ES2656516T3 - Composiciones y métodos para inhibir la expresión de transtiretina - Google Patents

Abstract

Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) para inhibir la expresión de transtiretina (TTR), en donde: (a) dicho ARNds comprende una hebra transcrita y una hebra complementaria, comprendiendo la hebra complementaria una región complementaria a una parte de un ARNm que codifica transtiretina (TTR), donde dicha región de complementariedad tiene 19 nucleótidos de longitud, la hebra complementaria comprende la SEC. ID N.º 170 y cada hebra del ARNds tiene 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 nucleótidos de longitud; o (b) dicho ARNds comprende una hebra complementaria que comprende una región complementaria a 19 nucleótidos de 618-648 nucleótidos de la SEC ID N.º 1331 y en donde dicha base de la hebra complementaria se empareja con la guanina en la posición 628 de la SEC. ID N.º 1331; y en donde el ARNds se formula en una partícula lipídica de ácido nucleico que comprende un lípido catiónico, un lípido no catiónico y un lípido que evita la agregación de la partícula.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones y métodos para inhibir la expresión de transtiretina.

La descripción se refiere a un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) que fija como objetivo un gen de la transtiretina (TTR) y métodos para usar el ARNds para inhibir la expresión de TTR.

La transtiretina (TTR) es una proteína de unión a hormonas tiroideas, segregada. La TTR se une y transporta proteína de unión a retinol (PUR)/ Vitamina A y tirosina en suero (T4) en plasma y líquido cefalorraquídeo.

Tanto la TTR de secuencia normal como la TTR de secuencia variable producen amiloidosis. La TTR de secuencia normal produce amiloidosis cardíaca en personas que son mayores y se denomina amiloidosis sistémica senil (SSA, por sus siglas en inglés) (también denominada amiloidosis cardíaca senil (SCA, por sus siglas en inglés)). La SSA con frecuencia va acompañada de depósitos microscópicos en otros muchos órganos. Las mutaciones de la TTR aceleran el proceso de formación amiloide de TTR y son el factor de riesgo más importante para el desarrollo de amiloidosis de TTR clínicamente significativa (también denominada ATTR (por sus siglas en inglés) (tipo amiloidosis - transtiretina)). Se sabe que más de 85 variantes de TTR amiloidogénicas producen amiloidosis familiar sistémica. El hígado es el principal sitio de expresión de TTR. Otros sitios de expresión significativos incluyen el plexo coloideo, la retina y el páncreas.

La amiloidosis por TTR se manifiesta de diversas formas. Cuando se ve afectado el sistema nervioso periférico más destacadamente, la enfermedad se denomina polineuropatía amiloidótica familiar (FAP, por sus siglas en inglés). Cuando está implicado principalmente el corazón, pero no el sistema nervioso, la enfermedad se denomina cardiomiopatía amiloidótica familiar (FAC, por sus siglas en inglés). Un tercer tipo principal de amiloidosis por TTR se denomina amiloidosis leptomeningea/del SNC (Sistema Nervioso Central).

Se ha demostrado que las moléculas de ARN bicatenarias (ARNds) bloquean la expresión génica en un mecanismo regulador altamente conservado conocido como interferencia por ARN (ARNi). La patente internacional WO 99/32619 Fire et al.) describe el uso de un ARNds de al menos 25 nucleótidos de longitud para inhibir la expresión de genes en C. elegans. Se ha demostrado también que el ARNds degrada el ARN objetivo en otros organismos, incluyendo las plantas (véase, por ejemplo, la patente internacional WO 99/53050, Waterhouse et al. y la patente internacional WO 99/61631, Heifetz et al.), Drosophila (véase, por ej. yang, D., et al, Curr. Biol. (2.000) 10: 1.1911.200) y mamíferos (véase la patente internacional WO 00/44895, Limmer y la patente alemana DE 101 00 586.5, Kreutzer et al).

La patente de EE. UU. 20070207974 describe los ARNsi funcionales e hiperfuncionales. La patente de EE. UU. 20090082300 describe moléculas antisentido dirigidas contra TTR. La Patente de EE. UU. N.° 7.250.496 describe microARNs dirigidos contra TTR. Stein et al. (The Journal of Neuroscience, 1 de septiembre de 2004, 24 (35), 7.7077.717) describen que la neutralización de la transtiretina invierte los efectos neuroprotectores de la proteína precursora amiloide secretada en ratones APPsw.

En una realización, la invención proporciona un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) para inhibir la expresión de la transtiretina (TTR), en la que (a) dicho ARNds comprende una hebra transcrita y una hebra complementaria, comprendiendo la hebra complementaria una región complementaria a una parte de un ARNm que codifique transtiretina (TTR), en la que dicha región de complementariedad tiene 19 nucleótidos de longitud, la hebra complementaria comprende la SEC. ID N.° 170 y cada hebra del ARNds tiene 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 nucleótidos de longitud o (b) dicho ARNds comprende una hebra complementaria que comprende una región complementaria a 19 nucleótidos de los nucleótidos 618-648 de la SEC. iD N.° 1331 y en la que dichos pares de bases de la hebra complementaria con la guanina en la posición 628 de la SEC. ID N.° 1331 y en la que el ARNds se formula en una formulación lipídica que comprende un lípido catiónico, un lípido no catiónico y un lípido que evita la agregación de la partícula.

Se describe un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) para inhibir la expresión de la transtiretina (TTR), en la que dicho ARNds comprende una hebra transcrita y una hembra complementaria, comprendiendo la hembra complementaria una región complementaria a una parte de un ARNm que codifica la transtiretina (TTR), en la que dicha región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud y la hebra complementaria comprende 15 o más nucleótidos contiguos de la SEC ID N.° 170, SEC ID N.° 450, sEc ID N.° 730 o SEC ID N.° 1.010. En una implementación relacionada, la hebra transcrita comprende 15 o más nucleótidos contiguos de la SEC ID N.° 169, SEC ID N.° 449, SEC ID N.° 729 o SEC ID N.° 1.009. En otra realización relacionada más, la hebra transcrita consta de la SEC ID N.° 449 y la hebra complementaria consta de la SEC ID N.° 450. En otra realización relacionada más, la hebra transcrita consta de la SEC ID N.° 729 y la hebra complementaria consta de la SEC ID N.° 730. En otra realización relacionada más, la hebra transcrita consta de la SEC ID N.° 1.009 y la hebra complementaria consta de la SEC ID N.° 1.010. En otra implementación relacionada más, el ARNds comprende una hebra transcrita seleccionada de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 y 16 y una hebra complementaria seleccionada de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 y 16.

En algunas implementaciones, la región de complementariedad entre la hebra complementaria del ARNds y el

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ARNm que codifica la transtiretina tiene 19 nucleótidos de longitud. En otra implementación, la región de complementariedad consta de la SEC ID N.° 169. En otras implementaciones, cada hebra del ARNds tiene 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 nucleótidos de longitud. En otra implementación más, cada hebra tiene 21 nucleótidos de longitud.

En algunas implementaciones, el ARNds para inhibir la expresión de la transtiretina no escinde un ARNm de la TTR entre el nucleótido adenina en la posición 637 de la SEC ID N.° 1.331 y el nucleótido guanina en la posición 638 de la SEC ID N.° 1.331. En otras implementaciones, el ARNds escinde un ARNm de la TTR entre el nucleótido guanina en la posición 636 de la SEC ID N.° 1.331 y el nucleótido adenina en la posición 637 de la SEC ID N.° 1.331. En algunas implementaciones, el ARNds hibrida a un ARNm de la TTR entre el nucleótido guanina en la posición 628 de la SEC ID N.° 1.331 y el nucleótido uracilo en la posición 646 de la SEC ID N.° 1.331.

En otras realizaciones más relacionadas, la invención proporciona ARNds como se reivindica para inhibir la expresión de la transtiretina en la que el ARNds comprende uno o más nucleótidos modificados. En realizaciones relacionadas, se elige al menos un nucleótido modificado (o nucleótidos) del grupo que consiste en: un nucleótido 2'- O-metilo-modificado, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido terminal ligado a un derivado de colesterilo o grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico. En otra realización relacionada, el nucleótido modificado se elige del grupo de: un nucleótido 2'-desoxi-2'-fluoro-modificado, un nucleótido 2'-desoxi-modificado, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido 2-amino-modificado, un nucleótido 2'-alquil-modificado, nucleótido de morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende base no natural. En ciertas realizaciones, el ARNds comprende al menos un nucleótido 2-O-metilo-modificado.

En otras implementaciones, se conjuga un ARNds como se describió anteriormente para inhibir la expresión de la transtiretina a un ligando o se formula en una formulación de lípidos. En algunas implementaciones, la formulación de lípidos puede ser una formulación de LNP, una formulación de LNP01, una formulación de XTC-SNALP o una formulación de SNALP. En implementaciones relacionadas, la formulación de XTC-SNALP es como sigue: usando 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (XTC) con XTC/DPPC/Colesterol/PEG-cDMA en una proporción de 57,1/7,1/34,4/1,4 y una proporción de lípido:ARNsi de aproximadamente 7. En otras implementaciones más relacionadas, la hebra transcrita del ARNds consta de la SEC ID N.° 1.009 y la hebra complementaria consta de la SEC ID N.° 1.010 y el ARNds se formula en una formulación de XTC-SNALP como sigue: usando 2,2-Dilinoleil-4- dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (XTC) con un XTC/DPPC/Colesterol/PEG-cDMA en una proporción de 57,1/7,1/34,4/1,4 y una relación de lípido:ARNsi de aproximadamente 7. Alternativamente, un ARNds tal como los descritos anteriormente se puede formular en una formulación de LNP09 como sigue: usando XTC/DSPC/Col/PEG2000-C14 en una proporción de 50/10/38,5/1,5 % en moles y una relación de lípido:ARNsi de aproximadamente 11:1. En otra variación, el ARNds se formula en una formulación de LNP11 como sigue: usando MC3/DSPC/Col/PEG2000-C14 en una proporción de 50/10/38,5/1,5 % en moles y una relación de lípido:ARNsi de aproximadamente 11:1. En otra implementación más, el ARNds se formula en una formulación de LNP09 o una formulación de LNP11 y reduce los niveles de ARNm de la TTR por aproximadamente 85 a 90 % a una dosis de 0,3 mg/kg, en relación con un grupo de control de PBS. En otra implementación más, el ARNds se formula en una formulación de LNP09 o una formulación de LNP11 y reduce los niveles de ARNm de la TTR por aproximadamente 50 % a una dosis de 0,1 mg/kg, en relación con un grupo de control de PBS. En otra implementación más, el ARNds se formula en una formulación de LNP09 o una formulación de LNP 11 y reduce los niveles de proteína TTR de una manera dependiente de la dosis en relación con un grupo de control de PBS cuando se mide mediante un método western. En otra implementación más, el ARNds se formula en una formulación de SNALP como sigue: usando DlinDMA con un DLinDMA/DPPC/Colesterol/PEG2000-cDMA en una proporción de 57,1/7,1/34,4/1,4 y una proporción de lípido:ARNsi de aproximadamente 7.

En algunas implementaciones, la descripción proporciona un ARNds tal como los descritos anteriormente para inhibir la expresión de transtiretina, en donde la administración del ARNds a una célula da como resultado una inhibición de aproximadamente 95 % de expresión de ARNm de la TTR cuando se mide por un ensayo PCR en tiempo real, en donde la célula es una célula HepG2 o una célula Hep3B y en donde la concentración del ARNds es 10 nM. En implementaciones relacionadas, la administración del ARNds a una célula da como resultado una inhibición de aproximadamente 74 % de expresión de ARNm de la TTR cuando se mide mediante un ensayo de ADN ramificado, en donde la célula es una célula HepG2 o una célula Hep3B y en donde la concentración del ARNds es 10 nM. En otras implementaciones relacionadas, el ARNds tiene un IC50 menor que 10 pM en una célula HepG2, en donde la concentración del ARNds es 10 nM. En otras implementaciones más relacionadas, el ARNds tiene un ED50 de aproximadamente 1 mg/kg. En otras implementaciones más relacionadas, la administración del ARNds reduce el ARNm de la TTR por aproximadamente 80 % en hígado de mono cynomolgus, en donde la concentración del ARNds es 3 mg/kg. En otras implementaciones más relacionadas, la administración del ARNds no da como resultado actividad inmunoestimuladora en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC, por sus siglas en inglés) cuando se mide por ensayos ELISA IFN-alfa y TNF-alfa. En otras implementaciones más relacionadas, la administración del ARNds reduce los niveles de ARNm de la TTR en el hígado por aproximadamente 97 % o los niveles de proteína TTR en suero por aproximadamente 90 %, en donde la concentración del ARNds es 6 mg/kg. En otras implementaciones más relacionadas, la administración del ARNds reduce los niveles de ARNm de la TTR en el hígado y/o los niveles de proteína TTR en suero hasta 22 días, en donde la concentración del ARNds es 6 mg/kg o 3 mg/kg. En otras implementaciones más relacionadas, el ARNds suprime los niveles de proteína TTR en suero hasta el día 14 postratamiento cuando se administra a un individuo

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con necesidad del mismo a 1 mg/kg o 3 mg/kg. En otras implementaciones más relacionadas, el ARNds reduce la expresión de TTR por 98,9 % en una célula Hep3B a una concentración de 0,1 nM cuando se mide por PCR en tiempo real. En otras implementaciones más relacionadas, el ARNds reduce la expresión de TTR por 99,4 % en una célula Hep3B a una concentración de 10 nM cuando se mide por PCR en tiempo real.

En otras implementaciones, la descripción proporciona un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) para inhibir la expresión de la transtiretina (TTR), en la que dicho ARNds comprende una hebra transcrita y una hebra complementaria, comprendiendo la hebra complementaria una región complementaria a una parte de una transtiretina (TTR) que codifica ARNm, en la que dicha región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud y en la que el ARNds comprende una hebra transcrita seleccionada de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 y 16 y una hebra complementaria seleccionada de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 y 16.

En otra implementación, la descripción proporciona un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) para inhibir la expresión de la transtiretina (TTR), en la que dicho ARNds comprende una hebra complementaria que comprende una región complementaria a 15-30 nucleótidos de los nucleótidos 618-648 de la SEC ID N.° 1.331 y en la que dicha base de la hebra complementaria se empareja con la guanina en la posición 628 de la SEC ID N.° 1.331.

Se describe una célula que contiene cualquiera de los ARNds descritos en el Sumario, anterior. También se describe un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una hebra de cualquiera de los ARNds descritos en el Sumario, anterior. En algunas implementaciones, el vector está en una célula.

En otras realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen de TTR que comprende cualquiera de los ARNds como se reivindica, anteriormente, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Se describe una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen de TTR que comprende un ARNds y una formulación de SNALP, en la que el ARNds comprende una hebra complementaria que tiene menos de 30 nucleótidos de longitud y comprende 15 o más contiguos nucleótidos de la SEC ID N.° 170, SEC ID N.° 450, SEC ID N.° 730 o SEC ID N.° 1.010 y en la que la formulación de SNALP comprende DlinDMA, DPPC, Colesterol y PEG2000-cDMA en una proporción de 57,1/7,1/34,4/1,4 respectivamente.

Se describe un método para inhibir la expresión de TTR en una célula, comprendiendo el método: (a) poner en contacto la célula con cualquiera de los ARNds descritos en el Sumario, anterior y (b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación de la transcripción del ARNm de un gen de TTR, inhibiendo de ese modo la expresión del gen de TTR en la célula.

Se describe un método para tratar un trastorno mediado por expresión de TTR, que comprende administrar a un ser humano con necesidad de dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los ARNds descritos en el Sumario, anterior. En realizaciones relacionadas, el ARNds se administra al ser humano a aproximadamente 0,01; 0,1; 0,5; 1,0; 2,5 ó 5,0 mg/kg. En otra implementación relacionada más, el ARNds se administra al ser humano a aproximadamente 1,0 mg/kg. En otra implementación relacionada más, el ser humano que se está tratando tiene amiloidosis por transtiretina y/o un trastorno hepático. En una implementación relacionada, el ser humano se somete a trasplante de hígado. En otra implementación más, la administración del ARNds reduce el ARNm de la TTR por aproximadamente 80 % en el hígado humano, en el que la concentración del ARNds es 3 mg/kg. En otra implementación relacionada más, la administración del ARNds no da como resultado actividad inmunoestimuladora en el ser humano cuando se mide por ensayos ELISA de IFN-alfa y TNF-alfa. En otra implementación relacionada más, la administración del ARNds reduce los niveles de ARNm de la TTR hepáticos por aproximadamente 97 % o los niveles de proteína TTR en suero por aproximadamente 90 %, en la que la concentración del ARNds es 6 mg/kg. En otra implementación relacionada más, la administración del ARNds reduce los niveles de ARNm de la TTR hepáticos y/o los niveles de proteína TTR en suero hasta 22 días, en la que la concentración del ARNds es 6 mg/kg o 3 mg/kg. En otra implementación relacionada más, el ARNds se formula en una formulación de LNP09 como sigue: usando XTC/DSPC/Col/PEG2000-C14 en una proporción de 50/10/38,5/1,5 % en moles y una proporción de lípido:ARNsi de aproximadamente 11:1. En otra implementación relacionada más, el ARNds se formula en una formulación de LNP11 como sigue: usando MC3/DSPC/Col/PEG2000-C14 en una proporción de 50/10/38,5/1,5 % en moles y una proporción de lípido:ARNsi de aproximadamente 11:1. En otra implementación relacionada más, el ARNds se formula en una formulación de LNP09 o una formulación de LNP11 y reduce los niveles de ARNm de la TTR por aproximadamente 85 a 90 % a una dosis de 0,3 mg/kg, en relación con un grupo de control de PBC. En otra implementación relacionada más, el ARNds se formula en una formulación de LNP09 o una formulación de LNP11 y reduce los niveles de ARNm de la TTR por aproximadamente 50 % a una dosis de 0,1 mg/kg, en relación con un grupo de control de PBC. En otra implementación relacionada más, el ARNds se formula en una formulación de LNP09 o una formulación de LNP11 y reduce los niveles de proteína TTR de una manera dependiente de la dosis en relación a un grupo de control de PBC cuando se mide por un método western. En otra implementación relacionada más, la administración del ARNds suprime los niveles de proteína TTR en suero hasta el día 14 postratamiento cuando se administra a un ser humano a 1 mg/kg o 3 mg/kg. En otra implementación relacionada más, el ARNds se formula en una formulación de SNALP como sigue: usando DlinDMA con un DLinDMA/DPPC/Colesterol/PEG2000-cDMA en una proporción de 57,1/7,1/34,4/1,4 y una proporción de lípido:ARNsi de aproximadamente 7.

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Se describe el uso de un ARNds para tratar un trastorno mediado por expresión de TTR que comprende administrar a un ser humano con necesidad de dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los ARNds descritos en el Sumario, anteriormente. En implementaciones relacionadas, se administra el ARNds al ser humano a aproximadamente 0,01; 0,1; 0,5; 1,0; 2,5 o 5,0 mg/kg. En una implementación relacionada particular, se administra el ARNds al ser humano a aproximadamente 1,0 mg/kg. En otra implementación relacionada, el ser humano tiene amiloidosis por transtiretina y/o un trastorno hepático. En otra implementación más del uso proporcionado por la invención, el ser humano tratado se somete además a trasplante de hígado.

Se describe el uso de un ARNds en un método para inhibir la expresión de TTR en una célula, en la que el método comprende (a) poner en contacto la célula con un ARNds descrito en el Sumario, anteriormente y (b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación de la transcripción de ARNm de un gen de TTR, inhibiendo de ese modo la expresión del gen de TTR en la célula.

La FIG. 1 es una gráfica de niveles de TNFalfa e IFNalfa en los PBMC humanos cultivados después de transinfección con ARNsi de TTR.

La FIG. 2A y 2B son curvas de respuesta a la dosis para AD-18324 y AD-18328, respectivamente, en células HepG2.

La FIG. 3 es una curva de respuesta a la dosis para AD-18246 en células HepG2.

La FIG. 4A y la FIG. 4B muestran la inhibición de los niveles de ARNm hepático y de proteínas en plasma, respectivamente, en ratones H129-mTTR-KO/iNOS-KO/hTTR transgénicos por una administración de inyección intravenosa rápida de TTR-ARNds (AD-18324, AD-18328 y AD-18246) formulada en LNP01.

La FIG. 5 es una gráfica que resume las mediciones de los niveles de ARNm de la TTR en los hígados de primates no humanos después de infusión intravenosa de 15 minutos de TTR-ARNds (AD-18324 y AD-18328) formulada en SNALP.

La FIG. 6A y la FIG. 6B muestran la inhibición de los niveles de ARNm hepático humano de la TTR V30M y de proteínas en suero, respectivamente, en ratones transgénicos por una administración intravenosa rápida de SNALP- 18328. Se determinaron las medias del grupo, se normalizó al grupo de control de PBS y después se representó gráficamente. Las barras de error representan desviaciones estándar. El porcentaje de reducción de la media del grupo, relativa a PBS, se indica para los grupos de SNALP-1955 y SNALP-18328. (*** p< 0,001, ANOVA de un factor, con ensayo retrospectivo de Dunn).

La FIG. 7A y la FIG. 7B muestran la durabilidad de la reducción de los niveles de ARNm hepático de TTR V30M humano y de proteínas en suero, respectivamente, en ratones transgénicos durante 22 días después de una administración intravenosa rápida única de SNALP-18328. Se determinaron las medias del grupo. Se normalizaron los niveles de ARNm de TTR/GAPDH a los niveles del día 0 y se representaron gráficamente. El porcentaje de reducción de los niveles de ARNm de la TTR normalizados en relación con SNALP-1955 para cada instante de tiempo se calculó y se indicó para los grupos de SNALP-18328. (*** p< 0,001 ANOVA de un factor, con ensayo restrospectivo de Dunn).

La FIG. 8 muestra el transcurso del tiempo de los niveles de proteína en suero de la TTR en primates no humanos durante 14 días después de una infusión intravenosa de 15 minutos, única, de SNALP-18328.

La FIG. 9 muestra la reducción de inmunorreactividad de la TTR en diversos tejidos de ratones en los que se ha invalidado TTR/HSF-1 V30M humano después de administración intravenosa rápida de SNALP-18328. E, esófago; S, estómago; II, intestino/duodeno; 14, intestino/colon; N, nervio; D, ganglios de la raíz dorsal.

La FIG. 10 muestra las mediciones de los niveles de ARNm de la TTR en los hígados de primates no humanos después de infusión intravenosa de 15 minutos de XTC-SNALP-18328.

Las FIGs. 11A y 11B muestran las mediciones de ARNm de la TTR y los niveles de proteína en suero, respectivamente, en hígados de primates no humanos después de infusión intravenosa de 15 minutos de LNP09- 18328 o LNP11 -18328. La FIG 11C muestra el transcurso del tiempo de los niveles de proteína en suero de la TTR después de 28 días después de infusión intravenosa de 15 minutos de 0,3 mg/kg de LNP09-18328, cuando se compara con el grupo de control de PBS.

La FIG. 12 muestra la secuencia de ARNm de la TTR humano (Ref. Sec. NM_000371.3, SEC ID N.° 1.331).

Las FIGs. 13A y 13B son las secuencias de ARNm de la TTR humano y de rata, respectivamente. La FIG. 13A es la secuencia de ARNm de la TTR humano (Ref. Sec. NM_000371.2, SeC ID N.° 1.329). La FIG. 13B es la secuencia de ARNm de la TTR de rata (Ref. Sec. NM_012681.1, SEC ID N.° 1.330).

La FIG. 14 muestra la alineación de nucleótidos de NM 000371.3, NM_000371.2 y AD-18328.

La FIG. 15 ilustra los síntomas y las mutaciones en TTR asociadas a neuropatía amiloidótica familiar, cardiomiopatía

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amiloidótica familiar y amiloidosis del SNC.

La FIG. 16 muestra la reducción de los niveles de ARNm de la TTR en el hígado con SNALP-18534 con diferentes duraciones de la infusión intravenosa. A los grupos de animales (n=4/grupo) se administró 1 mg/kg de SNALP-18534 por una infusión intravenosa de 15 minutos o 1, 2 ó 3 horas. Cuarenta y ocho horas más tarde, se practicó la eutanasia a las ratas y se recogieron los hígados. Se midieron los niveles de ARNm de TTR y GAPDH de lisados de hígado usando el ensayo de ADNb Quantigene. Se calculó la relación de los niveles de ARNm de TTR a GAPDH para cada animal. Se determinaron las medias del grupo y se normalizó a un grupo de control de PBS y después se representó gráficamente. Las barras de error representan desviaciones estándar. (*** p < 0,001, ANOVA de un factor con ensayo retrospectivo de Bonferroni, en relación con PBS).

La FIG 17 muestra las mediciones de los niveles de ARNm de la TTR en hígados de ratas después de infusión intravenosa de 15 minutos de LNP07-18534 o LNP08-18534.

La FIG. 18 muestra inhibición in vivo de niveles de ARNm de la TTR endógenos en hígados de ratas Sprague- Dawley después de una infusión IV de 15 minutos de LNP09-18534 o LNP11-18534. Se administró de manera intravenosa a grupos de animales (n=4/grupo) 0,01; 0,03; 0,1 ó 0,3 mg/kg de LNP09-18534, LNP-11-18534 o PBS por una infusión intravenosa de 15 minutos. Cuarenta y ocho horas más tarde, se practicó la eutanasia a los animales y se recogieron los hígados. Se midieron los niveles de ARNm de TTR y GAPDh de lisados de biopsia de hígado usando el ensayo de ADNb Quantigene. Se calculó la relación de los niveles de ARNm de TTR a GAPDH para cada animal. Se determinaron las medias del grupo, se normalizó al grupo de control de PBS y después se representó gráficamente. Las barras de error representan desviaciones estándar.

La invención se define por las reivindicaciones.

Se describen ARNds y métodos para usar los ARNds para inhibir la expresión de un gen de TTR en una célula o un mamífero donde el ARNds fija como objetivo un gen de TTR. La descripción también proporciona composiciones y métodos para tratar afecciones y enfermedades patológicas, tales como una amiloidosis por TTR, en un mamífero producida por la expresión de un gen de TTR. El ARNds dirige la degradación específica de la secuencia de ARNm por un procedimiento conocido como interferencia de ARN (ARNi).

Los ARNds de las composiciones caracterizadas en la presente memoria incluyen una hebra de ARN (la hebra complementaria) con una región que tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, en general 19-24 nucleótidos de longitud y es sustancialmente complementaria a al menos parte de una transcripción de ARNm de un gen de TTR. El uso de estos ARNds permite la degradación fijada como objetivo de los ARNm de los genes que están implicados en patologías asociadas a la expresión de la tTr en mamíferos. Dosis muy bajas de los ARNds de la TTR pueden mediar de manera específica y de manera eficaz en particular ARNi, dando como resultado una inhibición significativa de la expresión de un gen de la TTR. Usando ensayos a base de células, los presentes autores han demostrado que la TTR que fija como objetivo los ARNds puede mediar de manera específica y de manera eficaz ARNi, dando como resultado una inhibición significativa de la expresión de un gen de la TTR. Así, los métodos y las composiciones que incluyen estos ARNds son útiles para tratar procesos patológicos que pueden estar mediados por TTR de regulación hacia abajo, tal como en el tratamiento de un trastorno hepático o una amiloidosis de la TTR, por ejemplo, FAP.

Los métodos y las composiciones que contienen un ARNds de la TTR son útiles para tratar procesos patológicos mediados por expresión de TTR, tal como una amiloidosis por TTR. En una implementación, un método para tratar un trastorno mediado por expresión de TTR incluye administrar a un ser humano con necesidad de dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARNds fijado como objetivo a TTR. En una realización, se administra un ARNds al ser humano a aproximadamente 0,01; 0,1; 0,5; 1,0; 2; 2,5; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24 ó 25 mg/kg.

La siguiente descripción detallada describe cómo preparar y usar las composiciones que contienen los ARNds para inhibir la expresión de un gen de TTR, así como composiciones y métodos para tratar enfermedades y trastornos producidos por la expresión de este gen. Las composiciones farmacéuticas incluyen un ARNds con una hebra complementaria que comprende una región de complementariedad que tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, en general 19-24 nucleótidos de longitud y es sustancialmente complementaria a al menos parte de una transcripción de ARN de un gen de TTR, junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones también incluyen un ARNds con una hebra complementaria con una región de complementariedad que tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, en general 19-24 nucleótidos de longitud y es sustancialmente complementaria a al menos parte de una transcripción de ARN de un gen de TTR.

La hebra transcrita de un ARNds puede incluir 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más nucleótidos contiguos de la SEC ID N.° 169, SEC ID N.° 449, SEC ID N.° 729 o SEC ID N.° 1.009. La hebra complementaria de un ARNds puede incluir 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más nucleótidos contiguos de la SEC ID N.° 170, SEC ID N.° 450, SEC ID N.° 730 o SEC ID N.° 1.010. En una realización, la hebra transcrita de un ARNds puede constar de la SEC ID N.° 449 y la hebra complementaria puede constar de la SEC ID N.° 450. En una realización, la hebra transcrita de un ARNds puede constar de la SEC ID N.° 729 y la hebra complementaria puede constar de la SEC ID N.° 730. En una realización, la

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hebra transcrita de un ARNds puede constar de la SEC ID N.° 1.009 y la hebra complementaria puede constar de la SEC ID N.° 1.010.

En una implementación, un ARNds puede incluir al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más nucleótidos modificados. En una realización, un nucleótido modificado puede incluir un nucleótido 2'-O-metil-modificado, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y/o un nucleótido terminal ligado a un derivado de colesterilo o grupo bisdecilamida de ácido dodecanoico. En una realización, un nucleótido modificado puede incluir un nucleótido 2'- desoxi-2'-fluoro-modificado, un nucleótido 2'-desoxi-modificado, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido 2-amino-modificado, un nucleótido 2-alquil-modificado, nucleótido de morfolino, un fosforamidato y/o un nucleótido que comprende base no natural.

En una implementación, la región de complementariedad de un ARNds tiene al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más nucleótidos de longitud. En una implementación, la región de complementariedad incluye 10,

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más nucleótidos contiguos de la SEC ID N.° 169.

En una implementación, cada hebra de un ARNds tiene 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más nucleótidos de longitud. En una implementación, el ARNds incluye una hebra transcrita o fragmento de 10, 11,

12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos de la misma, seleccionados de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 y 16 y una hebra complementaria o fragmento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos de la misma, seleccionados de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 y 16.

En una implementación, la administración de un ARNds a una célula da como resultado aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 % o más de inhibición de expresión de ARNm de la TTR cuando se mide por un ensayo de PCR en tiempo real. En una implementación, la administración de un ARNds a una célula da como resultado aproximadamente 40 % a 45 %, 45 % a 50 %, 50 % a 55 %, 55 % a 60 %, 60 % a 65 %, 65 % a 70 %, 70 % a 75 %, 75 % a 80 %, 80 % a 85 %, 85 % a 90 %, 90 % a 95 % o más de inhibición de la expresión de ARNm de la TTR cuando se mide por un ensayo de PCR en tiempo real. En una implementación, la administración de un ARNds a una célula da como resultado aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 % o más de inhibición de la expresión de ARNm de la TTR cuando se mide por un ensayo de ADN ramificado. En una implementación, la administración de un ARNds a una célula da como resultado aproximadamente 40 % a 45 %, 45 % a 50 %, 50 % a 55 %, 55 % a 60 %, 60 % a 65 %, 65 % a 70 %, 70 % a 75 %, 75 % a 80 %, 80 % a 85 %, 85 % a 90 %, 90 % a 95 % o más de inhibición de la expresión de ARNm de la TTR cuando se mide por un ensayo de ADN ramificado.

En una implementación, un ARNds tiene un IC50 menor que 0,01 pM, 0,1 pM, 1 pM, 5 pM, 10 pM, 10 pM, 100pM o 1.000 pM. En una implementación, un ARNds tiene un ED50 de aproximadamente 0,01; 0,1; 1; 5 ó 10 mg/kg.

En una implementación, la administración de un ARNds puede reducir ARNm de la TTR por aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 % o más en monos cynomolgus. En una implementación, la administración de un ARNds reduce los niveles de ARNm de la TTR hepáticos por aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 % o más o los niveles de proteína TTR en suero por aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 % o más. En una implementación, la administración de un ARNds reduce los niveles de ARNm de la TTR hepáticos y/o los niveles de proteína TTR en suero hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más días.

En una implementación, un ARNds se formula en una formulación de LNP y reduce los niveles de ARNm de la TTR por aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 % o más a una dosis de

0. 1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 ó 1 mg/kg, en relación con un grupo de control de PBC. En una implementación, un ARNds se formula en una formulación de LNP y reduce los niveles de proteína TTR aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 % o más en relación con un grupo de control de PBC cuando se mide por un método western. En una implementación, un ARNds suprime los niveles de proteína TTR en suero hasta del día 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 postratamiento cuando se administra a un individuo con necesidad del mismo a 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 mg/kg.

De acuerdo con esto, en algunos aspectos, se describen composiciones farmacéuticas que contienen un ARNds de la TTR y un portador farmacéuticamente aceptable, métodos para usar las composiciones para inhibir la expresión de un gen de TTR y métodos para usar las composiciones farmacéuticas para tratar enfermedades producidas por expresión de un gen de TTR.

1. Definiciones

Por conveniencia, el significado de ciertos términos y expresiones usados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas, se proporciona a continuación. Si existe una aparente discrepancia entre el uso de un término en otras partes de esta memoria descriptiva y su definición proporcionada en esta sección, prevalecerá la definición en esta sección.

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"G," "C," "A" y "U" representan en general cada uno un nucleótido que contiene guanina, citosina, adenina y uracilo como una base, respectivamente. "T" y "dT" se usan de forma intercambiable en la presente memoria y se refieren a un desoxirribonucleótido en el que la nucleobase es timina, por ej., desoxirribotimina. Sin embargo, se puede entender que el término "ribonucleótido" o "nucleótido" o "desoxirribonucleótido" también se puede referir a un nucleótido modificado, como se detalla además a continuación, o un resto de reemplazo de sustitución. El experto sabe que se pueden reemplazar guanina, citosina, adenina y uracilo por otros restos sin modificar sustancialmente las propiedades de apareamiento de bases de un oligonucleótido que comprende un nucleótido que soporta dicho resto de sustitución. Por ejemplo, sin limitación, un nucleótido que comprende inosina como su base puede emparejar base con nucleótidos que contienen adenina, citosina o uracilo. Por lo tanto, los nucleótidos que contienen uracilo, guanina o adenina se pueden reemplazar en las secuencias de nucleótidos de la invención por un nucleótido que contenga, por ejemplo, inosina. Las secuencias que comprenden tales restos de sustitución son realizaciones de la invención.

Como se usa en la presente memoria, "transtiretina" ("TTR") se refiere a un gen en una célula. TTR es también conocido como ATTR, HsT2651, PALB, prealbúmina, TBPA y la transtiretina (prealbúmina, amiloidosis tipo I). La secuencia de una transcripción de ARNm de la TTR humano se puede encontrar en NM_000371. La secuencia de ARNm de la TTR de ratón se puede encontrar en NM_013697.2 y la secuencia de ARNm de la TTR de rata se puede encontrar en NM_012681.1.

Como se usa en la presente memoria, "secuencia objetivo" se refiere a una porción contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen de TTR, incluyendo ARNm que es un producto de tratamiento de ARN de un producto de transcripción primario.

Como se usa en la presente memoria, el término "hebra que comprende una secuencia" se refiere a un oligonucleótido que comprende una cadena de nucleótidos que se describe por la secuencia referida usando la nomenclatura de nucleótidos clásica.

Como se usa en la presente memoria y a menos que se indique de otro modo, el término "complementario," cuando se usa para describir una primera secuencia de nucleótidos en relación a una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos para hibridar y formar una estructura dúplex en ciertas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos, como entenderá el experto. Tales condiciones, por ejemplo, pueden ser condiciones rigurosas, donde las condiciones rigurosas pueden incluir: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, AEDT 1 mM, 50°C o 70°C durante 12-16 horas seguido por lavado. Se pueden aplicar otras condiciones, tales como condiciones fisiológicamente relevantes como se pueden encontrar en el interior de un organismo. El experto podrá determinar la serie de condiciones más apropiadas para un ensayo de complementariedad de dos secuencias de acuerdo con la aplicación última de los nucleótidos hibridados.

Esto incluye apareamiento de bases del oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos al oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos por la longitud completa de la primera y segunda secuencia de nucleótidos. Dichas secuencias se pueden referir como "completamente complementarias" con respecto una a la otra en la presente memoria. Sin embargo, en el caso de que una primera secuencia se refiera como "sustancialmente complementaria" con respecto a una segunda secuencia en la presente memoria, las dos secuencias pueden ser completamente complementarias o pueden formar una o más, pero generalmente no más de 4, 3 ó 2 pares de bases erróneamente emparejadas en la hibridación, al tiempo que se retiene la capacidad para hibridar en las condiciones más relevantes a su aplicación última. Sin embargo, en el caso de que se designen dos oligonucleótidos para formar, en la hibridación, uno o más salientes monocatenarios, dicho salientes no se considerarán como errores de emparejamiento con respecto a la determinación de complementariedad. Por ejemplo, un ARNds que comprende un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de longitud, en el que el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es completamente complementario al oligonucleótido más corto, se puede referir como "completamente complementario" para los fines descritos en la presente memoria.

Secuencias "complementarias", como se usa en la presente memoria, también pueden incluir, o se forman completamente de, pares de bases no de Watson-Crick y/o pares de bases formadas de nucleótidos no naturales y modificados, en la medida en que se satisfagan los requerimientos anteriores con respecto a su capacidad para hibridar. Dichos pares de bases no de Watson-Crick incluyen, pero no se limitan a, apareamiento de bases G:U Wobble o Hogstein.

Los términos "complementario," "completamente complementario" y "sustancialmente complementario" en la presente memoria se pueden usar con respecto al emparejamiento de bases entre la hebra transcrita y la hebra complementaria de un ARNds o entre la hebra complementaria de un ARNds y una secuencia objetivo, como se entenderá a partir del contexto de su uso.

Como se usa en la presente memoria, un polinucleótido que es "sustancialmente complementario a al menos parte de" un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es sustancialmente complementario a una porción contigua del ARNm de interés (por ej., un ARNm que codifica TTR) incluyendo un 5' UTR, un marco de lectura

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abierto (ORF, por sus siglas en inglés) o un 3' UTR. Por ejemplo, un polinucleótido es complementario a al menos una parte de un ARNm de la TTR si la secuencia es sustancialmente complementaria a una porción no interrumpida de un ARNm que codifica TTR.

El término "ARN bicatenario" o "ARNds," como se usa en la presente memoria, se refiere a un complejo de moléculas de ácido ribonucleico, que tienen una doble estructura que comprende dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y sustancialmente complementarias, como se definió anteriormente. En general, la mayoría de los nucleótidos de cada cadena son ribonucleótidos, pero como se describe con detalle en la presente memoria, cada una o las dos cadenas también pueden incluir al menos un no ribonucleótido, por ejemplo, desoxirribonucleótido y/o un nucleótido modificado. Además, como se usa en esta memoria descriptiva, "ARNds" puede incluir modificaciones químicas a los ribonucleótidos, incluyendo modificaciones sustanciales en múltiples nucleótidos e incluyendo todos los tipos de modificaciones descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica. Cualquiera de tales modificaciones, como se usa en una molécula de tipo ARNsi, están incluidas por "ARNds" para los fines de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones.

Las dos hebras que forman la estructura doble pueden ser diferentes porciones de una molécula de ARN más grande o pueden ser moléculas de ARN separadas. En el caso de que las dos hebras sean parte de una molécula más grande, y por lo tanto estén conectadas por una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva formando la doble estructura, la cadena de ARN que conecta se refiere como un "bucle horquilla". En el caso de que las dos hebras estén conectadas mediante enlaces covalentes por medios distintos de una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva formando la doble estructura, la estructura de conexión se refiere como un "ligador". Las hebras de ARN pueden tener el mismo número de nucleótidos o uno diferente. El número máximo de pares de bases es el número de nucleótidos en la hebra más corta del ARNds menos cualquier saliente que esté presente en el dúplex. Además de la doble estructura, un ARNds puede comprender uno o más salientes de nucleótidos. El término "ARNsi" se usa también en la presente memoria para referirse a un ARNds como se describió anteriormente.

Como se usa en la presente memoria, un "saliente de nucleótido" se refiere a un nucleótido o nucleótidos no emparejados que sobresalen de la doble cadena de un ARNds cuando un extremo 3' de una hebra del ARNds se extiende más allá del extremo 5' de la otra hebra, o viceversa. "Romo" o "extremo romo" significa que no hay nucleótidos no emparejados en ese extremo del ARNds, es decir, no saliente de nucleótido. Un ARNds "de extremo romo" es un ARNds que tiene doble cadena por toda su longitud, es decir, no tiene saliente de nucleótidos en ningún extremo de la molécula.

El término "hembra complementaria" se refiere a la hebra de un ARNds que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una secuencia objetivo. Como se usa en la presente memoria, el término "región de complementariedad" se refiere a la región en la hebra complementaria que es sustancialmente complementaria a una secuencia, por ejemplo, una secuencia objetivo, como se define en la presente memoria. En el caso de que la región de complementariedad no sea completamente complementaria a la secuencia objetivo, los errores de emparejamiento son mejor tolerados en las regiones terminales y, si hay, están en general en una región o regiones terminales, por ejemplo, en 6, 5, 4, 3 ó 2 nucleótidos del extremo 5' y/o 3'.

El término "hebra transcrita," como se usa en la presente memoria, se refiere a la hebra de un ARNds que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una región de la hebra complementaria.

Como se usa en la presente memoria, el término "SNALP" se refiere a una partícula de ácido nucleico-lípido estable. Una SNALP representa una vesícula de lípidos que recubre un interior acuoso reducido que comprende un ácido nucleico tal como un ARNds o un plásmido a partir del cual se transcribe un ARNds. Se describe SNALP, por ej., en las Publicaciones de Solicitud de Patente de Ee. UU. Nos. 20060240093, 20070135372 y la Patente de EE. uU. n.° de Serie 61/045.228 presentada el 15 de abril de 2.008.

"Introducir en una célula", cuando se refiere a un ARNds, significa facilitar la captación o absorción en la célula, como entienden los expertos en la materia. La absorción o captación de ARNds puede tener lugar a través de procesos de difusión no auxiliados o procesos celulares activos o mediante agentes o dispositivos auxiliares. El significado de este término no se limita a células in vitro; un ARNds también se puede “introducir en una célula", en el que la célula es parte de un organismo viviente. En tal caso, la introducción en la célula incluirá el suministro al organismo. Por ejemplo, para suministro in vivo, se puede inyectar ARNds en un sitio del tejido o administrar por vía sistémica. La introducción in vitro en una célula incluye métodos conocidos en la técnica tales como electroporación y lipofección. Otras propuestas se describen en la presente memoria o son conocidas en la técnica.

Los términos "silenciar," "inhibir la expresión de," "regular hacia abajo la expresión de," " suprimir la expresión de" y similares en la medida en que se refieren a un gen de TTR, se refieren en la presente memoria a la eliminación al menos parcial de la expresión de un gen de TTR, como se manifiesta por una reducción de la cantidad de ARNm que se puede aislar de una primera célula o grupo de células en que se transcribe un gen de TTR y que ha sido o han sido tratadas de manera que se inhibe la expresión de un gen de TTR, cuando se compara con una segunda célula o grupo de células sustancialmente idénticas a la primera célula o grupo de células pero que no ha sido o no

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han sido tratadas así (células de control). El grado de inhibición se expresa normalmente en términos de:

(ARNm en células control) - (ARNm en células tratadas)

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(ARNm en células control)

Alternativamente, el grado de inhibición se puede proporcionar en términos de una reducción de un parámetro que esté funcionalmente ligado a la expresión de un gen de TTR, por ej., la cantidad de proteína codificada por un gen de TTR que es segregada por una célula o el número de células que muestra un cierto fenotipo, por ejemplo, muerte celular programada. En principio, se puede determinar el silenciamiento de un gen de TTR en cualquier célula que exprese el objetivo, de manera constitutiva o por ingeniería genómica y por cualquier ensayo apropiado. Sin embargo, cuando se requiere una referencia para determinar si un ARNds determinado inhibe la expresión de un gen de TTR en un cierto grado y, por lo tanto, se incluye por la invención inmediata, los ensayos proporcionados en los Ejemplos a continuación servirán como tal referencia.

Por ejemplo, en algunos casos, la expresión de un gen de TTR se suprime por al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 % o 50 % por administración del oligonucleótido bicatenario caracterizado en la invención. En algunas realizaciones, se suprime un gen de TTR por al menos aproximadamente 60 %, 70 % u 80 % por administración del oligonucleótido bicatenario caracterizado en la invención. En algunas realizaciones, se suprimen un gen de TTR por al menos aproximadamente 85 %, 90 % o 95 % por administración del oligonucleótido bicatenario caracterizado en la invención.

Como se usa en la presente memoria en el contexto de la expresión de TTR, los términos “tratar”, “tratamiento” y similares, se refieren a alivio de o mitigación de procesos patológicos mediados por expresión de TTR. En el contexto de la presente invención en la medida en que se refiere a cualquiera de las otras afecciones citadas en la presente memoria a continuación (distintas de procesos patológicos mediados por expresión de TTR), los términos “tratar”, “tratamiento” y similares significan alivio o mitigación de al menos un síntoma asociado a dicha afección o a retardar o invertir el progreso de dicha afección, tal como el retardamiento de la progresión de una amiloidosis por TTR, tal como FAP. Los síntomas de amiloidosis por TTR incluyen neuropatía sensorial (por ejemplo, parestesia, hipoestesia en miembros distales), neuropatía autonómica (por ejemplo, disfunción gastrointestinal, tal como úlcera gástrica o hipotensión ortostática), neuropatía motora, convulsiones, demencia, mielopatía, polineuropatía, síndrome del túnel carpiano, insuficiencia autonómica, cardiomiopatía, opacidades vítreas, insuficiencia renal, nefropatía, sustancialmente mBMI reducido (Índice de Masa Corporal modificado, por sus siglas en inglés), disfunción de los nervios craneales y distrofia del entramado de la córnea.

Como se usa en la presente memoria, las expresiones "cantidad terapéuticamente eficaz" y "cantidad profilácticamente eficaz" se refieren a una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento, prevención o gestión de procesos patológicos mediados por expresión de TTR o un síntoma sintomático de procesos patológicos mediados por expresión de TTR. La cantidad específica que es terapéuticamente eficaz se puede determinar fácilmente por un profesional habilitado médico ordinario y puede variar dependiendo de factores conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, el tipo de procesos patológicos mediados por expresión de TTR, la historia y la edad del paciente, la fase de los procesos patológicos mediados por expresión de TTR y la administración de otros procesos antipatológicos mediados por agentes de expresión de TTR.

Como se usa en la presente memoria, una "composición farmacéutica" comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de un ARNds y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente memoria, "cantidad farmacológicamente eficaz," "cantidad terapéuticamente eficaz " o simplemente “cantidad eficaz” se refiere a esa cantidad de un ARN eficaz para producir el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo, deseado. Por ejemplo, si se considera eficaz un tratamiento clínico determinado cuando hay al menos 25 % de reducción en un parámetro medible asociado a una enfermedad o trastorno, una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco para el tratamiento de esa enfermedad o trastorno es la cantidad necesaria para efectuar al menos una reducción del 25 % en ese parámetro. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARNds que fija como objetivo TTR puede reducir los niveles en suero de TTR por al menos 25 %. En otro ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARNds que fija como objetivo TTR puede mejorar la función hepática o la función renal por al menos 25 %.

El término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador para administración de un agente terapéutico. Tales portadores incluyen, pero no se limitan a, disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. El término excluye específicamente medio de cultivo celular. Para fármacos administrados por vía oral, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, excipientes farmacéuticamente aceptables tales como diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes de unión, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y conservantes. Diluyentes inertes adecuados incluyen carbonato de sodio y de calcio, fosfato de sodio y de calcio y lactosa, mientras almidón de maíz y ácido algínico son agentes disgregantes adecuados. Los agentes aglutinantes pueden incluir almidón y gelatina, mientras que el agente lubricante, si hay, será generalmente estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Si se desea, los comprimidos pueden estar recubiertos con un material tal como monoestearato de glicerilo o

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diestearato de glicerilo, para retardar la absorción en el tubo digestivo.

Como se usa en la presente memoria, una "célula transformada" es una célula en que se ha introducido un vector a partir del cual se puede expresar una molécula de ARNds.

II. Ácido ribonucleico bicatenario (ARNds)

Como se describe con más detalle en la presente memoria, la descripción proporciona moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) para inhibir la expresión de un gen de TTR en una célula o mamífero, por ejemplo, en un ser humano que tiene una amiloidosis por TTR, donde el ARNds incluye una hebra complementaria con una región de complementariedad que es complementaria a al menos una parte de un ARNm formado en la expresión de un gen de TTR y donde la región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, en general 1924 nucleótidos de longitud y donde dicho ARNds, en el contacto con una célula que expresa dicho gen de TTR, inhibe la expresión de dicho gen de TTR por al menos 30 % cuando se ensaya por, por ejemplo, un método basado en PCR o ADN ramificado (ADNb) o por un método basado en proteínas, tal como por método western. La expresión de un gen de TTR se puede reducir por al menos 30 % cuando se mide mediante un ensayo como se describe en los Ejemplos a continuación. Por ejemplo, la expresión de un gen de TTR en cultivo celular, tal como en células Hep3B, se puede ensayar midiendo los niveles de ARNm de la TTR, tales como por ensayo de ADNb o TaqMan o midiendo los niveles de proteína, tal como por el método ELISA. El ARNds de la invención puede incluir además uno o más salientes de nucleótidos monocatenarios.

El ARNds se puede sintetizar por métodos clásicos conocidos en la técnica como se discute además a continuación, por ejemplo, por uso de un sintetizador de ADN automatizado, tal como están comercialmente disponibles en, por ejemplo, Biosearch, Applied Biosystems, Inc. El ARNds incluye dos hebras de ARN que son suficientemente complementarias para hibridación para formar una doble estructura. Una hebra del ARNds (la hebra complementaria) incluye una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria y en general completamente complementaria, a una secuencia objetivo, derivada de la secuencia de un ARNm formada durante la expresión de un gen de TTR, la otra hebra (la hebra transcrita) incluye una región que es complementaria a la hebra complementaria, de manera que las dos hebras se hibridan y forman una doble estructura cuando se combinan en condiciones adecuadas. En general, la doble estructura tiene entre 15 y 30 o entre 25 y 30 o entre 18 y 25 o entre 19 y 24 o entre 19 y 21 ó 19, 20 ó 21 pares de bases de longitud. En una realización, el dúplex tiene 19 pares de bases de longitud. En otra realización, el dúplex tiene 21 pares de bases de longitud. Cuando se usan dos ARNsi diferentes en asociación, las longitudes del dúplex pueden ser idénticas o pueden diferir.

Cada hebra del ARNds tiene en general entre 15 y 30 o entre 18 y 25 ó 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 nucleótidos de longitud. En otras realizaciones, cada hebra tiene 25-30 nucleótidos de longitud. Cada hebra del dúplex puede tener la misma longitud o ser de longitudes diferentes. Cuando se usan dos ARNsi en asociación, las longitudes de cada hebra de cada ARNsi pueden ser idénticas o pueden diferir.

El ARNds puede incluir uno o más salientes monocatenarios de uno o más nucleótidos. En una implementación, al menos un extremo del ARNds tiene un saliente de nucleótidos monocatenario de 1a 4, en general 1 ó 2 nucleótidos. En otra implementación, la hebra complementaria del ARNds tiene salientes de 1-10 nucleótidos cada uno en el extremo 3' y el extremo 5' por la hebra transcrita. En más implementaciones, la hebra transcrita del ARNds tiene salientes de 1-10 nucleótidos cada uno en el extremo 3' y el extremo 5' por la hebra complementaria.

Un ARNds que tiene al menos un saliente de nucleótidos puede presentar propiedades inhibidoras inesperadamente superiores que la contrapartida de extremo romo. En algunas implementaciones, la presencia de saliente de sólo un nucleótido refuerza la actividad interferente del ARNds, sin afectar a su estabilidad total. Un ARNds que tiene sólo un saliente se ha demostrado particularmente estable y eficaz in vivo, así como en una variedad de células, medios de cultivo celular, sangre y suero. En general el saliente monocatenario se sitúa en el extremo terminal 3' de la hebra complementaria o, alternativamente, en el extremo terminal 3' de la hebra transcrita. El ARNds también puede tener un extremo romo, en general situado en el extremo 5' de la hebra complementaria. Dichos ARNds pueden presentar estabilidad y actividad inhibidora mejoradas, permitiendo así la administración a dosis bajas, es decir, menores que 5 mg/kg de peso corporal del receptor al día. En general, la hebra complementaria del ARNds presenta un saliente de nucleótidos en el extremo 3' y el extremo 5' es romo. En otra implementación, uno o más de los nucleótidos en el saliente se reemplaza con un tiofosfato del nucleósido.

En una implementación, un gen de TTR es un gen de TTR humano. En implementaciones específicas, la hebra transcrita del ARNds es una de las secuencias transcritas de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B o 7 y la hebra complementaria es una de las secuencias complementarias de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B o 7. Los agentes complementarios alternativos que fijan como objetivo en otra parte en la secuencia objetivo proporcionada en las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B o 7 se pueden determinar fácilmente usando la secuencia objetivo y la secuencia de TTR flanqueadora.

El experto sabe que el ARNds que tiene una doble estructura de entre 20 y 23, pero específicamente 21, pares de bases se ha estimado como particularmente eficaz en la inducción de interferencia por ARN (Elbashir et al., EMBO 2.001, 20: 6.877-6.888). Sin embargo, otros han encontrado que los ARNds más cortos o más largos también

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pueden ser eficaces. En las realizaciones descritas anteriormente, debido a la naturaleza de las secuencias de oligonucleótidos proporcionadas en las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B y 7, los ARNds caracterizados en la invención pueden incluir al menos una hebra de una longitud descrita en la presente memoria. Se puede esperar razonablemente que los ARNds más cortos que tengan una de las secuencias de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B o 7 menos sólo unos nucleótidos en uno o en ambos extremos pueden ser similarmente eficaces cuando se compara con el ARNds descrito anteriormente. Por lo tanto, se considera el ARNds con una secuencia parcial de al menos 15,16, 17,18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos de una de las secuencias de las Tablas 3, 4, 6 ó 7 y que difieren en su capacidad para inhibir la expresión de un gen de TTR en un ensayo como se describe en la presente memoria a continuación por no más de 5,10,15, 20, 25 ó 30 % de inhibición de un ARNds que comprenda la secuencia completa. Además, el ARNds que se escinde dentro de una secuencia objetivo de TTR deseada se puede preparar fácilmente usando la correspondiente secuencia complementaria de TTR y una secuencia transcrita complementaria.

Además, los ARNds proporcionados en las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B o 7 identifican un sitio en un TTR que es susceptible a escisión a base de ARNi. Como tal, la presente descripción caracteriza además los ARNds que fijan como objetivo dentro de la secuencia fijada como objetivo por uno de los agentes de la presente descripción. Como se usa en la presente memoria, se dice que un segundo ARNds fija como objetivo dentro de la secuencia de un primer ARNds si el segundo ARNds escinde el mensaje en cualquier parte dentro del ARNm que es complementario a la hebra complementaria del primer ARNds. Dicho segundo ARNds constará en general de al menos 15 nucleótidos contiguos a partir de una de las secuencias proporcionadas en las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B o 7 acoplados a secuencias de nucleótidos adicionales tomadas de la región contigua a la secuencia seleccionada en un gen de TTR.

El ARNds caracterizado en la presente memoria puede contener uno o más errores de emparejamiento a la secuencia fijada como objetivo. En una implementación, el ARNds caracterizado en la descripción contiene no más de 3 errores de emparejamiento. Si la hebra complementaria del ARNds contiene errores de emparejamiento a una secuencia fijada como objetivo, es preferible que el área de desajuste no esté situada en el centro de la región de complementariedad. Si la hebra complementaria del ARNds contiene errores de emparejamiento a la secuencia fijada como objetivo, es preferible que el desajuste esté restringido a 5 nucleótidos de cualquier extremo, por ejemplo 5, 4, 3, 2 ó 1 nucleótido de cualquiera de los extremos 5' o 3' de la región de complementariedad. Por ejemplo, para una hebra de ARNds de 23 nucleótidos que sea complementaria una región de un gen de TTR, el ARNds no contiene en general ningún error de emparejamiento dentro de los 13 nucleótidos centrales. Los métodos descritos en la descripción se pueden usar para determinar si un ARNds que contiene un error de emparejamiento a una secuencia fijada como objetivo es eficaz en la inhibición de la expresión de un gen de TTR. La consideración de la eficacia de los ARNds con errores de emparejamiento en la inhibición de la expresión de un gen de TTR es importante, especialmente si se sabe que la región particular de complementariedad en un gen de TTR presenta variación de secuencia polimórfica en la población.

Modificaciones

En otra realización más, el ARNds se modifica de manera química para mejorar la estabilidad. Los ácidos nucleicos caracterizados en la invención se pueden sintetizar y/o modificar por métodos establecidos en la técnica, tales como los descritos en "Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S. L. et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, USA, que se incorpora por este medio en la presente memoria por referencia. Ejemplos específicos de compuestos de ARNds útiles en esta invención incluyen los ARNds que contienen cadenas carbonadas modificadas o uniones internucleósido no naturales. Como se define en esta memoria descriptiva, los ARNds con cadenas carbonadas modificadas incluyen aquéllos que retienen un átomo de fósforo en la cadena carbonada y aquéllos que no tienen un átomo de fósforo en la cadena carbonada. Para los fines de esta memoria descriptiva y como a veces se refiere en la técnica, el ARNds modificado que no presenta un átomo de fósforo en su cadena carbonada internucleósido también se puede considerar que son oligonucleósidos.

Las cadenas carbonadas de ARNds modificado incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil y otros alquil-fosfonatos incluyendo 3'-alquileno- fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos con uniones 3'-5' normales, análogos de éstos 2'-5' ligados y aquéllos) con polaridad invertida en los que los pares adyacentes de unidades de nucleósido están ligados 3'-5' a 5'-3' o 2-5' a 5-2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.

Las Patentes de EE. UU. representativas que explican la preparación de las uniones que contienen fósforo anteriores incluyen, pero no se limitan a, las Patentes de EE. UU. N.° 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361 y 5.625.050.

Las cadenas principales de ARNds modificado que no incluyen un átomo de fósforo en las mismas presentan cadenas principales que están formadas por uniones alquil o cicloalquil internucleósido de cadena corta, heteroátomos mixtos y uniones alquil o cicloalquil internucleósido o una o más uniones internucleósido

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heteroatómicas o heterocíclicas. Estas incluyen aquéllas que tienen uniones morfolino (formadas en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metilenoformacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenoimino y metilenohidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida y otros que tienen partes de componentes de N, O, S y CH2 mixtas.

Las Patentes de EE. UU. representativas que explican la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero no se limitan a, las Patentes de EE. UU. N.° 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437 y 5.677.439, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria como referencia.

En otros miméticos de ARNds adecuados, tanto el azúcar como la unión internucleósido, es decir, la cadena principal, de las unidades de nucleótidos se reemplazan con nuevos grupos. Las unidades de base se mantienen para hibridación con un compuesto fijado como objetivo de ácido nucleico apropiado. Uno de tales compuestos oligoméricos, un mimético de ARNds que ha demostrado presentar excelentes propiedades de hibridación, se refiere como un ácido nucleico peptídico (PNA, por sus siglas en inglés). En compuestos de PNA, la cadena principal de azúcar de un ARNds es reemplazada con una cadena principal que contiene amida, en particular una cadena principal de aminoetilglicina. Las nucleobases son retenidas y se ligan directamente o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la cadena principal. Las Patentes de EE. UU. representativas que explican la preparación de compuestos PNA incluyen, pero no se limitan a, las Patentes de EE. uU. N.° 5.539.082; 5.714.331 y 5.719.262. Se puede encontrar explicación adicional de compuestos PNA en Nielsen et al., Science, 1.991, 254, 1.497-1.500.

Otras realizaciones de la invención son ARNds con cadenas principales de fosforotioato y oligonucleósidos con cadenas principales heteroatómicas y en particular --CH2--NH--CH2--, --CH2--N(CH3)--O—CH2— [conocido como un metileno (metilimino) o cadena principal de MMI], --CH2--O-N(CH3)-CH2--, --CH2-N(CH3)--N(CHa)--CH2- y -N(CH3)-- CH2— [en las que la cadena principal de fosfodiéster natural se representa como --O--P--O--CH2--] de la Patente de EE. UU. N.° 5.489.677 referida anteriormente y las cadenas principales de amida de la Patente de EE. UU. N.° 5.602.240 referida anteriormente. También se prefieren los ARNds con estructuras de la cadena principal de morfolino de la Patente de EE. UU. N.° 5.034.506 referida anteriormente.

Los ARNds modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. Los ARNds preferidos comprenden uno de lo siguiente en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo u O-alquil-O-alquilo, en los que el alquilo, alquenilo y alquinilo puede ser al que alquilo C1 a C10 o alquenilo y alquinilo C2 a C10 sustituido o no sustituido. Se prefieren en particular O[(CH2)n)O]mCH3, O(CH2)n)OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, donde n y m son desde 1 a aproximadamente 10. Otros ARNds preferidos comprenden uno de lo siguiente en la posición 2': alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, CI, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ARNds o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un ARNds y otros sustituyentes con propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2'-metoxietoxi (2'-O--CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. chim. Acta, 1.995, 78, 486-504) es decir, un grupo alcoxi-alcoxi. Una modificación preferida más incluye 2'-dimetilaminoxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CHa)2, también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos en la presente memoria a continuación y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'- DMAEOE), es decir, 2'-O--CH2--O-CH2--N(CH2)2, también descrito en los ejemplos en la presente memoria a continuación.

Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2-OCH3), 2'-aminopropoxi (2-OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro (2'- F). También se pueden hacer modificaciones similares en otras posiciones en el ARNds, en particular la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3' terminal o en los ARNds 2'-5' ligados y la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los ARNds también pueden presentar miméticos de azúcar tales como restos ciclobutilo en vez del azúcar pentofuranosilo. Las Patentes de EE. UU. representativas que explican la preparación de dichas estructuras de azúcar modificado incluyen, pero no se limitan a, las Patentes de EE. UU. N.° 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633 y 5.700.920.

Los ARNds también pueden incluir modificaciones o sustituciones de nucleobase (también referido en la técnica simplemente como "base"). Como se usa en la presente memoria, nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G) y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como: 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros alquil-derivados de adenina y guanina, 2- propil y otros alquil-derivados de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil-uracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 813

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tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilanal otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, en particular 5-bromo, 5-trifluorometil y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7- deazaguanina y 7-daazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Más nucleobases incluyen las descritas en la Patente de EE. UU. N.° 3.687.808, las descritas en The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1.990, estas descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, Edición Internacional, 1.991, 30, 613 y las descritas por Sanghvi Y S., Capítulo 15, DsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1.993. Algunas de estas nucleobases son útiles en particular para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligómeros caracterizados en la invención. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5- metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de los ácidos nucleicos por 0,6-1,2°C. (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. y Lebleu, B., Eds., DsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1.993, págs. 276-278) y son sustituciones de bases ejemplares, incluso más en particular cuando se combinan con modificaciones de 2'-O- metoxietil-azúcar.

Las Patentes de EE. UU. representativas que explican la preparación de algunas de las nucleobases modificadas indicadas anteriormente así como otras nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a, la Patente de EE. UU. N.° 3.687.808 indicada anteriormente, así como las Patentes de Ee. UU. N.° 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121; 5.596.091; 5.614.617 y 5.681.941 y la Patente de EE. UU. N.° 5.750.692.

Conjugados

Otra modificación de los ARNds implica ligar mediante enlaces covalentes al ARNds uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, distribución celular o absorción celular del ARNds. Dichos restos incluyen, pero no están limitados a restos de lípidos tales como un resto de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. uSa, 1.989, 86: 6.553-6.556), ácido cólico (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1.994, 4: 1.053-1.060), un tioéter, por ej., beril- S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1.992, 660: 306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1.993, 3: 2.765-2.770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acid Res., 1.992, 20: 533-538), una cadena alifática, por ej., dodecandiol o restos undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1.991, 10: 1.111-1.118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1.990, 259: 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1.993, 75: 49-54), un fosfolípido, por ej., di-hexadecil- rac-glicerol o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-Hfosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1.995, 36: 3.651-3.654; Shea et al., Nucl. Acid Res., 1.990, 18: 3.777-3.783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleótido, 1.995, 14: 969-973) o ácido adamantanoacético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1.995, 36: 3.651-3.654), un resto palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1.995, 1.264: 229-237) o un resto octadecilamina o hexiloamino-carboniloxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Then, 1.996, 277: 923-937).

Las Patentes de EE. UU. representativas que explican la preparación de dichos conjugados de ARNds incluyen

pero no se limitan a, las Patentes de EE. UU. N.° 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730

5.552.538

5.578.718

4.904.582

5.258.506

5.512.667

5.599.928

5.578.717.

5.608.046;

4.958.013;

5.262.536;

5.514.785;

' 5.688.941.

5.580.731

4.587.044

5.082.830

5.272.250

5.565.552

5.591.584

4.605.735

5.112.963

5.292.873

5.567.810

5.109.124

4.667.025

5.214.136

5.317.098

5.574.142

5.118.802

4.762.779

5.082.830

5.371.241

5.585.481

5.138.045

4.789.737

5.112.963

5.391.723

5.587.371

5.414.077

4.824.941

5.214.136

5.416.203

5.595.726

5.486.603

4.835.263

5.245.022

5.451.463

5.597.696

5.512.439

4.876.335

5.254.469

5.510.475

5.599.923

No es necesario que todas las posiciones en un compuesto determinado se modifiquen de manera uniforme y de hecho más de una de las modificaciones mencionadas se puede incorporar en un único compuesto o incluso en un único nucleósido en un ARNds. La presente descripción también incluye compuestos de ARNds que son compuestos quiméricos. Compuestos de ARNds “quiméricos” o “quimeras” en el contexto de esta descripción, son compuestos de ARNds, en particular los ARNds, que contienen dos o más regiones distintas químicamente, constituyendo cada una al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de ARNds. Estos ARNds contienen típicamente al menos una región en la que se modifica el ARNds de manera que se confiere en el ARNds resistencia aumentada a la degradación de la nucleasa, absorción celular aumentada y/o afinidad de unión aumentada para el ácido nucleico fijado como objetivo. Una región adicional del ARNds puede servir como sustrato para enzimas capaces de escindir ARN: ADN o híbridos de ARN:ARN. Como ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN. La activación de la RNasa H, por lo tanto, da como resultado escisión del objetivo de ARN, aumentando normalmente de ese modo la eficacia de la inhibición de ARNds de expresión del gen. Por consiguiente, con frecuencia se pueden obtener resultados comparables con ARNds más cortos cuando se usan los ARNds quiméricos, comparado con los fosforotioato desoxiARNds que hibridan la misma región fijada como objetivo.

La escisión del objetivo de ARN se puede detectar de manera rutinaria mediante electroforesis de gel y, si es necesario, técnicas de hibridación de ácidos nucleicos asociados conocidas en la técnica. El sitio de escisión en el ARNm fijado como objetivo de un ARNds puede ser determinado usando métodos conocidos en general para un experto en la materia, por ejemplo, el método 5'-RACE descrito en Soutschek et al., Nature; 2.004, Vol. 432, págs.

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173-178 (que se incorpora en la presente memoria como referencia para todos los fines). En una realización, usando el método 5'-RACE descrito por Soutschek et al., se determinó ALN-18328 para escindir un ARNm de la TTR entre el nucleótido guanina en la posición 636 de la SEC ID N.° 1.331 (NM_000371.3) y el nucleótido adenina en la posición 637 de la SEC ID N.° 1.331. En una realización, se determinó que ALN-18328 no escinde un ARNm de la TTR entre el nucleótido adenina en la posición 637 de la SEC ID N.° 1.331 y el nucleótido guanina en la posición 638 de la SEC ID N.° 1.331.

En algunos casos, el ARNds se puede modificar mediante un grupo no ligando. Se han conjugado una serie de moléculas no ligando a los ARNds para aumentar la actividad, la distribución celular o la absorción celular del ARNds y están disponibles procedimientos para realizar dichas conjugaciones en la bibliografía científica. Dichos restos no ligandos tienen restos lipídicos incluidos, tales como colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1.989, 86: 6.553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1.994, 4: 1.053), un tioéter, por ej., hexil-S- tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1.992, 660: 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1.993, 3: 2.765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1.992, 20: 533), una cadena alifática, por ej., dodecandiol o restos undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1.991, 10: 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1.990, 259: 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1.993, 75: 49), un fosfolípido, por ej., di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O- hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1.995, 36: 3.651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1.990,18: 3.777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleótido, 1.995, 14: 969) o ácido adamantanoacético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1.995, 36: 3.651), un resto palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1.995, 1.264: 229) o un resto octadecilamina o hexilamino- carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1.996, 277: 923). Las patentes de Estados Unidos representativas que explican la preparación de dichos conjugados de ARNds se enumeraron anteriormente. Los protocolos de conjugación típicos implican la síntesis de los ARNds que soportan un aminoligador en una o más posiciones de la secuencia. El grupo amino se hace reaccionar después con la molécula que se conjuga usando reactivos de acoplamiento o activantes apropiados. La reacción de conjugación se puede realizar con el ARNds aún ligado al soporte sólido o después de escisión del ARNds en fase disolución. La purificación del conjugado de ARNds por HPLC proporciona típicamente el conjugado puro.

ARNds codificados de vector.

En otro aspecto, se expresa moléculas de ARNds de la TTR a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN (véase, por ejemplo, Couture, A, et al., TIG. (1.996), 12: 5-10; Skillern, A., et al., Publicación de Patente Internacional PCT N.° WO 00/22113, Conrad, Publicación de Patente Internacional PCT N.° WO 00/22114 y Conrad, Patente de EE. UU. N.° 6.054.299). Estos transgenes se pueden introducir, una construcción lineal, un plásmido circular o un vector vírico, que se puede incorporar y heredar como un transgen integrado en el genoma huésped. También se puede construir el transgen para permitir que se herede como un plásmido extracromosómico (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1.995) 92: 1.292).

Se pueden transcribir las hebras individuales de un ARNds mediante activadores en dos vectores de expresión separados y transinfectar conjuntamente en una célula fijada como objetivo. Alternativamente, cada hebra individual del ARNds se puede transcribir mediante activadores ambos de los cuales se sitúan en el mismo plásmido de expresión. En una realización, un ARNds se expresa como una repetición invertida unida mediante una secuencia de polinucleótidos ligadora de manera que el ARNds presente una estructura de horquilla.

Los vectores de expresión de ARNds recombinante son en general plásmidos de ADN o vectores víricos. Se pueden construir vectores víricos de expresión de ARNds basándose en, pero no limitándose a, virus adenoasociados (para una revisión, véase Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1.992) 158: 97-129)); adenovirus (véase, por ejemplo, Berkner, et al., BioTechniques (1.998) 6: 616), Rosenfeld et al. (1.991, Science 252: 431-434) y Rosenfeld et al. (1.992), Cell 68:143-155)) o alfavirus, así como otros conocidos en la técnica. Se han usado retrovirus para introducir una variedad de genes en muchos diferentes tipos de células, incluyendo células epiteliales, in vitro y/o in vivo (véase, por ejemplo, Eglitis, et al., Science (1.985) 230: 1.395-1.398; Danos y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1.998) 85: 6.460-6.464; Wilson et al., 1.988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3.014-3.018; Armentano et al., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 61416145; Huber et al., 1.991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8.039-8.043; Ferry et al., 1.991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8.377-8.381; Chowdhury et al., 1.991, Science 254: 1.802-1.805; van Beusechem. et al., 1.992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7.640-19; Kay et al., 1.992, Human Gene Therapy 3: 641-647; Dai et al., 1.992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10.892-10.895; Hwu et al., 1.993, J. Immunol. 150: 4.1044.115; Patente de EE. UU. N.° 4.868.116; Patente de EE. UU. N.° 4.980.286; Solicitud de Patente Internacional PCT WO 89/07136; Solicitud de Patente Internacional PCT WO 89/02468; Solicitud de Patente Internacional PCT WO 89/05345 y Solicitud de Patente Internacional PCT WO 92/07573). Los vectores retrovirales recombinantes capaces de transducir y expresar genes insertados en el genoma de una célula pueden ser producidos por transinfección del genoma retroviral recombinante en estirpes celulares empaquetadas adecuadas tales como PA317 y Psi-CRIP (Comette et al., 1.991, Human Gene Therapy 2: 5-10; Cone et al., 1.984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6.349). Se pueden usar vectores adenovíricos recombinantes para infectar una amplia variedad de células y tejidos en huéspedes susceptibles (por ejemplo, rata, hámster, perro y chimpancé) (Hsu et al., 1.992, J. Infectious Disease, 166: 769) y también presentan la ventaja de no requerir células mitóticamente activas para infección.

Se puede usar cualquier vector vírico capaz de aceptar las secuencias codificadoras para la molécula o las

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moléculas de ARNds que se tienen que expresar, por ejemplo, vectores procedentes de adenovirus (AV); virus adenoasociados (AAV); retrovirus (por ejemplo, lentivirus (LV), Rabdovirus, virus de la leucemia murina); herpesvirus y similares. El tropismo de vectores víricos se puede modificar mediante pseudotipificación de los vectores con proteínas de envoltura u otros antígenos de superficie de otros virus o por sustitución de diferentes proteínas de cápside vírica, como sea apropiado.

Por ejemplo, los vectores lentivíricos caracterizados en la invención se pueden pseudotipificar con proteínas de superficie a partir de virus de la estomatitis vesicular (VSV, por sus siglas en inglés), rabia, Ebola, Mokola y similares. Los vectores AAV caracterizados en la invención se pueden hacer para fijar como objetivo diferentes células por diseño de los vectores para expresar diferentes serotipos de proteínas de cápside. Por ejemplo, un vector AAV que expresa una cápside de serotipo 2 en un genoma de serotipo 2 se denomina AAV 2/2. Este gen de cápside de serotipo 2 en el vector AAV 2/5 puede ser reemplazado por un gen de cápside de serotipo 5 para producir un vector AAV 2/2. Las técnicas para construir vectores AAV que expresen diferentes serotipos de proteínas de cápside están dentro de la destreza de la técnica; véase, por ejemplo, Rabinowitz J E et al., (2.002), J Virol 76: 791-801.

La selección de vectores víricos recombinantes, los métodos para insertar secuencias de ácidos nucleicos para expresar el ARNds en el vector y los métodos para suministrar el vector vírico a las células de interés están dentro de la destreza de la técnica. Véase, por ejemplo, Domburg R (1.995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1.988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1.990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1.998), Nature 392: 25-30 y Rubinson DA et al., Nat. Genet. 33: 401-406.

Los vectores víricos pueden proceder de AV y AAV. En una implementación, el ARNds caracterizado en la invención se expresa como dos moléculas de ARN monocatenarias complementarias, separadas, a partir de un vector AAV recombinante que tiene, por ejemplo, los activadores de ARN U6 o H1 o el activador de citomegalovirus (CMV).

Un vector AV adecuado para expresar el ARNds caracterizado en la invención, un método para construir el vector AV recombinante y un método para suministrar el vector a células fijadas como objetivo, se describen en Xia H et al. (2.002), Nat. Biotech. 20: 1.006-1.010.

Los vectores AAV adecuados para expresar el ARNds caracterizado en la invención, los métodos para construir el vector AV recombinante y los métodos para suministrar los vectores a las células fijadas como objetivo, se describen en Samulski R et al. (1.987), J. Virol. 61: 3.096-3.101; Fisher K J et al., (1.996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1.989), J. Virol, 63: 3.822-3.826; Patente de EE. UU. N.° 5.252.479; Patente de EE. UU. N.° 5.139.941; Solicitud de Patente Internacional N.°WO 94/13788 y Solicitud de Patente Internacional N.° WO 93/24641.

El activador que conduce la expresión de ARNds en un plásmido de ADN o vector vírico caracterizado en la invención puede ser una polimerasa I de ARN eucariota (por ejemplo, activador de ARN ribosómico), polimerasa II de ARN (por ejemplo, activador temprano de CMV o activador de actina o activador de ARNsn U1) o en general activador de polimerasa III de ARN (por ej., ARNsn U6 o activador de ARN 7SK) o un activador procariota, por ejemplo el activador T7, siempre que el plásmido de expresión también codifique la polimerasa de ARN T7 requerida para la transcripción de un activador de T7. El activador también puede dirigir la expresión transgen al páncreas (véase, por ejemplo, la secuencia reguladora de la insulina para páncreas (Bucchini et al., 1.986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2.511-2.515)).

Además, la expresión del transgen se puede regular de manera precisa, por ejemplo, usando una secuencia reguladora inducible y sistemas de expresión tales como una secuencia reguladora que es sensible a ciertos reguladores fisiológicos, por ejemplo, niveles de glucosa circulantes u hormonas (Docherty et al., 1.994, FASEB J. 8: 20-24). Dichos sistemas de expresión inducibles, adecuados para el control de la expresión transgen en células o en mamíferos incluyen la regulación por estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de la dimerización e isopropil-beta-D1-tiogalactopiranósido (EPTG). Un experto en la materia podría elegir la secuencia reguladora/activadora apropiada basándose en el uso deseado del transgen de ARNds.

En general, los vectores recombinantes capaces de expresar moléculas de ARNds se suministran como se describe a continuación y persisten en células fijadas como objetivo. Alternativamente, se pueden usar vectores víricos que proporcionen expresión transitoria de moléculas de ARNds. Dichos vectores se pueden administrar de manera repetida como sea necesario. Una vez expresados, los ARNds se unen a ARN fijado como objetivo y modulan su función o expresión. El suministro de vectores de expresión de ARNds puede ser sistémico, tal como por administración intravenosa o intramuscular, por administración a células fijadas como objetivo explantadas del paciente seguido por reintroducción al paciente o por cualquier otro medio que permita la introducción en una célula fijada como objetivo deseada.

Los plásmidos de ADN de expresión de ARNds se transinfectan típicamente en células fijadas como objetivo como un complejo con portadores lipídicos catiónicos (por ej. Oligofectamina) o portadores de base lipídica no catiónicos (por ej. Transit-TKo™). Las transinfecciones lipídicas múltiples para destrucciones mediadas por ARNds que fijan como objetivo diferentes regiones de un gen de TTR único o genes de TTR múltiples durante un periodo de una semana o más también se consideran por la invención. La introducción exitosa de vectores en células huésped se

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puede controlar usando diversos métodos conocidos. Por ejemplo, se puede señalar la transinfección transitoria con un informador, tal como un marcador fluorescente, tal como Proteína Fluorescente Verde (GFP, por sus siglas en inglés). La transinfección estable de células ex vivo se puede asegurar usando marcadores que proporcionen la célula transinfectada con resistencia a factores medioambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y fármacos), tales como resistencia al higromicina B.

También se pueden insertar moléculas de ARNds específicas de TTR en vectores y se pueden usar como vectores de tratamiento de genes para pacientes humanos. Se pueden suministrar vectores de tratamiento de genes a un individuo por, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (véase, La Patente de EE. UU. 5.328.470) o por inyección estereotáctica (véase por ej., Chen et al., (1.994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3.054-3.057). La preparación farmacéutica del vector de tratamiento de genes puede incluir el vector de tratamiento de genes en un diluyente aceptable o puede incluir una matriz de liberación retardada en que se embebe el vehículo de suministro de genes. Alternativamente, en el caso de que se produzca el vector de suministro de genes completo intacto de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovíricos, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que produzcan el sistema de suministro de genes.

III. Composiciones farmacéuticas que contienen ARNds.

En una realización, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen un ARNds como se reivindica y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica que contiene el ARNds es útil para tratar una enfermedad o trastorno asociado a la expresión o actividad de un gen de TTR, tales como procesos patológicos mediados por expresión de TTR. Dichas composiciones farmacéuticas se formulan basándose en el modo de suministro. Un ejemplo son composiciones que se formulan para administración sistémica vía suministro parenteral, por ejemplo, por suministro intravenoso (IV). Otro ejemplo son composiciones que se formulan para suministro directo al parénquima cerebral, por ejemplo, por infusión intravenosa en el cerebro, tal como por infusión intravenosa de bomba continua.

Las composiciones farmacéuticas caracterizadas en la presente memoria se administran en dosis suficientes para inhibir la expresión de genes TTR.

En general, una dosis adecuada de ARNds estará en el intervalo de 0,01 a 200,0 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor al día, en general en el intervalo de 1 a 50 mg por kilogramo de peso corporal al día. Por ejemplo, el ARNds se puede administrar a 0,0059 mg/kg, 0,01 en mg/kg, 0,0295 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,0590 mg/kg, 0,163 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,543 mg/kg, 0,5900 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,628 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5,0 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg o 50 mg/kg por dosis única.

En una implementación, la dosis está entre 0,01 y 0,2 mg/kg. Por ejemplo, el ARNds se puede administrar a una dosis de 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,07 mg/kg 0,08 mg/kg, 0,09 mg/kg ,0,10 mg/kg, 0,11 mg/kg, 0,12 mg/kg, 0,13 mg/kg, 0,14 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,16 mg/kg, 0,17 mg/kg, 0,18 mg/kg, 0,19 mg/kg o 0,20 mg/kg.

En una implementación, la dosis está entre 0,005 mg/kg y 1,628 mg/kg. Por ejemplo, el ARNds se puede administrar a una dosis de 0,0059 mg/kg, 0,0295 mg/kg, 0,0590 mg/kg, 0,163 mg/kg, 0,543 mg/kg, 0,5900 mg/kg o 1,628 mg/kg.

En una implementación, la dosis está entre 0,2 mg/kg y 1,5 mg/kg. Por ejemplo, el ARNds se puede administrar a una dosis de 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg o 1,5 mg/kg.

La composición farmacéutica se puede administrar una vez al día o el ARNds se puede administrar como dos, tres o más sub-dosis a intervalos apropiados a lo largo del día o incluso usar infusión intravenosa continua o suministrar a través de una formulación de liberación controlada. En ese caso, el ARNds contenido en cada sub dosis debe ser igualmente menor para conseguir la dosis diaria total. La unidad de dosificación también puede estar combinada para suministro durante varios días, por ejemplo, usando una formulación de liberación prolongada convencional que proporcione liberación prolongada del ARNds durante un periodo de varios días. Las formulaciones de liberación prolongada son conocidas en la técnica y son particularmente útiles para suministro de agentes en un sitio particular, tal como se podía usar con los agentes de la presente invención. En esta realización, la unidad de dosificación contiene un correspondiente múltiplo de la dosis diaria.

El efecto de una sola dosis sobre los niveles de TTR es larga duración, de manera que se administran dosis posteriores en intervalos de no más de 3, 4 o 5 días o en intervalos de no más de 1, 2, 3 ó 4 semanas o a intervalos de no más de 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 semanas.

El experto apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis y sincronización requerida para tratar de manera eficaz a un individuo, incluyendo, pero no limitándose a la importancia de la enfermedad o el trastorno, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad del individuo y otras enfermedades presentes. Por otra parte, el tratamiento de un individuo con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición puede incluir un solo tratamiento o a una serie de tratamientos. Los cálculos de dosis eficaces y los periodos de semidescomposición in

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vivo para los ARNds individuales incluidos por la invención se pueden realizar usando metodologías convencionales o sobre la base de ensayos in vivo usando un modelo animal apropiado, como se describe en otra parte en la presente memoria.

Los avances en genética en ratones han generado una serie de modelos en ratones para el estudio de diversas enfermedades humanas, tales como procesos patológicos mediados por expresión de la TTR. Dichos modelos se usan para ensayos in vivo de ARNds, así como para determinar una dosis terapéuticamente eficaz. Un modelo de ratón adecuado es, por ejemplo, un ratón que contiene un plásmido que expresa TTR humana. Otro modelo de ratón adecuado es un ratón transgénico que soporta un transgen que expresa TTR humana.

Los datos obtenidos a partir de ensayos en cultivos celulares y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosis para uso en seres humanos. La dosis de composiciones caracterizadas en la invención se encuentra en general dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye el ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en los métodos caracterizados en la invención, una dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos en cultivos celulares. Se puede formular una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración en plasma circulante del compuesto o, cuando sea apropiado, del producto polipeptídico de una secuencia fijada como objetivo (por ejemplo, consiguiendo una concentración disminuida del polipéptido) que incluya el IC50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que consigue una inhibición medio máxima de los síntomas) cuando se determina en cultivo celular. Dicha información se puede usar para determinar de manera más precisa dosis útiles en seres humanos. Se pueden medir los niveles en plasma, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución.

Los ARNds caracterizados en la invención se pueden administrar en asociación con otros agentes conocidos eficaces en el tratamiento de procesos patológicos mediados por expresión de genes fijados como objetivo. En cualquier caso, el médico que lo administra puede ajustar la cantidad y la sincronización de la administración de ARNds sobre la base de los resultados observados usando medidas clásicas de eficacia conocidas en la técnica o descritas en la presente memoria.

Administración

La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas y formulaciones que incluyen los compuestos de ARNds caracterizados en la invención. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de si se desea el tratamiento local o sistémico y dependiendo del área que se tiene que tratar. La administración puede ser tópica, por vía pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidémica y transdérmica, oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular o infusión intravenosa o administración intracraneal, por ejemplo, intraparenquimal, intratecal o intraventricular.

El ARNds se puede suministrar de manera que se fije como objetivo un tejido particular, tal como el hígado (por ejemplo, los hepatocitos del hígado).

La presente descripción incluye composiciones farmacéuticas que pueden suministrarse por inyección directamente en el cerebro. La inyección puede ser por inyección estereotáctica en una región particular del cerebro (por ejemplo, la sustancia negra, el córtex, el hipocampo, el cuerpo estriado o el globo pálido), o puede suministrarse el ARNds en múltiples regiones del sistema nervioso central (por ejemplo, en múltiples regiones del cerebro y/o en la médula espinal). El ARNds también se puede suministrar en regiones difusas del cerebro (por ejemplo, suministro difuso a la corteza del cerebro).

En una implementación, se puede suministrar un ARNds que fija como objetivo TTR por medio de una cánula u otro dispositivo de suministro que tenga un extremo implantado en un tejido, por ejemplo, el cerebro, la sustancia negra, córtex, hipocampo, el cuerpo estriado, cuerpo calloso o globo pálido del cerebro. La cánula puede estar conectada a un depósito de la composición de ARNds. El flujo o el suministro puede estar mediado por una bomba, por ejemplo, una bomba osmótica o minibomba, tal como una bomba Alzet (Durect, Cupertino, CA). En una realización, se implanta una bomba y depósito en un área distante del tejido, por ejemplo, en el abdomen, y el suministro se efectúa por un conducto que conduce desde la bomba o depósito al sitio de liberación. La infusión intravenosa de la composición del ARNds en el cerebro puede ser durante varias horas o durante varios días, por ejemplo, durante 1,2, 3, 5 ó 7 días o más. Los dispositivos para suministro al cerebro se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE. UU. Números 6.093.180 y 5.814.014.

Las composiciones farmacéuticas y las formulaciones para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, esprays, líquidos y polvos. Los portadores farmacéuticos convencionales, bases en polvo acuosas u oleosas, espesantes y similares pueden ser necesarios o deseables. También pueden ser útiles preservativos recubiertos, guantes y similares. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen aquéllas en que los ARNds caracterizados en la invención están mezclados con un agente de suministro tópico tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes

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quelantes y tensioactivos. Los lípidos y los liposomas adecuados incluyen neutros (por ej., dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidilcolina DMPC, diestearoilfosfatidilcolina) negativos (por ej., dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) y catiónicos (por ej., dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP y dioleoilfosfatidiletanolamina DOTMA). Los ARNds caracterizados en la invención pueden estar encapsulados en liposomas o pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas catiónicos. Alternativamente, los ARNds se pueden complejar con lípidos, en particular con lípidos catiónicos. Los ácidos grasos y ésteres adecuados incluyen, pero no se limitan a: ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1- monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina o un éster alquílico C1-10 (por ej., miristato de isopropilo IPM), monoglicérido, diglicérido o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Se describen formulaciones tópicas con detalle en la Patente de EE. UU. N.° 6.747.014, que se incorpora en la presente memoria como referencia.

Formulaciones de liposomas.

Hay muchas estructuras de tensioactivo organizadas además de microemulsiones que se han estudiado y usado para la formulación de fármacos. Estas incluyen monocapas, micelas, bicapas y vesículas. Las vesículas, tales como liposomas, han atraído gran interés debido a su especificidad y la duración de acción que ofrecen desde el punto de vista del suministro de fármaco. Como se usa la presente invención, el término "liposoma" significa una vesícula constituida por lípidos anfifílicos dispuestos en una bicapa o bicapas esféricas.

Los liposomas son vesículas unilaminares o multilaminares que tienen una membrana formada de un material lipófilo y un interior acuoso. La porción acuosa contiene la composición que se tiene que suministrar. Los liposomas catiónicos poseen la ventaja de poder fusionarse a la pared celular. Los liposomas no catiónicos, aunque no pueden fusionarse tan eficazmente con la pared celular, son absorbidos por macrófagos in vivo.

Para cruzar la piel del mamífero intacta, las vesículas de lípido deben pasar por una serie de poros finos, cada uno con un diámetro menor que 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Por lo tanto, es deseable usar un liposoma que sea altamente deformable y pueda pasar a través de dichos poros finos.

Más ventajas de los liposomas incluyen: los liposomas obtenidos de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables; los liposomas pueden incorporar un amplio intervalo de fármacos solubles en agua y en lípidos; los liposomas pueden proteger fármacos encapsulados en sus compartimentos internos de metabolismo y degradación (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1.988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., volumen 1, pág. 245). Son consideraciones importantes en la preparación de formulaciones de liposomas la carga superficial lipídica, el tamaño de la vesícula y el volumen acuoso de los liposomas.

Los liposomas son útiles para la transferencia y el suministro de ingredientes activos al sitio de acción. Debido a que la membrana liposomal es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando se aplican liposomas a un tejido, los liposomas empiezan a fundirse con las membranas celulares y a medida que progresa la fusión de liposoma y la célula, se vacía el contenido liposomal en la célula donde puede actuar el agente activo.

Las formulaciones de liposomas han sido el foco de investigación extensa como el modo de suministro para muchos fármacos. Hay una evidencia creciente en que para administración tópica, los liposomas presentan diversas ventajas sobre otras formulaciones. Dichas ventajas incluyen efectos secundarios reducidos relacionados con la absorción sistémica alta del fármaco administrado, acumulación aumentada del fármaco administrado en el objetivo deseado y la capacidad para administrar una amplia variedad de fármacos, tanto hidrófilos como hidrófobos, a la piel.

Diversos informes han detallado la capacidad de los liposomas para suministrar agentes incluyendo ADN de alto peso molecular a la piel. Los compuestos incluyendo analgésicos, anticuerpos, hormonas y los ADN de alto peso molecular han sido administrados a la piel. La mayoría de las aplicaciones dieron como resultado la fijación como objetivo de la epidermis superior.

Los liposomas se encuentran en dos amplias clases. Los liposomas catiónicos son liposomas cargados positivamente que interactúan con las moléculas de ADN cargadas negativamente para formar un complejo estable. El complejo ADN cargado positivamente/liposoma se une a la superficie de la célula cargadas negativamente y se internaliza en un endosoma. Debido al pH ácido dentro del endosoma, los liposomas se rompen, liberando su contenido en el citoplasma celular (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1.987, 147, 980-985).

Los liposomas que son sensibles al pH o están cargados negativamente, atrapan ADN en vez de complejarse con él. Puesto que tanto el ADN como el lípido están cargados de manera similar, tiene lugar repulsión en vez de formación de complejo. Sin embargo, algo de ADN es atrapado dentro del interior acuoso de estos liposomas. Los liposomas sensibles al pH se han usado para suministrar ADN codificador del gen timidina cinasa a monocapas de células en cultivo. La expresión del gen exógeno se detectó en las células fijadas como objetivo (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1.992, 19, 269-274).

Un tipo principal de composición de liposomas incluye fosfolípidos distintos de fosfatidilcolina de procedencia natural. Las composiciones de liposomas neutras, por ejemplo, se pueden formar a partir de dimiristoil fosfatidilcolina

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(DMPC) o dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC). Las composiciones de liposomas aniónicos generalmente se forman de dimiristoil fosfatidilglicerol, mientras que los liposomas fusogénicos aniónicos se forman principalmente de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composición de liposomas se forma de fosfatidilcolina (PC, por sus siglas en inglés) tal como, por ejemplo, PC de soja y PC de huevo. Otro tipo se forma de mezclas de fosfolípido y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.

Diversos estudios han evaluado el suministro tópico de formulaciones de fármacos de liposomas a la piel. La aplicación de liposomas que contienen interferón a piel de conejillo de indias dio como resultado una reducción de lesiones del herpes cutáneo mientras que el suministro de interferón por otros medios (por ejemplo, como una disolución o como una emulsión) fue ineficaz (Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1.992, 2, 405-410). Además, un estudio adicional ensayó la eficacia del interferón administrado como parte de una formulación de liposomas para la administración de interferón usando un sistema acuoso y concluyó que la formulación de liposomas era superior a la administración acuosa (de Plessis et al., Antiviral Research, 1.992, 18, 259-265).

También se han examinado sistemas de liposomas no iónicos para determinar su utilidad en el suministro de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden tensioactivo no iónico y colesterol. Se usaron formulaciones de liposomas no iónicos que comprenden Novasome™ I (dilaurato de glicerilo/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) y Novasome™ II (diestearato de glicerilo/colesterol/polioxietileno- 10-estearil éter) para suministrar ciclosporina-A a la dermis de piel de ratón. Los resultados indicaron que dichos sistemas de liposomas no iónicos eran eficaces facilitando la deposición de ciclosporina-A en diferentes capas de la piel (Hu et al., S.T.P. Pharma. Sci., 1.994, 4, 6, 466).

Liposomas también incluye liposomas “estabilizados estéricamente”, un término que, como se usa en la presente memoria, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan a los liposomas, dan como resultado semividas de circulación aumentadas en relación a los liposomas que carecen de dichos lípidos especializados. Ejemplos de liposomas estabilizados estéricamente son aquéllos en que parte de la porción lipídica que forma la vesícula del liposoma (A) comprende uno o más glucolípidos, tales como monosialogangliósido Gmi o (B) se derivatiza con uno o más polímeros hidrófilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Aunque no se desea estar limitados por ninguna teoría particular, se piensa en la técnica que, al menos para liposomas estabilizados estéricamente que contienen gangliósidos, esfingomielina o lípidos derivatizados de PEG, la semivida de circulación aumentada de estos liposomas estabilizados estéricamente procede de una absorción reducida en las células del sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1.987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1.993, 53, 3.765).

Se conocen en la técnica diversos liposomas que comprenden uno o más glucolípidos. Papahadjopoulos et al. (Ann. N. Y. Acad. Sci., 1.987, 507, 64) indicaron la capacidad del monosialogangliósido Gm- galactocerebrósido sulfato y fosfatidilinositol para mejorar las semividas en sangre de los liposomas. Estos hallazgos fueron expuestos por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1.988, 85, 6.949). La Patente de EE. UU. N.° 4.837.028 y la patente internacional WO 88/04924, ambas a Allen et al., describen liposomas que comprenden (1) esfingomielina y (2) el gangliósido Gmi o un éster de galactocerebrósido sulfato. La Patente de eE. UU. N.° 5.543.152 (Webb et al.) describe liposomas que comprenden esfingomielina. Los liposomas que comprenden 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilcolina se describen en la patente internacional WO 97/13499 (Lim et al.).

Se conocen en la técnica muchos liposomas que comprenden lípidos derivatizados con uno o más polímeros hidrófilos, y métodos de preparación de los mismos. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1.980, 53, 2.778) describe liposomas que comprenden un detergente no iónico, 2C1215G, que contiene un resto PEG. Illum et al. (FEBS Lett., 1.984,167, 79) indicaron que el recubrimiento hidrófilo de partículas de poliestireno con glicoles poliméricos da como resultado semividas en sangre significativamente aumentadas. Los fosfolípidos sintéticos modificados por la unión de grupos carboxílicos de polialquilenglicoles (por ej., PEG) se describen por Sears (Patentes de EE. UU. N.° 4.426.330 y 4.534.899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) describieron experimentos que demuestran que los liposomas que comprenden fosfatidiletanolamina (PE) derivatizada con PEG o estearato de PEG presentan aumentos significativos en las semividas de circulación en sangre. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1.990, 1.029, 91) extendieron tales observaciones a otros fosfolípidos derivatizados de PEG, por ejemplo, DSPE- PEG, formado de la combinación de diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) y PEG. Los liposomas que tienen restos PEG ligados mediante enlaces covalentes en su superficie externa se describen en la Patente Europea N.° EP 0 445 131 B1 y la Patente Internacional WO 90/04384 a Fisher. Las composiciones de liposomas que contienen 1-20 por ciento en moles de PE derivatizados con PEG y métodos para usar los mismos, se describen por Woodle et al. (Patentes de EE. UU. N.° 5.013.556 y 5.356.633) y Martin et al. (Patente de EE. UU. N.° 5.213.804 y Patente Europea N.° EP 0 496 813 B1). Los liposomas que comprenden una serie de otros conjugados lípido-polímero se describen en la patente internacional Wo 91/05545 y la Patente de EE. UU. N.° 5.225.212 (ambas a Martin et al.) y en la patente internacional WO 94/20073 (Zalipsqui et al.). Los liposomas que comprenden lípidos de ceramida modificados con PEG se describen en la patente internacional WO 96/10391 (Choi et al.). La Patente de EE. UU. N.° 5.540.935 (Miyazaki et al.) y la Patente de EE. UU. N.° 5.556.948 (Tagawa et al.) describen liposomas que contienen PEG que se pueden derivatizar además con restos funcionales en sus superficies.

Se conoce en la técnica una serie de liposomas que comprenden ácidos nucleicos. La patente internacional WO 96/40062 a Tierry et al. describe métodos para encapsular ácidos nucleicos de alto peso molecular en liposomas. La

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Patente de EE. UU. N.° 5.264.221 a Tagawa et al., describe liposomas ligados a proteína y sostiene que el contenido de dichos liposomas puede incluir un ARNds. La Patente de EE. UU. N.° 5.665.710 a Rahman et al., describe algunos métodos para encapsular oligodesoxinucleótidos en liposomas. La patente internacional WO 97/04787 a Love et al., describe liposomas que comprenden ARNds fijado como objetivo al gen raf.

Los transfersomas son otro tipo más de liposomas y son agregados de lípidos muy deformables que son candidatos atractivos para vehículos de suministro de fármacos. Los transfersomas se pueden describir como gotitas de lípido que son tan altamente deformables que pueden penetrar fácilmente por los poros que son más pequeños que la gotita. Los transfersomas son adaptables al entorno en que se usan, por ejemplo, se auto-optimizan (adaptable a la forma de los poros en la piel), auto-reparadores, logran con frecuencia sus objetivos sin fragmentación y con frecuencia se auto-cargan. Para preparar transfersomas es posible añadir activadores del borde superficial, normalmente tensioactivos, a una composición de liposomas clásica. Los transfersomas se han usado para suministrar albúmina de suero a la piel. El suministro mediado por transfersomas de albúmina de suero se ha demostrado que es tan eficaz como la inyección subcutánea de una disolución que contiene albúmina de suero.

Los tensioactivos encuentran amplia aplicación en formulaciones tales como emulsiones (incluyendo microemulsiones) y liposomas. La manera más común de clasificar y ordenar las propiedades de los muy diferentes tipos de tensioactivos, tanto naturales como sintéticos, es por el uso del equilibrio hidrófilo/lipófilo (hLb, por sus siglas en inglés). La naturaleza del grupo hidrófilo (también conocido como la “cabeza”) proporciona el medio más útil para categorizar los diferentes tensioactivos usados en las formulaciones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., 1.988, pág. 285).

Si la molécula de tensioactivos no está ionizada, se clasifica como un tensioactivo no iónico. Los tensioactivos no iónicos encuentran amplia aplicación en productos farmacéuticos y cosméticos y son utilizables por un amplio intervalo de valores de pH. En general, sus valores de HLB oscilan de 2 a aproximadamente 18 dependiendo de su estructura. Los tensioactivos no iónicos incluyen ésteres no iónicos tales como ésteres de etilenglicol, ésteres de propilenglicol, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitán, ésteres de sacarosa y ésteres etoxilados. Las alcanolamidas y los éteres no iónicos tales como etoxilados de alcoholes grasos, alcoholes propoxilados y polímeros de bloque etoxilados/propoxilados también se incluyen en esta clase. Los tensioactivos de polioxietileno son los miembros más populares de la clase de tensioactivos no iónicos.

Si la molécula de tensioactivo soporta una carga negativa cuando se disuelve o se dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como aniónico. Los tensioactivos aniónicos incluyen carboxilatos tales como jabones, lactilatos de acilo, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tales como alquilsulfatos y alquilsulfatos etoxilados, sulfonatos tales como alquilbencenosulfonatos, isetionatos de acilo, tauratos de acilo y sulfosuccinatos y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase de tensioactivos aniónicos son los alquilsulfatos y los jabones.

Si la molécula de tensioactivo soporta una carga positiva cuando se disuelve o se dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como catiónico. Los tensioactivos catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros más usados de esta clase.

Se la molécula de tensioactivo presenta la capacidad de soportar carga positiva o negativa, el tensioactivo se clasifica como anfótero. Los tensioactivos anfóteros incluyen derivados de ácido acrílico, alquilamidas sustituidas, N- alquilbetaínas y fosfatidas.

El uso de tensioactivos en fármacos, formulaciones y en emulsiones ha sido revisado (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., 1.988, pág. 285).

Partículas lipídicas de ácido nucleico.

En una implementación, un ARNds de la TTR caracterizado en la invención se encapsula completamente en la formulación lipídica, por ejemplo, para formar un SPLP, pSPLP, SNALP u otra partícula lipídica de ácido nucleico. Como se usa en la presente memoria, el término "SNALP" se refiere a una partícula lipídica de ácido nucleico estable, incluyendo SPLP. Como se usa en la presente memoria, el término "SPLP" se refiere a una partícula lipídica de ácido nucleico que comprende ADN plásmido encapsulado dentro de una vesícula lipídica. Los SNALP y SPLP contienen típicamente un lípido catiónico, un lípido no catiónico y un lípido que evita la agregación de la partícula (por ejemplo, un conjugado PEG-lípido). Los SNALP y SPLP son extremadamente útiles para aplicaciones sistémicas, ya que presentan semividas de circulación prolongadas después de inyección intravenosa (i.v.) y se acumulan en sitios distales (por ejemplo, sitios físicamente separados del sitio de administración). Los SPLP incluyen "pSPLP," que incluyen un complejo de agente de condensación-ácido nucleico encapsulado como se explica en la Publicación de patente internacional PCT N.° WO 00/03683. Las partículas de la presente invención tienen típicamente un diámetro medio de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm, más típicamente aproximadamente 60 nm a aproximadamente 130 nm, más típicamente aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm, lo más típicamente aproximadamente 70 nm a aproximadamente 90 nm y son sustancialmente no tóxicas. Además, los ácidos nucleicos cuando están presentes en las partículas lipídicas de ácido nucleico de la presente invención son resistentes en disolución acuosa a la degradación con una nucleasa. Las partículas lipídicas de ácido nucleico y su método de preparación se describen en, por ejemplo, las Patentes de

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EE. UU. Números 5.976.567; 5.981.501; 6.534.484; 6.586.410; 6.815.432 y la Publicación de patente internacional PCT N.°WO 96/40964.

En una implementación, la relación lípido a fármaco (relación masa/masa) (por ejemplo, relación de lípido a ARNds) estará en el intervalo de desde aproximadamente 1:1 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 9:1 o aproximadamente 6:1 a aproximadamente 9:1.

El lípido catiónico puede ser, por ejemplo, cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,N- diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(1-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), cloruro de N-(1-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (dOtMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi)propilamina (DOdMa), 1,2- DiLinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2- Dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-Dilinoleioxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin- DAC), 1,2-Dilinoleioxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-Dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2- Dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-Linoleoil-2-linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloruro de 1,2-Dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), sal de cloruro de 1,2-Dilinoleoil-3- trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-Dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin-MPZ) o 3-(N,N- Dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-Dioleilamino)-1,2-propanodio (DOAP), 1,2-Dilinoleiloxo-3-(2-N,N- dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), 1,2-Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-Dilinoleil-4- dimetilaminometiI-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA) o análogos de los mismos, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2- di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d] [1,3]dioxol-5-amina (ALN100), 4-

(dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2- hidroxidodecil)amino)etil)(2-hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanodiil)didodecan-2-ol (Tech G1) o una mezcla de los mismos. El lípido catiónico puede comprender de aproximadamente 20 % en moles a aproximadamente 50 % en moles o aproximadamente 40 % en moles de lípido total presente la partícula.

En otra implementación, el compuesto 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano se puede usar para preparar nanopartículas de lípido-ARNsi. La síntesis de 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano se describe en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos número 61/107.998 presentado el 23 de octubre de 2.008, que se incorpora en la presente memoria como referencia.

En una implementación, la partícula de lípido-ARNsi incluye un 40 % de 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]- dioxolano: 10 % de DSPC: 40 % de Colesterol: 10 % de PEG-C-DOMG (porcentaje en moles) con un tamaño de partícula de 63,0 ± 20 nm y una relación de ARNsi/Lípido de 0,027.

El lípido no catiónico puede ser un lípido aniónico o un lípido neutro incluyendo, pero no limitándose a, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), fosfatidiletanolamina 4-(N- maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de dioleoilo (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1 -trans PE, 1 -estearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE), colesterol o una mezcla de los mismos. El lípido no catiónico puede ser de aproximadamente 5 % en moles a aproximadamente 90 % en moles, aproximadamente 10 % en moles o aproximadamente 58 % en moles si se incluye el colesterol, del lípido total presente en la partícula.

El lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas puede ser, por ejemplo, un polietilenglicol (PEG)-lípido incluyendo, sin limitación un PEG-diacilglicerol (DAG), un PEG-dialquiloxipropilo (DAA), un PEG-fosfolípido, un PEG- ceramida (Cer) o una mezcla de los mismos. El conjugado PEG-DAA puede ser, por ejemplo, un PEG- dilauriloxipropilo (Ci2), un PEG-dimiristiloxipropilo (Ci4), un PEG-dipalmitiloxipropilo (Ci6) o un PEG-diesteariloxipropilo (C]s). El lípido conjugado que evita la agregación de partículas puede ser de 0 % en moles a aproximadamente 20 % en moles o aproximadamente 2 % en moles del lípido total presente en la partícula.

En algunas implementaciones, la partícula lipídica de ácido nucleico incluye además colesterol en, por ejemplo, aproximadamente 10 % en moles a aproximadamente 60 % en moles o aproximadamente 48 % en moles de lípido total presente en la partícula.

LNP01

En una implementación, el lipidoide ND98-4HC1 (M 1.487) (Fórmula 1), Colesterol (Sigma-Aldrich) y PEG-Ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) se pueden usar para preparar nanopartículas de lípido-ARNsi (es decir, partículas de LNP01). Las disoluciones madre de cada uno en etanol se pueden preparar como sigue: ND98, 133 mg/ml; Colesterol, 25 mg/ml, PEG-Ceramida C16, 100 mg/ml. Las disoluciones madre de ND98, Colesterol y PEG- Ceramida C16 se pueden combinar después en una relación molar, por ejemplo, 42:48:10. La disolución lipídica combinada se puede mezclar con ARNsi acuoso (por ej., en acetato de sodio pH 5) de manera que la concentración final de etanol sea aproximadamente 35-45 % y la concentración final de acetato de sodio sea aproximadamente 100-300 mM. Las nanopartículas de Lípido-ARNsi se forman típicamente de manera espontánea en el

mezclamiento. Dependiendo de la distribución de tamaño de partícula deseado, la mezcla de nanopartículas resultante se puede extruir a través de una membrana de policarbonato (por ejemplo, 100 nm de corte) usando, por ejemplo, una extrusora de termocilindro, tal como Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc). En algunos casos, se puede omitir la etapa de extrusión. La eliminación de etanol e intercambio de tampón simultáneo se pueden llevar a cabo, 5 por ejemplo, por diálisis o filtración de flujo tangencial. Los tampones se pueden intercambiar, por ejemplo, con disolución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) a aproximadamente pH 7, por ej., aproximadamente pH 6,9, aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 7,1, aproximadamente pH 7,2, aproximadamente pH 7,3 o aproximadamente pH 7,4.

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Se describen formulaciones LNP01, por ej., en la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional N.° WO 2008/042973.

Las formulaciones de lípido-ARNsi ejemplares adicionales son como sigue:

Lípido Catiónico Lípido Catiónico /lípido no catiónico /colesterol/Conjugado PEG-lípido Relación Lípido:RNAsi Procedimiento

SNALP

1,2-Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA) DLinDMA/DPPC/Colesterol/PEG-cDMA

(57,1/7,1/34,4/1,4)

lípido:ARNsi ~ 7:1

SNALP- XTC

2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (XTC) XTC/DPPC/Colesterol/PEG-cDMA

57,1/7,1/34,4/1,4

lípido:ARNsi ~ 7:1

LNP05

2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (XTC) XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG Extrusión

57,5/7,5/31,5/3,5

lípido:ARNsi ~ 6:1

LNP06

2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (XTC) XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG Extrusión

57,5/7,5/31,5/3,5

lípido:ARNsi ~ 11: 1

LNP07

2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG Mezclamiento

Lípido Catiónico Lípido Catiónico /lípido no catiónico /colesterol/Conjugado PEG-lípido Relación Lípido:RNAsi Procedimiento

(XTC) 60/7,5/31/1,5, en línea

lípido:ARNsi ~ 6:1

LNP08

2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (XTC) XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG Mezclamiento en línea

60/7,5/31/1,5,

lípido:ARNsi ~ 11:1

LNP09

2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (XTC) XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG Mezclamiento en línea

50/10/38,5/1,5

Lípido:ARNsi 10:1

LNP10

(3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)- octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH- ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100) ALN100/DSPC/Colesterol/PEG-DMG Mezclamiento en línea

50/10/38,5/1,5

Lípido:ARNsi 10:1

LNP11

4-(Dimetilamino)butanoato (6Z,9Z,28Z,31Z)- heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo (MC3) MC-3/DSPC/Colesterol/PEG-DMG Mezclamiento en línea

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Lípido:ARNsi 10:1

LNP12

1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2- hidroxidodecil)amino)etil)(2- hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1- il)etilazanediil)didodecan-2-ol (Tech G1) Tech G1/DSPC/Colesterol/PEG-DMG Mezclamiento en línea

50/10/38,5/1,5

Lípido:ARNsi 10:1

Las formulaciones de LNP09 y formulaciones que comprenden XTC se describen, por ej., en la Patente Provisional de EE. UU. N.° de Serie 61/239.686, presentada el 3 de septiembre de 2.009, que se incorpora por el presente como referencia. Las formulaciones de LNP11 y las formulaciones que comprenden MC3 se describen, por ej., en la 5 Patente Provisional de EE. UU. N.° de Serie 61/244.834, presentada el 22 de septiembre de 2.009.

Las formulaciones preparadas por el método clásico o sin extrusión se pueden caracterizar de maneras similares. Por ejemplo, las formulaciones se caracterizan típicamente por inspección visual. Deberían ser disoluciones traslúcidas blanquecinas exentas de agregados o sedimento. El tamaño de partícula y la distribución de tamaños de partícula de nanopartículas lipídicas se pueden medir por dispersión de luz usando, por ejemplo, un Malvern 10 Zetasizer Nano ZS (Malvern, USA). Las partículas deberían tener un tamaño de aproximadamente 20-300 nm, tal como 40-100 nm. La distribución de tamaños de partícula debería ser unimodal. La concentración de ARNsi total en la formulación, así como la fracción atrapada, se estima usando un ensayo de exclusión de colorante. Se puede incubar una muestra del ARNsi formulado con un colorante de unión de RNA, tal como Ribogreen (Sondas Moleculares) en presencia o ausencia de un tensioactivo de ruptura molecular de la formulación, por ejemplo, Tritón- 15 X100 al 0,5 %. Se puede determinar el ARNsi total en la formulación por la señal de la muestra que contiene el

tensioactivo, respecto o a una curva estándar. Se determina la fracción atrapada por sustracción del contenido de ARNsi "libre" (cuando se mide por la señal en ausencia de tensioactivo) del contenido de ARNsi total. El ARNsi atrapado en porcentaje es típicamente >85 %. Para la formulación de SNALP, el tamaño de partícula es al menos 30 nm, al menos 40 nm, al menos 50 nm, al menos 60 nm, al menos 70 nm, al menos 80 nm, al menos 90 nm, al 20 menos 100 nm, al menos 110 nm y al menos 120 nm. El intervalo adecuado es típicamente aproximadamente al

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menos 50 nm a aproximadamente al menos 110 nm, aproximadamente al menos 60 nm a aproximadamente al menos 100 nm o aproximadamente al menos 80 nm a aproximadamente al menos 90 nm.

Las composiciones y las formulaciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o disoluciones en agua o medio no acuoso, cápsulas, cápsulas en gel, sobrecitos, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes saborizantes, diluyentes, emulsionantes, agentes auxiliares de dispersión o aglutinantes. En algunas realizaciones, las formulaciones orales son aquéllas en que los ARNds caracterizados en la invención se administran junto con uno o más tensioactivos y quelantes mejoradores de la penetración. Los tensioactivos adecuados incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos. Los ácidos biliares/sales adecuados incluyen ácido quenodesoxicólico (CDCA, por sus siglas en inglés) y ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA, por sus siglas en inglés), ácido cólico, ácido deshidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio y glicodihidrofusidato de sodio. Los ácidos grasos adecuados incluyen ácido araquidónico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina o un monoglicérido, un diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos (por ejemplo, sodio). En algunas realizaciones, se usan combinaciones de potenciadores de la penetración, por ejemplo, ácidos grasos/sales junto con ácidos biliares/sales. Potenciadores de la penetración adicionales incluyen polioxietilen-9- lauril éter, polioxietilen-20-cetil éter. Los ARNds caracterizados en la invención se pueden suministrar por vía oral, en forma granular incluyendo partículas secas pulverizadas o complejadas para formar micro o nanopartículas. Los agentes complejantes de ARNds incluyen poliaminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albúminas, almidones, acrilatos, polietilenglicoles (PEG) y almidones; polialquilcianoacrilatos; poliiminas derivatizadas de DEAE, contaminantes, celulosas y almidones. Los agentes complejantes adecuados incluyen: quitosán, N-trimetilquitosán, poli-L-lisina, polihistidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P (TDAE), poliaminoestireno (por ej., p- amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etilcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilcianoacrilato), poli(isohexilcianoacrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albúmina y DEAE- dextrano, polimetilacrilato, polihexilacrilato, poli(D,L-ácido láctico), poli(DL-ácido láctico-co-glicólico (PLGA), alginato y polietilenglicol (PEG). Las formulaciones orales para los ARNds y su preparación se describen con detalle en la Patente de EE. UU. 6.887.906, Publicación de Patente de EE. UU. N.° 20030027780 y la Patente de EE. UU. N.° 6.747.014, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria por referencia.

Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intraparenquimal (al cerebro), intratecal, intraventricular o intrahepática pueden incluir disoluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero no limitándose a, potenciadores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, disoluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero no se limitan a, líquidos preformados, sólidos autoemulsionables y semisólidos autoemulsionables. Se prefieren en particular las formulaciones que fijan como objetivo el hígado cuando se tratan trastornos hepáticos tales como carcinoma hepático.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que se pueden presentar convenientemente en forma farmacéutica unitaria, se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de llevar a asociación los ingredientes activos con el portador o los portadores o excipiente o excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan llevando a asociación de manera uniforme y de manera íntima los ingredientes activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario, conformar el producto.

Las composiciones de la presente invención se pueden formular en cualquiera de muchas formas farmacéuticas posibles tales como, pero no limitándose a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invención también se pueden formular como suspensiones en medio acuoso, no acuoso o mixto. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión puede contener también estabilizantes.

Emulsiones

Las composiciones de la presente invención se pueden preparar y formular como emulsiones. Las emulsiones son típicamente sistemas heterogéneos de un líquido dispersado en otro en la forma de gotitas normalmente que exceden de 0,1 pm de diámetro (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.),

1.988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., volumen 1, pág. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1.988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, pág. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1.988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., volumen 2, pág. 335; Higuchi et al., en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa.,

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1.985, pág. 301). Las emulsiones son con frecuencia sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles mezcladas íntimamente y dispersadas entre sí. En general, las emulsiones pueden ser de la variedad agua en aceite (w/o) o la variedad aceite en agua (o/w). Cuando una fase acuosa está finamente dividida en y dispersada como gotitas insignificantes en una fase oleosa volumétrica, la composición resultante se denomina una emulsión de agua en aceite (o/w). Alternativamente, cuando una fase oleosa está finamente dividida en y dispersada como gotitas insignificantes en una fase acuosa volumétrica, la composición resultante se denomina una emulsión de aceite en agua (o/w). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersadas y el fármaco activo que puede estar presente como una disolución en la fase acuosa, fase oleosa o ella misma como una fase separada. Los excipientes farmacéuticos tales como emulsionantes, estabilizantes, colorantes y antioxidantes también pueden estar presentes en las emulsiones cuando sea necesario. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser emulsiones múltiples que están constituidas por más de dos fases tales como, por ejemplo, en el caso de emulsiones de aceite en agua en aceite (o/w/o) y agua en aceite en agua (w/o/w). Dichas formulaciones complejas con frecuencia proporcionan ciertas ventajas que no proporcionan las emulsiones binarias simples. Las emulsiones múltiples en que las gotitas de aceite individuales de una emulsión o/w encierran gotitas de agua pequeñas constituyen una emulsión w/o/w. Asimismo, un sistema de gotitas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizados en una fase continua oleosa proporciona una emulsión o/w/o.

Las emulsiones se caracterizan por poca o ninguna estabilidad termodinámica. Con frecuencia, la fase dispersada o discontinua de la emulsión se dispersa bien en la fase externa o continua y se mantiene de esta forma por medio de emulsionantes o la viscosidad de la formulación.

Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser un semisólido o un sólido, como es el caso de bases y cremas de pomadas de estilo emulsión. Otros medios de estabilización de emulsiones implican el uso de emulsionantes que se pueden incorporar a cualquier fase de la emulsión. Los emulsionantes se pueden clasificar ampliamente en cuatro categorías: tensioactivo sintéticos, emulsionantes que se encuentran en la naturaleza, bases de absorción y sólidos finamente dispersados (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1.988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., volumen 1, pág. 199).

Los tensioactivos sintéticos, también denominados como agentes tensioactivos, han encontrado amplia aplicabilidad de la formulación de emulsiones y se han revisado en la bibliografía (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1.988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., volumen 1, pág. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., 1.988, volumen 1, pág. 199). Los tensioactivos son típicamente anfifílicos y comprenden una porción hidrófila y una hidrófoba. La relación de la naturaleza hidrófila a la hidrófoba del tensioactivo se ha denominado el equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB) y es una herramienta valiosa en la categorización y selección de tensioactivos en la preparación de formulaciones. Los tensioactivos se pueden clasificar en diferentes clases basándose en la naturaleza del grupo hidrófilo: no iónico, aniónico, catiónico y anfótero (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1.988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., volumen 1, pág. 285).

Los emulsionantes que se encuentran en la naturaleza usados en formulaciones de emulsión incluyen: lanolina, cera de abejas, fosfatidas, lecitina y goma arábiga. Las bases de absorción poseen propiedades hidrófilas de manera que pueden absorber agua para formar emulsiones w/o reteniendo aún sus consistencias semisólidas, tales como lanolina anhidra y vaselina hidrófila. Los sólidos finamente divididos también han sido usados como buenos emulsionantes especialmente junto con tensioactivos y en preparaciones viscosas. Estos incluyen sólidos inorgánicos polares, tales como hidróxidos de metal pesado, arcillas de no hinchamiento tales como: bentonita, atapulgita, hectorita, caolín, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de aluminio y magnesio coloidal, pigmentos y sólidos no polares tales como carbón o triestearato de glicerilo.

También se incluye una gran variedad de materiales no emulsionantes en formulaciones de emulsión y contribuyen a las propiedades de las emulsiones. Estos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrófilos, conservantes y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1.988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., volumen 1, pág. 335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1.988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., volumen 1, pág. 199).

Los coloides hidrófilos o los hidrocoloides incluyen, gomas que se encuentran en la naturaleza y polímeros sintéticos tales como polisacáridos (por ejemplo, goma arábiga, agar, ácido algínico, carragenina, goma guar, goma karaya y tragacanto), derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa) y polímeros sintéticos (por ejemplo, carbómeros, éteres de celulosa y polímeros de carboxivinilo). Estos se dispersan o se hinchan en agua para formar disoluciones coloidales que estabilizan emulsiones por formación de películas interfaciales fuertes alrededor de las gotitas de fase dispersada y aumentando la viscosidad de la fase externa.

Como las emulsiones con frecuencia contienen una serie de ingredientes tales como carbohidratos, proteínas, esteroles y fosfatidas que pueden soportar fácilmente el crecimiento de microbios, estas formulaciones con frecuencia incorporan conservantes. Los conservantes comúnmente usados incluidos en formulaciones de emulsión incluyen metilparabeno, propilparabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres de ácido p- hidroxibenzoico y ácido bórico. También se añaden comúnmente antioxidantes para evitar el deterioro de la

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formulación. Los antioxidantes usados pueden ser eliminadores de radicales libres tales como: tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o agentes reductores tales como ácido ascórbico y metabisulfito de sodio y agentes sinérgicos antioxidantes tales como ácido cítrico, ácido tartárico y lecitina.

La aplicación de formulaciones de emulsión por vías dermatológica, oral y parenteral y métodos para su fabricación se han revisado en la bibliografía (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.),

1.988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., volumen 1, pág. 199). Las formulaciones de emulsión para suministro oral se han usado muy extensamente debido a la facilidad de formulación, así como desde un punto de vista de absorción y biodisponibilidad (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.),

1.988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., volumen 1, pág. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1.988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., volumen 1, pág. 199). Los laxantes a base de aceite de parafina, vitaminas solubles en aceite y preparaciones nutritivas altas en grasa son entre los materiales que se han administrado comúnmente por vía oral como emulsiones o/w.

En una implementación, las composiciones de los ARNds y los ácidos nucleicos se formulan como microemulsiones. Una microemulsión se puede definir como un sistema de agua, aceite y anfifilo que es una disolución líquida ópticamente isotrópica y termodinámicamente estable, única, (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1.988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., volumen 1, pág. 245). Las microemulsiones típicamente son sistemas que se preparan dispersando primero un aceite en una disolución acuosa de tensioactivo y añadiendo después una cantidad suficiente de un cuarto componente, en general un alcohol de longitud de cadena intermedia para formar un sistema transparente. Por lo tanto, las microemulsiones también se han descrito como dispersiones isotrópicamente claras, termodinámicamente estables de dos líquidos inmiscibles que se estabilizan por películas interfaciales de moléculas tensioactivas (Leung and Shah, en: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1.989, VCH Publishers, Nueva York, páginas 185-215). Las microemulsiones se preparan comúnmente por una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, tensioactivo, tensioactivo conjunto y electrólito. Si la microemulsión es del tipo agua en aceite (w/o) o uno de aceite en agua (o/w) depende de las propiedades del aceite y el tensioactivo usados y de la estructura y empaquetamiento geométrico de las cabezas polares y las colas hidrocarbonadas de las moléculas de tensioactivo (Schott, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1.985, pág. 271).

La propuesta fenomenológica que utiliza diagramas de fase se ha estudiado extensamente y ha proporcionado un conocimiento comprensivo, para un experto en la materia, de cómo formular microemulsiones (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1.988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., volumen 1, pág. 245; Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1.988, Marcel- Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., volumen 1, pág. 335). Comparado con emulsiones convencionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar fármacos insolubles en agua en una formulación de gotitas termodinámicamente estables que se forman de manera espontánea.

Los tensioactivos usados en la preparación de microemulsiones incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos iónicos, tensioactivos no iónicos, Brij 96, polioxietilenoleil éteres, ésteres de ácido graso y poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sesquioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), solos o en asociación con tensioactivos conjuntos. El tensioactivo conjunto, normalmente un alcohol de cadena corta tal como etanol, 1-propanol y 1-butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial por penetración en la película de tensioactivo y creando por consiguiente una película desordenada debido al espacio vacío generado entre las moléculas de tensioactivo. Las microemulsiones, sin embargo, se pueden preparar sin el uso de tensioactivos conjuntos y se conocen en la técnica sistemas de microemulsión autoemulsionables exentos de alcohol. La fase acuosa puede ser típicamente, pero no limitarse a, agua, una disolución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propilenglicoles y derivados de etilenglicol. La fase oleosa puede incluir, pero no limitarse a, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácido graso, mono, di y tri-glicéridos de cadena media (C8-C12), ésteres de ácido graso y glicerilo polioxietilado, alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados, glicéridos C8-C10 poliglicolizados saturados, aceites vegetales y aceite de silicona.

Las microemulsiones son particularmente de interés desde el punto de vista de la solubilización de fármacos y la absorción mejorada de fármacos. Las microemulsiones a base de lípidos (ambas o/w y w/o) se han propuesto para mejorar la biodisponibilidad oral de los fármacos, incluyendo péptidos (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1.994, 11, 1.385-1.390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1.993, 13, 205). Las microemulsiones proporcionan ventajas de solubilización de fármacos mejorada, protección de fármacos de hidrólisis enzimática, posible mejora de la absorción de fármaco debido a alteraciones inducidas por tensioactivo en la fluidez y permeabilidad de la membrana, facilidad de preparación, facilidad de administración oral sobre formas farmacéuticas sólidas, potencia clínica mejorada y toxicidad disminuida (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1.994, 11, 1.385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1.996, 85, 138-143). Con frecuencia se pueden formar las microemulsiones de manera espontánea cuando se ponen juntos sus componentes a temperatura normal. Esto puede ser particularmente ventajoso cuando se formulan fármacos termolábiles, péptidos o los ARNds. Las microemulsiones también han sido eficaces en el suministro transdérmico de componentes activos en aplicaciones tanto cosméticas

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como farmacéuticas. Se espera que las composiciones y las formulaciones de microemulsión de la presente invención faciliten la absorción sistémica aumentada de los ARNds y los ácidos nucleicos del tubo digestivo, así como mejoren la absorción celular local de los ARNds y los ácidos nucleicos.

Las microemulsiones de la presente invención también pueden contener componentes y aditivos adicionales tales como monoestearato de sorbitán (Grill 3), Labrasol y potenciadores de la penetración para mejorar las propiedades de la formulación y mejorar la absorción de los ARNds y ácidos nucleicos de la presente invención. Los potenciadores de la penetración usados en las microemulsiones en la presente invención se pueden clasificar como pertenecientes a una de cinco amplias categorías --tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1.991, pág. 92). Cada una de estas clases ha sido discutida anteriormente.

Potenciadores de la penetración

En una implementación, la presente invención emplea diversos potenciadores de la penetración para efectuar el suministro eficaz de ácidos nucleicos, en particular los ARNds, a la piel de los animales. La mayoría de los fármacos está presente en disolución en formas tanto ionizadas como no ionizadas. Sin embargo, normalmente sólo los fármacos solubles en lípidos o lipofílicos atravesar fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso los fármacos no lipofílicos pueden atravesar las membranas celulares si la membrana que se tiene que atravesar se trata con un potenciador de la penetración. Además de auxiliar en la difusión de fármacos no lipofílicos a través de membranas celulares, los potenciadores de la penetración también aumentan la permeabilidad de los fármacos lipofílicos.

Los potenciadores de la penetración se pueden clasificar como pertenecientes a una de cinco categorías amplias, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1.991, pág. 92). Cada una de las clases mencionadas anteriormente de potenciadores de la penetración se describe a continuación con mayor detalle.

Tensioactivos: En relación con la presente invención, los tensioactivos (o "agentes tensioactivos") son entidades químicas que, cuando se disuelven en una disolución acuosa, reducen la tensión superficial de la disolución o la tensión interfacial entre la disolución acuosa y otro líquido, con el resultado que se aumenta la absorción de los ARNds por la mucosa. Además de sales biliares y ácidos grasos, estos potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, laurilsulfato de sodio, polioxietilen-9-lauril éter y polioxietilen-20-cetil éter) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1.991, pág. 92) y emulsiones perfluoroquímicas, tales como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1.988, 40, 252).

Ácidos grasos: diversos ácidos grasos y sus derivados que actúan como potencia dores de la penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, ésteres alquílicos C.sub.1-10 de los mismos (por ej., metílico, isopropílico y t-butílico) y mono- y diglicéridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1.991, pág. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1.990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1.992, 44, 651-654).

Sales biliares: La función fisiológica de la bilis incluye el facilitamiento de la dispersión y absorción de lípidos y vitaminas solubles en grasa (Brunton, Capítulo 38 en: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, Nueva York, 1.996, págs. 934-935). Diversas sales biliares naturales, y sus derivados sintéticos, actúan como potenciadores de la penetración. Así, el término "sales biliares" incluye cualquiera de los componentes que se encuentran en la naturaleza de la bilis, así como cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares adecuadas incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o su sal de sodio farmacéuticamente aceptable, colato de sodio), ácido de deshidrocólico (deshidrocolato de sodio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sodio), ácido glucólico (glucolato de sodio), ácido glicólico (glicolato de sodio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sodio), ácido taurocólico (taurocolato de sodio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sodio), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sodio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio (STDHF), glicodihidrofusidato de sodio y polioxietilen-9-lauril éter (POE) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1.991, página 92; Swinyard, Capítulo 39 En: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1.990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1.990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1.992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1.990, 79, 579-583).

Agentes quelantes: Los agentes quelantes, como se usa en relación con la presente invención, se pueden definir como compuestos que eliminan iones metálicos de la disolución por formación de complejos con los mismos, con el resultado de que se mejora la absorción de los ARNds por la mucosa. Con respecto a su uso como potenciadores de la penetración en la presente invención, los agentes quelantes tienen la ventaja añadida de servir también como inhibidores de DNasa, ya que la mayoría de las nucleasas de ADN caracterizadas requieren un ión de metal divalente para la catálisis y se inhiben así por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1.993, 618, 315-339). Los

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agentes quelantes adecuados incluyen pero no se limitan a etilendiaminatetraacetato de sodio (AEDT), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato y homovanilato), N-acil-derivados de colágeno, laureth- 9 y N-aminoacil-derivados de beta-dicetonas (enaminas) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1.991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1.990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1.990, 14, 43-51).

No tensioactivos no quelantes: Como se usa en la presente memoria, compuestos potenciadores de la penetración no tensioactivos no quelantes se puede definir como compuestos que demuestran una actividad insignificante como agentes quelantes o como tensioactivos pero que sin embargo potencian la absorción de los ARNds por la mucosa alimentaria (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1.990, 7, 1-33). Esta clase de potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, 1 -alquil- y 1-alqueniloazaciclo- alcanona-derivados (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1.991, página 92) y agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como diclofenac sodio, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1.987, 39, 621-626).

Portadores

Algunas composiciones de la presente descripción también incorporan compuestos portadores en la formulación. Como se usa la presente memoria, "compuesto portador" o "portador" se puede referir a un ácido nucleico o análogo del mismo, que sea inerte, (es decir, no posea actividad biológica de por sí) pero se reconozca como un ácido nucleico, por ejemplo, por procedimientos que reduzcan la biodisponibilidad de un ácido nucleico con actividad biológica, por ejemplo, por degradación del ácido nucleico biológicamente activo o fomentando su eliminación de la circulación. La administración conjunta de un ácido nucleico y un compuesto portador, típicamente con un exceso de la última sustancia, puede dar como resultado una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperada en el hígado, riñón u otros depósitos extracirculatorios, presumiblemente debido a competición entre el compuesto portador y el ácido nucleico para un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un ARNds fosforotioato parcialmente en tejido hepático se puede reducir cuando se administra conjuntamente con poli(ácido inosínico), sulfato o de dextrano, poli(ácido citídico) o ácido 4-acetamido-4'isotiociano-estilbeno-2,2'-disulfónico (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1.995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1.996, 6, 177-183.

Excipientes

Al contrario que un compuesto portador, un "portador farmacéutico" o "excipiente", es un disolvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para suministrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, teniendo en mente la manera de administración planeada, de manera que se proporcione el volumen, la consistencia, etc., deseados, cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica determinada. Los portadores farmacéuticos típicos incluyen, pero no se limitan a, agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinipirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); cargas (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); disgregantes (por ejemplo, almidón, almidón glicolato de sodio, etc.) y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc.).

También se pueden encontrar excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables para administración no parenteral que no reaccionen perjudicialmente con ácidos nucleicos para formular las composiciones de la presente invención. Portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, disoluciones de sal, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

Las formulaciones para administración tópica de ácidos nucleicos pueden incluir disoluciones acuosas estériles y no estériles, disoluciones no acuosas en disolventes comunes tales como alcoholes o disoluciones de los ácidos nucleicos en líquido o bases oleosas sólidas. Las disoluciones también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. Se pueden usar excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parenteral que no reaccionen perjudicialmente con ácidos nucleicos.

Excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, disoluciones de sal, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

Otros componentes

Las composiciones de la presente descripción pueden contener adicionalmente otros componentes adjuntos encontrados convencionalmente en composiciones farmacéuticas, a sus niveles de uso establecidos en la técnica. Así, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmacéuticamente activos compatibles, adicionales, tales como, por ejemplo, antipruríticos, astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios o

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pueden contener materiales adicionales útiles en la formulación de manera física de diversas formas farmacéuticas de las composiciones de la presente invención, tales como colorantes, agentes saborizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantes. Sin embargo, tales materiales, cuando se añaden, no deberían interferir excesivamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influenciar en la presión osmótica, tampones, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no interactúen perjudicialmente con el ácido o los ácidos nucleicos de la formulación.

Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.

En algunas implementaciones, las composiciones farmacéuticas caracterizadas de la invención incluyen (a) uno o más compuestos de ARNds y (b) uno o más agentes biológicos anticitocinas que actúen por un mecanismo no ARNi. Ejemplos de tales componentes biológicos incluyen, componentes biológicos que fijan como objetivo IL1p (por ej., anakinra), IL6 (tocilizumab) o TNF (etanercept, infliximab, adlimumab o certolizumab).

La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos se puede determinar por procedimientos farmacéuticos clásicos en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar el LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y el ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de la dosis entre efectos tóxico y terapéutico es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que presentan altos índices terapéuticos.

Los datos obtenidos de ensayos de cultivos celulares y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. La dosis de las composiciones caracterizadas en la invención se encuentra en general dentro de un intervalo de concentraciones de circulación que incluye el ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en los métodos caracterizados en la invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares. Se puede formular una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración en plasma circulante del compuesto o, cuando se apropiado, del producto polipeptídico de una secuencia fijada como objetivo (por ejemplo, consiguiendo una concentración disminuida del polipéptido) que incluye el IC50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logra una inhibición medio máxima de los síntomas) como se determina en cultivo celular. Tal información se puede usar para determinar con más precisión dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución.

Además de su administración, como se discutió anteriormente, los ARNds caracterizados en la invención se pueden administrar en asociación con otros agentes conocidos eficaces en el tratamiento de procesos patológicos mediados por la expresión de la TTR. En cualquier caso, el médico administrador puede ajustar la cantidad y sincronizar la administración de ARNds sobre la base de los resultados observados usando medidas clásicas de eficacia conocidas en la técnica o descritas en la presente memoria.

Métodos para tratar enfermedades producidas por expresión de un gen de la TTR.

La descripción se refiere en particular al uso de un ARNds que fija como objetivo TTR y composiciones que contienen al menos uno de dicho ARNds para el tratamiento de un trastorno o enfermedad mediado por TTR. Por ejemplo, puede ser útil un ARNds que fije como objetivo un gen de la TTR para el tratamiento de una amiloidosis por TTR, tal como polineuropatía amiloidótica familiar (FAP), cardiomiopatía amiloidótica familiar (FAC), amiloidosis leptomeningea/del SNC, forma de amiloidosis VII (también conocida como amiloidosis leptomeníngea o meningocerebrovascular), hipertiroxinemia y amiloidosis cardíaca (también denominada amiloidosis sistémica senil (SSA, por sus siglas en inglés) y amiloidosis cardiaca senil (SCA, por sus siglas en inglés)).

La FIG. 15 ilustra los síntomas y las mutaciones en TTR asociados con neuropatía amiloidótica familiar, cardiomiopatía amiloidótica familiar y amiloidosis del SNC. La invención incluye composiciones y métodos para tratamiento de estas enfermedades y síntomas y se dirige a estas versiones mutantes de TTR.

Un ARNds que fija como objetivo un gen de la TTR se usa también para tratamiento de síntomas y trastornos, tales como amiloidosis por TTR. Los sistemas asociados a dicha amiloidosis incluyen, por ejemplo, convulsiones, demencia, mielopatía, polineuropatía, síndrome del túnel carpiano, insuficiencia autonómica, cardiomiopatía, disfunción gastrointestinal, (por ej., úlceras gástricas, diarrea, estreñimiento, malabsorción), pérdida de peso, hepatomegalia, adenopatías adenopatía, vacío, opacidades vítreas, insuficiencia renal (incluyendo proteinuria y fallo renal), nefropatía, disfunción de los nervios craneales, distrofia del entramado de la córnea e insuficiencia cardíaca congestiva con debilidad generalizada y dificultades respiratorias de retención de fluidos.

Debido a los efectos inhibidores sobre la expresión de la TTR, una composición de acuerdo con la invención o una composición farmacéutica preparada a partir de la misma puede mejorar la calidad de vida.

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La descripción se refiere además al uso de un ARNds o una composición farmacéutica del mismo, por ejemplo, para tratar una amiloidosis por TTR, junto con otros productos farmacéuticos y/o otros métodos terapéuticos, por ejemplo, con productos farmacéuticos conocidos y/o métodos terapéuticos conocidos, tales como, por ejemplo, aquéllos que se emplean actualmente para tratar estos trastornos. En un ejemplo, un ARNds que fija como objetivo TTR se puede administrar junto con un trasplante de hígado. En otros ejemplos, un ARNds que fija como objetivo TTR se puede administrar junto con un producto farmacéutico o método terapéutico para tratar un síntoma de una enfermedad por TTR, tal como diuréticos, inhibidores de ACE (enzima de conversión de angiotensina), bloqueadores de los receptores de angiotensina (los ARB) o diálisis, por ejemplo, para tratamiento de la función renal.

El ARNds y un agente terapéutico adicional se pueden administrar en la misma asociación, por ejemplo, por vía parenteral, o se puede administrar el agente terapéutico adicional como parte de una composición separada o por otro método descrito en la presente memoria.

La descripción caracteriza un método para administrar un ARNds que fija como objetivo TTR a un paciente con una enfermedad o trastorno mediado por expresión de TTR, tal como una amiloidosis por TTR, por ejemplo, FAP. La administración del ARNds puede estabilizar y mejorar la función neurológica periférica, por ejemplo, en un paciente con FAP. Se puede administrar a los pacientes una cantidad terapéutica del ARNds, tal como 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg o 2,5 mg/kg de ARNds. El ARNds se puede administrar por infusión intravenosa durante un periodo de tiempo, tal como durante un periodo de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 60 minutos, 120 minutos o 180 minutos. La administración se repite, por ejemplo, sobre una base es una base regular, tal como bisemanalmente (es decir, cada dos semanas) durante un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses o más tiempo. Después de un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos se pueden administrar sobre una base menos frecuente. Por ejemplo, después de administración bisemanalmente durante tres meses, la administración se puede repetir una vez al mes, durante seis meses o un año o más tiempo. La administración del ARNds puede reducir los niveles de la TTR en la sangre o la orina del paciente por al menos 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % o más.

Antes de la administración de una dosis completa del ARNds, se puede administrar a los pacientes una dosis menor, tal como una dosis que sea 5 % de la dosis total y controlar los efectos secundarios, tales como una reacción alérgica o un cambio en la función hepática. Por ejemplo, en los pacientes en los que se han controlado los cambios en la función hepática, es aceptable una incidencia baja de cambio en LFT (Ensayo de Función Hepática) (por ejemplo, una incidencia del 10-20 % de LFT) es aceptable (por ejemplo, un aumento de 3 veces, reversible, en los niveles de ALT (alanina aminotransferasa) y/o AST (aspartato aminotransferasa)).

Muchas enfermedades y trastornos asociados a la TTR son hereditarios. Por lo tanto, se puede identificar un paciente con necesidad de un ARNds de TTR llevando una historia familiar. Un suministrador de asistencia sanitaria, tal como un doctor, enfermera o miembro de la familia, puede llevar una historia familiar antes de prescribir o administrar un ARNds de TTR. Se puede realizar también un ensayo de ADN en el paciente para identificar una mutación en el gen de la TTR, antes de que se administre al paciente un ARNds de TTR.

Se puede haber realizado una biopsia al paciente antes de recibir un ARNds de TTR. La biopsia puede ser, por ejemplo, en un tejido, tal como la mucosa gástrica, nervio periférico, piel, grasa abdominal, hígado o riñón, y la biopsia puede revelar placas amiloides, que son indicativas de un trastorno mediado por la TTR. En la identificación de placas amiloides, se administra al paciente un ARNds de TTR.

Métodos para inhibir la expresión de un gen de la TTR.

En otro aspecto más, la descripción proporciona un método para inhibir la expresión de un gen de la TTR en un mamífero. El método incluye administrar una composición caracterizada en la invención al mamífero de manera que la expresión del gen de la TTR fijado como objetivo se silencie.

Cuando el organismo que se tiene que tratar es un mamífero tal como un ser humano, la composición se puede administrar por cualquier medio conocido en la técnica incluyendo, pero no limitándose a, vías oral o parenteral, incluyendo administración intracraneal (por ejemplo, intraventricular, intraparenquimal e intratecal), intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, por las vías respiratorias (aerosol), nasal, rectal y tópica (incluyendo bucal y sublingual). En algunas realizaciones, las composiciones se administran por infusión intravenosa o inyección.

A menos que se defina de otro modo, todo los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, los métodos y los ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1. Síntesis de ARNds.

Fuente de reactivos.

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Cuando la fuente de un reactivo no se determina específicamente en la presente memoria, dichos reactivos se pueden obtener de cualquier suministrador de reactivos para biología molecular en una calidad/pureza estándar para aplicación en biología molecular.

Síntesis de ARNsi.

Se produjeron los ARN monocatenarios por síntesis en fase sólida en una escala de 1 ^mol usando un sintetizador Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Alemania) y vidrio de poro controlado (CPG, 500 Á, Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Alemania) como soporte sólido. El aRN y el ARN que contiene 2- O-metil-nucleótido se generaron por síntesis en fase sólida empleando las correspondientes fosforamiditas y 2-0- metil-fosforamiditas, respectivamente (Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Alemania). Estos bloques de construcción se incorporaron en sitios seleccionados dentro de la secuencia de la cadena de oligoribonucleótido usando la química de la nucleósido fosforamidita clásica tal como se describe en protocolos actuales en la química de los ácidos nucleicos, Beaucage, S. L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, uSa. Se introdujeron uniones fosforotioato por sustitución de la disolución oxidante de yodo con una disolución del reactivo Beaucage (Chruachem Ltd, Glasgow, RU) en acetonitrilo (1 %). Se obtuvieron reactivos auxiliares adicionales de Mallinckrodt Baker (Griesheim, Alemania).

La desprotección y purificación de los oligoribonucleótidos brutos por HPLC de intercambio aniónico se llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos establecidos. Se determinaron los rendimientos y concentraciones por absorción UV de una disolución del ARN respectivo a una longitud de onda de 260 nm usando un espectrofotómetro (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschleiftheim, Alemania). Se generó ARN bicatenario por mezclamiento de una disolución equimolar de hebras complementarias en tampón de hibridación (fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8; cloruro de sodio 100 mM), se calentó en un baño de agua a 85 - 90°C durante 3 minutos y se enfrió a temperatura ambiente durante un periodo de 3-4 horas. Se almacenó la disolución de ARN hibridada a -20°C hasta su uso.

Para la síntesis de los ARNsi 3'-colesterol-conjugados (en la presente memoria referidos como -Chol-3'), se usó un soporte sólido modificado de manera apropiada para síntesis de ARN. El soporte sólido modificado se preparó como sigue:

2-Azabutano-1,4-dicarboxilato de dietilo AA

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Se añadió una disolución acuosa 4,7 M de hidróxido de sodio (50 ml) a una disolución enfriada en hielo, agitada, de hidrocloruro de etilglicinato (32,19 g, 0,23 moles) en agua (50 ml). Después, se añadió acrilato de etilo (23,1 g, 0,23 moles) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente hasta que se determinó la terminación de la reacción por TLC. Después de 19 h, la disolución se repartió con diclorometano (3 x 100 ml). Se secó la capa orgánica con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se evaporó. Se destiló el residuo para proporcionar AA (28,8 g, 61 %).

Éster etílico del ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonil-amino)-hexanoil]-amino}-propiónico AB

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Se disolvió ácido Fmoc-6-amino-hexanoico (9,12 g, 25,83 mmoles) en diclorometano (50 ml) y se enfrió con hielo. Se añadió diisopropilcarbodimida (3,25 g, 3,99 ml, 25,83 mmoles) a la disolución a 0°C. Fue seguido después por la adición Azabutano-1,4-dicarboxilato de dietilo (5 g, 24,6 mmoles) y dimetilaminopiridina (0,305 g, 2,5 mmoles). Se llevó la disolución a temperatura ambiente y se agitó además durante 6 h. La terminación de la reacción se determinó por TLC. Se concentró la mezcla de reacción a vacío y se añadió acetato de etilo para precipitar diisopropilurea. Se filtró la suspensión. Se lavó el líquido filtrado con ácido clorhídrico acuoso al 5 %, bicarbonato de sodio al 5 % y agua. Se secó la capa orgánica combinada sobre sulfato de sodio y se concentró para proporcionar el

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producto bruto que se purificó por cromatografía de columna (EtOAC/Hexanos al 50 %) para proporcionar 11,87 g (88 %) de AB.

Éster etílico del ácido 3-[(6-amino-hexanoil)-etoxicarbonilmetil-amino]-propiónico AC

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Se disolvió éster etílico del ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-hexanoil]-amino}- propiónico AB (11,5 g, 21,3 mmoles) en piperidina al 20 % en dimetilformamida a 0°C. Se continuó agitando la disolución durante 1 h. Se concentró la mezcla de reacción a vacío, se añadió agua al residuo y se extrajo el producto con acetato de etilo. Se purificó el producto bruto por conversión a su sal de hidrocloruro.

Éster etílico del ácido 3-({6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro- 1H-ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}etoxicarbonilmetil-amino)-propiónico AD

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Se absorbió la sal de hidrocloruro de éster etílico del ácido 3-[(6-amino-hexanoil)-etoxicarbonilmetil-amino]- propiónico AC (4,7 g, 14,8 mmoles) en diclorometano. Se enfrió la suspensión a 0 °C sobre hielo. Se añadió a la suspensión de diisopropiletilamina (3,87 g, 5,2 ml, 30 mmoles). A la disolución resultante se añadió cloroformiato de colesterilo (6,675 g, 14,8 moles). Se agitó la mezcla de reacción durante la noche. Se diluyó la mezcla de reacción con diclorometano y se lavó con ácido clorhídrico al 10 %. Se purificó el producto por cromatografía por desorción súbita (10,3 g, 92 %).

Éster etílico del ácido 1-{6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro- 1H-ciclopenta[a] fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}-4-oxo-pirrolidin-3-carboxílico AE.

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Se suspendió terc-butóxido de potasio (1,1 g, 9,8 mmoles) en 30 ml de tolueno seco. Se enfrió la mezcla a 0°C sobre hielo y se añadieron lentamente 5 g (6,6 mmoles) de diéster AD con agitación durante 20 minutos. Se mantuvo la temperatura por debajo de 5°C durante la adición. Se continuó con agitación durante 30 minutos a 0°C y se añadió 1 ml de ácido acético glacial, seguido inmediatamente por 4 g de NaH2PO4 ^2O en 40 ml de agua. Se extrajo la mezcla resultante dos veces con 100 ml de diclorometano cada vez y se lavaron los extractos orgánicos

combinados dos veces con 10 ml de tampón de fosfato cada vez, se secó y se evaporó a sequedad. Se disolvió el residuo en 60 ml de tolueno, se enfrió a 0°C y se extrajo con tres porciones de 50 ml de tampón de carbonato de pH 9,5 frío. Se ajustaron los extractos acuosos a pH 3 con ácido fosfórico y se extrajo con cinco porciones de 40 ml de cloroformo que se combinaron, se secaron y se evaporaron a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía de 5 columna usando acetato de etilo/hexano al 25 % para proporcionar 1,9 g de b-cetoéster (39 %).

Éster 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-

ciclopenta[a]fenantren-3-ílico del ácido [6-(3-hidroxi-4-hidroximetil-pirrolidin-1-il)-6-oxo-hexil]-carbámico AF.

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Se añadió gota a gota metanol (2 ml) durante un periodo de 1 ha una mezcla de reflujo de b-cetoéster AE (1,5 g, 2,2 mmoles) y borohidruro de sodio (0,226 g, 6 mmoles) en tetrahidrofurano (10 ml). Se continuó con agitación a 15 temperatura de reflujo durante 1 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió HCl 1 N (12,5 ml), se extrajo la mezcla con acetato de etilo (3 x 40 ml). Se secó la capa de acetato de etilo combinada sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a vacío para proporcionar el producto que se purificó por cromatografía de columna (MeOH/CHCls al 10 %) (89 %).

Éster 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-

20 ciclopenta[a]fenantren-3-ílico del ácido (6-{3-[bis-(4-metoxi-fenil)-fenil-metoximetil]-4-hidroxi-pirrolidin-1-il}-6-oxo- hexil)-carbámico AG.

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AG

Se secó diol AF (1,25 gm 1,994 mmoles) por evaporación con piridina (2 x 5 ml) a vacío. Se añadió con agitación piridina anhidra (10 ml) y cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo (0,724 g, 2,13 mmoles). Se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente durante la noche. Se enfrió rápidamente la reacción por la adición de metanol. Se concentró la 30 mezcla de reacción a vacío y se añadió al residuo diclorometano (50 ml). Se lavó la capa orgánica con bicarbonato de sodio acuoso 1 M. Se secó la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró. Se retiró la piridina residual por evaporación con tolueno. Se purificó el producto bruto por cromatografía de columna

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(MeOH/Cloroformo al 2 %, Rf = 0,5 en MeOH/CHCl3 al 5 %) (1,75 g, 95 %).

Éster mono-(4-[bis-(4-metoxi-fenil)-fenil-metoximetil]-1-{6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil

2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro- 1H-ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}- pirrolidin-3-ílico) del ácido succínico AH.

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Se mezcló compuesto AG (1,0 g, 1,05 mmoles) con anhídrido succínico (0,150 g, 1,5 mmoles) y DMAP (0,073 g, 0,6 mmoles) y se secó a vacío a 40 °C durante la noche. Se disolvió la mezcla en diclorometano anhidro (3 ml), se añadió trietilamina (0,318 g, 0,440 ml, 3,15 mmoles) y se agitó la disolución a temperatura ambiente en atmósfera de argón durante 16 h. Después se diluyó con diclorometano (40 ml) y se lavó con ácido cítrico acuoso enfriado en hielo (5 % en peso, 30 ml) y agua (2 X 20 ml). Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a sequedad. Se usó el residuo como tal para la siguiente etapa.

CPG derivatizado de colesterol A1.

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Se disolvió Succinato AH (0,254 g, 0,242 mmoles) en una mezcla de diclorometano/acetonitrilo (3:2, 3 ml). A esa disolución se añadieron sucesivamente DMAP (0,0296 g, 0,242 mmoles) en acetonitrilo (1,25 ml), 2,2'-Ditio-bis(5- nitropiridina) (0,075 g, 0,242 mmoles) en acetonitrilo/dicloroetano (3:1, 1,25 ml). A la disolución resultante se añadió trifenilfosfina (0,064 g, 0,242 mmoles) en acetonitrilo (0,6 ml). La mezcla de reacción se volvió naranja brillante de color. Se agitó brevemente la disolución usando un agitador con movimiento de muñeca (5 minutos). Se añadió alquilamina de cadena larga-CPG (LCAA-CPG) (1,5 g, 61 mM). Se agitó la suspensión durante 2 h. Se filtró el CPG por un embudo sintetizado y se lavó con acetonitrilo, diclorometano y éter sucesivamente. Se enmascararon los grupos amino no reaccionados usando anhídrido acético/piridina. Se midió la carga lograda del CPG tomando medición UV (37 mM/g).

Se realizó la síntesis de los ARNsi soportando un grupo bisdecilamida de ácido 5'-12-dodecanoico (referido en la presente memoria como "5-C32-") o un grupo 5'-colesteril-derivado (referido en la presente memoria como "5'-Chol- ") como se describe en la patente internacional WO 2004/065601, excepto que, para el derivado de colesterilo, la etapa de oxidación se realizó usando el reactivo Beaucage para introducir una unión fosforotioato en el extremo 5’ del oligómero de ácido nucleico.

Se representan a continuación las secuencias de ácidos nucleicos usando nomenclatura clásica y específicamente las abreviaturas en la Tabla 1.

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Tabla 1: Abreviaturas de los monómeros de nucleótidos usados en la representación de secuencias de ácidos nucleicos. Se entenderá que estos monómeros, cuando están presentes en un oligonucleótido, están ligados mutuamente mediante enlaces 5'-3'-fosfodiéster.

Abreviatura

Nucleótido(s)

A

adenosina-3'-fosfato

C

citidina-3'-fosfato

G

guanosina-3'-fosfato

T

5-metiluridina-3'-fosfato

U

uridina-3'-fosfato

N

cualquier nucleótido (G, A, C o T)

a

2'-O-metiladenosina-3'-fosfato

c

2'-O-metilcitidina-3'-fosfato

g

2'-O-metilguanosina-3'-fosfato

u

2'-O-metiluridina-3'-fosfato

dT

2'-desoxitimidina-3'-fosfato

sT; sdT

2'-desoxi-timidina-5'fosfato-fosforotioato

Ejemplo 2A. Diseño de ARNsi de TTR.

Transcripciones

Se llevó a cabo el diseño de ARNsi para identificar ARNsi que fija como objetivo del gen de la transtiretina de ser humano (símbolo TTR) y rata (símbolo Ttr). El diseño usó las transcripciones de TTR NM_000371.2 (SEC ID N.° 1.329) (ser humano) y NM_012681.1 (SEC ID N.° 1.330) (rata) de la colección Refseq del NCBI. Se diseñaron los dúplex de ARNsi con 100 % de identidad a sus respectivos genes de la TTR.

Diseño de ARNsi y predicción de especificidad.

Se determinó la especificidad prevista de todos los posibles 19meros de cada secuencia. Se usaron los ARNsi de la TTR en una búsqueda exhaustiva contra los transcriptomas humanos y de rata (definido como la serie de registros NM_ y XM_ dentro de la serie Refseq del NCBI) usando el algoritmo FASTA. La secuencia de comandos de Python 'offtargetFasta.py' se usó después para analizar las alineaciones y generar una puntuación basándose en la posición y el número de desajustes entre el ARNsi y cualquier transcripción potencial "fuera de lugar". La puntuación de fuera de lugar se ponderó para enfatizar las diferencias en la región "siembra" de los ARNsi, en las posiciones 2-9 del extremo 5' de la molécula. La puntuación de fuera de lugar se calcula como sigue: los desajustes entre el oligo y la transcripción se penalizan. Un desajuste en la región de siembra en las posiciones 2-9 del oligo se penaliza con 2,8; los desajustes en los sitios de escisión putativos 10 y 11 se penalizan con 1,2 y los desajustes en las posiciones 1219 tienen una penalización de 1. Los desajustes en la posición 1 no se tienen en cuenta. La puntuación de fuera de lugar para cada par oligo-transcripción se calcula después sumando las penalizaciones de los desajustes. La proporción de fuera de lugar más baja de todos los pares oligo-transcripción se determina después y se usa en la clasificación posterior de oligos. Las dos hebras de ARNsi se asignan a una categoría de especificidad de acuerdo con las puntuaciones calculadas: una puntuación de 3 cualifica como altamente específico, igual a 3 como específico y entre 2,2 y 2,8 como moderadamente específico. En la elección de qué oligos sintetizar, se clasificaron las puntuaciones de fuera de lugar de la hebra complementaria desde alta a baja y se seleccionaron los 144 mejores pares oligo (puntuación de fuera de lugar más baja) de seres humanos y los mejores 26 pares de rata.

Selección de secuencia de ARNsi.

Se sintetizaron un total de 140 oligos de ARNsi procedente de TTR humanos transcritos y 140 complementarios y se formaron dúplex. Se sintetizó un total de oligos de ARNsi derivados de TTR de rata de 26 transcritos y 26 complementarios y se formaron dúplex. Los dúplex incluyendo los oligos se presentan en las Tablas 2-4 (TTR humana) y las Tablas 5-7 (TTR de rata).

5 Tabla 2. Números de identificación para ARNds de la TTR humano.

Véase la Tabla 4 para secuencias y modificaciones de oligos.

Dúplex #

Oligo Transcrito# Oligo Complementario#

AD-18243

A-32153 A-32154

AD-18244

A-32155 A-32156

AD-18245

A-32157 A-32158

AD-18246

A-32159 A-32160

AD-18247

A-32163 A-32164

AD-18248

A-32165 A-32166

AD-18249

A-32167 A-32168

AD-18250

A-32169 A-32170

AD-18251

A-32171 A-32172

AD-18252

A-32175 A-32176

AD-18253

A-32177 A-32178

AD-18254

A-32179 A-32180

AD-18255

A-32181 A-32182

AD-18256

A-32183 A-32184

AD-18257

A-32187 A-32188

AD-18258

A-32189 A-32190

AD-18259

A-32191 A-32192

AD-18260

A-32193 A-32194

AD-18261

A-32195 A-32196

AD-18262

A-32199 A-32200

AD-18263

A-32201 A-32202

AD-18264

A-32203 A-32204

AD-18265

A-32205 A-32206

Véase la Tabla 4 para secuencias y modificaciones de oligos.

Dúplex #

Oligo Transcrito# Oligo Complementario#

AD-18266

A-32207 A-32208

AD-18267

A-32211 A-32212

AD-18268

A-32213 A-32214

AD-18269

A-32215 A-32216

AD-18270

A-32217 A-32218

AD-18271

A-32219 A-32220

AD-18272

A-32221 A-32222

AD-18273

A-32223 A-32224

AD-18274

A-32225 A-32226

AD-18275

A-32227 A-32228

AD-18276

A-32229 A-32230

AD-18277

A-32231 A-32232

AD-18278

A-32233 A-32234

AD-18279

A-32235 A-32236

AD-18280

A-32237 A-32238

AD-18281

A-32239 A-32240

AD-18282

A-32241 A-32242

AD-18283

A-32243 A-32244

AD-18284

A-32247 A-32248

AD-18285

A-32249 A-32250

AD-18286

A-32251 A-32252

AD-18287

A-32253 A-32254

AD-18288

A-32255 A-32256

AD-18289

A-32259 A-32260

AD-18290

A-32261 A-32262

AD-18291

A-32263 A-32264

Véase la Tabla 4 para secuencias y modificaciones de oligos.

Dúplex #

Oligo Transcrito# Oligo Complementario#

AD-18292

A-32265 A-32266

AD-18293

A-32267 A-32268

AD-18294

A-32269 A-32270

AD-18295

A-32271 A-32272

AD-18296

A-32273 A-32274

AD-18297

A-32275 A-32276

AD-18298

A-32277 A-32278

AD-18299

A-32279 A-32280

AD-18300

A-32281 A-32282

AD-18301

A-32283 A-32284

AD-18302

A-32285 A-32286

AD-18303

A-32287 A-32288

AD-18304

A-32289 A-32290

AD-18305

A-32291 A-32292

AD-18306

A-32295 A-32296

AD-18307

A-32297 A-32298

AD-18308

A-32299 A-32300

AD-18309

A-32301 A-32302

AD-18310

A-32303 A-32304

AD-18311

A-32307 A-32308

AD-18312

A-32309 A-32310

AD-18313

A-32311 A-32312

AD-18314

A-32313 A-32314

AD-18315

A-32315 A-32316

AD-18316

A-32319 A-32320

AD-18317

A-32321 A-32322

Véase la Tabla 4 para secuencias y modificaciones de oligos.

Dúplex #

Oligo Transcrito# Oligo Complementario#

AD-18318

A-32323 A-32324

AD-18319

A-32325 A-32326

AD-18320

A-32327 A-32328

AD-18321

A-32331 A-32332

AD-18322

A-32333 A-32334

AD-18323

A-32335 A-32336

AD-18324

A-32337 A-32338

AD-18325

A-32339 A-32340

AD-18326

A-32341 A-32342

AD-18327

A-32343 A-32344

AD-18328

A-32345 A-32346

AD-18329

A-32347 A-32348

AD-18330

A-32349 A-32350

AD-18331

A-32351 A-32352

AD-18332

A-32353 A-32354

AD-18333

A-32355 A-32356

AD-18334

A-32357 A-32358

AD-18335

A-32359 A-32360

AD-18336

A-32363 A-32364

AD-18337

A-32367 A-32368

AD-18338

A-32369 A-32370

AD-18339

A-32371 A-32372

AD-18340

A-32373 A-32374

AD-18341

A-32375 A-32376

AD-18342

A-32379 A-32380

AD-18343

A-32381 A-32382

Véase la Tabla 4 para secuencias y modificaciones de oligos.

Dúplex #

Oligo Transcrito# Oligo Complementario#

AD-18344

A-32383 A-32384

AD-18345

A-32385 A-32386

AD-18346

A-32387 A-32388

AD-18347

A-32391 A-32392

AD-18348

A-32393 A-32394

AD-18349

A-32395 A-32396

AD-18350

A-32397 A-32398

AD-18351

A-32399 A-32400

AD-18352

A-32401 A-32402

AD-18353

A-32403 A-32404

AD-18354

A-32405 A-32406

AD-18355

A-32407 A-32408

AD-18356

A-32409 A-32410

AD-18357

A-32411 A-32412

AD-18358

A-32415 A-32416

AD-18359

A-32417 A-32418

AD-18360

A-32419 A-32420

AD-18361

A-32421 A-32422

AD-18362

A-32423 A-32424

AD-18363

A-32427 A-32428

AD-18364

A-32429 A-32430

AD-18446

A-32161 A-32162

AD-18447

A-32173 A-32174

AD-18448

A-32185 A-32186

AD-18449

A-32197 A-32198

AD-18450

A-32209 A-32210

Véase la Tabla 4 para secuencias y modificaciones de oligos.

Dúplex #

Oligo Transcrito# Oligo Complementario#

AD-18451

A-32245 A-32246

AD-18452

A-32257 A-32258

AD-18453

A-32293 A-32294

AD-18454

A-32305 A-32306

AD-18455

A-32317 A-32318

AD-18456

A-32329 A-32330

AD-18457

A-32361 A-32362

AD-19458

A-32365 A-32366

AD-18459

A-32377 A-32378

AD-18460

A-32389 A-32390

AD-18461

A-32401 A-32402

AD-18462

A-32413 A-32414

AD-18463

A-32425 A-32426

Tabla 3A. Secuencias de hebra transcrita y complementaria de ARNds de TTR humano

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.° Secuencia con saliente de dinucleótido 3' (5' a 3') SEC ID N.°

t

100 CCGGUGAAUCCAAGUGUCC 1 CCGGUGAAUCCAAGUGUCCNN 281

c

118 GGACACUUGGAUUCACCGG 2 GGACACUUGGAUUCACCGGNN 282

t

11 ACUCAUUCUUGGCAGGAUG 3 ACUCAUUCUUGGCAGGAUGNN 283

c

29 CAUCCUGCCAAGAAUGAGU 4 CAUCCUGCCAAGAAUGAGUNN 284

T

111 AAGUGUCCUCUGAUGGUCA 5 AAGUGUCCUCUGAUGGUCANN 285

c

129 UGACCAUCAGAGGACACUU 6 UGACCAUCAGAGGACACUUNN 286

T

13 UCAUUCUUGGCAGGAUGGC 7 UCAUUCUUGGCAGGAUGGCNN 287

c

31 GCCAUCCUGCCAAGAAUGA 8 GCCAUCCUGCCAAGAAUGANN 288

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.° Secuencia con saliente de dinucleótido 3' (5' a 3') SEC ID N.°

t

130 AAGUUCUAGAUGCUGUCCG 9 AAGUUCUAGAUGCUGUCCGNN 289

c

148 CGGACAGCAUCUAGAACUU 10 CGGACAGCAUCUAGAACUUNN 290

t

132 GUUCUAGAUGCUGUCCGAG 11 GUUCUAGAUGCUGUCCGAGNN 291

c

150 CUCGGACAGCAUCUAGAAC 12 CUCGGACAGCAUCUAGAACNN 292

t

135 CUAGAUGCUGUCCGAGGCA 13 CUAGAUGCUGUCCGAGGCANN 293

c

153 UGCCUCGGACAGCAUCUAG 14 UGCCUCGGACAGCAUCUAGNN 294

t

138 GAUGCUGUCCGAGGCAGUC 15 GAUGCUGUCCGAGGCAGUCNN 295

c

156 GACUGCCUCGGACAGCAUC 16 GACUGCCUCGGACAGCAUCNN 296

t

14 CAUUCUUGGCAGGAUGGCU 17 CAUUCUUGGCAGGAUGGCUNN 297

c

32 AGCCAUCCUGCCAAGAAUG 18 AGCCAUCCUGCCAAGAAUGNN 298

t

140 UGCUGUCCGAGGCAGUCCU 19 UGCUGUCCGAGGCAGUCCUNN 299

c

158 AGGACUGCCUCGGACAGCA 20 AGGACUGCCUCGGACAGCANN 300

t

146 CCGAGGCAGUCCUGCCAUC 21 CCGAGGCAGUCCUGCCAUCNN 301

c

164 GAUGGCAGGACUGCCUCGG 22 GAUGGCAGGACUGCCUCGGNN 302

t

152 CAGUCCUGCCAUCAAUGUG 23 CAGUCCUGCCAUCAAUGUGNN 303

c

170 CACAUUGAUGGCAGGACUG 24 CACAUUGAUGGCAGGACUGNN 304

t

164 CAAUGUGGCCGUGCAUGUG 25 CAAUGUGGCCGUGCAUGUGNN 305

c

182 CACAUGCACGGCCACAUUG 26 CACAUGCACGGCCACAUUGNN 306

t

178 AUGUGUUCAGAAAGGCUGC 27 AUGUGUUCAGAAAGGCUGCNN 307

c

196 GCAGCCUUUCUGAACACAU 28 GCAGCCUUUCUGAACACAUNN 308

t

2 CAGAAGUCCACUCAUUCUU 29 CAGAAGUCCACUCAUUCUUNN 309

c

20 AAGAAUGAGUGGACUUCUG 30 AAGAAUGAGUGGACUUCUGNN 310

t

21 GGCAGGAUGGCUUCUCAUC 31 GGCAGGAUGGCUUCUCAUCNN 311

c

39 GAUGAGAAGCCAUCCUGCC 32 GAUGAGAAGCCAUCCUGCCNN 312

t

210 GAGCCAUUUGCCUCUGGGA 33 GAGCCAUUUGCCUCUGGGANN 313

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.° Secuencia con saliente de dinucleótido 3' (5' a 3') SEC ID N.°

c

228 UCCCAGAGGCAAAUGGCUC 34 UCCCAGAGGCAAAUGGCUCNN 314

t

23 CAGGAUGGCUUCUCAUCGU 35 CAGGAUGGCUUCUCAUCGUNN 315

c

41 ACGAUGAGAAGCCAUCCUG 36 ACGAUGAGAAGCCAUCCUGNN 316

t

24 AGGAUGGCUUCUCAUCGUC 37 AGGAUGGCUUCUCAUCGUCNN 317

c

42 GACGAUGAGAAGCCAUCCU 38 GACGAUGAGAAGCCAUCCUNN 318

t

245 AGAGCUGCAUGGGCUCACA 39 AGAGCUGCAUGGGCUCACANN 319

c

263 UGUGAGCCCAUGCAGCUCU 40 UGUGAGCCCAUGCAGCUCUNN 320

t

248 GCUGCAUGGGCUCACAACU 41 GCUGCAUGGGCU CACAACUNN 321

c

266 AGUUGUGAGCCCAUGCAGC 42 AGUUGUGAGCCCAUGCAGCNN 322

t

25 GGAUGGCUUCUCAUCGUCU 43 GGAUGGCUUCUCAUCGUCUNN 323

c

43 AGACGAUGAGAAGCCAUCC 44 AGACGAUGAGAAGCCAUCCNN 324

t

251 GCAUGGGCUCACAACUGAG 45 GCAUGGGCUCACAACUGAGNN 325

c

269 CUCAGUUGUGAGCCCAUGC 46 CUCAGUUGUGAGCCCAUGCNN 326

t

253 AUGGGCUCACAACUGAGGA 47 AUGGGCUCACAACUGAGGANN 327

c

271 UCCUCAGUUGUGAGCCCAU 48 UCCUCAGUUGUGAGCCCAUNN 328

t

254 UGGGCUCACAACUGAGGAG 49 UGGGCUCACAACUGAGGAGNN 329

c

272 CUCCUCAGUUGUGAGCCCA 50 CUCCUCAGUUGUGAGCCCANN 330

t

270 GAGGAAUUUGUAGAAGGGA 51 GAGGAAUUUGUAGAAGGGANN 331

c

288 UCCCUUCUACAAAUUCCUC 52 UCCCUUCUACAAAUUCCUCNN 332

t

276 UUUGUAGAAGGGAUAUACA 53 UUUGUAGAAGGGAUAUACANN 333

c

294 UGUAUAUCCCUUCUACAAA 54 UGUAUAUCCCUUCUACAAANN 334

t

277 UUGUAGAAGGGAUAUACAA 55 UUGUAGAAGGGAUAUACAANN 335

c

295 UUGUAUAUCCCUUCUACAA 56 UUGUAUAUCCCUUCUACAANN 336

t

278 UGUAGAAGGGAUAUACAAA 57 UGUAGAAGGGAUAUACAAANN 337

c

296 UUUGUAUAUCCCUUCUACA 58 UUUGUAUAUCCCUUCUACANN 338

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.° Secuencia con saliente de dinucleótido 3' (5' a 3') SEC ID N.°

t

281 AGAAGGGAUAUACAAAGUG 59 AGAAGGGAUAUACAAAGUGNN 339

c

299 CACUUUGUAUAUCCCUUCU 60 CACUUUGUAUAUCCCUUCUNN 340

t

295 AAGUGGAAAUAGACACCAA 61 AAGUGGAAAUAGACACCAANN 341

c

313 UUGGUGUCUAUUUCCACUU 62 UUGGUGUCUAUUUCCACUUNN 342

t

299 GGAAAUAGACACCAAAUCU 63 GGAAAUAGACACCAAAUCUNN 343

c

317 AGAUUUGGUGUCUAUUUCC 64 AGAUUUGGUGUCUAUUUCCNN 344

t

300 GAAAUAGACACCAAAUCUU 65 GAAAUAGACACCAAAUCUUNN 345

c

318 AAGAUUUGGUGUCUAUUUC 66 AAGAUUUGGUGUCUAUUUCNN 346

t

303 AUAGACACCAAAUCUUACU 67 AUAGACACCAAAUCUUACUNN 347

c

321 AGUAAGAUUUGGUGUCUAU 68 AGUAAGAUUUGGUGUCUAUNN 348

t

304 UAGACACCAAAUCUUACUG 69 UAGACACCAAAUCUUACUGNN 349

c

322 CAGUAAGAUUUGGUGUCUA 70 CAGUAAGAUUUGGUGUCUANN 350

t

305 AGACACCAAAUCUUACUGG 71 AGACACCAAAUCUUACUGGNN 351

c

323 CCAGUAAGAUUUGGUGUCU 72 CCAGUAAGAUUUGGUGUCUNN 352

t

317 UUACUGGAAGGCACUUGGC 73 UUACUGGAAGGCACUUGGCNN 353

c

335 GCCAAGUGCCUUCCAGUAA 74 GCCAAGUGCCUUCCAGUAANN 354

t

32 UUCUCAUCGUCUGCUCCUC 75 UUCUCAUCGUCUGCUCCUCNN 355

c

50 GAGGAGCAGACGAUGAGAA 76 GAGGAGCAGACGAUGAGAANN 356

t

322 GGAAGGCACUUGGCAUCUC 77 GGAAGGCACUUGGCAUCUCNN 357

c

340 GAGAUGCCAAGUGCCUUCC 78 GAGAUGCCAAGUGCCUUCCNN 358

t

326 GGCACUUGGCAUCUCCCCA 79 GGCACUUGGCAUCUCCCCANN 359

c

344 UGGGGAGAUGCCAAGUGCC 80 UGGGGAGAUGCCAAGUGCCNN 360

t

333 GGCAUCUCCCCAUUCCAUG 81 GGCAUCUCCCCAUUCCAUGNN 361

c

351 AUGGAAUGGGGAGAUGCCTT 82 AUGGAAUGGGGAGAUGCCTTNN 362

t

334 GCAUCUCCCCAUUCCAUGA 83 GCAUCUCCCCAUUCCAUGANN 363

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.° Secuencia con saliente de dinucleótido 3' (5' a 3') SEC ID N.°

c

352 UCAUGGAAUGGGGAGAUGC 84 UCAUGGAAUGGGGAGAUGCNN 364

t

335 CAUCUCCCCAUUCCAUGAG 85 CAUCUCCCCAUUCCAUGAGNN 365

c

353 CUCAUGGAAUGGGGAGAUG 86 CUCAUGGAAUGGGGAGAUGNN 366

t

336 AUCUCCCCAUUCCAUGAGC 87 AUCUCCCCAUUCCAUGAGCNN 367

c

354 GCUCAUGGAAUGGGGAGAU 88 GCUCAUGGAAUGGGGAGAUNN 368

t

338 CUCCCCAUUCCAUGAGCAU 89 CUCCCCAUUCCAUGAGCAUNN 369

c

356 AUGCUCAUGGAAUGGGGAG 90 AUGCUCAUGGAAUGGGGAGNN 370

t

341 CCCAUUCCAUGAGCAUGCA 91 CCCAUUCCAUGAGCAUGCANN 371

c

359 UGCAUGCUCAUGGAAUGGG 92 UGCAUGCUCAUGGAAUGGGNN 372

t

347 CCAUGAGCAUGCAGAGGUG 93 CCAUGAGCAUGCAGAGGUGNN 373

c

365 CACCUCUGCAUGCUCAUGG 94 CACCUCUGCAUGCUCAUGGNN 374

t

352 AGCAUGCAGAGGUGGUAUU 95 AGCAUGCAGAGGUGGUAUUNN 375

c

370 AAUACCACCUCUGCAUGCU 96 AAUACCACCUCUGCAUGCUNN 376

t

354 CAUGCAGAGGUGGUAUUCA 97 CAUGCAGAGGUGGUAUUCANN 377

c

372 UGAAUACCACCUCUGCAUG 98 UGAAUACCACCUCUGCAUGNN 378

t

355 AUGCAGAGGUGGUAUUCAC 99 AUGCAGAGGUGGUAUUCACNN 379

c

373 GUGAAUACCACCUCUGCAU 100 GUGAAUACCACCUCUGCAUNN 380

t

362 GGUGGUAUUCACAGCCAAC 101 GGUGGUAUUCACAGCCAACNN 381

c

380 GUUGGCUGUGAAUACCACC 102 GUUGGCUGUGAAUACCACCNN 382

t

363 GUGGUAUUCACAGCCAACG 103 GUGGUAUUCACAGCCAACGNN 383

c

381 CGUUGGCUGUGAAUACCAC 104 CGUUGGCUGUGAAUACCACNN 384

t

364 UGGUAUUCACAGCCAACGA 105 UGGUAUUCACAGCCAACGANN 385

c

382 UCGUUGGCUGUGAAUACCA 106 UCGUUGGCUGUGAAUACCANN 386

t

365 GGUAUUCACAGCCAACGAC 107 GGUAUUCACAGCCAACGACNN 387

c

383 GUCGUUGGCUGUGAAUACC 108 GUCGUUGGCUGUGAAUACCNN 388

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.° Secuencia con saliente de dinucleótido 3' (5' a 3') SEC ID N.°

t

366 GUAUUCACAGCCAACGACU 109 GUAUUCACAGCCAACGACUNN 389

c

384 AGUCGUUGGCUGUGAAUAC 110 AGUCGUUGGCUGUGAAUACNN 390

t

367 UAUUCACAGCCAACGACUC 111 UAUUCACAGCCAACGACUCNN 391

c

385 GAGUCGUUGGCUGUGAAUA 112 GAGUCGUUGGCUGUGAAUANN 392

t

370 UCACAGCCAACGACUCCGG 113 UCACAGCCAACGACUCCGGNN 393

c

388 CCGGAGUCGUUGGCUGUGA 114 CCGGAGUCGUUGGCUGUGANN 394

t

390 CCCCGCCGCUACACCAUUG 115 CCCCGCCGCUACACCAUUGNN 395

t

408 CAAUGGUGUAGCGGCGGGG 116 CAAUGGUGUAGCGGCGGGGNN 396

t

4 GAAGUCCACUCAUUCUUGG 117 GAAGUCCACUCAUUCUUGGNN 397

c

22 CCAAGAAUGAGUGGACUUC 118 CCAAGAAUGAGUGGACUUCNN 398

t

412 CCCUGCUGAGCCCCUACUC 119 CCCUGCUGAGCCCCUACUCNN 399

c

430 GAGUAGGGGCUCAGCAGGG 120 GAGUAGGGGCUCAGCAGGGNN 400

t

417 CUGAGCCCCUACUCCUAUU 121 CUGAGCCCCUACUCCUAUUNN 401

c

435 AAUAGGAGUAGGGGCUCAG 122 AAUAGGAGUAGGGGCUCAGNN 402

t

418 UGAGCCCCUACUCCUAUUC 123 UGAGCCCCUACUCCUAUUCNN 403

c

436 GAAUAGGAGUAGGGGCUCA 124 GAAUAGGAGUAGGGGCUCANN 404

t

422 CCCCUACUCCUAUUCCACC 125 CCCCUACUCCUAUUCCACCNN 405

c

440 GGUGGAAUAGGAGUAGGGG 126 GGUGGAAUAGGAGUAGGGGNN 406

t

425 CUACUCCUAUUCCACCACG 127 CUACUCCUAUUCCACCACGNN 407

c

443 CGUGGUGGAAUAGGAGUAG 128 CGUGGUGGAAUAGGAGUAGNN 408

t

426 UACUCCUAUUCCACCACGG 129 UACUCCUAUUCCACCACGGNN 409

c

444 CCGUGGUGGAAUAGGAGUA 130 CCGUGGUGGAAUAGGAGUANN 410

t

427 ACUCCUAUUCCACCACGGC 131 ACUCCUAUUCCACCACGGCNN 411

c

445 GCCGUGGUGGAAUAGGAGU 132 GCCGUGGUGGAAUAGGAGUNN 412

t

429 UCCUAUUCCACCACGGCUG 133 UCCUAUUCCACCACGGCUGNN 413

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.° Secuencia con saliente de dinucleótido 3' (5' a 3') SEC ID N.°

c

447 CAGCCGUGGUGGAAUAGGA 134 CAGCCGUGGUGGAAUAGGANN 414

t

432 UAUUCCACCACGGCUGUCG 135 UAUUCCACCACGGCUGUCGNN 415

c

450 CGACAGCCGUGGUGGAAUA 136 CGACAGCCGUGGUGGAAUANN 416

t

433 AUUCCACCACGGCUGUCGU 137 *AUUCCACCACGGCUGUCGUNN 417

c

451 ACGACAGCCGUGGUGGAAU 138 ACGACAGCCGUGGUGGAAUNN 418

t

437 CACCACGGCUGUCGUCACC 139 CACCACGGCUGUCGUCACCNN 419

c

455 GGUGACGACAGCCGUGGUG 140 GGUGACGACAGCCGUGGUGNN 420

t

438 ACCACGGCUGUCGUCACCA 141 ACCACGGCUGUCGUCACCANN 421

c

456 UGGUGACGACAGCCGUGGU 142 UGGUGACGACAGCCGUGGUNN 422

t

439 CCACGGCUGUCGUCACCAA 143 CCACGGCUGUCGUCACCAANN 423

c

457 UUGGUGACGACAGCCGUGG 144 UUGGUGACGACAGCCGUGGNN 424

t

441 ACGGCUGUCGUCACCAAUC 145 ACGGCUGUCGUCACCAAUCNN 425

c

459 GAUUGGUGACGACAGCCGU 146 GAUUGGUGACGACAGCCGUNN 426

t

442 CGGCUGUCGUCACCAAUCC 147 CGGCUGUCGUCACCAAUCCNN 427

c

460 GGAUUGGUGACGACAGCCG 148 GGAUUGGUGACGACAGCCGNN 428

t

449 CGUCACCAAUCCCAAGGAA 149 CGUCACCAAUCCCAAGGAANN 429

c

467 UUCCUUGGGAUUGGUGACG 150 UUCCUUGGGAUUGGUGACGNN 430

t

455 CAAUCCCAAGGAAUGAGGG 151 CAAUCCCAAGGAAUGAGGGNN 431

c

473 CCCUCAUUCCUUGGGAUUG 152 CCCUCAUUCCUUGGGAUUGNN 432

t

491 CCUGAAGGACGAGGGAUGG 153 CCUGAAGGACGAGGGAUGGNN 433

c

509 CCAUCCCUCGUCCUUCAGG 154 CCAUCCCUCGUCCUUCAGGNN 434

t

497 GGACGAGGGAUGGGAUUUC 155 GGACGAGGGAUGGGAUUUCNN 435

c

515 GAAAUCCCAUCCCUCGUCC 156 GAAAUCCCAUCCCUCGUCCNN 436

t

5 AAGUCCACUCAUUCUUGGC 157 AAGUCCACUCAUUCUUGGCNN 437

c

23 GCCAAGAAUGAGUGGACUU 158 GCCAAGAAUGAGUGGACUUNN 438

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.° Secuencia con saliente de dinucleótido 3' (5' a 3') SEC ID N.°

t

508 GGGAUUUCAUGUAACCAAG 159 GGGAUUUCAUGUAACCAAGNN 439

c

526 CUUGGUUACAUGAAAUCCC 160 CUUGGUUACAUGAAAUCCCNN 440

t

509 GGAUUUCAUGUAACCAAGA 161 GGAUUUCAUGUAACCAAGANN 441

c

527 UCUUGGUUACAUGAAAUCC 162 UCUUGGUUACAUGAAAUCCNN 442

t

514 UCAUGUAACCAAGAGUAUU 163 UCAUGUAACCAAGAGUAUUNN 443

c

532 AAUACUCUUGGUUACAUGA 164 AAUACUCUUGGUUACAUGANN 444

t

516 AUGUAACCAAGAGUAUUCC 165 AUGUAACCAAGAGUAUUCCNN 445

c

534 GGAAUACUCUUGGUUACAU 166 GGAAUACUCUUGGUUACAUNN 446

t

517 UGUAACCAAGAGUAUUCCA 167 UGUAACCAAGAGUAUUCCANN 447

c

535 UGGAAUACUCUUGGUUACA 168 UGGAAUACUCUUGGUUACANN 448

t

518 GUAACCAAGAGUAUUCCAU 169 GUAACCAAGAGUAUUCCAUNN 499

c

536 AUGGAAUACUCUUGGUUAC 170 AUGGAAUACUCUUGGUUACNN 450

t

54 UGCCUUGCUGGACUGGUAU 171 UGCCUUGCUGGACUGGUAUNN 451

c

72 AUACCAGUCCAGCAAGGCA 172 AUACCAGUCCAGCAAGGCANN 452

t

543 UAAAGCAGUGUUUUCACCU 173 UAAAGCAGUGUUUUCACCUNN 453

c

561 AGGUGAAAACACUGCUUUA 174 AGGUGAAAACACUGCUUUANN 454

t

55 GCCUUGCUGGACUGGUAUU 175 GCCUUGCUGGACUGGUAUUNN 455

c

73 AAUACCAGUCCAGCAAGGC 176 AAUACCAGUCCAGCAAGGCNN 456

t

551 UGUUUUCACCUCAUAUGCU 177 UGUUUUCACCUCAUAUGCUNN 457

c

569 AGCAUAUGAGGUGAAAACA 178 AGCAUAUGAGGUGAAAACANN 458

t

552 GUUUUCACCUCAUAUGCUA 179 GUUUUCACCUCAUAUGCUANN 459

c

570 UAGCAUAUGAGGUGAAAAC 180 UAGCAUAUGAGGUGAAAACNN 460

t

553 UUUUCACCUCAUAUGCUAU 181 UUUUCACCUCAUAUGCUAUNN 461

c

571 AUAGCAUAUGAGGUGAAAA 182 AUAGCAUAUGAGGUGAAAANN 462

t

555 UUCACCUCAUAUGCUAUGU 183 UUCACCUCAUAUGCUAUGUNN 463

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.° Secuencia con saliente de dinucleótido 3' (5' a 3') SEC ID N.°

c

573 ACAUAGCAUAUGAGGUGAA 184 ACAUAGCAUAUGAGGUGAANN 464

t

557 CACCUCAUAUGCUAUGUUA 185 CACCUCAUAUGCUAUGUUANN 465

c

575 UAACAUAGCAUAUGAGGUG 186 UAACAUAGCAUAUGAGGUGNN 466

t

56 CCUUGCUGGACUGGUAUUU 187 CCUUGCUGGACUGGUAUUUNN 467

c

74 AAAUACCAGUCCAGCAAGG 188 AAAUACCAGUCCAGCAAGGNN 468

t

563 AUAUGCUAUGUUAGAAGUC 189 AUAUGCUAUGUUAGAAGUCNN 469

c

581 GACUUCUAACAUAGCAUAU 190 GACUUCUAACAUAGCAUAUNN 470

t

564 UAUGCUAUGUUAGAAGUCC 191 UAUGCUAUGUUAGAAGUCCNN 471

c

582 GGACUUCUAACAUAGCAUA 192 GGACUUCUAACAUAGCAUANN 472

t

566 UGCUAUGUUAGAAGUCCAG 193 UGCUAUGUUAGAAGUCCAGNN 473

c

584 CUGGACUUCUAACAUAGCA 194 CUGGACUUCUAACAUAGCANN 474

t

57 CUUGCUGGACUGGUAUUUG 195 CUUGCUGGACUGGUAUUUGNN 475

c

75 CAAAUACCAGUCCAGCAAG 196 CAAAUACCAGUCCAGCAAGNN 476

t

578 AGUCCAGGCAGAGACAAUA 197 AGUCCAGGCAGAGACAAUANN 477

c

596 AUUGUCUCUGCCUGGACUTT 198 AUUGUCUCUGCCUGGACUTTNN 478

t

580 UCCAGGCAGAGACAAUAAA 199 UCCAGGCAGAGACAAUAAANN 479

c

598 UUUAUUGUCUCUGCCUGGA 200 UUUAUUGUCUCUGCCUGGANN 480

t

607 GUGAAAGGCACUUUUCAUU 201 GUGAAAGGCACUUUUCAUUNN 481

c

625 AAUGAAAAGUGCCUUUCAC 202 AAUGAAAAGUGCCUUUCACNN 482

t

62 UGGACUGGUAUUUGUGUCU 203 UGGACUGGUAUUUGUGUCUNN 483

c

80 AGACACAAAUACCAGUCCA 204 AGACACAAAUACCAGUCCANN 484

t

77 GUCUGAGGCUGGCCCUACG 205 GUCUGAGGCUGGCCCUACGNN 485

c

95 CGUAGGGCCAGCCUCAGAC 206 CGUAGGGCCAGCCUCAGACNN 486

t

79 CUGAGGCUGGCCCUACGGG 207 CUGAGGCUGGCCCUACGGGNN 487

c

97 CCCGUAGGGCCAGCCUCAG 208 CCCGUAGGGCCAGCCUCAGNN 488

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.° Secuencia con saliente de dinucleótido 3' (5' a 3') SEC ID N.°

t

81 GAGGCUGGCCCUACGGGCA 209 GAGGCUGGCCCUACGGGCANN 489

c

99 UGCCCGUAGGGCCAGCCUC 210 UGCCCGUAGGGCCAGCCUCNN 490

t

82 AGGCUGGCCCUACGGGCAC 211 AGGCUGGCCCUACGGGCACNN 491

c

100 GUGCCCGUAGGGCCAGCCU 212 GUGCCCGUAGGGCCAGCCUNN 492

t

84 GCUGGCCCUACGGGCACCG 213 GCUGGCCCUACGGGCACCGNN 493

c

102 CGGUGCCCGUAGGGCCAGC 214 CGGUGCCCGUAGGGCCAGCNN 494

t

85 CUGGCCCUACGGGCACCGG 215 CUGGCCCUACGGGCACCGGNN 495

c

103 CCGGUGCCCGUAGGGCCAG 216 CCGGUGCCCGUAGGGCCAGNN 496

t

87 GGCCCUACGGGCACCGGUG 217 GGCCCUACGGGCACCGGUGNN 497

c

105 CACCGGUGCCCGUAGGGCC 218 CACCGGUGCCCGUAGGGCCNN 498

t

9 CCACUCAUUCUUGGCAGGA 219 CCACUCAUUCUUGGCAGGANN 499

c

27 UCCUGCCAAGAAUGAGUGG 220 UCCUGCCAAGAAUGAGUGGNN 500

t

90 CCUACGGGCACCGGUGAAU 221 CCUACGGGCACCGGUGAAUNN 501

c

108 AUUCACCGGUGCCCGUAGG 222 AUUCACCGGUGCCCGUAGGNN 502

t

91 CUACGGGCACCGGUGAAUC 223 CUACGGGCACCGGUGAAUCNN 503

c

109 GAUUCACCGGUGCCCGUAG 224 GAUUCACCGGUGCCCGUAGNN 504

t

92 UACGGGCACCGGUGAAUCC 225 UACGGGCACCGGUGAAUCCNN 505

c

110 GGAUUCACCGGUGCCCGUA 226 GGAUUCACCGGUGCCCGUANN 506

t

93 ACGGGCACCGGUGAAUCCA 227 ACGGGCACCGGUGAAUCCANN 507

c

111 UGGAUUCACCGGUGCCCGU 228 UGGAUUCACCGGUGCCCGUNN 508

t

97 GCACCGGUGAAUCCAAGUG 229 GCACCGGUGAAUCCAAGUGNN 509

c

115 CACUUGGAUUCACCGGUGC 230 CACUUGGAUUCACCGGUGCNN 510

t

98 CACCGGUGAAUCCAAGUGU 231 CACCGGUGAAUCCAAGUGUNN 511

c

116 ACACUUGGAUUCACCGGUG 232 ACACUUGGAUUCACCGGUGNN 512

t

167 UGUGGCCAUGCAUGUGUUC 233 UGUGGCCAUGCAUGUGUUCNN 513

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.° Secuencia con saliente de dinucleótido 3' (5' a 3') SEC ID N.°

c

185 GAACACAUGCAUGGCCACA 234 GAACACAUGCAUGGCCACANN 514

t

168 GUGGCCAUGCAUGUGUUCA 235 GUGGCCAUGCAUGUGUUCANN 515

c

186 UGAACACAUGCAUGGCCAC 236 UGAACACAUGCAUGGCCACNN 516

t

171 GCCAUGCAUGUGUUCAGAA 237 GCCAUGCAUGUGUUCAGAANN 517

c

189 UUCUGAACACAUGCAUGGC 238 UUCUGAACACAUGCAUGGCNN 518

t

432 UAUUCCACCACGGCUGUCA 239 UAUUCCACCACGGCUGUCANN 519

c

449 UGACAGCCGUGGUGGAAUA 240 UGACAGCCGUGGUGGAAUANN 520

t

447 GUCAUCACCAAUCCCAAGG 241 GUCAUCACCAAUCCCAAGGNN 521

c

465 CCUUGGGAUUGGUGAUGAC 242 CCUUGGGAUUGGUGAUGACNN 522

t

115 GUCCUCUGAUGGUCAAAGU 243 GUCCUCUGAUGGUCAAAGUNN 523

c

133 ACUUUGACCAUCAGAGGAC 244 ACUUUGACCAUCAGAGGACNN 524

t

122 GAUGGUCAAAGUUCUAGAU 245 GAUGGUCAAAGUUCUAGAUNN 525

c

140 AUCUAGAACUUUGACCAUC 246 AUCUAGAACUUUGACCAUCNN 526

t

139 AUGCUGUCCGAGGCAGUCC 247 AUGCUGUCCGAGGCAGUCCNN 527

c

157 GGACUGCCUCGGACAGCAU 248 GGACUGCCUCGGACAGCAUNN 528

t

172 CCGUGCAUGUGUUCAGAAA 249 CCGUGCAUGUGUUCAGAAANN 529

c

190 UUUCUGAACACAUGCACGG 250 UUUCUGAACACAUGCACGGNN 530

t

238 AGUCUGGAGAGCUGCAUGG 251 AGUCUGGAGAGCUGCAUGGNN 531

c

256 CCAUGCAGCUCUCCAGACU 252 CCAUGCAGCUCUCCAGACUNN 532

t

252 CAUGGGCUCACAACUGAGG 253 CAUGGGCUCACAACUGAGGNN 533

c

270 CCUCAGUUGUGAGCCCAUG 254 CCUCAGUUGUGAGCCCAUGNN 534

t

33 UCUCAUCGUCUGCUCCUCC 255 UCUCAUCGUCUGCUCCUCCNN 535

c

51 GGAGGAGCAGACGAUGAGA 256 GGAGGAGCAGACGAUGAGANN 536

t

340 CCCCAUUCCAUGAGCAUGC 257 CCCCAUUCCAUGAGCAUGCNN 537

c

358 GCAUGCUCAUGGAAUGGGG 258 GCAUGCUCAUGGAAUGGGGNN 538

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.° Secuencia con saliente de dinucleótido 3' (5' a 3') SEC ID N.°

t

421 GCCCCUACUCCUAUUCCAC 259 GCCCCUACUCCUAUUCCACNN 539

c

439 GUGGAAUAGGAGUAGGGGC 260 GUGGAAUAGGAGUAGGGGCNN 540

t

431 CUAUUCCACCACGGCUGUC 261 CUAUUCCACCACGGCUGUCNN 541

c

449 GACAGCCGUGGUGGAAUAG 262 GACAGCCGUGGUGGAAUAGNN 542

t

440 CACGGCUGUCGUCACCAAU 263 CACGGCUGUCGUCACCAAUNN 543

c

458 AUUGGUGACGACAGCCGUG 264 AUUGGUGACGACAGCCGUGNN 544

t

496 AGGACGAGGGAUGGGAUUU 265 AGGACGAGGGAUGGGAUUUNN 545

c

514 AAAUCCCAUCCCUCGUCCU 266 AAAUCCCAUCCCUCGUCCUNN 546

t

556 UCACCUCAUAUGCUAUGUU 267 UCACCUCAUAUGCUAUGUUNN 547

c

574 AACAUAGCAUAUGAGGUGA 268 AACAUAGCAUAUGAGGUGANN 548

t

559 CCUCAUAUGCUAUGUUAGA 269 CCUCAUAUGCUAUGUUAGANN 549

c

577 UCUAACAUAGCAUAUGAGG 270 UCUAACAUAGCAUAUGAGGNN 550

t

570 AUGUUAGAAGUCCAGGCAG 271 AUGUUAGAAGUCCAGGCAGNN 551

c

588 CUGCCUGGACUUCUAACAU 272 CUGCCUGGACUUCUAACAUNN 552

t

78 UCUGAGGCUGGCCCUACGG 273 UCUGAGGCUGGCCCUACGGNN 553

c

96 CCGUAGGGCCAGCCUCAGA 274 CCGUAGGGCCAGCCUCAGANN 554

t

87 GGCCCUACGGGCACCGGUG 275 GGCCCUACGGGCACCGGUGNN 555

c

105 CACCGGUGCCCGUAGGGCC 276 CACCGGUGCCCGUAGGGCCNN 556

t

95 GGGCACCGGUGAAUCCAAG 277 GGGCACCGGUGAAUCCAAGNN 557

c

113 CUUGGAUUCACCGGUGCCC 278 CUUGGAUUCACCGGUGCCCNN 558

t

167 CCAUGCAUGUGUUCAGAAA 279 CCAUGCAUGUGUUCAGAAANN 559

c

185 UUUCUGAACACAUGCAUGG 280 UUUCUGAACACAUGCAUGGNN 560

Tabla 3B. Secuencias de hebra transcrita y complementaria de ARNds de TTR humano

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia con saliente 3'desoxitimidina (5' a 3') SEC ID N.°

t

100 CCGGUGAAUCCAAGUGUCCdTdT 561

c

118 GGACACUUGGAUUCACCGGdTdT 562

t

11 ACUCAUUCUUGGCAGGAUGdTdT 563

c

29 CAUCCUGCCAAGAAUGAGUdTdT 564

t

111 AAGUGUCCUCUGAUGGUCAdTdT 565

c

129 UGACCAUCAGAGGACACUUdTdT 566

t

13 UCAUUCUUGGCAGGAUGGCdTdT 567

c

31 GCCAUCCUGCCAAGAAUGAdTdT 568

t

130 AAGUUCUAGAUGCUGUCCGdTdT 569

c

148 CGGACAGCAUCUAGAACUUdTdT 570

t

132 GUUCUAGAUGCUGUCCGAGdTdT 571

c

150 CUCGGACAGCAUCUAGAACdTdT 572

t

135 CUAGAUGCUGUCCGAGGCAdTdT 573

c

153 UGCCUCGGACAGCAUCUAGdTdT 574

t

138 GAUGCUGUCCGAGGCAGUCdTdT 575

c

156 GACUGCCUCGGACAGCAUCdTdT 576

t

14 CAUUCUUGGCAGGAUGGCUdTdT 577

c

32 AGCCAUCCUGCCAAGAAUGdTdT 578

t

140 UGCUGUCCGAGGCAGUCCUdTdT 579

c

158 AGGACUGCCUCGGACAGCAdTdT 580

t

146 CCGAGGCAGUCCUGCCAUCdTdT 581

c

164 GAUGGCAGGACUGCCUCGGdTdT 582

t

152 CAGUCCUGCCAUCAAUGUGdTdT 583

c

170 CACAUUGAUGGCAGGACUGdTdT 584

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia con saliente 3'desoxitimidina (5' a 3') SEC ID N.°

t

164 CAAUGUGGCCGUGCAUGUGdTdT 585

c

182 CACAUGCACGGCCACAUUGdTdT 586

t

178 AUGUGUUCAGAAAGGCUGCdTdT 587

c

196 GCAGCCUUUCUGAACACAUdTdT 588

t

2 CAGAAGUCCACUCAUUCUUdTdT 589

c

20 AAGAAUGAGUGGACUUCUGdTdT 590

t

21 GGCAGGAUGGCUUCUCAUCdTdT 591

c

39 GAUGAGAAGCCAUCCUGCCdTdT 592

t

210 GAGCCAUUUGCCUCUGGGAdTdT 593

c

228 UCCCAGAGGCAAAUGGCUCdTdT 594

t

23 CAGGAUGGCUUCUCAUCGUdTdT 595

c

41 ACGAUGAGAAGCCAUCCUGdTdT 596

t

24 AGGAUGGCUUCUCAUCGUCdTdT 597

c

42 GACGAUGAGAAGCCAUCCUdTdT 598

t

245 AGAGCUGCAUGGGCUCACAdTdT 599

c

263 UGUGAGCCCAUGCAGCUCUdTdT 600

t

248 GCUGCAUGGGCUCACAACUdTdT 601

c

266 AGUUGUGAGCCCAUGCAGCdTdT 602

t

25 GGAUGGCUUCUCAUCGUCUdTdT 603

c

43 AGACGAUGAGAAGCCAUCCdTdT 604

t

251 GCAUGGGCUCACAACUGAGdTdT 605

c

269 CUCAGUUGUGAGCCCAUGCdTdT 606

t

253 AUGGGCUCACAACUGAGGAdTdT 607

c

271 UCCUCAGUUGUGAGCCCAUdTdT 608

t

254 UGGGCUCACAACUGAGGAGdTdT 609

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia con saliente 3'desoxitimidina (5' a 3') SEC ID N.°

c

272 CUCCUCAGUUGUGAGCCCAdTdT 610

t

270 GAGGAAUUUGUAGAAGGGAdTdT 611

c

288 UCCCUUCUACAAAUUCCUCdTdT 612

t

276 UUUGUAGAAGGGAUAUACAdTdT 613

c

294 UGUAUAUCCCUUCUACAAAdTdT 614

t

277 UUGUAGAAGGGAUAUACAAdTdT 615

c

295 UUGUAUAUCCCUUCUACAAdTdT 616

t

278 UGUAGAAGGGAUAUACAAAdTdT 617

c

296 UUUGUAUAUCCCUUCUACAdTdT 618

t

281 AGAAGGGAUAUACAAAGUGdTdT 619

c

299 CACUUUGUAUAUCCCUUCUdTdT 620

t

295 AAGUGGAAAUAGACACCAAdTdT 621

c

313 UUGGUGUCUAUUUCCACUUdTdT 622

t

299 GGAAAUAGACACCAAAUCUdTdT 623

c

317 AGAUUUGGUGUCUAUUUCCdTdT 624

t

300 GAAAUAGACACCAAAUCUUdTdT 625

c

318 AAGAUUUGGUGUCUAUUUCdTdT 626

t

303 AUAGACACCAAAUCUUACUdTdT 627

c

321 AGUAAGAUUUGGUGUCUAUdTdT 628

t

304 UAGACACCAAAUCUUACUGdTdT 629

c

322 CAGUAAGAUUUGGUGUCUAdTdT 630

t

305 AGACACCAAAUCUUACUGGdTdT 631

c

323 CCAGUAAGAUUUGGUGUCUdTdT 632

t

317 UUACUGGAAGGCACUUGGCdTdT 633

c

335 GCCAAGUGCCUUCCAGUAAdTdT 634

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia con saliente 3'desoxitimidina (5' a 3') SEC ID N.°

t

32 UUCUCAUCGUCUGCUCCUCdTdT 635

c

50 GAGGAGCAGACGAUGAGAAdTdT 636

t

322 GGAAGGCACUUGGCAUCUCdTdT 637

c

340 GAGAUGCCAAGUGCCUUCCdTdT 638

t

326 GGCACUUGGCAUCUCCCCAdTdT 639

c

344 UGGGGAGAUGCCAAGUGCCdTdT 640

t

333 GGCAUCUCCCCAUUCCAUGdTdT 641

c

351 AUGGAAUGGGGAGAUGCCTTdTdT 642

t

334 GCAUCUCCCCAUUCCAUGAdTdT 643

c

352 UCAUGGAAUGGGGAGAUGCdTdT 644

t

335 CAUCUCCCCAUUCCAUGAGdTdT 645

c

353 CUCAUGGAAUGGGGAGAUGdTdT 646

t

336 AUCUCCCCAUUCCAUGAGCdTdT 647

c

354 GCUCAUGGAAUGGGGAGAUdTdT 648

t

338 CUCCCCAUUCCAUGAGCAUdTdT 649

c

356 AUGCUCAUGGAAUGGGGAGdTdT 650

t

341 CCCAUUCCAUGAGCAUGCAdTdT 651

c

359 UGCAUGCUCAUGGAAUGGGdTdT 652

t

347 CCAUGAGCAUGCAGAGGUGdTdT 653

c

365 CACCUCUGCAUGCUCAUGGdTdT 654

t

352 AGCAUGCAGAGGUGGUAUUdTdT 655

c

370 AAUACCACCUCUGCAUGCUdTdT 656

t

354 CAUGCAGAGGUGGUAUUCAdTdT 657

c

372 UGAAUACCACCUCUGCAUGdTdT 658

t

355 AUGCAGAGGUGGUAUUCACdTdT 659

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia con saliente 3'desoxitimidina (5' a 3') SEC ID N.°

c

373 GUGAAUACCACCUCUGCAUdTdT 660

t

362 GGUGGUAUUCACAGCCAACdTdT 661

c

380 GUUGGCUGUGAAUACCACCdTdT 662

t

363 GUGGUAUUCACAGCCAACGdTdT 663

c

381 CGUUGGCUGUGAAUACCACdTdT 664

t

364 UGGUAUUCACAGCCAACGAdTdT 665

c

382 UCGUUGGCUGUGAAUACCAdTdT 666

t

365 GGUAUUCACAGCCAACGACdTdT 667

c

383 GUCGUUGGCUGUGAAUACCdTdT 668

t

366 GUAUUCACAGCCAACGACUdTdT 669

c

384 AGUCGUUGGCUGUGAAUACdTdT 670

t

367 UAUUCACAGCCAACGACUCdTdT 671

c

385 GAGUCGUUGGCUGUGAAUAdTdT 672

t

370 UCACAGCCAACGACUCCGGdTdT 673

c

388 CCGGAGUCGUUGGCUGUGAdTdT 674

t

390 CCCCGCCGCUACACCAUUGdTdT 675

c

408 CAAUGGUGUAGCGGCGGGGdTdT 676

t

4 GAAGUCCACUCAUUCUUGGdTdT 677

c

22 CCAAGAAUGAGUGGACUUCdTdT 678

t

412 CCCUGCUGAGCCCCUACUCdTdT 679

c

430 GAGUAGGGGCUCAGCAGGGdTdT 680

t

417 CUGAGCCCCUACUCCUAUUdTdT 681

c

435 AAUAGGAGUAGGGGCUCAGdTdT 682

t

418 UGAGCCCCUACUCCUAUUCdTdT 683

c

436 GAAUAGGAGUAGGGGCUCAdTdT 684

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia con saliente 3'desoxitimidina (5' a 3') SEC ID N.°

t

422 CCCCUACUCCUAUUCCACCdTdT 685

c

440 GGUGGAAUAGGAGUAGGGGdTdT 686

t

425 CUACUCCUAUUCCACCACGdTdT 687

c

443 CGUGGUGGAAUAGGAGUAGdTdT 688

t

426 UACUCCUAUUCCACCACGGdTdT 689

c

444 CCGUGGUGGAAUAGGAGUAdTdT 690

t

427 ACUCCUAUUCCACCACGGCdTdT 691

c

445 GCCGUGGUGGAAUAGGAGUdTdT 692

t

429 UCCUAUUCCACCACGGCUGdTdT 693

c

447 CAGCCGUGGUGGAAUAGGAdTdT 694

t

432 UAUUCCACCACGGCUGUCGdTdT 695

c

450 CGACAGCCGUGGUGGAAUAdTdT 696

t

433 AUUCCACCACGGCUGUCGUdTdT 697

c

451 ACGACAGCCGUGGUGGAAUdTdT 698

t

437 CACCACGGCUGUCGUCACCdTdT 699

c

455 GGUGACGACAGCCGUGGUGdTdT 700

t

438 ACCACGGCUGUCGUCACCAdTdT 701

c

456 UGGUGACGACAGCCGUGGUdTdT 702

t

439 CCACGGCUGUCGUCACCAAdTdT 703

c

457 UUGGUGACGACAGCCGUGGdTdT 704

t

441 ACGGCUGUCGUCACCAAUCdTdT 705

c

459 GAUUGGUGACGACAGCCGUdTdT 706

t

442 CGGCUGUCGUCACCAAUCCdTdT 707

c

460 GGAUUGGUGACGACAGCCGdTdT 708

t

449 CGUCACCAAUCCCAAGGAAdTdT 709

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia con saliente 3'desoxitimidina (5' a 3') SEC ID N.°

c

467 UUCCUUGGGAUUGGUGACGdTdT 710

t

455 CAAUCCCAAGGAAUGAGGGdTdT 711

c

473 CCCUCAUUCCUUGGGAUUGdTdT 712

t

491 CCUGAAGGACGAGGGAUGGdTdT 713

c

509 CCAUCCCUCGUCCUUCAGGdTdT 714

t

497 GGACGAGGGAUGGGAUUUCdTdT 715

c

515 GAAAUCCCAUCCCUCGUCCdTdT 716

t

5 AAGUCCACUCAUUCUUGGCdTdT 717

c

23 GCCAAGAAUGAGUGGACUUdTdT 718

t

508 GGGAUUUCAUGUAACCAAGdTdT 719

c

526 CUUGGUUACAUGAAAUCCCdTdT 720

t

509 GGAUUUCAUGUAACCAAGAdTdT 721

c

527 UCUUGGUUACAUGAAAUCCdTdT 722

t

514 UCAUGUAACCAAGAGUAUUdTdT 723

c

532 AAUACUCUUGGUUACAUGAdTdT 724

t

516 AUGUAACCAAGAGUAUUCCdTdT 725

c

534 GGAAUACUCUUGGUUACAUdTdT 726

t

517 UGUAACCAAGAGUAUUCCAdTdT 727

c

535 UGGAAUACUCUUGGUUACAdTdT 728

t

518 GUAACCAAGAGUAUUCCAUdTdT 729

c

536 AUGGAAUACUCUUGGUUACdTdT 730

t

54 UGCCUUGCUGGACUGGUAUdTdT 731

c

72 AUACCAGUCCAGCAAGGCAdTdT 732

t

543 UAAAGCAGUGUUUUCACCUdTdT 733

c

561 AGGUGAAAACACUGCUUUAdTdT 734

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia con saliente 3'desoxitimidina (5' a 3') SEC ID N.°

t

55 GCCUUGCUGGACUGGUAUUdTdT 735

c

73 AAUACCAGUCCAGCAAGGCdTdT 736

t

551 UGUUUUCACCUCAUAUGCUdTdT 737

c

569 AGCAUAUGAGGUGAAAACAdTdT 738

t

552 GUUUUCACCUCAUAUGCUAdTdT 739

c

570 UAGCAUAUGAGGUGAAAACdTdT 740

t

553 UUUUCACCUCAUAUGCUAUdTdT 741

c

571 AUAGCAUAUGAGGUGAAAAdTdT 742

t

555 UUCACCUCAUAUGCUAUGUdTdT 743

c

573 ACAUAGCAUAUGAGGUGAAdTdT 744

t

557 CACCUCAUAUGCUAUGUUAdTdT 745

c

575 UAACAUAGCAUAUGAGGUGdTdT 746

t

56 CCUUGCUGGACUGGUAUUUdTdT 747

c

74 AAAUACCAGUCCAGCAAGGdTdT 748

t

563 AUAUGCUAUGUUAGAAGUCdTdT 749

c

581 GACUUCUAACAUAGCAUAUdTdT 750

t

564 UAUGCUAUGUUAGAAGUCCdTdT 751

c

582 GGACUUCUAACAUAGCAUAdTdT 752

t

566 UGCUAUGUUAGAAGUCCAGdTdT 753

c

584 CUGGACUUCUAACAUAGCAdTdT 754

t

57 CUUGCUGGACUGGUAUUUGdTdT 755

c

75 CAAAUACCAGUCCAGCAAGdTdT 756

t

578 AGUCCAGGCAGAGACAAUAdTdT 757

c

596 AUUGUCUCUGCCUGGACUTTdTdT 758

t

580 UCCAGGCAGAGACAAUAAAdTdT 759

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia con saliente 3'desoxitimidina (5' a 3') SEC ID N.°

c

598 UUUAUUGUCUCUGCCUGGAdTdT 760

t

607 GUGAAAGGCACUUUUCAUUdTdT 761

c

625 AAUGAAAAGUGCCUUUCACdTdT 762

t

62 UGGACUGGUAUUUGUGUCUdTdT 763

c

80 AGACACAAAUACCAGUCCAdTdT 764

t

77 GUCUGAGGCUGGCCCUACGdTdT 765

c

95 CGUAGGGCCAGCCUCAGACdTdT 766

t

79 CUGAGGCUGGCCCUACGGGdTdT 767

c

97 CCCGUAGGGCCAGCCUCAGdTdT 768

t

81 GAGGCUGGCCCUACGGGCAdTdT 769

c

99 UGCCCGUAGGGCCAGCCUCdTdT 770

t

82 AGGCUGGCCCUACGGGCACdTdT 771

c

100 GUGCCCGUAGGGCCAGCCUdTdT 772

t

84 GCUGGCCCUACGGGCACCGdTdT 773

c

102 CGGUGCCCGUAGGGCCAGCdTdT 774

t

85 CUGGCCCUACGGGCACCGGdTdT 775

c

103 CCGGUGCCCGUAGGGCCAGdTdT 776

t

87 GGCCCUACGGGCACCGGUGdTdT 777

c

105 CACCGGUGCCCGUAGGGCCdTdT 778

t

9 CCACUCAUUCUUGGCAGGAdTdT 779

c

27 UCCUGCCAAGAAUGAGUGGdTdT 780

t

90 CCUACGGGCACCGGUGAAUdTdT 781

c

108 AUUCACCGGUGCCCGUAGGdTdT 782

t

91 CUACGGGCACCGGUGAAUCdTdT 783

c

109 GAUUCACCGGUGCCCGUAGdTdT 784

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia con saliente 3'desoxitimidina (5' a 3') SEC ID N.°

t

92 UACGGGCACCGGUGAAUCCdTdT 785

c

110 GGAUUCACCGGUGCCCGUAdTdT 786

t

93 ACGGGCACCGGUGAAUCCAdTdT 787

c

111 UGGAUUCACCGGUGCCCGUdTdT 788

t

97 GCACCGGUGAAUCCAAGUGdTdT 789

c

115 CACUUGGAUUCACCGGUGCdTdT 790

t

98 CACCGGUGAAUCCAAGUGUdTdT 791

c

116 ACACUUGGAUUCACCGGUGdTdT 792

t

167 UGUGGCCAUGCAUGUGUUCdTdT 793

c

185 GAACACAUGCAUGGCCACAdTdT 794

t

168 GUGGCCAUGCAUGUGUUCAdTdT 795

c

186 UGAACACAUGCAUGGCCACdTdT 796

t

171 GCCAUGCAUGUGUUCAGAAdTdT 797

c

189 UUCUGAACACAUGCAUGGCdTdT 798

t

432 UAUUCCACCACGGCUGUCAdTdT 799

c

449 UGACAGCCGUGGUGGAAUAdTdT 800

t

447 GUCAUCACCAAUCCCAAGGdTdT 801

c

465 CCUUGGGAUUGGUGAUGACdTdT 802

t

115 GUCCUCUGAUGGUCAAAGUdTdT 803

c

133 ACUUUGACCAUCAGAGGACdTdT 804

t

122 GAUGGUCAAAGUUCUAGAUdTdT 805

c

140 AUCUAGAACUUUGACCAUCdTdT 806

t

139 AUGCUGUCCGAGGCAGUCCdTdT 807

c

157 GGACUGCCUCGGACAGCAUdTdT 808

t

172 CCGUGCAUGUGUUCAGAAAdTdT 809

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia con saliente 3'desoxitimidina (5' a 3') SEC ID N.°

c

190 UUUCUGAACACAUGCACGGdTdT 810

t

238 AGUCUGGAGAGCUGCAUGGdTdT 811

c

256 CCAUGCAGCUCUCCAGACUdTdT 812

t

252 CAUGGGCUCACAACUGAGGdTdT 813

c

270 CCUCAGUUGUGAGCCCAUGdTdT 814

t

33 UCUCAUCGUCUGCUCCUCCdTdT 815

c

51 GGAGGAGCAGACGAUGAGAdTdT 816

t

340 CCCCAUUCCAUGAGCAUGCdTdT 817

c

358 GCAUGCUCAUGGAAUGGGGdTdT 818

t

421 GCCCCUACUCCUAUUCCACdTdT 819

c

439 GUGGAAUAGGAGUAGGGGCdTdT 820

t

431 CUAUUCCACCACGGCUGUCdTdT 821

c

449 GACAGCCGUGGUGGAAUAGdTdT 822

t

440 CACGGCUGUCGUCACCAAUdTdT 823

c

458 AUUGGUGACGACAGCCGUGdTdT 824

t

496 AGGACGAGGGAUGGGAUUUdTdT 825

c

514 AAAUCCCAUCCCUCGUCCUdTdT 826

t

556 UCACCUCAUAUGCUAUGUUdTdT 827

c

574 AACAUAGCAUAUGAGGUGAdTdT 828

t

559 CCUCAUAUGCUAUGUUAGAdTdT 829

c

577 UCUAACAUAGCAUAUGAGGdTdT 830

t

570 AUGUUAGAAGUCCAGGCAGdTdT 831

c

588 CUGCCUGGACUUCUAACAUdTdT 832

t

78 UCUGAGGCUGGCCCUACGGdTdT 833

c

96 CCGUAGGGCCAGCCUCAGAdTdT 834

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.2, SEC ID N.° 1.329)

Hebra

Posición Secuencia con saliente 3'desoxitimidina (5' a 3') SEC ID N.°

t

87 GGCCCUACGGGCACCGGUGdTdT 835

c

105 CACCGGUGCCCGUAGGGCCdTdT 836

t

95 GGGCACCGGUGAAUCCAAGdTdT 837

c

113 CUUGGAUUCACCGGUGCCCdTdT 838

t

167 CCAUGCAUGUGUUCAGAAAdTdT 839

c

185 UUUCUGAACACAUGCAUGGdTdT 840

Tabla 4. Secuencias de hebra transcrita y complementaria químicamente modificadas de ARNds de TTR humano.

Véase la Tabla 2 para dúplex #. Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en la transcripción (NM_000371.2, SEC ID N.° 1.329).

Hebra

Oligo # Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.°

t

A-32153 100 ccGGuGAAuccAAGuGuccdTdT 841

c

A-32154 118 GGAcACUUGGAUUcACCGGdTdT 842

t

A-32155 11 AcucAuucuuGGcAGGAuGdTdT 843

c

A-32156 29 cAUCCUGCcAAGAAUGAGUdTdT 844

t

A-32157 111 AAGuGuccucuGAuGGucAdTdT 845

c

A-32158 129 UGACcAUcAGAGGAcACUUdTdT 846

t

A-32163 13 ucAuucuuGGcAGGAuGGcdTdT 847

c

A-32164 31 GCcAUCCUGCcAAGAAUGAdTdT 848

t

A-32165 130 AAGuucuAGAuGcuGuccGdTdT 849

c

A-32166 148 CGGAcAGcAUCuAGAACUUdTdT 850

t

A-32167 132 GuucuAGAuGcuGuccGAGdTdT 851

c

A-32168 150 CUCGGAcAGcAUCuAGAACdTdT 852

t

A-32169 135 cuAGAuGcuGuccGAGGcAdTdT 853

c

A-32170 153 UGCCUCGGAcAGcAUCuAGdTdT 854

t

A-32171 138 GAuGcuGuccGAGGcAGucdTdT 855

Hebra

Oligo # Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.°

c

A-32172 156 GACUGCCUCGGAcAGcAUCdTdT 856

t

A-32175 14 cAuucuuGGcAGGAuGGcudTdT 857

c

A-32176 32 AGCcAUCCUGCcAAGAAUGdTdT 858

t

A-32177 140 uGcuGuccGAGGcAGuccudTdT 859

c

A-32178 158 AGGACUGCCUCGGAcAGcAdTdT 860

t

A-32179 146 ccGAGGcAGuccuGccAucdTdT 861

c

A-32180 164 GAUGGcAGGACUGCCUCGGdTdT 862

t

A-32181 152 cAGuccuGccAucAAuGuGdTdT 863

c

A-32182 170 cAcAUUGAUGGcAGGACUGdTdT 864

t

A-32183 164 cAAuGuGGccGuGcAuGuGdTdT 865

c

A-32184 182 cAcAUGcACGGCcAcAUUGdTdT 866

t

A-32187 178 AuGuGuucAGAAAGGcuGcdTdT 867

c

A-32188 196 GcAGCCUUUCUGAAcAcAUdTdT 868

t

A-32189 2 cAGAAGuccAcucAuucuudTdT 869

c

A-32190 20 AAGAAUGAGUGGACUUCUGdTdT 870

t

A-32191 21 GGcAGGAuGGcuucucAucdTdT 871

c

A-32192 39 GAUGAGAAGCcAUCCUGCCdTdT 872

t

A-32193 210 GAGccAuuuGccucuGGGAdTdT 873

c

A-32194 228 UCCcAGAGGcAAAUGGCUCdTdT 874

t

A-32195 23 cAGGAuGGcuucucAucGudTdT 875

c

A-32196 41 ACGAUGAGAAGCCAUCCUGdTdT 876

t

A-32199 24 AGGAuGGcuucucAucGucdTdT 877

c

A-32200 42 GACGAUGAGAAGCcAUCCUdTdT 878

t

A-32201 245 AGAGcuGcAuGGGcucAcAdTdT 879

c

A-32202 263 UGUGAGCCcAUGcAGCUCUdTdT 880

t

A-32203 248 GcuGcAuGGGcucAcAAcudTdT 881

c

A-32204 266 AGUUGUGAGCCcAUGcAGCdTdT 882

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o N ai 03S

(.8 B .S) epuanoas UpjOjSOd # oBmo BjqaH

Hebra

Oligo # Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.°

c

A-32234 322 cAGuAAGAUUUGGUGUCuAdTdT 910

t

A-32235 305 AGAcAccAAAucuuAcuGGdTdT 911

c

A-32236 323 CcAGuAAGAUUUGGUGUCUdTdT 912

t

A-32237 317 uuAcuGGAAGGcAcuuGGcdTdT 913

c

A-32238 335 GCcAAGUGCCUUCcAGuAAdTdT 914

t

A-32239 32 uucucAucGucuGcuccucdTdT 915

c

A-32240 50 GAGGAGcAGACGAUGAGAAdTdT 916

t

A-32241 322 GGAAGGcAcuuGGcAucucdTdT 917

c

A-32242 340 GAGAUGCcAAGUGCCUUCCdTdT 918

t

A-32243 326 GGcAcuuGGcAucuccccAdTdT 919

c

A-32244 344 UGGGGAGAUGCcAAGUGCCdTdT 920

t

A-32247 333 GGcAucuccccAuuccAuGdTdT 921

c

A-32248 351 cAUGGAAUGGGGAGAUGCCdTdT 922

t

A-32249 334 GcAucuccccAuuccAuGAdTdT 923

c

A-32250 352 UcAUGGAAUGGGGAGAUGCdTdT 924

t

A-32251 335 cAucuccccAuuccAuGAGdTdT 925

c

A-32252 353 CUcAUGGAAUGGGGAGAUGdTdT 926

t

A-32253 336 AucuccccAuuccAuGAGcdTdT 927

c

A-32254 354 GCUcAUGGAAUGGGGAGAUdTdT 928

t

A-32255 338 cuccccAuuccAuGAGcAudTdT 929

c

A-32256 356 AUGCUcAUGGAAUGGGGAGdTdT 930

t

A-32259 341 cccAuuccAuGAGcAuGcAdTdT 931

c

A-32260 359 UGcAUGCUcAUGGAAUGGGdTdT 932

t

A-32261 347 ccAuGAGcAuGcAGAGGuGdTdT 933

c

A-32262 365 cACCUCUGcAUGCUcAUGGdTdT 934

t

A-32263 352 AGcAuGcAGAGGuGGuAuudTdT 935

c

A-32264 370 AAuACcACCUCUGcAUGCUdTdT 936

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o N ai 03S

(.£ B .S) epuanoas UpjOjSOd # oBmo BjqaH

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o N ai 03S

(.8 B .S) epuanoas UpjOjSOd # oBmo BjqaH

u

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o N ai 03S

(.8 B .S) epuanoas UpjOjSOd # oBmo BjqaH

Hebra

Oligo # Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.°

c

A-32354 569 AGcAuAUGAGGUGAAAAcAdTdT 1.018

t

A-32355 552 GuuuucAccucAuAuGcuAdTdT 1.019

c

A-32356 570 uAGcAuAUGAGGUGAAAACdTdT 1.020

t

A-32357 553 uuuucAccucAuAuGcuAudTdT 1.021

c

A-32358 571 AuAGcAuAUGAGGUGAAAAdTdT 1.022

t

A-32359 555 uucAccucAuAuGcuAuGudTdT 1.023

c

A-32360 573 AcAuAGcAuAUGAGGUGAAdTdT 1.024

t

A-32363 557 cAccucAuAuGcuAuGuuAdTdT 1.025

c

A-32364 575 uAAcAuAGcAuAUGAGGUGdTdT 1.026

t

A-32367 56 ccuuGcuGGAcuGGuAuuudTdT 1.027

c

A-32368 74 AAAuACcAGUCcAGcAAGGdTdT 1.028

t

A-32369 563 AuAuGcuAuGuuAGAAGucdTdT 1.029

c

A-32370 581 GACUUCuAAcAuAGcAuAUdTdT 1.030

t

A-32371 564 uAuGcuAuGuuAGAAGuccdTdT 1.031

c

A-32372 582 GGACUUCuAAcAuAGcAuAdTdT 1.032

t

A-32373 566 uGcuAuGuuAGAAGuccAGdTdT 1.033

c

A-32374 584 CUGGACUUCuAAcAuAGcAdTdT 1.034

t

A-32375 57 cuuGcuGGAcuGGuAuuuGdTdT 1.035

c

A-32376 75 cAAAuACcAGUCcAGcAAGdTdT 1.036

t

A-32379 578 AGuccAGGcAGAGAcAAuAdTdT 1.037

c

A-32380 596 uAUUGUCUCUGCCUGGACUdTdT 1.038

t

A-32381 580 uccAGGcAGAGAcAAuAAAdTdT 1.039

c

A-32382 598 UUuAUUGUCUCUGCCUGGAdTdT 1.040

t

A-32383 607 GuGAAAGGcAcuuuucAuudTdT 1.041

c

A-32384 625 AAUGAAAAGUGCCUUUcACdTdT 1.042

t

A-32385 62 uGGAcuGGuAuuuGuGucudTdT 1.043

c

A-32386 80 AGAcAcAAAuACcAGUCcAdTdT 1.044

ez

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o N ai 03S

(.8 B .S) epuanoas UpjOjSOd # oBmo BjqaH

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o N ai 03S

(.8 B .S) epuanoas UpjOjSOd # oBmo BjqaH

Hebra

Oligo # Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.°

t

A-32293 421 GccccuAcuccuAuuccAcdTdT 1.099

c

A-32294 439 GUGGAAuAGGAGuAGGGGCdTdT 1.100

t

A-32305 431 cuAuuccAccAcGGcuGucdTdT 1.101

c

A-32306 449 GAcAGCCGUGGUGGAAuAGdTdT 1.102

t

A-32317 440 cAcGGcuGucGucAccAAudTdT 1.103

c

A-32318 458 AUUGGUGACGAcAGCCGUGdTdT 1.104

t

A-32329 496 AGGAcGAGGGAuGGGAuuudTdT 1.105

c

A-32330 514 AAAUCCcAUCCCUCGUCCUdTdT 1.106

t

A-32361 556 ucAccucAuAuGcuAuGuudTdT 1.107

c

A-32362 574 AAcAuAGcAuAUGAGGUGAdTdT 1.108

t

A-32365 559 ccucAuAuGcuAuGuuAGAdTdT 1.109

c

A-32366 577 UCuAAcAuAGcAuAUGAGGdTdT 1.110

t

A-32377 570 AuGuuAGAAGuccAGGcAGdTdT 1.111

c

A-32378 588 CUGCCUGGACUUCuAAcAUdTdT 1.112

t

A-32389 78 ucuGAGGcuGGcccuAcGGdTdT 1.113

c

A-32390 96 CCGuAGGGCcAGCCUcAGAdTdT 1.114

t

A-32401 87 GGcccuAcGGGcAccGGuGdTdT 1.115

c

A-32402 105 cACCGGUGCCCGuAGGGCCdTdT 1.116

t

A-32413 95 GGGcAccGGuGAAuccAAGdTdT 1.117

c

A-32414 113 CUUGGAUUcACCGGUGCCCdTdT 1.118

t

A-32425 167 ccAuGcAuGuGuucAGAAAdTdT 1.119

c

A-32426 185 UUUCUGAAcAcAUGcAUGGdTdT 1.120

Tabla 5: Números de identificación para los ARNds de TTR de rata

Véase la Tabla 7 para las secuencias.

Dúplex #

Oligo Transcrito# Oligo Complementario#

AD-18529

A-32745 A-32746

Véase la Tabla 7 para las secuencias.

Dúplex #

Oligo Transcrito# Oligo Complementario#

AD-18530

A-32747 A-32748

AD-18531

A-32749 A-32750

AD-18532

A-32751 A-32752

AD-18533

A-32753 A-32754

AD-18534

A-32755 A-32756

AD-18535

A-32757 A-32758

AD-18536

A-32759 A-32760

AD-18537

A-32761 A-32762

AD-18538

A-32763 A-32764

AD-18539

A-32159 A-32160

AD-18540

A-32765 A-32766

AD-18541

A-32767 A-32768

AD-18542

A-32769 A-32770

AD-18543

A-32771 A-32772

AD-18544

A-32773 A-32774

AD-18545

A-32775 A-32776

AD-18546

A-32777 A-32778

AD-18547

A-32779 A-32780

AD-18548

A-32781 A-32782

AD-18549

A-32783 A-32784

AD-18550

A-32785 A-32786

AD-18551

A-32787 A-32788

AD-18552

A-32791 A-32792

AD-18553

A-32793 A-32794

AD-18554

A-32795 A-32796

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en la transcripción (NM 012681.1, SEC ID N.° 1.330).

Hebra

Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.° Secuencia con 3' dinucleotide overhang (5' a 3') SEC ID N.°

t

115 GUCCUCUGAUGGUCAAAGU 1.121 GUCCUCUGAUGGUCAAAGUNN 1.173

c

133 ACUUUGACCAUCAGAGGAC 1.122 ACUUUGACCAUCAGAGGACNN 1.174

t

537 UUCUUGCUCUAUAAACCGU 1.123 UUCUUGCUCUAUAAACCGUNN 1.175

c

555 ACGGUUUAUAGAGCAAGAA 1.124 ACGGUUUAUAGAGCAAGAANN 1.176

t

543 CUCUAUAAACCGUGUUAGC 1.125 CUCUAUAAACCGUGUUAGCNN 1.177

c

561 GCUAACACGGUUUAUAGAG 1.126 GCUAACACGGUUUAUAGAGNN 1.178

t

392 UCGCCACUACACCAUCGCA 1.127 UCGCCACUACACCAUCGCANN 1.179

c

410 UGCGAUGGUGUAGUGGCGA 1.128 UGCGAUGGUGUAGUGGCGANN 1.180

t

538 UCUUGCUCUAUAAACCGUG 1.129 UCUUGCUCUAUAAACCGUGNN 1.181

c

556 CACGGUUUAUAGAGCAAGA 1.130 CACGGUUUAUAGAGCAAGANN 1.182

t

541 UGCUCUAUAAACCGUGUUA 1.131 UGCUCUAUAAACCGUGUUANN 1.183

c

559 UAACACGGUUUAUAGAGCA 1.132 UAACACGGUUUAUAGAGCANN 1.184

t

532 CAGUGUUCUUGCUCUAUAA 1.133 CAGUGUUCUUGCUCUAUAANN 1.185

c

550 UUAUAGAGCAAGAACACUG 1.134 UUAUAGAGCAAGAACACUGNN 1.186

t

542 GCUCUAUAAACCGUGUUAG 1.135 GCUCUAUAAACCGUGUUAGNN 1.187

c

560 CUAACACGGUUUAUAGAGC 1.136 CUAACACGGUUUAUAGAGCNN 1.188

t

134 CCUGGAUGCUGUCCGAGGC 1.137 CCUGGAUGCUGUCCGAGGCNN 1.189

c

152 GCCUCGGACAGCAUCCAGG 1.138 GCCUCGGACAGCAUCCAGGNN 1.190

t

119 UCUGAUGGUCAAAGUCCUG 1.139 UCUGAUGGUCAAAGUCCUGNN 1.191

c

137 CAGGACUUUGACCAUCAGA 1.140 CAGGACUUUGACCAUCAGANN 1.192

t

241 CUGGAGAGCUGCACGGGCU 1.141 CUGGAGAGCUGCACGGGCUNN 1.193

c

259 AGCCCGUGCAGCUCUCCAG 1.142 AGCCCGUGCAGCUCUCCAGNN 1.194

t

544 UCUAUAAACCGUGUUAGCA 1.143 UCUAUAAACCGUGUUAGCANN 1.195

c

562 UGCUAACACGGUUUAUAGA 1.144 UGCUAACACGGUUUAUAGANN 1.196

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en la transcripción (NM 012681.1, SEC ID N.° 1.330).

Hebra

Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.° Secuencia con 3' dinucleotide overhang (5' a 3') SEC ID N.°

t

530 AACAGUGUUCUUGCUCUAU 1.145 AACAGUGUUCUUGCUCUAUNN 1.197

c

548 AUAGAGCAAGAACACUGUU 1.146 AUAGAGCAAGAACACUGUUNN 1.198

t

118 CUCUGAUGGUCAAAGUCCU 1.147 CUCUGAUGGUCAAAGUCCUNN 1.199

c

136 AGGACUUUGACCAUCAGAG 1.148 AGGACUUUGACCAUCAGAGNN 1.200

t

140 UGCUGUCCGAGGCAGCCCU 1.149 UGCUGUCCGAGGCAGCCCUNN 1.201

c

158 AGGGCUGCCUCGGACAGCA 1.150 AGGGCUGCCUCGGACAGCANN 1.202

t

239 GUCUGGAGAGCUGCACGGG 1.151 GUCUGGAGAGCUGCACGGGNN 1.203

c

257 CCCGUGCAGCUCUCCAGAC 1.152 CCCGUGCAGCUCUCCAGCNN 1.204

t

531 ACAGUGUUCUUGCUCUAUA 1.153 ACAGUGUUCUUGCUCUAUANN 1.205

c

549 UAUAGAGCAAGAACACUGU 1.154 UAUAGAGCAAGAACACUGUNN 1.206

t

117 CCUCUGAUGGUCAAAGUCC 1.155 CCUCUGAUGGUCAAAGUCCNN 1.207

c

135 GGACUUUGACCAUCAGAGG 1.156 GGACUUUGACCAUCAGAGGNN 1.208

t

131 AGUCCUGGAUGCUGUCCGA 1.157 AGUCCUGGAUGCUGUCCGANN 1.209

c

149 UCGGACAGCAUCCAGGACU 1.158 UCGGACAGCAUCCAGGACUNN 1.210

t

217 UUGCCUCUGGGAAGACCGC 1.159 UUGCCUCUGGGAAGACCGCNN 1.211

c

235 GCGGUCUUCCCAGAGGCAA 1.160 GCGGUCUUCCCAGAGGCAANN 1.212

t

242 UGGAGAGCUGCACGGGCUC 1.161 UGGAGAGCUGCACGGGCUCNN 1.213

c

260 GAGCCCGUGCAGCUCUCCA 1.162 GAGCCCGUGCAGC UCUCCANN 1.214

t

244 GAGAGCUGCACGGGCUCAC 1.163 GAGAGCUGCACGGGCUCACNN 1.215

c

262 GUGAGCCCGUGCAGCUCUC 1.164 GUGAGCCCGUGCAGCUCUCNN 1.216

t

246 GAGCUGCACGGGCUCACCA 1.165 GAGCUGCACGGGCUCACCANN 1.217

c

264 UGGUGAGCCCGUGCAGCUC 1.166 UGGUGAGCCCGUGCAGCUCNN 1.218

t

399 UACACCAUCGCAGCCCUGC 1.167 UACACCAUCGCAGCCCUGNN 1.219

c

417 GCAGGGCUGCGAUGGUGUA 1.168 GCAGGGCUGCGAUGGUGUANN 1.220

t

132 GUCCUGGAUGCUGUCCGAG 1.169 GUCCUGGAUGCUGUCCGAGNN 1.221

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en la transcripción (NM 012681.1, SEC ID N.° 1.330).

Hebra

Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.° Secuencia con 3' dinucleotide overhang (5' a 3') SEC ID N.°

c

150 CUCGGACAGCAUCCAGGAC 1.170 CUCGGACAGCAUCCAGGACNN 1.222

t

245 AGAGCUGCACGGGCUCACC 1.171 AGAGCUGCACGGGCUCACCNN 1.223

c

263 GGUGAGCCCGUGCAGCUCU 1.172 GGUGAGCCCGUGCAGCUCUNN 1.224

Tabla 6B. Secuencias de hebra transcrita y complementaria para los ARNds de TTR de rata

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 012681.1, SEC ID N.° 1.330)

Hebra

Posición Secuencia con saliente 3'desoxitimidina (5' a 3') SEC ID N.°

t

115 GUCCUCUGAUGGUCAAAGUdTdT 1.225

c

133 ACUUUGACCAUCAGAGGACdTdT 1.226

t

537 UUCUUGCUCUAUAAACCGUdTdT 1.227

c

555 ACGGUUUAUAGAGCAAGAAdTdT 1.228

t

543 CUCUAUAAACCGUGUUAGCdTdT 1.229

c

561 GCUAACACGGUUUAUAGAGdTdT 1.230

t

392 UCGCCACUACACCAUCGCAdTdT 1.231

c

410 UGCGAUGGUGUAGUGGCGAdTdT 1.232

t

538 UCUUGCUCUAUAAACCGUGdTdT 1.233

c

556 CACGGUUUAUAGAGCAAGAdTdT 1.234

t

541 UGCUCUAUAAACCGUGUUAdTdT 1.235

c

559 UAACACGGUUUAUAGAGCAdTdT 1.236

t

532 CAGUGUUCUUGCUCUAUAAdTdT 1.237

c

550 UUAUAGAGCAAGAACACUGdTdT 1.238

t

542 GCUCUAUAAACCGUGUUAGdTdT 1.239

c

560 CUAACACGGUUUAUAGAGCdTdT 1.240

t

134 CCUGGAUGCUGUCCGAGGCdTdT 1.241

c

152 GCCUCGGACAGCAUCCAGGdTdT 1.242

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 012681.1, SEC ID N.° 1.330)

Hebra

Posición Secuencia con saliente 3'desoxitimidina (5' a 3') SEC ID N.°

t

119 UCUGAUGGUCAAAGUCCUGdTdT 1.243

c

137 CAGGACUUUGACCAUCAGAdTdT 1.244

t

241 CUGGAGAGCUGCACGGGCUdTdT 1.245

c

259 AGCCCGUGCAGCUCUCCAGdTdT 1.246

t

544 UCUAUAAACCGUGUUAGCAdTdT 1.247

c

562 UGCUAACACGGUUUAUAGAdTdT 1.248

t

530 AACAGUGUUCUUGCUCUAUdTdT 1.249

c

548 AUAGAGCAAGAACACUGUUdTdT 1.250

t

118 CUCUGAUGGUCAAAGUCCUdTdT 1.251

c

136 AGGACUUUGACCAUCAGAGdTdT 1.252

t

140 UGCUGUCCGAGGCAGCCCUdTdT 1.253

c

158 AGGGCUGCCUCGGACAGCAdTdT 1.254

t

239 GUCUGGAGAGCUGCACGGGdTdT 1.255

c

257 CCCGUGCAGCUCUCCAGACdTdT 1.256

t

531 ACAGUGUUCUUGCUCUAUAdTdT 1.257

c

549 UAUAGAGCAAGAACACUGUdTdT 1.258

t

117 CCUCUGAUGGUCAAAGUCCdTdT 1.259

c

135 GGACUUUGACCAUCAGAGGdTdT 1.260

t

131 AGUCCUGGAUGCUGUCCGAdTdT 1.261

c

149 UCGGACAGCAUCCAGGACUdTdT 1.262

t

217 UUGCCUCUGGGAAGACCGCdTdT 1.263

c

235 GCGGUCUUCCCAGAGGCAAdTdT 1.264

t

242 UGGAGAGCUGCACGGGCUCdTdT 1.265

c

260 GAGCCCGUGCAGCUCUCCAdTdT 1.266

t

244 GAGAGCUGCACGGGCUCACdTdT 1.267

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 012681.1, SEC ID N.° 1.330)

Hebra

Posición Secuencia con saliente 3'desoxitimidina (5' a 3') SEC ID N.°

c

262 GUGAGCCCGUGCAGCUCUCdTdT 1.268

t

246 GAGCUGCACGGGCUCACCAdTdT 1.269

c

264 UGGUGAGCCCGUGCAGCUCdTdT 1.270

t

399 UACACCAUCGCAGCCCUGCdTdT 1.271

c

417 GCAGGGCUGCGAUGGUGUAdTdT 1.272

t

132 GUCCUGGAUGCUGUCCGAGdTdT 1.273

c

150 CUCGGACAGCAUCCAGGACdTdT 1.274

t

245 AGAGCUGCACGGGCUCACCdTdT 1.275

c

263 GGUGAGCCCGUGCAGCUCUdTdT 1.276

Tabla 7. Secuencias de hebra transcrita y complementaria químicamente modificadas para los ARNds de TTR de rata.

Véase la Tabla 5 para dúplex # (nombre ARNds). Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de 5 base 5' en transcripción (NM_012681.1, SEC ID N.° 1.330)

Hebra

Oligo # Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.°

t

A-32159 115 GuccucuGAuGGucAAAGudTdT 1.277

c

A-32160 133 ACUUUGACcAUcAGAGGACdTdT 1.278

t

A-32745 537 uucuuGcucuAuAAAccGudTdT 1.279

c

A-32746 555 ACGGUUuAuAGAGcAAGAAdTdT 1.280

t

A-32747 543 cucuAuAAAccGuGuuAGcdTdT 1.281

c

A-32748 561 GCuAAcACGGUUuAuAGAGdTdT 1.282

t

A-32749 392 ucGccAcuAcAccAucGcAdTdT 1.283

c

A-32750 410 UGCGAUGGUGuAGUGGCGAdTdT 1.284

t

A-32751 538 ucuuGcucuAuAAAccGuGdTdT 1.285

c

A-32752 556 cACGGUUuAuAGAGcAAGAdTdT 1.286

t

A-32753 541 uGcucuAuAAAccGuGuuAdTdT 1.287

c

A-32754 559 uAAcACGGUUuAuAGAGcAdTdT 1.288

9ue' u

lPlpo930VOWOOOnonoo9nn LiZ i-szze-v 1

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909 1

ipipvoovovooonooonoooov 991 ZLLZ9-M 0

909 1

ipipnooogvoggvooongnogn OH \.LLZ9-M

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909 1

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109 1

IPXPnvnonognnonngngvow oes L9LZ9-M

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IPIPVaOVnngngoovwnvnon VV9 99LZ9-M

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ipipovoononoovoonooooov 69Z V9 LZ9-M 0

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IPIpnogggovoonogvoVOOno IVZ 99LZ9-M

96Z'l

ipipvovon voovon n n ovoovo L£i Z9LZ9-M 0

96ZI

IPIPOnoongvwanggnvonon 6U Í9LZ9-M

V6Z'l

ipipoovoonvoovovooonooo Z91 09LZ9-M 0

96ZI

lPlP0OOVO°on9no9nvoonoo V£l 69LZ9-M

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16Z'1

IPIPOVnngngoovwnvnonog Z\?9 L9LZ9-M

06ZI

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69ZI

IPIPWnvnonognnonngngvo Z£9 99LZ9-M

o N ai 03S

(.£ B .S) epuanoas UpjOjSOd # oBmo BjqaH

5

10

15

20

25

Hebra

Oligo # Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID N.°

c

A-32782 235 GCGGUCUUCCcAGAGGcAAdTdT 1.316

t

A-32783 242 uGGAGAGcuGcAcGGGcucdTdT 1.317

c

A-32784 260 GAGCCCGUGcAGCUCUCcAdTdT 1.318

t

A-32785 244 GAGAGcuGcAcGGGcucAcdTdT 1.319

c

A-32786 262 GUGAGCCCGUGcAGCUCUCdTdT 1.320

t

A-32787 246 GAGcuGcAcGGGcucAccAdTdT 1.321

c

A-32788 264 UGGUGAGCCCGUGcAGCUCdTdT 1.322

t

A-32791 399 uAcAccAucGcAGcccuGcdTdT 1.323

c

A-32792 417 GcAGGGCUGCGAUGGUGuAdTdT 1.324

t

A-32793 132 GuccuGGAuGcuGuccGAGdTdT 1.325

c

A-32794 150 CUCGGAcAGcAUCcAGGACdTdT 1.326

t

A-32795 245 AGAGcuGcAcGGGcucAccdTdT 1.327

c

A-32796 263 GGUGAGCCCGUGcAGCUCUdTdT 1.328

Sintesis de secuencias de TTR.

Se sintetizaron secuencias de TTR en un sintetizador MerMade 192 en escala de 1 |jmol. Para todas las secuencias en la lista, se aplicó la química 'endolight' como se detalla continuación.

• Todas las pirimidinas (citosina y uridina) en la hebra transcrita fueron reemplazadas con correspondientes 2'-O-Metil-bases (2' O-Metil C y 2'-O-Metil U).

• En la hebra complementaria, las pirimidinas adyacentes a (hacia la posición 5') ribo A nucleósido fueron reemplazadas con sus correspondientes 2-O-Metil-nucleósidos.

• Se introdujo una extensión dTdT de dos bases en el extremo 3' de ambas secuencias transcrita y complementaria.

• La fila de la secuencia se convirtió en una fila de texto para hacerla compatible para carga en el programa informático de síntesis MerMade 192.

La síntesis de secuencias TTR usó síntesis de oligonucleótidos soportados en sólido usando la química de la fosforamidita. La síntesis de las secuencias anteriores se realizó en escala 1 um en placas de 96 pozos. Las disoluciones de amidita se prepararon a concentración 0,1 M y se usó etiltiotetrazol (0,6 M en acetonitrilo) como activador.

Las secuencias sintetizadas se escindieron y se desprotegieron en placas de 96 pozos, usando metilamina en la primera etapa y trietilamina. 3HF en la segunda etapa. Las secuencias brutas así obtenida se precipitaron usando mezcla de acetona: etanol y el botón se volvió a suspender en tampón de acetato de sodio 0,5 M. Se analizaron las muestras de cada secuencia por LC-MS y los datos de masa resultantes confirmaron la identidad de las secuencias. También se analizó una serie seleccionada de muestras por cromatografía IEX.

La siguiente etapa en el procedimiento fue la purificación. Todas las secuencias se purificaron en un sistema de purificación AKTA explorer usando una columna Source 15Q. Se recogió un único pico correspondiente a la secuencia de longitud completa en el eluyente y se analizó con posterioridad la pureza por cromatografía de intercambio iónico.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Se desalaron las secuencias purificadas en una columna Sephadex G25 usando purificador AKTA. Se analizó la concentración y la pureza en las secuencias de TTR desaladas. Después se hibridaron las hebras solas para formar ARNds-TTR.

Ejemplo 2B: Identificación sistemática in vitro de los ARNsi de TTR para supresión de ARNm.

Se ensayó en los ARNds que fijan como objetivo TTR humano (Tabla 2) la inhibición de expresión de TTR endógena en células HepG2 y Hep3B, usando ensayos de qPCR (PCR en tiempo real) y ADNb (ADN ramificado) para cuantificar ARNm de TTR. Se sintetizó ARNds que fija como objetivo TTR de roedores (Tabla 5) y se ensayó la inhibición de expresión de TTR endógena usando ensayos de ADNb en células H.4.II.E. Se usaron los resultados de los ensayos de dosis única para seleccionar una subserie de dúplex de ARNds de TTR para experimentos de respuesta a la dosis para calcular los IC50. Se usaron los resultados de IC50 para seleccionar los ARNds de TTR para ensayo adicional.

Cultivo celular y transinfecciones:

Se cultivaron células de estirpes celulares de hepatocitos HepG2, Hep3B y H.4.II.E (ATCC, Manassas, VA) a cerca de confluencia a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5 % en medio Eagle modificado de Dulbecco (ATCC) enriquecido con FBS al 10 %, estreptomicina y glutamina (ATCC) antes de liberarse de la placa por tripsinización. También se cultivaron células H.4.II.E en medio esencial mínimo de Earle. Se llevó a cabo transinfección inversa por adición de 5 |jl de Opti-MEM a 5 jl de dúplex de ARNsi por pozo en una placa de 96 pozos junto con 10 jl de Opti-MEM más 0,2 |jl de Lipofectamine RNAiMax por pozo (Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150) y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después se añadieron 80 jl de medio de crecimiento completo con antibióticos que contenían 4x104 células (HepG2), 2x104 (Hep3B) o 2x104 (H.4.II.E). Se incubaron las células durante 24 horas previamente a purification de ARN. Se realizaron experimentos de dosis única a concentración de dúplex final 10 nM y se realizaron experimentos de respuesta a la dosis con 10; 1; 0,5; 0,1; 0,05; 0,01; 0,005; 0,001; 0,0005; 0,0001; 0,00005; 0,00001 nM.

Aislamiento de ARN total usando Estuche de Aislamiento de ARN Total MagMAX-96 (Applied Biosystems, Foster City CA, parte#: AM 1.830):

Se recogieron células y se lisaron en 140 jl de disolución de Lisis/Unión después se mezclaron durante 1 minuto a 89 rad/s (850 rpm) usando un Eppendorf Thermomixer (la velocidad de mezclamiento fue la misma durante todo el procedimiento). Se añadieron veinte microlitros de perlas magnéticas al lisado de células y se mezcló durante 5 minutos. Se capturaron perlas magnéticas usando soporte magnético y se eliminó el sobrenadante sin alterar a las perlas. Después de eliminar el sobrenadante, se lavaron las perlas magnéticas con Disolución de Lavado 1 (isopropanol añadido) y se mezcló durante 1 minuto. Se capturaron las perlas de nuevo y se eliminó el sobrenadante. Después se lavaron las perlas con 150 jl de Disolución de Lavado 2 (Etanol añadido), se capturó y eliminó el sobrenadante. Después se añadieron 50 jl de mezcla de DNasa (tampón de DNasa MagMax turbo y DNasa Turbo) a las perlas y se mezclaron durante 10 a 15 minutos. Después de mezclamiento, se añadieron 100 jl de Disolución de Unión de Nuevo de ARN y se mezclaron durante 3 minutos. Se retiró el sobrenadante y se lavaron las perlas magnéticas de nuevo con 150 jl de Disolución de Lavado 2 y se mezclaron durante 1 minuto y se eliminó completamente el sobrenadante. Se mezclaron las perlas magnéticas durante 2 minutos a sequedad antes de que se eluyera ARN con 50 jl de agua.

Síntesis de ADNc usando estuche de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad AB1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813):

Se añadió una mezcla patrón de 2 jl de Tampón x10, 0,8 jl de dNTP x25, 2 jl de cebadores Aleatorios, 1 jl de Transcriptasa Inversa, 1 jl de inhibidor de RNasa y 3,2 jl de H2O por reacción a 10 jl de ARN total. Se generó ADNc usando un termociclador Bio-Rad C-1000 o S-1000 (Hercules, CA) por las siguientes etapas: 25°C 10 min, 37°C 120 min, 85°C 5 s, mantenido a 4°C.

PCR de tiempo real:

Se añadieron 2 jl de ADNc a un mezclador maestro de 1jl de Sonda 18S TaqMan (Applied Biosystems Cat # 4319413E), 1 jl de sonda TaqMan de TTR (Applied Biosystems cat # HS00174914 M1) y 10 jl de Mezcla Maestra de PCR TaqMan Universal (Applied Biosystems Cat #4324018) por pozo en una placa de 96 pozos MicroAmp Optical (Applied Biosystems cat # 4326659). Se realizó PCR en tiempo real en un sistema de PCR en tiempo real ABI 7000 Prism o uno ABI 7900HT (Applied Biosystems) usando el ensayo AA Ct(RQ). Todas las reacciones se realizaron por triplicado.

Se analizaron los datos en tiempo real usando el método AA Ct y se normalizaron a ensayos realizados a partir de células transinfectadas con Oligo fluorescente BlockIT 10 nM (Invitrogen Cat # 2013) o aD-1955 10 nM (un dúplex de control que fija como objetivo el gen de luciferasa no de mamífero) para calcular el cambio de plegamiento.

Ensayos de ADN ramificado-QuantiGene 1.0 (Panomics, Fremont, CA. cat #: QG0004)-Usado para identificar sistemáticamente duplex específicos de roedores.

5

10

15

20

25

30

35

40

Se transinfectaron células H.4.II.E (ATCC) con ARNsi 10 nM. Después de eliminar el medio, se lisaron H.4.II.E en 100 ul de mezcla de Lisis Diluida (una mezcla de 1 volumen de mezcla de Lisis, 2 volúmenes de agua exenta de nucleasa y 10 ul de Proteinasa-K por ml para la concentración final de 20 mg/ml) después se incubaron a 65°C durante 35 minutos. Después, se añadieron 80 pl Conjunto de Sondas de Trabajo (una mezcla de sonda de TTR o GAPDH) y se añadieron 20 ul de lisado de células a la Placa de Captura. Se incubaron las Placas de Captura a 53°C ±1°C durante la noche (aproximadamente 16-20 h). Se lavaron las Placas de Captura 3 veces con Tampón de Lavado x1 (una mezcla de agua exenta de nucleasa, Componente de Tampón 1 y Componente de Tampón de Lavado 2), se secó después por centrifugación durante 1 minuto a 105 rad/s (1.000 rpm). Se añadieron 100 pl de Reactivo de Trabajo Multiplicador a la Placa de Captura, que se selló después y se incubó durante 1 h a 46°C ±1°C. Se repitieron las etapas de lavado y secado durante 1 hora de incubación y se añadieron 100 pl de reactivo de disolución de Etiquetado. Se lavó después la placa, se secó y se añadieron 100 pl de sustrato (una mezcla de laurilsulfato de litio y disolución de Sustrato). Se pusieron las Placas de Captura en la incubadora durante 30 minutos a 46°C ±1°C. Se retiraron después las Placas de Captura de la incubadora y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Finalmente, se leyeron las Placas de Captura usando el Luminómetro Victor (Perkin Elmer, Waltham, MA).

Ensayos de ADN ramificado-QuantiGene 2.0 (Panomics cat #: QS0011): Usado para identificar sistemáticamente todos los demás duplex.

Después de una incubación de 24 horas a la dosis o las dosis establecidas, se retiraron los medios y se lisaron las células en 100 ul de Mezcla de Lisis (1 volumen de mezcla de lisis, 2 volúmenes de agua exenta de nucleasa y 10 pl de Proteinasa-K/ml para una concentración final de 20 mg/ml) se incubaron después a 65°C durante 35 minutos. Después se añadieron 20 pl de Conjunto de Sondas de Trabajo (sonda de TTR para fijar como objetivo genes y GAPDH para control endógeno) y se añadieron después 80 pl de lisado de células a las Placas de Captura. Las Placas de Captura se incubaron a 55°C ±1°C (aprox. 16-20 h). Al día siguiente, se lavaron las Placas de Captura 3 veces con Tampón de Lavado x1 (agua exenta de nucleasa, Componente de Tampón 1 y Componente de Tampón de Lavado 2), después se secó por centrifugación durante 1 minuto a 240 g. Se añadieron 100 pl de Reactivo de Trabajo pre-Multiplicador a las Placas de Captura, que se sellaron con hoja de aluminio y se incubaron durante 1 hora a 55°C ±1°C. Después de una incubación de 1 hora, se repitió la etapa de lavado, después se añadieron 100 pl de Reactivo de Trabajo Multiplicador. Después de 1 hora, se repitieron las etapas de lavado y secado y se añadieron 100 pl de sonda de Etiquetado. Se incubaron las placas de captura 50°C ±1°C durante 1 hora. Después se lavaron las placas con Tampón de lavado x1 y se secaron y después se añadieron 100 pl de Sustrato a las Placas de Captura. Se leyeron las Placas de Captura usando el Luminómetro SpectraMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) después de 5 a 15 minutos de incubación.

Análisis de datos de ADNb:

Se analizaron los datos de ADNb por (i) sustracción del fondo medio de cada muestra por triplicado, (ii) promedio de los valores de GAPDH (sonda de control) y TTR (sonda experimental) por triplicado resultantes y después (iii) tomando la relación: (sonda experimental-fondo)/(sonda de control-fondo).

Resultados

Se presenta un resumen de los resultados de la dosis única e IC50 para ARNds - TTR (ARNsi de la TTR) a continuación en la Tabla 8. Los resultados de la dosis única se expresan como % de ARNm de la TTR respecto al control, ensayado en células HepG2. Se determinaron los IC50 en células HepG2 y/o Hep3B, como se indicó.

Tabla 8. Resultados de dosis única e IC50 de identificaciones sistemáticas in vitro de los ARNsi de la TTR.

ND: no datos; * indica resultados que representan promedio de dos experimentos.

Dosis Única a 10 nM % relativo a control IC50 (nM)

HepG2 HepG2 Hep3B

Dúplex #

qPCR ADNb qPCR ADNb qPCR ADNb

AD-18243

50,35 141,53 ND ND ND ND

AD-18244

64,26 158,55 ND ND ND ND

AD-18245

56,89 107,22 ND ND ND ND

Dosis Única a 10 nM % relativo a control IC50 (nM)

HepG2 HepG2 Hep3B

Dúplex #

qPCR ADNb qPCR ADNb qPCR ADNb

AD-18246

10,53 32,51 * 0,265 0,086 ND ND

AD-18247

125,56 69,57 ND ND ND ND

AD-18248

127,78 66,97 ND ND ND ND

AD-18249

48,77 48,76 ND ND ND ND

AD-18250

96,94 86,42 ND ND ND ND

AD-18251

170,41 129,15 ND ND ND ND

AD-18252

73,52 81,90 ND ND ND ND

AD-18253

25,25 61,25 ND ND ND ND

AD-18254

95,13 103,96 ND ND ND ND

AD-18255

119,46 ND ND ND ND ND

AD-18256

42,64 95,67 ND ND ND ND

AD-18257

146,25 141,75 ND ND ND ND

AD-18258

10,20 13,41* 0,007 0,005 0,004 0,005

AD-18259

9,30 20,91 * 0,102 0,005 ND ND

AD-18260

125,37 81,36 ND ND ND ND

AD-18261

14,27 19,40* 0,210 ND ND ND

AD-18262

84,95 104,05 ND ND ND ND

AD-18263

16,32 23,25* 0,110 ND ND ND

AD-18264

104,18 83,69 ND ND ND ND

AD-18265

41,62 64,87 ND ND ND ND

AD-18266

39,98 110,53 ND ND ND ND

AD-18267

149,64 ND ND ND ND ND

AD-18268

152,93 174,04 ND ND ND ND

Dosis Única a 10 nM % relativo a control IC50 (nM)

HepG2 HepG2 Hep3B

Dúplex #

qPCR ADNb qPCR ADNb qPCR ADNb

AD-18269

37,27 92,28 ND ND ND ND

AD-18270

99,44 164,75 ND ND ND ND

AD-18271

18,89 28,33* 0,503 0,004 ND ND

AD-18272

128,32 132,58 ND ND ND ND

AD-18273

115,78 201,95 ND ND ND ND

AD-18274

8,97 20,04* 0,009 0,176 0,036 0,012

AD-18275

4,09 22,25* 0,026 0,118 ND ND

AD-18276

19,73 45,22* 0,198 0,677 ND ND

AD-18277

10,55 26,31* 0,121 0,426 ND ND

AD-18278

108,86 116,26 ND ND ND ND

AD-18279

66,59 ND ND ND ND ND

AD-18280

103,26 170,52 ND ND ND ND

AD-18281

87,98 123,88 ND ND ND ND

AD-18282

82,47 140,32 ND ND ND ND

AD-18283

106,54 182,78 ND ND ND ND

AD-18284

106,93 151,78 ND ND ND ND

AD-18285

26,58 60,05* ND 0,089 ND ND

AD-18286

109,95 173,66 ND ND ND ND

AD-18287

54,23 155,45 ND ND ND ND

AD-18288

73,52 174,09 ND ND ND ND

AD-18289

103,36 174,76 ND ND ND ND

AD-18290

17,06 52,04* 1,253 0,181 ND ND

AD-18291

7,71 169,29* 1,304 0,019 ND ND

Dosis Única a 10 nM % relativo a control IC50 (nM)

HepG2 HepG2 Hep3B

Dúplex #

qPCR ADNb qPCR ADNb qPCR ADNb

AD-18292

7,51 210,03* 0,604 0,005 ND ND

AD-18293

3,61 62,53* 0,078 0,003 ND ND

AD-18294

111,53 107,56 ND ND ND ND

AD-18295

115,88 105,37 ND ND ND ND

AD-18296

57,03 38,03 ND ND ND ND

AD-18297

87,69 73,87 ND ND ND ND

AD-18298

10,39 7,25* 0,455 0,008 ND ND

AD-18299

18,79 18,06* 0,895 0,014 ND ND

AD-18300

108,70 ND ND ND ND ND

AD-18301

114,22 70,50 ND ND ND ND

AD-18302

116,19 122,40 ND ND ND ND

AD-18303

124,89 ND ND ND ND ND

AD-18304

132,99 89,54 ND ND ND ND

AD-18305

153,10 ND ND ND ND ND

AD-18306

159,22 ND ND ND ND ND

AD-18307

116,83 84,57 ND ND ND ND

AD-18308

156,72 87,80 ND ND ND ND

AD-18309

113,22 101,97 ND ND ND ND

AD-18310

132,33 ND ND ND ND ND

AD-18311

161,68 92,92 ND ND ND ND

AD-18312

103,01 71,17 ND ND ND ND

AD-18313

120,65 53,26 ND ND ND ND

AD-18314

116,33 ND ND ND ND ND

Dosis Única a 10 nM % relativo a control IC50 (nM)

HepG2 HepG2 Hep3B

Dúplex #

qPCR ADNb qPCR ADNb qPCR ADNb

AD-18315

115,13 ND ND ND ND ND

AD-18316

118,73 122,34 ND ND ND ND

AD-18317

114,03 121,10 ND ND ND ND

AD-18318

80,85 122,57 ND ND ND ND

AD-18319

119,14 148,87 ND ND ND ND

AD-18320

22,86 55,43* ND 0,023 0,403 ND

AD-18321

6,44 31,56* 0,001 0,033 ND ND

AD-18322

54,21 100,46 ND ND ND ND

AD-18323

6,37 28,71 * 0,005 0,023 ND ND

AD-18324

2,53 15,98* 0,002 0,006 0,005 0,014

AD-18325

2,52 11,96* 0,001 0,016 ND ND

AD-18326

18,34 43,16* 0,025 0,186 ND ND

AD-18327

18,28 13,90* 0,044 0,215 ND ND

AD-18328

4,53 26,04* 0,003 0,004 0,006 0,006

AD-18329

96,93 131,54 ND ND ND ND

AD-18330

11,80 45,18* 0,0004 0,010 0,020 ND

AD-18331

117,77 163,07 ND ND ND ND

AD-18332

11,53 35,09* 0,001 0,076 0,065 ND

AD-18333

12,24 46,94* 0,001 0,115 0,075 ND

AD-18334

16,27 55,28* 0,0004 0,181 1,071 ND

AD-18335

53,52 112,80 ND ND ND ND

AD-18336

6,39 33,00* 0,001 0,112 0,081 ND

AD-18337

51,77 105,33 ND ND ND ND

Dosis Única a 10 nM % relativo a control IC50 (nM)

HepG2 HepG2 Hep3B

Dúplex #

qPCR ADNb qPCR ADNb qPCR ADNb

AD-18338

48,21 102,86 ND ND ND ND

AD-18339

6,48 26,56* 0,004 0,002 0,018 0,029

AD-18340

4,53 30,76* 0,002 0,002 ND ND

AD-18341

31,27 100,41 ND ND ND ND

AD-18342

7,60 42,89* ND 0,016 0,076 ND

AD-18343

3,42 17,45* ND 0,001 ND ND

AD-18344

75,08 134,31 ND ND ND ND

AD-18345

13,62 42,75* 0,002 0,013 ND ND

AD-18346

59,25 121,10 ND ND ND ND

AD-18347

91,23 139,54 ND ND ND ND

AD-18348

89,95 159,29 ND ND ND ND

AD-18349

108,01 144,96 ND ND ND ND

AD-18350

123,65 125,87 ND ND ND ND

AD-18351

108,36 104,02 ND ND ND ND

AD-18352

87,82 128,72 ND ND ND ND

AD-18353

14,40 65,77 0,012 0,027 ND ND

AD-18354

99,27 123,53 ND ND ND ND

AD-18355

135,04 150,88 ND ND ND ND

AD-18356

100,76 178,96 ND ND ND ND

AD-18357

125,30 162,85 ND ND ND ND

AD-18358

103,15 136,01 ND ND ND ND

AD-18359

34,74 140,48 ND ND ND ND

AD-18360

103,86 146,86 ND ND ND ND

Dosis Única a 10 nM % relativo a control IC50 (nM)

HepG2 HepG2 Hep3B

Dúplex #

qPCR ADNb qPCR ADNb qPCR ADNb

AD-18361

105,74 152,74 ND ND ND ND

AD-18362

106,96 188,22 ND ND ND ND

AD-18363

124,22 58,46 ND ND ND ND

AD-18364

113,75 66,87 ND ND ND ND

AD-18446

29,73 13,30 ND ND ND ND

AD-18447

109,74 53,63 ND ND ND ND

AD-18448

22,96 8,81 ND ND ND ND

AD-18449

112,59 50,11 ND ND ND ND

AD-18450

89,41 34,89 ND ND ND ND

AD-18451

74,35 23,88 ND ND ND ND

AD-18452

125,25 54,86 ND ND ND ND

AD-18453

126,98 56,31 ND ND ND ND

AD-18454

113,88 52,48 ND ND ND ND

AD-18455

163,00 48,89 ND ND ND ND

AD-18456

15,70 10,52 ND ND ND ND

AD-18457

12,86 8,22 ND ND ND ND

AD-18458

13,00 7,00 ND ND ND ND

AD-18459

14,41 10,72 ND ND ND ND

AD-18460

121,16 74,87 ND ND ND ND

AD-18461

100,53 71,87 ND ND ND ND

AD-18462

47,75 29,35 ND ND ND ND

AD-18463

58,98 44,79 ND ND ND ND

Los datos de respuesta a la dosis usados para identificar el IC50 para 5 ARNds-TTR (AD-18258, AD-18274, AD- 18324, AD-18328 y AD-18339), se presentan con detalle a continuación en la Tabla 9. Se determinó que los 5 ARNsi tenían pM IC50. Los datos de IC50 para los ARNds en la Tabla 8 es un sumario de los datos presentados en la

% inhibición relativa a control AD-1955

Dúplex AD-18258

Dosis de dúplex (nM)

Tipo célula

Método de detección 10 1 0,5 0,1 0,05 0,01 0,005 0,001 0,0005 0,0001 0,00005 0,00001 IC50 (nM)

HepG2

qPCR 14,4 14,1 16,2 23,9 27,26 40,19 68,46 78,1 74,48 104,37 98,28 113,68 0,007

HepG2

ADNb 14,3 14,5 11,1 12,8 18,82 19,77 51,21 56,03 63,63 58,35 43,64 51,05 0,005

Hep3B

qPCR 11,9 8,62 12,4 16,4 28,35 30,49 58,36 54,57 81,26 89,43 81,85 101,87 0,004

Hep3B

ADNb 7,65 7,5 11,3 12,6 28,85 27,89 64,57 73,48 72,03 91,44 86,71 89,31 0,005

% inhibición relativa a control AD-1955

Dúplex AD-18274

Dosis de dúplex (nM)

Tipo célula

Método de detección 10 1 0,5 0,1 0,05 0,01 0,005 0,001 0,0005 0,0001 0,00005 0,00001 IC50 (nM)

HepG2

qPCR 6,68 8,45 11,7 24,2 42,08 49,89 56,95 62,99 64,47 54,92 67,39 72,67 0,009

HepG2

ADNb 27,5 69 25,2 34,2 73,03 103,4 121,57 97,31 154,93 156,7 Nd 152,25 0,176

Hep3B

qPCR 7,58 17 15,6 43,9 42,22 60,55 78,8 77,81 79,97 85,84 86,13 83,99 0,036

Hep3B

ADNb 3,77 4,92 7,51 15 35,21 51,66 72,45 70,12 78,31 77,52 90,72 83,01 0,012

% inhibición relativa a control AD-1955

Dúplex AD-18324

Dosis de dúplex (nM)

Tipo célula

Método de detección 10 1 0,5 0,1 0,05 0,01 0,005 0,001 0,0005 0,0001 0,00005 O o o o o IC50 (nM)

HepG2

qPCR 2,07 2,27 2,74 6,36 8,18 15,23 28,82 52,79 90,86 94,72 116,07 98,97 0,002

HepG2

ADNb 14,5 7,88 11,8 15,9 17,2 46,44 40,4 91,86 0 95,57 0 52,15 0,006

Hep3B

qPCR 2,07 3,48 5,76 16,2 18,73 44,54 49,77 68,88 63,48 76,61 74,7 77,83 0,005

Hep3B

ADNb 3,48 3,8 5,15 15,2 30,84 55,36 74,75 99,39 88,89 110,83 96,55 110,26 0,014

% inhibición relativa a control AD-1955

Dúplex AD-18328

Dosis de dúplex (nM)

Tipo célula

Método de detección 10 1 0,5 0,1 0,05 0,01 0,005 0,001 0,0005 0,0001 0,00005 0,00001 IC50 (nM)

HepG2

qPCR 5,85 3,97 3,32 5,62 8 16,75 55,01 39,76 122,41 102,37 114,02 124,09 0,003

HepG2

ADNb 12,3 10,7 10,7 11,9 20,06 25 69,52 57,29 112,28 98,14 142,26 148,92 0,004

Hep3B

qPCR 3,17 5,52 11,7 13,8 27,68 39,58 61,21 61,87 90,51 87,56 106,03 108,72 0,006

Hep3B

ADNb 3,08 3,66 4,19 7,25 21,05 22,1 73,74 63,19 105,55 96,27 105,97 96,46 0,006

% inhibición relativa a control AD-1955

Dúplex AD-18339

Dosis de dúplex (nM)

Tipo célula

Método de detección 10 1 0,5 0,1 0,05 0,01 0,005 0,001 0,0005 0,0001 0,00005 0,00001 IC50 (nM)

HepG2

qPCR 6,27 7,28 Nd 11 15,25 38,69 38,78 71,7 84,09 62,2 75,61 85,46 0,004

HepG2

ADNb 15,1 8,14 5,13 6,89 12,17 32,14 42,98 64,01 60,76 79,95 81,97 95,43 0,002

Hep3B

qPCR 8,3 9,47 13,2 34,5 44,54 77,38 81,04 81,41 93,95 81,04 75,61 78,28 0,018

Hep3B

ADNb 10,5 9,43 11,7 27,1 44,88 72,32 79,88 79,6 87,46 96,53 95,13 89,88 0,029

Un sumario de los resultados de dosis única para ARNds - TTR específico de roedores (ARNsi de TTR) se presenta a continuación en la Tabla 10. Los resultados de la dosis única se expresan como %ARNm de TTR relativo a control, 5 ensayado en células H.4.II.E de rata, después de transinfección de ARNsi de TTR específico de roedores a 10 nM. Estos resultados muestran que algunos ARNsi de TTR específicos de roedores son eficaces en la supresión de ARNm de TTR de rata endógeno in vitro.

Table 10. Resultados de dosis única de detección sistemática in vitro de los ARNds-TTR específicos de roedores (ARNsi de TTR).

Dúplex #

% Relativo a control a 10 nM Dúplex # % Relativo a control a 10 nM

AD-18529

19,83 AD-18542 6,3

AD-18530

44,49 AD-18543 16,46

AD-18531

6,01 AD-18544 17,55

AD-18532

24,06 AD-18545 3,53

AD-18533

37,78 AD-18546 2,75

AD-18534

8,19 AD-18547 7,01

AD-18535

10,18 AD-18548 5,02

AD-18536

16,13 AD-18549 1,61

5

10

15

20

25

Dúplex #

% Relativo a control a 10 nM Dúplex # % Relativo a control a 10 nM

AD-18537

15,88 AD-18550 9,58

AD-18538

19,93 AD-18551 7,74

AD-18539

49,24 AD-18552 3,74

AD-18540

2,99 AD-18553 50,39

AD-18541

1,32 AD-18554 111,06

Ejemplo 3. Ensayo in vitro de ARNsi de TTR para inducción de TNF-a y secrección de IFN-a.

Para evaluar el potencial para inmunoestimulación, se ensayaron los ARNsi de TTR in vitro para inducción de TNF-a y secreción de IFN-a.

Se aislaron PBMC humanas de capas leucocíticas recién recogidas obtenidas de donadores sanos (Research Blood Components, Inc., Boston, MA) por centrifugación de densidad Ficoll-Hypaque estándar. Se sembraron células recién aisladas (1x105/pozo/100 jl) en placas de 96 pozos y se cultivaron en medio RPMI 1640 GlutaMax (Invitrogen) enriquecido con suero fetal bovino inactivado por calor al 10 % y antibióticos/antimicótico al 1 % (Invitrogen).

Se transinfectaron los ARNsi en PBMC usando reactivo de transinfección DOTAP (Roche Applied Science). Se diluyó primero el DOTAP en Opti-MEM (Invitrogen) durante 5 minutos antes de mezcla con un volumen igual de Opti- MEM que contenía el ARNsi. Se incubaron complejos de ARNsi/DOTAP como se especificó por las instrucciones del fabricante y se añadió con posterioridad a PBMC (50 jl/pozo) que se cultivaron después durante 24 horas. Se incluyeron en todos los ensayos ARNsi de control positivo y negativo. Se usó AD-5048 como un ARNsi de control positivo. AD-5048 corresponde a una secuencia que fija como objetivo Apolipoproteína B humana (Soutschek et al., 2.004) y provoca secrección de tanto IFN-a como TNF-a en este ensayo. AD-1955, que no provoca secrección de IFN-a y TNF-a en este ensayo, se usó como un ARNsi de control negativo. Se usaron todos los ARNsi a una concentración final de 133 nM. La relación de ARN a reactivo de transinfección fue 16,5 pmoles por jg de DOTAP.

Se detectaron y se cuantificaron las citocinas en sobrenadantes de cultivo con un estuche ELISA comercialmente disponible para IFN-a (BMS216INST) y TNF-a (BMS223INST), ambos de Bender MedSystems (Vienna, Austria). La inducción de citocinas de ARNsi de TTR se expresa como porcentaje de IFN-a o TNF-a producido relativo al AD- 5048 de ARNsi de control positivo.

Los resultados de estimulación de IFN-a y TNF-a para una serie de ARNsi de TTR se presentan en la FIG. 1 (media de pozos por cuadriplicado ± SD) y a continuación en la Tabla 11 (porcentaje comparado con AD-5048). Ninguno de los ARNsi de TTR evaluado indujo secrección significativa de TNF-a o IFN-a mediante las PBMC humanas cultivadas.

Tabla 11. Resultados de estimulación de IFN-a y TNF-a para ARNsi de TTR.

Dúplex #

IFN-a (% de AD-5048) TNF-a ( % de AD-5048)

AD-18246

0 4

AD-18258

0 0

AD-18259

0 0

AD-18261

0 0

AD-18263

0 0

AD-18271

0 0

Dúplex #

IFN-a ( % de AD-5048) TNF-a ( % de AD-5048)

AD-18274

2 1

AD-18275

0 0

AD-18276

0 0

AD-18277

0 0

AD-18285

0 0

AD-18290

0 0

AD-18291

0 0

AD-18292

0 0

AD-18293

0 0

AD-18298

0 0

AD-18299

0 0

AD-18320

0 0

AD-18321

0 0

AD-18323

0 0

AD-18324

0 0

AD-18325

0 0

AD-18326

0 0

AD-18327

0 0

AD-18328

0 0

AD-18330

0 0

AD-18332

1 0

AD-18333

0 1

AD-18334

0 1

AD-18336

1 0

AD-18339

0 0

AD-18340

0 0

AD-18342

0 0

Dúplex #

IFN-a ( % de AD-5048) TNF-a ( % de AD-5048)

AD-18343

0 0

AD-18345

0 0

AD-18353

0 0

AD-18448

0 0

AD-18456

0 0

AD-18457

0 0

AD-18458

0 0

AD-18459

0 0

Se seleccionaron los cinco ARNds que fijan como objetivo TTR de plomo (ARNsi de TTR) basándose en los IC50s en el intervalo de pM en las estirpes celulares de hepatocitos humanos HepG2 y Hep3B, y la ausencia de actividad inmunoestimuladora. Los dúplex sin ningún desajuste es más probable que consigan precipitación significativa de las 5 transcripciones fijadas como objetivo que los dúplex con desajustes entre el oligo y el ARNm. Para permitir mejor la interpretación de los datos de toxicología de especies cruzadas y para tener la aplicabilidad más amplia a pacientes humanos, se prefieren en general los dúplex que tienen una identidad del 100 % en genes ortólogos de rata, mono cynomolgus y ser humano y que no fijan como objetivo regiones con polimorfismos conocidos. Se seleccionaron los cincos compuestos de plomo basándose en IC50 en estirpes celulares de hepatocitos en el intervalo de pM, la 10 ausencia de actividad inmunoestimuladora, especificidad de las transcripciones de TTR humanas y ausencia de polimorfismos conocidos (mutaciones) en la región del ARNm fijado como objetivo por el dúplex. En el caso de TTR, no se encontraron oligos de 19 bases con completa identidad en ser humano, rata y mono cynomolgus. Un resumen de estos datos se presenta en la Tabla 12, que también incluye información sobre mutaciones de TTR conocidas en la región fijada como objetivo por el dúplex y reactividad de especies cruzadas.

15 Tabla 12. Sumario de datos para los cinco ARNds de TTR más potentes.

Dúplex #

IC50 (qPCR): nM HepG2 IC50 (ADNb): nM HepG2 IFNa/TNFa Mutaciones no cubiertas Reactividad especies cruzadas

AD-18258

0,007 0,005 Negativo Ninguna (región no codificadora) Cyno: 1 desajuste @ posición 14 A a G Rata: no homología en ninguna posición

AD-18274

0,009 0,176 Negativo Lys70Asn; Val71Ala; Ile73Val; Asp74His Cyno: no desajuste Rata: no homología en ninguna posición

AD-18324

0,002 0,006 Negativo Ninguna (región no codificadora) Cyno: no desajuste Rata: no homología en ninguna posición

AD-18328

0,003 0,004 Negativo Ninguna (región no codificadora) Cyno: no desajuste

Rata: 7 desajustes

AD-18339

0,004 0,002 Negativo Ninguna (región no Ninguna

5

10

15

20

25

30

35

40

Dúplex #

IC50 (qPCR): nM HepG2 IC50 (ADNb): nM HepG2 IFNa/TNFa Mutaciones no cubiertas Reactividad especies cruzadas

codificadora)

Ejemplo 4. Reducción in vivo de ARNm de TTR hepático y proteína TTR en plasma por LNP01-18324, LNP01-18328 y LNP01-18246 en ratones transgénicos.

Se eligieron dos ARNsi de TTR, AD-18324 y AD-18328, para evaluación in vivo. Estos dúplex presentaron un silenciamiento dependiente de la dosis potente in vitro en estirpes celulares de hepatocitos (por ej., HepG2). La FIG. 2A y la FIG. 2B muestran las respuestas a la dosis en células HepG2 después de transinfección con AD-18324 (FIG. 2A) o AD-18328 (FIG. 2B) donde se expresan las dosis en nM en el eje x y las respuestas se expresan como fracción ARNm de TTR restante respecto o al control, en el eje y. En las células HepG2, los IC50 de AD-18324 y AD- 18328 se determinaron que eran 2 pM y 3 pM, respectivamente. Los sitios fijados como objetivo de TTR para ambos candidatos de ARNds de plomo están en la región no traducida 3' del ARNm de la TTR, en una región donde en no han indicado mutaciones en la bibliografía.

Las secuencias de cada hebra de los dos candidatos de plomo se reproducen a continuación a partir de las Tablas. Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en la transcripción NM_000371.2.

Dúplex #

Hebra Oligo # Posición * Secuencia 5' a 3' SEC ID N.°

AD-18324

t A-32337 509 GGAuuucAuGuAAccAAGAdTdT 1.001

AD-18324

c A-32338 527 UCUUGGUuAcAUGAAAUCCdTdT 1.002

AD-18328

t A-32345 518 GuAAccAAGAGuAuuccAudTdT 1.009

AD-18328

c A-32346 536 AUGGAAuACUCUUGGUuACdTdT 1.010

Además, se eligió un ARNds de la TTR de reacción cruzada de roedores, AD-18246, para evaluación adicional in vivo. AD-18246 fija como objetivo una secuencia que comienza en la posición 88 del marco de lectura abierto, donde hay tres mutaciones indicadas en la bibliografía. Se muestra una curva de respuesta a la dosis para AD-18246 en células HepG2 en la FIG. 3. AD-18246 es sustancialmente menos potente que AD-18324 y AD-18328; el IC50 de AD-18246 se determinó que era 265 pM.

Se administraron AD-18324, AD-18328 y AD-18246 a ratones transgénicos después de formulación en LNP01. A ratones transgénicos H129-mTTR-KO/iNOS-KO/hTTR de 3-5 meses (inhibición de transtiretina de ratón/inhibición de óxido nítrico-sintasa inducible/transtiretina transgénica humana) se les administraron por vía intravenosa (IV) 200 pl de ARNsi específico de transtiretina formulada de LNP01 (aD-18324, AD-18328 o AD-18246), ARNsi de control formulado de LNP01 que fija como objetivo el gen de la luciferasa de no mamífero (AD-1955) o PBS vía la vena caudal a concentraciones de 1,0 mg/kg, 3,0 mg/kg o 6,0 mg/kg para ARNsi AD-18324 y AD-18328, 3,0 mg/kg para ARNsi AD-18246 y 6,0 mg/kg para ARNsi AD-1955. LNP01 es una formulación lipoide constituida por ND98, Colesterol y PEG-Ceramida C16.

Después de aproximadamente cuarenta horas, se anestesiaron los ratones con 200 pl de ketamina y después se sangraron cortando la arteria caudal derecha. Se asiló sangre completa y se aisló plasma y se almacenó a -80°C hasta el ensayo. Se recogió tejido hepático, se ultracongeló y se almacenó a -80°C hasta el tratamiento.

Se evaluó la eficacia del tratamiento por (i) medición de ARNm de TTR en el hígado a las 48 horas postdosis y (ii) medición de proteína TTR en plasma en el presangrado y a las 48 horas postdosis. Se ensayaron los niveles de ARNm hepático de la TTR utilizando los ensayos de ADN Ramificado -QuantiGene 2.0 (Panomics cat #: QS0011). En resumen, se molieron muestras hepáticas de ratón y se prepararon lisados de tejido. Se incubó la mezcla de lisis hepática (una mezcla de 1 volumen de mezcla de lisis, 2 volúmenes de agua exenta de nucleasa y 10 ul de Proteinasa-K/ml para una concentración final de 20 mg/ml) a 65°C durante 35 minutos. Después se añadieron 20 pl de Conjunto de Sondas de Trabajo (sonda de TTR para fijar como objetivo gen y GAPDH para control endógeno) y 80 ul de lisado de tejido a la Placa de Captura. Las Placas de Captura se incubaron a 55 °C ±1 °C (aprox. 16-20 h). Al día siguiente, se lavó la Placa de Captura 3 veces con Tampón de Lavado x1 (agua exenta de nucleasa, Componente de Tampón 1 y Componente de Tampón de Lavado 2), después se secó por centrifugación durante 1 minuto a 240 g. Se añadieron 100 ul de Reactivo de Trabajo preMultiplicador a la Placa de Captura, que se selló con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

hoja de aluminio y se incubó durante 1 hora a 55°C±1°C. Después de 1 hora de incubación, se repitió la etapa de lavado, después se añadieron 100 |jl de Reactivo de Trabajo Multiplicador. Después de 1 hora, se repitieron las etapas de lavado y secado, y se añadieron 100 jl de Sonda de Etiquetado. Se incubaron placas de captura 50 °C ±1 °C durante 1 hora. Después se lavó la placa con tampón de lavado x1, se secó y se añadieron 100 jl de Sustrato a la Placa de Captura. Se leyeron las Placas de Captura usando el Luminómetro SpectraMax después de una incubación de 5 a 15 minutos. Se analizaron los datos de ADNb por sustracción del fondo promedio de cada muestra por triplicado, promediando los valores de GAPDH (sonda de control) y TTR (sonda experimental) por triplicado resultantes y calculando después la relación: (sonda experimental-fondo)/(sonda de control-fondo).

Se ensayaron los niveles en plasma de la TTR utilizando el estuche comercialmente disponible "Estuche ELISA de Prealbúmina Humana AssayMax" (AssayPro, St. Charles, MO, Catálogo # EP3010-1) según las directrices del fabricante. En resumen, se diluyó el plasma de ratón 1:10.000 en diluyentes de mezcla x1 y se añadieron las placas precubiertas junto con patrones del estuche y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente seguido por lavados x5 con tampón de lavado del estuche. Se añadieron cincuenta microlitros de anticuerpo de prealbúmina biotinilado a cada pozo y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente, seguido por lavados x5 con tampón de lavado. Se añadieron cincuenta microlitros de conjugado de estreptavidina-peroxidasa a cada pozo y se incubaron las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente seguido por lavado como se prescribió previamente. Se desarrolló la reacción por la adición de 50 jl/pozo de sustrato de cromogen e incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente con detención de la reacción por la adición de 50 jl/pozo de disolución de detención. Se leyó la absorbancia a 450 nm en una lectora de microplacas Versamax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y se analizaron los datos utilizando el paquete de programas informáticos Softmax 4.6 (Molecular Devices).

Se encontró que LNP01-18324 y LNP01-18328 reducían los niveles de ARNm de TTR hepático (FIG. 4A) y proteína TTR en plasma (FIG. 4B) de una manera dependiente de la dosis con administración de bolo IV. Se determinó que el ED50 de ARNm de LNP01-18328 era ~1 mg/kg mientras se determinó que el ED50 de LNP01-18324 era ~ 2 mg/kg. Los efectos de LNP01-18324 y LNP01-18328 fueron específicos, debido a que el control, LNP01-1955 a 6 mg/kg, no afectaba significativamente a los niveles de ARNm de TTR hepático, cuando se compara con el grupo PBS. LNP01- 18324 y LNP01-18328 redujeron los niveles de proteína TTR en plasma relativo al grupo PBS, con potencias que fueron similares a las de los niveles de ARNm de la TTR. A 3 mg/kg, LNP01-18246 redujeron los niveles de ARNm de TTR hepático en una extensión menor que 3 mg/kg de LNP01-18324 o LNP01-18328.

Estos resultados demuestran que LNP01-18324 y LNP1-18328, administrados por bolo IV, reducen sustancialmente el ARNm de TTR humano expresado por el hígado de ratón transgénico, que da como resultado reducción de la proteína TTR humana en la circulación.

Ejemplo 5. Reducción in vivo de ARNm de TTR natural en hígado de primate no humano por SNALP-18324 y SNALP-18328.

Para evaluar la eficacia de ARNsi de TTR AD-18324 y AD-18328 en primates no humanos sobre los niveles de ARNm de TTR hepático, se formularon los ARNsi en SNALP y se administraron por infusión intravenosa IV de 15 minutos. Se administró a monos cynomolgus (Macaca fascicularis) (2 a 5 kg, 3 animales por grupo) infusiones intravenosas IV de 15 minutos de SNALP-18324 (0,3; 1,0 ó 3,0 mg/kg), SNALP-18328 (0,3; 1 ó 3 mg/kg) o SNALP- 1955 (3 mg/kg, con ARNsi de control negativo AD-1955 que fija como objetivo el gen luciferasa no mamífero). A las cuarenta y ocho horas postdosis, se anestesia de Hong los monos con pentobarbital sódico y se sangraron. El tejido hepático para determinación de ARNm de TTR se recogió, se ultracongeló y se almacenó a -80°C hasta tratamiento.

Se ensayaron los niveles de ARNm de TTR en el hígado utilizando un ensayo de y Ramificado diseñado de costumbre, utilizando la tecnología QuantiGene1.0. En resumen, se molieron muestras hepáticas de mono y se prepararon lisados de tejido. Se incubó la mezcla de lisis hepática (1 volumen de mezcla de lisis, 2 volúmenes de agua exenta de nucleasa y 10 jl de Proteinasa-K/ml para una concentración final de 20 mg/ml) a 65°C durante 35 minutos. Después se añadieron 20 jl de Conjunto de Sondas de Trabajo (sonda de TTR para fijar como objetivo gen y GAPDH para control endógeno) y 80 jl de lisado de tejido a la Placa de Captura. Las Placas de Captura se incubaron a 55°C ±1°C (aprox. 16-20 h). Al día siguiente, se lavaron las Placas de Captura tres veces con Tampón de Lavado x1 (agua exenta de nucleasa, Componente de Tampón 1 y Componente de Tampón de Lavado 2), después se secó por centrifugación durante 1 minuto a 240 g. Se añadieron 100 jl de Reactivo de Trabajo preMultiplicador a la Placa de Captura, que se selló con hoja de aluminio y se incubó durante 1 hora a 55°C±1°C. Después de 1 hora de incubación, se repitió la etapa de lavado y después se añadieron 100 jl de Reactivo de Trabajo Multiplicador. Después de 1 hora, se repitieron las etapas de lavado y secado y se añadieron 100 jl de Sonda de Etiquetado. Se incubaron las placas de captura 50 °C ±1 °C durante 1 hora. Después se lavaron las placas con Tampón de Lavado x1 y se secó y se añadieron después 100 jl de Sustrato a la Placa de Captura. Se leyeron las Placas de Captura usando el Luminómetro SpectraMax después de una incubación de 5 a 15 minutos. Se analizaron los datos de ADNb por (i) sustracción del fondo promedio de cada muestra por triplicado, (ii) promediando los valores de GAPDH (sonda de control) y TTR (sonda experimental) y después (iii) tomando la relación: (sonda experimental-fondo)/(sonda de control-fondo).

Los resultados se muestran en la FIG. 5. SNALP-18324 y SNALP-18328 redujeron los niveles de ARNm de TTR en el hígado de una manera dependiente de la dosis, comparado con el SNALP-1955 de control negativo. Se determinó

que los ED50 de ARNm de SNALP-18328 y SNALP-18324 eran ~0,3 y ~ 1 mg/kg, respectivamente.

Estos resultados demuestran que SNALP-18324 y SNALP-18328 fueron eficaces para suprimir ARNm de TTR natural en hígado de primate no humano cuando se administró por infusión intravenosa IV.

Ejemplo 6. Reducción in vivo reducción de ARNm de TTR mutante (V30M) y proteína por SNALP-18328 en el ratón 5 transgénico.

Para evaluar la eficacia de ARNsi de la TTR AD-18328 en ARNm de TTR mutante (V30M) en el hígado y proteína de TTR mutante (V30M) en el suero, se formuló AD-18328 en SNALP y se administra por bolo IV a ratones transgénicos V30M hTTR. Se administraron a ratones transgénicos V30M hTTR (5 animales/ grupo) de 8 a 12 semanas, por vía intravenosa (IV) 200 pl de SNALP-18328 (0,03; 0,3 ó 3 mg/kg), SNALP-1955 (3 mg/kg, con ARNsi 10 AD-1955 de control negativo que fija como objetivo el gen de luciferasa de no mamífero) o PBS. Los ratones usados

fueron la cepa Mus musculus H129-hTTR KO del Institute of Molecular y Cellular Biology, Porto, Portugal. En resumen se cruzaron ratones transgénicos hTTR H129 con ratones TTR KO endógenos H129 (cero ratones para generar los ratones transgénicos H129-hTTR, en un fondo de TTR de ratón nulo (Maeda, S., (2.003), Use of genetically altered mice to study the role of serum amyloid P component in amyloid deposition. Amyloid Suppl. 1, 1715 20).

A las 48 horas postinyección, se proporcionó a los animales en los cinco grupos de tratamiento una dosis letal de ketamina/xilazina. Se recogieron muestras de suero y se almacenaron a -80 °C hasta análisis. Se recogió tejido hepático, se ultracongeló y se almacenó a -80 °C hasta tratamiento.

Para cuantificación de ARNm de TTR, se cultivó tejido hepático congelado en polvo y se prepararon lisados. Se 20 determinaron los niveles de ARNm de TTR relativos a los de ARNm de GAPDH en los lisados usando un ensayo de ADN ramificado (QuantiGene Reagent System, Panomics, Fremont, CA). En resumen, se usó el ensayo QuantiGene (Genospectra) para cuantificar los niveles de ARNm en lisados de muestras de tejido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel medio de ARNm de TTR se normalizó al nivel medio de ARNm de GAPDH para cada muestra. Las medias del grupo de los valores normalizados se normalizaron después además al valor medio 25 para el grupo tratado con PBS, para obtener el nivel relativo de expresión de ARNm de TTR.

Para cuantificación de proteínas TTR, se ensayo suero usando el Estuche ELISA de Prealbúmina Assaymax de AssayPro (St. Charles, MO) según el protocolo del fabricante.

Los resultados se muestran en la FIG. 6A y la FIG. 6B para ARNm hepático y proteína en suero, respectivamente. Ratones transgénicos V30M hTTR tratados con SNALP-18328 presentaban una disminución dependiente de la dosis 30 y significativa en los niveles de ARNm de TTR hepáticos relativos al grupo de control PBS, logrando una reducción máxima de 97 % (p < 0,001) a 3 mg/kg de SNALP-18328 y una reducción del 50 % (ED50) a ~ 0,15 mg/kg de SNALP-18328. También se suprimió la proteína TTR en suero de una manera dependiente de la dosis, con una reducción máxima de proteína TTR en suero de 99 % (p < 0,01) (relativo a los niveles de predosis) a 3 mg/kg de SNALP-18328, consistente con la reducción en los niveles de ARNm de TTR. SNALP-1955 a 3 mg/kg no presentó 35 un efecto estadísticamente significativo sobre los niveles de ARNm de TTR o proteína, comparado con PBS.

Estos resultados demuestran que SNALP-18328, cuando se administra IV, es activo en la supresión de ARNm de TTR V30M mutante en el hígado de ratón transgénico, que da como resultado reducción de proteína TTR V30M mutante en la circulación.

Ejemplo 7. Durabilidad de ARNm de TTR y supresión de proteína por SNALP-18328 en el ratón transgénico.

40 Para evaluar la durabilidad de ARNm de TTR y supresión de proteína por SNALP-18328, se formuló AD-18328 en SNALP y se administró por bolo IV a ratones transgénicos V30M hTTR. En diversos instantes de tiempo post-dosis, se cuantificaron los niveles de ARNm de TTR hepáticos y los niveles de proteína TTR en suero. Se administró a ratones transgénicos V30M hTTR de 8 a 12 semanas (4 animales / grupo) por vía intravenosa (IV) 200 pl de SNALP- 18328 (1 mg/kg) o SNALP-1955 (1 mg/kg) con ARNsi de control negativo AD-1955 que fija como objetivo el gen de 45 luciferasa de no mamífero). Los ratones usados fueron H129-hTTR KO de la cepa Mus musculus del Institute of Molecular y Cellular Biology, Porto, Portugal. En resumen, se cruzaron ratones transgénicos hTTR H129 con ratones TTR KO endógenos H129 (ratones nulos para generar los ratones transgénicos H129-hTTR, en un fondo de TTR de ratón nulo (Maeda, S., (2.003), Use of genetically altered mice to study the role of serum amyloid P component in amyloid deposition. Amyloid Suppl. 1, 17-20). Los días 3, 8, 15 ó 22 post-dosis, se proporcionó a los animales en 50 ambos grupos de tratamiento una dosis letal de ketamina/xilazina. Se recogieron muestras en suero y se almacenaron a -80 °C hasta análisis. Se recogió tejido hepático, se ultracongeló y se almacenó a -80 °C hasta tratamiento.

Para cuantificación de ARNm de TTR, se cultivó tejido hepático congelado en polvo y se prepararon lisados. Se determinaron los niveles de ARNm de TTR relativos a los de ARNm de GAPDH en los lisados usando un ensayo de 55 ADN ramificado (QuantiGene Reagent System, Panomics, Fremont, CA). En resumen, se usó el ensayo QuantiGene (Genospectra) para cuantificar los niveles de ARNm en lisados de muestras de tejido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel medio de ARNm de TTR se normalizó al nivel medio de ARNm de GAPDH para

99

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

cada muestra. Las medias del grupo de los valores normalizados se normalizaron después además al valor medio para el grupo tratado con PBS, para obtener el nivel relativo de expresión de ARNm de TtR.

Para cuantificación de proteínas TTR, se ensayó suero usando el Estuche ELISA de Prealbúmina Assaymax de AssayPro (St. Charles, MO) según el protocolo del fabricante.

Los resultados se muestran en la FIG. 7A y la FIG. 7B para ARNm hepático y proteína en suero, respectivamente. Una administración de bolo única IV única de SNALP-18328 en los ratones transgénicos V30M hTTR dio como resultado una inhibición duradera de los niveles de ARNm de TTR en el hígado y los niveles de proteína TTR en el suero. Comparado con el grupo de control (1 mg/ml de SNALP-1955), una administración IV única de SNALP-18328 a 1 mg/kg redujo significativamente en los niveles de ARNm de TTR relativos a los Días 3,8, 15 y 22 postdosis por 96 % (p < 0,001), 90 % (p < 0,001), 82 % (p < 0,001) y 73 % (p < 0,001), respectivamente, y no volvió a los niveles de referencia a la terminación del estudio (Día 22 postdosis). Los niveles de proteína también disminuyeron con una reducción máxima de TTR en suero de 97 % (p < 0,001) (relativo a SNALP-1955) el Día 3 postdosis. Los Días 8,15 y 22 postdosis, se suprimieron los niveles de proteína tTR por 72 % (p < 0,05), 32 % (p < 0,05) y 40 % (p < 0,001), respectivamente, relativo a SNALP-1955.

Estos resultados demuestran que una sola administración IV de SNALP-18328 produce supresión duradera de ARNm hepático fijado como objetivo que los niveles de proteína en suero en el ratón transgénico V30M hTTR, con reducciones significativas de tanto ARNm de TTR hepático como y proteína TTR en suero el día 22 postdosis.

Ejemplo 8. Durabilidad de supresión de proteína TTR en suero por SNALP-18328 en el primate no humano.

Para evaluar la durabilidad de supresión de proteína TTR en suero por SNALP-18328, se formuló AD-18328 en SNALP y se administró por infusión intravenosa IV a primates no humanos. En diversos instantes de tiempo postdosis, se cuantificaron los niveles de proteína TTR en suero.

Se administró a monos cynomolgus (Macaca fascicularis) (n = 5 animales / grupo para grupos de SNALP-18328 y n= 3 animales/grupo para SNALP-1955 y grupos PBS) una infusión intravenosa IV de 15 minutos de SNALP-18328 (0,3; 1 ó 3 mg/kg), SNALP-1955 (3 mg/kg) con ARNsi de control negativo AD-1955 que fija como objetivo el gen luciferasa de no mamífero) o PBS. Los Días 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10 y 14 de la fase de dosificación, se recogieron muestras de suero y se almacenaron a -80 °C hasta análisis.

Se usó análisis por métodos Western para evaluar los niveles de proteína TTR en muestras de suero. Las muestras de suero de cada grupo se mezclaron y se diluyeron 1:1 con tampón de muestra Laemmli (se añadió p- mercaptoetanol a una dilución 1:20). Se calentaron las muestras a 95°C durante 10 minutos. Se cargaron 12,5 pl de cada muestra en cada vía de un gel prep al 10-20 % Criterion (Biorad, Hercules; CA) y se separó por SDS-PAGE a 120 V durante 1,5 h, después se transfirió a una membrana de nitrocelulosa usando un sistema semiseco a 15 V durante 1 hora. Se bloqueó la membrana durante la noche a 4°C en tampón de bloqueo LiCOR (Lincoln, NE) diluido 1:1 con PBS x1. Se analizó la mancha primero con anticuerpos primarios (anti-TTR de cabra de Santa Cruz (Santa Cruz, CA) a una dilución de 1:1.000 diluido en tampón de bloqueo LiCOR /PBS en un balancín durante 1 h a temperatura ambiente. Las manchas se lavaron X 4 con PBS + Tween 20 al 0,2 % (10 minutos por lavado). Se añadieron los anticuerpos secundarios etiquetados fluorescentes (anti-cabra 680 nm de Invitrogen (Carlsbad, CA) a una dilución de 1:10.000 en tampón de bloqueo LiCOR/PBS y se incubó la mancha durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de incubación, se lavaron las manchas X 4 con PBS + Tween 20 al 0,2 % seguido por un lavado con PBS 1X. Se usó el Sistema de Formación de Imagen de Infrarrojos Odyssey de Li-COR para detectar las bandas de proteínas. El monómero de TTR migra a 15 kDa.

Los resultados se muestran en la FIG. 8. Los niveles de proteína TTR en suero mostraron una reducción dependiente de la dosis con 1 ó 3 mg/kg de SNALP-18328, cuando se compara con niveles predosis (Día 0). La duración de la supresión, después de una única administración IV de SNALP-18328 es al menos 14 días después de 1 ó 3 mg/kg de SNALP-18328 de tratamiento.

Estos resultados demuestran que una sola administración IV de SNALP-18328 produce una supresión durable de proteína TTR en la circulación en el primate no humano (Macaca fascicularis), con reducción significativa de proteína TTR a los 14 días postdosis.

Ejemplo 9: Reducción in vivo de TTR mutante (V30M) en tejidos periféricos por SNALP-18328 en el ratón transgénico.

Para evaluar la eficacia de SNALP-18328 en la reducción de TTR en tejidos periféricos, se evaluaron ratones transgénicos hTTR V30M/HSF-1 con tinción inmunohistoquímica para TTR. Se administer a ratones transgénicos hTTR V30M/HSF-1 de dos meses (Maeda, S., (2.003), Use of genetically altered mice to study the role of serum amyloid P component in amyloid deposition. Amyloid Suppl. 1, 17-20) un bolo IV de 3 mg/kg de SNALP-18328 (12 animales), 3 mg/kg de SNALP-1955 (con ARNsi de control negativo AD-1955 que fija como objetivo el gen luciferasa no de mamífero, 4 animales) o PBS (4 animales) cada dos semanas durante un total de cuatro dosis los días 0, 14, 28 y 42. Se evaluaron los niveles de ARNm hepático de TTR y la inmunoreactividad de TTR en múltiples tejidos periféricos a las 8 semanas después de la primera dosis el día 56.

100

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Se anestesiaron los ratones con 1 mg/kg de medetomidina y se les proporcionó una dosis letal de ketamina. Se recogieron los tejidos y órganos de interés. Para inmunohistoquímica, se fijaron esófago (E), estómago (S), intestino (duodeno (I1) y colon (I4)), nervio (N) y ganglios de la raíz dorsal (D) en formalina tamponada neutra y se embebieron en parafina. Para detección de la TTR, anticuerpo primario de la TTR anti-humano de conejo (1:1.000, DAKO, Dinamarca) y anticuerpo secundario conjugado con biotina anti-conejo (1:20 Sigma, USA) fueron seguidos por etiquetado con extravidina (1:20, Sigma, USA) para colorear la proteína de TTR. La reacción se desarrolló con 3- amino-9-etilcarbaxol, AEC (Sigma, USA). El análisis semi-cuantitativo de extensiones inmunohistoquímicas se realizó usando un programa Scion image quant que mide el área ocupada por el color de reacción del sustrato y normaliza este valor al área de imagen total. Los valores medios de % de área ocupada se muestran con la correspondiente desviación estándar. Se evaluó cada tejido animal en cuatro diferentes áreas. La presencia de TTR humana en ganglios parasimpáticos del estómago y el intestino se estudió por doble tinción immunofluorescente con TTR anti-humana de conejo (1:1.000, DAKO, Dinamarca) y anti-PGP9.5 de ratón (1:40, Serotec, USA) como los anticuerpos primarios; los anticuerpos secundarios fueron, respectivamente: Alexa Fluor 488 anti-conejo (Molecular probes, RU) y Alexa Fluor 568 anti-conejo de cabra (Molecular probes, RU). Se montaron las extensiones con vectashield (Vector) y se visualizaron en un microscopio de Sistema Cell Observer de Zeiss (Carl Zeiss, Alemania) provisto de filtros para FITC y rodamina.

Los resultados se representaron gráficamente en la FIG. 9. Al contrario que con animales tratados con PBS y SNALP-1955, los animales tratados con SNALP-18328 presentaron una reducción significativa de inmunoreactividad de TTR en todos los tejidos examinados (esófago (E), estómago (S), intestino (duodeno (I1) y colon (I4)), nervio (N) y ganglios de la raíz dorsal (D).

Estos resultados demuestran que la administración de SNALP-18328 a ratones transgénicos hTTR V30M/HSF-1 produce una reducción significativa de la proteína TTR en tejidos y órganos periféricos, incluyendo esófago, estómago, intestino (duodeno y colon), nervios y ganglios de la raíz dorsal.

Ejemplo 10. Reducción in vivo de ARNm de TTR natural en el hígado de primate no humano por XTC-SNALP- 18328.

Para evaluar la eficacia de la nueva formulación de nanopartículas de lípidos XTC-SNALP para suministro de ARNsi en primate no humano, se formuló ARNsi de TTR AD-18328 en XTC-SnALP (XTC-SNALP-18328) y se administró por infusión intravenosa IV de 15 minutos y se cuantificó el ARNm de TTR hepático. Se administró a monos cynomolgus (Macaca fascicularis) infusiones intravenosas IV de 15 minutos de XTC-SNALP-18328 (0,03; 0,1; 0,3 ó 1 mg/kg) o XTC-SNALP-1955 (1 mg/kg, con ARNsi de control negativo AD-1955 que fija como objetivo el gen luciferasa no de mamífero). A las cuarenta y ocho horas postdosis, se anestesiaron los monos con pentobarbital sódico y se sangraron. Se recogió tejido hepático para determinación de ARNm de TTR, se ultracongeló y se almacenó a -80 °C hasta tratamiento. Los métodos usados para cuantificación de ARNm de TTR en tejido hepático fueron similares a los descritos en el Ejemplo 5 anteriormente.

Los resultados se muestran en la FIG. 10. XTC-SNALP -18328 redujo los niveles de ARNm de TTR en el hígado de una manera dependiente de la dosis, comparado con el XTC-SNALP -1955 de control negativo. Se determinó que el ED50 de ARNm era ~ 0,1 mg/kg de XTC-SNALP -18328.

Estos resultados demuestran que XTC-SNALP-18328 es eficaz en la supresión de ARNm de TTR en hígado de primate no humano cuando se administra por infusión intravenosa IV.

Ejemplo 11: Reducción in vivo de ARNm de TTR natural en el hígado de primate no humano por LNP09-18328 y LNP11-18328.

Para evaluar la eficacia de dos nuevas formulaciones de nanopartículas de lípidos, LNP09 y LNP11, para suministro de ARNsi en primate no humano, se formuló ARNsi de la TTR AD-18328 en LNP09 (LNP09-18328) o LNP11 (LNP11-18328) y se administró por infusión intravenosa IV de 15 minutos y se ensayaron los niveles de ARNm de TTR hepático y de proteína TTR en suero. Se administraron a monos cynomolgus (Macaco fascicularis) infusiones intravenosas iV de 15 minutos de LNP09-18328 (0,03; 0,1 ó 0,3 mg/kg), LNP11-18328 (0,03; 0,1 ó 0,3 mg/kg) o PBS. Se recogieron muestras de biopsias de hígado a las 48 h postdosis, se ultracongelaron y se almacenaron a -80 °C hasta tratamiento. Se recogió suero antes de dosificación (presangrado) y los Días 1, 2, 4, 7, 14, 21 y 28 postdosificación y se almacenaron a -80 °C hasta tratamiento. Los métodos usados para cuantificación de ARNm de TTR y la evaluación de proteína TTR en suero fueron similares a los descritos en los Ejemplos 5 y 8 anteriores.

Los resultados se muestran en la FIG. 11A para ARNm y en la FIG. 11B y FIG. 11C para proteína. Los animales tratados con LNP09-18328 y LNP11-18328 mostraron una disminución dependiente de la dosis en los niveles de ARNm de TTR en el hígado, logrando una reducción máxima a 0,3 mg/kg de ~ 85 % (LNP09-18328) y ~ 90 % (LNP11-18328) de ARNm relativo al control de PBS . Se determinó que el ED50 de ARNm era ~ 0,02 mg/kg para ambos LNP09-18328 y LNP11-18328. El Día 7 postdosis, las muestras de suero también presentaron una reducción dependiente de la dosis de proteína TTR para 0,1 y 0,3 mg/kg de LNP09-18328 y LNP1-18328, comparado con niveles de control de PBS. La FIG. 11C muestra una disminución en los niveles de proteína TTR con una dosis de 0,3 mg/kg de LNP09-18328 que persistió durante al menos 28 días postdosis, cuando se compara con el grupo de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

control de PBS y cuando se compara con las muestras presangradas.

Estos resultados demuestran que LNP09-18328 y LNP11-18328 son eficaces en la supresión de ARNm de TTR natural en hígado de primate no humano y proteína TTR natural en la circulación, cuando se administra por infusión intravenosa IV. Además, la supresión con LN09-18328 es duradera, persistiendo durante al menos 28 días después de infusión intravenosa IV.

Ejemplo 12. Sintesis de secuencias de TTR mosaico.

Se designó una serie de dúplex de TTR ("dúplex en mosaico") que fijaban como objetivo el gen de la TTR cerca de la región fijada como objetivo de AD-18328, que fija como objetivo el gen de la TTR humano empezando en el nucleótido 628 de NM_000371.3.

En los ejemplos a continuación, la numeración que representa la posición de la base 5' de un ARNsi en la transcripción se basa en NM_000371.3 (FIG. 12; SEC ID N.° 1.331). En los ejemplos mostrados a continuación, la numeración para ARNsi que fija como objetivo ARNsi humano está basada en NM_000371.2 (FIG. 13A). NM_000371.3 extiende la secuencia de la 5' UTR por 110 bases comparado con NM_000371.2, como se muestra en la FIG. 14. Así, como un ejemplo, la posición de partida de aD-18328 es 628 en NM_000371.3 y 518 en NM_000371.2 (FIG. 14).

Se sintetizaron secuencias de TTR en mosaico en un sintetizador MerMade 192 en escala de 1 umol. Para todas las secuencias en la lista, se aplicó la química 'endolight' como se detalla continuación.

• Todas las pirimidinas (citosina y uridina) en la hebra transcrita contenían 2'-O-Metil-bases (2' O-Metil C y 2'- O-Metil U).

• En la hebra complementaria, las pirimidinas adyacentes a (hacia la posición 5') ribo A nucleósido fueron reemplazadas con sus correspondientes 2-O-Metil-nucleósidos.

• Se introdujo una extensión dTdT de dos bases en el extremo 3' de ambas secuencias transcrita y complementaria.

• La fila de la secuencia se convirtió en una fila de texto para hacerla compatible para carga en el programa informático de síntesis MerMade 192.

Síntesis, escisión y desprotección:

La síntesis de secuencias TTR usó síntesis de oligonucleótidos soportados en sólido usando la química de la fosforamidita. La síntesis de las secuencias se realizó en escala 1 um en placas de 96 pozos. Las disoluciones de amidita se prepararon a concentración 0,1 M y se usó etiltiotetrazol (0,6 M en Acetonitrilo) como activador. Las secuencias sintetizadas se escindieron y se desprotegieron en placas de 96 pozos, usando metilamina en la primera etapa y reactivo de fluoruro en la segunda etapa. Las secuencias brutas se precipitaron usando mezcla de acetona: etanol (80:20) y el botón se volvió a suspender en tampón de acetato de sodio 0,2 M. Se analizaron las muestras de cada secuencia por LC-MS para confirmar la identidad, UV para cuantificación y una serie de muestras seleccionada por cromatografía IEX para determinar la pureza.

Purificación y desalación:

Las secuencias de TTR en mosaico se purificaron en un sistema de purificación AKTA explorer usando una columna Source 15Q. Se mantuvo una temperatura de la columna de 65 °C durante la purificación. Se realizó la inyección y recogida de la muestra en placas de 96 pozos (1,8 ml-de profundidad del pozo). Se recogió un único pico correspondiente a la secuencia de longitud completa en el eluyente. Se desalaron las secuencias purificadas en una columna Sephadex G25 usando purificador AKTA. Se analizó la concentración en las secuencias de TTR desaladas (por medición UV a A260) y la pureza (por HPLC de intercambio iónico). Se sometieron después a hibridación las hebras solas.

Hebras solas y dúplex de TTR:

Se presenta una lista detallada de dúplex en mosaico de TTR y correspondientes hebras únicas (transcrita y complementaria) en la tabla a continuación (Tabla 13).

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.3, SEC ID N.° 1.331).

Dúplex #

Posición Oligo # Hebra Secuencia (5' a 3") SEC ID N.°

AD-18323

618 A-32335 T GGGAuuucAuGuAAccAAGdTdT 1.332

A-32336 C CUUGGUuAcAUGAAAUCCCdTdT 1.333

AD-18324

619 A-32337 T GGAuuucAuGuAAccAAGAdTdT 1.334

A-32338 C UCUUGGUuAcAUGAAAUCCdTdT 1.335

AD-23000

620 A-42927 T GAuuucAuGuAAccAAGAGdTdT 1.336

A-42928 C CUCUUGGUuAcAUGAAAUCdTdT 1.337

AD-23001

621 A-42929 T AuuucAuGuAAccAAGAGudTdT 1.338

A-42930 C ACUCUUGGUuAcAUGAAAUdTdT 1.339

AD-23002

622 A-42931 T uuucAuGuAAccAAGAGuAdTdT 1.340

A-42932 C uACUCUUGGUuAcAUGAAAdTdT 1.341

AD-23003

623 A-42933 T uucAuGuAAccAAGAGuAudTdT 1.342

A-42934 C AuACUCUUGGUuAcAUGAAdTdT 1.343

AD-18325

624 A-32339 T ucAuGuAAccAAGAGuAuudTdT 1.344

A-32340 C AAuACUCUUGGUuAcAUGAdTdT 1.345

AD-23004

625 A-42935 T cAuGuAAccAAGAGuAuucdTdT 1.346

A-42936 C GAAuACUCUUGGUuAcAUGdTdT 1.347

AD-18326

626 A-32341 T AuGuAAccAAGAGuAuuccdTdT 1.348

A-32342 C GGAAuACUCUUGGUuAcAUdTdT 1.349

AD-18327

627 A-32343 T uGuAAccAAGAGuAuuccAdTdT 1.350

A-32344 C UGGAAuACUCUUGGUuAcAdTdT 1.351

AD-23005

628 A-42937 T uAAccAAGAGuAuuccAuudTdT 1.352

A-42938 C AAUGGAAuACUCUUGGUuAdTdT 1.353

AD-23006

629 A-42939 T AAccAAGAGuAuuccAuuudTdT 1.354

A-42940 C AAAUGGAAuACUCUUGGUUdTdT 1.355

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.3, SEC ID N.° 1.331).

Dúplex #

Posición Oligo # Hebra Secuencia (5' a 3") SEC ID N.°

AD-23007

631 A-42941 T AccAAGAGuAuuccAuuuudTdT 1.356

A-42942 C AAAAUGGAAuACUCUUGGUdTdT 1.357

AD-23008

632 A-42943 T ccAAGAGuAuuccAuuuuudTdT 1.358

A-42944 C AAAAAUGGAAuACUCUUGGdTdT 1.359

AD-23009

633 A-42945 T cAAGAGuAuuccAuuuuuAdTdT 1.360

A-42946 C uAAAAAUGGAAuACUCUUGdTdT 1.361

AD-23010

634 A-42947 T AAGAGuAuuccAuuuuuAcdTdT 1.362

A-42948 C GuAAAAAUGGAAuACUCUUdTdT 1.363

AD-23011

635 A-42949 T AGAGuAuuccAuuuuuAcudTdT 1.364

A-42950 C AGuAAAAAUGGAAuACUCUdTdT 1.365

AD-23012

636 A-42951 T GAGuAuuccAuuuuuAcuAdTdT 1.366

A-42952 C uAGuAAAAAUGGAAuACUCdTdT 1.367

AD-23013

637 A-42953 T AGuAuuccAuuuuuAcuAAdTdT 1.368

A-42954 C UuAGuAAAAAUGGAAuACUdTdT 1.369

AD-23014

638 A-42955 T GuAuuccAuuuuuAcuAAAdTdT 1.370

A-42956 C UUuAGuAAAAAUGGAAuACdTdT 1.371

AD-23015

639 A-42957 T uAuuccAuuuuuAcuAAAGdTdT 1.372

A-42958 C CUUuAGuAAAAAUGGAAuAdTdT 1.373

AD-23016

640 A-42959 T AuuccAuuuuuAcuAAAGcdTdT 1.374

A-42960 C GCUUuAGuAAAAAUGGAAUdTdT 1.375

AD-23017

641 A-42961 T uuccAuuuuuAcuAAAGcAdTdT 1.376

A-42962 C UGCUUuAGuAAAAAUGGAAdTdT 1.377

AD-23018

642 A-42963 T uccAuuuuuAcuAAAGcAGdTdT 1.378

A-42964 C CUGCUUuAGuAAAAAUGGAdTdT 1.379

AD-23019

643 A-42965 T ccAuuuuuAcuAAAGcAGudTdT 1.380

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.3, SEC ID N.° 1.331).

Dúplex #

Posición Oligo # Hebra Secuencia (5' a 3") SEC ID N.°

A-42966 C ACUGCUUuAGuAAAAAUGGdTdT 1.381

AD-23020

644 A-42967 T cAuuuuuAcuAAAGcAGuGdTdT 1.382

A-42968 C cACUGCUUuAGuAAAAAUGdTdT 1.383

AD-23021

645 A-42969 T AuuuuuAcuAAAGcAGuGudTdT 1.384

A-42970 C AcACUGCUUuAGuAAAAAUdTdT 1.385

AD-23022

646 A-42971 T uuuuuAcuAAAGcAGuGuudTdT 1.386

A-42972 C AAcACUGCUUuAGuAAAAAdTdT 1.387

AD-23023

647 A-42973 T uuuuAcuAAAGcAGuGuuudTdT 1.388

A-42974 C AAAcACUGCUUuAGuAAAAdTdT 1.389

AD-23024

648 A-42975 T uuuAcuAAAGcAGuGuuuudTdT 1.390

A-42976 C AAAAcACUGCUUuAGuAAAdTdT 1.391

AD-23025

649 A-42977 T uuAcuAAAGcAGuGuuuucdTdT 1.392

A-42978 C GAAAAcACUGCUUuAGuAAdTdT 1.393

AD-23026

650 A-42979 T uAcuAAAGcAGu Guu uucAdTdT 1.394

A-42980 C UGAAAAcACUGCUUuAGuAdTdT 1.395

AD-23027

651 A-42981 T AcuAAAGcAGuGuuuucAcdTdT 1.396

A-42982 C GUGAAAAcACUGCUUuAGUdTdT 1.397

AD-23028

652 A-42983 T cuAAAGcAGuGuuuucAccdTdT 1.398

A-42984 C GGUGAAAAcACUGCUUuAGdTdT 1.399

AD-18330

653 A-32349 T uAAAGcAGuGuuuucAccudTdT 1.400

A-32350 C AGGUGAAAAcACUGCUUuAdTdT 1.401

AD-23029

654 A-42985 T AAAGcAGuGuuuucAccucdTdT 1.402

A-42986 C GAGGUGAAAAcACUGCUUUdTdT 1.403

AD-23030

655 A-42987 T AAGcAGuGuuuucAccucAdTdT 1.404

A-42988 C UGAGGUGAAAAcACUGCUUdTdT 1.405

5

10

15

20

25

30

35

40

Hebra: t= transcrita; c= complementaria; Posición: posición de base 5' en transcripción (NM 000371.3, SEC ID N.° 1.331).

Dúplex #

Posición Oligo # Hebra Secuencia (5' a 3") SEC ID N.°

AD-23031

656 A-42989 T AGcAGuGuuuucAccucAudTdT 1.406

A-42990 C AUGAGGUGAAAAcACUGCUdTdT 1.407

AD-18328

628 A-32345 T GuAAccAAGAGuAuuccAudTdT 1.408

A-32346 C AUGGAAuACUCUUGGUuACdTdT 1.409

Ejemplo 13. Identificación sistemática in vitro de ARNsi en mosaico de TTR.

Se ensayaron dúplex de TTR en mosaico en células Hep3B para inhibición de expresión de TTR endógena usando ensayos de PCR en tiempo real.

Cultivo celular y transinfección: se cultivaron células Hep3B (ATCC, Manassas, VA) a cerca de confluencia a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 % en Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM, ATCC) enriquecido con FBS al 10 %, estreptomicina y glutamina (ATCC) antes de que se liberara de la placa por tripsinización. Se llevó a cabo transinfección inversa por adición de 5 pl de Opti-MEM a 5 pl de cada ARNsi en pozos individuales de una placa de 96 pozos. A estos 10 pl de Opti-MEM más 0,2 pl de Lipofectamina se añadió RNAiMax por pozo (Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150) y se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron después 80 pl de medio de cultivo completo descrito anteriormente, pero sin antibiótico conteniendo 2,0 x104 células Hep3B. Se incubaron las células durante 24 horas previamente a purificación de ARN. Los experimentos se realizaron a concentración final de dúplex 0,1 ó 10 nM.

Aislamiento de ARN total usando Estuche de Aislamiento de ARN Total MagMAX-96 (Applied Biosystems, Foster City CA, parte #: AM 1.830): Se recogieron células y se lisaron en 140 pl de Disolución de Lisis/Unión después se mezclaron durante 1 minuto a 89 rad/s (850 rpm) usando un Termomezclador Eppendorf (la velocidad de mezclamiento fue la misma durante todo el procedimiento). Se añadieron veinte microlitros de perlas magnéticas al lisado de células y se mezcló durante 5 minutos. Se capturaron perlas magnéticas usando soporte magnético y se eliminó el sobrenadante sin alterar las perlas. Después de eliminar el sobrenadante, se lavaron las perlas magnéticas con Disolución de Lavado 1 (isopropanol añadido) y se mezcló durante 1 minuto. Se capturaron las perlas de nuevo y se eliminó el sobrenadante. Después se lavaron las perlas con 150 pl de Disolución de Lavado 2 (Etanol añadido), se capturó y eliminó el sobrenadante. Después se añadieron 50 pl de mezcla de DNasa (tampón de DNasa MagMax turbo y DNasa Turbo) a las perlas y se mezclaron durante 10 a 15 minutos. Después de mezclamiento, se añadieron 100 pl de Disolución de Unión de Nuevo de ARN y se mezclaron durante 3 minutos. Se retiró el sobrenadante y se lavaron las perlas magnéticas de nuevo con 150 pl de Disolución de Lavado 2 y se mezclaron durante 1 minuto y se eliminó completamente el sobrenadante. Se mezclaron las perlas magnéticas durante 2 minutos a sequedad antes de que se eluyera ARN con 50 pl de agua.

Síntesis de ADNc usando estuche de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813): Se añadió una mezcla patrón de 2 pl de Tampón x10, 0,8 pl de dNTP x25, 2 pl de cebadores Aleatorios, 1 pl de Transcriptasa Inversa, 1 pl de inhibidor de RNasa y 3,2 pl de H2O por reacción a 10 pl de ARN total. Se generó ADNc usando un termociclador Bio-Rad C-1000 o S-1000 (Hercules, CA) por las siguientes etapas: 25°C 10 min, 37°C 120 min, 85°C 5 s, mantenido a 4°C.

PCR de tiempo real: Se añadieron 2 pl de ADNc a un mezclador maestro que contenía 0,5 pl de Sonda TaqMan GAPDH (Applied Biosystems Cat # 4326317E), 0,5 pl de sonda TaqMan de TTR (Applied Biosystems cat # HS00174914 M1) y 10 pl de Mezcla Maestra de Sondas Roche (Roche Cat 04887301001) por pozo en una placa de 384 pozos LightCycler 480 (Roche cat # 0472974001). Se realizó PCR en tiempo real en una máquina PCR de Tiempo Real LightCycler 480 (Roche). Cada dúplex se ensayó en dos transinfecciones independientes y cada transinfección se ensayó por duplicado.

Se analizaron los datos en tiempo real usando el método AA Ct. Se normalizó cada muestra para expresión GAPDH y se valoraron inhibiciones relativas a células transinfectadas con el dúplex no fijado como objetivo AD-1955. La Tabla 14 muestra la inhibición de TTR usando los ARNsi. Los datos se expresan como el porcentaje de mensaje restante relativo a las células fijadas como objetivo con AD-1955.

Muchos pero no todos los ARNds de TTR en mosaico, que fijan como objetivo TTR cerca del objetivo de AD-18328, redujeron el ARNm de la TTR por al menos 70 % cuando se transinfectaron en células Hep3B a 0,1 nM.

Dúplex #

% mensaje restante 0,1 nM % SD 0,1 nM % mensaje restante 10 nM % SD10 nM

AD-18323

6,7 1,90 1,7 0,02

AD-18324

1,8 0,58 0,9 0,10

AD-23000

5,5 0,93 2,1 0,87

AD-23001

15,2 4,89 4,9 1,74

AD-23002

3,1 1,12 1,4 0,55

AD-23003

17,3 3,13 1,7 0,06

AD-18325

1,5 0,27 1,4 0,66

AD-23004

9,0 0,15 10,5 0,96

AD-18326

22,0 1,85 7,6 0,78

AD-18327

11,6 2,64 9,6 1,67

AD-18328

1,1 0,70 0,6 0,16

AD-23005

0,8 0,31 0,6 0,21

AD-23006

1,5 0,46 1,2 0,43

AD-23007

2,4 0,91 1,9 0,46

AD-23008

0,6 0,10 0,8 0,26

AD-23009

1,0 0,13 0,9 0,22

AD-23010

60,1 15,66 66,2 22,71

AD-23011

56,5 16,99 53,6 4,70

AD-23012

7,7 2,36 7,7 3,25

AD-23013

7,0 0,64 8,0 1,06

AD-23014

0,7 0,01 0,6 0,10

AD-23015

15,4 0,25 16,5 7,07

AD-23016

27,1 0,37 6,7 1,80

AD-23017

4,5 1,26 1,4 0,40

AD-23018

44,6 9,45 7,5 1,09

AD-23019

2,2 0,68 0,8 0,10

Dúplex #

% mensaje restante 0,1 nM % SD 0,1 nM % mensaje restante 10 nM % SD10 nM

AD-23020

52,7 6,45 29,7 1,17

AD-23021

95,4 16,16 45,0 3,00

AD-23022

70,1 3,01 60,8 12,11

AD-23023

2,7 1,12 1,8 0,07

AD-23024

1,7 0,30 1,8 0,33

AD-23025

64,2 13,21 10,5 1,34

AD-23026

1,9 0,15 1,9 0,78

AD-23027

2,5 0,21 1,6 0,49

AD-23028

6,7 4,41 1,2 0,50

AD-18330

6,0 0,56 5,7 1,15

AD-23029

4,5 0,47 1,6 0,10

AD-23030

3,9 0,25 3,3 0,84

AD-23031

3,4 0,78 1,7 0,02

Ejemplo 14. Evaluación de duración de infusión intravenosa sobre la eficacia de una administración intravenosa única de SNALP-18534 en ratas Sprague-Dawley.

Objetivos

5 Para determinar el efecto de la duración de la infusión intravenosa sobre la eficacia de una única infusión IV de SNALP-18534 sobre los niveles de ARNm de TTR hepático en ratas Sprague-Dawley.

Tabla 15: Abreviaturas y definiciones usadas.

SNALP-18534

ARNsi específico de transtiretina de roedores formulado en SNALP

SNALP-1955

ARNsi específico de luciferasa no de mamífero formulado en SNALP

Las secuencias de las hebras transcrita y complementaria de AD-18534 se reproducen a continuación a partir de las 10 tablas anteriores:

Hebra

Oligo # Posición Secuencia 5' a 3' SEC ID N.°

t

A-32755 532 cAGuGuucuuGcucuAuAAdTdT 1.289

c

A-32756 550 UuAuAGAGcAAGAAcACUGdTdT 1.290

Materiales de estudio.

Artículo o artículos de ensayo.

SNALP-18534 está constituido por un ARNsi que fija como objetivo ARNm de TTR de roedores (AD-18534), formulado en partículas lipídicas de ácido nucleico estables (SNALP) para suministro a tejidos fijados como objetivo. La formulación de SNALp (partícula lipídica) consta de un aminolípido nuevo (DLinDMA), un lípido PEGilado (mPEG2000-C-DMA), un lípido neutro (DPPC) y colesterol. La relación de lípido: ácido nucleico en la formulación de 5 SNALP es aproximadamente 5,8:1 (p:p). SNALP-1955 contiene un ARNsi que fija como objetivo el ARNm de luciferasa no de mamífero, se formula con la partícula lipídica idéntica como SNALP-18534 y sirve como un control no farmacológicamente activo. Los niveles de dosis se expresan como mg/kg basado en el peso de contenido en ARNsi.

Diseño del estudio y procedimientos.

10 Animales y administración del artículo de ensayo:

El estudio estuvo constituido por 9 grupos de ratas Sprague-Dawley (4 machos/ grupo). Se dejó que los animales tuvieran al menos un periodo de aclimatación de 2 días antes del estudio y todos los animales tenían 7 semanas al inicio de la dosificación. La dosis administrada se calculó basándose en los datos de peso corporal recogidos previamente a la dosificación del Día 1. Se administraron los artículos de ensayo y de control como una infusión 15 intravenosa IV única de 15 minutos, 1 hora, 2 horas o 3 horas vía la vena caudal usando una cánula 24G de 1,9 cm (%") sellada con un septo de Sitio de Inyección Baxter vía un aguja de mariposa un Terumo 27G a una bomba de jeringa Baxter AS40A. El volumen de dosis fue 3 ml/kg, la velocidad de infusión intravenosa fue 12 ml/kg/h y se movieron libremente los animales en las jaulas durante la dosificación. Se dividieron las ratas en nueve grupos de tratamiento y se les administró una infusión intravenosa IV de SNALP-18534, SNALP-1955 o PBS como se muestra 20 en la Tabla 16:

Tabla 16: Grupos de dosificación de animales de ensayo

Grupo

N Artículo de Ensayo Duración de la infusión intravenosa Dosis

A

4 PBS 15 minutos —

B

4 PBS 3 horas —

C

4 SNALP -1955 1 hora 1 mg/kg

D

4 SNALP -1955 2 horas 1 mg/kg

E

4 SNALP -1955 3 horas 1 mg/kg

F

4 SNALP-18534 15 minutos 1 mg/kg

G

4 SNALP-18534 1 hora 1 mg/kg

H

4 SNALP-18534 2 horas 1 mg/kg

I

4 SNALP-18534 3 horas 1 mg/kg

Recogida de tejido y aislamiento de ARN:

El Día 0, se anestesiaron los animales por inhalación de isofluorano y se recogieron muestras de sangre 25 predosificación en tubos de separador de suero por sangrado retro-orbital. Se dejó que las muestras de sangre coagularan a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos antes de centrifugación a 4°C. Después se almacenaron las muestras de suero a -80 °C hasta que se realizó el análisis. El Día 3, se proporcionó a los animales en los nueve grupos de tratamiento una dosis letal de ketamina/xilazina. Se recogió sangre vía caudal vena cava en tubos de separación de suero y se dejó coagular a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 30 minutos antes de centrifugación a 4°C. Se almacenaron las muestras de suero a -80 °C hasta que se realizó el análisis. Se recogió el tejido de hígado y se congeló instantáneamente en nieve carbónica. El tejido de hígado congelado se cultivó y se prepararon lisados de tejido para cuantificación de ARNm en hígado.

Cuantificación de ARNm de la TTR:

Se determinaron los niveles de ARNm de TTR relativos a los de ARNm de GAPDH en los lisados mediante ensayos 35 de ADN ramificado (QuantiGene Reagent System, Panomics, Fremont, CA). En resumen, se usó el ensayo

109

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

QuantiGene (Genospectra) para cuantificar los niveles de ARNm en lisados de muestras de tejidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel medio de ARNm de TTR fue normalizado al nivel medio de ARNm de GAPDH para cada muestra.

Para obtener el nivel relativo de expresión de ARNm de TTR, se normalizaron después los valores medios del grupo para grupos tratados con SNALP-1955 y SNALP-18534 con duraciones de infusión intravenosa de 15 minutos, 1 hora y 2 horas, al valor medio para el grupo tratado con PBS con infusión intravenosa de 15 minutos mientras que los valores medios del grupo para grupos tratados con SNALP-1955 y SNALP-18534 con duración de infusión intravenosa de 3 horas fueron normalizados después al valor medio para el grupo tratado con PBS con duración de la infusión intravenosa de 3 horas.

Resultados

Como se muestra en la FIG. 16, una infusión IV única de 1 mg/kg de SNALP-18534 con diferentes duraciones de la infusión intravenosa de 15 minutos a 3 horas da como resultado una inhibición comparable de los niveles de ARNm de la TTR en el hígado medido dos días después de la dosificación. Una infusión intravenosa IV única de 1 mg/kg de SNALP-18534 también mostró regulación hacia abajo de la TTR duradera más de 29 días después de una infusión intravenosa IV única de 15 minutos, cuando se compara con control de SNALP-1955 (datos no mostrados). Comparado con el grupo tratado con PBS, una infusión intravenosa IV única de 15 minutos, 1 hora, 2 horas o 2 horas de SNALP-18534 a 1 mg/kg redujo significativamente los niveles de expresión de ARNm de la TTR relativos por 94 % (p < 0,001), 94 % (p < 0,001), 92 % (p < 0,001) y 93 % (p < 0,001), respectivamente. La especificidad de la actividad de SNALP-18534 se demostró por la ausencia de inhibición objetivo significativa por administración de SNALP-1955 vía infusión intravenosa IV de 1 hora, 2 horas o 3 horas al mismo nivel de dosis.

Conclusiones

Este estudio demuestra que variar la duración de la infusión intravenosa desde 15 minutos hasta 3 horas no afecta a la eficacia de una administración IV única de 1 mg/kg de SNALP-18534 en ratas, como se evaluó por reducción de los niveles de ARNm de TTR en el hígado.

Ejemplo 15. Reducción in vivo de ARNm de TTR natural en el hígado de rata por LNP07-18534 y LNP08-18534.

Para evaluar la eficacia de 2 nuevas formulaciones de nanopartículas de lípidos, LNP07 y LNP08, para suministro de ARNsi en la rata, se formuló ARNsi de la TTR específico de roedores, AD-18534, en LNP07 (LNP07-18534) o LNP08 (LNP08-18534) y se administró por infusión intravenosa IV de 15 minutos y se cuantificó ARNm de TTR en el hígado. Se administraron a ratas Sprague-Dawley (4 animales por grupo) infusiones intravenosas IV de 15 minutos de LNP07-18534 ((0,03; 0,1, 0,3 1 mg/kg), LNP08-18534 (0,01, 0,03; ó 0,1 mg/kg) o LNP07-1955 (1 mg/kg) ó LNP078-1955 (0,1 mg/kg) que contenían el ARNsi de control negativo AD-1955 que fija como objetivo el gen de luciferasa de no mamífero. Cuarenta y ocho horas más tarde, se practicó la eutanasia a los animales y se recogió tejido hepático, se ultracongeló y se almacenó a -80 °C hasta tratamiento.

Para cuantificación de ARNm de TTR, se molió tejido hepático congelado en polvo, y se prepararon lisados. Se determinaron los niveles de ARNm de TTR relativos a los de ARNm de GAPDH en los lisados usando un ensayo de ADN ramificado (QuantiGene Reagent System, Panomics, Fremont, CA). En resumen, se usó el ensayo QuantiGene (Genospectra) para cuantificar los niveles de ARNm en lisados de muestra de tejido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel medio de ARNm de TTR fue normalizado al nivel medio de ARNm de GAPDH para cada muestra. Las medias del grupo de los valores normalizados se normalizaron después además al valor medio para el grupo tratado con PBS, para obtener el nivel relativo de expresión de ARNm de TTR.

Los resultados se muestran en la FIG. 17. LNP07-18534 redujo los niveles de ARNm de TTR en el hígado de una manera dependiente de la dosis, con 94 % de supresión de ARNm de TTR a 1 mg/kg. El efecto fue específico, puesto que el LNP07-1955 de control negativo a 1 mg/kg no afectó significativamente a los niveles de ARNm de TTR comparado con el control de PBS. Se determinó que el ED50 de ARNm era ~ 0,05 mg/kg de LNP07-18534. LNP08- 18534 redujo los niveles de ARNm de TTR en el hígado de una manera dependiente de la dosis, con supresión del 86 % de ARNm de la TTR a 0,1 mg/kg. El efecto fue específico, puesto que el LNP08-1955 de control negativo a 0,1 mg/kg no afectó significativamente a los niveles de ARNm de la TTR comparado con el control de PBS. Se determinó que el ED50 del ARNm era ~ 0,02 mg/kg de LNP08-18534.

Estos resultados demuestran que LNP07-18534 y LNP08-18534 son eficaces en la supresión de ARNm de TTR natural en la rata cuando se administra por infusión intravenosa IV y que LNP07 y LNP08 son formulaciones eficaces para suministrar ARNsi al hígado.

Ejemplo 16: Reducción de ARNm de la TTR hepático por una administración intravenosa única de LNP09-18534 o LNP11-18534 en ratas Sprague-Dawley.

Objetivo:

Para evaluar la eficacia de dos nuevas formulaciones de nanopartículas lipídicas (LNP, por sus siglas en inglés) para

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

suministro del ARNsi específico de la TTR de roedores, AD-18534 en la rata Sprague-Dawley para reducir los niveles de ARNm de TTR hepático (natural) endógeno. Se dosificó por vía intravenosa a las ratas vía una infusión intravenosa de 15 minutos 0,01, 0,03, 0,1 ó 0,3 mg/kg de LNP09-18534, LNP11-18534 o disolución salina tamponada con fosfato (PBS) y se ensayaron los niveles de ARNm hepático de la TTR a las 48 horas posttratamiento.

Material y métodos:

Formulación de LNP09: (XTC/DSPC/Chol/PEG2000-C14) = 50/10/38,5/1,5 % en moles; Lípido:ARNsi ~ 11:1. Formulación de LNP11: (MC3/DSPC/Chol/PEG2000-C14) =50/10/38,5/1,5% en moles; Lípido:ARNsi ~ 11,1.

Recogida de tejido y aislamiento de ARN: El Día 3, se proporcionó a los animales en todos los grupos de tratamiento una dosis letal de ketamina/xilazina. Se recogió sangre vía caudal vena cava en tubos de separación de suero y después se dejó que coagulara a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos antes de centrifugación a 4 °C. Se almacenaron las muestras de suero a -80 °C hasta futuro análisis. Se recogieron tejidos de hígado y se congelaron instantáneamente sobre nieve carbónica. Se molió tejido de hígado congelado y se prepararon lisados de tejido para cuantificación de ARNm de hígado.

Cuantificación de ARNm de TTR: Se determinaron los niveles de ARNm de TTR relativos a los de ARNm de GAPDH en los lisados usando un ensayo de ADN ramificado (QuantiGene Reagent System, Panomics, Fremont, CA). En resumen, se usó el ensayo QuantiGene (Genospectra) para cuantificar los niveles de ARNm en lisados de muestra de tejido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel medio de ARNm de TTR fue normalizado al nivel medio de ARNm de GAPDH para cada muestra. Los valores medios de los grupos fueron normalizados después al valor medio para el grupo tratado con PBS, para obtener el nivel relativo de expresión de ARNm de TTR.

Resultados:

Como se muestra en la FIG. 18, por el contrario a los animales tratados con PBS, los animales tratados con LNP09- 18534 y LNP11-18534 presentaron una disminución significativa dependiente de la dosis en los niveles de ARNm de TTR en el hígado, alcanzando una reducción máxima de ~ 90 % de reducción de ARNm para grupos formulados con tanto LNP09 como LNP11, relativo al grupo de control de PBC a 0,3 mg/kg y una dosis que consigue una reducción del 50 % (ED50) de < 0,03 mg/kg para LNP11-18534 y < 0,1 mg/kg para LNP09-18534.

Conclusiones

Este estudio demuestra que una infusión intravenosa IV única de 15 minutos de LNP09-18534 o LNP11-18534 en ratas Sprague-Dawley da como resultado una reducción dependiente de la dosis de ARNm de TTR del hígado. Estos datos demuestran la eficacia de LNP09-18328 y LNP11-18328 era reducción del ARNm de TTR (natural) expresado de manera endógena con los niveles de ED50 de <0,03 y <0,1 mg/kg para LNP11-18534 y LNP09-18534, respectivamente.

Ejemplo 17: Inhibición de TTR en seres humanos.

Se trató un individuo humano con ARNds fijado como objetivo a un gen de la TTR para inhibir la expresión del gen de la TTR para tratar una afección.

Se selecciona o identifica un individuo con necesidad de tratamiento. El individuo puede presentar un trastorno hepático, amiloidosis por transtiretina y/o un hígado trasplantado.

La identificación del individuo puede tener lugar en un contexto clínico o en cualquier otra parte, por ejemplo, en la casa del individuo por el propio uso del individuo de un estuche de autoensayo.

En el instante cero, se administra al individuo una primera dosis adecuada de un ARNsi anti-TTR. Se formula el ARNds como se describe en la presente memoria. Después de un periodo de tiempo después de la primera dosis, por ejemplo, 7 días, 14 días y 21 días, se evaluó el estado del individuo, por ejemplo, midiendo la función hepática. Esta medición puede ir acompañada de una medición de la expresión de TTR en dicho individuo y/o los productos del ARNsi exitoso de fijación como objetivo de ARNm de la TTR. También se pueden medir otros criterios relevantes. El número y la concentración de las dosis se ajustan de acuerdo con las necesidades del individuo.

Después de tratamiento, se reduce la velocidad de crecimiento del tumor del individuo relativa a la velocidad que existe previamente al tratamiento o relativa a la velocidad medida en un individuo afectado de manera similar pero no tratado.

La presente descripción se refiere además a los siguientes puntos:

1. Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) para inhibir la expresión de transtiretina (TTR), en donde dicho ARNds comprende una hebra transcrita y una hebra complementaria, comprendiendo la hebra complementaria una región complementaria a una parte de un ARNm que codifica transtiretina (TTR), en donde dicha región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud y la hebra complementaria comprende 15 o más

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2. El ARNds del punto 1, en donde la hebra transcrita comprende 15 o más nucleótidos contiguos de la SEC. ID N.° 169, la SEC. ID N.° 449, la SEC. ID N.° 729 o la SEC. ID N.° 1009.

3. El ARNds del punto 1, en donde la hebra transcrita consiste en la SEC. ID N.° 449 y la hebra complementaria consiste en la SEC. ID N.° 450.

4. El ARNds del punto 1, en donde la hebra transcrita consiste en la SEC. ID N.° 729 y la hebra complementaria consiste en la SEC. ID N.° 730.

5. El ARNds del punto 1, en donde la hebra transcrita consiste en la SEC. ID N.° 1009 y la hebra complementaria consiste en la SEC. ID N.° 1010.

6. El ARNds del punto 1, en donde el ARNds comprende una hebra transcrita seleccionada de las tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 y 16 y una hebra complementaria seleccionada de las tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 y 16.

7. El ARNds del punto 1 o 2 o 6, en donde la región de complementariedad tiene 19 nucleótidos de longitud.

8. El ARNds del punto 1 o 2 o 6, en donde la región de complementariedad consiste en la SEC. ID N.° 169.

9. El ARNds del punto 1o 2 o 6, en donde cada hebra del ARNds tiene 19, 20, 21, 22, 23 o 24 nucleótidos de

longitud.

10. El ARNds del punto 1 o 2 o 6, en donde cada hebra tiene 21 nucleótidos de longitud.

11. El ARNds de los puntos 1, 2, 3, 4, 5 o 6, en donde el ARNds no escinde un ARNm de la TTR entre el nucleótido

adenina en la posición 637 de la SEC. ID N.° 1331 y el nucleótido guanina en la posición 638 de la SEC. ID N.°

1331.

12. El ARNds de los puntos 1, 2, 3, 4, 5 o 6, en donde el ARNds escinde un ARNm de la TTR entre el nucleótido

guanina en la posición 636 de la SEC. ID N.° 1331 y el nucleótido adenina en la posición 637 de la SEC. ID N.°

1331.

13. El ARNds de los puntos 1, 2, 3, 4, 5 o 6, en donde el ARNds hibrida a un ARNm de la TTR entre el nucleótido

guanina en la posición 628 de la SEC. ID N.° 1331 y el nucleótido uracilo en la posición 646 de la SEC. ID N.° 1331.

14. El ARNds de los puntos 1, 2, 3, 4, 5 o 6, en donde dicho ARNds comprende al menos un nucleótido modificado.

15. El ARNds del punto 14, en donde al menos uno de dichos nucleótidos modificados se elige del grupo de: un nucleótido 2-O-metilo-modificado, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido terminal ligado a un derivado de colesterilo o un grupo bisdecilamida de ácido dodecanoico.

16. El ARNds del punto 14, en donde dicho nucleótido modificado se elige del grupo de: un nucleótido 2'-desoxi-2'- fluoro-modificado, un nucleótido 2'-desoxi-modificado, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido 2-amino-modificado, un nucleótido 2'-alquil-modificado, nucleótido de morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende base no natural.

17. El ARNds del punto 14, que comprende al menos un nucleótido 2-O-metilo-modificado.

18. El ARNds de los puntos 1, 2, 3, 4, 5 o 6, en donde el ARNds está conjugado a un ligando.

19. El ARNds de los puntos 1, 2, 3, 4, 5 o 6, en donde el ARNds se formula en una formulación de lípidos.

20. El ARNds del punto 19, en donde el ARNds se formula en una formulación de LNP, una formulación de LNP01, una formulación de XTC-SNALP o una formulación de SNALP.

21. El ARNds del punto 19, en donde el ARNds se formula en una formulación de XTC-SNALP como sigue: usando 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1.3]-dioxolano (XTC) con XTC/DPPC/colesterol/PEG-cDMA en una proporción de 57,1/7,1/34,4/1,4 y una proporción de lípido:ARNsi de aproximadamente 7.

22. El ARNds del punto 19, en donde la hebra transcrita consiste en la SEC. ID N.° 1009 y la hebra complementaria consiste en la SEC. ID N.° 1010 y en donde el ARNds se formula en una formulación de XTC-SNALP como sigue: usando 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1.3]-dioxolano (XTC) con XTC/DPPC/colesterol/PEG-cDMA en una proporción de 57,1/7,1/34,4/1,4 y una proporción de lípido:ARNsi de aproximadamente 7.

23. El ARNds del punto 19, en donde el ARNds se formula en una formulación de LNP09 como sigue: usando XTC/DSPC/Col/PEG2000-C14 en una proporción de 50/10/38,5/1,5 % en moles y una proporción de lípido:ARNsi de aproximadamente 11:1.

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24. El ARNds del punto 19, en donde el ARNds se formula en una formulación de LNP11 como sigue: usando MC3/DSPC/Col/PEG2ooo-C14 en una proporción de 50/10/38,5/1,5 % en moles y una proporción de lípido:ARNsi de aproximadamente 11:1.

25. El ARNds del punto 19, en donde el ARNds se formula en una formulación de LNP09 o una formulación de LNP11 y reduce los niveles de ARNm de la TTR por aproximadamente 85 % a 90 % con una dosis de 0,3 mg/kg, en relación con un grupo de control de PBS.

26. El ARNds del punto 19, en donde el ARNds se formula en una formulación de LNP09 o una formulación de LNP11 y reduce los niveles de ARNm de la TTR por aproximadamente 50 % con una dosis de 0,1 mg/kg, en relación con un grupo de control de PBS.

27. El ARNds del punto 19, en donde el ARNds se formula en una formulación de LNP09 o una formulación de LNP11 y reduce los niveles de proteína TTR de una manera dependiente de la dosis en relación con un grupo de control de PBS cuando se mide mediante un método western.

28. El ARNds del punto 19, en donde el ARNds se formula en una formulación de SNALP como sigue: usando DlinDMA con un DLinDMA/DPPC/colesterol/PEG2000-cDMA en una proporción de 57,1/7,1/34,4/1,4 y una proporción de lípido:ARNsi de aproximadamente 7.

29. El ARNds de los puntos 1, 2, 3, 4, 5 o 6, en donde la administración del ARNds a una célula da como resultado una inhibición de aproximadamente el 95 % de expresión de ARNm de la TTR cuando se mide por un ensayo PCR en tiempo real, en donde la célula es una célula HepG2 o una célula Hep3B y en donde la concentración del ARNds es 10 nM.

30. El ARNds de los puntos 1, 2, 3, 4, 5 o 6, en donde la administración del ARNds a una célula da como resultado una inhibición de aproximadamente el 74 % de expresión de ARNm de la TTR cuando se mide mediante un ensayo de ADN ramificado, en donde la célula es una célula HepG2 o una célula Hep3B y en donde la concentración del ARNds es 10 nM.

31. El ARNds de los puntos 1, 2, 3, 4, 5 o 6, en donde el ARNds tiene un IC50 menor que 10 pM en una célula HepG2 y en donde la concentración del ARNds es 10 nM.

32. El ARNds de los puntos 1, 2, 3, 4, 5 o 6, en donde el ARNds tiene un ED50 de aproximadamente 1 mg/kg.

33. El ARNds de los puntos 1, 2, 3, 4, 5 o 6, en donde la administración del ARNds reduce el ARNm de la TTR por aproximadamente el 80 % en hígado de mono cynomolgus, en donde la concentración del ARNds es 3 mg/kg.

34. El ARNds de los puntos 1, 2, 3, 4, 5 o 6, en donde la administración del ARNds no da como resultado actividad inmunoestimuladora en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) cuando se mide por ensayos ELISA IFN-alfa y TNF-alfa.

35. El ARNds de los puntos 1, 2, 3, 4, 5 o 6, en donde la administración del ARNds reduce los niveles de ARNm de la TTR en el hígado por aproximadamente el 97 % o los niveles de proteína TTR en suero por aproximadamente el 90 %, en donde la concentración del ARNds es 6 mg/kg.

36. El ARNds de los puntos 1, 2, 3, 4, 5 o 6, en donde la administración del ARNds reduce los niveles de ARNm de la TTR en el hígado y/o los niveles de proteína TTR en suero hasta 22 días, en donde la concentración del ARNds es 6 mg/kg o 3 mg/kg.

37. El ARNds de los puntos 1, 2, 3, 4, 5 o 6, donde el ARNds suprime los niveles de proteína TTR en suero hasta el

día 14 postratamiento cuando se administra a un individuo con necesidad del mismo a 1 mg/kg o 3 mg/kg.

38. El ARNds de los puntos 1,2, 3, 4, 5 o 6, en donde el ARNds reduce la expresión de TTR por un 98,9 % en una

célula Hep3B en una concentración 0,1 nM cuando se mide por PCR en tiempo real.

39. El ARNds de los puntos 1,2, 3, 4, 5 o 6, en donde el ARNds reduce la expresión de TTR por un 99,4 % en una

célula Hep3B en una concentración 10 nM cuando se mide por PCR en tiempo real.

40. Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) para inhibir la expresión de la transtiretina (TTR), en el que dicho ARNds comprende una hebra transcrita y una hebra complementaria, comprendiendo la hebra complementaria una región complementaria a una parte de un ARNm que codifica transtiretina (TTR), en donde dicha región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud y en donde el ARNds comprende una hebra transcrita seleccionada de las tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 y 16 y una hebra complementaria seleccionada de las tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 y 16.

41. Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) para inhibir la expresión de la transtiretina (TTR), en donde dicho ARNds comprende una hebra complementaria que comprende una región complementaria a 15-30 nucleótidos de los nucleótidos 618-648 de la SEC ID N.° 1331 y en donde dicha base de la hebra complementaria se empareja con

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la guanina en la posición 628 de la SEC. ID N.° 1331.

42. Una célula que contiene el ARNds de los puntos 1-41.

43. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una hebra del ARNds según los puntos 1-41.

44. Una célula que contiene el vector del punto 43.

45. Una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen de la TTR que comprende el ARNds según los puntos 1-41 y un portador farmacéuticamente aceptable.

46. Una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen de la TTR que comprende un ARNds y una formulación de SNALP, en donde el ARNds comprende una hebra complementaria que tiene menos de 30 nucleótidos de longitud y comprende 15 o más nucleótidos contiguos de la sEc. ID N.° 170, SEC. ID N.° 450, SEC. ID N.° 730 o SEC. ID N.° 1010 y en donde la formulación de SNALP comprende DlinDMA, DPPC, colesterol y PEG2000-cDMA en una proporción de 57,1/7,1/34,4/1,4, respectivamente.

47. Un método para inhibir la expresión de la TTR en una célula, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto la célula con el ARNds según los puntos 1-41 y

(b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación de la transcripción de ARNm de un gen de la TTR, inhibiendo de ese modo la expresión del gen de la TTR en la célula.

48. Un método para tratar un trastorno mediado por expresión de TTR, que comprende administrar a un ser humano con necesidad de dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz del ARNds de los puntos 1-41.

49. El método según el punto 48, en el que el ARNds se administra al ser humano a aproximadamente 0,01; 0,1; 0,5; 1,0; 2,5 o 5,0 mg/kg.

50. El método según los puntos 48-49, en donde el ARNds se administra al ser humano a aproximadamente 1,0 mg/kg.

51. El método según los puntos 48-50, en donde el ser humano presenta amiloidosis por transtiretina.

52. El método según los puntos 48-51, en donde el ser humano presenta un trastorno hepático.

53. El método según los puntos 48-52, en donde el ser humano se somete además a trasplante de hígado.

54. El método según los puntos 48-53, en donde la administración del ARNds reduce el ARNm de la TTR por

aproximadamente un 80 % en hígado humano, en donde la concentración del ARNds es 3 mg/kg.

55. El método según los puntos 48-54, en donde la administración del ARNds no da como resultado actividad inmunoestimuladora en el ser humano cuando se mide por ensayos ELISA de IFN-alfa y TNF-alfa.

56. El método según los puntos 48-55, en donde la administración del ARNds reduce los niveles de ARNm de la TTR en el hígado por aproximadamente un 97 % o los niveles de proteína TTR en suero por aproximadamente un 90 %, en donde la concentración del ARNds es 6 mg/kg.

57. El método según los puntos 48-56, en donde la administración del ARNds reduce los niveles de ARNm de la TTR en el hígado y/o los niveles de proteína TTR en suero hasta 22 días, en donde la concentración del ARNds es 6 mg/kg o 3 mg/kg.

58. El método según los puntos 48-57, en donde el ARNds se formula en una formulación de LNP09 como sigue: usando XTC/DSPC/Col/PEG2000-C14 en una proporción de 50/10/38,5/1,5 % en moles y una proporción de lípido:ARNsi de aproximadamente 11:1.

59. El método según los puntos 48-58, en donde el ARNds se formula en una formulación de LNP11 como sigue: usando MC3/DSPC/Col/PEG2000-C14 en una proporción de 50/10/38,5/1,5 % en moles y una proporción de lípido:ARNsi de aproximadamente 11:1.

60. El método según los puntos 48-59, en donde el ARNds se formula en una formulación de LNP09 o una

formulación de LNP11 y reduce los niveles de ARNm de la TTR por aproximadamente un 85 % a 90 % con una

dosis de 0,3 mg/kg, en relación con un grupo de control de PBC.

61. El método según los puntos 48-60, en donde el ARNds se formula en una formulación de LNP09 o una

formulación de LNP11 y reduce los niveles de ARNm de la TTR por aproximadamente un 50 % con una dosis de 0,1

mg/kg, en relación con un grupo de control de PBC.

62. El método según los puntos 48-61, en donde el ARNds se formula en una formulación de LNP09 o una formulación de LNP11 y reduce los niveles de proteína TTR de una manera dependiente de la dosis en relación a un grupo de control de PBC cuando se mide por un método western.

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63. El método según los puntos 48-62, donde el ARNds suprime los niveles de proteína TTR en suero hasta el día 14 postratamiento cuando se administra a un ser humano a 1 mg/kg o 3 mg/kg.

64. El método según los puntos 48-63, en donde el ARNds se formula en una formulación de SNALP como sigue: usando DlinDMA con un DLinDMA/DPPC/colesterol/PEG2000-cDMA en una proporción de 57,1/7,1/34,4/1,4 y una proporción de lípido:ARNsi de aproximadamente 7.

65. Uso de un ARNds para tratar un trastorno mediado por expresión de TTR que comprende administrar a un ser humano con necesidad de dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz del ARNds según los puntos 141.

66. El uso según el punto 65, en donde el ARNds se administra al ser humano a aproximadamente 0,01; 0,1; 0,5; 1,0; 2,5 o 5,0 mg/kg.

67. El uso según los puntos 65-66, en donde el ARNds se administra al ser humano a aproximadamente 1,0 mg/kg.

68. El uso según los puntos 65-67, en donde el ser humano tiene amiloidosis por transtiretina.

69. El uso según los puntos 65-68, en donde el ser humano tiene un trastorno hepático.

70. El uso según los puntos 65-69, en donde el ser humano se somete además a trasplante de hígado.

71. Uso de un ARNds para inhibir la expresión de la TTR en una célula, comprendiendo el uso:

(a) poner en contacto la célula con el ARNds según los puntos 1-41 y

(b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación de la transcripción de ARNm de un gen de la TTR, inhibiendo de ese modo la expresión del gen de la TTR en la célula.

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Listado de secuencias

<110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC.

<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA INHIBIR LA EXPRESIÓN DE LA TRANSTIRETINA <130> T1668 EP/1

<150> Patente de EE. UU. 61/244,794 <151> 2009-09-22 <150> Patente de EE. UU. 61/242,783 <151> 2009-09-15 <150> Patente de EE. UU. 61/185,545 <151> 2009-06-09 <150> Patente de EE. UU. 61/156,670 <151> 2009-03-02 <150> Patente de EE. UU. 61/115,738 <151> 2008-11-18 <150> Patente de EE. UU. 61/106,956 <151> 2008-10-20 <160> 1410

<170> Patentln versión 3.5

<210> 1

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<212> ARN

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<400> 1

ccggugaauccaagugucc 19

<210> 2

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<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 2

ggacacuugg auucaccgg 19

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<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 3

acucauucuu ggcaggaug 19

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<212> ARN

<213> Homo sapiens

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cauccugcca agaaugagu 19

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 5 <400>5

aaguguccucugaugguca 19

<210>6 <211> 19 <212> ARN

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ugaccaucag aggacacuu 19

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<213> Homo sapiens <400> 7

ucauucuugg caggauggc 19

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<212> ARN <213> Homo sapiens <400> 8

gccauccugc caagaauga 19

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<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 9

30 aaguucuaga ugcuguccg 19

<210> 11 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 35 <210> 10

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<213> Homo sapiens <400> 10

cggacagcaucuagaacuu 19

5 <400> 11

guucuagaug cuguccgag 19

<210> 12 <211> 19 <212> ARN

10 <213> Homo sapiens

<400> 12

cucggacagc aucuagaac 19

<210> 13 <211> 19 15 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 13

cuagaugcug uccgaggca 19

<210> 14 20 <211> 19

<212> ARN <213> Homo sapiens <400> 14

ugccucggac agcaucuag 19

25 <210> 15

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 15

30 gaugcugucc gaggcaguc 19

<210> 16 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 35 <400> 16

gacugccucg gacagcauc 19

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens 5 <400> 17

cauucuuggcaggauggcu 19

<210> 18 <211> 19 <212> ARN

10 <213> Homo sapiens

<400> 18

agccauccug ccaagaaug 19

<210> 19 <211> 19 15 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 19

ugcuguccga ggcaguccu 19

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<212> ARN <213> Homo sapiens <400> 20

aggacugccu cggacagca 19

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<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 21

30 ccgaggcagu ccugccauc 19

<210> 22 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 35 <400> 22

gauggcagga cugccucgg 19

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens 5 <400> 23

caguccugccaucaaugug 19

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10 <213> Homo sapiens

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cacauugaug gcaggacug 19

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caauguggccgugcaugug 19

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<212> ARN <213> Homo sapiens <400> 26

cacaugcacg gccacauug 19

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30 auguguucag aaaggcugc 19

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gcagccuuucugaacacau 19

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens 5 <400> 29

cagaaguccacucauucuu 19

<210> 30 <211> 19 <212> ARN

10 <213> Homo sapiens

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aagaaugagu ggacuucug 19

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<213> Homo sapiens <400> 31

ggcaggaugg cuucucauc 19

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<212> ARN <213> Homo sapiens <400> 32

gaugagaagc cauccugcc 19

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30 gagccauuug ccucuggga 19

<210> 34 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 35 <400> 34

ucccagaggcaaauggcuc 19

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<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens <400> 35

caggauggcu ucucaucgu 19

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<212> ARN

<213> Homo sapiens

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acgaugagaa gccauccug 19

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<212> ARN

<213> Homo sapiens

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aggauggcuu cucaucguc 19

<210> 38

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 38

gacgaugaga agccauccu 19

<210> 39

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 39

agagcugcau gggcucaca 19

<210> 40

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 40

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens 5 <400> 41

gcugcauggg cucacaacu 19

<210> 42 <211> 19 <212> ARN

10 <213> Homo sapiens

<400> 42

aguugugagcccaugcagc 19

<210> 43 <211> 19 15 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 43

ggauggcuuc ucaucgucu 19

<210> 44 20 <211> 19

<212> ARN <213> Homo sapiens <400> 44

agacgaugag aagccaucc 19

25 <210> 45

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 45

30 gcaugggcuc acaacugag 19

<210> 46 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 35 <400> 46

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 5 <400> 47

augggcucacaacugagga 19

<210> 48 <211> 19 <212> ARN

10 <213> Homo sapiens

<400> 48

uccucaguug ugagcccau 19

<210> 49 <211> 19 15 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 49

ugggcucacaacugaggag 19

<210> 50 20 <211> 19

<212> ARN <213> Homo sapiens <400> 50

cuccucaguu gugagccca 19

25 <210> 51

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 51

30 gaggaauuug uagaaggga 19

<210> 52 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 35 <400> 52

ucccuucuac aaauuccuc 19

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens 5 <400> 53

uuuguagaag ggauauaca 19

<210> 54 <211> 19 <212> ARN

10 <213> Homo sapiens

<400> 54

uguauaucccuucuacaaa 19

<210> 55 <211> 19 15 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 55

uuguagaagg gauauacaa 19

<210> 56 20 <211> 19

<212> ARN <213> Homo sapiens <400> 56

uuguauaucc cuucuacaa 19

25 <210> 57

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 57

30 uguagaaggg auauacaaa 19

<210> 58 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 35 <400> 58

uuuguauaucccuucuaca 19

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens 5 <400> 59

agaagggaua uacaaagug 19

<210> 60 <211> 19 <212> ARN

10 <213> Homo sapiens

<400> 60

cacuuuguau aucccuucu 19

<210> 61 <211> 19 15 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 61

aaguggaaau agacaccaa 19

<210> 62 20 <211> 19

<212> ARN <213> Homo sapiens <400> 62

uuggugucua uuuccacuu 19

25 <210> 63

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 63

30 ggaaauagac accaaaucu 19

<210> 64 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 35 <400> 64

agauuuggug ucuauuucc 19

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens 5 <400> 65

gaaauagacaccaaaucuu 19

<210> 66 <211> 19 <212> ARN

10 <213> Homo sapiens

<400> 66

aagauuuggu gucuauuuc 19

<210> 67 <211> 19 15 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 67

auagacacca aaucuuacu 19

<210> 68 20 <211> 19

<212> ARN <213> Homo sapiens <400> 68

aguaagauuu ggugucuau 19

25 <210> 69

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 69

30 uagacaccaa aucuuacug 19

<210> 70 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 35 <400> 70

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens 5 <400> 71

agacaccaaa ucuuacugg 19

<210> 72 <211> 19 <212> ARN

10 <213> Homo sapiens

<400> 72

ccaguaagau uuggugucu 19

<210> 73 <211> 19 15 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 73

uuacuggaag gcacuuggc 19

<210> 74 20 <211> 19

<212> ARN <213> Homo sapiens <400> 74

gccaagugcc uuccaguaa 19

25 <210> 75

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 75

30 uucucaucgu cugcuccuc 19

<210> 76 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 35 <400> 76

gaggagcaga cgaugagaa 19

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens 5 <400> 77

ggaaggcacu uggcaucuc 19

<210> 78 <211> 19 <212> ARN

10 <213> Homo sapiens

<400> 78

gagaugccaa gugccuucc 19

<210> 79 <211> 19 15 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 79

ggcacuuggc aucucccca 19

<210> 80 20 <211> 19

<212> ARN <213> Homo sapiens <400> 80

uggggagaug ccaagugcc 19

25 <210> 81

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 81

30 ggcaucuccccauuccaug 19

<210> 82 <211> 20 <212>ADN <213> Homo sapiens 35 <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 82

auggaauggg gagaugcctt 20

<210> 83 5 <211> 19

<212> ARN <213> Homo sapiens <400> 83

gcaucucccc auuccauga 19

10 <210> 84

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 84

15 ucauggaaug gggagaugc 19

<210> 85 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 20 <400> 85

caucucccca uuccaugag 19

<210> 86 <211> 19 <212> ARN

25 <213> Homo sapiens

<400> 86

cucauggaau ggggagaug 19

<210> 87 <211> 19 30 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 87

aucuccccau uccaugagc 19

<210> 88 35 <211> 19

<210> 89 5 <211> 19

<212>ARN <213> Homo sapiens <400> 89

cuccccauuc caugagcau 19

10 <210> 90

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 90

15 augcucaugg aauggggag 19

<210> 91 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 20 <400> 91

cccauuccaugagcaugca 19

<210> 92 <211> 19 <212> ARN

25 <213> Homo sapiens

<400> 92

ugcaugcuca uggaauggg 19

<210> 93 <211> 19 30 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 93

ccaugagcau gcagaggug 19

<210> 94 35 <211> 19

<210> 95 5 <211> 19

<212>ARN <213> Homo sapiens <400> 95

agcaugcaga ggugguauu 19

10 <210> 96

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 96

15 aauaccaccu cugcaugcu 19

<210> 97 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 20 <400> 97

caugcagagg ugguauuca 19

<210> 98 <211> 19 <212> ARN

25 <213> Homo sapiens

<400> 98

ugaauaccaccucugcaug 19

<210> 99 <211> 19 30 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 99

augcagaggu gguauucac 19

<210> 100 35 <211> 19

gugaauacca ccucugcau 19

<210> 101 5 <211> 19

<212>ARN <213> Homo sapiens <400> 101

ggugguauuc acagccaac 19

10 <210> 102 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 102

15 guuggcugug aauaccacc 19

<210> 103 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 20 <400> 103

gugguauucacagccaacg 19

<210> 104 <211> 19 <212> ARN

25 <213> Homo sapiens

<400> 104

cguuggcugu gaauaccac 19

<210> 105 <211> 19 30 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 105

ugguauucacagccaacga 19

<210> 106 35 <211> 19

<210> 107 5 <211> 19

<212>ARN <213> Homo sapiens <400> 107

gguauucaca gccaacgac 19

10 <210> 108 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 108

15 gucguuggcugugaauacc 19

<210> 109 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 20 <400> 109

guauucacag ccaacgacu 19

<210> 110 <211> 19 <212> ARN

25 <213> Homo sapiens

<400> 110

agucguuggcugugaauac 19

<210> 111 <211> 19 30 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 111

uauucacagc caacgacuc 19

<210> 112 35 <211> 19

gagucguuggcugugaaua 19

<210> 113 5 <211> 19

<212> ARN <213> Homo sapiens <400> 113

ucacagccaa cgacuccgg 19

10 <210> 114

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 114

15 ccggagucgu uggcuguga 19

<210> 115 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 20 <400> 115

ccccgccgcu acaccauug 19

<210> 116 <211> 19 <212> ARN

25 <213> Homo sapiens

<400> 116

caauggugua gcggcgggg 19

<210> 117 <211> 19 30 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 117

gaaguccacu cauucuugg 19

<210> 118 35 <211> 19

ccaagaauga guggacuuc 19

<210> 119 5 <211> 19

<212>ARN <213> Homo sapiens <400> 119

cccugcugag ccccuacuc 19

10 <210> 120 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 120

15 gaguaggggc ucagcaggg 19

<210> 121 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 20 <400> 121

cugagccccu acuccuauu 19

<210> 122 <211> 19 <212> ARN

25 <213> Homo sapiens

<400> 122

aauaggaguaggggcucag 19

<210> 123 <211> 19 30 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 123

ugagccccua cuccuauuc 19

<210> 124 35 <211> 19

gaauaggaguaggggcuca 19

<210> 125 5 <211> 19

<212> ARN <213> Homo sapiens <400> 125

ccccuacucc uauuccacc 19

10 <210> 126 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 126

15 gguggaauag gaguagggg 19

<210> 127 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 20 <400> 127

cuacuccuau uccaccacg 19

<210> 128 <211> 19 <212> ARN

25 <213> Homo sapiens

<400> 128

cgugguggaa uaggaguag 19

<210> 129 <211> 19 30 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 129

uacuccuauu ccaccacgg 19

<210> 130 35 <211> 19

ccguggugga auaggagua 19

<210> 131 5 <211> 19

<212>ARN <213> Homo sapiens <400> 131

acuccuauuc caccacggc 19

10 <210> 132

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 132

15 gccguggugg aauaggagu 19

<210> 133 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens 20 <400> 133

uccuauuccaccacggcug 19

<210> 134 <211> 19 <212> ARN

25 <213> Homo sapiens

<400> 134

cagccguggu ggaauagga 19

<210> 135 <211> 19 30 <212> ARN

<213> Homo sapiens <400> 135

uauuccaccacggcugucg 19

<210> 136 35 <211> 19

5

10

15

20

25

30

35

cgacagccgu gguggaaua

<210> 137

<211> 19

<212>ARN

<213> Homo sapiens

<400> 137

auuccaccac ggcugucgu

<210> 138

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 138

acgacagccg ugguggaau

<210> 139

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 139

caccacggcu gucgucacc

<210> 140

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 140

ggugacgaca gccguggug

<210> 141

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 141

accacggcug ucgucacca <210> 142 <211> 19 <212> ARN

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

uggugacgac agccguggu

<210> 143

<211> 19

<212>ARN

<213> Homo sapiens

<400> 143

ccacggcugu cgucaccaa

<210> 144

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 144

uuggugacga cagccgugg

<210> 145

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 145

acggcugucg ucaccaauc

<210> 146

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 146

gauuggugac gacagccgu

<210> 147

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 147

cggcugucgu caccaaucc <210> 148 <211> 19 <212> ARN

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

ggauugguga cgacagccg

<210> 149

<211> 19

<212>ARN

<213> Homo sapiens

<400> 149

cgucaccaau cccaaggaa

<210> 150

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 150

uuccuuggga uuggugacg

<210> 151

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 151

caaucccaag gaaugaggg

<210> 152

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 152

cccucauucc uugggauug

<210> 153

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 153

ccugaaggac gagggaugg <210> 154 <211> 19 <212> ARN

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

ccaucccucg uccuucagg

<210> 155

<211> 19

<212>ARN

<213> Homo sapiens

<400> 155

ggacgaggga ugggauuuc

<210> 156

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 156

gaaaucccau cccucgucc

<210> 157

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 157

aaguccacuc auucuuggc

<210> 158

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 158

gccaagaaug aguggacuu

<210> 159

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 159

gggauuucau guaaccaag <210> 160 <211> 19 <212> ARN

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

cuugguuaca ugaaauccc

<210> 161

<211> 19

<212>ARN

<213> Homo sapiens

<400> 161

ggauuucaug uaaccaaga

<210> 162

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 162

ucuugguuac augaaaucc

<210> 163

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 163

ucauguaacc aagaguauu

<210> 164

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 164

aauacucuug guuacauga

<210> 165

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 165

auguaaccaa gaguauucc <210> 166 <211> 19 <212> ARN

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

ggaauacucu ugguuacau

<210> 167

<211> 19

<212>ARN

<213> Homo sapiens

<400> 167

uguaaccaag aguauucca <210> 168 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 168

uggaauacuc uugguuaca

<210> 169

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 169

guaaccaaga guauuccau

<210> 170

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 170

auggaauacu cuugguuac

<210> 171

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 171

ugccuugcug gacugguau <210> 172 <211> 19 <212> ARN

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

auaccagucc agcaaggca

<210> 173

<211> 19

<212>ARN

<213> Homo sapiens

<400> 173

uaaagcagug uuuucaccu

<210> 174

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 174

aggugaaaac acugcuuua

<210> 175

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 175

gccuugcugg acugguauu

<210> 176

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 176

aauaccaguc cagcaaggc

<210> 177

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 177

uguuuucacc ucauaugcu <210> 178 <211> 19 <212> ARN

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

agcauaugag gugaaaaca

<210> 179

<211> 19

<212>ARN

<213> Homo sapiens

<400> 179

guuuucaccu cauaugcua

<210> 180

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 180

uagcauauga ggugaaaac <210> 181 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 181

uuuucaccuc auaugcuau <210> 182 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 182

auagcauaug aggugaaaa

<210> 183

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 183

uucaccucau augcuaugu <210> 184 <211> 19 <212> ARN

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

acauagcaua ugaggugaa

<210> 185

<211> 19

<212>ARN

<213> Homo sapiens

<400> 185

caccucauau gcuauguua

<210> 186

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 186

uaacauagca uaugaggug

<210> 187

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 187

ccuugcugga cugguauuu

<210> 188

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 188

aaauaccagu ccagcaagg

<210> 189

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 189

auaugcuaug uuagaaguc <210> 190 <211> 19 <212> ARN

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

gacuucuaac auagcauau

<210> 191

<211> 19

<212>ARN

<213> Homo sapiens

<400> 191

uaugcuaugu uagaagucc

<210> 192

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 192

ggacuucuaa cauagcaua

<210> 193

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 193

ugcuauguua gaaguccag

<210> 194

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 194

cuggacuucu aacauagca

<210> 195

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 195

cuugcuggac ugguauuug <210> 196 <211> 19 <212> ARN

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

caaauaccag uccagcaag 19

<210> 197

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 197

aguccaggca gagacaaua 19

<210> 198

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 198

auugucucug ccuggacutt 20

<210> 199

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 199

uccaggcagagacaauaaa 19

<210> 200 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 200

uuuauugucu cugccugga 19

<210> 201 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 201

gugaaaggcacuuuucauu 19

5

10

15

20

25

30

35

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens <400> 202

aaugaaaagu gccuuucac 19

<210> 203

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 203

uggacuggua uuugugucu 19

<210> 204

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 204

agacacaaau accagucca 19

<210> 205

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 205

gucugaggcu ggcccuacg 19

<210> 206

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 206

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<210> 207

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 207

cugaggcugg cccuacggg 19

5

10

15

20

25

30

35

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 208

cccguagggc cagccucag

<210> 209

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 209

gaggcuggcc cuacgggca

<210> 210

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 210

ugcccguagg gccagccuc <210> 211 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 211

aggcuggccc uacgggcac

<210> 212

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

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gugcccguag ggccagccu

<210> 213

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

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gcuggcccua cgggcaccg

19

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

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cggugcccgu agggccagc

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<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

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cuggcccuac gggcaccgg

<210> 216

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 216

ccggugcccg uagggccag

<210> 217

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 217

ggcccuacgg gcaccggug

<210> 218

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 218

caccggugcc cguagggcc

<210> 2

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 2

ccacucauuc uuggcagga

19

19

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens <400> 220

uccugccaag aaugagugg <210> 221 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 221

ccuacgggca ccggugaau

<210> 222

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 222

auucaccggu gcccguagg

<210> 223

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 223

cuacgggcac cggugaauc

<210> 224

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 224

gauucaccgg ugcccguag

<210> 225

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 225

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

<211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 226

ggauucaccg gugcccgua

<210> 227

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 227

acgggcaccg gugaaucca

<210> 228

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 228

uggauucacc ggugcccgu

<210> 229

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 229

gcaccgguga auccaagug

<210> 230

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 230

cacuuggauu caccggugc

<210> 231

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 231

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens <400> 232

acacuuggau ucaccggug

<210> 233

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 233

uguggccaug cauguguuc

<210> 234

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 234

gaacacaugc auggccaca

<210> 235

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 235

guggccaugc auguguuca

<210> 236

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 236

ugaacacaug cauggccac

<210> 237

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 237

gccaugcaug uguucagaa

19

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens <400> 238

uucugaacacaugcauggc 19

<210> 239

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 239

uauuccaccacggcuguca 19

<210> 240

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 240

ugacagccgu gguggaaua 19

<210> 241

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 241

gucaucacca aucccaagg 19

<210> 242

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 242

ccuugggauu ggugaugac 19

<210> 243

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 243

5

10

15

20

25

30

35

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens <400> 244

acuuugaccaucagaggac 19

<210> 245

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 245

gauggucaaaguucuagau 19

<210> 246

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 246

aucuagaacu uugaccauc 19

<210> 247

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 247

augcuguccg aggcagucc 19

<210> 248

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 248

ggacugccucggacagcau 19

<210> 249

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

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ccgugcaugu guucagaaa 19

5

10

15

20

25

30

35

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens <400> 250

uuucugaaca caugcacgg

<210> 251

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 251

agucuggaga gcugcaugg

<210> 252

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 252

ccaugcagcu cuccagacu

<210> 253

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 253

caugggcuca caacugagg

<210> 254

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 254

ccucaguugu gagcccaug

<210> 255

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 255

ucucaucguc ugcuccucc

19

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens <400> 256

ggaggagcag acgaugaga 19

<210> 257

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 257

ccccauucca ugagcaugc 19

<210> 258

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 258

gcaugcucau ggaaugggg 19

<210> 259

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 259

gccccuacuccuauuccac 19

<210> 260

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 260

guggaauagg aguaggggc 19

<210> 261

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 261

cuauuccaccacggcuguc 19

5

10

15

20

25

30

35

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens <400> 262

gacagccgug guggaauag 19

<210> 263

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 263

cacggcuguc gucaccaau 19

<210> 264

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 264

auuggugacg acagccgug 19

<210> 265

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 265

aggacgaggg augggauuu 19

<210> 266

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 266

aaaucccauc ccucguccu 19

<210> 267

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 267

ucaccucaua ugcuauguu 19

5

10

15

20

25

30

35

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens <400> 268

aacauagcau augagguga

<210> 269

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 269

ccucauaugc uauguuaga

<210> 270

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 270

ucuaacauag cauaugagg

<210> 271

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 271

auguuagaag uccaggcag

<210> 272

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 272

cugccuggac uucuaacau

<210> 273

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 273

ucugaggcug gcccuacgg

19

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens <400> 274

ccguagggcc agccucaga

<210> 275

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 275

ggcccuacgg gcaccggug

<210> 276

<211> 19

<212> ARN

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<400> 276

caccggugcc cguagggcc

<210> 277

<211> 19

<212> ARN

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<400> 277

gggcaccggu gaauccaag

<210> 278

<211> 19

<212> ARN

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<400> 278

cuuggauuca ccggugccc

<210> 279

<211> 19

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 279

ccaugcaugu guucagaaa

19

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

<211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens <400> 280

uuucugaaca caugcaugg 19

<210> 281 <211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 281

ccggugaauc caaguguccn n

<210> 282

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 282

ggacacuugg auucaccggn n

<210> 283

<211> 21

<212> ADN

21

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 283

acucauucuu ggcaggaugn n 21

<210> 284

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 284

cauccugcca agaaugagun n 21

<210> 285

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 285

aaguguccuc ugauggucan n 21

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 286

ugaccaucag aggacacuun n 21

<210> 287

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 287

ucauucuugg caggauggcn n 21

<210> 288 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

5

10

15

20

25

30

35

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 288

gccauccugc caagaaugan n 21

<210> 289

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 289

aaguucuaga ugcuguccgn n 21

<210> 290

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 290

cggacagcau cuagaacuun n 21

<210> 291

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

5

10

15

20

25

30

35

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 291

guucuagaug cuguccgagn n 21

<210> 292

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 292

cucggacagc aucuagaacn n 21

<210> 293

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 293

cuagaugcug uccgaggcan n 21

<210> 294

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<220>

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 294

ugccucggac agcaucuagn n 21

<210> 295

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 295

gaugcugucc gaggcagucn n 21

<210> 296

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 296

gacugccucg gacagcaucn n 21

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 297

cauucuuggc aggauggcun n 21

<210> 298

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 298

agccauccug ccaagaaugn n 21

<210> 299

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro

5

10

15

20

25

30

35

<400> 299

ugcuguccga ggcaguccun n 21

<210> 300

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 300

aggacugccu cggacagcan n 21

<210> 301

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 301

ccgaggcagu ccugccaucn n 21

<210> 302

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

5

10

15

20

25

30

35

<223> a, c, t, g, desconocido u otro<400> 302

gauggcagga cugccucggn n 21

<210> 303

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 303

caguccugcc aucaaugugn n 21

<210> 304

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 304

cacauugaug gcaggacugn n 21

<210> 305

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

5

10

15

20

25

30

35

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 305

caauguggcc gugcaugugn n 21

<210> 306

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 306

cacaugcacg gccacauugn n 21

<210> 307

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 307

auguguucag aaaggcugcn n 21

<210> 308

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 308

gcagccuuuc ugaacacaun n 21

<210> 309

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 309

cagaagucca cucauucuun n 21

<210> 310

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 310

aagaaugagu ggacuucugn n 21

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 311

ggcaggaugg cuucucaucn n 21

<210> 312

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 312

gaugagaagc cauccugccn n 21

<210> 313

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro

5

10

15

20

25

30

35

<400> 313

gagccauuug ccucugggan n 21

<210> 314

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 314

ucccagaggc aaauggcucn n 21

<210> 315

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 315

caggauggcu ucucaucgun n 21

<210> 316

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<220>

5

10

15

20

25

30

35

<222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 316

acgaugagaa gccauccugn n 21

<210> 317

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 317

aggauggcuu cucaucgucn n 21

<210> 318

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 318

gacgaugaga agccauccun n 21

<210> 319

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 319

agagcugcau gggcucacan n 21

<210> 320

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 320

ugugagccca ugcagcucun n 21

<210> 321

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 321

gcugcauggg cucacaacun n 21

<210> 322 <211> 21

5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 322

aguugugagc ccaugcagcn n 21

<210> 323

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 323

ggauggcuuc ucaucgucun n 21

<210> 324

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 324

5

10

15

20

25

30

35

agacgaugag aagccauccn n

21

<210> 325

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 325

gcaugggcuc acaacugagn n 21

<210> 326

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 326

cucaguugug agcccaugcn n 21

<210> 327

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

5

10

15

20

25

30

35

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 327

augggcucac aacugaggan n 21

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<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 328

uccucaguug ugagcccaun n 21

<210> 329

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 329

ugggcucaca acugaggagn n 21

<210> 330

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

5

10

15

20

25

30

35

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 330

cuccucaguu gugagcccan n 21

<210> 331

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 331

gaggaauuug uagaagggan n 21

<210> 332

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 332

ucccuucuac aaauuccucn n 21

<210> 333 <211> 21 <212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 333

uuuguagaag ggauauacan n 21

<210> 334

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 334

uguauauccc uucuacaaan n 21

<210> 335

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 335

uuguagaagg gauauacaan n 21

5

10

15

20

25

30

35

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 336

uuguauaucc cuucuacaan n 21

<210> 337

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 337

uguagaaggg auauacaaan n 21

<210> 338

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

5

10

15

20

25

30

35

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 338

uuuguauauc ccuucuacan n 21

<210> 339

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 339

agaagggaua uacaaagugn n 21

<210> 340

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 340

cacuuuguau aucccuucun n 21

<210> 341

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

5

10

15

20

25

30

35

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 341

aaguggaaau agacaccaan n 21

<210> 342

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 342

uuggugucua uuuccacuun n 21

<210> 343

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 343

ggaaauagac accaaaucun n 21

<210> 344

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 344

agauuuggug ucuauuuccn n 21

<210> 345

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 345

gaaauagaca ccaaaucuun n 21

<210> 346

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 346

aagauuuggu gucuauuucn n 21

<210> 347

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 347

auagacacca aaucuuacun n 21

<210> 348

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 348

aguaagauuu ggugucuaun n 21

<210> 349

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro

5

10

15

20

25

30

35

<400> 349

uagacaccaa aucuuacugn n 21

<210> 350

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 350

caguaagauu uggugucuan n 21

<210> 351

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 351

agacaccaaa ucuuacuggn n 21

<210> 352

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

5

10

15

20

25

30

35

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 352

ccaguaagau uuggugucun n 21

<210> 353

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 353

uuacuggaag gcacuuggcn n 21

<210> 354

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 354

gccaagugcc uuccaguaan n 21

<210> 355

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 355

uucucaucgu cugcuccucn n 21

<210> 356

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 356

gaggagcaga cgaugagaan n 21

<210> 357

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 357

ggaaggcacu uggcaucucn n 21

<210> 358

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) . . (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 358

gagaugccaa gugccuuccn n 21

<210> 359

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 359

ggcacuuggc aucuccccan n 21

<210> 360

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro

5

10

15

20

25

30

35

<400> 360

uggggagaug ccaagugccn n 21

<210> 361

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 361

ggcaucuccc cauuccaugn n 21

<210> 362

<211> 22

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (21)..(22)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 362

auggaauggg gagaugcctt nn 22

<210> 363

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<220>

5

10

15

20

25

30

35

<222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 363

gcaucucccc auuccaugan n 21

<210> 364

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 364

ucauggaaug gggagaugcn n 21

<210> 365

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 365

caucucccca uuccaugagn n 21

<210> 366

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 366

cucauggaau ggggagaugn n 21

<210> 367 <211> 21 <212> ADN

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 367

aucuccccau uccaugagcn n 21

<210> 368

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 368

gcucauggaa uggggagaun n 21

<210> 369 <211> 21 <212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 369

cuccccauuc caugagcaun n 21

<210> 370

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 370

augcucaugg aauggggagn n 21

<210> 371

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 371

cccauuccau gagcaugcan n 21

5

10

15

20

25

30

35

<210> 372

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 372

ugcaugcuca uggaaugggn n 21

<210> 373

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 373

ccaugagcau gcagaggugn n 21

<210> 374

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

5

10

15

20

25

30

35

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 374

caccucugca ugcucauggn n 21

<210> 375

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 375

agcaugcaga ggugguauun n 21

<210> 376

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 376

aauaccaccu cugcaugcun n 21

<210> 377

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

5

10

15

20

25

30

35

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 377

caugcagagg ugguauucan n 21

<210> 378

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 378

ugaauaccac cucugcaugn n 21

<210> 379

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 379

augcagaggu gguauucacn n 21

<210> 380

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 380

gugaauacca ccucugcaun n 21

<210> 381

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 381

ggugguauuc acagccaacn n 21

<210> 382

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 382

guuggcugug aauaccaccn n 21

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 383

gugguauuca cagccaacgn n 21

<210> 384

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 384

cguuggcugu gaauaccacn n 21

<210> 385

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20) .. (21)

5

10

15

20

25

30

35

<400> 385

ugguauucac agccaacgan n 21

<210> 386

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 386

ucguuggcug ugaauaccan n 21

<210> 387

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 387

gguauucaca gccaacgacn n 21

<210> 388

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

5

10

15

20

25

30

35

<222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 388

gucguuggcu gugaauaccn n 21

<210> 389

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 389

guauucacag ccaacgacun n 21

<210> 390

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 390

agucguuggc ugugaauacn n 21

<210> 391

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 391

uauucacagc caacgacucn n 21

<210> 392

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 392

gagucguugg cugugaauan n 21

<210> 393

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 393

ucacagccaa cgacuccggn n 21

<210> 394 <211> 21

5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 394

ccggagucgu uggcugugan n

<210> 395

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 395

ccccgccgcu acaccauugn n 21

<210> 396

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 396

21

5

10

15

20

25

30

35

caauggugua gcggcggggn n

21

<210> 397

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 397

gaaguccacu cauucuuggn n 21

<210> 398

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 398

ccaagaauga guggacuucn n 21

<210> 399

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

5

10

15

20

25

30

35

cccugcugag ccccuacucn n 21

<210> 400

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 400

gaguaggggc ucagcagggn n

<210> 401

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 401

cugagccccu acuccuauun n

<210> 402

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 402

aauaggagua ggggcucagn n 21

<210> 403

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 403

ugagccccua cuccuauucn n 21

<210> 404

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 404

gaauaggagu aggggcucan n 21

<210> 405 <211> 21 <212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) . . (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 405

ccccuacucc uauuccaccn n 21

<210> 406

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 406

gguggaauag gaguaggggn n

<210> 407

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 407

21

5

10

15

20

25

30

35

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 408

cgugguggaa uaggaguagn n 21

<210> 409

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 409

uacuccuauu ccaccacggn n 21

<210> 410

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

5

10

15

20

25

30

35

<210> 411

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 411

acuccuauuc caccacggcn n 21

<210> 412

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 412

gccguggugg aauaggagun n 21

<210> 413

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

5

10

15

20

25

30

35

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 413

uccuauucca ccacggcugn n 21

<210> 414

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 414

cagccguggu ggaauaggan n 21

<210> 415

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 415

uauuccacca cggcugucgn n 21

<210> 416 <211> 21 <212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 416

cgacagccgu gguggaauan n 21

<210> 417

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 417

auuccaccac ggcugucgun n 21

<210> 418

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 418

5

10

15

20

25

30

35

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 419

caccacggcu gucgucaccn n 21

<210> 420

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 420

ggugacgaca gccguggugn n 21

<210> 421

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

5

10

15

20

25

30

35

<210> 422

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 422

uggugacgac agccguggun n 21

<210> 423

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 423

ccacggcugu cgucaccaan n 21

<210> 424

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

5

10

15

20

25

30

35

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 424

uuggugacga cagccguggn n 21

<210> 425

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 425

acggcugucg ucaccaaucn n 21

<210> 426

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 426

gauuggugac gacagccgun n 21

<210> 427

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 427

cggcugucgu caccaauccn n 21

<210> 428

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 428

ggauugguga cgacagccgn n 21

<210> 429

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 429

cgucaccaau cccaaggaan n 21

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) . . (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 430

uuccuuggga uuggugacgn n 21

<210> 431

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 431

caaucccaag gaaugagggn n 21

<210> 432

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 432

5

10

15

20

25

30

35

cccucauucc uugggauugn n

21

<210> 433

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 433

ccugaaggac gagggauggn n 21

<210> 434

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 434

ccaucccucg uccuucaggn n 21

<210> 435

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

5

10

15

20

25

30

35

ggacgaggga ugggauuucn n

<210> 436

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 436

gaaaucccau cccucguccn n 21

<210> 437

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 437

aaguccacuc auucuuggcn n

<210> 438

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

21

5

10

15

20

25

30

35

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 438

gccaagaaug aguggacuun n 21

<210> 439

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 439

gggauuucau guaaccaagn n 21

<210> 440

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 440

cuugguuaca ugaaaucccn n 21

<210> 441 <211> 21 <212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 441

ggauuucaug uaaccaagan n 21

<210> 442

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 442

ucuugguuac augaaauccn n 21

<210> 443

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 443

ucauguaacc aagaguauun n 21

5

10

15

20

25

30

35

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 444

aauacucuug guuacaugan n 21

<210> 445

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 445

auguaaccaa gaguauuccn n 21

<210> 446

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

5

10

15

20

25

30

35

ggaauacucu ugguuacaun n 21

<210> 447

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> modified__base

<222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 447

uguaaccaag aguauuccan n 21

<210> 448

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 448

uggaauacuc uugguuacan n 21

<210> 449

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

5

10

15

20

25

30

35

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 449

guaaccaaga guauuccaun n 21

<210> 450

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 450

auggaauacu cuugguuacn n 21

<210> 451

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 451

ugccuugcug gacugguaun n 21

<210> 452

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 452

auaccagucc agcaaggcan n 21

<210> 453

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 453

uaaagcagug uuuucaccun n 21

<210> 454

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 454

aggugaaaac acugcuuuan n 21

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 455

gccuugcugg acugguauun n 21

<210> 456

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 456

aauaccaguc cagcaaggcn n 21

<210> 457

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro

5

10

15

20

25

30

35

uguuuucacc ucauaugcun n 21

<210> 458

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 458

agcauaugag gugaaaacan n 21

<210> 459

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 459

guuuucaccu cauaugcuan n 21

<210> 460

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

5

10

15

20

25

30

35

<222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 460

uagcauauga ggugaaaacn n 21

<210> 461

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 461

uuuucaccuc auaugcuaun n 21

<210> 462

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 462

auagcauaug aggugaaaan n 21

<210> 463

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 463

uucaccucau augcuaugun n 21

<210> 464

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 464

acauagcaua ugaggugaan n 21

<210> 465

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 465

caccucauau gcuauguuan n 21

<210> 466 <211> 21

5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 466

uaacauagca uaugaggugn n 21

<210> 467

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro<

400> 467

ccuugcugga cugguauuun n 21

<210> 468

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 468

5

10

15

20

25

30

35

aaauaccagu ccagcaaggn n

21

<210> 469

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 469

auaugcuaug uuagaagucn n 21

<210> 470

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 470

gacuucuaac auagcauaun n 21

<210> 471

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

5

10

15

20

25

30

35

uaugcuaugu uagaaguccn n 21

<210> 472

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 472

ggacuucuaa cauagcauan n 21

<210> 473

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 473

ugcuauguua gaaguccagn n 21

<210> 474

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

5

10

15

20

25

30

35

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 474

cuggacuucu aacauagcan n 21

<210> 475

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 475

cuugcuggac ugguauuugn n 21

<210> 476

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 476

caaauaccag uccagcaagn n 21

<210> 477

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 477

aguccaggca gagacaauan n 21

<210> 478

<211> 22

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (21)..(22)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 478

auugucucug ccuggacutt nn 22

<210> 479

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 479

5

10

15

20

25

30

35

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 480

uuuauugucu cugccuggan n 21

<210> 481

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 481

gugaaaggca cuuuucauun n 21

<210> 482

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

5

10

15

20

25

30

35

<210> 483

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 483

uggacuggua uuugugucun n 21

<210> 484

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 484

agacacaaau accaguccan n 21

<210> 485

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

5

10

15

20

25

30

35

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 485

gucugaggcu ggcccuacgn n 21

<210> 486

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 486

cguagggcca gccucagacn n 21

<210> 487

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 487

cugaggcugg cccuacgggn n 21

<210> 488

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 488

cccguagggc cagccucagn n 21

<210> 489

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 489

gaggcuggcc cuacgggcan n 21

<210> 490

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 490

ugcccguagg gccagccucn n 21

<210> 491

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 491

aggcuggccc uacgggcacn n 21

<210> 492

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 492

gugcccguag ggccagccun n 21

<210> 493

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

5

10

15

20

25

30

35

<400> 493

gcuggcccua cgggcaccgn n 21

<210> 494

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 494

cggugcccgu agggccagcn n 21

<210> 495

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 495

cuggcccuac gggcaccggn n 21

<210> 496

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

5

10

15

20

25

30

35

<222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 496

ccggugcccg uagggccagn n 21

<210> 497

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 497

ggcccuacgg gcaccggugn n 21

<210> 498

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 498

caccggugcc cguagggccn n 21

<210> 499

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 499

ccacucauuc uuggcaggan n 21

<210> 500

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 500

uccugccaag aaugaguggn n 21

<210> 501

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 501

ccuacgggca ccggugaaun n 21

<210> 502 <211> 21

5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 502

auucaccggu gcccguaggn n 21

<210> 503

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 503

cuacgggcac cggugaaucn n 21

<210> 504

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 504

5

10

15

20

25

30

35

gauucaccgg ugcccguagn n

21

<210> 505

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 505

uacgggcacc ggugaauccn n

<210> 506

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 506

ggauucaccg gugcccguan n 21

<210> 507

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<220>

21

5

10

15

20

25

30

35

acgggcaccg gugaauccan n

<210> 508

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 508

uggauucacc ggugcccgun n

<210> 509

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 509

gcaccgguga auccaagugn n

<210> 510

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 510

cacuuggauu caccggugcn n

<210> 511

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 511

caccggugaa uccaagugun n

<210> 512

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 512

acacuuggau ucaccggugn n <210> 513 <211> 21 <212> ADN

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 513

uguggccaug cauguguucn n

<210> 514

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 514

gaacacaugc auggccacan n

<210> 515

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 515

guggccaugc auguguucan n

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 516

ugaacacaug cauggccacn n

<210> 517

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 517

gccaugcaug uguucagaan n

<210> 518

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

21

21

5

10

15

20

25

30

35

uucugaacac augcauggcn n

<210> 519

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 519

uauuccacca cggcugucan n

<210> 520

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 520

ugacagccgu gguggaauan n

<210> 521

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 521

gucaucacca aucccaaggn n

<210> 522

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 522

ccuugggauu ggugaugacn n

<210> 523

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 523

guccucugau ggucaaagun n

<210> 524

<211> 21

<212> ADN

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 524

acuuugacca ucagaggacn n

<210> 525

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 525

gauggucaaa guucuagaun n

<210> 526

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 526

aucuagaacu uugaccaucn n <210> 527

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 527

augcuguccg aggcaguccn n

<210> 528

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 528

ggacugccuc ggacagcaun n

<210> 529

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

21

21

5

10

15

20

25

30

35

ccgugcaugu guucagaaan n

<210> 530

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 530

uuucugaaca caugcacggn n

<210> 531

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 531

agucuggaga gcugcauggn n

<210> 532

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 532

ccaugcagcu cuccagacun n

<210> 533

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 533

caugggcuca caacugaggn n

<210> 534

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 534

ccucaguugu gagcccaugn n

<210> 535

<211> 21

<212> ADN

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 535

ucucaucguc ugcuccuccn n

<210> 536

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 536

ggaggagcag acgaugagan n

<210> 537

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 537

ccccauucca ugagcaugcn n <210> 538 <211> 21

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 538

gcaugcucau ggaauggggn n

<210> 539

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 539

gccccuacuc cuauuccacn n 21

<210> 540

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro

21

5

10

15

20

25

30

35

guggaauagg aguaggggcn n

<210> 541

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 541

cuauuccacc acggcugucn n

<210> 542

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 542

gacagccgug guggaauagn n

<210> 543

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 543

cacggcuguc gucaccaaun n

<210> 544

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 544

auuggugacg acagccgugn n

<210> 545

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 545

aggacgaggg augggauuun n

<210> 546

<211> 21

<212> ADN

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 546

aaaucccauc ccucguccun n

<210> 547

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 547

ucaccucaua ugcuauguun n

<210> 548

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 548

aacauagcau augaggugan n <210> 549 <211> 21

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 549

ccucauaugc uauguuagan n

<210> 550

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 550

ucuaacauag cauaugaggn n

<210> 551

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 551

21

21

5

10

15

20

25

30

35

auguuagaag uccaggcagn n

21

<210> 552

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 552

cugccuggac uucuaacaun n

<210> 553

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 553

ucugaggcug gcccuacggn n

<210> 554

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

21

21

5

10

15

20

25

30

35

ccguagggcc agccucagan n

<210> 555

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 555

ggcccuacgg gcaccggugn n

<210> 556

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 556

caccggugcc cguagggccn n

<210> 557

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 557

gggcaccggu gaauccaagn n

<210> 558

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 558

cuuggauuca ccggugcccn n

<210> 559

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 559

ccaugcaugu guucagaaan n <210> 560 <211> 21 <212> ADN

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 560

uuucugaaca caugcauggn n

<210> 561

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 561

ccggugaauc caagugucct t 21

<210> 562

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 562

ggacacuugg auucaccggt t 21

<210> 563

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

21

5

10

15

20

25

30

35

acucauucuu ggcaggaugtt <210> 564

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 564

cauccugcca agaaugagut t

<210> 565

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 565

aaguguccuc ugauggucat t

<210> 566

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 566

ugaccaucag aggacacuut t

<210> 567

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

ucauucuugg caggauggct t

<210> 568

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 568

gccauccugc caagaaugat t

<210> 569

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 569

aaguucuaga ugcuguccgt t

<210> 570

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 570

cggacagcau cuagaacuut t

<210> 571

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

21

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<210> 572

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 572

cucggacagc aucuagaact t

<210> 573

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 573

cuagaugcug uccgaggcat t

<210> 574

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 574

ugccucggac agcaucuagt t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<210> 576

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens" <400> 576

gacugccucg gacagcauct t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 577

cauucuuggc aggauggcut t

<210> 578

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 578

agccauccug ccaagaaugt t

<210> 579

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<210> 580

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 580

aggacugccu cggacagcat t

<210> 581

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 581

ccgaggcagu ccugccauct t

<210> 582

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 582

gauggcagga cugccucggt t

<210> 583

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

caguccugcc aucaaugugt t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 584

cacauugaug gcaggacugt t

<210> 585

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens" <400> 585

caauguggcc gugcaugugt t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 586

cacaugcacg gccacauugt t

<210> 587

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

21

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

auguguucag aaaggcugct t

<210> 588

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 588

gcagccuuuc ugaacacaut t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 589

cagaagucca cucauucuut t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 590

aagaaugagu ggacuucugt t

<210> 591

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

21

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

ggcaggaugg cuucucauct t

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<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 592

gaugagaagc cauccugcct t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 593

gagccauuug ccucugggat t

<210> 594

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 594

ucccagaggc aaauggcuct t

<210> 595

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

21

21

21

21

5

10

15

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30

35

caggauggcu ucucaucgut t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 596

acgaugagaa gccauccugt t

<210> 597

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 597

aggauggcuu cucaucguct t

<210> 598

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 598

gacgaugaga agccauccut t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

21

21

21

5

10

15

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35

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<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 600

ugugagccca ugcagcucut t <210> 601 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 601

gcugcauggg cucacaacut t

<210> 602

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 602

aguugugagc ccaugcagct t

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<211> 21

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<220>

21

21

21

5

10

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35

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Homo sapiens"

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<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 604

agacgaugag aagccaucct t 21

<210> 605

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 605

gcaugggcuc acaacugagt t 21

<210> 606 <211> 21 <212> ADN

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 606

cucaguugug agcccaugct t 21

<210> 607

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5

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30

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<211> 21

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<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 608

uccucaguug ugagcccaut t

<210> 609

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 609

ugggcucaca acugaggagt t <210> 610 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 610

cuccucaguu gugagcccat t

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<211> 21

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21

21

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10

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20

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 612

ucccuucuac aaauuccuct t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 613

uuuguagaag ggauauacatt

<210> 614

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 614

uguauauccc uucuacaaat t

<210> 615

<211> 21

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21

21

5

10

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20

25

30

35

uuguagaagg gauauacaat t <210> 616 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 616

uuguauaucc cuucuacaat t

<210> 617

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 617

uguagaaggg auauacaaat t <210> 618 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 618

uuuguauauc ccuucuacat t

<210> 619

<211> 21

<212> ADN

21

21

5

10

15

20

25

30

35

agaagggaua uacaaagugt t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 620

cacuuuguau aucccuucut t

<210> 621

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 621

aaguggaaau agacaccaat t

<210> 622

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 622

uuggugucua uuuccacuutt

<210> 623

<211> 21

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21

21

5

10

15

20

25

30

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 624

agauuuggug ucuauuucct t

<210> 625

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 625

gaaauagaca ccaaaucuut t

<210> 626

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 626

aagauuuggu gucuauuuctt

<210> 627

<211> 21

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21

21

5

10

15

20

25

30

35

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<210> 628

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 628

aguaagauuu ggugucuaut t

<210> 629

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 629

uagacaccaa aucuuacugt t

<210> 630

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 630

caguaagauu uggugucuat t <210> 631 <211> 21 <212> ADN

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 631

agacaccaaa ucuuacuggt t

<210> 632

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 632

ccaguaagau uuggugucut t

<210> 633

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 633

uuacuggaag gcacuuggct t

<210> 634

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 634

gccaagugcc uuccaguaat t <210> 635 <211> 21 <212> ADN

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 635

uucucaucgu cugcuccuct t

<210> 636

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 636

gaggagcaga cgaugagaat t

<210> 637

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 637

ggaaggcacu uggcaucuct t

<210> 638

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 638

gagaugccaa gugccuucct t <210> 639 <211> 21 <212> ADN

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 639

ggcacuuggc aucuccccat t

<210> 640

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 640

uggggagaug ccaagugcct t

<210> 641

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 641

ggcaucuccc cauuccaugt t

<210> 642

<211> 22

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 643

gcaucucccc auuccaugat t

<210> 644

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 644

ucauggaaug gggagaugctt

<210> 645

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 645

caucucccca uuccaugagt t

<210> 646

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

cucauggaau ggggagaugt t <210> 647 <211> 21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 647

aucuccccau uccaugagct t

<210> 648

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 648

gcucauggaa uggggagaut t

<210> 649

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 649

cuccccauuc caugagcaut t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

augcucaugg aauggggagt t <210> 651

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 651

cccauuccau gagcaugcat t

<210> 652

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 652

ugcaugcuca uggaaugggt t

<210> 653

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 653

ccaugagcau gcagaggugt t

<210> 654

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

caccucugca ugcucauggt t <210> 655

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 655

agcaugcaga ggugguauut t

<210> 656

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 656

aauaccaccu cugcaugcut t

<210> 657

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 288

caugcagagg ugguauucatt

<210> 658

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

ugaauaccac cucugcaugt t <210> 659

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 659

augcagaggu gguauucact t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 660

gugaauacca ccucugcaut t 21

<210> 661

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 661

ggugguauuc acagccaact t 21

<210> 662

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 662

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 663

gugguauuca cagccaacgt t

<210> 664

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 664

cguuggcugu gaauaccact t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 665

ugguauucac agccaacgat t <210> 666 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 290

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

5

10

15

20

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30

35

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 667

gguauucaca gccaacgact t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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gucguuggcu gugaauacct t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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guauucacag ccaacgacut t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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agucguuggc ugugaauact t 21

5

10

15

20

25

30

35

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 671

uauucacagc caacgacuct t 21

<210> 672

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 672

gagucguugg cugugaauat t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 673

ucacagccaa cgacuccggt t 21

<210> 674

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 674

5

10

15

20

25

30

35

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 676

caauggugua gcggcggggt t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 677

gaaguccacu cauucuuggt t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 678

5

10

15

20

25

30

35

ccaagaauga guggacuuct t <210> 679

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 679

cccugcugag ccccuacuct t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 680

gaguaggggcucagcagggtt 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 681

cugagccccu acuccuauut t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 682

5

10

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20

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30

35

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<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 683

ugagccccua cuccuauuct t

<210> 684

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 684

gaauaggagu aggggcucat t

<210> 685

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 685

ccccuacucc uauuccacct t

<210> 686

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens" 21

21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens"

5

10

15

20

25

30

35

<210> 687

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 687

cuacuccuau uccaccacgt t 21

<210> 688

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 688

cgugguggaa uaggaguagt t 21

<210> 689

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 689

uacuccuauu ccaccacggt t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

5

10

15

20

25

30

35

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 691

acuccuauuc caccacggct t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 692

gccguggugg aauaggagutt

<210> 693

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 693

uccuauucca ccacggcugtt

<210> 694

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

21

5

10

15

20

25

30

35

cagccguggu ggaauaggat t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 695

uauuccacca cggcugucgt t

<210> 696

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 696

cgacagccgu gguggaauat t

<210> 697

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 697

auuccaccac ggcugucgut t

<210> 698

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

5

10

15

20

25

30

35

acgacagccg ugguggaaut t

<210> 699

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 699

caccacggcu gucgucacct t

<210> 700

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 700

ggugacgaca gccguggugt t

<210> 701

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 701

accacggcug ucgucaccat t

<210> 702

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

5

10

15

20

25

30

35

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 702

uggugacgac agccguggut t

<210> 703

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 703

ccacggcugu cgucaccaat t

<210> 704

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 704

uuggugacga cagccguggt t

<210> 705

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 705

acggcugucg ucaccaauct t

<210> 706

<211> 21

<212> ADN

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

5

10

15

20

25

30

35

gauuggugac gacagccgut t 21

<210> 707

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 707

cggcugucgu caccaaucct t 21

<210> 708

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 708

ggauugguga cgacagccgt t 21

<210> 709

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 709

cgucaccaau cccaaggaat t 21

<210> 710

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

uuccuuggga uuggugacgt t

<210> 711

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 711

caaucccaag gaaugagggt t

<210> 712

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<213> Homo sapiens

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<221> fuente

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cccucauucc uugggauugt t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 713

ccugaaggac gagggauggt t

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<212> ADN

21

Homo sapiens" 21

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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ggacgaggga ugggauuuctt 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 716

gaaaucccau cccucgucct t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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<400> 720

cuugguuaca ugaaauccctt

<210> 721

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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Homo sapiens" 21

21

5

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20

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30

35

<221> fuente

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ucuugguuac augaaaucct t 21

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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ucauguaacc aagaguauut t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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<212> ADN

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<220>

<221> fuente

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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uggaauacuc uugguuacat t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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<400> 729

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Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

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20

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<221> fuente

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<212> ADN

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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uaaagcagug uuuucaccutt 21

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<220>

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aauaccaguc cagcaaggct t 21

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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uguuuucaccucauaugcutt 21

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<213> Homo sapiens

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Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

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<220>

<221> fuente

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<220>

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<220>

<221> fuente

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<221> fuente

Homo sapiens" 21

21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

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<221> fuente

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uaugcuaugu uagaagucct t 21

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<221> fuente

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<221> fuente

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cuugcuggac ugguauuugt t 21

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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Homo sapiens"

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caaauaccag uccagcaagt t 21

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<221> fuente

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21

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Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<221> fuente

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21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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ccacucauuc uuggcaggat t

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

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21

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Homo sapiens" 21

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<212> ADN

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<221> fuente

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cuacgggcac cggugaauct t

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21

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<220>

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cacuuggauu caccggugct t

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 792

acacuuggau ucaccggugt t

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<211> 21

<212> ADN

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

5

10

15

20

25

30

35

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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gaacacaugc auggccacatt 21

<210> 795

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 795

guggccaugc auguguucat t 21

<210> 796

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 796

ugaacacaug cauggccact t 21

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<212> ADN

5

10

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20

25

30

35

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gccaugcaug uguucagaatt 21

<210> 798

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 798

uucugaacac augcauggct t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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<221> fuente

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ugacagccgu gguggaauat t 21

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10

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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ccuugggauu ggugaugactt

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

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10

15

20

25

30

35

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gauggucaaaguucuagautt 21

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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aucuagaacu uugaccauct t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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<400> 327

uuucugaaca caugcacggt t <210> 811 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

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agucuggaga gcugcauggt t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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ccaugcagcu cuccagacut t <210> 813 <211> 21

21

Homo sapiens" 21

5

10

15

20

25

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<221> fuente

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<212> ADN

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

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ucucaucguc ugcuccucct t 21

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<221> fuente

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10

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20

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30

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<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

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ccccauucca ugagcaugct t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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gcaugcucau ggaauggggt t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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gccccuacuc cuauuccact t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

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Homo sapiens" 21

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30

35

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 822

gacagccgug guggaauagt t 21

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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cacggcuguc gucaccaaut t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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auuggugacg acagccgugt t 21

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<220>

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aggacgaggg augggauuutt

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 827

ucaccucaua ugcuauguut t <210> 828 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 828

aacauagcau augaggugat t

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

21

5

10

15

20

25

30

35

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<212> ADN

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<220>

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 831

auguuagaag uccaggcagt t 21

<210> 832

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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cugccuggac uucuaacaut t 21

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10

15

20

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30

35

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 833

ucugaggcug gcccuacggt t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 834

ccguagggcc agccucagat t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 835

ggcccuacgg gcaccggugt t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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caccggugcc cguagggcct t 21

5

10

15

20

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30

35

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<221> fuente

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Homo sapiens"

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<220>

<221> fuente

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cuuggauuca ccggugccct t 21

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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<212> ADN

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<220>

<221> fuente

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5

10

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20

25

30

35

uuucugaaca caugcauggt t <210> 841

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

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ccggugaauc caagugucct t 21

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<211> 21

<212> ADN

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<220>

<221> fuente

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ggacacuugg auucaccggt t 21

<210> 843

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 843

acucauucuu ggcaggaugt t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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5

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<213> Homo sapiens

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 847

ucauucuugg caggauggct t

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

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21

Homo sapiens" 21

21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens"

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<220>

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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guucuagaug cuguccgagt t 21

<210> 852

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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10

15

20

25

30

35

cucggacagc aucuagaact t

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<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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cuagaugcug uccgaggcat t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 854

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 855

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<211> 21

<212> ADN

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<220>

21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

21

5

10

15

20

25

30

35

gacugccucg gacagcauct t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 857

cauucuuggc aggauggcut t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 858

agccauccug ccaagaaugt t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 859

ugcuguccga ggcaguccut t <210> 860 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

5

10

15

20

25

30

35

aggacugccu cggacagcat t

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<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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ccgaggcagu ccugccauct t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 862

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 863

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<211> 21

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<220>

21

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Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

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<212> ADN

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<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 865

caauguggcc gugcaugugt t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 866

cacaugcacg gccacauugt t

<210> 867

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 867

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<211> 21

<212> ADN

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

5

10

15

20

25

30

35

gcagccuuuc ugaacacautt 21

<210> 869

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 869

cagaagucca cucauucuut t 21

<210> 870

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 870

aagaaugagu ggacuucugt t 21

<210> 871

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 871

ggcaggaugg cuucucauct t 21

<210> 872

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

gaugagaagc cauccugcct t 21

<210> 873

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> Znote="Description of Combined ADNZARN Molecule:

Homo sapiens" <400> 873

gagccauuug ccucugggat t 21

<210> 874

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 874

ucccagaggc aaauggcuct t 21

<210> 875

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 875

caggauggcu ucucaucgut t 21

<210> 876

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

acgaugagaa gccauccugt t 21

<210> 877

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 877

aggauggcuu cucaucguct t 21

<210> 878

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 878

gacgaugaga agccauccut t 21

<210> 879

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 879

agagcugcau gggcucacat t 21

<210> 880

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

ugugagccca ugcagcucut t <210> 881 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 881

gcugcauggg cucacaacut t

<210> 882

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 882

aguugugagc ccaugcagct t

<210> 883

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 883

ggauggcuuc ucaucgucut t

<210> 884

<211> 21

<212> ADN

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

21

Homo sapiens" 21

5

10

15

20

25

30

35

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agacgaugag aagccaucct t 21

<210> 885

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 885

gcaugggcuc acaacugagt t 21

<210> 886

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 886

cucaguugug agcccaugct t 21

<210> 887

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 887

augggcucac aacugaggat t 21

<210> 888

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 888

uccucaguug ugagcccautt

<210> 889

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 889

ugggcucaca acugaggagt t

<210> 890

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 890

cuccucaguu gugagcccatt

<210> 891

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 891

gaggaauuug uagaagggat t <210> 892 <211> 21 <212> ADN

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 892

ucccuucuac aaauuccuct t 21

<210> 893

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 893

uuuguagaag ggauauacat t 21

<210> 894

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 894

uguauauccc uucuacaaat t 21

<210> 895

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 895

uuguagaagg gauauacaat t 21

<210> 896 <211> 21 <212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 896

uuguauaucc cuucuacaat t 21

<210> 897

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 897

uguagaaggg auauacaaat t 21

<210> 898

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 898

uuuguauauc ccuucuacat t 21

<210> 899

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 899

agaagggaua uacaaagugt t 21

<210> 900 <211> 21 <212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 900

cacuuuguau aucccuucut t

<210> 901

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 901

aaguggaaau agacaccaat t

<210> 902

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 902

uuggugucua uuuccacuutt

<210> 903

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 903

ggaaauagac accaaaucut t <210> 904 <211> 21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 904

agauuuggug ucuauuucct t 21

<210> 905

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 905

gaaauagaca ccaaaucuut t 21

<210> 906

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 906

aagauuuggugucuauuuctt 21

<210> 907

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 907

auagacacca aaucuuacut t 21

<210> 908 <211> 21

5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 908

aguaagauuu ggugucuautt

<210> 909

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 909

uagacaccaa aucuuacugt t

<210> 910

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 910

caguaagauu uggugucuat t

<210> 911

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

agacaccaaa ucuuacuggt t <210> 912

Homo sapiens" 21

21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 912

ccaguaagau uuggugucut t 21

<210> 913

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 913

uuacuggaag gcacuuggct t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 914

gccaagugcc uuccaguaat t 21

<210> 915

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 915

uucucaucgu cugcuccuct t 21

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5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 916

gaggagcaga cgaugagaat t

<210> 917

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 917

ggaaggcacu uggcaucuct t

<210> 918

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 918

gagaugccaa gugccuucct t

<210> 919

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

ggcacuuggc aucuccccat t

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

21

Homo sapiens" 21

5

10

15

20

25

30

35

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 920

uggggagaug ccaagugcct t

<210> 921

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 921

ggcaucuccc cauuccaugt t

<210> 922

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 922

cauggaaugg ggagaugcct t

<210> 923

<355> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

gcaucucccc auuccaugat t

21

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 924

ucauggaaug gggagaugctt

<210> 925

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 925

caucucccca uuccaugagt t

<210> 926

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 926

cucauggaau ggggagaugt t

<210> 927

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 927

21

21

21

5

10

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20

25

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35

aucuccccau uccaugagct t <210> 928

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 928

gcucauggaa uggggagaut t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 929

cuccccauuc caugagcaut t

<210> 930

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 930

augcucaugg aauggggagt t

<210> 931

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 931

21

21

21

5

10

15

20

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30

35

<210> 932

<211> 21

<212>ADN

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<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 932

ugcaugcuca uggaaugggt t

<210> 933

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 933

ccaugagcau gcagaggugt t

<210> 934

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 934

caccucugca ugcucauggt t

<210> 935

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 935

21

21

21

5

10

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20

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30

35

<210> 936

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 936

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 937

caugcagagg ugguauucatt

<210> 938

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 938

ugaauaccac cucugcaugt t

<210> 939

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

21

21

21

5

10

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20

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35

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<211> 21

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<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 940

gugaauacca ccucugcaut t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 941

ggugguauuc acagccaact t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 942

guuggcugug aauaccacct t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

21

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

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ugguauucac agccaacgat t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 946

ucguuggcug ugaauaccat t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

21

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

gguauucaca gccaacgact t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 948

gucguuggcu gugaauacct t

<210> 949

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 949

guauucacag ccaacgacut t

<210> 950

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 950

agucguuggc ugugaauact t

<210> 951

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

21

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

uauucacagc caacgacuct t

<210> 952

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 952

gagucguugg cugugaauat t

<210> 953

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 953

ucacagccaa cgacuccggt t

<210> 954

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 954

ccggagucgu uggcugugat t

<210> 955

<211> 21

<212> ADN

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 956

caauggugua gcggcggggt t 21

<210> 957

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 957

gaaguccacu cauucuuggt t 21

<210> 958

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 958

ccaagaauga guggacuuct t 21

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5

10

15

20

25

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35

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 960

gaguaggggcucagcagggtt 21

<210> 961

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 961

cugagccccu acuccuauut t 21

<210> 962

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 962

aauaggagua ggggcucagt t 21

<210> 963

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

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Homo sapiens"

<400> 963

ugagccccua cuccuauuct t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 964

gaauaggagu aggggcucat t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 965

ccccuacucc uauuccacct t

<210> 966

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 966

gguggaauag gaguaggggtt

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21

21

5

10

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30

35

cuacuccuau uccaccacgt t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 968

cgugguggaa uaggaguagt t

<210> 969

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 969

uacuccuauu ccaccacggt t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 970

ccguggugga auaggaguat t

<210> 971

<211> 21

<212> ADN

21

21

5

10

15

20

25

30

35

acuccuauuc caccacggct t

<210> 972

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<368> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 972

gccguggugg aauaggagutt

<210> 973

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 973

uccuauucca ccacggcugtt

<210> 974

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 974

cagccguggu ggaauaggat t <210> 975 <211> 21 <212> ADN

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 975

uauuccacca cggcugucgt t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 976

cgacagccgu gguggaauat t 21

<210> 977

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 977

auuccaccac ggcugucgut t 21

<210> 978

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 978

acgacagccg ugguggaaut t 21

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5

10

15

20

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30

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<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 979

caccacggcu gucgucacct t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 980

ggugacgaca gccguggugt t

<210> 981

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<370> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 981

accacggcug ucgucaccat t

<210> 982

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 982

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Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

21

Homo sapiens" 21

5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

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ccacggcugu cgucaccaat t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 984

uuggugacga cagccguggt t 21

<210> 985

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 985

acggcugucg ucaccaauct t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 986

gauuggugac gacagccgut t 21

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5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 987

cggcugucgu caccaaucct t

<210> 988

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 988

ggauugguga cgacagccgt t

<210> 989

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 989

cgucaccaau cccaaggaat t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 990

uuccuuggga uuggugacgt t <210> 991

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

21

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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caaucccaag gaaugagggt t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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cccucauucc uugggauugt t 21

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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ccugaaggac gagggauggt t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 994

ccaucccucg uccuucaggt t 21

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5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 995

ggacgaggga ugggauuuctt

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 996

gaaaucccau cccucgucct t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 997

aaguccacuc auucuuggct t

<210> 998

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 998

gccaagaaug aguggacuut t <210> 999

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 999

gggauuucau guaaccaagt t

<210>1000

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 1000

cuugguuaca ugaaauccct t

<210> 1001

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <400> 1001

ggauuucaug uaaccaagat t

<210> 1002

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

ucuugguuac augaaaucct t

21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

Homo sapiens" 21

5

10

15

20

25

30

35

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<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1003

ucauguaacc aagaguauut t 21

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<211> 21

<212> ADN

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<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1004

aauacucuug guuacaugat t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1005

auguaaccaa gaguauucct t 21

<210> 1006

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1006

ggaauacucu ugguuacaut t 21

5

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20

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30

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<221> fuente

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uguaaccaag aguauuccatt 21

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<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

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uggaauacuc uugguuacat t 21

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<211> 21

<212> ADN

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<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1009

guaaccaaga guauuccaut t 21

<210> 1010

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

5

10

15

20

25

30

35

auggaauacu cuugguuactt <210> 1011

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1011

ugccuugcug gacugguaut t 21

<210> 1012 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1012

auaccagucc agcaaggcat t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1013

uaaagcagug uuuucaccutt 21

<210> 1014

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

5

10

15

20

25

30

35

aggugaaaac acugcuuuat t <210> 1015

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1015

gccuugcugg acugguauut t

<210> 1016

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1016

aauaccaguc cagcaaggct t

<210> 1017

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 1017

uguuuucacc ucauaugcut t <210> 1018 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

agcauaugag gugaaaacat t 21

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<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1019

guuuucaccu cauaugcuat t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1020

uagcauaugaggugaaaactt 21

<210> 1021 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1021

uuuucaccuc auaugcuaut t 21

<210> 1022 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

5

10

15

20

25

30

35

auagcauaug aggugaaaatt 21

<210> 1023

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1023

uucaccucau augcuaugut t 21

<210> 1024

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1024

acauagcaua ugaggugaat t 21

<210> 1025

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1025

caccucauau gcuauguuat t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

5

10

15

20

25

30

35

Homo sapiens"

<400> 1026

uaacauagca uaugaggugtt 21

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<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1027

ccuugcugga cugguauuut t 21

<210> 1028

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1028

aaauaccagu ccagcaaggt t 21

<210> 1029

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1029

auaugcuaug uuagaaguct t 21

<210>1030

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

5

10

15

20

25

30

35

gacuucuaac auagcauaut t 21

<210> 1031

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1031

uaugcuaugu uagaagucct t 21

<210> 1032

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1032

ggacuucuaa cauagcauat t 21

<210>1033

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1033

ugcuauguua gaaguccagt t 21

<210> 1034

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

5

10

15

20

25

30

35

cuggacuucu aacauagcat t 21

<210>1035

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 1035

cuugcuggac ugguauuugt t 21

<210> 1036

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1036

caaauaccag uccagcaagt t 21

<210>1037

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1037

aguccaggca gagacaauat t 21

<210>1038

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

uauugucucu gccuggacut t 21

<210>1039

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1039

uccaggcaga gacaauaaat t 21

<210> 1040

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1040

uuuauugucu cugccuggat t 21

<210> 1041

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1041

gugaaaggca cuuuucauut t 21

<210> 1042

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

aaugaaaagu gccuuucact t 21

<210> 1043

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1043

uggacuggua uuugugucut t 21

<210> 1044

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 1044

agacacaaau accaguccat t 21

<210> 1045

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1045

gucugaggcu ggcccuacgt t 21

<210> 1046

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

cguagggcca gccucagact t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1047

cugaggcugg cccuacgggt t 21

<210> 1048

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1048

cccguagggc cagccucagt t 21

<210> 1049

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1049

gaggcuggcc cuacgggcat t 21

<210>1050

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

ugcccguagg gccagccuct t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1051

aggcuggccc uacgggcact t 21

<210> 1052

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1052

gugcccguag ggccagccut t 21

<210>1053

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 1053

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1054

cggugcccgu agggccagct t 21

<210>1055

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1055

cuggcccuac gggcaccggt t 21

<210> 1056

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1056

ccggugcccg uagggccagt t 21

<210>1057

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1057

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1058

caccggugcc cguagggcct t 21

<210>1059

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1059

ccacucauuc uuggcaggat t 21

<210> 1060

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1060

uccugccaag aaugaguggt t 21

<210> 1061 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1061

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 1062

auucaccggu gcccguaggt t 21

<210> 1063

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1063

cuacgggcac cggugaauct t 21

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1064

gauucaccgg ugcccguagt t 21

<210> 1065

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1065

<210> 1066 <211> 21

5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1066

ggauucaccg gugcccguat t 21

<210> 1067

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1067

acgggcaccg gugaauccat t 21

<210> 1068

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1068

uggauucacc ggugcccgut t 21

<210> 1069

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1069

gcaccgguga auccaagugt t 21

<210>1070 <211> 21

5

10

15

20

25

30

35

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1070

cacuuggauu caccggugct t 21

<210> 1071

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 1071

caccggugaa uccaagugut t 21

<210> 1072

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1072

acacuuggau ucaccggugt t 21

<210>1073

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1073

uguggccaug cauguguuct t 21

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1074

gaacacaugc auggccacatt 21

<210>1075

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1075

guggccaugc auguguucatt 21

<210> 1076

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1076

ugaacacaug cauggccact t 21

<210>1077

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1077

gccaugcaug uguucagaatt 21

<210>1078

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1078

uucugaacac augcauggct t 21

<210>1079

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1079

uauuccacca cggcugucat t 21

<210>1080 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 1080

ugacagccgu gguggaauat t 21

<210> 1081 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1081

gucaucacca aucccaaggt t 21

5

10

15

20

25

30

35

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1082

ccuugggauuggugaugactt 21

<210>1083

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1083

guccucugau ggucaaagut t 21

<210> 1084

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1084

acuuugacca ucagaggact t 21

<210>1085

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1085

gauggucaaa guucuagaut t 21

5

10

15

20

25

30

35

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1086

aucuagaacu uugaccauct t 21

<210>1087

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1087

augcuguccg aggcagucct t 21

<210>1088

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1088

ggacugccuc ggacagcaut t 21

<210>1089

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

5

10

15

20

25

30

35

ccgugcaugu guucagaaat t <210>1090

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1090

uuucugaaca caugcacggt t 21

<210> 1091

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1091

agucuggaga gcugcauggt t 21

<210> 1092

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1092

ccaugcagcu cuccagacut t 21

<210>1093

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1093

5

10

15

20

25

30

35

caugggcuca caacugaggt t <210> 1094

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1094

ccucaguugu gagcccaugt t 21

<210>1095

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1095

ucucaucguc ugcuccucct t 21

<210> 1096

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1096

ggaggagcag acgaugagat t 21

<210>1097

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1097

5

10

15

20

25

30

35

ccccauucca ugagcaugct t <210>1098

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 1098

gcaugcucau ggaauggggt t 21

<210>1099

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1099

gccccuacuc cuauuccact t 21

<210> 1100

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1100

guggaauagg aguaggggctt 21

<210> 1101

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

5

10

15

20

25

30

35

cuauuccacc acggcuguct t 21

<210> 1102

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1102

gacagccgug guggaauagt t 21

<210> 401

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1103

cacggcuguc gucaccaaut t 21

<210> 1104

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1104

auuggugacg acagccgugt t 21

<210> 1105

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

5

10

15

20

25

30

35

aggacgaggg augggauuutt 21

<210> 1106

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1106

aaaucccauc ccucguccut t 21

<210> 1107

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 1107

ucaccucaua ugcuauguut t 21

<210> 1108 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1108

aacauagcau augaggugat t 21

<210> 1109

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

5

10

15

20

25

30

35

ccucauaugc uauguuagat t 21

<210> 1110

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1110

ucuaacauag cauaugaggt t 21

<210> 1111 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1111

auguuagaag uccaggcagt t 21

<210> 403

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1112

cugccuggac uucuaacaut t 21

<210> 1113

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

5

10

15

20

25

30

35

ucugaggcug gcccuacggt t 21

<210> 1114

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1114

ccguagggcc agccucagat t 21

<210> 1115

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1115

ggcccuacgg gcaccggugt t 21

<210> 1116

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 1116

caccggugcc cguagggcct t 21

<210> 1117

<211> 21

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

gggcaccggu gaauccaagt t 21

<210> 1118

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1118

cuuggauuca ccggugccct t 21

<210> 1119

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1119

ccaugcaugu guucagaaat t 21

<210> 1120

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1120

uuucugaaca caugcauggt t 21

<210> 405 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1121

5

10

15

20

25

30

35

guccucugau ggucaaagu

19

<210> 1122 <211> 19 <212>ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1122

acuuugaccaucagaggac 19

<210> 1123 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1123

uucuugcucu auaaaccgu 19

<210> 1124 <211> 19 <212> ARN <213> Rattus norvegicus <400> 1124

acgguuuauagagcaagaa 19

<210> 1125 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1125

cucuauaaaccguguuagc 19

<210> 1126 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1126

gcuaacacgg uuuauagag 19

<210> 1127 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1127

ucgccacuac accaucgca 19

5

10

15

20

25

30

35

<212>ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1128

ugcgauggug uaguggcga 19

<210> 1129 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1129

ucuugcucua uaaaccgug 19

<210> 1130 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1130

cacgguuuau agagcaaga 19

<210> 1131 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1131

ugcucuauaa accguguua 19

<210> 1132 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1132

uaacacgguu uauagagca 19

<210> 1133 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1133

caguguucuu gcucuauaa 19

5

10

15

20

25

30

35

<212>ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1134

uuauagagca agaacacug 19

<210> 1135 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1135

gcucuauaaaccguguuag 19

<210> 1136 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1136

cuaacacggu uuauagagc 19

<210> 1137 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1137

ccuggaugcu guccgaggc 19

<210> 1138 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1138

gccucggaca gcauccagg 19

<210> 1139 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1139

ucugaugguc aaaguccug 19

5

10

15

20

25

30

35

<212>ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1140 caggacuuug accaucaga <210> 1141 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1141

cuggagagcu gcacgggcu <210> 1142 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1142 agcccgugca gcucuccag <210> 1143 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1143 ucuauaaacc guguuagca <210> 1144 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1144

ugcuaacacg guuuauaga <210> 1145 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1145 aacaguguuc uugcucuau <210> 1146

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

<212>ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1146

auagagcaag aacacuguu <210> 1147 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1147 cucugauggu caaaguccu <210> 1148 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1148 aggacuuuga ccaucagag <210> 1149 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1149 ugcuguccga ggcagcccu <210> 1150 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1150 agggcugccu cggacagca <210> 1151 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1151

gucuggagag cugcacggg <210> 1152

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

<212>ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1152 cccgugcagc ucuccagac <210> 1153 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1153 acaguguucu ugcucuaua <210> 1154 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1154 uauagagcaa gaacacugu <210> 1155 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1155 ccucugaugg ucaaagucc <210> 1156 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1156 ggacuuugac caucagagg <210> 1157 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1157 aguccuggau gcuguccga <210> 1158

19

19

19

19

5

10

15

20

25

30

35

<212>ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1158

ucggacagca uccaggacu 19

<210> 1159 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1159

uugccucugg gaagaccgc 19

<210> 1160 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1160

gcggucuucccagaggcaa 19

<210> 1161 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1161

uggagagcug cacgggcuc 19

<210> 1162 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1162

gagcccgugc agcucucca 19

<210> 1163 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1163

gagagcugca cgggcucac 19

<210> 1164

5

10

15

20

25

30

35

<212>ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1164

gugagcccgu gcagcucuc 19

<210> 1165 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1165

gagcugcacg ggcucacca 19

<210> 1166 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1166

uggugagcccgugcagcuc 19

<210> 1167 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1167

uacaccaucg cagcccugc 19

<210> 1168 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1168

gcagggcugcgauggugua 19

<210> 1169 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1169

guccuggaug cuguccgag 19

5

10

15

20

25

30

35

<212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1170 cucggacagc auccaggac <210> 1171 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1171

agagcugcac gggcucacc <210> 1172 <211> 19 <212> ARN

<213> Rattus norvegicus <400> 1172 ggugagcccg ugcagcucu <210> 1173 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1173

guccucugau ggucaaagun n 21

<210> 1174 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

19

19

5

10

15

20

25

30

35

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1174

acuuugacca ucagaggacn n <210> 1175 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1175

uucuugcucu auaaaccgun n <210> 1176 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1176

acgguuuaua gagcaagaan n <210> 1177 <211> 21 <212> ADN

21

Rattus norvegicus"

21

Rattus norvegicus"

21

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1177

cucuauaaac cguguuagcn n 21

<210> 1178 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1178

gcuaacacgg uuuauagagn n 21

<210> 1179 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1179

ucgccacuac accaucgcan n 21

5

10

15

20

25

30

35

<211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1180

ugcgauggug uaguggcgan n 21

<210> 1181 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1181

ucuugcucua uaaaccgugn n 21

<210> 1182 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

5

10

15

20

25

30

35

cacgguuuau agagcaagan n 21

<210> 1183 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1183

ugcucuauaa accguguuan n 21

<210> 1184 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1184

uaacacgguu uauagagcan n 21

<210> 1185 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus"

5

10

15

20

25

30

35

<220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1185

caguguucuu gcucuauaan n <210> 1186 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1186

uuauagagca agaacacugn n <210> 1187 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1187

gcucuauaaa ccguguuagn n <210> 1188 <211> 21 <212> ADN

Rattus norvegicus"

21

Rattus norvegicus"

21

5

10

15

20

25

30

35

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1188

cuaacacggu uuauagagcn n 21

<210> 1189 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1189

ccuggaugcu guccgaggcn n 21

<210> 1190 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1190

gccucggaca gcauccaggn n 21

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1191

ucugaugguc aaaguccugn n 21

<210> 1192 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1192

caggacuuug accaucagan n 21

<210> 1193 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

5

10

15

20

25

30

35

<400> 1193

cuggagagcu gcacgggcun n 21

<210> 1194 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1194

agcccgugca gcucuccagn n 21

<210> 1195 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1195

ucuauaaacc guguuagcan n 21

<210> 1196 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

5

10

15

20

25

30

35

<222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1196

ugcuaacacg guuuauagan n <210> 1197 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1197

aacaguguuc uugcucuaun n <210> 1198 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1198

auagagcaag aacacuguun n <210> 1199 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

Rattus norvegicus"

21

Rattus norvegicus"

21

5

10

15

20

25

30

35

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1199

cucugauggu caaaguccun n <210>1200 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1200

aggacuuuga ccaucagagn n <210> 1201 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1201

ugcuguccga ggcagcccun n <210> 1202 <211> 21 <212> ADN

21

Rattus norvegicus"

21

Rattus norvegicus"

21

5

10

15

20

25

30

35

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1202

agggcugccu cggacagcan n 21

<210>1203 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1203

gucuggagag cugcacgggn n 21

<210> 1204 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1204

cccgugcagc ucuccagacn n 21

5

10

15

20

25

30

35

<211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1205

acaguguucu ugcucuauan n 21

<210> 1206 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1206

uauagagcaa gaacacugun n 21

<210>1207 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

5

10

15

20

25

30

35

ccucugaugg ucaaaguccn n 21

<210>1208 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1208

ggacuuugac caucagaggn n 21

<210>1209 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1209

aguccuggau gcuguccgan n 21

<210> 1210 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus"

5

10

15

20

25

30

35

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1210

ucggacagca uccaggacun n <210> 1211 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1211

uugccucugg gaagaccgcn n <210> 1212 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <220>

<221> base _modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1212

gcggucuucc cagaggcaan n <210> 1213 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus

Rattus norvegicus"

21

Rattus norvegicus"

21

5

10

15

20

25

30

35

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1213

uggagagcug cacgggcucn n 21

<210> 1214 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1214

gagcccgugc agcucuccan n 21

<210> 1215 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1215

gagagcugca cgggcucacn n 21

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1216

gugagcccgu gcagcucucn n 21

<210> 1217 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1217

gagcugcacg ggcucaccan n 21

<210> 1218 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

5

10

15

20

25

30

35

<400> 1218

uggugagccc gugcagcucn n 21

<210> 1219 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20) . . (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1219

uacaccaucg cagcccugcn n 21

<210>1220 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20) .. (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1220

gcagggcugc gaugguguan n 21

<210> 1221 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

5

10

15

20

25

30

35

<222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1221

guccuggaug cuguccgagn n <210>1222 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <220>

<221> base_modificada <222> (20) . . (21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1222

cucggacagc auccaggacn n <210>1223 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1223

agagcugcac gggcucaccn n <210>1224 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

Rattus norvegicus"

21

Rattus norvegicus"

5

10

15

20

25

30

35

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <220>

<221> base_modificada <222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 1224

ggugagcccg ugcagcucun n 21

<210>1225 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1225

guccucugau ggucaaagut t 21

<210>1226 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1226

acuuugacca ucagaggact t 21

<210>1227 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1227

uucuugcucu auaaaccgut t 21

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1228

acgguuuaua gagcaagaat t 21

<210>1229 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1229

cucuauaaac cguguuagct t 21

<210>1230 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1230

gcuaacacgg uuuauagagt t 21

<210> 1231 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1231

ucgccacuac accaucgcat t 21

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1232

ugcgauggug uaguggcgat t 21

<210>1233 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1233

ucuugcucua uaaaccgugt t 21

<210> 1234 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1234

cacgguuuau agagcaagat t 21

<210>1235 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1235

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1236

uaacacgguu uauagagcat t 21

<210>1237 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1237

caguguucuu gcucuauaat t 21

<210>1238 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1238

uuauagagca agaacacugt t 21

<210>1239 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1239

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1240

cuaacacggu uuauagagct t 21

<210> 1241 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1241

ccuggaugcu guccgaggct t 21

<210>1242 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1242

gccucggaca gcauccaggt t 21

<210>1243 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1243

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1244

caggacuuug accaucagat t 21

<210>1245 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1245

cuggagagcu gcacgggcut t 21

<210>1246 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1246

agcccgugca gcucuccagtt 21

<210>1247 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1247

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1248

ugcuaacacg guuuauagat t 21

<210>1249 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1249

aacaguguuc uugcucuaut t 21

<210>1250 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1250

auagagcaag aacacuguut t 21

<210> 1251 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1251

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1252

aggacuuuga ccaucagagt t 21

<210>1253 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1253

ugcuguccga ggcagcccut t 21

<210> 1254 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1254

agggcugccu cggacagcat t 21

<210>1255 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1255

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1256

cccgugcagc ucuccagact t 21

<210>1257 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1257

acaguguucu ugcucuauat t 21

<210>1258 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1258

uauagagcaa gaacacugut t 21

<210>1259 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1259

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1260

ggacuuugac caucagaggt t 21

<210> 1261 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1261

aguccuggau gcuguccgat t 21

<210>1262 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1262

ucggacagca uccaggacut t 21

<210>1263 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1263

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1264

gcggucuucc cagaggcaat t 21

<210>1265 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1265

uggagagcug cacgggcuct t 21

<210>1266 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1266

gagcccgugc agcucuccat t 21

<210>1267 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

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5

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30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1268

gugagcccgu gcagcucuct t 21

<210>1269 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1269

gagcugcacg ggcucaccat t 21

<210>1270 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1270

uggugagccc gugcagcuct t 21

<210> 1271 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1271

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1272

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<210>1273 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1273

guccuggaug cuguccgagt t 21

<210> 1274 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1274

cucggacagc auccaggact t 21

<210>1275 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1275

5

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25

30

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<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1276

ggugagcccg ugcagcucut t 21

<210>1277 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1277

guccucugau ggucaaagut t 21

<210>1278 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1278

acuuugacca ucagaggact t 21

<210>1279 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1279

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1280

acgguuuaua gagcaagaat t 21

<210> 1281 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1281

cucuauaaac cguguuagct t 21

<210> 1282 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1282

gcuaacacgg uuuauagagt t 21

<210>1283 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1283

ucgccacuac accaucgcat t 21

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1284

ugcgauggug uaguggcgat t 21

<210>1285 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1285

ucuugcucua uaaaccgugt t 21

<210> 1286 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1286

cacgguuuau agagcaagat t 21

<210>1287 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1287

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1288

uaacacgguu uauagagcat t 21

<210>1289 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1289

caguguucuu gcucuauaat t 21

<210>1290 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1290

uuauagagca agaacacugt t 21

<210> 1291 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1291

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1292

cuaacacggu uuauagagct t 21

<210>1293 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1293

ccuggaugcu guccgaggct t 21

<210> 1294 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1294

gccucggaca gcauccaggt t 21

<210>1295 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1295

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1296

caggacuuug accaucagat t 21

<210>1297 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1297

cuggagagcu gcacgggcut t 21

<210>1298 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1298

agcccgugca gcucuccagtt 21

<210>1299 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1299

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1300

ugcuaacacg guuuauagat t 21

<210> 1301 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1301

aacaguguuc uugcucuaut t 21

<210> 1302 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1302

auagagcaag aacacuguut t 21

<210>1303 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1303

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1304

aggacuuuga ccaucagagt t 21

<210>1305 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1305

ugcuguccga ggcagcccut t 21

<210> 1306 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1306

agggcugccu cggacagcat t 21

<210>1307 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1307

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1308

cccgugcagc ucuccagact t 21

<210>1309 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1309

acaguguucu ugcucuauat t 21

<210> 1310 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1310

uauagagcaa gaacacugut t 21

<210> 1311 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1311

5

10

15

20

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30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1312

ggacuuugac caucagaggt t 21

<210> 1313 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1313

aguccuggau gcuguccgat t 21

<210> 1314 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1314

ucggacagca uccaggacut t 21

<210> 1315 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1315

uugccucugg gaagaccgct t 21

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1316

gcggucuucc cagaggcaat t 21

<210> 1317 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1317

uggagagcug cacgggcuct t 21

<210> 1318 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1318

gagcccgugc agcucuccat t 21

<210> 1319 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1319

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1320

gugagcccgu gcagcucuct t 21

<210> 1321 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1321

gagcugcacg ggcucaccat t 21

<210> 1322 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1322

uggugagccc gugcagcuct t 21

<210> 1323 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1323

uacaccaucg cagcccugct t 21

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1324

gcagggcugc gaugguguat t 21

<210> 1325 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1325

guccuggaug cuguccgagt t 21

<210> 1326 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1326

cucggacagc auccaggact t 21

<210> 1327 <211> 21 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1327

10

15

<212>ADN

<213> Rattus norvegicus <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Rattus norvegicus" <400> 1328

ggugagcccg ugcagcucut t 21

<210> 1329 <211> 650 <212> ADN

<213> Homo sapiens <400> 1329

acagaagtcc actcattctt ggcaggatgg cttctcatcg ctggactggt atttgtgtct gaggctggcc ctacgggcac tgatggtcaa agttctagat gctgtccgag gcagtcctgc tgttcagaaa ggctgctgat gacacctggg agccatttgc ctggagagct gcatgggctc acaactgagg aggaatttgt aaatagacac caaatcttac tggaaggcac ttggcatctc aggtggtatt cacagccaac gactccggcc cccgccgcta gcccctactc ctattccacc acggctgtcg tcaccaatcc ctccagtgga cctgaaggac gagggatggg atttcatgta actaaagcag tgttttcacc tcatatgcta tgttagaagt attcctgtga aaggcacttt tcattccaaa aaaaaaaaaa

<210>1330 <211>595 <212> ADN

tctgctcctc

ctctgccttg 60

cggtgaatcc

aagtgtcctc 120

catcaatgtg

gccgtgcatg 180

ctctgggaaa

accagtgagt 240

agaagggata

tacaaagtgg 300

cccattccat

gagcatgcag 360

caccattgcc

gccctgctga 420

caaggaatga

gggacttctc 480

accaagagta

ttccattttt 540

ccaggcagag

acaataaaac 600

aaaaaaaaaa

650

<400> 1330 cctgacagga

tctgaagctg

gatgctgtcc

gacggaagct

ctcaccacag

tactggaagg

aatgactctg

accactgctg

ttgccaaagc

agcaactcgg

tggcttccct tcgcctgttc gccctggggg tgctggagaa gaggcagccc tgctgtcgat gggagccgtt tgcctctggg atgagaagtt cacggaaggg ctcttggcat ttccccattc gtcatcgcca ctacaccatc tcgtcagtaa cccccagaac agtagctccc atttgtactg gaagatgccg tgaaacgttc

ctcctctgcc tcgctggact tccaagtgtc ctctgatggt gtggccgtga aagtgttcaa aagaccgccg agtctggaga gtgtacaggg tagaactgga catgaatacg cagaggtggt gcagccctgc tcagcccgta tgagggaccc agcccacgag aaacagtgtt cttgctctat ttattaaacc acctttattt

gatatttgcg

60

caaagtcctg

120

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180

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240

caccaaatca

300

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360

ctcctacagc

420

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cattc

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5

10

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tcaataatca gaatcagcag gtttgcagtc agattggcag ggataagcag 60

cctagctcag

gagaagtgag tataaaagcc ccaggctggg agcagccatc acagaagtcc 120

actcattctt

ggcaggatgg cttctcatcg tctgctcctc ctctgccttg ctggactggt 180

atttgtgtct

gaggctggcc ctacgggcac cggtgaatcc aagtgtcctc tgatggtcaa 240

agttctagat

gctgtccgag gcagtcctgc catcaatgtg gccgtgcatg tgttcagaaa 300

ggctgctgat

gacacctggg agccatttgc ctctgggaaa accagtgagt ctggagagct 360

gcatgggctc

acaactgagg aggaatttgt agaagggata tacaaagtgg aaatagacac 420

caaatcttac

tggaaggcac ttggcatctc cccattccat gagcatgcag aggtggtatt 480

cacagccaac

gactccggcc cccgccgcta caccattgcc gccctgctga gcccctactc 540

ctattccacc

acggctgtcg tcaccaatcc caaggaatga gggacttctc ctccagtgga 600

cctgaaggac

gagggatggg atttcatgta accaagagta ttccattttt actaaagcag 660

tgttttcacc

tcatatgcta tgttagaagt ccaggcagag acaataaaac attcctgtga 720

aaggcacttt

tcattccact ttaacttgat tttttaaatt cccttattgt cccttccaaa 780

aaaaagagaa

tcaaaatttt acaaagaatc aaaggaattc tagaaagtat ctgggcagaa 840

cgctaggaga

gatccaaatt tccattgtct tgcaagcaaa gcacgtatta aatatgatct 900

gcagccatta <210> 1332 <211> 21

aaaagacaca ttctgtaaaa aaaaaaaa 938

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1332

gggauuucau guaaccaagtt <210>1333 <211> 21 <212> ADN

21

<213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

5

10

15

20

25

30

35

<210> 1334

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1334

ggauuucaug uaaccaagat t

<210>1335

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1335

ucuugguuac augaaaucct t

<210> 1336

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1336

gauuucaugu aaccaagagt t

<210>1337

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

cucuugguua caugaaauct t <210>1338

<211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1338

auuucaugua accaagagut t

<210>1339

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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acucuugguu acaugaaaut t

<210> 1340

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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uuucauguaa ccaagaguat t

<210> 1341

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

21

21

21

5

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20

25

30

35

<210> 1342

<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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uucauguaac caagaguaut t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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auacucuugg uuacaugaat t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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ucauguaacc aagaguauut t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

21

21

21

5

10

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20

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30

35

<210> 1346

<211> 21

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<220>

<221> fuente

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cauguaacca agaguauuct t

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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Homo sapiens"

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gaauacucuu gguuacaugt t

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<211> 21

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<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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auguaaccaa gaguauucct t

<210> 1349

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

ggaauacucu ugguuacaut t

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<211> 21

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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uggaauacuc uugguuacat t

<210> 1352

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1352

uaaccaagag uauuccauut t

<210>1353

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

21

21

21

21

5

10

15

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25

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35

aauggaauac ucuugguuat t

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<211> 21

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<220>

<221> fuente

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aaccaagagu auuccauuut t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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aaauggaaua cucuugguut t

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

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21

21

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<220>

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<220>

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aaaaauggaa uacucuuggt t

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<220>

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21

21

21

5

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aagaguauuc cauuuuuact t

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<220>

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guaaaaaugg aauacucuut t

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agaguauucc auuuuuacut t

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21

21

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<220>

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<220>

<221> fuente

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uaguaaaaau ggaauacuct t

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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aguauuccau uuuuacuaat t

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21

21

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<220>

<221> fuente

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guauuccauu uuuacuaaat t

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<211> 21

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<220>

<221> fuente

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<220>

<221> fuente

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uauuccauuu uuacuaaagtt

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21

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<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

<400> 1374

auuccauuuu uacuaaagct t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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gcuuuaguaa aaauggaaut t

<210> 1376

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

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uuccauuuuu acuaaagcat t

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21

21

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ugcuuuagua aaaauggaat t

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<211> 21

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<213> Homo sapiens

<220>

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uccauuuuua cuaaagcagt t

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<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1379

cugcuuuagu aaaaauggat t

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<211> 21

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<213> Homo sapiens

<220>

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ccauuuuuac uaaagcagut t

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21

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acugcuuuag uaaaaauggtt

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<220>

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cauuuuuacu aaagcagugt t

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<220>

<221> fuente

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Homo sapiens"

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cacugcuuua guaaaaaugt t

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<220>

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<220>

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uuuuuacuaa agcaguguut t

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<220>

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21

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<220>

<221> fuente

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Homo sapiens"

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21

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5

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<220>

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ugaaaacacu gcuuuaguat t

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<220>

<221> fuente

21

21

5

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<221> fuente

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<220>

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<211> 21

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<220>

<221> fuente

21

21

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20

25

30

35

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<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada:

Homo sapiens"

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<211> 21

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<220>

<221> fuente

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aaagcagugu uuucaccuct t

<210>1403

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descnpción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1403

gaggugaaaa cacugcuuut t

<210> 1404

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

aagcaguguu uucaccucat t <210>1405

21

21

21

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1405

ugaggugaaa acacugcuut t

<210> 1406

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1406

agcaguguuu ucaccucaut t

<210>1407

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens" <400> 1407

augaggugaa aacacugcut t

<210>1408

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> fuente

guaaccaaga guauuccaut t <210>1409

21

21

21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

5 <221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: Homo sapiens"

<400> 1409

auggaauacucuugguuactt 21

<210> 1410 10 <211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<221> fuente

15 <223> /nota=“Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético"

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de molécula de ADN/ARN combinada: oligonucleótido sintético" <400> 1410

20 gtaaccaa gagtattccat 19

Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   1. Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) para inhibir la expresión de transtiretina (TTR), en donde:

   (a) dicho ARNds comprende una hebra transcrita y una hebra complementaria, comprendiendo la hebra complementaria una región complementaria a una parte de un ARNm que codifica transtiretina (TTR), donde dicha región de complementariedad tiene 19 nucleótidos de longitud, la hebra complementaria comprende la SEC. ID N.° 170 y cada hebra del ARNds tiene 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 nucleótidos de longitud; o

   (b) dicho ARNds comprende una hebra complementaria que comprende una región complementaria a 19 nucleótidos de 618-648 nucleótidos de la SEC ID N.° 1331 y en donde dicha base de la hebra complementaria se empareja con la guanina en la posición 628 de la SEC. ID N.° 1331;

   y en donde el ARNds se formula en una partícula lipídica de ácido nucleico que comprende un lípido catiónico, un lípido no catiónico y un lípido que evita la agregación de la partícula.
2. 2. El ARNds según la reivindicación 1, en donde dicho lípido catiónico es 4-(dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo (MC3).
3. 3. El ARNds según la reivindicación 1, en donde dicho lípido no catiónico es diestearoilfosfatidilcolina (DSPC).
4. 4. El ARNds según la reivindicación 1, en donde dicho lípido que evita la agregación de la partícula es un polietilenglicol (PEG)-lípido.
5. 5. El ARNds según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la formulación comprende además colesterol.
6. 6. El ARNds según la reivindicación 1, en donde la formulación comprende MC3, DSPC, colesterol y PEG2000-C14.
7. 7. El ARNds según la reivindicación 1, en donde la formulación comprende MC3/DSPC/colesterol/PEG2000-C14 en una proporción de 50/10/38,5/1,5 % en moles.
8. 8. El ARNds según una cualquiera de las reivindicaciones 1a 7, en donde:

   (a) la hebra transcrita consiste en la SEC. ID N.° 449 y la hebra complementaria consiste en la SEC. ID N.° 450;

   (b) la hebra transcrita consiste en la SEC. ID N.° 729 y la hebra complementaria consiste en la SEC. ID N.° 730; o

   (c) la hebra transcrita consiste en la SEC. ID N.° 1009 y la hebra complementaria consiste en la SEC. ID N.° 1010.
9. 9. El ARNds según una cualquiera de las reivindicaciones 1a 7, en donde la hebra transcrita comprende la SEC. ID N.° 169.
10. 10. El ARNds según una cualquiera de las reivindicaciones 1a 7, en donde dicho ARNds comprende al menos un nucleótido modificado, en donde preferiblemente al menos uno de dichos nucleótidos modificados se elige del grupo de: un nucleótido 2-O-metilo-modificado, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato, un nucleótido terminal ligado a un derivado de colesterilo o un grupo bisdecilamida de ácido dodecanoico, un nucleótido 2'-desoxi- 2-fluoro-modificado, un nucleótido 2'-desoxi-modificado, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido 2'-amino-modificado, nucleótido 2'-alquil-modificado, nucleótido de morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende base no natural.
11. 11. El ARNds según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el ARNds está conjugado a un ligando.
12. 12. Una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen de la TTR que comprende el ARNds según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un portador farmacéuticamente aceptable.
13. 13. Un método para inhibir la expresión de la TTR en una célula, comprendiendo el método:

    (a) poner en contacto la célula con el ARNds según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11; y

    (b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación de la transcripción de ARNm de un gen de la TTR, inhibiendo de ese modo la expresión del gen de la TTR en la célula;

    siempre que se excluya cualquier método de tratamiento del cuerpo de un ser humano o animal por terapia.
14. 14. Un ARNds según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para uso en el tratamiento en un ser humano de

    482

    un trastorno mediado por expresión de la TTR, en donde:

    (a) el ser humano presenta amiloidosis por transtiretina y/o

    (b) el ser humano presenta un trastorno hepático

    en donde dicha amiloidosis por transtiretina se selecciona preferiblemente de polineuropatía amiloidótica familiar 5 (FAP), cardiomiopatía amiloidótica familiar (FAC), amiloidosis leptomeningea/del SNC, amiloidosis sistémica senil (SSA) y amiloidosis cardíaca senil (SCA).
15. 15. El ARNds para uso según la reivindicación 14, en donde dicho ARNds se tiene que administrar al ser humano a aproximadamente 0,01; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,546; 0,59; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 2,5 o 5,0 mg/kg.
16. 16. El ARNds para uso según la reivindicación 14 o 15, en donde el ser humano recibe adicionalmente un método 10 terapéutico para tratar una amiloidosis por TTR, el método terapéutico seleccionado del grupo que consiste en:

    diuréticos, inhibidores de la enzima de conversión de angiotensina, bloqueadores de los receptores de angiotensina, diálisis y un trasplante de hígado.
17. 17. El ARNds para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde el ARNds se tiene que administrar al ser humano a intervalos de no más de 1, 2, 3 o 4 semanas.

    15 18. El ARNds para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde dicho ARNds se tiene que

    administrar por vía intravenosa o por infusión intravenosa durante un tiempo de 15 minutos.