JP2024521793A - 正確な編集修復の効率を向上させるための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

標的遺伝子の正確な遺伝子編集の効率を向上させるための組成物及び方法が提供される。１つの方法は、表２から選択される１つの遺伝子または遺伝子の組み合わせの発現または活性を一時的に阻害、下方制御、遮断、または低減する組成物を、遺伝子編集系の成分の前またはそれと同時に、インビボで哺乳動物対象に投与すること、またはエクスビボで哺乳動物細胞と接触させること、を含む。一実施形態では、そのような成分は、当該標的遺伝子の正確な編集修復のためのＣａｓ酵素及びＲＮＡガイドを含む。別の実施形態では、そのような成分は、当該標的遺伝子の正確な編集修復のための他のＤＮＡ標的化酵素様ＴＡＬＥまたはＺＦＮを含む。別の方法は、表１から選択される少なくとも１つの追加の遺伝子もしくは追加の遺伝子の組み合わせの産物、発現、もしくは活性を一時的に活性化、上方制御、刺激、もしくは過剰発現させる組成物、または阻害剤及び活性化因子の任意の組み合わせを、当該標的遺伝子の正確な編集修復のための遺伝子編集系の成分の前またはそれと同時に、インビボで哺乳動物対象に投与すること、またはエクスビボで哺乳動物細胞と接触させること、を含む。さらに他の方法は、そのような阻害組成物及び活性化組成物のさまざまな組み合わせを投与することを含む。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月２４日出願の米国特許出願第６３／１９２，２７７号の優先権の利益を米国特許法第１１９条（ｅ）の下で主張する。この出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国防高等研究計画局によって付与された助成金番号Ｄ１８ＡＰ０００５３の下で政府の支援を受けてなされた。本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された助成金番号ＤＰ２ＨＧ０１００９９の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

遺伝子編集治療は、先天性の遺伝的欠陥の正確な修復及び疾患の予防または好転のための新たなクラスの遺伝子治療である。遺伝子編集系は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質編集系または転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ＤＮＡ結合ドメイン編集系、及び規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）ゲノム編集系などを含めて、さまざまなものが知られている。こうした手法は、標的遺伝子を選択的に活性化／抑制すること、特定のＤＮＡ領域を精製すること、生細胞中のＤＮＡを画像化すること、ならびにＤＮＡ及びＲＮＡを正確に編集することに使用されている。簡潔に記載すると、こうした編集系は、推定上のＤＮＡ標的または遺伝子標的に結合する。標的が切断されると、遺伝子標的中に一本鎖切断または二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックが生じる。切断の修復及び特定の標的配列の編集は、細胞によって使用されている修復方針の型に依存する。

主なＤＮＡ修復経路は、非相同ＤＮＡ末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え修復（ＨＤＲ）の２つである。ＮＨＥＪ修復経路は、可変サイズの遺伝子の挿入または欠失を高効率で生じさせるために使用されているが、この修復系はエラーが生じやすく、不正確である。ＮＨＥＪ修復経路はＤＳＢ部位に小さなヌクレオチド挿入または欠失（インデル）を高頻度で生じさせ、こうしたインデルが生じる結果、アミノ酸欠失、挿入、またはフレームシフト変異が引き起されて、標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に未成熟終止コドンが生じる。

ＨＤＲ経路では、姉妹染色分体または外来ＤＮＡに由来する相同ドナーＤＮＡ配列が使用されて、遺伝子編集系によって創出される二本鎖切断（ＤＳＢ）部位の間に挿入、塩基置換が正確に創出される。この機構は、忠実度は高いが、発生率は低いものである。ＣＲＩＳＰＲ手法においてＨＤＲを遺伝子編集に利用するには、例えば、ＤＮＡの切断を導くための所望の配列を含む外来性ＤＮＡ修復テンプレートがｇＲＮＡ（複数可）及びＣａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼと共に目的の細胞型に送達されなくてはならない。用途及び修復方法に応じて、修復テンプレートは一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、または二本鎖ＤＮＡプラスミドであり得る。これによって、相同組換え（ＨＲ）の確率が約１，０００倍に上昇し得る。注目すべきことに、ＨＤＲは、コンディショナル遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺伝子置換、及び点変異を含めて、さまざまな手法においてゲノムの正確な編集に使用することができる。しかしながら、ＨＤＲの効率は一般的に低い（改変アレルのうちの１０％未満）。正確な遺伝子修復を施す他の方法には、塩基編集修復機構またはプライム編集修復機構が含まれる。

正確な遺伝子修復の効率の向上についてはさまざまな方法が概説されている。例えば、非特許文献１及び非特許文献２を参照のこと。非特許文献２では、ＤＮＡリガーゼＩＶ阻害剤の使用、またはｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡを用いるある特定の遺伝子発現の妨害によるさまざまなＮＨＥＪ阻害方法、Ｇ２／Ｓ期におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの送達、ドナーテンプレートへの相同アームの付加、及び改変Ｃａｓ９の使用について概説された。ＨＤＲを増加させるための小分子（Ｌ７５５５０７、ブレフェルジンＡ、及びＲＳ－１）ならびにＢＲＣＡ１の過剰発現に関する研究についても言及された。さらに、Ｃａｓ９－ＣｔＩＰ（Ｃａｓ９とＣｔＩＰ（二本鎖切断切除に関与するタンパク質）との融合体）はＨＤＲ効率の向上に寄与し得る。

エクスビボ環境及びインビボ環境の両方において正確な編集修復の効率が向上すれば、多くのＤＮＡ変異関連疾患の治療及び修正においてＣＲＩＳＰＲまたは他の遺伝子編集系を使用することが可能になる。

Ｘ－Ｄ．Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ／Ｃａｓ９－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７ Ｊｕｎｅ ２０１９，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｇｅｎｅ．２０１９．００５５１ Ｌｉｕ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ＨＤＲ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，９，６９１

正確な遺伝子編集修復の効率を改善するためのさまざまな組成物及び方法が提供される。本明細書では、簡略化のために、遺伝子編集手法または遺伝子編集成分の一例としてＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系への言及がなされる。ＣＲＩＳＰＲの記載箇所を問わず、ＣＲＩＳＰＲの代わりに別の遺伝子編集系及びその成分も使用できることを理解されたい。

一態様では、組成物は、ゲノム編集手法及び標的遺伝子（例えば、疾患または障害と関連する標的遺伝子）の正確な遺伝子修復を実施する上で必要な成分と、表２から選択される遺伝子の発現または活性を一時的に阻害、下方制御、または遮断する少なくとも１つの阻害成分と、を含む。さらに他の態様では、組成物は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子の少なくとも１つの阻害剤を含む。一態様では、組成物は、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）遺伝子編集系における使用向けに設計される。

別の態様では、組成物は、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）ゲノム編集手法、及び疾患または障害と関連する標的遺伝子の正確な遺伝子修復を実施する上で必要な成分と、表１から選択される遺伝子の遺伝子産物または活性を一時的に増加、上方制御、または過剰発現させる少なくとも１つの活性化成分と、を含む。

さらに別の態様では、組成物は、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）ゲノム編集手法、及び疾患または障害と関連する標的遺伝子の正確な遺伝子修復を実施する上で必要な成分と、本明細書で特定される少なくとも１つの阻害成分と少なくとも１つの活性化成分との組み合わせと、を含む。さらに別の態様では、組成物は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子の少なくとも１つの阻害剤との組み合わ
せを含む。

特定された阻害成分及び／または活性化成分がさまざまな組み合わせでこうした組成物中に存在することで、標的遺伝子の正確な遺伝子修復の効率を向上させることが可能になる。

さらに別の態様では、標的遺伝子の正確な遺伝子編集の効率を向上させるための方法は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集手法及び当該標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ介在性の正確な編集修復を実施する上で必要な成分の前またはそれと同時に、表２から選択される１つの遺伝子または遺伝子の組み合わせの発現または活性を一時的に阻害、下方制御、遮断、または低減する組成物をインビボで哺乳動物対象に投与すること、またはエクスビボで哺乳動物細胞と接触させること、を含む。さらに他の態様では、方法は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子の少なくとも１つの阻害剤を含む。

さらに別の態様では、標的遺伝子の正確な遺伝子編集の効率を向上させるための方法は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集手法及び当該標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ介在性の正確な編集修復を実施する上で必要な成分の前またはそれと同時に、表１から選択される少なくとも１つの追加の遺伝子または追加の遺伝子の組み合わせの産物、発現、または活性を一時的に活性化、上方制御、刺激、または過剰発現させる組成物をインビボで哺乳動物対象に投与すること、またはエクスビボで哺乳動物細胞と接触させること、を含む。

別の態様では、標的遺伝子の正確な遺伝子編集の効率を向上させるための方法は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集手法及び当該標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ介在性の正確な編集修復を実施する上で必要な成分の前またはそれと同時に、上記の阻害組成物または阻害成分と本明細書に記載の活性化組成物または活性化成分との両方を含む組成物をインビボで哺乳動物対象に投与すること、またはエクスビボで哺乳動物細胞と接触させること、を含む。さらに他の態様では、方法は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子の少なくとも１つの阻害剤を含む。

研究における使用及び遺伝子関連疾患の治療のためのそのような組成物及び方法の使用もまた、本明細書に記載の本発明の一態様である。

こうした組成物及び方法のさらに他の態様及び利点については、その好ましい実施形態についての後述の詳細な説明においてさらに記載される。

実施例１のＣＲＩＳＰＲ阻害（ＣＲＩＳＰＲｉ）スクリーニングにおいて特定された上位遺伝子ヒットの検証結果を示すグラフである。ＨＤＲを促進する上位ＣＲＩＳＰＲｉヒットの中で、ＤＮＡ損傷に関与する遺伝子（ＤＮＡ－ＰＫ、ＴＰ５３ＢＰ１、及びＬＩＧ４）を特定した。ＤＮＡ－ＰＫ、ＴＰ５３ＢＰ１、及びＬＩＧ４をノックアウトすると、以前に確立されたようにＨＤＲレベルが上昇した。ノックアウトするとＫ５６２細胞でのＨＤＲが促進される遺伝子をさらに１３個特定した。ＮＨＥＪを遮断した場合、ＨＤＲのレベルは約５０～６０％に上昇したにすぎなかった。 Ａは、ＨＥＫ２９３のＤＮＡ－ＰＫノックアウトモノクローナル細胞株を示すウエスタンブロットである。ガイド及びＣａｓ９ヌクレアーゼを用いてＨＥＫ２９３細胞中のＤＮＡ－ＰＫ遺伝子を標的とすることによってＨＥＫ２９３細胞においてＤＮＡ－ＰＫモノクローナルノックアウト細胞を生成させた。ウエスタンブロットによってモノクローナル株を試験して、タンパク質レベルでのＤＮＡ－ＰＫの発現を調べた。野生型（ＷＴ）ＨＥＫ２９３細胞はＤＮＡ－ＰＫの発現を示す一方で、クローン２、３、１８、１９、及び２２ではノックアウトによってＤＮＡ－ＰＫが完全に消失していた。クローン１及び２４では、残存ＤＮＡ－ＰＫタンパク質レベルが検出された。Ｂは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）への変換アッセイを使用した場合のＤＮＡ－ＰＫモノクローナル株におけるＨＤＲレベルを示す棒グラフである。ＨＤＲのレベルはＷＴ細胞と比較して２倍に上昇し、ＤＮＡ－ＰＫ発現が完全に消失しているモノクローナル株（クローン２、３、１８、１９、２２）にわたって一貫していた。 ＣＲＩＳＰＲ阻害スクリーニングの結果を示す。生物学的反復としてＤＮＡ－ＰＫノックアウトクローン株１８及び２２を使用して、これらの細胞においてゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ阻害スクリーニングを実施した。本発明者らは、ＨＤＲ（変化倍率中央値）を増加させる遺伝子（図３の最も右側の３分の１）及び減少させる遺伝子を特定した。ＨＤＲを減少させる遺伝子（チャートの最も左側の３分の１）には、ＢＲＣＡ１、ＦＡＮＣＭ、ＦＡＮＣＩ、ＢＡＲＤ１、及びＲＢＢＰ８が含まれている。 コンビナトリアル遺伝子摂動がＨＤＲレベルを有意に上昇させることを示す。示される遺伝子のノックアウト細胞株を２μＭのＤＮＡ－ＰＫ阻害剤で処理した。ＨＤＲレベルは細胞選別によって決定した。ＲＦＣ５ノックアウト株、ＴＵＢＡ１Ｂノックアウト株、ＮＥＤＤ８ノックアウト株、ＬＩＧ４ノックアウト株、ＰＯＬＱノックアウト株、及びＲＡＤ５１ノックアウト株においてＤＮＡ－ＰＫを遮断すると、ＨＤＲレベルが有意に増加した。 ＤＮＡ－ＰＫ及び第２の遺伝子標的を阻害することで生じるＨＤＲの増加をＧＦＰ→ＢＦＰアッセイを使用して決定したアレイ検証の追加の結果を示す棒グラフである。簡潔に記載すると、ＤＮＡ－ＰＫノックアウト細胞クローン２２をＮＴ（対照としての非標的化ガイド）の標的としてベースラインを確立するか、または示される遺伝子のうちの１つを標的とするガイドの標的とした。Ｘ軸の下に示されるこれらの遺伝子のほとんどが、ＤＮＡ－ＰＫノックアウト細胞において摂動を受けた場合にＨＤＲレベルを上昇させた。ＮＴは対照であり、標的が示される。赤色の点線は、ＤＮＡ－ＰＫのみの阻害がＨＤＲに与える影響の結果を示す。正確な修復レベルは、ＤＭＳＯに対するＢＦＰ＋細胞の％として示される。 表２から選択された遺伝子標的、及び既知の小分子阻害剤のリストである。これらの小分子阻害剤は、こうした試験のためにＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ．ｃｏｍ、Ｍｅｄ ＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａから購入した。 ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）または１μＭの示される阻害剤で処理したＤＮＡ－ＰＫ ＫＯ細胞クローン２２における薬物検証の結果のグラフである。１８個の標的を３８個の薬物の標的とした。いくつかの薬物は致死性であったため、使用を控えた。小分子阻害剤は、Ｃａｓ９、ガイドＲＮＡ、及びＢＦＰをコードする一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の導入と同時に培地に添加した。ＨＤＲレベルは、ＢＦＰ→ＧＦＰアッセイを用いて測定した。薬物は２４時間後に洗い流した。示される遺伝子標的の阻害剤化合物の約７５％がＨＤＲレベルを上昇させた。正確な修復レベルは、ＤＭＳＯに対するＢＦＰ＋細胞の％として示される。 ＨＤＲに対する小分子阻害剤の用量依存的効果を示すヒートプロットである。記載の化合物を１０μＭ、５μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．１μＭ、及び０．０１μＭの化合物濃度で図４及び６と同様に用いてＤＮＡ－ＰＫ ＫＯ細胞を試験した。ＨＤＲレベルは、薬物処理から２４時間後のＤＭＳＯに対するＢＦＰ＋細胞の％として示される。 薬物処理後の細胞毒性を示すヒートプロットである。１０μＭ、５μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．１μＭ、及び０．０１μＭで記載の化合物を用いてＨＥＫ２９３ ＤＮＡ－ＰＫ ＫＯ細胞を３連で処理した。２４時間後、ＭＴＴアッセイを実施した。色が濃いほど、ＤＭＳＯとの比較時の生存細胞率が高いことを示す。 Ａは、化合物ＫＰＴ－２７６についてＤＭＳＯに対するＢＦＰ＋の増加及び細胞毒性を示すグラフである。１０μＭ、５μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．１μＭ、及び０．０１μＭで記載の化合物を図４及び６と同様に用いてＤＮＡ－ＰＫ ＫＯ細胞を試験した。阻害剤は低濃度ではＨＤＲを促進し、高濃度では毒性を示すことが認められた。Ｂは、化合物ＳＢＥ１３ＨＣｌについてＤＭＳＯに対するＢＦＰ＋の増加及び細胞毒性を示すグラフである。１０μＭ、５μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．１μＭ、及び０．０１μＭで記載の化合物を図４及び６と同様に用いてＤＮＡ－ＰＫ ＫＯ細胞を試験した。この化合物についてはＨＤＲを用量依存的に増加させることが認められ、毒性の低さが認められた。 化合物の組み合わせの表を示す。図７及び８向けに記載した実験の結果から１１個の化合物を選択した。これらの化合物を記載の濃度で組み合わせて試験する。

正確な遺伝子修復を施すさまざまな手法の効率を増強するための方法及び組成物が提供される。こうした方法及び組成物は、阻害または活性化されると正確な遺伝子修復機構のうちの１つ以上の効率を向上させ得るある特定の遺伝子を特定すること及び組み合わせることを含む。ある特定の実施形態では、こうした組成物は、治療状況において遺伝子編集手法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）と組み合わせて使用される。そのような手法は、遺伝子編集修復の効率を向上させる上で、多くの臨床状況及び研究状況においても有用であると予想される。

本明細書の説明及び実施例及び図に記載のように、本発明者らは、遺伝子産物の活性または発現が阻害または活性化（すなわち、過剰発現）された場合に正確な遺伝子修復の形態を増強し得るある特定のヒト遺伝子を特定している。一実施形態では、こうした方法及び組成物によって効率が増強される正確な遺伝子修復の形態は相同組換え修復（ＨＤＲ）である。別の実施形態では、こうした方法及び組成物によって効率が増強される正確な遺伝子修復の形態は非相同ＤＮＡ末端結合修復である。他の形態の正確な遺伝子修復もまた、塩基編集修復及びプライム編集修復ならびに他の形態の遺伝子編集修復を含めて、同じ方法及び組成物に応答することが見込まれる。

Ａ．方法及び組成物の用語及び成分についての説明
本明細書で使用される専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味、及び刊行された教科書（本出願において使用される用語の多くに対する一般的な指針を当業者に与えるもの）を参照することによって一般に理解される意味、と同じ意味を有する。本明細書に含まれる定義は、本明細書に記載の成分及び組成物の説明における明確化のために提供されるものであり、請求される発明の限定を意図するものではない。

「遺伝子編集系」は、標的遺伝子の機能または発現が変化し、改変され、または欠失するように標的遺伝子を編集する系または技術を意味する。ゲノム編集系は、標的遺伝子の切断を可能にする少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ成分と、少なくとも１つの遺伝子標的化エレメントと、を含む。ゲノム標的化エレメントの例としては、米国特許公開出願２０２０／３６１８７７（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質または転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ＤＮＡ結合ドメイン）、ガイドＲＮＡエレメント（例えば、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ）、及びガイドＤＮＡエレメント（例えば、ＮｇＡｇｏガイドＤＮＡ）が挙げられる。当該技術分野で知られるさらに他の遺伝子編集系もまた、この用語によって包含されることが意図される。上記のように、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系の使用は、すべての他の遺伝子編集系及び成分を代表するものであることが意図される。

「ＣＲＩＳＰＲ」ゲノム編集手法、すなわち、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列ゲノム編集手法は、多くの種類の遺伝学的研究、及び遺伝子の機能不全または機能障害によって引き起こされる疾患または疾患状態の治療に有用である。ＣＲＩＳＰＲ
は遺伝子編集系である。一般に、操作されたＣＲＩＳＰＲ系は、２つの成分（ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）及びＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓタンパク質））を含む。ｇＲＮＡは、Ｃａｓの結合に必要なスキャフォールド配列と、改変すべきゲノム標的を規定する約２０ヌクレオチドのユーザー定義スペーサーと、から構成される短い合成ＲＮＡである。ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質が細胞中で発現すると、それらが結合するゲノム標的配列が挿入もしくは欠失によって改変されるか、または永久的に破壊され得る。ＣＲＩＳＰＲに関する追加の情報については、他にも刊行物が多く知られているが、とりわけ、Ａｄｄｇｅｎｅ ＣＲＩＳＰＲオンラインガイド（ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｇｕｉｄｅｓ／ｃｒｉｓｐｒ／）中に、より詳細に提供されている。米国特許第８，９９９，６４１号、同第８，９９３，２３３号、同第８，９４５，８３９号、同第８，９３２，８１４号、同第８，９０６，６１６号、同第８，８９５，３０８号、同第８，８８９，４１８号、同第８，８８９，３５６号、同第８，８７１，４４５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，７９５，９６５号、同第８，７７１，９４５号、及び同第８，６９７，３５９号；米国特許公開公報ＵＳ２０１４－０３１０８３０、同ＵＳ２０１４－０２８７９３８Ａ１、同ＵＳ２０１４－０２７３２３４Ａ１、同ＵＳ２０１４－０２７３２３２Ａ１、同ＵＳ２０１４－０２７３２３１、同ＵＳ２０１４－０２５６０４６Ａ１、同ＵＳ２０１４－０２４８７０２Ａ１、同ＵＳ２０１４－０２４２７００Ａ１、同ＵＳ２０１４－０２４２６９９Ａ１、同ＵＳ２０１４－０２４２６６４Ａ１、同ＵＳ２０１４－０２３４９７２Ａ１、同ＵＳ２０１４－０２２７７８７Ａ１、同ＵＳ２０１４－０１８９８９６Ａ１、同ＵＳ２０１４－０１８６９５８、同ＵＳ２０１４－０１８６９１９Ａ１、同ＵＳ２０１４－０１８６８４３Ａ１、同ＵＳ２０１４－０１７９７７０Ａ１、及び同ＵＳ２０１４－０１７９００６Ａ１、同ＵＳ２０１４－０１７０７５３；欧州特許ＥＰ２７８４１６２Ｂ１及び同ＥＰ２７７１４６８Ｂ１；欧州特許出願ＥＰ２７７１４６８（ＥＰ１３８１８５７０．７）、同ＥＰ２７６４１０３（ＥＰ１３８２４２３２．６）、及び同ＥＰ２７８４１６２（ＥＰ１４１７０３８３．５）、ならびにＰＣＴ特許公開公報ＰＣＴ特許公開公報ＷＯ２０１４／０９３６６１、同ＷＯ２０１４／０９３６９４、同ＷＯ２０１４／０９３５９５、同ＷＯ２０１４／０９３７１８、同ＷＯ２０１４／０９３７０９、同ＷＯ２０１４／０９３６２２、同ＷＯ２０１４／０９３６３５、同ＷＯ２０１４／０９３６５５、同ＷＯ２０１４／０９３７１２、同ＷＯ２０１４／０９３７０１、同ＷＯ２０１４／０１８４２３、同ＷＯ２０１４／２０４７２３、同ＷＯ２０１４／２０４７２４、同ＷＯ２０１４／２０４７２５、同ＷＯ２０１４／２０４７２６、同ＷＯ２０１４／２０４７２７、同ＷＯ２０１４／２０４７２８、同ＷＯ２０１４／２０４７２９、及び同ＷＯ２０１６／０２８６８２も併せて参照のこと。これらの文書はすべて、方法、材料、送達媒体、ベクター、粒子、ＡＡＶ、ならびにその調製及び使用（量及び製剤に関するものを含む）（それらのいくつかは、本開示の方法及び組成物またはキットに有用である）を含めて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、その成分、及びそのような成分の送達に関する追加の一般情報を提供するために、参照によって組み込まれる。

本明細書で使用される「ＣＲＩＳＰＲ成分」という用語は、一般に、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を意味する。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ成分は、Ｃａｓ９タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、及びトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集系から選択される。一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの融合体）は特定の配列を効率的に認識し、Ｃａｓ９タンパク質の作用を導く。本明細書に記載の組成物及び方法において利用されるＣＲＩＳＰＲ成分は、ゲノム編集に使用されている、より新しいＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（Ｖ型Ｃａｓ１２ａ系を含む）ならびに内在性のＩ型及びＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からも選択され得る。こうした系は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）領域、Ｃａｓタンパク質サイズ、及び切断部位が異なる。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａゲノム編集系は、ｃｒＲＮＡ及びＣａｓ１２ａタンパク質を含む。他のＣａｓタンパク質は、１２ｂｋ、１２ｃ、及び１４である。Ｉ型系は、最多のｃａｓ遺伝子（１
つ以上のオペロンによってコードされる）を有する。Ｉ型系は、ヘリカーゼ活性及びヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ３タンパク質を含めて、６つのタンパク質を含む。複数のＣａｓタンパク質が成熟ｃｒＲＮＡと組み合わさって、抗ウイルス防御のためのＣＲＩＳＰＲ関連複合体（Ｃａｓｃａｄｅ）を形成する。このＣａｓｃａｄｅは侵入外来ＤＮＡに結合し、ｃｒＲＮＡと外来性ＤＮＡの相補鎖との対形成を促進してＲループを形成し、これがＣａｓ３によって認識されることで相補鎖及び非相補鎖の両方が切断される。ＩＩＩ型系は、ＲＮａｓｅ活性を有するＣａｓ１０タンパク質及びＣａｓｃａｄｅを含み、Ｃａｓｃａｄｅの機能はＩ型系と類似している。ＩＩＩ型系は、Ａ～Ｄと命名された４つのサブタイプに分類される。ＩＶ型Ｃａｓ系は、Ｃａｓ１３を使用してＲＮＡを切断する。例えば、Ｌｉｕ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ １９，１７２（２０２０）、及びＭｏｏｎ，Ｓ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｏｏｌ ｓｅｔ．Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ５１，１－１１（２０１９）を参照のこと。これらの文献は両方共、参照によって本明細書に組み込まれる。さらに他のＣＲＩＳＰＲ成分には、改変Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ９ニッカーゼ、ＳｐＣａｓ９のＤ１０Ａ変異体、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）、及びＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ＨｙｐａＣａｓ９、ｅｖｏＣａｓ９、ｘＣａｓ９ ３．７、ならびにＳｎｉｐｅｒ－Ｃａｓ（上で引用したＡｄｄｇｅｎｅ ＣＲＩＳＰＲガイド）、またはそれらの組み合わせなど）が含まれ得る。本発明の組成物及び方法では、任意の適切なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣＲＩＳＰＲ成分及び改変成分が利用され得ることが見込まれる。

「遺伝子」という用語は、当該技術分野でのその慣習的な意味に従って使用される。遺伝子は、染色体の一部を形成するヌクレオチドの配列であり、その順序によって、細胞（またはウイルス）が合成し得るポリペプチドまたは核酸分子中のモノマーの順序が決定される。本明細書で使用される「標的遺伝子」という用語は、遺伝子編集の標的となる遺伝子を指す。ある特定の実施形態では、方法及び組成物に有用な遺伝子標的は、遺伝的に媒介される疾患に関与する遺伝子である。

「遺伝子産物」という用語は、既知の機能及び／または活性を有する特定された遺伝子によってコードされる配列を指す。遺伝子産物には、限定されないが、とりわけ、断片、アイソフォーム、相同タンパク質、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、タンパク質バリアント、改変タンパク質、誘導体、類似体、及び融合タンパク質が含まれる。タンパク質には、機能及び／または活性が特定されている天然もしくは天然起源のタンパク質、組換えタンパク質、合成タンパク質、またはそれらの組み合わせが含まれる。この用語は、遺伝子産物の任意の組換え形態もしくは天然起源形態、または既知の機能もしくは活性を維持するそれらのバリアント（例えば、野生型タンパク質と比較して少なくとも３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、９５％以内、もしくは１００％の活性を有するもの）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ヒト遺伝子産物である。本明細書に記載の組成物及び方法に有用な遺伝子及び遺伝子産物の例については、表１及び表２を参照のこと。

「正確な遺伝子修復」という用語は、遺伝子編集によって生じる核酸標的中の切断の修復に利用し得る任意の方法を意味する。上記のように、主な修復経路は、背景技術に定義されるＮＨＥＪ及びＨＤＲの２つである。他の修復形態には、塩基編集及びプライム編集が含まれる。

「塩基編集」では、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を生じさせることなく細胞ＤＮＡまたはＲＮＡに点変異を直接導入するための他の酵素と一緒にＣＲＩＳＰＲ系由来成分が使用される。これによって、望ましくない編集副産物を過剰に生成することなく非分裂細胞に
点変異を効率的に導入することが可能になる。Ｒｅｅｓ ＨＡ，Ｌｉｕ ＤＲ．Ｂａｓｅ
ｅｄｉｔｉｎｇ：ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｏｆ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ
Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１８ Ｄｅｃ；１９（１２）：７７０－７８８．Ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１８ Ｏｃｔ １９；ＰＭＩＤ：３０３２３３１２；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６５３５１８１を参照のこと。ＤＮＡ塩基エディターは、核酸塩基デアミナーゼ酵素と融合した触媒的に不能なヌクレアーゼと、場合によってはＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤と、を含む。ＲＮＡ塩基エディターは、ＲＮＡを標的とする成分を使用して類似の変更を達成する。

「プライム編集」は、両方のＤＮＡ鎖を切断することもＤＮＡテンプレートを使用することもなく挿入、欠失、及び変換を促進する標的化編集手法である。Ａｎｚａｌｏｎｅ ＡＶ ｅｔ ａｌ．Ｓｅａｒｃｈ－ａｎｄ－ｒｅｐｌａｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｏｒ ｄｏｎｏｒ
ＤＮＡ，Ｏｃｔ ２０１９，Ｎａｔｕｒｅ：５７６，：１４９－１５７（参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

本明細書で使用される「発現系」または「送達系」という用語は、哺乳動物細胞にＣＲＩＳＰＲ成分を送達するか、または哺乳動物細胞においてＣＲＩＳＰＲ成分を発現させるための成分及び手法を指す。こうした系には、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの送達を行うものが含まれ得る。一実施形態では、ウイルス送達系（インビボ送達にも使用され得る）では、単一のレンチウイルス導入ベクターまたは別々の導入ベクターにＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡが挿入される。パッケージングプラスミド及びエンベローププラスミドは、レンチウイルス粒子の作製に必要な成分を提供する。このよく知られる発現系は、インビボ発現を含めて、ＣＲＩＳＰＲ成分の安定かつ調節可能な発現も与え得る。別の頻繁に使用されるウイルス発現系では、ＣＲＩＳＰＲ成分はＡＡＶ導入ベクターに挿入され、ＡＡＶ粒子の生成に使用され得る。他の非ウイルス送達系には、構成的なＣａｓ酵素プロモーター（ＣＭＶ、ＥＦ１アルファ、ＣＢｈなど）もしくは誘導性のＣａｓ酵素プロモーター（Ｔｅｔ－ＯＮなど）、またはｇＲＮＡ向けのＵ６プロモーターを使用するプラスミド発現ベクターが含まれ、こうした非ウイルス送達系は、哺乳動物細胞におけるＣａｓタンパク質及び／またはｇＲＮＡの一過性発現または安定発現に使用され得る。さらに別の実施形態では、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡのＲＮＡ送達をインビトロ転写反応によって達成して成熟Ｃａｓ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを生成させることができ、その後、これらは、マイクロインジェクションまたは電気穿孔を介して標的細胞に送達される。さらに別の発現系は、複合体に統合される精製Ｃａｓタンパク質及びインビトロ転写ｇＲＮＡから形成されるＣａｓ９－ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。そのような複合体は、カチオン性脂質を使用して細胞に送達され得る。別の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）（主に肝臓を標的とする）が好ましい。Ｃａｓ９をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及びガイドＲＮＡ、ならびに必要に応じてドナーＤＮＡテンプレートがＬＮＰに封入されて、肝臓へのこれらの成分の送達が行われる。

「脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）」は、一般に、コレステロール（安定化に役立ち、膜融合を促進する）、リン脂質（ＬＮＰ二重層に構造を付与し、エンドソーム脱出にも役立ち得る）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体（ＬＮＰ凝集を低減し、免疫細胞による非特異的エンドサイトーシスからＬＮＰを「遮蔽する」）、及びイオン化可能な脂質（負荷電ＲＮＡと複合体を形成し、エンドソーム脱出を増進する）（ＬＮＰ形成組成物を形成する）から構成される粒子を指す。例えば、Ｆｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｓｐｉｒｅｄ Ａｌｋｅｎｙｌ Ａｍｉｎｏ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｉｏｎｉｚａｂｌｅ Ｌｉｐｉｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｌｙ Ｐｏｔｅｎｔ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ．２０１６ Ａｐｒ ２０；２８（１５）
：２９３９－２９４３を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される「活性化組成物」は、表１の遺伝子または遺伝子産物の少なくとも１つの活性化因子と、活性化因子の形態（例えば、プラスミドまたはウイルスにおいて送達されるもの、それとは対照的にタンパク質として送達されるものなど）に適した他の化学成分（担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、及び／または医薬品添加物など）と、の混合物を指す。

本明細書で使用される「阻害組成物」は、表２の遺伝子または遺伝子産物の少なくとも１つの阻害剤と、阻害剤の形態（例えば、ｓｉＲＮＡとして送達されるもの、それとは対照的にタンパク質として送達されるものなど）に適した他の化学成分（担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、及び／または医薬品添加物など）と、の混合物を指す。

「組み合わせ組成物」は、表２の遺伝子または遺伝子産物の少なくとも１つの阻害剤も、表１の遺伝子または遺伝子産物の少なくとも１つの活性化因子も、一実施形態中に含む。別の実施形態は、少なくとも１つの阻害剤、少なくとも１つの活性化因子、及びＣＲＩＳＰＲ（または他の遺伝子編集）成分を含む。組成物は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの細胞への阻害剤及び／または活性化因子／及び／またはＣＲＩＳＰＲ成分の投与を促進する。

「投与すること」及び「投与」という用語は、本明細書で企図される化合物、薬剤、または組成物が治療的に有効な量で研究目的または治療目的のために細胞または対象に送達されるプロセスを指す。当該技術分野では、化合物の投与手段は多数存在しており、こうした投与手段には、限定されないが、静脈内投与、経口投与、エアロゾル投与、非経口投
与、経眼投与、経肺投与、及び局所投与が含まれる。医薬組成物を調製するための指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，（２０ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ．Ｒ．，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓにおいて見つけることができる。組成物は、対象の臨床状態、投与の部位及び方法、用量、患者の年齢、性別、体重、ならびに医師に知られる他の要因を考慮して、適正な医学的慣行に従って投与される。

本明細書で使用される「プライミング」もしくは「前処理」という用語またはその任意の変形形態は、遺伝子編集成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡ）を細胞もしくは対象に送達する前に、またはそれと実質的に同時に、阻害組成物、活性化組成物、または組み合わせ組成物をエクスビボで細胞にまたはインビボで対象に投与または送達することを意味する。一実施形態では、この用語は、遺伝子編集成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡ）を細胞または対象に送達する少なくとも１～２４時間前に阻害組成物、活性化組成物、または組み合わせ組成物をエクスビボで細胞にまたはインビボで対象に投与または送達することを意味する。

「減少させる」、「低減する」、「阻害する」、「下方制御する」はすべて、一般に、統計的に有意な量の減少を指すために本明細書で使用される。減少は、例えば、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少であり得、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％の減少、もしくは少なくとも約３０％の減少、もしくは少なくとも約４０％の減少、もしくは少なくとも約５０％の減少、もしくは少なくとも約６０％の減少、もしくは少なくとも約７０％の減少、もしくは少なくとも約８０％の減少、もしくは少なくとも約９０％の減少、もしくは最大で１００％の減少（例えば、参照レベルと比較して存在しないレベルもしくは検出不可能なレベル）、または１０～１００％の任意の減少である。減少または阻害は、活性、相互作用、発現、機能、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメーターの減少であり得る。これは、限定されないが、活性、相互作用、発現、機能、応答、状態、または疾患の完全消失を含み得る。

「活性化する」、「刺激する」、「過剰発現させる」、「上方制御する」はすべて、一般に、統計的に有意な量の増加を指すために本明細書で使用される。増加は、例えば、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加であり得、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％の増加、もしくは少なくとも約３０％の増加、もしくは少なくとも約４０％の増加、もしくは少なくとも約５０％の増加、もしくは少なくとも約６０％の増加、もしくは少なくとも約７０％の増加、もしくは少なくとも約８０％の増加、もしくは少なくとも約９０％の増加、もしくは最大で１００％の増加（例えば、参照レベルと比較して存在しないレベルもしくは検出不可能なレベル）、または１０～１００％の任意の増加である。増加または活性化は、活性、相互作用、発現、機能、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメーターの増加であり得る。

「有効量」は、有利な結果または所望の結果をもたらす上で十分な薬剤の量を指す。治療的に有効な量は、治療されている対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与の様式、ならびに同様のもの（当業者が容易に決定できる）のうちの１つ以上に応じて変わり得る。この用語は、具体的な選択薬剤、従うべき投与レジメン、それが他の化合物と併用投与されるかどうか、投与のタイミング、画像化すべき組織、及びそれを運ぶ物理的送達系のうちの１つ以上に応じて変わり得る用量にも適用される。本明細書で使用されるように、本明細書に開示の阻害剤及び／または活性化因子及び／または組み合わせ組成物を含む組成物の有効量は、標的遺伝子の選択される正確な遺伝子修復の効率の向上に有効な量である。そのような結果には、限定されないが、当該技術分野の適切な任意の手段によって決定される本明細書に開示の疾患または状態の治療が含まれる。一実
施形態では、有効量の各阻害化合物及び／または活性化化合物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び最大で１０、またはそれを超えるマイクロモル濃度の小分子阻害剤／活性化因子である。さらに他の量は、患者の身体的特徴に鑑みて、医師によって、有効となるように決定され得る。

「医薬的に許容可能」は、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなくヒト及び動物の組織と接触させて使用する上で化合物、薬剤、材料、組成物、及び／または剤形が健全な医学的判断の範囲内で適しており、合理的な利益／リスク比に見合うものであることを指す。

「医薬的に許容可能な担体」は、標準的な医薬担体（リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション（油／水エマルションまたは水／油エマルションなど）、及びさまざまな型の湿潤剤など）をいずれも含む。この用語は、規制機関（ＦＤＡなど）によって承認された薬剤、または動物（ヒトを含む）における使用向けに米国薬局方に収載されている薬剤も、いずれも含む。

「対象」、「個体」、または「患者」という用語は、温血動物（哺乳動物など）を互換的に指す。具体的には、この用語はヒトを指す。対象、個体、または患者は、本明細書に記載の遺伝的に媒介される疾患に罹患していか、または当該疾患を有する疑いがあるか、または当該疾患に罹患しやすくあり得る。この用語は、食物用、ペット、または研究用として飼われている動物も含み、こうした動物には、ウマ、雌ウシ、ヒツジ、家禽、魚類、ブタ、ネコ、イヌ、及び動物園の動物、ヤギ、類人猿（例えば、ゴリラまたはチンパンジー）、ならびにげっ歯類（ラット及びマウスなど）が含まれる。

本明細書で使用される「遺伝的に媒介される疾患」という用語は、遺伝的原因（そのために遺伝子が疾患を引き起こすか、または疾患の一因となり、遺伝子編集手法によって修復し得るもの）を有する任意の疾患を指す。そのような疾患、障害、または状態は、野生型タンパク質のアミノ酸配列中の挿入、変化、または欠失と関連し得る。そのような疾患には、遺伝性及び／または非遺伝性の遺伝障害、ならびに幼児期または小児期に身体症状が顕在化し得ない疾患及び状態が含まれる。例えば、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔでは、遺伝性疾患と関連する変異のリストが提供されており、こうした遺伝性疾患は、例えば、嚢胞性線維症［ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ１３５６９、ＯＭＩＭ：２１９７００とも表記される］、ＭＰＳＩＨ［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ３５４７５、ＯＭＩＭ：６０７０１４］、血友病Ｂ［第ＩＸ因子、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ００４５１］、血友病Ａ［第ＶＩＩＩ因子、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ００４５１］である。このデータベースを参照することで、変異、挿入、及び／または欠失と関連する疾患を他にもさらに知ることができる。さらに他の疾患は、遺伝的原因を有するがん、または野生型遺伝子中の変異に起因するがんである。さまざまながんの実施形態には、限定されないが、癌腫、黒色腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、白血病、骨髄腫、骨肉腫、及び神経性腫瘍が含まれる。ある特定の実施形態では、がんは、乳癌、卵巣癌、膵癌、または前立腺癌である。遺伝子編集治療の標的である他の疾患には、糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ Ｉａ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）が含まれる。遺伝子編集での治療に適した他の疾患、ひいてはこうした方法及び組成物に適した他の疾患は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｇｏｖ／１０００１２００、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｕｍｃ．ｅｄｕ／ｇｅｃ／ｓｕｐｐｏｒｔ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ２２１８３／に掲載されている。遺伝的要素を有するがん（非小細胞肺癌など）、血液障害（ベータ－サラセミア及び鎌状赤血球症及び血友病など）、遺伝的原因の失明（レーバー先天性黒内障など）、ＡＩＤＳ、嚢胞
性線維症、筋ジストロフィー、ハンチントン病、ならびにウイルス性疾患を治療するためにＣＲＩＳＰＲを使用する臨床試験が既に進行中である。例えば、Ｃ．Ｒ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅｉｇｈｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ＣＲＩＳＰＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｕｌｄ Ｃｕｒｅ，Ｂｅｓｔ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌａｂｉｏｔｅｃｈ．ｅｕ（Ａｐｒｉｌ ２０２１）を参照のこと。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、別に文脈上明確に示されない限り、複数の参照対象を含む。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書で互換的に使用される。

本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉（ならびに含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」など））、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という言葉（ならびに有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態（「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」など））、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という言葉（ならびに含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態（「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」など））、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という言葉（ならびに含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態（「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」など））は包括的または非限定的であり、記載されていない追加の要素または方法ステップを除外するものではない。

「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」及び「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という言葉ならびにその変形形態は、包括的ではなく排他的であると解釈され、すなわち、具体的に記載されていない成分またはステップを除外するものである。

本明細書で使用される「約」という用語は、所与の言及値からの変動率が±１０％であることを意味する。

Ｂ．阻害化合物（複数可）での前処理／プライミング方法
一実施形態では、標的遺伝子の正確な遺伝子編集の効率を向上させるための方法は、選択される遺伝子または遺伝子産物の発現または活性を一時的に阻害、下方制御、遮断、または低減する阻害組成物または阻害成分もしくは化合物を、遺伝子編集に供すことを意図する哺乳動物細胞に送達することによって、当該細胞のプライミングまたは前処理を実施することを含む。一実施形態では、選択阻害組成物の組み合わせが送達される。ある特定の実施形態では、組成物中の各阻害成分または化合物は、１つの遺伝子または遺伝子産物を阻害する。２つ以上の阻害組成物の組み合わせによって、２つ以上の遺伝子または遺伝子産物のある特定の組み合わせが阻害され得る。

一実施形態では、プライミングステップまたは前処理ステップは、遺伝子編集手法及び標的遺伝子の正確な編集修復を実施する上で必要な成分の送達と同時に実施される。一実施形態では、プライミングステップまたは前処理ステップは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集手法及び標的遺伝子の正確な編集修復を実施する上で必要なＣＲＩＳＰＲ成分（例えば、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡ）の送達と同時に実施される。別の実施形態では、プライミングステップまたは前処理ステップは、遺伝子編集手法及び標的遺伝子の正確な編集修復を実施する上で必要な成分の送達の前に実施される。一実施形態では、プライミングステップまたは前処理ステップは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集手法及び標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ介在性の正確な編集修復を実施する上で必要な成分の送達の前に実施される。一実施形態では、プライミングステップまたは前処理ステップは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集手法及び標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ介在性の正確な編集修復を実施する上で必要な成分の送達の
１～２４時間前に実施される。別の実施形態では、阻害化合物は、遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）成分を含む単一の組成物において送達される。

標的遺伝子の正確な遺伝子編集の効率を向上させるためのこうした方法は、体外で標的遺伝子を操作するために、細胞にＣＲＩＳＰＲ成分を送達することによって阻害組成物（複数可）または阻害成分（複数可）もしくは化合物（複数可）をインビトロまたはエクスビボで哺乳動物細胞に送達することを含み得る。標的遺伝子の正確な遺伝子編集の効率を向上させるためのこうした方法は、ＣＲＩＳＰＲ系の成分及び阻害組成物（複数可）をインビボで哺乳動物対象に投与または送達することも含み得る。

本明細書に記載の阻害組成物は、遺伝子または遺伝子産物の発現または活性を一時的に阻害、下方制御、遮断、または低減する。遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）は、表２のリスト中で順位付けされて特定されている。一実施形態では、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）は、表２のリスト中の上位２５０個の遺伝子から順位付けされて特定される。別の実施形態では、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）は、表２のリスト中の上位１００個の遺伝子から順位付けされて特定される。別の実施形態では、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）は、表２のリスト中の上位５０個の遺伝子から順位付けされて特定される。別の実施形態では、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）は、表２のリスト中の上位２５個の遺伝子から順位付けされて特定される。別の実施形態では、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）は、表２のリスト中の上位１５個の遺伝子から順位付けされて特定される。別の実施形態では、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）は、表２のリスト中の上位１０個の遺伝子から順位付けされて特定される。別の実施形態では、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）は、表２のリスト中の上位５個の遺伝子から順位付けされて特定される。

一実施形態では、阻害組成物は、ＤＮＡ－ＰＫ、ＬＩＧ４、ＴＰ５３ＢＰ１、ＮＥＤＤ８、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＳＲＰＫ１、ＲＦＣ５、ＰＯＬＱ、ＲＰＬ４、ＲＡＮＢＰ１、ＣＤＫ７、ＣＤＫ１２、ＰＲＣＣ、ＲＡＤ５１、ＲＲＳ１０、ＷＲＮ、ＲＰＡ３、ＮＵＰ９８、ＭＢＤ１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＣ５、ＥＳＣＯ２、ＴＡＴＤＮ２、ＦＩＧＮＬ１、ＰＤＳ５Ａ、またはＤＤＸ５の中から選択される遺伝子の阻害剤を含む。別の実施形態では、阻害組成物は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子の阻害剤を含む。ある特定の実施形態では、ＮＨＥＪに関与する遺伝子は、ＤＮＡ－ＰＫ、ＬＩＧ４、またはＴＰ５３ＢＰ１である。さらに別の実施形態では、阻害組成物は、ＮＨＥＪに関与する遺伝子（複数可）の阻害剤と、１つ以上の追加の表２の遺伝子の阻害剤と、を含み、ＮＨＥＪ遺伝子の一時的な阻害と１つ以上の当該追加の遺伝子の一時的な阻害とが組み合わさることで当該修復の効率が向上する。ある特定の実施形態では、阻害組成物は、ＮＨＥＪに関与する遺伝子（複数可）と、ＰＯＬＱ、ＸＰＯ１、ＲＰＬ２６、ＡＲＣＮ１、ＣＡＣＴＩＮ、ＲＰＳ２４、ＴＭＡ１６、ＴＷＩＳＴＮＢ、ＣＤＣ４０、ＰＳＭＤ２、ＳＮＲＰＧ、ＳＭＵ１、ＣＤＫ７、またはＮＥＰＲＯから選択される追加の遺伝子と、の阻害剤を含む。ある特定の実施形態では、阻害組成物は、ＮＨＥＪに関与する遺伝子（複数可）と、ＭＲＰＳ２７、ＭＲＰＬ１１、ＨＮＲＮＰＣ、ＵＳＥ１、ＣＳＴＦ１、ＰＯＬＺ、ＣＡＣＴＩＮ、ＩＮＴＳ９、ＲＰＬ７、ＴＷＩＳＴＮＢ、ＰＯＬＡ１、ＥＦＨ、ＮＢＡＳ、ＳＮＲＰＧ、ＲＰＳ２４、ＩＮＴＳ７、ＰＳＭＣ２、ＥＰ２０Ｃ、ＰＳＭＡ６、ＣＤＣ４、ＴＭＡ１６、ＰＬＲＧ１、ＣＤＫ７、ＤＡＰ３、ＲＰＬ３４、ＮＵＰ１５３、ＮＵＰ１５３、ＰＯＬＡ２、ＲＰＬ２６、ＢＲＤ９、ＳＴＸ１８、ＭＲＰＳ５、ＩＮＴＳ４、ＮＵＰ１０７、Ｃ６ｏｒｆ５２、またはＨＮＲＮＰＨ２から選択される追加の遺伝子と、の阻害剤を含む。さらに他の実施形態では、阻害組成物は、ＤＮＡ－ＰＫと、ＰＯＬＱ、ＸＰＯ１、ＲＰＬ２６、ＡＲＣＮ１、ＣＡＣＴＩＮ、ＲＰＳ２４、ＴＭＡ１６、ＴＷＩＳＴＮＢ、ＣＤＣ４０、ＰＳＭＤ２、ＳＮＲＰＧ、ＳＭＵ１、ＣＤＫ７、ＮＥＰＲＯ、ＭＲＰＳ２７、ＭＲＰＬ１１、ＨＮＲＮＰＣ、ＵＳＥ１、ＣＳＴＦ１、ＰＯＬＺ、ＣＡＣＴＩＮ、ＩＮＴＳ９、Ｒ
ＰＬ７、ＴＷＩＳＴＮＢ、ＰＯＬＡ１、ＥＦＨ、ＮＢＡＳ、ＳＮＲＰＧ、ＲＰＳ２４、ＩＮＴＳ７、ＰＳＭＣ２、ＥＰ２０Ｃ、ＰＳＭＡ６、ＣＤＣ４、ＴＭＡ１６、ＰＬＲＧ１、ＣＤＫ７、ＤＡＰ３、ＲＰＬ３４、ＮＵＰ１５３、ＮＵＰ１５３、ＰＯＬＡ２、ＲＰＬ２６、ＢＲＤ９、ＳＴＸ１８、ＭＲＰＳ５、ＩＮＴＳ４、ＮＵＰ１０７、Ｃ６ｏｒｆ５２、またはＨＮＲＮＰＨ２から選択される追加の遺伝子と、の阻害剤を含む。

さらに他の実施形態では、阻害組成物は、ＤＮＡ－ＰＫと、ＰＬＫ１、ＡＵＲＫＡ、ＸＰＯ１、ＣＤＫ７、ＰＳＭＣ２、ＦＮＴＡ、ＢＲＤ９、またはＰＴＧＤＲから選択される追加の遺伝子と、の阻害剤を含む。阻害組成物（複数可）は、さらに他の実施形態では、本明細書で特定される遺伝子及びそれぞれの遺伝子産物のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超える数の発現を阻害する２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超える数の阻害剤を用いるものである。

さらに他の実施形態では、阻害組成物は、ＰＬＫ１、ＡＵＲＫＡ、ＸＰＯ１、ＣＤＫ７、ＰＳＭＣ２、ＦＮＴＡ、ＢＲＤ９、またはＰＴＧＤＲから選択される遺伝子の阻害剤を含む。阻害組成物（複数可）は、さらに他の実施形態では、本明細書で特定される遺伝子及びそれぞれの遺伝子産物のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超える数の発現を阻害する２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超える数の阻害剤を用いるものである。

一実施形態では、阻害剤（複数可）は、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）の小化学分子阻害剤（複数可）（図５に記載の小分子など）である。別の実施形態では、阻害剤（複数可）は、遺伝子（複数可）を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。別の実施形態では、阻害剤（複数可）は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、阻害剤（複数可）は、ＲＮＡ標的化酵素Ｃａｓ１３と共に送達される。さらに別の実施形態では、阻害剤（複数可）は、遺伝子産物またはその活性の発現を抑制するためのｄＣａｓ９－リプレッサー（ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２など）融合タンパク質を送達することによって、Ｃａｓ９でのＣＲＩＳＰＲ阻害と協奏的に送達される。

ある特定の実施形態では、阻害剤は、ＳＢＥ１３ＨＣｌである。別の実施形態では、阻害剤は、アリセルチブである。別の実施形態では、阻害剤は、ＬＹ３２９５６８８である。別の実施形態では、阻害剤は、ＭＫ－８７４５である。別の実施形態では、阻害剤は、ＫＰＴ－２７６である。別の実施形態では、阻害剤は、ＹＫＬ－５－１２４である。別の実施形態では、阻害剤は、ＶＲ－２３である。別の実施形態では、阻害剤は、ＭＧ－１３２である。別の実施形態では、阻害剤は、ＦＴＩ２７７ＨＣｌである。別の実施形態では、阻害剤は、ＢＩ－７２７３である。別の実施形態では、阻害剤は、セチピプラント（ＡＣＴ－１２９９６８）である。以下の表３には、いくつかの望ましい阻害剤の構造が示される。

Ｃ．活性化化合物（複数可）での前処理／プライミング方法
一実施形態では、標的遺伝子の正確な遺伝子編集の効率を向上させるための方法は、少なくとも１つの追加の遺伝子または追加の遺伝子の組み合わせの産物、発現、または活性を一時的に活性化、上方制御、刺激、または過剰発現させる活性化組成物または活性化成分もしくは化合物を、遺伝子編集に供すことを意図する哺乳動物細胞に送達することによって、当該細胞のプライミングまたは前処理を実施することを含む。一実施形態では、選択活性化組成物の組み合わせが送達される。ある特定の実施形態では、組成物中の各活性化成分または化合物は、１つの遺伝子または遺伝子産物を活性化、過剰発現、または上方制御する。２つ以上の活性化組成物の組み合わせによって、２つ以上の遺伝子または遺伝子産物のある特定の組み合わせが活性化、上方制御、過剰発現、または刺激され得る。

一実施形態では、プライミングステップまたは前処理ステップは、遺伝子編集手法及び標的遺伝子の正確な編集修復を実施する上で必要な成分の送達と同時に実施される。一実施形態では、プライミングステップまたは前処理ステップは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集手法及び標的遺伝子の正確な編集修復を実施する上で必要なＣＲＩＳＰＲ成分（例えば、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡ）の送達と同時に実施される。一実施形態では、プライミングステップまたは前処理ステップは、遺伝子編集手法及び標的遺伝子の正確な編集修復を実施する上で必要な成分の送達の前に実施される。別の実施形態では、プライミングステップまたは前処理ステップは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集手法及び標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ介在性の正確な編集修復を実施する上で必要な成分の送達の前に実施される。一実施形態では、プライミングステップまたは前処理ステップは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集手法及び標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ介在性の正確な編集修復を実施する上で必要な成分の送達の１～２４時間前に実施される。別の実施形態では、活性化化合物は、遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）成分を含む単一の組成物において送達される。

標的遺伝子の正確な遺伝子編集の効率を向上させるためのこうした方法は、活性化組成物または活性化成分もしくは化合物をインビトロまたはエクスビボで哺乳動物細胞に送達することを含み得る。標的遺伝子の正確な遺伝子編集の効率を向上させるためのこうした方法は、ＣＲＩＳＰＲ系の成分及び活性化組成物をインビボで投与または送達することも含み得る。

別の実施形態では、標的遺伝子の正確な遺伝子編集の効率を向上させるための方法は、哺乳動物細胞に対する、ある特定の遺伝子、遺伝子産物、またはそのような遺伝子もしくは遺伝子産物の組み合わせの発現または活性を一時的に阻害、下方制御、遮断、または低減する活性化組成物を、哺乳動物細胞に投与することを含む。

本明細書に記載の活性化組成物は、遺伝子の発現もしくは活性またはその遺伝子産物の量（本明細書を通じて互換的に使用される）を一時的に活性化、刺激、過剰発現、または上方制御する。遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）は、表１のリスト中で順位付けされて特定されている。一実施形態では、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）は、表１のリスト中の上位２５０個の遺伝子から順位付けされて特定される。別の実施形態では、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）は、表１のリスト中の上位１００個の遺伝子から順位付けされて特定される。別の実施形態では、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）は、表１のリスト中の上位５０個の遺伝子から順位付けされて特定される。別の実施形態では、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）は、表１のリスト中の上位２５個の遺伝子から順位付けされて特定される。別の実施形態では、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）は、表１のリスト中の上位１５個の遺伝子から順位付けされて特定される。別の実施形態では、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）は、表１のリスト中の上位１０個の遺伝子から順位付けされて特定される。別の
実施形態では、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）は、表１のリスト中の上位５個の遺伝子から順位付けされて特定される。

一実施形態では、活性化組成物は、２つ以上の活性化成分を含み、各成分は、表１から選択される１つの遺伝子の遺伝子産物または活性を一時的に増加、上方制御、または過剰発現させる。一実施形態では、遺伝子または遺伝子産物は、過剰発現、上方制御、刺激、または活性化されると正確な遺伝子修復を増加させるものであり、ＷＤＲ７７、ＲＢＢＰ８、ＲＦＣ３、ＦＡＮＣＢ、ＢＲＣＡ１、ＲＦＣ１、ＡＴＭ、またはＦＡＮＣＯ２のうちの１つである。活性化組成物（複数可）は、さらに他の実施形態では、本明細書で特定される遺伝子及びそれぞれの遺伝子産物のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超える数の発現を活性化、過剰発現、上方制御、または刺激する２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超える数の活性化因子を用いるものである。

一実施形態では、活性化因子（複数可）は、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）の小化学分子阻害剤（複数可）である。遺伝子活性化は、ｄＣａｓ９－活性化因子（ｐ６５、ＨＳＦ１、ＶＰ６４など）融合タンパク質である融合タンパク質を送達することによって、遺伝子のｍＲＮＡを送達することによって、本明細書で論じられるプラスミドもしくは組換えウイルスにおいて発現する遺伝子産物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を送達することによって、または遺伝子の精製タンパク質産物を送達することによって、実施され得る。示される遺伝子または遺伝子活性を活性化または過剰発現させる他の既知の方法も本明細書に包含されると考えられる。

Ｄ．阻害化合物（複数可）と活性化化合物（複数可）との組み合わせでの前処理／プライミング方法
別の実施形態では、標的遺伝子の正確な遺伝子編集の効率を向上させるための方法は、選択される遺伝子または遺伝子産物（複数可）の発現または活性を一時的に阻害、下方制御、遮断、または低減する阻害組成物または阻害成分もしくは化合物と、少なくとも１つの遺伝子または追加の遺伝子もしくは遺伝子産物（複数可）の組み合わせの産物、発現、または活性を一時的に活性化、上方制御、刺激、または過剰発現させる活性化組成物または活性化成分もしくは化合物とを、遺伝子編集に供すことを意図する哺乳動物細胞に送達することによって、当該細胞のプライミングまたは前処理を実施することを含む。一実施形態では、１つの選択阻害組成物と１つの活性化組成物とが組み合わせられ、それぞれは、異なる遺伝子または遺伝子産物に指向化されている。別の実施形態では、組み合わせは、選択される遺伝子または遺伝子産物の組み合わせの発現または活性をそれぞれが阻害、下方制御、遮断、または低減する２つ以上の選択阻害組成物と、１つの活性化組成物と、を含む。別の実施形態では、組み合わせは、異なる遺伝子または遺伝子産物の活性化に対して指向化された２つ以上の選択活性化組成物と、１つの阻害組成物と、を含む。さらに別の実施形態では、組み合わせは、２つ以上の選択活性化組成物と共に２つ以上の選択阻害組成物を含み、各組成物は、異なる遺伝子または遺伝子産物の阻害または活性化に対して指向化されている。ある特定の実施形態では、組成物中の各阻害成分または化合物は、１つの遺伝子を阻害する。ある特定の実施形態では、組成物中の各活性化成分または化合物は、１つの遺伝子を活性化する。

一実施形態では、プライミングステップまたは前処理ステップは、遺伝子編集手法及び標的遺伝子の正確な編集修復を実施する上で必要な成分の送達と同時に実施される。一実施形態では、プライミングステップまたは前処理ステップは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集手法及び標的遺伝子の正確な編集修復を実施する上で必要なＣＲＩＳＰＲ成分（例えば、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡ）の送達と同時に実施される。一実施形態では、プライミングステップまたは前処理ステップは、遺伝子編集手法及び標的遺伝子の正確な編集修復を実施する上で必要な成分の送達の前に実施される。別の実施形態では、プライミングステ
ップまたは前処理ステップは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集手法及び標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ介在性の正確な編集修復を実施する上で必要な成分の送達の前に実施される。一実施形態では、プライミングステップまたは前処理ステップは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集手法及び標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ介在性の正確な編集修復を実施する上で必要な成分の送達の１～２４時間前に実施される。一実施形態では、組み合わせ組成物の阻害成分は、活性化成分とは異なる送達系を介して送達される。一実施形態では、組み合わせ組成物の阻害成分は、同じ形態の送達系を介して送達される。別の実施形態では、組み合わせ組成物の阻害成分は、活性化成分と同時または連続的である。別の実施形態では、阻害化合物（複数可）と活性化化合物（複数可）との組み合わせは、遺伝子編集成分の前に、または遺伝子編集成分と同時に、単一の組成物において送達される。別の実施形態では、阻害化合物（複数可）と活性化化合物（複数可）との組み合わせは、遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）成分を含む単一の組成物において送達される。

標的遺伝子の正確な遺伝子編集の効率を向上させるためのこうした方法は、体外で標的遺伝子を操作するために、細胞にＣＲＩＳＰＲ成分を送達することによって組み合わせ組成物（複数可）をインビトロまたはエクスビボで哺乳動物細胞に送達することを含み得る。標的遺伝子の正確な遺伝子編集の効率を向上させるためのこうした方法は、ＣＲＩＳＰＲ系の成分及び組み合わせ阻害剤／活性化因子組成物（複数可）をインビボで哺乳動物対象に投与または送達することも含み得る。

一実施形態では、組み合わせ組成物の阻害成分は、本明細書に記載のように表２のリストから選択される。一実施形態では、組み合わせ組成物の活性化成分は、上に定義されるように表１のリストから選択される。一実施形態では、組み合わせ組成物は、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＬＩＧ４、ＴＰ５３ＢＰ１、ＮＥＤＤ８、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＳＲＰＫ１、ＲＦＣ５、ＰＯＬＱ、ＲＰＬ４、ＲＡＮＢＰ１、ＣＤＫ７、ＣＤＫ１２、ＰＲＣＣ、ＲＡＤ５１、ＲＲＳ１０、ＷＲＮ、ＲＰＡ３、ＮＵＰ９８、ＭＢＤ１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＣ５、ＥＳＣＯ２、ＴＡＴＤＮ２、ＦＩＧＮＬ１、ＰＤＳ５Ａ、またはＤＤＸ５の中から選択される遺伝子のうちの１つ以上の阻害剤と、ＷＤＲ７７、ＲＢＢＰ８、ＲＦＣ３、ＦＡＮＣＢ、ＢＲＣＡ１、ＲＦＣ１、ＡＴＭ、またはＦＡＮＣＯ２から選択される遺伝子のうちの１つ以上の活性化因子と、を含む。別の実施形態では、組み合わせ組成物は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子の阻害剤と、少なくとも１つの他の表２の遺伝子の阻害剤と、少なくとも１つの表１の遺伝子の活性化因子と、を含む。ある特定の実施形態では、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子は、ＤＮＡ－ＰＫ、ＬＩＧ４、またはＴＰ５３ＢＰ１である。別の実施形態では、組み合わせ組成物は、ＤＮＡ－ＰＫの阻害剤と、ＬＩＧ４、ＴＰ５３ＢＰ１、ＮＥＤＤ８、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＳＲＰＫ１、ＲＦＣ５、ＰＯＬＱ、ＲＰＬ４、ＲＡＮＢＰ１、ＣＤＫ７、ＣＤＫ１２、ＰＲＣＣ、ＲＡＤ５１、ＲＲＳ１０、ＷＲＮ、ＲＰＡ３、ＮＵＰ９８、ＭＢＤ１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＣ５、ＥＳＣＯ２、ＴＡＴＤＮ２、ＦＩＧＮＬ１、ＰＤＳ５Ａ、またはＤＤＸ５の中から選択される遺伝子のうちの１つ以上の阻害剤と、ＷＤＲ７７、ＲＢＢＰ８、ＲＦＣ３、ＦＡＮＣＢ、ＢＲＣＡ１、ＲＦＣ１、ＡＴＭ、またはＦＡＮＣＯ２から選択される遺伝子のうちの１つ以上の活性化因子と、を含む。

当業者なら、本開示を読めば、請求される発明を実施するために、より具体的な阻害剤と活性化因子との組み合わせを、任意選択で、既知の阻害剤の中から選択されるＤＮＡ－ＰＫ、ＬＩＧ４、またはＴＰ５３ＢＰ１の阻害剤と共に、容易に選択することができる。

Ｅ．組成物及びキット
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキット及び組成物は、標的遺伝子を編集することによって、遺伝的に媒介される疾患を有する対象を治療するために使用されるか、または任意の治療状況もしくは非治療状況において任意の標的遺伝子を編集するため
に使用される。遺伝的に媒介される疾患を有する対象の治療に適した組成物またはキットは、一実施形態では、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）ゲノム編集手法、及び疾患または障害と関連する標的遺伝子の正確な遺伝子修復を実施する上で必要な成分を含む。組成物は、選択標的遺伝子に結合することが可能なＣａｓエンドヌクレアーゼ及び少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。一実施形態では、組成物またはキットは、表２から選択される遺伝子の発現または活性を一時的に阻害、下方制御、または遮断する阻害成分を含む。別の実施形態では、組成物またはキットは、表１から選択される遺伝子の遺伝子産物または活性を一時的に増加、上方制御、または過剰発現させる活性化成分を含む。さらに別の実施形態では、組成物またはキットは、上に定義される少なくとも１つの阻害剤成分と少なくとも１つの活性化成分との組み合わせを含む。組成物またはキット中に阻害成分（複数可）、活性化成分（複数可）、または阻害成分及び活性化成分の１つ以上の組み合わせが存在することで、標的遺伝子の当該正確な遺伝子修復の効率を向上させることが可能になる。正確な遺伝子修復の形態は、いくつかある修復形式の中でもとりわけ、相同組換え修復（ＨＤＲ）、非相同ＤＮＡ末端結合修復、塩基編集修復、またはプライム編集修復である。

一実施形態では、そのような組成物またはキットは、２つ以上の阻害成分を含み、各成分は、表２から選択される１つの遺伝子の発現または活性を一時的に阻害、下方制御、または遮断する。一実施形態では、阻害成分は、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＬＩＧ４、ＴＰ５３ＢＰ１、ＮＥＤＤ８、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＳＲＰＫ１、ＲＦＣ５、ＰＯＬＱ、ＲＰＬ４、ＲＡＮＢＰ１、ＣＤＫ７、ＣＤＫ１２、ＰＲＣＣ、ＲＡＤ５１、ＲＲＳ１０、ＷＲＮ、ＲＰＡ３、ＮＵＰ９８、ＭＢＤ１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＣ５、ＥＳＣＯ２、ＴＡＴＤＮ２、ＦＩＧＮＬ１、ＰＤＳ５Ａ、またはＤＤＸ５から選択される遺伝子のうちの１つ以上を阻害する。一実施形態では、阻害成分は、ＰＯＬＱ、ＸＰＯ１、ＲＰＬ２６、ＡＲＣＮ１、ＣＡＣＴＩＮ、ＲＰＳ２４、ＴＭＡ１６、ＴＷＩＳＴＮＢ、ＣＤＣ４０、ＰＳＭＤ２、ＳＮＲＰＧ、ＳＭＵ１、ＣＤＫ７、またはＮＥＰＲＯから選択される。別の成分では、阻害化合物は、ＭＲＰＳ２７、ＭＲＰＬ１１、ＨＮＲＮＰＣ、ＵＳＥ１、ＣＳＴＦ１、ＰＯＬＺ、ＣＡＣＴＩＮ、ＩＮＴＳ９、ＲＰＬ７、ＴＷＩＳＴＮＢ、ＰＯＬＡ１、ＥＦＨ、ＮＢＡＳ、ＳＮＲＰＧ、ＲＰＳ２４、ＩＮＴＳ７、ＰＳＭＣ２、ＥＰ２０Ｃ、ＰＳＭＡ６、ＣＤＣ４、ＴＭＡ１６、ＰＬＲＧ１、ＣＤＫ７、ＤＡＰ３、ＲＰＬ３４、ＮＵＰ１５３、ＮＵＰ１５３、ＰＯＬＡ２、ＲＰＬ２６、ＢＲＤ９、ＳＴＸ１８、ＭＲＰＳ５、ＩＮＴＳ４、ＮＵＰ１０７、Ｃ６ｏｒｆ５２、またはＨＮＲＮＰＨ２から選択される遺伝子を阻害する。別の実施形態では、阻害成分は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子（例えば、ＤＮＡ－ＰＫ、ＬＩＧ４、またはＴＰ５３ＢＰ１）の阻害剤と、表２から選択される遺伝子のその他の阻害剤のうちの１つ以上と、を含む。ある特定の実施形態では、阻害成分は、図５の小分子のうちの１つ以上である。他の例では、ＤＮＡ－ＰＫの阻害剤は、国際特許公開公報第ＷＯ２０１４／１５９６９０号及び米国特許出願公開公報第２０２０／３６１８７７号（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載の化合物である。

ＮＨＥＪ遺伝子の一時的な阻害と１つ以上の追加の遺伝子の一時的な阻害とが組み合わさることで当該修復の効率が向上する。

別の実施形態では、組成物またはキットは、２つ以上の活性化成分を含み、各成分は、表１から選択される１つの遺伝子の遺伝子産物または活性を一時的に増加、上方制御、または過剰発現させる。一実施形態では、表１の遺伝子は、過剰発現または活性化されると正確な遺伝子修復を増加させるものであり、ＷＤＲ７７、ＲＢＢＰ８、ＲＦＣ３、ＦＡＮＣＢ、ＢＲＣＡ１、ＲＦＣ１、ＡＴＭ、またはＦＡＮＣＯ２から選択される。

さらに別の実施形態では、組成物またはキットは、本明細書に定義される阻害成分及び活性化成分の組み合わせを含む。一実施形態では、阻害成分のうちの１つは、非相同末端
結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子の阻害剤であり、１つ以上の追加の表１の遺伝子の産物の過剰発現を引き起こす成分と組み合わせられ、ＮＨＥＪ遺伝子の一時的な阻害と表１の遺伝子の産物の一時的な過剰発現とが組み合わさることで修復の効率が向上する。

さらに他の実施形態は、ＮＨＥＪ遺伝子（例えば、ＤＮＡ－ＰＫ）の阻害剤、上記の表２から選択される別の遺伝子の阻害剤、及び上記の表１から選択される遺伝子の少なくとも１つの活性化因子を含む。

組成物またはキットは、哺乳動物対象へのインビボでの投与に適した送達媒体も含み得る。別の実施形態では、組成物またはキットは、哺乳動物対象の細胞へエクスビボでの投与に適した送達媒体も含み得る。阻害剤または活性化因子の発現形態は、独立して、小分子、追加の遺伝子をコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡ、プラスミド、組換えウイルス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、追加の遺伝子に指向化された第２のＲＮＡガイド配列、精製タンパク質産物、抗体、ＤＮＡもしくはタンパク質としての成分を発現するプラスミドもしくは組換えウイルス、またはそれらの組み合わせであり得る。阻害化合物及び／または活性化化合物の性質に応じて、送達媒体は、ポリマーナノ粒子、無機ナノ粒子、脂質ベースの組成物、ナノカプセル脂質ベース、組換えウイルスベクター、組換えプラスミド、医薬的に許容可能な緩衝液、またはそれらの組み合わせである。

一実施形態では、組成物またはキットは、ナノ粒子またはナノカプセルに封入され、阻害成分及び／または活性化成分とは別に対象または細胞に送達される、標的遺伝子の修復のためのＣａｓ酵素及びＲＮＡガイドを含む。

Ｆ．治療方法
上記の方法及び組成物は、治療状況における正確な遺伝子修復の効率を向上させて、哺乳動物対象における遺伝的に媒介される疾患の治療を改善するために使用され得る。一実施形態では、対象は、遺伝的に媒介される疾患を有するヒト患者である。

一実施形態では、方法及び組成物は、エクスビボでの細胞の前処理に使用され得る。自己哺乳動物Ｔ細胞、骨髄細胞、または任意の組織の細胞が哺乳動物対象から採取され、適切な本明細書に記載の阻害組成物、活性化組成物、または組み合わせ組成物を有効量で用いて前処理される。遺伝子編集成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ成分）がエクスビボで細胞に送達されると、挿入、欠失、または置換によって細胞中の標的遺伝子が修正される。その後、処理細胞は、哺乳動物対象にインビボ移入される。一実施形態では、前処理／編集細胞は、対象に全身性に送達される。別の実施形態では、前処理／編集細胞は、所望の標的組織に送達される。この方法は、ＣＡＲ Ｔ細胞、または疾患の治療に編集が必要な標的遺伝子を有する任意の組織もしくは臓器の細胞に適用され得る。

他の方法では、現在臨床試験において実施中であるが、組成物は、ウイルス送達方法（ＡＡＶまたはレンチウイルスによるものなど）を使用して対象にインビボで投与され得る。例えば、米国特許公開出願２０２０／３６１８７７及びそこで引用されている刊行物（参照によって組み込まれる）を参照のこと。

送達方法は他にも開発されるであろうが、そうした送達方法が、本明細書の開示を踏まえれば実験を行わずとも、本発明の組成物及び成分の送達に使用されることが予想される。

Ｇ．実施例
下記の実施例では、ある特定の遺伝子標的を阻害してＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集状況にお
けるＨＤＲの効率を向上させる特定の実施形態が開示される。こうした実施例は、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる、ありとあらゆる変形形態を包含する。

実施例１－オリジナルのＣＲＩＳＰＲ阻害及び活性化スクリーニング
本発明者らは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の阻害との相乗作用を生み出し、ヒト細胞における相同組換え修復（ＨＤＲ）レベルをさらに向上させるＨＤＲの制御因子を特定した。本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲベースのスクリーニングのペアを使用してヒトゲノム中の２０，０００個の遺伝子をすべて標的にすることで、喪失（ノックアウト）時または獲得（過剰発現）時に正確な遺伝子修復を増加させる遺伝子を特定した。ＣＲＩＳＰＲ阻害スクリーニングを使用することで、正確な遺伝子修復に対するあらゆるヒト遺伝子の喪失の効果を順位付けしてリスト化した。ＣＲＩＳＰＲ活性化スクリーニングでは、正確な遺伝子修復に対するあらゆるヒト遺伝子の獲得の効果を順位付けしてリスト化した。正確な遺伝子修復の強化に対する複数の遺伝子／薬物摂動のコンビナトリアル効果も調べた。特定の遺伝子ノックアウトを有する一連の細胞株を２μＭのＤＮＡ－ＰＫ小分子阻害剤で処理した。ＲＦＣ５ノックアウト細胞株、ＴＵＢＡ１Ｂノックアウト細胞株、ＮＥＤＤ８ノックアウト細胞株、ＬＩＧ４ノックアウト細胞株、ＰＯＬＱノックアウト細胞株、及びＲＡＤ５１ノックアウト細胞株においてＤＮＡ－ＰＫを阻害すると、ＨＤＲレベルが有意に上昇した。コンビナトリアル遺伝子摂動の結果、ＨＤＲレベルは７５％にまで上昇し、これは、対照細胞と比較して約３倍の上昇である。

効率的な相同組換え修復（ＨＤＲ）に必要な遺伝子を特定するために、２つのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲスクリーニングを実施した：Ｋｒａｂ－ｄＣａｓ９－ＭｅＣＰ２を使用するＣＲＩＳＰＲ阻害スクリーニング（ＣＲＩＳＰＲｉ）、及びｄＣａｓ９－ＰＰ７－ｐ６５－ＶＰ６４系を使用するＣＲＩＳＰＲ活性化スクリーニング（ＣＲＩＳＰＲａ）。

ヒト細胞におけるＨＤＲの効率を試験するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）へのペア（ＧＦＰからＢＦＰへの変換が生じるには２つのヌクレオチドが編集されることが必要である）を使用した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を安定発現するＫ５６２ヒト細胞株でＣＲＩＳＰＲスクリーニングを実施した。Ｃａｓ９、ＧＦＰを標的とするガイドＲＮＡ、及びＢＦＰをコードする一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を用いてＧＦＰを標的とした。特定の遺伝的摂動（遺伝的な阻害または活性化）を有する細胞におけるＨＤＲの効率を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）後に、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を使用するガイドＲＮＡの回収及び定量化を実施して特定した。

図１に示されるように、ＣＲＩＳＰＲｉアレイ検証における上位ヒットは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子であった。ＨＤＲを促進する上位ＣＲＩＳＰＲｉヒットの中で、ＤＮＡ損傷に関与する遺伝子（ＤＮＡ－ＰＫ、ＴＰ５３ＢＰ１、及びＬＩＧ４）を特定した。ＤＮＡ－ＰＫ、ＴＰ５３ＢＰ１、及びＬＩＧ４をノックアウトすると、以前に確立されたようにＨＤＲレベルが上昇した。ノックアウトするとＫ５６２細胞でのＨＤＲが促進される遺伝子をさらに１３個特定した。ＮＨＥＪを遮断した場合、ＨＤＲのレベルは約５０～６０％に上昇したにすぎなかった。表２には、阻害されるとＨＤＲレベルが上昇するＣＲＩＳＰＲｉスクリーニング由来の上位５００個の遺伝子が順位付けされて示される。これらの遺伝子は、ｌｏｇ２変換した平均ガイド変化倍率（６つの個別ガイドで各遺伝子を標的とした）に基づいて順位付けされている。

表１には、活性化されるとＨＤＲのレベルまたは効率が上昇するＣＲＩＳＰＲａスクリーニング由来の上位５００個の遺伝子が示される。これらの遺伝子は、ｌｏｇ２変換した平均ガイド変化倍率（６つの個別ガイドで各遺伝子を標的とした）に基づいて順位付けされている。

変化倍率によって順位付けした上位２００個の遺伝子の上位のＣＲＩＳＰＲスクリーニング結果をＲｅａｃｔｏｍｅ解析によって評価した。以下の表に示されるように、上位遺伝子のほとんどが、特定の生物学的プロセス（ｍＲＮＡスプライシング、タンパク質翻訳、細胞周期など）に関与するものであった。

実施例２－ＤＮＡ－ＰＫノックアウトモノクローナル細胞株
ＮＨＥＪの阻害との相乗作用を生み出し、ヒト細胞におけるＨＤＲレベルをさらに上昇させるＨＤＲの制御因子をさらに特定するために、ＤＮＡ－ＰＫモノクローナルノックアウト細胞を生成させた。ＨＥＫ２９３ ＤＮＡ－ＰＫノックアウト細胞は、ガイド及びＣａｓ９ヌクレアーゼを用いてＨＥＫ２９３細胞中のＤＮＡ－ＰＫ遺伝子を標的とすることによって生成させた。ウエスタンブロットによってモノクローナル株を試験して、タンパク質レベルでのＤＮＡ－ＰＫの発現を調べた。野生型（ＷＴ）ＨＥＫ２９３細胞はＤＮＡ－ＰＫの発現を示す一方で、図２Ａのウエスタンブロットのクローン２、３、１８、１９、及び２２ではノックアウトによってＤＮＡ－ＰＫが完全に消失していた。クローン１及び２４では、残存ＤＮＡ－ＰＫタンパク質レベルが検出された。

緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）への変換アッセイを使用してＤＮＡ－ＰＫモノクローナル株におけるＨＤＲレベルを測定した。図２Ｂの棒グラフに示されるように、ＨＤＲのレベルはＷＴ細胞と比較して２倍に上昇し、ＤＮＡ－ＰＫ発現が完全に消失しているモノクローナル株（クローン２、３、１８、１９、２２）にわたって一貫していた。

実施例３－ＤＮＡ－ＰＫ ＫＯ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ阻害スクリーニング
フォローアップ実験において、ＣＲＩＳＰＲｉスクリーニング由来の２６個の上位ヒッ
ト遺伝子及びＣＲＩＳＰＲａスクリーニング由来の１３個の上位ヒット遺伝子をノックアウトした。試験した遺伝子の中で、我々の機能喪失型（ＣＲＩＳＰＲｉ）スクリーニング由来の１６個の遺伝子（図１）及び我々の機能獲得型（ＣＲＩＳＰＲａ）スクリーニング由来の１１個の遺伝子を検証した。これらの遺伝子がＨＤＲレベルを上昇させることを検証した。

生物学的反復としてＤＮＡ－ＰＫノックアウトクローン株１８及び２２を使用して、これらの細胞においてゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ阻害スクリーニングを実施した。ＨＤＲ（変化倍率中央値）を増加させる遺伝子（図３の最も右側３分の１）及び減少させる遺伝子を特定した。ＨＤＲを減少させる遺伝子（図３の最も左側３分の１）には、ＢＲＣＡ１、ＦＡＮＣＭ、ＦＡＮＣＩ、ＢＡＲＤ１、及びＲＢＢＰ８が含まれている。ＨＤＲレベルを上昇させる遺伝子には、ＰＯＬＱ、ＸＰＯ１、ＡＲＣＮ１、ＲＰＬ２６、ＣＡＣＴＩＮ、ＴＭＡ１６、ＲＰＳ２４、ＴＷＩＳＴＮＢ、ＣＤＣ４０、ＰＳＭＤ２、ＳＮＲＰＧ、ＮＥＰＲＯ、ＣＤＫ７、及びＳＭＵ１が含まれている。

コンビナトリアル遺伝子摂動がＨＤＲレベルを有意に上昇させることを実証するために、ＲＰＬ４ノックアウト細胞株、ＳＲＰＫ１ノックアウト細胞株、ＲＡＮＢＰ１ノックアウト細胞株、ＷＲＮノックアウト細胞株、ＲＡＤ５１ノックアウト細胞株、ＰＯＬＺノックアウト細胞株、ＬＩＧ４ノックアウト細胞株、ＮＥＤＤ８ノックアウト細胞株、ＴＵＢＡ１Ｂノックアウト細胞株、及びＲＦＣＳノックアウト細胞株を２μＭのＤＮＡ－ＰＫ阻害剤ＮＵ７４４１で処理した。ＨＤＲレベルは細胞選別によって決定した。図４Ａに示されるように、ＲＦＣ５ノックアウト株、ＴＵＢＡ１Ｂノックアウト株、ＮＥＤＤ８ノックアウト株、ＬＩＧ４ノックアウト株、ＰＯＬＱノックアウト株、及びＲＡＤ５１ノックアウト株におけるＤＮＡ－ＰＫの遮断（すなわち、２つの遺伝子阻害／ノックアウトの組み合わせ）の結果、ＨＤＲレベルが有意に上昇した。

ＧＦＰ→ＢＦＰアッセイを使用するアレイ検証の追加の結果から、ＤＮＡ－ＰＫ及び第２の遺伝子標的を阻害することでＨＤＲが増加することが認められた。簡潔に記載すると、ＤＮＡ－ＰＫノックアウト細胞クローン２２をＮＴ（対照としての非標的化ガイド）の標的としてベースラインを確立するか、または示される遺伝子（すなわち、ＭＲＰＳ２７、ＭＲＰＬ１１、ＨＮＲＮＰＣ、ＵＳＥ１、ＣＳＴＦ１、ＰＯＬＺ、ＣＡＣＴＩＮ、ＩＮＴＳ９、ＲＰＬ７、ＴＷＩＳＴＮＢ、ＰＯＬＡ１、ＥＦＨ、ＮＢＡＳ、ＳＮＲＰＧ、ＲＰＳ２４、ＩＮＴＳ７、ＰＳＭＣ２、ＥＰ２０Ｃ、ＰＳＭＡ６、ＣＤＣ４、ＴＭＡ１６、ＰＬＲＧ１、ＣＤＫ７、ＤＡＰ３、ＲＰＬ３４、ＮＵＰ１５３、ＮＵＰ１５３、ＰＯＬＡ２、ＲＰＬ２６、ＢＲＤ９、ＳＴＸ１８、ＭＲＰＳ５、ＩＮＴＳ４、ＮＵＰ１０７、Ｃ６ｏｒｆ５２、またはＨＮＲＮＰＨ２）のうちの１つを標的とするガイドの標的とした。図４Ｂの棒グラフに示されるように、これらの遺伝子のほとんどが、ＤＮＡ－ＰＫノックアウト細胞において摂動を受けた場合にＨＤＲレベルを上昇させた。

実施例４－小分子阻害剤の組み合わせを用いるＨＤＲの阻害
２つの遺伝子標的を同時に阻害する効果を評価し、ＨＤＲレベルに対する効果を決定するために、表２の遺伝子標的のうちの３８個の既知の小分子阻害剤をＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ．ｃｏｍ、Ｍｅｄ ＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａから購入した。図５の表には、遺伝子標的のリスト及び対応する既知の小分子阻害剤が示される。

ＤＮＡ－ＰＫノックアウトＨＥＴ２９３細胞に対して１０μＭまたは１μＭの濃度で小分子を試験した。３８個の薬物を用いて１８個の標的を標的とした。いくつかの薬物は致死性であったため、使用を控えた。薬物検証は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、または１μＭもしくは１０μＭの示される阻害剤で処理したＤＮＡ－ＰＫ ＫＯ細胞クロー
ン２２において実施した。ＨＤＲレベルは、ＢＦＰ→ＧＦＰアッセイを用いて測定した。小分子阻害剤は、Ｃａｓ９、ガイドＲＮＡ、及びＢＦＰをコードする一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の導入と同時に培地に添加した。２４時間後に薬物を洗い流した。

図６に示されるように、示される遺伝子標的の阻害剤化合物の約７５％が１μＭ濃度でＨＤＲレベルを上昇させた。これらには、
ＰＬＫ１阻害剤 ＭＬＮ０９０５、
ＡＵＲＫＡ阻害剤 アリセルチブ（ＭＬＮ８２３７）及びＬＹ３２９５６６８、
ＸＰＯ１阻害剤 エルタネクソル（ＫＰＴ－８６０２）及びＫＰＴ－２７６、
ＣＤＫ７阻害剤 ＹＫＬ－５－１２４、
ＰＡＫ６（汎Ｐａｋ阻害剤） ＰＦ－３７５８３０９、
ＣＥＲＳ６阻害剤 フィンゴリモド（ＦＴＹ７２０）ＨＣｌ、
ＢＲＤ９阻害剤 Ｉ－ＢＲＤ９及びＢＩ－７２７３、
ＰＯＬＡ１阻害剤 ＳＴ１９２６及びＣＤ４３７、
ＶＣＰ／ｐ９７阻害剤 ＮＭＳ－８７３及びＤＢｅＱ、
ＣＳＮＫ１Ｇ３（カゼインキナーゼ１ガンマ３）阻害剤 ＰＦ－６７０４６２及びＰＦ４８００５６７、
ＨＳＰＡ５阻害剤 ＨＡ１５及びＶＥＲ１５５００８、
ＰＴＧＤＲ阻害剤 セチピプラント（ＡＣＴ－１２９９６８）、
ＰＯＬＱ 阻害剤ノボビオシン、
ＦＮＴＡ 阻害剤ＦＴＩ２７７ＨＣｌ、ならびに
ＶＣＰ／ｐ９７阻害剤 ＣＢ－５０８３
が含まれる。

こうしたデータは、少なくとも２つの遺伝子標的を阻害するこれらの薬物組み合わせがＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集手法との併用時にＨＤＲ効率の増強に有用であり得るという証拠を与えるものである。

図６に示される化合物を、用量依存的効果についてさらに試験した。記載の化合物を１０μＭ、５μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．１μＭ、及び０．０１μＭの化合物濃度で用いて、上記のものと同じ細胞を処理した。ＨＤＲレベルは、薬物処理から２４時間後のＤＭＳＯに対するＢＦＰ＋細胞の％として示される（図７）。

１０μＭ、５μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．１μＭ、及び０．０１μＭでの細胞毒性についても、同じ化合物を試験した。図８は、薬物処理後の細胞毒性を示す。図９Ａは、化合物ＫＰＴ－２７６についてＤＭＳＯに対するＢＦＰ＋の増加及び細胞毒性を示すグラフであり、図９Ｂは、化合物ＳＢＥ１３ＨＣｌの結果を示す。いくつかの小分子阻害剤は、特に高濃度で細胞毒性を示した一方で、この化合物についてはＨＤＲを用量依存的に増加させることが認められ、毒性の低さが認められた。

実施例５－組み合わせのスクリーニング
上記の実施例の結果から、ある特定の組み合わせを試験して、高レベルのＨＤＲを生じさせる最小用量を決定する。図１０は、化合物の組み合わせの表を示す。１１個の化合物を選択した。これらの化合物を記載の濃度で組み合わせて試験する。被験化合物及びそれらの構造は表３に示される。

実施例６－ＨＤＲ効率が向上した遺伝子編集
ムコ多糖症１（ＭＰＳ１）疾患に罹患しているヒト患者を対象として遺伝子編集効率の増強方法を実証する。ＭＰＳ１は、ＩＤＵＡ遺伝子が変異することで生じる。ＩＤＵＡは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の分解に必要なアルファ－Ｌ－イズロニダーゼと呼ば
れる酵素をコードする。この酵素に変異を有する患者では、ＧＡＧが大量に蓄積して細胞、組織、及び臓器に損傷が生じる。現在のところ、この疾患に有効な治療は存在しない。この変異を有して生まれる子供の平均寿命は約１０年である。

ＭＰＳＩ疾患表現型を好転させるために、相同組換え修復を制御することを我々が特定した遺伝子の遺伝子発現を抑制または活性化することによって患者の一過性プライミングを実施する。このプライミングは、所望の遺伝子を阻害または活性化することによって実施する。遺伝子阻害は、小分子阻害剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ標的化酵素Ｃａｓ１３、またはｄＣａｓ９リプレッサー（ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２など）を送達することによって実施する。遺伝子活性化は、ｍＲＮＡ、プラスミド上の遺伝子ＯＲＦ、ｄＣａｓ９活性化因子（ｐ６５、ＨＳＦ１など）を送達するか、または遺伝子送達ウイルスベースの方法によって達成する。本明細書に記載のプライミング方法は、高効率のＨＤＲを可能にする一過性かつ可逆的な変化を可能にする。上記の阻害剤（複数可）及び／または活性化因子（複数可）の所望の組み合わせを用いて患者のプライミングを実施した時点で、Ｃａｓ９酵素ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、及び所望のＤＮＡ編集を含む一本鎖ＤＮＡテンプレートをナノ粒子ベースの方法を介して送達する。プライミングを実施した患者は、ＨＤＲベースの永続的遺伝子編集を高レベルで示す。インビボでの遺伝子編集の効率は組織生検によって検査する。

実施例７－ＨＤＲ効率向上のための組み合わせ阻害組成物でのプライミングを用いる遺伝子編集
ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤及び別の阻害剤を使用するコンビナトリアル阻害がＨＤＲ遺伝子編集率に与える効果を調べるために、ＥＧＦＰ標的化ｓｇＲＮＡ及びＥＢＦＰ ｓｓＯＤＮを含むＳｐＣａｓ９ ＲＮＰをヒトＫ５６２ ＰＲＫＤＣ－／－細胞（ＤＮＡノックアウト細胞株）にヌクレオフェクションし、その後に１μＭ（マイクロモル濃度）濃度のＳＴ１９２６（ＰＯＬＡ１の阻害剤）と共にインキュベートするか、またはＤＭＳＯで処理した（対照）。遺伝子編集率はパーセントで表され、正確な修復の％（ＢＦＰ変換の％）として分類されている。ＰＲＫＤＣヌルヒト細胞でのＳＴ１９２６処理の組み合わせによって、正確な編集が５６％から７３％に強化された。図６を参照のこと。

類似の様式で、がんに罹患している患者から採取した体外のＴ細胞に対して、ＳＴ１９２６とＤＮＡ－ＰＫ阻害剤（ＮＵ７４４１など）との組み合わせをエクスビボ、室温で５時間送達する。阻害剤の送達は、医薬的に許容可能な緩衝液及び医薬品添加物において行う。５時間後、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、変異遺伝子を標的とするｇＲＮＡ、及び所望のＤＮＡ編集を含む一本鎖ＤＮＡテンプレートを含むＬＮＰを、ナノ粒子ベースの方法によってエクスビボで細胞に送達する。標的遺伝子が編集された時点で、細胞を患者に再注入する。これと同様のプロトコールを使用して、現在の臨床試験プロトコールに従って、とりわけ、嚢胞性線維症を治療することができる。変異遺伝子が修正される結果、患者に治療効果が生じる。

本明細書に記載の特定の実施形態は単に本発明の一態様の一例を意図するものにすぎず、したがって、本発明は、そのような実施形態による範囲に限定されないものであり、機能的に均等な実施形態はいずれも、本発明の範囲に含まれる。実際、明示及び本明細書に記載されるものに加えて、前述の説明及び添付の図面から本発明のさまざまな改変が当業者に明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることが意図される。

本明細書で言及される刊行物、特許、及び特許出願はすべて、個々の刊行物、特許、または特許出願のそれぞれが、その全体が参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、それらの全体が参照によって組み込まれる。本明細書でのい
ずれの参考文献の引用も、そのような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることを認めるものではない。

Claims (43)

1. （ａ）標的遺伝子の正確な遺伝子修復の実施に必要な成分と、
   少なくとも１つの、
   （ｂ）表２から選択される遺伝子の発現もしくは活性を一時的に阻害、下方制御、もしくは遮断する阻害成分、
   （ｃ）表１から選択される遺伝子の遺伝子産物もしくは活性を一時的に増加、上方制御、もしくは過剰発現させる活性化成分、または
   （ｄ）少なくとも１つの（ｂ）の阻害剤成分と少なくとも１つの（ｃ）の活性化成分との組み合わせ、
   とを含む組成物であって、
   前記組成物中に（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）が存在することで、前記標的遺伝子の前記正確な遺伝子修復の効率を向上させることが可能になる、前記組成物。
2. ２つ以上の阻害成分を含み、各成分が、表２から選択される１つの遺伝子の発現または活性を一時的に阻害、下方制御、または遮断する、請求項１に記載の組成物。
3. ２つ以上の活性化成分を含み、各成分が、表１から選択される１つの遺伝子の遺伝子産物または活性を一時的に増加、上方制御、または過剰発現させる、請求項１または請求項２に記載の組成物。
4. 前記正確な遺伝子修復の形態が、相同組換え修復（ＨＤＲ）、塩基編集修復、またはプライム編集修復である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
5. 前記成分（ａ）が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）タンパク質と、前記標的遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ配列と、を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 哺乳動物対象へのインビボでの投与または哺乳動物対象の細胞へのエクスビボでの投与に適した送達媒体をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
7. 前記送達媒体が、ポリマーナノ粒子、無機ナノ粒子、脂質ベースの組成物、ナノカプセル脂質ベース、組換えウイルスベクター、組換えプラスミド、緩衝液、またはそれらの組み合わせである、請求項６に記載の組成物。
8. 前記阻害成分が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子の阻害剤を含む、請求項１に記載の組成物。
9. 阻害されると正確な編集修復を増加させる前記遺伝子（ｂ）が、ＤＮＡ－ＰＫ、ＬＩＧ４、ＴＰ５３ＢＰ１、ＮＥＤＤ８、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＳＲＰＫ１、ＲＦＣ５、ＰＯＬＱ、ＲＰＬ４、ＲＡＮＢＰ１、ＣＤＫ７、ＣＤＫ１２、ＰＲＣＣ、ＲＡＤ５１、ＲＲＳ１０、ＷＲＮ、ＲＰＡ３、ＮＵＰ９８、ＭＢＤ１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＣ５、ＥＳＣＯ２、ＴＡＴＤＮ２、ＦＩＧＮＬ１、ＰＤＳ５Ａ、またはＤＤＸ５である、請求項１に記載の組成物。
10. 前記阻害成分の組み合わせが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子の阻害剤と、１つ以上の追加の表２の遺伝子の阻害剤と、を含み、前記組み合わせが、前記修復の効率を向上させる、請求項２に記載の組成物。
11. 前記追加の遺伝子が、ＰＯＬＱ、ＸＰＯ１、ＲＰＬ２６、ＡＲＣＮ１、ＣＡＣＴＩＮ、ＲＰＳ２４、ＴＭＡ１６、ＴＷＩＳＴＮＢ、ＣＤＣ４０、ＰＳＭＤ２、ＳＮＲＰＧ、ＳＭ
    Ｕ１、ＣＤＫ７、またはＮＥＰＲＯである、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記追加の遺伝子が、ＭＲＰＳ２７、ＭＲＰＬ１１、ＨＮＲＮＰＣ、ＵＳＥ１、ＣＳＴＦ１、ＰＯＬＺ、ＣＡＣＴＩＮ、ＩＮＴＳ９、ＲＰＬ７、ＴＷＩＳＴＮＢ、ＰＯＬＡ１、ＥＦＨ、ＮＢＡＳ、ＳＮＲＰＧ、ＲＰＳ２４、ＩＮＴＳ７、ＰＳＭＣ２、ＥＰ２０Ｃ、ＰＳＭＡ６、ＣＤＣ４、ＴＭＡ１６、ＰＬＲＧ１、ＣＤＫ７、ＤＡＰ３、ＲＰＬ３４、ＮＵＰ１５３、ＮＵＰ１５３、ＰＯＬＡ２、ＲＰＬ２６、ＢＲＤ９、ＳＴＸ１８、ＭＲＰＳ５、ＩＮＴＳ４、ＮＵＰ１０７、Ｃ６ｏｒｆ５２、またはＨＮＲＮＰＨ２である、請求項１０に記載の組成物。
13. 前記追加の表２の遺伝子が、ＰＬＫ１、ＡＵＲＫＡ、ＸＰＯ１、ＣＤＫ７、ＰＳＭＣ２、ＦＮＴＡ、ＢＲＤ９、またはＰＴＧＤＲである、請求項１０に記載の組成物。
14. （ｂ）の阻害成分及び（ｃ）の活性化成分を含む、請求項１に記載の組成物。
15. 前記表１の遺伝子が、ＷＤＲ７７、ＲＢＢＰ８、ＲＦＣ３、ＦＡＮＣＢ、ＢＲＣＡ１、ＲＦＣ１、ＡＴＭ、またはＦＡＮＣＯ２である、請求項１５に記載の組成物。
16. 前記非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子が、ＤＮＡ－ＰＫ、ＬＩＧ４、またはＴＰ５３ＢＰ１である、請求項８または１０～１３のいずれか１項に記載の組成物。
17. 前記活性化成分または過剰発現成分が、小分子、前記追加の遺伝子をコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡ、または前記追加の遺伝子の精製タンパク質産物である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組成物。
18. 前記阻害成分が、独立して、小分子、核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、追加の遺伝子に指向化された第２のＲＮＡガイド配列、抗体、タンパク質、ＤＮＡもしくはタンパク質としての前記成分を発現するプラスミド、またはそれらの組み合わせである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組成物。
19. 前記阻害成分が、図４Ｂまたは６の小分子のうちの１つ以上である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組成物。
20. 標的遺伝子の正確な遺伝子編集の効率を向上させるための方法であって、前記方法が、
    （ａ）表２から選択される１つの遺伝子もしくは遺伝子の組み合わせの発現もしくは活性を一時的に阻害、下方制御、遮断、もしくは低減する組成物、
    （ｂ）表１から選択される少なくとも１つの追加の遺伝子もしくは追加の遺伝子の組み合わせの産物、発現、もしくは活性を一時的に活性化、上方制御、刺激、もしくは過剰発現させる組成物、または
    （ｃ）（ａ）の組成物及び（ｂ）の組成物
    をインビボで哺乳動物対象に投与すること、またはエクスビボで哺乳動物細胞と接触させること、を含み、
    前記組成物（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）が、遺伝子編集手法及び前記標的遺伝子の正確な編集修復を実施する上で必要な成分の前またはそれと同時に投与される、前記方法。
21. 前記正確な遺伝子修復の形態が、相同組換え修復（ＨＤＲ）、塩基編集修復、またはプライム編集修復である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記遺伝子編集がＣＲＩＳＰＲであり、前記ＣＲＩＳＰＲ介在性の正確な編集修復の実施に必要な成分が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）タンパク質及びガイ
    ドＲＮＡ配列を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
23. 前記阻害組成物（ａ）または（ｃ）が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子の阻害剤を含む、請求項２０～請求項２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 阻害されると正確な編集修復を増加させる前記表２から選択される遺伝子が、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＬＩＧ４、ＴＰ５３ＢＰ１、ＮＥＤＤ８、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＳＲＰＫ１、ＲＦＣ５、ＰＯＬＱ、ＲＰＬ４、ＲＡＮＢＰ１、ＣＤＫ７、ＣＤＫ１２、ＰＲＣＣ、ＲＡＤ５１、ＲＲＳ１０、ＷＲＮ、ＲＰＡ３、ＮＵＰ９８、ＭＢＤ１、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＣ５、ＥＳＣＯ２、ＴＡＴＤＮ２、ＦＩＧＮＬ１、ＰＤＳ５Ａ、またはＤＤＸ５である、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記組成物（ａ）が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子の阻害剤と、１つ以上の追加の表２の遺伝子の阻害剤と、を含み、前記組み合わせが、前記修復の効率を向上させる、請求項２０～２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記追加の表２の遺伝子が、ＰＯＬＱ、ＸＰＯ１、ＲＰＬ２６、ＡＲＣＮ１、ＣＡＣＴＩＮ、ＲＰＳ２４、ＴＭＡ１６、ＴＷＩＳＴＮＢ、ＣＤＣ４０、ＰＳＭＤ２、ＳＮＲＰＧ、ＳＭＵ１、ＣＤＫ７、またはＮＥＰＲＯである、請求項２０～２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記追加の表２の遺伝子が、ＰＬＫ１、ＡＵＲＫＡ、ＸＰＯ１、ＣＤＫ７、ＰＳＭＣ２、ＦＮＴＡ、ＢＲＤ９、またはＰＴＧＤＲである、請求項２０～２５のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記追加の表２の遺伝子が、ＭＲＰＳ２７、ＭＲＰＬ１１、ＨＮＲＮＰＣ、ＵＳＥ１、ＣＳＴＦ１、ＰＯＬＺ、ＣＡＣＴＩＮ、ＩＮＴＳ９、ＲＰＬ７、ＴＷＩＳＴＮＢ、ＰＯＬＡ１、ＥＦＨ、ＮＢＡＳ、ＳＮＲＰＧ、ＲＰＳ２４、ＩＮＴＳ７、ＰＳＭＣ２、ＥＰ２０Ｃ、ＰＳＭＡ６、ＣＤＣ４、ＴＭＡ１６、ＰＬＲＧ１、ＣＤＫ７、ＤＡＰ３、ＲＰＬ３４、ＮＵＰ１５３、ＮＵＰ１５３、ＰＯＬＡ２、ＲＰＬ２６、ＢＲＤ９、ＳＴＸ１８、ＭＲＰＳ５、ＩＮＴＳ４、ＮＵＰ１０７、Ｃ６ｏｒｆ５２、またはＨＮＲＮＰＨ２である、請求項２０～２５のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記追加の表１の遺伝子が、ＷＤＲ７７、ＲＢＢＰ８、ＲＦＣ３、ＦＡＮＣＢ、ＢＲＣＡ１、ＲＦＣ１、ＡＴＭ、またはＦＡＮＣＯ２である、請求項２０～２８のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記阻害成分と活性化成分との組み合わせが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子の阻害剤と、１つ以上の追加の表１の遺伝子の産物の過剰発現を引き起こす成分と、を含み、前記第１の追加の遺伝子の一時的な阻害と、前記第２の追加の遺伝子の産物の一時的な過剰発現と、が組み合わさることで前記修復の効率が高まる、請求項２０～２８のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記追加の表１の遺伝子が、ＷＤＲ７７、ＲＢＢＰ８、ＲＦＣ３、ＦＡＮＣＢ、ＢＲＣＡ１、ＲＦＣ１、ＡＴＭ、またはＦＡＮＣＯ２である、請求項２９に記載の方法。
32. 前記非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子が、ＤＮＡ－ＰＫ、ＬＩＧ４、またはＴＰ５３ＢＰ１である、請求項２３、２５、または２９に記載の方法。
33. 前記活性化成分または過剰発現成分が、送達時に前記追加の遺伝子の細胞レベルを向上
    させ得る、小分子、前記追加の遺伝子をコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡ、または前記追加の遺伝子の精製タンパク質産物であり、前記追加の遺伝子（複数可）の発現が増加することで、前記修復の効率が高まる、請求項２０～３１のいずれか１項に記載の方法。
34. 前記阻害成分が、独立して、小分子、核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、追加の遺伝子に指向化された第２のＲＮＡガイド配列、抗体、タンパク質、ＤＮＡもしくはタンパク質としての前記成分を発現するプラスミド、またはそれらの組み合わせである、請求項２０～３１のいずれか１項に記載の方法。
35. 前記阻害組成物が、図４Ａまたは６の小分子のうちの１つ以上を含む、請求項２０～３３のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記哺乳動物細胞が、前記哺乳動物対象から採取される自己細胞であり、インビボでの遺伝子編集に供され、その後に前記哺乳動物対象にインビボ移入される、請求項２０～３４のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記遺伝子編集成分の投与の１～２４時間前に前記組成物（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）を投与することをさらに含む、請求項２０～３５のいずれか１項に記載の方法。
38. 前記標的遺伝子の修復のための前記遺伝子編集成分がナノ粒子またはナノカプセルに封入され、前記組成物（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）とは別に前記対象または細胞に送達される、請求項２０～３６のいずれか１項に記載の方法。
39. 前記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の組成物が、独立して、小分子、核酸配列、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、追加の遺伝子に指向化された第２のＲＮＡガイド配列、抗体、タンパク質、前記追加の遺伝子をＤＮＡもしくはタンパク質として一時的に発現するように設計されたプラスミドもしくは組換えウイルス、またはそれらの組み合わせである、請求項２０～３７のいずれか１項に記載の方法。
40. 前記哺乳動物対象が、遺伝的に媒介される疾患を有するヒト対象である、請求項２０～３８のいずれか１項に記載の方法。
41. 前記標的遺伝子が、ヒト対象における遺伝的に媒介される疾患を媒介するまたはその原因である遺伝子である、請求項２０に記載の方法。
42. 前記阻害剤が、ＳＢＥ１３ＨＣｌ、アリセルチブ、ＬＹ３２９５６６８、ＭＫ－８７４５、ＫＰＴ－２７６、ＹＫＬ－５－１２４、ＶＲ２３、ＭＧ１３２、ＦＴＩ２７７ＨＣｌ、ＢＩ－７２７３、またはセチピプラントである、いずれかの先行請求項に記載の組成物または方法。
43. ＳＢＥ１３ＨＣｌ、アリセルチブ、ＬＹ３２９５６６８、ＭＫ－８７４５、ＫＰＴ－２７６、ＹＫＬ－５－１２４、ＶＲ２３、ＭＧ１３２、ＦＴＩ２７７ＨＣｌ、ＢＩ－７２７３、またはセチピプラントのうちの２つ以上を含む組成物。
    

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