EA020312B1 - Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина - Google Patents

Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина Download PDF

Info

Publication number
EA020312B1
EA020312B1 EA201170591A EA201170591A EA020312B1 EA 020312 B1 EA020312 B1 EA 020312B1 EA 201170591 A EA201170591 A EA 201170591A EA 201170591 A EA201170591 A EA 201170591A EA 020312 B1 EA020312 B1 EA 020312B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
dsrna
nucleotide
expression
acid
nucleotides
Prior art date
Application number
EA201170591A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201170591A1 (ru
Inventor
Динах Вен-Йи Сах
Грегори Хинкл
Рене Альварес
Стюарт Милстейн
Цинминь Чэнь
Original Assignee
Элнилэм Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Элнилэм Фармасьютикалз, Инк.
Publication of EA201170591A1 publication Critical patent/EA201170591A1/ru
Publication of EA020312B1 publication Critical patent/EA020312B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6527—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6533—Six-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

Данное изобретение относится к двухцепочечной рибонуклеиновой кислоте (дцРНК), поражающей ген транстиретина (TTR), и способам применения этой дцРНК для ингибирования TTR.

Description

Это изобретение относится к двухцепочечной рибонуклеиновой кислоте (дцРНК), поражающей ген транстиретина (ТТН), и к способам применения этой дцРНК для ингибирования экспрессии ТТН.
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Эта заявка заявляет приоритет Предварительной заявки США с порядковым номером 61/106956, поданной 20 октября 2008 г.; Предварительной заявки США с порядковым номером 61/156670, поданной 2 марта 2009 г.; Предварительной заявки США с порядковым номером 61/185545, поданной 9 июня 2009 г.; Предварительной заявки США с порядковым номером 61/242783, поданной 15 сентября 2009 г.; и Предварительной заявки США с порядковым номером 61/244794, поданной 22 сентября 2009 г., все из которых включены здесь посредством ссылки в их полном виде, для всех целей.
Ссылка на список последовательностей
Эта заявка включает в себя список последовательностей, представленный электронно в виде текстового файла, названного ..!χ!, созданного... 2009, с размером байтов. Этот список последовательностей включен посредством ссылки.
Уровень техники
Транстиретин (ТТН) является секретируемым связывающим тиреоидный гормон белком. ТТН связывает и транспортирует ретинолсвязывающий белок (НВР)/Витамин А и сывороточный тироксин (Т4) в плазме и цереброспинальной жидкости.
Как ТТН с нормальной последовательностью, так и ТТН с вариантной последовательностью вызывают амилоидоз. ТТН с нормальной последовательностью вызывает амилоидоз сердца у людей, которые являются пожилыми, и амилоидоз этого типа называют сенильным системным амилоидозом (88А) (также называемым сенильным сердечным амилоидозом (8СА)). 88А часто сопровождается микроскопическими отложениями во многих других органах. Мутации ТТН ускоряют процесс образования ТТНамилоида и являются наиболее важным фактором риска для развития клинически значимого ТТНамилоидоза (также называемого АТТН (амилоидозом транстиретинового типа)). Известно, что более 85 амилоидогенных вариантов ТТН вызывают системный наследственный амилоидоз. Главным местом экспрессии ТТН является печень. Другие существенные места экспрессии включают в себя сосудистое сплетение, сетчатку и поджелудочную железу.
ТТН-амилоидоз проявляется в различных формах. При более сильном поражении периферической нервной системы это заболевание называют наследственной амилоидной невропатией (ГАР).
Когда первично вовлечено сердце, но не нервная система, это заболевание называют наследственной амилоидной кардиомиопатией (ГАС). Третий основной тип ТТН-амилоидоза называют лептоменингеальным амилоидозом/амилоидозом ЦНС (центральной нервной системы).
Было показано, что двухцепочечные молекулы РНК (дцРНК) блокируют экспрессию генов в высоко консервативном механизме, известном как интерференция РНК (Κ,ΝΛί). \УО 99/32619 (Иге е! а1) описал применение дцРНК, состоящей по меньшей мере из 25 нуклеотидов, для ингибирования экспрессии генов в С. е1едап5. Было также показано, что дцРНК деградирует РНК-мишень в других организмах (см., например, \УО 99/53050, \Уа1ег1юи5е е1 а1.; и \УО 99/61631, Нс|Ге1х е! а1.), ЭгоюрйПа (см., например, Уаид Ό., е! а1., Сигг. ΒίοΙ. (2000) 10:1191-1200) и млекопитающих (см., например, \УО 00/44895, Ышшег; и ΌΕ 101005865, КгеШхег е! а1.).
И8. 20070207974 описывает функциональные и гиперфункциональные §1^А. И8. 20090082300 описывает антисмысловые молекулы, направленные против ТТН. И.8. Ра!. Νο. 7250496 описывает микроРНК, направленные против ТТН.
Сущность изобретения
В одном варианте осуществления это изобретение обеспечивает двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (дцРНК) для ингибирования экспрессии транстиретина, причем указанная дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем эта антисмысловая цепь содержит участок, комплементарный части мРНК, кодирующей транстиретин (ТТН), где указанный участок комплементарности имеет длину менее 30 нуклеотидов и эта антисмысловая цепь содержит 15 или более смежных нуклеотидов 8ЕЦ Ш NО:170, 8ЕЦ Ш NО:450, 8ЕЦ Ш NО:730 или 8ЕЦ Ш NО:1010. В родственном варианте осуществления, эта смысловая цепь содержит 15 или более смежных нуклеотидов 8ЕЦ Ш NО:169, 8ЕЦ Ш NО:449, 8ЕЦ Ш NО:729 или 8ЕЦ Ш NО:1009. Еще в одном варианте осуществления, эта смысловая цепь состоит из 8ЕЦ Ш NО:449, а антисмысловая цепь состоит из 8ЕЦ Ш NО:450. В другом родственном варианте осуществления, эта смысловая цепь состоит из 8ЕЦ Ш NО:729, а эта антисмысловая цепь состоит из 8ЕЦ Ш NО:730. Еще в одном родственном варианте осуществления, смысловая цепь состоит из 8ЕЦ Ш NО:1009, а антисмысловая цепь состоит из 8ЕЦ Ш NО:1010. В другом родственном варианте осуществления, эта дцРНК содержит смысловую цепь, выбранную из таблиц 3А, 3В, 4, 6А, 6В, 7 и 16, и антисмысловую цепь, выбранную из таблиц 3А, 3В, 4, 6А, 6В, 7 и 16.
В некоторых вариантах осуществления участок комплементарности между антисмысловой цепью этой дцРНК и мРНК, кодирующей транстиретин, имеет длину 19 нуклеотидов. В другом варианте осуществления, этот участок комплементарности состоит из 8ЕЦ Ш NО:169. В других вариантах осуществления, каждая цепь дцРНК имеет длину 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов. Еще в одном варианте
- 1 020312 осуществления каждая цепь имеет длину 21 нуклеотид.
В некоторых вариантах осуществления дцРНК для ингибирования экспрессии транстиретина не расщепляет мРНК ТТН между нуклеотидом аденином в положении 637 8ЕО ГО N0:1331 и нуклеотидом гуанином в положении 638 οί 8Е0 ГО N0:1331. В других вариантах осуществления, эта дцРНК расщепляет мРНК ТТН между нуклеотидом гуанином в положении 636 8Е0 ГО N0:1331 и нуклеотидом аденином в положении 637 8Е0 ГО N0:1331. В некоторых вариантах осуществления эта дцРНК отжигается с мРНК ТТН между нуклеотидом гуанином в положении 628 8Е0 ГО N0:1331 и нуклеотидом урацилом в положении 646 8Е0 ГО N0:1331.
В других родственных вариантах осуществления это изобретение обеспечивает дцРНК, описанную выше, для ингибирования экспрессии транстиретина, причем эта дцРНК содержит по меньшей мере один или несколько модифицированных нуклеотидов. В родственных вариантах осуществления, по меньшей мере один модифицированный нуклеотид (или нуклеотиды) выбран (выбраны) из группы, состоящей из: 2'-О-метилмодифицированного нуклеотида, нуклеотида, содержащего 5'-фосфоротиоатную группу, и конечного нуклеотида, связанного с холестерил-производным или группой бисдециламида додекановой кислоты. В другом родственном варианте осуществления, модифицированный нуклеотид выбран из группы, состоящей из 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированного нуклеотида, 2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, замкнутого нуклеотида, лишенного азотистого основания нуклеотида, 2'-амино-модифицированного нуклеотида, 2'-алкил-модифицированного нуклеотида, морфолинонуклеотида, фосфорамидата и содержащего неприродное основание нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления, эта дцРНК содержит по меньшей мере один 2'-метилмодифицированный нуклеотид.
В других вариантах осуществления, вышеописанная дцРНК для ингибирования экспрессии транстиретина конъюгирована с лигандом или приготовлена в липидной готовой форме. В некоторых вариантах осуществления, эта липидная готовая форма может быть готовой Ь№-формой, готовой Ь№01формой, готовой ХТС-8ХАЕР-формой или готовой 8ХАЕР-формой. В родственных вариантах осуществления, готовая ХТС-8ХАЕР-форма является следующей: использующей 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (ХТС) с ХТС/БРРС/холестерин/РЕС-сБМА в соотношении 57,1/7,1/34,4/1,4 и отношение липид^гНЫЛ приблизительно 7. В других родственных вариантах осуществления, смысловая цепь этой дцРНК состоит из 8Е0 ГО N0:1009 и антисмысловая цепь состоит из 8Е0 ГО N0:1010, и эта дцРНК приготовлена в готовой форме ХТС-8ХЛЕР следующим образом: с использованием 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана (ХТС) с ХТС/БРРС/холестерин/РЕСсБМА в соотношении 57,1/7,1/34,4/1,4 и отношения липид^гНИЛ приблизительно 7. Альтернативно, дцРНК, такая как дцРНК, описанные выше, может быть приготовлена в готовой Ь№09-форме следующим образом: с использованием ХТС/Б8РС/Сйо1/РЕС2000-С14 в соотношении 50/10/38,5/1,5 мол.% и отношения липидМНХЛ приблизительно 11:1. В другой вариации, эту дцРНК готовят в готовой Ь№11форме следующим образом: с использованием МС3/Б8РС/Сйо1/РЕ62000-С14 в соотношении 50/10/38,5/1,5 мол.% и соотношения липид:мННА приблизительно 11:1. В другом варианте осуществления, эта дцРНК приготовлена в готовой Ь№09-форме или ЬЯРИ-форме и уменьшает уровни мРНК ТТН приблизительно на 85-90% при дозе 0,3 мг/кг относительно группы ЗФР-контроля. Еще в одном варианте осуществления, эта дцРНК приготовлена в готовой ЕХР09-форме или готовой ЬКР11-форме и уменьшает уровни мРНК ТТН при дозе 0,1 мг/кг относительно группы ЗФР-контроля. В еще одном варианте осуществления, эта дцРНК приготовлена в готовой ЕХР09-форме или готовой ЬКР11-форме и уменьшает уровни белка ТТН, как измерено при помощи Вестерн-блоттинга. Еще в одном варианте осуществления, эта дцРНК приготовлена следующим образом: с использованием ΌΙίηϋΜΑ с 0Е|п0МА/0РРС7холестерин/РЕС2000-сБМА в соотношении 57,1/7,1/34,4/1,4 и отношения липидМНХА приблизительно 7.
В некоторых вариантах осуществления, это изобретение обеспечивает дцРНК, такую как описанные выше дцРНК, для ингибирования экспрессии транстиретина, где введение этой дцРНК в клетку приводит приблизительно к 95% ингибированию экспрессии мРНК ТТН, как измерено ПЦР-анализом реального времени, где этой клеткой является клетка НерО2 или клетка Нер3В и где концентрация дцРНК равна 10 нМ. В родственных вариантах осуществления, введение этой дцРНК в клетку приводит приблизительно к 74% ингибированию экспрессии мРНК ТТН, как измерено анализом разветвленной ДНК, где этой клеткой является клетка НерО2 или клетка НерО2 и где концентрация дцРНК равна 10 нМ. В других родственных вариантах осуществления, эта дцРНК имеет 1С50 менее 10 пМ в клетке НерО2, где концентрация дцРНК равна 10 нМ. В других родственных вариантах осуществления, эта дцРНК имеет ЕБ50 приблизительно 1 мг/кг. В других родственных вариантах осуществления, введение этой дцРНК уменьшает мРНК ТТН приблизительно на 80% в печени собакоподобной обезьяны, где концентрация этой дцРНК равна 3 мг/кг. В других родственных вариантах осуществления, введение этой дцРНК не приводит к иммуностимулирующей активности в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС), как измерено при помощи ЕЬ18А-анализов на ГЕЛ-а и ТКЕ-α. В других родственных вариантах осуществления, введение дцРНК уменьшает уровни мРНК ТТН печени приблизительно на 97% или сывороточные уровни белка ТТН приблизительно на 90%, при концентрации дцРНК 6 мг/кг. В других родственных вариантах осуществления, введение дцРНК уменьшает уровни мРНК ТТН печени и/или сыворо
- 2 020312 точные уровни белка ТТК до 22 дней, где концентрация дцРНК равна 6 или 3 мг/кг. В других родственных вариантах осуществления, эта дцРНК подавляет сывороточные уровни белка ТТК до дня 14 после обработки при введении субъекту, нуждающемуся в этом, при 1 или 3 мг/кг. В других родственных вариантах осуществления, эта дцРНК уменьшает экспрессию ТТК на 98,9% в клетке НерЗВ при концентрации 0,1 нМ, как измерено ПЦР реального времени. В других родственных вариантах осуществления, эта дцРНК уменьшает экспрессию ТТК на 99,4% в клетке НерЗВ при концентрации 10 нМ, как измерено ПЦР реального времени.
В других вариантах осуществления, это изобретение обеспечивает двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (дцРНК) для ингибирования экспрессии транстиретина (ТТК), где указанная дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где эта антисмысловая цепь содержит участок, комплементарный части мРНК, кодирующей транстиретин (ТТК), причем указанный участок комплементарности имеет длину менее 30 нуклеотидов, и где эта дцРНК содержит смысловую цепь, выбранную из таблиц ЗА, ЗВ, 4, 6А, 6В, 7 и 16, и антисмысловую цепь, выбранную из таблиц ЗА, ЗВ, 4, 6А, 6В, 7 и 16.
В другом варианте осуществления это изобретение обеспечивает двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (дцРНК) для ингибирования экспрессии транстиретина (ТТК), где указанная дцРНК содержит антисмысловую цепь, содержащую участок, комплементарный 15-З0 нуклеотидам из нуклеотидов 618-648 8ЕЦ ГО ЫО:1ЗЗ1 и где указанная антисмысловая цепь спаривается с гуанином в положении 628 8ЕС ГО ЫО:1ЗЗ1.
В некоторых вариантах осуществления, это изобретение обеспечивает клетку, содержащую любую из дцРНК, описанных в разделе Сущность изобретения выше. В некоторых других вариантах осуществления, это изобретение обеспечивает вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере одну цепь любой из дцРНК, описанных в разделе Сущность изобретения выше. В некоторых вариантах осуществления, этот вектор находится в клетке.
В других вариантах осуществления, это изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для ингибирования экспрессии гена ТТК, содержащую дцРНК, описанную в разделе Сущность изобретения выше, и фармацевтически приемлемый носитель. В родственных вариантах осуществления, это изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для ингибирования экспрессии гена ТТК, содержащую дцРНК и готовую ЗЫЛЬР-форму, где эта дцРНК содержит антисмысловую цепь, которая имеет длину менее З0 нуклеотидов и содержит 15 или более смежных нуклеотидов 8ЕЦ ГО N0:170, 8ЕЦ ГО N0:450, 8ЕЦ ГО N0^0 или 8ЕЦ ГО N0:1010, и где эта готовая δΝΑΕΡ-форма содержит ΌΙίπΌΜΑ, ΌΡΡί.’. холестерин и РЕС2000-СЭМА в соотношении 57,1/7,1/З4,4/1,4 соответственно.
Еще в одном варианте осуществления, это изобретение обеспечивает способ ингибирования экспрессии ТТК, предусматривающий: (а) контактирование клетки с любой из дцРНК, описанных в разделе Сущность изобретения выше; (Ь) поддержание клетки, полученной в стадии (а), в течение времени, достаточного для деградации мРНК-транскрипта гена ТТК, с ингибированием посредством этого экспрессии гена ТТК в этой клетке.
Еще в одном варианте осуществления, это изобретение обеспечивает способ лечения нарушения, опосредованного экспрессией ТТК, предусматривающий введение человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества любой из дцРНК, описанных в разделе Сущность изобретения выше. В родственных вариантах осуществления, эту дцРНК вводят человеку при приблизительно 0,01, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5 или 5,0 мг/кг. Еще в одном родственном варианте осуществления человек, получающий лечение, имеет транстиретиновый амилоидоз и/или нарушение печени. В родственном варианте осуществления этот человек дополнительно имеет трансплантат печени. Еще в одном варианте осуществления, введение дцРНК уменьшает мРНК ТТК приблизительно на 80% в печени человека, когда концентрация дцРНК равна З мг/кг. Еще в одном родственном варианте осуществления, дцРНК не приводит к иммуностимулирующей активности в человеке, как измерено ЕЬ18А-анализами на №N-0. и ЮТа. В другом родственном варианте осуществления, введение дцРНК уменьшает уровни мРНК ТТК печени приблизительно на 97% или сывороточные уровни белка ТТК приблизительно на 90%, когда концентрация дцРНК равна 6 мг/кг. В другом родственном варианте осуществления, введение дцРНК уменьшает уровни мРНК ТТК печени и/или уровни белка ТТК сыворотки до 22 дней, когда концентрация дцРНК равна 6 мг/кг или З мг/кг. Еще в одном родственном варианте осуществления, дцРНК готовят в готовой Ь№09-форме следующим образом: с использованием ХТС/П8РС/Сйо1/РЕС2000-С14 в соотношении 50/10/З8,5/1,5 мол.% и отношения липид:8^КNΑ приблизительно 11:1. Еще в одном родственном варианте осуществления, дцРНК готовят в готовой Ь№11-форме следующим образом: с использованием МСЗ/О8РС.7С11о1/РЕС2000-С14 в соотношении 50/10/З8,5/1,5 мол.% и отношения липид:8^КNΑ приблизительно 11:1. Еще в одном родственном варианте осуществления, эта дцРНК приготовлена в готовой Ь№09-форме или готовой Ь№11-форме и уменьшает уровни мРНК ТТК приблизительно на 85-90% при дозе 0,З мг/кг относительно группы ЗФР-контроля. Еще в одном родственном варианте осуществления, эта дцРНК приготовлена в готовой Ь№09-форме или готовой Ь№11-форме и уменьшает уровни белка ТТК зависимым от дозы образом относительно группы ЗФР-контроля, как измерено Вестернблоттингом. Еще в одном родственном варианте осуществления, введение дцРНК подавляет уровни бел
- З 020312 ка ТТК в сыворотке до дня 14 после обработки при введении человеку 1 мг/кг или 3 мг/кг. Еще в одном родственном варианте осуществления, эта дцРНК приготовлена в готовой ЗЫЛЬР-форме следующим образом: с использованием ΌΙίπΌΜΆ с соотношением 0Ь1п0МА/0РРС/холестерин/РЕС2000-с0МА 57,1/7,1/34,4/1,4 и отношения липид^ЖЫА приблизительно 7.
В другом варианте осуществления это изобретение обеспечивает применение дцРНК для лечения нарушения, опосредованного экспрессией ТТК, предусматривающее введение человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества любой из дцРНК, описанных в разделе Сущность изобретения выше. В родственных вариантах осуществления эту дцРНК вводят человеку при приблизительно 0,01, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5 или 5,0 мг/кг. В другом конкретном родственном варианте осуществления дцРНК вводят человеку при приблизительно 1,0 мг/кг. В другом родственном варианте осуществления, этот человек имеет транстиретиновый амилоидоз и/или нарушение печени. В другом варианте осуществления, этот человек дополнительно имеет трансплантат печени.
В другом варианте осуществления это изобретение обеспечивает применение дцРНК в способе ингибирования экспрессии ТТК в клетке, где этот способ предусматривает: (а) контактирование клетки с дцРНК, описанной в разделе Сущность изобретения выше; и (Ь) поддержание клетки, полученной в стадии (а) , в течение времени, достаточного для деградации мРНК-транскрипта гена ТТК, с ингибированием посредством этого экспрессии гена ТТК в этой клетке.
Подробности одного или нескольких вариантов осуществления этого изобретения представлены в приведенном ниже описании. Другие признаки, цели и преимущества этого изобретения будут очевидными из описания и фигур и из формулы изобретения.
Описание фигур
Фиг. 1 является диаграммой уровней ΪΝΕα и ΙΡΝ-α в культивируемых РВМС человека после трансфекции δίΚΝΑ ТТК.
Фиг. 2А и 2В являются кривыми доза-ответ для АО-1832 4 и АО-18328, соответственно, в клетках НерС2.
Фиг. 3 является кривой доза-ответ для АО-18246 в клетках НерС2.
Фиг. 4А и 4В показывают ингибирование уровней мРНК печени и уровней белка плазмы, соответственно, в трансгенных мышах Н12 9-шТТК-КО^О8-КО/йТТК посредством внутривенного болюсного введения ТТΚ-ά8ΚNΑ (АО-18324, АО-18328 и АО-18246), приготовленного в Ь№01.
Фиг. 5 является диаграммой, суммирующей измерения уровней мРНК ТТК в печени приматов (не человека) после 15-минутной внутривенной инфузии ТТΚ-ά8ΚNΑ (АО-18324 и АО-18328), приготовленных в ^АЬР.
Фиг. 6А и 6В показывают ингибирование мРНК У30М-ТТК печени человека и уровней белка в сыворотке, соответственно, в трансгенных мышах посредством внутривенного болюсного введения ^АЬР-18328. Средние величины групп определяли, нормализовали относительно группы ЗФР-контроля и затем строили диаграмму. Стержни ошибок представляют стандартные отклонения. Процентное уменьшение средней величины группы, относительно ЗФР, показано для групп ^АЬР-1955 и ^АЬР18328. (*** р<0,001, однофакторный дисперсионный анализ (ΑNОVΑ) с апостериорным (ροδΐ-йос) критерием Дунна)).
Фиг. 7А и 7В показывают продолжительность уменьшения мРНК У30М-ТТК печени человека, соответственно, в трансгенных мышах на протяжении 22 дней после однократного внутривенного болюсного введения ^АЬР-18328. Определяли средние величины групп. Уровни мРНК ТТК/САРОН нормализовали относительно уровней дня 0 и строили диаграмму. Рассчитывали процентное уменьшение нормализованных уровней мРНК ТТК относительно ^АЬР-1955 для каждой временной точки, и они показаны для групп ^АЬР-18328. (*** р<0,001, однофакторный дисперсионный анализ (ΑNОVΑ) с апостериорным (ροδΐ-йос) критерием Дунна)).
Фиг. 8 показывает временной ход уровней белка ТТК в сыворотке в приматах (не человеке) на протяжении 14 дней после однократной 15-минутной инфузии ^АЬР-18328.
Фиг. 9 показывает уменьшение ТТК-иммунореактивности в различных тканях мышей с нокаутом У30М ТТВ/Н8Р-1 человека после внутривенного болюсного введения ^АЬР-18328. Е, пищевод; 8, желудок; Ι1, кишечник/двенадцатиперстная кишка; Ι4, кишечник/ободочная кишка; Ν, нерв; О, дорсальные ганглии блуждающего нерва.
Фиг. 10 показывает измерения мРНК ТТК и уровни белка в сыворотке, соответственно, в печени приматов (не человека) после 15-минутной внутривенной инфузии XТС-8NΑ^Р-18328.
Фиг. 11А и 11В показывают измерения мРНК ТТК и уровней белка в сыворотке, соответственно, в печени приматов (не человека) после 15-минутной внутривенной инфузии Ь№09-18328 или Ь№1118328. Фиг. 11с показывает временной ход уровней белка ТТК в сыворотке на протяжении 28 дней после 15-минутной внутривенной инфузии 0,3 мг/кг Ь№09-18328, в сравнении с группой ЗФР-контроля.
Фиг. 12 показывает последовательность мРНК ТТК человека (Ке£. 8ес.|. ΝΜ_000371.3, 8ЕО ГО N0:1331).
Фиг. 13А и 13В являются последовательностями мРНК ТТК человека и крысы, соответственно.
- 4 020312
Фиг. 13А является последовательностью мРНК ТТН человека (Не!. 8ец. ΝΜ_000371.2, 8ЕС ΙΌ N0: 1329).
Фиг. 13В является мРНК ТТН крысы (Не!. 8ец. ΝΜ_012681.1, ЛА) ΙΌ N0:1330).
Фиг. 14 показывает сопоставление нуклеотидов ΝΜ_000371.3, ΝΜ_000371.2 и АО-18328.
Фиг. 15 иллюстрирует симптомы и мутации в ТТН, ассоциированные с наследственной амилоидной невропатией, наследственной амилоидной кардиомиопатией и амилоидозом ЦНС.
Фиг. 16 показывает уменьшение уровней мРНК ТТН в печени с использованием 8ΝΑΒΡ-18534 с различными продолжительностями инфузии. Группам животных (п=4/группа) вводили 1 мг/кг δΝΑΒΡ18534 посредством 15-минутной или 1-, 2- или 3-часовой инфузии.
Спустя сорок восемь часов, крыс эвтанизировали и печени извлекали. Измеряли уровни мРНК ТТН и САРИН из лизатов печени с использованием ОнапЕдепе ΗΟΝΑ-анализа. Для каждого животного рассчитывали отношение уровней мРНК ТТН к мРНК САРИН. Определяли средние величины групп и нормализовали их относительно группы ЗФР-контроля и затем строили диаграммы. Стержни ошибок представляют стандартные отклонения. (*** р<0,001, однофакторный дисперсионный анализ (ΑΝΟνΑ) с апостериорным (рой-йос) критерием Бонферрони, относительно ЗФР).
Фиг. 17 показывает измерения уровней мРНК ТТН в печени крыс после 15-минутной внутривенной инфузии ΓΝΡ07-18534 или ΓΝΡ08-18534.
Фиг. 18 показывает ίη νίνο ингибирование эндогенных уровней мРНК ТТН в печенях крыс 8ргадиеИа\\!еу после 15-минутной Ιν-инфузии ΓΝΡ09-18534 или ΓΝΡ11-18534. Группам животных (п=4/группа) вводили внутривенно 0,01, 0,03, 0,1 или 0,3 мг/кг ΓΝΡ09-18534, ΓΝΡ11-18534; или ЗФР посредством 15минутной инфузии. Спустя сорок восемь часов крыс эвтанизировали и печени извлекали. Измеряли уровни мРНК ТТН и САРИН из лизатов биопсии печени с использованием ОнаШщепе Ь^NΑ-анализа. Для каждого животного рассчитывали отношение уровней мРНК ТТН к мРНК САРИН. Определяли средние величины групп и нормализовали их относительно группы ЗФР-контроля и затем строили диаграммы. Стержни ошибок представляют стандартные отклонения.
Подробное описание изобретения
Это изобретение обеспечивает дцРНК (ά8НNΑ) и способы применения этих дцРНК для ингибирования экспрессии гена ТТН в клетке или млекопитающем, где эта дцРНК поражает (деградирует) ген ТТН. Это изобретение обеспечивает также композиции и способы для лечения патологических состояний и заболеваний, таких как ТТН-амилоидоз, в млекопитающем, вызываемых экспрессией гена ТТН. дцРНК управляет последовательность-специфической деградацией мРНК посредством процесса, известного как интерференция РНК (НNΑ^).
дцРНК (ά&ΚNΑ) описанных здесь композиций включают в себя цепь РНК (антисмысловую цепь), имеющую участок, который имеет длину 30 нуклеотидов, обычно длину 19-24 нуклеотидов, и является по существу комплементарным по меньшей мере части мРНК-транскрипта гена ТТН. Применение этих дцРНК делает возможной нацеленную деградацию мРНК генов, которые предположительно участвуют в патологиях, ассоциированных с экспрессией ТТН в млекопитающих. Очень низкие дозы дцРНК ТТН, в частности, могут специфически и эффективно опосредовать НNΑ^. приводя к значимому ингибированию экспрессии гена ТТН. С использованием анализов на основе клеток авторы этого изобретения продемонстрировали, что дцРНК, поражающие ТТН, могут специфически и эффективно опосредовать НNΑ^. приводя к значимому ингибированию экспрессии гена ТТН. Таким образом, способы и композиции, включающие в себя эти дцРНК, применимы для лечения патологических процессов, которые могут опосредоваться даун-регуляцией (понижающей регуляцией) ТТН, например, в лечении нарушения печени или ТТН-амилоидоза, например РАР.
Способы и композиции, содержащие дцРНК ТТН, применимы для лечения патологических процессов, опосредуемых экспрессией ТТН, таких как ТТН-амилоидоз. В одном варианте осуществления способ лечения нарушения, опосредуемого экспрессией ТТН, предусматривает введение человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества дцРНК, поражающей (ген) ТТН. В одном варианте осуществления дцРНК вводят этому человеку при приблизительно 0,01, 0,1, 0,5, 1,0, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мг/кг.
Следующее подробное описание описывает, как можно готовить и применять композиции, содержащие дцРНК, для ингибирования экспрессии гена ТТН, а также композиции и способы для лечения заболеваний и нарушений, вызываемых экспрессией этого гена. Фармацевтические композиции, описанные в этом изобретении, включают в себя дцРНК, имеющую антисмысловую цепь, содержащую участок комплементарности, который имеет длину менее 30 нуклеотидов, обычно длину 19-24 нуклеотидов, и является, по существу, комплементарным по меньшей мере части РНК-транскрипта гена ТТН, вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Композиции, представленные в этом изобретении, включают в себя также дцРНК, имеющую антисмысловую цепь, имеющую участок комплементарности, который имеет длину менее 30 нуклеотидов, обычно длину 19-24 нуклеотидов, и является, по существу, комплементарным по меньшей мере части РНК-транскрипта гена ТТН.
Смысловая цепь дцРНК может включать в себя 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или более смежных нуклеотидов 8ЕС 1И ΝΟ:169, 8ЕС 1И ΝΟ:449, 8ЕС 1И ΝΟ:729 или 8ЕС 1И ΝΟ:1009. Антисмысловая цепь
- 5 020312 дцРНК может включать в себя 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или более смежных нуклеотидов ЗЕО ΙΌ N0:170, ЗЕО ΙΌ N0:450, ЗЕО ΙΌ N0:730 или ЗЕО ΙΌ N0:1010. В одном варианте осуществления, смысловая цепь дцРНК может состоять из ЗЕО ΙΌ N0:449 или ее фрагментов и антисмысловая цепь может состоять из ЗЕО ΙΌ N0:450 или ее фрагментов. В одном варианте осуществления, смысловая цепь дцРНК может состоять из ЗЕО ΙΌ N0:729 или ее фрагментов и антисмысловая цепь может состоять из ЗЕО ΙΌ N0:730 или ее фрагментов. В одном варианте осуществления, смысловая цепь дцРНК может состоять из ЗЕО ΙΌ N0:1009 или ее фрагментов и антисмысловая цепь может состоять из ЗЕО ΙΌ N0:1010 или ее фрагментов.
В одном варианте осуществления, дцРНК может включать в себя по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более модифицированных нуклеотидов. В одном варианте осуществления, модифицированный нуклеотид может включать в себя 2'-0-метилмодифицированный нуклеотид, нуклеотид, содержащий 5'-фосфоротиоатную группу и/или концевой нуклеотид, связанный с холестерилпроизводным или группой бисдециламида додекановой кислоты. В одном варианте осуществления, модифицированный нуклеотид может включать в себя 2'-дезокси-2'-фтормодифицированный нуклеотид, 2'дезоксимодифицированный нуклеотид, замкнутый нуклеотид, лишенный азотистого основания нуклеотид, 2'-аминомодифицированный нуклеотид, 2'-алкилмодифицированный нуклеотид, морфолинонуклеотид, фосфорамидат и/или содержащий неприродное основание нуклеотид.
В одном варианте осуществления, участок комплементарности дцРНК имеет длину по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или более нуклеотидов. В одном варианте осуществления участок комплементарности дцРНК имеет длину по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или более смежных нуклеотидов ЗЕО ΙΌ N0:169.
В одном варианте осуществления, каждая цепь дцРНК имеет длину 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более нуклеотидов. В одном варианте осуществления, дцРНК включает в себя смысловую цепь или ее состоящий из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 нуклеотидов или 21 нуклеотида фрагмент, выбранный из табл. 3А, 3В, 4, 6А, 6В, 7 и 16, и антисмысловую цепь или ее состоящий из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 нуклеотидов или 21 нуклеотида фрагмент, выбранный из табл. 3А, 3В, 4, 6А, 6В, 7 и 16.
В одном варианте осуществления, введение дцРНК в клетку приводит приблизительно к 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95% или большему ингибированию экспрессии мРНК ТТН, как измерено при помощи ПЦР-анализа реального времени. В одном варианте осуществления, введение дцРНК в клетку приводит приблизительно к 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95% или большему ингибированию экспрессии мРНК ТТН, как измерено при помощи ПЦРанализа реального времени. В одном варианте осуществления, введение дцРНК в клетку приводит приблизительно к 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95% или большему ингибированию экспрессии мРНК ТТН, как измерено при помощи анализа разветвленной ДНК. В одном варианте осуществления введение дцРНК в клетку приводит приблизительно к 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80, 80-85%, 85-90%, 90-95% или большему ингибированию экспрессии мРНК ТТН, как измерено при помощи анализа разветвленной ДНК.
В одном варианте осуществления, дцРНК имеет Ю50 менее 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 100 или 1000 пМ. В одном варианте осуществления, дцРНК имеет ЕО50 приблизительно 0,01, 0,1, 1, 5 или 10 мг/кг.
В одном варианте осуществления, дцРНК может уменьшать мРНК ТТН приблизительно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95% или более в собакоподобных обезьянах. В одном варианте осуществления, введение дцРНК уменьшает уровни мРНК ТТН печени приблизительно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95% или более или уровни белка ТТН сыворотки приблизительно на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% или более. В одном варианте осуществления, введение дцРНК уменьшает уровни мРНК ТТН печени и/или уровни белка ТТН сыворотки до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более дней.
В одном варианте осуществления, дцРНК приготовлена в готовой Ь№-форме и уменьшает уровни мРНК ТТН приблизительно на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% или более при дозе 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1 мг/кг, относительно группы ЗФР-контроля. В одном варианте осуществления, дцРНК приготовлена в готовой Ь№-форме и уменьшает уровни белка ТТН приблизительно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95% или более относительно группы ЗФР-контроля, как измерено при помощи Вестерн-блоттинга. В одном варианте осуществления, дцРНК подавляет уровни белка ТТН в сыворотке до дня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 после лечения при введении субъекту, нуждающемуся в этом, при 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мг/кг.
Таким образом, в некоторых аспектах, в этом изобретении представлены фармацевтические композиции, содержащие дцРНК ТТН и фармацевтически приемлемый носитель, способы применения этих композиций для ингибирования гена ТТН и способы применения этих фармацевтических композиций для лечения заболеваний, вызываемых экспрессией гена ТТН.
Ι. Определения
Для удобства, ниже обеспечено значение определенных терминов и фраз, используемых в этом
- 6 020312 описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения. Если имеется явное разногласие между применением термина в других частях этого описания и его определением, даваемым в этом разделе, должно превалировать определение, приведенное в этом разделе.
С, С, А и И обычно обозначают, каждый, нуклеотид, который содержит гуанин, цитозин, аденин и урацил в качестве основания, соответственно. Т и 6Т используются здесь взаимозаменяемо и относятся к дезоксирибонуклеотиду, в котором нуклеооснованием является тимин, например, дезоксириботимин. Однако должно быть понятно, что термин рибонуклеотид или нуклеотид или дезоксирибонуклеотид может также относиться к модифицированному нуклеотиду, как более детально описано ниже, или суррогатной замененной части молекулы. Квалифицированному в данной области специалисту хорошо известно, что гуанин, цитозин, аденин и урацил могут быть заменены другими частями молекул по существу без изменения свойств спаривания оснований олигонуклеотида, содержащего нуклеотид, несущий такую замененную часть. Например, без ограничения, нуклеотид, содержащий инозин в качестве его основания, может участвовать в спаривании оснований с нуклеотидами, содержащими аденин, цитозин или урацил. Таким образом, нуклеотиды, содержащие урацил, гуанин или аденин, могут быть заменены в нуклеотидных последовательностях этого изобретения нуклеотидом, содержащим, например, инозин. Последовательности, содержащие такие замененные части, являются вариантами этого изобретения.
В данном контексте, термин транстиретин (ТТН) относится к гену в клетке. ТТН известен также как АТТН, НкТ2651, РАЬВ, пре(д)альбумин, ТВРА и транстиретин (пре(д)альбумин, амилоидоз типа I). Последовательность мРНК-транскрипта ТТН человека может быть найдена в ΝΜ_000371. Последовательность мРНК ТТН мыши может быть найдена в ΝΜ_013697.2 и последовательность мРНК ТТН крысы может быть найдена в ΝΜ_012681.1.
В данном контексте, последовательность-мишень относится к смежной части нуклеотидной последовательности молекулы мРНК, образованной во время транскрипции гена ТТН, в том числе мРНК, которая является продуктом процессинга РНК первичного продукта транскрипции.
В данном контексте, термин цепь, содержащая последовательность, относится к олигонуклеотиду, содержащему цепь нуклеотидов, которая описывается последовательностью, ссылающейся на использование стандартной номенклатуры нуклеотидов.
В данном контексте, если нет другого указания, термин комплементарная, при использовании для описания первой нуклеотидной последовательности относительно второй нуклеотидной последовательности, относится к способности олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, гибридизоваться и образовывать дуплексную структуру при определенных условиях с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, как будет понятно квалифицированному в данной области лицу. Такие условия могут быть, например, строгими условиями, где строгие условия могут включать в себя: 400 мМ №01, 40 мМ Р1РЕ8 рН 6,4, 1 мМ ЭДТА, 50 или 70°С в течение 12-16 ч с последующим промыванием. Могут использоваться другие условия, например, физиологически релевантные условия, которые могут встречаться внутри организма. Квалифицированный в данной области специалист будет способен определить набор условий, наиболее подходящих для тестирования комплементарности двух последовательностей в соответствии с конечным применением гибридизуемых нуклеотидов.
Этот тест включает в себя спаривание оснований олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, на протяжении полной длины этой первой и второй нуклеотидной последовательности. Такие последовательности могут называться здесь полностью комплементарными относительно друг друга. Однако, когда первую последовательность называют здесь по существу комплементарной относительно второй последовательности, эти две последовательности могут быть полностью комплементарными, или они могут образовывать одну или несколько, но обычно не более 4, 3 или 2 ошибочно спаренных пар оснований после гибридизации, с сохранением способности гибридизоваться при условиях, наиболее релевантных относительно их конечного применения. Однако, когда два олигонуклеотида конструируют для образования, после гибридизации, одного или нескольких одноцепочечных выступов, такие выступы не должны рассматриваться как ошибочные спаривания в связи с определением комплементарности. Например, дцРНК, содержащая один олигонуклеотид с длиной 21 нуклеотида и другой олигонуклеотид с длиной 23 нуклеотида, причем этот более длинный олигонуклеотид содержит последовательность из 21 нуклеотида, которая полностью комплементарна более короткой последовательности, может все еще называться полностью комплементарной для описанных здесь целей.
Комплементарные последовательности в данном контексте могут также включать в себя, или быть полностью образованы из них, пары оснований не Уотсона-Крика и/или пары оснований, образованные из неприродных и модифицированных нуклеотидов, пока удовлетворяются вышеуказанные требования в отношении их способности гибридизоваться. Такие пары оснований не Уотсона-Крика включают в себя, но не ограничиваются ими, спаривание Ο:ϋ Уоббла или спаривание оснований по Хугстину.
Термины комплементарные, полностью комплементарные и по существу комплементарные
- 7 020312 могут использоваться в данном контексте в отношении спаривания оснований между смысловой цепью и антисмысловой цепью άδΚΝΑ, или между антисмысловой цепью дцРНК и последовательностьюмишенью, как будет понятно из контекста их применения.
В данном контексте, полинуклеотид, который является по существу комплементарным по меньшей мере части мессенджер РНК (мРНК), обозначает полинуклеотид, который является по существу комплементарным смежной (непрерываемой) части представляющей интерес мРНК (например, мРНК, кодирующей ТТК), включающей в себя 5'-ИТК, открытую рамку считывания (ОКБ), или З'-ИТК. Например, полинуклеотид является комплементарным по меньшей мере части мРНК ТТК, если эта последовательность является, по существу, комплементарной непрерываемой части мРНК, кодирующей ТТК.
Термин двухцепочечная РНК или дцРНК относится в данном контексте к комплексу молекул рибонуклеиноых кислот, имеющему дуплексную структуру, содержащую две антипараллельных и по существу комплементарных, как определено выше, цепи нуклеиновых кислот. Обычно большинство нуклеотидов каждой цепи являются рибонуклеотидами, но, как описано подробно здесь, каждая цепь или обе цепи могут также включать в себя по меньшей мере один не-рибонуклеотид, например дезоксирибонуклеотид, и/или модифицированный нуклеотид. Кроме того, в контексте этого описания, дцРНК может включать в себя химические модификации во множественных нуклеотидах, включающие в себя существенные модификации во многих нуклеотидах, и включающие в себя все типы модификаций, описанные здесь или известные в данной области. Любые такие модификации, используемые в молекуле типа δίΚΝΑ. охватываются термином дцРНК для целей этого описания и формулы изобретения.
Две цепи, образующие дуплексную структуру, могут быть различными частями одной большей молекулы РНК, или они могут быть отдельными молекулами РНК. Когда эти две цепи являются частью одной большей молекулы, и, следовательно, соединены непрерываемой цепью нуклеотидов между З'концом одной цепи и 5'-концом соответствующей другой цепи с образованием дуплексной структуры, эту соединяющую РНК-цепь называют шпилечной петлей. Когда эти две цепи соединены ковалентно другим способом, чем непрерываемая цепь нуклеотидов, между З'-концом одной цепи и 5'-концом соответствующей другой цепи с образованием дуплексной структуры, эту соединяющую структуру называют линкером. Эти цепи РНК могут иметь одинаковое или разное число нуклеотидов. Максимальное число пар оснований равно числу нуклеотидов в самой короткой цепи дцРНК минус любые выступы, которые присутствуют в этом дуплексе. Наряду с этой дуплексной структурой, дцРНК может содержать один или несколько нуклеотидных выступов. Термин δίΚΝΑ здесь также относится к дцРНК, описанной выше.
В данном контексте термин нуклеотидный выступ относится к неспаренному нуклеотиду или неспаренным нуклеотидам, которые выступают из дуплексной структуры дцРНК, когда З'-конец одной цепи этой дцРНК простирается за пределы 5'-конца другой цепи, или наоборот. Тупой или тупой конец обозначает, что на конце этой дцРНК не имеются неспаренные нуклеотиды, т.е. ни на одном конце этой молекулы нет нуклеотидного выступа.
Термин антисмысловая цепь относится к цепи дцРНК, которая включает в себя участок, который является по существу комплементарным последовательности-мишени. В данном контексте, термин участок комплементарности относится к участку на антисмысловой цепи, который является, по существу, комплементарным последовательности, например последовательности-мишени, определенной здесь. Когда этот участок комплементарности является не полностью комплементарным этой последовательности-мишени, эти ошибочные спаривания являются наиболее приемлемыми в концевых участках и, если присутствуют, находятся обычно в концевом участке или в концевых участках, например, в пределах 6, 5, 4, 3 или 2 нуклеотидов 5'- и/или З'-конца.
Термин смысловая цепь относится в данном контексте к цепи дцРНК, которая включает в себя участок, который является, по существу, комплементарным участку антисмысловой цепи.
В данном контексте термин 8ΝΑΤΡ относится к стабильной частице нуклеиновая кислота-липид. 8ΝΑΤΡ представляет пузырек из липидов, покрывающий уменьшенное водное пространство, содержащее нуклеиновую кислоту, такую как дцРНК или плазмиду, из которой транскрибируется дцРНК. δΝΑΣΡ описаны, например, в Публикациях заявок на патент США с номерами 200602 40093, 20070135372 и υδδΝ 61/045228, поданными 15 апреля 2008 г. Эти заявки включены здесь посредством ссылки.
Введение в клетку в контексте с дцРНК обозначает облегчение поглощения или абсорбции в эту клетку, как понятно квалифицированным в данной области специалистам. Абсорбция или поглощение дцРНК может осуществляться без посторонней помощи диффузионными или активными клеточными процессами, или при помощи вспомогательных агентов или устройств. Значение этого термина не ограничивается клетками ίη νίίτο; дцРНК может также быть введенной в клетку, где эта клетка является частью живого организма. В таком случае, введение в эту клетку будет включать в себя доставку этому организму. Например, для доставки ίη νίνο дцРНК может быть инъецирована в участок ткани или введена системно. Введение ίη νίίτο в клетку включает в себя способы, известные в данной области, такие как электропорация и липофекция. Дополнительные подходы описаны здесь или известны в данной области.
Термины сайленсинг, ингибирование экспрессии, даун-регуляция (понижающая регуляция) экспрессии, супрессия экспрессии и т.п., когда они относятся к гену ТТК, относятся здесь, по меньшей
- 8 020312 мере, к частичной супрессии экспрессии гена ТТК, которая проявляется уменьшением количества мРНК, которое может быть выделено из первой клетки или группы клеток, в которых транскрибируется ген ТТК и которые были обработаны таким образом, что ген ТТК является ингибированным, в сравнении со второй клеткой или группой клеток, по существу идентичных первой клетке или группе клеток, но которые не были обработаны таким образом (контрольных клеток). Степень ингибирования обычно выражают в виде (мРНК в контрольных клетках) - (мРНК в обработанных клетках -------------------------------------------------------------------------------------------------· 10 0/о (мРНК в контрольных клетках)
Альтернативно, степень ингибирования может выражаться в виде уменьшения параметра, который функционально связан с экспрессией гена ТТК, например в виде количества белка, кодируемого геном ТТК, который секретируется клеткой, или количества клеток, проявляющих определенный фенотип, например апоптоз. В принципе сайленсинг гена ТТК может быть определен в любой клетке, экспрессирующей эту мишень, или конститутивно, или генной инженерией, или любым подходящим анализом. Однако, при необходимости ссылки для определения, ингибирует ли конкретная дцРНК экспрессию гена ТТК в определенной степени и, следовательно, может быть включена в это изобретение, анализы, обеспеченные в примерах ниже, будут обеспечивать такую ссылку.
Например, в некоторых случаях,экспрессия гена ТТК подавляется по меньшей мере приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% введением двухцепочечного олигонуклеотида, описанного в этом изобретении. В некоторых вариантах осуществления, ген ТТК подавляется по меньшей мере приблизительно на 60, 70 или 80% введением двухцепочечного олигонуклеотида, описанного в этом изобретении. В некоторых вариантах осуществления ген ТТК подавляется по меньшей мере приблизительно на 85, 90 или 95% введением двухцепочечного олигонуклеотида, описанного в этом изобретении.
При использовании здесь в контексте экспрессии ТТК, термины лечить, лечение и т.п. относятся к облегчению или ослаблению патологических процессов, опосредуемых экспрессией ТТК. В контексте данного изобретения, когда речь идет о любом из состояний, цитируемых здесь ниже (других, чем патологические процессы, опосредуемые экспрессией ТТК), термины лечить, лечение и т.п. обозначают облегчение или ослабление по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с таким состоянием, или замедление или обращение прогрессирования такого состояния, например, замедление прогрессирования ТТК-амилоидоза, такого как ГЛР. Симптомы ТТК-амилоидоза включают в себя сенсорную невропатию (например, парестезию, гипестезию в дистальных участках конечностей), вегетативную невропатию (например, желудочно-кишечную дисфункцию, такую как язва желудка, или ортостатическую гипотензию), моторную невропатию, припадки, деменцию, миелопатию, полиневропатию, синдром канала запястья, вегетативную недостаточность, кардиомиопатию, помутнения стекловидного тела, почечную недостаточность, нефропатию, существенно пониженный тВМ1 (модифицированный индекс массы тела), дисфункцию черепных нервов и дистрофию корнеальной решетки.
В данном контексте, фразы терапевтически эффективное количество и профилактически эффективное количество относятся к количеству, которое обеспечивает терапевтическую пользу в лечении, предупреждении или излечивании патологических процессов, опосредуемых экспрессией ТТК, или хорошо видимого симптома патологических процессов, опосредуемых экспрессией ТТК. Конкретное количество, которое является терапевтически эффективным, может быть легко определено медицинским работником с обычной квалификацией в данной области и может варьироваться в зависимости от факторов, известных в данной области, таких как, например, тип патологических процессов, опосредуемых экспрессией ТТК, история болезни и возраст пациента, стадия патологических процессов, опосредуемых экспрессией ТТК, и введение других антипатологических агентов процессов, опосредуемых экспрессией ТТК.
В данном контексте, фармацевтическая композиция содержит фармакологически эффективное количество дцРНК и фармацевтически приемлемый носитель. В данном контексте, термины фармакологически эффективное количество, терапевтически эффективное количество или просто эффективное количество относятся к количеству РНК, эффективному для получения предполагаемого фармакологического, терапевтического или превентивного результата. Например, если конкретное клиническое лечение считается эффективным, когда имеется по меньшей мере 25% уменьшение в измеримом параметре, ассоциированном с заболеванием или нарушением, терапевтически эффективное количество лекарственного средства для лечения этого заболевания или нарушения является количеством, необходимым для осуществления по меньшей мере 25% уменьшения в этом параметре. Например, терапевтически эффективное количество дцРНК, поражающей ТТК, может уменьшать уровни ТТК в сыворотке по меньшей мере на 25%. В другом примере, терапевтически эффективное количество дцРНК, поражающей ТТК, может улучшать функцию печени или почечную функцию по меньшей мере на 25%.
Термин фармацевтически приемлемый носитель относится к носителю для введения терапевтического агента. Такие носители включают в себя, но не ограничиваются ими, солевой раствор, забуференный раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их комбинации. Этот термин специфически исключает среду культуры клеток. Для лекарственных средств, вводимых перорально, фармацевтически приемле
- 9 020312 мые носители включают в себя, но не ограничиваются ими, фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как инертные разбавители, дезинтегрирующие агенты, связывающие агенты, смазывающие агенты, подслащивающие агенты, ароматизирующие агенты, красящие агенты и консерванты. Подходящие инертные разбавители включают в себя карбонат натрия и кальция, фосфат натрия и кальция, и лактозу, тогда как кукурузный крахмал и альгиновая кислота являются подходящими дезинтегрирующими агентами. Связывающие агенты могут включать в себя крахмал и желатин, тогда как смазывающими агентами, если они присутствуют, будут обычно стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Если желательно, таблетки могут быть покрыты материалом, таким как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, для задержки абсорбции в желудочно-кишечном тракте.
В данном контексте трансформированной клеткой является клетка, в которую был введен вектор, из которого может быть экспрессирована молекула дцРНК.
II. Двухцепочечная рибонуклеиновая кислота
Как описано более подробно здесь, это изобретение обеспечивает молекулы двухцепочечной рибонуклеиновой кислоты (дцРНК) для ингибирования экспрессии гена ТТН в клетке или млекопитающем, например, в человеке, имеющем ТТН-амилоидоз, где эта молекула дцРНК включает в себя антисмысловую цепь, имеющую участок комплементарности, который является комплементарным по меньшей мере части мРНК, образуемой в экспрессии гена ТТН, и где этот участок комплементарности имеет длину менее 30 нуклеотидов, обычно длину 19-24 нуклеотидов, и где указанная дцРНК, после контакта с клеткой, экспрессирующей указанный ген ТТН, ингибирует экспрессию указанного гена ТТН по меньшей мере на 30%, как анализировано, например, при помощи ПЦР или способа на основе разветвленной ДНК φΌΝΑ), или способа на основе белка, такого как Вестерн-блоттинг. Экспрессия гена ТТН может уменьшаться по меньшей мере на 30% при измерении с использованием анализа, описанного в примерах ниже. Например, экспрессия гена ТТН в культуре клеток, таких как клетки НерЗВ, может анализироваться измерением уровней мРНК ТТН, например, с использованием 6ΌΝΑ- или ТацМап-анализа, или измерением уровней белка, например, с использованием ЕЬ18А-анализа. дцРНК этого изобретения может дополнительно включать в себя один или несколько одноцепочечных нуклеотидных выступов.
дцРНК может быть синтезирована стандартными способами, известными в данной области, дополнительно обсуждаемыми ниже, например, с использованием автоматического ДНК-синтезатора, такого как ДНК-синтезаторы, коммерчески доступные, например, из Бюзеатсй, Аррйеб Вю8у81ет8, 1пс. Эта дцРНК включает в себя две цепи РНК, которые являются достаточно комплементарными, чтобы гибридизоваться с образованием дуплексной структуры. Одна цепь этой дцРНК (антисмысловая цепь) включает в себя участок комплементарности, который является, по существу, комплементарным, и обычно полностью комплементарным, последовательности-мишени, полученной из последовательности мРНК, образованной во время экспрессии гена ТТН, другая цепь (смысловая цепь) включает в себя участок, который является комплементарным этой антисмысловой цепи, так что эти две цепи гибридизуются и образуют дуплексную структуру при объединении при подходящих условиях. Обычно эта дуплексная структура имеет длину между 15 и 30, или между 25 и 30, или между 18 и 25, или между 19 и 24, или между 19 и 21, или 19, 20 пар оснований или 21 пару оснований. В одном варианте осуществления дуплекс имеет длину 19 пар оснований. В другом варианте осуществления дуплекс имеет длину 21 пару оснований. При использовании двух разных 8ΪΗΝΑ в комбинации, длины этого дуплекса могут быть одинаковыми или могут различаться.
Каждая цепь дцРНК эти имеет обычно длину между 15 и 30 или между 18 и 25, или 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов. В других вариантах осуществления каждая цепь имеет длину 25-30 нуклеотидов. Каждая цепь этого дуплекса может иметь одну и ту же длину или эти цепи могут иметь разную длину.
При использовании двух различных δίΚΝΑ в комбинации, длины каждой цепи каждой δίΕΝΑ могут быть одинаковыми или могут различаться.
дцРНК этого изобретения может включать в себя один или несколько одноцепочечных выступов из одного или нескольких нуклеотидов. В одном варианте осуществления по меньшей мере один конец этой дцРНК имеет одноцепочечный нуклеотидный выступ из 1-4, обычно 1 или 2 нуклеотидов. В другом варианте осуществления, антисмысловая цепь дцРНК имеет содержащие 1-10 нуклеотидов выступы за 3'концом и 5'-концом смысловой цепи. В других вариантах осуществления, смысловая цепь этой дцРНК имеет содержащие 1-10 нуклеотидов выступы за 3'-концом и 5'-концом антисмысловой цепи.
дцРНК, имеющая содержащий по меньшей мере один нуклеотид выступ, может иметь неожиданно лучшие ингибирующие свойства, чем ее имеющая тупые концы копия. В некоторых вариантах осуществления, присутствие только одного выступа нуклеотидов усиливает активность интерференции этой дцРНК, без влияния на ее общую стабильность. Было показано, что дцРНК, имеющая только один выступ, была особенно стабильной и эффективной ίη νίνο, а также в различных клетках, средах для культуры клеток, крови и сыворотке. Обычно одноцепочечный выступ локализован на 3'-конце антисмысловой цепи или, альтернативно, на 3'-конце смысловой цепи. Эта дцРНК может также иметь тупой конец, обычно расположенный на 5'-конце антисмысловой цепи. Такая дцРНК может иметь улучшенную стабильность и улучшенную ингибирующую активность, что позволяет введение в низких дозах, т.е. менее
- 10 020312 мг/кг массы тела реципиента в день. Обычно, антисмысловая цепь дцРНК имеет выступ нуклеотидов на 3'-конце, а 5'-конец является тупым. В другом варианте осуществления один или несколько нуклеотидов в этом выступе заменены нуклеозидтиофосфатом.
В одном варианте осуществления геном ТТН является ген ТТН человека. В конкретных вариантах осуществления смысловая цепь этой дцРНК является одной из смысловых последовательностей из табл. 3А, 3В, 4, 6А, 6В или 7, и антисмысловая цепь является одной из антисмысловых последовательностей таблиц 3А, 3В, 4, 6А, 6В или 7. Альтернативные антисмысловые агенты, которые действуют в другом месте в последовательности-мишени, обеспеченной в табл. 3А, 3В, 4, 6А, 6В или 7, могут быть легко определены с использованием последовательности-мишени и фланкирующей последовательности ТТН.
Квалифицированному в данной области специалисту хорошо известно, что дцРНК, имеющая дуплексную структуру из 20-23, но особенно из 21 пар оснований, приветствовались в качестве особенно эффективных в индуцировании интерференции РНК (Е1Ьа§Ыт с1 а1., ЕМВО 2001, 20:6877-6888). Однако другие авторы нашли, что более короткие или более длинные дцРНК могут быть также эффективными. В вышеописанных вариантах осуществления, благодаря природе олигонуклеотидных последовательностей, обеспеченных в табл. 3А, 3В, 4, 6А, 6В и 7, дцРНК, описанные в этом изобретении, могут включать в себя по меньшей мере одну цепь с описанной здесь длиной. Не без оснований можно ожидать, что более короткие дцРНК, имеющие одну из последовательностей табл. 3А, 3В, 4, 6А, 6В или 7, минус только несколько нуклеотидов на одном или на обоих концах, могут быть сходным образом эффективными в сравнении с вышеописанными дцРНК. Таким образом, данное изобретение рассматривает также дцРНК, имеющие частичную последовательность по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более смежных (непрерываемых) нуклеотидов из одной из последовательностей табл. 3, 4, 6 или 7, и отличающиеся по их способности ингибировать экспрессию гена ТТН в анализе, описанном здесь ниже, не более, чем на 5, 10, 15, 20, 25 или 30% ингибирования от дцРНК, содержащей полную последовательность. Кроме того, дцРНК, которая расщепляет в желаемой последовательности-мишени ТТН, может быть легко получена с использованием соответствующей антисмысловой последовательности ТТН и комплементарной смысловой последовательности.
Кроме того, дцРНК, обеспеченные в табл. 3А, 3В, 4, 6А, 6В или 7, идентифицируют сайт в ТТН, который является чувствительным к расщеплению, основанному на ΗΝΑί. Вследствие этого данное изобретение дополнительно описывает дцРНК, которые поражают в пределах последовательности, являющейся мишенью одного из агентов данного изобретения. В данном контексте считается, что вторая дцРНК наносит удар в пределах последовательности первой дцРНК, если эта вторая дцРНК расщепляет мРНК в любом месте в пределах мРНК, которая является комплементарной антисмысловой цепи первой дцРНК. Такая вторая дцРНК будет обычно состоять по меньшей мере из 15 смежных нуклеотидов из одной из последовательностей, обеспеченных в таблицах 3А, 3В, 4, 6А, 6В или 7, связанных с дополнительными нуклеотидными последовательностями, взятыми из участка, смежного с выбранной последовательностью в гене ТТН.
дцРНК, описанная в этом изобретении, может содержать одно или несколько ошибочных спариваний с последовательностью-мишенью. В одном варианте осуществления, дцРНК, описанная в этом изобретении, содержит не более 3 ошибочных спариваний. Если антисмысловая цепь этой дцРНК содержит ошибочные спаривания с последовательностью-мишенью, предпочтительно, чтобы зона ошибочного спаривания не была расположена в центре участка комплементарности. Если антисмысловая цепь этой дцРНК содержит ошибочные спаривания с последовательностью-мишенью, предпочтительно, чтобы это ошибочное спаривание было ограничено 5 нуклеотидами от любого конца, например, 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотидами из любого 5'- или 3'-конца участка комплементарности. Например, для цепи дцРНК из 23 нуклеотидов, которая является комплементарной участку гена ТТН, эта дцРНК не содержит никакого ошибочного спаривания в пределах 13 центральных нуклеотидов. Способы, описанные в этом изобретении, могут быть использованы для определения, является ли дцРНК, содержащая ошибочное спаривание с последовательностью-мишенью, эффективной в ингибировании экспрессии гена ТТН. Рассмотрение эффективности дцРНК с ошибочными спариваниями в ингибировании экспрессии ТТН является важным, особенно, если известно, что этот конкретный участок комплементарности в гене ТТН имеет полиморфную вариацию последовательности в этой популяции.
Модификации
Еще в одном варианте осуществления дцРНК модифицируют химически для увеличения стабильности. Нуклеиновые кислоты, описанные в этом изобретении, могут быть синтезированы и/или модифицированы способами, хорошо установившимися в данной области, такими как описанные в СиггсШ рго1оеок ίη пис1е1с ас1й ейстМгу. Веаисаде, 8. Ь. е1 а1. (Ей§.) А 1ойп \УПеу & 8оп§, 1пс., Νο\ν Уотк, ΝΥ, И8А, которые включены здесь посредством ссылки. Конкретные примеры соединений дцРНК, применимых в этом изобретении, включают в себя дцРНК, содержащие модифицированные скелеты молекул или не природно-встречающиеся межнуклеозидные связи. Как определено в этом описании, дцРНК, имеющие модифицированные скелеты молекул, включают в себя дцРНК, которые сохраняют атом фосфора в этом скелете и которые не имеют атома фосфора в этом скелете. Для целей этого описания, и, как иногда указывается в данной области, модифицированные дцРНК, которые не имеют атома фосфора в их межнук
- 11 020312 леозидном скелете, могут также рассматриваться как олигонуклеозиды.
Модифицированные молекулярные скелеты дцРНК включают в себя, например, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфоротриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другой алкилфосфонаты, включающие в себя 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включающие в себя 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, имеющие нормальные 3'-5'-связи, их 2'-5'-связанные аналоги, и имеющие обращенную полярность, при которой смежные пары нуклеозидных звеньев связаны 3'-5' - 5'-3' или 2'-5' - 5'-2'. В изобретение включены также смешанные соли и формы свободных кислот.
Репрезентативные Патенты США, которые описывают получение вышеуказанных фосфорсодержащих связей, включают в себя, но не ограничиваются ими, Патенты США с номерами 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177195; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541316; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361 и 5625050, каждый из которых включен здесь посредством ссылки.
Модифицированные скелеты дцРНК, которые не содержат атома фосфора, имеют скелеты, которые образованы алкильными (с короткой цепью) или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомами и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями или одной или несколькими имеющими короткие цепи гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают в себя скелеты, имеющие морфолиносвязи (образованные частично из сахарной части нуклеозида); силоксановые скелеты; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые скелеты; формацетил- и тиоформацетил-скелеты; метиленформацетил- и тиоформацетил-скелеты; алкенсодержащие скелеты; сульфаматные скелеты; метиленимино- и метиленгидразиноскелеты; сульфонатные и сульфонамидные скелеты; амидные скелеты и другие, имеющие смешанные части Ν-, О-, 8- и СН2компонентов.
Репрезентативные патенты США, которые описывают получение вышеуказанных олигонуклеозидов, включают в себя, но не ограничиваются ими, Патенты США с номерами 5034506; 5166315; 5185444; 5,214,134; 5216141; 5235033; 564562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437 и 5677439, каждый из которых включен здесь посредством ссылки.
В других подходящих миметиках дцРНК как сахар, так и межнуклеозидная связь, т.е. скелет, нуклеотидных звеньев заменены новыми группами. Звенья оснований сохраняются для гибридизации с подходящим соединением-мишенью нуклеиновой кислоты. Одно такое олигомерное соединение, миметик дцРНК, который, как было показано, имеет превосходные свойства гибридизации, называют пептиднуклеиновой кислотой (ПНК). В соединениях ПНК, сахарный скелет дцРНК заменен амидсодержащим скелетом, в частности, аминоэтилглициновым скелетом.
Нуклеооснования сохраняются и связываются прямо или опосредованно с атомами азогруппы амидной части этого скелета. Репрезентативные Патенты США, которые описывают получение соединений ПНК, включают в себя, но не ограничиваются ими, Патенты США с номерами 5539082; 5714331 и 5719262, каждый из которых включен здесь посредством ссылки. Дополнительное описание соединений ПНК может быть найдено в №екеп е1 а1., 8е1еисе, 1991, 254, 1497-1500.
Другими вариантами этого изобретения являются дцРНК с фосфоротиоатными скелетами и олигонуклеозидами с гетероатомными скелетами, и, в частности, -ΟΗ2-ΝΗ-ΟΗ2-, -ΟΗ2-Ν (СН3) -О-СН2[известными как метилен-(метиламино-) или ΜΜΙ-скелет], -Ο42-Ο-Ν(0Η3)-0Η2-, -ΟΗ2-Ν(ΟΗ3)-Ν(ΟΗ3)ΟΗ2- и -Ν (СН3)-СН2-СН2- [где природный фосфодиэфирный скелет представлен как -О-Р-О-СН2-] цитируемого выше патента США № 5489677, и амидные скелеты цитируемого выше патента США № 5602240. Предпочтительными также являются дцРНК, имеющие структуры морфолиноскелета, цитируемого выше патента США № 5034506.
Модифицированные дцРНК могут также содержать одну или несколько замененных сахарных частей. Предпочтительные дцРНК содержат одну из следующих групп в 2'-положении: ОН; Р; О-, 8-или Νалкил; О-, 8- или Ν-алкенил; О-, 8- или Ν-алкинил; или О-алкил-О-алкил, где эти алкил, алкенил и алкинил могут быть замещенными или незамещенными С1-С10-алкилом или С2-С]0 алкенилом или -алкинилом. Особенно предпочтительными являются Ο[(СΗ2)ηΟ]тСΗ3, О^^^Щ
Ο(СΗ2)пСΗ3, Ο(СΗ2)пΟNΗ2, и О(СН2)пΟN[(СН2)пСΗ3)]2, где п и т являются 1 - приблизительно 10. Другие предпочтительные дцРНК содержат одну из следующих групп в 2'-положении: низший Ц-Сю-алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил, 8Η, 8ΟΗ3. ОСИ, С1, Вг, ΟΝ, СР3, ОСР3, 8ОСЩ 8Ο2СΗ3, ΟNΟ2, NΟ2, Ν3, ΝΗ2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, РНК-расщепляющую группу, репортерную группу, интеркалят, группу для улучшения фармакокинетических свойств дцРНК или группу для улучшения фармакодинамических свойств дцРНК и другие заместители, имеющие сходные свойства. Одна предпочтительная модификация включает в себя 2'-метоксиэтокси (2'-О-СН2СН2ОСН3, также известную как 2'-О-(2метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (Магйп е1 а1., Шк. СЫт. Ас1а, 1995, 78, 486-504), т.е., алкоксиалкоксигруппу. Одна дополнительная предпочтительная модификация включает в себя 2'-диметиламинооксиэтокси, т.е.,
- 12 020312 группу О(СН2)2ОМ(СНз)2, также известную как 2'-ΌΜΑΟΕ, описанную здесь в примерах ниже, и 2'диметиламиноэтоксиэтокси (также известную в данной области как 2'-О-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-ΌΜΑΕΟΕ), т.е., 2'-О-СН2-О-СН2-Ы(СН2)2, также описанную здесь в примерах ниже.
Другие предпочтительные модификации включают в себя 2'-метокси (2'-ОСН3), 2'-аминопропокси (2'-ОСН2СН2СН2ХН2) и 2'-фтор (2'-Е). Сходные модификации могут быть также произведены в других положениях на дцРНК, в частности З'-положении сахара на З'-концевом нуклеотиде или в 2'-5'-связанных дцРНК и 5'-положении 5'-концевого нуклеотида. дцРНК могут также иметь сахарные миметики, такие как циклобутильные группы вместо пентофуранозильного сахара. Репрезентативные патенты США, которые описывают получение таких модифицированных сахарных структур, включают в себя, но не ограничиваются ими, патенты США с номерами 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633 и 5700920, некоторые из которых находятся в общем владении с данной заявкой и каждый из которых включен здесь посредством ссылки в его полном объеме.
дцРНК могут также включать в себя модификации и замены нуклеооснования (часто называемого в данной области просто основанием). В данном контексте, немодифицированные или природные нуклеооснования включают в себя пуриновые основания аденин (А) и гуанин (С) и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (И). Модифицированные нуклеооснования включают в себя другие синтетические и природные нуклеооснования, такие как 5-метилцитозин (5-те-С), 5гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метилпроизводное и другие алкилпроизводные аденина и гуанина, 2-пропилпроизводное и другие алкилпроизводные аденина и гуанина, 2тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и -цитозин, 5-пропинилурацил и -цитозин, 6азоурацил, -цитозин и -тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, в частности, 5-бром-, 5трифторметил- и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Дополнительные нуклеооснования включают в себя нуклеооснования, описанные в Патенте США № 3687808, нуклеооснования, описанные в Соис1ве Еисус1орек1а О! Ро1утег 8с1еисе Аик Еидшеекид, радев 858-859, КтовскМй 1. Ь., ек. .Токи ХУПеу & 8оив, 1990, нуклеооснования, описанные ЕидНвск е! а1, Аидетаик!е Скет1е, [гИетакошк Екйюи, 1991, 30, 613, и нуклеооснования, описанные 8аидку1 Υ 8., Скар!ег 15, ЭвВΝΑ Вевеагск аик Аррксайоив, радев 289-302, Сгооке 8. Т. аик ЬеЫеи В., Ек., СВС Ргевв, 1993. Некоторые из этих нуклеооснований являются особенно применимыми для увеличения аффинности связывания олигомерных соединений, описанных в этом изобретении. Они включают в себя 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и Ν-2, Ν-6 и О-6 замещенные пурины, включающие в себя 2аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что замены 5метилцитозином увеличивают стабильность дуплекса нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°С. (8аидку1, Υ. 8., Сгооке, 8. Т. аик ЬеЫеи, В., Екв., ΌβΚΝΑ Вевеагск аик Аррксакоив, СВС Ргевв, Воса Ва!ои, 1993, рр. 276278) и являются примерами замен оснований, даже более предпочтительными при объединении с 2'-Ометоксиэтильными модификациями сахара.
Репрезентативные Патенты США, которые описывают получение некоторых из вышеуказанных модифицированных нуклеооснований, а также других модифицированных нуклеооснований, включают в себя, но не ограничиваются ими, вышеупомянутый патент США № 3687808, а также патенты США с номерами 4845205; 513030; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121, 5596091; 5614617 и 5681941, каждый из которых включен здесь посредством ссылки и патент США № 5750692, также включенный здесь посредством ссылки.
Конъюгаты
Другая модификация дцРНК этого изобретения включает в себя химическое связывание с дцРНК одной или нескольких частиц или конъюгатов, которые усиливают их активность, клеточное распределение или клеточное поглощение дцРНК. Такие частицы включают в себя, но не ограничиваются ими, липидные частицы, такие как частица холестерина (Ье!втдет е! а1., Ргос. №!1. Ас1к. 8ск И8А, 1989, 86: 6553-6556), холевую кислоту (Маиокагаи е! а1, Вютд. Мек. Скет. Ье!., 1994, 4:1053-1060), простой тиоэфир, например, гексил-8-тритилтиол (Маиокагаи е! а1., Аии. Ν.Υ. Асак. 8ск, 1992, 660:306-309; Маиокагаи е! а1., Вютд. Мек. Скет. Ье!., 1993, 3:2765-2770), тиохолестерин (Океткаивет е! а1., Νϋθ1. Ас1кв Вев., 1992, 20:533-538), алифатическую цепь, например, додекандиол или ундецильные остатки (8а1воиВектоагав е! а1, ЕМВО 1, 1991, 10:1111-1118; Какаиоу е! а1., ЕЕВ8 Ьей., 1990, 259:327-330; 8ушатскик е! а1, Вюск1т1е, 1993, 75:49-54), фосфолипид, например, дигексадецил-гас-глицерин или 1,2-ди-Огексадецил-гас-глицеро-3-Н-фосфонат триэтиламмония (Маиокагаи е! а1, Тейакектои Ье!!., 1995, 36:36513654; 8кеа е! а1, Νϋθ1. Ас1кв Вев., 1990, 18:3777-3783), цепь полиамина или полиэтиленгликоля (Маиокагаи е! а1, Иис1еов1кев & Хис1ео1|кев, 1995, 14:969-973) или адамантануксусную кислоту (Маиокагаи е! а1., Те!гакекгои Ьей., 1995, 36:3651-3654), пальмитильную группу (М1вкга е! а1., Вюск1т. Вюркув. Ас!а, 1995, 1264:229-237) или октадециламин или гексиламино-карбонилоксихолинстериновую группу (Сгооке е! а1., 1. Ркагтасо1. Ехр. Ткег., 1996, 277:923-937).
Репрезентативные патенты США, которые описывают получение таких конъюгатов дцРНК, вклю- 13 020312 чают в себя, но не ограничиваются ими, патенты США с номерами 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717, 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603;
5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335;
4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506;
5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785;
5565552; 5567810; 5574142; 5,585,481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941, каждый из которых включен здесь посредством ссылки.
Необязательно, чтобы все положения в конкретном соединении были однородно модифицированы, и фактически более одной из вышеупомянутых модификаций могут быть включены в отдельном соединении или даже в отдельном нуклеозиде в дцРНК. Данное изобретение включает в себя также дцНКсоединения, которые являются химерными соединениями. Химерные дцРНК-соединения, или химеры, являются в контексте этого изобретения дцРНК-соединениями, в частности, дцРНК, которые содержат два или более химически различных участков, каждый из которых построен по меньшей мере из одного мономерного звена, т.е. нуклеотида, в случае дцРНК-соединения. Эти дцРНК обычно содержат по меньшей мере один участок, в котором эта дцРНК является модифицированной для придания этой дцРНК устойчивости к нуклеазной деградации, увеличенного клеточного поглощения и/или увеличенной аффинности связывания в отношении нуклеиновой кислоты-мишени. Дополнительный участок этой дцРНК может служить в качестве субстрата для ферментов, способных расщеплять гибриды РНК-ДНК или РНК-РНК. В качестве примера, РНКаза Н является клеточной эндонуклеазой, которая расщепляет РНК-цепь дуплекса РНК-ДНК. Таким образом, активация РНКазы Н приводит к расщеплению РНКмишени, увеличивая посредством этого в значительной степени эффективность ингибирования дцРНК экспрессии генов. В результате, сравнимые результаты могут быть часто получены с более короткими дцРНК при использовании химерных дцРНК, в сравнении с фосфоротиоатными деокси-дцРНК, гибридизующимися с тем же самым участком-мишенью.
Расщепление РНК-мишени может быть детектировано рутинным образом при помощи гельэлектрофореза и, если необходимо, ассоциированными способами гибридизации, известными в данной области. Сайт расщепления на мРНК-мишени дцРНК может быть определен с использованием способов, обычно известных специалисту с обычной квалификацией в данной области, например, способ 5'-НАСЕ, описанный в статье 8ои1ксНск с! а1., №1игс; 2004, νοί. 432, рр. 173-178 (которая включена здесь посредством ссылки для всех целей). В одном варианте осуществления, с использованием способа 5'-К.АСЕ, описанного 8ои1кс11ск с! а1., было определено, что ΑΕΝ-18328 расщепляет мРНК ТТН между нуклеотидом гуанином в положении 636 8ЕО ΙΌ N0:1331 (ΝΜ_000371.3) и нуклеотидом аденином в положении 637 8ЕО ΙΌ N0:1331. В одном варианте осуществления было определено, что ΑΕΝ-18328 действительно расщепляет мРНК ТТН между нуклеотидом аденином в положении 637 8ЕО ΙΌ N0:1331 и нуклеотидом гуанином в положении 638 8ЕО ΙΌ N0:1331.
В некоторых случаях, дцРНК может быть модифицирована не являющейся лигандом группой. Некоторое число не-лигандных молекул конъюгировали с дцРНК для усиления активности, клеточного распределения и клеточного поглощения этой дцРНК, и процедуры для выполнения таких конъюгаций доступны в научной литературе. Такие не-лигандные части молекулы включали в себя липидные частицы, такие как холестерин (ЬсШидст с! а1., Ргос. №11. Асай. 8ск И8А, 1989, 86:6553), холевую кислоту (МапоНагап с! а1., Вюотд. Мсй. СНст. Ьс!!., 1994, 4:1053), простой тиоэфир, например, гексил-8тритилтиол (МапоНагап с! а1., Апп. КУ. Асай. 8ск, 1992, 660:306; МапоНагап с! а1., Вюотд. Мсй. СНст. Ьс!., 1993, 3:2765), тиохолестерин (0ЬсгНаиксг с! а1., N^1. Аайк Иск., 1992, 20:533), алифатическую цепь, например, додекандиол или ундецильные остатки (8а1коп-ВсНтоатак с! а1., ЕМВ0 1, 1991, 10:1111-1118; ΚаЬаηον с! а1, ЕЕВ8 Ьс!!., 1990, 259:327-330; 8\'шагс1шк с! а1., ВюсЫшк, 1993, 75:49-54), фосфолипид, например, дигексадецил-гас-глицерин или 1,2-ди-О-гексадецил-гас-глицеро-3-Н-фосфонат триэтиламмония (МапоНагап с! а1., Тс!гаНсйгоп Ьс!!., 1995, 36:3651-3654; 8Нса с! а1., №с1. Ас1йк Иск., 1990, 18:37773783), цепь полиамина или полиэтиленгликоля (МапоНагап с! а1, №с1сок1йск & №с1соййск, 1995, 14:969973) или адамантануксусную кислоту (МапоНагап с! а1., Тс1гаНсйгоп ЬсН., 1995, 36:3651-3654), пальмитильную группу (М1кНга с! а1., ВюсЫш. ВюрНук. Ас!а, 1995, 1264:229-237) или октадециламин или гексиламинокарбонилоксихолестериновую группу (Сгоокс с! а1., 1. РНагтасо1. Ехр. ТНсг., 1996, 277:923-937). Репрезентативные Патенты США, которые описывают получение таких конъюгатов дцРНК, были перечислены выше. Типичные протоколы конъюгации включают в себя синтез дцРНК, несущих аминолинкер в одном или нескольких положениях этой последовательности. Затем эта аминогруппа реагирует с молекулой, конъюгированной с использованием подходящих реагентов связывания или активации. Эта реакция конъюгации может проводиться или с дцРНК, все еще связанной с твердой подложкой, или после отщепления этой дцРНК в фазу раствора. Очистка этого дцРНК-конъюгата при помощи ВЖХ обычно дает чистый конъюгат.
Кодируемые вектором дцРНК
В другом аспекте, молекулы дцРНК ТТН экспрессируются из транскрипционных единиц, инсертированных в ДНК- или РНК-векторы (см., например, Сои!игс А. с! а1., ТЮ. (1996), 12:5-10; 8кй1стп, А., с! а1, 1п!ста!юпа1 РСТ РиЬНсайоп №. \У0 00/22113, Сопгай, 1и!стпайопа1 РСТ РиЬ11са!юи №. \¥0 00/22114,
- 14 020312 и Сопгаб. и.8. Ра!. Νο. 6,054,299). Эти трансгены могут быть введены в виде линейной конструкции, кольцевой плазмиды или вирусного вектора, которые могут быть включены и унаследованы в виде трансгена, интегрированного в геном хозяина. Этот трансген может быть также сконструирован таким образом, что он может наследоваться в виде внехромосомной плазмиды. (Сакктапп, е! а1, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А (1995) 92:1292).
Отдельные цепи дцРНК могут транскрибироваться промоторами на двух отдельных экспрессионных (экспрессирующих) векторах и котрансфицироваться в клетку-мишень. Альтернативно, каждая отдельная цепь дцРНК может быть экспрессирована промоторами, оба из которых расположены на одной и той же экспрессионной плазмиде. В одном варианте осуществления, дцРНК экспрессируется в виде инвертированного повтора, присоединенного линкерной полинуклеотидной последовательностью, так что эта дцРНК имеет структуру стебля и петли.
Рекомбинантные экспрессионные векторы дцРНК являются обычно ДНК-плазмидами или вирусными векторами. Экспрессирующие дцРНК вирусные векторы могут быть сконструированы на основе аденоассоциированного вируса (но не только) (в отношении обзора см. Михусхка е! а1., Сигг. Торюк М1сго. 1ттипо1. (1992) 158:97-129)); аденовируса (см., например, Гог ехатр1е, Вегкпег, е! а1., ВюТесЬтциек (1998) 6:616), НокепГе1б е! а1. (1991, 8с1епсе 252:431-434) и НокепГе1б е! а1. (1992), Се11 68:143-155)); или альфавируса, а также других вирусов, известных в данной области. Ретровирусы использовали для введения различных генов во многие различные типы клеток, в том числе эпителиальных клеток, ίη νίΙΐΌ и/или ίη у1уо (см., например, Едббк, е! а1., 8аепсе (1985) 230: 1395-1398; Бапок апб МиШдап, Ргос. №ι!1. Асаб. 8с1. И8А (1998) 85:6460-6464; АПкоп е! а1., 1988, Ргос. №аб. Асаб. 8ά. И8А 85:3014-3018; Агтеп!апо е! а1., 1990, Ргос. №П1. Асаб. 8ст И8А 87:61416145; НиЬег е! а1., 1991, Ргос. №П1. Асаб. 8с1. И8А 88:8039-8043; Ееггу е! а1., 1991, Ргос. №а!1. Асаб. 8ск И8А 88:8377-8381; С1ю\\б1шгу е! а1., 1991, 8с1епсе 254:1802-1805; уап ВеикесЬет. е! а1., 1992, Ргос. №а!1. Асаб. 8сЬ И8А 89:7640-19; Кау е! а1., 1992, Нитап Сепе ТЬегару 3:641-647; Ба1 е! а1., 1992, Ргос. №ι!1. Асаб. 8с1. И8А 89:10892-10895; Н\\п е! а1., 1993, 1. 1ттипо1. 150:4104-4115; Патент США № 4868116; Патент США № 4980286; РСТ Заявка АО 89/07136; РСТ Заявка АО 89/02468; РСТ Заявка АО 89/05345 и РСТ Заявка АО 92/07573). Рекомбинантные аденовирусные векторы, способные трансдуцировать и экспрессировать гены, инсертированные в геном клетки, могут быть получены трансфекцией рекомбинантного ретровирусного генома в подходящие упаковывающие клеточные линии, такие как РА317 и Р81-СН1Р (Соте!!е е! а1., 1991, Нитап Сепе ТЬегару 2:510; Сопе е! а1., 1984, Ргос. №111. Асаб. 8ст И8А 81:6349). Рекомбинантные аденовирусные векторы могут быть использованы для инфицирования большого разнообразия клеток и тканей в восприимчивых хозяевах (например, крысе, хомячке, собаке и шимпанзе) (Нки е! а1., 1992, ί. 1пГесбои8 Б18еа8е, 166:769), а также имеют преимущество, заключающееся в том, что для инфицирования не требуются митотически активные клетки.
Может быть использован любой вирусный вектор, способный акцептировать кодирующие последовательности для молекулы (молекул) дцРНК, подлежащие экспрессии, например, векторы, произведенные из аденовируса (АУ); аденоассоциированного вируса (ААУ); ретровируса (например, лентивирусов (ЬУ), рабдовирусов, вируса мышиного лейкоза); герпес-вируса и т.п. Тропизм вирусных векторов может быть модифицирован псевдотипированием (упаковкой) этих векторов белками оболочки или другими поверхностными антигенами из других вирусов или заменой различных белков вирусного капсида, соответственно.
Например, лентивирусные векторы, описанные в этом изобретении, могут быть псевдотипированы поверхностными белками из вируса везикулярного стоматита (У8У), вируса бешенства, вируса Эбола, вируса Мокола и т.п. ААУ-векторы, описанные в этом изобретении, могут быть нацелены на различные клетки-мишени конструированием векторов для экспрессии различных серотипов капсидных белков. Например, ААМ-вектор, экспрессирующий капсид серотипа 2 на геноме серотипа 2, назван ААУ 2/2. Этот ген капсида серотипа 2 в векторе ААУ 2/2 может быть заменен геном капсида серотипа 5 с получением вектора ААУ 2/5. Способы конструирования векторов ААУ, которые экспрессируют различные серотипы капсидных белков, находятся в пределах квалификации в данной области; см., например, статью РаЬто\\'Ц/ I Ε е! а1. (2002), ί У1го1 76:791-801, все описание которой включено здесь посредством ссылки.
Селекция (отбор) рекомбинантных вирусных векторов, подходящих для применения в этом изобретении, способы для инсертирования последовательностей нуклеиновых кислот для экспрессии дцРНК в вектор и способы доставки вирусного вектора в представляющие интерес клетки находятся в рамках квалификации в данной области. См., например, БотпЬитд Н (1995), Сепе ТЬегар. 2: 301-310; ЕдШтк М А (1988), Вю1ес11пк.|ие8 6: 608-614; М111ег А Б (1990), Нит Сепе ТЬегар. 1: 5-14; Апбегкоп А Г (1998), №а!иге 392: 25-30 и НиЫпкоп Б А е! а1., №а!. Сепе!. 33: 401-406, полные описания которых включены здесь посредством ссылки.
Вирусные векторы могут быть получены из АУ и ААУ. В одном варианте осуществления дцРНК, описанная в этом изобретении, экспрессируется в виде двух отдельных, комплементарных одноцепочечных молекул РНК из рекомбинантного ААУ-вектора, имеющего, например, промоторы РНК И6 или Н1 или промотор цитомегаловируса (СМУ).
- 15 020312
Подходящий АУ-вектор для экспрессии дцРНК, описанной в этом изобретении, способ конструирования рекомбинантного АУ-вектора и способ доставки этого вектора в клетки-мишени описаны в Х1а Н е! а1. (2002), №ΐ. ВЫесЬ. 20: 1006-1010.
Подходящие ААУ-векторы для экспрессии дцРНК, описанной в этом изобретении, способы конструирования рекомбинантного ААУ-вектора и способ доставки этого вектора в клетки-мишени описаны в 8ати15к1 К е! а1. (1987), 1. У1го1. 61: З096-З101; И8Ьег К 1 е! а1. (1996), 1. У1го1, 70: 520-5З2; 8ати15к1 К е! а1. (1989), 1. У1го1. 6З: З822-З826; Патенте США № 5,252,479; Патенте США № 51З9941; Международной заявке на патент № \¥О 94/1З788 и Международной заявке на патент № \¥О 9З/24641, полные описания которых включены здесь посредством ссылки.
Промотор, запускающий экспрессию дцРНК либо в ДНК-плазмиде, либо в вирусном векторе, описанных в этом изобретении, может быть эукариотическим промотором РНК-полимеразы I (например, промотором рибосомной РНК), РНК-полимеразы II (например, ранним промотором СМУ или промотором актина или промотором И1 8ηКNΑ) или обычно промотором РНК-полимеразы III (например, промотором РНК И6 $пЖА или 78К РНК) или прокариотическим промотором; например, промотор Т7, обеспечиваемый экспрессионной плазмидой, кодирует также РНК-полимеразу Т7, необходимую для транскрипции от промотора Т7 . Этот промотор может также управлять экспрессией трансгена в поджелудочную железу (см., например, регуляторную последовательность инсулина для поджелудочной железы (ВиссЫш е! а1., 1986, Ргос. Nа^1. Асаб. 8ά. И8А 8З:2511-2515)).
Кроме того, экспрессия трансгена может точно регулироваться, например, с использованием индуцируемой регуляторной последовательности и экспрессионных систем, таких как регуляторная последовательность, которая чувствительна к некоторым физиологическим регуляторам, например, уровням циркуляции глюкозы или гормонам (ЭосНеПу е1 а1., 1994, РА8ЕВ 1. 8:20-24). Такие индуцируемые экспрессионные системы, подходящие для регуляции экспрессии трансгенов в клетках или в млекопитающих, включают в себя регуляцию экдизоном, эстрогеном, прогестероном, тетрациклином, химическими индукторами димеризации и изопропил-бета-01-тиогалактопиранозидом (ЕРТС). Специалист с квалиификацией в данной области будет способен выбрать подходящую регуляторную/промоторную последовательность на основе предполагаемого применения трансгена дцРНК.
Обычно, рекомбинантные векторы, способные экспрессировать молекулы дцРНК, доставляются, как описано ниже, и продолжают существовать в клетках-мишенях. Альтернативно, могут быть использованы вирусные векторы, которые обеспечивают транзиторную экспрессию молекул дцРНК. Такие векторы могут вводиться повторно в случае необходимости. После экспрессии, эти дцРНК связываются с РНК-мишенью и модулируют ее функцию или экспрессию. Доставка дцРНК-экспрессирующих векторов может быть системной, например, внутривенным или внутримышечным введением, введением в клеткимишени, эксплантируемые из пациента, с последующим повторным введением в этого пациента, или любым другим способом, который позволяет введение в желаемую клетку-мишень.
Экспрессирующие дцРНК ДНК-плазмиды обычно трансфицируют в клетки-мишени в виде комплекса с катионоактивными липидными носителями (например, олигофектамином) или носителями на основе некатионоактивного липида (например, ТгапкД-ТКО™).
Множественные липидные трансфекции для дцРНК-опосредованных нокдаунов, поражающих различные участки единственного гена ТТК или множественных генов ТТК, на протяжении периода одной недели или более также рассматриваются этим изобретением. Успешное введение векторов в клеткихозяева может подвергаться мониторингу с использованием различных известных способов. Например, транзиторная трансфекция может сигнализироваться репортером, таким как флуоресцентный маркер, такой как зеленый флуоресцентный белок (СРР). Стабильная трансфекция клеток ех у1уо может обеспечиваться с использованием маркеров, которые обеспечивает трансфицированная клетка, с устойчивостью к конкретным факторам окружающей среды (например, антибиотикам и лекарственным средствам), такой как устойчивость к гигромицину В.
ТТК-специфические молекулы дцРНК могут быть также инсертированы в векторы и использованы в качестве векторов генной терапии для пациентов-людей. Векторы генной терапии могут доставляться субъекту, например, внутривенной инъекцией, локальным введением (см. Патент США № 5З28470) или стереотаксической инъекцией (см., например, СНеп е! а1. (1994) Ргос. №И. Асаб. δα. И8А 91:З054-З057). Фармацевтический препарат вектора генной терапии может включать в себя вектор генной терапии в приемлемом растворителе или может включать в себя матрикс медленного высвобождения, в который заделан носитель доставки гена. Альтернативно, когда вектор доставки полного гена может быть получен интактным из рекомбинантных клеток, например, ретровирусных клеток, этот фармацевтический препарат может включать в себя одну или несколько клеток, которые продуцируют эту систему доставки генов.
III. Фармацевтические композиции, содержащие дцРНК
В одном варианте осуществления это изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие дцРНК, описанные здесь, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция, содержащая дцРНК, применима для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного с экспрессией или активностью гена ТТК, например, патологических процессов, опосредованных экс
- 16 020312 прессией ТТН. Такие фармацевтические композиции готовят на основе способа доставки. Одним примером являются композиции, которые готовят для системного введения посредством парентеральной доставки, например, внутривенной (IV) доставки. Другим примером являются композиции, которые готовят для прямой доставки в паренхиму головного мозга, например, инфузией в головной мозг, например, непрерывной нагнетательной инфузией.
Описанные здесь фармацевтические композиции вводят в дозах, достаточных для ингибирования экспрессии генов ТТН.
Обычно, подходящая доза дцРНК будет находиться в диапазоне 0,01-200,0 мг на кг массы тела реципиента в день, обычно в диапазоне 1-50 мг на кг массы тела в день. Например, дцРНК может вводиться при 0,0059, 0,01, 0,0295, 0,05, 0,0590, 0,163, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,543, 0,590, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,628, 2, 3, 5,0, 10, 20, 30, 40 или 50 мг/кг на однократную дозу.
В одном варианте осуществления, эта доза находится между 0,01 и 0,2 мг/кг. Например, дцРНК может вводиться в дозе 0,01, 0,02, 0,3, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19 или 0,20 мг/кг.
В одном варианте осуществления, эта доза находится в диапазоне 0,005-1,628 мг/кг. Например, дцРНК может вводиться в дозе 0,0059, 0,0295, 0,0590, 0,163, 0,543, 0,5900 или 1,628 мг/кг.
В одном варианте осуществления, эта доза находится в диапазоне 0,2-1,5 мг/кг. Например, дцРНК может вводиться в дозе 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 или 1,5 мг/кг.
Эта фармацевтическая композиция может вводиться один раз в день или дцРНК может вводиться в виде двух, трех или более субдоз при подходящих интервалах на протяжении дня или даже с использованием непрерывной инфузии или доставки с использованием формы пролонгированного высвобождения. В этом случае дцРНК, содержащаяся в каждой субдозе, должна быть соответственно в меньшем количестве для достижения общей суточной дозы. Единица дозы может быть также компаундирована для доставки на протяжении нескольких дней, например, с использованием общепринятой формы пролонгированного высвобождения, которая обеспечивает поддерживаемое высвобождение дцРНК на протяжении периода нескольких дней. Готовые формы пролонгированного высвобождения хорошо известны в данной области и особенно применимы для доставки агентов в конкретном месте, так чтобы их можно было использовать с агентами данного изобретения. В этом варианте осуществления унифицированная лекарственная форма содержит соответствующее множество суточных доз.
Действие однократной дозы на уровни ТТН является продолжительным, так что последующие дозы вводят с интервалами не более 3, 4 или 5 дней, или с интервалами не более 1, 2, 3 или 4 недель или с интервалами не более 5, 6, 7, 8, 9 или 10 недель.
Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что некоторые факторы могут влиять на дозу и тайминг, необходимые для эффективного лечения субъекта, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, тяжесть заболевания или нарушения, предшествующее лечение, общее здоровье и/или возраст субъекта и другие присутствующие заболевания. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции может включать в себя однократный курс лечения или ряд курсов лечения. Оценивания эффективных доз и времени полужизни ίη νίνο для отдельных дцРНК, рассматриваемых данным изобретением, могут быть выполнены с использованием общепринятых методологий или на основе тестирования ίη νίνο с применением подходящей модели животного, как описано здесь в другом месте.
Успехи в области генетики мышей позволили создать ряд мышиных моделей для исследования различных заболеваний человека, таких как патологические процессы, опосредуемые экспрессией ТТН, а также для определения терапевтически эффективной дозы. Подходящей мышиной моделью является, например, мышь, содержащая плазмиду, экспрессирующую ТТН человека. Другой подходящей мышиной моделью является трансгенная мышь, несущая трансген, который экспрессирует ТТН человека.
Данные, полученные из анализов культур клеток и исследований на животных, могут быть использованы в приготовлении диапазона доз для применения в людях. Доза композиций, описанных в этом изобретении, обычно находится в диапазоне циркулирующих концентраций, которые включают в себя ΕΌ50 с малой токсичностью или с отсутствием токсичности. Доза может варьироваться в этом диапазоне в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого способа введения. Для любого соединения, используемого в описанных в данном изобретении способах, терапевтически эффективная доза может быть приближенно определена сначала из анализов культуры клеток. Доза может быть приготовлена с использованием моделей животных для получения диапазона циркулирующей в плазме концентрации этого соединения или, при необходимости, полипептидного продукта последовательностимишени (например, получением уменьшенной концентрации этого полипептида), который включает в себя 1С50 (т.е. концентрацию тест-соединения, которая дает полумаксимальное ингибирование симптомов), определенную в культуре клеток. Такая информация может быть использована для более точного определения доз, применимых в людях. Могут быть измерены уровни в плазме, например, с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Описанные в этом изобретении дцРНК могут вводиться в комбинации с другими известными агентами, эффективными в лечении патологических процессов, опосредуемых экспрессией гена-мишени. В
- 17 020312 любом случае, осуществляющий введение врач может корректировать количество и тайминг введения дцРНК на основании результатов, наблюдаемых с использованием стандартных измерений эффективности, известных в данной области или описанных здесь.
Введение
Данное изобретение включает в себя также фармацевтические композиции и готовые формы, которые включают в себя дцРНК-соединения, описанные в этом изобретении. Фармацевтические композиции данного изобретения могут вводиться различными способами в зависимости от того, является ли желательным местное или системное лечение, и от подлежащей обработке зоны. Введение может быть локальным, легочным, например с использованием ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, в том числе при помощи распылителя; интратрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным, пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает в себя внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; или интракраниальное, например, внутрипаренхимное, внутриоболочечное или внутрижелудочковое введение.
Эти дцРНК могут доставляться таким образом, чтобы поражать конкретную ткань, такую как печень (например, гепатоциты печени).
Данное изобретение включает в себя фармацевтические композиции, которые могут доставляться инъекцией непосредственно в головной мозг. Эта инъекция может выполняться стереотаксической инъекцией в конкретный участок головного мозга (например, черное вещество, кору, гиппокамп, полосатое тело или бледный шар), или дцРНК может доставляться во множественные участки центральной нервной системы (например, во множественные участки головного мозга и/или в спинной мозг). дцРНК могут также доставляться в диффузные участки головного мозга (например, диффузной доставкой в кору головного мозга).
В одном варианте осуществления дцРНК, поражающая ТТК, может доставляться посредством канюли или другого устройства доставки, имеющего один конец, имплантированный в ткань, например, головной мозг, например, черное вещество, кору, гиппокамп, полосатое тело, мозолистое тело или бледный шар головного мозга. Эта канюля может быть соединена с резервуаром композиции дцРНК. Поток или доставка может быть опосредована насосом, например, осмотическим насосом или мининасосом, таким как насос Л1хс1 (Энгесй Сиретйио, СА). В одном варианте осуществления эти насос и резервуар имплантированы в зоне, удаленной от этой ткани, например, в брюшной полости, и доставка осуществляется посредством канала, идущего от насоса или резервуара к участку высвобождения. Инфузия композиции дцРНК в головной мозг может осуществляться на протяжении нескольких часов или в течение нескольких дней, например, в течение 1, 2, 3, 5 или 7 дней или более. Устройства для доставки в головной мозг описаны, например, в Патентах США с номерами 6093180 и 5814014.
Фармацевтические композиции и готовые формы для локального введения могут включать в себя трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Могут быть необходимыми или желательными общепринятые фармацевтические носители, водные, порошкообразные или масляные основы, загущающие агенты и т.п. Могут быть также применимы имеющие покрытия презервативы, перчатки и т.п. Подходящие локальные готовые формы включают в себя формы, в которых дцРНК, описанные в этом изобретении, находятся в смеси с агентом локальной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, эфиры жирных кислот, стероиды, хелатообразующие агенты и поверхностно-активные вещества. Подходящие липиды и липосомы включают в себя нейтральные (например, диолеоилфосфатидилэтаноламин ΌΘΡΕ, димиристоилфосфатидилхолин ЭМРС. дистеароилфосфатидилхолин), отрицательные (например, димиристоилфосфатидилглицерин ΌΜΡΟ) и катионоактивные (например, диолеилтетраметиламинопропил ЭОТАР и диолеоилфосфатидилэтаноламин Ό0ΕΜΑ). дцРНК, описанные в этом изобретении, могут быть инкапсулированы в липосомах или могут образовывать комплексы с ними, в частности с катионоактивными липосомами. Альтернативно, дцРНК могут образовывать комплексы с липидами, в частности, с катионоактивными липидами. Подходящие жирные кислоты и эфиры включают в себя, но не ограничиваются ими, арахидоновую кислоту, олеиновую кислоту, эйкозановую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, акрилкарнитин, ацилхолин или С1-10-алкиловый эфир (например, изопропилмиристат ΙΡΜ), моноглицерат, диглицерид или их фармацевтически приемлемая соль. Г отовые формы для локального введения описаны подробно в Патенте США № 6747014, который включен здесь посредством ссылки.
Липосомные готовые формы
Имеются многие организованные структуры поверхностно-активных веществ, наряду с микроэмульсиями, которые были исследованы и использованы для приготовления лекарственных средств. Они включают в себя монослои, мицеллы, бислои и пузырьки (везикулы). Везикулы, такие как липосомы, привлекают большой интерес вследствие их специфичности и длительности действия, которые они предоставляют с точки зрения доставки лекарственных средств. В контексте данного изобретения термин липосома обозначает везикулу (пузырек), состоящий из амфифильных липидов, аранжированных в
- 18 020312 сферический бислой или бислои.
Липосомы являются однослойными или многослойными пузырьками (везикулами), которые имеют мембрану, образованную из липофильного материала и водной внутренней части. Эта водная часть содержит подлежащую доставке композицию. Катионоактивные липосомы имеют то преимущество, что они способны сливаться с клеточной стенкой. Некатионоактивные липосомы, хотя они и неспособны эффективно сливаться с клеточной стенкой, поглощаются макрофагами ίη νίνο.
Для прохождения интактной кожи млекопитающего, липидные пузырьки должны проходить через ряд тонких пор, каждая из которых имеет диаметр менее 50 нм, под влиянием подходящего трансдермального градиента. Таким образом, желательно использовать липосому, которая является высокодеформируемой и способна проходить через эти тонкие поры.
Следующие преимущества липосом включают в себя следующее: липосомы, полученные из природных фосфолипидов, являются биосовместимыми и биодеградируемыми; липосомы могут включать в себя широкий диапазон водорастворимых и растворимых в липидах лекарственных средств; липосомы могут защищать инкапсулированные лекарственные средства в их внутренних компартментах от метаболизма и деградации (КоюГГ. ίη Рйагтасеибса1 Эозаде Еогпъ. ЫеЬегтап, К1едег апб Вапкег (Ебз.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., Νον Уогк, Ν.Υ., νο1. 1, р. 2 45). Важными условиями в приготовлении липосомных готовых форм являются заряд липидной поверхности, размер пузырьков и водный объем липосом.
Липосомы применимы для транспорта и доставки активных ингредиентов к участку действия. Поскольку липосомная мембрана является структурно сходной с биологическими мембранами, при нанесении липосом на ткань, липосомы начинают сливаться с клеточными мембранами, и по мере прогрессирования слияния липосомы и клетки, содержимое липосомы опустошается в эту клетку, где может действовать активный агент.
Липосомные готовые формы были центром интенсивного исследования в качестве способа доставки для многих лекарственных средств. Существует растущее доказательство того, что для локального применения липосомы предоставляют несколько преимуществ над другими готовыми формами. Такие преимущества включают в себя уменьшенные побочные действия, связанные с высокой системной абсорбцией вводимого лекарственного средства, увеличенное накапливание введенного лекарственного средства в желаемой мишени и способность к введению большого разнообразия лекарственных средств, как гидрофильных, так и гидрофобных, в кожу.
Несколько сообщений подробно описали способность липосом к доставке агентов, в том числе ДНК с высокой молекулярной массой, в кожу. В кожу вводили соединения, включающие в себя аналгезирующие вещества, антитела, гормоны и ДНК с высокой молекулярной массой. Большинство применений приводили к достижению верхнего эпидермиса.
Липосомы подразделяются на два широких класса.
Катионоактивные липосомы являются положительно заряженными липосомами, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. Положительно заряженный комплекс ДНК/липосома связывается с отрицательно заряженной клеточной поверхностью и интернализуется в эндосоме. Вследствие кислого рН в этой эндосоме эти липосомы разрываются с высвобождением их содержимого в цитоплазму клетки (Лапд е1 а1., Вюсйет. Вюрйуз. Кез. Соттип., 1987, 147, 980-985).
Липосомы, которые являются рН-чувствительными или отрицательно заряженными, захватывают скорее ДНК, чем комплекс с ней. Поскольку как ДНК, так и липид являются сходным образом заряженными, происходит скорее отталкивание, чем образование комплекса. Тем не менее, некоторая часть ДНК захватывается в водной внутренней части этих липосом. рН-чувствительные липосомы использовали для доставки ДНК, кодирующей ген тимидинкиназы к монослоям клеток в культуре. Экспрессию этого экзогенного гена детектировали в клетках-мишенях (Укон е1 а1., 1оигпа1 оГ Соп1го11еб Ке1еазе, 1992, 19, 269274).
Основной тип липосомной композиции включает в себя фосфолипиды, другие чем природно производимый фосфатидилхолин. Нейтральные липосомные композиции могут быть, например, образованы из димиристоилфосфатидилхолина (ЭМРС) или дипальмитоилфосфатидилхолина (ЭРРС). Анионогенные липосомные композиции обычно образуются из димиристоилфосфатидилглицерина, тогда как анионогенные вызывающие слияние (фузогенные) липосомы образуются прежде всего из диолеоилфосфатидилэтанолходина (ЭОРЕ). Другой тип липосомной композиции образуется из фосфатидилхолина (РС), такого как, например, РС сои и РС яйца. Другой тип образуется из смесей фосфолипида и/или фосфатидилхолина и/или холестерина.
Несколько исследований оценивали локальную доставку липосомных готовых форм лекарственных средств в кожу. Нанесение липосом, содержащих интерферон, на кожу морской свинки приводила к уменьшению кожных язв, вызываемых герпес-вирусом, тогда как доставка интерферона посредством другого способа (например, в виде раствора или в виде эмульсии) была неэффективной (Летег е1 а1., 1оигпа1 оГ Эгид Тагдебпд, 1992, 2, 405-410). Кроме того, дополнительное исследование тестировало эффективность интерферона, вводимого в виде части липосомной готовой формы, относительно введения интерферона с использованием водной системы, и был сделан вывод, что эта липосомная готовая форма
- 19 020312 была лучшей, чем водное введение (би Р1екк1к е! а1., АпНуйа1 НекеагсН, 1992, 18, 259-265).
Неионные липосомные системы также испытывались для определения их применимости в доставке лекарственных средств в кожу, в частности, системы, содержащие неионогенное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионогенные липосомные готовые формы, содержащие ^уакопче™ Ι (глицерилдилаурат/холестерин/простой стеариловый эфир полиоксиэтилена-10) и Коуа^оте™ ΙΙ (глицерилдистеарат/холестерин простой стеариловый эфир полиоксиэтилена-10) использовали для доставки циклоспорина-А в дерму кожи мыши. Результаты показали, что такие неионные липосомные системы были эффективны в облегчении депонирования циклоспорина-А в различных слоях кожи (Ни е! а1. З.Т.Р.РНагта. ЗсЬ, 1994, 4, 6, 466).
Липосомы включают в себя также стерически стабилизированные липосомы, этот термин относится в данном контексте к липосомам, содержащим один или несколько специализированных липидов, которые при включении в липосомы, приводят к увеличенным периодам полужизни в кровотоке относительно липосом, лишенных таких специализированных липидов. Примерами стерически стабилизированных липосом являются липосомы, в которых часть образующей пузырьки липидной части липосомы (А) содержит один или несколько гликолипидов, таких как моносиалоганглиозид СМ1, или (В) дериватизована одним или несколькими гидрофильными полимерами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Хотя и без связывания с какой-либо конкретной теорией, в данной области считается, что по меньшей мере для стерически стабилизированных липосом, содержащих ганглиозиды, сфингомиелин или ПЭГдериватизованные липиды, увеличенный период полужизни в кровотоке этих стерически стабилизированных липосом происходит вследствие уменьшенного поглощения в клетки ретикулоэндотелиальной системы (НЕЗ) (А11еп е! а1., ГЕВЗ Ьейетк, 1987, 223, 42; \Уи е! а1, Сапсег НекеагсН, 1993, 53, 3765).
В данной области известны различные липосомы, содержащие один или несколько гликолипидов. РараНаб)орои1о8 е! а1. (Апп. КУ. Асаб. Зс1, 1987, 507, 64) сообщал о способности моносиалоганглиозида СМ1 сульфата галактоцереброзида и фосфатидилинозита улучшать периоды полужизни липосом в крови. Эти открытия были изложены СаЫхоп е! а1. (Ргос. N311. Асаб. ЗсР и.З.А., 1988, 85, 6949). Патент США № 4837028 и \У0 88/04924, оба, выданные А11еп е! а1., описывают липосомы, содержащие (1) сфингомиелин и (2) ганглиозид ΟΜι или сульфатный эфир галактоцереброзида. Патент США № 5543152 (\УеЬЬ е! а1.) описывает липосомы, содержащие сфингомиелин. Липосомы, содержащие 1,2-кпдимиристоилфосфатидилхолин, описаны в \У0 97/13499 (Нт е! а1.).
Многие липосомы, содержащие липиды, дериватизованные одним или несколькими гидрофильными полимерами, и способы их получения известны в данной области. Зипато!о е! а1. (Ви11. СНет. Зос. 1рп., 1980, 53, 2778) описывали липосомы, содержащие неионогенное поверхностно-активное вещество, 2С1215О, которое содержит ПЭГ-часть. Шит е! а1. (ГЕВЗ Ре!!.. 1984, 167, 79) отмечал, что гидрофильное покрытие частиц из полистирола полимерными гликолями приводит к значимо увеличенным периодам полужизни в крови. Синтетические фосфолипиды, модифицированные присоединением карбоксильных групп полиалкиленгликолей (например, ПЭГ), описаны Зеагк (Патенты США с номерами 4,426,330 апб 4,534,899). КПЬапоу е! а1. (ГЕВЗ Ьей., 1990, 2 68, 235) описывал эксперименты, демонстрирующие, что липосомы, содержащие фосфатилилэтаноламин (РЕ), дериватизованный ПЭГ или ПЭГ-стеаратом, имели значимые увеличения периодов полужизни в кровотоке. В1ите е! а1. (ВюсНитса е! ВюрНукюа Ас!а, 1990, 1029, 91) распространили такие наблюдения на другие ПЭГ-дериватизованные фосфолипиды, например, ЭЗРЕ-РЕС, образованный из объединения дистеароилфосфатидилэтаноламина (ЭЗРЕ) и ПЭГ. Липосомы, имеющие ковалентно связанные ПЭГ-части на их наружной поверхности, описаны в Европейском патенте № ЕР 0 445 131 В1 и \У0 90/04384, выданном ПкНег. Липосомные композиции, содержащие 1-20 мол.% РЕ, дериватизованные ПЭГ, и способы их применения, описаны \Уооб1е е! а1. (Патенты США с номерами 5013556 и 5356633) и Майш е! а1. (Патент США с номером 5213804 и Европейский патент № ЕР 0 496 813 В1). Липосомы, содержащие ряд других конъюгатов липид-полимер, описаны в \У0 91/05545 и Патенте США № 5225212 (оба, выданные Майш е! а1) и в \У0 94/20073 (АаПркку е! а1.). Липосомы, содержащие ПЭГ-модифицированные церамид-липиды, описаны в \У0 96/10391 (СНо1 е! а1) . Патент США № 5540935 (М|уахак| е! а1.) и Патент США № 5556948 (Тадауа е! а1.) описывают ПЭГсодержащие липосомы, которые могут быть дополнительно дериватизованы функциональными частями на их поверхностях.
В данной области известен ряд липосом, содержащих нуклеиновые кислоты. \У0 96/40062, выданный ТЫетту е! а1., описывает способы инкапсулирования высокомолекулярных нуклеиновых кислот в липосомах. Патент США № 52 64221, выданный Тадауа е! а1., описывает белок-связанные липосомы и доказывает, что содержимое таких липосом может включать в себя дцРНК. Патент США № 5665710, выданный НаНтап е! а1., описывает некоторые способы инкапсулирования олигодезоксинуклеотидов в липосомах. \У0 97/04787, выданный Ьоуе е! а1., описывает липосомы, содержащие дцРНК, нацеленные на ген таГ.
Трансферсомы являются еще одним типом липосом и представляют собой высокодеформируемые липидные агрегаты, которые являются привлекательными кандидатами для носителей доставки лекарственных средств. Трансферсомы могут быть описаны как липидные капельки, которые являются настоль
- 20 020312 ко высокодеформируемыми, что они способны легко проникать через поры, которые являются меньшими, чем эта капелька. Трансферсомы являются адаптируемыми к среде, в которой их используют, например, они являются самооптимизирующимися (адаптивными к форме пор в коже), саморепарирующимися, часто достигающими их мишени без фрагментации и часто самозагружающимися. Для получения трансферсом можно добавлять активаторы краев поверхности, обычно поверхностно-активные вещества, к стандартной липосомной композиции. Трансферсомы использовали для доставки сывороточного альбумина в кожу. Было показано, что опосредуемая трансферсомами доставка сывороточного альбумина является эффективной в виде подкожной инъекции раствора, содержащего сывороточный альбумин.
Сурфактанты (поверхностно активные вещества) находят широкое применение в таких готовых формах, как эмульсии (в том числе микроэмульсии) и липосомы. Наиболее обычным способом классификации и ранжирования свойств многих различных типов поверхностно-активных веществ как природных, так и синтетических, является применение гидрофильного/липофильного баланса (НЬВ). Природа гидрофильной группы (также известной как головка) обеспечивает наиболее полезное свойство для классификации различных поверхностно-активных веществ, используемых в готовых формах (Рледег, ίη Рйагтасеи11са1 Иокаде Рогтк, Μαι^Ι Иеккег, 1пс., Νο\ν Уогк, Ν.Υ., 1988, р. 285).
Если молекула поверхностно-активного вещества является неионизированной, она классифицируется как неионогенное поверхностно-активное вещество. Неионогенные поверхностно-активные вещества находят широкое применение в фармацевтических и косметических продуктах и применимы в широком диапазоне величин рН. Обычно их величины НЬВ находятся в диапазоне 2-18 в зависимости от их структуры. Неионогенные поверхностно-активные вещества включают в себя неионогенные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, эфиры пропиленгликоля, глицериловые эфиры, полиглицериловые эфиры, эфиры сорбитана, эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры. Неионогенные алканоламиды и простые эфиры, такие как этоксилаты жирных спиртов, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блоксополимеры, также включены в этот класс. Полиоксиэтиленовые поверхностно-активные вещества являются наиболее популярными членами класса неионогенных поверхностно-активных веществ.
Если молекула поверхностно-активного вещества несет отрицательный заряд при ее растворении или диспергировании в воде, это поверхностно-активное вещество классифицируется как анионогенное поверхностно-активное вещество. Анионогенные поверхностно-активные вещества включают в себя карбоксилаты, такие как мыла, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты, ацилизетионаты, ацилтаураты и сульфосукцинаты, и фосфаты. Наиболее важными членами класса анионогенных поверхностно-активных веществ являются алкилсульфаты и мыла.
Если молекула поверхностно-активного вещества несет положительный заряд при ее растворении или диспергировании в воде, это поверхностно-активное вещество классифицируется как катионогенное поверхностно-активное вещество. Катионогенные поверхностно-активные вещества включают в себя соли четвертичного аммония и этоксилированные амины. Соли четвертичного аммония являются наиболее используемыми членами этого класса.
Если молекула поверхностно-активного вещества способна нести или положительный, или отрицательный заряд, это поверхностно-активное вещество классифицируется как амфотерное поверхностноактивное вещество. Амфотерные поверхностно-активные вещества включают в себя производные акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, Ν-алкилбетаины и фосфатиды.
Применение поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, готовых формах и в эмульсиях обсуждается в обзоре (Н1едег, ίη Рйагтасеи11са1 Иокаде Рогтк, Μа^се1 Иеккег, 1пс., №\ν Υο^к. Ν.Υ., 1988, р. 285).
Частицы нуклеиновая кислота-липид
В одном варианте осуществления, описанная в этом изобретении дцРНК ТТН полностью инкапсулирована в липидной готовой форме, например, с образованием 8РЬР, р8РЬР, ^АЬР или другой частицы нуклеиновая кислота-липид. В данном контексте, термин ^АЬР относится к стабильной частице нуклеиновая кислота-липид, включающей в себя 8РЕР. В данном контексте термин 8РЬР относится к частице нуклеиновая кислота-липид, содержащей плазмидную ДНК, инкапсулированную в липидном пузырьке. ^АЬР и 8РЕР обычно содержат катионоактивный липид, некатионоактивный липид и липид, который препятствует агрегации этой частицы (например, конъюгата ПЭГ-липид). ^АЬР и 8РЕР чрезвычайно полезны для системных применений, так как они проявляют увеличенные периоды полужизни в кровотоке после внутривенной (ί.ν.) инъекции и накапливаются в дистальных участках (например, в местах, физически отделенных от места введения). 8РЕР включают в себя р8РЬР, которые включают в себя инкапсулированный комплекс конденсирующий агент-нуклеиновая кислота, представленный в публикации РСТ № ΧΥΟ 00/03683. Частицы данного изобретения обычно имеют средний диаметр приблизительно 50-150 нм, более часто приблизительно 60-130 нм, более часто приблизительно 70-110 нм, наиболее часто приблизительно 70-90 нм, и являются, по существу, нетоксичными. Кроме того, когда эти нуклеиновые кислоты присутствуют в частицах нуклеиновая кислота-липид данного изобретения, являются устойчивыми в водном растворе к деградации нуклеазой. Частицы нуклеиновая кислота-липид и спосо
- 21 020312 бы их получения описаны, например, в патентах США с номерами 5976567; 5981501; 6534484; 6586410; 6815432 и публикации РСТ № №0 96/40964.
В одном варианте осуществления отношение липид-лекарственное средство (отношение масса/масса) (например, отношение липида к дцРНК) находится в диапазоне от приблизительно 1:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 1:1 до приблизительно 25:1, от приблизительно 3:1 до приблизительно 15:1, от приблизительно 4:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 5:1 до приблизительно 9:1 или от приблизительно 6:1 до приблизительно 9:1.
Катионоактивным липидом может быть, например, N,N-диолеил-N,N-диметиламмонийхлорид (Б0БАС). N,N-дистеарил-N,N-диметиламмонийбромид (ΌΌΑΒ), N-(1-(2,3-диолеоилокси)пропил)-N,N,Nтриметиламмонийхлорид (Б0ТАР), N-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмонийхлорид (Б0ТМА), N,N-диметил-2,3-диолеилоксипропиламин (Б0БМА), ^-дилинолеилокси-Н^диметиламинопропан (БЫпБМА), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (БЬепБМА), 1,2дилинолеилкарбамоилокси-3 -диметиламинопропан (БЬт-С-БАР), 1,2-дилинолеилокси-3 -(диметиламино)ацетоксипропан (БЬт-БАС), 1,2-дилинолеилокси-3-морфолинопропан (БЬт-МА), 1,2дилинолеил-3-диметиламинопропан (БЫпБАР), 1,2-дилинолеилтио-3-диметиламинопропан (БЬт-8БМА), 1-линолеоил-2-линолеилокси-3-диметиламинопропан (БЬт-2-ОМАР), хлоридная соль 1,2дилинолеилокси-3-триметиламинопропана (БЬт-ТМА.С1), хлоридная соль 1,2-дилинолеил-3триметиламинопропана (БЫп-ТАР.О), 1,2-дилинолеилокси-3-(N-метилпиперазино)пропан (БЬт-МР2) или 3-(N,N-дилинолеиламино)-1,2-пропандиол (БЬ1пАР), 3-(N,N-диолеиламино)-1,2-пропандиол (Б0АР), 1,2-дилинолеилоксо-3-(2-N,N-диметиламино)этоксипропан (ПЬт-ЕС-БМА), 1/2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (БЫпБМА), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан (БЬт-К-ЭМА) или его аналоги, (3аК,58,6а8)-N,N-диметил-2,2-ди((9Ζ,12Ζ)-октадека-9,12диенил)тетрагидро-3аН-циклопента[б][1,3]диоксол-5-амин (Α^N100), (6Ζ,9Ζ,28Ζ,31Ζ)-гептатриаконта6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат (МС3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидодецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазандиил)дидодекан-2-ол (ТесН С1) или их смесь. Этот катионоактивный липид может содержать от приблизительно 20 мол.% до приблизительно 50 мол.% или приблизительно 40 мол.% общего содержания липида, присутствующего в этой частице.
В другом варианте осуществления соединение 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан может быть использовано для получения наночастиц липид-кг^МА. Синтез 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана описан в Предварительной заявке на патент США с номером 61/107,998, поданной 23 октября 2008 года, которая включена здесь посредством ссылки.
В одном варианте осуществления, частица липид-аККА включает в себя 40% 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан: 10% Б8РС: 40% холестерин: 10% РЕС-С-Б0МС (мол.%) с размером частицы 63,0 ± 20 нм и отношением 0,027 8^НNΛ/липид.
Некатионоактивный липид может быть анионоактивным липидом или нейтральным липидом, включающим в себя, но не ограничивающимся ими, дистеароилфосфатидилхолин (Б8РС), диолеилфосфатидилхолин (Б0РС), дипальмитоилфосфатидилхолин (БРРС), диолеоилфосфатидилглицерин (Б0РС), дипальмитоил фосфатидилглицерин (БРРС), диолеоилфосфатидилэтаноламин (Б0РЕ), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин (Р0РЕ), диолеилфосфатидилэтанол-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбокислат диолеоилфосфатидилэтаноламина (Б0РЕ-та1), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (БРРЕ), димиристоилфосфоэтаноламин (БМРЕ), дистеароилфосфатидилэтаноламин (Б8РЕ), 16-О-монометил РЕ, 16-0-диметил РЕ, 18-1-транс РЕ, 1-стеароил-2-олеоилфосфатидилэтаноламин (80РЕ), холестерин или их смесь. Этот некатионоактивный липид может составлять от приблизительно 5 до приблизительно 90 мол.%, приблизительно 10 мол.% или приблизительно 58 мол.%, если включен холестерин, общего содержания липида, присутствующего в этой частице.
Конъюгированным липидом, который ингибирует агрегацию частиц, может быть, например, полиэтиленгликоль (РЕС)-липид, в том числе, без ограничения, РЕС-диацилглицерин (БАС), РЕСдиалкилоксипропил (БАЛ), РЕС-фосфолипид, РЕС-церамид (Сег) или их смесь. Конъюгатом РЕО-БАА может быть, например, РЕС-дилаурилоксипропил (С12), РЕС-димиристилоксипропил (С14), РЕСдипальмитилоксипропил (С16) или РЕС-дистеарилоксипропил (С18). Конъюгированный липид, который предотвращает агрегацию частиц, может составлять от 0 до приблизительно 20 мол.% или приблизительно 2 мол.% общего содержания липида, присутствующего в этой частице.
В некоторых вариантах осуществления частица нуклеиновая кислота-липид дополнительно включает в себя холестерин в количестве, например, приблизительно 10-60 мол.% или приблизительно 48 мол.% общего содержания липида в этой частице.
Ι.ΝΡ01
В одном варианте осуществления, липидоид ХБ984НС1 (М№ 1487) (формула 1), холестерин (Ыдта-АШпсН) и РЕС-Церамид С16 (Ауапй Ро1аг ЫрИк) могут быть использованы для приготовления наночастиц липид-8^НNΑ (т.е., частиц ^NР01). Исходные растворы каждого из них в этаноле могут быть получены следующим образом: N^98. 133 мг/мл; Холестерин, 25 мг/мл, РЕС-Церамид С16, 100 мг/мл. Затем эти исходные растворы N^98. Холестерина и РЕС-Церамида С16 могут быть объединены, напри- 22 020312 мер, в молярном соотношении 42:48:10. Этот объединенный раствор липидов может быть смешан с водной δίΚΝΑ (например, в ацетате натрия с рН 5), так что конечная концентрация этанола равна приблизительно 35-45% и конечная концентрация ацетата натрия равна приблизительно 100-300 мМ. Наночастицы липид-81К№А обычно образуются самопроизвольно после смешивания. В зависимости от желаемого распределения размеров частиц, полученная смесь наночастиц может быть экструдирована через поликарбонатную мембрану (например, с заданным пределом 100 нм) с использованием, например, термобаррельного экструдера, такого как Ырех Ехр-ибег (ΝοΠίκτη Εΐρΐάδ, 1пс). В некоторых случаях, эта стадия экструзии может быть опущена. Удаление этанола и одновременная замена буфера может выполняться, например, диализом или фильтрованием с тангенциальным потоком. Буфер может быть заменен, например, забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР) при приблизительно рН 7, например, приблизительно рН 6,9, приблизительно рН 7,0, приблизительно рН 7,1, приблизительно рН 7,2, приблизительно рН 7,3 или приблизительно рН 7,4.
Изомер IТВ98
Формула 1
Готовые формы ΓΝΡ01 описаны, например, в публикации Международной заявки на патент № ШО 2008/042973, включенной здесь посредством ссылки.
Другие примерные готовые формы ίηιιη/ι-81ΚΝΑ являются следующими:
Катионоактивный липид
Конъюгат катионоактивный липид/не-катионоактивный липид/холестерин/РЕС-липид
Отношение липид:3ΪΚΝΑ
3ΝΆΣΡ
1,2-дилиноленил-И,ΝОЫпОМА/ОРРС/Холестерин/РЕСПроцесс диметиламинопропан (ОЫпОМА)
СОМА) липид 51ΚΝΑ ~ 7:1
5ΝΑ1.Ρ2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтилХТС/ОРРС/Холестерин/РЕО-сОМА
ХТЗ [1,3]-диоксолан (ХТС) липид ΒίΚΝΑ ~ 7:1
ΠΝΡ05
2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтилХТС/ОЗРС/Холестерин/РЕС-ОМС
Экструзия [1,3]-диоксолан (ХТС) липид 51 НПА ~ 6:1
11ΝΡ06
2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтилХТС/ОЗРС/Холестерин/РЕС-ОМС
Экструзия [ 1,3]-диоксолан (ХТС) липид ΒίΚΝΑ ~ 11:1
1ΤΙΡ07
2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтилХТС/ОЗРС/Холестерин/РЕС-ОМС
Совмещенное [ 1,3]-диоксолан (ХТС) смешивание липид βιΚΝΑ ~ 6:1
- 23 020312
ЬЫР08 2,2-дилинолеил~4-диметиламиноэтил- [ 1,3]-диоксолан (ХТС) ХТС/ПЗРС/Холестерин/РЕС-ϋΜΟ (60/7,5/31/1,5) липид 3ίΡΝΑ ~ 11:1 Совмещенное смешивание
1Ж1Р09 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил- ХТС/ИЗРС/Холестерин/РЕС-ОМО
[ 1,3]-диоксолан (ХТС) (50/10/38,5/1,5)
липид 31Ρ.ΝΑ ~ 10:1
ЬЫРЮ (ЗаК,5з,баЗ)-Ν,Ν-диметил-2,2- АЬЫ100/ОЗРС/Холестерин/РЕС- Совмещенное
ди((9Ζ,12Ζ)-октадека-9, 12- ϋΜΟ смешивание
диенил)тетрагидро-ЗаН- (50/10/38,5/1,5)
циклопента[ά][1,3]диоксол-5-амин липид 31Ι3ΝΆ ~ 10:1
(АЬЫ100)
ΣΝΡΙΙ (6Ζ,9Ζ,28Ζ,31Ζ)-гептатриаконта- МС-З/ОЗРС/Холестерин/РЕС-ϋΜΟ Совмещенное
6,9,28,31-тетраен-19-ил-4- (50/10/38,5/1,5) смешивание
(диметиламино)бутаноат (МСЗ) липид 3ίΡΝΑ ~ 10:1
ΣΝΡ12 1,1'-(2-(4-(2-( (2- ТесЪ С1/ВЗРС/Холестерин/РЕС- Совмещенное
гидроксидодецил)амино)этил)(2- ΩΜΟ смешивание
гидроксидодецил)амино)этил)пиперазин- (50/10/38,5/1,5)
1-ил)этилазанедил)дидодекан-2-ол липид 3ίΡΝΑ ~ 10:1
(Теск С1)
Готовые формы ΓΝΡ09 и ХТС-содержащие готовые формы описаны, например, в Предварительной заявке на патент США с порядковым номером 61/239686, поданной 2 сентября 2009 года, включенной здесь посредством ссылки. Готовые формы ΓΝΡ11 МС3-содержащие готовые формы описаны, например, в Предварительной заявке на патент США с порядковым номером 61/244834, поданной 22 сентября 2009 г., включенной здесь посредством ссылки.
Г отовые формы, полученные стандартным или не предусматривающим экструзию способом, могут быть охарактеризованы сходным образом. Например, готовые формы обычно характеризуют посредством визуального исследования. Они должны быть беловатыми полупрозрачными растворами, не содержащими агрегатов или осадка. Размер частиц и распределение размеров частиц могут быть измерены по светорассеянию с использованием, например, Макет /,е1а81/ег №ηο Ζδ (Макегп, υδΑ). Частицы должны иметь размер приблизительно 20-300 нм, например, 40-100 нм. Распределение размеров частиц должно быть унимодальным. Общую концентрацию 8ΪΕΝΑ в готовой форме, а также в захваченной фракции оценивают приближенно с использованием анализа вытеснения красителя. Проба приготовленной δΐΕΝΑ может инкубироваться с РНК-связывающим красителем, таким как НтЪодгееп (Мо1еси1аг РгоЪез) в присутствии или в отсутствие разрушающего готовую форму сурфактанта, например, 0,5% Тритона-Х100. Тотальная δΐΕΝΑ в этой готовой форме может быть определена по сигналу из этой пробы, содержащей сурфактант, относительно калибровочной кривой. Захваченную фракцию определяют вычитанием содержания свободной δΐΒΝΑ (измеренного по этому сигналу в отсутствие сурфактанта) из содержания тотальной δΐΕΝΑ. Процент захваченной δΐΕΝΑ обычно равен >85%. Для готовой формы 8ΝΑΓΡ, размер частиц равен по меньшей мере 30 нм, по меньшей мере 40 нм, по меньшей мере 50 нм, по меньшей мере 60 нм, по меньшей мере 70 нм, по меньшей мере 80 нм, по меньшей мере 90 нм, по меньшей мере 100 нм, по меньшей мере 110 нм и по меньшей мере 120 нм. Подходящим диапазоном является обычно приблизительно по меньшей мере 50-110 нм, приблизительно по меньшей мере 60-100 нм или приблизительно по меньшей мере 80-90 нм.
Композиции и готовые формы для перорального введения включают в себя порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в водных или неводных средах, капсулы, гелевые капсулы, подушечки, таблетки или минитаблетки. Могут быть желательными загустители, ароматизирующие агенты, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие добавки или связывающие агенты. В некоторых вариантах осуществления, пероральными готовыми формами являются формы, в которых δΐΕΝΑ, описанные в этом изобретении, вводят вместе с одним или несколькими усилителями проникновения, поверхностно-активными веществами (сурфактантами) и хелаторами. Подходящие поверхностноактивные вещества включают в себя жирные кислоты и/или их эфиры и соли, желчные кислоты и/или из соли. Подходящие желчные кислоты/соли включают в себя хенодезоксихолевую кислоту (ΟΌΟΑ) и урсодезоксихенодезоксихолевую кислоту (υΌΟΑ), холевую кислоту, дегидрохолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, глюхолевую кислоту, глихолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту, таурохолевую кислоту, тауродезоксихолевую кислоту, натрий-тауро-24,25-дигидрофузидат и натрийгликодигидрофузидат.
Подходящие жирные кислоты включают в себя арахидоновую кислоту, ундекановую кислоту, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кисло
- 24 020312 ту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль (например, соль натрия). В некоторых вариантах осуществления, используют комбинации усилителей проникновения, например, жирные кислоты/соли в комбинации с желчными кислотами/солями. Одной примерной комбинацией является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновая кислота и иЭСА. Дополнительные усилители проникновения включают в себя лауриловый эфир полиоксиэтилена-9, цетиловый эфир полиоксиэтилена-20. дцРНК, описанная в этом изобретении, может доставляться перорально, в гранулярной форме, включающей в себя распыленные высушенные частицы, или в комплексе для образования микроили наночастиц. Образующие комплексы дцРНК агенты включают в себя полиаминокислоты; полиимины; полиакрилаты; полиалкилакрилаты; полиоксетаны; полиалкилианоакрилаты; катионизированные желатины, альбумины, крахмалы, акрилаты, полиэтиленгликоли (ПЭГ) и крахмалы; полиалкилцианоакрилаты; ДЭАЭ-дериватизованные полиимины, пуллуланы, целлюлозы и крахмалы. Подходящие комплексообразующие агенты включают в себя хитозан, Ν-триметилхитозан, поли-Ь-лизин, полигистидин, полиорнитин, полиспермины, протамин, поливинилпиридин, политиодиэтиламинометилэтилен Р Р(ТЭАЕ), полиаминостирол (например, п-амино), поли(метилцианоакрилат), поли(этилцианоакрилат), поли(бутилцианоакрилат), поли(изобутилцианоакрилат), поли(изогексилцианоакрилат), ДЭАЭметакрилат, ДЭАЭ-гексилакрилат, ДЭАЭ-акриламид, ДЭАЭ-альбумин и ДЭАЭ-декстран, полиметилакрилат, полигексилакрилат, поли(П,Ь-молочную кислоту), поли(сополимер ОЬ-молочной и гликолевой кислот (РЬСА), альгинат и полиэтиленгликоль (РЕС). Пероральные готовые формы для дцРНК и их приготовление описаны подробно в патенте США № 6887906, публикации США № 20030027780 и патенте США № 6747014, каждый из которых включен здесь посредством ссылки.
Композиции и готовые формы для парентерального, интрапаренхимного (в головной мозг), внутриоболочечного, внутрижелудочкового или внутрипеченочного введения могут включать в себя стерильные водные растворы, которые могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки, такие как, но не ограничивающиеся ими, усилители проникновения, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты.
Фармацевтические композиции данного изобретения включают в себя, но не ограничиваются ими, растворы, эмульсии и содержащие липосомы готовые формы. Эти композиции могут быть созданы из различных компонентов, которые включают в себя, но не ограничиваются ими, предварительно приготовленные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества. Особенно предпочтительными являются готовые формы, которые нацелены на печень, при лечении нарушений печени, таких как рак печени.
Фармацевтические готовые формы данного изобретения, которые могут удобным образом предоставляться в стандартной лекарственной форме, могут быть приготовлены в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в фармацевтической промышленности. Такие способы включают в себя стадию приведения в контакт активных ингредиентов с фармацевтическим носителем (фармацевтическими носителями) или эксципиентом (эксципиентами). Обычно эти готовые формы готовят однородным и тонким приведением в контакт активных ингредиентов с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями или и теми, и другими, с последующим формованием этого продукта, если необходимо.
Композиции данного изобретения могут быть приготовлены в виде любой из многих лекарственных форм, таких как, но не ограничивающихся ими, таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Композиции данного изобретения могут быть также приготовлены в виде суспензий в водных, неводных или смешанных средах. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, которые увеличивают вязкость этой суспензии, включающие в себя, например, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Эта суспензия может также содержать стабилизаторы.
Эмульсии
Композиции данного изобретения могут быть получены и приготовлены в виде эмульсий. Эмульсии являются обычно гетерогенными системами одной жидкости, диспергированной в другой в форме капелек, обычно превышающих 0,1 мкм в диаметре (Икоп, ίη Р11агтасеиНса1 Оокаде Рогтк, ЫеЬегтап, Н1едег апй Вапкег (Ейк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Υо^к, Ν.Υ., уок. 1, р. 199; НокоГГ, ш Р11агтасеиНса1 Эокаде Рогтк, ЫеЬегтап, Н1едег апй Вапкег (Ейк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уо^к. Ν.Υ., Уо1ите 1, р. 245; В1оск т Рйагтасеи11са1 Эокаде Рогтк, ЫеЬегтап, Ыедег апй Вапкег (Ейк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уогк, Ν.Υ., уо1. 2, р. 335; ШдисЫ е1 а1., т НеттдЮп'к Р11агтасеиНса1 8с1епсек, Маск РнЬНкЫпд Со., Еайоп, Ра., 1985, р. 301). Эмульсии являются часто двухфазными системами, содержащими две не смешивающиеся жидкие фазы, тонко смешанные и диспергированные друг с другом. Обычно, эмульсии могут быть или эмульсиями типа вода-в-масле (в/м) , или эмульсиями типа масло-в-воде (м/в). Когда водная фаза мелко разделена и диспергирована в виде мельчайших капелек в объемную масляную фазу, полученную композицию называют эмульсией вода-в-масле (в/м). Альтернативно, когда масляная фаза мелко разделена и диспергирована в виде мельчайших капелек в объемную водную фазу, полученную
- 25 020312 композицию называют эмульсией масло-в-воде (м/в). Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты, наряду с диспергированными фазами, и активное лекарственное средство, которое может присутствовать в виде раствора или в водной фазе, или в масляной фазе, или может само быть отдельной фазой. Если необходимо, фармацевтические эксципиенты, такие как эмульгаторы, стабилизаторы, красители и антиоксиданты, могут также присутствовать в эмульсиях. Фармацевтические эмульсии могут быть также множественными эмульсиями, которые содержат более двух фаз, например, в случае эмульсий масло-в-воде-в-масле (м/в/м) и вода-в-масле-в-воде (в/м/в). Такие комплексные готовые формы часто обеспечивают определенные преимущества, которые не обеспечивают простые бинарные (двойные) эмульсии. Множественные эмульсии, в которых индивидуальные капельки масла м/в-эмульсии заключают в себя малые капельки воды, составляют в/м/в-эмульсию. Подобным образом, система капелек масла, заключенных в глобулы воды, стабилизированных в масляной непрерывной фазе, обеспечивают эмульсию м/в/м.
Эмульсии характеризуются низкой термодинамической стабильностью или отсутствием термодинамической стабильности. Часто диспергированная или прерывистая фаза эмульсии хорошо диспергируется в наружную или непрерывную фазу и сохраняется в этой форме посредством эмульгаторов или вязкости этой готовой формы. Любая из этих фаз эмульсии может быть полутвердым или твердым веществом, как в случае основ и кремов мазей эмульсионного типа. Другие способы стабилизации эмульсий влекут за собой применение эмульгаторов, которые могут быть включены в любую фазу этой эмульсии. Другие средства стабилизации эмульсий влекут за собой применение эмульгаторов, которые могут быть включены в любую фазу этой эмульсии. Эмульгаторы могут быть в общих чертах классифицированы на четыре категории:
синтетические сурфактанты (поверхностно-активные вещества), природно-встречающиеся эмульгаторы, абсорбционные основы и тонкоизмельченные твердые вещества. (1бкоп, ίη РЕагтасеибса1 Эокаде Еогтк, ЫеЬегтап, Ыедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уогк, Ν.Υ., уо1ите 1, р. 199).
Синтетические сурфактанты, также известные как поверхностно-активные вещества, нашли широкую применимость в приготовлении эмульсий и обсуждались в виде обзоров в литературе (Шедег, ш РЕагтасеи11са1 Эокаде Еогтк, ЫеЬегтап, Ыедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уо^к. Ν.Υ., уо1. 1, р. 285; 1бкоп, т Р11агтасеиНса1 Эокаде Еогтк, ЫеЬегтап, Ыедег апб Вапкег (Ебк.), Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Υо^к, Ν.Υ., 1988, уо1. 1, р. 199). Сурфактанты являются обычно амфифильными и содержат гидрофильную и гидрофобную часть. Отношение гидрофильной природы к гидрофобной природе сурфактанта было названо гидрофильным/липофильным балансом (ΗΡ-В), и оно является ценным инструментом в классификации и выборе сурфактантов в приготовлении готовых форм. Сурфактанты могут быть классифицированы в различные классы на основе природы гидрофильной группы: неионогенные, анионогенные, катионогенные и амфотерные (Ыедег, ш РЕагтасеибса1 Эокаде Еогтк, ЫеЬегтап, Ыедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., Νο\ν Уо^к. Ν. Υ., уо1. 1, р. 285).
Природно встречающиеся эмульгаторы, используемые в эмульсионных готовых формах, включают в себя ланолин, пчелиный воск, фосфатиды, лецитин и аравийскую камедь. Абсорбционные основы обладают гидрофильными свойствами, так что они могут впитывать воду с образованием в/м-эмульсий с сохранением все еще их полутвердой консистенции, например, в случае безводного ланолина и гидрофильного вазелина. Тонкоизмельченные твердые вещества также использовали в качестве хороших эмульгаторов, особенно в комбинации с сурфактантами и в вязких препаратах. Они включают в себя полярные неорганические твердые вещества, такие как гидроксиды тяжелых металлов, ненабухаемые глины, такие как бентонит, аттапульгит, гекторит, каолин, монтомориллонит, коллоидный силикат алюминия и коллоидный силикат магния-алюминия, пигменты и неполярные твердые вещества, такие как углерод или глицерилтристеарат.
Большое разнообразие неэмульгирующих веществ также включают в эмульсионные готовые формы, и они вносят вклад в свойства эмульсий. Они включают в себя жиры, масла, воски и антиоксиданты (В1оск, 1п РЕагтасеибса1 Эокаде Ролик, ЫеЬегтап, Ыедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уогк, Ν.Υ., уоР 1, р. 335; 1бкоп, т Р11агтасеиНса1 Эокаде Еогтк, ЫеЬегтап, Ыедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уо^к, Ν.Υ., уо1. 1, р. 199).
Гидрофильные коллоиды или гидроколлоиды включают в себя природно-встречающиеся камеди и синтетические полимеры, такие как полисахариды (например, аравийская камедь, агар, альгиновая кислота, каррагенан, гуаровая камедь, камедь карайи и трагакантовая камедь), производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозу и карбоксипропилцеллюлозу) и синтетические полимеры (например, карбомеры, простые эфиры целлюлозы и карбоксивиниловые полимеры). Они диспергируются или набухают в воде с образованием коллоидных растворов, которые стабилизируют эмульсии образованием сильных межфазных пленок вокруг капелек диспергированной фазы и увеличением вязкости наружной фазы.
Поскольку эмульсии часто содержат ряд ингредиентов, таких как углеводы, белки, стеролы и фосфатиды, которые могут легко поддерживать рост микробов, эти готовые формы часто включают в себя консерванты. Обычно применяемыми консервантами, включаемыми в эмульсионные готовые формы, включают в себя метилпарабен, пропилпарабен, соли четвертичного азота, хлорид бензалкония, эфиры п
- 26 020312 гидроксибензойной кислоты и борную кислоту. Антиоксиданты также добавляют обычно в эмульсионные готовые формы для предотвращения ухудшения качества этой готовой формы. Используемыми антиоксидантами могут быть акцепторы свободных радикалов, такие как токоферолы, алкилгаллаты, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, или восстанавливающие агенты, такие как аскорбиновая кислота и метабисульфит натрия, и синергисты антиоксидантов, такие как лимонная кислота, винная кислота и лецитин.
Применение эмульсионных готовых форм посредством дерматологических, пероральных и парентеральных способов и способы их приготовления обсуждались в обзорах в литературе (Ιάκοη, ίη РйагтассиНеа1 Иокаде Еогтк, ЫсЬсгтан. Н1едег αηά Ваикег (Εάκ.), 1988, Магсе1 Эскксг. 1пс., Νο\ν Уогк, Ν. Υ., νοί. 1, р. 199). Эмульсионные готовые формы для пероральной доставки широко использовались вследствие их легкого приготовления, а также эффективности с точки зрения абсорбции и биодоступности (ΒοκοίΤ, ίη Рйагтасеи11са1 ^οκаде Εοπηκ, Ыейегтац Н1едег ηηά Ваикег (Εάκ.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν ΥογΚ, Ν.Υ., νο1. 1, р. 245; Ιάκοη, ίη Рйагтасеи11са1 ^οκаде Εοπηκ, Ыейегтац Н1едег ηηά Ваикег (Εάκ.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν ΥογΚ, Ν.Υ., νο1. 1, р. 199) . Слабительные вещества на основе минерального масла, растворимые в масле витамины и питательные препараты с высоким содержанием жира находятся среди веществ, которые обычно вводят перорально в виде м/в-эмульсий.
В одном варианте осуществления данного изобретения, композиции дцРНК и нуклеиновых кислот готовят в виде микроэмульсий. Микроэмульсия может быть определена как система из воды, масла и амфифильного соединения, которая является единым оптически изотропным и термодинамически стабильным жидким раствором (ΚοκοίΤ, ίη Рйагтасеи1гса1 ^οκаде Εοπηκ, ^^еЬе^таη. Н1едег ηηά Ваикег (Εάκ.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν ΥογΚ, Ν.Υ., νο1. 1, р. 245). Обычно микроэмульсии являются системами, которые готовят сначала диспергированием масла в водном растворе сурфактанта с добавлением затем достаточного количества четвертого компонента, обычно спирта со средней длиной цепи, с получением прозрачной системы. Таким образом, микроэмульсии описывали также как термодинамически стабильные, изотропически прозрачные дисперсии двух несмешиваемых жидкостей, которые стабилизированы межфазными пленками поверхностно-активных молекул (й-еинд ηηά Зйай, ίη: ίΌηΙΐΌ1Βά Не1еаке οΤ Эгндк: Рο1уте^κ аЫ Аддгеда1е 8ук1етк, ΚοκοΤΕ, Μ., Εά., 1989, \;СН РиЫ1кйегк, №\ν ΥογΚ, радек 185-215) . Микроэмульсии готовят обычно посредством объединения трех-пяти компонентов, которые включают в себя масло, воду, сурфактант и электролит. Является ли эта микроэмульсия эмульсией типа вода-в-масле (в/т) или типа масло-в-воде (м/в), зависит от свойств используемых масла и сурфактанта и от структуры и геометрической упаковки полярных головок и углеводородных хвостов молекулы сурфактанта (БсйюШ ίη Нет^д^'к Рйагтасеийса1 Заемсек, МасК РиЫЫппд ΕηκΙοη, Ра., 1985, р. 271).
Интенсивно исследовался феноменологический подход, использующий фазовые диаграммы (диаграммы фазового равновесия, или диаграммы состояния), которые предоставили квалифицированным в данной области специалистам всеобъемлющие сведения о том, как следует готовить микроэмульсии (ΒοκοΤΤ, ίη Рйагтасеийса1 ^οκаде Εοπηκ, ^^еЬе^таη. Н1едег ηηά ВанКег (Εάκ.), 1988, Магсе1 ИеККег, 1пс., №\ν ΥογΚ, Ν.Υ., νο1. 1, р. 245; В^ск, ίη Рйагтасеи11са1 Ωο^·^ Εοπηκ, Ыейегтац Н1едег ηηά ВниКсг (Εάκ.), 1988, Магсе1 ИеКкег, 1пс., №\ν ΥογΚ, Ν. Υ., νο1. 1, р. 335). В сравнении с общепринятыми эмульсиями, микроэмульсии предоставляют преимущество солюбилизации водонерастворимых лекарственных средств в готовой форме термодинамических стабильных капелек, которые образуются спонтанно.
Сурфактанты, используемые в приготовлении микроэмульсий, включают в себя, но не ограничиваются ими, ионогенные сурфактанты, неионогенные сурфактанты, Вл] 96, олеиловые эфиры полиоксиэтилена, эфиры полиглицерина и жирных кислот, монолаурат тетраглицерина (МЬ310), моноолеат тетраглицерина (МО310), моноолеат гексаглицерина (РО310), пентаолеат гексаглицерина (РО500), монокапрат декаглицерина (МСА750), моноолеат декаглицерина (МО750), секвиолеат декаглицерина (8Θ750), декаолеат декаглицерина (ΌΑΘ750), отдельно или в комбинации с вторичными сурфактантами. Вторичный сурфактант, обычно спирт с короткой цепью, такой как этанол, 1-пропанол и 1-бутанол, служит для увеличения межфазной текучести проникновением в пленку сурфактанта и создания вследствие этого пустого пространства, генерируемого среди молекул сурфактанта. Однако микроэмульсии могут быть приготовлены без применения вторичных сурфактантов, и в данной области известны не содержащие спирта самоэмульгирующиеся микроэмульсионные системы. Водной фазой может быть обычно, но без ограничения ими, вода, водный раствор лекарственных средств, глицерин, РΕС300, РΕС4 00, полиглицерины, пропиленгликоли и производные этиленгликоля. Масляная фаза может включать в себя, но не ограничивается ими, такие вещества, как Сар1ех 300, Сар1ех 355, Сарти1 МСМ, эфиры жирных кислот, моно-, ди- и триглицериды со средней цепью (С8-С12), полиоксиэтилированные глицериловые эфиры жирных кислот, жирные спирты, полигликолизированные глицериды, насыщенные полигликолизированные С8-С10 глицериды, растительные масла и силиконовое масло.
Микроэмульсии представляют особый интерес с точки зрения солюбилизации лекарственных средств и увеличенной абсорбции лекарственных средств. Микроэмульсии на основе липидов (как м/в, так и в/м) были предложены для увеличения пероральной биодоступности лекарственных средств, в том числе пептидов (Сοнκίаηΐ^н^άеκ е1 а1., Рйагтасеийса1 Не^атсй, 1994, 11, 1385-1390; НШсйеЕ Ме1й. Είηά. Εxр. С1ш. РйаттаотЦ 1993, 13, 205) . Микроэмульсии предоставляют преимущества улучшенной солюби
- 27 020312 лизации лекарственных средств, защиты лекарственного средства от ферментативного гидролиза, возможного усиления абсорбции лекарственных средств вследствие индуцируемых сурфактантом изменений в текучести и проницаемости мембран, легкости приготовления, легкости перорального введения в сравнении с твердыми лекарственными формами, улучшенной клинической эффективности и уменьшенной токсичности (Сои81апйшйе8 е! а1., Рйагтасеи!юа1 КевеагсН, 1994, 11, 1385; Но е! а1., 1. РНагт. 8οΐ, 1996, 85, 138-143). Часто микроэмульсии могут образовываться спонтанно при сведении их компонентов вместе при комнатной температуре. Это может быть особенно выгодным при приготовлении термолабильных лекарственных средств, пептидов или дцРНК. Микроэмульсии были также эффективны в чрескожной доставке активных компонентов как в косметических, так и фармацевтических применениях. Ожидается, что микроэмульсионные композиции и готовые формы данного изобретения будут способствовать увеличенной системной абсорбции дцРНК и нуклеиновых кислот из желудочно-кишечного тракта, а также улучшать локальное клеточное поглощение дцРНК и нуклеиновых кислот.
Микроэмульсии данного изобретения могут также содержать дополнительные компоненты и добавки, такие как моностеарат сорбитана (Сп11 3), лабразол и усливающие проникновение агенты, для улучшения свойств готовой формы и усиления абсорбции дцРНК и нуклеиновых кислот данного изобретения. Усиливающие проникновение агенты, используемые в микроэмульсиях данного изобретения, могут быть классифицированы как принадлежащие к одной из пяти широких категорий: сурфактанты, жирные кислоты, желчные кислоты, хелатообразующие агенты и не-хелатообразующие неповерхностно-активные вещества (Ьее е! а1., СгШса1 Кеу1е^8 ίη Тйетареийс Эгид Сатет 8ув!ет8, 1991, р. 92). Каждый из этих классов обсуждался выше.
Усиливающие проникновение агенты
В одном варианте осуществления, данное изобретение использует различные усиливающие проникновение агенты для выполнения эффективной доставки нуклеиновых кислот, в частности дцРНК, в кожу животных. Большинство лекарственных средств присутствуют в растворе как в ионизированной, так и неионизированной формах. Однако, обычно только растворимые в липидах или липофильные лекарственные средства легко пересекают клеточные мембраны. Было обнаружено, что даже нелипофильные лекарственные средства могут пересекать клеточные мембраны, если мембрана, которая должна быть пересечена, обработана усиливающим проникновение агентом. Кроме содействия диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны, усиливающие проникновение агенты усиливают также проникаемость липофильных лекарственных средств.
Усиливающие проникновение агенты могут быть классифицированы как принадлежащие к одной из пяти широких категорий: сурфактанты, жирные кислоты, желчные кислоты, хелатообразующие агенты и не-хелатообразующие не-поверхностно-активные вещества (Ьее е! а1., С’гШса1 Кеу1е^8 ίη Тйетареийс Эгид Сатет 8ув!ет8, 1991, р. 92). Каждый из этих классов усиливающих проникновение агентов описан ниже более подробно.
Сурфактанты.
В связи с данным изобретением сурфактанты (или поверхностно-активные агенты) являются химическими частицами, которые при растворении в водном растворе уменьшают поверхностное натяжение этого раствора или межфазное натяжение между водным раствором и другой жидкостью, результатом чего является усиление абсорбции дцРНК через слизистую оболочку. Кроме желчных кислот и жирных кислот, эти усиливающие проникновение агенты включают в себя, например, лаурилсульфат натрия, лауриловый эфир полиоксиэтилена-9 и цетиловый эфир полиоксиэтилен-20 (Ьее е! а1., С.'пБса1 Кеу1е^8 ίη ТНегареиБс Эгид Сатет 8ув!ет8, 1991, р.92) и перфторхимические эмульсии, такие как РС-43 (ТакаНахЫ е! а1., 1. РНагт. РНагтасо1, 1988, 40, 252).
Жирные кислоты.
Различные жирные кислоты и их производные, которые действуют как усиливающие проникновение агенты, включают в себя, например, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприновую кислоту (н-декановую кислоту), миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин (1-моноолеоил-та8-глицерин), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, глицерол-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан2-он, ацилкарнитины, ацилхолины, их Смо-алкиловые эфиры (например, метиловый, изопропиловый и трет-бутиловый) и их моно- и диглицериды (т.е., олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат, линолеат и т.д.) (Ьее е! а1., СпБса1 Кеу1е^8 ίη Ткетареийс Эгид Сатет 8ув!ет8, 1991, р.92; МиташвЫ, Стй1са1 Кеу1е\\'8 ίη ТНетареийс Эгид Сатет 8ув!ет8, 1990, 7, 1-33; Ε1 Натт е! а1., 1. РНагт. РНагтасо1, 1992, 44, 651-654).
Соли желчных кислот.
Физиологическая роль желчи включает в себя облегчение диспергирования и абсорбции липидов и жирорастворимых витаминов (Втип!оп, СНар!ег 38 ίη: 6ооάтаη & Сйтан'в ТНе РНагтасо1од1са1 Вав1в ок Ткегареийсв, 9!Н Εά., Нагйтан е! а1. Εάβ., МсСга^-НШ, Ыете Уогк, 1996, рр. 934-935). Различные природные соли желчных кислот и их синтетические производные действуют в качестве усиливающих проникновение агентов. Таким образом, термин соли желчных кислот включает в себя любой из природновстречающихся компонентов желчи, а также их синтетические производные. Подходящие соли желчных
- 28 020312 кислот включают в себя, например, холевую кислоту (или ее фармацевтически приемлемую натриевую соль, холат натрия), дегидрохолевую кислоту (дегидрохолат натрия), дезоксихолевую кислоту (дезоксихолат натрия), глюхолевую кислоту (глюхолат натрия), гликохолевую кислоту (гликохолат натрия), гликодезоксихолевую кислоту (гликодезоксихолат натрия), таурохолевую кислоту (таурохолат натрия), тауродезоксихолевую кислоту (тауродезоксихолат натрия), хенодезоксихолевую кислоту (хенодезоксихолат натрия), урсодезоксихолевую кислоту (ИЭСА), тауро-24,25-дигидрофузидат натрия (8ТЭНР), гликодигидрофузидат натрия и лауриловый эфир полиоксиэтилена-9 (РОЕ) (Ьее е! а1., СпЦса1 Ке\зе\У5 ш Тйегареийс Эгид Сатег 8ук!ет5, 1991, раде 92; 8утуагб, Сйар!ег 39 1п: Кеттд!оп'к Рйагтасеи!1са1 8с1епсек, 18Ш Еб., Сеппаго, еб., Маск РиЬНкЫпд Со., ЕакЮп, Ра., 1990, радек 782-783; МигашкЫ, СгШса1 Кеу1е\У5 т Тйегареийс Эгид Сатег 8ук!ет5, 1990, 7, 1-33; Υататο!ο е! а1., 1. Рйагт. Ехр. Тйег., 1992, 263, 25; Υатакййа е! а1., 1. Рйагт. 8с1, 1990, 79, 579-583).
Хелатообразующие агенты.
Хелатообразующие агенты, при использовании в связи с данном изобретением, могут быть определены как соединения, которые удаляют ионы металлов из раствора образованием с ними комплексов, в результате чего усиливается абсорбция дцРНК через слизистую оболочку. Что касается их применения в качестве усиливающих проникновение агентов в данном изобретении, хелатообразующие агенты имеют дополнительное преимущество, служа в качестве ингибиторов ДНКазы, так как наиболее охарактеризованные ДНКазы требуют двухвалентного иона металла для катализа и, следовательно, ингибируются хелатообразующими агентами (РигеИ 1. СйготаЮдг., 1993, 618, 315-339). Подходящие хелатообразующие агенты включают в себя, но не ограничиваются ими, динатрийэтилендиаминтетраацетат (ЕЭТА), лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат натрия, 5-метоксисалицилат и гомованилат), Νацилпроизводные коллагена, лаурет-9 и Ν-аминоацилпроизводные бета-дикетонов (енамины) (Ьее е! а1., Сгй1са1 Ке\зе\\ъ ш Тйегареийс Эгид Сатег 8у51ет5, 1991, раде 92; Мигашкйц СгШса1 Кеу1е\\ъ т ТйегареиЦс Эгид Сатег 8ук!етк, 1990, 7, 1-33; Вииг е! а1., 1. Соп!го1 КеЬ, 1990, 14, 43-51).
Не-хелатообразующие не-сурфактанты.
В данном контексте не-хелатообразующие не-сурфактанты, усиливающие проникновение соединения, могут быть определены как соединения, которые демонстрируют незначительную активность в качестве хелатообразующих агентов или в качестве сурфактантов, но тем не менее усиливают абсорбцию дцРНК через алиментарную слизистую оболочку (Мигашкйц Сгйка1 Ке\зе\\ъ ш Тйегареийс Эгид Сатег 8у51ет5, 1990, 7, 1-33). Этот класс усиливающих проникновение агентов включает в себя, например, ненасыщенные циклические мочевины, производные 1-алкил- и 1-алкенилазациклоалканона (Ьее е! а1., Сгйка1 Ке\зе\У5 ш Тйегареийс Эгид Сатег 8ук!ет5, 1991, раде 92); и нестероидные противовоспалительные агенты, такие как диклофенак-натрий, индометацин и фенилбутазон (Уашакййа е! а1., 1. Рйагт. Рйагтасо1., 1987, 39, 621-626).
Носители
Некоторые композиции данного изобретения включают в себя также соединения-носители в готовой форме. В данном контексте, соединение-носитель или носитель могут относиться к нуклеиновой кислоте или ее аналогу, которые являются инертными (т.е. не имеют сами по себе биологической активности), но узнается в качестве нуклеиновой кислоты процессами ш у|уо, которые уменьшают биодоступность нуклеиновой кислоты, имеющей биологическую активность, например, деградацией этой биологически активной нуклеиновой кислоты или стимулированием ее удаления из кровотока. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединения-носителя, обычно с избытком последнего вещества, может приводить к существенному уменьшению количества нуклеиновой кислоты, улавливаемой в печени, почке или других резервуарах вне кровотока, предположительно вследствие конкуренции между соединением-носителем и нуклеиновой кислотой за общий рецептор. Например, улавливание частично фосфоротиоатной дцРНК в ткани печени может уменьшаться при совместном введении полиинозиновой кислоты, декстрансульфата, полицитидиновой кислоты или 4-ацетамидо-4'-изотиоцианостильбен-2,2'дисульфоновой кислоты (М1уао е! а1, Эк^А Кек. ^еν., 1995, 5, 115-121; Такакига е! а1., ^5ΚNΑ & №с1. Ас1б Эгид Бет., 1996, 6, 177-183.
Эксципиенты
В отличие от соединения-носителя фармацевтический носитель или эксципиент является фармацевтически приемлемым растворителем, суспендирующим агентом или любым другим фармакологически инертным носителем для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот животному. Этот эксципиент может быть жидкостью или твердым веществом, и его выбирают, имея в виду запланированный способ введения, таким образом, чтобы обеспечить желаемый объем, консистенцию и т.д., при объединении с нуклеиновой кислотой и другими компонентами конкретной фармацевтической композиции. Обычные фармацевтические носители включают в себя, но не ограничиваются ими, связывающие агенты (например, желатинированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу и т.д.); наполнители (например, лактозу и другие сахара, микрокристаллическую целлюлозу, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлозу, полиакрилаты или гидрофосфат кальция и т.д.); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк, диоксид кремния, коллоидный диоксид кремния, стеариновую кислоту, стеараты металлов, гидрогенизированные растительные масла, кукурузный крах
- 29 020312 мал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т.д.); дезинтегрирующие агенты (например, крахмал, гликолат натрий-крахмала и т.д.) и увлажняющие агенты (например, лаурилсульфат натрия и т.д.).
Фармацевтически приемлемые органические или неорганические эксципиенты, подходящие для непарентерального введения, которые не реагируют вредным образом с нуклеиновыми кислотами, могут быть также использованы для приготовления композиций данного изобретения. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают в себя, но не ограничиваются ими, воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.п.
Готовые формы для местного (локального) введения нуклеиновых кислот могут включать в себя стерильные и нестерильные водные растворы, неводные растворы в обычных растворителях, таких как спирты, или растворы нуклеиновых кислот в жидких или твердых масляных основах. Эти растворы могут также содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. Могут быть использованы фармацевтически приемлемые органические или неорганические эксципиенты, подходящие для непарентерального введения, которые не реагируют вредным образом с нуклеиновыми кислотами.
Подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты включают в себя, но не ограничиваются ими, воду, солевые растворы, спирт, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.п.
Другие компоненты
Композиции данного изобретения могут дополнительно содержать вспомогательные компоненты, обнаруживаемые в фармацевтических композициях, при их установленных в данной области уровнях. Так, например, эти композиции могут содержать дополнительные, совместимые, фармацевтически активные вещества, такие как, например, противозудные средства, останавливающие кровотечение средства, местные анестезирующие средства или противовоспалительные агенты, или могут содержать дополнительные вещества, применимые в физическом приготовлении различных лекарственных форм композиций данного изобретения, такие как красители, ароматизирующие агенты, консерванты, антиоксиданты, глушители (делающие материал непрозрачным), загущающие агенты и стабилизаторы. Однако такие вещества при добавлении должны чрезмерно препятствовать биологическим активностям компонентов композиций данного изобретения. Эти готовые формы могут быть стерилизованы и, если желательно, смешаны со вспомогательными агентами, например, смазывающими веществами, консервантами, стабилизаторами, увлажняющими агентами, эмульгаторами, солями для влияния на осмотическое давление, буферами, красящими агентами, отдушками и/или ароматическими веществами и т.п., которые не взаимодействуют вредным образом с нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) этой готовой формы.
Водные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость этой суспензии, в том числе, например, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Эта суспензия может также содержать стабилизаторы.
В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции, описанные в этом изобретении, включают в себя (а) одно или несколько дцРНК-соединений и (Ь) один или несколько антицитокиновых биологических агентов, которые функционируют посредством другого, чем НNΑ^, механизма. Примеры таких биологических веществ включают в себя биологические вещества, которые нацелены на ΙΛ-1β (например, анакинра) , 1Ь6 (тоцилицунаб) или Т№ (этанерцепт, инфликсимаб, адлимумаб или цертолицумаб).
Токсичность и терапевтическая эффективность таких соединений может быть определена стандартными фармацевтическими процедурами в культурах клеток или в экспериментальных животных, например, для определения ЕИ50 (дозы, летальной для 50% этой популяции) и ЕИ50 (дозы, терапевтически эффективной в 50% этой популяции). Дозовое отношение между токсическим и терапевтическим эффектами называют терапевтическим индексом, и он может быть выражен в виде отношения Ε050/ΕΌ50. Предпочтительными являются соединения, которые обнаруживают высокие терапевтические индексы.
Данные, полученные из анализов культур клеток и исследований на животных, могут быть использованы в приготовлении диапазона доз для применения в людях. Доза композиций, описанных в этом изобретении, лежит обычно в диапазоне циркулирующих в кровотоке концентраций, которые включают в себя ЕИ50 с низкой токсичностью или с отсутствием токсичности. Эта доза может варьироваться в пределах этого диапазона в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого способа введения. Для любого соединения, используемого в описанных в этом изобретении способах, терапевтически эффективная доза может быть приближенно оценена сначала из анализов культур клеток. Доза может быть определена в моделях животных для получения диапазона, циркулирующих в плазме концентраций соединения, или, соответственно, полипептидного продукта последовательности-мишени (например, с получением уменьшенной концентрации этого полипептида), который включает в себя 1С50 (т.е. концентрацию тест-соединения, которая дает полумаксимальное ингибирование симптомов), при определении в культуре ткани. Такая информация может быть использована для более точного определения применимых доз в людях. Уровни в плазме могут быть измерены, например, высокоэффективной жидкостной хроматографией.
- 30 020312
Кроме их обсуждаемого выше введения, дцРНК описанные в этом изобретении, могут вводиться в комбинации с другими известными агентами, эффективными в лечении патологических процессов, опосредуемых экспрессией ТТК. В любом случае, производящий введения врач может корректировать количество и тайминг введения дцРНК на основании наблюдаемых результатов, с использованием стандартных критериев эффективности, известных в данной области или описанных здесь.
Способы лечения заболеваний, вызываемых экспрессией гена ТТК
Это изобретение относится к применению дцРНК, поражающей ТТК, и композициям, содержащим по меньшей мере одну такую дцРНК, для лечения ТТК-опосредуемого нарушения или заболевания. Например, дцРНК, поражающая ген ТТК, может быть использована для лечения ТТК-амилоидоза, такого как наследственная амилоидная полиневропатия (ТАР), наследственная амилоидная кардиомиопатия (РАС), лептоменингеальный амилоидоз/амилоидоз ЦНС (центральной нервной системы), форма VII амилоидоза (также называемая лептоменингеальным или менингоцереброваскулярным амилоидозом), гипертироксинемия и амилоидоз сердца (также называемый сенильным системным амилоидозом (88А) и сенильным амилоидозом сердца (8СА)).
Фиг. 15 иллюстрирует симптомы и мутации в ТТК, ассоциированные с наследственной амилоидной невропатией, наследственной амилоидной карбиомиопатией и амилоидозом ЦНС. Это изобретение включает в себя композиции и способы для лечения этих заболеваний и симптомов и направлено на мутантные версии ТТК.
дцРНК, поражающая ген ТТК, используется также для лечения симптомов и нарушений, таких как ТТК-амилоидоз. Симптомы, ассоциированные с таким амилоидозом, включают в себя, например, припадки, деменцию, миелопатию, полиневропатию, синдром канала запястья, вегетативную недостаточность, кардиомиопатию, желудочно-кишечную дисфункцию (например, язвы желудка, диарею, констипацию, малабсорбцию (синдром недостаточности всасывания)), потерю массы, гепатомегалию, лимфаденопатию, зоб, помутнения стекловидного тела, почечную недостаточность (в том числе протеинурию и почечную недостаточность), нефропатию, дисфункцию черепных нервов и дистрофию корнеальной решетки и застойную сердечную недостаточность с генерализованной слабостью и трудностью дыхания из-за задержки жидкости.
Благодаря ингибирующим действиям на экспрессию ТТК, композиция согласно этому изобретению или приготовленная из нее фармацевтическая композиция может улучшать качество жизни.
Это изобретение относится также к применению дцРНК или содержащей ее фармацевтической композиции, например, для лечения ТТК-амилоидоза, в комбинации с другими фармацевтическими веществами и/или другими терапевтическими способами, например, с известными фармацевтическими веществами и/или известными терапевтическими способами, такими как, например, вещества и/или способы, котроые используются в настоящее время для лечения этих нарушений. В одном примере, дцРНК, поражающая ТТК, может вводиться в комбинации с фармацевтическим или терапевтическим способом для лечения симптома ТТК-заболевания, например, диуретическими средствами, ингибиторами АСЕ (ангиотензин-превращающего фермента), блокаторами рецептора ангиотензина (АКВ), или диализом, например, для лечения почечной функции.
дцРНК и дополнительный терапевтический агент могут вводиться в одной и той же комбинации, например, парентерально, или может вводиться дополнительный терапевтический агент в виде части композиции или другим описанным здесь способом.
Это изобретение описывает способ введения дцРНК, поражающей ТТК, пациенту, имеющему заболевание или нарушение, опосредуемое экспрессией ТТК, такое как ТТК-амилоидоз, например, РАР. Введение этой дцРНК может стабилизировать и улучшать периферическую неврологическую функцию, например, в пациенте с РАР. Пациентам может вводиться терапевтическое количество дцРНК, например, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 или 2,5 мг/кг б8КNΑ. Эта дцРНК может вводиться внутривенной инфузией на протяжении периода времени, такого как 5-минутный, 10-минутный, 15-минутный, 20-минутный, 25минутный, 60-минутный, 120-минутный или 180-минутный период. Это введение повторяют, например, на регулярной основе, например, один раз в две недели (т.е. каждую вторую неделю) в течение одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев или дольше. После начальной схемы введения эти обработки могут выполняться на менее частой основе. Например, после введения каждые две недели в течение трех месяцев введение может повторяться один раз в месяц в течение шести месяцев или года или дольше. Введение дцРНК может уменьшать уровни ТТК в крови или моче пациента по меньшей мере на 20, 25, З0, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% или более.
Перед введением полной дозы дцРНК, пациентам может вводиться более низкая доза, например, доза, которая является 5% полной дозы, и может проводиться мониторинг на вредные действия, такие как аллергическая реакция или изменение функции печени. Например, у пациентов, подвергаемых мониторингу на изменения функции печени, приемлемой является низкая частота изменения ЬРТ (теста функции печени) (например, 10-20% частота ЬРТ) (например, обратимое З-кратное увеличение уровней АЬТ (аланинаминотрансферазы) и/или А8Т (аспартатаминотрансферазы).
Многие ТТК-ассоциированные заболевания и нарушения являются наследственными. Таким образом, пациент, нуждающийся в дцРНК ТТК, может быть идентифицирован просматриванием семейного
- З1 020312 анамнеза. Наблюдающее за здоровьем лицо, например, доктор, медсестра или член семьи может использовать историю болезни (анамнез) перед прописыванием или введением дцРНК ТТН. На пациенте может быть также выполнен ДНК-тест для идентификации мутации в гене ТТН, перед введением дцРНК ТТН этому пациенту.
Пациент может иметь биопсию, выполненную перед получением дцРНК ТТН. Эта биопсия может быть выполнена на ткани, например, слизистой оболочке желудка, периферическом нерве, коже, жире живота, печени или почке, и эта биопсия может выявить амилоидные бляшки, которые являются показателями ТТН-опосредованного нарушения. После идентификации амилоидных бляшек пациенту вводят дцРНК ТТН.
Способы идентификации экспрессии гена ТТК
Еще в одном аспекте, это изобретение обеспечивает способ ингибирования экспрессии гена ТТН в млекопитающем. Этот способ включает в себя введение композиции, описанной в этом изобретении, млекопитающему таким образом, что происходит сайленсинг экспрессии гена-мишени ТТН.
Когда подлежащим лечению организмом является человек, эта композиция может вводиться любым способом, известным в данной области, включающим в себя, но не ограничивающимся ими, пероральный или парентеральный способы, включающие в себя интракраниальное (например, интравентрикулярное, интрапаренхимное и внутриоболочечное), внутривенное, внутримышечное, подкожное, чрескожное, введение через дыхательные пути (аэроназальное), ректальное и местное (локальное) (в том числе буккальное и сублингвальное) введение. В некоторых вариантах осуществления, эти композиции вводят внутривенной инфузией или инъекцией.
Если нет другого определения, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют значение, обычно понимаемое лицом, имеющим обычную квалификацию в области, к которой принадлежит это изобретение. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным здесь способам и материалам, могут быть использованы в практике или испытании дцРНК и способов, описанных в этом изобретении, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие ссылки, упомянутые здесь, включены посредством ссылки в полном объеме. В случае противоречия, превалирующим должно быть данное описание, в том числе определения. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения изобретения.
Примеры
Пример 1. Синтез дцРНК
Источник реагентов
Если источник реагента не приведен здесь конкретно, такой реагент может быть получен от любого поставщика реагентов для молекулярной биологии в качестве/чистоте, стандартных для применения в молекулярной биологии.
Синтез 8ΪΚΝΑ (миРНК)
Одноцепочечные РНК получали твердофазным синтезом в масштабе 1 мкмоль с использованием синтезатора Ехрсййс 8909 (Аррйсй В1окук!стк, Арр1сга Пси!ксЫапй СтЬН, Оагтк!ай!, Ссгтапу) и стекла с контролируемыми порами (СРС, 500А, Ргойдо ВюсНстю СтЬН, НатЬигд, Ссгтапу) в качестве твердого носителя. РНК и РНК, содержащую 2'-О-метилнуклеотиды, генерировали твердофазным синтезом, использующим соответствующие фосфорамидиты и 2'-О-метилфосфорамидиты, соответственно (Ргойдо ВюсНстэс СтЬН, НатЬигд, Ссгтапу). Эти элементарные звенья включали в выбранных сайтах в последовательности олигорибонуклеотидной цепи с использованием способа стандартной химии нуклеозидфосфорамидитов, такого как способ, описанный в Сиггеп! рго!осо1к ш пис1с1с ас1й сйст1к!гу, Всаисадс, 8.Ь. с! а1. (Ейгк.), 1оНп \УПсу & 8опк, 1пс., №\ν Уогк, КУ, И8А. Фосфоротиоатные связи вводили заменой раствора йодного окислителя раствором реагента Всаисадс (СНгиасНст Ь!й, С1акдоч, иК) в ацетонитриле (1%). Другие вспомогательные реагенты получали из МаШпскгой! Ваксг (СпскНст, Ссгтапу).
Удаление защитных групп и очистку неочищенных олигорибонуклеотидов анионообменной ВЖХ проводили в соответствии с установленными процедурами. Выходы и концентрации определяли по УФпоглощению раствора соответствующей РНК при длине волны 260 нм с использованием спектрального фотометра (Όυ 640В, Вссктап Сои1!сг СтЬН, ип!сгксЫс1Вйс1т, Ссгтапу). Двухцепочечную РНК генерировали смешиванием эквимолярного раствора комплементарных цепей в буфере для отжига (20 мМ фосфат натрия, рН 6,8; 100 мМ хлорид натрия), нагревали на водяной бане при 85-90°С в течение 3 мин и охлаждали при комнатной температуре на протяжении периода 3-4 ч. Раствор отожженной РНК хранили при -20°С до использования.
Для синтеза 3-холестерин-конъюгированных к^НNΑ (здесь называемых как -СНо1-3'), использовали подходящим образом модифицированный твердый носитель для синтеза РНК. Этот модифицированный твердый носитель получали следующим образом.
- 32 020312
Диэтил-2-азабутан-1,4-дикарбоксилат АА
4,7 М водный раствор гидроксида натрия (50 мл) добавляли в перемешиваемый охлажденный на льду раствор гидрохлорида этилглицината (50 мл) (32,19 г, 0,23 моль) в воде (50 мл). Затем добавляли этилакрилат (23,1 г, 0,23 моль) и эту смесь перемешивали при комнатной температуре, пока не определяли завершение реакции с использованием ТСХ. Спустя 19 ч этот раствор распределяли дихлорметаном (3x100 мл). Органический слой сушили безводным сульфатом натрия, фильтровали и упаривали. Остаток дистиллировали с получением АА (28,8 г, 61%).
Этиловый эфир 3-{этоксикарбонилметил-3-[6-(9Н-флуорен-9-илметоксикарбониламино)гексаноил]амино}пропионовой кислоты АВ о
АВ
Ртос-6-аминогексановую кислоту (9,12 г, 25,83 ммоль) растворяли в дихлорметане (50 мл) и охлаждали на льду. Диизопропилкарбодиимид (3,25 г, 3,99 мл, 25,83 ммоль) добавляли к этому раствору при 0°С. Затем добавляли диэтилазабутан-1,4-дикарбоксилат (5 г, 24,6 ммоль) и диметиламинопиридин (0,305 г, 2,5 ммоль). Этот раствор доводили до комнатной температуры и перемешивали дополнительно в течение 6 ч. Завершение реакции устанавливали при помощи ТСХ. Реакционную смесь концентрировали в вакууме и добавляли этилацетат для осаждения диизопропилмочевины. Суспензию фильтровали. Фильтрат промывали 5% водной хлористоводородной кислотой, 5% бикарбонатом натрия и водой. Объединенный органический слой сушили над сульфатом натрия и концентрировали с получением неочищенного продукта, который очищали колоночной хроматографией (50% ЕЮАС/гексаны) с получением 11,87 г (88%) АВ.
Этиловый эфир 3-[(6-аминогексаноил)этоксикарбониламино]пропионовой кислоты АС
АС
Этиловый эфир 3-{этоксикарбонилметил-[6-(9Н-флуорен-9-илметоксикарбониламино)гексаноил]амино}пропионовой кислоты АВ (11,5 г, 21,3 ммоль) растворяли в 20% пиперидине в диметилформамиде при 0°С. Этот раствор продолжали перемешивать в течение 1 ч. Эту реакционную смесь концентрировали в вакууме, к остатку добавляли воду и продукт экстрагировали этилацетатом. Неочищенный продукт очищали превращением его в гидрохлоридную соль.
Этиловый эфир 3-({6-[17-(1,5-диметилгексил)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-илоксикарбониламино]гексаноил}этоксикарбонилметиламино)пропионовой кислоты АО
Хлористоводородную соль этилового эфира 3-[(6-аминогексаноил)этоксикарбонилметиламино]пропионовой кислоты АС (4,7 г, 14,8 ммоль) помещали в дихлорметан. Эту суспензию охлаждали до 0°С на льду. К суспензии добавляли диизопропилэтиламин (3,87 г, 5,2 мл, 30 ммоль). К полученному раствору добавляли холестерилхлорформиат (6,675 г, 14,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и промывали 20% хлористоводородной кислотой. Продукт очищали флеш-хроматографией (10,3 г, 92%).
Этиловый эфир 1-{6-[17-(1,5-диметилгексил)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-илоксикарбониламино]гексанил}-4-оксопирролидин-3карбоновой кислоты АЕ
- 33 020312
Трет-бутоксид калия (1,1 г, 9,8 ммоль) суспендировали в 30 мл сухого толуола. Эту смесь охлаждали до 0°С на льду и 5 мг (6,6 ммоль) диэфира ΆΌ добавляли медленно при перемешивании в течение 20 мин. Во время этого добавления температуру поддерживали ниже 5°С. Перемешивание продолжали в течение 30 мин при 0°С и добавляли 1 мл ледяной уксусной кислоты с последующим немедленным добавлением 4 г ΝαΗ2ΡΟ4.Η2Ο в 40 мл воды. Полученную смесь экстрагировали дважды 100 мл дихлорметана каждый раз и объединенные органические экстракты промывали дважды 10 мл фосфатного буфера каждый раз, сушили и упаривали досуха. Остаток растворяли в 60 мл толуола, охлаждали до 0°С и экстрагировали тремя порциями по 50 мл холодного карбонатного буфера 9,5 рН. Водные экстракты доводили до рН 3 фосфорной кислотой и экстрагировали пятью порциями по 40 мл хлороформа, которые затем объединяли, сушили и упаривали досуха. Остаток очищали колоночной хроматографией с использованием 25% смеси этилацетат/гексан с получением 1,9 г бета-кетоэфира (39%).
17-( 1,5-диметилгексил)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1 Н-цикло-
Метанол (2 мл) добавляли по каплям на протяжении периода 1 ч к нагреваемой в колбе с обратным холодильником смеси бета-кетоэфира АЕ (1,5 г, 2,2 ммоль) и боргидрида натрия (0,226 г, 6 ммоль) в тетрагидрофуране (10 мл). Перемешивание продолжали при температуре дефлегмации в течение 1 ч. После охлаждения до комнатной температуры добавляли 1 н НС1 (12,5 мл) и эту смесь экстрагировали этилацетатом (3x40 мл). Объединенный этилацетатный слой сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали в вакууме с получением продукта, который очищали колоночной хроматографией (10% МеОН/СНС13) (89%).
17-( 1,5-диметилгексил)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1 Н-циклопента[а]фенантрен-3-иловый эфир (6-{3-[бис-(4-метоксифенил)фенилметоксиметил]-4-гидроксипирродидин-1-ил}-6-оксогексил)карбаминовой кислоты АО
Диол АР (1,25 г, 1,994 моль) сушили упариванием с пиридином (2x5 мл) в вакууме. Добавляли безводный пиридин (10 мл) и 4,4'-диметокситритилхлорид (0,724 г, 2,13 ммоль) при перемешивании. Эту реакцию проводили при комнатной температуре в течение ночи. Реакцию гасили добавлением метанола. Реакционную смесь концентрировали в вакууме и к остатку добавляли дихлорметан (50 мл) . Органический слой промывали 1 М водным бикарбонатом натрия. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Оставшийся пиридин удаляли упариванием с толуолом. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией (2% МеОН/хлороформ, Κί=0,5 в 5% МеОН/СНС13) (1,75 г, 95%).
- 34 020312
Моно-(4-[бис-(4-метоксифенил)фенилметоксиметил]-1-{6-[17-(1,5-диметилгексил)-10,13-диметил2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-илоксикарбониламино]гексаноил}пирролидин-3-иловый)эфир янтарной кислоты АН
Соединение АО (1,0 г, 1,05 ммоль) смешивали с янтарным ангидридом (0,150 г, 1,5 ммоль) и ΏΜΑΡ (0,073 г, 0,6 ммоль) и сушили в вакууме при 40°С в течение ночи. Эту смесь растворяли в безводном дихлорэтане (3 мл), добавляли триэтиламин (0,318 г, 0,440 мл, 3,15 ммоль) и этот раствор перемешивали при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение 16 ч. Затем его разбавляли дихлорметаном (40 мл) и промывали охлажденной на льду водной лимонной кислотой (5 мас.%, 30 мл) и водой (2x20 мл). Органическую фазу сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали досуха. Остаток использовали в таком виде для следующей стадии.
Дериватизованный холестерином ΟΡΟ ΑΙ
Сукцинат АН (0,254 г, 0,242 ммоль) растворяли в смеси дихлорметан/ацетонитрил (3:2,3 мл). К этому раствору добавляли последовательно ΏΜΑΡ (0,0296 г, 0,242 ммоль) в ацетонитриле (1,25 мл), 2,2'дитио-бис-(5-нитропиридин) (0,075 г, 0,242 ммоль) в смеси ацетонитрил/дихлорэтан (3:1, 1,25 мл). К полученному раствору добавляли трифенилфосфин (0,064 г, 0,242 ммоль) в ацетонитриле (0,6 мл). Реакционная смесь приобретала яркую оранжевую окраску. Этот раствор кратковременно встряхивали с использованием ручного шейкера (5 мин). Добавляли алкиламин-ΟΡΟ с длинной цепью (ΕΟΑΑ-ΟΡΟ) (1,5 г, 61 мМ). Эту суспензию встряхивали в течение 2 ч. ΟΡΟ фильтровали через воронку с фильтром из спекшегося стекла и промывали последовательно ацетонитрилом, дихлорметаном и эфиром. Непрореагировавшие аминогруппы маскировали с использованием смеси уксусный ангидрид/пиридин. Полученную нагрузку ΟΡΟ измеряли с использованием измерения УФ-поглощения (37 мМ/г).
Синтез δίΚΝΑ, несущих группу бисдециламида 5'-12-додекановой кислоты (здесь называемую 5'С32-) или группу 5'-холестерин-производного (здесь называемую 5'-Хол-), выполняли, как описано в ШО 2004/065601, за исключением того, что для холестерин-производного стадию окисления выполняли с использованием реагента Веаисаде для введения фосфоротиоатной связи при 5'-конце олигомера нуклеиновой кислоты.
Последовательности нуклеиновых кислот представлены ниже с использованием стандартной номенклатуры и, конкретно, аббревиатур табл. 1.
Таблица 1. Аббревиатуры нуклеотидных мономеров, используемые в представлении последовательностей нуклеиновых кислот. Должно быть понятно, что эти мономеры, когда они присутствуют в олигонуклеотиде, взаимосвязаны 5'-3'-фосфодиэфирными связями
- 35 020312
Аббревиатура Нуклеотид (нуклеотиды)
А аденозин-3'-фосфат
С цитидин-3'-фосфат
С гуанозин-3' -фосфат
Т 5-метилуридин-З' -фосфат
и уридин-3'-фосфат
N любой нуклеотид (С, А, С или Т)
а 2'-0-метиладенозин-З' -фосфат
с 2'-О-метилцитидин-3'-фосфат
д 2'-0-метилгуанозин-З'-фосфат
и 2'-О-метилуридин-3'-фосфат
ат 2'-0-дезокситимидин-З'-фосфат
зТ; зЦТ 2' -дезокситимидин-5'-фосфат-фосфоротиоат
Пример 2А. Конструирование 31К№А ТТН
Транскрипты
Конструирование 31Н№А (короткой интерферирующей РНК) проводили для идентификации 31Н№А, поражающих ген транстиретина из человека (символ ТТН) и крысы (символ Т!г). Это конструирование использовало ТТН-транскрипты №М_000371.2 (8ЕР ГО №О:1329) (человека) и №М_012681.1 (8ЕР ГО №О:1330) (крысы) из №СВ1 НсГзсц со11ес!юп. Эти з1Н№А-дуплексы конструировали с 100% идентичностью относительно их соответствующих генов ТТН.
Конструирование и предсказание специфичности 8ΪΚΝΑ
Предсказанную специфичность всех возможных 19-меров определяли для каждой последовательности. Эти §1Н№А ТТН использовали в обширном поиске против транскриптом человека и крысы (определяемых как набор №М_ и ХМ_ записей в №СВ1 НеГзец зе!) с использованием алгоритма ГА8ТА. Затем использовали Ру!1оп зспр! О£йагде!Таз!а.ру' для подвергания лексическому анализу этих сопоставлений и генерирования оценки (балла) на основании положения и количества ошибочных спариваний между этой з1Н№А и любым потенциальным находящимся 'вне мишени' транскриптом. Эту оценку 'вне мишени' взвешивают для подчеркивания различий в 'затравочном' участоке этих з1Н№А, в положениях 2-9 от 5'конца этой молекулы. Оценку 'вне мишени' рассчитывают следующим образом: ошибочным спариваниям между олиго (олигонуклеотидом) и транскриптом присваивают штрафы. Ошибочному спариванию в затравочном участке в положениях 2-9 этого олиго назначается штраф 2,8; ошибочным спариваниям в предположительных сайтах расщепления 10 и 11 назначается штраф 1,2, а ошибочным спариваниям в положениях 12-19 штраф 1. Ошибочные спаривания в положении 1 не учитываются. Затем оценку 'вне мишени' для каждой пары олиго-транскрипт рассчитывают суммированием штрафов за ошибочные спаривания. Затем определяют самую низкую оценку 'вне мишени' из всех пар олиго-транскрипт и используют ее в последующем сортинге олиго. Обе цепи з1Н№А относят к категории специфичности в соответствии с рассчитанными оценками: оценка выше 3 характеризует их как высоко специфические, оценка 3 как специфические и между 2,2 и 2,8 как умеренно специфические (среднеспецифические). При выборе, какие олигонуклеотиды (олиго) синтезировать, оценки вне мишени антисмысловой цепи классифицировали от высокой к низкой и отобрали 144 наилучших (с наименьшей оценкой вне мишени) пар олиго из человека и 26 наилучших пар из крысы.
Выбор 8^ΒNΑ-последовательности
В целом, синтезировали 140 смысловых и 140 антисмысловых произведенных из ТТН человека з1Н№А-олиго и образовывали из них дуплексы. В целом, синтезировали 26 смысловых и 26 антисмысловых произведенных из ТТН крысы з1Н№А-олиго и образовывали из них дуплексы. Дуплексы, включающие в себя эти олиго, представлены в табл. 2-4 (ТТН человека) и табл. 5-7 (ТТН крысы).
Таблица 2. Идентификационные номера для дцРНК ТТН человека
См. табл. 4 в отношении последовательностей и модификаций олигонуклеотидов (олиго).
- 36 020312
Номер дуплекса Номер смыслового олиго Номер антисмыслового олиго
АО-18243 А-32153 А-32154
АО-18244 А-32155 А-32156
АО-18245 А-32157 А-32158
АО-18246 А-32159 А-32160
Αϋ-18247 А-32163 А-32164
АО-18248 А-32165 А-32166
АО-18249 А-32167 А-32168
АО-18250 А-32169 А-32170
АО-18251 А-32171 А-32172
АО-18252 А-32175 А-32176
АО-18253 А-32177 А-32178
АО-18254 А-32179 А-32180
АО-18255 А-32181 А-32182
АО-18256 А-32183 А-32184
АО-18257 А-32187 А-32188
АО-18258 А-32189 А-32190
Αϋ-18259 А-32191 А-32192
АО-18260 А-32193 А-32194
Αϋ-18261 А-32195 А-32196
АО-18262 А-32199 А-32200
АО-18263 А-32201 А-32202
АО-18264 А-32203 А-32204
Αϋ-18265 А-32205 А-32206
АО-18266 А-32207 А-32208
АО-18267 А-32211 А-32212
АО-18268 А-32213 А-32214
АО-18269 А-32215 А-32216
АО-18270 А-32217 А-32218
АО-18271 А-32219 А-32220
АО-18272 А-32221 А-32222
АО-18273 А-32223 А-32224
Αϋ-18274 А-32225 А-32226
АО-18275 А-32227 А-32228
Αϋ-18276 А-32229 А-32230
АО-18277 А-32231 А-32232
АО-18278 А-32233 А-32234
Αϋ-18279 А-32235 А-32236
Αϋ-18280 А-32237 А-32238
АО-18281 А-32239 А-32240
Αϋ-18282 А-32241 А-32242
АО-18283 А-32243 А-32244
- 37 020312
Номер дуплекса Номер смыслового олиго Номер антисмыслового олиго
Αϋ-18284 А-32247 А-32248
АО-18285 А-32249 А-32250
АО-18286 А-32251 А-32252
АО-18287 А-32253 А-32254
АО-18288 А-32255 А-32256
АО-18289 А-32259 А-32260
Αϋ-18290 А-32261 А-32262
АО-18291 А-32263 А-32264
АО-18292 А-32265 А-32266
Αϋ-18293 А-32267 А-32268
АО-18294 А-32269 А-32270
АО-18295 А-32271 А-32272
АО-18296 А-32273 А-32274
АО-18297 А-32275 А-32276
АО-18298 А-32277 А-32278
АО-18299 А-32279 А-32280
АО-18300 А-32281 А-32282
АО-18301 А-32283 А-32284
АО-18302 А-32285 А-32286
АО-18303 А-32287 А-32288
АО-183 04 А-32289 А-32290
АО-18305 А-32291 А-32292
Αϋ-18306 А-32295 А-32296
АО-18307 А-32297 А-32298
АО-18308 А-32299 А-32300
АО-18309 А-32301 А-32302
АО-18310 А-32303 А-32304
АО-18311 А-32307 А-32308
АО-18312 А-32309 А-32310
Αϋ-18313 А-32311 А-32312
АО-18314 А-32313 А-32314
АО-18315 А-32315 А-32316
АО-18316 А-32319 А-32320
АО-18317 А-32321 А-32322
АО-18318 А-32323 А-32324
АО-18319 А-32325 А-32326
АО-18320 А-32327 А-32328
АО-18321 А-32331 А-32332
АО-18322 А-32333 А-32334
Αϋ-18323 А-32335 А-32336
АО-18324 А-32337 А-32338
АО-18325 А-32339 А-32340
АО-18326 А-32341 А-32342
Αϋ-183 27 А-32343 А-32344
- 38 020312
Номер дуплекса Номер смыслового олиго Номер антисмыслового олиго
АО-18328 А-32345 А-32346
Αϋ-18329 А-32347 А-32348
АО-18330 А-32349 А-32350
АО-18331 А-32351 А-32352
АО-18332 А-32353 А-32354
АО-18333 А-32355 А-32356
АО-18334 А-32357 А-32358
АО-18335 А-32359 А-32360
АО-18336 А-32363 А-32364
АО-18337 А-32367 А-32368
АО-18338 А-32369 А-32370
АО-18339 А-32371 А-32372
АО-18340 А-32373 А-32374
Αϋ-18341 А-32375 А-32376
АО-18342 А-32379 А-32380
АО-18343 А-32381 А-32382
АО-18344 А-32383 А-32384
АО-18345 А-32385 А-32386
АО-18346 А-32387 А-32388
АО-18347 А-32391 А-32392
Αϋ-18348 А-32393 А-32394
АО-18349 А-32395 А-32396
АО-18350 А-32397 А-32398
АО-18351 А-32399 А-32400
АО-18352 А-32401 А-32402
АО-18353 А-32403 А-32404
АО-18354 А-32405 А-32406
АО-18355 А-32407 А-32408
АО-18356 А-32409 А-32410
АО-18357 А-32411 А-32412
АО-18358 А-32415 А-32416
АО-18359 А-32417 А-32418
АО-18360 А-32419 А-32420
АО-18361 А-32421 А-32422
Αϋ-18362 А-32423 А-32424
АО-18363 А-32427 А-32428
АО-18364 А-32429 А-32430
Αϋ-18446 А-32161 А-32162
АО-18447 А-32173 А-32174
АО-18448 А-32185 А-32186
АО-18449 А-32197 А-32198
АО-18450 А-32209 А-32210
Αϋ-18451 А-32245 А-32246
Αϋ-18452 А-32257 А-32258
Номер дуплекса Номер смыслового олиго Номер антисмыслового олиго
АО-18453 А-32293 А-32294
АО-18454 А-32305 А-32306
АО-18455 А-32317 А-32318
АО-18456 А-32329 А-32330
Αϋ-18457 А-32361 А-32362
АО-18458 А-32365 А-32366
АО-18459 А-32377 А-32378
АО-18460 А-32389 А-32390
АО-18461 А-32401 А-32402
АО-18462 А-32413 А-32414
Αϋ-18463 А-32425 А-32426
- 39 020312
ЗЕО
Ю
ΝΟ:
281
Таблица 3А. Последовательности смысловых и антисмысловых цепей дцРНК ТТР человека
Цепь
1~ аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз
Положение
100
111
129
130
148
132
150
135
153
138
156
140
158
146
164
152
170
164
182
196
Последовательность (5'-3’) сссеисзААиссААСоеисс ссАСАСиисслиисАссос
АсисАиисиисесАССАис
САиССиСССААБААОЕАби
ААбисиссисисАиссисА исАССАисАбАСБАСАсии исАиисииобСАбБАиббс
БССАиССиБССААБААОБА
ААбиисиАБАиосиаиссб
СББАСАССАиСиАОААСии сиисиАСАиссиоиссБАБ
СиСББАСАБСАиСиАБААС сиАбАибсиоиссбАББСА иОССиСББАСАБСАиСиАБ
БАиосибиссБАББСАбис
БАСиБССиСОБАСАБСАиС
САиисииббСАБЕАиббси
АБССАиССибССААБААиб иБсиоиссбАББСАвисси
АббАСиОССиСООАСАБСА ссБАББСАсиссибссАис
БАиБОСАББАСиОССиСББ
САоиссиББСАисААибис
САСАииБАиббСАббАсиб
САлиоисБССБибСАибиБ
САСАиБСАСББССАСАОиО
АисибиисАбАААББсибс
БСАБССииисибААСАСАи
САБААзиссАсисАоисии
ЗЕО
ΙΟ
ΝΟ:
Последовательность с
З’-динуклеотидным выступом (5-3’)____________________________ ссобиБААиссААБиоисс1ш оеАСАсииесАиосАсссоцм
АсисАиисииссслссАиемц
САиссисссААБАлисАоимл
ААоисиссисисАисоисАип ибАССАисАбАС0АСАсии1то исАиисиибБСАбБАиббсыя бССАЧССиБССААСААибАММ
ААбиисиАБАибсибиссс1га
СББАСАОСАиСиАБТЕАСиотт биисиАБАибсибисссАБми
СиСБСАСАБСАиСиАБААСЦЫ сиАБАиосиЕиссБАсесАнм иоссисББАСАБСАисиАбиц
БАиБСОБиССЕАбБСАбиСМЧ
БАСибССиСББАСАБСАиСЫМ сдиисиисесАССАиббсицц абсслисеиессААБААиеыы ивсибиссБАББСАБиссичн
АбБАСибССиСББАСАБСАИЦ
ССБАББСАбиССиСССАиСМН
БАибБСАББАсибссисбБ1т
САбиссиБССАисААибибиы
САСдиисАисссАБСАсисии
СААОБтеесссиБСАиеибш
САСдиссАссосСАСдииош
ΑυουβυυοΑΕΑΑΑΟΕουοοΝΝ
БСАБСсииисиБАдсАСАиым
САБААсиссАсислиисииш
282
283
284
285
286
287
288
289
290
291
292
293
294
295
296
297
298
299
300
301
302
303
304
305
306
307
308
309
- 40 020312
Цепь Положение Последовательность (5’-3') 8Е0 Ιϋ ΝΟ: Последовательность с З’-динуклеотидным выступом (5-3’) 8Ε<2 Ιϋ ΝΟ:
аз 20 ААбААисАсиссАсиисиб 30 ААЗААисАсизсАсиисибцм 310
3 21 сссАССАисссиисисАис 31 сссАбЗАисссиисисАисцм 311
аз 39 слисАСААессАиссиесс 32 бАисАСААсссАиссисссгш 312
3 210 САСССАииисссисисеоА 33 САЗссАииизссисисззАыц 313
аз 228 исссАОАсссАААибссис 34 ОСССАбАСССАААиСССиСШ! 314
3 23 САСслисесиисисАисси 35 САССАиессиисисАиссими 315
аз 41 АССАиСАСААСССАиССиб 36 АССАиСАСААСССАиССиСПН 316
3 24 АОбАисссиисисАиссис 37 АбСАисесиисисАиссисыы 317
аз 42 САССАиСАСААСССАиССи 38 САССАиСАСААСССАиССиНМ 318
3 245 АелссиссАисбссисАсл 39 АСАСсиссАиссссисАСАт! 319
аз 263 иеисАССссАиосАбсиси 40 изисАссссАиссАСсисицц 320
3 248 бсиесАиссесисАСААси 41 осиссАиссссисАСААсимп 321
аз 266 АсиисисАОСссАиссАОС 42 АсиисисАССссАиссАосим 322
3 25 ссАисссиисисАиссиси 43 ссАисссиисосАисбисотш 323
аз 43 АСАССАиСАСААСССАиСС 44 АСАССАиСАСААСССАиССЫЦ 324
3 251 ссапсссс исасААсисАб 45 ссаоссссисАСААСОСАСнм 325
аз 269 сисАсиисисАбссслисс 46 сисАзиизисАЗСссАиесцк 326
3 253 АисеесисАСААсибАССА 47 АиЗСбСиСАСААСиЗАССАЫЫ 327
аз 271 оссисАсиисибАбсссАи 48 иссисАсиисисАесссАиыц 328
3 254 исоосисАСААсисАССАо 49 исессисАСААсисАССАиш 329
аз 272 сиссисАсиисисАОСссА 50 сиссисАзиизисАССССАцц 330
3 270 САснААии из иАСААСССА 51 ΟΑΟΕΑΑϋυυβϋΑΘΑΑΟΟΟΑΝΝ 331
аз 288 исссиисиАСАААииссис 52 исссиисиАСАААиоссисыы 332
3 276 ииисиАЗААСЗЗАиАиАСА 53 ииисиАСААСссАиАОАСАыц 333
аз 294 иоиАиАисссиисиАСААА 54 изиАиАисссиисиАСЛААцц 334
3 277 иисиАЗААбсзАилиАСАА 55 иисидсмсссАиАиАСААИм 335
аз 295 ииеиАилисссиисиАСАА 56 иисилиАисссиисиАСААгт 336
3 278 ибиАЗААЗССАиАиАСААА 57 υ3ϋΑ6ΑΑ336ΑυΑϋΑ0ΑΑΑΝΝ 337
аз 296 ииибиАилисссиисиАСА 58 ииисиАиАисссиисиАСАии 338
3 281 АСААеебАиАиАСАААеис 59 АСААСССАиАОАСАААСиСЦЦ 339
аз 299 САсииисиАиАисссииси 60 САсииисиАиАисссиисиып 340
3 295 ААЗиЗЗААЛиАСАСАССАА 61 ААЗиССАААиАСАСАССААЦЫ 341
аз 313 ииссиеисиАиииссАсии 62 ииссисисиАиииссАсиицц 342
3 299 ССАААиАСАСАССАААЦСϋ 63 ССЛААЦАСАСАССААЛиСиМН 343
аз 317 АЗАоииссиеисиАииисс 64 АСАиииесисисиАииисснн 344
3 300 ЗАААиАСАСАССАААиСии 65 САААиАСАСАССАААиСииЦН 345
аз 318 ААЗАиииссисисиАииис 66 ΑΑΘΑυυυοουουουΑυυυοΝΝ 346
3 303 АСАСАСАССАААиСииАСи 67 ΑϋАСАСАССАААЦСОТАСυΝΝ 347
аз 321 АсиААЗАиииссисисиАи 68 АсиААСАиииссиеисиАиип 348
3 304 иАбАСАссААлисиилсис 69 иАСАСАССАААисииАсисмм 349
аз 322 САсиААОАиииззисисиА 70 САсиААСАииибсисисиАмы 350
3 305 АСАСАССААлисиилсизс 71 АСАСАССАААисииАсиесмм 351
аз 323 ссАсиААСАииисзисиси 72 ссАсиААСАиииеоиоисиыы 352
3 317 иилсиссААСССАсиисбс 73 иилсибСААСССАсиисссцц 353
аз 335 сссАлсисссииссАсиАА 74 сссААсисссииссАсиААнн 354
3 32 иисисАиссисиссиссис 75 иисосАиссисиссиссисцм 355
аз 50 САССАССАСАССАиСАСАА 76 САССАССАСАССАиСАСААНМ 356
3 322 есААСссАсиизесАисис 77 ссААСссАсииессАисисыц 357
аз 340 САСАизссААзисссиисс 78 САСАисссААсисссииссцц 358
- 41 020312
Цепь 3 Положение 32 6 Последовательность (5’-3’) сссАсиисеслисиссссА 5Е0 ГО ΝΟ: 79 Последовательность с З’-динуклеотидным выступом (5’-3) БЕСАсииББСАисиссссАяя 8Е0 ГО ΝΟ: 359
аз 344 иссссАСАиессААсиесс 80 иОЕССАСАиСССААЕиСССПИ 360
3 333 еесАисиссссдииссАис 81 ЕОСАисиссссАииссАиЕмы 361
аз 351 АиссААиссооАСАиссстт 82 АиССАА.иССССАЕАиСССТТМП 362
3 334 сслисиссссАииссАисА 83 БСАисиссссдииссАисАяя 363
аз 352 исАиссАлиссБбАСАиес 84 иСАибБАДиБЕБСАБАибСЯЯ 364
3 335 САисиссссАииссАисле 85 сдисиссссАииссАибАБяя 365
аз 353 сисАиссААиссссАЕАис 86 СиСАиББААиббББАБАибЯЯ 366
3 336 АисисссслииссАисАсс 87 АисиссссАииссАиЕАЕсмы 367
аз 354 ссисАиесААисбесАОАи 88 ЕСиСАиЕЕААиССОЕАЕАигт 368
3 338 сисссслииссАисАССАи 89 сиссссАиисслисАССАинм 369
аз 356 АиссисАиооААиссссАС 90 АиССиСАиЕЕААиОЕСЕАБМИ 370
3 341 ссслииссАисАОСАиссА 91 ссСАоиссАибАБСдибСАЯя 371
аз 359 иссАиссисАиссААиссс 92 иБСА.иЕсисАисЕА.Аиссснм 372
3 347 ссАисАбСАиссАОАОсис 93 ССАиБАБСАиБСАБАББибЯЯ 373
аз 365 САСсисисслиесисАисс 94 сдссисиосАибсисАоееми 374
3 352 АССАиесАСАсеиссиАии 95 АссАиссАЕАСсиссиАиимп 375
аз 370 ААиАССАСсисиесАисси 96 АдиАССАСсисиссАиесимя 376
3 354 САиссАСАСсиссилиисА 97 сдиссАСАЕБиБсиАиисАмя 377
аз 372 исААиАССАСсисиссАио 98 иодАОАССАСсисиБСАибяя 378
3 355 АиссАСАСсисоиАиисАС 99 АибСАБАббиббиАиисАсяя 379
аз 373 сосААиАССАСсисиссАи 100 БибАдиАССАСсисибСАияя 380
3 362 сеиссилиисАСАСссААС 101 БбибБиАиисАСАБССААСяя 381
аз 380 сииеесиеиеААиАССАСС 102 биибБсибибААидссАссня 382
3 363 СиССОАОиСАСАСССААСС 103 БибБидииСАСАБССААСБЯЯ 383
аз 381 сеииессиоисААиАССАС 104 СБиибБсиоиЕААиАссдсяя 384
3 364 исеиАиисАСАОссААССА 105 иббидиисАСАбссААСбдяя 385
аз 382 исеиисесибиоААиАССА 106 исБииБбсивибААиАССАяя 386
3 365 ссилиисАСАСССААССАС 107 БбиАииСАСАБССААСБАСЯЯ 387
аз 383 сиссиисесиоисААЦАСС 108 БисбииЕЕсиБисААиАссяя 388
3 366 еилиисАСАЕссААССАси 109 БидиисАСАБссААСБАсияя 389
аз 384 АеисеииеесиеиеААиАС 110 АБисбииббсибиБААиАСня 390
3 367 иАиисАСАОссААссАсис 111 ОАииСАСАБССААСБАСиСЯЯ 391
аз 385 САсисеииобсисисААиА 112 БАБисБииББсиБиБААидяя 392
3 370 исАСАбссААСОАсиссее 113 иСАСАБССААСБАСиССББЯЯ 393
аз 388 сссбАсиссиисосисисА 114 ссББАбисбоиббсиБиБАяя 394
3 390 ссссбссосилсАссАиис 115 ссссбССБсиАСАСслииБяя 395
аз 408 СААиебисиАбссосббСб 116 СААиЕбиБиАБСббсббббяя 396
3 4 ОААсиссАсисАиисиисо 117 ЕААБиссАсисАиисииббяя 397
аз 22 ссААОАлиелЕиссАсиис 118 ССААБААибАБиББАСииСЯЯ 398
8 412 сссиссиЕАЕССсеиАсис 119 сссибсиБАБСсссиАсисяя 399
аз 430 САСиАЕОЕЕСиСАЕСАЕЕС 120 6АБиАБ6ББСиСА6САББ6ЯЯ 400
3 417 сисАбссссиАсисстаии 121 сибАбссссидсиссиАиияя 401
аз 435 ААЦАССАСиАЕССЕСиСАЕ 122 ААиАБбАбиАББББСиСАБЯЯ 402
3 418 исАССССстасиссиАиис 123 ибАбссссидсиссиАиисяя 403
аз 436 ЕААиАССАСиАСЕСССиСА 124 БАДиАББАбиАбОББСиСАЯЯ 404
3 422 ссссиАсиссилииссАсс 125 ссссиАсиссидииссдссяя 405
аз 440 ССиеСААОАЕСАОТАСССС 126 Ббиб6ААиА6БАбиАБ6ББЯЯ 406
3 425 силсиссиАииссАССАСЕ 127 сиАсиссоАииссАссАСбяя 407
- 42 020312
Цепь Положение Последовательность (5-3’) ЗЕО Ιϋ ΝΟ: Последовательность с З’-динуклеотидным выступом (5’-3') 8Е0 1И ΝΟ:
аз 443 ссиссиссААиАсеАсиАС 128 06υθ6υ66ΑΑϋΑΕ6ΑΟϋΑ6ΝΝ 408
3 426 иАсиссилииссАССАСбс 129 иАсиссиАииссАССАСБбым 409
аз 444 сссиссиссААиАсзЕАеиА 1зо ССОиББиООААиАББАбиАММ 410
3 427 АсиссилииссАССАСССС 131 АсиссиАииссАССАСББСгш 411
аз 445 ссссисеисбААиАбСАои 132 ссссиссиееААиАССАеоты 412
3 429 иссиАииссАССАСССсис 133 иссиАииссАССАСССсиеыы 413
аз 447 САБССбиббиббААиАББА 134 0ΑΕ000υ60υ66ΑΑυΑΕ0ΑΝΝ 414
3 432 иАииссАССАСсесисисе 135 иАииссАССАССбсиоисетт 415
аз 450 ССАСАССССиЕЕиССААиА 136 06Α0Α0006υ66ϋ66ΆΑϋΑΝΝ 416
3 433 АииссАССАСсссиоисси 137 АииссАССАСБбсисисбипн 417
аз 451 АССАСАЕССсисоиесААи 138 АСБАСАОССБиооиссАлимм 418
3 437 САССАСсесисисеисАСс 139 САССАСббСибиССиСАССОТ 419
аз 455 ссисАССАСАЕСсеиссиБ 140 осиоАСБАСАБСссиссиош! 420
3 438 АССАСсесисисоисАССА 141 АССАСББСиСиСБиСАССАМП 421
аз 456 иссиоА.ссАСАЕСссисси 142 иоБисАСбАСАСССБисбшп: 422
3 439 ссАсоосисисеисАССАА 143 ССАСББОТбиССиСАССААНП 423
аз 457 иисеиоАСбАСАСсссиео 144 υυ66υ6Α0ΕΑ0Α600ΟϋΕ6ΝΝ 424
3 441 АСЕЕсиеисоисАССААис 145 АСббсиоисбисАССААисыы 425
аз 459 САииссиоАСбАСАСССои 146 БАиибоибАСБАСАБССбипн 426
3 442 соосиоисеисАССАдисс 147 сессибисоисАССААисснп 427
аз 460 СБАииееисАССАСАсссс 148 БбАииОБибАСбАСАБССБММ 428
3 449 сеисАССААисссААеоАА 149 СБиСАССААиСССААББААНИ 429
аз 467 ииссиисбОАииосисАСБ 150 ииссииообАиибБиоАСБ№<1 430
3 455 СААиСССААССААиСАБСС 151 СААиСССААББААиБА666№ 431
аз 473 сссисАииссиисосАиис 152 сссисАииссичосБАииБыы 432
3 491 ССиБААББАСБАБОБАибб 153 ССибААББАСБАЕбБАиБОИМ 433
аз 509 сслисссиссоссиисАсс 154 ссАисссиссиссиисАбспп 434
3 497 сеАСБАББСАиебЕАииис 155 ббАСбАбББАибббАииис№ 435
аз 515 ОАААисссАисссиссисс 156 БАААисссАисссиссиссмп 436
3 5 ААсиссАсислиисииесс 157 ААбиссАсиСАиисииебснн 437
аз 23 ессААБААисАоиссАсии 158 ΟΟΟΑΑΕΑΑϋΕΑΕυΟΟΑΟυυΝΝ 438
3 508 БББАиииСАиБиААССААБ 159 БББАииисАиоиААссААбпп 439
аз 526 сииссииАСАиБАААиссс 160 сииссииАБАисАААиссспп 440
3 509 ББАииисАибиААССААБА 161 ББАиииСАиСиААССААБАНИ 441
аз 52 7 исииБоииАСАибАААисс 162 исииобииАСАиБАААисспп 442
3 514 исАисиААССААБАБилии 163 исА.исиААССААСАсилиимп 443
аз 532 ААиАсисиибоииАСАиБА 164 ААиАсисииесииАСАиБАгш 444
3 516 АибиААССААБАбиАиисс 165 АисиААССААБАсиАииссш: 445
аз 534 ББААиАсисиоББииАСАи 166 ссАлиАсисииссиилсАиип 446
3 517 ибиААССААБАБиАЧиССА 167 ОбиААССААБАбиАииССАЫН 447
аз 535 иББААиАсисииббиоАСА 168 иоБАлиасисииббииасανν 448
3 518 БиААССААСАсилииссАи 169 БиААССААСАСиАииссАими 449
аз 536 АиобААиАсисиибБииАС 170 АисбААиАсисииббиоАсыи 450
3 54 исссииосиББАсиБсиАи 171 обссииссиБОАсиБсиАимн 451
аз 72 АиАССАбиССАБСААСБСА 172 АиАССАСиССАССААСССА.Ш! 452
3 543 иАААбсАоибиииисАССи 173 иАААБСАбибиииисАСсимл 453
аз 561 АББиоААААСАсиосиииА 174 АБсисААААСАсиссиииАнп 454
3 55 БссиибсисБАсивБиАии 175 бСсииБсиББАсиббиАиицп 455
аз 73 ААЦАССАбиССАОСААОБС 176 ААИАССАБиССАБСААББСНП 456
- 4З 020312
Цепь Положение Последовательность (5-3) ЗЕО ю ΝΟ: Последовательность с З'-динуклеотидным выступом (5-3’) ЗЕО Ιϋ ΝΟ:
8 551 исиииисАссисАОАисси 177 исиииисАссисАидиЕсиым 457
аз 569 АЕСАОАибАЕСиЕААААСА 178 АЕСАиАиЕАЕЕиЕААААСА1т 458
8 552 сиииислссисАиАиссиА 179 еиииисАСсисАиАиЕсиАыи 459
аз 570 иАЕСАиАиоАоеисААААС 180 ЦАССАиАиСАССиСААААСПМ 460
8 553 иииисАСсисАиАиссили 181 иииисАСсисАиАиссиАинм 461
аз 571 АиАССАОАибАСбиСАААА 182 АиАЕСАиАиеАЕсиеААААш 462
3 555 иисАссисАиАиссилиси 183 иисАссисАиАиссоАисипп 463
аз 573 АСАиАОСАиАЦЕАССибАА 184 ΑΟΑυΑΕΕΑυΑϋΕΑΕΕυΕΑΑΝΝ 464
3 557 САСсисАиАибсиАиЕииА 185 САСсисАиА.иосиАисииАнн 465
аз 575 иААслиАЕСАиАисАСсис 186 ОААСАиАССАиАиСАСбиСНМ 466
3 56 ссииосиббАсиЕбиАиии 187 ссииЕсисеАсиссиАииииы 467
аз 74 АААиАССАСиССАССААСС 188 АААиАССАбиССАССААбСШ 468
3 563 АилиссиАисииАЕААсис 189 АиАиссиАисииАЕААсиспп 469
аз 581 ЕАсиисиААСАиАЕСАили 190 ЕАсиисиААСАиАЕСАиАтаи 470
3 564 иАиссилисиилсААбисс 191 иАибсиАисииАеААЕиссш 471
аз 582 ЕСАсиисиААСАиАССАиА 192 ЕБАсиисиААСАиАОСАилыи 472
3 566 иссиАисииАЕААсиссАс 193 иссиАосииАЕААЕоссАСНй 473
аз 584 сиЕЕАсиисиААСАиАЕСА 194 сиссАсиисиААСАОАЕСАш 474
3 57 сииссиббАсиссоАииис 195 сиоссиЕбАсиееиАиоисмы 475
аз 75 САААиАССАЕиССАЕСААЕ 196 САААиАССАЕиССАЕСААСЦЦ 476
3 578 АСиССАСССАСАСАСААиА 197 АЕиССАЕЕСАЕАЕАСААиА1Ш 477
аз 596 АиисисисивссиЕБАСитт 198 АиисисисисссиссАситтыи 478
3 580 иССАЕЕСАЕАЕАСААиААА 199 иССАЕЕСАЕАЕАСААиААА1Ш 479
аз 598 иииАиисисисиЕСсиЕЕА 200 иииАииЕисисиоссиЕЕАыц 480
3 607 ЕиЕАААЕЕСАсиииисАии 201 ЕибАААЕОСАсиииисАиимм 481
аз 625 ААиЕААААбибссииисАС 202 ААибААААбосссииисАСмк 482
3 62 иссАсиосиАииисибиси 203 цЕСАсиЕЕиАипиеибистш 483
аз 80 АСАСАСАААиАССАОиССА 204 АЕАСАСААДиАССАБиССАЛЫ 484
3 77 ЕисиЕАЕЕСиЕЕСССиАСЕ 205 ЕиСиЕАЕЕСиЕЕСССиАСЕЫН 485
аз 95 СЕиАЕЕСССАЕССиСАЕАС 206 СЕиАЕЕЕССАЕССиСАЕАСМИ 486
3 79 СиЕАЕЕСиЕЕСССиАСЕЕЕ 207 СиБАЕБСиЕБСССиАСЕЕЕМЦ 487
аз 97 СССЕиАЕБЕССАБССиСАЕ 208 СССЕиАЕССССАЕССиСАЕМН 488
3 81 САбЕСиСССССиАСССССА 209 ЕАЕЕСиЕЕСССиАСЕЕЕСАШ 489
аз 99 иЕСССЕиАЕЕЕССАЕССиС 210 ибСССОиАЕЕЕССАЕССиСНЫ 490
3 82 АЕЕСиЕЕСССиАСЕЕССАС 211 АЕЕСиЕЕСССиАСЕЕЕСАСМЫ 491
аз 100 сисссссиАСОсссАССси 212 ЕиЕСССЕиАЕЕЕССАЕССиМИ 492
3 84 ЕСибЕСССиАСЕЕЕСАССЕ 213 ЕСиЕЕСССиАСЕЕЕСАССБМП 493
аз 102 СЕЕиЕСССЕиАЕЕЕССАЕС 214 СЕЕиЕСССЕиАЕЕЕССАЕСШ 494
3 85 СиЕЕСССиАСЕЕЕСАССЕЕ 215 СиЕЕСССиАСЕЕЕСАССЕЕМЙ 495
аз 103 ССЕбиОСССЕиАЕЕЕССАЕ 216 ССЕЕиЕСССЕиАОБЕССАЕМН 496
3 87 ЕЕСССиАСЕЕЕСАССЕЕиЕ 217 ЕЕСССиАСЕЕЕСАССЕЕиЕЦЦ 497
аз 105 САССЕЕиЕСССВиАЕЕЕСС 218 САССЕЕиВСССЕиАЕЕЕССЖ 498
3 9 ссАсисАиисииЕБСАЕЕА 219 ССАСиСАииСииЕЕСАЕбАЦН 499
аз 27 иссисссААЕААисАсисо 220 иссисссААСАлисАБисомц 500
3 90 ССиАСЕОЕСАССЕБиСААи 221 ССиАСОЕЕСАССЕЕиЕААиММ 501
аз 108 АииСАССЕЕиБСССЕиАЕС 222 АиисАССЕЕиЕСССЕиАЕЕгт 502
3 91 СиАСЕЕЕСАССЕЕиЕААиС 223 СиАСЕЕЕСАССЕЕиЕААиСШ 503
аз 109 САОТСАССЕСиСССССиАС 224 ЕАииСАССЕЕиЕСССЕиАЕМЦ 504
3 92 иАСЕЕЕСАССЕЕиЕААиСС 225 иАСЕЕЕСАССЕбибААиССМЫ 505
- 44 020312
Цепь Положение Последовательность (5’-3’) 8ЕЙ Ю ΝΟ: Последовательность с З'-динукпеотидным выступом (5-3’) ЗЕЙ Ιϋ ΝΟ:
аз 110 ссАиисАССсеисссссиА 226 ббАиисАССббибсссбиАМы 506
3 93 АСССбСАССсеиоАдиссА 227 АСбббСАССббибААиССАЫН 507
аз 111 иссАиисАссссиссссси 228 иббАиосАССббибсссоимм 508
3 97 ссАссссисААиссААсис 229 бСАСсббибААиссААбиолт 509
аз 115 САсииесАиисАССссиес 230 САсииесАиисАссбоиссш 510
3 98 САСсесисАлиссААсиси 231 САССбсибАдиссААоисинм 511
аз 116 АСАсииссАиисАССосис 232 АСАсииббАиисАсссбиот! 512
5 167 ибизессАиссАисисиис 233 ибиббссАиосАибибиисмн 513
аз 185 СААСАСАиССАиССССАСА 234 ОААСАСАиССАиССССАСАШ 514
3 168 сиссссАиссАиеисиисА 235 сибсссАиосАиеибиисАШ 515
аз 186 иСААСАСАиССАиОСССАС 236 ибААСАСАибСАиббССАС1Ш 516
3 171 сссАиесАиоисиисАЕАА 237 бсСАибСАибибииСАбАА1т 517
аз 189 иисисААСАСдиссАиесс 238 шсибААСАСАибСАиоос™ 518
3 432 иАииссАССАСбесисисА 239 иАииссАССАСббсисисАин 519
аз 449 исАСАСССсиссиосААиА 240 ϋ6Α6Α6666υ66υ66ΑΑϋΑΝΝ 520
8 447 СиСАиСАССААЦСССААСС 241 бисАисАССААисссААбб1т 521
аз 465 ссииеесАииесисАисАС 242 ссиибббАииббибАибАСМц 522
3 115 сиссисисАиесисАААси 243 биссисибАиббосАААботт 523
аз 133 АсииисАссАиСАСАОСАс 244 АсиииоАССАисАбАСбАСЫы 524
3 122 ОАисзсисАААеиисиАйАи 245 бАиббисАААбиисиАбАилт 525
аз 140 АисиАЕААсиииоАССАис 246 АисиАбААсиоиеАССАисыы 526
3 139 АиссисисссАсесАсисс 247 АибсиоиссбАббСАсисст! 527
аз 157 ббдсиессисонАСАесАи 248 ббАсибссисбСАСАссА1лт 528
3 172 сссиссАисисиисАбААА 249 ссбиссАибисииСАбАААгш 529
аз 190 ииисисААСАСАиссАсеб 250 ииисибААСАСАОбСАСббнм 530
3 238 АсисиссАСАЗсибСАисс 251 АбисиббАбАбсибСАиобмк 531
аз 256 ссАоосАбсисиссАСАси 252 ссАиссАбсисиссАбАСотш 532
3 252 САибббсисАСААсибАбб 253 САибббсисАСААсибАбб1т 533
аз 270 ссисАбиибибАбсссАио 254 ссисАСшеиоАбсссАибий 534
3 33 исисАисбисобсиссисс 255 исисАисбисиесиссиссш 535
аз 51 ббАббАбСА6АСбАибАбА 256 ббАб6АбСАбАСбАибА6А1Ш 536
3 340 ссссАииссАибАбСАибс 257 ссссАииссАибАбСАибсмм 537
аз 358 бСАиосисАиобААибббб 258 бСАибсисАиббААисбббпн 538
3 421 бссссоАсиссилииссАС 259 ессссоАсоссиАииссАсш 539
аз 439 биббААиАббАбиА00ббс 260 0υ66ΑΑϋΑ06Α0υΑ66666ΝΝ 540
3 431 силииссАссАСббсибис 261 сиАииссАССАСббсибиснн 541
аз 449 0АСА6С СбиОбиббААЦАб 262 бАСА6ССбиббиббААиАб1Ш 542
3 440 САСббсибисбисАссААи 263 САСббсисисбисАССАдипм 543
аз 458 АоиббибАСбАСАбссбиб 264 АииббиСАСЕАСАбсСбибт! 544
3 496 АббАСбАбббАибббАиии 265 АббАССАССбАибосАиииш 545
аз 514 ААдисссАисссисбисси 266 АААисссАисссисеиссиым 546
3 556 исАСсисАиАиосиАисии 267 исАСсисАиАиесиАисиилы 547
аз 574 ААСАиАбСАиАибАббОбА 268 ΑΑ6ΑϋΑ66ΑϋΑυ6Α66υ6ΑΝΝ 548
3 559 ссисАиАиссиАВбицАОА 269 ссисАиАиссиАисииАбАпг! 549
аз 577 исиААСАиАОСАиАибАбб 270 исиААСАиАбСАиАисАбсш 550
3 570 АибииАОААбиссАббСАб 271 АибииАбААбиссАббСАбмм 551
аз 588 сибссиббАсиисиААСАи 272 сосссиобАсиисиААСАинм 552
3 78 исибАббсибосссиАСбб 273 исибАбосиббсссиАСббин 553
аз 96 ССбиАбббССАбССиСАбА 274 ССбиАбббССАбССиСАбАНМ 554
Цепь Положение Последовательность (5’-3') ЗЕЙ Ю ΝΟ: Последовательность с З’-динуклеотидным выступом (5-3’) 8ЕЙ Ю ΝΟ:
3 87 ббсссиАСбббСАСсобиб 275 обсссиАСОббСАссббибым 555
аз 105 САССббибсссбиАбббсс 276 САСсббибсссбиАбббссин 556
3 95 бббСАССббибААиССААб 277 бббСАССббибААиССААбЫМ 557
аз 113 сииббАиисАССббооссс 278 сииббАиисАССббиосссш) 558
3 167 ссАибСАиоибиисАбААА 279 ссАибСАибибиисАбАААлга 559
аз 185 ииисибААСАСАибСАиоб 280 ииисибААСАСАибСАиббыл 560
Цепь: к= смысловая; ак= антисмысловая;
Положение: положение 5'-основания на транскрипте (ΝΜ_ 000371.2, 8Е0 Ιϋ ΝΟ:1329)
- 45 020312
Таблица 3В. Последовательности смысловых и антисмысловых цепей дцРНК ТТР человека
Цепь Положение Последовательность с З’-дезокситимидиновым выступом (5’-3’) 8Е<2 Ю ΝΟ:
3 100 ссссисАлиссААсисиссатат 561
аз 118 ссАСАсиибСАиисАССоеатит 562
3 11 АсисАиисиисосАССАисатат 563
аз 29 САиссисссАА&ААисАоиатдт 564
3 111 ААсисиссисисАиссисАнтат 565
аз 129 ийАССАисАбАЕСАСАсиийтнт 566
3 13 исАиисиисссАССАисссатсгт 567
аз 31 сссАиссиессААСААисАНтат 568
3 130 АлсиисиАСАиссисисссатат 569
аз 148 сссАСАбСАисиАбААсииатат 570
3 132 сиисиАСАиесисисссАсатат 571
аз 150 сисссАСАЕСАисиАСААсатат 572
3 135 сиАОАибсиеисссАСССАНтит 573
аз 153 иоссисссАСАССАисиАоатат 574
3 138 слиссисисссАбссАсисатат 575
аз 156 еАсиЕСсиссЕАСАОСАисатнт 576
3 14 СА.иисиисссАбСАисссиатат 577
аз 32 АессАиссисссААбАдисатат 578
3 140 иссиеисссАСЕСАсиссиатат 579
аз 158 АССАсиоссиссЕАСАССАатат 580
3 146 сссАсссАсиссисссАисатат 581
аз 164 САисссАССАсисссисссатат 582
3 152 СА.сиссиоссАиСААисисатат 583
аз 170 САСАиислисссАссАсисатат 584
3 164 СААиеисссссиесАисисатат 585
аз 182 САСАиесАсссесАСАиисатат 586
3 178 АиеисиисАЕАААббсиссатат 587
аз 196 сс.АбссииисисАлсАСАиатат 588
3 2 САОААсиссАсисАиисииатат 589
аз 20 ААСААисАсиссАсиисисатат 590
3 21 сбСАССАисесиисислисатат 591
аз 39 сАисАбААсссАиссисссатат 592
3 210 бАСССАиииоссисисссАатат 593
аз 228 исссАОАбссАААибссисатат 594
3 23 САселисссиисисАиссиатат 595
аз 41 АССАисАЕААбссАиссисатат 596
3 24 АЕСАиессиисислиссисатат 597
аз 42 САССАибАСААЕССАиссиатат 598
3 245 АбАссиссА.иссесисАСАатат 599
аз 263 иеисАССссАиссАбсисиатат 600
3 248 есиссАибббсисАСААсиатат 601
- 46 020312
602
603
607
Цепь аз з аз з аз з аз з аз з аз з аз з аз з аз з аз з аз з аз з аз з аз з
аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз
Положение
266
251
269
253
271
254
272
270
288
276
294
277
295
278
296
281
299
295
313
299
317
300
318
303
321
304
322
305
323
317
335
322
340
326
344
333
351
334
352
335
353
336
354
338
356
341
359
347
365
352
370
354
372
Последовательность с З’-дезокситимидиновым выступом (5’-3') _______АсииеибАССССАиБСАСсотат______ _______ссАиеБсиисисАисоисиатат______ _______АБАСБАЦБАБААБССАиССатат______ _______БСАОББОСиСАСААСЦБАеаТОТ______ _______сисАсиисибАбсссАиссатат______ _______АиСббСиСАСААСББАББАатат______ _______иссисАбаисцбАБсссАоатат______ _______цбебсисАСААсиоАББАеатат______ _______сиссисАБОБбибАБсссАатат______ _______БАББААЦЦибиАБААбСБАатаТ______ _______исссиисиАСАААииссисатат______ _______ЦЦиЕЦАбААЕБбАиАиАСАатат______ _______иБиАиАисссиисиАСАААатат______ _______оиБиАБААБББАиАиАСААатат______ _______ииеиАиАисссиисиАСААатат______ _______ибиАбААБСБАЦАиАСАААатаТ______ _______иииБиАЦАисссиисиАСАатат______ _______АБААбБбАиАиАСАААбиСатаТ______ _______САсииибБАиАисссиисиатат______ _______ААбЦББАААОАБАСАССААатаТ______ _______иисбиБисиАииоссАсииатат______ _______ббАААЦАБАСАССАААиСОатаТ______ _______АбАиииесибисцАошссат ат______ БАААиАБАСАССАААисииатат
ААБдииисБиБисиАшисатат _______АЦАБАСАССАААисииАсиатат______ _______АбиААБАииибБисосиАиатат______ иАбАСАССАААисииАсиеатат
САБиААБАиииБбивисиАатат
АБАСАССАААисииАсиооатат ссАбиААБАиииобобисиатат иилсиссААйссАсиисссатат
БссААбисссииссАсиААатат иисосАисбисиБСРСсисатат
БАБбАБСАбАСБАибАОААатаТ
БСААббСАсиибБСАисисатат
БАБАиоссААоисссииссатат
ЕБСАсиисссАисиссссАатат иббббАОАибссААбиоссатат
БбсдисиссссдииссАЦБатат
АибБААЦбБббдбАибссттатат ссдисиссссдииссАиоАатат исАиББААибБббАБАибсатат сАисиссссдииссАисАсатат сисАиобААиббБСАБдиБатат
АисиссссАиисслиоАбсатат ссисАиббААибБббАБдиатат сиссссАииссАибАБСдиатат
АиБсисАиБбАдиобссАБатат
СССАииССАОБАБСАЦБСАатат обСАиБсисАисбАдиБбеатат ссАиБАССАиссАБАБбисатат
САСсисиосАибсисАибеатат
АОСАиосАОАБбиббиАииатат
АдидссАСсисибсдиБсиатат
САиБСАБАббосбиАиисАатат □БААиАссАСсисиБСАиБатат
8Е0 Ιϋ ΝΟ:
604
605
606
608
609
610
611
612
613
614
615
616
617
618
619
620
621
622
623
624
625
626
627
628
629
630
631
632
633
634
635
636
637
638
639
640
641
642
643
644
645
646
647
648
649
650
651
652
653
654
655
656
657
658
- 47 020312
Цепь Положение Последовательность с З’-дезокситимидиновым выступом (5'-3’) 8Е0 Ιϋ ΝΟ:
8 355 АиссАОАОсиссилиисАсатат 659
аз 373 оисААиАССАСсисиосАоатат 660
3 362 сеиссиАиисАСАбссААсатат 661
аз 380 еиисесиеисААиАССАСсатат 662
3 363 сиеоилиисАСАСссААсеатат 663
аз 381 сбиисйсисисАлиАССАсатат 664
3 364 иссиАиисАСАСссААСслатат 665
аз 382 исеиисссисисААиАССАатат 666
3 365 есилиисАСАСссААССАсатат 667
аз 383 сиссиисссисисААиАссатат 668
3 366 сиАиисАСАессААСЕАсиатат 669
аз 384 АеисеиисссисисААиАсатат 670
3 367 илоисАСАоссААссАсисатат 671
аз 385 ОАсиссиисссисисААиАатат 672
3 370 исАСАСССААССАсиссесатат 673
аз 388 ссссАсиссиисссисисАатат 674
3 390 ссссессссилсАссАиисатат 675
аз 408 СААиссиеиАбссссссбеатат 676
3 4 бААоиссАсисАиисииссатат 677
аз 22 ссААбААибАбиббАсиисатат 678
3 412 сссибсисАсссссиАсисатат 679
аз 430 бАбиАббббсисАбСАбббатат 680
3 417 сибАоссссиАсиссиАииатат 681
аз 435 ААиАббАоиАббббсисАбатат 682
3 418 ибАбссссилсиссиАиисатат 683
аз 436 бААиАббАбилббббсисАатат 684
3 422 ссссиАсиссиАииссАсеатат 685
аз 440 ббиббААиАбОАбиАОбОбатат 686
3 425 сиАсиссиАииссАсслсбатат 687
аз 443 сб0ббиббААиАббАбиАбатат 688
3 426 иАсиссиАииссАбСАСббатат 689
аз 444 ссеиЕбиббААиАббАбиАатат 690
3 427 АбоссиАииссАССАСббсатат 691
аз 445 бссбоббиобААиАббАбиатат 692
5 429 иссиАииссАССАСбссисатат 693
аз 447 САбссоиббиббААиАббАатат 694
3 432 илиисСАССАСббсибисбат ат 695
аз 450 сбАСАбссбиббиббААиАатат 696
3 433 АииссАССАСббсибисбиатат 697
аз 451 АСбАСАбссбиббиббААиатат 698
3 437 САссАСббсибисбисАссатат 699
аз 455 ббиоАсоАСАбссбиббиоатат 700
3 438 АССАСббсибисбисАССАатат 701
аз 456 иббибАСЕАСАбссбиббиатат 702
3 439 ссАСббсибиссисАССААатат 703
аз 457 ииЕбиЕАССАСАЕССЕиЕсатат 704
3 441 АСббсиоисбисАССААисатат 705
аз 459 бАииббиоАСбАСАбссбиатат 706
3 442 собсибисбисАссААиссатат 707
аз 460 сбАииббибАСЕАСАбссбатат 708
3 449 соисАССААисссААббААатат 709
аз 467 ииссииоббАииббибАСбатат 710
3 455 СААиСССААббААЦбАбббатат 711
аз 473 сссисАииссиибббАиибатат 712
3 491 ССиЕААЕЕАССАЕЕЕАиОСатат 713
аз 509 ссАисссисбиссиисАббатат 714
3 497 0бАСбАбббАибббАииисатат 715
- 48 020312
Цепь Положение Последовательность с З’-дезокситимидиновым выступом (5’-3’) 8Е0 Ιϋ ΝΟ:
аз 515 СААдисссАисссисеиссатат 716
3 5 ААсиссАсисАиисииебсатат 717
аз 23 сссААСААисАсисоАсииатат 718
3 508 есеАииисАисиглссААзатат 719
аз 526 сииееииАСАисАААисссйтат 720
3 509 5бАииисАиеиААССААбАс1тат 721
аз 527 исииоеииАСАисАААиссатат 722
3 514 исАисиААссААСАоиАиийтат 723
аз 532 ААиАсисоиееииАСАисАбтат 724
3 516 АисиААССААОАсиАииссатат 725
аз 534 БСААиАсисииоеииАСАиатат 726
3 517 исиААССААЕАсиАииссдатат 727
аз 535 иосААиАсисииссииАСАатат 728
3 518 сиААССААСАсилииссАиатат 729
аз 536 АисЕАлиАсисииссиилсатат 730
3 54 исссииссисЕАсиссиАиатат 731
аз 72 АиАССАЕиССАЕСААСЕСАатат 732
3 543 иАААЕСАсиеиииисАссиатат 733
аз 561 АЕЕиЕААААСАсиссиииАатат 734
3 55 сссииосиоЕАсисЕиАииатат 735
аз 73 ААиАССАЕиССАЕСААОЕСатаТ 736
3 551 исиииисАссосАиАиссоатат 737
аз 569 АССАиАиСАЕСиСААААСАатат 738
3 552 сиииисАСсиСАиАибсилатат 739
аз 570 иАЕСАиАисАЕЕиЕААААсатат 740
3 553 иииисАсеисАиАиссиАоатат 741
аз 571 АилссАиАисАСЕисААААатат 742
3 555 иисАСсисАиАиосиАиоиатат 743
аз 573 АСАиАЕСАиАибАОЕиЕААатат 744
3 557 САСсисАиАиссиАиеиилатат 745
аз 575 иААСАПАЕСАиАисАСсисатат 746
3 56 ссииссиссАсиЕсиАиииатат 747
аз 74 АААиАССАСиССАССААЕбатат 748
3 563 АиАиссиАисииАЕААсисатат 749
аз 581 ЕАсиисиААСАиАЕСАилиатат 750
3 564 иАОЕсиАиЕииАЕААЕиссатат 751
аз 582 ссАсиисиААСАиАсслиАатат 752
3 566 иесиАибииАЕААсиссАоатат 753
аз 584 сиЕЕАсиисиААСАиАосАатат 754
3 57 сииЕсоЕЕАсиссиАиииЕатат 755
аз 75 САААиАССАСПССАССААСатат 756
3 578 АСиССАЕЕСАЕАСАСААиАатаТ 757
аз 596 лиисисосиоссисЕАситтатат 758
3 580 иССАЕЕСАЕАЕАСААиАААатат 759
аз 598 иииАиисисисиЕссиЕЕАатат 760
3 607 сиеАААОЕСАсиишсАииатат 761
аз 625 ААиЕААААЕисссииисАсатат 762
3 62 иЕЕАсисбиАиииЕиЕисиатат 763
аз 80 АСАСАСАААиАССАЕиССАатаТ 764
3 77 оисисАсссисссссиАСЕатат 765
аз 95 ссиАбссссАоссисАЕАсатат 766
3 79 сисАсссисесссиАСЕсеатат 767
аз 97 сссЕилсЕСссАЕСсисАЕатат 768
3 81 ЕАСЕСибЕСССиАСЕЕЕСАатат 769
аз 99 ' иссссеилсссссАсссисатат 770
3 82 АЕЕСиЕЕСССиАСОСЕСАСатат 771
аз 100 сиЕсссЕилЕЕЕССАЕСсиатат 772
- 49 020312
Цепь Положение Последовательность с З’-дезокситимидиновым выступом (5'-3’) 8Е0 Ιϋ ΝΟ:
8 84 ссибссссиАсссосАсссатат 773
аз 102 сесиессссиАбссссАссатат 774
5 85 сисссссиАсссссАссссатнт 775
аз 103 ссссисссссиАсссссАсатат 776
8 87 сбсссиАссессАсссБиеатат 777
аз 105 САСсеоиссссеиАооБссатат 778
3 9 ссАсисАиисиисесАССАНтат 779
аз 27 иссиессААЕАлисАсисБатат 780
3 90 ССиАСБЕБСАССБбибААОатат 781
аз 108 АииСАССББОБСССбиАББНтат 782
3 91 сиАСБББСАССБоиБААисатат 783
аз 109 ОАиисАССББибсссБиАБдтат 784
3 92 иАсоББСАСсоБиолАиссатат 785
аз 110 БбАиисАССБоиБсссБиАатат 786
3 93 АСББбСАССББибААиССАатат 787
аз 111 иоБАиисАССббиосссБиатат 788
3 97 БСАССБСибААиССААбибдтат 789
аз 115 САсиибБАиисАссбБибсатнт 790
3 98 САССББибААиссААбибиатат 791
аз 116 АСАсиисБАиисАССБоисатат 792
3 167 ибОббссАибСАибисиисатат 793
аз 185 БААСАСАибСАиОБССАСАатат 794
8 168 сиссссАиссАисиоиисАатат 795
аз 186 ибААСАСАиссАисоссАсатат 796
3 171 БССАибСАибибиисАБААатат 797
аз 189 оисисААСАСАиссАиассатат 798
3 432 идииссАССАСББсибисАатат 799
аз 449 ибАСАбссбиббиббААиАатат 800
3 447 БиСАОСАССААОСССААББатаТ 801
аз 465 ссииБББАииБбибАиБАсатат 802
3 115 БиссисибАибоисАААбиатат 803
аз 133 АсииоБАССАисАБАББАсатат 804
3 122 ОАиббисАААбиисиАБАиатат 805
аз 140 АисиАБААсииибАССАисатат 806
5 139 АиБсибиссбАББСАБиссатат 807
аз 157 СБАСООССиСББАСАБСАиатат 808
3 172 сссиссАисисиисАСААлатат 809
аз 190 ииисиБААСАСАиБСАСббатат 810
3 238 АБосиобАбАБсиБСАиБсатат 811
аз 256 ссАиБСАОсисиссАБАсиатат 812
3 252 САибББсисАСААсибАббатат 813
аз 270 ссисАбиисисАбссслисатат 814
3 33 исисАисбисиосиссиссатат 815
аз 51 60АБ6А6САБАС6АиБА6Аатат 816
3 340 ссссАиисслибАБСАиБсатат 817
аз 358 БСАиБсисАиоБААибБББатат 818
3 421 БссссиАсиссилииссАсатат 819
аз 439 оиббААиАСбАбиАОБОбсатат 820
3 431 сиАииссАССАСБбсиоисатат 821
аз 449 БАСАБссБиббиооААиАбатат 822
3 440 САСОБсиоисоисАССААиатат 823
аз 458 АииббибАСБАСАбссбиоатат 824
3 496 АбБАСБАббБАисБбАиииатат 825
аз 514 АААисссАисссисоиссиатат 826
3 556 исАссисАиАиссиАиоииатат 827
аз 574 ААСАиАССАиАисАбсиодатат 828
3 559 ссисАиАиосиАиБииАБАатат 829
Цепь Положение Последовательность с З’-дезокситимидиновым выступом (5'-3’) 5Е0 Ιϋ ΝΟ:
аз 577 исиААСАиАБСАилиБАбБатат 830
3 570 АиоиоАбААбиссАБосАоатат 831
аз 588 сиоссибБАсиисиААСАиатат 832
3 78 исиоАББсиБбсссиАСББатат 833
аз 96 ССбиАОББССАБССиСАБАатат 834
8 87 БбсссиАСбББСАСссоиБатат 835
аз 105 САССББиОСССБиАЕББССатат 836
3 95 БбосАссооибААиссААбатат 837
аз 113 сииББАиисАссоБиосссатат 838
3 167 ссАиссАиоиеиисАСААлатат 839
аз 185 ииисибААСАСАибСАибоатат 840
Цепь: 8=смысловая; а8=антисмысловая;
Положение: положение 5'-основания на транскрипте (ΝΜ_000371.2, ЗКС) ΙΌ ΝΟ:1329)
- 50 020312
Таблица 4. Химически модифицированные последовательности смысловых и антисмысловых цепей дцРНК ТТК человека (см. табл. 2 в отношении номера дуплекса)
Цепь Номер олиго Положение Последовательность (5’-3’) ЗЕф ГО ΝΟ:
3 А-32153 100 ссйСиСААиссАА6и<ЗиссбТс1Т 841
аз А-32154 118 ссАсАсииссАиисАсссссГМт 842
3 А-32155 11 АсисАиисииССсАССАиСбТбТ 843
аз А-32156 29 сАиссисссААСААийАсибтат 844
3 А-32157 111 ААСиСиссисиСАиССисАсЗТдТ 845
аз А-32158 129 исАСсАисАСАссАсАсииатат 846
3 А-32163 13 исАиисииССсАССАиССсбТбТ 847
аз А-32164 31 ССсАиССиССсААСААиСАбТбТ 848
3 А-32165 130 ААСиисиАСАиСсиСиссСбТбТ 849
аз А-32166 148 сссАсАСсАисиАСААсииатат 850
3 А-32167 132 СиисиАСАиСсиСиссСАСсГТсГГ 851
аз А-32168 150 сисссАсАСсАисиАОААсатат 852
3 А-32169 135 сиАСАиСсиСиссСАССсАЦТбТ 853
аз А-32170 153 исесисссАсАСсАисиАсатат 854
3 А-32171 138 САиСсиСиссСАССсАСисбТдТ 855
аз А-32172 156 йАсисссисссАсАйсАисатат 856
3 А-32175 14 сАиисииССсАССАиССсибТбТ 857
аз А-32176 32 АсссАиссисссААСААисатат 858
3 А-32177 140 иСсиСиссСАССсАСиссибТбТ 859
аз А-32178 158 АСЙАСиСССиСССАсАСсАбтат 860
3 А-32179 146 ссСАССсАСиссиСссАисбТбТ 861
аз А-32180 164 йАисссАссАсисссисссатат 862
3 А-32181 152 сАСиссиСссАисААиСиСйТбТ 863
аз А-32182 170 сАсАиисАисесАссАсисатат 864
3 А-32183 164 сААиСиССссСиСсАиСиСдТбТ 865
аз А-32184 182 сАсАиссАсеессАсАииеатат 866
3 А-32187 178 АиСиСиисАСАААССсиСсбТбТ 867
аз А-32188 196 ссАсссииисисААсАсАибтбт 868
3 А-32189 2 сАСААСиссАсисАиисиибТбТ 869
аз А-32190 20 ААСААисАсиссАсиисисатат 870
3 А-32191 21 ССсАССАиССсиисисАисдТбТ 871
аз А-32192 39 САисАйААсссАиссисссцтцт 872
3 А-32193 210 САСссАиииСссисиСССАбТбТ 873
аз А-32194 228 исссАСАсссАААисссисцтат 874
3 А-32195 23 сАССАиССсиисисАисСис!Тс1Т 875
аз А-32196 41 АсслисАСААсссАиссисатат 876
- 51 020312
Цепь з
аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз
Номер олиго
А-32199
А-32200
А-32201
А-32202
А-32203
А-32204
А-32205
А-32206
А-32207
А-32208
А-32211
А-32212
А-32213
А-32214
А-32215
А-32216
А-32217
А-32218
А-32219
А-32220
А-32221
А-32222
А-32223
А-32224
А-32225
А-32226
А-32227
А-32228
А-32229
А-32230
А-32231
А-32232
А-32233
А-32234
А-32235
А-32236
А-32237
А-32238
А-32239
А-32240
А-32241
А-32242
А-32243
А-32244
А-32247
А-32248
А-32249
А-32250
А-32251
А-32252
А-32253
А-32254
А-32255
А-32256
А-32259
А-32260
А-32261
А-32262
Положение
Последовательность (5’-3')
АССАибСсиисисАисСисатат САсеАцсАСААСсслиссиатат АСАОсибсАиООбсисАсАатат иеисАбсссАиссАссисибтат бсибсАибббсисАсААсиатат АсиисисАссссАиссАосбтат ббАиббсиисисАисбисиатат АбАСбАЦбАбААбСсАЦССатат бсАибббсисАсААсибАбатат сисАоицдисАссссАиссбтат АибббсисАсААсибАббАатат иссисАеииеибАссссАиатат ибббсисАсААсибАббАбатат сиссисАбиисисАссссАатат бАб6ААииибиАбААб66Аатат исссиисиАсАААииссисатат ииибиАбААбббАиАиАсАатат ЦСиАиАисССииСиАсАААдтат иибиАСААбССАиАиАсААбТдТ ЦЦеиАиАЦСССииСиАсААбтат ибиАбААбббАиАиАсАААатат ииибиАиАисссиисиАсАбтбт АбААбббАиАиАсАААбибатат сАсииисиАиАисссиисибтбт ААбиббАААиАбАсАссААатат циосиоисиАиииссАсиибтат бСАААиАбАсАссАААисиатат АОАиииссисисиАиииссбтат ОАААиАСАсАссАААисиибТбТ ААСАиииссисисиАииисатат АиАбАсАссАААисииАсиатат АСиААбАииисоиеисиАицтат иАбАсАссАААисииАсибатат сАСиААеАциисеиоисиАбтат АСАсАссАААисииАсиОСс1Тс1Т ссАСиААСАиииссиеисиатат ииАсиббААббсАсииббсатат ессААсиессииссАбиААатат иисисАисСисиСсиссисатат бА6бАбсАбАСбАЦбАбААатат ббААббсАсииббсАисисатат еАСАисссААоиессииссатат ббсАсииббсАисиссссАатат иеооеАеАиоссААбисссатат ССсАисиссссАииссАиСатат сАиооААисссоАбАисссатат СсАисиссссАииссАиСАатат цсАиееААиоеоеАбАиссатат сАисиссссАииссАиСАСатат сисАиссАлисбссАбАцеатат АисиссссАииссАиСАСсатат ссисАиссАдиссссАСАиатат сиссссАииссАибАбсАиатат АиссисАиссААцссссАсатат сссАииссАибАОсАибсАатат иссАиссисАиссААцсоеатат ссАиСАСсАиСсАСАССиСатат сАссисиссАиссисАиосатат
5Е0 Ю ΝΟ:
- 52 020312
Цепь Номер олиго Положение Последовательность (5’-3’) ЗЕО Ιϋ ΝΟ:
3 А-32263 352 АСсАиСсАСАССиССиАиийТЦТ 935
аз А-32264 370 ААиАСсАссисибсАиесиатат 936
3 А-32265 354 сАибсАСАССиССиАиисАЦТбТ 937
аз А-32266 372 исААиАСсАссисиссАиоатат 938
3 А-32267 355 АибсАСАССиССиАиисАсйТЦТ 939
аз А-32268 373 ООСААиАСсАССисиСсАиЦтат 940
3 А-32269 362 ССиССиАиисАсАСссААсйТЦТ 941
аз А-32270 380 еиисссисиеААиАссассцтат 942
3 А-32271 363 СибСиАиисАсАСссААсСбТЦТ 943
аз А-32272 381 сеииессиеиеААиАСсАсцтцт 944
3 А-32273 364 иССиАиисАсАСссААс<ЗАс1Тс1Т 945
аз А-32274 382 иссиисесисисААиАСсАЦтат 946
3 А-32275 365 С<ЗиАиисАсАС;ссААсОАсс1Тс1Т 947
аз А-32276 383 оисоиибссисиеААиАссцтцт 948
8 А-32277 366 биАиисАсАСссААсбАсисИЦТ 949
аз А-32278 384 АсисоиисссиеиоААиАсцтат 950
3 А-32279 367 иАиисАсАОссААсСАсисЦТбТ 951
аз А-32280 385 САсиссииобсисисААиАЦМт 952
3 А-32281 370 исАсАСссААсСАсиссССЦТбТ 953
аз А-32282 388 ссссАсиссиисссисисАЦтат 954
3 А-32283 390 ссссСссбсиАсАссАииСЦТбТ 955
аз А-32284 408 сААиссисиАесессбоосцтат 956
3 А-32285 4 СААеиссАсисАиисиибЗЦТбТ 957
аз А-32286 22 ссААОААиоАсиссАсиисатат 958
3 А-32287 412 сссибсиСАСссссиАсисЦТЦТ 959
аз А-32288 430 САСиАСеСССисАСсАСССбТбТ 960
3 А-32289 417 сиСАбссссиАсиссиАииЦТбТ 961
аз А-32290 435 ААиАССАСиАбССбСисАЕЦТЦТ 962
3 А-32291 418 иСАСссссиАсиссиАиисЦТбТ 963
аз А-32292 436 СААиАОСАеиАСССССисАЦТат 964
3 А-32295 422 ссссиАсиссиАииссАсссЗТбТ 965
аз А-32296 440 ССиССААиАССАбиАССООЦТат 966
3 А-32297 425 сиАсиссиАииссАссАсСЦТЦТ 967
аз А-32298 443 ссиосиссААиАесАСиАеатат 968
3 А-32299 426 иАсиссиАииссАссАсСбйМТ 969
аз А-32300 444 ссоиссиеоААиАесАбиАЦтат 970
3 А-32301 427 АсиссиАииссАссАсСбссЗТбТ 971
аз А-32302 445 есссибсиобААиАСбАсиатат 972
3 А-32303 429 иссиАииссАссАсСОсибЦТЦТ 973
аз А-32304 447 сАссссисоиссААиАосАДтат 974
3 А-32307 432 иАииссАссАсСбсиСисбйТдТ 975
аз А-32308 450 СОАсАСССбибвиОСААиАЦТЦТ 976
3 А-32309 433 АииссАссАсССсиСисСиЭтат 977
аз А-32310 451 АссАсАсссоисеиссААиатат 978
3 А-32311 437 сАссАсСОсиСисСисАссЦТат 979
аз А-32312 455 есисАсеАсАсссоиеоиеатат 980
3 А-32313 438 АссАсССсиСисбисАссАдтат 981
аз А-32314 456 иссисАсоАсАсссеиссиатат 982
3 А-32315 439 ссАсООсиеисСисАссААЦТат 983
аз А-32316 457 ииссисАссАсАссссиссатат 984
3 А-32319 441 АсООсибисСисАссААисатат 985
аз А-32320 459 бАиисоиоАсоАсАССссиатат 986
3 А-32321 442 сССсибисОисАссААиссйтат 987
аз А-32322 460 соАиисеиеАссАсАсссеатат 988
3 А-32323 449 сСисАссААисссААССААбтат 989
аз А-32324 467 ииссииссслииссисАссатат 990
3 А-32325 455 сААисссААССААиСАСССатат 991
аз А-32326 473 сссисАииссииеосАииеатат 992
- 53 020312
Цепь Номер олиго Положение Последовательность (5’-3') ЗЕф Ιϋ ΝΟ:
3 А-32327 491 ссиСААССАсбАССОАибСатйТ 993
аз А-32328 509 ссАисссисоиссиисАбСйтат 994
3 А-32331 497 С С А с ОАО 3 3 АиЗ 3 3 Аии и. с с! Т с! Т 995
аз А-32332 515 сАААисссАисссисеиссйтат 996
3 А-32333 5 ААбиссАсисАиисииОбсйтат 997
аз А-32334 23 сссААСААиоАсиссАсиийтат 998
3 А-32335 508 бббАииисАибиААссААОатат 999
аз А-32336 526 сииссииАсАисАААисссйтат 1000
3 А-32337 509 ббАииисАибиААссААбАйтат 1001
аз А-32338 527 исииссииАсАисАААиссйтат 1002
3 А-32339 514 исАибиААссААбАбиАиийТсГТ 1003
аз А-32340 532 ААиАсисииссииАсдисАдтат 1004
3 А-32341 516 АибиААссААбАбиАииссйтат 1005
аз А-32342 534 осААиАсисииоеииАсАиатат 1006
3 А-32343 517 ибиААссААбАбиАииссАйтат 1007
аз А-32344 535 иссААиАсисииесииАсАйтат 1008
3 А-32345 518 СиААссААСАОиАииссАийТйТ 1009
аз А-32346 536 АиссААиАсисиисеииАСйтат 1010
3 А-32347 54 ибссиибсиббАсиббиАийтат 1011
аз А-32348 72 АиАСсАбиСсАбсААббсАйТат 1012
3 А-32349 543 иАААбсАбибиииисАссийтат 1013
аз А-32350 561 АссиоААААсАсиссиииАйтат 1014
3 А-32351 55 бссиибсиббАсиббиАииатат 1015
аз А-32352 73 ААиАСсАСиСсАСсААОбСйТйТ 1016
3 А-32353 . 551 иСиииисАссисАиАибсийТйТ 1017
аз А-32354 569 АСсАиАиСАССиСААААсАсПат 1018
3 А-32355 552 биииисАссисАиАибсиАйтат 1019
аз А-32356 570 иАОсАиАиОАеСиСААААСатйТ 1020
3 А-32357 553 иииисАссисАиАибсиАийтат 1021
аз А-32358 571 АиАОсАиАиСАССиСААААйТйТ 1022
3 А-32359 555 иисАссисАиАибсиАибийтат 1023
аз А-32360 573 АсАиАОсАиАиСАСОиСААсЗтат 1024
3 А-32363 557 сАссисАиАиСсиАибииАйТсИ 1025
аз А-32364 575 иААсАиАОсАиАиСАССиСйТйТ 1026
3 А-32367 56 с сиибсиббАсиббиАииийТйТ 1027
аз А-32368 74 АААиАСсАСиСсАСсААСОЙМТ 1028
3 А-32369 563 АиАибсиАибииАбААбисйтат 1029
аз А-32370 581 слсиисиААсАиАСсАиАоатат 1030
3 А-32371 564 иАибсиАибииАбААбиссйтат 1031
аз А-32372 582 ССАСииСиААсАиАСсАиАатат 1032
3 А-32373 566 иСсиАибииАСААСиссАбйтат 1033
аз А-32374 584 СиеОАСииСиААсАиАСсАйтат 1034
3 А-32375 57 сиибсиббАсиббиАииибйтат 1035
аз А-32376 75 сАААиАСсАСиСсАОсААСатат 1036
3 А-32379 578 АСиссАСбсАСАСАсААиАатаТ 1037
аз А-32380 596 иАиисисисисссиссАсиатат 1038
3 А-32381 580 иссАОбсАСАСАсААиАААатат 1039
аз А-32382 598 иииАиисисисисссиссАатат 1040
3 А-32383 607 бибАААССсАсиииисАиийтат 1041
аз А-32384 625 ААиоААААсисссииисАсатат 1042
3 А-32385 62 иббАсиббиАииибибисийтат 1043
аз А-32386 80 АСАсАсАААиАСсАСиСсАаТйТ 1044
8 А-32387 77 СисиСАСбсиСОсссиАсСатат 1045
аз А-32388 95 ССиАССССсАСССисАСАСатат 1046
3 А-32391 79 сибАббсиббсссиАсбббйтат 1047
аз А-32392 97 ссссиАсеоссАсссисАсатат 1048
3 А-32393 81 САССсиССсссиАсССОсАйтат 1049
аз А-32394 99 исссссиАссоссАоссисатат 1050
- 54 020312
Цепь Номер олиго Положение Последовательность (5’-3’) 8Εζ2 Ιϋ ΝΟ:
3 А-32395 82 АбСсиСОсссиАсСбесАсатат 1051
аз А-32396 100 сисссссилссоссАсссиатат 1052
3 А-32397 84 СсиССсссиАсСССсАссСбтат 1053
аз А-32398 102 сесисссссиАсссссАссатат 1054
3 А-32399 85 сиббсссиАсОССсАссСОатат 1055
аз А-32400 103 ссссиссссеиАсссссАсатат 1056
3 А-32401 87 ССсссиАсСССсАссбСиСйТйТ 1057
аз А-32402 105 сАссссисссссиАеезссатат 1058
3 А-32403 9 ссАсисАиисииОСсАССАатат 1059
аз А-32404 27 иссисссААСААисАоиссатат 1060
3 А-32405 90 ссиАсСССсАссббиСААиНТНТ 1061
аз А-32406 108 АиисАссесисссссиАосатат 1062
3 А-32407 91 сиАсСССсАссССиСААисйТдТ 1063
аз А-32408 109 САиисАССССисССССиАСйТйТ 1064
3 А-32409 92 иАсСССсАссССиСААисссГМТ 1065
аз А-32410 110 ССАиисАССССиСССССиАйТйТ 1066
5 А-32411 93 АсЗСбсАссССиСААиссАйТйТ 1067
аз А-32412 111 иссАиисАССссиссссоиатат 1068
3 А-32415 97 СсАссСОиСААиссААОиОатат 1069
аз А-32416 115 сАсииссАиисАссссиссатат 1070
3 А-32417 98 с Ас сССиСААи с сААСиСиНТсГГ 1071
аз А-32418 116 АсАсиисслиисАссссисатат 1072
3 А-32419 167 иСиССссАиСсАиСиСииссГМТ 1073
аз А-32420 185 СААсАслие слиесс сАслатат 1074
3 А-32421 168 СиССссАиСсАиСиОиисАатат 1075
аз А-32422 186 иСААсАсАиСсАиСССсАСйТйТ 1076
8 А-32423 171 ОссАиСсАиСиСиисАСААатат 1077
аз А-32424 189 иисиоААсАсАиосАисссатат 1078
5 А-32427 432 иАииссАссАсССсибисАатат 1079
аз А-32428 449 исАсАсссзисоиссААиАйтат 1080
3 А-32429 447 СисАисАссААисссААССНТНТ 1081
аз А-32430 465 ссиисссАоиссислисАсатат 1082
3 А-32159 115 ОиссисиСАиОСисАААСиатат 1083
аз А-32160 133 АсииисАСсАисАСАссАсатат 1084
3 А-32161 122 САиССисАААСиисиАСАийТдТ 1085
аз А-32162 140 АисиАСААсииисАСсАисйтат 1086
3 А-32173 139 АибсибиссСАОСсАСиссатат 1087
аз А-32174 157 осАсиессиссбАсАОсАШтат 1088
3 А-32185 172 ссСиСсАи<ЗиСиисАСАААс1тат 1089
аз А-32186 190 ииисисААсАсАиссАссоатат 1090
3 А-32197 238 АбисиССАСАСсиСсАибСдТбТ 1091
аз А-32198 256 ссАисеАссисиссАСАсиатат 1092
3 А-32209 252 сАиСССсисАсААсиСАССатат 1093
аз А-32210 270 ссисАсииеисАссссАисатат 1094
3 А-32245 33 исисАисбисиСсиссиссатат 1095
аз А-32246 51 ССАССАСсАСАССАиСАСАатат 1096
3 А-32257 340 ссссАииссАиСАСсАиСсатат 1097
аз А-32258 358 ссАиосисАиссААиссссатат 1098
3 А-32293 421 СссссиАсиссиАииссАсатат 1099
аз А-32294 439 СиССААиАССАСиАССеССатат 1100
3 А-32305 431 сиАииссАссАсССсиСисатат 1101
аз А-32306 449 САсАССССиССиССААиАСатаТ 1102
3 А-32317 440 сАсбСсиСисСисАссААиатат 1103
аз А-32318 458 АииссисАссАсАсссоиоатат 1104
3 А-32329 496 АССАсСАбССАиСССАиииатат 1105
аз А-32330 514 АААисссАисссисеиссиатат 1106
3 А-32361 556 исАссисАиАиСсиАиСииатат 1107
аз А-32362 574 ААсАиАСсАиАиСАССНСАатаТ 1108
Цепь Номер олиго Положение Последовательность (5'-3’) 5Εζ) Ю ΝΟ:
3 А-32365 559 ссисАиАиСсиАиСииАСАатат 1109
аз А-32366 577 исиААсАиАСсАилисАсеатат 1110
3 Ά-32377 570 АиСииА&ААСиссАССсАСатат 1111
аз А-32378 588 сиессиссАсиисиААсАиатат 1112
3 А-32389 78 исиСАССсиССсссиАсССатат 1113
аз А-32390 96 сссиАссессАсссисАслатат 1114
3 А-32401 87 ССсссиАсСССсАссССисатат 1115
аз А-32402 105 сАссссисссссиАссоссатат 1116
3 А-32413 95 СССсАссССиСААиссААСатат 1117
аз А-32414 113 сииссАнисАссссиесссатат 1118
3 А-32425 167 ссАиСсАиСибиисАСАААатат 1119
аз А-32426 185 ииисисААсАсАисслиосатат 1120
Цепь: 8= смысловая; ак= антисмысловая;
Положение: положение 5'-основания на транскрипте (ЫМ_000371.2, 8ЕЦ ΙΌ N0:1329)
- 55 020312
Таблица 5. Идентификационные номера для дцРНК ТТН крысы (См. табл. 7 в отношении последовательностей).
Номер дуплекса Номер смыслового олиго Номер антисмыслового олиго
АО-18529 А-32745 А-32746
АВ-18530 А-32747 А-32748
АО-18531 А-32749 А-32750
АО-18532 А-32751 А-32752
АО-18533 А-32753 А-32754
АО-18534 А-32755 А-32756
АО-18535 А-32757 А-32758
АВ-18536 А-32759 А-32760
АО-18537 А-32761 А-32762
АВ-1853 8 А-32763 А-32764
АО-18539 А-32159 А-32160
АВ-18540 А-32765 А-32766
АО-18541 А-32767 А-32768
АВ-18542 А-32769 А-32770
АО-18543 А-32771 А-32772
АО-18544 А-32773 А-32774
АО-18545 А-32775 А-32776
АО-18546 А-32777 А-32778
АО-18547 А-32779 А-32780
АО-18548 А-32781 А-32782
АО-18549 А-32783 А-32784
АВ-18550 А-32785 А-32786
АВ-18551 А-32787 А-32788
АО-18552 А-32791 А-32792
АО-18553 А-32793 А-32794
АВ-18554 А-32795 А-32796
- 56 020312
Таблица 6А. Последовательности смысловых и антисмысловых цепей для дцРНК ТТК крысы
Цепь Положение Последовательность (5*-3)
3 115 сиссисисАисбисАААси
аз 133 АСиииСАССАисАСАОСАС
3 537 шсииссисиАиАААссеи
аз 555 АСЕСиОиАиАСАССААСАА
3 543 сисиАиАААсесисииАес
аз 561 есиААСАСсеиииАиАОАй
3 392 иСБССАСиАСАССАПСССА
аз 410 исссАиссисиАбисссБА
3 538 исииссисиАиАААсссие
аз 556 САСбСиииАОАСАССААбА
3 541 иосисиАиАААССбиеииА
аз 559 иААСАССЕиииАиАСАССА
3 532 САеиеиисииссисилиАА
аз 550 иилиАСАбСААБААСАСиС
3 542 осисиАиАААССбиеииАб
аз 560 сиААСАСсоиииАиАОАбс
3 134 ссиссАиссисисссАсес
аз 152 сссиссоАСАосАиссАсе
3 119 исибАиссисАААсиссис
аз 137 САБОАсиииоАССАисАбА
3 241 СиСБАБАССиССАССБССи
аз 259 АБСсссиссАСсисиссАО
3 544 исиАилААСсоиситаесА
аз 562 иссиААСАСбсииоАиАСА
3 530 ААОАСисиисотБсисиАи
аз 548 АиАБАССААБААСАСиСии
3 118 сисиеАиеоисАААсисси
аз 136 АСБАСиииСАССАиСАБАБ
3 140 иссисисссАбссАоссси
аз 158 АББССиОССиСББАСАБСА
3 239 сисисБАБАБсиесАСБбс
аз 257 сссоиссАБсис ис сабас
3 531 АСАбисиисииесисиАиА
аз 549 иАиАСАбСААСААСАсиеи
3 117 ссисиБАиббисАААБисс
аз 135 ОБАсиииБАССАисАБАбо
3 131 АсиссибБАиссисиссоА
аз 149 иСББАСАБСАиССАБСАСи
3 217 иисссисисББААБАссБС
аз 235 БСЕБиСииСССАБАБЕСАА
3 242 иббАбАбсиссАСбббсис
аз 260 БАБСССбиОСАБСисиССА
3 244 БАБАССиБСАСбббСиСАС
аз 262 оисАОСССоиосАбсисис
3 246 БАбСибСАСббОСиСАССА
аз 264 иооиелосссоиссАбсис
3 399 идсАССАисесАБсссисс
аз 417 БСАбессиссБАиесисиА
3 132 сиссибБАиссисисссАе
аз 150 СиСОБАСАБСАиССАББАС
Цепь Положение Последовательность (5-3')
3 245 АСАБСиБСАСБОбСиСАСС
аз 263 ббибАбсссбибСАбсиси
5Е0 ГО ΝΟ: Последовательность с З’-динуклеотидным выступом (5-3’) ЗЕЙ ГО ΝΟ:
1121 биссисиоАибБисАААбилл 1173
1122 АСииибАССАиСАЕАББАСМП 1174
1123 иисиибсисиАОАААССбилл 1175
1124 АСббОТиАиАОАбСААбААЛЛ 1176
1125 сисиАиАААссбибииАбслм 1177
1126 бсиААСАСббиииАиАбАблы 1178
1127 иСБССАСиАСАССАиСБСАНП 1179
1128 иБСБАиЕЕиЕиАЕибБСБАШ! 1180
1129 исииБсисиАиАААССбиБпн 1181
1130 САСЕСиОиАиАБАЕСААЕАНМ 1182
1131 ибсисиАиАААССБибииАны 1183
1132 иААСАСБбиииАиАЕАБСАМН 1184
1133 САЕивиисиибсисиАиААИп 1185
1134 ииАиАбАбСААбААСАСибШ 1186
1135 ЕсисиАиАААСсвобииАЕШ! 1187
1136 СиААСАЕББиииАиАЕАЕЕПМ 1188
1137 ссиббАиссибиссбАбБслы 1189
1138 ЕССиСББАСАЕСАиССАЕБНК 1190
1139 исибАиббисАААбиссиблы 1191
1140 САббАСОиибАССАиСАбАПЛ 1192
1141 СиББАБАОСибСАСБББСиЛЛ 1193
1142 АБСССбибСАбСОСиССАБЛЛ 1194
1143 исиА.иААдсссисииАЕСАмп 1195
1144 ибсиААСАСббиииАиАБАлы 1196
1145 ААСАоибиисиибсисиАилл 1197
1146 АиАбАБСААбААСАСибииЛЫ 1198
1147 сисибАиоЕисАААбиссипп 1199
1148 АббАсииибАссАисАбАБ1т 1200
1149 ибсиоиссБАББСАбсссимы 1201
1150 АбОбСибССиСБбАСАбСАНЛ 1202
1151 бисиббАбАбсибСАСббблы 1203
1152 сссбибСАбсисиссАбАсли 1204
1153 АСАбисиисиибсисиАиАпи 1205
1154 иАиАБАбСААбААСАСибиЛЛ 1206
1155 ссисибАиббисАААбисслл 1207
1156 ббАсииибАССАисАСАбблл 1208
1157 АбиссиббАибсибиссбАли 1209
1158 иСББАСАЕСАиССАЕБАСипМ 1210
1159 ииоссисиббБААбАссБскл 1211
1160 осбоисиисссАбАбссААлл 1212
1161 иббАОАБсибСАСбббсисим 1213
1162 БАбсссбиБСАбсисиссАлл 1214
1163 БАбАбСибСАСбббСиСАСЛЛ 1215
1164 биБАбсссбибСАбсисислл 1216
1165 бАБСибСАСбббСОСАССАЛЛ 1217
1166 иЕБиБАБСССЕиБСАЕСиСМП 1218
1167 иАСАССАиСБСАБСССибСЛЛ 1219
1168 бСАбббсибСБАиббибиАлл 1220
1169 БиссиббАибсибиссбАблл 1221
1170 СиСббАСАбСАиССАББАСЛЛ 1222
8Е0 ГО ΝΟ: Последовательность с З'-динуклеотидным выступом (5-3’) 8Е0 ГО ΝΟ:
1171 АбАбСибСАСбббСиСАССЛЛ 1223
1172 обибАбсссбибСАбсисилл 1224
Цепь: з= смысловая; аз= антисмысловая;
Положение: положение 5'-основания на транскрипте (ИМ_012671.1, 8ЕЦ ГО NО:1330)
- 57 020312
Таблица 6В. Последовательности смысловых и антисмысловых цепей для дцРНК ТТК крысы
Цепь Положение Последовательность с З'-дезокситимидиновым выступом (5’-3’) ЗЕО Ю ΝΟ:
3 115 сиссисиБАивсисАААеиатат 1225
аз 133 АсииисдссАисАСАЕСАсатат 1226
3 537 иисииссисиАилАлсссиатат 1227
аз 555 АссбиииАиАОАССААеААдтат 1228
3 543 сисилиАААСсеисииАссатат 1229
аз 561 всоААСАСсвиииАиАБАСзатат 1230
3 392 иссссАсиАСАсслисссАатат 1231
аз 410 иссеАисоисиАсисбссАатат 1232
3 538 исииссисиАиАААССвиоатат 1233
аз 556 САСввиииАиАСАССААСАатат 1234
3 541 иссисиАиА-ААССсисииАатат 1235
аз 559 иААСАсесиииАилсАссАатат 1236
3 532 САвиеиисииосисиАиААатат 1237
аз 550 иЧАиАБАВСААВААСАСиСатат 1238
3 542 всисиАиАААСссиоииАсатат 1239
аз 560 сиААСАсесиииАиАСАЕсатат 1240
3 134 ссиссАиссисисссАсссатат 1241
аз 152 ессисссАСАбСАиссАСсатат 1242
3 119 исисАиссислААсиссисатат 1243
аз 137 САСБАсииисАссАисАБАатат 1244
3 241 сиссАСАСсибСАСссвсиатат 1245
аз 259 АоссссивсАСсисиссАватат 1246
3 544 исиАилААССсивицАБСАатат 1247
аз 562 ибсиААСАсесиииАиАВАатат 1248
3 530 ААСАвиеиисиивсисиАиатат 1249
аз 548 АЦАСАВСААСААСАСиВиоатат 1250
3 118 сисисАиссисААА.сиссиатат 1251
аз 136 АссАсииисАсслисАСАоатат 1252
3 140 оосиеисссАВССАссссиатат 1253
аз 158 АБЕСсивссисссАСАССАатат 1254
3 239 сисиБСАСАЕсисслСсссатат 1255
аз 257 сссеиесАСсисиссАСАсатат 1256
3 531 АСАсисиисииссисилиАатат 1257
аз 549 иАиАСАбСААОААСАсивиатат 1258
3 117 ссисисАиссзисАААсиссатат 1259
аз 135 есАсиииоАССАисАБАбМтат 1260
3 131 АсиссшсАиссиочсссАатат 1261
аз 149 исссАСАБСАиссАБСАсиатат 1262
3 217 иисзссисибсвААСАссвсатат 1263
аз 235 сссоисиис ссАОАсесАдат ат 1264
3 242 иссАслссиссАсссссисатат 1265
аз 260 САССссеиссАСсисиссАатат 1266
3 244 САЕАвсиссАсевссисАсатат 1267
аз 262 ЕиЕАЕСССбиосАЕсисисатат 1268
3 246 ЕАЕСиЕСАСЕСЕСОСАССАатат 1269
Цепь Положение Последовательность с З’-дезокситимидиновым выступом (5’-3’) 8Е0 Ιϋ ΝΟ:
аз 264 иЕвиоАЕсссЕиссАссисатат 1270
3 399 иАСАСслисЕСАЕСссиссатат 1271
аз 417 ссАЕсссисссАиссисиАатат 1272
3 132 ЕиссиЕЕАиЕсисиссЕАоатат 1273
аз 150 СиСЕЕАСАОСАиССАЕЕАСатат 1274
3 245 АЕАЕСиЕСАСЕЕЕСиСАССатат 1275
аз 263 ЕочЕАсссссоссАЕсисиатат 1276
Цепь: δ= смысловая; αδ= антисмысловая;
Положение: положение 5'-основания на транскрипте (ΝΜ_012681.1, 8ЕЦ ΙΌ N0:1330)
- 58 020312
Таблица 7. Химически модифицированные последовательности смысловых и антисмысловых цепей дцРНК ТТР крысы (см. табл. 5 в отношении номера дуплекса)
Цепь Номер олиго Положение Последовательность (5’-3') ЗЕО ΙΟ ΝΟ:
3 А-32159 115 СиссисиОАиббисАААбиатат 1277
аз А-32160 133 АсииибАСсАисАбАбСАсатат 1278
3 А-32745 537 иисиибсисиАиАААссбиатат 1279
аз А-32746 555 АСССиииАиАСАСсААЕААсГТсГТ 1280
3 А-32747 543 си сиАиАААс сбибииАб сатат 1281
аз А-32748 561 6СиААсАС6СиииАиАбАб<1тат 1282
3 А-32749 392 исбссАсиАсАссАисбсАЦТсГТ 1283
аз А-32750 410 ибСбАиббибиАбиббСбАЦтат 1284
3 А-32751 538 исиибсисиАиАААссбибатат 1285
аз А-32752 556 сАС0биииАиА6АбсАА6А0Тат 1286
3 А-32753 541 ибсисиАиАААссбибииАсГГсГТ 1287
аз А-32754 559 иААсАС6биииАиА6АбсАс1Тс1Т 1288
3 А-32755 532 сАбибиисиибсисиАиААЦТЦТ 1289
аз А-32756 550 ЦиАиАбАбсААбААсАСибатат 1290
3 А-32757 542 бсисиАиАААссбибииАбатат 1291
аз А-32758 560 СиААсАСббОТиАиАбАбСатат 1292
8 А-32759 134 ссиббАибсибиссСАОбсатат 1293
аз А-32760 152 бссисббАсАбсАиссАбоатат 1294
3 А-32761 119 исиОАиббисАААбиссибдТсГГ 1295
аз А-32762 137 сАбОАСшибАСсАисАбАатат 1296
3 А-32763 241 сибОАбАбсибсАсОббсиатат 1297
аз А-32764 259 АбсссбибсАбсисиссАбатат 1298
3 А-32765 544 исиАиАААссбибииАбсАатат 1299
аз А-32766 562 иббиААсАСббиииАиАбАатат 1300
3 А-32767 530 ААсАбибиисиибсисиАиатат 1301
аз А-32768 548 АиАбАбсААОААсАсиоииатат 1302
3 А-32769 118 сисибАиббисАААбиссиатаТ 1303
аз А-32770 136 АббАсииибАСсАисАСАбатат 1304
3 А-32771 140 ибсибиссбАббсАбсссиатат 1305
аз А-32772 158 АббосисссисбСАсАбсАатат 1306
3 А-32773 239 6иси66А6А6си6сАс666с1Тс1Т 1307
аз А-32774 257 сссбибсАбсисиссАбАсатат 1308
3 А-32775 531 АсАОибиисиибсисиАиАатат 1309
аз А-32776 549 иАиАОАСсААСААсАСибиатат 1310
3 А-32777 117 ссисибАиббисАААбиссатат 1311
аз А-32778 135 ббАсииибАСсАисАСАббатат 1312
3 А-32779 131 АбиссиббАибсибиссбАатат 1313
аз А-32780 149 иссоАсАбслиссАббАсоатат 1314
3 А-32781 217 иибссисибббААбАссбсатат 1315
аз А-32782 235 бСббисиисссАбАббсААатат 1316
3 А-32783 242 и66А6А6си6сАсбббсисатат 1317
аз А-32784 260 бАбсссбибсАбсисиссАатат 1318
Цепь Номер олиго Положение Последовательность (5’-3') 8Εβ Ю ΝΟ:
3 А-32785 244 ОАбАбсибсАсббОсисАсатат 1319
аз А-32786 262 бибАбсссбибсАосисисатат 1320
3 А-32787 246 бАбсибсАсбббсисАссАатат 1321
аз А-32788 264 ибоибАбсссбибсАбсисатат 1322
3 А-32791 399 иАсАссАисбсАбсссибсбтат 1323
аз А-32792 417 СсАбббсиосбАиббибиАатат 1324
3 А-32793 132 СиссиббАибсибиссбАбатат 1325
аз А-32794 150 сисббАсАбсАиссАббАсатат 1326
3 А-32795 245 АбАСсибсАсСббсисАссатат 132 7
аз А-32796 263 ббисАбсссбибсАбсисиатат 1328
Цепь: к= смысловая; ак= антисмысловая;
Положение: положение 5'-основания на транскрипте (№М_012681.1, 8ЕЦ Ю №О:1330)
Синтез последовательностей ТТК
Последовательности ТТН синтезировали на синтезаторе МегМабе 192 в масштабе 1 мкмоль. Для всех последовательностей в этом списке использовали 'епбо11дЬ!'-химию, описанную подробно ниже.
Все пиримидины (цитозин и уридин) в смысловой цепи заменяли соответствующими 2'-О-Метилоснованиями (2'-О-Метил С и 2'-О-Метил и)
- В антисмысловой цепи, пиримидины, соседние (в направлении 5') относительно рибо-А- 59 020312 нуклеозида, заменяли их соответствующими 2'-О-Метил-нуклеозидами;
На 3'-конце как смысловой, так и антисмысловой последовательностей вводили удлинение из двух оснований бТбТ;
Этот файл последовательностей преобразовывали в текстовой файл, чтобы он был совместимым для ввода в программу синтеза МегМабе 192;
Синтез последовательностей ТТН использовал синтез олигонуклеотидов на твердом носителе с применением фосфорамидитной химии.
Синтез вышеуказанных последовательностей выполняли в масштабе 1 мкМ в 96-луночных планшетах. Растворы амидита готовили в концентрации 0,1 М и в качестве активатора использовали этилтиотетразол (0,6 М в ацетонитриле).
Синтезированные последовательности расщепляли и освобождали от защитных групп в 96луночных планшетах с использованием метиламина в первой стадии и триэтиламина.3НР во второй стадии. Неочищенные последовательности, полученные таким образом, осаждали с использованием смеси ацетон:этанол и осадок ресуспендировали в 0,5 М натрий-ацетатном буфере. Пробы из каждой последовательности анализировали при помощи ЬС-М8, и полученные данные масс подтверждали идентичность этих последовательностей. Отобранный набор проб анализировали также 1ЕХ-хроматографией.
Следующей стадией в этом процессе была очистка. Все последовательности очищали на системе очистки АКТА ехр1огег с использованием колонки 8оитсе 15р. Единственный пик, соответствующий полноразмерной последовательности, собирали в элюенте и затем анализировали на чистоту ионообменной хроматографией.
Очищенные последовательности обессоливали на колонке 8ербабех С25 с использованием очищающего агента (АКТА рипйег). Эти обессоленные последовательности ТТН анализировали на концентрацию и чистоту. Затем одиночные цепи отжигали с получением ТТΚ-бδНNΑ (ТТН-дцРНК).
Пример 2В. Ιη νΐ6Ό скрининг δί^ΝΑ ТТН на супрессию мРНК
Поражающие ТТН дцРНК человека (табл. 2) анализировали на ингибирование эндогенной экспрессии ТТН в клетках НерС2 и Нер3В, с использованием анализов с|РСН (ПЦР реального времени) и 6ΌΝΑ (разветвленной ΌΝΑ) для количественного определения мРНК ТТН. Поражающие ТТН грызуна дцРНК (таблица 5) синтезировали и анализировали на ингибирование эндогенной экспрессии ТТН с использованием анализов 6ΌΝΑ в клетках Η.4.ΙΙ.Ε. Результаты из анализов с однократными дозами использовали для выбора субпопуляции дцРНК-дуплексов ТТН для экспериментов доза-ответ для расчета 1С50. Результаты 1С50 использовали для отбора дцРНК ТТН для дальнейшего тестирования.
Культивирование клеток и трансфекции
Линии гепатоцитов НерС2, Нер3В и клеток Η.4.ΙΙ.Ε (АТСС, Маηаδδаδ, νΑ) выращивали почти до конфлюэнтности при 37°С в атмосфере 5% СО2 в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (АТСС), дополненной 10% ФТС, стрептомицином и глутамином (АТСС) перед высвобождением из планшета трипсинизацией. Клетки Η.4.ΙΙ.Ε выращивали также в минимальной поддерживающей среде Игла. Обратную транскрипцию проводили добавлением 3 мкл Орб-МЕМ к 5 мкл δ^НNΑ-дуплексов на лунку в 96-луночном планшете вместе с 10 мкл Орб-МЕМ плюс 0,2 мкл Липофектамина НИАтМах на лунку Ппуйгодеп, СатИЬаб СΑ. са! # 13778-150) и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем добавляли 80 мкл полной среды для выращивания без антибиотиков, содержащей 4х104 (НерС2), 2х104 (Нер3В) или 2х104 (Н.4.П.Е)-клеток. Клетки инкубировали в течение 24 ч перед очисткой РНК. Эксперименты с однократными дозами выполняли с 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, 0,00001 нМ.
Выделение тотальной РНК с использованием набора для выделения РНК МадМАХ-96 (Аррбеб ВюхуЧетх, Еох1ег Сбу сА. раИ #: АМ1 830)
Клетки собирали и лизировали в 140 мкл раствора для лизиса/связывания, затем перемешивали в течение 1 мин при 850 об./мин с использованием термомиксера Эппендорфа (скорость смешивания была одной и той же на протяжении этого процесса) . Двадцать микролитров магнитных гранул добавляли в лизат клеток и смешивали в течение 5 мин. Магнитные гранулы извлекали при помощи магнитного устройства и супернатант удаляли без нарушения этих гранул. После удаления супернатанта магнитные гранулы промывали Промывочным раствором 1 (дополненным изопропанолом) и смешивали в течение 1 мин. Гранулы опять собирали и супернатант удаляли. Затем гранулы промывали 150 мкл промывочного раствора 2 (дополненного этанолом), собирали и супернатант удаляли. Затем к этим гранулам добавляли 50 мкл ДНКазной смеси (МадМах 1нгЬо-буфер для ДНКазы и ДНКаза Титбо) и их перемешивали в течение 10-15 мин. После перемешивания добавляли 100 мкл раствора для повторного связывания РНК и перемешивали в течение 3 мин. Супернатант удаляли и магнитные гранулы опять промывали 150 мкл Промывочного раствора 2 и смешивали в течение 1 мин и супернатант удаляли полностью. Эти магнитные гранулы смешивали в течение 2 мин для высыхания перед элюцией РНК 50 мкл воды.
Синтез кДНК с использованием набора для высокоэффективной обратной транскрипции кДНК ΑΒΙ (Аррйеб Β^οδνδΐетδ. Ροδΐе^ Сйу. СΑ. Са! #4368813):
Основную смесь 2 мкл 10Х буфера, 0,8 мкл 25х 6ΝΨΡ, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной
- 60 020312 транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКаз и 3,2 мкл Н2О на одну реакцию добавляли в 10 мкл тотальной РНК. кДНК генерировали с использованием термоциклера Вю-Кай С-1000 или 8-1000 (Негси1е§, СА) посредством следующих стадий: 25°С 10 мин, 37°С 120 мин, 85°С 5 с, 4°С выдерживание.
ПЦР реального времени:
мкл кДНК добавляли к основной смеси 1 мкл зонда 188 Тас|Ман (Аррйей Вювуйетв Са! # 4319413Ε), 1 мкл зонда ТТК ТацМаи (Аррйей Вювуйетв са! # Н8ОО 174914 М1) и 10 мкл основной смеси Тас|Ман для универсальной ПЦР (Аррйей Вювуйетв Са! #4324018) на лунку в 96-луночном планшете МюгоАтр Ор!1са1 (Аррйей Вювуйетв са! # 4326659) . ПЦР реального времени выполняли в системе ПЦР реального времени АВ1 7000 Рпвт или АВ1 7900НТ (Аррйей Вювуйетв) с использованием ΔΔ С1(КЦ)анализа. Все реакции выполняли в трех повторностях.
Данные ПЦР реального времени анализировали с использованием этого ДД С!-способа и нормализовали относительно анализов, выполненных на клетках, трансфицированных 10 нМ В1оск1Т Пиогевсен! Окдо (Iην^!^одеη Са! # 2013) или 10 нМ АО-1955 (контрольным дуплексом, который поражает ген люциферазы не-млекопитающих) для расчета изменения укладки.
Анализы с разветвленной ДНК - ОиапйСепе 1.0 (Рапошкз. Егетоп!. СА. са! #: ОС0004) - используемые для скрининга специфических дуплексов грызунов
Клетки НАИЪ (АТСС) трансфицировали 10 нМ ЦКЫА. После удаления среды НАПЦ лизировали в 100 мкл Разбавленной лизисной смеси (смеси 1 объема лизисной смеси, 2 объемов не содержащей нуклеаз воды и 10 мкл Протеиназы-К на мл для конечной концентрации 20 мг/мл), затем инкубировали при 65°С в течение 35 мин. Затем в этот захватывающий планшет добавляли 80 мкл рабочего набора зондов (смеси ТТК- или САРЭН-зонда) и 20 мкл клеточного лизата. Захватывающие планшеты инкубировали при 53°С±1°С в течение ночи (приблизительно 16-20 ч). Захватывающие планшеты промывали 3 раза 1Х Промывочным буфером (смесью не содержащей нуклеаз воды, Буферного Компонента 1 и Промывочного Буферного Компонента 2), затем сушили центрифугированием в течение 1 мин при 1000 об/мин. В захватывающий планшет добавляли рабочий амплификаторный реагент, добавляли в этот захватывающий планшет, который затем герметично заделывали и инкубировали в течение 1 ч при 46°С±1°С. Стадии промывания и сушки повторяли после 1 ч инкубирования и добавляли 100 мкл реагента раствора метки. Затем этот планшет промывали, сушили и добавляли 100 мкл субстрата (смеси лаурилсульфата лития и раствора субстрата). Захватывающие планшеты помещали в термостат на 30 мин при 46°С±1°С. Затем захватывающие планшеты вынимали из термостата и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Наконец, захватывающие планшеты считывали с использованием люминометра (У1с!от Ьиттоте!ег, Регкт Б1тег, \Уа1111ат, МА).
Анализы разветвленной ДНК - ОиапйСепе 2.0 (Рапоткх са! #: 08ОО1 1): используемые для скрининга всех других дуплексов
После 24 ч инкубации при установленной дозе или при установленных дозах среду удаляли и клетки лизировали в 100 мкл лизисной смеси (1 объем лизисной смеси, 2 объема не содержащей нуклеаз воды и 10 мкл Протеиназы-К/мл для конечной концентрации 20 мг/мл), затем инкубировали при 65°С в течение 35 мин. Затем в этот захватывающий планшет добавляли 20 мкл рабочего набора зондов (ТТКзонд для гена-мишени и САРЭН для эндогенного контроля) и 80 мкл клеточного лизата. Захватывающие планшеты инкубировали при 55°С±1°С (приблизительно 16-20 ч). На следующий день захватывающие планшеты промывали 3 раза 1Х промывочным буфером (не содержащей нуклеаз воды, Буферного Компонента 1 и промывочного буферного компонента 2), затем сушили центрифугированием в течение 1 мин при 240 г. Добавляли 100 мкл рабочего пре-амплификаторного реагента в эти захватывающие планшеты, которые заделывали алюминиевой фольгой и инкубировали в течение 1 ч при 55°С±1°С. После 1 ч стадию промывания повторяли, затем добавляли 100 мкл рабочего амплификаторного реагента. После 1 ч стадии промывания и сушки повторяли и добавляли 100 мкл зонда метки. Захватывающие планшеты инкубировали при 50°С±1°С в течение 1 ч. Затем эти планшеты промывали 1Х промывочным буфером и сушили и затем добавляли к этим захватывающим планшетам 100 мкл субстрата. Захватывающие планшеты считывали с использованием люминометра 8рес!гаМах (Мо1еси1аг Оеу1се8, 8иηηуνа1е, СА) с последующей инкубацией в течение 5-15 мин.
Анализ данных ΙιϋΝΑ
Данные ЮМА анализировали (ί) вычитанием среднего фона из каждой из трех повторностей пробы, (ίί) усреднением величин полученных трех повторностей САРЭН (контрольного зонда) и ТТК (экспериментального зонда) и затем получением (вычислением) отношения: (фон экспериментального зонда)/фон контрольного зонда).
Результаты
Суммирование результатов однократных доз и 1С50 для ТТК-йвКЫА (ТТК ЦКЫА) представлены ниже в табл. 8. Результаты однократных доз выражены в виде % мРНК ТТК относительно контроля, при анализе в клетках НерС2. 1С50 определяли в клетках НерС2 и/или Нер3В, как указано.
- 61 020312
Таблица 8. Результаты отдельных доз и 1С50 ιη νίΐΓΟ скринингов δίΚΝΑ ТТК
Номер дуплекса Однократная доза при 10 нМ, % относительно контроля 1С50(нМ)
НерС2 НерС2 НерЗВ
цРСК ΟϋΝΑ цРСК &ϋΝΑ цРСК 1)ϋΝΑ
АО-18243 50.35 141.53 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18244 64.26 158.55 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18245 56.89 107.22 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18246 10.53 32.51* 0.265 0.086 Νϋ Νϋ
АО-18247 125.56 69.57 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18248 127.78 66.97 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18249 48.77 48.76 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18250 96.94 86.42 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18251 170.41 129.15 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18252 73.52 81.90 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18253 25.25 61.25 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18254 95.13 103.96 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18255 119.46 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18256 42.64 95.67 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18257 146.25 141.75 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18258 10.20 13.41* 0.007 0.005 0.004 0.005
АО-18259 9.30 20.91* 0.102 0.005 Νϋ Νϋ
АО-18260 125.37 81.36 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18261 14.27 19.40* 0.210 Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18262 84.95 104.05 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18263 16.32 23.25* 0.110 Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18264 104.18 83.69 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18265 41.62 64.87 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18266 39.98 110.53 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18267 149.64 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18268 152.93 174.04 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18269 37.27 92.28 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18270 99.44 164.75 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18271 18.89 28.33* 0.503 0.004 Νϋ Νϋ
АО-18272 128.32 132.58 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18273 115.78 201.95 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18274 8.97 20.04* 0.009 0.176 0.036 0.012
АО-18275 4.09 22.25* 0.026 0.118 Νϋ Νϋ
Αϋ-18276 19.73 45.22* 0.198 0.677 Νϋ Νϋ
Αϋ-18277 10.55 26.31* 0.121 0.426 Νϋ Νϋ
АО-18278 108.86 116.26 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18279 66.59 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18280 103.26 170.52 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18281 87.98 123.88 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18282 82.47 140.32 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18283 106.54 182.78 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18284 106.93 151.78 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18285 26.58 60.05* Νϋ 0.089 Νϋ Νϋ
АО-18286 109.95 173.66 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18287 54.23 155.45 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18288 73.52 174.09 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18289 103.36 174.76 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18290 17.06 52.04* 1.253 0.181 Νϋ Νϋ
АО-18291 7.71 169.29* 1.304 0.019 Νϋ Νϋ
АО-18292 7.51 210.03* 0.604 0.005 Νϋ Νϋ
Αϋ-18293 3.61 62.53* 0.078 0.003 Νϋ Νϋ
АО-18294 111.53 107.56 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18295 115.88 105.37 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18296 57.03 38.03 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18297 87.69 73.87 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
- 62 020312
Αϋ-18298 10.39 7.25* 0.455 0.008 Νϋ Νϋ
Αϋ-18299 18.79 18.06* 0.895 0.014 Νϋ Νϋ
Αϋ-18300 108.70 Νσ Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18301 114.22 70.50 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18302 116.19 122.40 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18303 124.89 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18304 132.99 89.54 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18305 153.10 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18306 159.22 Νσ Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18307 116.83 84.57 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18308 156.72 87.80 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18309 113.22 101.97 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18310 132.33 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18311 161.68 92.92 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18312 103.01 71.17 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18313 120.65 53.26 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18314 116.33 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18315 115.13 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18316 118.73 122.34 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18317 114.03 121.10 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18318 80.85 122.57 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18319 119.14 148.87 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18320 22.86 55.43* Νϋ 0.023 0.403 Νϋ
Αϋ-18321 6.44 31.56* 0.001 0.033 Νϋ Νϋ
АО-18322 54.21 100.46 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18323 6.37 28.71* 0.005 0.023 Νϋ Νϋ
Αϋ-18324 2.53 15.98* 0.002 0.006 0.005 0.014
Αϋ-18325 2.52 11.96* 0.001 0.016 Νϋ Νϋ
Αϋ-18326 18.34 43.16* 0.025 0.186 Νϋ Νϋ
Αϋ-18327 18.28 13.90* 0.044 0.215 Νϋ Νϋ
Αϋ-18328 4.53 26.04* 0.003 0.004 0.006 0.006
АО-18329 96.93 131.54 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18330 11.80 45.18* 0.0004 0.010 0.020 Νϋ
ΑΟ-18331 117.77 163.07 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
ΑΟ-18332 11.53 35.09* 0.001 0.076 0.065 Νϋ
Αϋ-18333 12.24 46.94* 0.001 0.115 0.075 Νϋ
Αϋ-18334 16.27 55.28* 0.0004 0.181 1.071 Νϋ
Αϋ-18335 53.52 112.80 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18336 6.39 33.00* 0.001 0.112 0.081 Νϋ
Αϋ-18337 51.77 105.33 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18338 48.21 102.86 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
Αϋ-18339 6.48 26.56* 0.004 0.002 0.018 0.029
Αϋ-18340 4.53 30.76* 0.002 0.002 Νϋ Νϋ
Αϋ-18341 31.27 100.41 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18342 7,60 42,89* Νϋ 0,016 0,076 Νϋ
- 63 020312
Αϋ-18343 3.42 17.45* ΝΟ 0.001 Νϋ ΝΟ
АО-18344 75.08 134.31 Νϋ ΝΟ Νϋ ΝΟ
Αϋ-18345 13.62 42.75* 0.002 0.013 ΝΟ Νϋ
АО-18346 59.25 121.10 Νϋ ΝΟ Νϋ ΝΟ
АО-18347 91.23 139.54 Νϋ ΝΟ Νσ ΝΟ
АО-18348 89.95 159.29 Νϋ ΝΟ Νϋ Νϋ
АО-18349 108.01 144.96 Νϋ ΝΟ Νϋ ΝΟ
АО-18350 123.65 125.87 Νϋ ΝΟ Νσ ΝΟ
АО-18351 108.36 104.02 Νϋ ΝΟ Νϋ ΝΟ
Αϋ-18352 87.82 128.72 Νϋ ΝΟ Νσ ΝΟ
АО-18353 14.40 65.77 0.012 0.027 Νσ ΝΟ
АО-18354 99.27 123.53 Νϋ ΝΟ Νσ ΝΟ
АО-18355 135.04 150.88 Νϋ ΝΟ Νϋ ΝΟ
АО-18356 100.76 178.96 Νϋ ΝΟ Νσ ΝΟ
АО-18357 125.30 162.85 Νϋ ΝΟ Νϋ ΝΟ
АО-18358 103.15 136.01 Νϋ ΝΟ Νσ Νϋ
АО-18359 34.74 140.48 Νϋ ΝΟ Νσ ΝΟ
АО-18360 103.86 146.86 Νϋ ΝΟ Νσ ΝΟ
АО-18361 105.74 152.74 Νϋ ΝΟ Νϋ ΝΟ
АО-18362 106.96 188.22 Νϋ ΝΟ Νσ ΝΟ
АО-18363 124.22 58.46 Νϋ ΝΟ Νσ ΝΟ
АО-18364 113.75 66.87 Νϋ ΝΟ Νσ ΝΟ
АО-18446 29.73 13.30 Νϋ ΝΟ Νσ Νϋ
АО-18447 109.74 53.63 Νϋ ΝΟ Νϋ ΝΟ
АО-18448 22.96 8.81 Νϋ ΝΟ Νϋ ΝΟ
АО-18449 112.59 50.11 Νϋ ΝΟ Νσ ΝΟ
АО-18450 89.41 34.89 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18451 74.35 23.88 Νϋ ΝΟ Νϋ ΝΟ
АО-18452 125.25 54.86 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18453 126.98 56.31 Νϋ Νσ Νϋ ΝΟ
АО-18454 113.88 52.48 Νϋ Νϋ Νϋ Νϋ
АО-18455 163.00 48.89 Νϋ ΝΟ Νσ ΝΟ
АО-18456 15.70 10.52 Νϋ ΝΟ Νϋ ΝΟ
АО-18457 12.86 8.22 Νϋ ΝΟ ΝΟ ΝΟ
АО-18458 13.00 7.00 Νϋ Νϋ Νσ ΝΟ
Αϋ-18459 14.41 10.72 Νϋ Νϋ Νσ Νσ
АО-18460 121.16 74.87 Νϋ Νϋ Νϋ ΝΟ
Αϋ-18461 100.53 71.87 Νϋ ΝΟ Νϋ ΝΟ
Αϋ-18462 47.75 29.35 Νϋ ΝΟ Νσ ΝΟ
АО-18463 58.98 44.79 Νϋ ΝΟ Νϋ ΝΟ
ΝΟ: нет данных;
* указывает на результат, который представляет среднее из двух экспериментов
Данные доза-ответ, используемые для идентификации 1С50 для 5 ТТН-дцРНК (ΑΏ-18258, ΑΏ-18274, ΑΏ-18324, ΑΏ-18328 и ΑΏ-18339), представлены подробно ниже в табл. 9. Было определено, что все 5 δίΚΝΑ имеют 1С50/ выраженные в пМ. Данные 1С50 для дцРНК в табл. 8 являются суммированием данных, представленных в табл. 9 ниже.
Таблица 9. Данные доза-ответ для 5 ТТН-дцРНК
1 % ингибирования относительно контроля АО-1955
Дуплекс ΑΟ18258 Доза дуплекса (нМ)
Тип клеток Способ 1С50
детектирования 10 1 0.5 0.1 0.05 0.01 0.005 0.001 0.0005 0.0001 0.00005 0.00001 (нМ)
Нер62 я РСК 14.4 14.1 16.2 23.9 27.26 40.19 68.46 78.1 74.48 104.37 98.28 113.68 0.007
Нер62 6ϋΝΑ 14.3 14.5 11.1 12.8 18.82 19.77 51.21 56.03 63.63 58.35 43.64 51.05 0.005
НерЗВ Я РСК 11.9 8.62 12.4 16.4 28.35 30.49 58.36 54.57 81.26 89.43 81.85 101.87 0.004
НерЗВ 5ΟΝΑ 7.65 7.5 11.3 12.6 28.85 27.89 64.57 73.48 72.03 91.44 86.71 89.31 0.005
I % ингибирования относительно контроля АО-1955
Дуплекс Αϋ-18274 Доза дуплекса (нМ)
Способ 1С50
Тип клеток детектирования 10 1 0.5 0.1 0.05 0.01 0.005 0.001 0.0005 0.0001 0.00005 0.00001 (нМ)
Нерб2 я РСК 6.68 8.45 11.7 24.2 42.08 49.89 56.95 62.99 64.47 54.92 67.39 72.67 0.009
Нерб2 6ϋΝΑ 27.5 69 25.2 34.2 73.03 103.4 121.57 97.31 154.93 156.7 N(1 152.25 0.176
НерЗВ Я РСК 7.58 17 15.6 43.9 42.22 60.55 78.8 77.81 79.97 85.84 86.13 83.99 0.036
НерЗВ ΒϋΝΑ 3.77 4.92 7.51 15 35.21 51.66 72.45 70.12 78.31 77.52 90.72 83.01 0.012
- 64 020312
Суммирование результатов однократных доз для специфических для грызунов ТТН-дцРНК (к1ЯХА ТТН) представлены ниже в табл. 10. Результаты однократных доз выражены в виде % 81НХА ТТН при 10 нМ. Эти результаты показывают, что некоторые специфические для грызунов 81НХА ТТН являются эффективными в супрессии эндогенной мРНК ТТН крысы ш уйго.
Дуплекс АР-18324
Доза дуплекса (нм)
Тип клеток Способ детектирования 10 1 0.5 0.1 0.05 0.01 0.005 0.001 0.0005 0.0001 0.00005 0.00001 1С50 (нМ)
Нер62 ЯРСК 2.07 2.27 2.74 6.36 8.18 15.23 28.82 52.79 90.86 94.72 116.07 98.97 0.002
Нер62 5ϋΝΑ 14.5 7.88 11.8 15.9 17.2 46.44 40.4 91.86 0 95.57 0 52.15 0.006
НерЗВ я РСК 2.07 3.48 5.76 16.2 18.73 44.54 49.77 68.88 63.48 76.61 74.7 77.83 0.005
НерЗВ όϋΝΑ 3.48 3.8 5.15 15.2 30.84 55.36 74.75 99.39 88.89 110.83 96.55 110.26 0.014
---------------------------------------------1 % ингибирования относительно контроля АО-1955
Дуплекс АО-18328 Доза дуплекса (нМ)
Тип клеток Способ детектирования 10 1 0.5 0.1 0.05 0.01 0.005 0.001 0.0005 0.0001 0.00005 0.00001 1С50 (нМ)
НерС2 ЯРСК 5.85 3.97 3.32 5.62 8 16.75 55.01 39.76 122.41 102.37 114.02 124.09 0.003
НерС2 №ΝΑ 12.3 10.7 10.7 11.9 20.06 25 69.52 57.29 112.28 98.14 142.26 148.92 0.004
НерЗВ я РСК 3.17 5.52 11.7 13.8 27.68 39.58 61.21 61.87 90.51 87.56 106.03 108.72 0.006
НерЗВ 6ϋΝΑ 3.08 3.66 4.19 7.25 21.05 22.1 73.74 63.19 105.55 96.27 105.97 96.46 0.006
% ингибирования относительно контроля АО-1955
Дуплекс АО-18339 Доза дуплекса (нМ)
Тип клеток Способ детектирования 10 1 0.5 0.1 0.05 0.01 0.005 0.001 0.0005 0.0001 0.00005 0.00001 1С50 (нМ)
Нер62 ЯРСК 6.27 7.28 N0 11 15.25 38.69 38.78 71.7 84.09 62.2 75.61 85.46 0.004
НерС2 №ΝΑ 15.1 8.14 5.13 6.89 12.17 32.14 42.98 64.01 60.76 79.95 81.97 95.43 0.002
НерЗВ ЯРСК 8.3 9.47 13.2 34.5 44.54 77.38 81.04 81.41 93.95 81.04 75.61 78.28 0.018
НерЗВ 6ϋΝΑ 10.5 9.43 11.7 27.1 44.88 72.32 79.88 79.6 87.46 96.53 95.13 89.88 0.029
Таблица 10. Результаты однократных доз ш уйго скрининга специфических для грызунов ТТН-дцРНК (κίΠΝΆ ТТН)
Номер дуплекса % относительно контроля при 10 нМ Номер дуплекса % относительно контроля при 10 нМ
Αϋ-18529 19.83 АО-18542 6.3
АО-18530 44.49 АО-18543 16.46
АО-18531 6.01 АО-18544 17.55
Αϋ-18532 24.06 АО-18545 3.53
АО-18533 37.78 АО-18546 2.75
АО-18534 8.19 АО-18547 7.01
АО-18535 10.18 АО-18548 5.02
АО-18536 16.13 АО-18549 1.61
АО-18537 15.88 Αϋ-18550 9.58
АО-18538 19.93 АО-18551 7.74
АО-18539 49.24 АО-18552 3.74
АО-18540 2.99 АО-18553 50.39
АО-18541 1.32 АО-18554 111.06 ’
Пример 3. 1п уйго анализ кйНЛ'А ТТН для индукции секреции Ί'ΝΤ-σ и ΙΓΝ-α
Для оценивания потенциала в отношении иммуностимуляции, 81НХА ТТН анализировали на индукцию секреции ΓΝΤ-σ и ΙΓΝ-α.
РВМС человека выделяли из свежесобранных лейкоцитных пленок, полученных из здоровых доноров (Некеагсй В1оой Сотропеп18, !пс., Вок1оп, ΜΑ) стандартным центрифугированием с использованием градиента плотности НсоП-Нурадие.
Свежевыделенные клетки (1х105/лунка/100 мкл) высевали в 96-луночные планшеты и культивировали в среде ΡΓΜΙ 1640 Ο1иΐаΜаx (Шуйгодеп), дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сывороткой и 1% смесью антибиотиков/фунгицидов Ппуйгодеп).
кйНЛ'А трансфицировали в РВМС с использованием реагента трансфекции ^ΟТΑΡ (Носйе Аррйей 8с1епсе). ^ΟТΑΡ сначала разбавляли в Οрΐ^-ΜΕΜ (Шуйгодеп) в течение 5 мин перед смешиванием с равным объемом ()р11-\П А1, содержащим 811<\'А. Комплексы 8^НNΑ/^ΟТΑΡ инкубировали, как указано инструкциями изготовителя, и затем добавляли к РВМС (50 мкл на лунку), которые затем культивировали в течение 24 ч. 81НХА положительного и отрицательного контроля включали во все анализы. АО-5048 использовали в качестве 81НХА положительного контроля. АР-5048 соответствует последовательности, которая поражает Аполипопротеин В человека (ЗоЩксЬек е! а1., 2004) и индуцирует секрецию как ΙΓΝ-α, так и ΓΝΓ-α в этом анализе. АО-1955, который не индуцирует секрецию ΙΓΝ-α и ΓΝΓ-α в этом анализе, использовали в качестве 81НХА отрицательного контроля. Все 81НХА использовали в конечной концентрации 133 нМ. Отношение РНК к реагенту трансфекции было равно 16,5 пмоль на мкг ^ΟТΑΡ.
- 65 020312
Цитокины детектировали и определяли количественно в культуральных супернатантах с использованием коммерчески доступного набора ЕЫЗА для ΙΕ\-σ (ВМЗ216ШЗТ) и Т\Е-« (ВМЗ223ШЗТ), оба из Вепбег МебЗук!етк (У1еппа, Аикйта). кйНЛ'А ТТН индукция цитокинов выражена в виде процента продуцированных ЕЕН-а или ТЫЕ-а относительно положительного контроля κί^ΉΆ АР-5048.
Результаты стимуляции ШЛ-а и ТМЕ-а количества κί^ΉΆ ТТН представлены на фиг. 1 (среднее из четырех повторностей лунок + ЗР) и ниже в табл. 11 (проценты в сравнении с АР-5048). Ни одна из оцениваемых 8^НNА ТТН не индуцировала значимо секрецию ТNЕ-α или ШН-а культивируемыми РВМС человека.
Таблица 11. Результаты стимуляции ΙΕ\-σ и Т\Е-« кйНЛ'А ТТН
Пять основных поражающих ТТН дцРНК (ТТН-8^НNА) выбирали на основании Ιί/0 в пМ-диапазоне в линиях печеночных клеток человека НерС2 и Нер3В и отсутствия иммуностимуляторной активности. Дуплексы без каких-либо ошибочных спариваний с большей вероятностью достигают значимого нокдауна транскрипта-мишени, чем дуплексы с ошибочными спариваниями между этим олиго и мРНК. Для возможности лучшей интерпретации данных перекрестно-видовой токсикологии и для получения наиболее широкой применимости к пациентам-людям, обычно предпочтительными являются дуплексы, которые имеют 100% идентичность в ортологических генах из крысы, собакоподобной обезьяны и человека, которые, кроме того, не имеют участоков-мишеней с известными полиморфизмами. Пять основных соединений отбирали на основании Ιί/0 в линиях печеночных клеток в пМ-диапазоне, отсутствия иммуностимуляторной активности, специфичности в отношении ТТН-транскриптов человек и отсутствия известных полиморфизмов (мутаций) в участоке мРНК, являющемся мишенью этого дуплекса. В случае
- 66 020312
ТТК, не были обнаружены состоящие из 19 оснований олигонуклеотиды (олиго) с полной идентичностью в человеке, крысе и собакоподобной обезьяне.
Суммирование этих данных представлено в табл. 12, которая также включает в себя информацию об известных мутациях ТТК в участоке, являющемся мишенью этого дуплекса и перекрестно-видовой реактивности.
Таблица 12. Суммирование данных для пяти наиболее сильнодействующих дцРНК ТТК
Номер дуплекса 1С50 (ЧРСК): нМ НерС2 1С50 (6ϋΝΑ): нМ НерС2 1ЕМа/ГМ-а Мутации, не покрываемые Перекрестно-видовая реактивность
АО-18258 0.007 0.005 Отрицательные Ни одной мутации (некодирующий участок) Собакоподобная обезьяна: 1 ошибочное спаривание в положении 14 А—*· С Крыса: нет гомологии ни в одном положении
АО-18274 0.009 0.176 Отрицательные Ьу870А8п; Уа171А1а; Пе73Уа1; Азр74Н18 Собакоподобная обезьяна: нет ошибочных спариваний Крыса: нет гомологии ни в одном положении
АО-18324 0.002 0.006 Отрицательные Ни одной мутации (некодирующий участок) Собакоподобная обезьяна: нет ошибочных спариваний Крыса: нет гомологии ни в одном положении
Αϋ-18328 0.003 0.004 Отрицательные Ни одной мутации (некодирующий участок) Собакоподобная обезьяна: нет ошибочных спариваний Крыса: 7 ошибочных спариваний
АО-18339 0.004 0.002 Отрицательные Ни одной мутации (некодирующий участок) Отсутствует
Пример 4. Ση у1уо уменьшение мРНК ТТК печени и белка ТТК плазмы Ь№01-18З24, Ь№01-18З28 и ^NΡ01-18246 в трансгенных мышах
Две ТТК-8^КNΑ, АЭ-18З24 и АО-18З28, были выбраны для оценивания ίη утуо. Эти дуплексы проявляли сильный зависимый от дозы сайленсинг ίη уПго в линиях печеночных клеток (например, НерС2) . Фиг. 2А и 2В показывают зависимости реакции от дозы в клетках НерС2 после трансфекции с использованием АБ-18З24 (фиг. 2А) или АЭ-18З28 (фиг. 2В), где эти дозы выражены в нМ на х-оси и реакции выражены в виде остающейся фракции мРНК ТТК относительно контроля, на у-оси. Было определено, что в клетках НерС2, !С50 АЭ-18З24 и АО-18З28 были равны 2 и З пМ соответственно. Сайты-мишени ТТК для обоих основных кандидатов дцРНК находятся в З'-нетранслируемом участке мРНК ТТК, в участке, где отсутствуют сообщенные мутации в литературе.
Последовательности каждой цепи этих двух основных кандидатов воспроизведены ниже из этих таблиц.
Номер дуплекса Цепь Номер олиго Положение Последовательность 5’-3' 2Е0 Ю ΝΟ:
АО-18324 3 А-32337 509 ССАииисАиСиААссААСАсЗТдТ 1001
Αϋ-18324 аз А-32338 527 исииссииАсАисАААиссйТбт 1002
Αϋ-18328 3 А-32345 518 СиААс сАА6АСиАииссАис(Тс1Т 1009
АО-18328 аз А-32346 536 АиссААиАсисииссииАсатбт 1010
Цепь: 8=смысловая; аз=антисмысловая;
Положение: положение 5'-основания на трансрипте NΜ_000371.2
Кроме того, перекрестно-реактивная дцРНК ТТК грызуна, АО-18246, была выбрана для дополнительного оценивания ίη у1уо. АО-18246 поражает последовательность, начинающуюся в положении 88 открытой рамки считывания, где имеются три мутации, сообщенные в литературе. Кривая доза-ответ для АО-18246 в клетках НерС2 показана на фиг. З. АО-18246 является существенно менее сильной, чем АЭ18З24 и АО-18З2 8; было определено, что !С50 АО-18246 равна 265 пМ.
АО-18З24, АО-18З28 и АО-18246 вводили трансгенным мышам после приготовления в Ь№01. З-5месячным трансгенным мышам Н12 9-тТТК-КО/^NО8-КО/кТТК (мышам с нокаутом транстиретина / мышам с индуцированным нокаутом синтазы оксида азота/трансгенным мышам с транстиретином человека) вводили внутривенно (IV) 200 мкл ^NΡ01-приготовленную транстиретин-специфическую 8^КNΑ (АО-18З24, АО-18З28 или АО-18246), Ь№01-приготовленную контрольную ^^КNΑ, нацеленную на ген люциферазы не-человека (АО-1955) или ЗФР через хвостовую вену при концентрациях 1,0 мг/кг, З,0 мг/кг или 6,0 мг/кг для 8^КNΑ АО-18З24 и АО-18З28, З,0 мг/кг для 8^КNΑ АО-18246 и 6,0 мг/кг для 81КNΑ АО-1955. Ь№01 является липидоидной готовой формой, состоящей из N098, холестерина и ПЭГцерамида С16.
- 67 020312
Спустя приблизительно 40 ч мышей анестезировали 200 мкл кетамина и затем обескровливали перерезанием правой хвостовой (каудальной) артерии. Выделяли цельную кровь и выделяли плазму и хранили при -80°С до анализа. Ткань печени собирали, быстро замораживали и хранили при -80°С до обработки.
Эффективность лечения оценивали посредством (ί) измерения мРНК ТТН в печени при 48 ч после введения дозы и (ίί) измерения белка ТТН в плазме перед кровопусканием и при 48 ч после введения дозы. Уровни мРНК ТТН анализировали с использованием анализов разветвленной ДНК-ОиапОСепе 2.0 (Рапоткк са! #: 080011). Вкратце, пробы печени мьши измельчали и готовили лизаты ткани. Лизисную смесь печени (смесь из 1 объема лизисной смеси, 2 объемов не содержащей нуклеаз воды и 10 мкл протеиназы-К/мл для конечной концентрации 20 мг/мл) инкубировали при 65°С в течение 35 мин. Затем в этот захватывающий планшет добавляли 20 мкл рабочего набора зондов (ТТН-зонд для гена-мишени и САРБН для эндогенного контроля) и 80 мкл клеточного лизата. Захватывающие планшеты инкубировали при 55°С±1°С (приблизительно 16-20 ч). На следующий день, захватывающие планшеты промывали 3 раза 1Х промывочным буфером (не содержащей нуклеаз воды, буферного компонента 1 и промывочного буферного компонента 2), затем сушили центрифугированием в течение 1 мин при 249 д. Добавляли 100 мкл Рабочего пре-амплификаторного реагента в захватывающий планшет, который заделывали алюминиевой фольгой и инкубировали в течение 1 ч при 55°С±1°С. После 1 ч стадию промывания повторяли, затем добавляли 100 мкл рабочего амплификаторного реагента. После 1 ч стадии промывания и сушки повторяли и добавляли 100 мкл зонда метки. Затем эти планшеты промывали 1Х промывочным буфером и сушили и затем добавляли к этим захватывающим планшетам 100 мкл субстрата. Захватывающие планшеты считывали с использованием люминометра 8ресГгаМах (Мо1еси1аг Беуюек, 8иппууа1е, СА) с последующей инкубацией в течение 5-15 мин. Данные Ь^NΛ анализировали вычитанием среднего фона из каждой из трех повторностей, усреднением величин полученных трех повторностей САРБН (контрольного зонда) и ТТН (экспериментального зонда) и затем вычислением отношения: (фон экспериментального зонда)/фон контрольного зонда).
Уровни ТТН плазмы анализировали с использованием коммерчески доступного набора АккауМах Нитап РгеаГЬитт ЕБГ8А Кй (АккауРго, 8ΐ. СНаг1ек, М0, Са!а1од # ЕР3010-1) в соответствии с указаниями изготовителя. Вкратце, плазму мыши разбавляли 1:10000 в 1Х смеси разбавителей и добавляли в предварительно покрытые планшеты вместе со стандартами набора и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с последующими 5Х промываниями промывочным буфером набора. Пятьдесят микролитров биотинилированного антитела преальбумина добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, с последующими 5Х промываниями промывочным буфером. Пятьдесят микролитров конъюгата стрептавидин-пероксидаза добавляли в каждую лунку и планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим промыванием, описанным выше. Эту реакцию проявляли добавлением 50 мкг на лунку хромогенного субстрата и инкубированием в течение 10 мин при комнатной температуре с остановкой реакции добавлением 50 мкл на лунку стопраствора. Поглощение при 450 нм считывали не микропланшет-ридере Уегкатах (Мо1еси1аг Беу1сек, 8иппууа1е, СА) и данные анализировали с использованием пакета программного обеспечения 8оПтах 4.6 (Мо1еси1аг Беуюек).
Было обнаружено, что Е№01-18324 и Е№01-1832 8 уменьшают уровни мРНК ТТН печени (фиг. 4А) и белка ТТН плазмы (фиг. 4В) зависимым от дозы образом при болюсном ГУ-введении. Было определено, что ЕБ50 мРНК Е№01-18328 равна ~1 мг/кг, тогда как ЕБ50 Е№01-18324 равна ~2 мг/кг. Действия Е№01-18324 и Е№01-18328 были специфическими, так как контроль, Е№01-1955 при 6 мг/кг, не влиял значимо на уровни мРНК ТТН печени, в сравнении с группой ЗФР. Е№01-18324 и Е№01-18328 уменьшали уровни белка ТТН плазмы относительно группы ЗФР, с эффективностями, которые были сходными с эффективностями на уровнях мРНК ТТН. При 3 мг/кг Е№01-18246 уменьшал уровни мРНК ТТН печени в меньшей степени, чем 3 мг/кг Е№01-18324 или ^NР01-18328.
Эти результаты демонстрируют, что Е№01-18324 и ^NР01-18328. вводимые ГУ-болюсом, существенно уменьшают мРНК ТТН человека, экспрессируемую печенью трансгенной мыши, что приводит к уменьшению белка ТТН человека в кровотоке.
Пример 5. Гп у1уо уменьшение мРНК ТТН дикого типа в печени примата (не человека) посредством 8^1.0-18324 и 8NΑ^Р-18328
Для оценивания эффективности ТТН-к^КNΑ АО-18324 и АО-18328 в приматах (не человеке) на уровнях мРНК ТТН печени, эти ЦЕХА готовили в 8NЛ^Р и вводили 15-минутной ГУ-инфузией. Обезьянам Супото1дик (Масаса Гаксюи1апк) (2-5 кг, 3 животных на группу) вводили 15-минутные ГУ-инфузии 8NΑ^Р-18324 (0,3, 1,0 или 3,0 мг/кг), 8NΑ^Р-18328 (0,3, 1 или 3 мг/кг) или 8NΑ^Р-1955 (3 мг/кг, с отрицательным контролем, кгНNΑ АО-1955, мишенью которой является ген люциферазы (немлекопитающего). При 48 ч после введения доз обезьян анестезировали натрий-пентобарбиталом и проводили кровоизвлечение. Ткань печени для определения мРНК ТТН собирали, быстро замораживали и хранили при -80°С до обработки.
Уровни мРНК ТТН в печени анализировали при помощи специально разработанного анализа раз
- 68 020312 ветвленной ДНК, использующего технологию РиапйСепе1,0. Вкратце, пробы печени обезьяны измельчали и готовили лизаты ткани. Лизисную смесь печени (смесь из 1 объема лизисной смеси, 2 объемов не содержащей нуклеаз воды и 10 мкл протеиназы-К/мл для конечной концентрации 20 мг/мл) инкубировали при 65°С в течение 35 мин. Затем в этот захватывающий планшет добавляли 20 мкл Рабочего Набора зондов (ΤΤΚ,-зонд для гена-мишени и ΟΑΓΩΗ для эндогенного контроля) и 80 мкл клеточного лизата. Захватывающие планшеты инкубировали при 55°С±1°С (приблизительно 16-20 ч). На следующий день захватывающие планшеты промывали 3 раза 1х промывочным буфером (не содержащей нуклеаз воды, буферного компонента 1 и промывочного буферного компонента 2), затем сушили центрифугированием в течение 1 мин при 249 д. Добавляли 100 мкл рабочего пре-амплификаторного реагента в захватывающий планшет, который заделывали алюминиевой фольгой и инкубировали в течение 1 ч при 55°С±1°С. После 1 ч стадию промывания повторяли и затем добавляли 100 мкл рабочего амплификаторного реагента. После 1 ч стадии промывания и сушки повторяли и добавляли 100 мкл зонда метки. Захватывающие планшеты инкубировали при 55°С±1°С в течение 1 ч. Затем эти планшеты промывали 1Х промывочным буфером и сушили и затем добавляли к этим захватывающим планшетам 100 мкл субстрата.
Захватывающие планшеты считывали с использованием люминометра 8рес1гаМах (Мо1еси1аг ЭеУ1сек, 8иппууа1е, СА) с последующей инкубацией в течение 5-15 мин. Данные ΕΩΝΑ анализировали (ί) вычитанием среднего фона из каждой из трех повторностей, (ίί) усреднением величин полученных трех повторностей ΟΑΓΌΗ (контрольного зонда) и ΤΤΡ (экспериментального зонда), и затем (ш) вычислением отношения: (фон экспериментального зонда)/фон контрольного зонда).
Эти результаты показаны на фиг. 5. 8ΝΑΡΓ-18324 и 8ΝΑΡΓ-18328 уменьшали уровни мРНК ΤΤΡ в печени зависимым от дозы образом, в сравнении с отрицательным контролем 8ЫАЬР-1955. Было определено, что ΕΌ50 8ЫАЬР-18328 и 8ЫАЬР-18324 были равны ~0,3 и ~1 мг/кг соответственно.
Эти результаты демонстрируют, что 8ЫАЬР-18324 и 8ЫАЬР-18328 являются эффективными в супрессии мРНК ΤΤΡ дикого типа в печени примата (не человека) при введении 1У-инфузией.
Пример 6. 1п у1уо уменьшение мутантной мРНК и мутантного белка (ν^^^^ΤΤΕ посредством 8ЫАЬР-18328 в трансгенной мыши
Для оценивания эффективности ΤΤΗ-κίΚΝΑ АО-18328 на мутантной мРНК (У30М) ΤΤΡ в печени и мутантном белке (У30М) ΤΤΡ в сыворотке, АО-18328 готовили в 8ЫАЬР и вводили посредством IVболюса в V30Μ ΙιΤΤΡ-трансгенную мышь. 8-12-недельным V30Μ ΗΤΤΡ-трансгенным мышам (5 животных на группу) внутривенно (IV) вводили 200 мкл 8ЫАЬР-18328 (0,03, 0,3 или 3 мг/кг), 8ЫАЬР-1955 (3 мг/кг с отрицательным контролем кЖНА АО-1955, мишенью которой является ген люциферазы (немлекопитающего)), или ЗФР. Используемые мыши были штаммом Мик тикси1ик Η129-11ΤΤΡ КО из Института молекулярной и клеточной биологии, Ройо, РойидаТ Вкратце, трансгенных мышей ΙιΤΤΡ Η129 скрещивали с мышами Н129 эндогенный ΤΤΡ КО (нуль-мышами для генерирования Η129-11ΤΤΡ трансгенных мышей в генетическом фоне нуль-мышей ΤΤΡ (Маеба, 8., (2003), Ике о£ депе11са11у айегеб тюе 1о кШбу [Не го1е о£ кегит ату1о1б Р сотропеп! т ату1о1б берокйюп. Ату1о1б 8ирр1. 1, 17-20).
При 48 ч после инъекции животным во всех пяти группах обработки вводили летальную дозу кетамина/ксилазина. Пробы сыворотки собирали и хранили при -80°С до анализа. Ткань печени собирали, быстро замораживали и хранили при -80°С до обработки.
Для количественного определения мРНК ΤΤΡ замороженную ткань печени измельчали в порошок и готовили лизаты. Уровни мРНК ΤΤΡ относительно уровней мРНК СΑР^Η определяли в этих лизатах с использованием анализа разветвленных ДНК (ОнапйСепе РеадеШ 8ук1ет, Рапотюк, Ргетой, СА) . Вкратце, анализ ОнапйСепе (Сепокресйа) использовали для количественного определения уровней мРНК в лизатах проб ткани в соответствии с инструкциями изготовителя. Средний уровень мРНК ΤΤΡ нормализовали относительно среднего уровня мРНК СΑР^Η для каждой пробы. Средние значения нормализованных величин групп затем дополнительно нормализовали относительно средней величины для обработанной ЗФР группы для получения относительного уровня экспрессии мРНК ΤΤΡ.
Для количественного определения белка ΤΤΚ. сыворотку анализировали с использованием набора АккауРго (8ΐ. СНаг1ек, МО) Аккаутах РгеА1Ьитш ЕЫ8А в соответствии с протоколом изготовителя.
Эти результаты показаны на фиг. 6А и 6В для мРНК печени и белка сыворотки соответственно. Обработанные 8НАЬР-18328 V30Μ ΙιΤΤΡ-трансгенные мыши имели зависимое от дозы и значимое уменьшение уровней мРНК ΤΤΡ печени относительно группы ЗФР-контроля, достигая максимального уменьшения 97% (р<0,001) при 3 мг/кг 8НАЬР-18328, и 50% уменьшения (ЕО50) при ~0,15 мг/кг 8НАЬР18328. Белок ΤΤΡ сыворотки также подавлялся зависимым от дозы образом, с максимальным уменьшением белка ΤΤΚ. сыворотки 99% (р<0,01) (относительно уровней перед введением дозы) при 3 мг/кг 8НАЬР-18328, что согласовалось с уменьшением уровней мРНК ΤΤΡ. 8НАЬР-1955 при 3 мг/кг не имел статистически значимого действия ни на уровни мРНК ΤΤΡ, ни на уровни белка, в сравнении с ЗФР.
Эти результаты демонстрируют, что 8НАЬР-18328, при введении IV, является активным в супрессии мутантной мРНК V30Μ ΤΤΡ в печени трансгенной мыши, что приводит к уменьшению мутантного белка V30Μ ΤΤΡ в кровотоке.
- 69 020312
Пример 7. Продолжительность супрессии мРНК и белка ТТВ посредством 8ΝΛΕΒ-18328 в трансгенной мыши
Для оценивания продолжительности супрессии мРНК и белка ТТВ посредством 8NΛ^Р-18328. АО18328 готовили в 8ХАЕР и вводили в виде 1У-болюса У30М йТТВ-трансгенным мышам. В различных временных точках после введения дозы определяли количественно уровни мРНК ТТВ в печени и уровни белка ТТВ сыворотки. 8-12-недельным У30М ЬТТВ-трансгенным мышам (4 животных на группу) вводили внутривенно (1У) 200 мкл 8ХАЕР-18328 (1 мг/кг) или 8ХАЕР-1955 (1 мг/кг, с отрицательным контролем втВЫА АО-1955, мишенью которой является ген люциферазы (не млекопитающего). Используемые мыши были штаммом Мив тивси1ив Н129-ЙТТВ КО из Института молекулярной и клеточной биологии, Ройо, Ройида1. Вкратце, трансгенных мышей кТТВ Н129 скрещивали с мышами Н129 эндогенный ТТВ КО (нуль-мышами для генерирования Н129-кТТВ трансгенных мышей в генетическом фоне нуль-мышей ТТВ (Маека 8., (2003), Иве о! деие!юа11у а1!егек плсе !о в!ику Ше го1е о! вегит ату1о1к Р сотроиеи! 1и ату1о1к керовйюи. Ату1о1к 8ирр1. 1, 17-20) . В дни 3, 8, 15 или 22 после введения дозы, животным обеиз групп давали леальную дозу кетамина/ксилазина. Пробы сыворотки собирали и хранили при -80°С до анализа. Ткань печени собирали, быстро замораживали и хранили при -80°С до обработки.
Для количественного определения мРНК ТТВ, замороженную ткань печени измельчали в порошок и готовили лизаты. Уровни мРНК ТТВ относительно уровней мРНК САРОН определяли в этих лизатах с использованием анализа разветвленных ДНК (РиаикСеие Веадеи! 8ув!ет, Раиоткв, Ргетои!, СА) . Вкратце, анализ РиаикСеие (Сеиовреска) использовали для количественного определения уровней мРНК в лизатах проб ткани в соответствии с инструкциями изготовителя. Средний уровень мРНК ТТВ нормализовали относительно среднего уровня мРНК САРОН для каждой пробы. Средние значения нормализованных величин групп затем дополнительно нормализовали относительно средней величины для обработанной ЗФР группы для получения относительного уровня экспрессии мРНК ТТВ.
Для количественного определения белка ТТВ сыворотку анализировали с использованием набора АввауРго (8!. Скаг1ев, МО) Авваутах РгеА1китт ЕЫ8А, в соответствии с протоколом изготовителя.
Эти результаты показаны на фиг. 7А и 7В для мРНК печени и белка сыворотки соответственно. Единственное 1У-болюсное введение 8ХАЕР-18328 в кТТВ У30М-трансгенную мышь приводило к продолжительному ингибированию уровней мРНК ТТВ в печени и уровней белка ТТВ в сыворотке. В сравнении с контрольной группой (1 мг/мл 8NΛ^Р-1955). однократное 1У-введение 8ХАЕР-18328 при 1 мг/кг значимо уменьшало относительные уровни мРНК ТТВ в дни 3, 8, 15 и 22 после введения дозы на 96% (р<0,001), 90% (р<0,001), 82% (р<0,001) и 73% (р<0,001) соответственно и не возвращало к уровням фона в конце этого исследования (день 22 после введения дозы). Уровни белка также уменьшались с максимальным уменьшением ТТВ сыворотки 97% (р<0,001) (относительно 8ХАЕР-1955) в день 3 после введения дозы. В дни 8, 15 и 22 после введения дозы уровни белка ТТВ были подавлены на 72% (р<0,05), 32% (р<0,05) и 40% (р<0,001), соответственно, относительно 8NΑ^Р-1955.
Эти результаты демонстрируют, что единственное 1У-введение 8ХАЕР-18328 производит продолжительную супрессию мРНК печени-мишени и уровней белка сыворотки в У30М кТТВ-трансгенной мыши, со значимыми уменьшениями как мРНК ТТВ печени, так и белка ТТВ сыворотки при 22 днях после введения дозы.
Пример 8. Продолжительность супрессии белка ТТВ сыворотки посредством 8ХАЕР-18328 в примате (не человеке)
Для оценивания продолжительности супрессии белка ТТВ сыворотки посредством 8NΛ^Р-18328. АО-18328 готовили в 8ХАЕР и вводили 1У-инфузией приматам (не человеку). В различных временных точках после введения дозы определяли количественно уровни белка.
Обезьянам Суиото1див (Масаса !авсюи1апв) (и= 5 животных на группу для групп 8ХАЕР-18328 и и=3 животных на группу для 8ХАЕР-1955- и ЗФР-групп) вводили 15-минутную инфузию 8ХАЕР-18328 (0,3, 1 или 3 мг/кг), 8ХАЕР-1955 (3 мг/кг) с отрицательным контролем вЖЫА АО-1955, который поражает ген люциферазы не-человека) или ЗФР. В дни 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10 и 14 фазы введения доз собирали пробы сыворотки и хранили при -80°С до анализа.
Для анализа уровней белка ТТВ в пробах сыворотки использовали Вестерн-блот-анализ. Пробы сыворотки из каждой группы объединяли и разбавляли 1:1 буфером Леммли для проб (β-меркаптоэтанол добавляли в разведении 1:20). Эти пробы нагревали при 95°С в течение 10 мин. 12,5 мкл каждой пробы наносили в каждую дорожку 10-20% преп-геля Ск!екои (Вютак, Негси1ев, СА) и разделяли электрофорезом на ДСН-ПААГ при 120 В в течение 1,5 ч, затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану с использованием полусухой системы при 15 В в течение 1 ч. Эту мембрану блокировали в течение ночи при 4°С в блокирующем буфере ЫСОВ (Ыисо1и, ΝΞ), разведенном 1:1 1х ЗФР. Этот блот зондировали сначала первичными антителами (козьими анти-ТТВ-антителами из 8аи!а ίτιιζ (8аи!а Οπιζ, СА) при разведении 1: 1000 в блокирующем буфере ЫСОВ/ЗФР на качалке в течение 1 ч при комнатной температуре. Блоты промывали 4х ЗФР + 0,2% Твин 20 (10 мин на одну промывку). Добавляли флуоресцентные меченые вторичные антитела (антитела против козьих антител 680 нМ из Шуйтодеи (Саг1вкак, СА) при разведении 1:10000 в блокирующем буфере ЫСОВ/ЗФР и этот блот инкубировали в течение 1 ч при комнат
- 70 020312 ной температуре. После инкубирования, блоты промывали 4х ЗФР + 0,2% Твин 20, с последующей одной промывкой 1х ЗФР. Для детектирования белковых полос использовали систему визуализации Обуδδеу ИтГгагеб ЫСОН. Мономер ТТН мигрирует при 15 кДа.
Эти результаты показаны на фиг. 8. Уровни белка ТТН сыворотки обнаруживали зависимое от дозы уменьшение с 1 или 3 мг/кг δΝΑΕΡ-18328, в сравнении с уровнями перед введением дозы (в день 0). Продолжительность супрессии после однократного Ιν-введения δΝΑΕΡ-18328 равна по меньшей мере 14 дням после обработки 1 или 3 мг/кг δΝΑΕΡ-18328.
Эти результаты демонстрируют, что однократное Ιν-введение δΝΑΕΡ-18328 производит продолжительную супрессию белка ТТН в кровотоке в примате (не человеке) (Масаса к^асик-иЮ, со значимым уменьшением белка ТТН при 14 днях после введения дозы.
Пример 9. Ιη νί\Ό уменьшение мутантного ^30М) ТТН в периферических тканях посредством δΝΑΕΡ-18328 в трансгенной мыши
Для оценивания эффективности δΝΑΕΡ-18328 в уменьшении ТТН в периферических тканях мышей с нокаутом 11ТТН V30М/ΗδΡ-1 оценивали при помощи иммуногистохимического окрашивания на ТТН.
Двухмесячным мышам с нокаутом 11ТТН V30М/ΗδΡ-1 (Маеба δ., (2003), ^е оГ депексаПу аИегеб Ш1се Ю δΐибу 1Не го1е оГ δе^ит ату1о1б Ρ сотропеп! т ату1о1б берοδ^ΐ^οη. Αту1ο^б 8ирр1. 1, 17-20) вводили Ιν-болюс 3 мг/кг δΝΑΕΡ-18328 (12 животных), З мг/кг δΝΑΕΡ-1955 (с отрицательным контролем δίΡΝΑ ΑΌ-1955, мишенью которого является ген люциферазы (не млекопитающего), 4 животных) или ЗФР (4 животных) один раз каждые две недели в виде четырех доз в целом в дни 0, 14, 28 и 42. Уровни мРНК ТТН печени и ТТН-иммунореактивность во множественных периферических тканях оценивали при 8 неделях после введения первой дозы в день 56.
Мышей анестезировали 1 мг/кг медетомидина и вводили летальную дозу кетамина. Собирали представляющие интерес ткани и органы. Для иммуногистохимии пищевод (Е), желудок (δ), кишечник (двенадцатиперстную кишку (Ι1) и ободочную кишку (Ι4)), нерв (Ν) и дорсальные ганглии блуждающего нерва (Ό) фиксировали в нейтральном забуференном формалине и заливали в парафин. Для детектирования ТТН, кроличье первичное антитело против ТТН человека (1:1000, ΌΑΚΟ, Эептагк) и анти-кроличье биотин-конъюгированное вторичное антитело (1:20 δ^дта, υδΑ) исследовали мечением экстравидином для окрашивания белка ТТН. Эту реакцию проявляли 3-амино-9-этилкарбаксолом, АЕС ф1дта, υδΑ) . Полуколичественный анализ иммуногистохимических предметных стекол выполняли с использованием программы δс^οη 1таде циап1, которая измеряет площадь, занимаемую цветом субстратной реакции, и нормализует эту величину относительно общей площади изображения. Средние величины % занимаемой площади изображены с соответствующим стандартным отклонением. Каждую ткань животного оценивали в четырех различных зонах. Присутствие ТТН человека в парасимпатических ганглиях желудка и кишечника исследовали двойным иммунофлуоресцентным окрашиванием кроличьими антителами против ТТН человека (1:1000, ΌΑΚΟ, ЭепМагк) и мышиным анти-РСР9.5-антителом (1:40, δе^οΐес, υδΑ) в качестве первичных антител; вторичными антителами были, соответственно: антикроличье антитело Α1еxа Р1иог 488 (Мо1еси1аг ΓΐΌ^δ, υΚ) и козье антимышиное антитело Α1еxа Р1иог 568 (Мо1еси1аг ΓΐΌ^δ, υΚ). Предметные стекла готовили с уесБЮпе1б (УесЮг) и визуализировали в микроскопе Ζе^δδ Се11 О^егуег δуδΐет (Саг1 Ζе^δδ. Сегтапу), оборудованном фильтрами для ПТС и родамина.
Эти результаты построены в виде диаграмм на фиг. 9. В отличие от обработанных ЗФР и δΝΑΕΡ1955 животных, обработанные δΝΑΕΡ-18328 животные имели значимое уменьшение ТТНиммунореактивности во всех исследованных тканях (пищеводе (Е) , желудке (δ), кишечнике (двенадцатиперстной кишке (Ι1) и ободочной кишке (Ι4)), нерве (Ν) и дорсальных ганглиях блуждающего нерва (О).
Эти результаты демонстрируют, что введение δΝΑΕΡ-18328 мышам с нокаутом 11ТТН V30М/ΗδΡ-1 вызывает значимое уменьшение белка ТТН в периферических тканях и органах, включающих в себя пищевод, желудок, кишечник (двенадцатиперстную кишку и ободочную кишку), нерв и дорсальный ганглий блуждающего нерва.
Пример 10. Ш νί\Ό уменьшение мРНК ТТН дикого типа в печени примата (не человека) посредством ΧΊΌ-δΝΑΕΡ-18328
Для оценивания эффективности новой состоящей из липидных наночастиц готовой формы ХТСδΝΑΕΡ для доставки δί^ΝΑ в примата (не человека) δί^ΝΑ ТТН ΑΌ-18328 готовили в ХТС-δΝΑΕΡ (XТС-δNΑ^Ρ-18328) и вводили 15-минутной Ιν-инфузией и определяли количественно мРНК ТТН печени. Обезьянам Супото1дш (Масаса П«с1си1аШ) вводили 15-минутными Ιν-инфузиями ХТС-δΝΑΕΡ18328 (0,03, 0,1, 0,3 или 1 мг/кг) или XТС-δNΑ^Ρ-1955 (1 мг/кг, с отрицательным контролем δίΡΝΑ ΑΌ1955, мишенью которой является ген люциферазы (не млекопитающего). При 48 ч после введения доз обезьян анестезировали натрий-пентобарбиталом и выполняли кровоизвлечение. Ткань печени для определения мРНК собирали, быстро замораживали и хранили при -80°С до обработки. Способы, использованные для количественного определения мРНК ТТН в ткани печени, были сходными со способами, описанными в примере 5 выше.
Эти результаты показаны на фиг. 10. XТС-δNΑ^Ρ-18328 уменьшал уровни мРНК ТТН в печени за
- 71 020312 висимым от дозы образом, в сравнении с отрицательным контролем ΧΤ^8ΝΑΕΡ-1955. Было определено, что ЕС50 мРНК была равна ~0,1 мг/кг ΧΤί.’-8ΝΑΕ·Ρ-18328.
Эти результаты демонстрируют, что ΧΤί.'-8ΝΑΕ·Ρ-18328 является эффективным в супрессии мРНК ТТК дикого типа в печени примата (не человека) при введении 1У-инфузией.
Пример 11. Ιη νίνο уменьшение мРНК ТТК дикого типа в печени примата (не человека) посредством ΕΝΡ09-18328 и ΕΝΡ11-18328
Для оценивания эффективности двух новых состоящих из липидных наночастиц готовых форм, Ь№0 9 и ΕΝΡ11, для доставки βίΚΝΑ в примата не человека, ТТК βίΚΝΑ АО-18328 готовили в ΕΝΡ09 (ΕΝΡ09-18328) или Ь№11 (ΕΝΡ11-18328) и вводили 15-минутной 1У-инфузией и анализировали уровни мРНК ТТК печени и уровни белка ТТК в сыворотке. Обезьянам Супото1див топкеув (Масаса ГавскШапв) вводили 15-минутные 1У-инфузии ΕΝΡ09-18328 (0,03, 0,1 или 0,3 мг/кг), ΕΝΡ11-18328 (0,03, 0,1 или 0,3 мг/кг) или ЗФР. Пробы биопсии печени собирали при 48 ч после введения доз, быстро замораживали и хранили при -80°С до обработки. Сыворотку собирали перед введением доз (перед кровопусканием) и в дни 1, 2, 4, 7, 14, 21 и 28 после введения доз и хранили при -80°С до обработки. Способы, использованные для количественного определения мРНК ТТК в ткани печени и оценивания белка ТТК в сыворотке, были сходными со способами, описанными в примерах 5 и 8 выше.
Эти результаты показаны на фиг. 11А для мРНК и на фиг. 11В для белка. Обработанные Ь№0918328 и ΕΝΡ11-18328 животные обнаруживали зависимое от дозы уменьшение уровней мРНК ТТК в печени с достижением максимального уменьшения при 0,3 мг/кг ~85% (ΕΝΡ09-18328) и ~90% (ΕΝΡ1118328) мРНК относительно ЗФР-контроля. Было определено, что ЕС50 мРНК была равна ~0,02 мг/кг как для ΕΝΡ09-18328, так и для ΕΝΡ11-18328. В день 7 после введения доз пробы сыворотки обнаруживали зависимое от дозы уменьшение белка ТТК для 0,1 и 0,3 мг/кг ΕΝΡ09-18328 и ΕΝΡ11-18328, в сравнении с уровнями ЗФР-контроля. Фиг. 11С показывает уменьшение уровней белка ТТК дозой 0,3 мг/кг Ь№0918328, которое удерживалось на протяжении по меньшей мере 28 дней после введения доз, в сравнении с группой ЗФР-контроля и в сравнении с пробами перед кровопусканием.
Эти результаты демонстрируют, что ΕΝΡ09-18328 и ΕΝΡ11-18328 являются эффективными в супрессии мРНК ТТК в печени примата не человека и белка ТТК дикого типа в кровотоке при введении 1Уинфузией. Кроме того, супрессия с использованием ΕΝ09-18328 является продолжительной, сохраняющейся в течение по меньшей мере 28 дней после 1У-инфузии.
Пример 12. Синтез черепичных (Шеб) последовательностей ТТК
Конструировали набор ТТК-дуплексов (черепичных дуплексов), которые поражали ген ТТК вблизи участка-мишени АО-18328, который поражает ген ТТК человека начиная с нуклеотида 628 ΝΜ_000371.3.
В приведенных ниже примерах нумерация, представляющая положение 5'-основания вгКЫА на транскрипте, основана на ΝΜ_000371.3 (ЕЮ. 12; 8ЕО ΙΟ ΝΟ:1331). В показанных выше примерах, эта нумерация для 51КЫА, поражающей 51КЫА человека, была основана на ΝΜ_000371.2 (фиг. 13А). ΝΜ_000371.3 удлиняет последовательность 5'ИТК на 110 оснований в сравнении с ΝΜ_000371.2, как показано на фиг. 14. Таким образом, в качестве примера, исходным положением АО-18328 является 628 на ΝΜ_000371.3 и 518 на ΝΜ_000371.2 (фиг. 14). Черепичные последовательности ТТК синтезировали на синтезаторе ЫегЫабе 192 в 1 мкмоль-масштабе. Для всех последовательностей в этом списке применяли химию 'епбоНдЫ'. подробно описанную ниже.
Все пиримидины (цитозин и уридин) в смысловой цепи содержали 2'-О-Метил-основания (2'-ΟМетил С и 2'Ю-Метил И).
В антисмысловой цепи, пиримидины, смежные (непрерываемые) (в направлении 5') с рибо-Ануклеозидом, заменяли их соответствующими 2Ю-метилнуклеозидами;
Вводили удлинение из двух оснований бТбТ на 3'-конце как смысловых, так и антисмысловых последовательностей.
Этот файл последовательностей превращали в текстовой файл, чтобы сделать его совместимым с вводом в программное обеспечение (программу) синтеза ЫегЫабе 192.
Синтез, расщепление и удаление защитных групп
Этот синтез последовательностей ТТК использовал синтез олигонуклеотидов на твердой подложке при помощи фосфороамидитной химии. Этот синтез последовательностей выполняли в 1 мкм-масштабе в 96-луночных планшетах. Амидитные растворы готовили в концентрации 0,1 М и в качестве активатора использовали этилтиотетразол (0,6 М в ацетонитриле).
Синтезированные последовательности отщепляли и освобождали от защитных групп в 96луночных планшетах с использованием метиламина в первой стадии и фторидного реагента во второй стадии. Эти неочищенные последовательности осаждали с использованием смеси ацетон:этанол (80:20) и осадок ресуспендировали в 0,1 М натрий-ацетатном буфере. Пробы из каждой последовательности анализировали при помощи ЬС-Μδ для подтверждения идентичности, ИУ для количественного определения и с использованием выбранного набора проб при помощи ΙΕΧ-хроматографии для определения чистоты.
- 72 020312
Очистка и обессоливание
Черепичные последовательности ТТН очищали на системе очистки АКТА ехр1огег с использованием колонки Зоигсе 15ф. Во время очистки температуру колонки поддерживали при 65°С. Инжекцию и сбор проб выполняли в 96-луночных планшетах (с глубиной лунок 1,8 мл). В этом элюенте собирали единственный пик, соответствующий полноразмерной последовательности.
Очищенные последовательности обессоливали на колонке ЗерНабех С25 с использованием очищающего агента АКТА. Обессоленные последовательности ТТН анализировали на концентрацию (УФизмерением при А260) и чистоту (ионообменной ВЖХ) . Затем эти одиночные цепи представляли для отжига.
Одиночные цепи и дуплексы ТТН:
Подробный список черепичных дуплексов и соответствующих одиночных цепей ТТН (смысловых и антисмысловых) показан в таблице ниже (табл. 13).
Таблица 13. Черепичные дуплексы и соответствующие одиночные цепи ТТН
Номер дуплекса Положение Номер олиго Цепь Последовательность (5’-3’) δΕΟΙΟΝΟ:
АЕМ8323 618 Α-32335 5 бббАииисАибиААссААббТбТ 1332
Α-32336 Α5 сииббииАсАибААдисссс1тбт 1333
АЦ-18324 619 Α-32337 5 ббАииисАибиААссААбАбТбТ 1334
Α-32338 Α5 исииббииАсАибААдиссбТбт 1335
Αϋ-23000 620 Α-42927 5 бАииисАибиААссААбАббТбТ 1336
Α-42928 Α5 сисииббииАсдибАААисбтбт 1337
Αϋ-23001 621 Α-42929 5 АииисАибиААссААбАбибТбТ 1338
Α-42930 Α5 АсисиивбииАсАибАААибтбт 1339
Αϋ-23002 622 Α-42931 5 и иисАи 6 и ААссААб Аб и Α6Τ 6Т 1340
Α-42932 Α5 иАСисииббииАсА1)бАААбТбТ 1341
Αϋ-23003 623 Α-42933 5 иисАибиААссААбАбиАибТбТ 1342
Α-42934 Α5 АиАСисииббииАсА1)бААбТбТ 1343
Αϋ-18325 624 Α-32339 5 исАибиААссААбАбиАиибТбТ 1344
Α-32340 Α5 ААиАСисииббииАсА11бАбТбТ 1345
Αϋ-23004 625 Α-42935 5 сАибиААссААбАбиАиисбТбТ 1346
Α-42936 Α5 вААидсисиибвииАсАиббтбт 1347
Αϋ-18326 626 Α-32341 5 АибиААссААбАбиАииссбТбТ 1348
Α-32342 Α5 ббААиАСисииббииАсАибТбТ 1349
Αϋ-18327 627 Α-32343 5 ибиААссААбАбиАииссАбТбТ 1350
Α-32344 Α5 1)ббААиАСисииббииАсАбТбТ 1351
ΑΕ>-23005 628 Α-42937 8 иААссААбАбиАииссАиибТбТ 1352
Α-42938 Α8 ААиббААиАСисииббииАбТбТ 1353
Αϋ-23006 629 Α-42939 5 ААссААбАби Аи иссАи и и 6Т6Т 1354
Α-42940 Α$ АААиббААидсисииббиибтбт 1355
Αϋ-23007 631 Α-42941 5 АссААбАбиАииссАиииибТбТ 1356
Α-42942 Α5 ААААиббААиАсисииббибТбт 1357
Αϋ-23008 632 Α-42943 8 ссААбАбиАииссАииииибТбТ 1358
- 73 020312
Номер дуплекса Положение Номер олиго Цепь Последовательность (5'-3’) 5ΕΟΙΟΝΟ:
А-42944 А5 ААААА1)6СААиАСиС1)ибСс1ТйТ 1359
Αϋ-23009 633 А-42945 5 сААбАбиАииссАиииииАйТйТ 1360
А-42946 А5 иАААААиСОААиАСисиибсГГсГГ 1361
ΑΓ>-23010 634 А-42947 5 АА6АС и Аи и ссАи и и и и Асс1Тс1Т 1362
А-42948 А5 СиАААААиСбААиАСисиийТйТ 1363
Αϋ-23011 635 А-42949 5 АбАб и Аи и ссАи ииииАсисПДТ 1364
А-42950 А5 АбиАААААиССААиАСисийТйТ 1365
Αϋ-23012 636 А-42951 5 бАбиАииссАиииииАсиАсГГсГТ 1366
А-42952 А5 иАбиАААААиббААиАС1)Сс1Тс1Т 1367
АО-23013 637 А-42953 5 АбиАииссАиииииАсиААсГГсГГ 1368
А-42954 А5 ииА6иААААА1)66ААиАСис1Тс1Т 1369
Αϋ-23014 638 А-42955 5 биАииссАиииииАсиАААсГГсГГ 1370
А-42956 А5 и 11 и Аби ААААА11ббААиАСс1Тс1Т 1371
Αϋ-23015 639 А-42957 5 иАииссАиииииАсиААДбсГГсГГ 1372
А-42958 А8 СиииА6иАААААиб6ААиАс1Тс1Т 1373
Αϋ-23016 640 А-42959 5 АииссАиииииАсиАААСссГГсГГ 1374
А-42960 А5 ССиииА6иААААА1)6САА1)с1ТйТ 1375
Αϋ-23017 641 А-42961 5 ииссАиииииАсиААА6сАс1Тс1Т 1376
А-42962 А8 ибСиииАСиАААААибСААйТйТ 1377
ΑΙ3-23018 642 А-42963 5 иссАиииииАсиААА6сАбС1Тс1Т 1378
А-42964 А5 СибСиииАСиАААААиССАс1ТсГГ 1379
Αϋ-23019 643 А-42965 5 ссАиииииАсиАААбсАбис1Тс1Т 1380
А-42966 А5 АСиСС1111иА6иАААААибСс1Тс1Т 1381
Αϋ-23020 644 А-42967 5 сАи и и и и Аси АААбсАб и б с1Тс1Т 1382
А-42968 А5 сАСибСиииАСиААААДиСйТйТ 1383
Αϋ-23021 645 А-42969 5 АиииииАсиАААбсАбибийТсГГ 1384
А-42970 А5 АсАСибСиииАбиАААААийТйТ 1385
Αϋ-23022 646 А-42971 5 иииииАсиАААбсАбибиисГГсГГ 1386
А-42972 А5 ААсАСибСиииА6иАААААс1Тс1Т 1387
АЭ-23023 647 А-42973 5 ииииАсиАААбсАбибииис1Тс1Т 1388
А-42974 А5 АААсАСибСиииАСиААААйТс1Т 1389
Αϋ-23024 648 А-42975 5 иииАсиААА6сАбибиииис1ТйТ 1390
А-42976 А8 ААААсАСибСиииАбиАААйТйТ 1391
Αϋ-23025 649 А-42977 8 ииАсиАААбсАбибиииисйТсГГ 1392
А-42978 А8 0ААААсАСибСиииА6иААйТс1Т 1393
Αϋ-23026 650 А-42979 8 иАсиААА6сА6ибиииисАс1Тс1Т 1394
А-42980 А8 иСААААсАСиССиииА6иАс1Тс1Т 1395
Αϋ-23027 651 А-42981 8 Аси А ААС сА6 и 6 и и и и сАссГГсГГ 1396
А-42982 А8 с исААААсАсивси ии ас ийтйт 1397
Αϋ-23028 652 А-42983 8 сиАААбсАбибиииисАсссГГсГГ 1398
А-42984 А8 СбиСААААсАСиССиииАбйТсП· 1399
Αϋ-18330 653 А-32349 8 иАААбсАбибиииисАссисГГсГГ 1400
А-32350 А8 АббибААААсАСибСиииАсПДТ 1401
Αϋ-23029 654 А-42985 8 АААбсАб и би и и и сАсси ссГГсГГ 1402
А-42986 А8 бАбб ибААААсдсибси и иатат 1403
Αϋ-23030 655 А-42987 8 ААбсАбибиииисАссисАсГТсГГ 1404
А-42988 А8 ибАббибААААсАсибсиисггс1т 1405
Αϋ-23031 656 А-42989 8 АбсАбибииии сАсси сАи ЙТЙТ 1406
А-42990 А8 АибАббибААААсАСибСис1Тс1Т 1407
Номер дуплекса Положение Номер олиго Цепь Последовательность (5'-3’) 5ΕΟΙΟΝΟ:
ΑΟ18328 628 А-32345 8 6иААссААбАбиАииссАис1Тс1Т 1408
А-32346 А8 АиббААиАСисииббииАСйТсГГ 1409
Цепь: 8= смысловая; а8= антисмысловая;
Положение: положение 5'-основания на транскрипте (ЦМ_000371.3, 8ΕΡ ΙΌ МО:1331).
Пример 13. Ιη У1!го скрининг черепичных (Шей) §1КМА ТТК
Черепичные дуплексы ТТК анализировали в клетках Нер3В на ингибирование эндогенной экспрессии ТТК с использованием ПЦР-анализов реального времени.
- 74 020312
Культивирование клеток и трансфекция
Клетки Нер3В (АТСС, Машк^к, νΑ) выращивали почти до конфлюэнтности при 37°С в атмосфере 5% СО2 в минимальной питательной среде Игла (ЕМЕМ, АТСС), дополненной 10% ФТС, стрептомицином и глутамином (АТСС), перед высвобождением из планшета трипсинизацией. Обратную транскрипцию проводили добавлением 5 мкл Орй-ΜΕΜ к 5 мкл каждой из κίΒΝΑ в индивидуальных лунках 96луночного планшета. Добавляли 10 мкл Орй-ΜΕΜ плюс 0,2 мкл Липофектамина ΡΝΑίΜηχ на лунку (Ιηνίΐιτ^η, Ο’;·ιιΊκό;·ιά СА. са! # 13778-150) и эту смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем добавляли 80 мкл полной среды для выращивания, описанной выше, но без антибиотиков, содержащей 2,0х104 клеток Нер3В. Клетки инкубировали в течение 24 ч перед очисткой РНК. Эксперименты с отдельными дозами выполняли при конечной концентрации дуплекса 0,1 или 10 нМ.
Выделение тотальной РНК с использованием набора для выделения РНК МадМАХ-96 (Арр^сй Είοкук!етк, ΕοκΟΓ Сйу СА. рай #: АМ 1830):
Клетки собирали и лизировали в 140 мкл раствора для лизиса/связывания, затем перемешивали в течение 1 мин при 850 об/мин с использованием термомиксера Эппендорфа (скорость смешивания была одной и той же на протяжении этого процесса). Двадцать микролитров магнитных гранул и смеси для усиления лизиса/связывания добавляли в лизат клеток и смешивали в течение 5 мин. Магнитные гранулы извлекали при помощи магнитного устройства и супернатант удаляли без нарушения этих гранул. После удаления супернатанта магнитные гранулы промывали промывочным раствором 1 (дополненным изопропанолом) и смешивали в течение 1 мин. Гранулы опять собирали и супернатант удаляли. Затем гранулы промывали 150 мкл промывочного раствора 2 (дополненного этанолом), собирали и супернатант удаляли. Затем к этим гранулам добавляли 50 мкл ДНКазной смеси (МадМах Шг^-буфер для ДНКазы и ДНКаза Тиг^) и перемешивали в течение 10-15 мин. После перемешивания добавляли 100 мкл раствора для повторного связывания РНК и перемешивали в течение 3 мин. Супернатант удаляли и магнитные гранулы опять промывали 150 мкл промывочного раствора 2 и смешивали в течение 1 мин и супернатант удаляли полностью. Эти магнитные гранулы смешивали в течение 2 мин для высыхания перед элюцией РНК 50 мкл воды.
Синтез кДНК с использованием набора для высокоэффективной обратной транскрипции кДНК АВ1 (Аррйсй Вюкхк1етк. Ροκί^τ Сйу. СА. Са! #4368813):
Основную смесь 2 мкл 10Х буфера, 0,8 мкл 25х й№ГР, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКаз и 3,2 мкл Н2О на одну реакцию добавляли в 10 мкл тотальной РНК. кДНК генерировали с использованием термоциклера Вю-Най С-1000 или 8-1000 (Негси1ек, СА) посредством следующих стадий: 25°С 10 мин, 37°С 120 мин, 85°С 5 с, 4°С выдерживание.
ПЦР реального времени мкл кДНК добавляли к основной смеси, содержащей 0,5 мкл зонда САРЦН Тас.|Маг1 (Аррйсй Вюкук!етк Са! # 43263173Ε), 0,5 мкл зонда ТТН Тас.|Маг1 (АррПсй Вюкук!етк са! # Н800174914 М1) и 10 мкл основной смеси ^Ле-зондов (Е^сйе Са! # 04887301001) на лунку в 384-луночном планшете Ыдй!Сус1ег 480 (Е^сйе са! # 0472974001). ПЦР реального времени выполняли в установке Ыдй!Сус1ет 480 Неа1 Т1те РСН (Нοсйе). Каждый дуплекс испытывали в двух независимых трансфекциях и каждую трансфекцию анализировали в двух повторностях.
Данные реального времени анализировали с использованием ААС!-способа. Каждую пробу нормализовали относительно экспрессии и нокдаун оценивали относительно клеток, трансфицированных ненацеливающим дуплексом АО-1955.
Табл. 14 показывает нокдаун ТТН с использованием кЖНА. Данные выражены в виде процента оставшегося транскрипта относительно клеток, являющихся мишенью АО-1955.
Многие, но не все, черепичные ТТН-дцРНК, поражающие ТТН вблизи мишени АО-18328, уменьшали мРНК ТТН по меньшей мере на 70% при трансфекции в клетки Нер3В при 0,1 нМ.
- 75 020312
Таблица 14. Ингибирование ТТН черепичной дцРНК, поражающей ТТН вблизи мишени ΑΌ-18328
Пример 14. Оценивание действия продолжительности инфузии на эффективность однократного внутривенного введения 8NΑ^Р-18534 в крысах 8ргадие-Оам4еу
Цели:
Для определения действия продолжительности инфузии на эффективность однократной IVинфузии 8NΑ^Р-18534 на уровнях мРНК ТТН печени в крысах 8ргадие-Оам4еу.
Таблица 15. Используемые аббревиатуры и определения
5ΝΑΣΡ-18534 Специфическая для транстиретина 31ΗΝΑ, приготовленная в ЗЧАЬР
ЗИАЬР-1955 Специфическая для люциферазы не млекопитающего 3ΪΡΝΑ, приготовленная в ЗЫАЬР
Последовательности смысловых и антисмысловых цепей ΑΏ-18534 воспроизведены ниже на основании представленных выше таблиц:
Цепь Номер олиго Положение Последовательность 5’-3’ ЗЕЦ 10 N0:
3 А-32755 532 сАСиСиисииСсисиАиААЦТЦТ 1289
аз А-32756 550 ииАиАСАСсААСААсАСиСЧТЦТ 1290
- 76 020312
Материалы исследования
Изделие (изделия).
8ΝΑΤΡ-18534 состоит из δίΒΝ.Α, поражающей мРНК ТТК грызуна (ΑΏ-18534), приготовленной в стабильных частицах нуклеиновая кислота-липид (8ΝΑΤΡ), для доставки в ткани-мишени. Г отовая форма 8ΝΑΤΡ (липидная частица) состоит из нового амино-липида (Ι)Ι.ίη[)ΜΑ), ПЭГ-илированного липида 0ώΙΨΟ2000-(''-[)ΜΑ), нейтрального липида (ΏΡΡϋ) и холестерина. Отношение липид:нуклеиновая кислота в готовой форме является приближенно 5,8:1 (м:м). 8ΝΑΤΡ-1955 содержит δίΒΝ.Α, поражающую мРНК люциферазы (не млекопитающего) , приготовлена с той же липидной частицей, с которой приготовлена 8ΝΑΤΡ-18534, и служит в качестве нефармакологического активного контроля. Уровни доз выражены в виде мг/кг на основе массы содержимого δίΒΝ.Α.
План исследования и процедуры
Животные и введение тест-изделий:
Это исследование содержит 9 групп крыс Зргадие-Эа'Меу (4 самца на группу). Этим животным предоставляли по меньшей мере 2-дневный период акклиматизации перед этим исследованием, и все животные были 7-недельного возраста в начале введения доз. Вводимую дозу рассчитывали на основе данных массы тела, собранных перед введением доз в день 1. Тест-изделия и контрольные изделия вводили в виде однократной 15-минутной, 1-часовой, 2-часовой или 3-часовой 1У-инфузии через хвостовую вену с использованием 24О 3/4 дюймовой канюли, герметизируемой при помощи Вах!ег 1п]ес!юп 8йе §ер1ит, присоединенной через иглу 27О ΊΤπιηιο ЬиПегПу к шприцу-насосу Вах1ег Α840Α. Объем дозы был 3 мл/кг, скорость инфузии была 12 мл/кг/ч и животные свободно перемещались в клетках во время введения доз. Крыс делили на девять групп обработки и им вводили однократную 1У-инфузию 8ΝΑΤΡ18534, 8ΝΑΤΡ-1955 или ЗФР, как показано в табл. 16:
Таблица 16. Группы доз тестируемых животных
Группа N Изделие Продолжительность инфузии Доза
А 4 РВЗ 15 минут -
В 4 РВЗ 3 часа -
С 4 3ΝΑΙ,Ρ-1955 1 час 1 мг/кг
ϋ 4 3ΝΑΣΡ-1955 2 часа 1 мг/кг
Е 4 3ΝΑΕΡ-1955 3 часа 1 мг/кг
Е 4 3ΝΑΣΡ-18534 15 минут 1 мг/кг
С 4 3ΝΆΙ.Ρ-18534 1 час 1 мг/кг
Н 4 3ΝΑΙϋΡ-18534 2 часа 1 мг/кг
I 4 5ЫАЬР-18534 3 часа 1 мг/кг
Сбор ткани и выделение РНК
В день 0, животных анестезировали ингаляцией изофлуорана и собирали пробы крови перед введением доз в пробирки для отделения сыворотки ретробульбарным кровоизвлечением. Пробам крови давали свертываться при комнатной температуре в течение приблизительно 30 мин перед центрифугированием при 4°С. Затем пробы сыворотки хранили при -80°С до выполнения анализа. В день 3 животным во всех группах обработки давали летальную дозу кетамина/ксилазина. Кровь собирали через хвостовую вену в пробирки для отделения сыворотки и затем давали свертываться при комнатной температуре в течение приблизительно 30 мин перед центрифугированием при 4°С. Пробы сыворотки хранили при -80°С до выполнения анализа. Ткань печени собирали и быстро замораживали на сухом льду. Замороженную ткань печени измельчали и готовили лизаты ткани для количественного определения мРНК печени.
Количественное определение мРНК ТТК
Уровни мРНК ТТК относительно уровней мРНК ΟΑΡΏΗ определяли в лизатах с использованием анализа разветвленных ДНК (ОнапПОепе Кеареп1 8у81ет, Ра^тЕз, Ρ^етοηί, С.Л) . Вкратце, использовали анализ ОнапПОе'пе' (ОемзресКа) для количественного определения уровней мРНК в лизатах проб ткани в соответствии с инструкциями изготовителя. Средний уровень мРНК ТТК нормализовали относительно среднего уровня мРНК ΟΑΡΏΗ для каждой пробы.
Для получения относительного уровня экспрессии мРНК ТТК средние величины группы для каждой из обработанных 8ΝΑΤΡ-1955 и 8ΝΑΤΡ-18534 групп с 15-минутной, 1-часовой и 2-часовой продолжительностями нормализовали затем относительно средней величины для ЗФР-обработанной группы с 15-минутной инфузией, в то время как средние величины групп для обработанных 8ΝΑΤΡ-1955 и 8ΝΑΤΡ-18534 с 3-часовой продолжительностью инфузии нормализовали затем относительно средней величины для ЗФР-обработанной группы с 3-часовой продолжительностью.
Результаты
Как показано на фиг. 16, однократная 1У-инфузия 1 мг/кг 8ΝΑΤΡ-18534 с разными продолжительностями инфузии от 15 мин до 3 ч приводит к сравнимому ингибированию уровней мРНК ТТК печени,
- 77 020312 измеренному спустя два дня после введения доз. Однократная 1У-инфузия 1 мг/кг 8NΛ^Р-18534 показала также продолжительную понижающую регуляцию ТТН на протяжении 29 дней после однократной 15минутной 1У-инфузии, в сравнении с контролем 8№АТР-1955 (данные не показаны). В сравнении с ЗФРобработанной группой, однократная 15-минутная, 1-часовая, 2-часовая или 3-часовая 1У-инфузия 8№АТР-18534 при 1 мг/кг значимо уменьшала относительные уровни экспрессии мРНК ТТН на 94% (р<0,001), 94% (р<0,001), 92% (р<0,001) и 93% (р<0,001) соответственно. Специфичность активности 8№АТР-18534 демонстрируется отсутствием значимого ингибирования мишени введением 8№АТР-1955 через 1-часовую, 2-часовую или 3-часовую инфузию при том же самом уровне доз.
Выводы
Это исследование демонстрирует, что варьирование продолжительности инфузии от 15 мин до 3 ч не влияет на эффективность однократного 1У-введения 1 мг/кг 8№АТР-18534 в крысах, как оценено по уменьшению уровней мРНК ТТН в печени.
Пример 15. 1п у1уо уменьшение мРНК ТТН дикого типа в печени крысы с использованием Ь№Р0718534 и Ь№Р08-18534
Для оценивания эффективности 2 новых готовых форм липидных наночастиц, Ь№Р07 и Ь№Р08, для доставки кЖ№А в крысе, специфическую для грызунов кЖ№А ТТН, АО-18534, готовили в Ь№Р07 (Ь№Р07-18534) или Ь№Р08 (Ь№Р08-18534) и вводили 15-минутной 1У-инфузией и определяли количественно мРНК ТТН печени. Крысам 8ргадие-ОаМеу (4 животных на группу) вводили 15-минутную 1Уинфузию Ь№Р07-18534 (0,03, 0,1, 0,3 или 1 мг/кг), Ь№Р08-18534 (0,01, 0,03 или 0,1 мг/кг) или Ь№Р07-1955 (1 мг/кг) или Ь№Р08-1955 (0,1 мг/кг), содержащую отрицательную контрольную кЖ№А АО-1955, мишенью которой является ген люциферазы не млекопитающего. Спустя сорок восемь часов, животных эвтанизировали и собирали ткань печени, быстро замораживали и хранили при -80°С до обработки.
Для количественного определения мРНК ТТН, замороженную ткань печени измельчали в порошок и готовили лизаты. Уровни мРНК ТТН относительно уровней мРНК САРБН определяли в этих лизатах с использованием анализа разветвленных ДНК (ОнапНСепе Неадеп! 8ук!ет, Рапотюк, Егетоп!, СА). Вкратце, анализ ОнапЕСепе (Сепокресйа) использовали для количественного определения уровней мРНК в лизатах проб ткани в соответствии с инструкциями изготовителя. Средний уровень мРНК ТТН нормализовали относительно среднего уровня мРНК САРБН для каждой пробы. Средние значения нормализованных величин групп затем дополнительно нормализовали относительно средней величины для обработанной ЗФР группы для получения относительного уровня экспрессии мРНК ТТН.
Эти результаты показаны на фиг. 17. Ь№Р07-18534 уменьшала уровни мРНК ТТН в печени зависимым от дозы образом с 94% супрессией мРНК ТТН при 1 мг/кг. Это действие было специфическим, так как отрицательный контроль Ь№Р07-1955 при 1 мг/кг не влияла значимо на уровни мРНК ТТН в сравнении с ЗФР-контролем. Было определено, что ЕС50 мРНК была равна ~0,05 мг/кг Ь№Р07-18534. Ь№Р0818534 уменьшала уровни мРНК ТТН в печени заисимым от дозы образом с 8 6% супрессией мРНК ТТН при 0,1 мг/кг. Это действие было специфическим, так как отрицательный контроль Ь№Р08-1955 при 0,1 мг/кг не влиял значимо на уровни мРНК ТТН в сравнении с ЗФР-контролем. Было определено, что ЕС50 мРНК была равна ~0,02 мг/кг Ь№Р08-18534.
Эти результаты демонстрируют, что Ь№Р07-18534 и Ь№Р08-18534 являются эффективными в супрессии мРНК ТТН дикого типа в печени крысы при введении 1У-инфузией и что Ь№Р07 и Ь№Р08 являются эффективными готовыми формами для доставки кгН№А в печень.
Пример 16. Уменьшение мРНК ТТН печени однократным внутривенным введением Ь№Р09-18534 или Ь№Р11-18534 в крыс 8ргадие-ОаМеу
Цель:
Для оценивания эффективности двух новых готовых форм липидных наночастиц (Ь№Р) для доставки специфической для ТТН грызунов кгН№А, АО-18534 в крысу 8ргадие-Баш1еу для уменьшения уровней мРНК печени эндогенного (дикого типа) ТТН. Крысам внутривенно вводили дозы посредством 15минутной инфузии 0,01, 0,03, 0,1 или 0,3 мг/кг Ь№Р09-18534, Ь№Р11-18534 или забуференного фосфатом солевого раствора (ЗФР) и уровни мРНК
ТТН анализировали при 48 ч после обработки
Материал и способы:
Готовая форма Ь№Р09: (ХТС/Б8РС/СЬо1/РЕС2000-С14) 50/10/38,5/1,5 мол.%;
липид:к1Р№А ~11:1.
Готовая форма Ь№Р11: (МС3/Б8РС/СЬо1/РЕС2000-С14) = 50/10/38,5/1,5 мол.%;
липид:к1Р№А ~11:1
Сбор ткани и выделение РНК.
В день 3 животным во всех группах обработки давали летальную дозу кетамина/ксилазина. Кровь собирали через каудальную полую вену в пробирки для отделения сыворотки и затем давали свертываться при комнатной температуре в течение приблизительно 30 мин перед центрифугированием при 4°С. Пробы сыворотки хранили при -80°С до последующего анализа. Ткани печени собирали, быстро замораживали на сухом льду. Замороженную ткань печени измельчали и готовили лизаты ткани для количест
- 78 020312 венного определения мРНК печени.
Количественное определение мРНК ТТК:
Уровни мРНК ТТК относительно уровней мРНК САРЭН определяли в этих лизатах с использованием анализа разветвленных ДНК (^иаηί^Сеηе Кеадей 8уйет, Раиотюк, Ртетой, СА). Вкратце, анализ ^иай^Сеηе (Сено5рес1га) использовали для количественного определения уровней мРНК в лизатах проб ткани в соответствии с инструкциями изготовителя. Средний уровень мРНК ТТК нормализовали относительно среднего уровня мРНК САРЭН для каждой пробы. Средние значения нормализованных величин групп затем дополнительно нормализовали относительно средней величины для обработанной ЗФР группы для получения относительного уровня экспрессии мРНК ТТК.
Результаты
Как показано на фиг. 18, в отличие от ЗФР-обработанныеых животных, обработанные Ь№09-185З4 и Ь№111-185З4 животные имели значимое зависимое от дозы уменьшение уровней мРНК ТТК в печени, с достижением максимального уменьшения ~90% мРНК как для Ь№09-приготовленных, так и для Ь№11-приготовленных групп относительно группы ЗФР-контроля при 0,З мг/кг, и доза, вызывающая 50% уменьшение (ЕИ50) , была равна<0,0З мг/кг для Ь№11-185З4 и <0,1 мг/кг для Ь№09-185З4.
Выводы
Это исследование демонстрирует, что однократная 15-минутная ^-инфузия Ь№09-185З4 или Ь№11-185З в крыс 8ргадие-Оа^1еу приводит к зависимому от дозы уменьшению мРНК ТТК печени. Эти данные демонстрируют эффективность Ь№09-18З28 и Ь№11-18З28 в уменьшении эндогенно экспрессируемой (дикого типа) мРНК ТТК с уровнями ЕИ50 <0,0З и <0,1 мг/кг для Ь№11-185З4 и Ь№09-185З4 соответственно.
Пример 17. Ингибирование ТТК в людях
Субъекта-человека обрабатывают дцРНК, поражающей ген ТТК, для ингибирования экспрессии гена ТТК для лечения какого-либо состояния.
Субъекта, нуждающегося в лечении, отбирают или идентифицируют. Этот субъект может иметь нарушение печени, транстиретиновый амилоидоз и/или трансплантированную печень.
Идентификация этого субъекта может выполняться в клинической обстановке или где-то еще, например, в доме этого субъекта посредством самостоятельного использования субъектом самотестирующего набора.
В момент 0 подходящую первую дозу анти-ТТК-8^КNΑ вводят этому субъекту. дцРНК готовят, как описано здесь. После некоторого периода времени после первой дозы, например 7 дней, 14 дней и 21 дня, оценивают состояние этого субъекта, например, измерением функции печени. Это измерение может сопровождаться измерением экспрессии ТТК в указанном субъекте, и/или продуктов успешного 8^КNΑпоражения мРНК ТТК. Могут быть также измерены другие релевантные критерии. Количество и эффективность доз корректируются в соответствии с потребностями этого субъекта.
После лечения скорость роста опухоли субъекта понижается относительно скорости, существующей перед этим лечением, или относительно скорости, измеренной в подобном образом страдающем, но не получавшем этого лечения субъекте.

Claims (23)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Двухцепочечная рибонуклеиновая кислота (дцРНК), способная ингибировать экспрессию транстиретина (ТТК) и содержащая смысловую и антисмысловую цепи, причем ее антисмысловая цепь включает участок, комплементарный части мРНК, кодирующей транстиретин (ТТК), имеющий длину менее З0 нуклеотидов, и содержит 15 или более смежных нуклеотидов 8ЕЦ ГО NО:170.
  2. 2. дцРНК по п.1, где:
    (a) смысловая цепь состоит из 8ЕЦ ГО NО:449 и антисмысловая цепь состоит из 8ЕЦ ГО NО:450;
    (b) смысловая цепь состоит из 8ЕЦ ГО NО:729 и антисмысловая цепь состоит из 8ЕЦ ГО NО:730 или (c) смысловая цепь состоит из 8ЕЦ ГО NО: 1009 и антисмысловая цепь состоит из 8ЕЦ ГО NО: 1010.
  3. 3. дцРНК по п.1, где участок комплементарности состоит из 8ЕЦ ГО NО:170.
  4. 4. дцРНК по п.1, где каждая цепь дцРНК имеет длину 19, 20, 21, 22, 2З или 24 нуклеотида.
  5. 5. дцРНК по п.1 или 2, где дцРНК:
    (a) не расщепляет мРНК ТТК между нуклеотидом аденином в положении 6З7 8ЕЦ ГО NО:1331 и нуклеотидом гуанином в положении 6З8 8ЕЦ ГО NО:1331;
    (b) расщепляет мРНК ТТК между нуклеотидом гуанином в положении 6З6 8ЕЦ ГО NО:1331 и нуклеотидом аденином в положении 6З7 8ЕЦ ГО NО:1331 и/или (c) отжигается с мРНК ТТК между нуклеотидом гуанином в положении 628 8ЕЦ ГО NО:1331 и нуклеотидом урацилом в положении 646 8ЕЦ ГО NО:1331.
  6. 6. дцРНК по любому из пп.1-5, где указанная дцРНК содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид.
  7. 7. дцРНК по п.6, где по меньшей мере один из указанных модифицированных нуклеотидов выбран
    - 79 020312 из группы, состоящей из 2'-О-метилмодифицированного нуклеотида, нуклеотида, содержащего 5'фосфоротиоатную группу, концевого нуклеотида, связанного с холестерилпроизводным или группой бисдециламида додекановой кислоты, 2'-дезокси-2'-фтормодифицированного нуклеотида, 2'дезоксимодифицированного нуклеотида, замкнутого нуклеотида, лишенного азотистого основания нуклеотида, 2'-аминомодифицированного нуклеотида, 2'-алкилмодифицированного нуклеотида, морфолинонуклеотида, фосфоамидата и нуклеотида, содержащего неприродное основание.
  8. 8. дцРНК по любому из пп.1-6, где дцРНК конъюгирована с лигандом.
  9. 9. дцРНК по любому из пп.1-6, где дцРНК приготовлена в виде липидной готовой формы.
  10. 10. Двухцепочечная рибонуклеиновая кислота (дцРНК), способная ингибировать экспрессию транстиретина (ТТН) и содержащая антисмысловую цепь, включающую участок, комплементарный 15-30 нуклеотидам из нуклеотидов в положении 618-648 8ЕО ΙΌ N0:1331, спаривающуюся с гуанином в положении 628 8Е0 ΙΌ N0:1331.
  11. 11. Вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, которая транскрибирует по меньшей мере одну цепь дцРНК по пп.1-10.
  12. 12. Клетка, содержащая:
    (a) дцРНК по пп.1-10 или (b) вектор по п.11.
  13. 13. Фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ТТН, содержащая дцРНК по пп.1-10 и фармацевтически приемлемый носитель.
  14. 14. Способ ингибирования экспрессии ТТН в клетке, предусматривающий:
    (a) приведение указанной клетки в контакт с дцРНК по пп.1-10 и (b) поддержание клетки, полученной в стадии (а), в течение времени, достаточного для получения деградации мРНК-транскрипта гена ТТН, посредством чего ингибируется ген ТТН в этой клетке.
  15. 15. Применение дцРНК по п.1 в лечении нарушения, опосредованного экспрессией ТТН.
  16. 16. Применение по п.15, где дцРНК вводят человеку приблизительно в количестве 0,01, 0,1, 0,3, 0,5, 1,0, 2,5 или 5,0 мг/кг.
  17. 17. Применение по п.15, где дцРНК вводят человеку в количестве от 0,2 до 1,5 мг/кг.
  18. 18. Применение по п.15, где дцРНК вводят человеку приблизительно в количестве 0,3 мг/кг.
  19. 19. Применение по п.15 или 16, где:
    (a) человек имеет транстиретиновый амилоидоз;
    (b) человек имеет нарушение печени и/или (c) человеку дополнительно обеспечен трансплантат печени.
  20. 20. Применение по любому из пп.15-19, где человек дополнительно получает другой терапевтический способ лечения ТТН-амилоидоза, где указанный способ выбран из группы, состоящей из диуретических средств, ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента, блокаторов рецептора ангиотензина, диализа и трансплантата печени для лечения почечной функции.
  21. 21. Применение по любому из пп.15-20, где указанный ТТН-амилоидоз выбран из наследственной амилоидной полиневропатии (РАР), наследственной амилоидной кардиомиопатии (РАС), лептоменингеального амилоидоза/амилоидоза, сенильного системного амилоидоза (88А) и сенильного амилоидоза сердца (8СА).
  22. 22. Применение по любому из пп.15-21, где указанную дцРНК вводят человеку с интервалами не более 1, 2, 3 или 4 недель.
  23. 23. Применение по любому из пп.15-22, где указанную дцРНК вводят человеку внутривенно или внутривенной инфузией на протяжении 15-минутного периода.
EA201170591A 2008-10-20 2009-10-20 Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина EA020312B1 (ru)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10695608P 2008-10-20 2008-10-20
US11573808P 2008-11-18 2008-11-18
US15667009P 2009-03-02 2009-03-02
US18554509P 2009-06-09 2009-06-09
US24278309P 2009-09-15 2009-09-15
US24479409P 2009-09-22 2009-09-22
PCT/US2009/061381 WO2010048228A2 (en) 2008-10-20 2009-10-20 Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201170591A1 EA201170591A1 (ru) 2011-12-30
EA020312B1 true EA020312B1 (ru) 2014-10-30

Family

ID=42062316

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201400170A EA029762B1 (ru) 2008-10-20 2009-10-20 Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина
EA201792626A EA036772B1 (ru) 2008-10-20 2009-10-20 Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина
EA201170591A EA020312B1 (ru) 2008-10-20 2009-10-20 Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201400170A EA029762B1 (ru) 2008-10-20 2009-10-20 Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина
EA201792626A EA036772B1 (ru) 2008-10-20 2009-10-20 Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина

Country Status (28)

Country Link
US (8) US8168775B2 (ru)
EP (4) EP2344639B1 (ru)
JP (6) JP5791505B2 (ru)
KR (6) KR102578331B1 (ru)
CN (3) CN106834291B (ru)
AU (1) AU2009307677C1 (ru)
CA (3) CA2739895C (ru)
CY (3) CY1116944T1 (ru)
DK (2) DK2937418T3 (ru)
EA (3) EA029762B1 (ru)
ES (2) ES2656516T3 (ru)
HK (3) HK1156348A1 (ru)
HR (2) HRP20150796T1 (ru)
HU (3) HUE026604T2 (ru)
IL (5) IL310600A (ru)
LT (2) LT2937418T (ru)
LU (1) LUC00098I2 (ru)
MX (4) MX360460B (ru)
NL (1) NL300965I2 (ru)
NO (2) NO2937418T3 (ru)
NZ (2) NZ592867A (ru)
PL (2) PL2937418T3 (ru)
PT (2) PT2344639E (ru)
SG (3) SG10201912276XA (ru)
SI (2) SI2344639T1 (ru)
SM (1) SMT201500176B (ru)
WO (1) WO2010048228A2 (ru)
ZA (1) ZA201102876B (ru)

Families Citing this family (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9228186B2 (en) 2002-11-14 2016-01-05 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US20050244869A1 (en) * 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
NZ587616A (en) 2006-05-11 2012-03-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for inhibiting expression of the pcsk9 gene
CN102119217B (zh) 2008-04-15 2015-06-03 普洛体维生物治疗公司 用于核酸递送的新型制剂
AU2009307677C1 (en) 2008-10-20 2022-09-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin
EP2373382B1 (en) * 2008-12-10 2017-02-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Gnaq targeted dsrna compositions and methods for inhibiting expression
AU2010208035B2 (en) * 2009-01-29 2016-06-23 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation for the delivery of nucleic acids
EA201791744A3 (ru) * 2009-06-10 2018-07-31 Арбутус Биофарма Корпорэйшн Улучшенная липидная композиция
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
US8273869B2 (en) * 2009-06-15 2012-09-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated dsRNA targeting the PCSK9 gene
CA2767127A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors
WO2011020023A2 (en) * 2009-08-14 2011-02-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus
JP5723378B2 (ja) * 2009-11-03 2015-05-27 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． トランスサイレチン（ｔｔｒ）を阻害する脂質製剤化組成物及び方法
EP3329924B1 (en) * 2010-03-29 2021-05-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dsrna therapy for transthyretin (ttr) related ocular amyloidosis
MX343559B (es) 2010-04-29 2016-11-10 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulacion de la expresion de transtiretina.
US20130123338A1 (en) * 2010-05-12 2013-05-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel cationic lipids and methods of use thereof
AU2011261434B2 (en) * 2010-06-02 2015-11-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods directed to treating liver fibrosis
US9006417B2 (en) 2010-06-30 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
JP2013545727A (ja) * 2010-10-21 2013-12-26 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション オリゴヌクレオチド送達用の新規低分子量カチオン性脂質
DK2640700T3 (en) 2010-11-15 2019-01-14 Life Technologies Corp AMINOUS TRANSFECTION REAGENTS AND METHODS FOR PREPARING USE THEREOF
EP2648763A4 (en) * 2010-12-10 2014-05-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR EXPRESSION INHIBITION OF GENES KLF-1 AND BCL11A
EP2525223A1 (en) * 2011-05-19 2012-11-21 Universiteit Maastricht In vitro method for predicting in vivo genotoxicity of chemical compounds.
CN112961855A (zh) * 2011-06-21 2021-06-15 阿尔尼拉姆医药品有限公司 血管生成素样3(ANGPTL3)iRNA组合物及其使用方法
WO2012177906A1 (en) * 2011-06-21 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
WO2012177921A2 (en) * 2011-06-21 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc Compositions and methods for inhibiting hepcidin antimicrobial peptide (hamp) or hamp-related gene expression
SI3301177T1 (sl) 2011-11-18 2020-07-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Sredstva RNAi, sestavki in postopki njihove uporabe za zdravljenje s transtiretinom (TTR) povezanih bolezni
ES2921724T1 (es) 2011-12-07 2022-08-31 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lípidos biodegradables para la administración de agentes activos
US9035039B2 (en) * 2011-12-22 2015-05-19 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing SMAD4
EP4074834A1 (en) 2012-11-26 2022-10-19 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
JP2016504050A (ja) 2013-01-17 2016-02-12 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 細胞表現型の改変のためのシグナルセンサーポリヌクレオチド
EP2953970A4 (en) 2013-02-08 2016-06-29 Misfolding Diagnostics Inc TRANSTYRETIN ANTIBODIES AND USES THEREOF
CN105518146B (zh) 2013-04-04 2022-07-15 哈佛学院校长同事会 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途
PT2992098T (pt) 2013-05-01 2019-07-05 Ionis Pharmaceuticals Inc Composições e métodos para modular a expressão de hbv e ttr
AU2014281028B2 (en) 2013-06-17 2020-09-10 Massachusetts Institute Of Technology Delivery and use of the CRISPR-Cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
JP2016528890A (ja) 2013-07-09 2016-09-23 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いるゲノム編集の治療用の使用
TW201610151A (zh) * 2013-09-23 2016-03-16 阿尼拉製藥公司 治療或預防與甲狀腺素運載蛋白相關疾病之方法
CA2925107A1 (en) * 2013-10-02 2015-04-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the lect2 gene
US10150965B2 (en) 2013-12-06 2018-12-11 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of transthyretin (TTR) by double-stranded RNA
EP3122365B1 (en) * 2014-03-25 2023-05-03 Arcturus Therapeutics, Inc. Transthyretin allele selective una oligomers for gene silencing
CN106460025A (zh) 2014-03-25 2017-02-22 阿克丘勒斯治疗公司 在基因沉默中具有降低的脱靶效应的una寡聚物
US9856475B2 (en) 2014-03-25 2018-01-02 Arcturus Therapeutics, Inc. Formulations for treating amyloidosis
PE20170010A1 (es) 2014-05-01 2017-03-04 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para modular la expresion del factor b del complemento
LT3185957T (lt) 2014-08-29 2022-09-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patisiranas, skirtas naudoti transtiretino amiloidozei gydyti
WO2016161299A1 (en) 2015-04-01 2016-10-06 Arcturus Therapeutics, Inc. Therapeutic una oligomers and uses thereof
MX2017012610A (es) 2015-04-08 2018-03-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para inhibir la expresion del gen lect2.
AU2016247922B2 (en) 2015-04-13 2022-04-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (ANGPTL3) iRNA compositions and methods of use thereof
WO2017015671A1 (en) * 2015-07-23 2017-01-26 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions for treating amyloidosis
CA2994285A1 (en) 2015-07-31 2017-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated diseases
UY37146A (es) 2016-03-07 2017-09-29 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Ligandos de direccionamiento para compuestos terapéuticos
SG11201901841TA (en) 2016-09-02 2019-03-28 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Targeting ligands
KR20190065341A (ko) 2016-10-06 2019-06-11 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 올리고머 화합물들의 접합 방법
AU2017368050A1 (en) 2016-11-29 2019-06-20 Puretech Lyt, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
SG11201906922TA (en) 2017-02-17 2019-09-27 Eidos Therapeutics Inc Processes for preparing ag-10, its intermediates, and salts thereof
JP2021508333A (ja) 2017-09-19 2021-03-04 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． トランスサイレチン（ｔｔｒ）媒介アミロイドーシスの治療用組成物及び方法
MX2020003589A (es) 2017-09-29 2020-07-22 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus ttr humanizado y metodos de uso.
JP2021500864A (ja) 2017-09-29 2021-01-14 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド Ｔｔｒ遺伝子編集およびａｔｔｒアミロイドーシスの治療用の組成物および方法
CA3094711A1 (en) * 2018-03-23 2019-09-26 Eidos Therapeutics, Inc. Methods of treating ttr amyloidosis using ag10
TWI834708B (zh) 2018-08-17 2024-03-11 美商文涵治療有限公司 Ag10之調配物
FI3864163T3 (fi) 2018-10-09 2024-05-03 Univ British Columbia Koostumukset ja järjestelmät, joihin sisältyvät transfektiokompetentit vesikkelit, joissa ei ole orgaanisia liuottimia eikä pesuaineita, sekä niihin liittyvät menetelmät
US20220071965A1 (en) 2018-12-20 2022-03-10 Pfizer Inc. Pharmaceutical Compositions and Methods Comprising A Combination of a Benzoxazole Transthyretin Stabilizer and an Additional Therapeutic Agent
US11891618B2 (en) 2019-06-04 2024-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
CN114423869A (zh) 2019-07-19 2022-04-29 旗舰先锋创新Vi有限责任公司 重组酶组合物和使用方法
WO2021041884A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Neurofilament light chain (nfl) as a biomarker for transthyretin amyloidosis polyneuropathy
KR20220110749A (ko) * 2019-11-06 2022-08-09 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 간외 전달
JP2023516748A (ja) 2020-03-06 2023-04-20 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド トランスサイレチン（ｔｔｒ）の発現を阻害するための組成物および方法
JP2023526422A (ja) 2020-05-20 2023-06-21 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー コロナウイルス抗原組成物及びそれらの使用
AU2021275213A1 (en) 2020-05-20 2023-02-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and uses thereof
JP2023527413A (ja) 2020-05-29 2023-06-28 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー Ｔｒｅｍ組成物及びそれに関連する方法
EP4158032A2 (en) 2020-05-29 2023-04-05 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Trem compositions and methods relating thereto
MX2023002439A (es) 2020-09-03 2023-05-09 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Composiciones immunogénicas y usos de las mismas.
CN117098541A (zh) 2020-11-25 2023-11-21 阿卡格拉医药公司 用于递送核酸的脂质纳米粒及相关使用方法
WO2022112919A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Pfizer Inc. (aza)benzothiazolyl substituted pyrazole compounds
MX2023007630A (es) 2020-12-23 2023-08-25 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Composiciones de trem modificadas y usos de las mismas.
EP4294409A1 (en) * 2021-02-22 2023-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Folliculin irna compositions and methods thereof
WO2022187435A1 (en) 2021-03-04 2022-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compositions and methods of use thereof
WO2022212784A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
WO2022235537A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating transthyretin (ttr) mediated amyloidosis
JP2024523000A (ja) 2021-06-08 2024-06-25 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド シュタルガルト病及び／又は網膜結合タンパク質４（ｒｂｐ４）関連障害を治療又は予防するための組成物及び方法
EP4377457A1 (en) 2021-07-26 2024-06-05 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Trem compositions and uses thereof
EP4381067A1 (en) * 2021-08-03 2024-06-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof
IL311225A (en) 2021-09-08 2024-05-01 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Methods and compositions for genome modulation
TW202330916A (zh) 2021-09-17 2023-08-01 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 用於產生環狀多核糖核苷酸之組成物和方法
WO2023069397A1 (en) 2021-10-18 2023-04-27 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
CN114058636A (zh) * 2021-11-16 2022-02-18 大连润生康泰医学检验实验室有限公司 一种转甲状腺素蛋白基因的克隆、表达与纯化方法
CA3239266A1 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Coronavirus immunogen compositions and their uses
WO2023096963A1 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Varicella-zoster virus immunogen compositions and their uses
CA3238735A1 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Jennifer A. Nelson Immunogenic compositions and their uses
CA3241061A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Alexandra Sophie DE BOER Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
WO2023122789A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Circular polyribonucleotides encoding antifusogenic polypeptides
WO2023196634A2 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
WO2023220083A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
TW202409283A (zh) 2022-05-13 2024-03-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 雙股ｄｎａ組合物及相關方法
WO2023250112A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of modified trems and uses thereof
WO2024030856A2 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory proteins and related methods
WO2024035952A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
WO2024097664A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
WO2024098061A2 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Genkardia Inc. Oligonucleotide-based therapeutics targeting cyclin d2 for the treatment of heart failure
WO2024102799A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
WO2024108217A1 (en) 2022-11-18 2024-05-23 Genkardia Inc. Methods and compositions for preventing, treating, or reversing cardiac diastolic dysfunction
WO2024129988A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for delivery of therapeutic agents to bone

Family Cites Families (218)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US564562A (en) 1896-07-21 Joseph p
US513030A (en) 1894-01-16 Machine for waxing or coating paper
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4522808A (en) 1980-08-15 1985-06-11 Societe Anonyme Dite: L'oreal Anti-sunburn compositions containing 2-phenyl-indole derivatives
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4534899A (en) 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
JP2703893B2 (ja) 1985-07-05 1998-01-26 ホワイトヘッド・インスティテュ−ト・フォ−・バイオメディカル・リサ−チ 外来遺伝子物質を発現する上皮細胞
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
AU598946B2 (en) 1987-06-24 1990-07-05 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
EP0378576B1 (en) 1987-09-11 1995-01-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Transduced fibroblasts and uses therefor
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
JP2914692B2 (ja) 1987-12-11 1999-07-05 ホワイトヘツド・インスチチユート・フオー・バイオメデイカル・リサーチ 内皮細胞の遺伝子修飾
WO1989007136A2 (en) 1988-02-05 1989-08-10 Whitehead Institute For Biomedical Research Modified hepatocytes and uses therefor
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
GB8824593D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Liposomes
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
DE69034150T2 (de) 1989-10-24 2005-08-25 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad 2'-Modifizierte Oligonukleotide
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5665710A (en) 1990-04-30 1997-09-09 Georgetown University Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
EP0455905B1 (en) 1990-05-11 1998-06-17 Microprobe Corporation Dipsticks for nucleic acid hybridization assays and methods for covalently immobilizing oligonucleotides
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
BR9106702A (pt) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Inc Analogo de oligonucleotideos e processos para modular a producao de uma proteina por um organismo e para tratar um organismo
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
DE69115702T2 (de) 1990-08-03 1996-06-13 Sterling Winthrop Inc Verbindungen und verfahren zur unterdrückung der genexpression
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
JP3249516B2 (ja) 1990-10-31 2002-01-21 ソマティクス セラピー コーポレイション 遺伝子治療のためのレトロウイルスのベクター
KR930702373A (ko) 1990-11-08 1993-09-08 안토니 제이. 페이네 합성 올리고누클레오티드에 대한 다중 리포터(Reporter)그룹의 첨합
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
ES2103918T3 (es) 1991-10-17 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios.
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
CA2159631A1 (en) 1993-03-30 1994-10-13 Sanofi Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
WO1994022891A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
CA2137297C (en) 1993-12-06 2000-04-18 Tsuyoshi Miyazaki Reactive vesicle and functional substance-fixed vesicle
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
WO2000022114A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Ingene, Inc. PRODUCTION OF ssDNA $i(IN VIVO)
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
WO1996033761A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Medtronic, Inc. Intraparenchymal infusion catheter system
IL122290A0 (en) 1995-06-07 1998-04-05 Inex Pharmaceuticals Corp Lipid-nucleic acid complex its preparation and use
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5756122A (en) 1995-06-07 1998-05-26 Georgetown University Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
ATE247971T1 (de) 1995-08-01 2003-09-15 Novartis Erfind Verwalt Gmbh Liposomale oligonukleotidzusammensetzungen
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
US5735814A (en) 1996-04-30 1998-04-07 Medtronic, Inc. Techniques of treating neurodegenerative disorders by brain infusion
DE69834038D1 (de) 1997-07-01 2006-05-18 Isis Pharmaceutical Inc Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
WO1999053050A1 (en) 1998-04-08 1999-10-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and means for obtaining modified phenotypes
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
EP1096921B1 (en) 1998-07-20 2003-04-16 Protiva Biotherapeutics Inc. Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
WO2000022113A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Ingene, Inc. ENZYMATIC SYNTHESIS OF ssDNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
JP2002537343A (ja) 1999-02-23 2002-11-05 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 多重粒子製剤
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
US20030229037A1 (en) * 2000-02-07 2003-12-11 Ulrich Massing Novel cationic amphiphiles
US20030072794A1 (en) * 2000-06-09 2003-04-17 Teni Boulikas Encapsulation of plasmid DNA (lipogenes™) and therapeutic agents with nuclear localization signal/fusogenic peptide conjugates into targeted liposome complexes
CZ302719B6 (cs) * 2000-12-01 2011-09-21 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Izolovaná molekula dvouretezcové RNA, zpusob její výroby a její použití
EP1386004A4 (en) * 2001-04-05 2005-02-16 Ribozyme Pharm Inc MODULATION OF GENE EXPRESSION ASSOCIATED WITH INFLAMMATORY PROLIFERATION AND GROWTH OF NEURITIES BY METHODS INVOLVING NUCLEIC ACID
US20030170891A1 (en) 2001-06-06 2003-09-11 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7956176B2 (en) * 2002-09-05 2011-06-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
EP1560931B1 (en) 2002-11-14 2011-07-27 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
US7250496B2 (en) * 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
DE10302421A1 (de) 2003-01-21 2004-07-29 Ribopharma Ag Doppelsträngige Ribonukleinsäure mit verbesserter Wirksamkeit
EP2239329A1 (en) 2003-03-07 2010-10-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions
CA2488224A1 (en) 2003-04-03 2004-10-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna conjugates
EP1648519B1 (en) 2003-07-16 2014-10-08 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid encapsulated interfering rna
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
AU2005252273B2 (en) 2004-06-07 2011-04-28 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
AU2005251403B2 (en) 2004-06-07 2011-09-01 Arbutus Biopharma Corporation Cationic lipids and methods of use
US7838561B2 (en) * 2004-06-14 2010-11-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for preventing or treating cardiac hypertrophy
ES2246715B1 (es) * 2004-08-04 2007-05-01 Consejo Superior Investig. Cientificas Modelo animal de enfermedades neurodegenerativas, procedimiento de obtencion y aplicaciones.
CN101189343B (zh) * 2004-08-23 2011-11-16 阿尔尼拉姆药物公司 多rna聚合酶ⅲ启动子表达构建体
CA2597724A1 (en) * 2005-02-14 2007-08-02 Sirna Therapeutics, Inc. Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them
JP2008537551A (ja) 2005-03-31 2008-09-18 カランド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２の阻害剤およびその使用
US7915230B2 (en) * 2005-05-17 2011-03-29 Molecular Transfer, Inc. Reagents for transfection of eukaryotic cells
WO2007008652A2 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions directed to dj-1 as regulator of the anti-oxidant transcription factor nrf2
CN101267805A (zh) 2005-07-27 2008-09-17 普洛体维生物治疗公司 制造脂质体的系统和方法
WO2007051303A1 (en) * 2005-11-02 2007-05-10 Protiva Biotherapeutics, Inc. MODIFIED siRNA MOLECULES AND USES THEREOF
KR101547579B1 (ko) 2006-03-31 2015-08-27 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｅｇ5 유전자의 발현을 억제하는 이본쇄 리보핵산
US8598333B2 (en) 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
MX2009003548A (es) 2006-10-03 2009-04-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc Formulaciones que contienen lipidos.
CA2910760C (en) * 2007-12-04 2019-07-09 Muthiah Manoharan Targeting lipids
AU2008342535B2 (en) * 2007-12-27 2015-02-05 Arbutus Biopharma Corporation Silencing of polo-like kinase expression using interfering RNA
CA3044134A1 (en) 2008-01-02 2009-07-09 Arbutus Biopharma Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
CN102119217B (zh) * 2008-04-15 2015-06-03 普洛体维生物治疗公司 用于核酸递送的新型制剂
WO2010017509A1 (en) 2008-08-07 2010-02-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of transthyretin expression for the treatment of cns related disorders
CA2740000C (en) * 2008-10-09 2017-12-12 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
AU2009307677C1 (en) * 2008-10-20 2022-09-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin
JP6087504B2 (ja) 2008-11-07 2017-03-01 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー アミノアルコールリピドイドおよびその使用
KR102344392B1 (ko) 2008-11-10 2021-12-28 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
AU2010208035B2 (en) 2009-01-29 2016-06-23 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation for the delivery of nucleic acids
NZ621981A (en) 2009-05-05 2015-09-25 Tekmira Pharmaceuticals Corp Lipid compositions
EA201791744A3 (ru) 2009-06-10 2018-07-31 Арбутус Биофарма Корпорэйшн Улучшенная липидная композиция
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
JP5723378B2 (ja) 2009-11-03 2015-05-27 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． トランスサイレチン（ｔｔｒ）を阻害する脂質製剤化組成物及び方法
MX343559B (es) 2010-04-29 2016-11-10 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulacion de la expresion de transtiretina.
KR102005337B1 (ko) * 2014-01-09 2019-07-30 에스케이하이닉스 주식회사 전압 변환 장치
US10799808B2 (en) 2018-09-13 2020-10-13 Nina Davis Interactive storytelling kit

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKINC AKIN ET AL.: "A combinatorial library of lipid-like materials for delivery of RNAi therapeutics", NATURE BIOTECHNOLOGY MAY 2008 LNKD-PUBMED:18438401, vol. 26, no. 5, May 2008 (2008-05), pages 561-569, XP002577899, ISSN: 1546-1696, the whole document *
KUROSAWA ET AL.: "Selective silencing of a mutant transthyretin allele by small interfering RNAs", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ACADEMIC PRESS INC. ORLANDO, FL, US LNKD-DOI:10.1016/J.BBRC.2005.09.142, vol. 337, no. 3, 25 November 2005 (2005-11-25), pages 1012-1018, XP005165808, ISSN: 0006-291X, figures 1-5 *
STEIN THOR D. ET AL.: "Neutralization of transthyretin reverses the neuroprotective effects of secreted amyloid precursor protein (APP) in APPSW mice resulting in tau phosphorylation and loss of hippocampal neurons: support for the amyloid hypothesis." THE JOURNAL OF NEUROSCIENCE: THE OFFICIAL JOURNAL OF THE SOCIETY FOR NEUROSCIENCE, 1 SEP. 2004, LNKD- PUBMED:15342738, vol. 24, no. 35, 1 September 2004 (2004-09-01), pages 7707-7717, XP002577897, ISSN: 1529-2401, figure 5 *
ZIMMERMANN TRACY S. ET AL.: "RNAi-mediated gene silencing in non-human primates." NATURE 4 MAY 2006, LNKD-PUBMED:16565705, vol. 441, no. 7089, 4 May 2006 (2006-05-04), pages 111-114, XP002577898, ISSN: 1476-4687, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
NL300965I2 (nl) 2020-07-28
IL302142B1 (en) 2024-03-01
SMT201500176B (it) 2015-09-07
KR20150007359A (ko) 2015-01-20
EA036772B1 (ru) 2020-12-18
US20100120893A1 (en) 2010-05-13
PT2937418T (pt) 2018-01-23
SI2937418T1 (en) 2018-02-28
LUC00098I2 (ru) 2019-12-24
PL2937418T3 (pl) 2018-04-30
US20160264963A1 (en) 2016-09-15
CN106834291A (zh) 2017-06-13
US8168775B2 (en) 2012-05-01
IL243178A0 (en) 2016-02-29
KR102354558B1 (ko) 2022-01-25
SG10201912276XA (en) 2020-02-27
CA3018487A1 (en) 2010-04-29
HK1258859A1 (zh) 2019-11-22
US9234196B2 (en) 2016-01-12
HK1156348A1 (en) 2012-06-08
DK2937418T3 (en) 2018-01-22
IL281434B1 (en) 2023-05-01
EP3354733A1 (en) 2018-08-01
IL212428A0 (en) 2011-06-30
HUS1900004I1 (hu) 2019-03-28
ES2656516T3 (es) 2018-02-27
KR20220012422A (ko) 2022-02-03
LUC00098I1 (ru) 2019-01-31
HUE037875T2 (hu) 2018-09-28
AU2009307677B2 (en) 2015-07-30
HUE026604T2 (hu) 2016-06-28
IL310600A (en) 2024-04-01
US20190309293A1 (en) 2019-10-10
CA2739895A1 (en) 2010-04-29
CN106834291B (zh) 2020-09-29
US20230257740A1 (en) 2023-08-17
ES2543004T3 (es) 2015-08-13
CY1116944T1 (el) 2017-04-05
JP2012506254A (ja) 2012-03-15
US20140194493A1 (en) 2014-07-10
JP2018007666A (ja) 2018-01-18
NZ602404A (en) 2014-04-30
CN102186978A (zh) 2011-09-14
EP2937418B1 (en) 2017-10-18
WO2010048228A3 (en) 2010-09-16
JP2019205442A (ja) 2019-12-05
MX344354B (es) 2016-12-14
JP2018171072A (ja) 2018-11-08
EA201792626A1 (ru) 2018-08-31
CN103937793A (zh) 2014-07-23
KR102031027B1 (ko) 2019-10-14
SI2344639T1 (sl) 2015-09-30
KR101635436B1 (ko) 2016-07-01
JP2022160408A (ja) 2022-10-19
US10240152B2 (en) 2019-03-26
CN103937793B (zh) 2017-08-11
LTPA2019501I1 (lt) 2019-02-25
IL302142B2 (en) 2024-07-01
HRP20180093T1 (hr) 2018-02-23
EP3354733B1 (en) 2020-12-09
NZ592867A (en) 2013-05-31
PL2344639T3 (pl) 2015-10-30
LTC2937418I2 (lt) 2019-12-27
NO2019004I1 (no) 2019-01-29
AU2009307677C1 (en) 2022-09-22
EA029762B1 (ru) 2018-05-31
US8741866B2 (en) 2014-06-03
HK1216652A1 (zh) 2016-11-25
NO2937418T3 (ru) 2018-03-17
IL281434B2 (en) 2023-09-01
EA201170591A1 (ru) 2011-12-30
KR101624869B1 (ko) 2016-05-30
CY2019005I2 (el) 2019-11-27
KR102578331B1 (ko) 2023-09-15
SG10201809460SA (en) 2018-11-29
US20200283766A1 (en) 2020-09-10
MX2011004268A (es) 2011-06-01
MX2018013398A (es) 2023-01-05
US20120225927A1 (en) 2012-09-06
JP5791505B2 (ja) 2015-10-07
PT2344639E (pt) 2015-09-07
ZA201102876B (en) 2015-06-24
IL281434A (en) 2021-04-29
KR20180017245A (ko) 2018-02-20
NL300965I1 (nl) 2019-02-06
CA2739895C (en) 2018-09-25
CY2019005I1 (el) 2019-11-27
JP2015062420A (ja) 2015-04-09
IL302142A (en) 2023-06-01
EP2344639A2 (en) 2011-07-20
EP2344639B1 (en) 2015-04-22
CY1120174T1 (el) 2018-12-12
EP3848461A1 (en) 2021-07-14
WO2010048228A2 (en) 2010-04-29
LT2937418T (lt) 2018-02-12
JP6553780B2 (ja) 2019-07-31
EP2937418A1 (en) 2015-10-28
JP7500658B2 (ja) 2024-06-17
KR20160079921A (ko) 2016-07-06
MX360460B (es) 2018-11-05
CN102186978B (zh) 2014-03-12
EA201400170A1 (ru) 2015-03-31
AU2009307677A1 (en) 2010-04-29
HRP20150796T1 (hr) 2015-09-11
SG10201703242XA (en) 2017-06-29
DK2344639T3 (en) 2015-07-27
US20170321213A1 (en) 2017-11-09
IL243178B (en) 2021-03-25
CA3222620A1 (en) 2010-04-29
BRPI0919732A2 (pt) 2015-12-08
JP6371446B2 (ja) 2018-08-08
KR20110073592A (ko) 2011-06-29
KR20190116553A (ko) 2019-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA020312B1 (ru) Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина
JP6933670B2 (ja) Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
CN103890000B (zh) 血管生成素样3(ANGPTL3)iRNA组合物及其使用方法
JP5723378B2 (ja) トランスサイレチン（ｔｔｒ）を阻害する脂質製剤化組成物及び方法
JP5860029B2 (ja) トランスチレチン（ＴＴＲ）関連眼アミロイドーシスのためのｓｉＲＮＡ療法
CN107201364A (zh) 用于抑制载脂蛋白c‑iii（apoc3）基因表达的组合物与方法
EA019531B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Eg5 И VEGF
CN104854242A (zh) PCSK9 iRNA组合物及其使用方法
CN104540948A (zh) 用于抑制alas1基因表达的组合物与方法
CN105793423A (zh) 用于抑制lect2基因表达的组合物和方法
TWI694080B (zh) 抑制ａｌａｓ１基因表現的組合物及方法
AU2017204161A1 (en) SiRNA therapy for transthyretin (TTR) related ocular amyloidosis