TW202112229A - 包含人化白蛋白基因座之非人的動物 - Google Patents

包含人化白蛋白基因座之非人的動物 Download PDF

Info

Publication number
TW202112229A
TW202112229A TW109119042A TW109119042A TW202112229A TW 202112229 A TW202112229 A TW 202112229A TW 109119042 A TW109119042 A TW 109119042A TW 109119042 A TW109119042 A TW 109119042A TW 202112229 A TW202112229 A TW 202112229A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
albumin
human
sequence
human animal
locus
Prior art date
Application number
TW109119042A
Other languages
English (en)
Inventor
方青
家珍 蕭
丹 沙洛索
克蒂 楊
利亞 沙賓
瑞秋 塞特勒
布萊恩 贊布羅維
洛里 莫頓
Original Assignee
美商雷傑納榮製藥公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商雷傑納榮製藥公司 filed Critical 美商雷傑納榮製藥公司
Publication of TW202112229A publication Critical patent/TW202112229A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本發明提供包含人化白蛋白(ALB) 基因座之非人的動物基因組、非人的動物細胞和非人的動物以及製造和使用該等非人的動物基因組、非人的動物細胞和非人的動物之方法。包含人化白蛋白基因座之非人的動物細胞或非人的動物表現人白蛋白或嵌合型白蛋白，該嵌合型白蛋白之片段係來自人白蛋白。本發明提供使用該包含人化白蛋白基因座之非人的動物來評估人白蛋白靶向劑(諸如被設計成靶向人白蛋白之核酸酶劑)的活體內效力之方法。

Description

包含人化白蛋白基因座之非人的動物
本申請案關於包含人化白蛋白基因座之非人的動物。 相關申請案之交叉引用
本申請案主張於2019年6月7日提出申請之美國申請案號62/858589和2019年10月17日提出申請之美國申請案號62/916666之權益，各該申請案之全文以引用方式併入本文以用於所有目的。 以文本文件之形式經由EFS WEB提交之序列表的參考
該以文檔54918 5 SEQLIST.txt書寫之序列表為158千字節，其創建於2020年6月4日並以引用方式併入本文。
基因療法為數種人類疾病之具有前景的治療方法。一種基因療法的方法係將轉基因插入基因組之安全港基因座。安全港基因座(safe harbor locus)包括其中轉基因或其他外源核酸插入物可穩定且可靠地表現在所有感興趣之組織中，而不會明顯改變細胞行為或表型的染色體基因座。通常，安全港基因座為其中該插入之基因序列的表現不會被來自鄰近基因之任何通讀表現(read through expression)干擾的基因座。例如，安全港基因座可包括其中外源DNA可以可預測之方式整合及發揮功能，而不會不利地影響內源基因結構或表現的染色體基因座。安全港基因座可包括基因外區域或基因內區域，諸如，例如在非必需、可有可無的或能夠被破壞而無明顯表型後果之基因內的基因座。
安全港基因座之一種實例為白蛋白。然而，對於合適之非人的動物仍有需要，該合適之非人的動物能夠提供真實或非常接近真實之人白蛋白靶向劑的人基因組DNA靶的，從而能夠在存活之動物中測試該等試劑之效力和作用模式以及在設置(其中該人化基因為唯一存在之白蛋白形式)中進行藥代動力學和藥效學研究。
本發明提供包含人化白蛋白(ALB) 基因座之非人的動物，以及製造和使用該等非人的動物之方法。亦提供包含人化白蛋白(ALB) 基因座之非人的動物基因組或細胞。亦提供人化白蛋白基因。
於一態樣中，本發明提供包含人化白蛋白(ALB) 基因座之非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物。該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物可在其基因組中包含人化內源性白蛋白基因座，其中該內源性白蛋白基因座的節段已被刪除並以對應之人白蛋白序列替代。
於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該人化內源性白蛋白基因座編碼包含人血清白蛋白肽之蛋白質。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該人化內源性白蛋白基因座編碼包含人白蛋白前肽之蛋白質。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該人化內源性白蛋白基因座編碼包含人白蛋白信號肽之蛋白質。
於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，同時包含編碼序列和非編碼序列之內源性白蛋白基因座的區域已被刪除並以同時包含編碼序列和非編碼序列之對應的人白蛋白序列替代。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該人化內源性白蛋白基因座包含內源性白蛋白啟動子，其中該人白蛋白序列係與該內源性白蛋白啟動子可操作地連接。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該內源性白蛋白基因座中至少一個內含子和至少一個外顯子已被刪除並以對應之人白蛋白序列替代。
於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該內源性白蛋白基因座的整個白蛋白編碼序列已被刪除並以對應之人白蛋白序列替代。可選擇地，該從起始密碼子至終止密碼子之該內源性白蛋白基因座的區域已被刪除並以對應之人白蛋白序列替代。
於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該人化內源性白蛋白基因座包含人白蛋白3'未轉譯區。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該內源性白蛋白5'未轉譯區尚未被刪除且尚未以對應之人白蛋白序列替代。
於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該從起始密碼子至終止密碼子之該內源性白蛋白基因座的區域已被刪除並以人白蛋白序列替代，該人白蛋白序列包含對應之人白蛋白序列和人白蛋白3'未轉譯區，該內源性白蛋白5'未轉譯區尚未被刪除且尚未以對應之人白蛋白序列替代，且該內源性白蛋白啟動子尚未被刪除且尚未以對應之人白蛋白序列替代。
於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，在該人化內源性白蛋白基因座之該人白蛋白序列包含與SEQ ID NO：35所示之序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該人化內源性白蛋白基因座編碼蛋白質，該蛋白質包含與SEQ ID NO：5所示之序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該人化內源性白蛋白基因座包含編碼序列，該編碼序列包含與SEQ ID NO：13所示之序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該人化內源性白蛋白基因座包含與SEQ ID NO：17或18所示之序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，在該人化內源性白蛋白基因座之該人白蛋白序列包含與SEQ ID NO：35所示之序列具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性之序列。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該人化內源性白蛋白基因座編碼蛋白質，該蛋白質包含與SEQ ID NO：5所示之序列具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性之序列。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該人化內源性白蛋白基因座包含編碼序列，該編碼序列包含與SEQ ID NO：13所示之序列具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性之序列。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該人化內源性白蛋白基因座包含與SEQ ID NO：17或18所示之序列具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性之序列。
於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該人化內源性白蛋白基因座不包含篩選卡匣或報告子基因。
於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該非人的動物之該人化內源性白蛋白基因座係呈同型合子。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該非人的動物在其種系中包含該人化內源性白蛋白基因座。
於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該非人的動物為哺乳動物。可選擇地，該非人的動物為大鼠或小鼠。可選擇地，該非人的動物為小鼠。
於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該非人的動物包含至少約10 mg/mL之血清白蛋白量。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該非人的動物之血清白蛋白量係至少與包含野生型白蛋白基因座之對照組非人的動物之血清白蛋白量一樣高。
於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該基因組、細胞或動物之該人化內源性白蛋白基因座係呈異型合子。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該基因組、細胞或動物之人化內源性白蛋白基因座係呈同型合子。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該基因組、細胞或動物進一步包含外源蛋白質之編碼序列，該編碼序列被整合入該非人的動物之一或多個細胞的人化內源性白蛋白基因座的至少一個等位基因。可選擇地，該外源蛋白質之編碼序列被整合入該人化內源性白蛋白基因座(例如，在非人的動物之一或多個細胞中)之至少一個等位基因的內含子1。於某些該等非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物中，該基因組、細胞或動物進一步包含去活化之內源性基因座，該去活化之內源性基因座非該內源性白蛋白基因座。可選擇地，該非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物進一步包含外源蛋白質之編碼序列，該編碼序列被整合入該人化內源性白蛋白基因座的至少一個等位基因(例如在該非人的動物之一或多個細胞中)，其中該外源蛋白質替代該去活化之內源性基因座的功能。可選擇地，該去活化之內源性基因座為去活化之F9基因座。
於另一態樣中，提供用於產生上述非人的動物基因組、非人的動物細胞或非人的動物之靶向載體。該等靶向載體可用於產生人化內源性白蛋白基因座，其中該內源性白蛋白基因座之節段已被刪除並以對應之人白蛋白序列替代，其中該靶向載體包含插入核酸，該插入核酸包含側面鄰接5'同源臂和3'同源臂之對應的人白蛋白序列，該5'同源臂靶向該內源性白蛋白基因座之5'靶序列且該3'同源臂靶向該內源性白蛋白基因座之3'靶序列。
於另一態樣中，提供評估人白蛋白靶向劑的活體內活性之方法。某些該等方法包含：(a)對上述之非人的動物投予該人白蛋白靶向劑；和(b)評估該人白蛋白靶向劑在該非人的動物中之活性。
於某些該等方法中，該投予包含由腺相關病毒(AAV)介導之遞送、由脂質奈米顆粒(LNP)介導之遞送或流體動力學遞送(HDD)。可選擇地，該投予包含由LNP介導之遞送。可選擇地，該LNP劑量係介於約0.1 mg/kg至約2 mg/kg之間。於某些該等方法中，該投予包含由AAV8介導之遞送。
於某些該等方法中，步驟(b)包含從該非人的動物分離出肝臟並評估該人白蛋白靶向劑在該肝臟中之活性。
於某些該等方法中，該人白蛋白靶向劑為基因組編輯劑，且該評估包含評估該人化內源性白蛋白基因座之修飾。可選擇地，該評估包含測量該人化內源性白蛋白基因座內之插入或缺失的頻率。
於某些該等方法中，該評估包含測量由該人化內源性白蛋白基因座編碼之白蛋白信使RNA的表現。於某些該等方法中，該評估包含測量由該人化內源性白蛋白基因座編碼之白蛋白的表現。可選擇地，評估該白蛋白之表現包含測量該非人的動物中之血清白蛋白量。可選擇地，評估該白蛋白之表現包含測量該非人的動物之肝臟中的白蛋白之表現。
於某些該等方法中，人白蛋白靶向劑包含經設計以靶向人白蛋白基因之區域的核酸酶劑。於某些該等方法中，該人白蛋白靶向劑包含核酸酶劑或編碼該核酸酶劑之核酸，其中該核酸酶劑經設計以靶向人白蛋白基因之區域。可選擇地，該核酸酶劑包含Cas蛋白和嚮導RNA，該嚮導RNA經設計以靶向該人白蛋白基因中之嚮導RNA靶序列。可選擇地，該嚮導RNA靶序列係在該人白蛋白基因之內含子1中。可選擇地，該Cas蛋白為Cas9蛋白。
於某些該等方法中，人白蛋白靶向劑包含外源供體核酸，其中該外源供體核酸經設計以靶向人白蛋白基因，且可選擇地其中該外源供體核酸係經由AAV遞送。可選擇地，該外源供體核酸為單股寡去氧核苷酸(ssODN)。可選擇地，該外源供體核酸能夠藉由非同源端接合插入人化白蛋白基因座。
於某些方法中，該外源供體核酸不包含同源臂。於某些方法中，該外源供體核酸包含插入核酸，該插入核酸側面鄰接5'同源臂和3'同源臂，該5'同源臂靶向該人化內源性白蛋白基因座的5'靶序列且該3'同源臂靶向該人化內源性白蛋白基因座的3'靶序列。可選擇地，該5'靶序列和3'靶序列各自包含人白蛋白基因之內含子1的節段。
於某些該等方法中，該外源供體核酸編碼外源蛋白質。可選擇地，該由已被該外源供體核酸靶向之人化內源性白蛋白基因座編碼的蛋白質為異源蛋白質，該異源蛋白質包含與該外源蛋白質融合之人白蛋白信號肽。可選擇地，該外源蛋白質為因子IX蛋白質。可選擇地，該評估包含測量該非人的動物之血清因子IX蛋白質量和/或包含評估活化部分凝血酶原時間(activated partial thromboplastin time)或進行凝血酶生成分析。可選擇地，該非人的動物還包含去活化之F9基因座，且該評估包含測量該非人的動物之血清因子IX蛋白質量和/或包含評估活化部分凝血酶原時間或進行凝血酶生成分析。可選擇地，該人白蛋白靶向劑包含(1)經設計以靶向人白蛋白基因之區域的核酸酶劑，及(2)外源供體核酸，該外源供體核酸經設計以靶向該人白蛋白基因，該外源供體核酸編碼外源蛋白質，且該由已被該外源供體核酸靶向之人化內源性白蛋白基因座編碼的蛋白質為異源蛋白質，該異源蛋白質包含與該外源蛋白質融合之人白蛋白信號肽。可選擇地，該評估包含測量由該外源供體核酸編碼之信使RNA的表現。可選擇地，該評估包含測量該外源蛋白質之表現。可選擇地，評估該異源蛋白質之表現包含測量該非人的動物之血清異源蛋白質量。可選擇地，評估該異源蛋白質之表現包含測量在該非人的動物之肝臟中的表現。
於另一態樣中，提供優化人白蛋白靶向劑的活體內活性之方法。某些該等方法包含：(I)在第一非人的動物中第一次實施上述任一方法以評估人白蛋白靶向劑之體內活性，該第一非人的動物之基因組包含人化內源性白蛋白基因座；(II)改變可變量並在第二非人的動物中第二次實施具有經改變之該可變量的該步驟(I)之方法，該第二非人的動物之基因組包含人化內源性白蛋白基因座；和(III)將該步驟(I)之該人白蛋白靶向劑的活性與該步驟(II)之該人白蛋白靶向劑的活性相比較，並選擇導致較高活性之方法。
於某些該等方法中，該步驟(II)中經改變的該可變量為將該人白蛋白靶向劑引入該非人的動物之遞送方法。可選擇地，該投予包含由LNP介導之遞送，且該步驟(II)中經改變的該可變量為該LNP配製劑。於某些該等方法中，該步驟(II)中經改變的該可變量為將該人白蛋白靶向劑引入該非人的動物之投予途徑。於某些該等方法中，該步驟(II)中經改變的該可變量為被引入該非人的動物之該人白蛋白靶向劑的濃度或量。於某些該等方法中，該步驟(II)中經改變的該可變量為被引入該非人的動物之該人白蛋白靶向劑的形式。於某些該等方法中，該步驟(II)中經改變的該可變量為被引入該非人的動物之該人白蛋白靶向劑。
於某些該等方法中，該人白蛋白靶向劑包含Cas蛋白和經設計以靶向人白蛋白基因中之嚮導RNA靶序列的嚮導RNA。於某些該等方法中，該人白蛋白靶向劑包含Cas蛋白或編碼該Cas蛋白之核酸及嚮導RNA或編碼該嚮導RNA之DNA，其中該嚮導RNA經設計以靶向人白蛋白基因之嚮導RNA靶序列。可選擇地，該步驟(II)中經改變的該可變量為該嚮導RNA序列或該嚮導RNA靶序列。可選擇地，該Cas蛋白和嚮導RNA各自以RNA之形式投予，且該步驟(II)中經改變的該可變量為該Cas mRNA對該嚮導RNA之比率。可選擇地，該步驟(II)中經改變的該可變量為嚮導RNA修飾。可選擇地，該人白蛋白靶向劑包含編碼Cas蛋白和嚮導RNA之信使RNA(mRNA)，且該步驟(II)中經改變的該可變量為該Cas mRNA對該嚮導RNA之比率。
於某些該等方法中，該人白蛋白靶向劑包含外源供體核酸。可選擇地，該步驟(II)中經改變的該可變量為該外源供體核酸之形式。可選擇地，該外源供體核酸包含插入核酸，該插入核酸側面鄰接5'同源臂和3'同源臂，該5'同源臂靶向該人化內源性白蛋白基因座之5'靶序列且該3'同源臂靶向該人化內源性白蛋白基因座之3'靶序列，且該步驟(II)中經改變的該可變量為該5'同源臂之序列或長度和/或該3'同源臂之序列或長度。
於另一態樣中，提供製造上述任何非人的動物之方法。某些該等方法包含：(a)對非人的動物之胚胎幹(ES)細胞引入：(i)靶向該內源性白蛋白基因座之靶序列的核酸酶劑；及(ii)靶向載體，其包含核酸插入子，該核酸插入子包含人白蛋白序列，該人白蛋白序列側面鄰接5'同源臂和3'同源臂，該5'同源臂對應該內源性白蛋白基因座之5'靶序列且該3'同源臂對應該內源性白蛋白基因座之3'靶序列，其中該靶向載體與該內源性白蛋白基因座組合以產生經基因修飾之非人的ES細胞，該非人的ES細胞之基因組包含該人化內源性白蛋白基因座，該人化內源性白蛋白基因座包含該人白蛋白序列；(b)將該經基因修飾之非人的ES細胞引入非人的動物宿主胚胎；和(c)在代孕母親中孕育該非人的動物宿主胚胎，其中該代孕母親產生經基因修飾之F0代非人的動物，該F0代非人的動物之基因組包含該人化內源性白蛋白基因座，該人化內源性白蛋白基因座包含該人白蛋白序列。於另一態樣中，提供製造上述任何非人的動物之方法。某些該等方法包含：(a)對非人的動物之胚胎幹(ES)細胞引入：(i)核酸酶劑或編碼該核酸酶劑之核酸，其中該核酸酶劑靶向該內源性白蛋白基因座之靶序列；和(ii)靶向載體，其包含核酸插入子，該核酸插入子包含人白蛋白序列，該人白蛋白序列側面鄰接5'同源臂和3'同源臂，該5'同源臂對應該內源性白蛋白基因座之5'靶序列且該3'同源臂對應該內源性白蛋白基因座之3'靶序列，其中該靶向載體與該內源性白蛋白基因座組合以產生經基因修飾之非人的ES細胞，該非人的ES細胞之基因組包含該人化內源性白蛋白基因座，該人化內源性白蛋白基因座包含該人白蛋白序列；(b)將該經基因修飾之非人的ES細胞引入非人的動物宿主胚胎；和(c)在代孕母親中孕育該非人的動物宿主胚胎，其中該代孕母親產生經基因修飾之F0代非人的動物，該F0代非人的動物之基因組包含該人化內源性白蛋白基因座，該人化內源性白蛋白基因座包含該人白蛋白序列。可選擇地，該靶向載體為長度至少10kb或其中該5'和3'同源臂之長度總和為至少10kb的大靶向載體。
某些該等方法包含：(a)對非人的動物之單細胞階段胚胎引入：(i)靶向該內源性白蛋白基因座之靶序列的核酸酶劑；和；(ii)靶向載體，其包含核酸插入子，該核酸插入子包含人白蛋白序列，該人白蛋白序列側面鄰接5'同源臂和3'同源臂，該5'同源臂對應該內源性白蛋白基因座之5'靶序列且該3'同源臂對應於該內源性白蛋白基因座之3'靶序列，其中該靶向載體與該內源性白蛋白基因座組合以產生經基因修飾之非人的單細胞階段胚胎，該非人的單細胞階段胚胎之基因組包含該人化內源性白蛋白基因座，該人化內源性白蛋白基因座包含該人白蛋白序列；(b)在代孕母親中孕育該經基因修飾之非人的動物之單細胞階段胚胎以產生經基因修飾之F0代非人的動物，該F0代非人的動物之基因組包含該人化內源性白蛋白基因座，該人化內源性白蛋白基因座包含該人白蛋白序列。某些該等方法包含：(a)對非人的動物之單細胞階段胚胎引入：(i)核酸酶劑或編碼該核酸酶劑之核酸，其中該核酸酶劑靶向該內源性白蛋白基因座之靶序列；和(ii)靶向載體，其包含核酸插入子，該核酸插入子包含人白蛋白序列，該人白蛋白序列側面鄰接5'同源臂和3'同源臂，該5'同源臂對應該內源性白蛋白基因座之5'靶序列且該3'同源臂對應於該內源性白蛋白基因座之3'靶序列，其中該靶向載體與該內源性白蛋白基因座組合以產生經基因修飾之非人的單細胞階段胚胎，該非人的單細胞階段胚胎之基因組包含該人化內源性白蛋白基因座，該人化內源性白蛋白基因座包含該人白蛋白序列；(b)在代孕母親中孕育該經基因修飾之非人的動物之單細胞階段胚胎以產生經基因修飾之F0代非人的動物，該F0代非人的動物之基因組包含該人化內源性白蛋白基因座，該人化內源性白蛋白基因座包含該人白蛋白序列。
於某些該等方法中，該核酸酶劑包含Cas蛋白和嚮導RNA。可選擇地，該Cas蛋白為Cas9蛋白。可選擇地，該步驟(a)進一步包含引入第二嚮導RNA，該第二嚮導RNA靶向該內源性白蛋白基因座內之第二靶序列。
於某些該等方法中，該非人的動物為小鼠或大鼠。可選擇地，該非人的動物為小鼠。
於另一態樣中，提供製造任何上述非人的動物之方法。某些該等方法包含：(a)修飾多能非人的動物細胞之基因組以使其包含該人化內源性白蛋白基因座；(b)鑑定或選擇包含該人化內源性白蛋白基因座之經基因修飾之多能非人的動物細胞；(c)將該經基因修飾之多能非人的動物細胞引入非人的動物宿主胚胎；和(d)在代孕母親中孕育該非人的動物宿主胚胎。某些該等方法包含：(a)修飾該非人的動物單細胞階段胚胎之基因組以使其包含該人化內源性白蛋白基因座；(b)選擇包含該人化內源性白蛋白基因座之經基因修飾之非人的動物單細胞階段胚胎；和(c)在代孕母親中孕育該經基因修飾之非人的動物單細胞階段胚胎。
定義
本文中可互換使用之術語"蛋白質"、"多肽"和"肽"包括任何長度之胺基酸的聚合形式，包括編碼和非編碼之胺基酸及經化學或生物化學修飾或衍生的胺基酸。該術語亦包括已經過修飾之聚合物，諸如具有經修飾之肽主鏈的多肽。術語"結構域"係指具有特定功能或結構之蛋白質或多肽的任何部分。
本文中可互換使用之術語"核酸"和"多核苷酸"包括任何長度之核苷酸的聚合形式，包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或其類似物或經修飾之形式。其包括單股、雙股和多股DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜交體，以及包含嘌呤鹼基、嘧啶鹼基或其他天然的、經化學修飾的、經生物化學修飾的、非天然的或衍生之核苷酸鹼基的聚合物。
術語"基因組整合的"指係已被引入細胞中，從而使該核苷酸序列整合入該細胞之基因組的核酸。可使用任何方案來將核酸穩定納入細胞之基因組中。
術語"靶向載體"係指可藉由同源重組、非同源端接合介導之連接或任何其他重組方式來引入細胞之基因組中之靶的位置的重組核酸。
術語"病毒載體"係指重組核酸，其包括至少一個病毒起源元件且包括足以或允許包裝入病毒載體顆粒中之元件。該載體和/或顆粒可用於在活體外、離體、或活體內將DNA、RNA或其他核酸轉移入細胞。現已知多種形式之病毒載體。
關於細胞、組織(例如肝樣本)、蛋白質和核酸之術語"分離的"包括相對於通常可能存在於原位的其他細菌、病毒、細胞或其他組分而言被相對純化之細胞、組織(例如肝臟樣本)、蛋白質和核酸，乃至於且包括該細胞、組織(例如肝臟樣本)、蛋白質和核酸之實質上純質的製劑。術語"分離的"亦包括不具有天然存在之對應部分，已由化學方式合成且因此實質上未被其他細胞、組織(例如肝臟樣本)、蛋白質和核酸污染，或已從自然伴隨它們(例如其他細胞性蛋白質、多核苷酸或細胞組分)的大部分其他組分(例如細胞組分)中分離或純化的細胞、組織(例如肝臟樣本)、蛋白質和核酸。
術語"野生型"包括具有在正常(與突變體、患病的、改變的，等相反)狀態或背景下發現之結構和/或活性的實體。野生型基因和多肽通常以多種不同形式(例如等位基因)存在。
術語"內源序列"係指天然存在於細胞或非人的動物體中之核酸序列。例如，非人的動物之內源性白蛋白序列係指天然存在於非人的動物中之白蛋白基因座的天然白蛋白序列。
"外源"分子或序列包括通常不以該種形式或位置(例如基因組基因座)存在於細胞中的分子或序列。正常存在包括與細胞之特定發展階段和環境條件相關的存在。例如，外源分子或序列可包括細胞內之對應內源序列的突變形式，諸如內源序列之人化形式，或者可包括對應於細胞內之內源序列，但不同形式(即，不在染色體內)的序列。相反地，內源分子或序列包括在特定環境條件下，通常存在於特定發展階段之特定細胞形式和位置中的分子或序列。
當在核酸或蛋白質之背景下使用時，術語"異源的"係表示該核酸或蛋白質包含至少二個非天然同時存在於同一分子中的節段。例如，當指核酸之節段或蛋白質之節段時，術語"異源的"係表示該核酸或蛋白質包含二或更多個在自然界中不會在相同的關係中找到彼此的子序列(例如連接在一起)。例如，核酸載體之"異源"區為在另一核酸分子內或附接於另一核酸分子之核酸節段，該核酸節段在自然界中並未被發現與另一分子聯結。例如，核酸載體之異源區可包括編碼序列，該編碼序列側面鄰接在自然界中未被發現與該編碼序列聯結之序列。同樣地，蛋白質之"異源"區為在另一肽分子內或附接於另一肽分子的胺基酸節段，該胺基酸節段在自然界中並未被發現與另一肽分子聯結(例如融合蛋白或具有標籤之蛋白)。類似地，核酸或蛋白質可包含異源標記或異源分泌或定位序列。
"密碼子優化"利用密碼子之簡併性(如具體指明胺基酸之多個三鹼基對密碼子組合所示)且通常包括修飾核酸序列以增強在特定宿主細胞中之表現的過程，該修飾係以宿主細胞之基因中較頻繁或最頻繁使用的密碼子替換至少一個天然序列之密碼子，但同時保持該天然胺基酸序列。例如，與天然存在之核酸序列相比較，編碼Cas9蛋白之核酸可經修飾以取代在指定之原核或真核細胞中使用頻率較高的密碼子，該原核或真核細胞包括細菌細胞、酵母細胞、人細胞、非人細胞、哺乳動物細胞、齧齒動物細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、倉鼠細胞或任何其他宿主細胞。密碼子使用表可輕易取得，例如可在"密碼子使用數據庫"取得。這些表可藉由多種方式進行調整。參見Nakamura et al.( 2000)Nucleic Acids Research 28:292(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。亦可取得用於對在特定宿主中表現之特定序列進行密碼子優化的電腦算法(參見，例如Gene Forge)。
術語"基因座"係指基因(或重要序列)、DNA序列、多肽編碼序列之特定位置，或在生物體之基因組的染色體上之位置。例如，"白蛋白基因座"或"Alb 基因座"可指白蛋白(Alb )基因、白蛋白DNA序列、白蛋白編碼序列之特定位置或已經確定為該等序列所在處之生物體基因組之染色體上的白蛋白位置。"白蛋白基因座"可包含白蛋白基因之調節元件，包括，例如增強子、啟動子、5'和/或3'未轉譯區(UTR)或彼等之組合。
術語"基因"係指染色體中編碼產物(例如RNA產物和/或多肽產物)之DNA序列且包括被非編碼內含子打斷之編碼區及位於鄰接5'和3'端之編碼區之位置處，從而使該基因對應於全長mRNA(包括5'和3'非轉譯序列)的序列。術語"基因"亦包括其他非編碼序列，包括調節序列(例如啟動子、增強子和轉錄因子結合位點)、聚腺苷酸化信號、內部核醣體進入位點、沉默子、隔離序列及核基質附著區。這些序列可靠近該基因之編碼區(例如在10kb之內)或在遠處，且其影響基因之轉錄和轉譯量或速率。
術語"等位基因"係指基因之變體形式。某些基因具有多種不同形式，這些形式位於染色體上之相同位置或遺傳基因座上。二倍體生物在每個遺傳基因座具有二個等位基因。每對等位基因代表特定遺傳基因座之基因型。若在特定之基因座具有二個完全相同的等位基因，則該基因型被描述為同型合子，若該二個等位基因不同，則該基因型被描述為異型合子。
"啟動子"為DNA之調節區，其通常包含TATA盒，該TATA盒能指導RNA聚合酶II在特定之多核苷酸序列之合適轉錄起始位點啟始RNA合成。啟動子可另外包含其他可影響轉錄起始速率之區域。本文所揭示之啟動子序列係調節以可操作方式連接之多核苷酸的轉錄。啟動子在本文所揭示之一或多種細胞類型(例如真核細胞、非人類哺乳動物細胞、人類細胞、齧齒動物細胞、多能細胞、單細胞階段胚胎，分化之細胞或彼等之組合)中可具有活性。啟動子可為，例如組成活性啟動子、條件啟動子、誘導型啟動子、時間限制性啟動子(例如發展調節性啟動子)或空間限制性啟動子(例如細胞特異性或組織特異性啟動子)。啟動子之實例可在，例如WO 2013/176772(其全文以引用方式併入本文中以用於所有目的)中找到。
誘導型啟動子之實例包括，例如化學方式調節之啟動子和物理方式調節之啟動子。化學方式調節之啟動子包括，例如醇調節啟動子(例如醇脫氫酶(alcA)基因啟動子)、四環素調節啟動子(例如四環素反應性啟動子、四環素操縱子序列(tetO)、tet-On啟動子或tet-Off啟動子)、類固醇調節啟動子(例如大鼠糖皮質激素受體、雌激素受體啟動子或蛻皮激素(ecdysone)受體之啟動子)或金屬調節啟動子(例如金屬蛋白啟動子)。物理方式調節之啟動子包括，例如溫度調節啟動子(例如熱休克啟動子)和光調節啟動子(例如光誘導型啟動子或光抑制型啟動子)。
組織特異性啟動子可為，例如神經元特異性啟動子、神經膠質細胞特異性啟動子、肌細胞特異性啟動子、心臟細胞特異性啟動子、腎臟細胞特異性啟動子、骨細胞特異性啟動子、內皮細胞特異性啟動子或免疫細胞特異性啟動子(例如B細胞啟動子或T細胞啟動子)。
發展調節啟動子包括，例如僅在胚胎發育階段或僅在成人細胞中具有活性之啟動子。
"可操作的連接"或"可操作地連接"包括二或更多個組分(例如啟動子和另一序列元件)並置，從而使二個組分正常運作，並允許至少一個該組分可能介導施加在至少一個其他組分上之功能。例如，若啟動子控制編碼序列之轉錄量來反應是否存有一或多種轉錄調節因子，則該啟動子可與編碼序列可操作地連接。可操作地連接可包括彼此相連接或相反作用之該等序列(例如調節序列可在遠處起作用以控制該編碼序列之轉錄)。
核酸之"互補性"意指核酸之一股中的核苷酸序列由於其核鹼基團之取向而與相對之核酸股上的另一序列形成氫鍵。DNA中之互補鹼基通常為A和T及C和G。在RNA中，其通常為C和G，及U和A。互補可為完美的，或為實質的/充分的。二種核酸之間的完美互補性意指該二種核酸可形成雙股體，其中該雙股體中的每個鹼基均藉由Watson-Crick配對與互補鹼基結合。"實質的"或"充分的"互補係指一股中之序列與相對股中之序列不完全和/或不完美互補，但在該二股上之鹼基之間發生充分鍵合以在一組雜交條件(例如鹽濃度和溫度)下形成穩定的雜交複合體。該等條件可藉由使用序列和用於預測雜交股之Tm(解鏈溫度)的標準數學計算或藉由使用常規方法憑經驗測定Tm來預測。Tm包括之溫度為在該溫度下二條核酸股之間形成之雜交複合物群體有50%變性(即，雙股核酸分子之群體有一半解離成單股)。在低於Tm之溫度下，有利於形成雜交複合物，而在高於Tm之溫度下，有利於雜交複合物中之股解鏈或分離。具有已知G + C含量之核酸在1 M NaCl溶液中的Tm可藉由使用，例如Tm = 81.5 + 0.41(%G + C)來估算，儘管其他已知Tm計算會考慮核酸結構特徵。
雜交需要該二種核酸含有互補序列，雖然鹼基之間可能有錯配。二種核酸之間雜交的適當條件取決於該核酸之長度和互補程度，眾所周知之可變量。二個核苷酸序列之間的互補程度越大，具有那些序列之核酸雜交體的解鏈溫度(Tm)的值越大。在具有短的互補延伸段(例如在35或更少個、30或更少個、25或更少個、22或更少個、20或更少個或18或更少個核苷酸上具有互補性)之核酸之間的雜交方面，錯配的位置變得很重要(參見Sambrook等人，同上文，11.7-11.8)。通常，可雜交之核酸的長度為至少約10個核苷酸。用於說明之可雜交之核酸的最小長度包括至少約15個核苷酸、至少約20個核苷酸、至少約22個核苷酸、至少約25個核苷酸和至少約30個核苷酸。此外，該溫度和洗滌液鹽濃度可根據，諸如互補區域之長度和互補程度等因素依需要調節。
多核苷酸之序列不需要與其可特異性雜交之靶核酸100%互補。再者，多核苷酸可在一或多個節段上雜交，從而使介於中間或毗鄰之節段不參與雜交事件(例如，環結構或髮夾結構)。多核苷酸(例如gRNA)可與其靶向之靶核酸序列內的標靶區具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%、或100%序列互補性。例如gRNA之20個核苷酸中有18個與標靶區互補，因此其將為特異性雜交，將代表90%互補性。在該實例中，剩餘之非互補性核苷酸可為成簇的或其間穿插互補性核苷酸且不需彼此或與互補核苷酸互相連接。
核酸內之核酸序列的特定延伸段之間的互補百分比可使用BLAST程式(基于局部比對算法之搜索工具)和PowerBLAST程式(Altschul et al.(1990)J. Mol. Biol . 215:403-410；Zhang and Madden(1997)Genome Res . 7:649-656，各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目)或利用默認設置，使用Gap程式(威斯康辛序列分析軟體，Unix版本8，Genetics Computer Group，美國威斯康辛州麥迪遜市大學研究園)來常規測定，該程式係使用Smith and Waterman(1981)Adv. Appl. Math . 2:482-489(其全文以引用方式併入本文以用於所有目)之算法。
本文提供之方法和組成物採用各種不同之組分。說明書全文中的某些組分可具有活性變體和片段。該等組分包括，例如Cas蛋白、CRISPR RNA、tracrRNA和嚮導RNA。這些組分的每一組分之生物活性描述於本文他處。術語"功能性"係指蛋白質或核酸(或其片段或變體)表現生物活性或功能之固有能力。該等生物活性或功能可包括，例如Cas蛋白與嚮導RNA及與靶DNA序列結合之能力。與原始分子相比較，功能性片段或變體之生物功能可能相同或可能實際上被改變(例如相關於其特異性、選擇性或功效)，但保留該分子之基本生物功能。
術語"變體"係指與群體中最普遍之序列不同的核苷酸序列(例如相差一個核苷酸)或與群體中最普遍之序列不同的蛋白質序列(例如相差一個胺基酸)。
當指蛋白質時，術語"片段"意指較全長蛋白質短或具有較少之胺基酸的蛋白質。當指核酸時，術語"片段"意指較全長核酸短或具有較少之核苷酸的核酸。當指蛋白質片段時，片段可為，例如N端片段(即，去除該蛋白質之C端的部分)、C端片段(即，去除該蛋白質之N端的部分)或內部片段(即，去除蛋白質之N端和C端二者的部分)。當指核酸片段時，片段可為，例如5'片段(即，去除核酸之3'端的部分)、3'片段(即，去除核酸之5'端的部分)、或內部片段(即，去除核酸之5'和3'端二者的部分)。
在二個多核苷酸或多肽序列之背景下，"序列同一性"或"同一性"係指當將二個序列在具體指定之比較窗口上做最大對應性比對時，二個序列中之相同的殘基。當序列同一性百分比係相關於蛋白質使用時，非同一之殘基位置通常因保守性胺基酸取代而有所不同，在保守性胺基酸取代中胺基酸殘基被具有類似之化學性質(例如電荷或疏水性)的其他胺基酸殘基取代，因此不會改變分子的功能特性。當序列的差異在於保守性取代時，可將序列同一性百分比向上調整以校正該取代之保守性。由該等保守性取代而導致差異的序列被稱為具有"序列相似性"或"相似性"。用於進行該種調整之方法為眾所周知。通常，此涉及將保守性取代當作部分錯配而非全部錯配來計分，從而增加序列同一性百分比。因此，例如當完全相同之胺基酸被記為1分，而非保守性取代之胺基酸被記為零分時，則保守性取代的得分係介於零與1之間。保守性取代之得分計算係，例如依程式PC/GENE(Intelligenetics，加州山景城)實行。
"序列同一性百分比"包括藉由在比較窗口上比較二個最佳比對序列(完美匹配之殘基的最大數量)所測定的值，其中與參考序列(其不包含添加或缺失)相比較時，多核苷酸序列在比較窗口中之部分可包含添加或缺失(即，間隙)以實現該二個序列的最佳比對。該百分比係藉由下述方式計算：測定在二個序列中出現完全相同之核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數以產生匹配位置之數目，將匹配位置之數目除以比較窗口中之位置的總數，然後將結果乘以100來產生序列同一性百分比。除非另外指明(例如該較短之序列包括連接之異源序列)，否則該比較窗口為被比較的二個序列中之較短序列的全長。
除非另有說明，否則序列同一性/相似性數值包括利用GAP版本10並使用下列參數所獲得之數值：核苷酸序列之同一性%和相似性%係使用GAP權重50和長度權重3，以及nwsgapdna.cmp評分矩陣獲得；胺基酸序列之同一性%和相似性%係使用GAP權重8重和長度權重2，以及BLOSUM62評分矩陣獲得；或使用其任何等同程式獲得。"等同程式"包括任何序列比較程式，該程式對所討論之任何二個序列所產生的比對在與由GAP版本10產生之對應比對相比較時將具有相同核苷酸或胺基酸殘基匹配及序列同一性百分比。
術語"保守性胺基酸取代"係指以具有類似大小、電荷或極性之不同胺基酸來取代通常存在於該序列中的胺基酸。保守性取代之實例包括以非極性(疏水)殘基，諸如異白胺酸、纈胺酸或白胺酸來取代另一非極性殘基。同樣地，保守性取代之實例包括以一個極性(親水)殘基取代另一殘基，諸如介於精胺酸和離胺酸之間、介於麩胺醯胺和天門冬醯胺之間，或介於甘胺酸和絲胺酸之間的取代。另外，保守性取代之另外的實例為以鹼性殘基，諸如離胺酸、精胺酸或組胺酸來取代另一殘基，或以一個酸性殘基，諸如天門冬胺酸或麩胺酸來替代另一酸性殘基。非保守性取代之實例包括以非極性(疏水性)胺基酸殘基，諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸或甲硫胺酸來取代極性(親水性)殘基，諸如半胱胺酸、麩胺醯胺、麩胺酸或離胺酸及/或以極性殘基來取代非極性殘基。典型之胺基酸類別總結於下列表 1 中。
Figure 02_image001
"同源"序列(例如核酸序列)包括與已知之參考序列相一致或大體上類似，從而使其與已知之參考序列具有，例如至少50%、至少55%。至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一性之序列。同源序列可包括，例如直系同源(orthologous)序列和旁系同源(paralogous)序列。例如，同源基因通常透過物種形成事件(直系同源基因)或遺傳複製事件(旁系同源基因)從共同的祖傳來源DNA序列傳下去。"直系同源"基因包括藉由物種形成從共同的祖傳來源基因進化而來之不同物種中的基因。直系同源體通常在進化過程中保留相同的功能。"旁系同源"基因包括藉基因組內之複製而相關的基因。旁系同源體可在進化過程中進化出新功能。
術語"活體外"包括人造環境及在人造環境(例如試管或分離出之細胞或細胞株)內發生的過程或反應。術語"活體內"包括自然環境(例如細胞或生物體或身體)及在自然環境內發生的過程或反應。術語"離體"包括已從個體之身體移出的細胞及在這些細胞內發生的過程或反應。
術語"報告子基因"係指具有編碼基因產物(通常為酶)之序列的核酸，當包含該與異源啟動子和/或增強子元件可操作地連接之報告子基因序列的構建體被引入含有(或可使其含有)啟動子和/或增強子元件活化所必需之因子的細胞中時，可容易且可定量地分析該基因產物。報告子基因之實例包括，但不限於編碼β-半乳糖苷酶之基因(lacZ)、細菌氯黴素乙醯轉移酶(cat)基因、螢火蟲螢光素酶基因、編碼β-葡醣醛酸糖苷酶之基因(GUS)和編碼螢光蛋白之基因。"報告蛋白"係指由報告子基因編碼的蛋白。
如本文所使用之術語"螢光報告蛋白"係指可基於螢光檢測之報告蛋白，其中該螢光可直接來自報告蛋白、報告蛋白在螢光基質上之活性或具有與螢光標記之化合物結合之親和力的蛋白質。螢光蛋白之實例包括綠色螢光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、eGFP、Emerald、Azami Green、單體Azami Green、CopGFP、AceGFP和ZsGreenl)、黃色螢光蛋白(例如YFP、eYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP和ZsYellowl)、藍色螢光蛋白(例如BFP、eBFP、eBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire和T-Sapphire)、青色螢光蛋白(例如CFP、eCFP、Cerulean、CyPet、AmCyanl和Midoriishi-Cyan)、紅色螢光蛋白(例如RFP、mKate、mKate2、mPlum、DsRed單體、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-單體、HcRed-Tandem、HcRedl、AsRed2、eqFP611、mRaspberry、mStrawberry和Jred)、橙色螢光蛋白(例如mOrange、mKO、Kusabira-Orange、單體Kusabira-Orange、mTangerine和tdTomato)，以及可藉由流式細胞術方法檢測其是否存在於細胞中之任何其他合適的螢光蛋白。
回應雙股斷裂(DSB)之修復主要係透過二個保留之DNA修復途徑發生：同源重組(HR)和非同源端接合(NHEJ)。參見Kasparek & Humphrey(2011)Seminars in Cell & Dev. Biol. 22:886-897(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。同樣地，由外源供體核酸介導之靶核酸的修復可包括二個多核苷酸之間遺傳信息交換的任何過程。
術語"重組"包括二個多核苷酸之間的遺傳信息交換的任何過程且可藉由任何機制發生。重組可經由同源引導修復(HDR)或同源重組(HR)發生。HDR或HR包括可能需要核苷酸序列同源性之核酸修復形式，其使用"供體"分子作為用於修復"靶"分子(即，經歷雙股斷裂之分子)之模板並導致遺傳信息從供體轉移至標靶。不欲受任何特定理論之束縛，該等轉移可能涉及在斷裂之標靶與供體之間形成的異源雙股DNA的錯配校正和/或合成依賴股黏合，其中該供體係用於重新合成將成為標靶和/或相關流程之一部分的遺傳信息。在某些情況下，該供體多核苷酸、供體多核苷酸之一部分、供體多核苷酸之副本、供體多核苷酸之副本的一部分整合入該靶DNA中。參見Wang et al.(2013)Cell 153:910-918；Mandalos et al.(2012)PLOS ONE 7:e45768:1-9；和Wang et al.(2013)Nat Biotechnol . 31:530-532(各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。
非同源端接合(NHEJ)包括藉由將斷裂端彼此直接連接或與外源序列直接連接而不需要同源模板之核酸中的雙股斷裂修復。藉由NHEJ之非毗鄰序列連接通常可導致該雙股斷裂位點附近之缺失、插入或轉位。例如，NHEJ亦可透過將斷裂端與外源供體核酸之端點直接連接(即，基於NHEJ之捕獲)而導致外源供體核酸的靶向整合。當同源引導修復(HDR)途徑不易使用時(例如，在非分裂細胞、原代細胞和基於同源性之DNA修復執行不良的細胞中)，該等NHEJ介導之靶向整合對於插入外源供體核酸而言為較佳者。另外，與同源引導修復相反，關於鄰接該裂解位點之大範圍序列同一性的知識並不需要，這在試圖靶向插入其基因組之基因組序列的知識有限的生物體時可能有利。該整合可經由連接外源供體核酸和該裂解之基因組序列之間的鈍端進行，或可經由使用外源供體核酸連接黏性端(即具有5'或3'突出端)來進行，該外源供體核酸側面鄰接突出端，該突出端與那些由核酸酶劑在裂解之基因組序列中所產生者相容。參見，例如US 2011/020722、WO 2014/033644、WO 2014/089290和Maresca et al.(2013)Genome Res . 23(3):539-546(各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。若連接鈍端，則可能需要進行標靶和/或供體切除以產生片段接合所需之微同源性區域，這可能會在靶序列中產生不欲有之改變。
"包含"或"包括"一或多個所列舉之元件的組成物或方法可包括其他未被具體列舉之元件。例如，"包含"或"包括"蛋白質之組成物可僅含有該蛋白質或可與其他成分組合。轉折句"實質上由……組成"係指申請專利之範圍應解釋為涵蓋該申請專利範圍中具體列舉之要素及那些不會實質影響本發明主張專利之基本和新穎特徵者。因此，當在本發明之申請專利範圍中使用術語"實質上由……組成"時，並不意圖被解釋為等同於"包含"。
"可選擇的"或"可選擇地"係指隨後描述之事件或情況可能發生或可能不會發生，且該描述包括其中該事件或情況發生的事例以及事件或情況沒有發生的事例。
指定之數值範圍包括在該範圍內或定義該範圍之所有整數，以及由該範圍內之整數定義的所有子範圍。
除非上下文中明顯表示相反，否則術語"約"包含在該陳述之數值的標準測量誤差範圍內之數值(例如SEM)。
術語"和/或"係指且包含相關列舉項目之一或多者的任意和所有可能組合，以及當在替代方案中("或")解釋時缺乏的組合。
術語"或"係指特定列表中之任一成員，且亦包括該列表之成員的任意組合。
除非上下文明確指示為相反，否則冠詞"一(a、an)"和"該"之單數形式包括複數形式。例如，術語"一種蛋白質"或"至少一種蛋白質"可包括多種蛋白質，包括其混合物。
統計學上有意義係指p≤0.05。詳細說明 I. 概述
本文揭示包含人化白蛋白(ALB) 基因座之非人的動物基因組、非人的動物細胞和非人的動物以及使用該等非人的動物細胞和非人的動物之方法。包含人化白蛋白基因座之非人的動物細胞或非人的動物表現人白蛋白或包含一或多個人白蛋白片段之嵌合型白蛋白。該等非人的動物細胞和非人的動物可用於評估人白蛋白靶向劑(例如CRISPR/Cas9基因組編輯劑)在活體外、離體或活體內之遞送或效力並可用於優化該等藥劑在活體外、離體或活體內的效力遞送。
於本文所揭示之某些非人的動物細胞和非人的動物中，大多數或全部之人白蛋白基因組DNA係插在對應之直系同源非人的動物白蛋白基因座中。在本文所揭示之某些非人的動物細胞和非人的動物中，大多數或全部之非人的動物白蛋白基因組DNA係以對應之直系同源人白蛋白基因組DNA一對一替代。與具有cDNA插入之非人的動物相比較，當該內含子-外顯子結構和剪接機制因為保留之調節元件較可能保持完整，且經歷RNA處理之剪接轉錄子較cDNA更穩定而被維持時，表現水準應較高。相反地，人白蛋白cDNA插在非人的動物之白蛋白基因座中將廢止保守之調節元件(諸如那些包含在非人的動物白蛋白之第一外顯子和內含子中者)。以對應之直系同源人基因組序列替代該非人的動物基因組序列或在對應之直系同源非人白蛋白基因座中插入人白蛋白基因組序列更可能導致從內源性白蛋白基因座忠實地表現轉基因。類似地，在隨機基因組基因座，而非內源性非人的動物白蛋白基因座處轉基因插入人白蛋白編碼序列的轉基因非人的動物將無法同樣準確反映白蛋白表現之內源性調節。以對應之直系同源人基因組DNA一對一替代大部分或全部之非人的動物基因組DNA或在對應之直系同源非人白蛋白基因座插入人白蛋白基因組序列所產生之人化白蛋白等位基因將提供人白蛋白靶向劑(例如經設計以靶向人白蛋白之CRISPR/Cas9試劑)真正的人類標靶或近似於真實人類標靶的標靶，從而能夠測試該等作用劑在存活動物中之功效和作用模式，以及在設置中進行藥代動力學和藥效學研究，該設置中之該人化蛋白質和人化基因為僅存有之白蛋白形式。Ⅱ . 包 含人化白蛋白 (ALB) 基因座之非人的動物
本文所揭示之非人的動物基因組、非人的動物細胞和非人的動物包含人化白蛋白(ALB )基因座。包含人化白蛋白基因座之細胞或非人的動物表現人白蛋白或部分人化之嵌合型白蛋白(其中該天然白蛋白之一或多個片段已被來自人白蛋白之對應片段替代)。本文亦揭示人化之非人的動物白蛋白基因，其中該非人白蛋白基因的節段已被刪除並以對應之人白蛋白序列替代。
本文所揭示之非人的動物基因組、非人的動物細胞和非人的動物可進一步包含不是白蛋白基因座之去活化(剔除)的內源基因。該等非人的動物基因組、非人的動物細胞和非人的動物可用於，例如篩選用於插入人化白蛋白基因座中之基因療法試劑(例如轉基因)以替代該去活化之內源基因。插入該人化白蛋白基因座以替代去活化之內源基因可，例如挽救被剔除之基因。於一特定之實例中，本文所揭示之非人的動物基因組、非人的動物細胞和非人的動物可進一步包含去活化(剔除)的內源性F9 基 因(編碼凝血因子IX)。去活化(剔除)之內源性F9 基因為一種不表現任何凝血因子IX(亦稱為Christmas因子、血漿凝血活酶(thromboplastin)組分或PTC)之基因。野生型人凝血因子IX蛋白之UniProt登錄號為P00740，而人類F9 基 因之登錄號為GeneID2158。野生型小鼠凝血因子IX蛋白之UniProt登錄號為P16294，而小鼠F9 基 因之登錄號為GeneID14071。野生型大鼠凝血因子IX蛋白之UniProt登錄號為P16296，而大鼠F9 基 因之登錄號為GeneID 24946。
本文所揭示之非人的動物基因組、非人的動物細胞和非人的動物可進一步包含外源蛋白質之編碼序列，該外源蛋白質之編碼序列係整合入至少一個人化白蛋白基因座之等位基因中(例如在非人的動物之一或多個細胞中，諸如在非人的動物之一或多個肝細胞中)。該編碼序列可整合在，例如人化白蛋白基因座之內含子1、內含子12或內含子13中。在某些情況下，該外源蛋白質之編碼序列被整合入至少一個該人化白蛋白基因座之等位基因中(例如在非人的動物之一或多個細胞中，諸如在該非人的動物之一或多個肝細胞中)之後，來自人化白蛋白基因座之人白蛋白的表現保持在相同水準。於一實例中，該非人的動物基因組、細胞或動物進一步包含去活化(剔除)之內源性基因，該內源性基因不是白蛋白基因座，且該外源蛋白質替代該去活化之內源基因的功能(例如拯救剔除基因)。於一具體之實例中，該外源蛋白質為凝血因子IX(例如人凝血因子IX)。A. 白蛋白
本文所描述之細胞和非人的動物包含人化白蛋白(ALB) 基因座。白蛋白係由ALB 基 因編碼(亦稱為白蛋白、血清白蛋白、PRO0883、PRO0903、HSA、GIG20、GIG42、PRO1708、PRO2044、PRO2619、PRO2675和UNQ696/PRO1341)。白蛋白在肝臟中以前白蛋白原之形式合成，前白蛋白原具有一個N端肽，該N端肽在新生蛋白質從粗糙之內質網釋放出來之前就被移除。該產物前白蛋白原轉而在高爾基體囊泡中裂解以產生分泌出之白蛋白(血清白蛋白)。人血清白蛋白為人血中發現之血清白蛋白。其為人血漿中含量最豐富之蛋白質；約佔血清蛋白之一半。其係在肝臟中產生。其可溶於水且為單體。除其他功能之外，白蛋白可運輸激素、脂肪酸和其他化合物、緩衝pH值，並保持滲透壓。血清中之人白蛋白濃度通常為約35至50 g/L(3.5至5.0 g/dL)。其血清半衰期為約20天。其分子量為66.5 kDa。
白蛋白被認為是基因組安全港基因座，因為相對於其他組織，其表現水準非常高且具有用於基因遞送和活體內編輯的肝臟易處理性。安全港基因座包括染色體基因座，其中轉基因或其他外源核酸插入子可穩定且可靠地表現在所有感興趣之組織中，而不會明顯改變細胞行為或表型。通常，安全港基因座為其中該插入之基因序列的表現不受鄰近基因之任何通讀表現干擾的基因座。例如，安全港基因座可包括染色體基因座，該染色體基因座中外源DNA可以可預測之方式整合和發揮功能，而不會不利地影響內源性基因結構或表現。安全港基因座可包括基因外區域或基因內區域，諸如，例如基因內之非必要的、可分配或能夠被破壞而無明顯表型後果的基因座。
白蛋白基因結構適合用於靶向內含子序列之轉基因，因為其第一外顯子編碼從最終蛋白質產物裂解出之分泌肽(信號肽)。例如，整合帶有剪接受體之無啟動子卡匣和治療性轉基因將支持許多不同蛋白質之表現和分泌。
人ALB 映射在4號染色體上之人4q13.3(NCBI RefSeq基因ID 213；部件GRCh38.p12(GCF_000001405.38)；位置NC_000004.12(73404239..73421484(+)))。據報導，該基因具有15個外顯子。其中之14個外顯子為編碼外顯子，而外顯子15為非編碼外顯子，其為3'未轉譯區(UTR)之一部分。野生型人白蛋白之UniProt登錄號為P02768。已知至少3種同種型(P02768-1至P02768-3)。一種同種型P02768-1(與NCBI登錄號NP_000468.1同一)之序列列於SEQ ID NO：5中。編碼典型同種型之mRNA(cDNA)的NCBI登錄號為NM_000477.7，且列於SEQ ID NO：37中。示例性編碼序列(CDS)被指派為CCDS ID CCDS3555.1且列於SEQ ID NO：13中。SEQ ID NO：5所示之全長人白蛋白具有609個胺基酸，包括信號肽(胺基酸1至8)、前肽(胺基酸19至24)和血清白蛋白(胺基酸25至609)。這些結構域之間係依UniProt中所指定的描繪。提及之人白蛋白包括典型(野生型)之形式及所有等位基因形式和同種型。人白蛋白之任何其他形式均具有與野生型式最大對齊之胺基酸編號，對齊之胺基酸被指定相同之編號。
小鼠Alb 映射在小鼠5 E1；5號染色體上之5 44.7 cM (NCBI RefSeq基因ID 11657；部件GRCm38.p4 (GCF_000001635.24)；位置NC_000071.6 (90,460,870..90,476,602(+)))。據報導，該基因具有15個外顯子。其中之14個外顯子為編碼外顯子，而外顯子15為非編碼外顯子，其為3'未轉譯區(UTR)之一部分。野生型小鼠白蛋白之UniProt登錄號為P07724。小鼠白蛋白之序列(與NCBI登錄號NP_033784.2同一)列於SEQ ID NO：1中。編碼典型同種型之示例性mRNA(cDNA)同種型的NCBI登錄號為NM_009654.4且列於SEQ ID NO：36中。示例性編碼序列(CDS)(CCDS ID CCDS19412.1)列於SEQ ID NO：9中。列舉於SEQ ID NO：1之典型全長小鼠白蛋白具有608個胺基酸，包括信號肽(胺基酸1至18)、前肽(胺基酸19至24)和血清白蛋白(胺基酸25至608)。這些結構域之間係依UniProt中之指派描繪。所提及之小鼠白蛋白包括典型(野生型)形式以及所有等位基因形式和同種型。小鼠白蛋白之任何其他形式均具有與野生型式最大對齊之胺基酸編號，對齊之胺基酸被指定相同之編號。
亦已知許多其他非人動物之白蛋白序列。這些包括，例如，牛(UniProt登錄號P02769；NCBI RefSeq基因ID 280717)、大鼠(UniProt登錄號P02770；NCBI RefSeq基因ID 24186)、雞(UniProt登錄號P19121)、蘇門達臘猩猩(Sumatran orangutan)(UniProt登錄號Q5NVH5；NCBI RefSeq基因ID 100174145)、馬(UniProt登錄號P35747；NCBI RefSeq基因ID 100034206)、貓(UniProt登錄號P49064；NCBI RefSeq基因ID 448843)、兔(UniProt登錄號P49065；NCBI RefSeq基因ID 100009195)、狗(UniProt登錄號P49822；NCBI RefSeq基因ID 403550)、豬(UniProt登錄號P08835；NCBI RefSeq基因ID 396960)、長爪沙鼠(Mongolian gerbil)(UniProt登錄號O35090)、恒河猴(UniProt登錄號Q28522；NCBI RefSeq基因ID 704892)、驢子(UniProt登錄號Q5XLE4；NCBI RefSeq基因ID 106835108)、綿羊(UniProt登錄號P14639；NCBI RefSeq基因ID 443393)、美國牛蛙(UniProt登錄號P21847)、金色倉鼠(UniProt登錄號A6YF56；NCBI RefSeq基因ID 101837229)和山羊(UniProt登錄號P85295)。B. 人化白蛋白基因座
人化白蛋白基因座為其中該內源性白蛋白基因座之節段已被刪除且被直系同源人白蛋白序列替代的白蛋白基因座。人化白蛋白基因座可為其中整個白蛋白基因被對應之直系同源人白蛋白序列替換的白蛋白基因座，或者其可為其中僅一部分白蛋白基因被對應之直系同源人白蛋白序列替代(即，人化)的白蛋白基因座。例如，可將內源性白蛋白基因座處之整個白蛋白編碼序列刪除並以對應之人白蛋白序列替代。對應於內源性白蛋白序列之特定節段的人白蛋白序列係指當人白蛋白與內源性白蛋白為最佳比對時，與該內源性白蛋白序列之特定節段對齊的人白蛋白區域。最佳比對係指完美匹配之殘基的最大數量。對應之直系同源人序列可包含，例如互補DNA(cDNA)或基因組DNA。可選擇地，該對應之直系同源人白蛋白序列係基於密碼子在非人的動物中之用途來修飾成密碼子優化的。替代或插入(即，人化)區域可包括編碼區(諸如外顯子)、非編碼區(諸如內含子)、未轉譯區或調節區(例如啟動子、增強子或轉錄抑制子結合元素)或彼等之任意組合。例如，可將對應於人白蛋白基因之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或全部15個外顯子的外顯子人化。例如，可將對應於人白蛋白基因的全部外顯子(即，外顯子1至15)人化。另一實例為，可將對應於人白蛋白基因的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或全部14個編碼外顯子的外顯子人化。例如，可將對應於人白蛋白基因的全部編碼外顯子(即，外顯子1至14)的外顯子人化。同樣地，可將對應於人白蛋白基因之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或全部14個內含子的內含子人化或保持內源性。例如，可將對應於人白蛋白基因之全部內含子(即，內含子1至14)的內含子人化。同樣地，可將對應於人白蛋白基因之編碼外顯子之間的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或全部13個內含子的內含子人化或可保持內源性。例如，可將對應於人白蛋白基因之編碼外顯子之間的全部內含子(即，內含子1至13)的內含子人化。亦可將包括調節序列之側面鄰接的未轉譯區人化或保持內源性。例如，可將5'未轉譯區(UTR)、3'UTR或5'UTR和3'UTR二者人化，或者5'UTR、3'UTR或5'UTR和3'UTR二者可保持內源性。可插入該人5'和3'UTR其中一者或二者，和/或可刪除該內源性人5'和3'UTR其中一者或二者。於一具體之實例中，該5'UTR和3'UTR二者均保持內源性。於另一具體之實例中，該5'UTR保持內源性且將該3'UTR人化。根據被直系同源序列替代之程度，調節序列(例如啟動子)可為內源性的，或由替代之人直系同源序列供應。例如，該人化白蛋白基因座可包括內源性非人的動物白蛋白啟動子(即，該人白蛋白序列可與該內源性非人的動物啟動子可操作地連接)。
可將編碼信號肽、前肽或血清白蛋白的一或多個或全部區域人化，或者該等區域之一或多者可保持內源性。小鼠白蛋白信號肽、前肽和血清白蛋白之示例性編碼序列分別列於SEQ ID NO：10至12中。人白蛋白信號肽、前肽和血清白蛋白之示例性編碼序列分別列於SEQ ID NO：14至16中。
例如，可將編碼信號肽之白蛋白基因座的全部或部分區域人化和/或可將編碼前肽之白蛋白基因座的全部或部分區域人化和/或可將編碼血清白蛋白之白蛋白基因座的全部或部分區域人化。或者，或此外，編碼信號肽之白蛋白基因座的全部或部分區域可保持內源性和/或編碼前肽之白蛋白基因座的全部或部分區域可保持內源性和/或編碼血清白蛋白之白蛋白基因座的全部或部分區域可保持內源性。於一實例中，可將編碼信號肽、前肽和血清白蛋白之白蛋白基因座的全部或部分區域人化。可選擇地，該白蛋白基因座之人化區域的CDS包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：13(或其簡併序列)具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列。可選擇地，該白蛋白基因座之人化區域的CDS包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：13(或其簡併序列)具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性之序列。可選擇地，該白蛋白基因座之人化區域包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：35具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列。可選擇地，該白蛋白基因座之人化區域包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：35具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性之序列。可選擇地，該人化白蛋白基因座編碼蛋白質，該蛋白質包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：5具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列。可選擇地，該人化白蛋白基因座編碼蛋白質，該蛋白質包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：5具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性之序列。可選擇地，該人化白蛋白基因座包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：17或18具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列。可選擇地，該人化白蛋白基因座包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：17或18具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性之序列。
由該人化白蛋白基因座編碼之白蛋白可包含一或多個來自人白蛋白之結構域和/或一或多個來自內源性(即，天然的)白蛋白之結構域。小鼠白蛋白信號肽、前肽和血清白蛋白之示例性胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：2至4中。人白蛋白信號肽、前肽和血清白蛋白之示例性胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：6至8中。
該白蛋白可包含人白蛋白信號肽、人白蛋白前肽和人血清白蛋白之一或多者或全部。或者，或此外，該白蛋白可以包含一或多個來自內源性(即，天然的)非人的動物白蛋白之結構域。例如，該白蛋白可包含來自內源性(即，天然的)非人的動物白蛋白之信號肽和/或來自內源性(即，天然的)非人的動物白蛋白之前肽和/或來自內源性(即，天然的)非人的動物白蛋白之血清白蛋白。例如，該白蛋白可包含人信號肽、前肽和血清白蛋白。
嵌合型白蛋白中之來自人白蛋白的結構域可由完全人化的序列(即，以同源直系的人白蛋白序列替代編碼該結構域的整個序列)編碼，或者可由部分人化的序列(即，以同源直系的人白蛋白序列替代編碼該結構域的某些序列，而編碼該結構域之其餘內源性(即，天然的)序列編碼與直系同源之人白蛋白序列相同的胺基酸，從而使該經編碼之結構域與人白蛋白中之該結構域同一)編碼。同樣地，嵌合型蛋白中之來自內源性白蛋白的結構域可由完全內源性序列(即，編碼該結構域的整個序列為內源性白蛋白序列)編碼或可由部分人化之序列(即，以同源直系的人白蛋白序列替代編碼該結構域的某些序列，而該直系同源人白蛋白序列編碼與被替代之內源性白蛋白序列相同的胺基酸，從而使該經編碼之結構域與該內源性白蛋白中之結構域同一)編碼。
舉例而言，該由人化白蛋白基因座編碼之白蛋白可包含人白蛋白信號肽。可選擇地，該人白蛋白信號肽包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：6具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列。可選擇地，該人白蛋白信號肽包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：6具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性之序列。另一實例為該由人化白蛋白基因座編碼之白蛋白可包含人白蛋白前肽。可選擇地，該人白蛋白前肽包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：7具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列。可選擇地，該人白蛋白前肽包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：7具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性之序列。另一實例為該由人化白蛋白基因座編碼之白蛋白可包含人血清白蛋白。可選擇地，該人血清白蛋白包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：8具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列。可選擇地，該人血清白蛋白包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：8具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性之序列。例如，該由人化白蛋白基因座編碼之白蛋白可包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：5具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列。例如，該由人化白蛋白基因座編碼之白蛋白可包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：5具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性之序列。可選擇地，該由人化白蛋白基因座編碼之白蛋白CDS可包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：13(或其簡併序列)具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列。可選擇地，該由人化白蛋白基因座編碼之白蛋白CDS可包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：與SEQ ID NO：13(或其簡併序列)具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性之序列。
該人化白蛋白可保留天然白蛋白和/或人白蛋白之活性。
可選擇地，人化白蛋白基因座可包含其他元件。該等元件之實例可包括選擇卡匣、報告基因、重組酶識別位點或其他元件。或者，該人化白蛋白基因座可缺少其他元件(例如可缺少選擇標記或選擇卡匣)。合適之報告基因和報告蛋白之實例揭示於本文他處。合適之選擇標記的實例包括新黴素磷酸轉移酶(neor )、潮黴素B磷酸轉移酶(hygr )、嘌呤黴素-N-乙醯轉移酶(puror )、殺稻瘟素(blasticidin)S脫胺酶(bsrr )、黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(gpt)和單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-k)。重組酶之實例包括Cre、Flp和Dre重組酶。Crei為一種Cre重組酶基因之實例，其中編碼該Cre重組酶的二個外顯子被內含子分隔以防止其在原核細胞中表現。該等重組酶可進一步包含核定位信號以促進定位在細胞核(例如NLS-Crei)。重組酶識別位點包括可被定點重組酶識別且可作為重組事件之受質的核苷酸序列。重組酶識別位點之實例包括FRT、FRT11、FRT71、attp、att、rox和lox位點，諸如loxP、lox511、lox2272、lox66、lox71、loxM2和lox5171。
其他元件，諸如報告基因或選擇卡匣可為側面鄰接重組酶識別位點之自我刪除卡匣。參見，例如US 8,697,851和US 2013/0312129(各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。舉例來說，該自我刪除卡匣可包含與小鼠Prm1 啟動子可操作地連接的Crei基因(包含編碼Cre重組酶之二個外顯子，該二個外顯子被內含子分隔)和與人泛素啟動子可操作地連接的新黴素抗性基因。藉由使用Prm1啟動子，可將F0動物之雄性生殖細胞中的自我刪除卡匣特異刪除。編碼該選擇標記之多核苷酸可與在被靶向之細胞中具有活性的啟動子可操作地連接。啟動子之實例描述於本文他處。另一具體實例為：自我刪除之選擇卡匣可包含潮黴素抗性基因編碼序列，該潮黴素抗性基因編碼序列與一或多個啟動子(例如人泛素和EM7啟動子二者)可操作地連接，隨後為聚腺苷酸化信號，接著為Crei編碼序列，該Crei編碼序列與一或多個啟動子(例如mPrm1啟動子)可操作地連接，隨後為另一聚腺苷酸化信號，其中該整個卡匣側面鄰接loxP位點。
人化白蛋白基因座亦可為條件性等位基因。例如，該條件性等位基因可為如US 2011/0104799(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)中描述之多功能等位基因。例如，該條件性等位基因可包含：(a)相對於靶基因之轉錄呈有義取向的起動序列(actuation sequence)；(b)呈有義或反義取向之藥物選擇卡匣(DSC)；(c)呈反義取向之感興趣的核苷酸序列(NSI)；(d)呈反向取向之逆轉條件模塊(COIN，其利用外顯子分裂性內含子和可逆之基因誘捕樣模塊)。參見，例如，US 2011/0104799。該條件性等位基因可進一步包含可重組單元，其在暴露於第一重組酶時重組以形成條件性等位基因，該條件性等位基因(i)缺乏起動序列和DSC；(ii)含有呈有義取向之NSI和呈反義取向之COIN。參見，例如US 2011/0104799。
一種示例性人化白蛋白基因座(例如人化小鼠白蛋白基因座)為其中從起始密碼子至終止密碼子之區域被對應之人序列取代者。參見第 1A 和1B 圖 及SEQ ID NO：17和18。於一具體實例中，可將從ATG起始密碼子至終止密碼子之區域(即，編碼外顯子1至14)從非人的動物(例如小鼠)白蛋白(Alb )基因座刪除，並可將從ATG起始密碼子至終止密碼子之下游約100 bp的人白蛋白(ALB) 對應區域插入其以取代該被刪除的內源區。C. 包 含人化白蛋白 (ALB ) 基因座之非人的動物基因組、非人的動物細胞和非人的動物
提供包含如本文他處描述之人化白蛋白(ALB )基因座之非人的動物之基因組、非人的動物細胞和非人的動物。該基因組、細胞或非人的動物可為雄性或雌性。該基因組、細胞、或非人的動物在人化白蛋白基因座方面可為異型合子或同型合子。二倍體生物在每個遺傳基因座具有二個等位基因。每對等位基因代表特定遺傳基因座之基因型。若在特定基因座具有二個完全相同的等位基因，則該基因型被描述為同型合子，若該二個等位基因不同，則該基因型被描述為異型合子。包含人化白蛋白基因座之非人的動物在其種系中可包含人化內源性白蛋白基因座。
本文提供之非人的動物基因組或細胞可為，例如任何包含與人白蛋白基因座為同源或直系同源之白蛋白基因座或基因組基因座之非人的動物基因組或細胞。該基因組可來自或該細胞可為：真核細胞，該真核細胞包括，例如真菌細胞(例如酵母)、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、非人類之哺乳動物細胞和人類細胞。術語"動物"包括動物界之任何成員，包括，例如哺乳動物、魚類、爬行動物、兩棲動物、鳥類和蟲類。哺乳動物細胞可為，例如非人類之哺乳動物細胞、齧齒動物細胞、大鼠細胞、小鼠細胞或倉鼠細胞。其他非人類之哺乳動物包括，例如非人類之靈長類動物、猴子、猿、猩猩、貓、狗、兔子、馬、公牛、鹿、野牛、家畜(例如牛種群，諸如母牛、閹公牛，等；羊種群，諸如綿羊、山羊，等；和豬種群，諸如豬、公豬，等)。鳥類包括，例如雞、火雞、鴕鳥、鵝、鴨，等。亦包括家養動物和農業動物。術語"非人類"不包括人類。
該細胞亦可為任何未分化或分化狀態之類型。例如，細胞可為全能細胞、多能細胞(例如多能細胞或非人類多能細胞，諸如小鼠胚胎幹(ES)細胞或大鼠ES細胞)或非多能細胞。全能細胞包括可產生任何細胞類型之未分化細胞，而多能細胞包括有能力發展成一種以上之分化細胞類型的未分化細胞。該等多能和/或全能細胞可為，例如ES細胞或ES樣細胞，諸如誘導型多能幹(iPS)細胞。ES細胞包括源自胚胎之全能或多能細胞，當其被引入胚胎時能夠對發育中之胚胎的任何組織做出貢獻。ES細胞可源自胚泡之內部細胞團且能夠分化成該三種脊椎動物胚層(內胚層、外胚層和中胚層)中之任一者的細胞。
本文提供之細胞亦可為生殖細胞(例如精子或卵母細胞)。該細胞可為有絲分裂勝任細胞或有絲分裂去活性細胞、減數分裂勝任細胞或減數分裂去活性細胞。類似地，該細胞亦可為原代體細胞或為非原代體細胞之細胞。體細胞包括任何不是配子、生殖細胞、配子細胞或未分化之幹細胞的細胞。例如，該細胞可為肝細胞，諸如肝母細胞或肝細胞。
本文提供之合適的細胞亦包括原代細胞。原代細胞包括已直接從生物體、器官或組織分離出的細胞或細胞培養物。原代細胞包括既非經轉化的，亦非永生化之細胞。其包括先前未曾在組織培養物中傳代之從生物體、器官或組織取得的任何細胞或先前已在組織培養物中傳代，但無法無限期地在組織培養物中傳代的任何細胞。該等細胞可藉由常規技術分離且包括，例如肝細胞。
本文提供之其他合適的細胞包括永生化細胞。永生化細胞包括來自多細胞生物之細胞，這些細胞正常情況下不會無限增殖，但是由於突變或改變，其已逃避正常之細胞衰老，而可以繼續分裂。該等突變或改變可自然發生或被有意誘導。永生化細胞株之具體實例為HepG2人肝癌細胞株。許多永生化細胞之類型為眾所周知。永生化或原代細胞包括通常用於培養或表現重組基因或蛋白質之細胞。
本文提供之細胞亦包括單細胞階段胚胎(即，受精之卵母細胞或受精卵)。該等單細胞階段胚胎可來自任何遺傳背景(例如用於小鼠之BALB/C、C57BL/6、129或彼等之組合)、可為新鮮的或冷凍的且可源自天然育種或活體外授精。
本文提供之細胞可為正常、健康細胞，或可為患病或攜帶突變體之細胞。
包含如本文所描述之人化白蛋白基因座的非人的動物可藉由本文他處描述之方法製備。術語"動物"包括動物界之任何成員，包括，例如哺乳動物、魚類、爬行動物、兩棲動物、鳥類和蟲。於一具體之實例中，該非人的動物為非人類之哺乳動物。非人類之哺乳動物包括，例如非人類之靈長類動物、猴子、猿、猩猩、貓、狗、馬、公牛、鹿、野牛、綿羊、兔子、齧齒動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠)，以及家畜(例如牛種群，諸如母牛、閹公牛，等；羊種群，諸如綿羊和山羊，等；及豬種群，諸如豬和公豬，等)。鳥類包括，例如雞、火雞、鴕鳥、鵝、鴨，等。亦包括家養動物和農業動物。術語"非人類"不包括人類。較佳之非人的動物包括，例如齧齒動物，諸如小鼠和大鼠。
該非人的動物可來自任何遺傳背景。例如，合適之小鼠可來自129品種、C57BL/6品種、129和C57BL/6之混合品種、BALB/c品種或Swiss Webster品種。129品種之實例包括129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/Svlm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1和129T2。參見，例如Festing et al.(1999)Mammalian Genome 10:836(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。C57BL品種之實例包括C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/Kal_wN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。合適之小鼠亦可來自前述129品種和前述C57BL/6品種之混合品種(例如50%129和50%C57BL/6)。同樣地，合適之小鼠可來自前述129品種之混合品種或前述BL/6品種之混合品種(例如129S6 (129/SvEvTac)品種)。
類似地，大鼠可來自任何大鼠品種，包括，例如ACI大鼠品種、Dark Agouti(DA)大鼠品種、Wistar大鼠品種、LEA大鼠品種、Sprague Dawley(SD)大鼠品種或Fischer大鼠品種，諸如Fisher F344或Fisher F6。亦可從源自二或更多種上述品種之混合品種的品種獲得大鼠。例如，合適之大鼠可來自DA品種或ACI品種。ACI大鼠品種之特徵為具有黑色野鼠色、白色腹部和腳，以及RT1av1 單倍型。該等品種可從多種不同來源獲得，包括哈蘭實驗室(Harlan Laboratories)。Dark Agouti(DA)大鼠品種之特徵為具有野鼠色外套和RT1AV1 單倍型。該等大鼠可從多種不同來源獲得，包括查爾斯河及哈蘭實驗室。某些合適之大鼠可來自近親繁殖大鼠品種。參見，例如US 2014/0235933 (其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。
包含人化白蛋白基因座(例如同型合子人化白蛋白基因座)之非人的動物(例如小鼠或大鼠)可表現來自該人化白蛋白基因座之白蛋白，從而使血清白蛋白之量(例如血清人白蛋白之量)與對照組野生型非人的動物中之血清白蛋白的量相當。於一實例中，包含人化白蛋白基因座(例如同型合子之人化白蛋白基因座)之非人的動物之血清白蛋白量(例如血清人白蛋白量)可為對照組野生型非人的動物之血清白蛋白量的至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約100%。於另一實例中，包含人化白蛋白基因座(例如同型合子人化白蛋白基因座)之非人的動物可具有至少與對照組野生型非人的動物之血清白蛋白量一樣高的血清白蛋白量(例如血清人白蛋白之量)。於另一實例中，包含人化白蛋白基因座(例如同型合子人化白蛋白基因座)之非人的動物可具有高於對照組野生型非人的動物之血清白蛋白量的血清白蛋白量(例如血清人白蛋白量)。例如，包含人化白蛋白基因座(例如同型合子人化白蛋白基因座)之非人的動物可具有至少約1mg/mL、至少約2mg/mL、至少約3 mg/mL、至少約4 mg/mL、至少約5 mg/mL、至少約6 mg/mL、至少約7 mg/mL、至少約8 mg/mL、至少約9 mg/mL、至少約10 mg/mL、至少約11 mg/mL、至少約12 mg/mL、至少約13 mg/mL、至少約14 mg/mL或至少約15 mg/mL的血清白蛋白量(例如，血清人白蛋白量)。於更具體之實例中，包含人化白蛋白基因座(例如同型合子人化白蛋白基因座)之非人的動物可為小鼠且可具有至少約1 mg/ml、至少約2 mg/mL、至少約3 mg/mL、至少約4 mg/mL、至少約5 mg/mL、至少約6 mg/mL、至少約7 mg/mL、至少約8 mg/mL、至少約9 mg/mL、至少約10 mg/mL、至少約11 mg/mL、至少約12 mg/mL、至少約13 mg/mL、至少約14mg/mL或至少約15mg/mL之血清白蛋白的量(例如血清人白蛋白的量)。於一具體實例中，包含人化白蛋白基因座(例如同型合子人化白蛋白基因座)之非人的動物(例如小鼠)可具有約10mg/mL至約15 mg/mL之血清白蛋白量(例如血清人白蛋白量)。於上述任何實例中，由人化白蛋白基因座編碼之白蛋白可包含，例如人白蛋白信號肽。例如，於一實例中，該內源性白蛋白基因座之整個白蛋白編碼序列已被刪除並以對應之人白蛋白序列替代，或者該內源性白蛋白基因座中從起始密碼子至終止密碼子的區域已被刪除且以對應之人白蛋白序列替代之。 Ⅲ . 使用包含人化白蛋白基因座之非人的動物來評估人白蛋白靶向劑之活體內或離體功效的方法
提供各種不同之方法以使用包含如本文他處描述之人化白蛋白基因座之非人的動物來評估或優化人白蛋白靶向劑(例如治療性分子或複合物)之活體內或離體遞送或功效。因為該非人的動物包含人化白蛋白基因座，該非人的動物將更準確地反映人白蛋白靶向劑之功效。該等非人的動物對測試經設計以靶向人白蛋白基因的基因組編輯試劑特別有用，因為本文所揭示之非人的動物包含人化內源性白蛋白基因座，而非轉基因插入隨機之基因組基因座處的人白蛋白序列，且該人化內源性白蛋白基因座可包含來自編碼區和非編碼區二者的直系同源人基因組白蛋白序列，而非人工cDNA序列。A. 測試人白蛋白靶向劑在活體內或離體之功效的方法
提供多種不同方法以使用包含如本文他處所描述之人化白蛋白基因座之非人的動物來評估人白蛋白靶向劑之活體內遞送或功效。該等方法可包含：(a)將人白蛋白靶向劑引入非人的動物中(即，對該非人的動物投予人白蛋白靶向劑)；和(b)評估該人白蛋白靶向劑之活性。
該人白蛋白靶向劑可為靶向人白蛋白基因座(人白蛋白基因)、人白蛋白mRNA或人白蛋白之任何生物或化學試劑。人白蛋白靶向劑之實例揭示於本文他處且包括，例如基因組編輯劑。例如，該人白蛋白靶向劑可為白蛋白靶向核酸(例如CRISPR/Cas指導RNA、短髮夾RNA(shRNA)或小干擾RNA(siRNA))或編碼白蛋白靶向蛋白之核酸(例如Cas蛋白，諸如Cas9、ZFN或TALEN)。或者，人白蛋白靶向劑可為白蛋白靶向抗體或抗原結合蛋白，或靶向人白蛋白之任何其他大分子或小分子。於一實例中，該人白蛋白靶向劑為基因組編輯劑，諸如核酸酶劑和/或外源供體核酸(例如靶向載體)。於一特定之實例中，該基因組編輯劑可靶向人白蛋白基因之內含子1、內含子12或內含子13。例如，該基因組編輯劑可靶向人白蛋白基因之內含子1。
該等人白蛋白靶向劑可藉由如本文他處更詳細地揭示之任何遞送方法(例如AAV、LNP或HDD)投予及藉由任何投予途徑投予。遞送治療性複合物和分子之方式和投予途徑更詳細地揭示於本文他處。於特定之方法中，該試劑係經由AAV介導之遞送來遞送。例如，AAV8可用於靶向肝臟。於其他特定方法中，該試劑係藉由LNP介導之遞送來遞送。於其他特定方法中，該試劑係藉由流體動力遞送(HDD)來遞送。該劑量可為任何合適之劑量。例如，於其中該試劑(例如Cas9 mRNA和gRNA)係藉由LNP介導之遞送來遞送的某些方法中，該劑量可介於約0.01至約10 mg/kg之間、約0.01至約5 mg/kg之間、約0.01至約4 mg/kg之間、約0.01至約3 mg/kg之間、約0.01至約2 mg/kg之間、約0.01至約1 mg/kg之間、約0.1至約10 mg/kg之間、約0.1至約6 mg/kg之間；約0.1至約5 mg/kg之間、約0.1至約4 mg/kg之間、約0.1至約3 mg/kg之間、約0.1至約2 mg/kg之間、約0.1至約1 mg/kg之間、約0.3至約10 mg/kg之間、約0.3至約6 mg/kg之間；約0.3至約5 mg/kg之間、約0.3至約4 mg/kg之間、約0.3至約3 mg/kg之間、約0.3至約2 mg/kg之間、約0.3至約1 mg/kg之間、約0.1 mg/kg、約0.3 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg或約3 mg/kg。於具體之實例中，該劑量係介於約0.1至約6 mg/kg之間；約0.1至約3 mg/kg之間、或約0.1至約2 mg/kg之間。
用於評估人白蛋白靶向劑之活性的方法為眾所周知且提供於本文他處。活性之評估可在如本文他處所揭示之任何細胞類型、任何組織類型或任何器官類型中進行。於某些方法中，活性之評估係在肝細胞中進行。若該白蛋白靶向劑為基因組編輯試劑(例如核酸酶劑)，則該等方法可包含評估該人化白蛋白基因座之修飾。舉例而言，該評估可包含測量人化白蛋白基因座處之非同源端接合(NHEJ)活性。此可包含，例如測量該人化白蛋白基因座內之插入或缺失的頻率。例如，該評估可包含測定從非人的動物分離出之一或多個細胞中之人化白蛋白基因座的序列(例如下一代測序)。評估可包含從非人的動物分離出靶器官或組織(例如肝臟)並評估該靶器官或組織中之人化白蛋白基因座的修飾。評估亦可包含評估該靶器官或組織內之二或更多種不同細胞類型中之人化白蛋白基因座的修飾。類似地，評估可包含從非人的動物分離出非標靶器官或組織(例如二或更多種非靶器官或組織)並評估該非靶器官或組織中之人化白蛋白基因座的修飾。
該等方法亦可包含測量由人化白蛋白基因座產生之mRNA的表現水準，或測量由人化白蛋白基因座編碼之蛋白質的表現水準。例如，可測量特定細胞、組織或器官類型(例如肝臟)中之蛋白質量，或者可測量血清中之分泌量。用於評估白蛋白mRNA或從人化白蛋白基因座表現之蛋白質的方法提供於本文他處且為人所熟知。舉例而言，該BASESCOPETM RNA原位雜交(ISH)分析可用於，例如定量細胞特異編輯之轉錄物。
於某些方法中，該人白蛋白靶向劑包含外源供體核酸(例如靶向載體)。該等外源供體核酸可編碼非由野生型內源性白蛋白基因座編碼或表現之外源蛋白質(例如，可包含編碼外源蛋白質之插入核酸)。於一實例中，該外源蛋白質可為包含人白蛋白信號肽之異源蛋白質，該人白蛋白信號肽與非由野生型內源性白蛋白基因座編碼或表現之蛋白融合。於一實例中，該由外源供體核酸編碼之外源蛋白質一旦被整合入人化白蛋白基因座中，其可為包含人白蛋白信號肽之異源蛋白質，該人白蛋白信號肽與非由野生型內源性白蛋白基因座編碼或表現之蛋白質融合。於某些方法中，評估可以包含測量由外源供體核酸編碼之信使RNA的表現。評估亦可包含測量該外源蛋白質之表現。例如，可在非人的動物之肝臟中測量外源蛋白質之表現，或者可測量外源蛋白質之血清量。
於某些方法中，包含如本文他處描述之人化白蛋白基因座的非人的動物進一步包含非為該白蛋白基因座之去活化的(剔除的)內源基因，且可選擇地，該人白蛋白靶向劑包含編碼外源蛋白質之外源供體核酸(例如靶向載體)以替代該去活化之內源基因的功能。於一具體之實例中，該去活化之內源基因為F9 ， 該外源蛋白質為凝血因子IX(例如人凝血因子IX)。
於某些方法中，該人白蛋白靶向劑包含(1)經設計以靶向人白蛋白基因區之核酸酶劑和(2)外源供體核酸，其中該外源供體核酸經設計以靶向人白蛋白基因。該外源供體核酸可，例如編碼外源蛋白質，可選擇地，其中該由人化內源性白蛋白基因座編碼之蛋白質為包含與該外源蛋白質融合之人白蛋白信號肽的異源蛋白質，該人化內源性白蛋白基因座已被外源供體核酸靶向。
一種具體之實例為若該人白蛋白靶向劑為基因組編輯試劑(例如核酸酶劑)，則可評估該人化白蛋白基因座(例如在肝細胞中)之編輯百分比(例如，在PCR反應中從溶解之匯集細胞讀取的序列總數中觀察到的插入或缺失總數)。
上文提供之用於評估體內活性的各種方法亦可用於離體評估如本文他處描述之人白蛋白靶向劑的活性。
於某些方法中，該人白蛋白靶向劑為靶向人白蛋白基因之核酸酶劑，諸如CRISPR/Ca核酸酶劑。該等方法可包含，例如：(a)將經設計以裂解人白蛋白基因之核酸酶劑(例如Cas蛋白，諸如Cas9和經設計以靶向人白蛋白基因中之嚮導RNA靶序列的嚮導RNA)引入非人的動物中；和(b)評估該人化白蛋白基因座之修飾。
例如，在CRISPR/Cas核酸酶之情況下，當該嚮導RNA與Cas蛋白形成複合物並指導Cas蛋白針對人化白蛋白基因座，且該Cas/嚮導RNA複合物裂解嚮導RNA靶序列，觸發細胞修復時(例如，若不存在供體序列，則經由非同源端接合(NHEJ))，則將誘導人化白蛋白基因座之修飾。
可選擇地，可引入二或更多個嚮導RNA，各嚮導RNA經設計以靶向人白蛋白基因內之不同的嚮導RNA靶序列。例如可設計二個嚮導RNA以切除介於該二個嚮導RNA之靶序列之間的基因組序列。當第一嚮導RNA與Cas蛋白形成複合物並指導Cas蛋白針對人化白蛋白基因座，第二嚮導RNA與Cas蛋白形成複合物並指導Cas蛋白針對人化白蛋白基因座時，第一Cas/嚮導RNA複合物裂解第一嚮導RNA靶序列，第二Cas/嚮導RNA複合物裂解第二嚮導RNA靶序列，導致該中間插入序列被切除，因而將誘導人化白蛋白基因座的修飾。
另外，或者，亦將能夠與人白蛋白基因重組並修飾人白蛋白基因之外源供體核酸(例如靶向載體)引入非人的動物中。可選擇地，可將核酸酶劑或Cas蛋白束縛至如本文他處描述之外源供體核酸上。例如，當該嚮導RNA與Cas蛋白形成複合物並指導Cas蛋白針對人化白蛋白基因座時，該Cas/嚮導RNA複合物裂解該嚮導RNA靶序列，且該人化白蛋白基因座與外源供體核酸重組以修飾該人化白蛋白基因座。該外源供體核酸可與人化白蛋白基因座重組，例如經由同源引導修復(HDR)或經由NHEJ介導之插入。可使用任何類型之外源供體核酸，其實例提供於本文他處。
於某些方法中，該人白蛋白靶向劑包含外源供體核酸(例如靶向載體)。該等外源供體核酸可編碼非由野生型內源性白蛋白基因座編碼或表現之外源蛋白質(例如，可包含編碼外源蛋白質之插入核酸)。於一實例中，該外源蛋白質可為包含人白蛋白信號肽之異源蛋白質，該人白蛋白信號肽與非由野生型內源性白蛋白基因座編碼或表現之蛋白質融合。例如，該外源供體核酸可為包含剪接受體之無啟動子卡匣，且該外源供體核酸可靶向人白蛋白之第一內含子。B. 優化人白蛋白靶向劑之活體內或離體遞送或功效的方法
提供用於優化對細胞或非人的動物遞送人白蛋白靶向劑，或優化人白蛋白靶向劑之活體內活性或功效的各種方法。該等方法可包含，例如：(a)在包含人化白蛋白基因座之第一非人的動物或第一細胞中第一次實施如上述之測試人白蛋白靶向劑的功效之方法；(b)改變可變量並在第二非人的動物(即，相同物種)或第二細胞中第二次實施該具有該改變之可變量的方法，該第二非人的動物(即，相同物種)或第二細胞包含人化白蛋白基因座；和(c)將步驟(a)中之該人白蛋白靶向劑的活性與步驟(b)中之該人白蛋白靶向劑的活性相比較，並選擇導致較高之活性的方法。
測量人白蛋白靶向劑之遞送、功效或活性的方法揭示於本文他處。例如，該等方法可包含測量該人化白蛋白基因座之修飾。該人化白蛋白基因座之更有效的修飾可根據該非人的動物或細胞內所需的效果而指不同的事項。例如，人化白蛋白基因座之更有效的修飾可指下列之一或多者或全部：較高之修飾水準、較高之精確度、較高之一致性或較高之特異性。人化白蛋白基因座之修飾水準較高(即，較高之功效)係指在特定之靶細胞類型內、特定之靶組織內或特定之靶器官(例如肝臟)內有較高百分比之細胞被靶向。較高之精確度係指該人化白蛋白基因座之修飾較精確(例如較高百分比之靶細胞具有相同修飾或具有所需修飾，而無多餘之非預期的插入和缺失(例如NHEJ indel))。較高之一致性係指若有一種以上之細胞、組織或器官類型被靶向(例如肝臟內有許多細胞類型之修飾)，在該被靶向之不同類型的細胞、組織或器官之中，該人化白蛋白基因座之修飾較一致。若特定器官被靶向，則較高之一致性亦可指該器官(例如，肝臟)內之所有位置處的修飾較一致。較高之特異性可指相關於該被靶向之基因組基因座之較高的特異性、相關於該被靶向之細胞類型之較高的特異性、相關於該被靶向之組織之較高的特異性、或相關於該被靶向之器官之較高的特異性。例如，增加之基因組基因座特異性係指脫靶基因組基因座之修飾較少(例如，除了靶基因組基因座之修飾外，在非預期之脫靶基因組基因座具有修飾之靶細胞的百分比較低)。同樣地，增加之細胞類型、組織或器官類型特異性係指若靶向特定之細胞類型、組織類型或器官類型，則脫靶細胞類型、組織類型或器官類型之修飾較少(例如，當靶向特定器官(例如肝臟)時，非預期標靶之器官或組織中的細胞修飾較少)。
該改變之可變量可為任何參數。舉例而言，該改變之可變量可為將人白蛋白靶向劑引入細胞或非人的動物中之包裝或遞送方法。遞送方法之實例，諸如LNP、HDD和AAV揭示於本文他處。例如，該改變之可變量可為AAV血清型。類似地，投予可包含由LNP介導之遞送，而該改變之可變量可為LNP配製劑。另一實例為該改變之可變量可為用於將人白蛋白靶向劑引入細胞或非人的動物之投予途徑。投予途徑之實例，諸如靜脈內、玻璃體內、器質內和鼻內滴注揭示於本文他處。
另一實例為該改變之可變量可為引入之人白蛋白靶向劑的濃度或量。另一實例為該改變之可變量可為一種引入之人白蛋白靶向劑(例如嚮導RNA、Cas蛋白、或外源供體核酸)的濃度或量相對於另一種引入之人白蛋白靶向劑的濃度或量。
另一實例為該改變之可變量可為引入人白蛋白靶向劑之時點相對於評估該試劑之活性或功效的時點。另一實例為該改變之可變量可為引入該人白蛋白靶向劑之次數或頻率。另一實例為該改變之可變量可為引入一種人白蛋白靶向劑(例如嚮導RNA、Cas蛋白或外源供體核酸)的引入時點相對於引入另一人白蛋白靶向劑(例如嚮導RNA、Cas蛋白、或外源供體核酸)之引入時點。
另一實例為該改變之可變量可為引入之人白蛋白靶向劑的形式。例如，嚮導RNA可以DNA之形式或以RNA之形式引入。Cas蛋白(例如Cas9)可以DNA之形式、或以RNA之形式、或以蛋白質之形式(例如與嚮導RNA複合)引入。該外源供體核酸可為DNA、RNA、單股、雙股、線性、環形，等。類似地，各組分可包含用於穩定性、降低脫靶效應、促進遞送，等之各種不同之修飾的組合。
另一實例為該改變之可變量可為引入之人白蛋白靶向劑。例如，若該人白蛋白靶向劑包含嚮導RNA，則該改變之可變量可為引入具有不同序列之不同嚮導RNA(例如，靶向不同嚮導RNA靶序列)。同樣地，若該人白蛋白靶向劑包含Cas蛋白，則該改變之可變量可為引入不同Cas蛋白(例如引入具有不同序列之不同Cas蛋白，或具有不同序列(例如密碼子優化的)，但編碼相同Cas蛋白胺基酸序列之核酸。同樣地，若該人白蛋白靶向劑包含外源供體核酸，則該改變之可變量可為引入具有不同序列之不同外源供體核酸(例如不同的插入核酸或不同的同源臂(例如較長或較短之同源臂或靶向人白蛋白基因之不同區域的同源臂)。
於一具體之實例中，該人白蛋白靶向劑包含Cas蛋白和設計成靶向人白蛋白基因中之嚮導RNA靶序列的嚮導RNA。於該等方法中，該改變之可變量可為嚮導RNA序列和/或嚮導RNA靶序列。於某些該等方法中，該Cas蛋白和嚮導RNA可各自以RNA之形式投予，且該改變之可變量可為Cas mRNA對嚮導RNA之比率(例如在LNP配製劑中)。於某些該等方法中，該改變之可變量可為嚮導RNA修飾(例如，將具有修飾之嚮導RNA與無該修飾之嚮導RNA相比較)。C. 人白蛋白靶向劑
人白蛋白靶向劑可為靶向人白蛋白基因、人白蛋白mRNA或人白蛋白之任何試劑。例如，其可為基因組編輯試劑(諸如裂解人白蛋白基因內之靶序列的核酸酶劑和/或與人白蛋白基因重組之外源供體序列)、其可為靶向人白蛋白mRNA之反義寡核苷酸、其可為靶向人白蛋白之表位的抗原結合蛋白、或者其可為靶向人白蛋白之小分子。本文所揭示之方法中的人白蛋白靶向劑可為已知之人白蛋白靶向劑、可為推定之白蛋白靶向劑(例如設計成靶向人白蛋白之候選試劑)或者可為經篩選之用於人白蛋白靶向活性的試劑。 (1) 靶向人白蛋白基因之核酸酶劑
人白蛋白靶向劑可為基因組編輯試劑，諸如裂解人白蛋白基因內之靶序列的核酸酶劑。核酸酶靶序列包括DNA序列，該DNA序列之切口或雙股斷裂係由核酸酶劑所誘導。該核酸酶劑之靶序列對細胞而言可為內源的(或天然的)，或者該靶序列對細胞而言可為外源的。對細胞而言為外源之靶序列並非天然存在於該細胞之基因組中。該靶序列對於欲定位在靶基因座處之所欲的多核苷酸而言亦可為外源性。在某些情況下，該靶序列僅出現在宿主細胞之基因組中一次。於特定之實例中，該核酸酶靶序列可在人白蛋白基因之內含子1、內含子12或內含子13中。例如，該核酸酶靶序列可在人白蛋白基因之內含子1中。
該靶序列之長度可有各種變化且包括，例如對鋅指核酸酶(ZFN)對而言靶序列為約30至36bp(即，每一ZFN為約15至18bp)、對轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)而言為約36 bp、或者對CRISPR/Cas9嚮導RNA而言為約20 bp。
在所需之靶序列上誘導切口或雙股斷裂的任何核酸酶劑均可用於本文所揭示之方法和組成物中。天然存在或天然之核酸酶劑均可使用，只要該核酸酶劑在所需之靶序列中誘導切口或雙股斷裂即可。或者，可使用經修飾或經工程處理之核酸酶劑。"經工程處理之核酸酶劑"包括從其天然形式進行工程處理(修飾或衍生)，以特異識別所需之靶序列並在其中誘導切口或雙股斷裂的核酸酶。因此，經工程處理之核酸酶劑可源自天然的、天然產生之核酸酶劑，或者其可經人工創造或合成。例如，該經工程處理之核酸酶可在靶序列中誘導切口或雙股斷裂，其中該靶序列並非可被天然(非經工程處理或未經修飾的)核酸酶劑識別之序列。核酸酶劑之修飾可少至為蛋白質裂解劑中的一個胺基酸或為核酸裂解劑中的一個核苷酸。本文中，在靶序列或其他DNA中製造切口或雙股斷裂可稱為"切割"或"裂解"該靶序列或其他DNA。
亦提供該示例性靶序列之活性變體和片段。該等活性變體可與指定靶序列具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多之序列同一性，其中該活性變體保留生物活性，因此能夠被核酸酶劑以序列特異性方式識別和裂解。用於測量藉由核酸酶劑對靶序列進行之雙股斷裂的分析為眾所周知。參見，例如Frendewey et al.(2010)Methods in Enzymology 476:295-307(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。
核酸酶劑之靶序列可位於該白蛋白基因座內或附近之任何位置。該靶序列可位於該白蛋白基因之編碼區內或在影響該基因之表現的調節區內。該核酸酶劑之靶序列可位於內含子、外顯子、啟動子、增強子、調節區或任何非蛋白質編碼區中。
一種核酸酶劑類型為轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)。TAL效應核酸酶為一種序列特異性核酸酶類別，其可用於在原核或真核生物基因組中之特定靶序列處產生雙股斷裂。TAL效應核酸酶係藉由將天然或經工程處理之轉錄活化因子樣(TAL)效應子或其功能部分與核酸內切酶(諸如，例如FokI)之催化結構域融合來創建。該獨特，模塊化之TAL效應子DNA結合結構域可用於設計可能具有任何指定之DNA識別特異性的蛋白質。因此，該TAL效應核酸酶之DNA結合結構域可經工程處理以識別特定之DNA靶位點，且因比用於在所需之靶序列處製造雙股斷裂。參見WO 2010/079430；Morbitzer et al.(2010)PNAS 10.1073/pnas.1013133107；Scholze & Boch(2010)Virulence 1:428-432；Christian et al.Genetics (2010)186:757-761；Li et al.(2010)Nuc. Acids Res. (2010)doi:10.1093/nar/gkq704；和Miller et al.(2011)Nature Biotechnology 29:143-148(各篇之全文以引用方式併入本文)。
合適之TAL核酸酶的實例及製備合適之TAL核酸酶的方法揭示於，例如US 2011/0239315 A1、US 2011/0269234 A1、US 2011/0145940 A1、US 2003/0232410 A1、US 2005/0208489 A1、US 2005/0026157 A1、US 2005/0064474 A1、US 2006/0188987 A1和US 2006/0063231 A1(各篇之全文以引用方式併入本文)中。於各種不同之實施態樣中，TAL效亞核酸酶經工程處理以在，例如所欲之基因座或所欲之基因組基因座中的靶核酸序列中或附近切割，其中該靶核酸序列係在或靠近將藉由靶向載體修飾之序列處。適合與本文提供之各種方法和組成物一起使用的TAL核酸酶包括那些經特異設計以在或靠近將藉由如本文所描述之靶向載體修飾之靶核酸序列處或附近結合的TAL核酸酶。
於某些TALEN中，每一TALEN單體包含33至35個TAL重複序列，該重複序列經由二個高變殘基識別單一鹼基對。於某些TALEN中，該核酸酶劑為包含基於TAL重複序列之DNA結合結構域的嵌合型蛋白，該基於TAL重複序列之DNA結合結構域係可操作地連接至獨立核酸酶(諸如FokI核酸內切酶)。例如，該核酸酶劑可包含第一基於TAL重複序列之DNA結合結構域和第二基於TAL重複序列之DNA結合結構域，其中該第一和第二基於TAL重複序列之DNA結合結構域各自可操作地連接至FokI核酸酶，其中該第一和第二基於TAL重複序列之DNA結合結構域識別二個毗鄰之靶DNA序列，該靶DNA序列的每一股被具有不同長度(12至20bp)之間隔序列分開，且其中該FokI核酸酶亞單位二聚化以創建活性核酸酶，該活性核酸酶在靶序列處製造雙股斷裂。
本文所揭示之各種方法和組成物中所使用之核酸酶劑可進一步包含鋅指核酸酶(ZFN)。於某些ZFN中，該ZFN的每個單體包含3或更多個基於鋅指之DNA結合結構域，其中每個基於鋅指之DNA結合結構域與3bp之亞位點結合。於其他ZFN中，該ZFN為嵌合型蛋白，該嵌合型蛋白包含可操作地連接至獨立核酸酶(諸如FokI核酸內切酶)之基於鋅指的DNA結合結構域。例如，該核酸酶劑可包含第一ZFN和第二ZFN，其中該第一ZFN和第二ZFN各自可操作地連接至FokI核酸酶亞單位，其中該第一ZFN和第二ZFN識別該靶DNA序列之每一股中的二個毗鄰之靶DNA序列，該靶DNA序列的每一股係藉由5至7bp之間隔子分開且其中該FokI核酸酶亞單位二聚化以創建活性核酸酶，該活性核酸酶在靶序列處製造雙股斷裂。參見，例如US20060246567；US20080182332；US20020081614；US20030021776；WO/2002/057308A2；US20130123484；US20100291048；WO/2011/017293A2；和Gaj et al.(2013)Trends in Biotechnology , 31(7):397-405(各篇以引用方式併入本文)。
另一種類型之核酸酶劑為經工程處理之巨核酸酶。根據保留之序列基序，巨核酸酶已被分為四個家族類別，這些家族為LAGLIDADG、GIY-YIG、H-N-H和His-Cys框家族。這些基序參與金屬離子之配位和磷酸二酯鍵之水解。巨核酸酶以其長的靶序列及容許其DNA受質中某些序列多態性而著稱。巨核酸酶結構域、結構和功能為已知的，參見，例如Guhan and Muniyappa(2003)Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248；Lucas et al.,(2001)Nucleic Acids Res 29:960-9；Jurica and Stoddard,(1999)Cell Mol Life Sci 55:1304-26；Stoddard,(2006)Q Rev Biophys 38:49-95；和Moure et al.,(2002)Nat Struct Biol 9:764。於一些實例中，使用天然存在之變體和/或經工程處理衍生之巨核酸酶。用於修飾動力學、輔因子交互作用、表現、最佳條件和/或靶序列特異性及篩選活性的方法為已知方法。參見，例如Epinat et al.,(2003)Nucleic Acids Res 31:2952-62；Chevalier et al.,(2002)Mol Cell 10:895-905；Gimble et al.,(2003)Mol Biol 334:993-1008；Seligman et al.,(2002)Nucleic Acids Res 30:3870-9；Sussman et al.,(2004)J Mol Biol 342:31-41；Rosen et al.,(2006)Nucleic Acids Res 34:4791-800；Chames et al. ,(2005)Nucleic Acids Res 33:e178；Smith et al.,(2006)Nucleic Acids Res 34:e149；Gruen et al.,(2002)Nucleic Acids Res 30:e29；Chen and Zhao,(2005)Nucleic Acids Res 33:e154；WO2005105989；WO2003078619；WO2006097854；WO2006097853；WO2006097784；和WO2004031346(各篇之全文以引用方式併入本文)。
任何巨核酸酶皆可使用，包括，例如I-SceI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SceVI、I-SceVII、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-CreI、I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-TliI、I-PpoI、PI-PspI、F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CsmI、I-CvuI、I-CvuAIP、I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HsNIP、I-LlaI、I-MsoI、I-NaaI、I-NanI、I-NcIIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PorI、I-PorIIP、I-PbpIP、I-SpBetaIP、I-ScaI、I-SexIP、I-SneIP、I-SpomI、I-SpomCP、I-SpomIP、I-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp6803I、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiSTe3bP、I-TdeIP、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-UarAP、I-UarHGPAIP、I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-MtuI、PI-MtuHIP PI-MtuHIIP、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-Rma43812IP、PI-SpBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI、PI-TliII或其任何活性變體或片段。
巨核酸酶可識別，例如具有12至40個鹼基對之雙股DNA序列。於某些情況下，巨核酸酶識別基因組中一個完全匹配之靶序列。
某些巨核酸酶為歸巢核酸酶。一種歸巢核酸酶類型為歸巢核酸酶之LAGLIDADG家族，包括，例如I-SceI、I-CreI和I-Dmol。
核酸酶劑可進一步包含如下文中更詳細地描述之CRISPR/Cas系統。
亦提供核酸酶劑之活性變體和片段(即，經工程處理之核酸酶劑)。該等活性變體可包含與天然核酸酶具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高之序列同一性，其中該活性變體保留在所需之靶序列切割的能力，並因此保留切口或雙股斷裂誘導型活性。例如，本文所描述之任何核酸酶均可從天然核酸內切酶序列修飾而來並設計成識別並在靶序列處誘導切口或雙股斷裂，該靶序列並未被天然核酸酶劑識別。因此，某些經工程處理之核酸酶具有在靶序列處誘導切口或雙股斷裂之特異性，該靶序列與該對應之天然核酸酶劑靶序列不同的。用於切口或雙股斷裂誘導活性之分析為已知的，且通常係測量該核酸內切酶對含有該靶序列之DNA受質的總體活性和特異性。
核酸酶劑可藉由任何已知方式被引入細胞或非人的動物中。可將編碼該核酸酶劑之多肽直接引入細胞或非人的動物中。或者，可將編碼該核酸酶劑之多核苷酸引入細胞或非人的動物中。當引入編碼該核酸酶劑之多核苷酸時，該核酸酶可在細胞內瞬時、條件式或組成性地表現。編碼該核酸酶劑之多核苷酸可包含在表現卡匣中並與條件式啟動子、誘導型啟動子、組成性啟動子或組織特異性啟動子可操作地連接。啟動子之實例進一步詳細討論於本文他處。或者，該核酸酶劑可以編碼該核酸酶劑之mRNA形式引入細胞中。
編碼核酸酶劑之多核苷酸可穩定地被整合在細胞之基因組中並可操作地連接細胞中具有活性之啟動子。或者，編碼核酸酶劑之多核苷酸可在靶向載體中。
當核酸酶劑係透過引入編碼該核酸酶劑之多核苷酸來提供給細胞時，與編碼該核酸酶劑之天然存在的多核苷酸序列相比較，該等編碼核酸酶劑之多核苷酸可經修飾以取代在所感興趣之細胞中具有較高之使用頻率的密碼子。例如，與天然存在之多核苷酸序列相比較，該編碼核酸酶劑之多核苷酸可經修飾以取代在指定之所感興趣的真核細胞中具有較高之使用頻率的密碼子，該感興趣之真核細胞包括人類細胞、非人的細胞、哺乳動物細胞、齧齒動物細胞、小鼠細胞、大鼠細胞或任何其他所感興趣之宿主細胞。 (2) 靶向人白蛋白基因之 CRISPR/Cas 系統
靶向人白蛋白基因之簇狀規則穿插的短回文重複序列(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats)(CRISPR)/CRISPR相關(Cas)系統可為一種特定類型之人白蛋白靶向劑。CRISPR/Cas系統包括轉錄子和涉及Cas基因之表現或指導其活性的其他元素。CRISPR/Cas系統可為，例如第I型、第II型、第III型系統，或第V型系統(例如VA亞型或VB亞型)。用於本文所揭示之組成物和方法中之CRISPR/Cas系統可為非天然存在的。"非天然存在的"系統包括表明涉及人工的任何事物，諸如該系統之一或多種組分從其天然存在之狀態改變或突變、至少實質上不含至少一種在自然界中與其天然聯結的其他組分，或與至少一種在自然界中並不與其天然聯結的其他組分相聯結。例如，某些CRISPR/Cas系統採用非天然存在之CRISPR複合物(該CRISPR複合物包含gRNA和Cas蛋白，而gRNA和Cas蛋白二者在自然情況下不會同時存在)、採用非天然存在之Cas蛋白，或採用非天然存在之gRNA。
Cas 蛋白和編碼 Cas 蛋白之多核苷酸 。 Cas蛋白一般包含至少一個RNA識別或結合結構域，該RNA識別或結合結構域可與嚮導RNA(gRNA)交互作用。Cas蛋白亦可包含核酸酶結構域(例如DNase或RNase結構域)、DNA結合結構域、解旋酶結構域、蛋白質-蛋白質交互作用結構域、二聚體化結構域及其他結構域。某些該等結構域(例如DNase結構域)可來自天然Cas蛋白。可加入其他該等結構域以製備經修飾之Cas蛋白。核酸酶結構域具有用於裂解核酸之催化活性，裂解核酸包括核酸分子之共價鍵斷裂。裂解可產生鈍端或交錯末端，且其可為單股或雙股裂解。例如，野生型Cas9蛋白通常會產生鈍端裂解產物。或者，野生型Cpf1蛋白(例如FnCpf1)可產生具有5-核苷酸5'突出端之裂解產物，該裂解係發生在非被靶向股上之PAM序列的第18個鹼基對之後及被靶向股上的第23個鹼基對之後。Cas蛋白可具有完全裂解活性以在靶基因組基因座處形成雙股斷裂(例如具有鈍端之雙股斷裂)，或者其可為在靶基因組基因座處形成單股斷裂的切口酶。
Cas蛋白之實例包括Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8al、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9(Csnl或Csxl2)、Casl0、Casl0d、CasF、CasG、CasH、Csyl、Csy2、Csy3、Csel(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csxl0、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4和Cul966，及其同源物或經修飾之形式。
一種示例性Cas蛋白為Cas9蛋白或源自Cas9蛋白之蛋白質。Cas蛋白係來自第II型CRISPR/Cas系統且通常與保守架構分享四個關鍵基序。基序1、2和4為RuvC樣基序，而基序3為HNH基序。示例性Cas9蛋白係來自下列群組：化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、鏈球菌種(Streptococcus sp.)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、達氏擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋鏈黴菌(Streptomyces pristinaespiralis)、綠色產色鏈黴菌(Streptomyces viridochromogenes)、玫瑰鏈孢囊菌(Streptosporangium roseum)、酸熱脂環酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈狀芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides)、還原硒酸鹽芽孢桿菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亞微小桿菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、海洋微顫菌(Microscilla marina)、伯克氏菌(Burkholderiales bacterium)、食萘極單胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、極單胞菌種(Polaromonas sp.)、瓦氏鱷球藻(Crocosphaera watsonii)、藍桿藻屬(Cyanothece sp.)、銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻屬(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋鹽桿菌(Acetohalobium arabaticum)、丹氏制氨菌(Ammonifex degensii)、熱角軍纖維素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、金礦菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈爾德菌(Finegoldia magna)、嗜熱鹽鹼厭氧菌(Natranaerobius thermophilus)、丙酸互營細菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜溫嗜酸硫桿菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、紫色硫細菌(Allochromatium vinosum)、海洋桿菌種(Marinobacter sp.)、嗜鹽亞硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亞硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、遊海假交替單胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、纖線桿菌(Ktedonobacter racemifer)、調查甲烷鹽菌(Methanohalobium evestigatum)、多變魚腥藻(Anabaena variabilis)、泡沬節球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻(Nostoc sp.)、極大節螺藻(Arthrospira maxima)、純頂節螺藻(Arthrospira platensis)、節螺藻(Arthrospira sp.)、鞘絲藻(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、顫藻(Oscillatoria sp.)、運動石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲棲熱腔菌(Thermosipho africanus)、深海單細胞藍細菌(Acaryochloris marina)、腦膜炎雙(Neisseria meningitis)或空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)。Cas9家族成員之另外的實例描述於WO 2014/131833中(其全文以引用方式併入本文)。來自化膿性鏈球菌(S.pyogenes)之Cas9(SpCas9)(指定SwissProt登錄號為Q99ZW2)為示例性Cas9蛋白。來自金黃色葡萄球菌之Cas9(SaCas9)(指定UniProt登錄號為J7RUA5)為另一示例性Cas9蛋白。來自空腸彎曲菌之Cas9蛋白(CjCas9)(指定UniProt登錄號為Q0P897)為另一示例性Cas9蛋白。參見，例如Kim et al.(2017)Nat. Comm. 8:14500(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。SaCas9較SpCas9小，而CjCas9小於SaCas9和SpCas9二者。示例性Cas9蛋白序列可包含SEQ ID NO：38、實質上由SEQ ID NO：38所組成或由SEQ ID NO：38所組成。編碼Cas9蛋白之示例性DNA可包含SEQ ID NO：39、實質上由SEQ ID NO：39所組成或由SEQ ID NO：39所組成。
Cas蛋白之另一實例為Cpf1(來自普雷沃氏菌(Prevotella )和法蘭西斯氏菌1(Francisella 1)之CRISPR)蛋白質。Cpf1為含有與Cas9之對應結構域同源之RuvC樣核酸酶結構域連同Cas9之特徵性精胺酸富集簇之對應部分的大蛋白質(約1300個胺基酸)。然而，Cpf1缺少存在於Cas9蛋白中之HNH核酸酶結構域，而與其中含有包括HNH結構域之長插入子的Cas9相反，Cpf1序列中之RuvC樣結構域為毗連的。參見，例如Zetsche et al.(2015)Cell 163(3):759-771(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。示例性Cpf1蛋白係來自土拉法蘭西斯氏菌1(Francisella tularensis 1 )、新兇手土拉法蘭西斯氏菌亞種(Francisella tularensis subsp. novicida )、歐本普雷沃氏菌(Prevotella albensis )、毛螺菌MC2017 1(Lachnospiraceae bacterium MC2017 1 )、變形支丁酸桿菌(Butyrivibrio proteoclasticu s )、百日咳桿菌屬細菌GW2011_GWA2_33_10 (Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA2_33_10 )、帕庫氏菌GW2011_GWC2_44_17 (Parcubacteria bacterium GW2011_GWC2_44_17 )、斯氏菌屬SCADC(Smithella sp. SCADC )、酸性胺基球菌 BV3L6 (Acidaminococcus sp. BV3L6 )、毛螺菌MA2020(Lachnospiraceae bacterium MA2020 )、Candidatus Methanoplasma termitum 、挑剔真桿菌(Eubacterium eligens )、牛莫拉氏菌237 (Moraxella bovoculi 237 )、稻田鉤端螺旋體(Leptospira inadai )、毛螺菌ND2006(Lachnospiraceae bacterium ND2006 )、狗口腔卟啉單胞菌3(Porphyromonas crevioricanis 3 )、解糖腖普雷沃氏菌(Prevotella disiens )和獼猴卟啉單胞菌(Porphyromonas macacae )。來自新法蘭西斯氏菌U112之Cpf1(FnCpf1；指定UniProt登錄號A0Q7Q2)為示例性Cpf1蛋白。
Cas蛋白可為野生型蛋白(即，天然存在之蛋白)、經修飾之Cas蛋白(即，Cas蛋白變體)或野生型或經修飾之Cas蛋白的片段。Cas蛋白相關於野生型或經修飾之Cas蛋白的催化活性而言亦可為活性變體或片段。關於催化活性方面之活性變體或片段可與野生型或經修飾之Cas蛋白或者其一部分具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高之序列同一性，其中該活性變體保留在所需之裂解位點處切割的能力，從而保留切口誘導活性或雙股斷裂誘導活性。用於切口誘導活性或雙股斷裂誘導活性之分析為已知的且通常係測量Cas蛋白對含有該裂解位點之DNA受質的總體活性和特異性。
可修飾Cas蛋白以增加或降低下列群組之一或多者：核酸結合親和力、核酸結合特異性和酶催化活性。亦可修飾Cas蛋白以改變該蛋白質之任何其他活性或性能，諸如穩定性。例如，Cas蛋白之一或多個核酸酶結構域可經修飾、刪除或去活化，或者可將Cas蛋白截短以去除對該蛋白質之功能而言並非必要的結構域或優化(例如增強或降低)Cas蛋白之活性或性能。
一種經修飾之Cas蛋白的實例為經修飾之SpCas9-HF1蛋白，其為帶有變化之化膿鏈球菌Cas9的高保真變異體(N497A/R661A/Q695A/Q926A)，其經過設計以減少非特異性DNA接觸。參見，例如Kleinstiver et al. (2016)Nature 529(7587):490-495(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。經修飾之Cas蛋白的另一實例為經修飾之eSpCas9變體(K848A/K1003A/R1060A)，其經過設計以減少脫靶效應。參見，例如Slaymaker et al.( 2016)Science 351(6268):84-88(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。其他SpCas9變體包括K855A和K810A/K1003A/R1060A。
Cas蛋白可包含至少一個核酸酶結構域，諸如DNase結構域。例如，野生型Cpf1蛋白通常包含可裂解靶DNA之二股的RuvC樣結構域，可能為二聚體構型。Cas蛋白亦可包含至少二個核酸酶結構域，諸如DNase結構域。例如，野生型Cas9蛋白通常包含RuvC樣核酸酶結構域和HNH樣核酸酶結構域。該RuvC結構域和HNH結構域可各自切割雙股DNA的不同股，從而在DNA中產生雙股斷裂。參見，例如Jinek et al.(2012)Science 337:816-821(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。
可將一或多個或全部之核酸酶結構域刪除或突變，從而使其不再有功能或具有降低之核酸酶活性。例如，若Cas9蛋白中之核酸酶結構域之一被刪除或突變，則所產生之Cas9蛋白可稱為切口酶且可在雙股DNA內產生單股斷裂，而非雙股斷裂(即，其可裂解互補股或非互補股，但無法同時裂解二者)。若該二個核酸酶結構域均缺失或突變，則所產生之Cas蛋白(例如Cas9)裂解雙股DNA之二股的能力會降低(例如無核酸酶或無核酸酶活性的Cas蛋白，或催化方式失去活性之Cas蛋白(dCas))。一種將Cas9轉變為切口酶之突變的實例為來自化膿性鏈球菌之Cas9的RuvC結構域中之D10A(Cas9之位置10處天門冬胺酸改變成丙胺酸)突變。同樣地，來自化膿性鏈球菌之Cas9之HNH結構域中的H939A(胺基酸位置839處之組胺酸改變成丙胺酸)、H840A(胺基酸位置840處之組胺酸改變成丙胺酸)或N863A(胺基酸位置N863之天門冬醯胺改變成丙胺酸)可將Cas9轉變為切口酶。將Cas9轉變為切口酶之其他突變實例包括來自嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)之Cas9的對應突變。參見，例如Sapranauskas et al.(2011)Nucleic Acids Research 39:9275-9282和WO 2013/141680 (各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。該等突變可使用，諸如定點誘變、PCR介導之誘變或全基因合成之方法來生成。其他創建切口酶之突變的實例可在，例如W0/2013/176772和W0/2013/142578中找到(各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。若Cas蛋白中之全部核酸酶結構域均缺失或突變(例如Cas9蛋白中的二個核酸酶結構域均缺失或突變)，則所產生之Cas蛋白(例如Cas9)裂解雙股DNA之二條股的能力將降低(例如無核酸酶或核酸酶無活性的Cas蛋白)。一種具體實例為D10A/H840A化膿性鏈球菌Cas9雙突變體或當與化膿性鏈球菌Cas9為最佳比對時，來自另一物種之Cas9中的對應雙突變體。另一具體實例為D10A/N863A化膿性鏈球菌Cas9雙突變體或當與化膿性鏈球菌Cas9為最佳比對時，來自另一物種之Cas9中的對應雙突變體。
已知金黃色葡萄球菌Cas9蛋白之催化性結構域中之去活化突變的實例。例如，金黃色葡萄球菌Cas9酶(SaCas9)可包含位置N580處之取代(例如N580A取代)和位置D10處之取代(例如D10A取代)以產生核酸酶無活性之Cas蛋白。參見，例如WO 2016/106236(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。
亦已知Cpf1蛋白之催化性結構域中的去活化突變之實例。關於來自新兇手法蘭西斯氏菌U112(FnCpf1)、酸性胺基球菌種BV3L6(AsCpf1)、毛螺菌ND2006(LbCpf1)和牛莫拉氏菌237(MbCpf1 Cpf1)的Cpf1蛋白，該等突變可包括在AsCpf1之位置908、993或1263、或Cpf1直系同源物中之對應位置、或LbCpf1之位置832、925、947或1180、或Cpf1直系同源物中之對應位置處的突變。該等突變可包括，例如下列突變之一或多者：AsCpf1之突變D908A、E993A和D1263A、或Cpf1直系同源物中之對應突變、或LbCpf1之突變D832A、E925A、D947A和D1180A或Cpf1直系同源物中之對應突變。參見，例如US 2016/0208243(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。
Cas蛋白(例如核酸酶活性之Cas蛋白或核酸酶無活性之Cas蛋白)亦可以融合蛋白之形式可操作地連接至異源多肽。例如，Cas蛋白可與裂解結構域或表觀基因修飾結構域融合。參見WO 2014/089290(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。Cas蛋白亦可與提供增加或降低之穩定性的異源多肽融合。該融合之結構域或異源多肽可位於該Cas蛋白內之N端、C端或內部。
舉例而言，可將Cas蛋白與提供次細胞定位之一或多種異源多肽融合。該等異源多肽可包括，例如一或多個核定位信號(NLS)，諸如用於靶向細胞核之單分型(monopartite)SV40 NLS和/或雙分型α-內輸蛋白(importin) NLS、用於靶向線粒體之線粒體定位信號、ER保留信號，等。參見，例如Lange et al.( 2007)J. Biol. Chem. 282:5101-5105(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。該等次細胞定位信號可位於N端、C端或在Cas蛋白內之任何地方。NLS可包含鹼性胺基酸之延伸，且可為單分型序列或雙分型序列。可選擇地，Cas蛋白可包含二或更多個NLS，包括在N端之NLS(例如α-內輸蛋白NLS或單分型NLS)和在C端之NLS(例如SV40 NLS或雙分型NLS)。Cas蛋白亦可在N端包含二或多個NLS和/或在C端包含二或多個NLS。
亦可將Cas蛋白可操作地連接至細胞穿透結構域或蛋白轉導結構域。例如，該細胞穿透結構域可源自HIV-1 TAT蛋白、來自人B型肝炎病毒之TLM細胞穿透基序、MPG、Pep-1、VP22、來自單純皰疹病毒之細胞穿透肽或聚精胺酸肽序列。參見，例如WO 2014/089290和WO 2013/176772(各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。該細胞穿透結構域可位於Cas蛋白之N端、C端或Cas蛋白內之任何位置。
為了易於追踪或純化，亦可將Cas蛋白可操作地連接至異源多肽，諸如螢光蛋白、純化標籤或表位標籤。螢光蛋白之實例包括綠色螢光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、eGFP、祖母綠、Azami Green、單體Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreenl)、黃色螢光蛋白(例如YFP、eYFP、黃晶、金星、YPet、PhiYFP、ZsYellowl)、藍色螢光蛋白(例如eBFP、eBFP2、藍寶石、mKalamal、GFPuv、藍寶石、T-藍寶石)、藍綠色螢光蛋白(例如eCFP、Cerulean、CyPet、AmCyanl、Midoriishi-Cyan)、紅色螢光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、DsRed單體、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-單體、HcRed-Tandem、HcRedl、AsRed2、eqFP611、mRaspberry、mStrawberry、Jred)、橙色螢光蛋白(例如mOrange、mKO、Kusabira-Orange、單體Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)和任何其他合適之螢光蛋白。標籤之實例包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、幾丁質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白、硫氧還蛋白(thioredoxin) (TRX)、聚(NANP)、串聯親和力純化(TAP)標籤、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、血凝素(HA)、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、組胺酸(His)、生物素羧基載體蛋白(BCCP)和鈣調蛋白。
亦可將Cas蛋白束縛於外源供體核酸或經標記之核酸。該等束縛(即，物理連接)可透過共價交互作用或非共價交互作用實現，且該束縛可為直接的(例如透過直接融合或化學軛合，此可藉由修飾蛋白質上之半胱胺酸或離胺酸殘基或內含肽修飾來實現)，或可透過一或多種中間連接子或銜接子分子，諸如鏈黴親和素或適體來實現。參見，例如，Pierce et al.(2005)Mini Rev. Med. Chem. 5(1):41-55；Duckworth et al.(2007)Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46(46):8819-8822；Schaeffer and Dixon(2009)Australian J. Chem. 62(10):1328-1332；Goodman et al. (2009)Chembiochem . 10(9):1551-1557；和Khatwani et al. (2012)Bioorg. Med. Chem. 20(14):4532-4539(各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。合成蛋白質-核酸軛合物之非共價策略包括生物素-鏈黴親和素和鎳-組胺酸方法。共價蛋白質-核酸軛合物可藉由使用多種化學方法連接適當官能化之核酸和蛋白質來合成。這些化學方法中有些涉及將寡核苷酸直接附接於該蛋白質表面上之胺基酸殘基(例如離胺酸胺或半胱胺酸硫醇)，而其他更複雜之方案則需要蛋白質之轉譯後修飾或涉及催化性或反應性蛋白質結構域。用於將蛋白質與核酸共價連接之方法可包括，例如寡核苷酸與蛋白質離胺酸或半胱胺酸殘基之化學交聯、表現之蛋白質接合、化學酶催化方法和使用光適體。可將外源供體核酸或經標記之核酸束縛在Cas蛋白之C端、N端或內部區域。於一實例中，該外源供體核酸或經標記之核酸係束縛在Cas蛋白之C端或N端。同樣地，可將Cas蛋白束縛在外源供體核酸或標經標記之核酸內的5'端、3'端或內部區域。亦即，可將該外源供體核酸或經標記之核酸以任何方向和極性束縛。例如，可將Cas蛋白束縛在外源供體核酸或經標記之核酸的5'端或3'端。
Cas蛋白可以任何形式提供。例如，Cas蛋白可以蛋白質之形式提供，諸如與gRNA複合之Cas蛋白。或者，Cas蛋白可以編碼Cas蛋白之核酸的形式提供，諸如RNA(例如，信使RNA(mRNA))或DNA。可選擇地，編碼Cas蛋白之核酸可經密碼子優化以在特定之細胞或生物體中有效地轉譯成蛋白。例如，可將編碼Cas蛋白之核酸加以修飾，以取代與天然存在之多核苷酸序列相比較，在細菌細胞、酵母細胞、人細胞、非人的細胞、哺乳動物細胞、齧齒動物細胞、小鼠細胞、大鼠細胞或任何其他所感興趣之宿主細胞中使用頻率較高之密碼子。當將編碼Cas蛋白之核酸引入細胞中時，該Cas蛋白可瞬時、條件性或組成性地表現在細胞中。
以mRNA之形式提供的Cas蛋白可經修飾以改善穩定性和/或免疫原性。該修飾可對mRNA內之一或多個核苷酸進行。對mRNA核鹼基進行之化學修飾的實例包括假尿苷、1-甲基-假尿苷和5-甲基-胞苷。例如，可使用含有N1-甲基假尿苷之加帽和聚腺苷酸化之Cas mRNA。同樣地，可藉由使用同義密碼子刪除尿苷來修飾Cas mRNA。
可將編碼Cas蛋白之核酸穩定地整合在該細胞之基因組中並可操作地連接至在細胞中具有活性的啟動子。或者，可將編碼Cas蛋白之核酸可操作地連接至表現構建體中之啟動子。表現構建體包括任何能夠指導所感興趣之基因或其他核酸序列(例如Cas基因)表現及可將該等所感興趣之核酸序列轉移至靶細胞的核酸構建體。例如，編碼Cas蛋白之核酸可在包含核酸插入子之靶向載體中和/或在包含編碼gRNA之DNA的載體中。或者，其可在與靶向載體分開的載體或質粒中，該靶向載體包含核酸插入子和/或與包含編碼該gRNA之DNA的載體分開。可用於表現構建體中之啟動子包括，例如在下列群組之一或多者中具有活性的啟動子：真核細胞、人細胞、非人的細胞、哺乳動物細胞、非人的哺乳動物細胞、齧齒動物細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、倉鼠細胞、兔細胞、多能細胞、胚胎幹(ES)細胞或合子。該等啟動子可為，例如條件性啟動子、誘導型啟動子、組成型啟動子或組織特異性啟動子。可選擇地，該啟動子可為雙向啟動子，其驅動一個方向上之Cas蛋白表現，並驅動另一方向上之嚮導RNA表現。該等雙向啟動子可由下列群體組成(1)完整的、習知之單向Pol III啟動子，其包含3個外部控制元件：遠端序列元件(DSE)、近端序列元件(PSE)和TATA卡匣；和(2)第二基礎Pol III啟動子，其包括PSE和以相反取向融合至DSE之5'端的TATA盒。例如，在H1啟動子中，DSE與PSE和TATA盒相鄰且該啟動子可藉由創建雜種啟動子而成為雙向的，於該雜種啟動子中，逆向轉錄受源自U6啟動子之附加的PSE和TATA盒控制。參見，例如US 2016/0074535(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。使用雙向啟動子來同時表現編碼Cas蛋白和嚮導RNA之基因可允許產生緊密表現匣，以促進遞送。
嚮導 RNA 。 "嚮導RNA"或"gRNA"為與Cas蛋白(例如Cas9蛋白)結合並將Cas蛋白靶向標靶DNA內之特定位置的RNA分子。嚮導RNA可包含二個節段："DNA靶向節段"和"蛋白質結合節段"。"節段"包括分子之一部分或區域，諸如RNA中之核苷酸連續延伸部分。某些gRNA，諸如用於Cas9之gRNA，可包含二個分開的RNA分子："活化子RNA"(例如tracrRNA)和"靶向劑RNA"(例如CRISPR RNA或crRNA)。其他gRNA為單一RNA分子(單一RNA多核苷酸)，其亦可稱為"單分子gRNA"、"單嚮導RNA"或"sgRNA"。參見，例如WO 2013/176772、WO 2014/065596、WO 2014/089290、WO 2014/093622、WO 2014/099750、WO 2013/142578和WO 2014/131833(各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。在Cas9方面，例如單嚮導RNA可包含與tracrRNA融合之crRNA(例如經由連接子)。例如在Cpf1方面，僅需要crRNA即可實現與靶序列結合和/或裂解靶序列。術語"嚮導RNA"和"gRNA"包括雙分子(即，模塊的)gRNA和單分子gRNA。
示例性雙分子gRNA包含crRNA樣("CRISPR RNA"或"標靶RNA"或"crRNA"或"crRNA重複子")分子和對應之tracrRNA樣("反式-作用CRISPR RNA"或"活化子RNA"或"tracrRNA")分子。crRNA同時包含gRNA之DNA靶向節段(單股)和形成gRNA之蛋白質結合節段的dsRNA雙股體之一半的核苷酸延伸部分(即，crRNA尾)。位於DNA-靶向節段下游(3')之crRNA尾的實例包含GUUUUAGAGCUAUGCU (SEQ ID NO：40)、實質上由GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO：40)所組成或由GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO：40)所組成。本文所揭示之任何DNA靶向節段連可接至SEQ ID NO：40之5'端以形成crRNA。
對應之tracrRNA(活化子-RNA)包含核苷酸延伸部分，該核苷酸延伸部分形成該gRNA之蛋白質結合節段的dsRNA雙股體之另一半。crRNA之核苷酸延伸部分與tracrRNA之核苷酸延伸部分互補並雜交以形成該gRNA之蛋白質結合結構域的dsRNA雙股體。因此，各crRNA可被說成具有對應之tracrRNA。tracrRNA序列之實例包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(SEQ ID NO：41)。
在其中需要crRNA和tracrRNA二者之系統中，該crRNA和對應之tracrRNA雜交以形成gRNA。在其中僅需要crRNA之系統中，該crRNA可為gRNA。crRNA另外提供與靶DNA之互補股雜交的單股DNA靶向節段。若用於細胞內修飾，則可將指定之crRNA或tracrRNA分子的確切序列設計成特異於其中將使用RNA分子之物種。參見，例如Mali et al.(2013)Science 339:823-826；Jinek et al.(2012)Science 337:816-821；Hwang et al.( 2013)Nat. Biotechnol. 31:227-229；Jiang et al.(2013)Nat. Biotechnol. 31:233-239；和Cong et al.(2013)Science 339:819-823(各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。
指定gRNA之DNA靶向節段(crRNA)包含與靶DNA之互補股上的序列互補的核苷酸序列(下文中將更詳細的描述)。gRNA之DNA靶向節段經由雜交(即，鹼基配對)以序列特異性之方式與靶DNA交互作用。因此，DNA靶向節段之核苷酸序列可能有變化並決定靶DNA內將與gRNA和靶DNA交互作用之位置。個體gRNA之DNA靶向節段可經修飾以與靶DNA內之任何所需序列雜交。天然產生之crRNA根據CRISPR/Cas系統和生物體而有不同，但通常含有21至72個核苷酸長之靶向節段，該靶向節段側面鄰接長度為21至46個核苷酸的二個直接重複序列(DR)(參見，例如W02014/131833，其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。在化膿性鏈球菌的情況中，DR為36個核苷酸長，而該靶向節段為30個核苷酸長。位於3'之DR與對應之tracrRNA互補並雜交，該tracrRNA再與Cas蛋白結合。
DNA靶向節段之長度為，例如至少約12、15、17、18、19、20、25、30、35或40個核苷酸。該等DNA靶向節段之長度可為，例如約12至約100、約12至約80、約12至約50、約12至約40、約12至約30、約12至約25、或約12至約20個核苷酸。例如，該DNA靶向節段可為約15至約25個核苷酸(例如，約17至約20個核苷酸，或約17、18、19或20個核苷酸)。參見，例如US 2016/0024523 (其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。在來自化膿鏈球菌之Cas9方面，典型之DNA靶向節段之長度為16至20個核苷酸或為17至20個核苷酸。在來自金黃色葡萄球菌之Cas9方面，典型之DNA靶向節段之長度為21至23個核苷酸。在Cpf1方面，典型之DNA靶向節段之長度為至少16個核苷酸或至少18個核苷酸。
TracrRNA可為任何形式(例如全長tracrRNA或活性部分tracrRNA)且可具有不同長度。其可包括初級轉錄子或加工形式。例如，tracrRNA(為單嚮導RNA之一部分或為雙分子gRNA之—部分的分開分子)可包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：野生型tracrRNA序列之全部或一部分(例如約為或多於野生型tracrRNA序列之約20、26、32、45、48、54、63、67、85個或更多個核苷酸)。來自化膿性鏈球菌之野生型tracrRNA序列的實例包括171個核苷酸、89個核苷酸、75個核苷酸以及65個核苷酸的形式。參見，例如Deltcheva et al.( 2011)Nature 471:602-607；WO 2014/093661(各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。單嚮導RNA (sgRNA)內之tracrRNA實例包括在sgRNA之+48、+54、+67和+85形式內找到的tracrRNA節段，其中"+n"表明該sgRNA中包含至多+n個野生型tracrRNA之核苷酸。參見US 8,697,359(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。
嚮導RNA之DNA靶向節段與靶DNA之互補股之間的互補性百分比可為至少60%(例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)。在約20個毗連之核苷酸內，DNA靶向節段與靶DNA之互補股之間的互補性百分比可為至少60%。例如，在靶DNA互補股之5'端處的14個毗連之核苷酸內，DNA靶向節段與靶DNA之互補股之間的互補性百分比可為100%，而其餘部分可低至0%。在此種情況下，DNA靶向節段之長度可被視為14個核苷酸。另一實例為，在靶DNA互補股之5'端處的7個毗連之核苷酸內，DNA靶向節段與靶DNA之互補股之間的互補性百分比可為100%，而其餘部分可低至0%。在此種情況下，DNA靶向節段之長度可被視為7個核苷酸。在某些嚮導RNA中，DNA靶向節段內至少17個核苷酸與靶DNA之互補股互補。例如，DNA靶向節段之長度可為20個核苷酸且可包含1、2或3個與靶DNA之互補股的錯配。於一實例中，該錯配不與對應於該前間隔子相鄰基序(PAM)序列之互補股的區域(即，PAM序列之反向互補)相鄰(例如該錯配係在嚮導RNA之DNA靶向節段的5'端，或者該錯配距離對應於PAM序列之互補股的區域至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個鹼基對)。
gRNA之蛋白結合節段可包含彼此互補的二個核苷酸延伸部分。該蛋白結合節段之互補核苷酸雜交以形成雙股RNA雙股體(dsRNA)。個體gRNA之蛋白結合節段與Cas蛋白交互作用，且該gRNA經由DNA靶向節段將結合之Cas蛋白指向靶DNA內之特異性核苷酸序列。
單嚮導RNA可包含與支架序列(即，嚮導RNA之蛋白質結合序列或Cas結合序列)連接之DNA靶向節段。例如，該等嚮導RNA可具有5'DNA靶向節段和3'支架序列。示例性支架序列包含下列群組、實質上由下列群組所組成或由下列群組所組成：
Figure 02_image003
Figure 02_image005
靶向任何嚮導RNA靶序列之嚮導RNA可包括，例如在嚮導RNA之5'端上的DNA靶向節段，其與嚮導RNA之3'端上的任何示例性嚮導RNA支架序列融合。亦即，本文所揭示之任何DNA靶向節段可與SEQ ID NO：42至45中任一者之5'端連接以形成單嚮導RNA(嵌合型嚮導RNA)。如本文他處所揭示之嚮導RNA形式1、2、3和4分別指與支架形式1、2、3和4連接之DNA靶向節段(即，嚮導序列或嚮導子)。
嚮導RNA可包括提供額外之所需特性的修飾或序列(例如修飾或調節之穩定性；次細胞靶向；以螢光標記追踪；蛋白質或蛋白質複合物之結合位點，等)。該等修飾之實例包括，例如5'帽(例如7-甲基鳥苷酸酯帽(m7G))；3'聚腺苷酸化尾端(即3'聚(A)尾)；核糖開關序列(例如允許由蛋白質和/或蛋白質複合物調節之穩定性和/或調節之可及性)；穩定性控制序列；形成dsRNA雙股體(即髮夾)之序列；將RNA靶向次細胞位置(例如細胞核、線粒體、葉綠體，等)之修飾或序列；提供追踪之修飾或序列(例如與螢光分子直接軛合、與促進螢光檢測之部分軛合、允許螢光檢測之序列，等)；提供蛋白質(例如作用於DNA之蛋白質，包括DNA甲基轉移酶、DNA脫甲基酶、組蛋白乙醯基轉移酶、組蛋白脫乙醯基酶，等)之結合位點的修飾或序列；及彼等之組合。其他修飾實例包括經工程處理之莖環雙股體結構、經工程處理之凸出區、莖環雙股體結構之經工程處理的髮夾3'或彼等之任何組合。參見，例如US 2015/0376586(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。凸起可為由crRNA樣區域和最小tracrRNA樣區域修成之雙股體內的不成對核苷酸區。凸起可在雙股體之一側上包含不成對之5'-XXXY-3'(其中X為任何嘌呤且Y可為可與相對股上之核苷酸形成擺動對的核苷酸)，並在該雙股體之另一側上包含不成對之核苷區域。
未經修飾之核酸可能易於降解。外源核酸亦可誘導先天免疫反應。修飾可協助引入穩定性並降低免疫原性。嚮導RNA可包含經修飾之核苷和經修飾之核苷酸，包括，例如下列之一或多者：(1)磷酸二酯主鏈鍵聯中之一或二個非連接之磷酸氧和/或一或多個連接之磷酸氧的變化或替代；(2)核糖之組成的變化或替代，諸如核糖上之2'羥基的變化或替代；(3)以去磷酸連接子替代磷酸部分；(4)天然存在之核鹼基的修飾或替代；(5)核糖磷酸主鏈的替代或修飾；(6)寡核苷酸之3'端或5'端的修飾(例如端磷酸基之去除、替代或修飾，或一個部分之軛合)；及(7)糖之修飾。其他可能之嚮導RNA修飾包括尿嘧啶或多尿嘧啶束修飾或替代。參見，例如WO 2015/048577和US 2016/ 0237455(各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。可對Cas編碼核酸，諸如Cas mRNA進行類似之修飾。
於一實例中，嚮導RNA之5'或3'端的核苷酸可包括硫代磷酸酯鍵聯(例如，該鹼基可具有為硫代磷酸酯基團之經修飾的磷酸基)。例如，嚮導RNA可在弦嚮導RNA之5'或3'端的2、3或4個端核苷酸之間包含硫代磷酸酯鍵聯。另一實例為嚮導RNA之5'和/或3'端的核苷酸可具有2'-O-甲基修飾。例如，嚮導RNA可在嚮導RNA之5'和/或3'端(例如5'端)的2、3或4個端核苷酸處包含2'-O-甲基修飾。參見，例如WO 2017/173054 A1和Finn et al.(2018)Cell Reports 22:1-9(各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。於一具體之實例中，該嚮導RNA在5'和3'端之前三個RNA殘基處包含2'-O-甲基類似物和3'硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。於另一具體之實例中，對嚮導RNA進行修飾，從而使所有不與Cas9蛋白交互作用之2'OH基團被2'-O-甲基類似物替代，且該與Cas9蛋白具有最少交互作用之嚮導RNA的尾部區域係以5'和3'硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾。參見，例如Yin et al.(2017)Nat. Biotech. 35(12):1179-1187(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。其他經修飾之嚮導RNA之實例提供於，例如WO 2018/107028 A1(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)中。
嚮導RNA可以任何形式提供。例如，該gRNA可以RNA之形式提供，其可以二個分子(單獨之crRNA和tracrRNA)或以一個分子(sgRNA)之形式提供，及可選擇地，以與Cas蛋白之複合物形式提供。gRNA亦可以編碼gRNA之DNA形式提供。編碼gRNA之DNA可編碼單一RNA分子(sgRNA)或單獨之RNA分子(例如單獨之crRNA和tracrRNA)。在後種情況下，該編碼gRNA之DNA可以一個DNA分子之形式提供或以分別編碼crRNA和tracrRNA之單獨的DNA分子之形式提供。
當以DNA之形式提供gRNA時，該gRNA可瞬時、條件性或組成型地表現在細胞中。可將編碼gRNA之DNA穩定整合在細胞之基因組中，並可操作地連接至細胞中具有活性之啟動子。或者，可將編碼gRNA之DNA可操作地連接至表現構建體中之啟動子。例如，編碼gRNA之DNA可在包含異源核酸(諸如編碼Cas蛋白之核酸)的載體中。或者，其可在載體或質粒中，該質粒係與包含編碼該Cas蛋白之核酸的載體分開。可用於該等表現構建體中之啟動子包括在，例如下列一或多者中具有活性之啟動子：真核細胞、人類細胞、非人的細胞、哺乳動物細胞、非人的哺乳動物細胞、齧齒動物細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、倉鼠細胞、兔細胞、多能細胞、胚胎幹(ES)細胞、成年幹細胞、發育受限之祖細胞、誘導型多能幹(iPS)細胞或單細胞階段胚胎。該等啟動子可為，例如條件性啟動子、誘導型啟動子、組成型啟動子或組織特異性啟動子。該等啟動子亦可為，例如雙向啟動子。合適之啟動子的具體實例包括RNA聚合酶III啟動子，諸如人U6啟動子、大鼠U6聚合酶III啟動子或小鼠U6聚合酶III啟動子。
或者，可藉由各種其他方法製備gRNA。例如，可使用，例如T7 RNA聚合酶，藉由活體外轉錄來製備gRNA(參見，例如WO 2014/089290和WO 2014/065596，各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。嚮導RNA亦可為藉由化學合成製備之合成產生的分子。
嚮導RNA(或編碼嚮導RNA之核酸)可在包含一或多個嚮導RNA(例如1、2、3、4或多個嚮導RNA)和增加該嚮導RNA之穩定性(例如延長在指定之儲存條件(例如-20℃、4℃或環境溫度)下的期間，在該指定之儲存條件下，降解產物保持低於閾值(諸如低於該起始核酸或蛋白質之0.5重量%)；或增加活體內之穩定性)的載體之組成物中。該等載體之非限制性實例包括聚(乳酸)(PLA)微球、聚(D,L-乳酸-共乙醇酸)(PLGA)微球、脂質體、微胞、反微胞、脂質卷(lipid cochleates)和脂質微管。該等組成物可進一步包含Cas蛋白，例如Cas9蛋白，或編碼Cas蛋白之核酸。
嚮導 RNA 靶序列 。 嚮導RNA之靶DNA包括存在於DNA中之核酸序列，惟其存在足夠之結合條件時，gRNA之DNA靶向節段將與之結合。合適之DNA/RNA結合條件包括細胞中通常存在之生理條件。其他合適之DNA/RNA結合條件(例如無細胞系統中之條件)為本技藝所已知(參見，例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed.(Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001)，其全文以引用方式併入本文以用於所有目的))。與gRNA互補並雜交之靶DNA股可稱為"互補股"，而與"互補股"互補之靶DNA的股(因此與Cas蛋白或gRNA不互補)稱為"非互補股"或"模板股"。
靶DNA包括與嚮導RNA雜交之互補股上的序列及在非互補股上之對應序列(例如，鄰接前間隔子相鄰基序(PAM))。如本文所使用之術語"嚮導RNA靶序列"係特指非互補股上之序列，其對應於(即，反向互補)互補股上與嚮導RNA雜交之序列。即，該嚮導RNA靶序列係指鄰接PAM之非互補股上的序列(例如在Cas9之情況下，在PAM之上游或5')。嚮導RNA靶序列等於嚮導RNA之DNA靶向節段，但以胸腺嘧啶取代尿嘧啶。舉例而言，SpCas9酶之嚮導RNA靶序列可指非互補股上之5'-NGG-3'PAM上游的序列。嚮導RNA係設計成與靶DNA之互補股互補，其中嚮導RNA之DNA靶向節段與靶DNA之互補股之間的雜交促進CRISPR複合物形成。完全互補性不是必需的，惟其存在足夠引起雜交並促進CRISPR複合物形成之充分互補性即可。若本文中嚮導RNA稱為靶向嚮導RNA靶序列，此意指該嚮導RNA與靶DNA之互補股序列(即，非互補股上之嚮導RNA靶序列的反向補體)雜交。
靶DNA或嚮導RNA靶序列可包含任何多核苷酸，且可位於，例如細胞之細胞核或細胞質中或在細胞之細胞器內，諸如線粒體或葉綠體。靶DNA或嚮導RNA靶序列可為任何細胞內源性或外源性核酸序列。該嚮導RNA靶序列可為編碼基因產物(例如蛋白質)之序列或非編碼序列(例如調節序列)，或者可包括二者。於一特定之實例中，該嚮導RNA靶序列可在人白蛋白基因之內含子1、內含子12或內含子13中。例如，該嚮導RNA靶序列可在人白蛋白基因之內含子1中。
靶DNA與Cas蛋白之定點結合和被 Cas蛋白裂解可發生在由下列(i)和(ii)決定之位置處：(i)嚮導RNA與靶DNA之互補股之間的鹼基配對互補性，和(ii)靶DNA之非互補股中稱為前間隔子相鄰基序(PAM)的短基序。PAM可側面鄰接該嚮導RNA靶序列。可選擇地，該嚮導RNA靶序列之3'端可側面鄰接PAM(例如，在Cas9方面)。可選擇地，該嚮導RNA靶序列之5'端可側面鄰接PAM(例如(例如，在Cpf1方面)。例如，Cas蛋白之裂解位點可在PAM序列之上游或下游(例如在嚮導RNA靶序列內)約1至約10個、或約2至約5個鹼基對(例如3個鹼基對)。在SpCas9之情況下，該PAM序列(即，在非互補股上)可為5'-N1 GG-3'，其中N1 為任何DNA核苷酸且其中該PAM緊接著該靶DNA之非互補股上的嚮導RNA靶序列之3'。因此，該對應於互補股上之PAM的序列(即，反向補體)將為5'-CCN2 -3'，其中N2 為任何DNA核苷酸且緊接著該靶DNA之互補股上，與嚮導RNA之DNA靶向節段雜交之序列的5'端。於某些該等情況下，N1 和N2 可互補且N1 -N2 鹼基對可為任何鹼基對(例如，N1 =C且N2 =G；N1 =G且N2 =C；N1 =A且N2 =T；或N1 =T且N2 =A)。在Cas9係來自金黃色葡萄球菌之情況下，該PAM可為NNGRRT或NNGRR，其中N可為A、G、C或T，而R可為G或A。在Cas9係來自空腸彎曲菌之情況下，該PAM可為，例如NNNNACAC或NNNNRYAC，其中N可為A、G、C或T且R可為G或A。在某些情況下(例如，在FnCpf1方面)，該PAM序列可位於5'之上游且具有序列5'-TTN-3'。
嚮導RNA靶序列之實例為緊接在可被SpCas 9蛋白識別的NGG基序之前的具有20個核苷酸之DNA序列。例如，嚮導RNA靶序列加PAM的二個實例為GN19 NGG (SEQ ID NO：46)或N20 NGG(SEQ ID NO：47)。參見，例如WO 2014/165825，其全文以引用方式併入本文以用於所有目的。5'端之鳥嘌呤可促進RNA聚合酶在細胞中進行之轉錄。嚮導RNA靶序列加PAM之其他實例可包括5'端處的二個鳥嘌呤核苷酸(例如，GGN20 NGG；SEQ ID NO：48)以促進T7聚合酶在活體外進行有效轉錄。參見，例如WO 2014/065596，其全文以引用方式併入本文以用於所有目的。其他嚮導RNA靶序列加PAM可具有長度在4至22個核苷酸之間的SEQ ID NO：46至48，包括5'G或GG及3'GG或NGG。而其他嚮導RNA靶序列PAM可具有長度在14至20個核苷酸之間的SEQ ID NO：46至48。
與靶DNA雜交之CRISPR複合物的形成可導致對應於該嚮導RNA靶序列(即，在靶DNA之非互補股上的嚮導RNA靶序列和在互補股上，與嚮導RNA雜交之反向補體)之區域內或附近的靶DNA之一或二股裂解。例如，該裂解位點可在嚮導RNA靶序列之內(例如，相對於PAM序列之限定位置處)。該"裂解位點"包括靶DNA之位置，Cas蛋白在此處產生單股斷裂或雙股斷裂。該裂解位點可僅在雙股DNA的一股上(例如，當使用切口酶時)或在二股上。該裂解位點可二股上之相同位置(產生鈍端；例如Cas9)，或可在每一股上之不同位點(產生交錯端(即，突出端)；例如Cpf1)。交錯端可，例如藉由使用二個Cas蛋白產生，每個Cas蛋白各自在不同股上之不同裂解位點產生單股斷裂，從而產生雙股斷裂。例如，第一切口酶可在雙股DNA(dsDNA)的第一股上產生單股斷裂，第二切口酶可在dsDNA之第二股上產生單股斷裂，從而產生突出序列。於某些情況下，第一股上之嚮導RNA靶序列或切口酶之裂解位點與第二股上之嚮導RNA靶序列或切口酶的裂解位點至少相隔2、3、4、5、6，7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100、250、500或1,000個鹼基對。(3) 靶向人白蛋白基因之外源供體核酸
本文所揭示之方法和組成物可在使用核酸酶劑裂解人化白蛋白基因座之後，或與使用核酸酶劑裂解人化白蛋白基因座無關的利用外源供體核酸來修飾人化白蛋白基因座。於該等使用核酸酶劑之方法中，該核酸酶劑蛋白質裂解人化白蛋白基因座以產生單股斷裂(缺口)或雙股斷裂，且該外源供體核酸經由非同源端接合(NHEJ)介導之連接或透過同源引導修復事件重組該人化白蛋白基因座。可選擇地，以外源供體核酸進行修復可去除或破壞核酸酶靶序列，從而使已被靶向之等位基因不能被該核酸酶劑重新靶向。
外源供體核酸可靶向人白蛋白基因中之任何序列。某些外源供體核酸包含同源臂。其他外源供體核酸不包含同源臂。該外源供體核酸可藉由同源引導修復插入人化白蛋白基因座中，和/或其能夠藉由非同源端接合插入人化白蛋白基因座中。於一實例中，該外源供體核酸(例如靶向載體)可靶向人白蛋白基因之內含子1、內含子12或內含子13。例如，該外源供體核酸可靶向人白蛋白基因之內含子1。
外源供體核酸可包含脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，其可為單股或雙股的，且其可為線性或環狀形式。例如，外源供體核酸可為單股寡去氧核苷酸(ssODN)。參見，例如Yoshimi et al.( 2016)Nat. Commun. 7:10431(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。外源供體核酸可為裸出之核酸或可藉由病毒(諸如AAV)遞送。於一具體實例中，該外源供體核酸可經由AAV遞送且能夠藉由非同源端接合插入人化白蛋白基因座中(例如該外源供體核酸可為不包含同源臂之核酸)。
示例性外源供體核酸之長度係在約50個核苷酸至約5kb之間、長度在約50個核苷酸至約3kb之間、或長度在約50個核苷酸至約1,000個核苷酸之間。其他示例性外源供體核酸之長度係在約40至約200個核苷酸之間。例如，外源供體核酸之長度可為約50至60、60至70、70至80、80至90、90至100、100至110、110至120、120至130、130至140、140至150、150至160、160至170、170至180、180至190、或190至200個核苷酸。或者，外源供體核酸之長度可為約50至100、100至200、200至300、300至400、400至500、500至600、600至700、700至800、800至900、或900至1000個核苷酸。或者，外源供體核酸之長度可為約1至1.5、1.5至2、2至2.5、2.5至3、3至3.5、3.5至4、4至4.5、或4.5至5kb。或者，外源供體核酸之長度可為，例如不超過5kb、4.5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、900個核苷酸、800個核苷酸、700個核苷酸、600個核苷酸、500個核苷酸、400個核苷酸、300個核苷酸、200個核苷酸、100個核苷酸、或50個核苷酸。外源供體核酸(例如靶向載體)亦可更長。
於一實例中，外源供體核酸為長度在約80個核苷酸至約200個核苷酸之間的ssODN。於另一實例中，外源供體核酸為長度在約80個核苷酸至約3kb之間的ssODN。該等ssODN可具有，例如其長度各為約40個核苷酸至約60個核苷酸之同源臂。該等ssODN亦可具有，例如長度各為約30個核苷酸至約100個核苷酸之同源臂。該同源臂可為對稱的(例如長度各為40個核苷酸或各為60個核苷酸)，或者其可為不對稱的(例如一個同源臂之長度為36個核苷酸，而一個同源臂之長度為91個核苷酸)。
外源供體核酸可包括提供另外之所需特性(例如經修飾或調節之穩定性；以螢光標記物追踪或檢測；蛋白質或蛋白質複合物之結合位點；等)的修飾或序列。外源供體核酸可包含一或多個螢光標記、純化標籤、表位標籤或彼等之組合。例如，外源供體核酸可包含一或多個螢光標記(例如螢光蛋白或其他螢光團或染料)，諸如至少1、至少2、至少3、至少4或至少5個螢光標記。示例性螢光標記包括螢光團，諸如螢光素(例如6-羧基螢光素(6-FAM))、德克薩斯紅(Texas Red)、HEX、Cy3、Cy5、Cy5.5、太平洋藍、5-(和-6)-羧基四甲基羅丹明(TAMRA)和Cy7。多種螢光染料可商購以用於標記寡核苷酸(例如來自Integrated DNA Technologies)。該等螢光標記(例如內部螢光標記)可用於，例如檢測外源供體核酸，該外源供體核酸已被直接整合入經裂解之靶核酸內，該經裂解之靶核酸具有與該外源供體核酸之末端相容的突出端。該  標記或標籤可在外源供體核酸之5'端、3'端或其內部。例如，外源供體核酸可在5'端與來自Integrated DNA Technologies之IR700螢光團軛合(5'IRDYE® 700)。
外源供體核酸亦可包含核酸插入子，該核酸插入子包括待整合在人化白蛋白基因座處之DNA節段。核酸插入子整合在人化白蛋白基因座處可導致在人化白蛋白基因座添加感興趣之核酸序列、刪除在人化白蛋白基因座處之感興趣的核酸序列、或替代在人化白蛋白基因座處之感興趣的核酸序列(即，缺失和插入)。某些外源供體核酸係設計成用於將核酸插入子插入人化白蛋白基因座，而不需在人化白蛋白基因座處進行任何對應刪除。其他外源供體核酸係設計成刪除在人化白蛋白基因座之感興趣的核酸序列，而不需對應插入任何核酸插入子。還有其他外源供體核酸係設計成刪除在人化白蛋白基因座之感興趣的核酸序列，並以核酸插入子替代之。
人化白蛋白基因座處之經刪除和/或替代之核酸插入子或對應之核酸可具有各種不同長度。人化白蛋白基因座處之經刪除和/或替代之示例性核酸插入子或對應之核酸的長度為約1個核苷酸至約5kb、或長度為約1個核苷酸至約1,000個核苷酸。例如，人化白蛋白基因座處之經刪除和/或替代之核酸插入子或對應之核酸的長度可為約1至10、10至20、20至30、30至40、40至50、50至60、60至70、70至80、80至90、90至100、100至110、110至120、120至130、130至140、140至150、150至160、160至170、170至180、180至190或190至120個核苷酸。同樣地，人化白蛋白基因座處之經刪除和/或替代之核酸插入子或對應之核酸的長度可為約1至100、100至200、200至300、300至400、400至500、500至600、600至700、700至800、800至900或900至1000個核苷酸。同樣地，人化白蛋白基因座處之經刪除和/或替代之核酸插入子或對應之核酸的長度可為約1至1.5、1.5至2、2至2.5、2.5至3、3至3.5、3.5至4、4至4.5、或4.5至5 kb或更長。
該核酸插入子可包含與被靶向替代之全部或部分序列同源或直系同源之序列。例如，與被靶向以在人化白蛋白基因座處進行替代之序列相比較，該核酸插入子可包含含有一或多個點突變(例如1、2、3、4、5或更多個)之序列。可選擇地，該等點突變可導致該經編碼之多肽中之保守性胺基酸取代(例如，以麩胺酸[Glu，E]取代天門冬胺酸[Asp，D])。
某些外源供體核酸可編碼非由野生型內源性白蛋白基因座編碼或表現之外源蛋白質(例如可包含編碼外源蛋白質之插入核酸)。於一實例中，該被外源供體核酸靶向之人化白蛋白基因座可編碼包含人白蛋白信號肽之異源蛋白質，該人白蛋白信號肽與非由野生型內源性白蛋白基因座編碼或表現之蛋白質融合。例如，該外源供體核酸可為包含剪接受體之無啟動子卡匣，且該外源供體核酸可靶向人白蛋白的第一內含子。
用於非同源端接合介導之插入的供體核酸。 某些外源供體核酸能夠藉由非同源端接合插入人化白蛋白基因座。在某些情況下，該等外源供體核酸不包含同源臂。例如，可在以核酸酶劑裂解後將該等外源供體核酸插入鈍端雙股斷裂。於一具體實例中，該外源供體核酸可經由AAV遞送，且能夠藉由非同源端接合插入人化白蛋白基因座中(例如該外源供體核酸可為不包含同源臂者)。於一具體之實例中，該外源供體核酸可經由非同源依賴之靶向整合來插入。例如，欲插入人化白蛋白基因座中之外源供體核酸中的插入序列的每一側可鄰接核酸酶劑之靶位點(例如，與人化白蛋白基因座中相同之靶位點及使用相同核酸酶劑來裂解人化白蛋白基因座中之靶位點)。然後，該核酸酶劑可裂解側面鄰接該插入序列之靶位點。於一具體之實例中，該外源供體核酸係經由AAV介導之遞送投遞，且將側面鄰接該插入序列之靶位點的裂解可去除AAV之反向終端重複序列(ITR)。於某些方法中，若該插入序列係以正確方向插入該人化白蛋白基因座中，則該人化白蛋白基因座中之靶位點(例如，包括該側面鄰接之前間隔子相鄰基序的gRNA靶序列)將不再存在，但若該插入序列以相反的方向插入該人化白蛋白基因座中，則其被改造。此可協助確保該插入序列係以用於表現之正確方向插入。
其他外源供體核酸在5'端和/或3'端具有短的單股區，該短的單股區與一或多個突出端互補，該一或多個突出端係由核酸酶介導在人化白蛋白基因座裂解所產生。這些突出端亦可稱為5'和3'同源臂。例如，某些外源供體核酸在5'端和/或3'端具有短的單股區，該5'端和/或3'端之短的單股區與一或多個突出端互補，該突出端係由核酸酶介導在人化白蛋白基因座處之5'和/或3'靶序列裂解所產生。某些該等外源供體核酸僅在5'端或僅在3'端具有互補區。例如，某些該等外源供體核酸具有互補區，該互補區僅在與突出端互補之5'端具有互補區，該突出端係在人化白蛋白基因座處之5'靶序列產生，或者該互補區僅在3'端與突出端互補，該突出端係在人化白蛋白基因座處之3'靶序列產生。其他該等外源供體核酸在5'和3'端均具有互補區，例如，其他該等外源供體核酸在，例如分別與第一和第二突出端互補的5'和3'端均具有互補區，該第一和第二突出端係由核酸酶介導在人化白蛋白基因座處之裂解產生。例如，若該外源供體核酸為雙股的，則該單股互補區可從該供體核酸之上游股的5'端和供體核酸下游股的5'端延伸，在每一端產生5'突出端。或者，該單股互補區可從供體核酸之上游股的3'端和供體核酸之下游股的3'端延伸，產生3'突出端。
該互補區之長度可為足以促進該外源供體核酸與靶核酸之間接合的任何長度。示例性互補區之長度為約1至約5個核苷酸、長度為約1至約25個核苷酸、或長度為約5至約150個核苷酸。例如，互補區之長度可為至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。或者，該互補區之長度可為約5至10、10至20、20至30、30至40、40至50、50至60、60至70、70至80、80至90、90至100、100至110、110至120、120至130、130至140或140至150個核苷酸或更長。
該等互補區可與由二對切口酶產生之突出端互補。具有交錯端的二個雙股斷裂可藉由使用裂解DNA之相對股的第一和第二切口酶產生，以創造第一雙股斷裂，並使用裂解DNA之相對股的第三和第四切口酶產生，以創造第二雙股斷裂。例如，Cas蛋白可用於切開對應於第一、第二、第三和第四嚮導RNA的第一、第二、第三和第四嚮導RNA靶序列。可定位第一和第二嚮導RNA靶序列以創造第一裂解位點，從而使該由第一和第二切口酶在DNA之第一和第二股上產生的切口創造出雙股斷裂(即，該第一裂解位點在第一和第二嚮導RNA靶序列內包含缺口)。同樣地，可定位第三和第四嚮導RNA靶序列以產生第二裂解位點，從而使該由第三和第四切口酶在DNA之第一和第二股上產生的切口創造出雙股斷裂(即，該第二裂解位點在第三和第四嚮導RNA靶序列內包含缺口)。較佳地，該在第一和第二嚮導RNA靶序列和/或第三和第四嚮導RNA靶序列內之切口可為創造突出端之偏置切口。該偏置窗口可為，例如，至少約5bp、10 bp、20 bp、30 bp、40 bp、50 bp、60 bp、70 bp、80 bp、90 bp、100 bp或更大。參見Ran et al.( 2013)Cell 154:1380-1389; Mali et al.( 2013)Nat. Biotech. 31:833-838；和Shen et al.( 2014)Nat. Methods 11:399-404，各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的。於該等情況下，可設計具有單股互補區的雙股外源供體核酸，該單股互補區與突出端互補，該突出端係由在第一和第二嚮導RNA靶序列內之缺口及第三和第四嚮導RNA靶序列內之缺口創造出。然後，可藉由非同源端接合介導之接合將該等外源供體核酸插入。
用於藉由同源引導修復插入的供體核酸。 某些外源供體核酸包含同源臂。若該外源供體核酸亦包含核酸插入子，該同源臂可側面鄰接該核酸插入子。為了容易參考，本文中將同源臂稱為5'和3'(即，上游和下游)同源臂。該術語與該同源臂相對於該外源供體核酸內之核酸插入子的相對位置有關。該5'和3'同源臂對應於該人化白蛋白基因座內之區域，該區域在本文中分別稱為" 5'靶序列"和" 3'靶序列"。
當同源臂和靶序列二個區域彼此共享足夠水準之序列同一性以充當同源重組反應之受質時，該同源臂和靶序列彼此"對應"或為"相對應的"。術語"同源性"包括與對應序列相一致或共享序列同一性之DNA序列。指定之靶序列與外源供體核酸中發現之對應的同源臂之間的序列同一性可為允許發生同源重組之任何程度的序列同一性。例如，外源供體核酸(或其片段)之同源臂和靶序列(或其片段)共有之序列同一性的量可為至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性，從而使該序列進行同源重組。再者，同源臂和對應之靶序列之間的同源對應區可具有足以促進同源重組的任何長度。示例性同源臂為約25個核苷酸至約2.5kb長、約25個核苷酸至約1.5kb長、或約25個核苷酸至約500個核苷酸長。例如，指定之同源臂(或各同源臂)和/或對應之靶序列可包含長度為約25至30、30至40、40至50、50至60、60至70、70至80、80至90、90至100、100至150、150至200、200至250、250至300、300至350、350至400、400至450、或450至500個核苷酸的對應同源區，從而使該同源臂具有足夠之同源性以與該靶核酸內之對應的靶序列進行同源重組。或者，指定之同源臂(或各同源臂)和/或對應之靶序列可包含長度為約0.5kb至約1kb、約1kb至約1.5kb、約1.5kb至約2kb、或約2 kb至約2.5 kb的同源對應區。例如，該同源臂之長度可各自為約750個核苷酸。該同源臂可為對稱的(每個同源臂長度大約相同)，亦可為不對稱的(一個同源臂較另一個同源臂長)。
當將核酸酶劑與外源供體核酸組合使用時，5'和3'靶序列較佳為位於與核酸酶裂解位點足夠接近之位置(例如，與核酸酶靶序列足夠接近之位置)，從而促進在核酸酶裂解位點處單股斷裂(切口)或雙股斷裂時靶序列和同源臂之間發生同源重組事件。術語"核酸酶裂解位點"包括其中具有藉由核酸酶劑(例如與嚮導RNA複合之Cas9蛋白)產生之切口或雙股斷裂的DNA序列。若對應於該外源供體核酸之5'和3'同源臂之被靶向之基因座內的靶序列與核酸酶裂解位點之間的距離足以促進該5'和3'靶序列與同源臂在核酸酶裂解位點單股斷裂或雙股斷裂時發生同源重組事件，則該被靶向之基因座內的靶序列與核酸酶裂解位點"距離足夠接近"。因此，對應於該外源供體核酸之5'和3'同源臂的靶序列可，例如在指定之核酸酶裂解位點的至少1個核苷酸內或在指定之核酸酶裂解位點的至少10個核苷酸至約1,000個核苷酸內。例如，該核酸酶裂解位點可緊接於至少一個或二個靶序列。
對應於該外源供體核酸之同源臂的靶序列和該核酸酶裂解位點的空間關係可以改變。例如，靶序列可位於該核酸酶裂解位點之5'，靶序列可以位於該核酸酶裂解位點之3'，或者該靶序列可側面鄰接該核酸酶裂解位點。 (4) 其他人白蛋白靶向劑
亦可使用本文所揭示之非人的動物來評估任何其他已知或推定之人白蛋白靶向劑的活性。類似地，可使用本文所揭示之非人的動物對任何其他分子篩選人白蛋白靶向活性。
其他人白蛋白靶向劑之實例包括透過RNA干擾(RNAi)來作用之反義寡核苷酸(例如siRNA或shRNA)。反義寡核苷酸(ASO)或反義RNA為短的合成核苷酸串，其係設計成藉由選擇性地與編碼被靶向之蛋白質的RNA結合，從而防止轉譯以防止靶蛋白表現。這些化合物透過已被充分表徵之Watson-Crick鹼基配對(雜交)以高親和力和選擇性與RNA結合。RNA干擾(RNAi)為用於控制基因表現之內源性細胞機制，其中與RNA誘導型沉默複合物(RISC)結合之小干擾RNA(siRNA)介導標靶信使RNA(mRNA)之裂解。
其他人白蛋白靶向劑包括設計成特異性結合人白蛋白表位之抗體或抗原結合蛋白。其他人白蛋白靶向劑包括小分子試劑。 D. 對非人的動物或細胞投予人白蛋白靶向劑
本文所揭示之方法可包含將各種不同之分子(例如人白蛋白靶向劑，諸如治療性分子或複合物)引入非人的動物或細胞中，包括，例如核酸、蛋白質、核酸-蛋白質複合物或蛋白質複合物。"引入"包括以能使分子(例如核酸或蛋白質)進入細胞內部或非人的動物之細胞內部的該等方式來將該分子呈現給細胞或非人的動物。引入可藉由任何方式完成，並可將二或更多種組分(例如二種組分或全部組分)同時或以任何組合依序引入細胞或非人的動物中。例如，可在引入嚮導RNA之前將Cas蛋白引入細胞或非人的動物中，或可在引入嚮導RNA之後再引入Cas蛋白。另一實例為可在引入Cas蛋白和嚮導RNA之前引入外源供體核酸，或可在引入Cas蛋白和嚮導RNA之後引入外源供體核酸(例如可在引入Cas蛋白和嚮導RNA之前或之後約1、2、3、4、8、12、24、36、48或72小時投予該外源供體核酸)。參見，例如US 2015/0240263和US 2015/0110762，各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的。另外，可藉由相同之遞送方法或不同之遞送方法將二或更多種組分引入細胞或非人的動物中。類似地，可藉由相同之投予途徑或不同之投予途徑將二或更多種組分引入非人的動物中。
於某些方法中，將CRISPR/Cas系統之組分引入非人的動物或細胞中。可將嚮導RNA以RNA之形式(例如活體外轉錄之RNA)或以編碼嚮導RNA之DNA的形式引入非人的動物或細胞中。當以DNA之形式引入時，該編碼嚮導RNA之DNA可以可操作之方式連接至非人的動物之細胞中之活性啟動子。例如，嚮導RNA可經由AAV遞送並在活體內在U6啟動子之控制下表現。該等DNA可在一或多種表現構建體中。例如，該等表現構建體可為單一核酸分子之組分。或者，其可以任何組合分隔在二或多個核酸分子之中(即，編碼一或多個CRISPR RNA之DNA和編碼一或多個tracrRNA之DNA可為分開之核酸分子的組分)。
同樣地，Cas蛋白可以任何形式提供。例如，Cas蛋白可以蛋白質之形式提供，諸如與gRNA複合之Cas蛋白質。或者，Cas蛋白可以編碼Cas蛋白之核酸的形式提供，諸如RNA(例如信使RNA(mRNA))或DNA。可選擇地，該編碼Cas蛋白之核酸可經密碼子優化以在特定細胞或生物體中有效轉譯成蛋白。例如，與天然存在之多核苷酸序列相比較，編碼Cas蛋白之核酸可經修飾以取代在哺乳動物細胞、齧齒動物細胞、小鼠細胞、大鼠細胞或任何其他感興趣之宿主細胞中具有較高使用頻率的密碼子。當將編碼Cas蛋白之核酸引入非人的動物中時，該Cas蛋白可瞬時、條件性或組成型地表現在該非人的動物之細胞中。
編碼Cas蛋白或嚮導RNA之核酸可以可操作之方式與表現構建體中之啟動子連接。表現構建體包括任何能夠指導基因或其他感興趣之核酸序列(例如Cas基因)表現之核酸構建體且該核酸構建體可將該等感興趣之核酸序列轉移至靶細胞。例如，編碼Cas蛋白之核酸可在包含編碼一或多種gRNA之DNA的載體中。或者，其可在與包含編碼一或多種gRNA之DNA的載體分開的載體或質粒中。可用於表現構建體中之合適的啟動子包括在例如下列之一或多者中具有活性的啟動子：真核細胞、人細胞、非人的細胞、哺乳動物細胞、非人的哺乳動物細胞、齧齒動物細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、倉鼠細胞、兔細胞、多能細胞、胚胎幹(ES)細胞、成年幹細胞、發育受限之祖細胞、誘導型多能幹(iPS)細胞或單細胞期之胚胎。該等啟動子可為，例如條件性啟動子、誘導型啟動子、組成型啟動子或組織特異性啟動子。可選擇地，該啟動子可為雙向啟動子，其同時驅動一個方向之Cas蛋白的表現，及另一方向之嚮導RNA的表現。該等雙向啟動子可由下列群組所組成(1)完整的、常規的單向Pol III啟動子，其含有3個外部控制元件：遠端序列元件(DSE)、近端序列元件(PSE)和TATA盒；及(2)第二基本Pol III啟動子，其包含以反方向融合至DSE之5'端的PSE和TATA盒。例如，在H1啟動子中，DSE鄰接PSE和TATA盒，且該啟動子可藉由創建雜種啟動子而為雙向的，在該雜種啟動子中，逆向轉錄係由附加之源自U6啟動子之PSE和TATA盒控制。參見，例如US 2016/0074535，其全文以引用方式併入本文以用於所有目的。使用雙向啟動子同時表現編碼Cas蛋白和嚮導RNA之基因可允許產生緊密表現卡匣以促進遞送。
被引入非人的動物或細胞中之分子(例如Cas蛋白或嚮導RNA)可在包含載體之組成物中提供，該組成物可增加所引入之分子的穩定性(例如延長在指定之儲存條件(例如-20℃、4℃或環境溫度)下的期間，在該指定之儲存條件下，降解產物保持低於閾值，諸如低於起始核酸或蛋白質之0.5重量%；或增加在活體內之穩定性)。該等載體之非限制性實例包括聚(乳酸)(PLA)微球、聚(D,L-乳酸-共乙醇酸)(PLGA)微球、脂質體、微胞、反微胞、脂質卷和脂質微管。
本文提供各種方法和組成物以允許將分子(例如核酸或蛋白質)引入細胞或非人的動物中。將分子引入各種不同之細胞類型的方法為已知且包括，例如穩定的轉染方法、瞬時轉染方法和由病毒介導之方法。
轉染方案及用於將分子引入細胞之方案可以改變。非限制性轉染方法包括使用下列群體之基於化學的轉染方法：脂質體；奈米粒子；磷酸鈣(Graham et al.(1973)Virology 52(2): 456-67、Bacchetti et al.(1977)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74(4): 1590-4，和Kriegler, M(1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company. pp. 96-97)；樹狀聚合物；或陽離子聚合物，諸如DEAE-葡聚醣或聚乙烯亞胺。非化學方法包括電穿孔、聲致穿孔(sonoporation)和光學轉染。基於粒子之轉染包括使用基因槍或磁輔助轉染(Bertram(2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7,277-28)。亦可使用病毒方法來轉染。
亦可藉由電穿孔、胞質內注射、病毒感染、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒、逆轉錄病毒、轉染、由脂質介導之轉染、或核轉染之介導 將分子(例如核酸或蛋白質)引入細胞中。核轉染為經改善之電穿孔技術，其使核酸受質不僅可遞送至細胞質，亦可通過核膜進入細胞核中。另外，在本文所揭示之方法中使用核轉染需要的細胞通常較常規電穿孔少得多(例如相較於常規電穿孔的700萬，僅約200萬)。於一實例中，使用LONZA® NUNLEOFECTORTM 系統進行核轉染。
將分子(例如核酸或蛋白質)引入細胞(例如受精卵)中亦可藉由顯微注射實現。在受精卵(即，單細胞期之胚胎)中，顯微注射可進入母體和/或親代原核或進入細胞質中。若顯微注射僅進入一個原核，則親代原核為較佳者，因為其尺寸較大。較佳地，將mRNA顯微注射入細胞質中(例如將mRNA直接遞送至轉譯器)，而Cas蛋白或編碼Cas蛋白或編碼RNA之多核苷酸的顯微注射較佳為注射入細胞核/原核中。或者，顯微注射可藉由同時注射入細胞核/原核和細胞質中來進行：先將針頭引入細胞核/原核後可注射第一個量，然後從單細胞階段胚胎中移出針頭，接著可將第二個量注射入細胞質中。若將Cas蛋白注射入細胞質中，則Cas蛋白較佳為包含核定位信號以確保遞送至細胞核/原核。進行顯微注射之方法為眾所周知。參見，例如Nagy et al.(Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003, Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)；亦參見Meyer et al.(2010)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:15022-15026和Meyer et al.(2012)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:9354-9359。
用於將分子(例如核酸或蛋白質)引入細胞或非人的動物中之其他方法可包括，例如載體遞送、由顆粒介導之遞送、由外來體介導之遞送、由脂質-奈米顆粒介導之遞送、由細胞穿透肽介導之遞送、或由可植入之設備介導之遞送。一種具體實例為核酸或蛋白質可在載體中引入細胞或非人的動物體內，該載體為，諸如聚(乳酸)(PLA)微球、聚(D,L-乳酸-共乙醇酸)(PLGA)微球、脂質體、微胞、反微胞、脂質卷或脂質微管。一些遞送至非人的動物之具體實例包括流體動力遞送、由病毒介導之遞送(例如腺相關病毒(AAV)介導之遞送)和由脂質奈米粒介導的遞送。
將核酸和蛋白質引入細胞或非人的動物中可藉由流體動力學遞送(HDD)來完成。在將基因遞送至實質細胞方面，僅需要將必需的DNA序列經由選定之血管注射，從而排除與當前之病毒和合成載體相關的安全考量。當注射入血液時，DNA能夠到達血液可及之不同組織中的細胞。流體動力遞送係利用由快速將大量溶液注入循環中不可壓縮之血液中所產生的力量來克服內皮和細胞膜之防止較大且膜不可滲透之化合物進入實質細胞的生理屏障。除了遞送DNA之外，該方法可用於在活體內有效地細胞內遞送RNA、蛋白質和其他小化合物。參見，例如Bonamassa et al.(2011)Pharm. Res. 28(4):694-701(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。
亦可藉由病毒介導之遞送來達成引入核酸，諸如由AAV介導之遞送或由慢病毒介導之遞送。其他示例性病毒/病毒載體包括逆轉錄病毒、腺病毒、痘苗病毒、痘病毒和單純皰疹病毒。該病毒可感染分裂細胞、非分裂細胞或同時感染分裂和非分裂細胞二者。該病毒可整合入宿主基因組中，或者不整合入宿主基因組中。亦可將該等病毒進行工程處理以具有降低之免疫力。該病毒可為複製勝任型或可為複製缺陷型(例如缺乏對其他回合之病毒體複製和/或包裝而言為必要的一或多個基因)。病毒可引起瞬時表現、持久表現(例如至少1週、2週、1個月、2個月或3個月)或永久表現(例如Cas9和/或gRNA之表現)。示例性病毒效價(例如AAV效價)包括1012 、1013 、1014 、1015 和1016 個載體基因組/mL。
ssDNA AAV基因組係由二個開放閱讀框Rep和Cap所組成，其側面鄰接二個反向終端重複序列，該終端重複序列可允許合成互補DNA股。當構建AAV轉移質粒時，該轉基因係置於二個ITR之間，且Rep和Cap可以反式供應。除了Rep和Cap之外，AAV可能需要含有來自腺病毒之基因的輔助質粒。這些基因(E4、E2a和VA)介導AAV複製。例如，可將轉移質粒Rep/Cap和輔助質粒轉染入含有腺病毒基因E1+之HEK293細胞中以產生感染性AAV顆粒。或者，可將Rep、Cap和腺病毒輔助基因合併為單一質粒。類似之包裝細胞和方法可用於其他病毒，諸如逆轉錄病毒。
已經鑑定出多種血清型AAV。該等血清型之差異在於其感染之細胞類型(即，其嗜性)，允許優先轉導特定之細胞類型。用於CNS組織之血清型包括AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8和AAV9。用於心臟組織之血清型包括AAV1、AAV8和AAV9。用於腎組織之血清型包括AAV2。用於肺組織之血清型包括AAV4、AAV5、AAV6和AAV9。用於胰腺組織之血清型包括AAV8。用於光受體細胞之血清型包括AAV2、AAV5和AAV8。用於視網膜色素上皮組織之血清型包括AAV1、AAV2、AAV4、AAV5和AAV8。用於骨骼肌組織之血清型包括AAV1、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。用於肝組織之血清型包括AAV7、AAV8和AAV9，尤其是AAV8。
向性(tropism)可透過假分型進一步細修，該假分型為來自不同病毒血清型之衣殼和基因組的混合。例如，AAV2/5表示含有血清型2之基因組，但包裝在來自血清型5之衣殼中的病毒。使用假型病毒可提高轉導效率並改變向性。源自不同血清型之雜種衣殼亦可用於改變病毒向性。例如，AAV-DJ含有來自八種血清型之雜種衣殼且在體內多種細胞類型中顯示出高感染性。AAV-DJ8為另一顯示AAV-DJ性能，但具有增強之腦部攝入的實例。AAV血清型亦可透過突變進行修飾。AAV2之突變修飾的實例包括Y444F、Y500F、Y730F和S662V。AAV3之突變修飾的實例包括Y705F、Y731F和T492V。AAV6之突變修飾的實例包括S663V和T492V。其他假型/修飾之AAV變體包括AAV2/1、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8、AAV2/9、AAV2.5、AAV8.2和AAV/SASTG。
為了加速轉基因表現，可使用自身互補之AAV(scAAV)變體。由於AAV依賴細胞之DNA複製機制來合成AAV單股DNA基因組之互補股，因此轉基因表現可能會延遲。為了解決此延遲，可使用含有能夠在感染時自發性黏合之互補序列的scAAV，從而排除對宿主細胞合成DNA之需求。然而，亦可使用單股AAV(ssAAV)載體。
為了增加包裝能力，可能將較長之轉基因分割在二個AAV轉移質粒之間，第一個具有3'剪接供體，第二個具有5'剪接受體。當共同感染細胞時，這些病毒形成多連體，被剪接在一起並可表現出全長轉基因。儘管這允許表現較長之轉基因，但表現效率較低。用於增加能力之類似方法係利用同源重組。例如，可將轉基因分割在二個轉移質粒之間，但具有實質之序列重疊，從而使共同表現誘導同源重組並表現該全長轉基因。
核酸和蛋白質之引入亦可藉由脂質奈米顆粒(LNP)介導之遞送實現。例如，由LNP介導之遞送可用於遞送Cas mRNA和嚮導RNA之組合或Cas蛋白和嚮導RNA之組合。透過該等方法之遞送導致瞬時Cas表現，且該可生物降解之脂質提升清除率、提升耐受性並降低免疫原性。脂質配製劑可保護生物分子免於降解，同時改善其細胞攝入。脂質奈米顆粒為包含多個藉由分子間力彼此物理結合之脂質分子的顆粒。這些包括微球(包括單層和多層囊泡，例如脂質體)、乳劑中之分散相、微胞或懸浮液中之內相。該等脂質奈米顆粒可用於將一或多種核酸或蛋白質封裝以供遞送。含有陽離子性脂質之配製劑可用於遞送聚陰離子，諸如核酸。其他可包括在內之脂質為中性脂質(即，不帶電荷或二性離子性脂質)、陰離子性脂質、增強轉染之輔助脂質以及增加奈米粒子可存在於體內之時間長度的隱形脂質。合適之陽離子性脂質、中性脂質、陰離子性脂質、輔助脂質和隱形脂質之實例可在WO 2016/010840 A1(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)中找到。示例性脂質奈米顆粒可包含陽離子性脂質及一或多種其他組分。於一實例中，另一組分可包含輔助脂質，諸如膽固醇。於另一實例中，其他組分可包含輔助脂質，諸如膽固醇和中性脂質，諸如DSPC。於另一實例中，其他組分可包含輔助脂質，諸如膽固醇、可選擇之中性脂質，諸如DSPC，以及隱形脂質，諸如S010、S024、S027、S031或S033。
該LNP可包含下列群組之一或多者或全部：(i)用於封裝和用於內體逃逸之脂質；(ii)用於穩定化之中性脂質；(iii)用於穩定化之輔助脂質；(iv)隱形脂質。參見，例如Finn et al.(2018)Cell Reports 22:1-9和WO 2017/173054 A1，各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的。在某些LNP中，該遞送物可包含嚮導RNA或編碼嚮導RNA之核酸。於某些LNP中，該遞送物可包含編碼Cas核酸酶之mRNA，諸如Cas9及嚮導RNA或編碼嚮導RNA之核酸。
用於封裝和內體逃逸之脂質可為陽離子性脂質。該脂質亦可為可生物降解之脂質，諸如可生物降解之可離子化脂質。合適之脂質的一種實例為脂質A或LP01，其為(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,12-二烯酸酯，亦稱為3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯。參見，例如Finn et al.(2018)Cell Reports 22:1-9和WO 2017/173054 A1，各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的。合適之脂質的另一實例為脂質B，其為((5-((二甲胺基)甲基)-1,3-伸苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)雙(癸酸酯)，亦稱為((5-((二甲胺基)甲基)-1,3-伸苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)雙(癸酸酯)。另一合適脂質之實例為脂質C，其為2-((4-(((3-(二甲胺基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷醯)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-雙(十八碳-9,12-二烯酸酯)。另一合適之脂質的實例為脂質D，其為3-(((3-(二甲胺基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛醯氧基)十三烷基3-辛基十一酸酯。其他合適之脂質包括三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲胺基)丁酸酯(亦稱為Dlin-MC3-DMA(MC3))。
某些適合用於本文描述之LNP中的該等脂質在活體內為可生物降解的。例如，包含該等脂質之LNP包括其中至少75%之脂質在8、10、12、24、或48小時、或3、4、5、6、7或10天之內從血漿中清除者。另一實例為至少50%之LNP在8、10、12、24、或48小時、或3、4、5、6、7或10天之內從血漿中清除。
該等脂質根據其所在之介質的pH可能為可離子化的。例如，在微酸性介質中，該脂質可被質子化且因此攜帶正電荷。相反地，在微鹼性之介質(諸如，例如其中pH值為約7.35之血液)中，該脂質可能不會質子化，因此不帶電荷。於一些實施態樣中，該脂質在至少約9、9.5或10之pH下可能質子化。該等脂質帶電荷之能力與其固有之pKa有關。例如，該脂質可獨立具有在約5.8至約6.2之範圍內的pKa。
中性脂質具有穩定和改善LNP之加工處理的作用。合適之中性脂質的實例包括多種中性、不帶電荷或二性離子性脂質。適合用於本揭示內容之中性磷脂的實例包括，但不限於5-十七烷基苯-1,3-二醇(間苯二酚)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、磷酸膽鹼(DOPC)、二肉荳蔻醯磷脂醯膽鹼(DMPC)、磷脂醯膽鹼(PLPC)、1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DAPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、卵磷脂醯膽鹼(EPC)、二月桂醯磷脂醯膽鹼(DLPC)、二肉荳蔻醯磷脂醯膽鹼(DMPC)、1-肉荳蔻醯-2-棕櫚醯磷脂醯膽鹼(MPPC)、1-棕櫚醯-2-肉荳蔻醯磷脂醯膽鹼(PMPC)、1-棕櫚醯-2-硬脂醯磷脂醯膽鹼(PSPC)、1,2-二花生醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DBPC)、1-硬脂醯-2-棕櫚醯磷脂醯膽鹼(SPPC)、1,2-二(二十碳醯)-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DEPC)、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼(POPC)、溶血磷脂醯膽鹼、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二亞油醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二肉荳蔻醯磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(DPPE)、棕櫚醯油醯磷脂醯乙醇胺(POPE)、溶血磷脂醯乙醇胺及彼等之組合。例如，中性磷脂可選自由二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)和二肉荳蔻醯磷脂醯乙醇胺(DMPE)所組成之群組。
輔助脂質包括增進轉染之脂質。輔助脂質增進轉染所憑藉之機制可包括增進顆粒穩定性。在某些情況下，輔助脂質可增進膜致融合性。輔助脂質包括類固醇、固醇和烷基間苯二酚。合適之輔助脂質的實例包括膽固醇、5-十七烷基間苯二酚和膽固醇半琥珀酸酯。於一實例中，該輔助脂質可為膽固醇或膽固醇半琥珀酸酯。
隱形脂質包括改變奈米顆粒可在活體內存在之時間長度的脂質。隱形脂質可藉由，例如減少顆粒聚集和控制顆粒大小來協助配製過程。隱形脂質可調節LNP之藥代動力學特性。合適之隱形脂質包括具有連接至脂質部分之親水頭部基團的脂質。
隱形脂質之親水性頭部基團可包含，例如選自基於下列群組之聚合物的聚合物部分：PEG(有時稱為聚(氧化乙烯))、聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(丙三醇)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚胺基酸和聚N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺。術語PEG係指任何聚乙二醇或其他聚伸烷基醚聚合物。於某些LNP配製劑中，該PEG為PEG-2K，亦稱為PEG 2000，其平均分子量為約2,000道耳吞。參見，例如WO 2017/173054 A1，其全文以引用方式併入本文以用於所有目的。
隱形脂質之脂質部分可源自，例如二醯基甘油或二醯基甘油醯胺，包括那些包含二烷基甘油或二烷基甘醯胺基團者，該二烷基甘油或二烷基甘油醯胺基團具有獨立包含約C4至約C40之飽和或不飽和碳原子的烷基鏈長，其中該鏈可包含一或多個官能基，諸如，例如醯胺或酯。該二烷基甘油或二烷基甘油醯胺基團可進一步包含一或多個經取代之烷基。
舉例而言，該隱形脂質可選自下列群組：PEG-二月桂醯甘油、PEG-二肉荳蔻醯基甘油(PEG-DMG)、PEG-二棕櫚醯甘油、PEG-二硬脂醯甘油(PEG-DSPE)、PEG-二月桂醯甘油醯胺、PEG-二肉荳蔻基甘油醯胺、PEG-二棕櫚醯甘油醯胺和PEG-二硬脂醯甘胺醯胺、PEG-膽固醇(1-[8'-(膽固醇-5-烯-3β-氧基)羧醯胺基-3',6'-二氧雜辛基]胺基甲醯-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二(十四碳氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉荳蔻醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DMG)、1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSPE)、1,2-二硬脂醯-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)和1,2-二硬脂基氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSA)。於一特定實例中，該隱形脂質可為PEG 2k -DMG。
配製劑中之LNP可包含不同各別莫耳比之脂質組分。該CCD脂質之mol%可為，例如約30 mol%至約60 mol%、約35 mol%至約55 mol%、約40 mol%至約50 mol%、約42 mol%至約47 mol%、或約45 mol%。該輔助脂質之mol%可為，例如約30 mol%至約60 mol%、約35 mol%至約55 mol%、約40 mol%至約50 mol%、約41mol%至約46 mol%、或約44 mol%。該中性脂質之mol%可為，例如約1 mol%至約20 mol%、約5 mol%至約15 mol%、約7 mol%至約12 mol%、或約9 mol%。隱形脂質之mol%可為，例如約1 mol%至約10 mol%、約1 mol%至約5 mol%、約1 mol%至約3 mol%、約2 mol%或約1 mol%。
LNP之可生物降解之脂質(N)的正電荷胺基團與待封裝之核酸的負電荷磷酸基團(P)之間可具有不同的比率。此可藉由等式N/P以數學方式表示。例如該N/P比可為約0.5至約100，約1至約50，約1至約25，約1至約10，約1至約7，約3至約5，約4至約5，約4，約4.5、或約5。該N/P比亦可為約4至約7、或約4.5至約6。於特定之實例中，該N/P比可為4.5或可為6。
於某些LNP中，該投遞物可包含Cas mRNA和gRNA。Cas mRNA對gRNA之比例可不同。例如該LNP配製劑可包含比例在下列範圍內之Cas mRNA對gRNA核酸比：約25：1至約1：25、約10：1至約1：10、約5：1至約1：5、或約1：1。或者，該LNP配製劑可包含約1：1至約1：5、或約10：1之Cas mRNA對gRNA核酸的比例。或者，該LNP配製劑可包含約1：10、25：1、10：1、5：1、3：1、1：1、1：3、1：5、1：10或1：25之Cas mRNA對gRNA核酸的比例。或者，該LNP配製劑可包含約1：1至約1：2之Cas mRNA對gRNA核酸的比例。於特定之實例中，該Cas mRNA對gRNA之比例可為約1：1或約1：2。
於某些LNP中，該投遞物可包含外源供體核酸和gRNA。外源供體核酸對gRNA之比例可不同。例如，該LNP配製劑可包含在下列範圍內之外源供體核酸對gRNA核酸的比例：約25：1至約1：25、約10：1至約1：10、約5：1至約1：5、或約1：1。或者，該LNP配製劑可包含之外源供體核酸對gRNA核酸的比例少時約1：1至約1：5、約5：1至約1：1、約10：1、或約1：10。或者，該LNP配製劑可包含之外源供體核酸對gRNA核酸的比例為約1：10、25：1、10：1、5：1、3：1、1：1、1：3、1：5、1：10或1：25。
一種合適之LNP的具體實例具有比例為4.5之氮對磷酸酯(N/P)比且含有莫耳比為45：44：9：2之生物可降解的陽離子性脂質、膽固醇、DSPC和PEG2k-DMG。可生物降解之陽離子性脂質可為(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,12-二烯酸酯，亦稱為3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯。參見，例如Finn et al. (2018)Cell Reports 22:1-9(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。Cas9 mRNA 與嚮導RNA之重量比可為1：1。合適之LNP的另一具體實例含有莫耳比為50：38.5：10：1.5之Dlin-MC3-DMA(MC3)、膽固醇、DSPC和PEG-DMG。
合適之LNP的另一具體實例的氮對磷比例(N/P)為6且含有莫耳比為50：38：9：3之可生物降解的陽離子性脂質、膽固醇、DSPC和PEG2k-DMG。該可生物降解之陽離子性脂質可為(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,12-二烯酸酯，亦稱為3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯。Cas9 mRNA對嚮導RNA之重量比可為1：2。
可選擇遞送方式以降低免疫原性。例如Cas蛋白和gRNA可藉由不同模式遞送(例如雙模式遞送)。這些不同模式可賦予該被遞送之分子(例如Cas或編碼之核酸、gRNA或編碼之核酸、或外源供體核酸/修復模板)不同的藥效動力學或藥代動力學性能。例如，不同的模式可導致不同的組織分佈、不同的半衰期或不同的時間分佈。某些遞送模式(例如藉由自主複製或基因組整合而持續存在細胞中之核酸載體的遞送)導致分子更持久的表現和存在，而其他遞送模式為瞬時的且持久性較低(例如RNA或蛋白質之遞送)。以更短暫之方式遞送Cas蛋白(例如以mRNA或蛋白質之形式)可確保Cas/gRNA複合物僅短時間存在且具有活性，並可降低由來自細菌衍生之Cas酶的肽所引起之免疫原性，該細菌衍生之Cas酶係由MHC分子顯示在細胞表面。該等瞬時遞送亦可降低脫靶修飾之可能性。
體內投遞可藉由任何合適之途徑進行，包括，例如腸胃道外、靜脈內、口服、皮下、動脈內、顱內、鞘內、腹膜內、局部、鼻內或肌肉內。全身性投予模式包括，例如口服和腸胃道外途徑。腸胃道外途徑之實例包括靜脈內、動脈內、骨內、肌肉內、皮內、皮下、鼻內和腹膜內途徑。一種具體實例為靜脈內輸注。鼻滴注和玻璃體內注射為其他具體實例。局部投予之模式包括，例如鞘內、腦室內、實質內(例如局部實質內遞送至紋狀體(例如進入尾狀核或進入殼核)、顳葉皮質、中央溝前迴(precentral gyrus)、海馬(例如進入齒狀迴或CA3區)、顳葉皮質、杏仁核(amygdala)、額葉皮質、丘腦(thalamus)、小腦(cerebellum)、延髓(medulla)、下丘腦(hypothalamus)、頂蓋(tectum)、背蓋(tegmentum)或黑質(substantia nigra))、眼內、眼眶內、結膜下、玻璃體內、視網膜下和經鞏膜途徑。與全身投予(例如靜脈內投予)相比較，當局部投予(例如實質內或玻璃體內投予)時，明顯較少量之組分(與全身途徑相比較)即可發揮作用。局部投予模式亦可減少或排除當全身投予治療有效量之組分時可能出現潛在毒性副作用的發生率。
活體內投予可藉由任何合適之途徑進行，包括，例如腸胃道外、靜脈內、口服、皮下、動脈內、顱內、鞘內、腹膜內、局部、鼻內或肌肉內。一種具體之實例為靜脈輸注。包含嚮導RNA和/或Cas蛋白(或編碼嚮導RNA和/或Cas蛋白之核酸)的組成物可使用一或多種生理和醫藥上可接受之載體、稀釋劑、賦形劑或佐劑配製。該配製劑可取決於所選擇之投予途徑。術語"醫藥上可接受的"係指與該配製劑之其他成分相容且對其接受者實質上無害的載體、稀釋劑、賦形劑或佐劑。
投予頻率和劑量數可取決於該外源供體核酸、嚮導RNA或Cas蛋白(或編碼該嚮導RNA或Cas蛋白之核酸)的半衰期和投予途徑等因素。將核酸或蛋白質引入細胞或非人的動物可在一段期間內進行一次或多次。例如，該引入可在一段期間內至少執行二次、在一段期間內至少執行三次、在一段期間內至少執行四次、在一段期間內至少執行五次、在一段期間內至少執行六次、在一段期間內至少執行七次、在一段期間內至少執行八次、在一段期間內至少執行九次、在一段期間內至少執行十次、在一段期間內至少執行11次、在一段期間內至少執行1具體在、在一段期間內至少執行13次、在一段期間內至少執行14次、在一段期間內至少執行15次、在一段期間內至少執行16次、在一段期間內至少執行17次、在一段期間內至少執行18次、在一段期間內至少執行19次、或在一段期間內至少執行20次。E. 測量人白蛋白靶向劑之活體內或離體的遞送、活性或功效
本文所揭示之方法可進一步包含檢測或測量人白蛋白靶向劑之活性。例如，若人白蛋白靶向劑為基因組編輯試劑(例如設計成靶向人白蛋白基因座之CRISPR/Cas)，則測量可包含評估該人化白蛋白基因座之修飾。
可使用各種不同的方法來鑑定具有被靶向之基因修飾的細胞。篩選可包含用於評估親本染色體之等位基因修飾(MOA)的定量分析。參見，例如US 2004/0018626；US 2014/0178879；US 2016/0145646；WO 2016/081923；和Frendewey et al.( 2010)Methods Enzymol. 476:295-307，各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的。例如，該定量分析可經由定量PCR，諸如實時PCR(qPCR)來進行。實時PCR可利用識別靶基因座之第一引物組和識別非被靶向之參考基因座的第二引物組。該引物組可包含識別經擴增之序列的螢光探針。合適之定量分析的其他實例包括螢光介導之原位雜交(FISH)、比較性基因組雜交、等溫DNA擴增、與固定化探針定量雜交、INVADER® 探針、TAQMAN® 分子信標探針或ECLIPSETM 探針技術(參見，例如US 2005/0144655(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的))。
亦可使用次代測序(NGS)來篩選。次代測序亦可稱為"NGS"或"大規模並行測序"或"高通量測序"。除了MOA分析外，可使用NGS作為篩選工具以定義該被靶向之基因修飾的確切性質及其在細胞類型、或組織類型、或器官類型之間是否一致。
評估非人的動物中之人化白蛋白基因座的修飾可在來自任何組織或器官的任何細胞類型進行。例如，該評估可在來自相同組織或器官之多種細胞類型中，或可在來自該組織或器官內之多個位置的細胞中進行。此可提供關於靶組織或器官內之何種細胞類型被靶向或組織或器官內之那些部分被人白蛋白靶向劑觸及的信息。另一實例為該評估可在多種類型之組織中或在多個器官中進行。在其中係靶向特定組織、器官或細胞類型的方法中，此可提供關於該組織或器官被靶向之有效程度及在其他組織或器官中是否存在脫靶效應的信息。
若該試劑被設計成將人化白蛋白基因座去活化、影響該人化白蛋白基因座之表現、防止該人化白蛋白mRNA之轉譯、或清除該人化白蛋白質，則測量可包含評估該人化白蛋白mRNA或蛋白質之表現。該測量可在肝臟內或在肝臟內之特定細胞類型或區域內進行，或者其可涉及測量分泌之人化白蛋白的血清量。
若該試劑為編碼非由野生型內源性白蛋白基因座編碼或表現之外源蛋白質的外源供體核酸，則該測量可包含評估由該外源供體核酸編碼之mRNA的表現或評估該外源蛋白質之表現。該測量可以在肝臟內或肝臟內之特定細胞類型或區域內進行，或者其可涉及測量分泌之外源蛋白質的血清量。於具體之實例中，該外源蛋白質為因子IX蛋白。可選擇地，該評估包含測量非人的動物中之IX因子蛋白的血清量和/或包含評估活化之部分凝血活酶時間或進行凝血酶生成分析。可選擇地，該非人的動物進一步包含去活化之F9基因座且該評估包含測量該非人的動物中因子IX蛋白之血清量和/或包含評估活化之部分凝血活酶時間(aPTT)或進行凝血酶生成分析(TGA)。這些分析在實施例中有更詳細的描述。
可使用之分析的一種實例為BASESCOPETM RNA原位雜交(ISH)分析，該方法可在完整之固定組織的背景下定量細胞特異性編輯之轉錄子，包括單核苷酸變化。該BASESCOPETM RNA ISH分析可在基因編輯表徵中補充NGS和qPCR。雖然NGS/qPCR可提供野生型和編輯之序列的定量平均值，但它們不提供有關組織內編輯之細胞的異質性或百分比之信息。該BASESCOPETM RNA ISH分析可提供整個組織的具體外觀，並藉由單細胞解析相對於編輯之轉錄子定量野生型轉錄子，其中該含有編輯之mRNA轉錄子的靶組織內之實際細胞數可被量化。該BASESCOPETM 分析使用成對之寡(ZZ)探針以在沒有非特異性背景之情況下擴增信號，從而達成單分子RNA檢測。然而，該BASESCOPETM 探針設計和信號擴增系統使得以ZZ探針檢測單分子RNA成為可行，並可差別檢測在完整之固定組織中的單核苷酸編輯和突變。
人化白蛋白或外源蛋白質之生產和分泌可藉由任何已知方法進行評估。例如，可藉由使用已知分析測量非人的動物之肝臟中經編碼之mRNA的量或非人的動物之肝臟中經編碼的蛋白質之量來評估表現。人化白蛋白或外源蛋白質之分泌可藉由使用已知之分析測量非人的動物中經編碼之人化白蛋白或外源蛋白質的血漿水準或血清水準來評估。 IV. 製造包含人化白蛋白基因座之非人的動物之方法
提供用於製造包含如本文他處揭示之人化白蛋白(ALB) 基因座之非人的動物基因組、非人的動物細胞和非人的動物之各種方法。用於產生經基因修飾之生物的任何便利的方法或方案均適合用於產生經基因修飾之非人的動物。參見，例如Cho et al.(2009)Current Protocols in Cell Biology 42:19.11:19.11.1-19.11.22和Gama Sosa et al.(2010)Brain Struct. Funct. 214(2-3):91-109，各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的。該等經基因修飾之非人的動物可，例如透過在被靶向之白蛋白基因座處的基因敲入來產生。
例如，產生包含人化白蛋白基因座之非人的動物之方法可包含(1)修飾多能細胞之基因組以包含人化白蛋白基因座；(2)鑑定或選擇包含該人化白蛋白基因座之經基因修飾的多能細胞；(3)將該經基因修飾之多能細胞引入非人的動物宿主胚胎；及(4)將該宿主胚胎植入代孕母親中並孕育。例如，產生包含人化白蛋白基因座之非人的動物之方法可包含：(1)修飾多能細胞之基因組以包含人化白蛋白基因座；(2)鑑定或選擇包含該人化白蛋白基因座之經基因修飾的多能細胞；(3)將該經基因修飾之多能細胞引入非人的動物宿主胚胎；及(4)在代孕母親中孕育該宿主胚胎。可選擇地，可將包含經修飾之多能細胞(例如非人的ES細胞)的宿主胚胎培育至胚泡階段，然後將其植入並在代孕母親中孕育以產生F0非人的動物。然後，該代孕母親可產生包含人化白蛋白基因座之F0代非人的動物。
該方法可進一步包含鑑定具有經修飾之靶基因組基因座的細胞或動物。可使用多種不同的方法來鑑定具有被靶向之基因修飾的細胞和動物。
修飾該基因組之步驟可，例如利用外源供體核酸(例如靶向載體)來修飾白蛋白基因座以包含本文所揭示之人化白蛋白基因座。一種實例為該靶向載體可用於在內源性白蛋白基因座(例如非人的動物之內源性白蛋白基因座)處產生人化白蛋白基因，其中該靶向載體包含靶向該內源性白蛋白基因座之5'靶序列的5'同源臂和靶向該內源性白蛋白基因座之3'靶序列的3'同源臂。外源供體核酸亦可包含核酸插入子，該核酸插入子包括欲整合在該白蛋白基因座中之DNA節段。將核酸插入子整合在白蛋白基因座中可導致插入子之核酸序列加入該白蛋白基因座中、白蛋白基因座中所感興趣之核酸序列缺失、或替換白蛋白基因座中所感興趣之核酸序列(即缺失和插入)。同源臂可側面鄰接插入核酸，該插入核酸包含人白蛋白序列以產生人化之白蛋白基因座(例如用於刪除內源性白蛋白基因座之節段並以直系同源人白蛋白序列替代)。
該外源供體核酸可為用於非同源端接合介導之插入或同源重組。外源供體核酸可包含脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，其可為單股或雙股的，且可為線性或環狀形式。例如，修復模板可為單股寡去氧核苷酸(ssODN)。
外源供體核酸亦可包含異源序列，該異源序列不存在於未被靶向之內源性白蛋白基因座。例如，外源供體核酸可包含選擇卡匣，諸如側面鄰接重組酶識別位點之選擇卡匣。
某些外源供體核酸包含同源臂。若該外源供體核酸亦包含核酸插入子，則該同源臂可側面鄰接該核酸插入子。為了便於參考，本文中該同源臂稱為5'和3'(即，上游和下游)同源臂。該術語關於該外源供體核酸內該同源臂相對於該核酸插入子的相對位置。5'和3'同源臂對應於該白蛋白基因座內之區域，其在本文中分別稱為"5'靶序列"和"3'靶序列"。
當二個區域彼此共享足夠水準之序列同一性以作為同源重組反應之受質時，同源臂和靶序列係彼此"對應(correspond或corresponding)"。術語"同源性"包括與對應序列相一致或共享序列同一性之DNA序列。在外源供體核酸中發現之介於指定之靶序列與對應的同源臂之間的序列同一性可為允許發生同源重組之任何程度的序列同一性。例如，外源供體核酸之同源臂(或其片段)與靶序列(或其片段)所共享之序列同一性的量可為至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性，從而使該序列發生同源重組。再者，該同源臂和對應之靶序列之間的同源性對應區可為足以促進同源重組的任何長度。於某些靶向載體中，該內源性白蛋白基因座中之預期突變係包含在側面鄰接該同源臂的插入核酸中。
在除了單細胞階段胚胎以外的細胞中，該外源供體核酸可為"大靶向載體"或"LTVEC"，其包括包含同源臂之靶向載體，該同源臂對應於且源自較大之核酸序列，該核酸序列較在其他意圖在細胞中進行同源重組的方法中所通常使用的核酸序列大。LTVEC亦包括包含核酸插入子之靶向載體，該核酸插入子具有較大之核酸序列，該核酸序列較在其他意圖在細胞中進行同源重組的方法中所通常使用的核酸序列大。例如，LTVEC使大基因座之修飾成為可能，該等大基因座由於大小的限制而無法被傳統之基於質粒的靶向載體所容納。例如，該靶向基因座可為(即，5'和3'同源臂可對應於)無法使用常規方法靶向、或僅能被錯誤地靶向、或在缺乏由核酸酶劑(例如Cas蛋白)誘導之切口或雙股斷裂下僅能以非常低之效率被靶向的細胞基因座。LTVEC可具有任何長度且長度通常為至少10 kb。LTVEC中之5'同源臂和3'同源臂的總和通常為至少10 kb。
篩選步驟可包含，例如用於評估親本染色體之等位基因(MOA)修飾的定量分析。例如，可經由定量PCR，諸如實時PCR(qPCR)來進行定量分析。實時PCR可利用識別靶基因座之第一引物組和識別非被靶向之參考基因座的第二引物組。該引物組可包含識別經擴增之序列的螢光探針。
合適之定量分析法的其他實例包括由螢光介導之原位雜交(FISH)、比較性基因組雜交、等溫DNA擴增、與固定化探針之定量雜交、INVADER® 探針、TAQMAN® 分子信標探針或ECLIPSETM 探針技術(參見，例如US 2005/0144655，其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。
合適之多能細胞的實例為胚胎幹(ES)細胞(例如小鼠ES細胞或大鼠ES細胞)。經  修飾之多能細胞可，例如透過下列步驟藉由重組產生：(a)將一或多個包含插入核酸之外源供體核酸(例如靶向載體)引入細胞中，該插入核酸側面鄰接，例如對應於5'和3'靶位點之5'和3'同源臂，其中該插入核酸包含人白蛋白序列以產生人化之白蛋白基因座；和(b)鑑定至少一種細胞，該細胞在其基因組中包含被整合在該內源性白蛋白基因座之插入核酸(即，鑑定至少一種包含人化白蛋白基因座的細胞)。該經修飾之多能細胞可，例如透過重組產生，該重組係藉由下列步驟進行：(a)將一或多個包含插入核酸之靶向載體引入細胞中，該插入核酸側面鄰接對應於5'和3'靶位點之5'和3'同源臂，其中該插入核酸包含人化白蛋白基因座；和(b)鑑定至少一種細胞，該細胞在其基因組中包含被整合在靶基因組基因座之插入核酸。
或者，該經修飾之多能細胞可藉由下列步驟產生：(a)在細胞中引入：(ⅰ)核酸酶劑，其中該核酸酶劑在內源性白蛋白基因座內之靶位點誘導切口或雙股斷裂；和(ii)一或多種外源供體核酸(例如靶向載體)，其可選擇地包含插入核酸，該插入核酸側面鄰接，例如對應於位於與核酸酶靶位點足夠接近之5'和3'靶位點的5'和3'同源臂，其中該插入核酸包含人白蛋白序列以產生人化白蛋白基因座；和(c)鑑定至少一種細胞，該細胞在其基因組中包含被整合在該內源性白蛋白基因座之插入核酸(即，鑑定至少一種包含人化白蛋白基因座的細胞)。或者，該經修飾之多能細胞可藉由下列步驟產生：(a)在細胞中引入：(ⅰ)核酸酶劑或編碼該核酸酶劑之核酸，其中該核酸酶劑在該內源性白蛋白基因座內之靶位點誘導切口或雙股斷裂；和(ii)一或多種外源供體核酸(例如靶向載體)，其可選擇地包含插入核酸，該插入核酸側面鄰接，例如對應於位於與核酸酶靶位點足夠接近之5'和3'靶位點的5'和3'同源臂，其中該插入核酸包含人白蛋白序列以產生人化白蛋白基因座；和(c)鑑定至少一種細胞，該細胞在其基因組中包含被整合在該內源性白蛋白基因座之插入核酸(即，鑑定至少一種包含人化白蛋白基因座的細胞)。或者，該經修飾之多能細胞可藉由下列步驟產生：(a)在細胞中引入：(ⅰ)核酸酶劑，其中該核酸酶劑在靶基因組基因座內之識別位點誘導切口或雙股斷裂；和(ii)一或多種靶向載體，其包含插入核酸，該插入核酸側面鄰接對應於位於與識別位點足夠接近之5'和3'靶位點的5'和3'同源臂，其中該插入核酸包含人化白蛋白基因座；和(c)鑑定至少一種細胞，其包含在靶基因組基因座之修飾(例如插入核酸之整合)。可使用任何可在所需之識別位點誘導切口或雙股斷裂之核酸酶劑。或者，該經修飾之多能細胞可藉由下列步驟產生：(a)在細胞中引入：(ⅰ)核酸酶劑或編碼該核酸酶劑之核酸，其中該核酸酶劑在靶基因組基因座內之識別位點誘導切口或雙股斷裂；和(ii)一或多種靶向載體，其包含插入核酸，該插入核酸側面鄰接對應於位於與識別位點足夠接近之5'和3'靶位點的5'和3'同源臂，其中該插入核酸包含人化白蛋白基因座；和(c)鑑定至少一種細胞，其包含在靶基因組基因座之修飾(例如插入核酸之整合)。可使用任何可在所需之識別位點誘導切口或雙股斷裂之核酸酶劑。合適之核酸酶的實例包括轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN)、鋅指核酸酶(ZFN)、巨核酸酶和成簇之規則穿插的短回文重複序列(CRISPR)/CRISPR相關(Cas)系統(例如CRISPR)/Cas9系統)或該等系統之組分(例如CRISPR/Cas9)。參見，例如US 2013/0309670和US 2015/0159175，各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的。
供體細胞可在任何階段，諸如胚泡階段或前桑椹胚階段(即，4細胞期或8細胞期)引入宿主胚胎中。產生能夠透過種系傳遞該基因修飾之後代。參見，例如美國專利案編號7,294,754(其全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。
或者，產生本文他處描述之非人的動物之方法可包含：(1)使用上述用於修飾多能細胞之方法修飾單細胞階段胚胎之基因組以包含人化白蛋白基因座；(2)選擇經基因修飾之胚胎；和(3)將經基因修飾之胚胎植入代孕母親並孕育之。或者，產生本文他處描述之非人的動物之方法可包含：(1)使用上述用於修飾多能細胞之方法修飾單細胞階段胚胎之基因組以包含人化白蛋白基因座；(2)選擇經基因修飾之胚胎；和(3)在代孕母親中孕育該經基因修飾之胚胎。產生能夠透過種系傳遞該基因修飾之後代。
亦可使用核轉移技術來產生非人的哺乳動物。簡而言之，核轉移之方法可包括下列步驟：(1)將卵母細胞去核或提供去核卵母細胞；(2)分離或提供將與該去核卵母細胞結合之供體細胞或核；(3)將細胞或細胞核插入該去核之卵母細胞中以形成重構成之細胞；(4)將該重構成之細胞植入動物子宮內以形成胚胎；和(5)允許胚胎發育。於該等方法中，卵母細胞通常係從死亡之動物收回，雖然其亦可從存活動物之輸卵管和/或卵巢中分離出。去核之前，可將卵母細胞在各種不同之眾所周知的培養基中成熟。卵母細胞可以多種為人熟知之方式進行去核。在融合前，藉由在透明帶下顯微注射供體細胞可將供體細胞或細胞核插入去核之卵母細胞中以形成重構成的細胞。融合可藉由下列方法誘導：在接觸/融合平面上施加DC電脈衝(電融合)、將細胞暴露於融合促進化學物質(諸如聚乙二醇)或藉由去活化之病毒(諸如仙台病毒)。重構成之細胞可在核供體和受體卵母細胞融合之前、融合期間和/或融合之後藉由電和/或非電方式活化。活化方法包括電脈衝、由化學方法誘導之電擊、精子穿透、增加卵母細胞中之二價陽離子的量及降低卵母細胞中之細胞蛋白的磷酸化程度(藉由激酶抑制劑)。可將活化之重構成的細胞或胚胎培養在眾所周知之培養基中，然後再轉移至動物的子宮中。參見，例如US 2008/0092249、WO 1999/005266、US 2004/0177390、WO 2008/017234和美國專利案編號7,612,250，各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的。
本文提供之各種方法允許產生經基因修飾之非人的F0動物，其中該經基因修飾之F0動物的細胞包含人化白蛋白基因座。眾所公認的是，根據用於產生F0動物之方法，該F0動物中具有人化白蛋白基因座之細胞數目將有不同。經由，例如VELOCIMOUSE® 方法將供體ES細胞引入來自對應之生物體的前桑椹胚期胚胎(例如8細胞期之小鼠胚胎)中可允許F0動物之較大百分比的細胞群包含具有所感興趣之核苷酸序列的細胞，該所感興趣之核苷酸序列包含被靶向之基因修飾。例如，至少50%、60%、65%、70%、75%、85%、86%、87%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之非人的F0動物之細胞貢獻可包含具有被靶向之修飾的細胞群。
經基因修飾之F0動物的細胞在人化白蛋白基因座方面可為異型合子，或者在人化白蛋白基因座方面可為同型合子。
上文或下文中所引用之所有專利文件、網站、其他出版物、登錄號，等之全文均以引用方式併入本文以用於所有目的，其程度如同各單獨項目被具體且個別指明以引用方式併入本文。若序列之不同版本與不同時間之登錄號相關，則指的是與本申請案之有效提交日期之登錄號相關的版本。有效提交日期係指與該登錄號相關之實際提交日期，或優先權申請案之提交日期(若有的話)中的較早者。同樣地，若出版物、網站，等之不同版本在不同時間發表，則除非另外指明，否則係指最接近本申請案之有效提交日期所發表的版本。除非另外具體指明，否則本發明之任何特性、步驟、要素、實施態樣或態樣可與任何其他特性、步驟、要素、實施態樣或態樣組合使用。雖然為了清楚和理解之目的本發明已藉由圖示和實例詳細描述，顯而易見的是，本發明可在所附之申請專利範圍內進行某些變化和修飾。序列簡單描述
使用用於核苷酸鹼基之標準字母縮寫和用於胺基酸之三字母代碼顯示所附之序列表中列出之核苷酸和胺基酸序列。核苷酸序列遵循標準約定，從序列之5'端開始向前(即，每行中從左到右)至3'端。每個核苷酸序列僅顯示一股，應理解的是，任何關於該顯示之股的引用均包括互補股。應理解的是，當提供編碼胺基酸序列之核苷酸序列時，亦提供其編碼相同胺基酸序列之密碼子簡併變體。該胺基酸序列遵循標準約定，從序列之胺基端開始向前(即，每行中從左到右)至羧基'端。
Figure 02_image007
Figure 02_image009
實施例 實施例 1. 產生包含人化白蛋白 (ALB ) 基因座之小鼠。
產生大型靶向載體(LTVEC)以使用17.3 kb(17,335bp)之對應的人白蛋白(Alb )序列(來自RP11-31P12)替代來自小鼠白蛋白(Alb )基因之14.4 kb(14,376bp)的區域，該大型靶向載體(LTVEC)包含5'同源臂和3'同源臂，該5'同源臂包含20 kb之小鼠白蛋白(Alb )基因座(來自bMQ-127G8)，該3'同源臂包含127 kb之小鼠白蛋白(Alb )基因座(來自bMQ-127G8)。表 3 提供關於小鼠和人白蛋白之信息。使用VELOCIGENE基因工程技術透過細菌同源重組(BHR)反應來產生源自細菌人工染色體(BAC)DNA的大靶向載體(LTVEC)及其使用方法描述於，例如US 6,586,251和Valenzuela et al.(2003)Nat. Biotechnol. 21(6):652-659(各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)中。透過體外組裝方法產生LTVEC之方法例描述於，例如US 2015/0376628和WO 2015/200334(各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)中。
Figure 02_image011
具體地說，從小鼠白蛋白(Alb )基因座刪除從ATG起始密碼子到終止密碼子的區域(即，編碼外顯子1至14)。插入從ATG起始密碼子到終止密碼子下游100 bp之人白蛋白(ALB )的對應區域以替代該被刪除之小鼠區域。將loxP-mPrm1-Crei-pA-hUb1-em7-Neo-pA-loxP卡匣(4766 bp)插入人3'UTR之下游，在3'UTR之後，緊接在該卡匣之前具有〜100bp之緩衝區。此為MAID 7626等位基因。參見，第 1A 圖 。刪除卡匣之後，loxP和選殖位點(38bp)保持在人3'UTR下游，在3'UTR之後，緊接在該保留之loxP位點之前具有100bp之3'人序列的緩衝區。此為MAID 7627等位基因。參見第 1B 圖 。
小鼠白蛋白信號肽、前肽和血清白蛋白之序列分別顯示於SEQ ID NO：2至4中，而對應之編碼序列分別列舉於SEQ ID NO：10至12中。人白蛋白信號肽、前肽和血清白蛋白之序列分別列舉於SEQ ID NO：6至8中，而對應之編碼序列分別列舉於SEQ ID NO：14至16中。預期之經編碼的人化白蛋白與人白蛋白相一致。參見第 1A 和1B 圖 。小鼠和人白蛋白與人化白蛋白之比對提供於第 3A 至3B 圖 中。小鼠和人Alb /ALB 編 碼序列分別列舉於SEQ ID NO：9和13中。小鼠和人白蛋白序列分別列舉於SEQ ID NO：1和5中。預期之人化ALB 編碼序列和預期之人化白蛋白序列分別列舉於SEQ ID NO：13和5中。
為了產生突變體等位基因，將上文中描述之大型靶向載體引入F1H4小鼠胚胎幹細胞中。F1H4小鼠ES細胞源自雜種胚胎中，該雜種胚胎係藉由將雌性C57BL/6NTac小鼠與雄性12956/SvEvTac小鼠雜交來產生。參見，例如US 2015-0376651和WO 2015/200805(各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。在抗生素選擇後，挑出菌落，擴增之，並藉由TAQMAN® 篩選。參見第 2 圖 。使用表 4 中列出之引物和探針進行等位基因丟失分析以檢測內源性小鼠等位基因的丟失，並進行等位基因獲得分析以檢測人化等位基因的獲得。
Figure 02_image013
包括等位基因丟失(LOA)和等位基因獲得(GOA)分析之等位基因修飾(MOA)分析描述於，例如US 2014/0178879；US 2016/0145646；WO 2016/081923；和Frendewey et al.( 2010)Methods Enzymol. 476:295-307(各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)中。該等位基因丟失(LOA)分析反轉傳統的篩選邏輯並量化該突變所針對之天然基因座的基因組DNA樣本中之副本數。在被正確靶向之雜合細胞選殖株中，該LOA分析檢測二個天然等位基因(不在X或Y染色體上之基因)的其中一者，另一等位基因被該靶向修飾破壞。相同原理可反向應用來作為等位基因獲得(GOA)分析以量化基因組DNA樣本中之插入的靶向載體之副本數。
使用VELOCIMOUSE® 方法從經修飾之ES細胞產生F0小鼠。具體地說，使用VELOCIMOUSE® 方法將藉由上述MOA分析所選擇之包含上述人化白蛋白基因座的小鼠ES細胞選殖株注射入8細胞階段胚胎。參見，例如US 7,576,259；US 7,659,442；US 7,294,754；US 2008/0078000；和Poueymirou et al.(2007)Nat. Biotechnol . 25(1):91-99(各篇之全文以引用方式併入本文以用於所有目的)。在VELOCIMOUSE® 方法中，將被靶向之小鼠胚胎幹(ES)細胞透過雷射輔助之注射注入前桑椹胚期胚胎(例如八細胞階段胚胎)，該前桑椹胚期胚胎有效地產生完全源自ES-細胞之F0代小鼠。在VELOCIMOUSE® 方法中，將該注射之前桑椹胚期胚胎培養至胚泡期，將該胚泡期之胚胎引入並在代孕母親中孕育以產生F0代小鼠。當從用於靶向修飾之小鼠ES細胞選殖株同型合子開始時，產生用於靶向修飾之F0小鼠同型合子。當從用於靶向修飾之小鼠ES細胞選殖株異型合子開始時，進行後續育種以產生用於靶向修飾之小鼠同型合子。實施例 2. 驗證包含人化白蛋白 (ALB ) 基因座之小鼠
為了驗證人化白蛋白小鼠，使用人和小鼠血清白蛋白ELISA套組(分別為Abcam ab179887和ab207620)測量血漿樣本中之小鼠和人白蛋白量。用於驗證之人化小鼠為F1小鼠，其中該自刪除選擇卡匣已被自刪除。在正常人血漿和人化白蛋白小鼠之血漿樣本中檢測到人白蛋白，但在野生型(WT)小鼠或VelocImmune(VI)小鼠血漿樣本中未檢測到。參見第 4 圖 。在野生型小鼠血漿樣本和VI小鼠血漿樣本中檢測到小鼠白蛋白，但在人化白蛋白小鼠之血漿樣本中未檢測到。參見第 5 圖 。特別是，匯集之常人血漿(購自George King-Biomedical Inc.)具有約30至40mg/mL之人白蛋白。人化白蛋白小鼠血漿具有約10至15mg/mL之人白蛋白，但無法檢測到小鼠白蛋白。正常之VI和WT小鼠血漿中具有約7至13 mg/mL之小鼠白蛋白。實施例 3. 驗證包含人化白蛋白 (ALB) 基因座之小鼠 - 用於 F9 插入之靶向人白蛋白的嚮導 RNA 。
為了進一步驗證該人化白蛋白小鼠，使用人化白蛋白小鼠來評估CRISPR/Cas9技術於將F9 轉基因整合入白蛋白基因座中的用途。具體而言，吾人測試該經整合之人F9帕多瓦(Padua)變體(hF9-R338L)在同型合子人化白蛋白小鼠中之整合及表現。針對人白蛋白基因座之內含子1設計不同之嚮導RNA。使用ALBhu/hu 小鼠建立二個單獨的小鼠實驗以篩選總共11個嚮導RNA，各自靶向人白蛋白基因座之第一內含子。在實驗的第0天，為所有小鼠稱重並經由尾靜脈注射。在第1、3、4和6週經由尾部血流收集血液，並分離血漿。在第7週殺死小鼠。經由腔靜脈收集血液並分離出血漿。亦解剖肝和脾。表 5 中提供這些嚮導RNA之嚮導序列(DNA靶向節段)。
Figure 02_image015
在第一個實驗中，測試分別包含Cas9 mRNA及各別之下列六個嚮導RNA的LNP：G009852、G009859、G009860、G009864、G009874和G012764。將LNP稀釋至0.3 mg/kg(使用之平均重量為30克)並與AAV8共同注射，該AAV8與雙向hF9 插入模板(SEQ ID NO：63；ITR-剪接受體-hF9(外顯子2-8)-bGH-SV40 polyA密碼子優化之hF9-pLac-pMB-剪接受體-Kan抗性)一起包裝，劑量為每隻小鼠3E11病毒基因組。為每組5隻12至14週齡之ALBhu/hu 雄性小鼠進行注射。為來自同一小組的五隻小鼠注射AAV8，該AAV8與可操作地連接至hF9 之CAGG啟動子(SEQ ID NO：64；CAGG-ITR-hF9-WPRE-bGH-ITR-pLac-pMB-Amp抗性)一起包裝，此導致hF9 之游離基因表現(劑量為每隻小鼠3E11病毒基因組)。三個陰性對照組為每組三隻小鼠，該小鼠分別注射單獨之緩衝液、單獨之與雙向hF9 插 入模板一起包裝的AAV8，或單獨之LNP -G009874。
在第二個實驗中，單獨測試包含Cas9 mRNA及各自包含下列六個嚮導RNA的LNP：G009860、G012764、G009844、G009857、G012752、G012753和G012761。將LNP稀釋至0.3 mg/kg(使用之平均重量為40克)，並與AAV8共同注射，該AAV8與雙向hF9 插 入模板(SEQ ID NO：63)一起包裝，劑量為每隻小鼠3E11病毒基因組。為每組5隻30週齡之ALBhu/hu 雄性小鼠進行注射。為來自同一小組的五隻小鼠注射AAV8，該AAV8與可操作地連接至hF9 之CAGG啟動子(SEQ ID NO：64)一起包裝，此導致hF9 之游離基因表現(劑量為每隻小鼠3E11病毒基因組)。三個陰性對照組為每組三隻小鼠，分別為小鼠注射單獨之緩衝液、單獨之與雙向hF9 插 入模板一起包裝的AAV8，或單獨之LNP -G009874。
為了分析，進行ELISA以測量每個時間點在小鼠體內循環的hFIX量。為了此目的，使用人因子IX ELISA套組(ab188393)並在所有盤中使用來自George King Bio-Medical之人類匯集的正常血漿進行運作以作為陽性分析對照組。各組在注射後第6週之血漿樣本中的人因子IX表現水準顯示於第 6A 和6B 圖 中。與體外插入數據一致，當使用嚮導RNA G009852時，低至無因子IX的血清量未檢測到。與人白蛋白中缺乏相鄰PAM序列相一致，當使用嚮導RNA G009864時無法檢測到因子IX血清量。G009864之嚮導序列(DNA靶向節段)為UACUUUGCACUUUCCUUAGU (SEQ ID NO：61)，且其靶向獼猴基因組座標(mf5)chr5：61199187-61199207。其他嚮導RNA中有數個(包括G009857、G009859、G009860、G009874和G0012764)在血清中觀察到因子IX表現。
將脾臟和所有肝臟之左外側葉的一部分提交進行下一代測序(NGS)分析。在注射AAV-hF9 供體和LNP-CRISPR/Cas9後第7週，使用NGS來評估在人化白蛋白基因座處具有插入/缺失(indels)之肝細胞的百分比。與人白蛋白中缺乏相鄰PAM序列相一致，當使用嚮導RNA G009864 時，在肝臟中未檢測到編輯。使用嚮導RNA G009859、G009860、G009874和G012764時，這些組別之肝臟中觀察到編輯(數據未顯示)。
將剩餘之肝臟在10%中性緩衝之福爾馬林中固定24小時，然後轉移到70%乙醇中。從不同之肝臟葉片切下四至五個樣本並運送至HistoWisz，將其加工處理並包埋在石蠟塊中。然後從每個石蠟塊切出五微米切片，在Ventana Ultra Discovery(羅氏公司)上，利用通用BASESCOPETM 程序和由Advanced Cell Diagnostics提供之試劑及訂製設計之靶向獨特mRNA連接點的探針進行BASESCOPETM 分析，該獨特之mRNA連接點係當成功達成整合和轉錄後，在來自ALBhu/hu 白蛋白基因座之第一內含子的人白蛋白信號列與hF9 轉基因之間形成。然後使用HALO成像軟體(Indica Labs)來量化每個樣本中之陽性細胞的百分比。然後將每隻動物之多個肝臟葉片間的陽性細胞百分比的平均值與第7週之血清中的hFIX量關聯化。結果顯示於第 7 圖 和表 6 中。第7週之血清量與hALB-hFIX mRNA之%陽性細胞高度相關(r = 0.89；R2 = 0.79)。
Figure 02_image017
實施例 4. 驗證在 F9 KO 小鼠中包含人化白蛋白 (ALB) 基因座 -F9 插 入子之小鼠
為了進一步驗證人化白蛋白小鼠，將人化白蛋白小鼠與F9 基 因剔除小鼠雜交以產生ALBm/hu xF9-/- 小鼠(用於人化白蛋白基因座之異型合子和F9基因剔除之同型合子)以用於評估使用CRISPR/Cas9技術來將F9轉基因整合入該白蛋白基因座中。
然後使用人化白蛋白F9 KO小鼠來測試將人F9 帕多瓦(Padua)變體(hF9-R338L)轉基因插入人化白蛋白基因座之內含子1中。在實驗之第0天，將所有小鼠稱重並經由尾靜脈注射。在第1和第3週經由尾部血流收集血液，並分離血漿。在第4週將小鼠殺死。經由腔靜脈收集血液，並分離血漿。亦解剖肝和脾。
測試分別包含Cas9 mRNA及下列二個嚮導RNA之LNP：G009860(靶向人白蛋白基因座之第一內含子)和G000666(靶向小鼠白蛋白基因座之第一內含子)。表 5 中提供G009860之嚮導序列(DNA靶向節段)。G000666之嚮導序列為CACUCUUGUCUGUGGAAACA(SEQ ID NO：62)且其靶向小鼠基因組座標(mm10)chr 5：90461709-90461729。將G009860稀釋至0.3 mg/kg並將G000666稀釋至1.0 mg/kg(使用之平均重量為31.2克)，然後將二者與AAV8共同注射，該AAV8與雙向hF9 插 入模板(SEQ ID NO：63)一起包裝，劑量為每隻小鼠3E11病毒基因組。為每組5隻之ALBms/hu xF9 -/- 雄性小鼠(16週齡)進行注射。為來自同一小組的5隻小鼠注射AAV8，該AAV8與可操作地連接至hF9 之CAGG啟動子(SEQ ID NO：64)一起包裝(劑量為每隻小鼠3E11病毒基因)，此導致hF9 之游離基因表現。有六隻陰性對照組動物，每組中有一隻小鼠注射單獨之緩衝液或單獨之與雙向hF9 插 入模板一起包裝的AAV8，每組中有二隻小鼠分別注射劑量為0.3mg/kg和1.0 mg/kg之單獨的LNP-G009860或LNP-G000666/kg。
為了分析，進行ELISA以測量每個時間點小鼠中之循環hFIX的量。為了此目的，使用人因子IX ELISA套組(ab188393)並在所有盤中使用來自George King Bio-Medical之人類匯集的正常血漿進行運作以作為陽性分析對照組。將脾臟和所有肝臟之左外側葉的一部分提交進行NGS分析。
注射後第1、2和4週各組之血漿樣本中的人因子IX表現水準顯示於第 8 圖 和表 7 中。另外，顯示肝臟和脾臟中之白蛋白基因座處之插入和缺失(插入/缺失)水準的NGS結果顯示於表 7 中。如第 8 圖 和表 7 中所示，在1、3和4週之經治療之Alb+/hu xF9 -/- 小鼠的血漿中檢測到hFIX，ELISA顯示在1、3和4週之表現值為0.5至10μg/mL。
Figure 02_image019
將剩餘之肝臟在10%中性緩衝之福馬林中固定24小時，然後轉移到70%乙醇中。從分別之肝臟葉片切下四至五個樣本並運送至HistoWisz，將其加工處理並包埋在石蠟塊中。然後從每個石蠟塊切出五微米切片，在Ventana Ultra Discovery(羅氏公司)上利用通用BASESCOPETM 程序和由Advanced Cell Diagnostics提供之試劑及訂製設計之靶向獨特mRNA連接點之探針經由BASESCOPETM 進行分析，該獨特之mRNA連接點係當成功達成整合和轉錄後，在來自ALBhu/hu 小鼠之各別白蛋白基因座之第一內含子的人或小鼠白蛋白信號序列與hF9 轉基因之間形成。使用HALO成像軟體(Indica Labs)來量化每個樣本中之陽性細胞的百分比。
接著，使用終端血液藉由活化之部分凝血活酶時間(aPTT)和凝血酶生成分析(TGA)來評估功能性凝血活性。活化之部分凝血活酶時間(aPTT)為血漿中內源途徑凝血活性之臨床測量值。藉由添加鞣花酸或高嶺土誘導血漿凝固，鞣花酸和高嶺土二者均會活化凝血之內源途徑(稱為接觸途徑)中的凝血因子XII，一旦凝血酶被活化，其隨後導致從纖維蛋白原生成纖維蛋白。aPTT分析提供個體產生凝血塊之能力的評估，而該信息可用於決定出血或血栓形成的風險。為了測試aPTT，使用半自動化台式系統(Diagnostica Stago STart 4)，以機電式血塊檢測方法(基於黏性之檢測系統)來評估血漿凝固。在每個具有鋼球的小玻璃管中添加50μL之檸檬酸鹽血漿並在37℃培育5分鐘，然後在37℃下，藉由加入50μL之鞣花酸(最終濃度為30μM)共300秒來觸發凝血。在每個小玻璃管中添加50μL之0.025 M氯化鈣(最終濃度為8 mM)最終活化凝血後，該鋼球開始在二個驅動線圈之間來回擺動。藉由接收線圈檢測球的運動。纖維蛋白的產生會增加血漿黏度，直到球停止移動為止，此記錄為凝血時間。測量的唯一參數是凝血時間。以一式二份運作。
凝血酶生成分析(TGA)為經活化之血漿中凝血酶生成動力學的非臨床評估。凝血酶生成為凝血之必要過程，因為凝血酶負責活化其他凝血因子並使額外之凝血酶(經由FXI活化)增殖以將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白。凝血酶生成分析可估算個人產生凝血酶之能力且該信息可用於測定出血或血栓形成之風險。為了進行TGA，使用經校準之自動化血栓圖在分光光度計(ThrombinographTM ，Thermo Scientific)中評估凝血酶生成量。在高通量實驗方面，使用96孔盤(Immulon II HB)。在每個孔中加入55μL檸檬酸化血漿(以生理鹽水4倍稀釋小鼠血漿)並在37℃下培育30分鐘。藉由在37℃下加入15μL之2μM鞣花酸(最終濃度為0.33μM)45分鐘來觸發凝血酶生成。在每個孔中自動注入15μL螢光生成受質與16 mM CaCl2 (FluCa；Thrombinoscope BV)後測定凝血酶生成。該螢光生成受質與產生之凝血酶反應，在460 nm下每33秒測量血漿一次，持續90分鐘。該螢光強度與凝血酶之蛋白水解活性成正比。追踪測量之主要參數為滯後時間、生成之凝血酶峰值、達到凝血酶生成峰值之時間和內源凝血酶潛力(ETP)。該滯後時間提供初次在血漿中檢測到凝血酶所需之時間的估計。峰值為活化後在指定時間生成之凝血酶的最大量。達到凝血酶生成峰值之時間為從凝血級聯反應開始到凝血酶生成達到峰值的時間。ETP為在測量之60分鐘內產生的凝血酶總量。以一式二份運作。
如第 9 圖 和表 8 中所示，在aPTT分析中使用小鼠白蛋白gRNA或人白蛋白gRNA插入ħ F9 轉基因顯示出回復凝血功能。生理鹽水、僅AAV和僅LNP之陰性對照樣本顯示出45至60秒之延長的aPTT時間。陽性對照組CAGG和測試樣本(AAV8 + LNP)接近28至34秒之正常人aPTT。
Figure 02_image021
如第 10A 、10B 和11 圖 及表 8 中所示，在TGA-EA分析中使用小鼠白蛋白gRNA或人白蛋白gRNA插入ħ F9 轉基因顯示出凝血酶生成增加。與陰性對照樣本相比較，陽性對照組CAGG和AAV8 + LNP中之凝血酶濃度較高。
總結，在1、3和4週時，Alb+/hu /F9-/- 小鼠之血漿中檢測到hFIX且發現該表現之hFIX-R338L具有功能，因為在TGA分析中產生凝血酶且aPTT凝血時間改善。
[第 1A 圖 ](未按比例)顯示具有新黴素選擇卡匣(MAID 7626)之人化小鼠白蛋白(Alb)基因座之示意圖。接合點A、B和C之序列分別列於SEQ ID NO：19至21中。
[第 1B 圖 ](未按比例)顯示去除新黴素選擇卡匣(MAID 7626)之後的人化小鼠白蛋白(Alb)基因座之示意圖。接合點A和D之序列分別列於SEQ ID NO：19和22中。
[第 2 圖 ](未按比例)顯示用於篩選人化之小鼠白蛋白(Alb)基因座的TAQMAN® 探針二位置。等位基因獲得(GOA)探針包括7626hU和7626hD。等位基因丟失(LOA)探針包括7626mTU和7626mTD。
[第 3A 和3B 圖 ]顯示小鼠(小鼠Alb)、人(人Alb)和人化(7626HumIn Prot)白蛋白之比對。方框內之殘基構成該信號肽。虛線表示該血清白蛋白肽序列。粗實線表示前肽序列。該人化白蛋白中之所有殘基均由引入之人類外顯子編碼。
[第 4 圖 ]顯示來自人化白蛋白小鼠(ALBhu/hu) 和野生型(WT)小鼠之血漿樣本中的人白蛋白量。使用匯集之正常人血漿(George King-Biomedical Inc.)作為陽性對照組。使用VelocImmune(VI)小鼠作為陰性對照組。
[第 5 圖 ]顯示來自人化白蛋白小鼠(ALBhu/hu) 和野生型(WT)小鼠之血漿樣本中的小鼠白蛋白量。使用匯集之正常人血漿(George King-Biomedical Inc.)作為陰性對照組。使用VI小鼠作為陽性對照組。
[第 6A 和6B 圖 ]顯示來自人化白蛋白小鼠之AAV-hF9 插入子的人因子IX血漿含量。
[第 7 圖 ]顯示為注射AAV-hF9 供體和LNP-CRISPR/Cas9後第7週，藉由BASESCOPETM 所測定之人因子IX血漿含量相對於hALB-hFIX mRNA陽性細胞的百分比繪製之圖形。
[第 8 圖 ]顯示來自ALBm/hu xF9-/- 小鼠之AAV-hF9 插入子的人因子IX血漿含量。
[第 9 圖 ]顯示人血漿樣本和來自插入AAV-hF9 之ALBm/hu xF9-/- 小鼠的小鼠血漿樣本中的aPTT效果。
[第 10A 和10B 圖 ]顯示TGA-EA變化形廓。第 10A 圖 顯示人類正常和因子IX缺失之血漿樣本的TGA-EA變化形廓。第 10B 圖 顯示來自插入AAV-hF9 之 ALBm/hu xF9-/- 小鼠之小鼠血漿的TGA-EA變化形廓。
[第 11 圖 ]顯示來自插入AAV-hF9 之ALBm/hu xF9-/- 小鼠的小鼠血漿樣本中之凝血酶生成。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
Figure 12_A0101_SEQ_0067
Figure 12_A0101_SEQ_0068
Figure 12_A0101_SEQ_0069
Figure 12_A0101_SEQ_0070
Figure 12_A0101_SEQ_0071
Figure 12_A0101_SEQ_0072
Figure 12_A0101_SEQ_0073
Figure 12_A0101_SEQ_0074
Figure 12_A0101_SEQ_0075
Figure 12_A0101_SEQ_0076
Figure 12_A0101_SEQ_0077
Figure 12_A0101_SEQ_0078
Figure 12_A0101_SEQ_0079
Figure 12_A0101_SEQ_0080
Figure 12_A0101_SEQ_0081
Figure 12_A0101_SEQ_0082
Figure 12_A0101_SEQ_0083
Figure 12_A0101_SEQ_0084
Figure 12_A0101_SEQ_0085
Figure 12_A0101_SEQ_0086
Figure 12_A0101_SEQ_0087
Figure 12_A0101_SEQ_0088
Figure 12_A0101_SEQ_0089
Figure 12_A0101_SEQ_0090

Claims (87)

  1. 一種非人的動物，該非人的動物在其基因組中包含人化內源性白蛋白基因座，其中該內源性白蛋白基因座的節段已被刪除並以對應之人白蛋白序列替代。
  2. 如請求項1之非人的動物，其中該人化內源性白蛋白基因座編碼包含人血清白蛋白肽之蛋白質。
  3. 如請求項1或2之非人的動物，其中該人化內源性白蛋白基因座編碼包含人白蛋白前肽之蛋白質。
  4. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中該人化內源性白蛋白基因座編碼包含人白蛋白信號肽之蛋白質。
  5. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中包含編碼序列和非編碼序列之該內源性白蛋白基因座的區域已被刪除並以包含編碼序列和非編碼序列之對應的人白蛋白序列替代。
  6. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中該人化內源性白蛋白基因座包含內源性白蛋白啟動子，其中該人白蛋白序列係與該內源性白蛋白啟動子可操作地連接。
  7. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中該內源性白蛋白基因座中至少一個內含子和至少一個外顯子已被刪除並以對應之人白蛋白序列替代。
  8. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中該內源性白蛋白基因座的整個白蛋白編碼序列已被刪除並以對應之人白蛋白序列替代。
  9. 如請求項8之非人的動物，其中從起始密碼子至終止密碼子之該內源性白蛋白基因座的區域已被刪除並以對應之人白蛋白序列替代。
  10. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中該人化內源性白蛋白基因座包含人白蛋白3'未轉譯區。
  11. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中該內源性白蛋白5'未轉譯區尚未被刪除且尚未以對應之人白蛋白序列替代。
  12. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中從起始密碼子至終止密碼子之該內源性白蛋白基因座的區域已被刪除並以人白蛋白序列替代，該人白蛋白序列包含對應之人白蛋白序列和人白蛋白3'未轉譯區且 其中該內源性白蛋白5'未轉譯區尚未被刪除且尚未以對應之人白蛋白序列替代，且 其中該內源性白蛋白啟動子尚未被刪除且尚未以對應之人白蛋白序列替代。
  13. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中： (i)在該人化內源性白蛋白基因座之該人白蛋白序列包含與SEQ ID NO：35所示之序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的序列；或者 (ii)該人化內源性白蛋白基因座編碼蛋白質，該蛋白質包含與SEQ ID NO：5所示之序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的序列； (iii)該人化內源性白蛋白基因座包含編碼序列，該編碼序列包含與SEQ ID NO：13所示之序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性之序列；或者 (iv)該人化內源性白蛋白基因座包含與SEQ ID NO：17或18所示之序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性之序列。
  14. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中該人化內源性白蛋白基因座不包含篩選卡匣或報告子基因。
  15. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中該非人的動物之該人化內源性白蛋白基因座係呈同型合子。
  16. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中該非人的動物在其種系中包含該人化內源性白蛋白基因座。
  17. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中該非人的動物為哺乳動物。
  18. 如請求項17之非人的動物，其中該非人的動物為大鼠或小鼠。
  19. 如請求項18之非人的動物，其中該非人的動物為小鼠。
  20. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中該非人的動物之該人化內源性白蛋白基因座係呈同型合子。
  21. 如請求項1至19中任一項之非人的動物，其中該非人的動物之該人化內源性白蛋白基因座係呈異型合子。
  22. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中該非人的動物包含至少約10 mg/mL之血清白蛋白量。
  23. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中該非人的動物之血清白蛋白量係至少與包含野生型白蛋白基因座之對照組非人的動物之血清白蛋白量一樣高。
  24. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中該非人的動物進一步包含外源蛋白質之編碼序列，該編碼序列被整合入該非人的動物之一或多個細胞的人化內源性白蛋白基因座的至少一個等位基因。
  25. 如請求項24之非人的動物，其中該外源蛋白質之編碼序列被整合入該非人的動物之一或多個細胞之人化內源性白蛋白基因座的至少一個等位基因之內含子1。
  26. 如前述請求項中任一項之非人的動物，其中該非人的動物進一步包含去活化之內源性基因座，該去活化之內源性基因座非該內源性白蛋白基因座。
  27. 如請求項26之非人的動物，其中該非人的動物進一步包含外源蛋白質之編碼序列，該編碼序列被整合入該非人的動物之一或多個細胞的人化內源性白蛋白基因座的至少一個等位基因，其中該外源蛋白質替代該去活化之內源性基因座的功能。
  28. 如請求項26或27之非人的動物，其中該去活化之內源性基因座為去活化之F9基因座。
  29. 一種非人的動物細胞，該非人的動物細胞在其基因組中包含人化內源性白蛋白基因座，其中該內源性白蛋白基因座的節段已被刪除並以對應之人白蛋白序列替代。
  30. 一種非人的動物基因組，其包含人化內源性白蛋白基因座，其中該內源性白蛋白基因座的節段已被刪除並以對應之人白蛋白序列替代。
  31. 一種非人的動物之人化白蛋白基因，其中該非人的動物之白蛋白基因之節段已被刪除並以對應之人白蛋白序列替代。
  32. 一種用於產生人化內源性白蛋白基因座之靶向載體，其中該內源性白蛋白基因座之節段已被刪除並以對應之人白蛋白序列替代，其中該靶向載體包含插入核酸，該插入核酸包含側面鄰接5'同源臂和3'同源臂之對應的人白蛋白序列，該5'同源臂靶向該內源性白蛋白基因座之5'靶序列且該3'同源臂靶向該內源性白蛋白基因座之3'靶序列。
  33. 一種評估人白蛋白靶向劑的活體內活性之方法，其包含： (a)對如請求項1至28中任一項之非人的動物投予該人白蛋白靶向劑；和 (b)評估該人白蛋白靶向劑在該非人的動物中之活性。
  34. 如請求項33之方法，其中該投予包含由腺相關病毒(AAV)介導之遞送、由脂質奈米顆粒(LNP)介導之遞送或流體動力學遞送(HDD)。
  35. 如請求項34之方法，其中該投予包含由LNP介導之遞送。
  36. 如請求項35之方法，其中該LNP劑量係介於約0.1 mg/kg至約2 mg/kg之間。
  37. 如請求項34之方法，其中該投予包含由AAV8介導之遞送。
  38. 如請求項33至37中任一項之方法，其中該步驟(b)包含從該非人的動物分離出肝臟並評估該人白蛋白靶向劑在該肝臟中之活性。
  39. 如請求項33至38中任一項之方法，其中該人白蛋白靶向劑為基因組編輯劑，且該評估包含評估該人化內源性白蛋白基因座之修飾。
  40. 如請求項39之方法，其中該評估包含測量該人化內源性白蛋白基因座內之插入或缺失的頻率。
  41. 如請求項33至40中任一項之方法，其中該評估包含測量由該人化內源性白蛋白基因座編碼之白蛋白信使RNA的表現。
  42. 如請求項33至41中任一項之方法，其中該評估包含測量由該人化內源性白蛋白基因座編碼之白蛋白的表現。
  43. 如請求項42之方法，其中評估該白蛋白之表現包含測量該非人的動物中之血清白蛋白量。
  44. 如請求項42之方法，其中評估該白蛋白之表現包含測量該非人的動物之肝臟中的白蛋白之表現。
  45. 如請求項33至43中任一項之方法，其中該人白蛋白靶向劑包含核酸酶劑或編碼該核酸酶劑之核酸，其中該核酸酶劑經設計以靶向人白蛋白基因之區域。
  46. 如請求項45之方法，其中該核酸酶劑包含Cas蛋白和嚮導RNA，該嚮導RNA經設計以靶向該人白蛋白基因中之嚮導RNA靶序列。
  47. 如請求項46之方法，其中該嚮導RNA靶序列係在該人白蛋白基因之內含子1中。
  48. 如請求項46或47之方法，其中該Cas蛋白為Cas9蛋白。
  49. 如請求項33至48中任一項之方法，其中該人白蛋白靶向劑包含外源供體核酸，其中該外源供體核酸經設計以靶向人白蛋白基因，且可選擇地其中該外源供體核酸係經由AAV遞送。
  50. 如請求項49之方法，其中該外源供體核酸為單股寡去氧核苷酸(ssODN)。
  51. 如請求項49或50之方法，其中該外源供體核酸不包含同源臂。
  52. 如請求項49或50之方法，其中該外源供體核酸包含插入核酸，該插入核酸側面鄰接5'同源臂和3'同源臂，該5'同源臂靶向該人化內源性白蛋白基因座的5'靶序列且該3'同源臂靶向該人化內源性白蛋白基因座的3'靶序列。
  53. 如請求項52之方法，其中該5'靶序列和3'靶序列各自包含人白蛋白基因之內含子1的節段。
  54. 如請求項49至53中任一項之方法，其中該外源供體核酸編碼外源蛋白質。
  55. 如請求項54之方法，其中該由已被該外源供體核酸靶向之人化內源性白蛋白基因座編碼的蛋白質為異源蛋白質，該異源蛋白質包含與該外源蛋白質融合之人白蛋白信號肽。
  56. 如請求項54或55之方法，其中該外源蛋白質為因子IX蛋白質。
  57. 如請求項56之方法，其中該評估包含測量該非人的動物之血清因子IX蛋白質量和/或包含評估活化部分凝血酶原時間(activated partial thromboplastin time)或進行凝血酶生成分析。
  58. 如請求項33至57中任一項之方法，其中該人白蛋白靶向劑包含(1)經設計以靶向人白蛋白基因之區域的核酸酶劑，及(2)外源供體核酸， 其中該外源供體核酸經設計以靶向該人白蛋白基因， 其中該外源供體核酸編碼外源蛋白質，且 其中該由已被該外源供體核酸靶向之人化內源性白蛋白基因座編碼的蛋白質為異源蛋白質，該異源蛋白質包含與該外源蛋白質融合之人白蛋白信號肽。
  59. 如請求項54至58中任一項之方法，其中該評估包含測量由該外源供體核酸編碼之信使RNA的表現。
  60. 如請求項59之方法，其中該評估包含原位雜交分析以在單細胞解析定量由該外源供體核酸編碼之該信使RNA的表現。
  61. 如請求項59或60之方法，其中該評估包含測量由該外源供體核酸編碼之該信使RNA的表現，該外源供體核酸係在來自該非人的動物之肝臟的多葉。
  62. 如請求項54至61中任一項之方法，其中該評估包含測量該外源蛋白質之表現。
  63. 如請求項62之方法，其中評估該異源蛋白質之表現包含測量該非人的動物之血清中該異源蛋白質的量。
  64. 如請求項62之方法，其中評估該異源蛋白質之表現包含測量在該非人的動物之肝臟中的表現。
  65. 一種優化人白蛋白靶向劑的活體內活性之方法，其包含： (I)在第一非人的動物中第一次實施如請求項33至64中任一項之方法，該第一非人的動物之基因組包含人化內源性白蛋白基因座； (II)改變可變量並在第二非人的動物中第二次實施具有經改變之該可變量的該步驟(I)之方法，該第二非人的動物之基因組包含人化內源性白蛋白基因座；和 (III)將該步驟(I)之該人白蛋白靶向劑的活性與該步驟(II)之該人白蛋白靶向劑的活性相比較，並選擇導致較高活性之方法。
  66. 如請求項65之方法，其中該步驟(II)中經改變的該可變量為將該人白蛋白靶向劑引入該非人的動物之遞送方法。
  67. 如請求項66之方法，其中該投予包含由LNP介導之遞送，且該步驟(II)中經改變的該可變量為該LNP配製劑。
  68. 如請求項65之方法，其中該步驟(II)中經改變的該可變量為將該人白蛋白靶向劑引入該非人的動物之投予途徑。
  69. 如請求項65之方法，其中該步驟(II)中經改變的該可變量為被引入該非人的動物之該人白蛋白靶向劑的濃度或量。
  70. 如請求項65之方法，其中該步驟(II)中經改變的該可變量為被引入該非人的動物之該人白蛋白靶向劑的形式。
  71. 如請求項65之方法，其中該步驟(II)中經改變的該可變量為被引入該非人的動物之該人白蛋白靶向劑。
  72. 如請求項65之方法，其中該人白蛋白靶向劑包含Cas蛋白或編碼該Cas蛋白之核酸及嚮導RNA或編碼該嚮導RNA之DNA，其中該嚮導RNA經設計以靶向人白蛋白基因之嚮導RNA靶序列。
  73. 如請求項72之方法，其中該步驟(II)中經改變的該可變量為該嚮導RNA序列或該嚮導RNA靶序列。
  74. 如請求項72之方法，其中該人白蛋白靶向劑包含編碼該Cas蛋白之信使RNA(mRNA)和該嚮導RNA，且該步驟(II)中經改變的該可變量為該Cas mRNA對該嚮導RNA之比率。
  75. 如請求項72之方法，其中該步驟(II)中經改變的該可變量為嚮導RNA修飾。
  76. 如請求項65之方法，其中該人白蛋白靶向劑包含外源供體核酸。
  77. 如請求項76之方法，其中該步驟(II)中經改變的該可變量為該外源供體核酸之形式。
  78. 如請求項76之方法，其中該外源供體核酸包含插入核酸，該插入核酸側面鄰接5'同源臂和3'同源臂，該5'同源臂靶向該人化內源性白蛋白基因座之5'靶序列且該3'同源臂靶向該人化內源性白蛋白基因座之3'靶序列，且該步驟(II)中經改變的該可變量為該5'同源臂之序列或長度和/或該3'同源臂之序列或長度。
  79. 一種製造如請求項1至28中任一項之非人的動物之方法，其包含： (a)對非人的動物之胚胎幹(ES)細胞引入： (i)核酸酶劑或編碼該核酸酶劑之核酸，其中該核酸酶劑靶向該內源性白蛋白基因座之靶序列；和 (ii)靶向載體，其包含核酸插入子，該核酸插入子包含人白蛋白序列，該人白蛋白序列側面鄰接5'同源臂和3'同源臂，該5'同源臂對應該內源性白蛋白基因座之5'靶序列且該3'同源臂對應該內源性白蛋白基因座之3'靶序列， 其中該靶向載體與該內源性白蛋白基因座組合以產生經基因修飾之非人的ES細胞，該非人的ES細胞之基因組包含該人化內源性白蛋白基因座，該人化內源性白蛋白基因座包含該人白蛋白序列； (b)將該經基因修飾之非人的ES細胞引入非人的動物宿主胚胎；和 (c)在代孕母親中孕育該非人的動物宿主胚胎，其中該代孕母親產生經基因修飾之F0代非人的動物，該F0代非人的動物之基因組包含該人化內源性白蛋白基因座，該人化內源性白蛋白基因座包含該人白蛋白序列。
  80. 如請求項79之方法，其中該靶向載體為長度至少10kb或其中該5'和3'同源臂之長度總和為至少10kb的大靶向載體。
  81. 一種製造如請求項1至28中任一項之非人的動物之方法，其包含： (a)對非人的動物之單細胞階段胚胎引入： (i)核酸酶劑或編碼該核酸酶劑之核酸，其中該核酸酶劑靶向該內源性白蛋白基因座之靶序列；和 (ii)靶向載體，其包含核酸插入子，該核酸插入子包含人白蛋白序列，該人白蛋白序列側面鄰接5'同源臂和3'同源臂，該5'同源臂對應該內源性白蛋白基因座之5'靶序列且該3'同源臂對應該內源性白蛋白基因座之3'靶序列， 其中該靶向載體與該內源性白蛋白基因座組合以產生經基因修飾之非人的單細胞階段胚胎，該非人的單細胞階段胚胎之基因組包含該人化內源性白蛋白基因座，該人化內源性白蛋白基因座包含該人白蛋白序列； (b)在代孕母親中孕育該經基因修飾之非人的動物之單細胞階段胚胎以產生經基因修飾之F0代非人的動物，該F0代非人的動物之基因組包含該人化內源性白蛋白基因座，該人化內源性白蛋白基因座包含該人白蛋白序列。
  82. 如請求項79至81中任一項之方法，其中該核酸酶劑包含Cas蛋白和嚮導RNA。
  83. 如請求項82之方法，其中該Cas蛋白為Cas9蛋白。
  84. 如請求項82之方法，其中該步驟(a)進一步包含引入第二嚮導RNA，該第二嚮導RNA靶向該內源性白蛋白基因座內之第二靶序列。
  85. 如請求項79至84中任一項之方法，其中該非人的動物為小鼠或大鼠。
  86. 如請求項85之方法，其中該非人的動物為小鼠。
  87. 一種製造如請求項1至28中任一項之非人的動物之方法，其包含： (I)  (a)修飾多能非人的動物細胞之基因組以使其包含該人化內源性白蛋白基因座； (b)鑑定或選擇包含該人化內源性白蛋白基因座之經基因修飾之多能非人的動物細胞； (c)將該經基因修飾之多能非人的動物細胞引入非人的動物宿主胚胎；和 (d)在代孕母親中孕育該非人的動物宿主胚胎；或者 (II) (a)修飾該非人的動物單細胞階段胚胎之基因組以使其包含該人化內源性白蛋白基因座； (b)選擇包含該人化內源性白蛋白基因座之經基因修飾之非人的動物單細胞階段胚胎；和 (c)在代孕母親中孕育該經基因修飾之非人的動物單細胞階段胚胎。
TW109119042A 2019-06-07 2020-06-05 包含人化白蛋白基因座之非人的動物 TW202112229A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962858589P 2019-06-07 2019-06-07
US62/858,589 2019-06-07
US201962916666P 2019-10-17 2019-10-17
US62/916,666 2019-10-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202112229A true TW202112229A (zh) 2021-04-01

Family

ID=71899847

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109119042A TW202112229A (zh) 2019-06-07 2020-06-05 包含人化白蛋白基因座之非人的動物

Country Status (13)

Country Link
US (2) US11622547B2 (zh)
EP (1) EP3796776A1 (zh)
JP (1) JP2022534560A (zh)
KR (1) KR20220017939A (zh)
CN (1) CN113939595A (zh)
AU (1) AU2020289581A1 (zh)
BR (1) BR112021022722A2 (zh)
CA (1) CA3137764A1 (zh)
IL (1) IL288606B1 (zh)
MX (1) MX2021015122A (zh)
SG (1) SG11202111256XA (zh)
TW (1) TW202112229A (zh)
WO (1) WO2020247812A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2018338790B2 (en) 2017-09-29 2022-09-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized TTR locus and methods of use
CN114206108B (zh) 2019-04-04 2023-09-29 瑞泽恩制药公司 包括人源化凝血因子12基因座的非人动物
WO2020247452A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use
SG11202111256XA (en) 2019-06-07 2021-11-29 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized albumin locus

Family Cites Families (151)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
WO1999005266A2 (en) 1997-07-26 1999-02-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Trans-species nuclear transfer
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US20030104526A1 (en) 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
US7026462B2 (en) 2000-12-07 2006-04-11 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
AU2002225187A1 (en) 2001-01-22 2002-07-30 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger polypeptides and their use
DK1353941T3 (da) 2001-01-22 2013-06-17 Sangamo Biosciences Inc Modificerede zinkfingerbindingsproteiner
AUPR446701A0 (en) * 2001-04-18 2001-05-17 Gene Stream Pty Ltd Transgenic mammals for pharmacological and toxicological studies
AUPR451401A0 (en) 2001-04-20 2001-05-24 Monash University A method of nuclear transfer
EP1476547B1 (en) 2002-01-23 2006-12-06 The University of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
CA2479153C (en) 2002-03-15 2015-06-02 Cellectis Hybrid and single chain meganucleases and use thereof
ATE531796T1 (de) 2002-03-21 2011-11-15 Sangamo Biosciences Inc Verfahren und zusammensetzungen zur verwendung von zinkfinger-endonukleasen zur verbesserung der homologen rekombination
US7612250B2 (en) 2002-07-29 2009-11-03 Trustees Of Tufts College Nuclear transfer embryo formation method
EP2806025B1 (en) 2002-09-05 2019-04-03 California Institute of Technology Use of zinc finger nucleases to stimulate gene targeting
WO2004031346A2 (en) 2002-09-06 2004-04-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions concerning designed highly-specific nucleic acid binding proteins
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
EP1591521A1 (en) 2004-04-30 2005-11-02 Cellectis I-Dmo I derivatives with enhanced activity at 37 degrees C and use thereof
US20060063231A1 (en) 2004-09-16 2006-03-23 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
PL1802193T3 (pl) 2004-10-19 2014-09-30 Regeneron Pharma Sposób wytwarzania myszy homozygotycznej pod względem modyfikacji genetycznej
ATE466933T1 (de) 2005-03-15 2010-05-15 Cellectis I-crei-meganuklease-varianten mit modifizierter spezifität sowie verfahren zu ihrer herstellung und verwendung
WO2006097784A1 (en) 2005-03-15 2006-09-21 Cellectis I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof
CN101117633B (zh) 2006-08-03 2011-07-20 上海交通大学附属儿童医院 一种细胞核移植方法
PT2415872T (pt) 2006-12-14 2016-07-07 Sangamo Biosciences Inc Proteínas com dedos de zinco não canónicas optimizadas
CN102037594A (zh) 2008-04-11 2011-04-27 Utc电力公司 燃料电池和具有歧管贮槽的双极板
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
JP5932632B2 (ja) 2009-03-20 2016-06-15 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 改変された亜鉛フィンガータンパク質を使用したｃｘｃｒ４の修飾
US8772008B2 (en) 2009-05-18 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increasing nuclease activity
US20120178647A1 (en) 2009-08-03 2012-07-12 The General Hospital Corporation Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly
WO2011020014A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Promoter-regulated differentiation-dependent self-deleting cassette
DK3417701T3 (da) 2009-10-06 2022-03-14 Regeneron Pharma Genmodificerede mus og indpodning
PT3147362T (pt) 2009-10-29 2019-04-02 Regeneron Pharma Alelos multifuncionais
PL2816112T3 (pl) 2009-12-10 2019-03-29 Regents Of The University Of Minnesota Modyfikacja DNA za pośrednictwem efektorów TAL
EP4233537A3 (en) 2011-02-15 2023-09-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized m-csf mice and uses thereof
ES2774491T3 (es) 2011-06-07 2020-07-21 Wisconsin Alumni Res Found Terapia génica con insulina basada en hepatocitos para la diabetes
ES2961613T3 (es) 2011-09-21 2024-03-12 Sangamo Therapeutics Inc Métodos y composiciones para la regulación de la expresión transgénica
MY164836A (en) 2011-10-28 2018-01-30 Regeneron Pharma Genetically modified major histocompatibility complex mice
CN108866101A (zh) 2011-10-28 2018-11-23 瑞泽恩制药公司 人源化il-6和il-6受体
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
EP2839013B1 (en) 2012-04-18 2020-08-26 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Non-disruptive gene targeting
PL2847335T3 (pl) 2012-04-25 2019-01-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Celowanie dużymi wektorami do celowania wspomagane nukleazą
DE202013012241U1 (de) 2012-05-25 2016-01-18 Emmanuelle Charpentier Zusammensetzungen für die durch RNA gesteuerte Modifikation einer Ziel-DNA und für die durch RNA gesteuerte Modulation der Transkription
US8962913B2 (en) 2012-06-18 2015-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-7 rodents
HUE051612T2 (hu) 2012-07-11 2021-03-01 Sangamo Therapeutics Inc Eljárások és készítmények lizoszomális tárolási betegségek kezelésére
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
WO2014033644A2 (en) 2012-08-28 2014-03-06 Novartis Ag Methods of nuclease-based genetic engineering
ES2926021T3 (es) 2012-10-23 2022-10-21 Toolgen Inc Composición para escindir un ADN objetivo que comprende un ARN guía específico para el ADN objetivo y ácido nucleico codificador de proteína Cas o proteína Cas, y uso de la misma
RU2673156C2 (ru) 2012-11-05 2018-11-22 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Генетически модифицированные не относящиеся к человеческому роду животные и способы их применения
WO2014089212A1 (en) 2012-12-05 2014-06-12 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of metabolic disorders
PL2928496T3 (pl) 2012-12-06 2020-04-30 Sigma-Aldrich Co. Llc Modyfikacja i regulacja genomu w oparciu o CRISPR
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
BR112015013784A2 (pt) 2012-12-12 2017-07-11 Massachusetts Inst Technology aplicação, manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições para manipulação de sequência e aplicações terapêuticas
RU2699523C2 (ru) 2012-12-17 2019-09-05 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж Рнк-направляемая инженерия генома человека
CA2900992C (en) 2013-02-20 2023-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetic modification of rats
US20150342163A1 (en) 2013-02-22 2015-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex mice
US10154658B2 (en) 2013-02-22 2018-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex mice
WO2014131833A1 (en) 2013-02-27 2014-09-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
KR102210322B1 (ko) 2013-03-15 2021-02-01 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 Rna-안내 게놈 편집의 특이성을 증가시키기 위한 rna-안내 foki 뉴클레아제(rfn)의 용도
CN105518146B (zh) 2013-04-04 2022-07-15 哈佛学院校长同事会 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途
AU2014253942B9 (en) 2013-04-16 2020-08-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Targeted modification of rat genome
WO2014182700A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
CN116083487A (zh) 2013-05-15 2023-05-09 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗遗传病状的方法和组合物
CN107995927B (zh) 2013-06-17 2021-07-30 布罗德研究所有限公司 用于肝靶向和治疗的crispr-cas系统、载体和组合物的递送与用途
ES2959333T3 (es) 2013-09-23 2024-02-23 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen un gen humanizado de la proteína reguladora de señales
WO2015048577A2 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
DK3138397T3 (en) 2013-10-15 2019-04-15 Regeneron Pharma Humanized IL-15 animals
CN116836957A (zh) 2013-10-17 2023-10-03 桑格摩生物科学股份有限公司 用于核酸酶介导的基因组工程改造的递送方法和组合物
EP3757116A1 (en) 2013-12-09 2020-12-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for genome engineering
RU2725520C2 (ru) 2013-12-11 2020-07-02 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
JP2017501149A (ja) 2013-12-12 2017-01-12 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 粒子送達構成成分を用いた障害及び疾患の標的化のためのｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用
EP3110454B1 (en) 2014-02-24 2020-11-18 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
US10612041B2 (en) 2014-03-21 2020-04-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Genome editing without nucleases
MX2016014504A (es) 2014-05-05 2017-05-23 Regeneron Pharma Animales c5 y c3 humanizados.
NO2785538T3 (zh) 2014-05-07 2018-08-04
AU2015264427B2 (en) 2014-05-19 2021-09-23 Institute For Research In Biomedicine (Irb) Genetically modified non-human animals expressing human EPO
EP3155116A4 (en) 2014-06-10 2017-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
EA039693B1 (ru) 2014-06-16 2022-02-28 Дзе Джонс Хопкинс Юниверсити Композиции и способы для экспрессии рнк-проводников crispr с использованием промотора h1
EP3354732B1 (en) 2014-06-23 2020-01-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated dna assembly
US20150376587A1 (en) 2014-06-25 2015-12-31 Caribou Biosciences, Inc. RNA Modification to Engineer Cas9 Activity
SG11201610633QA (en) 2014-06-26 2017-01-27 Regeneron Pharma Methods and compositions for targeted genetic modifications and methods of use
US10342761B2 (en) 2014-07-16 2019-07-09 Novartis Ag Method of encapsulating a nucleic acid in a lipid nanoparticle host
CN107072184A (zh) 2014-09-19 2017-08-18 瑞泽恩制药公司 嵌合抗原受体
KR102531016B1 (ko) 2014-11-21 2023-05-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 쌍 형성된 가이드 rna를 사용하는 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
EP4248744A3 (en) 2015-04-06 2023-12-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized t cell mediated immune responses in non-human animals
US10626393B2 (en) 2015-06-04 2020-04-21 Arbutus Biopharma Corporation Delivering CRISPR therapeutics with lipid nanoparticles
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
WO2017011519A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
EP3159407A1 (en) 2015-10-23 2017-04-26 Silence Therapeutics (London) Ltd Guide rnas, methods and uses
BR112018008519A2 (pt) 2015-10-28 2018-11-06 Sangamo Therapeutics Inc construtos específicos de fígado, cassetes de expressão de fator viii e métodos de uso dos mesmos
CN109328231A (zh) 2015-11-06 2019-02-12 克里斯普治疗股份公司 用于治疗1a型糖原贮积病的材料和方法
BR112018010158A2 (pt) 2015-11-20 2018-11-21 Regeneron Pharma roedor, polipeptídeo lag-3 humanizado, célula ou tecido, célula-tronco embrionária e embrião de roedor, métodos para produzir um roedor, para avaliar a eficácia antitumoral e as propriedades farmacocinéticas de uma droga
JP6976249B2 (ja) 2015-11-23 2021-12-08 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 免疫を工学操作するための方法および組成物
WO2017093804A2 (en) 2015-12-01 2017-06-08 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of alpha-1 antitrypsin deficiency
BR112018012894A2 (pt) 2015-12-23 2018-12-04 Crispr Therapeutics Ag materiais e métodos para tratamento de esclerose lateral amiotrófica e/ou degeneração lobular frontotemporal
WO2017134529A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of severe combined immunodeficiency (scid) or omenn syndrome
CN108779159B (zh) 2016-02-04 2022-12-30 瑞泽恩制药公司 具有经改造的angptl8基因的非人动物
EP3416689B1 (en) 2016-02-18 2023-01-18 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of severe combined immunodeficiency (scid) or omenn syndrome
EP3429632B1 (en) 2016-03-16 2023-01-04 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of hereditary haemochromatosis
KR102617874B1 (ko) 2016-03-30 2023-12-22 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. Crispr/cas 성분을 위한 지질 나노입자 제제
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
EP3478829A1 (en) 2016-06-29 2019-05-08 Crispr Therapeutics AG Materials and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 (dm1) and other related disorders
WO2018007871A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
CA3030587A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Salk Institute For Biological Studies Methods and compositions for genome editing in non-dividing cells
US11219695B2 (en) 2016-10-20 2022-01-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of Fabry disease
IL267024B2 (en) 2016-12-08 2023-12-01 Intellia Therapeutics Inc Adapted leader RNAs for genomic editing
CA3045122A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
WO2018126087A1 (en) 2016-12-29 2018-07-05 Applied Stemcell, Inc. Gene editing method using virus
EP3585899A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of primary hyperoxaluria type 1 (ph1) and other alanine-glyoxylate aminotransferase (agxt) gene related conditions or disorders
CA3054167A1 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized model of kidney and liver disorders
JP7123982B2 (ja) 2017-06-15 2022-08-23 ツールゲン インコーポレイテッド 肝臓において目的のタンパク質を発現するためのプラットフォーム
CN111032867A (zh) 2017-06-16 2020-04-17 应用干细胞有限公司 具有提高的敲入效率的基因编辑方法
AU2018338790B2 (en) 2017-09-29 2022-09-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized TTR locus and methods of use
KR20200067190A (ko) 2017-10-17 2020-06-11 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 A형 혈우병을 위한 유전자 편집용 조성물 및 방법
WO2019102381A1 (en) 2017-11-21 2019-05-31 Casebia Therapeutics Llp Materials and methods for treatment of autosomal dominant retinitis pigmentosa
AU2018378672A1 (en) 2017-12-06 2020-07-09 Generation Bio Co. Gene editing using a modified closed-ended dna (ceDNA)
WO2019118875A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 Ou Li Crispr-mediated genome editing with vectors
CN111886341A (zh) 2018-01-05 2020-11-03 香港中文大学 使用crispr的高效体内敲入
CA3088180A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing by targeting transferrin
EP3752616A1 (en) 2018-02-16 2020-12-23 CRISPR Therapeutics AG Compositions and methods for gene editing by targeting fibrinogen-alpha
IL314733A (en) 2018-03-26 2024-10-01 Regeneron Pharma Humanized rodents for testing therapeutic agents
US11690921B2 (en) 2018-05-18 2023-07-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
BR112020024731A2 (pt) 2018-06-08 2021-03-23 Intellia Therapeutics, Inc. rnas guias modificados para edição de gene
GB2596224B (en) 2018-06-19 2022-09-07 Univ Texas Lipid nanoparticle compositions for delivery of mRNA and long nucleic acids
US20220306699A1 (en) 2018-06-27 2022-09-29 Altius Institute For Biomedical Sciences Nucleic Acid Binding Domains and Methods of Use Thereof
EP3814370A4 (en) 2018-06-27 2022-06-22 Altius Institute For Biomedical Sciences NUCLEASES FOR GENOMIC EDITING
US20210371847A1 (en) 2018-06-27 2021-12-02 Altius Institute For Biomedical Sciences Gapped And Tunable Repeat Units For Use In Genome Editing And Gene Regulation Compositions
SG11202011284RA (en) 2018-07-16 2020-12-30 Regeneron Pharma Non-human animal models of ditra disease and uses thereof
EP3833755A4 (en) 2018-08-10 2022-05-25 Logicbio Therapeutics, Inc. DISRUPTIVE GENE THERAPY FOR THE TREATMENT OF MMA
US20220001030A1 (en) 2018-10-15 2022-01-06 Fondazione Telethon Genome editing methods and constructs
CA3116885A1 (en) 2018-10-17 2020-04-23 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for delivering transgenes
KR20210102882A (ko) 2018-10-18 2021-08-20 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 핵산 구조체 및 사용 방법
JP2022512731A (ja) 2018-10-18 2022-02-07 インテリア セラピューティクス，インコーポレーテッド 第ｉｘ因子を発現するための組成物及び方法
AU2019361203A1 (en) 2018-10-18 2021-05-27 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for transgene expression from an albumin locus
SG11202103735TA (en) 2018-10-18 2021-05-28 Intellia Therapeutics Inc Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiencey
EP3887513A2 (en) 2018-11-28 2021-10-06 CRISPR Therapeutics AG Optimized mrna encoding cas9 for use in lnps
AU2020221340A1 (en) 2019-02-15 2021-09-16 Bayer Healthcare Llc Gene editing for hemophilia A with improved Factor VIII expression
SG11202108451VA (en) 2019-04-03 2021-09-29 Regeneron Pharma Methods and compositions for insertion of antibody coding sequences into a safe harbor locus
CN114206108B (zh) 2019-04-04 2023-09-29 瑞泽恩制药公司 包括人源化凝血因子12基因座的非人动物
US11702644B2 (en) 2019-04-11 2023-07-18 California Institute Of Technology Methods and compositions for in vivo gene editing based cell-type-specific cellular engineering
WO2020241679A1 (ja) 2019-05-30 2020-12-03 国立大学法人北海道大学 脂質ナノ粒子
WO2020247452A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use
SG11202111256XA (en) 2019-06-07 2021-11-29 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized albumin locus
US20230416776A1 (en) 2019-10-08 2023-12-28 Regents Of The University Of Minnesota Crispr-mediated human genome editing with vectors
WO2021083073A1 (zh) 2019-10-31 2021-05-06 华东师范大学 一种基于肝细胞Alb基因的疾病治疗的产品
CN115715203A (zh) 2020-05-06 2023-02-24 塞勒克提斯公司 对细胞进行基因修饰以递送治疗性蛋白质的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20230232797A1 (en) 2023-07-27
JP2022534560A (ja) 2022-08-02
SG11202111256XA (en) 2021-11-29
WO2020247812A1 (en) 2020-12-10
CN113939595A (zh) 2022-01-14
IL288606A (en) 2022-02-01
KR20220017939A (ko) 2022-02-14
CA3137764A1 (en) 2020-12-10
AU2020289581A1 (en) 2021-11-18
BR112021022722A2 (pt) 2022-01-04
US11622547B2 (en) 2023-04-11
IL288606B1 (en) 2024-08-01
MX2021015122A (es) 2022-04-06
EP3796776A1 (en) 2021-03-31
US20200383304A1 (en) 2020-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12010979B2 (en) Non-human animals comprising a humanized TTR locus and methods of use
JP7359753B2 (ja) Ｃａｓトランスジェニックマウスの胚性幹細胞およびマウスならびにその使用
US20210261985A1 (en) Methods and compositions for assessing crispr/cas-mediated disruption or excision and crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo
US11622547B2 (en) Genetically modified mouse that expresses human albumin
US11891618B2 (en) Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
ES2966625T3 (es) Roedores que comprenden un locus del factor de coagulación 12 humanizado
US20190032156A1 (en) Methods and compositions for assessing crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo