PT2344639E - Composição e métodos de inibição da expressão de transtirretina - Google Patents

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PT2344639E
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Dinah Wen-Yee Sah
Rene Alvarez
Stuart Milstein
Qingmin Chen
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Description

DESCRIÇÃO
"COMPOSIÇÃO E MÉTODOS DE INIBIÇÃO DA EXPRESSÃO DE TRANSTIRRETINA" A invenção refere-se a um ácido ribonucleico de cadeia dupla (ARNds) que visa um gene de transtirretina (TTR), e a métodos de utilização do ARNds para inibir a expressão de TTR. A transtirretina (TTR) é uma proteína de ligação da hormona tiroideia segregada. A TTR liga e transporta a proteína de ligação de retinol (RBP)/ Vitamina A, e a tiroxina sérica (T4) no plasma e líquido cefalorraquidiano.
Tanto a TTR de sequência normal como a TTR de sequência variante originam amiloidose. A TTR de sequência normal origina amiloidose cardíaca em pessoas que são idosas e é designada amiloidose sistémica senil (SSA) (também designada amiloidose cardíaca senil (SCA)). A SSA é frequentemente acompanhada por depósitos microscópicos em muitos outros órgãos. As mutações de TTR aceleram o processo de formação de amiloide de TTR e são o fator de risco mais importante para o desenvolvimento de amiloidose de TTR clinicamente significativa (também designada ATTR (amiloidose de tipo transtirretina)). Sabe-se que mais do que 85 variantes amiloidogénicas de TTR originam amiloidose familiar sistémica. 0 fígado é o sítio principal de expressão de TTR. Outros sítios de expressão significativa incluem o plexo coroideu, retina e pâncreas. A amiloidose de TTR manifesta-se em várias formas. Quando o sistema nervoso periférico é afetado mais proeminentemente, a doença é designada polineuropatia amiloidótica familiar (FAP). Quando está envolvido principalmente o coração mas o sistema nervoso não está, a doença é designada cardiomiopatia amiloidótica familiar (FAC). Um terceiro tipo principal de amiloidose de TTR é designado amiloidose leptomeningeal/do SNC (Sistema Nervoso Central).
Foi demonstrado que as moléculas de ARN de cadeia dupla (ARNds) bloqueiam a expressão de genes num mecanismo regulador altamente conservado conhecido como interferência de ARN (iARN) . A WO 99/32619 (Fire et al. ) divulgou a utilização de um ARNds com pelo menos 25 nucleótidos de comprimento para inibir a expressão de genes em C. elegans. Foi também demonstrado que o ARNds degrada ARN alvo noutros organismos, incluindo plantas (ver, por exemplo, WO 99/53050, Waterhouse et ai./ e WO 99/61631, Heifetz et al.), Drosophila (ver, por exemplo, Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200) e mamíferos (ver WO 00/44895, Limmer; e DE 101 00 586.5, Kreutzer et al.). A U.S. 20070207974 divulga ARNsis funcionais e hiperfuncionais. A U.S. 20090082300 divulga moléculas antimensageiras dirigidas contra TTR. A Pat. U.S. N.° 7,250,496 divulga microARNs dirigidos contra TTR.
Stein et al. (The Journal of Neuroscience 24, 7707-7717 (2004)) descreve que a neutralização de transtirretina inverte os efeitos neuroprotetores da proteína precursora de amiloide segregada em ratos. Kurosawa et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications 337, 1012-1018 (2005)) descreve o silenciamento seletivo de um alelo de transtirretina mutante por ARNs interferentes pequenos. A invenção é definida pelas reivindicações.
Num aspeto, a invenção proporciona um ácido ribonucleico de cadeia dupla (ARNds) para inibir a expressão de transtirretina (TTR) , em que o referido ARNds compreende uma cadeia mensageira e uma cadeia antimensageira, em que a cadeia antimensageira compreende uma região complementar a uma parte de um ARNm que codifica a transtirretina (TTR) , em que a referida região de complementaridade tem 19 nucleótidos de comprimento, a cadeia antimensageira compreende a SEQ ID NO:170, e cada cadeia do ARNds tem 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 nucleótidos de comprimento. É também descrito um ácido ribonucleico de cadeia dupla (ARNds) para inibir a expressão de transtirretina (TTR), em que o referido ARNds compreende uma cadeia mensageira e uma cadeia antimensageira, em que a cadeia antimensageira compreende uma região complementar a uma parte de um ARNm que codifica a transtirretina (TTR) , em que a referida região de complementaridade tem menos de 30 nucleótidos de comprimento e a cadeia antimensageira compreende 15 ou mais nucleótidos contíguos de SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO:450, SEQ ID NO:730 ou SEQ ID N0:1010. A cadeia mensageira pode compreender também 15 ou mais nucleótidos contíguos de SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:449, SEQ ID NO:729 ou SEQ ID NO: 1009.
Noutra forma de realização, a cadeia mensageira consiste na SEQ ID NO:449 e a cadeia antimensageira consiste na SEQ ID NO:450. Ainda noutra forma de realização relacionada, a cadeia mensageira consiste em SEQ ID NO:729 e a cadeia antimensageira consiste na SEQ ID NO:730. Ainda noutra forma de realização relacionada, a cadeia mensageira consiste na SEQ ID NO: 1009 e a cadeia antimensageira consiste na SEQ ID NO:1010. O ARNds pode compreender também uma cadeia mensageira selecionada das Tabelas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 e 16, e uma cadeia antimensageira selecionada das Tabelas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 e 16.
De acordo com a invenção, a região de complementaridade entre a cadeia antimensageira do ARNds e o ARNm que codifica a transtirretina tem 19 nucleótidos de comprimento. É também descrita uma região de complementaridade que consiste na SEQ ID NO: 169. De acordo com a invenção, cada cadeia do ARNds tem 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 nucleótidos de comprimento. Noutra forma de realização, cada cadeia tem 21 nucleótidos de comprimento. É também descrito um ARNds para inibir a expressão de transtirretina que não dissocia um ARNm de TTR entre o nucleótido de adenina na posição 637 de SEQ ID NO:1331 e o nucleótido de guanina na posição 638 de SEQ ID NO:1331. O ARNds descrito pode dissociar um ARNm de TTR entre o nucleótido de guanina na posição 636 de SEQ ID NO: 1331 e o nucleótido de adenina na posição 637 de SEQ ID NO:1331. O ARNds descrito pode emparelhar com um ARNm de TTR entre o nucleótido de guanina na posição 628 de SEQ ID NO: 1331 e o nucleótido de uracilo na posição 646 de SEQ ID NO: 1331.
Noutras formas de realização relacionadas, a invenção proporciona ARNds da invenção para inibir a expressão de transtirretina em que o ARNds compreende um ou mais nucleótidos modificados. Em formas de realização relacionadas, pelo menos um nucleótido modificado (ou nucleótidos) é escolhido do grupo que consiste em: um nucleótido modificado com 2'-0-metilo, um nucleótido compreendendo um grupo 5'-fosforotioato, e um nucleótido terminal ligado a um derivado de colesterilo ou grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico. Noutra forma de realização relacionada, o nucleótido modificado é escolhido do grupo de: um nucleótido modificado com 2'-desoxi-2'- fluoro, um nucleótido modificado com 2'-desoxi, um nucleótido bloqueado, um nucleótido abásico, nucleótido modificado com 2'-amino, nucleótido modificado com 2'-alquilo, nucleótido de morfolino, um fosforamidato e um nucleótido compreendendo uma base não natural. Em certas formas de realização, o ARNds compreende pelo menos um nucleótido modificado com 2'-0-metilo.
Noutras formas de realização, um ARNds como descrito acima para inibir a expressão de transtirretina está conjugado com um ligando, ou formulado numa formulação de lipidos. A formulação de lipidos pode ser uma formulação de LNP, uma formulação de LNP01, uma formulação de XTC-SNALP ou uma formulação de SNALP. A formulação de XTC-SNALP pode ser como se segue: utilizando 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (XTC) com XTC/DPPC/Colesterol/PEG-cDMA numa proporção de 57,1/7,1/34,4/1,4 e uma proporção de lípido:ARNsi de cerca de 7. Ainda noutras formas de realização relacionadas, a cadeia mensageira do ARNds consiste na SEQ ID NO:1009 e a cadeia antimensageira consiste na SEQ ID NO:1010, e o ARNds é formulado num formulação de XTC-SNALP como se segue: utilizando 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]— dioxolano (XTC) com um XTC/DPPC/Colesterol/PEG-cDMA numa proporção de 57,1/7,1/34,4/1,4 e uma proporção de lípido:ARNsi de cerca de 7. Alternativamente, um ARNds, tal como aqueles descritos acima, pode ser formulado numa formulação de LNP09 como se segue: utilizando XTC/DSPC/ Co1/PEG2ooo_C14 numa proporção de 50/10/38,5/1,5% molar e uma proporção de lípido:ARNsi de cerca de 11:1. Noutra variante, o ARNds é formulado numa formulação de LNPll como se segue: utilizando MC3/DSPC/Col/PEG2ooo_C14 numa proporção de 50/10/38,5/1,5% molar e uma proporção de lípido:ARNsi de cerca de 11:1. O ARNds pode ser também formulado numa formulação de LNP09 ou uma formulação de LNPll e reduz os níveis de ARNm de TTR em cerca de 85 a 90% a uma dose de 0,3 mg/kg, relativamente a um grupo de controlo de PBS. Também, o ARNds pode ser formulado numa formulação de LNP09 ou uma formulação de LNPll e reduz os níveis de ARNm de TTR em cerca de 50% a uma dose de 0,1 mg/kg, relativamente a um grupo de controlo de PBS. O ARNds pode ser formulado numa formulação de LNP0 9 ou uma formulação de LNPll e reduz os níveis da proteína TTR de uma maneira dependente da dose relativamente a um grupo de controlo de PBS como medidos por uma transferência de Western. O ARNds pode ser formulado numa formulação de SNALP como se segue: utilizando DlinDMA com um DLinDMA/DPPC/Colesterol/PEG2000-cDMA numa proporção de 57,1/7,1/34,4/1,4 e uma proporção de lípido:ARNsi de cerca de 7. A administração de um ARNds, tal como aqueles descritos acima, para inibir a expressão de transtirretina, pode resultar em cerca de 95% de inibição da expressão de ARNm de TTR como medida por um ensaio de PCR em tempo real, em que a célula é uma célula HepG2 ou uma célula Hep3B, e em que a concentração do ARNds é ΙΟηΜ. A administração do ARNds a uma célula pode resultar em cerca de 74% de inibição da expressão de ARNm de TTR como medida por um ensaio de ADN ramificado, em que a célula é uma célula
HepG2 ou uma célula Hep3B, e em que a concentração do ARNds é ΙΟηΜ. O ARNds pode ter uma IC50 inferior a 10 pM numa célula HepG2, em que a concentração do ARNds é ΙΟηΜ. O ARNds pode ter uma ED50 de cerca de 1 mg/kg. A administração do ARNds pode reduzir o ARNm de TTR em cerca de 80% no fígado de macaco cinomolgo, em que a concentração do ARNds é de 3 mg/kg. A administração do ARNds pode não resultar em atividade imunoestimulante em células
mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) como medida por ensaios ELISA de IFN-alfa e TNF-alfa. A administração do ARNds pode reduzir os níveis de ARNm de TTR no fígado em cerca de 97% ou os níveis da proteína TTR no soro em cerca de 90%, em que a concentração do ARNds é de 6 mg/kg. A administração do ARNds pode reduzir os níveis de ARNm de TTR no fígado e/ou níveis da proteína TTR no soro até 22 dias, em que a concentração do ARNds é 6 mg/kg ou 3 mg/kg. O ARNds pode suprimir os níveis da proteína TTR no soro até ao dia 14 após tratamento quando administrados a um indivíduo necessitado do mesmo a 1 mg/kg ou 3 mg/kg. O ARNds pode reduzir a expressão de TTR em 98,9% numa célula Hep3B a uma concentração de 0,lnM como medida por PCR em tempo real. O ARNds pode reduzir a expressão de TTR em 99,4% numa célula Hep3B a uma concentração de lOnM como medida por PCR em tempo real.
Além disso é descrito um ácido ribonucleico de cadeia dupla (ARNds) para inibir a expressão de transtirretina (TTR), em que o referido ARNds compreende uma cadeia mensageira e uma cadeia antimensageira, compreendendo a cadeia antimensageira uma região complementar a uma parte de um ARNm que codifica a transtirretina (TTR), em que a referida região de complementaridade tem menos de 30 nucleótidos de comprimento e em que o ARNds compreende uma cadeia mensageira selecionada das Tabelas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 e 16, e uma cadeia antimensageira selecionada das Tabelas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 e 16.
Noutra forma de realização, a invenção proporciona um ácido ribonucleico de cadeia dupla (ARNds) para inibir a expressão de transtirretina (TTR), em que o referido ARNds compreende uma cadeia antimensageira compreendendo uma região complementar a 19 nucleótidos dos nucleótidos 618-648 de SEQ ID NO: 1331 e em que a referida cadeia antimensageira emparelha com a guanina na posição 628 da SEQ ID NO: 1331 .
Em certas formas de realização, a invenção proporciona uma célula contendo qualquer um dos ARNdss da invenção. Em certas outras formas de realização, a invenção proporciona um vetor que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica pelo menos uma cadeia de qualquer um dos ARNdss da invenção. Em certas formas de realização, o vetor está numa célula.
Noutras formas de realização, a invenção proporciona uma composição farmacêutica para inibir a expressão de um gene de TTR compreendendo qualquer um dos ARNdss da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. É também descrita uma composição farmacêutica para inibir a expressão de um gene de TTR compreendendo um ARNds e uma formulação de SNALP, em que o ARNds compreende uma cadeia antimensageira que tem menos de 30 nucleótidos de comprimento e compreende 15 ou mais nucleótidos contíguos da SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 4 5 0, SEQ ID NO:730 ou SEQ ID N0:1010, e em que a formulação de SNALP compreende DlinDMA, DPPC, Colesterol e PEG2000-CDMA numa proporção de 57,1/7,1/34,4/1,4 respetivamente.
Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um método de inibição da expressão de TTR numa célula, em que o método compreende: (a) pôr em contacto a célula com qualquer um dos ARNdss da invenção; e (b) manter a célula produzida no passo (a) durante um tempo suficiente para obter degradação do ARNm transcrito de um gene de TTR, inibindo, desse modo, a expressão do gene de TTR na célula, na condição de que seja excluído qualquer método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia.
Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um ARNds da invenção para ser utilizado num método de tratamento de um distúrbio mediado pela expressão de TTR, em que o humano tem amiloidose de transtirretina e/ou distúrbio hepático. Em formas de realização relacionadas, o ARNds é para ser administrado ao humano a cerca de 0,01, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5 ou 5,0 mg/kg. Ainda noutra forma de realização relacionada, o ARNds é para ser administrado ao humano a cerca de 1,0 mg/kg. O humano pode ser ainda proporcionado com um transplante hepático. A administração do ARNds pode reduzir o ARNm de TTR em cerca de 80% no fígado humano, em que a concentração do ARNds é 3 mg/kg. A administração do ARNds pode não resultar em atividade imunoestimulante no humano como medida por ensaios ELISA de IFN-alfa e TNF-alfa. A administração do ARNds pode reduzir os níveis de ARNm de TTR no fígado em cerca de 97% ou os níveis da proteína TTR no soro em cerca de 90%, em que a concentração do ARNds é 6 mg/kg. A administração do ARNds pode reduzir os níveis de ARNm de TTR no fígado e/ou níveis da proteína TTR no soro durante até 22 dias, em que a concentração do ARNds é 6 mg/kg ou 3 mg/kg. O ARNds pode ser formulado numa formulação de LNP09 como se segue: utilizando XTC/DSPC/Col/PEG2ooo_C14 numa proporção de 50/10/38,5/1,5% molar e uma proporção de lípido:ARNsi de cerca de 11:1. O ARNds pode ser formulado numa formulação de LNPll como se segue: utilizando MC3/DSPC/Col/PEG2ooo_C14 numa proporção de 50/10/38,5/1,5% molar e uma proporção de lípido:ARNsi de cerca de 11:1. O ARNds pode ser formulado numa formulação de LNP09 ou uma formulação de LNPll e reduz os níveis de ARNm de TTR em cerca de 85 a 90% a uma dose de 0,3 mg/kg, relativamente a um grupo de controlo de PBC. O ARNds pode ser formulado numa formulação de LNP0 9 ou uma formulação de LNPll e reduz os níveis de ARNm de TTR em cerca de 50% a uma dose de 0,1 mg/kg, relativamente a um grupo de controlo de PBC. O ARNds pode ser formulado numa formulação de LNP09 ou uma formulação de LNPll e reduz os níveis da proteína TTR de uma maneira dependente da dose relativamente a um grupo de controlo de PBC como medidos por uma transferência de Western. A administração do ARNds pode suprimir os níveis da proteína TTR no soro até ao dia 14 após tratamento quando administrado ao humano a 1 mg/kg ou 3 mg/kg. 0 ARNds pode ser formulado numa formulação de SNALP como se segue: utilizando DlinDMA com um DLinDMA/DPPC/Colesterol/PEG2000-cDMA numa proporção de 57,1/7,1/34,4/1,4 e uma proporção de lípido:ARNsi de cerca de 7. É descrita a utilização de um ARNds para tratar um distúrbio mediado pela expressão de TTR compreendendo administrar, a um humano necessitado desse tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos ARNdss descritos no Sumário, acima. A utilização de um ARNds num método de inibição da expressão de TTR numa célula, em que o método compreende (a) pôr em contacto a célula com um ARNds descrito no Sumário, acima; e (b) manter a célula produzida no passo (a) durante um tempo suficiente para obter degradação do ARNm transcrito de um gene de TTR, inibindo, desse modo, a expressão do gene de TTR na célula. A FIG. 1 é um gráfico dos níveis de TNFalfa e IFNalfa em PBMCs humanas cultivadas após transfeção com ARNsis de TTR.
As FIG. 2A e 2B são curvas dose-resposta para AD-18324 e AD-18328, respetivamente, em células HepG2. A FIG. 3 é uma curva dose-resposta para AD-18246 em células HepG2. A FIG. 4A e a FIG. 4B mostram a inibição do ARNm hepático e os níveis de proteína no plasma, respetivamente, em ratos H129-mTTR-K0/iN0S-K0/hTTR transgénicos por uma administração de bolus intravenoso de TTR-ARNds (AD-18324, AD-18328 e AD-18246) formulado em LNP01. A FIG. 5 é um gráfico que resume as medições dos níveis de ARNm de TTR em fígados de primatas não humanos após 15 minutos de infusão intravenosa de TTR-ARNds (AD-18324 e AD-18328) formulado em SNALP. A FIG. 6A e a FIG. 6B mostram a inibição do ARNm hepático de TTR V30M humano e os níveis de proteína sérica, respetivamente, em ratos transgénicos por uma administração de bolus intravenoso de SNALP-18328. Foram determinadas as médias dos grupos, normalizadas ao grupo de controlo de PBS, e em seguida representadas graficamente. As barras de erro representam desvios padrão. É indicada a percentagem de redução da média do grupo, relativamente ao PBS, para os grupos de SNALP-1955 e SNALP-18328. (*** p< 0,001, ANOVA unifatorial, com teste post-hoc de Dunn). A FIG. 7A e a FIG. 7B mostra a durabilidade da redução de ARNm hepático de TTR V30M humano e os níveis de proteína sérica, respetivamente, em ratos transgénicos ao longo de 22 dias após uma única administração de bolus intravenoso de SNALP-18328. Foram determinadas as médias dos grupos. Os níveis de ARNm de TTR/GAPDH foram normalizados aos níveis do dia 0 e representados graficamente. As percentagens de redução dos níveis de ARNm de TTR normalizados relativamente ao SNALP-1955 para cada ponto no tempo foram calculadas e são indicados para os grupos de SNALP-18328. (*** p< 0,001, ANOVA unifatorial, com teste post-hoc de Dunn). A FIG. 8 mostra o curso ao longo do tempo dos níveis de proteína TTR sérica em primatas não humanos ao longo de 14 dias após uma única infusão intravenosa de 15 minutos de SNALP-18328. A FIG. 9 mostra a redução da imunorreatividade de TTR em vários tecidos de ratos com TTR/HSF-1 V30M humana anulada após administração de bolus intravenoso de SNALP-18328. E, esófago; S, estômago; II, intestino/duodeno; 14, intestino/cólon; N, tecido nervoso; D, gânglios da raiz dorsal. A FIG. 10 mostra as medições dos níveis de ARNm de TTR em fígados de primatas não humanos após infusão intravenosa de 15 minutos de XTC-SNALP-18328.
As FIGs. 11A e 11B mostram as medições de ARNm de TTR e dos níveis de proteína sérica, respetivamente, em fígados de primatas não humanos após infusão intravenosa de 15 minutos de LNP09-18328 ou LNPll-18328. A FIG. 11C mostra o curso ao longo do tempo dos níveis de proteína TTR sérica ao longo de 28 dias após uma infusão intravenosa de 15 minutos de 0,3 mg/kg de LNP09-18328, em comparação com o grupo de controlo de PBS. A FIG. 12 mostra a sequência de ARNm de TTR humano (Ref. Seq. NM_000371.3, SEQ ID NO:1331).
As FIGs. 13A e 13B são as sequências de ARNm de TTR humano e de ratazana, respetivamente. A FIG. 13A é a sequência de ARNm de TTR humano (Ref. Seq. NM_000371.2, SEQ ID NO: 1329) . A FIG. 13B é a sequência de ARNm de TTR de ratazana (Ref. Seq. NM_012681.1, SEQ ID NO: 1330). A FIG. 14 mostra o alinhamento de nucleótidos de NM_000371.3, NM_000371.2 e AD-18328. A FIG. 15 ilustra os sintomas e mutações na TTR associada a neuropatia amiloidótica familiar, cardiomiopatia amiloidótica familiar e amiloidose do SNC. A FIG. 16 mostra a redução dos níveis de ARNm de TTR no fígado com SNALPs-18534 com diferentes durações de infusão. Grupos de animais (n=4/grupo) foram administrados com 1 mg/kg de SNALP-18534 através de uma infusão de 15 minutos, ou 1, 2 ou 3 horas. Quarenta e oito horas depois, as ratazanas foram sacrificadas e os fígados colhidos. Os níveis de ARNm de TTR e GAPDH foram medidos a partir dos lisados dos fígados utilizando o ensaio bDNA Quantigene. A proporção dos níveis de ARNm de TTR relativamente ao GAPDH foi calculada para cada animal. Foram determinadas as médias dos grupos e normalizadas a um grupo de controlo de PBS, e em seguida representadas graficamente. As barras de erro representam desvios padrão. (*** p < 0,001, ANOVA unifatorial com teste post-hoc de Bonferroni, relativamente ao PBS). A FIG. 17 mostra as medições dos níveis de ARNm de TTR em fígados de ratazanas após infusão intravenosa de 15 minutos de LNP07-18534 ou LNP08-18534.
A FIG. 18 mostra a inibição in vivo dos níveis de ARNm de TTR endógeno em fígados de Ratazanas Sprague-Dawley após uma infusão IV de 15 minutos de LNP09-18534 ou LNPll-18534. Grupos de animais (n=4/grupo) foram administrados por via intravenosa com 0,01, 0,03, 0,1 ou 0,3 mg/kg de LNP09-18534, LNP-11-18534; ou PBS através de uma infusão de 15 minutos. Quarenta e oito horas depois, os animais foram sacrificados e os fígados colhidos. Os níveis de ARNm de TTR e GAPDH foram medidos a partir de lisados de biopsia de fígado utilizando o ensaio bDNA Quantigene. Foi calculada a proporção dos níveis de ARNm de TTR relativamente ao GAPDH para cada animal. Foram determinadas as médias dos grupos, normalizadas ao grupo de controlo de PBS, e em seguida representadas graficamente. As barras de erro representam desvios padrão. São descritos ARNdss e métodos de utilização dos ARNdss para inibir a expressão de um gene de TTR numa célula ou num mamífero em que o ARNds visa um gene de TTR. São também descritos composições e métodos de tratamento de condições patológicas e doenças, tais como uma amiloidose de TTR, num mamífero, provocadas pela expressão de um gene de TTR. 0 ARNds coordena a degradação específica da sequência de ARNm através de um processo conhecido como interferência de ARN (iARN).
Os ARNdss das composições aqui caracterizadas incluem uma cadeia de ARN (a cadeia antimensageira) possuindo uma região que tem menos de 30 nucleótidos de comprimento, geralmente 19-24 nucleótidos de comprimento, e é substancialmente complementar a pelo menos parte de um transcrito de ARNm de um gene de TTR. A utilização destes ARNdss possibilita a degradação direcionada de ARNms de genes que estão implicados em patologias associadas à expressão de TTR em mamíferos. Em particular, doses muito baixas de ARNdss de TTR podem mediar específica e eficientemente a iARN, resultando numa inibição significativa da expressão de um gene de TTR. Utilizando ensaios baseados em células, a presente requerente demonstrou que os ARNdss que visam a TTR podem mediar específica e eficientemente a iARN, resultando numa inibição significativa da expressão de um gene de TTR. Assim, os métodos e composições que incluem estes ARNdss são úteis para tratar processos patológicos que podem ser mediados regulando negativamente a TTR, tal como no tratamento de um distúrbio hepático ou de uma amiloidose de TTR, por exemplo, FAP.
Os métodos e composições que contêm um ARNds de TTR são úteis para tratar processos patológicos mediados pela expressão de TTR, tal como uma amiloidose de TTR. Um método de tratamento de um distúrbio mediado pela expressão de TTR pode incluir a administração, a um humano necessitado desse tratamento, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ARNds dirigido à TTR. Um ARNds pode ser administrado ao humano a cerca de 0,01, 0,1, 0,5, 1,0, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 mg/kg. A seguinte descrição detalhada divulga como preparar e utilizar as composições contendo ARNdss para inibir a expressão de um gene de TTR, bem como as composições e métodos de tratamento de doenças e distúrbios provocados pela expressão deste gene. As composições farmacêuticas descritas incluem um ARNds que tem uma cadeia antimensageira compreendendo uma região de complementaridade que tem menos de 30 nucleótidos de comprimento, geralmente 19-24 nucleótidos de comprimento, e é substancialmente complementar a pelo menos parte de um transcrito de ARN de um gene de TTR, em conjunto com um veiculo farmaceuticamente aceitável. As composições incluem também um ARNds que tem uma cadeia antimensageira possuindo uma região de complementaridade que tem menos de 30 nucleótidos de comprimento, geralmente 19-24 nucleótidos de comprimento, e é substancialmente complementar a pelo menos parte de um transcrito de ARN de um gene de TTR.
A cadeia mensageira de um ARNds pode incluir 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou mais nucleótidos contíguos de SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:449, SEQ ID NO:729 ou SEQ ID NQ:1009. A cadeia antimensageira de um ARNds pode incluir 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou mais nucleótidos contíguos de SEQ ID NO: 17 0, SEQ ID NO:450, SEQ ID NO:730 ou SEQ ID N0:1010. Numa forma de realização, a cadeia mensageira de um ARNds consiste na SEQ ID NO:449 e a cadeia antimensageira consiste na SEQ ID NO:450. Numa forma de realização, a cadeia mensageira de um ARNds consiste na SEQ ID NO:729 e a cadeia antimensageira consiste na SEQ ID NO:730. Numa forma de realização, a cadeia mensageira de um ARNds consiste na SEQ ID NO:1009 da mesma e a cadeia antimensageira consiste na SEQ ID NO:1010 .
Um ARNds pode incluir pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais nucleótidos modificados. Um nucleótido modificado pode incluir um nucleótido modificado com 2'-0-metilo, um nucleótido compreendendo um grupo 5'-fosforotioato, e/ou um nucleótido terminal ligado a um derivado de colesterilo ou grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico. Numa forma de realização, um nucleótido modificado pode incluir um nucleótido modificado com 2'-desoxi-2'-fluoro, um nucleótido modificado com 2'-desoxi, um nucleótido bloqueado, um nucleótido abásico, nucleótido modificado com 2'-amino, nucleótido modificado com 2'-alquilo, nucleótido de morfolino, um fosforamidato e/ou um nucleótido compreendendo uma base não natural. A região de complementaridade de um ARNds pode ter pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou mais nucleótidos de comprimento. A região de complementaridade pode incluir 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou mais nucleótidos contíguos de SEQ ID NO:169.
Cada cadeia de um ARNds pode ter 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais nucleótidos de comprimento. 0 ARNds pode incluir uma cadeia mensageira, ou um fragmento com 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleótidos da mesma, selecionada das Tabelas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 e 16, e uma cadeia antimensageira, ou um fragmento com 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleótidos da mesma, selecionada das Tabelas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 e 16. A administração de um ARNds a uma célula pode resultar em cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% ou mais de inibição da expressão do ARNm de TTR como medida por um ensaio de PCR em tempo real. A administração de um ARNds a uma célula pode resultar em cerca de 40% a 45%, 45% a 50%, 50% a 55%, 55% a 60%, 60% a 65%, 65% a 70%, 70% a 75%, 75% a 80%, 80% a 85%, 85% a 90%, 90% a 95% ou mais de inibição da expressão do ARNm de TTR como medida por um ensaio de PCR em tempo real. A administração de um ARNds a uma célula pode resultar em cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% ou mais de inibição da expressão do ARNm de TTR como medida por um ensaio de ADN ramificado. A administração de um ARNds a uma célula pode resultar em cerca de 40% a 45%, 45% a 50%, 50% a 55%, 55% a 60%, 60% a 65%, 65% a 70%, 70% a 75%, 75% a 80%, 80% a 85%, 85% a 90%, 90% a 95% ou mais de inibição da expressão do ARNm de TTR como medida por um ensaio de ADN ramificado.
Um ARNds pode ter uma IC50 inferior a Ο,ΟΙρΜ, Ο,ΙρΜ, ΙρΜ, 5pM, 10 pM, ΙΟΟρΜ ou lOOOpM. Um ARNds pode ter uma ED50 de cerca de 0,01, 0,1, 1, 5 ou 10 mg/kg. A administração de um ARNds pode reduzir o ARNm de TTR em cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% ou mais em macacos cinomolgos. A administração de um ARNds pode reduzir os níveis de ARNm de TTR no fígado em cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% ou mais ou os níveis da proteína TTR no soro em cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% ou mais. A administração de um ARNds pode reduzir os níveis de ARNm de TTR no fígado e/ou níveis da proteína TTR no soro até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais dias.
Um ARNds pode ser formulado numa formulação de LNP e reduz os níveis de ARNm de TTR em cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% ou mais a uma dose de 0. 1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 mg/kg, relativamente a um grupo de controlo de PBC. Um ARNds pode ser formulado numa formulação de LNP e reduz os níveis da proteína TTR em cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% ou mais relativamente a um grupo de controlo de PBC como medidos por uma transferência de Western. Um ARNds pode suprimir os níveis da proteína TTR no soro até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 dias após tratamento quando administrado a um indivíduo necessitado do mesmo a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 mg/kg.
Por conseguinte, são descritos composições farmacêuticas contendo um ARNds de TTR e um veículo farmaceuticamente aceitável, métodos de utilização das composições para inibir a expressão de um gene de TTR, e métodos de utilização das composições farmacêuticas para tratar doenças provocadas pela expressão de um gene de TTR. 1. Definições
Por conveniência é proporcionado a seguir o significado de certos termos e frases utilizados na descrição, exemplos e reivindicações apensas. Se houver uma discrepância evidente entre a utilização de um termo noutras partes desta descrição e a sua definição proporcionada nesta secção, a definição nesta secção deve prevalecer. "G, " "C," "A" e "U" significam, cada, em geral um nucleótido que contém guanina, citosina, adenina e uracilo como uma base, respetivamente. "T" e "dT" são aqui utilizados indistintamente e referem-se a um desoxirribonucleótido em que a base azotada é timina, por exemplo, desoxirribotimina. No entanto, entender-se-á que o termo "ribonucleótido" ou "nucleótido" ou "desoxirribonucleótido" pode referir-se também a um nucleótido modificado, como detalhado em mais pormenor abaixo, ou uma unidade de substituição substituta. 0 especialista está bem ciente que guanina, citosina, adenina e uracilo podem ser substituídos por outras unidades sem alterar substancialmente as propriedades de emparelhamento das bases de um oligonucleótido compreendendo um nucleótido que tem essa unidade de substituição. Por exemplo, sem limitação, um nucleótido compreendendo inosina como a sua base pode emparelhar com nucleótidos contendo adenina, citosina ou uracilo. Deste modo, os nucleótidos contendo uracilo, guanina ou adenina podem estar substituídos nas sequências de nucleótidos da invenção por um nucleótido contendo, por exemplo, inosina. As sequências que compreendem tais unidades de substituição são formas de realização da invenção.
Como aqui utilizada, "transtirretina" ("TTR") refere-se a um gene numa célula. A TTR é também conhecida como ATTR, HsT2651, PALB, pré-albumina, TBPA e transtirretina (pré-albumina, amiloidose tipo I). A sequência de um transcrito de ARNm de TTR humano pode ser encontrada em NM_000371. A sequência do ARNm de TTR de rato pode ser encontrada em NM_013697.2 e a sequência do ARNm de TTR de ratazana pode ser encontrada em NM_012681.1.
Como aqui utilizada, "sequência alvo" refere-se a uma porção contígua da sequência de nucleótidos de uma molécula de ARNm formada durante a transcrição de um gene de TTR, incluindo o ARNm que é um produto de processamento de ARN de um produto de transcrição primário.
Como aqui utilizado, o termo "cadeia que compreende uma sequência" refere-se a um oligonucleótido que compreende uma cadeia de nucleótidos que é descrita pela sequência referida utilizando a nomenclatura de nucleótidos convencional.
Como aqui utilizado, e salvo indicação em contrário, o termo "complementar, " quando utilizado para descrever uma primeira sequência de nucleótidos em relação a uma segunda sequência de nucleótidos, refere-se à aptidão de um oligonucleótido ou polinucleótido compreendendo a primeira sequência de nucleótidos para hibridizar e formar, em certas condições, uma estrutura de dupla hélice com um oligonucleótido ou polinucleótido compreendendo a segunda sequência de nucleótidos, como será entendido pelo especialista. Tais condições podem ser, por exemplo, condições restringentes, em que as condições restringentes podem incluir: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM, pH 6,4, EDTA 1 mM, 50 °C ou 70 °C durante 12-16 horas, seguido de lavagem. Pode aplicar-se outras condições, tais como as condições fisiologicamente relevantes como podem ser encontradas dentro de um organismo. O especialista será capaz de determinar o conjunto de condições mais apropriadas para um ensaio de complementaridade de duas sequências de acordo com a aplicação final dos nucleótidos hibridizados.
Isto inclui o emparelhamento de bases do oligonucleótido ou polinucleótido compreendendo a primeira sequência de nucleótidos com o oligonucleótido ou polinucleótido compreendendo a segunda sequência de nucleótidos ao longo de todo o comprimento da primeira e segunda sequências de nucleótidos. Tais sequências podem ser aqui referidas como "completamente complementares" em relação uma à outra. No entanto, quando uma primeira sequência é referida como "substancialmente complementar" em relação a uma segunda sequência aqui, as duas sequências podem ser completamente complementares, ou elas podem formar um ou mais, mas geralmente não mais do que 4, 3 ou 2 pares de bases desemparelhadas após hibridação, mantendo ao mesmo tempo a aptidão para hibridizar nas condições mais relevantes para a sua aplicação final. No entanto, quando dois oligonucleótidos são referidos como formando, após hibridação, uma ou mais saliências de cadeia simples, tais saliências não devem ser entendidas como desemparelhamentos no que se refere à determinação da complementaridade. Por exemplo, um ARNds compreendendo um oligonucleótido com 21 nucleótidos de comprimento e outro oligonucleótido com 23 nucleótidos de comprimento, em que o oligonucleótido mais comprido compreende uma sequência de 21 nucleótidos que é completamente complementar ao oligonucleótido mais curto, pode ser ainda referido como "completamente complementar" para os fins aqui descritos.
Sequências "complementares", como aqui utilizadas, podem incluir também, ou ser totalmente formadas a partir de, pares de bases não-Watson-Crick e/ou pares de bases formadas a partir de nucleótidos não naturais e modificados, na medida em que sejam preenchidos os requisitos anteriores em relação à sua aptidão para hibridizar. Tais pares de bases não-Watson-Crick incluem, mas não se limitam ao, emparelhamento G:U de Wobble ou Hoogstein.
Os termos "complementar," "completamente complementar" e "substancialmente complementar" podem ser aqui utilizados em relação à correspondência de bases entre a cadeia mensageira e a cadeia antimensageira de um ARNds, ou entre a cadeia antimensageira de um ARNds e uma sequência alvo, como será entendido a partir do contexto da sua utilização.
Como aqui utilizado, um polinucleótido que é "substancialmente complementar a pelo menos parte de" um ARN mensageiro (ARNm) refere-se a um polinucleótido que é substancialmente complementar a uma porção contígua do ARNm de interesse (por exemplo, um ARNm que codifica a TTR) incluindo um 5' UTR, uma grelha de leitura aberta (ORF), ou um 3' UTR. Por exemplo, um polinucleótido é complementar a pelo menos uma parte de um ARNm de TTR se a sequência é substancialmente complementar a uma porção não interrompida de um ARNm que codifica a TTR. 0 termo "ARN de cadeia dupla" ou "ARNds," como aqui utilizado, refere-se a um complexo de moléculas de ácido ribonucleico, possuindo um estrutura de dupla hélice compreendendo duas cadeias de ácido nucleico antiparalelas e substancialmente complementares, como definido acima. Em geral, a maioria dos nucleótidos de cada cadeia são ribonucleótidos, mas como aqui descrito em pormenor, cada uma ou ambas as cadeias podem incluir também pelo menos um não-ribonucleótido, por exemplo, um desoxirribonucleótido e/ou um nucleótido modificado. Além disso, como utilizado nesta descrição, o "ARNds" pode incluir modificações químicas aos ribonucleótidos, incluindo modificações substanciais em múltiplos nucleótidos e incluindo todos os tipos de modificações aqui divulgados ou conhecidos na técnica. Quaisquer modificações desse tipo, como utilizadas numa molécula de tipo ARNsi, estão abrangidas pelo "ARNds" para os fins desta descrição e reivindicações.
As duas cadeias que formam a estrutura de dupla hélice podem ser porções diferentes de uma molécula de ARN maior, ou podem ser moléculas de ARN separadas. Quando as duas cadeias pertencem a uma molécula maior e, por conseguinte, estão ligadas por uma cadeia ininterrupta de nucleótidos entre a extremidade 3' de uma cadeia e a extremidade 5' da respetiva outra cadeia que forma a estrutura de dupla hélice, a cadeia de ARN de conexão é referida como uma "ansa." Quando as duas cadeias estão unidas covalentemente por um meio diferente de uma cadeia ininterrupta de nucleótidos entre a extremidade 3' de um cadeia e a extremidade 5' da respetiva outra cadeia que forma a estrutura de dupla hélice, a estrutura de conexão é referida como uma "unidade de ligação." As cadeias de ARN podem ter o mesmo ou um número diferente de nucleótidos. 0 número de pares de bases máximo é o número de nucleótidos na cadeia do ARNds mais curta menos quaisquer saliências que estejam presentes na hélice dupla. Além da estrutura de dupla hélice, um ARNds pode compreender uma ou mais saliências de nucleótidos. 0 termo "ARNsi" é aqui também utilizado para se referir a um ARNds como descrito acima.
Como aqui utilizada, uma "saliência de nucleótidos" refere-se ao nucleótido ou nucleótidos desemparelhados que sobressaem a partir da estrutura de dupla hélice de um ARNds quando uma extremidade 3' de uma cadeia do ARNds se prolonga para além da extremidade 5' da outra cadeia, ou vice-versa. "Romba" ou "extremidade romba" significa que não há nucleótidos desemparelhados nessa extremidade do ARNds, isto é, sem saliência de nucleótidos. Um ARNds de "extremidade romba" é um ARNds que é de cadeia dupla ao longo de todo o seu comprimento, isto é, sem saliência de nucleótidos em qualquer uma das extremidades da molécula. 0 termo "cadeia antimensageira" refere-se à cadeia de um ARNds que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma sequência alvo. Como aqui utilizado, o termo "região de complementaridade" refere-se à região na cadeia antimensageira que é substancialmente complementar a uma sequência, por exemplo uma sequência alvo, como aqui definida. Quando a região de complementaridade não é completamente complementar à sequência alvo, os desemparelhamentos são mais tolerados nas regiões terminais e, se presentes, estão geralmente numa região ou regiões terminais, por exemplo, dentro de 6, 5, 4, 3 ou 2 nucleótidos da extremidade 5' e/ou 3'. 0 termo "cadeia mensageira," como aqui utilizado, refere-se à cadeia de um ARNds que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma região da cadeia antimensageira.
Como aqui utilizado, o termo "SNALP" refere-se a uma partícula de ácido nucleico-lípido estável. Uma SNALP representa uma vesícula de lípidos que reveste um interior aquoso reduzido que compreende um ácido nucleico tal como um ARNds ou um plasmídeo a partir do qual é transcrito um ARNds. SNALP são descritos, por exemplo, nas Publicações de Pedido de Patente U.S. N.° 20060240093, 20070135372, e USSN 61/045,228 apresentado em 15 de abril de 2008. "Introduzir numa célula," quando se refere a um ARNds, significa facilitar a captação ou absorção para a célula, como é entendido pelos especialistas na técnica. A absorção ou captação de ARNds pode ocorrer através de processos celulares difusivos não assistidos ou ativos, ou por agentes ou dispositivos auxiliares. 0 significado deste termo não se limita a células in vitro; um ARNds pode ser também "introduzido numa célula," em que a célula faz parte de um organismo vivo. Neste caso, a introdução na célula incluirá a administração ao organismo. Por exemplo, para administração in vivo, o ARNds pode ser injetado num sitio tecidular ou administrado sistemicamente. A introdução in vitro numa célula inclui métodos conhecidos na técnica tais como electroporação e lipofecção. Outras abordagens são aqui descritas ou conhecidas na técnica.
Os termos "silenciar," "inibir a expressão de," "regular negativamente a expressão de," "suprimir a expressão de" e semelhantes na medida em que se referem a um gene de TTR, referem-se aqui, pelo menos, à supressão parcial da expressão de um gene de TTR, como manifestada por uma redução da quantidade de ARNm que pode ser isolada a partir de uma primeira célula ou grupo de células em que um gene de TTR é transcrito e que foi ou foram tratadas de tal forma que a expressão de um gene de TTR é inibida, em comparação com uma segunda célula ou grupo de células substancialmente idênticas à primeira célula ou grupo de células mas que não foi ou não foram tratadas desse modo (células de controlo). 0 grau de inibição é geralmente exprimido em termos de
Alternativamente, o grau de inibição pode ser dado em termos de uma redução de um parâmetro que está funcionalmente ligado à expressão do gene de TTR, por exemplo, a quantidade de proteina codificada por um gene de TTR que é segregada por uma célula, ou o número de células que apresentam um certo fenótipo, por exemplo, apoptose. Em princípio, o silenciamento do gene de TTR pode ser determinado em qualquer célula que expressa o alvo, quer constitutivamente quer por manipulação genómica, e por qualquer ensaio apropriado. No entanto, quando é necessária uma referência para determinar se um dado ARNds inibe a expressão de um gene de TTR num certo grau e, por conseguinte, está abrangido pela presente invenção, os ensaios proporcionados nos exemplos abaixo devem servir como essa referência.
Por exemplo, em certos casos, a expressão de um gene de TTR é suprimido em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou 50% por administração do oligonucleótido de cadeia dupla caracterizado na invenção. Nalgumas formas de realização, um gene de TTR é suprimido em pelo menos cerca de 60%, 70% ou 80% por administração do oligonucleótido de cadeia dupla caracterizado na invenção. Nalgumas formas de realização, um gene de TTR é suprimido em pelo menos cerca de 85%, 90% ou 95% pela administração do oligonucleótido de cadeia dupla caracterizado na invenção.
Como aqui utilizado no contexto da expressão de TTR, os termos "tratar," "tratamento," e semelhantes, referem-se à eliminação ou alívio de processos patológicos mediados pela expressão de TTR. No contexto da presente invenção, na medida em que se refira a qualquer uma das outras condições especificadas a seguir (diferentes dos processos patológicos mediados pela expressão de TTR), os termos "tratar," "tratamento," e semelhantes significam eliminar ou aliviar pelo menos um sintoma associado a essa condição, ou para abrandar ou inverter a progressão dessa condição, tal como o abrandamento da progressão de uma amiloidose de TTR, tal como FAP. Os sintomas da amiloidose de TTR incluem neuropatia sensorial (por exemplo parestesia, hipoestesia em membros distais), neuropatia autónoma (por exemplo, disfunção gastrointestinal, tal como úlcera gástrica, ou hipotensão ortostática), neuropatia motora, ataques apopléticos, demência, mielopatia, polineuropatia, sindrome do túnel cárpico, insuficiência autónoma, cardiomiopatia, opacidades vítreas, insuficiência renal, nefropatia, mBMI (índice de Massa Corporal modificado) substancialmente reduzido, disfunção dos nervos cranianos e distrofia da estrutura da córnea.
Como aqui utilizadas, as frases "quantidade terapeuticamente eficaz" e "quantidade profilaticamente eficaz" referem-se a uma quantidade que proporciona um benefício terapêutico no tratamento, prevenção ou gestão de processos patológicos mediados pela expressão de TTR ou de um sintoma evidente de processos patológicos mediados pela expressão de TTR. A quantidade específica que é terapeuticamente eficaz pode ser facilmente determinada por um médico assistente, e pode variar dependendo de fatores conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, o tipo de processos patológicos mediados pela expressão de TTR, o passado e idade do doente, a fase dos processos patológicos mediados pela expressão de TTR, e a administração de outros agentes antipatológicos de processos mediados pela expressão de TTR.
Como aqui utilizada, uma "composição farmacêutica" compreende uma quantidade farmacologicamente eficaz de um ARNds e um veículo farmaceuticamente aceitável. Como aqui utilizada, "quantidade farmacologicamente eficaz," "quantidade terapeuticamente eficaz" ou simplesmente "quantidade eficaz" refere-se àquela quantidade de um ARN eficaz para produzir o resultado farmacológico, terapêutico ou profilático pretendido. Por exemplo, se um dado tratamento clínico é considerado eficaz quando há pelo menos uma redução de 25% num parâmetro mensurável associado a uma doença ou distúrbio, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um fármaco para o tratamento dessa doença ou distúrbio é a quantidade necessário para efetuar pelo menos uma redução de 25% nesse parâmetro. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ARNds que visa a TTR pode reduzir os níveis séricos de TTR em pelo menos 25%. Noutro exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ARNds que visa a TTR pode melhorar a função hepática ou função renal em pelo menos 25%. 0 termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um veículo para administração de um agente terapêutico. Tais veículos incluem, mas não se limitam a, soro fisiológico, soro fisiológico tamponado, dextrose, água, glicerol, etanol e associações dos mesmos. 0 termo exclui especificamente o meio de cultura de células. Para fármacos administrados por via oral, os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como diluentes inertes, desintegrantes, aglutinantes, lubrificantes, edulcorantes, aromatizantes, corantes e conservantes. Os diluentes inertes adequados incluem carbonato de sódio e cálcio, fosfato de sódio e cálcio, e lactose, enquanto o amido de milho e ácido algínico são desintegrantes adequados. Os aglutinantes podem incluir amido e gelatina, enquanto o lubrificante, se presente, será geralmente estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos com um material tal como monoestearato de glicerilo ou diestearato de glicerilo, para retardar a absorção no trato gastrointestinal.
Como aqui utilizada, uma "célula transformada" é uma célula na qual foi introduzido um vetor a partir do qual pode ser expressa uma molécula de ARNds. II. Ácido ribonucleico de cadeia dupla (ARNds) São aqui descritas moléculas de ácido ribonucleico de cadeia dupla (ARNds) para inibir a expressão de um gene de TTR numa célula ou mamífero, por exemplo, num humano possuindo uma amiloidose de TTR, em que o ARNds inclui uma cadeia antimensageira que tem uma região de complementaridade que é complementar a pelo menos uma parte de um ARNm formado na expressão de um gene de TTR, e em que a região de complementaridade tem menos de 30 nucleótidos de comprimento, geralmente 19-24 nucleótidos de comprimento, e em que o referido ARNds, após contacto com uma célula que expressa o referido gene de TTR, inibe a expressão do referido gene de TTR em pelo menos 30% como analisado, por exemplo, por um método baseado em PCR ou ADN ramificado (bDNA), ou por um método baseado em proteínas, tal como por transferência de Western. A expressão de um gene de TTR pode ser reduzida em pelo menos 30% quando medida por um ensaio como descrito nos exemplos abaixo. Por exemplo, a expressão de um gene de TTR em cultura de células, tal como em células Hep3B, pode ser analisada medindo os níveis de ARNm de TTR, tal como pelo ensaio bDNA ou TaqMan, ou medindo os níveis de proteína, tal como por ensaio ELISA. O ARNds da invenção pode incluir ainda uma ou mais saliências de nucleótidos de cadeia simples. O ARNds pode ser sintetizado por métodos correntes conhecidos na técnica como discutido em mais pormenor abaixo, por exemplo, através da utilização de um sintetizador automático de ADN, tal como estão comercialmente disponíveis de, por exemplo, Biosearch, Applied Biosystems, Inc. O ARNds inclui duas cadeias de ARN que são suficientemente complementares para hibridizar para formar uma estrutura de dupla hélice. Uma cadeia do ARNds (a cadeia antimensageira) inclui uma região de complementaridade que é substancialmente complementar, e em geral completamente complementar, a uma sequência alvo, derivada da sequência de um ARNm formado durante a expressão de um gene de TTR, a outro cadeia (a cadeia mensageira) inclui uma região que é complementar à cadeia antimensageira, de tal forma que as duas cadeias hibridizam e formam uma estrutura de dupla hélice quando combinadas sob condições adequadas. Em geral, a estrutura de dupla hélice tem entre 15 e 30 ou entre 25 e 30, ou entre 18 e 25, ou entre 19 e 24, ou entre 19 e 21, ou 19, 20 ou 21 pares de bases de comprimento. Numa forma de realização, a hélice dupla tem 19 pares de bases de comprimento. Noutra forma de realização, a hélice dupla tem 21 pares de bases de comprimento. Quando são utilizados em combinação dois ARNsis diferentes, os comprimentos da hélice dupla podem ser idênticos ou podem diferir.
Cada cadeia do ARNds tem geralmente entre 15 e 30, ou entre 18 e 25, ou 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleótidos de comprimento. Noutras formas de realização, cada cadeia tem 25-30 nucleótidos de comprimento. Cada cadeia da hélice dupla pode ser do mesmo comprimento ou de comprimentos diferentes. Quando são utilizados em combinação dois ARNsis diferentes, os comprimentos de cada cadeia de cada ARNsi podem ser idênticos ou podem diferir. O ARNds pode incluir uma ou mais saliência (s) de cadeia simples de um ou mais nucleótidos. Pelo menos uma extremidade do ARNds pode ter uma saliência de nucleótidos de cadeia simples com 1 a 4, geralmente 1 ou 2 nucleótidos. A cadeia antimensageira do ARNds pode ter saliências de Ι-ΙΟ nucleótidos cada na extremidade 3' e na extremidade 5' ao longo da cadeia mensageira. A cadeia mensageira do ARNds pode ter saliências de 1-10 nucleótidos cada na extremidade 3' e na extremidade 5' ao longo da cadeia antimensageira.
Um ARNds tendo pelo menos uma saliência de nucleótidos pode ter propriedades inibidoras inesperadamente superiores do que o homólogo de extremidades rombas. A presença de apenas uma saliência de nucleótidos pode fortalecer a atividade de interferência do ARNds, sem afetar a sua estabilidade global. Um ARNds que tem apenas uma saliência mostrou ser particularmente estável e eficaz in vivo, bem como numa variedade de células, meios de cultura de células, sangue, e soro. Em geral, a saliência de cadeia simples está localizada na extremidade 3'-terminal da cadeia antimensageira ou, alternativamente, na extremidade 3'-terminal da cadeia mensageira. O ARNds pode ter também uma extremidade romba, geralmente localizada na extremidade 5' da cadeia antimensageira. Tais ARNdss podem ter estabilidade e atividade inibidora melhoradas, permitindo assim a administração em doses baixas, ou seja, inferiores a 5 mg/kg de peso corporal do recetor por dia. Em geral, a cadeia antimensageira do ARNds tem uma saliência de nucleótidos na extremidade 3' , e a extremidade 5' é romba. Um ou mais dos nucleótidos na saliência podem estar substituídos por um tiofosfato de nucleósido.
Um gene de TTR pode ser um gene de TTR humano. A cadeia mensageira do ARNds pode ser uma das sequências mensageiras das Tabelas 3A, 3B, 4, 6A, 6B ou 7, e a cadeia antimensageira pode ser uma das sequências antimensageiras das Tabelas 3A, 3B, 4, 6A, 6B ou 7. Agentes antimensageiros alternativos que visam outra parte da sequência alvo proporcionados nas Tabelas 3A, 3B, 4, 6A, 6B ou 7 podem ser facilmente determinados utilizando a sequência alvo e a sequência flanqueadora de TTR. 0 especialista está bem ciente de que os ARNdss que têm uma estrutura de dupla hélice com entre 20 e 23, mas especificamente 21, pares de bases foram declarados como particularmente eficazes na indução de interferência de ARN (Elbashir et ai., EMBO 2001, 20:6877-6888). No entanto, outros determinaram que ARNdss mais curtos ou mais compridos também podem ser eficazes. Nas formas de realização descritas acima, em virtude da natureza das sequências oligonucleotidicas proporcionadas nas Tabelas 3A, 3B, 4, 6A, 6B e 7, os ARNdss caracterizados na invenção podem incluir pelo menos uma cadeia de um comprimento aqui descrito. Pode esperar-se de forma razoável que os ARNdss mais curtos tendo uma das sequências das Tabelas 3A, 3B, 4, 6A, 6B ou 7 sem apenas alguns nucleótidos em uma ou ambas as extremidades possam ser igualmente eficazes em comparação com os ARNdss descritos acima. Assim, são considerados pela invenção os ARNdss que têm uma sequência parcial de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleótidos contíguos de uma das sequências das Tabelas 3, 4, 6 ou 7, e que diferem na sua aptidão para inibir a expressão de um gene de TTR num ensaio como descrito a seguir em não mais do que 5, 10, 15, 20, 25 ou 30% da inibição de um ARNds compreendendo a sequência total. Além disso, os ARNdss que dissociam dentro de uma sequência alvo de TTR desejada podem ser facilmente preparados utilizando a sequência antimensageira de TTR correspondente e uma sequência mensageira complementar.
Além disso, os ARNdss proporcionados nas Tabelas 3A, 3B, 4, 6A, 6B ou 7 identificam um sítio numa TTR que é suscetível a dissociação baseada em iARN. Como tal, são descritos ARNdss que direcionam para dentro da sequência visada por um dos agentes da presente invenção. Como aqui utilizado, um segundo ARNds é referido como sendo direcionado para dentro da sequência de um primeiro ARNds se o segundo ARNds dissocia o mensageiro em qualquer parte dentro do ARNm que é complementar À cadeia antimensageira do primeiro ARNds. Um tal segundo ARNds consistirá geralmente em pelo menos 15 nucleótidos contíguos de uma das sequências proporcionadas nas Tabelas 3A, 3B, 4, 6A, 6B ou 7 acoplados a sequências de nucleótidos adicionais retiradas da região contígua à sequência selecionada num gene de TTR. 0 ARNds descrito pode conter um ou mais desemparelhamentos com a sequência alvo. 0 ARNds descrito pode conter não mais do que 3 desemparelhamentos. Se a cadeia antimensageira do ARNds contém desemparelhamentos com uma sequência alvo, é preferível que a área de desemparelhamento não esteja localizada no centro da região de complementaridade. Se a cadeia antimensageira do ARNds contém desemparelhamentos com a sequência alvo, é preferível que o desemparelhamento se limite aos 5 nucleótidos de qualquer uma das extremidades, por exemplo 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleótido de qualquer extremidade 5' ou 3' da região de complementaridade. Por exemplo, para uma cadeia de ARNds com 23 nucleótidos que é complementar a uma região de um gene de TTR, o ARNds geralmente não contém qualquer desemparelhamento dentro dos 13 nucleótidos centrais. Os métodos descritos podem ser utilizados para determinar se um ARNds que contém um desemparelhamento com uma sequência alvo é eficaz em inibir a expressão de um gene de TTR. A consideração da eficácia de ARNdss com desemparelhamentos na inibição da expressão de um gene de TTR é importante, especialmente se a região de complementaridade particular num gene de TTR é conhecida como tendo variantes de sequência polimórficas dentro da população.
Modificações 0 ARNds pode ser quimicamente modificado para melhorar a estabilidade. Os ácidos nucleicos caracterizadas na invenção podem ser sintetizados e/ou modificados por métodos bem estabelecidos na técnica, tais como aqueles descritos em "Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, EUA, o qual é por este meio aqui incorporado por referência. Os exemplos específicos de compostos de ARNds úteis nesta invenção incluem ARNdss contendo esqueletos modificados ou sem ligações internucleosídicas naturais. Como definidos nesta descrição, os ARNdss que têm esqueletos modificados incluem aqueles que retêm um átomo de fósforo no esqueleto e aqueles que não têm um átomo de fósforo no esqueleto. Para os fins desta descrição, e como por vezes referenciado na técnica, os ARNdss modificados que não têm um átomo de fósforo no seu esqueleto internucleosídico podem ser também considerados como sendo oligonucleósidos.
Os esqueletos de ARNds modificados incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil- e outros alquil-fosfonatos incluindo 3'-alquilenofosfonatos e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos incluindo 3'-aminofosforamidato e aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, e boranofosfatos possuindo ligações 3'-5' normais, análogos ligados 2'-5' destes, e aqueles que têm polaridade invertida em que os pares adjacentes de unidades de nucleósidos estão ligados 3'-5' a 5'-3' ou 2'-5' a 5'-2'. Estão também incluídos vários sais, sais mistos e formas de ácido livre.
As patentes U.S. representativas que ensinam a preparação das ligações contendo fósforo anteriores incluem, mas não se limitam a, Pat. U.S. N.° 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; e 5,625,050.
Os esqueletos de ARNds modificados que não incluem um átomo de fósforo nos mesmos têm esqueletos que são formados por ligações internucleosidicas de alquilo de cadeia curta ou cicloalquilo, ligações internucleosidicas mistas de heteroátomos e alquilo ou cicloalquilo, ou uma ou mais ligações internucleosidicas heteroatómicas ou heterocíclicas de cadeia curta. Estes incluem aqueles que têm ligações morfolino (formadas em parte a partir da porção de açúcar de um nucleósido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfureto, sulfóxido e sulfona; esqueletos de formacetilo e tioformacetilo; esqueletos de metileno-formacetilo e tioformacetilo; esqueletos contendo alceno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenoimino e metileno-hidrazino; esqueletos de sulfonato e sulfonamida; esqueletos de amida; e outros que têm partes componentes mistas de N, O, S e CH2.
As patentes U.S. representativas que ensinam a preparação dos oligonucleósidos acima incluem, mas não se limitam a, Pat. U.S. N.° 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; e, 5,677,439.
Noutros miméticos de ARNds adequados, tanto o açúcar como a ligação internucleosídica, ou seja, o esqueleto, das unidades de nucleótidos são substituídos por grupos novos. As unidades de base são mantidas para hibridação com um composto alvo de ácido nucleico apropriado. Um tal composto oligomérico, um mimético de ARNds que demonstrou ter excelentes propriedades de hibridação, é referido como um ácido nucleico peptídico (PNA). Nos compostos de PNA, o esqueleto de açúcar de um ARNds está substituído por um esqueleto contendo amida, em particular um esqueleto de aminoetilglicina. As bases azotadas são retidas e estão ligadas direta ou indiretamente a átomos de azoto aza da porção amida do esqueleto. As patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de compostos de PNA incluem, mas não se limitam às Pat. U.S. N.° 5,539, 082; 5,714,331; e 5,719,262. Outros ensinamentos sobre compostos de PNA podem ser encontrados em Nielsen et al. , Science, 1991, 254, 1497-1500 . São descritos os ARNdss com esqueletos de fosforotioato e oligonucleósidos com esqueletos possuindo heteroátomos, e em particular --CH2--NH--CH2--, --CH2--N (CH3)-0--CH2-- [conhecido como um esqueleto metileno (metilimino) ou MMI], — CH2 —O—N (CH3) —CH2 —, —CH2—N (CH3) -N (CH3) —CH2— e — N (CH3) —CH2 — CH2— [em que o esqueleto fosfodiéster nativo é representado como --0--P--0--CH2--] da Pat. U.S. N.° 5,489,677 supramencionada, e os esqueletos de amida da Pat. U.S. N.° 5,602,240 supramencionada. São também preferidos ARNdss tendo estruturas de esqueleto de morfolino da Pat. U.S. N.° 5,034,506 supramencionada.
Os ARNdss modificados podem conter também uma ou mais unidades de açúcar substituídas. Os ARNdss podem compreender um dos seguintes na posição 2': OH; F; Ο-, Ξου N-alquilo; O-, S- ou N-alcenilo; O-, S- ou N-alcinilo; ou O-alquil-O-alquilo, em que o alquilo, alcenilo e alcinilo podem ser alquilo Ci a Cio ou alcenilo e alcinilo C2 a Cio substituídos ou não substituídos. São particularmente preferidos os 0 [ (CH2) n0] mCH3, 0 (CH2) nOCH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)n0NH2 e 0 (CH2) n0N [ (CH2) nCH3) ] 2, em que nem são desde 1 a cerca de 10. Outros ARNdss preferidos compreendem um dos seguintes na posição 2' : alquilo inferior Ci a Cio, alquilo inferior substituído, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo ou O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02CH3, 0N02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo substituído, um grupo de dissociação de ARN, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas de um ARNds, ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um ARNds, e outros substituintes possuindo propriedades semelhantes. Uma modificação preferida inclui 2'-metoxietoxilo (2'-0--CH2CH20CH3, também conhecido como 2'-O-(2-metoxietilo) ou 2'-MOE) (Martin et al. , Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), ou seja, um grupo alcoxi-alcoxilo. Uma modificação mais preferida inclui 2'-dimetilaminooxietoxilo, isto é, um grupo O (CH2) 2ON (CH3) 2, também conhecido como 2'-DMAOE, como descrito nos exemplos a seguir, e 2'- dimetilaminoetoxietoxilo (também conhecido na técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo ou 2'-DMAEOE), isto é, 2 '-0-CH2--0--CH2--N (CH2) 2, também descrito nos exemplos a seguir.
Outras modificações incluem 2'-metoxilo (2'-OCH3), 2'- aminopropoxilo (2 '-OCH2CH2CH2NH2) e 2'-fluoro (2 ' — F) . Podem ser também feitas modificações semelhantes noutras posições do ARNds, em particular a posição 3' do açúcar no nucleótido terminal 3' ou nos ARNdss ligados 2'-5' e a posição 5' do nucleótido terminal 5'. Os ARNdss podem ter também miméticos de açúcares tais como unidades ciclobutilo em vez do açúcar de pentofuranosilo. As patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de tais estruturas de açúcar modificadas incluem, mas não se limitam às Pat. U.S. N.° 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5, 627,053; 5, 639, 873; 5, 646, 265; 5, 658,873; 5, 670, 633; e 5,700,920, algumas das quais são de propriedade comum com o presente pedido.
Os ARNdss podem incluir também modificações ou substituições da base azotada (frequentemente referida na técnica simplesmente como "base")· Como aqui utilizadas, bases azotadas "não modificadas" ou "naturais" incluem as bases de purina adenina (A) e guanina (G) , e as bases de pirimidina timina (T), citosina (C) e uracilo (U). As bases azotadas modificadas incluem outras bases azotadas sintéticas e naturais tais como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil- e outros derivados de alquilo de adenina e guanina, 2-propil- e outros derivados de alquilo de adenina e guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halo-uracilo e citosina, 5-propinil-uracilo e citosina, 6-azo-uracilo, citosina e timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo-, 8-amino-, 8-tiol-, 8-tioalquil-, 8-hidroxi- e outras adeninas e guaninas substituídas na posição 8, 5-halo-, particularmente 5-bromo-, 5-trifluorometil- e outros uracilos e citosinas substituídos na posição 5, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-desazaguanina e 7-desazaadenina e 3-desazaguanina e 3-desazaadenina. Outras bases azotadas incluem aquelas divulgadas da Pat. U.S. N.° 3,687,808, aquelas divulgadas no Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, aquelas divulgadas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, e aquelas divulgadas por Sanghvi, Y S., Capitulo 15, DsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. e Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Algumas destas bases azotadas são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos oligoméricos caracterizados na invenção. Estas incluem pirimidinas substituídas na posição 5, 6-azapirimidinas e purinas substituídas em N-2, N-6 e 0-6, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo e 5-propinilcitosina. Foi demonstrado que as substituições de 5-metilcitosina aumentam a estabilidade da hélice dupla do ácido nucleico em 0,6-1,2 °C. (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. e Lebleu, B., Eds., DsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) e são substituições de bases ilustrativas, mesmo mais em particular quando combinadas com modificações de açúcar de 2'-O-metoxietilo.
As patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de algumas das bases azotadas modificadas indicadas acima bem como outras bases azotadas modificadas incluem, mas não se limitam à Pat. U.S. N.° 3, 687, 808 assinalada cima, bem como às Pat. U.S. N.° 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; e 5,681,941, e Pat. U.S. N.° 5,750,692.
Conjugados
Outra modificação dos ARNdss da invenção envolve a ligação química ao ARNds de uma ou mais unidades ou conjugados que melhoram a atividade, distribuição celular ou captação celular do ARNds. Tais unidades incluem mas não se limitam a unidades lipídicas tais como uma unidade de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), ácido eólico (Manoharan et al. , Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), um tioéter, por exemplo, beril-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al. , Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), urn tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecanodiol ou undecilo (Saison-Behmoaras et al. , EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al. , FEBS Lett., 19 90,259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), um fosfolípido, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou 1,2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3H-fosfonato de trietilamónio (Manoharan et al. , Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al. , Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), uma cadeia de poliamina ou polietileno glicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), ou ácido adamantano-acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), uma unidade de palmitilo (Mishra et al. , Biochim. Biophys. Acta, 1995, 12 64:229-237), ou uma unidade octadecilamina ou hexilamino-carboniloxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937) .
As patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de tais conjugados de ARNds incluem, mas não se limitam a, Pat. U.S. N.° 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597, 696; 5,599, 923; 5,599, 928 e 5, 688, 941. Não é necessário que todas as posições de um dado composto estejam uniformemente modificadas e, de facto, podem ser incorporadas mais do que uma das modificações supramencionadas num único composto ou até mesmo num único nucleósido dentro de um ARNds. A presente invenção inclui também compostos de ARNds que são compostos quiméricos. Os compostos de ARNds "quiméricos" ou "quimeras, " no contexto desta invenção, são compostos de ARNds, em particular ARNds s, que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada uma constituída por pelo menos uma unidade de monómero, ou seja, um nucleótido no caso de um composto de ARNds. Estes ARNdss contêm tipicamente pelo menos uma região em que o ARNds é modificado de forma a conferir ao ARNds maior resistência à degradação pela nuclease, maior captação celular e/ou maior afinidade de ligação para o ácido nucleico alvo. Uma região adicional do ARNds pode servir como um substrato para enzimas capazes de dissociar híbridos de ARN:ADN ou ARN:ARN. A título de exemplo, a RNase H é uma endonuclease celular que dissocia a cadeia de ARN de uma hélice dupla de ARN:ADN. Por conseguinte, a ativação de RNase H, resulta na dissociação do ARN alvo, melhorando, desse modo, muito a eficiência da inibição da expressão de genes pelo ARNds. Consequentemente, podem ser frequentemente obtidos resultados comparáveis com ARNdss mais curtos quando se utiliza ARNdss quiméricos, em comparação com fosforotioato desoxiARNdss que hibridizam com a mesma região alvo. A dissociação do ARN alvo pode ser rotineiramente detetada por eletroforese em gel e, se for necessário, pelas técnicas de hibridação de ácido nucleico associadas conhecidas na matéria. 0 sitio de dissociação no ARNm alvo de um ARNds pode ser determinado utilizando métodos geralmente conhecidos para um especialista com conhecimentos médios na matéria, por exemplo, o método 5'-RACE descrito em Soutschek et ai., Nature; 2004, Vol. 432, pp. 173-178. Numa forma de realização, utilizando o método 5'-RACE descrito por Soutschek et ai., determinou-se que o ALN-18328 dissocia um ARNm de TTR entre o nucleótido de guanina na posição 636 da SEQ ID NO:1331 (NH_000371.3) e o nucleótido de adenina na posição 637 da SEQ ID NO:1331. Numa forma de realização, determinou-se que o ALN-18328 não dissocia um ARNm de TTR entre o nucleótido de adenina na posição 637 da SEQ ID NO:1331 e o nucleótido de guanina na posição 638 da SEQ ID NO: 1331.
Em certos casos, o ARNds pode ser modificado por um grupo não-ligando. Um número de moléculas de não-ligando foi conjugado com ARNdss para melhorar a atividade, distribuição celular ou captação celular do ARNds, e os procedimentos para realizar tais conjugações estão disponíveis na literatura científica. Tais unidades de não-ligando têm incluídas unidades de lípidos, tais como colesterol (Letsinger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1989, 86:6553), ácido eólico (Manoharan et ai., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), um tioéter, por exemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et ai., Ann. N.Y. Acad. Sei., 1992,660:306; Manoharan et ai., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), um tiocolesterol (Oberhauser et ai., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecanodiol ou undecilo (Saison-Behmoaras et ai., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et ai., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et ai., Biochimie, 1993, 75:49), um fosfolípido, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou 1,2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamónio (Manoharan et ai., Tetrahedron
Lett., 1995,36:3651; Shea et al. , Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), uma cadeia de poliamina ou polietileno glicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), ou ácido adamantano-acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), uma unidade de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), ou uma unidade de octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al. , J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). As patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais conjugados de ARNds foram listadas acima. Os protocolos de conjugação tipicos envolvem a sintese de ARNdss que têm um grupo de ligação amino em uma ou mais posições da sequência. O grupo amino é em seguida feito reagir com a molécula a ser conjugada utilizando reagentes de acoplamento ou ativação apropriados. A reação de conjugação pode ser realizada com os ARNds ainda ligados ao suporte sólido ou após dissociação do ARNds em fase de solução. A purificação do conjugado de ARNds por HPLC proporciona tipicamente o conjugado puro. ARNdss codificados pelo vetor
Noutro aspeto, as moléculas de ARNds de TTR são expressas a partir de unidades de transcrição inseridas nos vetores de ADN ou ARN (ver, por exemplo, Couture, A, et al. , TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al. , Publicação Internacional PCT N.° WO 00/22113, Conrad, Publicação Internacional PCT N.° WO 00/22114, e Conrad, Pat. U.S. N.° 6,054,299). Estes transgenes podem ser introduzidos como uma construção linear, um plasmideo circular ou um vetor virai, o qual pode ser incorporada e herdado como um transgene integrado no genoma do hospedeiro. O transgene pode ser também construído para permitir que seja herdado como um plasmídeo extracromossómico (Gassmann, et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1995) 92:1292).
As cadeias individuais de um ARNds podem ser transcritas por promotores em dois vetores de expressão separados e co-transfetadas numa célula alvo. Alternativamente, cada cadeia individual do ARNds pode ser transcrita por promotores que estão ambos localizados no mesmo plasmídeo de expressão. Numa forma de realização, um ARNds é expresso como uma repetição invertida unida por uma sequência polinucleotídica de ligação de tal forma que o ARNds tem uma estrutura de haste e volta.
Os vetores de expressão de ARNds recombinantes são geralmente plasmídeos de ADN ou vetores virais. Os vetores virais que expressam ARNds podem ser construídos com base em, mas não se limitam a, vírus adeno-associados (para um revisão, ver Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)); adenovirus (ver, por exemplo, Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434), e Rosenfeld et al. (1992),
Cell 68:143-155)); ou alfavírus bem como outros conhecidos na técnica. Os retrovirus têm sido utilizados para introduzir uma variedade de genes em muitos tipos de células diferentes, incluindo células epiteliais, in vitro e/ou in vivo (ver, por exemplo, Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos e Mulligan, Proc. Natl Acad.
Sei. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc.
Natl. Acad. Sei. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:61416145; Huber et al. , 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8039-8043; Ferry et al. , 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. , 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:7640-19 ; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 8 9:10892-10895; Hwu et al. , 1993, J. Immunol. 150:4104-4115; Patente U.S. N.° 4,868,116; Patente U.S. N.° 4,980,286; Pedido PCT WO 89/07136; Pedido PCT WO 89/02468; Pedido PCT WO 89/05345; e Pedido PCT WO 92/07573). Os vetores retrovirais recombinantes capazes de transduzir e expressar genes inseridos no genoma de uma célula podem ser produzidos transfetando o genoma retroviral recombinante em linhas de células de empacotamento adequadas tais como PA317 e Psi-CRIP (Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349) . Os vetores adenovirais recombinantes podem ser utilizados para infetar uma grande variedade de células e tecidos em hospedeiros suscetíveis (por exemplo, ratazana, hamster, cão e chimpanzé) (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769), e têm também a vantagem de não requererem células mitoticamente ativas para infeção.
Pode utilizar-se qualquer vetor virai capaz de aceitar as sequências codificantes para a(s) molécula(s) de ARNds a serem expressas, por exemplo vetores derivados de adenovirus (AV); vírus adeno-associados (AAV); retrovirus (e.g, lentivirus (LV), Rabdovírus, vírus da leucemia murídea); vírus do herpes, e semelhantes. O tropismo de vetores virais pode ser modificado por pseudotipagem dos vetores com proteínas de envelope ou outros antigénios de superfície de outros vírus, ou por substituição de diferentes proteínas virais do capsídeo, consoante apropriado.
Por exemplo, os vetores lentivirais caracterizados na invenção podem ser pseudotipados com proteínas da superfície do vírus da estomatite vesicular (VSV), raiva, Ébola, Mokola, e semelhantes. Os vetores de AAV caracterizados na invenção podem ser preparados para visar diferentes células manipulando os vetores por engenharia para expressar diferentes serótipos de proteínas do capsídeo. Por exemplo, um vetor AAV que expressa um capsídeo de serótipo 2 num genoma de serótipo 2 é designado AAV 2/2. Este gene de capsídeo de serótipo 2 no vetor AAV 2/2 pode ser substituído por um gene de capsídeo de serótipo 5 para produzir um vetor AAV 2/5. As técnicas para construir vetores de AAV que expressam diferentes serótipos de proteínas do capsídeo estão dentro da perícia na técnica; ver, por exemplo, Rabinowitz J E et ai. (2002), J Virol 76:791-801. A seleção de vetores virais recombinantes adequados para serem utilizados na invenção, os métodos de inserção das sequências de ácidos nucleicos para expressar o ARNds no vetor e os métodos de administração do vetor virai às células de interesse estão dentro da perícia na técnica. Ver, por exemplo, Domburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; e Rubinson D A et al. , Nat. Genet. 33: 401-406.
Os vetores virais podem ser derivados de AV e AAV. Numa forma de realização, o ARNds caracterizado na invenção é expresso como duas moléculas de ARN de cadeia simples complementares, separadas a partir de um vetor de AAV recombinante possuindo, por exemplo, os promotores de ARN U6 ou Hl, ou o promotor de citomegalovírus (CMV).
Um vetor de AV adequado para expressar o ARNds caracterizado na invenção, um método para construir o vetor de AV recombinante e um método de administração do vetor em células alvo, são descritos em Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.
Os vetores de AAV adequados para expressar o ARNds caracterizado na invenção, os métodos para construir o vetor de AV recombinante e os métodos de administração dos vetores em células alvo são descritos em Samulski R et ai. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et ai. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et ai. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Pat. U.S. N.° 5, 252,479; Pat. U.S. N.° 5,139,941; Pedido Internacional de Patente N.° WO 94/13788; e Pedido Internacional de Patente N.° WO 93/24641. O promotor que conduz a expressão de ARNds num plasmideo de ADN ou vetor virai caracterizado na invenção pode ser um promotor de polimerase I de ARN (por exemplo, promotor de ARN ribossómico), polimerase II de ARN (por exemplo, promotor precoce de CMV ou promotor de actina ou promotor de ARNsn Ul) ou, em geral, polimerase III de ARN eucariótico (por exemplo, promotor de ARNsn U6 ou de ARN 7SK) ou um promotor procariótico, por exemplo o promotor T7, na condição de que o plasmideo de expressão também codifique a polimerase de ARN T7 necessária para transcrição a partir de um promotor T7. O promotor pode também dirigir a expressão do transgene para o pâncreas (ver, por exemplo, a sequência reguladora de insulina para o pâncreas (Bucchini et ai., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:2511-2515)) .
Além disso, a expressão do transgene pode ser regulada com exatidão, por exemplo, utilizando uma sequência reguladora e sistemas de expressão induziveis tais como uma sequência reguladora que é sensivel a certos reguladores fisiológicos, por exemplo, níveis circulantes de glucose, ou hormonas (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24) . Tais sistemas de expressão induziveis, adequados para o controlo da expressão de transgenes nas células ou em mamíferos incluem a regulação por ecdisona, por estrogénio, progesterona, tetraciclina, indutores químicos da dimerização e isopropil-beta-Dl-tiogalactopiranosídeo (EPTG). Um especialista na técnica seria capaz de escolher a sequência reguladora/promotora apropriada com base na utilização pretendida do transgene de ARNds.
Em geral, os vetores recombinantes capazes de expressar as moléculas de ARNds são administrados como se descreve abaixo, e persistem em células alvo. Alternativamente, pode utilizar-se vetores virais que proporcionam a expressão transitória de moléculas de ARNds. Tais vetores podem ser administrados repetidamente, consoante necessário. Uma vez expressado, os ARNdss ligam-se ao ARN alvo e modulam a sua função ou expressão. A administração de vetores que expressam ARNds pode ser sistémica, tal como por administração intravenosa ou intramuscular, por administração a células alvo explantadas do doente, seguida de reintrodução no doente, ou por qualquer outro meio que permita a introdução numa célula alvo desejada.
Os plasmídeos de ADN de expressão de ARNds são tipicamente transfetados em células alvo como um complexo com veículos lipídicos catiónicos (por exemplo, Oligofectamina) ou veículos à base de lípidos não catiónicos (por exemplo, Transit-TKO™) . As transfeções com múltiplos lípidos para anulações mediadas por ARNds que visam diferentes regiões de um único gene de TTR ou de múltiplos genes de TTR ao longo de um período de uma semana ou mais são também consideradas pela invenção. A introdução bem-sucedida de vetores em células hospedeiras pode ser monitorizada utilizando vários métodos conhecidos. Por exemplo, a transfeção transitória pode ser assinalada com um repórter, tal como um marcador fluorescente, tal como a Proteína
Fluorescente Verde (GFP). A transfeção estável de células ex vivo pode ser garantida utilizando marcadores que proporcionam a célula transfetada com resistência a fatores ambientais específicos (por exemplo, antibióticos e fármacos), tal como a resistência à higromicina B.
As moléculas de ARNds específicas para TTR podem ser também inseridas em vetores e utilizadas como vetores de terapia genética para doentes humanos. Os vetores de terapia genética podem ser administrados a um indivíduo, por exemplo, por injeção intravenosa, administração local (ver Patente U.S. 5,328,470) ou por injeção estereotáxica (ver por exemplo, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:3054-3057). A preparação farmacêutica do vetor de terapia genética pode incluir o vetor de terapia genética num diluente aceitável, ou pode incluir uma matriz de libertação lenta, na qual o veículo de administração do gene se encontra embebido. Alternativamente, quando o vetor de administração do gene completo pode ser produzido intacto a partir de células recombinantes, por exemplo, vetores retrovirais, a preparação farmacêutica pode incluir uma ou mais células que produzem o sistema de administração do gene. III. Composições farmacêuticas contendo ARNds
Numa forma de realização, a invenção proporciona composições farmacêuticas contendo um ARNds da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica contendo o ARNds é útil para tratar uma doença ou distúrbio associado à expressão ou atividade de um gene de TTR, tal como os processos patológicos mediados pela expressão de TTR. Tais composições farmacêuticas são formuladas com base no modo de administração. Um exemplo é composições que são formuladas para administração sistémica através de administração parentérica, por exemplo, por administração intravenosa (IV). Outro exemplo é composições que são formuladas para administração direta no parênquima do cérebro, por exemplo, por infusão no cérebro, tal como por infusão continua com bomba.
As composições farmacêuticas aqui caracterizadas são administradas em doses suficientes para inibir a expressão dos genes de TTR.
Em geral, uma dose adequada de ARNds situar-se-á na gama de 0,01 a 200,0 miligramas por quilograma de peso corporal do recetor por dia, em geral na gama de 1 a 50 mg por quilograma de peso corporal por dia. Por exemplo, o ARNds pode ser administrado a 0,0059 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,0295 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,0590 mg/kg, 0,163 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,543 mg/kg, 0,5900 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,628 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5,0 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg ou 50 mg/kg por dose única. A dosagem pode ser entre 0,01 e 0,2 mg/kg. Por exemplo, o ARNds pode ser administrado a uma dose de 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,07 mg/kg 0,08 mg/kg 0,09 mg/kg, 0,10 mg/kg, 0,11 mg/kg, 0,12 mg/kg, 0,13 mg/kg, 0,14 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,16 mg/kg, 0,17 mg/kg, 0,18 mg/kg, 0,19 mg/kg ou 0,20 mg/kg. A dosagem pode ser entre 0,005 mg/kg e 1,628 mg/kg. Por exemplo, o ARNds pode ser administrado a uma dose de 0,0059 mg/kg, 0,0295 mg/kg, 0,0590 mg/kg, 0,163 mg/kg, 0,543 mg/kg, 0,5900 mg/kg ou 1,628 mg/kg. A dosagem pode ser entre 0,2 mg/kg e 1,5 mg/kg. Por exemplo, o ARNds pode ser administrado a uma dose de 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg ou 1,5 mg/kg. A composição farmacêutica pode ser administrada uma vez por dia, ou o ARNds pode ser administrado como duas, três ou mais subdoses em intervalos apropriados ao longo do dia ou até mesmo utilizando infusão continua ou administração através de uma formulação de libertação controlada. Nesse caso, o ARNds contido em cada subdose tem de ser correspondentemente mais pequeno para se conseguir a dosagem diária total. A unidade de dosagem pode ser também formulada para administração ao longo de vários dias, por exemplo, utilizando uma formulação de libertação sustentada convencional, a qual proporciona a libertação sustentada do ARNds ao longo de um período de vários dias. As formulações de libertação sustentada são bem conhecidas na técnica e são particularmente úteis para a administração de agentes num sítio particular, tal como poderiam ser utilizadas com os agentes da presente invenção. Nesta forma de realização, a unidade de dosagem contém um múltiplo correspondente da dose diária. O efeito de uma única dose nos níveis de TTR é duradouro, pelo que as doses subsequentes são administradas em intervalos de não mais do que 3, 4 ou 5 dias, ou em intervalos de não mais do que 1, 2, 3 ou 4 semanas, ou em intervalos de não mais do que 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 semanas. O especialista aperceber-se-á que certos fatores podem influenciar a dosagem e tempo necessário para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo mas não se limitando à gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, a saúde geral e/ou idade do indivíduo, e outras doenças presentes. Além do mais, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode incluir um único tratamento ou uma série de tratamentos. As estimativas de dosagens eficazes e semividas in vivo para os ARNdss individuais abrangidos pela invenção podem ser feitas utilizando metodologias convencionais ou com base em avaliações in vivo utilizando um modelo animal apropriado, como aqui descrito noutra parte.
Os avanços na genética de ratos geraram um número de modelos em ratos para o estudo de várias doenças humanas, tais como os processos patológicos mediados pela expressão de TTR. Tais modelos são utilizados para avaliação in vivo de ARNds, bem como para determinar uma dose terapeuticamente eficaz. Um modelo de rato adequado é, por exemplo, um rato contendo um plasmídeo que expressa a TTR humana. Outro modelo de rato adequado é um rato transgénico que tem um transgene que expressa a TTR humana.
Os dados obtidos a partir dos ensaios em cultura de células e estudos animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagem para utilização em humanos. A dosagem das composições caracterizadas na invenção situa-se geralmente na gama de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta gama dependendo da forma de dosagem utilizada e da via de administração utilizada. Para qualquer composto utilizado nos métodos caracterizados na invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios em culturas de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para conseguir uma gama de concentração plasmática circulante do composto ou, quando apropriado, do produto polipeptídico de uma sequência alvo (por exemplo, conseguindo uma menor concentração do polipéptido) que inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto de ensaio que consegue uma inibição semimáxima dos sintomas) como determinada em cultura de células. Tal informação pode ser utilizada para determinar com mais exatidão as doses úteis em humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência. 0 ARNdss caracterizado na invenção pode ser administrado em associação com outros agentes conhecidos eficazes no tratamento de processos patológicos mediados pela expressão de genes alvo. Em qualquer caso, o médico assistente pode ajustar a quantidade e tempo de administração do ARNds com base nos resultados observados utilizando medições de eficácia convencionais, conhecidas na técnica ou aqui descritas.
Administração A presente invenção inclui também composições e formulações farmacêuticas que incluem os compostos de ARNds caracterizados na invenção. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas num número de formas dependendo de se pretende um tratamento local ou sistémico e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica, pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossoles, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica, oral ou parentérica. A administração parentérica inclui a injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; ou a administração intracraniana, por exemplo, intraparenquimatosa, intratecal ou intraventricular. 0 ARNds pode ser administrado de maneira a visar um tecido particular, tal como o fígado (por exemplo, os hepatócitos do fígado). São descritas composições farmacêuticas que podem ser administradas por injeção diretamente no cérebro. A injeção pode ser por injeção estereotáxica numa região particular do cérebro (por exemplo, a substantia nigra, córtex, hipocampo, corpo estriado ou globo pálido), ou o ARNds pode ser administrado em múltiplas regiões do sistema nervoso central (por exemplo, em múltiplas regiões do cérebro, e/ou na medula espinal). 0 ARNds pode ser também administrado em regiões difusas do cérebro (por exemplo, administração difusa ao córtex do cérebro).
Um ARNds que visa a TTR pode ser administrado por meio de uma cânula ou outro dispositivo de administração possuindo uma extremidade implantada num tecido, por exemplo, o cérebro, por exemplo, a substantia nigra, córtex, hipocampo, corpo estriado, corpo caloso ou globo pálido do cérebro. A cânula pode ser conectada a um reservatório da composição de ARNds. 0 caudal ou administração pode ser mediado por uma bomba, por exemplo, uma bomba osmótica ou minibomba, tal como uma bomba Alzet (Durect, Cupertino, CA). Numa forma de realização, uma bomba e reservatório são implantados numa área distante do tecido, por exemplo, no abdómen, e a administração é efetuada por uma conduta que vai desde a bomba ou reservatório até ao sítio de libertação. A infusão da composição de ARNds no cérebro pode ser ao longo de várias horas ou durante vários dias, por exemplo, durante 1, 2, 3, 5 ou 7 dias ou mais. Os dispositivos para administração ao cérebro são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N.° 6,093,180 e 5,814,014.
As composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir adesivos transdérmicos, pomadas, loções, cremes, geles, gotas, supositórios, formulações para pulverização, líquidos e pós. Podem ser necessários ou desejáveis veículos farmacêuticos convencionais, base aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e semelhantes. Os preservativos, luvas e semelhantes revestidos podem ser também úteis. As formulações tópicas adequadas incluem aquelas em que os ARNdss caracterizados na invenção são misturados com um agente de administração tópica tal como lípidos, lipossomas, ácidos gordos, ésteres de ácidos gordos, esteroides, agentes quelantes e tensioativos. Os lípidos e lipossomas adequados incluem neutros (por exemplo, dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidilcolina DMPC, distearoilfosfatidil-colina) negativos (por exemplo, dimiristoilfosfatidil-glicerol DMPG) e catiónicos (por exemplo, dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP e dioleoilfosfatidil-etanolamina DOTMA). Os ARNdss caracterizados na invenção podem ser encapsulados dentro de lipossomas ou podem formar complexos com os mesmos, em particular com lipossomas catiónicos. Alternativamente, os ARNdss podem ser complexados com lípidos, em particular com lípidos catiónicos. Os ácidos gordos e ésteres adequados incluem mas não se limitam a ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazaciclo-heptan-2-ona, uma acilcamitina, uma acilcolina, ou um éster de alquilo Ci-io (por exemplo, miristato de isopropil IPM), monoglicérido, diglicérido ou seu sal farmaceuticamente aceitável. As formulações tópicas são descritas em pormenor na Patente U.S. N.° 6,747,014, a qual é aqui incorporada por referência.
Formulações lipossómicas
Existem muitas estruturas tensioativas organizadas, além das microemulsões, que foram estudadas e utilizadas para a formulação de fármacos. Estas incluem monocamadas, micelas, bicamadas e vesículas. As vesículas, tais como lipossomas, têm atraído muito interesse devido à sua especificidade e à duração de ação que oferecem do ponto de vista de administração de fármacos. Como utilizado na presente invenção, o termo "lipossoma" significa uma vesícula constituída por lípidos anfifílicos organizados numa bicamada ou bicamadas esféricas.
Os lipossomas são vesículas unilamelares ou multilamelares que têm uma membrana formada a partir de um material lipófilo e um interior aquoso. A porção aquosa contém a composição a ser administrada. Os lipossomas catiónicos têm a vantagem de serem capazes de se fundir à parede celular. Os lipossomas não catiónicos, apesar de não serem capazes de se fundir tão eficientemente com a parede celular, são captados por macrófagos in vivo. A fim de atravessar a pele intacta de mamíferos, as vesículas de lípidos têm de passar através de uma série de poros finos, cada um com um diâmetro inferior a 50 nm, sob a influência de um gradiente transdérmico adequado. Por conseguinte, é desejável utilizar um lipossoma que seja altamente deformável e capaz de passar através de tais poros finos.
Outras vantagens dos lipossomas incluem; os lipossomas obtidos de fosfolípidos naturais são biocompatíveis e biodegradáveis; os lipossomas podem incorporar uma grande gama de fármacos solúveis em água e lípidos; os lipossomas podem proteger os fármacos encapsulados nos seus compartimentos internos do metabolismo e degradação (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245) . As considerações importantes na preparação de formulações de lipossomas são a carga superficial do lípido, tamanho da vesícula e o volume aquoso dos lipossomas.
Os lipossomas são úteis para a transferência e administração de ingredientes ativos para o sítio de ação. Uma vez que a membrana lipossómica é estruturalmente semelhante às membranas biológicas, quando os lipossomas são aplicados a um tecido, os lipossomas começam a fundir com as membranas celulares e à medida que a fusão do lipossoma e da célula progride, os conteúdos lipossómicos são esvaziados para a célula onde o agente ativo pode atuar.
As formulações lipossómicas têm sido o foco de investigação extensa como o modo de administração para muitos fármacos. Há evidência crescente que para administração tópica, os lipossomas apresentam várias vantagens em relação a outras formulações. Tais vantagens incluem menores efeitos secundários relacionados com uma alta absorção sistémica do fármaco administrado, maior acumulação do fármaco administrado no alvo desejado, e a aptidão para administrar uma grande variedade de fármacos, tanto hidrófilos como hidrófobos, na pele. Vários relatórios detalharam a aptidão dos lipossomas para administrar agentes, incluindo ADN de alto peso molecular, na pele. Compostos incluindo analgésicos, anticorpos, hormonas e ADNs de alto peso molecular foram administrados na pele. A maioria das aplicações resultou no direcionamento para a epiderme superior
Os lipossomas enquadram-se dentro de duas grandes classes. Os lipossomas catiónicos são lipossomas carregados positivamente gue interagem com as moléculas de ADN carregadas negativamente para formar um complexo estável. 0 complexo de ADN carregado positivamente/lipossoma liga-se à superfície celular carregada negativamente e é internalizado num endossoma. Devido ao pH ácido dentro do endossoma, os lipossomas são rompidos, libertando o seu conteúdo para o citoplasma da célula (Wang et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
Os lipossomas gue são sensíveis ao pH ou carregados negativamente armadilham o ADN em vez de complexos deste. Uma vez gue tanto o ADN como o lípido estão carregados de forma semelhante, ocorre repulsão em vez da formação de complexo. Apesar disso, algum ADN é retido dentro do interior aguoso destes lipossomas. Os lipossomas sensíveis ao pH foram utilizados para administrar ADN que codifica o gene da timidina-cinase a monocamadas de células em cultura. A expressão do gene exógeno foi detetada nas células alvo (Zhou et ai., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
Um tipo principal de composição lipossómica inclui fosfolípidos diferentes da fosfatidilcolina de origem natural. Por exemplo, composições de lipossomas neutros podem ser preparadas a partir de dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC) ou dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC). As composições de lipossomas aniónicos são geralmente preparadas a partir de dimiristoil-fosfatidilglicerol, enquanto os lipossomas fusogénicos aniónicos são preparados principalmente a partir de dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE). Outro tipo de composição lipossómica é preparado a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por exemplo, PC de soja, e PC de ovo. Outro tipo é preparado a partir de misturas de fosfolipido e/ou fosfatidilcolina e/ou colesterol. Vários estudos avaliaram a administração tópica na pele de formulações farmacológicas lipossómicas. A aplicação de lipossomas contendo interferão na pele de porquinhos-da-índia resultou numa redução das feridas cutâneas devidas ao herpes, enquanto a administração do interferão por outros meios (por exemplo, como uma solução ou como uma emulsão) foi ineficaz (Weiner et ai., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Além disso, um estudo adicional testou a eficácia do interferão administrado como parte de uma formulação lipossómica em comparação com a administração de interferão utilizando um sistema aquoso, e concluiu que a formulação lipossómica foi superior à administração aquosa (du Plessis et ai., Antiviral Research, 1992,18,259-265).
Os sistemas lipossómicos não iónicos foram também examinados para determinar a sua utilidade na administração de fármacos na pele, em particular sistemas compreendendo tensioativo não iónico e colesterol. Foram utilizadas formulações lipossómicas não iónicas compreendendo Novasome” I (dilaurato de glicerilo/colesterol/éter de polioxietileno-10-estearilo) e Novasome” II (diestearato de glicerilo/colesterol/éter de polioxietileno-10-estearilo) para administrar a ciclosporina-A na derme da pele de rato. Os resultados indicaram que tais sistemas lipossómicos não iónicos eram eficazes para facilitar a deposição de ciclosporina-A nas diferentes camadas da pele (Hu et al. S.T.P. Pharma. Sei., 1994,4,6,466).
Os lipossomas incluem também lipossomas "estabilizados estericamente", um termo que, como aqui utilizado, refere-se a lipossomas compreendendo um ou mais lípidos especializados que, quando incorporados nos lipossomas, resultam em tempos de vida circulantes melhorados relativamente aos lipossomas que careciam desses lípidos especializados. Os exemplos de lipossomas estabilizados estericamente são aqueles em que parte da porção de lípido que forma a vesícula do lipossoma (A) compreende um ou mais glicolípidos, tais como o monossialogangliosídeo Gmi, ou (B) está derivatizada com um ou mais polímeros hidrófilos, tal como uma unidade de polietileno glicol (PEG) . Embora não se pretenda ficar limitado por qualquer teoria particular, julga-se na técnica que, pelo menos para os lipossomas estabilizados estericamente contendo gangliosídeos, esfingomielina ou lípidos derivatizados com PEG, a semivida circulante melhorada destes lipossomas estabilizados estericamente deriva de uma captação reduzida para as células do sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al. , FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al. , Cancer Research, 1993, 53, 3765).
Na técnica são conhecidos vários lipossomas compreendendo um ou mais glicolípidos. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sei., 1987, 507, 64) referiram a aptidão do monossialogangliosídeo Gmi, sulfato de galactocerebrosídeo e fosfatidilinositol para melhorar as semividas de lipossomas no sangue. Estas constatações foram expostas por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). A Pat. U.S. N.° 4,837,028 e a WO 88/04924, ambas de Allen et al. , divulgam lipossomas compreendendo (1) esf ingomielina e (2) o gangliosídeo Gmi ou um éster de sulfato de galactocerebrosídeo. A Pat. U.S. N.° 5,543, 152 (Webb et al.) divulga lipossomas compreendendo esfingomielina. Os lipossomas compreendendo 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilcolina são divulgados em WO 97/13499 (Lim et al).
Muitos lipossomas compreendendo lípidos derivatizados com um ou mais polímeros hidrófilos, e os métodos para a sua preparação, são conhecidos na técnica. Sunamoto et al. (Buli. Chem. Soc. Jpn., 1980,53,2778) descreveram lipossomas compreendendo um detergente não iónico, 2Ci2i5G/ que contém uma unidade de PEG. Ilium et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) assinalaram que o revestimento hidrófilo de partículas de poliestireno com glicóis poliméricos resulta em semividas significativamente melhoradas no sangue. Fosfolípidos sintéticos modificados pela fixação de grupos carboxílicos de polialquilenoglicóis (por exemplo, PEG) são descritos por Sears (Pat. U.S. N.° 4,426,330 e 4,534,899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990,268,235) descreveram experiências que demonstram que os lipossomas compreendendo fosfatidiletanolamina (PE) derivatizada com PEG ou estearato de PEG têm aumentos significativos nas semividas circulantes sanguíneas. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) alargaram essas observações a outros fosfolípidos derivatizados com PEG, por exemplo, DSPE-PEG, preparado a partir da combinação de distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) e PEG. Lipossomas que têm unidades de PEG ligadas covalentemente na sua superfície externa são descritos na Patente Europeia N.° EP 0 445 131 Bl e WO 90/04384 de Fisher. Composições de lipossomas contendo 1-20 moles percentuais de PE derivatizada com PEG, e métodos de utilização dos mesmos, são descritos por Woodle et al. (Pat. U.S. N.° 5,013,556 e 5,356, 633) e Martin et al. (Pat. U.S. N.° 5,213, 804 e Patente Europeia N.° EP 0 496 813 Bl). Lipossomas compreendendo um número de outros conjugados de lípido-polímero são divulgados em WO 91/05545 e Pat. U.S. N.° 5,225,212 (ambas de Martin et al.) e em WO 94/20073 (Zalipsky et al.) Lipossomas compreendendo lipidos de ceramida modificados com PEG são descritos em WO 96/10391 (Choi et al). A Pat. U.S. N.° 5,540,935 (Miyazaki et al.) e a Pat. U.S. N.° 5,556,948 (Tagawa et al.) descrevem lipossomas contendo PEG que podem ser adicionalmente derivatizados com unidades funcionais nas suas superficies.
Na técnica é conhecido um número de lipossomas compreendendo ácidos nucleicos. A WO 96/40062 de Thierry et al. divulga métodos para a encapsulação de ácidos nucleicos de alto peso molecular em lipossomas. A Pat. U.S. N.° 5,264,221 de Tagawa et al. divulga lipossomas ligados a proteínas e afirma que o conteúdo de tais lipossomas pode incluir um ARNds. A Pat. U.S. N.° 5, 665,710 de Rahman et al. descreve certos métodos de encapsulação de oligodesoxinucleótidos em lipossomas. A WO 97/04787 de Love et al. divulga lipossomas compreendendo ARNdss que visam o gene raf.
Os transfersomas são ainda outro tipo de lipossomas, e são agregados de lipidos altamente deformáveis que são candidatos atrativos para veículos de administração de fármacos. Os transfersomas podem ser descritos como gotículas de lipidos que são tão altamente deformáveis que são facilmente capazes de penetrar através de poros que são menores do que a gotícula. Os transfersomas são adaptáveis ao ambiente no qual são utilizados, por exemplo, eles são auto-otimizantes (adaptáveis à forma dos poros na pele), autorreparáveis, atingem frequentemente os seus alvos sem se fragmentar e frequentemente autocarregáveis. Para preparar os transfersomas pode-se adicionar ativadores do rebordo da superfície, geralmente tensioativos, a uma composição lipossómica convencional. Os transfersomas foram utilizados para administrar albumina de soro à pele. Foi demonstrado que a administração de albumina de soro mediada por transfersomas é tão eficaz quanto a injeção subcutânea de uma solução contendo albumina de soro.
Os tensioativos têm uma grande aplicação em formulações tais como emulsões (incluindo microemulsões) e lipossomas. A forma mais comum de classificação e ordenação das propriedades dos muitos tipos diferentes de tensioativos, tanto naturais como sintéticos, é através da utilização do equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB) . A natureza do grupo hidrófilo (também conhecido como "cabeça") proporciona o meio mais útil de classificação dos diferentes tensioativos utilizados em formulações (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285) .
Se a molécula de tensioativo não está ionizada, é classificada como um tensioativo não iónico. Os tensioativos não iónicos encontram grande aplicação em produtos farmacêuticos e cosméticos e podem ser utilizados ao longo de uma grande gama de valores de pH. Em geral, os valores de HLB variam desde 2 a cerca de 18 dependendo da sua estrutura. Os tensioativos não iónicos incluem ésteres não iónicos tais como ésteres etilenoglicólicos, ésteres propilenoglicólicos, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitano, ésteres de sacarose e ésteres etoxilados. As alcanolamidas e éteres não iónicos tais como os etoxilatos de álcoois gordos, álcoois propoxilados e polímeros de bloco etoxilados/propoxilados, estão também incluídos nesta classe. Os tensioativos de polioxietileno são os membros mais populares da classe de tensioativos não iónicos.
Se a molécula de tensioativo tem uma carga negativa quando é dissolvida ou dispersa em água, o tensioativo é classificado como aniónico. Os tensioativos aniónicos incluem carboxilatos tais como sabões, acil-lactilatos, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tais como sulfatos de alquilo e sulfatos de alquilo etoxilados, sulfonatos tais como benzenossulfonatos de alquilo, acil-isetionatos, acil-tauratos e sulfossuccinatos, e fosfatos. Os membros mais importantes da classe de tensioativos aniónicos são os sulfatos de alquilo e os sabões.
Se a molécula de tensioativo tem uma carga positiva quando é dissolvida ou dispersa em água, o tensioativo é classificado como catiónico. Os tensioativos catiónicos incluem sais de amónio quaternário e aminas etoxiladas. Os sais de amónio quaternário são os membros mais utilizados desta classe.
Se a molécula de tensioativo tem a aptidão para ter uma carga positiva ou negativa, o tensioativo é classificado como anfotérico. Os tensioativos anfotéricos incluem os derivados de ácido acrílico, alquilamidas substituídas, N-alquilbetaínas e fosfatídeos. A utilização de tensioativos em produtos farmacológicos, formulações e em emulsões foi revista (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
Partículas de ácido nucleico-lipido
Um ARNds de TTR caracterizado na invenção pode ser completamente encapsulado na formulação lipídica, por exemplo, para formar um SPLP, pSPLP, SNALP, ou outra partícula de ácido nucleico-lípido. Como aqui utilizado, o termo "SNALP" refere-se a uma partícula de ácido nucleico-lípido estável, incluindo SPLP. Como aqui utilizado, o termo "SPLP" refere-se a uma partícula de ácido nucleico-lípido compreendendo ADN de plasmídeo encapsulado dentro de uma vesícula de lípido. As SNALPs e SPLPs contêm tipicamente um lípido catiónico, um lípido não catiónico, e um lípido que impede a agregação da partícula (por exemplo, um conjugado PEG-lípido). As SNALPs e SPLPs são extremamente úteis para aplicações sistémicas, já que exibem tempos de vida circulantes prolongados após injeção intravenosa (i.v.) e acumulam-se em sítios distais (por exemplo, sítios fisicamente separados de um sítio de administração). As SPLPs incluem "pSPLP," as quais incluem um complexo de agente de condensação-ácido nucleico encapsulado como explicitado na Publicação PCT N.° WO 00/03683. As partículas da presente invenção têm tipicamente um diâmetro médio de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, mais tipicamente de cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, mais tipicamente de cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, muito tipicamente de cerca de 70 nm a cerca de 90 nm, e são substancialmente não tóxicas. Além disso, os ácidos nucleicos quando presentes nas partículas de ácido nucleico-lípido da presente invenção são resistentes, em solução aquosa, à degradação por uma nuclease. Partículas de ácido nucleico-lípido e seu método de preparação são divulgados, por exemplo, na Patente U.S. N.° 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; e Publicação PCT N.° WO 96/40964. A proporção de lípido para fármaco (proporção massa/massa) (por exemplo, proporção de lípido para ARNds) pode situar-se na gama desde cerca de 1:1 a cerca de 50:1, desde cerca de 1:1 a cerca de 25:1, desde cerca de 3:1 a cerca de 15:1, desde cerca de 4:1 a cerca de 10:1, desde cerca de 5:1 a cerca de 9:1, ou desde cerca de 6:1 a cerca de 9:1. 0 lípido catiónico pode ser, por exemplo, cloreto de N,N-dioleil-N,N-dimetilamónio (DODAC), brometo de N,N-diestearil-N,N-dimetilamónio (DDAB), cloreto de N-(1-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamónio (DOTAP), cloreto de N-(1-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamónio (DOTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi)propilamina (DODMA), 1.2- Dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-
Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2-
Dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1.2- Dilinoleiloxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin- DAC) , 1,2-Dilinoleiloxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-
Dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-
Dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-
Linoleoil-2-linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2- DMAP), sal de cloreto de 1,2-Dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), sal de cloreto 1,2-Dilinoleoil-3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-
Dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin-MPZ) ou 3-(N,N-Dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-
Dioleilamino)-1,2-propanodio (DOAP), 1,2-Dilinoleiloxo-3- (2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), 1,2-
Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-
Dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA) ou análogos do mesmo, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienil)tetra-hidro-3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100), 4- (dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31 Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-l9-ilo (MC3), 1,1 ' — (2 — (4 — (2 — ( (2—(bis(2 — hidroxidodecil)amino)etil) (2- hidroxidodecil) amino)etil)piperazin-1- il)etilazanediil)didodecan-2-ol (Tech Gl) , ou uma mistura dos mesmos. 0 lipido catiónico pode compreender desde cerca de 20% molar a cerca de 50% molar ou cerca de 40% molar do lipido total presente na partícula. 0 composto 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[ 1,3]-dioxolano pode ser utilizado para preparar nanopartículas de lipido-ARNsi. A síntese de 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano é descrita no pedido de patente provisório dos Estados Unidos número 61/107,998 apresentado em 23 de outubro de 2008. A partícula de lipido-ARNsi pode incluir 40% de 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano: 10% de DSPC: 40% de Colesterol: 10% de PEG-C-DOMG (percentagem molar) com um tamanho de partícula de 63,0 ± 20 nm e uma Proporção ARNsi/Lípido de 0,027. O lípido não catiónico pode ser um lípido aniónico ou um lípido neutro incluindo, mas não se limitando a, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) , dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-l-carboxilato de dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE-mal) , dipalmitoilfosfatidil-etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil-PE, 16-O-dimetil-PE, 18-1-trans PE, l-estearoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE), colesterol, ou uma mistura dos mesmos. O lípido não catiónico pode perfazer desde cerca de 5% molar a cerca de 90% molar, cerca de 10% molar, ou cerca de 58% molar se estiver incluído colesterol, do lípido total presente na partícula. 0 lípido conjugado que inibe a agregação de partículas pode ser, por exemplo, um polietileno glicol (PEG)-lípido incluindo, sem limitação, um PEG-diacilglicerol (DAG), um PEG-dialquiloxipropilo (DAA), um PEG-fosfolípido, um PEG-ceramida (Cer), ou uma mistura dos mesmos. 0 conjugado de PEG-DAA pode ser, por exemplo, um PEG-dilauriloxipropilo (C12) , um PEG-dimiristiloxipropilo (Ci4) , um PEG-dipalmitiloxipropilo {Cie) , ou um PEG-diesteariloxipropilo (C] a) · 0 lípido conjugado que impede a agregação de partículas pode perfazer desde 0% molar a cerca de 20% molar ou cerca de 2% molar do lípido total presente na partícula. A partícula de ácido nucleico-lípido pode incluir ainda colesterol, por exemplo, a cerca de 10% molar até cerca de 60% molar ou a cerca de 48% molar do lípido total presente na partícula. LNP01 O lipoide ND98-4HC1 (MM 1487) (Fórmula 1), Colesterol (Sigma-Aldrich) e PEG-Ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) podem ser utilizados para preparar nanopartícuias de lípido-ARNsi (isto é, partículas de LNP01). Pode preparar-se soluções-mãe de cada um em etanol como se segue: ND98, 133 mg/mL; Colesterol, 25 mg/mL, PEG-Ceramida C16, 100 mg/mL. As soluções-mãe de ND98, Colesterol e PEG-Ceramida C16 podem ser em seguida combinadas, por exemplo, na proporção molar de 42:48:10. A solução de lípidos combinados pode ser misturada com ARNsi aquoso (por exemplo, em acetato de sódio pH 5) de tal forma que a concentração final de etanol seja de cerca de 35-45% e a concentração final de acetato de sódio seja de cerca de 100-300 mM. Tipicamente, as nanopartícuias de lípido-ARNsi formam-se espontaneamente ao misturar. Dependendo da distribuição de tamanho de partícula desejada, a mistura de nanopartículas resultante pode ser extrudida através de uma membrana de policarbonato (por exemplo, limiar de 100 nm) utilizando, por exemplo, uma extrusora Thermobarrel, tal como a Extrusora Lipex (Northern Lipids, Inc) . Nalguns casos, o passo de extrusão pode ser omitido. A remoção do etanol e a troca simultânea de tampão podem ser conseguidas, por exemplo, por diálise ou filtração de fluxo tangencial. O tampão pode ser trocado, por exemplo, por soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) a cerca de pH 7, por exemplo, cerca de pH 6,9, cerca de pH 7,0, cerca de pH 7,1, cerca de pH 7,2, cerca de pH 7,3 ou cerca de pH 7,4.
As formulações de LNP01 são descritas, por exemplo, na Publicação de Pedido Internacional N.° WO 2008/042973.
Formulações de lípido-ARNsi ilustrativas adicionais são como se segue:
As formulações de LNP09 e as formulações compreendendo XTC são descritas, por exemplo, no N.° de Série Provisório U.S. 61/239,686, apresentado em 3 de setembro de 2009. As formulações de LNPll e as formulações compreendendo MC3 são descritas, por exemplo, no N.° de Série Provisório U.S. 61/244,834, apresentado em 22 de setembro de 2009.
As formulações preparadas pelo método padrão ou sem extrusão podem ser caracterizadas de maneiras semelhantes.
Por exemplo, as formulações são tipicamente caracterizadas por inspeção visual. Elas devem ser soluções translúcidas esbranquiçadas isentas de agregados ou sedimentos. 0 tamanho de partícula e a distribuição de tamanho de partícula das nanopartícuias de lípidos podem ser medidos por dispersão de luz utilizando, por exemplo, um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, EUA) . As partículas devem ter cerca de 20-300 nm, tal como 40-100 nm de tamanho. A distribuição de tamanho de partícula deve ser unimodal. A concentração total de ARNsi na formulação, bem como a fração retida, é estimada utilizando um ensaio de exclusão de corante: A amostra do ARNsi formulado pode ser incubada com um corante de ligação a ARN, tal como Ribogreen (Molecular Probes) na presença ou ausência de um tensioativo de rutura da formulação, por exemplo, 0,5% de Triton-Xl00. O ARNsi total na formulação pode ser determinado pelo sinal da amostra contendo o tensioativo, relativamente a uma curva de calibração. A fração retida é determinada subtraindo o teor de ARNsi "livre" (como medido pelo sinal na ausência de tensioativo) do teor de ARNsi total. A percentagem de ARNsi retido é tipicamente >85%. Para a formulação de SNALP, o tamanho de partícula é de pelo menos 30 nm, pelo menos 40 nm, pelo menos 50 nm, pelo menos 60 nm, pelo menos 70 nm, pelo menos 80 nm, pelo menos 90 nm, pelo menos 100 nm, pelo menos 110 nm, e pelo menos 12 0 nm. A gama adequada é tipicamente de cerca de pelo menos 50 nm a cerca de pelo menos 110 nm, de cerca de pelo menos 60 nm a cerca de pelo menos 100 nm, ou de cerca de pelo menos 80 nm a cerca de pelo menos 90 nm.
As composições e formulações para administração oral incluem pós ou granulados, micropartícuias, nanopartícuias, suspensões ou soluções em água ou meios não aquosos, cápsulas, cápsulas de gel, saquetas, comprimidos ou minicomprimidos. Podem ser desejáveis espessantes, aromatizantes, diluentes, emulsionantes, auxiliares de dispersão ou aglutinantes. Nalgumas formas de realização, as formulações orais são aquelas em que os ARNdss caracterizados na invenção são administrados em conjunto com um ou mais potenciadores de penetração, tensioativos e quelantes. Os tensioativos adequados incluem ácidos gordos e/ou ésteres ou seus sais, ácidos biliares e/ou seus sais. Os ácidos biliares/sais adequados incluem o ácido quenodesoxicólico (CDCA) e ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido eólico, ácido desidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-di-hidro-fusidato de sódio e glicodi-hidrofusidato de sódio. Os ácidos gordos adequados incluem ácido araquidónico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido miristico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazaciclo-heptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina, ou um monoglicérido, um diglicérido ou um seu sal farmaceuticamente aceitável (por exemplo, sódio). Nalgumas formas de realização, são utilizadas combinações de potenciadores de penetração, por exemplo, ácidos gordos/sais em combinação com ácidos biliares/sais. Uma combinação ilustrativa é o sal de sódio de ácido láurico, ácido cáprico e UDCA. Outros potenciadores de penetração incluem o éter de polioxietileno-9-laurilo, éter de polioxietileno-20-cetilo. Os ARNdss caracterizados na invenção podem ser administrados por via oral, na forma granular incluindo partículas secas por pulverização, ou complexados para formar micro ou nanopartículas. Os complexantes de ARNds incluem poli-aminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; poli (acrilatos de alquilo), polioxetanos, poli (cianoacrilatos de alquilo); cationized gelatinas, albumins, amidos, acrilatos, polietileno glicóis (PEG) e amidos; poli (cianoacrilatos de alquilo); poliiminas derivatizadas com DEAE, polulanos, celuloses e amidos. Os complexantes adequados incluem quitosano, N-trimetilquitosano, poli-L-lisina, poli-histidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (por exemplo, p-amino), poli (cianoacrilato de metilo), poli (cianoacrilato de etilo), poli(cianoacrilato de butilo), poli(cianoacrilato de isobutilo), poli(cianoacrilato de iso-hexilo), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albumina e DEAE-dextrano, poli (acrilato de metilo), poli(acrilato de hexilo), poli(ácido D,L-láctico), poli (ácido DL-láctico-co-glicólico) (PLGA), alginato e polietileno glicol (PEG). As formulações orais para ARNdss e a sua preparação são descritas em pormenor na Patente U.S. 6,887,906, Publicação US N.° 20030027780, e Patente U.S. N.° 6,747,014, cada uma das quais é aqui incorporada por referência.
As composições e formulações para administração parentérica, intraparenquimatosa (no cérebro), intratecal, intraventricular ou intra-hepática podem incluir soluções aquosas estéreis, as quais podem conter também tampões, diluentes e outros aditivos adequados tais como, mas não se limitando a, potenciadores de penetração, compostos transportadores e outros veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
As composições farmacêuticas descritas incluem soluções, emulsões e formulações contendo lipossomas. Estas composições podem ser geradas a partir de uma variedade de componentes que incluem, mas não se limitam a, líquidos pré-formados, sólidos autoemulsionantes e semissólidos autoemulsionantes. São particularmente preferidas as formulações que visam o fígado quando se tratam distúrbios hepáticos tais como o carcinoma hepático.
As formulações farmacêuticas da presente invenção, as quais podem ser convenientemente apresentadas em formas de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem o passo de pôr em associação os ingredientes ativos com o(s) veículo(s) ou excipiente(s) farmacêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas colocando em associação uniforme e íntima os ingredientes ativos com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e em seguida, se for necessário, moldando o produto.
As composições da presente invenção podem ser formuladas em qualquer uma de muitas formas de dosagem possíveis tais como, mas não se limitando a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, geles moles, supositórios e enemas. As composições da presente invenção podem ser também formuladas como suspensões em meios aquosos, não aquosos ou mistos. As suspensões aquosas podem conter ainda substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão pode conter também estabilizantes.
Emulsões
As composições da presente invenção podem ser preparadas e formuladas como emulsões. As emulsões são tipicamente sistemas heterogéneos de um líquido disperso noutro na forma de gotículas que excedem, em geral, 0,1 ym de diâmetro (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New
York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988,
Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301) . As emulsões são frequentemente sistemas bifásicos que compreendem duas fases líquidas imiscíveis intimamente misturadas e dispersas uma na outra. Em geral, as emulsões podem ser da variedade de água em óleo (w/o) ou óleo em água (o/w) . Quando uma fase aquosa está finamente dividida e dispersa como gotículas minúsculas numa fase oleosa a granel, a composição resultante é denominada de uma emulsão de água em óleo (w/o). Alternativamente, quando uma fase oleosa está finamente dividida e dispersa como gotículas minúsculas numa fase aquosa a granel, a composição resultante é denominada de uma emulsão de óleo em água (o/w). As emulsões podem conter componentes adicionais além das fases dispersas, e do fármaco ativo que possa estar presente como uma solução na fase aquosa, na fase oleosa ou ele mesmo como uma fase separada. Nas emulsões podem estar também presente excipientes farmacêuticos tais como emulsionantes, estabilizantes, corantes e antioxidantes, consoante necessário. As emulsões farmacêuticas podem ser também emulsões múltiplas que são constituídas por mais do que duas fases tais como, por exemplo, no caso de emulsões de óleo em água em óleo (o/w/o) e água em óleo em água (w/o/w) . Estas formulações complexas proporcionam frequentemente certas vantagens que as emulsões binárias simples não proporcionam. As emulsões múltiplas nas quais gotículas de óleo individuais de uma emulsão de o/w encerram pequenas gotículas de água constituem uma emulsão de w/o/w. Do mesmo modo um sistema de gotículas de óleo encerradas em glóbulos de água estabilizados numa fase oleosa continua proporciona uma emulsão de o/w/a.
As emulsões caracterizam-se por pouca ou nenhuma estabilidade termodinâmica. Frequentemente, a fase dispersa ou descontinua da emulsão encontra-se bem dispersa na fase externa ou continua e é mantida nesta forma pelo meio de emulsionantes ou da viscosidade da formulação. Qualquer uma das fases da emulsão pode ser um semissólido ou um sólido, como é o caso de bases de pomadas e cremes do tipo emulsão. Outros meios de estabilização de emulsões incluem a utilização de emulsionantes que podem ser incorporados em qualquer uma das fases da emulsão. Os emulsionantes podem ser classificados de forma lata em quatro categorias: tensioativos sintéticos, emulsionantes naturais, bases de absorção e sólidos finamente dispersos (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
Os tensioativos sintéticos, também conhecidos como agentes tensioativos, têm encontrado grande aplicabilidade na formulação de emulsões e foram revistos na literatura (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1., p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). Os tensioativos são tipicamente anfifilicos e compreendem uma porção hidrófila e uma hidrófoba. A proporção da natureza hidrófila para hidrófoba do tensioativo tem sido designada o equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB) e é uma ferramenta valiosa para classificar e selecionar tensioativos na preparação de formulações. Os tensioativos podem ser classificados em diferentes classes com base na natureza do grupo hidrófilo: não iónicos, aniónicos, catiónicos e anfotéricos (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).
Os emulsionantes naturais utilizados em formulações de tipo emulsão incluem lanolina, cera de abelha, fosfatideos, lecitina e goma-arábica. As bases de absorção possuem propriedades hidrófilas de tal forma que pode embeber água para formar emulsões de w/o, retendo mesmo assim a sua consistência semissólida, tal como a lanolina anidra e vaselina hidrófila. Os sólidos finamente divididos têm sido também utilizados como bons emulsionantes especialmente em combinação com tensioativos e em preparações viscosas. Estes incluem sólidos inorgânicos polares, tais como hidróxidos de metais pesados, argilas não expansíveis tais como bentonite, atapulgita, hectorite, caulino, montemorilonite, silicato de alumínio coloidal e silicato de alumínio e magnésio coloidal, pigmentos e sólidos apoiares tais como carbono ou triestearato de glicerilo.
Uma grande variedade de materiais não emulsionantes é também incluída nas formulações de emulsão e contribui para as propriedades das emulsões. Estes incluem gorduras, óleos, ceras, ácidos gordos, álcoois gordos, ésteres gordos, humectantes, coloides hidrófilos, conservantes e antioxidantes (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199) .
Os coloides hidrófilos ou hidrocoloides incluem gomas naturais e polímeros sintéticos tais como polissacáridos (por exemplo, goma-arábica, ágar, ácido algínico, carragenina, goma de guar, goma karaya e tragacanta), derivados de celulose (por exemplo, carboximetilcelulose e carboxipropilcelulose) e polímeros sintéticos (por exemplo, carbómeros, éteres de celulose e polímeros de carboxivinilo). Estes dispersam-se ou expandem em água para formar soluções coloidais que estabilizam as emulsões por formação de películas de interface fortes em torno das gotículas da fase dispersa e pelo aumento da viscosidade da fase externa.
Uma vez que as emulsões contêm frequentemente um número de ingredientes tais como hidratos de carbono, proteínas, esteróis e fosfatídeos que podem sustentar facilmente o crescimento de micróbios, estas formulações incorporam frequentemente conservantes. Os conservantes geralmente utilizados, incluídos nas formulações de emulsão incluem metilparabeno, propilparabeno, sais de amónio quaternário, cloreto de benzalcónio, ésteres do ácido p-hidroxibenzoico, e ácido bórico. Os antioxidantes são também geralmente adicionados às formulações de emulsão para prevenir a deterioração da formulação. Os antioxidantes utilizados podem ser armadilhas de radicais livres tais como tocoferóis, galhatos de alquilo, hidroxianisole butilado, hidroxitolueno butilado, ou agentes redutores tais como ácido ascórbico e metabissulfito de sódio, e sinergistas antioxidantes tais como ácido cítrico, ácido tartárico e lecitina. A aplicação das formulações de emulsão pelas vias dermatológica, oral e parentérica e os métodos para o seu fabrico foram revistos na literatura (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199) . As formulações de emulsão para administração oral têm sido muito largamente utilizadas devido à facilidade de formulação, assim como à eficácia do ponto de vista de absorção e biodisponibilidade (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Os laxantes à base de óleos minerais, vitaminas solúveis em óleo e preparações nutritivas com alto teor de gordura estão entre os materiais que foram geralmente administrados por via oral como emulsões de o/w.
As composições de ARNdss e ácidos nucleicos podem ser formuladas como microemulsões. Uma microemulsão pode ser definida como um sistema de água, óleo e anfifílico que é uma solução líquida única oticamente isotrópica e termodinamicamente estável (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245) . Tipicamente, as microemulsões são sistemas que são preparados dispersando primeiro um óleo numa solução aquosa de tensioativo e adicionando em seguida uma quantidade suficiente de um quarto componente, geralmente um álcool de comprimento de cadeia médio para formar um sistema transparente. Por conseguinte, as microemulsões têm sido também descritas como dispersões termodinamicamente estáveis, isotropicamente transparentes de dois líquidos imiscíveis que estão estabilizadas por películas de interface de moléculas de tensioativos (Leung e Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, páginas 185-215) . As microemulsões são geralmente preparadas via uma associação de três a cinco componentes que incluem óleo, água, tensioativo, co-tensioativo e eletrólito. Se a microemulsão é do tipo água em óleo (w/o) ou óleo em água (o/w) depende das propriedades do óleo e tensioativo utilizado e da estrutura e empacotamento geométrico das cabeças polares e caudas de hidrocarboneto das moléculas de tensioativo (Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271) . A abordagem fenomenológica utilizando diagramas de fase foi exaustivamente estudada e produziu um conhecimento abrangente, para um especialista na técnica, de como formular microemulsões (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel-Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). Em comparação com as emulsões convencionais, as microemulsões oferecem a vantagem de solubilizar fármacos insolúveis em água numa formulação de goticulas termodinamicamente estáveis que se formam espontaneamente.
Os tensioativos utilizados na preparação de microemulsões incluem, mas não se limitam a, tensioativos iónicos, tensioativos não iónicos, Brij 96, éteres oleilicos de polioxietileno, ésteres de poliglicerol de ácidos gordos, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (P0500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), sozinhos ou em combinação com co-tensioativos. 0 co-tensioativo, em geral um álcool de cadeia curta tal como etanol, 1-propanol e 1-butanol, serve para aumentar a fluidez interfacial através na penetração na película de tensioativo e, consequentemente, criação de uma película desordenada devido ao espaço vazio gerado entre as moléculas de tensioativo. No entanto, as microemulsões podem ser preparadas sem a utilização de co-tensioativos e os sistemas de microemulsão autoemulsionantes sem álcool são conhecidos na técnica. A fase aquosa pode ser tipicamente, mas não se limita a, água, uma solução aquosa do fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceróis, propileno glicóis, e derivados de etileno glicol. A fase oleosa pode incluir, mas não se limita a, materiais tais como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos gordos, mono, di e triglicéridos de cadeia média (C8-C12), ésteres de glicerilo de ácidos gordos polioxietilados, álcoois gordos, glicéridos poliglicolizados, glicéridos C8-C10 poliglicolizados saturados, óleos vegetais e óleo de silicone.
As microemulsões são de interesse particular do ponto de vista de solubilização do fármaco e absorção melhorada dos fármacos. As microemulsões à base de lípidos (tanto o/w como w/o) têm sido propostas para melhorar a biodisponibilidade oral de fármacos, incluindo péptidos (Constantinides et ai., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). As microemulsões proporcionam as vantagens de melhor solubilização do fármaco, proteção do fármaco da hidrólise enzimática, melhoria possível da absorção do fármaco devido às alterações induzidas pelo tensioativo na fluidez e permeabilidade da membrana, facilidade de preparação, facilidade de administração oral relativamente às formas de dosagem sólidas, melhor potência clínica e menor toxicidade (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al. , J. Pharm. Sei., 1996, 85, 138-143) . Frequentemente, as microemulsões podem formar-se espontaneamente quando os seus componentes são trazidos em conjunto até à temperatura ambiente. Isto pode ser particularmente vantajoso quando se formula fármacos, péptidos ou ARNdss termicamente instáveis. As microemulsões têm sido também eficazes na administração transdérmica de componentes ativos em aplicações cosméticas e farmacêuticas. Prevê-se que as composições e formulações de microemulsão da presente invenção facilitarão uma maior absorção sistémica de ARNdss e ácidos nucleicos a partir do trato gastrointestinal, assim como melhorarão a captação celular local de ARNdss e ácidos nucleicos.
As microemulsões podem conter também componentes e aditivos adicionais tais como monoestearato de sorbitano (Grill 3), Labrasol, e potenciadores de penetração para melhorar as propriedades da formulação e para melhorar a absorção dos ARNdss e ácidos nucleicos da presente invenção. Os potenciadores de penetração utilizados nas microemulsões da presente invenção podem ser classificados como pertencendo a uma de cinco categorias latas -- tensioativos, ácidos gordos, sais biliares, agentes quelantes, e não-tensioativos não quelantes (Lee et ai., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada uma destas classes foi discutida acima.
Potenciadores de Penetração Vários potenciadores de penetração podem ser utilizados para efetuar a administração eficaz de ácidos nucleicos, particularmente ARNdss, na pele de animais. A maioria dos fármacos está presente em solução em formas ionizadas e não ionizadas. No entanto, em geral, apenas os fármacos solúveis em lípidos ou lipófilos atravessam as membranas celulares. Constatou-se que até mesmo fármacos não lipófilos podem atravessar as membranas celulares se a membrana a ser atravessada for tratada com um potenciador da penetração. Além de ajudar à difusão de fármacos não lipófilos através das membranas celulares, os potenciadores de penetração também melhoram a permeabilidade de fármacos lipófilos.
Os potenciadores de penetração podem ser classificados como pertencendo a uma de cinco grandes categorias, ou seja, tensioativos, ácidos gordos, sais biliares, agentes quelantes e não-tensioativos não quelantes (Lee et ai., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p,92) . Cada uma das classes de potenciadores de penetração supramencionada é descrita em mais pormenor a seguir.
Os tensioativos (ou "agentes tensioativos") são entidades químicas que, quando dissolvidas numa solução aquosa, reduzem a tensão superficial da solução ou a tensão interfacial entre a solução aquosa e outro líquido, com o resultado de que a absorção de ARNdss através da mucosa é melhorada. Além dos sais biliares e ácidos gordos, estes potenciadores de penetração incluem, por exemplo, laurilsulfato de sódio, éter de polioxietileno-9-laurilo e éter de polioxietileno-20-cetilo) (Lee et ai., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p,92); e emulsões perfluoroquimicas, tais como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988,40, 252). Ácidos gordos: Vários ácidos gordos e seus derivados que atuam como potenciadores de penetração incluem, por exemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, l-dodecilazaciclo-heptan-2-ona, acilcarniinas, acilcolinas, ésteres de alquilo C.sub.1-10 dos mesmos (por exemplo, metilo, isopropilo e t-butilo), e mono- e diglicéridos dos mesmos (isto é, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al. , Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p,92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
Sais biliares: O papel fisiológico da bílis inclui a facilitação da dispersão e absorção de lípidos e vitaminas solúveis em gordura (Brunton, Capítulo 38 em: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Theraputics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935) . Vários sais biliares naturais, e seus derivados sintéticos, atuam como potenciadores de penetração. Assim, o termo "sais biliares" inclui qualquer um dos componentes naturais da bílis bem como qualquer um dos seus derivados sintéticos. Os sais biliares adequados incluem, por exemplo, ácido eólico (ou seu sal de sódio, colato de sódio farmaceuticamente aceitável), ácido desidrocólico (desidrocolato de sódio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sódio), ácido glucólico (glucolato de sódio), ácido glicólico (glicocolato de sódio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sódio), ácido taurocólico (taurocolato de sódio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sódio), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sódio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-di-hidro-fusidato de sódio (STDHF), glicodi-hidrofusidato de sódio e éter de polioxietileno-9-laurilo (POE) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, Capítulo 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J.
Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al. , J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
Agentes quelantes: Os agentes quelantes, como utilizados em relação à presente invenção, podem ser definidos como compostos que removem iões metálicos da solução formando complexos com os mesmos, tendo como consequência que a absorção de ARNdss através da mucosa é melhorada. No que se refere à sua utilização como potenciadores de penetração na presente invenção, os agentes quelantes têm a vantagem adicional de também servir como inibidores de DNase, já que a maioria das ADN-nucleases caracterizadas requer um ião de metal bivalente para catálise e é, desse modo, inibida por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Os agentes quelantes adequados incluem mas não se limitam a etilenodiaminotetraacetato dissódico (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por exemplo, salicilato de sódio, 5-metoxissalicilato e homovanilato), derivados N-acilo de colagénio, derivados de lauret-9- e N-amino-acilo de beta-dicetonas (enaminas) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51). Não-tensioativos não quelantes: Como aqui utilizados, os compostos potenciadores da penetração não-tensioativos não quelantes podem ser definidos como compostos que demonstram atividade insignificante como agentes quelantes ou como tensioativos mas que, no entanto, melhoram a absorção de ARNdss através da mucosa alimentar (Muranishi, Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta classe de potenciadores de penetração inclui, por exemplo, ureias cíclicas insaturadas, derivados de 1-alquil- e 1-alcenilazaciclo-alcanono (Lee et al., Criticai
Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); e agentes anti-inflamatórios não esteroides tais como diclofenac sódico, indometacina e fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
Veiculos
Certas composições da presente invenção também incorporam compostos transportadores na formulação. Como aqui utilizado, "composto transportador" ou "veiculo" pode referir-se a um ácido nucleico, ou análogo do mesmo, o qual é inerte (ou seja, não possui atividade biológica per se) mas é reconhecido como um ácido nucleico por processos in vivo que reduzem a biodisponibilidade de um ácido nucleico possuindo atividade biológica, por exemplo, degradando o ácido nucleico biologicamente ativo ou promovendo a sua eliminação da circulação. A coadministração de um ácido nucleico e um composto transportador, tipicamente com um excesso da última substância, pode resultar numa redução substancial da quantidade de ácido nucleico recuperada no fígado, rim ou outros reservatórios extracirculatórios, presumivelmente devido à competição entre o composto transportador e o ácido nucleico para um recetor comum. Por exemplo, a recuperação de um ARNds parcialmente fosforotioato no tecido hepático pode ser reduzida quando é coadministrado com ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico ou ácido 4-acetamido-4'isotiociano-estilbeno-2,2'-dissulfónico (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
Excipientes
Em contraste com um composto transportador, um "veículo farmacêutico" ou "excipiente" é um solvente, agente de suspensão farmaceuticamente aceitável ou qualquer outro veículo farmacologicamente inerte para administrar um ou mais ácidos nucleicos a um animal. 0 excipiente pode ser líquido ou sólido e é selecionado tendo em mente a forma de administração planeada, de forma a proporcionam o volume, consistência desejados, etc., quando combinado com um ácido nucleico e os outros componentes de uma dada composição farmacêutica. Os veículos farmacêuticos típicos incluem, mas não se limitam a, aglutinantes (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropilmetilcelulose, etc.); enchimentos (por exemplo, lactose e outros açúcares, celulose microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de cálcio, etilcelulose, poliacrilatos ou hidrogenofosfato de cálcio, etc.); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, sílica, dióxido de silício coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, óleos vegetais hidrogenados, amido de milho, polietileno glicóis, benzoato de sódio, acetato de sódio, etc.); desintegrantes (por exemplo, amido, amidoglicolato de sódio, etc.); e humectantes (por exemplo, laurilsulfato de sódio, etc).
Os excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis adequados para administração não parentérica que não reagem de forma prejudicial com os ácidos nucleicos podem ser também utilizados para formular as composições da presente invenção. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não se limitam a, água, soluções salinas, álcoois, polietileno glicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e semelhantes.
As formulações para administração tópica de ácidos nucleicos podem incluir soluções aquosas estéreis e não estéreis, soluções não aquosas em solventes comuns tais como álcoois, ou soluções dos ácidos nucleicos em bases oleosas liquidas ou sólidas. As soluções podem conter também tampões, diluentes e outros aditivos adequados. Podem ser utilizados excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis adequados para administração não parentérica que não reagem de forma prejudicial com os ácidos nucleicos.
Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não se limitam a, água, soluções salinas, álcool, polietileno glicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silicico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e semelhantes.
Outros Componentes
As composições da presente invenção podem conter adicionalmente outros componentes auxiliares convencionalmente presentes em composições farmacêuticas, aos seus níveis de utilização estabelecidos na técnica. Assim, por exemplo, as composições podem conter materiais farmaceuticamente ativos, compatíveis, adicionais tais como, por exemplo, antipruriginosos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios, ou podem conter materiais adicionais úteis na formulação física de várias formas de dosagem das composições da presente invenção, tais como corantes, aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, espessantes e estabilizantes .
No entanto, tais materiais, quando adicionados, não devem interferir inadequadamente com as atividades biológicas dos componentes das composições da presente invenção. As formulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizantes, humectantes, emulsionantes, sais para influenciar pressão osmótica, tampões, corantes, aromatizantes e/ou substâncias aromáticas e semelhantes que não interagem de forma prejudicial com o(s) ácido (s) nucleico(s) da formulação.
As suspensões aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão pode conter também estabilizantes.
As composições farmacêuticas podem incluir (a) um ou mais compostos de ARNds e (b) um ou mais agentes biológicos anti-citocinas que atuam por um mecanismo não iARN. Os exemplos de tais biologias incluem biologias que visam a ILlp (por exemplo, anacinra), IL6 (tocilizumab) ou TNF (etanercept, infliximab, adlimumab ou certolizumab). A toxicidade e a eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos correntes em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) . A proporção de dose entre os efeitos tóxico e terapêutico é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50/ED50. São preferidos compostos que exibem altos índices terapêuticos.
Os dados obtidos a partir dos ensaios em culturas de células e estudos animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagem para ser utilizada em humanos. A dosagem das composições caracterizadas na invenção situa-se geralmente dentro da gama de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta gama dependendo da forma de dosagem utilizada e da via de administração utilizada. Para qualquer composto utilizado nos métodos caracterizados na invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios em culturas de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para conseguir uma gama de concentrações plasmáticas circulantes do composto ou, quando apropriado, do produto polipeptídico de uma sequência alvo (por exemplo, conseguindo uma menor concentração do polipéptido) que inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto de ensaio que consegue uma inibição semi-máxima dos sintomas) como determinado em cultura de células. Tal informação pode ser utilizada para determinar com maior exatidão doses úteis em humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência.
Além da sua administração, como discutida acima, os ARNdss caracterizados na invenção podem ser administrados em associação com outros agentes conhecidos eficazes no tratamento de processos patológicos mediados pela expressão de TTR. Em qualquer caso, o médico assistente pode ajustar a quantidade e tempo de administração do ARNds com base nos resultados observados utilizando medições convencionais de eficácia conhecidas na técnica ou aqui descritas.
Métodos de tratamento de doenças provocadas por expressão de um gene de TTR A invenção refere-se em particular à utilização de um ARNds que visa a TTR e a composições contendo pelo menos um tal ARNds para o tratamento de um distúrbio ou doença mediado pela TTR. De acordo com a invenção, uma amiloidose de TTR é preferencialmente selecionada de polineuropatia amiloidótica familiar (FAP), cardiomiopatia amiloidótica familiar (FAC), amiloidose leptomeningeal/do SNC, forma VII de amiloidose (também conhecida como amiloidose leptomeningeal ou meningocerebrovascular), hipertiroxinemia, e amiloidose cardíaca (também designada amiloidose sistémica senil (SSA) e amiloidose cardíaca senil (SCA)). A FIG. 15 ilustra sintomas e mutações na TTR associados a neuropatia amiloidótica familiar, cardiomiopatia amiloidótica familiar e amiloidose do SNC. A invenção inclui composições e métodos para o tratamento destas doenças e sintomas, e dirigidas a estas versões mutantes de TTR.
Um ARNds que visa um gene de TTR é também utilizado para o tratamento de sintomas e distúrbios, tais como a amiloidose de TTR. Os sintomas associados a tal amiloidose incluem, por exemplo, ataques apopléticos, demência, mielopatia, polineuropatia, síndrome do túnel cárpico, insuficiência autónoma, cardiomiopatia, disfunção gastrointestinal (por exemplo, úlceras gástricas, diarreia, obstipação intestinal, malabsorção), perda de peso, hepatomegalia, lintadenopatia, bócio, opacidades vítreas, insuficiência renal (incluindo proteinúria e insuficiência renal), nefropatia, disfunção dos nervos cranianos, distrofia da estrutura da córnea, e insuficiência cardíaca congestiva com fraqueza generalizada e dificuldades de respiração devido a retenção de líquido.
Devido aos efeitos inibidores sobre a expressão de TTR, uma composição de acordo com a invenção ou uma composição farmacêutica preparada a partir daquela pode melhorar a qualidade de vida. É também descrita a utilização de um ARNds ou de uma composição farmacêutica do mesmo, por exemplo, para tratar uma amiloidose de TTR, em associação com outros produtos farmacêuticos e/ou outros métodos terapêuticos, por exemplo, com produtos farmacêuticos conhecidos e/ou métodos terapêuticos conhecidos, tais como, por exemplo, aqueles que são atualmente utilizados para tratar estes distúrbios. Num exemplo, um ARNds que visa a TTR pode ser administrado em associação com um transplante hepático. Noutros exemplos, um ARNds que visa a TTR pode ser administrado em associação com um método farmacêutico ou terapêutico de tratamento de um sintoma de uma doença de TTR, tal como diuréticos, inibidores de ACE (enzima de conversão da angiotensina), bloqueadores do recetor de angiotensina (ARBs), ou diálise, por exemplo, para gestão da função renal. 0 ARNds e um agente terapêutico adicional podem ser administrados na mesma associação, por exemplo, por via parentérica, ou o agente terapêutico adicional pode ser administrado como parte de uma composição separada ou por outro método aqui descrito. É também descrito um método de administração de um ARNds que visa a TTR a um doente possuindo uma doença ou distúrbio mediado pela expressão de TTR, tal como uma amiloidose de TTR, por exemplo, FAP. A administração do ARNds pode estabilizar e melhorar a função neurológica periférica, por exemplo, num doente com FAP. Os doentes podem ser administrados com uma quantidade terapêutica de ARNds, tal como 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg ou 2,5 mg/kg de ARNds. O ARNds pode ser administrado por infusão intravenosa ao longo de um intervalo de tempo, tal como ao longo de um período de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 60 minutos, 120 minutos ou 180 minutos. A administração é repetida, por exemplo, numa base regular, tal como quinzenal (isto é, a cada duas semanas) durante um mês, dois meses, três meses, quatro meses ou mais. Após um regímen de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados numa base menos frequente. Por exemplo, após administração quinzenal durante três meses, a administração pode ser repetida uma vez per mês, durante seis meses ou um ano ou mais. A administração do ARNds pode reduzir os níveis de TTR no sangue ou urina do doente em pelo menos 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80 % ou 90% ou mais.
Antes da administração de uma dose completa do ARNds, os doentes podem ser administrados com um dose mais pequena, tal como uma dose que é 5% da dose completa, e monitorizados para efeitos adversos, tais como uma reação alérgica ou uma alteração na função hepática. Por exemplo, em doentes monitorizados para alterações na função hepática é aceitável (por exemplo, um aumento, reversível, de 3 vezes nos níveis de ALT (alanina aminotransferase) e/ou AST (aspartato aminotransferase)) uma baixa incidência de alteração (por exemplo, uma incidência de 10-20% de LFT) no LFT (Teste da Função Hepática).
Muitas doenças e distúrbios associados à TTR são hereditários. Por conseguinte, um doente necessitado de um ARNds de TTR pode ser identificado recolhendo o passado familiar. Um prestador de cuidados de saúde, tal como um médico, enfermeiro ou membro da família, pode recolher o passado familiar antes de prescrever ou administrar um ARNds de TTR. Pode também realizar-se no doente um teste de ADN para identificar uma mutação no gene de TTR, antes de se administrar um ARNds de TTR ao doente. 0 doente pode sofrer uma biopsia antes de receber um ARNds de TTR. A biopsia pode ser, por exemplo, num tecido, tal como a mucosa gástrica, nervo periférico, pele, gordura abdominal, fígado ou rim, e a biopsia pode revelar placas de amiloide, as quais são indicativas de um distúrbio mediado por TTR. Após a identificação de placas de amiloide, o doente é administrado com um ARNds de TTR.
Métodos de inibição da expressão de um gene de TTR É também descrito um método de inibição da expressão de um gene de TTR num mamífero. 0 método inclui administrar uma composição caracterizada na invenção ao mamífero de tal forma que expressão do gene de TTR alvo é silenciada.
Quando o organismo a ser tratado é um mamífero tal como um humano, a composição pode ser administrada por qualquer meio conhecido na técnica incluindo, mas não se limitando às vias orais ou parentéricas, incluindo a administração intracraniana (por exemplo, intraventricular, intraparenquimatosa e intratecal) , intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica, nas vias aéreas (aerossol), nasal, retal e tópica (incluindo bucal e sublingual). Em certas formas de realização, as composições são administradas por infusão ou injeção intravenosa.
Salvo indicação em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o geralmente entendido por um especialista com conhecimentos médios na matéria à qual esta invenção pertence. Embora possam ser utilizados métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos na prática ou avaliação do ARNdss e dos métodos caracterizados na invenção, os métodos e materiais adequados são descritos a seguir.
Exemplo 1. Síntese de ARNds
Origem dos reagentes
Quando a origem de um reagente não é aqui especificamente indicada, esse reagente pode ser obtido de qualquer fornecedor de reagentes para biologia molecular com uma qualidade/pureza convencional para aplicação em biologia molecular.
Sintese de ARNsi
Os ARNs de cadeia simples foram produzidos por síntese em fase sólida numa escala de 1 ymole utilizando um sintetizador Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Alemanha) e vidro de poro controlado (CPG, 500À, Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Alemanha) como suporte sólido. O ARN e o ARN contendo 2'-0-metil-nucleótidos foram gerados por síntese em fase sólida utilizando as fosforamiditas e 2 '-O-metil-fosforamiditas correspondentes, respetivamente (Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Alemanha). Estas unidades estruturais foram incorporadas em sítios selecionados dentro da sequência da cadeia oligorribonucleotídica utilizando química de nucleósidos de fosforamidita convencional tal como descrita em Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, EUA. As ligações de fosforotioato foram introduzidas por substituição da solução oxidante de iodo por uma solução do reagente de Beaucage (Chruachem Ltd, Glasgow, UK) em acetonitrilo (1%). Outros reagentes auxiliares foram obtidos de Mallinckrodt Baker (Griesheim, Alemanha). A desproteção e purificação dos oligorribonucleótidos em bruto por HPLC de troca aniónica foram realizadas de acordo com procedimentos estabelecidos. Os rendimentos e concentrações foram determinados por absorção no UV de uma solução do respetivo ARN a um comprimento de onda de 260 nm utilizando um espetrofotómetro (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, UnterschleiBheim, Alemanha). O ARN de cadeia dupla foi gerado misturando uma solução equimolar de cadeias complementares em tampão de emparelhamento (fosfato de sódio 20 mM, pH 6,8; cloreto de sódio 100 mM), aquecida num banho de água a 85 - 90 °C durante 3 minutos e arrefecida até à temperatura ambiente ao longo de um período de 3 - 4 horas. A solução de ARN emparelhado foi conservada a -20 °C até a sua utilização.
Para a síntese de ARNsis conjugados com 3'-colesterol (aqui referido como -Col-3') foi utilizado um suporte sólido apropriadamente modificado para a síntese de ARN. O suporte sólido modificado foi preparado como se segue:
2-Azabutano-l,4-dicarboxilato de dietilo AA
Uma solução aquosa 4,7 M de hidróxido de sódio (50 mL) foi adicionada a uma solução gelada, mantida sob agitação, de cloridrato de glicinato de etilo (32,19 g, 0,23 mole) em água (50 mL). Em seguida, foi adicionado acrilato de etilo (23,1 g, 0,23 mole) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente até a conclusão da reação ter sido apurada por TLC. Após 19 h, a solução foi partilhada com diclorometano (3 x 100 mL) . A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e evaporada. O resíduo foi destilado para proporcionar AA (28,8 g, 61%).
Éster etílico do ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonil-amino)-hexanoil]-amino}-propiónico AB
Ácido Fmoc-6-amino-hexanoico (9,12 g, 25,83 mmol) foi dissolvido em diclorometano (50 mL) e arrefecido com gelo. Foi adicionada diisopropilcarbodiimida (3,25 g, 3,99 mL, 25, 83 mmol) à solução a 0 °C. Foi então seguida da adição de azabutano-1,4-dicarboxilato de dietilo (5 g, 24,6 mmol) e dimetilaminopiridina (0,305 g, 2,5 mmol). A solução foi trazida até à temperatura ambiente e agitada durante mais 6 h. A conclusão da reação foi apurada por TLC. A mistura reacional foi concentrada sob vácuo e foi adicionado acetato de etilo para precipitar diisopropilureia. A suspensão foi filtrada. O filtrado foi lavado com ácido clorídrico aquoso a 5%, bicarbonato de sódio a 5% e água. A camada orgânica combinada foi seca sobre sulfato de sódio e concentrada para dar o produto em bruto que foi purificado por cromatografia em coluna (50% de AcOEt/Hexanos) para produzir 11,87 g (88%) de AB.
Éster etílico do ácido 3-[ ( 6-amino-hexanoil)-etoxicarbonilmetil-amino]-propiónico AC
Éster etílico do ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H- fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-hexanoil]-amino}-propiónico AB (11,5 g, 21,3 mmol) foi dissolvido em 20% de piperidina em dimetilformamida a 0 °C. A solução foi mantida em agitação durante 1 h. A mistura reacional foi concentrada sob vácuo, foi adicionada água ao resíduo e o produto foi extraído com acetato de etilo. O produto em bruto foi purificado por conversão no seu sal de cloridrato.
Éster etílico do ácido 3-({6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10, 13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}etoxicarbonilmetil-amino)-propiónico AD
0 sal de cloridrato do éster etílico do ácido 3-[(6-amino-hexanoil)-etoxicarbonilmetil-amino]-propiónico AC (4,7 g, 14,8 mmol) foi retomado em diclorometano. A suspensão foi arrefecida até 0 °C sobre gelo. À suspensão foi adicionada diisopropiletilamina (3,87 g, 5,2 mL, 30 mmol) . À solução resultante foi adicionado cloroformato de colesterilo (6,675 g, 14,8 mol). A mistura reacional foi agitada de um dia para o outro. A mistura reacional foi diluída com diclorometano e lavada com ácido clorídrico a 10%. O produto foi purificado por cromatografia flash (10,3 g, 92%) .
Éster etílico do ácido 1-{6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}-4-oxo-pirrolidina-3-carboxílico AE
Suspendeu-se t-butóxido de potássio (1,1 g, 9,8 mmol) em 30 mL de tolueno seco. A mistura foi arrefecida até 0 °C sobre gelo e foi adicionada, lentamente sob agitação dentro de 20 min, 5 g (6,6 mmol) de diéster AD. A temperatura foi mantida abaixo de 5 °C durante a adição. A agitação foi prosseguida durante 30 min a 0 °C e foi adicionado 1 mL de ácido acético glacial, imediatamente seguido de 4 g de NaH2P04 -H20 em 40 mL de água A mistura resultante foi extraída duas vezes com 100 mL de diclorometano cada e os extratos orgânicos combinados foram lavados duas vezes com 10 mL de tampão de fosfato cada, secos, e evaporados até à secura. O resíduo foi dissolvido em 60 mL de tolueno, arrefecido até 0 °C e extraído com três porções de 50 mL de tampão de carbonato pH 9,5 frio. Os extratos aquosos foram ajustados a pH 3 com ácido fosfórico, e extraídos com cinco porções de 40 mL de clorofórmio, as quais foram combinadas, secas e evaporadas até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna utilizando 25% de acetato de etilo/hexano para proporcionar 1,9 g de b-cetoéster (39%). Éster de 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo do ácido [6-(3-hidroxi-4-
hidroximetil-pirrolidin-l-il)-6-oxo-hexil]-carbâmico AF
Foi adicionado, gota a gota ao longo de um período de 1 h, metanol (2 mL) a uma mistura a refluxo de b-cetoéster AE (1,5 g, 2,2 mmol) e boro-hidreto de sódio (0,226 g, 6 mmol) em tetra-hidrofurano (10 mL). A agitação foi prosseguida à temperatura de refluxo durante 1 h. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, foi adicionado HC1 1 N (12,5 mL), a mistura foi extraída com acetato de etilo (3 χ 40 mL) . A camada de acetato de etilo combinada foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada sob vácuo para produzir o produto que foi purificado por cromatografia em coluna (10% de MeOH/CHCls) (89%) . Éster de 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-
2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo do ácido (6-{3-[bis-(4-metoxi-fenil)-fenil-metoximetil]-4-hidroxi-pirrolidin-l-il}-6-oxo-hexil)-carbâmico AG
O diol AF (1,25 g 1, 994 mmol) foi seco evaporando com piridina (2x5 mL) in vacuo. Foram adicionados, sob agitação, piridina anidra (10 mL) e cloreto de 4,4'-dimetoxitritilo (0,724 g, 2,13 mmol). A reação foi realizada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi desativada pela adição de metanol. A mistura reacional foi concentrada sob vácuo e foi adicionado diclorometano (50 mL) ao resíduo. A camada orgânica foi lavada com bicarbonato de sódio aquoso 1M. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada. A piridina residual foi removida evaporando com tolueno. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna (2% de MeOH/Clorofórmio, Rf = 0,5 em 5% de MeOH/CHC13) (1,75 g, 95%). Éster de mono-(4-[bis-(4-metoxi-fenil)-fenil-metoximetil]-1—{6 —[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-
2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-lH ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}-pirrolidin-3-ilo) do ácido succinico AH
O composto AG (1,0 g, 1,05 mmol) foi misturado com anidrido succinico (0,150 g, 1,5 mmol) e DMAP (0,073 g, 0,6 mmol) e seco em vácuo a 40 °C de um dia para o outro. A mistura foi dissolvida em dicloroetano anidro (3 mL) , foi adicionada trietilamina (0,318 g, 0,440 mL, 3,15 mmol) e a solução foi agitada à temperatura ambiente sob atmosfera de árgon durante 16 h. Foi em seguida diluída com diclorometano (40 mL) e lavada com ácido cítrico aquoso gelado (5% em peso, 30 mL) e água (2 χ 20 mL). A fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada até à secura. O resíduo foi utilizado tal e qual no passo seguinte.
CPG derivatizado com colesterol AI
0 succinato AH (0,254 g, 0,242 mmol) foi dissolvido numa mistura de diclorometano/acetonitrilo (3:2, 3 mL) . A essa solução foram adicionadas sucessivamente DMAP (0,0296 g, 0,242 mmol) em acetonitrilo (1,25 mL) , 2,2'-Ditio-bis (5-nitropiridina) (0,075 g, 0,242 mmol) em acetonitrilo/dicloroetano (3:1, 1,25 mL) . À solução resultante foi adicionada trifenilfosfina (0,064 g, 0,242 mmol) em acetonitrilo (0,6 mL) . A mistura reacional ficou de cor laranja brilhante. A solução foi agitada por breves instantes utilizando um agitador de ação de pulso (5 min) . Foi adicionado alquilamina de cadeia longa-CPG (LCAA-CPG) (1,5 g, 61 mM). A suspensão foi agitada durante 2 h. O CPG foi filtrado através de um funil sinterizado e lavado sucessivamente com acetonitrilo, diclorometano e éter. Os grupos amino por reagir foram mascarados utilizando anidrido acético/piridina. A carga de CPG conseguida foi medida efetuando a medição de UV (37 mM/g). A síntese de ARNsis com um grupo bisdecilamida do ácido 5'-12-dodecanoico (aqui referido como "5'-C32-") ou um grupo derivado de 5'-colesterilo (aqui referido como "5'-Col-") foi realizada como descrita em WO 2004/065601, exceto que, para o derivado de colesterilo, o passo de oxidação foi realizado utilizando o reagente de Beaucage a fim de introduzir uma ligação fosforotioato na extremidade 5' do oligómero de ácido nucleico.
As sequências de ácidos nucleicos são representadas abaixo utilizando nomenclatura convencional e especificamente as abreviaturas da Tabela 1.
Tabela 1: Abreviaturas dos monómeros de nucleótidos utilizados na representação das sequências de ácidos nucleicos. Entender-se-á que estes monómeros, quando presentes num oligonucleótido, estão mutuamente ligados por ligações 5'-3'-fosfodiéster.
Exemplo 2A. Conceção de ARNsi de TTR Transcritos A conceção de ARNsi foi realizada para identificar ARNsis que visam o gene transtirretina de humanos (símbolo TTR) e ratazanas (símbolo Ttr). A conceção utilizou os transcritos de TTR NM_000371.2 (SEQ ID NO: 1329) (humano) e NM_012681.1 (SEQ ID NO:133 (ratazana) da coleção Refseq da NCBI. As hélices duplas de ARNsi foram concebidas com 100% de identidade com os seus respetivos genes de TTR.
Conceção de ARNsi e Previsão da Especificidade A especificidade prevista de todos os 19meros possíveis foi determinada para cada sequência. Os ARNsis de TTR foram utilizados numa pesquisa sistemática contra os transcriptomas humano e de ratazana (definidos como o conjunto de registos NM_ e XM_ dentro do conjunto Refseq da NCBI) utilizando o algoritmo FASTA. 0 roteiro Python ' offtargetFasta.py' foi em seguida utilizado para analisar os alinhamentos e gerar uma pontuação com base na posição e número de desemparelhamentos entre o ARNsi e qualquer transcrito 'desviado do alvo' potencial. A pontuação de desvio do alvo é ponderada para acentuar diferenças na região de 'semente' dos ARNsis, nas posições 2-9 a partir da extremidade 5' da molécula. A pontuação de desvio do alvo é calculada como se segue: aos desemparelhamentos entre o oligo e o transcrito são dados penalizações. A um desemparelhamento na região semente nas posições 2-9 do oligo é dada uma penalização de 2,8; aos desemparelhamentos nos sítios de dissociação putativos 10 e 11 é dada uma penalização de 1,2, e aos desemparelhamentos nas posições 12-19 uma penalização de 1. Os desemparelhamentos na posição 1 não são considerados. A pontuação de desvio do alvo para cada par oligo-transcrito é então calculada somando as penalizações por desemparelhamento. A pontuação de desvio do alvo mais baixa de todos os pares oligo-transcrito é em seguida determinada e utilizada na ordenação subsequente dos oligos. Ambas as cadeias do ARNsi foram atribuídas a uma categoria de especificidade de acordo com as pontuações calculadas: uma pontuação superior a 3 qualifica como altamente específica, igual a 3 como específica, e entre 2,2 e 2,8 como moderadamente específica. Na escolha dos oligos a sintetizar, as pontuações de desvio do alvo da cadeia antimensageira foram ordenadas de altas para baixas, e foram selecionados os 144 melhores (pontuação de desvio do alvo mais baixa) pares de oligo dos humanos, e os 26 melhores pares da ratazana.
Seleção de sequências de ARNsi
Um total de 140 oligos mensageiros e 140 oligos antimensageiros de ARNsis derivados da TTR humana foram sintetizados e transformados em hélices duplas. Um total de 26 oligos mensageiros e 26 oligos antimensageiros de ARNsis derivados da TTR de ratazana foram sintetizados e transformados em hélices duplas. As hélices duplas incluídas nos oligos são apresentadas nas Tabelas 2-4 (TTR humana) e Tabelas 5-7 (TTR de ratazana).
Tabela 2. Números de identificação para os ARNdss de TTR humanos
Ver Tabela 4 para sequências e modificações de oligos.
Tabela 3A. Sequências das cadeias mensageira e antimensageira de ARNdss de TTR humanos Cadeia: s= mensageira; as= antimensageira; Posição: posição da base 5' no transcrito (NM_000371.2, SEQ ID NO:1329)
Tabela 3B. Sequências das cadeias mensageira e antimensageira de ARNdss de TTR humanos Cadeia: s= mensageira; as= antimensageira; Posição: posição da base 5' no transcrito (NM_000371.2, SEQ ID NO: 1329)
Tabela 4. Sequências das cadeias mensageira e antimensageira quimicamente modificadas de ARNdss de TTR humanos
Ver Tabela 2 para # hélice dupla. Cadeia: s= mensageira; as= antimensageira; Posição: posição da base 5' no transcrito (NM_000371.2, SEQ ID NO:1329)
Tabela 5: Números de identificação para os ARNdss de TTR de ratazana
Ver Tabela 7 para sequências.
Tabela 6A. Sequências das cadeias mensageira e antimensageira para ARNdss de TTR de ratazana Cadeia: s= mensageira; as= antimensageira; Posição: posição da base 5' no transcrito (NM_012681.1, SEQ ID NO:1330)
Tabela 6B. Sequências das cadeias mensageira e antimensageira para ARNdss de TTR de ratazana Cadeia: s= mensageira; as= antimensageira; Posição: posição da base 5' no transcrito (NM_012681.1, SEQ ID NO:1330)
Tabela 7. Sequências das cadeias mensageira e antimensageira quimicamente modificadas para ARNdss de TTR de ratazana
Ver Tabela 5 para # hélice dupla (nome do ARNds). Cadeia: s= mensageira; as= antimensageira; Posição: posição da base 5' no transcrito (NM_012681.1, SEQ ID NO: 1330)
Síntese das Sequências de TTR
As sequências de TTR foram sintetizadas no sintetizador MerMade 192 à escala de lymol. Para todas as sequências na lista foi aplicada química 'endolight' como se detalha a seguir. • Todas as pirimidinas (citosina e uridina) na cadeia mensageira foram substituídas pelas 2'-O-Metil-bases correspondentes (2' O-Metil-C e 2'-O-Metil-U) • Na cadeia antimensageira, as pirimidinas adjacentes ao (na direção da posição 5') nucleósido ribo A foram substituídas pelos seus 2-0-Metil-nucleósidos correspondentes • Foi introduzida uma extensão de duas bases dTdT na extremidade 3' de ambas as sequências mensageira e antimensageira • 0 ficheiro de sequência foi convertido num ficheiro de texto para torná-lo compatível para introduzir no software de síntese MerMade 192 A síntese das sequências de TTR utilizou síntese de oligonucleótidos suportada em sólidos utilizando química de fosforamidita. A síntese das sequências anteriores foi realizada à escala de lum em placas de 96 poços. As soluções de amidita foram preparadas à concentração de 0,1M e foi utilizado etiltiotetrazole (0,6M em acetonitrilo) como ativador.
As sequências sintetizadas foram dissociadas e desprotegidas em placas de 96 poços, utilizando metilamina no primeiro passo e trietilamina.3HF no segundo passo. As sequências em bruto assim obtidas foram precipitadas utilizando uma mistura de acetona: etanol e o sedimento foi ressuspenso em tampão de acetato de sódio 0,5M. Amostras de cada sequência foram analisadas por LC-MS e os dados de massa resultantes confirmaram a identidade das sequências. Um conjunto selecionado de amostras foi também analisado por cromatografia IEX. 0 passo seguinte no processo foi a purificação. Todas as sequências foram purificadas num sistema de purificação AKTA explorer utilizando uma coluna Source 15Q. Foi recolhido um único pico correspondente à sequência de comprimento total no eluente e foi subsequentemente analisado quanto à pureza por cromatografia de troca iónica.
As sequências purificadas foram dessalinizadas numa coluna Sephadex G25 utilizando o purificador AKTA. As sequências de TTR dessalinizadas foram analisadas quanto à concentração e pureza. As cadeias simples foram em seguida emparelhadas para formar ARNds de TTR.
Exemplo 2B: Seleção in vitro de ARNsis de TTR para supressão de ARNm
Os ARNdss que visam a TTR humana (Tabela 2) foram analisados quanto à inibição da expressão de TTR endógena em células HepG2 e Hep3B, utilizando qPCR (PCR em tempo real) e bDNA (ADN ramificado) ensaios para quantificar ARNm de TTR. 0 ARNds que visa a TTR de roedor (Tabela 5) foi sintetizado e analisado quanto à inibição da expressão de TTR endógena utilizando ensaios bDNA em células H.4.II.E. Os resultados dos ensaios de dose única foram utilizados para selecionar um subconjunto de hélices duplas de ARNds de TTR para experiências dose-resposta para calcular a IC50. Os resultados da IC50 foram utilizados para selecionar ARNdss de TTR para avaliação adicional.
Cultura de células e transfeções:
As linhas de células de hepatócitos HepG2, Hep3B e as células H.4.II.E (ATCC, Manassas, VA) foram cultivadas até quase à confluência a 37 °C numa atmosfera de 5% de CO2 em meio de Eagle modificado por Dulbecco (ATCC) suplementado com 10% de FBS, estreptomicina e glutamina (ATCC) antes de serem libertadas da placa por tripsinização. As células H.4.II.E foram também cultivadas em meio essencial mínimo de Earle. A transfeção inversa foi realizada adicionando 5 pL de Opti-MEM a 5 pL de hélices duplas de ARNsi por poço numa placa de 96 poços juntamente com 10 pL de Opti-MEM mais 0,2 pL de Lipofectamina RNAiMax por poço (Invitrogen, Carlsbad CA., # cat 13778-150) e incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos. Foram então adicionados 80 pL de meio de crescimento completo sem antibióticos contendo 4x104 (HepG2), 2χ104 (Hep3B) ou 2χ104 (H.4.II.E) células. As células foram incubadas durante 24 horas antes da purificação do ARN. Foram realizadas experiências de dose única a uma concentração final de 10 nM de hélice dupla e foram feitas experiências dose-resposta com 10, 1, 0,5, 0,1,0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, 0,00001 nM.
Isolamento do ARN total utilizando o Kit de Isolamento de ARN total MagMAX-96 (Applied Biosystems, Foster City CA, # do consumivel: AM 1830):
As células foram colhidas e sujeitas a lise em 140 pL de Solução de Lise/Ligação, em seguida misturadas durante 1 minuto a 850rpm utilizando um Thermomixer Eppendorf (a velocidade de mistura foi a mesma ao longo do processo). Foram adicionados vinte microlitros de esférulas magnéticas ao lisado de células e misturados durante 5 minutos. As esférulas magnéticas foram capturadas utilizando um suporte magnético e o sobrenadante foi removido sem perturbar as esférulas. Após remoção do sobrenadante, as esférulas magnéticas foram lavadas com Solução de Lavagem 1 (adicionada com isopropanol) e misturadas durante 1 minuto. As esférulas foram novamente capturadas e o sobrenadante removido. As esférulas foram em seguida lavadas com 150 pL de Solução de Lavagem 2 (adicionada com Etanol), capturadas e o sobrenadante foi removido. Foram então adicionados 50 pL de mistura de DNase (Tampão de DNASe MagMax turbo e Turbo DNase) às esférulas e foram misturados durante 10 a 15 minutos. Após a mistura, foram adicionados 100 pL de Solução de Religação de ARN e misturados durante 3 minutos. O sobrenadante foi removido e as esférulas magnéticas foram novamente lavadas com 150 pL de Solução de Lavagem 2 e misturados durante 1 minuto e o sobrenadante foi completamente removido. As esférulas magnéticas foram misturadas durante 2 minutos para secar antes do ARN ter sido eluido com 50 pL de água. Síntese de ADNc utilizando o kit de transcrição inversa de ADNc de Alta capacidade ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, # Cat 4368813):
Uma mistura principal de 2 pL de Tampão 10X, 0,8 pL de dNTPs 25X, 2 pL de Iniciadores aleatórios, 1 pL de Transcriptase Inversa, 1 pL de inibidor de RNase e 3,2 pL de H20 por reação foi adicionada a 10 pL de ARN total. O ADNc foi gerado utilizando um ciclizador térmico Bio-Rad C-1000 ou S-1000 (Hercules, CA) através dos passos seguintes: 25 °C 10 min, 37 °C 120 min, 85 °C 5 s, patamar a 4 °C. PCR de tempo real:
Foram adicionados 2 pL de ADNc a uma mistura principal de 1 pL de Sonda de 18S TaqMan (Applied Biosystems # Cat 4319413E), 1 pL de sonda de TTR TaqMan (Applied Biosystems # Cat HS00174914 Ml) e 10 pL de Mistura Principal de PCR TaqMan Universal (Applied Biosystems # Cat4324018) por poço numa placa de 96 poços MicroAmp Optical (Applied Biosystems # Cat 4326659) . A PCR de tempo real foi feita num sistema de PCR de Tempo Real ABI 7000 Prism ou um ABI 7900HT (Applied Biosystems) utilizando o ensaio ΔΔ Ct(RQ). Todas as reações foram feitas em triplicado.
Os dados de tempo real foram analisados utilizando o método ΔΔ Ct e normalizados aos ensaios realizados com células transfetada com lOnM de Oligo Fluorescente BlockIT (Invitrogen # Cat 2013) ou lOnM de AD-1955 (uma hélice dupla de controlo que visa o gene da luciferase não mamífera) para calcular o número de vezes de alteração.
Ensaios de ADN ramificado - QuantiGene 1.0 (Panomics, Fremont, CA. # Cat: QG0004)- Utilizados para selecionar hélices duplas especificas de roedores Células H.4.II.E (ATCC) foram transfetadas com ARNsi 10 nM. Após remoção do meio, as H.4.II.E foram sujeitas a lise em 100 uL de Mistura de Lise Diluída (uma mistura de 1 volume de mistura de Lise, 2 volumes de água isenta de nuclease e 10 uL de Proteinase-K por mL para uma concentração final de 20 mg/mL), em seguida incubadas a 65 °C durante 35 minutos. Em seguida, foram adicionados 80 pL de Conjunto de Sondas de Trabalho (uma mistura de sonda de TTR ou GAPDH) e 20 uL de lisado de células na Placa de Captura. As Placas de Captura foram incubadas a 53 °C ± 1 °C de um dia para o outro (aproximadamente 16-20 h). As Placas de Captura foram lavadas 3 vezes com Tampão de lavagem IX (uma mistura de água isenta de nuclease, Componente de Tampão 1 e Componente de Tampão de Lavagem 2), em seguida secas por centrifugação durante 1 minuto a lOOOrpm. Foram adicionados 100 pL de Reagente de Trabalho de Amplificação na Placa de Captura, que foi em seguida selada e incubada durante 1 hora a 46 °C ± 1 °C. Os passos de lavagem e secagem foram repetidos após 1 hora de incubação e foram adicionados 100 pL de Reagente de Solução Marcadora. A placa foi em seguida lavada, seca e foram adicionados 100 pL de Substrato (uma mistura de Laurilsulfato de Lítio e Solução de substrato) . As Placas de Captura foram colocadas na incubadora durante 30 minutos a 46 °C ± 1 °C. As Placas de Captura foram em seguida removidas da incubadora e incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos. Finalmente, as Placas de Captura foram lidas utilizando o Luminómetro Victor (Perkin Elmer, Waltham, MA).
Ensaios de ADN Ramificado - QuantiGene 2.0 (Panomics # Cat: QS0011): Utilizado para selecionar todas as outras hélices duplas
Após uma incubação de 24 horas à dose ou doses especificadas, o meio foi removido e as células foram sujeitas a lise em 100 uL de Mistura de Lise (1 volume de mistura de lise, 2 volumes de água isenta de nuclease e 10 pL de Proteinase-K/mL para uma concentração final de 20 mg/mL), em seguida incubadas a 65 °C durante 35 minutos. Foram então adicionados 20 pL de Conjunto de Sondas de Trabalho (sonda de TTR para o gene alvo e GAPDH para controlo endógeno) e 80 pL de lisado celular às Placas de Captura. As Placas de Captura foram incubadas a 55 °C ±
1 °C (aprox. 16-20 h) . No dia seguinte, as Placas de Captura foram lavadas 3 vezes com Tampão de Lavagem IX (água isenta de nuclease, Componente de Tampão 1 e Componente de Tampão de Lavagem 2), em seguida secas por centrifugação durante 1 minuto a 240 g. Foram adicionados 100 pL de Reagente de Trabalho de pré-Amplificação às Placas de Captura, as guais foram seladas com folha de alumínio e incubadas durante 1 hora a 55 °C ± 1 °C. Após 1 hora de incubação, o passo de lavagem foi repetido, em seguida foram adicionados 100 pL de Reagente de Trabalho de Amplificação. Após 1 hora, os passos de lavagem e secagem foram repetidos, e foram adicionados 100 pL de Sonda Marcadora. As placas de captura foram incubadas a 50 °C ± 1 °C durante 1 hora. As placas foram em seguida lavadas com Tampão de Lavagem IX e secas, e em seguida foram adicionadas 100 pL de Substrato às Placas de Captura. As Placas de Captura foram lidas utilizando o Luminómetro SpectraMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) após 5 a 15 minutos de incubação.
Análise dos dados de bDNA:
Os dados de bDNA foram analisados (i) subtraindo a média do fundo de cada amostra em triplicado, (ii) calculando a média dos valores em triplicado resultantes das GAPDH (sonda de controlo) e TTR (sonda experimental), e em seguida (iii) calculando a razão: (sonda experimental- fundo) /(sonda de control-fundo).
Resultados
Um sumário da dose única e resultados de IC50 para os TTR-ARNdss (ARNsis de TTR) são apresentados a seguir na Tabela 8. Os resultados da dose única são expressos como % de ARNm de TTR relativamente ao controlo, analisados em células HepG2. As IC50s foram determinadas em células HepG2 e/ou Hep3B, como indicado.
Tabela 8. Dose única e resultados de IC50 de pesquisas in
vitro de ARNsis de TTR ND: sem dados; * indica resultado que representa a média de duas experiências.
Os dados dose-resposta utilizados para identificar a IC50 para 5 TTR-ARNdss (AD-18258, AD-18274, AD-18324, AD-18328, e AD-18339) , são apresentados em pormenor a seguir na Tabela 9. Todos os 5 ARNsis foram determinados como tendo IC50s nos pM. Os dados de IC50 para os ARNdss na Tabela 8 é um resumo dos dados apresentados na Tabela 9 abaixo.
Um sumário dos resultados da dose única para TTR-ARNdss (ARNsis de TTR) específicos de roedores é apresentado abaixo na Tabela 10. Os resultados de dose única são expressos como % de ARNm de TTR relativamente ao controlo, analisados em células H.4.II.E de ratazana, após transfeção do ARNsis de TTR específico do roedor a 10 nM. Estes resultados mostram que alguns ARNsis de TTR específicos de roedores são eficazes na supressão de ARNm de TTR de ratazana endógeno in vitro.
Tabela 10. Resultados de dose única de pesquisas in vitro de TTR-ARNdss específicos de roedores (ARNsis de TTR)
Exemplo 3. Ensaio in vitro de ARNsis de TTR para indução da secreção de TNF-ot e IFN-ot A fim de avaliar o potencial para imunoestimulação, os ARNsis de TTR foram analisados in vitro quanto à indução da secreção de TNF-α e IFN-a.
As PBMC humanas foram isoladas a partir de camadas leucocitárias recém-recolhidas obtidas de dadores saudáveis (Research Blood Components, Inc., Boston, MA) por uma centrifugação de densidade Ficoll-Hypaque convencional. As células recém-isoladas (1χ105/poço/10OyL) foram aplicadas em placas de 96 poços e cultivadas em meio RPMI 1640 GlutaMax (Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal bovino termicamente inativado e 1% de antibiótico/antimicótico (Invitrogen).
Os ARNsis foram transfetados nas PBMC utilizando o reagente de transfeção DOTAP (Roche Applied Science). O DOTAP foi primeiro diluído em Opti-MEM (Invitrogen) durante 5 minutos antes de se misturar com um volume igual de Opti-MEM contendo o ARNsi. Os complexos de ARNsi/DOTAP foram incubados como especificado pelas instruções do fabricante e subsequentemente adicionados às PBMC (50yL/poço) que foram em seguida cultivadas durante 24 horas. Foram incluídos em todos os ensaios ARNsis de controlo positivo e negativo. O AD-5048 foi utilizado como um ARNsi de controlo positivo. O AD-5048 corresponde a uma sequência que visa a Apolipoproteína B humana (Soutschek et ai., 2004) e desencadeia a secreção de IFN-α e TNF-a neste ensaio. O AD-1955, o qual não desencadeia a secreção de IFN-α e TNF-a neste ensaio, foi utilizado como um ARNsi de controlo negativo. Todos os ARNsis foram utilizados a uma concentração final de 133 nM. A proporção de ARN para reagente de transfeção foi de 16,5 pmoles por yg de DOTAP.
As citocinas foram detetadas e quantificadas nos sobrenadantes das culturas com um kit ELISA comercialmente disponível para IFN-α (BMS216INST) e TNF-α (BMS223INST), ambos da Bender MedSystems (Vienna, Áustria). A indução de citocinas pelo ARNsi de TTR é expressa como a percentagem de IFN-α ou TNF-a produzido relativamente ao ARNsi de controlo positivo, AD-5048.
Os resultados de estimulação de IFN-α e TNF-a para um número de ARNsis de TTR são apresentados na FIG. 1 (média de poços em quadruplicado ± DP) e na Tabela 11 (percentagem em comparação com o AD-5048) abaixo. Nenhum dos ARNsis de TTR avaliado induziu secreção significativa de TNF-α ou IFN-α pelas PBMCs humanas cultivadas.
Tabela 11. Resultados da estimulação de IFN-α e TNF-α para
os ARNsis de TTR
Os cinco ARNdss que visam a TTR (ARNsis de TTR) principais foram selecionados com base em IC50s na gama dos pM nas linhas de células de hepatócitos humanas HepG2 e Hep3B, e na ausência de atividade imunoestimulante. Há uma maior probabilidade das hélices duplas sem quaisquer desemparelhamentos conseguirem anulações significativas do transcrito alvo do que as hélices duplas com desemparelhamentos entre o oligo e o ARNm. Para permitir uma melhor interpretação dos dados de toxicologia entre espécies e para ter a aplicabilidade mais lata em doentes humanos, são geralmente preferidas hélices duplas que têm 100% de identidade com genes ortólogos de ratazana, macaco cinomolgo e humanos, e que não visem regiões com polimorfismos conhecidos. Os cinco compostos principais foram selecionados com base na IC50 em linhas de células de hepatócito na gama dos pM, na ausência de atividade imunoestimulante, especificidade para transcritos de TTR humanos e ausência de polimorfismos (mutações) conhecidos na região do ARNm visada pela hélice dupla. No caso da TTR, não foram encontrados oligos de 19 bases com identidade completa em humanos, ratazanas e macacos cinomolgos. Um resumo destes dados é apresentado na Tabela 12, a qual inclui também informação sobre mutações de TTR conhecidas na região visada pela hélice dupla e reatividade cruzada entre espécies.
Exemplo 4. Redução in vivo do ARNm de TTR hepático e proteína TTR no plasma pelos LNP01-18324, LNP01-18328 e LNP01-18246 em ratos transgénicos
Dois ARNsis de TTR, AD-18324 e AD-18328, foram escolhidos para avaliação in vivo. Estas hélices duplas exibiram silenciamento dependente da dose potente in vitro em linhas de células de hepatócitos (por exemplo HepG2). A FIG. 2A e a FIG. 2B mostram as respostas das doses em células HepG2 após transfeção com AD-18324 (FIG. 2A) ou AD-18328 (FIG. 2B) , onde as doses são expressas em nM no eixo dos x e as respostas são expressas como fração de ARNm de TTR remanescente relativamente ao controlo, no eixo dos y. Nas células HepG2, as IC50s de AD-18324 e AD-18328 foram determinadas como sendo 2 pM e 3 pM, respetivamente. Os sítios alvo de TTR para ambos os candidatos de ARNds principais são na região não traduzida 3' do ARNm de TTR, numa região onde não existem mutações relatadas na literatura.
As sequências de cada cadeia dos dois candidatos principais são reproduzidas abaixo a partir das tabelas. Cadeia: s= mensageira; as= antimensageira; Posição: posição da base 5' no transcrito NM_000371.2.
Além disso, um ARNds de TTR de roedor de reatividade cruzada, AD-18246, foi escolhido para avaliação adicional in vivo. 0 AD-18246 visa uma sequência que começa na posição 88 da grelha de leitura aberta, onde existem três mutações relatadas na literatura. Uma curva dose-resposta para o AD-18246 em células HepG2 é mostrada na FIG. 3. 0 AD-18246 é substancialmente menos potente do que o AD-18324 e o AD-18328; a IC50 do AD-18246 foi determinada como sendo de 265 pM.
Os AD-18324, AD-18328 e AD-18246 foram administrados a ratos transgénicos após formulação em LNP01. Ratos transgénicos H129-mTTR-K0/iN0S-K0/hTTR (transtirretina de rato anulada/ óxido nitrico-sintase induzivel anulada/ transtirretina humana transgénica) com 3-5 meses de idade foram administrados por via intravenosa (IV) com 200 yL de ARNsi especifico para transtirretina formulado em LNP01 (AD-18324, AD-18328 ou AD-18246), ARNsi de controlo que visa o gene da luciferase não mamífera formulado em LNP01 (AD-1955) ou PBS através da veia da cauda às concentrações de 1,0 mg/kg, 3,0 mg/kg ou 6,0 mg/kg para os ARNsis AD-18324 e AD-18328, 3,0 mg/kg para o ARNsi AD-18246 e 6,0 mg/kg para o ARNsi AD-1955. A LNP01 é uma formulação lipoide constituída por ND98, Colesterol e PEG-Ceramida Cl 6.
Após aproximadamente quarenta horas, os ratos foram anestesiados com 200 yL de cetamina e em seguida sangrados cortando a artéria caudal direita. O sangue inteiro foi isolado e o plasma foi isolado e conservado a -80 °C até doseamento. O tecido do fígado foi recolhido, congelado instantaneamente e conservado a -80 °C até processamento. A eficácia do tratamento foi avaliada por (i) medição do ARNm de TTR no fígado às 48 horas após administração, e (ii) medição da proteína TTR no plasma antes do sangramento e às 48 horas após administração. Os níveis de ARNm de TTR hepático foram analisados utilizando os ensaios de ADN Ramificado-QuantiGene 2.0 (Panomics # Cat: QS0011). Resumidamente, amostras de fígado de rato foram trituradas e preparados lisados do tecido. A mistura de lise do fígado (uma mistura de 1 volume de mistura de lise, 2 volume de água isenta de nuclease e 10 uL de Proteinase-K/mL para uma concentração final de 20 mg/mL) foi incubada a 65 °C durante 35 minutos. Foram então adicionados 20 yL de
Conjunto de Sondas de Trabalho (sonda de TTR para o gene alvo e GAPDH para controlo endógeno) e 80 uL de lisado de tecido para a Placa de Captura. As Placas de Captura foram incubadas a 55 °C ± 1 °C (aprox. 16-20 h). No dia seguinte, as Placas de Captura foram lavadas 3 vezes com Tampão de Lavagem IX (água isenta de nuclease, Componente de Tampão 1 e Componente de Tampão de Lavagem 2), em seguida secas por centrifugação durante 1 minuto a 240 g. Foram adicionados 100 uL de Reagente de Trabalho de pré-Amplificação à Placa de Captura, que foi selada com folha de alumínio e incubada durante 1 hora a 55 °C ± 1 °C. Após 1 hora de incubação, o passo de lavagem foi repetido, em seguida foram adicionados 100 pL de Reagente de Trabalho de Amplificação. Após 1 hora, os passos de lavagem e secagem foram repetidos, e foram adicionados 100 pL de Sonda Marcadora. As placas de captura foram incubadas a 50 °C ± 1 °C durante 1 hora. A placa foi em seguida lavada com Tampão de Lavagem IX, seca e foram adicionados 100 pL de Substrato na Placa de Captura. As Placas de Captura foram lidas utilizando o Luminómetro SpectraMax após uma incubação de 5 a 15 minutos. Os dados de bDNA foram analisados subtraindo a média do fundo de cada amostra em triplicado, calculando a média dos valores em triplicado resultantes de GAPDH (sonda de controlo) e TTR (sonda experimental), e calculando em seguida a razão: (sonda experimental-fundo)/(sonda de controlo-fundo).
Os níveis de TTR no plasma foram analisados utilizando o kit comercialmente disponível "AssayMax Human Prealbumin ELISA Kit" (AssayPro, St. Charles, MO, # Catálogo EP3010-1) de acordo com as orientações do fabricante. Resumidamente, o plasma de rato foi diluído a 1:10 000 em mistura de diluentes IX e adicionado a placas pré-revestidas juntamente com os padrões do kit, e incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente, seguida de lavagens 5X com o tampão de lavagem do kit. Foram adicionados cinquenta microlitros de anticorpo contra pré-albumina biotinilado a cada poço e incubados durante 1 h à temperatura ambiente, seguida de lavagens 5X com tampão de lavagem. Foram adicionados cinquenta microlitros de conjugado de estreptavidina-peroxídase a cada poço e as placas foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente, seguida de lavagem como anteriormente descrita. A reação foi desenvolvida pela adição de 50 pL/poço de substrato cromogénico e incubação durante 10 minutos à temperatura ambiente com paragem da reação pela adição de 50 pL/poço de solução de paragem. Foi lida a absorvância a 450 nm num leitor Versamax de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) e os dados foram analisados utilizando o pacote de software Softmax 4.6 (Molecular Devices).
Determinou-se que o LNP01-18324 e o LNP01-18328 reduzem os níveis de ARNm de TTR hepático (FIG. 4A) e da proteína TTR no plasma (FIG. 4B) de uma maneira dependente da dose com administração bolus IV. A ED50 do LNP01-18328 para o ARNm foi determinada como sendo ~1 mg/kg, enquanto a ED50 do LNP01-18324 foi determinada como sendo ~2 mg/kg. Os efeitos dos LNP01-18324 e LNP01-18328 foram específicos, porque o controlo, LNP01-1955 a 6 mg/kg, não afetou significativamente os níveis de ARNm de TTR no fígado, em comparação com o grupo de PBS. O LNP01-18324 e o LNP01-18328 reduziram os níveis da proteína TTR no plasma relativamente ao grupo de PBS, com potências que foram semelhantes àquelas dos níveis de ARNm de TTR. Aos 3 mg/kg, o LNP01-18246 reduziu os níveis de ARNm de TTR no fígado numa menor extensão do que 3 mg/kg de LNP01-18324 ou LNP01-18328 .
Estes resultados demonstram que o LNP01-18324 e o LNPl-18328, administrados por bolus IV, reduzem substancialmente o ARNm de TTR humano expressado pelo fígado de ratos transgénicos, o que resulta na redução de proteína TTR humana em circulação.
Exemplo 5. Redução in vivo de ARNm de TTR de tipo selvagem no fígado de primatas não humanos por SNALP-18324 e SNALP-18328 A fim de avaliar a eficácia dos ARNsis de TTR AD-18324 e AD-18328 nos níveis de ARNm de TTR no fígado de primatas não humanos, os ARNsis foram formulados em SNALP e administrados por infusão IV de 15 minutos. Macacos cinomolgos (Macaca fascicularis) (2 a 5 kg, 3 animais por grupo) foram administrados com infusões IV durante 15 minutos de SNALP-18324 (0,3, 1,0 ou 3,0 mg/kg), SNALP-18328 (0,3, 1 ou 3 mg/kg) ou SNALP-1955 (3 mg/kg, com ARNsi de controlo negativo, AD-1955, que visa o gene de luciferase não mamífera). Às quarenta e oito horas após administração, os macacos foram anestesiado com pentobarbital de sódio e sangrados. Tecido de fígado para determinação do ARNm de TTR foi recolhido, congelado instantaneamente e conservado a -80 °C até processamento.
Os níveis de ARNm de TTR no fígado foram analisados utilizando um ensaio de ADN Ramificado adaptado, utilizando a tecnologia QuantiGenel.0. Resumidamente, amostras de fígado de macaco foram trituradas e foram preparados lisados do tecido. A mistura de lise do fígado (1 volume de mistura de lise, 2 volumes de água isenta de nuclease, e 10 pL de Proteinase-K/mL para uma concentração final de 20 mg/mL) foi incubada a 65 °C durante 35 minutos. Foram então adicionados 20 pL do Conjunto de Sondas de Trabalho (sonda de TTR para o gene alvo e GAPDH para o controlo endógeno) e 80 pL de lisado de tecido à Placa de Captura. As Placas de Captura foram incubadas a 55 °C ± 1 °C (aprox. 16-20 h). No dia seguinte, as Placas de Captura foram lavadas três vezes com Tampão de Lavagem IX (água isenta de nuclease,
Componente de Tampão 1 e Componente de Tampão de Lavagem 2), em seguida secas por centrifugação durante 1 minuto a 240 g. Foram adicionados lOOpL de Reagente de Trabalho de pré-Amplificação à Placa de Captura, que foi selada com folha de alumínio e incubada durante 1 hora a 55 °C ± 1 °C. Após uma incubação de 1 hora, o passo de lavagem foi repetido, e em seguida foram adicionados 100 pL de Reagente de Trabalho de Amplificação. Após 1 hora, os passos de lavagem e secagem foram repetidos, e foram adicionados 100 pL de Sonda Marcadora. As placas de captura foram incubadas a 50 °C ± 1 °C durante 1 hora. As placas foram em seguida lavadas com Tampão de Lavagem IX e secas, e em seguida foram adicionados 100 pL de Substrato à Placa de Captura. As Placas de Captura foram lidas utilizando o
Luminómetro SpectraMax após uma incubação de 5 a 15 minutos. Os dados de bDNA foram analisados (i) subtraindo a média do fundo de cada amostra em triplicado, (ii) calculando a média dos valores resultantes de GAPDH (sonda de controlo) e TTR (sonda de experimental), e em seguida (iii) calculando a razão: (sonda de experimental- fundo) /(sonda de controlo-fundo).
Os resultados são mostrados na FIG. 5. O SNALP-18324 e o SNALPs-18328 reduziram os níveis de ARNm de TTR no fígado de uma maneira dependente da dose, em comparação com o controlo negativo SNALP-1955. As ED50s dos SNALP-18328 e SNALP-18324 para o ARNm foram determinados como sendo de ~0,3 e ~1 mg/kg, respetivamente.
Estes resultados demonstram que o SNALP-18324 e o SNALP-18328 são eficazes na supressão de ARNm de TTR de tipo selvagem no fígado de primatas não humanos quando administrados por infusão IV.
Exemplo 6. Redução in vivo de ARNm e proteína de TTR mutante (V30M) por SNALP-18328 no rato transgénico A fim de avaliar a eficácia do ARNsi de TTR AD-18328 sobre o ARNm de TTR mutante (V30M) no fígado e proteína TTR mutante (V30M) no soro, o AD-18328 foi formulado em SNALP e administrado por bolus IV a ratos transgénicos hTTR V30M. Ratos transgénicos hTTR V30M com 8 a 12 semanas de idade (5 animais/ grupo) foram administrados por via intravenosa (IV) com 200 yL de SNALP-18328 (0,03, 0,3 ou 3 mg/kg) , SNALP-1955 (3 mg/kg, com ARNsi de controlo negativo AD-1955 que visa o gene de luciferase não mamífera) ou PBS. Os ratos utilizados foram da raça Hl29-hTTR KO de Mus musculus do Institute of Molecular and Cellular Biology, Porto, Portugal. Resumidamente, ratos transgénicos hTTR H129 foram cruzados com ratos H129 TTR endógena KO (null mice to generate the Hl29-hTTR transgenic mice, in a null mouse TTR background (Maeda, S., (2003), Use of genetically altered mice to study the role of serum amyloid P component in amyloid deposition. Amyloid Suppl. 1, 17-20.). Às 48 h após injeção, os animais em todos os cinco grupos de tratamento foram administrados com uma dose letal de cetamina/xilazina. As amostras de soro foram recolhidas e conservadas a -80 °C até análise. O tecido de fígado foi recolhido, congelado instantaneamente e conservado a -80 °C até processamento.
Para quantificação do ARNm de TTR, tecido de figado congelado foi triturado até um pó, e foram preparados lisados. Os niveis de ARNm de TTR relativamente àqueles de ARNm de GAPDH foram determinados nos lisados utilizando um ensaio de ADN ramificado (QuantiGene Reagent System, Panomics, Fremont, CA). Resumidamente, o ensaio QuantiGene (Genospectra) foi utilizado para quantificar os niveis de ARNm em lisados de amostras de tecidos de acordo com as instruções do fabricante. 0 nivel médio de ARNm de TTR foi normalizado ao nivel médio de ARNm de GAPDH para cada amostra. As médias dos grupos dos valores normalizados foram ainda adicionalmente normalizadas ao valor médio para o grupo tratado com PBS, para obter o nivel relativo de expressão de ARNm de TTR.
Para a quantificação da proteína TTR, o soro foi analisado utilizando o Kit ELISA Assaymax PreAlbumin AssayPro (St. Charles, MO) de acordo com o protocolo do fabricante.
Os resultados são mostrados na FIG. 6A e FIG. 6B para o ARNm hepático e proteína sérica, respetivamente. Os ratos transgénicos hTTR V30M tratados com SNALP-18328 tiveram uma diminuição significativa e dependente da dose dos níveis de ARNm de TTR no fígado relativamente ao grupo de controlo de PBS, atingindo uma redução máxima de 97% (p < 0,001) a 3 mg/kg de SNALP-18328, e uma redução de 50% (ED50) a ~0,15 mg/kg de SNALP-18328. A proteína TTR no soro foi também suprimida de uma maneira dependente da dose, com uma redução máxima da proteína TTR no soro de 99% (p < 0,01) (relativamente aos níveis pré-dose) a 3 mg/kg de SNALP-18328, coerente com a redução nos níveis de ARNm de TTR. O SNALP-1955 a 3 mg/kg não teve um efeito estatisticamente significativo nos níveis de ARNm de TTR ou proteína, em comparação com o PBS.
Estes resultados demonstram que o SNALP-18328, quando administrado IV, é ativo na supressão do ARNm de TTR V30M mutante no figado do rato transgénico, o que resulta na redução da proteína TTR V30M mutante em circulação.
Exemplo 7. Durabilidade da supressão do ARNm e proteína de TTR por SNALP-18328 no rato transgénico A fim de avaliar a durabilidade da supressão do ARNm e proteína de TTR pelo SNALP-18328, o AD-18328 foi formulado em SNALP e administrado por bolus IV em ratos transgénicos hTTR V30M. Os níveis de ARNm de TTR no fígado e os níveis da proteína TTR no soro foram quantificados em vários pontos no tempo após administração. Ratos transgénicos hTTR V30M com 8 a 12 semanas de idade (4 animais/ grupo) foram administrados por via intravenosa (IV) com 200 yL de SNALP-18328 (1 mg/kg) ou SNALP-1955 (1 mg/kg, com ARNsi de controlo negativo AD-1955 que visa o gene de luciferase não mamífera). Os ratos utilizados foram da raça Hl29-hTTR KO de Mus musculus do Institute of Molecular and Cellular Biology, Porto, Portugal. Resumidamente, ratos transgénicos hTTR H129 foram cruzados com ratos H129 TTR endógena KO (null mice to generate the Hl29-hTTR transgenic mice, in a null mouse TTR background (Maeda, S., (2003), Use of genetically altered mice to study the role of serum amyloid P component in amyloid deposition. Amyloid Suppl. 1, 17-20). Nos dias 3, 8, 15 ou 22 após administração, os animais em ambos os grupos de tratamento foram administrados com uma dose letal de cetamina/xilazina. Foram recolhidas amostras de soro e conservadas a -80 °C até análise. Foi recolhido tecido de fígado, congelado instantaneamente e conservado a -80 °C até processamento.
Para a quantificação do ARNm de TTR, tecido de figado congelado foi triturado até um pó, e foram preparados lisados. Os niveis de ARNm de TTR relativamente àqueles de ARNm de GAPDH foram determinados nos lisados utilizando um ensaio de ADN ramificado (QuantiGene Reagent System, Panomics, Fremont, CA). Resumidamente, o ensaio QuantiGene (Genospectra) foi utilizado para quantificar os niveis de ARNm em lisados de amostras de tecido de acordo com as instruções do fabricante. 0 nivel médio de ARNm de TTR foi normalizado ao nivel médio de ARNm de GAPDH para cada amostra. As médias dos grupos dos valores normalizados foram em seguida adicionalmente normalizadas ao valor médio para o grupo tratado com PBS, para obter o nivel relativo de expressão de ARNm de TTR.
Para quantificação da proteína TTR, o soro foi analisado utilizando o Kit ELISA Assaymax PreAlbumin AssayPro (St. Charles, MO) de acordo com o protocolo do fabricante.
Os resultados são mostrados nas FIG. 7A e FIG. 7B para o ARNm hepático e proteína sérica, respetivamente. Uma única administração de bolus IV de SNALP-18328 no rato transgénico hTTR V30M resultou em inibição persistente dos níveis de ARNm de TTR no fígado e níveis da proteína TTR no soro. Em comparação com o grupo de controlo (1 mg/mL de SNALP-1955), uma única administração IV de SNALP-18328 a 1 mg/kg reduziu significativamente os níveis relativos de ARNm de TTR nos Dias 3, 8, 15 e 22 após dose em 96% (p < 0,001), 90% (p < 0,001), 82% (p < 0,001) e 73% (p < 0,001), respetivamente, e não regressaram aos níveis de base no final do estudo (Dia 22 após dose) . Os níveis de proteína também diminuíram com uma redução máxima de TTR no soro de 97% (p < 0,001) (relativamente ao SNALP-1955) no Dia 3 após dose. Nos Dias 8, 15 e 22 após dose, os níveis da proteína TTR foram suprimidos em 72% (p < 0,05), 32% (p < 0,05) e 40% (p < 0,001), respetivamente, relativamente ao SNALP- 1955.
Estes resultados demonstram que uma única administração IV de SNALP-18328 produz uma supressão persistente dos níveis de ARNm hepático alvo e dos níveis de proteína sérica no rato transgénico V30M hTTR, com reduções significativas do ARNm de TTR hepático e proteína TTR sérica aos 22 dias após administração.
Exemplo 8. Durabilidade da supressão da proteína TTR sérica por SNALP-18328 no primata não humano A fim de avaliar a durabilidade da supressão da proteína TTR sérica por SNALP-18328, o AD-18328 foi formulado em SNALP e administrado por infusão IV a primatas não humanos. Os níveis da proteína TTR no soro foram quantificados em vários pontos no tempo após administração.
Macacos cinomolgos (Macaca fascicularis) (n= 5 animais/grupo para os grupos de SNALP-18328 e n = 3 animais/grupo para os grupos de SNALP-1955 e PBS) foram administrados com uma infusão IV de 15 minutos de SNALP-18328 (0,3, 1 ou 3 mg/kg) , SNALP-1955 (3 mg/kg) com ARNsi de controlo negativo AD-1955 que visa o gene de luciferase não mamífera), ou PBS. Nos Dias 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10 e 14 da fase de administração, foram recolhidas amostras de soro e conservadas a -80 °C até análise.
Foi utilizada análise de transferência de Western para avaliar os níveis da proteína TTR em amostras de soro. As amostras de soro de cada grupo foram agrupadas e diluídas 1:1 com tampão de amostra de Laemmli (foi adicionado β-mercaptoetanol a uma diluição de 1:20) . As amostras foram aquecidas a 95 °C durante 10 minutos. Foram aplicados 12,5 yL de cada amostra em cada faixa de um gel preparativo Criterion a 10-20% (Biorad, Hercules; CA) e separados por SDS-PAGE a 120V durante 1,5 h, em seguida transferidos para uma membrana de nitrocelulose utilizando um sistema semi-seco a 15V durante 1 hora. A membrana foi bloqueada de um dia para o outro a 4 °C em tampão de bloqueio LiCOR (Lincoln, NE) diluído a 1:1 com PBS IX. A transferência foi primeiro testada com anticorpos primários (anti-TTR de cabra de Santa Cruz (Santa Cruz, CA) a uma diluição de 1:1000 diluídos em tampão de bloqueio LiCOR /PBS num oscilador durante 1 h à temperatura ambiente. As transferências foram lavadas 4X com PBS + 0,2% de Tween 20 (10 minutos por lavagem). Foram adicionados anticorpos secundários marcados com fluorescência (anti-cabra 680nm de Invitrogen (Carlsbad, CA) a uma diluição de 1:10 000 em tampão de bloqueio LiCOR/PBS e a transferência foi incubada durante 1 hora à temperatura ambiente. Após incubação, as transferências foram lavadas 4X com PBS + 0,2% de Tween 20, seguida de uma lavagem com PBS IX. O Sistema de Imagem de Infravermelho Odyssey da Li-COR foi utilizado para detetar as bandas da proteína. O monómero de TTR migra aos 15 kDa.
Os resultados são mostrados na FIG. 8. Os níveis de proteína TTR no soro exibiram uma redução dependente da dose com 1 ou 3 mg/kg de SNALP-18328, em comparação com os níveis pré-dose (Dia 0) . A duração da supressão, após uma única administração IV de SNALP-18328 é de pelo menos 14 dias após tratamento com 1 ou 3 mg/kg de SNALP-18328.
Estes resultados demonstram que uma única administração IV de SNALP-18328 produz supressão persistente da proteína TTR em circulação no primata não humano (Macaca fascicularis), com redução significativa da proteína TTR aos 14 dias após administração.
Exemplo 9: Redução in vivo da TTR mutante (V30M) nos tecidos periféricos por SNALP-18328 no rato transgénico A fim de avaliar a eficácia de SNALP-18328 na redução de TTR nos tecidos periféricos, ratos anulados hTTR V30M/HSF-1 foram avaliados por revelação imuno-histoquímica para a TTR. Ratos anulados hTTR V30M/HSF-1 com dois meses de idade (Maeda, S., (2003), Use of genetically altered mice to study the role of serum amyloid P component in amyloid deposition. Amyloid Suppl. 1, 17-20) foram administrados com urn bolus IV de 3 mg/kg de SNALP-18328 (12 animais), 3 mg/kg de SNALP-1955 (com ARNsi de controlo negativo AD-1955 que visa o gene de luciferase não mamífera, 4 animais) , ou PBS (4 animais) uma vez a cada duas semanas durante um total de quatro doses nos dias 0, 14, 28 e 42. Os níveis de ARNm de TTR hepático e a imunorreatividade de TTR em tecidos periféricos múltiplos foram avaliados às 8 semanas após a primeira dose, no dia 56.
Os ratos foram anestesiados com 1 mg/kg de medetomidina, e administrados com uma dose letal de cetamina. Os tecidos e órgãos de interesse foram recolhidos. Para imuno-histoquímica, o esófago (E) , estômago (S), intestino (duodeno (II) e cólon (14)), tecido nervoso (N) e gânglios da raiz dorsal (D) foram fixados em formalina tamponada neutra e embutidos em parafina. Para deteção de TTR, o anticorpo primário anti-TTR humana de coelho (1:1000, DAKO, Dinamarca) e o anticorpo secundário anti-coelho conjugado com biotina (1:20 Sigma, EUA) foram seguidos de marcação com extravidina (1:20, Sigma, EUA) para revelar para a proteína TTR. A reação foi desenvolvida com 3-amino-9-etil-carbaxole, AEC (Sigma, EUA). A análise semiquantitativa de lâminas imuno-histoquímicas foi realizada utilizando o programa de quantificação de imagem Scion que mede a área ocupada pela cor da reação do substrato e normaliza este valor à área da imagem total. Os valores médios da % de área ocupada são apresentados com o desvio padrão correspondente. Cada tecido animal foi avaliado em quatro áreas distintas. A presença de TTR humana nos gânglios parassimpáticos do estômago e intestino foi estudada por revelação imunofluorescente dupla com anti-TTR humana de coelho (1:1000, DAKO, Dinamarca) e anti-PGP9.5 de rato (1:40, Serotec, EUA) como os anticorpos primários; os anticorpos secundários foram, respetivamente: Alexa Fluor 488 anti-coelho (Molecular probes, UK) e Alexa Fluor 568 anti-rato de cabra (Molecular probes, UK). As lâminas foram montadas com vectashield (Vetor) e visualizadas num microscópio com Sistema Observador de Células Zeiss (Cari Zeiss, Alemanha) munido de filtros para FITC e rodamina.
Os resultados são apresentados graficamente na FIG. 9. Em contraste com os animais tratados com PBS e SNALP-1955, os animais tratados com SNALP-18328 tiveram uma redução significativa da imunorreatividade de TTR em todos os tecidos examinados (esófago (E) , estômago (S) , intestino (duodeno (II) e cólon (14)), tecido nervoso (N) e gânglios da raiz dorsal (D).
Estes resultados demonstram que a administração de SNALP-18328 a ratos anulados hTTR V30M/HSF-1 provoca uma redução significativa da proteína TTR nos tecidos periféricos e órgãos, incluindo esófago, estômago, intestino (duodeno e cólon), tecido nervoso e gânglios da raiz dorsal.
Exemplo 10. Redução in vivo de ARNm de TTR de tipo selvagem no fígado de primatas não humanos por XTC-SNALP-18328 A fim de avaliar a eficácia da nova formulação de nanoparticulas de lípidos XTC-SNALP para a administração de ARNsi em primatas não humanos, o ARNsi de TTR AD-18328 foi formulado em XTC-SNALP (XTC-SNALP-18328) e administrado por infusão IV durante 15 minutos, e o ARNm de TTR hepático foi quantificado. Macacos cinomolgos (Macaca fascicularis) foram administrados com infusões IV durante 15 minutos de XTC-SNALP-18328 (0,03, 0,1, 0,3 ou 1 mg/kg) ou XTC-SNALP-1955 (1 mg/kg, com ARNsi de controlo negativo AD-1955 que visa o gene de luciferase não mamífera). Às quarenta e oito horas após administração, os macacos foram anestesiado com pentobarbital de sódio e sangrados. Tecido de fígado para determinação do ARNm de TTR foi recolhido, congelado instantaneamente e conservado a -80 °C até processamento. Os métodos utilizados para quantificação do ARNm de TTR no tecido de fígado foram semelhantes aos descritos no Exemplo 5 acima.
Os resultados são mostrados na FIG. 10. O XTC-SNALP-18328 reduziu os níveis de ARNm de TTR no fígado de uma maneira dependente da dose, em comparação com o controlo negativo XTC-SNALP-1955. A ED50 para o ARNm foi determinada como sendo ~0,1 mg/kg de XTC-SNALP-18328.
Estes resultados demonstram que o XTC-SNALP-18328 é eficaz na supressão do ARNm de TTR de tipo selvagem no fígado de primatas não humanos quando administrado por infusão IV.
Exemplo 11: Redução in vivo do ARNm de TTR de tipo selvagem no fígado de primatas não humanos por LNP09-18328 e LNP11-18328 A fim de avaliar a eficácia de duas novas formulações de nanoparticulas de lípidos, LNP09 e LNPll, para administração de ARNsi em primatas não humanos, o ARNsi de TTR AD-18328 foi formulado em LNP09 (LNP09-18328) ou LNPll (LNPll-18328), e administrado por infusão IV durante 15 minutos, e foram analisados os níveis de ARNm de TTR hepático e da proteína TTR sérica. Macacos cinomolgos (Macaco fascicularis) foram administrados com infusões IV durante 15 minutos de LNP09-18328 (0,03, 0,1 ou 0,3 mg/kg), LNPll-18328 (0,03, 0,1 ou 0,3 mg/kg), ou PBS. Foram recolhidas amostras de biopsia do fígado às 48 h após administração, congeladas instantaneamente, e conservadas a -80 °C até processamento. O soro foi recolhido antes da administração (pré-sangramento), e nos Dias 1, 2, 4, 7, 14, 21 e 28 após administração e conservado a -80 °C até processamento. Os métodos utilizados para quantificação do ARNm de TTR no tecido de fígado e a avaliação da proteína TTR sérica foram semelhantes aos descritos nos Exemplos 5 e 8 acima.
Os resultados são mostrados na FIG. 11A para o ARNm, e nas FIG. 11B e FIG. 11C para a proteína. Os animais tratados com LNP09-18328 e LNPll-18328 exibiram uma diminuição dependente da dose dos níveis de ARNm de TTR no fígado, atingindo uma redução máxima aos 0,3 mg/kg de ~ 85% (LNP09-18328) e ~ 90% (LNPll-18328) do ARNm relativamente ao controlo de PBS. A ED50 para o ARNm foi determinada como sendo de ~ 0,02 mg/kg para LNP09-18328 e LNPll-18328. No Dia 7 após administração, as amostras de soro exibiram também uma redução dependente da dose da proteína TTR para 0,1 e 0,3 mg/kg de LNP09-18328 e LNPl-18328, em comparação com os níveis de controlo de PBS. A FIG. 11C mostra uma diminuição nos níveis da proteína TTR com uma dose de 0,3 mg/kg de LNP09-18328 que persistiu ao longo de pelo menos 28 dias após administração, em comparação com o grupo de controlo de PBS e em comparação com as amostras pré-sangramento.
Estes resultados demonstram que o LNP09-18328 e o LNPll-18328 são eficazes na supressão do ARNm de TTR de tipo selvagem no fígado de primatas não humanos e da proteína TTR de tipo selvagem em circulação, quando administrados por infusão IV. Além disso, a supressão com LN09-18328 é duradoura, persistindo durante pelo menos 28 dias após a infusão IV.
Exemplo 12. Sintese de Sequências em Mosaico de TTR
Foi concebido um conjunto de hélices duplas de TTR ("hélices duplas em mosaico") que visa o gene de TTR próximo da região alvo do AD-18328, o qual visa o gene de TTR humano que começa no nucleótido 628 da NM_000371.3.
Nos exemplos abaixo, a numeração que representa a posição da base 5' de um ARNsi no transcrito baseia-se em NM_000371.3 (FIG. 12; SEQ ID NO:1331). Nos exemplos mostrados acima, a numeração do ARNsi que visa o ARNsi humano baseou-se em NM_000371.2 (FIG. 13A) . O NM_000371.3 prolonga a sequência do 5' UTR em 110 bases em comparação com a NM_000371.2, como se mostra na FIG. 14. Assim, como um exemplo, a posição inicial do AD-18328 é 628 em NM_000371.3 e 518 em NM_000371.2 (FIG. 14).
As sequências em mosaico da TTR foram sintetizadas no sintetizador MerMade 192 à escala de lumol. Para todas as sequências na lista foi aplicada química 'endolight' como se detalha abaixo. • Todas as pirimidinas (citosina e uridina) na cadeia mensageira continham 2'-O-Metil-bases (2' O-Metil-C e 2 '-0-Metil-U) • Na cadeia antimensageira, as pirimidinas adjacentes (na direção da posição 5') ao nucleósido ribo A foram substituídas pelos seus 2-0-Metil-nucleósidos correspondentes • Foi introduzida uma extensão de duas bases dTdT na extremidade 3' de ambas as sequências mensageira e antimensageira • 0 ficheiro da sequência foi convertido num ficheiro de texto para torná-lo compatível para introdução no software de síntese MerMade 192 Síntese, Dissociação e desproteção: A síntese de sequências de TTR utilizou síntese de oligonucleótidos suportada em sólidos utilizando química de fosforamidita. A síntese das sequências foi realizada à escala de lum em placas de 96 poços. As soluções de amidita foram preparadas à concentração de 0,1M e foi utilizado etiltitetrazole (0,6M em acetonitrilo) como ativador. As sequências sintetizadas foram dissociadas e desprotegidas em placas de 96 poços, utilizando metilamina no primeiro passo e reagente de fluoreto no segundo passo. As sequências em bruto foram precipitadas utilizando uma mistura de acetona: etanol (80:20) e os sedimentos foram ressuspensos em tampão de acetato de sódio 0,2M. Amostras de cada sequência foram analisadas por LC-MS para confirmar a identidade, por UV para quantificação e um conjunto selecionado de amostras por cromatografia IEX para determinar a pureza.
Purificação e dessalinização:
As sequências em mosaico de TTR foram purificadas num sistema de purificação AKTA explorer utilizando uma coluna Source 15Q. Foi mantida uma temperatura da coluna de 65 °C durante a purificação. A injeção e colheita da amostra foram realizadas em placas de 96 poços (poços profundos de 1,8 mL) . No eluente foi recolhido um único pico correspondente à sequência de comprimento total. As sequências purificadas foram dessalinizadas numa coluna Sephadex G25 utilizando o purificador AKTA. As sequências de TTR dessalinizadas foram analisadas quanto à concentração (por medição de UV a A260) e pureza (por HPLC de troca iónica). As cadeias simples foram depois submetidas a emparelhamento.
Cadeias simples e hélices duplas de TTR:
Uma lista detalhada de hélices duplas em mosaico de TTR e correspondentes cadeias simples (mensageira e antimensageira) é mostrada na tabela abaixo (Tabela 13).
Tabela 13: Hélices duplas em mosaico de TTR e cadeias simples correspondentes
Cadeia: s= mensageira; as= antimensageira; Posição: posição da base 5' no transcrito (NM_000371.3, SEQ ID NO:1331).
Exemplo 13. Seleção in vitro de ARNsis em Mosaico de TTR
As hélices duplas de TTR em mosaico foram analisadas em células Hep3B quanto à inibição da expressão de TTR endógena utilizando ensaios de PCR em tempo real.
Cultura de células e transfeção: células Hep3B (ATCC, Manassas, VA) foram cultivadas até quase à confluência a 37 °C numa atmosfera de 5% de CO2 em meio Essencial Mínimo de Eagle (EMEM, ATCC) suplementado com 10% de FBS, estreptomicina e glutamina (ATCC) antes de serem libertadas da placa por tripsinização. A transfeção inversa foi realizada adicionando 5 pL de Opti-MEM a 5 pL de cada ARNsi em poços individuais de uma placa de 96 poços. A esta foram adicionados 10 pL de Opti-MEM mais 0,2 pL de Lipofectamina RNAiMax por poço (Invitrogen, Carlsbad CA. # Cat 13778-150) e a mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 15 minutos. Foram então adicionados 80 pL de meio de crescimento completo descrito acima, mas sem antibiótico, contendo 2,0 χ 104 células de Hep3B. As células foram incubadas durante 24 horas antes da purificação do ARN. As experiências foram realizadas a uma concentração final de hélice dupla de 0,1 ou lOnM.
Isolamento do ARN total utilizando o Kit de Isolamento de ARN Total MagMAX-96 (Applied Biosystems, Foster City CA, # de consumível: AM1830): As células foram colhidas e sujeitas a lise em 140 pL de Solução de Lise/Ligação, em seguida misturadas durante 1 minuto a 850rpm utilizando um Eppendorf Thermomixer (a velocidade de mistura foi a mesma ao longo do processo). Foram adicionados vinte microlitros de esférulas magnéticas e mistura Potenciadora de Lise/Ligação ao lisado celular e misturados durante 5 minutos. As esférulas magnéticas foram capturadas utilizando um suporte magnético e o sobrenadante foi removido sem perturbar as esférulas. Após remoção do sobrenadante, as esférulas magnéticas foram lavadas com Solução de Lavagem 1 (adicionado isopropanol) e misturadas durante 1 minuto. As esférulas foram novamente capturadas e o sobrenadante removido. As esférulas foram em seguida lavadas com 150 pL de Solução de Lavagem 2 (adicionado
Etanol), capturadas e o sobrenadante foi removido. Foram então adicionados 50 pL de mistura de DNase (Tampão de DNase MagMax turbo e Turbo DNase) às esférulas e foram misturados durante 10 a 15 minutos. Após a mistura, foram adicionados 100 pL de Solução de Religação de ARN e misturados durante 3 minutos. O sobrenadante foi removido e as esférulas magnéticas foram novamente lavadas com 150 pL de Solução de Lavagem 2 e misturadas durante 1 minuto e o sobrenadante foi completamente removido. As esférulas magnéticas foram misturadas durante 2 minutos para secar antes de o ARN ter sido eluido com 50 pL de água. Síntese de ADNc utilizando um kit de transcrição inversa de ADNc de Alta capacidade ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, # Cat 4368813): Uma mistura principal de 2 pL de Tampão 10X, 0,8 pL de dNTPs 125X, 2 pL de Iniciadores aleatórios, 1 pL de Transcriptase Inversa, 1 pL de inibidor de RNase e 3,2 pL de H20 por reação foi adicionada a 10 pL de ARN total. O ADNc foi gerado utilizando um ciclizador térmico Βίο-Rad C-1000 ou S-1000 (Hercules, CA) através dos seguintes passos: 25 °C 10 min, 37 °C 120 min, 85 °C 5 s, patamar a 4 °C. PCR de tempo real: foram adicionados 2 pL de ADNc a uma mistura principal contendo 0,5 pL de sonda de GAPDH TaqMan (Applied Biosystems # Cat 4326317E), 0,5 pL de sonda de TTR TaqMan (Applied Biosystems # Cat HS00174914 Ml) e 10 pL de Mistura Principal de Sondas Roche (Roche # Cat 04887301001) por poço numa placa de 384 poços LightCicler 480 (Roche # Cat 0472974001) . A PCR de tempo real foi efetuada numa máquina de PCR de tempo real LightCicler 480 (Roche). Cada hélice dupla foi testada em duas transfeções independentes e cada transfeção foi analisada em duplicado.
Os dados de tempo real foram analisados utilizando o método ΔΔΟΤ. Cada amostra foi normalizada à expressão de GAPDH e a anulação foi avaliada relativamente a células transfetadas com a hélice dupla AD-1955 não direcionada. A Tabela 14 mostra a anulação de TTR utilizando os ARNsis. Os dados são expressos como a percentagem de mensagem remanescente relativamente às células visadas com o AD-1955.
Muitos, mas nem todos os TTR-ARNdss em mosaico, que visam a TTR próximo do alvo do AD-18328, reduziram o ARNm de TTR em pelo menos 70% quando transfetados em células Hep3B a 0,1 nM.
Tabela 14: Inibição de TTR pelos ARNds em mosaico que visam uma TTR próxima do alvo do AD-18328.
Exemplo 14. Avaliação da Duração da Infusão na Eficácia de uma Única Administração Intravenosa de SNALP-18534 em Ratazanas Sprague-Pawley
Objetivos
Determinar o efeito da duração da infusão na eficácia de uma única infusão IV de SNALP-18534 nos níveis de ARNm de TTR no fígado em ratazanas Sprague-Dawley.
Tabela 15: Abreviaturas e definições utilizadas
As sequências das cadeias mensageira e antimensageira do AD-18534 são reproduzidas abaixo a partir das tabelas acima:
Materiais de Estudo Artigo(s) de Ensaio 0 SNALP-18534 é constituído por um ARNsi que visa o ARNm de TTR de roedor (AD-18534), formulado em partículas de ácido nucleico-lípido estáveis (SNALP) para administração nos tecidos alvo. A formulação de SNALP (partícula de lípido) consiste em um novo aminolípido (DLinDMA), um lípido Peguilado (mPEG2000-C-DMA), um lípido neutro (DPPC) e colesterol. A proporção de lípido:ácido nucleico na formulação de SNALP é aproximadamente 5,8:1 (p:p). 0 SNALP- 1955 contém um ARNsi que visa o ARNm da lucif erase não mamífera, é formulado com a partícula lípido idêntica à do SNALP-18534, e serve como um controlo não farmacologicamente ativo. Os níveis de dose são expressos como mg/kg com base no peso de teor de ARNsi.
Conceção do Estudo & Procedimentos
Animais e administração do artigo de ensaio: 0 estudo foi constituído por 9 grupos de ratazanas Sprague-Dawley (4 machos/ grupo). Foi permitido aos animais um período de aclimatação de, pelo menos, 2 dias antes do estudo e todos os animais tinham 7 semanas de idade no início da administração. A dose administrada foi calculada com base nos dados de peso corporal recolhidos antes da administração no Dia 1. Os artigos de ensaio e controlo foram administrados como uma única infusão IV de 15 minutos, 1 hora, 2 horas ou 3 horas através da veia da cauda utilizando uma cânula de M" 24G selada com um septo de Sítio de Injeção Baxter ligado através de uma agulha de borboleta 27G Terumo a uma Bomba de Seringa Baxter AS40A. 0 volume da dose foi de 3 mL/kg, a velocidade de infusão foi de 12 mL/kg/h, e os animais movimentavam-se livremente nas gaiolas durante a administração. As ratazanas foram divididas em nove grupos de tratamento e administradas com uma única infusão IV de SNALP-18534, SNALP-1955, ou PBS como se mostra na Tabela 16:
Tabela 16: Grupos de Dosagem dos Animais de Ensaio
Colheita de tecido e isolamento de ARN:
No Dia 0, os animais foram anestesiados por inalação de isofluorano e foram colhidas amostras de sangue pré-administração para tubos de separação de soro por sangramento retroorbital. As amostras de sangue foram deixadas coagular à temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos antes da centrifugação a 4 °C.
As amostras de soro foram em seguida conservadas a -80 °C até a análise ser realizada. No Dia 3, os animais em todos os nove grupos de tratamento foram administrados com uma dose letal de cetamina/xilazina. O sangue foi recolhido através da veia cava caudal para tubos de separação de soro, e em seguida deixado coagular à temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos antes da centrifugação a 4 °C. As amostras de soro foram conservadas a -80 °C até ser realizada a análise. O tecido de fígado foi colhido e congelado instantaneamente em gelo seco. O tecido de fígado congelado foi triturado e os lisados do tecido foram preparados para quantificação do ARNm hepático.
Quantificação do ARNm de TTR:
Os níveis de ARNm de TTR relativamente aos do ARNm de GAPDH foram determinados nos lisados utilizando um ensaio de ADN ramificado (QuantiGene Reagent System, Panomics, Fremont, CA) . Resumidamente, o ensaio QuantiGene (Genospectra) foi utilizado para quantificar os níveis de ARNm nos lisados de amostras de tecido de acordo com as instruções do fabricante. 0 nível médio do ARNm de TTR foi normalizado ao nível médio do ARNm de GAPDH para cada amostra.
Para obter o nível relativo de expressão do ARNm de TTR, os valores médios de grupo para os grupos tratados com SNALP-1955 e SNALP-18534 com durações de infusão de 15 minutos, 1 hora e 2 horas foram em seguida normalizados ao valor médio para o grupo tratado com PBS com 15 minutos de infusão, enquanto os valores médios de grupo para os grupos tratados com SNALP-1955 e SNALP-18534 com 3 horas de duração de infusão foram em seguida normalizados ao valor médio para o grupo tratado com PBS com 3 horas de duração de infusão.
Resultados
Como se mostra na FIG. 16, uma única infusão IV de 1 mg/kg de SNALP-18534 com diferentes durações de infusão de 15 minutos até 3 horas resulta numa inibição comparável dos níveis de ARNm de TTR no fígado medidos dois dias após administração. Uma única infusão IV de 1 mg/kg de SNALP-18534 também mostrou regulação negativa de TTR persistente ao longo de 29 dias após uma única infusão IV de 15 minutos, em comparação com o controlo de SNALP-1955 (dados não apresentados). Em comparação com o grupo tratado com PBS, uma única infusão IV de 15 minutos, 1 hora, 2 horas ou 3 horas de SNALP-18534 a 1 mg/kg reduziu significativamente os níveis de expressão relativos do ARNm de TTR em 94% (p<0, 0 01), 94% (p < 0, 001), 92% (p < 0,001) e 93% (p < 0,001), respetivamente. A especificidade da atividade do SNALP-18534 é demonstrada pela ausência de inibição significativa do alvo pelo SNALP-1955 através de administração por infusão IV durante 1 hora, 2 horas ou 3 horas ao mesmo nível de dose.
Conclusões
Este estudo demonstra que a modificação da duração da infusão desde 15 minutos até 3 horas não afeta a eficácia de uma única administração IV de 1 mg/kg de SNALP-18534 em ratazanas, como avaliada pela redução dos níveis de ARNm de TTR no fígado.
Exemplo 15. Redução in vivo do ARNm de TTR de tipo selvagem no fígado de ratazanas por LNP07-18534 e LNP08-18534 A fim de avaliar a eficácia de 2 novas formulações de nanopartículas de lípidos, LNP07 e LNP08, para a administração de ARNsi em ratazanas, o ARNsi de TTR específico para o roedor, AD-18534, foi formulado em LNP07 (LNP07-18534) ou LNP08 (LNP08-18534), e administrado por infusão IV durante 15 minutos, e o ARNm de TTR hepático foi quantificado. Ratazanas Sprague-Dawley (4 animais por grupo) foram administradas com infusões IV durante 15 minutos de LNP07-18534 (0,03, 0,1, 0,3 ou 1 mg/kg), LNP08- 18534 (0,01, 0,03 ou 0,1 mg/kg), ou LNP07-1955 (1 mg/kg) ou LNP08-1955 (0,1 mg/kg) contendo o ARNsi de controlo negativo AD-1955 que visa o gene de luciferase não mamífera. Quarenta e oito horas mais tarde, os animais foram sacrificados e o tecido do fígado foi recolhido, congelado instantaneamente e conservado a -80 °C até processamento.
Para quantificação do ARNm de TTR, o tecido de fígado congelado foi triturado até um pó, e foram preparados lisados. Os níveis de ARNm de TTR relativamente aos de ARNm de GAPDH foram determinados nos lisados utilizando um ensaio de ADN ramificado (QuantiGene Reagent System, Panomics, Fremont, CA). Resumidamente, o ensaio QuantiGene (Genospectra) foi utilizado para quantificar os níveis de ARNm nos lisados de amostras de tecido de acordo com as instruções do fabricante. O nível médio de ARNm de TTR foi normalizado ao nível médio de ARNm de GAPDH para cada amostra. As médias de grupo dos valores normalizados foram em seguida ainda normalizadas ao valor médio para o grupo tratado com PBS, para obter o nível relativo de expressão do ARNm de TTR.
Os resultados são mostrados na FIG. 17. O LNP07-18534 reduziu os níveis de ARNm de TTR no fígado de uma maneira dependente da dose, com 94% de supressão do ARNm de TTR a 1 mg/kg. O efeito foi específico, uma vez que o controlo negativo LNP07-1955 a 1 mg/kg não afetou significativamente os níveis de ARNm de TTR em comparação com o controlo de PBS. A ED50 para o ARNm foi determinada como sendo ~ 0,05 mg/kg de LNP07-18534. O LNP08-18534 reduziu os níveis de ARNm de TTR no fígado de uma maneira dependente da dose, com 86% de supressão do ARNm de TTR a 0,1 mg/kg. O efeito foi específico, uma vez que o controlo negativo LNP08-1955 a 0,1 mg/kg não afetou significativamente os níveis de ARNm de TTR em comparação com o controlo de PBS. A ED50 para o ARNm foi determinada como sendo ~ 0,02 mg/kg de LNP08-18534 .
Estes resultados demonstram que o LNP07-18534 e o LNP08-18534 são eficazes na supressão do ARNm de TTR de tipo selvagem no fígado de ratazanas quando administrados por infusão IV, e que a LNP07 e a LNP08 são formulações eficazes para administrar o ARNsi ao fígado.
Exemplo 16: Redução do ARNm de TTR hepático por uma única administração intravenosa de LNP09-18534 ou LNP11-18534 em Ratazanas Sprague-Pawley
Objetivo: A fim de avaliar a eficácia de duas novas formulações de nanopartículas de lípidos (LNP) para administração do ARNsi específico para a TTR de roedores, AD-18534, em ratazanas Sprague-Dawley para reduzir os níveis de ARNm de TTR endógena (tipo selvagem) no fígado. As ratazanas foram administradas por via intravenosa através de uma infusão de 15 minutos com 0,01, 0,03, 0,1, ou 0,3 mg/kg de LNP09- 18534, LNPll-18534 ou soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e os níveis de ARNm de TTR hepático foram analisados às 48 h após tratamento.
Material e Métodos:
Formulação de LNP09: (XTC/DSPC/Col/PEG20oo-C14) 50/10/38,5/1,5% molar; Lípido:ARNsi ~ 11:1. Formulação de LNP11: (MC3/DSPC/Col/PEG2ooo-C14) = 5 0/10/38,5/1,5% molar; Lípido:ARNsi ~ 11,1
Colheita de tecido e isolamento de ARN: No Dia 3, os animais em todos os grupos de tratamento foram administrados com uma dose letal de cetamina/xilazina. O sangue foi recolhido através da veia cava caudal para tubos de separação de soro, e em seguida deixado coagular à temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos antes da centrifugação a 4 °C. As amostras de soro foram conservadas a -80 °C até análise futura. Os tecidos do fígado foram colhidos e congelados instantaneamente em gelo seco. O tecido de fígado congelado foi triturado e foram preparados lisados do tecido para quantificação do ARNm hepático.
Quantificação do ARNm de TTR: os níveis de ARNm de TTR relativamente àqueles de ARNm de GAPDH foram determinados nos lisados utilizando um ensaio de ADN ramificado (QuantiGene Reagent System, Panomics, Fremont, CA). Resumidamente, o ensaio QuantiGene (Genospectra) foi utilizado para quantificar os níveis de ARNm em lisados de amostras de tecido de acordo com as instruções do fabricante. O nível médio de ARNm de TTR foi normalizado ao nível médio de ARNm de GAPDH para cada amostra. Os valores médios dos grupos foram em seguida normalizados ao valor médio do grupo tratado com PBS, para obter o nível relativo de expressão do ARNm de TTR.
Resultados:
Como se mostra na FIG. 18, em contraste com os animais tratados com PBS, os animais tratados com LNP09-18534 e LNPll-18534 tiveram uma diminuição significativa dependente da dose dos níveis de ARNm de TTR no fígado, atingindo uma redução máxima de ~ 90% de redução do ARNm para ambos os grupos formulados com LNP09 e LNPll, relativamente ao grupo de controlo de PBC a 0,3 mg/kg, e uma dose que consegue 50% de redução (ED50) de < 0,03 mg/kg para o LNPll-18534 e <0,1 mg/kg para o LNP09-18534.
Conclusões
Este estudo demonstra que uma única infusão IV de 15 minutos de LNP09-18534 ou LNPll-18534 em ratazanas Sprague-Dawley resulta numa redução dependente da dose do ARNm de TTR hepático. Estes dados demonstram a eficácia dos LNP09-18328 e LNPll-18328 na redução do ARNm de TTR expressado endogenamente (tipo selvagem) com níveis de ED50 de <0,03 e <0,1 mg/kg para o LNPll-18534 e o LNP09-18534, respetivamente.
Exemplo 17: Inibição de TTR em humanos
Um indivíduo humano é tratado com um ARNds direcionado para um gene de TTR para inibir a expressão do gene de TTR para tratar uma condição.
Um indivíduo necessitado de tratamento é selecionado ou identificado. O indivíduo pode ter um distúrbio hepático, amiloidose de transtirretina e/ou um transplantado fígado. A identificação do indivíduo pode ocorrer num cenário clínico, ou noutro local, por exemplo, na casa do indivíduo através da utilização pelo próprio indivíduo de um kit de autodiagnóstico.
Ao tempo zero, é administrada uma primeira dose adequada de um ARNsi anti-TTR ao indivíduo. O ARNds é formulado como aqui descrito. Depois de um intervalo de tempo após a primeira dose, por exemplo, 7 dias, 14 dias e 21 dias, a condição do indivíduo é avaliada, por exemplo, medindo a função hepática. Esta medição pode ser acompanhada de uma medição da expressão da TTR no referido indivíduo, e/ou os produtos de um direcionamento bem-sucedido do ARNsi para o ARNm de TTR. Podem ser também medidos outros critérios relevantes. 0 número e potência das doses são ajustados de acordo com as necessidades do indivíduo.
Após tratamento, a taxa de crescimento de tumores do indivíduo é reduzida relativamente à taxa existente antes do tratamento, ou relativamente à taxa medida num indivíduo afetado de forma semelhante mas não tratado.
Lisboa, 16 de Julho de 2015

Claims (18)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Ácido ribonucleico de cadeia dupla (ARNds) para inibir a expressão de transtirretina (TTR), em que o referido ARNds compreende uma cadeia mensageira e uma cadeia antimensageira, em que a cadeia antimensageira compreende uma região complementar a uma parte de um ARNm que codifica a transtirretina (TTR), em que a referida região de complementaridade tem 19 nucleótidos de comprimento, a cadeia antimensageira compreende a SEQ ID NO:170, e cada cadeia do ARNds tem 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 nucleótidos de comprimento.
  2. 2. ARNds da reivindicação 1, em que (a) a cadeia mensageira consiste na SEQ ID NO:449 e a cadeia antimensageira consiste na SEQ ID NO:450; (b) a cadeia mensageira consiste na SEQ ID NO:729 e a cadeia antimensageira consiste na SEQ ID NO:730; ou (c) a cadeia mensageira consiste na SEQ ID NO:1009 e a cadeia antimensageira consiste na SEQ ID NO:1010.
  3. 3. ARNds da reivindicação 1, em que a cadeia mensageira compreende a SEQ ID NO:169.
  4. 4. ARNds de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido ARNds compreende pelo menos um nucleótido modificado.
  5. 5. ARNds da reivindicação 4, em que pelo menos um dos referidos nucleótidos modificados é escolhido do grupo de: um nucleótido modificado com 2'-0-metilo, um nucleótido compreendendo um grupo 5'-fosforotioato, um nucleótido terminal ligado a um derivado de colesterilo ou grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico, um nucleótido modificado com 2'-desoxi-2'-fluoro, um nucleótido modificado com 2'-desoxi, um nucleótido bloqueado, um nucleótido abásico, nucleótido modificado com 2'-amino, nucleótido modificado com 2'-alquilo, nucleótido de morfolino, um fosforamidato e um nucleótido compreendendo uma base não natural.
  6. 6. ARNds de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o ARNds é conjugado com um ligando.
  7. 7. ARNds de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o ARNds é formulado numa formulação lipidica.
  8. 8. Ácido ribonucleico de cadeia dupla (ARNds) para inibir a expressão de transtirretina (TTR), em que o referido ARNds compreende uma cadeia antimensageira compreendendo uma região complementar aos 19 nucleótidos dos nucleótidos 618-648 da SEQ ID NO: 1331 e em que a referida cadeia antimensageira emparelha com a guanina na posição 628 da SEQ ID NO:1331.
  9. 9. Vetor compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica ambas as cadeias do ARNds das reivindicações 1 a 8.
  10. 10. Célula (a) contendo o ARNds de qualquer uma das reivindicações 1 a 8; ou (b) compreendendo o vetor da reivindicação 9.
  11. 11. Composição farmacêutica para inibir a expressão de um gene de TTR compreendendo o ARNds das reivindicações 1 a 8 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
  12. 12. Método de inibição da expressão de TTR numa célula, em que o método compreende: (a) pôr em contacto a célula com o ARNds das reivindicações 1 a 8; e (b) manter a célula produzida no passo (a) durante um tempo suficiente para se obter degradação do transcrito de ARNm de um gene de TTR, inibindo, desse modo, a expressão do gene de TTR na célula; na condição de que seja excluído qualquer método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia.
  13. 13. ARNds das reivindicações 1 a 8 para ser utilizado no tratamento num humano de um distúrbio mediado pela expressão de TTR, em que (a) o humano tem amiloidose de transtirretina; e/ou (b) o humano tem um distúrbio hepático.
  14. 14. ARNds para a utilização da reivindicação 13, em que o referido ARNds é para ser administrado ao humano a cerca de 0,01, 0,1, 0,3, 0,5, 1,0, 2,5 ou 5,0 mg/kg.
  15. 15. ARNds para a utilização da reivindicação 13 ou 14, em que o humano está adicionalmente a receber um método terapêutico de tratamento de uma amiloidose de TTR, o método terapêutico selecionado do grupo que consiste em diuréticos, inibidores da enzima de conversão da angiotensina, bloqueadores do recetor de angiotensina, diálise ou um transplante hepático.
  16. 16. ARNds para a utilização de qualquer uma das reivindicações 13 a 15, em que a referida amiloidose de transtirretina é selecionada de polineuropatia amiloidótica familiar (FAP), cardiomiopatia amiloidótica familiar (FAC), amiloidose leptomeningeal/do SNC, amiloidose sistémica senil (SSA) e amiloidose cardíaca senil (SCA).
  17. 17. ARNds para a utilização de qualquer uma das reivindicações 13 a 16, em que o ARNds é administrado ao humano em intervalos não superiores a 1, 2, 3 ou 4 semanas.
  18. 18. ARNds para a utilização de qualquer uma das reivindicações 13 a 17, em que o referido ARNds é para ser administrado por via intravenosa ou por infusão intravenosa ao longo de 15 minutos. Lisboa, 16 de Julho de 2015
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Families Citing this family (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9228186B2 (en) 2002-11-14 2016-01-05 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US20050244869A1 (en) * 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
AU2007249329C1 (en) 2006-05-11 2011-03-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the PCSK9 gene
CA2721333C (en) 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
CN103937793B (zh) 2008-10-20 2017-08-11 阿尔尼拉姆医药品有限公司 抑制运甲状腺素蛋白表达的组合物和方法
EP3225281A1 (en) * 2008-12-10 2017-10-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Gnaq targeted dsrna compositions and methods for inhibiting expression
CA3036963A1 (en) * 2009-01-29 2010-08-05 Arbutus Biopharma Corporation Lipid formulations comprising cationic lipid and a targeting lipid comprising n-acetyl galactosamine for delivery of nucleic acid
PL3431076T3 (pl) 2009-06-10 2022-01-31 Arbutus Biopharma Corporation Ulepszona formulacja lipidowa
KR20120050429A (ko) * 2009-06-15 2012-05-18 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｐｃｓｋ9 유전자를 표적으로 하는 지질 제형된 ｄｓｒｎａ
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
JP5766188B2 (ja) 2009-07-01 2015-08-19 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 固形腫瘍に治療剤を送達するための脂質製剤
WO2011020023A2 (en) * 2009-08-14 2011-02-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus
EP2496238A4 (en) * 2009-11-03 2013-10-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc FORMULATED LIPID COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING TRANSTHYRETIN EXPRESSION (TTR)
CA2792291A1 (en) * 2010-03-29 2011-10-06 Kumamoto University Sirna therapy for transthyretin (ttr) related ocular amyloidosis
US20230340473A1 (en) * 2010-03-29 2023-10-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Sirna therapy for transthyretin (ttr) related ocular amyloidosis
PT2563920T (pt) 2010-04-29 2017-05-26 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulação da expressão de transtirretina
EP2569276B1 (en) * 2010-05-12 2021-02-24 Arbutus Biopharma Corporation Novel cationic lipids and methods of use thereof
CA3102008A1 (en) * 2010-06-02 2011-12-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods directed to treating liver fibrosis
WO2012000104A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
US9029590B2 (en) * 2010-10-21 2015-05-12 Sirna Therapeutics, Inc. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
EP2640700B1 (en) 2010-11-15 2018-10-31 Life Technologies Corporation Amine-containing transfection reagents and methods for making and using same
WO2012079046A2 (en) * 2010-12-10 2012-06-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of klf-1 and bcl11a genes
EP2525223A1 (en) * 2011-05-19 2012-11-21 Universiteit Maastricht In vitro method for predicting in vivo genotoxicity of chemical compounds.
WO2012177921A2 (en) * 2011-06-21 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc Compositions and methods for inhibiting hepcidin antimicrobial peptide (hamp) or hamp-related gene expression
WO2012177906A1 (en) * 2011-06-21 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
EP2723758B1 (en) 2011-06-21 2018-06-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compostions and methods of use thereof
DK3301177T3 (da) * 2011-11-18 2020-06-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc Rnai-midler, sammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse deraf til behandling af transthyretin (ttr)-forbundne sygdomme
WO2013086354A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
US9035039B2 (en) * 2011-12-22 2015-05-19 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing SMAD4
HRP20220607T1 (hr) * 2012-11-26 2022-06-24 Modernatx, Inc. Terminalno modificirana rna
WO2014113089A2 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
JP2016514091A (ja) 2013-02-08 2016-05-19 ミスフォールディング ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド トランスサイレチン抗体およびその使用
CN115261411A (zh) 2013-04-04 2022-11-01 哈佛学院校长同事会 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途
EP2992098B1 (en) * 2013-05-01 2019-03-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating hbv and ttr expression
RU2716420C2 (ru) * 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
WO2015006498A2 (en) * 2013-07-09 2015-01-15 President And Fellows Of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
WO2015042564A1 (en) * 2013-09-23 2015-03-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing transthyretin (ttr) associated diseases
EP3052626A1 (en) * 2013-10-02 2016-08-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the lect2 gene
US10150965B2 (en) 2013-12-06 2018-12-11 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of transthyretin (TTR) by double-stranded RNA
AU2015236215B2 (en) 2014-03-25 2020-03-19 Arcturus Therapeutics, Inc. UNA oligomers having reduced off-target effects in gene silencing
JP6771387B2 (ja) * 2014-03-25 2020-10-21 アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｒｃｔｕｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 遺伝子サイレンシング用トランスサイレチン対立遺伝子選択的ｕｎａオリゴマー
US9856475B2 (en) 2014-03-25 2018-01-02 Arcturus Therapeutics, Inc. Formulations for treating amyloidosis
KR102369736B1 (ko) 2014-05-01 2022-03-02 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 보체 인자 b 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
KR102631505B1 (ko) * 2014-08-29 2024-02-01 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스타이레틴(ttr) 매개 아밀로이드증의 치료 방법
US10519447B2 (en) 2015-04-01 2019-12-31 Arcturus Therapeutics, Inc. Therapeutic UNA oligomers and uses thereof
WO2016164746A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the lect2 gene
EP3283631A1 (en) 2015-04-13 2018-02-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compositions and methods of use thereof
US10968426B2 (en) 2015-05-08 2021-04-06 President And Fellows Of Harvard College Universal donor stem cells and related methods
WO2017015671A1 (en) * 2015-07-23 2017-01-26 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions for treating amyloidosis
JP6896703B2 (ja) 2015-07-31 2021-06-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ＴＴＲ関連疾患を治療または予防するためのトランスサイレチン（ＴＴＲ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
EP3426261A4 (en) 2016-03-07 2020-03-25 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. TARGETED LIGANDS FOR THERAPEUTIC CONNECTIONS
AU2017320582B2 (en) 2016-09-02 2023-11-16 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc Targeting ligands
WO2018067900A1 (en) 2016-10-06 2018-04-12 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method of conjugating oligomeric compounds
JP2019535839A (ja) 2016-11-29 2019-12-12 ピュアテック ヘルス エルエルシー 治療剤の送達のためのエクソソーム
IL268683B2 (en) 2017-02-17 2023-04-01 Eidos Therapeutics Inc Processes for the preparation of ag-10, its intermediates and salts
AU2018336806A1 (en) 2017-09-19 2020-05-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating transthyretin (TTR) mediated amyloidosis
US20190098879A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-Human Animals Comprising A Humanized TTR Locus And Methods Of Use
WO2019067872A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Intellia Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR EDITING THE TTR GENE AND TREATING AMYLOID DOSE ATTR
JP2021518381A (ja) * 2018-03-23 2021-08-02 エイドス セラピューティクス，インコーポレイティド Ａｇ１０を使用するｔｔｒアミロイドーシスの治療方法
KR20210046708A (ko) 2018-08-17 2021-04-28 에이도스 테라퓨틱스, 인코포레이티드 Ag10의 제형
PT3864163T (pt) 2018-10-09 2024-04-30 Univ British Columbia Composições e sistemas que compreendem vesículas competentes para transfeção isentas de solventes orgânicos e detergentes e métodos relacionados com as mesmas
US20220071965A1 (en) 2018-12-20 2022-03-10 Pfizer Inc. Pharmaceutical Compositions and Methods Comprising A Combination of a Benzoxazole Transthyretin Stabilizer and an Additional Therapeutic Agent
CA3137761A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use
CN114423869A (zh) 2019-07-19 2022-04-29 旗舰先锋创新Vi有限责任公司 重组酶组合物和使用方法
EP4022062A1 (en) 2019-08-30 2022-07-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Neurofilament light chain (nfl) as a biomarker for transthyretin amyloidosis polyneuropathy
CN114945669A (zh) * 2019-11-06 2022-08-26 阿尔尼拉姆医药品有限公司 肝外递送
CN115461460A (zh) 2020-03-06 2022-12-09 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制转甲状腺素蛋白(ttr)的表达的组合物和方法
WO2021236980A1 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Coronavirus antigen compositions and their uses
TW202208629A (zh) 2020-05-20 2022-03-01 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 免疫原性組成物及其用途
US20230203510A1 (en) 2020-05-29 2023-06-29 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods relating thereto
WO2021243301A2 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc. Trem compositions and methods relating thereto
AU2021336976A1 (en) 2020-09-03 2023-03-23 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and uses thereof
EP4251170A1 (en) 2020-11-25 2023-10-04 Akagera Medicines, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids, and related methods of use
WO2022112919A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Pfizer Inc. (aza)benzothiazolyl substituted pyrazole compounds
WO2022140702A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Flagship Pioneering, Inc. Compositions of modified trems and uses thereof
EP4294409A1 (en) * 2021-02-22 2023-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Folliculin irna compositions and methods thereof
WO2022187435A1 (en) 2021-03-04 2022-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compositions and methods of use thereof
AU2022246895A1 (en) 2021-03-31 2023-10-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
WO2022235537A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating transthyretin (ttr) mediated amyloidosis
EP4351541A2 (en) 2021-06-08 2024-04-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating or preventing stargardt's disease and/or retinal binding protein 4 (rbp4)-associated disorders
WO2023009547A1 (en) 2021-07-26 2023-02-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and uses thereof
CN117795074A (zh) 2021-08-03 2024-03-29 阿尔尼拉姆医药品有限公司 转甲状腺素蛋白（TTR）iRNA组合物和其使用方法
EP4399292A2 (en) 2021-09-08 2024-07-17 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Methods and compositions for modulating a genome
CN118234867A (zh) 2021-09-17 2024-06-21 旗舰创业创新六公司 用于产生环状多核糖核苷酸的组合物和方法
CN118382705A (zh) 2021-10-18 2024-07-23 旗舰创业创新六公司 用于纯化多核糖核苷酸的组合物和方法
CN114058636A (zh) * 2021-11-16 2022-02-18 大连润生康泰医学检验实验室有限公司 一种转甲状腺素蛋白基因的克隆、表达与纯化方法
AU2022397300A1 (en) 2021-11-24 2024-06-27 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and their uses
AU2022398478A1 (en) 2021-11-24 2024-06-13 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Coronavirus immunogen compositions and their uses
AU2022397292A1 (en) 2021-11-24 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Varicella-zoster virus immunogen compositions and their uses
TW202340461A (zh) 2021-12-22 2023-10-16 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 用於純化多核糖核苷酸之組成物和方法
TW202342064A (zh) 2021-12-23 2023-11-01 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 編碼抗融合多肽之環狀多核糖核苷酸
WO2023196634A2 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
WO2023220083A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
WO2023220729A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Double stranded dna compositions and related methods
US12064479B2 (en) 2022-05-25 2024-08-20 Akagera Medicines, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids and methods of use thereof
WO2023250112A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of modified trems and uses thereof
WO2024030856A2 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory proteins and related methods
WO2024035952A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
US20240174732A1 (en) 2022-10-05 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additional polypeptides and their use in treating cancer
WO2024097664A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
WO2024098061A2 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Genkardia Inc. Oligonucleotide-based therapeutics targeting cyclin d2 for the treatment of heart failure
WO2024102799A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
WO2024108217A1 (en) 2022-11-18 2024-05-23 Genkardia Inc. Methods and compositions for preventing, treating, or reversing cardiac diastolic dysfunction
WO2024129874A1 (en) * 2022-12-13 2024-06-20 Sirnaomics, Inc. Products and compositions
WO2024129988A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for delivery of therapeutic agents to bone
US20240238473A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Recombinant nucleic acid molecules and their use in wound healing
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
WO2024151685A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Recombinant nucleic acid molecules and their use in wound healing
US20240293318A1 (en) 2023-02-13 2024-09-05 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cleavable linker-containing ionizable lipids and lipid carriers for therapeutic compositions
US20240293582A1 (en) 2023-02-17 2024-09-05 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Dna compositions comprising modified cytosine
US20240285805A1 (en) 2023-02-17 2024-08-29 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Dna compositions comprising modified uracil

Family Cites Families (218)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US564562A (en) 1896-07-21 Joseph p
US513030A (en) 1894-01-16 Machine for waxing or coating paper
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4522808A (en) 1980-08-15 1985-06-11 Societe Anonyme Dite: L'oreal Anti-sunburn compositions containing 2-phenyl-indole derivatives
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4534899A (en) 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
EP0228458B2 (en) 1985-07-05 1997-10-22 Whitehead Institute For Biomedical Research Epithelial cells expressing foreign genetic material
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
WO1988010264A1 (en) 1987-06-24 1988-12-29 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology Nucleoside derivatives
EP0378576B1 (en) 1987-09-11 1995-01-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Transduced fibroblasts and uses therefor
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
WO1989005345A1 (en) 1987-12-11 1989-06-15 Whitehead Institute For Biomedical Research Genetic modification of endothelial cells
JP2917998B2 (ja) 1988-02-05 1999-07-12 ホワイトヘッド・インスティチュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ 修飾された肝細胞およびその用途
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
GB8824593D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Liposomes
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
EP0942000B1 (en) 1989-10-24 2004-06-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-Modified oligonucleotides
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5665710A (en) 1990-04-30 1997-09-09 Georgetown University Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
ES2116977T3 (es) 1990-05-11 1998-08-01 Microprobe Corp Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente.
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5614617A (en) 1990-07-27 1997-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
ES2083593T3 (es) 1990-08-03 1996-04-16 Sterling Winthrop Inc Compuestos y metodos para inhibir la expresion de genes.
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
WO1992005186A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 Gilead Sciences Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
AU656544B2 (en) 1990-10-31 1995-02-09 Brigham And Women's Hospital Genetic modification of endothelial cells
CA2095212A1 (en) 1990-11-08 1992-05-09 Sudhir Agrawal Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
ES2103918T3 (es) 1991-10-17 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios.
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
DK0691968T3 (da) 1993-03-30 1998-02-23 Sanofi Sa Acykliske nukleosid-analoge og oligonukleotidsekvenser indeholdende disse
AU6412794A (en) 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5540935A (en) 1993-12-06 1996-07-30 Nof Corporation Reactive vesicle and functional substance-fixed vesicle
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
AU5545596A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Medtronic, Inc. Intraparenchymal infusion catheter system
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
IL122290A0 (en) 1995-06-07 1998-04-05 Inex Pharmaceuticals Corp Lipid-nucleic acid complex its preparation and use
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5756122A (en) 1995-06-07 1998-05-26 Georgetown University Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells
HUP9802445A3 (en) 1995-08-01 1999-03-29 Novartis Ag Liposomal oligonucleotide compositions and process for inhibiting the human raf
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
US5735814A (en) 1996-04-30 1998-04-07 Medtronic, Inc. Techniques of treating neurodegenerative disorders by brain infusion
AU731909B2 (en) 1997-07-01 2001-04-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
WO1999053050A1 (en) 1998-04-08 1999-10-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and means for obtaining modified phenotypes
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
WO2000003683A2 (en) 1998-07-20 2000-01-27 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
MXPA01003643A (es) 1998-10-09 2003-07-21 Ingene Inc Produccion de adnss in vivo.
IL142490A0 (en) 1998-10-09 2002-03-10 Ingene Inc ENZYMATIC SYNTHESIS OF ssDNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
AU3243300A (en) 1999-02-23 2000-09-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Multiparticulate formulation
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
WO2001057064A2 (en) * 2000-02-07 2001-08-09 Roche Diagnostics Corporation Cationic amphiphiles for use in nucleic acid transfection
WO2002081628A2 (en) * 2001-04-05 2002-10-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth, using nucleic acid based technologies
US20030072794A1 (en) * 2000-06-09 2003-04-17 Teni Boulikas Encapsulation of plasmid DNA (lipogenes™) and therapeutic agents with nuclear localization signal/fusogenic peptide conjugates into targeted liposome complexes
WO2002044321A2 (en) * 2000-12-01 2002-06-06 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rna interference mediating small rna molecules
US20030170891A1 (en) 2001-06-06 2003-09-11 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7514099B2 (en) * 2005-02-14 2009-04-07 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
US7956176B2 (en) * 2002-09-05 2011-06-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US7250496B2 (en) 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
DK2284266T3 (da) * 2002-11-14 2014-01-13 Thermo Fisher Scient Biosciences Inc sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53
DE10302421A1 (de) 2003-01-21 2004-07-29 Ribopharma Ag Doppelsträngige Ribonukleinsäure mit verbesserter Wirksamkeit
CA2518475C (en) 2003-03-07 2014-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna agents comprising asymmetrical modifications
AU2004227414A1 (en) 2003-04-03 2004-10-21 Alnylam Pharmaceuticals iRNA conjugates
JP4951338B2 (ja) 2003-07-16 2012-06-13 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 脂質に封入された干渉ｒｎａ
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
JP4764426B2 (ja) 2004-06-07 2011-09-07 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド カチオン性脂質および使用方法
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
US7838561B2 (en) * 2004-06-14 2010-11-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for preventing or treating cardiac hypertrophy
ES2246715B1 (es) * 2004-08-04 2007-05-01 Consejo Superior Investig. Cientificas Modelo animal de enfermedades neurodegenerativas, procedimiento de obtencion y aplicaciones.
CN101189343B (zh) * 2004-08-23 2011-11-16 阿尔尼拉姆药物公司 多rna聚合酶ⅲ启动子表达构建体
AU2006230436B2 (en) 2005-03-31 2011-11-24 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
US7915230B2 (en) * 2005-05-17 2011-03-29 Molecular Transfer, Inc. Reagents for transfection of eukaryotic cells
WO2007008652A2 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions directed to dj-1 as regulator of the anti-oxidant transcription factor nrf2
EP1937213B1 (en) 2005-07-27 2017-10-25 Protiva Biotherapeutics Inc. Systems and methods for manufacturing liposomes
WO2007051303A1 (en) * 2005-11-02 2007-05-10 Protiva Biotherapeutics, Inc. MODIFIED siRNA MOLECULES AND USES THEREOF
JP5704741B2 (ja) 2006-03-31 2015-04-22 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｅｇ５遺伝子発現の抑制のための組成物および方法
US8598333B2 (en) 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
WO2008042973A2 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid containing formulations
EP4074344A1 (en) * 2007-12-04 2022-10-19 Arbutus Biopharma Corporation Targeting lipids
CA2710713C (en) * 2007-12-27 2017-09-19 Protiva Biotherapeutics, Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering rna
EP3100718B1 (en) 2008-01-02 2019-11-27 Arbutus Biopharma Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
CA2721333C (en) * 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
EP2323667A4 (en) 2008-08-07 2012-07-25 Isis Pharmaceuticals Inc MODULATION OF TRANSTHYRETIN EXPRESSION BY TREATMENT OF CNS DISEASES
PL2350043T3 (pl) * 2008-10-09 2014-09-30 Tekmira Pharmaceuticals Corp Ulepszone aminolipidy i sposoby dostarczania kwasów nukleinowych
CN103937793B (zh) * 2008-10-20 2017-08-11 阿尔尼拉姆医药品有限公司 抑制运甲状腺素蛋白表达的组合物和方法
CA3006395C (en) 2008-11-07 2022-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
EP3808177A1 (en) 2008-11-10 2021-04-21 Arbutus Biopharma Corporation Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
CA3036963A1 (en) 2009-01-29 2010-08-05 Arbutus Biopharma Corporation Lipid formulations comprising cationic lipid and a targeting lipid comprising n-acetyl galactosamine for delivery of nucleic acid
EP2416760A4 (en) 2009-05-05 2014-01-22 Tekmira Pharmaceuticals Corp LIPID COMPOSITIONS
PL3431076T3 (pl) * 2009-06-10 2022-01-31 Arbutus Biopharma Corporation Ulepszona formulacja lipidowa
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
EP2496238A4 (en) 2009-11-03 2013-10-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc FORMULATED LIPID COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING TRANSTHYRETIN EXPRESSION (TTR)
PT2563920T (pt) 2010-04-29 2017-05-26 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulação da expressão de transtirretina
KR102005337B1 (ko) * 2014-01-09 2019-07-30 에스케이하이닉스 주식회사 전압 변환 장치
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