７８９８ ＡＡＶ）、および４ｅ１２ ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶ（例えば、ＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ）を含む、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６（例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶまたはＳＢ－７１５５７ ＡＡＶおよびＳＢ－４７８９８ ＡＡＶまたはＳＢ ７１７２８ ＡＡＶ）、および８ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶ（例えば、ＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ）を含む、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ（例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶまたはＳＢ－７１５５７およびＳＢ－４７８９８ ＡＡＶまたはＳＢ ７１７２８ ＡＡＶ）、および４ｅ１３のｈＩＤＳドナーＡＡＶ（例えば、ＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ）を含む、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１３ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、構成成分は、別々に投与することができる、または好ましくは、全構成成分（例えば、同じまたは異なるベクターにおけるペアードＺＦＮ、およびＩＤＳドナー）を含む組成物、例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶまたはＳＢ－７１５５７（例えば、表１または表４）、ＳＢ－４７８９８ ＡＡＶまたはＳＢ－７１７２８（例えば、表２または表５）およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３）を含む組成物として投与することができる。
一部の実施形態では、ＥＲＴの必要性の延期は、例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇおよび／または１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総用量を有する組成物による処置後に、対象に関して測定される。一部の実施形態では、ＥＲＴの必要性の延期は、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間（例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間および／または５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間）の総用量を受けた後に測定される。
別の態様では、ＭＰＳ ＩＩを有する対象においてＥＲＴを除去（中止）するための方法であって、例えば、（ａ）ＥＲＴを受けている対象に、有効量の本明細書に記載されるｈＩＤＳ導入遺伝子およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を投与するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の後に対象からＥＲＴを中止するステップとを含む方法が本明細書に開示される。ＥＲＴは、導入遺伝子およびＺＦＮ（複数可）の投与後数時間（０～４８）、数日間（１～７日間）、数週間（１～４週間）、数ヶ月間（１～１２）または数年間（１～１０年間）を含む、投与後のいずれかの時点で中止することができる。ある特定の実施形態では、ＥＲＴは完全に中止されるが、他の実施形態では、ＥＲＴは、例えば、導入遺伝子およびＺＦＮ（複数可）を投与されていない対象と比較してより長い期間を含む、いずれかの期間中止することができる。一部の実施形態では、本方法は、例えば、ＭＰＳ ＩＩに関連する１つまたは複数の症状を測定することにより、例えば、導入遺伝子およびＺＦＮ（複数可）の投与後の対象における臓器腫大、機能亢進、攻撃性、神経学的増悪、関節硬直、骨格変形、心臓弁肥厚、難聴、ヘルニアおよび／または上気道感染症の変化を査定することにより、対象におけるＥＲＴを中止させる能力を査定するステップをさらに含むことができ、測定が、これらの（ＭＰＳ ＩＩ）症状のうち１つまたは複数が、本明細書に開示される組成物および方法によって低減、延期または排除されることを実証する場合、その結果、ＥＲＴはもはや必要とされなくなる。一部の実施形態では、本方法は、ＡＡＶ２／６送達により送達される（例えば、肝細胞に）ｈＩＤＳ導入遺伝子（例えば、配列番号１５）と、例えば、アルブミン遺伝子座におけるＺＦＮカット部位に隣接する領域に対する特異性を有するｈＩＤＳ導入遺伝子に隣接する相同性アーム（例えば、配列番号１３および配列番号１６）をさらに含むｈＩＤＳ送達ベクター（例えば、ＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ、表３、例えば、配列番号１７に示す通り）とを含む。相同性の左アーム（ＬＡ）は、アルブミンイントロン１切断部位の上流の約２８０ヌクレオチド（例えば、配列番号１３）の同一配列を含有し、相同性の右アーム（ＲＡ）は、本明細書に開示される方法および組成物において有用なＺＦＮの切断部位の下流の約１００ヌクレオチド（例えば、配列番号１６）の同一配列を含有する。一部の実施形態では、相同性のアームは、例えば、アルブミンイントロン１遺伝子座におけるｈＩＤＳ導入遺伝子の標的化組込み（例えば、相同組換え修復により）を容易にするのに役立つように使用される。一部の実施形態では、相同性アームのサイズは、例えば、標的化組込みまたは導入遺伝子発現を阻害し得る、アルブミン遺伝子座における反復配列およびスプライシングエレメントを回避するように選ばれる。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来する。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子ドナーは、３’末端に停止コドンをさらに含んで、例えば、ＩＤＳ導入遺伝子が挿入されるアルブミン配列のさらなる転写を防止する。一部の実施形態では、ヒトＩＤＳ導入遺伝子を含有するｒＡＡＶ２／６ドナーベクター（例えば、ＳＢ－ＩＤＳドナー）は、エクソン１プラスエクソン２～９（配列番号１５）の部分を含む部分的ＩＤＳ ｃＤＮＡを含むプロモーターなし構築物である。ｈＦ９エクソン２に由来するスプライスアクセプター部位（ＳＡ、配列番号１４）が存在して、アルブミン遺伝子座から成熟ｍＲＮＡへのｈＩＤＳ転写物の効率的スプライシングを可能にし、これは両方の種類のドナー組込み機構（ＮＨＥＪまたはＨＤＲ）で有効である。
一部の実施形態では、アルブミン特異的対におけるＺＦＮは、ＡＡＶ２／６送達により肝細胞に同様に送達され、一方のＡＡＶは、左ＺＦＮ（ＳＢＳ－４７１７１またはＳＢ－７１５５７；それぞれ配列番号９または配列番号３０）を含み、もう一方は、右ＺＦＮ（ＳＢＳ－４７８９８またはＳＢ－７１７２８；それぞれ配列番号１２または配列番号３１）を含む。一部の実施形態では、ＺＦＮは、２種の別々のポリヌクレオチド（ＡＡＶベクターで運ばれる）：ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶまたはＳＢ－７１５５７（例えば、表１または表４、それぞれ配列番号９または配列番号３０）およびＳＢ－４７８９８またはＳＢ－７１７２８（例えば、表２または表５、それぞれ配列番号１２または配列番号３１）を含む。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、例えば、ヒトＡｐｏＥエンハンサーおよびヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターで構成される肝臓特異的エンハンサーおよびプロモーターの制御下にある（Miao CH et al. (2000) Mol. Ther. 1(6):522-532 (200)）。一部の実施形態では、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーター（例えば、配列番号２）は、意図される標的組織である肝細胞において特異的にかつ高度に活性であるが、一部の実施形態では、非肝臓細胞および組織型において不活性である；このことは、非標的組織におけるＺＦＮ発現および活性を防止する。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（例えば、表１、配列番号９）；ＳＢ－４７８９８（例えば、表２、配列番号１２）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（例えば、表４、配列番号３０）；ＳＢ－７１７２８（例えば、表５、配列番号３１）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物による処置後のＭＰＳ ＩＩを有する対象におけるＥＲＴの中止は、処置の前および後に次のうち１つまたは複数によって査定される：処置の前および後の間における、血漿、ＣＳＦ、肝臓もしくは白血球におけるＩＤＳ活性もしくはレベルの変化もしくは安定化を測定することであり、処置後に増加したＩＤＳ活性は、ＥＲＴを延期もしくは中止することができることを指し示す；処置の前および後の間における、処置されている対象の尿における総ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧ（例えば、デルマタン硫酸を含むＧＡＧ）および／もしくはＨＳ ＧＡＧ（例えば、ヘパラン硫酸を含むＧＡＧ）レベル（クレアチニンに対する比として表現される）の変化もしくは安定化を測定することであり、処置後の総ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧおよび／もしくはＨＳ ＧＡＧのレベルの低減もしくは安定化は、ＥＲＴを中止もしくは延期することができることを指し示す；処置の前および後の間における、肺機能検査によって測定される努力肺活量のベースラインからの変化もしくは安定化を測定することであり、処置後の努力肺活量の増加もしくは安定化は、ＥＲＴを中止もしくは延期することができることを指し示す；処置の前および後の６分間歩行検査を行う対象によって測定される歩行距離のベースラインからの変化もしくは安定化を測定して、処置により生じるベースラインからの変化を決定することであり、処置後の対象による歩行距離の増加もしくは安定化は、ＥＲＴを中止もしくは延期することができることを指し示す；処置の前および後の間における、関節可動域（ＪＲＯＭ）のベースラインからの変化もしくは安定化を測定することであり、処置後の可動域の増加もしくは安定化は、ＥＲＴを中止することができることを指し示す；処置の前および後の間における、ＭＲＩによって測定される脾臓および／もしくは肝臓体積のベースラインからの変化もしくは安定化を測定することであり、処置後の脾臓および／もしくは肝臓体積の減少もしくは安定化は、ＥＲＴを中止もしくは延期することができることを指し示す；ＷＡＳＩ－ＩＩ（ウェクスラー短縮知能検査第２版（Shapiro et al.、同書））、ＷＰＰＳＩ－ＩＶ（ウェクスラー幼児用知能検査）もしくはＢＳＩＤ－ＩＩＩ（ベイリー乳幼児発達検査）およびＶＡＢＳ－ＩＩ（ヴァインランド適応行動尺度）によって測定される神経認知能力のベースラインからの変化もしくは安定化（処置前）を測定することであり、ベースライン（前）および処置後の間における神経認知能力の改善もしくは安定化は、ＥＲＴを中止もしくは延期することができることを指し示す；ならびに／または処置の前および後の肝臓組織およびＣＳＦにおいて測定される総ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧおよび／もしくはＨＳ ＧＡＧレベルのベースラインからの変化を測定することであり、処置後の総ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧおよび／もしくはＨＳ ＧＡＧレベルの低減もしくは安定化は、ＥＲＴを中止もしくは延期することができることを指し示す。よって、処置後にこれらの査定のうち１つまたは複数に肯定的な変化または安定化が見られる場合（処置前（ベースライン）と比較して）、ＥＲＴを中止または延期することができる。一部の実施形態では、対象は、ベースライン時にＥＲＴを受けた、または過去にＥＲＴを受けたことがある。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、例えば、末梢静脈カテーテルによる、組成物の投与を含む。一部の実施形態では、組成物は、生理的食塩水（ＮＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）希釈剤に添加され、希釈剤は、例えば、ヒト血清アルブミンをさらに含むことができる。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１１ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。他の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。さらなる実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ、および４ｅ１３のｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１３ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。本明細書に開示される方法および組成物は、別々に投与することができる、または好ましくは、全構成成分（例えば、同じまたは異なるベクターにおけるペアードＺＦＮ、およびＩＤＳドナー）を含む組成物、例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（例えば、表１）、ＳＢ－４７８９８ ＡＡＶ（例えば、表２）およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３）を含む組成物として投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（例えば、表４、配列番号３０）；ＳＢ－７１７２８（例えば、表５、配列番号３１）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）を含む。
一部の実施形態では、本発明の組成物とともに本明細書に開示される方法および組成物の使用後に対象においてＥＲＴを中止する能力は、対象が、例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇおよび／または１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総用量を受けるときに見られる。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の使用後に対象においてＥＲＴを中止する能力は、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間（例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間および／または５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間）の総用量を受けた後に見られる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される本発明の方法および組成物で処置されていない対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有する対象における骨髄移植の必要性を延期、低減または予防する方法であって、有効量のｈＩＤＳ導入遺伝子およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を対象に投与するステップを含み、対象は、例えば、本明細書に開示される方法および組成物による処置後に、骨髄移植の必要性が延期、低減または予防避けられる、方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子（例えば、配列番号１５）は、ＡＡＶ２／６送達により送達され（例えば、肝細胞に）、ｈＩＤＳ送達ベクターは、アルブミン遺伝子座におけるＺＦＮカット部位に隣接する領域に対する特異性を有する、ｈＩＤＳ導入遺伝子に隣接する相同性アーム（例えば、配列番号１３および配列番号１６）をさらに含む。相同性の左アーム（ＬＡ）は、アルブミンイントロン１切断部位の上流の約２８０ヌクレオチド（例えば、配列番号１３）の同一配列を含有し、相同性の右アーム（ＲＡ）は、切断部位の下流の約１００ヌクレオチド（例えば、配列番号１６）の同一配列を含有する。一部の実施形態では、相同性のアームは、例えば、アルブミンイントロン１遺伝子座におけるｈＩＤＳ導入遺伝子の標的化組込み（例えば、相同組換え修復による）を容易にするのに役立つように使用される。一部の実施形態では、相同性アームのサイズは、例えば、標的化組込みまたは導入遺伝子発現を阻害し得る、アルブミン遺伝子座における反復配列およびスプライシングエレメントを回避するように選ばれる。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来する。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子ドナーは、例えば、３’末端に停止コドンをさらに含んで、ＩＤＳ導入遺伝子が挿入されるアルブミン配列のさらなる転写を防止する。一部の実施形態では、ヒトＩＤＳ導入遺伝子を含有するｒＡＡＶ２／６ドナーベクター（例えば、ＳＢ－ＩＤＳドナー）は、エクソン１プラスエクソン２～９（例えば、配列番号１５）の部分を含む部分的ＩＤＳ ｃＤＮＡを含むプロモーターなし構築物である。一部の実施形態では、スプライスアクセプター部位（例えば、ＳＡ、配列番号１４）は、例えば、ｈＦ９エクソン２に由来し、例えば、アルブミン遺伝子座から成熟ｍＲＮＡへのｈＩＤＳ転写物の効率的なスプライシングを可能にし、これは両方の種類のドナー組込み機構（例えば、ＮＨＥＪまたはＨＤＲ）で有効である。一部の実施形態では、ドナーは、ＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）と命名されたドナーである。
一部の実施形態では、対象に送達される本明細書に開示される方法および組成物において有用なＺＦＮは、ＡＡＶ２／６送達によるアルブミン特異的対であり（例えば、肝細胞に送達される）、一方のＡＡＶは、左ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７１７１またはＳＢＳ－７１５５７；それぞれ配列番号９または配列番号３０）を含み、もう一方は、右ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７８９８またはＳＢＳ－７１７２８；それぞれ配列番号１２または配列番号３１）を含む。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、例えば、ヒトＡｐｏＥエンハンサーおよびヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターで構成される肝臓特異的エンハンサーおよびプロモーターの制御下にある（Miao CH et al. (2000) Mol. Ther. 1(6): 522-532 (200)）。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、最小トランスサイレチンプロモーターの下にある。一部の実施形態では、ＺＦＮを含む発現カセットは、上に記載されている１つまたは複数のＦＬＡＧタグ、核局在化配列（ＮＬＳ）、ＷＰＲＥ配列、代替ポリＡ配列、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーター（例えば、配列番号２）は、特異的にかつ高度に活性である（例えば、意図される標的組織である肝細胞において）が、非肝臓細胞および組織型において不活性である；このことは、非標的組織におけるＺＦＮ発現および活性を防止する。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物において有用なＺＦＮ対は、２種の別々のＡＡＶベクター、即ち、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶまたはＳＢ－７１５５７（例えば、それぞれ表１、配列番号９または表４、配列番号３０）およびＳＢ－４７８９８ ＡＡＶまたはＳＢ－７１７２８（例えば、それぞれ表２、配列番号１２または表５、配列番号３１）を使用して送達される。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物のいずれかは、３構成成分ＡＡＶ系（ペアードＺＦＮの各構成成分のための２種のＡＡＶ、およびドナーを運ぶ１種のＡＡＶ）、例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（例えば、表１）、ＳＢ－４７８９８ ＡＡＶ（例えば、表２）およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３）を含む組成物を使用することができる。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（例えば、表４、配列番号３０）；ＳＢ－７１７２８（例えば、表５、配列番号３１）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）を含む。
一部の実施形態では、骨髄移植の必要性の延期、低減または予防は、本明細書に開示される方法および組成物を使用した処置の後に対象において測定される。一部の実施形態では、骨髄移植の必要性の延期、低減または予防は、血漿におけるＩＤＳ活性またはレベルの変化によって測定される。一部の実施形態では、血漿、ＣＳＦ、肝臓または白血球におけるＩＤＳの活性および／またはレベルは、増加する、同じ状態を保つまたは検出レベルを下回る。一部の実施形態では、骨髄移植の必要性の延期、低減または予防は、対象の白血球におけるＩＤＳ活性またはレベルの変化によって測定される。一部の実施形態では、骨髄移植の必要性の延期、低減または予防は、処置されている対象の尿において測定される総ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧ（例えば、デルマタン硫酸を含むＧＡＧ）およびＨＳ ＧＡＧ（例えば、ヘパラン硫酸を含むＧＡＧ）レベル（例えば、クレアチニンに対する比として表現される）（例えば、尿ＧＡＧレベル）の変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、骨髄移植の必要性の延期、低減または予防は、例えば、肺機能検査によって測定される努力肺活量のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、骨髄移植の必要性の延期または低減は、例えば、６分間歩行検査によって測定される歩行距離のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、骨髄移植の必要性の延期または低減は、例えば、関節可動域（ＪＲＯＭ）のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、骨髄移植の必要性は、例えば、ＭＲＩによって測定される脾臓および／または肝臓体積のベースラインからの変化または安定化によって減少する。一部の実施形態では、骨髄移植の必要性の低減、延期または予防は、例えば、ＷＡＳＩ－ＩＩ（ウェクスラー短縮知能検査第２版（Shapiro et al.、同書））、ＷＰＰＳＩ－ＩＶ（ウェクスラー幼児用知能検査）またはＢＳＩＤ－ＩＩＩ（ベイリー乳幼児発達検査）およびＶＡＢＳ－ＩＩ（ヴァインランド適応行動尺度）によって測定される神経認知能力のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、ＥＲＴの必要性の低減または延期は、例えば、肝臓組織およびＣＳＦにおいて測定される総ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧおよびＨＳ ＧＡＧレベルのベースラインからの変化または安定化によって測定される。
一部の実施形態では、対象は、ベースライン時にＥＲＴを受けたが、他の実施形態では、対象は、ＥＲＴを受けていない。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、組成物の投与（例えば、末梢静脈カテーテルによる）を含む。一部の実施形態では、組成物は、生理的食塩水（ＮＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）希釈剤に添加され、希釈剤は、例えば、ヒト血清アルブミンをさらに含む。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、５ｅ１１ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、１ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ、および４ｅ１３のｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１３ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、構成成分は、別々に投与することができる、または好ましくは、全構成成分（同じまたは異なるベクターにおけるペアードＺＦＮ、およびＩＤＳドナー）を含む組成物、例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（例えば、表１）、ＳＢ－４７８９８ ＡＡＶ（例えば、表２）およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３）を含む組成物として投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（例えば、表４、配列番号３０）；ＳＢ－７１７２８（例えば、表５、配列番号３１）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）を含む。
一部の実施形態では、骨髄移植の必要性の低減、延期または予防は、例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの、５ｖｇ／ｋｇおよび／または１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総用量を含む、本明細書に開示される方法および組成物による処置の後の対象に関して測定される。一部の実施形態では、骨髄（bond marrow）移植の必要性の低減、延期または予防は、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間（例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間および／または５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間）の総用量を受けた後の対象に関して測定される。
一部の実施形態では、処置されていない対象と比較して、本明細書に開示される方法および組成物による処置によって尿ＧＡＧ（例えば、尿ＧＡＧレベル）を低減、安定化または排除する方法であって、例えば、有効量の本明細書に記載されるヌクレアーゼ（複数可）およびドナー（複数可）（例えば、ｈＩＤＳ導入遺伝子およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む３構成成分組成物）を対象に投与するステップを含み、対象が、処置後に低減、安定化または排除された尿ＧＡＧ（例えば、尿ＧＡＧレベル）を有する、方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、血漿におけるＩＤＳの活性またはレベルは、検出レベルを下回る。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子（例えば、配列番号１５）は、ＡＡＶ２／６送達により送達され（例えば、肝細胞に）、ｈＩＤＳ送達ベクターは、例えば、アルブミン遺伝子座におけるＺＦＮカット部位に隣接する領域に対する特異性を有する、ｈＩＤＳ導入遺伝子に隣接する相同性アーム（例えば、配列番号１３および配列番号１６）をさらに含む。一部の実施形態では、相同性の左アーム（ＬＡ）は、アルブミンイントロン１切断部位の上流の約２８０ヌクレオチド（例えば、配列番号１３）の同一配列を含有し、相同性の右アーム（ＲＡ）は、切断部位の下流の約１００ヌクレオチド（例えば、配列番号１６）の同一配列を含有する。一部の実施形態では、相同性のアームは、例えば、相同組換え修復による、アルブミンイントロン１遺伝子座におけるｈＩＤＳ導入遺伝子の標的化組込みを容易にするのに役立つように使用される。一部の実施形態では、相同性アームのサイズは、例えば、標的化組込みまたは導入遺伝子発現を阻害し得る、アルブミン遺伝子座における反復配列およびスプライシングエレメントを回避するように選ばれる。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来する。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子ドナーは、例えば、３’末端に停止コドンをさらに含んで、ＩＤＳ導入遺伝子が挿入されるアルブミン配列のさらなる転写を防止する。一部の実施形態では、ヒトＩＤＳ導入遺伝子を含むｒＡＡＶ２／６ドナーベクター（例えば、ＳＢ－ＩＤＳドナー）は、エクソン１プラスエクソン２～９（例えば、配列番号１５）の部分を含む部分的ＩＤＳ ｃＤＮＡを含むプロモーターなし構築物である。一部の実施形態では、例えば、ｈＦ９エクソン２に由来するスプライスアクセプター部位（例えば、ＳＡ、配列番号１４）が存在して、アルブミン遺伝子座から成熟ｍＲＮＡへのｈＩＤＳ転写物の効率的スプライシングを可能にし、これは両方の種類のドナー組込み機構（例えば、ＮＨＥＪまたはＨＤＲ）で有効である。一部の実施形態では、ドナーは、ＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）と命名されたドナーである。
一部の実施形態では、処置に先立つ対象における総尿ＧＡＧの量と比較して、または処置されていない患者における総尿ＧＡＧと比較して、総尿ＧＡＧの量は、本明細書に開示される方法および組成物によって対象において安定化または低減される。一部の実施形態では、総尿ＧＡＧは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％またはその間のいずれかの値だけ低減される。一部の実施形態では、処置に先立つ対象における尿デルマタン硫酸ＧＡＧの量と比較して、または処置されていない患者における尿デルマタン硫酸ＧＡＧと比較して、尿デルマタン硫酸ＧＡＧの量は、本明細書に開示される方法および組成物によって対象において安定化または低減される。一部の実施形態では、尿デルマタン硫酸ＧＡＧは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％またはその間のいずれかの値だけ低減される。一部の実施形態では、処置に先立つ対象における尿ヘパラン硫酸ＧＡＧの量と比較して、または処置されていない患者における尿ヘパラン硫酸ＧＡＧと比較して、尿ヘパラン硫酸ＧＡＧの量は、本明細書に開示される方法および組成物によって対象において安定化または低減される。一部の実施形態では、尿ヘパラン硫酸ＧＡＧは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％またはその間のいずれかの値だけ低減される。一部の実施形態では、ＧＡＧレベルは、患者が、本明細書に開示される組成物による処置後にＥＲＴを中止してから、処置効果を査定するための生化学的マーカーとして使用される。ＧＡＧ測定は、患者に関する他の臨床パラメーターの査定と併せて使用された場合に、最も有用である。
一部の実施形態では、アルブミン特異的対における本明細書に開示される方法および組成物において有用なＺＦＮは、ＡＡＶ２／６送達により同様に送達され（例えば、肝細胞に）、一方のＡＡＶは、左ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７１７１またはＳＢ－７１５５７；それぞれ配列番号９または配列番号３０）を含み、もう一方は、右ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７８９８またはＳＢ－７１７２８；それぞれ配列番号１２または配列番号３１）を含む。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、例えば、ヒトＡｐｏＥエンハンサーおよびヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターで構成される肝臓特異的エンハンサーおよびプロモーターによる制御下にある（Miao CH et al. (2000) Mol. Ther. 1(6):522-532 (200)）。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、最小トランスサイレチンプロモーターの下にある。一部の実施形態では、ＺＦＮを含む発現カセットは、上に記載されている１つまたは複数のＦＬＡＧタグ（例えば、Ｎ末端ペプチド）、核局在化配列（ＮＬＳ）、ＷＰＲＥ配列、代替ポリＡ配列、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーター（例えば、配列番号２）は、特異的にかつ高度に活性である（例えば、意図される標的組織である肝細胞において）が、非肝臓細胞および組織型において不活性である；このことは、非標的組織におけるＺＦＮ発現および活性を防止する。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、最小トランスサイレチンプロモーターの下にある。一部の実施形態では、ＺＦＮを含む発現カセットは、上に記載されている１つまたは複数のＦＬＡＧタグ、核局在化配列（ＮＬＳ）、ＷＰＲＥ配列、代替ポリＡ配列、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＺＦＮおよびＩＤＳドナーは、例えば、全３種の構成成分：ペアードＺＦＮの各構成成分のための２種のＡＡＶベクター、およびドナーを運ぶ１種のＡＡＶを含む組成物（例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶまたはＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（例えば、表１または表４）、ＳＢ－４７８９８ ＡＡＶまたはＳＢ－７１７２８ ＡＡＶ（例えば、表２または表５）およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３）を含む組成物）を使用して送達される。
一部の実施形態では、低減、安定化または排除された尿ＧＡＧ（例えば、尿ＧＡＧレベル）は、本明細書に開示される方法および組成物による処置の後に、対象の尿において測定される。一部の実施形態では、尿における低減、安定化または排除されたＧＡＧ（例えば、尿ＧＡＧレベル、ヘパラン硫酸ＧＡＧおよび／またはデルマタン硫酸ＧＡＧ）は、当技術分野で公知のいずれかの方法によって測定される。尿ＧＡＧを測定するための例示的な方法は、ジメチルメチレンブルー（ＤＭＢ）アッセイ（例えば、de Jong et al. (1989) Clin Chem 35/7:1472-1479を参照）；セリンプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼに対する標識基質、セリンプロテアーゼの阻害剤、ならびに１種または複数種のグリコサミノグリカンを含むことが疑われる尿試料に依存した方法（例えば、米国特許出願公開第２０１３／０１８９７１８号を参照）；尿に見出されるヘパラン硫酸（ＨＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）およびケラタン硫酸（ＫＳ）の酵素消化と、それに続くＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる定量に基づくマルチプレックスアッセイ（Langereis et al. (2015) PLoS One 10(9):e0138622）；ならびにＲａｐｉｄＦｉｒｅ（ＲＦ、Ａｇｉｌｅｎｔ）ハイスループット質量分析システムを利用する、特異的な種類のＧＡＧの濃度の決定に使用することができるアッセイ（Tomatsu et al. (2014) J Anal Bioanal Tech. Mar 1; 2014 (Suppl 2):006を参照）を含む。
一部の実施形態では、対象は、ベースライン時にＥＲＴを受けた、または過去にＥＲＴを受けたことがあるが、他の実施形態では、対象は、ＥＲＴを受けていない。
一部の実施形態では、対象の本明細書に開示される方法および組成物を使用した処置は、例えば、末梢静脈カテーテルによる、本発明の組成物の投与を含む。一部の実施形態では、組成物は、生理的食塩水（ＮＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）希釈剤に添加され、希釈剤は、例えば、ヒト血清アルブミンをさらに含む。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、５ｅ１１ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、１ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ、および４ｅ１３のｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１３ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、構成成分は、別々に投与することができる、または好ましくは、全構成成分（同じまたは異なるベクターにおけるペアードＺＦＮ、およびＩＤＳドナー）を含む組成物、例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（例えば、表１）、ＳＢ－４７８９８ ＡＡＶ（例えば、表２）およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３）を含む組成物として投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（例えば、表４、配列番号３０）；ＳＢ－７１７２８（例えば、表５、配列番号３１）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）を含む。
一部の実施形態では、低減、安定化または排除された尿ＧＡＧは、例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇおよび／または１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総用量の本発明の組成物による処置の後の対象に関して測定される。一部の実施形態では、低減、安定化または排除された尿ＧＡＧは、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間（例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間および／または５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間）の総用量を受けた後の対象に関して測定される。
一部の実施形態では、例えば、本明細書に開示される本発明の組成物による処置と組み合わせたＥＲＴの標準投与レジメンで対象を処置することにより、処置されていない対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有する対象における機能的能力を改善、減退延期、または維持する方法であって、有効量のｈＩＤＳ導入遺伝子およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）と標準ＥＲＴ用量を対象に投与するステップを含み、対象が、処置後に例えば、機能的能力の改善、機能的能力の減退延期または維持を有する、方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子（例えば、配列番号１５）は、ＡＡＶ２／６送達により肝細胞に送達され、ｈＩＤＳ送達ベクターは、アルブミン遺伝子座におけるＺＦＮカット部位に隣接する領域に対する特異性を有する、ｈＩＤＳ導入遺伝子に隣接する相同性アーム（例えば、配列番号１３および配列番号１６）をさらに含む。一部の実施形態では、相同性の左アーム（ＬＡ）は、アルブミンイントロン１切断部位の上流の約２８０ヌクレオチド（例えば、配列番号１３）の同一配列を含有し、相同性の右アーム（ＲＡ）は、切断部位の下流の約１００ヌクレオチド（例えば、配列番号１６）の同一配列を含有する。一部の実施形態では、相同性のアームは、例えば、相同組換え修復による、アルブミンイントロン１遺伝子座におけるｈＩＤＳ導入遺伝子の標的化組込みを容易にするのに役立つように使用される。一部の実施形態では、相同性アームのサイズは、例えば、標的化組込みまたは導入遺伝子発現を阻害し得る、アルブミン遺伝子座における反復配列およびスプライシングエレメントを回避するように選ばれる。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来する。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子ドナーは、例えば、３’末端に停止コドンをさらに含んで、ＩＤＳ導入遺伝子が挿入されるアルブミン配列のさらなる転写を防止する。一部の実施形態では、ヒトＩＤＳ導入遺伝子を含有するｒＡＡＶ２／６ドナーベクター（例えば、ＳＢ－ＩＤＳドナー）は、例えば、エクソン１プラスエクソン２～９（例えば、配列番号１５）の部分を含む部分的ＩＤＳ ｃＤＮＡを含むプロモーターなし構築物である。一部の実施形態では、例えば、ｈＦ９エクソン２に由来するスプライスアクセプター部位（例えば、ＳＡ、配列番号１４）が存在して、アルブミン遺伝子座から成熟ｍＲＮＡへのｈＩＤＳ導入遺伝子の効率的スプライシングを可能にし、これは両方の種類のドナー組込み機構（例えば、ＮＨＥＪまたはＨＤＲ）で有効である。一部の実施形態では、ドナーは、ＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）と命名されたドナーである。
一部の実施形態では、アルブミン特異的対におけるＺＦＮは、ＡＡＶ２／６送達により同様に送達され（例えば、肝細胞に）、一方のＡＡＶは、左ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７１７１またはＳＢ－７１５５７；それぞれ配列番号９または配列番号３０）を含み、もう一方は、右ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７８９８またはＳＢ－７１７２８；それぞれ配列番号１２または配列番号３１）を含む。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、例えば、ヒトＡｐｏＥエンハンサーおよびヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターで構成される肝臓特異的エンハンサーおよびプロモーターによる制御下にある（Miao CH et al. (2000) Mol. Ther. 1(6):522-532 (200)）。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、最小トランスサイレチンプロモーターの下にある。一部の実施形態では、ＺＦＮを含む発現カセットは、上に記載されている１つまたは複数のＦＬＡＧタグ、核局在化配列（ＮＬＳ）、ＷＰＲＥ配列、代替ポリＡ配列、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーター（例えば、配列番号２）は、特異的にかつ高度に活性である（例えば、意図される標的組織である肝細胞において）が、非肝臓細胞および組織型において不活性である；このことは、非標的組織におけるＺＦＮ発現および活性を防止する。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物による処置の後の機能的能力の改善、減退延期または維持は、処置後の対象において測定される。一部の実施形態では、機能的能力の改善、減退延期または維持は、例えば、肺機能検査によって測定される努力肺活量のベースラインからの変化によって測定される。一部の実施形態では、機能的能力の改善、減退延期または維持は、例えば、６分間歩行検査によって測定される歩行距離のベースラインからの変化によって測定される。一部の実施形態では、機能的能力の改善、減退延期または維持は、例えば、関節可動域のベースラインからの変化によって測定される。一部の実施形態では、機能的能力の改善、減退延期または維持は、例えば、ＷＡＳＩ－ＩＩ（ウェクスラー短縮知能検査第２版（Shapiro et al.、同書））、ＷＰＰＳＩ－ＩＶ（ウェクスラー幼児用知能検査）またはＢＳＩＤ－ＩＩＩ（ベイリー乳幼児発達検査）およびＶＡＢＳ－ＩＩ（ヴァインランド適応行動尺度）によって測定される神経認知能力のベースラインからの変化によって測定される。
一部の実施形態では、対象は、ベースライン時にＥＲＴを受けた、または過去にＥＲＴを受けたことがあるが、他の実施形態では、対象は、ＥＲＴを受けていない。
一部の実施形態では、処置は、本発明の組成物の投与（例えば、末梢静脈カテーテルによる）を含む。一部の実施形態では、組成物は、生理的食塩水（ＮＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）希釈剤に添加され、希釈剤は、ヒト血清アルブミンをさらに含む。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、５ｅ１１ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。他の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、１ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ、および４ｅ１３のｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１３ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、構成成分は、別々に投与することができる、または好ましくは、全構成成分（同じまたは異なるベクターにおけるペアードＺＦＮ、およびＩＤＳドナー）を含む組成物、例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（例えば、表１）、ＳＢ－４７８９８ ＡＡＶ（例えば、表２）およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３）を含む組成物として投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（例えば、表４、配列番号３０）；ＳＢ－７１７２８（例えば、表５、配列番号３１）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）を含む。
一部の実施形態では、機能能力の改善、減退延期または維持は、例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇおよび／または１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総用量における本発明の組成物による処置の後の対象に関して測定される。一部の実施形態では、機能的能力の改善、減退延期または維持は、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間（例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間および／または５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間）の総用量を受けた後の対象に関して測定される。
一部の実施形態では、本発明の方法および組成物で処置されていない対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有するヒト対象における身体障害進行を抑制または延期する方法であって、有効量のｈＩＤＳ導入遺伝子およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を対象に投与するステップを含み、対象が、本明細書に開示される方法および組成物による処置後に身体障害進行の安定化、抑制または延期を有する、方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子（例えば、配列番号１５）は、ＡＡＶ２／６送達により送達され（例えば、肝細胞に）、ｈＩＤＳ送達ベクターは、アルブミン遺伝子座におけるＺＦＮカット部位に隣接する領域に対する特異性を有するｈＩＤＳ導入遺伝子に隣接する相同性アーム（例えば、配列番号１３および配列番号１６）をさらに含む。一部の実施形態では、相同性の左アーム（ＬＡ）は、アルブミンイントロン１切断部位の上流の約２８０ヌクレオチド（例えば、配列番号１３）の同一配列を含有し、相同性の右アーム（ＲＡ）は、切断部位の下流の約１００ヌクレオチド（例えば、配列番号１６）の同一配列を含有する。一部の実施形態では、相同性のアームは、例えば、相同組換え修復による、アルブミンイントロン１遺伝子座におけるｈＩＤＳ導入遺伝子の標的化組込みを容易にするのに役立つように使用される。一部の実施形態では、相同性アームのサイズは、例えば、標的化組込みまたは導入遺伝子発現を阻害し得る、アルブミン遺伝子座における反復配列およびスプライシングエレメントを回避するように選ばれた。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来する。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子ドナーは、例えば、３’末端に停止コドンをさらに含んで、ＩＤＳ導入遺伝子が挿入されるアルブミン配列のさらなる転写を防止する。一部の実施形態では、ヒトＩＤＳ導入遺伝子を含有するｒＡＡＶ２／６ドナーベクター（例えば、ＳＢ－ＩＤＳドナー）は、例えば、エクソン１プラスエクソン２～９（例えば、配列番号１５）の部分を含む部分的ＩＤＳ ｃＤＮＡを含むプロモーターなし構築物である。一部の実施形態では、例えば、ｈＦ９エクソン２に由来するスプライスアクセプター部位（例えば、ＳＡ、配列番号１４）が存在して、アルブミン遺伝子座から成熟ｍＲＮＡへのｈＩＤＳ転写物の効率的スプライシングを可能にし、これは両方の種類のドナー組込み機構（ＮＨＥＪまたはＨＤＲ）で有効である。一部の実施形態では、ドナーは、ＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）と命名されたドナーである。
一部の実施形態では、アルブミン特異的対におけるＺＦＮは、ＡＡＶ２／６送達により同様に送達され（例えば、肝細胞に）、一方のＡＡＶは、左ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７１７１またはＳＢ－７１５５７；それぞれ配列番号９または配列番号３０）を含み、もう一方は、右ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７８９８またはＳＢ－７１７２８；それぞれ配列番号１２または配列番号３１）を含む。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、例えば、ヒトＡｐｏＥエンハンサーおよびヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターで構成される、肝臓特異的エンハンサーおよびプロモーターによって制御される（Miao CH et al. (2000) Mol. Ther. 1(6):522-532 (200)）。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、最小トランスサイレチンプロモーターの下にある。一部の実施形態では、ＺＦＮを含む発現カセットは、上に記載されている１つまたは複数のＦＬＡＧタグ、核局在化配列（ＮＬＳ）、ＷＰＲＥ配列、代替ポリＡ配列、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーター（例えば、配列番号２）は、意図される標的組織である肝細胞において特異的にかつ高度に活性であるが、非肝臓細胞および組織型において不活性である；このことは、非標的組織におけるＺＦＮ発現および活性を防止する。
一部の実施形態では、身体障害進行の安定化、抑制または延期は、本明細書に開示される方法および組成物による処置の後の対象において測定される。一部の実施形態では、身体障害進行の安定化、抑制または延期は、例えば、肺機能検査によって測定される努力肺活量のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、身体障害進行の安定化、抑制または延期は、例えば、６分間歩行検査によって測定される歩行距離のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、身体障害進行の安定化、抑制または延期は、例えば、関節可動域（ＪＲＯＭ）のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、身体障害進行の安定化、抑制または延期は、例えば、ＷＡＳＩ－ＩＩ（ウェクスラー短縮知能検査第２版（Shapiro et al.、同書））、ＷＰＰＳＩ－ＩＶ（ウェクスラー幼児用知能検査）またはＢＳＩＤ－ＩＩＩ（ベイリー乳幼児発達検査）およびＶＡＢＳ－ＩＩ（ヴァインランド適応行動尺度）によって測定される神経認知能力のベースラインからの変化または安定化によって測定される。
一部の実施形態では、対象は、ベースライン時にＥＲＴを受けた、または過去にＥＲＴを受けたことがあるが、他の実施形態では、対象は、ＥＲＴを受けていない。
一部の実施形態では、処置は、本発明の組成物の投与（例えば、末梢静脈カテーテルによる）を含む。一部の実施形態では、組成物は、生理的食塩水（ＮＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）希釈剤に添加される。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、５ｅ１１ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、１ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ、および４ｅ１３のｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１３ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、構成成分は、別々に投与することができる、または好ましくは、全構成成分（同じまたは異なるベクターにおけるペアードＺＦＮ、およびＩＤＳドナー）を含む組成物、例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（例えば、表１）、ＳＢ－４７８９８ ＡＡＶ（例えば、表２）およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３）を含む組成物として投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（例えば、表４、配列番号３０）；ＳＢ－７１７２８（例えば、表５、配列番号３１）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）を含む。
一部の実施形態では、ＥＲＴの必要性の延期は、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇおよび／または１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総用量による本発明の組成物による処置の後の対象に関して測定される。一部の実施形態では、ＥＲＴの必要性の延期は、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間（例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間および／または５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間）の総用量を受けた後の対象に関して測定される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物で処置されなかった対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有する対象における医療用人工呼吸器デバイスの使用の必要性を安定化、延期、低減または予防する方法であって、有効量のｈＩＤＳ導入遺伝子およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を対象に投与するステップを含み、対象が、医療用人工呼吸器デバイスの使用の必要性の延期、低減または予防を有する、方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子（配列番号１５）は、ＡＡＶ２／６送達により送達され（例えば、肝細胞に）、ｈＩＤＳ送達ベクターは、アルブミン遺伝子座におけるＺＦＮカット部位に隣接する領域に対する特異性を有する、ｈＩＤＳ導入遺伝子に隣接する相同性アーム（例えば、配列番号１３および配列番号１６）をさらに含む。一部の実施形態では、相同性の左アーム（ＬＡ）は、アルブミンイントロン１切断部位の上流の約２８０ヌクレオチド（例えば、配列番号１３）の同一配列を含有し、相同性の右アーム（ＲＡ）は、切断部位の下流の約１００ヌクレオチド（例えば、配列番号１６）の同一配列を含有する。一部の実施形態では、相同性のアームは、相同組換え修復による、アルブミンイントロン１遺伝子座におけるｈＩＤＳ導入遺伝子の標的化組込みを容易にするのに役立つように使用される。一部の実施形態では、相同性アームのサイズは、標的化組込みまたは導入遺伝子発現を阻害し得る、アルブミン遺伝子座における反復配列およびスプライシングエレメントを回避するように選ばれた。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来する。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子ドナーは、３’末端に停止コドンをさらに含んで、ＩＤＳ導入遺伝子が挿入されるアルブミン配列のさらなる転写を防止する。一部の実施形態では、ヒトＩＤＳ導入遺伝子を含有するｒＡＡＶ２／６ドナーベクター（例えば、ＳＢ－ＩＤＳドナー）は、エクソン１プラスエクソン２～９（例えば、配列番号１５）の部分を含む部分的ＩＤＳ ｃＤＮＡを含むプロモーターなし構築物である。ｈＦ９エクソン２に由来するスプライスアクセプター部位（例えば、ＳＡ、配列番号１４）が存在して、アルブミン遺伝子座から成熟ｍＲＮＡへのｈＩＤＳ導入遺伝子の効率的スプライシングを可能にし、これは両方の種類のドナー組込み機構（例えば、ＮＨＥＪまたはＨＤＲ）で有効である。一部の実施形態では、ドナーは、ＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）と命名されたドナーである。
一部の実施形態では、アルブミン特異的対におけるＺＦＮは、ＡＡＶ２／６送達により肝細胞に同様に送達され、一方のＡＡＶは、左ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７１７１またはＳＢ－７１５５７；それぞれ配列番号９または配列番号３０）を含み、もう一方は、右ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７８９８またはＳＢ－７１７２８；それぞれ配列番号１２または配列番号３１）を含む。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、ヒトＡｐｏＥエンハンサーおよびヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターで構成される肝臓特異的エンハンサーおよびプロモーターによって制御される（Miao CH et al. (2000) Mol. Ther. 1(6):522-532 (200)）。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、最小トランスサイレチンプロモーターの下にある。一部の実施形態では、ＺＦＮを含む発現カセットは、上に記載されている１つまたは複数のＦＬＡＧタグ、核局在化配列（ＮＬＳ）、ＷＰＲＥ配列、代替ポリＡ配列、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーター（例えば、配列番号２）は、意図される標的組織である肝細胞において特異的にかつ高度に活性であるが、非肝臓細胞および組織型において不活性である；このことは、非標的組織におけるＺＦＮ発現および活性を防止する。一部の実施形態では、人工呼吸器の使用の必要性の安定化、延期、低減または予防は、処置後の対象において測定される。一部の実施形態では、人工呼吸器の使用の必要性の安定化、延期、低減または予防は、例えば、肺機能検査によって測定される努力肺活量のベースラインからの変化によって測定される。一部の実施形態では、人工呼吸器の使用の必要性の安定化、延期、低減または予防は、例えば、６分間歩行検査によって測定される歩行距離のベースラインからの変化によって測定される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物を使用した処置は、本発明の組成物の投与を含む（例えば、末梢静脈カテーテルによる）。一部の実施形態では、組成物は、生理的食塩水（ＮＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）希釈剤に添加され、希釈剤は、ヒト血清アルブミンをさらに含む。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、５ｅ１１ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。他の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、１ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ、および４ｅ１３のｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１３ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、構成成分は、別々に投与することができる、または好ましくは、全構成成分（同じまたは異なるベクターにおけるペアードＺＦＮ、およびＩＤＳドナー）を含む組成物、例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（例えば、表１）、ＳＢ－４７８９８ ＡＡＶ（例えば、表２）およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３）を含む組成物として投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（例えば、表４、配列番号３０）；ＳＢ－７１７２８（例えば、表５、配列番号３１）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）を含む。
一部の実施形態では、人工呼吸器の使用の必要性の低減または延期は、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇおよび／または１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総用量による本発明の組成物による処置の後の対象に関して測定される。一部の実施形態では、人工呼吸器の使用の必要性の低減または延期は、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間（例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間および／または５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間）の総用量を受けた後の対象に関して測定される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物で処置されていない対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有するヒト対象において対象が車椅子に依存することの開始を安定化、延期、低減または予防する方法であって、有効量のｈＩＤＳ導入遺伝子およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を対象に投与するステップを含み、対象において、処置後に車椅子に依存することの開始が安定化、延期、低減または予防されている、方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子（例えば、配列番号１５）は、ＡＡＶ２／６送達により肝細胞に送達され、ｈＩＤＳ送達ベクターは、アルブミン遺伝子座におけるＺＦＮカット部位に隣接する領域に対して特異的な、ｈＩＤＳ導入遺伝子に隣接する相同性アーム（例えば、配列番号１３および配列番号１６）をさらに含む。一部の実施形態では、相同性の左アーム（ＬＡ）は、アルブミンイントロン１切断部位の上流の約２８０ヌクレオチド（例えば、配列番号１３）の同一配列を含有し、相同性の右アーム（ＲＡ）は、切断部位の下流の約１００ヌクレオチド（例えば、配列番号１６）の同一配列を含有する。一部の実施形態では、相同性のアームは、相同組換え修復による、アルブミンイントロン１遺伝子座におけるｈＩＤＳ導入遺伝子の標的化組込みを容易にするのに役立つように使用される。一部の実施形態では、相同性アームのサイズは、標的化組込みまたは導入遺伝子発現を阻害し得る、アルブミン遺伝子座における反復配列およびスプライシングエレメントを回避するように選ばれる。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来する。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子ドナーは、３’末端に停止コドンをさらに含んで、ＩＤＳ導入遺伝子が挿入されるアルブミン配列のさらなる転写を防止する。一部の実施形態では、ヒトＩＤＳ導入遺伝子を含有するｒＡＡＶ２／６ドナーベクター（例えば、ＳＢ－ＩＤＳドナー）は、エクソン１プラスエクソン２～９（例えば、配列番号１５）の部分を含む部分的ＩＤＳ ｃＤＮＡを含むプロモーターなし構築物である。ｈＦ９エクソン２に由来するスプライスアクセプター部位（例えば、ＳＡ、配列番号１４）が存在して、アルブミン遺伝子座から成熟ｍＲＮＡへのｈＩＤＳ転写物の効率的スプライシングを可能にし、これは両方の種類のドナー組込み機構（例えば、ＮＨＥＪまたはＨＤＲ）で有効である。ある特定の実施形態では、ドナーは、ＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）と命名されたドナーである。
一部の実施形態では、アルブミン特異的対におけるＺＦＮは、ＡＡＶ２／６送達により肝細胞に同様に送達され、一方のＡＡＶは、左ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７１７１またはＳＢ－７１５５７；それぞれ配列番号９または配列番号３０）を含み、もう一方は、右ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７８９８またはＳＢ－７１７２８；それぞれ配列番号１２または配列番号３１）を含む。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、ヒトＡｐｏＥエンハンサーおよびヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターで構成される肝臓特異的エンハンサーおよびプロモーターによって制御される（Miao CH et al. (2000) Mol. Ther. 1(6):522-532 (200)）。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、最小トランスサイレチンプロモーターの下にある。一部の実施形態では、ＺＦＮを含む発現カセットは、上に記載されている１つまたは複数のＦＬＡＧタグ、核局在化配列（ＮＬＳ）、ＷＰＲＥ配列、代替ポリＡ配列、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーター（例えば、配列番号２）は、意図される標的組織である肝細胞において特異的にかつ高度に活性であるが、非肝臓細胞および組織型において不活性である；このことは、非標的組織におけるＺＦＮ発現および活性を防止する。
一部の実施形態では、車椅子に依存することの開始の安定化、延期、低減または予防は、処置後の対象において測定される。一部の実施形態では、車椅子に依存することの開始の安定化、延期、低減または予防は、肺機能検査によって測定される努力肺活量のベースラインからの変化によって測定される。一部の実施形態では、車椅子に依存することの開始の安定化、延期、低減または予防は、６分間歩行検査によって測定される歩行距離のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、車椅子に依存することの開始の安定化、延期、低減または予防は、関節可動域のベースラインからの変化または安定化によって測定される。一部の実施形態では、車椅子に依存することの開始の安定化、延期、低減または予防は、ＷＡＳＩ－ＩＩ（ウェクスラー短縮知能検査第２版（Shapiro et al.、同書））、ＷＰＰＳＩ－ＩＶ（ウェクスラー幼児用知能検査）またはＢＳＩＤ－ＩＩＩ（ベイリー乳幼児発達検査）およびＶＡＢＳ－ＩＩ（ヴァインランド適応行動尺度）によって測定される。一部の実施形態では、確認された身体障害進行の開始の安定化もしくは延期、または確認された身体障害進行のリスクの低減は、肝臓組織およびＣＳＦにおいて測定される総ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧおよびＨＳ ＧＡＧレベルのベースラインからの変化または安定化によって測定される。
一部の実施形態では、対象は、ベースライン時にＥＲＴを受けた、または過去にＥＲＴを受けたことがあるが、他の実施形態では、対象は、ＥＲＴを受けていない。
一部の実施形態では、処置は、末梢静脈カテーテルによる本発明の組成物による投与を含む。一部の実施形態では、組成物は、生理的食塩水（ＮＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）希釈剤に添加され、希釈剤は、ヒト血清アルブミンをさらに含む。一部の実施形態では、対象は、５ｅ１１ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。他の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、１ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ、および４ｅ１３のｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１３ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、構成成分は、別々に投与することができる、または好ましくは、全構成成分（例えば、同じまたは異なるベクターにおけるペアードＺＦＮ、およびＩＤＳドナー）を含む組成物、例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（例えば、表１）、ＳＢ－４７８９８ ＡＡＶ（例えば、表２）およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３）を含む組成物として投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（例えば、表４、配列番号３０）；ＳＢ－７１７２８（例えば、表５、配列番号３１）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）を含む。
一部の実施形態では、車椅子に依存することの開始の安定化、延期、低減または予防は、本明細書に記載される５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの組成物、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇおよび／または１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総用量の後の対象に関して測定される。一部の実施形態では、車椅子に依存することの開始の安定化、延期、低減または予防は、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間（例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間および／または５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間）の総用量を受けた後の対象に関して測定される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物で処置されなかった対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有する対象における平均余命を延長する方法であって、有効量のｈＩＤＳ導入遺伝子およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を対象に投与するステップを含み、対象が、延長された平均余命を有する、方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子（例えば、配列番号１５）は、ＡＡＶ２／６送達により肝細胞に送達され、ｈＩＤＳ送達ベクターは、アルブミン遺伝子座におけるＺＦＮカット部位に隣接する領域に対して特異的な、ｈＩＤＳ導入遺伝子に隣接する相同性アーム（例えば、配列番号１３および配列番号１６）をさらに含む。相同性の左アーム（ＬＡ）は、アルブミンイントロン１切断部位の上流の約２８０ヌクレオチド（例えば、配列番号１３）の同一配列を含有し、相同性の右アーム（ＲＡ）は、切断部位の下流の約１００ヌクレオチド（例えば、配列番号１６）の同一配列を含有する。一部の実施形態では、相同性のアームは、相同組換え修復による、アルブミンイントロン１遺伝子座におけるｈＩＤＳ導入遺伝子の標的化組込みを容易にするのに役立つように使用される。一部の実施形態では、相同性アームのサイズは、標的化組込みまたは導入遺伝子発現を阻害し得る、アルブミン遺伝子座における反復配列およびスプライシングエレメントを回避するように選ばれた。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来する。一部の実施形態では、ｈＩＤＳ導入遺伝子ドナーは、３’末端に停止コドンをさらに含んで、ＩＤＳ導入遺伝子が挿入されるアルブミン配列のさらなる転写を防止する。一部の実施形態では、ヒトＩＤＳ導入遺伝子を含有するｒＡＡＶ２／６ドナーベクター（ＳＢ－ＩＤＳドナー）は、エクソン１プラスエクソン２～９（配列番号１５）の部分を含む部分的ＩＤＳ ｃＤＮＡを含むプロモーターなし構築物である。一部の実施形態では、ｈＦ９エクソン２に由来するスプライスアクセプター部位（例えば、ＳＡ、配列番号１４）が存在して、アルブミン遺伝子座から成熟ｍＲＮＡへのｈＩＤＳ転写物の効率的スプライシングを可能にし、これは両方の種類のドナー組込み機構（例えば、ＮＨＥＪまたはＨＤＲ）で有効である。ある特定の実施形態では、ドナーは、ＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３および表３に従った配列）と命名されたドナーである。
一部の実施形態では、アルブミン特異的対におけるＺＦＮは、ＡＡＶ２／６送達により肝細胞に同様に送達され、一方のＡＡＶは、左ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７１７１またはＳＢ－７１５５７；それぞれ配列番号９または配列番号３０）を含み、もう一方は、右ＺＦＮ（例えば、ＳＢＳ－４７８９８またはＳＢ－７１７２８；それぞれ配列番号１２または配列番号３１）を含む。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、ヒトＡｐｏＥエンハンサーおよびヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターで構成される肝臓特異的エンハンサーおよびプロモーターによって制御される（Miao CH et al. (2000) Mol. Ther. 1(6):522-532）。一部の実施形態では、ＺＦＮ発現は、最小トランスサイレチンプロモーターの下にある。一部の実施形態では、ＺＦＮを含む発現カセットは、上に記載されている１つまたは複数のＦＬＡＧタグ、核局在化配列（ＮＬＳ）、ＷＰＲＥ配列、代替ポリＡ配列、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーター（例えば、配列番号２）は、意図される標的組織である肝細胞において特異的にかつ高度に活性であるが、非肝臓細胞および組織型において不活性である；このことは、非標的組織におけるＺＦＮ発現および活性を防止する。一部の実施形態では、平均余命の延長は、処置後の対象において測定される。
一部の実施形態では、処置は、末梢静脈カテーテルによる本明細書に開示される組成物の投与を含む。一部の実施形態では、組成物は、生理的食塩水（ＮＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）希釈剤に添加され、希釈剤は、ヒト血清アルブミンをさらに含む。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、５ｅ１１ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、１ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、本明細書に開示される通り、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ、および４ｅ１３のｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１３ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および４ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、対象は、例えば、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの例えば、左ＺＦＮまたは右ＺＦＮのいずれかを含む各ＺＦＮ ＡＡＶ２／６、および８ｅ１４ｖｇ／ｋｇのｈＩＤＳドナーＡＡＶを含む、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量を受ける。一部の実施形態では、構成成分は、別々に投与することができる、または好ましくは、全構成成分（同じまたは異なるベクターにおけるペアードＺＦＮ、およびＩＤＳドナー）を含む組成物、例えば、ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ（例えば、表１）、ＳＢ－４７８９８ ＡＡＶ（例えば、表２）およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３）を含む組成物として投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ（例えば、表４、配列番号３０）；ＳＢ－７１７２８（例えば、表５、配列番号３１）；およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（例えば、表３、配列番号１７）を含む。
一部の実施形態では、延長された平均余命は、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇおよび／または１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総用量における本発明の組成物による処置の後の対象に関して測定される。一部の実施形態では、延長された平均余命は、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間（例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間および／または５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間）の総用量を受けた後の対象に関して測定される。
ある特定の実施形態では、ａ）ＭＰＳ ＩＩを有する対象における追加の治療手順の必要性は、減少または安定化される；ｂ）ＭＰＳ ＩＩを有する対象における症状は、減少または安定化される、ｃ）ＭＰＳ ＩＩを有する対象の尿におけるＧＡＧの量は、低減、安定化または排除される；ｄ）ＭＰＳ ＩＩを有する対象における機能的能力は、改善または安定化される；ｅ）ＭＰＳ ＩＩを有する対象におけるＥＲＴの必要性は、減少または安定化される；ｆ）ＭＰＳ ＩＩを有する対象におけるＥＲＴの必要性は、延期または安定化される；ｇ）ＥＲＴ処置の用量および／もしくは頻度は、本明細書に開示される組成物で同様に処置されたＭＰＳ ＩＩを有する対象において安定化もしくは減少させられる、および／または対象は、ＥＲＴ単独で処置されたＭＰＳ－ＩＩ対象と比較して機能的能力の安定化もしくは増加を有する；ｈ）ＭＰＳ ＩＩを有する対象における身体障害進行のリスクは、安定化または減少する；ｉ）確認された身体障害進行の開始は、本発明の組成物で処置された対象において安定化または延期される、ｊ）車椅子に依存するようになることが遅くなる、または車椅子の必要性がなくなる；ｋ）機械的人工呼吸器の使用の必要性が、安定化、低減、延期または予防される；ｌ）本発明の組成物で処置した対象における平均余命が、組成物で処置されていない対象と比較して拡大される。
一部の実施形態では、対象は、本発明の組成物の注入に先立ち前投与される。一部の実施形態では、対象は、組成物の注入の前日に、プレドニゾンまたは等価コルチコステロイドを前投与される。一部の実施形態では、対象は、組成物の注入の前日に、および再度、注入当日に、プレドニゾンまたは等価コルチコステロイドを前投与される。一部の実施形態では、対象は、組成物の注入の前日に、再度、注入当日に、および／または再度、７日目に、および／または２週目に、および／または４週目に、および／または６週目に、および／または８週目から最大で２０週目の最大持続時間に、プレドニゾンまたは等価コルチコステロイドを前投与される。
上および本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、ＭＰＳ ＩＩは、身体的および認知的合併症を伴う、疾患の早期発症型、重症形態であるが、他の実施形態では、ＭＰＳ ＩＩは、身体的疾患のより晩期発症および中枢神経系疾患が殆どないまたは全くないことによって特徴付けされる軽症型ＭＰＳ ＩＩである。さらなる実施形態では、ＭＰＳ ＩＩ疾患は、両者の間の連続体にある。一部の実施形態では、対象は、成人であるが、一部の実施形態では、対象は、小児集団に由来する。
上述の実施形態のいずれかに係る（またはこれに適用される）ある特定の実施形態では、対象は、ＭＰＳ ＩＩの早期発症型、重症形態を有することに基づき処置に選択されるが、他の実施形態では、対象は、身体的疾患のより晩期発症と中枢神経系疾患が殆どないまたは全くないことによって特徴付けされる軽症型ＭＰＳ ＩＩを有するが、一部の実施形態では、対象は、両者の間の連続体にあるＭＰＳ ＩＩ疾患を有することに基づき処置に選択される。
上および本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、本発明の組成物は、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇおよび／または１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総用量で投与される。上および本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、本発明の組成物は、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間（例えば、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの間および／または５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの間）の総用量で投与される。上および本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、組成物は、静脈内投与される。
上述または本明細書における方法のいずれかのある特定の実施形態では、本発明の組成物の投与後の安定化、低減または減少または改善は、ベースラインレベル、無処置対象（複数可）におけるレベルおよび／または異なる処置（ＥＲＴなど）を受ける対象（複数可）におけるレベルと比較することができる。一部の実施形態では、組成物の投与の後の低減または減少または改善は、Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）を受ける対象（複数可）におけるレベルと比較することができる。
別の態様では、本明細書に記載される組成物のうち１種または複数種を含む製造品が本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、製造品は、本明細書に記載される３種の医薬組成物を含む（例えば、バイアルなどの異なる容器内に）製剤を含む：ＺＦＮ対の一方のメンバー（例えば、左ＺＦＮ）を含む第１の医薬組成物；ＺＦＮ対の第２のメンバー（例えば、右ＺＦＮ）を含む第２の医薬組成物；およびＩＤＳドナー（例えば、ＡＡＶ ＩＤＳドナー）を含む第３の医薬組成物。表６に示す濃度を含むがこれらに限定されない、いずれかの濃度の構成成分を使用することができる。さらに、いずれかの比の３種の医薬組成物を使用することができ、例えば、１：１：８（左ＺＦＮ：右ＺＦＮ：ＩＤＳドナー）を使用することができる。異なる構成成分は、いずれかの仕方で、例えば、組成物毎に使用される異なる色で標識することができる。ある特定の実施形態では、製造品は、次のものを含む、医薬品（drug product）バイアルのセットを含む：ｉ）ＺＦＮ１ベクター医薬品（ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＬＥＦＴ）、これは必要に応じて、第１の色（例えば、白色）を有するアルミニウムフリップトップシールを含む容器（例えば、バイアル）内にある；ｉｉ）ＺＦＮ２ベクター医薬品（ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＲＩＧＨＴ）、これは必要に応じて、第１の色とは異なる第２の色（例えば、青色）を有するアルミニウムフリップトップシールを含む容器（例えば、バイアル）内にある；ならびにｉｉｉ）プロモーターレス（promotorless）ＩＤＳ導入遺伝子をコードするＤＮＡ修復鋳型をコードする、第３のベクターＳＢ－Ａ６Ｐ－ＨＲＬ医薬品、これは必要に応じて、第１および第２の色とは異なる第３の色（例えば、オレンジ色）のアルミニウムフリップトップシールを含む容器（例えば、バイアル）内にある。さらなる実施形態では、ＳＢ－７１５５７（ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＬ２）またはＳＢ－７１７２８（ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＲ２）をコードするＡＡＶベクター、およびＳＢ－Ａ６Ｐ－ＨＲＬベクターを含む医薬品のセットが提供される。本明細書に記載される組成物のいずれかにおいて、組換えベクターの精製されたロットは、ガラス医薬品バイアルに５ｍＬの体積で充填された、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、スクロースおよびポロクサマー１８８を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において製剤化することができる、ｂ）上および本明細書に記載されている方法のうちいずれか１つに従って対象におけるＭＰＳ ＩＩを処置するための指示を有する添付文書。一部の実施形態では、組成物は、およそ１．１５ｍｇ／ＭＬのリン酸ナトリウム、０．２ｍｇ／ｍＬリン酸カリウム、８．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、０．２ｍｇ／ｍＬ塩化カリウム、０．１３ｍｇ／ｍＬ塩化カルシウムおよび０．１ｍｇ／ｍＬ塩化マグネシウムを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。ＰＢＳは、２．０５ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、１０～１２ｍｇ／ｍＬのスクロースおよび０．５～０ｍｇ／ｍＬのＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）（ポロクサマーまたはＰ１８８）によりさらに改変される。製造品（医薬品）は、対象に適したいずれかの濃度（例えば、本明細書に記載される通り体重に基づき決定）におけるＭＰＳ ＩＩの処置のための治療レベルを含む、対象においてＩＤＳが発現されるように、それを必要とする対象に投与される（例えば、静脈内に）。投与は、１回、またはいずれかの頻度での複数回となることができる。加えて、医薬品のセットは、別々に投与することができる、または例えば静脈内注入バッグにおいて、投与に先立ち組み合わせることができる。
別の態様では、選択された対象に関する本明細書に記載される組成物（例えば、製造品／医薬品のセットを形成する）の用量を決定する方法であって、処置前に（ベースライン）対象の体重（小数第３位で四捨五入される（rounded to two decimal points））を決定するステップと、対象の体重をｖｇ／ｍＬ濃度で割って、使用されるべき用量を決定するステップとを含む方法が提供される。例えば、コホート１で処置されるべき５０ｋｇ対象に関して、０．５ｅ１４ｖｇのＺＦＮ１（例えば、４７１７１または７１５５７）、０．５ｅ１４ｖｇのＺＦＮ２（例えば、４７８９８または７１７２９）および４ｅ１４ ＳＢ－ＩＤＳが使用される。さらに、これらのステップが実行される：（ｉ）コホート用量にベースライン時の患者体重を掛け、次いでＶＧ濃度で割ることにより、３種の製品構成成分体積を計算するステップであって、例えば、次の通りに行われるステップ：（ａ）試験コーディネーターからコホートおよびベースライン時の患者体重を得ること、（ｂ）臨床解析証明書（Clinical Certificates of Analysis）からＶＧ濃度を得ること、（ｉｉ）３種の製品構成成分体積およびＮＳ／ＰＢＳ体積をまとめて加算することにより、総体積を計算するステップ、（ｉｉｉ）０．２５％ＨＳＡの最終濃度の達成に要求されるＨＳＡ静脈内液剤の体積を計算するステップ、ならびに（ｉｖ）調整されたＮＳ／ＰＢＳ体積を計算するステップ。本方法は、総体積を決定することにより、対象の体重に対して正確な投与量で製剤（例えば、本明細書に記載される３種の医薬品を含む製造品を含む）を用意するステップと、必要とされるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）静脈内液剤の体積を計算し、これにより、選択された対象に対する正確な構成成分濃度を達成するステップとをさらに含むことができる。
一部の実施形態では、用量は、対象の肝臓の体積によって決定される。対象の体重は、特に、より重い患者では、必ずしも肝臓体積と直接相関するとは限らない。月齢２ヶ月未満の小児患者では、種々の治療薬の最適な投与量は、肝毒性を回避するために肝臓体積に基づくことができる（Bartelink et al. (2006) Clin Pharm 45(11):1077-1097を参照）。よって、一部の対象に対し、用量は、おおよその肝臓体積によって決定することができる。これらの実例では、肝臓体積は、例えば、年齢、性別、体重、身長、ボディ・マス・インデックスおよび体表面積などのパラメーターの組合せに基づく式の使用により、当技術分野で公知の方法によって推定することができる（Yuan et al. (2008) Transplant Proc 40(10):3536-40）。当技術分野で公知の、肝臓体積を推定または決定するための他の方法は、ＣＴまたはＭＲＩスキャン、および腹部形状寸法の推定を含む（Yang et al. (2018) Yonsei Med J 59(4):546-553；Huynh et al. (2014) AJR Am J Roentgenol 202(1):152-59）。
別の態様では、本明細書に記載される組成物を投与する方法であって、本明細書に記載される製造品（例えば、本明細書に記載される通り、３種の（ＡＡＶ）医薬組成物（左ＺＦＮ、右ＺＦＮ、ＡＡＶドナー）を別々にまたは一緒に含む医薬品）を用意するステップと、対象に対して選択された用量で１種または複数種の静脈内液剤を製剤化するステップと（例えば、本明細書に記載される方法を使用して）、静脈内液剤を、それを必要とする対象に静脈内投与するステップとを含む方法が本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、製造品の３種の構成成分（ＺＦＮ１、ＺＦＮ２およびＩＤＳドナー）は、およそ２００ｍＬ ＩＶ注入バッグ、例えば、ＮＳまたはＰＢＳ中０．２５％ＨＳＡを含有するＩＶ注入バッグに別々に添加される。総注入体積は、対象のコホート割り当ておよび体重（ｋｇ）に従って計算され、対象のコホート割り当ておよび体重（ｋｇ）に応じておよそ２４０～８００ｍＬの間であると予想される。調製された注入製品は、対象が病院または救急治療施設にいる間に、定速注入ポンプを使用して、１００ｍＬ／時間の静脈内注入により投与される。本明細書に記載される方法のいずれかは、いずれかの速度で、例えば、１０～２００ｍＬ／時間（またはその間のいずれかの値）で、注入ポンプを使用して送達することができる。ある特定の実施形態では、静脈内液剤は、１００ｍＬ／時間の速度で送達される。対象は、ＥＲＴを受けていてよい、または過去にＥＲＴを受けたことがあってよい。ある特定の実施形態では、ＥＲＴは、静脈内液剤注入の週の間に与えられない。
対象の白血球におけるＩＤＳのレベル（活性）を増加させる方法であって、本明細書に記載される静脈内液剤（例えば、３種の医薬組成物を含む系）を投与するステップを含む方法も提供される。ある特定の実施形態では、ＩＤＳレベルは、正常未満（ＭＰＳ ＩＩ対象における）から、正常範囲内のレベル（非ＭＰＳ ＩＩ対象におけるレベル）へと増加する。増加したＩＤＳレベル／活性は、ＩＤＳレベル／活性を直接測定することにより、および／またはＧＡＧレベルを測定することにより決定することができる。本明細書に記載される方法および組成物を使用して、血漿および尿におけるＩＤＳレベル（活性）を増加させることもできる。
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、対象は、例えば、静脈内液剤の注入の１、２、３、４、５、６、７日前にもしくはそれよりも前に、注入当日に、および／または注入の最大２０週間後にもしくはそれよりも後に、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）を受けることができ、投与量は、対象の体重に基づき決定される。対象の体重によって決定される、経時的な経口プレドニゾン漸減用量の例示的なスケジュールを下の表Ａに示す：
Figure 0007432581000001
一部の実施形態では、表Ａに例示される用量以外の、コルチコステロイドまたは他の免疫抑制薬の他の用量（より多いまたは少ない用量を含む）を使用することができる（例えば、２．０、１．５ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾロンもしくはそれよりも多く、またはメトトレキセート７．５～１５．５ｍｇ／週）。一部の実施形態では、漸減の開始は、表Ａに例示されているよりも後に行う（例えば、４、５、６、７または８週間またはそれよりも後に）。
これらのおよび他の態様は、開示を全体として踏まえることにより、当業者に直ちに明らかとなる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ＭＰＳ ＩＩを有する対象における追加の処置手順の必要性、症状の開始、進行および／または重症度を低減、延期および／または排除する方法であって、第１、第２および第３のＡＡＶベクターを含む組成物を投与することにより、前記対象を処置するステップを含み、前記第１のＡＡＶベクターが、７１５５７または４７１７１と命名された左ＺＦＮをコードする配列を含み、前記第２のＡＡＶベクターが、７１７２８または４７８９８と命名された右ＺＦＮをコードする配列を含み、前記第３のＡＡＶベクターが、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードする配列を含む、方法。
（項目２）
前記対象におけるＧＡＧレベルが低減、安定化される、および／またはＧＡＧが前記対象の尿から排除される、項目１に記載の方法。
（項目３）
血漿および／または白血球におけるＩＤＳレベルが、安定化および／または増加され、必要に応じて、ＩＤＳレベルが、同じ状態を保つまたは検出レベルを下回る、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目４）
第１、第２および第３のＡＡＶベクターが、１：１：８の固定比で投与される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
低減、延期および／または排除される前記追加の処置手順が、酵素補充療法（ＥＲＴ）；骨髄移植；ならびに／または整形外科的、心臓および／もしくは上気道閉塞（例えば、アデノイド口蓋扁桃摘出術、ヘルニア修復術、脳室腹腔シャント、心臓弁置換術、手根管開放術、脊髄減圧）のための１種もしくは複数種の支持的外科手順を含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）
その開始、進行または重症度が低減、延期または排除される、ＭＰＳ ＩＩに関連する前記症状が、機能的能力の減退、神経学的増悪、関節硬直、車椅子に依存するようになること、身体障害の進行、強制空気陽圧換気の要求（人工呼吸器の要求）および／または寿命短縮を含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記第１および／または第２のＡＡＶベクターが、次の配列：小型のペプチド（ＦＬＡＧまたはＨｉｓタグ配列などのペプチドタグを含むがこれらに限定されない）をコードする配列；ＷＰＲＥ配列；核局在化シグナル（ＮＬＳ）コード配列；ポリＡシグナル；ジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガータンパク質のうち１つもしくは複数における１個もしくは複数の変異；前記ジンクフィンガーヌクレアーゼのＦｏｋＩヌクレアーゼ切断ドメインもしくは切断ハーフドメインにおける１個もしくは複数の変異；前記ＺＦＮの発現を駆動するプロモーター配列（例えば、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターなどの肝臓特異的プロモーター）；１つもしくは複数のイントロン配列（例えば、ヒトβ－グロビン遺伝子の第１のイントロン由来の５’ドナー部位ならびに免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロン由来の分枝および３’アクセプター部位を含むＨＧＧ－ＩＧＧキメライントロン）；および／または１つもしくは複数のエンハンサー配列（例えば、ヒトＡｐｏＥエンハンサー配列）のうち１つまたは複数を含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記左ＺＦＮが、７１５５７を含み、前記右ＺＦＮが、７１７２８を含む、または
前記左ＺＦＮが、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＦＬ２を含み、前記右ＺＦＮが、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＲ２を含む、または
前記左ＺＦＮが、４７１７１を含み、前記右ＺＦＮが、４７８９８を含む、または
前記左ＺＦＮが、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＬＥＦＴを含み、前記右ＺＦＮが、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＲＩＧＨＴを含む、
先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記ＩＤＳドナーが、ヒトＩＤＳコード配列、必要に応じて、配列番号１５に示す配列、および／または（ｉ）表３に示す配列もしくは（ｉｉ）配列番号１７に示す配列を含むＡＡＶベクターを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
処置の前および後の前記対象において、血漿、肝臓、ＣＳＦにおけるまたは白血球におけるＩＤＳ活性および／またはレベルを測定するステップをさらに含み、ＩＤＳ活性が処置後に増加する（例えば、正常範囲まで）場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
処置の前および後の前記対象の尿における総ＧＡＧレベル、デルマタン硫酸を含むＧＡＧ（ＤＳ ＧＡＧ）レベルおよび／またはヘパラン硫酸を含むＧＡＧ（ＨＳ ＧＡＧ）レベルを測定するステップをさらに含み、ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧおよび／またはＨＳ ＧＡＧレベルが処置後に低減する場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
処置の前および後の努力肺活量を測定するステップをさらに含み、肺機能が処置後に増加する場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
処置の前および後の歩行距離を測定するステップをさらに含み、歩行距離が処置後に増加する場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
処置の前および後の関節可動域（ＪＲＯＭ）を測定するステップをさらに含み、ＪＲＯＭが処置後に増加する場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
脾臓および／または肝臓体積が処置後に増加する前および後に脾臓および／または肝臓体積を測定するステップをさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
処置の前および後の１つまたは複数の神経認知能力を測定するステップをさらに含み、前記神経認知能力のうち１つまたは複数が処置後に増加する場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
身体障害進行、臓器腫大、機能亢進、攻撃性、神経学的増悪、関節硬直、骨格変形、心臓弁肥厚、難聴、角膜混濁および視覚障害、ヘルニアおよび／または上気道感染症が、処置後に前記対象において抑制、低減、延期または排除される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
前記対象における医療用人工呼吸器デバイスの使用の必要性が、処置後に安定化、延期、低減または避けられる、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
前記対象が車椅子に依存することの開始が、処置後に延期、低減または避けられる、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
前記対象の平均余命が、処置後に増加する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
前記追加の治療手順が、ＥＲＴであり、必要に応じて、ＥＲＴが、処置後に低減または中止され、必要に応じて、ＥＲＴが、処置後に数時間、数週間、数ヶ月間または数年間低減または中止される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記追加の治療手順が、骨髄移植である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記対象が、１ｅ１２～１ｅ１６ｖｇ／ｋｇの間の総ＡＡＶ用量を受け、必要に応じて、前記総ＡＡＶ用量が、（ｉ）５ｅ１１ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに４ｅ１２ｖｇ／ｋｇの前記第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ；（ｉｉ）１ｅ１２ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに８ｅ１２ｖｇ／ｋｇの第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ；（ｉｉｉ）５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに４ｅ１３の第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ；（ｉｖ）１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに８ｅ１３ｖｇ／ｋｇの前記第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ；（ｖ）５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに４ｅ１４ｖｇ／ｋｇの前記第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ；または（ｖｉ）１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに８ｅ１４ｖｇ／ｋｇの前記第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
前記組成物が、必要に応じて注入ポンプにより、１０～２００ｍＬ／時間の間のいずれか、必要に応じて１００ｍＬ／時間の速度で静脈内投与される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
前記対象が、本発明の組成物による処置の前および／または後に、必要に応じて、処置に先立つ１週間またはそれより長い間、毎日；処置の当日；処置後７日目に；処置後毎週；および／または処置後最大２０週間まで１週間おきに、必要に応じて表Ａに示す通り、必要に応じてコルチコステロイド、必要に応じてプレドニゾンを前投与される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
前記対象が、早期発症型ＭＰＳ ＩＩ、軽症型ＭＰＳ ＩＩまたは早期発症型ＭＰＳ ＩＩと軽症型ＭＰＳ ＩＩとの間のＭＰＳ ＩＩを含むハンター症候群を有する成人または子供である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２７）
前記組成物が、前記第１、第２および第３のＡＡＶベクターを含む３種の医薬組成物を含む製剤を含む製造品を含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２８）
各医薬組成物が、異なる色で標識されている、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記医薬組成物が、投与に先立ち、必要に応じて静脈内注入バッグにおいて組み合わされる、項目２７または項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記対象のための総用量が、次の通り：処置前に前記対象の体重を決定するステップと；前記対象の体重をｖｇ／ｍＬ濃度で割って、使用されるべき用量を決定するステップとによって決定され、必要に応じて、前記方法が、（ｉ）コホート用量に処置前の前記患者体重を掛け、次いで、前記ＶＧ濃度で割ることによって、例えば、次の通り：（ａ）試験コーディネーターから前記コホートおよびベースライン時の患者体重を得て、（ｂ）臨床解析証明書から前記ＶＧ濃度を得ることによって、３種の製品構成成分体積を計算するステップ；（ｉｉ）前記３種の製品構成成分体積およびＮＳ／ＰＢＳ体積をまとめて加算することにより、総体積を計算するステップ；（ｉｉｉ）０．２５％ＨＳＡの最終濃度の達成に要求されるＨＳＡ静脈内液剤の体積を計算するステップ、ならびに（ｉｖ）調整された前記ＮＳ／ＰＢＳ体積を計算するステップを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目３１）
第１、第２および第３のＡＡＶベクターを含む組成物の使用であって、前記第１のＡＡＶベクターが、７１５５７または４７１７１と命名された左ＺＦＮをコードする配列を含み、前記第２のＡＡＶベクターが、７１７２８または４７８９８と命名された右ＺＦＮをコードする配列を含み、前記第３のＡＡＶベクターが、ＩＤＳをコードする配列を含む、ＭＰＳ ＩＩを有する対象における追加の処置手順の必要性、症状の開始、進行および／または重症度を低減、延期および／または排除するための、使用。
（項目３２）
前記対象におけるＧＡＧレベルが、前記対象の尿において低減、安定化および／または排除される、項目３１に記載の使用。
（項目３３）
血漿および／または白血球におけるＩＤＳレベルが、安定化および／または増加され、必要に応じて、ＩＤＳレベルが、同じ状態を保つまたは検出レベルを下回る、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目３４）
第１、第２および第３のＡＡＶベクターが、１：１：８の固定比で投与される、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目３５）
低減、延期および／または排除される前記追加の処置手順が、酵素補充療法（ＥＲＴ）；骨髄移植；ならびに／または整形外科的、心臓および／もしくは上気道閉塞に対する１種もしくは複数種の支持的外科手順を含み、必要に応じて、心臓および／または上気道閉塞が、アデノイド口蓋扁桃摘出術、ヘルニア修復術、脳室腹腔シャント、心臓弁置換術、手根管開放術、脊髄減圧を含む、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目３６）
その開始、進行または重症度が低減、延期または排除される、ＭＰＳ ＩＩに関連する前記症状が、機能的能力の減退、神経学的増悪、関節硬直、車椅子に依存するようになること、身体障害の進行、強制空気陽圧換気の要求および／または寿命短縮を含む、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目３７）
前記第１および／または第２のＡＡＶベクターが、次の配列：小型のペプチド、必要に応じて、ＦＬＡＧまたはＨｉｓタグ配列などのペプチドタグをコードする配列；ＷＰＲＥ配列；核局在化シグナル（ＮＬＳ）コード配列；ポリＡシグナル；ジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガータンパク質のうち１つもしくは複数における１個もしくは複数の変異；前記ジンクフィンガーヌクレアーゼのＦｏｋＩヌクレアーゼ切断ドメインもしくは切断ハーフドメインにおける１個もしくは複数の変異；前記ＺＦＮの発現を駆動するプロモーター配列、必要に応じて、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターなどの肝臓特異的プロモーター；１つもしくは複数のイントロン配列、必要に応じて、ヒトβ－グロビン遺伝子の第１のイントロン由来の５’ドナー部位ならびに免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロン由来の分枝および３’アクセプター部位を含むＨＧＧ－ＩＧＧキメライントロン；ならびに／または１つもしくは複数のエンハンサー配列、必要に応じて、ヒトＡｐｏＥエンハンサー配列のうち１つまたは複数を含む、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目３８）
前記左ＺＦＮが、７１５５７を含み、前記右ＺＦＮが、７１７２８を含む、または
前記左ＺＦＮが、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＬ２を含み、前記右ＺＦＮが、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＲ２を含む、または
前記左ＺＦＮが、４７１７１を含み、前記右ＺＦＮが、４７８９８を含む、または
前記左ＺＦＮが、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＬＥＦＴを含み、前記右ＺＦＮが、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＲＩＧＨＴを含む、
先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目３９）
前記ＩＤＳドナーが、ヒトＩＤＳコード配列、必要に応じて、配列番号１５に示す配列を含むドナー、および／または（ｉ）表３に示す配列もしくは（ｉｉ）配列番号１７に示す配列を含むＡＡＶベクターを含む、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目４０）
処置の前および後の前記対象において、血漿、肝臓、ＣＳＦにおけるまたは白血球におけるＩＤＳ活性および／またはレベルを測定するステップをさらに含み、ＩＤＳ活性が、処置後に必要に応じて正常範囲まで増加する場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除される、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目４１）
処置の前および後の前記対象の尿における総ＧＡＧレベル、デルマタン硫酸を含むＧＡＧ（ＤＳ ＧＡＧ）レベルおよび／またはヘパラン硫酸を含むＧＡＧ（ＨＳ ＧＡＧ）レベルを測定するステップをさらに含み、ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧおよび／またはＨＳ ＧＡＧレベルが処置後に低減する場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除され、必要に応じて、ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧおよび／またはＨＳ ＧＡＧレベルが、クレアチニンに対する比として表現される、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目４２）
処置の前および後の努力肺活量を測定するステップをさらに含み、肺機能が処置後に増加する場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除される、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目４３）
処置の前および後の歩行距離を測定するステップをさらに含み、歩行距離が処置後に増加する場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除される、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目４４）
処置の前および後の関節可動域（ＪＲＯＭ）を測定するステップをさらに含み、ＪＲＯＭが処置後に増加する場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除される、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目４５）
脾臓および／または肝臓体積が処置後に増加する前および後に脾臓および／または肝臓体積を測定するステップをさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目４６）
処置の前および後の１つまたは複数の神経認知能力を測定するステップをさらに含み、前記神経認知能力のうち１つまたは複数が処置後に増加する場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除される、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目４７）
身体障害進行、臓器腫大、機能亢進、攻撃性、神経学的増悪、関節硬直、骨格変形、心臓弁肥厚、難聴、角膜混濁および視覚障害、ヘルニアおよび／または上気道感染症が、処置後に前記対象において抑制、低減、延期または排除される、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目４８）
前記対象における医療用人工呼吸器デバイスの使用の必要性が、処置後に安定化、延期、低減または避けられる、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目４９）
前記対象が車椅子に依存することの開始が、処置後に延期、低減または避けられる、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目５０）
前記対象の平均余命が、処置後に増加する、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目５１）
前記追加の治療手順が、ＥＲＴであり、必要に応じて、ＥＲＴが、処置後に数時間、数日間、数週間、数ヶ月間または数年間低減または中止される、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目５２）
前記追加の治療手順が、骨髄移植である、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目５３）
前記対象が、１ｅ１２～１ｅ１６ｖｇ／ｋｇの間の総ＡＡＶ用量を受け、必要に応じて、前記総ＡＡＶ用量が、（ｉ）５ｅ１１ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに４ｅ１２ｖｇ／ｋｇの前記第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ；（ｉｉ）１ｅ１２ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに８ｅ１２ｖｇ／ｋｇの第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ；（ｉｉｉ）５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに４ｅ１３の第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ；（ｉｖ）１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに８ｅ１３ｖｇ／ｋｇの前記第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ；（ｖ）５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに４ｅ１４ｖｇ／ｋｇの前記第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ；または（ｖｉ）１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに８ｅ１４ｖｇ／ｋｇの前記第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇを含む、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目５４）
前記組成物が、必要に応じて注入ポンプにより、１０～２００ｍＬ／時間の間のいずれかの速度で、必要に応じて１００ｍＬ／時間の速度で静脈内投与される、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目５５）
前記対象が、本発明の組成物による処置の前および／または後に、必要に応じて、処置に先立つ１週間またはそれより長い間、毎日；処置の当日；処置後７日目に；処置後毎週；および／または処置後最大２０週間まで１週間おきに、必要に応じて表Ａに示すスケジュールに従って、必要に応じてコルチコステロイド、必要に応じてプレドニゾンを前投与される、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目５６）
前記対象が、早期発症型ＭＰＳ ＩＩ、軽症型ＭＰＳ ＩＩまたは早期発症型ＭＰＳ ＩＩと軽症型ＭＰＳ ＩＩとの間のＭＰＳ ＩＩを含むハンター症候群を有する成人または子供である、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目５７）
前記組成物が、前記第１、第２および第３のＡＡＶベクターを含む３種の医薬組成物を含む製剤を含む製造品を含む、先行する項目のいずれかに記載の使用。
（項目５８）
各医薬組成物が、異なる色で標識されている、項目５７に記載の使用。
（項目５９）
前記医薬組成物が、投与に先立ち、必要に応じて静脈内注入バッグにおいて組み合わされる、項目５７または項目５８に記載の使用。
（項目６０）
前記対象のための総用量が、次の通り：処置前に、必要に応じて小数点第２位を四捨五入した前記対象の体重を決定するステップと；前記対象の体重をｖｇ／ｍＬ濃度で割って、使用されるべき用量を決定するステップとによって決定され、必要に応じて、前記方法が、（ｉ）コホート用量に処置前の前記患者体重を掛け、次いで、前記ＶＧ濃度で割ることによって、例えば、次の通り：（ａ）試験コーディネーターから前記コホートおよびベースライン時の患者体重を得て、（ｂ）臨床解析証明書から前記ＶＧ濃度を得ることによって、前記３種の製品構成成分体積を計算するステップ；（ｉｉ）前記３種の製品構成成分体積およびＮＳ／ＰＢＳ体積をまとめて加算することにより、総体積を計算するステップ；（ｉｉｉ）０．２５％ＨＳＡの最終濃度の達成に要求されるＨＳＡ静脈内液剤の体積を計算するステップ、ならびに（ｉｖ）調整された前記ＮＳ／ＰＢＳ体積を計算するステップを含む、先行する項目のいずれかに記載の使用。
図１は、対象におけるＭＰＳ ＩＩの症状の軽減に必要とされる最小有効用量を推定するためのＰＫ／ＰＤモデルを発明するために選ばれたステップを示す、概略図である。
図２は、モデルの発明において考慮される因子、および観察されるＳＢ－９１３マウスデータにＥｌａｐｒａｓｅ（登録商標）ヒトＰＫデータを関連付けるのに使用される数学的計算を示す概略図である。
図３は、マウス試験からの予測薬物動態（ＰＫ、ＩＤＳ血漿活性）および予測薬物動態力学的（ＰＤ、尿ＧＡＧ濃度）データの整列を示し、この試験において、マウスは、本発明のポリヌクレオチドで処置された。予測値は、黒色の実線として示す一方、実測値は、白丸として示す。データは、予測値および実測値がアラインすることを実証する。
図４は、３種の異なる用量群に関する、ヒトにおける予測ＰＫおよびＰＤ値を示す。モデルは、５ｅ＋１２の最低用量であっても、尿ＧＡＧの低減において有効性を有することを予測する。
図５Ａおよび図５Ｂは、グルコサミノグリカン（glucosaminoglycan）（ＧＡＧ）の分解を描写する図である。図５Ａは、デルマタン硫酸の異化分解を示す。図５Ｂは、ヘパラン硫酸の異化分解を示す。ＭＰＳ ＩＩ疾患は、デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸の両方を分解するプロセスを開始不能にして、ＭＰＳ ＩＩを有する対象のほぼ全ての臓器および体組織ならびに尿におけるこれらのＧＡＧの蓄積を生じる。細胞リソソームの内側へのＧＡＧの慢性蓄積は、ＭＰＳ ＩＩ患者における細胞のうっ血（cellular engorgement）、臓器腫大、組織破壊および臓器系機能不全をもたらす。 図５Ａおよび図５Ｂは、グルコサミノグリカン（glucosaminoglycan）（ＧＡＧ）の分解を描写する図である。図５Ａは、デルマタン硫酸の異化分解を示す。図５Ｂは、ヘパラン硫酸の異化分解を示す。ＭＰＳ ＩＩ疾患は、デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸の両方を分解するプロセスを開始不能にして、ＭＰＳ ＩＩを有する対象のほぼ全ての臓器および体組織ならびに尿におけるこれらのＧＡＧの蓄積を生じる。細胞リソソームの内側へのＧＡＧの慢性蓄積は、ＭＰＳ ＩＩ患者における細胞のうっ血（cellular engorgement）、臓器腫大、組織破壊および臓器系機能不全をもたらす。
図６Ａ～図６Ｃは、処置後１６週間の尿ＧＡＧ、尿デルマタン硫酸および尿ヘパラン硫酸レベルのパーセント変化を描写するグラフである。図６Ａは、コホート１およびコホート２における尿総ＧＡＧのベースラインからのパーセント変化を示し、コホート１（左パネル）において、三角形は、対象＃１のデータ点を示し、丸は、対象＃２のデータ点を示し、コホート２（右パネル）において、菱形は、対象＃３のデータ点を示し、四角形は、対象＃４のデータ点を示す。総尿ＧＡＧは、検証済みの１，９－ジメチレンブルー（ＤＭＢ）比色アッセイによって測定した。図６Ｂは、コホート１およびコホート２における尿デルマタン硫酸のベースラインからのパーセント変化を示し、コホート１（左パネル）において、三角形は、対象＃１のデータ点を示し、丸は、対象＃２のデータ点を示し、コホート２（右パネル）において、菱形は、対象＃３のデータ点を示し、四角形は、対象＃４のデータ点を示す。図６Ｃは、コホート１およびコホート２における尿ヘパラン硫酸のベースラインからのパーセント変化を描写し、コホート１（左パネル）において、三角形は、対象＃１のデータ点を示し、丸は、対象＃２のデータ点を示し、コホート２（右パネル）において、菱形は、対象＃３のデータ点を示し、四角形は、対象＃４のデータ点を示す。尿デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸は、検証済みのＭＳ／ＭＳアッセイによって測定した。図６におけるデータは、コホート２における対象が、減少した総尿ＧＡＧ、デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸を有したことを示す。 図６Ａ～図６Ｃは、処置後１６週間の尿ＧＡＧ、尿デルマタン硫酸および尿ヘパラン硫酸レベルのパーセント変化を描写するグラフである。図６Ａは、コホート１およびコホート２における尿総ＧＡＧのベースラインからのパーセント変化を示し、コホート１（左パネル）において、三角形は、対象＃１のデータ点を示し、丸は、対象＃２のデータ点を示し、コホート２（右パネル）において、菱形は、対象＃３のデータ点を示し、四角形は、対象＃４のデータ点を示す。総尿ＧＡＧは、検証済みの１，９－ジメチレンブルー（ＤＭＢ）比色アッセイによって測定した。図６Ｂは、コホート１およびコホート２における尿デルマタン硫酸のベースラインからのパーセント変化を示し、コホート１（左パネル）において、三角形は、対象＃１のデータ点を示し、丸は、対象＃２のデータ点を示し、コホート２（右パネル）において、菱形は、対象＃３のデータ点を示し、四角形は、対象＃４のデータ点を示す。図６Ｃは、コホート１およびコホート２における尿ヘパラン硫酸のベースラインからのパーセント変化を描写し、コホート１（左パネル）において、三角形は、対象＃１のデータ点を示し、丸は、対象＃２のデータ点を示し、コホート２（右パネル）において、菱形は、対象＃３のデータ点を示し、四角形は、対象＃４のデータ点を示す。尿デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸は、検証済みのＭＳ／ＭＳアッセイによって測定した。図６におけるデータは、コホート２における対象が、減少した総尿ＧＡＧ、デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸を有したことを示す。 図６Ａ～図６Ｃは、処置後１６週間の尿ＧＡＧ、尿デルマタン硫酸および尿ヘパラン硫酸レベルのパーセント変化を描写するグラフである。図６Ａは、コホート１およびコホート２における尿総ＧＡＧのベースラインからのパーセント変化を示し、コホート１（左パネル）において、三角形は、対象＃１のデータ点を示し、丸は、対象＃２のデータ点を示し、コホート２（右パネル）において、菱形は、対象＃３のデータ点を示し、四角形は、対象＃４のデータ点を示す。総尿ＧＡＧは、検証済みの１，９－ジメチレンブルー（ＤＭＢ）比色アッセイによって測定した。図６Ｂは、コホート１およびコホート２における尿デルマタン硫酸のベースラインからのパーセント変化を示し、コホート１（左パネル）において、三角形は、対象＃１のデータ点を示し、丸は、対象＃２のデータ点を示し、コホート２（右パネル）において、菱形は、対象＃３のデータ点を示し、四角形は、対象＃４のデータ点を示す。図６Ｃは、コホート１およびコホート２における尿ヘパラン硫酸のベースラインからのパーセント変化を描写し、コホート１（左パネル）において、三角形は、対象＃１のデータ点を示し、丸は、対象＃２のデータ点を示し、コホート２（右パネル）において、菱形は、対象＃３のデータ点を示し、四角形は、対象＃４のデータ点を示す。尿デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸は、検証済みのＭＳ／ＭＳアッセイによって測定した。図６におけるデータは、コホート２における対象が、減少した総尿ＧＡＧ、デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸を有したことを示す。
図７は、肝臓におけるアルブミン遺伝子座へのＩＤＳ導入遺伝子の組込みの検出に使用されるアッセイを説明する概略図である。アッセイは、肝臓において発現されたｍＲＮＡにおける特有のアルブミンエクソン１－ＩＤＳ融合体を検出するプライマーセットの使用に依存する、ＰＣＲに基づくアッセイである。挿入された導入遺伝子の存在下で、ＰＣＲ産物は、アルブミン遺伝子に対応する１種のプライマーと、ＩＤＳ導入遺伝子に対応する１種のプライマーとによって駆動される。ＰＣＲ産物は、ＩＤＳ導入遺伝子の組込みに依存する。ＩＤＳ導入遺伝子組込みの非存在下では、第２のＰＣＲアッセイは、アルブミンｍＲＮＡに対応するｍＲＮＡ発現のみを検出する。
図８は、試験薬による処置前および処置後経時的な、最初の６名の対象における血漿ＩＤＳのレベルを描写するグラフのセットである。血漿ＩＤＳは、全対象で検出可能であった。
図９は、試験薬による処置前および処置後経時的な、最初の６名の対象の尿において測定された、クレアチニンに対して正規化されたＧＡＧ（ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸および総グリコサミノグリカン）のレベルを描写するグラフのセットである。
図１０は、血液で測定されるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル増加を呈した対象６の血漿ＩＤＳレベルの詳細な表示である。点線は、血漿におけるＩＤＳレベルを描写する一方、実線は、血液におけるＡＬＴのレベルを描写する。矢印は、プレドニゾンの投与を指し示す。
詳細な説明
標的細胞における適した導入遺伝子配列の挿入を含む、ヒト対象におけるハンター（ＭＰＳ ＩＩ）症候群を処置および／または予防するための方法および組成物が本明細書に開示される。処置は、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏで対象自身の肝細胞のアルブミン遺伝子座に、酵素イズロン酸－２－スルファターゼ（ｈＩＤＳ）導入遺伝子の補正コピーを部位特異的に組み込む。組み込まれた導入遺伝子から発現されると、ｈＩＤＳは、活性があり、ムコ多糖グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を分解することができる。本発明は、ＭＰＳ ＩＩ対象のための予防または処置の方法について記載する。
通常、ＩＤＳ酵素は、細胞の内側に産生され、そのうち少量が、細胞の不完全な内部輸送系のために、循環中へと漏出し得る。細胞外酵素として定常状態が確立され、これは、細胞の表面にある受容体によって取り入れられて戻される。結果として、通常、身体内で産生される酵素の大部分は、組織に見出され、一般に、循環中にごく僅かな濃度の酵素が見出される。対照的に、ＥＲＴは、ＩＤＳ欠損組織への取り込みを可能にするために、循環中に高濃度を生じるように設計された酵素の大量ボーラスの、血流への直接注入である。しかし、ＥＲＴは、一過性高レベルのＩＤＳ酵素のみをもたらし、それに続いて、酵素の短い半減期により、また、大量に肝臓によって取り入れられるため、僅か数分間～数時間以内に循環から急速にクリアランスされる。組織への短時間の酵素曝露しかもたらされないため、これにより、ＥＲＴの有効性が限定され、本出願人らは、細胞による酵素取り込みが、緩徐な受容体媒介性プロセスであることが分かる。代わりに、ＭＰＳ ＩＩのための理想的な治療法は、循環において連続的で安定したレベルの酵素を産生し維持することにより、組織へのＩＤＳ酵素の長期的かつ持続した曝露を可能にするであろう。循環へと連続的に分泌される少ない量のＩＤＳであっても、組織ＧＡＧの低減に十分であり、潜在的に、本明細書に開示される組成物に有効性をもたらす可能性がある。
ＥＲＴは、処置後に患者の白血球におけるリソソーム酵素活性の量を増加させることが示されたが、これはおそらく、この細胞が、血漿から酵素を取り入れるためである（白血球は、リソソームが豊富な細胞である）。例えば、組換えＩＤＵＡを受けるＭＰＳ Ｉ患者の試験において、白血球におけるＩＤＵＡの平均活性は、処置に先立ち１ｍｇ当たり０．０４Ｕであり、処置後では、注入７日後に（即ち、次の処置の直前に）１ｍｇ当たり４．９８Ｕで測定されたことが報告された（Kakkis et al. (2001) NEJM 344(3)を参照）。同様に、ＭＰＳ ＩＩ患者の循環白血球におけるＩＤＳの測定は、組織に達する酵素の存在の決定に有用となり得る。
リソソーム蓄積病（ＬＳＤ）は、通常、廃脂質（waste lipid）、ムコ多糖（即ち、グリコサミノグリカン（glycosoaminoglycan）（ＧＡＧ））の分解に関与する機能的な個々のリソソームタンパク質の欠如を特徴とする希少な代謝的単一遺伝子疾患の群である。これらの疾患は、分解経路における特定の酵素が機能しないことに起因してこれらの化合物を再利用のために処理できないことから、これらの化合物が細胞内に集積することを特徴とする。ＬＳＤの病態生理は、最初、ＧＡＧの単純な沈着に関係すると考えられたが、現在の研究により、これらの疾患の複雑さが認識されている。ＧＡＧ貯蔵は、細胞、組織および器官の恒常性の撹乱をもたらすようであり、また、炎症応答の活性化をもたらすサイトカインおよび炎症性モジュレーターの分泌の増加にも結び付けられている（Muenzer（２０１４年）、Mol Gen Metabol、１１１巻：６３～７２頁）。
ハンター症候群とも称されるムコ多糖症ＩＩ（ＭＰＳ ＩＩ）は、主に男性に見出されるＸ連鎖型劣性リソソーム蓄積障害である。ＭＰＳ ＩＩの発生率は、１００，０００人の生児出生当たり０．３～０．７１として報告される（Burton & Giugliani (2012) Eur J Pediatr. (2012) Apr;171(4):631-9）。疾患の軽症型形態に関する２１．７年のより保存的な平均余命中央値の、年間発生率への適用により（疾患の重症形態に関する平均余命は、１１．８年である）（Burrow et al. (2008) Biologics. Jun;2(2):311-20；Young & Harper (1982) Med Genet. Dec;19(6):408-11）、現在米国で暮らすＭＰＳ ＩＩを有する約６２９名の個体の推定有病率が得られる。ＭＰＳ ＩＩは、ムコ多糖グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のリソソーム分解に関与する酵素をコードするイズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）遺伝子における変異によって引き起こされる。これは、尿、血漿および組織におけるＧＡＧの蓄積をもたらし、多系統進行性疾患を引き起こす。ＧＡＧは、ＭＰＳ ＩＩのための最も重要な生化学的測定値である。細胞および組織におけるＧＡＧ、特にデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸の蓄積は、ＭＰＳ ＩＩの根本的な病変および臨床症状の原因となる；ＧＡＧは、ＭＰＳ ＩＩの処置に最も一般的に使用される静脈内酵素補充療法の薬力学を査定するための、ＦＤＡおよびＥＭＡによって使用される生化学的マーカーであった。ハンター症候群は、身体的および認知的合併症を伴う早期発症型、重症疾患（対象の３分の２）から、身体的疾患のより晩期発症および殆どないまたは全くない中枢神経系（ＣＮＳ）疾患によって特徴付けされる軽症型ＭＰＳ ＩＩに及ぶ疾患スペクトラムを表す。特異的な種類のＩＤＳ変異（＞１５０種の遺伝子変異が同定された）およびその結果生じる残留ＩＤＳ酵素のレベルは、疾患の重症度を決定する可能性が最も高い。軽症型形態における残留ＩＤＳ活性は、野生型ＩＤＳ活性の０．２～２．４％で測定され、重症表現型の場合は、活性がなかった（Sukegawa-Hayasaka et al. (2006) J Inherit Metab Dis 29(6):755-61）。ＩＤＳ遺伝子は、Ｘｑ２８にマッピングされ、２４ｋｂにわたって拡散した９個のエクソンを含有する。主要な欠失および再編成は常に、疾患の重症形態に関連する。
重症型ＭＰＳ ＩＩ対象は典型的に、１８ヶ月齢～３歳の間に言葉の遅れおよび発育遅延を有し始める。疾患は、臓器腫大、機能亢進および攻撃性、神経学的増悪、関節硬直および骨格変形（異常脊柱骨を含む）、肥大した舌による粗な顔貌、心臓弁肥厚、難聴およびヘルニアなど、重症型ＭＰＳ ＩＩ対象における症状を特徴とする。関節硬直は、歩行および手先の器用さに関する問題を生じる。小児期初期において、対象は、身体活動中に仲間についていくことができないことを示す場合がある一方、その後の人生で、歩行する能力は、短い距離であっても、失われる場合があり、多くの対象は最終的に、車椅子に依存するようになる（Raluy-Callado et al. (2013) Orphanet J Rare Dis 8:101）。対象は、頻繁な上気道感染症を有し、これは最初に、アデノイド口蓋扁桃摘出術などの外科的手順によって処置することができるが、最終的に、気管開口術および／または陽圧換気を要求する場合がある（J. Ed. Wraith (2013) in Emery and Rimoin's Principles and Practice of Medical Genetics, Chapter 102.3, Rimoin, Pyeritz and Korf eds. Elsevier Ltd；Sasaki et al. (1987) Laryngoscope 97: 280-285）。主要な死亡率因子は、中枢神経系合併症、心臓合併症および上気道閉塞である（Sato et al. (2013) Pediatr Cardiol. 34(8):2077-2079）。重症型ハンター症候群を患う無処置対象の平均余命は、１０代半ばの年齢に収まり、神経学的増悪および／または心肺不全により死亡する。軽症型形態を有する対象は典型的に、重症対象よりも遅く診断される。疾患の症状は、重症対象と同様であるが、全体的な疾患重症度はより軽度であり、一般に、より緩徐な疾患進行により、認知的機能障害はないまたはごく軽度である。無処置の軽症型形態における死亡は多くの場合、心臓および呼吸器疾患による、２０～３０歳の間である。
ＭＰＳ ＩＩのために現在承認されている唯一の治療法は、酵素補充療法（ＥＲＴ）である。組換えＩＤＳタンパク質（イデュルスルファーゼ；Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）、Ｓｈｉｒｅ）による静脈内（ＩＶ）ＥＲＴは、０．５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で毎週１回の投与に関して２００６年以来米国ＦＤＡ承認されており、５歳およびそれより年上のＭＰＳ ＩＩ対象において歩行能力を改善することが示された。ＥＲＴの限界は、生涯にわたる処置の必要、中和抗体の発生、酵素が血液脳関門を通過できないこと、および毎週の静脈内注入の不便を含む。加えて、Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）は、処置後に血漿において非常に短い半減期を有する。承認された用量（０．５ｍｇ／ｋｇを３時間注入として毎週投与）で与えた場合、タンパク質は、４４分間のおおよその半減期を有する（Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）液剤、静脈内注入用処方情報、Ｓｈｉｒｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ ２００７ Ｏｃｔｏｂｅｒ）。イデュルスルファーゼは、ＣＮＳへと通過することができないため、ＥＲＴは、認知的機能に影響が殆どない～全くない（Parini et al. (2015) Mol Gen Metabol Rep 3:65-74）。ＭＰＳ ＩＩに伴う心弁疾患の処置に対して限られた有効性を有することも示唆された（Sato et al.、同書）。ハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉの重症形態）とは対照的に、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、認知的機能障害の処置における有効性の欠如のため、ＭＰＳ ＩＩの重症形態に対して歴史的に推奨されていない（Guffon et al. (2009) J. Pediatric 154(5):733）。
予備的解析において、分子および酵素的な証拠が、ｉｎ ｖｉｖｏ（身体の内側）でのヒトゲノムの編集により見出された。本明細書に開示される組成物は、機能的ＩＤＳ酵素の連続的供給が、対象の生涯にわたり産生されるように、対象の肝臓を処置するように意図されている。ｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集の予備的証拠は、ゲノム編集された肝臓細胞が、ＭＰＳ ＩＩを有する患者においてＩＤＳ酵素を生成することができる可能性があることを示唆するが、より多くのデータが、ＩＤＳ酵素増加が、臨床成績を改善するかどうかに関する理解に必要とされる。中間結果は、ｉｎ ｖｉｖｏ編集が、肝臓において起こったことを示唆し、生化学的データ（例えば、活性ＩＤＳ酵素の産生および血液中への分泌）は、ゲノム編集された肝臓細胞が、ＭＰＳ ＩＩを有する患者においてＩＤＳ酵素を生成することができることを示唆する。肝臓生検は、現在のところ、３名の適格対象について解析された － そのうち１名は低用量コホートから、２名は中間用量コホートから得た。両方の中間用量コホート対象由来の肝臓組織試料において、遺伝子組込みアッセイを使用して、ゲノム編集成功の分子シグナルが検出された。この検査は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）方法を使用して、アルブミン－ＩＤＳキメラｍＲＮＡ転写物を同定する。中間用量コホートにおける２名の対象由来の生検試料におけるアルブミン－ＩＤＳ ｍＲＮＡ融合転写物の検出は、内因性アルブミン遺伝子内の予想される部位においてＩＤＳ遺伝子のＺＦＮ媒介性組込みが起こったことを指し示す。より低感度のアッセイ（０．１％の定量下限）であるＭｉＳｅｑ ＤＮＡ配列決定を使用して行われた別の肝臓組織解析は、低および中間用量コホート対象由来の試料において編集を検出しなかった。第二世代の、潜在的により強力なＺＦＮ構築物（例えば、ＳＢ－７１５５７およびＳＢ－７１７２８）を、いくつかの改善の中でもとりわけ編集効率を増加させるように設計した。前臨床データは、３種の潜在的なＺＦＮ ２．０利点を示した：（１）構造変化による効率および効力の５～３０倍改善；（２）アルブミン遺伝子における標的遺伝子座に一塩基多型（ＳＮＰ）を有する患者（集団のおよそ２０％）において等しく良好に機能する能力；ならびに（３）改善された特異性（米国特許出願第１６／２７１，２５０号を参照）。これらのＺＦＮ組成物も検査される。
新たに開発された高感度定量的アッセイ（０．７８ｎｍｏｌ／時間／ｍＬの定量下限）を使用して、血漿ＩＤＳ活性を測定した。ベースラインと比較したＩＤＳ酵素活性の僅かな増加が、中間用量を受ける２名の対象において記録され、高用量を受ける１名の対象において、２４週間ではまだ、このような測定値は、ベースライン値に対して予想される範囲内のままであった（８２ｎｍｏｌ／時間／ｍＬより高いと推定される正常範囲と比較して、１０ｎｍｏｌ／時間／ｍＬ未満）。
血漿ＩＤＳ活性の実質的な増加は、高用量コホートの第２の患者において測定され、レベルは、本明細書に記載される組成物の投与後６週目までにおよそ５０ｎｍｏｌ／時間／ｍＬへと高まる。血漿ＩＤＳ活性レベルはその後、疑われる免疫応答によるＡＡＶに基づく治療法の公知リスクである軽度高トランスアミナーゼ血症の発症と併せて減少した。肝臓機能検査におけるグレード１上昇は、６２、１１１および１２８日目に測定した。患者は、試験薬とは無関係の嵌頓臍ヘルニアのため１２１日目に入院した。最新の観察の時点で、患者の血漿ＩＤＳ活性は、１４ｎｍｏｌ／時間／ｍＬと測定され、これはベースライン値を上回るが、正常範囲を下回る。
全６名の患者のベースライン尿ＧＡＧ測定値は、ベースラインで全対象において上昇したヘパラン硫酸を除いて、正常であるまたはそれを僅かに上回るとみなされる範囲内であった。結果全体は、ベースラインの変動性を明らかにした後に、本明細書に開示される組成物の用量に関してＧＡＧの実質的な増加も減少も示さなかった。
本明細書に開示される組成物の投与後に観察される生化学的変化の臨床関連性は、臨床データとして査定され、患者成績は、ＥＲＴ中止の試みの後に解析される。今日まで、２名の中間用量および１名の高用量患者が、ＥＲＴ中止を開始した。手順を開始した１名の中間用量患者は、疲労および増加するＧＡＧのため、およそ３ヶ月後にＥＲＴを再開した。将来における追加のデータ読み取りは、高用量コホート拡大対象由来の生化学的データ、肝臓生検解析およびＥＲＴ中止後の成績を含む。
概要
本明細書に開示される方法、ならびに組成物の調製および使用の実施は、特に示さない限り、本技術分野の技術範囲内の、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年および第３版、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年および定期的更新；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９８年；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、３０４巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ． ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ． Ｐ． Ｗｏｌｆｆｅ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９９年；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、１１９巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ． Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、１９９９年を参照されたい。
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用され、直鎖状または環状コンフォメーションの、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的のため、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈すべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有する；即ち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対合する。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、相互交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１または複数のアミノ酸が、対応する天然起源のアミノ酸の化学的アナログまたは修飾された誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有結合相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）必要はない。かかる相互作用は一般に、１０－６Ｍ－１またはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度を指す：増加した結合親和性は、より低いＫｄと相関する。
「結合タンパク質」は、別の分子と非共有結合的に結合できるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合できる。タンパク質結合タンパク質の場合、これは、それ自体と結合でき（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）および／または異なるタンパク質（単数もしくは複数）の１もしくは複数の分子に結合できる。結合タンパク質は、１つよりも多い型の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインであり、その構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１または複数のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する。用語、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、１個のＺＦＮと共に、二量体形成して標的遺伝子を切断するＺＦＮの対（対のメンバーは、「左および右」または「第１および第２の」または「対」と称される）を含む。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１または複数のＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。これらのリピートドメインは、その同族標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」とも呼ぶ）は、典型的には、３３～３５アミノ酸長であり、天然起源のＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号および同第９，４５８，２０５号を参照されたい。用語「ＴＡＬＥＮ」は、１個のＴＡＬＥＮと共に、二量体形成して標的遺伝子を切断するＴＡＬＥＮの対（対のメンバーは、「左および右」または「第１および第２の」または「対」と称される）を含む。ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然起源のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の工学技術での作製（１または複数のアミノ酸を変更する）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「工学技術で作製され」得る。したがって、工学技術で作製されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然起源のタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を工学技術で作製するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が合理的基準から主に生じる、天然起源でないタンパク質である。設計のための合理的基準には、置換ルールの適用、ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥの設計および結合データの情報を記憶するデータベース中の情報を処理するためのコンピューターアルゴリズムが含まれる。例えば、米国特許第８，５６８，５２６号、同第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；および同第６，５３４，２６１号を参照されたい；国際特許公開番号ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６もまた参照されたい。
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生がファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの実験プロセスから主に生じる、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；同第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；国際特許公開番号ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０ ＷＯ０１／８８１９７およびＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のため、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同性指向性の修復機構を介した細胞における二本鎖切断の修復の間に行われる、かかる交換の特殊化された形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、「標的」分子（即ち、二本鎖切断を経験したもの）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移入をもたらすので、「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔ ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として様々に公知である。いかなる特定の理論に制約されることも望まないが、かかる移入は、切断された標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／もしくは標的の一部となる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、ならびに／または関連するプロセスに関与し得る。かかる特殊化されたＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチド中に取り込まれるように、標的分子の配列の変更をもたらす。
本開示の方法では、本明細書に記載される１または複数の標的化されたヌクレアーゼは、所定の部位において標的配列（例えば、細胞クロマチン）中に二本鎖切断を生じ、切断の領域中のヌクレオチド配列に対する相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドが、細胞中に導入され得る。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組込みを容易にすることが示されている。このドナー配列は、物理的に組み込まれ得、またはあるいは、このドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによる切断の修復のための鋳型として使用されて、細胞クロマチン中への、ドナーと同様のヌクレオチド配列の全てまたは一部の導入を生じる。したがって、細胞クロマチン中の第１の配列は、変更され得、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列へと変換され得る。したがって、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、別のヌクレオチド配列による１つのヌクレオチド配列の置き換え（即ち、情報的な意味での配列の置き換え）を示すと理解され得、別のポリヌクレオチドによる１つのポリヌクレオチドの物理的または化学的置き換えを必ずしも必要としない。
本明細書に記載される方法のいずれかでは、さらなるジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥＮタンパク質の対が、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖開裂に使用され得る。
細胞クロマチン中の目的の領域中の配列の標的化された組換えおよび／または置き換えおよび／または変更のための方法のある特定の実施形態では、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって変更される。かかる相同組換えは、切断の領域と相同な配列が存在する場合に、細胞クロマチン中の二本鎖切断の存在によって刺激される。
本明細書に記載される方法のいずれかでは、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的の領域中のゲノム配列と相同ではあるが同一ではない配列を含み得、それによって、目的の領域において非同一配列を挿入するように相同組換えを刺激する。したがって、ある特定の実施形態では、目的の領域中の配列と相同なドナー配列の一部分は、置き換えられるゲノム配列に対して、約８０～９９％の間（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は、例えば、１ヌクレオチドのみが１００個を超える連続する塩基対のドナー配列とゲノム配列との間で異なる場合、９９％よりも高い。ある特定の場合、ドナー配列の非相同部分は、新たな配列が目的の領域中に導入されるように、目的の領域中に存在しない配列を含み得る。これらの例では、非相同配列には、一般に、目的の領域中の配列と相同または同一な、５０～１，０００塩基対（またはそれらの間の任意の整数値）または１，０００よりも大きい任意の数の塩基対の配列が隣接する。他の実施形態では、このドナー配列は、第一の配列とは非相同であり、非相同組換え機構によってゲノム中に挿入される。
本明細書に記載される方法のいずれかは、目的の遺伝子（複数可）の発現を破壊するドナー配列の標的化された組込みによる細胞中の１種もしくは複数種の標的配列の部分的もしくは完全な不活性化に使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株もまた提供される。
さらに、本明細書に記載される標的化された組込みの方法は、１種または複数種の外因性配列を組み込むためにも使用され得る。外因性核酸配列は、例えば、１種もしくは複数種の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の型のコード配列もしくは非コード配列、および１種もしくは複数種の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。さらに、この外因性核酸配列は、１種または複数種のＲＮＡ分子（例えば、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害的ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を産生し得る。
「開裂」（cleavage）とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。開裂は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が含まれるがこれらに限定されない種々の方法によって開始され得る。一本鎖開裂および二本鎖開裂の両方が可能であり、二本鎖開裂は、２つの個別の一本鎖開裂事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ開裂は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生を生じ得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドが、標的化された二本鎖ＤＮＡ開裂に使用される。
「開裂ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なるのいずれか）と協同して、開裂活性（好ましくは二本鎖開裂活性）を有する複合体を形成する、ポリペプチド配列である。用語「第１および第２の開裂ハーフドメイン」；「＋および－の開裂ハーフドメイン」ならびに「右および左の開裂ハーフドメイン」は、相互交換可能に使用されて、二量体形成する開裂ハーフドメインの対を指す。
「工学技術で作製された開裂ハーフドメイン」は、別の開裂ハーフドメイン（例えば、別の工学技術で作製された開裂ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体を形成するように改変された開裂ハーフドメインである。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号および同第８，８２３，６１８号を参照されたい。
用語「配列」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得；直鎖状、環状または分枝状であり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。用語「ドナー配列」とは、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２ヌクレオチド長と１０，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間もしくはそれらを上回る任意の整数値）、好ましくは約１００ヌクレオチド長と１，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは約２００ヌクレオチド長と５００ヌクレオチド長との間のものであり得る。
「疾患関連遺伝子」とは、単一遺伝子疾患においていくつかの様式で欠損している遺伝子である。単一遺伝子疾患の非限定的な例としては、重症複合免疫不全症、嚢胞性線維症、リソソーム蓄積病（例えば、ゴーシェ病、ハーラー病 ハンター病、ファブリー病、ニーマン・ピック病、テイ・サックス病など）、鎌状赤血球貧血、およびサラセミアが挙げられる。
「血液脳関門」とは、中枢神経系において循環血液を脳から分離する高度に選択的な透過性障壁である。血液脳関門は、血液溶質の通過を制限するＣＮＳ血管中の密着結合によって接続された脳内皮細胞によって形成される。血液脳関門は、長い間、大きな分子治療薬の取り込みを妨げ、大多数の小分子治療薬の取り込みを妨げると考えられてきた（Pardridge（２００５年）NeuroRx、２巻（１号）：３～１４頁）。
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核生物細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、各々２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含む：リンカーＤＮＡ（生物に依存して変動する長さのもの）が、ヌクレオソームコア間に延びる。１分子のヒストンＨ１が、一般に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的のため、用語「クロマチン」は、原核生物および真核生物の両方の、全ての型の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンには、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方が含まれる。
「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、細胞のゲノムを構成する全ての染色体のコレクションであるその核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１または複数の染色体を含み得る。
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製性の核酸、核タンパク質複合体または他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在する場合に、結合分子が結合する核酸の一部分を規定する核酸配列である。
「外因性」分子は、細胞中に通常は存在しない分子であるが、１または複数の遺伝学的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞中に導入され得る。「細胞中での通常の存在」は、特定の発生段階または細胞の環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、ヒートショックによって誘導される分子は、ヒートショックされていない細胞に関して、外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能障害性内因性分子の機能性バージョン、または正常に機能する内因性分子の機能障害性バージョンを含み得る。
外因性分子は、とりわけ、例えば、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるような小分子、または巨大分子、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾された誘導体、あるいは上記分子のうちの１または複数を含む任意の複合体であり得る。核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であり得；直鎖状、分枝状または環状であり得；任意の長さのものであり得る。核酸には、二重鎖を形成することが可能な核酸、ならびに三重鎖形成性核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが含まれるがこれらに限定されない。
外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入された感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または細胞中に通常は存在しない染色体を含み得る。細胞中への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、脂質媒介性移入（即ち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接的注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が含まれるがこれらに限定されない。外因性分子はまた、内因性分子と同じ型の分子であり得るが、細胞が由来するのとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターに元々由来する細胞株中に導入され得る。
対照的に、「内因性」分子は、特定の発生段階で特定の環境条件下で特定の細胞中に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然起源のエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれ得る。
「融合」分子は、２つまたはそれ超のサブユニット分子が、好ましくは共有結合によって連結された分子である。これらのサブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。融合分子の例としては、これだけに限定されないが、融合タンパク質（例えば、タンパク質ＤＮＡ結合ドメインと開裂ドメインとの間の融合物）、ポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｓｇＲＮＡ）が開裂ドメインに作用的に会合した融合物および融合核酸（例えば、融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。
細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じ得、このポリヌクレオチドは転写され、この転写物は翻訳されて、融合タンパク質を生じる。トランス－スプライシング、ポリペプチド開裂およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達のための方法は、本開示の他の場所に示される。
「遺伝子」には、本開示の目的のために、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（以下を参照）、ならびにかかる調節配列がコード配列および／または転写された配列に隣接してもしなくても、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域が含まれる。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
「遺伝子発現」とは、遺伝子中に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質もまた含まれる。
遺伝子発現の「モジュレーション」とは、遺伝子の活性における変化を指す。発現のモジュレーションには、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、開裂、変更、不活性化、ランダム変異）が、発現をモジュレートするために使用され得る。遺伝子不活性化とは、本明細書に記載されるＺＦＰまたはＴＡＬＥＮを含まない細胞と比較して、遺伝子発現における任意の低下を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的または完全であり得る。
「目的の領域」は、外因性分子に結合することが望まれる、細胞クロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接した非コード配列などである。結合は、標的化されたＤＮＡ開裂および／または標的化された組換えを目的とすることができる。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノム中に存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えばリーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写された非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ほどの小ささもしくは最大２，０００ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。
「真核生物」細胞には、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む動物細胞が含まれるがこれらに限定されない。
「赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）」（ＲＢＣ）または赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）は、造血幹細胞に由来する最終分化細胞である。赤血球は、ヌクレアーゼおよび大多数の細胞小器官が欠如している。ＲＢＣは、肺から末梢組織へ酸素を運搬するためのヘモグロビンを含有する。実際、個々のＲＢＣの３３％がヘモグロビンである。ＲＢＣはまた、代謝中に細胞によって産生されたＣＯ２も組織の外へ運搬し、呼気中に放出するために肺に戻る。ＲＢＣは、骨髄において血中低酸素に応答して産生され、これは、腎臓によるエリスロポエチン（ＥＰＯ）の放出によって媒介される。ＥＰＯにより前赤芽球の数の増加が引き起こされ、完全なＲＢＣ成熟化に必要な時間が短縮される。ＲＢＣは核または任意の他の再生能を含有しないので、およそ１２０日後に、その細胞は肝臓、脾臓およびリンパ節におけるマクロファージの食作用活動によって（約９０％）または血漿中での溶血によって（約１０％）のいずれかで循環から取り除かれる。マクロファージ貪食後、ＲＢＣの化学構成成分は、リソソーム酵素の作用によってマクロファージの液胞中で分解される。
「分泌組織」とは、産物を個々の細胞から一般には上皮に由来する一部の型の管腔中に分泌する、動物内の組織である。胃腸管に局在化している分泌組織の例としては、腸、膵臓、および胆嚢を裏打ちする細胞が挙げられる。他の分泌組織としては、肝臓、眼に関連する組織および粘膜、例えば唾液腺、乳腺、前立腺、下垂体および内分泌系の他のメンバーが挙げられる。さらに、分泌組織は、分泌を行うことが可能な組織型の個々の細胞を含む。
用語「作動可能な連結」および「作動可能に連結した（「ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ」または「ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ」）」は、２つまたはそれ超の構成成分（例えば、配列エレメント）の並置に関して相互交換可能に使用され、ここで、これらの構成成分は、両方の構成成分が正常に機能し、他の構成成分のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能をこれらの構成成分のうちの少なくとも１つが媒介し得る可能性を許容するように、配置される。例示として、転写調節配列、例えばプロモーターは、転写調節配列が、１または複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に作動可能に連結される。転写調節配列は、一般に、コード配列とシスで作動可能に連結されるが、このコード配列に直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、エンハンサーとコード配列とが連続していない場合であっても、コード配列に作動可能に連結した転写調節配列である。
融合ポリペプチドに関して、用語「作動可能に連結した」とは、構成成分の各々が、他の構成成分と連結して、そのように連結されていない場合にそれが果たすのと同じ機能を果たすという事実を指し得る。例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、このＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、この融合ポリペプチド中で、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合できるが、活性化ドメインは遺伝子発現を上方調節できる場合に、作動可能な連結状態にある。ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが開裂ドメインに融合した融合ポリペプチドの場合、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインは、この融合ポリペプチド中で、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合できるが、開裂ドメインは標的部位の近位においてＤＮＡを開裂できる場合に、作動可能な連結状態にある。
「機能的」タンパク質、ポリペプチドまたは核酸は、野生型タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能をもたらすいずれかのタンパク質、ポリペプチドまたは核酸を含む。タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列は、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多い、より少ない、もしくは同じ数の残基を有し得、および／または、１もしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含み得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、本技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイによって、決定され得る。ＤＮＡ開裂は、ゲル電気泳動によってアッセイされ得る。Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは遺伝学的および生化学的の両方の補完によって、決定され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４０巻：２４５～２４６頁；米国特許第５，５８５，２４５号および国際特許公開番号ＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
「ベクター」は、標的細胞に遺伝子配列を移入させることが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指向することが可能であり、標的細胞に遺伝子配列を移入させることができる、任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびに組込みベクターを含む。
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、好ましくは、慣用的なアッセイにおいてである必要はないが、容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。適切なレポーター遺伝子には、抗生物質抵抗性（例えば、アンピシリン抵抗性、ネオマイシン抵抗性、Ｇ４１８抵抗性、ピューロマイシン抵抗性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色または蛍光もしくは発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）ならびに増強された細胞成長および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が含まれるがこれらに限定されない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１または複数のコピーが含まれる。「発現タグ」には、目的の遺伝子の発現をモニタリングするために、所望の遺伝子配列に作動可能に連結され得るレポーターをコードする配列が含まれる。「ＷＰＲＥ」配列は、ウッドチャック肝炎ウイルスに由来するウッドチャック肝炎転写後調節エレメントである。ＷＰＲＥは、ガンマ、アルファおよびベータエレメントを所与の順序で含有する６００ｂｐ長の三部構成エレメント（tripartite element）であり（Donello et al. (1992) J Virol 72:5085-5092）、ＡＡＶ系における導入遺伝子の強い発現に寄与する（Loeb et al. (1999) Hum Gene Ther 10:2295-2305）。これは、イントロンを欠如する導入遺伝子の発現も増強する。その天然形態では、ＷＰＲＥは、ＷＨＶ－Ｘタンパク質の部分的オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。ＷＨＶ（Ｗｅ２）エンハンサーのような他のウイルスエレメントの文脈における、十分に発現されたＷＨＶ－Ｘタンパク質は、ウッドチャックおよびマウスにおけるより高い肝臓癌リスクに関連付けられてきた（Hohne et. al (1990) EMBO J 9(4):1137-45；Flajolet et. al (1998) J Virol 72(7):6175-80）。ＷＨＶ－Ｘタンパク質は、直接発癌性ではないようであるが、いくつかの試験は、ある特定の状況下で、これが、ヘパドナウイルス（人間に対するＢ型肝炎ウイルス；ウッドチャックに対するウッドチャック肝炎ウイルス）による感染に伴う肝臓がんの生成のための弱い補因子として作用し得ることを示唆する。多くの場合（Many times）、「野生型」ＷＰＲＥの言及は、その３’領域におけるＷＨＶ Ｘタンパク質オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の部分を含有する５９１ｂｐ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０２４４２におけるヌクレオチド１０９４～１６８４）を指している。このエレメントにおいて、１５０２位にＷＨＶ－Ｘのための最初のＡＴＧ開始コドンが存在し、１４８８位に配列ＧＣＴＧＡを有するプロモーター領域が存在する。Zanta-Boussif（同書）において、ｍｕｔ６ＷＰＲＥ配列が開示されており、この配列中、１４８８位におけるプロモーター配列は、ＡＴＣＡＴに改変され、１５０２位における開始コドンは、ＴＴＧに改変され、ＷＨＶ－Ｘの発現を有効に禁止する。Ｊ０４５１４．１ ＷＰＲＥバリアントにおいて、ＡＴＧ ＷＨＶ Ｘ開始部位は、１５０４位であり、ｍｕｔ６型バリアントは、このＪ０４５１４．１系統において作製することができる。別のＷＰＲＥバリアントは、野生型 ＷＰＲＥ由来の最小ガンマおよびアルファエレメントのみを含む２４７ｂｐ ＷＰＲＥ３バリアントであり（Choi et al. (2014) Mol Brain 7:17）、これは、ＷＨＶ Ｘ配列を欠如する。
ある特定の細胞型を囲みこれに結合する細胞外基質は、様々なコラーゲンなどの線維性構造タンパク質、ラミニンおよびフィブロネクチンのような接着性タンパク質、ならびに線維性構造タンパク質が包埋されるゲルを形成するプロテオグリカンを含む、多数の構成成分で構成される。プロテオグリカンは、グリコサミノグリカンと呼ばれる多くの長い多糖鎖が共有結合により結合されたコアタンパク質からなる、非常に大型の巨大分子である。グリコサミノグリカンの高い負電荷のため、プロテオグリカンは、非常に高度に水和されており、これは、プロテオグリカンに、拡張および収縮することができるゲル様マトリックスを形成させることができる特性である。プロテオグリカンは、有効な潤滑剤でもある。「グリコサミノグリカン（glycosoaminoglycan）」即ち「ＧＡＧ」は、反復二糖単位からなる分枝していない多糖の長い直鎖状ポリマーである。反復単位（ケラタンを除いた）は、酸性ウロン酸糖（グルクロン酸またはイズロン酸）またはガラクトースと共に、アミノヘキソース糖（Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン）からなる。この一般構造の例外は、酸性ヘキソースの代わりにガラクトースを有するケラタン硫酸である。グリコサミノグリカンは、高度に極性であり、水を引きつける。ヒアルロナンを除くＧＡＧの全てが、およそ３０種の異なるコアタンパク質のうち１種に共有結合により連結されて、プロテオグリカンを形成する。コアタンパク質は、粗面小胞体上で合成され、ゴルジへと移され、そこで、ヌクレオシド二リン酸活性化された酸性およびアミノ糖が、グリコシルトランスフェラーゼによって、成長している多糖の非還元末端に交互に付加され、ＧＡＧに共通している特徴的な反復二糖構造をもたらす。ヘパリン／ヘパラン硫酸（ＨＳ ＧＡＧ）およびコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸（ＣＳ ＧＡＧ）は、ゴルジ体内で合成され、そこで、粗面小胞体において作製されたタンパク質コアが、グリコシルトランスフェラーゼによるＯ結合型グリコシル化により翻訳後に改変され、プロテオグリカンを形成する。ケラタン硫酸は、プロテオグリカンのＮ結合型グリコシル化またはＯ結合型グリコシル化によりコアタンパク質を改変することができる。第４のクラスのＧＡＧであるヒアルロン酸は、ゴルジによって合成されず、むしろ、動的に伸長される二糖鎖を直ちに分泌する膜内在性シンターゼによって合成される。細胞外基質の正常ターンオーバーにおけるプロテオグリカンの分解は、細胞外基質におけるプロテアーゼによるコアタンパク質のタンパク質分解性切断から始まり、これは次いで、エンドサイトーシスにより細胞に進入する。エンドソームは、その内容物をリソソームに送達し、そこで、タンパク質分解性酵素が、コアタンパク質の分解を完了し、一連のグリコシダーゼおよびスルファターゼが、ＧＡＧを加水分解して単糖にする。リソソームは、長いポリマーを加水分解してより短いオリゴ糖にするエンドグリコシダーゼと、ＧＡＧ断片から個々の酸性またはアミノ糖を切断するエキソグリコシダーゼの両方を含有する。ＧＡＧのリソソーム異化反応は、非還元末端から段階的様式で進む（図５を参照）。末端糖が硫酸化される場合、糖が除去され得る前に、硫酸結合（sulfate bond）は、特異的スルファターゼによって加水分解されなければならない。サルフェートが除去された場合、特異的エキソグリコシダーゼは、オリゴ糖の非還元末端から末端糖を加水分解し、よって、これを糖１個分短くする。分解は、この段階的様相で続き、スルファターゼによるサルフェートの除去と、エキソグリコシダーゼによる末端糖の切断を交互に繰り返す。リソソームは、グルコサミンの除去に要求される酵素を欠如するため、サルフェートの除去が、末端グルコサミン残基を残す場合、これをまずアセチル化して、Ｎ－アセチルグルコサミンにしなければならない。これは、アセチル基ドナーとしてアセチル－ＣｏＡを使用するアセチルトランスフェラーゼによって達成される。グルコサミン残基が、Ｎ－アセチル化された場合、これをα－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼによって加水分解し、ＧＡＧの段階的分解の継続を可能にすることができる。ＭＰＳ ＩＩの場合、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸の末端糖が硫酸化され、欠損したＩＤＳ酵素は、この硫酸基を除去することができない。正常では、末端糖の基におけるサルフェートは、イズロン酸スルファターゼ（ＩＤＳ）によって除去され、次いで、ＧＡＧは、末端糖の除去のためにアルファイズロニダーゼ（iduromidase）（ＩＤＵＡ）の作用を受ける。
用語「対象」および「患者」は、互換的に使用され、ヒト対象および非ヒト霊長類などの哺乳動物、ならびにウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよび他の動物などの実験動物を指す。したがって、用語「対象」または「患者」は、本明細書で使用される場合、本発明の変更された細胞および／または本発明の変更された細胞によって産生されたタンパク質を投与することができるいずれかの哺乳動物対象を意味する。本発明の対象は、ＭＰＳ ＩＩ障害を有する対象を含む。
一般に、対象は、ＭＰＳ ＩＩのための処置に適格である。本明細書における目的のため、斯かる適格対象は、ＭＰＳ ＩＩの１つまたは複数の兆候、症状または他の指標を経験している、経験したことがある、または経験する可能性がある対象である；例えば、ＭＰＳ ＩＩと新たに診断されたおよび／またはその発症リスクがある、のいずれであれ、ＭＰＳ ＩＩと診断された。ＭＰＳ ＩＩを患うまたはこれを患うリスクがある対象は、必要に応じて、組織および／または尿におけるＧＡＧのレベル上昇に関してスクリーニングされた対象として同定することができる。
本明細書で使用される場合、「処置」または「処置すること」は、臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のため、有益なまたは所望の臨床結果は、次のうち１つまたは複数を含むがこれらに限定されない：疾患に起因する１つもしくは複数の症状の減少、疾患の程度の縮小、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の予防または延期）、疾患の進行の延期もしくは緩徐化、疾患状態の寛解、疾患の処置に要求される１種もしくは複数種の他の薬物療法の用量の減少、および／またはクオリティ・オブ・ライフの増加。
本明細書で使用される場合、ＭＰＳ ＩＩの進行の「延期」または「緩徐化」は、疾患の発症を予防する、延ばす、遅らせる、緩徐化する、減速する、安定化するおよび／または先送りにすることを意味する。この延期は、病歴および／または処置されている個体に応じて、様々な期間のものであってよい。
「有効用量」または「有効量」は、尿ＧＡＧを安定化、減少もしくは排除するのに、および／または血漿における測定可能なＩＤＳ活性をもたらすのに有効な、本明細書に開示される対象に与えられる組成物の用量および／または量である。
本明細書で使用される場合、「処置開始時に」は、本発明の組成物などのＭＰＳ ＩＩ治療組成物への最初の曝露におけるまたはそれに先立つ期間を指す。一部の実施形態では、「処置開始時に」は、ＳＢ－９１３などのＭＰＳ ＩＩ薬物の約１年、９ヶ月、６ヶ月、３ヶ月、２ヶ月（second months）または１ヶ月前のいずれかである。一部の実施形態では、「処置開始時に」は、ＭＰＳ ＩＩ治療組成物への最初の曝露と一致した直前である。
用語「車椅子に依存する」は、傷害または疾病により歩行することができず、動き回るには車椅子に頼らなければならない対象を意味する。
用語「機械的人工呼吸器」は、対象の肺と大気との間で空気の交換を改善するデバイスについて記載する。
本明細書で使用される場合、「に基づく」は、（１）本明細書に記載される対象の特徴の査定、決定または測定（および好ましくは、処置を受けるのに適した対象の選択）；および（２）本明細書に記載される処置（複数可）の投与を含む。
ＭＰＳ ＩＩの「症状」は、対象によって経験され、ＭＰＳ ＩＩを指し示す、構造、機能または感覚における、いずれかの現象または正常からの逸脱である。
対象における「重症型ＭＰＳ ＩＩ」は、１８ヶ月齢～３歳の間の言葉の遅れおよび発育遅延によって特徴付けられる。疾患は、重症型ＭＰＳ ＩＩ対象において、臓器腫大、機能亢進および攻撃性、神経学的増悪、関節硬直および骨格変形（異常脊柱骨を含む）、肥大した舌による粗な顔貌、心臓弁肥厚、難聴およびヘルニアによって特徴付けられる。重症型ハンター症候群を有する無処置対象の平均余命は、１０代半ばの年齢に収まり、神経学的増悪および／または心肺不全により死亡する。
対象における「軽症型形態のＭＰＳ ＩＩ」は典型的に、重症対象よりも遅く診断される。身体的臨床特色は、重症対象と同様であるが、全体的な疾患重症度はより軽度であり、一般に、より緩徐な疾患進行により、認知的機能障害はないまたはごく軽度である。無処置の軽症型形態における死亡は多くの場合、心臓および呼吸器疾患による、２０～３０歳の間である。
用語「支持的外科手術」は、疾患に関連し得る症状を軽減するために、対象に行うことができる外科的手順を指す。ＭＰＳ ＩＩを有する対象のため、斯かる支持的外科手術は、心臓弁置換術による外科手術、扁桃摘出術およびアデノイド切除術、換気チューブの配置、腹部ヘルニアの修復、頸部減圧、手根管症候群の処置、正中神経の外科的減圧、計装融合（instrumented fusion）（脊椎を安定化および強化するため）、関節鏡検査、股または膝置換、および下肢の軸の補正、および気管開口術を含むことができる（Wraith et al. (2008) Eur J Pediatr. 167(3):267-277；およびScarpa et al. (2011) Orphanet Journal of Rare Diseases 6:72を参照）。
用語「免疫抑制剤」は、補助療法に関して本明細書で使用される場合、本明細書で処置されている哺乳動物の免疫系を抑制または遮蔽するために作用する物質を指す。これは、サイトカイン産生を抑制する、自己抗原発現を下方調節もしくは抑制する、またはＭＨＣ抗原を遮蔽する物質を含むであろう。斯かる薬剤の例は、２－アミノ－６－アリール－５－置換ピリミジン（米国特許第４，６６５，０７７号を参照）；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；ガンシクロビル、タクロリムス、コルチゾールまたはアルドステロンなどのグルココルチコイド、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、５－リポキシゲナーゼ阻害剤またはロイコトリエン受容体アンタゴニストなどの抗炎症剤；アザチオプリンまたはミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）などのプリンアンタゴニスト；シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブロモクリプチン（bromocryptine）；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド（米国特許第４，１２０，６４９号に記載されている通り、ＭＨＣ抗原を遮蔽する）；ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；コルチコステロイドもしくはグルココルチコステロイドなどのステロイド、またはグルココルチコイドアナログ、例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロンおよびデキサメタゾン；メトトレキセート（経口または皮下）などのジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤；ヒドロキシクロロキン（hydroxycloroquine）；スルファサラジン；レフルノミド；抗インターフェロン－アルファ、－ベータまたは－ガンマ抗体、抗腫瘍壊死因子－アルファ抗体（インフリキシマブまたはアダリムマブ）、抗ＴＮＦ－アルファイムノアドヘシン（immunoahesin）（エタネルセプト）、抗腫瘍壊死因子－ベータ抗体、抗インターロイキン－２抗体および抗ＩＬ－２受容体抗体を含む、サイトカインまたはサイトカイン受容体アンタゴニスト；抗ＣＤｌ ｌａおよび抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ－１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種抗リンパ球グロブリン；汎（pan）Ｔ抗体、好ましくは、抗ＣＤ３または抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ－３結合ドメインを含有する可溶性ペプチド（７／２６／９０に公開された国際（Internationla）特許公開番号ＷＯ９０／０８１８７）；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ－ベータ；ストレプトドルナーゼ；宿主由来のＲＮＡまたはＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ－６１４４３；デオキシスパガリン（deoxysperguahn）；ラパマイシン；Ｔ細胞受容体（Cohen et al.、米国特許第５，１１４，７２１号）；Ｔ細胞受容体断片（Offner et al. (1991) Science 251:430-432；国際特許公開番号ＷＯ９０／１１２９４；Janeway (1989) Nature 341:482；および国際特許公開番号ＷＯ９１／０１１３３）；ならびにＴ１０Ｂ９などのＴ細胞受容体抗体（ＥＰ３４０，１０９）を含む。
「コルチコステロイド」は、天然に存在するコルチコステロイドの効果を模倣または増大させるステロイドの一般化学構造を有するいくつかの合成のまたは天然に存在する物質のうちいずれか１種を指す。合成コルチコステロイドの例は、プレドニゾン、プレドニゾロン（メチルプレドニゾロンを含む）、デキサメタゾン、グルココルチコイドおよびベタメタゾンを含む。
「添付文書」は、適応症、用法、投与量、投与、禁忌、包装製品と組み合わせるべき他の治療製品、および／または斯かる治療製品の使用に関する警告等に関する情報を含有する、治療製品の商業的パッケージに習慣的に含まれる指示を参照するために使用される。
「標識」は、バイアルなどの容器および添付文書を含む、医薬製剤の商業的パッケージ、ならびに他の種類のパッケージングと共に習慣的に含まれる情報を指すように本明細書で使用される。
本明細書に記載される様々な実施形態の特性のうち１つ、いくつかまたは全てを組み合わせて、本発明の他の実施形態を構成することができることを理解されたい。本発明のこれらのおよび他の態様は、当業者には明らかになる。
ヌクレアーゼ
本明細書に記載される方法では、ＩＤＳ導入遺伝子の標的化導入のために１種または複数種のヌクレアーゼを使用することができる。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、導入遺伝子が標的化された様式でゲノム中に組み込まれるように導入遺伝子と細胞のゲノムの開裂のためのヌクレアーゼとを保有するドナー分子のｉｎ ｖｉｖｏ開裂に有用な、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＴｔａｇｏガイドＲＮＡが挙げられる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼの１種または複数種は、天然起源である。他の実施形態では、ヌクレアーゼの１種または複数種は、非天然起源である、即ち、ＤＮＡ結合分子（ＤＮＡ結合ドメインとも称される）および／または開裂ドメインにおいて工学技術で作製されている。例えば、天然起源のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように変更され得る（例えば、選択された標的部位に結合するように工学技術で作製されたＺＦＰ、ＴＡＬＥおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓのｓｇＲＮＡ）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメイン（例えば、異種開裂ドメインを有する、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬエフェクタードメインＤＮＡ結合タンパク質；メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含む。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｔｔａｇｏ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなどを含む。
Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ドナー分子に結合するためおよび／または細胞のゲノム中の目的の領域に結合するために、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインを使用する。天然起源のメガヌクレアーゼは、１５～４０塩基対の開裂部位を認識し、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーへと一般に分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩが含まれる。それらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５巻：３３７９～３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ ８２巻：１１５～１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２巻、１１２５～１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １２巻：２２４～２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３巻：１６３～１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８０巻：３４５～３５３頁およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログもまた参照されたい。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、工学技術で作製された（非天然起源の）ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含むヌクレアーゼを使用する。Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列は、公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５巻：３３７９～３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ ８２巻：１１５～１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２巻、１１２５～１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １２巻：２２４～２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３巻：１６３～１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８０巻：３４５～３５３頁およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログもまた参照されたい。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように工学技術で作製され得る。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２年）Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ １０巻：８９５～９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１巻：２９５２～２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ ４４１巻：６５６～６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７巻：４９～６６頁；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体としてヌクレアーゼに関して変更され得（即ち、ヌクレアーゼが同族開裂ドメインを含むように）、または異種開裂ドメインに融合され得る。
他の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において使用される１種または複数種のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のまたは工学技術で作製された（非天然起源の）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原性細菌は、重要な作物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、植物細胞中に２５種よりも多い異なるエフェクタータンパク質を注入する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されたタンパク質のなかでも、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターである（Ｋａｙら（２００７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８巻：６４８～６５１頁を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬエフェクターの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら（１９８９年）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１８巻：１２７～１３６頁および国際特許公開番号ＷＯ２０１０／０７９４３０を参照されたい）。ＴＡＬエフェクターは、タンデムリピートの集中したドメインを含有し、各リピートは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要なおよそ３４アミノ酸を含有する。さらに、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説については、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ Ｓ、ら（２００６年）Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６３巻（３号）：２５６～２７２頁を参照されたい）。さらに、植物病原性細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ生物型（ｂｉｏｖａｒ）１株ＧＭＩ１０００および生物型４株ＲＳ１０００における、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と称される２つの遺伝子が、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒら（２００７年）Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ Ｍｉｃｒｏ ７３巻（１３号）：４３７９～４３８４頁を参照されたい）。これらの遺伝子は、互いにヌクレオチド配列において９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメインにおける１，５７５ｂｐの欠失が異なる。しかし、両方の遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、その全体が本明細書に参考として援用される米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、これらのタンデムリピート中に見出される配列に依存する。リピートされる配列は、およそ１０２ｂｐを含み、これらのリピートは、典型的には、互いに９１～１００％相同である（Ｂｏｎａｓら、同書）。これらのリピートの多型は、１２位および１３位に通常位置し、１２位および１３位における超可変二残基（ＲＶＤ）の正体と、ＴＡＬエフェクターの標的配列中の連続ヌクレオチドの正体との間には、一対一の相関が存在するようである（ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ、（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６巻：１５０１頁ならびにＢｏｃｈら（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６巻：１５０９～１５１２頁を参照されたい）。実験的に、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然コードは、１２位および１３位におけるＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）への結合をもたらし；ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、そしてＩＮＧがＴに結合するように、決定されている。これらのＤＮＡ結合リピートは、新たな配列と相互作用でき植物細胞において非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化できる人工の転写因子を作製するために、新たな組合せおよびリピート数を有するタンパク質へとアセンブルされている（Ｂｏｃｈら、同書）。工学技術で作製されたＴＡＬタンパク質は、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインに連結されて、酵母レポーターアッセイにおいて活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）を生じている（プラスミドベースの標的）。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（２０１０年） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｅｐｕｂ １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７）を参照されたい。
ある特定の実施形態では、細胞のゲノムのｉｎ ｖｉｖｏ開裂および／または標的化された開裂に使用される１種または複数種のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するように工学技術で作製されているという点で、非天然起源である。例えば、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０巻：１３５～１４１頁；Ｐａｂｏら（２００１年）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７０巻：３１３～３４０頁；Ｉｓａｌａｎら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９巻：６５６～６６０頁；Ｓｅｇａｌら（２００１年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２巻：６３２～６３７頁；Ｃｈｏｏら（２０００年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １０巻：４１１～４１６頁；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；および同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。
工学技術で作製されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然起源のジンクフィンガータンパク質と比較して、新規結合特異性を有し得る。工学技術での作製方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ））ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各トリプレットまたはクアドルプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１種または複数種のアミノ酸配列と関連する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有に係る米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号および同第６，２４２，５６８号；ならびに国際特許公開番号ＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；およびＷＯ０１／８８１９７中に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共有に係る国際特許公開番号ＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。例示的なリンカー配列については、米国特許第８，７７２，４５３号；同第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。
標的部位の選択；融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＺＦＰおよび方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；同第５，７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；および同第６，２００，７５９号；ならびに国際特許公開番号ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０ ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して、一緒に連結され得る。６またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列について、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号もまた参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、例えば、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含めた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の一部である。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号を参照されたい。系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら（２００２年）Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４３巻：１５６５～１５７５頁；Ｍａｋａｒｏｖａら（２００２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０巻：４８２～４９６頁；Ｍａｋａｒｏｖａら（２００６年）Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ １巻：７頁；Ｈａｆｔら（２００５年）ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ． １巻：ｅ６０頁）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主中のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子およびＣＲＩＳＰＲ媒介性の核酸開裂の特異性をプログラムすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、４つの連続的ステップで、標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を実施する。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、標的認識のためのさらなる要求、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーとプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合を介して、標的ＤＮＡにＣａｓ９を指向させる。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの開裂を媒介して、プロトスペーサー内の二本鎖切断を生じる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップから構成される：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、さらなる攻撃を防止するための、ＣＲＩＳＰＲアレイ中への異質ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、その後の、（ｉｉｉ）異質核酸によるＲＮＡ媒介性の干渉。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然機能と関連し、異質ＤＮＡなどの挿入などの機能において役割を果たす。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然起源のＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通する定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、対応する天然配列ポリペプチドと共通した生物学的活性を有することを条件として、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合的修飾、およびその融合物の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適切な誘導体には、Ｃａｓタンパク質またはその断片の変異体、融合物、共有結合的修飾が含まれるがこれらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から取得可能であり得るか、もしくは化学的に合成され得るか、またはこれらの２つの手順の組合せによって、取得可能であり得る。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するように、もしくは外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように工学技術で作製された細胞であり得、この核酸は、内因性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする。一部の場合には、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように工学技術で作製される。Ｃａｓタンパク質に加えておよび／またはその代わりに使用することができる、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（RNA guided nuclease）の追加的な非限定的な例としては、Ｃｐｆ１などのクラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質が挙げられる。例えば、Zetscheら、（２０１５年）Cell、１６３巻：１～１３頁を参照されたい。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインはＴｔＡｇｏ系の一部である（Ｓｗａｒｔｓら（２０１４） Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８－２６１；Ｓｗａｒｔｓら（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（４）：ｅ３５８８８；Ｓｈｅｎｇら（２０１４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １１１（２）：６５２－６５７を参照されたい）。真核生物では、遺伝子サイレンシングは、タンパク質のアルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーによって媒介される。このパラダイムでは、Ａｇｏは小さな（１９～３１ｎｔ）ＲＮＡに結合する。このタンパク質－ＲＮＡサイレンシング複合体は、標的ＲＮＡを、低分子ＲＮＡと標的の間のワトソン・クリック塩基対合を介して認識し、標的ＲＮＡをヌクレオチド鎖切断的に開裂する（Vogel（２０１４年）Science ３４４巻：９７２～９７３頁）。対照的に、原核生物Ａｇｏタンパク質は、小さな一本鎖ＤＮＡ断片に結合し、外来（多くの場合ウイルス）ＤＮＡを検出し、除去するように機能するようである（Yuanら、（２００５年）Mol. Cell １９巻、４０５頁；Olovnikovら（２０１３年）Mol. Cell ５１巻、５９４頁；Swartsら、同書）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質としては、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のもの、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のもの、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のものが挙げられる。
最もよく特徴付けられている原核生物Ａｇｏタンパク質のうちの１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のもの（ＴｔＡｇｏ；Swartsら、同書）である。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基を伴う１５ｎｔまたは１３～２５ｎｔの一本鎖ＤＮＡ断片と会合する。ＴｔＡｇｏが結合するこの「ガイドＤＮＡ」は、タンパク質－ＤＮＡ複合体と第３のＤＮＡ分子内のワトソン・クリック相補ＤＮＡ配列の結合を導くように機能する。これらのガイドＤＮＡ内の配列情報により標的ＤＮＡの同定が可能になったら、ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ複合体が標的ＤＮＡを開裂する。そのような機構は、その標的ＤＮＡと結合する一方でＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ複合体の構造によっても支持される（G. Shengら、同書）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は同様の特性を有する（Olovnikovら、同書）。
任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡをＴｔＡｇｏタンパク質に負荷することができる（Swartsら、同書）。ＴｔＡｇｏ開裂の特異性はガイドＤＮＡによって導かれるので、したがって、外因性の研究者指定のガイドＤＮＡと形成されるＴｔＡｇｏ－ＤＮＡ複合体により、相補的な研究者指定の標的ＤＮＡへのＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ開裂が導かれる。このように、ＤＮＡにおいて標的化された二本鎖切断を生じさせることができる。ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ系（または他の生物由来のオルソロガスなＡｇｏ－ガイドＤＮＡ系）の使用により、細胞内のゲノムＤＮＡの標的化された開裂が可能になる。そのような開裂は、一本鎖のものでも二本鎖のものでもあり得る。哺乳動物ゲノムＤＮＡの開裂のためには、哺乳動物細胞における発現についてコドン最適化されたＴｔＡｇｏのバージョンを使用することが好ましい。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質を細胞透過性ペプチドと融合する場合には、細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて形成されたＴｔＡｇｏ－ＤＮＡ複合体で処理することが好ましい場合がある。さらに、３７摂氏温度における活性が改善されるように変異誘発によって変更されたＴｔＡｇｏタンパク質のバージョンを使用することが好ましい場合がある。ＴｔＡｇｏ－ＲＮＡ媒介性ＤＮＡ開裂を使用して、ＤＮＡ切断を活用するための、当技術分野における標準の技法を使用した遺伝子ノックアウト、標的化された遺伝子付加、遺伝子補正、標的化された遺伝子欠失を含めた転帰のひと揃い（panopoly）をもたらすことができる。
したがって、ヌクレアーゼは、ドナー（導入遺伝子）を挿入することが望まれる任意の遺伝子中の標的部位に特異的に結合するという点で、ＤＮＡ結合ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、アルブミンに結合する、例えば、ＳＢＳ－４７１７１およびＳＢＳ－４７８９８と命名されたＺＦＰのＤＮＡ結合ドメインである。例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１７２号を参照されたい。
Ｂ．開裂ドメイン
任意の適切な開裂ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに会合（例えば、作動可能に連結）されて、ヌクレアーゼを形成し得る。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼドメインに融合されて、ＺＦＮ－その工学技術で作製された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを介してその意図した核酸標的を認識でき、ヌクレアーゼ活性を介してＺＦＰ結合部位の近くでＤＮＡが切断されるようにする、機能的実体－を生じている。例えば、Ｋｉｍら（１９９６年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３巻（３号）：１１５６～１１６０頁を参照されたい。より最近、ＺＦＮは、種々の生物においてゲノム改変に使用されている。例えば、米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号；同第２００５／０２０８４８９号；同第２００５／００２６１５７号；同第２００５／００６４４７４号；同第２００６／０１８８９８７号；同第２００６／００６３２３１号；ならびに国際公開第０７／０１４２７５号を参照されたい。同様に、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼドメインに融合されて、ＴＡＬＥＮを生じている。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。ＤＮＡに結合し、開裂ドメイン（例えば、Ｃａｓドメイン）と会合して、標的化された開裂を誘導する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系も記載されている。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および同第８，９３２，８１４号、ならびに米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号を参照されたい。
上述のように、開裂ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であり得る、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン、またはＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン、ｓｇＲＮＡ ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ならびに／またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン。異種開裂ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。開裂ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるがこれらに限定されない。例えば、２００２～２００３年カタログ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻：３３７９～３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを開裂するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９３年もまた参照）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１または複数は、開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインの供給源として使用され得る。
同様に、開裂ハーフドメインは、開裂活性のために二量体形成を必要とする、上記のような任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般に、融合タンパク質が開裂ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が、開裂に必要とされる。あるいは、２つの開裂ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。これら２つの開裂ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得、または各開裂ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。さらに、２つの融合タンパク質についての標的部位は、好ましくは、互いに関して配置され、その結果、そのそれぞれの標的部位への２つの融合タンパク質の結合は、例えば二量体形成によって開裂ハーフドメインに機能的開裂ドメインを形成させる互いに対する空間的配向に、これらの開裂ハーフドメインを置く。したがって、ある特定の実施形態では、標的部位の近くの端は、５～８ヌクレオチドまたは１５～１８ヌクレオチド離れている。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位間に介在し得る（例えば、２～５０ヌクレオチド対またはそれ超）。一般に、開裂の部位は、標的部位間に存在する。
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在しており、（認識部位における）ＤＮＡへの配列特異的結合が可能であり、結合の部位またはその近傍でＤＮＡを開裂させることが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から取り出された部位においてＤＮＡを開裂させ、分離可能な結合ドメインおよび開裂ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチドおよび他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドの場所において、ＤＮＡの二本鎖開裂を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉら（１９９２年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９巻：４２７５～４２７９頁；Ｌｉら（１９９３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻：２７６４～２７６８頁；Ｋｉｍら（１９９４年ａ）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１巻：８８３～８８７頁；Ｋｉｍら（１９９４年ｂ）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９巻：３１，９７８～３１，９８２頁を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、工学技術で作製されてもされなくてもよい、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素および１または複数のジンクフィンガー結合ドメイン由来の開裂ドメイン（または開裂ハーフドメイン）を含む。
その開裂ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５巻：１０，５７０～１０，５７５頁。したがって、本開示の目的のため、開示された融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の一部は、開裂ハーフドメインとみなされる。したがって、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物を使用した細胞配列の標的化された二本鎖開裂および／または標的化された置き換えのために、各々がＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質が、触媒的に活性な開裂ドメインを再構成するために使用され得る。あるいは、１つのジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子もまた、使用され得る。ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物を使用した標的化された開裂および標的された配列変更のためのパラメーターは、本開示の別の場所に提供される。
開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインは、機能的開裂ドメインを形成するために、開裂活性を保持するまたは多量体形成する（例えば、二量体形成する）能力を保持する、タンパク質の任意の部分であり得る。
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号に記載されている。さらなる制限酵素もまた、分離可能な結合および開裂ドメインを含み、これらは、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１巻：４１８～４２０頁を参照されたい。
ある特定の実施形態では、開裂ドメインは、例えば、その全ての開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，７７２，４５３号；同第８，６２３，６１８号；同第８，４０９，８６１号；同第８，０３４，５９８号；同第７，９１４，７９６号；および同第７，８８８，１２１号に記載されるように、ホモ二量体形成を最小化または防止する１種または複数種の工学技術で作製された開裂ハーフドメイン（二量体形成ドメイン変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位および５３８位におけるアミノ酸残基は、全て、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインの二量体形成に影響を与えるための標的である。
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な工学技術で作製された開裂ハーフドメインには、第１の開裂ハーフドメインが、ＦｏｋＩの４９０位および５３８位のアミノ酸残基において変異を含み、第２の開裂ハーフドメインが、アミノ酸残基４８６および４９９において変異を含む、対が含まれる。
したがって、一実施形態では、４９０位における変異によりＧｌｕ（Ｅ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられ、５３８位における変異によりＩｓｏ（Ｉ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられ、４８６位における変異によりＧｌｎ（Ｑ）がＧｌｕ（Ｅ）で置き換えられ、４９９位における変異によりＩｓｏ（Ｉ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられる。特に、本明細書に記載される工学技術で作製された開裂ハーフドメインは、一方の開裂ハーフドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と称される工学技術で作製された開裂ハーフドメインを産生し、および別の開裂ハーフドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と称される工学技術で作製された開裂ハーフドメインを産生することにより調製された。本明細書に記載される工学技術で作製された開裂ハーフドメインは、異常な開裂が最小化または消失される、偏性ヘテロ二量体変異体である。それらの開示が参照によりそれらの全体が組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号および同第８，０３４，５９８号を参照されたい。ある特定の実施形態では、工学技術で作製された開裂ハーフドメインは、４８６位、４９９位および４９６位における変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換える変異、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＥＬＤ」ドメインおよび「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、工学技術で作製された開裂ハーフドメインは、４９０位、５３８位および５３７位における変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＫＫ」ドメインおよび「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、工学技術で作製された開裂ハーフドメインは、４９０位および５３７位における変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＩＫ」ドメインおよび「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む（例えば、米国特許第８，７７２，４５３号を参照されたい）。他の実施形態では、工学技術で作製された開裂ハーフドメインは、「シャーキー」および／または「シャーキー」変異を含む（Ｇｕｏら（２０１０年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４００巻（１号）：９６～１０７頁を参照されたい）。
本明細書に記載される工学技術で作製された開裂ハーフドメインは、例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号および同第８，６２３，６１８号に記載されるように、野生型開裂ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発によって、任意の適切な方法を使用して調製できる。
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「開裂酵素」（split-enzyme）技術を使用して、核酸標的部位においてｉｎ ｖｉｖｏでアセンブルされ得る（例えば、米国特許出願公開第２００９／００６８１６４号を参照されたい）。かかる開裂酵素の構成成分は、別々の発現構築物のいずれか上に発現され得るか、または、例えば、自己開裂性２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって個々の構成成分が分離されて、１つのオープンリーディングフレームで連結され得る。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，５６３，３１４号に記載される酵母ベースの染色体系における使用の前に、活性についてスクリーニングされ得る。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあり得る。
Ｃａｓ９関連のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、同一のダイレクトリピート（ＤＲ）によって空間が置かれたヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有する２種のＲＮＡ非コード構成成分：ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイを含む。ゲノム工学技術での作製を達成するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用するために、これらのＲＮＡの両方の機能が存在しなければならない（Ｃｏｎｇら（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ １／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ １２３１１４３を参照されたい）。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ－ｃｒＲＮＡは、別々の発現構築物を介して、または別々のＲＮＡとして、供給される。他の実施形態では、工学技術で作製された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を付与する）がｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用を供給する）に融合されてキメラｃｒ－ＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（単一ガイドＲＮＡとも呼ぶ）を生じる、キメラＲＮＡが構築される（Ｊｉｎｅｋら（２０１３）Ｅｌｉｆｅ ２：ｅ００４７１． ｄｏｉ： １０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．００４７１．；Ｊｉｎｅｋら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１；およびＣｏｎｇ、同書を参照されたい）。
本明細書に記載されるヌクレアーゼ（複数可）により、標的部位において１つまたは複数の二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｕｔ）および／または一本鎖切断（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｕｔ）を生じさせ得る。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒として不活性な開裂ドメイン（例えば、ＦｏｋＩおよび／またはＣａｓタンパク質）を含む。例えば、米国特許第９，２００，２６６号および同第８，７０３，４８９号およびGuillingerら、（２０１４年）Nature Biotech.、３２巻（６号）：５７７～５８２頁を参照されたい。触媒として不活性な開裂ドメインは、一本鎖切断を生じさせるためのニッカーゼとして作用する触媒として活性なドメインと組み合わせることができる。したがって、２つのニッカーゼを組み合わせて使用して、特定の領域において二本鎖切断を生じさせることができる。追加的なニッカーゼも当技術分野で公知である、例えば、McCafferyら、（２０１６年）Nucleic Acids Res.、４４巻（２号）：e11. doi:10.1093/nar/gkv878.２０１５年１０月１９日に電子出版。
よって、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインを含むいずれかのヌクレアーゼを使用することができる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、左および右ＺＦＮ、例えば、ＳＢＳ－４７１７１と命名されたＺＦＰおよび切断ドメインを含む第１のＺＦＮ、ならびにＳＢＳ－４７８９８と命名されたＺＦＰおよび切断ドメインを含む第２のＺＦＮを含むＺＦＮで構成されているＺＦＮを含む。ある特定の実施形態では、ＺＦＮの左および右（第１および第２の）ＺＦＮは、同じベクターで運ばれ、他の実施形態では、ＺＦＮのペアの構成成分は、異なるベクター、例えば、２種のＡＡＶベクター、即ち、表１、配列番号９に示す通りＳＢ－４７１７１ ＡＡＶと命名された一方（ＳＢＳ－４７１７１と命名されたＺＦＰを含むＺＦＮを運ぶＡＡＶ２／６ベクター）と、表２、配列番号１２に示す通りＳＢ－４７８９８ ＡＡＶと命名された他方（ＳＢＳ－４７８９８と命名されたＺＦＰを含むＺＦＮを運ぶＡＡＶ２／６ベクター）で運ばれる。
標的部位
上に詳細に記載したように、ＤＮＡドメインは、遺伝子座、例えば、アルブミンまたは他のセーフハーバー遺伝子中の選択された任意の配列に結合するように工学技術で作製され得る。工学技術で作製されたＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のＤＮＡ結合ドメインと比較して、新規結合特異性を有し得る。工学技術での作製方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列および個々の（例えば、ジンクフィンガー）アミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各トリプレットまたはクアドルプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するＤＮＡ結合ドメインの１種または複数種のアミノ酸配列と関連する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有に係る米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的設計もまた実施され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む、ＤＮＡ結合ドメインに適用可能な例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびに国際特許公開番号ＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；およびＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。
標的部位の選択；融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのヌクレアーゼおよび方法は、当業者に公知であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号および同第２００６／０１８８９８７号に詳細に記載されている。
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質）は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。６またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列について、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。米国特許第８，５８６，５２６号もまた参照されたい。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン（複数可）のための標的部位（複数可）は、アルブミン遺伝子内にある。例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１７２号を参照されたい。
ドナー
上に記す通り、例えば、変異体遺伝子の補正のための、またはＭＰＳ ＩＩ疾患において欠如もしくは欠損するタンパク質（例えば、ＩＤＳ）をコードする遺伝子の発現増加のための、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」とも呼ばれる）の挿入が提供される。一部の実施形態では、導入遺伝子機能は、尿におけるＧＡＧの安定化、減退もしくは排除によって、ならびに／または本明細書に開示される方法および組成物で処置された対象の血漿における導入遺伝子発現（例えば、ｈＩＤＳ）および／もしくは活性を測定することにより測定することができる。ドナー配列は、典型的には、それが配置されるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかとなる。ドナー配列は、２つの相同な領域に隣接する非相同配列を含有し、目的の位置での効率的なＨＤＲを可能とする。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン内の目的の領域に相同でない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンに相同ないくつかの不連続な領域を含有することができる。例えば、常態では目的の領域に存在しない標的化された配列を挿入するために、前記配列を、ドナー核酸分子中に存在させることができ、目的の領域中の配列に相同な領域を隣接させることができる。
本明細書に記載されているのは、選択された位置内へ挿入するための、ＩＤＳタンパク質をコードする導入遺伝子の標的化された挿入の方法である。挿入に用いるポリヌクレオチドは、「外因性」ポリヌクレオチド、「ドナー」ポリヌクレオチドもしくは分子、または「導入遺伝子」とも呼ばれ得る。ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、一本鎖および／または二本鎖であってもよく、直鎖状または環状の形態で細胞内に導入することができる。米国特許第８，７０３，４８９号および同第９，００５，９７３号を参照されたい。ドナー配列（複数可）は、ＤＮＡ ＭＣ内に含まれ得、これは、培養中の細胞内へ環状または直鎖状の形態で導入され得る。米国特許出願公開第２０１４／０３３５０６３号を参照されたい。直鎖状の形態で導入される場合、当業者に公知の方法によって、ドナー配列の末端を保護する（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）ことができる。例えば、１つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に付加する、および／または自己相補的なオリゴヌクレオチドを一端または両端にライゲーションする。例えば、Ｃｈａｎｇら、１９８７年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４巻：４９５９～４９６３頁、Ｎｅｈｌｓら、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２巻：８８６～８８９頁を参照されたい。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加的な方法としては、末端アミノ基（複数可）の付加、および例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミダートやＯ－メチルリボースもしくはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間の結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーターや抗生物質耐性をコードしている遺伝子などの追加的な配列を有するベクター分子の部分として、細胞内に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドを、ネイキッド核酸として、リポソームまたはポロキサマーなどの剤と複合体を形成した核酸として、導入することができ、また、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達することができる。
ドナーは、一般に、組込み部位の内因性プロモーター、即ちドナーが挿入されている内因性遺伝子（例えば、高度に発現される、アルブミン、ＡＡＶＳ１、ＨＰＲＴなど）の発現を駆動するプロモーターによって、発現が駆動されるように挿入される。しかし、ドナーが、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成性のプロモーターまたは誘導可能なもしくは組織特異的なプロモーターを含み得ることは明らかである。一部の実施形態では、遺伝子が染色体外で発現するように、ドナーを発現プラスミド中に入れて細胞中で維持する。
ドナー分子は、内因性遺伝子の全てまたは一部が発現するか、またはその全てが発現しないように、内因性遺伝子中に挿入することができる。例えば、本明細書に記載される導入遺伝子を、アルブミンまたは他の遺伝子座に、例えば、ＩＤＳタンパク質（複数可）をコードする導入遺伝子との融合物として、内因性アルブミン配列の一部（リソソーム酵素をコードする導入遺伝子に対してＮ末端および／またはＣ末端）が発現するか、またはその全てが発現しないように、挿入することができる。他の実施形態では、導入遺伝子（例えば、アルブミンに対するものなどの追加的なコード配列を伴うまたは伴わない）を任意の内因性遺伝子座、例えば、セーフハーバー遺伝子座に組み込む。
内因性配列（内因性または導入遺伝子の一部）を、導入遺伝子を用いて発現させる場合、内因性配列（例えば、アルブミンなど）は、全長配列（野生型または変異体）であっても部分配列であってもよい。内因性配列は機能的であることが好ましい。これらの全長または部分配列（例えば、アルブミン）の機能の非限定的な例としては、導入遺伝子（例えば、治療遺伝子）によって発現されるポリペプチドの血清中半減期を増加させることおよび／またはキャリアとして作用することが挙げられる。
さらに、発現を必要としていなくとも、外因性配列は、転写調節配列または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルをも含み得る。
ある特定の実施形態では、外因性配列（ドナー）は、目的のタンパク質と、その融合パートナーとして、融合タンパク質を細胞の表面上に配置される膜タンパク質の細胞外ドメインとの融合物を含む。これにより、導入遺伝子によりコードされるタンパク質が血清中で潜在的に作用することが可能になる。ＭＰＳ ＩＩ疾患に対する処置の場合では、導入遺伝子融合物によりコードされるＩＤＳ酵素が細胞（例えば、ＲＢＣ）の表面上のその位置から血清中に蓄積する代謝産物に作用する。さらに、ＲＢＣが正常な分解の経過と同様に脾臓マクロファージによって呑み込まれると、マクロファージが細胞を呑み込むときに形成されるリソソームにより、膜に結合した融合タンパク質が、その酵素により天然に好都合なｐＨにあるリソソーム中で高濃度の代謝産物に曝露される。
一部の場合では、ドナーは、改変された内因性遺伝子（ＩＤＳ）であり得る。例えば、内因性遺伝子にコドン最適化を実施してドナーを生成することができる。さらに、酵素補充療法に対する抗体応答は、問題の特異的治療酵素および個々の対象に関して変動するが、野生型ＩＤＳを用いた酵素補充で処置されている多くのＭＰＳ ＩＩ疾患対象において有意な免疫応答が見られている。さらに、これらの抗体と処置の有効性の関連性も変動する（Katherine Ponder、（２００８年）J Clin Invest、１１８巻（８号）：２６８６頁を参照されたい）。したがって、本発明の方法および組成物は、これだけに限定されないが、内因性免疫応答に対するプライミングエピトープであることが公知の部位において機能的にサイレントなアミノ酸の変化を生じさせる改変、および／または、そのようなドナーによって産生されるポリペプチドの免疫原性が低くなるような短縮を含めた、野生型ＩＤＳと比較して改変された配列を有するドナーの生成を含み得る。
ＭＰＳ ＩＩ疾患対象は、多くの場合、脳における欠けているＩＤＳ酵素の欠如に起因して神経性後遺症を有する。残念ながら、多くの場合、治療薬を、血液を介して脳に送達することは、血液脳関門の不透過性に起因して難しい。したがって、本発明の方法および組成物は、これだけに限定されないが、脳毛細血管の細胞間の密着結合の一過性の開放、例えば、高張性マンニトール溶液の頸動脈内投与の使用による一過性の浸透圧破壊、集束超音波の使用およびブラジキニン類似体の投与などを含めた、治療薬の脳への送達を増加させるための方法と併せて使用することができる。あるいは、治療薬を、脳への特異的輸送のための受容体または輸送機構を利用するように設計することができる。使用することができる特異的な受容体の例としては、トランスフェリン受容体、インスリン受容体または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１および２（ＬＲＰ－１およびＬＲＰ－２）が挙げられる。ＬＲＰは、例えばａｐｏＥ、ｔＰＡ、ＰＡＩ－１などの様々な分泌タンパク質と相互作用することが公知であり、したがって、ＬＲＰに対するこれらのタンパク質のうちの１つに由来する認識配列の融合により、治療タンパク質の肝臓における発現および血流中への分泌後の、酵素の脳への輸送が容易になる（Gabathuler、（２０１０年）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ． ３７（１）：４８－５７、同上を参照されたい）。
ある特定の実施形態では、ドナーベクターは、ＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ（表３、配列番号１７）に示す通りのベクターである。
組成物／系
本明細書に記載される本発明は、方法を実施するための３種のＡＡＶベクターを利用する。２種のベクターは、右ＺＦＮおよび左ＺＦＮの送達に使用され、第３のベクターは、ＩＤＳドナー配列の提供に使用される（実施例を参照）。ある特定の実施形態では、組成物／系は、ＳＢ－４７１７１、ＳＢ－４７８９８およびＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶを含む３種のベクターを含む。
細胞
本明細書に記載される方法によって生成される細胞を含めた、ＩＤＳタンパク質をコードする導入遺伝子を含む遺伝子改変された細胞、例えば、肝細胞または幹細胞も本明細書で提供される。ＩＤＳ導入遺伝子は、染色体外に発現させることもでき、または、１種または複数種のヌクレアーゼを使用して、標的化された様式で細胞のゲノム中に組み込むこともできる。ランダムな組込みとは異なり、ヌクレアーゼ媒介性標的化組込みでは、導入遺伝子の指定の遺伝子への組込みが確実になる。導入遺伝子は、標的遺伝子中のどこにでも組み込むことができる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子をクレアーゼ結合部位および／または開裂部位またはその付近、例えば、開裂部位および／または結合部位の上流または下流の１～３００塩基対（またはそれらの間の任意の数の塩基対）内、より好ましくは開裂部位および／または結合部位のいずれか側の１～１００塩基対（またはそれらの間の任意の数の塩基対）内、さらにより好ましくは開裂部位および／または結合部位のいずれか側の１～５０塩基対（またはそれらの間の任意の数の塩基対）内に組み込む。ある特定の実施形態では、組み込まれる配列は、いかなるベクター配列（例えば、ウイルスベクター配列）をも含まない。
これだけに限定されないが、細胞または細胞株を含めた任意の細胞型を本明細書に記載されるように遺伝子改変して導入遺伝子を含めることができる。本明細書に記載される遺伝子改変された細胞の他の非限定的な例としては、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋など）；樹状細胞；Ｂ細胞；自己（例えば、対象由来）細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞は、肝細胞であり、ｉｎ ｖｉｖｏで改変されている。ある特定の実施形態では、細胞は、異種性の多能性幹細胞、全能性幹細胞または複能性幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞など）を含めた幹細胞である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞は、対象に由来する幹細胞である。
本明細書に記載される細胞は、障害を有する対象におけるＭＰＳ ＩＩ疾患を、例えばｉｎ ｖｉｖｏ療法によって処置および／または予防することにおいて有用である。例えば、ヌクレアーゼにより改変された細胞を拡大増殖させ、次いで、標準の技法を使用して対象に再導入することができる場合、ｅｘ ｖｉｖｏ療法も提供される。例えば、Tebasら、（２０１４年）New Eng J Med、３７０巻（１０号）：９０１頁を参照されたい。幹細胞の場合では、対象への注入後、これらの前駆体の、機能的なタンパク質（挿入されたドナーに由来する）を発現する細胞へのｉｎ ｖｉｖｏ分化も起こる。
本明細書に記載される組成物（ヌクレアーゼ、ＩＤＳドナー、細胞等）のうち１つまたは複数を含む医薬組成物（「製剤」または「製造品」または「医薬品」または「医薬品のセット」とも称される）も提供される。医薬組成物は、同じまたは異なる種類の構成成分組成物をいずれかの濃度で含むことができる。例えば、次の通りの３種の別々の医薬組成物を含む医薬品のセットを含む製造品が本明細書に提供される：ＺＦＮ対の一方のメンバー（例えば、左ＺＦＮ）を運ぶ精製されたＡＡＶベクターを含む第１の医薬組成物；ＺＦＮ対の他方のメンバー（例えば、右ＺＦＮ）を運ぶ精製されたＡＡＶベクターを含む第２の医薬組成物；およびＩＤＳドナーを運ぶ精製されたＡＡＶベクターを含む第３の医薬組成物。左ＺＦＮは、４７１７１と命名されたＺＦＮ（例えば、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＬＥＦと命名された医薬品）または７１５５７と命名されたＺＦＮ（例えば、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＬ２と命名された医薬品）を含むことができ、右ＺＦＮは、４７８９８と命名されたＺＦＮ（例えば、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＲＩＧＨＴと命名された医薬品）または７１７２８と命名されたＺＦＮ（例えば、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＬ２と命名された医薬品）を含むことができる。３種の医薬組成物のうち１、２または３種は、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、スクロースおよびポロクサマー（例えば、ポロクサマーＰ１８８）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において、または生理的食塩水（ＮＳ）製剤において個々に製剤化することができる。一部の実施形態では、組成物は、およそ１．１５ｍｇ／ＭＬのリン酸ナトリウム、０．２ｍｇ／ｍＬリン酸カリウム、８．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、０．２ｍｇ／ｍＬ塩化カリウム、０．１３ｍｇ／ｍＬ塩化カルシウムおよび０．１ｍｇ／ｍＬ塩化マグネシウムを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。ＰＢＳは、２．０５ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、１０～１２ｍｇ／ｍＬのスクロースおよび０．５～０ｍｇ／ｍＬのＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）（ポロクサマーまたはＰ１８８）によりさらに改変される。表６に示す濃度を含むがこれらに限定されない、いかなる濃度のＺＦＮを使用することもできる。さらに、製造品は、３種の医薬組成物を任意の比、例えば、１：１：８（左ＺＦＮ：右ＺＦＮ：ＩＤＳドナー）で含むことができる。
医薬組成物（製造品／医薬品のセット）は、ＭＰＳ ＩＩの処置のための治療レベル（例えば、血漿および／または血液白血球における）を含んで、ＩＤＳが対象において発現されるように、それを必要とする対象に投与される（例えば、静脈内に）。組成物は、別々に投与することができる、または好ましくは、３種の医薬品（ＺＦＮ１、ＺＦＮ２およびＩＤＳドナー）のセットを含む製造品は、投与に先立ち、例えば、静脈内注入バッグにおいて組み合わされる。加えて、これらの製剤は、対象への投与に先立ち、凍結保存することができる。
送達
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されているタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物を、任意の適当な手段によって、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで送達してもよい。
本明細書に記載されているようなヌクレアーゼの送達方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号および同第７，１６３，８２４号に記載されており、それらの全ての開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。
また、本明細書に記載されているようなヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を、１種または複数種のジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣａｓ系タンパク質（複数可）をコードする配列を含有するベクターを使用して送達してもよい。以下に限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターなどを含めた任意のベクター系を使用してもよい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号および同第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、任意のこれらのベクターが、処置に求められる１種または複数種の配列を含んでもよいことは明らかである。そのため、１種または複数種のヌクレアーゼおよびドナー構築物を細胞内に導入する際に、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドを同じベクターまたは異なるベクターに保有させてもよい。複数のベクターを使用する際には、各ベクターは、１種または複数種のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物をコードする配列を含んでもよい。
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を導入するために使用することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルとの複合体を形成している核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられ、これらは細胞へ送達された後に、エピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのどちらかを有する。遺伝子治療手順の総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：８０８～８１３頁、ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ（１９９３年）ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：２１１～２１７頁、ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ（１９９３年）ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６２～１６６頁、Ｄｉｌｌｏｎ（１９９３年）ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６７～１７５頁、Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２年）Ｎａｔｕｒｅ、３５７巻：４５５～４６０頁、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９８８年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻（１０号）：１１４９～１１５４頁、Ｖｉｇｎｅ（１９９５年）Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、８巻：３５～３６頁、ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ（１９９５年）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、５１巻（１号）：３１～４４頁、Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中のＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｅｈｍ著（１９９５年）ならびにＹｕら（１９９４年）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１巻：１３～２６頁を参照されたい。
核酸の非ウイルス送達方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤で増強されたＤＮＡ取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。
追加的な例示の核酸送達系としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ケルン、ドイツ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（ロックビル、メリーランド州）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ホリストン、マサチューセッツ州）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ、（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）によって提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適した陽イオン性および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒの国際特許公開番号ＷＯ９１／１７４２４およびＷＯ９１／１６０２４の脂質が挙げられる。
免疫脂質複合体などの標的化されたリポソームを含めた脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ（１９９５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４０４～４１０頁、Ｂｌａｅｓｅら（１９９５年）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２巻：２９１～２９７頁、Ｂｅｈｒら（１９９４年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５巻：３８２～３８９頁；Ｒｅｍｙら（１９９４年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５巻：６４７－６５４、Ｇａｏら（１９９５年）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２巻：７１０～７２２頁、Ａｈｍａｄら（１９９２年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２巻：４８１７～４８２０頁、ならびに米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号および同第４，９４６，７８７号を参照されたい）。
追加的な送達方法としては、送達される核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）内へのパッケージングを使用することが挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の１つのアームが標的組織に対する特異性を有し、かつ他方がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞の表面に運び、次いでＥＤＶは、エンドサイトーシスにより細胞内に運ばれる。細胞内に取り込まれると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら、（２００９年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７巻（７号）、６４３頁を参照されたい）。
工学技術で作製されたＺＦＰをコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイルスに体内の特定の細胞を標的とさせ、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、対象に直接投与（ｉｎ ｖｉｖｏ）することができるか、またはインビトロで細胞を処置するために使用することができ、改変された細胞は対象に投与される（ｅｘ ｖｉｖｏ）。ＺＦＰを送達するための従来のウイルスに基づく系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクチン、および単純ヘルペスウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主ゲノム内の組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ関連ウイルスの遺伝子移入方法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い形質導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織において測定されている。
レトロウイルスの向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み入れることによって変更することができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大させる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることができるレトロウイルスベクターであり、典型的には高ウイルス力価を生じる。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列に用いるパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。最小限のシス作用性ＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングには十分であり、それらは、次いで、治療遺伝子を標的細胞内に組み込むために使用されて、導入遺伝子の永続的な発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら（１９９２年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：２７３１～２７３９頁、Ｊｏｈａｎｎら（１９９２年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：１６３５～１６４０頁、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら（１９９０年）Ｖｉｒｏｌ．、１７６巻：５８～５９頁、Ｗｉｌｓｏｎら（１９８９年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：２３７４～２３７８頁、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５巻：２２２０～２２２４頁、国際特許公開番号ＷＯ９４／２６８７７を参照されたい）。
一過性発現が好適な用途では、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型で非常に高い効率で形質移入が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現を得ている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。また、アデノ関連ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療の手順（例えば、Ｗｅｓｔら（１９８７年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６０巻：３８～４７頁、米国特許第４，７９７，３６８号、国際特許公開番号ＷＯ９３／２４６４１、Ｋｏｔｉｎ（１９９４年）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、５巻：７９３～８０１頁、Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９４年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９４巻：１３５１頁を参照されたい）に用いるために、細胞に標的核酸を形質導入することもできる。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻：３２５１～３２６０頁、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４巻：２０７２～２０８１頁、ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４年）ＰＮＡＳ、８１巻：６４６６～６４７０頁、およびＳａｍｕｌｓｋｉら（１９８９年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：０３８２２～３８２８頁（１９８９年）を含めた多数の刊行物に記載されている。
少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、現在、臨床試験の遺伝子移入に利用可能であり、それらは、形質導入薬剤を生成するために、ヘルパー細胞株内に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性を含むアプローチを利用する。
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ－Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら（１９９５年）Ｂｌｏｏｄ、８５巻：３０４８～３０５頁、Ｋｏｈｎら（１９９５年）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１巻：１０１７～１０２頁、Ｍａｌｅｃｈら（１９９７年）ＰＮＡＳ、９４巻（２２号）１２１３３～１２１３８頁）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅら（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４７５～４８０頁）。ＭＦＧ－Ｓでパッケージされたベクターについて、５０％またはそれ超の形質導入効率が測定されている。（Ｅｌｌｅｍら（１９９７年）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、４４巻（１号）：１０～２０頁、Ｄｒａｎｏｆｆら（１９９７年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１巻：１１１～２頁。）
組換えアデノ関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損型および非病原性のパルボウイルスアデノ関連２型ウイルスに基づく有望な代替の遺伝子送達システムである。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノム内への組込みに起因する効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の鍵となる特長である（Ｗａｇｎｅｒら（１９９８年）Ｌａｎｃｅｔ ３５１巻（９１１７号）１７０２～３頁、Ｋｅａｒｎｓら（１９９６年）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９巻：７４８～５５頁）。非限定的な例によれば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０、ならびに偽型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６）を含めた他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用することができる。
複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生することができ、多数の異なる細胞型を容易に感染させる。アデノウイルスベクターのほとんどは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えて、その後、複製欠損性ベクターが、欠失した遺伝子機能をトランスに供給するヒト２９３細胞で増殖するように、工学技術で作製される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉で見出されるものなど非分裂性の分化細胞を含む、複数の種類の組織をｉｎ ｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな保有能力を有する。臨床試験でＡｄベクターを使用する例では、筋肉内注入を用いた抗腫瘍免疫化のポリヌクレオチド治療が含められた（Ｓｔｅｒｍａｎら（１９９８年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７巻：１０８３～９頁）。臨床試験における遺伝子移入に用いるアデノウイルスベクターの使用の追加的な例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら（１９９６年）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、２４巻（１号）：５～１０頁、Ｓｔｅｒｍａｎら（１９９８年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、９巻（７号）：１０８３～１０８９頁、Ｗｅｌｓｈら（１９９５年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２巻：２０５～１８頁、Ａｌｖａｒｅｚら（１９９７年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５巻：５９７～６１３頁、Ｔｏｐｆら（１９９８年）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５巻：５０７～５１３頁、Ｓｔｅｒｍａｎら（１９９８年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７巻：１０８３～１０８９頁が挙げられる。
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させることが可能なウイルス粒子を形成する。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７が含まれる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子内に核酸ベクターをパッケージングする生産細胞株によって生成される。これらのベクターは、典型的に、パッケージングおよびその後の宿主への組込みに必要とされる最小限のウイルス配列（適用可能な場合）、発現させるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられている他のウイルス配列を含有する。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば、遺伝子治療に使用するＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム内へのパッケージングおよび組込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを具える。ウイルスＤＮＡは、細胞株中にパッケージングされ、他のＡＡＶ遺伝子即ち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするもののＩＴＲ配列を欠失したヘルパープラスミドを含有する。細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製、およびヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠失しているため、有意な量にはパッケージングされない。アデノウイルスによる夾雑は、例えば、ＡＡＶよりも感受性があるアデノウイルスに対する熱処理によって低減することができる。
多くの遺伝子治療用途では、遺伝子治療ベクターが、高度な特異性で特定の細胞型に送達されることが望ましい。したがって、ウイルスの外表面上でウイルス外被タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、ウイルスベクターを所与の細胞型に対する特異性を有するように改変することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するように選ばれる。例えば、Ｈａｎら（１９９５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２巻：９７４７～９７５１頁は、モロニーマウス白血病ウイルスを改変して、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現することができ、その組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現しているある特定のヒト乳がん細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質をウイルスが発現する、他のウイルス－標的細胞の対にまで及び得るものである。例えば、線状ファージを工学技術で作製して、事実上いかなる選ばれた細胞受容体にも特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示することができる。上記の記載は、主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターを工学技術で作製して、特異的な標的細胞による取り込みに好都合な特異的な取り込み配列を含有させることができる。
遺伝子治療ベクターは、下記に説明するように、個々の対象への投与によって、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下もしくは頭蓋内注入）または局所適用によって、ｉｎ ｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、個々の対象から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）や万能ドナーの造血幹細胞などの細胞に、ベクターをｅｘ ｖｉｖｏで送達し、続いて、通常はベクターを組み入れた細胞を選択した後に、対象への細胞の再移植を行うことができる。
また、ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）を、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために、生物に直接投与することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、血液または組織の細胞との最終的な接触の内に分子を導入するために通常使用される経路のいずれかに依り、そのような経路としては、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する適当な方法は、利用可能であり、当業者に周知であり、そして、１つよりも多い経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、多くの場合、特定の経路は、別の経路よりも速やかかつ有効な反応を提供することができる。
本明細書に記載されているポリヌクレオチドの導入に適したベクターとしては、非組込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が挙げられる。例えば、Ｏｒｙら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３巻：１１３８２～１１３８８頁、Ｄｕｌｌら（１９９８年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：８４６３～８４７１頁、Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８年）、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：９８７３～９８８０頁、Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２５巻：２１７～２２２頁、米国特許出願公開第２００９／０５４９８５号を参照されたい。
薬学的に許容される担体は、投与されている特定の組成物によって、および組成物を投与するために使用される特定の方法によって、ある程度は決定される。したがって、下記に記載するように、利用可能な医薬組成物の実に様々な適当な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９年を参照されたい）。
ヌクレアーゼをコードする配列とドナー構築物とを、同じまたは異なる系を使用して送達することができることは明らかである。例えば、ドナーポリヌクレオチドをプラスミドによって保有することができ、一方、１種または複数種のヌクレアーゼをＡＡＶベクターによって保有することができる。さらに、これらの異なるベクターを、同じまたは異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射）によって投与することができる。これらのベクターを、同時にまたは任意の順番で、送達することができる。
ｅｘ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｖｏとの両方の投与に用いる製剤としては、液体中懸濁液物または乳濁液が挙げられる。多くの場合、活性成分は、薬学的に許容され、かつ活性成分に適合する賦形剤と混合される。適当な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組合せが挙げられる。さらに、組成物は、湿潤剤もしくは乳濁剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の効果を高める他の試薬などの微量の補助的な物質を含有していてもよい。
適用
本発明の方法は、ＭＰＳ ＩＩ疾患（例えば、リソソーム蓄積病）の処置および／または予防を企図する。処置は、必要とされる酵素（複数可）の発現および血流への放出のための、細胞におけるセーフハーバー遺伝子座（例えば、アルブミン）への１種または複数種の補正疾患関連遺伝子（例えば、ＩＤＳ等）の挿入を含むことができる。血流中に入ると、分泌された酵素は、組織中の細胞によって取り入れられることができ、そこで次に、酵素は、ＧＡＧが分解されるように、リソソームによって取り込まれる。導入遺伝子は、コドン最適化された導入遺伝子（例えば、ＩＤＳ）；および／またはタンパク質を機能的に変更させずにエピトープを除去することができる導入遺伝子を含むタンパク質をコードするものであり得る。一部の場合では、方法は、必要な酵素を発現させ、血流中に放出させるために、補正酵素をコードする導入遺伝子を発現するエピソームを細胞中に挿入することを含む。産物を血流中に放出させるために肝細胞などの分泌細胞に挿入することが特に有用である。本発明の方法および組成物はまた、１種または複数種の治療薬をコードするＩＤＳ導入遺伝子を造血幹細胞中に供給し、したがって、これらの細胞に由来する成熟細胞（例えば、ＲＢＣ）が治療薬を含有することが望まれる任意の状況で使用することができる。これらの幹細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで分化させることができ、また、対象全てに対して使用することができる普遍的なドナー細胞型に由来し得る。さらに、細胞は、細胞を体内で輸送するための膜貫通タンパク質を含有し得る。処置は、治療導入遺伝子を含有する対象細胞の使用も含み得、その場合、細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏで発生させ、次いで、対象に導入して戻す。例えば、適切なＩＤＳをコードする導入遺伝子を含有するＨＳＣを対象に自己骨髄移植によって挿入することができる。あるいは、ＩＤＳをコードする導入遺伝子を使用して編集された筋肉幹細胞またはｉＰＳＣなどの幹細胞を筋組織に注射することもできる。
したがって、この技術は、対象が、問題（例えば、発現レベルの問題または低機能性もしくは非機能性で発現するタンパク質の問題）に起因していくつかのタンパク質を欠損している状態において有用であり得る。本発明で特に有益なのは、ＭＰＳ ＩＩ疾患を有する対象における機能性を補正するまたは回復させるための導入遺伝子の発現である。
非限定的な例として、欠損しているまたは欠けているタンパク質の産生がＭＰＳ ＩＩ疾患を処置するために実践され、使用される。タンパク質をコードする核酸ドナーをセーフハーバー遺伝子座（例えば、アルブミンまたはＨＰＲＴ）に挿入し、外因性プロモーターを使用してまたはセーフハーバーに存在するプロモーターを使用してのいずれかで発現させることができる。あるいは、ドナーを使用して、欠損している遺伝子をｉｎ ｓｉｔｕで補正することができる。所望のＩＤＳをコードする導入遺伝子をＣＤ３４＋幹細胞に挿入し、骨髄移植中に対象に戻すことができる。最後に、核酸ドナーを、この細胞に由来する成熟赤血球が核酸ドナーによりコードされる生物剤を高濃度で有するように、ＣＤ３４＋幹細胞中のベータグロビン遺伝子座に挿入することができる。次いで、生物剤を含有するＲＢＣを、正しい組織に、膜貫通タンパク質（例えば、受容体または抗体）を介して標的化することができる。さらに、ＲＢＣを、ｅｘ ｖｉｖｏで電気感作（ｅｌｅｃｔｒｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）によって感作して、エネルギー源への曝露後にそれらをより破壊されやすくすることができる（国際特許公開番号ＷＯ２００２／００７７５２を参照）。
一部の適用では、本発明の方法および組成物を使用することによって内因性遺伝子をノックアウトすることができる。この態様の例としては、異常な遺伝子調節因子または異常な疾患関連遺伝子をノックアウトすることが挙げられる。一部の適用では、異常な内因性遺伝子を、機能的にまたはｉｎ ｓｉｔｕでのいずれかで、野生型バージョンの遺伝子で置き換えることができる。挿入される遺伝子は、治療ＩＤＳタンパク質の発現および／または機能性が改善されるようにまたはその免疫原性が低下するように変更することもできる。一部の適用では、挿入されるＩＤＳをコードする導入遺伝子は、脳などの選択された組織へのその輸送を増加させるための融合タンパク質である。
一部の適用では、本発明の方法および組成物で処置されていない対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有するヒト対象における機能的能力を改善または維持（減退を緩徐化）する方法が本明細書に提供される。他の適用では、本発明の方法および組成物で処置されていない対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有する対象におけるＥＲＴの必要性（用量レベルまたは頻度）を減少させる方法が本明細書に提供される。さらに別の態様では、本発明の方法および組成物で処置されていない対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有する対象におけるＥＲＴ開始の必要性を延期させる方法が本明細書に提供される。一態様では、組成物を受けていない対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有する対象における支持的外科手術の必要性を延期、低減または排除する方法であって、対象を本発明の組成物で処置するステップを含む方法が本明細書に提供される。別の態様では、本発明の方法および組成物で処置されていない対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有する対象における骨髄移植の必要性を延期、低減または予防する方法が本明細書に提供される。さらに別の態様では、本明細書に記載される組成物による処置と組み合わせたＥＲＴの標準投与レジメンで対象を処置することにより、本発明の方法および組成物で処置されていない対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有する対象における機能的能力を改善（減退を延期、維持）する方法が本明細書に提供される。別の態様では、本発明の方法および組成物で処置されていない対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有するヒト対象における身体障害進行を抑制する方法が本明細書に提供される。さらに別の態様では、本発明の方法および組成物で処置されていない対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有する対象における医療用人工呼吸器デバイスの使用の必要性を延期、低減または予防する方法が本明細書に提供される。別の態様では、本発明の方法および組成物で処置されていない対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有するヒト対象における確認された身体障害進行の開始を延期させる、または確認された身体障害進行のリスクを低減させる方法が本明細書に提供される。本発明の一態様では、ＭＰＳ ＩＩを有する対象における尿ＧＡＧを低減、安定化または維持する方法であって、対象を本発明の組成物で処置するステップを含む方法が本明細書に提供される。さらに別の態様では、本発明の方法および組成物で処置されていない対象と比較して、ＭＰＳ ＩＩを有する対象における平均余命を延ばす方法が本明細書に提供される。
以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥＮを含む、本開示の例示的な実施形態に関する。このことが、実例のみの目的にあること、ならびに他のヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ系が使用され得ること、例えば、工学技術で作製されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）が使用され得ること、および／または天然起源のもしくは工学技術で作製されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）のＤＮＡ結合ドメインと異種由来開裂ドメインとの融合物、および／または工学技術で作製された単一ガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が使われ得ることであることは理解されよう。
（実施例１）
ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの調製は次の通りである：ＳＢ－４７１７１ ＺＦＮ（左ＺＦＮ）をコードするＡＡＶ２／６ベクターは、以下のいくつかの構造的特徴を含む：ＡＡＶベクターの５’および３’ＩＴＲ、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ肝制御領域およびα１－アンチトリプシンプロモーター、ヒトβ－グロビン－ＩｇＧキメライントロン、核局在化配列、ＺＦＰ ４７１７１ ＺＦＮ結合ドメイン、ＦｏｋＩ ＥＬＤヌクレアーゼドメイン、ならびにポリアデニル化シグナル。様々なエレメントの位置は、下の表１に示す。
Figure 0007432581000002
ＳＢ－４７１７１ ＡＡＶ２／６ベクターの完全ヌクレオチド配列を下に示す。表１に示す特異的アノテーションは、表１に示す通りに配列テキストに指し示される：
Figure 0007432581000003
Figure 0007432581000004
Figure 0007432581000005
ＳＢ－４７８９８を含むＡＡＶ２／６ベクターは同様に、いくつかの特徴を含み、それらを下の表２に示す。
Figure 0007432581000006
ＳＢ－４７８９８ ＡＡＶ２／６ベクターの完全ヌクレオチド配列を下に示す。表２に示す特異的アノテーションは、表２に示す通りに配列テキストに指し示される。
Figure 0007432581000007
Figure 0007432581000008
Figure 0007432581000009
ＳＢ－ＩＤＳ導入遺伝子ドナーをコードするＡＡＶ２／６ベクターは、以下のいくつかの構造的特徴を含む：ＡＡＶベクターの５’および３’ＩＴＲ、アルブミン遺伝子における標的とした切断部位に隣接する領域に対して相同性を有する左および右相同性アーム（ＬＡおよびＲＡ）、アルブミンプロモーターへの導入遺伝子配列の効率的連結を確実にするための、ヒト第ＩＸ因子エクソン２スプライスアクセプターに由来するスプライスアクセプター、コドン最適化されたｈＩＤＳ ｃＤＮＡ配列、ならびにポリアデニル化シグナル配列。様々なエレメントの位置は、下の表３に示す。
Figure 0007432581000010
ＳＢ－ＩＤＳ ＡＡＶ２／６ベクターの完全ヌクレオチド配列を下に示す。表３に示す特異的アノテーションは、表３に示す通りに配列テキストに指し示される。
Figure 0007432581000011
Figure 0007432581000012
Figure 0007432581000013
ＳＢ－７１５５７ ＡＡＶ２／６ベクターの完全ヌクレオチド配列を下に示す。表４に示す特異的アノテーションは、表４に示す通りに配列テキストに指し示される。
Figure 0007432581000014
Figure 0007432581000015
Figure 0007432581000016
 ７１５５７ ＡＡＶの完全配列：
Figure 0007432581000017
Figure 0007432581000018
Figure 0007432581000019
ＳＢ－７１７２８ ＡＡＶ２／６ベクターの完全ヌクレオチド配列を下に示す。表５に示す特異的アノテーションは、表５に示す通りに配列テキストに指し示される。
Figure 0007432581000020
Figure 0007432581000021
Figure 0007432581000022
 ７１７２８ ＡＡＶの完全配列：
Figure 0007432581000023
Figure 0007432581000024
Figure 0007432581000025
（実施例２）
実施例１に記載されているポリヌクレオチドおよびＡＡＶを含む組成物を、次の通りに調製した：構成成分は、３種の蓋付きバイアルにおいて供給した：各１種はそれぞれ次に対応する：ＺＦＮ１（ＳＢ－４７１７１、白色の蓋で、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＬＥＦＴと標識）；ＺＦＮ２（ＳＢ４７８９８、青色の蓋で、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＲＩＧＨＴと標識）；およびｈＩＤＳドナー（ｈＩＤＳ、オレンジ色の蓋で、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＨＮＴと標識）。製品構成成分は全て、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、スクロースおよびＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）（ポロクサマー）Ｐ１８８を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）においてまたは生理的食塩水（ＮＳ）製剤において個々に製剤化された、精製されたＡＡＶであった。小数第３位で四捨五入された対象の体重を使用して用量計算を行った。コホート用量にベースライン時の対象体重を掛け、次いでｖｇ／ｍＬ濃度で割ることにより、計算を行った。３種の製品構成成分体積を一緒に加算し、総体積を決定した。加えて、添加のためのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）静脈内液剤の体積を計算して、０．２５％ＨＳＡの最終濃度を達成し、最後に、要求される量のＰＢＳまたはＮＳを加えて、正確な構成成分濃度を達成した。
次に、製品構成成分を、ＮＳまたはＰＢＳ中０．２５％ＨＳＡを含有するＩＶ注入バッグに添加した。各製品構成成分を別々に添加し、次いでバッグを穏やかに混合し、注入の責任者へと移送した。次に、注入ポンプ（Ｓｉｇｍａ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を使用して、１００ｍＬ／時間の速度で製品を対象に注入した。
（実施例３）
試験適格性および除外基準
試験における対象のための主要適格性基準は、次のものを含んだ：≧５歳（成人コホート１～３：≧１８歳；小児コホート４および６：１２～１７歳；小児コホート５および７：５～１１歳）；肝脾腫大の証拠、Ｘ線による多発性骨形成不全、遺伝子配列決定によって確認されたＩＤＳ欠乏による心臓弁膜症および／または閉塞性気道疾患；肝臓塊（liver mass）に対して陰性である磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に基づく、ＭＰＳ ＩＩの臨床診断。
試験における対象のための主要除外基準は、次のものを含んだ：酵素補充療法に対する公知の無応答性；血清におけるＡＡＶ６に対する中和抗体；ＢもしくはＣ型肝炎または活動性Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１／２に対する抗レトロウイルス療法を受けていること；イデュルスルファーゼ処置（Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標））に対する耐容性の欠如；アルブミン遺伝子座内のＺＦＮ標的化領域における多型；０～４段階尺度における３または４の肝臓線維症スコア（Desmet et al. (1994) Hepatology 19(6):1513-20）、肝機能不全のマーカー；妊娠中または授乳中の女性；コルチコステロイド使用の禁忌；全身性免疫調節剤またはステロイド使用による現在の処置；遺伝子療法製品による以前の処置；および上昇したまたは異常なα－フェトプロテイン。
試験設計
ＭＰＳ ＩＩ疾患を有する対象において試験を行った。いくつかのコホートを試験した：ｉ）≧１８歳（成人コホート１～３）；ｉｉ）１２～１７歳（小児コホート４および６）；ならびにｉｉｉ）５～１１歳（小児コホート５および７）。これらのコホートにおいて使用した用量を下の表６に示す。コホート１は低用量と見なされ、コホート２は中間用量であり、コホート３は高用量である。全コホートについて、総ＡＡＶ用量は、２種のＺＦＮベクターおよび１種のドナーベクターを１：１：８の固定比で含む。
Figure 0007432581000026
臨床エンドポイント
一次エンドポイント：本試験の一次エンドポイントは、有害事象および重大な有害事象の発生率によって査定される、組成物の安全性および忍容性であった。追加の安全性評価は、次のものを含んだ：ルーチンの血液学、化学および肝臓機能臨床検査、バイタルサイン、身体検査、ＥＣＧ、ＥＣＨＯおよび付随する薬物療法；脳神経試験および筋力検査；連続的α－フェトプロテイン検査、ならびに肝臓塊について評価するための肝臓のＭＲＩ。全対象において安全性査定を行った。全ての報告された有害事象を、ICH国際医薬用語集（Medical Dictionary for Regulatory Activities）（ＭｅｄＤＲＡ）ＡＥ辞書を使用して、用語の標準セットへとコード化した。各事象の頻度を、重症度および試験薬との関連性によってまとめた。
主要二次エンドポイントは、次のもののベースラインからの変化を含んだ：血漿において測定されるＩＤＳ活性、尿において測定される総ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧおよびＨＳ ＧＡＧレベル（クレアチニンに対する比として表現される）；ＰＣＲによって血漿、唾液、尿、糞便および精液におけるベクターゲノムによって測定されるＡＡＶ２／６クリアランス。尿ＧＡＧレベルは、ＭＰＳ ＩＩ疾患病態生理学の主要バイオマーカーである。追加の二次エンドポイントは、ＩＤＳ（または等価ＥＲＴ）の頻度および用量の毎月のモニタリングを含む。
主要探索的エンドポイントは、次のもののベースラインからの変化を含んだ：生検で得た肝臓組織におけるアルブミン遺伝子座における遺伝子改変のパーセンテージおよび耐久性；ＰＦＴによって測定される努力肺活量；６ＭＷＴによって測定される歩行距離；ＪＲＯＭ；肝臓および脾臓体積を評価するための肝臓のＭＲＩ；臨床軟部組織および／または骨を評価するための脳および頸椎のＭＲＩ；ＷＡＳＩ－ＩＩ、ＷＰＰＳＩ－ＩＶまたはＢＳＩＤ－ＩＩＩおよびＶＡＢＳ－ＩＩによる神経認知能力；肝臓組織の病理組織学的試験；肝臓組織およびＣＳＦにおいて測定される総ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧおよびＨＳ ＧＡＧレベル、ならびに血清において測定されるＡＡＶ２／６およびＺＦＮに対する免疫応答。これらのエンドポイントの解析は、記述的および探索的な性質であった。連続変数は、全登録対象に関する平均、標準偏差、中央値および範囲によってまとめた。カテゴリー変数は、全登録対象に関するカテゴリー毎の計数およびパーセンテージによりまとめた。前年の値からの変化は、選択された臨床および実験室パラメーターに関して計算することができる。シフト表（正常範囲と比べたベースラインからの変化）は、選択された実験室パラメーターに関して構築することができる。
統計解析およびデータ解析
これは、探索的第Ｉ相試験であったため、有効性および関係した生物学的エンドポイントを評価するために限られた統計的検定力が存在する。したがって、解析は、主に記述的および探索的な性質であった。本試験は、最大２３名の対象を登録する（７種のコホートのそれぞれにおける２名の対象と、３種の年齢コホートのそれぞれにおける最大耐用量における３名の追加の対象の潜在的な登録）。これが、安全性および忍容性を評価するための第Ｉ相安全性試験であるため、コホート当たり２名の対象の選択は、統計的計算に基づくものではなかった。全ての表、リストおよびデータ概要は、ＳＡＳバージョン９．２またはそれ以降で行った。
患者
患者人口統計を下の表７に示し、これは、全患者が、軽症型ＭＰＳ ＩＩ疾患を有したことを実証する。表８は、治験開始後３２週間に各対象が得た処置への曝露を収載する。
Figure 0007432581000027
Figure 0007432581000028
観察された有害事象
全対象が、継続中のＭＰＳ ＩＩ疾患と一致して、処置下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ）を報告した。大部分は軽度（グレード１）であり、処置なしで消散した。３種の重篤有害事象（ＳＡＥ）が、３名の対象において報告され、治験施設の責任医師によって、試験薬に関係するとはみなされなかった。これらを次に示す：Ａ）自身のＭＰＳ ＩＩによる慢性肺疾患の対象の病歴に続発すると考えられた、グレード３気管支炎であり、気管支炎は、医学的処置後に消散した；Ｂ）グレード２心房細動。これは、自身のＭＰＳ ＩＩ疾患による心弁疾患の対象の病歴に続発すると考えられ、事象は医学的処置後に消散した；Ｃ）対象の根本的なＭＰＳ ＩＩ疾患、ヘルニアの病歴および病的肥満に続発すると考えられた臍ヘルニア、閉塞性。これらの事象を下の表９Ａにまとめる：
Figure 0007432581000029
２例を除く全ての試験薬に関係する有害事象（ＡＥ）は、軽度（グレード１）であり、全て介入なしで消散し、用量依存性ではなかった。ＡＥを下の表１０に示す。
Figure 0007432581000030
表１０において、「Ｎ」は、各処置群における対象の総数を指し示し；「ｎ」は、基本語毎の有害事象を有する対象の数を指し示し；「［Ｔ］」は、有害事象の総数を指し示す。＊は、中等度重症度（グレード２）を指し示す。
予備的肝臓ゲノム編集結果
ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを使用して、ＩＤＳ導入遺伝子がアルブミン遺伝子に挿入された場合に肝臓組織に発生する特有のｍＲＮＡを検出した（実施例４を参照）。結果は、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ用量を受けた両方のコホート２対象において陽性（＋）であった（下の表１１を参照）。アルブミン遺伝子内の標的部位における挿入／欠失を検出するための、より低感度のゲノムＤＮＡアッセイは、検査した全試料で陰性であった。
予備的血漿ＩＤＳ測定
血漿ＩＤＳ活性は、可能な場合ＥＲＴ投与の直前の期間に、および対象の最後のＥＲＴ注入後９６時間以降として定義された、トラフにおいて測定した。ＩＤＳは、本試験において、基質として４－硫酸メチルウンベリフェリル（４ＭＵ）を使用した標準の検証済みの蛍光測定アッセイを使用して測定した（例示的な血漿ＩＤＳアッセイについては、下の実施例４を参照）。血漿ＩＤＳ活性は、ベースライントラフにおいて、また、投与後最初の１６週間にわたり、定量のレベルを下回った（５．２ｎｍｏｌ／時間／ｍＬ）。
改善された血漿ＩＤＳ活性アッセイを開発した（実施例４を参照）。図８に示す通り、新たなアッセイの使用により、血漿ＩＤＳは、全対象において検出可能であった。上述の通り、ＥＲＴ投与後９６時間未満に得られた試料は除外した。このアッセイにおいて、ＭＰＳ ＩＩベースライン対象は、＜１０ｍｍｏｌ／ｍＬ／時間ＩＤＳ活性であり、正常集団におけるベースラインは、＞７９ｍｍｏｌ／ｍＬ／時間である。図８は、試験薬による処置に先立つ対象における血漿ＩＤＳレベルを示す（０日目に投与する前に陰性として表示された試験日データを参照）。
１２週の尿ＧＡＧ結果、コホート１および２
実施例１に記載されているポリヌクレオチドおよびＡＡＶを含む組成物による投与後１２週間に、コホート２における全ＧＡＧ生化学的マーカーに減少が見られた。総尿ＧＡＧレベルは、検証済みの１，９－ジメチレンブルー（ＤＭＢ）比色アッセイによって測定した（実施例４を参照）一方、尿デルマタン硫酸および尿ヘパラン硫酸ＧＡＧレベルは、検証済みのＭＳ／ＭＳアッセイ（超高速液体クロマトグラフィーとそれに続くタンデム質量分析）によって測定した。例示的なＭＳ／ＭＳアッセイ手順は、実施例４に記載されている。コホート２における総ＧＡＧの、ならびにＭＰＳ ＩＩに最も密接に関連付けられる２種のＧＡＧであるデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸の低減が観察された。これらの結果を下の表８Ａに示す。
Figure 0007432581000032
１６週の尿ＧＡＧ結果、コホート１および２
実施例１に記載されているポリヌクレオチドおよびＡＡＶを含む組成物による投与後１６週間に、コホート２における全ＧＡＧ生化学的マーカーの減少が見られた。総尿ＧＡＧレベルは、検証済みの１，９－ジメチレンブルー（ＤＭＢ）比色アッセイによって測定した（実施例４を参照）一方、尿デルマタン硫酸および尿ヘパラン硫酸ＧＡＧレベルは、検証済みのＭＳ／ＭＳアッセイ（超高速液体クロマトグラフィーとそれに続くタンデム質量分析）によって測定した。例示的なＭＳ／ＭＳアッセイ手順は、実施例４に記載されている。これらの結果を下の表８Ｂに示す。
Figure 0007432581000033
１６週間の結果の概要
コホート１、２および３の登録および投与を完了したが、１６週のデータは、コホート１および２に関するこの予備的報告のものしか利用できなかった。したがって、現在のデータは、低用量および中間用量のみから得た。コホート３由来の２名の患者は、最近、コホート２用量よりも５倍高い５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で処置した。実施例１に記載されているポリヌクレオチドおよびＡＡＶを含む組成物は、最大５．００ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で、軽症型ＭＰＳ ＩＩを有する６名の対象に投与し、全対象において全般に耐容性が良かった。組成物に関係したＳＡＥは報告されず、持続性高トランスアミナーゼ血症は観察されなかった。尿ＧＡＧバイオマーカーは、用量依存性様式で、総ＧＡＧ、デルマタン硫酸（ＤＳ ＧＡＧ）およびヘパラン硫酸（ＨＳ ＧＡＧ）の低減を示した。１．００ｅ１３ｖｇ／ｋｇ用量で処置した２名の対象（コホート２）は、本明細書に記載される組成物による投与後１６週間の尿ヘパラン硫酸の６０％を超える平均減少を示した。第１の患者のおおよその５３％および第２の患者のおおよそ６９．９％を含む、コホート２に関するおおよそ６１．５％の尿ヘパラン硫酸の平均低減が観察された。デルマタン硫酸に関して、第１の患者のおおよその４７．４％および第２の患者のおおよそ１６．３％を含む、コホート２に関するおおよそ３１．８の平均低減が観察された。第１の患者のおおよそ６２．５％および第２の患者のおおよそ３９．１％を含む、コホート２に関するおおよそ５０．８％の尿ヘパラン硫酸の平均低減を観察した。コホート２患者に関して、総尿中ＧＡＧ、デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸はそれぞれ、両方の患者でベースラインを下回って減退した。特に、１６週間のコホート２（中間用量）において、総尿中ＧＡＧは５１％、デルマタン硫酸は３２％、ヘパラン硫酸は６２％減退した。
さらに、図６Ａ～図６Ｃ（対象毎のベースラインおよび各毎月の来診における個々の対象値を描写する）に示す通り、処置後ＭＰＳ ＩＩバイオマーカーの低減は、経時的に持続した。対象が、試験薬とは無関係の心房細動のＳＡＥのために入院し、数時間低血圧となってから４日後に試料が得られた１時点を例外として、コホート２における両方の対象に関して、総ＧＡＧ、デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸の実測値は、１６週間を通してベースラインを下回ったままであった。次の測定において、この患者のＧＡＧは、４週目から観察された以前の低い範囲に戻った。
コホート２とは対照的に、コホート１対象のＧＡＧは全般に、自身のベースライン測定値の前後のままであった。コホート１における１名の患者に関して、総ＧＡＧは、僅かに高まり、他の患者に関して、総ＧＡＧは僅かに減退した。本試験における患者は全てＥＲＴを受けており、これは、ＥＲＴ未処置ＭＰＳ ＩＩ患者と比較して、そのＧＡＧが有意に低減されることを意味する。ＥＲＴを受けている軽症型疾患を有するＭＰＳ ＩＩ患者のＧＡＧレベルは、変動し得るが、通常、診断モデルが、正常の最下端（very low end）までずっと、疾患の下端とみなす範囲内である。コホート１および２における患者は、高い正常範囲におけるベースラインＧＡＧ値を有し、測定可能な減退の余地を依然として有するのに十分に上昇した。血漿ＩＤＳ活性は、ベースライン時および組成物による投与後最初の１６週間において定量のレベルを下回った。検出可能レベルの非存在は、ＩＤＳが、本明細書に開示される方法および組成物を使用して編集された肝臓細胞によって産生されていないことを指し示すものではない。これらの組織がＩＤＳを欠乏しているため、低レベルの循環ＩＤＳへの細胞の連続的曝露が、細胞への酵素取り込みの駆動に、およびＧＡＧの低減または抑制維持に十分となり得ることが可能である。第６の対象（コホート３）は、５．００ｅ１３ｖｇ／ｋｇで投与され、上に記載されている安全性および探索的エンドポイントを観察するために追跡される。患者は、ＥＲＴの中止に関して評価される。ＥＲＴ中止後の尿ＧＡＧレベルの安定化は、本明細書に開示される方法および組成物の治療潜在力を評価するための１つの重要なパラメーターとなる。
２４週の尿ＧＡＧ結果、コホート１～３
５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇおよび５ｅ１３ｖｇ／ｋｇを含む３種の用量コホートに関して、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸および総ＧＡＧを含む尿ＧＡＧを測定した。８名の対象を処置したが、この２４週データセットは、最初の６名の対象のみを含む。データを図９に提示する。
図８は、処置後おおよそ５０日目にコホート３における対象６における血漿ＩＤＳの大幅な増加、および高トランスアミナーゼ血症の発症を実証する。図１０は、対象６のＩＤＳレベル、およびＩＤＳレベルのスパイクにおいて観察された肝臓アラニンアミノトランスフェラーゼの変化のクローズアップを描写する。肝臓機能検査の軽度（グレード１）増加が、試験６２、１１１および１２８日目に報告された。プレドニゾン用量は、毎日６０ｍｇ ＰＯに増加させ、次いで漸減させた。この対象も、試験１２１日目に、試験薬とは無関係のＳＡＥ（嵌頓臍ヘルニア）を有した。
２４週間の結果の概要
ヒトゲノムの編集成功の予備的証拠を示した。肝臓試料のＰＣＲ解析（遺伝子組込みを検出するためのアッセイ）の結果により、コホート２における２名の患者は、遺伝子組込みを実証した。加えて、融合アルブミンＩＤＳ転写物を合成した。これらのゲノム編集された肝臓細胞は、処置されたＭＰＳ ＩＩ患者の血漿においてＩＤＳ活性を生成した。本明細書で要約される患者は、ＡＡＶ ＳＢ－４７１７１、ＡＡＶ ＳＢ４７８９８およびＡＡＶ ｈＩＤＳドナーを含む本明細書に開示される組成物で処置した。
ＥＲＴ中止は、安全性、ＩＤＳ／ＧＡＧ生化学的マーカーおよび機能的尺度をモニタリングしつつ、プロトコール指定のスケジュールの下で開始された。ＥＲＴ中止後の尿ＧＡＧレベルの応答は、試験薬の潜在的臨床関連性の決定に重要である。３名の対象（コホート２の２名およびコホート３の１名）は、ＥＲＴ中止を開始したが、コホート２における１名の対象は、疲労および尿ＧＡＧの並行した増加により、おおよそ３ヶ月後にＥＲＴを再開し得る。
試験薬を最大５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で、軽症型ＭＰＳ ＩＩを有する８名の対象に投与したところ、全般に耐容性が良かった。試験薬に関係する有害事象は、軽度または中等度であり、全て消散した。試験薬の投与は、これらの患者において、好ましい安全性プロファイルにより、全般に耐容性が良かった。１７種の有害事象が報告され、そのうち１５種は軽度、グレード１であり、全ての報告された有害事象が処置なしで消散した。試験薬に関係する重篤有害事象は報告されなかった。低用量コホートにおける１名の患者および中間用量コホートにおける２名の患者由来の肝臓生検結果は、１ｅ１３中間用量で処置した２名の対象における肝臓細胞のゲノム編集の予備的証拠を指し示す。特異的な分子シグナルの増幅および検出に使用される標準実験室方法である逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用したアッセイを使用して、解析を行った。アッセイは、ＩＤＳ遺伝子が内因性アルブミン遺伝子内の予想部位への組込みに成功した場合にのみ作られ得る、アルブミン－ＩＤＳキメラｍＲＮＡ転写物を同定することにより、遺伝子組込みを検出するように設計した。このアッセイは、両方の中間用量コホート患者においてアルブミン－ＩＤＳキメラｍＲＮＡ転写物を検出した。より低感度のアッセイ（０．１％の定量下限）であるＭｉＳｅｑ ＤＮＡ配列決定を使用して行われた別の肝臓組織解析は、低および中間用量コホート患者由来の試料における編集を検出しなかったため、中間用量コホート患者におけるゲノム編集は、低頻度で起こるようである。肝臓組織の解析は、２４週間後に１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ用量の両方の対象においてアルブミン－ＩＤＳ ｍＲＮＡ転写物の証拠を示し、ゲノム編集が起こったことを指し示す。コホート３対象の解析は完了していない。５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ用量の１名の対象において血漿ＩＤＳ活性の実質的増加が観察されたが、これは、軽度高トランスアミナーゼ血症の発症後に減少した。
加えて、この概要は、より高感度の定量的ＩＤＳアッセイを使用した血漿ＩＤＳ活性測定値も含んだ。ＩＤＳ酵素データは、ベースラインと比較して、処置後２４週間に試験の全３コホートにわたって登録された最初の６名の患者由来の血漿活性レベルを含んだ。酵素アッセイ解析は、１ｅ１３中間用量の２名の対象および５ｅ１３高用量の１名の対象の血漿におけるＩＤＳ活性の僅かな増加を検出した。さらに、５ｅ１３高用量で処置した第２の患者において血漿ＩＤＳ活性の有意な増加が測定され、血漿ＩＤＳレベルは、ＳＢ－９１３処置後５０日目までにおおよそ５０ｎｍｏｌ／時間／ｍＬへと高まり、これは、正常血漿ＩＤＳ活性の下限のおよそ６０％である。６２、１１１および１２８日目にこの患者において、軽度、グレード１の肝臓機能検査上昇が測定され、疑われる高トランスアミナーゼ血症事象と一致し、処置後２４週間に１４ｎｍｏｌ／時間／ｍＬまで下がるこの対象における血漿ＩＤＳ活性の散逸をもたらした。
これらの最初の６名の患者において、２４週間の尿ＧＡＧ測定値も収集し、ベースラインと比較した。登録した全対象が、正常または正常を僅かに上回るとみなされる範囲内のベースライン尿ＧＡＧレベルを有し、２４週間に、最初の６名の患者由来の尿ＧＡＧレベルは、明らかな傾向または有意義な変化を示さなかった。
ＡＡＶ ｈＩＤＳドナーと共にＡＡＶ ＳＢ－７１５５７およびＡＡＶ ＳＢ－７１７２８（４７１７１および４７８９８の代わりに）を含む本明細書に開示される組成物を使用して、本明細書に記載される通りに追加の試験を行った。前臨床試験において、ＡＡＶ ＳＢ－７１５５７およびＡＡＶ ＳＢ－７１７２８は、本明細書に記載される通りに処置されるＭＰＳ ＩＩ対象において欠損した酵素であるＩＤＳの改善されたカッティング効率（５～３０倍）および改善された発現（５～２０倍）を実証した（米国特許出願第１６／２７１，２５０号を参照）。
（実施例４）
イズロン酸－２－スルファターゼ酵素アッセイ
利用することができる例示的な実験室手順は、次の通りに行われる。ＩＤＳ酵素活性を検出するために、使用することができる多くのアッセイが存在する。例示的なアッセイは次の通りである：イズロン酸－２－スルファターゼは、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸の両方に存在するイズロン酸残基の２’位から硫酸残基を除去するリソソーム酵素である。このアッセイは、末端イズロン酸を含有した人工４－ＭＵ基質を使用した。しかし、４－ＭＵの蛍光が放出されるためには、基質から全イズロン酸部分が除去されなければならない。イズロン酸の除去は、α－イズロニダーゼ酵素によって触媒され、これは、イズロン酸－２－スルファターゼによる硫酸残基の除去後でのみ起こることができる。したがって、このアッセイは、２ステップ反応であった。第１のステップにおいて、内因性イズロン酸－２－スルファターゼは、４－ＭＵ基質の末端でイズロン酸残基から２’硫酸残基を切断する機会を与えられた。第２のステップにおいて、外因性リソソーム酵素（α－イズロニダーゼを含むが、イズロン酸－２－スルファターゼを含まない）が、反応物に添加された。α－イズロニダーゼ酵素は、内因性イズロン酸－２－スルファターゼによって２’硫酸残基が既に除去されたいずれかの４－ＭＵ基質から、イズロン酸を除去することができる。４－ＭＵ基質からの末端イズロン酸の除去は、蛍光光度計を使用して観察されるその蛍光を放出する。しかし、内因性イズロン酸－２－スルファターゼ酵素が、患者試料内に存在しない場合、２’硫酸残基は除去され得ず、これは、全イズロン酸部分が除去されることを防止し、これにより、４－ＭＵ基質の蛍光をクエンチする（Voznyi et al. (2001) J Inher Metab Dis 24:675-680）。
手順：全血から血漿を遠心分離により分離した（ヘパリン処理、グリーントップまたはＥＤＴＡ保存、パープルトップ）。全血から血漿を遠心分離により分離した。遠心分離後に、上層の液体層（血漿）を慎重に引き抜くまたは注ぎ出し、別の適切な収集チューブ内に収集した。血漿を含有するこのチューブを凍結し、ドライアイス中に詰めて送る。
凍結した血漿試料をフリーザーから取り出し、３７℃ウォーターバスで急速に解凍し、その後に希釈した。血漿試料を、別の微量遠心分離チューブにおいて基質緩衝液で１：１０希釈した（１０μＬ血漿＋９０μＬ基質緩衝液）。各患者／対照チューブにおいて、１０μＬ希釈血漿＋２０μＬハンター基質を組み合わせてマイクロプレートに入れ、３７℃インキュベーターで３時間インキュベートした。５０μＬクエンチング溶液（０．２％ＢＳＡおよび１μｇ／ｍＬ組換えヒトα－Ｌ－イズロニダーゼを有する２×マッキルベイン（Mcilvaine）緩衝液）を各試料に添加し、反応プレートを２４時間３７℃インキュベーターに戻した。４０μＬの各反応物を平らで白色不透明なプレートに移し、１００μＬ停止緩衝液を添加した。（３６５ｎｍ励起、４５０ｎｍ発光）プレートリーダーを使用して、蛍光シグナルを取得した。次の計算を使用して、総酵素活性を決定した：
血漿：平均補正読み取り値×希釈係数（１０）＝血漿１ｍＬ当たりの３時間当たりの加水分解された基質のｎモル数。正常血漿値は、８２～２００ｎｍｏｌ／時間／ｍＬから得た（５０名のドナーから決定）。酵素活性の定量下限（ＬＬＯＱ）は、０．７８ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間である。酵素活性の解析的測定範囲の上限は、１６７ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間である。
基質緩衝液を次の通りに調製した：０．１Ｍ酢酸ナトリウムを０．０１Ｍ酢酸鉛と組み合わせ、氷酢酸を使用して５．０のｐＨに調整した。試料希釈のための使用当日に基質緩衝液に０．２％ＢＳＡを添加した。ハンター基質４ＭＵ－αＩｄｏＡ－２Ｓ（２．５ｍＭ）は、商業的に購入した。
クエンチング溶液：２×マッキルベイン緩衝液は、０．４Ｍリン酸二ナトリウムおよび０．２Ｍクエン酸塩、ｐＨ４．５に調製した。使用当日に２×マッキルベイン緩衝液に０．２％ＢＳＡを添加した。１μｇ／ｍＬの最終濃度で０．２％ＢＳＡを含有する２×マッキルベイン緩衝液に組換えヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）を希釈することにより、クエンチング溶液を調製した。
このアッセイは、定量下限＝０．７８を有する。罹患していない個体の参照範囲（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間）は、８２～２００である一方、ＭＰＳ ＩＩ患者（ＥＲＴ後＞９６時間）のベースラインは、０～１０と推定される。
血液におけるＩＤＳ活性を測定するための別の例示的なアッセイは次の通りである：４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イドピラノシドウロン酸（idopyranosiduronic acid）２－硫酸（ＩＤＳ－Ｓ）は、ＩＤＳの基質として使用される。次に、その酵素産物、４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イドピラノシドウロン酸（ＩＤＳ－Ｐ）および内部標準、４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イドピラノシド（ＩＤＳ－ＩＳ）は、ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって直接測定される（Lee et al. (2015) Clin Biochem. 48(18):1350-3）。
ＭＳ／ＭＳによる総尿グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）アッセイならびに定量的尿ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸およびコンドロイチン硫酸アッセイ
尿におけるＧＡＧのレベルを測定するための種々のアッセイが存在する。例示的なアッセイの１種を次の通り記載する：尿試料は、試験中に収集され、ジメチルメチレンブルー（ＤＭＢ）アッセイを使用してグリコサミノグリカンレベルに関して解析される。簡潔に説明すると、尿試料は、１，９－ジメチルメチレンブルー色素で試料を処理することによりヘパラン硫酸に関して染色され、３．３のｐＨのギ酸に再懸濁され、５２０ｎｍの波長での吸光度に関して測定される。尿試料において同定されたクレアチニンタンパク質の総濃度を使用して、ヘパラン硫酸の濃度を正規化した（例えば、de Jong et al. (1989) Clin Chem 35/7:1472-1479を参照）。
生体試料に存在する総ＧＡＧを測定するための別の例示的なアッセイは次の通りである：方法は、（ａ）検出可能シグナルを産生するためのセリンプロテアーゼによる標識された基質の切断に適した条件および時間において、セリンプロテアーゼ（例えば、凝固カスケードの）、セリンプロテアーゼのための標識された基質、セリンプロテアーゼの阻害剤、および１種または複数種のグリコサミノグリカンを含むことが疑われる試料を組み合わせるステップと、（ｂ）検出可能シグナルを検出するステップと、（ｃ）検出可能シグナルの量を標準と比較して、前記試料における前記１種または複数種のグリコサミノグリカンの濃度を決定するステップであって、前記セリンプロテアーゼの前記阻害剤が、ヘパリン補因子ＩＩおよびアンチトロンビンＩＩＩからなる群から選択され、前記１種または複数種のグリコサミノグリカンが、デルマタン硫酸（ＤＳ）およびヘパリン硫酸（ＨＳ）からなる群から選択される、ステップとを包含する（例えば、米国特許出願公開第２０１３／０１８９７１８号を参照）。
別の例示的なアッセイは、存在するＧＡＧの種類を測定し、マルチプレックスアッセイと名付けられる（Langereis et al. (2015) PLoS One 10(9):e0138622）。このアッセイは、尿に見出されるヘパラン硫酸（ＨＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）およびケラタン硫酸（ＫＳ）の酵素消化と、それに続くＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる定量に基づく。このアッセイは、非常に高感度のアッセイであり、尿におけるＧＡＧの正確な種類の測定に使用することができる。
ＧＡＧの特異的な種類の濃度の決定に使用することができる別の例示的なアッセイは、ＲａｐｉｄＦｉｒｅ（ＲＦ、Ａｇｉｌｅｎｔ）ハイスループット質量分析システムを利用する。試料を、マトリックスに吸収して、濃縮および脱塩し、次いで、クロマトグラフィー分離なしでＭＳ／ＭＳへと直接的に溶出する。各試料を、１０秒間未満で処理し、従来のＬＣ－ＭＳ／ＭＳに基づく方法よりもはるかに高速のスループットをもたらす（Tomatsu et al. (2014) J Anal Bioanal Tech. Mar 1; 2014(Suppl 2):006を参照）。
血漿、唾液、尿、糞便および精液におけるＡＡＶ２／６クリアランス
生体試料におけるＡＡＶの検出は、当技術分野で公知のいくつかの方法によって行うことができる。例示的なシェディングアッセイは、ヒト血漿、精液、唾液、尿および大便試料におけるＡＡＶ２／６－ドナーおよびＡＡＶ２／６－ＺＦＮベクターの解析のためのものであり、５種のマトリックスからのＤＮＡの回収率を評価する。ヒトドナー由来のヒト血漿、精液、唾液、尿および大便試料は、ｑＰＣＲ解析のためのマトリックスＤＮＡの供給源を提供した。
ヒト血漿からのＤＮＡ単離：ヒト血漿試料のアリコート（２００μＬ）を解凍し、２μｇのサケ精子ＤＮＡの存在下、プロテイナーゼＫで処理し、その後、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキットを使用してＤＮＡ単離を行った。精製された血漿ＤＮＡを１００μＬの溶出緩衝液ＡＥに溶解した。
ヒト精液からのＤＮＡ単離：ヒト精液試料のアリコート（最大１００μＬ）を解凍し、プロテイナーゼＫで処理し、次いで、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキットを使用してＤＮＡ単離のために処理した。精製された精液ＤＮＡを１００μＬの溶出緩衝液ＡＥに溶解し、ＤＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－８０００機器を用いて２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収によって決定した。
ヒト唾液からのＤＮＡ単離：ヒト唾液試料のアリコート（最大２００μＬ）を解凍し、プロテイナーゼＫで処理し、次いで、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキットを使用してＤＮＡ単離のために処理した。精製された唾液ＤＮＡを１００μＬの溶出緩衝液ＡＥに溶解し、ＤＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－８０００機器を用いて２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収によって決定した。
ヒト尿からのＤＮＡ単離：ヒト唾液試料のアリコート（最大２００μＬ）を解凍し、プロテイナーゼＫで処理し、次いで、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキットを使用してＤＮＡ単離のために処理した。精製された唾液ＤＮＡを１００μＬの溶出緩衝液ＡＥに溶解し、ＤＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－８０００機器を用いて２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収によって決定した。
ヒト大便からのＤＮＡ単離：ヒト大便試料のアリコート（９０～１１０ｍｇ）を部分的に解凍し、ホモジナイズし、プロテイナーゼＫで処理し、その後、ＱＩＡａｍｐ Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉキットを使用してＤＮＡ単離を行った。精製された大便ＤＮＡを２００μＬの緩衝液ＡＴＥに溶解し、ＤＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－８０００機器を用いて２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収によって決定した。
７９００ＨＴ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲ系において、標準９６ウェルプレート上で各ｑＰＣＲを行った。反応ミックスを有するプレートをオプティカルキャップでシールし、１５００ｒｐｍ１５分間の遠心分離によって全液滴をスピンダウンし、その後、ｑＰＣＲを行った。
ドナーＡＡＶ（ＳＢ－ＩＤＳ、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＨＮＴ）のための反応は、９１ヌクレオチドアンプリコンを増幅および検出した。ＺＦＮ ＤＮＡ（ＳＢ－４７１７１：ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＬＥＦＴおよびＳＢ－４７８９８：ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＲＩＧＨＴ）の検出のための反応は、９６ヌクレオチドアンプリコンを増幅および検出した。
使用したアッセイ条件：５０℃で２分間保持した。９５℃で１０分間保持した。９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクル。直鎖化ＭＰＳ ＩＩまたはＺＦＮプラスミドＤＮＡを使用した以前に調製された標準曲線と結果を比較した。
肝臓組織におけるアルブミン遺伝子座における遺伝子改変
配列決定による遺伝子改変の検出のための例示的なアッセイは、ＭｉＳｅｑ次世代配列決定（ＮＧＳ）プラットフォームを使用して、対象試料におけるアルブミン遺伝子における挿入および欠失（インデル）のレベルを決定することである。標準手順を使用して肝臓組織からｇＤＮＡを単離し、２０ｎｇ／ｍＬに希釈した。試料をアダプターＰＣＲ、続いてバーコードＰＣＲに付し、配列決定のためにＭｉＳｅｑカートリッジ上にロードした。ＰＣＲ反応のために次の条件を使用した：
ＰＣＲ反応（アダプター）：９５℃３分間、［９８℃２０秒間、５５℃１５秒間、７２℃１５秒間］、角括弧内のステップを２９回反復。７２℃で１分間の最終伸長。
ＰＣＲ反応（バーコード）：９５℃３分間、［９８℃２０秒間、６０℃１５秒間、７２℃１５秒間］、角括弧内のステップを９回反復。７２℃で１分間の最終伸長。
肝臓生検におけるアルブミン－ＩＤＳ ｍＲＮＡ転写物の同定
ＲＴ－ＰＣＲ方法を開発して、アルブミン遺伝子座へのＩＤＳ遺伝子の挿入の結果として生じる特有のアルブミン－ＩＤＳ ｍＲＮＡ転写物の存在をアッセイした。このアッセイを使用して、試験薬で処置された対象由来の肝臓生検組織を検査した。手短に説明すると、製造業者（manufacture）のＲＮＡ肝臓環境を使用したＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）機器（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用して、凍結した肝臓組織からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは、製造業者のプロトコールに従ってＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡ ｍｉｎｉキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を使用して単離される。ＲＮＡを定量し、製造業者のプロトコールに従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ第１鎖合成系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した逆転写に使用した。逆転写後に、試料を、次のプライマーセットを使用したＰＣＲに付した：
Figure 0007432581000034
図７に描写される通りにプライマーおよびプローブを使用して、アルブミン遺伝子へのＩＤＳ組込み後の特有のＰＣＲ産物を増幅した、またはＩＤＳ組込みなしのアルブミン単独を検出した。
ＬａｂＣｈｉｐＧＸ Ｔｏｕｃｈ ＨＴ系（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、ＰＣＲ産物の定量を行った。このアッセイの検出下限は、１，０００ゲノムにつきおよそ１ゲノムである。
（実施例５）
最小に効果的な用量を決定するためのモデルを開発して、本発明の組成物で処置した対象における効果的な用量を予測することができる。モデルを開発して、組成物の予測される薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）を試験して、治療上効果的な用量を予測した。ヒトおよび非ヒト霊長類においてＥｌａｐｒａｓｅ（登録商標）を使用した、発表されたＰＫデータ（Tomanin et al. (2014) Orphanet J Rare Dis. 9:129.；Garcia et al. (2007) Mol Genet Metab. 91(2):183-90；Kim, S et al. (2017) Mol Genet Metab.122(1-2):92-99. doi: 10.1016/j.ymgme.2017.06.001.；Sohn et al. (2013) Orphanet J Rare Dis. 8:42.；Kim, C et al. (2017) J Hum Genet. 62(2):167-174.；Elaprase FDA Pharmacology/Toxicology and Medical Review Documents）、ならびに本発明の組成物におけるマウス試験由来のＰＤおよびＰＫデータ（Ou, L. et al.、投稿準備中）を適合させた。まず、ヒト、サルおよびＩＤＳノックアウトマウス（参照）を使用したＥｌａｐｒａｓｅ（登録商標）のＰＫ／ＰＤモデルを開発した。次に、ＩＤＳノックアウトマウスにおいて本発明の組成物を使用して、ＰＫ／ＰＤモデルを開発した（Ou et al. (2014) Mol Genet Metab. 111(2):116-122）。次いで、２種のモデルを連結して、ヒトにおける本発明の組成物の挙動をシミュレートし（図１）、それによると、計算のセットを行って、２種の治療薬の挙動を数学的に連結した（図２）。マウス観察データにモデルを適用して、予測値に合わせた（図３）。次に、モデルを使用して、尿ＧＡＧレベルの低下をもたらす血漿ＩＤＳ活性に要求される効果的な用量を予測した。図示される通り（図４）、５．０ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇの最低用量であっても、推定最低有効用量（lowest estimated efficacious dose）を上回るＩＤＳ血漿活性をもたらすことが予測されるため、処置されている対象における尿ＧＡＧを低下させることが予測される（後述を参照）。
文献検索は、正常ヒト、ＭＰＳ－ＩＩ保因者（ヘテロ接合体）および罹患対象におけるＩＤＳ活性の量（ＧＣＣアッセイによって測定される）が、下の表に示す通りであることを見出した：
上の表に示すデータの出典は次の通りである：「（１）」はVoznyi et al. (2001) J. Inherit Metab Dis 24(6):675-80であり；「（２）」はGreenwood Genetic Center, internal observations；「（３）」はLee et al. (2015) Clin Biochem 48(18):1350-3であり；「（４）」はde Camargo Pinto et al. (2010) Am J Med Genet A.であり；「（５）」はLin et al. (2006) Clin Chim Acta 369(1): 29-34であり；「（６）」はSchwartz et al. (2009) J Inherit Metab Dis 32(6):732-738であり；「（７）」はQuaio et al. (2012) J Inherit Metab Dis 4:125-8であり；「（８）」はChistiakov et al. (2014) J. Genet Genomics 41(4): 197-203である。
全身性ＩＤＳの３０％が、細胞によって取り込まれ、正常ＩＤＳの２５％が、ＭＰＳ－ＩＩ表現型の補正に十分であることが推定された（Eliahu et al. (1981) Am J Hum Genet 33(4):576-83）。「保因者」ＭＰＳ－ＩＩ表現型から単離された白血球において実測される活性（表９Ｂを参照）は、９～５４ｎｍｏｌ／４時間／ｍＬである。よって、血漿におけるＩＤＳの３０％が、細胞へと内部移行される場合、おおよそ６．５ｎｍｏｌ／４時間／ｍｇ～１０ｎｍｏｌ／４時間／ｍｇの内部細胞濃度をもたらす２０～３０ｎｍｏｌ／４時間／ｍＬの血漿濃度が、疾患に関連する症状の軽減に十分である。
本明細書に言及されるあらゆる特許、特許出願および刊行物は、それらの全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
理解を明確にする目的のため、説明および例としてある程度詳細に本開示を提示してきたが、当業者には、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、様々な変化および改変を実施することができることが明らかである。したがって、前述の記載および例は、限定として解釈されるべきではない。

Claims (12)

  1. ＭＰＳ ＩＩを有する対象における追加の処置手順の必要性、症状の開始、進行および／または重症度を低減、延期および／または排除する方法における使用のための組成物であって、前記組成物は、
    第１、第２および第３のＡＡＶベクターであって、前記第１のＡＡＶベクターが、ＺＦＮ ７１５５７をコードする配列番号３０を含み、前記第２のＡＡＶベクターが、ＺＦＮ ７１７２８をコードする配列番号３１を含み、前記第３のＡＡＶベクターが、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードする配列を含む、ベクター
    を含む、使用のための組成物。
  2. 前記対象におけるＧＡＧレベルが低減、安定化される、および／またはＧＡＧが前記対象の尿から排除される；ならびに／あるいは
    血漿および／または白血球におけるＩＤＳレベルが、安定化および／または増加され、必要に応じて、ＩＤＳレベルが、同じ状態を保つまたは検出レベルを下回る、請求項１に記載の使用のための組成物。
  3. 第１、第２および第３のＡＡＶベクターが、１：１：８の固定比で投与されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の使用のための組成物。
  4. （ｉ）低減、延期および／または排除される前記追加の処置手順が、酵素補充療法（ＥＲＴ）；骨髄移植；ならびに／または整形外科的、心臓および／もしくは上気道閉塞（例えば、アデノイド口蓋扁桃摘出術、ヘルニア修復術、脳室腹腔シャント、心臓弁置換術、手根管開放術、脊髄減圧）のための１種もしくは複数種の支持的外科手順を含む；ならびに／あるいは
    （ｉｉ）その開始、進行または重症度が低減、延期または排除される、ＭＰＳ ＩＩに関連する前記症状が、機能的能力の減退、神経学的増悪、関節硬直、車椅子に依存するようになること、身体障害の進行、強制空気陽圧換気の要求（人工呼吸器の要求）および／または寿命短縮を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  5. 前記第１および／または第２のＡＡＶベクターが、次の配列：小型のペプチド（ＦＬＡＧまたはＨｉｓタグ配列などのペプチドタグを含むがこれらに限定されない）をコードする配列；ＷＰＲＥ配列；核局在化シグナル（ＮＬＳ）コード配列；ポリＡシグナル；ジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガータンパク質のうち１つもしくは複数における１個もしくは複数の変異；前記ジンクフィンガーヌクレアーゼのＦｏｋＩヌクレアーゼ切断ドメインもしくは切断ハーフドメインにおける１個もしくは複数の変異；前記ＺＦＮの発現を駆動するプロモーター配列（例えば、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターなどの肝臓特異的プロモーター）；１つもしくは複数のイントロン配列（例えば、ヒトβ－グロビン遺伝子の第１のイントロン由来の５’ドナー部位ならびに免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロン由来の分枝および３’アクセプター部位を含むＨＧＧ－ＩＧＧキメライントロン）；および／または１つもしくは複数のエンハンサー配列（例えば、ヒトＡｐｏＥエンハンサー配列）のうち１つまたは複数を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  6. 前記ＩＤＳドナーが、ヒトＩＤＳコード配列、必要に応じて、配列番号１５に示す配列、および／または配列番号１７に示す配列を含むＡＡＶベクターを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  7. 前記方法が、
    （ｉ）処置の前および後の前記対象において、血漿、肝臓、ＣＳＦにおけるまたは白血球におけるＩＤＳ活性および／またはレベルを測定するステップであって、ＩＤＳ活性が処置後に増加する（例えば、正常範囲まで）場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除されるステップ；
    （ｉｉ）処置の前および後の前記対象の尿における総ＧＡＧレベル、デルマタン硫酸を含むＧＡＧ（ＤＳ ＧＡＧ）レベルおよび／またはヘパラン硫酸を含むＧＡＧ（ＨＳ ＧＡＧ）レベルを測定するステップであって、ＧＡＧ、ＤＳ ＧＡＧおよび／またはＨＳ ＧＡＧレベルが処置後に低減する場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除されるステップ；
    （ｉｉｉ）処置の前および後の努力肺活量を測定するステップであって、肺機能が処置後に増加する場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除されるステップ；
    （ｉｖ）処置の前および後の歩行距離を測定するステップであって、歩行距離が処置後に増加する場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除されるステップ；
    （ｖ）処置の前および後の関節可動域（ＪＲＯＭ）を測定するステップであって、ＪＲＯＭが処置後に増加する場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除されるステップ、
    （ｖｉ）脾臓および／または肝臓体積が処置後に増加する前および後に脾臓および／または肝臓体積を測定するステップ；ならびに／あるいは
    （ｖｉｉ）処置の前および後の１つまたは複数の神経認知能力を測定するステップであって、前記神経認知能力のうち１つまたは複数が処置後に増加する場合、追加の治療手順が、延期、低減または排除されるステップ
    をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  8. （ｉ）身体障害進行、臓器腫大、機能亢進、攻撃性、神経学的増悪、関節硬直、骨格変形、心臓弁肥厚、難聴、角膜混濁および視覚障害、ヘルニアおよび／または上気道感染症が、処置後に前記対象において抑制、低減、延期または排除される；
    （ｉｉ）前記対象における医療用人工呼吸器デバイスの使用の必要性が、処置後に安定化、延期、低減または避けられる；
    （ｉｉｉ）前記対象が車椅子に依存することの開始が、処置後に延期、低減または避けられる；ならびに／あるいは
    （ｉｖ）前記対象の平均余命が、処置後に増加する、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  9. （ｉ）前記追加の治療手順が、ＥＲＴであり、必要に応じて、ＥＲＴが、処置後に低減または中止され、必要に応じて、ＥＲＴが、処置後に数時間、数週間、数ヶ月間または数年間低減または中止される；ならびに／あるいは
    （ｉｉ）前記追加の治療手順が、骨髄移植である、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  10. 前記対象が、１ｅ１２～１ｅ１６ｖｇ／ｋｇの間の総ＡＡＶ用量を受け、必要に応じて、前記総ＡＡＶ用量が、（ｉ）５ｅ１１ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに４ｅ１２ｖｇ／ｋｇの前記第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ；（ｉｉ）１ｅ１２ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに８ｅ１２ｖｇ／ｋｇの第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ；（ｉｉｉ）５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに４ｅ１３の第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ；（ｉｖ）１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに８ｅ１３ｖｇ／ｋｇの前記第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ；（ｖ）５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに４ｅ１４ｖｇ／ｋｇの前記第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ；または（ｖｉ）１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの前記第１および第２のＡＡＶベクターならびに８ｅ１４ｖｇ／ｋｇの前記第３のＡＡＶベクターを必要に応じて含む、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  11. （ｉ）前記組成物が、必要に応じて注入ポンプにより、１０～２００ｍＬ／時間の間のいずれか、必要に応じて１００ｍＬ／時間の速度で静脈内投与されることを特徴とする；
    （ｉｉ）前記対象が、本発明の組成物による処置の前および／または後に、必要に応じて、処置に先立つ１週間またはそれより長い間、毎日；処置の当日；処置後７日目に；処置後毎週；および／または処置後最大２０週間まで１週間おきに、必要に応じて表Ａに示す通り、必要に応じてコルチコステロイド、必要に応じてプレドニゾンを前投与されることを特徴とする；ならびに／あるいは
    （ｉｉｉ）前記対象が、早期発症型ＭＰＳ ＩＩ、軽症型ＭＰＳ ＩＩまたは早期発症型ＭＰＳ ＩＩと軽症型ＭＰＳ ＩＩとの間のＭＰＳ ＩＩを含むハンター症候群を有する成人または子供である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  12. 前記対象のための総用量が、次の通り：処置前に前記対象の体重を決定するステップと；前記対象の体重をｖｇ／ｍＬ濃度で割って、使用されるべき用量を決定するステップとによって決定され、必要に応じて、前記方法が、（ｉ）コホート用量に処置前の前記患者体重を掛け、次いで、前記ＶＧ濃度で割ることによって、例えば、次の通り：（ａ）試験コーディネーターから前記コホートおよびベースライン時の患者体重を得て、（ｂ）臨床解析証明書から前記ＶＧ濃度を得ることによって、３種の製品構成成分体積を計算するステップ；（ｉｉ）前記３種の製品構成成分体積およびＮＳ／ＰＢＳ体積をまとめて加算することにより、総体積を計算するステップ；（ｉｉｉ）０．２５％ＨＳＡの最終濃度の達成に要求されるＨＳＡ静脈内液剤の体積を計算するステップ、ならびに（ｉｖ）調整された前記ＮＳ／ＰＢＳ体積を計算するステップを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
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