JP2024508832A - ゲノム編集球状核酸(sna)を開発するための戦略 - Google Patents
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Abstract
球状核酸(SNA)は、その化学的に調整可能な構造、生体適合性、及びトランスフェクション試薬なしで細胞に迅速に侵入する能力により、治療的送達のための魅力的なプラットフォームである。本開示は、遺伝子編集タンパク質を細胞に送達するためのSNA及び戦略を提供する。送達された遺伝子編集タンパク質は、酵素活性のままであり、哺乳類細胞に迅速に侵入する。【選択図】図1
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2021年2月26日に出願された米国仮特許出願第63/154,530号、2021年10月28日に出願された米国仮特許出願第63/273,086号、及び2021年12月16日に出願された米国仮特許出願第63/290,522号の米国特許法第119条(e)下の優先権の利益を主張し、それらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2021年2月26日に出願された米国仮特許出願第63/154,530号、2021年10月28日に出願された米国仮特許出願第63/273,086号、及び2021年12月16日に出願された米国仮特許出願第63/290,522号の米国特許法第119条(e)下の優先権の利益を主張し、それらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
政府の利益に関する声明
本発明は、Federal Bureau of Investigation(FBI)によって授与された認可番号DJF-15-1200-K-0001730の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、Federal Bureau of Investigation(FBI)によって授与された認可番号DJF-15-1200-K-0001730の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
電子的に提出された資料の参照による組み込み
この出願には、本開示の別の部分として、参照によりその全体が組み込まれ、次のように識別される、コンピュータ読み取り可能な形式の配列表が含まれる:ファイル名:2021-043R_Seqlisting.txt;サイズ:61,129バイト;作成日:2022年2月25日。
この出願には、本開示の別の部分として、参照によりその全体が組み込まれ、次のように識別される、コンピュータ読み取り可能な形式の配列表が含まれる:ファイル名:2021-043R_Seqlisting.txt;サイズ:61,129バイト;作成日:2022年2月25日。
ゲノム編集とは、特定のDNA配列の除去又は挿入を指す。ゲノム編集タンパク質のメンバーの中で、その特異性及び汎用性のために、CRISPR/Cas9(クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート、及びCRISPR関連タンパク質9)タンパク質は、臨床翻訳のためのゲノムを編集及び調節するための効率的なゲノム編集ツールとして利用されている[P.Horvath,R.Barrangou,Science 2010,327,167-170]。Cas9酵素のかなりの成果がなされているが、Cas9単一ガイドRNA(sgRNA)複合体の低減されたオフターゲット効果及び効率的かつ直接的な形質導入は、依然として非常に望ましい[L.Y.Chou,K.Ming,W.C.Chan,Chem.Soc.Rev.2011,40,233-245、V.Biju,Chem.Soc.Rev.2014,43,744-764、Y.Lu,A.A.Aimetti,R.Langer,Z.Gu,Nat.Rev.Mater.2017,2,16075]。
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)/CRISPR関連(Cas)タンパク質及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)などの迅速にプログラム可能なヌクレアーゼは、広範囲の遺伝性疾患を治療する可能性を有する[Gupta et al.,J Clin Invest.124(10):4154-4161(2014)、Hsu et al.,Cell 157(6):1262-1278(2014)]が、哺乳類細胞への効率的な送達は依然として課題である。
遺伝子編集タンパク質のオフターゲット効果及び効率的な形質導入を含むゲノム編集による現在の制限に対処しようとするために、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー、及び無機ナノ粒子などの様々な非ウイルス送達系が、Cas9-sgRNA複合体の送達を安定化及び増強するために設計及び用いられている[Y.Fu,J.A.Foden,C.Khayter,M.L.Maeder,D.Reyon,J.K.Joung,J.D.Sander,Nat.Biotechnol.2013,31,822-826、J.G.Doench,N.Fusi,M.Sullender,M.Hegde,E.W.Vaimberg,K.F.Donovan,I.Smith,Z.Tothova,C.Wilen,R.Orchard,H.W.Virgin,J.Listgarten,D.E.Root,Nat.Biotechnol.2016,34,184-191、B.P.Kleinstiver,V.Pattanayak,M.S.Prew,S.Q.Tsai,N.T.Nguyen,Z.Zheng,J.K.Joung,Nature 2016,529,490-495、I.M.Slaymaker,L.Gao,B.Zetsche,D.A.Scott,W.X.Yan,F.Zhang,Science 2016,351,84-88]。しかしながら、これらの担体の複雑な設計、放出効率、並びに潜在的な毒性及び免疫原性の副作用は、それらの迅速な臨床的採用を妨げる。ウイルス系は、インビボで細胞を形質導入するための第一の手段として使用されている。これらの系は、パッケージングの制約、免疫原性、及びオフターゲット事象を好むCas発現の寿命に関連する問題に悩まされている。したがって、ウイルスベクターは、CRISPR/Casの直接インビボ送達のための最良の選択ではない。本開示は、ナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェルを含む球状核酸、及び遺伝子編集タンパク質の送達におけるそれらの使用に関する。
したがって、いくつかの態様では、本開示は、(a)遺伝子編集タンパク質を含むタンパク質コアと、(b)タンパク質コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、タンパク質-コア球状核酸(ProSNA)を提供する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、タンパク質コアに共有結合している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、リンカーを介してタンパク質コアに結合している。更なる実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、無痕跡型リンカー、又はそれらの組み合わせである。なお更なる実施形態では、リンカーは、カルバミン酸アルキレンジチオレートリンカーである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドは、タンパク質-コア-NH-C(O)-O-C2-5アルキレン-S-S-C2-7アルキレン-オリゴヌクレオチド、又はタンパク質-コア-NH-C(O)-O-CH2-Ar-S-S-C2-7アルキレン-オリゴヌクレオチドを含み、Arは、メタ又はパラ置換フェニルを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドは、タンパク質-コア-NH-C(O)-O-C(ZA)(ZB)C1-4アルキレン-C(XA)(XB)-S-S-C(YA)(YB)C1-6アルキレン-オリゴヌクレオチドを含み、ZA、ZB、XA、XB、YA、及びYBは、それぞれ独立して、H、Me、Et、又はiPrである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドは、タンパク質-コア-NH-C(O)-O-C(XA)(XB)-Ar-S-S-C(YA)(YB)C2-6アルキレン-オリゴヌクレオチドを含み、XA、XB、YA、及びYBは、それぞれ独立して、H、Me、Et、又はiPrである。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミドアルキレンジチオレートリンカーである。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドは、タンパク質-コア-NH-C(O)-C2-5アルキレン-S-S-C2-7アルキレン-オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドは、タンパク質-コア-NH-C(O)-C1-4アルキレン-C(XA)(XB)-S-S-C(YA)(YB)C1-6アルキレン-オリゴヌクレオチドを含み、XA、XB、YA、及びYBは、それぞれ独立して、H、Me、Et、又はiPrである。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミドアルキレンチオエーテルリンカーである。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドは、タンパク質-コア-NH-C(O)-C2-4アルキレン-N-スクシンイミジル-S-C2-6アルキレン-オリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの態様では、本開示は、(a)ナノ粒子コア、(b)ナノ粒子コアの外側表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェル、及び(c)遺伝子編集タンパク質を含む、球状核酸(SNA)を提供する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子コアは、リポソームコア又は脂質ナノ粒子コアである。更なる実施形態では、脂質ナノ粒子コアは、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、脂質-PEGコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。いくつかの実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、脂質ナノ粒子コアに封入されている。いくつかの実施形態では、本開示のProSNAは、脂質ナノ粒子コアに封入されている。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質(RNP)複合体は、脂質ナノ粒子コアに封入され、RNPは、遺伝子編集タンパク質、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)RNA(crRNA)、及びトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含む。いくつかの実施形態では、リポソームコアは、複数の脂質基を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、リポソームコアに封入されている。いくつかの実施形態では、本開示のProSNAは、リポソームナノ粒子コアに封入されている。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質(RNP)複合体は、脂質ナノ粒子コアに封入され、RNPは、遺伝子編集タンパク質、CRISPR RNA(crRNA)、及びトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含む。いくつかの実施形態では、複数の脂質基は、脂質のホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジルエタノールアミンのファミリーからなる群から選択される脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1,2-ジミリストイル-sn-ホスファチジルコリン(DMPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-ホスファチジルコリン(POPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1’-rac-グリセロール)(DSPG)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1’-rac-グリセロール)(DOPG)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、1,2-ジ-(9Z-オクタデセノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、及び1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPPE)からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドは、脂質アンカー基を介してリポソーム又は脂質ナノ粒子コアの外部に結合している。いくつかの実施形態では、脂質アンカー基は、少なくとも1個のオリゴヌクレオチドの5’終端又は3’終端に結合している。更なる実施形態では、脂質アンカー基は、トコフェロール又はコレステロールである。いくつかの実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、CRISPR関連タンパク質(Cas)である。更なる実施形態では、Casは、Cas9、Cas12、Cas13、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドは、その5’終端及び/又は3’終端でジベンゾシクロオクチル(DBCO)で修飾される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約2~約100個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約10~約80個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約5~約50個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約5~約20個のオリゴヌクレオチドを含む。なお更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約14個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約15個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、約5~約100ヌクレオチド長である。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、約10~約50ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の1個以上のオリゴヌクレオチドは、(GGX)nヌクレオチド配列を含み、配列中、nは2~20であり、Xは核酸塩基(A、C、T、G、又はU)である。いくつかの実施形態では、(GGX)nヌクレオチド配列は、1個以上のオリゴヌクレオチドの5’終端にある。いくつかの実施形態では、(GGX)nヌクレオチド配列は、1個以上のオリゴヌクレオチドの3’終端にある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の1個以上のオリゴヌクレオチドは、(GGT)nヌクレオチド配列を含み、配列中、nは2~20である。いくつかの実施形態では、(GGT)nヌクレオチド配列は、1個以上のオリゴヌクレオチドの5’終端にある。いくつかの実施形態では、(GGT)nヌクレオチド配列は、1個以上のオリゴヌクレオチドの3’終端にある。いくつかの実施形態では、ProSNA又はSNAの直径は、約1ナノメートル(nm)~約500nmである。いくつかの実施形態では、SNAの直径は、約50ナノメートル以下である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドは、標的化オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、阻害性オリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、遺伝子編集因子基質DNA若しくはRNA、又はそれらの組み合わせを含む。更なる実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、アプタマー、短いヘアピンRNA(shRNA)、DNAザイム、又はアプタザイムである。いくつかの実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、CpGモチーフ含有オリゴヌクレオチド、二本鎖DNAオリゴヌクレオチド、又は一本鎖RNAオリゴヌクレオチドである。更なる実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドのそれぞれは、toll様受容体(TLR)アゴニストである。なお更なる実施形態では、TLRは、toll様受容体1(TLR1)、toll様受容体2(TLR2)、toll様受容体3(TLR3)、toll様受容体4(TLR4)、toll様受容体5(TLR5)、toll様受容体6(TLR6)、toll様受容体7(TLR7)、toll様受容体8(TLR8)、toll様受容体9(TLR9)、toll様受容体10(TLR10)、toll様受容体11(TLR11)、toll様受容体12(TLR12)、及びtoll様受容体13(TLR13)からなる群から選択される。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される複数のタンパク質-コア球状核酸(ProSNA)を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、ガイドRNAを更に含む。いくつかの実施形態では、少なくとも2つのProSNAは、異なるタンパク質コアを含む。
いくつかの態様では、本開示は、本開示の複数の球状核酸(SNA)を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、SNAの少なくとも2つは、異なるナノ粒子コアを含む。
いくつかの態様では、本開示は、遺伝子編集タンパク質を細胞に送達する方法であって、細胞を本開示のProSNAと接触させることを含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、遺伝子編集タンパク質を細胞に送達する方法であって、細胞を本開示の組成物と接触させることを含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、遺伝子編集タンパク質を細胞に送達する方法であって、細胞を本開示のSNAと接触させることを含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、遺伝子編集タンパク質を細胞に送達する方法であって、細胞を本開示の組成物と接触させることを含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、対象において障害を治療、改善、及び/又は予防する方法であって、対象に、有効量の(i)本開示のProSNA、(ii)本開示のSNA、(iii)本開示の組成物、又は(iv)それらの組み合わせを投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、遺伝性疾患、心血管疾患、又はそれらの組み合わせである。
いくつかの態様では、本開示は、以下のように、N末端からC末端に配置された、以下:(i)1つ以上のGALAペプチド、(ii)遺伝子編集タンパク質、及び(iii)核局在化シグナル(NLS)、を含む、融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、1つ以上のGALAペプチドは、3つの連続したGALAペプチドを含む。様々な実施形態では、1つ以上のGALAペプチドのそれぞれは、配列番号22に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、1つ以上のGALAペプチドは、配列番号26に記載のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、CRISPR関連タンパク質(Cas)である。更なる実施形態では、Casは、Cas9、Cas12、Cas13、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、Cas9は、配列番号1又は配列番号25に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、Cas12は、配列番号27に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、Cas13は、配列番号29に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。様々な実施形態では、NLSは、配列番号23又は配列番号28に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
いくつかの態様では、本開示は、本開示の融合タンパク質と、生理学的に許容される担体と、を含む、組成物を提供する。
更なる態様では、本開示は、本明細書に記載されるProSNAであって、遺伝子編集タンパク質が本開示の融合タンパク質である、ProSNAを提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるSNAであって、遺伝子編集タンパク質が本開示の融合タンパク質である、SNAを提供する。
更なる態様では、本開示は、遺伝子編集タンパク質を細胞に送達する方法であって、細胞を本明細書に記載の融合タンパク質と接触させることを含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、遺伝子編集タンパク質を細胞に送達する方法であって、細胞を融合タンパク質を含む本開示の組成物と接触させることを含む、方法を提供する。
更なる態様では、本開示は、対象において障害を治療、改善、及び/又は予防する方法であって、対象に、有効量の(i)本開示の融合タンパク質、(ii)融合タンパク質を含む本開示の組成物、又は(iii)それらの組み合わせを投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、遺伝性疾患、心血管疾患、又はそれらの組み合わせである。
球状核酸(SNA)は、交換可能なナノ粒子コアを取り囲むオリゴヌクレオチドの高密度層で官能化されたナノ粒子のクラスである。この核酸シェルは、いくつかの機能を付与する:オリゴヌクレオチドコーティングは、ナノ粒子表面上のエンドヌクレアーゼ活性を低下させ、細胞表面タンパク質と相互作用し、実質的に全ての細胞株において高い細胞取り込みをもたらす、高濃度の塩雲を形成する。これらの固有の特性の組み合わせにより、SNAは容易に調整可能な単一体の薬剤として動作することができる。
用語
「~から」、「~まで」、「最大」、「少なくとも」、「~より大きい」、「~より小さい」などの全ての言語は、列挙された数を含み、その後部分的な範囲に分解することができる範囲を指す。
「~から」、「~まで」、「最大」、「少なくとも」、「~より大きい」、「~より小さい」などの全ての言語は、列挙された数を含み、その後部分的な範囲に分解することができる範囲を指す。
範囲には、各個々のメンバーが含まれる。したがって、例えば、1~3つのメンバーを有する群は、1つ、2つ、又は3つのメンバーを有する群を指す。同様に、6つのメンバーを有する群は、1つ、2つ、3つ、4つ、又は6つのメンバーを有する群を指す。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、冠詞「a」及び「an」は、冠詞の文法的対象のうちの1つ又は2つ以上(例えば、少なくとも1つ)を指す。
「約」及び「およそ」とは、一般に、測定の性質又は精度を考慮して測定された量について許容される誤差の程度を意味するものとする。例示的な誤差の程度は、20~25パーセント(%)以内、例えば、記載された値又は値の範囲の20パーセント以内、10パーセント以内、5パーセント以内、4パーセント以内、3パーセント以内、2パーセント以内、又は1パーセント以内である。
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合には交換可能である。
本明細書で使用される場合、「リンカー」は、本明細書に記載されるタンパク質-コア球状核酸(ProSNA)のタンパク質コアにオリゴヌクレオチドを結合する部分である。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、リンカーは、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、無痕跡型リンカー、又はそれらの組み合わせである。
「対象」は、脊椎動物生物である。対象は、非ヒト哺乳動物(例えば、マウス、ラット、又は非ヒト霊長類)であり得るか、又は対象は、ヒト対象であり得る。
本明細書で使用される場合、「投与すること」、「投与する」、「投与」などの用語は、治療剤を、そのような薬剤による治療を必要とする対象に移送、送達、導入、又は輸送する任意のモードを指す。そのようなモードには、経口、局所、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、鼻腔内、及び皮下投与が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「治療すること」及び「治療」は、異常な瘢痕に関連する症状の重症度及び/又は発症の任意の低減を指す。したがって、「治療すること」及び「治療」には、治療的及び予防的手段が含まれる。当業者は、異常な瘢痕からの任意の程度の保護又は改善が、ヒト患者などの対象に有益であることを理解するであろう。患者の生活の質は、対象における症状の重症度を任意の程度まで低減し、かつ/又は症状の出現を遅らせることによって向上させる。
本明細書で使用される場合、「標的化オリゴヌクレオチド」は、SNAを特定の組織及び/又は特定の細胞型に指向するオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドはアプタマーである。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のSNAは、ナノ粒子コアの外部に結合したアプタマーを含み、アプタマーは、特定の細胞型の表面上の1つ以上の受容体に結合するように設計されている。
本明細書で使用される場合、「免疫刺激性オリゴヌクレオチド」は、免疫応答を刺激(例えば、誘導又は増強)することができるオリゴヌクレオチドである。免疫刺激性オリゴヌクレオチドの典型的な例は、CpGモチーフ含有オリゴヌクレオチド、一本鎖RNAオリゴヌクレオチド、二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、及び二本鎖DNAオリゴヌクレオチドである。「CpGモチーフ」は、シトシン-グアニンジヌクレオチド配列である。一本鎖RNA配列は、toll様受容体8及び9によって認識することができ、二本鎖RNA配列は、toll様受容体3によって認識することができ、二本鎖DNAは、toll様受容体3及び環状GMP-AMP合成酵素(cGAS)によって認識することができる。
「阻害性オリゴヌクレオチド」という用語は、例えば、mRNAをリボソーム内のタンパク質に翻訳することを妨げることによって、又は1つ以上の標的遺伝子若しくはmRNAに特異的に結合(ハイブリダイズ)し、それによって標的タンパク質の発現又は生物学的活性を低減する、標的タンパク質のうちの1つ以上をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である、タンパク質の産生又は発現を低減するオリゴヌクレオチドを指す。阻害性オリゴヌクレオチドには、単離又は合成の短いヘアピンRNA(shRNA又はDNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスRNA又はDNA、キメラアンチセンスDNA又はRNA)、miRNA及びmiRNA模倣物、低分子干渉RNA(siRNA)、先天性免疫受容体のDNA又はRNA阻害剤、アプタマー、DNAザイム、又はアプタザイムが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される全ての参考文献、特許、及び特許出願は、それぞれが引用される主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては、本明細書の全体を包含し得る。
遺伝子編集タンパク質
本開示のSNAは、1つ以上の遺伝子編集タンパク質を含む。本開示によって企図される遺伝子編集タンパク質には、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ(TALEN)、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、CRISPR関連タンパク質、CRISPR/Cas9、Cas9、xCas9、Cas12a(Cpf1)、Cas13、Cas13a、Cas14、CasX、CasY、クラス1のCasタンパク質、クラス2のCasタンパク質、MAD7、又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本開示の任意の態様又は実施形態では、ゲノム編集は、標的遺伝子の産生を阻害又は低減するために使用される。特定の実施形態では、遺伝子発現及びその後の生物学的活性タンパク質発現の低減は、非相同終端結合(NHEJ)を介したヌクレオチドの挿入/欠失、又は早期停止コドン及び非機能性タンパク質の発現につながる相同性指向修復(HDR)を介した適切なドナーカセットの挿入、又はヌクレオチドの挿入によって達成することができる。
本開示のSNAは、1つ以上の遺伝子編集タンパク質を含む。本開示によって企図される遺伝子編集タンパク質には、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ(TALEN)、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、CRISPR関連タンパク質、CRISPR/Cas9、Cas9、xCas9、Cas12a(Cpf1)、Cas13、Cas13a、Cas14、CasX、CasY、クラス1のCasタンパク質、クラス2のCasタンパク質、MAD7、又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本開示の任意の態様又は実施形態では、ゲノム編集は、標的遺伝子の産生を阻害又は低減するために使用される。特定の実施形態では、遺伝子発現及びその後の生物学的活性タンパク質発現の低減は、非相同終端結合(NHEJ)を介したヌクレオチドの挿入/欠失、又は早期停止コドン及び非機能性タンパク質の発現につながる相同性指向修復(HDR)を介した適切なドナーカセットの挿入、又はヌクレオチドの挿入によって達成することができる。
図28に示されるように、遺伝子編集タンパク質の細胞への侵入には障壁がある。これらの障壁には、遺伝子編集タンパク質の内在化(膜障壁及び大型の遺伝子編集タンパク質による)、遺伝子編集タンパク質の核取り込みを達成する方法、及び遺伝子編集タンパク質がエンドソームを脱出できる方法が含まれる。したがって、本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、遺伝子編集タンパク質は、「融合した」タンパク質の一部である。この意味での「融合した」という用語は、様々な態様では、N末端からC末端の順に一緒に融合した以下の要素:(i)1つ以上のGALAペプチド、(ii)遺伝子編集タンパク質、及び(iii)核局在化シグナル(NLS)を含むか、又はそれらからなるタンパク質を指す。いくつかの態様では、融合タンパク質は、N末端からC末端の順に一緒に融合した以下の要素:(i)遺伝子編集タンパク質及び(ii)核局在化シグナル(NLS)を含むか、又はそれらからなる。融合タンパク質の遺伝子編集部分は、当技術分野で知られている及び/又は本明細書に記載の任意の遺伝子編集タンパク質、例えば、及び限定されないが、CRISPR関連タンパク質(Cas)であり得る。様々な実施形態では、Casは、Cas9、Cas12、Cas13、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、Cas9は、Harrington,L.B.,Paez-Espino,D.,Staahl,B.T.et al.A thermostable Cas9 with increased lifetime in human plasma.Nat Commun 8,1424(2017).https://doi.org/10.1038/s41467-017-01408-4(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている通りである。いくつかの実施形態では、Cas9は、配列番号1又は配列番号25に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、Cas12は、配列番号27に記載のiアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる(Strecker J,Jones S,Koopal B,Schmid-Burgk J,Zetsche B,Gao L,Makarova KS,Koonin EV,Zhang F.Nat Commun.2019 Jan 22;10(1):212.doi:10.1038/s41467-018-08224-4.10.1038/s41467-018-08224-4 PubMed 30670702)。いくつかの実施形態では、Cas13は、配列番号29に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる(Smargon AA,Cox DB,Pyzocha NK,Zheng K,Slaymaker IM,Gootenberg JS,Abudayyeh OA,Essletzbichler P,Shmakov S,Makarova KS,Koonin EV,Zhang F.Mol Cell.2017 Feb 16;65(4):618-630.e7.doi:10.1016/j.molcel.2016.12.023.Epub 2017 Jan 5.10.1016/j.molcel.2016.12.023 PubMed 28065598)。GALAは、当技術分野で知られており(例えば、Schach et al.,J.Am.Chem.Soc.2015,137,38,12199-12202(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい)、本明細書に記載されている。本開示は、様々な実施形態では、融合タンパク質が、タンデムで1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つのGALAペプチドを含むか、又はそれらからなることを企図する。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質のN末端は、タンデムで3つのGALAペプチドを含むか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質のN末端は、タンデムで3つのGALAペプチドを含むか、又はそれらからなり、各GALAペプチドは、配列番号22に記載のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、本明細書に記載される融合タンパク質のC末端は、NLS配列を含むか、又はそれからなる。NLS配列は、当技術分野で知られている(例えば、Cutrona,G.,Carpaneto,E.,Ulivi,M.et al.Effects in live cells of a c-myc anti-gene PNA linked to a nuclear localization signal.Nat Biotechnol 18,300-303(2000).https://doi.org/10.1038/73745(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい)。いくつかの実施形態では、NLS配列は、SV40ウイルス大型T抗原のNLSに由来し、アミノ酸配列PKKKRKV(配列番号23)を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、NLSは、アミノ酸配列KRTADGSEFESPKKKRKV(配列番号28)を含むか、又はそれからなる。本開示はまた、本明細書に記載される融合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物を提供する。本開示によって提供される融合タンパク質は、本明細書に記載のProSNA、SNA、組成物、及び/又は方法のいずれかで使用され得る。したがって、いくつかの態様では、本開示のProSNAは、(a)融合タンパク質を含むタンパク質コアと、(b)タンパク質コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェルと、を含む。更なる態様では、本開示は、(a)ナノ粒子コア、(b)ナノ粒子コアの外側表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェル、及び(c)融合タンパク質を含む、SNAを提供する。
Streptococcus pyogenes II型CRISPR/Cas系を使用したインビトロ研究を通じて、効率的なCRISPR/Cas媒介標的DNA又はゲノム修飾に必要な唯一の構成要素は、Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9ヌクレアーゼ)、CRISPR RNA(crRNA)、及びトランス活性化crRNA(tracrRNA)であることが示されている。CRISPR/Cas媒介DNA切断の野生型機構は、いくつかのステップを介して起こる。遭遇した(又は標的)DNAの小断片(20~30塩基対)を含有するCRISPRアレイの、pre-crRNAの直接リピートを介したtracrRNAとのハイブリダイゼーションを通して成熟する、pre-crRNAへの転写。ガイドRNA(gRNA又はsgRNA)として知られるpre-crRNA及びtracrRNAのハイブリダイゼーションは、pre-crRNAの成熟crRNAへの変換を媒介するリボ核タンパク質複合体を形成するCasヌクレアーゼと会合する。成熟crRNA:tracrRNA二本鎖は、crRNAのスペーサー領域と宿主ゲノム上のプロトスペーサーDNAとの間のヘテロ二本鎖形成を介して、プロトスペーサー及び必要なプロトスペーサー隣接モチーフ(CRISPR/casプロトスペーサー隣接モチーフ;PAM)からなるDNA標的にCas9を指向する。Cas9ヌクレアーゼは、PAMの上流の標的DNAの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を生じさせるか、又は変異したCas9ヌクレアーゼを使用して鎖特異的ニックを生じさせ、それによって1つのDNA鎖特異的切断モチーフを変異させる。
したがって、遺伝子編集を伴う様々な態様では、本開示のSNA(例えば、ProSNA、LNP-SNA、LSNA)は、遺伝子編集タンパク質に加えて、DNA又はRNA遺伝子編集因子基質(例えば、ガイドRNA)を含み、DNA又はRNA遺伝子編集因子基質は、様々な実施形態では、SNAの表面に結合されるか、又はSNA内に封入される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集タンパク質を含むSNAは、DNA又はRNA遺伝子編集因子基質とは別個に送達される。
プログラム可能な核酸切断にも適合されている関連CRISPR系からの他のRNA誘導ヌクレアーゼとしては、Staphylococcus aureus Cas9(SaCas9)、Prevotella又はFranciscella IからのCRISPR(CpfI)、Geobacillus Cas9(GeoCas9)、Campylobacter jejuni Cas9(CjCas9)、メタゲノム由来のCRISPR-CasX及びCRISPR-CasY、CRISPR-Cas3、並びにRNAを切断するCRISPR-C2c2が挙げられる。
CRISPR/Cas系は、遺伝子ノックアウト及び編集以外のいくつかの機能を実行するように修飾されており、そのうちの3つの例を以下に記載する。触媒的に不活性化されたCas9(dCas9)は、転写活性化及び抑制ドメインに融合されており、それによって、遺伝子発現のプログラム可能な制御を可能にしている[Gilbert et al.,Cell 154,442-451(2013)、Zalatan et al.,Cell 160339-350(2015)]。dCas9転写活性化因子は特に、siRNA又はCRISPRノックアウトライブラリーに類似するが、遺伝子が過剰発現している新規スクリーニングを可能にする[Gilbert et al.,Cell 159,647-61(2014)]。蛍光タンパク質に融合されたdCas9は、ゲノム内の特定の部位の顕微鏡的追跡及び配列特異的核組織の研究を可能にする[Chen et al.,Cell 155,1479-91(2013)]。最後に、活性Cas9を標的にして、接合体内の様々な非機能性ゲノム領域を切断することができ、成熟生物の各細胞における変異の頻度及び配列を使用して、胚発生中の細胞分化の系譜を追跡することができる[Mckenna et al.,Science 42,237-241(2016)]。
本明細書で使用される場合、TALENという用語は広範であり、別のTALENからの支援なしに二本鎖DNAを切断することができる単量体TALENを含む。TALENという用語は、同じ部位でDNAを切断するように一緒に機能するように操作された一対のTALENのうちの1つ又は両方のメンバーを指すためにも使用される。一緒に機能するTALENは、DNAの利き手又はTALEN対に言及する、左TALEN及び右TALENと称され得る。
TALENという用語は、転写活性化因子様(TAL)エフェクター結合ドメイン及びヌクレアーゼドメインを含むタンパク質を意味し、それ自体が機能的である単量体TALEN、及び別の単量体TALENによる二量体化を必要とする他のものを含む。二量体化は、両方の単量体TALENが同一である場合にホモ二量体TALENをもたらすことができるか、又は単量体TALENが異なる場合にヘテロ二量体TALENをもたらすことができる。TALENは、2つの主要な真核生物DNA修復経路、非相同終端結合(NHEJ)、及び相同性指向修復によって、不死化ヒト細胞において遺伝子修飾を誘導することが示されている。TALENは、しばしば対で使用されるが、単量体TALENは、知られている。TALEN(及び他の遺伝子ツール)による治療のための細胞としては、培養細胞、不死化細胞、一次細胞、一次体細胞、接合体、生殖細胞、原始生殖細胞、胚盤胞、又は幹細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、TALエフェクターを使用して、他のタンパク質ドメイン(例えば、非ヌクレアーゼタンパク質ドメイン)を特定のヌクレオチド配列に標的化することができる。例えば、TALエフェクターは、限定されないが、DNA相互作用酵素(例えば、メチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、又はリガーゼ)、転写活性化因子若しくは抑制因子、又はヒストンなどの他のタンパク質と相互作用するか、若しくはそれを修飾するタンパク質からのタンパク質ドメインに結合され得る。そのようなTALエフェクター融合物の用途には、例えば、エピジェネティック調節エレメントを創出又は修飾すること、DNAにおける部位特異的挿入、欠失、又は修復を行うこと、遺伝子発現を制御すること、及びクロマチン構造を修飾することが含まれる。
したがって、いくつかの態様では、本開示は、遺伝子編集タンパク質の送達に使用するためのSNA(例えば、ProSNA、LSNA、LNP-SNA)を提供する。様々な実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、リボ核タンパク質(RNP)複合体中にある。様々な実施形態では、SNAに封入されたリボ核タンパク質(RNP)複合体は、CRISPR関連タンパク質9(Cas9)(配列番号1又は配列番号25)、CRISPR RNA(crRNA)、トランス活性化crRNA(tracrRNA)、及び/又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法で利用されるCas9は、EnGen(登録商標)Cas9 NLS、S.pyogenes(New England Biolabsカタログ番号M0646T)である。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、本開示のヌクレオチド又はアミノ酸配列は、参照又は野生型配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%同一である配列を含むか、又はそれからなる。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、遺伝子編集タンパク質は、参照又は野生型配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。様々な実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、参照又は野生型Cas9配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCas9タンパク質である。したがって、様々な実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、配列番号1又は配列番号25と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCas9タンパク質である。更なる実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、配列番号27と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCas12タンパク質である。更なる実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、配列番号29と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCas13タンパク質である。
球状核酸(SNAS)
本明細書に記載されるように、球状核酸(SNA)は、高度に配向されたオリゴヌクレオチドシェルで官能化された球状ナノ粒子コアを含むナノ材料の固有のクラスである。オリゴヌクレオチドシェルは、ナノ粒子コアの外側表面に結合した1個以上のオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、阻害性オリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、遺伝子編集因子基質DNA若しくはRNA、標的化オリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。ナノ粒子コアは、有機(例えば、リポソーム)、無機(例えば、金、銀、又は白金)、ポリマーベース(例えば、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)粒子)、又は中空(例えば、シリカベース)のいずれかであり得る。本開示の様々な実施形態では、ナノ粒子コアは、タンパク質(タンパク質-コアSNA(ProSNA))、リポソーム(リポソームSNA(LSNA))、又は脂質ナノ粒子(LNP-SNA)である。
本明細書に記載されるように、球状核酸(SNA)は、高度に配向されたオリゴヌクレオチドシェルで官能化された球状ナノ粒子コアを含むナノ材料の固有のクラスである。オリゴヌクレオチドシェルは、ナノ粒子コアの外側表面に結合した1個以上のオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、阻害性オリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、遺伝子編集因子基質DNA若しくはRNA、標的化オリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。ナノ粒子コアは、有機(例えば、リポソーム)、無機(例えば、金、銀、又は白金)、ポリマーベース(例えば、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)粒子)、又は中空(例えば、シリカベース)のいずれかであり得る。本開示の様々な実施形態では、ナノ粒子コアは、タンパク質(タンパク質-コアSNA(ProSNA))、リポソーム(リポソームSNA(LSNA))、又は脂質ナノ粒子(LNP-SNA)である。
ポリヌクレオチドシェルの球状アーキテクチャは、トランスフェクション剤とは無関係なほぼ全ての細胞中への侵入及びヌクレアーゼ分解に対する耐性を含む、伝統的な核酸送達方法を上回る特有の利点を与える。更に、SNAは、血液脳関門(例えば、米国特許出願公開第2015/0031745号(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい)及び血液腫瘍関門並びに表皮(例えば、米国特許出願公開第2010/0233270号(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい)を含む、生物学的関門を貫通し得る。
タンパク質-コア球状核酸(ProSNA)
最近、タンパク質コアに結合した(例えば、共有結合した)オリゴヌクレオチドの高密度シェルを含むタンパク質球状核酸(ProSNA)が、タンパク質送達、組み立て、及び細胞内検出における多様な生物学的用途を有する刺激的な新しいアーキテクチャとして浮上している[Brodin,J.D.;Sprangers,A.J.;McMillan,J.R.;Mirkin,C.A.DNA-Mediated Cellular Delivery of Functional Enzymes.J.Am.Chem.Soc.2015,137(47),14838-14841、Kusmierz,C.D.;Bujold,K.E.;Callmann,C.E.;Mirkin,C.A.Defining the Design Parameters for in Vivo Enzyme Delivery Through Protein Spherical Nucleic Acids.ACS Cent.Sci.2020,6(5),815-822]。オリゴヌクレオチドの高密度シェルは、それらの個々の構成要素に対するタンパク質の細胞取り込み、生理学的安定性、及び生体適合性を促進する[Giljohann,D.A.;Seferos,D.S.;Patel,P.C.;Millstone,J.E.;Rosi,N.L.;Mirkin,C.A.Oligonucleotide Loading Determines Cellular Uptake of DNA-Modified Gold Nanoparticles.Nano Lett.2007,7(12),3818-3821]。SNAのこの増強された細胞内在化は、コンジュゲートの3次元アーキテクチャ、及びほとんどの細胞の表面上のスカベンジャー受容体と係合するその能力に由来する。重要なことに、SNAの好ましい生物学的特性は、それらのタンパク質コアとは無関係であり、したがって、タンパク質送達ゲノム編集用途のために選択することができる。
最近、タンパク質コアに結合した(例えば、共有結合した)オリゴヌクレオチドの高密度シェルを含むタンパク質球状核酸(ProSNA)が、タンパク質送達、組み立て、及び細胞内検出における多様な生物学的用途を有する刺激的な新しいアーキテクチャとして浮上している[Brodin,J.D.;Sprangers,A.J.;McMillan,J.R.;Mirkin,C.A.DNA-Mediated Cellular Delivery of Functional Enzymes.J.Am.Chem.Soc.2015,137(47),14838-14841、Kusmierz,C.D.;Bujold,K.E.;Callmann,C.E.;Mirkin,C.A.Defining the Design Parameters for in Vivo Enzyme Delivery Through Protein Spherical Nucleic Acids.ACS Cent.Sci.2020,6(5),815-822]。オリゴヌクレオチドの高密度シェルは、それらの個々の構成要素に対するタンパク質の細胞取り込み、生理学的安定性、及び生体適合性を促進する[Giljohann,D.A.;Seferos,D.S.;Patel,P.C.;Millstone,J.E.;Rosi,N.L.;Mirkin,C.A.Oligonucleotide Loading Determines Cellular Uptake of DNA-Modified Gold Nanoparticles.Nano Lett.2007,7(12),3818-3821]。SNAのこの増強された細胞内在化は、コンジュゲートの3次元アーキテクチャ、及びほとんどの細胞の表面上のスカベンジャー受容体と係合するその能力に由来する。重要なことに、SNAの好ましい生物学的特性は、それらのタンパク質コアとは無関係であり、したがって、タンパク質送達ゲノム編集用途のために選択することができる。
本明細書で使用される場合、「タンパク質-コア」は、遺伝子編集タンパク質を含む。したがって、本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、本開示の遺伝子編集タンパク質は、一般に、タンパク質-コアSNA(SNA)の「コア」として機能する。タンパク質は、アミノ酸の1つ以上のポリマーを含む分子である。本開示の様々な実施形態では、タンパク質-コアは、単一のタンパク質(すなわち、アミノ酸の単一のポリマー)、多量体タンパク質、ペプチド(例えば、約2~50アミノ酸長のアミノ酸のポリマー)、又は2つ以上のタンパク質の合成融合タンパク質を含むか、若しくはそれらからなる。合成融合タンパク質には、発現された融合タンパク質(単一の遺伝子から発現される)及びタンパク質が化学的に一緒にコンジュゲートされる発現後融合物が含まれるが、これらに限定されない。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、タンパク質-コアは、遺伝子編集タンパク質を含むか、又はそれからなる。タンパク質は、当技術分野で理解されており、天然に存在するか又は天然に存在しないかのいずれかであり得る。
タンパク質-コアSNA合成。本開示は、1個以上のオリゴヌクレオチドが、リンカーを介してタンパク質-コアSNAの表面に会合し、かつ/又は結合している組成物及び方法を提供する。様々な実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、無痕跡型リンカー、又はそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、還元剤(例えば、グルタチオン(GSH)、ジチオスレイトール(DTT))又は還元環境(例えば、細胞内)に感受性である(かつそれに応答して切断される)。様々な実施形態では、切断可能なリンカーは、例えば、酸性度(例えば、低pH)、酵素(例えば、ペプチダーゼ)、光(例えば、NIRレーザー)、及び/又は加水分解などの様々な化学刺激に感受性である(かつそれに応答して切断される)。
リンカーは、タンパク質-コアを、開示されたタンパク質-コアSNA内のオリゴヌクレオチド(すなわち、タンパク質-コア-LINKER-オリゴヌクレオチド)に結合する。様々な実施形態では、単一のオリゴヌクレオチドがリンカーに結合している。更なる実施形態では、2個以上のオリゴヌクレオチド(例えば、2個、3個、又はそれ以上)が単一のリンカーに結合している。一般に、本開示によって企図されるリンカーには、本開示のProSNAにおいて単独で又は組み合わせて使用され得る以下が含まれる:アミド、チオエーテル、トリアゾール、オキシム、尿素、及びチオ尿素。いくつかの具体的に企図されるリンカーとしては、カルバメートアルキレン、カルバメートアルキレンアリールジチオレートリンカー、アミドアルキレンジチオレートリンカー、アミドアルキレンアリールジチオレートリンカー、及びアミドアルキレンスクシンイミジルリンカーが挙げられる。場合によっては、リンカーは、-NH-C(O)-O-C2-5アルキレン-S-S-C2-7アルキレン-又は-NH-C(O)-C2-5アルキレン-S-S-C2-7アルキレン-を含む。-S-S-部分に対する炭素アルファは、分岐状、例えば、-C(XA)(XB)-S-S-若しくは-S-S-C(YA)(YB)-又はそれらの組み合わせであり得、式中、XA、XB、YA、及びYBは、独立して、H、Me、Et、又はiPrである。タンパク質に対する炭素アルファは、分岐状、例えば、-C(XA)(XB)-C2-4アルキレン-S-S-であり得、式中、XA及びXBは、H、Me、Et、又はiPrである。場合によっては、リンカーは、-NH-C(O)-O-CH2-Ar-S-S-C2-7アルキレン-であり、Arは、メタ又はパラ置換フェニルである。場合によっては、リンカーは、-NH-C(O)-C2-4アルキレン-N-スクシンイミジル-S-C2-6アルキレン-である。
本開示によって企図される追加のリンカーとしては、国際特許公開第2018/213585号(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているものが挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーは、SHリンカー、SMリンカー、SEリンカー、又はSIリンカーである。本開示は、タンパク質-コア上のオリゴヌクレオチドの複数の結合点を企図する。
本開示のオリゴヌクレオチドは、タンパク質コアへの結合のために、5’末端又は3’末端のいずれかで修飾され得る。
本開示のオリゴヌクレオチドは、アルキン部分、例えば、タンパク質表面のアジドと反応するためのDBCO型部分:
を有する末端で修飾することができ、式中、Lは、ポリヌクレオチドの末端へのリンカーである。L2は、C1-10アルキレン、-C(O)-C1-10アルキレン-Y-、及び-C(O)-C1-10アルキレン-Y-C1-10アルキレン-(OCH2CH2)m-Y-であり得、式中、各Yは、独立して、結合、C(O)、O、NH、C(O)NH、及びNHC(O)からなる群から選択され、mは、0、1、2、3、4、又は5である。例えば、DBCO官能基は、
の構造を有するリンカーを介して結合され得、末端「O」はポリヌクレオチド上の末端ヌクレオチドからである。このDBCO型部分の使用は、表面アミンが修飾される場合に、ポリヌクレオチドとタンパク質との間に、
の構造をもたらし、式中、L及びL2は、それぞれ独立して、C1-10アルキレン、-C(O)-C1-10アルキレン-Y-、及び-C(O)-C1-10アルキレン-Y-C1-10アルキレン-(OCH2CH2)m-Y-から選択され、各Yは、独立して、結合、C(O)、O、NH、C(O)NH、及びNHC(O)からなる群から選択され、mは、0、1、2、3、4、又は5であり、PNは、ポリヌクレオチドである。タンパク質の表面チオール又は表面カルボキシレートが修飾される同様の構造は、同等の結合構造をもたらすように同様の方法で作製することができる。
タンパク質は、アジド官能基で終結するリンカーを用いて、表面官能基(例えば、表面アミン、表面カルボキシレート、表面チオール)で修飾することができる:タンパク質-X-L-N3(Xは、タンパク質上の表面アミノ基(例えば、-NH-)、カルボキシ基(例えば、-C(O)-若しくは-C(O)O-)、又はチオール基(例えば、-S-)からであり、Lは、C1-10アルキレン、-Y-C(O)-C1-10アルキレン-Y-、及び-Y-C(O)-C1-10アルキレン-Y-C1-10アルキレン-(OCH2CH2)m-Y-から選択され、各Yは、独立して、結合、C(O)、O、NH、C(O)NH、及びNHC(O)からなる群から選択され、mは、0、1、2、3、4、又は5である)。タンパク質の表面部分への「L-N3」官能基の導入は、周知の技術を使用して達成することができる。例えば、タンパク質の表面アミンは、末端N3を有するリンカーの活性化エステルと反応させて、タンパク質のアミンとリンカー試薬の活性化エステルのカルボキシレートとの間にアミド結合を形成することができる。
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの末端にアルキン官能基を含むように修飾することができる:オリゴヌクレオチド-L2-X-≡-R(L2は、C1-10アルキレン、
-C(O)-C1-10アルキレン-Y-、及び-C(O)-C1-10アルキレン-Y-C1-10アルキレン-(OCH2CH2)m-Y-から選択され、各Yは、独立して、結合、C(O)、O、NH、C(O)NH、及びNHC(O)からなる群から選択され、mは、0、1、2、3、4、又は5であり、Xは、結合であり、Rは、H若しくはC1-10アルキルであるか、又はX及びRは、それらが結合している炭素と一緒に、8~10員炭素環式基若しくは8~10員複素環式基を形成する)。場合によっては、ポリヌクレオチドは、構造
を有する。
-C(O)-C1-10アルキレン-Y-、及び-C(O)-C1-10アルキレン-Y-C1-10アルキレン-(OCH2CH2)m-Y-から選択され、各Yは、独立して、結合、C(O)、O、NH、C(O)NH、及びNHC(O)からなる群から選択され、mは、0、1、2、3、4、又は5であり、Xは、結合であり、Rは、H若しくはC1-10アルキルであるか、又はX及びRは、それらが結合している炭素と一緒に、8~10員炭素環式基若しくは8~10員複素環式基を形成する)。場合によっては、ポリヌクレオチドは、構造
表面修飾アジドを有するタンパク質、及びアルキンを含むように修飾された末端を有するポリヌクレオチドを一緒に反応させて、銅(II)塩及び還元剤の存在下でトリアゾール環を形成して、インサイチュで銅(I)塩を生成することができる。場合によっては、銅(I)塩を直接添加する。企図される還元剤には、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、水素化ホウ素ナトリウム、2-メルカプトエタノール、ジチオスレイトール(DTT)、ヒドラジン、水素化アルミニウムリチウム、水素化ジイソブチルアルミニウム、シュウ酸、リンドラー触媒、亜硫酸化合物、スズ化合物、鉄化合物、アマルガムナトリウム、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン、ヒドロキノン、及びそれらの混合物が含まれる。
タンパク質の表面官能基は、他の結合化学を使用してオリゴヌクレオチドに結合することができる。例えば、表面アミンは、オリゴヌクレオチドの末端でカルボキシレート又は活性化エステルに直接コンジュゲートされて、アミド結合を形成することができる。表面カルボキシレートは、オリゴヌクレオチドの末端上のアミンにコンジュゲートされて、アミド結合を形成することができる。あるいは、表面カルボキシレートをジアミンと反応させて、表面カルボキシレートでアミド結合を形成し、他の末端でアミンを形成することができる。次いで、この末端アミンは、タンパク質の表面アミンの場合と同様の方法で修飾することができる。表面チオールは、ポリヌクレオチド上のチオール部分とコンジュゲートされて、ジスルフィド結合を形成することができる。あるいは、チオールは、ポリヌクレオチドの末端上の活性化エステルとコンジュゲートされて、チオカルボキシレートを形成することができる。あるいは、チオールは、ポリヌクレオチドの末端上のマイケルアクセプター(例えば、スクシンイミド)とコンジュゲートされて、チオエーテルを形成することができる。
一般に、タンパク質-コアSNA(ProSNA)を合成するための代表的な手順は、所望の量のオリゴヌクレオチドをタンパク質の表面に結合させることを含む。結合は、2段階のプロセスを繰り返すことによって行われる:(1)タンパク質の表面へのリンカーの結合及び精製、(2)タンパク質コンジュゲートリンカーへのオリゴヌクレオチド(例えば、DNA)の結合及び精製。所望の量のオリゴヌクレオチドがタンパク質に結合するまで、これらの2つのステップを繰り返す。前述の手順は、本質的に例示的であることが理解されるであろう。
脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)
脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)は、オリゴヌクレオチドで装飾された脂質ナノ粒子コアから構成される。脂質ナノ粒子コアは、遺伝子編集タンパク質、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートを含む。オリゴヌクレオチドシェルは、脂質ナノ粒子コアの外側表面に結合した1個以上のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドシェルの球状アーキテクチャは、トランスフェクション剤とは独立したほぼ全ての細胞への侵入、ヌクレアーゼ分解に対する耐性、配列に基づく機能、標的化、及び診断を含む、従来の核酸送達方法よりも独自の利点を与える。
脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)は、オリゴヌクレオチドで装飾された脂質ナノ粒子コアから構成される。脂質ナノ粒子コアは、遺伝子編集タンパク質、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートを含む。オリゴヌクレオチドシェルは、脂質ナノ粒子コアの外側表面に結合した1個以上のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドシェルの球状アーキテクチャは、トランスフェクション剤とは独立したほぼ全ての細胞への侵入、ヌクレアーゼ分解に対する耐性、配列に基づく機能、標的化、及び診断を含む、従来の核酸送達方法よりも独自の利点を与える。
したがって、様々な態様では、本開示は、(a)脂質ナノ粒子コア、(b)脂質ナノ粒子コアの外側表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェル、及び(c)遺伝子編集タンパク質を含む脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)を提供する。したがって、LNP-SNAは、遺伝子編集タンパク質、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、ジリノレイルメチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、C12-200、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)、同様の脂質/リピドイド構造、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、リン脂質は、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジヘキサデカノイルホスファチジルコリン(DPPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、又はそれらの組み合わせである。更なる実施形態では、ステロールは、3β-ヒドロキシコレスト-5-エン(コレステロール)、9,10-セココレスタ-5,7,10(19)-トリエン-3β-オール(ビタミンD3)、9,10-セコエルゴスタ-5,7,10(19),22-テトラエン-3β-オール(ビタミンD2)、カルシポトリオール、24-エチル-5,22-コレスタジエン-3β-オール(スチグマステロール)、22,23-ジヒドロスチグマステロール(β-シトステロール)、3,28-ジヒドロキシ-ルペオール(ベツリン)、ルペオール、ウルゾール酸、オレアノール酸、24α-メチルコレステロール(カンペステロール)、24-エチルコレスタ-5,24(28)E-ジエン-3β-オール(フコステロール)、24-メチルコレスタ-5,22-ジエン-3β-オール(ブラシカステロール)、24-メチルコレスタ-5,7,22-トリエン-3β-オール(エルゴステロール)、9,11-デヒドロエルゴステロール、ダウコステロール、又は1つ以上のアミノ酸で修飾された前述のステロールのうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートは、2000ダルトン(Da)のポリエチレングリコールを含む。更なる実施形態では、脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートは、脂質-PEG-マレイミドである。なお更なる実施形態では、脂質-PEG-マレイミドは、2000Daのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた1,2-ジパルミトリル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPPE)、2000Daのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE)、又はそれらの組み合わせである。
本開示による使用が企図されるオリゴヌクレオチドには、任意の手段(例えば、共有結合又は非共有結合)を通してナノ粒子コアに結合したものが含まれる。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートへの共有結合を介して、脂質ナノ粒子コアの外部に結合している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、又は100%は、脂質-PEGコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドシェル内の1個以上のオリゴヌクレオチドは、脂質アンカー基を介して脂質ナノ粒子コアの外部に結合している。脂質アンカー基は、様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドの5’又は3’終端に結合している。様々な実施形態では、脂質アンカー基は、コレステロール又はトコフェロールである。
本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、LNP-SNAは、遺伝子編集タンパク質が脂質ナノ粒子コアに封入され、オリゴヌクレオチドのシェルが脂質ナノ粒子コアの外部に結合するように合成される。一般に、かつ一例として、脂質ナノ粒子(LNP)は、脂質及びステロールをエタノール中で希釈することによって製剤化されてもよい。
リポソーム球状核酸(LSNA)
リポソームは、親水性コアを有する1つ又はいくつかの疎水性脂質二重層を含む様々なサイズ範囲の球状の自己閉鎖構造である。これらの脂質ベースの担体の直径は、0.15~1マイクロメートルの範囲であり、これは、20~100ナノメートルの有効な治療範囲よりも顕著に大きい。小さな単層小胞(SUV)と呼ばれるリポソームは、20~50ナノメートルのサイズの範囲で合成することができるが、粒子間融合につながる不安定性及び凝集などの課題に直面する。この粒子間融合は、治療剤におけるSUVの使用を制限する。
リポソームは、親水性コアを有する1つ又はいくつかの疎水性脂質二重層を含む様々なサイズ範囲の球状の自己閉鎖構造である。これらの脂質ベースの担体の直径は、0.15~1マイクロメートルの範囲であり、これは、20~100ナノメートルの有効な治療範囲よりも顕著に大きい。小さな単層小胞(SUV)と呼ばれるリポソームは、20~50ナノメートルのサイズの範囲で合成することができるが、粒子間融合につながる不安定性及び凝集などの課題に直面する。この粒子間融合は、治療剤におけるSUVの使用を制限する。
リポソーム球状核酸(LSNA)は、その化学的に調整可能な構造、生体適合性、及びトランスフェクション試薬なしで細胞に迅速に侵入する能力により、治療的送達のための魅力的なプラットフォームである。本開示は、遺伝子編集タンパク質をLSNAに封入することによって、それらを細胞に送達するための方法を提供する。封入された遺伝子編集酵素は、酵素活性のままであり、哺乳類細胞に迅速に侵入する。これらの特性は、この新しい形態のLSNAを、遺伝子編集治療剤のための送達ビヒクルにする。
以前のSNA媒介タンパク質送達戦略は、タンパク質上のアミノ酸の化学修飾を必要とし、これは、タンパク質機能を阻害し得る。LSNAに封入されたタンパク質は、任意の化学修飾なしに細胞内に送達することができる。更に、タンパク質送達のためのカチオン性脂質媒介戦略は、アニオン性タンパク質複合体を必要とする。しかしながら、SNA媒介送達は、中性リン脂質を使用し、アニオン性タンパク質を必要としてはならない。したがって、この方法は、TALENなどの正に帯電したタンパク質の送達にも適している。
したがって、いくつかの態様では、本開示は、遺伝子編集方法における、遺伝子編集酵素(例えば、CRISPR関連タンパク質9(Cas9)(Jinek et al.,(2012)Science.816-821、Zuris et al.,Nat Biotechnol.2015 Jan;33(1):73-80(それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる))、CRISPR RNA(crRNA)、及びトランス活性化crRNA(tracrRNA)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN))及び表面官能化オリゴヌクレオチドを含む、本明細書に開示されるLSNAの使用を企図する。
したがって、本開示は、遺伝子編集タンパク質の(例えば、細胞への)インビトロ又はインビボ送達を含むが、これらに限定されない方法で使用するためのLSNAを提供する。リポソーム粒子(例えば、国際特許出願第PCT/US2014/068429号(その全体が参照により本明細書に組み込まれる、特にリポソーム粒子の考察に関して)に開示されるような)もまた、本開示によって企図される。本開示のリポソーム粒子は、少なくとも実質的に球状の形状、内側及び外側を有し、脂質二重層を含む。したがって、様々な態様では、本開示は、(a)リポソームコア、(b)リポソームコアの外側表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェル、及び(c)遺伝子編集タンパク質を含む、球状核酸(SNA)を提供する。脂質二重層は、様々な実施形態では、脂質のホスホコリンファミリー又は脂質のホスホエタノールアミンファミリーからの脂質を含む複数の脂質基を含む。本開示によって企図される脂質としては、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1,2-ジミリストイル-sn-ホスファチジルコリン(DMPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-ホスファチジルコリン(POPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1’-rac-グリセロール)(DSPG)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1’-rac-グリセロール)(DOPG)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、1,2-ジ-(9Z-オクタデセノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1’-rac-グリセロール)(DOPG)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホスホエタノールアミン(DSPE)、カルジオリピン、脂質A、それらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドは、脂質アンカー基を介してリポソームコアの外部に結合している。更なる実施形態では、脂質アンカー基は、少なくとも1個のオリゴヌクレオチドの5’終端又は3’終端に結合している。なお更なる実施形態では、脂質アンカー基は、トコフェロール又はコレステロールである。したがって、様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの少なくとも1個(又は全て)は、脂質アンカー基を含有するオリゴヌクレオチド-脂質コンジュゲートであり、該脂質アンカー基は、脂質二重層に吸着される。脂質アンカー基は、様々な実施形態では、トコフェロール、パルミトイル、ジパルミトイル、ステアリル、ジステアリル、又はコレステロールを含む。更なる態様では、本開示は、実質的に球状の形状を有し、複数の脂質基を含む脂質二重層と、リポソーム粒子に封入されたリボ核タンパク質(RNP)複合体であって、RNPが、遺伝子編集タンパク質(例えば、CRISPR関連タンパク質9(Cas9))及びガイドRNAを含む、リボ核タンパク質(RNP)複合体と、LSNAの表面上の1個以上のオリゴヌクレオチドと、を含む、LSNAを提供する。
本開示のLSNAの表面上のオリゴヌクレオチドの表面密度に関して、本明細書に記載されるLSNAが、その表面上に約1~約400個のオリゴヌクレオチドを含むことが企図される。様々な実施形態では、LSNAは、その表面上に、約10~約100、又は10~約90、又は約10~約80、又は約10~約70、又は約10~約60、又は約10~約50、又は約10~約40、又は約10~約30、又は約10~約20、又は約50~約100、又は約60~約100、又は約70~約100、又は約80~約100、又は約90~約100個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、LSNAは、その表面上に少なくとも約5個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、又は400個のオリゴヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、LSNAは、その表面上に70個のオリゴヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。SNAの追加の表面密度は、本明細書において以下に記載される。
いくつかの態様では、トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドを含むアーキテクチャが開示される。様々な実施形態では、トコフェロールは、オリゴヌクレオチド又はその修飾形態の5’終端又は3’終端にあることが企図される。トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドは、親油性終端及び非親油性終端を含む。親油性終端はトコフェロールを含み、及びトコフェロール誘導体、アルファ-トコフェロール、ベータ-トコフェロール、ガンマ-トコフェロール、及びデルタ-トコフェロールからなる群から選択され得る。更なる実施形態では、親油性終端は、パルミトイル、ジパルミトイル、ステアリル、コレステロール、又はジステアリルを含む。
更なる態様では、本開示は、コレステロール又はリン脂質が、トコフェロールの代わりに使用されることを企図する。コレステロールは固相オリゴヌクレオチド合成で結合され、調製されたリポソームと混合されてSNAを形成する。いくつかの実施形態では、95%の1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3ホスファチジルコリン(DOPC)及び5%の1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(6-アジドヘキサノイル)(DPPE-アジド)から構成されるリポソームを以下に記載するように調製する。次いで、アジド脂質と反応して表面を官能化するDBCO修飾オリゴヌクレオチドが付加される。
なお更なる態様では、リン脂質コンジュゲートオリゴヌクレオチドは、以下のように調製される。まず、DOPEなどのホスファチジルエタノールアミン脂質を、クロロホルム中に25mg/mLの脂質、1当量のSMPB、及び1当量のN,N-ジイソプロピルエチルアミンを混合することによって、スクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB)と反応させる。混合物を一晩反応させる。次に、産物をシリカカラム(溶媒A:ジクロロメタン、溶媒B:メタノール)を使用したフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。チオール修飾オリゴヌクレオチド(修飾された3’又は5’終端)を、40℃で2時間、0.2MのDTT及び0.1Mのリン酸緩衝液(pH8)で還元する。次いで、オリゴヌクレオチドを、水を使用してサイズ排除カラムで精製する。ホスファチジルエタノールアミン-SMPB脂質を窒素ガス上で乾燥させ、オリゴヌクレオチドと同じ体積でエタノールに溶解させる。次いで、オリゴヌクレオチドを、反応が50:50の水及びエタノールであるように脂質と混合する。この混合物を一晩反応させ、過剰な脂質を、反応混合物をクロロホルムで3回洗浄することによって抽出する。次に、水相及び界面を乾燥させ、水に溶解させる。本明細書に開示される全ての脂質コンジュゲートオリゴヌクレオチドは、LSNAの調製において互換的に使用されることが企図される。トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドの非親油性終端は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドである。
脂質アンカーを含むオリゴヌクレオチドを作製する方法が、本明細書に開示される。例えば、最初に、オリゴヌクレオチド及びホスホラミダイト修飾トコフェロールが提供される。次いで、オリゴヌクレオチドをホスホラミダイト修飾トコフェロールに曝露して、トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドを作製する。限定することを意図するものではないが、当業者に既知の任意の化学を使用して、アミド結合又はクリックケミストリーを含む、トコフェロール(又は任意の脂質アンカー)をオリゴヌクレオチドに結合させることができる。
本開示はまた、LSNAを作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、リン脂質、溶媒、及びトコフェロール修飾オリゴヌクレオチドが提供される。次いで、リン脂質を溶媒に添加して、リポソームを含む第1の混合物を形成する。第1の混合物中のリポソームのサイズは、約100ナノメートル~約150ナノメートルである。次に、リポソームを破壊して、リポソーム及び小さな単層小胞(SUV)を含む第2の混合物を作製する。第2の混合物中のリポソーム及びSUVのサイズは、約20ナノメートル~約150ナノメートルである。次に、約20ナノメートル~約50ナノメートルの粒子サイズを有するSUVを第2の混合物から単離する。最後に、トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドを、単離されたSUVに添加して、リポソーム粒子を作製する。様々な実施形態では、本開示の方法によって作製されるLSNAの直径は、約50ナノメートル以下である。いくつかの実施形態では、複数のLSNAが産生され、複数の中の粒子は、約50ナノメートル以下(例えば、約5ナノメートル~約50ナノメートル、又は約5ナノメートル~約40ナノメートル、又は約5ナノメートル~約30ナノメートル、又は約5ナノメートル~約20ナノメートル、又は約10ナノメートル~約50ナノメートル、又は約10ナノメートル~約40ナノメートル、又は約10ナノメートル~約30ナノメートル、又は約10ナノメートル~約20ナノメートル)の平均直径を有する。更なる実施形態では、本開示の方法によって作製される複数のLSNA内の粒子は、約20ナノメートル以下、又は約25ナノメートル以下、又は約30ナノメートル以下、又は約35ナノメートル以下、又は約40ナノメートル以下、又は約45ナノメートル以下の平均直径を有する。
いくつかの態様では、方法は、(1)1×PBSを添加して、脂質を1~25mg/mLの最終濃度まで乾燥させる(したがって、様々な実施形態では、最終濃度は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25mg/mlである)、(2)3回、液体窒素中で急速に凍結させ、バスソニケーターで解凍させる、(3)200、100、80、50、及び30nmフィルターを通して押し出す。二重フィルターが使用され、典型的には各フィルターに2~10回通過させる。いくつかの実施形態では、プロセスは50nmで停止されるが、30nmの構造が所望される場合、30nmのフィルターが更に追加される。更なる態様では、30nmのリポソームが所望される場合、1つのプローブが、ステップ(2)の後に超音波処理される。次に、リポソームを21000×gで10分間遠心分離して、超音波処理で剥がれる金属切粉を除去し、混合物を、ステップ(3)に記載されるように、30nmのフィルターを通して押し出す。
したがって、いくつかの態様では、本開示は、リン脂質を溶媒に添加して第1の混合物を形成することであって、該第1の混合物が複数のリポソームを含む、形成することと、該複数のリポソームを破壊して第2の混合物を作製することであって、該第2の混合物が、リポソーム及び小さな単層小胞(SUV)を含む、作製することと、該SUVを該第2の混合物から単離することであって、該SUVが、約20ナノメートル~50ナノメートルの粒子サイズを有する、単離することと、オリゴヌクレオチド又は複数のオリゴヌクレオチドを単離したSUVに添加して、LSNAを作製することと、を含む、LSNAを作製する方法を提供する。
オリゴヌクレオチド
本開示は、ナノ粒子コアと、ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、球状核酸(例えば、ProSNA、LSNAS、LNP-SNA)を提供する。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、阻害性オリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、標的化オリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、ナノ粒子コアは、封入された遺伝子編集タンパク質を含む。様々な実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドには、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、それらの修飾形態、又はそれらの組み合わせが含まれる。本明細書に記載の任意の態様又は実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖である。本開示の任意の態様又は実施形態では、オリゴヌクレオチドは、検出可能なマーカーを含む。
本開示は、ナノ粒子コアと、ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、球状核酸(例えば、ProSNA、LSNAS、LNP-SNA)を提供する。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、阻害性オリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、標的化オリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、ナノ粒子コアは、封入された遺伝子編集タンパク質を含む。様々な実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドには、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、それらの修飾形態、又はそれらの組み合わせが含まれる。本明細書に記載の任意の態様又は実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖である。本開示の任意の態様又は実施形態では、オリゴヌクレオチドは、検出可能なマーカーを含む。
本明細書に記載されるように、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間結合を有するものを含む、オリゴヌクレオチドの修飾形態もまた、本開示によって企図される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、全て又は部分的にペプチド核酸である。他の修飾ヌクレオシド間結合は、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含む。更に他の修飾オリゴヌクレオチドとしては、1つ以上のユニバーサル塩基を含むものが挙げられる。「ユニバーサル塩基」とは、著しい構造不安定化を伴わずに水素結合を形成することによって、核酸中のA、C、G、T及びUのうちのいずれか1つへの結合を置き換えることができる分子を指す。ユニバーサル塩基類似体と組み込まれたオリゴヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションにおけるプローブとして機能することができる。ユニバーサル塩基の例には、5’-ニトロインドール-2’-デオキシリボシド、3-ニトロピロール、イノシン、及びヒポキサンチンが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語又はその複数形は、本明細書で論じられ、それ以外は当技術分野で知られている変形形態と交換可能である。本明細書で使用される「核酸塩基」という用語又はその複数形は、本明細書で論じられ、それ以外は当技術分野で知られている変形形態と交換可能である。ヌクレオチド又は核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基A、G、C、T、及びUを含む。天然に存在しない核酸塩基には、例えば、限定されないが、キサンチン、ジアミノプリン、8-オキソ-N6-メチルアデニン、7-デアザキサンチン、7-デアザグアニン、N4,N4-エタノシトシン、N’,N’-エタノ-2,6-ジアミノプリン、5-メチルシトシン(mC)、5-(C3-C6)-アルキニル-シトシン、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、2-ヒドロキシ-5-メチル-4-トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、並びにBenner et al.、米国特許第5,432,272号及びSusan M.Freier and Karl-Heinz Altmann,1997,Nucleic Acids Research,vol.25:pp4429-4443に記載の「天然に存在しない」核酸塩基が挙げられる。「核酸塩基」という用語には、既知のプリン及びピリミジン複素環だけでなく、その複素環類似体及び互変異性体も含まれる。更に、天然に存在する及び天然に存在しない核酸塩基には、米国特許第3,687,808号(Merigan, et al.)、Antisense Research and Application,Ed.S.T.Crooke and B.Lebleu,CRC Press,1993、Englisch et al.,1991,Angewandte Chemie,International Edition,30:613-722におけるSanghviによる第15章において、開示されているものが挙げられる(特に頁622及び623、かつConcise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,J.I.Kroschwitz Ed.,John Wiley & Sons,1990,pages 858-859、Cook,Anti-Cancer Drug Design 1991,6,585-607において参照されたく、これらの各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる)。様々な態様では、オリゴヌクレオチドは、最も古典的な意味でのヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能する、特定の「ユニバーサル塩基」を含む核酸塩基のように機能し得る複素環式化合物などの化合物を含む天然に存在しないヌクレオチドのカテゴリーである1つ以上の「ヌクレオシド塩基」又は「塩基単位」も含む。ユニバーサル塩基には、3-ニトロピロール、任意選択で置換されたインドール(例えば、5-ニトロインドール)、及び任意選択で置換されたヒポキサンチンが含まれる。他の望ましいユニバーサル塩基には、当該技術分野において既知のユニバーサル塩基を含む、ピロール、ジアゾール、又はトリアゾール誘導体が挙げられる。
オリゴヌクレオチドの例には、修飾された骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含有するものが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格にリン原子を有するもの及び骨格にリン原子を有さないものが含まれる。ヌクレオシド間骨格にリン原子を有していない修飾オリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」の意味の範囲内であるとみなされる。
リン原子を含む修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホトリエステル、3’-アルキレンホスホネート、5’-アルキレンホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスネート、ホスフィネート、3’-アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及び正常な3’-5’結合を有するボラノホスフェート、これらの2’-5’結合類似体、並びに1つ以上のヌクレオチド間結合が3’-3’、5’-5’又は2’-2’結合である逆向きの極性を有するものが挙げられる。最も3’側のヌクレオチド間結合にあるただ1つの3’-3’結合を含む、すなわち、塩基がない(ヌクレオチドがない、若しくはその場所に水酸基を有する)場合があるただ1つの逆向きのヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドも企図される。塩、混合塩、及び遊離酸形態も企図される。上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第3,687,808号、同第4,469,863号、同第4,476,301号、同第5,023,243号、同第5,177,196号、同第5,188,897号、同第5,264,423号、同第5,276,019号、同第5,278,302号、同第5,286,717号、同第5,321,131号、同第5,399,676号、同第5,405,939号、同第5,453,496号、同第5,455,233号、同第5,466,677号、同第5,476,925号、同第5,519,126号、同第5,536,821号、同第5,541,306号、同第5,550,111号、同第5,563,253号、同第5,571,799号、同第5,587,361号、同第5,194,599号、同第5,565,555号、同第5,527,899号、同第5,721,218号、同第5,672,697号及び同第5,625,050号が挙げられ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキル若しくはシクロアルキルとが混合されたヌクレオシド間結合、又は1つ以上の短鎖のヘテロ原子若しくは複素環のヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合を有する骨格;シロキサン骨格;スルフィド、スルフォキシド及びスルホン骨格;ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格;メチレンホルムアセチル及びメチレンチオホルムアセチル骨格;リボアセチル骨格;アルケン含有骨格;スルファミン酸骨格;メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格;スルホン酸及びスルホンアミド骨格;アミド骨格;並びにN、O、S及びCH2構成要素部分が混在するその他の骨格がある。例えば、米国特許第5,034,506号、同第5,166,315号、同第5,185,444号、同第5,214,134号、同第5,216,141号、同第5,235,033号、同第5,264,562号、同第5,264,564号、同第5,405,938号、同第5,434,257号、同第5,466,677号、同第5,470,967号、同第5,489,677号、同第5,541,307号、同第5,561,225号、同第5,596,086号、同第5,602,240号、同第5,610,289号、同第5,602,240号、同第5,608,046号、同第5,610,289号、同第5,618,704号、同第5,623,070号、同第5,663,312号、同第5,633,360号、同第5,677,437号、同第5,792,608号、同第5,646,269号及び同第5,677,439号を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
なお更なる実施形態では、1つ以上の糖及び/又はヌクレオチド単位の1つ以上のヌクレオチド間結合の両方が「天然に存在しない」基で置き換えられている、オリゴヌクレオチド模倣物がある。オリゴヌクレオチドの塩基は、ハイブリダイゼーションのために維持される。いくつかの態様では、この実施形態は、ペプチド核酸(PNA)を企図する。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格で置き換えられる。例えば、米国特許第5,539,082号、同第5,714,331号、及び同第5,719,262号、並びにNielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
なお更なる実施形態では、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドが提供され、米国特許第5,489,677号及び同第5,602,240号に記載の-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-、及び-O-N(CH3)-CH2-CH2-を含む。米国特許第5,034,506号に記載のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも企図される。
様々な形態では、オリゴヌクレオチド中の2つの連続する単量体間の結合は、-CH2-、-O-、-S-、-NRH-、>C=O、>C=NRH、>C=S、-Si(R’’)2-、-SO-、-S(O)2-、-P(O)2-、-PO(BH3)-、-P(O,S)-、-P(S)2-、-PO(R’’)-、-PO(OCH3)-、及び-PO(NHRH)から選択される2~4個の、望ましくは3個の基/原子からなり、式中、RHは、水素及びC1-4-アルキルから選択され、R’’は、C1-6-アルキル及びフェニルから選択される。そのような結合の例示的な例は、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CHOH-CH2-、-O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH=(後続単量体への結合として使用される場合、R5を含む)、-CH2-CH2-O-、-NRH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NRH-、-CH2-NRH-CH2--、-O-CH2-CH2-NRH-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-NRH-CS-NRH-、-NRH-C(=NRH)-NRH-、-NRH-CO-CH2-NRH-O-CO-O-、-O-CO-CH2-O-、-O-CH2-CO-O-、-CH2-CO-NRH-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CH=N-O-、-CH2-NRH-O-、-CH2-O-N=(後続単量体への結合として使用される場合、R5を含む)、-CH2-O-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-O-、-CH2-NRH-CO-、-O-NRH-CH2-、-O-NRH、-O-CH2-S-、-S-CH2-O-、-CH2-CH2-S-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH=(後続単量体への結合として使用される場合、R5を含む)、-S-CH2-CH2-、-S-CH2-CH2--O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S-CH2-、-CH2-SO-CH2-、-CH2-SO2-CH2-、-O-SO-O-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-NRH-、-NRH-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-CH2-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O、S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O、S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O、S)-S-、-O-P(S)2-S-、-S-P(O)2-S-、-S-P(O、S)-S-、-S-P(S)2-S-、-O-PO(R’’)-O-、-O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(OCH2CH3)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRN)-O-、-O-P(O)2-NRHH-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O、NRH)-O-、-CH2-P(O)2-O-、-O-P(O)2-CH2-、及び-O-Si(R’’)2-O-であり、その中でも、-CH2-CO-NRH-、-CH2-NRH-O-、-S-CH2-O-、-O-P(O)2-O-O-P(-O、S)-O-、-O-P(S)2-O-、-NRHP(O)2-O-、-O-P(O、NRH)-O-、-O-PO(R’’)-O-、-O-PO(CH3)-O-、及び-O-PO(NHRN)-O-であり、式中、RHは、水素及びC1-4-アルキルから選択され、R’’は、C1-6-アルキル及びフェニルから選択される。更なる例示は、Mesmaeker et.al.,Current Opinion in Structural Biology 1995,5,343-355及びSusan M.Freier and Karl-Heinz Altmann,Nucleic Acids Research,1997,vol 25,pp 4429-4443に提供されている。
オリゴヌクレオチドのなお他の修飾形態は、米国特許出願第2004/0219565号に詳細に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
修飾オリゴヌクレオチドはまた、1つ以上の置換糖部分を含有してもよい。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、以下のうちの1つを2’位に含み:OH;F;O-、S-、若しくはN-アルキル;O-、S-、若しくはN-アルケニル;O-、S-、若しくはN-アルキニル;又はO-アルキル-O-アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は非置換のC1~C10アルキル又はC2~C10アルケニル及びアルキニルであり得る。他の実施形態には、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、及びO(CH2)nON[(CH2)nCH3]2が含まれ、式中、n及びmは、1~約10である。他のオリゴヌクレオチドは、2’位に以下のうちの1つを含む:C1~C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリル又はO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、又はRNA切断基。一態様では、修飾には、2’-メトキシエトキシ(2’-O-(2-メトキシエチル)又は2’-MOEとしても知られる、2’-O-CH2CH2OCH3)(Martin et al.Helv.Chim.Acta199578486-504)、すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。他の修飾には、2’-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、2’-DMAOEとしても知られるO(CH2)2ON(CH3)2基、及び2’-ジメチルアミノエトキシエトキシ(当該技術分野において、2’-O-ジメチル-アミノ-エトキシ-エチル又は2’-DMAEOEとしても知られる)、すなわち、2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2が挙げられる。
更に他の修飾には、2’-メトキシ(2’-O-CH3)、2’-アミノプロポキシ(2’-OCH2CH2CH2NH2)、2’-アリル(2’-CH2-CH=CH2)、2’-O-アリル(2’-O-CH2-CH=CH2)、及び2’-フルオロ(2’-F)が挙げられる。2’修飾は、アラビノ(上)位又はリボ(下)位にあってもよい。一態様では、2’-アラビノ修飾は2’-Fである。同様の修飾はまた、オリゴヌクレオチドの他の位置、例えば、3’末端ヌクレオチド上の糖の3’位、又は2’-5’結合オリゴヌクレオチド中、及び5’末端ヌクレオチドの5’位で行ってもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有していてもよい。例えば、米国特許第4,981,957号、同第5,118,800号、同第5,319,080号、同第5,359,044号、同第5,393,878号、同第5,446,137号、同第5,466,786号、同第5,514,785号、同第5,519,134号、同第5,567,811号、同第5,576,427号、同第5,591,722号、同第5,597,909号、同第5,610,300号、同第5,627,053号、同第5,639,873号、同第5,646,265号、同第5,658,873号、同第5,670,633号、同第5,792,747号、及び同第5,700,920号を参照されたく、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、糖の修飾には、2’-ヒドロキシル基が糖環の3’又は4’炭素原子に結合し、それにより、二環式糖部分を形成する、ロックド核酸(LNA)が含まれる。特定の態様では、結合は、2’酸素原子と4’炭素原子とを架橋するメチレン(-CH2-)nであり、式中、nは1又は2である。LNA及びその調製は、WO98/39352及びWO99/14226に記載されている。
修飾ヌクレオチドは、EP1072679及びWO97/12896に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。修飾核酸塩基には、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-メチル並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、2-プロピル並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン、及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニルウラシル及びシトシン、並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル並びに他の8-置換アデニン及びグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチル並びに他の5-置換ウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン及び7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニン及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン及び7-デアザアデニン、並びに3-デアザグアニン及び3-デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。更なる修飾塩基には、三環系のピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン)、フェノチアジンシチジン(1H-ピリミド[5,4‐b][1,4]ベンゾチアジン-2(3H)-オン)、置換フェノキサジンシチジン(例えば9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾキサジン‐2(3H)-オン)のようなG-クランプ(G‐clamp)、カルバゾールシチジン(2H-ピリミド[4,5-b]インドール-2-オン)、ピリドインドールシチジン(H-ピリド[3’,2’:4,5]ピロロ[2,3-d]ピリミジン‐2‐オン)が挙げられる。修飾塩基には、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環、例えば、7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジン、及び2-ピリドンで置き換えられたものも含まれ得る。追加の核酸塩基には、米国特許第3,687,808号に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley & Sons1990に開示されているもの、Englisch et al.,1991Angewandte Chemie,International Edition,30:613に開示されているもの、及びSanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,ed.,CRC Press,1993に開示されているものが含まれる。これらの塩基のいくつかは、結合親和性を高めるのに有用であり、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、並びにN-2、N-6、及びO-6置換プリンを含み、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、及び5-プロピニルシトシンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6~1.2℃上昇させることが示されており、特定の態様では、2’-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。米国特許第3,687,808号、米国特許第4,845,205号、同第5,130,302号、同第5,134,066号、同第5,175,273号、同第5,367,066号、同第5,432,272号、同第5,457,187号、同第5,459,255号、同第5,484,908号、同第5,502,177号、同第5,525,711号、同第5,552,540号、同第5,587,469号、同第5,594,121号、同第5,596,091号、同第5,614,617号、同第5,645,985号、同第5,830,653号、同第5,763,588号、同第6,005,096号、同第5,750,692号及び同第5,681,941号を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
所定の配列のポリヌクレオチドを作製する方法は周知である。例えば、Sambrook et al.Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed.1989)及びF.Eckstein(ed.)Oligonucleotides and Analogues,1st Ed.(Oxford University Press,New York,1991)を参照されたい。固相合成法は、ポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドの両方に適している(DNA合成の周知の方法は、RNA合成にも有用である)。ポリリボヌクレオチドは酵素的に調製することもできる。天然に存在しない核酸塩基もポリヌクレオチドに組み込むことができる。例えば、米国特許第7,223,833号、Katz,J.Am.Chem.Soc.,74:2238(1951)、Yamane,et al.,J.Am.Chem.Soc.,83:2599(1961)、Kosturko,et al.,Biochemistry,13:3949(1974)、Thomas,J.Am.Chem.Soc.,76:6032(1954)、Zhang,et al.,J.Am.Chem.Soc.,127:74-75(2005)、及びZimmermann,et al.,J.Am.Chem.Soc.,124:13684-13685(2002)を参照されたい。
様々な態様では、本開示のオリゴヌクレオチド又はその修飾形態は、一般に、約5ヌクレオチド長~約100ヌクレオチド長である。より具体的には、本開示のオリゴヌクレオチドは、約5~約90ヌクレオチド長、約5~約80ヌクレオチド長、約5~約70ヌクレオチド長、約5~約60ヌクレオチド長、約5~約50ヌクレオチド長約5~約45ヌクレオチド長、約5~約40ヌクレオチド長、約5~約35ヌクレオチド長、約5~約30ヌクレオチド長、約5~約25ヌクレオチド長、約5~約20ヌクレオチド長、約5~約15ヌクレオチド長、約5~約10ヌクレオチド長、約10~約100ヌクレオチド長、約10~約90ヌクレオチド長、約10~約80ヌクレオチド長、約10~約70ヌクレオチド長、約10~約60ヌクレオチド長、約10~約50ヌクレオチド長約10~約45ヌクレオチド長、約10~約40ヌクレオチド長、約10~約35ヌクレオチド長、約10~約30ヌクレオチド長、約10~約25ヌクレオチド長、約10~約20ヌクレオチド長、約10~約15ヌクレオチド長、約18~約28ヌクレオチド長、約15~約26ヌクレオチド長、及びオリゴヌクレオチドが所望の結果を達成できる程度に、具体的に開示されたサイズの中間にある全てのオリゴヌクレオチド長である。更なる実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、約5~約100ヌクレオチド長、約5~約90ヌクレオチド長、約5~約80ヌクレオチド長、約5~約70ヌクレオチド長、約5~約60ヌクレオチド長、約5~約50ヌクレオチド長、約5~約40ヌクレオチド長、約5~約30ヌクレオチド長、約5~約20ヌクレオチド長、約5~約10ヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチドが所望の結果を達成できる程度に具体的に開示されたサイズの中間にある全てのオリゴヌクレオチド長である。したがって、様々な実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100以上のヌクレオチド長であるか、又は少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100以上のヌクレオチド長である。更なる実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100以上少ないヌクレオチド長である。様々な実施形態では、SNAのナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、全てが同じ長さ/配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含み、いくつかの実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、複数の中の少なくとも1個の他のオリゴヌクレオチドに対して異なる長さ及び/又は配列を有する1個以上のオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、ナノ粒子コアは、その中に封入された1個以上のオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドは、アプタマーである。したがって、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの全ての特徴及び態様(例えば、長さ、タイプ(DNA、RNA、それらの修飾形態)、スペーサーの任意の存在)は、アプタマーにも適用される。アプタマーは、目的の様々な標的分析物に結合するように進化させることができるオリゴヌクレオチド配列である。アプタマーは、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖であってもよい。
本明細書に記載の検出可能なマーカー(例えば、フルオロフォア、放射性標識)及び治療剤(例えば、抗体)をオリゴヌクレオチドに結合させる方法は、当技術分野において既知である。
スペーサー。いくつかの態様及び実施形態では、SNAのナノ粒子コアに結合するオリゴヌクレオチドのシェル内の1個以上のオリゴヌクレオチドは、スペーサーを含む。本明細書で使用される場合、「スペーサー」は、ナノ粒子コアとオリゴヌクレオチドとの間の距離を増加させる、又は複数のコピーでナノ粒子コアに結合したときに個々のオリゴヌクレオチド間の距離を増加させる、又はSNAの合成を向上させる役割を果たす部分を意味する。したがって、スペーサーは、オリゴヌクレオチドとナノ粒子コアとの間に位置することが企図される。
いくつかの態様では、スペーサーは、存在する場合、有機部分である。いくつかの態様では、スペーサーは、水溶性ポリマー、核酸、ポリペプチド、オリゴ糖、炭水化物、脂質、エチルグリコール、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されないポリマーである。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、スペーサーは、オリゴ(エチレングリコール)ベースのスペーサーである。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、1、2、3、4、5、又はそれ以上のスペーサー(例えば、スペーサー-18(ヘキサエチレングリコール))部分を含む。更なる実施形態では、スペーサーはアルカン系スペーサー(例えば、C12)である。いくつかの実施形態では、スペーサーはオリゴヌクレオチドスペーサー(例えば、T5)である。オリゴヌクレオチドスペーサーは、ナノ粒子コア又は標的に結合するようになるオリゴヌクレオチドの能力を妨害しない任意の配列を有し得る。特定の態様では、オリゴヌクレオチドスペーサーの塩基は、全てのアデニル酸、全てのチミジル酸、全てのシチジル酸、全てのグアニル酸、全てのウリジル酸、又は全ての他のいくつかの修飾塩基である。
様々な実施形態では、スペーサーの長さは、少なくとも約2ヌクレオチド、少なくとも約3ヌクレオチド、少なくとも約4ヌクレオチド、少なくとも約5ヌクレオチド、5~10ヌクレオチド、10ヌクレオチド、10~30ヌクレオチド、又は更には30ヌクレオチド超であるか、又はそれらに等しい。
SNA表面密度。一般に、少なくとも約2pモル/cm2のオリゴヌクレオチド表面密度が、安定なSNAを提供するのに適当である。いくつかの態様では、本開示のSNA(例えば、ProSNA、LSNA、LNP-SNA)の表面密度は、少なくとも15pモル/cm2である。また、オリゴヌクレオチドが、約2pmol/cm2~約200pmol/cm2、又は約10pmol/cm2~約100pmol/cm2の表面密度でSNAのナノ粒子コアに結合される方法も提供される。更なる実施形態では、表面密度は、少なくとも約2pmol/cm2、少なくとも3pmol/cm2、少なくとも4pmol/cm2、少なくとも5pmol/cm2、少なくとも6pmol/cm2、少なくとも7pmol/cm2、少なくとも8pmol/cm2、少なくとも9pmol/cm2、少なくとも10pmol/cm2、少なくとも約15pmol/cm2、少なくとも約19pmol/cm2、少なくとも約20pmol/cm2、少なくとも約25pmol/cm2、少なくとも約30pmol/cm2、少なくとも約35pmol/cm2、少なくとも約40pmol/cm2、少なくとも約45pmol/cm2、少なくとも約50pmol/cm2、少なくとも約55pmol/cm2、少なくとも約60pmol/cm2、少なくとも約65pmol/cm2、少なくとも約70pmol/cm2、少なくとも約75pmol/cm2、少なくとも約80pmol/cm2、少なくとも約85pmol/cm2、少なくとも約90pmol/cm2、少なくとも約95pmol/cm2、少なくとも約100pmol/cm2、少なくとも約125pmol/cm2、少なくとも約150pmol/cm2、少なくとも約175pmol/cm2、少なくとも約200pmol/cm2、少なくとも約250pmol/cm2、少なくとも約300pmol/cm2、少なくとも約350pmol/cm2、少なくとも約400pmol/cm2、少なくとも約450pmol/cm2、少なくとも約500pmol/cm2、少なくとも約550pmol/cm2、少なくとも約600pmol/cm2、少なくとも約650pmol/cm2、少なくとも約700pmol/cm2、少なくとも約750pmol/cm2、少なくとも約800pmol/cm2、少なくとも約850pmol/cm2、少なくとも約900pmol/cm2、少なくとも約950pmol/cm2、少なくとも約1000pmol/cm2以上である。更なる実施形態では、表面密度は、約2pmol/cm2未満、約3pmol/cm2未満、約4pmol/cm2未満、約5pmol/cm2未満、約6pmol/cm2未満、約7pmol/cm2未満、約8pmol/cm2未満、約9pmol/cm2未満、約10pmol/cm2未満、約15pmol/cm2未満、約19pmol/cm2未満、約20pmol/cm2未満、約25pmol/cm2未満、約30pmol/cm2未満、約35pmol/cm2未満、約40pmol/cm2未満、約45pmol/cm2未満、約50pmol/cm2未満、約55pmol/cm2未満、約60pmol/cm2未満、約65pmol/cm2未満、約70pmol/cm2未満、約75pmol/cm2未満、約80pmol/cm2未満、約85pmol/cm2未満、約90pmol/cm2未満、約95pmol/cm2未満、約100pmol/cm2未満、約125pmol/cm2未満、約150pmol/cm2未満、約175pmol/cm2未満、約200pmol/cm2未満、約250pmol/cm2未満、約300pmol/cm2未満、約350pmol/cm2未満、約400pmol/cm2未満、約450pmol/cm2未満、約500pmol/cm2未満、約550pmol/cm2未満、約600pmol/cm2未満、約650pmol/cm2未満、約700pmol/cm2未満、約750pmol/cm2未満、約800pmol/cm2未満、約850pmol/cm2未満、約900pmol/cm2未満、約950pmol/cm2未満、又は約1000pmol/cm2未満である。
あるいは、SNAに結合したオリゴヌクレオチドの密度を、SNAに結合したオリゴヌクレオチドの数によって測定する。本開示のSNAに結合したオリゴヌクレオチドの表面密度に関して、本明細書に記載されるSNAが、その表面上に約1~約2,500個又は約1~約500個のオリゴヌクレオチドを含むことが企図される。様々な実施形態では、SNAは、ナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に、約10~約500個、又は約10~約300個、又は約10~約200個、又は約10~約190個、又は約10~約180個、又は約10~約170個、又は約10~約160個、又は約10~約150個、又は約10~約140個、又は約10~約130個、又は約10~約120個、又は約10~約110個、又は約10~約100個、又は10~約90個、又は約10~約80個、又は約10~約70個、又は約10~約60個、又は約10~約50個、又は約10~約40個、又は約10~約30個、又は約10~約20個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、SNAは、ナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に、約80~約140個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、SNAは、ナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に、少なくとも約5、10、20、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、又は200個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、SNAは、ナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェル内の5、10、20、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、又は200個のオリゴヌクレオチドからなる。なお更なる実施形態では、SNAのナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、SNAのナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個以上のオリゴヌクレオチドからなる。
組成物
本開示はまた、本開示のSNA、又はその複数を含む組成物を提供する。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、組成物は、ガイドRNAを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。「担体」という用語は、本明細書に記載されるSNAが対象に投与されるビヒクルを指す。本開示によるSNAと互換性のある任意の従来の媒体又は薬剤を使用することができる。担体という用語は、希釈剤、賦形剤、補助剤、及びそれらの組み合わせを包含する。薬学的に許容される担体は、当技術分野でよく知られている(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences by Martin,1975(その全体の開示は、参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい)。
本開示はまた、本開示のSNA、又はその複数を含む組成物を提供する。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、組成物は、ガイドRNAを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。「担体」という用語は、本明細書に記載されるSNAが対象に投与されるビヒクルを指す。本開示によるSNAと互換性のある任意の従来の媒体又は薬剤を使用することができる。担体という用語は、希釈剤、賦形剤、補助剤、及びそれらの組み合わせを包含する。薬学的に許容される担体は、当技術分野でよく知られている(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences by Martin,1975(その全体の開示は、参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい)。
例示的な「希釈剤」には、注射用水、生理食塩水、Tris、酢酸塩、クエン酸塩、若しくはリン酸塩などの緩衝液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒が含まれる。例示的な「賦形剤」には、アミノ酸及びアミノ酸誘導体、ポリエチレングリコール及びポリエチレングリコール誘導体、ポリオール、酸、アミン、多糖又は多糖誘導体、塩、及び界面活性剤などの安定剤、並びにpH調整剤が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明で提供されるSNAは、アジュバントとして免疫刺激性オリゴヌクレオチド(例えば、及び限定されないが、CpGオリゴヌクレオチド)を含む。当技術分野で知られている他のアジュバントも、本開示の組成物に使用することができる。例えば、アジュバントは、アルミニウム又はその塩、鉱物油、フロイントアジュバント、植物油、油中水型エマルション、鉱物塩、小分子(例えば、イミキモド、レシキモド)、細菌構成要素(例えば、フラゲリン、モノホスホリル脂質A)、又はそれらの組み合わせであり得る。
遺伝子調節におけるSNAの使用
本開示のいくつかの態様では、SNA(例えば、ProSNA、LNP-SNA、LSNA)に関連するオリゴヌクレオチドは、遺伝子の発現を阻害する。遺伝子産物の発現を阻害する方法には、標的遺伝子産物の発現が、SNAの不在下での遺伝子産物の発現と比較して、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、又は100%阻害されるものが含まれる。言い換えれば、提供される方法は、本質的に標的遺伝子産物の発現のあらゆる程度の阻害をもたらすものを包含する。
本開示のいくつかの態様では、SNA(例えば、ProSNA、LNP-SNA、LSNA)に関連するオリゴヌクレオチドは、遺伝子の発現を阻害する。遺伝子産物の発現を阻害する方法には、標的遺伝子産物の発現が、SNAの不在下での遺伝子産物の発現と比較して、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、又は100%阻害されるものが含まれる。言い換えれば、提供される方法は、本質的に標的遺伝子産物の発現のあらゆる程度の阻害をもたらすものを包含する。
阻害の程度は、体液試料若しくは生検試料から、又は当技術分野において周知の画像化技術により、インビボで決定される。あるいは、阻害の程度は、一般に、特定の種類のSNA及び特定のオリゴヌクレオチドの使用から生じるインビボで予想され得る阻害の程度の予測可能な尺度として、細胞培養アッセイにおいて決定される。
本開示のいくつかの態様では、SNAが、遺伝子阻害機能及び薬剤送達機能の両方を果たすことが企図される。そのような態様では、薬剤(例えば、治療剤)は、SNAと会合し、粒子は、標的遺伝子発現の阻害をもたらすように設計された1個以上のオリゴヌクレオチドで追加的に官能化される。
様々な態様では、方法は、標的オリゴヌクレオチドに100%相補的である、すなわち完全に一致するが、他の態様では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さにわたってポリヌクレオチドに少なくとも(以上を意味する)約95%相補的、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子産物の所望の阻害を達成できる程度にオリゴヌクレオチドの長さにわたってポリヌクレオチドに少なくとも約90%、少なくとも約85%、少なくとも約80%、少なくとも約75%、少なくとも約70%、少なくとも約65%、少なくとも約60%、少なくとも約55%、少なくとも約50%、少なくとも約45%、少なくとも約40%、少なくとも約35%、少なくとも約30%、少なくとも約25%、少なくとも約20%相補的である、オリゴヌクレオチドの使用を含む。
当技術分野では、特異的にハイブリダイズ可能であるために、アンチセンス化合物の配列は、その標的核酸の配列と100%相補的である必要はないことが理解される。更に、オリゴヌクレオチドは、介在又は隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、1つ以上のセグメント上でハイブリダイズし得る(例えば、ループ構造又はヘアピン構造)。相補性パーセントは、オリゴヌクレオチドの長さにわたって決定される。例えば、アンチセンス化合物の20ヌクレオチドのうち18ヌクレオチドが全長100ヌクレオチドの標的オリゴヌクレオチドの20ヌクレオチド領域に相補的であるアンチセンス化合物を考えると、オリゴヌクレオチドは90パーセント相補的であろう。この例では、残りの非相補的ヌクレオチドは、クラスター化されるか又は相補的ヌクレオチドが散在していてもよく、互いに又は相補的核酸塩基に隣接する必要はない。アンチセンス化合物の標的核酸の領域との相補性パーセントは、当技術分野で知られているBLASTプログラム(基本的なローカルアライメント検索ツール)及びPowerBLASTプログラム(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,1990215,403-410、Zhang and Madden,Genome Res.,1997,7,649-656)を使用して日常的に決定することができる。
そのような方法で利用されるオリゴヌクレオチドは、RNA又はDNAのいずれかである。RNAは、調節機能を果たす阻害性RNA(RNAi)などの阻害性オリゴヌクレオチドであってもよく、様々な実施形態では、小阻害性RNA(siRNA)、一本鎖RNA(ssRNA)、及びリボザイムからなる群から選択される。あるいは、RNAは、調節機能を果たすマイクロRNAである。DNAは、いくつかの実施形態では、アンチセンス-DNAである。いくつかの実施形態では、RNAはpiwi相互作用RNA(piRNA)である。
免疫調節におけるSNAの使用
Toll様受容体(TLR)は、センチネル細胞で発現されるタンパク質のクラスであり、自然免疫系の調節に重要な役割を果たす。哺乳類の免疫系は、感染性疾患と戦うために2つの一般的な戦略を使用する。病原体への曝露は、免疫刺激性サイトカイン、ケモカイン、及び多反応性IgM抗体の産生によって特徴付けられる自然免疫応答を急速に引き起こす。自然免疫系は、多様な感染性微生物群によって発現される病原体関連分子パターン(PAMP)への曝露によって活性化される。PAMPの認識は、受容体のToll様ファミリーのメンバーによって媒介される。特定のオリゴヌクレオチドに応答するTLR4、TLR8、及びTLR9などのTLR受容体は、エンドソームと呼ばれる特別な細胞内区画内に存在する。TLR4、TLR8、及びTLR9受容体の調節機構は、例えば、限定されないが、DNA-タンパク質相互作用に基づいている。
Toll様受容体(TLR)は、センチネル細胞で発現されるタンパク質のクラスであり、自然免疫系の調節に重要な役割を果たす。哺乳類の免疫系は、感染性疾患と戦うために2つの一般的な戦略を使用する。病原体への曝露は、免疫刺激性サイトカイン、ケモカイン、及び多反応性IgM抗体の産生によって特徴付けられる自然免疫応答を急速に引き起こす。自然免疫系は、多様な感染性微生物群によって発現される病原体関連分子パターン(PAMP)への曝露によって活性化される。PAMPの認識は、受容体のToll様ファミリーのメンバーによって媒介される。特定のオリゴヌクレオチドに応答するTLR4、TLR8、及びTLR9などのTLR受容体は、エンドソームと呼ばれる特別な細胞内区画内に存在する。TLR4、TLR8、及びTLR9受容体の調節機構は、例えば、限定されないが、DNA-タンパク質相互作用に基づいている。
本明細書に記載されるように、細菌DNAに見られるものと同様のCpGモチーフを含有する合成免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、TLR受容体の同様の応答を刺激する。したがって、本開示のCpGオリゴヌクレオチドは、TLRアゴニストとして機能する能力を有する。本開示によって企図される他のTLRアゴニストには、一本鎖RNA及び小分子(例えば、R848(レシキモド))が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、免疫調節(例えば、免疫刺激性)オリゴヌクレオチドには、免疫不全及びがんの治療を含む、様々な有望な治療用途がある。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のSNAは、toll様受容体(TLR)の活性を調節する方法で使用される。
いくつかの実施形態では、本開示のSNA(例えば、ProSNA、LSNA、LNP-SNA)は、TLRアンタゴニストであるオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、TLRアンタゴニストは一本鎖DNA(ssDNA)である。
いくつかの実施形態では、免疫系の下方調節は、Toll様受容体の発現に関与する遺伝子のノックダウンを伴う。このアンチセンスアプローチは、任意のtoll様タンパク質の発現を阻害するための本開示のSNAの使用を伴う。
したがって、いくつかの実施形態では、toll様受容体を調節するために本明細書に記載されるSNAを利用する方法が開示される。本方法は、それぞれ、TLRアゴニスト又はTLRアンタゴニストを使用して、Toll様受容体活性を上方調節又は下方調節するかのいずれかである。方法は、toll様受容体を有する細胞を本開示のSNAと接触させ、それによってtoll様受容体の活性及び/又は発現を調節することを含む。調節されるtoll様受容体には、toll様受容体1、toll様受容体2、toll様受容体3、toll様受容体4、toll様受容体5、toll様受容体6、toll様受容体7、toll様受容体8、toll様受容体9、toll様受容体10、toll様受容体11、toll様受容体12、及び/又はtoll様受容体13のうちの1つ以上が含まれる。
障害を治療するためのSNAの使用
いくつかの実施形態では、本開示のSNA(例えば、ProSNA、LSNA、LNP-SNA)は、障害を治療するために使用される。したがって、いくつかの態様では、本開示は、障害を治療する方法であって、有効量の本開示のSNAを、それを必要とする対象(例えば、ヒト対象)に投与することを含み、投与することにより、障害を治療する、方法を提供する。様々な実施形態では、障害は、がん、感染性疾患、肺疾患、胃腸疾患、血液疾患、ウイルス疾患、炎症疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、遺伝性疾患、心血管疾患、又はそれらの組み合わせである。SNAの「有効量」は、例えば、遺伝子編集に影響を及ぼし、障害を治療するのに十分な量である。SNAの有効量はまた、例えば、遺伝子発現を阻害するか、自然免疫応答を活性化するか、又はそれらを組み合わせて、障害を治療する量である。したがって、自然免疫応答を活性化する方法も本明細書で企図され、そのような方法は、本開示のSNAを、対象における自然免疫応答を活性化するのに有効な量で、それを必要とする対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のSNA(例えば、ProSNA、LSNA、LNP-SNA)は、障害を治療するために使用される。したがって、いくつかの態様では、本開示は、障害を治療する方法であって、有効量の本開示のSNAを、それを必要とする対象(例えば、ヒト対象)に投与することを含み、投与することにより、障害を治療する、方法を提供する。様々な実施形態では、障害は、がん、感染性疾患、肺疾患、胃腸疾患、血液疾患、ウイルス疾患、炎症疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、遺伝性疾患、心血管疾患、又はそれらの組み合わせである。SNAの「有効量」は、例えば、遺伝子編集に影響を及ぼし、障害を治療するのに十分な量である。SNAの有効量はまた、例えば、遺伝子発現を阻害するか、自然免疫応答を活性化するか、又はそれらを組み合わせて、障害を治療する量である。したがって、自然免疫応答を活性化する方法も本明細書で企図され、そのような方法は、本開示のSNAを、対象における自然免疫応答を活性化するのに有効な量で、それを必要とする対象に投与することを含む。
本開示のSNAは、非経口投与、筋肉内注射、皮下注射、皮内投与、及び/又は経口若しくは鼻腔内などの粘膜投与などの任意の好適な経路を介して投与することができる。追加の投与経路には、静脈内、腹腔内、鼻腔内投与、膣内、直腸内、及び経口投与が挙げられるが、これらに限定されない。異なる投与経路の別々又は同時の組み合わせも、本開示によって企図される。
治療剤
本明細書で提供するSNAは、任意選択で、治療剤又はその複数を更に含む。治療剤は、様々な実施形態では、SNAのナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに単純に会合しており、かつ/又は治療剤はSNAのナノ粒子コアに会合しており、かつ/又は治療剤はSNAに封入されている。いくつかの実施形態では、治療剤は、ナノ粒子コアに結合していないオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの終端に会合している(例えば、オリゴヌクレオチドがその3’終端を介してナノ粒子コアに結合している場合、治療剤はオリゴヌクレオチドの5’終端に会合している)。あるいは、いくつかの実施形態では、治療剤は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの終端に会合している(例えば、オリゴヌクレオチドがその3’終端を介してナノ粒子コアに結合している場合、治療剤はオリゴヌクレオチドの3’終端に会合している)。いくつかの実施形態では、治療剤は、SNAのナノ粒子コアの外部に結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに共有結合的に会合している。いくつかの実施形態では、治療剤は、SNAのナノ粒子コアの外部に結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに非共有結合的に会合している。しかしながら、本開示は、1つ以上の治療剤が、SNAのナノ粒子コアの外部に結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに共有結合的及び非共有結合的の両方で会合しているSNAを提供することを理解されたい。また、非共有結合的な会合には、ハイブリダイゼーション、タンパク質結合、及び/又は疎水性相互作用が含まれることも理解されるであろう。いくつかの実施形態では、治療剤は、本開示のSNAとは別個に投与される。したがって、いくつかの実施形態では、治療剤は、障害を治療するために、本開示のSNAの前、後、又は同時に投与される。
本明細書で提供するSNAは、任意選択で、治療剤又はその複数を更に含む。治療剤は、様々な実施形態では、SNAのナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに単純に会合しており、かつ/又は治療剤はSNAのナノ粒子コアに会合しており、かつ/又は治療剤はSNAに封入されている。いくつかの実施形態では、治療剤は、ナノ粒子コアに結合していないオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの終端に会合している(例えば、オリゴヌクレオチドがその3’終端を介してナノ粒子コアに結合している場合、治療剤はオリゴヌクレオチドの5’終端に会合している)。あるいは、いくつかの実施形態では、治療剤は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの終端に会合している(例えば、オリゴヌクレオチドがその3’終端を介してナノ粒子コアに結合している場合、治療剤はオリゴヌクレオチドの3’終端に会合している)。いくつかの実施形態では、治療剤は、SNAのナノ粒子コアの外部に結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに共有結合的に会合している。いくつかの実施形態では、治療剤は、SNAのナノ粒子コアの外部に結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに非共有結合的に会合している。しかしながら、本開示は、1つ以上の治療剤が、SNAのナノ粒子コアの外部に結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに共有結合的及び非共有結合的の両方で会合しているSNAを提供することを理解されたい。また、非共有結合的な会合には、ハイブリダイゼーション、タンパク質結合、及び/又は疎水性相互作用が含まれることも理解されるであろう。いくつかの実施形態では、治療剤は、本開示のSNAとは別個に投与される。したがって、いくつかの実施形態では、治療剤は、障害を治療するために、本開示のSNAの前、後、又は同時に投与される。
本開示によって企図される治療剤には、タンパク質(例えば、治療用タンパク質)、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、抗体又は抗体断片、小分子、ペプチド、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、化学療法剤、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「小分子」という用語は、化学化合物若しくは薬物、又は天然若しくは合成のいずれかの任意の他の低分子量有機化合物を指す。「低分子量」とは、1500ダルトン未満、典型的には100~700ダルトンの分子量を有する化合物を意味する。
以下の実施例に関して、「CRISPR-SNA」の使用への言及は、任意のGALAペプチド配列を含まないCas9タンパク質の利用を示し得る。また、以下の実施例に関して、「Cas9 SNA」の使用への言及は、N末端からC末端の順に以下の構造:(i)1つ以上のGALAペプチド、(ii)遺伝子編集タンパク質、及び(iii)核局在化シグナル(NLS)、を含む、本明細書に記載される「融合」Cas9タンパク質の利用を示し得る。
実施例1
遺伝子編集におけるLSNAの使用
本開示は、球状核酸を使用して遺伝子編集タンパク質を哺乳類細胞に送達するための方法を提供する。tracrRNA及びcrRNAを有するStreptococcus pyogenes Cas9の酵素活性リボ核タンパク質(RNP)複合体を合成し、次いで、RNPを、95%の1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3ホスファチジルコリン(DOPC)及び5%の1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(6-アジドヘキサノイル)(DPPE-アジド)から作製したリポソームに封入する。次いで、リポソームを5’DBCO修飾DNAで官能化して、LSNAを生成する。これらの粒子は、酵素活性Cas9を含有し、哺乳類細胞によって効率的に取り込まれる。
遺伝子編集におけるLSNAの使用
本開示は、球状核酸を使用して遺伝子編集タンパク質を哺乳類細胞に送達するための方法を提供する。tracrRNA及びcrRNAを有するStreptococcus pyogenes Cas9の酵素活性リボ核タンパク質(RNP)複合体を合成し、次いで、RNPを、95%の1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3ホスファチジルコリン(DOPC)及び5%の1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(6-アジドヘキサノイル)(DPPE-アジド)から作製したリポソームに封入する。次いで、リポソームを5’DBCO修飾DNAで官能化して、LSNAを生成する。これらの粒子は、酵素活性Cas9を含有し、哺乳類細胞によって効率的に取り込まれる。
方法
特に明記しない限り、全ての試薬は商業的供給源から購入し、受け取ったままで使用した。オリゴヌクレオチド、crRNA、及びtracrRNA合成について、全てのホスホラミダイト及び試薬をGlen Research,Co.(Sterling,VA,USA)から購入した。全ての脂質は、乾燥粉末形態又はクロロホルムのいずれかでAvanti Polar Lipids(Alabaster,AL,USA)から購入し、更に精製することなく使用した。EnGen(登録商標)Cas9 NLS(Cas9)、プロテイナーゼK、及びPhusion PCRキットをNew England Biolabs(Ipswich,MA,USA)から購入した。Alexa Fluor647 NHSエステル色素(Alexa647)をLumiprobe Corp.(Cockneysville,MD,USA)から購入した。プラスミドをAddGene(Cambridge,MA,USAから購入した。GelRed色素をBiotium Inc.(Fremont,CA,USA)から購入した。他の全ての試薬をSigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)から購入した。C166-GFP細胞をATCC(Manassas,VA,USA)から購入し、Opti-MEMをLife Technologies(Carlsbad,CA)から購入した。
特に明記しない限り、全ての試薬は商業的供給源から購入し、受け取ったままで使用した。オリゴヌクレオチド、crRNA、及びtracrRNA合成について、全てのホスホラミダイト及び試薬をGlen Research,Co.(Sterling,VA,USA)から購入した。全ての脂質は、乾燥粉末形態又はクロロホルムのいずれかでAvanti Polar Lipids(Alabaster,AL,USA)から購入し、更に精製することなく使用した。EnGen(登録商標)Cas9 NLS(Cas9)、プロテイナーゼK、及びPhusion PCRキットをNew England Biolabs(Ipswich,MA,USA)から購入した。Alexa Fluor647 NHSエステル色素(Alexa647)をLumiprobe Corp.(Cockneysville,MD,USA)から購入した。プラスミドをAddGene(Cambridge,MA,USAから購入した。GelRed色素をBiotium Inc.(Fremont,CA,USA)から購入した。他の全ての試薬をSigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)から購入した。C166-GFP細胞をATCC(Manassas,VA,USA)から購入し、Opti-MEMをLife Technologies(Carlsbad,CA)から購入した。
Cas9の標識化及び定量化
Cas9を追跡及び定量化するために、2ナノモルのCas9を、10ナノモルのAlexa647 NHSエステルとともに、1×HBS中で4℃で一晩インキュベートし、Alexa-Cas9を生成した。未反応の色素を除去するために、Alexa-Cas9を、1×HBS中で平衡化したNAP5カラムに通し、1mLの1×HBS中で溶出した。2ナノモルの未修飾Cas9を、NAP5カラムを使用して1×HBSに交換し、Alexa Cas9と組み合わせた。Cas9及びAlexa色素の濃度を、それぞれ280nm及び650nmの吸光度を使用して計算し、Alexa色素のCas9に対するモル比を計算した。次いで、Alexa-Cas9を1μMに希釈した。活性及び濃度アッセイのために20μLのアリコートを確保した。
Cas9を追跡及び定量化するために、2ナノモルのCas9を、10ナノモルのAlexa647 NHSエステルとともに、1×HBS中で4℃で一晩インキュベートし、Alexa-Cas9を生成した。未反応の色素を除去するために、Alexa-Cas9を、1×HBS中で平衡化したNAP5カラムに通し、1mLの1×HBS中で溶出した。2ナノモルの未修飾Cas9を、NAP5カラムを使用して1×HBSに交換し、Alexa Cas9と組み合わせた。Cas9及びAlexa色素の濃度を、それぞれ280nm及び650nmの吸光度を使用して計算し、Alexa色素のCas9に対するモル比を計算した。次いで、Alexa-Cas9を1μMに希釈した。活性及び濃度アッセイのために20μLのアリコートを確保した。
Cas9リボ核タンパク質の合成及び濃度
10ナノモルのcrRNA及びtracrRNAを、10μMのcrRNAを10μMのtracrRNAとともに1×HBS中で95℃で5分間インキュベートすることによって生成し、10分間室温に冷却させた。次いで、10ナノモルのcrRNA/tracrRNA複合体を4ナノモルの1μMのAlexa-Cas9と混合し、室温で10分間放置して、Cas9リボ核タンパク質(RNP)を形成する。次いで、RNPをAmicon 10Kスピンフィルターで5分間濃縮し、次いで、保持された液体体積が500μL以下に達するまで再懸濁した。Cas9濃度を再び、Alexa647色素の吸光度を使用して定量化した。活性及び濃度測定のために20μLを確保した。
10ナノモルのcrRNA及びtracrRNAを、10μMのcrRNAを10μMのtracrRNAとともに1×HBS中で95℃で5分間インキュベートすることによって生成し、10分間室温に冷却させた。次いで、10ナノモルのcrRNA/tracrRNA複合体を4ナノモルの1μMのAlexa-Cas9と混合し、室温で10分間放置して、Cas9リボ核タンパク質(RNP)を形成する。次いで、RNPをAmicon 10Kスピンフィルターで5分間濃縮し、次いで、保持された液体体積が500μL以下に達するまで再懸濁した。Cas9濃度を再び、Alexa647色素の吸光度を使用して定量化した。活性及び濃度測定のために20μLを確保した。
SNAの合成及び精製
Cas9 RNPを封入するリポソームを合成するために、クロロホルム中の3mgのDOPC及び0.15mgのDPPE-アジドの混合物を凍結乾燥させることによって、脱水リン脂質フィルムを生成した。次いで、脂質フィルムを、5~8μMの濃度で、1×HBS中の400μLのAlexa647標識リボ核タンパク質複合体(Alexa-RNP)で再水和した。次いで、この溶液を、液体窒素及び室温のバスソニケーターを使用した7回の凍結/解凍サイクルに供して、単一の単層小胞(SUV)を生成した。SUVを、Sepharose 6Bで満たされたカラムに通し、1×HBS中で平衡化して、それらを封入されていないRNPから分離した。多分散性を低減するために、SUVを200nm、次いで100nmの膜フィルターを通して2回押し出した。残りの封入されていないRNPを除去するために、SUVを、プロテイナーゼK(10U、500μLの1×NEB緩衝液2+1×HBS中)とともに室温で1時間インキュベートした。SUVを、Superdex 200で充填したカラムを使用して、消化されたRNPから分離し、1×HBS中で平衡化した。次いで、SNAを生成するために、SUVを、5’終端でDBCOで官能化したオリゴヌクレオチド、及び内部的にCy3(20個のリン脂質当たりおよそ1個のDNA)とともに一晩インキュベートした。次いで、SNAを、Superdex 200で充填したカラムを使用して、遊離オリゴヌクレオチドから分離し、1×HBS中で平衡化した。図1を参照されたい。
Cas9 RNPを封入するリポソームを合成するために、クロロホルム中の3mgのDOPC及び0.15mgのDPPE-アジドの混合物を凍結乾燥させることによって、脱水リン脂質フィルムを生成した。次いで、脂質フィルムを、5~8μMの濃度で、1×HBS中の400μLのAlexa647標識リボ核タンパク質複合体(Alexa-RNP)で再水和した。次いで、この溶液を、液体窒素及び室温のバスソニケーターを使用した7回の凍結/解凍サイクルに供して、単一の単層小胞(SUV)を生成した。SUVを、Sepharose 6Bで満たされたカラムに通し、1×HBS中で平衡化して、それらを封入されていないRNPから分離した。多分散性を低減するために、SUVを200nm、次いで100nmの膜フィルターを通して2回押し出した。残りの封入されていないRNPを除去するために、SUVを、プロテイナーゼK(10U、500μLの1×NEB緩衝液2+1×HBS中)とともに室温で1時間インキュベートした。SUVを、Superdex 200で充填したカラムを使用して、消化されたRNPから分離し、1×HBS中で平衡化した。次いで、SNAを生成するために、SUVを、5’終端でDBCOで官能化したオリゴヌクレオチド、及び内部的にCy3(20個のリン脂質当たりおよそ1個のDNA)とともに一晩インキュベートした。次いで、SNAを、Superdex 200で充填したカラムを使用して、遊離オリゴヌクレオチドから分離し、1×HBS中で平衡化した。図1を参照されたい。
Cas9の定量化及びDNAローディング
SUV濃度を測定するために、誘導結合プラズマ発光分光法(ICP-OES)及びリン標準を使用して、リン脂質濃度を計算した。リポソームの直径を、動的光散乱(DLS)を介して測定し、リポソーム当たりのリン脂質の数を、以下の式1を使用して計算した。SUV濃度は、リン脂質濃度をSUV当たりのリン脂質の数で割ることによって計算した。
SUV濃度を測定するために、誘導結合プラズマ発光分光法(ICP-OES)及びリン標準を使用して、リン脂質濃度を計算した。リポソームの直径を、動的光散乱(DLS)を介して測定し、リポソーム当たりのリン脂質の数を、以下の式1を使用して計算した。SUV濃度は、リン脂質濃度をSUV当たりのリン脂質の数で割ることによって計算した。
SNAを合成した後(図1)、SNA試料を0.1%のTween 20洗剤で処理し(リポソームを破壊し、オリゴヌクレオチドを分散させる)、SNA試料中のCy3蛍光を、遊離DBCO及びCy3標識オリゴヌクレオチドから生成された標準曲線と比較することによって、プレートリーダーでオリゴヌクレオチドの濃度を測定した。リポソームの濃度は、オリゴヌクレオチドの濃度及びオリゴヌクレオチド当たりのリン原子の数に基づいて補正されたリン濃度を用いて、上記のようにICP-OESで決定した。
RNPの濃度を計算するために、取っておいたAlexa-RNPアリコートから標準曲線を生成した。RNPの濃度を、リポソーム試料からのAlexa647の蛍光を測定することによって決定し、次いで、それをプレートリーダーにおけるAlexa-RNP標準曲線の線形回帰上にプロットした。
代表的な合成では、粒子当たりおよそ450のDNA鎖で115nmのCRISPR SNAを生成し、リポソーム当たりおよそ3つのRNPを封入した(図2)。
インビトロCas9 DNA切断アッセイ
Cas9酵素活性を測定するために、EGFP遺伝子を標的とするRNPを合成し、CRISPR SNAを作製するために使用した。精製したプラスミドpcDNA3-EGFPを、制限酵素SmaIで消化することによって線状化した。線状化したプラスミドとともにインキュベートした活性RNPを2kb及び4kbの断片に切断し、これは、TBE緩衝液中で30分間実行された1%アガロース電気泳動ゲル上で見ることができる。RNPが、CRISPR SNAの合成中に分解しない又は活性を失わないことを検証するために、200ナノグラムの線状化したプラスミドを、それらを作製した直後、凍結/解凍サイクル後、サイズ排除後、及び押し出し後に、1pmol及び0.1pmolのAlexa RNPとともにインキュベートした。RNPは、これらのステップで活性を失わなかった(図3)。
Cas9酵素活性を測定するために、EGFP遺伝子を標的とするRNPを合成し、CRISPR SNAを作製するために使用した。精製したプラスミドpcDNA3-EGFPを、制限酵素SmaIで消化することによって線状化した。線状化したプラスミドとともにインキュベートした活性RNPを2kb及び4kbの断片に切断し、これは、TBE緩衝液中で30分間実行された1%アガロース電気泳動ゲル上で見ることができる。RNPが、CRISPR SNAの合成中に分解しない又は活性を失わないことを検証するために、200ナノグラムの線状化したプラスミドを、それらを作製した直後、凍結/解凍サイクル後、サイズ排除後、及び押し出し後に、1pmol及び0.1pmolのAlexa RNPとともにインキュベートした。RNPは、これらのステップで活性を失わなかった(図3)。
RNPは、SNA合成手順を通して活性を維持する-プロテイナーゼ安定性研究
RNPがSNA内に封入されていることを検証するために、クリーンなCRISPR SNAを、NEBの制限酵素緩衝液2中のプロテイナーゼKとともに1時間室温でインキュベートした。対照として、Alexa-RNPを空のSNAと混合し、プロテイナーゼKとともにインキュベートした。次いで、インキュベートした試料を、1×HBS中で平衡化したSuperdex 200サイズの除外カラムを通して200μLの画分で溶出した。次いで、これらの画分を、Cy3及びAlexa Fluor647蛍光の蛍光ゲルスキャナで画像化した。封入されたRNPは、プロテイナーゼK消化後にSNAと共溶出したが、空のSNAとともにインキュベートしたRNPは消化され、したがって、RNP関連Alexa蛍光は、SNA関連Cy3蛍光よりもはるかに遅く溶出した。
RNPがSNA内に封入されていることを検証するために、クリーンなCRISPR SNAを、NEBの制限酵素緩衝液2中のプロテイナーゼKとともに1時間室温でインキュベートした。対照として、Alexa-RNPを空のSNAと混合し、プロテイナーゼKとともにインキュベートした。次いで、インキュベートした試料を、1×HBS中で平衡化したSuperdex 200サイズの除外カラムを通して200μLの画分で溶出した。次いで、これらの画分を、Cy3及びAlexa Fluor647蛍光の蛍光ゲルスキャナで画像化した。封入されたRNPは、プロテイナーゼK消化後にSNAと共溶出したが、空のSNAとともにインキュベートしたRNPは消化され、したがって、RNP関連Alexa蛍光は、SNA関連Cy3蛍光よりもはるかに遅く溶出した。
封入されたRNPが依然として活性であることを検証するために、インビトロCas9 DNA切断アッセイをいくつかの試料で実行した。CRISPR SNA中のリポソームを、それらを上記のようにプロテイナーゼKとともにインキュベートする前又はインキュベートした後のいずれかで、0.1%のTween 20洗剤で破壊した。インビトロDNA切断活性アッセイを、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)でプロテイナーゼKを不活性化した後に行った。対照RNPについて、Tweenは活性に影響を及ぼさなかったが、プロテイナーゼKインキュベーションは活性を消失させた。しかしながら、CRISPR SNAは、TweenがプロテイナーゼKインキュベーションの後に添加された場合、その活性を維持したが、TweenがプロテイナーゼKインキュベーションの前に添加された場合、活性を示さなかった(図4)。これは、CRISPR SNA中のRNPが封入され(プロテイナーゼ消化から保護され)、酵素活性の両方であることを示した。
細胞取り込み研究
SNAがRNPを細胞に送達することができるかどうかを決定するために、C166-GFP細胞を、CRISPR SNA、空のSNA、裸のリポソームに封入されたRNP、及びRNAiMAXトランスフェクション試薬と複合体化されたRNPとともに、Opti-MEM還元血清培地中で16時間インキュベートした。次いで、Alexa Fluor647で標識されたRNPの取り込みをフローサイトメトリーを介して測定した。CRISPR-SNAで処理された細胞は、裸のリポソームに封入されたRNP/RNAiMAX混合物又はRNPで処理された細胞よりも蛍光中央値が高く、高蛍光(蛍光>1000AU)細胞の割合が高かったが、未処理の細胞はほとんど蛍光を示さなかった(図5)。このデータは、リポソームSNAに封入された遺伝子編集酵素が、哺乳類細胞に能動的に取り込まれることを示した。
SNAがRNPを細胞に送達することができるかどうかを決定するために、C166-GFP細胞を、CRISPR SNA、空のSNA、裸のリポソームに封入されたRNP、及びRNAiMAXトランスフェクション試薬と複合体化されたRNPとともに、Opti-MEM還元血清培地中で16時間インキュベートした。次いで、Alexa Fluor647で標識されたRNPの取り込みをフローサイトメトリーを介して測定した。CRISPR-SNAで処理された細胞は、裸のリポソームに封入されたRNP/RNAiMAX混合物又はRNPで処理された細胞よりも蛍光中央値が高く、高蛍光(蛍光>1000AU)細胞の割合が高かったが、未処理の細胞はほとんど蛍光を示さなかった(図5)。このデータは、リポソームSNAに封入された遺伝子編集酵素が、哺乳類細胞に能動的に取り込まれることを示した。
実施例2
この実施例は、Cas9-sgRNA複合体の効率的なゲノム編集送達プラットフォームとしてのCRISPR/Cas9 ProSNAの合成を詳述する。本明細書に記載されるように、Cas9は、ProSNAのナノ粒子コアとして機能する。表面リジンアミンを、反対側の末端で、アジド及びアミン反応性N-ヒドロキシスクシンイミド部分を有する小さなポリエチレングリコールポリマーと反応させた。次いで、共有結合したアジドを、5’末端に歪んだシクロオクチン、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)を含有するDNA鎖と反応させた。本明細書で使用される配列(dGGT)10は、ポリdTシェルに対して、G豊富シェルを含むSNAの細胞取り込みの増強を示した以前の研究に基づいて選択された。三次元オリゴヌクレオチドシェルは、立体及び静電障壁を創出してCas9タンパク質を安定化し、細胞侵入に関してそれらに機能性を付与する。この戦略は、優れた生体適合性及び細胞取り込み性能、並びにヒト細胞株においておよそ42.5%の優れたゲノム編集活性を有するゲノム編集ツールの容易な生成を可能にする。我々の知見は、Cas9 ProSNAが、ゲノム編集及び遺伝子サイレンシングにおいて魅力的な展望を有することを実証する。
この実施例は、Cas9-sgRNA複合体の効率的なゲノム編集送達プラットフォームとしてのCRISPR/Cas9 ProSNAの合成を詳述する。本明細書に記載されるように、Cas9は、ProSNAのナノ粒子コアとして機能する。表面リジンアミンを、反対側の末端で、アジド及びアミン反応性N-ヒドロキシスクシンイミド部分を有する小さなポリエチレングリコールポリマーと反応させた。次いで、共有結合したアジドを、5’末端に歪んだシクロオクチン、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)を含有するDNA鎖と反応させた。本明細書で使用される配列(dGGT)10は、ポリdTシェルに対して、G豊富シェルを含むSNAの細胞取り込みの増強を示した以前の研究に基づいて選択された。三次元オリゴヌクレオチドシェルは、立体及び静電障壁を創出してCas9タンパク質を安定化し、細胞侵入に関してそれらに機能性を付与する。この戦略は、優れた生体適合性及び細胞取り込み性能、並びにヒト細胞株においておよそ42.5%の優れたゲノム編集活性を有するゲノム編集ツールの容易な生成を可能にする。我々の知見は、Cas9 ProSNAが、ゲノム編集及び遺伝子サイレンシングにおいて魅力的な展望を有することを実証する。
材料
寒天を含むLBブロス(カタログ番号L2897-250G)及びLBブロスをSigmaから購入した。イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(カタログ番号DSI5600)をドットサイエンティフィックインク(dot scientific inc)から購入した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)をGibco Life Technologiesから購入した。SA MALDIマトリックス(カタログ番号90032)、Alexa Fluor647(カタログ番号A37573)、及びNHS-PEG4-アジド(カタログ番号26130)を、ThermoFisherから購入した。T7 RNAポリメラーゼ(M0251S)は、NEBから購入した。超純水(18.25MΩ.cm、25℃)を使用して、全ての溶液を調製した。
寒天を含むLBブロス(カタログ番号L2897-250G)及びLBブロスをSigmaから購入した。イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(カタログ番号DSI5600)をドットサイエンティフィックインク(dot scientific inc)から購入した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)をGibco Life Technologiesから購入した。SA MALDIマトリックス(カタログ番号90032)、Alexa Fluor647(カタログ番号A37573)、及びNHS-PEG4-アジド(カタログ番号26130)を、ThermoFisherから購入した。T7 RNAポリメラーゼ(M0251S)は、NEBから購入した。超純水(18.25MΩ.cm、25℃)を使用して、全ての溶液を調製した。
オリゴヌクレオチドの設計、合成、及び精製
Glen Researchから入手した試薬及び標準プロトコルを使用して、オリゴヌクレオチドを固体支持体上で合成した。産物を、室温で一晩、30%のNH4OHを使用して固体支持体から切断し、45分にわたって酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液中0~75%のアセトニトリルの勾配で逆相HPLCを使用して精製した。HPLC精製後、最終ジメトキシトリチル基を20%酢酸中で2時間除去し、続いて酢酸エチルで抽出した。3-ヒドロキシピコリン酸をマトリックスとして使用するマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析を使用して、オリゴヌクレオチドの質量を確認した。sgRNAを、マニュアルに従ってNEB T7 Transcription Kitを用いて合成した。
Glen Researchから入手した試薬及び標準プロトコルを使用して、オリゴヌクレオチドを固体支持体上で合成した。産物を、室温で一晩、30%のNH4OHを使用して固体支持体から切断し、45分にわたって酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液中0~75%のアセトニトリルの勾配で逆相HPLCを使用して精製した。HPLC精製後、最終ジメトキシトリチル基を20%酢酸中で2時間除去し、続いて酢酸エチルで抽出した。3-ヒドロキシピコリン酸をマトリックスとして使用するマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析を使用して、オリゴヌクレオチドの質量を確認した。sgRNAを、マニュアルに従ってNEB T7 Transcription Kitを用いて合成した。
Cas9 SNAの合成及び特性評価
Cas9の発現及び精製。Cas9プラスミド(番号87703)を電気ショックによりOne Shot(登録商標)BL21(DE3)Chemically Competent E.coli(Thermo Fisher)に形質転換し、細胞を100μg/mLアンピシリンを有するLB寒天プレート上で一晩増殖させた。単一のコロニーを選び、7mLの培養物をLBブロス中で、37℃で一晩成長させた。これらの培養物を750mLの2×YBTブロス及び100μg/mLのアンピシリンに添加し、細胞を37℃で光学密度0.6~0.9まで成長させ、次いで1mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドとともに17℃で一晩誘導した。細胞を沈降させ(6000g、15分間)、100mLの1×PBSに再懸濁し、次いで、高圧ホモジナイザーを使用して溶解した。細胞溶解物を30000gで30分間遠心分離することにより清澄化し、Bio-Scale(商標)Mini Profinity(商標)IMACカートリッジ(Bio-Rad)に充填した。カラムを100mLの1×PBSで洗浄し、次いで、250mMのイミダゾールを含む同じ緩衝液で溶出した。溶出した画分を透析によって更に精製した。
Cas9の発現及び精製。Cas9プラスミド(番号87703)を電気ショックによりOne Shot(登録商標)BL21(DE3)Chemically Competent E.coli(Thermo Fisher)に形質転換し、細胞を100μg/mLアンピシリンを有するLB寒天プレート上で一晩増殖させた。単一のコロニーを選び、7mLの培養物をLBブロス中で、37℃で一晩成長させた。これらの培養物を750mLの2×YBTブロス及び100μg/mLのアンピシリンに添加し、細胞を37℃で光学密度0.6~0.9まで成長させ、次いで1mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドとともに17℃で一晩誘導した。細胞を沈降させ(6000g、15分間)、100mLの1×PBSに再懸濁し、次いで、高圧ホモジナイザーを使用して溶解した。細胞溶解物を30000gで30分間遠心分離することにより清澄化し、Bio-Scale(商標)Mini Profinity(商標)IMACカートリッジ(Bio-Rad)に充填した。カラムを100mLの1×PBSで洗浄し、次いで、250mMのイミダゾールを含む同じ緩衝液で溶出した。溶出した画分を透析によって更に精製した。
表面アクセス可能なシステインとAlexa Fluor647(AF647)との反応。Cas9タンパク質を1×リン酸緩衝生理食塩水(1×PBS;Thermo Fisher Scientific)に溶解した。次いで、DMSOに溶解した10当量のAlexa Fluor647-C2-マレイミド(Thermo Fisher Scientific)を、1500μLの1×PBS中およそ10μMのCas9に添加し、反応物を一晩振盪した(900rpm)。非コンジュゲートAlexa Fluor647を、100kDaフィルターを使用して遠心分離を繰り返すことによって、濾液がUV-Visによって650nmで検出可能な吸光度を有さないまで除去した。タンパク質当たりのAlexa Fluor647修飾の数をUV-Vis分光法に基づいて計算した。
表面アクセス可能なリジンとNHS-PEG4-アジドとの反応。100mMの濃度で無水DMSOに溶解した50当量のNHS-PEG4-アジド架橋剤(Thermo Fisher Scientific)を、550μLの1×PBS中およそ45μMのCas9-AF647に添加した。反応物を25℃で一晩振盪した(900rpm)。非コンジュゲートリンカーを、100kDaフィルターを使用して10回遠心分離することによって除去した。アジド修飾の数を、Bruker AutoFlex-IIIにおいてマトリックスとしてシナピン酸(Thermo Fisher Scientific)を使用して、MALDI-MSによって評価した。
DNAコンジュゲーション。DNAコンジュゲーションは、精製直後に行った。350当量のDBCO-dT末端DNA鎖を最初に凍結乾燥し、次いで、450μLの1×PBS中10μMのCas9-AF647-アジドを添加してDNAを再水和した。この溶液を、振盪(900rpm)しながら25℃で72時間インキュベートした。未反応のDNA鎖を、100kDaフィルターで連続した遠心分離によって濾液が260nmで検出可能な吸光度を有さないまで除去した。典型的には、DNAの完全な除去は、30~40の洗浄ステップを必要とする。タンパク質当たりのDNA鎖の数は、UV-Vis分光法及びMALDI-MSに基づいて計算した。
Cas9 SNA-sgRNA複合体の結合及び切断活性。Cas9 SNA-sgRNA複合体を組み立てるために、ヒトゲノム内の非コード領域を標的とする精製したCas9 SNA及びsgRNAを、それぞれ30nM及び60nMの濃度で、37℃で30分間、1×NEBuffer 4.1中でインキュベートした。その後、標的配列を有するCy5標識DNAを添加して150nMの濃度を得、混合物を同じ条件下で30分間更にインキュベートした。6%のnative PAGEゲルを使用した分析の前に、10μLの反応物を2μLの6×天然ローディング緩衝液と混合して、切断活性を調べた。
Cas9 SNAに関するインビトロ調査。細胞株HaCaT(ヒトケラチノサイト細胞株)、EGFP発現HEK293(ヒト胚性腎細胞、HEK293/EGFP)を、American Type Culture Collectionから購入した。細胞を、加湿した5%CO2雰囲気で、37℃で、10%のウシ胎仔血清及び1%のペニシリン-ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)培地中で培養した。
HaCat細胞における細胞取り込み。HaCaT細胞をフローサイトメトリーチューブ(0.7×105、0.5mL)に播種し、10%のFBSを含むDMEM中で一晩培養した。その後、培養培地を450μLのOPTI-MEMに交換し、50μLのCas9 SNAを添加して混合し、異なる時間間隔(0.5時間、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間)の20nMの最終濃度を得た。後処理として、細胞を1×PBS、300μL(トリプシン処理)(Gibco)で洗浄し、300μLの1×PBSを添加して、300Gで5分間洗浄し、次いで、細胞を1mLのPBS中に再懸濁した。細胞を計数し、密度をPBSで1mLの体積中1×106個の細胞に調整した。1μLの生死色素を1mLの細胞懸濁液に添加し、よく混合した。0.5時間生死染色し、室温で30分間インキュベートし、光から保護した。細胞を1回、0.5mLのPBSで洗浄し、次いで、150μLの4%のパラホルムアルデヒド(Thermo Fisher Scientific)中で15分間固定した。次いで、450μLの1×PBSを添加し、3分間洗浄し、その後、200μLのPBSを添加し、次いで、試料当たり少なくとも30000の単一細胞事象の蛍光(励起640nm、発光655~685nm)を測定するBD LSRFortessaを使用して、フローサイトメトリーによって分析した。生のFCSファイルは、前方及び側方の散乱強度に基づいてゲートされ、FlowJoで分析された。
細胞生存率。細胞生存率を評価するために、Standard Cell Counting Kit-8(CCK-8)アッセイを利用した。簡単に説明すると、細胞を96ウェルプレート(ウェル当たり1×104)に播種し、1%のFBSの200μLのDMEM培地中で一晩培養した。次いで、異なる濃度(50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、及び500nM)のCas9 SNAを含有する2%のFBSの200μLのOPTI-MEM培地を添加し、続いて24時間インキュベートした。その後、培地を200μLのPBS中10%のCCK-8に交換した。37℃で0.5時間の連続的なインキュベーション後、150μLの培地を使用して、マイクロプレートリーダーを使用して450nmでの吸光度を測定した。細胞生存率も、カルセイン-AM/PI染色によって評価した。
インビトロ遺伝子サイレンシング。EGFPを絶えず発現するHEK293細胞(HEK293/EGFP)を用いて、Cas9 SNAの遺伝子サイレンシング効果を評価した。HEK293/EGFP細胞を24ウェルプレート(24ウェルプレート、ウェル当たり1.3×105、0.5mL)に播種し、37℃で一晩培養した。培地をOPTI-MUM中2%のFBSに5時間変更した。POTI-MUM中のCas9 SNAとともに6時間インキュベートした後、EGFPのコード領域を24時間標的化し、細胞を新鮮な培地に交換し、5日間培養した。次いで、細胞をトリプシン-EDTA溶液で消化し、フローサイトメトリーのために0.3mLのPBS中に再懸濁した。
Surveyorアッセイ。HEK293/EGFP細胞を24ウェルプレート(ウェル当たり5×104細胞)に播種し、37℃で一晩培養した。組み立てられたCas9 SNA(100nM、ヒトDNase I高活性部位、ヒトGRIN2B部位、及びEGFP部位を24時間標的化する)とのインキュベーション後、細胞を新鮮な培地に交換し、更に4日間培養した。次いで、ゲノムDNA抽出キットを使用して、ゲノムDNA抽出のために細胞を採取した。250ngのDNA抽出物を、19μLの総体積で、2μLのNEBuffer2(NEB)と組み合わせて変性させ、次いで、95℃で5分間、2℃/秒で95~85℃、0.2℃/秒で85~20℃の熱循環で再アニーリングした。再アニーリングしたDNAを、1μLのT7エンドヌクレアーゼI(10U/μL、NEB)とともに、37℃で15分間インキュベートした。10μLの50%のグリセロールをT7エンドヌクレアーゼ反応に添加し、200Vで30分間電気泳動したPAGEゲル(Bio-Rad)上で12μLを分析し、次いで、1×SYBR Gold(Life Technologies)で30分間染色した。Cas9誘導切断バンド及び切断されていないバンドを使用して、ImageJを使用してゲノム編集効率を計算した。標的ゲノム修飾も、Sangerシーケンシングによって検出した。
結果
組換えCas9タンパク質をEscherichia coli BL21(DE3)から精製し、Cas9-sgRNA複合体の結合/切断活性を溶液中で確認した。Cas9 ProSNAは、以前に開発された方法によって合成された。具体的には、Cas9タンパク質をAlexa Fluor647(AF647)でタグ付けして、インビトロでの追跡を容易にし、Cas9 SNAの濃度を計算した。次いで、表面リジンアミンを、反対側の末端で、アジド及びアミン反応性N-ヒドロキシスクシンイミド部分を有する小さなポリエチレングリコールポリマーと反応させた。次いで、共有結合したアジドを、銅不含クリックケミストリーを介して、5’末端に歪んだシクロオクチン、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)を含有するDNA鎖と反応させた。合成に成功したCas9 SNAを、平均サイズ10nmの透過電子顕微鏡法(TEM)で特性評価した(図6a)。合成したタンパク質の純度は、SDS-PAGEゲルを使用して確認した(図6b)。ゲル画像は、各合成ステップ後に明らかな分子量変化を示し、その表面との非特異的会合ではなく、オリゴヌクレオチドの共有結合を実証する。DNAで官能化した後、平均ゼータ電位を-15.8mVに変更した(図6c)。これにより、より多くの負電荷で溶液安定性が増強した。DNA修飾のレベルを、AF Cas9とProSNA Cas9との間の260nmでの吸光度の差を比較することによって決定した(図6d)。これらの結果は、Cas9のDNA官能化の成功を明確に示した。
組換えCas9タンパク質をEscherichia coli BL21(DE3)から精製し、Cas9-sgRNA複合体の結合/切断活性を溶液中で確認した。Cas9 ProSNAは、以前に開発された方法によって合成された。具体的には、Cas9タンパク質をAlexa Fluor647(AF647)でタグ付けして、インビトロでの追跡を容易にし、Cas9 SNAの濃度を計算した。次いで、表面リジンアミンを、反対側の末端で、アジド及びアミン反応性N-ヒドロキシスクシンイミド部分を有する小さなポリエチレングリコールポリマーと反応させた。次いで、共有結合したアジドを、銅不含クリックケミストリーを介して、5’末端に歪んだシクロオクチン、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)を含有するDNA鎖と反応させた。合成に成功したCas9 SNAを、平均サイズ10nmの透過電子顕微鏡法(TEM)で特性評価した(図6a)。合成したタンパク質の純度は、SDS-PAGEゲルを使用して確認した(図6b)。ゲル画像は、各合成ステップ後に明らかな分子量変化を示し、その表面との非特異的会合ではなく、オリゴヌクレオチドの共有結合を実証する。DNAで官能化した後、平均ゼータ電位を-15.8mVに変更した(図6c)。これにより、より多くの負電荷で溶液安定性が増強した。DNA修飾のレベルを、AF Cas9とProSNA Cas9との間の260nmでの吸光度の差を比較することによって決定した(図6d)。これらの結果は、Cas9のDNA官能化の成功を明確に示した。
良好な生体適合性は、生物学的応用の前提条件であるため、いくつかの細胞株の生存率を評価した。Cas9 SNAの細胞傷害性を、モデルとしてHaCat、HEK293T/EGFP、hMSC、及びRaw264.7細胞株を使用して調査した(図7a)。標準的なCCK-8を使用して、細胞生存率を決定した。Cas9 SNAの濃度は、インビトロ実験で使用される典型的な濃度を超えたが、細胞毒性は観察されなかった。Cas9 SNAの細胞質送達を、モデルとしてHaCat細胞株を使用して調査した。細胞を20nMのタンパク質で0~8時間インキュベートし、それらの取り込み性能をフローサイトメトリーによって決定した(図7b)。Cas9でインキュベートした細胞と比較して、Cas9 SNAは、細胞取り込みが約10倍増加したことを示した。Cas9 SNAの増強された細胞取り込みは、細胞表面スカベンジャー受容体の関与、続いて小窩媒介エンドサイトーシスに起因した。
次に、ゲノム編集におけるCas9 SNAの能力を評価した。ヒトゲノム内のDNase I高感受性部位を標的とするCas9 SNA、すなわち、比較的安全であり、ゲノム編集にアクセス可能であるCas9 SNAを、HEK293T/EGFP細胞に送達した。Surveyorアッセイは、39.2%のインデル頻度を明らかにした(図8a)。その後、まれな神経発達障害に関連する遺伝子GRIN2B内の部位(すなわち、GRIN2B)を標的とするCas9 SNAも決定し、42.5%のインデル頻度をもたらした(図8b)。増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)のコード領域を標的とするsgRNAを使用して、遺伝子サイレンシングにおけるCas9 SNAの能力も評価した。対応するインデル及びEGFPサイレンシング効率は、35.5%であった(図8c)。遺伝子サイレンシング性能は、フローサイトメトリーによるEGFP蛍光変化によっても確認され、効率は17.8%であった。これらの結果は、Cas9 SNAが非常に高い編集効率を達成したことを実証した。
結論として、CRISPR/Cas9 SNAは、効率的なゲノム編集及び遺伝子サイレンシングのために確立された。Cas9 SNAは、スカベンジャー受容体経路によって効果的に細胞に侵入した。更に、インビトロ研究は、Cas9 SNAが、良好な生体適合性を有する効率的なゲノム編集及び遺伝子サイレンシングをもたらしたことを実証した。この単純で汎用性のある細胞質送達アプローチは、遺伝子療法の生物医学的用途に拡張することができ、その優れた生体適合性は、遺伝子療法及び個別化医療における新しい道を開く。
実施例3
この実施例は、CRISPR/Cas9 ProSNAを使用した追加の実験を記載する。
この実施例は、CRISPR/Cas9 ProSNAを使用した追加の実験を記載する。
Cas9の設計、発現、及び精製
Cas9発現ベクターの構築。pET-MBP-NLS-Geo_st発現ベクター(Addgene Plasmid番号87703(Harrington et al.,Nat Commun.2017 Nov 10;8(1):1424.doi:10.1038/s41467-017-01408-4))を、Geo Cas9のN末端に3つの連続したGALAペプチド(3GALA)を挿入することによって更に操作した(図9)。使用される全ての配列を、表1に列挙する。GALA遺伝子配列をIntegrated DNA Technologiesから購入し、Golden Gateアセンブリ(GG)を使用してクローニングした。pET-MBP-NLS-Geo_stベクターを最初にPCRサーモサイクラー(ABI)で増幅し、続いてDpnI消化及びゲル精製によって元のプラスミド鋳型を除去した。続いて、3GALA遺伝子配列をGG-アセンブリによって増幅したベクターにサブクローニングした。構築したベクターを、エレクトロポレーションによってOne Shot(登録商標)BL21(DE3)に形質転換し、従来のSangerシーケンシングで確認し、3GALA Cas9ベクターを得た。Cas9のC末端は、核局在化シグナルを含有したことに留意されたい。融合タンパク質(配列番号24)のアミノ酸配列を以下に示す。
Cas9発現ベクターの構築。pET-MBP-NLS-Geo_st発現ベクター(Addgene Plasmid番号87703(Harrington et al.,Nat Commun.2017 Nov 10;8(1):1424.doi:10.1038/s41467-017-01408-4))を、Geo Cas9のN末端に3つの連続したGALAペプチド(3GALA)を挿入することによって更に操作した(図9)。使用される全ての配列を、表1に列挙する。GALA遺伝子配列をIntegrated DNA Technologiesから購入し、Golden Gateアセンブリ(GG)を使用してクローニングした。pET-MBP-NLS-Geo_stベクターを最初にPCRサーモサイクラー(ABI)で増幅し、続いてDpnI消化及びゲル精製によって元のプラスミド鋳型を除去した。続いて、3GALA遺伝子配列をGG-アセンブリによって増幅したベクターにサブクローニングした。構築したベクターを、エレクトロポレーションによってOne Shot(登録商標)BL21(DE3)に形質転換し、従来のSangerシーケンシングで確認し、3GALA Cas9ベクターを得た。Cas9のC末端は、核局在化シグナルを含有したことに留意されたい。融合タンパク質(配列番号24)のアミノ酸配列を以下に示す。
太字の配列(WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAAWEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAAWEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA(配列番号26))は、3GALAペプチドである
下線付きの配列(MRYKIGLDIGITSVGWAVMNLDIPRIEDLGVRIFDRAENPQTGESLALPRRLARSARRRLRRRKHRLERIRRLVIREGILTKEELDKLFEEKHEIDVWQLRVEALDRKLNNDELARVLLHLAKRRGFKSNRKSERSNKENSTMLKHIEENRAILSSYRTVGEMIVKDPKFALHKRNKGENYTNTIARDDLEREIRLIFSKQREFGNMSCTEEFENEYITIWASQRPVASKDDIEKKVGFCTFEPKEKRAPKATYTFQSFIAWEHINKLRLISPSGARGLTDEERRLLYEQAFQKNKITYHDIRTLLHLPDDTYFKGIVYDRGESRKQNENIRFLELDAYHQIRKAVDKVYGKGKSSSFLPIDFDTFGYALTLFKDDADIHSYLRNEYEQNGKRMPNLANKVYDNELIEELLNLSFTKFGHLSLKALRSILPYMEQGEVYSSACERAGYTFTGPKKKQKTMLLPNIPPIANPVVMRALTQARKVVNAIIKKYGSPVSIHIELARDLSQTFDERRKTKKEQDENRKKNETAIRQLMEYGLTLNPTGHDIVKFKLWSEQNGRCAYSLQPIEIERLLEPGYVEVDHVIPYSRSLDDSYTNKVLVLTRENREKGNRIPAEYLGVGTERWQQFETFVLTNKQFSKKKRDRLLRLHYDENEETEFKNRNLNDTRYISRFFANFIREHLKFAESDDKQKVYTVNGRVTAHLRSRWEFNKNREESDLHHAVDAVIVACTTPSDIAKVTAFYQRREQNKELAKKTEPHFPQPWPHFADELRARLSKHPKESIKALNLGNYDDQKLESLQPVFVSRMPKRSVTGAAHQETLRRYVGIDERSGKIQTVVKTKLSEIKLDASGHFPMYGKESDPRTYEAIRQRLLEHNNDPKKAFQEPLYKPKKNGEPGPVIRTVKIIDTKNQVIPLNDGKTVAYNSNIVRVDVFEKDGKYYCVPVYTMDIMKGILPNKAIEPNKPYSEWKEMTEDYTFRFSLYPNDLIRIELPREKTVKTAAGEEINVKDVFVYYKTIDSANGGLELISHDHRFSLRGVGSRTLKRFEKYQVDVLGNIYKVRGEKRVGLASSAHSKPGKTIRPLQSTRD(配列番号25)は、Cas9である。
太字で斜体の配列(PKKKRKV(配列番号23))は、NLSである。
下線付きの配列(MRYKIGLDIGITSVGWAVMNLDIPRIEDLGVRIFDRAENPQTGESLALPRRLARSARRRLRRRKHRLERIRRLVIREGILTKEELDKLFEEKHEIDVWQLRVEALDRKLNNDELARVLLHLAKRRGFKSNRKSERSNKENSTMLKHIEENRAILSSYRTVGEMIVKDPKFALHKRNKGENYTNTIARDDLEREIRLIFSKQREFGNMSCTEEFENEYITIWASQRPVASKDDIEKKVGFCTFEPKEKRAPKATYTFQSFIAWEHINKLRLISPSGARGLTDEERRLLYEQAFQKNKITYHDIRTLLHLPDDTYFKGIVYDRGESRKQNENIRFLELDAYHQIRKAVDKVYGKGKSSSFLPIDFDTFGYALTLFKDDADIHSYLRNEYEQNGKRMPNLANKVYDNELIEELLNLSFTKFGHLSLKALRSILPYMEQGEVYSSACERAGYTFTGPKKKQKTMLLPNIPPIANPVVMRALTQARKVVNAIIKKYGSPVSIHIELARDLSQTFDERRKTKKEQDENRKKNETAIRQLMEYGLTLNPTGHDIVKFKLWSEQNGRCAYSLQPIEIERLLEPGYVEVDHVIPYSRSLDDSYTNKVLVLTRENREKGNRIPAEYLGVGTERWQQFETFVLTNKQFSKKKRDRLLRLHYDENEETEFKNRNLNDTRYISRFFANFIREHLKFAESDDKQKVYTVNGRVTAHLRSRWEFNKNREESDLHHAVDAVIVACTTPSDIAKVTAFYQRREQNKELAKKTEPHFPQPWPHFADELRARLSKHPKESIKALNLGNYDDQKLESLQPVFVSRMPKRSVTGAAHQETLRRYVGIDERSGKIQTVVKTKLSEIKLDASGHFPMYGKESDPRTYEAIRQRLLEHNNDPKKAFQEPLYKPKKNGEPGPVIRTVKIIDTKNQVIPLNDGKTVAYNSNIVRVDVFEKDGKYYCVPVYTMDIMKGILPNKAIEPNKPYSEWKEMTEDYTFRFSLYPNDLIRIELPREKTVKTAAGEEINVKDVFVYYKTIDSANGGLELISHDHRFSLRGVGSRTLKRFEKYQVDVLGNIYKVRGEKRVGLASSAHSKPGKTIRPLQSTRD(配列番号25)は、Cas9である。
太字で斜体の配列(PKKKRKV(配列番号23))は、NLSである。
Cas9の産生及び精製。N末端3GALAペプチドを有する組換えCas9過剰発現ベクターを、電気ショックによりOne Shot(登録商標)BL21(DE3)に形質転換し、LB-アンピシリン寒天プレート(100μg/mLアンピシリン)上で一晩成長させた。得られた発現コロニーを、7mL(LB、100μg/mLアンピシリン)スターター培養物に接種し、これを37℃で一晩激しく振盪した。翌日、スターター培養物を750mLの2×YBTブロス(100μg/mLアンピシリン)に接種し、37℃で0.8の光学密度まで成長させ、その後、1mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドで遺伝子発現を誘導し、続いて17℃で一晩インキュベートした。細胞を採取し(6000g、15分間)、100mLの溶解緩衝液(20mMのHEPES、pH7.5RT、0.5mMのTCEP、500mMのNaCl、1mMのPMSF)に再懸濁し、次いで、高圧ホモジナイザーによって溶解した。溶解物画分を30000gで30分間遠心分離することにより清澄化し、結合緩衝液(20mMのHEPES、pH7.5 RT、500mMのNaCl)中で予備平衡化した5mLのBio-Scale(商標)Mini Profinity(商標)IMACカートリッジ(Bio-Rad)に充填した。結合したタンパク質を洗浄緩衝液(20mMのHEPES、pH7.5、500mMのNaCl、250mMのイミダゾール)によって溶出した。マルトース結合タンパク質を一晩TEVプロテイナーゼによって溶出したタンパク質から切断し、第2のMBP親和性ステップによって捕捉した。得られたタンパク質をヘパリンカラムに充填し、300~1250mMのNaClの勾配で溶出した。Cas9を含有する溶出液の画分を、貯蔵緩衝液(20mMのHEPES、pH7.5、5%のグリセロール、150mMのNaCl、1mMのTCEP)中で予備平衡化したBio-Scale(商標)Mini Bio-Gel(登録商標)P-6脱塩カートリッジによって精製し、濃度をNanoDrop 8000分光光度計(Thermo Scientific)によって測定した(図10)。タンパク質を、4℃の一定温度で精製し、液体窒素中で瞬間凍結し、-20℃で保存した。
オリゴヌクレオチド及びsgRNAの合成
オリゴヌクレオチドの合成及び精製。全てのホスホラミダイト及びDNA合成試薬をGlen Researchから入手した。この研究で使用される配列を表2に列挙する。DNA合成を、MerMade12オリゴヌクレオチド合成装置(MM12,Bio Automation Inc.、Texas,USA)又はABI394合成装置によって、10μmolのスケールで、制御された細孔ガラス(CPG)ビーズ上で行った。全てのオリゴヌクレオチドを、30%のNH4OHを使用して室温で一晩CPGビーズから脱保護した。次いで、Organomation(登録商標)Multivap(登録商標)Nitrogen Evaporatorを使用して、窒素流下でアンモニアを除去した。残りの溶液を0.2μMのフィルターを通して濾過して、CPGビーズを除去した。濾液の画分を逆相高性能液体クロマトグラフィー(RP-HPLC、Varian ProStar 210,Agilent Technologies Inc.、Palo Alto,CA,USA)によって精製して、産物を単離した。Agilent Dynamax Microsorb C4カラム及び45分にわたる0~75%Bの勾配(A=酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液、B=アセトニトリル)を使用した。収集した画分を凍結乾燥し、20%の酢酸に2時間再溶解し、切断したジメトキシトリチル基を酢酸エチル抽出によって除去した。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS;RapiFlex,Bruker)を使用して、2’,6’-ジヒドロキシアセトフェノン及びクエン酸水素ジアンモニウムをマトリックスとして使用して、オリゴヌクレオチドの質量を確認した。IDT Oligo Analyzer Toolから得られたオリゴヌクレオチドの吸光係数を使用して、UV-vis分光法Cary 5000 UV-vis分光光度計、Varian)を使用してλ=260nmで溶液吸光度を測定することによって、DNA濃度を決定した。
オリゴヌクレオチドの合成及び精製。全てのホスホラミダイト及びDNA合成試薬をGlen Researchから入手した。この研究で使用される配列を表2に列挙する。DNA合成を、MerMade12オリゴヌクレオチド合成装置(MM12,Bio Automation Inc.、Texas,USA)又はABI394合成装置によって、10μmolのスケールで、制御された細孔ガラス(CPG)ビーズ上で行った。全てのオリゴヌクレオチドを、30%のNH4OHを使用して室温で一晩CPGビーズから脱保護した。次いで、Organomation(登録商標)Multivap(登録商標)Nitrogen Evaporatorを使用して、窒素流下でアンモニアを除去した。残りの溶液を0.2μMのフィルターを通して濾過して、CPGビーズを除去した。濾液の画分を逆相高性能液体クロマトグラフィー(RP-HPLC、Varian ProStar 210,Agilent Technologies Inc.、Palo Alto,CA,USA)によって精製して、産物を単離した。Agilent Dynamax Microsorb C4カラム及び45分にわたる0~75%Bの勾配(A=酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液、B=アセトニトリル)を使用した。収集した画分を凍結乾燥し、20%の酢酸に2時間再溶解し、切断したジメトキシトリチル基を酢酸エチル抽出によって除去した。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS;RapiFlex,Bruker)を使用して、2’,6’-ジヒドロキシアセトフェノン及びクエン酸水素ジアンモニウムをマトリックスとして使用して、オリゴヌクレオチドの質量を確認した。IDT Oligo Analyzer Toolから得られたオリゴヌクレオチドの吸光係数を使用して、UV-vis分光法Cary 5000 UV-vis分光光度計、Varian)を使用してλ=260nmで溶液吸光度を測定することによって、DNA濃度を決定した。
sgRNAの設計及び合成。コンセンサス5’T7プロモーター結合部位に続いて20bpのsgRNA標的配列を有するsgRNAの合成dsDNA鋳型を、MEGAscript(商標)T7転写キット(ThermoFisher)を使用してインビトロで転写した。転写を、20mMのTris-HCl(pH8.0)、30mMのMgCl2、10mMのDTT、各5mMのNTP、100μg/mLのT7ポリメラーゼ、RNase Inhibitor(Promega)、及び100ngのDNA鋳型を含有する緩衝液中で行った。反応物を37℃でおよそ18時間インキュベートした。インビトロで転写されたRNAをエタノールで沈殿させ、水に再溶解し、sgRNA濃度を最終的にNano Drop8000分光光度計(Thermo Scientific)によって定量化し、液体窒素中で瞬間凍結し、-20℃で保存した。配列を表2に列挙する。DNase I-sgRNA、GRIN2B-sgRNA、Grin2b-sgRNA、及びEGFP-sgRNAを使用して、DNase I、GRIN2B、Grin2b、及びEGFP部位におけるゲノム編集又は遺伝子サイレンシングのためのsgRNAを生成した。
Cas9 ProSNAの合成及び特性評価
Alexa Fluor647(AF647)との反応。Cas9タンパク質を、アミノ活性Alexa Fluor(商標)647 NHSエステル(Thermo Fisher Scientific)で最初に修飾した(図11)。Alexa Fluor(商標)647 NHSエステルをDMSOに溶解して、UV-可視吸光度分光法(ε647=270,000M-1cm-1)によって決定されるように、10mMのストック溶液を得た。5当量過剰のAF-647をCas9タンパク質の溶液に添加し、反応物を900rpmで一晩振盪した。過剰なAlexa Fluor647を650nmで監視し、Bio-Rad FPLCでサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。タンパク質当たりのAlexa Fluor647修飾の数を、Cary-500 UV-vis分光光度計、及びそれらのそれぞれの吸光係数(εCas9=280nmで204,470M-1cm-1、260nmで324,610M-1cm-1、εAF-647=650nmで270,000)で収集した(図12)。
Alexa Fluor647(AF647)との反応。Cas9タンパク質を、アミノ活性Alexa Fluor(商標)647 NHSエステル(Thermo Fisher Scientific)で最初に修飾した(図11)。Alexa Fluor(商標)647 NHSエステルをDMSOに溶解して、UV-可視吸光度分光法(ε647=270,000M-1cm-1)によって決定されるように、10mMのストック溶液を得た。5当量過剰のAF-647をCas9タンパク質の溶液に添加し、反応物を900rpmで一晩振盪した。過剰なAlexa Fluor647を650nmで監視し、Bio-Rad FPLCでサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。タンパク質当たりのAlexa Fluor647修飾の数を、Cary-500 UV-vis分光光度計、及びそれらのそれぞれの吸光係数(εCas9=280nmで204,470M-1cm-1、260nmで324,610M-1cm-1、εAF-647=650nmで270,000)で収集した(図12)。
表面アクセス可能なリジンとNHS-PEG4-アジドとの反応。表面アミンを、反対側の末端で、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル及びアジド部分を含有するテトラエチレングリコールリンカーと反応させることによってアジドに変換した(NHS-PEG4-N3、Thermo Scientific)(図13)。Cas9-AF647の溶液に、600当量のNHS-PEG4-アジド架橋剤を添加した。反応物を4℃で一晩振盪した(900rpm)。2時間後、Bio-Rad FPLCでサイズ排除クロマトグラフィーによって非コンジュゲートアジドリンカーを除去した。アジドリンカー修飾の数を、Bruker AutoFlex-IIIにおいてマトリックスとしてシナピン酸(Thermo Fisher Scientific)を使用して、MALDI-MSによって特定した。各リンカーコンジュゲーションは、275m/zの質量増加をもたらす(図14)。
DNAコンジュゲーション。DNAコンジュゲーションは、アジド官能化Cas9精製直後に行った。300倍過剰のDBCO末端DNAは、クリック反応によって反応したCas9-アジドであった。この反応溶液を、900rpmで振盪しながら4℃で72時間インキュベートした。3日後、未反応のDNA鎖を、Bio-Rad FPLCでサイズ排除クロマトグラフィー650によって除去した。タンパク質当たりのDNAの数は、コンジュゲートされたAlexaFluor色素の吸光度に基づいて、UV-可視吸光度分光法によって決定された(図15)。吸光度が260nmで重複するため、AF-647フルオロフォアを使用して、タンパク質の濃度を計算した。タンパク質吸光度を差し引いた後、DNAの濃度を、オンラインIDT oligo analyzer(ε260=276,000M-1cm-1)を使用して計算された吸光係数に基づいて決定した(図16)。
Cas9 SNAの生体安定性分析。DNAの表面コンジュゲーションがプロテイナーゼ分解からタンパク質を保護できるかどうかを実証するために、天然Cas9タンパク質及びCas9 ProSNAの両方をトリプシン(プロテイナーゼ)とともにインキュベートし、SDS-PAGEゲルを行った。反応溶液をNEB緩衝液2中で37℃で1時間にわたってインキュベートした。トリプシンとともにインキュベートした天然タンパク質バンドは、10分後に顕著に減少したことが観察された。しかしながら、Cas9 ProSNAの分解は観察されず、DNAシェルがトリプシンによる実質的な分解からタンパク質を保護することができたことを示唆している(図17)。
Cas9 ProSNAのインビトロ調査
細胞生存率。細胞生存率は、標準のCell Counting Kit-8(CCK-8)アッセイで決定した。CCK-8試薬は、生細胞に自由に侵入することができるWST-8(2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム、一ナトリウム塩)を含有する。細胞に侵入すると、WST-8(弱蛍光化合物)は、細胞デヒドロゲナーゼによってオレンジ色のホルマザン色素に還元される。具体的には、細胞を10%のFBSのDMEM培地中で一晩、96ウェル細胞培養プレート(ウェル当たり1×104)に播種した。次に、細胞培養培地を、異なる濃度のCas9 ProSNAを含有する200μLの培地に交換し、続いて更に24時間インキュベートした。その後、細胞を1×PBSで洗浄し、PBS中10%のCCK-8に交換した。細胞を更に30分間インキュベートした。最後に、450nmでのCCKの吸光度をBioTek Synergy H4 Hybrid Plate Readerによって測定した。実験は3つ組で行った。細胞生存率も、カルセイン-AM/PI染色によって評価した。簡単に説明すると、細胞を24ウェルプレート(ウェル当たり5×104)に播種し、一晩培養し、続いてCas9 ProSNAを含有する培地で24時間インキュベートした。その後、細胞を、2μg/mLのカルセイン-AM及び3μg/mLのPIを含有する500μLのPBSで一緒に処理した。生細胞又は死細胞を、カルシン-AMについては488nm、PIについては535nmの励起で、Biotek Synergy H4 Hybrid Plate Readerによって観察した(図18)。
細胞生存率。細胞生存率は、標準のCell Counting Kit-8(CCK-8)アッセイで決定した。CCK-8試薬は、生細胞に自由に侵入することができるWST-8(2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム、一ナトリウム塩)を含有する。細胞に侵入すると、WST-8(弱蛍光化合物)は、細胞デヒドロゲナーゼによってオレンジ色のホルマザン色素に還元される。具体的には、細胞を10%のFBSのDMEM培地中で一晩、96ウェル細胞培養プレート(ウェル当たり1×104)に播種した。次に、細胞培養培地を、異なる濃度のCas9 ProSNAを含有する200μLの培地に交換し、続いて更に24時間インキュベートした。その後、細胞を1×PBSで洗浄し、PBS中10%のCCK-8に交換した。細胞を更に30分間インキュベートした。最後に、450nmでのCCKの吸光度をBioTek Synergy H4 Hybrid Plate Readerによって測定した。実験は3つ組で行った。細胞生存率も、カルセイン-AM/PI染色によって評価した。簡単に説明すると、細胞を24ウェルプレート(ウェル当たり5×104)に播種し、一晩培養し、続いてCas9 ProSNAを含有する培地で24時間インキュベートした。その後、細胞を、2μg/mLのカルセイン-AM及び3μg/mLのPIを含有する500μLのPBSで一緒に処理した。生細胞又は死細胞を、カルシン-AMについては488nm、PIについては535nmの励起で、Biotek Synergy H4 Hybrid Plate Readerによって観察した(図18)。
フローサイトメトリーによるHaCat細胞における細胞取り込み。HaCaT細胞を48ウェルプレート(ウェル当たり60,000)に播種し、10%のウシ胎仔血清(FBS)及び1%のペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM中で一晩培養した。その後、培養培地をCas9 ProSNA又はCas9 AF647を含有するOPTI-MEMに交換して、異なる時間間隔(0.5時間、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間)の20nMの最終濃度を得た。各処理の終了時に、細胞を、1×PBS、300uL(トリプシン処理)(Gibco)、300uLの1×PBSで洗浄し、300Gで5分間遠心分離した後、1mLのPBS中に再懸濁した。1μLの生死色素を細胞懸濁液に添加した。30分後、細胞を遠心分離によって収集し、4%のパラホルムアルデヒド(Thermo Fisher Scientific)に固定した。次いで、Becton Dickinson LSR IIを使用してフローサイトメトリーを行い、試料当たり10,000の単一細胞事象の蛍光(励起640nm、発光655~685nm)を測定した。生のFCSファイルは、前方及び側方の散乱強度に基づいてゲートされ、FlowJoで分析された(図19)。
細胞内共焦点顕微鏡法。Cas9 ProSNAの細胞内送達を共焦点レーザー走査顕微鏡(Zeiss LSM 810顕微鏡)によって評価した。Cas9 ProSNA又はCas9 AF647のエンドソーム脱出を調査するために、HaCat細胞(ウェル当たり1×104)をホウケイ酸8チャンバーカバーガラススライド(Nalge Nunc International)に播種した。8時間後、細胞を37℃でリソソーム色素(CellLight(商標)リソソーム-GFP、BacMam 2.0)とともにインキュベートし、異なる時間間隔でCas9 ProSNA又はCas9 AF647(20nM)を含有する500μLのOptiMEMとともにインキュベートし、続いてPBSで洗浄し、核色素(Hoechst、1μg/mL)で10分間室温で染色した後、4%のPFAで10分間細胞を固定した。その後、生細胞を、それぞれ、Hoechstについては405nm、Lysosomes-GFPについては488nm、AF647標識Cas9 ProSNA又はCas9 AF647については561nmで、蛍光顕微鏡によって画像化した。核輸送効率は、共焦点顕微鏡法によって、AF647によって重複した核の割合として決定され、各試料について約100個の細胞を分析した(n=3)(図20)。
Surveyorアッセイ(図21)。HaCat、hBMSC、RAW264.7、及びA549/EGFP細胞を48ウェルプレート(ウェル当たり5×104細胞)に播種し、37℃で一晩培養した。組み立てられたCas9 ProSNA(50nM、ヒトDNase I高活性部位:
ヒトGRIN2B部位:
相同性マウスGrin2b部位:
及びEGFP部位:
(下線はゲノム編集標的を示す)を標的とする)と、OPTIMEM中で4時間インキュベートした後、細胞を新鮮な培地に交換し、更に3日間培養した。次いで、Quick Extraction Solution(Epicentre)を使用してゲノムDNA抽出のために細胞を採取し、続いてPCRによって増幅した。idleアッセイのために、250ngのDNA抽出物を、19μLの総体積で、2μLのNEBuffer2(NEB)と組み合わせて変性させ、次いで、95℃で5分間、2℃/秒で95~85℃、0.2℃/秒で85~20℃の熱循環で再アニーリングした。再アニーリングしたDNAを、1μLのT7エンドヌクレアーゼI(10U/μL、NEB)とともに、37℃で15分間インキュベートした。10μLの50%のグリセロールをT7エンドヌクレアーゼ反応に添加し、200Vで30分間電気泳動したPAGEゲル(Bio-Rad)上で12μLを分析した。Cas9誘導切断バンド及び切断されていないバンドを使用して、ImageJを使用してゲノム編集効率を計算した。
Lipofectamine CRISPRMAX Cas9トランスフェクション。Lipofectamine CRISPRMAXトランスフェクション試薬を、提供されたトランスフェクションプロトコルに従って、Cas9-sgRNA複合体を細胞にトランスフェクションするために用いた。簡単に説明すると、1μLのCas9 Plus試薬を、Cas9タンパク質(500nM)及びsgRNA(1μM)を含有する25μLのOpti-MEM培地に添加し、続いて室温で5分間インキュベートした(チューブ1)。更に、1.5μLのlipofectamine CRISPRMAX試薬を25μLのOpti-MEM培地に添加し、更に室温で5分間インキュベートした(チューブ2)。その後、チューブ1からのCas9-sgRNA Plus混合物をチューブ2からのlipofectamine CRISPRMAX溶液と混合し、続いて室温で10分間インキュベーションした。その後、50μLの調製したCas9-sgRNAトランスフェクション複合体を各ウェルに滴下した(48ウェルプレート、ウェル当たり5×104)。
インビトロ遺伝子サイレンシング。EGFPを絶えず発現するHEK293T細胞(HEK293T/EGFP)を用いて、Cas9 ProSNAの遺伝子サイレンシング効果を評価した。HEK293T/EGFP細胞を48ウェルプレート(ウェル当たり5×104、0.5mL)に播種し、37℃で一晩培養した。次いで、培地をOPTI-MUM中2%のFBSに5時間変更する。POTI-MUM中のCas9 ProSNAとともに6時間インキュベートした後、EGFPのコード領域を24時間標的化し、細胞を新鮮な培地に交換し、3日間培養した。次いで、細胞をトリプシン-EDTA溶液で消化し、フローサイトメトリー(BD FACSCANTO II、EGFPのチャネル)のために0.3mLのPBS中に再懸濁した。全てのデータを、FCS Expressフローサイトメトリーデータ分析を使用して分析した(図22)。
この実施例は、Cas9 ProSNAが細胞内在化を最大およそ45倍向上させたことを示した。更に、d(GGT)10配列を用いることにより、およそ45.4%の優れた生体適合性、プロテイナーゼ生体安定性、及び優れたゲノム編集インデル効率を有するゲノム編集ツールの容易な生成が可能となった。これらの観察は、細胞機能が特異的かつ一過性に操作され得るように、普遍的に使用され得る核酸官能化(生体)巨大分子カーゴの設計につながる。
実施例4
この実施例は、CRISPR/Cas9 ProSNAを使用した追加の実験を記載する。
この実施例は、CRISPR/Cas9 ProSNAを使用した追加の実験を記載する。
Alexa Fluor(商標)647の官能化。Cas9タンパク質を、アミノ活性Alexa Fluor(商標)647 NHSエステル(AF647、Thermo Fisher Scientific)で修飾した。AF647をDMSOに溶解して、UV-可視分光光度法(ε647=270,000M-1cm-1)によって決定されるように、10mMのストック溶液を得た。5過剰当量のAF647をCas9タンパク質の溶液に添加し、反応物を900rpmで一晩振盪した。過剰なAF647を、Bio-Rad FPLCでサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。AF647修飾タンパク質のスペクトルをCary-500 UV-可視分光光度計(Molecular Devices Inc、USA)で収集し、修飾の数をそれぞれの吸光係数を使用して計算した(Cas9:280nmでε280=204,470M-1cm-1及び260nmでε260=324,610M-1cm-1、AF647:650nmでε650=270,000)。(図23)
AF647フルオロフォア修飾Cas9のUV-可視スペクトル。スペクトルは、Cary5000分光光度計で周囲温度で得た。タンパク質及びAF647の濃度を、それぞれ280nm及び650nmでの吸光度から計算した。AF647フルオロフォアを使用して、DNAコンジュゲーション後のタンパク質の濃度を計算し、フローサイトメトリー及び共焦点画像化実験の両方で細胞取り込みを追跡した。(図23)
表面アクセス可能なリジンとNHS-PEG4-アジドとの反応。表面リジンを、反対側の末端で、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル及びアジド部分を含有するテトラエチレングリコールリンカーと反応させることによってアジドに変換した(NHS-PEG4-N3、Thermo Scientific)。Cas9-AF647の溶液に、600当量のNHS-PEG4-アジドリンカーを添加した。2時間後、非コンジュゲートリンカーを、Bio-Rad FPLCでサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。アジド修飾の数を、マトリックスとしてシナピン酸(Thermo Fisher Scientific)を使用して、MALDI-MSによって特定した。各リンカーコンジュゲーションは、275m/zの質量増加をもたらした。(図23)
DNAコンジュゲーション。DNAコンジュゲーション反応は、アジド修飾Cas9の精製直後に行った。300倍過剰のDBCO末端DNAを、クリック反応によってCas9-AF647-アジドと反応させた。この反応溶液を4℃で3日間インキュベートした。3日後、未反応のDNA鎖をBio-Rad FPLCでサイズ排除クロマトグラフィー(ENrich(商標)SEC650カラム、Bio-Rad Inc.、USA)によって除去した。タンパク質当たりのDNA修飾の数は、UV-可視分光光度法によって決定された。両方の吸光度が260nmで重複するため、AF647フルオロフォアを使用して、DNAコンジュゲーション後のタンパク質の濃度を計算した。タンパク質吸光度を差し引いた後、DNAの濃度を、Integrated DNA Technologies oligo analyzer(ε260=276,000M-1cm-1)から得られた吸光係数に基づいて決定した。(図23)
UV-可視分光光度法によるCas9 ProSNA上のDNA鎖の数の決定。スペクトルをCary5000分光光度計で収集した。タンパク質及びDNA濃度を、それぞれ650nm及び260nmでの吸光度から計算した。(図23)
円二色性分光法。円二色性(CD)を使用して、DNA官能化後の無傷のCas9タンパク質構造を特性評価した。全ての試料をPBSで緩衝液交換し、CDスペクトルをJasco J-1700分光光度計で室温で収集した。Cas9及びDNA試料を、それぞれ500nM及び7.13μMの濃度で調製した。Cas9 ProSNAの理論スペクトルは、Cas9-AF647及び遊離DNAのスペクトルを合計することによって計算した。Cas9 ProSNAの収集されたスペクトルは、計算されたスペクトルと一致した。(図24)
Cas9 ProSNAの生体安定性分析。ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を使用して、DNAの表面コンジュゲーションが、Cas9タンパク質をトリプシン分解から保護することができるかどうかを調査した。天然Cas9タンパク質及びCas9 ProSNAの両方を37℃でトリプシンとともにインキュベートし、異なる時点にわたる分析のために30μLのタンパク質を充填した。Cas9タンパク質に対応するバンドは、トリプシンとともに10分間ほどインキュベートすると顕著に減少したことが観察された。しかしながら、Cas9 ProSNAは、DNAコンジュゲーションにより、この研究の時間経過においてほとんど分解を示さなかった。(図25)
細胞生存率。細胞生存率は、標準のCell Counting Kit-8(CCK-8)アッセイで決定した。CCK-8試薬は、生細胞に自由に侵入することができる2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム(WST-8)を含有した。細胞に侵入すると、WST-8は、細胞デヒドロゲナーゼによってオレンジ色のホルマザン色素に還元された(460nmでの吸光度)。具体的には、細胞を10%のFBSを含むDMEM培地中で一晩、96ウェル細胞培養プレート(ウェル当たり104)に播種した。次に、細胞培養培地を、異なる濃度のCas9 ProSNAを含有する新鮮な培地に交換し、更に24時間インキュベートした。次に、細胞をPBSで洗浄し、10%のCCK-8に交換した。細胞を更に30分間インキュベートし、460nmの吸光度値をBioTek Synergy H4 Hybrid Plate Readerによって測定した。全ての実験は、独立した3つ組で行った。細胞生存率も、生/死染色によって評価した。簡単に説明すると、細胞を24ウェルプレート(ウェル当たり5×104)に播種し、一晩培養し、続いてCas9 ProSNAを含有する細胞培地中で24時間インキュベートした。その後、細胞をカルセインアセトキシメチル(2μg/mL)及びヨウ化プロピジウム(3μg/mL)で一緒に処理した。生細胞又は死細胞を、カルシン-AMについては488nm、ヨウ化プロピジウムについては535nmの励起で、Biotek Synergy H4 Hybrid Plate Reader(BioRad、USA)によって観察した。(図26)
フローサイトメトリーによるHaCat細胞における細胞取り込み。HaCaT細胞を48ウェルプレート(ウェル当たり60,000)に播種し、10%のウシ胎仔血清(FBS)並びに1%のペニシリン及びストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。その後、細胞培養培地を、Cas9 ProSNA又はCas9-AF647を含有するOpti-MEMに交換し、異なる時間間隔(0.5時間、1時間、2時間、4時間、6時間、及び8時間)の20nMの最終濃度を得た。各処理の終了時に、細胞をPBS(トリプシン処理)(Gibco)で洗浄し、800×gで5分間遠心分離し、固定緩衝液(BioLegend)で固定した。次いで、Becton Dickinson LSR IIを使用してフローサイトメトリーを行い、試料当たり少なくとも10,000の単一細胞事象の蛍光(励起640nm、発光655~685nm)を測定した。全ての実験は3つ組で行った。(図27)
共焦点顕微鏡法による細胞内送達分析。Cas9 ProSNAの細胞内送達を共焦点レーザー走査顕微鏡(Zeiss LSM 810、ドイツ製)によって評価した。Cas9 ProSNA又はCas9 AF647のエンドソーム脱出を調査するために、HaCat細胞(ウェル当たり104)をホウケイ酸8チャンバーカバーガラススライド(Nalge Nunc International)に播種した。8時間後、異なる時間間隔にわたってCas9 ProSNA又はCas9 AF647(20nM)を含有するエンドソーム染色(CellLight(商標)Late Endosomes-GFP,BacMam 2.0)とともに細胞をインキュベートした。過剰なタンパク質をPBSで洗浄し、核をHoechst(1μg/mL)で1分間染色した後、4%のパラホルムアルデヒド(Thermo Fisher Scientific)で15分間細胞を固定した。その後、細胞を、Hoechstについては405nm、Lysosomes-GFPについては488nm、Cas9 ProSNA又はCas9 AF647については561nmで、共焦点蛍光顕微鏡によって同時に画像化した。核輸送効率は、AF647と重複する核を計数する共焦点顕微鏡画像から決定され、各試料について約100個の細胞を分析した。(図29)
ゲノム編集インデル効率を検出するSurveyor アッセイ。HaCat、hBMSC、RAW264.7、及びHEK293T/EGFP細胞を48ウェルプレート(ウェル当たり5×104細胞)に播種し、一晩培養した。Opti-MEM中の組み立てられたCas9 ProSNA-sgRNA複合体(50nM)で4時間トランスフェクションした後、細胞を新鮮な培地に交換し、更に3日間培養した。次に、ゲノムDNA抽出キット(Quick Extraction Solution、Epicentre)を使用して、製造業者のプロトコルに従って、細胞からゲノムDNAを抽出した。簡単に説明すると、細胞をQuickExtract溶液中に再懸濁し、65℃で15分間及び98℃で6分間インキュベートした。次いで、5μLの抽出溶液を、標的領域プライマーとのPCR反応によって増幅した。idle形成アッセイのために、5μLのPCR産物のアリコートを、19μLの総体積でT7エンドヌクレアーゼI(T7EI)緩衝液と混合し変性させ、次いで、熱循環で再アニーリングして、ヘテロ二重鎖形成(95℃で10分間、-2℃/秒の勾配で95~85℃、-0.2℃/秒の勾配で85~20℃)を可能にした。再アニーリング産物を1μLのT7EI(10U/μL、NEB)とともに15分間インキュベートし、4~15%のポリアクリルアミドゲル(BioRad)で分析した。Cas9誘導切断バンド及び切断されていないバンドをGel Docゲル画像化システム(BioRad)で視覚化し、ImageJデンシトメトリー分析を使用して定量化した。図21に示されるように、ゲノム編集効率スキームを決定した。結果を図30に示す。
Lipofectamine CRISPRMAX Cas9-sgRNA複合体トランスフェクション。Lipofectamine(商標)CRISPRMAX(商標)トランスフェクション試薬を使用して、製造のトランスフェクションプロトコルに従って、Cas9-sgRNA複合体をRAW 264.7細胞にトランスフェクトした。簡単に説明すると、Cas9 Plus試薬を、Cas9タンパク質及びsgRNAを含有する培地に添加し、続いて、室温で5分間インキュベートして、Cas9-sgRNA複合体を形成した。次いで、lipofectamine CRISPRMAX試薬をOpti-MEM培地と混合し、更に5分間インキュベートした。その後、Cas9-sgRNA混合物をlipofectamine CRISPRMAX溶液と混合し、続いて、10分間インキュベートした。その後、50μLの調製したCas9-sgRNAトランスフェクション複合体(50nMの最終濃度)を添加し、細胞培地に4時間混合した。Cas9-sgRNA複合体の処理後、細胞を対応する培地中で3日間培養した。次いで、後続のSurveyorアッセイのために細胞を採取した。結果を図31に示す。
インビトロ遺伝子サイレンシング。EGFP遺伝子を含有するHEK293T細胞(HEK293T/EGFP)を用いて、Cas9 ProSNAの遺伝子サイレンシング効果を評価した。HEK293T/EGFP細胞を48ウェルプレート(ウェル当たり5×104)に播種し、一晩培養した。Opti-MEM中のEGFPのコード領域を標的とするCas9 ProSNA(50nM)と4時間インキュベートした後、細胞を新鮮な培地に交換し、更に3日間培養した。次いで、細胞をトリプシン-EDTA溶液で消化し、生死細胞懸濁液中に再懸濁した。30分後、細胞をPBSで洗浄し、フローサイトメトリー(Becton Dickinson LSR II、EGFPのチャネル)のために固定した。全ての実験は、独立した3つ組で行った。結果を図32に示す。
Claims (82)
- タンパク質-コア球状核酸(ProSNA)であって、
(a)遺伝子編集タンパク質を含むタンパク質コアと、
(b)前記タンパク質コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、タンパク質-コア球状核酸。 - 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、前記タンパク質コアに共有結合している、請求項1に記載のProSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、リンカーを介して前記タンパク質コアに結合している、請求項2に記載のProSNA。
- 前記リンカーが、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、無痕跡型リンカー、又はそれらの組み合わせである、請求項3に記載のProSNA。
- 前記リンカーが、カルバミン酸アルキレンジチオレートリンカーである、請求項3又は4に記載のProSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドが、タンパク質-コア-NH-C(O)-O-C2-5アルキレン-S-S-C2-7アルキレン-オリゴヌクレオチド、又はタンパク質-コア-NH-C(O)-O-CH2-Ar-S-S-C2-7アルキレン-オリゴヌクレオチドを含み、Arが、メタ又はパラ置換フェニルを含む、請求項5に記載のProSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドが、タンパク質-コア-NH-C(O)-O-C(ZA)(ZB)C1-4アルキレン-C(XA)(XB)-S-S-C(YA)(YB)C1-6アルキレン-オリゴヌクレオチドを含み、ZA、ZB、XA、XB、YA、及びYBが、それぞれ独立して、H、Me、Et、又はiPrである、請求項5に記載のProSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドが、タンパク質-コア-NH-C(O)-O-C(XA)(XB)-Ar-S-S-C(YA)(YB)C2-6アルキレン-オリゴヌクレオチドを含み、XA、XB、YA、及びYBが、それぞれ独立して、H、Me、Et、又はiPrである、請求項5に記載のProSNA。
- 前記リンカーが、アミドアルキレンジチオレートリンカーである、請求項3に記載のProSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドが、タンパク質-コア-NH-C(O)-C2-5アルキレン-S-S-C2-7アルキレン-オリゴヌクレオチドを含む、請求項9に記載のProSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドが、タンパク質-コア-NH-C(O)-C1-4アルキレン-C(XA)(XB)-S-S-C(YA)(YB)C1-6アルキレン-オリゴヌクレオチドを含み、XA、XB、YA、及びYBが、それぞれ独立して、H、Me、Et、又はiPrである、請求項9に記載のProSNA。
- 前記リンカーが、アミドアルキレンチオエーテルリンカーである、請求項3に記載のProSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドが、タンパク質-コア-NH-C(O)-C2-4アルキレン-N-スクシンイミジル-S-C2-6アルキレン-オリゴヌクレオチドを含む、請求項12に記載のProSNA。
- 球状核酸(SNA)であって、
(a)ナノ粒子コアと、
(b)前記ナノ粒子コアの外側表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルと、
(c)遺伝子編集タンパク質と、を含む、球状核酸。 - 前記ナノ粒子コアが、リポソームコア又は脂質ナノ粒子コアである、請求項14に記載のSNA。
- 前記脂質ナノ粒子コアが、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートを含む、請求項15に記載のSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、前記脂質-PEGコンジュゲートを介して前記脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している、請求項16に記載のSNA。
- 前記遺伝子編集タンパク質が、前記脂質ナノ粒子コアに封入されている、請求項15~17のいずれか一項に記載のSNA。
- 請求項1~13のいずれか一項に記載のProSNAが、前記脂質ナノ粒子コアに封入されている、請求項15~18のいずれか一項に記載のSNA。
- リボ核タンパク質(RNP)複合体が、前記脂質ナノ粒子コアに封入され、前記RNPが、前記遺伝子編集タンパク質、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)RNA(crRNA)、及びトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含む、請求項15~18のいずれか一項に記載のSNA。
- 前記リポソームコアが、複数の脂質基を含む、請求項15に記載のSNA。
- 前記遺伝子編集タンパク質が、前記リポソームコアに封入されている、請求項15又は21に記載のSNA。
- 請求項1~13のいずれか一項に記載のProSNAが、リポソームナノ粒子コアに封入されている、請求項22に記載のSNA。
- リボ核タンパク質(RNP)複合体が、前記脂質ナノ粒子コアに封入され、前記RNPが、前記遺伝子編集タンパク質、CRISPR RNA(crRNA)、及びトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含む、請求項15又は21に記載のSNA。
- 前記複数の脂質基が、脂質のホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジルエタノールアミンファミリーからなる群から選択される脂質を含む、請求項21~24のいずれか一項に記載のSNA。
- 前記脂質が、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1,2-ジミリストイル-sn-ホスファチジルコリン(DMPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-ホスファチジルコリン(POPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1’-rac-グリセロール)(DSPG)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1’-rac-グリセロール)(DOPG)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、1,2-ジ-(9Z-オクタデセノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、及び1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPPE)からなる群から選択される、請求項25に記載のSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドが、脂質アンカー基を介して前記リポソーム又は前記脂質ナノ粒子コアの前記外部に結合している、請求項14~26のいずれか一項に記載のSNA。
- 前記脂質アンカー基が、前記少なくとも1個のオリゴヌクレオチドの5’終端又は3’終端に結合している、請求項27に記載のSNA。
- 前記脂質アンカー基が、トコフェロール又はコレステロールである、請求項27又は28に記載のSNA。
- 前記遺伝子編集タンパク質が、CRISPR関連タンパク質(Cas)である、請求項1~13のいずれか一項に記載のProSNA又は請求項14~29のいずれか一項に記載のSNA。
- 前記Casが、Cas9、Cas12、Cas13、又はそれらの組み合わせである、請求項30に記載のProSNA又はSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドが、その5’終端及び/又は3’終端でジベンゾシクロオクチル(DBCO)で修飾される、請求項1~31のいずれか一項に記載のProSNA又はSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、又はそれらの組み合わせを含む、請求項1~32のいずれか一項に記載のProSNA又はSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオチドである、請求項1~33のいずれか一項に記載のProSNA又はSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約2~約100個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項1~34のいずれか一項に記載のProSNA又はSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約10~約80個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項35に記載のProSNA又はSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約5~約50個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項35に記載のProSNA又はSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約5~約20個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項35に記載のProSNA又はSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約14個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項35に記載のProSNA又はSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約15個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項35に記載のProSNA又はSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、約5~約100ヌクレオチド長である、請求項1~40のいずれか一項に記載のProSNA又はSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、約10~約50ヌクレオチド長である、請求項41に記載のProSNA又はSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の1個以上のオリゴヌクレオチドが、(GGX)nヌクレオチド配列を含み、配列中、nは2~20であり、Xは核酸塩基(A、C、T、G、又はU)である、請求項1~42のいずれか一項に記載のProSNA又はSNA。
- 前記(GGX)nヌクレオチド配列が、前記1個以上のオリゴヌクレオチドの5’終端にある、請求項43に記載のProSNA又はSNA。
- 前記(GGX)nヌクレオチド配列が、前記1個以上のオリゴヌクレオチドの3’終端にある、請求項43に記載のProSNA又はSNA。
- 前記(GGX)nヌクレオチド配列が、(GGT)nヌクレオチド配列である、請求項43~45のいずれか一項に記載のProSNA又はSNA。
- 前記ProSNA又はSNAの直径が、約1ナノメートル(nm)~約500nmである、請求項1~46のいずれか一項に記載のProSNA又はSNA。
- 前記SNAの直径が、約50ナノメートル以下である、請求項14~47のいずれか一項に記載のSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドが、標的化オリゴヌクレオチドである、請求項1~47のいずれか一項に記載のProSNA若しくはSNA、又は請求項48に記載のSNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、阻害性オリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、遺伝子編集因子基質DNA若しくはRNA、又はそれらの組み合わせを含む、請求項1~47のいずれか一項に記載のProSNA若しくはSNA、又は請求項48に記載のSNA。
- 前記阻害性オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、アプタマー、短いヘアピンRNA(shRNA)、DNAザイム、又はアプタザイムである、請求項50に記載のProSNA又はSNA。
- 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、CpGモチーフ含有オリゴヌクレオチド、二本鎖DNAオリゴヌクレオチド、又は一本鎖RNAオリゴヌクレオチドである、請求項50に記載のProSNA又はSNA。
- 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドのそれぞれが、toll様受容体(TLR)アゴニストである、請求項50に記載のProSNA又はSNA。
- 前記TLRが、toll様受容体1(TLR1)、toll様受容体2(TLR2)、toll様受容体3(TLR3)、toll様受容体4(TLR4)、toll様受容体5(TLR5)、toll様受容体6(TLR6)、toll様受容体7(TLR7)、toll様受容体8(TLR8)、toll様受容体9(TLR9)、toll様受容体10(TLR10)、toll様受容体11(TLR11)、toll様受容体12(TLR12)、及びtoll様受容体13(TLR13)からなる群から選択される、請求項53に記載のProSNA又はSNA。
- 請求項1~13、30~47、又は49~54のいずれか一項に記載の複数のタンパク質-コア球状核酸(ProSNA)を含む、組成物。
- ガイドRNAを更に含む、請求項55に記載の組成物。
- 前記ProSNAのうちの少なくとも2つが、異なるタンパク質コアを含む、請求項55又は56に記載の組成物。
- 請求項14~54のいずれか一項に記載の複数の球状核酸(SNA)を含む、組成物。
- 前記SNAのうちの少なくとも2つが、異なるナノ粒子コアを含む、請求項57に記載の組成物。
- 遺伝子編集タンパク質を細胞に送達する方法であって、前記細胞を、請求項1~13、30~47、又は49~54のいずれか一項に記載のProSNAと接触させることを含む、方法。
- 遺伝子編集タンパク質を細胞に送達する方法であって、前記細胞を、請求項55~57のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
- 遺伝子編集タンパク質を細胞に送達する方法であって、前記細胞を、請求項14~54のいずれか一項に記載のSNAと接触させることを含む、方法。
- 遺伝子編集タンパク質を細胞に送達する方法であって、前記細胞を、請求項58又は59に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
- 対象において障害を治療、改善、及び/又は予防する方法であって、前記対象に、有効量の(i)請求項1~13、30~47、若しくは49~54のいずれか一項に記載のProSNA、(ii)請求項14~54のいずれか一項に記載のSNA、(iii)請求項55~59に記載の組成物、又は(iv)それらの組み合わせを投与することを含む、方法。
- 前記障害が、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、遺伝性疾患、心血管疾患、又はそれらの組み合わせである、請求項64に記載の方法。
- 以下のように、N末端からC末端に配置された、以下:
(i)1つ以上のGALAペプチド、
(ii)遺伝子編集タンパク質、及び
(iii)核局在化シグナル(NLS)、を含む、融合タンパク質。 - 前記1つ以上のGALAペプチドが、3つの連続したGALAペプチドを含む、請求項66に記載の融合タンパク質。
- 前記1つ以上のGALAペプチドのそれぞれが、配列番号22に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項66又は67に記載の融合タンパク質。
- 前記1つ以上のGALAペプチドが、配列番号26に記載のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項66~68のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記遺伝子編集タンパク質が、CRISPR関連タンパク質(Cas)である、請求項66~69のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記Casが、Cas9、Cas12、Cas13、又はそれらの組み合わせである、請求項70に記載の融合タンパク質。
- 前記Cas9が、配列番号1又は配列番号25に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項71に記載の融合タンパク質。
- 前記Cas12が、配列番号27に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項71又は72に記載の融合タンパク質。
- 前記Cas13が、配列番号29に記載の前記アミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項71~73のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記NLSが、配列番号23又は配列番号28に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項66~74のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 請求項66~75のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
- 前記遺伝子編集タンパク質が、請求項66~75のいずれか一項に記載の融合タンパク質である、請求項1~13、30~47、若しくは49~54のいずれか一項に記載のProSNA、又は請求項55~57のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記遺伝子編集タンパク質が、請求項66~75のいずれか一項に記載の融合タンパク質である、請求項14~54のいずれか一項に記載のSNA、又は請求項58若しくは59に記載の組成物。
- 遺伝子編集タンパク質を細胞に送達する方法であって、前記細胞を、請求項66~75のいずれか一項に記載の融合タンパク質と接触させることを含む、方法。
- 遺伝子編集タンパク質を細胞に送達する方法であって、前記細胞を、請求項76に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
- 対象において障害を治療、改善、及び/又は予防する方法であって、前記対象に、有効量の(i)請求項66~75のいずれか一項に記載の融合タンパク質、(ii)請求項76に記載の組成物、又は(iii)それらの組み合わせを投与することを含む、方法。
- 前記障害が、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、遺伝性疾患、心血管疾患、又はそれらの組み合わせである、請求項81に記載の方法。
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