KR20230150852A - 게놈 편집 구형 핵산 (sna) 개발 전략 - Google Patents

게놈 편집 구형 핵산 (sna) 개발 전략 Download PDF

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KR20230150852A
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차드 에이. 미르킨
이삭 라킨
치 후앙
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노쓰웨스턴유니버시티
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Abstract

구형 핵산 (SNA)은 이의 화학적으로 조정 가능한 구조, 생체적합성, 및 형질감염 시약 없이 세포에 빠르게 들어갈 수 있는 능력으로 인해 치료적 전달을 위한 매력적인 플랫폼이다. 본 개시내용은 유전자 편집 단백질을 세포 내로 전달하기 위한 SNA 및 전략을 제공한다. 전달된 유전자 편집 단백질은 효소 활성을 유지하고 빠르게 포유동물 세포에 진입한다.

Description

게놈 편집 구형 핵산 (SNA) 개발 전략
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 2월 26에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/154,530, 2021년 10월 28일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/273,086, 및 2021년 12월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/290,522의 35 U.S.C. §119(e)에 따른 우선권 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
정부 이해 진술서
본 발명은 미연방수사국 (FBI)가 수여한 승인 번호 DJF-15-1200-K-0001730 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
전자적으로 출원된 자료를 참조하여 포함
본 출원은 개시내용의 별도의 부분으로서 전체가 참고로 포함되고 다음과 같이 식별되는 컴퓨터 판독 가능 형태의 서열 목록을 포함한다: 파일명: 2021-043R_Seqlisting.txt; 크기: 61,129 바이트; 생성일: 2022년 2월 25일.
게놈 편집은 특정 DNA 서열의 제거 또는 삽입을 지칭한다. 게놈 편집 단백질의 구성원 중에서, CRISPR/Cas9 (규칙적으로 간격을 두고 배치된 짧은 회문형 반복, 및 CRISPR-관련 단백질 9) 단백질은 특이성과 다양성으로 인해 임상 번역을 위한 게놈을 편집하고 조절하는 효율적인 게놈 편집 도구로 활용되었다 [P. Horvath, R. Barrangou, Science 2010, 327, 167 - 170]. Cas9 효소의 상당한 성과가 이루어졌지만, 표적외 효과의 감소와 Cas9-단일 가이드 RNA (sgRNA) 복합체의 효율적이고 직접적인 형질도입이 여전히 매우 바람직하다 [L. Y. Chou, K. Ming, W. C. Chan, Chem. Soc. Rev. 2011, 40, 233 - 245; V. Biju, Chem. Soc. Rev. 2014, 43, 744 - 764; Y. Lu, A. A. Aimetti, R. Langer, Z. Gu, Nat. Rev. Mater. 2017, 2, 16075].
규칙적으로 간격을 두고 배치된 짧은 회문형 반복 (CRISPR)/CRISPR 관련 (Cas) 단백질 및 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)와 같은 신속하게 프로그래밍 가능한 뉴클레아제는 광범위한 유전 질환을 치료할 수 있는 잠재력이 있지만 [Gupta et al., J Clin Invest. 124(10): 4154-4161 (2014); Hsu et al., Cell 157(6): 1262-1278 (2014)], 포유동물 세포로의 효율적인 전달은 여전히 과제로 남아 있다.
표적외 효과 및 유전자 편집 단백질의 효율적인 전달을 포함한 게놈 편집의 현재 한계를 해결하기 위해, 양이온성 리포솜, 양이온성 중합체 및 무기 나노입자와 같은 다양한 비바이러스 전달 시스템이 Cas9-sgRNA 복합체의 전달을 안정화하고 향상시키기 위해 설계되고 사용되었다 [Y. Fu, J. A. Foden, C. Khayter, M. L. Maeder, D. Reyon, J. K. Joung, J. D. Sander, Nat. Biotechnol. 2013, 31, 822 - 826; J. G. Doench, N. Fusi, M. Sullender, M. Hegde, E. W. Vaimberg, K. F. Donovan, I. Smith, Z. Tothova, C. Wilen, R. Orchard, H. W. Virgin, J. Listgarten, D. E. Root, Nat. Biotechnol. 2016, 34, 184 - 191; B. P. Kleinstiver, V. Pattanayak, M. S. Prew, S. Q. Tsai, N. T. Nguyen, Z. Zheng, J. K. Joung, Nature 2016, 529, 490 - 495; I. M. Slaymaker, L. Gao, B. Zetsche, D. A. Scott, W. X. Yan, F. Zhang, Science 2016, 351, 84 - 88]. 그러나 이러한 담체의 복잡한 설계, 방출 효율성, 잠재적인 독성 및 면역원성 부작용으로 인해 신속한 임상 적용이 방해를 받는다. 바이러스 시스템은 생체 내에서 세포를 변환하는 첫 번째 수단으로 사용되었다. 이러한 시스템은 포장 제약, 면역원성 및 Cas 발현의 수명과 관련된 문제로 인해 표적 외 이벤트를 선호한다. 따라서 바이러스 벡터는 CRISPR/Cas의 생체 내 직접 전달을 위한 최선의 선택이 아니다. 본 개시내용은 나노입자 코어에 부착된 올리고뉴클레오티드의 쉘을 포함하는 구형 핵산, 및 유전자 편집 단백질의 전달에서의 그의 용도에 관한 것이다.
따라서, 일부 양태에서 본 개시내용은 (a) 유전자 편집 단백질을 포함하는 단백질 코어; 및 (b) 단백질 코어에 부착된 올리고뉴클레오티드의 쉘을 포함하는 단백질 코어 구형 핵산 (ProSNA)을 제공한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 쉘 내의 각각의 올리고뉴클레오티드는 단백질 코어에 공유적으로 부착된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 쉘 내의 각각의 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 단백질 코어에 부착된다. 추가 구현예에서, 링커는 절단 가능한 링커, 절단 불가능한 링커, 미량 링커, 또는 이들의 조합이다. 추가 구현예에서, 링커는 카바메이트 알킬렌 디티올레이트 링커이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 단백질-코어-NH-C(O)-O-C2-5알킬렌-S-S-C2-7알킬렌-올리고뉴클레오티드, 또는 단백질-코어-NH-C(O)-O-CH2-Ar-S-S-C2-7알킬렌-올리고뉴클레오티드를 포함하고, 그리고 Ar은 메타- 또는 파라-치환된 페닐을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 단백질-코어-NH-C(O)-O-C(ZA)(ZB)C1-4알킬렌-C(XA)(XB)-S-S-C(YA)(YB)C1-6알킬렌-올리고뉴클레오티드를 포함하고, 그리고 ZA, ZB, XA, XB, YA, 및 YB는 각각 독립적으로 H, Me, Et, 또는 iPr이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 단백질-코어-NH-C(O)-O-C(XA)(XB)-Ar-S-S-C(YA)(YB)C2-6알킬렌-올리고뉴클레오티드를 포함하고, 그리고 XA, XB, YA, 및 YB는 각각 독립적으로 H, Me, Et, 또는 iPr이다. 일부 구현예에서, 링커는 아미드 알킬렌 디티올레이트 링커이다. 추가 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 백질-코어-NH-C(O)- C2-5알킬렌-S-S-C2-7알킬렌-올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 단백질-코어-NH-C(O)- C1-4알킬렌-C(XA)(XB)-S-S-C(YA)(YB)C1-6알킬렌-올리고뉴클레오티드를 포함하고, 그리고 XA, XB, YA 및 YB는 각각 독립적으로 H, Me, Et, 또는 iPr이다. 일부 구현예에서, 링커는 아미드 알킬렌 티오에테르 링커이다. 추가 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 단백질-코어-NH-C(O)- C2-4알킬렌-N-숙신이미딜-S-C2-6알킬렌-올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 (a) 나노입자 코어; (b) 나노입자 코어의 외부 표면에 부착된 올리고뉴클레오티드의 쉘; 및 (c) 유전자 편집 단백질을 포함하는 구형 핵산 (SNA)을 제공한다. 일부 구현예에서, 나노입자 코어는 리포좀 코어 또는 지질 나노입자 코어이다. 추가 구현예에서, 상기 지질 나노입자 코어는 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤, 및 지질-폴리에틸렌 글리콜 (지질-PEG) 접합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 쉘 내의 각각의 올리고뉴클레오티드는 지질-PEG 접합체를 통해 지질 나노입자 코어의 외부에 공유적으로 부착된다. 일부 구현예에서, 상기 유전자 편집 단백질은 지질 나노입자 코어에서 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 ProSNA는 지질 나노입자 코어에서 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 리보핵단백질 (RNP) 복합체는 지질 나노입자 코어에서 캡슐화되고, RNP는 유전자 편집 단백질, 규칙적으로 간격을 두고 배치된 짧은 회문형 반복 (CRISPR) RNA (crRNA), 및 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 리포솜 코어는 복수의 지질 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유전자 편집 단백질은 리포솜 코어에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 ProSNA는 리포솜 나노입자 코어에서 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 리보핵단백질 (RNP) 복합체는 지질 나노입자 코어에서 캡슐화되며, RNP는 유전자 편집 단백질, CRISPR RNA (crRNA), 및 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 지질 기는 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 및 포스파티딜에탄올아민 계열의 지질로 이루어진 군으로부터 선택된 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-디미리스토일-sn-포스파티딜콜린 (DMPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-포스파티딜콜린 (POPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DSPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DOPG), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 및 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 지질 앵커 그룹을 통해 리포솜 또는 지질 나노입자 코어의 외부에 부착된다. 일부 구현예에서, 상기 지질 앵커 그룹은 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 부착된다. 추가 구현예에서, 지질 앵커 그룹은 토코페롤 또는 콜레스테롤이다. 일부 구현예에서, 상기 유전자 편집 단백질은 CRISPR-관련 단백질 (Cas)이다. 추가 구현예에서, 상기 Cas는 Cas9, Cas12, Cas13, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 디벤조시클로옥틸 (DBCO)로 변형된다. 일부 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘은 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 RNA, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 변형된 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘은 약 2 내지 약 100개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 추가 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘은 약 10 내지 약 80개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘은 약 5 내지 약 50개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 추가 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘은 약 5 내지 약 20개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 추가 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘은 약 14개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘은 약 15개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 각각의 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 100 뉴클레오티드 길이이다. 추가 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 각각의 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 약 50 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 (GGX)n 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 n은 2-20이고 X는 핵염기 (A, C, T, G, 또는 U)이다. 일부 구현예에서, 상기 (GGX)n 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 (GGX)n 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 존재한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 (GGT)n 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 n은 2-20이다. 일부 구현예에서, 상기 (GGT)n 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 존재한다. 일부 구현예에서, (GGT)n 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 존재한다. 일부 구현예에서, ProSNA 또는 SNA의 직경은 약 1 나노미터 (nm) 내지 약 500 nm이다. 일부 구현예에서, SNA의 직경은 내지 약 50 나노미터 이하이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 표적화 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘은 억제성 올리고뉴클레오티드, 면역자극 올리고뉴클레오티드, 유전자 편집기 기질 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 조합을 포함한다. 추가 구현예에서, 억제성 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 소형 간섭 RNA (siRNA), 압타머, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), DNA자임, 또는 압타자임이다. 일부 구현예에서, 면역자극 올리고뉴클레오티드는 CpG-모티프 함유 올리고뉴클레오티드, 이중 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드, 또는 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드이다. 추가 구현예에서, 각각의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 톨-유사 수용체 (TLR) 작용제. 추가 구현예에서, TLR은 톨-유사 수용체 1 (TLR1), 톨-유사 수용체 2 (TLR2), 톨-유사 수용체 3 (TLR3), 톨-유사 수용체 4 (TLR4), 톨-유사 수용체 5 (TLR5), 톨-유사 수용체 6 (TLR6), 톨-유사 수용체 7 (TLR7), 톨-유사 수용체 8 (TLR8), 톨-유사 수용체 9 (TLR9), 톨-유사 수용체 10 (TLR10), 톨-유사 수용체 11 (TLR11), 톨-유사 수용체 12 (TLR12), 및 톨-유사 수용체 13 (TLR13)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 다수의 단백질-코어 구형 핵산 (ProSNA)을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 가이드 RNA를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, ProSNA 중 적어도 2개는 상이한 단백질 코어를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 다수의 구형 핵산 (SNA)을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, SNA 중 적어도 2개는 상이한 나노입자 코어를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 세포를 본 개시내용의 ProSNA와 접촉시키는 것을 포함하는 세포에 유전자 편집 단백질을 전달하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 세포를 본 개시내용의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 세포에 유전자 편집 단백질을 전달하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 세포를 본 개시내용의 SNA와 접촉시키는 것을 포함하는 세포에 유전자 편집 단백질을 전달하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 세포에 유전자 편집 단백질을 전달하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 유효량의 (i) 본 개시내용의 ProSNA, (ii) 본 개시내용의 SNA, (iii) 본 개시내용의 조성물, 또는 (iv) 이들의 조합을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 장애를 치료, 개선, 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 장애는 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환, 유전 질환, 심혈관 질환, 또는 이들의 조합이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 다음과 같이 N-말단에서 C-말단으로 배열된 다음을 포함하는 융합 단백질을 제공한다: (i) 하나 이상의 GALA 펩티드; (ii) 유전자 편집 단백질, 및 (iii) 핵 국소화 신호 (NLS). 일부 구현예에서, 하나 이상의 GALA 펩티드는 3개의 연속적인 GALA 펩티드를 포함한다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 GALA 펩티드 각각은 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 GALA 펩티드는 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 단백질은 CRISPR-관련 단백질 (Cas)이다. 추가 구현예에서, 상기 Cas는 Cas9, Cas12, Cas13, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 상기 Cas9은 서열 번호 1 또는 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 상기 Cas12는 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 상기 Cas13은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 다양한 구현예에서, 상기 NLS는 서열 번호 23 또는 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 ProSNA를 제공하며, 여기서 유전자 편집 단백질은 본 개시내용의 융합 단백질이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 SNA를 제공하며, 여기서 유전자 편집 단백질은 본 개시내용의 융합 단백질이다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 세포를 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는 세포에 유전자 편집 단백질을 전달하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 융합 단백질을 포함하는 본 개시내용의 조성물과 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 세포에 유전자 편집 단백질을 전달하는 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 대상체에 유효량의 (i) 본 개시내용의 융합 단백질, (ii) 융합 단백질을 포함하는 본 개시내용의 조성물, 또는 (iii) 이들의 조합을 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 장애를 치료, 개선, 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 장애는 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환, 유전 질환, 심혈관 질환, 또는 이들의 조합이다.
도 1은 CRISPR-SNA 합성의 개략도이다. 농축된 Cas9 RNP는 리포솜에 캡슐화되고, 대부분의 캡슐화되지 않은 RNP는 SEC를 통해 제거되고, 리포솜은 다분산도를 줄이기 위해 압출되었으며, DBCO-DNA는 DNA로 리포솜을 기능화하기 위해 추가되고, 리포솜은 단백질분해효소 K와 함께 배양되어 남은 캡슐화되지 않은 Cas9를 소화하고, 마지막으로 소화된 Cas9은 SEC를 통해 제거된다.
도 2는 다음을 보여준다: (A) DNA 기능화 및 세척 후 CRISPR SNA의 DLS. (B) SNA 샘플을 사용한 Cy3-DNA 형광의 표준 곡선 (절반으로 희석). (C) B에서 얻은 DNA 농도를 보정한 후 표준 곡선 (파란색), SNA 샘플 (빨간색), 및 SNA 샘플을 포함하는 CRISPR SNA 샘플에서 인 (그리고 따라서 인지질) 농도의 ICP-OES 정량화. SNA 농도는 방정식 1을 사용하여 계산된다. (D) 선형 맞춤으로 플롯팅된 SNA 샘플 (파란색)을 사용한 Alexa647-RNP 형광의 표준 곡선.
도 3은 SNA 합성 과정 전반에 걸쳐 RNP가 활성 상태를 유지함을 보여준다. (A) 시험관 내 Cas9 활성 테스트의 개략도. (B) 신선한 Cas9 RNP (B1), Alexa 염료로 변형된 Cas9 RNP (B2), Amicon 10K 필터로 농축한 다음 (B3), 7주기의 동결/해동/초음파 처리 (B4), Sepharose 6b SEC 컬럼을 통과한 다음 (B5), 0.2 μM 및 0.1 μM PES 막을 통해3X 압출 (B6)의 활성 테스트.
도 4는 CRISPR-SNA가 활성 RNP를 프로테아제로부터 보호하여 캡슐화를 나타냄을 보여준다. (A) 빈 SNA와 Alexa-RNP (상단) 또는 CRISPR SNA와 캡슐화된 Alexa-RNP (하단)의 혼합물로 단백질분해효소 K를 배양한 후 Superdex 200 컬럼에서 수집된 크기 배제 분획. Cy3 (DNA) 형광은 빨간색으로, Alexa647 (Cas9) 형광은 파란색으로, Cy3 및 Cas9 형광의 공동 국소화는 분홍색으로 표시된다. (B) 시험관 내 Cas9 활성 테스트는 Cas9 없이 (1); 신선한 Cas9은 단백질분해효소 K 없이 (2) 및 단백질분해효소 K가 있는 (3); Alexa-변형된 Cas9는 단백질분해효소 K 없이 (4) 및 단백질분해효소 K가 있는 (5); CRISPR 리포좀은 단백질분해효소 K가 없이 (6), 및 단백질분해효소 K가 있는 (7); Tween 20으로 리포솜을 파괴한 후 첨가된 단백질분해효소 K가 있는 (8); 및 마지막으로, CRISPR SNA는 단백질분해효소 K가 없이 (9), 및 단백질분해효소 K가 있는 (10), 및 Tween 20으로 리포솜을 파괴한 후 첨가된 단백질분해효소 K가 있는 (11) 상태로 실행되었다.
도 5는 CRISPR-SNA가 포유류 세포에 적극적으로 흡수되는 것을 보여준다. 각 샘플의 Alexa RNP 5 피코몰 상당액을 C166-GFP 세포와 함께 16시간 동안 배양한 후, Alexa 647 형광을 알로피코시아닌 (APC) 여기 및 방출 필터에서 측정했다. 미처리 세포에 대한 Alexa-RNP 형광 (빨간색, 빈 리포솜 구형 핵산 (LSNA)와 중첩, 빈 Cy3 변형 LSNA (밝은 녹색), 리포솜에 캡슐화된 RNP (주황색), RNAiMax, 및 마지막으로 CRISPR SNA로 형질감염된 Alexa-RNP (진한 녹색)의 히스토그램.
도 6은 ProSNA (빨간색 점선) Cas9의 구조 특성을 보여준다. (A) Cas9 SNA의 TEM 특성화. (B) 및 (C) 변형되지 않은 Cas9, Cas9 AF647, Cas9 아지드 및 Cas9 SNA의 변성 겔 전기영동 및 제타 전위. (D) AlexaFluor 647 및 DNA를 사용하여 Cas9의 기능화를 정량화하는 데 사용된 UV-Vis 흡광도 스펙트럼.
도 7은 생체 적합성과 세포 흡수를 입증하는 세포 실험 결과를 보여준다. (a) 48시간 동안 Cas9 SNA로 처리된 HaCat, HEK 293T, hMSC, 또는 Raw 264.7 세포의 세포 생존율; (b) 유세포 분석으로 측정한 Cas9 (흰색) 및 Cas9 SNA (검은색)의 세포 흡수.
도 8은 Cas9 SNA의 HEK293T/EGFP 세포 게놈 편집을 보여준다. (a) DNase I 과민성 부위, (b) GRIN2B 및 (c) EGFP의 측량 분석. d) Cas9 SNA로 처리된 HEK293T/EGFP 세포의 유세포 분석.
도 9는 N-말단에서 GALA 엔도솜과 융합된 GeoCas9 엔지니어링의 개략도를 보여준다.
도 10은 (a) 260 nm 및 (b) 280 nm에서 GeoCas9의 정량적 몰 흡광 계수를 보여준다. 몰 흡광 계수는 Pierce 비신코닌산 검정으로 결정되었으며 GeoCas9 및 Cas9 SNA의 농도를 정량화하는데 사용되었다.
도 11은 Cas9-AF647을 제조하는 데 사용된 Alexa Fluor™ 647 NHS 에스테르 (AF647)의 구조를 보여준다.
도 12는 AF-647 형광단 변형 Cas9의 UV-Vis 스펙트럼을 보여준다. 분광학은 Cary5000 분광광도계를 사용하여 주변 온도에서 측정되었다. 단백질 및 AF647 농도는 각각, 650 nm 및 280 nm에서의 흡광도로부터 계산되었다. AF647 형광단은 DNA 변형 후 단백질의 농도를 계산하고 유세포 분석 및 공초점 이미징 실험에서 단백질 흡수를 추적하는 데 사용되었다. 삽도: Cas9 당 형광단의 계산 세부정보.
도 13은 아지드 말단 Cas9 (Cas9-AF647-아지드)를 제조하는데 사용되는 NHS-PEG4-아지드 링커의 구조를 보여준다.
도 14는 비변형 Cas9-AF647 (파란색) 및 Cas9-AF647-아지드 (빨간색)의 MALDI-MS 스펙트럼을 보여준다. 단백질당 NHS-PEG4-아지드의 수를 계산하기 위해, MALDI-MS를 사용하여 비변형 단백질과 아지드 변형된 단백질 사이의 질량 차이를 결정했다. 각 링커 접합은 275 m/z의 질량 증가로 이어진다.
도 15는 UV-Vis 스펙트럼을 사용하여 Cas9 ProSNA의 DNA 가닥 수를 측정한 결과를 보여준다. 스펙트럼은 Cary5000 분광광도계로 측정되었다. 단백질 및 DNA 농도는 각각 650 nm 및 260 nm에서의 흡광도로부터 계산되었다. 삽도: Cas9 당 DNA 계산 세부정보.
도 16은 (a) Cas9 SNA (b) 및 Cas9-AF647-아지드의 FPLC 크기 배제 크로마토그램 (SEC) 분석을 보여준다. 실선은 650 nm에서의 소멸에 해당하고, 점선은 260 nm에 해당한다. 모든 샘플은 4℃에서 1mL/분의 유속으로 SEC650 컬럼 (Bio-Rad)에서 실행되었다.
도 17은 트립신 (프로테아제)과 함께 배양된 (a) Cas9 및 (b) Cas9 ProSNA의 SDS-PAGE 겔 생체안정성 분석을 보여주며, Cas9는 1시간의 시간 경과에 따라 분해되는 반면 (Cas9 단백질 밴드의 소멸로 입증됨), Cas9 ProSNA는 그대로 유지되었음을 보여준다.
도 18은 HaCat 세포에서 Cas9 ProSNA의 생존 및 사멸 분석을 통한 세포 생존율 측정을 보여준다. 살아있는 세포는 칼슘 AM으로 염색되었고, 죽은 세포는 요오드화 프로피듐 (PI)으로 염색되었다. 형광 현미경으로 측정한 결과 Cas9 단백질 처리 후 유의미한 세포 독성은 관찰되지 않았다. 스케일 바: 300 μm.
도 19는 HaCat 세포에서 AF647 변형 Cas9 ProSNA 및 천연 Cas9의 세포 흡수를 묘사하는 흐름 히스토그램을 보여준다. 20 nM 단백질로 4시간 처리한 후 HaCat 세포에서 Cas9 ProSNA 또는 천연 단백질의 흡수를 측정하기 위해 유세포 측정법을 사용했다.
도 20은 서로 다른 시점에서 Cas9-AF647 및 Cas9 ProSNA로 처리된 HaCat 세포의 핵 도입 효율 결과를 보여주며, Cas9 ProSNA의 향상된 핵 도입을 보여준다.
도 21은 이중 가닥 파손으로 인한 미세 삽입 및 결실의 검출을 위한 SURVEYOR 검정을 보여준다. Cas9 매개 절단 효율을 결정하는 데 사용되는 SURVEYOR 검정의 개략도. 첫째, 게놈 PCR (gPCR)을 사용하여 변형 및 비변형 세포의 이종 집단으로부터 Cas9 표적 영역을 증폭시키고, gPCR 생성물을 천천히 재혼성화하여 이종이중체를 생성한다. 재어닐링된 이종이중체는 T7EI 뉴클레아제에 의해 절단되는 반면, 동종이중체는 그대로 남아 있다. Cas9-매개 절단 효율 (% 인델)은 절단된 DNA의 분율을 기준으로 계산된다.
도 22는 게놈 편집 분석을 보여준다. Cas9 단백질, 또는 Cas9 ProSNA로 처리된 HEK293T/EGFP 세포의 유세포 분석 히스토그램 결과.
도 23은 표면 반응성 리신 화학이 Cas9에 대한 DNA 접합을 가능하게 함을 보여준다.
도 24는 Cas9의 구조가 DNA 기능화 후에도 유지되었음을 보여준다.
도 25는 Cas9 ProSNA가 프로테아제 분해에 대해 향상된 안정성을 입증했음을 보여준다.
도 26은 Cas9 ProSNA와 함께 배양된 세포가 HaCaT, HEK293T, hMSC, 및 RAW 264.7 세포를 포함하는 여러 세포 유형에서 높은 세포 생존율을 나타냄을 보여준다.
도 27은 AlexaFluor 647 형광에 의해 관찰된 바와 같이 Cas9 ProSNA로 처리된 세포에 의한 향상된 세포 흡수를 보여준다.
도 28은 유전자 편집 단백질의 세포 전달에 대한 장벽 및 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 융합 단백질)을 포함하는 SNA에 의해 제공되는 이점을 보여준다.
도 29는 GALA 및 NLS와 융합된 Cas9 SNA가 상당한 엔도솜 탈출 및 핵 도입 효율을 입증했음을 보여준다.
도 30은 Cas9 ProSNA가 HaCaT 및 hMSC 세포에서 대조군 Cas9 단백질과 비교하여 삽입 및 결실 모두에 대해 높은 유전자 편집 효율을 달성했음을 보여준다.
도 31 은 대식세포 유사 RAW264.7 세포에서 Cas9 ProSNA의 편집 효율을 입증한다. Cas9 ProSNA는 대조군 Cas9 단백질 및 상업용 형질감염 시약과 비교하여 유전자 편집 활성이 증가한 것으로 나타났다.
도 32는 HEK293T 세포에서 Cas9 ProSNA의 유전자 침묵 활성을 입증한다. Cas9 ProSNA는 대조군 Cas9 단백질과 비교하여 GFP의 녹다운이 증가한 것으로 나타났다.
구형 핵산 (SNA)은 교환 가능한 나노입자 코어를 둘러싸는 조밀한 올리고뉴클레오티드 층으로 기능화된 나노입자 종류이다. 이 핵산 쉘은 여러 기능을 부여한다: 올리고뉴클레오티드 코팅은 나노입자 표면의 엔도뉴클레아제 활성을 감소시키는 고농축 염 구름을 형성하고 세포 표면 단백질과 상호작용하여 사실상 모든 세포주에서 세포 흡수가 높아진다. 이러한 고유한 특성의 조합을 통해 SNA는 쉽게 맞춤화할 수 있는 단일 독립체 작용제로 작동할 수 있다.
용어
"부터," "까지," "최대," "적어도," "초과," "미만" 등과 같은 모든 언어는 인용된 숫자가 포함되며 이후에 하위 범위로 분류될 수 있는 범위를 나타낸다.
범위에는 각 개별 구성원이 포함된다. 따라서, 예를 들어, 1~3개의 구성원을 갖는 그룹은 1, 2, 또는 3개의 구성원을 갖는 그룹을 지칭한다. 유사하게, 6개의 구성원을 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4, 또는 6개의 구성원 등을 갖는 그룹을 지칭한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 목적어 중 하나 또는 하나 이상 (예를 들어, 적어도 하나)을 지칭한다.
"약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 특성이나 정밀도를 고려하여 측정된 양에 대해 허용 가능한 오류 정도를 의미한다. 예시적인 오류 정도는 20-25 퍼센트 (%), 예를 들어, 명시된 값 또는 값 범위의 20 퍼센트, 10 퍼센트, 5 퍼센트, 4 퍼센트, 3 퍼센트, 2 퍼센트, 또는 1 퍼센트 이내이다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 본원에서 사용된 바와 같이 상호교환 가능하다.
본원에 사용된 "링커"는 본원에 기재된 바와 같은 단백질 코어 구형 핵산 (ProSNA)의 단백질 코어에 올리고뉴클레오티드를 연결하는 모이어티이다. 본 개시내용의 임의의 양태 또는 구현예에서, 링커는 절단 가능 링커, 비-절단 가능 링커, 미량 링커, 또는 이들의 조합이다.
"대상체"는 척추동물 유기체이다. 대상체는 비인간 포유동물 (예를 들어, 마우스, 랫트, 또는 비인간 영장류)일 수 있거나, 대상체는 인간 대상체일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "투여하는", "투여하다", "투여" 등은 그러한 제제를 사용한 치료가 필요한 대상체에게 치료제를 전송, 전달, 도입 또는 운반하는 모든 방식을 지칭한다. 이러한 방식에는 경구, 국소, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 종양 내, 피내, 비강 내 및 피하 투여가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료하는" 및 "치료"는 비정상적인 흉터와 관련된 증상의 중증도 및/또는 발병의 임의의 감소를 지칭한다. 따라서 "치료하는" 및 "치료"는 치료적 및 예방적 조치를 포함한다. 당업자는 비정상적인 흉터로부터의 어느 정도의 보호 또는 개선이 인간 환자와 같은 대상체에게 유익하다는 것을 이해할 것이다. 환자의 삶의 질은 대상체의 증상 중증도를 어느 정도 감소시키고/시키거나 증상 발현을 지연시킴으로써 개선된다.
본원에 사용된 바와 같이, "표적화 올리고뉴클레오티드"는 SNA를 특정 조직 및/또는 특정 세포 유형으로 지시하는 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 표적화 올리고뉴클레오티드는 압타머이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 SNA는 나노입자 코어의 외부에 부착된 압타머를 포함하며, 여기서 압타머는 특정 세포 유형의 표면에 있는 하나 이상의 수용체에 결합하도록 설계된다.
본원에 사용된 바와 같이, "면역자극 올리고뉴클레오티드"는 면역 반응을 자극 (예를 들어, 유도 또는 향상)할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 면역자극 올리고뉴클레오티드의 전형적인 예는 CpG-모티프 함유 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드, 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드, 및 이중 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드이다. "CpG-모티프"는 시토신-구아닌 디뉴클레오티드 서열이다. 단일 가닥 RNA 서열은 톨-유사 수용체 8 및 9에 의해 인식될 수 있고, 이중 가닥 RNA 서열은 톨-유사 수용체 3에 의해 인식될 수 있고, 이중 가닥 DNA는 톨-유사 수용체 3 및 순환 GMP-AMP 합성효소 (cGAS)에 의해 인식될 수 있다.
용어 "억제성 올리고뉴클레오티드"는 mRNA가 리보솜에서 단백질로 번역되는 것을 방해함으로써 단백질의 생산 또는 발현을 감소시키거나 표적 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 유전자 또는 mRNA에 충분히 상보적인 올리고뉴클레오티드를 지칭하며, 이는 하나 이상의 표적 유전자 또는 mRNA에 특이적으로 결합 (혼성화)하여 표적 단백질의 발현 또는 생물학적 활성을 감소시키는 것이다. 억제성 올리고뉴클레오티드는 단리된 또는 합성 짧은 헤어핀 RNA (shRNA 또는 DNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 안티센스 RNA 또는 DNA, 키메라 안티센스 DNA 또는 RNA), miRNA 및 miRNA 모방체, 소형 간섭 RNA (siRNA), 선천성 면역 수용체의 DNA 또는 RNA 억제제, 압타머, DNA자임, 또는 압타자임을 제한 없이 포함한다.
본 문서에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각 인용된 주제와 관련하여 참조로 포함되어 있으며, 일부 경우에는 문서 전체를 포괄할 수 있다.
유전자 편집 단백질
본 개시내용의 SNA는 하나 이상의 유전자 편집 단백질을 포함한다. 본 개시내용에 의해 고려되는 유전자 편집 단백질은 전사 활성제 유사 이펙터 기반 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제, 뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), CRISPR-관련 단백질, CRISPR/Cas9, Cas9, xCas9, Cas12a (Cpf1), Cas13, Cas13a, Cas14, CasX, CasY, 클래스 1 Cas 단백질, 클래스 2 Cas 단백질, MAD7, 또는 이들의 조합을 제한 없이, 포함한다. 본 개시내용의 임의의 양태 및 구현예에서, 게놈 편집은 표적 유전자의 생산을 억제하거나 감소시키기 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 유전자 발현의 감소 및 그에 따른 생물학적 활성 단백질 발현의 감소는 비-상동 말단 연결 (NHEJ)을 통한 뉴클레오티드의 삽입/결실 또는 조기 정지 코돈 및 비기능성 단백질의 발현을 유도하는 상동성 지정 복구 (HDR)를 통한 적절한 공여자 카세트의 삽입 또는 뉴클레오티드 삽입을 통해 달성될 수 있다.
도 28에 묘사된 바와 같이, 유전자 편집 단백질의 세포 진입에 대한 장벽이 있다. 이러한 장벽에는 유전자 편집 단백질의 내재화 (막 장벽 및 유전자 편집 단백질의 큰 크기로 인해), 유전자 편집 단백질의 핵 흡수를 달성하는 방법, 및 유전자 편집 단백질이 엔도솜을 탈출할 수 있는 방법이 포함된다. 따라서, 본 개시내용의 임의의 양태 또는 구현예에서, 유전자 편집 단백질은 "융합된" 단백질의 일부이다. 이러한 의미에서 용어 "융합된"은 다양한 양태에서, N-말단에서 C-말단으로 순서대로 함께 융합된 다음 요소를 포함하거나 이로 이루어지는 단백질을 지칭한다: (i) 하나 이상의 GALA 펩티드; (ii) 유전자 편집 단백질, 및 (iii) 핵 국소화 신호 (NLS). 일부 양태에서, 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 순서대로 함께 융합된 다음 요소를 포함하거나 이로 이루어진다: (i) 유전자 편집 단백질, 및 (ii) 핵 국소화 신호 (NLS). 융합 단백질의 유전자 편집 부분은 당업계에 공지되어 있고/거나 본원에 기술된 임의의 유전자 편집 단백질, 예를 들어 제한 없이 CRISPR-관련 단백질 (Cas)일 수 있다. 다양한 구현예에서, Cas는 Cas9, Cas12, Cas13, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, Cas9은 Harrington, L.B., Paez-Espino, D., Staahl, B.T. et al. A thermostable Cas9 with increased lifetime in human plasma. Nat Commun 8, 1424 (2017). https://doi.org/10.1038/s41467-017-01408-4에 기술된 바와 같으며, 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다. 일부 구현예에서, Cas9은 서열 번호 1 또는 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, Cas12는 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다 (Strecker J, Jones S, Koopal B, Schmid-Burgk J, Zetsche B, Gao L, Makarova KS, Koonin EV, Zhang F. Nat Commun. 2019 Jan 22;10(1):212. doi: 10.1038/s41467-018-08224-4. 10.1038/s41467-018-08224-4 PubMed 30670702). 일부 구현예에서, Cas13은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다 (Smargon AA, Cox DB, Pyzocha NK, Zheng K, Slaymaker IM, Gootenberg JS, Abudayyeh OA, Essletzbichler P, Shmakov S, Makarova KS, Koonin EV, Zhang F. Mol Cell. 2017 Feb 16;65(4):618-630.e7. doi: 10.1016/j.molcel.2016.12.023. Epub 2017 Jan 5. 10.1016/j.molcel.2016.12.023 PubMed 28065598). GALA 펩티드는 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, Schach et al., J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 38, 12199-12202 참조, 전체 내용이 참조로 본원에 포함됨) 본원에 기재되어 있다. 본 개시내용은 다양한 구현예에서, 융합 단백질은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 GALA 펩티드를 나란히 포함하거나 이로 이루어진다는 것을 고려한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 융합 단백질의 N-말단은 3개의 GALA 펩티드를 나란히 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 융합 단백질의 N-말단은 3개의 GALA 펩티드를 나란히 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 각각의 GALA 펩티드는 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 본 개시내용의 임의의 양태 또는 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질의 C-말단은 NLS 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. NLS 서열은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Cutrona, G., Carpaneto, E., Ulivi, M. et al. Effects in live cells of a c-myc anti-gene PNA linked to a nuclear localization signal. Nat Biotechnol 18, 300-303 (2000). https://doi.org/10.1038/73745 참조, 전체 내용이 참조로 본원에 포함됨). 일부 구현예에서, NLS 서열은 SV40 바이러스 대형 T-항원의 NLS로부터 유래되고 아미노산 서열 PKKKRKV (서열 번호 23)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, NLS는 아미노산 서열 KRTADGSEFESPKKKRKV (서열 번호 28)를 포함하거나 이로 이루어진다. 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용에 의해 제공된 융합 단백질은 본원에 기술된 ProSNA, SNA, 조성물 및/또는 방법 중 어느 것에도 사용될 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용의 ProSNA는 (a) 융합된 단백질을 포함하는 단백질 코어; 및 (b) 단백질 코어에 부착된 올리고뉴클레오티드의 쉘을 포함한다. 추가 양태에서, 본 개시내용은 (a) 나노입자 코어; (b) 나노입자 코어의 외부 표면에 부착된 올리고뉴클레오티드 쉘; 및 (c) 융합된 단백질을 포함하는 SNA를 제공한다.
스트렙토코쿠스 피오게네스 유형 II CRISPR/Cas 시스템을 사용한 시험관 내 연구를 통해 효율적인 CRISPR/Cas-매개 표적 DNA 또는 게놈 변형에 필요한 유일한 구성요소는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 뉴클레아제), CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스 활성화 crRNA (tracrRNA)인 것으로 나타났다. CRISPR/Cas-매개 DNA 절단의 야생형 메커니즘은 여러 단계를 통해 발생한다. 마주친 (또는 표적) DNA의 작은 단편 (20-30개 염기쌍)을 함유하는, CRISPR 어레이의 프리-crRNA로의 전사는 프리-crRNA의 직접 반복을 통해 tracrRNA와의 혼성화를 통해 성숙을 거친다. 가이드 RNA (gRNA 또는 sgRNA)로 알려진 프리-crRNA와 tracrRNA의 혼성화는 Cas 뉴클레아제 형성 리보핵단백질 복합체와 관련되고, 이는 프리-crRNA의 성숙한 crRNA로의 전환을 매개한다. 성숙한 crRNA:tracrRNA 이중체는 Cas9을 숙주 게놈의 crRNA의 스페이서 영역과 프로토스페이서 DNA 사이 이종이중체 형성을 통해 프로토스페이서 및 필수 프로토스페이서 인접 모티프 (CRISPR/cas 프로토스페이서-인접 모티프; PAM)로 이루어진 DNA 표적으로 지시한다. Cas9 뉴클레아제는 PAM의 표적 DNA 업스트림의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내 이중 가닥 절단 또는 돌연변이 Cas9 뉴클레아제를 사용하여 가닥 특이적 닉을 생성하여 하나의 DNA 가닥 특이적 절단 모티프가 돌연변이된다.
따라서, 유전자 편집을 포함하는 다양한 양태에서, SNA (예를 들어, ProSNA, LNP-SNA, LSNA)는 유전자 편집 단백질 외에 DNA 또는 RNA 유전자 편집기 기질 (예를 들어, 가이드 RNA)을 포함하며, 여기서 DNA 또는 RNA 유전자 편집기 기질은 다양한 구현예에서, SNA의 표면에 부착되거나 SNA 내에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 단백질을 포함하는 SNA는 DNA 또는 RNA 유전자 편집기 기질과 별도로 전달된다.
프로그래밍 가능한 핵산 절단에도 적용되는 관련 CRISPR 시스템의 다른 RNA 유도 뉴클레아제는 스타피로코커스 아우레우스 Cas9 (SaCas9), 프레보텔라 또는 프란시셀라 I의 CRISPR (CpfI), 지오바실러스 Cas9 (GeoCas9), 캄필로박터 제주니 Cas9 (CjCas9), 메타게놈학적으로 유래된 CRISPR-CasX 및 CRISPR-CasY, CRISPR-Cas3, 및 RNA를 절단하는 CRISPR-C2c2를 포함한다.
CRISPR/Cas 시스템은 유전자 녹아웃 및 편집 외에 다양한 기능을 수행하도록 수정되었으며, 그 중 세 가지 예가 아래에 설명되어 있다. 촉매적으로 불활성화된 Cas9 (dCas9)은 전사 활성화 및 억제 도메인에 융합되어, 유전자 발현의 프로그래밍 가능한 제어를 가능하게 한다 [Gilbert et al., Cell 154, 442-451 (2013); Zalatan et al., Cell 160, 339-350 (2015)]. 특히 dCas9 전사 활성화제는 siRNA 또는 CRISPR 녹아웃 라이브러리와 유사하지만 유전자가 과발현되는 새로운 스크린을 가능하게 한다 [Gilbert et al., Cell 159, 647-61 (2014)]. 형광 단백질에 융합된 dCas9은 게놈의 특정 부위를 현미경으로 추적하고 서열 특이적 핵 조직에 대한 연구를 가능하게 한다 [Chen et al., Cell 155, 1479-91 (2013)]. 마지막으로, 활성 Cas9을 표적화하여 접합체에서 다양한 비기능적 게놈 영역을 절단할 수 있으며, 성숙한 유기체의 각 세포에서 돌연변이의 빈도와 순서를 사용하여 배아 발달 동안 세포 분화의 계통을 추적할 수 있다 [Mckenna et al., Science 42, 237-241 (2016)].
본원에 사용된 바와 같이, 용어 TALEN은 광범위하며 다른 TALEN의 도움 없이 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있는 단량체 TALEN을 포함한다. 용어 TALEN은 또한 동일한 부위에서 DNA를 절단하기 위해 함께 작동하도록 조작된 TALEN 쌍의 구성원 중 하나 또는 두 구성원을 지칭하는 데에 사용된다. 함께 작동하는 TALEN은 DNA 또는 TALEN 쌍의 방향성을 참조하는 왼쪽 TALEN 및 오른쪽 TALEN으로 지칭될 수 있다.
용어 TALEN은 전사 활성화제 유사 (TAL) 이펙터 결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인을 포함하는 단백질을 의미하고 자체로 기능적인 단량체 TALEN뿐만 아니라 또 다른 단량체 TALEN과의 이량체화를 필요로 하는 다른 것들을 포함한다. 이량체화는 두 단량체 TALEN이 동일할 때 동종이량체 TALEN을 생성할 수 있거나 단량체 TALEN이 다를 때 이종이량체 TALEN을 생성할 수 있다. TALEN은 두 가지 주요 진핵 DNA 복구 경로인, 비상동 말단 연결 (NHEJ) 및 상동성 지정 복구를 통해 불멸화 인간 세포에서 유전자 변형을 유도하는 것으로 나타났다. TALEN은 종종 쌍으로 사용되지만 단량체 TALEN도 알려졌다. TALEN (및 기타 유전적 도구)에 의한 치료를 위한 세포는 배양된 세포, 불멸화 세포, 일차 세포, 일차 체세포, 접합체, 생식 세포, 원시 생식 세포, 배반포 또는 줄기 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, TAL 이펙터는 다른 단백질 도메인 (예를 들어, 비-뉴클레아제 단백질 도메인)을 특정 뉴클레오티드 서열에 표적화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, TAL 이펙터는 제한 없이, DNA 상호작용 효소 (예를 들어, 메틸라제, 토포이소머라제, 인테그라제, 트랜스포사제, 또는 리가제), 전사 활성화제 또는 억제인자로부터의 단백질 도메인, 또는 히스톤과 같은 다른 단백질과 상호작용하거나 변형하는 단백질에 연결될 수 있다. 이러한 TAL 이펙터 융합의 응용은 예를 들어, 후성 유전적 조절 요소 생성 또는 수정, DNA의 부위 특이적 삽입, 삭제 또는 복구 제조, 유전자 발현 제어 및 염색질 구조 수정을 포함한다.
따라서 일부 양태에서, 본 개시내용은 유전자 편집 단백질의 전달에 사용하기 위한 SNA (예를 들어, ProSNA, LSNA, LNP-SNA)를 제공한다. 다양한 구현예에서, 유전자 편집 단백질(들)은 리보핵단백질 (RNP) 복합체에 있다. SNA에 캡슐화된 리보핵단백질 (RNP) 복합체는 다양한 구현예에서, CRISPR-관련 단백질 9 (Cas9) (서열 번호 1 또는 서열 번호 25), CRISPR RNA (crRNA), 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA), 및/또는 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법에 활용되는 Cas9은 EnGen® Cas9 NLS, S. 피오게네스 (New England Biolabs 카탈로그 번호 M0646T)이다. 본 개시내용의 임의의 양태 또는 구현예에서, 본 개시내용의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 참조 또는 야생형 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 본 개시내용의 임의의 양태 또는 구현예에서, 유전자 편집 단백질은 참조 또는 야생형 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 다양한 구현예에서, 유전자 편집 단백질은 참조 또는 야생형 Cas9 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 Cas9 단백질이다. 따라서, 다양한 구현예에서, 유전자 편집 단백질은 서열 번호 1 또는 서열 번호 25와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 Cas9 단백질이다. 추가 구현예에서, 유전자 편집 단백질은 서열 번호 27과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 Cas12 단백질이다. 추가 구현예에서, 유전자 편집 단백질은 서열 번호 29와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 Cas13 단백질이다.
구형 핵산 (SNA)
본원에 기재된 바와 같은, 구형 핵산 (SNA)은 고도로 배향된 올리고뉴클레오티드 쉘로 기능화된 구형 나노입자 코어를 포함하는 독특한 부류의 나노물질이다. 올리고뉴클레오티드 쉘은 나노입자 코어의 외부 표면에 부착된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘은 억제성 올리고뉴클레오티드, 면역자극 올리고뉴클레오티드, 유전자 편집기 기질 DNA 또는 RNA, 표적화 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 나노입자 코어는 유기 (예를 들어, 리포솜), 무기 (예를 들어, 금, 은 또는 백금), 중합체 기반 (예를 들어, 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA) 입자), 또는 중공 (예를 들어, 실리카 기반)일 수 있다. 본 개시내용의 다양한 구현예에서, 나노입자 코어는 단백질 (단백질-코어 SNA (ProSNA)), 리포솜 (리포솜 l SNA (LSNA)), 또는 지질 나노입자 (LNP-SNA)이다.
폴리뉴클레오티드 쉘의 구형 구조는 형질감염 시약과 관계없이 거의 모든 세포에 진입하고 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 포함하여 전통적인 핵산 전달 방법에 비해 독특한 이점을 제공한다. 더욱이, SNA는 혈액-뇌 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0031745 참조, 전체 내용이 참조로 본원에 포함됨) 및 혈액-종양 장벽뿐만 아니라 표피 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0233270 참조, 전체 내용이 참조로 본원에 포함됨)를 포함하는 생물학적 장벽을 관통할 수 있다.
단백질-코어 구형 핵산 (ProSNA)
최근, 단백질 코어에 부착된 (예를 들어, 공유적으로 부착된) 올리고뉴클레오티드의 조밀한 쉘을 포함하는, 단백질 구형 핵산 (ProSNA)은 단백질 전달, 조립 및 세포 내 검출에서 다양한 생물학적 응용을 통해 흥미로운 새로운 구조로 등장했다 [Brodin, J. D.; Sprangers, A. J.; McMillan, J. R.; Mirkin, C. A.DNA-Mediated Cellular Delivery of Functional Enzymes. J. Am.Chem. Soc. 2015, 137 (47), 14838 - 14841; Kusmierz, C. D.; Bujold, K. E.; Callmann, C. E.; Mirkin, C. A. Defining the Design Parameters for in Vivo Enzyme Delivery Through Protein Spherical Nucleic Acids. ACS Cent. Sci. 2020, 6 (5), 815 - 822]. 올리고뉴클레오티드의 조밀한 쉘은 개별 성분에 비해 세포 흡수, 생리학적 안정성 및 단백질의 생체적합성을 촉진한다 [Giljohann, D. A.; Seferos, D. S.; Patel, P. C.; Millstone, J. E.;Rosi, N. L.; Mirkin, C. A. Oligonucleotide Loading Determines Cellular Uptake of DNA-Modified Gold Nanoparticles. Nano Lett. 2007, 7 (12), 3818 - 3821]. SNA의 이러한 향상된 세포 내재화는 접합체의 3차원 구조와 대부분의 세포 표면에 있는 스캐빈저 수용체와 결합하는 능력에서 유래된다. 중요한 것은 SNA의 유리한 생물학적 특성은 단백질 코어와 무관하므로 단백질 전달 게놈 편집 응용 분야에 선택할 수 있다는 것이다.
본원에 사용된 "단백질-코어"는 유전자 편집 단백질을 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 임의의 양태 또는 구현예에서, 본 개시내용의 유전자 편집 단백질은 일반적으로 단백질-코어 SNA (SNA)의 "코어"로서 기능한다. 단백질은 하나 이상의 아미노산 중합체로 구성된 분자이다. 본 개시내용의 다양한 구현예에서, 단백질 코어는 단일 단백질 (즉, 아미노산의 단일 중합체), 다량체 단백질, 펩티드 (예를 들어, 약 2 내지 50개 아미노산 길이의 아미노산 중합체), 또는 두 개 이상의 단백질로 구성된 합성 융합 단백질을 포함하거나 이로 이루어진다. 합성 융합 단백질은 제한 없이, 발현된 융합 단백질 (단일 유전자로부터 발현됨) 단백질이 화학적으로 함께 접합되는 발현후 융합을 포함한다. 본 개시내용의 임의의 양태 또는 구현예에서, 단백질 코어는 유전자 편집 단백질을 포함하거나 이로 이루어진다. 단백질은 당업계에서 이해되며 자연적으로 발생하거나 비자연적으로 발생될 수 있다.
단백질-코어 SNA 합성. 본 개시내용은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 링커를 통해 단백질-코어 SNA의 표면과 회합 및/또는 부착되는 조성물 및 방법을 제공한다. 링커는 다양한 구현예에서, 절단 가능 링커, 비-절단 가능한 링커, 미량 링커, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 절단 가능 링커는 환원제 (예를 들어, 글루타티온 (GSH), 디티오트레이톨 (DTT)) 또는 환원 환경 (예를 들어, 세포 내부)에 민감하다 (그리고 이에 반응하여 절단된다). 다양한 구현예에서, 절단 가능한 링커는 예를 들어, 산성 (예를 들어, 낮은 pH), 효소 (예를 들어, 펩티다제), 빛 (예를 들어, NIR 레이저)), 및/또는 가수분해와 같은 다양한 화학적 자극에 민감하다 (그리고 그에 반응하여 절단된다).
링커는 단백질-코어를 개시된 단백질-코어 SNA의 올리고뉴클레오티드에 연결한다 (즉, 단백질-코어-링커-올리고뉴클레오티드). 다양한 구현예에서, 단일 올리고뉴클레오티드가 링커에 부착된다. 추가 구현예에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 2개, 3개 또는 그 이상)가 단일 링커에 부착된다. 일반적으로, 본 개시내용에 의해 고려되는 링커는 본 개시내용의 ProSNA에서 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있는 다음을 포함한다: 아미드, 티오에테르, 트리아졸, 옥심, 우레아, 및 티오우레아. 구체적으로 고려되는 일부 링커는 카바메이트 알킬렌, 카바메이트 알킬렌아릴 디티올레이트 링커, 아미드 알킬렌 디티올레이트 링커, 아미드 알킬렌아릴 디티올레이트 링커, 및 아미드 알킬렌 숙신이미딜 링커를 포함한다. 일부 경우에, 링커는 -NH-C(O)-O-C2-5알킬렌-S-S-C2-7알킬렌- 또는 -NH-C(O)-C2-5알킬렌-S-S-C2-7알킬렌-을 포함한다. -S-S- 모이어티에 대한 탄소 알파는 -C(XA)(XB)-S-S- 또는 -S-S-C(YA)(YB)- 또는 이들의 조합과 같이 분지형일 수 있으며, 여기서 XA, XB, YA 및 YB는 독립적으로 H, Me, Et, 또는 iPr이다. 단백질에 대한 탄소 알파는 -C(XA)(XB)-C2-4알킬렌-S-S-와 같이 분지형일 수 있으며, 여기서 XA 및 XB는 H, Me, Et, 또는 iPr이다. 일부 경우에, 링커는 -NH-C(O)-O-CH2-Ar-S-S-C2-7알킬렌-이고, Ar은 메타- 또는 파라-치환된 페닐이다. 일부 경우에, 링커는 -NH-C(O)- C2-4알킬렌-N-숙신이미딜-S-C2-6알킬렌-이다.
본 개시내용에 의해 고려되는 추가 링커는 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 번호 WO 2018/213585에 기재된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 SH 링커, SM 링커, SE 링커, 또는 SI 링커이다. 본 개시내용은 단백질 코어 상의 올리고뉴클레오티드에 대한 다중 부착 지점을 고려한다.
본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 단백질 코어에 부착을 위해 5' 말단 또는 3' 말단에서 변형될 수 있다.
본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 말단에서 알킨 모이어티, 예를 들어, 단백질 표면의 아지드와의 반응을 위한 DBCO-유형 모이어티로 변형될 수 있으며: , 여기서 L은 폴리뉴클레오티드의 말단에 대한 링커이다. L2는 C1-10 알킬렌, -C(O)-C1-10 알킬렌-Y-, 및 -C(O)-C1-10 알킬렌-Y- C1-10 알킬렌-(OCH2CH2)m-Y-일 수 있고; 여기서 각각의 Y는 독립적으로 결합, C(O), O, NH, C(O)NH, 및 NHC(O)로 이루어진 군으로부터 선택되고; m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다. 예를 들어, DBCO 작용기는
의 구조를 갖는 링커를 통해 부착될 수 있고, 여기서 말단 "O"는 폴리뉴클레오티드 상의 말단 뉴클레오티드로부터 유래된다. DBCO-유형 모이어티를 사용하면 표면 아민이 변형된 경우 폴리뉴클레오티드와 단백질 사이에 다음과 같은 구조가 생성되고: (I) 및 (II), 여기서 L 및 L2는 각각 C1-10 알킬렌, -C(O)-C1-10 알킬렌-Y-, 및 -C(O)-C1-10 알킬렌-Y- C1-10 알킬렌-(OCH2CH2)m-Y-로부터 독립적으로 선택되고; 각각의 Y는 결합, C(O), O, NH, C(O)NH, 및 NHC(O)로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고; m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; PN은 폴리뉴클레오티드이다. 단백질의 표면 티올 또는 표면 카르복실레이트가 변형된 유사한 구조를 비슷한 방식으로 만들어 비슷한 연결 구조를 얻을 수 있다.
단백질은 아지드 작용기로 종결되는 링커를 사용하여 표면 작용기 (예를 들어, 표면 아민, 표면 카르복실레이트, 표면 티올)에서 변형될 수 있다: 단백질-X-L-N3, X는 단백질 상의 표면 아미노기 (예를 들어, -NH-), 카르복실기 (예를 들어, -C(O)- 또는 -C(O)O-), 또는 티올기 (예를 들어, -S-)로부터 유래하고; L은 C1-10 알킬렌, -Y-C(O)-C1-10 알킬렌-Y-, 및 -Y-C(O)-C1-10 알킬렌-Y- C1-10 알킬렌-(OCH2CH2)m-Y-로부터 선택되고; 각각의 Y는 결합, C(O), O, NH, C(O)NH, 및 NHC(O)로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고; m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다. 단백질의 표면 모이어티에 "L-N3" 작용기를 도입하는 것은 잘 알려진 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 표면 아민은 말단 N3를 갖는 링커의 활성화된 에스테르와 반응하여 단백질의 아민과 링커 시약의 활성화된 에스테르의 카르복실레이트 사이에 아미드 결합을 형성할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 말단에 알킨 작용기를 포함하도록 변형될 수 있고: 올리고뉴클레오티드-L2-X≡R2는 C1-10 알킬렌, -C(O)-C1-10 알킬렌-Y-, 및 -C(O)-C1-10 알킬렌-Y- C1-10 알킬렌-(OCH2CH2)m-Y-로부터 선택되고; 각각의 Y는 결합, C(O), O, NH, C(O)NH, 및 NHC(O)로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고; m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; X는 결합이고 R은 H 또는 C1-10알킬이고; 또는 X 및 R은 이들이 결합된 탄소와 함께 8-10원 탄소환식 또는 8-10원 복소환식 기를 형성한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 구조 를 갖는다.
표면 변형 아지드를 갖는 단백질, 및 알킨을 포함하도록 변형된 말단을 갖는 폴리뉴클레오티드는 구리 (II) 염 및 환원제의 존재하에서 함께 반응하여 트리아졸 고리를 형성하여 제자리에서 구리 (I) 염을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 구리 (I) 염이 직접 첨가된다. 고려되는 환원제는 아스코르브산, 아스코르베이트염, 수소화붕소나트륨, 2-머캅토에탄올, 디티오트레이톨 (DTT), 히드라진, 수소화알루미늄리튬, 수소화디이소부틸알루미늄, 옥살산, 린들라 촉매, 아황산염 화합물, 주석 화합물, 철 화합물, 나트륨 아말감, 트리스(2- 카르복시에틸)포스핀, 히드로퀴논, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
단백질의 표면 작용기는 다른 부착 화학을 사용하여 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 예를 들어, 표면 아민은 올리고뉴클레오티드의 말단에서 카르복실레이트 또는 활성화된 에스테르에 직접적으로 접합되어 아미드 결합을 형성할 수 있다. 표면 카르복실레이트는 올리고뉴클레오티드 말단의 아민에 접합되어 아미드 결합을 형성할 수 있다. 대안적으로, 표면 카르복실레이트는 디아민과 반응하여 표면 카르복실레이트에 아미드 결합을 형성하고 다른 말단에 아민을 형성할 수 있다. 그런 다음 이 말단 아민은 단백질의 표면 아민과 유사한 방식으로 변형될 수 있다. 표면 티올은 폴리뉴클레오티드 상의 티올 부분과 접합되어 이황화 결합을 형성할 수 있다. 대안적으로, 티올은 폴리뉴클레오티드 말단의 활성화된 에스테르와 접합되어 티오 카르복실레이트를 형성할 수 있다. 대안적으로, 티올은 폴리뉴클레오티드의 말단에서 마이클 수용체 (예를 들어, 숙신이미드)와 접합되어 티오에테르를 형성할 수 있다.
단백질-코어 SNA (ProSNA)를 합성하는 일반적인 대표적인 절차는 원하는 양의 올리고뉴클레오티드를 단백질 표면에 부착하는 것을 포함한다. 부착은 2단계 과정을 반복하여 수행된다: (1) 단백질 표면에 링커 부착 및 정제; (2) 단백질 결합 링커에 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, DNA)의 부착 및 정제. 이 두 단계는 원하는 양의 올리고뉴클레오티드가 단백질에 부착될 때까지 반복된다. 전술한 절차는 본질적으로 예시적이라는 것이 이해될 것이다.
지질 나노입자 구형 핵산 (LNP-SNA)
지질 나노입자 구형 핵산 (LNP-SNA)은 올리고뉴클레오티드로 장식된 지질 나노입자 코어로 구성된다. 지질 나노입자 코어는 유전자 편집 단백질, 이온화 가능 지질, 인지질, 스테롤, 및 지질-폴리에틸렌 글리콜 (지질-PEG) 접합체를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 쉘은 지질 나노입자 코어의 외부 표면에 부착된 하나 또는 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 쉘의 구형 구조는 형질감염 시약과 독립적인 거의 모든 세포로의 진입, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성, 서열 기반 기능, 표적화 및 진단을 포함하여 전통적인 핵산 전달 방법에 비해 독특한 이점을 제공한다.
따라서 다양한 양태에서, 본 개시내용은 (a) 지질 나노입자 코어; (b) 지질 나노입자 코어의 외부 표면에 부착된 올리고뉴클레오티드 쉘; 및 (c) 유전자 편집 단백질을 포함하는 지질 나노입자 구형 핵산 (LNP-SNA)을 제공한다. 따라서, LNP-SNA는 유전자 편집 단백질, 이온화 가능 지질, 인지질, 스테롤, 및 지질-폴리에틸렌 글리콜 (지질-PEG) 접합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 이온화 가능 지질은 디리놀레일메틸-4-디메틸아미노부티레이트 (DLin-MC3-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-KC2-DMA), C12-200, 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 (DODAP), 유사한 지질/리피도이드 구조, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-디헥사데카노일 포스파티딜콜린 (DPPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 또는 이들의 조합이다. 추가 구현예에서, 스테롤은 3β-히드록시콜레스트-5-엔 (콜레스테롤), 9,10-세코콜레스타-5,7,10(19)-트리엔-3β-올 (비타민 D3), 9,10-세코에르고스타-5,7,10(19),22-테트라엔-3β-올 (비타민 D2), 칼시포트리올, 24-에틸-5,22-콜레스타디엔-3β-올 (스티그마스테롤), 22,23-디히드로스티그마스테롤 (β-시토스테롤), 3,28-디히드록시-루페올 (베툴린), 루페올, 우르솔산, 올레아놀산, 24α-메틸콜레스테롤 (캄페스테롤), 24- 에틸콜레스타-5,24(28)E-디엔-3β-올 (푸코스테롤), 24-메틸콜레스타-5,22-디엔-3β-올 (브라시카스테롤), 24-메틸콜레스타-5,7,22-트리엔-3β-올 (에르고스테롤), 9,11-디히드로에르고스테롤, 다우코스테롤, 또는 하나 이상의 아미노산으로 변형된 상기 스테롤 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 지질 -폴리에틸렌 글리콜 (지질-PEG) 접합체는 2000 달톤 (Da) 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 추가 구현예에서, 지질-폴리에틸렌 글리콜 (지질-PEG) 접합체는 지질-PEG-말레이미드이다. 추가 구현예에서, 지질-PEG-말레이미드는 2000 Da 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드에 접합된 1,2-디팔미토릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE), 2000 Da 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드에 접합된 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DMPE), 또는 이들의 조합이다.
본 개시내용에 따라 사용하기 위해 고려되는 올리고뉴클레오티드는 임의의 수단 (예를 들어, 공유 또는 비공유 부착)을 통해 나노입자 코어에 부착된 것을 포함한다. 본 개시내용의 임의의 양태 또는 구현예에서 올리고뉴클레오티드는 지질-폴리에틸렌 글리콜 (지질-PEG) 접합체에 대한 올리고뉴클레오티드의 공유 부착을 통해 지질 나노입자 코어의 외부에 부착된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내 올리고뉴클레오티드의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%는 지질-PEG 접합체를 통해 지질 나노입자 코어 외부에 공유적으로 부착된다. 다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 쉘 내 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 지질 앵커 그룹을 통해 지질 나노입자 코어의 외부에 부착된다. 지질 앵커 그룹은 다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 5'- 또는 3'- 말단에 부착된다. 다양한 구현예에서, 지질 앵커 그룹은 콜레스테롤 또는 토코페롤이다.
본 개시내용의 임의의 양태 또는 구현예에서, LNP-SNA는 유전자 편집 단백질이 지질 나노입자 코어에서 캡슐화되고 올리고뉴클레오티드의 쉘이 지질 나노입자 코어의 외부에 부착되도록 합성된다. 일반적으로 그리고 예를 들어, 지질 나노입자 (LNP)는 지질과 스테롤을 에탄올에 희석하여 제제화될 수 있다.
리포좀 구형 핵산 (LSNA)
리포솜은 친수성 코어가 있는 하나 이상의 소수성 지질 이중층으로 구성된 다양한 크기 범위의 구형, 자체 폐쇄형 구조이다. 이러한 지질 기반 담체의 직경은 0.15-1 마이크로미터 범위이며, 이는 효과적인 치료 범위인 20-100 나노미터보다 상당히 높다. 소형 단층 소포 (SUV)로 불리는 리포솜은 20-50 나노미터 크기 범위에서 합성될 수 있지만, 입자 간 융합으로 이어지는 불안정성 및 응집과 같은 문제에 직면한다. 이러한 입자 간 융합은 치료제에서 SUV의 사용을 제한한다.
리포솜 구형 핵산 (LSNA)은 화학적으로 조정 가능한 구조, 생체 적합성 및 형질감염 시약 없이 세포에 빠르게 들어가는 능력으로 인해 치료 전달을 위한 매력적인 플랫폼이다. 본 개시내용은 유전자 편집 단백질을 LSNA에 캡슐화함으로써 세포 내로 전달하는 방법을 제공한다. 캡슐화된 유전자 편집 효소는 효소 활성을 유지하며 빠르게 포유동물 세포에 들어간다. 이러한 특성으로 인해 이 새로운 형태의 LSNA는 유전자 편집 치료제를 위한 전달 수단이 된다.
이전 SNA 매개 단백질 전달 전략에서는 단백질 아미노산의 화학적 변형이 필요했는데, 이는 단백질 기능을 억제할 수 있다. LSNA에 캡슐화된 단백질은 화학적 변형 없이 세포 내로 전달될 수 있다. 또한, 단백질 전달을 위한 양이온성 지질 매개 전략에는 음이온성 단백질 복합체가 필요하다. 그러나 SNA 매개 전달은 중성 인지질을 사용하므로 음이온성 단백질이 필요하지 않다. 따라서, 이 방법은 TALEN과 같은 양전하를 띤 단백질의 전달에도 적합하다.
따라서 일부 양태에서 본 개시내용은 유전자 편집 방법에서 유전자 편집 효소 (예를 들어, CRISPR-관련 단백질 9 (Cas9) (Jinek et al., (2012) Science. 816-821; Zuris et al., Nat Biotechnol. 2015 Jan;33(1):73-80, 전체 내용이 참조로 본원에 포함됨), CRISPR RNA (crRNA), 및 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA), 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)) 및 표면-기능화된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 본원에 개시된 LSNA의 사용을 고려한다.
따라서 본 개시내용은 유전자 편집 단백질의 (예를 들어, 세포로) 시험관 내 또는 생체 내 전달을 포함하지만 이제 제한되지 않는 방법에서 사용하기 위한 LSNA를 제공한다. 예를 들어 국제 특허 출원 번호 PCT/US2014/068429 (특히 리포솜 입자의 논의와 관련하여 전체 내용이 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같은 리포솜 입자는 또한 본 개시내용에 의해 고려된다. 본 개시내용의 리포솜 입자는 실질적으로 구형인 기하학적 형태, 내부 측면 및 외부 측면을 갖고, 지질 이중층을 포함한다. 따라서, 다양한 양태에서, 본 개시내용은 (a) 리포솜 코어; (b) 리포솜 코어의 외부 표면에 부착된 올리고뉴클레오티드 쉘; 및 (c) 유전자 편집 단백질을 포함하는 구형 핵산 (SNA)을 제공한다. 지질 이중층은 다양한 구현예에서, 지질의 포스포콜린 계열 또는 지질의 포스포에탄올아민 계열로부터의 지질을 포함하는 복수의 지질 기를 포함한다. 본 개시내용에 의해 고려되는 지질은 제한 없이, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-디미리스토일-sn-포스파티딜콜린 (DMPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-포스파티딜콜린 (POPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DSPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DOPG), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DOPG), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE), 카르디오리핀, 지질 A, 이들의 조합을 포함한다. 다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 지질 앵커 그룹을 통해 리포솜 코어의 외부에 부착된다. 추가 구현예에서, 지질 앵커 그룹은 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 부착된다. 추가 구현예에서, 지질 앵커 그룹은 토코페롤 또는 콜레스테롤이다. 따라서, 다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나 (또는 전부)는 지질 앵커 그룹을 함유하는 올리고뉴클레오티드-지질 접합체이고, 여기서 상기 지질 앵커 그룹은 지질 이중층에 흡착된다. 지질 앵커 그룹은 다양한 구현예에서, 토코페롤, 팔미토일, 디팔미토일, 스테아릴, 디스테아릴, 또는 콜레스테롤을 포함한다. 추가 양태에서, 본 개시내용은 실질적으로 구형 기하학적 구조를 가지며 복수의 지질 기를 포함하는 지질 이중층을 포함하는 LSNA; 리포솜 입자에 캡슐화된 리보핵단백질 (RNP) 복합체, 유전자 편집 단백질 (예를 들어, CRISPR-관련 단백질 9 (Cas9)) 및 가이드 RNA를 포함하는 RNP; 및 LSNA 표면의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 개시내용의 LSNA 표면상의 올리고뉴클레오티드의 표면 밀도와 관련하여, 본원에 기재된 바와 같은 LSNA는 그의 표면상에 약 1 내지 약 400개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것으로 고려된다. 다양한 구현예에서, LSNA는 그의 표면상에 약 10 내지 약 100, 또는 10 내지 약 90, 또는 약 10 내지 약 80, 또는 약 10 내지 약 70, 또는 약 10 내지 약 60, 또는 약 10 내지 약 50, 또는 약 10 내지 약 40, 또는 약 10 내지 약 30, 또는 약 10 내지 약 20, 또는 약 50 내지 약 100, 또는 약 60 내지 약 100, 또는 약 70 내지 약 100, 또는 약 80 내지 약 100, 또는 약 90 내지 약 100개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 추가 구현예에서, LSNA는 그의 표면상에 적어도 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 또는 400개의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, LSNA는 그의 표면상에 70개의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다. SNA에 대한 추가 표면 밀도는 아래에 설명되어 있다.
일부 양태에서, 토코페롤 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 구조가 개시된다. 다양한 구현예에서, 토코페롤은 올리고뉴클레오티드 또는 이의 변형된 형태의 5' 말단 또는 3' 말단에 있는 것으로 고려된다. 토코페롤 변형된 올리고뉴클레오티드는 친유성 말단과 비친유성 말단을 포함한다. 친유성 말단은 토코페롤을 포함하고, 토코페롤 유도체, 알파-토코페롤, 베타-토코페롤, 감마-토코페롤 및 델타-토코페롤로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다. 추가 구현예에서, 친유성 말단은 팔미토일, 디팔미토일, 스테아릴, 콜레스테롤 또는 디스테아릴을 포함한다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 토코페롤 대신 콜레스테롤 또는 인지질이 사용되는 것을 고려한다. 콜레스테롤은 고체상 올리고뉴클레오티드 합성에서 부착되며, 여기서 준비된 리포솜과 혼합되어 SNA를 형성한다. 일부 구현예에서, 95% 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3 포스파티딜콜린 (DOPC) 및 5% 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(6-아지도헥사노일) (DPPE-아지드)로 구성된 리포솜을 아래와 같이 제조한다. 그런 다음 DBCO-변형된 올리고뉴클레오티드가 추가되어, 아지드 지질과 반응하여 표면을 기능화한다.
추가 양태에서, 인지질 접합된 올리고뉴클레오티드는 다음과 같이 제조된다: 먼저, 포스파티딜에탄올아민 지질, 예를 들어 DOPE를 25 mg/mL 지질, 1 당량 SMPB 및 1 당량의 클로로포름 중 N,N-디이소프로필에틸아민과 혼합하여 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 (SMPB)와 반응시킨다. 혼합물을 밤새 반응시킨다. 다음으로 실리카 컬럼을 이용한 플래쉬 크로마토그래피로 생성물을 정제한다 (용매 A: 디클로로메탄, 용매 B: 메탄올). 티올 변형된 올리고뉴클레오티드 (3' 또는 5' 말단 변형)을 0.2M DTT 및 0.1 M 인산염 완충액 (pH 8)으로 40℃에서 2시간 동안 환원시킨다. 그런 다음 올리고뉴클레오티드를 물을 사용하여 크기 배제 컬럼에서 정제한다. 포스파티딜에탄올아민-SMPB 지질을 질소 가스로 건조시키고 올리고뉴클레오티드와 동일한 부피의 에탄올에 용해시킨다. 그런 다음 올리고뉴클레오티드를 지질과 혼합하여 반응이 물과 에탄올의 50:50이 되도록 한다. 이 혼합물을 밤새 반응시키고, 반응 혼합물을 클로로포름으로 3회 세척하여 과량의 지질을 추출한다. 다음으로, 수상과 계면을 건조시키고 물에 용해시킨다. 본원에 개시된 모든 지질-접합 올리고뉴클레오티드는 LSNA의 제조에서 상호 교환적으로 사용되는 것으로 고려된다. 토코페롤 변형된 올리고뉴클레오티드의 비친유성 말단은 본원에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드이다.
지질 앵커를 포함하는 올리고뉴클레오티드 제조 방법이 본원에 개시된다. 예를 들어, 먼저 올리고뉴클레오티드 및 포스포라미디트 변형 토코페롤이 제공된다. 그런 다음, 올리고뉴클레오티드는 포스포라미디트 변형 토코페롤에 노출되어 토코페롤 변형 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 제한하려는 의도는 아니지만, 아미드 연결 또는 클릭 화학을 포함하여, 당업자에게 알려진 임의의 화학을 사용하여 토코페롤 (또는 임의의 지질 앵커)을 올리고뉴클레오티드에 부착할 수 있다.
본 개시내용은 또한 LSNA 제조 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 인지질, 용매, 및 토코페롤 변형 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 그런 다음, 인지질을 용매에 첨가하여 리포솜을 포함하는 제1 혼합물을 형성한다. 제1 혼합물의 리포솜 크기는 약 100 나노미터 내지 약 150 나노미터이다. 다음으로, 리포솜을 파괴하여 리포솜과 소형 단층 소포 (SUV)를 포함하는 제2 혼합물을 생성한다. 제2 혼합물의 리포솜과 SUV의 크기는 약 20 나노미터 내지 약 150 나노미터이다. 다음으로, 입자 크기 약 20 나노미터 내지 약 50 나노미터를 갖는 SUV를 제2 혼합물로부터 단리한다. 마지막으로, 단리된 SUV를 토코페롤 변형 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 리포솜 입자를 만든다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 LSNA의 직경은 약 50 나노미터 이하이다. 일부 구현예에서, 복수의 LSN가 생성되고 복수의 LSNA 입자는 약 50 나노미터 이하 (예를 들어, 약 5 나노미터 내지 약 50 나노미터, 또는 약 5 나노미터 내지 약 40 나노미터, 또는 약 5 나노미터 내지 약 30 나노미터, 또는 약 5 나노미터 내지 약 20 나노미터, 또는 약 10 나노미터 내지 약 50 나노미터, 또는 약 10 나노미터 내지 약 40 나노미터, 또는 약 10 나노미터 내지 약 30 나노미터, 또는 약 10 나노미터 내지 약 20 나노미터)의 평균 직경을 갖는다. 추가 구현예에서, 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 복수의 LSNA 내의 입자는 약 20 나노미터 이하, 또는 약 25 나노미터 이하, 또는 약 30 나노미터 이하, 또는 약 35 나노미터 이하, 또는 약 40 나노미터 이하, 또는 약 45 나노미터 이하의 평균 직경을 갖는다.
일부 양태에서, 방법은 다음 단계를 포함한다: (1) 1X PBS를 건조 지질에 첨가하여 최종 농도가 1-25 mg/mL가 되도록 하는 단계 (따라서, 다양한 구현예에서, 최종 농도는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 mg/ml임); (2) 액체질소에서 급속 냉동시킨 후 수조 초음파처리기에서 3회 해동시키는 단계; (3) 200, 100, 80, 50 및 30 nm 필터를 통해 압출하는 단계. 이중 필터가 사용되며 일반적으로 각 필터를 2~10회 통과한다. 일부 구현예에서, 공정은 50 nm에서 중단되지만, 30 nm 구조가 요구되는 경우에는, 30 nm 필터가 추가로 추가된다. 추가 양태에서, 30 nm 리포솜이 요구되는 경우, 하나의 프로브는 단계 (2) 후에 초음파 처리된다. 다음으로, 리포솜을 21000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 초음파 처리에서 떨어져 나온 금속 부스러기를 제거하고 혼합물을 단계 (3)에 설명된 대로 30 nm 필터를 통해 압출한다.
따라서, 일부 양태에서 본 개시내용은 인지질을 용매에 첨가하여 복수의 리포솜을 포함하는 제1 혼합물을 형성하는 단계; 상기 다수의 리포솜을 파괴하여 리포솜과 소형 단층 소포 (SUV)를 포함하는 제2 혼합물을 생성하는 단계; 입자 크기 약 20 나노미터 내지 50 나노미터를 입자 크기를 갖는 상기 SUV를 제2 혼합물로부터 단리하는 단계; 및 단리된 SUV에 올리고뉴클레오티드 또는 다수의 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 LSNA를 제조하는 단계를 포함하는, LSNA를 제조하는 방법을 제공한다.
올리고뉴클레오티드
본 개시내용은 나노입자 코어 및 나노입자 코어의 외부에 부착된 올리고뉴클레오티드의 쉘을 포함하는 구형 핵산 (예를 들어, ProSNA, LSNA, LNP-SNA)을 제공한다. 올리고뉴클레오티드의 쉘은 다양한 구현예에서, 억제성 올리고뉴클레오티드, 면역자극 올리고뉴클레오티드, 표적화 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은, 일부 구현예에서 나노입자 코어는 캡슐화된 유전자 편집 단백질을 포함한다. 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 다양한 구현예에서, DNA 올리고뉴클레오티드, RNA 올리고뉴클레오티드, 그의 변형된 형태, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 양태 또는 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 부분적으로 이중 가닥이다. 본 개시내용의 임의의 양태 또는 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 검출 가능한 마커를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은, 하나의 변형된 뉴클레오티드간 결합을 갖는 것들을 포함하는 변형된 형태의 올리고뉴클레오티드도 본 개시내용에 의해 고려된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 전부 또는 부분적으로 펩티드 핵산이다. 다른 변형된 뉴클레오시드간 결합은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 또 다른 변형된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 범용 염기를 포함하는 것들을 포함한다. "범용 염기"는 상당한 구조 불안정화 없이 수소 결합을 형성하여 핵산의 A, C, G, T 및 U 중 어느 하나에 결합을 대체할 수 있는 분자를 지칭한다. 범용 염기 유사체와 통합된 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 혼성화에서 프로브로서 기능할 수 있다. 범용 염기의 예는 5'-니트로인돌-2'-데옥시리보시드, 3-니트로피롤, 이노신 및 하이포잔틴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드" 또는 그 복수형은 본원에서 논의되고 당업계에 달리 공지된 변형된 형태와 상호교환 가능하다. 본원에 사용된 용어 "핵염기" 또는 그 복수형은 본원에 논의되고 당업계에 달리 공지된 변형된 형태와 상호교환 가능하다. 뉴클레오티드 또는 핵염기는 자연 발생 핵염기 A, G, C, T, 및 U를 포함한다. 비-자연 발생 핵염기는 예를 들어 제한 없이, 잔틴, 디아미노퓨린, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아잔틴, 7-데아자구아닌, N4,N4-에타노시토신, N',N'-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸시토신 (mC), 5-(C3―C6)-알키닐-시토신, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 슈도이소시토신, 2-히드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소시토신, 이소구아닌, 이노신 및 Benner et al., 미국 특허 번호 5,432,272 및 Susan M. Freier 및 Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol. 25: pp 4429-4443에 기술된 "비-자연 발생" 핵염기를 포함한다. 용어 "핵염기"는 또한, 공지된 퓨린 및 피리미딘 복소환뿐만 아니라 이의 복소환 유사체 및 호변이성체도 포함한다. 추가로 자연 및 비-자연 발생 핵염기는 미국 특허 번호 3,687,808 (Merigan, et al.), Sanghvi의 Antisense Research and Application, Ed. S. T. Crooke 및 B. Lebleu, CRC Press, 1993 15장, Englisch et al., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613-722에 개시된 것을 포함한다 (특히, Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz Ed., John Wiley & Sons, 1990 페이지 622 및 623, Cook, Anti-Cancer Drug Design 1991, 6, 585-607 페이지 858-859 참조, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함됨). 다양한 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 또한 가장 고전적인 의미의 뉴클레오시드 염기는 아니지만 뉴클레오시드 염기의 역할을 하는 특정 "범용 염기"를 포함하여 핵염기처럼 작용할 수 있는 헤테로고리 화합물과 같은 화합물을 포함하는 비-자연 발생 뉴클레오티드의 범주인 하나 이상의 "뉴클레오시드 염기" 또는 "염기 단위"를 포함한다. 범용 염기는 3-니트로피롤, 임의로 치환된 인돌 (예를 들어, 5-니트로인돌), 및 임의로 치환된 하이포잔틴을 포함한다. 다른 바람직한 범용 염기는 당업계에 공지된 범용 염기를 비롯한 피롤, 디아졸 또는 트리아졸 유도체를 포함한다.
올리고뉴클레오티드의 예는 변형된 백본 또는 비-천연 뉴클레오시드간 결합을 함유하는 것들이 포함된다. 변형된 백본을 갖는 올리고뉴클레오티드는 백본에 인 원자를 보유하는 것과 백본에 인 원자를 갖지 않는 것을 포함한다. 뉴클레오시드간 백본에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드는 "올리고뉴클레오티드"의 의미 내에 있는 것으로 간주된다.
인 원자를 함유하는 변형된 올리고뉴클레오티드 백본은 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 포스포피네이트, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트를 포함하는 포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 정상적인 3'-5' 결합을 갖는 셀레노포스페이트 및 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 결합된 유사체, 및 하나 이상의 뉴클레오티드 간 결합이 3'에서 3', 5'에서 5' 또는 2'에서 2' 결합인 역전된 극성을 갖는 것을 포함한다. 또한, 3'-최대 뉴클레오티드간 결합에서 단일 3'에서 3'으로의 결합을 포함하는 역전된 극성을 갖는 올리고뉴클레오티드, 즉 무염기일 수 있는 단일 역전된 뉴클레오시드 잔기를 갖는 것이 고려된다 (뉴클레오티드가 없거나 그 자리에 히드록실기를 가짐). 염, 혼합 염 및 유리산 형태도 고려된다. 상기 인 함유 결합의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 및 5,625,050을 포함하고, 그 개시내용은 본원에 참조로 포함되어 있다.
내부에 인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드는 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 결합에 의해 형성된 백본을 갖는다. 이는 모르폴리노 결합; 실록산 백본; 설파이드, 설폭시드 및 설폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 리보아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 설파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 설포네이트 및 설폰아미드 백본; 아미드 백본을 갖는 것들; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 기타를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 및 5,677,439 참조, 그 개시내용은 전체 내용이 본원에 참조로 포함되어 있다.
추가 구현예에서, 뉴클레오티드 단위의 하나 이상의 당 및/또는 하나 이상의 뉴클레오티드간 결합이 둘 다 "비-자연 발생" 기로 대체되는 올리고뉴클레오티드 모방체. 올리고뉴클레오티드의 염기는 혼성화를 위해 유지된다. 일부 양태에서, 이 구현예는 펩티드 핵산 (PNA)을 고려한다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-백본은 아미드 함유 백본으로 대체된다. 예를 들어 미국 특허 번호 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262, 및 Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500 참조, 그 개시내용은 본원에 참조로 포함되어 있다.
추가 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 백본 및 헤테로원자 백본을 갖는 올리고뉴클레오시드가 제공되며, 미국 특허 번호 5,489,677, 및 5,602,240에 기재된 ―CH2―NH―O―CH2―, ―CH2―N(CH3)―O―CH2―, ―CH2―O―N(CH3)―CH2―, ―CH2―N(CH3)―N(CH3)―CH2― 및 ―O―N(CH3)―CH2―CH2―를 포함한다. 미국 특허 번호 5,034,506에 기술된 모르폴리노 백본 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드도 고려된다.
다양한 형태에서, 올리고뉴클레오티드 내의 2개의 연속적인 단량체 사이의 결합은―CH2―, ―O―, ―S―, ―NRH―, >C=O, >C=NRH, >C=S, ―Si(R")2―, ―SO―, ―S(O)2―, ―P(O)2―, ―PO(BH3) ―, ―P(O,S) ―, ―P(S)2―, ―PO(R")―, ―PO(OCH3) ―, 및 ―PO(NHRH)―로부터 선택된 2 내지 4, 바람직하게는 3개의, 그룹/원자로 이루어지고, 여기서 RH는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택되고, R"는 C1-6-알킬 및 페닐로부터 선택된다. 이러한 결합의 예시적인 예는 ―CH2―CH2―CH2―, ―CH2―CO―CH2―, ―CH2―CHOH―CH2―, ―O―CH2―O―, ―O―CH2―CH2―, ―O―CH2―CH=(다음 단량체에 대한 결합으로 사용되는 경우 R5 포함), ―CH2―CH2―O―, ―NRH―CH2―CH2―, ―CH2―CH2―NRH―, ―CH2―NRH―CH2― -, ―O―CH2―CH2―NRH―, ―NRH―CO―O―, ―NRH―CO―NRH―, ―NRH―CS―NRH―, ―NRH―C(=NRH)―NRH―, ―NRH―CO―CH2―NRH―O―CO―O―, ―O―CO―CH2―O―, ―O―CH2―CO―O―, ―CH2―CO―NRH―, ―O―CO―NRH―, ―NRH―CO―CH2 ―, ―O―CH2―CO―NRH―, ―O―CH2―CH2―NRH―, ―CH=N―O―, ―CH2―NRH―O―, ―CH2―O―N=(다음 단량체에 대한 결합으로 사용되는 경우 R5 포함), ―CH2―O―NRH―, ―CO―NRH― CH2―, ― CH2―NRH―O―, ― CH2―NRH―CO―, ―O―NRH― CH2―, ―O―NRH, ―O― CH2―S―, ―S― CH2―O―, ― CH2― CH2―S―, ―O― CH2― CH2―S―, ―S― CH2―CH=(다음 단량체에 대한 결합으로 사용되는 경우 R5 포함), ―S― CH2― CH2―, ―S― CH2― CH2―- O―, ―S― CH2― CH2―S―, ― CH2―S― CH2―, ― CH2―SO― CH2―, ― CH2―SO2― CH2―, ―O―SO―O―, ―O―S(O)2―O―, ―O―S(O)2― CH2―, ―O―S(O)2―NRH―, ―NRH―S(O)2― CH2―; ―O―S(O)2― CH2―, ―O―P(O)2―O―, ―O―P(O,S)―O―, ―O―P(S)2―O―, ―S―P(O)2―O―, ―S―P(O,S)―O―, ―S―P(S)2―O―, ―O―P(O)2―S―, ―O―P(O,S)―S―, ―O―P(S)2―S―, ―S―P(O)2―S―, ―S―P(O,S)―S―, ―S―P(S)2―S―, ―O―PO(R")―O―, ―O―PO(OCH3)―O―, ―O―PO(O CH2CH3)―O―, ―O―PO(O CH2CH2S―R)―O―, ―O―PO(BH3)―O―, ―O―PO(NHRN)―O―, ―O―P(O)2―NRH H―, ―NRH―P(O)2―O―, ―O―P(O,NRH)―O―, ― CH2―P(O)2―O―, ―O―P(O)2― CH2―, 및 ―O―Si(R")2―O―; 그 중 ― CH2―CO―NRH―, ― CH2―NRH―O―, ―S― CH2―O―, ―O―P(O)2―O―O―P(- O,S)―O―, ―O―P(S)2―O―, ―NRH P(O)2―O―, ―O―P(O,NRH)―O―, ―O―PO(R")―O―, ―O―PO(CH3)―O―, 및 ―O―PO(NHRN)―O―이며, 여기서 RH는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택되고, R"는 C1-6-알킬 및 페닐로부터 선택되고 고려된다. 추가적인 예시적 예는 Mesmaeker et. al., Current Opinion in Structural Biology 1995, 5, 343-355 및 Susan M. Freier 및 Karl-Heinz Altmann, Nucleic Acids Research, 1997, vol 25, pp 4429-4443에서 제공된다.
올리고뉴클레오티드의 또 다른 변형된 형태가 미국 특허 출원 번호 20040219565에 상세히 기재되어 있고, 그 개시내용은 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
변형된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수도 있다. 특정 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에서 다음 중 하나를 포함하고: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 다른 구현예는 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2를 포함하고, 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, 또는 RNA 절단기. 한 양태에서, 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 알려짐) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) 즉, 알콕시알콕시기를 포함한다. 다른 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 2'-DMAOE로도 알려진, O(CH2)2ON(CH3)2 기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (당업계에서 2'-O-디메틸-아미노-에톡시-에틸 또는 2'-DMAEOE로도 알려짐), 즉, 2'-O―CH2―O―CH2―N(CH3)2를 포함한다.
또 다른 변형은 2'-메톡시 (2'-O―CH3), 2'-아미노프록시 (2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-알릴 (2'-CH2―CH=CH2), 2'-O-알릴 (2'-O―CH2―CH=CH2) 및 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 2'-변형은 아라비노 (위) 위치 또는 리보 (아래) 위치에 있을 수 있다. 하나의 양태에서, 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 유사한 변형이 올리고뉴클레오티드의 다른 위치, 예를 들어, 3' 말단 뉴클레오티드 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서도 이루어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 시클로부틸 잔기와 같은 당 모방체를 가질 수도 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; 및 5,700,920 참조, 이의 개시내용은 전체 내용이 본원에 참조로 포함되어 있다.
일부 양태에서, 당의 변형은 2'-히드록실기가 당 고리의 3' 또는 4' 탄소 원자에 연결되어, 이환식 당 모이어티를 형성하는 잠금 핵산 (LNA)을 포함한다. 특정 양태에서 결합은 2' 산소 원자와 4' 탄소 원자를 연결하는 메틸렌 (―CH2―)n 기이고, 여기서 n은 1 또는 2이다. LNA 및 이의 제조는 WO 98/39352 및 WO 99/14226에 기재되어 있다.
변형된 뉴클레오티드는 EP 1 072 679 및 WO 97/12896에 기술되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 변형된 핵염기는 제한 없이, 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 피리미딘 염기의 5-프로피닐 우라실 및 시토신 및 기타 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메티구아닌 및 7-에틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가로 변형된 염기는 페녹사진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤족티아진-2(3H)-온), 치환된 페녹사진 시티딘과 같은 G-클램프 (예를 들어 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤족-사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘 (H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)과 같은 삼환식 피리미딘을 포함한다. 또한, 변형된 염기는 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로고리, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 대체된 염기를 포함할 수 있다. 추가 핵염기는 미국 특허 번호 3,687,808에 개시된 염기, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 페이지 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990에 의해 개시된 염기, Englisch et al., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613에 의해 개시된 염기, 및 Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, 페이지 289-302, Crooke, S. T. 및 Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993에 의해 개시된 염기를 포함한다. 이러한 염기 중 일부는 결합 친화도를 높이는 데 유용하며 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 이중체 안정성을 0.6-1.2℃까지 증가시키는 것으로 나타났으며, 특정 양태에서 2'-O- 메톡시에틸 당 변형과 결합된다. 미국 특허 번호 3,687,808, 미국 특허 번호 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,750,692 및 5,681,941 참조, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함되어 있다.
미리 결정된 서열의 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법은 잘 알려졌다. 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989) 및 F. Eckstein (ed.) Oligonucleotides and Analogues, 1st Ed. (Oxford University Press, New York, 1991) 참조. 리보뉴클레오티드와 폴리데옥시리보뉴클레오티드 모두에 대해 고체상 합성 방법이 바람직하다 (잘 알려진 DNA 합성 방법은 RNA 합성에도 유용하다). 폴리리보뉴클레오티드는 또한 효소적으로 제조될 수 있다. 비-천연 발생 핵염기는 또한 폴리뉴클레오티드에 통합될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7,223,833; Katz, J. Am. Chem. Soc., 74:2238 (1951); Yamane, et al., J. Am. Chem. Soc., 83:2599 (1961); Kosturko, et al., Biochemistry, 13:3949 (1974); Thomas, J. Am. Chem. Soc., 76:6032 (1954); Zhang, et al., J. Am. Chem. Soc., 127:74-75 (2005); 및 Zimmermann, et al., J. Am. Chem. Soc., 124:13684-13685 (2002) 참조.
다양한 양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 변형된 형태는 일반적으로 약 5개 뉴클레오티드 내지 약 100개 뉴클레오티드 길이이다. 더욱 구체적으로, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 90개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 80개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 70개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 50개 뉴클레오티드 길이, 및 약 5 내지 약 45개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 40개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 35개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 30개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 25개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 20개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 길이, 약 10 내지 약 100개 뉴클레오티드 길이, 약 10 내지 약 90개 뉴클레오티드 길이, 약 10 내지 약 80개 뉴클레오티드 길이, 약 10 내지 약 70개 뉴클레오티드 길이, 약 10 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이, 약 10 내지 약 50개 뉴클레오티드 길이, 및 약 10 내지 약 45개 뉴클레오티드 길이, 약 10 내지 약 40개 뉴클레오티드 길이, 약 10 내지 약 35개 뉴클레오티드 길이, 약 10 내지 약 30개 뉴클레오티드 길이, 약 10 내지 약 25개 뉴클레오티드 길이, 약 10 내지 약 20개 뉴클레오티드 길이, 약 10 내지 약 15개 뉴클레오티드 길이, 약 18 내지 약 28개 뉴클레오티드 길이, 약 15 내지 약 26개 뉴클레오티드 길이이며, 모든 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드가 원하는 결과를 달성할 수 있는 정도까지 구체적으로 개시된 크기의 중간 길이이다. 추가 구현예에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 100개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 90개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 80개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 70개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 50개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 40개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 30개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 20개 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 길이이며, 모든 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드가 원하는 결과를 달성할 수 있는 정도까지 구체적으로 개시된 크기의 중간 길이이다. 따라서 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 이상의 뉴클레오티드 길이이거나 적어도 그 길이이다. 추가 구현예에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 이상 뉴클레오티드 길이보다 작다. 다양한 구현예에서, SNA의 나노입자 코어의 외부에 부착된 올리고뉴클레오티드의 쉘은 모두 동일한 길이/서열을 갖는 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 반면, 일부 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 다수 중 적어도 하나의 다른 올리고뉴클레오티드에 비해 길이 및/또는 서열이 상이한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다양한 구현예에서, 나노입자 코어는 그 안에 캡슐화된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 쉘 내 올리고뉴클레오티드는 압타머이다. 따라서 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드의 모든 특징 및 양태 (예를 들어, 길이, 유형 (DNA, RNA, 이의 변형된 형태), 선택적 스페이서의 존재)도 압타머에 적용된다. 압타머는 관심있는 다양한 표적 분석물에 결합하도록 진화될 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열이다. 압타머는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 부분 이중 가닥일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 검출 가능한 마커 (예를 들어, 형광단, 방사성표지) 및 치료제 (예를 들어, 항체)를 올리고뉴클레오티드에 부착하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
스페이서 . 일부 양태 및 구현예에서, SNA의 나노입자 코어에 부착된 올리고뉴클레오티드의 쉘 내 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 스페이서를 포함한다. 본원에 사용된 "스페이서"는 나노입자 코어와 올리고뉴클레오티드 사이의 거리를 증가시키거나, 다중 카피로 나노입자 코어에 부착될 때 개별 올리고뉴클레오티드 사이의 거리를 증가시키거나, SNA의 합성을 개선시키는 역할을 하는 모이어티를 의미한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드와 나노입자 코어 사이에 스페이서가 위치하는 것이 고려된다.
일부 양태에서, 존재하는 경우 스페이서는 유기 모이어티이다. 일부 양태에서, 스페이서는 수용성 중합체, 핵산, 폴리펩티드, 올리고당, 탄수화물, 지질, 에틸글리콜, 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 중합체이다. 본 개시내용의 임의의 양태 또는 구현예에서, 스페이서는 올리고(에틸렌 글리콜)계 스페이서이다. 다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 스페이서 (예를 들어, 스페이서-18 (헥사에틸렌글리콜)) 모이어티를 포함한다. 추가 구현예에서, 스페이서는 알칸계 스페이서 (예를 들어, C12)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 올리고뉴클레오티드 스페이서 (예를 들어, T5)이다. 올리고뉴클레오티드 스페이서는 나노입자 코어 또는 표적에 결합되는 올리고뉴클레오티드의 능력을 방해하지 않는 임의의 서열을 가질 수 있다. 특정 양태에서, 올리고뉴클레오티드 스페이서의 염기는 모두 아데닐산, 모두 티미딜산, 모두 시티딜산, 모두 구아닐산, 모두 유리딜산, 또는 모든 기타 변형된 염기이다.
다양한 구현예에서, 스페이서의 길이는 적어도 약 2개 뉴클레오티드, 적어도 약 3개 뉴클레오티드, 적어도 약 4개 뉴클레오티드, 적어도 약 5개 뉴클레오티드, 5-10개 뉴클레오티드, 10개 뉴클레오티드, 10-30개 뉴클레오티드이거나 이와 동등하거나, 또는 심지어 30개 이상의 뉴클레오티드이다.
SNA 표면 밀도 . 일반적으로, 적어도 약 2 pmoles/cm2인 올리고뉴클레오티드의 표면 밀도가 안정한 SNA를 제공하는데 적절할 것이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 SNA (예를 들어, ProSNA, LSNA, LNP-SNA)의 표면 밀도는 적어도 15 pmoles/cm2이다. 또한, 올리고뉴클레오티드가 SNA의 나노입자 코어에 약 2 pmol/cm2 내지 약 200 pmol/cm2, 또는 약 10 pmol/cm2 내지 약 100 pmol/cm2. 추가 구현예에서, 표면 밀도는 적어도 약 2 pmol/cm2, 적어도 3 pmol/cm2, 적어도 4 pmol/cm2, 적어도 5 pmol/cm2, 적어도 6 pmol/cm2, 적어도 7 pmol/cm2, 적어도 8 pmol/cm2, 적어도 9 pmol/cm2, 적어도 10 pmol/cm2, 적어도 약 15 pmol/cm2, 적어도 약 19 pmol/cm2, 적어도 약 20 pmol/cm2, 적어도 약 25 pmol/cm2, 적어도 약 30 pmol/cm2, 적어도 약 35 pmol/cm2, 적어도 약 40 pmol/cm2, 적어도 약 45 pmol/cm2, 적어도 약 50 pmol/cm2, 적어도 약 55 pmol/cm2, 적어도 약 60 pmol/cm2, 적어도 약 65 pmol/cm2, 적어도 약 70 pmol/cm2, 적어도 약 75 pmol/cm2, 적어도 약 80 pmol/cm2, 적어도 약 85 pmol/cm2, 적어도 약 90 pmol/cm2, 적어도 약 95 pmol/cm2, 적어도 약 100 pmol/cm2, 적어도 약 125 pmol/cm2, 적어도 약 150 pmol/cm2, 적어도 약 175 pmol/cm2, 적어도 약 200 pmol/cm2, 적어도 약 250 pmol/cm2, 적어도 약 300 pmol/cm2, 적어도 약 350 pmol/cm2, 적어도 약 400 pmol/cm2, 적어도 약 450 pmol/cm2, 적어도 약 500 pmol/cm2, 적어도 약 550 pmol/cm2, 적어도 약 600 pmol/cm2, 적어도 약 650 pmol/cm2, 적어도 약 700 pmol/cm2, 적어도 약 750 pmol/cm2, 적어도 약 800 pmol/cm2, 적어도 약 850 pmol/cm2, 적어도 약 900 pmol/cm2, 적어도 약 950 pmol/cm2, 적어도 약 1000 pmol/cm2 또는 그 이상의 표면 밀도로 부착되는 방법이 본원에서 제공된다. 추가 구현예에서, 표면 밀도는 약 2 pmol/cm2 미만, 약 3 pmol/cm2 미만, 약 4 pmol/cm2 미만, 약 5 pmol/cm2 미만, 약 6 pmol/cm2 미만, 약 7 pmol/cm2 미만, 약 8 pmol/cm2 미만, 약 9 pmol/cm2 미만, 약 10 pmol/cm2 미만, 약 15 pmol/cm2 미만, 약 19 pmol/cm2 미만, 약 20 pmol/cm2 미만, 약 25 pmol/cm2 미만, 약 30 pmol/cm2 미만, 약 35 pmol/cm2 미만, 약 40 pmol/cm2 미만, 약 45 pmol/cm2 미만, 약 50 pmol/cm2 미만, 약 55 pmol/cm2 미만, 약 60 pmol/cm2 미만, 약 65 pmol/cm2 미만, 약 70 pmol/cm2 미만, 약 75 pmol/cm2 미만, 약 80 pmol/cm2 미만, 약 85 pmol/cm2 미만, 약 90 pmol/cm2 미만, 약 95 pmol/cm2 미만, 약 100 pmol/cm2 미만, 약 125 pmol/cm2 미만, 약 150 pmol/cm2 미만, 약 175 pmol/cm2 미만, 약 200 pmol/cm2 미만, 약 250 pmol/cm2 미만, 약 300 pmol/cm2 미만, 약 350 pmol/cm2 미만, 약 400 pmol/cm2 미만, 약 450 pmol/cm2 미만, 약 500 pmol/cm2 미만, 약 550 pmol/cm2 미만, 약 600 pmol/cm2 미만, 약 650 pmol/cm2 미만, 약 700 pmol/cm2 미만, 약 750 pmol/cm2 미만, 약 800 pmol/cm2 미만, 약 850 pmol/cm2 미만, 약 900 pmol/cm2 미만, 약 950 pmol/cm2 미만, 또는 약 1000 pmol/cm2 미만이다.
대안적으로, SNA에 부착된 올리고뉴클레오티드의 밀도는 SNA에 부착된 올리고뉴클레오티드의 수로 측정된다. 본 개시내용의 SNA에 부착된 올리고뉴클레오티드의 표면 밀도와 관련하여, 본원에 기재된 바와 같은 SNA는 그 표면에 약 1 내지 약 2,500, 또는 약 1 내지 약 500개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것으로 고려된다. 다양한 구현예에서, SNA는 나노입자 코어에 부착된 올리고뉴클레오티드의 쉘 내에 약 10 내지 약 500, 또는 약 10 내지 약 300, 또는 약 10 내지 약 200, 또는 약 10 내지 약 190, 또는 약 10 내지 약 180, 또는 약 10 내지 약 170, 또는 약 10 내지 약 160, 또는 약 10 내지 약 150, 또는 약 10 내지 약 140, 또는 약 10 내지 약 130, 또는 약 10 내지 약 120, 또는 약 10 내지 약 110, 또는 약 10 내지 약 100, 또는 10 내지 약 90, 또는 약 10 내지 약 80, 또는 약 10 내지 약 70, 또는 약 10 내지 약 60, 또는 약 10 내지 약 50, 또는 약 10 내지 약 40, 또는 약 10 내지 약 30, 또는 약 10 내지 약 20개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, SNA는 나노입자 코어에 부착된 올리고뉴클레오티드의 쉘 내에 약 80 내지 약 140개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 추가 구현예에서, SNA는 나노입자 코어에 부착된 올리고뉴클레오티드의 쉘 내에 적어도 약 5, 10, 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 또는 200개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 추가 구현예에서, SNA는 나노입자 코어에 부착된 올리고뉴클레오티드의 쉘 내에 5, 10, 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 또는 200개의 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 추가 구현예에서, SNA의 나노입자 코어에 부착된 올리고뉴클레오티드의 쉘은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, SNA의 나노입자 코어에 부착된 올리고뉴클레오티드의 쉘은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 올리고뉴클레오티드로 이루어진다.
조성물
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 SNA, 또는 그의 다수를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용의 임의의 양태 또는 구현예에서, 상기 조성물은 가이드 RNA를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다. 용어 "담체"는 본원에 기재된 바와 같은 SNA가 대상체에게 투여되는 비히클을 지칭한다. 본 개시내용에 따른 SNA와 호환되는 임의의 기존 매체 또는 제제가 사용될 수 있다. 용어 담체는 희석제, 부형제, 보조제 및 이들의 조합을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 당업계에 잘 알려졌다 (예를 들어, Martin의 Remington's Pharmaceutical Sciences, 1975 참조, 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨).
예시적인 "희석제"는 주사용수, 식염수, 트리스, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매를 포함한다. 예시적인 "부형제"는 아미노산 및 아미노산 유도체와 같은 안정화제, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 폴리올, 산, 아민, 다당류 또는 다당류 유도체, 염 및 계면활성제; 및 pH-조정제를 포함하지만 이제 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 SNA는 면역자극 올리고뉴클레오티드 (예를 들어 제한 없이, CpG 올리고뉴클레오티드)를 보조제로서 포함한다. 당업계에 공지된 다른 보조제도 본 개시내용의 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들어, 보조제는 알루미늄 또는 이의 염, 미네랄 오일, 프로인트 보조제, 식물성 오일, 유중수 에멀젼, 미네랄 염, 소분자 (예를 들어, 이미퀴모드, 레시퀴모드), 박테리아 성분 (예를 들어, 플라젤린, 모노포스포릴 지질 A), 또는 이들의 조합일 수 있다.
유전자 조절에서 SNA의 용도
본 개시내용의 일부 양태에서, SNA (예를 들어, ProSNA, LNP-SNA, LSNA)와 연관된 올리고뉴클레오티드는 유전자의 발현을 억제한다. 본원에 제공된 유전자 산물 발현을 억제하는 방법에는 SNA가 없는 경우의 유전자 산물 발현과 비교하여 표적 유전자 산물의 발현이 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 억제되는 것을 포함한다. 다시 말해서, 제공된 방법은 본질적으로 표적 유전자 산물의 발현을 어느 정도 억제하는 방법을 포함한다.
억제 정도는 체액 샘플 또는 생검 샘플로부터 또는 당업계에 잘 알려진 영상 기술에 의해 생체 내에서 결정된다. 대안적으로, 억제 정도는 일반적으로 특정 유형의 SNA 및 특정 올리고뉴클레오티드의 사용으로 인해 생체 내에서 예상될 수 있는 억제 정도의 예측 가능한 측정으로서 세포 배양 분석에서 결정된다.
본 개시내용의 일부 양태에서, SNA는 유전자 억제성 기능뿐만 아니라 제제 전달 기능을 모두 수행하는 것으로 고려된다. 그러한 양태에서, 제제 (예를 들어, 치료제)는 SNA와 연관되고 입자는 표적 유전자 발현의 억제를 달성하도록 설계된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드로 추가로 기능화된다.
다양한 양태에서, 방법은 표적 폴리뉴클레오티드에 100% 상보적인, 즉, 완벽한 일치인 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함하는 반면, 다른 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 폴리뉴클레오티드에 적어도 (즉 그 이상을 의미함) 약 95% 상보적, 올리고뉴클레오티드가 표적 유전자 산물의 원하는 정도의 억제를 달성할 수 있는 정도까지 올리고뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 적어도 약 90%, 적어도 약 85%, 적어도 약 80%, 적어도 약 75%, 적어도 약 70%, 적어도 약 65%, 적어도 약 60%, 적어도 약 55%, 적어도 약 50%, 적어도 약 45%, 적어도 약 40%, 적어도 약 35%, 적어도 약 30%, 적어도 약 25%, 적어도 약 20% 상보적이다.
필요한 안티센스 화합물의 서열이 특이적으로 혼성화 되기 위해 표적 핵산의 서열과 100% 상보적일 필요는 없다는 것이 당업계에서 이해된다. 더욱이, 올리고뉴클레오티드는 개재 또는 인접 세그먼트가 혼성화 사건 (예를 들어, 루프 구조 또는 헤어핀 구조)에 관여하지 않도록 하나 이상의 세그먼트에 걸쳐 혼성화할 수 있다. 상보성 퍼센트는 올리고뉴클레오티드의 길이에 따라 결정된다. 예를 들어, 안티센스 화합물의 20개 뉴클레오티드 중 18개가 전체 길이가 100개 뉴클레오티드인 표적 폴리뉴클레오티드의 20개 뉴클레오티드 영역에 상보적인 안티센스 화합물이 주어지면, 올리고뉴클레오티드는 90 퍼센트 상보적일 것이다. 이 예에서, 나머지 비상보적 뉴클레오티드는 상보적 핵염기와 클러스터링되거나 산재될 수 있으며 서로 또는 상보적 뉴클레오티드에 인접할 필요는 없다. 표적 핵산 영역과 안티센스 화합물의 퍼센트 상보성은 당업계에 공지된 BLAST 프로그램 (기본 국소 정렬 검색 도구) 및 PowerBLAST 프로그램 (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang 및 Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656)을 사용하여 일상적으로 결정될 수 있다.
이러한 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA이다. RNA는 조절 기능을 수행하는 억제성 RNA (RNAi)와 같은 억제성 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 다양한 구현예에서 작은 억제성 RNA (siRNA), 단일 가닥 RNA (ssRNA), 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대안적으로, RNA는 조절 기능을 수행하는 마이크로RNA이다. 일부 구현예에서, DNA는 안티센스-DNA이다. 일부 구현예에서, RNA는 피위-상호작용 RNA (piRNA)이다.
면역 조절에서 SNA의 용도
톨-유사 수용체 (TLR)는 감시 세포에서 발현되는 단백질 종류로 선천성 면역 체계 조절에 핵심적인 역할을 한다. 포유류의 면역 체계는 감염성 질환과 싸우기 위해 두 가지 일반적인 전략을 사용한다. 병원체 노출은 면역자극성 사이토카인, 케모카인 및 다반응성 IgM 항체의 생성을 특징으로 하는 선천적 면역 반응을 빠르게 유발한다. 선천적 면역체계는 다양한 감염성 미생물 그룹에 의해 발현되는 병원체 관련 분자 패턴 (PAMP)에 노출되면 활성화된다. PAMP의 인식은 톨 유사 수용체 계열의 구성원에 의해 매개된다. 특정 올리고뉴클레오티드에 반응하는 TLR 4, TLR 8 및 TLR 9과 같은 TLR 수용체는 엔도좀이라고 불리는 특별한 세포 내 구획 내부에 위치한다. 예를 들어 제한 없이, TLR 4, TLR 8 및 TLR 9 수용체의 조절 메커니즘은 DNA-단백질 상호작용에 기초한다.
본원에 기재된 바와 같은, 박테리아 DNA에서 발견되는 것과 유사한 CpG 모티프를 함유하는 합성 면역자극 올리고뉴클레오티드는 TLR 수용체의 유사한 반응을 자극한다. 따라서, 본 개시내용의 CpG 올리고뉴클레오티드는 TLR 작용제로서 기능하는 능력을 갖는다. 본 개시내용에 의해 고려되는 다른 TLR 작용제는 제한 없이, 단일 가닥 RNA 및 소분자 (예를 들어, R848 (레시퀴모드))를 포함한다. 따라서, 면역조절 (예를 들어, 면역자극) 올리고뉴클레오티드는 면역 결핍 및 암 치료를 포함하여 다양한 잠재적인 치료 용도를 가지고 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 SNA는 톨-유사 수용체 (TLR)의 활성을 조절하는 방법에 사용된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 SNA (예를 들어, ProSNA, LSNA, LNP-SNA)는 TLR 길항제인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, TLR 길항제는 단일 가닥 DNA (ssDNA)이다.
일부 구현예에서, 면역체계의 하향 조절은 톨-유사 수용체의 발현을 담당하는 유전자를 녹다운시키는 것을 포함한다. 이러한 안티센스 접근법은 임의의 톨-유사 단백질의 발현을 억제하기 위해 본 개시내용의 SNA의 사용을 포함한다.
따라서 일부 구현예에서, 톨 유사 수용체를 조절하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 SNA를 활용하는 방법이 개시된다. 이 방법은 각각 TLR 작용제 또는 TLR 길항제를 사용하여 톨-유사 수용체 활성을 상향 조절하거나 하향 조절한다. 방법은 톨-유사 수용체를 갖는 세포를 본 개시내용의 SNA와 접촉시켜, 톨-유사 수용체의 활성 및/또는 발현을 조절하는 것을 포함한다. 조절되는 톨-유사 수용체는 톨-유사 수용체 1, 톨-유사 수용체 2, 톨-유사 수용체 3, 톨-유사 수용체 4, 톨-유사 수용체 5, 톨-유사 수용체 6, 톨-유사 수용체 7, 톨-유사 수용체 8, 톨-유사 수용체 9, 톨-유사 수용체 10, 톨-유사 수용체 11, 톨-유사 수용체 12, 및/또는 톨-유사 수용체 13 중 하나 이상을 포함한다.
장애 치료를 위한 SNA의 용도
일부 구현예에서, 본 개시내용의 SNA (예를 들어, ProSNA, LSNA, LNP-SNA)는 장애를 치료하는 데 사용된다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용의 SNA를 이를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에 투여하는 것을 포함하는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 투여는 장애를 치료한다. 다양한 구현예에서, 장애는 암, 감염성 질환, 폐 질환, 위장 질환, 혈액학적 질환, 바이러스성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환, 유전 질환, 심혈관 질환, 또는 이들의 조합을 포함한다. "유효량"의 SNA는 예를 들어, 유전자 편집을 수행하고 장애를 치료하기에 충분한 양이다. 유효량의 SNA는 또한 예를 들어, 유전자 발현을 억제하고, 선천성 면역 반응을 활성화하거나, 또는 이들의 조합 및 장애를 치료하는 양이다. 따라서, 선천성 면역 반응을 활성화하는 방법이 또한 본원에서 고려되며, 이러한 방법은 대상체에서 선천성 면역 반응을 활성화하기에 효과적인 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 본 개시내용의 SNA를 투여하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 SNA는 비경구 투여, 근육 내 주사, 피하 주사, 피내 투여 및/또는 경구 또는 비강 내와 같은 점막 투여와 같은 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 추가적인 투여 경로는 정맥 내, 복강 내, 비강 내 투여, 질 내, 직장 내 및 경구 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 개별적으로 또는 동시에 다양한 투여 경로의 조합도 본 개시내용에 의해 고려된다.
치료제
본원에 제공된 SNA는 선택적으로 치료제 또는 이의 복수를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 치료제는 SNA의 나노입자 코어의 외부에 부착된 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 올리고뉴클레오티드와 단순히 결합되고/되거나 치료제는 SNA의 나노입자 코어와 결합되고/되거나 치료제는 SNA에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 치료제는 나노입자 코어에 부착되지 않은 올리고뉴클레오티드 쉘의 올리고뉴클레오티드 말단과 결합된다 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드가 3' 말단을 통해 나노입자 코어에 부착된 경우, 치료제는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단과 결합되어 있음). 대안적으로, 일부 구현예에서, 치료제는 나노입자 코어에 부착된 올리고뉴클레오티드 쉘 내의 올리고뉴클레오티드 말단과 결합된다 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드가 3' 말단을 통해 나노입자 코어에 부착된 경우, 치료제는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단과 결합되어 있음). 일부 구현예에서, 치료제는 SNA의 나노입자 코어의 외부에 부착된 올리고뉴클레오티드 쉘 내의 올리고뉴클레오티드와 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 치료제는 SNA의 나노입자 코어의 외부에 부착된 올리고뉴클레오티드 쉘 내의 올리고뉴클레오티드와 비공유적으로 결합된다. 그러나 본 개시내용은 하나 이상의 치료제가 SNA의 나노입자 코어의 외부에 부착된 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 올리고뉴클레오티드와 공유 및 비공유적으로 결합된 SNA를 제공하는 것으로 이해된다. 비공유 결합에는 혼성화, 단백질 결합 및/또는 소수성 상호작용이 포함된다는 것도 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 치료제는 본 개시내용의 SNA와 별도로 투여된다. 따라서, 일부 구현예에서, 치료제는 장애를 치료하기 위해 본 개시내용의 SNA 이전, 이후 또는 동시에 투여된다.
본 개시내용에 의해 고려되는 치료제는 제한 없이 단백질 (예를 들어, 치료 단백질), 성장 인자, 호르몬, 인터페론, 인터루킨, 항체 또는 항체 단편, 소분자, 펩티드, 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 화학요법제, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "소분자"는 화학적 화합물, 약물, 또는 천연 또는 합성의 기타 저분자량 유기 화합물을 지칭한다. "저분자량"은 1500 달톤 미만, 전형적으로 100 내지 700 달톤의 분자량을 갖는 화합물을 의미한다.
실시예
아래 실시예와 관련하여, "CRISPR-SNA"의 사용에 대한 언급은 임의의 GALA 펩티드 서열을 포함하지 않는 Cas9 단백질의 활용을 나타낼 수 있다. 또한, 아래 실시예와 관련하여, "Cas9 SNA"의 사용에 대한 언급은 N-말단에서 C-말단으로 순서대로 다음 구조를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 "융합된" Cas9 단백질의 활용을 나타낼 수 있다: (i) 하나 이상의 GALA 펩티드; (ii) 유전자 편집 단백질, 및 (iii) 핵 국소화 신호 (NLS).
실시예 1
유전자 편집에서 LSNA의 용도
본 개시내용은 구형 핵산을 사용하여 유전자 편집 단백질을 포유동물 세포 내로 전달하는 방법을 제공한다. tracrRNA 및 crRNA를 갖는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 효소 활성 리보핵산단백질 (RNP) 복합체가 합성된 다음, RNP는 95% 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3 포스파티딜콜린 (DOPC) 및 5% 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(6-아지도헥사노일) (DPPE-아지드)로 만들어진 리포솜에 캡슐화된다. 그런 다음 리포솜은 5' DBCO-변형된 DNA로 기능화되어 LSNA를 생성한다. 이 입자는 효소 활성 Cas9를 함유하고 포유동물 세포에 효율적으로 흡수된다.
방법
달리 명시하지 않는 한, 모든 시약은 시판 공급원에서 구입하여 받은 대로 사용했다. 올리고뉴클레오티드, crRNA 및 tracrRNA 합성을 위해, 모든 포스포라미디트 및 시약은 Glen Research, Co. (Sterling, VA, 미국)에서 구입했다. 모든 지질은 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, 미국)에서 건조 분말 형태 또는 클로로포름으로 구입하여 추가 정제 없이 사용했다. EnGen® Cas9 NLS (Cas9), 단백질분해효소 K 및 Phusion PCR 키트는 New England Biolabs (Ipswich, MA, 미국)에서 구입했다. Alexa Fluor 647 NHS 에스테르 염료 (Alexa 647)는 Lumiprobe Corp. (Cockneysville, MD, 미국)에서 구입했다. 플라스미드는 AddGene (Cambridge, MA, 미국에서 구입했다. GelRed 염료는 Biotium Inc. (Fremont, CA, 미국)에서 구입했다. 다른 모든 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, 미국)에서 구입했다. C166-GFP 세포는 ATCC (Manassas, VA, 미국)에서 구입했고, Opti-MEM은 Life Technologies (Carlsbad, CA)에서 구입했다.
Cas9 표지 및 정량화
Cas9을 추적하고 정량화하기 위해, Cas9 2 나노몰을 Alexa 647 NHS 에스테르 10 나노몰과 함께 4℃에서 1X HBS에서 밤새 배양하여, Alexa-Cas9을 생성했다. 반응하지 않은 염료를 제거하기 위해, Alexa-Cas9을 1X HBS에서 평형화된 NAP5 컬럼을 통해 실행하고, 1 mL 1X HBS에서 용출했다. 2 나노몰의 변형되지 않은 Cas9를 NAP5 컬럼을 사용하여 1X HBS로 교환하고, Alexa Cas9과 결합했다. Cas9 및 Alexa 염료의 농도는 각각 280 nm 및 650 nm에서의 흡광도를 이용하여 계산하였고, Cas9에 대한 Alexa 염료의 몰 비를 계산하였다. 그런 다음 Alexa-Cas9을 1 μM로 희석했다. 20 μL 분취량은 활성 및 농도 분석을 위해 남겨두었다.
Cas9 리보핵산단백질 합성 및 농도
10 나노몰의 crRNA 및 tracrRNA는 1X HBS에서 10μM crRNA와 10μM tracrRNA를 95℃에서 5분 동안 배양하여 생성하고, 10분 동안 실온으로 냉각되도록 하였다. 그런 다음 10 나노몰의 crRNA/tracrRNA 복합체를 4 나노몰의 1 μM Alexa-Cas9과 혼합하고 실온에서 10분 동안 방치하여, Cas9 리보핵단백질 (RNP)을 형성하였다. 그런 다음 RNP를 Amicon 10K 스핀 필터에서 5분간 농축한 후, 보유 액체량이 500μL 이하에 도달할 때까지 재현탁했다. Cas9 농도는 Alexa 647 염료의 흡광도를 사용하여 다시 정량화되었다 활성 및 농도 측정을 위해 20μL를 따로 보관했다.
SNA의 합성 및 정제
Cas9 RNP를 캡슐화하는 리포솜을 합성하기 위해, 클로로포름 중 DOPC 3mg과 DPPE-아지드 0.15mg의 혼합물을 동결건조하여 탈수된 인지질 필름을 생성했다. 그런 다음 지질 필름을 1X HBS에서 400 μL의 Alexa 647-표지 리보핵단백질 복합체 (Alexa-RNP)로 5-8 μM 농도로 재수화했다. 그런 다음 이 용액을 액체 질소와 실온 수조 초음파 처리기를 사용하여 7회 동결/해동 주기를 거쳐 단일 단층 소포 (SUV)를 생성했다. SUV를 Sepharose 6B로 패킹된 컬럼으로 실행하고 1X HBS에서 평형화하여 캡슐화되지 않은 RNP와 분리했다. 다분산도를 줄이기 위해, SUV를 200 nm에 이어서 100 nm 막 필터를 통해 2회 압출하였다. 캡슐화되지 않은 나머지 RNP를 제거하기 위해, SUV를 단백질분해효소 K (10 U, 500 μL 1X NEB 완충액 2 + 1X HBS 중)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했다. SUV를 Superdex 200으로 패킹된 컬럼을 사용하여 소화된 RNP로부터 분리하고 1X HBS에서 평형화하였다. SNA를 생성하기 위해, SUV를 DBCO로 5' 말단에서 기능화된 올리고뉴클레오티드 및 내부적으로 Cy3와 밤새 배양하였다 (대략 20개 인지질당 1개의 DNA). 그런 다음 SNA를 Superdex 200 로 패킹된 컬럼을 사용하여 유리 올리고뉴클레오티드로부터 분리하고 1X HBS에서 평형화하였다. 도 1 참조.
Cas9 및 DNA 로딩의 정량화
SUV 농도를 측정하기 위해, 유도 결합 플라즈마 광방출분광법 (ICP-OES)과 인 표준물질을 사용하여 인지질 농도를 계산했다. 리포솜 직경은 동적광산란 (DLS)을 통해 측정하였고, 리포솜당 인지질의 수는 하기 방정식 1을 이용하여 계산하였다. SUV 농도는 인지질 농도를 SUV당 인지질 수로 나누어 계산했다.
방정식 1. D는 리포솜의 직경 (Z 평균) (또는 SNA의 Z 평균, DNA 쉘의 경우 5 nm 제외)이다. 알파 (α)는 DOPC = 0.72 nm2 인 지질 머리 그룹의 발자국이다.
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SNA를 합성한 후 (도 1), 올리고뉴클레오티드의 농도는 (리포솜을 파괴하고 올리고뉴클레오티드를 분산시키기 위해) 0.1% Tween 20 세제로 SNA 샘플을 처리하여 플레이트 판독기에서, SNA 샘플 내 Cy3 형광을 유리 DBCO- 및 Cy3-표지된 올리고뉴클레오티드로부터 생성된 표준 곡선과 비교하여 계산하여 측정하였다. 리포솜의 농도는 위와 같이 ICP-OES를 사용하여 결정되었으며, 인 농도는 올리고뉴클레오티드의 농도와 올리고뉴클레오티드당 인 원자의 수를 기준으로 보정되었다.
RNP의 농도를 계산하기 위해, 표준 곡선을 보존된 Alexa-RNP 분액으로부터 생성했다. RNP의 농도는 리포솜 샘플에서 Alexa 647 형광을 측정한 다음, 이를 플레이트 판독기에서 Alexa-RNP 표준 곡선의 선형 회귀에 플롯하여 결정했다.
대표적인 합성에서, 115 nm CRISPR SNA는 입자당 대략 450개의 DNA 가닥으로 생성되었으며, 리포솜당 대략 3개의 RNP를 캡슐화했다 (도 2).
시험관 내 Cas9 DNA 절단 검정
Cas9 효소 활성을 측정하기 위해, EGFP 유전자를 표적으로 하는 RNP를 합성하고 CRISPR SNA를 만드는 데 사용했다. 정제된 플라스미드 pcDNA3-EGFP는 제한 효소 Sma I로 소화시켜 선형화되었다. 선형화된 플라스미드와 함께 배양된 활성 RNP는 이를 2kb 및 4kb 단편으로 절단하며, 이는 30분 동안 TBE 완충액에서 실행되는 1% 아가로스 전기영동 겔에서 볼 수 있다. CRISPR SNA 합성 중에 RNP가 분해되거나 활성을 잃지 않는지 확인하기 위해, 200 나노그램의 선형화된 플라스미드를 만든 직후, 동결/해동 사이클링 후, 크기 배제 후, 및 압출 후 1 pmol 및 0.1 pmol Alexa RNP와 함께 배양하였다. RNP는 이 단계에서 활성을 잃지 않았다 (도 3).
RNP는 SNA 합성 과정 전반에 걸쳐 활성 상태를 유지한다 -- 프로테아제 안정성 연구
RNP가 SNA 내부에 캡슐화되어 있는지 확인하기 위해, 깨끗한 CRISPR SNA를 NEB의 제한 효소 완충액 2에서 단백질분해효소 K와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했다. 대조군으로서, Alexa-RNP를 빈 SNA와 혼합하고 단백질분해효소 K와 함께 배양했다. 그런 다음 배양된 샘플을 1x HBS로 평형화된 Superdex 200 크기 배제 컬럼을 통해 200μL 분획으로 용출했다. 그런 다음 이러한 분획을 Cy3 및 Alexa Fluor 647 형광을 위한 형광 젤 스캐너로 이미지화했다. 캡슐화된 RNP는 단백질분해효소 K 소화 후 SNA와 함께 용출되는 반면, 빈 SNA와 함께 배양된 RNP는 소화되었으며, 따라서 RNP-관련 Alexa 형광은 SNA 관련 Cy3 형광보다 훨씬 늦게 용출되었다.
캡슐화된 RNP가 여전히 활성 상태인지 확인하기 위해, 시험관 내 DNA 절단 검정을 여러 샘플에서 실행했다. CRISPR SNA의 리포솜은 위와 같이 단백질분해효소 K와 함께 배양하기 전이나 후에 0.1% Tween 20 세제로 파괴되었다. 시험관 내 DNA 절단 활성 검정은 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF)로 단백질분해효소 K를 비활성화한 후 수행되었다. 대조군 RNP의 경우, Tween은 활성에 영향을 미치지 않았지만, 단백질분해효소 K 배양은 활성을 폐지했다. 그러나 CISPR SNA는 단백질분해효소 K 배양 후에 Tween을 첨가한 경우 활성을 유지했지만, 단백질분해효소 K 배양 전에 Tween을 첨가한 경우에는 활성을 나타내지 않았다 (도 4). 이는 CRISPR SNA의 RNP가 캡슐화되어 있고 (프로테아제 소화로부터 보호됨) 효소 활성이 있음을 나타낸다.
세포 흡수 연구
SNA가 RNP를 세포 내로 전달할 수 있는지 결정하기 위해, C166-GFP 세포를 CRISPR SNA, 빈 SNA, 맨 리포솜에 캡슐화된 RNP, 및 RNAiMAX 형질감염 시약과 복합체화된 RNP와 함께 Opti-MEM 환원 혈청 배지에서 16시간 동안 배양했다. 그런 다음 Alexa Fluor 647로 표지된 RNP의 흡수를 유 세포 분석을 통해 측정했다. CRISPR-SNA로 처리한 세포는 RNP/RNAiMAX 혼합물 또는 맨 리포솜에 캡슐화된 RNP로 처리된 것보다 더 높은 중간 형광과 고형광 (형광 >1000 AU) 세포의 비율이 더 높은 반면, 처리되지 않은 세포는 거의 형광을 나타내지 않았다 (도 5). 이 데이터는 리포솜 SNA에 캡슐화된 유전자 편집 효소가 포유동물 세포에 적극적으로 흡수된다는 것을 나타낸다.
실시예 2
이 실시예는 Cas9-sgRNA 복합체를 위한 효율적인 게놈 편집 전달 플랫폼인 CRISPR/Cas9 ProSNA의 합성을 자세히 설명한다. 본원에 기재된 바와 같은, Cas9은 ProSNA의 나노입자 코어 역할을 한다. 표면 리신 아민은 반대 말단에 아지드 및 아민 반응성 N-히드록시 숙신이미드 부분이 있는 작은 폴리에틸렌 글리콜 중합체와 반응했다. 그런 다음 공유 결합된 아지드를 5' 말단에 긴장된 시클로옥틴, 디벤조시클로옥틴 (DBCO)을 함유하는 DNA 가닥과 반응시켰다. 여기에 사용된 서열 (dGGT)10은 폴리 dT 쉘에 비해 G가 풍부한 쉘을 가진 SNA의 향상된 세포 흡수를 보여주는 이전 연구를 기반으로 선택되었다. 3차원 올리고뉴클레오티드 쉘은 Cas9 단백질을 안정화하고 세포 진입과 관련하여 기능적으로 만드는 입체 및 정전기 장벽을 만든다. 이 전략을 통해 뛰어난 생체적합성과 세포 흡수 성능, 그리고 인간 세포주에서 약 42.5%의 우수한 게놈 편집 활성을 갖춘 게놈 편집 도구를 쉽게 생성할 수 있다. 우리의 연구 결과는 Cas9 ProSNA가 게놈 편집 및 유전자 침묵에 대한 매력적인 관점을 가지고 있음을 보여준다.
재료
한천이 포함된 LB 액체배지 (카탈로그 번호 L2897-250G)와 LB 액체배지는 Sigma에서 구입했다. 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (카탈로그 번호 DSI5600)는 dot scientific inc에서 구입했다. 인산염 완충 식염수 (PBS, pH 7.4)는 Gibco Life Technologies에서 구입했다. SA MALDI 매트릭스(카탈로그 번호 90032), Alexa Fluor 647 (카탈로그 번호 A37573) 및 NHS-PEG4-아지드 (카탈로그 번호 26130)는 ThermoFisher에서 구입했다. T7 RNA 중합효소 (M0251S)는 NEB에서 구입했다. 모든 용액을 제조하기 위해 초순수 (18.25 MΩ.cm, 25℃)를 사용했다.
올리고뉴클레오티드 설계, 합성 및 정제
Glen Research에서 얻은 시약과 표준 프로토콜을 사용하여 고체 지지체에서 올리고뉴클레오티드를 합성했다. 실온에서 밤새 30% NH4OH를 사용하여 고체 지지체로부터 생성물을 절단하고, 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액 중 0 내지 75% 아세토니트릴 구배를 사용하여 45분에 걸쳐 역상 HPLC를 사용하여 정제했다. HPLC 정제 후, 20% 아세트산에서 2시간 동안 최종 디메톡시트리틸기를 제거하고, 이어서 에틸아세테이트로 추출했다. 올리고뉴클레오티드의 질량은 3-히드록시피콜린산을 매트릭스로 사용하는 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량 분석기를 사용하여 확인되었다. sgRNA는 매뉴얼에 따라 NEB T7 전사 키트를 사용하여 합성되었다.
Cas9 SNA의 합성 및 특성화
Cas9 발현 및 정제. Cas9 플라스미드(#87703)를 전기 충격에 의해 One Shot®BL21(DE3) 화학적으로 능력이 있는 대장균 (Thermo Fisher)으로 형질전환시키고, 세포를 100 μg/mL 암피실린이 포함된 LB 한천 플레이트에서 밤새 성장시켰다. 단일 콜로니를 선택하고, 7 mL 배양물을 LB 액체배지에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 이러한 배양물을 750 mL의 2xYBT 액체배지 및 100 μg/mL 암피실린에 첨가하고, 세포를 0.6-0.9의 광학 밀도까지 37℃에서 성장시킨 다음, 17℃에서 밤새 1 mM 이소프로필β-D-1-티오갈락토피라노시드로 유도했다. 세포를 스핀다운 (6000 g, 15분)하고 100 mL의 1x PBS에서 재현탁시킨 다음, 고압 균질기를 사용하여 용해했다. 세포 용해물을 30000 g에서 30분 동안 원심분리하여 정화하고 Bio-Scale™ Mini Profinity™ IMAC 카트리지 (Bio-Rad)에 로드했다. 컬럼을 100 mL의 1x PBS로 세척한 다음, 250 mM 이미다졸을 포함하는 동일한 완충액에서 용출시켰다. 용출된 분획은 투석을 통해 추가로 정제되었다.
Alexa Fluor 647 (AF647)과 표면 접근 가능한 시스테인의 반응. Cas9 단백질을 1X 인산염 완충 식염수 (1X PBS; Thermo Fisher Scientific)에 용해시켰다. 그런 다음, DMSO에 용해된, 10 당량의 Alexa Fluor 647-C2-말레이미드 (Thermo Fisher Scientific)를 1500 μL 1X PBS 중 대략 10 μM Cas9에 첨가하고 반응물을 밤새 진탕시켰다 (900 rpm). 접합되지 않은 Alexa Fluor 647을 여액이 UV-Vis에 의해 650 nm에서 검출 가능한 흡광도를 갖지 않을 때까지 100 kDa 필터를 사용하여 원심분리를 반복하여 제거했다. 단백질당 Alexa Fluor 647 변형 수는 UV-Vis 분광학을 기반으로 계산되었다.
NHS-PEG4-아지드와 표면 접근 가능한 리신의 반응. 100 mM의 농도로 무수 DMSO에 용해된 50 당량의 NHS-PEG4 -아지드 가교제 (Thermo Fisher Scientific)를 550 μL 1X PBS 중 대략 45 μM Cas9-AF647에 첨가했다. 반응물을 25℃에서 밤새 진탕하였다 (900 rpm). 접합되지 않은 링커를 100 kDa 필터를 사용하여 10회 원심분리하여 제거했다. 아지드 변형 수를 Bruker AutoFlex-III에서 매트릭스로서 시나핀산 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 MALDI-MS로 평가하였다.
DNA 접합. DNA 접합을 정제 직후 수행하였다. 350 당량의 DBCO-dT 종결 DNA 가닥을 먼저 동결건조한 다음, 450 μL 1X PBS 중 10 μM Cas9-AF647-아지드를 첨가하여 DNA를 재수화했다. 이 용액을 진탕 (900rpm)하면서 25℃에서 72시간 동안 배양하였다. 여액이 260 nm에서 검출 가능한 흡광도를 갖지 않을 때까지 100 kDa 필터에서 연속적인 원심분리를 통해 미반응 DNA 가닥을 제거했다. 전형적으로, DNA를 완전히 제거하려면 30-40회의 세척 단계가 필요하다. 단백질 당 DNA 가닥의 수는 UV-Vis 분광학 및 MALDI-MS를 기반으로 계산되었다.
Cas9 SNA-sgRNA 복합체의 결합 및 절단 활동. Cas9 SNA-sgRNA 복합체를 조립하기 위해, 인간 게놈 내의 비암호화 영역을 표적으로 하는 정제된 Cas9 SNA 및 sgRNA를 각각, 30 nM 및 60 nM의 농도로 37℃에서 30분 동안 1Х NEBuffer 4.1에서 배양하였다. 그 후, 표적 서열을 포함하는 Cy5-표지된 DNA를 첨가하여 150 nM의 농도를 제공하고, 혼합물을 동일한 조건에서 30분 동안 추가로 배양하였다. 6% 천연 PAGE 겔을 사용하여 분석하기 전에, 10 μL의 반응물을 2 μL 6Х 천연 로딩 완충액과 혼합하여 절단 활성을 조사했다.
Cas9 SNA에 대한 시험관 내 조사. 세포주 HaCaT (인간 각질세포 세포주), HEK293을 발현하는 EGFP (인간 배아 신장 세포, HEK293/EGFP)를 American Type Culture Collection에서 구입했다. 세포를 37℃에서, 가습된 5% CO2 대기에서 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) 배지에서 배양했다.
HaCat 세포의 세포 흡수. HaCaT 세포를 유세포 분석 튜브 (0.7Х105, 0.5 mL)에 접종하고, 10 % FBS가 포함된 DMEM에서 밤새 배양했다. 그 후, 배양 배지를 450 μL의 OPTI-MEM로 교체하고, 50 μL Cas9 SNA를 첨가하여 서로 다른 시간 간격 (0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간)에 따라 최종 농도가 20 nM이 되도록 혼합했다. 처리 후, 세포를 1X PBS로 세척하고, 300 μL 트립신화하고 (Gibco), 300 μL 1X PBS를 첨가하여 세척하고, 300 G 5분 후, 세포를 1 mL의 PBS에 재현탁했다. 세포를 1 mL 부피에서 PBS를 사용하여 1 Х 106 세포로 조정된 밀도로 계수하였다. 1 μL의 살아 있는 염료와 죽은 염료를 1 mL의 세포 현탁액에 첨가하고 잘 혼합했다; 0.5시간 생존 및 죽은 염색, 실온에서 30분 동안 배양, 빛으로부터 보호됨. 세포를 0.5 mL의 PBS로 1회 세척한 다음 150 μL 4% 파라포름알데히드 (Thermo Fisher Scientific)에서 15분 동안 고정했다. 그런 다음 450 μL 1X PBS를 첨가하고, 3분 동안 세척한 후, 200 μL PBS를 첨가한 다음, 적어도 샘플당 30000개의 단일 셀 사건의 형광 (여기 640 nm, 방출 655-685 nm)을 측정하는 BD LSRFortessa를 사용하여 유세포 분석으로 분석하였다. 원시 FCS 파일은 전방 및 측면 산란 강도를 기반으로 게이트되고 FlowJo에서 분석되었다.
세포 생존율. 표준 세포 계수 키트-8 (CCK-8) 검정을 사용하여 세포 생존율을 평가했다. 간략하게, 세포를 96-웰 플레이트 (웰당 1Х104)에 접종하고, 1 % FBS의 200 μL DMEM 배지에서 밤새 배양했다. 그런 다음 (50 nM, 100 nM, 200 nM, 300 nM, 400 nM 및 500 nM)의 Cas9 SNA를 함유하는 2 % FBS의 200 μL OPTI-MEM 배지를 첨가한 후, 24시간 동안 배양했다. 그 후, 배지를 PBS 중 200 μL의 10% CCK-8로 교체했다. 37℃에서 0.5시간 동안 연속 배양한 후, 150 μL 배지를 사용하여 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm 흡광도를 측정했다. 세포 생존율은 또한 칼세인-AM/PI 염색으로 평가되었다.
시험관 내 유전자 침묵. EGFP를 지속적으로 발현하는 HEK293 세포 (HEK293/EGFP)를 사용하여 Cas9 SNA의 유전자 침묵 효과를 평가했다. HEK293/EGFP 세포를 24-웰 플레이트 (24 웰 플레이트, 웰당 1.3Х105, 0.5 mL)에 접종하고, 37℃에서 밤새 배양했다. 배지를 5시간 동안 OPTI-MUM 중 2% FBS로 변경했다. 6시간 동안 POTI-MUM에서 Cas9 SNA와 배양한 후, EGFP의 코딩 영역을 표적으로 24시간 동안, 세포를 새로운 배지로 교체하고 5일 동안 배양했다. 그런 다음 세포를 트립신-EDTA 용액으로 소화하고, 유세포 분석을 위해 0.3 mL PBS에 재현탁했다.
Surveyor 검정. HEK293/EGFP 세포를 24-웰 플레이트 (웰당 5Х104 세포)에 접종하고, 37℃에서 밤새 배양했다. 24시간 동안 조립된 Cas9 SNA와 배양한 후 (100 nM, 인간 DNase I 과민성 부위, 인간 GRIN2B 부위, 및 EGFP 부위를 표적으로 함, 세포를 신선한 새로운 배지로 교체하고 추가로 4일 동안 배양했다. 그런 다음 세포를 게놈 DNA 추출 키트를 사용하는 게놈 DNA 추출을 위해 수확했다. 250 ng의 DNA 추출물을 19 μL의 총 부피에서 2 μL의 NEBuffer 2 (NEB)로 결합하고 변성시킨 후, 95℃에서 5분 동안, 2℃/s로 95 내지 85℃; 0.2℃/s로 85 내지 20℃로 순환으로 재어닐링했다. 재어닐링된 DNA를 37℃에서 15분 동안 1 μL의 T7 엔도뉴클레아제 I (10 U/μL, NEB)과 배양했다. 10 μL의 50% 글리세롤을 T7 엔도뉴클레아제 반응물에 첨가하고 12 μL를 30분 동안 200 V에서 30분 동안 PAGE 겔 (Bio-Rad) 상에서 전기영동하여 분석한 다음 30분 동안 1Х SYBR 골드 (Life Technologies)로 염색했다. Cas9-유도 절단 밴드와 절단되지 않은 밴드는 ImageJ를 사용하여 게놈 편집 효율을 계산하는 데 사용되었다. 생어 시퀀싱을 통해 표적화된 게놈 변형도 검출되었다.
결과
재조합 Cas9 단백질을 대장균 BL21 (DE3)로부터 정제하였고, Cas9-sgRNA 복합체의 결합/절단 활성은 용액에서 확인되었다. Cas9 ProSNA는 이전에 개발된 방법을 통해 합성되었다. 구체적으로, Cas9 단백질을 Alexa Fluor 647 (AF647)로 태그하여 시험관 내 추적을 용이하게 하고 Cas9 SNA의 농도를 계산했다. 그런 다음, 표면 리신 아민을 반대 말단에 아지드 및 아민 반응성 N-히드록시 숙신이미드 모이어티가 있는 작은 폴리에틸렌 글리콜 중합체와 반응시켰다. 그런 다음 공유 부착된 아지드를 구리가 없는 클릭 화학을 통해 5'-말단에 긴장된 시클로옥틴, 디벤조시클로옥틴 (DBCO)을 함유하는 DNA 가닥과 반응시켰다. 성공적으로 합성된 Cas9 SNA를 평균 크기가 10 nm인 투과전자현미경 (TEM)으로 특성화하였다 (도 6a). 합성된 단백질의 순도는 SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인했다 (도 6b). 겔 이미지는 합성된 각 단계 후에 명백한 분자량 변화를 보여주며, 이는 표면과의 비특이적 연관성보다는 올리고뉴클레오티드의 공유 결합을 입증한다. DNA로 기능화한 후, 평균 제타 전위는 -15.8 mV로 변경되었으며 (도 6c), 이는 더 많은 음전하로 용액 안정성을 향상시켰다. AF Cas9과 ProSNA Cas9 사이의 260 nm에서 흡광도 차이를 비교하여 DNA 변형 수준을 결정했다 (도 6d). 이러한 결과는 Cas9의 성공적인 DNA 기능화를 명확하게 나타낸다.
우수한 생체적합성은 생물학적 적용의 전제조건이기 때문에 여러 세포주의 생존 가능성을 평가했다. HaCat, HEK293T/EGFP, hMSC, 및 Raw 264.7 세포주를 모델로 사용하여 Cas9 SNA의 세포독성을 조사했다 (도 7a). 표준 CCK-8을 사용하여 세포 생존율을 결정했다. Cas9 SNA의 농도는 시험관 내 실험에 사용된 일반적인 농도를 초과했지만, 세포 독성은 관찰되지 않았다. Cas9 SNA의 세포질 전달은 HaCat 세포주를 모델로 사용하여 조사되었다. 세포를 20 nM 단백질과 함께 0 - 8시간 동안 배양하고, 세포 흡수 성능을 유세포 분석법으로 측정했다 (도 7b). Cas9과 함께 배양된 세포와 비교하여, Cas9 SNA는 세포 흡수가 대략 10배 증가한 것으로 나타났다. Cas9 SNA의 향상된 세포 흡수는 세포 표면 스캐빈저 수용체의 결합에 이어 카베올라 매개 세포 내 이입에 기인한다.
다음으로, 게놈 편집에서 Cas9 SNA의 능력을 평가했다. 인간 게놈 내의 DNase I 과민성 부위를 표적으로 하는 즉 상대적으로 안전하고 게놈 편집에 접근할 수 있는 부위를 표적으로 하는 Cas9 SNA를 HEK 293T/EGFP 세포에 전달했다. Surveyor 검정 결과 인델 빈도는 39.2%로 나타났다 (도 8a). 후속적으로, 희귀 신경발달 장애와 관련된 유전자 GRIN2B 부위 (즉 GRIN2B)를 표적으로 하는 Cas9 SNA도 확인되었으며, 인델 빈도는 42.5%였다 (도 8b). 유전자 침묵에서 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 코딩 영역을 표적으로 하는 sgRNA를 사용하여 Cas9 SNA의 능력을 또한 평가하였다. 해당 인델 및 EGFP 침묵 효율은 35.5%였다 (도 8c). 유전자 침묵 성능은 또한 유세포 분석법에 의한 EGFP 형광 변화를 통해 17.8%의 효율로 확인되었다. 이러한 결과는 Cas9 SNA가 매우 높은 편집 효율성을 달성했음을 보여준다.
결론적으로, 효율적인 게놈 편집 및 유전자 침묵을 위한 CRISPR/Cas9 SNA가 확립되었다. Cas9 SNA는 스캐빈저 수용체 경로를 통해 효과적으로 세포에 들어갔다. 또한, 시험관 내 연구에서는 Cas9 SNA가 우수한 생체적합성으로 효율적인 게놈 편집 및 유전자 침묵을 초래한다는 사실이 입증되었다. 이 간단하고 다재다능한 세포질 전달 접근법은 유전자 치료 생의학 응용 분야로 확장될 수 있으며, 뛰어난 생체 적합성은 유전자 치료 및 맞춤형 의학에 새로운 길을 열어준다.
실시예 3
이 실시예는 CRISPR/Cas9 ProSNA를 사용하는 추가 실험을 기술한다.
Cas9의 설계, 발현, 및 정제
Cas9 발현 벡터의 구축. pET-MBP-NLS-Geo_st 발현 벡터 (Addgene Plasmid #87703 (Harrington et al., Nat Commun. 2017 Nov 10;8(1):1424. doi: 10.1038/s41467-017-01408-4))를 Geo Cas9의 N 말단에서 3개의 연속된 GALA 펩티드 (3GALA)를 삽입하여 생성한다 (도 9). 사용된 모든 서열은 표 1에 나열되어 있다. GALA 유전자 서열은 Integrated DNA Technologies에서 구입하고 Golden Gate 어셈블리 (GG)를 사용하여 클로닝되었다. pET-MBP-NLS-Geo_st 벡터를 먼저 PCR 열순환기 (ABI)에서 증폭시킨 후, DpnI 소화 및 겔 정제를 통해 원래의 플라스미드 주형을 제거했다. 후속적으로, 3GALA 유전자 서열을 GG-어셈블리에 의해 증폭된 벡터에 서브클로닝하였다. 구축된 벡터는 전기천공법을 통해 One Shot®BL21(DE3)로 형질전환되었으며, 전통적인 생어 시퀀싱으로 확인되어, 3GALA Cas9 벡터를 제공한다. Cas9의 C-말단은 핵 국소화 신호를 함유함을 주목한다. 융합 단백질의 아미노산 서열 (서열 번호 24)은 아래에 나타낸다.
MKSSHHHHHHHHHHGSSMKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEENLYFQSMWEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAAWEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAAWEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAASGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSMRYKIGLDIGITSVGWAVMNLDIPRIEDLGVRIFDRAENPQTGESLALPRRLARSARRRLRRRKHRLERIRRLVIREGILTKEELDKLFEEKHEIDVWQLRVEALDRKLNNDELARVLLHLAKRRGFKSNRKSERSNKENSTMLKHIEENRAILSSYRTVGEMIVKDPKFALHKRNKGENYTNTIARDDLEREIRLIFSKQREFGNMSCTEEFENEYITIWASQRPVASKDDIEKKVGFCTFEPKEKRAPKATYTFQSFIAWEHINKLRLISPSGARGLTDEERRLLYEQAFQKNKITYHDIRTLLHLPDDTYFKGIVYDRGESRKQNENIRFLELDAYHQIRKAVDKVYGKGKSSSFLPIDFDTFGYALTLFKDDADIHSYLRNEYEQNGKRMPNLANKVYDNELIEELLNLSFTKFGHLSLKALRSILPYMEQGEVYSSACERAGYTFTGPKKKQKTMLLPNIPPIANPVVMRALTQARKVVNAIIKKYGSPVSIHIELARDLSQTFDERRKTKKEQDENRKKNETAIRQLMEYGLTLNPTGHDIVKFKLWSEQNGRCAYSLQPIEIERLLEPGYVEVDHVIPYSRSLDDSYTNKVLVLTRENREKGNRIPAEYLGVGTERWQQFETFVLTNKQFSKKKRDRLLRLHYDENEETEFKNRNLNDTRYISRFFANFIREHLKFAESDDKQKVYTVNGRVTAHLRSRWEFNKNREESDLHHAVDAVIVACTTPSDIAKVTAFYQRREQNKELAKKTEPHFPQPWPHFADELRARLSKHPKESIKALNLGNYDDQKLESLQPVFVSRMPKRSVTGAAHQETLRRYVGIDERSGKIQTVVKTKLSEIKLDASGHFPMYGKESDPRTYEAIRQRLLEHNNDPKKAFQEPLYKPKKNGEPGPVIRTVKIIDTKNQVIPLNDGKTVAYNSNIVRVDVFEKDGKYYCVPVYTMDIMKGILPNKAIEPNKPYSEWKEMTEDYTFRFSLYPNDLIRIELPREKTVKTAAGEEINVKDVFVYYKTIDSANGGLELISHDHRFSLRGVGSRTLKRFEKYQVDVLGNIYKVRGEKRVGLASSAHSKPGKTIRPLQSTRD PKKKRKV (서열 번호 24)
볼드체 서열 (WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAAWEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAAWEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA (서열 번호 26))는 3GALA 펩티드이다
밑줄 친 서열 (MRYKIGLDIGITSVGWAVMNLDIPRIEDLGVRIFDRAENPQTGESLALPRRLARSARRRLRRRKHRLERIRRLVIREGILTKEELDKLFEEKHEIDVWQLRVEALDRKLNNDELARVLLHLAKRRGFKSNRKSERSNKENSTMLKHIEENRAILSSYRTVGEMIVKDPKFALHKRNKGENYTNTIARDDLEREIRLIFSKQREFGNMSCTEEFENEYITIWASQRPVASKDDIEKKVGFCTFEPKEKRAPKATYTFQSFIAWEHINKLRLISPSGARGLTDEERRLLYEQAFQKNKITYHDIRTLLHLPDDTYFKGIVYDRGESRKQNENIRFLELDAYHQIRKAVDKVYGKGKSSSFLPIDFDTFGYALTLFKDDADIHSYLRNEYEQNGKRMPNLANKVYDNELIEELLNLSFTKFGHLSLKALRSILPYMEQGEVYSSACERAGYTFTGPKKKQKTMLLPNIPPIANPVVMRALTQARKVVNAIIKKYGSPVSIHIELARDLSQTFDERRKTKKEQDENRKKNETAIRQLMEYGLTLNPTGHDIVKFKLWSEQNGRCAYSLQPIEIERLLEPGYVEVDHVIPYSRSLDDSYTNKVLVLTRENREKGNRIPAEYLGVGTERWQQFETFVLTNKQFSKKKRDRLLRLHYDENEETEFKNRNLNDTRYISRFFANFIREHLKFAESDDKQKVYTVNGRVTAHLRSRWEFNKNREESDLHHAVDAVIVACTTPSDIAKVTAFYQRREQNKELAKKTEPHFPQPWPHFADELRARLSKHPKESIKALNLGNYDDQKLESLQPVFVSRMPKRSVTGAAHQETLRRYVGIDERSGKIQTVVKTKLSEIKLDASGHFPMYGKESDPRTYEAIRQRLLEHNNDPKKAFQEPLYKPKKNGEPGPVIRTVKIIDTKNQVIPLNDGKTVAYNSNIVRVDVFEKDGKYYCVPVYTMDIMKGILPNKAIEPNKPYSEWKEMTEDYTFRFSLYPNDLIRIELPREKTVKTAAGEEINVKDVFVYYKTIDSANGGLELISHDHRFSLRGVGSRTLKRFEKYQVDVLGNIYKVRGEKRVGLASSAHSKPGKTIRPLQSTRD (서열 번호 25)는 Cas9이다.
볼드체 및 이탤릭체 서열 (PKKKRKV (서열 번호 23))은 NLS이다.
표 1. 프라이머 설계 및 GALA 단편.
Cas9 생산 및 정제. N-말단 3GALA 펩티드를 보유하는 재조합 Cas9 과발현 벡터를 전기 충격에 의해 One Shot®BL21(DE3)로 형질전환시키고, LB-암피실린 한천 플레이트 (100 μg/mL 암피실린)에서 밤새 성장시켰다. 생성된 발현 콜로니를 7 mL (LB, 100 μg/mL 암피실린) 스타터 배양액에 접종하고 37℃에서 밤새 세게 진탕했다. 다음날, 스타터 배양액을 750 mL 2xYBT 액체배지 (100 μg/mL 암피실린)에 접종하고 37℃에서 광학 밀도 0.8로 성장시킨 후, 유전자 발현을 후속적으로 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드로 유도하고 밤새 17℃에서 배양한다. 세포를 수확하고 (6000 g, 15분) 100 mL의 용해 완충액 (20mM HEPES, pH 7.5 RT, 0.5mM TCEP, 500mM NaCl, 1mM PMSF)에 재현탁한 다음, 고압 균질화기로 용해했다. 용해물 분획을 30 000 g에서 30분 동안 원심분리하여 정화하고 결합 완충액 (20mM HEPES, pH 7.5 RT, 500mM NaCl)에 미리 평형화된 5 mL Bio-Scale™ Mini Profinity™ IMAC 카트리지 (Bio-Rad)에 로딩했다. 결합된 단백질은 세척 완충액 (20mM HEPES, pH 7.5, 500mM NaCl, 250 mM 이미다졸)에 의해 용출되었다. 말토오스 결합 단백질은 TEV 프로테아제에 의해 용출된 단백질로부터 밤새 절단되었고 두 번째 MBP 친화도 단계에 의해 포획되었다. 생성된 단백질을 헤파린 컬럼에 로딩하고, 300 내지 1250mM NaCl의 구배로 용출시켰다. Cas9을 함유하는 용출 분획을 저장 완충액 (20mM HEPES, pH 7.5, 5% 글리세롤, 150mM NaCl, 1mM TCEP)에서 사전 평형화된 Bio-Scale™ Mini Bio-Gel® P-6 탈염 카트리지로 정제하였으며 농도를 NanoDrop 8000 분광광도계 (Thermo Scientific)로 측정했다 (도 10). 단백질은 4℃의 일정한 온도에서 정제되었으며 액체 질소에서 급속 냉동되어 -20℃ 보관되었다.
올리고뉴클레오티드 및 sgRNA 합성
올리고뉴클레오티드 합성 및 정제. 모든 포스포라미디트 및 DNA 합성 시약은 Glen Research에서 구입했다. 이 작업에 사용된 서열은 표 2에 나열되어 있다. DNA 합성은 MerMade12 올리고뉴클레오티드 합성기 (MM12, Bio Automation Inc., Texas, 미국) 또는 제어 기공 유리 (CPG) 비드에서 10 μmol 규모의 ABI 394 합성기에 의해 수행되었다. 모든 올리고뉴클레오티드는 실온에서 밤새 30% NH4OH를 사용하여 CPG 비드로부터 보호해제되었다. 그런 다음 Organomation® Multivap® 질소 증발기를 사용하여 질소 흐름 하에서 암모니아를 제거했다. 남은 용액을 0.2 μM 필터를 통해 여과하여 CPG 비드를 제거했다. 여과액 분획을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC, Varian ProStar 210, Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA, 미국)로 정제하여 생성물을 단리했다. Agilent Dynamax Microsorb C4 컬럼 및 45분에 걸쳐 0 내지 75% B의 구배 (A = 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액, B = 아세토니트릴)를 사용했다. 수집된 분획을 동결건조하고 20% 아세트산 아세트산에 2시간 동안 재용해시킨 후 에틸아세테이트 추출을 통해 절단된 디메톡시트리틸 기를 제거하였다. 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법 (MALDI-TOF MS; RapiFlex, Bruker))을 사용하여 2',6'-디히드록시아세토페논 및 시트르산수소이암모늄을 매트릭스로 사용하여 올리고뉴클레오티드의 질량을 확인했다. DNA 농도를 UV-vis 분광분석 Cary 5000 UV-vis 분광광도계, Varian)를 사용하여 λ = 260 nm에서 용액 흡광도를 측정하고, IDT 올리고 분석기 도구에서 얻은 올리고뉴클레오티드의 흡광 계수를 사용하여 결정했다.
sgRNA 설계 및 합성. 공통 5' T7 프로모터 결합 부위에 이어 20-bp sgRNA 표적 서열을 보유하는 sgRNA의 합성 dsDNA 주형을 MEGAscript™ T7 전사 키트 (ThermoFisher)를 사용하여 시험관 내에서 전사했다. 전사는 20 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 30 mM MgCl2, 10 mM DTT, 5 mM 각각 NTP, 100 μg/mL T7 중합효소, RNase 억제제 (Promega) 및 100 ng DNA 주형을 포함하는 완충액에서 수행되었다. 반응물을 37℃에서 대략 18시간 동안 배양하였다. 시험관 내 전사된 RNA를 에탄올로 침전시키고 물에 재용해시킨 후, sgRNA 농도를 Nano Drop 8000 분광광도계 (Thermo Scientific)로 최종 정량하고 액체 질소에서 급속 동결시킨 후 -20℃에 보관했다. 서열은 표 2에 열거된다. DNase I-sgRNA, GRIN2B-sgRNA, Grin2b-sgRNA, 및 EGFP-sgRNA가 DNase I, GRIN2B, Grin2b, 및 EGFP 부위에서 게놈 편집 또는 유전자 침묵을 위한 sgRNA를 생성하는 데 사용되었다.
표 2. 실시예에서 사용된 DNA 서열.
DBCO: 5'-디메톡시트리틸-5-[(6-옥소-6-(디벤조[b,f]아자시클로오토-4-인-1-일)-카프라미도-N-헥스-6-일)-3-아크릴리미도]-2'-데옥시우리딘,3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]- 포스포라미디트 (5'- DBCO-dT-CE 포스포라미디트)
Cy3: 1-[3-(4-모노메톡시트리틸록시)프로필]-1'-[3-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)포스포라미디틸]프로필]-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 클로라이드 (시아닌 3 포스포라미디트)
Cas9 ProSNA의 합성 및 특성화
Alexa Fluor 647 (AF647)를 사용한 반응. Cas9 단백질은 먼저 아미노 활성 Alexa Fluor™ 647 NHS 에스테르 (Thermo Fisher Scientific)로 변형되었다 (도 11). Alexa Fluor™ 647 NHS 에스테르는 DMSO에 용해시켜, UV-가시광선 흡광도 분광법 (ε647 = 270,000 M-1 cm-1)에 의해 측정한 바와 같이, 10 mM 스톡 용액을 얻었다. 5 당량 과량의 AF-647을 Cas9 단백질 용액에 첨가하고, 반응물을 밤새 900 rpm으로 진탕시켰다. 과량의 Alexa Fluor 647은 650 nm에서 모니터링되었으며 Bio-Rad FPLC에서 크기 배제 크로마토그래피로 제거되었다. 단백질당 Alexa Fluor 647 변형 수 및 각각의 흡광 계수를 Cary-500 UV-vis 분광광도계에서 수집했다 (280 nm에서 εCas9 = 204,470 M-1cm-1 및 260 nm에서 324,610 M-1cm-1; 650 nm에서 εAF-647 = 270,000) (도 12).
NHS-PEG 4 -아지드와 표면 접근 가능한 리신의 반응. 표면 아민은 반대쪽 말단에 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르 및 아지드 모이어티를 함유하는 테트라에틸렌 글리콜 링커 (NHS-PEG4-N3, Thermo Scientific)와의 반응에 의해 아지드로 전환되었다 (도 13). 600 당량의 NHS-PEG4-아지드 가교제를 Cas9-AF647 용액에 첨가했다. 반응물을 4℃에서 밤새 진탕하였다 (900 rpm). 2시간 후, 접합되지 않은 아지드 링커를 Bio-Rad FPLC에서 크기 배제 크로마토그래피로 제거했다. 아지드 링커 변형 수는 Bruker AutoFlex-III에서 매트릭스로서 시나핀산 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 MALDI-MS로 확인하였다. 각 링커 접합은 275 m/z의 질량 증가로 이어진다 (도 14).
DNA 접합. DNA 접합은 아지드-기능화된 Cas9 정제 직후에 수행되었다. 300배 과량의 DBCO 종결 DNA를 클릭 반응을 통해 Cas9-아지드와 반응시켰다. 이 반응 용액을 900 rpm으로 진탕시키면서 4℃에서 72시간 동안 배양하였다. 3일 후, 미반응 DNA 가닥을 Bio-Rad FPLC에서 크기 배제 크로마토그래피 650으로 제거했다. 단백질당 DNA 수를 접합된 AlexaFluor 염료의 흡광도를 기반으로 한 UV-가시광선 흡광도 분광법으로 측정했다 (도 15). AF-647 형광단은 흡광도가 260 nm에서 겹치기 때문에 단백질의 농도를 계산하는 데 사용되었다. 단백질 흡광도를 뺀 후, DNA의 농도를 온라인 IDT 올리고 분석기를 사용하여 계산된 흡광 계수를 기반으로 계산했다 (ε260 =276,000 M-1 cm-1) (도 16).
Cas9 SNA의 생체안정성 분석. DNA의 표면 접합이 단백질 분해효소 분해로부터 단백질을 보호할 수 있는지를 입증하기 위해, 천연 Cas9 단백질 및 Cas9 ProSNA를 모두 트립신 (프로테아제)과 함께 배양하고 SDS-PAGE 겔을 수행했다. 반응 용액을 NEB 완충액 2에서 37℃에서 1시간 이상 배양했다. 트립신과 함께 배양된 천연 단백질 밴드는 10분 후에 크게 감소하는 것으로 관찰되었다. 그러나 Cas9 ProSNA 분해는 관찰되지 않았으며 DNA 쉘이 트립신에 의한 실질적인 분해로부터 단백질을 보호할 수 있음을 시사한다 (도 17).
Cas9 ProSNA의 시험관 내 조사
세포 생존율. 세포 생존율을 표준 세포 계수 키트-8 (CCK-8) 검정으로 결정하였다. CCK-8 시약은 WST-8 (2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨, 일나트륨염)을 함유하고, 이는 살아있는 세포에 자유롭게 진입할 수 있다. 세포에 진입하면, WST-8 (약한 형광 화합물)은 세포 탈수소효소에 의해 오렌지색 포르마잔 염료로 환원된다. 구체적으로, 세포를 밤새 10 % FBS의 DMEM 배지에서 96-웰 세포 배양 플레이트 (웰당 1Х104)에 접종했다. 다음으로, 세포 배양 배지를 상이한 농도의 Cas9 ProSNA를 함유하는 200 μL 배지로 교체한 후 추가로 24시간 동안 배양했다. 그 후, 세포를 1X PBS로 세척하고 PBS 중 10% CCK-8로 교체했다 세포를 30분 동안 추가로 배양하였다. 마지막으로, 450 nm에서 CCK의 흡광도를 BioTek Synergy H4 하이브리드 플레이트 판독기로 측정했다. 실험을 3회 반복 수행하였다. 또한, 세포 생존율을 칼세인-AM/PI 염색으로 평가했다. 간단하게, 세포를 24-웰 플레이트 (웰당 5Х104)에 접종하고, 밤새 배양한 후, Cas9 ProSNA를 함유하는 배지에서 24시간 동안 배양했다. 그 후, 세포를 2 μg/mL 칼세인-AM 및 3 μg/mL PI을 함께 함유하는 500 μL PBS로 처리했다. 생존 가능하거나 죽은 세포는 칼신-AM의 경우 488 nm 여기 및 PI의 경우 535 nm를 사용하여 Biotek Synergy H4 하이브리드 플레이트 판독기로 관찰했다 (도 18).
유세포 분석에 의한 HaCat 세포의 세포 흡수. HaCaT 세포를 48 웰 플레이트 (웰당 60,000)에 접종하고, 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신이 포함된 DMEM에서 밤새 배양했다. 그 후, 배양 배지를 Cas9 ProSNA 또는 Cas9 AF647를 함유하는 OPTI-MEM로 교체하여 다양한 시간 간격 (0.5 시간, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간)에 따라 최종 농도가 20 nM가 되게 하였다. 각 처리가 끝나면, 세포를 1X PBS로 세척하고, 300 uL 트립신화하고 (Gibco), 300 uL 1X PBS, 300 G에서 5분 동안 원심분리한 후, 1 mL의 PBS에 재현탁했다. 1 μL의 살아있는 및 죽은 염료를 세포 현탁액에 첨가했다. 30분 후, 원심분리로 세포를 수집하고 4% 파라포름알데히드 (Thermo Fisher Scientific)에 고정했다. 그런 다음 Becton Dickinson LSR II를 사용하여 유세포 분석을 수행하여 샘플당 10,000개의 단일 세포 이벤트의 형광 (여기 640 nm, 방출 655-685 nm)을 측정했다. 원시 FCS 파일은 전방 및 측면 산란 강도를 기반으로 게이트되고 FlowJo에서 분석되었다 (도 19).
세포 내 공초점 현미경. Cas9 ProSNA의 세포 내 전달은 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (Zeiss LSM 810 현미경)으로 평가되었다. Cas9 ProSNA 또는 Cas9 AF647의 엔도솜 탈출을 조사하기 위해, HaCat 세포 (웰당 1Х104)를 붕규산염 8-챔버 커버 유리 슬라이드 (Nalge Nunc International)에 접종했다. 8시간 후, 세포를 37℃에서 리소좀 염료 (CellLight™ 리소좀-GFP, BacMam 2.0)와 배양하고 Cas9 ProSNA 또는 Cas9 AF647 (20 nM)를 함유하는 500 μL의 OptiMEM과 다양한 시간 간격으로 배양한 후, PBS로 세척하고 실온에서 10분 동안 핵 염료 (회흐스트, 1 μg/mL)로 염색한 후 10분 동안 4% PFA로 세포를 고정했다. 그 후, 살아있는 세포는 각각, 회흐스트에 대해 405 nm, 리소좀-GFP에 대해 488 nm 및 AF 647 표지된 Cas9 ProSNA 또는 Cas9 AF647에 대해 561 nm의 형광 현미경으로 이미지화되었다. 핵 도입 효율은 공초점 현미경으로 AF647에 의해 중첩된 핵의 백분율로 결정되었으며, 약 100개의 세포가 각 샘플 (n=3)에 대해 분석되었다 (도 20).
Surveyor 검정 (도 21). HaCat, hBMSC, RAW 264.7 및 A549/EGFP 세포를 48-웰 플레이트 (웰당 5Х104 세포)에 접종하고, 밤새 37℃에서 배양하였다. 조립된 Cas9 ProSNA (50 nM, 표적화 인간 DNase I 과민성 부위: AGTGCTGGAGAATGGGTCACAgtggCAAA(서열 번호 18), 인간 GRIN2B 부위: AGTCATTGGCAGCTACAGGCAgagaCAAA(서열 번호 19), 상동 마우스 Grin2b 부위: ATGGCTTCCTGGTCCGTGTCAtccgCGAA(서열 번호 20), 및 EGFP 부위: ACGACTTCTTCAAGTCCGCCAtgccCGAA(서열 번호 21) (밑줄은 게놈 편집 표적을 나타냄))와 4시간 동안 OPTIMEM에서 배양한 후, 세포를 신선한 배지로 교체하고 추가로 3일 동안 배양하였다. 그런 다음 세포를 Quick 추출 용액 (Epicentre)을 사용하여 게놈 DNA 추출을 위해 수확한 후, PCR을 통해 증폭시켰다. 유휴 분석을 위해, 250 ng의 DNA 추출을 19 μL의 총 부피에서 2 ml의 NEBuffer 2 (NEB)와 결합하고 변성시킨 다음, 5분 동안 95℃, 2℃/s에서 95 내지 85℃; 0.2℃/s에서 85 내지 20℃로 열순환으로 다시 어닐링했다. 재어닐링된 DNA를 37℃에서 15분 동안 1 μL의 T7 엔도뉴클레아제 I (10 U/μL, NEB)와 배양했다. 10 μL의 50% 글리세롤을 T7 엔도뉴클레아제 반응에 첨가하고 12 μL를 200 V에서 30분 동안 전기영동한 PAGE 겔 (Bio-Rad)에서 분석했다. Cas9-유도 절단 밴드 및 절단되지 않은 밴드를 사용하여 ImageJ를 사용하여 게놈 편집 효율을 계산했다.
리포펙타민 CRISPRMAX Cas9 형질감염. 제공된 형질감염 프로토콜에 따라 Cas9-sgRNA 복합체를 세포에 형질감염시키기 위해 리포펙타민 CRISPRMAX 형질감염 시약을 사용했다. 간략하게, 1 μL Cas9 플러스 시약을 Cas9 단백질 (500 nM) 및 sgRNA (1 μM)를 함유하는 25 μL Opti-MEM 배지에 첨가한 후, 실온에서 5분 동안 배양했다 (튜브1). 또한, 1.5 μL 리포펙타민 CRISPRMAX 시약을 25 μL Opti-MEM 배지에 첨가하고 실온에서 5분 동안 추가로 배양했다 (튜브2). 그 후, 튜브1의 Cas9-sgRNA 플러스 혼합물을 튜브2의 리포펙타민 CRISPRMAX 용액과 혼합한 후, 실온에서 10분 동안 배양했다. 후속적으로, 50 μL의 제조된 Cas9-sgRNA 형질감염 복합체를 각 웰에 떨어뜨렸다 (48-웰 플레이트, 웰당 5Х104).
시험관 내 유전자 침묵. EGFP를 지속적으로 발현하는 HEK293T 세포 (HEK293T/EGFP)를 사용하여 Cas9 ProSNA의 유전자 침묵 효과를 평가했다. HEK293T/EGFP 세포를 48-웰 플레이트 (웰당 5Х104, 0.5 mL)에 접종하고, 37℃에서 밤새 배양했다. 그런 다음 배지를 5시간 동안 OPTI-MUM 중 2% FBS로 변경한다. 6시간 동안 POTI-MUM에서 Cas9 ProSNA와 배양한 후, EGFP의 코딩 영역을 24시간 동안 표적으로 삼아, 세포를 신선한 배지로 교체하고 3일 동안 배양했다. 그런 다음 세포를 트립신-EDTA 용액으로 소화시키고, 유세포 분석을 위해 (BD FACSCANTO II, EGFP의 채널) 0.3 mL PBS에 재현탁했다. 모든 데이터는 FCS Express 유세포 분석 데이터 분석을 사용하여 분석되었다 (도 22).
이 실시예는 Cas9 ProSNA가 세포 내재화를 대략 45배까지 개선했음을 보여주었다. 또한, d(GGT)10 서열의 사용으로 뛰어난 생체적합성, 프로테아제 생체안정성, 및 대략 45.4%의 우수한 게놈 편집 인델 효율을 갖는 게놈 편집 도구를 쉽게 생성할 수 있었다. 이러한 관찰은 세포 기능이 특이적이고 일시적으로 조작될 수 있도록 보편적으로 사용될 수 있는 핵산 기능화된 (생체)거대분자 화물의 설계로 이어진다.
실시예 4
이 실시예는 CRISPR/Cas9 ProSNA를 사용하는 추가 실험을 기술한다.
Alexa Fluor™ 647의 기능화. Cas9 단백질을 아미노 활성 Alexa Fluor™ 647 NHS 에스테르 (AF647, Thermo Fisher Scientific)로 변형하였다. AF647을 DMSO에 용해시켜 UV-가시광선 분광광도법 (ε647 =270,000 M-1 cm-1)에 의해 측정된 10 mM 스톡 용액을 얻었다. 5 과량의 당량의 AF647을 Cas9 단백질의 용액에 첨가하고, 반응물을 밤새 900 rpm로 진탕하였다. 과량의 AF647을 Bio-Rad FPLC에서 크기 배제 크로마토그래피로 제거했다. AF647 변형 단백질의 스펙트럼을 Cary-500 UV-가시광선 분광광도계 (Molecular Devices Inc, 미국)에서 수집하고 변형 수를 각각의 흡광 계수를 사용하여 계산했다 (Cas9: 280 nm에서 ε280 = 204,470 M-1cm-1 및 260 nm에서 ε260 = 324,610 M-1cm-1; AF647: 650 nm에서 ε650 = 270,000). (도 23)
AF647 형광단 변형 Cas9의 UV-가시광선 스펙트럼. 스펙트럼은 Cary5000 분광광도계를 사용하여 주변 온도에서 얻었다. 단백질 및 AF647 농도는 각각, 280 nm 및 650 nm에서 흡광도로부터 계산되었다. AF647 형광단은 DNA 접합 후 단백질의 농도를 계산하고 유세포 분석 및 공초점 이미징 실험에서 세포 흡수를 추적하는 데 사용되었다. (도 23)
NHS-PEG 4 -아지드와 표면 접근 가능한 리신의 반응. 표면 리신은 반대쪽 말단에 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르 및 아지드 모이어티를 함유하는 테트라에틸렌 글리콜 링커 (NHS-PEG4-N3, Thermo Scientific)와의 반응에 의해 아지드로 변환되었다. 600 당량의 NHS-PEG4-아지드 링커를 Cas9-AF647의 용액에 첨가했다. 2시간 후, 접합되지 않은 링커를 Bio-Rad FPLC에서 크기 배제 크로마토그래피로 제거했다. 아지드 변형의 수는 시나핀산 (Thermo Fisher Scientific)을 매트릭스로 사용하여 MALDI-MS에 의해 확인되었다. 각 링커 접합은 275 m/z의 질량 증가를 가져왔다. (도 23)
DNA 접합. DNA 접합 반응은 아지드 변형된 Cas9의 정제 직후에 수행되었다. 300배 과량의 DBCO 종결 DNA를 클릭 반응을 통해 Cas9-AF647-아지드와 반응시켰다. 이 반응 용액을 4℃에서 3일 동안 배양했다. 3일 후, 미반응 DNA 가닥을 Bio-Rad FPLC에서 크기 배제 크로마토그래피 (ENrich™ SEC 650 컬럼, Bio-Rad Inc., 미국)로 제거했다. 단백질당 DNA 변형 수는 UV-가시광선 분광광도법으로 결정되었다. AF647 형광단은 두 흡광도가 260 nm에서 겹치기 때문에 DNA 접합 후 단백질 농도를 계산하는 데 사용되었다. 단백질 흡광도를 뺀 후, DNA의 농도는 Integrated DNA Technologies 올리고 분석기에서 얻은 흡광 계수를 기준으로 DNA 농도를 결정했다 (ε260 =276,000 M-1 cm-1). (도 23)
UV-가시광선 분광광도법을 사용하는 Cas9 ProSNA의 DNA 가닥 수 결정. 스펙트럼을 Cary5000 분광광도계에서 수집했다. 단백질 및 DNA 농도는 각각 650 nm 및 260 nm에서의 흡광도로부터 계산되었다. (도 23)
원형 이색성 분광학. 원형 이색성 (CD)을 사용하여 DNA 기능화 후 온전한 Cas9 단백질 구조를 특성화했다. 모든 샘플은 PBS에서 완충액 교환되었고 CD 스펙트럼은 실온에서 Jasco J-1700 분광광도계로 수집되었다. Cas9 및 DNA 샘플을 각각, 500 nM 및 7.13 μM의 농도로 제조했다. Cas9 ProSNA의 이론적 스펙트럼은 Cas9-AF647 및 유리 DNA의 스펙트럼을 합산하여 계산되었다. Cas9 ProSNA의 수집된 스펙트럼은 계산된 스펙트럼과 일치했다. (도 24)
Cas9 ProSNA의 생체안정성 분석. 나트륨 도데실 황산염-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 사용하여 DNA의 표면 접합이 Cas9 단백질을 트립신 분해로부터 보호할 수 있는지를 조사했다. 천연 Cas9 단백질 및 Cas9 ProSNA 둘 다 37℃에서 트립신과 함께 배양되었으며 30 μL의 단백질을 다양한 시점에 걸쳐 분석을 위해 로딩하였다. Cas9 단백질에 해당하는 밴드는 트립신과 함께 배양한 지 10분 만에 크게 감소하는 것으로 관찰되었다. 그러나 Cas9 ProSNA는 DNA 접합으로 인해 본 연구 기간 동안 거의 분해되지 않는 것으로 나타났다. (도 25)
세포 생존율. 세포 생존율을 표준 세포 계수 키트-8 (CCK-8) 검정으로 결정했다. CCK-8 시약은 2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨 (WST-8)을 함유하며, 이는 세포에 자유롭게 진입할 수 있다. 세포에 진입하면, WST-8은 세포 탈수소효소에 의해 오렌지색 포르마잔 염료로 환원되었다 (460 nm에서의 흡광도). 구체적으로, 세포를 밤새 10 % FBS가 포함된 DMEM 배지에서 96-웰 세포 배양 플레이트 (웰당 104)에 접종했다. 다음으로, 세포 배양 배지를 상이한 농도의 Cas9 ProSNA를 함유하는 신선한 배지로 교체하고 추가 24시간 동안 배양했다. 다음으로 세포를 PBS로 세척하고 10% CCK-8로 교체했다. 세포를 30분 동안 추가로 배양하고 460 nm에서의 흡광도 값을 BioTek Synergy H4 하이브리드 플레이트 판독기로 측정했다. 모든 실험은 독립적인 삼중으로 수행되었다. 세포 생존율은 또한 살아있는/죽은 염색으로 평가되었다. 간단하게, 세포를 24-웰 플레이트 (웰당 5Х104)에 접종하고 밤새 배양한 후, 24시간 동안 Cas9 ProSNA를 함유하는 배양 배지에서 배양했다. 그 후, 세포를 칼세인 아세톡시메틸 (2 μg/mL) 및 요오드화 프로피듐 (3 μg/mL)으로 함께 처리하였다. 생존 가능하거나 죽은 세포는 Biotek Synergy H4 하이브리드 플레이트 판독기 (BioRad, 미국)를 사용하여 칼신-AM의 경우 488 nm 여기 및 요오드화 프로피듐의 경우 535 nm로 관찰되었다. (도 26)
유세포 분석에 의한 HaCat 세포의 세포 흡수. HaCaT 세포를 48 웰 플레이트 (웰당 60,000)에 접종하고 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 DMEM에서 밤새 배양했다. 그 후, 세포 배양 배지를 Cas9 ProSNA 또는 Cas9-AF647를 함유하는 Opti-MEM로 교체하여 다양한 시간 간격 (0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간 및 8시간)에 대해 최종 농도가 20 nM이 되도록 했다. 각 처리가 끝나면, 세포를 PBS로 세척하고, 트립신화하고 (Gibco) 800 Х g에서 5분 동안 원심분리하고 고정 완충액 (BioLegend)으로 고정했다. 그런 다음 Becton Dickinson LSR II를 사용하여 유세포 분석을 수행하여 샘플당 최소 10,000개의 단일 세포 이벤트의 형광 (여기 640 nm, 방출 655-685 nm)을 측정했다. 모든 실험은 삼중으로 수행되었다. (도 27)
공초점 현미경에 의한 세포 내 전달 분석. Cas9 ProSNA의 세포 내 전달을 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (Zeiss LSM 810, 독일)로 평가했다. Cas9 ProSNA 또는 Cas9 AF647의 엔도솜 탈출을 조사하기 위해, HaCat 세포 (웰당 104)를 붕규산염 8-챔버 커버 유리 슬라이드 (Nalge Nunc International)에 접종했다. 8시간 후, 세포를 Cas9 ProSNA 또는 Cas9 AF647 (20 nM)을 함유하는 엔도솜 염색제 (CellLight™ 후기 엔도솜-GFP, BacMam 2.0)와 함께 다양한 시간 간격에 걸쳐 배양했다. 과량의 단백질을 PBS로 세척하고 핵을 1분 동안 회흐스트 (1 μg/mL)로 염색한 후 15분 동안 4% 파라포름알데히드 (Thermo Fisher Scientific)로 세포를 고정했다. 그 후, 세포를 회흐스트에 대해 405 nm, 리소좀-GFP에 대해 488 nm 및 Cas9 ProSNA 또는 Cas9 AF647에 대해 561 nm를 동시에 사용하여 공초점 형광 현미경으로 세포를 이미지화했다. AF647에 의해 중첩된 핵을 계산하는 공초점 현미경 이미지로부터 핵 도입 효율을 결정하고, 각 샘플에 대해 약 100개의 세포를 분석했다. (도 29)
게놈 편집 인델 효율을 검출하기 위한 Surveyor 검정. HaCat, hBMSC, RAW 264.7 및 HEK293T/EGFP 세포를 48-웰 플레이트 (웰당 5Х104 세포)에 접종하고 밤새 배양했다. Opti-MEM에서 4시간 동안 조립된 Cas9 ProSNA-sgRNA 복합체 (50 nM)로 형질감염 후, 세포를 신선한 배지로 교체하고 추가 3일 동안 배양했다. 다음으로 게놈 DNA를 제조사 프로토콜에 따라 게놈 DNA 추출 키트 (Quick 추출 용액, Epicentre)을 사용하여 추출했다. 간략하게, 세포를 QuickExtract 용액에 재현탁하고 65℃에서 15분 동안 및 98℃에서 6분 동안 배양했다. 그런 다음 5 μL 추출 용액을 표적 영역 프라이머와 함께 PCR 반응으로 증폭시켰다. 유휴 형성 분석을 위해, 5 μL의 PCR 생성물 분취량을 19 μL의 총 부피에서 T7 엔도뉴클레아제 I (T7EI) 환충액과 혼합하고 변성시킨 다음, 열순환으로 다시 어닐링하여 이종이중체 형성을 허용했다 (10분 동안 95℃, -2℃/s에서 95 내지 85℃ 램핑, -0.2℃/s에서 85 내지 20℃ 램핑. 재어닐링된 생성물을 15분 동안 1 μL의 T7EI (10 U/μL, NEB)와 배양하고 4-15% 폴리아크릴아미드 겔 (BioRad)에서 분석했다. Cas9-유도 절단 밴드 및 절단되지 않은 밴드를 Gel Doc 겔 이미징 시스템 (BioRad)에서 시각화하고 ImageJ 농도계 분석을 사용하여 정량화했다. 도 21에 나타낸 바와 같이 게놈 편집 효율 계획을 측정했다. 결과는 도 30에 나타낸다.
리포펙타민 CRISPRMAX Cas9-sgRNA 복합체 형질감염. LipofectamineTM CRISPRMAXTM 형질감염 시약를 사용하여 제조 형질감염 프로토콜에 따라 Cas9-sgRNA 복합체 RAW 264.7 세포에 형질감염시켰다. 간략하게, Cas9 플러스 시약을 Cas9 단백질 및 sgRNA를 함유하는 배지에 첨가한 후, 실온에서 5분 동안 배양하여 Cas9-sgRNA 복합체를 형성했다. 그런 다음 리포펙타민 CRISPRMAX 시약을 Opti-MEM 배지와 혼합하고 추가 5분 동안 배양했다. 그 후, Cas9-sgRNA 혼합물을 리포펙타민 CRISPRMAX 용액과 혼합한 후, 10분 동안 배양했다. 후속적으로, 50 μL의 제조된 Cas9-sgRNA 형질감염 복합체 (50 nM의 최종 농도)를 첨가하고 4시간 동안 세포 배지에 혼합했다. Cas9-sgRNA 복합체 처리 후, 세포를 3일 동안 해당 배지에서 배양했다. 그런 다음 세포를 후속 Surveyor 검정을 위해 수확했다. 결과를 도 31에 나타낸다.
시험관 내 유전자 침묵. EGFP 유전자를 함유하는 HEK293T 세포 (HEK293T/EGFP) Cas9 ProSNA의 유전자 침묵 효과를 평가하기 위해 사용했다. HEK293T/EGFP 세포를 48-웰 플레이트 (웰당 5Х104)에 접종하고 밤새 배양했다. Opti-MEM에서 4시간 동안 EGFP의 코딩 영역을 표적으로 하는 Cas9 ProSNA (50 nM) 와 배양한 후, 세포를 신선한 배지로 교체하고 추가 3일 동안 배양했다. 그런 다음 세포를 트립신-EDTA 용액으로 소화시키고 살아 있는 및 죽은 세포 현탁 용액에 재현탁했다. 30분 후, 세포를 PBS로 세척하고 유세포 분석 (Becton Dickinson LSR II, EGFP의 채널)을 위해 고정했다. 모든 실험은 독립적인 삼중으로 수행되었다. 결과를 도 32에 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Northwestern University <120> STRATEGIES TO DEVELOP GENOME EDITING SPHERICAL NUCLEIC ACIDS (SNAs) <130> 30938/2021-043R <150> US 63/154,530 <151> 2021-02-26 <150> US 63/273,086 <151> 2021-10-28 <150> US 63/290,522 <151> 2021-12-16 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1368 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <220> <221> MISC_FEATURE <223> CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 <400> 1 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly 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Ile Lys Lys Tyr Gly Ser Pro Val Ser 485 490 495 Ile His Ile Glu Leu Ala Arg Asp Leu Ser Gln Thr Phe Asp Glu Arg 500 505 510 Arg Lys Thr Lys Lys Glu Gln Asp Glu Asn Arg Lys Lys Asn Glu Thr 515 520 525 Ala Ile Arg Gln Leu Met Glu Tyr Gly Leu Thr Leu Asn Pro Thr Gly 530 535 540 His Asp Ile Val Lys Phe Lys Leu Trp Ser Glu Gln Asn Gly Arg Cys 545 550 555 560 Ala Tyr Ser Leu Gln Pro Ile Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Pro Gly 565 570 575 Tyr Val Glu Val Asp His Val Ile Pro Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Asp 580 585 590 Ser Tyr Thr Asn Lys Val Leu Val Leu Thr Arg Glu Asn Arg Glu Lys 595 600 605 Gly Asn Arg Ile Pro Ala Glu Tyr Leu Gly Val Gly Thr Glu Arg Trp 610 615 620 Gln Gln Phe Glu Thr Phe Val Leu Thr Asn Lys Gln Phe Ser Lys Lys 625 630 635 640 Lys Arg Asp Arg Leu Leu Arg Leu His Tyr Asp Glu Asn Glu Glu Thr 645 650 655 Glu Phe Lys Asn Arg Asn Leu Asn Asp Thr Arg Tyr Ile Ser Arg Phe 660 665 670 Phe Ala Asn Phe Ile Arg Glu His Leu Lys Phe Ala Glu Ser Asp Asp 675 680 685 Lys Gln Lys Val Tyr Thr Val Asn Gly Arg Val Thr Ala His Leu Arg 690 695 700 Ser Arg Trp Glu Phe Asn Lys Asn Arg Glu Glu Ser Asp Leu His His 705 710 715 720 Ala Val Asp Ala Val Ile Val Ala Cys Thr Thr Pro Ser Asp Ile Ala 725 730 735 Lys Val Thr Ala Phe Tyr Gln Arg Arg Glu Gln Asn Lys Glu Leu Ala 740 745 750 Lys Lys Thr Glu Pro His Phe Pro Gln Pro Trp Pro His Phe Ala Asp 755 760 765 Glu Leu Arg Ala Arg Leu Ser Lys His Pro Lys Glu Ser Ile Lys Ala 770 775 780 Leu Asn Leu Gly Asn Tyr Asp Asp Gln Lys Leu Glu Ser Leu Gln Pro 785 790 795 800 Val Phe Val Ser Arg Met Pro Lys Arg Ser Val Thr Gly Ala Ala His 805 810 815 Gln Glu Thr Leu Arg Arg Tyr Val Gly Ile Asp Glu Arg Ser Gly Lys 820 825 830 Ile Gln Thr Val Val Lys Thr Lys Leu Ser Glu Ile Lys Leu Asp Ala 835 840 845 Ser Gly His Phe Pro Met Tyr Gly Lys Glu Ser Asp Pro Arg Thr Tyr 850 855 860 Glu Ala Ile Arg Gln Arg Leu Leu Glu His Asn Asn Asp Pro Lys Lys 865 870 875 880 Ala Phe Gln Glu Pro Leu Tyr Lys Pro Lys Lys Asn Gly Glu Pro Gly 885 890 895 Pro Val Ile Arg Thr Val Lys Ile Ile Asp Thr Lys Asn Gln Val Ile 900 905 910 Pro Leu Asn Asp Gly Lys Thr Val Ala Tyr Asn Ser Asn Ile Val Arg 915 920 925 Val Asp Val Phe Glu Lys Asp Gly Lys Tyr Tyr Cys Val Pro Val Tyr 930 935 940 Thr Met Asp Ile Met Lys Gly Ile Leu Pro Asn Lys Ala Ile Glu Pro 945 950 955 960 Asn Lys Pro Tyr Ser Glu Trp Lys Glu Met Thr Glu Asp Tyr Thr Phe 965 970 975 Arg Phe Ser Leu Tyr Pro Asn Asp Leu Ile Arg Ile Glu Leu Pro Arg 980 985 990 Glu Lys Thr Val Lys Thr Ala Ala Gly Glu Glu Ile Asn Val Lys Asp 995 1000 1005 Val Phe Val Tyr Tyr Lys Thr Ile Asp Ser Ala Asn Gly Gly Leu 1010 1015 1020 Glu Leu Ile Ser His Asp His Arg Phe Ser Leu Arg Gly Val Gly 1025 1030 1035 Ser Arg Thr Leu Lys Arg Phe Glu Lys Tyr Gln Val Asp Val Leu 1040 1045 1050 Gly Asn Ile Tyr Lys Val Arg Gly Glu Lys Arg Val Gly Leu Ala 1055 1060 1065 Ser Ser Ala His Ser Lys Pro Gly Lys Thr Ile Arg Pro Leu Gln 1070 1075 1080 Ser Thr Arg Asp 1085 <210> 26 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <223> 3GALA Peptide <400> 26 Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His 1 5 10 15 Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Trp Glu 20 25 30 Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala 35 40 45 Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Trp Glu Ala Ala 50 55 60 Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala 65 70 75 80 Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala 85 90 <210> 27 <211> 1054 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <223> Cas12 (NCBI Reference Sequence: WP_142383421.1) <400> 27 Met Asn Leu Leu Thr Leu Tyr Arg Gln Glu Ala Ile Gly Asp Lys Thr 1 5 10 15 Lys Glu Ala Tyr Gln Ala Glu Leu Ile Asn Ile Ile Arg Asn Gln Gln 20 25 30 Arg Asn Asn Gly Ser Ser Glu Glu His Gly Ser Asp Gln Glu Ile Leu 35 40 45 Ala Leu Leu Arg Gln Leu Tyr Glu Leu Ile Ile Pro Ser Ser Ile Gly 50 55 60 Glu Ser Gly Asp Ala Asn Gln Leu Gly Asn Lys Phe Leu Tyr Pro Leu 65 70 75 80 Val Asp Pro Asn Ser Gln Ser Gly Lys Gly Thr Ser Asn Ala Gly Arg 85 90 95 Lys Pro Arg Trp Lys Arg Leu Lys Glu Glu Gly Asn Pro Asp Trp Glu 100 105 110 Leu Glu Lys Lys Lys Asp Glu Glu Arg Lys Ala Lys Asp Pro Thr Val 115 120 125 Lys Ile Phe Asp Asn Leu Asn Lys Tyr Gly Leu Leu Pro Leu Phe Pro 130 135 140 Leu Phe Thr Asn Ile Gln Lys Asp Ile Glu Trp Leu Pro Leu Gly Lys 145 150 155 160 Arg Gln Ser Val Arg Lys Trp Asp Lys Asp Met Phe Ile Gln Ala Ile 165 170 175 Glu Arg Leu Leu Ser Trp Glu Ser Trp Asn Arg Arg Val Ala Asp Glu 180 185 190 Tyr Lys Gln Leu Lys Glu Lys Thr Glu Ser Tyr Tyr Lys Glu His Leu 195 200 205 Thr Gly Gly Glu Glu Trp Ile Glu Lys Ile Arg Lys Phe Glu Lys Glu 210 215 220 Arg Asn Met Glu Leu Glu Lys Asn Ala Phe Ala Pro Asn Asp Gly Tyr 225 230 235 240 Phe Ile Thr Ser Arg Gln Ile Arg Gly Trp Asp Arg Val Tyr Glu Lys 245 250 255 Trp Ser Lys Leu Pro Glu Ser Ala Ser Pro Glu Glu Leu Trp Lys Val 260 265 270 Val Ala Glu Gln Gln Asn Lys Met Ser Glu Gly Phe Gly Asp Pro Lys 275 280 285 Val Phe Ser Phe Leu Ala Asn Arg Glu Asn Arg Asp Ile Trp Arg Gly 290 295 300 His Ser Glu Arg Ile Tyr His Ile Ala Ala Tyr Asn Gly Leu Gln Lys 305 310 315 320 Lys Leu Ser Arg Thr Lys Glu Gln Ala Thr Phe Thr Leu Pro Asp Ala 325 330 335 Ile Glu His Pro Leu Trp Ile Arg Tyr Glu Ser Pro Gly Gly Thr Asn 340 345 350 Leu Asn Leu Phe Lys Leu Glu Glu Lys Gln Lys Lys Asn Tyr Tyr Val 355 360 365 Thr Leu Ser Lys Ile Ile Trp Pro Ser Glu Glu Lys Trp Ile Glu Lys 370 375 380 Glu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Ala Pro Ser Ile Gln Phe Asn Arg Gln 385 390 395 400 Ile Lys Leu Lys Gln His Val Lys Gly Lys Gln Glu Ile Ser Phe Ser 405 410 415 Asp Tyr Ser Ser Arg Ile Ser Leu Asp Gly Val Leu Gly Gly Ser Arg 420 425 430 Ile Gln Phe Asn Arg Lys Tyr Ile Lys Asn His Lys Glu Leu Leu Gly 435 440 445 Glu Gly Asp Ile Gly Pro Val Phe Phe Asn Leu Val Val Asp Val Ala 450 455 460 Pro Leu Gln Glu Thr Arg Asn Gly Arg Leu Gln Ser Pro Ile Gly Lys 465 470 475 480 Ala Leu Lys Val Ile Ser Ser Asp Phe Ser Lys Val Ile Asp Tyr Lys 485 490 495 Pro Lys Glu Leu Met Asp Trp Met Asn Thr Gly Ser Ala Ser Asn Ser 500 505 510 Phe Gly Val Ala Ser Leu Leu Glu Gly Met Arg Val Met Ser Ile Asp 515 520 525 Met Gly Gln Arg Thr Ser Ala Ser Val Ser Ile Phe Glu Val Val Lys 530 535 540 Glu Leu Pro Lys Asp Gln Glu Gln Lys Leu Phe Tyr Ser Ile Asn Asp 545 550 555 560 Thr Glu Leu Phe Ala Ile His Lys Arg Ser Phe Leu Leu Asn Leu Pro 565 570 575 Gly Glu Val Val Thr Lys Asn Asn Lys Gln Gln Arg Gln Glu Arg Arg 580 585 590 Lys Lys Arg Gln Phe Val Arg Ser Gln Ile Arg Met Leu Ala Asn Val 595 600 605 Leu Arg Leu Glu Thr Lys Lys Thr Pro Asp Glu Arg Lys Lys Ala Ile 610 615 620 His Lys Leu Met Glu Ile Val Gln Ser Tyr Asp Ser Trp Thr Ala Ser 625 630 635 640 Gln Lys Glu Val Trp Glu Lys Glu Leu Asn Leu Leu Thr Asn Met Ala 645 650 655 Ala Phe Asn Asp Glu Ile Trp Lys Glu Ser Leu Val Glu Leu His His 660 665 670 Arg Ile Glu Pro Tyr Val Gly Gln Ile Val Ser Lys Trp Arg Lys Gly 675 680 685 Leu Ser Glu Gly Arg Lys Asn Leu Ala Gly Ile Ser Met Trp Asn Ile 690 695 700 Asp Glu Leu Glu Asp Thr Arg Arg Leu Leu Ile Ser Trp Ser Lys Arg 705 710 715 720 Ser Arg Thr Pro Gly Glu Ala Asn Arg Ile Glu Thr Asp Glu Pro Phe 725 730 735 Gly Ser Ser Leu Leu Gln His Ile Gln Asn Val Lys Asp Asp Arg Leu 740 745 750 Lys Gln Met Ala Asn Leu Ile Ile Met Thr Ala Leu Gly Phe Lys Tyr 755 760 765 Asp Lys Glu Glu Lys Asp Arg Tyr Lys Arg Trp Lys Glu Thr Tyr Pro 770 775 780 Ala Cys Gln Ile Ile Leu Phe Glu Asn Leu Asn Arg Tyr Leu Phe Asn 785 790 795 800 Leu Asp Arg Ser Arg Arg Glu Asn Ser Arg Leu Met Lys Trp Ala His 805 810 815 Arg Ser Ile Pro Arg Thr Val Ser Met Gln Gly Glu Met Phe Gly Leu 820 825 830 Gln Val Gly Asp Val Arg Ser Glu Tyr Ser Ser Arg Phe His Ala Lys 835 840 845 Thr Gly Ala Pro Gly Ile Arg Cys His Ala Leu Thr Glu Glu Asp Leu 850 855 860 Lys Ala Gly Ser Asn Thr Leu Lys Arg Leu Ile Glu Asp Gly Phe Ile 865 870 875 880 Asn Glu Ser Glu Leu Ala Tyr Leu Lys Lys Gly Asp Ile Ile Pro Ser 885 890 895 Gln Gly Gly Glu Leu Phe Val Thr Leu Ser Lys Arg Tyr Lys Lys Asp 900 905 910 Ser Asp Asn Asn Glu Leu Thr Val Ile His Ala Asp Ile Asn Ala Ala 915 920 925 Gln Asn Leu Gln Lys Arg Phe Trp Gln Gln Asn Ser Glu Val Tyr Arg 930 935 940 Val Pro Cys Gln Leu Ala Arg Met Gly Glu Asp Lys Leu Tyr Ile Pro 945 950 955 960 Lys Ser Gln Thr Glu Thr Ile Lys Lys Tyr Phe Gly Lys Gly Ser Phe 965 970 975 Val Lys Asn Asn Thr Glu Gln Glu Val Tyr Lys Trp Glu Lys Ser Glu 980 985 990 Lys Met Lys Ile Lys Thr Asp Thr Thr Phe Asp Leu Gln Asp Leu Asp 995 1000 1005 Gly Phe Glu Asp Ile Ser Lys Thr Ile Glu Leu Ala Gln Glu Gln 1010 1015 1020 Gln Lys Lys Tyr Leu Thr Met Phe Arg Asp Pro Ser Gly Tyr Phe 1025 1030 1035 Phe Asn Asn Glu Thr Trp Arg Pro Gln Lys Glu Tyr Trp Ser Ile 1040 1045 1050 Val <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <223> NLS <400> 28 Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys Arg 1 5 10 15 Lys Val <210> 29 <211> 791 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <223> Cas13b (NCBI Reference Sequence: WP_002664492.1) <400> 29 Met Glu Asn Lys Thr Ser Leu Gly Asn Asn Ile Tyr Tyr Asn Pro Phe 1 5 10 15 Lys Pro Gln Asp Lys Ser Tyr Phe Ala Gly Tyr Phe Asn Ala Ala Met 20 25 30 Glu Asn Thr Asp Ser Val Phe Arg Glu Leu Gly Lys Arg Leu Lys Gly 35 40 45 Lys Glu Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Phe Asp Ala Ile Phe Lys Glu Asn 50 55 60 Ile Ser Leu Val Glu Tyr Glu Arg Tyr Val Lys Leu Leu Ser Asp Tyr 65 70 75 80 Phe Pro Met Ala Arg Leu Leu Asp Lys Lys Glu Val Pro Ile Lys Glu 85 90 95 Arg Lys Glu Asn Phe Lys Lys Asn Phe Lys Gly Ile Ile Lys Ala Val 100 105 110 Arg Asp Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Lys Glu His Gly Glu Val Glu 115 120 125 Ile Thr Asp Glu Ile Phe Gly Val Leu Asp Glu Met Leu Lys Ser Thr 130 135 140 Val Leu Thr Val Lys Lys Lys Lys Val Lys Thr Asp Lys Thr Lys Glu 145 150 155 160 Ile Leu Lys Lys Ser Ile Glu Lys Gln Leu Asp Ile Leu Cys Gln Lys 165 170 175 Lys Leu Glu Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Lys Arg 180 185 190 Arg Asn Gln Arg Glu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Val Ala 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Arg Tyr Glu 405 410 415 Asp Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Ala Gln 420 425 430 Phe Pro Thr Leu Arg Phe Gln Val His Leu Gly Asn Tyr Leu His Asp 435 440 445 Ser Arg Pro Lys Glu Asn Leu Ile Ser Asp Arg Arg Ile Lys Glu Lys 450 455 460 Ile Thr Val Phe Gly Arg Leu Ser Glu Leu Glu His Lys Lys Ala Leu 465 470 475 480 Phe Ile Lys Asn Thr Glu Thr Asn Glu Asp Arg Glu His Tyr Trp Glu 485 490 495 Ile Phe Pro Asn Pro Asn Tyr Asp Phe Pro Lys Glu Asn Ile Ser Val 500 505 510 Asn Asp Lys Asp Phe Pro Ile Ala Gly Ser Ile Leu Asp Arg Glu Lys 515 520 525 Gln Pro Val Ala Gly Lys Ile Gly Ile Lys Val Lys Leu Leu Asn Gln 530 535 540 Gln Tyr Val Ser Glu Val Asp Lys Ala Val Lys Ala His Gln Leu Lys 545 550 555 560 Gln Arg Lys Ala Ser Lys Pro Ser Ile Gln Asn Ile Ile Glu Glu Ile 565 570 575 Val Pro Ile Asn Glu Ser Asn Pro Lys Glu Ala Ile Val Phe Gly Gly 580 585 590 Gln Pro Thr Ala Tyr Leu Ser Met Asn Asp Ile His Ser Ile Leu Tyr 595 600 605 Glu Phe Phe Asp Lys Trp Glu Lys Lys Lys Glu Lys Leu Glu Lys Lys 610 615 620 Gly Glu Lys Glu Leu Arg Lys Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Lys Lys 625 630 635 640 Ile Val Gly Lys Ile Gln Ala Gln Ile Gln Gln Ile Ile Asp Lys Asp 645 650 655 Thr Asn Ala Lys Ile Leu Lys Pro Tyr Gln Asp Gly Asn Ser Thr Ala 660 665 670 Ile Asp Lys Glu Lys Leu Ile Lys Asp Leu Lys Gln Glu Gln Asn Ile 675 680 685 Leu Gln Lys Leu Lys Asp Glu Gln Thr Val Arg Glu Lys Glu Tyr Asn 690 695 700 Asp Phe Ile Ala Tyr Gln Asp Lys Asn Arg Glu Ile Asn Lys Val Arg 705 710 715 720 Asp Arg Asn His Lys Gln Tyr Leu Lys Asp Asn Leu Lys Arg Lys Tyr 725 730 735 Pro Glu Ala Pro Ala Arg Lys Glu Val Leu Tyr Tyr Arg Glu Lys Gly 740 745 750 Lys Val Ala Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg Phe Met Pro Thr 755 760 765 Asp Phe Lys Asn Glu Trp Lys Gly Glu Gln His Ser Leu Leu Gln Lys 770 775 780 Ser Leu Ala Tyr Tyr Glu Gln 785 790

Claims (82)

  1. 하기를 포함하는 단백질 코어 구형 핵산 (ProSNA):
    (a) 유전자 편집 단백질을 포함하는 단백질 코어; 및
    (b) 단백질 코어에 부착된 올리고뉴클레오티드의 쉘.
  2. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 각각의 올리고뉴클레오티드는 단백질 코어에 공유적으로 부착된 ProSNA.
  3. 제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 각각의 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 단백질 코어에 부착된 ProSNA.
  4. 제3항에 있어서, 상기 링커는 절단 가능 링커, 비-절단 가능 링커, 미량 링커, 또는 이들의 조합인 ProSNA.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 링커는 카바메이트 알킬렌 디티올레이트 링커인 ProSNA.
  6. 제5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 단백질-코어-NH-C(O)-O-C2-5알킬렌-S-S-C2-7알킬렌-올리고뉴클레오티드, 또는 단백질-코어-NH-C(O)-O-CH2-Ar-S-S-C2-7알킬렌-올리고뉴클레오티드를 포함하고, Ar은 메타- 또는 파라-치환된 페닐을 포함하는 ProSNA.
  7. 제5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 단백질-코어-NH-C(O)-O-C(ZA)(ZB)C1-4알킬렌-C(XA)(XB)-S-S-C(YA)(YB)C1-6알킬렌-올리고뉴클레오티드를 포함하고, ZA, ZB, XA, XB, YA, 및 YB는 각각 독립적으로 H, Me, Et, 또는 iPr인 ProSNA.
  8. 제5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 단백질-코어-NH-C(O)-O-C(XA)(XB)-Ar-S-S-C(YA)(YB)C2-6알킬렌-올리고뉴클레오티드를 포함하고, XA, XB, YA, 및 YB는 각각 독립적으로 H, Me, Et, 또는 iPr인 ProSNA.
  9. 제3항에 있어서, 상기 링커는 아미드 알킬렌 디티올레이트 링커인 ProSNA.
  10. 제9항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 단백질-코어-NH-C(O)- C2-5알킬렌-S-S-C2-7알킬렌-올리고뉴클레오티드를 포함하는 ProSNA.
  11. 제9항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 단백질-코어-NH-C(O)- C1-4알킬렌-C(XA)(XB)-S-S-C(YA)(YB)C1-6알킬렌-올리고뉴클레오티드를 포함하고, XA, XB, YA 및 YB는 각각 독립적으로 H, Me, Et, 또는 iPr인 ProSNA.
  12. 제3항에 있어서, 상기 링커는 아미드 알킬렌 티오에테르 링커인 ProSNA.
  13. 제12항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 단백질-코어-NH-C(O)- C2-4알킬렌-N-숙신이미딜-S-C2-6알킬렌-올리고뉴클레오티드를 포함하는 ProSNA.
  14. 하기를 포함하는 구형 핵산 (SNA):
    (a) 나노입자 코어;
    (b) 나노입자 코어의 외부 표면에 부착된 올리고뉴클레오티드 쉘; 및
    (c) 유전자 편집 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 상기 나노입자 코어는 리포좀 코어 또는 지질 나노입자 코어인 SNA.
  16. 제15항에 있어서, 상기 지질 나노입자 코어가 이온화 가능 지질, 인지질, 스테롤, 및 지질-폴리에틸렌 글리콜 (지질-PEG) 접합체를 포함하는 SNA.
  17. 제16항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 각각의 올리고뉴클레오티드는 지질-PEG 접합체를 통해 지질 나노입자 코어의 외부에 공유적으로 부착되는 SNA.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질이 지질 나노입자 코어에서 캡슐화되는 것인 SNA.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 ProSNA가 지질 나노입자 코어에서 캡슐화되는 것인 SNA.
  20. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리보핵단백질 (RNP) 복합체가 지질 나노입자 코어에서 캡슐화되고, RNP가 유전자 편집 단백질, 규칙적으로 간격을 두고 배치된 짧은 회문형 반복 (CRISPR) RNA (crRNA), 및 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)를 포함하는 SNA.
  21. 제15항에 있어서, 상기 리포솜 코어가 복수의 지질 기를 포함하는 SNA.
  22. 제15항 또는 제21항에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질이 리포솜 코어에 캡슐화되는 것인 SNA.
  23. 제22항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 ProSNA가 리포솜 나노입자 코어에서 캡슐화되는 것인 SNA.
  24. 제15항 또는 제21항에 있어서, 상기 리보핵단백질 (RNP) 복합체가 지질 나노입자 코어에서 캡슐화되고, RNP가 유전자 편집 단백질, CRISPR RNA (crRNA), 및 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)를 포함하는 SNA.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 지질 기는 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 및 포스파티딜에탄올아민 계열의 지질로 이루어진 군으로부터 선택된 지질을 포함하는 SNA.
  26. 제25항에 있어서, 상기 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-디미리스토일-sn-포스파티딜콜린 (DMPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-포스파티딜콜린 (POPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DSPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DOPG), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 및 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE)로 이루어진 군으로부터 선택되는 SNA.
  27. 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 지질 앵커 그룹을 통해 리포솜 또는 지질 나노입자 코어의 외부에 부착되는 SNA.
  28. 제27항에 있어서, 상기 지질 앵커 그룹이 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 부착되는 SNA.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 지질 앵커 그룹이 토코페롤 또는 콜레스테롤인 SNA.
  30. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항, 또는 제14항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질이 CRISPR-관련 단백질 (Cas)인 ProSNA 또는 SNA.
  31. 제30항에 있어서, 상기 Cas는 Cas9, Cas12, Cas13, 또는 이들의 조합인 ProSNA 또는 SNA.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 디벤조시클로옥틸 (DBCO)로 변형되는 ProSNA 또는 SNA.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘은 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 RNA, 또는 이들의 조합을 포함하는 ProSNA 또는 SNA.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 변형된 올리고뉴클레오티드인 ProSNA 또는 SNA.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘은 약 2 내지 약 100개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 ProSNA 또는 SNA.
  36. 제35항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘은 약 10 내지 약 80개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 ProSNA 또는 SNA.
  37. 제35항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘은 약 5 내지 약 50개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 ProSNA 또는 SNA.
  38. 제35항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘은 약 5 내지 약 20개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 ProSNA 또는 SNA.
  39. 제35항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘은 약 14개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 ProSNA 또는 SNA.
  40. 제35항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘은 약 15개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 ProSNA 또는 SNA.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 각각의 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 100개의 뉴클레오티드 길이인 ProSNA 또는 SNA.
  42. 제41항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 각각의 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오티드 길이인 ProSNA 또는 SNA.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘 내 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 (GGX)n 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 n은 2-20이고 X는 핵염기 (A, C, T, G, 또는 U)인 ProSNA 또는 SNA.
  44. 제43항에 있어서, 상기 (GGX)n 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 있는 ProSNA 또는 SNA.
  45. 제43항에 있어서, 상기 (GGX)n 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 있는 ProSNA 또는 SNA.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (GGX)n 뉴클레오티드 서열은 (GGT)n 뉴클레오티드 서열인 ProSNA 또는 SNA.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ProSNA 또는 SNA의 직경이 약 1 나노미터 (nm) 내지 약 500 nm인 ProSNA 또는 SNA.
  48. 제14항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SNA의 직경이 약 50 나노미터 이하인 ProSNA 또는 SNA.
  49. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항, 또는 제48항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 표적화 올리고뉴클레오티드인 ProSNA 또는 SNA.
  50. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항, 또는 제48항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 쉘은 억제성 올리고뉴클레오티드, 면역자극 올리고뉴클레오티드, 유전자 편집기 기질 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 조합을 포함하는 ProSNA 또는 SNA.
  51. 제50항에 있어서, 상기 억제성 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 소형 간섭 RNA (siRNA), 압타머, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), DNA자임, 또는 압타자임인 ProSNA 또는 SNA.
  52. 제50항에 있어서, 상기 면역자극 올리고뉴클레오티드는 CpG-모티프 함유 올리고뉴클레오티드, 이중 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드, 또는 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드인 ProSNA 또는 SNA.
  53. 제50항에 있어서, 상기 각각의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 톨-유사 수용체 (TLR) 작용제인 ProSNA 또는 SNA.
  54. 제53항에 있어서, 상기 TLR은 톨-유사 수용체 1 (TLR1), 톨-유사 수용체 2 (TLR2), 톨-유사 수용체 3 (TLR3), 톨-유사 수용체 4 (TLR4), 톨-유사 수용체 5 (TLR5), 톨-유사 수용체 6 (TLR6), 톨-유사 수용체 7 (TLR7), 톨-유사 수용체 8 (TLR8), 톨-유사 수용체 9 (TLR9), 톨-유사 수용체 10 (TLR10), 톨-유사 수용체 11 (TLR11), 톨-유사 수용체 12 (TLR12), 및 톨-유사 수용체 13 (TLR13)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ProSNA 또는 SNA.
  55. 제1항 내지 제13항, 제30항 내지 제47항, 또는 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항의 복수의 단백질-코어 구형 핵산 (ProSNA)을 포함하는 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 가이드 RNA를 추가로 포함하는 조성물.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 ProSNA 중 적어도 2개는 상이한 단백질 코어를 포함하는 조성물.
  58. 제14항 내지 제54항 중 어느 한 항의 복수의 구형 핵산 (SNA)을 포함하는 조성물.
  59. 제57항에 있어서, 상기 SNA 중 적어도 2개는 상이한 나노입자 코어를 포함하는 조성물.
  60. 세포를 제1항 내지 제13항, 제30항 내지 제47항, 또는 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항의 ProSNA와 접촉시키는 것을 포함하는 유전자 편집 단백질을 세포에 전달하는 방법.
  61. 세포를 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 유전자 편집 단백질을 세포에 전달하는 방법.
  62. 세포를 제14항 내지 제54항 중 어느 한 항의 SNA와 접촉시키는 것을 포함하는 유전자 편집 단백질을 세포에 전달하는 방법.
  63. 세포를 제58항 또는 제59항의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 유전자 편집 단백질을 세포에 전달하는 방법.
  64. 유효량의 (i) 제1항 내지 제13항, 제30항 내지 제47항, 또는 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항의 ProSNA, (ii) 제14항 내지 제54항 중 어느 한 항의 SNA, (iii) 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 (iv) 이들의 조합을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 장애가 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환, 유전 질환, 심혈관 질환, 또는 이들의 조합인 방법.
  66. N-말단에서 C-말단으로 다음과 같이 배열된, 하기를 포함하는 융합 단백질:
    (i) 하나 이상의 GALA 펩티드;
    (ii) 유전자 편집 단백질, 및
    (iii) 핵 국소화 신호 (NLS).
  67. 제66항에 있어서, 상기 하나 이상의 GALA 펩티드가 3개의 연속적인 GALA 펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 상기 각각의 하나 이상의 GALA 펩티드는 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 융합 단백질.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 GALA 펩티드는 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 융합 단백질.
  70. 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질은 CRISPR-관련 단백질 (Cas)인 융합 단백질.
  71. 제70항에 있어서, 상기 Cas는 Cas9, Cas12, Cas13, 또는 이들의 조합인 융합 단백질.
  72. 제71항에 있어서, 상기 Cas9은 서열 번호 1 또는 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 융합 단백질.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 상기 Cas12는 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 융합 단백질.
  74. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas13은 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 융합 단백질.
  75. 제66항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NLS는 서열 번호 23 또는 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 융합 단백질.
  76. 제66항 내지 제75항 중 어느 한 항의 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  77. 제1항 내지 제13항, 제30항 내지 제47항, 또는 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항, 또는 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질이 제66항 내지 제75항 중 어느 한 항의 융합 단백질인 ProSNA, 또는 조성물.
  78. 제14항 내지 제54항 중 어느 한 항, 또는 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질이 제66항 내지 제75항 중 어느 한 항의 융합 단백질인 SNA, 또는 조성물.
  79. 세포를 제66항 내지 제75항 중 어느 한 항의 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는 유전자 편집 단백질을 세포에 전달하는 방법.
  80. 세포를 제76항의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 유전자 편집 단백질을 세포에 전달하는 방법.
  81. 유효량의 (i) 제66항 내지 제75항 중 어느 한 항의 융합 단백질, (ii) 제76항의 조성물, 또는 (iii) 이들의 조합을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 장애가 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환, 유전 질환, 심혈관 질환, 또는 이들의 조합인 방법.
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