ES2893199T3 - Terapia de ARNbc para amiloidosis ocular relacionada con transtiretina (TTR) - Google Patents

Terapia de ARNbc para amiloidosis ocular relacionada con transtiretina (TTR) Download PDF

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Kumamoto University NUC
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Abstract

Un ARNbc que selecciona como diana TTR para su uso en un método de tratamiento de amiloidosis ocular relacionada con TTR reduciendo la expresión de TTR en un epitelio pigmentario de la retina de un sujeto, en el que el ARNbc va a administrarse a la retina del sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia de ARNbc para amiloidosis ocular relacionada con transtiretina (TTR)
Campo de la invención
La presente invención está definida por las reivindicaciones. En términos generales, la presente invención se refiere al tratamiento de la amiloidosis ocular relacionada con TTR con ARNip.
Antecedentes de la invención
La transtiretina (TTR) es una proteína de unión a la hormona tiroidea secretada. La TTR se une y transporta la proteína de unión al retinol (RBP)/vitamina A y la tiroxina en suero (T4) en el plasma y el líquido cefalorraquídeo. Tanto la TTR de secuencia normal como la TTR de secuencia variante provocan amiloidosis. La TTR de secuencia normal provoca amiloidosis cardíaca en personas de edad avanzada y se denomina amiloidosis sistémica senil (SSA) (también denominada amiloidosis cardíaca senil (SCA)). La SSA a menudo va acompañada de depósitos microscópicos en muchos otros órganos. Las mutaciones TTR aceleran el proceso de formación de amiloide TTR y son el factor de riesgo más importante para el desarrollo de amiloidosis por TTR clínicamente significativa (también denominada ATTR (tipo amiloidosis-transtiretina)). Se sabe que más de 85 variantes de TTR amiloidogénicas provocan amiloidosis familiar sistémica. El hígado es el sitio principal de expresión de TTR. Otros sitios importantes de expresión incluyen el plexo coroideo, la retina y el páncreas.
La amiloidosis por TTR se manifiesta de diversas formas. Cuando el sistema nervioso periférico se ve afectado de manera más prominente, la enfermedad se denomina polineuropatía amiloidótica familiar (FAP). Cuando el corazón está principalmente afectado pero el sistema nervioso no, la enfermedad se denomina miocardiopatía amiloidótica familiar (FAC). Un tercer tipo importante de amiloidosis por TTR se denomina amiloidosis leptomeníngea/SNC (sistema nervioso central).
Se ha demostrado que las moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) bloquean la expresión génica en un mecanismo regulador altamente conservado conocido como interferencia de ARN (iARN). El documento WO 99/32619 (Fire et al.) dio a conocer el uso de un ARNbc de al menos 25 nucleótidos de longitud para inhibir la expresión de genes en C. elegans. También se ha demostrado que el ARNbc degrada el ARN diana en otros organismos, incluyendo las plantas (véase, por ejemplo, el documento WO 99/53050, Waterhouse et al.; y el documento WO 99/61631, Heifetz et al.), Drosophila (véase, por ejemplo, Yang, D. et al., Curr. Biol. (2000) 10: 1191-1200) y mamíferos (véase el documento 00/44895, Limmer; y el documento DE 10100586,5, Kreutzer et al.).
El documento U.S. 20070207974 da a conocer ARNip funcionales e hiperfuncionales. El documento U.S.
20090082300 da a conocer moléculas antisentido dirigidas contra TTR. La patente estadounidense n.° 7.250.496 da a conocer microARN dirigidos contra TTR.
Sumario
La presente invención está definida por las reivindicaciones. Con más detalle, la invención proporciona un ARNbc que selecciona como diana TTR para su uso en un método de tratamiento de amiloidosis ocular relacionada con TTR reduciendo la expresión de TTR en un epitelio pigmentario de la retina de un sujeto, en el que el ARNbc va a administrarse a la retina del sujeto. En una realización, el ARNbc que va a usarse tiene (i) la hebra sentido uuuuAcuAAAGcAGuGuuudTdT y la hebra antisentido AAAcACUGCUUuAGuAAAAdTdT, o (ii) la hebra sentido uuuAcuAAAGcAGuGuuuudTdAdT y la hebra antisentido AAAAcACUGCUUuAGuAAAdTdT, en el que c es 2'-O-metilcitidina-3'-fosfato, u es 2'-O-metiluridina-3'-fosfato y dT es 2'-desoxitimidina-3'-fosfato. En otra realización, el ARNbc que va a usarse tiene (i) la hebra sentido AGuccAGGcAGAGAcAAuAdTdT y la hebra antisentido uAUUGUCUCUGCCUGGACUdTdT, o (ii) la hebra sentido uccAGGcAGAGAcAAuAAAdTdT y la hebra antisentido UUuAUUGUCUCUGCCUGGAdTdT, en el que c es 2'-O-metilcitidina-3'-fosfato, u es 2'-O-metiluridina-3'-fosfato y dT es 2'-desoxitimidina-3'-fosfato.
También se describe en el presente documento un método para reducir la expresión de transtiretina (TTR) en el epitelio pigmentario de la retina (RPE) de un sujeto administrando una cantidad suficiente de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) a la retina del sujeto. El ARNbc puede ser AD-18324 o AD-18534. El ARNbc puede conjugarse con, por ejemplo, colesterol.
El sujeto puede ser un ser humano. El sujeto puede ser un ser humano que necesite tratamiento para la amiloidosis ocular relacionada con TTR. El ARNbc puede ser AD-18324. El método puede dar como resultado una expresión de TTR reducida en el RPE. El método puede dar como resultado una expresión de ARNm de TTR reducida en al menos el 40% o en al menos el 60% en comparación con un control. La administración del ARNbc puede no dar como resultado una respuesta inflamatoria en el ser humano tal como se mide mediante los niveles de IL-6 o TNF-alfa.
El sujeto puede ser un ser humano que posee un gen ATTR (transtiretina amiloidogénica) V30M que necesita tratamiento para la amiloidosis ocular relacionada con TTR. El ARNbc administrado al sujeto con ATTR V30M puede ser AD-18324. El método puede dar como resultado una reducción de la expresión de TTR V30M en el epitelio pigmentario de la retina. El método puede dar como resultado una reducción de la expresión de ARNm de TTR V30M en al menos el 60% en comparación con un control. La administración del ARNbc puede no dar como resultado una respuesta inflamatoria en el ser humano que posee un gen ATTR V30M tal como se mide mediante los niveles de IL-6 o TNF-alfa.
El sujeto puede ser una rata Dark Agouti (DA). El ARNbc que se administra a la rata DA puede ser AD-18534. El método puede dar como resultado una reducción de la expresión de TTR en el epitelio pigmentario de la retina. El método puede dar como resultado una reducción de la expresión de ARNm de TTR en la rata DA en al menos el 60% en comparación con un control. La administración del ARNbc puede no dar como resultado una respuesta inflamatoria en la rata DA tal como se mide mediante los niveles de IL-6 o TNF-alfa.
El sujeto puede ser una rata transgénica que posee un gen ATTR (transtiretina amiloidogénica) V30M humano. El ARNbc administrado a la rata transgénica ATTR V30M puede ser AD-18324. El método puede dar como resultado una reducción de la expresión de TTR en el epitelio pigmentario de la retina. El método puede dar como resultado una reducción de la expresión de ARNm de TTR en al menos el 60% en comparación con un control. La administración del ARNbc puede no dar como resultado una respuesta inflamatoria en la rata Tg con ATTR V30M tal como se mide mediante los niveles de IL-6 o TNF-alfa.
También se describe en el presente documento un método para tratar, prevenir o manejar la amiloidosis ocular relacionada con TTR administrando a un paciente que necesita dicho tratamiento, prevención o manejo de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de AD-18324 a la retina del paciente.
También se describe en el presente documento un método para tratar a un ser humano, que incluye identificar a un ser humano diagnosticado con amiloidosis ocular relacionada con TTR o en riesgo de desarrollar amiloidosis ocular relacionada con TTR y administrar al ser humano una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de AD-18324 a la retina del ser humano.
También se describe en el presente documento un método para inhibir la expresión de TTR en una célula del epitelio de la retina, en el que el método comprende (a) introducir en la célula del epitelio de la retina un ARNbc, en el que el ARNbc es AD-18324 o AD-18534 y (b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm de un gen de TTR, inhibiendo así la expresión del gen de TTR en la célula. El ARNbc administrado en este método puede ser AD-18324. La célula del epitelio de la retina puede ser una célula transgénica del epitelio pigmentario de la retina humana. El método puede dar como resultado la inhibición de la expresión de TTR en al menos el 10%, el 40% o al menos el 60%. La introducción del ARNbc en la célula del epitelio de la retina puede no dar como resultado una respuesta inflamatoria tal como se mide mediante los niveles de IL-6 o TNF-alfa.
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se establecen en la descripción siguiente. Otras características, objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y los dibujos y de las reivindicaciones.
Descripción de los dibujos
La figura 1 es un gráfico de los niveles de TNFalfa e IFNalfa en PBMC humanas cultivadas tras la transfección con ARNip de TTR.
Las figuras 2A y 2B son curvas de respuesta a la dosis para AD-18324 y AD-18328, respectivamente, en células HepG2.
La figura 3 es una curva de respuesta a la dosis para AD-18246 en células HepG2.
Las figuras 4A y 4B muestran la inhibición de los niveles de ARNm en hígado y de proteínas plasmáticas, respectivamente, en ratones transgénicos H129-mTTR-KO/iNOS-KO/hTTR mediante la administración de un bolo intravenoso de TTR-ARNbc (AD-18324, AD-18328 y AD-18246) formulados en LNP01.
La figura 5 es un gráfico que resume las mediciones de los niveles de ARNm de TTR en hígados de primates no humanos después de una infusión intravenosa de 15 minutos de ARNbc de TTR (AD-18324 y AD-18328) formulado en SNALP.
Las figuras 6A y 6B muestran la inhibición de los niveles de ARNm en hígado de TTR V30M humano y de proteínas en suero, respectivamente, en ratones transgénicos mediante la administración de un bolo intravenoso de SNALP-18328. Se determinaron las medias de los grupos, se normalizaron con respecto al grupo de control de PBS y luego se representaron gráficamente. Las barras de error representan desviaciones estándar. La reducción porcentual de la media del grupo, en relación con PBS, está indicada para los grupos SNALP-1955 y SNALP-18328. (*** p <0,001, ANOVA de una vía, con prueba a posteriori de Dunn).
Las figuras 7A y 7B muestran la durabilidad de la reducción de los niveles e ARNm en hígado de TTR V30M humano y de proteínas en suero, respectivamente, en ratones transgénicos durante 22 días después de una única administración de un bolo intravenoso de SNALP-18328. Se determinaron las medias del grupo. Los niveles de ARNm de TTR/GAPDH se normalizaron a los niveles del día 0 y se representaron gráficamente. Se calculó el porcentaje de reducción de los niveles de ARNm de TTR normalizados en relación con SNALP-1955 para cada punto de tiempo y se indicaron para los grupos de SNALP-18328. (*** p <0,001, ANOVA de una vía, con prueba a posteriori de Dunn).
La figura 8 muestra el transcurso temporal de los niveles de proteínas en suero de TTR en primates no humanos durante 14 días tras una única infusión intravenosa de 15 minutos de SNALP-18328.
La figura 9 muestra la reducción de la inmunorreactividad de TTR en diversos tejidos de ratones deficientes en TTR/HSF-1 V30M humana tras la administración de un bolo intravenoso de SNALP-18328. E, esófago; S, estómago; 11, intestino/duodeno; 14, intestino/colon; N, nervio; D, ganglios de la raíz posterior.
La figura 10 muestra las mediciones de los niveles de ARNm de TTR en hígados de primates no humanos tras una infusión intravenosa de 15 minutos de XTC-SNALP-18328.
Las figuras 11A y 11B muestran las mediciones de los niveles de ARNm de TTR y de proteínas en suero, respectivamente, en hígados de primates no humanos tras una infusión intravenosa de 15 minutos de LNP09-18328 o LNP11-18328. La figura 11C muestra el transcurso de tiempo de los niveles de proteína en suero de TTR durante 28 días tras una infusión intravenosa de 15 minutos de 0,3 mg/kg de LNP09-18328, en comparación con el grupo de control de PBS.
La figura 12 muestra la secuencia de ARNm de TTR humana (secuencia de referencia NM_000371.3, SEQ ID NO: 1331).
Las figuras 13A y 13B son las secuencias de ARNm de TTR humana y de rata, respectivamente. La figura 13A es la secuencia de ARNm de TTR humana (secuencia de referencia NM_000371.2, SeQ ID NO: 1329). La figura 13B es la secuencia de ARNm de TTR de rata (secuencia de referencia NM_012681.1, SEQ ID NO: 1330).
La figura 14 muestra la alineación de nucleótidos de NM_000371.3, NM_000371.2 y AD-18328.
La figura 15 ilustra síntomas y mutaciones en TTR asociados con neuropatía amiloidótica familiar, miocardiopatía amiloidótica familiar y amiloidosis del SNC.
La figura 16 muestra la reducción de los niveles de ARNm de TTR en hígado con SNALP-18534 con diferentes duraciones de infusión. A los grupos de animales (n = 4/grupo) se les administró 1 mg/kg de SNALP-18534 mediante una infusión de 15 minutos o 1, 2 ó 3 horas. Cuarenta y ocho horas más tarde, se sacrificaron las ratas y se recogieron los hígados. Los niveles de ARNm de TTR y GAPDH se midieron a partir de lisados de hígado usando el ensayo ADNr Quantigene. Se calculó la razón de los niveles de ARNm de TTR con respecto a GAPDH para cada animal. Las medias de los grupos se determinaron y normalizaron con respecto a un grupo de control de PBS y luego se representaron gráficamente. Las barras de error representan desviaciones estándar. (*** p <0,001, ANOVA de una vía con prueba a posteriori de Bonferroni, en relación con PBS).
La figura 17 muestra las mediciones de los niveles de ARNm de TTR en hígados de ratas después de una infusión intravenosa de 15 minutos de LNP07-18534 o LNP08-18534.
La figura 18 muestra inhibición in vivo de los niveles de ARNm de TTR endógeno en hígados de ratas Sprague-Dawley tras una infusión intravenosa de 15 minutos de LNP09-18534 o LNP11-18534. Se administraron por vía intravenosa a grupos de animales (n = 4/grupo) 0,01, 0,03, 0,1 ó 0,3 mg/kg de LNP09-18534, LNP-11-18534; o PBS a través de una infusión de 15 minutos. Cuarenta y ocho horas después, se sacrificaron los animales y se recogieron los hígados. Los niveles de ARNm de TTR y GAPDH se midieron a partir de lisados de biopsia del hígado usando el ensayo ADNr Quantigene. Se calculó la razón de los niveles de ARNm de TTR a GAPDH para cada animal. Se determinaron las medias de los grupos, se normalizaron con respecto al grupo de control de PBS y luego se representaron gráficamente. Las barras de error representan desviaciones estándar.
La figura 19 muestra la eficacia del ARNip formulado con LNP12 que selecciona como diana TTR en primates no humanos. Los puntos de datos representan la media del grupo ± de.
La figura 20 es un gráfico con los resultados de un estudio de GLP en NHP que ilustra la durabilidad de la supresión de ARNm por ALN-TTR01.
La figura 21 es un gráfico que ilustra la regresión de los depósitos de TTR en diversos tejidos de animales maduros (ratones deficientes en Tt R/HSF-1 hV30M) tras la administración de un bolo intravenoso de SNALP-18328 (ALN-TTR01).
La figura 22 es un gráfico que muestra los efectos de ARNip de TTR humana AD-18324 sobre la expresión del ARNm de TTR en células a Rp E 19. Se comparó AD-18324 con ARNip de TTR de rata AD-18534. La expresión de ARNm de TTR humana se calculó en relación con la expresión de GAPDH humana.
La figura 23 es un gráfico que muestra el efecto de AD-18534 sobre la expresión de ARNm de TTR en células del epitelio pigmentario de la retina de ratas Dark Agouti (DA). Se comparó AD-18534 con un grupo de ARNip de control, un grupo de solución salina y un grupo sin tratamiento. La expresión de ARNm de TTR de rata endógena se calculó en relación con la expresión de GAPDh de rata.
La figura 24 es un gráfico que muestra el efecto de AD-18324 sobre la expresión de ARNm de ATTR en células del epitelio pigmentario de la retina en ratas transgénicas con ATTR V30M. Se comparó AD-18324 con un grupo de ARNip de control, un grupo de solución salina y un grupo sin tratamiento. La expresión de ARNm de TTR humana se calculó en relación con la expresión de GAPDH de rata.
La figura 25 es una inmunotransferencia de tipo Western que muestra el efecto del ARNip de TTR humana sobre la expresión de la proteína TTR humana en células epiteliales pigmentarias de la retina en ratas transgénicas con ATTR V30M en comparación con un ARNip de control.
La figura 26 es un gráfico que muestra el efecto de AD-23043 (ARNip cho-TTR) sobre la expresión de ARNm de TTR de rata en células del epitelio pigmentario de la retina de ratas Dark Agouti (DA) 14 y 21 días después de la administración. La expresión de ARNm de TTR de rata endógena se calculó en relación con la expresión de GAPDH de rata.
La figura 27 es un gráfico que muestra el efecto de AD-23043 (ARNip cho-TTR) sobre la expresión de ARNm de TTR de rata en células del epitelio pigmentario de la retina de ratas Dark Agouti (DA) 21 días después de la administración. La expresión de ARNm de TTR de rata endógena se calculó en relación con la expresión de GAPDH de rata.
Descripción detallada
La presente invención está definida por las reivindicaciones. En términos generales, la invención proporciona ARNbc y métodos de uso de ARNbc para inhibir la expresión de un gen de TTR en una célula o un mamífero donde el ARNbc selecciona como diana un gen de TTR. También se proporcionan en el presente documento composiciones y métodos para tratar estados y enfermedades patológicas, tales como amiloidosis por TTR en un mamífero provocada por la expresión de un gen de TTR. El ARNbc dirige la degradación específica de secuencia del ARNm a través de un proceso conocido como interferencia de ARN (iARN).
Los ARNbc de las composiciones descritas en el presente documento incluyen una hebra de ARN (la hebra antisentido) que tiene una región que tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente 19-24 nucleótidos de longitud y es sustancialmente complementaria a al menos parte de un transcrito de ARNm de un gen de TTR. El uso de estos ARNbc permite la degradación dirigida de ARNm de genes que están implicados en patologías asociadas con la expresión de TTR en mamíferos. En particular, dosis muy bajas de ARNbc de TTR pueden mediar de manera específica y eficaz iARN, lo que da como resultado una inhibición significativa de la expresión de un gen de TTR. Usando ensayos basados en células, los presentes inventores han demostrado que los ARNbc que seleccionan como diana TTR pueden mediar de manera específica y eficaz iARN, lo que da como resultado una inhibición significativa de la expresión de un gen de TTR. Por tanto, los métodos y composiciones que incluyen estos ARNbc son útiles para tratar procesos patológicos que pueden estar mediados por la regulación por disminución de TTR, tal como en el tratamiento de un trastorno en hígado o una amiloidosis por TTR, por ejemplo, FAP.
Los métodos y composiciones que contienen un ARNbc de TTR son útiles para tratar procesos patológicos mediados por la expresión de TTR, tales como la amiloidosis por TTR. Un método para tratar un trastorno mediado por la expresión de TTR puede incluir administrar a un ser humano que necesite dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARNbc que selecciona como diana TTR. Puede administrarse un ARNbc al ser humano a aproximadamente 0,01, 0,1, 0,5, 1,0, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 mg/kg.
La siguiente descripción detallada da a conocer cómo fabricar y usar las composiciones que contienen ARNbc para inhibir la expresión de un gen de TTR, así como composiciones y métodos para tratar enfermedades y trastornos provocados por la expresión de este gen. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento incluyen un ARNbc que tiene una hebra antisentido que comprende una región de complementariedad que tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente de 19 a 24 nucleótidos de longitud y es sustancialmente complementaria a al menos parte de un transcrito de ARN de un gen de TTR, junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones descritas en el presente documento también incluyen un ARNbc que tiene una hebra antisentido que tiene una región de complementariedad que tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente de 19-24 nucleótidos de longitud y es sustancialmente complementaria a al menos parte de un transcrito de ARN de un gen de TTR.
La hebra sentido de un ARNbc puede incluir 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más nucleótidos contiguos de cualquiera de las hebras sentido dadas a conocer en el presente documento. La hebra antisentido de un ARNbc puede incluir 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más nucleótidos contiguos de cualquiera de las hebras antisentido dadas a conocer en el presente documento.
Un ARNbc puede incluir al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más nucleótidos modificados. Un nucleótido modificado puede incluir un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y/o un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o grupo bisdecilamida de ácido dodecanoico. Un nucleótido modificado puede incluir un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxilo, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, nucleótido de morfolino, un fosforamidato y/o una base no natural que comprende un nucleótido.
La región complementaria de un ARNbc puede tener al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más nucleótidos de longitud. La región complementaria puede incluir 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 169.
Cada hebra de un ARNbc puede tener 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más nucleótidos de longitud. El ARNbc puede incluir una hebra sentido, o un fragmento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos del mismo, seleccionado de las tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 y 16 y una hebra antisentido, o un fragmento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos del mismo, seleccionado de las tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 y 16.
La administración de un ARNbc a una célula puede dar como resultado aproximadamente el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 90%, el 95% o más de inhibición de la expresión de ARNm de TTR tal como se mide mediante un ensayo de PCR en tiempo real. La administración de un ARNbc a una célula puede dar como resultado de aproximadamente el 40% al 45%, del 45% al 50%, del 50% al 55%, del 55% al 60%, del 60% al 65%, del 65% al 70%, del 70% al 75%, del 75% al 80%, del 80% al 85%, del 85% al 90%, del 90% al 95% o más inhibición de la expresión de ARNm de TTR tal como se mide mediante un ensayo de PCR en tiempo real. La administración de un ARNbc a una célula puede dar como resultado aproximadamente el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 90%, el 95% o más de inhibición de la expresión de ARNm de TTR tal como se mide mediante ensayo de ADN ramificado. La administración de un ARNbc a una célula puede dar como resultado aproximadamente el 40% al 45%, del 45% al 50%, del 50% al 55%, del 55% al 60%, del 60% al 65%, del 65% al 70%, del 70% al 75%, del 75% al 80%, del 80% al 85%, del 85% al 90%, del 90% al 95% o más inhibición de la expresión de ARNm de TTR tal como se mide mediante un ensayo de ADN ramificado.
Un ARNbc puede tener una CI50 de menos de 0,01 pM, 0,1 pM, 1 pM, 5 pM, 10 pM, 100 pM o 1000 pM. Un ARNbc puede tener una DE50 de aproximadamente 0,01, 0,1, 1, 5 ó 10 mg/kg.
La administración de un ARNbc puede reducir el ARNm de TTR en aproximadamente el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 90%, el 95% o más en macacos cangrejeros. La administración de un ARNbc puede reducir los niveles de ARNm de TTR en hígado en aproximadamente el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 90%, el 95% o más o los niveles de proteína TTR en suero en aproximadamente el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 90%, el 95% o más. La administración de un ARNbc puede reducir los niveles de ARNm de TTR en hígado y/o los niveles de proteína TTR en suero hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más días. Un ARNbc puede formularse en una formulación de LNP y puede reducir los niveles de ARNm de TTR en aproximadamente el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 90%, el 95% o más a una dosis de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ó 1 mg/kg, en relación con un grupo de control de PBC. Un ARNbc puede formularse en una formulación de LNP y puede reducir los niveles de proteína TTR aproximadamente en el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 90%, el 95% o más en relación con un grupo de control de PBC medido por una inmunotransferencia de tipo Western. Un ARNbc puede suprimir los niveles de proteína TTR en suero hasta el día 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 después del tratamiento cuando se administra a un sujeto que lo necesita en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 mg/kg.
Por consiguiente, en algunos aspectos, se describen en el presente documento composiciones farmacéuticas que contienen un ARNbc de TTR y un portador farmacéuticamente aceptable, métodos para usar las composiciones para inhibir la expresión de un gen de TTR y métodos para usar las composiciones farmacéuticas para tratar enfermedades provocadas por la expresión de un gen de TTR.
I. Definiciones
Por conveniencia, se proporciona a continuación el significado de determinados términos y expresiones usados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas. Si existe una aparente discrepancia entre el uso de un término en otras partes de esta memoria descriptiva y su definición proporcionada en esta sección, prevalecerá la definición en esta sección.
“G”, “C”, “A” y “U” generalmente representan un nucleótido que contiene guanina, citosina, adenina y uracilo como base, respectivamente. “T” y “dT” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a un desoxirribonucleótido en el que la nucleobase es timina, por ejemplo, desoxirribotimina. Sin embargo, se entenderá que el término “ribonucleótido” o “nucleótido” o “desoxirribonucleótido” también puede referirse a un nucleótido modificado, tal como se detalla adicionalmente a continuación, o un resto sustituto de reemplazo. El experto en la técnica es consciente de que la guanina, la citosina, la adenina y el uracilo pueden reemplazarse por otros restos sin alterar sustancialmente las propiedades de apareamiento de bases de un oligonucleótido que comprende un nucleótido que porta tal resto de reemplazo. Por ejemplo, sin limitación, un nucleótido que comprende inosina como base puede aparearse con nucleótidos que contienen adenina, citosina o uracilo. Por tanto, los nucleótidos que contienen uracilo, guanina o adenina pueden reemplazarse en las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento por un nucleótido que contiene, por ejemplo, inosina. Las secuencias que comprenden tales restos de reemplazo también se describen en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, “transtiretina” (“TTR”) se refiere a un gen en una célula. TTR también se conoce como ATTR, HsT2651, PALB, prealbúmina, TBPA y transtiretina (prealbúmina, amiloidosis tipo I). La secuencia de un transcrito de ARNm de TTR humana puede encontrarse en Nm_000371. La secuencia de ARNm de TTR de ratón puede encontrarse en NM_013697.2 y la secuencia de ARNm de TTR de rata puede encontrarse en NM_012681.1.
Tal como se usa en el presente documento, “secuencia diana” se refiere a una porción contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante el transcrito de un gen de TTR, incluyendo el ARNm que es un producto del procesamiento de ARN de un producto de transcripción primario.
Tal como se usa en el presente documento, el término “hebra” que comprende una secuencia” se refiere a un oligonucleótido que comprende una cadena de nucleótidos que se describe mediante la secuencia a la que se hace referencia usando la nomenclatura de nucleótidos convencional.
Tal como se usa en el presente documento y a menos que se indique lo contrario, el término “complementario”, cuando se usa para describir una primera secuencia de nucleótidos en relación con una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos para hibridarse y formar un estructura de dúplex en determinadas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos, tal como entenderá el experto en la técnica. Tales condiciones pueden ser, por ejemplo, condiciones rigurosas, donde las condiciones rigurosas pueden incluir: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, 50°C o 70°C durante 12-16 horas seguido de lavado. Pueden aplicarse otras condiciones, tales como las condiciones fisiológicamente relevantes que pueden encontrarse dentro de un organismo. El experto en la técnica podrá determinar el conjunto de condiciones más apropiadas para una prueba de complementariedad de dos secuencias según la aplicación final de los nucleótidos hibridados.
Esto incluye el apareamiento de bases del oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos con el oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos en toda la longitud de la primera y segunda secuencia de nucleótidos. Tales secuencias pueden denominarse “completamente complementarias” entre sí en el presente documento. Sin embargo, cuando una primera secuencia se denomina “sustancialmente complementaria” con respecto a una segunda secuencia en el presente documento, las dos secuencias pueden ser completamente complementarias, o pueden formar una o más, pero generalmente no más de 4, 3 ó 2 pares de bases con apareamiento erróneo tras la hibridación, mientras se conserva la capacidad de hibridarse en las condiciones más relevantes para su aplicación final. Sin embargo, cuando se diseñan dos oligonucleótidos para formar, tras la hibridación, una o más proyecciones monocatenarias, tales proyecciones no se considerarán apareamientos erróneos con respecto a la determinación de complementariedad. Por ejemplo, un ARNbc que comprende un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de longitud, en el que el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es completamente complementaria al oligonucleótido más corto, aún puede denominarse “completamente complementario” para los propósitos descritos en el presente documento.
Las secuencias “complementarias”, tal como se usan en el presente documento, también pueden incluir, o estar formadas completamente a partir de pares de bases que no son de Watson-Crick y/o pares de bases formados a partir de nucleótidos modificados y no naturales, en la medida en que los requisitos anteriores con respecto a su capacidad de hibridarse se cumplen. Tales pares de bases que no son de Watson-Crick incluyen, pero no se limitan a, apareamiento de bases G:U Wobble o Hoogstein.
Los términos “complementario”, “completamente complementario” y “sustancialmente complementario” en el presente documento pueden usarse con respecto al apareamiento de bases entre la hebra sentido y la hebra antisentido de un ARNbc, o entre la hebra antisentido de un ARNbc y una secuencia diana, tal como se entenderá por el contexto de su uso.
Tal como se usa en el presente documento, un polinucleótido que es “sustancialmente complementario a al menos parte” de un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es sustancialmente complementario a una porción contigua del ARNm de interés (por ejemplo, un ARNm que codifica para TTR) que incluye un 5' UTR, un marco de lectura abierto (ORF) o 3' UTR. Por ejemplo, un polinucleótido es complementario al menos a una parte de un ARNm de TTR si la secuencia es sustancialmente complementaria a una porción no interrumpida de un ARNm que codifica para TTR.
El término “ARN bicatenario” o “ARNbc”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un complejo de moléculas de ácido ribonucleico, que tiene una estructura de dúplex que comprende dos hebras de ácido nucleico antiparalelas y sustancialmente complementarias, tal como se definió anteriormente. En general, la mayoría de los nucleótidos de cada hebra son ribonucleótidos, pero tal como se describe con detalle en el presente documento, cada una o ambas hebras también pueden incluir al menos un no ribonucleótido, por ejemplo, un desoxirribonucleótido y/o un nucleótido modificado. Además, tal como se usa en esta memoria descriptiva, “ARNbc” puede incluir modificaciones químicas a ribonucleótidos, incluyendo modificaciones sustanciales en múltiples nucleótidos e incluyendo todos los tipos de modificaciones dadas a conocer en el presente documento o conocidas en la técnica. Cualquiera de tales modificaciones, tal como se usa en una molécula de tipo ARNip, está englobada por “ARNbc” para los propósitos de esta memoria descriptiva y reivindicaciones.
Las dos hebras que forman la estructura de dúplex pueden ser porciones diferentes de una molécula de ARN más grande o pueden ser moléculas de ARN separadas. Cuando las dos hebras son parte de una molécula más grande y, por tanto, están conectadas por una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva que forma la estructura de dúplex, la cadena de ARN de conexión se denomina como un “bucle de horquilla”. Cuando las dos hebras están conectadas covalentemente por medios distintos a una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva que forma la estructura de dúplex, la estructura de conexión se denomina “ligador”. Las hebras de ARN pueden tener el mismo o diferente número de nucleótidos. El número máximo de pares de bases es el número de nucleótidos en la hebra más corta del ARNbc menos cualquier proyección que esté presente en el dúplex. Además de la estructura de dúplex, un ARNbc puede comprender una o más proyecciones de nucleótidos. El término “ARNip” también se usa en el presente documento para hacer referencia a un ARNbc tal como se describió anteriormente.
Tal como se usa en el presente documento, una “proyección de nucleótidos” se refiere al nucleótido o nucleótidos no apareados que sobresalen de la estructura de dúplex de un ARNbc cuando un extremo 3' de una hebra del ARNbc se extiende más allá del extremo 5' de la otra hebra, o viceversa. “Romo” o “extremo romo” significa que no hay nucleótidos desapareados en ese extremo del ARNbc, es decir, sin proyección de nucleótidos. Un ARNbc de “extremos romos” es un ARNbc bicatenario en toda su longitud, es decir, sin proyección de nucleótidos en ninguno de los extremos de la molécula.
El término “hebra antisentido” se refiere a la hebra de un ARNbc que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una secuencia diana. Tal como se usa en el presente documento, el término “región de complementariedad” se refiere a la región de la hebra antisentido que es sustancialmente complementaria a una secuencia, por ejemplo, una secuencia diana, tal como se define en el presente documento. Cuando la región de complementariedad no es completamente complementaria a la secuencia diana, los apareamientos erróneos se toleran más en las regiones terminales y, si están presentes, generalmente se encuentran en una región o regiones terminales, por ejemplo, dentro de 6, 5, 4, 3 ó 2 nucleótidos del extremo 5' y/o 3'.
El término “hebra sentido”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la hebra de un ARNbc que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una región de la hebra antisentido.
Tal como se usa en el presente documento, el término “SNALP” se refiere a una partícula estable de ácido nucleicolípido. Un SNALP representa una vesícula de lípidos que recubre un interior acuoso reducido que comprende un ácido nucleico tal como un ARNbc o un plásmido a partir del cual se transcribe un ARNbc. Se describen SNALP, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.os 20060240093, 20070135372 y USSN 61/045.228 presentada el 15 de abril de 2008.
“Introducir en una célula”, cuando se refiere a un ARNbc, significa facilitar la captación o absorción en la célula, como entienden los expertos en la técnica. La absorción o captación de ARNbc puede producirse a través de procesos celulares activos o de difusión sin ayuda, o por agentes o dispositivos auxiliares. El significado de este término no se limita a las células in vitro; un ARNbc también puede “introducirse en una célula”, en el que la célula es parte de un organismo vivo. En tal caso, la introducción en la célula incluirá la administración al organismo. Por ejemplo, para la administración in vivo, el ARNbc puede inyectarse en un sitio de tejido o administrarse sistémicamente. La introducción in vitro en una célula incluye métodos conocidos en la técnica tales como electroporación y lipofección. En el presente documento se describen enfoques adicionales o se conocen en la técnica.
Los términos “silencio”, “inhibir la expresión de”, “regular por disminución la expresión de”, “suprimir la expresión de” y similares en la medida en que se refieren a un gen de TTR, en el presente documento se refieren a la supresión al menos parcial de la expresión de un gen de TTR, tal como se manifiesta por una reducción de la cantidad de ARNm que puede aislarse de una primera célula o grupo de células en el que se transcribe un gen de TTR y que se ha o se han tratado de tal manera que la expresión de un gen de TTR se inhibe, en comparación con una segunda célula o grupo de células sustancialmente idénticas a la primera célula o grupo de células, pero que se no se ha o han tratado así (células de control). El grado de inhibición se expresa normalmente en cuanto a
[(ARNm en células de control)-(ARNm en células tratadas)/(ARNm en células de control)] x 100% Alternativamente, el grado de inhibición puede darse en cuanto a una reducción de un parámetro que está funcionalmente ligado a la expresión del gen de TTR, por ejemplo, la cantidad de proteína codificada por un gen de TTR que es secretado por una célula, o el número de células que muestran determinado fenotipo, por ejemplo, apoptosis. En principio, el silenciamiento del gen de TTR puede determinarse en cualquier célula que exprese la diana, o bien de manera constitutiva o bien mediante ingeniería genómica y mediante cualquier ensayo apropiado. Sin embargo, cuando se necesita una referencia con el fin de determinar si un ARNbc dado inhibe la expresión de un gen de TTR en un determinado grado y, por tanto, está incluido en la presente divulgación, los ensayos proporcionados en los ejemplos a continuación servirán como referencia.
Por ejemplo, en determinados casos, la expresión de un gen de TTR se suprime en al menos aproximadamente un 5%, un 10%, un 15%, un 20%, un 25%, un 30%, un 35%, un 40%, un 45% o un 50% mediante la administración del oligonucleótido bicatenario descrito en el presente documento. Un gen de TTR puede suprimirse en al menos aproximadamente un 60%, un 70% o un 80% mediante la administración del oligonucleótido bicatenario descrito en el presente documento. Un gen de TTR puede suprimirse en al menos aproximadamente un 85%, un 90% o un 95% mediante la administración del oligonucleótido bicatenario descrito en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento en el contexto de la expresión de TTR, los términos “tratar”, “tratamiento” y similares, se refieren a la mitigación o al alivio de procesos patológicos mediados por la expresión de TTR. En el contexto en el presente documento, en la medida en que se refiere a cualquiera de los otros estados enumerados a continuación en el presente documento (que no sean procesos patológicos mediados por la expresión de TTR), los términos “tratar”, “tratamiento” y similares significan mitigar o aliviar al menos un síntoma asociado con tal estado, o para ralentizar o revertir la progresión de tal estado, tal como la desaceleración de la progresión de una amiloidosis por TTR, tal como FAP. Los síntomas de la amiloidosis por TTR incluyen neuropatía sensorial (por ejemplo, parestesia, hiperestesia en las extremidades distales), neuropatía autónoma (por ejemplo, disfunción gastrointestinal, tal como úlcera gástrica o hipotensión ortostática), neuropatía motora, convulsiones, demencia, mielopatía, polineuropatía, síndrome del túnel carpiano, insuficiencia autonómica, miocardiopatía, opacidades vítreas, insuficiencia renal, nefropatía, IMCm (índice de masa corporal modificado) sustancialmente reducido, disfunción de los pares craneales y distrofia de la red corneal.
Tal como se usa en el presente documento, las expresiones “cantidad terapéuticamente eficaz” y “cantidad profilácticamente eficaz” se refieren a una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento, prevención o manejo de procesos patológicos mediados por la expresión de TTR o un síntoma manifiesto de procesos patológicos mediados por la expresión de TTR. La cantidad específica que es terapéuticamente eficaz puede determinarla fácilmente un médico habitual puede variar dependiendo de factores conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, el tipo de procesos patológicos mediados por la expresión de TTR, los antecedentes y la edad del paciente, la etapa de procesos patológicos mediados por la expresión de TTR y la administración de otros procesos antipatológicos mediados por agentes de expresión de TTR.
Tal como se usa en el presente documento, una “composición farmacéutica” comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de un ARNbc y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, “cantidad farmacológicamente eficaz”, “cantidad terapéuticamente eficaz” o simplemente “cantidad eficaz” se refiere a la cantidad de un ARN eficaz para producir el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo pretendido. Por ejemplo, si un tratamiento clínico dado se considera eficaz cuando hay al menos una reducción del 25% en un parámetro medible asociado con una enfermedad o trastorno, una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco para el tratamiento de esa enfermedad o trastorno es la cantidad necesaria para efectuar al menos una reducción del 25% en ese parámetro. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARNbc que selecciona como diana TTR puede reducir los niveles en suero de TTR en al menos un 25%. En otro ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARNbc que selecciona como diana TTR puede mejorar la función en hígado o renal en al menos un 25%.
El término “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un portador para la administración de un agente terapéutico. Tales portadores incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. El término excluye específicamente medio de cultivo celular. Para fármacos administrados por vía oral, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, excipientes farmacéuticamente aceptables tales como diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y conservantes. Los diluyentes inertes adecuados incluyen carbonato de sodio y calcio, fosfato de sodio y calcio y lactosa, mientras que el almidón de maíz y el ácido algínico son agentes disgregantes adecuados. Los agentes aglutinantes pueden incluir almidón y gelatina, mientras que el agente lubricante, si está presente, será generalmente estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Si se desea, los comprimidos pueden recubrirse con un material tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, para retrasar la absorción en el tracto gastrointestinal.
Tal como se usa en el presente documento, una “célula transformada” es una célula en la que se ha introducido un vector a partir del cual puede expresarse una molécula de ARNbc.
II. Ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc)
Tal como se describe con más detalle en el presente documento, en el presente documento se proporcionan moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen de TTR en una célula o mamífero, por ejemplo, en un ser humano que tiene una amiloidosis por TTR, donde el ARNbc incluye una hebra antisentido que tiene una región de complementariedad que es complementaria a al menos una parte de un ARNm formado en la expresión de un gen de TTR y donde la región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente 19-24 nucleótidos de longitud y donde dicho ARNbc, al entrar en contacto con una célula que expresa dicho gen de TTR, inhibe la expresión de dicho gen de TTR en al menos un 30%, tal como se somete a ensayo, por ejemplo, mediante un método basado en PCR o ADN ramificado (ADNr), o mediante un método basado en proteínas, tal como mediante inmunotransferencia de tipo Western. La expresión de un gen de TTR puede reducirse en al menos un 30% cuando se mide mediante un ensayo tal como se describe en los ejemplos a continuación. Por ejemplo, la expresión de un gen de TTR en cultivo celular, tal como en células Hep3B, puede someterse a ensayo midiendo los niveles de ARNm de TTR, tal como mediante el ensayo de ADNr o TaqMan, o midiendo los niveles de proteínas, tal como mediante el ensayo ELISA. El ARNbc descrito en el presente documento puede incluir además una o más proyecciones de nucleótidos monocatenarios.
El ARNbc puede sintetizarse mediante métodos convencionales conocidos en la técnica tal como se comenta adicionalmente a continuación, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado, tal como los que se encuentran disponibles comercialmente en, por ejemplo, Biosearch, Applied Biosystems, Inc. El ARNbc incluye dos hebras de ARN que son suficientemente complementarias para hibridarse para formar una estructura de dúplex. Una hebra del ARNbc (la hebra antisentido) incluye una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria y en general completamente complementaria, a una secuencia diana, derivada de la secuencia de un ARNm formado durante la expresión de un gen de TTR, la otra hebra (la hebra sentido) incluye una región que es complementaria a la hebra antisentido, de modo que las dos hebras se hibridan y forman una estructura de dúplex cuando se combinan en condiciones adecuadas. Generalmente, la estructura de dúplex tiene entre 15 y 30 o entre 25 y 30, o entre 18 y 25, o entre 19 y 24, o entre 19 y 21, o 19, 20 ó 21 pares de bases de longitud. El dúplex puede tener una longitud de 19 pares de bases. Además, el dúplex puede tener una longitud de 21 pares de bases. Cuando se usan dos ARNip diferentes en combinación, las longitudes de los dúplex pueden ser idénticas o pueden diferir.
Cada hebra del ARNbc descrito en el presente documento tiene generalmente entre 15 y 30, o entre 18 y 25, o 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 nucleótidos de longitud. Cada hebra puede tener una longitud de 25-30 nucleótidos. Cada hebra del dúplex puede tener la misma longitud o diferentes longitudes. Cuando se usan dos ARNip diferentes en combinación, las longitudes de cada hebra de cada ARNip pueden ser idénticas o pueden diferir.
El ARNbc descrito en el presente documento puede incluir una o más proyecciones monocatenarias de uno o más nucleótidos. Al menos un extremo del ARNbc puede tener una proyección de nucleótidos monocatenario de 1 a 4, generalmente 1 ó 2 nucleótidos. La hebra antisentido del ARNbc puede tener proyecciones de 1-10 nucleótidos cada una en el extremo 3' y en el extremo 5' sobre la hebra sentido. La hebra sentido del ARNbc puede tener proyecciones de 1-10 nucleótidos cada una en el extremo 3' y el extremo 5' sobre la hebra antisentido.
Un ARNbc que tiene al menos una proyección de nucleótidos puede tener propiedades inhibidoras inesperadamente superiores que el homólogo de extremos romos. La presencia de únicamente una proyección de nucleótidos puede fortalecer la actividad de interferencia del ARNbc, sin afectar su estabilidad general. Un ARNbc que tiene únicamente una proyección ha demostrado ser particularmente estable y eficaz in vivo, así como en una variedad de células, medios de cultivo celular, sangre y suero. Generalmente, la proyección monocatenaria se ubica en el extremo 3' terminal de la hebra antisentido o, alternativamente, en el extremo 3' terminal de la hebra sentido. El ARNbc también puede tener un extremo romo, generalmente ubicado en el extremo 5' de la hebra antisentido. Tales ARNbc pueden tener una estabilidad y una actividad inhibidoras mejoradas, lo que permite la administración en dosificaciones bajas, es decir, menos de 5 mg/kg de peso corporal del receptor por día. Generalmente, la hebra antisentido del ARNbc tiene una proyección de nucleótidos en el extremo 3' y el extremo 5' es romo. Uno o más de los nucleótidos en la proyección pueden reemplazarse con un tiofosfato de nucleósido.
Un gen de TTR puede ser un gen de TTR humana. La hebra sentido del ARNbc puede ser una de las secuencias sentido de las tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B o 7 y la hebra antisentido puede ser una de las secuencias antisentido de las tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B o 7. Los agentes antisentido alternativos que seleccionan como diana otra parte de la secuencia diana proporcionada en las tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B o 7 pueden determinarse fácilmente usando la secuencia diana y la secuencia TTR flanqueante.
El experto en la técnica es consciente de que los ARNbc que tienen una estructura de dúplex de entre 20 y 23, pero específicamente 21, pares de bases han sido aclamados como particularmente eficaces para inducir interferencias de ARN (Elbashir et al., EMBO 2001,20: 6877-6888.). Sin embargo, otros han descubierto que ARNbc más cortos o más largos también pueden ser eficaces. En el ejemplo descrito anteriormente, en virtud de la naturaleza de las secuencias de oligonucleótidos proporcionadas en las tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B y 7, los ARNbc descritos en el presente documento pueden incluir al menos una hebra de una longitud descrita en el presente documento. Puede esperarse razonablemente que los ARNbc más cortos que tengan una de las secuencias de las tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B o 7 menos sólo unos pocos nucleótidos en uno o ambos extremos puedan ser igualmente eficaces en comparación con los ARNbc descritos anteriormente. Por tanto, los ARNbc que tienen una secuencia parcial de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos de una de las secuencias de las tablas 3, 4, 6 o 7 y que difieren en su capacidad para inhibir la expresión de un gen de TTR en un ensayo tal como se describe a continuación en el presente documento en no más del 5, el 10, el 15, el 20, el 25 o el 30% de inhibición de un ARNbc que comprende la secuencia completa, también se describen en el presente documento. Además, los ARNbc que se escinden dentro de una secuencia diana de TTR deseada pueden prepararse fácilmente usando la secuencia antisentido de TTR correspondiente y una secuencia sentido complementaria.
Además, los ARNbc proporcionados en las tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B o 7 identifican un sitio en una TTR que es susceptible a la escisión basada en iARN. Como tal, también se describen en el presente documento ARNbc que se dirigen dentro de la secuencia seleccionada como diana por uno de los agentes descritos en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, se dice que un segundo ARNbc se dirige dentro de la secuencia de un primer ARNbc si el segundo ARNbc escinde el mensaje en cualquier lugar dentro del ARNm que sea complementario a la hebra antisentido del primer ARNbc. Un segundo ARNbc de este tipo consistirá generalmente en al menos 15 nucleótidos contiguos de una de las secuencias proporcionadas en las tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B o 7 acopladas a secuencias de nucleótidos adicionales tomadas de la región contigua a la secuencia seleccionada en un gen de TTR.
La escisión de la diana de ARN puede detectarse de manera rutinaria mediante electroforesis en gel y, si es necesario, técnicas de hibridación de ácido nucleico asociadas conocidas en la técnica. El sitio de escisión en el ARNm diana de un ARNbc puede determinarse usando métodos generalmente conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, el método 5'-RACE descrito en Soutschek et al., Nature; 2004, vol. 432, págs.173-178. En un ejemplo, usando el método 5'-RACE descrito por Soutschek et al., se determinó que ALN-18328 escindía un ARNm de TTR entre el nucleótido de guanina en la posición 636 de SEQ ID NO: 1331 (NM_000371.3) y el nucleótido de adenina en la posición 637 de SEQ ID NO: 1331. En un ejemplo, se determinó que ALN-18328 no escinde un ARNm de TTR entre el nucleótido de adenina en la posición 637 de SEQ ID NO: 1331 y el nucleótido de guanina en la posición 638 de SEQ ID NO: 1331.
El ARNbc descrito en el presente documento puede contener uno o más apareamientos erróneos con la secuencia diana. El ARNbc descrito en el presente documento puede contener no más de 3 apareamientos erróneos. Si la hebra antisentido del ARNbc contiene apareamientos erróneos con una secuencia diana, es preferible que el área de apareamiento erróneo no esté ubicada en el centro de la región de complementariedad. Si la hebra antisentido del ARNbc contiene apareamientos erróneos con la secuencia diana, es preferible que el apareamiento erróneo se restrinja a 5 nucleótidos de cualquier extremo, por ejemplo, 5, 4, 3, 2 ó 1 nucleótido del extremo o bien 5' o bien 3' de la región de complementariedad. Por ejemplo, para una hebra de ARNbc de 23 nucleótidos que es complementaria a una región de un gen de TTR, el ARNbc generalmente no contiene ningún apareamiento erróneo dentro de los 13 nucleótidos centrales. Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para determinar si un ARNbc que contiene un apareamiento erróneo con una secuencia diana es eficaz para inhibir la expresión de un gen de TTR. Es importante considerar la eficacia de los ARNbc con apareamientos erróneos en la inhibición de la expresión de un gen de TTR, especialmente si se sabe que la región particular de complementariedad en un gen de TTR tiene una variación de secuencia polimórfica dentro de la población.
Modificaciones
El ARNbc puede modificarse químicamente para mejorar la estabilidad. Los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden sintetizarse y/o modificarse mediante métodos bien establecidos en la técnica, tales como los descritos en “Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage, S.L. et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EE.UU. Los ejemplos específicos de compuestos de ARNbc útiles en la presente divulgación incluyen ARNbc que contienen estructuras principales modificadas o ningún enlace internucleosídico natural. Tal como se define en esta memoria descriptiva, los ARNbc modificados que tienen estructuras principales incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en la estructura principal y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la estructura principal. Para los propósitos de esta memoria descriptiva y como a veces se hace referencia en la técnica, los ARNbc modificados que no tienen un átomo de fósforo en su estructura principal internucleosídica también pueden considerarse oligonucleósidos.
Las estructuras principales de ARNbc modificadas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metilo y otros alquilfosfonatos que incluyen 3'-alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos enlazados 2'-5' de estos y aquellos) que tienen polaridad invertida en los que los pares adyacentes de unidades de nucleósidos están enlazados 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácidos libres.
Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de los enlaces que contienen fósforo anteriores incluyen, pero no se limitan a, las patentes estadounidenses n.os 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; y 5.625.050.
Las estructuras principales de ARNbc modificadas que no incluyen un átomo de fósforo en ellas tienen estructuras principales que están formadas por enlaces intemucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, heteroátomos mixtos y enlaces intemucleosídicos de alquilo o cicloalquilo, o enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta o más. Estos incluyen los que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); estructuras principales de siloxano; estructuras principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras principales de formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales de metileno formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales que contienen alqueno; estructuras principales de sulfamato; estructuras principales de metilenimino y metilenhidrazino; estructuras principales de sulfonato y sulfonamida; estructuras principales de amida; y otros que tiene partes de componentes de N, O, S y CH2 mezclados.
Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero no se limitan a, las patentes estadounidenses n.os 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y, 5.677.439.
En otros miméticos de ARNbc adecuados, tanto el enlace de azúcar como internucleosídico, es decir, la estructura principal, de las unidades de nucleótidos se reemplazan con grupos novedosos. Las unidades de base se mantienen para la hibridación con un compuesto diana de ácido nucleico apropiado. Uno de estos compuestos oligoméricos, un mimético de ARNbc que ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridación, se denomina ácido nucleico peptídico (PNA). En los compuestos de PNA, la estructura principal de azúcar de un ARNbc se reemplaza por una estructura principal que contiene amida, en particular una estructura principal de aminoetilglicina. Las nucleobases se retienen y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la estructura principal. Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de compuestos de PNA incluyen, pero no se limitan a, las patentes estadounidenses n.os 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262. Pueden encontrarse enseñanzas adicionales sobre los compuestos de PNA en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497­ 1500.
También se describen en el presente documento ARNbc con estructuras principales de fosforotioato y oligonucleósidos con estructuras principales de heteroátomos y en particular --CH2--NH--CH2--, —CH2—N(CH3)—O— CH2--[conocido como una estructura principal de metileno (metilimino) o MMI], --CH2--O-N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- y --N(CH3)--CH2--CH2--[en el que la estructura principal de fosfodiéster nativa se representa como --O--P--O--CH2--] de la patente estadounidense mencionada anteriormente n.° 5.489.677 y la estructura principal de amida de la patente estadounidense mencionada anteriormente n.° 5.602.240. También se prefieren los ARNbc que tienen estructuras principales de morfolino de la patente estadounidense mencionada anteriormente n.° 5.034.506.
Los ARNbc modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. Los ARNbc preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, en el que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10 sustituido o no sustituido o alquenilo y alquinilo C2 a C10. Se prefieren particularmente O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, y O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, donde n y m son desde 1 hasta aproximadamente 10. Otros ARNbc preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': alquilo inferior C1 a C10, alquilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo inferior sustituido, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquiloamino, polialquiloamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ARNbc, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un ARNbc, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2'-metoxietoxilo (2'-O--CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietyilo) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) es decir, un grupo alcoxi-alcoxilo. Una modificación preferida adicional incluye 2'-dimetilaminooxietoxilo, es decir, un grupo O(CH2^O n (CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, tal como se describe en los ejemplos en el presente documento a continuación, y 2'-dimetilaminoetoxietoxilo (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2, también descrito en los ejemplos en el presente documento a continuación.
Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxilo (2'-OCH3), 2'-aminopropoxilo (2'-OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro (2'-F). También pueden realizarse modificaciones similares en otras posiciones del ARNbc, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3' o en los ARNbc enlazados 2'-5' y la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Los ARNbc también pueden tener miméticos de azúcar como restos de ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo. Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no se limitan a, las patentes estadounidenses n.os 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920.
Los ARNbc también pueden incluir modificaciones o sustituciones de nucleobase (a menudo denominado en la técnica simplemente como “base”). Tal como se usa en el presente documento, las nucleobases “no modificadas” o “naturales” incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G) y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-daazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Las nucleobases adicionales incluyen las dadas a conocer en la patente estadounidense n.° 3.687.808, las dadas a conocer en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, páginas 858­ 859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, estas dadas a conocer por Englisch et al., Angewandte Chemie, edición internacional, 1991, 30, 613 y aquellas dadas a conocer por Sanghvi, Y S., capítulo 15, ARNbc Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Algunas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos descritos en el presente documento. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico entre 0,6 y 1,2°C. (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. y Lebleu, B., Eds., ARNbc Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, págs. 276-278) y son sustituciones de bases a modo de ejemplo, incluso más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar de 2'-O-metoxietilo.
Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de algunas de las nucleobases modificadas indicadas anteriormente, así como otras nucleobases modificadas, incluyen, pero no se limitan a, la patente estadounidense indicada anteriormente n.° 3.687.808, así como también las patentes estadounidenses n.os 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091; 5.614.617; 5.681.941, y 5.750.692.
Conjugados
Otra modificación de los ARNbc descritos en el presente documento implica unir químicamente al ARNbc uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, distribución celular o captación celular del ARNbc. Tales restos incluyen, pero no se limitan a, restos de lípidos tales como un resto de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4: 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, beril-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660: 306-309.; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3: 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20: 533­ 538), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10: 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259: 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75: 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o trietil-amonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-Hfosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18: 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14: 969-973), o ácido adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651-3654), un resto palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264: 229-237), o un resto octadecilamina o hexilamino-carboniloxicolesterol (Crooke etal., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277: 923-937).
Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales conjugados de ARNbc incluyen pero no se limitan a, las patentes estadounidenses n.os 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465 5.541.313 5.545.730 5.552.538 5.578.717, 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077 5.486.603 5.512.439 5.578.718 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941 4.835.263 4.876.335 4.904.582 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136 5.245.022 5.254.469 5.258.506 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241, 5.391.723; 5.416.203, 5.451.463 5.510.475 5.512.667 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726 5.597.696 5.599.923 5.599.928 5.688.941.
No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado se modifiquen uniformemente y, de hecho, más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente puede incorporarse en un solo compuesto o incluso en un solo nucleósido dentro de un ARNbc. También se describen en el presente documento compuestos de ARNbc que son compuestos quiméricos. Los compuestos de ARNbc “quiméricos” o “quimeras”, en el contexto descrito en el presente documento, son compuestos de ARNbc, particularmente ARNbc, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una compuesta por al menos una unidad de monómero, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de ARNbc. Estos ARNbc normalmente contienen al menos una región en la que el ARNbc se modifica para conferir al ARNbc una mayor resistencia a la degradación de nucleasas, una mayor captación celular y/o una mayor afinidad de unión por el ácido nucleico diana. Una región adicional del ARNbc puede servir como sustrato para enzimas que pueden escindir híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex de ARN:ADN. La activación de la ARNasa H, por tanto, da como resultado la escisión de la diana de ARN, potenciando así en gran medida la eficacia de la inhibición de la expresión génica por ARNbc. Por consiguiente, a menudo pueden obtenerse resultados comparables con ARNbc más cortos cuando se usan ARNbc quiméricos, en comparación con desoxiARNbc de fosforotioato que se hibridan con la misma región diana.
En determinados casos, el ARNbc puede modificarse mediante un grupo no ligando. Se han conjugado varias moléculas que no son ligandos con ARNbc con el fin de potenciar la actividad, distribución celular o captación celular del ARNbc y los procedimientos para realizar tales conjugaciones están disponibles en la bibliografía científica. Tales restos no ligandos han incluido restos de lípidos, tales como colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86: 6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4: 1053), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660: 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3: 2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20: 533), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10: 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259: 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75: 49), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-racglicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18: 3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14: 969), o ácido adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651), un resto palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264: 229), o un resto octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277: 923). Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales conjugados de ARNbc se han enumerado anteriormente. Los protocolos de conjugación típicos implican la síntesis de ARNbc que portan un ligador amino en una o más posiciones de la secuencia. A continuación, el grupo amino se hace reaccionar con la molécula que se está conjugando usando reactivos de acoplamiento o de activación apropiados. La reacción de conjugación puede realizarse o bien con el ARNbc todavía unido al soporte sólido o bien después de la escisión del ARNbc en fase de disolución. La purificación del conjugado de ARNbc mediante HPLC proporciona normalmente el conjugado puro.
ARNbc codificados por vectores
En otro aspecto, las moléculas de ARNbc de TTR se expresan a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN (véase, por ejemplo, Couture, A et al., TIG. (1996), 12: 5-10; Skillern, A., et al., publicación PCT internacional n.° w O 00/22113, Conrad, publicación PCT internacional n.° WO 00/22114 y Conrad, patente estadounidense n.° 6.054.299). Estos transgenes pueden introducirse como un constructo lineal, un plásmido circular o un vector viral, que pueden incorporarse y heredarse como un transgén integrado en el genoma del huésped. El transgén también puede construirse para permitir que se herede como un plásmido extracromosómico (Gassmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 1292).
Las hebras individuales de un ARNbc pueden transcribirse mediante promotores en dos vectores de expresión separados y transfectarse conjuntamente en una célula diana. Alternativamente, cada hebra individual del ARNbc puede transcribirse mediante promotores, ambos ubicados en el mismo plásmido de expresión. Un ARNbc puede expresarse como una repetición invertida unida por una secuencia de polinucleótidos ligadora de manera que el ARNbc tiene una estructura de tallo y bucle.
Los vectores de expresión de ARNbc recombinante son generalmente plásmidos de ADN o vectores virales. Los vectores virales que expresan ARNbc pueden construirse basándose en, pero sin limitarse a, virus adenoasociados (para una revisión, véase Muzyczka et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158: 97-129)); adenovirus (véase, por ejemplo, Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6: 616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252: 431-434) y Rosenfeld et al. (1992), Cell 68: 143-155)); o alfavirus así como otros conocidos en la técnica. Los retrovirus se han usado para introducir una variedad de genes en muchos tipos de células diferentes, incluyendo células epiteliales, in vitro y/o in vivo (véase, por ejemplo, Eglitis, et al., Science (1985) 230: 1395-1398; Danos y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85: 6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 85: 3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 61416145; Huber et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254: 1802-1805.; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7640-19; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3: 641­ 647; Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150: 4104-4115; patente estadounidense n.° 4.868.116; patente estadounidense n.° 4.980.286; solicitud PCT WO 89/07136; solicitud PCT WO 89/02468; solicitud PCT WO 89/05345; y solicitud PCT WO 92/07573). Los vectores retrovirales recombinantes que pueden transducir y expresar genes insertados en el genoma de una célula pueden producirse transfectando el genoma retroviral recombinante en líneas celulares de empaquetamiento adecuadas tales como PA317 y Psi-CRIP (Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2: 5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349). Los vectores adenovirales recombinantes pueden usarse para infectar una amplia variedad de células y tejidos en huéspedes susceptibles (por ejemplo, rata, hámster, perro y chimpancé) (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166: 769) y también tienen la ventaja de no requerir células mitóticamente activas para la infección.
Puede usarse cualquier vector viral que pueda aceptar las secuencias codificantes de la(s) molécula(s) de ARNbc que va(n) a expresarse, por ejemplo, vectores derivados de adenovirus (AV); virus adenoasociado (AAV); retrovirus (por ejemplo, lentivirus (LV), rabdovirus, virus de la leucemia murina); virus del herpes y similares. El tropismo de los vectores virales puede modificarse pseudotipando los vectores con proteínas de la envoltura u otros antígenos de superficie de otros virus, o sustituyendo diferentes proteínas de la cápside viral, según sea apropiado.
Por ejemplo, los vectores lentivirales descritos en el presente documento pueden pseudotiparse con proteínas de superficie del virus de la estomatitis vesicular (VSV), rabia, ébola, Mokola y similares. Los vectores de a Av descritos en el presente documento pueden elaborarse para seleccionar como diana diferentes células modificando los vectores para que expresen diferentes serotipos de proteínas de la cápside. Por ejemplo, un vector de AAV que expresa una cápside de serotipo 2 en un genoma de serotipo 2 se denomina AAV 2/2. Este gen de la cápside del serotipo 2 en el vector de AAV 2/2 puede reemplazarse por un gen de la cápside de serotipo 5 para producir un vector de AAV 2/5. Las técnicas para construir vectores de AAV que expresan diferentes serotipos de proteínas de la cápside están dentro del conocimiento de la técnica; véase, por ejemplo, Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76: 791-801.
La selección de vectores virales recombinantes adecuados para su uso en el presente documento, los métodos para insertar secuencias de ácido nucleico para expresar el ARNbc en el vector y los métodos para administrar el vector viral a las células de interés están dentro de los conocimientos de la técnica. Véase, por ejemplo, Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1:5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; y Rubinson DA et al., Nat. Genet. 33: 401-406.
Los vectores virales pueden derivarse de AV y AAV. El ARNbc descrito en el presente documento puede expresarse como dos moléculas de ARN monocatenario complementarias separadas de un vector de AAV recombinante que tiene, por ejemplo, los promotores de ARN o bien U6 o bien H1, o el promotor de citomegalovirus (CMV).
Un vector de AV adecuado para expresar el ARNbc descrito en el presente documento, un método para construir el vector de AV recombinante y un método para administrar el vector en las células diana, se describen en Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.
Los vectores de AAV adecuados para expresar el ARNbc descrito en el presente documento, los métodos para construir el vector de AV recombinante y los métodos para administrar los vectores en las células diana se describen en Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61:3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; patente estadounidense n.° 5.252.479; patente estadounidense n.° 5.139.941; solicitud de patente internacional n.° WO 94/13788; y solicitud de patente internacional n.° WO 93/24641.
El promotor que impulsa la expresión de ARNbc en o bien un plásmido de ADN o bien en un vector viral descrito en el presente documento puede ser una ARN polimerasa eucariota I (por ejemplo, promotor de ARN ribosómico), ARN polimerasa II (por ejemplo, promotor temprano de CMV o promotor de actina o promotor de ARNnn de U1) o, en general, promotor de ARN polimerasa III (por ejemplo, promotor de ARNpn U6 o ARN 7SK) o un promotor procariota, por ejemplo, el promotor T7, siempre que el plásmido de expresión también codifique para la ARN polimerasa de t 7 necesaria para el transcrito de un promotor T7. El promotor también puede dirigir la expresión transgénica al páncreas (véase, por ejemplo, la secuencia reguladora de la insulina para el páncreas (Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2511-2515)).
Además, la expresión del transgén puede regularse con precisión, por ejemplo, mediante el uso de una secuencia reguladora inducible y sistemas de expresión como una secuencia reguladora que sea sensible a determinados reguladores fisiológicos, por ejemplo, niveles de glucosa circulantes u hormonas (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8: 20-24). Tales sistemas de expresión inducible, adecuados para el control de la expresión transgénica en células o en mamíferos, incluyen la regulación por ecdisona, estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de dimerización e isopropil-beta-D1-tiogalactopiranósido (EPTG). Un experto en la técnica podrá elegir la secuencia promotora/reguladora apropiada basándose en el uso pretendido del transgén de ARNbc.
Generalmente, los vectores recombinantes que pueden expresar moléculas de ARNbc se administran como se describe a continuación y persisten en las células diana. Alternativamente, pueden usarse vectores virales que proporcionen la expresión transitoria de moléculas de ARNbc. Tales vectores pueden administrarse repetidamente según sea necesario. Una vez expresados, los ARNbc se unen al ARN diana y modulan su función o expresión. La administración de vectores que expresan ARNbc puede ser sistémica, tal como por administración intravenosa o intramuscular, por administración a células diana explantadas del paciente seguido de reintroducción en el paciente, o por cualquier otro medio que permita la introducción en una célula diana deseada.
Los plásmidos de ADN de expresión de ARNbc se transfectan normalmente en células diana como un complejo con portadores de lípidos catiónicos (por ejemplo, oligofectamina) o portadores basados en lípidos no catiónicos (por ejemplo, Transit-TKO™). También se describen en el presente documento múltiples transfecciones de lípidos para silenciamientos mediados por ARNbc que seleccionan como diana diferentes regiones de un solo gen de TTR o múltiples genes TTR durante un periodo de una semana o más. La introducción exitosa de vectores en células huésped puede monitorizarse usando diversos métodos conocidos. Por ejemplo, la transfección transitoria puede señalarse con un indicador, como un marcador fluorescente, tal como la proteína verde fluorescente (GFP). Puede garantizarse una transfección estable de células ex vivo usando marcadores que proporcionen a la célula transfectada con resistencia a factores ambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y fármacos), tal como resistencia a la higromicina B.
Las moléculas de ARNbc específicas de TTR también pueden insertarse en vectores y usarse como vectores de terapia génica para pacientes humanos. Los vectores de terapia génica pueden administrarse a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (véase la patente estadounidense 5.328.470) o por inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente aceptable o puede incluir una matriz de liberación lenta en la que está incrustado el vehículo de inserción de genes. Alternativamente, cuando el vector completo de inserción de genes puede producirse intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de inserción de genes.
III. Composiciones farmacéuticas que contienen ARNbc
También se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que contienen un ARNbc, tal como se describe en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica que contiene el ARNbc es útil para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad de un gen de TTR, tal como procesos patológicos mediados por la expresión de TTR. Tales composiciones farmacéuticas se formulan basándose en el modo de administración. Un ejemplo son las composiciones formuladas para administración directa al ojo. Otro ejemplo son las composiciones que se formulan para la administración sistémica por administración por vía parenteral, por ejemplo, administración por vía intravenosa (i.v.). Otro ejemplo son las composiciones que se formulan para la administración directa al parénquima cerebral, por ejemplo, mediante infusión en el cerebro, tal como mediante infusión continua con bomba.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se administran en dosificaciones suficientes para inhibir la expresión de genes TTR.
En general, una dosis adecuada de ARNbc estará en el intervalo de 0,00001 a 200,0 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor por día, generalmente en el intervalo de 1 a 50 mg por kilogramo de peso corporal por día.
Es posible que la dosificación no se corresponda con el peso corporal cuando se administra el ARNip en el ojo. La dosificación puede ser, por ejemplo, 25 |ig para una persona de 75 kg, por ejemplo, 0,3 |ig/kg. Otras dosificaciones incluyen 0,01, 0,03, 0,05, 0,07, 0,1, 0,3, 0,5, 0,7, 1,0, 3,0, 5,0, 7,0, 10,0, 30,0, 50,0, 70,0 ó 100,0 |ig/kg.
Por ejemplo, el ARNbc puede administrarse a 0,0059 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,0295 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,0590 mg/kg, 0,163 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,543 mg/kg, 0,5900 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,628 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5,0 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg o 50 mg/kg por dosis única.
La dosificación puede estar entre 0,01 y 0,2 mg/kg. Por ejemplo, el ARNbc puede administrarse a una dosis de 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,07 mg/kg 0,08 mg/kg 0,09 mg/kg, 0,10 mg/kg, 0,11 mg/kg, 0,12 mg/kg, 0,13 mg/kg, 0,14 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,16 mg/kg, 0,17 mg/kg, 0,18 mg/kg, 0,19 mg/kg o 0,20 mg/kg.
La dosificación puede estar entre 0,005 mg/kg y 1,628 mg/kg. Por ejemplo, el ARNbc puede administrarse a una dosis de 0,0059 mg/kg, 0,0295 mg/kg, 0,0590 mg/kg, 0,163 mg/kg, 0,543 mg/kg, 0,5900 mg/kg o 1,628 mg/kg. La dosificación puede estar entre 0,2 mg/kg y 1,5 mg/kg. Por ejemplo, el ARNbc puede administrarse a una dosis de 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg o 1,5 mg/kg.
El ARNbc puede administrarse a una dosis de 0,03 mg/kg o 0,03, 0,1, 0,2 o 0,4 mg/kg.
La composición farmacéutica puede administrarse una vez al día, o el ARNbc puede administrarse como dos, tres o más subdosis a intervalos apropiados a lo largo del día o incluso usando infusión o administración continua a través de una formulación de liberación controlada. En ese caso, el ARNbc contenido en cada subdosis debe ser correspondientemente más pequeño para alcanzar la dosificación diaria total. La unidad de dosificación también puede combinarse para la administración durante varios días, por ejemplo, usando una formulación de liberación sostenida convencional que proporciona una liberación sostenida del ARNbc durante un periodo de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida son bien conocidas en la técnica y son particularmente útiles para la administración de agentes en un sitio particular, tal como podría usarse con los agentes descritos en el presente documento. La unidad de dosificación puede contener un múltiplo correspondiente de la dosis diaria.
El efecto de una sola dosis sobre los niveles de TTR es duradero, de modo que las dosis posteriores se administran en intervalos de no más de 3, 4 ó 5 días, o en intervalos de no más de 1, 2, 3 ó 4 semanas, o en intervalos en no más de 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 semanas.
El experto en la técnica apreciará que determinados factores pueden influir en la dosificación y el tiempo necesario para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo pero sin limitarse a, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición puede incluir un único tratamiento o una serie de tratamientos. Pueden realizarse estimaciones de dosificaciones eficaces y semividas in vivo para los ARNbc individuales abarcados por la divulgación usando metodologías convencionales o basándose en pruebas in vivo usando un modelo animal apropiado, tal como se describe en otra parte en el presente documento.
Los avances en la genética del ratón han generado una serie de modelos de ratón para el estudio de diversas enfermedades humanas, tales como los procesos patológicos mediados por la expresión de TTR. Estos modelos se usan para pruebas in vivo de ARNbc, así como para determinar una dosis terapéuticamente eficaz. Un modelo de ratón adecuado es, por ejemplo, un ratón que contiene un plásmido que expresa TTR humana. Otro modelo de ratón adecuado es un ratón transgénico que porta un transgén que expresa TTR humana.
Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificaciones para su uso en seres humanos. La dosificación de las composiciones descritas en el presente documento se encuentra generalmente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en los métodos descritos en el presente documento, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante del compuesto o, cuando sea apropiado, del producto polipeptídico de una secuencia diana (por ejemplo, lograr una concentración disminuida del polipéptido) que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que alcanza la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) determinada en cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución.
Los ARNbc descritos en el presente documento pueden administrarse en combinación con otros agentes conocidos eficaces en el tratamiento de procesos patológicos mediados por la expresión del gen diana. En cualquier caso, el médico que lo administra puede ajustar la cantidad y el momento de la administración de ARNbc basándose en los resultados observados usando mediciones convencionales de eficacia conocidas en la técnica o descritas en el presente documento.
Administración
También se describen en el presente documento composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen los compuestos de ARNbc descritos en el presente documento. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden administrarse de varias formas dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área que va a tratarse. La administración puede ser tópica, pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica, oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o intracraneal, por ejemplo, administración intraparenquimatosa, intratecal o intraventricular.
El ARNbc puede administrarse de manera que seleccione como diana un tejido en particular, tal como el hígado (por ejemplo, los hepatocitos del hígado).
El ARNbc puede administrarse de manera que seleccione como diana un tejido particular, tal como el ojo. Los modos de administración ocular incluyen retrobulbar, párpado subcutáneo, subconjuntival, subtenón, cámara anterior o inyección intravítrea (o inyección o infusión interna).
También se describen en el presente documento composiciones farmacéuticas que pueden administrarse mediante inyección directamente en el cerebro. La inyección puede ser por inyección estereotáctica en una región particular del cerebro (por ejemplo, la sustancia negra, la corteza, el hipocampo, el cuerpo estriado o el globo pálido), o el ARNbc puede administrarse en múltiples regiones del sistema nervioso central (por ejemplo, en múltiples regiones del cerebro y/o en la médula espinal). El ARNbc también puede administrarse en regiones difusas del cerebro (por ejemplo, administración difusa a la corteza cerebral).
Puede administrarse un ARNbc que selecciona como diana TTR mediante una cánula u otro dispositivo de administración que tenga un extremo implantado en un tejido, por ejemplo, el cerebro, por ejemplo, la sustancia negra, corteza, hipocampo, cuerpo estriado, cuerpo calloso o globo pálido del cerebro. La cánula puede conectarse a un depósito de la composición de ARNbc. El flujo o la administración pueden estar mediados por una bomba, por ejemplo, una bomba osmótica o minibomba, tal como una bomba Alzet (Durect, Cupertino, CA). Puede implantarse una bomba y un depósito en un área distante del tejido, por ejemplo, en el abdomen y la administración se efectúa mediante un conducto que va desde la bomba o depósito hasta el sitio de liberación. La infusión de la composición de ARNbc en el cerebro puede durar varias horas o varios días, por ejemplo, durante 1, 2, 3, 5 ó 7 días o más. Los dispositivos para la administración al cerebro se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 6.093.180 y 5.814.014.
Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables portadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares. También pueden ser útiles preservativos recubiertos, guantes y similares. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen aquellas en las que los ARNbc descritos en el presente documento están mezclados con un agente de administración tópica tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Los lípidos y liposomas adecuados incluyen neutros (por ejemplo, dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidilcolina d MpC, diestearoilfosfatidilcolina) negativos (por ejemplo, dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) y catiónicos (por ejemplo, dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP y dioleoilfosfatidil etanolamina DOTMA). Los ARNbc descritos en el presente documento pueden encapsularse dentro de liposomas o pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas catiónicos. Alternativamente, los ARNbc pueden formar complejos con lípidos, en particular con lípidos catiónicos. Los ácidos grasos y ésteres adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina o un éster alquílico C1-10 (por ejemplo, miristato de isopropilo IPM), monoglicérido, diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Las formulaciones tópicas se describen con detalle en la patente estadounidense n.° 6.747.014.
Conjugación de colesterol
Puede conjugarse un ARNip con un ligando tal como colesterol y vitamina E tal como se describe en el presente documento. Se entiende que pueden unirse otros conjugados a los oligonucleótidos mediante un método similar conocido por un experto en la técnica, tales métodos pueden encontrarse en las publicaciones estadounidenses n.os 2005/0107325, 2005/0164235, 2005/0256069 y 2008/0108801.
Formulaciones liposomales
Existen muchas estructuras tensioactivas organizadas además de las microemulsiones que se han estudiado y usado para la formulación de fármacos. Estas incluyen monocapas, micelas, bicapas y vesículas. Las vesículas, tales como los liposomas, han atraído un gran interés por su especificidad y la duración de la acción que ofrecen desde el punto de vista de la administración de fármacos. Tal como se usa en el presente documento, el término “liposoma” significa una vesícula que se compone de lípidos anfífilos dispuestos en una bicapa o bicapas esféricas. Los liposomas son vesículas unilaminares o multilaminares que tienen una membrana formada por un material lipófilo y un interior acuoso. La porción acuosa contiene la composición que va a administrarse. Los liposomas catiónicos poseen la ventaja de poder fusionarse con la pared celular. Los macrófagos absorben los liposomas no catiónicos, aunque no pueden fusionarse con la misma eficacia con la pared celular in vivo.
Con el fin de atravesar la piel intacta de los mamíferos, las vesículas lipídicas deben atravesar una serie de poros finos, cada uno con un diámetro inferior a 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Por tanto, es deseable usar un liposoma que sea altamente deformable y capaz de atravesar tales poros finos.
Las ventajas adicionales de los liposomas incluyen; los liposomas obtenidos a partir de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables; los liposomas pueden incorporar una amplia gama de fármacos solubles en agua y lípidos; los liposomas pueden proteger a los fármacos encapsulados en sus compartimentos internos del metabolismo y la degradación (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245). Las consideraciones importantes en la preparación de formulaciones de liposomas son la carga de la superficie lipídica, el tamaño de las vesículas y el volumen acuoso de los liposomas.
Los liposomas son útiles para la transferencia y administración de principios activos al sitio de acción. Debido a que la membrana liposomal es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando los liposomas se aplican a un tejido, los liposomas comienzan a fusionarse con las membranas celulares y, a medida que avanza la fusión del liposoma y la célula, el contenido de los liposomas se vacía en la célula donde puede actuar el agente activo.
Las formulaciones liposomales han sido objeto de una extensa investigación como modo de administración de muchos fármacos. Existe una creciente evidencia de que para la administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas con respecto a otras formulaciones. Tales ventajas incluyen efectos secundarios reducidos relacionados con una alta absorción sistémica del fármaco administrado, mayor acumulación del fármaco administrado en la diana deseada y la capacidad de administrar una amplia variedad de fármacos, tanto hidrófilos como hidrófobos, en la piel.
Varios informes han detallado la capacidad de los liposomas para administrar agentes que incluyen ADN de alto peso molecular en la piel. Se han administrado a la piel compuestos que incluyen analgésicos, anticuerpos, hormonas y ADN de alto peso molecular. La mayoría de las aplicaciones dieron como resultado la selección como diana de la epidermis superior.
Los liposomas se dividen en dos grandes clases. Los liposomas catiónicos son liposomas cargados positivamente que interactúan con las moléculas de ADN cargadas negativamente para formar un complejo estable. El complejo ADN/liposoma cargado positivamente se une a la superficie celular cargada negativamente y se internaliza en un endosoma. Debido al pH ácido dentro del endosoma, los liposomas se rompen, liberando su contenido en el citoplasma celular (Wang etal., Biochem. Biophys. Res. Comun., 1987, 147, 980-985).
Los liposomas que son sensibles al pH o cargados negativamente atrapan el ADN en lugar de formar complejos con él. Dado que tanto el ADN como el lípido están cargados de manera similar, se produce la repulsión en lugar de la formación de complejos. Sin embargo, algo de ADN queda atrapado dentro del interior acuoso de estos liposomas. Se han usado liposomas sensibles al pH para administrar ADN que codifica para el gen de la timidina cinasa a monocapas celulares en cultivo. Se detectó expresión del gen exógeno en las células diana (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
Un tipo principal de composición liposomal incluye fosfolípidos distintos de la fosfatidilcolina derivada de manera natural. Las composiciones de liposomas neutros, por ejemplo, pueden formarse a partir de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) o dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC). Las composiciones de liposomas aniónicos generalmente se forman a partir de dimiristoilfosfatidilglicerol, mientras que los liposomas fusogénicos aniónicos se forman principalmente a partir de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composición liposomal se forma a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por ejemplo, PC de soja y PC de huevo. Otro tipo está formado por mezclas de fosfolípidos y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.
Varios estudios han evaluado la administración tópica de formulaciones de fármacos liposomales a la piel. La aplicación de liposomas que contienen interferón a la piel de cobaya dio como resultado una reducción de las llagas de herpes en la piel mientras que la administración de interferón por otros medios (por ejemplo, como disolución o como emulsión) fueron ineficaces (Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Además, un estudio adicional sometió a prueba la eficacia del interferón administrado como parte de una formulación liposomal para la administración de interferón usando un sistema acuoso y concluyó que la formulación liposomal era superior a la administración acuosa (du Plessis etal., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).
También se han examinado sistemas liposomales no iónicos para determinar su utilidad en la administración de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden tensioactivo no iónico y colesterol. Se usaron formulaciones liposomales no iónicas que comprenden Novasome™ I (dilaurato de glicerilo/colesterol/polioxietilen-10-estearil éter) y Novasome™ II (diestearato de glicerilo/colesterol/polioxietilen-10-estearil éter) para administrar ciclosporina A en la dermis de piel de ratón. Los resultados indicaron que tales sistemas liposomales no iónicos eran eficaces para facilitar la deposición de ciclosporina A en diferentes capas de la piel (Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
Los liposomas también incluyen liposomas “estabilizados estéricamente”, un término que, tal como se usa en el presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan a los liposomas, dan como resultado duraciones potenciadas en la circulación en relación con los liposomas que carecen de tales lípidos especializados. Ejemplos de liposomas estabilizados estéricamente son aquellos en los que parte de la porción lipídica formadora de vesículas del liposoma (A) comprende uno o más glicolípidos, tales como monosialogangliósido Gm-i, o (B) se derivatiza con uno o más polímeros hidrófilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Si bien no se desea vincularse a ninguna teoría en particular, se cree en la técnica que, al menos para los liposomas estabilizados estéricamente que contienen gangliósidos, esfingomielina o lípidos derivatizados con PEG, la semivida en la circulación potenciada de estos liposomas estabilizados estéricamente se deriva de una captación reducida en las células del sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
Se conocen en la técnica varios liposomas que comprenden uno o más glicolípidos. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) informaron de la capacidad del monosialogangliósido Gm i, sulfato de galactocerebrósido y fosfatidilinositol para mejorar las semividas en sangre de los liposomas. Estos hallazgos fueron expuestos por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). La patente estadounidense n.° 4.837.028 y el documento WO 88/04924, ambos de Allen et al., dan a conocer liposomas que comprenden (1) esfingomielina y (2) el gangliósido Gmi o un éster sulfato de galactocerebrósido. La patente estadounidense n.° 5.543.152 (Webb et al.) da a conocer liposomas que comprenden esfingomielina. Los liposomas que comprenden 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilcolina se dan a conocer en el documento WO 97/13499 (Lim et al).
Se conocen en la técnica muchos liposomas que comprenden lípidos derivatizados con uno o más polímeros hidrófilos y métodos de preparación de los mismos. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) describieron liposomas que comprenden un detergente no iónico, 2C1215G, que contiene un resto de PEG. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) indicaron que el recubrimiento hidrófilo de partículas de poliestireno con glicoles poliméricos da como resultado semividas en sangre significativamente potenciadas. Los fosfolípidos sintéticos modificados por la unión de grupos carboxílicos de polialquilenglicoles (por ejemplo, PEG) son descritos por Sears (patentes estadounidenses n.os 4.426.330 y 4.534.899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) describieron experimentos que demuestran que los liposomas que comprenden fosfatidiletanolamina (PE) derivatizada con PEG o estearato de PEG tienen aumentos significativos en las semividas en la circulación sanguínea. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) extendieron tales observaciones a otros fosfolípidos derivatizados con PEG, por ejemplo, DSPE-PEG, formado a partir de la combinación de diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) y PEG. Los liposomas que tienen restos de PEG unidos covalentemente en su superficie externa se describen en la patente europea n.° e P 0445131 B1 y el documento WO 90/04384 de Fisher. Las composiciones de liposomas que contienen el 1-20 por ciento en moles de PE derivatizado con PEG y los métodos de uso de las mismas, se describen en Woodle et al. (patentes estadounidenses n.os 5.013.556 y 5.356.633) y Martin et al. (patente estadounidense n.° 5.213.804 y la patente europea n.° EP 0496813 B1). Los liposomas que comprenden una serie de otros conjugados lípido-polímero se dan a conocer en el documento WO 91/05545 y la patente estadounidense n.° 5.225.212 (ambos de Martin et al.) y en el documento WO 94/20073 (Zalipsky et al.).Los liposomas que comprenden lípidos de ceramida modificados con PEG se describen en el documento Wo 96/10391 (Choi et al). La patente estadounidense n.° 5.540.935 (Miyazaki et al.) y la patente estadounidense n.° 5.556.948 (Tagawa et al.) describen liposomas que contienen PEG que pueden derivatizarse adicionalmente con restos funcionales en sus superficies.
Se conocen en la técnica varios liposomas que comprenden ácidos nucleicos. El documento WO 96/40062 de Thierry et al. da a conocer métodos para encapsular ácidos nucleicos de alto peso molecular en liposomas. La patente estadounidense n.° 5.264.221 de Tagawa et al. da a conocer liposomas unidos a proteínas y afirma que el contenido de tales liposomas puede incluir un ARNbc. La patente estadounidense n.° 5.665.710 de Rahman et al. describe determinados métodos para encapsular oligodesoxinucleótidos en liposomas. El documento WO 97/04787 de Love et al. da a conocer liposomas que comprenden ARNbc que selecciona como diana al gen raf.
Los transfersomas son otro tipo adicional de liposomas y son agregados de lípidos altamente deformables que son candidatos atractivos para vehículos de administración de fármacos. Los transfersomas pueden describirse como gotitas de lípidos que son tan altamente deformables que pueden penetrar fácilmente a través de poros que son más pequeños que la gotita. Los transfersomas son adaptables al entorno en el que se usan, por ejemplo, se optimizan a sí mismos (se adaptan a la forma de los poros de la piel), se reparan a sí mismos, alcanzan con frecuencia sus dianas sin fragmentarse y, a menudo, se cargan a sí mismos. Para elaborar transfersomas, es posible añadir activadores de bordes de superficie, habitualmente tensioactivos, a una composición liposomal convencional. Se han usado transfersomas para administrar albúmina en suero a la piel. Se ha demostrado que la administración de albúmina en suero mediada por transfersomas es tan eficaz como la inyección subcutánea de una disolución que contiene albúmina en suero.
Los tensioactivos encuentran una amplia aplicación en formulaciones tales como emulsiones (incluyendo microemulsiones) y liposomas. La forma más común de clasificar y puntuar las propiedades de los muchos tipos diferentes de tensioactivos, tanto naturales como sintéticos, es mediante el uso del equilibrio hidrófilo/lipófilo (h Lb ). La naturaleza del grupo hidrófilo (también conocido como “cabeza”) proporciona los medios más útiles para clasificar los diferentes tensioactivos usados en las formulaciones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, pág. 285).
Si la molécula de tensioactivo no está ionizada, se clasifica como tensioactivo no iónico. Los tensioactivos no iónicos encuentran una amplia aplicación en productos farmacéuticos y cosméticos y pueden usarse en un amplio intervalo de valores de pH. En general, sus valores de HLB oscilan entre 2 y aproximadamente 18, dependiendo de su estructura. Los tensioactivos no iónicos incluyen ésteres no iónicos tales como ésteres de etilenglicol, ésteres de propilenglicol, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitano, ésteres de sacarosa y ésteres etoxilados. También se incluyen en esta clase alcanolamidas y éteres no iónicos tales como etoxilatos de alcoholes grasos, alcoholes propoxilados y polímeros de bloques etoxilados/propoxilados. Los tensioactivos de polioxietileno son los miembros más populares de la clase de tensioactivos no iónicos.
Si la molécula de tensioactivo porta una carga negativa cuando se disuelve o dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como aniónico. Los tensioactivos aniónicos incluyen carboxilatos como jabones, lactilatos de acilo, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tales como sulfatos de alquilo y sulfatos de alquilo etoxilados, sulfonatos tales como sulfonatos de alquilbenceno, isetionatos de acilo, tauratos de acilo y sulfosuccinatos y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase de tensioactivos aniónicos son los sulfatos de alquilo y los jabones.
Si la molécula de tensioactivo porta una carga positiva cuando se disuelve o dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como catiónico. Los tensioactivos catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros más usados de esta clase.
Si la molécula de tensioactivo tiene la capacidad de portar una carga o bien positiva o bien negativa, el tensioactivo se clasifica como anfótero. Los tensioactivos anfóteros incluyen derivados del ácido acrílico, alquilamidas sustituidas, N-alquilbetaínas y fosfátidos.
Se ha revisado el uso de tensioactivos en productos farmacéuticos, formulaciones y emulsiones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, pág. 285).
Partículas lipídicas de ácido nucleico
Un ARNbc de TTR descrito en el presente documento puede encapsularse completamente en la formulación de lípidos, por ejemplo, para formar una SPLP, pSPLP, SNALP u otra partícula de ácido nucleico-lípido. Tal como se usa en el presente documento, el término “SNALP” se refiere a una partícula estable de ácido nucleico-lípido, que incluye SPLP. Tal como se usa en el presente documento, el término “SPLP” se refiere a una partícula de ácido nucleico-lípido que comprende ADN plasmídico encapsulado dentro de una vesícula lipídica. Las SNALP y SPLP normalmente contienen un lípido catiónico, un lípido no catiónico y un lípido que evita la agregación de la partícula (por ejemplo, un conjugado de PEG-lípido). Las SNALP y SPLP son extremadamente útiles para aplicaciones sistémicas, ya que exhiben duraciones en la circulación prolongadas tras la inyección intravenosa (i.v.) y se acumulan en los sitios distales (por ejemplo, sitios físicamente separados del sitio de administración). Las SPLP incluyen “pSPLP”, que incluyen un complejo de ácido nucleico-agente de condensación encapsulado tal como se establece en la publicación PCT n.° WO 00/03683. Las partículas descritas en el presente documento tienen normalmente un diámetro medio de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm, más normalmente de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 130 nm, más normalmente de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm, más normalmente de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 90 nm, y son sustancialmente no tóxicos. Además, los ácidos nucleicos cuando están presentes en las partículas de ácido nucleico-lípido descritas en el presente documento son resistentes en disolución acuosa a la degradación con una nucleasa. Las partículas de ácido nucleico-lípido y su método de preparación se dan a conocer en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.976.567; 5.981.501; 6.534.484; 6.586.410; 6.815.432; y la publicación PCT n.° WO 96/40964.
La razón de lípido con respecto al fármaco (razón masa/masa) (por ejemplo, razón de lípido con respecto a ARNbc) puede estar en el intervalo de desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 50:1, desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 25:1, desde aproximadamente 3:1 hasta aproximadamente 15:1, desde aproximadamente 4:1 hasta aproximadamente 10:1, desde aproximadamente 5:1 hasta aproximadamente 9:1, o desde aproximadamente 6:1 hasta aproximadamente 9:1. La razón de lípido con respecto a ARNbc puede ser de aproximadamente 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 ó 11:1.
En general, la partícula de lípido-ácido nucleico se suspende en un tampón, por ejemplo, PBS, para su administración. El pH del ARNip formulado con lípidos puede estar entre 6,8 y 7,8, por ejemplo, 7,3 ó 7,4. La osmolalidad puede estar, por ejemplo, entre 250 y 350 mOsm/kg, por ejemplo, alrededor de 300, por ejemplo, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ó 305.
El lípido catiónico puede ser, por ejemplo, cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(I-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), cloruro de N-(I-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DoTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi)propilamina (DOd Ma ), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2-dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-dilinoleioxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-dilinoleioxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-linoleoil-2-linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloruro de 1,2-dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), sal de cloruro de 1,2-dilinoleoil-3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin-MPZ), o 3-(N,N-dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-dioleilamino)-1,2-propanodio (DOAP), 1,2-dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA) o análogos de los mismos, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100), 4-(dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo (MC3), 1,r-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2-hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanodiil)didodecan-2-ol (Tech G1), o una mezcla de los mismos. El lípido catiónico puede comprender desde aproximadamente el 20% en moles hasta aproximadamente el 50% en moles o aproximadamente el 40% en moles del lípido total presente en la partícula.
El lípido no catiónico puede ser un lípido aniónico o un lípido neutro que incluye, pero no se limita a, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), dioleoil-fosfatidiletanolamina-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolina (DMPE), diestearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE), colesterol o una mezcla de los mismos. El lípido no catiónico puede ser de desde aproximadamente el 5% en moles hasta aproximadamente el 90% en moles, aproximadamente el 10% en moles, o aproximadamente el 58% en moles si se incluye colesterol, del lípido total presente en la partícula.
El lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas puede ser, por ejemplo, un polietilenglicol (PEG)-lípido que incluye, sin limitación, un PEG-diacilglicerol (DAG), un PEG-dialquiloxipropilo (DAA), un PEG-fosfolípido, un PEG-ceramida (Cer), o una mezcla de los mismos. El conjugado PEG-DAA puede ser, por ejemplo, un PEG-dilauriloxipropilo (C¡2), un PEG-dimiristiloxipropilo (Ci4), un PEG-dipalmitiloxipropilo (C1a), o un PEG-diesteariloxipropilo (C18). Otros ejemplos de conjugados de PEG incluyen PEG-cDMA (N-[(metoxipoN(etNenglico¡)2000)carbaiTiN]-1,2-diiT iinstNoxipropN-3-aiT iina), mPEG2000-DMG (mPEG-dimiristilglicerol (con un peso molecular promedio de 2.000) y PEG-C-DOMG (R-3-[(ro-metoxi-poli(etilenglicol)2000)carbamoil)]-1,2-dimiristiloxilpropil-3-amina). El lípido conjugado que evita la agregación de partículas puede ser de desde el 0% en moles hasta aproximadamente el 20% en moles o de aproximadamente el 1,0, el 1,1, el 1,2, el 1,3, el 1,4, el 1,5, el 1,6, el 1,7, el 1,8, el 1,9 o el 2% en moles del lípido total presente en la partícula.
La partícula de ácido nucleico-lípido puede incluir además colesterol en, por ejemplo, aproximadamente del 10% en moles a aproximadamente el 60% en moles o aproximadamente el 48% en moles del lípido total presente en la partícula.
El compuesto 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano puede usarse para preparar nanopartículas de lípido-ARNip. La síntesis de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano se describe en la solicitud de patente provisional estadounidense número 61/107.998 presentada el 23 de octubre de 2008.
Por ejemplo, la partícula de lípido-ARNip puede incluir el 40% de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano: el 10% de DSPC: el 40% de colesterol: el 10% de PEG-C-DOMG (porcentaje en moles) con un tamaño de partícula de 63,0 ± 20 nm y una razón de ARNip/lípido de 0,027.
Puede usarse el compuesto 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2-hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanodiil)didodecan-2-ol (Tech G1) para preparar partículas de lípido-ARNip. Por ejemplo, el ARNbc puede formularse en una formulación de lípidos que comprende Tech-G1, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), colesterol y mPEG2000-DMG en una razón molar de 50:10:38,5:1,5 a una razón de lípido total con respecto a ARNip de 7:1 (peso:peso).
LNP01
Pueden usarse el lipidoide ND98 ■ 4HCl (PM 1487) (fórmula 1), colesterol (Sigma-Aldrich) y PEG-ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) para preparar nanopartículas de lípido-ARNip (es decir, partículas LNP01). Las disoluciones madre de cada uno en etanol pueden prepararse tal como sigue: ND98, 133 mg/ml; colesterol, 25 mg/ml, PEG-ceramida C16, 100 mg/ml. Las disoluciones madre de ND98, colesterol y PEG-ceramida C16 pueden combinarse luego por ejemplo, en una razón molar 42:48:10. La disolución de lípidos combinada puede mezclarse con ARNip acuoso (por ejemplo, en acetato de sodio pH 5) de manera que la concentración final de etanol es de aproximadamente el 35-45% y la concentración final de acetato de sodio es de aproximadamente 100-300 mM. Las nanopartículas de lípido-ARNip se forman normalmente de manera espontánea al mezclarse. Dependiendo de la distribución de tamaño de partícula deseada, la mezcla de nanopartículas resultante puede extruirse a través de una membrana de policarbonato (por ejemplo, punto de corte de 100 nm) usando, por ejemplo, una prensa extrusora Thermobarrel, tal como Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc). En algunos casos, puede omitirse la etapa de extrusión. La eliminación de etanol y el intercambio de tampón simultáneo pueden realizarse mediante, por ejemplo, diálisis o filtración de flujo tangencial. El tampón puede intercambiarse con, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS) a aproximadamente pH 7, por ejemplo, aproximadamente pH 6,9, aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 7,1, aproximadamente pH 7,2, aproximadamente pH 7,3 o aproximadamente pH 7,4.
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Formulaciones de lípido-ARNip a modo de ejemplo adicionales son tal como siguen:
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Se describen formulaciones de LNP09 y formulaciones que comprenden XTC, por ejemplo, en la provisional estadounidense con n.° de serie 61/239.686, presentada el 3 de septiembre de 2009.
Se describen formulaciones de LNP11 y formulaciones que comprenden MC3, por ejemplo, en la provisional estadounidense con n.° de serie 61/244.834, presentada el 22 de septiembre de 2009.
Se describen formulaciones de LNP12 y formulaciones que comprenden TechGI, por ejemplo, en la provisional estadounidense con n.° de serie 61/175.770, presentada el 5 de mayo de 2009.
Las formulaciones preparadas mediante el método o bien convencional o bien sin extrusión pueden caracterizarse de maneras similares. Por ejemplo, las formulaciones se caracterizan normalmente por inspección visual. Deben ser disoluciones blanquecinas translúcidas libres de agregados o sedimentos. El tamaño de partícula y la distribución del tamaño de partícula de nanopartículas de lípidos pueden medirse mediante dispersión de luz usando, por ejemplo, un aparato Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, EE.UU.). Las partículas deben ser de aproximadamente 20­ 300 nm, tal como de 40-100 nm de tamaño. La distribución del tamaño de partícula debe ser unimodal. La concentración total de ARNip en la formulación, así como la fracción atrapada, se estima usando un ensayo de exclusión de colorante. Una muestra del ARNip formulado puede incubarse con un colorante de unión a ARN, tal como Ribogreen (Molecular Probes) en presencia o ausencia de un tensioactivo disruptor de formulación, por ejemplo, Triton-X100 al 0,5%. El ARNip total en la formulación puede determinarse mediante la señal de la muestra que contiene el tensioactivo, en relación con una curva de calibración. La fracción atrapada se determina restando el contenido de ARNip “libre” (tal como se mide mediante la señal en ausencia de tensioactivo) del contenido de ARNip total. El porcentaje de ARNip atrapado es normalmente> 85%. Para la formulación de SNALP, el tamaño de partícula es de al menos 30 nm, al menos 40 nm, al menos 50 nm, al menos 60 nm, al menos 70 nm, al menos 80 nm, al menos 90 nm, al menos 100 nm, al menos 110 nm y al menos 120 nm. El intervalo adecuado es normalmente de aproximadamente al menos 50 nm a aproximadamente 110 nm, de aproximadamente al menos 60 nm a aproximadamente 100 nm, o de aproximadamente al menos 80 nm a aproximadamente 90 nm.
Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o disoluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, sobres, tabletas o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes saborizantes, diluyentes, emulsionantes, coadyuvantes de dispersión o aglutinantes. Las formulaciones orales pueden ser aquellas en las que los ARNbc descritos en el presente documento se administran junto con uno o más tensioactivos y quelantes potenciadores de penetración. Los tensioactivos adecuados incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos. Los ácidos/sales biliares adecuados incluyen ácido quenodesoxicólico (CDCA) y ácido ursodesoxicanodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido deshidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio y glicodihidrofusidato de sodio. Los ácidos grasos adecuados incluyen ácido araquidónico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina o un monoglicérido, un diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (por ejemplo, sodio). Pueden usarse combinaciones de potenciadores de penetración, por ejemplo, ácidos grasos/sales en combinación con ácidos/sales biliares. Una combinación a modo de ejemplo es la sal sódica de ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Los potenciadores de penetración adicionales incluyen polioxietilen-9-lauril éter, polioxietilen-20-cetil éter. Los ARNbc descritos en el presente documento pueden administrarse por vía oral, en forma granular que incluyen partículas secadas por pulverización, o complejados para formar micropartículas o nanopartículas. Los agentes complejantes de ARNbc incluyen poliaminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas, albúminas, almidones, acrilatos, polietilenglicoles (PEG) y almidones cationizados; polialquilcianoacrilatos; poliiminas, polulanos, celulosas y almidones derivatizados de DEAE. Los agentes complejantes adecuados incluyen quitosano, N-trimetilquitosano, poli-L-lisina, polihistidina, poliornitina, polisperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P (TDAE), poliaminostireno (por ejemplo, p-amino), poli(cianoacrilato de metilo), poli(cianoacrilato de etilo), poli(cianoacrilato de butilo), poli (cianoacrilato de isobutilo), poli(cinaoacrilato de isohexilo), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albúmina y DEAE-dextrano, poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de hexilo), poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido DL-láctico-co-glicólico) (PLGA), alginato y polietilenglicol (PEG). Las formulaciones orales para ARNbc y su preparación se describen con detalle en la patente estadounidense 6.887.906, publicación estadounidense n.° 20030027780 y la patente estadounidense n.° 6.747.014.
Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intraparenquimatosa (en el cerebro), intratecal, intraventricular o intrahepática pueden incluir disoluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero no se limitan a, potenciadores de penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, disoluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero no se limitan a, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes. Son particularmente preferidas las formulaciones que seleccionan como diana el hígado cuando se tratan trastornos hepáticos tales como el carcinoma en hígado.
Las formulaciones farmacéuticas descritas en el presente documento, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, pueden prepararse según técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de asociar los principios activos con el/los portador(es) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente los principios activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, dando forma al producto.
Las composiciones descritas en el presente documento pueden formularse para dar cualquiera de las muchas formas de dosificación posibles, tales como, pero sin limitarse, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones descritas en el presente documento también pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes
Emulsiones
Las composiciones descritas en el presente documento pueden prepararse y formularse como emulsiones. Las emulsiones son normalmente sistemas heterogéneos de un líquido disperso en otro en forma de gotitas que generalmente exceden 0,1 |im de diámetro (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 2, pág. 335; Higuchi et al., en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, pág. 301). Las emulsiones son a menudo sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles íntimamente mezcladas y dispersas entre sí. En general, las emulsiones pueden ser o bien del tipo agua en aceite (w/o) o bien de aceite en agua (o/w). Cuando una fase acuosa se divide finamente y se dispersa como gotitas diminutas en una fase oleosa a granel, la composición resultante se denomina emulsión de agua en aceite (w/o). Alternativamente, cuando una fase oleosa se divide finamente y se dispersa como gotitas diminutas en una fase acuosa a granel, la composición resultante se denomina emulsión de aceite en agua (o/w). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersas, y el fármaco activo que puede estar presente como una disolución o bien en la fase acuosa, o bien en la fase oleosa o en sí mismo como una fase separada. Los excipientes farmacéuticos tales como emulsionantes, estabilizadores, colorantes y antioxidantes también pueden estar presentes en las emulsiones según sea necesario. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser múltiples emulsiones que se componen de más de dos fases tal como, por ejemplo, en el caso de emulsiones de aceite en agua en aceite (o/w/o) y agua en aceite en agua (w/o/w). Estas formulaciones complejas a menudo proporcionan determinadas ventajas que las emulsiones binarias simples no ofrecen. Las emulsiones múltiples en las que las gotitas de aceite individuales de una emulsión o/w encierran pequeñas gotas de agua constituyen una emulsión w/o/w. Asimismo, un sistema de gotitas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizados en una fase aceitosa continua proporciona una emulsión o/w/o.
Las emulsiones se caracterizan por una estabilidad termodinámica escasa o nula. A menudo, la fase dispersa o discontinua de la emulsión se dispersa bien en la fase externa o continua y se mantiene en esta forma por medio de emulsionantes o la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser semisólida o sólida, como es el caso de las bases y cremas de pomadas en forma de emulsión. Otros medios para estabilizar las emulsiones implican el uso de emulsionantes que pueden incorporarse en cualquier fase de la emulsión. Los emulsionantes pueden clasificarse en general en cuatro categorías: tensioactivos sintéticos, emulsionantes que se producen de manera natural, bases de absorción y sólidos finamente dispersos (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199).
Los tensioactivos sintéticos, también conocidos como agentes tensioactivos, han encontrado una amplia aplicabilidad en la formulación de emulsiones y se han revisado en la bibliografía (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág.
285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, volumen 1, pág. 199). Los tensioactivos son normalmente anfífilos y comprenden una porción hidrófila y una hidrófoba. La razón de la naturaleza hidrófila con respecto a la hidrófoba del tensioactivo se ha denominado equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB) y es una herramienta valiosa para categorizar y seleccionar tensioactivos en la preparación de formulaciones. Los tensioactivos pueden clasificarse en diferentes clases según la naturaleza del grupo hidrófilo: no iónico, aniónico, catiónico y anfótero (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 285).
Los emulsionantes que se producen de manera natural usados en las formulaciones de emulsión incluyen lanolina, cera de abejas, fosfátidos, lecitina y goma arábiga. Las bases de absorción poseen propiedades hidrófilas, de modo que pueden absorber agua para formar emulsiones w/o conservando sus consistencias semisólidas, tales como lanolina anhidra y vaselina hidrófila. Los sólidos finamente divididos también se han usado como buenos emulsionantes, especialmente en combinación con tensioactivos y en preparaciones viscosas. Estos incluyen sólidos inorgánicos polares, tales como hidróxidos de metales pesados, arcillas no hinchables tales como bentonita, atapulgita, hectorita, caolín, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de aluminio y magnesio coloidal, pigmentos y sólidos apolares tales como triestearato de carbono o glicerilo.
También se incluye una gran variedad de materiales no emulsionantes en las formulaciones de emulsión y contribuyen a las propiedades de las emulsiones. Estos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrófilos, conservantes y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág.
335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199).
Los coloides o hidrocoloides hidrófilos incluyen gomas que se producen de manera natural y polímeros sintéticos tales como polisacáridos (por ejemplo, goma arábiga, agar, ácido algínico, carragenano, goma guar, goma karaya y tragacanto), derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa) y polímeros sintéticos (por ejemplo, carbómeros, éteres de celulosa y polímeros de carboxivinilo). Estos se dispersan o se hinchan en agua para formar disoluciones coloidales que estabilizan las emulsiones formando películas interfaciales fuertes alrededor de las gotitas de la fase dispersa y aumentando la viscosidad de la fase externa.
Dado que las emulsiones a menudo contienen varios componentes tales como hidratos de carbono, proteínas, esteroles y fosfátidos que pueden ayudar fácilmente al crecimiento de microbios, estas formulaciones a menudo incorporan conservantes. Los conservantes comúnmente usados incluidos en las formulaciones de emulsión incluyen metilparabeno, propilparabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres de ácido phidroxibenzoico y ácido bórico. Los antioxidantes también se añaden comúnmente a las formulaciones de emulsión para evitar el deterioro de la formulación. Los antioxidantes usados pueden ser eliminadores de radicales libres tales como tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o agentes reductores tales como ácido ascórbico y metabisulfito de sodio, y sinergistas antioxidantes tales como ácido cítrico, ácido tartárico y lecitina.
Se ha revisado en la bibliografía la aplicación de formulaciones de emulsión por vía dermatológica, oral y parenteral y los métodos para su fabricación (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199). Las formulaciones de emulsión para administración oral se han usado ampliamente debido a la facilidad de formulación, así como a la eficacia desde el punto de vista de la absorción y la biodisponibilidad (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199). Los laxantes a base de aceite mineral, las vitaminas solubles en aceite y las preparaciones nutritivas con alto contenido de grasa se encuentran entre los materiales que se han administrado comúnmente por vía oral como emulsiones o/w.
Las composiciones de ARNbc y ácidos nucleicos pueden formularse como microemulsiones. Una microemulsión puede definirse como un sistema de agua, aceite y molécula anfífila que es una única disolución líquida ópticamente isotrópica y termodinámicamente estable (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245). Normalmente, las microemulsiones son sistemas que se preparan en primer lugar dispersando un aceite en una disolución acuosa de tensioactivo y luego añadiendo una cantidad suficiente de un cuarto componente, generalmente un alcohol de cadena intermedia para formar un sistema transparente. Por tanto, las microemulsiones también se han descrito como dispersiones termodinámicamente estables, isotrópicamente transparentes de dos líquidos inmiscibles que se estabilizan mediante películas interfaciales de moléculas tensioactivas (Leung y Shah, en: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, v Ch Publishers, Nueva York, páginas 185-215). Las microemulsiones se preparan comúnmente mediante una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, tensioactivo, cotensioactivo y electrolito. Si la microemulsión es del tipo agua en aceite (w/o) o aceite en agua (o/w) depende de las propiedades del aceite y del tensioactivo usados y de la estructura y el empaquetamiento geométrico de las cabezas polares y colas de hidrocarburos de las moléculas de tensioactivo (Schott, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, pág. 271).
El enfoque fenomenológico que utiliza diagramas de fase se ha estudiado ampliamente y ha proporcionado un conocimiento integral, para un experto en la técnica, de cómo formular microemulsiones (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág.
245; Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 335). En comparación con las emulsiones convencionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar fármacos insolubles en agua en una formulación de gotitas termodinámicamente estables que se forman espontáneamente.
Los tensioactivos usados en la preparación de microemulsiones incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos iónicos, tensioactivos no iónicos, Brij 96, éteres oleílicos de polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de tetraglicerol (MO310), PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), solo o en combinación con cotensioactivos. El cotensioactivo, habitualmente un alcohol de cadena corta tal como etanol, 1-propanol y 1-butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial al penetrar en la película de tensioactivo y, en consecuencia, crear una película desordenada debido al espacio vacío generado entre las moléculas de tensioactivo. Sin embargo, se conocen en la técnica que las microemulsiones pueden prepararse sin el uso de cotensioactivos y los sistemas de microemulsión autoemulsionantes sin alcohol. La fase acuosa puede ser normalmente, pero no se limita a, agua, una disolución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propilenglicoles y derivados de etilenglicol. La fase oleosa puede incluir, pero no se limita a, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos grasos, mono, di y triglicéridos de cadena media (C8-C12), ésteres de ácidos grasos de glicerilo polioxietilados, alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados, glicéridos saturados poliglicolizados C8-C10, aceites vegetales y aceite de silicona.
Las microemulsiones son particularmente interesantes desde el punto de vista de la solubilización de fármacos y la absorción mejorada de fármacos. Se han propuesto microemulsiones a base de lípidos (tanto o/w como w/o) para potenciar la biodisponibilidad oral de los fármacos, incluyendo péptidos (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390.; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Las microemulsiones ofrecen ventajas de solubilización mejorada del fármaco, protección del fármaco frente a la hidrólisis enzimática, posible potenciamiento de la absorción del fármaco debido a alteraciones inducidas por el tensioactivo en la fluidez y permeabilidad de la membrana, facilidad de preparación, facilidad de administración oral con respecto a formas de dosificación sólidas, potencia clínica mejorada y disminución de la toxicidad (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). A menudo, las microemulsiones pueden formarse espontáneamente cuando sus componentes se juntan a temperatura ambiental. Esto puede ser particularmente ventajoso cuando se formulan fármacos, péptidos o ARNbc termolábiles. Las microemulsiones también han sido eficaces en la administración transdérmica de componentes activos tanto en aplicaciones cosméticas como farmacéuticas. Se espera que las composiciones y formulaciones de microemulsión descritas en el presente documento faciliten la absorción sistémica aumentada de ARNbc y ácidos nucleicos del tracto gastrointestinal, así como mejoren la captación celular local de ARNbc y ácidos nucleicos.
Las microemulsiones descritas en el presente documento también pueden contener componentes y aditivos adicionales tales como monoestearato de sorbitano (Grill 3), Labrasol y potenciadores de penetración para mejorar las propiedades de la formulación y potenciar la absorción de los ARNbc y ácidos nucleicos descritos en el presente documento. Los potenciadores de penetración usados en las microemulsiones descritas en el presente documento pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco categorías amplias: tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92). Cada una de estas clases se ha comentado anteriormente.
Potenciadores de penetración
También se emplean en el presente documento diversos potenciadores de penetración para efectuar la administración eficaz de ácidos nucleicos, particularmente ARNbc, a la piel de animales. La mayoría de los fármacos están presentes en disolución tanto en forma ionizada como no ionizada. Sin embargo, normalmente sólo los fármacos solubles en lípidos o lipófilos atraviesan fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso los fármacos no lipofílicos pueden atravesar las membranas celulares si la membrana que va a atravesarse se trata con un potenciador de penetración. Además de ayudar a la difusión de fármacos no lipófilos a través de las membranas celulares, los potenciadores de penetración también potencian la permeabilidad de los fármacos lipófilos.
Los potenciadores de penetración pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco amplias categorías, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92). Cada una de las clases de potenciadores de penetración mencionadas anteriormente se describen a continuación con mayor detalle.
Tensioactivos: en relación con la presente divulgación, los tensioactivos (o “agentes tensioactivos”) son entidades químicas que, cuando se disuelven en una disolución acuosa, reducen la tensión superficial de la disolución o la tensión interfacial entre la disolución acuosa y otro líquido, con el resultado de que se potencia la absorción de ARNbc a través de la mucosa. Además de las sales biliares y los ácidos grasos, estos potenciadores de penetración incluyen, por ejemplo, laurilsulfato de sodio, polioxietilen-9-lauril éter y polioxietilen-20-cetil éter) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92); y emulsiones perfluoroquímicas, tales como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Ácidos grasos: diversos ácidos grasos y sus derivados que actúan como potenciadores de penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, ésteres de alquilo C1-10 de los mismos (por ejemplo, metilo, isopropilo y t-butilo) y mono y diglicéridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
Sales biliares: el papel fisiológico de la bilis incluye la facilitación de la dispersión y absorción de lípidos y vitaminas liposolubles (Brunton, capítulo 38 en: The Pharmacological Basis of Therapeutics de Goodman & Gilman, 9a ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, Nueva York, 1996, págs. 934-935). Diversas sales biliares naturales y sus derivados sintéticos actúan como potenciadores de penetración. Por tanto, el término “sales biliares” incluye cualquiera de los componentes de la bilis que se producen de manera natural, así como cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares adecuadas incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o su sal de sodio farmacéuticamente aceptable, colato de sodio), ácido deshidrocólico (deshidrocolato de sodio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sodio), ácido glucólico (glucolato de sodio), ácido glicólico (glicocolato de sodio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sodio), ácido taurocólico (taurocolato de sodio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sodio), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sodio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-dihidrofusidato de sodio (STDHF), glicodihidrofusidato de sodio y polioxietilen-9-lauril éter (POE) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, capítulo 39 en: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782­ 783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
Agentes quelantes: los agentes quelantes, tal como se usan en el presente documento, pueden definirse como compuestos que retiran iones metálicos de la disolución formando complejos con los mismos, con el resultado de que se potencia la absorción de ARNbc a través de la mucosa. Con respecto a su uso como potenciadores de penetración en la presente divulgación, los agentes quelantes tienen la ventaja adicional de servir también como inhibidores de la ADNasa, ya que la mayoría de las ADN nucleasas caracterizadas requieren un ión metálico divalente para la catálisis y, por tanto, son inhibidas por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315­ 339). Los agentes quelantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, etilendiaminotetraacetato de disodio (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato y homovanilato), derivados de N-acilo de colágeno, lauril éter-9 y derivados de N-aminoacilo de beta-dicetonas (enaminas) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
No tensioactivos no quelantes: tal como se usa en el presente documento, los compuestos que potencian la penetración de no tensioactivos no quelantes pueden definirse como compuestos que demuestran una actividad insignificante como agentes quelantes o tensioactivos pero que, no obstante, potencian la absorción de ARNbc a través de la mucosa alimentaria (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta clase de potenciadores de penetración incluye, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1 -alquil- y 1-alquenilazacicloalcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); y agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como diclofenaco de sodio, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
Portadores
Determinadas composiciones descritas en el presente documento también incorporan compuestos portadores en la formulación. Tal como se usa en el presente documento, “compuesto portador” o “portador” puede referirse a un ácido nucleico, o análogo del mismo, que es inerte (es decir, no posee actividad biológica per se) pero es reconocido como un ácido nucleico mediante procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico que tiene actividad biológica, por ejemplo, degradando el ácido nucleico biológicamente activo o promoviendo su eliminación de la circulación. La coadministración de un ácido nucleico y un compuesto portador, normalmente con un exceso de la última sustancia, puede dar como resultado una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperado en el hígado, riñón u otros reservorios extracirculatorios, presumiblemente debido a la competencia entre el compuesto portador y el ácido nucleico para un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un ARNbc parcialmente fosforotioato en el tejido hepático puede reducirse cuando se coadministra con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4-acetamido-4'isotiociano-estilbeno-2,2'-disulfónico (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
Excipientes
A diferencia de un compuesto portador, un “portador farmacéutico” o “excipiente” es un disolvente, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte farmacéuticamente aceptable para administrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, teniendo en cuenta la forma de administración planificada, para proporcionar el volumen, la consistencia deseados etc., cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los portadores farmacéuticos típicos incluyen, pero no se limitan a, agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); cargas (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); disgregantes (por ejemplo, almidón, almidón glicolato de sodio, etc.); y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc).
Los excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionan de manera perjudicial con los ácidos nucleicos también pueden usarse para formular las composiciones descritas en el presente documento. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares. Las formulaciones para la administración tópica de ácidos nucleicos pueden incluir disoluciones acuosas estériles y no estériles, disoluciones no acuosas en disolventes comunes tales como alcoholes o disoluciones de ácidos nucleicos en bases oleosas líquidas o sólidas. Las disoluciones también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. Pueden usarse excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parenteral que no reaccionen de manera perjudicial con los ácidos nucleicos. Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Otros componentes
Las composiciones descritas en el presente documento pueden contener adicionalmente otros componentes adjuntos que se encuentran convencionalmente en las composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos en la técnica. Así, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmacéuticamente activos compatibles adicionales tales como, por ejemplo, antipruriginosos, astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles para formular físicamente diversas formas de dosificación de las composiciones descritos en el presente documento, tales como colorantes, agentes saborizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizadores. Sin embargo, tales materiales, cuando se añaden, no deberían interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones descritas en el presente documento. Las formulaciones pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, agentes de coloración, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no interactúan de manera perjudicial con el/los ácido(s) nucleico(s) de la formulación.
Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden incluir (a) uno o más compuestos de ARNbc y (b) uno o más agentes biológicos anti-citocina que funcionan mediante un mecanismo que no es iARN. Los ejemplos de tales agentes biológicos incluyen, agentes biológicos que seleccionan como diana IL1 p (por ejemplo, anakinra), IL6 (tocilizumab) o TNF (etanorcept, infliximab, adlimumab o certolizumab).
La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La razón de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la razón DL50/DE50. Se prefieren los compuestos que exhiben altos índices terapéuticos.
Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de las composiciones descritas en el presente documento se encuentra generalmente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en los métodos descritos en el presente documento, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante del compuesto o, cuando sea apropiado, del producto polipeptídico de una secuencia diana (por ejemplo, logrando una concentración disminuida del polipéptido) que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) determinada en cultivo celular. Esta información puede usarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución.
Además de su administración, tal como se comentó anteriormente, los ARNbc descritos en el presente documento pueden administrarse en combinación con otros agentes conocidos eficaces en el tratamiento de procesos patológicos mediados por la expresión de TTR. En cualquier caso, el médico que lo administra puede ajustar la cantidad y el momento de la administración de ARNbc basándose en los resultados observados usando mediciones convencionales de eficacia conocidas en la técnica o descritas en el presente documento.
Métodos para tratar la enfermedad ocular provocada por la expresión de un gen de TTR
La invención se refiere en particular al uso de un ARNbc que selecciona como diana TTR para el tratamiento de una amiloidosis ocular relacionada con TTR tal como se define en las reivindicaciones. También se describe en el presente documento un método para tratar, prevenir o manejar la amiloidosis ocular relacionada con TTR administrando al paciente que necesita dicho tratamiento, prevención o manejo de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de AD-18324 en la retina del paciente. El método puede implicar tratar a un ser humano identificando a un ser humano diagnosticado con amiloidosis ocular relacionada con TTR o en riesgo de desarrollar amiloidosis ocular relacionada con TTR y administrar al ser humano una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de AD-18324 en la retina del ser humano. También se describe en el presente documento el método para tratar a un ser humano con amiloidosis ocular relacionada con TTR mediante la introducción en la célula del epitelio de la retina un ARNbc, en el que el ARNbc es AD-18324 o AD-18534; y mantener la célula producida en la etapa anterior durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm de un gen de TTR, inhibiendo así la expresión del gen de TTR en la célula. El ARNip de TTR tal como se describe en el presente documento puede usarse en métodos de pacientes con polineuropatía amiloidótica familiar (FAP) relacionada con transtiretina (TTR) y en el tratamiento de manifestaciones oculares, tales como opacidad vítrea y glaucoma. Un experto en la técnica sabe que la transtiretina amiloidogénica (ATTR) sintetizada por el epitelio pigmentario de la retina (RPE) desempeña papeles importantes en la progresión de la amiloidosis ocular. Estudios previos han demostrado que la fotocoagulación panretiniana con láser, que redujo las células del RPE, evitó la progresión del depósito de amiloide en el vítreo, lo que indica que la supresión eficaz de la expresión de ATTR en el RPE puede convertirse en una nueva terapia para la amiloidosis ocular (véase, por ejemplo, Kawaji, T. et al., Ophthalmology. (2010) 117: 552-555). La administración de cualquiera de los ARNip de tTr dados a conocer en el presente documento puede usarse para el tratamiento de manifestaciones oculares de FAP relacionada con TTR, por ejemplo, amiloidosis ocular. El ARNbc puede administrarse de manera que seleccione como diana un tejido particular, tal como el ojo. Los modos de administración ocular incluyen retrobulbar, párpado subcutáneo, subconjuntival, subtenón, cámara anterior o inyección intravítrea (o inyección o infusión interna). Las formulaciones específicas para la administración ocular incluyen gotas o pomadas para los ojos.
El ARNbc y un agente terapéutico adicional pueden administrarse en la misma combinación, por ejemplo, por vía parenteral, o el agente terapéutico adicional puede administrarse como parte de una composición separada o mediante otro método descrito en el presente documento.
También se describe en el presente documento un método para administrar un ARNbc que selecciona como diana TTR a un paciente que tiene una enfermedad o trastorno mediado por la expresión de TTR, tal como una amiloidosis por TTR, por ejemplo, FAP. La administración del ARNbc puede estabilizar y mejorar la función neurológica periférica, por ejemplo, en un paciente con FAP. Puede administrarse a los pacientes una cantidad terapéutica de ARNbc, tal como 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg o 2,5 mg/kg de ARNbc. El ARNbc puede administrarse mediante infusión intravenosa durante un periodo de tiempo, tal como durante un periodo de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 60 minutos, 120 minutos o 180 minutos. La administración se repite, por ejemplo, de forma regular, tal como quincenalmente (es decir, cada dos semanas) durante un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses o más. Después de un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos pueden administrarse con menos frecuencia. Por ejemplo, después de la administración quincenal durante tres meses, la administración puede repetirse una vez al mes, durante seis meses o un año o más. La administración del ARNbc puede reducir los niveles de TTR en la sangre u orina del paciente en al menos un 20%, un 25%, un 30%, un 40%, un 50%, un 60%, un 70%, un 80% o un 90% o más.
Antes de la administración de una dosis completa del ARNbc, puede administrarse a los pacientes una dosis más pequeña, tal como una dosis que es el 5% de la dosis completa, y monitorizarse para detectar efectos adversos, tales como una reacción alérgica o un cambio en la función en hígado. Por ejemplo, en pacientes monitorizados para detectar cambios en la función en hígado, una baja incidencia de cambios en LFT (prueba de función en hígado) (por ejemplo, una incidencia del 10-20% de LFT) es aceptable (por ejemplo, un aumento reversible de 3 veces en los niveles de ALT (alanina aminotransferasa) y/o AST (aspartato aminotransferasa)).
Muchas enfermedades y trastornos asociados con TTR son hereditarios. Por tanto, un paciente que necesita un ARNbc de TTR puede identificarse tomando los antecedentes familiares. Un profesional sanitario, tal como un médico, una enfermera o un miembro de la familia, puede tomar los antecedentes familiares antes de recetar o administrar un ARNbc de TTR. También puede realizarse una prueba de ADN en el paciente para identificar una mutación en el gen de TTR, antes de que se administre al paciente un ARNbc de TTR.
Puede tomarse una biopsia del paciente antes de recibir un ARNbc de TTR. La biopsia puede realizarse, por ejemplo, en un tejido, tal como la mucosa gástrica, el nervio periférico, la piel, la grasa abdominal, el hígado o el riñón, y la biopsia puede revelar placas amiloides, que son indicativas de un trastorno mediado por TTR. Tras la identificación de las placas de amiloide, se administra al paciente un ARNbc de TTR.
Métodos para inhibir la expresión de un gen de TTR
También se proporciona en el presente documento un método para inhibir la expresión de un gen de TTR en un mamífero. El método incluye administrar una composición descrita en el presente documento al mamífero de manera que se silencie la expresión del gen de TTR diana.
Cuando el organismo que va a tratarse es un mamífero, tal como un ser humano, la composición puede administrarse por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, las vías oral o parenteral, incluyendo administración intracraneal (por ejemplo, intraventricular, intraparenquimatosa e intratecal), intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, vías respiratorias (aerosol), nasal, rectal y tópica (incluyendo bucal y sublingual). Las composiciones pueden administrarse mediante infusión o inyección intravenosa.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1. Síntesis de ARNbc
Fuente de reactivos
Cuando no se proporciona específicamente la fuente de un reactivo en el presente documento, tal reactivo puede obtenerse de cualquier proveedor de reactivos para biología molecular a un criterio de calidad/pureza para aplicación en biología molecular.
Síntesis de ARNip
Se produjeron ARN monocatenarios mediante síntesis de fase sólida en una escala de 1 |imol usando un sintetizador Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Alemania) y vidrio de poro controlado (CPG, 500Á, Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania) como soporte sólido. Se generaron a Rn y ARN que contenían nucleótidos 2'O-metilo mediante síntesis de fase sólida que emplea las correspondientes fosforamiditas y 2-O-metilo fosforamiditas, respectivamente (Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania). Estos bloques de construcción se incorporaron en sitios seleccionados dentro de la secuencia de la cadena de oligorribonucleótidos usando química de fosforamidita de nucleósidos convencional tal como se describe en Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EE.UU. Se introdujeron enlaces de fosforotioato mediante reemplazo de la disolución de oxidante de yodo con una disolución del reactivo Beaucage (Chruachem Ltd, Glasgow, RU) en acetonitrilo (1%). Se obtuvieron reactivos auxiliares adicionales de Mallinckrodt Baker (Griesheim, Alemania).
Se llevaron a cabo desprotección y purificación de los oligorribonucleótidos en bruto mediante HPLC de intercambio aniónico según procedimientos establecidos. Se determinaron los rendimientos y concentraciones mediante absorción de UV de una disolución del ARN respectivo a una longitud de onda de 260 nm usando un espectrofotómetro (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, UnterschleilJheim, Alemania). Se generó ARN bicatenario mezclando una disolución equimolar de hebras complementarias en tampón de hibridación (fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8; cloruro de sodio 100 mM), se calentó en un baño de agua a 85 - 90°C durante 3 minutos y se enfrió hasta temperatura ambiente durante un periodo de 3 - 4 horas. Se almacenó la disolución de ARN hibridado a -20°C hasta su uso.
Para la síntesis de ARNip conjugados con 3'-colesterol (en el presente documento denominados -Chol-3'), se usó un soporte sólido apropiadamente modificado para la síntesis de ARN. Se preparó el soporte sólido modificado tal como sigue:
Dietil-2-azabutano-1,4-dicarboxilato AA
Figure imgf000031_0001
Se añadió una disolución acuosa 4,7 M de hidróxido de sodio (50 ml) en una disolución helada con agitación de clorhidrato de glicinato de etilo (32,19 g, 0,23 moles) en agua (50 ml). Luego, se añadió acrilato de etilo (23,1 g, 0,23 moles) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente hasta que se determinó la finalización de la reacción mediante CCF. Después de 19 h, se repartió la disolución con diclorometano (3 x 100 ml). Se secó la fase orgánica con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se evaporó. Se destiló el residuo para dar AA (28,8 g, 61%).
Éster etílico del ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonil-amino)-hexanoil]-amino}-propiónico AB
Figure imgf000031_0002
Se disolvió Fmoc-6-amino-ácido hexanoico (9,12 g, 25,83 mmol) en diclorometano (50 ml) y se enfrió con hielo. Se añadió diisopropilcarbodiimda (3,25 g, 3,99 ml, 25,83 mmol) a la disolución a 0°C. Luego se continuó con la adición de dietil-azabutano-1,4-dicarboxilato (5 g, 24,6 mmol) y dimetilaminopiridina (0,305 g, 2,5 mmol). Se llevó la disolución hasta temperatura ambiente y se agitó adicionalmente durante 6 h. Se determinó la finalización de la reacción mediante CCF. Se concentró la mezcla de reacción a vacío y se añadió acetato de etilo para precipitar diisopropilurea. Se filtró la suspensión. Se lavó el filtrado con ácido clorhídrico acuoso al 5%, bicarbonato de sodio al 5% y agua. Se secó la fase orgánica combinada sobre sulfato de sodio y se concentró para dar el producto en bruto que se purificó mediante cromatografía en columna (EtOAC al 50%/hexanos) para proporcionar 11,87 g (88%) de AB.
Éster etílico del ácido 3-[(6-amino-hexanoil)-etoxicarbonilmetil-amino]-propiónico AC
Figure imgf000032_0001
Se disolvió éster etílico del ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-hexanoil]-amino}-propiónico AB (11,5 g, 21,3 mmol) en piperidina al 20% en dimetilformamida a 0°C. Se continuó agitando la disolución durante 1 h. Se concentró la mezcla de reacción a vacío, se añadió agua al residuo y se extrajo el producto con acetato de etilo. Se purificó el producto en bruto mediante conversión en su sal de clorhidrato.
Éster etílico del ácido 3-({6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}etoxicarbonilmetil-amino)-propiónico AD
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Se llevó la sal de clorhidrato de éster etílico del ácido 3-[(6-amino-hexanoil)-etoxicarbonilmetil-amino]-propiónico AC (4,7 g, 14,8 mmol) a diclorometano. Se enfrió la suspensión hasta 0°C sobre hielo. A la suspensión se le añadió diisopropiletilamina (3,87 g, 5,2 ml, 30 mmol). A la disolución resultante se le añadió cloroformiato de colesterilo (6,675 g, 14,8 mmol). Se agitó la mezcla de reacción durante la noche. Se diluyó la mezcla de reacción con diclorometano y se lavó con ácido clorhídrico al 10%. Se purificó el producto mediante cromatografía ultrarrápida (10,3 g, 92%).
Éster etílico del ácido 1-{6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}-4-oxo-pirrolidina-3-carboxílico AE
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Se suspendió t-butóxido de potasio (1,1 g, 9,8 mmol) en 30 ml de tolueno seco. Se enfrió la mezcla hasta 0°C sobre hielo y se añadieron 5 g (6,6 mmol) de diéster AD lentamente con agitación en el plazo de 20 min. Se mantuvo la temperatura por debajo de 5°C durante la adición. Se continuó la agitación durante 30 min a 0°C y se añadió 1 ml de ácido acético glaciar, inmediatamente seguido de 4 g de NaH2PO4 ^2O en 40 ml de agua. Se extrajo la mezcla resultante dos veces con 100 ml de diclorometano cada una y se lavaron los extractos orgánicos combinados dos veces con 10 ml de tampón fosfato cada uno, se secaron y se evaporaron hasta sequedad. Se disolvió el residuo en 60 ml de tolueno, se enfrió hasta 0°C y se extrajo con tres porciones de 50 ml de tampón carbonato frío pH 9,5. Se ajustaron los extractos acuosos a pH 3 con ácido fosfórico y se extrajeron con cinco porciones de 40 ml de cloroformo que se combinaron, se secaron y se evaporaron hasta sequedad. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna usando acetato de etilo al 25%/hexano para dar 1,9 g de b-cetoéster (39%).
Éster 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ílico del ácido [6-(3-hidroxi-4-hidroximetil-pirrolidin-1-il)-6-oxo-hexil]-carbámico AF
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Se añadió gota a gota metanol (2 ml) durante un periodo de 1 h a una mezcla de reflujo de b-cetoéster AE (1,5 g, 2,2 mmol) y borohidruro de sodio (0,226 g, 6 mmol) en tetrahidrofurano (10 ml). Se continuó la agitación a temperatura de reflujo durante 1 h. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, se añadió HCl 1 N (12,5 ml), se extrajo la mezcla con acetato de etilo (3 x 40 ml). Se secó la fase de acetato de etilo combinada sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a vacío para proporcionar el producto que se purificó mediante cromatografía en columna (MeOH al 10% /CHCh) (89%).
Éster 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ílico del ácido (6-{3-[bis-(4-metoxi-fenil)-fenil-metoximetil]-4-hidroxi-pirrolidin-1-il}-6-oxohexil)-carbámico AG
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Se secó diol AF (1,25 g, 1,994 mmol) evaporando con piridina ( 2 x 5 ml) a vacío. Se añadieron piridina anhidra (10 ml) y 4,4’-dimetoxitritilcloruro (0,724 g, 2,13 mmol) con agitación. Se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente durante la noche. Se extinguió la reacción mediante la adición de metanol. Se concentró la mezcla de reacción a vacío y al residuo se le añadió diclorometano (50 ml). Se lavó la fase orgánica con bicarbonato de sodio acuoso 1 M. Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró. Se retiró la piridina residual evaporando con tolueno. Se purificó el producto en bruto mediante cromatografía en columna (MeOH 2% /cloroformo, Rf = 0,5 en MeOH al 5%/CHCl3) (1,75 g, 95%).
Éster mono-(4-[bis-(4-metoxi-fenil)-fenil-metoximetil]-1-{6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}-pirrolidin-3-il)éster del ácido succínico AH
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Se mezcló el compuesto AG (1,0 g, 1,05 mmol) con anhídrido succínico (0,150 g, 1,5 mmol) y DMAP (0,073 g, 0,6 mmol) y se secó en un vacío a 40°C durante la noche. Se disolvió la mezcla en dicloroetano anhidro (3 ml), se añadió trietilamina (0,318 g, 0,440 ml, 3,15 mmol) y se agitó la disolución a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón durante 16 h. Luego se diluyó con diclorometano (40 ml) y se lavó con ácido cítrico acuoso helado (5% en peso, 30 ml) y agua (2 x 20 ml). Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró hasta sequedad. Se usó el residuo como tal para la siguiente etapa.
CPG derivatizado con colesterol AI
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Se disolvió succinato AH (0,254 g, 0,242 mmol) en una mezcla de diclorometano/acetonitrilo (3:2, 3 ml). A esa disolución, se le añadieron sucesivamente DMAP (0,0296 g, 0,242 mmol) en acetonitrilo (1,25 ml), 2,2’-ditio-bis(5-nitropiridina) (0,075 g, 0,242 mmol) en acetonitrilo/dicloroetano (3:1, 1,25 ml). A la disolución resultante se añadió trifenilfosfina (0,064 g, 0,242 mmol) en acetonitrilo (0,6 ml). La mezcla de reacción se volvió de color naranja brillante. Se agitó la disolución brevemente usando un agitador Wrist Action (5 min). Se añadió alquilamina de cadena larga-CPG (LCAA-CPG) (1,5 g, 61 mM). Se agitó la suspensión durante 2 h. Se filtró CPG a través de un embudo sinterizado y se lavó con acetonitrilo, diclorometano y éter sucesivamente. Se enmascararon grupos amino sin reaccionar usando anhídrido acético/piridina. Se midió la carga lograda del CPG tomando una medición de UV (37 mM/g).
Se realizó la síntesis de ARNip que portan un grupo bisdecilamida de ácido 5’-12-dodecanoico (denominado en el presente documento “5’-C32-”) o un grupo derivado de 5’-colesterilo (denominado en el presente documento “5’-Chol-”) tal como se describe en el documento WO 2004/065601, excepto que, para el derivado de colesterilo, se realizó la etapa de oxidación usando el reactivo Beaucage con el fin de introducir un enlace fosforotioato en el extremo 5’ del oligómero de ácido nucleico.
Se representan a continuación secuencias de ácido nucleico usando nomenclatura convencional y específicamente las abreviaturas de la tabla 1.
Tabla 1:abreviaturas
Abreviaturas de monómeros de nucleótido usados en la representación de la secuencia de ácido nucleico. Se entenderá que estos monómeros, cuando están presentes en un oligonucleótido, están mutuamente ligados por enlaces 5’-3’-fosfodiéster.
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ARNip conjugados
Se muestra la preparación de ARNip conjugados con un ligando tal como colesterol y vitamina E en los esquemas 1 y 2.
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Esquema 2. Síntesis de conjugados de ARNip-lipófilos. A, B: en la columna y C: conjugaciones tras la síntesis. (I) a. síntesis de fase sólida; b. desprotección y c. purificación por HPLC; (ii) hibridación con hebra complementaria; (iii) a. Conjugación tras la síntesis con el ligando y b. hibridación con hebra complementaria. X = O o S.
Ejemplo 2A. Diseño de ARNip de TTR
Transcripciones
Se llevó a cabo el diseño de ARNip para identificar ARNip que seleccionan como diana el gen transtiretina de humanos (símbolo TTR) y rata (símbolo Ttr). El diseño usó los transcritos de TTR NM_000371.2 (SEQ ID NO:1329) (humana) y NM_012681.1 (SeQ ID NO:1330) (rata) de la colección Refseq del NCBI. Se diseñaron los dúplex de ARNip con una identidad del 100% con respecto a sus genes TTR.
Diseño de ARNip y predicción de especificidad
La especificidad predicha de todos los posibles nonadecámeros se determinó para cada secuencia. Se usaron los ARNip de TTR en una búsqueda completa contra los transcriptomas humanos y de rata (definidos como el conjunto de registros NM_ y XM_ dentro del conjunto Refseq del NCBI) usando el algoritmo FASTA. El texto Python ‘offtargetFasta.py' se usó luego para analizar las alineaciones y generar una puntuación basándose en la posición y número de apareamientos erróneos entre el ARNip y cualquier transcrito potencial “fuera de la diana”. La puntuación fuera de la diana se pondera para enfatizar las diferencias entre la región “semilla” de los ARNip, en las posiciones 2-9 desde el extremo 5' de la molécula. Se calcula la puntuación fuera de la diana tal como sigue: apareamientos erróneos entre el oligonucleótido y el transcrito se dan como penalidades. A un apareamiento erróneo en la región semilla en las posiciones 2-9 del oligonucleótido se la da una penalidad de 2,8; a los apareamientos erróneos en los sitios de escisión supuestos 10 y 11 se les da una penalidad de 1,2 y a los apareamientos erróneos en las posiciones 12-19 una penalidad de 1. Los apareamientos erróneos en la posición 1 no se consideran. La puntuación fuera de la diana del par oligonucleótido-transcrito se calcula luego sumando las penalidades de apareamiento erróneo. La puntuación más baja fuera de la diana de todos los pares oligonucleótido-transcrito se determina luego y se usa en una clasificación posterior de los oligonucleótidos. A ambas hebras de ARNip se les asignó la categoría de especificidad según las puntuaciones calculadas: una puntuación superior a 3 se califica como muy específica, igual a 3 como específica y entre 2,2 y 2,8 como moderadamente específica. Al escoger qué oligonucleótidos sintetizar, se clasificaron las puntuaciones fuera de la diana de la hebra antisentido desde alta hasta baja y se seleccionaron los 144 mejores pares de oligonucleótido (puntuación más baja fuera de la diana) de ser humano y los 26 mejores pares de rata.
Selección de secuencia de ARNip
Se sintetizaron un total de 140 oligonucleótidos de ARNip derivados de TTR humana sentido y 140 antisentido y se formaron para dar dúplex. Se sintetizaron un total de 26 oligonucleótidos de ARNip derivados de TTR de rata sentido y 26 antisentido y se formaron para dar dúplex. Los dúplex se presentan en las tablas 2-4 (TTR humana) y las tablas 5-7 (TTR de rata).
Tabla 2. Números de identificación para ARNbc de TTR humana
Véase la tabla 4 para secuencias y modificaciones de oligonucleótidos.
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Tabla 3A. Secuencias de hebra sentido y antisentido de ARNbc de TTR humana
Hebra: s= sentido; as= antisentido; Posición: posición de la base 5' en el transcrito (NM_000371.2, SEQ ID NO:1329)
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Tabla 3B. Secuencias de hebra sentido y antisentido de ARNbc de TTR humana
Hebra: s= sentido; as= antisentido; Posición: posición de la base 5' en el transcrito (NM_000371.2, SEQ ID NO:1329)
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Tabla 4. Secuencias de hebra sentido y antisentido químicamente modificadas de ARNbc de TTR humana Véase la tabla 2 para el n.° de dúplex. Hebra: s= sentido; as= antisentido; Posición: posición de la base 5' en el transcrito (NM_000371.2, SEQ ID NO:1329)
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Tabla 5: Números de identificación para ARNbc de TTR de rata
Véase la tabla 7 para las secuencias.
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Tabla 6A. Secuencias de hebra sentido y antisentido para ARNbc de TTR de rata
Hebra: s= sentido; as= antisentido; Posición: posición de la base 5' en el transcrito (NM_012681.1, SEQ ID NO:1330)
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Tabla 6B. Secuencias de hebra sentido y antisentido para ARNbc de TTR de rata
Hebra: s= sentido; as= antisentido; Posición: posición de la base 5' en el transcrito (NM_012681.1, SEQ ID NO:1330)
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Tabla 7. Secuencias de hebra sentido y antisentido químicamente modificadas para ARNbc de TTR de rata Véase la tabla 5 para el n.° de dúplex (nombre de ARNbc). Hebra: s= sentido; as= antisentido; Posición: posición de la base 5' en el transcrito (NM_012681.1, SEQ ID NO:1330)
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Síntesis de secuencias de TTR
Las secuencias de TTR se sintetizaron en un sintetizador MerMade 192 a una escala de 1 |imol. Para todas las secuencias de la lista, se aplicó la química “endolight” tal como se detalla a continuación.
• Todas las pirimidinas (citosina y uridina) en la hebra sentido se reemplazaron con las correspondientes bases 2'-O-Metil (2' O-Metil C y 2'-O-Metil U)
• En la hebra antisentido, las pirimidinas adyacentes (hacia la posición 5') ribo A nucleósido se reemplazaron con sus correspondientes 2-O-Metil nucleósidos
• Se introdujo una extensión de dTdT de dos bases en el extremo 3' de las secuencias sentido y antisentido
• El archivo de secuencia se convirtió en un archivo de texto para que sea compatible con la carga en el software de síntesis MerMade 192
La síntesis de secuencias de TTR usó síntesis de oligonucleótidos con soporte sólido que usa química de fosforamidita. La síntesis de las secuencias anteriores se realizó a escala de 1 um en placas de 96 pocillos. Las disoluciones de amidita se prepararon a una concentración de 0,1 M y se usó etiltiotetrazol (0,6 M en acetonitrilo) como activador.
Las secuencias sintetizadas se escindieron y desprotegieron en placas de 96 pocillos, usando metilamina en la primera etapa y trietilamina.3HF en la segunda etapa. Las secuencias en bruto así obtenidas se precipitaron usando una mezcla de acetona: etanol y se resuspendió el sedimento en tampón acetato de sodio 0,5 M. Las muestras de cada secuencia se analizaron mediante CL-EM y los datos de masa resultantes confirmaron la identidad de las secuencias. También se analizó un conjunto seleccionado de muestras mediante cromatografía IEX.
La siguiente etapa del procedimiento fue la purificación. Todas las secuencias se purificaron en un sistema de purificación explorador AKTA usando una columna Source 15Q. Se recogió en el eluyente un solo pico correspondiente a la secuencia de longitud completa y posteriormente se analizó su pureza mediante cromatografía de intercambio iónico.
Las secuencias purificadas se desalaron en una columna Sephadex G25 usando un purificador AKTA. Las secuencias de TTR desaladas se analizaron en cuanto a concentración y pureza. A continuación, las hebras simples se hibridaron para formar TTR-ARNbc.
Ejemplo 2B: cribado in vitro de ARNip de TTR para la supresión de ARNm
Se sometieron a ensayo ARNbc que seleccionan como diana TTR humana para determinar la inhibición de la expresión de TTR endógena en células HepG2 y Hep3B, usando ensayos de qPCR (PCR en tiempo real) y ADNr (ADN ramificado) para cuantificar el ARNm de TTR. Se sintetizaron y sometieron a ensayo los ARNbc que seleccionan como diana TTR de roedores (tabla 5) para determinar la inhibición de la expresión de TTR endógena usando ensayos de ADNr en células H.4.II.E. Los resultados de los ensayos de dosis única se usaron para seleccionar un subconjunto de dúplex de ARNbc de TTR para experimentos de respuesta a dosis para calcular CI50. Los resultados de CI50 se usaron para seleccionar ARNbc de TTR para pruebas adicionales.
Cultivo celular y transfecciones:
Se cultivaron las líneas celulares de hepatocitos HepG2, Hep3B y células H.4.II.E (ATCC, Manassas, VA) hasta casi la confluencia a 37°C en una atmósfera del 5% de CO2 en medio de Eagle modificado con Dulbecco (ATCC) suplementado con FBS al 10%, estreptomicina y glutamina (ATCC) antes de liberarse de la placa por tripsinización. Se cultivaron las células H.4.II.E también en el medio esencial mínimo de Earle. La transfección inversa se llevó a cabo añadiendo 5 |il de Opti-MEM a 5 |il de dúplex de ARNip por pocillo en una placa de 96 pocillos junto con 10 |il de Opti-MEM más 0,2 |il de Lipofectamine RNAiMax por pocillo (Invitrogen, Carlsbad CA. n.° de cat. 13778-150) y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego se añadieron 80 |il de medio de cultivo completo sin antibióticos que contenía 4x104 (HepG2), 2 x 104 (Hep3B) o 2x104 células (H.4.II.E). Se incubaron las células durante 24 horas antes de la purificación del ARN. Los experimentos de dosis única se realizaron a una concentración dúplex final de 10 nM y los experimentos de respuesta a la dosis se realizaron con 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, 0,00001 nM.
Aislamiento de ARN total usando el kit de aislamiento de ARN total MagMAX-96 (Applied Biosystems, Foster City CA, n.° de pieza: AM1830):
Se recogieron las células y se lisaron en 140 |il de disolución de lisis/unión y luego se mezclaron durante 1 minuto a 850 rpm usando un instrumento Eppendorf Thermomixer (la velocidad de mezclado fue la misma durante todo el procedimiento). Se añadieron veinte microlitros de perlas magnéticas al lisado celular y se mezclaron durante 5 minutos. Se capturaron las perlas magnéticas usando un soporte magnético y se retiró el sobrenadante sin alterar las perlas. Después de retirar el sobrenadante, se lavaron las perlas magnéticas con la disolución de lavado 1 (se añadió isopropanol) y se mezclaron durante 1 minuto. Se capturaron de nuevo las perlas y se retiró el sobrenadante. A continuación, se lavaron las perlas con 150 |il de disolución de lavado 2 (se añadió etanol), se capturaron y se retiró el sobrenadante. Luego se añadieron a las perlas 50 |il de mezcla de ADNasa (tampón de ADNasa MagMax turbo y ADNasa Turbo) y se mezclaron durante de 10 a 15 minutos. Después de mezclar, se añadieron 100 |il de disolución de unión de ARN y se mezclaron durante 3 minutos. Se retiró el sobrenadante y se lavaron las perlas magnéticas de nuevo con 150 |il de disolución de lavado 2 y se mezclaron durante 1 minuto y se retiró completamente el sobrenadante. Se mezclaron las perlas magnéticas durante 2 minutos para secar antes de que el ARN se eluyera con 50 |il de agua.
Síntesis de ADNc usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad ABI (Applied Biosvstems. Foster City, CA, n.° de cat. 4368813):
Se añadió una mezcla maestra de 2 |il de tampón 10X, 0.8 |il de dNTP 25X. 2 |il de cebadores aleatorios. 1 |il de transcriptasa inversa. 1 |il de inhibidor de ARNasa y 3.2 |il de H2O por reacción a 10 |il de ARN total. Se generó ADNc usando un termociclador Bio-Rad C-1000 o S-1000 (Hercules. CA) a través de las siguientes etapas: 25°C 10 min. 37°C 120 min. 85°C 5 s. mantener a 4°C.
PCR en tiempo real:
Se añadió 2 |il de ADNc a una mezcla maestra de 1 |il de sonda TaqMan 18S (Applied Biosystems n.° de cat.
4319413E). 1 |il de sonda TTR TaqMan (Applied Biosystems n.° de cat. HS00174914 M1) y 10 |il de mezcla maestra para PCR TaqMan Universal (Applied Biosystems n.° de cat. 4324018) por pocillo en una placa MicroAmp Optical de 96 pocillos (Applied Biosystems n.° de cat. 4326659). Se realizó PCR en tiempo real en un sistema de PCR en tiempo real ABI 7000 Prism o ABI 7900HT (Applied Biosystems) usando el ensayo AA Ct (RQ). Todas las reacciones se realizaron por triplicado.
Se analizaron los datos en tiempo real usando el método AA Ct y se normalizaron con los ensayos realizados a partir de células transfectadas con oligómero fluorescente BlockIT 10 nM (Invitrogen n.° de cat. 2013) o AD-1955 10 nM (un dúplex de control que selecciona como diana gen de la luciferasa no de mamíferos) para calcular el cambio en veces.
Ensayos de ADN ramificado - QuantiGene 1.0 (Panomics. Fremont. CA. n.° de cat.: QG0004) - se usa para cribar dúplex específicos de roedores
Se transfectaron células H.4.II.E (ATCC) con ARNip 10 nM. Después de retirar el medio. se lisaron H.4.II.E en 100 ul de mezcla de lisis diluida (una mezcla de 1 volumen de mezcla de lisis. 2 volúmenes de agua libre de nucleasas y 10 ul de proteinasa K por ml para la concentración final de 20 mg/ml) y luego se incubó a 65°C durante 35 minutos. Luego. se añadieron 80 |il de conjunto de sonda de trabajo (una mezcla de sonda TTR o GAPDH) y 20 |il de lisado celular en la placa de captura. Se incubaron las placas de captura a 53°C ± 1°C durante la noche (aproximadamente 16-20 horas). Se lavaron las placas de captura 3 veces con tampón de lavado 1X (una mezcla de agua libre de nucleasas. componente de tampón 1 y componente de tampón de lavado 2). luego se secaron por centrifugación durante 1 minuto a 1000 rpm. Se añadieron 100 |il de reactivo de trabajo del amplificador a la placa de captura. que luego se selló y se incubó durante 1 hora a 46°C ± 1°C. Se repitieron las etapas de lavado y secado después de 1 hora de incubación y se añadieron 100 |il de reactivo de disolución de marcador. Después. se lavó la placa. se secó y se añadieron 100 |il de sustrato (una mezcla de laurilsulfato de litio y disolución de sustrato). Se colocaron las placas de captura en la incubadora durante 30 minutos a 46°C ± 1°C. Luego se retiraron las placas de captura de la incubadora y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Finalmente. se leyeron las placas de captura usando el luminómetro Victor (Perkin Elmer. Waltham. MA).
Ensayos de ADN ramificado - QuantiGene 2.0 (Panomics n.° de cat.: QS0011): se usa para cribar todos los demás dúplex
Después de una incubación de 24 horas a la dosis o dosis indicadas. se retiró el medio y se lisaron las células en 100 ul de mezcla de lisis (1 volumen de mezcla de lisis. 2 volúmenes de agua libre de nucleasas y 10 |il de proteinasa K/ml para una concentración final de 20 mg/ml). ml) luego se incubaron a 65°C durante 35 minutos. Luego se añadieron a las placas de captura 20 |il de conjunto de sondas de trabajo (sonda de TTR para el gen diana y GAPDH para el control endógeno) y 80 |il de lisado celular. Se incubaron las placas de captura a 55°C ± 1°C (aproximadamente 16-20 horas). Al día siguiente. se lavaron las placas de captura 3 veces con tampón de lavado 1X (agua libre de nucleasas. componente de tampón 1 y componente de tampón de lavado 2). luego se secaron mediante centrifugación durante 1 minuto a 240 g. Se añadieron 100 |il de reactivo de trabajo preamplificador a las placas de captura. que se sellaron con papel de aluminio y se incubaron durante 1 hora a 55°C ± 1°C. Después de una incubación de 1 hora. se repitió la etapa de lavado. luego se añadieron 100 |il de reactivo de trabajo amplificador. Después de 1 hora. se repitieron las etapas de lavado y secado. y se añadieron 100 |il de sonda de marcador. Se incubaron las placas de captura a 50°C ± 1°C durante 1 hora. Luego se lavaron las placas con tampón de lavado 1X y se secaron. y luego se añadieron 100 |il de sustrato a las placas de captura. Se leyeron las placas de captura usando el luminómetro SpectraMax (Molecular Devices. Sunnyvale. CA) después de una incubación de 5 a 15 minutos.
Análisis de datos de ADNr:
Se analizaron los datos de ADNr (i) restando el fondo promedio de cada muestra por triplicado. (ii) promediando los valores de GAPDH (sonda de control) y TTR (sonda experimental) triplicados resultantes. y luego (iii) tomando la razón: (sonda experimental-fondo)/(sonda de control-fondo).
Resultados
A continuación, en la tabla 8, se presenta un resumen de la dosis única y los resultados de CI50 para TTR-ARNbc (ARNip de TTR). Los resultados de dosis única se expresan como % de ARNm de TTR con respecto al control, sometido a ensayo en células HepG2. Se determinaron las CI50 en células HepG2 y/o Hep3B, tal como se indica. Tabla 8. Resultados de dosis única y CI50 de cribados in vitro de ARNip de TTR
ND: sin datos; * indica un resultado que representa el promedio de dos experimentos.
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Los datos de respuesta a la dosis usados para identificar la CI50 para 5 TTR-ARNbc (AD-18258, AD-18274, AD-18324, AD-18328 y AD-18339), se presentan con detalle a continuación en la tabla 9. Se determinó que todos los 5 ARNip tenían CI50 en pM. Los datos de CI50 para los ARNbc en la tabla 8 es un resumen de los datos presentados en la tabla 9 a continuación.
Tabla 9. Datos de respuesta a la dosis para 5 TTR-ARNbc
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Se presenta a continuación un resumen de los resultados de dosis única para los TTR-ARNbc específicos de roedores (ARNip de TTR) en la tabla 10. Los resultados de dosis única se expresan como % de ARNm de TTR en relación con el control, se sometió a ensayo en células H.4.II.E de rata, después de la transfección de ARNip de TTR específicos de roedor a 10 nM. Estos resultados muestran que algunos ARNip de TTR específicos de roedor son eficaces en la supresión de ARNm de TTR de rata endógena in vitro.
Tabla 10. Resultados de dosis única de cribado in vitro de TTR-ARNbc específicos de roedores (ARNip de TTR)
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Ejemplo 3. Ensayo in vitro de ARNip de TTR para inducción de secreción de TNF-a e IFN-a
Para evaluar el potencial de inmunoestimulación, se sometieron a ensayo los ARNip de TTR in vitro para la inducción de secreción de TNF-a e IFN-a.
Se aislaron PBMC humanas de capas leucocitarias recién recogidas obtenidas de donantes sanos (Research Blood Components, Inc., Boston, MA) mediante una centrifugación de densidad Ficoll-Hypaque convencional. Se sembraron células recién aisladas (1x105/pocillo/100 |il) en placas de 96 pocillos y se cultivaron en medio RPMI 1640 GlutaMax (Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% y antibiótico/antimicótico al 1% (Invitrogen).
Se transfectaron los ARNip en PBMC usando reactivo de transfección DOTAP (Roche Applied Science). Se diluyó en primer lugar el DOTAP en Opti-MEM (Invitrogen) durante 5 minutos antes de mezclarlo con un volumen igual de Opti-MEM que contenía el ARNip. Se incubaron los complejos de ARNip/DOTAP según lo especificado por las instrucciones del fabricante y posteriormente se añadieron a PBMC (50 |il/pocillo) que luego se cultivaron durante 24 horas. Se incluyeron ARNip de control positivo y negativo en todos los ensayos. Se usó AD-5048 como un ARNip de control positivo. AD-5048 corresponde a una secuencia que selecciona como diana la apolipoproteína B humana (Soutschek et al., 2004) y provoca la secreción de IFN-a y TNF-a en este ensayo. AD-1955, que no provoca la secreción de IFN-a y TNF-a en este ensayo, se usó como un ARNip de control negativo. Se usaron todos los ARNip a una concentración final de 133 nM. La razón de ARN con respecto a reactivo de transfección fue de 16,5 pmoles por |ig de DOTAP.
Se detectaron citocinas y se cuantificaron en sobrenadantes de cultivo con un kit ELISA disponible comercialmente para IFN-a (BMS216INST) y TNF-a (BMS223INST), ambos de Bender MedSystems (Viena, Austria). La inducción de citocinas de ARNip de TTR se expresa como porcentaje de IFN-a o TNF-a producido con respecto al ARNip de control positivo AD-5048.
Los resultados de la estimulación con IFN-a y TNF-a para varios ARNip de TTR se presentan en la figura 1 (media de pocillos cuadriplicados ± DE) y a continuación en la tabla 11 (porcentaje en comparación con AD-5048). Ninguno de los ARNip de TTR evaluados indujo secreción significativa de TNF-a o IFN-a por PBMC humanas cultivadas.
Tabla 11. Resultados de estimulación de IFN-a y TNF-a para ARNip de TTR
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Se seleccionaron los cinco principales ARNbc que seleccionan como diana TTR (ARNip de TTR) basándose en las CI50 en el intervalo pM en las líneas celulares de hepatocitos humanos HepG2 y Hep3B, y la ausencia de actividad inmunoestimuladora. Es más probable que los dúplex sin apareamientos erróneos logren un silenciamiento significativo del transcrito diana que los dúplex con apareamientos erróneos entre el oligómero y el ARNm. Para permitir una mejor interpretación de los datos de toxicología de especies cruzadas y tener la aplicabilidad más amplia a pacientes humanos, generalmente se prefieren los dúplex que tienen una identidad del 100% en genes ortólogos de rata, macaco cangrejero y ser humano, y que no seleccionan como diana regiones con polimorfismos conocidos. Los cinco compuestos principales se seleccionaron basándose en la CI50 en líneas celulares de hepatocitos en el intervalo pM, la ausencia de actividad inmunoestimuladora, la especificidad para los transcritos de TTR humanas y la ausencia de polimorfismos (mutaciones) conocidos en la región del ARNm seleccionado como diana por el dúplex. En el caso de TTR, no se encontraron oligómeros de 19 bases con identidad completa en seres humanos, ratas y macacos cangrejeros. En la tabla 12 se presenta un resumen de estos datos, que también incluye información sobre mutaciones de TTR conocidas en la región seleccionada como diana por la reactividad del dúplex y especies cruzadas.
Tabla 12. Resumen de los datos para los cinco ARNbc de TTR más potentes.
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Ejemplo 4. Reducción in vivo de ARNm de TTR en hígado y proteína TTR plasmática mediante LNP01-18324, LNP01-18328 y LNP01-18246 en ratones transgénicos
Se eligieron dos ARNip de TTR, AD-18324 y AD-18328, para la evaluación in vivo. Estos dúplex exhibieron un potente silenciamiento dependiente de la dosis in vitro en líneas celulares de hepatocitos (por ejemplo, HepG2). La figura 2A y la figura 2B muestran las respuestas a la dosis en células HepG2 después de la transfección con AD-18324 (figura 2A) o AD-18328 (figura 2B) donde las dosis se expresan en nM en el eje x y las respuestas se expresan como fracción de ARNm de TTR restante en relación con el control, en el eje y. En las células HepG2, se determinó que las CI50 de AD-18324 y AD-18328 eran de 2 pM y 3 pM, respectivamente. Los sitios diana de TTR para ambos candidatos de ARNbc principales están en la región no traducida 3' del ARNm de TTR, en una región en la que no hay mutaciones notificadas en la bibliografía.
Las secuencias de cada hebra de los dos candidatos principales se reproducen a continuación de las tablas. Hebra: s = sentido; as = antisentido; Posición: posición de la base 5' en el transcrito NM_000371.2.
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Además, se eligió un ARNbc de TTR con reactividad cruzada de roedores, AD-18246, para una evaluación adicional in vivo. AD-18246 selecciona como diana una secuencia que comienza en la posición 88 del marco de lectura abierto, donde hay tres mutaciones notificadas en la bibliografía. En la figura 3 se muestra una curva de respuesta a la dosis para AD-18246 en células HepG2. AD-18246 es sustancialmente menos potente que AD-18324 y AD-18328; se determinó que la CI50 de AD-18246 era de 265 pM.
Se administraron AD-18324, AD-18328 y AD-18246 a ratones transgénicos después de la formulación en LNP01. A ratones transgénicos H129-mTTR-KO/iNOS-KO/hTTR de 3-5 meses de edad (inactivación de transtiretina de ratón/inactivación de óxido nítrico sintasa inducible/transtiretina humana transgénica) se les administró por vía intravenosa (i.v.) 200 |il de ARNip específico de transtiretina formulada con LNP01 (AD-18324, AD-18328 o AD-18246), ARNip de control formulado con LNP01 que selecciona como diana el gen de luciferasa no de mamífero (AD-1955) o PBS a través de la vena de la cola a concentraciones de 1,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, o 6,0 mg/kg para los ARNip AD-18324 y AD-18328, 3,0 mg/kg para ARNip AD-18246 y 6,0 mg/kg para ARNip AD-1955. LNP01 es una formulación lipidoide compuesta por ND98, colesterol y PEG-ceramida C16.
Después de aproximadamente cuarenta horas, se anestesiaron los ratones con 200 |il de ketamina y luego se desangraron cortando la arteria caudal derecha. Se aisló la sangre completa y se aisló el plasma y se almacenó a -80°C hasta el momento del ensayo. Se recogió tejido hepático, se ultracongeló y se almacenó a -80°C hasta su procesamiento.
La eficacia del tratamiento se evaluó mediante (i) la medición del ARNm de TTR en hígado a las 48 horas posteriores a la dosis, y (ii) la medición de la proteína TTR en el plasma antes de la hemorragia y a las 48 horas posteriores a la dosis. Los niveles de ARNm de hígado de TTR se sometieron a ensayo utilizando los ensayos de ADN ramificado-QuantiGene 2.0 (Panomics n.° de cat.: QS0011). Brevemente, se trituraron muestras de hígado de ratón y se prepararon lisados de tejido. Se incubó la mezcla de lisis en hígado (una mezcla de 1 volumen de mezcla de lisis, 2 volúmenes de agua libre de nucleasas y 10 ul de proteinasa K/ml para una concentración final de 20 mg/ml) a 65°C durante 35 minutos. A continuación, se añadieron 20 |il de conjunto de sonda de trabajo (sonda de TTR para el gen diana y GAPDH para el control endógeno) y 80 ul de lisado de tejido en la placa de captura. Se incubaron las placas de captura a 55°C ± 1°C (aproximadamente 16-20 horas). Al día siguiente, se lavaron las placas de captura 3 veces con tampón de lavado 1X (agua libre de nucleasas, componente de tampón 1 y componente de tampón de lavado 2), luego se secaron mediante centrifugación durante 1 minuto a 240 g. Se añadieron 100 ul de reactivo de trabajo preamplificador a la placa de captura, que se selló con papel de aluminio y se incubó durante 1 hora a 55°C ± 1°C. Tras 1 hora de incubación, se repitió la etapa de lavado, luego se añadieron 100 |il de Reactivo de trabajo amplificador. Después de 1 hora, se repitieron las etapas de lavado y secado, y se añadieron 100 |il de sonda de marcador. Se incubaron las placas de captura a 50°C ± 1°C durante 1 hora. Después, la placa se lavó con tampón de lavado 1X, se secó y se añadieron 100 |il de sustrato a la placa de captura. Las placas de captura se leyeron usando el luminómetro SpectraMax después de una incubación de 5 a 15 minutos. Se analizaron los datos de ADNr restando el fondo promedio de cada muestra por triplicado, promediando los valores de GAPDH (sonda de control) y TTR (sonda experimental) triplicados resultantes, y luego calculando la razón: (sonda experimental-fondo)/(sonda de control-fondo).
Los niveles plasmáticos de TTR se sometieron a ensayo utilizando el kit disponible comercialmente “kit para ELISA de prealbúmina humana AssayMax” (AssayPro, St. Charles, MO, n.° de catálogo EP3010-1) según las directrices del fabricante. Brevemente, el plasma de ratón se diluyó 1:10.000 en diluyentes de mezcla 1X y se añadió a placas recubiertas previamente con los patrones del kit, y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente seguido de lavados 5X con tampón de lavado del kit. Se añadieron cincuenta microlitros de anticuerpo de prealbúmina biotinilado a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de lavados 5X con tampón de lavado. Se añadieron cincuenta microlitros de conjugado de estreptavidina-peroxidasa a cada pocillo y las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente seguido de lavado tal como se describió previamente. La reacción se desarrolló mediante la adición de 50 |il/pocillo de sustrato cromógeno e incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente con parada de la reacción mediante la adición de 50 |il/pocillo de disolución de parada. Se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas Versamax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y los datos se analizaron utilizando el paquete de software Softmax 4.6 (Molecular Devices).
Se descubrió que LNP01-18324 y LNP01-18328 reducen los niveles de ARNm de TTR en hígado (figura 4A) y de proteína TTR plasmática (figura 4b ) de una manera dependiente de la dosis con la administración de bolo i.v. Se determinó que la DE50 de ARNm de LNP01-18328 era ~1 mg/kg, mientras que se determinó que la DE50 de LNP01-18324 era ~2 mg/kg. Los efectos de LNP01-18324 y LNP01-18328 fueron específicos, porque el control, LNP01-1955 a 6 mg/kg, no afectó significativamente los niveles de ARNm de TTR en hígado, en comparación con el grupo de PBS. LNP01-18324 y LNP01-18328 redujeron los niveles de proteína TTR en plasma en relación con el grupo PBS, con potencias similares a las de los niveles de ARNm de TTR. A 3 mg/kg, LNP01-18246 redujo los niveles de ARNm de TTR en hígado en un grado menor que 3 mg/kg de LNP01-18324 o LNP01-18328.
Estos resultados demuestran que LNP01-18324 y LNP01-18328, administrados por bolo i.v., reducen sustancialmente el ARNm de TTR humana expresado por el hígado de ratón transgénico, lo que da como resultado una reducción de la proteína TTR humana en la circulación.
Ejemplo 5. Reducción in vivo del ARNm de TTR silvestre en el hígado de primates no humanos por SNALP-18324 y SNALP-18328
Para evaluar la eficacia de los ARNip de TTR AD-18324 y AD-18328 en primates no humanos sobre los niveles de ARNm de TTR en hígado, los ARNip se formularon en SNALP y se administraron mediante infusión i.v. de 15 minutos. A macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) (de 2 a 5 kg, 3 animales por grupo) se les administraron infusiones i.v. de 15 minutos de SNALP-18324 (0,3, 1,0 ó 3,0 mg/kg), SNALP-18328 (0,3, 1 ó 3 mg/kg), o SNALP-1955 (3 mg/kg, con ARNip de control negativo AD-1955 que selecciona como diana el gen de la luciferasa no de mamíferos). A las cuarenta y ocho horas posteriores a la dosificación, los monos se anestesiaron con pentobarbital de sodio y se desangraron. Se recogió tejido hepático para la determinación de ARNm de TTR, se ultracongeló y se almacenó a -80°C hasta su procesamiento.
Los niveles de ARNm de TTR en hígado se sometieron a ensayo utilizando un ensayo de ADN ramificado diseñado a medida, que utiliza la tecnología QuantiGene1.0. Brevemente, se trituraron muestras de hígado de mono y se prepararon lisados de tejido. Se incubó la mezcla de lisis en hígado (1 volumen de mezcla de lisis, 2 volúmenes de agua libre de nucleasas y 10 |il de proteinasa K/ml para una concentración final de 20 mg/ml) a 65°C durante 35 minutos. A continuación, se añadieron a la placa de captura 20 |il de conjunto de sonda de trabajo (sonda de TTR para el gen diana y GAPDH para el control endógeno) y 80 |il de lisado de tejido. Se incubaron las placas de captura a 55°C ± 1°C (aproximadamente 16-20 horas). Al día siguiente, se lavaron las placas de captura tres veces con tampón de lavado 1X (agua libre de nucleasas, componente de tampón 1 y componente de tampón de lavado 2), luego se secaron mediante centrifugación durante 1 minuto a 240 g. Se añadieron 100 |il de reactivo de trabajo preamplificador a la placa de captura, que se selló con papel de aluminio y se incubó durante 1 hora a 55°C ± 1°C. Después de una incubación de 1 hora, se repitió la etapa de lavado y luego se añadieron 100 |il de reactivo de trabajo amplificador. Después de 1 hora, se repitieron las etapas de lavado y secado, y se añadieron 100 |il de sonda de marcador. Se incubaron las placas de captura a 50°C ± 1°C durante 1 hora. A continuación, se lavaron las placas con tampón de lavado 1X y se secaron, y luego se añadieron 100 |il de sustrato a la placa de captura. Las placas de captura se leyeron usando el luminómetro SpectraMax después de una incubación de 5 a 15 minutos. se analizaron los datos de ADNr (i) restando el fondo promedio de cada muestra por triplicado, (ii) promediando los valores de GAPDH (sonda de control) y TTR (sonda experimental) resultantes, y luego (iii) tomando la razón: (sonda experimental-fondo)/(sonda de control-fondo).
Los resultados se muestran en la figura 5. SNALP-18324 y SNALP-18328 redujeron los niveles de ARNm de TTR en hígado de una manera dependiente de la dosis, en comparación con el control negativo SNALP-1955. Se determinó que las DE50 de ARNm de SNALP-18328 y SNALP-18324 eran ~0,3 y ~ 1 mg/kg, respectivamente.
Estos resultados demuestran que SNALP-18324 y SNALP-18328 son eficaces para suprimir el ARNm de TTR silvestre en hígado de primates no humanos cuando se administran mediante infusión i.v.
Ejemplo 6. Reducción in vivo de ARNm y proteína de TTR mutante (V30M) por SNALP-18328 en el ratón transgénico
Para evaluar la eficacia del ARNip de TTR AD-18328 sobre el ARNm de TTR mutante (V30M) en el hígado y la proteína TTR mutante (V30M) en el suero, se formuló AD-18328 en SNALP y se administró por bolo i.v. a ratones transgénicos hTTR V30M. Se administraron por vía intravenosa (i.v.) a ratones transgénicos hTTR V30M de 8 a 12 semanas de edad (5 animales/grupo) 200 |il de SNALP-18328 (0,03, 0,3 ó 3 mg/kg), SNALP-1955 (3 mg/kg, con control negativo ARNip AD-1955 que selecciona como diana el gen luciferasa no de mamíferos), o PBS. Los ratones usados fueron la cepa de Mus musculus H129-hTTR KO del Instituto de Biología Molecular y Celular, Oporto, Portugal. Brevemente, se cruzaron ratones transgénicos hTTR H129 con ratones TTR KO endógenos H129 (ratones nulos para generar los ratones transgénicos H129-hTTR, en un fondo de TTR de ratón nulo (Maeda, S., (2003), Use of Genetically altered mice to study the role of serum amyloid P component in amyloid deposition. Amyloid Suppl. 1, 17-20.).
A las 48 horas posteriores a la inyección, los animales de los cinco grupos de tratamiento recibieron una dosis letal de ketamina/xilazina. Las muestras de suero se recogieron y almacenaron a -80°C hasta el análisis. Se recogió tejido hepático, se ultracongeló y se almacenó a -80°C hasta su procesamiento.
Para la cuantificación del ARNm de TTR, se trituró tejido hepático congelado en polvo y se prepararon lisados. Los niveles de ARNm de TTR en relación con los de ARNm de GAPDH se determinaron en los lisados usando un ensayo de ADN ramificado (sistema de reactivo QuantiGene, Panomics, Fremont, CA). Brevemente, se usó el ensayo QuantiGene (Genospectra) para cuantificar los niveles de ARNm en lisados de muestras de tejido según las instrucciones del fabricante. El nivel medio de ARNm de TTR se normalizó con respecto al nivel medio de ARNm de GAPDH para cada muestra. Las medias de grupo de los valores normalizados se normalizaron luego adicionalmente con respecto al valor medio para el grupo tratado con PBS, para obtener el nivel relativo de expresión de ARNm de TTR.
Para la cuantificación de la proteína TTR, se sometió a ensayo el suero usando el kit para ELISA de prealbúmina Assaymax AssayPro (St. Charles, MO) según el protocolo del fabricante.
Los resultados se muestran en la figura 6A y la figura 6B para ARNm de hígado y proteína en suero, respectivamente. Los ratones transgénicos V30M hTTR tratados con SNALP-18328 tuvieron una disminución significativa y dependiente de la dosis en los niveles de ARNm de TTR en hígado en relación con el grupo de control de PBS, alcanzando una reducción máxima del 97% (p <0,001) a 3 mg/kg de SNALP-18328, y una reducción del 50% (DE50) a ~ 0,15 mg/kg de SNALP-18328. La proteína TTR en suero también se suprimió de manera dependiente de la dosis, con una reducción máxima de la proteína TTR en suero del 99% (p <0,01) (en relación con los niveles previos a la dosis) a 3 mg/kg de SNALP-18328, coherente con la reducción de los niveles de ARNm de TTR. SNALP-1955 a 3 mg/kg no tuvo un efecto estadísticamente significativo sobre los niveles de o bien ARNm de TTR o bien de proteínas, en comparación con PBS.
Estos resultados demuestran que SNALP-18328, cuando se administra i.v., es activo en la supresión del ARNm de TTR mutante V30M en el hígado de ratón transgénico, lo que da como resultado la reducción de la proteína TTR V30M mutante en la circulación.
Ejemplo 7. Durabilidad del ARNm de TTR y supresión de proteínas por SNALP-18328 en el ratón transgénico Para evaluar la durabilidad del ARNm de TTR y la supresión de proteínas por SNALP-18328, se formuló AD-18328 en SNALP y se administró mediante bolo i.v. a ratones transgénicos V30M hTTR. En diversos puntos de tiempo posteriores a la dosis, se cuantificaron los niveles de ARNm de TTR en hígado y los niveles de proteína TTR en suero. A ratones transgénicos V30M hTTR de 8 a 12 semanas de edad (4 animales/grupo) se les administraron por vía intravenosa (i.v.) 200 |il de SNALP-18328 (1 mg/kg) o SNALP-1955 (1 mg/kg, con ARNip de control negativo AD-1955 que selecciona como diana el gen luciferasa no de mamíferos). Los ratones usados fueron la cepa de Mus musculus H129-hTTR KO del Instituto de Biología Molecular y Celular, Oporto, Portugal. Brevemente, se cruzaron ratones transgénicos hTTR H129 con ratones TTR KO endógenos H129 (ratones nulos para generar los ratones transgénicos H129-hTTR, en un fondo TTR de ratón nulo (Maeda, S., (2003), Use of Genetically altered mice to study the role of serum amyloid P component in amyloid deposition. Amyloid Suppl. 1, 17-20). Los días 3, 8, 15 ó 22 posterior a la dosis, los animales de ambos grupos de tratamiento recibieron una dosis letal de ketamina/xilazina. Las muestras de suero se recogieron y almacenaron a -80°C hasta el análisis. Se recogió tejido hepático, se ultracongeló y se almacenó a -80°C hasta su procesamiento.
Para la cuantificación del ARNm de TTR, se trituró tejido hepático congelado en polvo y se prepararon lisados. Los niveles de ARNm de TTR en relación con los de ARNm de GAPDH se determinaron en los lisados usando un ensayo de ADN ramificado (sistema de reactivo QuantiGene, Panomics, Fremont, CA). Brevemente, se usó el ensayo QuantiGene (Genospectra) para cuantificar los niveles de ARNm en lisados de muestras de tejido según las instrucciones del fabricante. El nivel medio de ARNm de TTR se normalizó con respecto al nivel medio de ARNm de GAPDH para cada muestra. Las medias de grupo de los valores normalizados se normalizaron luego adicionalmente con respecto al valor medio para el grupo tratado con PBS, para obtener el nivel relativo de expresión de ARNm de TTR.
Para la cuantificación de la proteína TTR, se sometió a ensayo el suero usando el kit para ELISA de prealbúmina Assaymax AssayPro (St. Charles, MO) según el protocolo del fabricante.
Los resultados se muestran en la figura 7A y la figura 7B para ARNm de hígado y proteína en suero, respectivamente. Una única administración en bolo i.v. de SNALP-18328 en el ratón transgénico hTTR V30M dio como resultado una inhibición duradera de los niveles de ARNm de TTR en el hígado y los niveles de proteína TTR en el suero. En comparación con el grupo de control (1 mg/ml de SNALP-1955), una única administración intravenosa de SNALP-18328 a 1 mg/kg redujo significativamente los niveles relativos de ARNm de TTR en los días 3, 8, 15 y 22 posteriores a la dosis en un 96% (p <0,001), 90% (p <0,001), 82% (p <0,001) y 73% (p <0,001), respectivamente, y no regresaron a los niveles iniciales al finalizar el estudio (día 22 posterior a la dosis). Los niveles de proteína también disminuyeron con una reducción máxima de la TTR en suero del 97% (p <0,001) (en relación con SNALP-1955) en el día 3 posterior a la dosis. En los días 8, 15 y 22 posteriores a la dosis, los niveles de proteína TTR se suprimieron en un 72% (p <0,05), 32% (p <0,05) y 40% (p <0,001), respectivamente, en relación con SNALP-1955.
Estos resultados demuestran que una sola administración intravenosa. de SNALP-18328 produce una supresión duradera del ARNm en hígado diana y los niveles de proteína en suero en el ratón transgénico V30M hTTR, con reducciones significativas tanto del ARNm de TTR en hígado como de la proteína TTR en suero 22 días posterior a la dosis.
Ejemplo 8. Durabilidad de la supresión de la proteína TTR en suero y del ARNm en hígado por SNALP-18328 en el primate no humano
Para evaluar la durabilidad de la supresión de la proteína TTR en suero por SNALP-18328, se formuló AD-18328 en SNALP y se administró por infusión i.v. a primates no humanos. En diversos puntos de tiempo posteriores a la dosis, se cuantificaron los niveles de proteína t Tr en suero.
A macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) (n=5 animales/grupo para los grupos SNALP-18328 y n=3 animales/grupo para los grupos SNALP-1955 y PBS) se les administró una infusión i.v. de 15 minutos de SNALP-18328 (0,3, 1 ó 3 mg/kg), SnALP-1955 (3 mg/kg) con ARNip de control negativo AD-1955 que selecciona como diana el gen luciferasa no de mamíferos), o PBS. En los días 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10 y 14 de la fase de dosificación, se recogieron muestras de suero y se almacenaron a -80°C hasta el análisis.
Se usó análisis de inmunotransferencia de tipo Western para evaluar los niveles de proteína TTR en muestras de suero. Las muestras de suero de cada grupo se combinaron y se diluyeron 1:1 con tampón de muestra Laemmli (se añadió p-mercaptoetanol a una dilución 1:20). Las muestras se calentaron a 95°C durante 10 minutos. Se cargaron 12,5 |il de cada muestra en cada carril de un gel de preparación Criterion al 10-20% (Biorad, Hercules, CA) y se separaron mediante SDS-PAGE a 120 V durante 1,5 horas, luego se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando un sistema semiseco a 15 V durante 1 hora. La membrana se bloqueó durante la noche a 4°C en tampón de bloqueo LiCOR (Lincoln, NE) diluido 1:1 con PBS 1X. La inmunotransferencia se sondó en primer lugar con anticuerpos primarios (anticuerpo de cabra anti-TTR de Santa Cruz (Santa Cruz, CA) a una dilución de 1:1000 diluido en tampón de bloqueo LiCOR/PBS en un balancín durante 1 hora a temperatura ambiente. Las inmunotransferencias se lavaron 4X con PBS Tween 20 al 0,2% (10 minutos por lavado). Los anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia (anticuerpo anti-cabra 680nm de Invitrogen (Carlsbad, CA) se añadieron a una dilución de 1:10.000 en tampón de bloqueo LiCOR/PBS y se incubó la inmunotransferencia durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, las inmunotransferencias se lavaron 4X con PBS Tween 20 al 0,2% seguido de un lavado con PBS 1X. Se usó el sistema de imágenes infrarrojas Odyssey de Li-COR para detectar las bandas de proteínas. El monómero de TTR migra a 15 kDa.
Los resultados se muestran en la figura 8. Los niveles de proteína TTR en suero mostraron una reducción dependiente de la dosis con 1 ó 3 mg/kg de SNALP-18328, en comparación con los niveles previos a la dosis (día 0). La duración de la supresión después de una única administración intravenosa de SNALP-18328 es de al menos 14 días después del tratamiento con 1 ó 3 mg/kg de SNALP-18328.
Estos resultados demuestran que una sola administración i.v. de SNALP-18328 produce una supresión duradera de la proteína TTR en la circulación en primates no humanos (Macaca fascicularis), con una reducción significativa de la proteína TTR 14 días posteriores a la dosis.
Para evaluar la durabilidad de la supresión del ARNm de TTR en hígado por SNALP-18328, se formuló AD-18328 en SNALP (ALN-TTR01) y se administró por infusión i.v única a primates no humanos. Los niveles de ARNm en hígado se midieron tal como se describe en el presente documento el día 3 o el día 30 tras la administración.
Los resultados se muestran en la figura 20 y demuestran que la supresión de ALN-TTR01 del ARNm de TTR silvestre es duradera en primates no humanos después de 3 días para dosificaciones de 1,0 y 3,0 mg/kg y durante 30 días a una dosis de 10 mg/kg.
Ejemplo 9: reducción in vivo de TTR mutante (V30M) en tejidos periféricos por SNALP-18328 en el ratón transgénico
Eficacia profiláctica
Para evaluar la eficacia de SNALP-18328 (ALN-TTR01) en la reducción de TTR en tejidos periféricos, se evaluaron ratones con inactivación de hTTR V30M/HSF-1 con tinción inmunohistoquímica para t Tr . A ratones con inactivación de hTTR V30M/HSF-1 de dos meses de edad (Maeda, S., (2003), Use of genetically altered mice to study the role of serum amyloid P component in amyloid deposition. Amyloid Suppl. 1, 17-20) se les administró un bolo i.v. de 3 mg/kg de SNALP-18328 (12 animales), 3 mg/kg de SNALP-1955 (con ARNip de control negativo AD-1955 que selecciona como diana el gen luciferasa no de mamíferos, 4 animales), o PBS (4 animales) una vez cada dos semanas para un total de cuatro dosis los días 0, 14, 28 y 42. Los niveles de ARNm de TTR en hígado y la inmunorreactividad de TTR en múltiples tejidos periféricos se evaluaron 8 semanas posteriores a la primera dosis el día 56.
Los ratones se anestesiaron con 1 mg/kg de medetomidina y se les administró una dosis letal de ketamina. Se recogieron tejidos y órganos de interés. Para la inmunohistoquímica, el esófago (E), el estómago (S), el intestino (duodeno (I1) y el colon (14)), el nervio (N) y los ganglios de la raíz posterior (D) se fijaron en formalina tamponada neutra y se incrustaron en parafina. Para la detección de TTR, el anticuerpo primario de conejo anti-TTR humana (1:1000, DAKO, Dinamarca) y el anticuerpo secundario conjugado con biotina anti-conejo (1:20 Sigma, EE.UU.) seguido de marcaje con extravidina (1:20, Sigma, EE.UU.) con el fin de teñir la proteína TTR. La reacción se desarrolló con 3-amino-9-etilcarbaxol, AEC (Sigma, EE.UU.). El análisis semicuantitativo de los portaobjetos inmunohistoquímicos se realizó usando el programa cuantitativo de imágenes Scion que mide el área ocupada por el color de reacción del sustrato y normaliza este valor con respecto al área total de la imagen. Los valores medios del % de área ocupada se muestran con la desviación estándar correspondiente. Cada tejido animal se evaluó en cuatro áreas diferentes. La presencia de TTR humana en los ganglios parasimpáticos del estómago y el intestino se estudió mediante doble tinción inmunofluorescente con anticuerpo de conejo anti-TTR humana (1:1000, DAKO, Dinamarca) y anticuerpo de ratón anti-PGP9.5 (1:40, Serotec, EE.u U.) como anticuerpos primarios; los anticuerpos secundarios fueron, respectivamente: anticuerpo Alexa Fluor 488 anti-conejo (Molecular probes, RU) y anticuerpo de cabra Alexa Fluor 568 anti-ratón (Molecular probes, Reino Unido). Los portaobjetos se montaron con Vectashield (Vector) y se visualizaron en un microscopio Zeiss Cell Observer System (Carl Zeiss, Alemania) equipado con filtros para FITc y rodamina.
Los resultados se representan gráficamente en la figura 9. A diferencia de los animales tratados con PBS y SNALP-1955, los animales tratados con SNALP-18328 tuvieron una reducción significativa de la inmunorreactividad de TTR en todos los tejidos examinados (esófago (E), estómago (S), intestino (duodeno (I1) y colon (14)), nervio (N) y ganglios de la raíz posterior (D).
Estos resultados demuestran que la administración de SNALP-18328 a ratones con inactivación de hTTR V30M/HSF-1 provoca una reducción significativa del depósito de proteína TTR en tejidos y órganos periféricos, incluidos el esófago, el estómago, el intestino (duodeno y colon), el nervio y el ganglio de la raíz posterior.
Eficacia terapéutica
Se administró ALN-TTR01 a ratones con inactivación de hTTR V30M/HSF-1 maduros para determinar los efectos del tratamiento de ARNip de TTR sobre la regresión de los depósitos de TTR humana mutantes.
A grupos de animales de 21 meses de edad (ratones con inactivación de hTTR V30M/HSF-1) se les administró por vía intravenosa un bolo i.v. de ALN-TTR01 o ARNip de control a una dosis de 3 mg/kg los días 0, 14, 28, 14, 56 y 70. El día 77, los ratones se sacrificaron, se recogió tejido y se sometió a ensayo la deposición de TTR mediante análisis semicuantitativo de portaobjetos teñidos inmunohistoquímicamente usando el programa cuantitativo de imágenes Scion tal como se describe en el presente documento. Se examinaron esófago, colon; estómago, nervio ciático; y tejido de los ganglios de la raíz posterior y los resultados se compararon con los datos históricos en este modelo animal que demuestra tanto el depósito de TTR como las fibrillas de TTR presentes en los tejidos a esta edad. Los resultados se muestran en el gráfico de la figura 21. Los resultados demuestran que el tratamiento con ARNip de TTR dio como resultado una regresión> 90% de los depósitos de tejido de hTTR V30M existentes.
Ejemplo 10. Reducción in vivo del ARNm de TTR silvestre en el hígado de primates no humanos por XTC-SNALP-18328
Para evaluar la eficacia de la nueva formulación de nanopartículas lipídicas XTC-SNALP para la administración de ARNip en primates no humanos, se formuló ARNip de TTR AD-18328 en XTC-SNALP (XTC-SNALP-18328) y se administró mediante infusión i.v. de 15 minutos, y se cuantificó el ARNm de TTR en hígado. A macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) se les administraron infusiones i.v. de 15 minutos de XTC-SNALP-18328 (0,03, 0,1, 0,3 ó 1 mg/kg) o XTC-SNALP-1955 (1 mg/kg, con ARNip de control negativo AD-1955 que selecciona como diana el gen luciferasa no de mamíferos). A las cuarenta y ocho horas posteriores a la dosificación, los monos se anestesiaron con pentobarbital sódico y se desangraron. Se recogió tejido hepático para la determinación de ARNm de TTR, se ultracongeló y se almacenó a -80°C hasta su procesamiento. Los métodos usados para la cuantificación del ARNm de TTR en tejido hepático fueron similares a los descritos en el ejemplo 5 anterior.
Los resultados se muestran en la figura 10. XTC-SNALP-18328 redujo los niveles de ARNm de TTR en hígado de una manera dependiente de la dosis, en comparación con el control negativo XTC-SNALP -1955. Se determinó que la DE50 de ARNm era ~ 0,1 mg/kg de XTC-SNALP-18328.
Estos resultados demuestran que XTC-SNALP-18328 es eficaz para suprimir el ARNm de TTR silvestre en hígado de primates no humanos cuando se administra mediante infusión i.v.
Ejemplo11: reducción in vivo del ARNm de TTR silvestre en el hígado de primates no humanos por LNP09-18328 y LNP11-18328
Para evaluar la eficacia de dos formulaciones novedosas de nanopartículas lipídicas, LNP09 y LNP11, para la administración de ARNip en primate no humano, se formuló ARNip de TTR AD-18328 en LNP09 (LNP09-18328) o LNP11 (LNP11-18328), y se administró por infusión i.v. de 15 minutos, y se sometieron a ensayo niveles ARNm de TTR en hígado y de proteína TTR en suero. A macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) se les administraron infusiones i.v. de 15 minutos de LNP09-18328 (0,03, 0,1 ó 0,3 mg/kg), lNp 11-18328 (0,03, 0,1 ó 0,3 mg/kg) o PBS. Las muestras de biopsia en hígado se recogieron a las 48 horas posteriores a la dosificación, se ultracongelaron y se almacenaron a -80°C hasta su procesamiento. El suero se recogió antes de la dosificación (previo a la hemorragia) y los días 1, 2, 4, 7, 14, 21 y 28 posteriores a la dosificación y se almacenó a -80°C hasta el procesamiento. Los métodos usados para la cuantificación del ARNm de TTR en tejido hepático y la evaluación de la proteína TTR en suero fueron similares a los descritos en los ejemplos 5 y 8 anteriores.
Los resultados se muestran en la figura 11A para ARNm, y en la figura 11B y la figura 11C para proteínas. Los animales tratados con LNP09-18328 y LNP11-18328 mostraron una disminución dependiente de la dosis en los niveles de ARNm de TTR en hígado, alcanzando una reducción máxima a 0,3 mg/kg de ~85% (LNP09-18328) y ~90% (LNP11-18328) de ARNm en relación con el control de PBS. Se determinó que la DE50 de ARNm era ~0,02 mg/kg tanto para LNP09-18328 como para LNP11-18328. En el día 7 posterior a la dosificación, las muestras de suero también mostraron una reducción dependiente de la dosis de la proteína TTR para 0,1 y 0,3 mg/kg de LNP09-18328 y LNP11-18328, en comparación con los niveles de control de PBS. La figura 11C muestra una disminución en los niveles de proteína TTR con una dosis de 0,3 mg/kg de LNP09-18328 que persistió durante al menos 28 días posteriores a la dosificación, en comparación con el grupo de control de PBS y en comparación con las muestras previas a la hemorragia.
Estos resultados demuestran que LNP09-18328 y LNP11-18328 son eficaces para suprimir el ARNm de TTR silvestre en el hígado de primates no humanos y la proteína TTR silvestre en la circulación, cuando se administran mediante infusión i.v. Además, la supresión con LN09-18328 es duradera y persiste durante al menos 28 días después de la infusión i.v.
Ejemplo 12: reducción in vivo del ARNm de TTR silvestre en el hígado de primates no humanos por LNP12-18328
Se administró AD-18328 formulado con LNP12 a primates no humanos para evaluar la eficacia de esta formulación. Las formulaciones de LNP12-18328 se prepararon usando un método adaptado de Jeffs et al. (Jeffs LB et al. (2004) A Scalable, Extrusion-Free Method for Efficient Liposomal Encapsulation of Plasmid DNA. Pharm Res 22: 362-372) Brevemente, Tech-Gl (descrito anteriormente), diestearoil fosfatidilcolina (DSPC), colesterol y mPEG2000-DMG se solubilizaron en etanol al 90% en una razón molar de 50:10:38,5:1,5. El ARNip se solubilizó en tampón citrato 10 mM, pH 3, a una concentración de 0,4 mg/ml. La disolución de lípidos etanólica y la solución acuosa de ARNip se bombearon por medio de una bomba peristáltica equipada con dos cabezales de bomba a caudales volumétricos equivalentes y se mezclaron en una unión en “T”. Los lípidos se combinaron con ARNip en una razón de lípido total con respecto a ARNip de 7:1 (peso:peso). Las formulaciones de LNP12-18328 formadas espontáneamente se dializaron contra PBS (NaCl 155 mM, Na2HPO43 mM, KH2PO41 mM, pH 7,5) para retirar el etanol y el tampón de intercambio. Esta formulación produce un diámetro medio de partícula de 80 nm con aproximadamente un 90 por ciento de eficacia de atrapamiento de ARNip.
Los macacos cangrejeros (n = 3 por grupo) recibieron o bien PBS o bien 0,03, 0,1 ó 0,3 mg/kg de LNP12-18328 como infusiones intravenosas de 15 minutos (5 ml/kg) a través de la vena cefálica. Se recogieron biopsias de hígado de animales 48 horas después de la administración. Los niveles de ARNm de TTR en relación con los niveles de ARNm de GAPDH se determinaron en muestras de hígado tal como se describe en el presente documento.
Tal como se muestra en la figura 19, se observaron altos niveles de silenciamiento específico del gen de la transtiretina silvestre (TTR) a dosis tan bajas como 0,03 mg/kg. Esto demostró que la formulación de LNP12 facilita el silenciamiento génico a dosis de órdenes de magnitud más bajas que las requeridas por cualquier sistema de administración en hígado de ARNip descrito anteriormente.
Ejemplo 13. Síntesis de secuencias en mosaico de TTR
Se diseñó un conjunto de dúplex de TTR (“dúplex en mosaico”) que seleccionaban como diana gen de TTR cerca de la región diana de AD-18328, que selecciona como diana el gen de TTR humana comenzando en el nucleótido 628 de NM_000371.3.
En los ejemplos a continuación, la numeración que representa la posición de la base 5' de un ARNip en el transcrito se basa en NM_000371.3 (figura 12; SEQ ID NO: 1331). En los ejemplos mostrados anteriormente, la numeración del ARNip que selecciona como diana ARNip humano se basó en NM 000371.2 (figura 13A). NM_000371.3 extiende la secuencia de la UTR 5' en 110 bases en comparación con NM_000371.2, tal como se muestra en la figura 14. Por tanto, como ejemplo, la posición inicial de AD-18328 es 628 en NM_000371.3 y 518 en NM_000371.2 (figura 14). Las secuencias en mosaico de TTR se sintetizaron en el sintetizador MerMade 192 a escala de 1 umol. Para todas las secuencias de la lista, se aplicó la química “endolight” tal como se detalla a continuación.
• Todas las pirimidinas (citosina y uridina) en la hebra sentido contenían bases 2'-O-Metil (2' O-Metil C y 2'-O-Metil U)
• En la hebra antisentido, las pirimidinas adyacentes (hacia la posición 5') ribo A nucleósido se reemplazaron con sus correspondientes 2-O-Metil nucleósidos
• Se introdujo una extensión de dTdT de dos bases en el extremo 3' de las secuencias sentido y antisentido • El archivo de secuencia se convirtió en un archivo de texto para que sea compatible con la carga en el software de síntesis MerMade 192
Síntesis, escisión y desprotección:
La síntesis de secuencias de TTR usó síntesis de oligonucleótidos con soporte sólido que usa química de fosforamidita. La síntesis de las secuencias se realizó a escala de 1 um en placas de 96 pocillos. Las disoluciones de amidita se prepararon a una concentración de 0,1 M y se usó etiltiotetrazol (0,6 M en acetonitrilo) como activador. Las secuencias sintetizadas se escindieron y desprotegieron en placas de 96 pocillos, usando metilamina en la primera etapa y reactivo de fluoruro en la segunda etapa. Las secuencias en bruto se precipitaron usando una mezcla de acetona: etanol (80:20) y el sedimento se resuspendió en tampón de acetato de sodio 0,2 M. Las muestras de cada secuencia se analizaron mediante CL-EM para confirmar la identidad, UV para cuantificación y un conjunto seleccionado de muestras mediante cromatografía iEx para determinar la pureza.
Purificación y desalación:
Las secuencias en mosaico de TTR se purificaron en un sistema de purificación AKTA Explorer usando una columna Source 15Q. Se mantuvo una temperatura de columna de 65°C durante la purificación. La inyección y recogida de la muestra se realizó en placas de 96 pocillos (pocillo de 1,8 ml de profundidad). Se recogió en el eluyente un solo pico correspondiente a la secuencia de longitud completa. Las secuencias purificadas se desalaron en una columna Sephadex G25 usando un purificador AKTA. Las secuencias de TTR desaladas se analizaron en cuanto a concentración (mediante medición de UV en A260) y pureza (mediante HPLC de intercambio iónico). A continuación, las hebras individuales se sometieron a hibridación.
Hebras individuales de TTR y dúplex:
En la tabla a continuación (tabla 13) se muestra una lista detallada de dúplex en mosaico de TTR y las correspondientes hebras individuales (sentido y antisentido).
Tabla 13: dúplex en mosaico de TTR y las correspondientes hebras individuales
Hebra: s= sentido; as= antisentido; Posición: posición de la base 5' en el transcrito (NM_000371.3, SEQ ID NO:1331).
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Ejemplo 14. Cribado in vitro de ARNip en mosaico de TTR
Los dúplex de TTR en mosaico se sometieron a ensayo en células Hep3B para determinar la inhibición de la expresión de TTR endógena usando ensayos de PCR en tiempo real.
Cultivo celular y transfección: se cultivaron células Hep3B (ATCC, Manassas, VA) hasta casi la confluencia a 37°C en una atmósfera del 5% de CO2 en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM, ATCC) suplementado con FBS al 10%, estreptomicina y glutamina (ATCC) antes de liberarse de la placa por tripsinización. La transfección inversa se llevó a cabo añadiendo 5 |il de Opti-MEM a 5 |il de cada ARNip en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. A esto se le añadieron 10 |il de Opti-MEM más 0,2 |il de Lipofectamine RNAiMax por pocillo (Invitrogen, Carlsbad CA. N.° de cat. 13778-150) y se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego se añadieron 80 |il de medio de cultivo completo descrito anteriormente, pero sin antibiótico que contenía 2,0x104 células Hep3B. Las células se incubaron durante 24 horas antes de la purificación del ARN. Los experimentos se realizaron a una concentración dúplex final de 0,1 ó 10 nM.
Aislamiento de ARN total usando el kit de aislamiento de ARN total MagMAX-96 (Applied Biosystems, Foster City CA, n.° de pieza: AM1830): las células se recogieron y lisaron en 140 |il de disolución de lisis/unión y luego se mezclaron durante 1 minuto a 850 rpm usando un termomezclador Eppendorf (la velocidad de mezclado fue la misma durante todo el procedimiento). Se añadieron veinte microlitros de perlas magnéticas y mezcla de lisis/potenciador de unión al lisado celular y se mezclaron durante 5 minutos. Las perlas magnéticas se capturaron usando un soporte magnético y el sobrenadante se retiró sin alterar las perlas. Después de retirar el sobrenadante, las perlas magnéticas se lavaron con la disolución de lavado 1 (se añadió isopropanol) y se mezclaron durante 1 minuto. Las perlas se capturaron de nuevo y se retiró el sobrenadante. A continuación, las perlas se lavaron con 150 |il de disolución de lavado 2 (se añadió etanol), se capturaron y se retiró el sobrenadante. A continuación, se añadieron a las perlas 50 |il de mezcla de ADNasa (tampón de ADNasa MagMax turbo y ADNasa Turbo) y se mezclaron durante de 10 a 15 minutos. Después de mezclar, se añadieron 100 |il de disolución de unión de ARN y se mezclaron durante 3 minutos. Se retiró el sobrenadante y las perlas magnéticas se lavaron de nuevo con 150 |il de disolución de lavado 2 y se mezclaron durante 1 minuto y se retiró completamente el sobrenadante. Las perlas magnéticas se mezclaron durante 2 minutos para secar antes de que se eluyera el ARN con 50 |il de agua.
Síntesis de ADNc usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, n.° de cat. 4368813): se añadieron una mezcla maestra de 2 |il de tampón 10X, 0,8 |il de dNTP 25X, 2 |il de cebadores aleatorios, 1 |il de transcriptasa inversa, 1 |il de inhibidor de ARNasa y 3,2 |il de H2O por reacción a 10 |il de ARN total. Se generó ADNc usando un termociclador Bio-Rad C-1000 o S-1000 (Hercules, CA) a través de las siguientes etapas: 25°C 10 min, 37°C 120 min, 85°C 5 s, mantener a 4°C.
PCR en tiempo real: se añadieron 2 |il de ADNc a una mezcla maestra que contenía 0,5 |il de sonda GAPDH TaqMan (Applied Biosystems, n.° de cat. 4326317E), 0,5 |il de sonda de TTR TaqMan (Applied Biosystems, n.° de cat. HS00174914 M1) y 10 |il de mezcla maestra par sondas Roche (Roche, n.° de cat. 04887301001) por pocillo en una placa LightCycler 480 de 384 pocillos (Roche, n.° de cat. 0472974001). La PCR en tiempo real se realizó en una máquina de PCR en tiempo real LightCycler 480 (Roche). Cada dúplex se analizó en dos transfecciones independientes y cada transfección se analizó por duplicado.
Los datos en tiempo real se analizaron usando el método AACt. Cada muestra se normalizó con respecto a la expresión de GAPDH y se evaluó el silenciamiento en relación con las células transfectadas con el dúplex AD-1955 que no selecciona como diana. La tabla 14 muestra el silenciamiento de TTR usando los ARNip. Los datos se expresan como el porcentaje de mensaje restante en relación con las células seleccionadas como diana con AD-1955.
Muchos pero no todos los TTR-ARNbc en mosaico, que seleccionan como diana TTR cerca de la diana de AD-18328, redujeron el ARNm de TTR en al menos un 70% cuando se transfectaron en células Hep3B a 0,1 nM.
Tabla 14: Inhibición de TTR por ARNbc en mosaico que selecciona como diana TTR cerca de la diana de AD-18328.
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Ejemplo 15. Evaluación de la duración de la infusión sobre la eficacia de una única administración intravenosa de SNALP-18534 en ratas Sprague-Dawley
Objetivos
Para determinar el efecto de la duración de la infusión sobre la eficacia de una única infusión i.v. de SNALP-18534 en los niveles de ARNm de TTR en hígado en ratas Sprague-Dawley.
Tabla 15: abreviaturas y definiciones usadas
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Las secuencias de las hebras sentido y antisentido de AD-18534 se reproducen a continuación a partir de las tablas anteriores:
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Materiales de estudio
Artículo(s) de prueba
SNALP-18534 se compone de un ARNip que selecciona como diana ARNm de TTR de roedor (AD-18534), formulado en partículas de lípidos de ácido nucleico estables (SNALP) para su administración a los tejidos diana. La formulación de SNALP (partícula lipídica) consiste en un aminolípido novedoso (DLinDMA), un lípido pegilado (mPEG2000-C-DMA), un lípido neutro (DPPC) y colesterol. La razón de lípido:ácido nucleico en la formulación de SNALP es de aproximadamente 5,8:1 (p:p). SNALP-1955 contiene un ARNip que selecciona como diana ARNm de luciferasa no de mamífero, está formulado con la partícula lipídica idéntica a SNALP-18534 y sirve como control no farmacológicamente activo. Los niveles de dosis se expresan en mg/kg basándose en el peso del contenido de ARNip.
Diseño y procedimientos del estudio
Animales y administración de artículos de prueba:
El estudio se compone de 9 grupos de ratas Sprague-Dawley (4 machos/grupo). Se permitió que los animales tuvieran al menos un periodo de aclimatación de 2 días antes del estudio y todos los animales tenían 7 semanas de edad al inicio de la dosificación. La dosis administrada se calculó basándose en los datos de peso corporal recopilados antes de la dosificación el día 1. Los artículos de prueba y control se administraron como una única infusión i.v. de 15 minutos, 1 hora, 2 horas o 3 horas a través de la vena de la cola usando una cánula de 24G de %” sellada con una membrana de goma del sitio de inyección Baxter conectado mediante una aguja de mariposa Terumo 27G a una bomba de jeringa Baxter AS40A. El volumen de dosis fue de 3 ml/kg, la velocidad de infusión fue de 12 ml/kg/h, y los animales estaban moviéndose libremente en las jaulas durante la dosificación. Las ratas se dividieron en nueve grupos de tratamiento y se les administró una única infusión i.v. de SNALP-18534, SNALP-1955 o PBS tal como se muestra en la tabla 16:
Tabla 16: grupos de dosificación de los animales de prueba
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Recogida de tejido y aislamiento de ARN:
El día 0, los animales se anestesiaron mediante inhalación de isofluorano y se recogieron muestras de sangre previas a la dosificación en tubos separadores de suero mediante hemorragia retroorbital. Las muestras de sangre se dejaron coagular a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos antes de la centrifugación a 4°C. A continuación, las muestras de suero se almacenaron a -80°C hasta que se realizó el análisis. El día 3, los animales de los nueve grupos de tratamiento recibieron una dosis letal de ketamina/xilazina. La sangre se recogió a través de la vena cava caudal en tubos de separación de suero y luego se dejó coagular a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos antes de la centrifugación a 4°C. Las muestras de suero se almacenaron a -80°C hasta que se realizó el análisis. Se recogió tejido hepático y se ultracongeló en hielo seco. Se trituró tejido hepático congelado y se prepararon lisados de tejido para la cuantificación del ARNm en hígado.
Cuantificación de ARNm de TTR:
Los niveles de ARNm de TTR en relación con los de ARNm de GAPDH se determinaron en los lisados usando un ensayo de ADN ramificado (sistema de reactivo QuantiGene, Panomics, Fremont, CA). Brevemente, se usó el ensayo QuantiGene (Genospectra) para cuantificar los niveles de ARNm en lisados de muestras de tejido según las instrucciones del fabricante. El nivel medio de ARNm de TTR se normalizó con respecto al nivel medio de ARNm de GAPDH para cada muestra.
Para obtener el nivel relativo de expresión de ARNm de TTR, los valores medios de grupo para los grupos tratados con SNALP-1955 y SNALP-18534 con duraciones de infusión de 15 minutos, 1 hora y 2 horas se normalizaron luego al valor medio para el grupo tratado con PBS con infusión de 15 minutos, mientras que los valores medios del grupo para los grupos tratados con SNALP-1955 y SNALP-18534 con una duración de infusión de 3 horas se normalizaron luego con respecto al valor medio para el grupo tratado con PBS con una duración de la infusión de 3 horas.
Resultados
Tal como se muestra en la figura 16, una única infusión i.v. de 1 mg/kg de SNALP-18534 con diferentes duraciones de infusión de 15 minutos a 3 horas da como resultado una inhibición comparable de los niveles de ARNm de TTR en hígado medidos dos días después de la dosificación. Una única infusión i.v. de 1 mg/kg de SNALP-18534 también mostró una regulación negativa de la TTR duradera durante 29 días después de una sola infusión i.v. de 15 minutos, en comparación con el control SNALP-1955 (datos no mostrados). En comparación con el grupo tratado con PBS, una única infusión i.v. de 15 minutos, 1 hora, 2 horas o 3 horas de SNALP-18534 a 1 mg/kg redujo significativamente los niveles de expresión relativa de ARNm de TTR en un 94% (p < 0,001), 94% (p <0,001), 92% (p <0,001) y 93% (p <0,001), respectivamente. La especificidad de la actividad de SNALP-18534 se demuestra por la falta de inhibición significativa de la diana mediante la administración de SNALP-1955 mediante infusión i.v. de 1 hora, 2 horas o 3 horas al mismo nivel de dosis.
Conclusiones
Este estudio demuestra que variar la duración de la infusión desde 15 minutos a hasta 3 horas no afecta la eficacia de una única administración i.v. de 1 mg/kg de SNALP-18534 en ratas, tal como se evalúa mediante la reducción de los niveles de ARNm de TTR en el hígado.
Ejemplo 16. Reducción in vivo del ARNm de TTR silvestre en el hígado de rata por LNP07-18534 y LNP08-18534
Para evaluar la eficacia de 2 formulaciones novedosas de nanopartículas lipídicas, LNP07 y LNP08, para la administración de ARNip en la rata, se formuló el ARNip de TTR específica de roedor, AD-18534, en LNP07 (LNP07-18534) o LNP08 (LNP08-18534) y se administró mediante infusión i.v. de 15 minutos, y se cuantificó el ARNm de TTR en hígado. A ratas Sprague-Dawley (4 animales por grupo) se les administraron infusiones i.v. de 15 minutos de LNP07-18534 (0,03, 0,1, 0,3 ó 1 mg/kg), LNP08-18534 (0,01, 0,03 ó 0,1 mg/kg) o LNP07-1955 (1 mg/kg) o LNP08-1955 (0,1 mg/kg) que contienen el ARNip de control negativo AD-1955 que selecciona como diana gen de la luciferasa no de mamíferos. Cuarenta y ocho horas más tarde, los animales se sacrificaron y se recogió tejido hepático, se ultracongeló y se almacenó a -80°C hasta su procesamiento.
Para la cuantificación del ARNm de TTR, se trituró tejido hepático congelado en polvo y se prepararon lisados. Los niveles de ARNm de TTR en relación con los de ARNm de GAPDH se determinaron en los lisados usando un ensayo de ADN ramificado (sistema de reactivo QuantiGene, Panomics, Fremont, CA). Brevemente, se usó el ensayo QuantiGene (Genospectra) para cuantificar los niveles de ARNm en lisados de muestras de tejido según las instrucciones del fabricante. El nivel medio de ARNm de TTR se normalizó con respecto al nivel medio de ARNm de GAPDH para cada muestra. Las medias de grupo de los valores normalizados se normalizaron luego adicionalmente con respecto al valor medio para el grupo tratado con PBS, para obtener el nivel relativo de expresión de ARNm de TTR.
Los resultados se muestran en la figura 17. LNP07-18534 redujo los niveles de ARNm de TTR en el hígado de una manera dependiente de la dosis, con una supresión del 94% del ARNm de TTR a 1 mg/kg. El efecto fue específico, ya que el control negativo LNP07-1955 a 1 mg/kg no afectó significativamente los niveles de ARNm de TTR en comparación con el control PBS. Se determinó que la DE50 de ARNm era ~ 0,05 mg/kg de LNP07-18534. LNP08-18534 redujo los niveles de ARNm de TTR en el hígado de una manera dependiente de la dosis, con una supresión del 86% del ARNm de TTR a 0,1 mg/kg. El efecto fue específico, ya que el control negativo LNP08-1955 a 0,1 mg/kg no afectó significativamente los niveles de ARNm de TTR en comparación con el control PBS. Se determinó que la DE50 de ARNm era ~ 0,02 mg/kg de LNP08-18534.
Estos resultados demuestran que LNP07-18534 y LNP08-18534 son eficaces para suprimir el ARNm de TTR silvestre en el hígado de rata cuando se administran mediante infusión i.v., y que LNP07 y LNP08 son formulaciones eficaces para administrar ARNip al hígado.
Ejemplo 17: reducción de ARNm de TTR en hígado mediante una única administración intravenosa de LNP09-18534 o LNP11-18534 en ratas Sprague-Dawley
Objetivo:
Evaluar la eficacia de dos formulaciones novedosas de nanopartículas lipídicas (LNP) para la administración del ARNip específico de TTR de roedor, AD-18534 en la rata Sprague-Dawley para reducir los niveles de ARNm de TTR en hígado endógeno (silvestre). Las ratas se dosificaron por vía intravenosa mediante una infusión de 15 minutos con o bien 0,01, 0,03, 0,1 ó 0,3 mg/kg de LNP09-18534, lNp 11-18534, o bien solución salina tamponada con fosfato (PBS) y los niveles de ARNm de TTR en hígado se sometieron a ensayo 48 horas después del tratamiento.
Material y métodos:
Formulación de LNP09: (XTC/DSPC/Chol/PEG2000-C14) = 50/10/38,5/1,5% en moles; Lípido: ARNip ~ 11:1. Formulación de LNP11: (MC3/DSPC/Chol/PEG2000-C14) = 50/10/38,5/1,5% en moles; Lípido: ARNip ~ 11,1 Recogida de tejido y aislamiento de ARN: el día 3, los animales de todos los grupos de tratamiento recibieron una dosis letal de ketamina/xilazina. La sangre se recogió a través de la vena cava caudal en tubos de separación de suero y luego se dejó coagular a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos antes de la centrifugación a 4°C. Las muestras de suero se almacenaron a -80°C hasta su análisis futuro. Los tejidos hepáticos se recogieron y ultracongelaron en hielo seco. Se trituró tejido hepático congelado y se prepararon lisados de tejido para la cuantificación del ARNm en hígado.
Cuantificación de ARNm de TTR: los niveles de ARNm de TTR en relación con los de ARNm de GAPDH se determinaron en los lisados usando un ensayo de ADN ramificado (sistema de reactivo QuantiGene, Panomics, Fremont, CA). Brevemente, se usó el ensayo QuantiGene (Genospectra) para cuantificar los niveles de ARNm en lisados de muestras de tejido según las instrucciones del fabricante. El nivel medio de ARNm de TTR se normalizó con respecto al nivel medio de ARNm de GAPDH para cada muestra. Los valores medios del grupo se normalizaron luego con respecto al valor medio para el grupo tratado con PBS, para obtener el nivel relativo de expresión de ARNm de TTR.
Resultados:
Tal como se muestra en la figura 18, en contraste con los animales tratados con PBS, los animales tratados con LNP09-18534 y LNP11-18534 tuvieron una disminución significativa dependiente de la dosis en los niveles de ARNm de TTR en el hígado, alcanzando una reducción máxima de ~ 90% de reducción de ARNm para los grupos formulados con LNP09 y LNP11, en relación con el grupo de control de PBC a 0,3 mg/kg, y una dosis que logra una reducción del 50% (DE50) de <0,03 mg/kg para LNP11-18534 y <0,1 mg/kg para LNP09-18534.
Conclusiones
Este estudio demuestra que una única infusión i.v. de 15 minutos de LNP09-18534 o LNP11-18534 en ratas Sprague-Dawley da como resultado una reducción dependiente de la dosis del ARNm de TTR en hígado. Estos datos demuestran la eficacia de LNP09-18534 y LNP11-18534 para reducir el ARNm de TTR expresado endógenamente (silvestre) con niveles de DE50 de <0,03 y <0,1 mg/kg para LNP11-18534 y LNP09-18534, respectivamente.
Ejemplo 18: ensayo de toxicidad en animales
Se sometió a ensayo la seguridad y toxicología de ALN-TTR01 en condiciones de no GLP y GLP. ALN-TTR01 es el ARNip AD-18328 en una formulación SNALP (DLinDMA/DPPC/colesterol/PEG2000-cDMA (57,1/7,1/34,4/1,4) lípido: ARNip ~7). Los ensayos se realizaron en macacos cangrejeros (1, 3 y 10 mg/kg) y en ratas Sprague-Dawley (0,3, 1, 3 y 6 mg/kg). No se encontró toxicidad de ALN-TTR01 a < 1 mg/kg en ratas y < 3 mg/kg en NHP (datos no mostrados).
Ejemplo 19: Medicamento ALN-TTR01
El medicamento, inyección ALN TTR01, es una suspensión líquida estéril homogénea de color blanco a blanquecino del ARNip ALN-18328 con excipientes lipídicos (denominados partículas lipídicas de ácido nucleico estables [SNALP]) en solución salina tamponada con fosfato isotónico. La composición de ALN TTR01 se muestra en la siguiente tabla.
Tabla 17: Composición del medicamento ALN-TTR01
Figure imgf000087_0001
Los excipientes de lípidos tienen los pesos moleculares y estructuras mostradas en la tabla a continuación.
Tabla 18: Excipientes lipídicos
Figure imgf000088_0002
• a nombre alternativo: mPEG2000-C-DMA
El medicamento ALN TTR01 se envasa en viales de vidrio de 10 ml con un volumen de llenado de 5,5 ml (11 mg de ALN-18328 por vial). El sistema de cierre del recipiente consiste en un vial de vidrio de borosilicato de tipo I según la USP/EP, un tapón de goma de butilo con cara de teflón y una tapa de aluminio abatible. El medicamento se almacenará a 5 ± 3°C.
La estabilidad del medicamento se somete a ensayo durante hasta 24 meses y se determina usando los siguientes criterios:
Aspecto: líquido opalescente homogéneo de color blanco a blanquecino, sin partículas extrañas
pH: 6,8 -7.8
Osmolalidad: 250-350 mOsm/kg
Razón lípido: ARNip: 5,6 - 8,4 mg/mg
Tamaño de partícula (promedio Z): 60 - 120 nm <0,15.
Ejemplo 20: reducción in vitro de la expresión de ARNm de TTR humana por AD-18324 en células ARPE 19 Para determinar el efecto del ARNip de TTR sobre la expresión del ARNm de TTR in vitro, se sometieron a prueba los ARNip AD-18324 y AD-18534 en células del epitelio pigmentario de la retina humana (ARPE-19).
AD-18324 es un dúplex de ARNip de TTR humana y AD-18534 es un dúplex de ARNip de TTR de rata. Las secuencias de las hebras sentido y antisentido de AD-18534 y AD-18324 se reproducen a continuación:
Figure imgf000088_0001
Un ARNip de control fue AD-1955 que seleccionaba como diana un gen LUC.
Se transfectaron células ARPE-19 con ARNip usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). En algunos ejemplos de este método, pueden usarse otros agentes de transfección, incluyendo colesterol o aterocolágeno. Después de la incubación durante 24 horas, se transfectaron transitoriamente células ARPE-19 con una confluencia del 50~60% con AD-18534 o AD-18324 siguiendo las instrucciones del fabricante. Se aisló el ARN total para PCR cuantitativa en tiempo real 48 horas después del inicio de la transfección. Las células ARPE-19 se dosificaron con 1 nM, 10 nM o 50 nM de AD-18534 o con 1 nM, 10 nM o 50 nM de AD-18324.
La expresión de ARNm de TTR se midió mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se aisló el ARN total de las células transfectadas usando el mini kit RNeasy (Qiagen). El ARN total (0,5 |ig) se transcribió de manera inversa a ADNc usando el reactivo ExScript RT (Takara Bio Inc.) según el protocolo del fabricante. Cada PCR se realizó con 2 |il de ADNc y 0,2 |imol/l de cada cebador en un sistema LightCycler con SYBR Premix DimerEraser (Takara Bio Inc.). Se usaron los siguientes cebadores: TTR humana (directo: 5'-CATTCTTGGCAGGATGGCTTC-3' (SeQ ID NO: 1415); inverso: 5'-CTCCCAGGTGTCATCAGCAG-3' (SEQ ID NO: 1416). La expresión de ARNm de Tt R humana se calculó en relación con los niveles de expresión de GAPDH humana en las células ARPE-19.
La expresión de ARNm de TTR humana se redujo notablemente por AD-18324 de una manera dependiente de la dosis. Los resultados se muestran en la figura 22. Una dosis de 1 nM de AD-18324 dio como resultado una reducción de al menos un 10% de la expresión relativa del ARNm de TTR humana en comparación con un grupo de ARNip de control. Una dosis de 10 nM de AD-18324 dio como resultado al menos un 40% de reducción de la expresión relativa del ARNm de TTR humana en comparación con el grupo de ARNip de control. Una dosis de 50 nM de AD-18324 dio como resultado una reducción de al menos un 60% de la expresión relativa del ARNm de TTR humana en comparación con el grupo de ARNip de control. AD-18534 no provocó una reducción marcada de la expresión relativa de TTR humana en cada dosis. No hubo ningún efecto sobre los niveles de 11-6 o TNF-alfa en comparación con los controles.
Estos resultados demuestran que AD-18324 es eficaz para inhibir la expresión de ARNm de TTR humana en una célula del epitelio pigmentario de la retina humana (ARPE-19) de una manera dependiente de la dosis y no produce una respuesta inflamatoria.
Ejemplo 21: reducción in vivo de la expresión de ARNm de TTR de rata endógena por AD-18534 en ratas Dark Agouti (DA)
Para determinar el efecto del ARNip de TTR de rata sobre la expresión de ARNm de TTR de rata endógena, se sometió a prueba el dúplex AD-18534 in vivo en ratas Dark Agouti (DA).
Las secuencias de las hebras sentido y antisentido de AD-18534 se describen anteriormente.
A las ratas DA se les inyectó AD-18534 en sus cavidades vítreas. Se anestesiaron ratas adultas mediante inhalación de dietil éter. Para dilatar las pupilas, se aplicaron 1-2 gotas de tropicamida al 1% en los ojos de la rata. Se realizaron inyecciones intravítreas de ARNip usando jeringas Hamilton y una aguja de calibre 33. El volumen inyectado fue de 5 |il de modo que el volumen vítreo se mantuviera lo más cerca posible a lo normal. Después de 24 horas, se sacrificó la rata mediante inhalación de dietil éter y se recogieron los ojos para su posterior disección. Se separaron los ojos de la córnea y el cristalino para conseguir las copas posteriores. Los complejos RPE-coroidesesclerótica se aislaron retirando la retina de las copas posteriores para su análisis. Pueden usarse otros métodos para optimizar la administración de ARNip, incluyendo la variación de la cantidad de dosis o el momento de la dosis. El método de inyección puede producirse en otra parte del ojo, incluyendo el espacio subconjuntival o subretina. Es posible que aumente la cantidad de solución salina o ARNip inyectada.
La expresión de ARNm de TTR de rata se midió mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR). Se aisló el ARN total de cada complejo RPE-coroides-esclerótica usando el mini kit RNeasy (Qiagen). El ARN total se transcribió de manera inversa a ADNc usando el reactivo ExScript RT (Takara Bio Inc.). Cada PCR se realizó en un sistema LightCycler con SYBR Premix DimerEraser (Takara Bio Inc.). Se usaron los siguientes cebadores: TTR de rata (directo: 5'-TGCCTCGCTGGACTGATATTTG-3' (SEQ ID NO: 1417); inverso: 5'-TTGAACACTTTCACGGCCACA-3' (SEQ ID NO: 1418)). La expresión de ARNm de TTR de rata se calculó en relación con los niveles de expresión de GAPDH de rata.
La figura 23 muestra la inhibición de la expresión de ARNm de TTR de rata endógena en ratas DA después de la inyección con AD-18534, en comparación con ratas DA a las que se les administró un ARNip de control, solución salina o ningún tratamiento (p <0,01). Las ratas DA tratadas con AD-18354 mostraron una reducción de la expresión de ARNm de TTR de rata endógena en al menos un 60% en relación con el grupo de ARNip de control y el grupo de control de solución salina (p <0,01).
Estos resultados demuestran que AD-18354 es activo en la supresión de la expresión de ARNm de TTR de rata endógena en las células del epitelio pigmentario de la retina de ratas DA.
Ejemplo 22: reducción in vivo de la expresión de ARNm de ATTR por AD-18324 en ratas transgénicas (Tg) ATTR V30M
Para evaluar el efecto del ARNip de TTR AD-18324 sobre la expresión del ARNm de ATTR mutante humana (V30M), se sometió a prueba AD-18324 in vivo en células del epitelio pigmentario de la retina de ratas transgénicas (Tg) ATTR V30M.
A ratas transgénicas que poseen un gen ATTR V30M humano se les inyectó AD-18324 en sus cavidades vítreas. Se realizaron inyecciones intravítreas de ARNip AD-18324 usando jeringas Hamilton y aguja de calibre 33. Después de 24 horas, las ratas Tg ATTR V30M se sacrificaron mediante inhalación de dietil éter y se recogieron los ojos para la disección posterior. Se separaron los ojos de la córnea y el cristalino para conseguir las copas posteriores. Los complejos RPE-coroides-esclerótica se aislaron retirando la retina de las copas posteriores para evaluar el efecto de AD-18324 sobre la expresión de ARNm de ATTR. Se inyectó ARNip AD-18324 en la cavidad vítrea usando una aguja de calibre 33. Después de 24 horas, se aisló el epitelio pigmentario de la retina para evaluar el efecto de AD-18324 sobre la expresión de ARNm de ATTR.
La expresión de ARNm de ATTR se midió mediante PCR en tiempo real. El ARN total se transcribió de manera inversa a ADNc usando el reactivo ExScript RT (Takara Bio Inc.). Cada PCR se realizó en un sistema LightCycler con Premix Ex Taq (Takara Bio Inc.). Se usaron los siguientes cebadores: TTR humana (directo: 5'-GCCGTGCATGTGTTCAGA-3' (SEQ ID NO: 1419); inverso: 5'-GCTCTCCAGACTCACTGGTTTT-3 (SEQ ID NO: 1420)'). La sonda la proporcionó Universal Probe Library (n.° de sonda 66, Roche Diagnostics). La expresión de ARNm de ATTR se calculó en relación con la expresión de GAPDH de rata en la rata Tg ATTR V30M.
La figura 24 muestra una reducción significativa de la expresión de ARNm de ATTR en células RPE de ratas Tg ATTR V30M, en comparación con el grupo de ARNip de control, el grupo de solución salina y el grupo sin tratamiento. La expresión de ARNm de ATTR se redujo en al menos un 60% en comparación con el grupo sin tratamiento.
Se usó el análisis de inmunotransferencia de tipo Western para evaluar la expresión de la proteína ATTR. Se fraccionaron cantidades iguales de proteína de humor acuoso de ratas mediante SDS-PAGE al 12% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories). Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 2,5% y se incubaron durante la noche a 4°C con un anticuerpo primario que era un anticuerpo policlonal de conejo anti-TTR (dilución 1:1000, Dako), seguido de un anticuerpo de cabra anti-inmunoglobulina de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (dilución 1:1000, Dako) como reacción secundaria durante 1 hora a temperatura ambiente. El inmunocomplejo se visualizó mediante el sistema de detección de inmunotransferencia de tipo Western ECL+ (GE Healthcare Bio-Science).
Los resultados se muestran en la figura 25. La expresión de la proteína ATTR se redujo significativamente por AD-18324 en comparación con la expresión de la proteína ATTR después de la inyección de un ARNip de control. Estos resultados demuestran que la inyección intravítrea de AD-18324 en ratas Tg ATTR V30M reduce significativamente el ARNm de TTR humana y la expresión de proteínas en el RPE.
Ejemplo 23: reducción in vivo de la expresión de ARNm de TTR de rata endógena en ratas Dark Agouti (DA) usando AD-18534 conjugado con colesterol
Para determinar el efecto del ARNip de TTR de rata conjugado con colesterol sobre la expresión de ARNm de TTR de rata endógena, se sometió a prueba el dúplex AD-23043 in vivo en ratas Dark Agouti (DA).
AD-23043 es un ARNip conjugado con colesterol con las siguientes secuencias.
Figure imgf000090_0001
A las ratas DA se les inyectó AD-23043 en sus cavidades vítreas. Se anestesiaron ratas adultas mediante inhalación de dietil éter. Para dilatar las pupilas, se aplicaron 1-2 gotas de tropicamida al 1% en los ojos de la rata. Se realizaron inyecciones intravítreas de ARNip (5 |ig) usando jeringas Hamilton y una aguja de calibre 33. El volumen inyectado fue de 5 |il de modo que el volumen vítreo se mantuviera lo más cerca posible a lo normal. Después de 14 ó 21 días, se sacrificó la rata mediante inhalación de dietil éter y se recogieron los ojos para su posterior disección. Se separaron los ojos de la córnea y el cristalino para conseguir las copas posteriores. Los complejos RPE-coroidesesclerótica se aislaron retirando la retina de las copas posteriores para su análisis.
La expresión de ARNm de TTR de rata se midió mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR). Se aisló el ARN total de cada complejo RPE-coroides-esclerótica usando el mini kit RNeasy (Qiagen). El ARN total se transcribió de manera inversa a ADNc usando el reactivo ExScript RT (Takara Bio Inc.). Cada PCR se realizó en un sistema LightCycler con SYBR Premix DimerEraser (Takara Bio Inc.). Se usaron los siguientes cebadores: TTR de rata

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un ARNbc que selecciona como diana TTR para su uso en un método de tratamiento de amiloidosis ocular relacionada con TTR reduciendo la expresión de TTR en un epitelio pigmentario de la retina de un sujeto, en el que el ARNbc va a administrarse a la retina del sujeto.
2. El ARNbc para su uso según la reivindicación 1, en el que el ARNbc tiene
(i) la hebra sentido uuuuAcuAAAGcAGuGuuudTdT y la hebra antisentido AAAcACUGCUUuAGuAAAAdTdT, o
(ii) la hebra sentido uuuAcuAAAGcAGuGuuuudTdT y la hebra antisentido AAAAcACUGCUUuAGuAAAdTdT,
en el que c es 2'-O-metilcitidina-3'-fosfato, u es 2'-O-metiluridina-3'-fosfato y dT es 2'-desoxitimidina-3'-fosfato.
3. El ARNbc para su uso según la reivindicación 1, en el que el ARNbc tiene
(i) la hebra sentido AGuccAGGcAGAGAcAAuAdTdT y la hebra antisentido uAUUGUCUCUGCCUGGACUdTdT, o
(ii) la hebra sentido uccAGGcAGAGAcAAuAAAdTdT y la hebra antisentido UUuAUUGUCUCUGCCUGGAdTdT,
en el que c es 2'-O-metilcitidina-3'-fosfato, u es 2'-O-metiluridina-3'-fosfato y dT es 2'-desoxitimidina-3'-fosfato.
El ARNbc para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ARNbc se conjuga con una molécula de colesterol.
5. El ARNbc para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el sujeto es un ser humano.
6. El ARNbc para su uso según la reivindicación 5, en el que el sujeto es un ser humano que comprende un gen de TTR V30M.
El ARNbc para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el sujeto es una rata Dark Agouti (DA).
8. El ARNbc para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el sujeto es una rata transgénica que posee un gen ATTR V30M humano.
9. El ARNbc para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la expresión de TTR se reduce en el epitelio pigmentario de la retina (RPE).
10. El ARNbc para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la expresión de TTR se inhibe en al menos el 60% en comparación con un control.
11. El ARNbc para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la introducción del ARNbc no da como resultado una respuesta inflamatoria tal como se mide mediante los niveles de IL-6 o TNF-alfa.
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