JP2022542839A - リコンビナーゼ組成物及び使用方法 - Google Patents

リコンビナーゼ組成物及び使用方法 Download PDF

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Abstract

標的ゲノムを調節するための方法及び組成物が開示される。

Description

関連出願
本出願は、２０１９年７月１９日に提出された米国特許出願第６２／８７６，１６５号明細書、及び２０２０年６月１５日に提出された米国特許出願第６３／０３９，３２８号明細書に対する優先権を主張し、それらの各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子ファイルにより提出された配列表を含み、これは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。上記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年７月１６日に作成され、Ｖ２０６５－７００３ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと称され、２，１０２，１０２バイトのサイズである。
ゲノムへの目的の核酸の組込みは、挿入事象を促進するための特殊なタンパク質の非存在下において、低頻度で起こり、しかも部位特異性はほとんどない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のようないくつかの存在する手法は、小さな編集により適しており、長い配列の組込みには有効性が低い。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰといった他の既存の手法は、ｌｏｘＰ部位をゲノムに挿入する第１ステップ、次いで目的の配列をｌｏｘＰ部位に挿入する第２ステップを必要とする。当技術分野では、改善された組成物（例えばタンパク質及び核酸）及びゲノム内に目的の配列を挿入、変更、又は削除するための方法が必要とされている。
本開示は、宿主細胞、組織若しくは被験者における１つ若しくは複数の位置のゲノムをインビボ又はインビトロで改変するための新規の組成物、システム及び方法に関する。特に、本発明は、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、本明細書に記載される、例えばチロシンリコンビナーゼ）を用いて、宿主ゲノムに外性遺伝因子を導入するための組成物、システム及び方法を特徴とする。
実施形態の列挙
１．以下：
ａ）表１若しくは２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド、或いは、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸；及び
ｂ）以下：
（ｉ）（ａ）のリコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、前記ＤＮＡ認識配列は、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列が、約１０～３０、１２～２７、又は１０～１５ヌクレオチド、例えば、約１３ヌクレオチドであり、第１及び第２パラパリンドローム配列は一緒に、表１のヌクレオチド配列のパラパリンドローム領域、或いは、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、若しくは４つ以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、且つ
前記ＤＮＡ認識配列が、約５～１０ヌクレオチド、例えば、約８ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、上記コア配列が、第１及び第２パラパリンドローム配列の間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）異種目的配列と
を含む二本鎖挿入ＤＮＡ
を含む、ＤＮＡを修飾するためのシステム。
２．以下：
ａ）表１若しくは２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド、或いは、上記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸；及び
ｂ）以下：
（ｉ）（ａ）のリコンビナーゼポリペプチドに結合する、表１のヒト第１パラパリンドローム配列及びヒト第２パラパリンドローム配列と、
（ｉｉ）任意選択で、異種目的配列と
を含む挿入ＤＮＡ
を含む、ＤＮＡを修飾するためのシステム。
３．上記リコンビナーゼポリペプチドが、表２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
４．上記リコンビナーゼポリペプチドが、表２のアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
５．上記リコンビナーゼポリペプチドが、表２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
６．上記リコンビナーゼポリペプチドが、表２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
７．上記リコンビナーゼポリペプチドが、表２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
８．上記リコンビナーゼポリペプチドが、表２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
９．上記リコンビナーゼポリペプチドが、表２のアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
１０．上記リコンビナーゼポリペプチドが、表２のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
１１．上記リコンビナーゼポリペプチドが、表２のアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
１２．上記リコンビナーゼポリペプチドが、表２のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
１３．上記リコンビナーゼポリペプチドが、表２のアミノ酸配列と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
１４．（ａ）及び（ｂ）が、個別の容器内にある、実施形態１～１３のいずれかに記載のシステム。
１５．（ａ）及び（ｂ）が、混合される、実施形態１～１３のいずれかに記載のシステム。
１６．以下：表１若しくは２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド、或いは、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を含む、細胞（例えば、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞；又は原核生物細胞）。
１７．以下：
（ｉ）リコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、前記ＤＮＡ認識配列は、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を含み、
各パラパリンドローム配列が、約１０～３０、１２～２７、又は１０～１５ヌクレオチド、例えば、約１３ヌクレオチドであり、第１及び第２パラパリンドローム配列は一緒に、表１のヌクレオチド配列のパラパリンドローム領域、或いは、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、若しくは４つ以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、
前記ＤＮＡ認識配列が、約５～１０ヌクレオチド、例えば、約８ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、上記コア配列が、第１及び第２パラパリンドローム配列の間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）任意選択で、異種目的配列と
を含む挿入ＤＮＡをさらに含む、実施形態１６に記載の細胞。
１８．以下：
（ｉ）ＤＮＡ認識配列であって、前記ＤＮＡ認識配列は、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を含み、
各パラパリンドローム配列が、約１０～３０、１２～２７、又は１０～１５ヌクレオチド、例えば、約１３ヌクレオチドであり、第１及び第２パラパリンドローム配列は一緒に、表１のヌクレオチド配列のパラパリンドローム領域、或いは、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、若しくは４つ以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、
前記ＤＮＡ認識配列が、約５～１０ヌクレオチド、例えば、約８ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、上記コア配列が、第１及び第２パラパリンドローム配列の間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）異種目的配列と
を含む、細胞（例えば、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞；又は原核生物細胞）。
１９．上記ＤＮＡ認識配列が、異種目的配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチド以内にある、実施形態１８に記載の細胞。
２０．上記ＤＮＡ認識配列及び異種目的配列が、染色体内にあるか、又は染色体外である、実施形態１８又は１９に記載の細胞。
２１．上記細胞が、真核生物細胞である、実施形態１６～２０のいずれかに記載の細胞。
２２．上記細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態２１に記載の細胞。
２３．上記細胞が、ヒト細胞である、実施形態２２に記載の細胞。
２４．上記細胞が、原核生物細胞（例えば、細菌細胞）である、実施形態１６～２０のいずれかに記載の細胞。
２５．表１の第２又は３列に列挙されるゲノム位置で、そのゲノム中に安定して組み込まれた異種目的配列を含む、単離された真核生物細胞。
２６．上記細胞が、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）又は植物細胞である、実施形態２５に記載の単離された真核生物細胞。
２７．上記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、実施形態２６に記載の単離された真核生物細胞。
２８．上記動物細胞が、ウシ細胞、ウマ細胞、ブタ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、ニワトリ細胞、又はシチメンチョウ細胞である、実施形態２６に記載の単離された真核生物細胞。
２９．上記植物細胞が、トウモロコシ細胞、ダイズ細胞、コムギ細胞、又はコメ細胞である、実施形態２６に記載の単離された真核生物細胞。
３０．真核生物細胞（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト細胞）のゲノムを修飾する方法であって、上記細胞を以下：
ａ）表１若しくは２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチド、或いは、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸；及び
ｂ）以下：
（ｉ）（ａ）のリコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、前記ＤＮＡ認識配列は、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を含み、各パラパリンドローム配列が、約１０～３０、１２～２７、又は１０～１５ヌクレオチド、例えば、約１３ヌクレオチドであり、第１及び第２パラパリンドローム配列は一緒に、表１のヌクレオチド配列のパラパリンドローム領域、或いは、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、若しくは４つ以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、
前記ＤＮＡ認識配列が、約５～１０ヌクレオチド、例えば、約８ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、上記コア配列が、第１及び第２パラパリンドローム配列の間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）異種目的配列と
を含む挿入ＤＮＡ
と接触させるステップを含み、
これにより上記真核生物細胞のゲノムを修飾する方法。
３１．真核生物細胞（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト細胞）のゲノムに異種目的配列を挿入する方法であって、上記細胞を以下：
ａ）表１若しくは２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチド、或いは、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸；及び
ｂ）以下：
（ｉ）（ａ）のリコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、前記ＤＮＡ認識配列は、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を含み、各パラパリンドローム配列が、約１０～３０、１２～２７、又は１０～１５ヌクレオチド、例えば、約１３ヌクレオチドであり、第１及び第２パラパリンドローム配列は一緒に、表１又は２のヌクレオチド配列のパラパリンドローム領域を含み、
前記ＤＮＡ認識配列が、約５～１０ヌクレオチド、例えば、約８ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列が、第１及び第２パラパリンドローム配列の間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）異種目的配列と
を含む挿入ＤＮＡ
と接触させるステップを含み、
これにより、例えば、実施例５のアッセイで測定して、例えば、上記真核生物細胞の集団の少なくとも約０．１％（例えば、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の頻度で、上記真核生物細胞のゲノムに上記異種目的配列を挿入する方法。
３２．（ａ）及び（ｂ）が、個別又は一緒に投与される、実施形態３０又は３１に記載の方法。
３３．（ａ）が、（ｂ）の投与の前、それと同時、又はその後に投与される、実施形態３０又は３１に記載の方法。
３４．（ａ）が、前記ポリペプチドをコードする核酸を含む、実施形態３０～３３のいずれかに記載の方法。
３５．（ａ）の核酸と（ｂ）の挿入ＤＮＡが、同じ核酸分子上に位置する、例えば、同じベクター上に位置する、実施形態３４に記載の方法。
３６．（ａ）の核酸と（ｂ）の挿入ＤＮＡが、別の核酸分子上に位置する、実施形態３４に記載の方法。
３７．上記細胞が、上記挿入ＤＮＡのＤＮＡ認識配列と適合性である唯一の内在性ＤＮＡ認識配列を有する、実施形態３０～３６のいずれかに記載の方法。
３８．上記細胞が、挿入ＤＮＡのＤＮＡ認識配列と適合性である２つ以上の内在性ＤＮＡ認識配列を有する、実施形態３０～３６のいずれかに記載の方法。
３９．表１若しくは２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
４０．表１若しくは２のアミノ酸配列に対して少なくとも１つの挿入、欠失、又は置換を含む、実施形態３９に記載の単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
４１．上記合成リコンビナーゼポリペプチドが、真核生物（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）ゲノム遺伝子座（例えば、表１の配列）に結合する、実施形態４０に記載の単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
４２．上記合成リコンビナーゼポリペプチドが、表１又は２の対応する非修飾アミノ酸配列と比較して、上記ゲノム遺伝子座に対する親和性の少なくとも２、３、４、若しくは５倍の増加を有する、実施４０又は４１に記載の単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
４３．表１若しくは２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする、単離された核酸。
４４．表１若しくは２のリコンビナーゼポリペプチドと比較して、少なくとも１つの挿入、欠失、又は置換を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする、実施形態４３に記載の単離された核酸。
４５．哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞に関してコドン最適化されている、実施形態４３又は４４に記載の単離された核酸。
４６．異種プロモータ（例えば、哺乳動物プロモータ、例えば、組織特異的プロモータ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（例えば、組織特異的制限ｍｉＲＮＡ）、ポリアデニル化シグナル、又は異種ペイロードをさらに含む、実施４３～４５のいずれかに記載の単離された核酸。
４７．以下：
（ｉ）ＤＮＡ認識配列であって、前記ＤＮＡ認識配列は、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を含み、各パラパリンドローム配列が、約１０～３０、１２～２７、又は１０～１５ヌクレオチド、例えば、約１３ヌクレオチドであり、第１及び第２パラパリンドローム配列は一緒に、表１のヌクレオチド配列のパラパリンドローム領域を含み、
前記ＤＮＡ認識配列は、約５～１０ヌクレオチド、例えば、約８ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、上記コア配列が、第１及び第２パラパリンドローム配列の間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）異種目的配列と
を含む単離された核酸（例えば、ＤＮＡ）。
４８．表１又は２のリコンビナーゼポリペプチドに結合する、実施形態４７に記載の単離された核酸。
４９．リコンビナーゼポリペプチドを作製する方法であって、この方法は、以下：
ａ）表１若しくは２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を用意するステップ、及び
ｂ）上記リコンビナーゼポリペプチドの産生を可能にする条件下で、細胞（例えば、本明細書に記載されるように、例えば、真核生物細胞又は原核生物細胞）に上記核酸を導入するステップを含み、
これにより、上記リコンビナーゼポリペプチドを作製する方法。
５０．リコンビナーゼポリペプチドを作製する方法であって、この方法は、以下：
ａ）表１若しくは２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を含む細胞（例えば、真核生物細胞又は原核生物細胞）を用意するステップ、及び
ｂ）上記リコンビナーゼポリペプチドの産生を可能にする条件下で、上記細胞をインキュベートするステップを含み、
これにより、上記リコンビナーゼポリペプチドを作製する方法。
５１．ＤＮＡ認識配列と異種配列とを含む挿入ＤＮＡを作製する方法において、以下：
ａ）以下：
（ｉ）表１若しくは２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、前記ＤＮＡ認識配列は、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を含み、各パラパリンドローム配列が、約１０～３０、１２～２７、又は１０～１５ヌクレオチド、例えば、約１３ヌクレオチドであり、第１及び第２パラパリンドローム配列は一緒に、表１のヌクレオチド配列のパラパリンドローム領域を含み、
前記ＤＮＡ認識配列が、約５～１０ヌクレオチド、例えば、約８ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、上記コア配列が、第１及び第２パラパリンドローム配列の間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）異種目的配列と
を含む核酸を用意するステップ、及び
ｂ）上記核酸の複製を可能にする条件下で、細胞（例えば、本明細書に記載されるように、例えば、真核生物細胞又は原核生物細胞）に上記核酸を導入するステップを含み、
これにより、上記挿入ＤＮＡを作製する方法。
５２．上記リコンビナーゼポリペプチドが、表１若しくは２のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つの挿入、欠失、又は置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
５３．上記リコンビナーゼポリペプチドが、表１若しくは２のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＮ及びＣ末端の両方に、切断を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
５４．上記リコンビナーゼポリペプチドが、核局在化配列、例えば、内在性核局在化配列又は異種核局在化配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
５５．上記異種目的配列が、例えば、実施例５のアッセイで測定して、上記細胞の集団の少なくとも約０．１％（例えば、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の効率で、上記細胞のゲノムに挿入される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
５６．上記異種目的配列が、例えば、実施例４のアッセイにより測定して、挿入事象の少なくとも約１％（例えば、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、若しくは１００％）における上記細胞のゲノム内の部位（例えば、表１の第４列に列挙される遺伝子座、例えば、表１の第１列に列挙されるリコンビナーゼの行に対応するもの）に挿入される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
５７．上記細胞の集団（例えば、上記システムと接触させた）において、上記異種目的配列が、例えば、実施例４のアッセイにより測定して、上記集団中の細胞の少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、若しくは１００％）における、上記細胞のゲノム内の１～１０、例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、２～１０、２～５、２～４、３～１０、３～５、若しくは５～１０の部位（例えば、表１の第４列に列挙される遺伝子座、例えば、表１の第１列に列挙されるリコンビナーゼの行に対応するもの）に挿入される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
５８．上記システムと接触させた細胞の集団において、上記異種目的配列が、例えば、実施例４のアッセイにより測定して、上記集団中の細胞の少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、若しくは１００％）における、上記細胞のゲノム内の厳密に１つの部位（例えば、表１の第４列に列挙される遺伝子座、例えば、表１の第１列に列挙されるリコンビナーゼの行に対応するもの）に挿入される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
５９．上記異種目的配列が、例えば、実施例４のアッセイにより測定して、上記細胞のゲノム内の１～１０、例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、２～１０、２～５、２～４、３～１０、３～５、若しくは５～１０の部位（例えば、表１の第４列に列挙される遺伝子座、例えば、表１の第１列に列挙されるリコンビナーゼの行に対応するもの）に挿入される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
６０．上記リコンビナーゼポリペプチドが、上記挿入ＤＮＡに結合される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
６１．上記リコンビナーゼポリペプチドが、上記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を用意することにより提供される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
６２．例えば、実施例５のアッセイで測定して、上記細胞の集団の少なくとも約０．１％（例えば、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）のゲノム中への上記異種目的配列の挿入頻度をもたらす、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
６３．上記第１パラパリンドローム配列が、表１の第２列若しくは第３列のヌクレオチド配列の最初の１０～３０、１２～２７、若しくは１０～１５、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５ヌクレオチドを有する配列、又はそれに対して１、２、若しくは３つ以下の置換、挿入、若しくは欠失を有する配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
６４．上記第２パラパリンドローム配列が、表１の第２列若しくは第３列の同じヌクレオチド配列の最後の１０～３０、１２～２７、若しくは１０～１５、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５ヌクレオチドを有する第２配列、又はそれに対して１、２、若しくは３つ以下の置換、挿入、若しくは欠失を有する配列をさらに含む、実施形態６３に記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
６５．上記挿入ＤＮＡが、表１の第３列のパラパリンドローム領域の間に位置する８ヌクレオチドを有するコア配列、又はそれに対して１、２、若しくは３つ以下の置換、挿入、若しくは欠失を有する配列をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
６６．上記第１及び第２パラパリンドローム配列が、完全に回文の配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
６７．上記パラパリンドローム配列が、１、２、３、４、５、若しくは６つの非回文位置を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
６８．上記パラパリンドローム領域が、１０～３０、１２～２７、若しくは１０～１５、例えば、約１３ヌクレオチドの５’領域、及び／又は１０～３０、１２～２７、若しくは１０～１５、例えば、約１３ヌクレオチドの３’領域を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
６９．上記第１及び第２パラパリンドローム配列が、同じ長さである、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
７０．上記コア配列が、５～１０ヌクレオチド（例えば、約８ヌクレオチド）長である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
７１．上記コア配列が、上記ヒトゲノム中の対応する配列、又はその逆相補鎖とハイブリダイズすることができる、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
７２．上記コア配列が、上記ヒトゲノム中の対応する配列と、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の同一性を有する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
７３．上記コア配列が、上記ヒトゲノム中の対応する配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、又は９つ以下のミスマッチを有する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
７４．上記コア配列は、リコンビナーゼにより切断されると、粘着末端を形成し、これは、上記ヒトゲノム中の対応する配列とハイブリダイズすることができる、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
７５．上記異種目的配列が、真核生物遺伝子、例えば、哺乳動物遺伝子、例えば、ヒト遺伝子、例えば、血液因子（例えば、ゲノム因子Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ若しくはＸＩＩＩ）又は酵素、例えば、リソソーム酵素、又は合成ヒト遺伝子（例えば、キメラ抗原受容体）を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
７６．上記挿入ＤＮＡが、異種目的配列と、ＤＮＡ認識配列とを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
７７．上記挿入ＤＮＡが、上記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
７８．上記挿入ＤＮＡと、上記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸が、個別の核酸分子中に存在する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
７９．上記挿入ＤＮＡと、上記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸が、同じ核酸分子中に存在する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
８０．上記挿入ＤＮＡが、以下：
の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、若しくは全部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
（ａ）オープンリーディングフレーム、例えば、ポリペプチド、例えば、酵素（例えば、リソソーム酵素）、血液因子、エキソンをコードする配列；
（ｂ）非コード及び／又は調節配列、例えば、転写モジュレーター、例えば、プロモータ（例えば異種プロモータ）、エンハンサー、インシュレーターに結合する配列；
（ｃ）スプライスアクセプター部位；
（ｄ）ポリＡ部位；
（ｅ）エピジェネティック修飾部位；
（ｆ）遺伝子発現単位
８１．上記挿入ＤＮＡが、プラスミド、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター若しくはエピソームベクター）、又は他の自己複製ベクターを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
８２．上記細胞が、異種目的配列に含まれる内在性ヒト遺伝子を含まないか、又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質を含まない、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
８３．上記細胞が、異種目的配列により含まれる内在性ヒト遺伝子を含まない生物、又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質を含まない生物に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
８４．上記細胞が、内在性ヒトＤＮＡ認識配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
８５．上記内在性ヒトＤＮＡ認識配列が、以下の基準：
（ｉ）癌関連遺伝子から＞３００ｋｂに位置する；
（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ／その他の機能性小分子ＲＮＡから＞３００ｋｂにある；
（ｉｉｉ）５’遺伝子末端から＞５０ｋｂにある；
（ｉｖ）複製起点から＞５０ｋｂにある；
（ｖ）任意の超保存エレメントから＞５０ｋｂにある；
（ｖｉ）低転写活性を有する（即ち、ｍＲＮＡ＋／－２５ｋｂがない）；（ｖｉｉ）コピー数可変領域内ではない；
（ｖｉｉｉ）オープンクロマチン中にある；及び／又は
（ｘｉ）例えば、ヒトゲノム中に１コピーを有し、ユニークである；
の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９つを有するヒトゲノム内の部位に作動可能に連結しているか、又はその中に位置する、実施形態８４に記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
８６．上記細胞が、動物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
８７．上記細胞が、植物細胞である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
８８．上記細胞が、遺伝子操作されていない、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
８９．上記細胞が、ｌｏｘＰ部位を含まない、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド、又は単離された核酸。
９０．上記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸が、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターである、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
９１．上記二本鎖挿入ＤＮＡが、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター中にある、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
９２．上記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸が、ｍＲＮＡであり、任意選択で、上記ｍＲＮＡが、ＬＮＰ中にある、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
９３．上記二本鎖挿入ＤＮＡが、ウイルスベクターではなく、例えば、上記二本鎖挿入ＤＮＡは、トランスフェクション試薬中のネイキッドＤＮＡ又はＤＮＡである、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
９４．上記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸が、第１ウイルスベクター、例えば、第１ＡＡＶベクター中にあり、且つ
上記挿入ＤＮＡが、第２ウイルスベクター、例えば、第２ＡＡＶベクター中にある、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
９５．上記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸が、ｍＲＮＡであり、任意選択で、上記ｍＲＮＡは、ＬＮＰ中にあり、且つ
上記挿入ＤＮＡが、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター中にある、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
９６．上記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸が、ｍＲＮＡであり、
上記二本鎖挿入ＤＮＡが、ウイルスベクター中になく、例えば、上記二本鎖挿入ＤＮＡは、ネイキッドＤＮＡ又はトランスフェクション試薬中のＤＮＡである、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
９７．上記挿入ＤＮＡが、少なくとも１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂ、又は１５０ｋｂの長さを有する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
９８．上記挿入ＤＮＡが、抗生物質耐性遺伝子又はいずれか他の細菌遺伝子若しくは部分を含まない、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
９９．上記リコンビナーゼポリペプチドが、以下：Ｒｅｃ１７（配列番号１２３１）、Ｒｅｃ１９（配列番号１２３３）、Ｒｅｃ２０（配列番号１２３４）、Ｒｅｃ２７（配列番号１２４１）、Ｒｅｃ２９（配列番号１２４３）、Ｒｅｃ３０（配列番号１２４４）、Ｒｅｃ３１（配列番号１２４５）、Ｒｅｃ３２（配列番号１２４６）、Ｒｅｃ３３（配列番号１２４７）、Ｒｅｃ３４（配列番号１２４８）、Ｒｅｃ３５（配列番号１２４９）、Ｒｅｃ３６（配列番号１２５０）、Ｒｅｃ３７（配列番号１２５１）、Ｒｅｃ３８（配列番号１２５２）、Ｒｅｃ３９（配列番号１２５３）、Ｒｅｃ３３８（配列番号１５５２）、若しくはＲｅｃ５８９（配列番号１８０３）から選択されるリコンビナーゼ、或いは、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、若しくは５０以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有するアミノ酸配列を有するリコンビナーゼポリペプチドである、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、ポリペプチド、核酸、又は方法。
１００．上記ポリペプチド、システム、又は核酸をリポータ遺伝子逆位アッセイ、例えば、実施例１３のアッセイで使用すると、細胞の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、若しくは６０％にリポータ遺伝子発現がもたらされる、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、ポリペプチド、核酸、又は方法。
１０１．上記リポータ遺伝子逆位アッセイが、以下：
ｉ）上記ポリペプチド、システム、又は核酸を試験細胞集団に導入するステップ、
ｉｉ）５’から３’に、プロモータ、リコンビナーゼポリペプチドに結合する第１ＤＮＡ認識配列、アンチセンス配向のＧＦＰ遺伝子、及び上記リコンビナーゼポリペプチドに結合する第２ＤＮＡ認識配列（例えば、上記第１及び第２ＤＮＡ認識配列は各々、対応するリコンビナーゼポリペプチドと同じ行から、表１の第３列からの１つ又は複数の配列を含む）を含む核酸を上記試験細胞集団に導入するステップ、
ｉｉｉ）上記ＧＦＰ遺伝子の逆位を可能にするのに十分な時間、例えば、実施例１３に記載のように、例えば、３７℃で２日間、上記試験細胞集団をインキュベートするステップ、並びに
ｉｖ）上記試験集団中、ＧＦＰ蛍光を展示する細胞のパーセンテージの値を決定するステップ（例えば、ＧＦＰ蛍光の閾値は、例えば、実施例１３に記載のように、バックグラウンド蛍光の少なくとも１．７×（１．７倍）、１．８×、１．９×、２×、２．１×、２．２×、又は２．３×（例えば、２×）である）
を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、ポリペプチド、核酸、又は方法。
１０２．上記ポリペプチド、システム、又は核酸をリポータ遺伝子組込みアッセイ、例えば、実施例１４のアッセイで使用すると、細胞当たり少なくとも０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は０．９５の平均リポータ遺伝子コピー数がもたらされる、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、ポリペプチド、核酸、又は方法。
１０３．上記リポータ遺伝子組込みアッセイが、以下：
ｉ）上記ポリペプチド、システム、又は核酸を試験細胞集団に導入するステップ、
ｉｉ）５’から３’に、リコンビナーゼポリペプチドに結合する第１ＤＮＡ認識配列、ＧＦＰ遺伝子、及び上記リコンビナーゼポリペプチドに結合する第２ＤＮＡ認識配列（例えば、上記第１及び第２ＤＮＡ認識配列は各々、対応するリコンビナーゼポリペプチドと同じ行から、表１の第３列からの１つ又は複数の配列を含む）を含む核酸を上記試験細胞集団に導入するステップ、
ｉｉｉ）上記試験細胞集団のゲノムＤＮＡへの上記ＧＦＰ遺伝子の組込みを可能にするのに十分な時間、例えば、実施例１４に記載のように、例えば、３７℃で２～５日間、上記試験細胞集団をインキュベートするステップ、並びに
ｉｖ）上記試験細胞集団のゲノムＤＮＡ中、細胞当たりのＧＦＰ遺伝子の平均コピー数の値を決定するステップ（例えば、閾値コピー数は、例えば、実施例１４に記載のように、検出されるバックグラウンドコピー数の少なくとも１．７×（１．７倍）、１．８×、１．９×、２×、２．１×、２．２×、又は２．３×（例えば、２×）である）
を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、ポリペプチド、核酸、又は方法。
１０４．上記核酸（例えば、単離された核酸）、挿入ＤＮＡ（例えば、二本鎖挿入ＤＮＡ）、又は異種目的配列が、人工染色体、例えば、細菌人工染色体を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、ポリペプチド、核酸、又は方法。
１０５．実験室若しくは研究ツールとしての使用、又は実験室的方法若しくは研究方法での使用のための、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、ポリペプチド、又は核酸。
１０６．上記方法が、実験室若しくは研究方法として、又は実験室的若しくは研究方法の一環として使用される、実施形態３０～３８又は５２～１０４のいずれかに記載の方法。
１０７．上記実験室若しくは研究ツール又は実験室的若しくは研究方法が、動物細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）、植物細胞、又は真菌細菌を修飾するために使用される、実施形態１０５又は１０６のいずれかに記載のシステム、細胞、ポリペプチド、核酸、又は方法。
１０８．上記実験室若しくは研究ツール又は実験室的若しくは研究方法が、インビトロで使用される、実施形態１０５～１０７のいずれかに記載のシステム、細胞、ポリペプチド、核酸、又は方法。
本開示は、以上の態様及び／又は実施形態のいずれか１つ若しくは複数のあらゆる組合せ、並びに詳細な説明及び実施例に記載される実施形態のいずれか１つ若しくは複数との組合せを考慮する。
定義
ドメイン：本明細書で使用される用語「ドメイン」は、生体分子の特定の機能に寄与する生体分子の構造を指す。ドメインは、生体分子の連続領域（例えば、連続配列）又は個別の非連続領域（例えば、非連続配列）を含み得る。タンパク質ドメインの例として、限定されないが、核局在化配列、リコンビナーゼドメイン、ＤＮＡ認識配列（例えば、本明細書に記載のように、認識部位と結合するか、若しくはそれと結合することができる）、チロシンリコンビナーゼＮ－末端ドメイン、及びチロシンリコンビナーゼＣ末端ドメインが挙げられ；核酸のドメインの一例は、調節ドメイン、例えば、転写因子結合ドメイン、パラパリンドローム配列、パラパリンドローム領域、コア配列、又は目的配列（例えば、異種目的配列）である。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、表１又は２のポリペプチドの１つ若しくは複数のドメイン（例えば、リコンビナーゼドメイン、若しくはＤＮＡ認識ドメイン）、又はその断片若しくは変異体を含む。
外性：本明細書で使用されるように、用語「外性」とは、生体分子（例えば、核酸配列又はポリペプチドなど）に関して用いられる場合、生体分子が、人為的に、宿主ゲノム、細胞若しくは生物に導入されたことを意味する。例えば、組換えＤＮＡ技術又はその他の方法を用いて、既存のゲノム、細胞、組織若しくは被験者に付加される核酸は、既存の核酸配列、細胞、組織若しくは被験者に対して外性である。
ゲノムセーフハーバー部位（ＧＳＨ部位）：ゲノムセーフハーバー部位は、例えば、挿入された遺伝因子が、宿主細胞若しくは生物にリスクをもたらす宿主ゲノムの有意な改変を引き起こさないように、新たな遺伝物質の組込みを収容することができる宿主ゲノム内の部位である。ＧＳＨ部位は、概して、以下の基準の１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９を満たす：（ｉ）癌関連遺伝子から＞３００ｋｂに位置する；（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ／その他の機能性低分子ＲＮＡから＞３００ｋｂに位置する；（ｉｉｉ）５’遺伝子末端から＞５０ｋｂに位置する；（ｉｖ）複製起点から＞５０ｋｂに位置する；（ｖ）超保存エレメントから＞５０ｋｂ離れている；（ｖｉ）低転写活性を有する（即ち、ｍＲＮＡ＋／－２５ｋｂがない）；（ｖｉｉ）コピー数可変領域内ではない；（ｖｉｉｉ）オープンクロマチン内である；及び／又は（ｉｘ）ヒトゲノム内に１コピーを有し、ユニークである。これらの基準のいくつか又は全部を満たすヒトゲノム内のＧＳＨ部位の例として、以下のものが挙げられる：（ｉ）アデノウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、１９番染色体上のＡＡＶウイルスの天然に存在する組込み部位；（ｉｉ）ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、ＨＩＶ－１共受容体として知られるケモカイン受容体遺伝子；（ｉｉｉ）マウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオーソログ；（ｉｖ）ｒＤＮＡ遺伝子座。さらに別のＧＳＨ部位が知られており、例えば、Ｐｅｌｌｅｎｚ ｅｔ ａｌ．ｅｐｕｂ Ａｕｇｕｓｔ ２０，２０１８（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／３９６３９０）に記載されている。
異種：用語「異種」は、第２の要素に関して第１の要素を表すために使用される場合、第１の要素と第２の要素が、記載されるような配置で天然に存在しないことを意味する。例えば、異種ポリペプチド、核酸分子、構築物若しくは配列は、（ａ）それが発現される細胞に対してネイティブではないポリペプチド、核酸分子、又はポリペプチド若しくは核酸分子配列の部分、（ｂ）その天然の状態に対して改変若しくは突然変異したポリペプチド若しくは核酸分子又はポリペプチド若しくは核酸分子の部分、或いは（ｃ）類似の条件下でのネイティブ発現レベルと比較して改変された発現を有するポリペプチド又は核酸分子を指す。例えば、異種調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサー）を用いて、遺伝子又は核酸分子が天然に通常発現されるものとは異なる様式で、遺伝子又は核酸分子の発現を調節することができる。特定の実施形態では、異種核酸分子は、天然の宿主細胞ゲノム内に存在し得るが、改変された発現レベル若しくは異なる配列を有するか、又はその両方であり得る。他の実施形態では、異種核酸分子は、宿主細胞又は宿主ゲノムに内在性ではなくてもよいが、その代わりに、形質転換（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション）により宿主細胞に導入されていてもよく、ここで、付加される分子は、宿主ゲノムに組み込まれ得るか、又は一過性（例えば、ｍＲＮＡ）若しくは２世代以上にわたって半安定的（例えば、エピソームウイルスベクター、プラスミド若しくは他の自己複製ベクター）のいずれかで染色体外遺伝材料として存在することができる。
突然変異又は突然変異型：用語「（突然）変異型」は、核酸配列に適用されるとき、核酸配列内のヌクレオチドが、参照（例えば、天然）核酸配列に比して、挿入、欠失若しくは変更されている可能性があることを意味する。単一の改変が１遺伝子座で為される（点変異）、又は単一遺伝子座で複数のヌクレオチドが挿入、欠失若しくは変更される場合もある。加えて、１核酸配列内の任意の数の遺伝子座で、１つ若しくは複数の改変が為される場合もある。核酸配列は、当技術分野で公知の任意の方法によって突然変異させることができる。
核酸分子：核酸分子は、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子の両方を指し、限定しないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡが挙げられ、本明細書に記載される通り、ＤＮＡ鋳型のように、化学的に合成される又は組換えにより生成されるものなどの合成核酸分子も含む。核酸分子は、二本鎖又は一本鎖、環状若しくは線状であってよい。一本鎖の場合、核酸分子は、センス鎖又はアンチセンス鎖であってよい。別に記載のない限り、また、一般フォーマット「配列番号」として本明細書に記載される全ての配列の例として、「配列番号１」を含む核酸は、少なくともその一部が、（ｉ）配列番号１の配列、又は（ｉｉ）配列番号１と相補的な配列のどちらかを有する核酸を指す。２つのどちらを選択するかは、配列番号１が使用される状況によって決定される。例えば、核酸がプローブとして使用される場合には、２つの間の選択は、プローブが、所望の標的と相補的であるという要件によって決定される。本開示の核酸配列は、当業者には容易に理解されるように、化学的若しくは生化学的に修飾されてもよいし、又は非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有してもよい。こうした修飾として、例えば、標識、メチル化、類似体による１つ若しくは複数の自然発生的なヌクレオチドの置換、無電荷結合（例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミダート、カルバミン酸塩など）、電荷結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）などのヌクレオチド間修飾、ペンダント部分、（例えば、ポリペプチド）、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、及び修飾結合（例えば、α－アノマー核酸など）が挙げられる。また、水素結合及びその他の化学的相互作用により指定配列と結合する能力についてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。こうした分子は、当技術分野において公知であり、例えば、分子の骨格中のリン酸結合の代わりにペプチド結合を使用するものがある。他の修飾として、例えば、リボース環が、架橋部分又は「ロックド」核酸に見いだされる修飾などの他の構造を含む類似体を挙げることができる。
遺伝子発現単位：遺伝子発現単位は、少なくとも１つのエフェクター配列に作動可能に連結された少なくとも１つの調節核酸配列を含む核酸配列である。第１の核酸配列は、第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的に関連して配置されるとき、第２の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモータ又はエンハンサーは、プロモータ又はエンハンサーが、コード配列の転写若しくは発現に影響を及ぼす場合、コード配列と作動可能に連結している。作動可能に連結したＤＮＡ配列は、連続的又は非連続であり得る。２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、作動可能に連結した配列が同じリーディングフレーム内に存在してもよい。
宿主：宿主ゲノム又は宿主細胞という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質及び／又は遺伝材料が導入された細胞及び／又はそのゲノムを指す。こうした用語は、特定の被験者細胞及び／又はゲノムだけではなく、そのような細胞の子孫及び／又はそのような細胞の子孫のゲノムも指す。特定の修飾は、突然変異又は環境の影響により後の世代に起こり得ることから、こうした子孫は、実際、親細胞と同一ではない場合もあるが、やはり本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲に含まれることを理解されたい。宿主ゲノム又は宿主細胞は、単離された細胞若しくは培養で増殖した細胞株、又はそうした細胞若しくは細胞株から単離されたゲノム物質であってもよいし、或いは生体組織若しくは生物を構成する宿主細胞又は宿主ゲノムであってもよい。いくつかの事例では、宿主細胞は、例えば、本明細書で記載されるように、動物細胞又は植物細胞であってよい。特定の例では、宿主細胞は、ウシ細胞、ウマ細胞、ブタ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、ニワトリ細胞、又はシチメンチョウ細胞であり得る。特定の例では、宿主細胞は、トウモロコシ細胞、ダイズ細胞、コムギ細胞、又はコメ細胞であり得る。
リコンビナーゼポリペプチド：本明細書で使用されるように、リコンビナーゼポリペプチドは、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）の組換え反応を触媒する機能的能力を有するポリペプチドを指す。組換え反応は、例えば、１つ若しくは複数の核酸鎖切断（例えば、二本鎖切断）、続いて、２つの核酸鎖末端（例えば、粘着末端）の結合を含み得る。いくつかの事例では、組換え反応は、例えば、ゲノム又は構築物中の、標的部位への挿入核酸の挿入を含む。いくつかの事例では、リコンビナーゼポリペプチドは、天然に存在するリコンビナーゼ（例えば、チロシンリコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ又はＦｌｐリコンビナーゼ）の１つ若しくは複数の構造エレメントを含む。特定の事例では、リコンビナーゼポリペプチドは、本明細書に記載の（例えば、表１又は２に列挙される）リコンビナーゼと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの事例では、リコンビナーゼポリペプチドは、天然に存在するリコンビナーゼ（例えば、チロシンリコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ又はＦｌｐリコンビナーゼ）の１つ若しくは複数の官能的特徴を有する。いくつかの事例では、リコンビナーゼポリペプチドは、核酸分子中の認識配列（例えば、表１若しくは２に列挙される認識配列、又はそれと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列）を認識する（例えば、それと結合する）。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、単離されたモノマーとして活性ではない。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、１つ又は複数のリコンビナーゼポリペプチド（例えば、１回の組換え反応につき４つのリコンビナーゼポリペプチド）と共同して組換え反応を触媒する。
挿入核酸分子：本明細書に記載されるように、挿入核酸分子（例えば、挿入ＤＮＡ）は、標的核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ）内の標的部位に、少なくとも部分的に、挿入されるか、又は挿入されることになる核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）である。挿入核酸分子として、例えば、標的核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ）に対して異種である核酸配列を挙げることができる。いくつかの事例では、挿入核酸分子は、目的配列（例えば、異種目的配列）を含む。いくつかの事例では、挿入核酸分子は、ＤＮＡ認識配列、例えば、標的核酸中に存在するＤＮＡに対するコグネイトである。一部の実施形態では、挿入核酸分子は、環状であり、一部の実施形態では、挿入核酸分子は、線状である。一部の実施形態では、挿入核酸分子は、鋳型核酸分子（例えば、鋳型ＤＮＡ）とも呼ばれる。
認識配列：認識配列（例えば、ＤＮＡ認識配列）は、概して、例えば、本明細書に記載されるリコンビナーゼポリペプチドにより認識される（例えば、それによって結合され得る）核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。いくつかの事例では、認識配列は、例えば、本明細書に記載されるように、２つのパラパリンドローム配列を含む。特定の事例では、２つのパラパリンドローム配列は、一緒に、パラパリンドローム領域又はその一部を形成する。いくつかの事例では、認識配列は、例えば、本明細書に記載されるように、２つのパラパリンドローム配列の間に位置するコア配列をさらに含む。いくつかの事例では、認識配列は、表１に列挙される核酸配列、又はそれと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。
コア配列：コア配列は、本明細書で使用される場合、２つのパラパリンドローム配列の間に位置する核酸配列を指す。いくつかの事例では、コア配列は、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、２つのパラパリンドローム配列を含む認識配列を認識するリコンビナーゼポリペプチド）により切断されて、例えば、粘着末端を形成することができる。一部の実施形態では、コア配列は、約５～１０ヌクレオチド、例えば、約８ヌクレオチド長である。
目的配列：本明細書で使用される場合、目的配列という用語は、例えば、本明細書に記載されるように、例えば、リコンビナーゼポリペプチドにより、標的核酸分子に望ましく挿入され得る核酸セグメントを指す。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、ＤＮＡ認識配列と、ＤＮＡ認識配列とは異種の目的配列（一般に、本明細書では「異種目的配列」と呼ばれる）とを含む。目的配列は、いくつかの事例では、それが挿入される核酸分子に対して異種であり得る。いくつかの事例では、目的配列は、例えば、本明細書に記載されるように、遺伝子（例えば、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト遺伝子）をコードする核酸配列又は目的の他のカーゴ（例えば、機能性ＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡをコードする配列）を含む。特定の事例では、遺伝子は、ポリペプチド（例えば、血液因子又は酵素）をコードする。いくつかの事例では、目的配列は、選択マーカ（例えば、栄養要求性マーカ若しくは抗生物質マーカ）、及び／又は核酸制御エレメント（例えば、プロモータ、エンハンサー、サイレンサー、若しくはインスレータ）をコードする核酸配列の１つ若しくは複数を含む。
パラパリンドローム：本明細書で使用される場合、パラパリンドロームという用語は、核酸配列の一方が、他方の核酸配列に対して回文であるか、或いは、他方の核酸配列に対する回文と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の配列同一性を有するか、又は他方の核酸配列に対して１、２、３、４、５、６、７、若しくは８以下の配列ミスマッチを有するかのいずれかである、一対の核酸配列の特性を指す。「パラパリンドローム配列」は、本明細書で使用される場合、互いに対してパラパリンドロームである一対の核酸配列の少なくとも１つを指す。「パラパリンドローム領域」は、本明細書で使用される場合、２つのパラパリンドローム配列を含む核酸配列、又はその部分を指す。いくつかの事例では、パラパリンドローム領域は、核酸配列セグメント（例えば、コア配列を含む）とフランキングする２つのパラパリンドローム配列を含む。
例示的なリコンビナーゼリポータプラスミドの概略図を示す。逆方向でリコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ）によりフランキングされる逆方向ＧＦＰ遺伝子を含む不活性のリポータプラスミドは、コグネイトリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）の存在により活性化することができ、その結果、コーディング配列の転写が上流プロモータ（例えば、ＣＭＶ）によって駆動される配向へのＧＦＰ遺伝子のフリッピングが起こる。 ヒトゲノムへの例示的なリコンビナーゼ媒介性組込みを説明する概略図を示す。上の図では、リコンビナーゼ発現プラスミドから発現されたリコンビナーゼが、挿入ＤＮＡプラスミド上の第１標的部位と、ヒトゲノム中の第２標的部位を認識して、これら２つの部位の間の組換えを触媒することにより、ヒトゲノム中の第２標的部位への挿入ＤＮＡプラスミドの組込みが達成される。下の図には、ゲノム組込み事象を定量するｄｄＰＣＲアッセイのためのプライマー及びプローブ位置を示す。
本開示は、例えば、インビボ又はインビトロで、細胞、組織若しくは被験者におけるＤＮＡ配列内の１つ若しくは複数の位置で、ＤＮＡ配列をターゲティング、編集、修飾若しくは操作する（例えば、哺乳動物ゲノムの標的部位に異種目的ＤＮＡ配列を挿入する）ための組成物、システム及び方法に関する。目的ＤＮＡ配列は、例えば、コード配列、調節配列、遺伝子発現単位を含み得る。
Ｇｅｎｅ－ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディター
本発明は、例えば、リコンビナーゼポリペプチドが結合することができる、コグネイト認識配列を含む２つのＤＮＡ配列を組み換えることにより、ＤＮＡ配列を修飾又は操作することができるリコンビナーゼポリペプチド（例えば、表１若しくは２に列挙される通り、例えば、チロシンリコンビナーゼポリペプチド）を提供する。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムは、一部の実施形態において、以下：（Ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸（ポリペプチドは、以下：（ｉ）リコンビナーゼ活性を有するドメインと、（ｉｉ）ＤＮＡ結合機能性を有するドメイン（例えば、本明細書に記載される、例えば、認識配列に結合するか、又は結合することができる、例えば、ＤＮＡ認識配列を含む）；及び（Ｂ）以下：（ｉ）ポリペプチドに結合する配列（例えば、本明細書に記載の認識配列）と、任意選択で（ｉｉ）目的配列（例えば、異種目的配列）と、を含む挿入ＤＮＡを含み得る。一部の実施形態では、リコンビナーゼ活性を有するドメインと、ＤＮＡ結合機能性を有するドメインは、同じドメインである。例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディタータンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインと、リコンビナーゼドメインとを含み得る。特定の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターポリペプチドの要素は、例えば、本明細書に記載されるように、例えば、表１又は２に列挙される、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、チロシンリコンビナーゼ）の配列から得ることができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディターを第２ポリペプチドと組み合わせる。一部の実施形態では、第２ポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるように、例えば、表１又は２に列挙される、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、チロシンリコンビナーゼ）から得られる。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ遺伝子エディターシステムのリコンビナーゼポリペプチド成分
本明細書に記載のシステム、細胞、及び方法で使用することができるリコンビナーゼポリペプチドの例示的なファミリーとして、チロシンリコンビナーゼが挙げられる。概して、チロシンリコンビナーゼは、２つの認識配列の間の部位特異的組換えを触媒する酵素である。２つの認識配列は、例えば、同じ核酸（例えば、ＤＮＡ）分子上にあってもよいし、又は２つの個別の核酸（例えば、ＤＮＡ）分子上にあってもよい。一部の実施形態では、チロシンリコンビナーゼポリペプチドは、２つのドメイン、即ち、ＤＮＡ接触部位を含むＮ－末端ドメインと、活性部位を含むＣ－末端ドメインを含む。
チロシンリコンビナーゼは、一般に、２つのリコンビナーゼポリペプチドモノマーを認識配列の各々に同時結合して、４つのモノマーを単一のリコンビナーゼ反応に関与させることにより、機能する。例えば、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．（２０１４；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１１（１）：１－１５；その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、チロシンリコンビナーゼモノマーの対が各々認識配列に結合した後、ＤＮＡ結合二量体は、ＤＮＡ鎖切断、鎖交換、及び再結合を経て、ホリデイ（Ｈｏｌｌｉｄａｙ）ジャンクション中間体を形成し、これに続いて、もう１ラウンドのＤＮＡ鎖切断及び連結が起こり、組換え鎖を形成する。チロシンリコンビナーゼの非限定的な例として、Ｃｒｅリコンビナーゼ及びＦｌｐリコンビナーゼ、並びに表１又は２に列挙されるリコンビナーゼポリペプチドが挙げられる。
当業者は、例えば、保存ドメイン解析のためのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）又はＣＤ－Ｓｅａｒｃｈのような常用の配列解析ツールを用いることにより、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、チロシンリコンビナーゼ）の核酸及び対応するポリペプチド配列並びにそれらのドメインを決定することができる。他の配列解析ツールは周知であり、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｍｏｌｂｉｏｌ－ｔｏｏｌｓ．ｃａ、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｍｏｌｂｉｏｌ－ｔｏｏｌｓ．ｃａ／Ｍｏｔｉｆｓ．ｈｔｍに見出すことができる。
例示的なリコンビナーゼポリペプチド
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムは、例えば、本明細書に記載されるリコンビナーゼポリペプチド（例えば、チロシンリコンビナーゼポリペプチド）を含む。一般に、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、チロシンリコンビナーゼポリペプチド）は、核酸認識配列に特異的に結合し、認識配列内の１部位（例えば、認識配列内のコア配列）で組換え反応を触媒する。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、認識配列、又はその一部（例えば、そのコア配列）と、別の核酸配列（例えば、コグネイト認識配列、及び任意選択で、目的配列、例えば、異種目的配列を含む挿入ＤＮＡ）との間の組換えを触媒する。例えば、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、チロシンリコンビナーゼポリペプチド）は、目的配列又はその一部の、別の核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ分子、例えば、染色体若しくはミトコンドリアＤＮＡ）への挿入をもたらす組換え反応を触媒する。
以下の表１は、例示的な二方向性チロシンリコンビナーゼポリペプチドアミノ酸配列（第１列を参照）、及びその対応するＤＮＡ認識配列（第２及び第３列を参照）を提供し、それらは、バイオインフォマティクスにより同定された。表１及び２は、これまで二方向性チロシンリコンビナーゼとして同定されなかったアミノ酸配列を含み、さらに、これまでＤＮＡ認識配列が不明であったチロシンリコンビナーゼの対応するＤＮＡ認識配列も包含する。表１の第１列に示す各アクセッション番号のアミノ酸配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
より具体的には、第２列には、ネイティブＤＮＡ認識配列（例えば、細菌又は古細菌由来）を記載し、第３列には、その行に列挙されるリコンビナーゼに対応するヒトＤＮＡ認識配列を記載する。第４列は、第３列のヒトＤＮＡ認識配列のゲノム位置を示す。第５列は、ヒトＤＮＡ認識配列のセーフハーバースコアを記載し、これは、当該部位が満たすセーフハーバー基準の数を示す。
表１のＤＮＡ認識配列は、以下のドメイン：第１パラパリンドローム配列、コア配列、及び第２パラパリンドローム配列を有する。特定の理論に束縛されることは意図しないが、一部の実施形態では、チロシンリコンビナーゼは、パラパリンドローム領域（第１及び第２パラパリンドローム配列）に基づいてＤＮＡ認識配列を認識し、コア配列についての具体的な配列要件は一切ない。従って、一部の実施形態では、チロシンリコンビナーゼは、ヒトゲノム中の標的部位にＤＮＡを挿入することができ、ここで、標的部位は、コア配列を有し、これは、ネイティブコア配列とは実質的に異なるものでも、又は完全にネイティブコア配列に由来するものであってもよい。その結果として、表１、第２列は、これらの位置にＮを含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡ中のコアオーバーラップ配列は、少なくとも部分的に、ヒトゲノム中の対応する配列と一致するように選択され得る。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、単一のヒトＤＮＡ認識配列のみを有する。
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チロシンリコンビナーゼのアミノ酸配列の非限定的な例を表１、第１列にアクセッション番号により記載する。表１にはさらに、第２列に、所与の例示的なチロシンリコンビナーゼが結合する例示的なネイティブ非ヒト（例えば、細菌、ウイルス、又は古細菌）認識配列も記載する。表１に列挙されるネイティブ認識配列の各々は、典型的に、３つのセグメント：（ｉ）第１パラパリンドローム配列、（ｉｉ）概して、規定核酸配列を含まないスペーサ（例えば、コア配列）、及び（ｉｉｉ）第２パラパリンドローム配列を含み、ここで、第１及び第２パラパリンドローム配列は、互いに対してパラパリンドロームである。表１にはさらに、第３列に、ヒトゲノム中の例示的なチロシンリコンビナーゼの各々に対する例示的な認識配列の各々を記載する。一般に、表１の第３列に列挙されるヒト認識配列は、それぞれ、３つのセグメント：（ｉ）第１パラパリンドローム配列、（ｉｉ）概して、規定核酸配列を含まないスペーサ（例えば、コア配列）、及び（ｉｉｉ）第２パラパリンドローム配列を含み、ここで、第１及び第２パラパリンドローム配列は、互いに対してパラパリンドロームである。表１は、第４列に、ヒトゲノム中の例示的なヒト認識配列のゲノム位置を含む。
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一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるシステム若しくは細胞中に含まれる）は、表２に列挙されるアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、若しくは５０以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるシステム若しくは細胞中に含まれる）は、表２に列挙されるリコンビナーゼポリペプチドのＤＮＡ結合ドメイン、リコンビナーゼ正常、Ｎ－末端ドメイン、及び／又はＣ－末端ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有する。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるシステム若しくは細胞中に含まれる）は、表２に列挙されるアミノ酸配列、或いは、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、若しくは５０以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチドのＤＮＡ結合活性及び／又はリコンビナーゼ活性の１つ若しくは複数を有する。
一部の実施形態では、挿入ＤＮＡ（例えば、本明細書に記載されるシステム若しくは細胞中に含まれる）は、表１の第２若しくは第３列に列挙される核酸認識配列、或いは、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、若しくは８つ以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡ（例えば、本明細書に記載されるシステム若しくは細胞中に含まれる）は、表１の第２若しくは第３列に列挙される核酸認識配列のパラパリンドローム配列の１つ若しくは複数（例えば、両方）、或いは、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、若しくは８つ以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡ（例えば、本明細書に記載されるシステム若しくは細胞中に含まれる）は、表１の第３列に列挙される核酸認識配列のスペーサ（例えば、コア配列）、或いは、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、若しくは８つ以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、挿入ＤＮＡは、異種目的配列をさらに含む。
一部の実施形態では、挿入ＤＮＡ（例えば、本明細書に記載されるシステム若しくは細胞中に含まれる）は、表１の第２若しくは第３列に列挙される核酸認識配列、或いは、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、若しくは８以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有する核酸配列、即ち、ヒト認識配列（例えば、表１の第３列、例えば、第２列の核酸認識配列を挙げる同じ列に列挙される通り）に対するコグネイト、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、若しくは８つ以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、コグネイト認識配列は、表１の第４列に列挙される位置のヒトゲノム中に位置する（第３列の同一行に列挙されるヒトコグネイト認識配列に対応する）。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又は方法で使用される挿入ＤＮＡ又はリコンビナーゼポリペプチドは、異種目的配列の挿入を、少なくとも３、４、５、６、７、若しくは８のセーフハーバースコアを有する位置に向ける。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又は方法で使用される挿入ＤＮＡ又はリコンビナーゼポリペプチドは、異種目的配列の挿入を、ヒトゲノム中に１コピーを有するユニークなゲノムセーフハーバー部位に向ける。例として、ユニークな部位は、二倍体細胞が、相同染色体対上に位置する当該部位の２コピーを含み得るように、一倍体ヒトゲノム中に１コピーで存在し得る。別の例として、ユニークな部位は、二倍体細胞が、相同染色体対の一方の染色体だけに位置する当該部位の１コピーを含むように、二倍体ヒトゲノム中に１コピーで存在し得る。
一部の実施形態では、コア配列に直接隣接するパラパリンドローム配列（「コア隣接モチーフ」中の３つの塩基対は、ＡＡＡ、ＡＧＡ、ＡＴＡ、又はＴＡＡを含む。一部の実施形態では、コア隣接モチーフは、少なくとも１つのＡを含む（例えば、２つ又は３つのＡを含む）。一部の実施形態では、コア隣接モチーフは、ＡＮＡ又はＮＡＡ（Ｎは、任意のヌクレオチドである）である。一部の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡ認識部位は、第１パラパリンドローム配列中の第１コア隣接モチーフと、第２パラパリンドローム配列中の第２コア隣接モチーフを含む。一部の実施形態では、第１コア隣接モチーフと第２コア隣接モチーフは、同じヌクレオチド配列を有し、また別の実施形態では、第１コア隣接モチーフと第２コア隣接モチーフは、異なるヌクレオチド配列を有する。
一部の実施形態では、挿入ＤＮＡ上のＤＮＡ認識配列は、ヒトＤＮＡ認識配列と比較して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のミスマッチを有する。特定の理論に束縛されることは意図しないが、ＤＮＡ認識配列同士のミスマッチは、一部の実施形態では、例えば、Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４，８６８－８７２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、切除よりも組込みにリコンビナーゼ活性が偏っている可能性があると考えられる。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡ及び／又はヒトＤＮＡ認識配列上のＤＮＡ認識配列は各々、リコンビナーゼポリペプチドにより認識されるネイティブ認識配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のミスマッチを含む。特定の実施形態では、挿入ＤＮＡとヒトＤＮＡ認識配列との組込みによって、組込み配列（例えば、異種目的配列）とフランキングする２つの認識配列を含む組込み核酸分子が形成される。特定の実施形態では、組込み核酸分子の２つの認識配列の一方又は両方が、以下：（ｉ）ネイティブ認識配列、（ｉｉ）挿入ＤＮＡ上の認識配列、及び／又は（ｉｉｉ）ヒトＤＮＡ認識配列の１つ若しくは複数（例えば、１つ、２つ、若しくは３つ全部）と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のミスマッチを含む。一部の実施形態では、ミスマッチは全て、同じパラパリンドローム配列上に存在する。一部の実施形態では、ミスマッチは、異なるパラパリンドローム配列上に存在する。複数の実施形態では、組込み核酸分子の２つの認識配列の一方又は両方が、ネイティブ認識配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のミスマッチを含む。一部の実施形態では、ミスマッチは、コア配列中に存在する。一部の実施形態では、組込み核酸分子の認識配列と、ネイティブ認識配列、挿入ＤＮＡ認識配列、及び／又はヒトＤＮＡ認識配列の間のこれらの相違によって、組込み核酸分子の認識配列及びネイティブ認識配列と比較して、リコンビナーゼポリペプチドと組込み核酸分子の認識配列との間の結合親和性の低下が起こる。
一部の実施形態では、ヒト認識配列（例えば、ヒトＤＮＡ認識配列、例えば、表１の第３列に列挙される通り）は、ゲノムセーフハーバー部位又はその付近（例えば、その１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、又は１０，０００ヌクレオチド以内）に位置する。一部の実施形態では、ヒトＤＮＡ認識配列は、以下の基準の１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９つを満たすゲノム内の位置に位置する：（ｉ）癌関連遺伝子から＞３００ｋｂに位置する；（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ／その他の機能性小分子ＲＮＡから＞３００ｋｂにある；（ｉｉｉ）５’遺伝子末端から＞５０ｋｂにある；（ｉｖ）複製起点から＞５０ｋｂにある；（ｖ）任意の超保存エレメントから＞５０ｋｂにある；（ｖｉ）低転写活性を有する（即ち、ｍＲＮＡ＋／－２５ｋｂがない）；（ｖｉｉ）コピー数可変領域内ではない；（ｖｉｉｉ）オープンクロマチン中にある；及び／又は（ｉｘ）ヒトゲノム中に１コピーを有し、ユニークである。一部の実施形態では、表１の第４列に列挙されるゲノム位置は、ゲノムセーフハーバー部位又はその付近（例えば、その１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、又は１０，０００ヌクレオチド以内）に位置する。一部の実施形態では、表１の第４列に列挙されるゲノム位置は、以下の基準の１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９つを満たすゲノム内の位置にある：（ｉ）癌関連遺伝子から＞３００ｋｂに位置する；（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ／その他の機能性小分子ＲＮＡから＞３００ｋｂにある；（ｉｉｉ）５’遺伝子末端から＞５０ｋｂにある；（ｉｖ）複製起点から＞５０ｋｂにある；（ｖ）任意の超保存エレメントから＞５０ｋｂにある；（ｖｉ）低転写活性を有する（即ち、ｍＲＮＡ＋／－２５ｋｂがない）；（ｖｉｉ）コピー数可変領域内ではない；（ｖｉｉｉ）オープンクロマチン中にある；及び／又は（ｘｉ）ヒトゲノム中に１コピーを有し、ユニークである。
複数の実施形態では、本明細書に記載の細胞又はシステムは、以下の１つ若しくは複数（例えば、その１つ、２つ、若しくは３つ）を含む：（ｉ）表１若しくは２の第１列の１つの行に列挙されるリコンビナーゼポリペプチド、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｉｉ）表１の第２列及び同一行に列挙されるＤＮＡ認識配列、或いは、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、若しくは４つ以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有する核酸配列を含む挿入ＤＮＡであって、任意選択で、上記挿入ＤＮＡは、目的配列（例えば、異種目的配列）を含む挿入ＤＮＡ；並びに／或いは（ｉｉｉ）表１の第３列及び同一行に列挙されるヒトＤＮＡ認識配列、或いは、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、若しくは４つ以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有する核酸配列を含むゲノム；好ましくは、上記ヒトＤＮＡ認識配列は、ヒトＤＮＡ認識配列の一覧と対応する表１の第４列及び同一行に列挙される位置のゲノム内に位置する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムのタンパク質成分は、鋳型（例えば、ＤＮＡ鋳型）と事前に結合されていてもよい。例えば、一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドを初めにＤＮＡ鋳型と組み合わせて、デオキシリボ核タンパク質（ＤＮＰ）複合体を形成してもよい。一部の実施形態では、例えば、トランスフェクション、ヌクレオフェクション、ウイルス、小胞、ＬＮＰ、エキソソーム、フソソームを介して、ＤＮＰを細胞に送達することができる。ＤＮＰ送達のさらなる説明は、例えば、Ｇｕｈａ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０２０）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に見出される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、１つ又は複数の（例えば、２、３、４、５）の核ターゲティング配列、例えば、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、双節型ＮＬＳである。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＮＬＳを含むタンパク質の細胞核への移入を促進する。一部の実施形態では、ＮＬＳは、本明細書に記載のＧｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒのＮ末端と融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒのＣ末端と融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＣａｓドメインのＮ末端又はＣ末端と融合される。一部の実施形態では、リンカー配列は、ＮＬＳと、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの隣接ドメインの間に配置される。
一部の実施形態では、ＮＬＳは、アミノ酸配列：ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号１８２２）、ＰＫＫＲＫＶＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１８２３）、ＲＫＳＧＫＩＡＡＩＷＫＲＰＲＫＰＫＫＫＲＫＶ ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１８２４）、ＫＫＴＥＬＱＴＴＮＡＥＮＫＴＫＫＬ（配列番号１８２５）、又はＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ（配列番号１８２６）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１８２７）、又はその機能性断片若しくは変異体を含む。例示的なＮＬＳ配列は、ＰＣＴ／欧州特許第２０００／０１１６９０号明細書にも記載されており、その内容は、その例示的な核局在化配列の開示について、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ＮＬＳは、双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳである。双節型ＮＬＳは、典型的に、スペーサ配列によって隔てられる２つの塩基性アミノ酸クラスター（例えば、約１０アミノ酸長であり得る）を含む。単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳは、典型的に、スペーサを欠いている。双節型ＮＬＳの例は、配列ＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号１８２８）（括弧内はスペーサ）を有するヌクレオプラスミンＮＬＳである。別の例示的な双節型ＮＬＳは、配列：ＰＫＫＫＲＫＶＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１８２９）を有する。例示的なＮＬＳは、国際公開第２０２００５１５６１号パンフレット（核局在化配列に関する開示を含め、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ＤＮＡ結合ドメイン
一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、本明細書に記載のシステム又は細胞に含まれる）、例えば、チロシンリコンビナーゼは、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、標的結合ドメイン又は鋳型結合ドメイン）を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のリコンビナーゼポリペプチドをヒトゲノム中の規定標的部位に対して向け直すことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のリコンビナーゼを、異種ドメイン、例えば、異種ＤＮＡ結合ドメインに融合させてもよい。一部の実施形態では、リコンビナーゼを、異種ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガー、ＴＡＬ、メガヌクレアーゼ、転写因子、又は配列誘導ＤＮＡ結合エレメントからのＤＮＡ結合ドメインに融合してもよい。一部の実施形態では、リコンビナーゼを、配列誘導ＤＮＡ結合エレメント、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ＤＮＡ結合エレメント、例えば、Ｃａｓ９からのＤＮＡ結合ドメインと融合させてもよい。一部の実施形態では、リコンビナーゼドメインと融合したＤＮＡ結合エレメントは、他の触媒機能を不活性化する突然変異、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を不活性化する突然変異、例えば、不活性化メガヌクレアーゼを生成するか、又はＣａｓタンパク質を部分的若しくは完全に不活性化する突然変異、例えば、ニッカーゼＣａｓ９若しくは不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を生成する突然変異を含み得る。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）又はその機能性断片若しくは変異体を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、修飾ＳｐＣａｓ９を含む。複数の実施形態では、修飾ＳｐＣａｓ９は、プロトスペーサ－隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を改変する修飾を含む。複数の実施形態では、ＰＡＭは、核酸配列５’－ＮＧＴ－３’に対する特異性を有する。複数の実施形態では、修飾ＳｐＣａｓ９は、例えば、以下：Ｌ１１１１、Ｄ１１３５、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２、又はＲ１３３５の１つ若しくは複数の位置に、１つ若しくは複数のアミノ酸置換を含み、それは、例えば、以下：Ｌ１１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｒ１３３５Ｖから選択される。複数の実施形態では、修飾ＳｐＣａｓ９は、アミノ酸置換Ｔ１３３７Ｒと、以下：Ｌ１１１１、Ｄ１１３５Ｌ、Ｓ１１３６Ｒ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｄ１３３２Ａ、Ｄ１３３２Ｓ、Ｄ１３３２Ｔ、Ｄ１３３２Ｖ、Ｄ１３３２Ｌ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｄ１３３２Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、Ｔ１３３７、Ｔ１３３７Ｌ、Ｔ１３３７Ｑ、Ｔ１３３７Ｉ、Ｔ１３３７Ｖ、Ｔ１３３７Ｆ、Ｔ１３３７Ｓ、Ｔ１３３７Ｎ、Ｔ１３３７Ｋ、Ｔ１３３７Ｈ、Ｔ１３３７Ｑ、及びＴ１３３７Ｍ、又はそれらに対応するアミノ酸置換から選択される１つ若しくは複数の別のアミノ酸置換を含む。複数の実施形態では、修飾ＳｐＣａｓ９は、以下：（ｉ）以下：Ｄ１１３５Ｌ、Ｓ１１３６Ｒ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｖ、Ａ１３２２Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、及びＴ１３３７から選択される１つ若しくは複数のアミノ酸置換；並びに（ｉｉ）以下：Ｌ１１１１Ｒ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｆ、Ｄ１３３２Ａ、Ｄ１３３２Ｓ、Ｄ１３３２Ｔ、Ｄ１３３２Ｖ、Ｄ１３３２Ｌ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｄ１３３２Ｒ、Ｔ１３３７Ｌ、Ｔ１３３７Ｉ、Ｔ１３３７Ｖ、Ｔ１３３７Ｆ、Ｔ１３３７Ｓ、Ｔ１３３７Ｎ、Ｔ１３３７Ｋ、Ｔ１３３７Ｒ、Ｔ１３３７Ｈ、Ｔ１３３７Ｑ、及びＴ１３３７Ｍ、又はそれらに対応するアミノ酸置換から選択される１つ若しくは複数の別のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓドメイン、例えば、Ｃａｓ９ドメインを含む。複数の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓドメイン、Ｃａｓニッカーゼ（ｎＣａｓ）ドメイン、又はヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ（ｄＣａｓ）を含む。複数の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９ドメイン、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ドメイン、又はヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９のＣａｓ９ドメイン（例えば、ｄＣａｓ９及びｎＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、又はＣａｓ１２ｉを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９及びｎＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、又はＣａｓ１２ｉを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）若しくはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９、又はその機能性断片を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｒｈｕｎ，ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ（２０１３）ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：５，７２６－７３７（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、Ｃａｓ９配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ、例えば、本明細書に記載されるように、Ｃａｓ９、又はその変異体のＨＮＨヌクレアーゼサブドメイン及び／又はＲｕｖＣ１サブドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、又はＣａｓ１２ｉを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓポリペプチド（例えば、酵素）、又はその機能性断片を含む。複数の実施形態では、Ｃａｓポリペプチド（例えば酵素）は、以下：Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（例えば、Ｃｓｎ１若しくはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、ＩＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、Ｖ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＶＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５Ａ）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、超精密（ｈｙｐｅｒ ａｃｃｕｒａｔｅ）Ｃａｓ９変異体（ＨｙｐａＣａｓ９）、それらの相同体、それらの修飾若しくは操作バージョン、及び／又はそれらの機能性断片から選択される。複数の実施形態では、Ｃａｓ９は、例えば、以下：Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、及びＤ１１２７Ａから選択される１つ又は複数の置換を含む。複数の実施形態では、Ｃａｓ９は、以下：Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／又はＡ９８７から選択される位置に１つ若しくは複数の突然変異、例えば、以下：Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、及び／又はＤ９８６Ａから選択される１つ若しくは複数の置換を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、以下：コリネバクテリウム・ウルセランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、スピロプラズマ・シルフィディコーラ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ）、プレボテーラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、スピロプラズマ・タイワネンス（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ）、ストレプトコッカス・イニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）、ベルリエラ・バルティカ（Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ）、サイクロフレクサス・トークイス（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓ）、スタフィロコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、若しくは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、又はその機能性断片若しくは変異体に由来するＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）配列を含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、位置：Ｄ９１７、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５又はそれらの任意の組合せに、例えば、以下：Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、及びＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａから選択される、１つ若しくは複数の置換を含む、Ｃｐｆ１ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ｓｐＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９－ＶＲＱＲ、ｓｐＣａｓ９－ＶＲＥＲ、ｘＣａｓ９（ｓｐ）、ｓａＣａｓ９、ｓａＣａｓ９－ＫＫＨ、ｓｐＣａｓ９－ＭＱＫＳＥＲ、ｓｐＣａｓ９－ＬＲＫＩＱＫ、又はｓｐＣａｓ９－ＬＲＶＳＱＬを含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、以下の表３に列挙されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０以下の相違（例えば、突然変異）を有するアミノ酸配列を含む。
Figure 2022542839000138
Figure 2022542839000139
Figure 2022542839000140
Figure 2022542839000141
一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン結合を指令するｇＲＮＡと結合する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、５’から３’に、（１）ｇＲＮＡスペーサ；（２）ｇＲＮＡスカフォールドを含む。一部の実施形態では：
（１）は、約１８～２２ｎｔのＣａｓ９スペーサであり、例えば、２０ｎｔである。
（２）は、鋳型をニッカーゼＣａｓ９ドメインと結合させるための１つ又は複数のループ、例えば、１、２、若しくは３つのループを含むｇＲＮＡスカフォールドである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡスカフォールドは、５’から３’に、配列：
ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＣＣ（配列番号１８３５）
を担持する。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを使用して、ＨＥＫ２９３、Ｋ５６２、Ｕ２ＯＳ、又はＨｅＬａ細胞に編集を実施する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを使用して、初代細胞、例えば、Ｅ１８．５マウスからの初代皮質ニューロンに編集を実施する。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるシステム又は方法は、米国特許出願公開第２０２０００６３１２６号明細書、米国特許出願公開第２０１９０００２８８９号明細書、若しくは米国特許出願公開第２０１９０００２８７５号明細書（それらの各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡターゲティング酵素若しくはシステム又はその機能性断片若しくは変異体を含む。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチド又はＣａｓエンドヌクレアーゼは、本段落で挙げたいずれかの出願に記載のポリペプチド配列を含み、一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、本段落で挙げたいずれかの出願に記載の核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、標的結合ドメイン又は鋳型結合ドメイン）は、メガヌクレアーゼドメイン、又はその機能性断片を含む。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼ活性、例えば、二本鎖切断及び／又はニッカーゼ活性を有する。他の実施形態では、メガヌクレアーゼドメインは、低下した活性を有し、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を欠失しており、例えば、メガヌクレアーゼは、触媒活性が欠失している。一部の実施形態では、例えば、Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０（２）：８４７－８６０（２０１２）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、触媒活性が欠失したメガヌクレアーゼをＤＮＡ結合ドメインとして使用する。複数の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、野生型ＤＮＡ結合ドメインに対して１つ又は複数の修飾、例えば、指向性方向進化、例えば、ファージ支援連続進化（ＰＡＣＥ）による修飾を含む。
インテイン
一部の実施形態では、以下にさらに詳しくされるように、インテイン－Ｎを、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド）のＮ－末端部分と、例えば、第１ドメインで、融合させることができる。複数の実施形態では、インテイン－Ｃを本明細書に記載されるポリペプチドのＣ－末端部分と（例えば、第２ドメインで）融合させて、例えば、Ｎ－末端部分をＣ－末端部分と連結し、それにより、第１ドメインと第２ドメインを連結することもできる。一部の実施形態では、第１ドメイン及び第２ドメインは、各々独立して、ＤＮＡ結合ドメイン及び触媒ドメイン、例えば、リコンビナーゼドメインから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載のインテイン戦略、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ｄＣａｓ９ドメインを用いて、単一ドメインを分断する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、例えば、フランキングするＮ－末端及びＣ－末端エクステイン（例えば、連結しようとする断片）を連結する、自己スプライシングタンパク質イントロン（例えば、ペプチド）であるインテインを含む。インテインは、いくつかの事例では、自動的に切除されて、タンパク質スプライシングとして知られるプロセスで、残りの断片（エクステイン）をペプチド結合と連結させることができるタンパク質の断片を含み得る。インテインは、「タンパク質イノン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｏｎ）」とも呼ばれる。自動的に切除されて、タンパク質の残り部分を連結させるインテインのプロセスは、本明細書では、「タンパク質スプライシング」又は「インテイン媒介性タンパク質スプライシング」と称される。一部の実施形態では、前駆体タンパク質（インテイン媒介性タンパク質スプライシング前のインテイン含有タンパク質）のインテインは、２つの遺伝子に由来する。こうしたインテインは、本明細書において、スプリットインテイン（例えば、スプリットインテイン－Ｎ及びスプリットインテイン－Ｃ）と呼ばれる。例えば、シアノバクテリア（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）では、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの触媒サブユニットであるＤｎａＥは、２つの個別の遺伝子、ｄｎａＥ－ｎ及びｄｎａＥ－ｃによってコードされる。ｄｎａＥ－ｎ遺伝子によってコードされるインテインは、本明細書では「インテイン－Ｎ」と呼ばれ得る。ｄｎａＥ－ｃ遺伝子によってコードされるインテインは、本明細書では「インテイン－Ｃ」と呼ばれ得る。
異種タンパク質断片を連結するためのインテインの使用は、例えば、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（２１）；１４５１２－９（２０１４）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。例えば、個別のタンパク質断片に融合されると、インテインＩｎｔＮ及びＩｎｔＣは、互いを認識し、それ自体からスプライシングして、且つ／又は同時に、それらが融合されているタンパク質断片のＮ－及びＣ－末端エクステインを連結し、それにより、２つのタンパク質断片から完全長タンパク質を再構成することができる。
一部の実施形態では、ｄｎａＥインテイン、Ｃｆａ－Ｎ（例えば、スプリットインテイン－Ｎ）及びＣｆａ－Ｃ（例えば、スプリットインテイン－Ｃ）インテイン対に基づく合成インテインを使用する。こうしたインテインの例は、例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１６ Ｆｅｂ．２４；１３８（７）：２１６２－５（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本開示に従って使用することができるインテイン対の非限定的な例として、以下：Ｃｆａ ＤｎａＥインテイン、Ｓｓｐ ＧｙｒＢインテイン、Ｓｓｐ ＤｎａＸインテイン、Ｔｅｒ ＤｎａＥ３インテイン、Ｔｅｒ ＴｈｙＸインテイン、Ｒｍａ ＤｎａＢインテイン及びＣｎｅ Ｐｒｐ８インテイン（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３９４，６０４号明細書に記載されるような）が挙げられる。
一部の実施形態では、インテイン－Ｎ及びインテイン－Ｃは、スプリットＣａｓ９のＮ－末端部分とスプリットＣａｓ９のＣ－末端部分との連結のために、スプリットＣａｓ９のＮ－末端部分及びスプリットＣａｓ９のＣ－末端部分にそれぞれ融合し得る。例えば、一部の実施形態では、インテイン－ＮをスプリットＣａｓ９のＮ－末端部分のＣ－末端に融合させ、即ち、Ｎ－［スプリットＣａｓ９のＮ－末端部分］－［インテイン－Ｎ］～Ｃの構造を形成する。一部の実施形態では、インテイン－ＣをスプリットＣａｓ９のＣ－末端部分のＮ－末端に融合させ、即ち、Ｎ－［インテイン－Ｃ］～［スプリットＣａｓ９のＣ－末端部分］－Ｃの構造を形成する。インテインが連結したタンパク質（例えば、スプリットＣａｓ９）を連結させるためのインテイン媒介性タンパク質スプライシングの機構は、Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２０１４；５（ｌ）：４４６－４６ｌ（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。インテインを設計及び使用する方法は、例えば、国際公開第２０２００５１５６１号パンフレット、国際公開第２０１４００４３３６号パンフレット、国際公開第２０１７１３２５８０号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５０３４４５４９号明細書、及び米国特許出願公開第２０１８０１２７７８０号明細書（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
一部の実施形態では、スプリットは、２つ以上の断片中の分割を指す。一部の実施形態では、スプリットＣａｓ９タンパク質又はスプリットＣａｓ９は、Ｃａｓ９タンパク質であり、これは、２つの個別のヌクレオチド配列によりコードされるＮ－末端断片及びＣ－末端断片として提供される。Ｃａｓ９タンパク質のＮ－末端部分及びＣ－末端部分に対応するポリペプチドはスプライシングされて、再構成Ｃａｓ９タンパク質を形成し得る。複数の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １５６，Ｉｓｓｕｅ ５，ｐｐ．９３５－９４９，２０１４に記載されているか、又はＪｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１：８６７－８７１及びＰＤＢ ｆｉｌｅ：５Ｆ９Ｒに記載されている（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）ように、タンパク質の変性領域内で２つの断片に分割される。変性領域は、当技術分野で公知の１つ又は複数のタンパク質構造決定技術により決定することができ、そうしたものとして、限定はしないが、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ分光法、電子顕微鏡法（例えば、ｃｒｙｏＥＭ）、及び／又はインシリコタンパク質モデル化が挙げられる。一部の実施形態では、タンパク質は、例えば、アミノ酸Ａ２９２－Ｇ３６４、Ｆ４４５－Ｋ４８３、若しくはＥ５６５－Ｔ６３７の間のＳｐＣａｓ９の領域内の任意のＣ、Ｔ、Ａ、若しくはＳ、或いは、いずれか他のＣａｓ９、Ｃａｓ９変異体（例えば、ｎＣａｓ９、ｄＣａｓ９）、又は他のｎａｐＤＮＡｂｐ内の対応する位置で、２つの断片に分割される。一部の実施形態では、タンパク質は、ＳｐＣａｓ９ Ｔ３１０、Ｔ３１３、Ａ４５６、Ｓ４６９、又はＣ５７４で２つの断片に分割される。一部の実施形態では、タンパク質を２つの断片に分割するプロセスは、タンパク質の分断と呼ばれる。
一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約２～１０００アミノ酸（例えば、２～１０、１０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、又は９００～１０００アミノ酸）の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約５～５００アミノ酸（例えば、５～１０、１０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、又は４００～５００アミノ酸）の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約２０～２００アミノ酸（例えば、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００、又は１００～２００アミノ酸）の範囲である。
一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの部分又は断片をインテインと融合させる。ヌクレアーゼをインテインのＮ－末端又はＣ－末端と融合させることができる。一部の実施形態では、融合タンパク質の部分又は断片をインテインと融合させると共に、ＡＡＶカプシドタンパク質と融合させる。インテイン、ヌクレアーゼ及びカプシドタンパク質を、任意の配置（例えば、ヌクレアーゼ－インテイン－カプシド、インテイン－ヌクレアーゼ－カプシド、カプシド－インテイン－ヌクレアーゼなど）で一緒に融合させることができる。一部の実施形態では、インテインのＮ－末端を融合タンパク質のＣ－末端と融合させ、インテインのＣ－末端をＡＡＶカプシドタンパク質のＮ－末端と融合させる。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（例えば、ニッカーゼＣａｓ９ドメインを含む）をインテイン－Ｎと融合させ、ポリメラーゼドメインを含むポリペプチドをインテイン－Ｃに融合させる。
インテインの例示的なヌクレオチド及びアミノ酸配列を以下に記載する：
ＤｎａＥインテイン－Ｎ ＤＮＡ：
Figure 2022542839000142
ＤｎａＥインテイン－Ｎタンパク質：
ＣＬＳＹＥＴＥＩＬＴＶＥＹＧＬＬＰＩＧＫＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＳＶＤＮＮＧＮＩＹＴＱＰＶＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＬＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＥＬＤＬＭＲＶＤＮＬＰＮ（配列番号１８３７）
ＤｎａＥインテイン－Ｃ ＤＮＡ：
ＡＴＧＡＴＣＡＡＧＡＴＡＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＡＧＴＡＴＣＴＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＣＧＴＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＧＧＡＧＴＣＧＡＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＡＡＴ（配列番号１８３８）
インテイン－Ｃ：
ＭＩＫＩＡＴＲＫＹＬＧＫＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＡＬＫＮＧＦＩＡＳＮ（配列番号１８３９）
Ｃｆａ－Ｎ ＤＮＡ：
Figure 2022542839000143
Ｃｆａ－Ｎタンパク質：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号１８４１）
Ｃｆａ－Ｃ ＤＮＡ：
Figure 2022542839000144
Ｃｆａ－Ｃタンパク質：
ＭＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１８４３）
挿入ＤＮＡ
一部の実施形態では、本明細書に記載される挿入ＤＮＡは、例えば、本明細書に記載されるように、例えば、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、チロシンリコンビナーゼポリペプチド）により、標的ＤＮＡ分子に組み込むことができる核酸配列を含む。挿入ＤＮＡは、典型的に、システムの１つ又は複数のリコンビナーゼポリペプチド（例えば、リコンビナーゼポリペプチドの複数のコピー）に結合することができる。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、本明細書に記載の認識配列）に結合することができる領域を含む。
挿入ＤＮＡは、一部の実施形態では、標的ＤＮＡに挿入するための目的配列を含む。目的配列は、コーディング又はノンコーディングのいずれでもよい。一部の実施形態では、目的配列は、オープンリーディングフレームを含んでもよい。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、コザック配列を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、内部リボソーム進入部位を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、Ｔ２Ａ又はＰ２Ａ部位などの自己切断ペプチドを含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、開始コドンを含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、スプライスアクセプター部位を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、スプライスドナー部位を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、例えば、停止コドンの下流に、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、例えば、オープンリーディングフレームの停止コドンの下流に、ポリＡテイルを含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、１つ又は複数のエキソンを含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、１つ又は複数のイントロンを含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、真核生物転写ターミネータを含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、増強された翻訳エレメント又は翻訳増強エレメントを含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列、ｓｉＲＮＡ配列、ガイドＲＮＡ配列、ｐｉｗｉＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、エフェクター配列に作動可能に連結された少なくとも１つの調節領域から構成される遺伝子発現単位を含む。エフェクター配列は、ＲＮＡに転写される配列（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡをコードする配列などのコーディング配列又はノンコーディング配列）であってもよい。一部の実施形態では、目的配列は、ノンコーディング配列を含み得る。例えば、挿入ＤＮＡは、プロモータ又はエンハンサー配列を含み得る。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、組織特異的プロモータ又はエンハンサーを含み、その各々は、一方向又は二方向であり得る。一部の実施形態では、プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモータ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータ、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータである。一部の実施形態では、プロモータは、ＴＡＴＡエレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータは、Ｂ認識エレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータは、転写因子のための１つ又は複数の結合部位を有する。
一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの目的配列は、内在性イントロン中の標的ゲノムに挿入される。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの目的配列は、標的ゲノムに挿入され、それにより、新たなエキソンとして作用する。一部の実施形態では、標的ゲノムへの目的配列の挿入によって、天然のエキソンの置換又は天然のエキソンのスキッピングが起こる。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの目的配列は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、又はＲＯＳＡ２６などのゲノムセーフハーバー部位中の標的部位に挿入される。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの目的配列は、遺伝子間又は遺伝子内領域内のゲノムに付加される。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの目的配列は、内在性活性遺伝子から０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ、若しくは１００ｋｂ内のゲノム５’又は３’に付加される。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの目的配列は、内在性プロモータ又はエンハンサーから０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ、若しくは１００ｋｂ内のゲノム５’又は３’に付加される。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの目的配列は、例えば、５０～５０，０００塩基対（例えば、５０～４０，０００ｂｐ、５００～３０，０００ｂｐ、５００～２０，０００ｂｐ、１００～１５，０００ｂｐ、５００～１０，０００ｂｐ、５０～１０，０００ｂｐ、５０～５０，０００ｂｐであり得る。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの目的配列は、１～５０塩基対（例えば、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、又は４０～５０塩基対）であり得る。
特定の実施形態では、挿入ＤＮＡは、例えば、異種コーディング領域をゲノム中に導入し；エキソン構造／選択的スプライシングに影響を与えるか、若しくはそれをもたらし；内在性遺伝子の破壊を引き起こし；内在性遺伝子の転写活性化を引き起こし；内在性ＤＮＡのエピジェネティック調節をもたらし；作動可能に連結した遺伝子の上方若しくは下方制御をもたらすことにより、標的細胞若しくは標的生物のゲノム機能を改変又は規定する配列を含むように、同定、設計、操作及び構成することができる。特定の実施形態では、挿入ＤＮＡは、エキソン及び／又はトランスジーンをコードする配列を含み、転写因子アクチベータ、リプレッサー、エンハンサーなど、及びそれらの組合せに対する結合部位を賦与するように、操作することができる。他の実施形態では、コーディング配列を、スプライスアクセプター部位、ポリ－Ａテイルでさらにカスタマイズすることもできる。
挿入ＤＮＡは、標的ＤＮＡに対してある程度の相同性を有し得る。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、標的ＤＮＡ又はその部分に対して厳密な相同性の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０以上の塩基を有する。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、標的ＤＮＡ又はその部分に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％相同性の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００以上の塩基を有する。
本明細書に記載される送達の他の方法に代わるものとして、一部の実施形態では、細胞に送達される核酸（例えば、リコンビナーゼをコードする核酸、若しくは鋳型核酸、又は両方）はミニサークルとして設計され、この場合、細胞への投与前に、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）に関連しないプラスミドバックボーン配列を除去する。ミニサークルは、細菌部分（例えば、細菌の複製起点、抗生物質選択カセット）を含むバックボーンを有するプラスミドと比較して、より高いトランスフェクション効率及び遺伝子発現を達成することが証明されており、転位の効率を改善するために使用されている（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２：Ｅ７４（２０１３））。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドをコードするＤＮＡベクターは、ミニサークルとして送達される。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）鋳型を含有するＤＮＡベクターは、ミニサークルとして送達される。核酸を送達するためのそうした代替手段の一部の実施形態では、細菌部分は、組換え部位、例えば、ａｔｔＰ／ａｔｔＢ、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ部位によってフランキングされる。一部の実施形態では、コグネイトリコンビナーゼの付加により、分子内組換え及び細菌部分の切除が起こる。一部の実施形態では、リコンビナーゼ部位は、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼにより認識される。一部の実施形態では、リコンビナーゼ部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識される。一部の実施形態では、リコンビナーゼ部位は、ＦＬＰリコンビナーゼにより認識される。一部の実施形態では、ミニサークルは、細菌生産株、例えば、誘導性ミニサークルアセンブリング酵素を安定に発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８（１２）：１２８７－１２８９（２０１０）に従う生産株中に生成される。ミニサークルＤＮＡベクター調製物及び生成の方法は、米国特許第９２３３１７４号明細書（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
プラスミドＤＮＡ以外にも、ウイルスバックボーン、例えば、ＡＡＶベクターから、所望の構築物、例えば、リコンビナーゼ発現カセット又は治療用発現カセットを切除することにより、ミニサークルを作製することができる。これまでに、ウイルスバックボーンからの挿入ＤＮＡ配列の切除及び環状化が、トランスポザーゼ媒介性組込み効率にとって重要であり得ることが明らかにされている（Ｙａｎｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０（１０）：９９９－１００５（２００２））。一部の実施形態では、まずミニサークルを製剤化し、次に、標的細胞に送達する。他の実施形態では、リコンビナーゼの同時送達により、リコンビナーゼ認識部位にフランキングする核酸（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドをコードする核酸、若しくはＤＮＡ鋳型、又はその両方）の切除及び環状化を達成することによって、細胞内で、ＤＮＡベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ、ｒＡＡＶ、ｓｃＡＡＶ、ｃｅＤＮＡ、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ ＤＮＡ）からミニサークルを形成する。一部の実施形態では、第１切除事象（例えば、分子内組換え）及び第２組込み（例えば、標的部位組込み）事象のために、同じリコンビナーゼを使用する。一部の実施形態では、切除された環状ＤＮＡ上の組換え部位（例えば、第１組換え事象、例えば、分子内組換えの後の）を、第２組換え（例えば、標的部位組換え）事象のための鋳型認識部位として使用する。
リンカー
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及びシステムのドメイン（例えば、本明細書に記載のリコンビナーゼポリペプチドのリコンビナーゼドメイン及び／又はＤＮＡ認識ドメイン）は、リンカーにより連結され得る。リンカーエレメントを含む本明細書に記載の組成物は、一般的形態Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を有し、ここで、Ｓ１及びＳ２は、同じでも異なってもよく、リンカーで互いに結合された２つの部分（例えば、各々、ポリペプチド又は核酸ドメイン）を呈示する。一部の実施形態では、リンカーは、２つのポリペプチドを連結し得る。一部の実施形態では、リンカーは、２つの核酸分子を連結し得る。一部の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドと核酸分子を連結し得る。リンカーは、化学結合、例えば、１つ若しくは複数の共有結合又は非共有結合であってよい。リンカーは、柔軟、剛直、及び／又は切断可能であってよい。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。概して、ペプチドリンカーは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくはそれを超えるアミノ酸長、例えば、２～５０アミノ酸長、２～３０アミノ酸長である。
最も一般的に使用される柔軟リンカーは、主としてＧｌｙ及びＳｅｒ残基の区間から成る配列を有する（「ＧＳ」リンカー）。柔軟リンカーは、ある程度の移動又は相互作用を必要とするドメインの連結に有用であると考えられ、小さい無極性（例えば、Ｇｌｙ）又は極性（例えば、Ｓｅｒ若しくはＴｈｒ）アミノ酸を含み得る。Ｓｅｒ又はＴｈｒの組込みはまた、水分子を用いて水素結合を形成することにより、水溶液中のリンカーの安定性を維持することができるため、リンカーと他の部分との好ましくない相互作用を低減することができる。こうしたリンカーの例としては、構造［ＧＧＳ］≧１又は［ＧＧＧＳ］≧１（配列番号１８４４）を有するものが挙げられる。剛直リンカーは、ドメイン間の定距離を保持すると共に、それらの独立の機能を維持するのに有用である。剛直リンカーはまた、薬剤中の１つ若しくは複数の成分の安定性又は生物活性を保存するためにドメインの空間的分離が不可欠である場合にも有用となり得る。剛直リンカーは、αヘリックス構造又はＰｒｏリッチ配列、（ＸＰ）ｎを有し得る（Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、若しくはＧｌｕを指す）。切断可能なリンカーは、遊離機能性ドメインをインビボで放出し得る。一部の実施形態では、リンカーは、特定の条件下、例えば、還元剤又はプロテアーゼの存在下で切断され得る。インビボで切断可能なリンカーは、ジスルフィド結合の可逆性を利用する場合がある。一例として、２つのＣｙｓ残基の間のトロンビン感受性配列（例えば、ＰＲＳ）がある。ＣＰＲＳＣのインビトロトロンビン処理によって、トロンビン感受性配列の切断が起こるのに対し、可逆性ジスルフィド結合はインタクトなままである。こうしたリンカーは、周知であり、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９に記載されている。本明細書に記載の組成物中のリンカーのインビボ切断は、特定の細胞若しくは組織において、病状（例えば、癌若しくは炎症）下、インビボで発現されるか、又は特定の細胞コンパートメント内に拘束されたプロテアーゼによっても実施され得る。様々なプロテアーゼの特異性によって、拘束されたコンパートメント内のリンカーの緩徐な切断が可能になる。
一部の実施形態では、アミノ酸リンカーは、天然のポリペプチド内のこうしたドメインの間に存在する内在性アミノ酸（又はそれらと相同性）である。一部の実施形態では、そのようなドメインの間に存在する内在性アミノ酸は、置換されているが、長さは天然の長さから不変である。一部の実施形態では、ドメイン間に天然に存在するアミノ酸残基に、追加のアミノ酸残基が付加される。
一部の実施形態では、アミノ酸リンカーは、タンパク質機能を最大化するように、コンピューターにより設計されるか、又はスクリーニングされる（Ａｎａｄ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８７：１９，２０１３）。
ゲノムセーフハーバー部位
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、ゲノムセーフハーバー部位をターゲティングする（例えば、異種目的配列の挿入を、少なくとも３、４、５、６、７、若しくは８のセーフハーバースコアを有する位置に向ける）。一部の実施形態では、ゲノムセーフハーバー部位は、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位である。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、可動遺伝子エレメント、例えば、リコンビナーゼ、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、又はレトロウイルスのネイティブ標的に由来する。可動エレメントのネイティブ標的は、それらの進化的選択を考慮すると、ゲノム組込みのための理想的な位置として役立ち得る。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）である。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、５ＳｒＤＮＡ、１８ＳｒＤＮＡ、５．８ＳｒＤＮＡ、又は２８ＳｒＤＮＡである。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、５ＳｒＤＮＡ内のＭｕｔｓｕ部位である。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、２８ＳｒＤＮＡ内のＲ２部位、Ｒ５部位、Ｒ６部位、Ｒ４部位、Ｒ１部位、Ｒ９部位、又はＲＴ部位である。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、１８ＳｒＤＮＡ内のＲ８部位又はＲ７部位である。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をコードするＤＮＡである。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、ｔＲＮＡ－Ａｓ又はｔＲＮＡ－ＧｌｕをコードするＤＮＡである。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、スプライソソームＲＮＡをコードするＤＮＡである。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、Ｕ２ｓｎＲＮＡなどの低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）をコードするＤＮＡである。
従って、いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを用いて、異種目的配列をＮａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位に挿入する方法を提供する。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、以下の表４に記載する部位である。一部の実施形態では、異種目的配列は、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位の２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、又は１０００塩基対内に挿入される。一部の実施形態では、異種目的配列は、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位の０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ、又は１００ｋｂ内に挿入される。一部の実施形態では、異種目的配列は、表４に示す配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する部位に挿入される。一部の実施形態では、異種目的配列は、表４に示す配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する部位の２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、若しくは１０００塩基対内、又は０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ、若しくは１００ｋｂ内に挿入される。一部の実施形態では、異種目的配列は、表４の第５列に示す遺伝子内、又はその遺伝子の２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、若しくは１０００塩基対内、又は０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ、若しくは１００ｋｂ内に挿入される。
Figure 2022542839000145
Figure 2022542839000146
Figure 2022542839000147
Figure 2022542839000148
Figure 2022542839000149
Figure 2022542839000150
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）のさらなる機能的特徴
本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、いくつかの事例において、１つ若しくは複数の機能的測定又は特徴によって特性決定され得る。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、標的結合ドメイン）は、以下に記載する機能的特徴の１つ又は複数を有する。一部の実施形態では、鋳型結合ドメインは、以下に記載する機能的特徴の１つ又は複数を有する。一部の実施形態では、鋳型（例えば、鋳型ＤＮＡ）は、以下に記載する機能的特徴の１つ又は複数を有する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒによって改変された鋳型部位は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒによる改変後に、以下に記載する機能的特徴の１つ又は複数を有する。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド
ＤＮＡ結合ドメイン
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、標準ＤＮＡ結合ドメインよりも高い親和性で、標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に結合することができる。一部の実施形態では、標準ＤＮＡ結合ドメインは、バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、１００ｐＭ～１０ｎＭ（例えば、１００ｐＭ～１ｎＭ又は１ｎＭ～１０ｎＭ）の親和性で、標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に結合することができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインの、その標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に対する親和性は、例えば、Ａｓｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４６：１０７－１１９（２０１８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、例えば、熱泳動によりインビトロで測定される。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、約１００倍モル過剰のスクランブル配列競合ｄｓＤＮＡの存在下で、例えば、１００ｐＭ～１０ｎＭ（例えば、１００ｐＭ～１ｎＭ又は１ｎＭ～１０ｎＭ）の親和性で、標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に結合することができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、Ｈｅ ａｎｄ Ｐｕ（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ ２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、例えば、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で）により測定して、標的細胞、例えば、ヒト標的細胞のゲノム中のいずれか他の配列よりも高い頻度で、その標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）と結合していることが認められる。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、前掲したＨｅ ａｎｄ Ｐｕ（２０１０）に記載されているように、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で）により測定して、標的細胞中のいずれか他の配列より少なくとも５倍又は１０倍高い頻度で、その標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）と結合していることが認められる。
鋳型結合ドメイン
一部の実施形態では、鋳型結合ドメインは、標準ＤＮＡ結合ドメインよりも高い親和性で、鋳型ＤＮＡに結合することができる。一部の実施形態では、標準ＤＮＡ結合ドメインは、バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、鋳型結合ドメインは、１００ｐＭ～１０ｎＭ（例えば、１００ｐＭ～１ｎＭ又は１ｎＭ～１０ｎＭ）の親和性で、鋳型ＤＮＡに結合することができる。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインの、その鋳型ＤＮＡに対する親和性は、例えば、Ａｓｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４６：１０７－１１９（２０１８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、例えば、熱泳動によりインビトロで測定される。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインの、その鋳型ＤＮＡに対する親和性は、細胞中で（例えば、ＦＲＥＴ又はＣｈＩＰ－Ｓｅｑにより）測定される。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、Ｙａｎｔ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２４（２０）：９２３９－９２４７（２００４）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、１０ｎＭ競合ＤＮＡの存在下で、少なくとも５０％鋳型ＤＮＡが結合した状態で、インビトロで鋳型ＤＮＡと会合する。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、スクランブルＤＮＡとの場合よりも、少なくとも約５倍又は１０倍高い頻度で、細胞中（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中）の鋳型ＤＮＡと会合する。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインと鋳型ＤＮＡ又はスクランブルＤＮＡとの会合の頻度は、前掲のＨｅ ａｎｄ Ｐｕ（２０１０）に記載されているように、ＣｈＩＰ－ｓｅｑにより測定される。
標的部位
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの後、組込み配列の周囲の標的部位は、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６４５９０３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、例えば、標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシングにより決定して、例えば、約５０％若しくは１０％未満の組込み事象に、限定的な数の挿入又は欠失を含む。一部の実施形態では、標的部位は、例えば、前掲のＫａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）に記載されているように、例えば、標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシングにより決定して、多重挿入事象、例えば、頭－尾又は頭－頭重複を示さない。一部の実施形態では、標的部位は、鋳型ＤＮＡに対応する組込み配列を含む。一部の実施形態では、標的部位は、完全に組み込まれた鋳型分子を含む。一部の実施形態では、標的部位は、ベクターＤＮＡ、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの成分を含む。一部の実施形態では、例えば、組込み前の第１組換え事象により、鋳型ＤＮＡがウイルスベクターから最初に切除される場合、標的部位は、例えば、前掲のＫａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）に記載されているように、例えば、標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシングにより決定して、約１％若しくは１０％超の事象に、非鋳型ＤＮＡ、例えば、内在性又はベクターＤＮＡ、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲから生じる挿入物を含まない。一部の実施形態では、標的部位は、鋳型ＤＮＡに対応する組込み配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、標的ＤＮＡの部位特異的編集、例えば、標的ＤＮＡへの鋳型ＤＮＡの挿入が可能である。一部の実施形態では、部位特異的Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、編集、例えば、挿入を生成することができ、それは、当該ゲノム中のいずれか他の部位より高い頻度で標的部位に存在する。一部の実施形態では、部位特異的Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、ヒトゲノム中の全ての他の部位の頻度の少なくとも２、３、４、５、１０、５０、１００、若しくは１０００倍の頻度で、標的部位に編集、例えば、挿入を生成することができる。一部の実施形態では、組込み部位の位置は、一方向シーケンシングにより決定される。ライブラリー調製に使用されるアダプター又はプライマーへのユニークな分子識別子（ＵＭＩ）の組込みによって、個別の挿入事象の定量が可能になり、それをオンターゲット挿入及びその他全ての挿入の間で比較して、規定標的部位に対する優先性を決定することができる。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、ヒトゲノム中の単一位置に存在する標的ＤＮＡ配列を編集する。一部の実施形態では、単一相同性染色体上のヒトゲノム中の単一位置に存在する標的ＤＮＡ配列を編集するために、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇが使用され、例えば、これは、ハロタイプ特異的である。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、２つの相同性染色体上のヒトゲノム中の単一位置に存在する標的ＤＮＡ配列を編集する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇを用いて、ゲノム中の複数の位置、例えば、ゲノム中の少なくとも２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、１００００、１０００００、２０００００、５０００００、１００００００（例えば、Ａｌｕ元素）の位置に存在する、標的ＤＮＡ配列を編集する。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、望ましくない突然変異を導入することなく、ゲノムを編集することができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、鋳型、例えば、鋳型ＤＮＡをゲノムに挿入することにより、ゲノムを編集することができる。一部の実施形態では、ゲノム中に得られた修飾は、鋳型ＤＮＡ配列に対して最小限の突然変異を含む。一部の実施形態では、鋳型ＤＮＡと比較したゲノム挿入の平均誤り率は、ヌクレオチド当たり１０－４、１０－５、又は１０－６未満の突然変異である。一部の実施形態では、標的細胞に導入される鋳型ＤＮＡに対する突然変異の数は、平均して、ゲノム当たり１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的ゲノムにおける導入の誤り率は、例えば、前掲のＫａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）に記載されているように、既知標的部位にわたるロングリードアンプリコンシーケンシングの後、鋳型ＤＮＡ配列と比較することにより決定される。一部の実施形態では、この方法により計数される誤りは、鋳型配列に対するヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、この方法により計数される誤りは、鋳型配列に対するヌクレオチド欠失を含む。一部の実施形態では、この方法により計数される誤りは、鋳型配列に対するヌクレオチド挿入を含む。一部の実施形態では、この方法により計数される誤りは、鋳型配列に対するヌクレオチド置換、欠失、又は挿入のいずれか１つ又は複数の組合せを含む。
組込み事象の効率を、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムによる標的部位又は標的細胞の編集の尺度として使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、標的部位又は標的細胞の画分に異種目的配列を組み込むことができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、標的全体を増幅した後、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）に記載されているように、例えば、ロングリードアンプリコンシーケンシングにより解析した場合、編集物の検出により測定して、標的遺伝子座の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は１００％を編集することができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７（５）：１９７－２０８（２０１６）に記載の方法に従い、例えば、トランスジーン特異的プライマー－プローブセットを用いるｄｄＰＣＲにより決定した場合、細胞の集団全体で、標準遺伝子、例えば、ＲＰＰ３０に対して正規化して、ゲノム当たり少なくとも０．１、例えば、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、若しくは１００コピーの平均コピー数で、細胞を編集することができる。
一部の実施形態では、細胞当たりのコピー数は、例えば、Ｉｇａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ６：８－１６（２０１７）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の方法に従い、単一細胞ｄｄＰＣＲ（ｓｃ－ｄｄＰＣＲ）により分析される。一部の実施形態では、トランスジーン特異的プライマー－プローブセットを用いたｓｃ－ｄｄＰＣＲにより評価して、標的細胞の少なくとも１％、例えば、少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は１００％が、組込みについて陽性である。一部の実施形態では、平均コピー数は、トランスジーン特異的プライマー－プローブセットを用いたｓｃ－ｄｄＰＣＲにより測定して、細胞当たり少なくとも０．１、例えば、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、又は１００コピーである。
さらなるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの特徴
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、内在性宿主因子を必要とすることなく、完全な書込み（ｗｒｉｔｉｎｇ）を達成し得る。一部の実施形態では、システムは、ＤＮＡ修復を必要とせずに、完全な書込みを達成し得る。一部の実施形態では、システムは、ＤＮＡ損傷応答を誘発することなく、完全な書込みを達成し得る。
一部の実施形態では、システムは、ＮＨＥＪ経路、相同組換え修復経路、塩基切除修復経路、又はそれらの任意の組合せによるＤＮＡ修復を必要としない。ＤＮＡ修復経路による参加は、例えば、ＤＮＡ修復経路阻害剤又はＤＮＡ修復経路欠失細胞株の適用によって、アッセイすることができる。例えば、ＤＮＡ修復経路阻害剤を適用する場合、まず、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ細胞生存アッセイを実施して、阻害剤の毒性、並びに何らかの正規化を適用すべきか否かを決定することができる。ＳＣＲ７は、ＮＨＥＪの阻害剤であり、これは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）送達中に連続希釈で適用することができる。ＰＡＲＰタンパク質は、一本鎖及び二本鎖切断の両方にホモ二量体として結合する核酵素である。従って、その阻害剤を、相同組換え修復経路及び塩基切除修復経路を含め、関連ＤＮＡ修復経路の試験に使用することができる。実験手順は、ＳＣＲ７のそれと同じである。ヌクレオチド切断修復（ＮＥＲ）経路のコアタンパク質が欠失した細胞株を使用して、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）に対するＮＥＲの効果を試験することができる。細胞へのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムの送達後、ｄｄＰＣＲを用いて、ＤＮＡ修復経路の阻害に関して、異種目的配列の挿入を評価することができる。また、シーケンシング解析を実施して、ＤＮＡ修復経路が特定の役割を果たしているか否かを評価することもできる。一部の実施形態では、ゲノムへのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）は、本明細書に記載のＤＮＡ修復経路のノックダウンによって低減されない。一部の実施形態では、ゲノムへのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）は、ＤＮＡ修復経路のノックダウンにより５０％以上低減されない。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの進化型変異体
一部の実施形態では、本発明は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの進化型変異体を提供する。進化型変異体は、一部の実施形態では、標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はそこに含まれる断片若しくはドメインの１つを突然変異誘発させることにより生産することができる。一部の実施形態では、ドメイン（例えば、触媒又はＤＮＡ結合ドメイン（例えば、標的結合ドメイン若しくは鋳型結合ドメイン）、例えば、配列誘導ＤＮＡ結合エレメントなど）の１つ若しくは複数が進化する。こうした進化型変異体ドメインの１つ又は複数は、一部の実施形態において、単独で、又は他のドメインと一緒に進化し得る。１つ又は複数の進化型変異体ドメインは、一部の実施形態では、非進化型コグネイト成分又はコグネイト成分の進化型変異体（例えば、平行若しくは連続様式で進化した可能性のあるもの）と組み合わせてもよい。
一部の実施形態では、標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はその断片若しくはドメインを突然変異誘発させるプロセスは、標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はその断片若しくはドメインを突然変異誘発させることを含む。複数の実施形態では、突然変異誘発は、例えば、本明細書に記載されるように、漸進的進化方法（例えば、ＰＡＣＥ）又は非漸進的進化方法（例えば、ＰＡＮＣＥ）を含む。一部の実施形態では、進化型Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はその断片若しくはドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、標的結合ドメイン若しくは鋳型結合ドメイン）は、標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はその断片若しくはドメインと比較して、そのアミノ酸配列に導入された１つ若しくは複数のアミノ酸変異を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列変異は、例えば、コーディング配列内のいずれか特定の位置のコドンの変化を招くｇｅｎｅ ｗｒｉｔｅｒをコードするヌクレオチド配列内の変化、１つ若しくは複数のアミノ酸の欠失（例えば、短縮タンパク質）、１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、又はそれらの任意の組合せの結果として、標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒのアミノ酸配列内に１つ若しくは複数の変異残基（例えば、保存的置換、非保存的置換、又はそれらの組合せ）を含み得る。進化型変異体Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの１つ若しくは複数の成分又はドメインに変異体（例えば、触媒ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、又はそれらの組合せに導入された変異体）を含み得る。
いくつかの態様では、本発明は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの進化型変異体を用いる、又はそれを含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、システム、キット、及び方法を提供し、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの進化型変異体、又はＰＡＣＥ若しくはＰＡＮＣＥにより生産若しくは生産可能なＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを使用する。複数の実施形態では、非進化型標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、本明細書に開示されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒである。
「ファージ支援型漸進的進化（ＰＡＣＥ）」という用語は、本明細書において、一般に、ウイルスベクターとしてファージを使用する漸進的進化を指す。ＰＡＣＥ技術の例は、例えば、以下：２００９年９月８日に出願され、２０１０年３月１１日に国際公開第２０１０／０２８３４７号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／米国特許出願第２００９／０５６１９４号明細書；２０１１年１２月２２日に出願され、２０１２年６月２８日に国際公開２０１２／０８８３８１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願第２０１１／０６６７４７号明細書；２０１５年５月５日に発行された米国特許第９，０２３，５９４号明細書；２０１７年９月２６日に発行された米国特許第９，７７１，５７４号明細書；２０１６年７月１９日に発行された米国特許第９，３９４，５３７号明細書；２０１５年１月２０日に出願され、２０１５年９月１１日に国際公開第２０１５／１３４１２１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許第２０１５／０１２０２２号明細書；２０１９年１月１５日に発行された米国特許第１０，１７９，９１１号明細書；並びに２０１６年４月１５日に出願され、２０１６年１０月２０日に国際公開第２０１６／１６８６３１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願第２０１６／０２７７９５号明細書に記載されており、これらは各々、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
「ファージ支援型非漸進的進化（ＰＡＮＣＥ）」という用語は、本明細書において、一般に、ウイルスベクターとしてファージを使用する非漸進的進化を指す。ＰＡＮＣＥ技術の例は、例えば、以下：Ｓｕｚｕｋｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｒｅｖｅａｌ ａｎ ｅｌｕｓｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｐｙｒｒｏｌｙｓｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１３（１２）：１２６１－１２６６（２０１７）に記載されており、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。手短には、ＰＡＮＣＥは、新鮮な宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞）全体に、進化させようとする目的の遺伝子を含有する、進化選択ファージ（ＳＰ）の連続フラスコ移入を用いる迅速なインビボ指向性進化のための技術である。ＳＰに含まれる遺伝子が漸進的に進化する間、宿主細胞内部の遺伝子を一定に保持することができる。ファージ増殖の後、感染した細胞のアリコートを用いて、宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含有する次のフラスコをトランスフェクトすることができる。このプロセスは、所望の表現型が、例えば、所望されるだけの数の移入について進化するまで、反復及び／又は継続することができる。
ＰＡＣＥ及びＰＡＮＣＥをＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒに適用する方法は、とりわけ、前述の参照文献を参照することにより、当業者により容易に理解されよう。例えば、ファージ粒子を用いて、例えば、宿主細胞の集団中に、ゲノム修飾タンパク質若しくはシステムの漸進的進化を指令するためのさらなる例示的な方法を適用して、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はその断片若しくはサブドメインの進化型変異体を作製することができる。こうした方法の非限定的な例は、例えば、以下：２００９年９月８日に出願され、２０１０年３月１１日に国際公開第２０１０／０２８３４７号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願第２００９／０５６１９４号明細書；２０１１年１２月２２日に出願され、２０１２年６月２８日に国際公開２０１２／０８８３８１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願第２０１１／０６６７４７号明細書；２０１５年５月５日に発行された米国特許第９，０２３，５９４号明細書；２０１７年９月２６日に発行された米国特許第９，７７１，５７４号明細書；２０１６年７月１９日に発行された米国特許第９，３９４，５３７号明細書；２０１５年１月２０日に出願され、２０１５年９月１１日に国際公開第２０１５／１３４１２１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願第２０１５／０１２０２２号明細書；２０１９年１月１５日に発行された米国特許第１０，１７９，９１１号明細書；２０１９年６月１４日に出願された国際出願、ＰＣＴ／米国特許出願第２０１９／３７２１６号明細書、２０１９年１月３１日に公開された国際公開第２０１９／０２３６８０号パンフレット、２０１６年４月１５日に出願され、２０１６年１０月２０日に国際公開第２０１６／１６８６３１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願第２０１６／０２７７９５号明細書、並びに２０１９年８月２３日に出願された国際出願、ＰＣＴ／米国特許出願第２０１９／４７９９６号明細書に記載されており、これらは各々、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの非限定的な例示的実施形態では、進化型変異体Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はその断片若しくはドメインの進化方法は、以下：（ａ）宿主細胞の集団を、目的の遺伝子を含むウイルスベクターの集団（出発Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はその断片若しくはドメイン）と接触させるステップを含み、ここで、（１）宿主細胞は、ウイルスベクターによる感染に適しており；（２）宿主細胞は、ウイルス粒子の産生に必要なウイルス遺伝子を発現し；（３）感染性ウイルス粒子の産生に必要な少なくとも１つのウイルス遺伝子の発現が、目的の遺伝子の機能に依存しており；及び／又は（４）ウイルスベクターが、宿主細胞でのタンパク質の発現を可能にし、且つ宿主細胞により複製されて、ウイルス粒子中にパッケージングされ得る。一部の実施形態では、本方法は、（ｂ）変異速度を高める（例えば、変異プラスミド、又は何らかのゲノム修飾－例えば、損傷ＤＮＡ校正ポリメラーゼ、ＳＯＳ遺伝子、例えば、ＵｍｕＣ、ＵｍｕＤ’、及び／又はＲｅｃＡ（それらの突然変異は、プラスミドと結合すると、誘導性プロモータの制御下となり得る）を輸送することにより、或いはそれらの組合せで）突然変異を含む宿主細胞を用いて、変異原と宿主細胞を接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、（ｃ）ウイルス複製及びウイルス粒子の産生を可能にする条件下で、宿主細胞の集団をインキュベートするステップを含み、その際、宿主細胞を宿主細胞集団から除去し、新鮮で、非感染の宿主細胞を宿主細胞の集団に導入し、このようにして、宿主細胞の集団を補給すると共に、宿主細胞の流れを形成する。一部の実施形態では、目的の遺伝子が突然変異を取得する条件下で細胞をインキュベートする。一部の実施形態では、本方法は、さらに（ｄ）宿主細胞の集団から、進化した遺伝子産物（例えば、進化型変異体Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はその断片若しくはドメイン）をコードするウイルスベクターの変異バージョンを単離するステップを含む。
当業者は、前述した枠組み内で使用可能な種々の特徴を理解するであろう。例えば、一部の実施形態では、ウイルスベクター又はファージは、繊維状ファージ、例えば、Ｍ１３ファージ、例えば、Ｍ１３選択ファージである。特定の実施形態では、感染性ウイルス粒子の産生に必要な遺伝子は、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩ（ｇＩＩＩ）である。複数の実施形態では、ファージは、機能性ｇＩＩＩを欠失している場合もあるが、その代わり、ｇＩ、ｇＩＩ、ｇＩＶ、ｇＶ、ｇＶＩ、ｇＶＩＩ、ｇＶＩＩＩ、ｇＩＸ、及びｇＸを含む。一部の実施形態では、感染性ＶＳＶ粒子の世代は、エンベロープタンパク質ＶＳＶ－Ｇを含む。様々な実施形態で、異なるレトロウイルスベクター、例えば、マウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）ベクター、又はレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベクターが使用され得る。複数の実施形態では、レトロウイルスベクターは、例えば、ウイルスのネイティブエンベロープタンパク質の代替物としてＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質を用いて、効率的にパッケージングすることができる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、好適な数のウイルス生活環、例えば、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１２５０、少なくとも１５００、少なくとも１７５０、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも７５００、少なくとも１００００、又はそれ以上の連続したウイルス生活環に応じてインキュベートされ、ここで、Ｍ１３ファージの例示的且つ非限定的な例は、ウイルス生活環毎に１０～２０分である。同様に、宿主細胞が、宿主細胞の集団中に滞留する時間（例えば、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１５０、又は約１８０分）を調整するために、条件を調節することができる。宿主細胞集団は、宿主細胞の密度、又は一部の実施形態では、流入中の宿主細胞密度、例えば、１０３細胞／ｍｌ、約１０４細胞／ｍｌ、約１０５細胞／ｍｌ、約５～１０５細胞／ｍｌ、約１０６細胞／ｍｌ、約５～１０６細胞／ｍｌ、約１０７細胞／ｍｌ、約５～１０７細胞／ｍｌ、約１０８細胞／ｍｌ、約５～１０８細胞／ｍｌ、約１０９細胞／ｍｌ、約５～１０９細胞／ｍｌ、約１０１０細胞／ｍｌ、又は約５～１０１０細胞／ｍｌにより、一部を制御することができる。
核酸
プロモータ
一部の実施形態では、１つ若しくは複数のプロモータ又はエンハンサーを、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードする核酸、又は例えば、異種目的配列の発現を制御する鋳型核酸と作動可能に連結する。特定の実施形態では、１つ若しくは複数のプロモータ又はエンハンサーは、細胞型若しくは組織特異的エレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータ又はエンハンサーは、同じであるか、或いは、異種目的配列の発現を天然で制御するプロモータ又はエンハンサーに由来する。例えば、オルニチントランスカルボミラーゼプロモータ及びエンハンサーを用いて、オルニチントランスカルボミラーゼ欠失を補正するために本発明により提供されるシステム若しくは方法におけるオルニチントランスカルボミラーゼ遺伝子の発現を制御することができる。一部の実施形態では、プロモータは、表３３のプロモータ又はその機能性断片若しくは変異体である。
市販されている例示的な組織特異的プロモータは、例えば、ＵＲＬ（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ－ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）に見出すことができる。一部の実施形態では、プロモータは、ネイティブプロモータ又は最小プロモータ（例えば、所与の遺伝子の５’領域からの単一断片から構成されるもの）である。一部の実施形態では、ネイティブプロモータは、コアプロモータとその天然の５’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、イントロンを含む。他の実施形態では、これらは、起源の異なるプロモータを組み合わせるか、又は同じ起源の最小プロモータと共に遠位エンハンサーをアセンブリングすることにより作製された複合プロモータを含む。一部の実施形態では、組織特異的発現制御配列は、国際公開第２０２００１４２０９号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の表２又は表３の配列の１つ若しくは複数を含む。
例示的な細胞又は組織特異的プロモータを以下の表に記載し、それらをコードする例示的な核酸は、当技術分野で公知であり、様々なリソース、例えば、ＲｅｆＳｅｑ．を含むＮＣＢＩデータベース、並びにＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｅｐｄ．ｅｐｆｌ．ｃｈ／／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）を用いて、容易に入手することができる。
Figure 2022542839000151
Figure 2022542839000152
Figure 2022542839000153
Figure 2022542839000154
Figure 2022542839000155
使用される宿主／ベクターシステムに応じて、構成性及び誘導性プロモータ、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネータなどを含め、いくつかの好適な転写及び翻訳制御エレメントのいずれを発現ベクターに使用してもよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４を参照されたい；尚、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒをコードする核酸又は鋳型核酸は、制御エレメント、例えば、プロモータなどの転写制御エレメントと作動可能に連結される。転写制御エレメントは、一部の実施形態では、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞；又は原核生物細胞（例えば、細菌若しくは古細菌細胞）のいずれかで機能性であり得る。一部の実施形態では、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、原核生物細胞及び真核生物細胞の両方でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする、複数の制御エレメントと作動可能に連結される。
例示の目的のために、空間限定プロモータの例として、限定されないが、ニューロン特異的プロモータ、脂肪細胞特異的プロモータ、心筋細胞特異的プロモータ、平滑筋特異的プロモータ、光受容体特異的プロモータなどが挙げられる。ニューロン特異的空間限定プロモータとして、限定されないが、以下のものが挙げられる：ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータ（例えば、ＥＭＢＬ ＨＳＥＮＯ２，Ｘ５１９５６を参照）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモータ、ニューロフィラメントプロモータ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＮＦＬ，Ｌ０４１４７を参照）；シナプシンプロモータ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＳＹＮＩＢ，Ｍ５５３０１を参照）；ｔｈｙ－１プロモータ（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：７－１９；及びＬｌｅｗｅｌｌｙｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１６（１０）：１１６１－１１６６を参照）；セロトニン受容体プロモータ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｓ６２２８３を参照）；チロシンヒドロキシラーゼプロモータ（ＴＨ）（例えば、Ｏｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６：４３７；Ｓａｓａｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１６：２７４；Ｂｏｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：９９８９；及びＫａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｅｕｒｏｎ ６：５８３－５９４を参照）；ＧｎＲＨプロモータ（例えば、Ｒａｄｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３４０２－３４０６を参照）；Ｌ７プロモータ（例えば、Ｏｂｅｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：２２３－２２６を参照）；ＤＮＭＴプロモータ（例えば、Ｂａｒｔｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３６４８－３６５２を参照）；エンケファリンプロモータ（例えば、Ｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３７９３－３８０５を参照）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモータ；Ｃａ２＋カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ－α（ＣａｍＫＩＩα）プロモータ（例えば、Ｍａｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３２５０；及びＣａｓａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓｉｓ ３１：３７を参照）；ＣＭＶエンハンサー／血小板由来成長因子－βプロモータ（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：５２－６０を参照）；など。
脂肪細胞特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：ａＰ２遺伝子プロモータ／エンハンサー、例えば、ヒトａＰ２遺伝子の－５．４ｋｂから＋２１ｂｐまでの領域（例えば、Ｔｏｚｚｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：１６０４；Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５９０；及びＰａｖｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：７９７を参照）；グルコーストランスポータ－４（ＧＬＵＴ４）プロモータ（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１４７２５を参照）；脂肪酸トランスロカーゼ（ＦＡＴ／ＣＤ３６）プロモータ（例えば、Ｋｕｒｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５：１４７６；及びＳａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１５７０３を参照）；ステアロイル－ＣｏＡデサチュラーゼ－１（ＳＣＤ１）プロモータ（Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２０６０３）；レプチンプロモータ（例えば、Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３９：１０１３；及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２６２：１８７を参照）；アジドネクチンプロモータ（例えば、Ｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３３１：４８４；及びＣｈａｋｒａｂａｒｔｉ （２０１０）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５１：２４０８を参照）；アジプシンプロモータ（例えば、Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７４９０を参照）；レジスチンプロモータ（例えば、Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７：１５２２を参照）；など。
心筋細胞特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下の遺伝子；ミオシン軽鎖－２、α－ミオシン重鎖、ＡＥ３、心臓トロポニンＣ、心臓アクチンなどに由来する制御配列が挙げられる。Ｆｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：５６０－５６６；Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５２：４９２－５０５；Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６：５８４－５９１；Ｐａｒｍａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１８７０－１８８５；Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２２：６０８－６１７；及びＳａｒｔｏｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４０４７－４０５１。
平滑筋細胞特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：ＳＭ２２αプロモータ（例えば、Ａｋｙｕｅｒｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：９８３；及び米国特許第７，１６９，８７４号明細書を参照）；スムーセリンプロモータ（例えば、国際公開第２００１／０１８０４８号パンフレットを参照）；α－平滑筋アクチンプロモータ；など。例えば、ＳＭ２２αプロモータの０．４ｋｂ領域（その内部に２つのＣＡｒＧエレメントが位置する）は、血管の平滑筋細胞特異的発現を媒介することが明らかにされている（例えば、Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７，２２６６－２２７８；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３２ ８４９－８５９；及びＭｏｅｓｓｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２，２４１５－２４２５を参照）。
光受容体特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：ロドプシンキナーゼプロモータ（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６）；βホスホジエステラーゼ遺伝子プロモータ（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９：１０１５）；網膜色素変性遺伝子プロモータ（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）前掲）；光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）前掲）；ＩＲＢＰ遺伝子プロモータ（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５５：２２５）；など。
非限定的な例示的細胞特異的プロモータ
当技術分野で公知の細胞特異的プロモータを用いて、例えば、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質の発現を指令することができる。非限定的な例示的哺乳動物細胞特異的プロモータは、特性決定されており、細胞特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスに使用されている。いくつかの非限定的な例示的哺乳動物細胞特異的プロモータは、米国特許第９８４５４８１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）の表１に列挙されている。
一部の実施形態では、細胞特異的プロモータは、植物で活性のプロモータである。多くの例示的な細胞特異的プロモータが当技術分野で知られている。例えば、米国特許第５，０９７，０２５号明細書；米国特許第５，７８３，３９３号明細書；米国特許第５，８８０，３３０号明細書；米国特許第５，９８１，７２７号明細書；米国特許第７，５５７，２６４号明細書；米国特許第６，２９１，６６６号明細書；米国特許第７，１３２，５２６号明細書；及び米国特許第７，３２３，６２２号明細書；並びに米国特許出願公開第２０１０／０２６９２２６号明細書；米国特許出願公開第２００７／０１８０５８０号明細書；米国特許出願公開第２００５／００３４１９２号明細書；及び米国特許出願公開第２００５／００８６７１２号明細書（これらは、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるベクターは、発現カセットを含む。「発現カセット」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の核酸分子の発現のために十分な核酸エレメントを含む核酸構築物を指す。典型的に、発現カセットは、プロモータ配列と作動可能に連結した本発明の核酸分子を含む。「作動可能に連結した」という用語は、一方の機能が他方の影響を受けるような、単一核酸断片上の２つ以上の核酸断片の会合を指す。例えば、プロモータは、それが、コーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、コーディング配列と作動可能に連結している（例えば、コーディング配列は、プロモータの転写制御下にある）。コーディング配列は、センス又はアンチセンス配向で調節配列と作動可能に連結することができる。特定の実施形態では、プロモータは、異種プロモータである。「異種プロモータ」という用語は、本明細書で使用される場合、天然で所与のコーディング配列と作動可能に連結されていないことがわかっているプロモータを指す。特定の実施形態では、発現カセットは、別のエレメント、例えば、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化部位、ウッドチャック（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ）応答エレメント（ＷＲＥ）、及び／又はコーディング配列の発現レベルに影響を及ぼすことがわかっている他のエレメントを含み得る。「プロモータ」は、典型的に、コーディング配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御する。特定の実施形態では、プロモータ配列は、近位及びより遠位の上流エレメントを含み、さらにエンハンサーエレメントも含み得る。「エンハンサー」は、典型的に、プロモータ活性を刺激することができ、プロモータの天然のエレメントであってもよいし、又はプロモータのレベル若しくは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであってもよい。特定の実施形態では、プロモータは、その全体がネイティブ遺伝子に由来する。特定の実施形態では、プロモータは、天然に存在する異なるプロモータ由来の様々なエレメントから構成される。特定の実施形態では、プロモータは、合成ヌクレオチド配列を含む。当業者であれば、種々のプロモータが、様々な組織若しくは細胞型において、又は様々な発生段階で、或いは様々な環境条件又は薬剤若しくは転写補因子の存在若しくは非存在に応答して、遺伝子の発現を指令し得ることは理解されよう。ユビキタス、細胞型特異的、組織特異的、発生段階特異的、及び条件的プロモータ、例えば、薬剤応答性プロモータ（例えば、テトラサイクリン応答性プロモータ）は、当業者には周知である。プロモータの例として、限定されないが、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＫＧ）プロモータ、ＣＡＧ（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモータ（ＣＢＡ）及びウサギβグロビンイントロンの複合物）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、シナプシン若しくはＮｅｕＮプロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルスＬＴＲプロモータ；アデノウイルス主要後期プロモータ（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶ）プロモータ、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）プロモータ、例えば、ＣＭＶ最初期プロモータ領域（ＣＭＶＩＥ）、ＳＦＦＶプロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）プロモータ、合成プロモータ、ハイブリダイゼーションプロモータなどが挙げられる。他のプロモータは、ヒト由来又はマウスをはじめとする他の種由来のものであり得る。一般的なプロモータとしては、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）の長い末端反復、［β］－アクチン、ラットインスリンプロモータ、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモータ、ヒトα－１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモータ、トランスサイレチンプロモータ、ＴＢＧプロモータ及び他の肝臓特異的プロモータ、デスミンプロモータ及び類似の筋肉特異的プロモータ、ＥＦ１－α－プロモータ、ＣＡＧプロモータ及び他の構成性プロモータ、多組織特異性を備えるハイブリッドプロモータ、シナプシン及びグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼプロモータのようなニューロン特異的プロモータが挙げられ、これらは全て、当業者には周知であり、容易に入手可能であり、目的のコーディング配列の高レベルの発現を達成するために使用することができる。加えて、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子由来の配列も本発明において有用であろう。こうしたプロモータ配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されている。さらに別の例示的なプロモータ配列は、例えば、国際公開第２０１８２１３７８６Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
一部の実施形態では、例えば、肝臓での発現を駆動するために、アポリポタンパク質Ｅエンハンサー（ＡｐｏＥ）又はその機能性断片を使用する。一部の実施形態では、ＡｐｏＥエンハンサー又はその機能性断片の２コピーを使用する。一部の実施形態では、ＡｐｏＥエンハンサー又はその機能性断片をプロモータ、例えば、ヒトα－１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモータと組み合わせて使用する。
一部の実施形態では、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能力を付与する。いくつかのケースでは、組織特異的調節配列は、組織特異的に転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。様々な組織特異的調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサーなど）が当技術分野で公知である。例示的な組織特異的調節配列として、限定されないが、以下の組織特異的プロモータが挙げられる：肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモータ、インスリンプロモータ、グルカゴンプロモータ、ソマトスタチンプロモータ、膵ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモータ、シナプシン－１（Ｓｙｎ）プロモータ、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ、哺乳動物デスミン（ＤＥＳ）プロモータ、α－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）プロモータ、又は心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモータ。他の例示的なプロモータとしては、β－アクチンプロモータ、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモータ、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９（１９９６）；α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモータ、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４（１９９６））、骨オステオカルシンプロモータ（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５－９６（１９９７））；骨シアロタンパク質プロモータ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４－６４（１９９６））、ＣＤ２プロモータ（Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３－８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖プロモータ；Ｔ細胞受容体α－鎖プロモータ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータなどのニューロンプロモータ（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５（１９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモータ（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５（１９９１））、並びにニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモータ（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４（１９９５））などが挙げられる。別の例示的なプロモータ配列は、例えば、米国特許第１０３００１４６号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。一部の実施形態では、組織特異的調節エレメント、例えば、組織特異的プロモータは、例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑ若しくはタンパク質発現データ、又はそれらの組合せにより測定して、所与の組織中で高度に発現される遺伝子と作動可能に連結していることがわかっているものから選択される。発現による組織特異性を分析する方法は、Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １３（２）：３９７－４０６ （２０１４）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、マルチシストロン性発現構築物である。マルチシストロン性発現構築物として、例えば、第１発現カセット（例えば、第１プロモータ及び第１コーディング核酸配列を含む）と、第２発現カセット（例えば、第２プロモータ及び第２コーディング核酸配列を含む）を有する構築物が挙げられる。こうしたマルチシストロン性発現構築物は、いくつかの事例では、ポリペプチド、例えば、ｇｅｎｅ ｗｒｉｔｅｒ及びｇｅｎｅ ｗｒｉｔｅｒ鋳型と一緒に、ヘアピンＲＮＡなどの非翻訳遺伝子産物の送達に、特に有用となり得る。一部の実施形態では、マルチシストロン性発現構築物は、例えば、プロモータ干渉、又は不適合性核酸エレメントの近接した存在のために、含まれるトランスジーンの１つ若しくは複数の発現レベル低下を呈示し得る。マルチシストロン性発現構築物がウイルスベクターの一部である場合、自己相補性核酸配列の存在は、いくつかの事例において、ウイルスの増殖又はパッケージングに必要な構造の形成を妨害し得る。
一部の実施形態では、配列は、ヘアピンを有するＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、ヘアピンＲＮＡは、ガイドＲＮＡ、鋳型ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉｃｒｏＲＮＡである。一部の実施形態では、第１プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモータである。一部の実施形態では、第１プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータである。一部の実施形態では、第２プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータである。一部の実施形態では、第２プロモータは、Ｕ６又はＨ１プロモータである。一部の実施形態では、核酸構築物は、ＡＡＶ構築物Ｂ１又はＢ２を含む。
特定の理論に束縛されることは意図しないが、マルチシストロン性発現構築物は、ただ１つのシストロンを含む発現系と比較して、最適な発現レベルを達成しないと考えられる。２つ以上のプロモータエレメントを含むマルチシストロン性発現構築物を用いて達成される発現レベル低下について示される原因の１つは、プロモータ干渉の現象である（例えば、Ｃｕｒｔｉｎ Ｊ Ａ，Ｄａｎｅ Ａ Ｐ，Ｓｗａｎｓｏｎ Ａ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｉ Ｅ，Ｇｉｎｎ Ｓ Ｌ．Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ ａ ｌａｔｅ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ Ｍａｒｃｈ；１５（５）：３８４－９０；及びＭａｒｔｉｎ－Ｄｕｑｕｅ Ｐ，Ｊｅｚｚａｒｄ Ｓ，Ｋａｆｔａｎｓｉｓ Ｌ，Ｖａｓｓａｕｘ Ｇ．Ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００４ Ｏｃｔｏｂｅｒ；１５（１０）：９９５－１００２を参照されたい；尚、いずれの参照文献も、プロモータ干渉現象の開示について、参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、プロモータ干渉の問題は、例えば、内部リボソーム進入部位により隔てられる複数のコーディング核酸配列の転写を駆動するただ１つのプロモータを含むマルチシストロン性発現構築物を生成することにより、又は転写インスレータエレメントを備えるそれ自身のプロモータを含むシストロンを分離することによって解消することができる。一部の実施形態では、単一プロモータにより駆動される多シストロンの発現は、シストロンの不均一な発現レベルを招き得る。一部の実施形態では、プロモータを効率的に分離することはできず、分離エレメントは、一部の遺伝子導入ベクター、例えば、一部のレトロウイルスベクターと適合性ではない場合がある。
ｍｉｃｒｏＲＮＡ
ｍｉＲＮＡ及び他の低分子干渉核酸は、一般に、標的ＲＮＡ転写物切断／分解又は標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制によって、遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、いくつかの事例において、典型的に、最終的な１９～２５の非翻訳ＲＮＡ産物として天然に発現され得る。ｍｉＲＮＡは、一般に、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を介してその活性を呈示する。これらの内在性発現ｍｉＲＮＡは、ヘアピン前駆体を形成し得るが、これらは、後に、ｍｉＲＮＡデュープレックス、さらには成熟一本鎖ｍｉＲＮＡ分子にプロセシングされる。この成熟ｍｉＲＮＡは、一般に、多タンパク質複合体、ｍｉＲＩＳＣを誘導し、これは、成熟ｍｉＲＮＡに対するその相補性に基づいて標的ｍＲＮＡの標的３’ＵＴＲ領域を識別する。有用なトランスジーン産物として、例えば、連結ポリペプチドの発現を調節するｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ結合部位を挙げることができる。ｍｉＲＮＡ遺伝子；これら遺伝子の産物及びその相同体の非限定的なリストは、トランスジーンとして、又は低分子干渉核酸（例えば、ｍｉＲＮＡスポンジ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の標的として、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０３００１４６号明細書、２２：２５－２５：４８に列挙されるものなどの方法において有用である。一部の実施形態では、前述したｍｉＲＮＡの１つ又は複数に対する１つ若しくは複数の結合部位は、トランスジーン、例えば、ｒＡＡＶベクターにより送達されるトランスジーンに組み込まれて、例えば、そのトランスジーンを保有する動物の１つ若しくは複数の組織中のトランスジーンの発現を阻害する。一部の実施形態では、組織特異的にトランスジーンの発現を制御するように、結合部位を選択してもよい。例えば、肝臓特異適ｍｉＲ－１２２に対する結合部位をトランスジーンに組み込んで、肝臓中の当該トランスジーンの発現を阻害することができる。別の例示的なｍｉＲＮＡ配列は、例えば、米国特許第１０３００１４６号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ｍｉＲ阻害剤又はｍｉＲＮＡ阻害剤は、概して、ｍｉＲＮＡ発現及び／又はプロセシングを阻止する薬剤である。こうした薬剤の例として、限定されないが、ｍｉｃｒｏＲＮＡアンタゴニスト、ｍｉｃｒｏＲＮＡ特異的アンチセンス、ｍｉｃｒｏＲＮＡスポンジ、及びｍｉｃｒｏＲＮＡオリゴヌクレオチド（二本鎖、ヘアピン、短いオリゴヌクレオチド）が挙げられ、これらは、Ｄｒｏｓｈａ複合体とのｍｉＲＮＡ相互作用を阻害する。ｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤、例えば、ｍｉＲＮＡスポンジは、トランスジーンから細胞に発現させることができる（例えば、Ｅｂｅｒｔ，Ｍ．Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｅｐｕｂ Ａｕｇ．１２，２００７に記載の通り；尚、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡスポンジ、又は他のｍｉＲ阻害剤は、ＡＡＶと一緒に使用される。ｍｉｃｒｏＲＮＡスポンジは、一般に、相補的ヘプタマーシード配列を介して、ｍｉＲＮＡを特異的に阻害する。一部の実施形態では、単一のスポンジ配列を用いて、ｍｉＲＮＡのファミリー全体をサイレンシングすることができる。細胞中でｍｉＲＮＡ機能をサイレンシングする（ｍｉＲＮＡ標的の抑制解除）他の方法は、当業者には明らかであろう。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表４に列挙される配列を含む。また、国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットからの例示的なｍｉＲＮＡの一覧も参照により本明細書に組み込まれる。
５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ
特定の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（例えば、本明細書に記載される）をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸は、５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲを含む。複数の実施形態では、タンパク質発現のための５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド若しくは異種目的配列のためのｍＲＮＡ（又はＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、最適化された発現配列を含む。一部の実施形態では、例えば、Ｒｉｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６８（６）：Ｐ１１１４－１１２５（２０１７）（その配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、５’ＵＴＲは、ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号１８６７）を含み、及び／又は３’ＵＴＲは、ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡ（配列番号１８６８）を含む。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのオープンリーディングフレーム、例えば、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡ（若しくはｍＲＮＡをコードするＤＮＡ）のＯＲＦ又は異種目的配列のｍＲＮＡ（若しくはｍＲＮＡをコードするＤＮＡ）の１つ若しくは複数のＯＲＦは、その発現を増強する、５’及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）によりフランキングされている。一部の実施形態では、システムのｍＲＮＡ成分（又はＤＮＡ成分から産生された転写物）の５’ＵＴＲは、配列５’－ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ－３’（配列番号１８６９）を含む。一部の実施形態では、システムのｍＲＮＡ成分（又はＤＮＡ成分から産生された転写物）の３’ＵＴＲは、配列５’－ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡ－３’（配列番号１８７０）を含む。５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲのこの組合せは、Ｒｉｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６８（６）：Ｐ１１１４－１１２５（２０１７）（その教示内容及び配列は、参照により本明細書に組み込まれる）により、作動可能に連結したＯＲＦの所望の発現をもたらすことが明らかにされている。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムは、転写物をコードするＤＮＡを含み、この場合、上記ＤＮＡは、上に挙げた配列中のＵをＴで置換した、対応する５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、システムのＲＮＡ成分を生産するために用いられるＤＮＡベクターは、インビトロ転写を開始するために、５’ＵＴＲの上流にプロモータ、例えば、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６プロモータを含む。上記の５’ＵＴＲは、ＧＧＧで開始するが、これは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写を最適化するのに好適な開始である。代替５’ＵＴＲに適合するように、転写レベルを調整し、且つ転写開始部位ヌクレオチドを改変するために、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐａｃ Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ ４３３－４４３（２０１０）の教示には、これらの特性の両方を満たすＴ７プロモータ変異体、及びそれを見出す方法が記載されている。
ウイルスベクター及びその成分
ウイルスは、本明細書に記載の関連酵素又はドメインの供給源、例えば、本発明で使用されるリコンビナーゼ及びＤＮＡ結合ドメイン、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、λインテグラーゼ、又はＡＡＶＲｅｐタンパク質由来のＤＮＡ結合ドメインの供給源以外に、本明細書に記載のシステムのための送達ビヒクルの有用な供給源である。一部の酵素は、複数の活性を有し得る。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ送達システム又はその成分の供給源として使用されるウイルスは、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ Ｒｅｖ ３５（３）：２３５－２４１（１９７１）により記載される一群から選択され得る。
一部の実施形態では、ウイルスは、Ｉ群ウイルスから選択され、例えば、ＤＮＡウイルスであり、ｄｓＤＮＡをビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、Ｉ群ウイルスは、例えば、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）から選択される。
一部の実施形態では、ウイルスは、ＩＩ群ウイルスから選択され、例えば、ＤＮＡウイルスであり、ｓｓＤＮＡをビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＩＩ群ウイルスは、例えば、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）は、ディペンドパルボウイルス属（ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、例えば、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）（ＡＡＶ）である。
一部の実施形態では、ウイルスは、ＩＩＩ群ウイルスから選択され、例えば、ＲＮＡウイルスであり、ｄｓＲＮＡをビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＩＩＩ群ウイルスは、例えば、レオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるｄｓＲＮＡの一方又は両方の鎖は、宿主細胞への形質導入時にｍＲＮＡとして直接役立ち得るコーディング分子であり、例えば、介在核酸複製又は重合ステップを一切必要とせずに、宿主細胞への形質導入時に、タンパク質に直接翻訳され得る。
一部の実施形態では、ウイルスは、ＩＶ群ウイルスから選択され、例えば、ＲＮＡウイルスであり、ｓｓＲＮＡ（＋）をビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＩＶ群ウイルスは、例えば、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、トガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるｓｓＲＮＡ（＋）は、宿主細胞への形質導入時にｍＲＮＡとして直接役立ち得るコーディング分子であり、例えば、介在核酸複製又は重合ステップを一切必要とせずに、宿主細胞への形質導入時に、タンパク質に直接翻訳され得る。
一部の実施形態では、ウイルスは、Ｖ群ウイルスから選択され、例えば、ＲＮＡウイルスであり、ｓｓＲＮＡ（－）をビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＩＶ群ウイルスは、例えば、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ）、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、ｓｓＲＮＡ（－）ゲノムを有するＲＮＡウイルスは、ビリオン内部に、ウイルスゲノムと一緒に宿主細胞に形質導入される酵素（例えば、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）も担持しており、これは、ｓｓＲＮＡ（－）を、宿主によって直接翻訳され得るｓｓＲＮＡ（＋）にコピーすることができる。
一部の実施形態では、ウイルスは、ＶＩ群ウイルスから選択され、例えば、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）であり、ｓｓＲＮＡ（＋）をビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＶＩ群ウイルスは、例えば、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）は、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＢＩＶである。一部の実施形態では、レトロウイルスは、スプマウイルス（ｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）、例えば、フォーミーウイルス（ｆｏａｍｙ ｖｉｒｕｓ）、例えば、ＨＦＶ、ＳＦＶ、ＢＦＶである。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるｓｓＲＮＡ（＋）は、宿主細胞への形質導入時にｍＲＮＡとして直接役立ち得るコーディング分子であり、例えば、介在核酸複製又は重合ステップを一切必要とせずに、宿主細胞への形質導入時に、タンパク質に直接翻訳され得る。一部の実施形態では、ｓｓＲＮＡ（＋）は、まず逆転写され、コピーされて、ｄｓＤＮＡゲノム中間体を生成し、そこからｍＲＮＡが宿主に転写され得る。一部の実施形態では、ｓｓＲＮＡ（＋）ゲノムを有するＲＮＡウイルスは、ビリオン内部に、ウイルスゲノムと一緒に宿主細胞に形質導入される酵素（例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）も担持しており、これは、ｓｓＲＮＡ（＋）をｄｓＤＮＡにコピーすることができ、このｄｓＤＮＡは、宿主によりｍＲＮＡに転写されて、翻訳され得る。
一部の実施形態では、ウイルスは、ＶＩＩ群ウイルスから選択され、例えば、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）であり、ｄｓＲＮＡをビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＶＩＩ群ウイルスは、例えば、ヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるｄｓＲＮＡの一方又は両方の鎖は、宿主細胞への形質導入時にｍＲＮＡとして直接役立ち得るコーディング分子であり、例えば、介在核酸複製又は重合ステップを一切必要とせずに、宿主細胞への形質導入時に、タンパク質に直接翻訳され得る。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるｄｓＲＮＡの一方又は両方の鎖は、まず逆転写され、コピーされて、ｄｓＤＮＡゲノム中間体を生成し、そこからｍＲＮＡが宿主に転写され得る。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡゲノムを有するＲＮＡウイルスは、ビリオン内部に、ウイルスゲノムと一緒に宿主細胞に形質導入される酵素（例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）も担持しており、これは、ｄｓＲＮＡをｄｓＤＮＡにコピーすることができ、このｄｓＤＮＡは、宿主によりｍＲＮＡに転写されて、翻訳され得る。
一部の実施形態では、本発明で核酸を送達するために用いられるビリオンはまた、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇのプロセスに関与する酵素を担持してもよい。例えば、ビリオンは、核酸と一緒に宿主細胞に送達されるリコンビナーゼドメインを含有してもよい。一部の実施形態では、鋳型核酸は、ビリオン内のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドを随伴してもよく、それにより、両者が、ウイルス粒子からの核酸の形質導入時に標的細胞に同時送達される。一部の実施形態では、ビリオン内の核酸は、ＤＮＡ、例えば、線状ｓｓＤＮＡ、線状ｄｓＤＮＡ、環状ｓｓＤＮＡ、環状ｄｓＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、ｄｂＤＮＡ、ｃｅＤＮＡを含み得る。一部の実施形態では、ビリオン内の核酸は、ＲＮＡ、例えば、線状ｓｓＲＮＡ、線状ｄｓＲＮＡ、環状ｓｓＲＮＡ、環状ｄｓＲＮＡを含み得る。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、宿主細胞への形質導入時に環状化してもよく、例えば、線状ｓｓＲＮＡ分子は、共有結合を経て、環状ｓｓＲＮＡを形成することができ、線状ｄｓＲＮＡ分子は、共有結合を経て、環状ｄｓＲＮＡ又は１つ若しくは複数の環状ｓｓＲＮＡを形成し得る。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、宿主細胞内でのローリングサークル複製により複製し得る。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、単一核酸分子を含んでもよく、例えば、非セグメント化ゲノムを含み得る。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、２つ以上の核酸分子を含んでもよく、例えば、セグメント化ゲノムを含み得る。一部の実施形態では、ビリオン内の核酸は１つ若しくは複数のタンパク質を随伴してもよい。一部の実施形態では、ビリオン内の１つ又は複数のタンパク質を、形質導入時に宿主細胞に送達することができる。一部の実施形態では、標的核酸に対するビリオンパッケージングシグナルの付加により、天然ウイルスを核酸の送達のために改変してもよく、その場合、宿主細胞を用いて、パッケージングシグナルを含有する標的核酸をパッケージングする。
一部の実施形態では、送達ビヒクルとして用いられるビリオンは、片利ヒトウイルスを含み得る。一部の実施形態では、送達ビヒクルとして用いられるビリオンは、アネロウイルス（ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）を含んでもよく、その使用は、国際公開第２０１８２３２０１７Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
組成物及びシステムの作製
当業者には理解されるように、核酸構築物及びタンパク質又はポリペプチド（例えば、本明細書に記載のシステム、構築物及びポリペプチド）を設計及び構築する方法は、当技術分野において常用的である。一般に、組換え法が使用され得る。概略については、Ｓｍａｌｅｓ ＆ Ｊａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）；及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｓｉｎｄｅｌａｒ ＆ Ｍｅｉｂｏｈｍ（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）を参照されたい。核酸組成物を設計、調製、評価、精製及び操作する方法は、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。
本明細書に記載の医薬用タンパク質又はポリペプチドを生産する例示的な方法は、哺乳動物細胞での発現を含むが、適切なプロモータの制御下の昆虫細胞、酵母、細菌、又は他の細胞を用いて、組換えタンパク質を生産することもできる。哺乳動物発現ベクターは、非転写因子、例えば、複製起点、好適なプロモータ、並びに他の５’若しくは３’フランキング非転写配列、及び５’若しくは３’非転写配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、並びに終結配列を含み得る。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０オリジン、アーリープロモータ、スプライス、及びポリアデニル化部位を使用して、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝因子を提供することができる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主での使用に適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。
様々な哺乳動物細胞培養系を使用して、組換えタンパク質を発現させ、製造することができる。哺乳動物発現系の例として、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬＡ、及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。タンパク質治療薬生産のための宿主培養方法は、Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ（Ｅｄｓ．），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１４）に記載されている。本明細書に記載の組成物は、組換えタンパク質をコードするベクター、例えば、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを含み得る。一部の実施形態では、ベクター、例えば、ウイルスベクターは、組換えタンパク質をコードする核酸を含み得る。
タンパク質治療薬の精製については、Ｆｒａｎｋｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＣｕｔｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている。
ＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ又はｍＲＮＡ、例えば、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒをコードするｍＲＮＡ）も本明細書に記載されるように生産することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡセグメントは、化学合成により生産することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡセグメントは、核酸鋳型のインビトロ転写により、例えば、ＤＮＡ鋳型のコグネイトプロモータに作用して、ＲＮＡ転写物を産生するＲＮＡポリメラーゼを用意することにより、生産することができる。一部の実施形態では、例えば、コグネイトプロモータ、例えば、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６プロモータの転写制御下で、例えば、ＲＮＡセグメントをコードする、ＤＮＡ、例えば、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、線状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、線状ＤＮＡアンプリコン、線状化プラスミドＤＮＡに作用する、例えば、Ｔ７、Ｔ３、若しくはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、又はその誘導体を用いて、インビトロ転写を実施する。一部の実施形態では、化学合成及びインビトロ転写の組合せを用いて、アセンブリーのためのＲＮＡセグメントを作製する。複数の実施形態では、化学合成によりｇＲＮＡを生産し、インビトロ転写により異種目的配列セグメントを生産する。特定の理論に束縛されることは意図しないが、インビトロ転写は、より長いＲＮＡ分子の生産に、より適していると考えられる。一部の実施形態では、より高い割合の完全長転写物を得るために、インビトロ転写のための反応温度を低下させ、例えば、３７℃未満（例えば、０～１０℃、１０～２０℃、又は２０～３０℃）にしてもよい（Ｋｒｉｅｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：６４６３（１９９０）を参照、尚、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、長い転写物の合成改善のためのプロトコルを使用して、長いＲＮＡ、例えば、５ｋｂ超のＲＮＡを合成し、例えば、Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓを使用して、２７ｋｂ転写物をインビトロで作製することができる（Ｔｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８２（６）：１２７３－１２８１（２００１））。一部の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ分子に対する修飾は、ＲＮＡセグメントの合成中に組み込んでもよく（例えば、修飾ヌクレオチドの含有又は別の結合化学によって）、その後、化学的若しくは酵素的プロセシングによるＲＮＡセグメントの合成、続いて、１つ若しくは複数のＲＮＡセグメントのアセンブリー、又はそれらの組合せを実施する。
一部の実施形態では、線状化ＤＮＡ鋳型からのＴ７ポリメラーゼ媒介性ＤＮＡ依存性ＲＮＡ転写を用いて、システムのｍＲＮＡ（例えば、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）をインビトロで合成するが、この場合、ＵＴＰは、任意選択で１－メチルプソイドＵＴＰで置換されている。一部の実施形態では、転写物は、５’及び３’ＵＴＲ、例えば、ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号１８７１）及びＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡ（配列番号１８７２）、又はその機能性断片若しくは変異体を組み込み、任意選択で、ポリＡテイルを含み、これは、ＤＮＡ鋳型においてコードされるか、又は転写後、酵素により付加され得る。一部の実施形態では、ドナーメチル基、例えば、Ｓ－アデノシルメチオニンを、キャップ０構造を有するメチル化キャップＲＮＡに付加して、ｍＲＮＡ翻訳効率を高めるキャップ１構造を取得する（Ｒｉｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６８（６）：Ｐ１１１４－１１２５（２０１７））。
一部の実施形態では、Ｔ７プロモータからの転写物は、ＧＧＧモチーフで開始する。一部の実施形態では、Ｔ７プロモータからの転写物は、ＧＧＧモチーフで開始しない。転写開始地点のＧＧＧモチーフは、優れた収率を提供するにもかかわらず、鋳型鎖中の＋１から＋３の３つのＣ残基に対する転写物のずれ（ｓｌｉｐｐａｇｅ）によって、ポリ（Ｇ）産物のラダーを合成するＴ７ ＲＮＡＰをもたらす（Ｉｍｂｕｒｇｉｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（３４）：１０４１９－１０４３０（２０００）。別の５’ＵＴＲに合わせるための、転写レベルの調整及び転写開始部位ヌクレオチドの改変について、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐａｃ Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ ４３３－４４３（２０１０）の教示には、これらの特性の両方を満たす、Ｔ７プロモータ変異体、及びその発見方法が記載されている。
一部の実施形態では、共有結合によりＲＮＡセグメントを互いに結合してもよい。一部の実施形態では、ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いて、２つ以上のＲＮＡセグメントを互いに結合させることができる。ＲＮＡリガーゼなどの試薬を使用する場合、５’末端は、典型的に、３’末端に連結される。一部の実施形態では、２つのセグメントが結合されると、２つの線状構築物が形成される可能性がある（即ち、（１）５’－セグメント１－セグメント２－３’及び（２）５’－セグメント２－セグメント１－３’）。一部の実施形態では、分子内環状化も起こり得る。これらの課題のいずれも、例えば、ＲＮＡリガーゼが、その末端を別の末端に連結することができないように、一方の５’末端又は一方の３’末端を遮断することにより対処することができる。複数の実施形態では、５’－セグメント１－セグメント２－３’の構築物が所望される場合、遮断基をセグメント１の５’末端又はセグメント２の３’末端に配置することによって、正しい線状連結産物のみの形成を達成し、且つ／又は分子内環状化を阻止することができる。２つの核酸（例えば、ＲＮＡ）セグメントの共有結合のための組成物及び方法は、例えば、米国特許出願第２０１６０１０２３２２Ａ１号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に、２つの一本鎖ＲＮＡセグメントを互いに指向性連結させるためのＲＮＡリガーゼの使用を含む方法と一緒に、開示されている。
例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼと一緒に使用され得る末端ブロッカーの一例は、ジデオキシターミネータである。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼは、典型的に、５’－リン酸及び３’－ヒドロキシル末端の間のホスホジエステル結合のＡＴＰ依存性連結を触媒する。一部の実施形態では、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いる場合、好適な末端が、連結される末端に存在しなければならない。末端上のＴ４ ＲＮＡリガーゼを遮断するための１つの手段は、正しい末端フォーマットを取得できないようにすることを含む。一般に、５－ヒドロキシル又は３’－リン酸を含むＲＮＡセグメントの末端は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼの基質として作用しないであろう。
ＲＮＡセグメントを結合するために使用され得る別の例示的な方法は、クリック化学によるものである（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，３７５，２３４号明細書及び同第７，０７０，９４１号明細書、並びに米国特許出願公開第２０１３／００４６０８４号明細書に記載される通り）。例えば、１つの例示的なクリック化学反応は、アルキン基とアジド基の間のものである（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１６０１０２３２２Ａ１号明細書の図１１を参照）。ＲＮＡセグメントを連結するために、任意のクリック反応を使用することが可能である（例えば、Ｃｕ－アジド－アルキン、歪み促進型アジド－アルキン、シュタウディンガーライゲーション、テトラジン連結、光誘導型テトラゾール－アルケン、チオール－エン、ＮＨＳエステル、エポキシド、イソシアネート、及びアルデヒド－アミノオキシ）。一部の実施形態では、クリック化学反応を用いるＲＮＡ分子の連結は、クリック化学反応が、高速で、モジュール式で、効率的であり、多くの場合、有毒な廃棄物を生成せず、溶媒として水を用いて実施することができ、且つ／又は立体特異的にセットアップすることができることから、有利である。
一部の実施形態では、アジド－アルキンヒュスゲン環化付加反応を用いて、ＲＮＡセグメントを結合してもよく、これは、典型的に、アジドと末端若しくは内部アルキンとの間の１，３－双極子環化付加反応であり、ＲＮＡセグメントの連結のための１，２，３－トリアゾールを付与する。特定の理論に束縛されることは意図しないが、この連結方法の１つの利点は、この反応が、必要なＣｕ（Ｉ）イオンの付加により開始され得ることであろう。ＲＮＡセグメントを結合することができる他の例示的な機構として、限定はしないが、ハロゲン（Ｆ－、Ｂｒ－、Ｉ－）／アルキン付加反応、カルボニル／スルフヒドリル／マレイミド、及びカルボキシル／アミン連結の使用が挙げられる。例えば、一方のＲＮＡ分子を３’にてチオールで修飾し（ジスルフィドアミダイト及びユニバーサル支持体又はジスルフィド修飾支持体を用いて）、他方のＲＮＡ分子を５’にてアクリダイトで修飾し（アクリル酸ホスホロアミダイトを用いて）、次に２つのＲＮＡ分子をマイケル付加反応により結合することができる。この戦略はまた、複数のＲＮＡ分子を段階的に結合するのにも適用することができる。また、３つ以上（例えば、３、４、５、６つなど）のＲＮＡ分子を互いに連結するための方法も提供される。特定の理論に束縛されることは意図しないが、これは、所望のＲＮＡ分子が、約４０ヌクレオチドより長く、例えば、米国特許出願第２０１６０１０２３２２Ａ１号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に指摘されているように、化学合成の効率が低下するような場合に、有意となり得る。
例示として、ｔｒａｃｒＲＮＡは、典型的に、約８０ヌクレオチド長である。こうしたＲＮＡ分子は、例えば、インビトロ転写又は化学合成などのプロセスにより生成され得る。一部の実施形態では、化学合成を用いて、このようなＲＮＡ分子を生成する場合、それらは、単一の合成生成物として生成されるか、又は２つ以上のＲＮＡセグメントを互いに連結することにより生成され得る。複数の実施形態では、３つ以上のＲＮＡセグメントを互いに連結する場合、異なる方法を用いて、個別のセグメントを互いに連結することができる。また、ＲＮＡセグメントを１つのポット（例えば、容器、ベッセル、ウェル、チューブ、プレート、若しくは他の入れ物）内で、全て同時に、又は異なる時点で１つのポット内で、又は異なる時点で異なるポット内で、互いに連結してもよい。非限定的な例において、ＲＮＡセグメント１、２及び３を番号順にアセンブリングするために、まず初めにＲＮＡセグメント１及び２を、５’から３’に、互いに連結してもよい。次に、反応生成物を反応混合物成分について（例えば、クロマトグラフィーにより）精製した後、３’末端とＲＮＡセグメント３の５’末端との結合のために、第２ポット内に配置することができる。続いて、最終反応生成物をＲＮＡセグメント３の５’末端に連結することができる。
別の非限定的な例では、ＲＮＡセグメント１（約３０ヌクレオチド）は、ｃｒＲＮＡとヘアピン領域１の１部分から成る標的遺伝子座認識配列である。ＲＮＡセグメント２（約３５ヌクレオチド）は、ヘアピン領域１の残り部分と、ヘアピン領域１及びヘアピン領域２の間の線状ｔｒａｃｒＲＮＡの一部を含む。ＲＮＡセグメント３（約３５ヌクレオチド）は、ヘアピン領域１及びヘアピン領域２の間の線状ｔｒａｃｒＲＮＡの残り部分と、ヘアピン領域２の全部を含む。この例では、ＲＮＡセグメント２及び３は、クリック化学を用いて、５’から３’に連結される。さらに、反応生成物の５’及び３’末端はいずれもリン酸化される。次に、３’末端ヒドロキシル基を有するＲＮＡセグメント１、及びＴ４ ＲＮＡリガーゼと反応生成物を接触させて、ガイドＲＮＡ分子を生成する。
本発明の方法に従ってＲＮＡセグメントを結合するために、いくつかの別の連結化学を用いてもよい。そうした化学のいくつかは、米国特許出願第２０１６０１０２３２２Ａ１号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の表６に表示されている。
ベクター
本開示は、一部に、核酸、例えば、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、本明細書に記載の鋳型核酸、又はその両方を提供する。一部の実施形態では、ベクターは、選択マーカ、例えば、抗生物質耐性マーカを含む。一部の実施形態では、抗生物質耐性マーカは、カナマイシン耐性マーカである。一部の実施形態では、抗生物質耐性マーカは、βラクタム抗生物質に耐性を付与しない。一部の実施形態では、ベクターは、アンピシリン耐性マーカを含まない。一部の実施形態では、ベクターは、カナマイシン耐性マーカを含み、アンピシリン耐性マーカを含まない。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれる（例えば、標的細胞、組織、器官、又は被験者への投与時に）。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれない（例えば、標的細胞、組織、器官、又は被験者への投与時に）。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＤＮＡ）を含むベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれない（例えば、標的細胞、組織、器官、又は被験者への投与時に）。一部の実施形態では、ベクターが、標的細胞ゲノム中の標的部位に組み込まれる場合、選択マーカは、ゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、ベクターが、標的細胞ゲノム中の標的部位に組み込まれる場合、ベクターの維持に関与する遺伝子又は配列（例えば、プラスミド維持遺伝子）は、ゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、ベクターが、標的細胞ゲノム中の標的部位に組み込まれる場合、移入調節配列（例えば、ＡＡＶ由来の、例えば、逆位末端配列）は、ゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、ベクター（例えば、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、本明細書に記載の鋳型核酸、又はその両方をコードする）を標的細胞、組織、器官、又は被験者へ投与することによって、前記標的細胞、組織、器官、又は被験者のゲノム中の１つ若しくは複数の標的部位へのベクターの１部分の組込みが起こる。一部の実施形態では、組み込まれた物質を含む標的部位の９９、９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、若しくは１％未満（例えば、標的部位なし）が、ベクター由来の、選択マーカ（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、移入調節配列（例えば、ＡＡＶ由来の、例えば、逆位末端配列）、又は両方を含む。
ＡＡＶベクター
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、本明細書に記載の鋳型核酸、又はその両方をコードするベクターは、例えば、ＡＡＶゲノムを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶゲノムは、４つの複製タンパク質及び３つのカプシドタンパク質をそれぞれコードする２つの遺伝子を含む。一部の実施形態では、これらの遺伝子は、１４５ｂｐ逆位末端配列（ＩＴＲ）により両側がフランキングされている。一部の実施形態では、ビリオンは、例えば、１：１：１０の比で産生される、最大３つのカプシドタンパク質（Ｖｐ１、Ｖｐ２、及び／又はＶｐ３）を含む。一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、同じオープンリーディングフレーム及び／又は異なるスプライシング（Ｖｐ１）並びに別の翻訳開始部位（それぞれ、Ｖｐ２及びＶｐ３）から産生される。一般に、Ｖｐ３は、ビリオン中で最も豊富なサブユニットであり、細胞表面での受容体認識に参加して、ウイルスの屈性を定める。一部の実施形態では、Ｖｐ１は、例えばＶｐ１のＮ末端において、ウイルスの感染力において機能するホスホリパーゼドメインを含む。
一部の実施形態では、ウイルスベクターのパッケージング能力は、ベクターにパッケージングされ得る塩基エディターのサイズを制限する。例えば、ＡＡＶのパッケージング能力は、例えば、１つ又は２つの逆位末端配列（ＩＴＲ）、例えば、１４５塩基ＩＴＲを含め、約４．５ｋｂ（例えば、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、若しくは６．０ｋｂ）であり得る。
一部の実施形態では、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ベクタートランスジーンカセットをフランキングするシス作用性１４５ｂｐ ＩＴＲを含み、例えば、外来ＤＮＡのパッケージングのために最大４．５ｋｂを提供する。感染の後、ｒＡＡＶは、いくつかの事例において、本明細書に記載のタンパク質を発現し、円形の頭－尾コンカテマー内にエピソームとして存在することにより、宿主ゲノムに組み込まれることなく存続する。ｒＡＡＶは、例えば、インビトロ及びインビボで使用することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶ媒介遺伝子送達のためには、遺伝子のコーディング配列の長さが野生型ＡＡＶゲノムと等しいか、又はそれ以上である必要がある。
上記サイズを超える遺伝子のＡＡＶ送達及び／又は大きな生理学的調節エレメントの使用は、例えば、送達しようとするタンパク質を２つ以上の断片に分割することにより、達成することができる。一部の実施形態では、Ｎ－末端断片をスプリットインテイン－Ｎと融合させる。一部の実施形態では、Ｃ－末端断片をスプリットインテイン－Ｃと融合させる。複数の実施形態では、上記断片を２つ以上のＡＡＶベクターにパッケージングする。
一部の実施形態では、大きなトランスジーン発現カセットを２つの個別の半分（５及び３末端、又は頭及び尾）に分割することによって、デュアルＡＡＶベクターを作製し、例えば、カセットの各半分を単一のＡＡＶベクター（＜５ｋｂ）にパッケージングする。次に、一部の実施形態では、両方のデュアルＡＡＶベクターによる同じ細胞の同時感染時に、完全長トランスジーン発現カセットの再アセンブリーを達成することができる。一部の実施形態では、同時感染の後に、以下：（１）５及び３ゲノム同士の相同組換え（ＨＲ）（デュアルＡＡＶ重複ベクター）；（２）ＩＴＲ媒介による５及び３ゲノムの尾－頭コンカテマー化（デュアルＡＡＶトランス－スプライシングベクター）；及び／又は（３）これら２つの機構の組合せ（デュアルＡＡＶハイブリッドベクター）の１つ若しくは複数が続く。一部の実施形態では、インビボでのデュアルＡＡＶベクターの使用により、完全長タンパク質の発現が達成される。一部の実施形態では、デュアルＡＡＶベクタープラットフォームの使用は、サイズが約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、又は５．０ｋｂ超のトランスジーンのための効率的且つ実行可能な遺伝子移入戦略を表している。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターはまた、例えば、核酸及びペプチドのインビトロ生産において、標的核酸で細胞を形質導入するために使用することもできる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、インビボ及びエクスビボ遺伝子療法手順に使用することができる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；国際公開第９３／２４６４１号パンフレット；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたい；尚、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。組換えＡＡＶベクターの構築については、いくつかの刊行物に記載されており、そうしたものとして、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（例えば、１つ若しくは複数のガイド核酸を含む、又は含まない）は、ＡＡＶ、レンチウイルス、アデノウイルス、又は他のプラスミド若しくはウイルスベクタータイプを用いて送達することができ、とりわけ、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルス用の製剤、用量）、米国特許第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶ用の製剤、用量）、及び米国特許第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミド用の製剤、用量）、並びにレンチウイルス、ＡＡＶ及びアデノウイルスに関係する臨床試験及びそうした臨床試験に関する刊行物から得られる製剤及び用量を用いて、送達することができる。例えば、ＡＡＶの場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号明細書に記載される通り、及びＡＡＶに関係する臨床試験に記載の通りであってよい。アデノウイルスの場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号明細書に記載される通り、及びアデノウイルスに関係する臨床試験に記載の通りであってよい。プラスミド送達の場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号明細書に記載される通り、及びプラスミドに関係する臨床試験に記載の通りであってよい。用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば、成人男性）を基準とするか、又はそれに外挿してもよく、異なる体重及び種の患者、被験者、哺乳動物について調節することができる。投与頻度は、患者又は被験者の年齢、性別、健康全般、他の状態を含む通常の要因、並びに対処しようとする具体的な病状又は症状に応じて、医学又は獣医療専門家（例えば、医師、獣医師）の範囲内である。一部の実施形態では、ウイルスベクターを目的の組織に注射することができる。細胞型特異的Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの場合、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ及び任意選択のガイド核酸の発現は、一部の実施形態では、細胞型特異的プロモータによって駆動することができる。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、免疫応答を活性化し得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法のために、低毒性を可能にする。一部の実施形態では、ＡＡＶは、例えば、それが実質的に宿主ゲノムに組み込まれないことから、挿入突然変異誘発を引き起こす低い可能性を可能にする。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、約４．４、４．５、４．６、４．７、又は４．７５ｋｂのパッケージング範囲を有する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、プロモータ、及び転写ターミネータは、単一のウイルスベクターに適合することができる。ＳｐＣａｓ９（４．１ｋｂ）は、いくつかの事例において、ＡＡＶにパッケージングするのが困難となり得る。そのため、一部の実施形態では、他のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又は塩基エディターよりも長さが短いＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを使用する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、約４．５ｋｂ、４．４ｋｂ、４．３ｋｂ、４．２ｋｂ、４．１ｋｂ、４ｋｂ、３．９ｋｂ、３．８ｋｂ、３．７ｋｂ、３．６ｋｂ、３．５ｋｂ、３．４ｋｂ、３．３ｋｂ、３．２ｋｂ、３．１ｋｂ、３ｋｂ、２．９ｋｂ、２．８ｋｂ、２．７ｋｂ、２．６ｋｂ、２．５ｋｂ、２ｋｂ、又は１．５ｋｂ未満である。
ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はそれらの任意の組合せであってよい。一部の実施形態では、ＡＡＶの種類は、ターゲティングしようとする細胞に関して選択され；例えば、脳又はニューロン細胞をターゲティングするためには、ＡＡＶ血清型１、２、５若しくはハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はそれらの任意の組合せを選択することができ；或いは、心臓組織をターゲティングするためには、ＡＡＶ４を選択することができる。一部の実施形態では、肝臓への送達のために、ＡＡＶ８を選択する。これらの細胞に関する例示的なＡＡＶ血清型は、例えば、Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７－５９１１（２００８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、あらゆる血清型、サブタイプ、及び天然に存在するＡＡＶ並びに組換えＡＡＶを指す。ＡＡＶが用いられるとき、ウイルス自体又はその誘導体を指す場合もある。一部の実施形態では、ＡＡＶとして、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒｌ、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈｌＯ、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ １２、ｒｈｌＯ、及びそれらのハイブリッド、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶが挙げられる。ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、並びにネイティブ末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、及びカプシドサブユニットの配列は、当技術分野で公知である。こうした配列は、文献又はＧｅｎＢａｎｋなどの公式データベースで見出すことができる。別の例示的なＡＡＶ血清型を表７に挙げる。
Figure 2022542839000156
一部の実施形態では、医薬組成物（例えば、本明細書に記載のＡＡＶを含む）は、１０％未満の空のカプシド、８％未満の空のカプシド、７％未満の空のカプシド、５％未満の空のカプシド、３％未満の空のカプシド、又は１％未満の空のカプシドを有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、約５％未満の空のカプシドを有する。一部の実施形態では、空のカプシドの数は、検出限界未満である。一部の実施形態では、例えば、空のカプシドは、有害な反応（例えば、免疫応答、炎症性応答、肝臓の反応、及び／又は心臓の反応）を起こす恐れがあり、例えば、実質的な治療利益がほとんど若しくは全くないことから、医薬組成物は少量の空のカプシドを有するのが有利である。
一部の実施形態では、医薬組成物中の残留宿主細胞タンパク質（ｒＨＣＰ）は、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１００ｎｇ／ｍｌ以下のｒＨＣＰ、例えば、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり４０ｎｇ／ｍｌ以下のｒＨＣＰ又は１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１～５０ｎｇ／ｍｌのｒＨＣＰである。一部の実施形態では、医薬組成物は、１．０×１０１３ｖｇ当たり１０ｎｇ未満のｒＨＣＰ、若しくは１．０×１０１３ｖｇ当たり５ｎｇ未満のｒＨＣＰ、１．０×１０１３ｖｇ当たり４ｎｇ未満のｒＨＣＰ、若しくは１．０×１０１３ｖｇ当たり３ｎｇ未満のｒＨＣＰ、又はこれらの間の任意の濃度を含む。一部の実施形態では、医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡ（ｈｃＤＮＡ）は、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり５×１０６ｐｇ／ｍｌ以下のｈｃＤＮＡ、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．２×１０６ｐｇ／ｍｌ以下のｈｃＤＮＡ、又は１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１×１０５ｐｇ／ｍｌのｈｃＤＮＡである。一部の実施形態では、前記医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡは、１×１０１３ｖｇ当たり５．０×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり２．０×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり１．１×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり１．０×１０５ｐｇ未満のｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．９×１０５ｐｇ未満のｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．８×１０５ｐｇ未満のｈｃＤＮＡ、又はこれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、医薬組成物中の残留プラスミドＤＮＡは、１．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．７×１０５ｐｇ／ｍｌ以下、１×１．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１×１０５ｐｇ／ｍｌ、又は１．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．７×１０６ｐｇ／ｍｌである。一部の実施形態では、医薬組成物中の残留ＤＮＡプラスミドは、１．０×１０１３ｖｇ当たり１０．０×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり８．０×１０５ｐｇ未満、又は１．０×１０１３ｖｇ当たり６．８×１０５ｐｇ未満である。一部の実施形態では、医薬組成物は、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．５ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．３ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２２ｎｇ未満、若しくは１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２ｎｇ未満、又は任意の中間濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。複数の実施形態では、医薬組成物中のベンゾナーゼは、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．１ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．０９ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．０８ｎｇ未満、又は任意の中間濃度である。複数の実施形態では、医薬組成物中のポロキサマー１８８は、約１０～１５０ｐｐｍ、約１５～１００ｐｐｍ又は約２０～８０ｐｐｍである。複数の実施形態では、医薬組成物中のセシウムは、５０ｐｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満、３０ｐｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満若しくは２０ｐｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満、又は任意の中間濃度である。
複数の実施形態では、医薬組成物は、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定して、１０％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又はそれらの間の任意のパーセンテージの総不純物を含む。複数の実施形態では、総不純物は、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定して、９０％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、又はそれらの間の任意のパーセンテージである。複数の実施形態では、単一の不特定関連不純物はいずれも、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定して、５％超、４％超、３％超、若しくは２％超、又はそれらの間の任意のパーセンテージである。複数の実施形態では、医薬組成物は、総カプシド（分析用超遠心により測定して、ピーク１＋ピーク２）に対して、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、９０％超、９１％超、９１．９％超、９２％超、９３％超のパーセンテージ、又はそれらの間の任意のパーセンテージの充填カプシドを含む。医薬組成物の複数の実施形態では、分析用超遠心によりピーク１で測定した充填カプシドのパーセンテージは、２０～８０％、２５～７５％、３０～７５％、３５～７５％、又は３７．４～７０．３％である。医薬組成物の複数の実施形態では、分析用超遠心によりピーク２で測定した充填カプシドのパーセンテージは、２０～８０％、２０～７０％、２２～６５％、２４～６２％、又は２４．９～６０．１％である。
一実施形態では、医薬組成物は、１．０～５．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、１．２～３．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、又は１．７～２．３×１０１３ｖｇ／ｍｌのゲノム力価を含む。一実施形態では、医薬組成物は、５ＣＦＵ／ｍＬ未満、４ＣＦＵ／ｍＬ未満、３ＣＦＵ／ｍＬ未満、２ＣＦＵ／ｍＬ未満若しくは１ＣＦＵ／ｍＬ未満、又は任意の中間濃度の生物学的負荷を示す。複数の実施形態では、ＵＳＰ、例えば、ＵＳＰ＜８５＞（その全体が参照により組み込まれる）に従うエンドトキシンの量は、１．０ＥＵ／ｍＬ未満、０．８ＥＵ／ｍＬ未満、又は０．７５ＥＵ／ｍＬ未満である。複数の実施形態では、ＵＳＰ、例えば、ＵＳＰ＜７８５＞（その全体が参照により組み込まれる）に従う医薬組成物の浸透圧は、３５０～４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、３７０～４４０ｍＯｓｍ／ｋｇ又は３９０～４３０ｍＯｓｍ／ｋｇである。複数の実施形態では、医薬組成物は、容器当たり１２００個未満の２５μｍ超の粒子、容器当たり１０００個未満の２５μｍ超の粒子、容器当たり５００個未満の２５μｍ超の粒子、又は任意の中間値を含有する。複数の実施形態では、医薬組成物は、容器当たり１０，０００個未満の１０μｍ超の粒子、容器当たり８０００個未満の１０μｍ超の粒子又は容器当たり６００個未満の１０ｐｍ超の粒子を含有する。
一実施形態では、医薬組成物は、０．５～５．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、１．０～４．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、１．５～３．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ又は１．７～２．３×１０１３ｖｇ／ｍｌのゲノム力価を有する。一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、以下のうちの１つ若しくは複数を含む：１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、約３０ｐｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、約２０～８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留ＤＮＡプラスミド、１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ、ｐＨ７．７～８．３、約３９０～４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、容器当たり約６００個未満の粒径＞２５μｍの粒子、容器当たり約６０００個未満の粒径＞１０μｍの粒子、約１．７×１０１３～２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８～８．４×１０１０ＩＵの感染力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００～３００ｐｇの総タンパク質、約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ用量のウイルスベクターを用いたＡ７ＳＭＡマウスで＞２４日の平均生存期間、インビトロ細胞アッセイに基づき約７０～１３０％の相対効力及び／又は約５％未満の空のカプシド。様々な実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書で扱うウイルス粒子のいずれかを含み、参照基準の±２０％の間、±１５％の間、±１０％の間又は±５％の間の効力を保持する。一部の実施形態では、好適なインビトロ細胞アッセイ又はインビボ動物モデルを用いて、効力を測定する。
ＡＡＶ粒子の別の調製、特性決定、及び投与方法は、国際公開第２０１９０９４２５３号パンフレット（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。
本発明と一致して使用することができる別のｒＡＡＶ構築物として、表１を含め、以下：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５７３－０１９－００１２－９で入手可能なＷａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１９（その全体が、参照により組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。
キット、製品、及び医薬組成物
一態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載される、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（又はポリペプチドをコードする核酸）及び鋳型ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、キットはさらに、細胞にシステムを導入するための試薬、例えば、トランスフェクション試薬、ＬＮＰなども含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかに好適である。一部の実施形態では、キットは、製品内に配置されるような、１つ若しくは複数のエレメント、例えば、組成物（例えば、医薬組成物）、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、及び／又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム、又はその機能性断片若しくは成分を含む。一部の実施形態では、キットは、その使用説明書を含む。
一態様では、本開示は、製品、例えば、その中に本明細書に記載のキット、又はその要素が配置される製品を提供する。
一態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載される、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、鋳型ＤＮＡを含む。
化学、製造、及び制御（ＣＭＣ）
タンパク質治療薬の精製は、例えば、Ｆｒａｎｋｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＣｕｔｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、ポリペプチド、及び／又は鋳型核酸（例えば、鋳型ＤＮＡ）は、特定の品質基準を満たす。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法により生産されたＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、ポリペプチド、及び／又は鋳型核酸（例えば、鋳型ＤＮＡ）は、特定の品質基準を満たす。従って、本開示は、いくつかの態様において、例えば、前記品質基準が検定される、特定の品質基準を満たすＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、ポリペプチド、及び／又は鋳型核酸を製造する方法に関する。本開示はまた、いくつかの態様において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、ポリペプチド、及び／又は鋳型核酸で、前記品質基準を検定する方法にも関する。一部の実施形態では、品質基準として、限定されないが、以下のうちの１つ若しくは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２）が挙げられる：
（ｉ）鋳型ＤＮＡ又はＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡの長さ、例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡが、標準長さを超えるか、又は標準長さ範囲内の長さを有するか否か、例えば、存在するＤＮＡ又はｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、１００、１２５、１５０、１７５、若しくは２００ヌクレオチド長を超えるか否か；
（ｉｉ）ｍＲＮＡ上のポリＡテイルの存在、非存在、及び／又は長さ、例えば、存在するｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、ポリＡテイルを含む（例えば、長さが、少なくとも５、１０、２０、３０、５０、７０、１００ヌクレオチド長のポリＡテイル）を含むか否か；
（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ上の５’キャップの存在、非存在、及び／又は種類、例えば、存在するｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、５’キャップを含むか否か、例えば、上記キャップが、７－メチルグアノシンキャップ、例えば、Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇキャップであるか否か；
（ｉｖ）ｍＲＮＡ中の１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド（例えば、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、１－Ｎ－メチルプソイドウリジン（１－Ｍｅ－Ψ）、５－メトキシウリジン（５－ＭＯ－Ｕ）、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、又はロックドヌクレオチドから選択される）の存在、非存在、及び／又は種類、例えば、存在するｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか否か；
（ｖ）鋳型ＤＮＡ又はｍＲＮＡの安定性（例えば、時間経過による及び／若しくは予め選択した条件下で）、例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、安定性試験の後、インタクトなままである（例えば、１００、１２５、１５０、１７５、若しくは２００ヌクレオチド長を超える）か否か；
（ｖｉ）ＤＮＡの修飾に関するシステム中の鋳型ＤＮＡ又はｍＲＮＡの効力、例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡを含むシステムを効力について検定した後に、標的部位の少なくとも１％が修飾されているか否か；
（ｖｉｉ）ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの長さ、例えば、ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドが、標準長さを超えるか、又は標準長さ範囲内の長さを有するか否か、例えば、存在するポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、若しくは２０００アミノ酸長を超える（且つ、任意選択で、２５００、２０００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、若しくは６００アミノ酸長以下である）か否か；
（ｖｉｉｉ）ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドに対する翻訳後修飾の存在、非存在、及び／又は種類、例えば、ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、リン酸化、メチル化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、グリピヤチヨン（ｇｌｉｐｙａｔｙｏｎ）、若しくはリポイル化、又はそれらの任意の組合せを含むか否か；
（ｉｘ）ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチド中の１つ若しくは複数の人工、合成、又は非標準アミノ酸（例えば、オルニチン、β－アラニン、ＧＡＢＡ、δ－アミノレブリン酸、ＰＡＢＡ、Ｄ－アミノ酸（例えば、Ｄ－アラニン若しくはＤ－グルタミン酸）、アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、シスタチオニン、ランチオニン、ジェンコル酸（Ｄｊｅｎｋｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ジアミノピメリン酸、ホモアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、ホモノルロイシン、ホモセリン、Ｏ－メチル－ホモセリン及びＯ－エチル－ホモセリン、エチオニン、セレノシステイン、セレノホモシステイン、セレノメチオニン、セレノエチオニン、テルロシステイン、若しくはテルロメチオニン）の存在、非存在、及び／又は種類、例えば、ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、１つ若しくは複数の人工、合成、又は非標準アミノ酸を含むか否か；
（ｘ）ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの安定性（例えば、時間経過による及び／若しくは予め選択した条件下で）、例えば、ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、安定性試験の後に、インタクトなままである（例えば、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、若しくは２０００アミノ酸長を超える（且つ、任意選択で、２５００、２０００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、若しくは６００アミノ酸長以下である））か否か；
（ｘｉ）ＤＮＡの修飾についてのシステム中のポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの効力、例えば、ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドを含むシステムを効力について検定した後に、標的部位の少なくとも１％が修飾されているか否か；又は
（ｘｉｉ）パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体、又は宿主細胞タンパク質の１つ又は複数の存在、非存在、及び／若しくはレベル、例えば、システムが、パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体、又は宿主細胞タンパク質混入を含まないか、若しくは実質的に含まないか否か。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は医薬組成物は、エンドトキシンを含まない。
一部の実施形態では、パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体、及び／又は宿主細胞タンパク質の１つ又は複数の存在、非存在、及び／若しくはレベルを決定する。複数の実施形態では、システムが、パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体、及び／又は宿主細胞タンパク質混入を含まない、若しくは実質的に含まないか否かを決定する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物又はシステムは、以下の特徴の１つ又は複数（例えば、１、２、３、若しくは４つ）を有する：
（ａ）例えば、モル基準で、ポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、若しくは０．１％）のＤＮＡ鋳型；
（ｂ）例えば、モル基準で、ポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、若しくは０．１％）の非キャップＲＮＡ；
（ｃ）例えば、モル基準で、ポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、若しくは０．１％）の部分長ＲＮＡ；
（ｄ）未反応キャップジヌクレオチドを実質的に含まない。
例示的な異種目的配列
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、異種目的配列を含み、異種目的配列又はその逆相補的配列は、タンパク質（例えば、抗体）又はペプチドをコードする。一部の実施形態では、治療法は、ＦＤＡなどの規制機関により承認されているものである。
一部の実施形態では、タンパク質又はペプチドは、ＴＨＰｄｂデータベース（Ｕｓｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２（７）：ｅ０１８１７４８（２０１７）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）からのタンパク質又はペプチドである。一部の実施形態では、タンパク質又はペプチドは、表８に開示されるタンパク質又はペプチドである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム又は方法（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを含むもの）を用いて、表８からのタンパク質又はペプチドの発現カセットを宿主細胞に組み込んで、宿主でのタンパク質又はペプチドの発現を可能にし得る。一部の実施形態では、表８の第１列中のタンパク質又はペプチドの配列は、表８の第３列に提供される特許又は出願（その全体が、参照により組み込まれる）に見出すことができる。
一部の実施形態では、タンパク質又はペプチドは、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ ２７（１）：１（２０２０）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）の表１に開示される抗体である。一部の実施形態では、タンパク質又はペプチドは、表９に開示される抗体である。一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム又は方法（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを含むもの）を用いて、表９からの抗体の発現カセットを宿主細胞に組み込んで、宿主での抗体の発現を可能にし得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法を用いて、表９の第２列の標的に結合する薬剤（例えば、表９の第１列のモノクローナル抗体）を、表９の第３列の適応症を有する被験者に発現させる。
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適用
コーディング遺伝子をＤＮＡ配列鋳型に組み込むことにより、例えば、機能喪失型変異を有する個体において治療トランスジーンの発現を提供することにより（例えば本明細書に記載されるような目的配列に含まれる）、機能獲得型変異を正常なトランスジーンで置換することにより、機能獲得型変異発現を排除するために調節配列を賦与することにより、及び／又は作動可能に連結した遺伝子、トランスジーン及びそのシステムの発現を制御することによって、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、治療ニーズに対処することができる。特定の実施形態では、目的配列（例えば、異種目的配列）は、宿主細胞の治療ニーズに特異的な機能性エレメント（例えば、本明細書に記載される、例えば、ポリペプチド若しくはノンコーディングＲＮＡ）をコードするコーディング配列を含む。一部の実施形態では、目的配列（例えば、異種目的配列）は、プロモータ、例えば、組織特異的プロモータ又はエンハンサーを含む。ある実施形態では、プロモータは、コーディング配列と作動可能に連結させることができる。
複数の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムは、例えば、代用血液因子又は代用酵素、例えば、リソソーム酵素を発現する治療剤（例えば治療トランスジーン）を含む目的配列を提供することができる。例えば、本明細書に記載の組成物、システム及び方法は、標的ヒトゲノムにおいて、ファブリー病治療のためのアガルシダーゼアルファ又はベータ；ゴーシェ病のためのイミグルセラーゼ、タリグルセラーゼアルファ、ベラグルセラーゼアルファ、又はアルグルセラーゼ；リソソーム酸性リパーゼ欠損症（ウォルマン病／ＣＥＳＤ）のためのセベリパーゼアルファ；ムコ多糖症のためのラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、エロスルファーゼアルファ、又はガルスルファーゼ；ポンペ病のためのアルグルコシダーゼを発現するのに有用である。例えば、本明細書に記載の組成物、システム及び方法は、標的ヒトゲノムにおいて、血液因子欠損症のための因子Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ又はＸＩＩＩを発現するのに有用である。
投与
本明細書に記載の組成物及びシステムは、インビトロ又はインビボで使用され得る。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、例えば、インビトロ又はインビボで細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）に送達される。当業者であれば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの成分が、ポリペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、及びそれらの組合せの形態で送達され得ることは理解されよう。
複数の実施形態では、システム及び／又はシステムの成分は、核酸として送達される。例えば、リコンビナーゼポリペプチドは、リコンビナーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの形態で送達してもよい。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分（例えば挿入ＤＮＡ及びリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸分子）は、１、２、３、４、又はそれ以上の個別の核酸分子上で送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＤＮＡ及びＲＮＡの組合せとして送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＤＮＡ及びタンパク質の組合せとして送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＲＮＡ及びタンパク質の組合せとして送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＲＮＡ及びタンパク質の組合せとして送達される。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドはタンパク質として送達される。
一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ベクターを用いて、細胞、例えば、哺乳動物細胞又はヒト細胞に送達される。ベクターは、例えば、プラスミド又はウイルスであってもよい。一部の実施形態では、送達は、インビボ、インビトロ、エクスビボ、又はインサイチュである。一部の実施形態では、ウイルスは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルスである。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ウイルス様粒子又はビロソームを用いて細胞に送達される。一部の実施形態では、送達には、ウイルス、ウイルス様粒子又はビロソームを使用する。
一実施形態では、本明細書に記載の組成物及びシステムは、リポソーム又は他の類似の小胞体中に製剤化することができる。リポソームは、内部水性コンパートメントを取り囲む単層又は多重層脂質二重膜と、比較的不透過性の外側親油性リン脂質二重膜から構成される球状の小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であってよい。リポソームは、生体適合性、非中毒性であり、親水性及び親油性薬物分子の両方を送達し、それらのカーゴをプラズマ酵素による分解から保護すると共に、それらのロードを生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を介して輸送することができる（例えば、論評については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。
小胞は、いくつかの異なるタイプの脂質から製造することができるが；薬物担体としてリポソームを作製するためにはリン脂質が最も一般的に使用される。多重層小胞脂質の調製方法は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照；多重層小胞脂質の調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。脂質膜を水溶液と混合すれば、小胞形成は自然に起こり得るが、ホモジナイザー、超音波発生装置、又は押出機を用いて振盪の形態で力を加えることにより、それを促進することもできる（例えば、論評については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。押出脂質は、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７（押出脂質調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、サイズ漸減フィルターを介した押出により調製することができる。
脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の医薬組成物のための生体適合性及び生分解性送達系を提供する担体のもう１つの例である。ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）は、ＳＬＮの特徴を保持し、薬物安定性及び負荷容量を向上させると共に、薬物漏出を防ぐ、修飾固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。ポリマーナノ粒子（ＰＮＰ）は、薬物送達の重要な成分である。これらのナノ粒子は、特定の標的に対して薬物送達を効果的に指向し、薬物安定性及び薬物放出制御を改善する。また、脂質－ポリマーナノ粒子（ＰＬＮ）、即ち、リポソーム及びポリマーを組み合わせた新しいタイプの担体を使用してもよい。これらのナノ粒子は、ＰＮＰ及びリポソームの相補的利点を有する。ＰＬＮは、コア－シェル構造から構成され；ポリマーコアは、安定した構造を提供し、リン脂質シェルは良好な生体適合性を賦与する。このように、２つの成分は、薬物封入効率を高め、表面修飾を促進すると共に、水溶性薬物の漏出を防ぐ。例えば、論評については、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ７，１２２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｎａｎｏ７０６０１２２を参照されたい。
また、本明細書に記載の組成物及びシステム用の薬物送達ビヒクルとしてエキソソームを使用することもできる。例えば、論評については、Ｈａ ｅｔ ａｌ．Ｊｕｌｙ ２０１６．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ．Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｉｓｓｕｅ ４，Ｐａｇｅｓ ２８７－２９６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｐｓｂ．２０１６．０２．００１を参照されたい。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムの少なくとも１つの成分は、フソソームを含む。フソソームは、標的細胞と相互作用して、それと融合することから、様々な分子の送達ビヒクルとして用いることができる。フソソームは、概して、管腔又は空洞を封入する両親媒性脂質の二重層、及び両親媒性脂質二重層と相互作用するフソゲンから構成される。フソゲン成分は、融合及びペイロード送達のための標的細胞特異性を付与し、プログラム可能な細胞特異性を備える送達ビヒクルの作製を可能にするために操作可能であることが明らかにされている（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットにおけるフソソーム設計、調製、及び使用に関するセクションを参照されたい）。
ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒシステムを細胞、組織及び多細胞生物に導入することができる。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、機械的手段又は物理的手段を用いて、細胞に送達される。
タンパク質治療薬の製剤化は、Ｍｅｙｅｒ（Ｅｄ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｅｒｉｅｓ（２０１２）に記載されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、以下：大脳、小脳、副腎、卵巣、膵臓、副甲状腺、下垂体、精巣、甲状腺、乳房、脾臓、扁桃腺、胸腺、リンパ節、骨髄、肺、心筋、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、唾液腺、腎臓、前立腺、血液、又はその他の細胞若しくは組織型からの組織若しくは細胞に送達される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、癌、炎症性疾患、感染症、遺伝子異常、又はその他の疾患などの疾患を処置する。癌は、以下：大脳、小脳、副腎、卵巣、膵臓、副甲状腺、下垂体、精巣、甲状腺、乳房、脾臓、扁桃腺、胸腺、リンパ節、骨髄、肺、心筋、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、唾液腺、腎臓、前立腺、血液、又はその他の細胞若しくは組織型の癌であってよく、複数の癌を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、経腸投与（例えば、経口、胃腸、舌下、唇下、又は口腔投与）により投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、硬膜外、脳内、脳室内、皮膚上、鼻内、動脈内、関節内、海綿体内、眼内、骨髄内輸液、腹腔内、髄腔内、子宮内、膣内、膀胱内、血管周囲、又は経粘膜投与）により投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、局所投与（例えば、経皮投与）により投与される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を修飾することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）を修飾することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、家畜動物（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラマ、アルパカ、ラクダ、ヤク、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、又はダチョウ）由来の細胞を修飾することができる。一部の実施形態では、例えば、動物細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）、植物細胞、又は真菌細胞を修飾するために、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを実験ツール若しくは研究ツールとして使用するか、又は実験方法若しくは研究方法に使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、タンパク質、鋳型、若しくは異種目的配列を（例えば、動物細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）、植物細胞、又は真菌細胞において）発現させることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、誘導性プロモータ（例えば、小分子誘導性プロモータ）の制御下で、タンパク質、鋳型、若しくは異種目的配列を発現させることができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステム又はそのペイロードを、例えば、誘導性プロモータの使用により、調整可能な制御のために設計する。例えば、目的の遺伝子を駆動するプロモータ、例えば、Ｔｅｔは、組込み時にサイレントであり得るが、いくつかの事例では、小分子誘導剤、例えば、ドキシサイクリンへの曝露時に活性化され得る。一部の実施形態では、調整可能な発現は、遺伝子（例えば、治療用遺伝子）の処置後制御を可能にし、例えば、小分子依存性投与効果を可能にする。複数の実施形態では、小分子依存性投与効果は、例えば、局所投与により、時間的及び／又は空間的に、遺伝子産物のレベルを変化させることを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムで使用されるプロモータは、誘導性、例えば、宿主の内在性分子及び／又はそこに投与された外性小分子に対して応答性であってもよい。
好適な適応症の処置
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）を用いて、疾患、障害、又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分を用いて、表１０～１５のいずれかに列挙される疾患、障害、又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分を用いて、例えば、表１０に列挙される造血幹細胞（ＨＳＣ）疾患、障害、又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分を用いて、例えば、表１１に列挙される腎臓疾患、障害、又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分を用いて、例えば、表１２に列挙される肝臓疾患、障害、又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分を用いて、例えば、表１３に列挙される肺疾患、障害、又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分を用いて、例えば、表１４に列挙される骨格筋疾患、障害、又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分を用いて、例えば、表１５に列挙される皮膚疾患、障害、又は病状を処置する。
表１０～１５：リコンビナーゼに使用されるトランスＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒに関して選択される適応症
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Figure 2022542839000174
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一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）を用いて、遺伝性疾患、障害、又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）を用いて、遺伝性疾患、障害、又は病状と診断された被験者（例えば、ヒト患者）を処置する。一部の実施形態では、遺伝性疾患、障害、又は病状は、特定の遺伝子型、例えば、ヘテロ接合性又はホモ接合性遺伝子型に関連する。一部の実施形態では、遺伝性疾患、障害、又は病状は、特定の突然変異、例えば、置換、欠失、又は挿入、例えば、ヌクレオチド増大に関連する。一部の実施形態では、遺伝性疾患、障害、又は病状は、嚢胞性線維症又はオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症である。一部の実施形態では、遺伝性疾患、障害、又は病状の処置に使用される本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、被験者（例えば、ヒト患者）が欠失している（例えば、全体的に、又は標的細胞集団中で）遺伝子の機能性（例えば、野生型）コピーを含む異種目的配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子の機能性コピーは、機能性（例えば、野生型）ＣＦＴＲ遺伝子又はＯＴＣ遺伝子を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）を用いて、健康な範囲外のレベルのバイオマーカ（例えば、疾患、障害、又は病状、例えば、遺伝性疾患、障害、又は病状に関連する）を有する被験者（例えば、ヒト患者）を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）を用いて、健康な範囲外のレベルのバイオマーカ（例えば、疾患、障害、又は病状、例えば、遺伝性疾患、障害、又は病状に関連する）を有する者として診断された被験者（例えば、ヒト患者）を処置する。
一部の実施形態では、被験者（例えば、ヒト患者）のバイオマーカ及び／又は遺伝子型の存在及び／又はレベルは、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）を用いる処置の前に決定する。一部の実施形態では、被験者（例えば、ヒト患者）のバイオマーカ及び／又は遺伝子型の存在及び／又はレベルは、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）を用いる処置の後に決定する。一部の実施形態では、被験者（例えば、ヒト患者）のバイオマーカ及び／又は遺伝子型の存在及び／又はレベルは、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）を用いる処置の前及び後に決定する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）は、被験者（例えば、ヒト患者）においてバイオマーカが正常及び／又は健康な範囲外のレベルで存在するという決定に応じて投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）は、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分の最初の投与後に、被験者（例えば、ヒト患者）においてバイオマーカが正常及び／又は健康な範囲外のレベルで存在するという決定に応じて再投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）は、被験者（例えば、ヒト患者）、例えば、又は被験者中の標的細胞集団が、遺伝子型（例えば、疾患、障害、若しくは病状に関連する）を有するという決定に応じて投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）は、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分の最初の投与後に、被験者（例えば、ヒト患者）、例えば、又は被験者中の標的細胞集団が、遺伝子型（例えば、疾患、障害、若しくは病状に関連する）を有するという決定に応じて再投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）の投与は、被験者（例えば、ヒト患者）においてバイオマーカが正常及び／又は健康な範囲内のレベルで存在するまで、継続又は反復される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）の投与は、被験者（例えば、ヒト患者）、例えば、又は被験者中の標的細胞集団が、上記遺伝子型（例えば、疾患、障害、若しくは病状に関連する）を保有しなくなるまで、継続又は反復される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）を用いて、出生前に（例えば、子宮内のヒト被験者、例えば、胚若しくは胎児の）疾患、障害、又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）を用いて、出生後に、例えば、ヒト乳児、幼児、又は小児の疾患、障害、又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）を用いて、新生児期に疾患、障害、又は病状を処置する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）により処置された被験者（例えば、ヒト患者）、例えば、又は被験者の標的細胞集団の遺伝子型は、被験者が成長する間、安定したままである。これに関連して、安定な（した）とは、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）による処置が完了した後に、被験者の遺伝子型（例えば、又は被験者の標的細胞集団）に追加的改変がないことを指す。これに関連して、安定な（した）とは、上記に加えて、又は代わり、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムにより作製された被験者の遺伝子型に対する改変の持続を指す場合もある。特定の理論に束縛されることは意図しないが、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムにより作製されたもの以外の被験者の遺伝子型の追加的改変を回避、阻止、又は最小化することが望ましい場合もある。これに加えて、又は代わり、被験者（例えば、又は被験者の標的細胞集団）の遺伝子型の改変は、処置の完了後（例えば、少なくとも選択された期間にわたって、例えば、無期限に）持続することが望ましい場合もある。一部の実施形態では、処置の完了後、被験者、例えば、又は被験者の標的細胞集団の遺伝子型は、処置の後の選択された期間、例えば、１、２、３、４、５、６、若しくは７日、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０週、又は３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくは１１ヶ月、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０年（例えば、無期限）にわたって、被験者、例えば、又は被験者の標的細胞集団の遺伝子型と同じである。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）により作製された、被験者、例えば、又は被験者の標的細胞集団の遺伝子型に対する改変は、処置の後の少なくとも選択された期間、例えば、１、２、３、４、５、６、若しくは７日、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０週、又は３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくは１１ヶ月、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０年（例えば、無期限）にわたって持続する。
植物修飾方法
本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを用いて、例えば、植物の適応度を高めるために、植物又は植物部分（例えば、葉、根、花、果実、若しくは種子）を修飾することができる。
Ａ．植物への送達
本明細書には、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを植物に送達する方法が提供される。植物、又はその部分をＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムと接触させることにより、植物にＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを送達する方法が含まれる。これらの方法は、例えば、植物の適応度を高める目的で、植物を修飾するために有用である。
より具体的には、一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸（例えば、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒをコードする核酸）をベクター内でコードしてもよく、例えば植物ベクター（例えば、ｐＨＵＣ４１１）中の植物プロモータ、例えば、トウモロコシユビキチンプロモータ（ＺｍＵＢＩ）に隣接して挿入してもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸を、アグロバクテリア（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）を介して、植物（例えば、ジャポニカ米（ｊａｐｏｎｉｃａ ｒｉｃｅ））又は植物の一部（例えば、植物のカルス）に導入する。一部の実施形態では、植物遺伝子（例えば、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ））をヌルアレル（例えば、開始コドンに塩基置換を含む）で置換することにより、本明細書に記載のシステム及び方法を植物に使用することができる。植物ゲノムを修飾するためのシステム及び方法は、Ｘｕ ｅｔ．ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐｒｉｍｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，２０２０，Ｐｌａｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓに記載されている。
一態様では、植物の適応度を高める方法が本明細書に提供され、この方法は、非処置の植物（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを送達されていない植物）と比較して、植物の適応度を高めるために、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを（例えば、有効な量及び期間で）植物に送達するステップを含む。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの送達の結果としての植物の適応度増大は、いくつかの方法で維持することができ、例えば、それにより、植物の生産改善、例えば、収率の向上、植物の成長力若しくは植物から収穫された産物の品質の向上、農業若しくは園芸に関して望ましいとみなされる収穫前後の特徴（例えば、味、外観、貯蔵寿命）の改善、又はそれ以外にヒトに有益な特徴改善（例えば、アレルゲン生成の低減）が達成される。植物の収率改善は、同じ条件下であるが、本組成物の適用なしで生産された植物の同じ産物の収率に対して、或いは従来の植物修飾剤の適用と比較して、測定可能な量による、植物の産物の収率の増加（例えば、植物バイオマス、穀粒、種子若しくは果実収率、タンパク質含量、炭水化物若しくは油含量又は葉面積により測定可能な）に関する。例えば、収率は、少なくとも約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、又は１００％超増加し得る。いくつかの事例では、本方法は、非処置植物と比較して、収率を約２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、又は１００倍超増加するのに有効である。収率は、植物の重量若しくは体積、又は何らかの基準に基づく植物の産物に関して表すことができる。基準は、時間、栽培面積、生産される植物の重量、又は使用される原材料の量に関して表すことができる。例えば、こうした方法は、限定されないが、以下：種子、果実、穀粒、実、塊茎、根、及び葉などの植物組織の収率を増加し得る。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの送達の結果としての植物の適応度増大は、他の手段、例えば、同じ条件下であるが、本組成物の投与なしで、又は従来の植物修飾剤を適用して、生産された植物の産物の同じ要因と比較して、測定可能若しくは認識可能な量による、成長力評価、群落（面積単位当たりの植物の数）、植物の高さ、茎の状況、茎の長さ、葉の数、葉のサイズ、林冠、外観（例えば、濃い緑色の葉の色など）、根評価、出芽、タンパク質含量、分けつ増加、葉のサイズの増加、葉の増加、根出葉の減少、より強い新芽、必要な肥料の減少、必要な種子の減少、より生産性の高い新芽、より早い開花、より早い穀粒若しくは種子成熟、植物の傾き（ｖｅｒｓｅ）（倒伏）の減少、シュートの成長増大、より早期の発芽、又はこれらの要因の任意の組合せの増大若しくは改善によって測定することもできる。
従って、本明細書には、植物を修飾する方法が提供され、この方法は、本明細書に提供されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのいずれかを有効な量で植物に送達するステップを含み、ここで、上記方法は、植物を修飾し、それにより、非処置植物と比較して、植物に有益な特徴を導入するか、又はそれを（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）増加する。特に、本方法は、非処置植物と比較して、植物適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）増加し得る。
いくつかの事例では、植物適応度の増加は、疾患耐性、干ばつ耐性、耐熱性、耐寒性、耐塩性、金属耐性、除草剤耐性、薬剤耐性、水使用効率、窒素利用、窒素ストレス耐性、窒素固定、害虫耐性、草食動物耐性、病原体耐性、収率、水制限条件下での収率、成長力、成長、光合成能力、栄養、タンパク質含量、炭水化物含量、油含量、バイオマス、シュート長さ、根長さ、根構造、種子重量、又は収穫可能な産物の量の（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、若しくは１００％超の）増加である。
いくつかの事例では、適応度の増加は、発育、成長、収率、非生物ストレス源に対する耐性、又は生物ストレス源に対する耐性の（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、若しくは１００％超の）増加である。非生物ストレスは、植物又は植物部分が被る環境ストレス条件を指し、例えば、干ばつストレス、塩ストレス、熱ストレス、低温ストレス、及び低栄養ストレスが挙げられる。生物ストレスは、植物又は植物部分が被る環境ストレス条件を指し、例えば、線虫ストレス、草食昆虫ストレス、真菌病原体ストレス、細菌病原体ストレス、又はウイルス病原体ストレスが挙げられる。ストレスは、一過性、例えば、数時間、数日、数ヶ月の場合もあれば、又は永続的、例えば、植物の寿命にわたる場合もある。
一部では、植物から収穫された産物の品質の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）。例えば、植物適応度の増加は、植物から収穫される産物の商業的に好ましい特徴（例えば、味又は外観）の改善であり得る。他の事例では、植物適応度の増加は、植物から収穫される産物の貯蔵寿命の（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超の）増加である。
或いは、適応度の増加は、ヒト又は動物の健康に対して有益な特徴の改変、例えば、アレルゲン生成の低減であり得る。例えば、適応度の増加は、動物（例えば、ヒト）の免疫応答を刺激するアレルゲン（例えば、花粉）の生成の（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超の）低減であり得る。
植物の修飾（例えば、適応度の増加）は、１つ又は複数の植物部分の修飾から起こり得る。例えば、植物は、植物の葉、種子、花粉、根、果実、シュート、花、細胞、プロトプラスト、又は組織（例えば、分裂組織）を接触させることにより、修飾することができる。従って、別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書における植物修飾組成物のいずれかと植物の花粉を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）増加する。
また別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書に開示のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのいずれかと植物の種子を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）増加する。
また別の態様では、有効量の本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのいずれかと植物のプロトプラストを接触させるステップを含む方法が本明細書に提供され、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）増加する。
さらに別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのいずれかと植物の植物細胞を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）増加する。
別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書における植物修飾組成物のいずれかと植物の分裂組織を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）増加する。
別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書における植物修飾組成物のいずれかと植物の胚を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）増加する。
Ｂ．適用方法
本明細書に記載の植物は、組成物を植物に送達又は投与することを可能にする任意の好適な様式で、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム組成物のいずれかに曝露することができる。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、単独で、又は他の活性（例えば、肥料）若しくは非活性物質と組み合わせて送達されてよく、例えば、有効濃度の植物修飾組成物を送達するために製剤化された濃縮液、ゲル、溶液、懸濁液、スプレー、粉末、ペレット、ブリケット、ブリックなどの形態で、噴霧、注入（例えば、マイクロインジェクション）、植物を媒介して、注ぎ込む、浸漬することにより、適用することができる。本明細書に記載の組成物の適用のための量及び位置は、一般に、植物の生息地、植物修飾組成物により植物をターゲティングすることができる生活環段階、適用を実施しようとする部位、並びに植物修飾組成物の物理的及び機能的特性により決定する。
いくつかの事例では、組成物は、例えば、バックパック噴霧、空中噴霧、作物噴霧／散布などにより、植物、例えば、作物に直接噴霧する。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを植物に送達する場合、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを受ける植物は、植物成長の任意の段階であってよい。例えば、製剤化された植物修飾組成物を植物成長の早期段階で種子コーティング若しくは根処理として、又は作物サイクルの後期段階での全植物処理として適用することができる。いくつかの事例では、植物修飾組成物は、植物に対する局所薬剤として適用してもよい。
さらに、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、植物の組織を通して吸収及び分布される浸透性薬剤として（例えば、植物が成長する土壌に、又は植物の水遣りに使用する水に）適用してもよい。いくつかの事例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを発現するように、植物又はえさ生物を遺伝子的に形質転換することもできる。
また、溶解性若しくは生体内分解性コーティング層、例えば、ゼラチンで、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム又は植物修飾組成物を含む組成物をコーティングすることにより、遅延又は連続的放出を達成することも可能であり、上記のコーティングは、使用環境内で溶解又は分解し、その後、植物修飾ｃｏｍ Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム位置が利用可能になり、或いは、溶解性若しくは分解性マトリックス中に薬剤を分散することによっても達成することができる。こうした連続的放出及び／又は分散は、デバイスを有利に使用して、本明細書に記載の植物修飾組成物の１つ又は複数の有効濃度を一定に維持し得ることを意味する。
いくつかの事例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを、植物の一部、例えば、その葉、種子、花粉、根、果実、シュート、若しくは花、若しくは組織、細胞、又はプロトプラストに送達する。いくつかの事例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを、植物の細胞に送達する。いくつかの事例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを、植物のプロトプラストに送達する。いくつかの事例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを、植物の組織に送達する。例えば、組成物を植物の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、側方分裂組織、又は介在分裂組織）に送達することもできる。いくつかの事例では、植物の永久組織（例えば、単組織（例えば、柔組織、厚角組織、若しくは厚膜組織）又は複合永久組織（例えば、木部若しくは師部）に組成物を送達する。いくつかの事例では、植物胚にＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを送達する。
Ｃ．植物
本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムで処置するために、多様な植物に送達することができる。本方法に従ってＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを送達する（即ち、「処置する」）ことができる植物は、全植物及び植物部分を含み、そうしたものとして、限定されないが、シュート栄養器官／構造（例えば、葉、茎及び塊茎）、根、花及び花器官／構造（例えば、苞葉、萼片、花弁、雄蕊、心皮、葯及び胚珠）、種子（胚、胚乳、子葉、及び種皮を含む）並びに果実（成熟卵胞）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）並びに細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞など）、並びにそれらの子孫が挙げられる。植物部分は、さらに、シュート、根、茎、種子、托葉、葉、花弁、花、胚珠、苞葉、枝、葉柄、節間、樹皮、軟毛、新芽、根茎、葉状体、（イネ科植物の）葉、花粉、雄蕊などの植物の部分も指す。
本明細書に開示される方法で処置することができる植物のクラスは、高等及び下等植物のクラスを含み、被子植物（単子葉及び双子葉植物）、裸子植物、シダ、ツクシ、古生マツバラン（ｐｓｉｌｏｐｈｙｔｅ）、小葉植物、コケ植物、及び藻類（例えば、多細胞又は単細胞藻類）が挙げられる。本方法に従って処置することができる植物はさらに、任意の維管束植物、例えば、単子葉若しくは双子葉植物、又は裸子植物を含み、限定されないが、以下のものが挙げられる：アルファルファ、リンゴ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、バナナ、カノーラ、トウゴマ、キク、クローバー、カカオ、コーヒー、綿、綿実、トウモロコシ、ハマナ（ｃｒａｍｂｅ）、クランベリー、キュウリ、デンドロビウム（ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ）、ヤマノイモ、ユーカリ、ウシノケグサ、亜麻、グラジオラス、リリアセア（ｌｉｌｉａｃｅａ）、亜麻仁、キビ、マスクメロン、カラシ、オートムギ、アブラヤシ、アブラナ、ピーナッツ、パイナップル、観賞植物、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、ジャガイモ、ナタネ、コメ、ライムギ、ライグラス、サフラワー、ゴマ、モロコシ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、イチゴ、タバコ、トマト、シバ、コムギ、並びにレタス、セロリ、ブロッコリー、カリフラワー、ウリ科植物（ｃｕｃｕｒｂｉｓ）などの野菜作物；リンゴ、ナシ、モモ、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ライム、アーモンド、ペカン、クルミ、ヘーゼルなどの果実及び堅果樹；ブドウ（例えば、ブドウ園）、キーウィ、ホップなどのつる植物；ラズベリー、ブラックベリー、グーズベリーなどの果実低木及びブランブル；トネリコ、マツ、モミ、カエデ、オーク、クリ、ポプラなどの森林樹；並びにアルファルファ、カノーラ、トウゴマ、トウモロコシ、綿、ハマナ（ｃｒａｍｂｅ）、亜麻、亜麻仁、カラシ、アブラヤシ、アブラナ、ピーナッツ、ジャガイモ、コメ、サフラワー、ゴマ、ダイズ、テンサイ、ヒマワリ、タバコ、トマト、及びコムギ。本明細書に開示される方法に従って処置することができる植物は、あらゆる作物植物、例えば、飼料作物、油糧種子作物、穀粒作物、果物作物、野菜作物、繊維作物、香辛料作物、ナッツ作物、芝土作物、糖料作物、飲料作物、及び森林作物を含む。特定の事例では、本方法で処置される作物植物は、ダイズ植物である。他の特定の事例では、作物植物は、コムギである。他の特定の事例では、作物植物は、トウモロコシである。他の特定の事例では、作物植物は、綿である。特定の事例では、作物植物は、アルファルファである。特定の事例では、作物植物は、テンサイである。特定の事例では、作物植物は、コメである。特定の事例では、作物植物は、ジャガイモである。特定の事例では、作物植物は、トマトである。
特定の事例では、植物は、作物である。こうした作物植物の例として、限定されないが、単子葉及び双子葉植物が挙げられ、限定されないが、下記のものから選択される飼料若しくは飼い葉用マメ科植物、観賞植物、食用作物、樹木、又は低木を含む：カエデ属種（Ａｃｅｒ ｓｐｐ．）、アリウム属種（Ａｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、アマランサス属種（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｓｐｐ．）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、セロリ（Ａｐｉｕｍ ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）、ラッカセイ属種（Ａｒａｃｈｉｓ ｓｐｐ）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アブラナ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐｐ．）（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラッシカ・ラパ種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｓｐ．）（カノーラ、アブラナ（ｏｉｌｓｅｅｄ ｒａｐｅ）、ナバナ（ｔｕｒｎｉｐ ｒａｐｅ））、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ダンドク（Ｃａｎｎａ ｉｎｄｉｃａ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｌｉｖａ）、トウガラシ属種（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｓｐｐ．）、クリ属種（Ｃａｓｔａｎｅａ ｓｐｐ．）、エンダイブ（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｅｎｄｉｖｉａ）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）、シトラス属種（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、ココス属種（Ｃｏｃｏｓ ｓｐｐ．）、コーヒーノキ属種（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．）、コリアンダー（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ハシバミ属種（Ｃｏｒｙｌｕｓ ｓｐｐ．）、クラタエグス属種（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ ｓｐｐ．）、カボチャ属種（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｓｐｐ．）、ククミス属種（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓｐｐ．）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ブナ属種（Ｆａｇｕｓ ｓｐｐ．）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）、フラガリア属種（Ｆｒａｇａｒｉａ ｓｐｐ．）、イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ）、ダイズ属種（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｐｐ．）（例えば、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ソーヤ・ヒスピダ（Ｓｏｊａ ｈｉｓｐｉｄａ）若しくはソーヤ・マックス（Ｓｏｊａ ｍａｘ））、リクチワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ヒマワリ属種（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ））、ハイビスカス属種（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｐｐ．）、オオムギ属種（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ）、クルミ属種（Ｊｕｇｌａｎｓ ｓｐｐ．）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、レイシ（Ｌｉｔｃｈｉ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ミヤコグサ属種（Ｌｏｔｕｓ ｓｐｐ．）、トカドヘチマ（Ｌｕｆｆａ ａｃｕｔａｎｇｕｌａ）、ルピナス属種（Ｌｕｐｉｎｕｓ ｓｐｐ．）、トマト属種（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｓｐｐ．）（例えば、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｒｎ）、リコペルシコン・リコペルシカム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、リコペルシコン・ピリフォルメ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｙｒｉｆｏｒｍｅ））、リンゴ属種（Ｍａｌｕｓ ｓｐｐ．）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、ハッカ属種（Ｍｅｎｔｈａ ｓｐｐ．）、ススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、クロミグワ（Ｍｏｒｕｓ ｎｉｇｒａ）、バショウ種種（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、タバコ属種（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐｐ．）、オリーブ属種（Ｏｌｅａ ｓｐｐ．）、オリザ属種（Ｏｒｙｚａ ｓｐｐ．）（例えば、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、オリザ・ラティフォリア（Ｏｒｙｚａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ））、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、パッションフルーツ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｅｄｕｌｉｓ）、イタリアンパセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ ｃｒｉｓｐｕｍ）、インゲンマメ属種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、マツ属種（Ｐｉｎｕｓ ｓｐｐ．）、ピスタチオ（Ｐｉｓｔａｃｉａ ｖｅｒａ）、エンドウ属種（Ｐｉｓｕｍ ｓｐｐ．）、イチゴツナギ属種（Ｐｏａ ｓｐｐ．）、ハコヤナギ属種（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｓｐｐ．）、サクラ属種（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐｐ．）、セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、コナラ属種（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｐｐ．）、ラディッシュ（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ショクヨウダイオウ（Ｒｈｅｕｍ ｒｈａｂａｒｂａｒｕｍ）、スグリ属種（Ｒｉｂｅｓ ｓｐｐ．）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、キイチゴ属種（Ｒｕｂｕｓ ｓｐｐ．）、サトウキビ属種（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．）、ヤナギ属種（Ｓａｌｉｘ ｓｐ．）、ニワトコ属種（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｓｐｐ．）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、ゴマ属種（Ｓｅｓａｍｕｍ ｓｐｐ．）、シナピス属種（Ｓｉｎａｐｉｓ ｓｐｐ．）、ナス属種（Ｓｏｌａｎｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ヒラナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉｕｍ）若しくはトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、セイバンモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｅ）、ホウレンソウ属種（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｓｐｐ．）、タマリンディス・インディカ（Ｔａｍａｒｉｎｄｕｓ ｉｎｄｉｃａ）、テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、トリフォリウム属種（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、トリチコセケル・リンパウイ（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ ｒｉｍｐａｕｉ）、コムギ属種（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、デュラムコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ）、ベットコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ）、トリチカム・ヒベルナム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｈｙｂｅｒｎｕｍ）、トリチカム・マチャ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍａｃｈａ）、トリチカム・サチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）若しくはリチカム・ブルガレ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、スノキ属種（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｓｐｐ．）、ソラマメ属種（Ｖｉｃｉａ ｓｐｐ．）、ササゲ属種（Ｖｉｇｎａ ｓｐｐ．）、ニオイスミレ（Ｖｉｏｌａ ｏｄｏｒａｔａ）、ブドウ属種（Ｖｉｔｉｓ ｓｐｐ．）、並びにトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）。特定の実施形態では、作物植物は、コメ、アブラナ、カノーラ、ダイズ、トウモロコシ（トウモロコシ）、綿、サトウキビ、アルファルファ、モロコシ、又はコムギである。
本発明で使用される植物又は植物部分は、植物発育のあらゆる段階の植物を含む。特定の事例では、送達は、発芽、苗成長、栄養成長、及び生殖成長の段階中に行うことができる。特定の事例では、植物への送達は、栄養及び生直成長段階の間に行う。いくつかの事例では、組成物は、植物の花粉に送達する。いくつかの事例では、植物の種子に組成物を送達する。いくつかの事例では、植物のプロトプラストに組成物を送達する。いくつかの事例では、植物の組織に組成物を送達する。例えば、植物の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、側方分裂組織、又は介在分裂組織）に組成物を送達することもできる。いくつかの事例では、植物の永久組織（例えば、単組織（例えば、柔組織、厚角組織、若しくは厚膜組織）又は複合永久組織（例えば、木部若しくは師部）に組成物を送達する。いくつかの事例では、植物胚に組成物を送達する。いくつかの事例では、植物細胞に組成物を送達する。栄養及び生殖成長の段階は、本明細書において、「成体」又は「成熟」植物とも呼ばれる。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを植物部分に送達する事例では、植物修飾剤により植物部分を修飾してもよい。或いは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを植物の他の部分に分布させ（例えば、植物の循環系によって）、その後、それらの部分を植物修飾剤により修飾する。
脂質ナノ粒子
本発明により提供される方法及びシステムは、特定の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む任意の好適な担体又は送達方法を含み得る。脂質ナノ粒子は、一部の実施形態において、１つ若しくは複数のイオン脂質、例えば、非カチオン脂質（例えば、中性若しくはアニオン、又は双性イオン脂質）；１つ若しくは複数の共役脂質（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表５に記載される、ＰＥＧ共役脂質又はポリマーと共役した脂質など）；１つ若しくは複数のステロール（例えば、コレステロール）；並びに、任意選択で、１つ若しくは複数のターゲティング分子（例えば、共役受容体、受容体リガンド、抗体）；又はこれらの組合せを含む。
ナノ粒子形成（例えば、脂質ナノ粒子）に使用することができる脂質として、例えば、国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の表４に記載されるものが挙げられ、例えば、脂質含有ナノ粒子は、国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表４に示される脂質の１つ又は複数を含み得る。脂質ナノ粒子は、ポリマー、例えば、国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の表５に記載されるポリマーなどの別の要素を含み得る。
一部の実施形態では、共役脂質は、存在する場合、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（例えば、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ））、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧ－コハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（例えば、４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－１－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、及び国際公開第２０１９０５１２８９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）、並びにこれらの組合せのうち１つ又は複数を含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子に組み込むことができるステロールは、コレステロール又はこれらのコレステロール誘導体、例えば、国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット又は米国特許出願第２０１０／０１３０５８８号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものなどを含む。別の例示的なステロールとして、フィトステロールが挙げられ、Ｅｙｇｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ（２０２０），ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．０ｃ０１３８６（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものを含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化性脂質、非カチオン脂質、粒子の凝集を阻害する共役脂質、及びステロールを含む。これらの成分の量は、独立して、且つ所望の特性を達成するように変動し得る。例えば、一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、総脂質の約２０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％の量のイオン化性脂質（他の実施形態では、それは、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）若しくは４０～５０％（ｍｏｌ）；約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％であり得る）、総脂質の約５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％の量の非カチオン脂質、総脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％の量の共役脂質、及び総脂質の約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の量のステロールを含む。核酸（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又は鋳型核酸をコードする）に対する総脂質の比は、要望に応じて変動し得る。例えば、核酸に対する総脂質（質量又は重量）は、約１０：１～約３０：１であり得る。
一部の実施形態では、脂質と核酸の比（質量／質量比；ｗ／ｗ比）は、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、又は約６：１～約９：１の範囲であり得る。脂質及び核酸の量は、所望のＮ／Ｐ比、例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上のＮ／Ｐ比を提供するように、調節することができる。一般に、脂質ナノ粒子製剤の総脂質含量は、約５ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍｌであり得る。
脂質ナノ粒子製剤に使用することができる例示的なイオン化性脂質は、限定されないが、国際公開第２０１９０５１２８９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の表１に列挙されるものを含む。別の例示的な脂質として、限定されないが、以下の式の１つ若しくは複数が挙げられる：米国特許出願第２０１６／０３１１７５９号明細書のＸ；米国特許出願第２０１５０３７６１１５号又は米国特許第２０１６／０３７６２２４号明細書のＩ；米国特許出願第２０１６０１５１２８４号明細書のＩ、ＩＩ又はＩＩＩ；米国特許出願第２０１７０２１０９６７号明細書のＩ、ＩＡ、ＩＩ、又はＩＩＡ；米国特許第２０１５０１４００７０号明細書のＩ－ｃ；米国特許出願第２０１３／０１７８５４１号明細書のＡ；米国特許出願第２０１３／０３０３５８７号又は米国特許第２０１３／０１２３３３８号明細書のＩ；米国特許出願第２０１５／０１４１６７８号明細書のＩ；米国特許出願第２０１５／０２３９９２６号明細書のＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、又はＶ；米国特許出願第２０１７／０１１９９０４号明細書のＩ；国際公開第２０１７／１１７５２８号パンフレットのＩ又はＩＩ；米国特許出願第２０１２／０１４９８９４号明細書のＡ；米国特許出願第２０１５／００５７３７３号明細書のＡ；国際公開第２０１３／１１６１２６号パンフレットのＡ；米国特許出願第２０１３／００９０３７２号明細書のＡ；米国特許出願第２０１３／０２７４５２３号明細書のＡ；米国特許出願第２０１３／０２７４５０４号明細書のＡ；米国特許出願第２０１３／００５３５７２号明細書のＡ；国際公開第２０１３／０１６０５８号パンフレットのＡ；国際公開第２０１２／１６２２１０号パンフレットのＡ；米国特許出願第２００８／０４２９７３号明細書のＩ；米国特許出願第２０１２／０１２８７６７０号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶ；米国特許出願第２０１４／０２００２５７号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願第２０１５／０２０３４４６号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願第２０１５／０００５３６３号明細書のＩ又はＩＩＩ；米国特許出願第２０１４／０３０８３０４号明細書のＩ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＣ、ＩＩＤ、又はＩＩＩ－ＸＸＩＶ；米国特許出願第２０１３／０３３８２１０号明細書の；国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレットのＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ；米国特許出願第２０１２／０１０１１４７８号明細書のＡ；米国特許出願第２０１２／００２７７９６号明細書のＩ又はＸＸＸＶ；米国特許出願第２０１２／００５８１４４号明細書のＸＩＶ又はＸＶＩＩ；米国特許出願第２０１３／０３２３２６９号明細書の；米国特許出願第２０１１／０１１７１２５号明細書のＩ；米国特許出願第２０１１／０２５６１７５号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願第２０１２／０２０２８７１号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ；米国特許出願第２０１１／００７６３３５号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、又はＸＶＩ；米国特許出願第２００６／００８３７８号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願第２０１３／０１２３３３８号明細書のＩ；米国特許出願第２０１５／００６４２４２号明細書のＩ又はＸ－Ａ－Ｙ－Ｚ；米国特許出願第２０１３／００２２６４９号明細書のＸＶＩ、ＸＶＩＩ、又はＸＶＩＩＩ；米国特許出願第２０１３／０１１６３０７号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願第２０１３／０１１６３０７号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願第２０１０／００６２９６７号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願第２０１３／０１８９３５１号明細書のＩ～Ｘ；米国特許出願第２０１４／００３９０３２号明細書のＩ；米国特許出願第２０１８／００２８６６４号明細書のＶ；米国特許出願第２０１６／０３１７４５８号明細書のＩ；米国特許出願第２０１３／０１９５９２０号明細書のＩ。
一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９に記載されているように、ＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３ ｌＺ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３，ｌ－テトラエン－ｌ９－イル－４－（ジメチルペンチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１０に記載されているように、脂質ＡＴＸ－００２である。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１１に記載されているように、（ｌ３Ｚ，ｌ６Ｚ）－Ａ，Ａ－ジメチル－３－ノニルドコサ－ｌ３、ｌ６－ジエン－１－アミン（化合物３２）である。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１２に記載されているように、化合物６又は化合物２２である。
例示的な非カチオン脂質として、限定されないが、以下のものが挙げられる：ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル
）－シクロヘキサン－１－カルボン酸ジオレオイル－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（例えば、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（例えば、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ）、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－１－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素添加ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、リソホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、又はそれらの混合物。さらに、他のジアセチルホスファチジルコリン及びジアセチルホスファチジルエタノールアミンリン脂質も使用できることは理解される。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０～２４炭素鎖を有する脂肪酸由来のアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。特定の実施形態における別の例示的な脂質として、限定しないが、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．０ｃ０１３８６（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものが挙げられる。こうした脂質には、一部の実施形態では、ｍＲＮＡを用いた肝トランスフェクションを改善することが判明している植物脂質（例えば、ＤＧＴＳ）が含まれる。
脂質ナノ粒子での使用に適した非カチオン脂質の他の例として、限定しないが、無リン脂質、例えば、ステアリルアミン、ドデエイルアミン、ヘキサアデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキル－アリール硫酸塩ポリエトキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウム臭化物、セラミド、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。他の非カチオン脂質は、国際公開第２０１７／０９９８２３号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書に記載されており、それらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、非カチオン脂質は、米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の式Ｉ、ＩＩ、若しくはＩＶのオレイン酸又は化合物である。非カチオン脂質は、例えば、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～３０％（ｍｏｌ）を占め得る。一部の実施形態では、非カチオン脂質含有率は、例えば、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の５～２０％（ｍｏｌ）又は１０～１５％（ｍｏｌ）である。複数の実施形態では、イオン化性脂質と中性脂質のモル比は、約２：１～約８：１（例えば、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、又は８：１）の範囲である。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質を一切含まない。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、膜完全性を賦与するために、ステロールなどの成分をさらに含み得る。脂質ナノ粒子に使用することができるステロールの一例は、コレステロール及びその誘導体である。コレステロール誘導体の非限定的な例として、５ａ－コレスタノール、５３－コプロスタノール、コレステリル－（２－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル、及び６－ケトコレスタノールなどの極性類似体；５ａ－コレスタン、コレステノン、５ａ－コレスタノン、５ｐ－コレスタノン、及びデカン酸コレステリルなどの非極性類似体；並びにそれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、コレステロール誘導体は、極性類似体、例えば、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエステルである。例示的なコレステロール誘導体は、国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
一部の実施形態では、膜完全性を賦与する成分、例えば、ステロールなどは、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～５０％（ｍｏｌ）（例えば、０～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、又は４０～５０％）を含む。一部の実施形態では、こうした成分は、脂質ナノ粒子の総脂質の２０～５０％（ｍｏｌ）、３０～４０％（ｍｏｌ）である。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は共役脂質分子を含み得る。一般に、これらは、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、且つ／又は立体安定化をもたらす。例示的な共役脂質として、限定されないが、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）、カチオンポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲート、及びそれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、共役脂質分子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）共役脂質である。
例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートとして、限定されないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（例えば、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ））、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（例えば、４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－１－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、又はそれらの混合物が挙げられる。別の例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第５，８８５，６ｌ３号明細書、米国特許第６，２８７，５９ｌ号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１７５６８２号明細書、米国特許出願公開第２００８／００２００５８号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１１７１２５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書、米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０４号明細書、及び米国特許出願公開第／０９９８２３号明細書に記載されており、これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書（その内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）の式ＩＩＩ、ＩＩＩ－ａ－Ｉ、ＩＩＩ－ａ－２、ＩＩＩ－ｂ－１、ＩＩＩ－ｂ－２の化合物である。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１５０３７６１１５号明細書又は米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書（いずれの内容も、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の式ＩＩのものである。一部の実施形態では、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウロイルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであってよい。ＰＥＧ－脂質は、以下：ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（ｌ－［８’－（コレスト－５－エン－３［β］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［ω］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［ω］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］の１つ若しくは複数であり得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、以下：
Figure 2022542839000176
から選択される構造を含む。
一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質の代わりに、ＰＥＧ以外の分子と共役した脂質を使用することもできる。例えば、ＰＥＧ－脂質の代わりに、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）、及びカチオンポリマー脂質（ＧＰＬ）コンジュゲートを使用することができる。
例示的な共役脂質、即ち、ＰＥＧ－脂質、（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート、及びカチオンポリマー脂質は、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレットの表２に列挙されるＰＣＴ及びＬＩＳ特許出願に記載されており、これらの内容は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ＰＥＧ又は共役脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～２０％（ｍｏｌ）を占め得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ又は共役脂質の含有率は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０．５～１０％又は２～５％（ｍｏｌ）である。イオン化性脂質、非カチオン脂質、ステロール、及びＰＥＧ／共役脂質のモル比は、必要に応じて変動し得る。例えば、脂質粒子は、組成物のモル又は総重量当たり３０～７０％のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり０～６０％のコレステロールと、組成物のモル又は総重量当たり０～３０％の非カチオン脂質と、組成物のモル又は総重量当たり１～１０％の共役脂質と、を含み得る。好ましくは、組成物は、組成物のモル又は総重量当たり３０～４０％のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり４０～５０％のコレステロールと、組成物のモル又は総重量当たり１０～２０％の非カチオン脂質と、を含む。一部の実施形態では、組成物は、組成物のモル又は総重量当たり５０～７５％のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり２０～４０％のコレステロールと、組成物のモル又は総重量当たり５～１０％の非カチオン脂質と、組成物のモル又は総重量当たり１～１０％の共役脂質である。組成物は、組成物のモル又は総重量当たり６０～７０％のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり２５～３５％のコレステロールと、組成物のモル又は総重量当たり５～１０％の非カチオン脂質と、を含み得る。組成物はまた、組成物のモル又は総重量当たり最大９０％のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり２～１５％の非カチオン脂質と、を含み得る。製剤はまた、例えば、組成物のモル若しくは総重量当たり８～３０％のイオン化性脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり５～３０％の非カチオン脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり０～２０％のコレステロールと；組成物のモル若しくは総重量当たり４～２５％のイオン化性脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり４～２５％の非カチオン脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり２～２５％のコレステロールと、組成物のモル若しくは総重量当たり１０～３５％の共役脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり５％のコレステロール；又は組成物のモル若しくは総重量当たり２～３０％のイオン化性脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり２～３０％の非カチオン脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり１～１５％のコレステロールと、組成物のモル若しくは総重量当たり２～３５％の共役脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり１～２０％のコレステロール；或いはまた、組成物のモル若しくは総重量当たり最大９０％のイオン化性脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり２～１０％の非カチオン脂質と、又は組成物のモル若しくは総重量当たり１００％のカチオン脂質であってもよい。一部の実施形態では、脂質粒子製剤は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化性脂質、リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ化脂質を含む。一部の他の実施形態では、脂質粒子製剤は、６０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化性脂質、コレステロール及びＰＥＧ化脂質を含む。
一部の実施形態では、脂質粒子は、イオン化性脂質、非カチオン脂質（例えば、リン脂質）、ステロール（例えば、コレステロール）及びＰＥＧ化脂質を含み、ここで、脂質のモル比は、イオン化性脂質の場合、２０～７０モル％の範囲で、目標は４０～６０であり、非カチオン脂質のモルパーセントは、０～３０の範囲で、目標は０～１５、ステロールのモルパーセントは、２０～７０の範囲で、目標は３０～５０、ＰＥＧ化脂質のモルパーセントは、１～６の範囲で、目標は２～５である。
一部の実施形態では、脂質粒子は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化性脂質／非カチオン脂質／ステロール／共役脂質を含む。
一態様では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。
一部の実施形態では、１つ又は複数の別の化合物を含有させることができる。そうした化合物は個別に投与することもできるし、又は追加的化合物を本発明の脂質ナノ粒子に含有させることもできる。言い換えれば、脂質ナノ粒子は、核酸又は最初の核酸とは異なる少なくとも１つの第２の核酸に加えて、他の化合物を含有することができる。限定はしないが、他の追加的化合物は、以下：小若しくは大有機又は無機分子、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及びその誘導体、ペプチド模倣物、核酸、核酸類似体及びその誘導体、生体材料から調製された抽出物、又はそれらの任意の組合せから選択することができる。
一部の実施形態では、ターゲティングドメインの付加により、ＬＮＰを特定の組織に指向させる。例えば、生物学的リガンドをＬＮＰの表面に展示して、同種受容体を展示する細胞との相互作用を増強し、それにより、上記受容体との結合、並びに細胞が受容体を発現する組織へのカーゴ送達を駆動することができる。一部の実施形態では、生物学的リガンドは、肝臓への送達を駆動するリガンドであってもよく、例えば、ＧａｌＮＡｃを展示するＬＮＰは、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を展示する肝細胞に対する核酸カーゴの送達を達成する。Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８（７）：１３５７－１３６４ ２０１０）の論文は、観察可能なＬＮＰカーゴ効果（例えば、図６を参照）についてＡＳＧＰＲに依存的なＬＮＰを取得するためのＰＥＧ－脂質に対する三価ＧａｌＮＡｃリガンド（ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－ＤＳＧ）の共役を教示している。例えば、葉酸塩、トランスフェリン、又は抗体を含む他のリガンド展示ＬＮＰ製剤は、国際公開第２０１７２２３１３５号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）、さらには、そこで使用される参照文献、即ち、Ｋｏｌｈａｔｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ ８：１９７－２０６；Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ ａｎｄ Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２０１１ １６：１３８８－１４１２；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ．２０１０ ２７：２８６－２９８；Ｐａｔｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２００８ ２５：１－６１；Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１ １２：２７０８－２７１４；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００８ ５：３０９－３１９；Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：１３５７－１３６４；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ ８２０：１０５－１１６；Ｂｅｎ－Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ ７５７：４９７－５０７；Ｐｅｅｒ ２０１０ Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０：６３－６８； Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７ １０４：４０９５－４１００；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１ ７２１：３３９－３５３；Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：２０２８－２０３７；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５ ２３：７０９－７１７；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８ ３１９：６２７－６３０；及びＰｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ １８：１１２７－１１３３で論じられている。
一部の実施形態では、イオン化性脂質、両性リン脂質、コレステロール及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質などの伝統的成分を含む製剤に対するＳｅｌｅｃｔｉｖｅ ＯＲｇａｎ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＳＯＲＴ）分子の添加により、組織特異的活性についてＬＮＰを選択する。Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ １５（４）：３１３－３２０（２０２０）の教示は、補足的「ＳＯＲＴ」成分の添加によって、インビボＲＮＡ送達プロファイルを厳密に改変し、ＳＯＲＴ分子のパーセンテージ及び生物物理学的特性に応じて組織特異的（例えば、肺、肝臓、脾臓）遺伝子送達を媒介することを実証している。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、生分解性、イオン化性脂質を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、オクタデカ－９，１２－ジエン酸（９Ｚ，ｌ２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルを含み、これは、（９Ｚ，ｌ２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン酸）３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルとも呼ばれる。例えば、国際公開第２０１９／０６７９９２号パンフレット、国際公開第２０１７／１７３０５４号パンフレット、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット、及び国際公開第２０１４／１３６０８６号パンフレット、並びにそこに記載される参照文献に記載の脂質を参照されたい。一部の実施形態では、ＬＮＰ脂質に関して、カチオン（性）及びイオン化性という用語は互換可能であり、例えば、イオン化性脂質は、ｐＨによってはカチオン性である。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの複数の構成要素を単一のＬＮＰ製剤として調製してもよく、例えば、ＬＮＰ製剤は、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドコードするｍＲＮＡ及びＲＮＡ鋳型を含む。核酸成分の比は、治療薬の特性を最大にするために変動させてよい。一部の実施形態では、ＲＮＡ鋳型と、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドコードするｍＲＮＡの比は、モル比で約１：１～１００：１、例えば、約１：１～２０：１、約２０：１～４０：１、約４０：１～６０：１、約６０：１～８０：１、又は約８０：１～１００：１である。他の実施形態では、複数の核酸のシステムは、個別の製剤、例えば、鋳型ＲＮＡを含む１つのＬＮＰ製剤と、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドコードするｍＲＮＡを含む第２のＬＮＰ製剤により調製してもよい。一部の実施形態では、システムは、ＬＮＰに製剤化された３つ以上の核酸成分を含み得る。一部の実施形態では、システムは、少なくとも１つのＬＮＰに製剤化された、タンパク質、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム、及び鋳型ＲＮＡを含み得る。
一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定して、数１０ｎｍ～数１００ｎｍであり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、例えば、約４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、又は１５０ｎｍであってよい。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約９０ｎｍ、約５０ｎｍ～約８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約５０ｎｍ～約６０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約８０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、又は約９０ｎｍ～約１００ｎｍであってよい。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約７０ｎｍ～約１００ｎｍであってよい。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約８０ｎｍであってよい。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約１００ｎｍであってよい。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約１ｍｍ～約５００ｍｍ、約５ｍｍ～約２００ｍｍ、約１０ｍｍ～約１００ｍｍ、約２０ｍｍ～約８０ｍｍ、約２５ｍｍ～約６０ｍｍ、約３０ｍｍ～約５５ｍｍ、約３５ｍｍ～約５０ｍｍ、又は約３８ｍｍ～約４２ｍｍの範囲である。
ＬＮＰは、いくつかの事例では、比較的均質であり得る。多分散指数を用いて、ＬＮＰの均質性、例えば、脂質ナノ粒子の粒度分布を示すことができる。低い（例えば、０．３未満の）多分散指数は、概して、狭い粒度分布を示す。ＬＮＰは、約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、又は０．２５の多分散指数を有し得る。一部の実施形態では、ＬＮＰの多分散指数は、約０．１０～約０．２０であり得る。
ＬＮＰのゼータ電位を用いて、組成物の界面動電位を示すことができる。一部の実施形態では、ゼータ電位は、ＬＮＰの表面電荷を表し得る。高度に荷電された種は、身体内の細胞、組織、及び他の要素と不必要に相互作用する可能性があるため、正又は負の比較的低い電荷を持つ脂質ナノ粒子が一般的に望ましい。一部の実施形態では、ＬＮＰのゼータ電位は、約－１０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－５ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約１５ｍＶ、又は約＋５ｍＶ～約１０ｍＶであってよい。
タンパク質及び／又は核酸、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド若しくはポリペプチドをコードするｍＲＮＡの封入の効率は、提供される初期量と比較して、封入されるか、若しくは調製後にＬＮＰと結合されるタンパク質及び／又は核酸の量を表す。封入効率は、高い（例えば、１００％近く）のが望ましい。封入効率は、例えば、１若しくは複数種の溶媒又はデタージェントで脂質ナノ粒子を分解する前と後で、脂質ナノ粒子を含有する溶液中のタンパク質又は核酸の量を比較することにより、測定することができる。アニオン交換樹脂を用いて、溶液中の遊離タンパク質又は核酸（例えば、ＲＮＡ）の量を測定することができる。蛍光を用いて、溶液中の遊離タンパク質又は核酸（例えば、ＲＮＡ）の量を測定することができる。本明細書に記載の脂質ナノ粒子の場合、タンパク質及び／又は核酸の封入効率は、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも９５％であり得る。
ＬＮＰは、任意選択で、１つ又は複数のコーティングを含んでもよい。一部の実施形態では、ＬＮＰは、コーティングを有するカプセル、フィルム、又は錠剤に製剤化してもよい。本明細書に記載の組成物を含むカプセル、フィルム、又は錠剤は、任意の有用なサイズ、引張強度、硬度若しくは密度を有し得る。
ＬＮＰのさらに別の例示的な脂質、製剤、方法、及び特性決定は、国際公開第２０２００６１４５７号パンフレットに教示されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）又はＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を用いて、インビトロ又はエクスビボ細胞リポフェクションを実施する。特定の実施形態では、ＧｅｎＶｏｙ＿ＩＬＭ ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ ｍｉｘ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＬＮＰを製剤化する。特定の実施形態では、ＬＮＰは、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２‐ＤＭＡ）又はジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノ酪酸塩（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ若しくはＭＣ３）を用いて、ＬＮＰを製剤化するが、その製剤及びインビボでの使用については、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ５１（３４）：８５２９－８５３３（２０１２）に教示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、例えば、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ ＲＮＰ、ｇＲＮＡ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの送達のために最適化されたＬＮＰ製剤は、国際公開第２０１９０６７９９２号パンフレット及び国際公開第２０１９０６７９１０号パンフレットに記載されており、そのいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
核酸の送達に有用な別の具体的なＬＮＰ製剤は、米国特許第８１５８６０１号明細書及び米国特許第８１６８７７５号明細書（そのいずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、これは、ＯＮＰＡＴＴＲＯの名称で販売されているパチシランに使用される製剤を含む。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ＬＮＰの例示的な用量としては、約０．１、０．２５、０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、８、１０、又は１００ ｍｇ／ｋｇ（ＲＮＡ）を挙げることができる。システムの１つ若しくは複数の成分をコードする核酸を含むＡＡＶの例示的な用量としては、約１０１１、１０１２、１０１３、及び１０１４ｖｇ／ｋｇのＭＯＩを挙げることができる。
本明細書に引用される全ての刊行物、特許出願、特許、並びに他の出版物及び参照文献（例えば、配列データベース参照番号）は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書に、例えば本明細書の任意の表に参照として掲載されるＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、及びＥｎｔｒｅｚは全て、参照により本明細書に組み込まれる。別に明示されない限り、本明細書の全ての表を含め、本明細書に記載される配列アクセッション番号は、２０１９年７月１９日現在で最新のデータベースエントリーを指す。１つの遺伝子又はタンパク質に複数の配列アクセッション番号が付いている場合、これら配列変異体の全てが包含される。
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。これらの実施例は、説明の目的で提供されるものであり、本発明の範囲又は内容を限定するものとして解釈すべきではない。
実施例１：哺乳動物細胞へのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムの送達
この実施例では、哺乳動物細胞ゲノムへの外因性ＤＮＡの部位特異的挿入のために哺乳動物細胞に送達されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノム編集システムを説明する。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムのポリペプチド成分は、表１、第１列から選択されるリコンビナーゼであり、鋳型ＤＮＡ成分は、例えば、表１の対応する行に列挙されるような、標的組換え部位を含むプラスミドＤＮＡである。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、以下の試験物質でトランスフェクトする：
１．スクランブルＤＮＡ対照
２．前述のポリペプチドをコードするＤＮＡ
３．前述の鋳型ＤＮＡ
４．２と３の組合せ
トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を少なくとも４日間培養し、部位特異的ゲノム編集について検定する。ゲノムＤＮＡを各群のＨＥＫ２９３細胞から単離する。表１の列４から選択された適切なゲノム遺伝子座と隣接するプライマーを用いて、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に泳動させて、増幅したＤＮＡの長さを測定する。
ＤＮＡプラスミド鋳型を標的ゲノムに挿入するＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）ゲノム編集事象の成功を示す、予想長さのＰＣＲ産物は、上の群４の完全Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムでトランスフェクトした細胞だけに観察される。
実施例２：Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いた哺乳動物細胞への遺伝子発現単位の標的送達
この実施例では、哺乳動物ゲノムに異種遺伝子発現単位を挿入するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディターの作製及び使用を説明する。
この実施例では、リコンビナーゼタンパク質は、表１、第１列から選択される。リコンビナーゼタンパク質は、ＤＮＡ組込みについて表１の第４列に列挙される、対応するゲノム遺伝子座をターゲティングする。鋳型ＲＮＡ成分は、標的組換え部位及び遺伝子発現単位を含むプラスミドＤＮＡである。遺伝子発現単位は、少なくとも１つのコーディング配列と作動可能に連結した少なくとも１つの調節配列を含む。この実施例では、調節配列は、ＣＭＶプロモータ及びエンハンサー、増強された翻訳エレメント、及びＷＰＲＥを含む。コーディング配列は、ＧＦＰオープンリーディングフレームである。
ＨＥＫ２９３細胞は、以下の試験物質でトランスフェクトする：
１．スクランブルＤＮＡ対照
２．前述のポリペプチドをコードするＤＮＡ
３．前述の鋳型ＤＮＡ
４．２と３の組み合わせ
トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３細胞を少なくとも４日間培養し、部位特異的Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集について検定する。ゲノムＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞から単離し、ゲノム中の標的組込み部位とフランキングするプライマーを用いて、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に泳動させて、ＤＮＡの長さを測定する。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）ゲノム編集事象の成功を示す、予想長さのＰＣＲ産物は、群４の試験物質（完全Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム）でトランスフェクトした細胞に検出される。
トランスフェクトした細胞をさらに１０日間培養し、複数の細胞培養継代後に、ＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーにより検定する。各細胞集団からＧＦＰ陽性の細胞のパーセントを算出する。ＧＦＰ陽性細胞は、群４の試験物質でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の集団に検出され、これは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集により哺乳動物細胞ゲノムに付加された遺伝子発現単位が発現されることを立証するものである。
実施例３：Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いた哺乳動物細胞へのスプライスアクセプター単位の標的送達。
この実施例では、上流エキソンのスプライスアクセプターとして作用させる目的で、異種配列をイントロン領域に付加するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集システムの作製及び使用を説明する。
第１イントロンへの、５’末端にスプライスアクセプター部位を、また３’末端にポリＡテールを含む新しいエキソンのスプライシングによって、新たなエキソンにスプライシングされた天然遺伝子座の第１天然エキソンを含有する成熟ｍＲＮＡが得られる。
この実施例では、リコンビナーゼタンパク質は、表１、第１列から選択される。リコンビナーゼタンパク質は、ＤＮＡ組込みについて表１、第４列に列挙される、対応するゲノム遺伝子座をターゲティングする。鋳型ＤＮＡは、成熟ＧＦＰ（開始コドンは除去される）の第１アミノ酸の５’側に隣接してスプライスアクセプター部位を備え、且つ停止コドンの下流に３’ポリＡテイルを備えるＧＦＰをコードする。
ＨＥＫ２９３細胞は、以下の試験物質でトランスフェクトする：
１．スクランブルＤＮＡ対照
２．前述のポリペプチドをコードするＤＮＡ
３．前述の鋳型ＤＮＡ
４．２と３の組合せ
トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３細胞を少なくとも４日間培養し、部位特異的Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集及び適切なｍＲＮＡプロセシングについて検定する。ゲノムＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞から単離する。逆転写－ＰＣＲを実施して、標的遺伝子座の第１天然エキソンと、新しいエキソンとを含む成熟ｍＲＮＡを測定する。ＲＴ－ＰＣＲ反応は、標的遺伝子座の第１天然エキソンに結合するフォワードプライマー、及びＧＦＰに結合するリバースプライマーを用いて実施する。ＲＴ－ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に泳動させて、ＤＮＡの長さを測定する。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集事象の成功を示す、予想長さのＰＣＲ産物は、群４の試験物質でトランスフェクトした細胞に検出される。この結果は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集システムが、上流エキソンのスプライスアクセプターとして作用させる目的で、或る遺伝子をコードする異種配列をイントロン領域に付加することができることを立証するものである。
トランスフェクトした細胞をさらに１０日間培養し、複数の細胞培養継代後に、ＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーにより検定する。各細胞集団からＧＦＰ陽性の細胞のパーセントを算出する。ＧＦＰ陽性細胞は、群４の試験物質でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の集団に検出され、これは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集を介して哺乳動物細胞ゲノムに付加される遺伝子発現単位が発現されることを立証するものである。
実施例４：哺乳動物細胞におけるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの特異性
この実施例は、哺乳動物細胞ゲノムへの外性ＤＮＡの部位特異的挿入のために哺乳動物細胞に送達されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノムシステム、及び部位特異的挿入の特異性の測定を記載する。
この実施例では、先行する実施例のいずれかに記載されるように、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に構築する。トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を少なくとも４日間培養してから、部位特異的ゲノム編集について検定する。隣接ゲノムＤＮＡを増幅する鋳型ＤＮＡに対して特異的なフォワードプライマーを用いて、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，１０５１－１０５７（２００７）に記載されているように、線状増幅ＰＣＲを実施する。次に、ＭｉＳｅｑ装置での次世代シーケンシング技術を用いて、増幅ＰＣＲ産物を配列決定する。ＭｉＳｅｑリードをＨＥＫ２９３Ｔゲノムにマッピングして、ゲノム内の組込み部位を特定する。
標的ゲノム部位にマッピングで対応するＬＡＭ－ＰＣＲシーケンシングリードのパーセントが、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの特異性である。
ＬＡＭ－ＰＣＲシーケンシングリードが対応する総ゲノム部位の数は、組換え部位の総数である。
実施例５：哺乳動物細胞におけるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの効率
この実施例は、哺乳動物細胞ゲノムへの外性ＤＮＡの部位特異的挿入のために哺乳動物細胞に送達されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノムシステム、及び部位特異的挿入の特異性の測定を記載する。
この実施例では、先行する実施例のいずれかに記載されるように、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に構築する。トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を少なくとも４日間培養してから、部位特異的ゲノム編集について検定する。Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７（５），１９７－２０８，２０１６に記載されているように、デジタルドロップレットＰＣＲを実施する。フォワードプライマーは、鋳型ＤＮＡに結合し、リバースプライマーは、表１の第４カラムから選択される適切なゲノム遺伝子座の片側に結合するため、ＰＣＲ増幅は、標的ＤＮＡの組込み時にのみ予測される。標的部位に対するプローブは、ＦＡＭ蛍光色素を含有し、ゲノム中の標的ＤＮＡのコピー数を計測するために使用される。ハウスキーピング遺伝子（例えば、ＲＰＰ３０）に対して特異的なプライマー及びＨＥＸ－蛍光色素プローブを用いて、ドロップレット当たりのゲノムＤＮＡのコピーを計測する。
ドロップレット当たりのハウスキーピングＤＮＡのコピー数に対して正規化されたドロップレット当たりの標的ＤＮＡのコピー数が、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの効率である。
実施例６：細胞中のリコンビナーゼのコピー数の決定
以下の実施例は、細胞を基準とするリコンビナーゼの絶対定量を記載する。この測定は、ＡＱＵＡ質量分析法に基づく方法を用いて実施され、こうした方法は、例えば、下記ＵＲＬ
（ＵＲＬ）：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｐｉｉ／Ｓ１０４６２０２３０４００２０８７？ｖｉａ％３Ｄｉｈｕｂ
で入手可能である。
細胞にリコンビナーゼ及びＤＮＡ鋳型を送達してから、組換えを２４時間進行させた後、細胞を定量し、次に、このＭＳ方法により定量する。この方法は、２段階を含む。
第１段階で、リコンビナーゼのアミノ酸配列を検査し、分析のために代表的なトリプシンペプチドを選択する。次に、タンパク質分解の過程で生成された対応するネイティブペプチドを厳密に模倣するアミノ酸配列を用いて、ＡＱＵＡペプチドを合成する。しかし、質量分析計が、被検物質と内部標準を識別することができるように、安定した同位体を１つの残基に組み込む。合成ペプチドとネイティブペプチドは、クロマトグラフィー共溶出、イオン化効率、及びフラグメントイオンの相対分布を含め、同じ物理化学的特性を共有するが、それらの質量の相違により、質量分析計では差次的に検出される。次に、合成ペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ技術により分析して、ペプチドの保持時間を確認し、フラグメントイオン強度を決定し、ＳＲＭ分析のためのイオンを選択する。このようなＳＲＭ実験では、トリプル四重極質量分析を、第１走査四極子、即ち、Ｑ１中の予測前駆体イオンを選択するように指令する。この１つの質量電荷（ｍ／ｚ）比を有するイオンだけが、衝突室（Ｑ２）に向けられて、フラグメント化される。得られた生成物イオンを第３四極子（Ｑ３）に通過させ、そこで、単一フラグメントのｍ／ｚ比を、狭いｍ／ｚウィンドウを介してモニターする。
第２段階は、細胞又は組織溶解物からのリコンビナーゼの定量を含む。定量された細胞数又は組織の質量を用いて、反応を開始し、それを用いて、定量を細胞基準に対して正規化する。細胞溶解物を分離した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるアッセイのダイナミックレンジを増大するためのタンパク質分解に付し、続いて、リコンビナーゼが泳動するゲルの領域の切除を実施する。ゲル内消化を実施して、ネイティブトリプシンペプチドを取得する。ゲル内消化は、ＡＱＵＡペプチドの存在下で実施するが、これは、消化過程中にゲル片に添加する。タンパク質分解の後、重いペプチドと軽いペプチドの両方を含有する複合ペプチド混合物を、第１段階で決定したパラメータを用いて、ＬＣ－ＳＲＭ試験で分析する。
質量分析に基づく定量の結果を、ロードされたタンパク質の数に変換して、細胞当たりのリコンビナーゼの数を決定する。
実施例７：細胞内部のＤＮＡのコピー数
Ｑ－ＦＩＳＨ
以下の実施例は、細胞基準での送達されたＤＮＡ鋳型の定量を記載する。この実施例において、リコンビナーゼが組み込むことになるＤＮＡは、ＤＮＡ－プローブ結合部位を含有する。リコンビナーゼ及びＤＮＡ鋳型を細胞に送達したら、組換えを２４時間進行させた後、細胞を定量し、定量的蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（Ｑ－ＦＩＳＨ）のために調製する。Ｑ－ＦＩＳＨは、Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ ５５５色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号Ｆ３２９４８）と共に、ＦＩＳＨ Ｔａｇ ＤＮＡ Ｏｒａｎｇｅ Ｋｉｔを用いて実施する。手短には、キットマニュアルに記載されるニック翻訳、色素標識、及び精製の手順によって、ＤＮＡ鋳型上のＤＮＡ－プローブ結合部位に結合するＤＮＡプローブを作製する。次に、キットマニュアルに記載されるように、細胞をＤＮＡプローブで標識する。３７℃及び５％ＣＯ２に維持しながら、６３×油浸対物レンズを用いるＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡で細胞を撮像する。ＤＮＡプローブを５５５ｎｍレーザ励起に付して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒを刺激する。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを書き込んで、既知量のＤＮＡを用いて作製した標準と比較して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ強度を測定する。この方法を用いて、細胞に送達された鋳型ＤＮＡの量を決定する。
ｑＰＣＲ
以下の施例は、細胞基準での送達されたＤＮＡ鋳型の定量を記載する。この実施例において、リコンビナーゼが組み込むことになるＤＮＡは、ＤＮＡ－プローブ結合部位を含有する。リコンビナーゼ及びＤＮＡ鋳型を細胞に送達したら、組換えを２４時間進行させた後、細胞を定量し、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のために細胞を調製する。ｑＰＣＲは、このプロトコルのための標準的キット、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｄｕｃｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ｐｃｒ／ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ－ｐｃｒ／ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ－ｐｃｒ－ａｓｓａｙｓ－ｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）を用いて実施する。手短には、送達された鋳型ＤＮＡの領域と、特定のアンプリコンに対するプローブを特異的に増幅するプライマーを設計する。定量した純粋な鋳型ＤＮＡの段階希釈を用いて、閾値Ｃｔ数をＤＮＡ鋳型の数と相関させることにより、標準曲線を作成する。次に、製造者の指示に従い、分析対象の細胞からＤＮＡを抽出して、全ての追加成分と一緒にｑＰＣＲ反応に投入する。続いて、サンプルを適切なｑＰＣＲ装置で分析して、Ｃｔ数を決定し、次に、これを絶対定量のために標準曲線にマッピングする。この方法を用いて、細胞に送達された鋳型ＤＮＡの量を決定する。
実施例８：ＤＮＡ：リコンビナーゼの細胞内比
以下の実施例は、標的細胞中のリコンビナーゼタンパク質と鋳型ＤＮＡの比の決定を記載する。リコンビナーゼ及びＤＮＡ鋳型を細胞に送達してから、組換えを２４時間進行させた後、細胞を定量し、前述した実施例に概説したように、リコンビナーゼ及び鋳型ＤＮＡの定量のために細胞を調製する。これらの２つの値（細胞当たりのリコンビナーゼ及び細胞当たりの鋳型ＤＮＡ）を除算（細胞当たりのリコンビナーゼ／細胞当たりの鋳型ＤＮＡ）して、これらの量のバルク平均比を決定する。この方法を用いて、細胞に送達されたリコンビナーゼと鋳型ＤＮＡの比を決定する。
実施例９：ＤＮＡ損傷応答阻害剤の存在下での活性－ＮＨＥＪ阻害剤の存在下での活性
以下の実施例は、リコンビナーゼの活性についてこれらの経路に関与するタンパク質の発現に対する依存性がないことを明示するために、非相同末端結合の阻害剤の存在下での、リコンビナーゼタンパク質の活性の検定を記載する。手短には、上の実施例で概説したリコンビナーゼ活性の効率を決定するために概説されるアッセイを実施する。しかし、この場合、２つの個別の実験を実施する。
実験１では、リコンビナーゼ及び鋳型ＤＮＡの送達から２４時間後に、１μＭのＮＨＥＪ阻害剤Ｓｃｒ７（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｓｉｇｍａ／ｓｍｌ１５４６？ｌａｎｇ＝ｅｎ＆ｒｅｇｉｏｎ＝ＵＳ）を細胞増殖培地に添加して、この経路を阻害する。プロトコルの他の全ての要素は同じである。
実験２では、細胞は、実験１と同じように操作するが、培地に阻害剤を添加しない。いずれの実験も上の実施例に従って効率について分析した後、非阻害活性と比較した％阻害活性を決定する。
実施例１０：ＤＮＡ損傷応答阻害剤の存在下での活性－ＨＤＲ阻害剤の存在下での活性
以下の実施例は、リコンビナーゼの活性についてこれらの経路に関与するタンパク質の発現に対する依存性がないことを明示するために、相同組換えの阻害剤の存在下での、リコンビナーゼタンパク質の活性の検定を記載する。手短には、上の実施例で概説したリコンビナーゼの効率を決定するために概説されるアッセイを実施する。しかし、この場合、２つの個別の実験を実施する。
実験１では、リコンビナーゼ及び鋳型ＤＮＡの送達から２４時間後に、１μＭのＨＲ阻害剤Ｂ０２（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂ０２．ｈｔｍｌ）を細胞増殖培地に添加して、この経路を阻害する。プロトコルの他の全ての要素は同じである。
実験２では、細胞は、実験１と同じように操作するが、培地に阻害剤を添加しない。いずれの実験も上の実施例に従って効率について分析した後、非阻害活性と比較した％阻害活性を決定する。
実施例１１：核リコンビナーゼ対細胞質リコンビナーゼのパーセンテージ
以下の実施例は、標的細胞の核対細胞質中のリコンビナーゼタンパク質の比の決定を記載する。本明細書に記載のように、リコンビナーゼ及びＤＮＡ鋳型を細胞に送達してから１２時間後に、細胞を定量し、分析のために調製する。下記の標準キットを用い、製造者の指示：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによるＮＥ－ＰＥＲ Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎに従って、細胞を核画分及び細胞質画分に分割する。核画分及び細胞質画分の両方を維持した後、上の実施例で概説した質量分析法に基づくリコンビナーゼ定量アッセイに付す。この方法を用いて、細胞中の核リコンビナーゼと細胞質リコンビナーゼの比を決定する。
実施例１２：植物細胞への送達
この実施例は、少なくとも１つのリコンビナーゼを植物細胞に送達する方法を説明し、この場合、植物細胞は、植物又は植物部分中に位置する。より具体的には、この実施例は、切除したダイズ胚の生殖系列細胞中の内在性植物遺伝子（即ち、フィトエン不飽和化酵素、ＰＤＳ）を編集する目的で、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇリコンビナーゼ及びその鋳型ＤＮＡの送達を記載する。この実施例は、複数の障壁（例えば、複数の細胞層、種皮、細胞壁、原形質膜）を介して送達されたトランスジーンをコードするポリヌクレオチドをダイズ生殖系列細胞に直接送達し、それにより、標的ヌクレオチド配列、ＰＤＳの遺伝的改変をもたらすことを説明する。記載される方法は、細菌により媒介される形質転換（例えば、アグロバクテリウム種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）による）又はバイオリステック法の一般的技術を使用しない。
ダイズ（グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ））中の内在性フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）をターゲティングするリコンビナーゼ及び単一鋳型ＤＮＡの送達のためにプラスミドを設計する。当業者には、他のリコンビナーゼ及び鋳型ＤＮＡ配列をコードするために類似のプラスミドが容易に設計され、これは、任意選択で、異なるエレメント（例えば、異なるプロモータ、ターミネータ、選択若しくは検出可能なマーカ、細胞浸透性ペプチド、核局在化シグナル、葉緑体通過ペプチド、又はミトコンドリアターゲティングペプチドなど）を含み、同様に使用されることは明らかであろう。
第１シリーズの実験では、送達剤及びエレクトロポレーションの組合せを用いて、これらのベクターをダイズ胚中の非表皮植物細胞に送達する。成熟した乾燥ダイズ種子（ｃｖ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２）を以下のように表面滅菌する。乾燥ダイズ種子を、１００ｍｌの５％塩酸ナトリウム溶液を含むビーカーを保持する密閉チャンバー内に４時間維持し、溶液には４ｍｌの塩酸を新しく添加する。この滅菌処理後、種子は乾燥状態で維持する。カミソリの刃を手で用いて、滅菌済種子を半分に割り、子葉から胚を手で分離する。各試験又は対照の処理を２０の切除した胚に対して実施する。次に、以下の一連の実験を実施する。
実験１：滅菌濾過ｍｉｌｌｉＱ水中０．０１％ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、第４級アンモニウム界面活性剤）中にベクター（各プラスミドのマイクロリットル当たり１００ナノグラム）を含有する送達溶液を調製する。各溶液を４℃に冷却し、５００マイクロリットルを胚に直接添加した後、直ちにこれを真空チャンバー内の氷上に配置し、陰圧（２×１０”３ミリバール）処理に１５分付す。冷却／陰圧処理の後、下記パラメータ：５０Ｖ、２５ミリ秒パルス長、９９パルスにわたり７５ミリ秒パルス間隔で設定されたＢＴＸ－Ｈａｒｖａｒｄ ＥＣＭ－８３０エレクトロポレーションを用いて、胚を電流で処理する。
実験２：送達溶液との初期接触及び陰圧処理を室温で実施する以外は、実験１と同じ条件。
実験３：送達溶液が、ＣＴＡＢなしで調製されるが、０．１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ－７７（商標）（ＣＡＳ番号２７３０６－７８－１、Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ａｌｂａｎｙ，Ｎ．Ｙから入手可能）を含む以外は、実験１と同じ条件。各処理を受けた胚の半分（２０のうち１０）をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験４：いくつかの送達溶液が調製され、この場合、各々が、カタログ番号７０４１１３、７５０５３０、７２４７７７、及び８０５０３３（全て、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）のものから選択される単層カーボンナノチューブ調製物を２０マイクログラム／ｍｌで含む以外は、実験３と同じ条件。各処理を受けた胚の半分（２０のうち１０）をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験５：送達溶液が、トリエトキシプロピルアミノシラン－官能化シリカナノ粒子（カタログ番号７９１３３４、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を２０マイクログラム／ｍｌでさらに含む以外は、実験３と同じ条件。各処理を受けた胚の半分（２０のうち１０）をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験６：送達溶液が、分岐ポリエチレンイミン、分子量－２５，０００（ＣＡＳ番号９００２－９８－６、カタログ番号４０８７２７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を９マイクログラム／ｍｌで、又は分岐ポリエチレンイミン、分子量－８００（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ ２５９８７－０６－８、カタログ番号４０８７１９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を９マイクログラム／ｍｌでさらに含む以外は、実験３と同じ条件。各処理を受けた胚の半分（２０のうち１０）をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験７：送達溶液が、２０％ｖ／ｖのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、カタログ番号Ｄ４５４０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をさらに含む以外は、実験３と同じ条件。各処理を受けた胚の半分（２０のうち１０）をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験８：送達溶液が、５０マイクロモルのｎｏｎｏ－アルギン（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、配列番号１８７３）をさらに含有する以外は、実験３と同じ条件。各処理を受けた胚の半分（２０のうち１０）をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験９：真空処理の後、胚及び処理溶液を微量遠心チューブに移し、４０００×ｇで２、５、１０、又は２０分遠心分離する以外は、実験３と同じ条件。各処理を受けた胚の半分（２０のうち１０）をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験１０：真空処理の後、胚及び処理溶液を微量遠心チューブに移し、４０００×ｇで２、５、１０、又は２０分遠心分離する以外は、実験３と同じ条件。
実験１１：真空処理の後、胚及び処理溶液を微量遠心チューブに移し、４０００×ｇで２、５、１０、又は２０分遠心分離する以外は、実験４と同じ条件。
実験１２：真空処理の後、胚及び処理溶液を微量遠心チューブに移し、４０００×ｇで２、５、１０、若しくは２０分遠心分離する以外は、実験５と同じ条件。
送達処理後、各処理群の胚を滅菌水で５回洗浄し、１／２ＭＳ固体培地（２．１６５ｇのムラシゲ・スクーグ培地塩、カタログ番号ＭＳＰ０５０１、Ｃａｉｓｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｓｍｉｔｈｆｉｅｌｄ，ＵＴ）、１０ｇのスクロース、及び８ｇのＢａｃｔｏアガー、蒸留水中に１．００リットルまで製造）を含有するペトリ皿に移し、２５℃に設定した組織培養インキュベータ内に配置する。胚が伸長し、根を発生し、真の葉が現れたら、苗を土壌に移して、成長させる。内在性ＰＤＳ対立遺伝子の修飾によって、クロロフィルを生成することができず、且つ明らかな漂白表現型を有する植物が得られる。全ての内在性ＰＤＳ対立遺伝子の画分の修飾によって、クロロフィルを依然として生成することができる植物が得られ；改変されたＰＤＳ遺伝子についてヘテロ接合型の植物を成長させて、種子を採取し、遺伝性ゲノム修飾の効率を子孫種子の分子解析により決定する。
実施例１３：エピソームリポータ逆位アッセイによるヒト細胞中のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ活性の評価
この実施例は、ヒト細胞中のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ活性についてのリポータアッセイを記載する。具体的には、リポータアッセイは、不活性リポータプラスミドと、リポータプラスミド上の逆位ＧＦＰ遺伝子を活性化し得るチロシンリコンビナーゼを担持する第２のプラスミドの共送達を含む。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ及びリポータをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に送達した。送達は、次の２つのプラスミド：１）哺乳動物ＣＭＶプロモータにより駆動される、リコンビナーゼ配列（例えば、表１からのリコンビナーゼ、表２からのリコンビナーゼ配列）をコードするリコンビナーゼ発現プラスミドと、２）リコンビナーゼ標的部位にフランキングされる逆位ＥＧＦＰ配列（例えば、互いに逆方向で、表１の第２列又は３列からの１対の認識部位によりフランキングされる逆位ＥＧＦＰ）上流のＣＭＶプロモータを含むリポータプラスミドを含んだ。本明細書の他所に記載のように見出され、且つ最大３つのミスマッチを含んで、ヒトゲノムに対して相同性を有する回分配列を認識するチロシンリコンビナーゼを、その天然の配列（例えば、表１の第２列に記載のように、例えば、細菌に見出される天然配列）、並びに対応するヒトゲノム配列（例えば、表１の第３列に記載のように、最大３つのミスマッチを含む）の両方に関する活性試験のために選択した。コグネイトリコンビナーゼの存在によって、ＥＧＦＰ配列の逆位が起こり、これは、例えば、図１の概略図に示すように、ＣＭＶプロモータにより駆動されるＥＧＦＰ発現を可能にする。
約１２０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＴｒａｎｓＩＴ－２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓｂｉｏ）を用いて、１：３のリコンビナーゼ：リポータプラスミドモル比の、プラスミドを発現するリコンビナーゼ及び逆位ＧＦＰリポータプラスミドで共トランスフェクトするか、又は負の対照としてリポータプラスミド単独で同様にトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後に、フローサイトメトリーを用いて、リコンビナーゼ活性を測定することにより、ＥＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを決定した。フローサイトメトリー分析の結果を表１６に示し、これは、ヒト細胞中の活性を有するリコンビナーゼが、負の対照（リポータプラスミドのみ）に対して、ＥＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージの増加をもたらしたことを示している。
実施例１４：内在性ゲノム遺伝子座での組込みによるヒト細胞中のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ活性の評価
この実施例は、ヒト細胞中のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ活性についての組込みアッセイを記載する。具体的には、このアッセイは、異種目的配列及びリコンビナーゼ認識部位を含む挿入ＤＮＡプラスミドと、挿入ＤＮＡプラスミドのゲノムへの組込みを触媒するためのチロシンリコンビナーゼを担持する第２プラスミドとの共送達を含む。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒと目的の配列をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に送達した。送達は、２つのプラスミド：１）哺乳動物ＣＭＶプロモータにより駆動される、リコンビナーゼ配列（例えば、表１からのリコンビナーゼ、表２からのリコンビナーゼ配列）を保有するリコンビナーゼ発現プラスミド、並びに２）目的の遺伝子（例えば、ＧＦＰ遺伝子配列）上流のＣＭＶプロモータ及びネイティブリコンビナーゼ認識部位（例えば、表１の第２列の配列）又はヒトゲノム中の配列、例えば、ネイティブ認識部位（例えば、表１の第３列の配列）に対して相同性を有するヒトゲノム中の配列と、３つ以下のミスマッチで一致するリコンビナーゼ標的部位を含んだ。組込み反応の一例を図２に示す。
約１２０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＴｒａｎｓＩＴ－２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓｂｉｏ）を用いて、１：３のリコンビナーゼ：挿入ＤＮＡプラスミドモル比の、プラスミドを発現するリコンビナーゼと、挿入ＤＮＡプラスミドで共トランスフェクトするか、又は負の対照としてリポータプラスミド単独で同様にトランスフェクトした。トランスフェクションから２～５日後に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いて、リコンビナーゼ媒介ゲノム組込みを測定した。ＲＰＰ３０参照対照に対して正規化した挿入ＤＮＡ組込み体の平均ゲノムコピー数を計算することにより、組込みが成功した細胞のパーセンテージを見積もった。ｄｄＰＣＲ分析の結果を表１６に記載し、これは、挿入ＤＮＡプラスミドをヒトゲノムに組み込むことができるリコンビナーゼが、負の対照（リポータプラスミドのみ）に対して、ゲノム当たりの組換え事象の平均数の増加をもたらしたことを示している。
実施例１５：逆位及び組込みアッセイデータ
表１又は２からのリコンビナーゼを、エピソームリポータ逆位（実施例１３）又はゲノム組込み（実施例１４）アッセイを用いて試験し、データを表１６に示す。第２列は、表１及び２に列挙されるリコンビナーゼタンパク質のアクセッションを示す。エピソームアッセイの場合、逆位活性は、フローサイトメトリーにより測定して、ＧＦＰ＋細胞の％として示し、第４列は、天然の認識部位（表１の第２列）を用いた逆位活性を示し、第６列は、最も一致するヒト部位（表１の第３列）を用いた逆位活性を示し、第３及び５列は、リコンビナーゼの非存在下でそれぞれのバックグラウンドＧＦＰを呈示する。ゲノム組込みアッセイの場合、ｄｄＰＣＲにより測定される組込み活性は、ゲノムコピー当たりの組込み挿入ＤＮＡベクターの平均コピーにより推定される細胞の％として表され、第７列に示される。表１６に列挙される例示的なリコンビナーゼのうち、少なくとも３４は、エピソームリポータ逆位アッセイ中の最も一致するヒト部位を用いて、バックグラウンドを超える活性を示した。これらのうち、少なくとも２１は、最も一致するヒト部位を用いて、バックグラウンドレベルの少なくとも２倍であった活性を示した。ゲノム組込みアッセイにより試験した表１６に列挙される例示的なリコンビナーゼのうち、少なくとも１７は、ヒトゲノム中の最も一致する部位で活性を示した。ＮＴ＝非試験
Figure 2022542839000177
Figure 2022542839000178
Figure 2022542839000179
実施例１６：哺乳動物細胞へのチロシンリコンビナーゼ及び鋳型ＤＮＡの二重ＡＡＶ送達
この実施例は、ヒトゲノムへの鋳型ＤＮＡの標的組込みを目的とする、チロシンリコンビナーゼベースのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの使用を記載する。より具体的には、リコンビナーゼ、例えば、表１又は２からのアミノ酸配列を有するチロシンリコンビナーゼと、関連認識部位、例えば、表１の第２又は３列からの配列を含む鋳型ＤＮＡを、個別のＡＡＶウイルスベクターとして、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共送達することにより、コグネイト認識部位、例えば、表１の第３列からの配列を含む哺乳動物細胞ゲノム中にＤＮＡを正確且つ効率的に挿入する。
２つのトランスジーン配列を評価して、異なるＡＡＶ挿入ＤＮＡフォーマット：１）細胞核へのＡＡＶ形質導入後の二本鎖環状化ＤＮＡの形成を利用する、単一認識部位を含む鋳型；又は２）所望の挿入配列をフランキングする２つの同配向認識部位、例えば、表１の第２又は３列からの認識配列の２つのコピーであって、まず環状化のためにリコンビナーゼによりＡＡＶゲノムから切除された後、哺乳動物細胞ゲノムに組み込むことができる上記ピーを含む鋳型を用いた組込み、安定性、及び発現を決定する。
リコンビナーゼをコードするアデノ随伴ウイルス又は対応する認識部位含有挿入ＤＮＡは、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡウイルスバックボーン（Ｓｉｒｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に基づいて作製されるが、ＣＭＶプロモータの代わりにＥＦ１ａプロモータを用いる。ｐＡＡＶ－Ｅｆ１ａ－リコンビナーゼ－ＷＰＲＥ－ｐＡは、ヒトコドン最適化リコンビナーゼ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を用いて作製される。ｐＡＡＶ－Ｓｔｕｆｆｅｒ挿入ＤＮＡ構築物は、５’ＡＡＶ２ＩＴＲ配列とＥｆ１ａプロモータとの間の５００ｂｐスタッファー配列、又は５’末端ＡＡＶ２ＩＴＲ配列近位の５００ｂｐスタッファー配列及び３’ＡＡＶ２ＩＴＲ配列近位の５００ｂｐスタッファー配列のいずれかをさらに含む。上に挙げたＡＡＶベクターは、１０１３総ｖｇスケールで、ＡＡＶ２血清型（Ｓｉｒｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にパッケージングされる。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４８ウェルプレート中に４０，０００細胞／ウェルで接種する。２４ｈ後、リコンビナーゼ発現ベクターを含むＡＡＶ及び挿入ＤＮＡベクターを含むＡＡＶ、又は挿入ＤＮＡベクターを含むＡＡＶ単独（負の対照）のいずれかで細胞を形質導入する。形質導入から３及び７日後に、ゲノムＤＮＡを抽出して、チロシンリコンビナーゼと、その認識部位を含む挿入ＤＮＡベクターとの二重ＡＡＶ送達を用いて、組込みの効率を評価する。ｄｄＰＣＲにより挿入事象を評価して、細胞集団全体の平均組込み事象（コピー／ゲノム）を定量することにより、編集が成功した細胞の割合を推定する。
実施例１７：ヒト細胞への部位特異的組込みを目的とする、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチド及び鋳型ＤＮＡのインビトロ組合せｍＲＮＡ及びＡＡＶ送達
この実施例は、哺乳動物細胞ゲノムへの外性ＤＮＡの部位特異的挿入のためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの使用を記載する。より具体的には、リコンビナーゼ、例えば、表１又は２からのアミノ酸配列を有するチロシンリコンビナーゼと、関連認識配列、例えば、表１の第２又は３列からの配列を含む鋳型ＤＮＡを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入する。この実施例では、リコンビナーゼは、リコンビナーゼをコードするｍＲＮＡとして送達し、鋳型ＤＮＡは、ＡＡＶにより送達する。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４８ウェルプレート中に４０，０００細胞／ウェルで接種する。２４ｈ後、リコンビナーゼポリペプチドをコードするｍＲＮＡ及び挿入ＤＮＡベクターを含むＡＡＶ、又は挿入ＤＮＡベクターを含むＡＡＶ単独（負の対照）のいずれかで細胞を形質導入する。送達のタイミングを下記の条件により評価する：１）同じ日にリコンビナーゼのｍＲＮＡ送達及び鋳型ＤＮＡのＡＡＶ送達、２）リコンビナーゼのｍＲＮＡ送達の２４ｈ後に鋳型ＤＮＡのＡＡＶ送達、３）鋳型ＤＮＡのＡＡＶ送達の２４ｈ後にリコンビナーゼのｍＲＮＡ送達。ｍＲＮＡのトランスフェクション及びＡＡＶのトランスフェクションから３日後に、ゲノムＤＮＡを抽出して、組込みの効率を評価する。ｄｄＰＣＲにより組込み効率を評価して、細胞集団全体の平均組込み事象（コピー／ゲノム）を定量することにより、編集が成功した細胞の割合を推定する。
実施例１８：βサラセミア及び鎌状赤血球症の処置を目的とする、ＨＳＣへのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチド及び鋳型ＤＮＡのエクスビボ組合せｍＲＮＡ及びＡＡＶ送達
この実施例は、βサラセミア及び鎌状赤血球症を引き起こす遺伝子突然変異を処置するために、活発に発現されるγ－グロビン遺伝子カセットを書き込むことを目的とする、Ｃ３４＋細胞（造血幹細胞及び子孫細胞）へのリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡ及びＡＡＶ鋳型ＤＮＡの送達を記載する。
この実施例では、ＡＡＶ６を用いて、鋳型ＤＮＡを送達する。より具体的には、ＡＡＶ６鋳型ＤＮＡは、順に、５’ＩＴＲ、リコンビナーゼ認識部位、例えば、表１の第２又は３列からの配列、ｐｏｌＩＩプロモータ、例えば、ヒトβ－グロビンプロモータ、ヒト胎児γ－グロビンコード配列、ポリＡテイル及び３’ＩＴＲを含む。エレクトロポレーション試薬の最大量限度を考慮して、様々な条件、例えば、：１）ＡＡＶ６鋳型及びリコンビナーゼｍＲＮＡの同時エレクトロポレーション；２）リコンビナーゼｍＲＮＡのエレクトロポレーションの１５分後に、ＡＡＶ６挿入ＤＮＡの形質導入で、リコンビナーゼｍＲＮＡ及びＡＡＶ６鋳型をＣＤ３４細胞に共送達する。
エレクトロポレーション／形質導入後に、細胞をＣＤ３４維持培地中で２日間インキュベートする。次に、処理細胞の約１０％をゲノムＤＮＡ単離のために採取して、組込み効率を決定する。残りの細胞を赤血球増殖及び分化培地に移す。約２０日の分化後、３つのアッセイを実施して、赤血球分化後のγ－グロビンの組込みを決定する：１）細胞のサブセットをＮｕｃＲｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色して、除核率を決定する；２）細胞のサブセットを蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役抗γ－グロビン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）で染色して、胎児ヘモグロビン陽性細胞のパーセンテージを決定する；３）細胞のサブセットをＨＰＬＣのために採取して、γ－グロビン鎖発現を決定する。
実施例１９：ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製を目的とする、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドのエクスビボ送達
この実施例は、ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、Ｂ細胞リンパ腫の処置のためのＣＡＲ－Ｔ細胞の作製を目的とする、デオキシリボ核タンパク質（ＤＮＰ）としてのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇのヒト初代Ｔ細胞への送達を記載する。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、例えば、リコンビナーゼ、例えば、表１又は表２からの配列を有するリコンビナーゼを、その活性タンパク質形態で直接使用するために調製し、精製する。鋳型成分については、プラスミドバックボーン及び細菌配列が欠失したミニサークルＤＮＡプライマーをこの実施例で使用し、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ８（３）：４９５－５００（２００３）の方法に従って調製し、この場合、初めに組換え事象を使用して、これらの外来プラスミド維持機能を切除することにより、プラスミドサイズ及び細胞応答を最小限にする。最初の組換え事象は、所望のベクター配列を、同じ配向に配置されるコグネイト認識部位とフランキングさせて、コグネイトリコンビナーゼによる組換えによって、リコンビナーゼ認識部位及び組込みのための所望の配列の単一コピーを含むミニサークル鋳型ＤＮＡが形成されるようにし、これを残りのプラスミドベクターから精製する。鋳型ＤＮＡミニサークルは、順に、リコンビナーゼ認識部位、例えば、表１の第２列又は３列からの配列、ポリＩＩプロモータ、例えば、ＥＦ－１、ヒトコドン最適化キメラア抗原受容体（細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメイン）、例えば、ＣＤ１９特異的Ｈｕ１９－ＣＤ８２８Ｚ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＭＮ６９８６４２；Ｂｒｕｄｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２６：２７０－２８０（２０２０））ＣＡＲ分子、及びポリＡテイルを含む。鋳型ＤＮＡをまず精製リコンビナーゼタンパク質と混合した後、室温で１５～３０分インキュベートして、ＤＮＰ複合体を形成する。次に、ＤＮＰ複合体を活性化Ｔ細胞にヌクレオフェクトする。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムによる組込みは、分子定量のためのｄｄＰＣＲを用いて検定し、ＣＡＲ発現は、フローサイトメトリーにより測定する。
実施例２０：Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生産
この実施例は、ＤＮＡベクターからのインビトロ転写による、リコンビナーゼをコードするｍＲＮＡの作製について記載する。ｍＲＮＡ鋳型プラスミドは、Ｔ７プロモータに続いて、５’ＵＴＲ、リコンビナーゼコード配列、３’ＵＴＲ、及び約１００ヌクレオチド長のポリ（Ａ）テイルを含む。プラスミドは、ポリ（Ａ）テイルの下流に、平滑末端又は５’オーバーハングを生じる酵素制限により線状化され、Ｔ７ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いるインビトロ転写（ＩＶＴ）のために使用される。ＩＶＴの後、ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（ＮＥＢ）で処理する。バッファー交換の後、ＧＴＰ及びＳＡＭ（ＮＥＢ）の存在下で、ワクシニアキャッピング酵素（Ｖａｃｃｉｎｉａ ｃａｐｐｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）（ＮＥＢ）及び２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ））を用いて、酵素キャッピングを実施する。シリカカラム（例えば、Ｍｏｎａｒｃｈ（商標登録）ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ）を用いて、キャップＲＮＡを精製及び濃縮した後、２ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．５により中和する。
実施例２１：組込み部位決定のための単一方向シーケンシングアッセイ
この実施例は、ゲノムレベルでの特異性の不偏プロフィールを備える未知の組込み部位の配列を決定するための単一方向シーケンシングの実施について記載する。
組込み実験は、リコンビナーゼと挿入のための鋳型ＤＮＡを含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、前述の実施例と同様に実施する。リコンビナーゼ及び挿入ＤＮＡプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションから７２時間後にゲノムＤＮＡを抽出し、以下の方法に従って、単一方向シーケンシングに付す。最初に、ゲノムＤＮＡのフラグメント化、エンドリペア、及びアダプター連結により、次世代ライブラリーを作製する。次に、鋳型特異的配列に結合するフォワードプライマーと、シーケンシングアダプターに結合するリバースプライマーを用いる２ステップネステッドＰＣＲにより、鋳型ＤＮＡ組込み事象を有する断片化ゲノムＤＮＡを増幅する。ＰＣＲ産物をキャピラリーゲル電気泳動装置で視覚化し、精製した後、Ｑｕｂｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により定量する。最終ライブラリーを、３００ｂｐペアエンドリードを用いるＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でシーケンシングする。挿入物とフランキングするＤＮＡを検出し、当該配列をヒトゲノム配列、例えば、ｈｇ３８に対してマッピングすることにより、データ解析を実施する。
実施例２２：ＣＦＴＲマウスモデルにおける嚢胞性線維症の処置のための二重ＡＡＶベクターの使用
この実施例は、疾患のマウスモデルにおける嚢胞性線維症の処置のための二重ＡＡＶベクターとしてのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの送達について記載する。嚢胞性線維症は、ＣＦＴＲ遺伝子中の突然変異に起因する肺疾患であり、肺細胞、例えば、呼吸細気管支に存在する細胞及び終末細気管支中の円柱上皮無線毛細胞などのゲノムに、野生型ＣＦＴＲ遺伝子を挿入することにより、処置することができる。
例えば、表１又は表２の配列を含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチドと、コグネイトリコンビナーゼ部位、例えば、表１の第２又は３列からの配列を含む鋳型ＤＮＡを、ＣＡＧプロモータにより駆動されるポリペプチドの発現を有するＡＡＶ６カプシド中にパッケージングするが、それらの組合せは、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １８（４）：３４４－３５４（２００７）の教示によれば、マウス呼吸器上皮細胞における高レベルの形質導入及び発現のために有効であることが明らかにされている。
ＡＡＶ調製物は、以前記載されている（Ｓａｎｔｒｙ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：４３（２０１７））ように、改変された鼻内投与を用いて、ＣＦＴＲ遺伝子ノックアウト（Ｃｆｔｒｔｍ１Ｕｎｃ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に共送達する。手短には、リコンビナーゼ発現カセット又は鋳型ＤＮＡのいずれかを含み、ｐｏｌ ＩＩプロモータ、例えば、ＧＡＧプロモータの制御下のＣＦＴＲ遺伝子と、コグネイトリコンビナーゼ認識部位を含むＡＡＶをパッケージングし、精製した後、濃縮する。一部の実施形態では、ＣＦＴＲ発現カセットは、リコンビナーゼ認識部位によりフランキングされる。ＣＦＴＲノックアウトマウスに対する修飾鼻内投与を用いて、１×１０１０～１×１０１２ｖｇ／マウスの範囲の用量で調製ＡＡＶを各々送達する。１週間後、肺細胞を採取して、ゲノム抽出及び組織分析のために使用する。組込み効率を測定するために、ｄｄＰＣＲを用いて、ＣＦＴＲ遺伝子組込みを定量して、挿入物を含む、又は含まない細胞及び標的部位の割合を決定する。組込みが成功したＣＦＴＲからの発現をアッセイするために、免疫組織学により組織を分析して、発現及び病状を決定する。
実施例２３：一過性発現されたインテグラーゼの導入によりオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症を処置する方法
この実施例は、組込みのための鋳型ＤＮＡを賦与するＡＡＶの送達と一緒に、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、例えば、表１又は表２からのリコンビナーゼ配列をコードするｍＲＮＡの送達及び発現によるオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症の処置について記載する。ＯＴＣ欠損症は、窒素の効率的な分解がないために、アンモニアの蓄積を引き起こす稀有な遺伝性障害である。アンモニアの蓄積は、衰弱させ、重篤な場合には致死的となり得る高アンモニア血症を引き起こす。ＡＡＶ鋳型は、ｐｏｌ ＩＩプロモータ、例えば、ＡｐｏＥ．ｈＡＡＴの制御下のヒトＯＴＣ遺伝子の野生型コピーと、コグネイトリコンビナーゼ認識部位、例えば、表１の第２又は３列からの配列を含む。一部の実施形態では、ＯＴＣ発現カセットは、リコンビナーゼ認識部位によりフランキングされる。
この実施例では、リコンビナーゼｍＲＮＡのＬＮＰ製剤化は、ＬＮＰ－ＩＮＴ－０１の製剤化（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：２２２７－２２３５（２０１８）により教示される方法）に従い、鋳型ＤＮＡは、ＡＡＶ２／８に製剤化される（参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｉｎｎ ｅｔ ａｌ．ＪＨＥＰ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１９）により教示される方法）。手短には、ＯＴＣ欠損症は、リコンビナーゼｍＲＮＡと、鋳型ＤＮＡを含有するＡＡＶ（１×１０１０～１×１０１２ｖｇ／マウス）とを含むＬＮＰ製剤（１～３ｍｇ／ｋｇ）を、浅側頭顔面静脈を介して注射する（Ｌａｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ９３：ｅ５２０３７（２０１４））ことにより、新生Ｓｐｆａｓｈマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ）を処置することによって回復する。Ｓｐｆａｓｈマウスは、幾分の残留マウスＯＴＣ活性を有し、一部の実施形態では、以前記載されている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９（５）：８５４－８５９（２０１１）、その方法は、参照により本明細書に組み込まれる）ように、マウスＯＴＣに対してｓｈＲＮＡを発現するＡＡＶの投与によりサイレンシングされる。ＯＴＣ酵素活性、アンモニアレベル、及びオロト酸は、以前記載されている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９（５）：８５４－８５９ （２０１１））通りに測定する。１週間後、マウスの肝臓を採取して、ｇＤＮＡ抽出及び組織分析のために使用する。抽出したｇＤＮＡに対するｄｄＰＣＲにより、ｈＯＴＣの組込み効率を測定する。マウス肝臓組織を免疫組織学により分析して、ｈＯＴＣ発現を確認する。
実施例２４：大きなペイロードをヒト細胞に組み込むためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの使用
この実施例は、インビトロでのヒト細胞への大きなペイロードのリコンビナーゼ媒介性組込みについて記載する。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド成分は、リコンビナーゼ、例えば、表１又は表２からのリコンビナーゼ配列をコードするｍＲＮＡと、以下：コグネイト認識部位、例えば、表１の第２又は３列の配列；ＧＦＰ発現カセット、例えば、ＥＧＦＰに作動可能に連結したＣＭＶプロモータ；及び総プラスミドサイズを約２０ｋｂにするスタッファー配列を含む鋳型ＤＮＡと、を含む。
手短には、リコンビナーゼｍＲＮＡ及び大きな鋳型ＤＮＡによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の同時エレクトロポレーションを実施する。３日後、組込み効率及び特異性を測定する。組込み効率を測定するために、組込みの接合部にわたって増幅するプライマー－プローブセット、例えば、組込み事象だけが定量されるように、一方のプライマーが鋳型ＤＮＡにアニーリングし、他方がゲノムの適切なフランキング領域にアニーリングするセットを用いて、例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７（５）：１９７－２０８（２０１６）により記載されているように、ゲノムＤＮＡに対して、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を実施する。データを内部標準遺伝子、例えば、ＲＰＰ３０に対して正規化し、細胞の集団全体にわたるゲノム当たりの平均組込み事象として効率を表す。特異性を測定するために、単一方向シーケンシングによりゲノムＤＮＡへの組込み事象を評価して、実施例２１に記載のように、ゲノム座標を決定する。
実施例２５：細菌人工染色体をヒト胚幹細胞にエクスビボで組み込むためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの使用
この実施例は、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）への細菌人工染色体（ＢＡＣ）のリコンビナーゼ媒介性組込みについて記載する。
ＢＡＣベクターは、極めて大きな（＞１００ｋｂ）ＤＮＡペイロードを維持することができ、従って、細胞操作において有用となり得る多くの遺伝子又は複合体を担持することができる。ｈＥＳＣへのそれらの組込みの実証はある（Ｒｏｓｔｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０（１９）：ｅ１５０（２０１２））が、これは、それらの組込みパターンに配列特異性を欠いたトランスポゾンを用いて達成された。この実施例は、大きな構築物の配列特異的組換えを記載する。
この実施例では、所望のペイロードを担持するように操作されたＢＡＣは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、例えば、リコンビナーゼ、例えば、表１又は表２からのリコンビナーゼによる認識を可能にするリコンビナーゼ認識部位、例えば、表１の第２又は３列の配列をさらに含む。Ｒｏｓｔｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０（１９）：ｅ１５０（２０１２）の教示に従うエレクトロポレーション又はリポフェクションにより、約１５０ｋｂのＢＡＣをｈＥＳＣに導入する。３日後、組込み効率及び特異性を測定する。組込み効率を測定するために、組込みの接合部にわたって増幅するプライマー－プローブセット、例えば、組込み事象だけが定量されるように、一方のプライマーが鋳型ＤＮＡにアニーリングし、他方がゲノムの適切なフランキング領域にアニーリングするセットを用いて、例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７（５）：１９７－２０８（２０１６）により記載されているように、ゲノムＤＮＡに対して、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を実施する。データを内部標準遺伝子、例えば、ＲＰＰ３０に対して正規化し、細胞の集団全体にわたるゲノム当たりの平均組込み事象として効率を表す。特異性を測定するために、単一方向シーケンシングによりゲノムＤＮＡへの組込み事象を評価して、実施例２１に記載のように、ゲノム座標を決定する。

Claims (12)

  1. 以下：
    ａ）Ｒｅｃ２７（ＷＰ＿０２１１７０３７７．１、配列番号１２４１）、Ｒｅｃ３５（ＷＰ＿１３４１６１９３９．１、配列番号１２４９）から選択されるか、又は表１若しくは２のアミノ酸配列、若しくはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド、或いは、前記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸；及び
    ｂ）以下：
    （ｉ）（ａ）の前記リコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、前記ＤＮＡ認識配列は、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列が、約１０～３０、１２～２７、又は１０～１５ヌクレオチド、例えば、約１３ヌクレオチドであり、前記第１及び第２パラパリンドローム配列は一緒に、表１のヌクレオチド配列のパラパリンドローム領域、或いは、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８つ以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、且つ
    前記ＤＮＡ認識配列が、約５～１０ヌクレオチド、例えば、約８ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、上記コア配列が、前記第１及び第２パラパリンドローム配列の間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
    （ｉｉ）異種目的配列と
    を含む二本鎖挿入ＤＮＡ
    を含む、ＤＮＡを修飾するためのシステム。
  2. 以下：
    ａ）Ｒｅｃ２７（ＷＰ＿０２１１７０３７７．１、配列番号１２４１）、Ｒｅｃ３５（ＷＰ＿１３４１６１９３９．１、配列番号１２４９）から選択されるか、又は表１若しくは２のアミノ酸配列、若しくはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド、或いは、前記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸；及び
    ｂ）以下：
    （ｉ）（ａ）の前記リコンビナーゼポリペプチドに結合する、表１のヒト第１パラパリンドローム配列及びヒト第２パラパリンドローム配列と、
    （ｉｉ）任意選択で、異種目的配列と
    を含む挿入ＤＮＡ
    を含む、ＤＮＡを修飾するためのシステム。
  3. 以下：Ｒｅｃ２７（ＷＰ＿０２１１７０３７７．１、配列番号１２４１）、Ｒｅｃ３５（ＷＰ＿１３４１６１９３９．１、配列番号１２４９）から選択されるか、又は表１若しくは２のアミノ酸配列、若しくはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド、或いは、前記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を含む、真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）。
  4. 以下：
    （ｉ）ＤＮＡ認識配列であって、前記ＤＮＡ認識配列は、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を含み、
    各パラパリンドローム配列が、約１０～３０、１２～２７、又は１０～１５ヌクレオチド、例えば、約１３ヌクレオチドであり、前記第１及び第２パラパリンドローム配列は一緒に、表１のヌクレオチド配列のパラパリンドローム領域、或いは、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、若しくは８つ以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、
    前記ＤＮＡ認識配列が、約５～１０ヌクレオチド、例えば、約８ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列が、第１及び第２パラパリンドローム配列の間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
    （ｉｉ）異種目的配列と
    を含む真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）。
  5. 真核生物細胞（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト細胞）のゲノムを修飾する方法であって、前記細胞を以下：
    ａ）Ｒｅｃ２７（ＷＰ＿０２１１７０３７７．１、配列番号１２４１）、Ｒｅｃ３５（ＷＰ＿１３４１６１９３９．１、配列番号１２４９）から選択されるか、又は表１若しくは２のアミノ酸配列、若しくはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド、或いは、前記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸；及び
    ｂ）以下：
    （ｉ）（ａ）の前記リコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、前記ＤＮＡ認識配列は、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列が、約１０～３０、１２～２７、又は１０～１５ヌクレオチド、例えば、約１３ヌクレオチドであり、前記第１及び第２パラパリンドローム配列は一緒に、表１のヌクレオチド配列のパラパリンドローム領域、或いは、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、若しくは４つ以下の配列改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、
    前記ＤＮＡ認識配列が、約５～１０ヌクレオチド、例えば、約８ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列が、前記第１及び第２パラパリンドローム配列の間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
    （ｉｉ）異種目的配列と
    を含む挿入ＤＮＡ
    と接触させるステップを含み、
    これにより前記真核生物細胞のゲノムを修飾する方法。
  6. 真核生物細胞（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト細胞）のゲノムに異種目的配列を挿入する方法であって、前記細胞を以下：
    ａ）Ｒｅｃ２７（ＷＰ＿０２１１７０３７７．１、配列番号１２４１）、Ｒｅｃ３５（ＷＰ＿１３４１６１９３９．１、配列番号１２４９）から選択されるか、又は表１若しくは２のアミノ酸配列、若しくはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド、或いは、前記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸；及び
    ｂ）以下：
    （ｉ）（ａ）の前記リコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、前記ＤＮＡ認識配列は、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列が、約１０～３０、１２～２７、又は１０～１５ヌクレオチド、例えば、約１３ヌクレオチドであり、前記第１及び第２パラパリンドローム配列は一緒に、表１のヌクレオチド配列のパラパリンドローム領域を含み、且つ
    前記ＤＮＡ認識配列が、約５～１０ヌクレオチド、例えば、約８ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列が、前記第１及び第２パラパリンドローム配列の間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
    （ｉｉ）異種目的配列と
    を含む挿入ＤＮＡ
    と接触させるステップを含み、
    これにより、実施例５のアッセイで測定して、前記真核生物細胞の集団の少なくとも約０．１％（例えば、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の頻度で、前記真核生物細胞のゲノムに前記異種目的配列を挿入する方法。
  7. Ｒｅｃ２７（ＷＰ＿０２１１７０３７７．１、配列番号１２４１）、Ｒｅｃ３５（ＷＰ＿１３４１６１９３９．１、配列番号１２４９）から選択されるか、又は表１若しくは２のアミノ酸配列、若しくはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
  8. Ｒｅｃ２７（ＷＰ＿０２１１７０３７７．１、配列番号１２４１）、Ｒｅｃ３５（ＷＰ＿１３４１６１９３９．１、配列番号１２４９）から選択されるか、又は表１若しくは２のアミノ酸配列、若しくはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする、単離された核酸。
  9. 以下：
    （ｉ）ＤＮＡ認識配列であって、前記ＤＮＡ認識配列は、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を含み、各パラパリンドローム配列が、約１０～３０、１２～２７、又は１０～１５ヌクレオチド、例えば、約１３ヌクレオチドであり、前記第１及び第２パラパリンドローム配列は一緒に、表１のヌクレオチド配列のパラパリンドローム領域を含み、
    前記ＤＮＡ認識配列は、約５～１０ヌクレオチド、例えば、約８ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列が、前記第１及び第２パラパリンドローム配列の間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
    （ｉｉ）異種目的配列と
    を含む単離された核酸（例えば、ＤＮＡ）。
  10. リコンビナーゼポリペプチドを作製する方法であって、前記方法は、以下：
    ａ）Ｒｅｃ２７（ＷＰ＿０２１１７０３７７．１、配列番号１２４１）、Ｒｅｃ３５（ＷＰ＿１３４１６１９３９．１、配列番号１２４９）から選択されるか、又は表１若しくは２のアミノ酸配列、若しくはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を用意するステップ、及び
    ｂ）前記リコンビナーゼポリペプチドの産生を可能にする条件下で、真核生物細胞に前記核酸を導入するステップを含み、
    これにより、前記リコンビナーゼポリペプチドを作製する方法。
  11. ＤＮＡ認識配列と異種配列とを含む挿入ＤＮＡを作製する方法において、以下：
    ａ）以下：
    （ｉ）Ｒｅｃ２７（ＷＰ＿０２１１７０３７７．１、配列番号１２４１）、Ｒｅｃ３５（ＷＰ＿１３４１６１９３９．１、配列番号１２４９）から選択されるか、又は表１若しくは２のアミノ酸配列、若しくはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、前記ＤＮＡ認識配列は、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列が、約１０～３０、１２～２７、又は１０～１５ヌクレオチド、例えば、約１３ヌクレオチドであり、前記第１及び第２パラパリンドローム配列は一緒に、表１のヌクレオチド配列のパラパリンドローム領域を含み、且つ
    前記ＤＮＡ認識配列が、約５～１０ヌクレオチド、例えば、約８ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列が、前記第１及び第２パラパリンドローム配列の間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
    （ｉｉ）異種目的配列と
    を含む核酸を用意するステップ、及び
    ｂ）前記核酸の複製を可能にする条件下で、真核生物細胞に前記核酸を導入するステップを含み、
    これにより、上記挿入ＤＮＡを作製する方法。
  12. 表１の第２列若しくは第３列に列挙されるゲノム位置のそのゲノムに安定に組み込まれた異種目的配列を含む、単離された真核生物細胞。
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