CN116997326A - 开发基因组编辑球形核酸（sna）的策略 - Google Patents

Abstract

球形核酸(SNA)由于其化学可调的结构、生物相容性以及在没有转染试剂的情况下快速进入细胞的能力而成为治疗递送的有吸引力的平台。本公开提供了用于将基因编辑蛋白递送到细胞中的SNA和策略。递送的基因编辑蛋白保持酶促活性并快速进入哺乳动物细胞。

Description

开发基因组编辑球形核酸(SNA)的策略

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2021年2月26日提交的美国临时专利申请第63/154,530号、2021年10月28日提交的美国临时专利申请第63/273,086号和2021年12月16日提交的美国临时专利申请第63/290,522号的优先权利益，这些专利申请通过引用以其整体并入本文。

政府利益声明

本发明是根据由联邦调查局(FBI)授予的政府资助号DJF-15-1200-K-0001730在政府支持下进行的。政府在本发明中具有某些权利。

通过引用方式并入以电子方式提交的材料

本申请含有作为本公开的独立部分的计算机可读形式的序列表，其通过引用以其整体并入本文并且标识如下：文件名：2021-043R_Seqlisting.txt；大小：61,129字节；创建时间：2022年2月25日。

背景

基因组编辑是指特定DNA序列的移除或插入。在基因组编辑蛋白的成员中，CRISPR/Cas9(成簇的规则间隔短回文重复序列和CRISPR缔合蛋白9)蛋白由于其特异性和多功能性而被用作高效的基因组编辑工具，以编辑和调节基因组用于临床翻译[P.Horvath和R.Barrangou，《科学(Science)》2010,327,167-170]。虽然已经取得了Cas9酶的相当大的成就，但是仍然非常需要减少的脱靶效应以及Cas9-单一指导RNA(sgRNA)复合物的高效和直接转导[L.Y.Chou、K.Ming和W.C.Chan，《化学学会评论(Chem.Soc.Rev.)》2011,40,233–245；V.Biju，《化学学会评论》2014,43,744–764；Y.Lu、A.A.Aimetti、R.Langer和Z.Gu，《自然评论材料(Nat.Rev.Mater.)》2017,2,16075]。

快速可编程核酸酶，诸如成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR缔合(Cas)蛋白和转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)具有治疗多种遗传疾病的潜力[Gupta等人，《临床研究杂志(J Clin Invest.)》124(10):4154-4161(2014)；Hsu等人，《细胞(Cell)》，157(6):1262-1278(2014)]，但是高效递送到哺乳动物细胞中仍然是一个挑战。

发明内容

为了尝试解决基因组编辑的当前限制，包含基因编辑蛋白的脱靶效应和高效转导，已经设计了各种非病毒递送系统，诸如阳离子脂质体、阳离子聚合物和无机纳米颗粒，并且用于稳定和增强Cas9-sgRNA复合物的递送[Y.Fu、J.A.Foden、C.Khayter、M.L.Maeder、D.Reyon、J.K.Joung和J.D.Sander，《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》2013,31,822-826；J.G.Doench、N.Fusi、M.Sullender、M.Hegde、E.W.Vaimberg、K.F.Donovan、I.Smith、Z.Tothova、C.Wilen、R.Orchard、H.W.Virgin、J.Listgarten和D.E.Root，《自然生物技术》2016,34,184–191；B.P.Kleinstiver、V.Pattanayak、M.S.Prew、S.Q.Tsai、N.T.Nguyen、Z.Zheng和J.K.Joung，《自然(Nature)》2016,529,490-495；I.M.Slaymaker、L.Gao、B.Zetsche、D.A.Scott、W.X.Yan和F.Zhang，《科学》2016,351,84-88]。然而，这些载剂的复杂设计、释放效率以及潜在的毒性和免疫原性副作用阻碍了它们的快速临床应用。病毒系统已经被用作体内转导细胞的首选手段。这些系统存在与包装限制、免疫原性和Cas表达的寿命相关的问题，这有利于脱靶事件。病毒载体因此并不是CRISPR/Cas的体内直接递送的最佳选择。本公开涉及球形核酸及其在递送基因编辑蛋白中的用途，球形核酸包括连接至纳米颗粒核的寡核苷酸壳。

因此，在一些方面，本公开提供了蛋白核球形核酸(ProSNA)，其包括：(a)包括基因编辑蛋白的蛋白核；和(b)连接至蛋白核的寡核苷酸壳。在一些实施例中，寡核苷酸壳中的每个寡核苷酸共价地连接至蛋白核。在一些实施例中，寡核苷酸壳中的每个寡核苷酸通过接头连接至蛋白核。在另外的实施例中，接头是可切割的接头、不可切割的接头、无痕接头或其组合。在仍另外的实施例中，接头是氨基甲酸酯亚烷基二硫基(dithiolate)接头。在一些实施例中，寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸包括蛋白-核-NH-C(O)-O-C_2-5亚烷基-S-S-C_2-7亚烷基-寡核苷酸，或蛋白-核-NH-C(O)-O-CH₂-Ar-S-S-C_2-7亚烷基-寡核苷酸，并且Ar包括间位或对位取代的苯基。在一些实施例中，寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸包括蛋白-核-NH-C(O)-O-C(ZA)(ZB)C_1-4亚烷基-C(XA)(XB)-S-S-C(YA)(YB)C_1-6亚烷基-寡核苷酸，并且ZA、ZB、XA、XB、YA和YB各自独立地为H、Me、Et或iPr。在一些实施例中，寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸包括蛋白-核-NH-C(O)-O-C(XA)(XB)-Ar-S-S-C(YA)(YB)C_2-6亚烷基-寡核苷酸，并且XA、XB、YA和YB各自独立地为H、Me、Et或iPr。在一些实施例中，接头是酰胺亚烷基二硫基接头。在另外的实施例中，寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸包括蛋白-核-NH-C(O)-C_2-5亚烷基-S-S-C_2-7亚烷基-寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸包括蛋白-核-NH-C(O)-C_1-4亚烷基-C(XA)(XB)-S-S-C(YA)(YB)C_1-6亚烷基-寡核苷酸，并且XA、XB、YA和YB各自独立地为H、Me、Et或iPr。在一些实施例中，接头是酰胺亚烷基硫醚接头。在另外的实施例中，寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸包括蛋白-核-NH-C(O)-C_2-4亚烷基-N-琥珀酰亚胺基-S-C_2-6亚烷基-寡核苷酸。

在一些方面，本公开提供了一种球形核酸(SNA)，其包括(a)纳米颗粒核；(b)连接至纳米颗粒核的外表面的寡核苷酸壳；以及(c)基因编辑蛋白。在一些实施例中，纳米颗粒核是脂质体核或脂质纳米颗粒核。在另外的实施例中，脂质纳米颗粒核包括可电离的脂质、磷脂、甾醇和脂质-聚乙二醇(脂质-PEG)缀合物。在一些实施例中，寡核苷酸壳中的每个寡核苷酸通过脂质-PEG缀合物共价连接至脂质纳米颗粒核的外部。在一些实施例中，基因编辑蛋白被包封在脂质纳米颗粒核中。在一些实施例中，本公开的ProSNA被包封在脂质纳米颗粒核中。在一些实施例中，核糖核蛋白(RNP)复合物被包封在脂质纳米颗粒核中，RNP包括基因编辑蛋白、成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一些实施例中，脂质体核包括多个脂质基团。在一些实施例中，基因编辑蛋白被包封在脂质体核中。在一些实施例中，本公开的ProSNA被包封在脂质体纳米颗粒核中。在一些实施例中，核糖核蛋白(RNP)复合物被包封在脂质纳米颗粒核中，RNP包括基因编辑蛋白、CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一些实施例中，多个脂质基团包括选自由脂质的磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺家族组成的组的脂质。在一些实施例中，脂质选自由以下组的组：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-磷脂酰胆碱(DMPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DSPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)以及1,2-双十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)。在一些实施例中，寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸通过脂质锚定基团被连接至脂质体或脂质纳米颗粒核的外部。在一些实施例中，脂质锚定基团连接到至少一个寡核苷酸的5'端或3'端。在另外的实施例中，脂质锚定基团是生育酚或胆固醇。在一些实施例中，基因编辑蛋白是CRISPR缔合蛋白(Cas)。在另外的实施例中，Cas是Cas9、Cas12、Cas13或其组合。在一些实施例中，寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸在其5'端和/或3'端用二苯并环辛基(DBCO)修饰。在一些实施例中，寡核苷酸壳包括单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA或其组合。在一些实施例中，寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸是经修饰的寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸壳包括约2至约100个寡核苷酸。在另外的实施例中，寡核苷酸壳包括约10至约80个寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸壳包括约5至约50个寡核苷酸。在另外的实施例中，寡核苷酸壳包括约5至约20个寡核苷酸。在仍另外的实施例中，寡核苷酸壳包括约14个寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸壳包括约15个寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸壳中的每个寡核苷酸的长度为约5至约100个核苷酸。在另外的实施例中，寡核苷酸壳中的每个寡核苷酸的长度为约10至约50个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸壳中的一个或多个寡核苷酸包括(GGX)_n核苷酸序列，其中n是2-20，并且X是核碱基(A、C、T、G或U)。在一些实施例中，(GGX)_n核苷酸序列在一个或多个寡核苷酸的5'端。在一些实施例中，(GGX)_n核苷酸序列在一个或多个寡核苷酸的3'端。在一些实施例中，寡核苷酸壳中的一个或多个寡核苷酸包括(GGT)_n核苷酸序列，其中n为2-20。在一些实施例中，(GGT)_n核苷酸序列在一个或多个寡核苷酸的5'端。在一些实施例中，(GGT)_n核苷酸序列在一个或多个寡核苷酸的3'端。在一些实施例中，ProSNA或SNA的直径为约1纳米(nm)至约500nm。在一些实施例中，SNA的直径小于或等于约50纳米。在一些实施例中，寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸是靶向寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸壳包括抑制性寡核苷酸、免疫刺激性寡核苷酸、基因编辑底物DNA或RNA或其组合。在另外的实施例中，抑制性寡核苷酸是反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、适体、短发夹RNA(shRNA)、DNA酶或适体酶。在一些实施例中，免疫刺激性寡核苷酸是含有CpG基序的寡核苷酸、双链DNA寡核苷酸或单链RNA寡核苷酸。在另外的实施例中，免疫刺激性寡核苷酸中的每一个是toll样受体(TLR)激动剂。在仍另外的实施例中，TLR选自由以下组成的组：toll样受体1(TLR1)、toll样受体2(TLR2)、toll样受体3(TLR3)、toll样受体4(TLR4)、toll样受体5(TLR5)、toll样受体6(TLR6)、toll样受体7(TLR7)、toll样受体8(TLR8)、toll样受体9(TLR9)、toll样受体10(TLR10)、toll样受体11(TLR11)、toll样受体12(TLR12)和toll样受体13(TLR13)。

在一些方面，本公开提供了一种包括如本文所述的多种蛋白核球形核酸(ProSNA)的组合物。在一些实施例中，组合物进一步包括指导RNA。在一些实施例中，ProSNA中的至少两个包括不同的蛋白核。

在一些方面，本公开提供了一种包括本公开的多个球形核酸(SNA)的组合物。在一些实施例中，SNA中的至少两个包括不同的纳米颗粒核。

在一些方面，本公开提供了一种将基因编辑蛋白递送至细胞的方法，包括使细胞与本公开的ProSNA接触。

在一些方面，本公开提供了一种将基因编辑蛋白递送至细胞的方法，包括使细胞与本公开的组合物接触。

在一些方面，本公开提供了一种将基因编辑蛋白递送至细胞的方法，包括使细胞与本公开的SNA接触。

在一些方面，本公开提供了一种将基因编辑蛋白递送至细胞的方法，包括使细胞与本公开的组合物接触。

在一些方面，本公开提供了一种在受试者中治疗、改善和/或预防病症的方法，包括向受试者施用有效量的(i)本公开的ProSNA，(ii)本公开的SNA，(iii)本公开的组合物，或(iv)其组合。在一些实施例中，病症为癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、遗传性疾病、心血管疾病或其组合。

在一些方面，本公开提供了一种融合蛋白，其包括从N末端到C末端排列如下的以下物质：(i)一个或多个GALA肽；(ii)基因编辑蛋白，和(iii)核定位信号(NLS)。在一些实施例中，一个或多个GALA肽包括三个连续的GALA肽。在各个实施例中，一个或多个GALA肽中的每一个包括与如SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，一个或多个GALA肽包括如SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，基因编辑蛋白是CRISPR缔合蛋白(Cas)。在另外的实施例中，Cas是Cas9、Cas12、Cas13或其组合。在一些实施例中，Cas9包括与如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，Cas12包括与如SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，Cas13包括与如SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列或由其组成。在各个实施例中，NLS包括与如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列或由其组成。

在一些方面，本公开提供了一种包括本公开的融合蛋白和药学上可接受的载剂的组合物。

在另外的方面，本公开提供了一种如本文所述的ProSNA，其中基因编辑蛋白是本公开的融合蛋白。

在一些方面，本公开提供了一种如本文所述的SNA，其中基因编辑蛋白是本公开的融合蛋白。

在另外的方面，本公开提供了一种将基因编辑蛋白递送至细胞的方法，包括使细胞与如本文所述的融合蛋白接触。

在一些方面，本公开提供了一种将基因编辑蛋白递送至细胞的方法，包括使细胞与包括融合蛋白的本公开的组合物接触。

在另外的方面，本公开提供了一种在受试者中治疗、改善和/或预防病症的方法，包括向受试者施用有效量的(i)本公开的融合蛋白，(ii)包括融合蛋白的本公开的组合物，或(iii)其组合。在一些实施例中，病症为癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、遗传性疾病、心血管疾病或其组合。

附图说明

图1是CRISPR-SNA的合成示意图。浓缩的Cas9 RNP被包封在脂质体中，大多数未包封的RNP经由SEC除去，脂质体被挤出以降低多分散性，加入DBCO-DNA以用DNA官能化脂质体，脂质体与蛋白酶K一起温育以消化剩余的未包封的Cas9，并且最后消化的Cas9经由SEC除去。

图2示出了：(A)在DNA官能化和清洗后CRISPR SNA的DLS。(B)Cy3-DNA荧光的标准曲线，具有SNA样品(稀释一半)。(C)CRISPR SNA样品中磷(以及因此磷脂)浓度的ICP-OES定量，包含标准曲线(蓝色)、SNA样品(红色)和在校正B中获得的DNA浓度后的SNA样品。使用等式1计算SNA浓度。(D)Alexa 647-RNP荧光的标准曲线，其中SNA样品(蓝色)用线性拟合绘制。

图3示出了RNP在整个SNA合成程序中保持活性。(A)体外Cas9活性测试的示意图。(B)新鲜Cas9 RNP(B1)，用Alexa染料修饰(B2)，然后用Amicon 10K过滤器浓缩(B3)，然后经历7次冷冻/解冻/超声波处理循环(B4)，然后通过Sepharose6b SEC柱(B5)，然后通过0.2μM和0.1μM PES膜挤出3次(B6)的Cas9 RNP的活性测试。

图4证明CRISPR-SNA保护活性RNP免受蛋白酶的影响，表明被包封。(A)在将蛋白酶K与空SNA和Alexa-RNP(顶部)或CRISPR SNA与包封的Alexa-RNP(底部)的混合物一起温育后，从Superdex 200柱收集的尺寸排阻级分。Cy3(DNA)荧光以红色示出，Alexa 647(Cas9)荧光以蓝色示出，并且Cy3和Cas9荧光的共定位以粉红色示出。(B)采用以下物质运行体外Cas9活性测试：没有Cas9(1)；不含蛋白酶K(2)和含有蛋白酶K(3)的新鲜Cas9；不含蛋白酶K(4)和含有蛋白酶K(5)的Alexa修饰的Cas9；不含蛋白酶K(6)，含蛋白酶K(7)，以及含有在用吐温20破坏脂质体后加入的蛋白酶K(8)的CRISPR脂质体；以及最后，不含蛋白酶K(9)，含蛋白酶K(10)，以及含有在用吐温20破坏脂质体后加入的蛋白酶K(11)的CRISPR SNA。

图5示出了CRISPR-SNA被哺乳动物细胞主动吸收。在将每个样品的5皮摩尔当量的Alexa RNP与C166-GFP细胞温育16小时后，在别藻蓝蛋白(APC)激发和发射滤光片上测量Alexa 647荧光。未处理的细胞的Alexa-RNP荧光的直方图(红色，与空的脂质体球形核酸(LSNA)重叠，空的Cy3修饰的LSNA(亮绿色)，包封在脂质体中的RNP(橙色)，用RNAiMax转染的Alexa-RNP，以及最后是CRISPR SNA(深绿色)。

图6示出了ProSNA(红色虚线)Cas9的结构表征。(A)Cas9 SNA的TEM表征。(B)和(C)未修饰的Cas9、Cas9 AF647、Cas9叠氮化物和Cas9 SNA的变性凝胶电泳和ζ电位。(D)用于定量Cas9与AlexaFluor 647和DNA的官能化的紫外-可见吸收光谱。

图7示出了证明生物相容性和细胞摄取的细胞实验的结果。(a)用Cas9 SNA处理48小时的HaCat、HEK 293T、hMSC或Raw 264.7细胞的细胞活力；(b)如通过流式细胞术确定的Cas9(白色)和Cas9 SNA(黑色)的细胞摄取。

图8描绘了Cas9 SNA的HEK293T/EGFP细胞基因组编辑。(a)DNA酶I过敏位点，(b)GRIN2B和(c)EGFP的Surveyor测定。d)用Cas9 SNA处理的HEK293T/EGFP细胞的流式细胞术。

图9示出了工程GeoCas9在N末端与GALA内体肽融合的示意性设计。

图10示出了GeoCas9在(a)260nm和(b)280nm的定量摩尔消光系数。摩尔消光系数通过Pierce二喹啉甲酸测定来确定，并且用于定量GeoCas9和Cas9 SNA的浓度。

图11描绘了用于制备Cas9-AF647的Alexa Fluor^TM647 NHS酯(AF647)的结构。

图12示出了AF-647荧光团修饰的Cas9的紫外-可见光谱。在Cary5000分光光度计上在环境温度下确定光谱。分别从在650nm和280nm的吸光度来计算蛋白和AF647的浓度。AF647荧光团用于计算DNA修饰后的蛋白浓度，并且在流式细胞术和共聚焦成像实验中追踪蛋白摄取。插图：每个Cas9的荧光团的计算细节。

图13示出了用于制备叠氮化物封端的Cas9(Cas9-AF647-叠氮化物)的NHS-PEG₄-叠氮化物接头的结构。

图14示出了未修饰的Cas9-AF647(蓝色)和Cas9-AF647-叠氮化物(红色)的MALDI-MS光谱。为了计算每个蛋白中NHS-PEG₄-叠氮化物的数量，使用MALDI-MS来确定未修饰和叠氮化物修饰的蛋白之间的质量差异。每个接头缀合导致275m/z的质量增加。

图15示出了用紫外-可见光谱确定Cas9 ProSNA上DNA链的数量。光谱在Cary5000分光光度计上确定。分别从在650nm和260nm的吸光度来计算蛋白和DNA浓度。插图：每个Cas9的DNA计算细节。

图16示出了(a)Cas9 SNA和(b)Cas9-AF647-叠氮化物的FPLC尺寸排阻色谱(SEC)分析。实线对应于在650nm的消光，并且虚线对应于在260nm的消光。所有样品都在SEC650柱(Bio-Rad)上以1mL/min的流速在4℃下运行。

图17示出了与胰蛋白酶(蛋白酶)一起温育的(a)Cas9和(b)Cas9 ProSNA的SDS-PAGE凝胶生物稳定性分析，示出了当Cas9在1小时的时间过程中降解时(如由Cas9蛋白带的消失所证明的)，Cas9 ProSNA保留。

图18示出了HaCat细胞中Cas9 ProSNA的活细胞和死细胞分析的细胞活力测量。活细胞用钙AM染色，并且死细胞用碘化丙啶(PI)染色。如通过荧光显微镜检查确定的，在处理Cas9蛋白后没有观察到显著的细胞毒性。比例尺：300μm。

图19示出了描绘HaCat细胞中AF647修饰的Cas9 ProSNA和天然Cas9的细胞摄取的流动直方图。在用20nM蛋白处理4小时后，使用流式细胞术测量HaCat细胞中Cas9 ProSNA或天然蛋白的摄取。

图20示出了在不同时间点用Cas9-AF647和Cas9 ProSNA处理的HaCat细胞的核输入效率结果，示出了Cas9 ProSNA的增强的核输入。

图21描绘了用于检测双链断裂诱导的微插入和缺失的SURVEYOR测定。用于确定Cas9介导的切割效率的SURVEYOR测定的示意图。首先，基因组PCR(gPCR)用于从修饰和未修饰细胞的异质群体中扩增Cas9靶区域，并且gPCR产物被缓慢再杂交以产生异源双链体。重退火的异源双链体被T7EI核酸酶切割，而同源双链体保持完整。Cas9介导的切割效率(indel％)是基于切割的DNA的级分计算的。

图22示出了基因组编辑分析。用Cas9蛋白或Cas9 ProSNA处理的HEK293T/EGFP细胞的流式细胞术直方图结果。

图23示出了表面反应性赖氨酸化学使得DNA能够与Cas9缀合。

图24示出了DNA官能化后保留了Cas9的结构。

图25示出了Cas9 ProSNA表现出增强的针对蛋白酶降解的稳定性。

图26示出了用Cas9 ProSNA温育的细胞在多种细胞类型中表现出高细胞活力，多种细胞类型包含HaCaT、HEK293T、hMSC和RAW 264.7细胞。

图27示出了如通过AlexaFluor 647荧光观察到的用Cas9 ProSNA处理的细胞的增强的细胞摄取。

图28描绘了基因编辑蛋白的细胞递送的屏障和由包括本公开的蛋白(例如，融合蛋白)的SNA提供的优点。

图29示出了与GALA和NLS融合的Cas9 SNA表现出显著的内体逃逸和核输入效率。

图30示出了在HaCaT和hMSC细胞中，与对照Cas9蛋白相比，Cas9 ProSNA对于插入和缺失两者均实现了高基因编辑效率。

图31示出了巨噬细胞样RAW264.7细胞中Cas9 ProSNA的编辑效率。与对照Cas9蛋白和商业转染剂相比，Cas9 ProSNA表现出增加的基因编辑活性。

图32示出了HEK293T细胞中Cas9 ProSNA的基因沉默活性。与对照Cas9蛋白相比，Cas9 ProSNA表现出GFP敲低增加。

具体实施方式

球形核酸(SNA)是一类纳米颗粒，其用围绕可交换纳米颗粒核的致密寡核苷酸层官能化。这种核酸壳赋予了若干种功能：寡核苷酸涂层形成了高度浓缩的盐云，盐云降低了纳米颗粒表面上的核酸内切酶活性，并且与细胞表面蛋白相互作用，导致几乎所有细胞系中的高细胞摄取。这些独特特征的组合允许SNA可以作为易于定制的单一实体药剂。

术语

所有语言，诸如“从”、“到”、“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等，包含所列举的数字，并且是指可以随后分解成子范围的范围。

范围包含每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个成员的组是指具有1、2或3个成员的组。类似地，具有6个成员的组是指具有1、2、3、4或6个成员的组，等等。

如本说明书和所附权利要求书中所用，冠词“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”是指一个或多于一个(例如，至少一个)该冠词的语法对象。

“约”和“近似”通常应当意指在给定测量的性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差程度。示例性的误差程度在20-25百分比(％)内，例如在所述值或值的范围的20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％内。

术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用。

如本文所述，如本文所用的“接头”是将寡核苷酸连接至蛋白核球形核酸(ProSNA)的蛋白核的部分。在本公开的任何方面或实施例中，接头是可切割的接头、不可切割的接头、无痕接头或其组合。

“受试者”是脊椎动物生物体。受试者可以是非人类哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或非人类灵长类动物)，或者受试者可以是人类受试者。

如本文所用的术语“施用(administering)”、“施用(administer)”、“施用(administration)”等是指将治疗剂转移、递送、引入或输送至需要用此类药剂治疗的受试者的任何方式。此类方式包含但不限于口服、局部、静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、肿瘤内、皮内、鼻内和皮下施用。

如本文所用，“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指与异常疤痕相关的症状的严重程度和/或发作的任何降低。因此，“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”包含治疗和预防措施。本领域普通技术人员将理解，对异常疤痕的任何程度的保护或改善对受试者诸如人类患者是有益的。通过将受试者的症状的严重程度降低到任何程度和/或延迟症状的出现来改善患者的生活质量。

如本文所用，“靶向寡核苷酸”是将SNA导向特定组织和/或特定细胞类型的寡核苷酸。在一些实施例中，靶向寡核苷酸是适体。因此，在一些实施例中，本公开的SNA包括连接至纳米颗粒核的外部的适体，其中适体被设计成结合特定细胞类型的表面上的一个或多个受体。

如本文所用，“免疫刺激性寡核苷酸”是可以刺激(例如，诱导或增强)免疫应答的寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸的典型实例是含有CpG基序的寡核苷酸、单链RNA寡核苷酸、双链RNA寡核苷酸和双链DNA寡核苷酸。“CpG基序”是胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列。通过toll样受体8和9可以识别单链RNA序列，通过toll样受体3可以识别双链RNA序列，并且通过toll样受体3和环状GMP-AMP合酶(cGAS)可以识别双链DNA。

术语“抑制性寡核苷酸”是指这样的寡核苷酸，其诸如通过干扰mRNA在核糖体中翻译成蛋白来减少蛋白的产生或表达，或者与编码一个或多个靶向的蛋白的基因或mRNA充分互补，特异性地结合至一个或多个靶向的基因或mRNA(与一个或多个靶向的基因或mRNA杂交)，从而减少靶蛋白的表达或生物活性。抑制性寡核苷酸包含但不限于分离的或合成的短发夹RNA(shRNA或DNA)、反义寡核苷酸(例如，反义RNA或DNA、嵌合反义DNA或RNA)、miRNA和miRNA模拟物、小干扰RNA(siRNA)、先天免疫受体的DNA或RNA抑制剂、适体、DNA酶或适体酶。

本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用关于每个所引用的主题并入本文，在一些情况下，主题可以涵盖整个文件。

基因编辑蛋白

本公开的SNA包含一种或多种基因编辑蛋白。由本公开预期的基因编辑蛋白包含但不限于基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)、巨大核酸酶、核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、CRISPR缔合蛋白、CRISPR/Cas9、Cas9、xCas9、Cas12a(Cpf1)、Cas13、Cas13a、Cas14、CasX、CasY、1类Cas蛋白、2类Cas蛋白、MAD7或其组合。在本公开的任何方面或实施例中，基因组编辑用于抑制或减少靶基因的产生。在某些实施例中，通过经由非同源端连接(NHEJ)插入/缺失核苷酸，或通过经由导致过早终止密码子和非功能性蛋白表达的同源定向修复(HDR)插入合适的供体盒，或通过插入核苷酸，可以实现基因表达的降低以及随后生物活性蛋白表达的降低。

如图28所示，基因编辑蛋白的细胞进入存在屏障。这些屏障包含基因编辑蛋白的内化(由于膜屏障和基因编辑蛋白的大尺寸)，如何实现基因编辑蛋白的核摄取，以及基因编辑蛋白如何逃离内体。因此，在本公开的任何方面或实施例中，基因编辑蛋白是“融合”蛋白的一部分。术语“融合的”在这个意义上是指，在各个方面，包括下列元件或由下列元件组成的蛋白，这些元件按照从N末端到C末端的顺序融合在一起：(i)一个或多个GALA肽；(ii)基因编辑蛋白，和(iii)核定位信号(NLS)。在一些方面，融合蛋白包括以下元件或由以下元件组成，这些元件按照从N末端到C末端的顺序融合在一起：(i)基因编辑蛋白，和(ii)核定位信号(NLS)。融合蛋白的基因编辑部分可以是本领域中已知的和/或本文描述的任何基因编辑蛋白，例如并且不限于CRISPR缔合蛋白(Cas)。在各个实施例中，Cas是Cas9、Cas12、Cas13或其组合。在一些实施例中，Cas9是如Harrington,L.B.、Paez-Espino,D.和Staahl,B.T.等人，在人血浆中具有增加的寿命的热稳定Cas9(A thermostable Cas9 withincreased lifetime in human plasma)，《自然通讯(Nat Commun)》8,1424(2017)，https://doi.org/10.1038/s41467-017-01408-4(其通过引用以其整体并入本文)中所描述的。在一些实施例中，Cas9包括与如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，Cas12包括与如SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列或由其组成(Strecker J、Jones S、Koopal B、Schmid-Burgk J、Zetsche B、Gao L、Makarova KS、Koonin EV和Zhang F，《自然通讯》2019年1月22日；10(1):212.doi:10.1038/s41467-018-08224-4，10.1038/s41467-018-08224-4PubMed 30670702)。在一些实施例中，Cas13包括与如SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列或由其组成(Smargon AA、Cox DB、Pyzocha NK、Zheng K、Slaymaker IM、Gootenberg JS、Abudayyeh OA、Essletzbichler P、Shmakov S、MakarovaKS、Koonin EV和Zhang F，《分子细胞(Mol Cell.)》2017年2月16日；65(4):618-630.e7，doi:10.1016/j.molcel.2016.12.023，2017年1月5日电子公开，10.1016/j.molcel.2016.12.023PubMed 28065598)。GALA肽是本领域中已知的(参见，例如，Schach等人，《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》2015,137,38,12199-12202，其通过引用以其整体并入本文)，并且在本文中描述。本公开考虑了在各个实施例中，融合蛋白包括串联的1、2、3、4或5个GALA肽或由其组成。在一些实施例中，本公开的融合蛋白的N末端包括串联的3个GALA肽或由其组成。在一些实施例中，本公开的融合蛋白的N末端包括串联的3个GALA肽或由其组成，其中每个GALA肽包括SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列或由其组成。在本公开的任何方面或实施例中，如本文所述的融合蛋白的C末端包括NLS序列或由其组成。NLS序列在本领域中是已知的(参见，例如，Cutrona,G.、Carpaneto,E.和Ulivi,M.等人，与核定位信号相连的c-myc反基因PNA在活细胞中的作用(Effects in live cells of a c-mycanti-gene PNA linked to a nuclear localization signal)，《自然生物技术》18,300-303(2000)，https://doi.org/10.1038/73745，其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施例中，NLS序列来源于SV40病毒大T抗原的NLS，并且包括氨基酸序列PKKKRKV(SEQ ID NO:23)或由其组成。在一些实施例中，NLS包括氨基酸序列KRTADGSEFESPKKKRKV(SEQ ID NO:28)或由其组成。本公开还提供了包括如本文所述的融合蛋白和药学上可接受的载剂的组合物。由本公开提供的融合蛋白可以用于本文所述的ProSNA、SNA、组合物和/或方法中的任一者。因此，在一些方面，本公开的ProSNA包括(a)包括融合蛋白的蛋白核；和(b)连接至蛋白核的寡核苷酸壳。在另外的方面，本公开提供了一种SNA，其包括(a)纳米颗粒核；(b)连接至纳米颗粒核的外表面的寡核苷酸壳；以及(c)融合蛋白。

通过使用化脓链球菌II型CRISPR/Cas系统的体外研究，已经表明高效CRISPR/Cas介导的靶DNA或基因组修饰所需的仅有组分是Cas核酸酶(例如，Cas9核酸酶)、CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。CRISPR/Cas介导的DNA切割的野生型机制经由几个步骤发生。含有遇到的(或靶)DNA的小片段(20-30个碱基对)的CRISPR阵列转录成前crRNA，其通过经由前crRNA的直接重复与tracrRNA杂交而经历成熟。前crRNA和tracrRNA的杂交，被称为指导RNA(gRNA或sgRNA)，与Cas核酸酶缔合形成核糖核蛋白复合物，其介导前crRNA转化为成熟crRNA。成熟crRNA:tracrRNA双链体将Cas9导向DNA靶标，DNA靶标由原间隔子和必需的原间隔子相邻基序(CRISPR/cas原间隔子相邻基序；PAM)经由crRNA的间隔子区域和宿主基因组上的原间隔子DNA之间的异源双链体组成。Cas9核酸酶介导PAM上游的靶DNA的切割，以使用突变的Cas9核酸酶在原间隔子内产生双链断裂或链特异性切口，由此一个DNA链特异性切割基序被突变。

因此，在涉及基因编辑的各个方面，本公开的SNA(例如，ProSNA、LNP-SNA和LSNA)除了基因编辑蛋白之外，还包括DNA或RNA基因编辑底物(例如，指导RNA)，其中在各个实施例中，DNA或RNA基因编辑底物连接至SNA的表面或被包封在SNA内。在一些实施例中，包括基因编辑蛋白的SNA与DNA或RNA基因编辑底物分开递送。

来自相关CRISPR系统的也适用于可编程核酸切割的其他RNA指导的核酸酶包含金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)、来自普雷沃氏菌或弗兰西斯菌I的CRISPR(CpfI)、地芽孢杆菌Cas9(GeoCas9)、空肠弯曲杆菌Cas9(CjCas9)、宏基因组衍生的CRISPR-CasX和CRISPR-CasY、CRISPR-Cas3和CRISPR-C2c2，其切割RNA。

对CRISPR/Cas系统进行了修饰，以除基因敲除和编辑之外还执行许多功能，下面描述了其中的三个实例。催化失活的Cas9(dCas9)已经与转录激活和阻遏结构域融合，从而能够对基因表达进行可编程控制[Gilbert等人，《细胞》154,442-451(2013)；Zalatan等人，《细胞》160,339-350(2015)]。dCas9转录激活因子尤其能够实现类似于siRNA或CRISPR敲除文库的新的筛选，但其中基因过表达[Gilbert等人，《细胞》159,647-61(2014)]。与荧光蛋白融合的dCas9使得能够显微镜追踪基因组中的特定位点并研究序列特异性核组织[Chen等人，《细胞》155,1479-91(2013)]。最后，活性Cas9可以被靶向以切割受精卵中的各种非功能基因组区域，并且成熟生物体的每个细胞中的突变频率和序列可以用于追踪胚胎发育期间的细胞分化谱系[Mckenna等人，《科学》42,237-241(2016)]。

如本文所用，术语TALEN是广义的，并且包含可以在没有另一TALEN帮助的情况下切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN也用于指一对TALEN中的一个或两个成员，它们被设计成一起工作以在同一位点处切割DNA。一起工作的TALEN可以被称为左TALEN和右TALEN，这是指DNA的利手性或TALEN对。

术语TALEN意指包括转录激活因子样(TAL)效应子结合结构域和核酸酶结构域的蛋白，并且包含本身具有功能的单体TALEN以及需要与另一单体TALEN二聚化的其他TALEN。当两个单体TALEN相同时，二聚化可以产生同二聚体TALEN，或者当单体TALEN不同时，可以产生异二聚体TALEN。已经证明TALEN通过两种主要的真核DNA修复途径，非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复，在永生化人类细胞中诱导基因修饰。TALEN经常成对使用，但单体TALEN是已知的。用TALEN(和其他遗传工具)处理的细胞包含培养细胞、永生化细胞、原代细胞、原代体细胞、受精卵、生殖细胞、原始生殖细胞、胚泡或干细胞。在一些实施例中，TAL效应子可以用于将其他蛋白结构域(例如，非核酸酶蛋白结构域)靶向至特定的核苷酸序列。例如，TAL效应子可以连接至蛋白结构域，该蛋白结构域来自但不限于DNA相互作用酶(例如甲基化酶、拓扑异构酶、整合酶、转座酶或连接酶)、转录激活子或阻抑子，或者与其他蛋白诸如组蛋白相互作用或修饰其他蛋白诸如组蛋白的蛋白。此类TAL效应子融合的应用包含，例如，创建或修饰表观遗传调控元件，在DNA中进行位点特异性插入、缺失或修复，控制基因表达，以及修饰染色质结构。

因此，在一些方面，本公开提供了用于递送基因编辑蛋白的SNA(例如，ProSNA、LSNA和LSNA)。在各个实施例中，基因编辑蛋白在核糖核蛋白(RNP)复合物中。在各个实施例中，包封在SNA中的核糖核蛋白(RNP)复合物包括CRISPR缔合蛋白9(Cas9)(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:25)、CRISPR RNA(crRNA)、反式激活crRNA(tracrRNA)和/或转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)。在一些实施例中，本公开的组合物和方法中使用的Cas9是Cas9 NLS化脓性链球菌(新英格兰生物实验室目录号M0646T)。在本公开的任何方面或实施例中，本公开的核苷酸或氨基酸序列包括与参考或野生型序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的序列或由其组成。在本公开的任何方面或实施例中，基因编辑蛋白包含与参考或野生型序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列或由其组成。在各个实施例中，基因编辑蛋白是包括与参考或野生型Cas9序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列或由其组成的Cas9蛋白。因此，在各个实施例中，基因编辑蛋白是包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:25至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列或由其组成的Cas9蛋白。在另外的实施例中，基因编辑蛋白是包括与SEQ ID NO:27至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列或由其组成的Cas12蛋白。在另外的实施例中，基因编辑蛋白是包括与SEQ ID NO:29至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列或由其组成的Cas13蛋白。

球形核酸(SNA)

如本文所述，球形核酸(SNA)是一类独特的纳米材料，其包括用高度定向的寡核苷酸壳官能化的球形纳米颗粒核。寡核苷酸壳包括一个或多个连接至纳米颗粒核的外表面的寡核苷酸。在各个实施例中，寡核苷酸壳包括抑制性寡核苷酸、免疫刺激性寡核苷酸、基因编辑底物DNA或RNA、靶向寡核苷酸或其组合。纳米颗粒核可以是有机的(例如脂质体)、无机的(例如金、银或铂)、基于聚合物的(例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)颗粒)或中空的(例如，基于二氧化硅的)。在本公开的各个实施例中，纳米颗粒核是蛋白(蛋白核SNA(ProSNA))、脂质体(脂质体SNA(LSNA))或脂质纳米颗粒(LNP-SNA)。

多核苷酸壳的球形架构赋予了优于传统核酸递送方法的独特优势，包含不依赖转染剂进入几乎所有细胞和抵抗核酸酶降解。此外，SNA可以穿透生物屏障，包含血脑屏障(参见，例如，美国专利申请公开第2015/0031745号，其通过引用以其整体并入本文)和血液肿瘤屏障以及表皮(参见，例如，美国专利申请公开第2010/0233270号，其通过引用以其整体并入本文)。

蛋白核球形核酸(ProSNA)

最近，包括连接(例如，共价连接)到蛋白核的寡核苷酸的致密壳的蛋白球形核酸(ProSNA)已经成为令人兴奋的新架构，在蛋白递送、组装和细胞内检测中具有多种生物学应用[Brodin,J.D.；Sprangers,A.J.；McMillan,J.R.；Mirkin,C.A.，DNA介导的功能性酶的细胞递送(DNA-Mediated Cellular Delivery of Functional Enzymes)，《美国化学学会杂志》2015,137(47),14838-14841；Kusmierz,C.D.；Bujold,K.E.；Callmann,C.E.；Mirkin,C.A，定义通过蛋白球形核酸进行体内酶递送的设计参数(Defining the DesignParameters for in Vivo Enzyme Delivery Through Protein Spherical NucleicAcids)，《Acs中央科学((ACS Cent.Sci.))》2020,6(5),815-822]。寡核苷酸的致密壳促进细胞摄取、生理稳定性和蛋白相对于其单个组分的生物相容性[Giljohann,D.A.；Seferos,D.S.；Patel,P.C.；Millstone,J.E.；Rosi,N.L.；Mirkin,C.A，寡核苷酸负载量决定对DNA修饰的金纳米颗粒的细胞摄取(Oligonucleotide Loading Determines Cellular Uptakeof DNA-Modified Gold Nanoparticles)，《纳米快报》2007,7(12),3818-3821]。SNA的这种增强的细胞内化源自缀合物的三维架构及其与大多数细胞的表面上的清道夫受体结合的能力。重要的是，SNA的有利生物学性质不依赖于它们的蛋白核，因此可以选择蛋白核用于蛋白递送基因组编辑应用。

如本文所用的“蛋白核”包括基因编辑蛋白。因此，在本公开的任何方面或实施例中，本公开的基因编辑蛋白通常充当蛋白核SNA(SNA)的“核”。蛋白是包括一个或多个氨基酸聚合物的分子。在本公开的各个实施例中，蛋白核包括单一蛋白(即单一氨基酸聚合物)、多聚体蛋白、肽(例如，长度在约2至50个氨基酸之间的氨基酸聚合物)或两种或更多种蛋白的合成融合蛋白或由其组成。合成融合蛋白包含但不限于表达的融合蛋白(由单个基因表达)和表达后融合体，其中蛋白化学缀合在一起。在本公开的任何方面或实施例中，蛋白核包括基因编辑蛋白或由其组成。蛋白在本领域中是已知的，并且可以是天然存在的或非天然存在的。

蛋白核SNA合成。本公开提供了组合物和方法，其中一个或多个寡核苷酸经由接头与蛋白核SNA的表面缔合和/或连接至蛋白核SNA的表面。在各个实施例中，接头可以是可切割的接头、不可切割的接头、无痕接头或其组合。在一些实施例中，可切割的接头对还原剂(例如，谷胱甘肽(GSH)、二硫苏糖醇(DTT))或还原环境(例如，在细胞内)敏感(并且响应于还原剂或还原环境而被切割)。在各个实施例中，可切割的接头对各种化学刺激敏感(并且响应于这些化学刺激而被切割)，化学刺激诸如例如酸度(例如低pH)、酶(例如肽酶)、光(例如NIR激光)和/或水解。

接头将蛋白核连接至所公开的蛋白核SNA中的寡核苷酸(即，蛋白核接头寡核苷酸)。在各个实施例中，单个寡核苷酸连接至接头上。在另外的实施例中，多于一个的寡核苷酸(例如，两个、三个或更多个)连接至单个接头。一般而言，由本公开所考虑的接头包含以下物质，它们可以单独或组合用于本公开的ProSNA中：酰胺、硫醚、三唑、肟、脲和硫脲。一些特别考虑的接头包含氨基甲酸酯亚烷基、氨基甲酸酯亚烷基芳基二硫基接头、酰胺亚烷基二硫基接头、酰胺亚烷基芳基二硫基接头和酰胺亚烷基琥珀酰亚胺基接头。在一些情况下，接头包括-NH-C(O)-O-C_2-5亚烷基-S-S-C_2-7亚烷基-或-NH-C(O)-C_2-5亚烷基-S-S-C_2-7亚烷基-。-S-S-部分的α碳可以是支链的，例如-C(XA)(XB)-S-S-或-S-S-C(YA)(YB)-或其组合，其中XA、XB、YA和YB独立地为H、Me、Et或iPr。蛋白的α碳可以是支链的，例如-C(XA)(XB)-C_2-4亚烷基-S-S-，其中XA和XB是H、Me、Et或iPr。在一些情况下，接头是-NH-C(O)-O-CH₂-Ar-S-S-C_2-7亚烷基-，并且Ar是间位或对位取代的苯基。在一些情况下，接头是-NH-C(O)-C_2-4亚烷基-N-琥珀酰亚胺基-S-C_2-6亚烷基-。

由本公开预期的其他接头包含国际专利公开第WO 2018/213585号中所述的那些接头，其通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，接头是SH接头、SM接头、SE接头或SI接头。本公开考虑了寡核苷酸在蛋白核上的多个连接点。

本公开的寡核苷酸可以在5'末端或3'末端进行修饰，以用于连接至蛋白核。

本公开的寡核苷酸可以在末端处用炔部分(例如用于与蛋白表面的叠氮化物反应的DBCO型部分)修饰：其中L是多核苷酸的末端的接头。L²可以是C_1-10亚烷基、-C(O)-C_1-10亚烷基-Y-以及-C(O)-C_1-10亚烷基-Y-C_1-10亚烷基-(OCH₂CH₂)_m-Y-，其中每个Y独立地选自由键、C(O)、O、NH、C(O)NH和NHC(O)组成的组；并且m是0、1、2、3、4或5。例如，DBCO官能团可以经由具有以下结构的接头连接：其中末端“O”来自多核苷酸上的末端核苷酸。在表面胺被修饰的情况下，该DBCO型部分的使用导致多核苷酸和蛋白之间的结构为： 以及 其中L和L²各自独立地选自C_1-10亚烷基、-C(O)-C_1-10亚烷基-Y-和-C(O)-C_1-10亚烷基-Y-C_1-10亚烷基-(OCH₂CH₂)_m-Y-；每个Y独立地选自由键、C(O)、O、NH、C(O)NH和NHC(O)组成的组；m是0、1、2、3、4或5；并且PN是多核苷酸。蛋白的表面硫醇或表面羧酸酯被修饰的类似结构可以以类似的方式产生，以导致类似的连接结构。

蛋白可以在表面官能团(例如，表面胺、表面羧酸酯、表面硫醇)处用以叠氮化物官能团终止的接头进行修饰：蛋白-X-L-N₃，X来自蛋白上的表面氨基基团(例如，-NH-)、羧基基团(例如，-C(O)-或-C(O)O-)，或硫醇基团(例如，-S-)；L选自C_1-10亚烷基、-Y-C(O)-C_1-10亚烷基-Y-和-Y-C(O)-C_1-10亚烷基-Y-C_1-10亚烷基-(OCH₂CH₂)_m-Y-；每个Y独立地选自由键、C(O)、O、NH、C(O)NH和NHC(O)组成的组；并且m是0、1、2、3、4或5。可以使用熟知的技术实现将“L-N₃”官能团引入到蛋白的表面部分。例如，蛋白的表面胺可以与具有末端N₃的接头的活化酯反应，以在蛋白的胺和接头试剂的活化酯的羧酸酯之间形成酰胺键。

寡核苷酸可以被修饰以在寡核苷酸的末端包含炔官能团：寡核苷酸-L₂-X-≡-R；L²选自C_1-10亚烷基、-C(O)-C_1-10亚烷基-Y-，以及-C(O)-C_1-10亚烷基-Y-C_1-10亚烷基-(OCH₂CH₂)_m-Y-；每个Y独立地选自由键、C(O)、O、NH、C(O)NH和NHC(O)组成的组；m是0、1、2、3、4或5；并且X是键，并且R是H或C_1-10烷基；或者X和R与它们所连接的碳一起形成8-10元碳环或8-10元杂环基团。在一些情况下，多核苷酸具有的结构。

在铜(II)盐和还原剂的存在下，具有表面修饰的叠氮化物的蛋白和具有经修饰以包含炔的末端的多核苷酸可以一起反应以形成三唑环，以原位产生铜(I)盐。在一些情况下，直接加入铜(I)盐。预期的还原剂包含抗坏血酸、抗坏血酸盐、硼氢化钠、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、肼、氢化铝锂、氢化二异丁基铝、草酸、Lindlar催化剂、亚硫酸盐化合物、亚锡化合物、亚铁化合物、钠汞齐、三(2-羧乙基)膦、氢醌及其混合物。

蛋白的表面官能团可以使用其他连接化学方法被连接至寡核苷酸。例如，表面胺可以直接与在寡核苷酸的末端处的羧酸酯或活化酯缀合，以形成酰胺键。表面羧酸酯可以与寡核苷酸的末端上的胺缀合，以形成酰胺键。可替代地，表面羧酸酯可以与二胺反应，以在表面羧酸酯处形成酰胺键，并且在另一末端处形成胺。然后，该末端胺可以以类似于蛋白的表面胺的方式进行修饰。表面硫醇可以与多核苷酸上的硫醇部分缀合以形成二硫键。可替代地，硫醇可以与多核苷酸的末端处的活化酯缀合，以形成硫代羧酸酯。可替代地，硫醇可以与多核苷酸的末端上的迈克尔受体(例如琥珀酰亚胺)缀合，以形成硫醚。

用于合成蛋白核SNA(ProSNA)的一般代表性程序包含将所需量的寡核苷酸连接至蛋白的表面。通过重复两步过程进行连接：(1)将接头连接至蛋白的表面并纯化；(2)将寡核苷酸(例如DNA)连接至蛋白缀合的接头并纯化。重复这两个步骤，直到所需量的寡核苷酸连接至蛋白。应当理解，前述程序在本质上是示例性的。

脂质纳米颗粒球形核酸(LNP-SNA)

脂质纳米颗粒球形核酸(LNP-SNA)由用寡核苷酸修饰的脂质纳米颗粒核组成。脂质纳米颗粒核包括基因编辑蛋白、可电离的脂质、磷脂、甾醇和脂质-聚乙二醇(脂质-PEG)缀合物。寡核苷酸壳包括一个或多个连接至脂质纳米颗粒核的外表面的寡核苷酸。寡核苷酸壳的球形架构赋予了优于传统核酸递送方法的独特优势，包含不依赖转染剂进入几乎所有细胞、对核酸酶降解的抗性、基于序列的功能、靶向和诊断。

因此，在各个方面，本公开提供了一种脂质纳米颗粒球形核酸(LNP-SNA)，其包括(a)脂质纳米颗粒核；(b)连接至脂质纳米颗粒核的外表面的寡核苷酸壳；以及(c)基因编辑蛋白。因此，LNP-SNA包括基因编辑蛋白、可电离的脂质、磷脂、甾醇和脂质-聚乙二醇(脂质-PEG)缀合物。在一些实施例中，可电离的脂质是二油烯基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二油烯基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、C12-200、1,2-二油烯基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、类似的脂质/类脂质结构或其组合。在一些实施例中，磷脂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十六烷酰磷脂酰胆碱(DPPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或其组合。在另外的实施例中，甾醇是3β-羟基胆甾-5-烯(胆固醇)、9,10-断胆甾烷-5,7,10(19)-三烯-3β-醇(维生素D3)、9,10-开环麦角甾-5,7,10(19),22-四烯-3β-醇(维生素D2)、钙泊三醇、24-乙基-5,22-胆甾二烯-3β-醇(豆甾醇)、22,23-二氢豆甾醇(β-谷甾醇)、3,28-二羟基-羽扇豆醇(桦木醇)、羽扇豆醇、熊果酸、齐墩果酸、24α-甲基胆固醇(菜油甾醇)、24-乙基胆甾-5,24(28)E-二烯-3β-醇(岩藻甾醇)、24-甲基胆甾-5,22-二烯-3β-醇(菜籽甾醇)、24-甲基胆甾-5,7,22-三烯-3β-醇(麦角甾醇)、9,11-去氢麦角甾醇、胡萝卜甾醇或用一个或多个氨基酸修饰的任何前述甾醇。在一些实施例中，脂质-聚乙二醇(脂质-PEG)缀合物包括2000道尔顿(Da)的聚乙二醇。在另外的实施例中，脂质-聚乙二醇(脂质-PEG)缀合物是脂质-PEG-马来酰亚胺。在仍另外的实施例中，脂质-PEG-马来酰亚胺是与2000Da聚乙二醇马来酰亚胺缀合的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)，与2000Da聚乙二醇马来酰亚胺缀合的1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)，或其组合。

根据本公开预期使用的寡核苷酸包含通过任何方式(例如，共价或非共价连接)连接至纳米颗粒核的寡核苷酸。在本公开的任何方面或实施例中，经由将寡核苷酸共价连接至脂质-聚乙二醇(脂质-PEG)缀合物上，将寡核苷酸连接至脂质纳米颗粒核的外部。在一些实施例中，寡核苷酸壳中10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的寡核苷酸通过脂质-PEG缀合物共价连接至脂质纳米颗粒核的外部。在各个实施例中，寡核苷酸壳中的一个或多个寡核苷酸通过脂质锚定基团连接至脂质纳米颗粒核的外部。在各个实施例中，脂质锚定基团连接至寡核苷酸的5'端或3'端。在各个实施例中，脂质锚定基团是胆固醇或生育酚。

在本公开的任何方面或实施例中，合成LNP-SNA，使得基因编辑蛋白被包封在脂质纳米颗粒核中，并且寡核苷酸壳被连接至脂质纳米颗粒核的外部。一般而言并且举例来说，脂质纳米颗粒(LNP)可以通过在乙醇中稀释脂质和甾醇来配制。

脂质体球形核酸(LSNA)

脂质体是在不同尺寸范围内的球形自封闭结构，包括一个或多个具有亲水性核的疏水性脂质双层。这些基于脂质的载剂的直径范围为0.15-1微米，其显著高于20-100纳米的有效治疗范围。被称为小单层囊泡(SUV)的脂质体可以在20-50纳米尺寸范围内合成，但是遇到了挑战，诸如不稳定性和导致颗粒间融合体的聚集。这种颗粒间融合体限制了SUV在治疗中的使用。

脂质体球形核酸(LSNA)由于其化学可调的结构、生物相容性和在无需转染试剂的情况下快速进入细胞的能力是一种有吸引力的治疗递送平台。本公开提供了通过将基因编辑蛋白封装在LSNA中而将它们递送到细胞中的方法。包封的基因编辑酶保持酶活性，并且迅速进入哺乳动物细胞。这些性质使得这种新形式的LSNA成为基因编辑治疗的递送载体。

先前的SNA介导的蛋白递送策略需要对蛋白上的氨基酸进行化学修饰，这可以抑制蛋白功能。包封在LSNA中的蛋白在没有任何化学修饰的情况下可以被递送到细胞中。此外，阳离子脂质介导的蛋白递送策略需要阴离子蛋白复合物。然而，SNA介导的递送使用中性磷脂，并且不需要阴离子蛋白。因此，这种方法也有助于递送带正电荷的蛋白，诸如TALEN。

因此，在一些方面，本公开考虑了本文公开的LSNA(包含基因编辑酶)和表面官能化的寡核苷酸在基因编辑的方法中的用途(例如，CRISPR缔合蛋白9(Cas9)(Jinek等人，(2012)《科学》，816-821；Zuris等人，《自然生物技术》2015年1月；33(1):73-80，其通过引用以其整体并入本文)、CRISPR RNA(crRNA)，和反式激活crRNA(tracrRNA)，转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN))。

因此，本公开提供了用于包含但不限于体外或体内递送基因编辑蛋白(例如，递送至细胞)的方法中的LSNA。例如如在国际专利申请第PCT/US2014/068429号(其通过引用以其整体并入本文，特别是关于脂质体颗粒的讨论)中公开的脂质体颗粒也是本公开所考虑的。本公开的脂质体颗粒具有至少基本上球形的几何形状、内侧和外侧，并且包括脂质双层。因此，在各个方面，本公开提供了球形核酸(SNA)，其包括(a)脂质体核；(b)连接至脂质体核的外表面的寡核苷酸壳；以及(c)基因编辑蛋白。脂质双层包括多个脂质基团，在各个实施例中，脂质基团包括来自脂质的磷酸胆碱家族或脂质的磷酸乙醇胺家族的脂质。由本公开考虑的脂质包含但不限于1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-磷脂酰胆碱(DMPC)、1-棕榈酰-2-油酰基-sn-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DSPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二十六酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、心磷脂、脂质A，其组合。在各个实施例中，寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸通过脂质锚定基团连接至脂质体核的外部。在另外的实施例中，脂质锚定基团被连接到至少一个寡核苷酸的5'端或3'端。在仍另外的实施例中，脂质锚定基团是生育酚或胆固醇。因此，在各个实施例中，寡核苷酸壳中的至少一个(或全部)寡核苷酸是含有脂质锚定基团的寡核苷酸-脂质缀合物，其中脂质锚定基团被吸附到脂质双层中。在各个实施例中，脂质锚定基团包括生育酚、棕榈酰、二棕榈酰、硬脂酰、二硬脂酰或胆固醇。在另外的方面，本公开提供了一种LSNA，其具有基本上球形的几何形状，并且包括含有多个脂质基团的脂质双层；包封在脂质体颗粒中的核糖核蛋白(RNP)复合物，RNP包括基因编辑蛋白(例如，CRISPR缔合蛋白9(Cas9))和指导RNA；以及在LSNA的表面上的一个或多个寡核苷酸。

关于本公开的LSNA的表面上的寡核苷酸的表面密度，预期如本文所述的LSNA在其表面上包括约1至约400个寡核苷酸。在各个实施例中，LSNA在其表面上包括约10至约100，或10至约90，或约10至约80，或约10至约70，或约10至约60，或约10至约50，或约10至约40，或约10至约30，或约10至约20，或约50至约100，或约60至约100，或约70至约100，或约80至约100，或约90至约100个寡核苷酸。在另外的实施例中，LSNA在其表面上包括至少约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350或400个寡核苷酸或由其组成。在一些实施例中，LSNA在其表面上包括70个寡核苷酸或由其组成。SNA的另外的表面密度在下文描述。

在一些方面，公开了包括生育酚修饰的寡核苷酸的架构。在各个实施例中，生育酚被认为位于寡核苷酸或其修饰形式的5'端或3'端。生育酚修饰的寡核苷酸包括亲脂端和非亲脂端。亲脂端包括生育酚，并且可以选自由生育酚衍生物、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚组成的组。在另外的实施例中，亲脂端包括棕榈酰、二棕榈酰、硬脂酰、胆固醇或二硬脂酰。

在另外的方面，本公开预期使用胆固醇或磷脂代替生育酚。胆固醇在固相寡核苷酸合成中被连接，在固相寡核苷酸合成中，胆固醇与制备的脂质体混合以形成SNA。在一些实施例中，如下所述制备由95％的1,2-二油酰基-sn-甘油-3磷脂酰胆碱(DOPC)和5％的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(6-叠氮基己酰基)(DPPE-叠氮化物)组成的脂质体。然后加入DBCO修饰的寡核苷酸，其与叠氮化物脂质反应以使表面官能化。

在仍另外的方面，磷脂缀合的寡核苷酸制备如下：首先，通过在氯仿中混合25mg/mL脂质、1当量SMPB和1当量的N,N-二异丙基乙胺，使磷脂酰乙醇胺脂质(诸如DOPE)与琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)反应。使混合物反应过夜。接下来，使用硅胶柱通过快速色谱法(溶剂A：二氯甲烷，溶剂B：甲醇)纯化产物。将硫醇修饰的寡核苷酸(3'或5'端修饰的)用0.2M DTT和0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8)在40℃下还原2小时。然后使用水在尺寸排阻柱中纯化寡核苷酸。将磷脂酰乙醇胺-SMPB脂质经氮气干燥，并且溶解在与寡核苷酸相同体积的乙醇中。然后将寡核苷酸与脂质混合，使得反应是50:50的水和乙醇。使该混合物反应过夜，并且通过用氯仿洗涤反应混合物三次来提取过量的脂质。接下来，水相和界面被干燥并溶解在水中。预期如本文公开的所有脂质缀合的寡核苷酸在LSNA的制备中可互换使用。生育酚修饰的寡核苷酸的非亲脂端是如本文所述的寡核苷酸。

本文公开了制备包括脂质锚的寡核苷酸的方法。例如，首先提供寡核苷酸和氨代亚磷酸酯修饰的生育酚。然后，将寡核苷酸暴露于氨代亚磷酸酯修饰的生育酚，以产生生育酚修饰的寡核苷酸。虽然不旨在是限制性的，但是本领域技术人员已知的任何化学方法都可以用于将生育酚(或任何脂质锚)连接至寡核苷酸，包含酰胺连接或点击化学。

本公开还提供了制造LSNA的方法。在一些实施例中，提供了磷脂、溶剂和生育酚修饰的寡核苷酸。然后，将磷脂加入到溶剂中，以形成包括脂质体的第一混合物。第一混合物中脂质体的尺寸在约100纳米和约150纳米之间。接下来，破坏脂质体以产生包括脂质体和小单层囊泡(SUV)的第二混合物。第二混合物中脂质体和SUV的尺寸在约20纳米和约150纳米之间。接下来，从第二混合物中分离具有在约20纳米和约50纳米之间的粒度的SUV。最后，将生育酚修饰的寡核苷酸加入到分离的SUV中以制备脂质体颗粒。在各个实施例中，通过本公开的方法产生的LSNA的直径小于或等于约50纳米。在一些实施例中，产生多个LSNA，并且多个LSNA中的颗粒具有小于或等于约50纳米(例如，约5纳米至约50纳米，或约5纳米至约40纳米，或约5纳米至约30纳米，或约5纳米至约20纳米，或约10纳米至约50纳米，或约10纳米至约40纳米，或约10纳米至约30纳米，或约10纳米至约20纳米)的平均直径。在另外的实施例中，通过本公开的方法产生的多个LSNA中的颗粒具有小于或等于约20纳米，或小于或等于约25纳米，或小于或等于约30纳米，或小于或等于约35纳米，或小于或等于约40纳米，或小于或等于约45纳米的平均直径。

在一些方面，方法包括：(1)向干脂质中加入1X PBS至1-25mg/mL的最终浓度(因此，在各个实施例中，最终浓度为约1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml或25mg/ml)；(2)在液氮中快速冷冻，并且在水浴超声器中解冻3次；(3)通过200nm、100nm、80nm、50nm和30nm的过滤器挤出。使用双过滤器，并且通常通过每个过滤器2-10次。在一些实施例中，过程在50nm停止，但是如果期望30nm的结构，则额外加入30nm过滤器。在另外的方面，当需要30nm脂质体时，一个探针在步骤(2)后进行超声波处理。接下来，将脂质体以21000×g离心10分钟，以去除超声波处理中脱落的金属屑，并且将混合物通过30nm过滤器挤出，如步骤(3)所述。

因此，在一些方面，本公开提供了一种制备LSNA的方法，包括将磷脂加入到溶剂中以形成第一混合物，所述第一混合物包括多个脂质体；破碎所述多个脂质体以产生第二混合物，所述第二混合物包括脂质体和小单层囊泡(SUV)；从所述第二混合物中分离所述SUV，所述SUV具有在约20纳米和50纳米之间的粒度；以及向分离的SUV中加入一个或多个寡核苷酸以制备LSNA。

寡核苷酸

本公开提供了球形核酸(例如，ProSNA、LSNA和LNP-SNA)，其包括纳米颗粒核和连接至纳米颗粒核的外部的寡核苷酸壳。在各个实施例中，寡核苷酸壳包括抑制性寡核苷酸、免疫刺激性寡核苷酸、靶向寡核苷酸或其组合。如本文所述，在一些实施例中，纳米颗粒核包括包封的基因编辑蛋白。在各个实施例中，本公开的寡核苷酸包含DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸、其修饰形式或其组合。在本文描述的任何方面或实施例中，寡核苷酸是单链的、双链的或部分双链的。在本公开的任何方面或实施例中，寡核苷酸包括可检测的标志物。

如本文所述，寡核苷酸的修饰形式也被本公开预期，其包含具有至少一个修饰的核苷酸间键的寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸全部或部分是肽核酸。其他修饰的核苷间键包含至少一个硫代磷酸酯键。仍其他修饰的寡核苷酸包含含有一个或多个通用碱基的寡核苷酸。“通用碱基”是指能够通过形成氢键取代结合至核酸中的A、C、G、T和U中的任何一个而没有显著的结构不稳定的分子。并入通用碱基类似物的寡核苷酸能够起到例如杂交中的探针的作用。通用碱基的实例包含但不限于5'-硝基吲哚-2'-脱氧核苷、3-硝基吡咯、肌苷和次黄嘌呤。

如本文所用的术语“核苷酸”或其复数可以与如本文所述和本领域中以其他方式已知的修饰形式互换。如本文所用的术语“核碱基”或其复数可与如本文所述和在本领域以其他方式已知的修饰形式互换。核苷酸或核碱基包括天然存在的核碱基A、G、C、T和U。非天然存在的核碱基包含，例如但不限于，黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N4,N4-乙醇胞嘧啶、N',N'-乙醇-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mC)、5-(C3-C6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷和在Benner等人，美国专利第5,432,272号以及Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann，1997，《核酸研究(Nucleic Acids Research)》，第25卷：第4429页-第4443页中描述的“非天然存在的”核碱基。术语“核碱基”还不仅包含已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且还包含其杂环类似物和互变异构体。另外的天然和非天然存在的核碱基包含以下中公开的那些：美国专利第3,687,808号(Merigan等人)、Sanghvi于《反义研究与应用(Research and Application)》，S.T.Crooke和B.Lebleu编辑，CRC出版社(CRCPress)，1993的第15章、Englisch等人，1991，《德国应用化学国际版(Angewandte Chemie,International Edition)》，30:613-722(尤其参见第622页和第623页以及《聚合物科学和工程化简明百科全书(The Concise Encyclopedia of Polymer Science andEngineering)》，J.I.Kroschwitz编辑，约翰·威利父子出版公司(John Wiley&Sons)，1990，第858页-第859页，Cook，《抗癌药物设计(Anti-Cancer Drug Design)》1991,6,585-607，文献中的每一个据此通过引用以其整体并入)。在各个方面，寡核苷酸还包含作为一种类别的非天然存在的核苷酸的一个或多个“核苷碱基”或“碱基单元”，其包含诸如可以如核碱基一样发挥作用的杂环化合物等的化合物，化合物包含在最经典的意义上不是核苷碱基但用作核苷碱基的某些“通用碱基”。通用碱基包含3-硝基吡咯、任选地取代的吲哚(例如5-硝基吲哚)和任选地取代的次黄嘌呤。其他期望的通用碱基包含吡咯、二唑或三唑衍生物，包含本领域中已知的那些通用碱基。

寡核苷酸的实例包含含有经修饰的主链或非天然核苷间键的寡核苷酸。具有修饰的主链的寡核苷酸包含那些在主链中保留磷原子的寡核苷酸和那些在主链中没有磷原子的寡核苷酸。在其核苷间主链中没有磷原子的修饰的寡核苷酸被认为在“寡核苷酸”的含义范围内。

含有磷原子的修饰的寡核苷酸主链包含，例如，具有正常3'-5'键的硫代磷酸酯类、手性硫代磷酸酯类、二硫代磷酸酯类、磷酸三酯类、氨基烷基磷酸三酯类、甲基和其他烷基磷酸酯类(包含3'-亚烷基磷酸酯、5'-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯、次磷酸酯)、氨代磷酸酯类(包含3'-氨基氨代磷酸酯和氨基烷基氨代磷酸酯、硫羰氨代磷酸酯)、硫羰烷基磷酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼烷磷酸酯、这些修饰的寡核苷酸主链的2'-5'连接的类似物以及具有反转极性的修饰的寡核苷酸主链，其中一个或多个核苷酸间键是3'至3'、5'至5'或2'至2'键。还考虑具有反转极性的寡核苷酸，其在3'-最末端的核苷酸键上包含单一3'至3'键，即，可能无碱基的(此核苷酸失去或在其位置中具有羟基基团)单一反转核苷酸残基。还考虑盐类、混合盐类以及游离酸形式。可以教导制备上述含磷的键的代表性美国专利包含：美国专利第3,687,808号；第4,469,863号；第4,476,301号；第5,023,243号；第5,177,196号；第5,188,897号；第5,264,423号；第5,276,019号；第5,278,302号；第5,286,717号；第5,321,131号；第5,399,676号；第5,405,939号；第5,453,496号；第5,455,233号；第5,466,677号；第5,476,925号；第5,519,126号；第5,536,821号；第5,541,306号；第5,550,111号；第5,563,253号；第5,571,799号；第5,587,361号；第5,194,599号；第5,565,555号；第5,527,899号；第5,721,218号；第5,672,697号和第5,625,050号，专利的公开内容通过引用并入本文。

其中不包含磷原子的修饰的寡核苷酸主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些主链包含：具有吗啉代键的主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；核糖乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及其他具有混合的N、O、S和CH₂组成部分的主链。参见例如美国专利第5,034,506号；第5,166,315号；第5,185,444号；第5,214,134号；第5,216,141号；第5,235,033号；第5,264,562号；第5,264,564号；第5,405,938号；第5,434,257号；第5,466,677号；第5,470,967号；第5,489,677号；第5,541,307号；第5,561,225号；第5,596,086号；第5,602,240号；第5,610,289号；第5,602,240号；第5,608,046号；第5,610,289号；第5,618,704号；第5,623,070号；第5,663,312号；第5,633,360号；第5,677,437号；第5,792,608号；第5,646,269和5,677,439，专利的公开内容通过引用以其整体并入本文。

在仍另外的实施例中，寡核苷酸模拟物，其中核苷酸单元的一个或多个糖和/或一个或多个核苷酸间键被“非天然存在的”基团替换。寡核苷酸的碱基被保留以用于杂交。在一些方面，该实施例考虑了肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链被含有酰胺的主链替换。参见例如美国专利第5,539,082号；第5,714,331号；和第5,719,262号以及Nielsen等人，《科学》，1991,254,1497-1500，专利的公开内容通过引用并入本文。

在仍另外的实施例中，寡核苷酸提供有硫代磷酸酯主链和具有杂原子主链的寡核苷，并且包含在美国专利第号5,489,677和第5,602,240号中描述的-CH₂-NH-O-CH₂-、-CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-、-CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-、-CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂-和-O-N(CH₃)-CH₂-CH₂-。还考虑了在美国专利第5,034,506号中描述的具有吗啉主链结构的寡核苷酸。

在各种形式中，寡核苷酸中两个连续单体之间的键由2至4个，理想地3个选自以下的基团/原子组成：-CH₂-、-O-、-S-、-NR^H-、>C＝O、>C＝NR^H、>C＝S、-Si(R")₂-、-SO-、-S(O)₂-、-P(O)₂-、-PO(BH₃)-、-P(O,S)-、-P(S)₂-、-PO(R")-、-PO(OCH₃)-和-PO(NHR^H)-，其中R^H选自氢和C_1-4-烷基，并且R"选自C_1-6-烷基和苯基。此类键的说明性实例是-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CO-CH₂-、-CH₂-CHOH-CH₂-、-O-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-、-O-CH₂-CH＝(当用作与下一个单体的键时包含R⁵)、-CH₂-CH₂-O-、-NR^H-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-NR^H-、-CH₂-NR^H-CH₂--、-O-CH₂-CH₂-NR^H-、-NR^H-CO-O-、-NR^H-CO-NR^H-、-NR^H-CS-NR^H-、-NR^H-C(＝NR^H)-NR^H-、-NR^H-CO-CH₂-NR^H-O-CO-O-、-O-CO-CH₂-O-、-O-CH₂-CO-O-、-CH₂-CO-NR^H-、-O-CO-NR^H-、-NR^H-CO-CH₂-、-O-CH₂-CO-NR^H-、-O-CH₂-CH₂-NR^H-、-CH＝N-O-、-CH₂-NR^H-O-、-CH₂-O-N＝(当用作与下一个单体的键时包含R⁵)、-CH₂-O-NR^H-、-CO-NR^H-CH₂-、-CH₂-NR^H-O-、-CH₂-NR^H-CO-、-O-NR^H-CH₂-、-O-NR^H、-O-CH₂-S-、-S-CH₂-O-、-CH₂-CH₂-S-、-O-CH₂-CH₂-S-、-S-CH₂-CH＝(当用作与下一个单体的键时包含R⁵)、-S-CH₂-CH₂-、-S-CH₂-CH₂--O-、-S-CH₂-CH₂-S-、-CH₂-S-CH₂-、-CH₂-SO-CH₂-、-CH₂-SO₂-CH₂-、-O-SO-O-、-O-S(O)₂-O-、-O-S(O)₂-CH₂-、-O-S(O)₂-NR^H-、-NR^H-S(O)₂-CH₂-、-O-S(O)₂-CH₂-、-O-P(O)₂-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)₂-O-、-S-P(O)₂-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)₂-O-、-O-P(O)₂-S-、-O-P(O,S)-S-、-O-P(S)₂-S-、-S-P(O)₂-S-、-S-P(O,S)-S-、-S-P(S)₂-S-、-O-PO(R")-O-、-O-PO(OCH₃)-O-、-O-PO(OCH₂CH₃)-O-、-O-PO(OCH₂CH₂S-R)-O-、-O-PO(BH₃)-O-、-O-PO(NHR^N)-O-、-O-P(O)₂-NR^HH-、-NR^H-P(O)₂-O-、-O-P(O,NR^H)-O-、-CH₂-P(O)₂-O-、-O-P(O)₂-CH₂-和-O-Si(R")₂-O-，其中考虑-CH₂-CO-NR^H-、-CH₂-NR^H-O-、-S-CH₂-O-、-O-P(O)₂-O-O-P(-O,S)-O-、-O-P(S)₂-O-、-NR^H P(O)₂-O-、-O-P(O,NR^H)-O-、-O-PO(R")-O-、-O-PO(CH₃)-O-和-O-PO(NHR^N)-O-，其中R^H选自氢和C_1-4-烷基，并且R"选自C_1-6-烷基和苯基。在Mesmaeker等人，《结构生物学的最新观点(Current Opinion in Structural Biology)》1995,5,343-355以及Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann，《核酸研究》，1997，第25卷，第4429页-第4443页中给出了另外的说明性实例。

寡核苷酸的其他修饰形式在美国专利申请第20040219565号中有详细描述，其公开内容通过引用以其整体并入本文。

经修饰的寡核苷酸也可以含有一个或多个取代的糖部分。在某些方面，寡核苷酸在2'位置上包括以下中的一个：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基以及炔基可以是取代或未取代的C₁至C₁₀烷基或C₂至C₁₀烯基和炔基。其他实施例包含O[(CH₂)_nO]_mCH₃、O(CH₂)_nOCH₃、O(CH₂)_nNH₂、O(CH₂)_nCH₃、O(CH₂)_nONH₂和O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃]₂，其中n和m是1至约10。其他寡核苷酸在2'位置包括以下中的一个：C₁至C₁₀低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团。在一个方面，修饰包含2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH₂CH₂OCH₃，也被称为2'-O-(2-甲氧乙基)或2'-MOE)(Martin等人，《瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta)》1995,78,486-504)，即烷氧基烷氧基基团。其他修饰包含2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH₂)₂ON(CH₃)₂基团，也被称为2'-DMAOE；以及2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也被称为2'-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₃)₂。

仍其他修饰包含2'-甲氧基(2'-O-CH³)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂)、2'-烯丙基(2'-CH₂-CH＝CH₂)、2'-O-烯丙基(2'-O-CH₂-CH＝CH₂)和2'-氟(2'-F)。2'-修饰可以在阿拉伯糖(上)位置或核糖(下)位置。在一个方面，2'-阿拉伯糖修饰是2'-F。也可以在寡核苷酸上的其他位置处进行类似的修饰，例如，在3'末端核苷酸上或在2'-5'连接的寡核苷酸中的糖的3'位置以及5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸也可以具有糖模拟物(如环丁基部分)来代替五碳呋喃糖。参见例如美国专利第4,981,957号、第5,118,800号、第5,319,080号、第5,359,044号、第5,393,878号、第5,446,137号、第5,466,786号、第5,514,785号、第5,519,134号、第5,567,811号、第5,576,427号、第5,591,722号、第5,597,909号、第5,610,300号、第5,627,053号、第5,639,873号、第5,646,265号、第5,658,873号、第5,670,633号、第5,792,747和5,700,920，专利的公开内容通过引用以其整体并入本文。

在一些方面，糖的修饰包含锁定的核酸(LNA)，其中2'-羟基基团连接至糖环的3'或4'碳原子，从而形成双环糖部分。在某些方面，该键是桥接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基(-CH₂-)_n基团，其中n是1或2。在WO 98/39352和WO 99/14226中描述了LNA及其制备。

在EP 1 072 679和WO 97/12896中描述了修饰的核苷酸，其公开内容通过引用并入本文。修饰的核碱基包含但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(具体为5-溴)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外修饰的碱基包含三环嘧啶类，诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噁嗪2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-形钳如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶2-酮)。修饰的碱基还可以包含其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环类替换的那些碱基，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶以及2-吡啶酮。另外的核碱基包含公开于美国专利第3,687,808号中的那些、公开于《聚合物科学和工程化简明百科全书》，第858页-第859页，Kroschwitz,J.I.编辑，约翰·威利父子出版公司，1990中的那些、由Englisch等人，1991，《德国应用化学国际版》，30:613公开的那些以及由Sanghvi,Y.S.，《反义研究与应用》第15章，第289页-第302页，Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑，CRC出版社，1993公开的那些。这些碱基中的某些碱基可用于提高结合亲和力并且包含5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包含2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已经显示使核酸双链体的稳定性提高0.6-1.2℃并且在某些方面与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合。参见美国专利第3,687,808号；第4,845,205号；第5,130,302号；第5,134,066号；第5,175,273号；第5,367,066号；第5,432,272号；第5,457,187号；第5,459,255号；第5,484,908号；第5,502,177号；第5,525,711号；第5,552,540号；第5,587,469号；第5,594,121,5,596,091号；第5,614,617号；第5,645,985号；第5,830,653号；第5,763,588号；第6,005,096号；第5,750,692and5,681,941，专利的公开内容通过引用并入本文。

制备预定序列的多核苷酸的方法是熟知的。参见，例如，Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(第2版，1989)和F.Eckstein(编辑)《寡核苷酸和类似物(Oligonucleotides and Analogues)》，第1版(纽约牛津大学出版社(Oxford University Press)，1991)。固相合成方法对于多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸都是优选的(熟知的合成DNA的方法也可用于合成RNA)。多核糖核苷酸也可以酶促地制备。非天然存在的核碱基也可以并入到多核苷酸中。参见例如美国专利第7,223,833号；Katz，《美国化学学会杂志》，74:2238(1951)；Yamane等人，《美国化学学会杂志》，83:2599(1961)；Kosturko等人，《生物化学(Biochemistry)》，13:3949(1974)；Thomas，《美国化学学会杂志》，76:6032(1954)；Zhang等人，《美国化学学会杂志》，127:74-75(2005)；和Zimmermann等人，《美国化学学会杂志》，124:13684-13685(2002)。

在各个方面，本公开的寡核苷酸或其修饰形式的长度通常为约5个核苷酸至约100个核苷酸。更具体地，本公开的寡核苷酸长度为约5至约90个核苷酸，长度为约5至约80个核苷酸，长度为约5至约70个核苷酸，长度为约5至约60个核苷酸，长度为约5至约50个核苷酸，长度为约5至约45个核苷酸，长度为约5至约40个核苷酸，长度为约5至约35个核苷酸，长度为约5至约30个核苷酸，长度为约5至约25个核苷酸长，长度为约5至约20个核苷酸，长度为约5至约15个核苷酸，长度为为约5至约10个核苷酸，长度为约10至约100个核苷酸，长度为约10至约90个核苷酸，长度为约10至约80个核苷酸，长度为约10至约70个核苷酸，长度为约10至约60个核苷酸，长度为约10至约50个核苷酸，长度为约10至约45个核苷酸，长度为约10至约40个核苷酸，长度为约10至约35个核苷酸，长度为约10至约30个核苷酸，长度为约10至约25个核苷酸，长度为约10至约20个核苷酸，长度为约10至约15个核苷酸，长度为约18至约28个核苷酸，长度为约15至约26个核苷酸，以及处于具体公开的长度大小之间的所有寡核苷酸，只要寡核苷酸能够实现所需的结果。在另外的实施例中，本公开的寡核苷酸长度为约5至约100个核苷酸，长度为约5至约90个核苷酸，长度为约5至约80个核苷酸，长度为约5至约70个核苷酸，长度为约5至约60个核苷酸，长度为约5至约50个核苷酸，长度为约5至约40个核苷酸，长度为约5至约30个核苷酸，长度为约5至约20个核苷酸，长度为约5至约10个核苷酸，以及处于具体公开的长度大小之间的所有寡核苷酸，只要寡核苷酸能够实现所需的结果。因此，在各个实施例中，本公开的寡核苷酸的长度为或为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个核苷酸。在另外的实施例中，本公开的寡核苷酸的长度少于6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个核苷酸。在各个实施例中，连接至SNA的纳米颗粒核的外部的寡核苷酸壳包括多个都具有相同长度/序列的寡核苷酸，而在一些实施例中，多个寡核苷酸包括一个或多个相对于多个寡核苷酸中的至少一个其他寡核苷酸具有不同长度和/或序列的寡核苷酸。在各个实施例中，纳米颗粒核包括一个或多个包封在其中的寡核苷酸。

在一些实施例中，寡核苷酸壳中的寡核苷酸是适体。因此，本文描述的寡核苷酸的所有特征和方面(例如，长度、类型(DNA、RNA、其修饰形式)、间隔子的任选存在)也适用于适体。适体是寡核苷酸序列，其可以被进化以结合至各种感兴趣的靶标分析物。适体可以是单链的、双链的或部分双链的。

将如本文所述的可检测标志物(例如，荧光团和放射性标记)和治疗剂(例如，抗体)连接至寡核苷酸的方法是本领域已知的。

间隔子。在一些方面和实施例中，连接至SNA的纳米颗粒核的寡核苷酸壳中的一个或多个寡核苷酸包括间隔子。如本文所用的“间隔子”意指这样的部分，该部分用于增加纳米颗粒核和寡核苷酸之间的距离，或者当以多拷贝连接至纳米颗粒核上时用于增加单个寡核苷酸之间的距离，或者用于改善SNA合成。因此，预期间隔子位于寡核苷酸和纳米颗粒核之间。

在一些方面，间隔子(当存在时)为有机部分。在一些方面，间隔子是聚合物，包含但不限于水溶性聚合物、核酸、多肽、寡糖、碳水化合物、脂质、乙二醇或其组合。在本公开的任何方面或实施例中，间隔子是基于低聚(乙二醇)的间隔子。在各个实施例中，寡核苷酸包括1、2、3、4、5或更多个间隔子(例如，间隔子-18(六乙二醇))部分。在另外的实施例中，间隔子是基于烷烃(例如，C12)的间隔子。在一些实施例中，间隔子是寡核苷酸间隔子(例如，T5)。寡核苷酸间隔子可以具有不干扰寡核苷酸变得结合到纳米颗粒核或靶的能力的任何序列。在某些方面，寡核苷酸间隔子的碱基是所有腺苷酸、所有胸苷酸、所有胞苷酸、所有鸟苷酸、所有尿苷酸或所有一些其他修饰的碱基。

在各个实施例中，间隔子的长度为或等于至少约2个核苷酸、至少约3个核苷酸、至少约4个核苷酸、至少约5个核苷酸、5-10个核苷酸、10个核苷酸、10-30个核苷酸，或者甚至大于30个核苷酸。

SNA表面密度。通常，至少约2皮摩尔/cm²的寡核苷酸的表面密度将足以提供稳定的SNA。在一些方面，本公开的SNA(例如，ProSNA、LSNA和LNP-SNA)的表面密度为至少15皮摩尔/cm²。还提供了方法，其中寡核苷酸以约2pmol/cm²至约200pmol/cm²，或约10pmol/cm²至约100pmol/cm²的表面密度连接至SNA的纳米颗粒核。在另外的实施例中，表面密度是至少约2pmol/cm²、至少3pmol/cm²、至少4pmol/cm²、至少5pmol/cm²、至少6pmol/cm²、至少7pmol/cm²、至少8pmol/cm²、至少9pmol/cm²、至少10pmol/cm²、至少约15pmol/cm²、至少约19pmol/cm²、至少约20pmol/cm²、至少约25pmol/cm²、至少约30pmol/cm²、至少约35pmol/cm²、至少约40pmol/cm²、至少约45pmol/cm²、至少约50pmol/cm²、至少约55pmol/cm²、至少约60pmol/cm²、至少约65pmol/cm²、至少约70pmol/cm²、至少约75pmol/cm²、至少约80pmol/cm²、至少约85pmol/cm²、至少约90pmol/cm²、至少约95pmol/cm²、至少约100pmol/cm²、至少约125pmol/cm²、至少约150pmol/cm²、至少约175pmol/cm²、至少约200pmol/cm²、至少约250pmol/cm²、至少约300pmol/cm²、至少约350pmol/cm²、至少约400pmol/cm²、至少约450pmol/cm²、至少约500pmol/cm²、至少约550pmol/cm²、至少约600pmol/cm²、至少约650pmol/cm²、至少约700pmol/cm²、至少约750pmol/cm²、至少约800pmol/cm²、至少约850pmol/cm²、至少约900pmol/cm²、至少约950pmol/cm²、至少约1000pmol/cm²或更大。在另外的实施例中，表面密度为小于约2pmol/cm²、小于约3pmol/cm²、小于约4pmol/cm²、小于约5pmol/cm²、小于约6pmol/cm²、小于约7pmol/cm²、小于约8pmol/cm²、小于约9pmol/cm²、小于约10pmol/cm²、小于约15pmol/cm²、小于约19pmol/cm²、小于约20pmol/cm²、小于约25pmol/cm²、小于约30pmol/cm²、小于约35pmol/cm²、小于约40pmol/cm²、小于约45pmol/cm²、小于约50pmol/cm²、小于约55pmol/cm²、小于约60pmol/cm²、小于约65pmol/cm²、小于约70pmol/cm²、小于约75pmol/cm²、小于约t 80pmol/cm²、小于约85pmol/cm²、小于约90pmol/cm²、小于约95pmol/cm²、小于约100pmol/cm²、小于约125pmol/cm²、小于约150pmol/cm²、小于约175pmol/cm²、小于约200pmol/cm²、小于约250pmol/cm²、小于约300pmol/cm²、小于约350pmol/cm²、小于约400pmol/cm²、小于约450pmol/cm²、小于约500pmol/cm²、小于约550pmol/cm²、小于约600pmol/cm²、小于约650pmol/cm²、小于约700pmol/cm²、小于约750pmol/cm²、小于约800pmol/cm²、小于约850pmol/cm²、小于约900pmol/cm²、小于约950pmol/cm²或小于约1000pmol/cm²。

可替代地，连接至SNA的寡核苷酸的密度通过连接至SNA的寡核苷酸的数量来测量。关于与本公开的SNA连接的寡核苷酸的表面密度，预期如本文所述的SNA在其表面上包括约1至约2,500，或约1至约500个寡核苷酸。在各个实施例中，SNA在连接至纳米颗粒核的寡核苷酸壳中包括约10至约500，或约10至约300，或约10至约200，或约10至约190，或约10至约180，或约10至约170，或约10至约160，或约10至约150，或约10至约140，或约10至约130，或约10至约120，或约10至约110，或约10至约100，或10至约90，或约10至约80，或约10至约70，或约10至约60，或约10至约50，或约10至约40，或约10至约30，或约10至约20个寡核苷酸。在一些实施例中，SNA在连接至纳米颗粒核的寡核苷酸壳中包括约80至约140个寡核苷酸。在另外的实施例中，SNA在连接至纳米颗粒核的寡核苷酸壳中包括至少约5、10、20、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200个寡核苷酸。在另外的实施例中，SNA由在连接至纳米颗粒核的寡核苷酸壳中的5、10、20、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200个寡核苷酸组成。在仍另外的实施例中，连接至SNA的纳米颗粒核的寡核苷酸壳包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个寡核苷酸。在一些实施例中，连接至SNA的纳米颗粒核的寡核苷酸壳由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个寡核苷酸组成。

组合物

本公开还提供了包括本公开的SNA或其多个的组合物。在本公开的任何方面或实施例中，组合物进一步包括指导RNA。在一些实施例中，组合物进一步包括药学上可接受的载剂。术语“载剂”是指将如本文所述的SNA施用于受试者的载体。可以使用与根据本公开的SNA相容的任何常规介质或药剂。术语载剂包含稀释剂、赋形剂、佐剂及其组合。药学上可接受的载剂在本领域中是熟知的(参见，例如，Martin的《雷明顿制药科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》，1975，其全部公开内容通过引用并入本文)。

示例性的“稀释剂”包含注射用水、盐水溶液、缓冲剂如Tris、乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。示例性的“赋形剂”包含但不限于稳定剂，如氨基酸和氨基酸衍生物、聚乙二醇和聚乙二醇衍生物、多元醇、酸、胺、多糖或多糖衍生物、盐和表面活性剂；以及pH调节剂。在一些实施例中，本文提供的SNA包括免疫刺激性寡核苷酸(例如但不限于CpG寡核苷酸)作为佐剂。本领域已知的其他佐剂也可以用于本公开的组合物中。例如，佐剂可以是铝或其盐、矿物油、弗氏佐剂、植物油、油包水乳液、无机盐、小分子(例如，咪喹莫特、瑞喹莫德)、细菌组分(例如，鞭毛蛋白、单磷酰脂质A)或其组合。

SNA在基因调控中的用途

在本公开的一些方面，与SNA(例如，ProSNA、LNP-SNA、LSNA)缔合的寡核苷酸抑制基因的表达。与在不存在SNA时的基因产物表达相比，本文提供的用于抑制基因产物表达的方法包含其中靶基因产物的表达被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。换句话说，所提供的方法包含那些导致靶基因产物的表达的基本上任何抑制程度的方法。

抑制程度由体液样品或活检样品或通过本领域熟知的成像技术在体内确定。可替代地，抑制程度在细胞培养测定中确定，通常作为由使用特定类型的SNA和特定寡核苷酸引起的在体内可预期的抑制程度的可预测测量。

在本公开的一些方面，预期SNA执行基因抑制功能以及药剂递送功能。在此类方面，药剂(例如，治疗剂剂)与SNA结合，并且颗粒另外用一个或多个被设计成用于实现抑制靶基因表达的寡核苷酸官能化。

在各个方面，方法包含使用与靶多核苷酸100％互补(即完全匹配)的寡核苷酸，而在其他方面，寡核苷酸在寡核苷酸的长度上与多核苷酸至少(意指大于或等于)约95％互补，在寡核苷酸的长度上与多核苷酸至少约90％，至少约85％，至少约80％，至少约75％，至少约70％，至少约65％，至少约60％，至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约20％互补，其程度为寡核苷酸能够实现对靶基因产物的所需抑制程度。

本领域应理解，反义化合物的序列不需要与其靶核酸的序列100％互补才能特异性杂交。此外，寡核苷酸可以在一个或多个区段上杂交，使得介入或相邻的区段不参与杂交事件(例如，环结构或发夹结构)。互补百分比由寡核苷酸的长度决定。例如，给定一种反义化合物，其中反义化合物的20个核苷酸中的18个与总长度为100个核苷酸的靶多核苷酸中的20个核苷酸区域互补，寡核苷酸将有90％的互补性。在这个实例中，剩余的非互补核苷酸可以与互补的核碱基成簇或散布在一起，并且不需要彼此相邻或与互补的核苷酸相邻。反义化合物与靶核酸的区域的互补性百分比可以使用BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和本领域中已知的PowerBLAST程序(Altschul等人，《分子生物学杂志》，1990,215,403-410；Zhang和Madden，《基因组研究(Genome Res.)》，1997,7,649-656)常规地确定。

此类方法中使用的寡核苷酸是RNA或DNA。RNA可以是抑制性寡核苷酸，如执行调节功能的抑制性RNA(RNAi)，并且在各个实施例中选自由小抑制性RNA(siRNA)、单链RNA(ssRNA)和核酶组成的组。可替代地，RNA是执行调节功能的微小RNA。在一些实施例中，DNA是反义DNA。在一些实施例中，RNA是piwi-相互作用RNA(piRNA)。

SNA在免疫调节中的用途

Toll样受体(TLR)是一类在哨兵细胞中表达的蛋白，其在先天免疫系统的调节中起关键作用。哺乳动物免疫系统使用两种一般策略来对抗传染性疾病。病原体暴露迅速触发先天免疫应答，其特征是产生免疫刺激性细胞因子、趋化因子和多反应性IgM抗体。先天免疫系统通过暴露于病原体相关分子模式(PAMP)而被激活，该模式由不同的感染微生物群表达。PAMP的识别是由Toll样受体家族成员介导的。响应于特定的寡核苷酸的TLR受体(如TLR 4，TLR 8和TLR 9)位于特殊的细胞内区室，被称为内体。例如但不限于TLR 4、TLR 8和TLR 9受体的调节机制基于DNA-蛋白相互作用。

如本文所述，含有与在细菌DNA中发现的CpG基序相似的CpG基序的合成免疫刺激性寡核苷酸刺激TLR受体的相似响应。因此，本公开的CpG寡核苷酸具有作为TLR激动剂的功能。由本公开预期的其他TLR激动剂包含但不限于单链RNA和小分子(例如R848(瑞喹莫德))。因此，免疫调节性(例如免疫刺激性)寡核苷酸具有各种潜在的治疗用途，包含治疗免疫缺陷和癌症。因此，在一些实施例中，本公开的SNA用于调节toll样受体(TLR)的活性的方法中。

在一些实施例中，本公开的SNA(例如，ProSNA、LSNA和LNP-SNA)包括作为TLR拮抗剂的寡核苷酸。在一些实施例中，TLR拮抗剂是单链DNA(ssDNA)。

在一些实施例中，免疫系统的下调涉及敲除负责Toll样受体的表达的基因。该反义方法涉及使用本公开的SNA来抑制任何toll样蛋白的表达。

因此，在一些实施例中，公开了利用如本文所述的SNA来调节toll样受体的方法。该方法通过分别使用TLR激动剂或TLR拮抗剂来上调或下调Toll样受体活性。该方法包括使具有toll样受体的细胞与本公开的SNA接触，从而调节toll样受体的活性和/或表达。受调节的toll样受体包含toll样受体1、toll样受体2、toll样受体3、toll样受体4、toll样受体5、toll样受体6、toll样受体7、toll样受体8、toll样受体9、toll样受体10、toll样受体11、toll样受体12和/或toll样受体13中的一种或多种。

SNA治疗病症的用途

在一些实施例中，本公开的SNA(例如，ProSNA、LSNA和LNP-SNA)用于治疗病症。因此，在一些方面，本公开提供了治疗病症的方法，包括向有此需要的受试者(例如，人类受试者)施用有效量的本公开的SNA，其中施用治疗病症。在各个实施例中，病症为癌症、传染性疾病、肺部疾部、胃肠疾病、血液疾病、病毒性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、遗传性疾病、心血管疾病或其组合。SNA的“有效量”是指例如足以影响基因编辑和治疗病症的量。SNA的有效量也是例如抑制基因表达、激活先天免疫应答或其组合并治疗病症的量。因此，本文也考虑了激活先天免疫应答的方法，此类方法包括以有效激活受试者的先天免疫应答的量向有此需要的受试者施用本公开的SNA。

本公开的SNA可以经由任何合适的途径施用，例如肠胃外施用、肌内注射、皮下注射、皮内施用和/或粘膜施用，例如口服或鼻内施用。另外的施用途径包含但不限于静脉内、腹膜内、鼻内施用、阴道内、直肠内和口服施用。本公开还预期了不同施用途径的组合，分别或同时施用。

治疗剂

本文提供的SNA任选地进一步包括治疗剂或其多种。在各个实施例中，治疗剂简单地与连接至SNA的纳米颗粒核的外部的寡核苷酸壳中的寡核苷酸缔合，和/或治疗剂与SNA的纳米颗粒核缔合，和/或治疗剂被包封在SNA中。在一些实施例中，治疗剂与寡核苷酸壳中未连接至纳米颗粒核的寡核苷酸的端缔合(例如，如果寡核苷酸通过其3'端连接至纳米颗粒核，则治疗剂与寡核苷酸的5'端缔合)。可替代地，在一些实施例中，治疗剂与连接到纳米颗粒核的寡核苷酸壳中的寡核苷酸的末端缔合(例如，如果寡核苷酸通过其3'端连接到纳米颗粒核，则治疗剂与寡核苷酸的3'端缔合)。在一些实施例中，治疗剂与寡核苷酸壳中的寡核苷酸共价缔合，寡核苷酸壳连接至SNA的纳米颗粒核的外部。在一些实施例中，治疗剂与寡核苷酸壳中的寡核苷酸非共价缔合，寡核苷酸壳连接至SNA的纳米颗粒核的外部。然而，应当理解，本公开提供了SNA，其中一个或多个治疗剂与连接至SNA的纳米颗粒核的外部的寡核苷酸壳中的寡核苷酸共价和非共价缔合。还应当理解，非共价缔合包含杂交、蛋白结合和/或疏水相互作用。在一些实施例中，治疗剂与本公开的SNA分开施用。因此，在一些实施例中，在施用本公开的SNA之前、之后或同时施用治疗剂来治疗病症。

由本公开预期的治疗剂包含但不限于蛋白(例如，治疗性蛋白)、生长因子、激素、干扰素、白介素、抗体或抗体片段、小分子、肽、抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、化疗剂或其组合。

如本文所用的术语“小分子”是指化合物或药物，或天然的或合成的任何其他低分子量有机化合物。“低分子量”意指分子量小于1500道尔顿，通常在100和700道尔顿之间的化合物。

实例

关于以下实例，提及使用“CRISPR-SNA”可以表示使用不包含任何GALA肽序列的Cas9蛋白。此外，关于以下实例，提及使用“Cas9 SNA”可以表示使用如本文所述的“融合”Cas9蛋白，其按照从N末端到C末端的顺序包括以下结构：(i)一个或多个GALA肽；(ii)基因编辑蛋白，以及(iii)核定位信号(NLS)。

实例1

LSNA在基因编辑中的用途

本公开提供了使用球形核酸将基因编辑蛋白递送到哺乳动物细胞中的方法。合成化脓性链球菌Cas9与tracrRNA和crRNA的酶促活性的核糖核蛋白(RNP)复合物，然后将RNP包封在由95％的1,2-二油酰基-sn-甘油-3磷脂酰胆碱(DOPC)和5％的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(6-叠氮基己酰基)(DPPE-叠氮化物)制成的脂质体中。然后用5'DBCO修饰的DNA将脂质体官能化，以产生LSNA。这些颗粒含有酶促活性的Cas9，并且被哺乳动物细胞高效吸收。

方法

除非另有说明，否则所有试剂均购自商业来源，并且按照收到时使用。对于寡核苷酸、crRNA和tracrRNA合成，所有氨代亚磷酸酯和试剂均购自格伦研究公司(GlenResearch,Co.)(美国弗吉尼亚州斯特灵)。所有的脂质均购自Avanti Polar Lipids(美国亚拉巴马州阿拉巴斯特)，为干粉形式或氯仿形式，并且在无需进一步纯化的情况下使用。Cas9 NLS(Cas9)、蛋白酶K和Phusion PCR试剂盒购自新英格兰生物实验室(美国马塞诸塞州伊普斯威奇)。Alexa Fluor 647NHS酯染料(Alexa 647)购自Lumiprobe公司(美国马里兰州科基斯维尔)。质粒购自AddGene(美国马萨诸塞州剑桥。GelRed染料购自Biotium公司(美国加利福尼亚州弗里蒙特)。所有其他试剂均购自Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。C166-GFP细胞购自ATCC(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)，并且Opti-MEM购自生命技术公司(Life Technologies)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。

Cas9标记和定量

为了追踪和定量Cas9，将2纳摩尔的Cas9与10纳摩尔的Alexa 647NHS酯在1X HBS中在4℃下温育过夜，产生Alexa-Cas9。为了除去未反应的染料，将Alexa-Cas9运行通过在1X HBS中平衡的NAP5柱，并在1mL 1X HBS中洗脱。使用NAP5柱将2纳摩尔未修饰的Cas9交换成1X HBS，并与Alexa Cas9组合。分别使用在280nm和650nm的吸光度来计算Cas9和Alexa染料的浓度，并且计算Alexa染料与Cas9的摩尔比。然后将Alexa-Cas9稀释至1μM。保留20μL等分试样用于活性和浓度测定。

Cas9核糖核蛋白的合成和浓缩

通过将10μM crRNA与10μM tracrRNA在1X HBS中在95℃下温育5分钟，并允许冷却至室温10分钟，来产生十纳摩尔的crRNA和tracrRNA。然后将十纳摩尔的crRNA/tracrRNA复合物与4纳摩尔的1μM Alexa-Cas9混合，并且允许在室温下静置10分钟，以形成Cas9核糖核蛋白(RNP)。然后将RNP在Amicon 10K旋转过滤器中浓缩5分钟，然后再悬浮，直到保留的液体体积达到500μL或更少。使用Alexa 647染料的吸光度再次量化Cas9浓度。留出20μL用于活性和浓度测量。

SNA的合成与纯化

为了合成包封Cas9 RNP的脂质体，通过冻在干氯仿中的3mg DOPC和0.15mg DPPE-叠氮化物的混合物来产生脱水的磷脂膜。然后用在1X HBS中浓度为5-8μM的400μL的Alexa647标记的核糖核蛋白复合物(Alexa-RNP)对脂质膜进行再水合。然后使用液氮和室温水浴超声仪对该溶液进行7次冷冻/解冻循环，以产生单个单层囊泡(SUV)。使SUV运行通过填充有Sepharose 6B并在1X HBS中平衡的柱，以将它们与未包封的RNP。为了降低多分散性，SUV通过200nm和100nm膜过滤器挤出两次。为了去除剩余的未包封的RNP，将SUV与蛋白酶K(10U，在500μL 1X NEB缓冲液2+1X HBS中)在室温下温育1小时。使用填充有Superdex 200并在1X HBS中平衡的柱将SUV与消化的RNP分离。为了产生SNA，然后将SUV与在5'端用DBCO官能化并且在内部用Cy3官能化的寡核苷酸(每20个磷脂近似1个DNA)一起温育过夜。然后使用填充有Superdex 200并在1X HBS中平衡的柱从游离寡核苷酸中分离SNA。参见图1。

Cas9和DNA负载的定量

为了测量SUV浓度，使用电感耦合等离子体光发射光谱法(ICP-OES)和磷标准物来计算磷脂浓度。脂质体直径经由动态光散射(DLS)测量，并且每个脂质体的磷脂的数量使用下面的等式1计算。通过将磷脂浓度除以每个SUV的磷脂的数量来计算SUV浓度。

等式1.D是脂质体的直径(Z平均值)(或SNA的Z平均值，对于DNA壳减去5nm)。Alpha(α)是脂质头部基团的足迹，其对于DOPC＝0.72nm²。

在合成SNA之后(图1)，通过用0.1％吐温20去污剂处理SNA样品(以破坏脂质体并分散寡核苷酸)，并将SNA样品中的Cy3荧光与由游离DBCO-和Cy3-标记的寡核苷酸产生的标准曲线进行比较，在平板读数器中测量寡核苷酸的浓度。脂质体的浓度如上用ICP-OES确定，其中磷浓度基于寡核苷酸的浓度和每个寡核苷酸的磷原子的数量进行校正。

为了计算RNP的浓度，从保留的Alexa-RNP等分试样产生标准曲线。RNP的浓度通过测量来自脂质体样品的Alexa 647荧光，然后在平板阅读器中将其绘制在Alexa-RNP标准曲线的线性回归上来确定。

在代表性的合成中，产生115nm CRISPR SNA，每个颗粒具有约450条DNA链，每个脂质体包封约3个RNP(图2)。

体外Cas9 DNA切割测定

为了测量Cas9酶促活性，合成了靶向EGFP基因的RNP，并用于制备CRISPR SNA。纯化的质粒pcDNA3-EGFP通过用限制性内切酶Sma I消化而线性化。与线性化的质粒一起温育的活性RNP将其切割成2kb和4kb片段，这可以在TBE缓冲液中的1％琼脂糖电泳凝胶上运行30分钟看到。为了证实RNP在CRISPR SNA的合成期间不降解或不丧失活性，在制备它们之后、在冷冻/解冻循环后、在尺寸排除后和在挤出后，立即将200纳克的线性化质粒与1pmol和0.1pmol的Alexa RNP一起温育。RNP在这些步骤中没有失去活性(图3)。

RNP在整个SNA合成程序中保持活性-蛋白酶稳定性研究

为了证实RNP被包封在SNA内，将干净的CRISPR SNA与NEB的限制性酶缓冲液2中的蛋白酶K在室温下温育1小时。作为对照，将Alexa-RNP与空SNA混合，并与蛋白酶k一起温育。然后通过在1x HBS中平衡的Superdex 200尺寸排阻柱以200μL级分来洗脱经温育的样品。然后在荧光凝胶扫描仪中对这些级分进行Cy3和Alexa Fluor 647荧光成像。在蛋白酶K消化后，包封的RNP与SNA共洗脱，而与空SNA温育的RNP被消化，因此RNP相关的Alexa荧光比SNA相关的Cy3荧光洗脱得晚得多。

为了验证包封的RNP仍有活性，对几个样品运行体外Cas9 DNA切割测定。CRISPRSNA中的脂质体在如上所述用蛋白酶K温育之前或之后用0.1％吐温20去污剂破坏。在用1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)灭活蛋白酶K之后，进行体外DNA切割活性测定。对于对照RNP，吐温对活性没有影响，但蛋白酶K温育使活性消失。然而，如果在蛋白酶K温育之前加入吐温，则CRISPR SNA保持其活性，但如果在蛋白酶K温育之前加入吐温，则不显示活性(图4)。这表明CRISPR SNA中的RNP既被包封(防止蛋白酶消化)又具有酶促活性。

细胞摄取研究

为了确定SNA是否可以将RNP递送到细胞中，将C166-GFP细胞与CRISPR SNA、空SNA、包封在裸脂质体中的RNP以及与RNAiMAX转染试剂复合的RNP在Opti-MEM减少的血清培养基中温育16小时。然后经由流式细胞术测量用Alexa Fluor 647标记的RNP的摄取。用CRISPR-SNA处理的细胞比用RNP/RNAiMAX混合物或包封在裸脂质体中的RNP处理的细胞具有更高的中值荧光和更高比例的高荧光(荧光>1000AU)细胞，而未处理的细胞几乎没有示出荧光(图5)。该数据表明，包封在脂质体SNA中的基因编辑酶被哺乳动物细胞积极吸收。

实例2

该实例详述了CRISPR/Cas9 ProSNA作为Cas9-sgRNA复合物的高效基因组编辑递送平台的合成。如本文所述，Cas9用作ProSNA的纳米颗粒核。表面赖氨酸胺与在相对末端具有叠氮化物和胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺部分的小聚乙二醇聚合物反应。共价连接的叠氮化物然后与在5'末端处含有应变环辛烯，二苯并环辛烯(DBCO)的DNA链反应。此处使用的序列(dGGT)₁₀是基于之前的工作选择的，该工作示出了与聚dT壳相比，富含G的壳对SNA的细胞摄取增强。三维寡核苷酸壳产生空间和静电屏障以使Cas9蛋白稳定，并且使它们在细胞进入方面具有功能。该策略允许容易地产生基因组编辑工具，其具有突出的生物相容性和细胞摄取性能，并且在人类细胞系中具有约42.5％的优异基因组编辑活性。我们的发现表明，Cas9 ProSNA在基因组编辑和基因沉默方面具有吸引人的前景。

材料

含琼脂的LB肉汤(目录号L2897-250G)和LB肉汤购自Sigma。异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(目录号DSI5600)购自dot scientific公司。磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)购自Gibco生命技术公司(Gibco Life Technologies)。SA MALDI基质(目录号90032)、AlexaFluor 647(目录号A37573)和NHS-PEG4-叠氮化物(目录号26130)购自赛默飞世尔(ThermoFisher)。T7 RNA聚合酶(M0251S)购自NEB。超纯水(18.25MΩ.cm，25℃)用于制备所有溶液。

寡核苷酸设计、合成和纯化

使用从格伦研究公司获得的试剂和标准方案在固体支持物上合成寡核苷酸。在室温下使用30％的NH₄OH将产物从固体支持物上切割过夜，并且使用反相HPLC在乙酸三乙酯铵缓冲液中以0至75％乙腈的梯度在45分钟内纯化。在HPLC纯化之后，在20％乙酸中在2小时内除去最终的二甲氧基三苯甲基基团，然后用乙酸乙酯提取。使用3-羟基吡啶甲酸作为基质，使用基质辅助激光解吸电离质谱来确认寡核苷酸的质量。sgRNA根据说明书用NEB T7转录试剂盒合成。

Cas9 SNA的合成与表征

Cas9表达和纯化。通过电击将Cas9质粒(#87703)转化到OneBL21(DE3)化学感受态大肠杆菌(赛默飞世尔)中，并且将细胞在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上生长过夜。挑取单个菌落，并且将7mL培养物在LB肉汤中在37℃下生长过夜。将这些培养物加入到750mL的2xYBT肉汤和100μg/mL氨苄青霉素中，并且将细胞在37℃下生长至0.6-0.9的光密度，然后在17℃下用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷诱导过夜。将细胞离心(6000g，15分钟)并重新悬浮在100mL的1x PBS中，然后使用高压匀浆器切割。通过以30000g离心30分钟来澄清细胞切割物，并将其加载到Bio-Scale^TMMini Profinity^TMIMAC柱(Bio-Rad)上。用100mL的1x PBS洗涤该柱，然后在含有250mM咪唑的相同缓冲液中洗脱。洗脱的级分通过透析进一步纯化。

表面可及的半胱氨酸与Alexa Fluor 647(AF647)的反应。将Cas9蛋白溶解在1X磷酸盐缓冲盐水(1X PBS；赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))中。然后，将溶解在DMSO中的10当量的Alexa Fluor 647-C2-马来酰亚胺(赛默飞世尔科技公司)加入到在1500μL的1X PBS中的约10μM Cas9中，并将反应摇动(900rpm)过夜。使用100kDa过滤器通过重复几轮离心来除去未缀合的Alexa Fluor 647，直到滤液在650nm通过紫外-可见光谱不具有可检测的吸光度。基于紫外-可见光谱来计算每个蛋白的Alexa Fluor 647修饰的数量。

表面可及的赖氨酸与NHS-PEG4-叠氮化物的反应。将溶解在无水DMSO中的浓度为100mM的50当量的NHS-PEG₄-叠氮化物交联剂(赛默飞世尔科技公司)加入到在550μL 1XPBS中的约45μM Cas9-AF647中。将反应在25℃下振荡(900rpm)过夜。通过使用100kDa过滤器的10轮离心来除去未缀合的接头。使用芥子酸(赛默飞世尔科技公司)作为BrukerAutoFlex-III中的基质，通过MALDI-MS来评估叠氮化物修饰的数量。

DNA缀合。在纯化之后立即进行DNA缀合。首先冻干350当量的DBCO-dT封端的DNA链，然后加入在450μL的1X PBS中的10μM Cas9-AF647-叠氮化物以使DNA再水合。将该溶液在25℃下在振荡(900rpm)下温育72小时。通过在100kDa过滤器中连续几轮离心除去未反应的DNA链，直到滤液在260nm没有可检测的吸光度。典型地，完全去除DNA需要30-40个洗涤步骤。基于紫外-可见光谱和MALDI-MS来计算每个蛋白的DNA链的数量。

Cas9 SNA-sgRNA复合物的结合和切割活性。为了组装Cas9 SNA-sgRNA复合物，将靶向人类基因组内的非编码区的纯化的Cas9 SNA和sgRNA在1×NEBuffer 4.1中在37℃下分别以30nM和60nM的浓度温育30分钟。然后，加入Cy5标记的带有靶序列的DNA，以得到150nM的浓度，并且将混合物在相同条件下进一步温育30分钟。在使用6％天然PAGE凝胶分析之前，将10μL的反应物与2μL 6×天然上样缓冲液混合以研究切割活性。

对Cas9 SNA的体外研究。细胞系HaCaT(人角质形成细胞系)、表达EGFP的HEK293(人胚胎肾细胞，HEK293/EGFP)购自美国模式培养物研究所(American Type CultureCollection)。在37℃下在潮湿的5％ CO₂气氛中，在补充有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中培养细胞。

在HaCat细胞中的细胞摄取。将HaCaT细胞接种于流式细胞术管(0.7×10⁵，0.5mL)中，并且在含10％ FBS的DMEM中培养过夜。之后，用450μL的OPTI-MEM替换培养基，并且加入50μL的Cas9 SNA并混合，以在不同的时间间隔(0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时)得到20nM的最终浓度。处理后，用1X PBS洗涤细胞，300μL胰蛋白酶化(Gibco)，加入300μL 1X PBS以进行洗涤，300G5分钟，然后将细胞重新悬浮在1mL的PBS中。对细胞进行计数，用PBS将密度调整为在1mL体积的1×10⁶个细胞。将1μL活的和死的染料加入到1mL的细胞悬浮液中，并充分混合；活的和死的染色0.5小时，在室温下温育30分钟，避光。用0.5mL的PBS洗涤细胞一次，然后在150μL的4％多聚甲醛(赛默飞世尔科技公司)中固定15分钟。然后加入450μL的1X PBS，洗涤3分钟，之后加入200μL的PBS，然后使用BD LSRFortessa通过流式细胞术分析，测量每个样品至少30000个单细胞事件的荧光(激发640nm，发射655-685nm)。基于前向和侧向散射强度对原始FCS文件进行门控，并且在FlowJo上进行分析。

细胞活力。使用标准细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定来评估细胞活力。简言之，将细胞接种在96孔板(1×10⁴个/孔)中，并在200μL含1％ FBS的DMEM培养基中培养过夜。然后加入200μL含有不同浓度(50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM)的Cas9 SNA的2％ FBS的OPTI-MEM培养基，接着温育24小时。然后，用200μL的在PBS中的10％ CCK-8替换培养基。在37℃下连续温育0.5小时后，使用150μL培养基，以使用酶标仪测量在450nm的吸光度。细胞活力也通过钙黄绿素-AM/PI染色进行评估。

体外基因沉默。持续表达EGFP的HEK293细胞(HEK293/EGFP)被用于评估Cas9 SNA的基因沉默效应。将HEK293/EGFP细胞接种在24孔板中(24孔板，1.3×10⁵个/孔，0.5mL)，并在37℃下培养过夜。将培养基更换成在OPTI-MUM中的2％的FBS，持续5小时。在POTI-MUM中用Cas9 SNA温育6小时，靶向EGFP的编码区24小时后，用新鲜培养基替换细胞并培养5天。然后用胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，并重新悬浮在0.3mL PBS中用于流式细胞术。

Surveyor测定。将HEK293/EGFP细胞接种在24孔板中(5×10⁴个细胞/孔)，并在37℃下培养过夜。在与装配的Cas9 SNA(100nM，靶向人DNase I超活性位点、人GRIN2B位点和EGFP位点)温育24小时后，用新鲜培养基替换细胞，并再培养4天。然后收获细胞，以用于使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。将250ng的DNA提取物与2μL的NEBuffer 2(NEB)以19μL的总体积组合并变性，然后在95℃下热循环5分钟，以2℃/s从95℃重新退火至85℃，以0.2℃/s从85℃重新退火至20℃。将重新退火的DNA与1μL的T7核酸内切酶I(10U/μL，NEB)在37℃下温育15分钟。将10μL的50％甘油加入到T7核酸内切酶反应中，并且将12μL在PAGE凝胶(Bio-Rad)上分析，在200V下电泳30分钟，然后用1×SYBR Gold(生命技术公司)染色30分钟。Cas9诱导的切割带和未切割的带用于使用ImageJ计算基因组编辑效率。还通过桑格测序来检测靶向的基因组修饰。

结果

从大肠杆菌BL21(DE3)纯化重组Cas9蛋白，并且在溶液中证实Cas9-sgRNA复合物的结合/切割活性。通过先前开发的方法来合成Cas9 ProSNA。具体来说，用Alexa Fluor647(AF647)标记Cas9蛋白，以便于体外追踪和计算Cas9 SNA的浓度。然后，表面赖氨酸胺与在相对末端处具有叠氮化物和胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺部分的小聚乙二醇聚合物反应。共价连接的叠氮化物然后经由无铜点击化学与在5'末端含有应变环辛烯，二苯并环辛烯(DBCO)的DNA链反应。成功合成的Cas9 SNA用平均尺寸为10nm的透射电子显微镜(TEM)表征(图6a)。使用SDS-PAGE凝胶来确认合成的蛋白的纯度(图6b)。凝胶图像示出每个合成的步骤后明显的分子量变化，证明寡核苷酸的共价连接而不是与其表面的非特异性缔合。在用DNA官能化后，平均ζ电位变为-15.8mV(图6c)，这增强了带有更多负电荷的溶液稳定性。通过比较AF Cas9和ProSNA Cas9在260nm的吸光度差异来确定DNA修饰水平(图6d)。这些结果清楚地表明Cas9的成功的DNA官能化。

因为良好的生物相容性是生物应用的先决条件，所以评估了几种细胞系的活力。使用HaCat、HEK293T/EGFP、hMSC和Raw 264.7细胞系作为模型研究了Cas9 SNA的细胞毒性(图7a)。标准CCK-8用于测定细胞活力。尽管Cas9 SNA的浓度超过了在体外实验中使用的典型浓度，但没有观察到细胞毒性。通过使用HaCat细胞系作为模型研究了Cas9 SNA的胞质递送。将细胞与20nM蛋白一起温育0-8小时，并且通过流式细胞术确定其摄取性能(图7b)。与用Cas9温育的细胞相比，Cas9 SNA示出细胞摄取增加约10倍。Cas9 SNA的细胞摄取增强归因于细胞表面清道夫受体的参与，随后是小窝介导的内吞作用。

接下来，评估Cas9 SNA在基因组编辑中的能力。靶向人类基因组内的DNase I过敏位点(即相对安全且可用于基因组编辑的位点)的Cas9 SNA被递送至HEK293T/EGFP细胞。Surveyor测定示出39.2％的插入缺失频率(图8a)。随后，还确定了靶向与罕见神经发育病症相关的基因GRIN2B中的位点(即GRIN2B)的Cas9 SNA，导致42.5％的插入缺失频率(图8b)。使用靶向增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的编码区的sgRNA，还评估了Cas9 SNA在基因沉默中的能力。相应的插入缺失和EGFP沉默效率为35.5％(图8c)。通过流式细胞术利用EGFP荧光变化也证实了基因沉默性能，其中效率为17.8％。这些结果表明，Cas9 SNA实现了非常高的编辑效率。

总之，已经建立了CRISPR/Cas9 SNA用于高效的基因组编辑和基因沉默。Cas9 SNA通过清道夫受体途径有效地进入细胞。此外，体外研究表明，Cas9 SNA导致高效的基因组编辑和基因沉默，并具有良好的生物相容性。这种简单和通用的胞质递送方法可以扩展到基因疗法生物医学应用，并且其优异的生物相容性为基因疗法和个性化的药物开辟了新的途径。

实例3

该实例描述了使用CRISPR/Cas9 ProSNA的附加实验。

Cas9的设计、表达和纯化

Cas9表达载体的构建。pET-MBP-NLS-Geo_st表达载体(Addgene质粒#87703(Harrington等人，《自然通讯》2017年11月10日；8(1):1424，doi:10.1038/s41467-017-01408-4))通过在Geo Cas9的N末端处插入三个连续的GALA肽(3GALA)而被进一步工程改造(图9)。所有使用的序列列于表1中。GALA基因序列购自Integrated DNA Technologies，并使用Golden Gate组件(GG)克隆。首先在PCR热循环仪(ABI)中扩增pET-MBP-NLS-Geo_st载体，然后通过DpnI消化和凝胶纯化去除原始质粒模板。随后，通过GG组件将3GALA基因序列亚克隆到扩增的载体中。通过电穿孔将构建的载体转化到OneBL21(DE3)中，并用传统的桑格测序证实，得到3GALA Cas9载体。应当注意，Cas9的C末端含有核定位信号。融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)如下所示。

粗体序列

(WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAAWEAALAEALAEALAEHLAEA LAEALEALAAWEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA(SEQ ID NO:26))是3GALA肽

下划线序列

(MRYKIGLDIGITSVGWAVMNLDIPRIEDLGVRIFDRAENPQTGESLALPRRLA RSARRRLRRRKHRLERIRRLVIREGILTKEELDKLFEEKHEIDVWQLRVEALDRKLNNDELARVLLHLAKRRGFKSNRKSERSNKENSTMLKHIEENRAILSSYRTVGEMIVKDPKFALHKRNKGENYTNTIARDDLEREIRLIFSKQREFGNMSCTEEFENEYITIWASQRPVASKDDIEKKVGFCTFEPKEKRAPKATYTFQSFIAWEHINKLRLISPSGARGLTDE ERRLLYEQAFQKNKITYHDIRTLLHLPDDTYFKGIVYDRGESRKQNENIRFLELDAYHQIRKAVDKVYGKGKSSSFLPIDFDTFGYALTLFKDDADIHSYLRNEYEQNGKRMPNLANKVYDNELIEELLNLSFTKFGHLSLKALRSILPYMEQGEVYSSACERAGYTFTGPKKKQKTMLLPNIPPIANPVVMRALTQARKVVNAIIKKYGSPVSIHIELARDLSQTFDERRKTKKEQDENRKKNETAIRQLMEYGLTLNPTGHDIVKFKLWSEQNGRCAYSLQPIEIERLLEPGYVEVDHVIPYSRSLDDSYTNKVLVLTRENREKGNRIPAEYLGVGTERWQQFETFVLTNKQFSKKKRDRLLRLHYDENEETEFKNRNLNDTRYISRFFANFIREHLKFAESDDKQKVYTVNGRVTAHLRSRWEFNKNREESDLHHAVDAVIVACTTPSDIAKVTAFYQRREQNKELAKKTEPHFPQPWPHFADELRARLSKHPKESIKALNLGNYDDQKLESLQPVFVSRMPKRSVTGAAHQETLRRYVGIDERSGKIQTVVKTKLSEIKLDASGHFPMYGKESDPRTYEAIRQRLLEHNNDPKKAFQEPLYKPKKNGEPGPVIRTVKIIDTKNQVIPLNDGKTVAYNSNIVRVDVFEKDGKYYCVPVYTMDIMKGILPNKAIEPNKPYSEWKEMTEDYTFRFSLYPNDLIRIELPREKTVKTAAGEEINVKDVFVYYKTIDSANGGLELISHDHRFSLRGVGSRTLKRFEKYQVDVLGNIYKVRGEKRVGLASSAHSKPGKTIRPLQSTRD(SEQ ID NO:25)为Cas9。

粗体和斜体序列(PKKKRKV(SEQ ID NO:23))为NLS。

表1.引物设计和GALA片段。

Cas9的生产和纯化。通过电击将携带N末端3GALA肽的重组Cas9过表达载体转化到OneBL21(DE3)中，并在LB-氨苄青霉素琼脂平板(100μg/mL氨苄青霉素)上生长过夜。将得到的表达菌落接种到7mL(LB，100μg/mL氨苄青霉素)起始培养物中，将其在37℃下剧烈振荡过夜。第二天，将起始培养物接种到750mL 2xYBT肉汤(100μg/mL氨苄青霉素)中，并在37℃下生长至0.8的光密度，随后用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导基因表达，随后在17℃下温育过夜。收获细胞(6000g，15分钟)并重新悬浮在100mL的切割缓冲液(20mMHEPES，pH 7.5室温，0.5mM TCEP，500mM NaCl，1mM PMSF)中，然后通过高压匀浆器切割。通过以30 000g离心30分钟来澄清切割物级分，并将其加载到在结合缓冲液(20mM HEPES，pH7.5室温，500mM NaCl)中预平衡的5mL Bio-Scale^TMMini Profinity^TMIMAC柱(Bio-Rad)上。通过洗涤缓冲液(20mM HEPES，pH 7.5，500mM NaCl，250mM咪唑)洗脱结合的蛋白。通过TEV蛋白酶将麦芽糖结合蛋白从洗脱的蛋白上切割过夜，并通过第二MBP亲和步骤捕获。将得到的蛋白加载到肝素柱上，并且用300至1250mM的NaCl梯度洗脱。通过在储存缓冲液(20mMHEPES，pH 7.5，5％甘油，150mM NaCl，1mM TCEP)中预平衡的Bio-Scale^TMMiniP-6脱盐柱来纯化含有Cas9的洗脱液级分，并且通过NanoDrop 8000分光光度计(赛默飞世尔科技公司)测量浓度(图10)。在4℃的恒温下纯化蛋白，并在液氮中快速冷冻，并且储存在-20℃下。

寡核苷酸和sgRNA合成

寡核苷酸合成和纯化。所有氨代亚磷酸酯和DNA合成试剂均从格伦研究公司获得。在这项工作中使用的序列列于表2中。DNA合成通过MerMade12寡核苷酸合成仪(MM12，BioAutomation公司，美国得克萨斯州)或ABI 394合成仪在10μmol规模的受控孔隙玻璃(CPG)珠上进行。所有的寡核苷酸在室温下使用30％ NH₄OH从CPG珠上脱保护过夜。然后使用氮气蒸发器以在氮气流下除去氨。剩余的溶液通过0.2μM过滤器过滤以除去CPG珠。通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC，Varian ProStar 210，安捷伦科技公司(Agilent Technologies Inc.)，美国加利福尼亚州帕洛阿尔托)来纯化滤液级分以分离产物。使用Agilent Dynamax Microsorb C4柱和在45分钟内0至75％ B的梯度(A＝乙酸三乙基铵缓冲液，B＝乙腈)。将收集的级分冻干并重新溶解在20％乙酸中持续2小时，并且通过乙酸乙酯提取来除去经切割的二甲氧基三苯甲基基团。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS；RapiFlex,Bruker))用于确认使用2',6'-二羟基苯乙酮和柠檬酸氢二铵作为基质的寡核苷酸的质量。通过使用紫外-可见分光光度计Cary 5000紫外-可见分光光度计，Varian)测量溶液在λ＝260nm的吸光度，使用从IDT寡聚物分析仪工具获得的寡核苷酸的消光系数来确定DNA浓度。

sgRNA设计和合成。使用MEGAscript^TMT7转录试剂盒(赛默飞世尔)体外转录sgRNA的合成dsDNA模板，该模板带有共有的5'T7启动子结合位点，随后是20bp sgRNA靶序列。转录在含有20mM Tris-HCl(pH 8.0)、30mM MgCl2、10mM DTT、5mM各NTP、100μg/mL T7聚合酶、RNA酶抑制剂(Promega)和100ng DNA模板的缓冲液中进行。将反应物在37℃下温育约18小时。将体外转录的RNA用乙醇沉淀并重新溶解在水中，并且最终通过Nano Drop 8000分光光度计(赛默飞世尔科技公司)定量sgRNA浓度，并在液氮中快速冷冻并储存在-20℃。序列列于表2中。DNase I-sgRNA、Grin2b-sgRNA、Grin2b-sgRNA和EGFP-sgRNA用于产生sgRNA，用于在DNase I、GRIN2B、GRIN2B和EGFP位点处进行基因组编辑或基因沉默。

表2.在本实例中使用的DNA序列。

DBCO：5'-二甲氧基三苯甲基-5-[(6-氧代-6-(二苯并[b,f]氮杂环辛-4-炔-1-基)-辛酰胺基-N-己-6-基)-3-丙烯酰亚胺基]-2'-脱氧尿苷,3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-氨代亚磷酸酯(5'-DBCO-dT-CE氨代亚磷酸酯)

CY3：1-[3-(4-单甲氧基三苯甲氧基)丙基]-1'-[3-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)氨代亚磷酸酯基]丙基]-3,3,3',3'-氯化四甲基吲哚碳菁(菁3氨代亚磷酸酯)

Cas9 ProSNA的合成与表征

与Alexa Fluor 647(AF647)的反应。首先用氨基活性Alexa Fluor^TM647 NHSEster酯(赛默飞世尔科技公司)修饰Cas9蛋白(图11)。将Alexa Fluor^TM647 NHS酯溶解在DMSO中以获得10mM储备溶液，如通过紫外-可见吸收光谱(ε647＝270,000M^-1cm^-1)确定的。将5当量过量的AF-647加入到Cas9蛋白的溶液中，并以900rpm摇动反应过夜。在650nm下监测过量的Alexa Fluor 647，并且通过Bio-Rad FPLC上的尺寸排阻色谱法除去。在Cary-500紫外-可见分光光度计上收集每个蛋白的Alexa Fluor 647修饰的数目及其各自的消光系数(在280nmεCas9＝204,470M^-1cm^-1并且在260nmεCas9＝324,610M^-1cm^-1；在650nmεAF-647＝270,000)(图12)。

表面可及的赖氨酸与NHS-PEG₄-叠氮化物的反应。将表面胺通过与含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯和在相对末端处的叠氮化物部分的四甘醇接头反应转化为叠氮化物(NHS-PEG₄-N₃，赛默飞世尔科技公司)(图13)。将600当量的NHS-PEG₄-叠氮化物交联剂加入到Cas9-AF647的溶液中。将反应物在4℃下振荡(900rpm)过夜。两小时后，通过在Bio-RadFPLC上的尺寸排阻色谱法除去未缀合的叠氮化物接头。使用芥子酸(赛默飞世尔科技公司)作为Bruker AutoFlex-III中的基质，通过MALDI-MS鉴定叠氮化物接头修饰的数量。每个接头缀合导致275m/z的质量增加(图14)。

DNA缀合。在叠氮官能化的Cas9纯化后立即进行DNA缀合。300倍过量的DBCO终止的DNA通过点击反应与Cas9-叠氮化物反应。将该反应溶液在4℃下在以900rpm振荡下温育72小时。在3天后，通过Bio-Rad FPLC上的尺寸排阻色谱650除去未反应的DNA链。基于缀合的AlexaFluor染料的吸光度，通过紫外-可见吸收光谱法确定每个蛋白的DNA数量(图15)。AF-647荧光团用于计算蛋白的浓度，因为吸光度在260nm重叠。在减去蛋白吸光度后，基于使用在线IDT寡聚物分析仪计算的消光系数(ε260＝276,000M^-1cm^-1)来确定DNA的浓度(图16)。

Cas9 SNA的生物稳定性分析。为了证明DNA的表面缀合是否可以保护蛋白免受蛋白酶降解，将天然Cas9蛋白和Cas9 ProSNA两者与胰蛋白酶(蛋白酶)一起温育，并进行SDS-PAGE凝胶。将反应溶液在NEB缓冲液2中在37℃下温育超过1小时。观察到与胰蛋白酶温育的天然蛋白条带在10分钟后显著减少。然而，没有观察到Cas9 ProSNA降解，这表明DNA壳能够保护蛋白免受胰蛋白酶的实质性降解(图17)。

Cas9 ProSNA的体外研究

细胞活力。用标准细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定来确定细胞活力。CCK-8试剂含有WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑鎓，单钠盐)，其可以自由地进入活细胞。在进入细胞后，WST-8(一种弱荧光化合物)被细胞脱氢酶还原成橙色甲臜染料。具体而言，将细胞接种在在10％ FBS的DMEM培养基中的96孔细胞培养板(1×10⁴个/孔)中过夜。接下来，将细胞培养基用含有不同浓度的Cas9 ProSNA的200μL培养基替换，然后再温育24小时。之后，用1X PBS洗涤细胞，并用在PBS中的10％ CCK-8替换。将细胞进一步温育30分钟。最后，通过BioTek Synergy H4混合板读取器测量CCK在450nm的吸光度。实验以一式三份进行。细胞活力也通过钙黄绿素-AM/PI染色进行评估。简言之，将细胞接种在24孔板(5×10⁴个/孔)中，并且培养过夜，然后在含有Cas9 ProSNA的培养基中温育24小时。之后，用含有2μg/mL钙黄绿素-AM和3μg/mL PI的500μL PBS一起处理细胞。通过Biotek Synergy H4杂交板读取器观察活细胞或死细胞，对于钙蛋白-AM的激发波长为488nm，并且对于PI的激发波长为535nm(图18)。

通过流式细胞术的HaCat细胞中的细胞摄取。将HaCaT细胞接种在48孔板(60,000个/孔)中，并且在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素链霉素的DMEM中培养过夜。之后，用含有Cas9 ProSNA或Cas9 AF647的OPTI-MEM替换培养基，以对于不同的时间间隔(0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时)得到20nM的最终浓度。在每次处理结束时，用1X PBS、300uL胰蛋白酶消化的(Gibco)、300uL 1X PBS洗涤细胞，并以300G离心5分钟，然后重新悬浮在1mL的PBS中。向细胞悬浮液中加入1μL活的和死的染料。30分钟后，通过离心收集细胞，并固定在4％多聚甲醛(赛默飞世尔科技公司)中。然后使用Becton Dickinson LSR II进行流式细胞术，以测量每个样品中10,000个单细胞事件的荧光(激发640nm，发射655-685nm)。基于前向和侧向散射强度对原始FCS文件进行门控，并在FlowJo上进行分析(图19)。

细胞内共聚焦显微镜检查。通过共聚焦激光扫描显微镜(蔡司LSM 810显微镜)来评估Cas9 ProSNA的细胞内递送。为了研究Cas9 ProSNA或Cas9 AF647的内体逃逸，将HaCat细胞(1×10⁴个/孔)接种于硼硅酸盐8室盖玻片(Nalge Nunc International)中。8小时后，将细胞与溶酶体染料(CellLight^TM溶酶体-GFP，BacMam 2.0)在37℃下温育，并且与500μL的含有Cas9 ProSNA或Cas9 AF647(20nM)的OptiMEM温育不同的时间间隔，随后用PBS洗涤并用核染料(Hoechst，1μg/mL)在室温下染色10分钟，然后用4％ PFA固定细胞10分钟。之后，活细胞通过荧光显微镜检查成像，其中分别对于Hoechst用405nm，对于溶酶体-GFP用488nm，并且对于AF 647标记的Cas9 ProSNA或Cas9 AF647用561nm成像。通过共聚焦显微镜检查以被AF647重叠的核的百分比来确定核输入效率，并且对每个样品分析了大约100个细胞(n＝3)(图20)。

Surveyor测定(图21)。将HaCat、hBMSC、RAW 264.7和A549/EGFP细胞接种在48孔板中(5×10⁴个细胞/孔)，并在37℃下培养过夜。在与组装的Cas9 ProSNA(50nM，靶向人DNaseI高活性位点：AGTGCTGGAGAATGGGTCACAgtggCAAA(SEQ ID NO:18)，人GRIN2B位点：AGTCATTGGCAGCTACAGGCAgagaCAAA(SEQ ID NO:19)，同源小鼠Grin2b位点：ATGGCTTCCTGGTCCGTGTCAtccgCGAA(SEQ ID NO:20)，和EGFP位点：ACGACTTCTTCAAGTCCGCCAtgccCGAA(SEQ ID NO:21)(下划线表示基因组编辑靶标)在OPTIMEM中一起温育4小时之后，用新鲜培养基替换细胞并再培养3天。然后收获细胞，用于使用Quick Extraction Solution(Epicentre)提取基因组DNA，随后通过PCR扩增。对于闲置测定，将250ng的DNA提取物与2μL的NEBuffer 2(NEB)以19μL的总体积混合，并且变性，然后在95℃下热循环5分钟，以2℃/s从95℃重新退火至85℃；以0.2℃/s从85℃重新退火至20℃。将重新退火的DNA与1μL的T7核酸内切酶I(10U/μL，NEB)在37℃下温育15分钟。将10μL的50％甘油加入到T7核酸内切酶反应中，并且将12μL在PAGE凝胶(Bio-Rad)上分析，在200V下电泳30分钟。Cas9诱导的切割带和未切割带用于使用ImageJ来计算基因组编辑效率。

Lipofectamine CRISPRMAX Cas9转染。根据提供的转染方案，使用LipofectamineCRISPRMAX转染试剂将Cas9-sgRNA复合物转染到细胞中。简而言之，将1μL的Cas9 Plus试剂加入到含有Cas9蛋白(500nM)和sgRNA(1μM)的25μL Opti-MEM培养基中，随后在室温下温育5分钟(管1)。此外，将1.5μL的lipofectamine CRISPRMAX试剂加入到25μL的Opti-MEM培养基中，并在室温下进一步温育5分钟(管2)。之后，将来自管1的Cas9-sgRNAPlus混合物与来自管2的lipofectamine CRISPRMAX溶液混合，随后在室温下温育10分钟。随后，将50μL制备的Cas9-sgRNA转染复合物滴入到每个孔中(48孔板，5×10⁴个/孔)。

体外基因沉默。使用持续表达EGFP的HEK293T细胞(HEK293T/EGFP)来评估Cas9ProSNA的基因沉默效应。将HEK293T/EGFP细胞接种在48孔板中(5×10⁴个/孔，0.5mL)，并在37℃下培养过夜。然后将培养基换成在OPTI-MUM中的2％ FBS持续5小时。在POTI-MUM中用Cas9-ProSNA温育6小时，靶向EGFP的编码区24小时后，用新鲜培养基替换细胞并培养3天。然后用胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，并重新悬浮在0.3mL PBS中用于流式细胞术(BDFACSCANTO II，EGFP的通道)。使用FCS Express流式细胞术数据分析对所有数据进行分析(图22)。

该实例示出Cas9 ProSNA将细胞内化提高了高达约45倍。此外，d(GGT)₁₀序列的使用允许容易地生成具有优异的生物相容性、蛋白酶生物稳定性和约45.4％的优异基因组编辑indel效率的基因组编辑工具。这些观察导致了核酸官能化(生物)大分子货物的设计，其可以被普遍使用，使得细胞功能可以被特异性和瞬时操纵。

实例4

该实例描述了使用CRISPR/Cas9 ProSNA的附加实验。

Alexa Fluor^TM647的官能化。用氨基活性Alexa Fluor^TM647NHS酯(AF647，赛默飞世尔科技公司)修饰Cas9蛋白。将AF647溶解在DMSO中以获得10mM储备溶液，如通过紫外-可见分光光度法确定的(ε₆₄₇＝270,000M-1cm-1)。将五过量当量的AF647加入到Cas9蛋白的溶液中，并以900rpm振荡反应过夜。通过Bio-Rad FPLC上的尺寸排阻色谱法除去过量的AF647。在Cary-500紫外-可见分光光度计(Molecular Devices公司，美国)上收集AF647修饰的蛋白的光谱，并且使用它们各自的消光系数来计算修饰的数目(在280nm Cas9：ε₂₈₀＝204,470M^-1cm^-1和在260nmε₂₆₀＝324,610M^-1cm^-1；在650nm AF647：ε₆₅₀＝270,000)。(图23)

AF647荧光团修饰的Cas9的紫外-可见光谱。光谱是在环境温度下在Cary5000分光光度计上获得的。分别从在280nm和650nm的吸光度来计算蛋白和AF647的浓度。AF647荧光团用于计算DNA缀合后的蛋白浓度，并在流式细胞术和共聚焦成像实验中追踪细胞摄取。(图23)

表面可及的赖氨酸与NHS-PEG₄-叠氮化物的反应。通过与含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯和在相对末端的叠氮化物部分的四甘醇接头反应，将表面赖氨酸转化为叠氮化物(NHS-PEG₄-N₃，赛默飞世尔科技公司)。将600当量的NHS-PEG₄-叠氮化物接头加入到Cas9-AF647的溶液中。两小时后，在Bio-Rad FPLC上通过尺寸排阻色谱法除去未缀合的接头。使用芥子酸(赛默飞世尔科技公司)作为基质，通过MALDI-MS鉴定叠氮化物修饰的数量。每个接头缀合导致275m/z的质量增加(图23)

DNA缀合。在叠氮化物修饰的Cas9纯化后立即进行DNA缀合反应。300倍过量的DBCO封端的DNA通过点击反应与Cas9-AF647-叠氮化物反应。将该反应溶液在4℃下温育3天。在3天后，在Bio-Rad FPLC上通过尺寸排阻色谱法(ENrich^TMSEC 650柱，Bio-Rad公司，美国)去除未反应的DNA链。通过紫外-可见分光光度法确定每个蛋白的DNA修饰的数量。AF647荧光团用于计算DNA缀合后的蛋白浓度，因为两者的吸光度在260nm重叠。在减去蛋白吸光度之后，基于从Integrated DNA Technologies oligo分析仪获得的消光系数(ε₂₆₀＝276,000M^{- 1}cm^-1)来确定DNA的浓度。(图23)

用紫外-可见分光光度法确定Cas9 ProSNA上的DNA链的数量。在Cary5000分光光度计上收集光谱。分别从在650nm和260nm的吸光度来计算蛋白和DNA浓度。

(图23)

圆二色光谱。圆二色性(CD)用于表征DNA官能化后完整的Cas9蛋白结构。所有样品在PBS中进行缓冲液交换，并且在室温下在Jasco J-1700分光光度计上收集CD光谱。分别在500nM和7.13μM的浓度下制备Cas9和DNA样品。通过将Cas9-AF647和游离DNA的光谱相加来计算Cas9 ProSNA的理论光谱。收集的Cas9 ProSNA的光谱与计算的光谱一致。(图24)

Cas9 ProSNA的生物稳定性分析。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)用于研究DNA的表面缀合是否可以保护Cas9蛋白免受胰蛋白酶降解。天然Cas9蛋白和Cas9 ProSNA两者均与胰蛋白酶在37℃下温育，并且加载30μL的蛋白用于跨不同时间点的分析。观察到对应于Cas9蛋白的条带在与胰蛋白酶温育10分钟的短时间内显著减少。然而，在本研究的时间过程中，由于DNA缀合，Cas9-ProSNA几乎没有表现出降解。(图25)

细胞活力。用标准细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定来确定细胞活力。CCK-8试剂含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑(WST-8)，其可以自由进入活细胞。在进入细胞后，WST-8被细胞脱氢酶还原成橙色甲臜染料(在460nm吸收)。具体而言，将细胞接种在含10％ FBS的DMEM培养基中的96孔细胞培养板(10⁴个/孔)中过夜。接下来，用含有不同浓度的Cas9 ProSNA的新鲜培养基替换细胞培养基，并且再培养24小时。接下来用PBS洗涤细胞，并用10％ CCK-8替换。将细胞进一步温育30分钟，并且通过BioTek Synergy H4杂交板读取器来测量在460nm的吸光度值。所有实验都以独立的三份进行。还通过活/死染色来评估细胞活力。简而言之，将细胞接种在24孔板(5×10⁴个/孔)中，并且培养过夜，然后在含有Cas9 ProSNA的细胞培养基中温育24小时。之后，用钙黄绿素乙酰氧基甲基(2μg/mL)和碘化丙啶(3μg/mL)一起处理细胞。通过Biotek Synergy H4杂交平板读取器(BioRad，美国)观察活细胞或死细胞，对于钙蛋白-AM用488nm激发，并且对于碘化丙啶用535nm激发。(图26)

通过流式细胞术的HaCat细胞中的细胞摄取。将HaCaT细胞接种在48孔板(60,000个/孔)中，并在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素和链霉素的DMEM中培养过夜。之后，用含有Cas9 ProSNA或Cas9-AF647的Opti-MEM替换细胞培养基，以在不同的时间间隔(0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时和8小时)得到20nM的最终浓度。在每次处理结束时，用PBS洗涤细胞，用胰蛋白酶消化(Gibco)并以800×g离心5分钟，并且用固定缓冲液(BioLegend)固定。然后使用Becton Dickinson LSR II进行流式细胞术，以测量每个样品中至少10,000个单细胞事件的荧光(激发640nm，发射655-685nm)。所有实验以一式三份进行。(图27)

通过共聚焦显微镜检查进行的细胞内递送分析。通过共聚焦激光扫描显微镜(蔡司LSM 810，德国)来评估Cas9 ProSNA的细胞内递送。为了研究Cas9 ProSNA或Cas9 AF647的内体逃逸，将HaCat细胞(10⁴个/孔)接种在硼硅酸盐8室盖玻片(Nalge NuncInternational)中。在8小时后，在不同的时间间隔内，用含有Cas9 ProSNA或Cas9 AF647(20nM)的内体染色剂(CellLight^TMLate Endosomes-GFP,BacMam 2.0)温育细胞。用PBS洗涤过量的蛋白，并且用Hoechst(1μg/mL)对核进行染色1分钟，然后用4％多聚甲醛(赛默飞世尔科技公司)固定细胞15分钟。之后，通过共聚焦荧光显微镜检查对细胞成像，其中对Hoechst使用405nm，对溶酶体-GFP使用488nm，并且对Cas9 ProSNA或Cas9 AF647使用561nm成像。从计数由AF647重叠的核的共聚焦显微镜检查图像确定核导入效率，并且对每个样品分析约100个细胞。(图29)

检测基因组编辑indel效率的Surveyor测定。将HaCat、hBMSC、RAW 264.7和HEK293T/EGFP细胞接种在48孔板中(5×10⁴个细胞/孔)并且培养过夜。在Opti-MEM中用组装的Cas9 ProSNA-sgRNA复合物(50nM)转染4小时后，用新鲜培养基替换细胞并再培养3天。接着使用基因组DNA提取试剂盒(Quick Extraction Solution,Epicentre)按照制造商的方案从细胞中提取基因组DNA。简而言之，将细胞重新悬浮在QuickExtract溶液中，并且在65℃下温育15分钟，并在98℃下温育6分钟。然后用靶区引物通过PCR反应对5μL提取溶液进行扩增。对于idle形成测定，将5μL的PCR产物的等分试样与T7核酸内切酶I(T7EI)缓冲液以19μL的总体积混合并且变性，然后用热循环重新退火以允许异源双链体形成(95℃持续10分钟，95℃至85℃以-2℃/s斜坡，85℃至20℃以-0.2℃/s斜坡。将重新退火的产物与1μL的T7EI(10u/μL，NEB)一起温育15分钟，并且在4-15％聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上进行分析。在Gel Doc凝胶成像系统(BioRad)上观察Cas9诱导的切割带和未切割带，并且使用ImageJ光密度分析进行定量。基因组编辑效率方案如图21所示确定。结果在图30中示出。

Lipofectamine CRISPRMAX Cas9-sgRNA复合物转染。根据制造商的转染方案，使用Lipofectamine^TMCRISPRMAX^TM转染试剂将Cas9-sgRNA复合物转染到RAW 264.7细胞中。简而言之，将Cas9 Plus试剂加入到含有Cas9蛋白和sgRNA的培养基中，然后在室温下温育5分钟以形成Cas9-sgRNA复合物。然后将lipofectamine CRISPRMAX试剂与Opti-MEM培养基混合，并且再温育5分钟。之后，将Cas9-sgRNA混合物与lipofectamine CRISPRMAX溶液混合，然后温育10分钟。随后，加入50μL制备的Cas9-sgRNA转染复合物(最终浓度为50nM)，并且与细胞培养基混合4小时。在Cas9-sgRNA复合物处理之后，将细胞在相应的培养基中培养3天。然后收获细胞用于随后的Surveyor测定。结果在图31中示出。

体外基因沉默。使用含有EGFP基因的HEK293T细胞(HEK293T/EGFP)来评估Cas9ProSNA的基因沉默效应。将HEK293T/EGFP细胞接种在48孔板(5×10⁴个/孔)中并培养过夜。在Opti-MEM中用靶向EGFP的编码区的Cas9 ProSNA(50nM)温育4小时后，用新鲜培养基替换细胞并再培养3天。然后将细胞用胰蛋白酶-EDTA溶液消化，并重新悬浮在活细胞和死细胞悬浮液中。30分钟后，用PBS洗涤细胞并固定用于流式细胞术(Becton Dickinson LSR II，EGFP的通道)。所有实验都以独立的三份进行。结果在图32中示出。

Claims (82)

1.一种蛋白核球形核酸(ProSNA)，其包括：

(a)包括基因编辑蛋白的蛋白核；以及

(b)连接至所述蛋白核的寡核苷酸壳。

2.根据权利要求1所述的ProSNA，其中所述寡核苷酸壳中的每个寡核苷酸共价连接至所述蛋白核。

3.根据权利要求2所述的ProSNA，其中所述寡核苷酸壳中的每个寡核苷酸通过接头连接至所述蛋白核。

4.根据权利要求3所述的ProSNA，其中所述接头是可切割的接头、不可切割的接头、无痕接头或其组合。

5.根据权利要求3或权利要求4所述的ProSNA，其中所述接头是氨基甲酸酯亚烷基二硫基(dithiolate)接头。

6.根据权利要求5所述的ProSNA，其中所述寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸包括蛋白-核-NH-C(O)-O-C_2-5亚烷基-S-S-C_2-7亚烷基-寡核苷酸，或蛋白-核-NH-C(O)-O-CH₂-Ar-S-S-C_2-7亚烷基-寡核苷酸，并且Ar包括间位或对位取代的苯基。

7.根据权利要求5所述的ProSNA，其中所述寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸包括蛋白-核-NH-C(O)-O-C(ZA)(ZB)C_1-4亚烷基-C(XA)(XB)-S-S-C(YA)(YB)C_1-6亚烷基-寡核苷酸，并且ZA、ZB、XA、XB、YA和YB各自独立地为H、Me、Et或iPr。

8.根据权利要求5所述的ProSNA，其中所述寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸包括蛋白-核-NH-C(O)-O-C(XA)(XB)-Ar-S-S-C(YA)(YB)C_2-6亚烷基-寡核苷酸，并且XA、XB、YA和YB各自独立地为H、Me、Et或iPr。

9.根据权利要求3所述的ProSNA，其中所述接头是酰胺亚烷基二硫基接头。

10.根据权利要求9所述的ProSNA，其中所述寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸包括蛋白-核-NH-C(O)-C_2-5亚烷基-S-S-C_2-7亚烷基-寡核苷酸。

11.根据权利要求9所述的ProSNA，其中所述寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸包括蛋白-核-NH-C(O)-C_1-4亚烷基-C(XA)(XB)-S-S-C(YA)(YB)C_1-6亚烷基-寡核苷酸，并且XA、XB、YA和YB各自独立地为H、Me、Et或iPr。

12.根据权利要求3所述的ProSNA，其中所述接头是酰胺亚烷基硫醚接头。

13.权利要求12所述的ProSNA，其中所述寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸包括蛋白-核-NH-C(O)-C_2-4亚烷基-N-琥珀酰亚胺基-S-C_2-6亚烷基-寡核苷酸。

14.一种球形核酸(SNA)，其包括：

(a)纳米颗粒核；

(b)连接至所述纳米颗粒核的外表面的寡核苷酸壳；以及

(c)基因编辑蛋白。

15.根据权利要求14所述的SNA，其中所述纳米颗粒核是脂质体核或脂质纳米颗粒核。

16.根据权利要求15所述的SNA，其中所述脂质纳米颗粒核包括可电离的脂质、磷脂、甾醇和脂质-聚乙二醇(脂质-PEG)缀合物。

17.根据权利要求16所述的SNA，其中所述寡核苷酸壳中的每个寡核苷酸通过所述脂质-PEG缀合物共价连接至所述脂质纳米颗粒核的外部。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的SNA，其中所述基因编辑蛋白被包封在所述脂质纳米颗粒核中。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的SNA，其中将根据权利要求1至13中任一项所述的ProSNA包封在所述脂质纳米颗粒核中。

20.根据权利要求15至18中任一项所述的SNA，其中核糖核蛋白(RNP)复合物被包封在所述脂质纳米颗粒核中，所述RNP包括所述基因编辑蛋白、成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。

21.根据权利要求15所述的SNA，其中所述脂质体核包括多个脂质基团。

22.根据权利要求15或权利要求21所述的SNA，其中所述基因编辑蛋白被包封在所述脂质体核中。

23.根据权利要求22所述的SNA，其中根据权利要求1至13中任一项所述的ProSNA被包封在所述脂质体纳米颗粒核中。

24.根据权利要求15或权利要求21所述的SNA，其中核糖核蛋白(RNP)复合物被包封在所述脂质纳米颗粒核中，所述RNP包括所述基因编辑蛋白、CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。

25.根据权利要求21至24中任一项所述的SNA，其中所述多个脂质基团包括选自由脂质的磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺家族组成的组的脂质。

26.根据权利要求25所述的SNA，其中所述脂质选自由以下组成的组：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-磷脂酰胆碱(DMPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DSPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)以及1,2-双十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)。

27.根据权利要求14至26中任一项所述的SNA，其中所述寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸通过脂质锚定基团连接至所述脂质体或脂质纳米颗粒核的外部。

28.根据权利要求27所述的SNA，其中所述脂质锚定基团被连接至所述至少一个寡核苷酸的5'端或3'端。

29.根据权利要求27或权利要求28所述的SNA，其中所述脂质锚定基团是生育酚或胆固醇。

30.根据权利要求1至13中任一项所述的ProSNA或根据权利要求14至29中任一项所述的SNA，其中所述基因编辑蛋白是CRISPR缔合蛋白(Cas)。

31.根据权利要求30所述的ProSNA或SNA，其中所述Cas是Cas9、Cas12、Cas13或其组合。

32.根据权利要求1至31中任一项所述的ProSNA或SNA，其中所述寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸在其5'端和/或3'端用二苯并环辛基(DBCO)修饰。

33.根据权利要求1至32中任一项所述的ProSNA或SNA，其中所述寡核苷酸壳包括单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA或其组合。

34.根据权利要求1至33中任一项所述的ProSNA或SNA，其中所述寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸是经修饰的寡核苷酸。

35.根据权利要求1至34中任一项所述的ProSNA或SNA，其中所述寡核苷酸壳包括约2至约100个寡核苷酸。

36.根据权利要求35所述的ProSNA或SNA，其中所述寡核苷酸壳包括约10至约80个寡核苷酸。

37.根据权利要求35所述的ProSNA或SNA，其中所述寡核苷酸壳包括约5至约50个寡核苷酸。

38.根据权利要求35所述的ProSNA或SNA，其中所述寡核苷酸壳包括约5至约20个寡核苷酸。

39.根据权利要求35所述的ProSNA或SNA，其中所述寡核苷酸壳包括约14个寡核苷酸。

40.根据权利要求35所述的ProSNA或SNA，其中所述寡核苷酸壳包括约15个寡核苷酸。

41.根据权利要求1至40中任一项所述的ProSNA或SNA，其中所述寡核苷酸壳中的每个寡核苷酸的长度为约5至约100个核苷酸。

42.根据权利要求41所述的ProSNA或SNA，其中所述寡核苷酸壳中的每个寡核苷酸的长度为约10至约50个核苷酸。

43.根据权利要求1至42中任一项所述的ProSNA或SNA，其中所述寡核苷酸壳中的一个或多个寡核苷酸包括(GGX)_n核苷酸序列，其中n为2-20，并且X为核碱基(A、C、T、G或U)。

44.根据权利要求43所述的ProSNA或SNA，其中所述(GGX)n核苷酸序列在所述一个或多个寡核苷酸的5'端。

45.根据权利要求43所述的ProSNA或SNA，其中所述(GGX)n核苷酸序列在所述一个或多个寡核苷酸的3'端。

46.根据权利要求43至45中任一项所述的ProSNA或SNA，其中所述(GGX)n核苷酸序列是(GGT)n核苷酸序列。

47.根据权利要求1至46中任一项所述的ProSNA或SNA，其中所述ProSNA或SNA的直径为约1纳米(nm)至约500nm。

48.根据权利要求14至47中任一项所述的SNA，其中所述SNA的直径小于或等于约50纳米。

49.根据权利要求1至47中任一项所述的ProSNA或SNA或根据权利要求48所述的SNA，其中所述寡核苷酸壳中的至少一个寡核苷酸是靶向寡核苷酸。

50.根据权利要求1至47中任一项所述的ProSNA或SNA或根据权利要求48所述的SNA，其中所述寡核苷酸壳包括抑制性寡核苷酸、免疫刺激性寡核苷酸、基因编辑底物DNA或RNA，或其组合。

51.根据权利要求50所述的ProSNA或SNA，其中所述抑制性寡核苷酸是反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、适体、短发夹RNA(shRNA)、DNA酶或适体酶。

52.根据权利要求50所述的ProSNA或SNA，其中所述免疫刺激性寡核苷酸是含有CpG基序的寡核苷酸、双链DNA寡核苷酸或单链RNA寡核苷酸。

53.根据权利要求50所述的ProSNA或SNA，其中所述免疫刺激性寡核苷酸中的每一个为toll样受体(TLR)激动剂。

54.根据权利要求53所述的ProSNA或SNA，其中所述TLR选自由以下组成的组：toll样受体1(TLR1)、toll样受体2(TLR2)、toll样受体3(TLR3)、toll样受体4(TLR4)、toll样受体5(TLR5)、toll样受体6(TLR6)、toll样受体7(TLR7)、toll样受体8(TLR8)、toll样受体9(TLR9)、toll样受体10(TLR10)、toll样受体11(TLR11)、toll样受体12(TLR12)和toll样受体13(TLR13)。

55.一种组合物，其包括多个根据权利要求1至13、30至47或49至54中任一项所述的蛋白核球形核酸(ProSNA)。

56.根据权利要求55所述的组合物，其进一步包括指导RNA。

57.根据权利要求55或权利要求56所述的组合物，其中所述ProSNA中的至少两个包括不同的蛋白核。

58.一种组合物，其包括多个根据权利要求14至54中任一项所述的球形核酸(SNA)。

59.根据权利要求57所述的组合物，其中所述SNA中的至少两个包括不同的纳米颗粒核。

60.一种将基因编辑蛋白递送至细胞的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求1至13、30至47或49至54中任一项所述的ProSNA接触。

61.一种将基因编辑蛋白递送至细胞的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求55至57中任一项所述的组合物接触。

62.一种将基因编辑蛋白递送至细胞的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求14至54中任一项所述的SNA接触。

63.一种将基因编辑蛋白递送至细胞的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求58或权利要求59所述的组合物接触。

64.一种在受试者中治疗、改善和/或预防病症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的(i)根据权利要求1至13、30至47或49至54中任一项所述的ProSNA，(ii)根据权利要求14至54中任一项所述的SNA，(iii)根据权利要求55至59所述的组合物，或(iv)其组合。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述病症为癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、遗传性疾病、心血管疾病或其组合。

66.一种融合蛋白，其包括从N末端到C末端排列如下的以下物质：

(i)一个或多个GALA肽；

(ii)基因编辑蛋白，以及

(iii)核定位信号(NLS)。

67.根据权利要求66所述的融合蛋白，其中所述一个或多个GALA肽包括三个连续的GALA肽。

68.根据权利要求66或权利要求67所述的融合蛋白，其中所述一个或多个GALA肽中的每一个包括与如SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列或由其组成。

69.根据权利要求66至68中任一项所述的融合蛋白，其中所述一个或多个GALA肽包括如SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列或由其组成。

70.根据权利要求66至69中任一项所述的融合蛋白，其中所述基因编辑蛋白是CRISPR缔合蛋白(Cas)。

71.根据权利要求70所述的融合蛋白，其中所述Cas是Cas9、Cas12、Cas13或其组合。

72.根据权利要求71所述的融合蛋白，其中所述Cas9包括与如SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：25中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列或由其组成。

73.根据权利要求71或权利要求72所述的融合蛋白，其中所述Cas12包括与如SEQ IDNO：27中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列或由其组成。

74.根据权利要求71至73中任一项所述的融合蛋白，其中所述Cas13包括与如SEQ IDNO：29中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列或由其组成。

75.根据权利要求66至74中任一项所述的融合蛋白，其中所述NLS包括与如SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：28中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列或由其组成。

76.一种组合物，其包括根据权利要求66至75中任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的载剂。

77.根据权利要求1至13、30至47或49至54中任一项所述的ProSNA，或根据权利要求55至57中任一项所述的组合物，其中所述基因编辑蛋白是根据权利要求66至75中任一项所述的融合蛋白。

78.根据权利要求14至54中任一项所述的SNA，或根据权利要求58或59所述的组合物，其中所述基因编辑蛋白是根据权利要求66至75中任一项所述的融合蛋白。

79.一种将基因编辑蛋白递送至细胞的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求66至75中任一项所述的融合蛋白接触。

80.一种将基因编辑蛋白递送至细胞的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求76所述的组合物接触。

81.一种在受试者中治疗、改善和/或预防病症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的(i)根据权利要求66至75中任一项所述的融合蛋白，(ii)根据权利要求76所述的组合物，或(iii)其组合。

82.根据权利要求81所述的方法，其中所述病症为癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、遗传性疾病、心血管疾病或其组合。