KR102617874B1 - Crispr/cas 성분을 위한 지질 나노입자 제제 - Google Patents

Crispr/cas 성분을 위한 지질 나노입자 제제 Download PDF

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루신다 제이. 쇼
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루치 루드라프라사드 샤
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Abstract

본 발명은 CRISPR/Cas 유전자 편집 성분의 전달에 유용한 지질 나노입자 기반 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

CRISPR/CAS 성분을 위한 지질 나노입자 제제
본원은 2016년 3월 30일 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/315,602, 2016년 8월 16일 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/375,776, 2016년 12월 12일 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/433,228, 및 2017년 3월 7일 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/468,300에 우선권의 이점을 주장하고; 각각의 전체 내용은 본 명세서에서 참고로 편입된다.
대상체에 (치료적으로 관련된 화합물을 포함하는) 생물학적 활성제의 전달은 표적 세포 또는 조직에 도달하는 제제에서 어려움으로 종종 방해받는다. 특히, 생 세포에 많은 생물학적 활성제의 이동조절은 세포의 막 시스템에 의해 제한될 수 있다.
세포에 전달하기 특히 어려운 생물학적 활성제의 하나의 부류는 단백질, 핵산-기반 약물, 및 이의 유도체를 포함하는 생물학이다. 특정 핵산 및 단백질은 세포 또는 혈장에서 단지 제한된 지속기간 동안 안정하고, 때때로 고도로 하전되어, 이는 세포 막을 거쳐 전달을 복잡하게 할 수 있다. 그와 같은 제제를 세포에 안정화시킬 수 있고 전달할 수 있는 조성물은 따라서 특히 관심이다. 지질 캐리어, 생분해성 폴리머 및 다양한 콘주게이트 시스템은 세포에 이들 생물학적 활성제의 전달을 개선하는데 사용될 수 있다.
생체내 세포에서 유전자 편집을 위한 수많은 성분 및 조성물은 현재 실존하여, 유전적, 바이러스성, 박테리아, 자가면역, 암, 노화-관련된, 및 염증성 질환 치료에 엄청난 잠재력을 제공한다. 몇 개의 이들 편집 기술은 효소 예컨대 메가뉴클레아제, 클러스터링된 규칙적으로 공간사이의 짧은 회문성 반복부 (CRISPR) 관련된 ("Cas") 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 ("ZFN"), 및 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제 ("TALEN")에 의해 창출된 이중-가닥 절단 ("DSB") 보수용 세포 기전을 이용한다. DSBs가 세포에서 만들어지는 경우, 세포는 몇 개의 과정 중 하나에 의해 절단을 보수할 수 있다. 하나의 그와 같은 과정은 DNA의 절단된 말단의 비-상동성 말단 연결 ("NHEJ")를 포함한다. NHEJ 동안, 뉴클레오타이드는 세포에 의해 첨가 또는 제거될 수 있어서, 절단된 서열로부터 변경된 서열을 초래한다. 다른 상황에서, DSB의 각각의 말단에 상동성을 가진 내인성 또는 외인성 템플레이트가, 예를 들어, 절단의 보수를 유도하는데 사용되는 경우, 세포는 상동 지정 보수 ("HDR") 또는 상동성 재조합 ("HR") 기전에 의해 DSBs를 보수한다. 몇 개의 이들 편집 기술은 단일-가닥 절단 또는 이중-가닥 절단 ("DSB") 보수를 위한 세포 기전을 이용한다.
CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템은 세포에서 리보핵단백질 복합체로서 활성이다. 세포, 예컨대 환자에서 세포에 CRISPR/Cas의 단백질 및 핵산 성분의 전달용 조성물은 필요하다.
우리는 본 명세서에서 CRISPR/Cas 유전자 편집 성분의 전달에 유용한 지질 나노입자-기반 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 우리는 본 명세서에서 하기를 포함하는 지질 나노입자 (LNPs)와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 유전자적으로 조작된 간 세포의 생산 방법을 제공한다: 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA; 가이드 RNA 핵산; CCD 지질; 헬퍼 지질; 중성 지질; 및 스텔스 지질. 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA, 가이드 RNA 핵산, CCD 지질, 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 스텔스 지질을 포함하는 지질 나노입자 (LNPs)가 또한 제공된다.
추가의 구현예는, 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA 및 가이드 RNA 핵산을 간 세포에 전달하는 것을 포함하는, 유전자 편집 방법을 제공하고, 여기에서 상기 부류 2 Cas mRNA 및 상기 가이드 RNA 핵산은 하기를 포함하는 적어도 하나의 LNP 조성물로서 제형화된다: CCD 지질; 헬퍼 지질; 중성 지질; 및 스텔스 지질. 추가 구현예는, 하기를 포함하는 LNPs와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 간 세포에 CRISPR-Cas 복합체의 투여 방법을 제공한다: 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA; 가이드 RNA 핵산; CCD 지질; 헬퍼 지질; 중성 지질; 및 스텔스 지질.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 LNP 제형이 하기: 가이드 RNA 핵산 또는 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA; CCD 지질; 헬퍼 지질; 중성 지질; 및 스텔스 지질을 포함하는, 하나 이상의 LNP 제형으로서 치료적 유효량의 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA 및 가이드 RNA 핵산을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 간 세포에서 유전자 발현의 변경 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 유전자적으로 조작된 간 세포의 생산 방법은 하기를 포함하는 지질 나노입자 (LNPs)와 세포를 접촉시키는 것을 포함한다: 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA; 단일-가이드 RNA (sgRNA)이거나 상기를 인코딩하는 가이드 RNA 핵산; CCD 지질; 헬퍼 지질; 중성 지질; 및 스텔스 지질.
특정 양태에서, 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA는 제1 LNP 조성물에서 제형화되고 가이드 RNA 핵산은 제2 LNP 조성물에서 제형이다. 다른 양태에서, 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA 및 가이드 RNA 핵산은 LNP 조성물에서 함께 제형화된다.
도 1은 100 ng 및 500 ng eGFP mRNA 전달된 / 웰의 양에서 마우스 간세포 세포 (Hepa1.6)에 다양한 LNP 제형의 전달 후 GFP의 발현을 보여준다.
도 2는, 용량-의존적 반응을 초래하는, 다양한 용량에서 다양한 LNP 제형의 투여 후 마우스에서 gLUC 발현을 보여준다.
도 3a는 다양한 LNP 제형의 투여 후 마우스에서 인자 VII 표적화의 편집 효율을 보여준다.
도 3b는 다양한 LNP 제형의 투여 후 마우스에서 TTR 표적화의 편집 효율을 보여준다.
도 4a는, gRNA 및 Cas9 mRNA가 별도로 제형화되는, 다양한 투약 다수에 따라, 다양한 LNP 제형의 전달 후 마우스에서 TTR 표적화의 편집 효율을 보여준다.
도 4b는 gRNA 및 Cas9 mRNA가 별도로 제형화되는 LNP 제형의 전달 후 마우스에서 TTR 표적화의 편집 효율을 보여준다.
도 5는 gRNA 및 Cas9 mRNA가 별도로 제형화되는 다양한 LNP 제형의 투여 후 세포에서 인자 VII 또는 TTR 표적화의 편집 효율을 보여준다.
도 6은 gRNA 및 Cas9 mRNA가 별도로 제형화되는 다양한 LNP 제형의 투여 후 마우스에서 인자 VII 또는 TTR 표적화의 편집 효율을 보여준다.
도 7은 gRNA 및 Cas9 mRNA가 함께 제형화되고 다양한 농도에서 전달되는 다양한 LNP 제형의 투여 후 세포에서 편집 효율을 보여준다.
도 8a는 다양한 LNP 제형의 투여 후 마우스에서 TTR 표적화의 편집 효율을 보여준다.
도 8b는 다양한 LNP 제형의 투여 후 마우스에서 인자 VII 표적화의 편집 효율을 보여준다.
도 9는 다양한 LNP 제형이 투여된 동물로부터 수집된 절개-부위 DNA의 PCR 증폭을 보여준다.
도 10은 gRNA 및 Cas9 mRNA이 함께 제형화되는 다양한 LNP 제형이 투여된 마우스의 혈청 TTR 수준을 보여준다.
도 11은 gRNA 및 Cas9 mRNA이 함께 제형화되는 다양한 LNP 제형이 동물에 투여된 후 마우스의 인자 VII 상대 활성을 보여준다.
도 12a는, 용량-의존적 반응을 초래하는, 다양한 용량에서 LNP-169 투여 후 마우스에서 TTR 표적화의 편집 효율을 보여준다.
도 12b는, 용량-의존적 반응을 초래하는, 다양한 용량에서 LNP-169 투여 후, 다양한 날에, 마우스에서 혈청 TTR 수준을 보여준다.
도 13a는 Cas9 mRNA 대 sgRNA의 비가 가변되었던 다양한 LNP 제형의 투여 후 마우스에서 TTR 표적화의 편집 효율을 보여준다.
도 13b는 Cas9 mRNA 대 sgRNA의 비가 가변되었던 다양한 LNP 제형의 투여 후, 2개의 별개의 날에, 마우스에서 혈청 TTR 수준을 보여준다.
도 14a는 1 또는 2 용량으로 LNP-169의 투여 후 마우스에서 TTR 표적화의 편집 효율을 보여준다.
도 14b는 1 또는 2 용량으로 LNP-169의 투여 9 일 후 마우스에서 혈청 TTR 수준을 보여준다.
도 15는 다양한 LNP 제형의 투여 후 마우스에서 TTR 표적화의 비장에서 편집 효율을 보여준다.
도 16은 다양한 LNP 제형의 투여 후 마우스에서 TTR 표적화의 편집 효율을 보여준다.
도 17은, 마우스 혈청의 존재 하에서, 다양한 농도로, 세포에 LNP-169의 전달 후 일차 마우스 간세포에서 TTR 표적화의 편집 효율을 보여준다.
도 18은 ApoE의 양이 증가함에 따라 ApoE에 의한 LNP-결합에서 증가를 보여준다.
도 19는 가이드 RNA가 DNA 발현 카셋트로서 전달되었던 다양한 LNP 제형의 편집 효율을 보여준다.
도 20은 편집 효율이 마우스에서 일차 간세포 배양물과 생체내 간 세포 사이 상관관계가 있다는 것을 보여준다.
도 21은 Neuro 2A 시험관내 세포주 대 일차 마우스 간세포에서 편집의 특유의 회복 스펙트럼을 보여준다.
도 22는 일차 마우스 간세포 대 생체내 마우스 간 세포에서 편집의 유사한 회복 스펙트럼을 보여준다.
도 23은, 시간의 함수로서, Cas9 mRNA 및 가이드 RNA의 혈장 농도를 보여준다.
도 24는, 시간의 함수로서, 간 조직에서 Cas9 mRNA 및 가이드 RNA의 농도를 보여준다.
도 25는, 시간의 함수로서, 비장 조직에서 Cas9 mRNA 및 가이드 RNA의 농도를 보여준다.
도 26a는, 시간의 함수로서, 혈장에서 그리고 조직에서 Cas9 mRNA 및 가이드 RNA의 상대 농도를 보여준다.
도 26b는, 시간의 함수로서, 혈장에서 그리고 조직에서 지질 A의 농도를 보여준다.
도 27은, LNP의 투여 후 시간의 함수로서, 혈장 사이토카인 수준에서 변화를 보여준다.
도 28은 LNP의 투여 후 경시적으로 마우스 혈청 TTR 수준을 보여준다.
도 29a는 LNP의 투여 후 마우스에서 경시적으로 TTR 편집을 보여준다.
도 29b는 LNP의 투여 후 마우스에서 경시적으로 TTR 편집 및 혈청 TTR 수준을 보여준다.
도 30은 상이한 mRNA 제제를 함유하는 LNPs의 투여 후 마우스 혈청 사이토카인 수준을 보여준다.
도 31은 상이한 mRNA 제제를 함유하는 LNPs의 투여 후 마우스 혈청 TTR 농도 수준을 보여준다.
도 32는 상이한 mRNA 제제를 함유하는 LNPs의 투여 후 마우스에서 경시적으로 TTR 편집 수준을 보여준다.
도 33은 -80℃ 또는 4℃에서 저장된 LNPs의 투여 후 마우스 혈청 TTR 농도 수준을 보여준다.
도 34는 -80℃ 또는 4℃에서 저장된 LNPs의 투여 후 마우스 TTR 편집 수준을 보여준다.
도 35는 다양한 제형의 투여 후 마우스 혈청 농도 수준을 보여준다.
도 36은 다양한 제형의 투여 후 마우스 간 TTR 편집 수준을 보여준다.
본 개시내용은 세포에 전달을 위한 CRISPR/Cas 성분 ("전달대상물")의 지질 나노입자 (LNP) 조성물 및 이들의 사용 방법의 구현예를 제공한다. LNP는 (i) CCD 지질, (ii) 중성 지질, (iii) 헬퍼 지질, 및 (iv) 스텔스 지질을 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 전달대상물은 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 인코딩하는 mRNA, 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
CRISPR/Cas 전달대상물
LNP 제형을 통해 전달된 CRISPR/Cas 전달대상물은, 세포에서 Cas 뉴클레아제의 발현을 허용하는, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 분자를 포함한다. 전달대상물은 추가로 하나 이상의 가이드 RNAs 또는 가이드 RNAs를 인코딩하는 핵산을 함유한다. 전달대상물은 추가로 보수 또는 재조합용 템플레이트 핵산을 포함할 수 있다.
Cas 뉴클레아제
개시된 제형의 하나의 성분은, 또한 Cas 뉴클레아제 mRNA로 불리는, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA이다. mRNA는 개선된 안정성 및/또는 면역원성 특성을 위하여 변형될 수 있다. 변형은 mRNA 내에서 하나 이상의 뉴클레오사이드로 만들어질 수 있다. mRNA 핵염기로의 화학적 변형의 예는 슈도우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 및 5-메틸-시티딘을 포함한다. 안정성, 발현, 및 면역원성을 개선하기 위한 추가의 공지된 변형은 고려된다. Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA는 특정 세포 유형, 예컨대 진핵 세포, 포유동물 세포, 또는 더 구체적으로, 인간 세포에서 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 Cas 뉴클레아제로서 인간 코돈 최적화된 Cas9 뉴클레아제 또는 인간 코돈 최적화된 Cpf 뉴클레아제를 인코딩한다. 일부 구현예에서, mRNA는 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 침전 방법 (예를 들면, LiCl 침전, 알코올 침전, 또는 동등한 방법, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이)을 사용하여 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 크로마토그래피-기반 방법, 예컨대 HPLC-기반 방법 또는 동등한 방법 (예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이)을 사용하여 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 양쪽 침전 방법 (예를 들면, LiCl 침전) 및 HPLC-기반 방법을 사용하여 정제된다.
Cas 뉴클레아제용 코딩 서열에 더하여, mRNA는 3' 또는 5' 미번역된 영역 (UTR)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 3' 또는 5' UTR은 인간 유전자 서열로부터 유래될 수 있다. 예시적인 3' 및 5' UTRs는 α- 및 β-글로빈, 알부민, HSD17B4, 및 진핵 신장 인자 1α를 포함한다. 또한, 바이러스성-유래된 5' 및 3' UTRs는 또한 사용될 수 있고 오르토폭스바이러스 및 사이토메갈로바이러스 UTR 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, mRNA는 5' 캡, 예컨대 m7G(5')ppp(5')N을 포함한다. 또한, 이러한 캡은 뉴클레오타이드 N이 2'OMe를 함유하지 않는 캡-0, 또는 뉴클레오타이드 N이 2'OMe를 함유하는 캡-1, 또는 뉴클레오타이드 N 및 N+1이 2'OMe를 함유하는 캡-2일 수 있다. 이러한 캡은 또한 항-전-캡 유사체 (ARCA)에 의해 편입된 경우 구조 m2 7,3'-OG(5')N일 수 있고, 또한 유사한 캡-0, 캡-1, 및 캡-2, 등, 구조를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 핵 방출을 조절할 수 있고; 엑소뉴클레아제에 의한 분해를 예방할 수 있고; 번역을 촉진시킬 수 있고; 5' 근위 인트론 절개를 촉진시킬 수 있다. 캡용 안정화 요소는 포스포로티오에이트 연결기, 보라노포스페이트 변형, 및 메틸렌 브릿지를 포함한다. 또한, 캡은 진핵 번역 개시 인자 4E, eIF4E용 결합 요소로서 작용하는 비-핵산 독립체를 또한 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, mRNA는 폴리(A) 꼬리를 포함한다. 이러한 꼬리는 길이 약 40 내지 약 300 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 꼬리는 길이 약 40 내지 약 100 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 꼬리는 길이 약 100 내지 약 300 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 꼬리는 길이 약 100 내지 약 300 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 꼬리는 길이 약 50 내지 약 200 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 꼬리는 길이 약 50 내지 약 250 뉴클레오타이드일 수 있다. 특정 구현예에서, 꼬리는 길이 약 100, 150, 또는 200 뉴클레오타이드일 수 있다. 폴리(A) 꼬리는 포스포로티오에이트 연결기를 포함하는 엑소뉴클레아제 분해를 예방하기 위한 변형 그리고 핵염기로의 변형을 함유할 수 있다. 또한, 폴리(A) 꼬리는 변형된 또는 비-천연 핵염기 또는 다른 합성 모이어티를 포함할 수 있는 3' "캡"을 함유할 수 있다.
본 명세서에서 기재된 mRNAs는 RNA의 세포내 반감기를 변형시킬 수 있는 적어도 하나의 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA의 반감기는 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA의 반감기는 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, 요소는 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 요소는 RNA의 안정성을 감소킬 수 있다. 일부 구현예에서 요소는 RNA 붕괴를 촉진시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 요소는 번역을 활성화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 요소는 RNA의 3' UTR 이내일 수 있다. 예를 들어, 요소는 mRNA 붕괴 신호일 수 있다. 일부 구현예에서, 요소는 폴리아데닐화 신호 (PA)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PA는 RNA의 3' UTR에서일 수 있다. 일부 구현예에서, RNA는 전사 후 세포에서 더 빠른 분해를 거치게 되도록 PA를 포함하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 요소는 적어도 하나의 AU-풍부 요소 (ARE)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 요소는 ARE를 포함하지 않는다. AREs는 조직 유형, 세포 유형, 타이밍, 세포 국재화, 및 환경에 의존적인 방식으로ARE 결합 단백질 (ARE-BPs)에 의해 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, ARE는 길이 50 내지 150 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ARE는 서열 AUUUA의 적어도 하나의 카피를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 ARE는 RNA의 3' UTR에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 요소는, 전사체로부터 발현을 향상시키기 위해 3차 구조를 창출하는, 우드처크 간염 바이러스 (WHV) 전사후 조절 인자 (WPRE)일 수 있다. 일부 구현예에서, WPRE는 RNA의 3' UTR에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 요소는 빠른- 또는 느린-부식 전사체에서 존재하는 다른 RNA 서열 모티프로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 요소는 단독으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 요소는 하나 이상의 요소와 조합으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 전달된 mRNA에 의해 인코딩된 뉴클레아제는 CRISPR/Cas 시스템으로부터 Cas 단백질을 포함할 수 있다. Cas 단백질은 가이드 RNA ("gRNA")와 상호작용하는 적어도 하나의 도메인을 포함할 수 있다. 추가로, Cas 단백질은 가이드 RNA에 의해 표적 서열로 유도될 수 있다. 가이드 RNA는 Cas 단백질 뿐만 아니라 표적 서열과 상호작용하여 표적 서열에 결합을 유도한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 표적화된 절단에 특이성을 제공하고, Cas 단백질은 보편적일 수 있고 상이한 가이드 RNAs와 짝짓기하여 상이한 표적 서열을 절단시킬 수 있다. 특정 구현예에서, Cas 단백질은 단일 또는 이중-가닥 DNA를 절단시킬 수 있다. 특정 구현예에서, Cas 단백질은 RNA를 절단시킬 수 있다. 특정 구현예에서, Cas 단백질은 RNA를 니킹할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 적어도 하나의 DNA 결합 도메인 및 적어도 하나의 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제 도메인은 DNA 결합 도메인에 이종성일 수 있다. 특정 구현예에서, Cas 단백질은 뉴클레아제 활성을 감소 또는 제거시키기 위해 변형될 수 있다. Cas 단백질은 DNA 서열의 발현 또는 활성을 조절하는데 그리고 상기에 결합하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은, 리보핵산 단백질 복합체를 포함하는, 부류 1 또는 부류 2 시스템 성분을 포함할 수 있다. 참고, 예를 들면, Makarova 등, Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015); Shmakov 등, Molecular Cell, 60:385-397 (2015). 부류 2 CRISPR/Cas 시스템은 단일 단백질 효과기를 갖는다. 유형 II, V, 및 VI의 Cas 단백질은, 본 명세서에서 "부류 2 Cas 뉴클레아제"로 불리는, 단일-단백질, RNA-유도된 엔도뉴클레아제일 수 있다. 부류 2 Cas 뉴클레아제는, 예를 들어, Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, 및 C2c3 단백질을 포함한다. Cpf1 단백질, Zetsche 등, Cell, 163 : 1-13 (2015)는 Cas9에 상동성이고, RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유한다. Zetsche의 Cpf1 서열은 그 전문이 참고로 편입된다. 참고, 예를 들면, Zetsche, 표 S1 및 S3.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 유형-II CRISPR/Cas 시스템, 즉, CRISPR/Cas9 시스템으로부터 Cas9 단백질, 또는 유형-V CRISPR/Cas 시스템, 예를 들면, Cpf1 단백질로부터일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 부류 2 CRISPR/Cas 시스템, 즉, 단일-단백질 Cas 뉴클레아제 예컨대 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질로부터일 수 있다. 단백질의 부류 2 Cas 뉴클레아제 계열은 DNA 엔도뉴클레아제 활성을 가진 효소이고, 이들은, 본 명세서에서 추가로 기재된 바와 같이, 적절한 가이드 RNA 설계에 의해 원하는 핵산 표적을 절단시키도록 유도될 수 있다.
부류 2 CRISPR/Cas 시스템 성분은 유형-IIA, 유형-IIB, 유형-IIC, 유형 V, 또는 유형 VI 시스템으로부터일 수 있다. Cas9 및 그것의 오쏘로그는 포괄된다. Cas9 단백질 또는 다른 성분이 출신일 수 있는 비제한적인 예시적인 종은 하기를 포함한다: 연쇄상구균 파이오제네스, 연쇄상구균 써모필루스, 연쇄상구균 sp., 스타필로코쿠스 아우레스, 리스테리아 인노쿠아, 락토바실러스 가쎄리, 프란시셀라 노비시다, 울리넬라 석시노게네스, 숫테렐라 와드스워텐시스, 감마 프로테오박테리움, 나이세리아 메닌기티디스, 캄필로박터 제주니, 파스튜렐라 멀토시다, 파이브로박터 석시노게네, 로도스피릴룸 루브럼, 노르카르디옵시스 닷손빌레이, 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스, 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토스포란기움 로세움, 알리사이클로바실러스 악시도칼다리우스, 바실러스 슈도마이코이데스, 바실러스 셀레니티레두센스, 엑시구오박테리움 시비리쿰, 락토바실러스 델브루엑키이, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 부크네리, 트레포네마 덴티콜라, 마이크로스실라 마리나, 버크홀데리알레스 박테리움, 폴라로모나스 나프탈레니보란스, 폴라로모나스 sp., 크로코스파에라 왓소니이, 시아노테세 sp., 마이크로사이스티스 에어루기노사, 사이네초코쿠스 sp., 아세토할로비움 아라바티쿰, 암모니펙스 데겐시, 칼디셀룰로시루프토르 벡스시이, 칸디다투스 데설포루디스, 클로스트리듐 보툴리눔, 클로스트리듐 디피실레, 피네골디아 마그나, 나트라나에로비우스 써모필루스, 펠로토마컬럼 써모프로피오니움, 악시디티오바실러스 칼두스, 악시디티오바실러스 페로옥시단스, 알로크로마티움 비노섬, 마리노박터 sp., 니트로소콕쿠스 할로필루스, 니트로소콕쿠스 왓소니, 가성알테로모나스 할로플랑크티스, 크테도노박터 라세미페르, 메타노할로비움 에베스티가툼, 아나바에나 바리아빌리스, 노둘라리아 스푸미게나, 노스톡 sp., 아트로스피라 맥시마, 아트로스피라 플라텐시스, 아트로스피라 sp., 린그비아 sp., 마이크로콜레우스 크토노플라스테스, 오스실라토리아 sp., 페트로토가 모빌리스, 테르모시포 아프리카누스, 연쇄상구균 파스퇴리아누스, 나이세리아 시네레아, 캄필로박터 라리, 파르비바쿨룸 라바멘티보란스, 코리네 박테리움 디프테리아, 또는 아카리오클로리스 마리나. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 연쇄상구균 파이오제네스로부터일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 연쇄상구균 써모필루스로부터일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 스타필로코쿠스 아우레스로부터일 수 있다. 추가 구현예에서, Cpf1 단백질은 프란시셀라 툴라렌시스, 라크노스피라세아에 박테리움, 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스, 페레그리니박테리아 박테리움, 파르쿠박테리아 박테리움, 스미텔라, 악시다미노코쿠스, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼, 유박테륨 엘리겐, 모락셀라 보보쿨리, 렙토스피라 이나다이, 포르파이로모나스 크레비오리카니스, 프레보텔라 디시엔스, 또는 포르파이로모나스 마카카애로부터일 수 있다. 특정 구현예에서 Cpf1 단백질은 악시다미노코쿠스 또는 라크노스피라세아애로부터일 수 있다.
일부 구현예에서, 부류 2 Cas 뉴클레아제는 적어도 하나의 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인, 예컨대 Cas9 또는 Cpf1 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 부류 2 Cas 뉴클레아제는 1 초과 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 부류 2 Cas 뉴클레아제는 적어도 하나의 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 적어도 하나의 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 부류 2 Cas 뉴클레아제는 표적 서열에서 DSB를 도입할 수 있다. 일부 구현예에서, 부류 2 Cas 뉴클레아제는 단 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인을 함유하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 부류 2 Cas 뉴클레아제는 뉴클레아제 도메인 중 하나가 돌연변이되거나 완전하게 또는 부분적으로 결실되어 그것의 핵산 절단 활성을 감소시키도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 부류 2 Cas 뉴클레아제는 기능적 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하지 않도록 변형될 수 있다. 다른 구현예에서, 부류 2 Cas 뉴클레아제, 예를 들면 Cas9 단백질은 기능적 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하지 않도록 변형될 수 있다. 단 하나의 뉴클레아제 도메인이 기능적인 일부 구현예에서, 부류 2 Cas 뉴클레아제는 표적 서열에 단일-가닥 절단 ("닉")을 도입할 수 있는 니카제일 수 있다. 일부 구현예에서, 부류 2 Cas 뉴클레아제의 뉴클레아제 도메인 이내 보존된 아미노산은 뉴클레아제 활성을 감소 또는 변경시키도록 치환된다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제 도메인 돌연변이는 DNA 절단 활성을 불활성화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제 도메인 돌연변이는, 니카제를 초래하는, 부류 2 Cas 뉴클레아제의 1 뉴클레아제 도메인을 불활성화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 니카제는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. RuvC-유사 뉴클레아제 도메인에서 예시적인 아미노산 치환은 (S. 파이오제네스 Cas9 단백질에 기반된, 참고, 예를 들면, UniProtKB - Q99ZW2 (CAS9 STRP1)) DIOA를 포함한다. 추가 예시적인 아미노산 치환은 (프란시셀라 노비시다 U112 Cpf1 (FnCpf1) 서열 (UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN)에 기반된) D917A, E1006A, 및 D1255A를 포함한다. 일부 구현예에서, 니카제는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. HNH-유사 뉴클레아제 도메인에서 예시적인 아미노산 치환은 (S. 파이오제네스 Cas9 단백질에 기반된) E762A, H840A, N863A, H983A, 및 D986A를 포함한다. 예시적인 돌연변이는 뉴클레아제 도메인에서 보존된 촉매적 잔기를 변경시키고 도메인의 핵산분해 활성을 변경시킨다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 뉴클레아제 시스템은 표적 서열, 각각의 센스 및 안티센스 가닥에 상보적인 한 쌍의 가이드 RNAs 및 니카제를 포함할 수 있다. 가이드 RNAs는 표적 서열의 반대편 가닥에 닉을 생성함으로써 (즉, 이중 니킹) DSB를 도입하기 위해 그리고 표적하기 위해 니카제를 유도할 수 있다. 키메라성 부류 2 Cas 뉴클레아제는 또한 사용될 수 있고, 여기에서 단백질의 하나의 도메인 또는 영역은 상이한 단백질의 한 부분에 의해 대체된다. 예를 들어, 뉴클레아제 도메인은 상이한 뉴클레아제 예컨대 Fok1로부터 도메인으로 대체될 수 있다. 특정 구현예에서, 부류 2 Cas 뉴클레아제는 뉴클레아제 활성을 감소 또는 제거시키도록 변형될 수 있다. DNA 서열의 발현 또는 활성을 조정하는데 그리고 상기에 결합하는데 사용될 수 있다.
대안적 구현예에서, Cas 단백질은 유형-I CRISPR/Cas 시스템의 캐스케이드 복합체의 성분일 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 Cas3 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 유형-II CRISPR/Cas 시스템으로부터일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 유형-III CRISPR/Cas 시스템으로부터일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 유형-IV CRISPR/Cas 시스템으로부터일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 유형-V CRISPR/Cas 시스템으로부터일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 유형- VI CRISPR/Cas 시스템으로부터일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 RNA 절단 활성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레아제는 적어도 하나의 이종성 단백질 도메인과 융합될 수 있다. 적어도 하나의 단백질 도메인은 뉴클레아제의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 이종성 단백질 도메인은 뉴클레아제에서 하나 이상의 위치에 있다.
일부 구현예에서, 단백질 도메인은 세포의 핵에 뉴클레아제의 수송을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 단백질 도메인은 핵 국재화 신호 (NLS)일 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 1-10 NLS(들)과 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 1-5 NLS(들)과 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 1 NLS와 융합될 수 있다. 1 NLS가 사용되는 경우, NLS는 뉴클레아제의 N-말단 또는 C-말단에서일 수 있다. 다른 구현예에서, 뉴클레아제는 1 초과 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 2, 3, 4, 또는 5 NLSs와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 2 NLSs와 융합될 수 있다. 특정 상황에서, 2 NLSs는 동일 (예를 들면, 2 SV40 NLSs)할 수 있거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 카복시 말단에서 2 SV40 NLS 서열에 융합된다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는, 2 NLSs, N-말단에서 하나 그리고 C-말단에서 하나와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 3 NLSs와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 무 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, NLS는 단절형 서열, 예컨대, 예를 들면, SV40 NLS, PKKKRKV 또는 PKKKRRV일 수 있다. 일부 구현예에서, NLS는 이절형 서열, 예컨대 뉴클레오플라스민의 NLS, KRPAATKKAGQAKKKK일 수 있다. 특정 구현예에서, 단일 PKKKRKV NLS는 뉴클레아제의 C-말단에서일 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 도메인은 뉴클레아제의 세포내 반감기를 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제의 반감기는 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제의 반감기는 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 도메인은 뉴클레아제의 안정성을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 도메인은 뉴클레아제의 안정성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 도메인은 단백질 분해용 신호 펩타이드로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 분해는 단백분해 효소, 예컨대, 예를 들어, 프로테아솜, 리소좀 프로테아제, 또는 칼페인 프로테아제에 의해 매개될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 도메인은 PEST 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴 사슬의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 유비퀴틴은 유비퀴틴-유사 단백질 (UBL)일 수 있다. 유비퀴틴-유사 단백질의 비-제한적인 예는 작은 유비퀴틴-유사 개질제 (SUMO), 유비퀴틴 교차-반응성 단백질 (UCRP, 또한 인터페론-자극된 유전자-15 (ISG15)로서 공지됨), 유비퀴틴-관련된 변형제-1 (URM1), 뉴런-전구체-세포-발현된 발전적으로 하향조절된 단백질-8 (NEDD8, 또한 S. 세레비지애에서 Rub1로 불림), 인간 백혈구 항원 F-관련된 (FAT10), 자가포식-8 (ATG8) 및 -12 (ATG12), Fau 유비퀴틴-유사 단백질 (FUB1), 막-고정된 UBL (MUB), 유비퀴틴 폴드-변형제-1 (UFM1), 및 유비퀴틴-유사 단백질-5 (UBL5)를 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질 도메인은 마커 도메인일 수 있다. 마커 도메인의 비-제한적인 예는 형광 단백질, 정제 태그, 에피토프 태그, 및 리포터 유전자 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 마커 도메인은 형광 단백질일 수 있다. 적합한 형광 단백질의 비-제한적인 예는 녹색 형광 단백질 (예를 들면, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, sfGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1 ), 황색 형광 단백질 (예를 들면, YFP, EYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), 청색 형광 단백질 (예를 들면, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire,), 시안 형광 단백질 (예를 들면, ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질 (예를 들면, mKate, mKate2, mPlum, DsRed monomer, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred), 및 오렌지 형광 단백질 (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) 또는 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 포함한다. 다른 구현예에서, 마커 도메인은 정제 태그 및/또는 에피토프 태그일 수 있다. 비제한적인 예시적인 태그는 글루타티온-S-전달효소 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토스 결합 단백질 (MBP), 티오레독신 (TRX), 폴리(NANP), 탠덤 친화성 정제 (TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 8xHis, 바이오틴 카복실 캐리어 단백질 (BCCP), 폴리-His, 및 칼모둘린을 포함한다. 비제한적인 예시적인 리포터 유전자는 글루타티온-S-전달효소 (GST), 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP), 클로르암페니콜 아세틸전달효소 (CAT), 베타-갈락토시다아제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라아제, 또는 형광 단백질을 포함한다.
추가의 구현예에서, 단백질 도메인은 특정 소기관, 세포 유형, 조직, 또는 장기에 뉴클레아제를 표적시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 도메인은 미토콘드리아에 뉴클레아제를 표적시킬 수 있다.
추가 구현예에서, 단백질 도메인은 효과기 도메인일 수 있다. 뉴클레아제가 그것의 표적 서열에 유도되는 경우, 예를 들면, Cas9 단백질이 가이드 RNA에 의해 표적 서열에 유도되는 경우, 효과기 도메인은 표적 서열을 변형시킬 수 있거나 영향을 줄 수 있다. 일부 구현예에서, 효과기 도메인은 핵산 결합 도메인, 뉴클레아제 도메인, 후성유전적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 메틸화 도메인, 또는 전사 억제인자 도메인으로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, DNA 변형 도메인은 메틸화 도메인, 예컨대 탈메틸화 또는 메틸전달효소 도메인이다. 특정 구현예에서, 효과기 도메인은 DNA 변형 도메인, 예컨대 염기-편집 도메인이다. 특정한 구현예에서, DNA 변형 도메인은 DNA에 특정 변형을 도입하는 핵산 편집 도메인, 예컨대 데아미나제 도메인이다. 참고 WO 2015/089406; US 2016/0304846. WO 2015/089406 및 US 2016/0304846에서 기재된 핵산 편집 도메인, 데아미나제 도메인, 및 Cas9 변이체는 참고로 이로써 편입된다.
가이드 RNA
본 개시내용의 일부 구현예에서, LNP 제형용 전달대상물은 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함한다. 가이드 RNA는 표적 핵산 분자상의 표적 서열에 부류 2 Cas 뉴클레아제를 가이드할 수 있고, 여기에서 상기 가이드 RNA는 하이브리드화하고 상기 Cas 뉴클레아제는 표적 서열을 절단하거나 조정한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 부류 2 뉴클레아제에 의해 절단의 특이성을 제공하고 결합한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 및 Cas 단백질은 리보핵단백질 (RNP), 예를 들면, CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 복합체는 유형-II CRISPR/Cas9 복합체일 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 복합체는 유형-V CRISPR/Cas 복합체, 예컨대 Cpf1/가이드 RNA 복합체일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 단일-단백질 Cas 뉴클레아제, 예를 들면 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는Cas9 단백질에 의한 절단을 표적한다.
CRISPR/Cas9 뉴클레아제 시스템용 가이드 RNA는 CRISPR RNA (crRNA) 및 tracr RNA (tracr)을 포함한다. 일부 구현예에서, crRNA는 표적 핵산 분자에서 표적 서열과 하이브리드화하고 상기에 상보적인 표적화 서열을 포함할 수 있다. crRNA는 또한 tracrRNA의 한 부분과 하이브리드화하고 상기에 상보적인 깃대를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA는 박테리아의 CRISPR 유전자좌로부터 전사된 자연 발생 crRNA의 구조를 평행시킬 수 있고, 여기에서 표적화 서열은 CRISPR/Cas9 시스템의 스페이서로서 작동하고, 깃대는 CRISPR 유전자좌에서 스페이서를 측접하는 반복 서열의 한 부분에 상응한다.
가이드 RNA는 crRNA의 표적화 서열을 통해 관심의 임의의 서열을 표적할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열과 표적 핵산 분자에서 표적 서열 사이 상보성의 정도는 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열 그리고 표적 핵산 분자에서 표적 서열은 100% 상보적일 수 있다. 다른 구현예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열 그리고 표적 핵산 분자에서 표적 서열은 적어도 하나의 미스매치를 함유할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA의 표적화 서열 그리고 표적 핵산 분자에서 표적 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 미스매치를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열 그리고 표적 핵산 분자에서 표적 서열은 1-6 미스매치를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열 그리고 표적 핵산 분자에서 표적 서열은 5 또는 6 미스매치를 함유할 수 있다.
표적화 서열의 길이는 사용된 CRISPR/Cas 시스템 및 성분에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 상이한 박테리아 종으로부터 상이한 Cas 단백질은 다양한 최적의 표적화 서열 길이를 갖는다. 따라서, 표적화 서열은 길이 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 50 초과 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 길이 18-24 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 길이 19-21 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 길이 20 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
깃대는 기능적 CRISPR/Cas 복합체의 형성을 촉진시키기 위해 tracr RNA와 충분한 상보성을 가진 임의의 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 깃대는 동일한 CRISPR/Cas 시스템에서 tracr RNA에 상보적인 자연-발생 crRNA의 (또한 "태그" 또는 "핸들"로 불리는) 서열의 전부 또는 한 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 깃대는 자연-발생 CRISPR/Cas 시스템으로부터 반복 서열의 전부 또는 한 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 깃대는 절단된 또는 변형된 태그 또는 핸들 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 2 서열 중 더 짧은 것의 길이를 따라 tracr RNA와 하이브리드화하는 깃대의 부분과 tracr RNA 사이 상보성의 정도는 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 더 높을 수 있지만, 100%보다 낮다. 일부 구현예에서, tracr RNA 그리고 tracr RNA와 하이브리드화하는 깃대의 부분은 tracr과 깃대 사이 워블 염기 짝짓기 및/또는 tracr에서 하나 이상의 팽출 구조의 존재 때문에 2 서열 중 더 짧은 것의 길이를 따라 100% 상보적이지 않다. 깃대의 길이는 사용된 tracr RNA 또는 CRISPR/Cas 시스템에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 깃대는 길이 10-50 뉴클레오타이드, 또는 50 초과 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 깃대는 길이 15-40 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 깃대는 길이 20-30 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 더욱 다른 구현예에서, 깃대는 길이 22 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이중 가이드 RNA가 사용되는 경우, 예를 들어, 깃대의 길이는 상한이 없을 수 있다.
일부 구현예에서, tracr RNA는 자연-발생 CRISPR/Cas 시스템으로부터 야생형 tracr RNA 서열의 전부 또는 한 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, tracr RNA는 야생형 tracr RNA의 절단된 또는 변형된 변이체를 포함할 수 있다. tracr RNA의 길이는 사용된 CRISPR/Cas 시스템에 의해 좌우될 수 있다. 일부 구현예에서, tracr RNA는 길이 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 100 초과 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, tracr은 길이 적어도 26 뉴클레오타이드이다. 추가의 구현예에서, tracr은 길이 적어도 40 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, tracr RNA는 특정 2차 구조, 예컨대, 예를 들면, 하나 이상의 헤어핀 또는 줄기구조 구조, 또는 하나 이상의 팽출 구조를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 2 RNA 분자를 포함할 수 있고 본 명세서에서 "이중 가이드 RNA" 또는 "dgRNA"로서 지칭된다. 일부 구현예에서, dgRNA는 crRNA를 포함하는 제1 RNA 분자, 그리고 tracr RNA를 포함하는 제2 RNA 분자를 포함할 수 있다. 제1 및 제2 RNA 분자는 crRNA 및 tracr RNA에서 깃대 사이 염기 짝짓기를 통해 RNA 듀플렉스를 형성할 수 있다.
추가의 구현예에서, 가이드 RNA는 단일 RNA 분자를 포함할 수 있고 본 명세서에서 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로서 지칭된다. 일부 구현예에서, sgRNA는 tracr RNA에 공유결합된 crRNA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA 및 tracr RNA는 링커를 통해 공유결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일-분자 가이드 RNA는 crRNA 및 tracr RNA에서 깃대 사이 염기 짝짓기를 통해 줄기-루프 구조를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, sgRNA는 Cas9 단백질에 의한 RNA-유도된 DNA 절단을 매개할 수 있는 "Cas9 sgRNA"이다. 일부 구현예에서, sgRNA는 Cpf1 단백질에 의한 RNA-유도된 DNA 절단을 매개할 수 있는 "Cpf1 sgRNA"이다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA는 Cas9 단백질과 활성 복합체 형성 그리고 RNA-유도된 DNA 절단 매개에 충분한 crRNA 및 tracr RNA를 포함한다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA는 Cpf1 단백질과 활성 복합체 형성 그리고 RNA-유도된 DNA 절단 매개에 충분한 crRNA를 포함한다. 참고 Zetsche 2015.
본 발명의 특정 구현예는 또한 본 명세서에서 기재된 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산, 예를 들면, 발현 카셋트를 제공한다. "가이드 RNA 핵산"은, 하나 이상의 가이드 RNAs를 인코딩하는 핵산인, 가이드 RNA (예를 들면 sgRNA 또는 dgRNA) 및 가이드 RNA 발현 카셋트를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
일부 구현예에서, 핵산은 DNA 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 crRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 자연-발생 CRISPR/Cas 시스템으로부터 반복 서열의 전부 또는 한 부분에 의해 측접된 표적화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 tracr RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA 및 tracr RNA는 2개의 별개의 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 다른 구현예에서, crRNA 및 tracr RNA는 단일 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA 및 tracr RNA는 단일 핵산의 반대편 가닥에 의해 인코딩될 수 있다. 다른 구현예에서, crRNA 및 tracr RNA는 단일 핵산의 동일한 가닥에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카셋트는 sgRNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 발현 카셋트는 Cas9 뉴클레아제 sgRNA를 인코딩한다. 컴 구현예에서, 발현 카셋트는 Cpf1 뉴클레아제 sgRNA를 인코딩한다.
가이드 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 전사 또는 조절 제어 서열, 예컨대 프로모터, 3' UTR, 또는 5' UTR에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일 예에서, 프로모터는 tRNA 프로모터, 예를 들면, tRNALys3, 또는 tRNA 키메라일 수 있다. 참고 Mefferd 등, RNA. 2015 21:1683-9; Scherer 등, Nucleic Acids Res. 2007 35: 2620-2628. 특정 구현예에서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 III (Pol III)에 의해 인식될 수 있다. Pol III 프로모터의 비-제한적인 예는 또한 U6 및 HI 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 인간 U6 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카셋트는 변형된 핵산이다. 특정 구현예에서, 발현 카셋트는 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 카셋트는 발현 카셋트의 통합을 안정화 및 예방하기 위해 5' 말단 변형, 예를 들어 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 카셋트는 각각의 가닥에서 5' 말단 변형을 갖는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카셋트는 5' 말단 변형으로서 역전된 디데옥시-T 또는 역전된 무염기성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 카셋트는, 예를 들어, FAM, ROX, TAMRA, 및 AlexaFluor를 포함하는, 라벨 예컨대 바이오틴, 데스티오바이오텐-TEG, 디곡시제닌, 및 형광 마커를 포함한다.
특정 구현예에서, 1 초과 가이드 RNA는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템과 사용될 수 있다. 각각의 가이드 RNA는 상이한 표적화 서열을 함유할 수 있어서, 이로써 CRISPR/Cas 시스템은 1 초과 표적 서열을 절단시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNAs는 CRISPR/Cas 복합체 내에서 동일한 또는 상이한 특성 예컨대 활성 또는 안정성을 가질 수 있다. 1 초과 가이드 RNA가 사용되는 경우, 각각의 가이드 RNA는 동일한 또는 상이한 발현 카셋트에서 인코딩될 수 있다. 1 초과 가이드 RNA의 발현을 구동시키는데 사용된 프로모터는 동일 또는 상이할 수 있다.
화학적으로 변형된 RNAs
변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 가이드 RNA 또는 mRNA에서 존재할 수 있다. 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 가이드 RNA 또는 Cas 뉴클레아제 인코딩 mRNA는 표준적 A, G, C, 및 U 잔기 대신에 또는 상기에 더하여 사용되는 하나 이상의 비-천연 및/또는 자연 발생 성분 또는 배치형태의 존재를 기재하기 위해 "변형된" RNA로 불린다. 일부 구현예에서, 변형된 RNA는, 여기에서 "변형된"으로 불리는, 비-표준적 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드와 합성된다. 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 하나 이상의 하기를 포함할 수 있다: (i) 포스포디에스테르 골격 연결기에서 연결 포스페이트 산소의 하나 이상의 및/또는 비-연결 포스페이트 산소의 한쪽 또는 양쪽의 변경, 예를 들면, 대체 (예시적인 골격 변형); (ii) 리보오스 당의 구성성분의, 예를 들면, 리보오스 당에서 2' 히드록실의 변경, 예를 들면, 대체 (예시적인 당 변형); (iii) 포스페이트 모이어티의 "데포스포" 링커로의 대규모 대체 (예시적인 골격 변형); (iv) 비-표준적 핵염기를 포함하는, 자연 발생 핵염기의 변형 또는 대체 (예시적인 염기 변형); (v) 리보오스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형 (예시적인 골격 변형); (vi) 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들면, 말단 포스페이트 기의 제거, 변형 또는 대체 혹은 모이어티, 캡 또는 링커의 콘주게이션 (그와 같은 3' 또는 5' 캡 변형은 당 및/또는 골격 변형을 포함할 수 있다); 및 (vii) 당의 변형 또는 대체 (예시적인 당 변형).
상기 열거된 변형은 2, 3, 4, 또는 초과 변형을 가질 수 있는 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드 (집합적으로 "잔기")를 포함하는 변형된 RNAs를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 예를 들어, 변형된 잔기는 변형된 당 및 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA의 모든 염기는 변형되고, 예를 들면, 모든 염기는 변형된 포스페이트 기, 예컨대 포스포로티오에이트 기를 갖는다. 특정 구현예에서, sgRNA 분자의 포스페이트 기의 모두, 또는 실질적으로 모두는 포스포로티오에이트 기로 대체된다. 일부 구현예에서, 변형된 RNAs는 RNA의 5' 말단에서 또는 근처에서 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 RNAs는 RNA의 3' 말단에서 또는 근처에서 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다.
특정 구현예에서, 변형된 잔기는 가이드 RNA에 편입될 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 잔기는 mRNA에 편입될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 1, 2, 3 또는 초과 변형된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 가이드 RNA의 각각의 5' 및 3' 말단에서 1, 2, 3 또는 초과 변형된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서 mRNA는 5, 10, 15, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 또는 초과 변형된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 가이드 RNA 또는 mRNA의 위치의 적어도 5% (예를 들면, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%), 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%)는 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드이다.
미변형된 핵산은, 예를 들면, 세포 뉴클레아제에 의해 분해하기 쉬울 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제는 핵산 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있다. 따라서, 일 양태에서 본 명세서에서 기재된 가이드 RNAs는, 예를 들면, 뉴클레아제를 향해 안정성을 도입하기 위해, 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 mRNAs는, 예를 들면, 뉴클레아제를 향해 안정성을 도입하기 위해, 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 변형된 RNA 분자는, 양쪽 생체내 및 생체외, 세포의 모집단에 도입된 경우 감소된 선천적인 면역 반응을 나타낼 수 있다. 용어 "선천적인 면역 반응"은, 사이토카인 발현 및 방출, 특히 인터페론, 및 세포 사망의 유도를 연루하는, 단일 가닥 핵산을 포함하는, 외인성 핵산에 세포 반응을 포함한다.
골격 변형의 일부 구현예에서, 변형된 잔기의 포스페이트 기는 하나 이상의 산소의 상이한 치환체로의 대체에 의해 변형될 수 있다. 또한, 변형된 잔기, 예를 들면, 변형된 핵산에서 존재하는 변형된 잔기는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 미변형된 포스페이트 모이어티의 변형된 포스페이트 기로의 대규모 대체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 포스페이트 골격의 골격 변형은 비대칭 전하 분포로 어느 한쪽 미하전된 링커 또는 하전된 링커를 초래하는 변경을 포함할 수 있다.
변형된 포스페이트 기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 수소 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 미변형된 포스페이트 기에서 인 원자는 아키랄이다. 그러나, 비-브릿징 산소 중 하나의 상기 원자 또는 원자의 그룹 중 하나로의 대체는 인 원자를 키랄로 만들 수 있다. 입체 인 원자는 어느 한쪽 "R" 배치형태 (본 명세서에서 Rp) 또는 "S" 배치형태 (본 명세서에서 Sp)를 가질 수 있다. 골격은 또한 브릿징 산소, (즉, 포스페이트를 뉴클레오사이드에 연결시키는 산소)의, 질소 (브릿징된 포스포로아미데이트), 황 (브릿징된 포스포로티오에이트) 및 탄소 (브릿징된 메틸렌포스포네이트)로의 대체에 의해 변형될 수 있다. 대체는 어느 한쪽 연결 산소에서 또는 연결 산소의 양쪽에서 발생할 수 있다.
포스페이트 기는 특정 골격 변형에서 비-인 함유 커넥터에 의해 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 하전된 포스페이트 기는 중성 모이어티에 의해 대체될 수 있다. 포스페이트 기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는, 제한 없이, 예를 들면, 메틸 포스포네이트, 히드록실아미노, 실록산, 카보네이트, 카복시 메틸, 카바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌디메틸하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함할 수 있다.
핵산을 모방할 수 있는 스캐폴드는 또한 작제될 수 있고 여기에서 포스페이트 링커 및 리보오스 당이 뉴클레아제 저항성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 대리물로 대체된다. 그와 같은 변형은 골격 및 당 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는 대리물 백본에 의해 결박될 수 있다. 예는, 제한 없이, 모폴리노, 사이클로부틸, 피롤리딘 및 펩타이드 핵산 (PNA) 뉴클레오사이드 대리물을 포함할 수 있다.
변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 당 그룹에, 즉 당 변형에서 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' 히드록실 기 (OH)는 수많은 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환체로 변형, 예를 들면 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 히드록실 기로의 변형은 히드록실이 2'-알콕시드 이온을 형성하기 위해 더 이상 탈양성자화될 수 없기 때문에 핵산의 안정성을 향상시킬 수 있다.
2' 히드록실 기 변형의 예는 하기를 포함할 수 있다: 알콕시 또는 아릴옥시 (OR, 여기서 "R"은, 예를 들면, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있다); 폴리에틸렌글리콜 (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR 여기서 R은, 예를 들면, H 또는 임의로 치환된 알킬일 수 있고, 및 n은 정수 0 내지 20 (예를 들면, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20일 수 있다). 일부 구현예에서, 2' 히드록실 기 변형은 2'-O-Me일 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 히드록실 기 변형은, 2' 히드록실 기를 플루오라이드로 대체하는, 2'-플루오로 변형일 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 히드록실 기 변형은 2' 히드록실이, 예를 들면, C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 브릿지에 의해, 동일한 리보오스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있는 "잠금된" 핵산 (LNA)를 포함할 수 있고, 여기에서 예시적인 브릿지는 하기를 포함할 수 있다: 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 또는 아미노 브릿지; O-아미노 (여기서 아미노는, 예를 들면, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있다) 및 아미노알콕시, O(CH2)n-아미노, (여기서 아미노는, 예를 들면, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있다). 일부 구현예에서, 2' 히드록실 기 변형은 리보오스 고리가 C2'-C3' 결합이 부족한 "미잠금된" 핵산 (UNA)를 포함할 수 있었다. 일부 구현예에서, 2' 히드록실 기 변형은 메톡시에틸 기 (MOE), (OCH2CH2OCH3, 예를 들면, PEG 유도체)를 포함할 수 있다.
"데옥시" 2' 변형은 하기를 포함할 수 있다: 수소 (즉 데옥시리보스 당, 예를 들면, 부분적으로 dsRNA의 돌출부 부분에서); 할로 (예를 들면, 브로모, 클로로, 플루오로, 또는 아이오도); 아미노 (여기서 아미노는, 예를 들면, -NH2, 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 디헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있다); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2- 아미노 (여기서 아미노는, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같을 수 있다), -NHC(O)R (여기서 R은, 예를 들면, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있다), 시아노; 메르캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 아미노로 임의로 치환될 수 있는, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐.
당 변형은 리보오스에서 상응하는 탄소의 것보다 반대편 입체화학적 배치형태를 갖는 하나 이상의 탄소를 또한 함유할 수 있는 당 기를 포함할 수 있다. 따라서, 변형된 핵산은 당으로서 예를 들면, 아라비노오스를 함유하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 변형된 핵산은 또한 무염기성 당을 포함할 수 있다. 이들 무염기성 당은 또한 하나 이상의 구성성분 당 원자에서 추가로 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 또한 L 형태인 하나 이상의 당, 예를 들면 L-뉴클레오사이드를 포함할 수 있다.
변형된 핵산에 편입될 수 있는, 본 명세서에서 기재된 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는, 또한 핵염기로 불리는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 핵염기의 예는, 비제한적으로, 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C), 및 우라실 (U)를 포함한다. 이들 핵염기는 변형된 핵산에 편입될 수 있는 변형된 잔기를 제공하기 위해 변형 또는 전체적으로 대체될 수 있다. 뉴클레오타이드의 핵염기는 퓨린, 피리미딘, 퓨린 유사체, 또는 피리미딘 유사체로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는, 예를 들어, 염기의 자연-발생 및 합성 유도체를 포함할 수 있다.
이중 가이드 RNA를 이용하는 구현예에서, 각각의 crRNA 및 tracr RNA는 변형을 함유할 수 있다. 그와 같은 변형은 crRNA 및/또는 tracr RNA의 한쪽 또는 양쪽 말단에서일 수 있다. sgRNA를 포함하는 구현예에서, sgRNA의 한쪽 또는 양쪽 말단에서 하나 이상의 잔기는 화학적으로 변형될 수 있거나, 전체 sgRNA는 화학적으로 변형될 수 있다. 특정 구현예는 5' 말단 변형을 포함한다. 특정 구현예는 3' 말단 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 분자의 단일 가닥 돌출부에서 하나 이상의 또는 모든 뉴클레오타이드는 데옥시뉴클레오타이드이다. 변형된 mRNA는 5' 말단 및/또는 3' 말단 변형을 함유할 수 있다.
템플레이트 핵산
본 명세서에서 개시된 제형은 템플레이트 핵산을 포함할 수 있다. 템플레이트는 Cas 뉴클레아제용 표적 부위에서 또는 근처에서 핵산 서열을 변경 또는 삽입하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 템플레이트는 상동성 재조합에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상동성 재조합은 표적 핵산 분자에 템플레이트 서열 또는 템플레이트 서열의 한 부분의 통합을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 템플레이트는 제공될 수 있다. 다른 구현예에서, 둘 이상의 템플레이트는 상동성 재조합이 둘 이상의 표적 부위에서 발생할 수 있도록 제공될 수 있다. 예를 들어, 상이한 템플레이트는 세포에서 단일 유전자, 또는 세포에서 2 상이한 유전자를 보수하기 위해 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 템플레이트의 다중 카피는 세포에 제공된다. 일부 구현예에서, 상이한 템플레이트는 독립적인 카피 수 또는 독립적인 양으로 제공될 수 있다.
다른 구현예에서, 템플레이트는, 핵산에서 절단의 부위에 DNA 가닥 침습을 포함하는, 상동 지정 보수에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상동 지정 보수는 편집된 표적 핵산 분자에서 템플레이트 서열을 포함하여 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 템플레이트는 제공될 수 있다. 다른 구현예에서, 상이한 서열을 갖는 둘 이상의 템플레이트는 상동 지정 보수에 의해 둘 이상의 부위에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상이한 템플레이트는 세포에서 단일 유전자, 또는 세포에서 2 상이한 유전자를 보수하기 위해 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 템플레이트의 다중 카피는 세포에 제공된다. 일부 구현예에서, 상이한 템플레이트는 독립적인 카피 수 또는 독립적인 양으로 제공될 수 있다.
더욱 다른 구현예에서, 템플레이트는 비-상동성 말단 연결에 의해 매개된 유전자 편집에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 템플레이트 서열은 절단 부위 근처에서 핵산 서열에 유사성을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 템플레이트 또는 템플레이트 서열의 한 부분은 편입된다. 일부 구현예에서, 단일 템플레이트는 제공될 수 있다. 다른 구현예에서, 상이한 서열을 갖는 둘 이상의 템플레이트는 비-상동성 말단 연결에 의해 둘 이상의 부위에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 상이한 템플레이트는 세포에서 단일 템플레이트, 또는 세포에서 2 상이한 템플레이트를 삽입하기 위해 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 템플레이트는 독립적인 카피 수로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 템플레이트는 측접하는 역전된 말단 반복 (ITR) 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 템플레이트 서열은 표적 세포의 내인성 서열에 상응할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "내인성 서열"은 세포에 원상태인 서열을 지칭한다. 용어 "외인성 서열"은 세포에 원상태가 아닌 서열, 또는 세포의 게놈에서 원상태 위치가 상이한 위치인 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 내인성 서열은 세포의 게놈성 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 내인성 서열은 염색체 또는 염색체외 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 내인성 서열은 세포의 플라스미드 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 템플레이트 서열은 절단 부위에서 또는 근처에서 세포내 내인성 서열의 한 부분에 실질적으로 동일할 수 있지만, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변화를 포함한다. 일부 구현예에서, 템플레이트로 절단된 표적 핵산 분자의 보수는 표적 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함하는 돌연변이를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 표적 서열을 포함하는 유전자로부터 발현된 단백질에서 하나 이상의 아미노산 변화를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 표적 유전자로부터 발현된 RNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드 변화를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 표적 유전자의 발현 수준을 변경시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 표적 유전자의 증가된 또는 감소된 발현을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 유전자 녹다운을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 유전자 녹아웃을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 회복된 유전자 기능을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 템플레이트로 절단된 표적 핵산 분자의 보수는 표적 유전자의 엑손 서열, 인트론 서열, 조절 서열, 전사 제어 서열, 번역 제어 서열, 스플라이싱 부위, 또는 비-코딩 서열에서 변화를 초래할 수 있다.
다른 구현예에서, 템플레이트 서열은 외인성 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 서열은 외인성 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 단백질 또는 RNA 코딩 서열을 포함할 수 있어서 이로써, 표적 핵산 분자에 외인성 서열의 통합시, 세포는 통합된 서열에 의해 인코딩된 단백질 또는 RNA를 발현시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 표적 핵산 분자에 외인성 서열의 통합시, 통합된 서열의 발현은 내인성 프로모터 서열에 의해 조절될 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 서열은 염색체 또는 염색체외 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 서열은 단백질 또는 단백질의 한 부분을 인코딩하는 cDNA 서열을 제공할 수 있다. 더욱 다른 구현예에서, 외인성 서열은 엑손 서열, 인트론 서열, 조절 서열, 전사 제어 서열, 번역 제어 서열, 스플라이싱 부위, 또는 비-코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 서열의 통합은 회복된 유전자 기능을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 서열의 통합은 유전자 녹-인을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 서열의 통합은 유전자 녹아웃을 초래할 수 있다.
템플레이트는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 템플레이트는 길이 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 또는 초과 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 템플레이트는 단일-가닥 핵산일 수 있다. 템플레이트는 이중-가닥 또는 부분적으로 이중-가닥 핵산일 수 있다. 특정 구현예에서, 단일 가닥 템플레이트는 길이 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 또는 200 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 템플레이트는 표적 서열을 포함하는 표적 핵산 분자의 한 부분에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 (즉, "상동 아암")을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 템플레이트는 표적 핵산 분자에서 절단 부위의 업스트림 또는 다운스트림 위치한 서열에 상보적인 상동 아암을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 템플레이트는 절단 부위, 각각의 업스트림 및 다운스트림 위치한 서열에 상보적인 (또한 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열로 불리는) 제1 상동 아암 및 제2 상동 아암을 포함할 수 있다. 템플레이트가 2 상동 아암을 함유하는 경우, 각각의 아암은 동일한 길이 또는 상이한 길이일 수 있고, 상동 아암 사이 서열은 상동 아암 사이 표적 서열에 실질적으로 유사 또는 동일할 수 있거나, 또는 전적으로 관련없을 수 있다. 일부 구현예에서, 템플레이트에서 제1 뉴클레오타이드 서열과 절단 부위의 서열 업스트림 사이, 그리고 템플레이트에서 제2 뉴클레오타이드 서열과 절단 부위의 서열 다운스트림 사이 상보성의 정도는, 템플레이트와 표적 핵산 분자 사이, 상동성 재조합, 예컨대, 예를 들면, 고-충실도 상동성 재조합을 허용할 수 있다. 일부 구현예에서, 상보성의 정도는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, 상보성의 정도는 약 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, 상보성의 정도는 적어도 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, 상보성의 정도는 100%일 수 있다.
일부 구현예에서, 템플레이트는 측접하는 역-말단 반복 (ITR) 서열을 함유하는 ssDNA 또는 dsDNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 템플레이트는 플라스미드, 미니서클, 나노서클, 또는 PCR 생성물로서 공급된다.
핵산의 정제
일부 구현예에서, 핵산은 정제된다. 일부 구현예에서, 핵산은 침전 방법 (예를 들면, LiCl 침전, 알코올 침전, 또는 동등한 방법, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이)을 사용하여 정제된다. 일부 구현예에서, 핵산은 크로마토그래피-기반 방법, 예컨대 HPLC-기반 방법 또는 동등한 방법 (예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이)을 사용하여 정제된다. 일부 구현예에서, 핵은 양쪽 침전 방법 (예를 들면, LiCl 침전) 및 HPLC-기반 방법을 사용하여 정제된다.
표적 서열
일부 구현예에서, 본 개시내용의 CRISPR/Cas 시스템은 표적 핵산 분자에서 표적 서열을 절단시킬 수 있고 상기에 유도될 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 Cas 뉴클레아제에 의해 인식 및 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 부류 2 Cas 뉴클레아제는 표적 핵산 분자의 표적 서열에 가이드 RNA에 의해 유도될 수 있고, 여기에서 가이드 RNA는 하이브리드화하고 Cas 단백질은 표적 서열을 절단시킨다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 하이브리드화하고 Cas 단백질은 그것의 동족 PAM을 포함하는 표적 서열을 절단시킨다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 가이드 RNA의 표적화 서열에 상보적일 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열과 가이드 RNA에 하이브리드화하는 상응하는 표적 서열의 부분 사이 상보성의 정도는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서 표적의 상동성 영역은 동족 PAM 서열에 인접한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 가이드 RNA의 표적화 서열과 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 표적 서열은, 가이드 RNA의 표적화 서열에 비교된 경우, 적어도 하나의 미스매치, 결실, 또는 삽입을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA의 표적 서열 및 표적화 서열은, 임의로 PAM에 인접한 표적 서열의 한 부분에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 미스매치를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 표적 서열 및 표적화 서열은 1-9 미스매치를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 표적 서열 및 표적화 서열은 3-6 미스매치를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 표적 서열 및 표적화 서열은 5 또는 6 미스매치를 함유할 수 있다.
표적 서열의 길이는 사용된 뉴클레아제 시스템에 좌우될 수 있다. 예를 들어, CRISPR/Cas 시스템용 가이드 RNA의 표적화 서열은 길이 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 50 초과 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고 표적 서열은, 임의로 PAM 서열에 인접한, 상응하는 길이이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 길이 15-24 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 길이 17-21 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 길이 20 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 니카제가 사용되는 경우, 표적 서열은 DNA 분자의 반대편 가닥을 절단시키는 한 쌍의 니카제에 의해 인식된 한 쌍의 표적 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 DNA 분자의 동일한 가닥을 절단시키는 한 쌍의 니카제에 의해 인식된 한 쌍의 표적 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 하나 이상의 Cas 뉴클레아제에 의해 인식된 표적 서열의 일부를 포함할 수 있다.
표적 핵산 분자는 세포에 내인성 또는 외인성인 임의의 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵산 분자는 세포로부터 또는 세포에서 에피솜 DNA, 플라스미드, 게놈성 DNA, 바이러스성 게놈, 미토콘드리아 DNA, 또는 염색체일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵산 분자의 표적 서열은 세포로부터 또는 세포에서 게놈성 서열일 수 있다. 다른 구현예에서, 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 설치류 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 간 세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 인간 간 세포일 수 있다. 일부 구현예에서 간 세포는 간세포이다. 일부 구현예에서, 간세포는 인간 간세포이다. 일부 구현예에서, 간 세포는 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 인간 간 세포는 간 시누소이드 내피 세포 (LSEC)일 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 간 세포는 쿠퍼 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 간 세포는 간 성상 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 간 세포는 종양 세포일 수 있다. 추가의 구현예에서, 세포는 ApoE-결합 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 간 세포는 간 줄기 세포일 수 있다. 참고, 예를 들면, Wang, 등. Nature, 2015; Font-Burgada, 등. Cell, 2015, 162:766-799.
추가 구현예에서, 표적 서열은 바이러스성 서열일 수 있다. 추가 구현예에서, 표적 서열은 병원체 서열일 수 있다. 더욱 다른 구현예에서, 표적 서열은 합성된 서열일 수 있다. 추가 구현예에서, 표적 서열은 염색체 서열일 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 서열은 전좌 접합, 예를 들면, 암과 관련된 전좌를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 진핵 염색체, 예컨대 인간 염색체에서일 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 서열은, 간 세포에서 발현된다는 점에서, 간-특이적 서열이다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 인트론 서열, 조절 서열, 유전자의 전사 제어 서열, 유전자의 번역 제어 서열, 스플라이싱 부위 또는 유전자 사이 비-코딩 서열에서 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자는 단백질 코딩 유전자일 수 있다. 다른 구현예에서, 유전자는 비-코딩 RNA 유전자일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 질환-관련된 유전자의 전부 또는 한 부분을 포함할 수 있다. 특정 경우에, 유전자는 간에서 발현된다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 염색질 조직화의 양태를 제어하는 게놈에서 비-유전자성 기능적 부위, 예컨대 스캐폴드 부위 또는 유전자좌 조절 영역에 위치할 수 있다.
Cas 뉴클레아제, 예컨대 부류 2 Cas 뉴클레아제를 포함하는 구현예에서, 표적 서열은 프로토스페이서 인접한 모티프 ("PAM")에 인접할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM은 표적 서열의 3' 말단의 1, 2, 3, 또는 4, 뉴클레오타이드에 또는 이내 인접할 수 있다. PAM의 길이 및 서열은 사용된 Cas 단백질에 좌우될 수 있다. 예를 들어, PAM은, Ran 등, Nature, 520: 186-191 (2015)의 도 1, 및 Zetsche 2015의 도 S5에서 개시된 것을 포함하는, 특정 Cas9 단백질 또는 Cas9 오쏘로그용 공통 또는 특정 PAM 서열로부터 선택될 수 있고, 이들 각각의 관련된 개시내용은 본 명세서에서 참고로 편입된다. 일부 구현예에서, PAM은 길이 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오타이드일 수 있다. 비제한적인 예시적인 PAM 서열은 하기를 포함한다: NGG, NGGNG, NG, NAAAAN, NNAAAAW, NNNNACA, GNNNCNNA, TTN, 및 NNNNGATT (여기서 N은 임의의 뉴클레오타이드로서 정의되고, W는 어느 한쪽 A 또는 T로서 정의된다). 일부 구현예에서, PAM 서열은 NGG일 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 NGGNG일 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 TTN일 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 NNAAAAW일 수 있다.
지질 제형
CRISPR/Cas 전달대상물용 LNP 제형의 다양한 구현예가 본 명세서에서 개시된다. 그와 같은 LNP 제형은, 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 스텔스 지질과 함께, CCD 지질을 포함할 수 있다. "지질 나노입자"는 분자간 힘에 의해 서로 물리적으로 관련된 복수의 (즉 1 초과) 지질 분자를 포함하는 입자를 의미한다. LNPs는, 예를 들면, (일부 구현예에서, 실질적으로 구형인 ― 및, 더욱 특정 구현예에서, 예를 들면, RNA 분자의 상당한 부분을 포함하는, 수성 코어를 포함할 수 있는 층 상 지질 이중층 ― 단일층 및 다중층 소포, 예를 들면, "리포좀"을 포함하는) 마이크로구형체, 에멀젼에서 분산상, 교질입자, 또는 현탁액에서 내부 상일 수 있다. 에멀젼, 교질입자, 및 현탁액은 국부 및/또는 국소 전달에 적합한 조성물일 수 있다.
본 명세서에서 제공된 LNP 조성물은 간 세포 (예를 들면, 간세포)에 의해 우선적으로 흡수된다. 또한, LNP 조성물은, 이들이 치료적으로 효과적인 용량으로 생체내 세포독성 수준으로 축적하지 않는다는 점에서 생분해성이다. 일부 구현예에서, LNP 조성물은 치료 용량 수준에서 실질적인 역효과를 유발시키는 선천적인 면역 반응을 야기시키지 않는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 LNP 조성물은 치료 용량 수준에서 독성을 야기시키지 않는다. LNP 조성물은 혈액에서 아포지질단백질 예컨대 아포지질단백질 E (ApoE)에 특이적으로 결합한다. 아포지질단백질은 지질 수송 조절에서 핵심인 혈장에서 순환하는 단백질이다. ApoE는 지질단백질의 흡수 동안 간에서 세포 표면 헤파린 설페이트 프로테오글리칸과 상호작용하는 아포지질단백질의 한 부류를 나타낸다. (참조 예를 들면, Scherphof and Kamps, The role of hepatocytes in the clearance of liposomes from the blood circulation. Prog Lipid Res. 2001 May;40(3): 149-66).
CCD 지질
생물학적 활성제의 전달용 지질 조성물은 간 세포 또는 장기를 우선적으로 표적시키기 위해 조정될 수 있다. 특정 구현예에서, 지질 조성물은 아포지질단백질 E (ApoE)-결합 세포, 예컨대 ApoE 수용체를 발현시키는 세포를 우선적으로 표적시킨다. 간 세포에 CRISPR/Cas mRNA 및 가이드 RNA 성분의 전달용 지질 조성물은 CCD 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, CCD 지질은, 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트로 또한 불리는, (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필옥타데카-9,12-디에노에이트인, 지질 A이다. 지질 A는 하기로서 묘사될 수 있다:
지질 A는 WO2015/095340 (예를 들면, pp. 84-86)에 따라 합성될 수 있다.
일부 구현예에서, CCD 지질은, ((5-((디메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-디일)비스(데카노에이트)로 또한 불리는, ((5-((디메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-디일)비스(데카노에이트)인, 지질 B이다. 지질 B는 하기로서 묘사될 수 있다:
지질 B는 WO2014/136086 (예를 들면, pp. 107-09)에 따라 합성될 수 있다.
일부 구현예에서, CCD 지질은, 2-((4-(((3-(디메틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-바이(옥타데카-9,12-디에노에이트)인, 지질 C이다. 지질 C는 하기로서 묘사될 수 있다:
일부 구현예에서, CCD 지질은, 3-(((3-(디메틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)-13-(옥타노일옥시)트리데실 3-옥틸운데카노에이트인, 지질 D이다.
지질 D는 하기로서 묘사될 수 있다:
지질 C 및 지질 D는 WO2015/095340에 따라 합성될 수 있다.
CCD 지질은 또한 지질 A, 지질 B, 지질 C, 또는 지질 D에 등가물일 수 있다. 특정 구현예에서, CCD 지질은 지질 A에 등가물이거나 지질 B에 등가물이다.
본 명세서에서 기재된 LNPs에서 사용에 적합한 CCD 지질은 생체내 생분해성이다. CCD 지질은 저독성을 갖는다 (예를 들면, 10 mg/kg 초과 또는 동등의 양으로 역효과 없이 동물 모델에서 용인된다). 특정 구현예에서, CCD 지질을 포함하는 LNPs는 CCD 지질의 적어도 75%가 8, 10, 12, 24, 또는 48 시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 10 일 이내 혈장으로부터 청소되는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, CCD 지질을 포함하는 LNPs는 mRNA 또는 가이드 RNA의 적어도 50%가 8, 10, 12, 24, 또는 48 시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 10 일 이내 혈장으로부터 청소되는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, CCD 지질을 포함하는 LNPs는 LNP의 적어도 50%가, 예를 들어 지질 (예를 들면 CCD 지질), RNA (예를 들면 mRNA), 또는 단백질 성분 측정에 의해, 8, 10, 12, 24, 또는 48 시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 10 일 이내 혈장으로부터 청소되는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, LNP의 지질-캡슐화된 대 자유 지질, RNA, 또는 단백질 성분은 측정된다.
지질 청소능은 문헌에서 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 참고 Maier, M.A., 등. Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics. Mol. Ther. 2013, 21(8), 1570-78 ("Maier"). 예를 들어, Maier에서, 루시퍼라아제-표적화 siRNA를 함유하는 LNP-siRNA 시스템은 측면 꼬리 정맥을 통해 정맥내 볼러스 주사로 0.3 mg/kg에서 6- 내지 8-주령 남성 C57B1/6 마우스에 투여되었다. 혈액, 간, 및 비장 샘플은 투여후 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96, 및 168 시간에서 수집되었다. 마우스는 조직 수집 전 염수로 살포되었고 혈액 샘플은 가공되어 혈장을 수득하였다. 모든 샘플은 가공되었고 LC-MS로 분석되었다. 또한, Maier는 LNP-siRNA 제형의 투여 후 독성의 평가 절차를 기재한다. 예를 들어, 루시퍼라아제-표적화 siRNA는 숫컷 스프래그-다우리 랫트에 5 mL/kg의 용량 용적에서 단일 정맥내 볼러스 주사를 통해 0, 1, 3, 5, 및 10 mg/kg (5 동물/그룹)에서 투여되었다. 24 시간 후, 약 1 mL의 혈액은 의식있는 동물의 경정맥으로부터 수득되었고 혈청은 단리되었다. 투여후 72 시간에, 모든 동물은 검시를 위하여 안락사되었다. 임상 징후, 체중, 혈청 화학, 장기 중량 및 조직병리의 평가는 수행되었다. Maier가 siRNA-LNP 제형의 평가 방법을 기재하여도, 이들 방법은 본 개시내용의 제형의 투여의 청소능, 약동학, 및 독성을 평가하는데 적용될 수 있다.
CCD 지질은 증가된 청소율을 초래한다. 일부 구현예에서, 청소율은 지질 청소율, 예를 들어 CCD 지질이 혈액, 혈청, 또는 혈장으로부터 청소되는 비율이다. 일부 구현예에서, 청소율은 RNA 청소율, 예를 들어 mRNA 또는 가이드 RNA가 혈액, 혈청, 또는 혈장으로부터 청소되는 비율이다. 일부 구현예에서, 청소율은 LNP가 혈액, 혈청, 또는 혈장으로부터 청소되는 비율이다. 일부 구현예에서, 청소율은 LNP가 조직, 예컨대 간 조직 또는 비장 조직으로부터 청소되는 비율이다. 특정 구현예에서, 청소율의 고율은 실질적인 역효과 없이 안전성 프로파일을 초래한다. CCD 지질은 순환에서 그리고 조직에서 LNP 축적을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 순환에서 그리고 조직에서 LNP 축적의 감소는 실질적인 역효과 없이 안전성 프로파일을 초래한다.
본 개시내용의 CCD 지질은 이들이 들어있는 배지의 pH에 의존하여 이온화가능성일 수 있다. 예를 들어, 약 산성 배지에서, CCD 지질은 양성자화될 수 있고 따라서 양전하를 보유한다. 반대로, 약 염기성 배지, 예컨대, 예를 들어, pH가 대략 7.35인 혈액에서, CCD 지질은 양성자화될 수 있고 따라서 전하를 보유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 CCD 지질은 적어도 약 9의 pH에서 양성자화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 CCD 지질은 적어도 약 9의 pH에서 양성자화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 CCD 지질은 적어도 약 10의 pH에서 양성자화될 수 있다.
전하를 보유하기 위한 CCD 지질의 능력은 그것의 고유 pKa에 관련된다. 예를 들어, 본 개시내용의 CCD 지질은 각각, 독립적으로, 약 5.8 내지 약 6.2의 범위에서 pKa를 가질 수 있다. 이것은 약 5.1 내지 약 7.4 범위의 pKa를 가진 양이온성 지질이 간에 전달대상물의 전달에 효과적임이 밝혀졌음에 따라 유리할 수 있다. 또한, 약 5.3 내지 약 6.4 범위의 pKa를 가진 양이온성 지질이 종양에 전달에 효과적임이 밝혀졌다. 참고, 예를 들면, WO 2014/136086.
추가의 지질
본 개시내용의 지질 조성물에서 사용에 적합한 "중성 지질"은, 예를 들어, 여러 가지의 중성, 미하전된 또는 쯔비터이온성 지질을 포함한다. 본 개시내용에서 사용에 적합한 중성 인지질의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 5-헵타데실벤젠-1,3-디올 (레조르시놀), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 포흐스포콜린 (DOPC), 디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 포스파티딜콜린 (PLPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DAPC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 에그 포스파티딜콜린 (EPC), 디라우릴로일포스파티딜콜린 (DLPC), 디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린 (MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린 (PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린 (PSPC), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DBPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린 (SPPC), 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DEPC), 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린 (POPC), 라이소포스파티딜 콜린, 디올레오일 포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 디리놀레오일포스파티딜콜린 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민 (DMPE), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 팔미토일올레오일 포스파티딜에탄올아민 (POPE), 라이소포스파티딜에탄올아민 및 이의 조합. 일 구현예에서, 중성 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC) 및 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민 (DMPE)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 중성 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC)일 수 있다. 중성 지질은 LNPs의 가공을 안정화 및 개선시키는 기능을 한다.
"헬퍼 지질"은 (형질감염 (예를 들면 생물학적 활성제를 포함하는 나노입자의 형질감염)을 향상시키는 지질이다. 헬퍼 지질이 형질감염을 향상시키는 기전은 향상 입자 안정성을 포함한다. 특정 구현예에서, 헬퍼 지질은 막 융합유도성을 향상시킨다. 헬퍼 지질은 스테로이드, 스테롤, 및 알킬 레조르시놀을 포함한다. 본 개시내용에서 사용에 적합한 헬퍼 지질은, 비제한적으로, 콜레스테롤, 5-헵타데실레조르시놀, 및 콜레스테롤 헤미석시네이트를 포함한다. 일 구현예에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤일 수 있다. 일 구현예에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤 헤미석시네이트일 수 있다.
"스텔스 지질"은 나노입자가 생체내 (예를 들면, 혈액에서) 실존할 수 있는 시간의 기간을 변경시키는 지질이다. 스텔스 지질은, 예를 들어, 입자 응집 감소 및 입자 크기 제어에 의해 제형 공정에서 일조할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 스텔스 지질은 LNP의 약동학적 특성을 조정할 수 있다. 본 개시내용의 지질 조성물에서 사용에 적합한 스텔스 지질은, 비제한적으로, 지질 모이어티에 연결된 친수성 헤드 기를 갖는 스텔스 지질을 포함한다. 본 개시내용의 지질 조성물에서 사용에 적합한 스텔스 지질 그리고 그와 같은 지질의 생화학에 대한 정보는 아래에 발견될 수 있다: Romberg 등, Pharmaceutical Research, Vol. 25, No. 1, 2008, pg. 55-71 및 Hoekstra 등, Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52. 추가의 적합한 PEG 지질은, 예를 들면, WO 2006/007712에서 개시된다.
일 구현예에서, 스텔스 지질의 친수성 헤드 기는 PEG (때때로 폴리(에틸렌 옥사이드)로 칭함), 폴리(옥사졸린), 폴리(비닐 알코올), 폴리(글리세롤), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리아미노산 및 폴리[N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드]에 기반된 폴리머로부터 선택된 폴리머 모이어티를 포함한다.
스텔스 지질은 지질 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스텔스 지질의 지질 모이어티는 약 C4 내지 약 C40 포화된 또는 불포화된 탄소 원자를 독립적으로 포함하는 알킬 사슬 길이를 갖는 디알킬글리세롤 또는 디알킬글리카미드 기를 포함하는 것을 포함하는, 디아실글리세롤 또는 디아실글리카미드로부터 유래될 수 있고, 여기서 상기 사슬은 하나 이상의 작용기 예컨대, 예를 들어, 아미드 또는 에스테르를 포함할 수 있다. 디알킬글리세롤 또는 디알킬글리카미드 기는 하나 이상의 치환된 알킬 기를 추가로 포함할 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "PEG"는 임의의 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 폴리알킬렌 에테르 폴리머를 의미한다. 일 구현예에서, PEG는 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 옥사이드의 임의로 치환된 선형 또는 분지형 폴리머이다. 일 구현예에서, PEG는 미치환된다. 일 구현예에서, PEG는, 예를 들면, 하나 이상의 알킬, 알콕시, 아실, 하이드록시, 또는 아릴 기로 치환된다. 일 구현예에서, 상기 용어는 PEG 코폴리머 예컨대 PEG-폴리우레탄 또는 PEG-폴리프로필렌 (참고, 예를 들면, J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992))를 포함하고; 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 PEG 코폴리머를 포함하지 않는다. 일 구현예에서, PEG는 약 130 내지 약 50,000, 하위-구현예에서, 약 150 내지 약 30,000, 하위-구현예에서, 약 150 내지 약 20,000, 하위-구현예에서 약 150 내지 약 15,000, 하위-구현예에서, 약 150 내지 약 10,000, 하위-구현예에서, 약 150 내지 약 6,000, 하위-구현예에서, 약 150 내지 약 5,000, 하위-구현예에서, 약 150 내지 약 4,000, 하위-구현예에서, 약 150 내지 약 3,000, 하위-구현예에서, 약 300 내지 약 3,000, 하위-구현예에서, 약 1,000 내지 약 3,000, 및 하위-구현예에서, 약 1,500 내지 약 2,500의 분자량을 갖는다.
특정 구현예에서, (예를 들면, 지질, 예컨대 스텔스 지질에 접합된) PEG는, 약 2,000 달톤의 평균 분자량을 갖는, "PEG-2K", 또한 일명 "PEG 2000"이다. PEG-2K는, 수평균화된 중합도가 약 45 하위단위를 포함하는 것을 의미하는, 하기 식 (I)로 본 명세서에서 표시되고, 여기서 n은 45이다 그러나, 예를 들면, 수-평균 중합도가 약 23 하위단위 (n=23), 및/또는 68 하위단위 (n=68)을 포함하는 것을 포함하는, 당해 분야에서 공지된 다른 PEG 구현예는 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, n은 약 30 내지 약 60의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, n은 약 35 내지 약 55의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, n은 약 40 내지 약 50의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, n은 약 42 내지 약 48의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, n은 45일 수 있다. 일부 구현예에서, R은 H, 치환된 알킬, 및 미치환된 알킬로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, R은 미치환된 알킬일 수 있다. 일부 구현예에서, R은 메틸일 수 있다.
본 명세서에서 기재된 임의의 구현예에서, 스텔스 지질은 하기로부터 선택될 수 있다: PEG-디라우로일글리세롤, PEG-디미리스토일글리세롤 (PEG-DMG) (카탈로그 # GM-020 NOF제, Tokyo, Japan), PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테아로일글리세롤 (PEG-DSPE) (카탈로그 # DSPE-020CN, NOF, Tokyo, Japan), PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, 및 PEG-디스테아로일글리카미드, PEG-콜레스테롤 (1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB (3,4-디테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2k-DMG) (cat. #880150P Avanti Polar Lipids제, Alabaster, Alabama, USA), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2k-DSPE) (cat. #880120C Avanti Polar Lipids제, Alabaster, Alabama, USA), 1,2-디스테아로일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (PEG2k-DSG; GS-020, NOF Tokyo, Japan), 폴리(에틸렌 글리콜)-2000-디메타크릴레이트 (PEG2k-DMA), 및 1,2-디스테아릴옥시프로필-3-아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2k-DSA). 일 구현예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG일 수 있다. 일부 구현예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DSG일 수 있다. 일 구현예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DSPE일 수 있다. 일 구현예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMA일 수 있다. 일 구현예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DSA일 수 있다. 일 구현예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-C11일 수 있다. 일부 구현예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-C14일 수 있다. 일부 구현예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-C16일 수 있다. 일부 구현예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-C18일 수 있다.
LNP 제형
LNP는 (i) 캡슐화용 및 엔도조말 탈출용 CCD 지질, (ii) 안정화용 중성 지질, (iii) 또한 안정화용 헬퍼 지질, 및 (iv) 스텔스 지질을 함유할 수 있다.
특정 구현예에서, 전달대상물은 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 인코딩하는 mRNA, 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, LNP 조성물은 CCD 지질, 예컨대 지질 A, 지질 B, 지질 C, 또는 지질 D를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, CCD 지질은 지질 A이다. 일부 양태에서, CCD 지질은 지질 B이다. 다양한 구현예에서, LNP 조성물은 CCD 지질, 중성 지질, 헬퍼 지질, 및 스텔스 지질을 포함한다. 특정 구현예에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 특정 구현예에서, 중성 지질은 DSPC이다. 특정 구현예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 구현예에서, LNP 조성물은 지질 A, 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 스텔스 지질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 조성물은 CCD 지질, DSPC, 콜레스테롤, 및 스텔스 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 조성물은 PEG를 포함하는 스텔스 지질을 포함한다. 특정 구현예에서, CCD 지질은 지질 A, 지질 B, 지질 C, 또는 지질 D로부터 선택된다. 추가의 구현예에서, LNP 조성물은 지질 A 또는 지질 B로부터 선택된 CCD 지질, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG를 포함한다.
일 구현예에서, LNP 조성물은 CCD 지질 그리고 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, LNP 조성물은 CCD 지질, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA, 및 적어도 하나의 다른 지질 성분을 포함할 수 있다. Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 일부 조성물에서, LNP는 헬퍼 지질, 중성 지질, 또는 스텔스 지질로부터 선택된 적어도 하나의 다른 지질 성분을 포함한다. Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 특정 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 다른 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 추가의 구현예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다. 특정 구현예에서, LNP 조성물은 CCD 지질, 헬퍼 지질, 중성 지질, 스텔스 지질, 및 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다. Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 특정 조성물에서, CCD 지질은 지질 A, 지질 B, 지질 C, 또는 지질 D로부터 선택된다. Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 추가의 조성물에서, CCD 지질은 지질 A, 지질 B, 지질 C, 또는 지질 D로부터 선택되고, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고, 중성 지질은 DSPC이고, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 조성물에서 CCD 지질은 지질 A이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 조성물에서 CCD 지질은 지질 B이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 조성물에서 CCD 지질은 지질 C이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 조성물에서 CCD 지질은 지질 D이다.
일 구현예에서, LNP 조성물은 CCD 지질 및 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, LNP 조성물은 CCD 지질, 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA, 및 적어도 하나의 다른 지질 성분을 포함할 수 있다. 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함하는 일부 조성물에서, LNP는 헬퍼 지질, 중성 지질, 또는 스텔스 지질로부터 선택된 적어도 하나의 다른 지질 성분을 포함한다. 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함하는 특정 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함하는 다른 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함하는 추가의 구현예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다. 특정 구현예에서, LNP 조성물은 CCD 지질, 헬퍼 지질, 중성 지질, 스텔스 지질, 및 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함할 수 있다. 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함하는 특정 조성물에서, CCD 지질은 지질 A, 지질 B, 지질 C, 또는 지질 D로부터 선택된다. 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함하는 추가의 조성물에서, CCD 지질은 지질 A, 지질 B, 지질 C, 또는 지질 D로부터 선택되고, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고, 중성 지질은 DSPC이고, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 구현예에서, 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함하는 조성물에서 CCD 지질은 지질 A이다. 일부 구현예에서, 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함하는 조성물에서 CCD 지질은 지질 B이다. 일부 구현예에서, 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함하는 조성물에서 CCD 지질은 지질 C이다. 일부 구현예에서, 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함하는 조성물에서 CCD 지질은 지질 D이다.
일부 구현예에서, LNP 조성물은 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, LNP 조성물은 CCD 지질, 가이드 RNA, 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 스텔스 지질을 포함할 수 있다. 가이드 RNA를 포함하는 특정 LNP 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 가이드 RNA를 포함하는 다른 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. 가이드 RNA를 포함하는 추가의 구현예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG 또는 PEG2k-C11이다. 특정 구현예에서, LNP 조성물은 지질 A, 지질 B, 지질 C, 또는 지질 D; 헬퍼 지질; 중성 지질; 스텔스 지질; 및 가이드 RNA를 포함한다. 가이드 RNA를 포함하는 특정 조성물에서, CCD 지질 지질 A. 가이드 RNA를 포함하는 특정 조성물에서, CCD 지질은 지질 B이다. 가이드 RNA를 포함하는 특정 조성물에서, CCD 지질은 지질 C이다. 가이드 RNA를 포함하는 특정 조성물에서, CCD 지질은 지질 D이다. 가이드 RNA를 포함하는 추가의 조성물에서, CCD 지질은 지질 A, 지질 B, 지질 C, 또는 지질 D이고; 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고; 중성 지질은 DSPC이고; 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다.
특정 구현예에서, LNP 제형은 약 25:1 내지 약 1:25 범위의 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함한다. 특정 구현예에서, LNP 제형은 약 10:1 내지 약 1:10 범위의 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함한다. 본 명세서에서 측정된 바와 같이, 비는 중량 기준이다. 일부 구현예에서, LNP 제형은 약 5:1 내지 약 1:5 범위의 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 제형은 약 1:1의 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 제형은 약 1:1 내지 약 1:5 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 제형은 약 10:1의 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 제형은 약 1:10의 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함한다. 비는 약 25:1, 10:1, 5:1, 3 :1, 1:1, 1:3, 1:5, 1:10, 또는 1:25일 수 있다.
일 구현예에서, LNP 조성물은 sgRNA를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, LNP 조성물은 Cas9 sgRNA를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, LNP 조성물은 Cpf1 sgRNA를 포함할 수 있다. sgRNA를 포함하는 일부 조성물에서, LNP는 CCD 지질, 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 스텔스 지질을 포함한다. sgRNA를 포함하는 특정 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. sgRNA를 포함하는 다른 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. sgRNA를 포함하는 추가의 구현예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG 또는 PEG2k-C11이다. 특정 구현예에서, LNP 조성물은 CCD 지질, 헬퍼 지질, 중성 지질, 스텔스 지질, 및 sgRNA를 포함할 수 있다. sgRNA를 포함하는 특정 조성물에서, CCD 지질은 지질 A, 지질 B, 지질 C, 또는 지질 D이다. sgRNA를 포함하는 추가의 조성물에서, CCD 지질은 지질 A, 지질 B, 지질 C, 또는 지질 D이고; 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고; 중성 지질은 DSPC이고; 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다.
특정 구현예에서, LNP 조성물은 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 및, sgRNA일 수 있는, 가이드 RNA를 포함한다. 일 구현예에서, LNP 조성물은 CCD 지질, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA, 가이드 RNA, 헬퍼 지질, 중성 지질, 및 스텔스 지질을 포함할 수 있다. Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 및 가이드 RNA를 포함하는 특정 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 및 가이드 RNA를 포함하는 일부 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 및 가이드 RNA를 포함하는 추가의 구현예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG 또는 PEG2k-C11이다. 특정 구현예에서, LNP 조성물은 CCD 지질, 헬퍼 지질, 중성 지질, 스텔스 지질, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA, 및 가이드 RNA를 포함할 수 있다. Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 및 가이드 RNA를 포함하는 특정 조성물에서, CCD 지질은 지질 A, 지질 B, 지질 C, 또는 지질 D이다. Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 및 가이드 RNA를 포함하는 추가의 조성물에서, CCD 지질은 지질 A, 지질 B, 지질 C, 또는 지질 D이고; 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고; 중성 지질은 DSPC이고; 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다.
본 명세서에서 개시된 LNP 조성물은 템플레이트 핵산을 포함할 수 있다. 템플레이트 핵산은 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA, 예컨대 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA와 공동-제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 템플레이트 핵산은 가이드 RNA와 공동-제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 템플레이트 핵산은 양쪽 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 및 가이드 RNA와 공동-제형화돨 수 있다. 일부 구현예에서, 템플레이트 핵산은 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 또는 가이드 RNA로부터 별도로 제형화될 수 있다. 그와 같은 제형에서, 템플레이트 핵산은, 원하는 보수 기전에 의존하여, 단일- 또는 이중-가닥일 수 있다. 템플레이트는 표적 DNA에, 또는 표적 DNA에 인접한 서열에 상동성의 영역을 가질 수 있다.
본 개시내용의 구현예는 또한 제형에서 성분 지질의 각각의 몰비에 따라 기재된 지질 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, CCD 지질의 mol-%는 약 30 mol-% 내지 약 60 mol-%일 수 있다. 일 구현예에서, CCD 지질의 mol-%는 약 35 mol-% 내지 약 55 mol-%일 수 있다. 일 구현예에서, CCD 지질의 mol-%는 약 40 mol-% 내지 약 50 mol-%일 수 있다. 일 구현예에서, CCD 지질의 mol-%는 약 42 mol-% 내지 약 47 mol-%일 수 있다. 일 구현예에서, CCD 지질의 mol-%는 약 45%일 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 배치의 CCD 지질 mol-%는 표적 mol-%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5%, 또는 ±2.5%일 것이다. 특정 구현예에서, LNP 인터-롯트 가변성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
일 구현예에서, 헬퍼 지질의 mol-%는 약 30 mol-% 내지 약 60 mol-%일 수 있다. 일 구현예에서, 헬퍼 지질의 mol-%는 약 35 mol-% 내지 약 55 mol-%일 수 있다. 일 구현예에서, 헬퍼 지질의 mol-%는 약 40 mol-% 내지 약 50 mol-%일 수 있다. 일 구현예에서, 헬퍼 지질의 mol-%는 약 41 mol-% 내지 약 46 mol-%일 수 있다. 일 구현예에서, 헬퍼 지질의 mol-%는 약 44 mol-%일 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 배치의 헬퍼 mol-%는 표적 mol-%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5%, 또는 ±2.5%일 것이다. 특정 구현예에서, LNP 인터-롯트 가변성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
일 구현예에서, 중성 지질의 mol-%는 약 1 mol-% 내지 약 20 mol-%일 수 있다. 일 구현예에서, 중성 지질의 mol-%는 약 5 mol-% 내지 약 15 mol-%일 수 있다. 일 구현예에서, 중성 지질의 mol-%는 약 7 mol-% 내지 약 12 mol-%일 수 있다. 일 구현예에서, 중성 지질의 mol-%는 약 9 mol-%일 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 배치의 중성 지질 mol-%는 표적 mol-%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5%, 또는 ±2.5%일 것이다. 특정 구현예에서, LNP 인터-롯트 가변성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
일 구현예에서, 스텔스 지질의 mol-%는 약 1 mol-% 내지 약 10 mol-%일 수 있다. 일 구현예에서, 스텔스 지질의 mol-%는 약 1 mol-% 내지 약 5 mol-%일 수 있다. 일 구현예에서, 스텔스 지질의 mol-%는 약 1 mol-% 내지 약 3 mol-%일 수 있다. 일 구현예에서, 스텔스 지질의 mol-%는 약 2 mol-%일 수 있다. 일 구현예에서, 스텔스 지질의 mol-%는 약 1 mol-%일 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 배치의 스텔스 지질 mol-%는 표적 mol-%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5%, 또는 ±2.5%일 것이다. 특정 구현예에서, LNP 인터-롯트 가변성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
본 개시내용의 구현예는 또한 CCD 지질의 양으로 하전된 아민 기 (N)과 캡슐화되기 위한 핵산의 음으로 하전된 포스페이트 기 (P) 사이 비에 따라 기재된 지질 조성물을 제공한다. 이것은 방정식 N/P로 수학적으로 표시될 수 있다. 일 구현예에서, N/P 비는 약 0.5 내지 약 100일 수 있다. 일 구현예에서, N/P 비는 약 1 내지 약 50일 수 있다. 일 구현예에서, N/P 비는 약 1 내지 약 25일 수 있다. 일 구현예에서, N/P 비는 약 1 내지 약 10일 수 있다. 일 구현예에서, N/P 비는 약 1 내지 약 7일 수 있다. 일 구현예에서, N/P 비는 약 3 내지 약 5일 수 있다. 일 구현예에서, N/P 비는 약 4 내지 약 5일 수 있다. 일 구현예에서, N/P 비는 약 4일 수 있다. 일 구현예에서, N/P 비는 약 4.5일 수 있다. 일 구현예에서, N/P 비는 약 5일 수 있다.
일부 구현예에서, LNPs는 수성 RNA 용액을 유기 용매-기반 지질 용액, 예를 들면, 100% 에탄올과 혼합시킴으로써 형성된다. 적합한 용액 또는 용매는 하기를 포함하거나 함유할 수 있다: 물, PBS, 트리스 완충액, NaCl, 시트레이트 완충액, 에탄올, 클로로포름, 디에틸에테르, 사이클로핵산, 테트라하이드로푸란, 메탄올, 이소프로판올. 예를 들면, LNPs의 생체내 투여를 위하여, 약제학적으로 허용가능한 완충액은 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 완충액은 pH 7.0에서 또는 초과 LNPs를 포함하는 조성물의 pH를 유지하는데 사용된다. 추가의 구현예에서, 조성물은 약 7.3 내지 약 7.7 범위의 또는 약 7.4 내지 약 7.6 범위의 pH를 갖는다. 추가 구현예에서, 조성물은 약 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 또는 7.7의 pH를 갖는다. 조성물의 pH는 마이크로 pH 탐침으로 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 동결보호제는 조성물에서 포함된다. 동결보호제의 비-제한적인 예는 수크로스, 트레할로스, 글리세롤, DMSO, 및 에틸렌 글리콜을 포함한다. 예시적인 조성물은 최대 10% 동결보호제, 예컨대, 예를 들어, 수크로스를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, LNP 조성물은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10% 동결보호제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, LNP 조성물은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10% 수크로스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 조성물은 완충액을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 완충액은 포스페이트 완충액 (PBS), 트리스 완충액, 시트레이트 완충액, 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 특정 예시적인 구현예에서, 완충액은 NaCl을 포함한다. NaCl의 예시적인 양은 약 40 mM 내지 약 50 mM의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, NaCl의 양은 약 45 mM이다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스 완충액이다. 트리스의 예시적인 양은 약 40 mM 내지 약 60 mM의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 트리스의 양은 약 50 mM이다. 일부 구현예에서, 완충액은 NaCl 및 트리스를 포함한다. LNP 조성물의 특정 예시적인 구현예는 트리스 완충액에서 5% 수크로스 및 45 mM NaCl을 포함한다. 다른 예시적인 구현예에서, 조성물은 약 5% w/v의 양으로 수크로스, 약 45 mM NaCl, 및 약 50 mM 트리스를 함유한다. 염, 완충액, 및 동결보호제 양은 전체적인 제형의 오스몰농도가 유지되는 정도로 가변될 수 있다. 예를 들어, 최종 오스몰농도는 450 mOsm/L 미만에서 유지될 수 있다. 추가 구현예에서, 오스몰농도는 350 내지 250 mOsm/L이다. 특정 구현예는 300 +/- 20 mOsm/L의 최종 오스몰농도를 갖는다.
일부 구현예에서, 미세유체 혼합, T-혼합, 또는 교차-혼합은 사용된다. 특정 양태에서, 유량, 접합 크기, 접합 기하학, 접합 형상, 튜브 직경, 용액, 및/또는 RNA 및 지질 농도는 가변될 수 있다. LNPs 또는 LNP 조성물은, 예를 들면, 투석 또는 크로마토그래피를 통해 농축 또는 정제될 수 있다. LNPs는 현탁액, 에멀젼, 또는 동결건조된 분말로서, 예를 들어 저장될 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 조성물은 2-8℃에서 저장되고, 특정 양태에서, LNP 조성물은 실온에서 저장된다. 추가의 구현예에서, LNP 조성물은, 예를 들어 -20℃ 또는 -80℃에서 냉동 저장된다. 다른 구현예에서, LNP 조성물은 약 0℃ 내지 약 -80℃ 범위의 온도에서 저장된다. 냉동된 LNP 조성물은 사용 전에, 예를 들어 얼음에서, 실온에서, 또는 25℃에서 해동될 수 있다
동적 광 산란 ("DLS")는 본 개시내용의 LNPs의 다분산도 지수 ("pdi") 및 크기를 특성규명하는데 사용될 수 있다. DLS는 광원에 샘플을 종속시킴에서 비롯하는 광의 산란을 측정한다. DLS 측정으로부터 결정된 바와 같이, PDI는, 제로의 PDI를 갖는 완벽하게 균일한 모집단으로, 모집단에서 입자 크기 (약 평균 입자 크기)의 분포를 나타낸다. 일부 구현예에서, pdi는 약 0.005 내지 약 0.75의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, pdi는 약 0.01 내지 약 0.5의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, pdi는 약 0.02 내지 약 0.4의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, pdi는 약 0.03 내지 약 0.35의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, pdi는 약 0.1 내지 약 0.35의 범위일 수 있다.
본 명세서에서 개시된 LNPs는 약 1 내지 약 250 nm의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, LNPs는 약 10 내지 약 200 nm의 크기를 갖는다. 추가 구현예에서, LNPs는 약 20 내지 약 150 nm의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, LNPs는 약 50 내지 약 150 nm의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, LNPs는 약 50 내지 약 100 nm의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, LNPs는 약 50 내지 약 120 nm의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, LNPs는 약 75 내지 약 150 nm의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, LNPs는 약 30 내지 약 200 nm의 크기를 갖는다. 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 지칭된 모든 크기는, Malvern Zetasizer에서 동적 광 산란에 의해 측정된 바와 같이, 완전하게 형성된 나노입자의 평균 크기 (직경)이다. 나노입자 샘플은 카운트 비율이 대략 200-400 kcts이도록 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에서 희석된다. 데이터는 강도 측정의 계량된-평균으로서 나타난다. 일부 구현예에서, LNPs는 약 50% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 구현예에서, LNPs는 약 50% 내지 약 70% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 구현예에서, LNPs는 약 70% 내지 약 90% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 구현예에서, LNPs는 약 90% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 구현예에서, LNPs는 약 75% 내지 약 95% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다.
세포의 조작 방법; 조작된 세포
본 명세서에서 개시된 LNP 조성물은, 양쪽 생체내 및 시험관내, 유전자 편집을 통해 세포의 조작 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본 명세서에서 기재된 LNP 조성물과 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 설치류 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 간 세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 인간 간 세포일 수 있다. 일부 구현예에서 간 세포는 간세포이다. 일부 구현예에서, 간세포는 인간 간세포이다. 일부 구현예에서, 간 세포는 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 인간 간 세포는 간 시누소이드 내피 세포 (LSEC)일 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 간 세포는 쿠퍼 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 간 세포는 간 성상 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 간 세포는 종양 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 간 세포는 간 줄기 세포일 수 있다. 추가의 구현예에서, 세포는 ApoE-결합 수용체를 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 세포, 예를 들어 이전의 단락에서 세포 유형의 어느 하나로부터 유래된 조작된 세포는 제공된다. 그와 같은 조작된 세포는 본 명세서에서 기재된 방법에 따라 생산된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 조직 또는 장기, 예를 들면, 대상체 내의 간 내에 거주한다.
본 명세서에서 기재된 방법 및 세포의 일부에서, 세포는 표적 서열에서 뉴클레오타이드의 변형, 예를 들어 삽입 또는 결실 ("인델") 또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 표적 서열에서 1, 2, 3, 4 또는 5 또는 초과 뉴클레오타이드의 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 표적 서열에서 어느 한쪽 1 또는 2 뉴클레오타이드의 삽입을 포함한다. 다른 구현예에서, 변형은 표적 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25 또는 초과 뉴클레오타이드의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 표적 서열에서 어느 한쪽 1 또는 2 뉴클레오타이드의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 표적 서열에서 프레임시프트 돌연변이를 초래하는 인델을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 표적 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25 또는 초과 뉴클레오타이드의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 표적 서열에서 어느 한쪽 1 또는 2 뉴클레오타이드의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 템플레이트 핵산, 예를 들어 본 명세서에서 기재된임의의 템플레이트 핵산의 편입에서 비롯하는 뉴클레오타이드의 하나 이상의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 세포를 포함하는 세포의 모집단, 예를 들어 본 명세서에서 기재된 방법에 따라 조작된 세포를 포함하는 세포의 모집단은 제공된다. 일부 구현예에서, 모집단은 시험관내 배양된 조작된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 모집단은 조직 또는 장기, 예를 들면, 대상체 내의 간 내에 거주한다. 모집단 내의 세포의 일부 구현예에서, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 초과는 조작된다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 방법은, 인델의 데테션에 의해 정의된, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 편집 효율 (또는 "퍼센트 편집")을 초래한다. 다른 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 방법은, 삽입, 결실, 치환으로 또는 다른 방법으로, 서열에서 변화 검출에 의해 정의된, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%) 또는 적어도 95% DNA 변형 효율을 초래한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 방법은 약 5% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20 내지 약 100%, 약 20 내지 약 80%, 약 40 내지 약 100%, 또는 약 40 내지 약 80%의 편집 효율 수준 또는 DNA 변형 효율 수준을 초래한다.
본 명세서에서 기재된 방법 및 세포의 일부에서, 모집단 내의 세포는 표적 서열에서 변형, 예를 들면, 인델 또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 표적 서열에서1, 2, 3, 4 또는 5 또는 초과 뉴클레오타이드의 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 표적 서열에서 어느 한쪽 1 또는 2 뉴클레오타이드의 삽입을 포함한다. 다른 구현예에서, 변형은 표적 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25 또는 초과 뉴클레오타이드의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 표적 서열에서 어느 한쪽 1 또는 2 뉴클레오타이드의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 표적 서열에서 프레임시프트 돌연변이를 초래하는 인델을 포함한다. 일부 구현예에서, 모집단에서 조작된 세포의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 또는 초과는 프레임시프트 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 표적 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25 또는 초과 뉴클레오타이드의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 표적 서열에서 어느 한쪽 1 또는 2 뉴클레오타이드의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 템플레이트 핵산, 예를 들어 본 명세서에서 기재된 임의의 템플레이트 핵산의 편입에서 비롯하는 뉴클레오타이드의 하나 이상의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함한다.
치료 방법
본 명세서에서 개시된 LNP 조성물은 생체내 및 시험관내 유전자 편집에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 LNP 조성물은 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 치료적 유효량의 조성물은 필요로 하는 대상체의 세포를 접촉시킬 수 있다. 일 구현예에서, 유전자적으로 조작된 세포는 본 명세서에서 기재된 LNP 조성물과 세포를 접촉시킴으로써 생산될 수 있다.
일부 구현예에서 상기 방법은 간 장애와 관련된 세포에 LNP 조성물 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 간 장애 치료를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 LNP 조성물과 간 세포 접촉을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 LNP 조성물과 간세포 접촉을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 LNP 조성물과 ApoE 결합 세포 접촉을 포함한다.
일 구현예에서, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA, gRNA, 및 템플레이트를 포함하는 LNP 조성물은 세포, 예컨대 ApoE 결합 세포에 투여될 수 있다. 특정 사례에서, Cas 뉴클레아제 및 sgRNA를 포함하는 LNP 조성물은 세포, 예컨대 ApoE 결합 세포에 투여될 수 있다. 일 구현예에서, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA, gRNA, 및 템플레이트를 포함하는 LNP 조성물은 간 세포에 투여될 수 있다. 특정 사례에서, Cas 뉴클레아제 및 sgRNA를 포함하는 LNP 조성물은 간 세포에 투여될 수 있다. 일부 경우에, 간 세포는 대상체내이다. 특정 구현예에서, 대상체는 LNP 조성물의 단일 용량을 받을 수 있다. 다른 예에서, 대상체는 LNP 조성물의 다중 용량을 받을 수 있다. 1 초과 용량이 투여된 경우, 용량은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 또는 28 일 떨어져; 약 2, 3, 4, 5, 또는 6 개월 떨어져; 또는 약 1, 2, 3, 4, 또는 5 년 떨어져 투여될 수 있다.
일 구현예에서, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 LNP 조성물은 (또한 간(hepatic) 세포로 불리는) 간 세포에 투여될 수 있고, gRNA 및 임의로 템플레이트를 포함하는 조성물의 투여가 이어질 수 있다. 일 구현예에서, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 LNP 조성물은 간 세포에 투여될 수 있고, 세포에 템플레이트를 포함하는 조성물의 투여가 이어질 수 있다. 일 구현예에서, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 LNP 조성물은 간 세포에 투여될 수 있고, 세포에 gRNA를 포함하는 LNP 조성물 및 템플레이트를 포함하는 LNP 조성물의 순차적인 투여가 이어질 수 있다. gRNA를 포함하는 LNP 조성물 전에 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 LNP 조성물이 투여되는 구현예에서, 투여는 약 4, 6, 8, 12, 또는 24 시간; 또는 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 일만큼 분리될 수 있다.
일 구현예에서, LNP 조성물은 유전자 녹아웃을 초래하는 유전자를 편집하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, LNP 조성물은 유전자 정정을 초래하는 유전자를 편집하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, LNP 조성물은 유전자 삽입을 초래하는 세포를 편집하는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, LNP 조성물의 투여는 지속적 반응을 초래하는 유전자 편집을 초래할 수 있다. 예를 들어, 투여는 1 일, 1 개월, 1 년, 또는 초과의 반응의 지속기간을 초래할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "반응의 지속기간"은, 세포가 본 명세서에서 개시된 LNP 조성물을 사용하여 편집된 후, 수득한 변형이 LNP 조성물의 투여 후 특정 기간 동안 여전히 존재한다는 것을 의미한다. 변형은 표적 단백질 수준 측정에 의해 검출될 수 있다. 변형은 표적 DNA 검출에 의해 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 반응의 지속기간은 적어도 1 주일 수 있다. 다른 구현예에서, 반응의 지속기간은 적어도 2 주일 수 있다. 일 구현예에서, 반응의 지속기간은 적어도 1 개월일 수 있다. 일부 구현예에서, 반응의 지속기간은 적어도 2 개월일 수 있다. 일 구현예에서, 반응의 지속기간은 적어도 4 개월일 수 있다. 일 구현예에서, 반응의 지속기간은 적어도 6 개월일 수 있다. 특정 구현예에서, 반응의 지속기간은 약 26 주일 수 있다. 일부 구현예에서, 반응의 지속기간은 적어도 1 년일 수 있다. 일부 구현예에서, 반응의 지속기간은 적어도 5 년일 수 있다. 일부 구현예에서, 반응의 지속기간은 적어도 10 년일 수 있다. 지속적 반응은, 표적 단백질 수준 측정에 의해 또는 표적 DNA의 검출에 의해, 적어도 6 개월 후 검출가능하다.
LNP 조성물은 비경구로 투여될 수 있다. LNP 조성물은 혈액 스트림, 조직, 근육, 또는 내부 기관에 직접적으로 투여될 수 있다. 투여는, 예를 들면, 주사 또는 주입에 전신성일 수 있다. 투여는 국부성일 수 있다. 적당한 투여 수단은 정맥내, 동맥내, 척추강내, 심실내, 요도내, 흉골내, 두개내, 망막하, 초자체내, 전방내, 근육내, 활막내 및 피하를 포함한다. 적합한 투여 디바이스는 바늘 (마이크로니들 포함) 주사기, 무바늘 주사기 및 주입 기술을 포함한다.
LNP 조성물은 일반적으로, 반드시 그렇지는 않지만, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 회합하여 제형으로서 투여될 것이다. 용어 "부형제"는 본 개시내용의 화합물(들) 이외의 임의의 성분, 다른 지질 성분(들) 및 생물학적 활성제를 포함한다. 부형제는 제형에 어느 한쪽 기능적 (예를 들면 약물 방출 속도 조절) 및/또는 비기능성 (예를 들면 가공 조제 또는 희석제) 특징을 부여할 수 있다. 부형제의 선택은 인자 예컨대 특정한 투여 방식, 용해도 및 안정성에서 부형제의 효과, 및 투약 형태의 성질에 큰 정도로 좌우될 것이다.
비경구 제형은 전형적으로 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액이다. 제형이 수성, 부형제 예컨대 당 (비제한적으로 글루코스, 만니톨, 소르비톨, 등 포함) 염, 탄수화물 및 완충제 (바람직하게는 3 내지 9의 pH로) 인 경우, 그러나, 일부 적용에 대하여, 이들은 적합한 비히클 예컨대 멸균된, 무발열원 물 (WFI)와 함께 사용되도록 건조된 형태로서 또는 멸균된 비-수성 용액으로 더욱 적합하게 제형화될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 방법은 인자 VII 표적 유전자를 변형시킨다. 특정 구현예에서, LNP 조성물은 인자 VII 유전자를 변형시키기 위해 간 세포에 투여된다. LNP 조성물은 간 장애, 예컨대 인자 VII 결핍 치료에 사용될 수 있다. 상기 방법은 비정상적인 인자 VII 활성을 조정할 수 있다. 특정 구현예에서, LNP 조성물은 혈우병, 또는 혈액 응고를 제어하는 무능을 치료 또는 예방하기 위해 투여될 수 있다. 참고, 예를 들면, Lapecorella, M. and Mariani, G. Factor VII deficiency: defining the clinical picture and optimizing therapeutic options. Haemophilia (2008), 14, 1170-1175. 특정 구현예에서, LNP 조성물은 혈전성향증, 혈액이 응고를 형성하기 위한 증가된 경향을 갖는 병태를 치료 또는 예방하기 위해 투여될 수 있다.
조직의 손상이 발생하는 경우, 인자 VII 서열의 위치 152에서 절단을 초래하는, 활성화된 인자 VII, 또는 인자 VIIa의 형성으로 이어지는, 인자 VII 자이모겐과 조직 인자 사이 등몰 복합체의 형성. 인자 VIIa/조직 인자 복합체는 응고를 유발시킨다. 인자 VH-관련된 장애의 치료 방법은 인자 VIIa 응고의 증가 방법, 혈액 응고의 개선 방법, 또는 혈액 응고 프로파일의 개선 방법을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 인자 VII 결핍을 가진 대상체에 LNP 조성물을 투여한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인자 VII 결핍에 대하여 이전에 치료된, 예를 들면 재조합 인자 VIIa를 가진 대상체에 LNP 조성물을 투여한다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 방법은 TTR 표적 유전자를 변형시킨다. 특정 구현예에서, LNP 조성물은 간에서 TTR 발현과 관련된 장애, 예컨대 아밀로이드증 치료에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, LNP 조성물은, 트랜스티레틴 유형 아밀로이드증을 포함하는, 아밀로이드증을 치료 또는 예방하기 위해 투여될 수 있다. 참고, 예를 들면, Patel, K. and Hawkins, P. Cardiac amyloidosis: where are we today? J. Intern. Med. (2008), 278, 126-144.
TTR-관련된 장애는 아밀로이드 침작의 축적으로 이어질 수 있다. 따라서, TTR-관련된 장애를 치료 또는 예방하기 위한 방법은 심장, 및 자율신경 및 말초 신경에서 TTR 수준의 감소 방법, TTR 생산의 감소 방법, 아밀로이드 침작의 감소 방법, 선천적 트랜스티레틴 유형 아밀로이드증의 감소 방법, 비선천성 트랜스티레틴 유형 아밀로이드증의 치료 방법, 또는 아밀로이드 침작의 작용 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, TTR-관련된 장애의 치료 또는 예방 방법은 아밀로이드 침작 진단된 대상체에 LNP 조성물 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 감소된 TTR 생산이 필요한 대상체에 LNP 조성물을 투여한다
일부 구현예에서, 유전자 편집 방법은 SERPINA1, FVIII, FIX, SERPING1, KLKB1, KNG1, FXII, ASS1, ASL, BCKDHA, BCKDHB, G6PC, GO/HAOl, AGXT, PCCA, PCCB, OTC, LIP A, ABCB11, GALT, ATP7B, 및 PAH로부터 선택된 유전자를 표적한다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 방법은 알파 1 항트립신 결핍, A형 혈우병, B형 혈우병, HAE, 유형 1 시트룰린혈증, 아르기니오석신산뇨증, 메이플 시럽 소변 질환, 글리코겐 축적 질환, 일차 수산과잉뇨증 유형 1, 프로피온산 아카데미아, 오르니틴 트란스카바밀라제 결핍, 콜레스테릴 에스테르 축적 질환, 진행성 가족성 간내 답증정체증, 갈락토스혈증, 윌슨병, 및 페닐케톤뇨증으로부터 선택된 질환으로 시달리는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다.
청구항 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용된 경우 단어 "한", "하나의" 또는 "그"는 "하나"를 의미할 수 있지만, 각각은 또한 "하나 이상의", "적어도 하나의", 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다. "또는"의 용도는 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 용어 "포괄하는" 및 "함유하는", 뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대 "포함한다", "포함된", "함유한다", 및 "함유된"의 용도는 제한하지 않는다. 본원에서 주어진 모든 범위는 달리 언급되지 않는 한 종점을 포괄한다.
실시예
실시예 1. 물질 및 방법.
지질 나노입자 ("LNP") 제형
LNPs는 약 4.5의 CCD 지질 아민 대 RNA 포스페이트 (N:P) 몰비로 제형화되었다. 지질 나노입자 성분은 하기 몰비로 100% 에탄올에 용해되었다: 45 mol-% (12.7 mM) CCD 지질 (예를 들면, 지질 A 또는 지질 B); 44 mol-% (12.4 mM) 헬퍼 지질 (예를 들면, 콜레스테롤); 9 mol-% (2.53 mM) 중성 지질 (예를 들면, DSPC); 및 2 mol-% (.563 mM) PEG (예를 들면, PEG2k-DMG 또는 PEG2k-C11). RNA 전달대상물은 50 mM 아세테이트 완충액, pH 4.5에 용해되어, 대략 0.45 mg/mL의 RNA 전달대상물의 농도를 초래하였다.
LNPs는, 제조자의 프로토콜에 따라, Precision Nanosystems NanoAssemblr™Benchtop Instrument를 사용하여 지질 및 RNA 용액의 미세유체 혼합에 의해 형성되었다. 수성 대 유기 용매의 2:1 비는 차별적인 유량을 사용하여 혼합 동안 유지되었다. 혼합 후, LNPs는 수집되었고, 포스페이트 완충 식염수 (PBS, 대략 1:1)에서 희석되었고, 그 다음 남아있는 완충액은 10 kDa Slide-a-Lyzer™G2 Dialysis Cassette (ThermoFisher Scientific)을 사용하여 완만한 교반 하에서 4℃에 밤새, PBS (100-배 과잉의 샘플 용적)에 교환되었다. 수득한 혼합물은 그 다음 0.2 μm 멸균된 필터를 사용하여 여과되었다. 수득한 여과물은 2-8 ℃에 저장되었다. 단리된 LNPs는, 아래에 기재된 바와 같이, 캡슐화 효율, 다분산도 지수, 및 평균 입자 크기를 결정하기 위해 특성규명되었다.
뉴클레아제 mRNA 및 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 시험관내 전사 ("IVT")
N1-메틸 슈도-U를 함유하는 캡핑된 및 폴리아데닐화된 Cas9 mRNA는 선형화된 플라스미드 DNA 템플레이트 및 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사로 생성되었다. T7 프로모터 및 100 nt 폴리(A/T) 영역을 함유하는 플라스미드 DNA는 하기 조건에 따라 Xbal로 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이팅시킴으로써 선형화되었다: 200 ng/μL 플라스미드, 2 U/μL Xbal (NEB), 및 lx 반응 완충액. Xbal은 20 분 동안 65 ℃에서 반응을 가열시킴으로써 불활성화되었다. 선형화된 플라스미드는 실리카 맥시 스핀 칼럼 (Epoch Life Sciences)를 사용하여 효소 및 완충액 염으로부터 정제되었고 아가로스 겔로 분석되어 선형화를 확인하였다. Cas9 변형된 mRNA를 생성하기 위한 IVT 반응은 하기 조건에서 4 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션되었다: 50 ng/μL 선형화된 플라스미드; 2 mM 각각의 GTP, ATP, CTP, 및 N1-메틸 슈도-UTP (Trilink); 10 mM ARC A (Trilink); 5 U/μL T7 RNA 폴리머라제 (NEB); 1 U/μL 쥣과 RNase 억제제 (NEB); 0.004 U/μL 무기 E. 콜리 파이로포스파타제 (NEB); 및 lx 반응 완충액. 4 시간 인큐베이션 후, TURBO DNase (ThermoFisher)는 0.01 U/μL의 최종 농도로 첨가되었고, 반응은 추가의 30 분 동안 인큐베이션되어 DNA 템플레이트를 제거하였다. Cas9 mRNA는 제조자의 프로토콜 (ThermoFisher)에 따라 MegaClear Transcription Clean-up 키트를 사용하여 효소 및 뉴클레오타이드로부터 정제되었다. 대안적으로, 예를 들어 실시예 15에서 나타낸 바와 같이, mRNA는 침전 프로토콜을 통해 정제되었고, 일부 경우에 HPLC-기반 정제가 이어졌다. 간단히, DNase 소화 후, mRNA는 7.5 M LiCl 용액의 0.21x 용적 첨가 및 혼합에 의해 침전되었고, 침전된 mRNA는 원심분리에 의해 펠릿화되었다. 일단 상청액이 제거되었다면, mRNA는 물에서 재구성되었다. mRNA는 아세트산암모늄 및 에탄올을 사용하여 재차 침전되었다. 5M 아세트산암모늄은 100% EtOH의 2x 용적과 함께 2M의 최종 농도로 mRNA 용액에 첨가되었다. 용액은 15 분 동안 -20 ℃에서 혼합 및 인큐베이션되었다. 침전된 mRNA는 원심분리에 의해 재차 펠릿화되었고, 상청액은 제거되었고, mRNA는 물에서 재구성되었다. 최종 단계로서, mRNA는 아세트산나트륨 및 에탄올을 사용하여 침전되었다. 3 M 아세트산나트륨 (pH 5.5)의 1/10 용적은 100% EtOH의 2x 용적과 함께 용액에 첨가되었다. 용액은 15 분 동안 -20 ℃에서 혼합 및 인큐베이션되었다. 침전된 mRNA는 원심분리에 의해 재차 펠릿화되었고, 상청액은 제거되었고, 펠릿은 70% 차가운 에탄올로 세정되었고 공기 건조되었다. mRNA는 물에서 재구성되었다. HPLC 정제된 mRNA에 대하여, LiCl 침전 및 재구성 후, mRNA는 RP-IP HPLC에 의해 정제되었다 (참고, 예를 들면, Kariko, 등. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 21 el42). 풀링을 위하여 선택된 분획은 조합되었고 상기 기재된 바와 같이 아세트산나트륨/에탄올 침전에 의해 데슬레이트되었다.
모든 방법에 대하여, 전사체 농도는 260 nm (Nanodrop)에서 흡광도 측정에 의해 결정되었고, 전사체는 Bioanlayzer (Agilent)에 의해 모세관 전기영동으로 분석되었다.
IVT는 유사한 공정에서 sgRNA를 생성하는데 또한 사용되었다. sgRNA용 DNA 템플레이트는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열로만 구성된 최상부 올리고 그리고 프로모터 부위에 상보적 서열 및 sgRNA 템플레이트를 함유하는 최하부 가닥의 어닐링에 의해 생성되었다. 어닐링된 템플레이트는 하기 조건으로 IVT 반응에서 직접적으로 사용되었다: 125 nM 템플레이트; 7.5 mM 각각의 GTP, ATP, CTP, 및 UTP; 5 U/μL T7 RNA 폴리머라제 (NEB); 1 U/μL 쥣과 RNase 억제제 (NEB); 0.004 U/μL 무기 E. 콜리 파이로포스파타제 (NEB); 및 lx 반응 완충액. 반응은 8 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션되었고, 그 후 TURBO DNase (ThermoFisher)는 0.01 U/μL의 최종 농도로 첨가되었고, 반응은 또 다른 30 분 인큐베이션되어 DNA 템플레이트를 제거하였다. sgRNA 전사체는 제조자의 프로토콜 (ThermoFisher)에 따라 MegaClear Transription Clean-up 키트에 의해 정제되었다. 전사체 농도는 260 nm (Nanodrop)에서 흡광도에 의해 결정되었고, 전사체는 PAGE에 의해 분석되었다.
제형 분석학
LNP 제형은 RNA의 평균 입자 크기, 다분산도 (pdi), 총 RNA 함량 및 캡슐화 효율에 대하여 분석되었다. 평균 입자 크기 및 다분산도는 Malvern Zetasizer DLS 기기를 사용하여 동적 광 산란 (DLS)에 의해 측정되었다. LNP 샘플은 DLS에 의해 측정되기에 앞서 PBS에서 3OX 희석되었다. 평균 입자 크기의 강도 기반 측정인 Z-평균 직경은 pdi와 함께 보고되었다.
형광-기반 검정은 총 RNA 농도 및 캡슐화 효율을 결정하는데 사용되었다. LNPs는 RiboGreen® 염료 (ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 R11491)의 선형 범위내이도록 lx TE 완충액으로 75X 희석되었다. 희석된 LNP의 50 μL는 어느 한쪽 50μl lx TE 완충액 또는 0.2% 트리톤 X-100을 가진 lx TE 완충액으로 반복하여 추가 혼합되었다. 샘플은 10 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션되어 트리톤이 LNPs를 완전히 파괴시키게 하였고 총 RNA를 노출시켜 RiboGreen® 염료와 상호작용하게 하였다. 표준 곡선용 샘플은 LNPs를 만들기 위해 사용된 개시 RNA 용액을 이용함으로써 그리고 상기와 동일한 단계를 따름으로써 제조되었다. 희석된 RiboGreen® 염료 (100 μL, lxTE 완충액내 100X, 제조자의 지침에 따름)는 그 다음 각각의 샘플에 첨가되었고, 광의 부재 하에서, 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하게 되었다. SpectraMax M5 Microplate Reader (Molecular Devices)는 488 nm, 515 nm, 및 525 nm 각각으로 설정된 여기, 오토 컷오프 및 방출 파장을 가진 샘플을 판독하는데 사용되었다. 캡슐화 효율 (%EE)는 하기 방정식을 이용하여 계산되었다:
%EE = (1 - 형광 @ 525 nm - 트리톤 / 형광 @ 525 nm + 트리톤) * 100
식중 형광 @ 525 nm - 트리톤은 트리톤이 없는 샘플용 평균 형광 판독이고, 형광 @ 525 nm + 트리톤은 트리톤이 있는 샘플용 평균 형광 판독이다. 총 RNA 농도는 트리톤 값을 가진 샘플에 대하여 평균 형광 판독 및 라이너 표준 곡선을 사용하여 결정되었다.
동일한 절차는 DNA-기반 전달대상물 성분의 캡슐화 효율 결정에 사용될 수 있다. 단일-가닥 DNA에 대하여 Oligreen 염료가 사용될 수 있고, 이중-가닥 DNA에 대하여, Picogreen 염료가 사용될 수 있다.
평균 입자 크기, 다분산도, 및 %EE에 대한 값은, 다양한 LNP 조성물에 대하여, 아래, 표 1에서 보고된다.
Figure 112018119969413-pct00006
Figure 112018119969413-pct00007
Figure 112018119969413-pct00008
Figure 112018119969413-pct00009
T7E1 검정
T7E1 검정은 Cas9에 의한 DNA 절단 이후 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)를 통해 창출된 게놈성 DNA의 돌연변이 사건 예컨대 삽입, 결실 및 치환을 검출하기 위해 일부 예에서 사용되었다 (참고, 예를 들면, Cho 등, Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 2013; 31, 230-232).
CRISPR/Cas9에 의해 표적화된 게놈성 DNA 영역은 PCR에 의해 증폭되었고, 10 분 동안 95℃에서 변성되었고, 그 다음 0.5℃/초의 비율로 95℃부터 25℃까지 온도 급락에 의해 재-어닐링되었다. 헤테로듀플렉스를 형성하기 위한 DNA의 조합은 증폭된 영역에서 돌연변이의 존재를 나타냈다. 재-어닐링된 헤테로듀플렉스는 25 분 이상 동안 37℃에서 박테리오파아지 리졸바제 T7E1 (New England Biolabs)로 소화되어 T7E1 뉴클레아제가 미스매치를 인식하였던 이중-가닥 절단을 생성하였다. 수득한 DNA 단편은 단편 분석기를 사용하여 분석되었고 정량화되어 편집 효율의 근사치를 결정하였다. 편집 효율의 정량적 분석을 위하여, 차세대 서열분석은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 사용되었다.
차세대 서열분석 ("NGS") 및 정확한 절단 효율용 분석
게놈에서 표적 위치에 편집의 효율을 정량적으로 결정하기 위해, 심층 서열분석은 유전자 편집에 의해 도입된 삽입 및 결실의 존재를 확인하는데 이용되었다.
PCR 프라이머는 표적 부위 (예를 들면, TTR, FVII) 주위 설계되었고, 관심의 게놈성 영역은 증폭되었다. 프라이머 서열은 아래에 제공된다. 추가의 PCR은 필요한 서열분석 화학을 부가하기 위해 제조자의 프로토콜 (Illumina)에 따라 수행되었다. 앰플리콘은 Illumina MiSeq 기기에서 서열분석되었다. 판독은 낮은 품질 스코어를 갖는 것의 제거 후 인간 참조 게놈 (예를 들면, hg38)로 정렬되었다. 판독이 들어있는 수득한 파일은 참조 게놈 (BAM 파일)로 맵핑되었고, 여기에서 관심의 표적 영역을 중첩하였던 판독은 선택되었고 삽입, 치환, 또는 결실을 함유하는 판독의 수 대 야생형 판독의 수는 계산되었다.
편집 백분율 (예를 들면, "편집 효율" 또는 "퍼센트 편집")은, 야생형을 포함하는, 서열 판독의 총 수에 대해 삽입 또는 결실을 가진 서열 판독의 총 수로서 정의된다.
시험관내 LNP 전달
마우스 세포주 (Neuro2A 및 Hepa1.6)은 10% 태아 소 혈청으로 보충된 DMEM 배지에서 배양되었고 본 명세서에서 기재된 바와 같이 용해 및 분석 (예를 들면, 리포터 발현, T7E1 검정, NGS)에 앞서 18-24 시간 동안 LNPs로 형질감염에 앞서 24 시간 15,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅되었다. 마우스 일차 간세포 (Invitrogen)은 콜라겐 코팅된 96 웰 플레이트를 사용하여 간세포 플레이팅 배지 (Invitrogen)에서 15,000 세포 / 웰로 배양되었다. 5 시간 후, 플레이팅 배지는 제거되었고 ( 37℃에서 5 분 동안 사전-인큐베이션된) 3% 마우스 혈청 및 LNPs를 함유하는 간세포 유지 배지로 대체되었다. 세포는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 용해 및 분석 (예를 들면, T7E1 검정, NGS)에 앞서 42-48 시간 동안 형질감염되었다. 양쪽 세포주 및 일차 간세포에 대하여 LNPs는 희석되었고 100 ng Cas9 mRNA 및 대략 30 nM 가이드 RNA / 웰로 시작하는, 0.1 ng Cas9 mRNA 및 0.03 nM 가이드 RNA / 웰까지 세미-로그 방식으로 연속 희석을 실행하는 세포에 첨가되었다.
생체내 LNP 전달
6-10 주령 범위의, CD-1 암컷 마우스는 각각의 연구에서 사용되었다. 동물은 그룹 평균 중량에 기반하여 투약 용액 제조용 체중에 따라 칭량 및 그룹화되었다. LNPs는 측면 꼬리 정맥을 통해 동물당 0.2 mL의 용적 (킬로그램 체중당 대략 10 mL)로 투여되었다. 동물은 역효과에 대하여 투여후 대략 6 시간에서 관측되었다. 체중은 투여후 24 시간에서 측정되었고, 동물은 이소플로우란 마취 하에서 심장 천자를 통해 방혈로 다양한 시점에서 안락사되었다. 혈액은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 혈장용 완충된 시트르산나트륨을 함유하는 튜브 또는 혈청 분리기 튜브에 수집되었다. 생체내 편집을 포함하는 연구를 위하여, 간 조직은 DNA 추출 및 분석을 위하여 각각의 동물로부터 중앙 엽에서 또는 3 독립 엽 (예를 들면, 우 중앙, 좌 중앙, 및 좌 측면 엽)에서 수집되었다. 일부 연구를 위하여, 비장 조직은 또한 수집되었다.
게놈성 DNA 단리
게놈성 DNA는, 용해 완충액에서 조직 (대략 200 μL / 10 mg 조직) 균질화 및 DNA 침전을 포함하는, 제조자의 프로토콜에 따라 Invitrogen PureLink Genomic DNA 키트 (Cat. K1820-02)를 이용하는 10 mg의 조직으로부터 추출되었다. 모든 DNA 샘플은, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, PCR 및 후속적인 NGS 분석을 위하여 100 ng/μL 농도로 정규화되었다.
트랜스티레틴 (TTR) ELISA 분석
혈액은 수집되었고 혈청은 지시된 바와 같이 단리되었다. 총 TTR 혈청 수준은 Mouse Prealbumin (Transthyretin) ELISA 키트 (Aviva Systems Biology, Cat. OKIAOO111)을 사용하여 결정되었다. 키트 시약 및 표준은 제조의 프로토콜에 따라 제조되었다. 마우스 혈청은 lx 검정 희석제로 10,000-배의 최종 희석액으로 희석되었다. 이것은 2,500-배 희석을 초래하는 2 순차적인 50-배 희석을 수행함으로써 실시되었다. 최종 4-배 희석 단계는 10,000-배의 총 샘플 희석액에 대하여 수행되었다. 양쪽 표준 곡선 희석액 (100 uL 각각) 및 희석된 혈청 샘플은 포착 항체로 사전-코팅된 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가되었다. 플레이트는 세정 전 30 분 동안 실온에서 인큐베이션되었다. 효소-항체 콘주게이트 (100 μL / 웰)은 20 분 인큐베이션 동안 첨가되었다. 미결합된 항체 콘주게이트는 제거되었고 플레이트는 발색 기질 용액의 첨가 전 재차 세정되었다. 플레이트는 100 μL의 중단 용액, 예를 들면, 황산 (대략 0.3 M) 첨가 전 10 분 동안 인큐베이션되었다. 플레이트는 450 nm의 흡광도에서 SpectraMax M5 플레이트 판독기에서 판독되었다. 혈청 TTR 수준은 표준 곡선을 벗어나 4 파라미터 로지스틱 곡선 적합화를 이용하여 SoftMax Pro 소프트웨어 ver. 6.4.2에 의해 계산되었다. 최종 혈청 값은 검정 희석액에 대하여 조정되었다.
인자-VII (FVII) 활성 검정
혈액은 지시된 바와 같이 혈장에 대하여 수집되었다. 혈장 인자 VII 활성 수준은 BIOPHEN FVII 검정 키트 (Anaria Diagnostics, Cat. A221304)를 사용하여 측정되었다. 키트 시약은 제조자의 프로토콜에 따라 제조되었다. 혈장은 2,500-배 희석을 초래하는 2 순차적인 50-배 희석을 수행함으로써 키트 샘플 희석 완충액으로 10,000-배 희석되었다. 최종 4-배 희석 단계는 10,000-배의 총 샘플 희석액에 대하여 수행되었다. 희석된 샘플 (30 μL)는 키트 시약 1 (30 μL)에 첨가되었다. 다음으로, 키트 시약 2 (60 μL)는 플레이트에 첨가되었고, 이것은 37℃에서 7 분 동안 후속적으로 인큐베이션되었다. 키트 시약 3 (60 μL)는 그 다음 플레이트에 첨가되었고 플레이트는 추가의 5 분 동안 37℃에서 인큐베이션된 다음, 아세트산 (물에서 20% v/v, 60 μL)를 첨가하여 효소 반응을 중단시켰다. 플레이트는 405 nM에서 SoftMax M5 플레이트 판독기에서 판독되었다. FVII 활성의 상대 값은 대조군 동물의 혈장으로부터 제조된 보정 곡선에 기반하여 계산되었고 비히클 대조군의 퍼센트로서 보고되었다.
실시예 2. eGFP mRNA 캡슐화된 LNPs의 시험관내 전달.
eGFP를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 LNPs (TriLink, Cat. L-6101)은 실시예 1에서 기재된 바와 같이 제조되었다. 각각의 LNP 제제의 성분은 CCD 지질 (45 mol-%), 콜레스테롤 (44 mol-%), DSPC (9 mol-%), 및 PEG2k-DMG 또는 PEG2k-C11 (2 mol-%)를 포함한다. LNP-002, -006, -007, -010, 및 -011은 지질 A를 CCD 지질로서 포함하고, 반면에 LNP-012 및 -013은 지질 B를 CCD 지질로서 포함한다. LNP-002, -010, 및 -012는 PEG2k-DMG를 포함하고, LNP-006, -007, -011, 및 -013은 PEG2k-C11을 포함한다. LNP 세부사항은, 평균 입자 크기, 다분산도, 및 캡슐화 효율을 포함하여, 표 1에서 제공된다. LNPs는, 각각의 LNP에 대하여, 어느 한쪽 100 ng 또는 500 ng / 웰인 전달된 eGFP mRNA의 총량으로, 실시예 1에서 기재된 바와 같이 마우스 간세포 세포주 (Hepa1.6)에 전달되었다. 세포는 대략 18 시간 동안 LNPs로 인큐베이션되었고, eGFP 발현은 CytoFLEX 세포 분석기 (Beckman Coulter)를 사용하여 측정되었다.
도 1에서 나타낸 바와 같이, eGFP 발현은 각각의 제형에 대하여 관측되었다. 지질 A (LNP-002, -006, -007, -010, 및 -011)을 포함하는 LNP 제형은 eGFP mRNA를 성공적으로 전달하였다. 지질 B (LNP-012 및 -013)을 포함하는 LNP 제형은 eGFP mRNA를 또한 전달하였다. PEG2k-C11 및 PEG2k-DMG 스텔스 지질을 포함하는 LNPs 모두는 이들 실험에서 효과적으로 mRNA를 전달하여, 시험관내 LNPs를 사용하여 마우스 간세포 세포주에 mRNA의 전달을 실증한다.
실시예 3. gLUC mRNA 캡슐화된 LNPs의 생체내 전달.
Gaussia 루시퍼라아제 (gLUC)를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 LNPs (TriLink, Cat. L-6123)은 실시예 1에서 기재된 바와 같이 제조되었고 생체내 동물에 mRNA 전달을 위하여 시험되었다. 각각의 LNP 제제의 성분은 CCD 지질 (45 mol-%), 콜레스테롤 (44 mol-%), DSPC (9 mol-%), 및 PEG2k-DMG (2 mol-%)를 포함한다. LNP-014는 지질 A를 포함하였고,반면에 LNP-015는 지질 B를 포함하였다. 이들 제형에 대하여 세부사항, 예컨대 평균 입자 크기, 다분산도, 및 캡슐화 효율은 표 1에서 제공된다. 0.1 mg/kg 및 0.3 mg/kg의 gLUC mRNA 용량은 각각의 LNP 제형과 전달되었다. 동물은 24 시간 후에 안락사되었고 혈액 수집 및 혈청 단리는 실시예 1에서 기재된 바와 같이 수행되었다. 혈청 루시퍼라아제 발현은 제조자의 프로토콜에 따라 Pierce™ Gaussia 루시퍼라아제 플래시 검정 키트 (ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 16158)을 사용하여 측정되었다.
도 2에서 나타낸 바와 같이, gLUC 발현에서 용량 의존적 증가는 PBS 대조군에 비교된 경우 각각의 동물에 대하여 관측되었다 (각각의 그룹에 대하여 n=5). 어느 한쪽 지질 A 또는 지질 B를 포함하는 LNPs는 루시퍼라아제 활성에 의해 측정된 경우 mRNA의 효과적인 생체내 전달 및 발현을 보여주었다.
실시예 4. 이중 가이드 RNA 캡슐화된 LNPs (dgRNA-LNP)와 Cas9 mRNA 캡슐화된 LNPs (mRNA-LNP)를 사용하는 생체내 전달 및 편집.
간에서 생체내 편집을 위하여 CRISPR/Cas RNA 성분 (예를 들면, Cas9를 인코딩하는 gRNA 및 mRNA) 전달용 LNPs는 CD-1 마우스에서 시험되었다. 이들 실험에서, dgRNA 및 mRNA는 별도로 제형화되었다.
LNPs는, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, 별도로, (어느 한쪽 TTR 또는 FVII을 표적하는) 화학적으로 변형된 dgRNA 및 시험관내 전사된 Cas9 mRNA로 제형화되었다. 이 실시예에서 사용된 dgRNAs는 화학적으로 합성되었고, 이중 가이드를 구성하는 crRNA 및 trRNA의 양쪽 5' 및 3' 말단에서 3 말단 뉴클레오타이드 사이 포스포로티오에이트 연결기로, 상업적 공급자로부터 공급되었다. 각각의 LNP 제제 (LNP-093, -094, -095, -096, 및 -097)의 성분은 CCD 지질 (지질 A) (45 mol-%), 콜레스테롤 (44 mol-%), DSPC (9 mol-%), 및 PEG2k-DMG (2 mol-%)를 포함한다. 이들 제형에 대하여 세부사항은, 평균 입자 크기, 다분산도, 및 캡슐화 효율을 포함하여, 표 1에서 제공된다. 2 상이한 투약 레지멘은 이용되었다: (1) (RNA의 중량 기준으로) 동일 부로 함께 mRNA-LNP 제형 (LNP-097) 및 dgRNA-LNP 제형 (LNP-093, -094, -095 또는 -096) 조합 및 2 연속 일에서 조합된 제형 투약 (총 2 mg/kg에 대하여, 1 mg/kg 각각의 RNA 성분 제형으로 투약된 각각의 일); 또는 (2) 2 연속 일에서, dgRNA-LNP (LNP-093, -094, -095, 및 -096) 투약에 4 시간 앞서 mRNA-LNP (LNP-097) 투약 (1 mg/kg으로 투약된 각각의 제형). 동물은 각각의 그룹에서 제1 용량 5 일 이후 안락사되었다. 대조군 그룹 비교 (PBS를 받는 동물)에 더하여, 각각의 실험적 그룹은 내부 서열분석 대조군을 가졌고, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, NGS 분석용 PCR 반응은 각각의 동물에서 양쪽 표적에 대하여 실행되었다 (각각의 그룹에 대하여 n=3). 간으로부터 게놈성 DNA는, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, NGS에 의해 단리 및 분석되었다.
도 3A 및 3B에서 나타낸 바와 같이, 생체내 편집 (대략 1.8% 편집 - 2.8% 편집)은 어느 한쪽 공동-투약 (A1 (LNP-093/-097) 또는 A2 (LNP-094/-097)) 또는 사전-투약 (A3 (LNP-093/-097)) 투약 레지멘을 사용하여 FVII을 표적하는 LNPs를 받았던 동물의 간에서 관측되었다. TTR을 표적하는 LNPs를 받았던 동물은 Cas9 mRNA (B1 (LNP-095/LNP-097) 또는 B2 (LNP-096/-097))로 공동-투약된 또는 (B3 (LNP-095/-097) 또는 B4 (LNP-096/-097)) 사전-투약된 경우 dgRNA를 받는 동물의 간에서 대략 2% - 4.5% 편집을 보여주었다. 혈청 및 혈장 분석은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, 모든 동물에 대하여 수행되었고, 동물의 어느 것도 어느 한쪽 TTR 또는 혈장 FVII 활성의 총 혈청 수준 (도시되지 않음)에서 (PBS 투여된 동물에 비교된 경우) 통계적으로 유의차를 나타내지 않았다.
실시예 5. dgRNA-LNPs 및 IVT sgRNA-LNPs를 사용하는 시험관내 및 생체내 전달 및 편집.
화학적으로 변형된 dgRNA를 포함하는 LNPs 및 시험관내 전사된 (IVT) sgRNA를 포함하는 LNPs의 효능은 Cas9 mRNA-LNPs로 공동-투약의 문맥에서 시험되었다.
LNP-115, -116, -117, -120, -121, 및 -123은 실시예 1에 따라 제형화되었고, 특정 제형에 대한 세부사항은 표 1에서 제공된다. 이 실시예의 제형은, 실시예 1에서 기재된 바와 같은 절차를 사용하여, Neuro2A 세포에 전달에 대하여 시험되었다.
LNP-121 (gRNA) 및 LNP-120 (Cas9 mRNA)는 함께 혼합되었고 152 nM, 76 nM, 및 38 nM의 gRNA 농도, 플러스 mRNA 570 ng, 285 ng, 및 142 ng / 웰, 각각에서 투여되었고; LNP-123 (gRNA) 및 LNP-120은 함께 혼합되었고 156 nM, 78 nM, 및 39 nM의 gRNA 농도, 플러스 mRNA 528 ng, 264 ng, 및 132 ng / 웰, 각각에서 투여되었고; LNP-116 (gRNA)는 LNP-120 (Cas9 mRNA)와 혼합되었고 124 nM, 62 nM, 및 31 nM의 gRNA 농도, 플러스 mRNA 460 ng, 229 ng, 및 114 ng / 웰, 각각에서 투여되었다. LNP-121은 198 nM, 99 nM, 및 49.5 nM의 gRNA 농도에서 투여되었고; LNP-123은 189 nM, 94.5 nM, 및 47 nM의 gRNA 농도에서 투여되었고; LNP-116은 124 nM, 62 nM, 및 31 nM의 gRNA 농도에서 투여되었고, Cas9 mRNA (100 ng / 웰)은 제조자의 지침에 따라 실험에 LF2K에 의해 첨가되었다. 편집은 어느 한쪽 LNP (LNP-120) 또는 LF2K를 사용하는 Cas9 mRNA과, 뿐만 아니라 gRNA (LNP-121)의 시험된 농도에서 화학적으로 변형된 dgRNA와 IVT sgRNA-LNP (LNP-123)의 양쪽 공동-투약을 포함하는 샘플에서 관측되었다.
이 실시예에서 제형은 그 다음 생체내 시험되었다. 동물은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, (각각의 그룹에 대하여 n=5) 단지 1 일에 투약되는 1 제형으로, 2 연속 일에서 Cas9 mRNA-LNP 및 gRNA-LNPs 중 하나의 혼합물이 투여되었다 (동물은 각각의 일, 1 mg/kg의 각각의 제형이 투약되었다). 동물은 제1 용량 6 일 (또는 단일 용량만을 받는 그룹으로 7 일) 이후 안락사되었고, 간 조직은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, NGS에 의해 수집 및 분석되었다.
도 4A에서 나타낸 바와 같이, 단일 및 이중 용량은 전달에 효과적이었다. 하루에 하나의 용량을 받았던 그룹 (LNP-121 및 LNP-120; 도 4A에서 C)와 화학적으로 변형된 dgRNA-LNPs와 Cas9 mRNA-LNP를 공동-투약한 경우 연속 일로 2 용량을 받았던 그룹 (LNP-116 및 LNP-120, 도 4A에서 A; LNP-121 및 LNP-120, 도 4B에서 B) 사이 통계적인 차이는 없다. 미변형된 IVT sgRNA-LNPs와 공동-투약된 Cas9 mRNA-LNP를 받았던 동물 (LNP-123 및 LNP-120,도 4B에서 D)는 이 실시예에서 사용된 dgRNA-LNPs에 비교된 경우 편집의 상대적으로 더 낮은 수준을 표시하였다 (도 4B). 이들 실험은 변형된 dgRNA 또는 IVT sgRNA를 포함하는 LNPs가 Cas9 mRNA-LNPs와 공동-투약된 경우 시험관내 및 생체내 편집을 허용한다는 것을 확립시킨다. 이 실험에서 IVT sgRNA를 포함하는 LNPs를 사용하는 경우 관측된 생체내 편집의 수준은 단리된 IVT sgRNA에서 불순물에 의해 영향받을 수 있다.
실시예 6. 변형된 dgRNA-LNPs 또는 변형된 sgRNA-LNPs를 사용하는 시험관내 및 생체내 전달 및 편집.
화학적으로 변형된 dgRNA를 포함하는 LNPs 및 화학적으로 변형된 sgRNA를 포함하는 LNPs는 Cas9 mRNA-LNPs로 공동-투약에 의해 또한 시험되었다.
LNPs는, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, (TTR 또는 FVII을 표적하는) 화학적으로 변형된 dgRNA, (TTR 또는 FVII을 표적하는) 화학적으로 변형된 sgRNA, 및 IVT Cas9 mRNA로 제형화되었다. 이 실시예에서 dgRNA는 화학적으로 합성되었고, 이중 가이드를 구성하는 양쪽 crRNA 및 trRNA의 양쪽 5' 및 3' 말단에서 3 말단 뉴클레오타이드 사이 포스포로티오에이트 연결기로, 상업적 공급자로부터 공급되었다. 이 실시예에서 sgRNA는 또한 화학적으로 합성되었고, sgRNA의 양쪽 5' 및 3' 말단에서 3 말단 뉴클레오타이드에서 그리고 그 사이 2'-O-메틸 변형 및 포스포로티오에이트 연결기로 상업적 공급자로부터 공급되었다. 각각의 LNP 제제의 성분은 CCD 지질 (지질 A, 45 mol-%), 콜레스테롤 (44 mol-%), DSPC (9 mol-%), 및 PEG2k-DMG (2 mol-%)를 포함한다. LNP-136, -137, -138, -139, 및 -140은 이들 실험에서 사용되었다. 세부사항은, 평균 입자 크기, 다분산도, 및 캡슐화 효율을 포함하여, 표 1에서 제공된다.
이 실시예에서 제형은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, Neuro2A 세포에 전달에 대하여 시험되었다. 세포는 세포 배양 배지에 직접적으로 각각의 제형 첨가에 의해 가이드 LNP 및 Cas9 mRNA LNP로 공동-형질감염되어, 표 2에서 열거된 농도를 초래하였고, 퍼센트 편집은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, T7E1 검정을 사용하여 결정되었다. 도 5에서, 라벨은, 표 2에서 기재된 바와 같이, 제형을 나타낸다.
Figure 112018119969413-pct00010
Figure 112018119969413-pct00011
편집에서 큰 증가는, 시험된 dgPvNA-LNP 제형에 비교된 경우, Cas9 mRNA-LNPs로 공동-형질감염된 화학적으로 변형된 sgRNA-LNPs를 사용하는 경우 양쪽 표적에 대하여 측정되었다 (도 5). 화학적으로 변형된 sgRNA-LNPs는 Cas9 mRNA-LNPs로 공동-형질감염시켜 (LNP-138 및 -139, 도 5), FVII 및 TTR, 각각을 표적하는 경우 세포에서 대략 35-50% 및 65-70% 편집을 초래하였다.
이 실시예에서 제형은 그 다음 생체내 시험되었다. 동물은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, Cas9 mRNA-LNP (LNP-140) 및 시험된 gRNA-LNPs (LNP-136, -137, -138, 및 -139) 중 하나의 혼합물이 투여되었고, 여기에서 각각의 성분 제형은, 2 연속 일 (각각의 그룹에 대하여 n=5)에, (총 2 mg/kg/일로) 1 mg/kg/일에서 투약되었다. 동물은 제1 용량 6 일 이후 안락사되었고, 간 조직은 수집되었고, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, NGS에 의해 분석되었다.
도 6에서, A1 및 A2는 제형 LNP-136 및 LNP-140의 혼합물의 투여를 나타내고; B1 및 B2는 제형 LNP-139 및 LNP-140의 혼합물의 투여를 나타내고; C1 및 C2는 제형 LNP-137 및 LNP-140의 혼합물의 투여를 나타내고; 그리고 D1 및 D2는 제형 LNP-138 및 LNP-140의 혼합물의 투여를 나타낸다. 도 6에서 나타낸 바와 같이, 편집 (대략 10% 편집-32% 편집)에서 증가는, dgRNA-LNP 제형의 용도가 초래하였던 편집의 양 (대략 2% 편집-5% 편집)에 비교된 경우, Cas9 mRNA-LNPs로 공동-투약된 화학적으로 변형된 sgRNA-LNPs를 사용하는 경우 양쪽 표적에 대하여 측정되었다. TTR을 표적하는 dgRNA-LNP 제형을 받는 동물은 2 간 생검을 거쳐 5% 미만 편집을 초래하였고, 한편 sgRNA-LNP 제형은 (하나의 동물에서 30%를 넘는 피크와) 20% 초과의 평균 퍼센트 편집을 초래하였다. 유사하게, FVII을 표적하는 dgRNA-LNP 제형을 받는 동물은 2 간 생검을 거쳐 3% 미만 편집을 표시하였고, 한편 sgRNA-LNP 제형은 (하나의 동물에서 12%를 넘는 피크와) 대략 10%의 평균 퍼센트 편집을 초래하였다.
이들 결과는 Cas9 mRNA 및 gRNA (양쪽 dgRNA 및 sgRNA)로 별도로 제형화된 LNPs가 함께 공동-투약된 경우 생체내 편집을 달성하고, LNPs가 gRNA-LNPs에 앞서 Cas9 mRNA-LNPs가 투약되는 경우 생체내 편집을 달성한다는 것을 확립시켰다.
실시예 7. Cas9 mRNA로 공동-제형화된 sgRNA를 포함하는 LNPs를 사용하는 시험관내 및 생체내 전달 및 편집.
LNP 조성물에서 함께 캡슐화된 Cas9 mRNA 및 sgRNA의 전달을 위하여 제형화된 LNPs는 CRISPR/Cas 성분을 또한 효과적으로 전달시킨다.
LNPs는, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, (TTR 또는 FVII을 표적하는) 화학적으로 변형된 sgRNA와 함께 IVT Cas9 mRNA로 제형화되었다. mRNA:sgRNA의 비는, RNA 성분의 중량 기준으로, 대략 1:1이었다. 이 실시예에서 sgRNA는 화학적으로 합성되었고, sgRNA, 각각의 양쪽 5' 및 3' 말단에서 3 말단 뉴클레오타이드에서 그리고 그 사이 2'-O-메틸 변형 및 포스포로티오에이트 연결기로, 상업적 공급자로부터 공급되었다. 각각의 LNP 제제의 성분은 CCD 지질 (지질 A, 45 mol-%), 콜레스테롤 (44 mol-%), DSPC (9 mol-%), 및 PEG2k-DMG (2 mol-%)를 포함한다. LNP-152, -153, -154, 및 -155는 이들 실험에서 사용되었고, 이들 제형의 세부사항은, 평균 입자 크기, 다분산도, 및 캡슐화 효율을 포함하여, 표 1에서 제공된다.
이 실시예의 제형은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, Neuro2A 세포에 전달에 대하여 시험되었다. 세포는 제형으로 형질감염되었고 퍼센트 편집은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, NGS를 사용하여 결정되었다.
도 7에서, A는 LNP-152의 투여를 나타내고; B는 LNP-153의 투여를 나타내고; C는 LNP-154의 투여를 나타내고; D는 LNP-155의 투여를 나타내고; 그리고 E는 LNP-152 및 LNP-153의 조합의 투여를 나타낸다. 각각의 제형은 300 ng Cas9 mRNA 및 93 nM gRNA; 100 ng Cas9 mRNA 및 31 nM gRNA; 30 ng Cas9 mRNA 및 10 nM gRNA; 및 10 ng Cas9 mRNA 및 3 nM gRNA에서 투여되었다. 도 7에서 나타낸 바와 같이, 각각의 LNP 제형의 투여는 강력한 편집 효율을 초래하였고, 일부 제형은 편집되는 세포 (LNP-153 및 -155)의 80% 초과를 초래하였다. 세포는 FVII을 표적하는 LNP 제형의 2개 (LNP-152 및 LNP-153)의 조합으로 처리되었고, 이는 또한 효율적인 편집 (대략 70-90% 편집), 뿐만 아니라 전달된 2 sgRNAs 사이 놓인 FVII 유전자의 한 부분의 절개를 초래하였다 (도 7, 및 데이터 도시되지 않음).
이 실시예에서 제형은 또한 생체내 시험되었다. 동물은 실시예 1에서 기재된 바와 같이 투약되었다 (각각의 그룹에 대하여 n=4). FVII을 표적하는 LNPs를 받는 처리 그룹은, 단일, 조합된 용량 (LNP-152 및 LNP-153)의 2 mg/kg (예를 들면, 1 mg/kg의 각각의 LNP-152 및 LNP-153)을 받았던 처리 그룹 중 하나로, 단일 용량 (2 mg/kg에서) 받았다. TTR을 표적하는 LNPs를 받는 처리 그룹은 2 용량 (2 mg/kg에서 각각)을 받았고, 여기서 제2 용량은 제1 용량 4 일 후 전달되었다 (즉, 일 1에서 용량 1, 일 5에서 용량 2). 모든 그룹에서 동물은 제1 용량 8 일 이후 안락사되었고 혈액 및 간 조직은 실시예 1에서 기재된 바와 같이 수집 및 분석되었다. 각각의 제형은 4 동물에 투여되었다.
도 8A, 8B, 및 9에서, A는 LNP-152의 투여를 나타내고; B는 LNP-153의 투여를 나타내고; 그리고 C는 LNP-152 및 LNP-153의 조합의 투여를 나타낸다. 각각의 제형은 4 동물에서 시험되었다. 도 8A 및 8B에서 나타낸 바와 같이, 시험된 각각의 LNP 제형은 강력한 생체내 편집 효율성을 초래하였다. TTR 서열을 표적하는 LNP 제형으로 처리된 동물에 대하여, 일부 동물용 각각의 생검으로부터 간 세포의 50% 초과는, 각각의 처리 그룹에 대하여 (모든 동물의 모든 생검을 거쳐) 45.2 ± 6.4% (LNP-154) 및 51.1 ± 3.7% (LNP-155)의 전체적인 평균으로, 표적 부위에서 인델을 표시하였다 (도 8A).
FVII 서열을 표적하는 LNPs로 처리된 동물은 간 생검에서 백분율 편집의 범위를 표시하였고, 간 세포의 70% 초과의 최대 관측된 편집은 FVII 서열을 표적하는 양쪽 LNP 제형을 받는 하나의 동물용 (예를 들면, 표적 부위(들)에서 또는 그 사이 어느 한쪽 인델 또는 절개 사건을 갖는) 생검 샘플로부터 편집되었다. 각각의 처리 그룹 (LNP-152, LNP-153, 및 LNP-152 및 LNP-153)에 대하여 (모든 동물의 모든 생검을 거쳐) 전체적인 평균은 16.9 ± 6.5%, 38.6 ± 13.2%, 및 50.7 ± 15.0%, 각각이었다 (도 8B). 양쪽 FVII-표적화 LNPs를 받는 동물에 대하여, 각각의 sgRNA용 표적 부위 사이 개입 게놈성 DNA의 절개는, 표적 부위의 한쪽 또는 양쪽에서 그러하였듯이, PCR에 의해 검출되었다 (도 9).
도 10 및 11에서, A는 LNP-152의 투여를 나타내고; B는 LNP-153의 투여를 나타내고; C는 LNP-154의 투여를 나타내고; D는 LNP-155의 투여를 나타내고; 그리고 E는 LNP-152 및 LNP-153의 조합의 투여를 나타낸다. LNP 제형이 이 실시예에서 투여된 경우 관측된 강력한 생체내 편집은 또한 표현형 변화를 초래하였다. 도 10에서 나타낸 바와 같이, 혈청 TTR 수준에서 (최대 대략 75%의) 큰 감소는 (FVII을 표적하는 LNPs로 처리된 동물 또는 대조군이 아닌) TTR 서열을 표적하는 LNPs로 처리된 동물에서 관측되었다. 유사하게, 혈장 FVII 활성의 감소된 수준은 (TTR을 표적하는 LNPs로 처리된 동물 또는 대조군이 아닌) FVII을 표적하는 LNPs로 처리된 동물에서 관측되었다 (도 11).
실시예 8. 제형 파라미터의 변화.
하나의 제형에서 함께 Cas9 mRNA 및 gRNA의 전달을 위하여 제형화된 LNPs는 (1) 용량의 범위를 거쳐; (2) mRNA:gRNA의 변경된 비로; (3) 단일 용량 대 2 용량으로 효능에 대하여; 그리고 (4) LNPs가 비장에 의해 흡수되고 비장에서 편집을 초래한즈에 따라 시험되었다.
LNPs는, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, (TTR을 표적하는) 화학적으로 변형된 sgRNA와 함께 IVT Cas9 mRNA로 제형화되었다. mRNA:sgRNA의 (RNA 성분의 중량 기준으로) 시험된 비는 대략 1:1 (LNP-169), 대략 10:1 (LNP-170), 또는 대략 1:10 (LNP-171)이었다. 이 실시예에서 사용된 sgRNA는 sgRNA, 각각의 양쪽 5' 및 3' 말단에서 3 말단 뉴클레오타이드에서 그리고 그 사이 2'-O-메틸 변형 및 포스포로티오에이트 연결기를 포함한다. 각각의 LNP 제제의 성분은 지질 A (45 mol-%), 콜레스테롤 (44 mol-%), DSPC (9 mol-%), 및 PEG2k-DMG (2 mol-%)를 포함하였다. LNP-169, -170 및 LNP-171은 이들 실험에서 사용되었다. 세부사항은, 평균 입자 크기, 다분산도, 및 캡슐화 효율을 포함하여, 표 1에서 제공된다.
용량 반응 연구
이 연구에서, 동물은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 또는 2 mg/kg (각각의 그룹에 대하여 n=5)의 용량에서 LNP-169로 일 1에서 투약되었다. 일 5 및 9에서 혈액은 TTR 혈청 수준 분석을 위하여 수집되었다. 간 및 비장은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, NGS 분석을 위하여 일 9에 검시에서 수집되었다.
도 12A에서 나타낸 바와 같이, 모든 3 용량의 투여는, 0.9441의 r2 값을 갖는 관측된 선형 용량 반응으로, 간에서 상당한 편집 효율을 수득하였다. 최고 용량 그룹 (2 mg/kg)에서, 하나의 동물에서 간 세포의 거의 60%는, 편집된 간 세포의 약 50%의 평균을 갖는 그룹으로, TTR 표적 부위에서 편집되었다. 최고 용량이 투여되었던 각각의 동물은 또한, (PBS 투여된 동물에 비교된 경우; 도 12B) 혈청 TTR 수준의 평균 감소 75%로, 투여후 일 5 및 9에서 측정된 경우 혈청 TTR 수준에서 통계적으로 상당한 감소를 표시하였다.
mRNA:gRNA의 비 변경
일 1에서, 동물은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, 1:1의 mRNA:gRNA 비 (즉, 2 mg/kg의 총 RNA 용량에 대하여, 1 mg/kg mRNA, 1 mg/kg gRNA)로 LNP-169, 10:1의 비 (즉, 1.98 mg/kg의 총 RNA 용량에 대하여, 1.8 mg/kg의 mRNA, 0.18 mg/kg의 gRNA)로 LNP-170, 또는 1:10의 비 (즉, 1.98 mg/kg의 총 RNA 용량에 대하여, 0.18 mg/kg mRNA, 1.8 mg/kg gRNA)로 LNP-171 (각각의 그룹에 대하여 n=5)이 투여되었다. (주석: 1:1 mRNA:gRNA 비로 용량을 받는 그룹 및 데이터는 이 실시예에서 용량 반응 연구에서 기재된 바와 동일한 그룹 및 데이터이다, 상동) 혈액은 일 5 및 9에서 수집되었고, 혈청 TTR 수준은 측정되었다. 간 및 비장은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, NGS 분석을 위하여 일 9에 검시에서 수집되었다.
도 13A에서 나타낸 바와 같이, LNP-169 (1:1의 mRNA:gRNA 비)의 투여는, 약 50% 편집의 평균을 갖는 그룹과, TTR 표적 부위에서 하나의 동물에서 거의 60%의 편집을 초래하였다. 1:10 및 10:1 LNP 제형을 받았던 동물은 편집을 또한 실증하였고, 이 실험에서 LNP-171을 받는 그룹에 대하여 평균 퍼센트 편집은 대략 32% 편집을 보여주었고 LNP-170을 받는 그룹은 대략 17% 편집을 보여주었다. 추가로, 도 13B에서 나타낸 바와 같이, 혈청 TTR 수준에서 통계적으로 상당한 감소는 (PBS 대조군에 비교된 경우) 일 5에서 각각의 처리 그룹에 대하여 검출되었다. 일 9까지, 1:1 mRNA:sgRNA 및 1:10 mRNA:sgRNA를 받는 그룹은 혈청 TTR 수준에서 통계적으로 상당한 감소를 유지하였다.
단일 용량 대 2 용량
이 연구에서, 동물의 한 그룹은 일 1에서 (2 mg/kg으로) LNP-169의 단일 용량을 받았고, 한편 또 다른 그룹은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이 투여된 (양쪽 그룹에 대하여 n=5), 일 1에서 투여된 제1 용량 및 일 5에서 투여된 제2 용량으로 LNP-169 (2 mg/kg에서 각각)의 2 용량을 받았다. (주석: LNP-169의 단일 용량을 받는 그룹 및 데이터는 이 실시예에서 용량 반응 및 mRNA:gRNA 비 연구에서 기재된 바와 동일한 그룹 및 데이터이다, 상동). 혈액은 (제2 용량을 받는 그룹에 대하여 제2 용량의 투여에 앞서) 일 5에서, 그리고 재차, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, 일 9에 검시에서 양쪽 그룹으로부터 TTR 혈청 수준에 대하여 수집되었다.
도 14A에서 나타낸 바와 같이, LNP-169의 단일 용량을 받는 그룹에서, TTR 표적 부위의 거의 60% 편집은, 약 50% 편집의 평균을 갖는 그룹으로, 하나의 동물에서 관측되었다. 유사한 평균 수는, TTR 표적 부위의 대략 55% 편집을 평균화하는 그룹으로 그리고 더 낮은 표준 편차로, LNP-169의 2 용량을 받는 동물에서 달성되었다. 도 14B에서 나타낸 바와 같이, 양쪽 그룹은 혈청 TTR 수준에서 상당한 감소를 표시하였다.
비장에서 편집 및 상기에 의한 흡수 평가
(이 실시예 내에서) 상기 연구에서 각각의 동물로부터 비장은 LNPs가 비장에 유도되었는지 그리고 비장에 의해 흡수되었는지 여부를 결정하기 위해 검시에서 수집되었고, 그렇게 함으로써 유전자 편집을 초래하였다. 게놈성 DNA는 비장 조직으로부터 추출되었고 실시예 1에서 기재된 바와 같이 NGS 분석을 거치게 되었다.
도 15에서, A는 2 용량에 대하여 2 mg/kg으로 투여된 LNP-169를 나타내고; B는 단일 용량으로서 0.1 mg/kg에서 mRNA:gRNA의 1:1 비로 LNP-169를 나타내고; C는 단일 용량으로서 0.5 mg/kg에서 mRNA:gRNA의 1:1 비로 LNP-169를 나타내고; D는 단일 용량으로서 2 mg/kg에서 mRNA:gRNA의 1:1 비로 LNP-169를 나타내고; E는 단일 용량으로서 2 mg/kg에서 mRNA:gRNA의 10:1 비로 LNP-170을 나타내고; 그리고 F는 단일 용량으로서 2 mg/kg에서 mRNA:gRNA의 1:10 비로 LNP-171을 나타낸다. 도 15에서 나타낸 바와 같이, 상당히 더 적은 편집 (대략 2% 미만의 세포)는 그것의 간에 비교된 경우 이들 동물의 비장에서 관측되었다. 간에서 대략 50%의 편집은 이들 연구에서 (예를 들면, LNP-169를 받는 그룹에서) 관측되었다. 이들 결과는 본 명세서에서 제공된 LNPs가, 비장과는 대조적으로, 간에서 크게 표적화된다는 것을 나타낸다.
실시예 9. 하나의 제형에서 (1) Cas9 mRNA-LNPs와 공동-투약된 변형된 dgRNA-LNPs와 (2) Cas9 mRNA 및 변형된 dgRNA를 함께 포함하는 LNPs 사이 비교 생체내 연구.
하나의 제형에서 어느 한쪽 별개의 LNPs로서 또는 함께 Cas9 mRNA 및 변형된 dgRNA의 전달을 위하여 제형화된 LNPs는 CRISPR/Cas 성분을 효과적으로 전달한다.
LNPs는, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, 어느 한쪽 (LNP-174, -175)와 함께 또는 (TTR을 표적하는) (LNP-172, -173) 화학적으로 변형된 dgRNA와 별도로 IVT Cas9 mRNA와 제형화되었다. 이 실시예에서 dgRNA를 구성하는 양쪽 crRNA 및 trRNA는 각각의 RNA의 양쪽 5' 및 3' 말단에서 3 말단 뉴클레오타이드 사이 포스포로티오에이트 연결기를 포함하였다. 각각의 LNP 제제의 성분은 CCD 지질 (지질 A, 45 mol-%), 콜레스테롤 (44 mol-%), DSPC (9 mol-%), 및 PEG2k-DMG (2 mol-%)를 포함한다. LNP-172, -173, -174, 및 -175는 이들 실험에서 사용되었다. LNP-174 및 LNP-175의 조성물은, LNP-175에서 dgRNA를 구성하는 crRNA 및 trRNA가 LNP로 제형화되기 앞서 서로 먼저 사전-어닐링되었던 것을 제외하고, 동일하였다. 이것은 실온으로 냉각 전 10 분 동안 95℃에서 함께 crRNA 및 trRNA를 먼저 인큐베이팅 그리고, 이전에 기재된 바와 같이, 제형으로 가공시킴으로써 달성되었다. LNPs에 관한 다른 세부사항은, 평균 입자 크기, 다분산도, 및 캡슐화 효율을 포함하여, 표 1에서 제공된다.
동물은 실시예 1에서 기재된 바와 같이 2 mg/kg에서 각각의 LNP로 투약되었다 (각각의 그룹에 대하여 n=5). 간은 투여후 8 일 검시에서 수집되었고, 게놈성 DNA는, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, 단리되었고 NGS 분석을 거치게 되었다.
도 16에서, A는 dgRNA 분할-제형 (LNP-172 및 LNP-173의 투여를 나타내고; B는 dgRNA 공동-제형 (LNP-174)의 투여를 나타내고; 그리고 C는 dgRNA가 사전-어닐링된 제형 (LNP-175)의 투여를 나타낸다. 도 16에서 나타낸 바와 같이, 편집은 (대략 4-6% 편집을 가진) 각각의 그룹으로부터 간에서 검출되었다. 함께 Cas9 mRNA 및 dgRNA로 공동-제형화된 LNP를 받았던 동물 그리고 별도로 제형화된 LNPs로부터 mRNA 및 dgRNA를 받았던 동물은 편집을 보여주었다. (어느 한쪽 Cas9 mRNA와 함께 또는 이와 별도로) dgRNA로 제형화된 LNPs를 사용하여 측정된 편집 효율성은 sgRNA로 제형화된 LNPs를 사용하여 검출된 것보다 실질적으로 더 낮다 (참조, 예를 들면, 실시예 6-8).
실시예 10. LNPs의 ApoE 결합 및 일차 간세포의 형질감염.
실시예 8에서 실증된 바와 같이, 본 명세서에서 제공된 LNPs는 간에 의해, 그리고 소량 정도로만 비장에 의해 효과적으로 흡수된다. 이 실시예는 일차 간세포에서 ApoE-매개된 흡수에 관하여 데이터를 제공하고 LNPs가 ApoE를 결합시킨다는 것을 실증하였던 LNP-ApoE 결합 표적에 대하여 검정을 제공한다.
일차 간세포에 LNP 전달
다른 단백질에 더하여, 혈청은 배양 배지에서 ApoE의 공급원을 제공하고, 따라서 LNPs가 일차 간세포에 흡수를 위하여 (예를 들면, ApoE의 공급원으로서) 혈청을 요구하는지 여부는 시험되었다. 이것은, 혈청의 존재가 있거나 없이, 시험관내 일차 간세포에 LNPs 첨가에 의해 달성되었다.
LNPs는 실시예 1에서 기재된 바와 같이 마우스 일차 간세포에 전달되었다. 임의의 혈청의 부재 하에서, 편집은 시험된 임의의 LNP용 T7E1 검정에 의해 검출되었다 (데이터 도시되지 않음). 그러나, LNPs는 형질감염에 앞서 3% 마우스 혈청으로 인큐베이션되었고, LNPs는 편집을 초래하는 간세포에 의해 흡수되었다. 대표적인 데이터 세트는 도 17에서 보여진다. 이 실험에서, (TTR을 표적하는) LNP-169는 3% 마우스 혈청에서 사전-인큐베이션되었고, 그 다음 다양한 농도에서 마우스 일차 간세포에 첨가되었다. 도 17에서 라벨은 표 3에서 정의되고 투여된 LNP-169의 농도를 기재한다. 도 17에서 나타낸 바와 같이, 혈청의 첨가는 NGS에 의해 측정된 경우 TTR 표적 부위에서 편집의 용량 의존적 증가를 초래하였다. 이들 결과는 혈청에서 존재하는 ApoE가 간세포에서 LNP 흡수를 매개한다는 것을 시사한다.
Figure 112018119969413-pct00012
ApoE 결합 검정
LNPs는, ApoE의 가장 통상적인 형태인, 재조합 ApoE3으로 인큐베이션되었고, 그 다음 HPLC에서 염 구배를 사용하여 헤파린 친화성 칼럼으로 분리되었다. ApoE3에 결합된 LNPs 및 미결합된 LNPs에 상응하는, HPLC 실행에서 2 피크 그룹이 있었다. 비-결합된은 ApoE3으로 결합하지 않았던 그리고 헤파린 칼럼을 통해 자유롭게 유동하였던 자유 LNP이다. 결합된은 헤파린 칼럼에 결합되었던 그리고 염 구배에서 용출되었던 LNP/ApoE3 복합체를 나타내는 더 긴 체류 시간을 가진 피크이었다. 결합을 계산하기 위해, 결합된 피크 면적의 백분율은 ApoE3에 결합된 LNPs에 상응하는 피크 면적으로 나눗셈 그리고 양쪽 피크의 면적의 합계로 그 수를 나눗셈함으로써 계산되었다.
LNPs는, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, Cas9 mRNA 및 화학적으로 변형된 sgRNA로 제형화되었다. 이 실시예에서 사용된 sgRNAs는 화학적으로 합성되었고, sgRNA, 각각의 양쪽 5' 및 3' 말단에서 3 말단 뉴클레오타이드에서 그리고 그 사이 2'-O-메틸 변형 및 포스포로티오에이트 연결기로, 상업적 공급자로부터 공급되었다. 각각의 LNP 제제 (LNP-169 및 LNP-171)의 성분은 지질 A (45 mol-%), 콜레스테롤 (44 mol-%), DSPC (9 mol-%)), 및 PEG2k-DMG (2 mol-%)를 포함한다. 이들 제형에 대하여 세부사항은, 평균 입자 크기, 다분산도, 및 캡슐화 효율을 포함하여, 표 1에서 제공된다. 0.5 mg/mL에서 스톡 ApoE3 (재조합 인간 아포지질단백질 E3, R&D 시스템, cat #4144-AE-500) 용액을 사용하여, ApoE3은 LNP 샘플에 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 및 300 μg/mL에서 첨가되었다. 샘플은 밤새 실온에서 인큐베이션되었다.
2 완충액은 제조되었고 (500 mL 각각); 완충액 A는, pH 8.0으로 조정된, 20 mM 트리스 완충액이고 완충액 B는, pH 8.0으로 조정된, 1 M NaCl을 가진, 20 mM 트리스 완충액이다. HPLC 분석용 구배 및 유량은 아래 기재된 바와 같다.
Figure 112018119969413-pct00013
밤새 샘플 인큐베이팅 후, 각각의 샘플은 HPLC에 의해 분석되었고 결합된 피크의 퍼센트 면적은 이전에 기재된 바와 같이 계산되었다.
도 18에서 나타낸 바와 같이, ApoE3의 증가하는 양으로, 더 많은 LNP (양쪽 (점선으로 표시되는) LNP-169 및 (실선으로 표시되는) -171)은, 예를 들면, ApoE3에 결합됨의 결과로서, 헤파린 칼럼에 결합되었다. 이들 결과는 LNPs가 ApoE3을 결합시키는 것을 나타낸다.
실시예 11. DNA 발현 카셋트로부터 발현된 sgRNA와 LNPs를 사용하여 시험관내 및 생체내 전달 및 편집.
이 실시예는 Cas9 mRNA로 장입된 LNPs 그리고 sgRNA를 인코딩하는 발현 카셋트를 사용하는 유전자 편집을 실증한다.
시험관내 LNP 전달
sgRNA를 인코딩하는 앰플리콘은 마우스 TTR을 표적하는 sgRNA로서 연결된 U6 프로모터를 함유하는 DNA 서열의 PCR 증폭에 의해 제조되었다. 각각의 프라이머는 게놈성 DNA에 DNA 앰플리콘의 통합을 예방하기 위해 5' 말단에서 역전된 디데옥시T 뉴클레오타이드를 함유하였다. PCR 생성물은 페놀/클로로포름 추출 이어서 에탄올 침전에 의해 정제되었다. DNA 펠릿은 건조되었고 TE 완충액에서 재현탁되었다.
LNPs는 실시예 1에서 기재된 바와 같이 IVT Cas9 mRNA ("mRNA-LNP" 또는 LNP-178) 또는 sgRNA 발현 카셋트 ("DNA-LNP" 또는 LNP-176)으로 제형화되었다. IVT Cas9 mRNA 및 sgRNA 발현 카셋트는 제조자의 지침에 따라 리포펙타민 2000 (Thermo Fisher)로 또한 별도로 제형화되었다 ("mRNA LF2K" 또는 "DNA LF2K", 각각). 제형은 하기 레지멘에 따라 각각의 웰내 세포 배양 배지에 직접적으로 희석시킴으로써 마우스 Neuro2A 세포 (100 ng Cas9 mRNA 및 100 ng sgRNA 발현 카셋트)에 적용되었다:
● Cas9 mRNA 및 sgRNA 발현 카셋트의 공동-전달;
● Cas9 mRNA에 앞서 2 시간 투여된 sgRNA 발현 카셋트; 및
● sgRNA 발현 카셋트에 앞서 2 시간 투여된 Cas9 mRNA.
세포는 형질감염후 48 시간 동안 인큐베이션되었고, 세포 용해물은 실시예 1에서 기재된 바와 같이 T7E1 분석에 의해 분석되었다. 도 19에서 나타낸 바와 같이, TTR 편집의 더 높은 백분율은, 하나의 성분 또는 다른 것이 리포펙타민 2000으로 제형화되었던 경우에 비교하여, 양쪽 mRNA 및 DNA 성분이 LNPs에서 제형화되었던 경우 관측되었다.
실시예 12. 시험관내 대 생체내 편집.
상이한 마우스 TTR 서열을 표적하는 화학적으로 변형된 sgRNA 및 Cas9 mRNA는 실시예 1에서 기재된 바와 같이 제형화되었고 마우스 (2 mg/kg)에 투약되었다. 동일한 LNP 제제는 시험관내 마우스 일차 간세포를 형질감염시키는데 사용되었다. 이 실시예에서 sgRNA는 화학적으로 합성되었고, sgRNA, 각각의 양쪽 5' 및 3' 말단에서 3 말단 뉴클레오타이드에서 그리고 그 사이 2'-O-메틸 변형 및 포스포로티오에이트 연결기로, 상업적 공급자로부터 공급되었다.
Figure 112018119969413-pct00014
Figure 112018119969413-pct00015
시험관내 연구를 위하여, 7 포인트 세미-로그 용량 반응은 수행되었다 (100 ng/웰에서 개시). 형질감염 48 시간 후, 게놈성 DNA는 수확되었고 편집 퍼센트는 NGS에 의해 측정되었다. 도 20은, 편집 효율이 배양물내 및 생체내 일차 간세포 사이 상관관계가 있다는 것을 실증하는, 이들 시험관내 및 생체내 실험에 대하여 편집 백분율을 보여준다.
NGS가 전체적인 편집 효율에 더하여 특정 서열분석 결과를 제공하기 때문에, 서열-특이적 편집 패턴은 Neuro 2A 세포에 비교되었다. 도 21은 삽입 및 결실 패턴이 (Cas9 mRNA 및 gRNA로 형질감염된) 마우스 Neuro2A 세포와 (Cas9 mRNA 및 gRNA를 함유하는 LNPs로 형질감염된) 마우스 일차 간세포 사이 상당히 상이하다는 것을 실증하는 대표적인 데이터를 보여준다. 마우스 일차 간세포는 (Cas9 mRNA 및 gRNA를 함유하는 LNPs로 형질감염된) 생체내 관측된 것에 매우 유사한 편집 패턴을 수득하였다 (도 22). 도 22에서 나타낸 바와 같이, 총 70% 편집에 대하여, 마우스에서 일차 간세포에서 측정된 편집의 53.2%는 결실 (주로 1 bp 결실)이었고 16.8%는 삽입 (주로 1 bp 삽입)이었다. 총 70% 편집을 벗어나서, 편집의 64.5%는 프레임시프트 돌연변이를 초래하였고, 이는 측정된 총 편집의 ∼92%를 나타낸다 (도시되지 않음). 유사하게, 대표적인 데이터는 Cas9 mRNA 및 gRNA의 LNP-기반 전달부터 생체내 마우스 간 세포까지 관측된 경우 편집 백분율 및 편집 유형에 대하여 보여진다: 총 59.5% 편집에 대하여, 생체내 마우스 간 세포에서 측정된 편집의 46.6%는 결실 (재차, 주로 1 bp 결실)이었고 12.9%는 삽입 (재차, 주로 1 bp 삽입)이었다. 총 59.5% 편집을 벗어나서, 편집의 57.4%는 프레임시프트 돌연변이를 초래하였고, 이는 생체내 측정된 총 편집의 ∼96%를 나타낸다 (도시되지 않음).
실시예 13. LNP에 의해 전달된 CRISPR/Cas9 성분의 약동학.
마우스 TTR을 표적하는 sgRNA 및 Cas9 mRNA를 함유하는, LNP-294는 실시예 1에서 기재된 바와 같이 제형화되었다. mRNA 대 가이드RNA의 비는 HPLC에 의해 확인되었다. 동물은 실시예 1에서 기재된 바와 같이 2 mg/kg에서 각각의 LNP로 투약되었고 (각각의 그룹에 대하여 n=3), 하기 시점에서 기록하였다: 5 분, 15 분, 30 분, 60 분, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 72 시간, 및 7 일. 검시에서, 혈장, 간, 및 비장은 Cas9 mRNA 및 가이드RNA의 수준의 qPCR 분석을 위하여 수집되었다. 도 23은 이들 성분의 혈장 농도를 보여주고, 도 24는 간에서 농도를 보여주고, 도 25는 비장에서 농도를 보여준다. 하기 약동학적 파라미터는 혈장 농도에 대하여 계산되었다:
Figure 112018119969413-pct00016
도 26A는 혈장 및 조직에서 sgRNA 대 Cas9 mRNA의 상대 비를 보여준다.
처리된 마우스에서 사이토카인 유도는 또한 측정되었다. 이 분석을 위하여, 대략 50-100 μL의 혈액은 혈청 사이토카인 측정을 위하여 꼬리 정맥 닉에 의해 수집되었다. 혈액은 대략 2 시간 동안 실온에서 응고하게 되었고, 그 다음 1OOOxg에서 10 분 동안 원심분리된 다음 혈청을 수집하였다. IL-6, TNF-알파, IFN-알파, 및 MCP-1을 측정하는 루미넥스 기반 자기 비드 다중 검정 (Affymetrix ProcartaPlus, 카탈로그 번호 Exp040-00000-801)은 샘플에서 수집된 사이토카인 분석을 위하여 사용되었다. 키트 시약 및 표준은 제조자의 프로토콜에서 지향된 바와 같이 제조되었다. 마우스 혈청은 제공된 샘플 희석제를 사용하여 4-배 희석되었고 50 μL는 50 μL의 희석된 항체 코팅된 자기 비드를 함유하는 웰에 첨가되었다. 플레이트는 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션되었고 그 다음 세정되었다. 희석된 바이오틴 항체 (50 μL)는 비드에 첨가되었고 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션되었다. 비드는 재차 세정된 다음 50 μL의 희석된 스트렙타비딘-PE를 각 웰에 첨가하였고, 이어서 30 분 동안 인큐베이션되었다. 비드는 다시 한번 세정되었고 그 다음 100 μL의 세정 완충액에 현탁되었고 Bio-Plex 200 기기 (Bio-Rad)에서 판독되었다. 데이터는 5 파라미터 로지스틱 곡선 맞춤을 사용하여 표준 곡선을 벗어나 계산된 사이토카인 농도로 Bioplex Manager ver. 6.1 분석 패키지를 사용하여 분석되었다. 도 27은 경시적으로 처리된 마우스에 대하여 혈장 사이토카인 수준을 보여준다. 도 27에서 나타낸 바와 같이, 각각의 사이토카인은 처리후 2-4 시간 사이 측정가능한 증가를 가졌고, 각각은 12-24 시간 지나서 기준선으로 되돌아왔다.
3 상이한 가이드 서열은, 실시예 1에 따라, 별도로 제형화되었고 마우스 (n=3)에 주사되어 지질 A의 약동학적 프로파일을 결정하였다. 마우스 간 및 혈장에서 지질 A의 수준은 LC/MS에 의해 측정되었다. 도 26B는 경시적으로 지질 A의 혈장 및 간 농도를 보여준다. 간에서 Tmax는 30 분의 투여 내에 달성되었고, 반면에 혈장 및 간에서 T1/2는 대략 5-6 시간의 LNP 투여 내에 달성되었다.
실시예 14. 생체내 편집용 반응의 지속기간
마우스 TTR 서열을 표적하는 화학적으로 변형된 sgRNA 및 Cas9 mRNA는 실시예 1에서 기재된 바와 같이 제형화되었다:
Figure 112018119969413-pct00017
LNPs는 실시예 1에서 기재된 바와 같이 마우스에 (3 mg/kg, 1 mg/kg, 또는 0.3 mg/kg에서 단일 용량) 투약되었다. 마우스의 집단은 투약후 1, 2, 4, 9, 13, 및 16 주에서 혈청 TTR 수준, 그리고 투약후 1, 2, 9, 및 16 주에서 간 TTR 편집에 대하여 측정되었다. 간 TTR 편집을 측정하기 위해, 간으로부터 조직 샘플은 DNA 추출 및 분석용 특정한 집단의 각각의 동물에서 중앙 엽으로부터 수집되었다. 게놈성 DNA는, 용해 완충액에서 조직 (대략 400 μL/10 mg 조직) 균질화 및 DNA 침전을 포함하는, 제조자의 프로토콜에 따라 비드-기반 추출 키트, MagMAX-96 DNA Multi-Sample Kit (ThermoFisher, 카탈로그 번호 4413020)을 사용하여 10 mg의 조직으로부터 추출되었다. 모든 DNA 샘플은 PCR 및 후속적인 NGS 분석을 위하여 100 ng/μL 농도로 정규화되었다.
이 실시예에서 sgRNA는 화학적으로 합성되었고, 아래 표시되는 바와 같이 2'-O-메틸 변형 및 포스포로티오에이트 연결기로, 상업적 공급자로부터 공급되었다 (m = 2'-OMe; * = 포스포로티오에이트):
sg282:
도 28은 경시적으로 마우스 혈청 TTR 수준을 보여주고, 도 29A는 NGS에 의해 측정된 경우 상응하는 편집 백분율을 보여준다. 도 29B는, 투약후 16 주를 통해, 경시적으로 마우스 혈청 TTR 수준 및 NGS에 의해 측정된 경우 상응하는 편집 백분율 양쪽을 보여준다.
실시예 15. mRNA 제제를 사용하는 제형
Cas9 mRNA는 양쪽 침전-단독 및 HPLC 정제 프로토콜을 사용하여 실시예 1에서 기재된 바와 같이 제조되었다 LNP는 HPLC 정제된 mRNA (LNP492)를 사용하여 제형화되었고, 침전-단독 가공된 mRNA (LNP490, LNP494)를 사용하여 제형화된 LNP에 비교되었다. LNP494의 Cas9 mRNA 전달대상물은 침전-단독 mRNA의 상이한 합성 롯트를 사용하여 제조되었다.
Figure 112018119969413-pct00019
마우스는 실시예 1, LNP 전달 생체내에서 기재된 바와 같이 0.5 또는 1 mg/kg의 각각의 제형으로 투약되었다. 이 실시예에서 사용된 sgRNA는, 실시예 14에서 기재된 바와 같이 sg282이었다.
도 30은 투약후 4 시간에서 마우스 혈청 사이토카인 활성을 보여준다. 도 31은 마우스 혈청 TTR 농도 수준을 보여주고, 도 32는 마우스 간 TTR 편집 수준을 보여준다.
Figure 112018119969413-pct00020
실시예 16. 냉동된 제형
LNPs는 약 4.5의 지질 A 대 RNA 포스페이트 (N:P) 몰비로 제형화되었다. 지질 나노입자 성분은 하기 몰비로 100% 에탄올에 용해되었다: 45 mol-% (12.7 mM) 지질 A; 44 mol-% (12.4 mM) 콜레스테롤; 9 mol-% (2.53 mM) DSPC; 및 2 mol-% (0.563 mM) PEG2k-DMG. RNA 전달대상물은 50 mM 아세테이트 완충액, pH 4.5에 용해되어, 대략 0.45 mg/mL의 RNA 전달대상물의 농도를 초래하였다. 이 연구를 위하여, 실시예 14에서 기재된 sg282는 사용되었다.
Figure 112018119969413-pct00021
LNPs (LNP493, LNP496)은, 제조자의 프로토콜에 따라, Precision Nanosystems NanoAssemblr™ Benchtop Instrument를 사용하여 지질 및 RNA 용액의 미세유체 혼합에 의해 형성되었다. 수성 대 유기 용매의 2:1 비는 차별적인 유량을 사용하여 혼합 동안 유지되었다. 혼합 후, LNPs는 수집되었고, 50 mM 트리스 완충액, pH 7.5에서 희석되었다 제형화된 LNPs는 0.2 μm 멸균된 필터를 사용하여 여과되었다. 수득한 여과물은 pH 7.5에 50 mM 트리스 완충액에서 10% w/v 수크로스 90 mM NaCl과 1:1 혼합되었다. 5% w/v 수크로스, 45 mM NaCl, 50 mM 트리스 완충액에서 최종 LNP 제형은 투약의 날까지 1.5 일 동안 4℃ 및 -80℃에서 저장되었다.
LNPs는 0.5 및 1 mg/kg으로 마우스에 투여되었다 (냉동된 제형은 투여 1 시간에 앞서 25℃에서 해동되었다). 도 33은 마우스 혈청 TTR 농도 수준을 보여주고, 도 34는 투약후 마우스 간 TTR 편집 수준을 보여준다.
Figure 112018119969413-pct00022
이 실시예에서 sgRNA는 화학적으로 합성되었고, 아래 표시되는 바와 같이 2'-O-메틸 변형 및 포스포로티오에이트 연결기로, 상업적 공급자로부터 공급되었다 (m = 2'-OMe; * = 포스포로티오에이트):
sg396:
실시예 17: 대안적 LNP 제형 공정
LNPs는 약 4.5의 지질 A 대 RNA 포스페이트 (N:P) 몰비로 제형화되었다. 지질 나노입자 성분은 하기 몰비로 100% 에탄올에 용해되었다: 45 mol-% (12.7 mM) 지질 A; 44 mol-% (12.4 mM) 콜레스테롤; 9 mol-% (2.53 mM) DSPC; 및 2 mol-% (0.563 mM) PEG2k-DMG. RNA 전달대상물은 대략 0.45 mg/mL의 RNA 전달대상물의 농도를 초래하는 어느 한쪽 (25 mM 아세트산나트륨, pH 4.5의 최종 농도로) 아세테이트 완충액, 또는 (25mM 시트르산나트륨, 100 mM NaCl, pH 5의 최종 농도로) 시트레이트 완충액에 용해되었다. 이 연구를 위하여, 실시예 14에서 기재된 sg282는 사용되었다.
LNPs는, 제조자의 프로토콜에 따라, Precision Nanosystems NanoAssemblr™ Benchtop Instrument를 사용하여 지질 및 RNA 용액의 미세유체 혼합 또는 교차-유동 혼합에 의해 형성되었다. LNP563 및 LNP564는 NanoAssemblr 제제를 사용하여 제조되었고, 여기에서 수성 대 유기 용매의 2:1 비는 차별적인 유량, 수성상에 대하여 8 mL/min 및 유기상에 대하여 4 mL/min을 사용하여 혼합 동안 유지되었다. 혼합 후, LNPs는 수집되었고 50 mM 트리스 완충액, pH 7.5에서 1:1 희석되었다. LNPs는 밤새 50 mM 트리스, pH 7.5에서 투석되었고 다음 날 0.2 μm 멸균된 필터를 사용하여 여과되었다. 수득한 여과물은 농축되엇고 pH 7.5에 50 mM 트리스 완충액에서 제조된 10% w/v 수크로스 90 mM NaCl로 1:1 혼합되었다. 5% w/v 수크로스, 45 mM NaCl, 50 mM 트리스 완충액에서 최종 LNP 제형은 투약의 날까지 1.5 일 동안 4℃ 및 -80℃에서 저장되었다.
Figure 112018119969413-pct00024
LNP561 및 LNP562는 교차-유동 기술을 사용하여 제조되었고 주사기 펌프는 0.45 mg/mL에서 RNA의 2 주사기, 지질을 함유하는 오가니스 상의 1 주사기 및 물의 1 주사기와 사용되었다. 이들은 가변성 튜우빙 길이로 40 mL/min에서 혼합되었고, 수성상 및 유기상은 0.5 mm 피크 크로스를 통해 통과되었고 이 출력은 물 튜우빙에 연결된 1 mm 티에 도입되었다. LNPs는 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션되었고 그 다음 물로 1:1 희석되었다. 간단히, LNPs 및 물은 주사기 펌프에 의해 1 mm 티에서 25 mL/min으로 도입되었다.
정제 및 농축을 위하여, 접선 유동 여과는 사용되었다. 일반적으로 이 절차를 위하여, Sartorius로부터 Vivaflow 50 카트리지는 500 mL 물로 프라이밍되고 그 다음 LNPs는 60 mL/min의 공급 속도로 Pall Minimate 시스템을 사용하여 도입된다. 침투 선은 약 1.7 mL/min의 고정된 유량을 유지하기 위해 고정된다. 일단 LNPs가 어느 한쪽 PBS 또는 5% 수크로스의 15 배 용적으로 농축되면, pH 7.5에서 45 mM NaCl, 50 mM Tris는 80 mL/min의 공급 속도로 진공 하에서 도입된다. 침투 선은 1.9 mL/min의 유량을 유지하기 위해 고정된다. 일단 정용여과가 완료되면, LNPs는 농축되고 멸균된 DNase RNase 자유 수집관에서 수집되고 투약의 날까지 PBS 제형에 대하여 4℃, 또는 TSS (즉, 트리스, 수크로스, 및 염) 제형에 대하여 4℃ 또는 -80℃에서 저장된다.
LNPs는 1.0 및 2 mg/kg으로 마우스에 투여되었다 (냉동된 제형은 투여 1 시간에 앞서 25℃에서 해동되었다). 도 35는 마우스 혈청 TTR 농도 수준을 보여주고, 한편 도 36은 상이한 제형으로 투약 후 마우스 간 TTR 편집 수준을 보여준다.
Figure 112018119969413-pct00025
실시예 18 고등 종에 LNPs의 전달.
제형은 실시예 14에서 기재된 것에 유사하게 제조되었다. 특정 실험에서, sgRNA는 sg282에서처럼 동일한 화학적 변형으로, 그러나 랫트 TTR 서열에 특이적인 표적 서열로 변형되었다. 랫트 간에서 효율적인 편집은 관측되었다. 2 mg/kg (총 전달대상물) 용량 및 5 mg/kg (총 전달대상물) 용량은 실험에서 널리 용인되었다. GFP를 인코딩하는 mRNA를 함유하는 유사한 제형은 1 mg/kg 및 3 mg/kg의 용량으로 비-인간 영장류에 의해 또한 널리-용인되었다.
서열
상기 예에서 기재된 서열은 아래와 같이 열거된다 (5'부터 3'까지 폴리뉴클레오타이드 서열):
Cas9 mRNA (볼드체로 Cas9 코딩 서열; 밑줄친 볼드체로 HA 태그; 밑줄친 2xNLS):
Figure 112018119969413-pct00026
표 11에서 참조된 그리고 실시예 17에서 사용된 'Cas9 lx NLS, HA 태그 없음':
trOO1 (trRNA):
cr002 (FVII을 표적하는 crRNA; 밑줄친 표적 서열):
sgO11 (FVII을 표적하는 sgRNA; 밑줄친 표적 서열):
cr003 (TTR을 표적하는 crRNA; 밑줄친 표적 서열):
sg006 (IVT로 만들어진 TTR을 표적하는 sgRNA; 밑줄친 표적 서열):
sg003 (TTR을 표적하는 sgRNA; 밑줄친 표적 서열):
sg007 (FVII을 표적하는 sgRNA; 밑줄친 표적 서열):
sg002 (FVII을 표적하는 sgRNA; 밑줄친 표적 서열):
sg004 (TTR을 표적하는 sgRNA; 밑줄친 표적 서열):
sg005 (TTR을 표적하는 sgRNA; 밑줄친 표적 서열):
* = 포스포로티오에이트 연결기
m = 2'OMe
tr002 (trRNA):
cr004 (FVII을 표적하는 crRNA; 밑줄친 표적 서열):
cr005 (TTR을 표적하는 crRNA; 밑줄친 표적 서열):
sg008 (FVII을 표적하는 sgRNA; 밑줄친 표적 서열):
sg009 (TTR을 표적하는 sgRNA; 밑줄친 표적 서열):
sgO1O (FVII을 표적하는 sgRNA; 밑줄친 표적 서열):
sg002 (FVII을 표적하는 sgRNA; 밑줄친 표적 서열):
sgO11 (TTR을 표적하는 sgRNA; 밑줄친 표적 서열):
sg012 (TTR을 표적하는 sgRNA; 밑줄친 표적 서열):
ecOO1 (발현 카셋트 - TTR을 표적하는 sgRNA 발현용 엠플리콘; 볼드체로 U6 프로모터, 밑줄친 표적 서열; 작제물은 각각의 5' 말단에서 역전된 디데옥시 T를 함유한다):
crOO1에 의해 표적된 FVII 표적 부위의 NGS 분석용 프라이머 쌍:
정방향:
역방향:
cr002 및 sgOO1에 의해 표적된 FVII 표적 부위의 NGS 분석용 프라이머 쌍:
정방향:
역방향:
sg002에 의해 표적된 FVII 표적 부위의 NGS 분석용 프라이머 쌍:
역방향:
cr003 및 sg003에 의해 표적된 TTR 표적 부위의 NGS 분석용 프라이머 쌍:
정방향:
역방향:
sg004에 의해 표적된 TTR 표적 부위의 NGS 분석용 프라이머 쌍:
정방향:
역방향:
sg005에 의해 표적된 TTR 표적 부위의 NGS 분석용 프라이머 쌍:
정방향:
역방향:
sg004 발현 카셋트의 PCR 증폭용 프라이머 쌍:
/5InvddT/ = 역전된 디데옥시T
정방향:
/5 InvddT/GCTGCAAGGCGATTAAGTTG
역방향:
/5InvddT/TAGCTCACTCATTAGGCACC
Figure 112018119969413-pct00067
Figure 112018119969413-pct00068
Figure 112018119969413-pct00069
Figure 112018119969413-pct00070
Figure 112018119969413-pct00071
Figure 112018119969413-pct00072
Figure 112018119969413-pct00073
Figure 112018119969413-pct00074
Figure 112018119969413-pct00075

Claims (136)

  1. 지질 나노입자(LNP) 조성물이며, 상기 조성물은
    Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA;
    가이드 RNA 핵산; 및
    이온화가능한 지질;
    콜레스테롤, 5-헵타데실레조르시놀 및 콜레스테롤 헤미석시네이트로부터 선택되는 헬퍼 지질;
    디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPE)으로부터 선택되는 중성 지질; 및
    지질 모이어티에 연결된 친수성 헤드 기를 갖는 지질인 스텔스 지질을 포함하는,
    복수의 성분 지질
    을 포함하고,
    여기서 이온화가능한 지질은
    지질 A [(9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필옥타데카-9,12-디에노에이트]; 및
    지질 B [((5-((디메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-디일)비스(데카노에이트)]로부터 선택되고;
    여기서 성분 지질은 30 mol-% 내지 60 mol-%의 이온화가능한 지질, 30 mol-% 내지 60 mol-%의 헬퍼 지질, 1 mol-% 내지 20 mol-%의 중성 지질, 및 1 mol-% 내지 10 mol-%의 스텔스 지질을 포함하는 것인,
    LNP 조성물.
  2. 제1항에 있어서, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA가 부류 2 Cas 뉴클레아제 mRNA이고, 가이드 RNA 핵산이 단일-가이드 RNA(sgRNA)이거나 sgRNA를 인코딩하는 것인, LNP 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 가이드 RNA 핵산이 sgRNA인, LNP 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 간 세포에서 시험관내 유전자 편집에 사용하기 위한, LNP 조성물.
  5. 제1항에 있어서, LNP 조성물이 제1 LNP 및 제2 LNP를 포함하고, mRNA가 제1 LNP에 캡슐화되고, 가이드 RNA 핵산이 제2 LNP에 캡슐화되는, LNP 조성물.
  6. 제1항에 있어서, mRNA 및 가이드 RNA 핵산이 LNP 조성물에 공동-캡슐화되는, LNP 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 템플레이트 핵산을 추가로 포함하는, LNP 조성물.
  8. 제1항에 있어서, mRNA가 Cas9 뉴클레아제 mRNA인, LNP 조성물.
  9. 제8항에 있어서, Cas9 뉴클레아제 mRNA가 인간 코돈-최적화된 Cas9 뉴클레아제인, LNP 조성물
  10. 제1항에 있어서, 가이드 RNA 핵산이 가이드 RNA를 인코딩하는 발현 카셋트인, LNP 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 이온화가능한 지질이 지질 B인, LNP 조성물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 이온화가능한 지질이 지질 A인, LNP 조성물.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 헬퍼 지질이 콜레스테롤인, LNP 조성물.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 중성 지질이 DSPC인, LNP 조성물.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 스텔스 지질의 친수성 헤드 기는 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEG), 폴리(옥사졸린), 폴리(비닐 알코올), 폴리(글리세롤), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리아미노산, 및 폴리[N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드]로부터 선택된 폴리머 모이어티를 포함하고; 스텔스 지질의 지질 모이어티는 4 내지 40개의 포화된 또는 불포화된 탄소 원자를 독립적으로 포함하는 알킬 사슬을 갖는 디알킬글리세롤 또는 디알킬글리카미드 기를 포함하는, LNP 조성물.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 스텔스 지질의 친수성 헤드 기는 PEG 2000 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는, LNP 조성물.
  17. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 스텔스 지질이 PEG2k-DMG 및 PEG2k-C11로부터 선택되는, LNP 조성물.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 LNP가 지질 A, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG를 포함하는, LNP 조성물.
  19. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 LNP가 지질 B, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG를 포함하는, LNP 조성물.
  20. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, LNP 조성물이 42 mol-% 내지 47 mol-%의 이온화가능한 지질, 41 mol-% 내지 46 mol-%의 헬퍼 지질, 5 mol-% 내지 15 mol-%의 중성 지질, 및 1 mol-% 내지 5 mol-%의 스텔스 지질을 포함하는 것인, LNP 조성물.
  21. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, LNP 조성물이 45 mol-%의 이온화가능한 지질, 44 mol-%의 헬퍼 지질, 9 mol-%의 중성 지질, 및 2 mol-%의 스텔스 지질을 포함하는 것인, LNP 조성물.
  22. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, LNP 조성물이 42 mol-% 내지 47 mol-%의 지질 A 또는 지질 B; 7 mol-% 내지 12 mol-%의 DSPC; 41 mol-% 내지 46 mol-%의 콜레스테롤; 및 1 mol-% 내지 3 mol-%의 스텔스 지질을 포함하고, 여기서 스텔스 지질의 친수성 헤드 기는 PEG 2000 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것인, LNP 조성물.
  23. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 이온화가능한 지질이 아민을 포함하고, 이온화가능한 지질 아민 대 RNA 포스페이트의 몰비가 3 내지 5의 범위인, LNP 조성물.
  24. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, LNP가 75 nm 내지 150 nm의 입자 크기를 갖는, LNP 조성물.
  25. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, LNP 조성물의 캡슐화 효율이 70% 내지 100%인, LNP 조성물.
  26. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 간 세포에서 시험관내 유전자의 발현 변경 방법에 사용하기 위한, LNP 조성물.
  27. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 LNP 조성물과 간 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 간 세포의 시험관내 유전자 편집 방법.
  28. 제27항에 있어서, 방법이 간 세포에서의 유전자 편집 방법이고, LNP 조성물과 간 세포를 접촉시키는 것이 LNP 조성물을 간 세포에 전달하는 것을 포함하는, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 간 세포가 간세포(hepatocyte)인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 간 세포가 줄기 세포인, 방법.
  31. 제27항에 있어서, 방법이 적어도 80% 편집 효율을 달성하는, 방법.
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