TW202208629A - 免疫原性組成物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供了編碼一種或多種免疫原性多肽的多核糖核苷酸的組成物、藥物製劑和用途。具體而言，本揭露之特徵在於編碼一種或多種免疫原性多肽的環狀多核糖核苷酸。

Description

免疫原性組成物及其用途
疫苗接種對人類和動物健康都做出了巨大貢獻。自1796年發明第一款疫苗以來，疫苗已被認為係藉由在受試者中激發免疫反應來預防多種傳染病最成功之方法。根據世界衛生組織的數據，免疫接種目前每年預防所有年齡段2-3百萬例死亡。如今，已開發出疫苗來預防和控制包括白喉、破傷風、百日咳、流感和麻疹在內的超過20種傳染病的傳播，並已使得天花被完全根除。仍然需要開發新的和改良的免疫原性組成物及其用途。
本揭露提供了編碼一種或多種免疫原的多核糖核苷酸（例如，環狀或線性多核糖核苷酸）的組成物、藥物製劑和用途。具體而言，本揭露提供了編碼多種免疫原的環狀多核糖核苷酸和包含多個環狀多核糖核苷酸的組成物。本揭露進一步關於使用編碼一種或多種多肽免疫原的環狀多核糖核苷酸之方法。本文所述之環狀多核糖核苷酸的組成物和藥物製劑在投與後可在受試者中誘導免疫反應。本文所述之環狀多核糖核苷酸的組成物和藥物製劑可用於治療或預防受試者的疾病、病症或病狀。
一方面，本揭露提供了一種環狀多核糖核苷酸，該環狀多核糖核苷酸包括多個序列，每個序列編碼多肽免疫原，其中該等多肽免疫原中的至少兩種（例如，至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種或至少九種）鑒別不同的蛋白質，其中該等不同的蛋白質中的每一種鑒別相同的靶標。
在一些實施方式中，該等多肽免疫原中的每一種鑒別不同的蛋白質。在一些實施方式中，該靶標係病原體。在一些實施方式中，該病原體係病毒、細菌、真菌或寄生蟲。在一些實施方式中，該病原體係病毒並且該等不同的蛋白質中的每一種係與該病毒相關的病毒蛋白質。在一些實施方式中，該病原體係細菌並且該等不同的蛋白質中的每一種係與該細菌相關的細菌蛋白質。在一些實施方式中，該靶標係癌細胞。在一些實施方式中，該等不同的蛋白質中的每一種係與該癌細胞相關的不同腫瘤抗原。在一些實施方式中，該靶標係過敏原或毒素。
另一方面，本揭露提供了一種環狀多核糖核苷酸，該環狀多核糖核苷酸包括多個序列，每個序列編碼多肽免疫原，其中該等多肽免疫原中的至少兩種（例如，至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種或至少九種）鑒別不同的靶標。在一些實施方式中，該等多肽免疫原中的每一種鑒別不同的靶標。在一些實施方式中，每個靶標係不同的病原體。在一些實施方式中，每個靶標獨立地是癌細胞、病毒、細菌、真菌或寄生蟲。在一些實施方式中，每個靶標係不同的病毒。在一些實施方式中，每個靶標係不同的細菌。在一些實施方式中，該等靶標包括病毒和細菌。
在一些實施方式中，由環狀多核糖核苷酸編碼的多種免疫原中的每一種具有小於90%的序列同一性。
在本文所述之任一種環狀多核糖核苷酸的一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括500至20,000個核糖核苷酸（例如500至10,000、500至9,000、500至8,000、500至5,000、500至4,000、500至3,000、1000和10,000、1,000和8,000、1,000至5,000、3,000至8,000、4,000至9,000或10,000至20,000個））。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括500至5,000個。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括1,000至5,000個核糖核苷酸。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括5,000至10,000個核糖核苷酸。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括至少500個核糖核苷酸（例如至少600、至少1000、至少1500、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000、至少4500、至少5000、至少5500、至少6000、至少6500、至少7000、至少7500、至少8000、至少8500、至少9000或至少9500個核糖核苷酸）。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或至少九個序列，每個序列編碼多肽免疫原。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括兩個或三個、兩個至五個（例如，兩個、三個或四個）、或五個至十個序列（例如，五個、六個、七個、八個、九個或多個序列），每個序列編碼多肽免疫原。
在一些實施方式中，至少一個編碼多肽免疫原的序列進一步編碼訊息序列。在一些實施方式中，每個編碼多肽免疫原的序列進一步編碼訊息序列。在一些實施方式中，編碼該等多肽免疫原中的每一種的每一個序列與內部核糖體進入位點（IRES）可操作地連接。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括單個IRES。在一些實施方式中，該等多肽免疫原中的每一種由與該單個IRES可操作地連接的單個開放閱讀框編碼，其中該開放閱讀框的表現產生包括該等多肽免疫原中的每一種的胺基酸序列的多肽。
在一些實施方式中，該等多肽免疫原各自被多肽連接子（linker）隔開。在一些實施方式中，該等多肽免疫原各自被裂解結構域隔開。在一些實施方式中，每個交錯元件均為2A自裂解肽。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括多個IRES。在一些實施方式中，每個IRES與包括編碼多肽免疫原的序列的開放閱讀框可操作地連接。
在一些實施方式中，至少一個編碼免疫原的序列進一步編碼訊息序列。在一些實施方式中，每個編碼免疫原的序列進一步編碼訊息序列。在一些實施方式中，至少一個編碼免疫原的序列不編碼訊息序列。在一些實施方式中，編碼免疫原的序列均未進一步編碼訊息序列
在本文所述之任一種環狀多核糖核苷酸的一些實施方式中，其中該環狀多核糖核苷酸包括具有5’末端和3’末端的第一多核糖核苷酸，其中5’末端和3’末端各自與第二多核苷酸雜交，由此連接第一多核糖核苷酸的5’末端和3’末端以形成環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸藉由夾板連接產生。在一些實施方式中，藉由提供具有3’末端和5’末端的線性多核糖核苷酸來產生環狀多核糖核苷酸，其中3’末端和5’末端各自包括內含子的一部分，並且其中3’末端的內含子部分和5’末端的內含子部分催化剪接反應，從而使5’末端和3’末端共價軛合以產生環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，內含子係I類自剪接內含子。
在另一方面，本揭露提供了包含多個環狀多核糖核苷酸的組成物，每個環狀多核糖核苷酸均包括編碼多肽免疫原的序列。在一些實施方式中，該多個環狀多核糖核苷酸中的每一個均為本文所述之環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，該等多肽免疫原中的每一種均包括一個或多個鑒別靶標的表位。在一些實施方式中，該組成物包含：包括編碼第一多肽免疫原的序列的至少第一環狀多核糖核苷酸和包括編碼第二多肽免疫原的序列的至少第二環狀多核糖核苷酸，其中該第一多肽免疫原和第二多肽免疫原鑒別不同的蛋白質，其中每種不同的蛋白質鑒別相同的靶標。在一些實施方式中，該組成物包含：包括編碼第一多肽免疫原的序列的至少第一環狀多核糖核苷酸和包括編碼第二多肽免疫原的序列的至少第二環狀多核糖核苷酸，其中該第一多肽免疫原鑒別第一靶標而該第二多肽免疫原鑒別第二靶標。在一些實施方式中，每個靶標獨立地是癌細胞、病毒、細菌、真菌、寄生蟲、毒素或過敏原。在一些實施方式中，該靶標係病原體。在一些實施方式中，該病原體係病毒、細菌、真菌或寄生蟲。在一些實施方式中，該靶標係癌細胞、過敏原或毒素。在一些實施方式中，每種多肽免疫原均與IRES可操作地連接。
在另一方面，本揭露提供了一種藥物組成物，該藥物組成物包含本文所述之環狀多核糖核苷酸、組成物或藥物製劑中的任一種以及藥學上可接受的賦形劑。在一些實施方式中，藥物組成物包含本文所述之環狀多核糖核苷酸、組成物或藥物製劑中的任一種和魚精蛋白（protamine）或魚精蛋白鹽（例如，硫酸魚精蛋白）。在一些實施方式中，該藥物組成物進一步包含佐劑。在一些實施方式中，該佐劑係無機佐劑、小分子佐劑和水包油乳劑、脂質或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基於RNA的佐劑、基於DNA的佐劑、病毒顆粒、細菌佐劑、雜交分子、真菌或卵母細胞微生物相關分子模式（MAMP）、無機奈米顆粒或多組分佐劑。在一些實施方式中，該佐劑係無機佐劑。在一些實施方式中，該無機佐劑係鋁鹽或鈣鹽。在一些實施方式中，該佐劑係小分子。在一些實施方式中，該小分子係咪喹莫特（imiquimod）、瑞喹莫德（resiquimod）或嘎德莫特（gardiquimod）。在一些實施方式中，該佐劑係水包油乳劑。在一些實施方式中，該水包油乳劑係角鯊烯、MF59、AS03、Montanide配製物（視需要Montanide ISA 51或Montanide ISA 720）或不完全弗氏佐劑（一種水包油乳劑）。在一些實施方式中，該佐劑係脂質或聚合物。在一些實施方式中，該脂質或聚合物係聚合物奈米顆粒，視需要PLGA、PLG、PLA、PGA或PHB；脂質體，視需要病毒體或CAF01；脂質奈米顆粒或其組分；脂多糖（LPS），視需要單磷醯基脂質A（MPLA）或哌喃葡糖苷脂質A（GLA）；脂肽，視需要Pam2（Pam2CSK4）或Pam3（Pam3CSK4）；或糖脂，視需要海藻糖二黴菌酸酯。在一些實施方式中，該佐劑係肽或肽聚糖。在一些實施方式中，該肽或肽聚糖對應於合成或純化的革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌的全部或一部分，視需要N-乙醯-胞壁醯-L-丙胺醯-D-異麩醯胺酸（MDP）、鞭毛蛋白融合蛋白、甘露糖結合凝集素（MBL）、細胞介素或趨化因子。在一些實施方式中，該佐劑係碳水化合物或多糖。在一些實施方式中，該碳水化合物或多糖係右旋糖酐（微生物支多糖）、硫酸右旋糖酐、香菇多糖、酵母聚糖、β-葡聚糖、Deltin、甘露聚糖或幾丁質。在一些實施方式中，該佐劑係皂苷。在一些實施方式中，該皂苷係附接至一條或多條糖側鏈的糖苷或多環苷元，視需要係ISCOMS、ISCOMS基質或QS-21。在一些實施方式中，該佐劑係基於RNA的佐劑。在一些實施方式中，基於RNA的佐劑係聚IC、聚IC:LC、髮夾RNA（視需要具有含5’PPP的序列）、病毒序列、含聚U的序列、dsRNA、天然或合成的免疫刺激RNA序列、核酸類似物，視需要環狀GMP-AMP或環狀二核苷酸（諸如環狀二GMP），或免疫刺激性鹼基類似物，視需要C8取代或N7,C8二取代的鳥嘌呤核糖核苷酸。在一些實施方式中，該佐劑係基於DNA的佐劑。在一些實施方式中，基於DNA的佐劑係CpG、dsDNA或天然或合成的免疫刺激DNA序列。在一些實施方式中，該佐劑係病毒顆粒。在一些實施方式中，病毒顆粒係病毒體，視需要係磷脂細胞膜雙層。在一些實施方式中，該佐劑係細菌佐劑。在一些實施方式中，細菌佐劑係鞭毛蛋白、LPS或細菌毒素，視需要腸毒素、熱不穩定性毒素或霍亂毒素。在一些實施方式中，該佐劑係雜交分子。在一些實施方式中，該佐劑係與咪喹莫特軛合的CpG。在一些實施方式中，該佐劑係真菌或卵母細胞微生物相關分子模式（MAMP）。在一些實施方式中，真菌或卵母細胞MAMP係幾丁質或β-葡聚糖。在一些實施方式中，該佐劑係無機奈米顆粒。在一些實施方式中，無機奈米顆粒係金奈米棒、基於二氧化矽的奈米顆粒，視需要係介孔二氧化矽奈米顆粒（MSN）。在一些實施方式中，該佐劑係多組分佐劑。在一些實施方式中，多組分佐劑係AS01、AS03、AS04、完全弗氏佐劑或CAF01。
在另一方面，本揭露提供了一種治療或預防受試者的疾病、病症或病狀之方法，該方法包括向受試者投與本文所述之環狀多聚核糖核苷酸、組成物、藥物製劑或藥物組成物中的任一種。在一些實施方式中，該疾病、病症或病狀係病毒感染、細菌感染、真菌感染。在一些實施方式中，該疾病、病症或病狀係癌症。在一些實施方式中，該疾病、病症或病狀與暴露於過敏原相關。在一些實施方式中，該疾病、病症或病狀與暴露於毒素相關。
在另一方面，本揭露提供了一種在受試者中誘導免疫反應之方法，該方法包括向受試者投與本文所述之環狀多聚核糖核苷酸、組成物、藥物製劑或藥物組成物中的任一種。在一些實施方式中，受試者係哺乳動物。在一些實施方式中，受試者係人。在一些實施方式中，該方法係非人哺乳動物。在一些實施方式中，非人哺乳動物係牛、綿羊、山羊、豬、狗、馬或貓。在一些實施方式中，受試者係鳥。在一些實施方式中，鳥係母雞、公雞、火雞或鸚鵡。在一些實施方式中，該方法進一步包括向該受試者投與佐劑。在一些實施方式中，該佐劑係與環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸或其製劑或組成物分開的分子實體。在一些實施方式中，該佐劑係無機佐劑、小分子佐劑和水包油乳劑、脂質或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基於RNA的佐劑、基於DNA的佐劑、病毒顆粒、細菌佐劑、雜交分子、真菌或卵母細胞微生物相關分子模式（MAMP）、無機奈米顆粒或多組分佐劑。在一些實施方式中，該佐劑係多肽佐劑。在一些實施方式中，多肽佐劑係細胞介素、趨化因子、共刺激分子、先天性免疫刺激劑、傳訊分子、轉錄活化劑、細胞介素受體、細菌組分或先天性免疫系統的組分。在一些實施方式中，該佐劑係先天性免疫系統刺激劑。在一些實施方式中，先天性免疫系統刺激劑選自包括富含GU的模體、富含AU的模體、包括dsRNA的結構化區域或適體的RNA。
在一些實施方式中，將本文所述之環狀多核糖核苷酸、組成物、藥物製劑或藥物組成物中的任一種作為單劑量投與給受試者。在一些實施方式中，將本文所述之環狀多核糖核苷酸、組成物、藥物製劑或藥物組成物中的任一種向受試者投與兩次或更多次、三次或更多次、四次或更多次、或五次或更多次。在一些實施方式中，本文所述之環狀多核糖核苷酸、組成物、藥物製劑或藥物組成物中的任一種的投與約每週一次，約每兩週一次，約每三週一次，約每個月一次，約每兩個月一次，約每三個月一次，約每四個月一次，約每五個月一次，約每六個月一次，約每年一次，約每兩年一次，約每三年一次，約每四年一次，約每五年一次，或約每十年一次。
在一些實施方式中，該方法進一步包括向受試者投與多肽免疫原（例如，包含多肽免疫原的蛋白質亞基）。在一些實施方式中，多肽免疫原對應於由環狀多核糖核苷酸序列編碼的多肽免疫原（例如，與之具有90%、95%、96%、97%、98%或100%的胺基酸序列同一性）。在一些實施方式中，在投與本文所述之環狀多核糖核苷酸、免疫原性組成物、藥物製劑或藥物組成物中的任一種之後，向受試者投與多肽免疫原。在一些實施方式中，該多肽免疫原維持或增強該受試者針對該多肽免疫原的免疫反應。
在另一方面，本揭露提供了一種維持或增強受試者的免疫反應之方法，該方法包括 (i) 向該受試者投與編碼多肽免疫原的環狀多核糖核苷酸並且 (ii) 向該受試者投與該多肽免疫原，其中步驟 (ii) 發生在步驟 (i) 之後的1週至6個月之間（例如1個月至5個月之間，2個月至3個月之間，2週至3個月之間，或3個月至6個月之間），並且其中步驟 (ii) 的該多肽免疫原的投與維持或增強該受試者針對該多肽免疫原的免疫反應。在一些實施方式中，多肽免疫原包含一個或多個鑒別靶標的表位。在一些實施方式中，該靶標係病原體。在一些實施方式中，該靶標係癌細胞、過敏原或毒素。編號的實施方式：
[1]      一種環狀多核糖核苷酸，該環狀多核糖核苷酸包含多個序列，每個序列編碼多肽免疫原，其中該等多肽免疫原中的至少兩種鑒別不同的靶標。
[2]      如段落[1]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該等多肽免疫原中的每一種鑒別不同的靶標。
[3]      如段落[1]或[2]所述之環狀多核糖核苷酸，其中每個靶標係不同的病原體。
[4]      如段落[3]所述之環狀多核糖核苷酸，其中每個靶標獨立地是病毒、細菌、真菌或寄生蟲。
[5]      如段落[4]所述之環狀多核糖核苷酸，其中每個靶標係不同的病毒。
[6]      如段落[4]所述之環狀多核糖核苷酸，其中每個靶標係不同的細菌。
[7]      如段落[4]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該等靶標包括病毒和細菌。
[8]      一種環狀多核糖核苷酸，該環狀多核糖核苷酸包含多個序列，每個序列編碼多肽免疫原，其中該等多肽免疫原中的至少兩種鑒別不同的蛋白質，其中該等不同的蛋白質中的每一種鑒別相同的靶標。
[9]      如段落[8]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該等多肽免疫原中的每一種鑒別不同的蛋白質。
[10]        如段落[8]或[9]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該靶標係病原體。
[11]        如段落[10]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該病原體係病毒、細菌、真菌或寄生蟲。
[12]        如段落[11]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該病原體係病毒並且該等不同的蛋白質中的每一種係與該病毒相關的病毒蛋白質。
[13]        如段落[11]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該病原體係細菌並且該等不同的蛋白質中的每一種係與該細菌相關的細菌蛋白質。
[14]        如段落[8]或[9]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該靶標係癌細胞
[15]        如段落[14]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該等不同的蛋白質中的每一種係與該癌細胞相關的不同腫瘤抗原。
[16]        如段落[8]或[9]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該靶標係過敏原或毒素。
[17]        如段落[1]至[16]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含500至20,000個核糖核苷酸。
[18]        如段落[17]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含500至10,000個核糖核苷酸。
[19]        如段落[18]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含500至5,000個核糖核苷酸。
[20]        如段落[1]至[16]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含至少500個核糖核苷酸。
[21]        如段落[20]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含至少1,000個核糖核苷酸。
[22]        如段落[21]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含至少5,000個核糖核苷酸。
[23]        如段落[1]至[22]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或至少九個序列，每個序列編碼多肽免疫原。
[24]        如段落[1]至[22]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含兩個至三個、兩個至五個或五個至十個序列，每個序列編碼多肽免疫原。
[25]        如段落[1]至[22]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中至少一個編碼多肽免疫原的序列進一步編碼訊息序列。
[26]        如段落[1]至[22]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中每個編碼多肽免疫原的序列進一步編碼訊息序列。
[27]        如段落[1]至[26]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中編碼該等多肽免疫原中的每一種的每一個序列與內部核糖體進入位點（IRES）可操作地連接。
[28]        如段落[27]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含單個IRES。
[29]        如段落[28]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該等多肽免疫原中的每一種由與該單個IRES可操作地連接的單個開放閱讀框編碼，其中該開放閱讀框的表現產生包含該等多肽免疫原中的每一種的胺基酸序列的多肽。
[30]        如段落[29]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該等多肽免疫原各自被多肽連接子隔開。
[31]        如段落[29]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該等多肽免疫原各自被裂解結構域隔開。
[32]        如段落[31]所述之環狀多核糖核苷酸，其中每個裂解結構域均為2A自裂解肽。
[33]        如段落[27]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含多個IRES。
[34]        如段落[33]所述之環狀多核糖核苷酸，其中每個IRES與包含編碼多肽免疫原的序列的開放閱讀框可操作地連接。
[35]        如段落[1]至[34]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸其中該環狀多核糖核苷酸包含具有5’末端和3’末端的第一多核糖核苷酸，其中5’末端和3’末端各自與第二多核苷酸雜交，由此連接第一多核糖核苷酸的5’末端和3’末端以形成環狀多核糖核苷酸。
[36]        如段落[35]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸藉由夾板連接產生。
[37]        如段落[1]至[34]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中藉由提供具有3’末端和5’末端的線性多核糖核苷酸來產生該環狀多核糖核苷酸，其中該3’末端和該5’末端各自包含內含子的一部分，並且其中該3’末端的內含子部分和該5’末端的內含子部分催化剪接反應，從而使該5’末端和該3’末端共價軛合以產生該環狀多核糖核苷酸。
[38]        如段落[37]所述之環狀多核糖核苷酸，其中該內含子係I類自剪接內含子。
[39]        一種包含多個環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物，每個環狀多核糖核苷酸均包含編碼多肽免疫原的序列。
[40]        如段落[39]所述之免疫原性組成物，其中該多個環狀多核糖核苷酸中的每一個均為段落中[1]至[38]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸。
[41]        如段落[39]所述之免疫原性組成物，其中該組成物包含 (a) 包含編碼第一多肽免疫原的序列的至少第一環狀多核糖核苷酸和 (b) 包含編碼第二多肽免疫原的序列的至少第二環狀多核糖核苷酸，其中該第一多肽免疫原和第二多肽免疫原鑒別不同的蛋白質，其中每種不同的蛋白質鑒別相同的靶標。
[42]        如段落[41]所述之免疫原性組成物，其中該靶標係病原體。
[43]        如段落[42]所述之免疫原性組成物，其中該病原體係病毒、細菌、真菌或寄生蟲。
[44]        如段落[43]所述之免疫原性組成物，其中該病原體係癌細胞、過敏原或毒素。
[45]        如段落[39]所述之免疫原性組成物，其中該組成物包含 (a) 包含編碼第一多肽免疫原的序列的至少第一環狀多核糖核苷酸和 (b) 包含編碼第二多肽免疫原的序列的至少第二環狀多核糖核苷酸，其中該第一多肽免疫原鑒別第一靶標而該第二多肽免疫原鑒別第二靶標。
[46]        如段落[45]所述之免疫原性組成物，其中每個靶標係病原體。
[47]        如段落[45]或[46]所述之免疫原性組成物，其中每個靶標獨立地是癌細胞、病毒、細菌、真菌、寄生蟲、毒素或過敏原。
[48]        如段落[39]至[47]中任一項所述之免疫原性組成物，其中每種多肽免疫原均與IRES可操作地連接。
[49]        一種藥物組成物，該藥物組成物包含如段落[1]至[38]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸或如段落[39]至[48]中任一項所述之免疫原性組成物，以及藥學上可接受的賦形劑。
[50]        如段落[49]所述之藥物組成物，該藥物組成物進一步包含佐劑。
[51]        如段落[50]所述之藥物組成物，其中，其中該佐劑係無機佐劑、小分子佐劑和水包油乳劑、脂質或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基於RNA的佐劑、基於DNA的佐劑、病毒顆粒、細菌佐劑、雜交分子、真菌或卵母細胞微生物相關分子模式（MAMP）、無機奈米顆粒或多組分佐劑。
[52]        如段落[51]所述之藥物組成物，其中該佐劑係無機佐劑。
[53]        如段落[52]所述之藥物組成物，其中該無機佐劑係鋁鹽或鈣鹽。
[54]        如段落[51]所述之藥物組成物，其中該佐劑係小分子。
[55]        如段落[51]所述之藥物組成物，其中該小分子係咪喹莫特、瑞喹莫德或嘎德莫特。
[56]        如段落[51]所述之藥物組成物，其中該佐劑係水包油乳劑。
[57]        如段落[56]所述之藥物組成物，其中該水包油乳劑係角鯊烯、MF59、AS03、Montanide配製物（視需要Montanide ISA 51或Montanide ISA 720）或不完全弗氏佐劑（一種水包油乳劑）。
[58]        如段落[51]所述之藥物組成物，其中該佐劑係脂質或聚合物。
[59]        如段落[58]所述之藥物組成物，其中該脂質或聚合物係聚合物奈米顆粒，視需要PLGA、PLG、PLA、PGA或PHB；脂質體，視需要病毒體或CAF01；脂質奈米顆粒或其組分；脂多糖（LPS），視需要單磷醯基脂質A（MPLA）或哌喃葡糖苷脂質A（GLA）；脂肽，視需要Pam2（Pam2CSK4）或Pam3（Pam3CSK4）；或糖脂，視需要海藻糖二黴菌酸酯。
[60]        如段落[51]所述之藥物組成物，其中該佐劑係肽或肽聚糖。
[61]        如段落[60]所述之藥物組成物，其中該肽或肽聚糖對應於合成或純化的革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌的全部或一部分，視需要N-乙醯-胞壁醯-L-丙胺醯-D-異麩醯胺酸（MDP）、鞭毛蛋白融合蛋白、甘露糖結合凝集素（MBL）、細胞介素或趨化因子。
[62]        如段落[51]所述之藥物組成物，其中該佐劑係碳水化合物或多糖。
[63]        如段落[62]所述之藥物組成物，其中該碳水化合物或多糖係右旋糖酐（微生物支多糖）、硫酸右旋糖酐、香菇多糖、酵母聚糖、β-葡聚糖、Deltin、甘露聚糖或幾丁質。
[64]        如段落[51]所述之藥物組成物，其中該佐劑係皂苷。
[65]        如段落[64]所述之藥物組成物，其中該皂苷係附接至一條或多條糖側鏈的糖苷或多環苷元，視需要係ISCOMS、ISCOMS基質或QS-21。
[66]        如段落[51]所述之藥物組成物，其中該佐劑係基於RNA的佐劑。
[67]        如段落[66]所述之藥物組成物，其中該基於RNA的佐劑係聚IC、聚IC:LC、髮夾RNA（視需要具有含5’PPP的序列）、病毒序列、含聚U的序列、dsRNA、天然或合成的免疫刺激RNA序列、核酸類似物，視需要環狀GMP-AMP或環狀二核苷酸（諸如環狀二GMP），或免疫刺激性鹼基類似物，視需要C8取代或N7,C8二取代的鳥嘌呤核糖核苷酸。
[68]        如段落[51]所述之藥物組成物，其中該佐劑係基於DNA的佐劑。
[69]        如段落[68]所述之藥物組成物，其中該基於DNA的佐劑係CpG、dsDNA或天然或合成的免疫刺激DNA序列。
[70]        如段落[51]所述之藥物組成物，其中該佐劑係病毒顆粒。
[71]        如段落[70]所述之藥物組成物，其中該病毒顆粒係病毒體，視需要係磷脂細胞膜雙層。
[72]        如段落[51]所述之藥物組成物，其中該佐劑係細菌佐劑。
[73]        如段落[72]所述之藥物組成物，其中該細菌佐劑係鞭毛蛋白、LPS或細菌毒素，視需要腸毒素、熱不穩定性毒素或霍亂毒素
[74]        如段落[51]所述之藥物組成物，其中該佐劑係雜交分子。
[75]        如段落[74]所述之藥物組成物，其中該佐劑係與咪喹莫特軛合的CpG。
[76]        如段落[51]所述之藥物組成物，其中該佐劑係真菌或卵母細胞微生物相關分子模式（MAMP）。
[77]        如段落[76]所述之藥物組成物，其中該真菌或卵母細胞MAMP係幾丁質或β-葡聚糖。
[78]        如段落[51]所述之藥物組成物，其中該佐劑係無機奈米顆粒。
[79]        如段落[78]所述之藥物組成物，其中該無機奈米顆粒係金奈米棒、基於二氧化矽的奈米顆粒，視需要係介孔二氧化矽奈米顆粒（MSN）。
[80]        如段落[51]所述之藥物組成物，其中該佐劑係多組分佐劑。
[81]        如段落[80]所述之藥物組成物，其中該多組分佐劑係AS01、AS03、AS04、完全弗氏佐劑或CAF01。
[82]        一種治療或預防受試者的疾病、病症或病狀之方法，該方法包括向該受試者投與如段落[1]至[38]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸、如段落[39]至[48]中任一項所述之免疫原性組成物或如段落[49]至[81]中任一項所述之藥物組成物。
[83]        如段落[82]所述之方法，其中該疾病、病症或病狀係病毒感染、細菌感染或真菌感染。
[84]        如段落[82]所述之方法，其中該疾病、病症或病狀係癌症。
[85]        如段落[82]所述之方法，其中該疾病、病症或病狀與暴露於過敏原相關。
[86]        如段落[82]所述之方法，其中該疾病、病症或病狀與暴露於毒素相關。
[87]        一種在受試者中誘導免疫反應之方法，該方法包括向該受試者投與如段落[1]至[38]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸、如段落[39]至[48]中任一項所述之免疫原性組成物或如段落[49]至[81]中任一項所述之藥物組成物。
[88]        如段落[82]至[87]中任一項所述之方法，其中該受試者係哺乳動物。
[89]        如段落[88]所述之方法，其中該受試者係人。
[90]        如段落[88]所述之方法，其中該方法係非人哺乳動物。
[91]        如段落[88]所述之方法，其中該非人哺乳動物係牛、綿羊、山羊、豬、狗、馬或貓。
[92]        如段落[82]至[91]中任一項所述之方法，其中該受試者係鳥。
[93]        如段落[92]所述之方法，其中該鳥係母雞、公雞、火雞或鸚鵡。
[94]        如段落[82]至[93]中任一項所述之方法，其中該方法進一步包括向該受試者投與佐劑。
[95]        如段落[94]所述之方法，其中該佐劑係無機佐劑、小分子佐劑和水包油乳劑、脂質或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基於RNA的佐劑、基於DNA的佐劑、病毒顆粒、細菌佐劑、雜交分子、真菌或卵母細胞微生物相關分子模式（MAMP）、無機奈米顆粒或多組分佐劑。
[96]        如段落[94]所述之方法，其中該佐劑係多肽佐劑。
[97]        如段落[96]所述之方法，其中該多肽佐劑係細胞介素、趨化因子、共刺激分子、先天性免疫刺激劑、傳訊分子、轉錄活化劑、細胞介素受體、細菌組分或先天性免疫系統的組分。
[98]        如段落[94]所述之方法，其中該佐劑係先天性免疫系統刺激劑。
[99]        如段落[98]所述之方法，其中該先天性免疫系統刺激劑選自包括富含GU的模體、富含AU的模體、包含dsRNA的結構化區域或適體的RNA。
[100]      如段落[82]至[99]中任一項所述之方法，其中將如段落[1]至[38]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸、如段落[39]至[48]中任一項所述之免疫原性組成物或如段落[49]至[81]中任一項所述之藥物組成物作為單劑量向該受試者投與。
[101]      如段落[86]至[99]中任一項所述之方法，其中將如段落[1]至[38]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸、如段落[39]至[48]中任一項所述之免疫原性組成物或如段落[49]至[81]中任一項所述之藥物組成物向該受試者投與兩次或更多次、三次或更多次、四次或更多次、或五次或更多次。
[102]      如段落[101]所述之方法，其中如段落[1]至[38]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸、如段落[39]至[48]中任一項所述之免疫原性組成物或如段落[49]至[81]中任一項所述之藥物組成物的投與約每週一次，約每兩週一次，約每三週一次，約每個月一次，約每兩個月一次，約每三個月一次，約每四個月一次，約每五個月一次，約每六個月一次，約每年一次，約每兩年一次，約每三年一次，約每四年一次，約每五年一次，或約每十年一次。
[103]      如段落[82]至[99]中任一項所述之方法，其中該方法進一步包括向受試者投與多肽免疫原（例如，包含多肽免疫原的蛋白質亞基）。
[104]      如段落[103]所述之方法，其中該多肽免疫原對應於由環狀多核糖核苷酸序列編碼的多肽免疫原（例如，與之具有90%、95%、96%、97%、98%或100%的胺基酸序列同一性。
[105]      如段落[103]所述之方法，其中在投與如段落[1]至[38]中任一項所述之環狀多核糖核苷酸、如段落[39]至[48]中任一項所述之免疫原性組成物或如段落[49]至[81]中任一項所述之藥物組成物之後，向該受試者投與該多肽免疫原。
[106]      如段落[103]至[105]中任一項所述之方法，其中該多肽免疫原維持或增強該受試者針對該多肽免疫原的免疫反應。
[107]      一種維持或增強受試者中的免疫反應之方法，該方法包括 (i) 向該受試者投與編碼多肽免疫原的環狀多核糖核苷酸並且 (ii) 向該受試者投與該多肽免疫原，其中步驟 (ii) 發生在步驟 (i) 之後的1週至6個月之間，並且其中步驟 (ii) 的該多肽免疫原的投與維持或增強該受試者針對該多肽免疫原的免疫反應。
[108]      如段落[107]所述之方法，其中該多肽免疫原包含一個或多個鑒別靶標的表位。
[109]      如段落[108]所述之方法，其中該靶標係病原體。
[110]      如段落[108]所述之方法，其中該靶標係癌細胞、過敏原或毒素。定義
本揭露將針對特定實施方式並參考某些附圖進行描述，但是本揭露不限於此，而是僅由申請專利範圍來限定。除非另有說明，否則下文陳述的術語通常應以其共識來理解。
如本文所用，術語「適應性免疫反應」係指體液或細胞介導的免疫反應。為了本揭露之目的，「體液免疫反應」係指由抗體分子介導的免疫反應，而「細胞免疫反應」係由T淋巴細胞和/或其他白血球介導的免疫反應。
如本文所用，術語「佐劑」係指增大或以其他方式改變或修改免疫反應的化合物。免疫反應的修改包括強化或擴大抗體和細胞免疫反應中的任一者或兩者的特異性。免疫反應的修改還可以意指降低或阻遏某些免疫原特異性免疫反應。
如本文所用，術語「與疾病、病症或病狀相關」係指實體與受試者的疾病、病症或病狀的發生或嚴重程度之間的因果關係或相關性關係。例如，如果靶標與疾病、病症或病狀相關，則該靶標可以是該疾病、病症或病狀的致病因子。例如，病毒可以是病毒感染的致病因子，細菌可以是細菌感染的致病因子，真菌可以是真菌感染的致病因子，或寄生蟲可以是寄生蟲感染的致病因子，癌細胞可以是癌症的致病因子，毒素可以是毒性的致病因子，或者過敏原可以是過敏反應的致病因子。與疾病、病症或病狀相關的靶標還可以或替代性地與疾病、病症或病狀發生的可能性增加或嚴重程度增加有關聯。
如本文所用，術語「載劑」意指利於將組成物（例如，線性或環狀多核糖核苷酸）運輸或遞送到受試者、組織或細胞中的化合物、組成物、試劑或分子。載劑的非限制性實例包括碳水化合物載劑（例如，酸酐改性的植物糖原或糖原型材料）、奈米顆粒（例如，封裝或共價連接結合至環狀或線性多核糖核苷酸的奈米顆粒）、脂質體、融合體（fusosome）、離體分化的網狀紅血球、外泌體、蛋白質載劑（例如，與多核糖核苷酸共價連接的蛋白質）或陽離子載劑（例如，陽離子脂聚合物或轉染試劑）。
如本文所用，術語「細胞穿透劑」意指當與細胞接觸時利於進入細胞的試劑。在一些情況下，細胞穿透劑利於細胞膜的直接穿透，例如經由與細胞膜帶負電荷的磷脂的直接靜電相互作用，或藉由誘導膜蛋白或磷脂雙層的構型變化而引起的暫態孔形成。在一些情況下，細胞穿透劑利於內吞作用介導的向細胞內的易位。例如，在某些情形下，細胞穿透劑可以刺激細胞經歷內吞過程，由此細胞膜可以向內折疊到細胞中。在某些實施方式中，細胞穿透劑有助於形成跨細胞膜轉運的過渡結構。不希望受特定理論的束縛，如本文所提供的細胞穿透劑可以增加細胞膜的滲透性或增加分子進入細胞的內化，其結果係，與沒有細胞穿透劑的其他相同遞送相比，當細胞同時與細胞穿透劑接觸時，可以更有效地遞送到細胞中。
如本文所用，術語「circRNA」或「環狀多核糖核苷酸」或「環狀RNA」或「環狀多核糖核苷酸分子」可互換使用，並且意指具有無游離末端的結構（即，沒有游離3’末端和/或5’末端）的多核糖核苷酸分子，例如藉由共價或非共價鍵形成環狀或無末端結構的多核糖核苷酸分子。
如本文所用，術語「環化效率」係所得環狀多核糖核苷酸相對於其非環狀起始材料的測量。
如本文所用，術語「circRNA製劑」或「環狀多核糖核苷酸製劑」或「環狀RNA製劑」可互換使用，並且意指包括circRNA分子和稀釋劑、載劑、第一佐劑或其組合的組成物。
詞語「用於治療、調節等的化合物、組成物、產物等」應理解為係指本身適合於所指示的治療、調節等目的的化合物、組成物、產物等。詞語「用於治療、調節等的化合物、組成物、產物等」另外作為一個較佳的實施方式揭露了此類化合物、組成物、產物等用於治療、調節等。
詞語「用於…的化合物、組成物、產物等」或「化合物、組成物、產物等用於製造用以…的藥物、藥物組成物、獸用組成物、診斷組成物等的用途」表示該等化合物、組成物、產物等將用於可在人體或動物身上實施的治療方法中。它們被認為係涉及治療方法等的實施方式和請求項的等同揭露。如果實施方式或請求項因此係指「用於治療疑似患有疾病的人或動物的化合物」，則這也被認為係揭露「化合物在製造用於治療疑似患有疾病的人或動物的藥物中的用途」或「藉由向疑似患有疾病的人或動物投與化合物的治療方法」。
術語「稀釋劑」意指包含非活性溶劑的媒介物，本文所述之組成物（例如，包含環狀或線性多核糖核苷酸的組成物）可以稀釋或溶解在其中。稀釋劑可以是RNA增溶劑、緩衝劑、等滲劑或其混合物。稀釋劑可以是液體稀釋劑或固體稀釋劑。液體稀釋劑的非限制性實例包括水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑（諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油類（尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油）、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨糖醇的脂肪酸酯以及1,3-丁二醇。固體稀釋劑的非限制性實例包括碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸二鈣、硫酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸鈉乳糖、蔗糖、纖維素、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化鈉、乾澱粉、玉米澱粉或糖粉。
如本文所用，術語「疾病」、「病症」和「病狀」各自指亞健康狀態，例如，通常被或將會被醫療專業人員診斷或治療的狀態。
如本文所用，術語「表位」係指被抗體或T細胞受體識別、靶向或結合的免疫原的一部分或全部。表位可以是線性表位，例如核酸或胺基酸的連續序列。表位可以是構象表位，例如，含有在蛋白質的折疊構象中形成表位的胺基酸的表位。構象表位可以含有來自一級胺基酸序列的非連續胺基酸。再如，構象表位包括基於其二級結構或三級結構在免疫原性序列的折疊構象中形成表位的核酸。
如本文所用，術語「加密原（encryptogen）」係環狀多核糖核苷酸的核酸序列或結構，該核酸序列或結構有助於減少、逃避和/或避免被免疫細胞檢測到和/或減少針對環狀或線性多核糖核苷酸的免疫反應的誘導。
如本文所用，術語「表現序列」係編碼產物，例如肽或多肽或調控核酸的核酸序列。編碼肽或多肽的示例性表現序列可以包括多個核苷酸三聯體，其中每一個都可以編碼胺基酸，並被稱為「密碼子」。
如本文所用，術語「鑒別」係指指示、建立或識別實體的同一性。例如，免疫原或其表位可以鑒別靶標，意指該靶標包括該免疫原或其表位，該免疫原或其表位源自該靶標，和/或該免疫原或其表位與該靶標的一部分或全部具有高度相似性。抗體或T細胞受體對免疫原或其表位的鑒別或結合可以鑒別靶標。當免疫原或其表位鑒別靶標時，該免疫原或其表位將靶標與一個或多個其他靶標區分開。同樣，多肽免疫原可以鑒別蛋白質。換句話說，多肽免疫原係蛋白質的組分或蛋白質的一部分（尤其是蛋白質的表位），源自蛋白質或蛋白質的一部分，或與蛋白質或蛋白質的一部分具有高度相似性。
如本文所用，術語「雜質」係存在於組成物中，例如如本文所述之藥物組成物中的不需要的物質。在一些實施方式中，雜質係與製程有關的雜質。在一些實施方式中，雜質係最終組成物中除所需產物以外，例如除如本文所述之活性藥物成分（例如，環狀或線性多核糖核苷酸）以外與產物有關的物質。如本文所用，術語「與製程有關的雜質」係在最終的組成物、製劑或產物中，除本文所述之線性多核糖核苷酸以外，在組成物、製劑或產物的製造中使用、存在或生成的不需要的物質。在一些實施方式中，與製程有關的雜質係在多核糖核苷酸的合成或環化中使用的酶。如本文所用，術語「與產物有關的物質」係在組成物、製劑或產物或其任何中間體的合成過程中產生的物質或副產物。在一些實施方式中，與產物有關的物質係去氧核糖核苷酸片段。在一些實施方式中，與產物有關的物質係去氧核糖核苷酸單體。在一些實施方式中，與產物有關的物質係以下的一種或多種：本文所述之多核糖核苷酸的衍生物或片段，例如10、9、8、7、6、5或4個核糖核酸、單核糖核酸、二核糖核酸或三核糖核酸的片段。
如本文所用，術語「免疫原」係指包括一個或多個被抗體或T細胞受體識別、靶向或結合的表位的任何分子或分子結構。具體而言，免疫原在受試者中誘導免疫反應（例如，如本文所定義的那樣具有免疫原性）。免疫原能夠在受試者中誘導免疫反應，其中該免疫反應係指當免疫原遇到免疫系統時誘導的一系列分子、細胞和生物事件。免疫反應可以是體液和/或細胞免疫反應。該等可以包括抗體的產生以及B細胞和T細胞的擴增。為了確定是否已經發生免疫反應並跟蹤其進程，可以監測免疫受試者針對特定免疫原的免疫反應物的出現。對大多數免疫原的免疫反應誘導特異性抗體和特異性效應T細胞的產生。在一些實施方式中，免疫原係宿主外源的。在一些實施方式中，免疫原不是宿主外源的。免疫原可以包括多肽、多糖、多核苷酸或脂質的全部或一部分。免疫原也可以是混合的多肽、多糖、多核苷酸和/或脂質。例如，免疫原可以是已經翻譯修飾的多肽。「多肽免疫原」係指包括多肽的免疫原。多肽免疫原還可以包括一個或多個翻譯後修飾，和/或可以與一個或多個其他分子形成複合物，和/或可以呈三級或四級結構，每種結構可以決定或影響多肽的免疫原性。
如本文所用，術語「免疫原性」係在特定的免疫反應測定中誘導超過預定閾值的對物質的反應的潛力。該測定可以是例如某些炎症標誌物的表現、抗體的產生或如本文所述之免疫原性的測定。在一些實施方式中，當生物體或某種類型的免疫細胞的免疫系統暴露於免疫原時，可以誘導免疫反應。
可以使用總抗體測定法、確認試驗、抗體的滴定和同種型分析以及中和抗體評估來評價受試者血漿或血清中的抗體，從而評估免疫原性反應。總抗體測定法測量在已經投與了免疫原的受試者的血清或血漿中作為免疫反應的一部分而生成的所有抗體。檢測抗體最常用的試驗係ELISA（酶聯免疫吸附測定），檢測受試血清中與目標抗體結合的抗體，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。可藉由確認測定法進一步評估免疫原性反應。在總抗體評估之後，可以使用確認測定法來確認總抗體測定法的結果。競爭測定法可用於確認抗體與靶標特異性結合，並且篩選測定法中的陽性發現不是試驗血清或檢測試劑與該測定法中其他物質發生非特異性相互作用的結果。
可藉由同種型分析和滴定來評估免疫原性反應。同種型分析可用於僅評估相關抗體的同種型。例如，預期的同種型可以是IgM和IgG，它們可以藉由同種型分析和滴定進行特異性檢測和定量，然後與存在的總抗體進行比較。
可以藉由中和抗體測定法（nAb）來評估免疫原性反應。中和抗體測定法（nAb）可用於確定響應於免疫原而產生的抗體是否中和免疫原，從而抑制免疫原對靶標產生作用並導致異常的藥物動力學行為。nAb測定法通常是基於細胞的測定法，其中靶細胞與抗體一起孵育。可以使用多種基於細胞的nAb測定法，包括但不限於細胞增殖、活力、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）、，補體依賴性細胞毒性（CDC）、細胞病變效應抑制（CPE）、凋亡、配位基刺激的細胞傳訊、酶活性、報告基因測定、蛋白質分泌、代謝活性、應激和線粒體功能。檢測讀數包括吸光度、螢光、發光、化學發光或流動式細胞測量術讀數。配位基結合測定法還可用於體外測量免疫原和抗體的結合親和力，以評價中和功效。
此外，可以藉由使用從受試者獲得的T細胞上的細胞標誌物測量受試者中的T細胞活化來評估細胞免疫反應的誘導。可以從受試者收集血液樣本、淋巴結生檢樣本或組織樣本，並評價來自樣本的T細胞中的以下一種或多種（例如，2、3、4種或更多種）活化標誌物：CD25、CD71、CD26、CD27、CD28、CD30、CD154、CD40L、CD134、CD69、CD62L或CD44。也可以在體內動物模型中使用相同之方法評估T細胞活化。也可以藉由向體外T細胞（例如，從受試者、動物模型、儲庫或商業來源獲得的T細胞）添加免疫原並測量上述標誌物來進行該測定以評估T細胞活化。可以使用類似方法評估對其他免疫細胞（諸如嗜酸性細胞（標誌物：CD35、CD11b、CD66、CD69和CD81））、樹突細胞（標誌物：IL-8、MHC II類、CD40、CD80、CD83和CD86）、嗜鹼性細胞（CD63、CD13、CD4和CD203c）和中性粒細胞（CD11b、CD35、CD66b和CD63）的活化的影響。可以使用流動式細胞測量術、免疫組織化學、原位雜交和其他允許測量細胞標誌物的測定法來評估該等標誌物。免疫原投與前後的比較結果可用於確定其影響。
如本文所用，術語「誘導免疫反應」係指引發、放大或維持受試者的免疫反應。誘導免疫反應可以指適應性免疫反應或先天性免疫反應。免疫反應的誘導可以如上所討論的那樣進行測量。
如本文所用，術語「線性對應物」係具有與環狀多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列（例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%或之間的任何百分比的序列同一性）並且具有兩個游離末端（即，環狀多核糖核苷酸的未環化形式（及其片段））的多核糖核苷酸分子（及其片段）。在一些實施方式中，線性對應物（例如，環化前形式）係具有與環狀多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列（例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%或之間的任何百分比的序列同一性）和相同或相似的核酸修飾並且具有兩個游離末端（即，環狀多核糖核苷酸的未環化形式（及其片段））的多核糖核苷酸分子（及其片段）。在一些實施方式中，線性對應物係具有與環狀多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列（例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%或之間的任何百分比的序列同一性）和不同的核酸修飾或沒有核酸修飾並且具有兩個游離末端（即，環狀多核糖核苷酸的未環化形式（及其片段））的多核糖核苷酸分子（及其片段）。在一些實施方式中，作為線性對應物的多核糖核苷酸分子的片段係線性對應物多核糖核苷酸分子的比該線性對應物多核糖核苷酸分子短的任何部分。在一些實施方式中，線性對應物進一步包括5’帽。在一些實施方式中，線性對應物進一步包括聚腺苷尾。在一些實施方式中，線性對應物進一步包括3’ UTR。在一些實施方式中，線性對應物進一步包括5’ UTR。
如本文所用，術語「線性RNA」或「線性多核糖核苷酸」或「線性多核糖核苷酸分子」可互換使用並且意指具有5’末端和3’末端的多核糖核苷酸分子。5’末端和3’末端中的一個或兩個可以是游離末端或者可以與另一部分連接。線性RNA包括尚未經歷環化（例如，環化前）的RNA，並且可以用作起始材料藉由例如夾板連接或化學、酶促、核酶或剪接催化的環化方法進行環化。
如本文所用，術語「混合物」意指由兩種或更多種不同物質混合而成的材料。在一些情況下，本文所述之混合物可以是兩種或更多種不同物質的均勻混合物，例如，在混合物的任何給定樣本中，混合物可以具有相同比例的組分（例如，兩種或更多種物質）。在一些情況下，本文所提供的混合物可以是兩種或更多種不同物質的不均勻混合物，例如，混合物組分（例如，兩種或更多種物質）的比例在整個混合物中可以不同。在一些情況下，混合物係液體溶液，例如，混合物以液相存在。在一些情況下，可以將液體溶液視為包含液體溶劑和溶質。將溶質混合在液體溶劑中可以稱為「溶解」過程。在一些情況下，液體溶液係液液溶液（例如，液體溶質溶解在液體溶劑中），固液溶液（例如，固體溶質溶解在液體溶劑中）或氣液溶液（例如，固體溶質溶解在液體溶劑中）。在一些情況下，存在一種以上的溶劑和/或一種以上的溶質。在一些情況下，混合物係膠體、液體懸浮液或乳液。在一些情況下，混合物係固體混合物，例如，混合物以固相存在。
如本文所用，術語「經修飾的核糖核苷酸」意指具有至少一個針對糖、核鹼基或核苷間鍵的修飾的核苷酸。
如本文所用，術語「裸遞送」意指無需借助於載劑而遞送至細胞且沒有對有助於遞送至細胞的部分進行共價修飾的配製物。裸遞送配製物不含任何轉染試劑、陽離子載劑、碳水化合物載劑、奈米顆粒載劑或蛋白質載劑。例如，環狀或線性多核糖核苷酸的裸遞送配製物係包含沒有共價修飾的環狀或線性多核糖核苷酸且不含載劑的配製物。
如本文所用，術語「帶切口的RNA」或「帶切口的多核糖核苷酸」或「帶切口的多核糖核苷酸分子」可以互換使用並且意指由於環狀RNA切口或降解而產生的具有5’末端和3’末端的多核糖核苷酸分子。
如本文所用，術語「非環狀RNA」意指總的帶切口的RNA和線性RNA。
術語「藉由……可獲得」、「藉由……可產生」或其他類似短語用於指示請求項或實施方式係指化合物、組成物、產物等本身，即該化合物、組成物、產物等可藉由描述用於製造該化合物、組成物、產物等之方法獲得或產生，但該化合物、組成物、產物等也可以藉由該描述之方法以外的其他方法獲得或產生。術語「藉由……獲得」、「藉由……產生」或等等指示化合物、組成物、產物係藉由所列舉的具體方法獲得或產生的。應理解，術語「藉由……可獲得」、「藉由……可產生」等還揭露了術語「藉由……獲得」、「藉由……產生」等作為「藉由……可獲得」、「藉由……可產生」等的較佳的實施方式。
如本文所用，術語「病原體」係指在受試者中引起疾病或疾病症狀的感染因子，例如，藉由直接感染受試者，藉由產生在受試者中引起疾病或疾病症狀的因子和/或藉由在受試者中引發免疫反應。如本文所用，病原體包括但不限於細菌、原生動物、寄生生物、真菌、線蟲、昆蟲、類病毒和病毒、或其任何組合，其中每種病原體能夠（自身或與另一種病原體共同）引發受試者的疾病或症狀。
如本文所用，術語「有效載荷」意指如本文所揭露的由多核糖核苷酸遞送的任何分子。在一些情況下，有效載荷係核酸、蛋白質、化學物質、核糖核蛋白或其任何組合。在一些情況下，有效載荷係如本文所揭露的直接包含在多核糖核苷酸內的核酸序列。在一些情況下，有效載荷例如經由互補雜交或經由蛋白質-核酸相互作用與如本文所揭露的多核糖核苷酸附接或締合。在一些情況下，有效載荷係由包含在多核糖核苷酸中、與多核糖核苷酸附接或締合的核酸序列編碼的蛋白質。在一些情況下，「附接」意指兩個分子之間的共價鍵或非共價相互作用。在一些情況下，當在有效載荷與多核糖核苷酸之間的相互作用的上下文中使用時「締合」意指有效載荷經由之間的一個或多個其他分子間接連接至多核糖核苷酸。在一些情況下，附接或締合可以是暫態的。在一些情況下，例如，根據環境pH條件或刺激物或結合伴侶的存在或不存在，有效載荷在一種條件下與多核糖核苷酸附接或締合，而在另一種條件下不與多核糖核苷酸附接或締合。
術語「藥物組成物」旨在同樣揭露包括在藥物組成物中的環狀或線性多核糖核苷酸可用於藉由療法治療人體或動物體。因此，這意味著等同於「在療法中使用的環狀或線性多核糖核苷酸」。
如本文所用，術語「多核苷酸」意指包含一個或多個核酸亞基或核苷酸的分子，並且可以與「核酸」或「寡核苷酸」互換使用。多核苷酸可以包括一個或多個選自腺苷（A）、胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）或其變體的核苷酸。核苷酸可以包括核苷和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個磷酸（PO3 ）基團。核苷酸可以包括核鹼基、五碳糖（核糖或去氧核糖）以及一個或多個磷酸基團。核糖核苷酸係其中糖為核糖的核苷酸。多核糖核苷酸或核糖核酸或RNA可以指包括經由磷酸二酯鍵聚合的多個核糖核苷酸的大分子。去氧核糖核苷酸係其中糖係去氧核糖的核苷酸。
聚去氧核糖核苷酸或去氧核糖核酸或DNA意指包括經由磷酸二酯鍵聚合的多個去氧核糖核苷酸的大分子。核苷酸可以是核苷一磷酸或核苷多磷酸。核苷酸意指包括可檢測標籤（諸如發光標籤）或標誌物（例如，螢光團）的去氧核糖核苷多磷酸，例如去氧核糖核苷三磷酸（dNTP），其可以選自去氧腺苷三磷酸（dATP）、去氧胞苷三磷酸（dCTP）、去氧鳥苷三磷酸（dGTP）、尿苷三磷酸（dUTP）和去氧胸苷三磷酸（dTTP）dNTP。核苷酸可以包括可以摻入正在生長的核酸股中的任何亞基。此類亞基可以是A、C、G、T或U，或對一個或多個互補A、C、G、T或U有特異性或與嘌呤（即，A或G或其變體）或嘧啶（即C、T或U或其變體）互補的任何其他亞基。在一些實例中，多核苷酸係去氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）或其衍生物或變體。在一些情況下，多核苷酸舉幾例來說係短干擾RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、質體DNA（pDNA）、短髮夾RNA（shRNA）、小核RNA（snRNA）、信使RNA（mRNA）、先質mRNA（前mRNA）、反義RNA（asRNA），並且涵蓋核苷酸序列及其任何結構實施方式，諸如單股、雙股、三股、螺旋、髮夾等。在一些情況下，多核苷酸分子為環狀的。多核苷酸可以具有各種長度。核酸分子可以具有至少約10個鹼基、20個鹼基、30個鹼基、40個鹼基、50個鹼基、100個鹼基、200個鹼基、300個鹼基、400個鹼基、500個鹼基、1千鹼基（kb）、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、10 kb、50 kb或更大的長度。可以從細胞或組織中分離多核苷酸。如本文所體現的，多核苷酸序列可以包括分離和純化的DNA/RNA分子、合成的DNA/RNA分子和合成的DNA/RNA類似物。
多核苷酸，例如多核糖核苷酸或多去氧核糖核苷酸，可以包括一種或多種核苷酸變體，包括非標準核苷酸、非天然核苷酸、核苷酸類似物和/或經修飾的核苷酸。經修飾的核苷酸的實例包括但不限於二胺基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基胺基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基辨苷（galactosylqueosine）、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辮苷（mannosylqueosine）、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-D46-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸（v）、懷丁苷（wybutoxosine）、假尿嘧啶、辮苷（queosine）、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸（v）、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-胺基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二胺基嘌呤等。在一些情況下，核苷酸在其磷酸酯部分中可以包括修飾，包括對三磷酸酯部分的修飾。此類修飾的非限制性實例包括長度更長的磷酸酯鏈（例如，具有4、5、6、7、8、9、10個或更多個磷酸酯部分的磷酸酯鏈）和帶有硫醇部分（例如，α-硫代三磷酸酯和β-硫代三磷酸酯）的修飾。核酸分子還可在鹼基部分處（例如，在通常可用於與互補核苷酸形成氫鍵的一個或多個原子處和/或在通常不能與互補核苷酸形成氫鍵的一個或多個原子處）、糖部分或磷酸骨架處被修飾。核酸分子還可含有胺修飾的基團，諸如胺基烯丙基1-dUTP（aa-dUTP）和胺基己基丙烯醯胺-dCTP（aha-dCTP），以允許胺反應性部分（諸如N-羥基琥珀醯亞胺酯（NHS））的共價附接。本揭露之寡核苷酸中標準DNA鹼基對或RNA鹼基對的替代物可以提供更高的密度（以位元/立方毫米計）、更高的安全性（抗天然毒素的偶然或有目的合成）、更容易辨別光程式性聚合酶（photo-programmed polymerases）或較低的二級結構。與用於從頭合成和/或擴增合成的天然和突變聚合酶相容的此類替代鹼基對在Betz K、Malyshev DA、Lavergne T、Welte W、Diederichs K、Dwyer TJ、Ordoukhanian P、Romesberg FE、Marx A. Nat. Chem. Biol. [自然化學生物學] 2012年7月; 8 (7): 612-4中有描述，其藉由援引併入本文用於所有目的。
如本文所用，「多肽」意指最常藉由肽鍵連接在一起的胺基酸殘基（天然或非天然的）的聚合物。如本文所用，該術語係指任何大小、結構或功能的蛋白質、多肽和肽。多肽可以包括基因產物、天然存在的多肽、合成多肽、同系物、直系同源物、旁系同源物、前述物質的片段和其他等同物、變體和類似物。多肽可以是單分子或者可以是多分子複合物，諸如二聚體、三聚體或四聚體。它們還可以包含單鏈或多鏈多肽，諸如抗體或胰島素，並且可以締合或連接。最常見的二硫鍵存在於多鏈多肽中。術語多肽也可以適用於胺基酸聚合物，其中一個或多個胺基酸殘基係相應的天然存在的胺基酸的人工化學類似物。
如本文所用，術語「預防」意指降低發展疾病、病症或病狀的可能性，或替代性地降低隨後發展的疾病或病症的嚴重程度。可以將治療劑投與給相對於一般群體而言發展疾病或病症的風險增加的受試者，以便預防疾病或病狀的發展或減輕疾病或病狀的嚴重程度。可以例如在疾病或病症的任何症狀或表現發展之前將治療劑作為預防劑投與。
如本文所用，短語「準螺旋結構」係環狀多核糖核苷酸的高階結構，其中環狀多核糖核苷酸的至少一部分折疊成螺旋結構。
如本文所用，短語「準雙股二級結構」係環狀多核糖核苷酸的高階結構，其中環狀多核糖核苷酸的至少一部分產生內部雙股。
如本文所用，術語「調控元件」係修飾環狀或線性多核糖核苷酸內表現序列的表現的部分，諸如核酸序列。
如本文所用，術語「重複核苷酸序列」係一段DNA或RNA內或整個基因組內的重複核酸序列。在一些實施方式中，重複核苷酸序列包括聚CA序列或聚TG（UG）序列。在一些實施方式中，重複核苷酸序列包括內含子Alu家族中的重複序列。
如本文所用，術語「複製元件」係可用於複製或起始環狀多核糖核苷酸轉錄的序列和/或模體。
如本文所用，術語受試者身體的「表面區域」意指受試者的暴露於或可能暴露於受試者身體外部環境的任何區域。受試者身體例如哺乳動物身體（例如人體）的表面區域可以包括皮膚，口腔、鼻腔、耳腔、胃腸道、呼吸道、陰道、宮頸、子宮內、泌尿道和眼睛的表面區域。在一些情況下，受試者身體的表面區域常常可以指上皮細胞排列在其下的外部區域。例如，皮膚可以是本文所討論的一種類型的表面區域，並且可以由表皮和真皮組成，前者形成皮膚的最外層並且可以包括上皮細胞在許多其他類型的細胞中的有組織的組裝。
如本文所用，術語「交錯元件」係在翻譯期間誘導核糖體暫停的部分，諸如核苷酸序列。在一些實施方式中，交錯元件係具有強α-螺旋傾向的胺基酸的非保守序列，然後是共有序列-D(V/I)ExNPG P，其中x = 任何胺基酸。在一些實施方式中，交錯元件可以包括化學部分，如甘油、非核酸連接部分、化學修飾、經修飾的核酸或其任何組合。
如本文所用，術語「基本上不含」係組成物、製劑或產物或其任何中間體中某一組分的水平低於誘導生物學、化學、物理和/或藥理學作用所需的水平。在一些實施方式中，如果某一組分的水平可檢測到痕量或該水平低於藉由相關檢測技術（例如層析法（使用柱、使用紙、使用凝膠、使用HPLC、使用UHPLC等，或藉由IC、藉由SEC、藉由反相、藉由陰離子交換、藉由混合模式等）或電泳（UREA PAGE、基於晶片、聚丙烯醯胺凝膠、RNA、毛細管、c-IEF等），用或不用分離前或分離後衍生化方法，使用基於質譜、紫外可見、螢光、光散射、折射率的檢測技術或使用銀或染料染色或放射性衰變以進行檢測的檢測技術可檢測到的水平，則組成物、製劑或產物基本上不含該組分。替代性地，可以在不使用分離技術的情況下藉由質譜法、藉由顯微鏡檢查、藉由圓二色（CD）光譜法、藉由UV或UV-可見分光光度法、藉由螢光測定法（例如Qubit）、藉由RNA酶H分析、藉由表面等離振子共振（SPR）或藉由利用銀或染料染色或放射性衰變進行檢測之方法）來確定組成物、製劑或產品是否基本不含某一組分。
如本文所用，術語「基本上對……有抗性」可以指相較於參考物對效應物具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%抗性的物質。
如本文所用，術語「滅菌劑」意指具有抑菌、殺菌和/或主動殺滅微生物，使微生物失活或防止微生物生長的任何試劑。殺滅微生物的滅菌劑可以是抗微生物的和/或抗菌的。在一些實施方式中，滅菌劑係液體，諸如醇、碘或過氧化氫。在一些實施方式中，滅菌劑係UV光或雷射。在一些實施方式中，滅菌劑藉由電學方式或藉由其他方式（例如，蒸氣、接觸）傳遞熱量。
如本文所用，術語「化學計量翻譯」係從環狀或線性多核糖核苷酸翻譯獲得的表現產物的基本上相等的產生。例如，對於具有兩個表現序列的環狀或線性多核糖核苷酸，環狀或線性多核糖核苷酸的化學計量翻譯意指兩個表現序列的表現產物可具有基本相等的量，例如兩個表現序列之間的量差（例如莫耳差）可以為約0，或小於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%或20%或之間的任何百分比。
如本文所用，術語「全身遞送」或「全身投與」意指將藥物組成物或其他物質投與到循環系統（例如血液或淋巴系統）中的途徑。全身投與可以包括口服投與、腸胃外投與、鼻內投與、舌下投與、直腸投與、透皮投與或其任何組合。如本文所用，術語「非全身性遞送」或「非全身性投與」可以指除藥物組成物或其他物質的全身性遞送以外的任何其他投與途徑，例如，所遞送的物質不進入受試者身體的循環系統（例如，血液和淋巴系統）。
如本文所用，術語「序列同一性」係藉由使用全域或局部比對演算法對兩個肽或兩個核苷酸序列進行比對來確定的。當序列（例如，藉由程式GAP或BESTFIT使用預設參數進行最佳比對時）至少具有某個最小百分比的序列同一性時，則可以將它們稱為「基本上相同」或「基本相似」。GAP使用Needleman和Wunsch全域比對演算法在兩個序列的整個長度上對其進行比對，從而最大程度地增加了匹配數目並最大程度地減少了空位數目。通常，使用GAP預設參數，空位產生罰分 = 50（核苷酸）/8（蛋白質），空位延伸罰分 = 3（核苷酸）/2（蛋白質）。對於核苷酸，使用的預設評分矩陣係nwsgapdna而對於蛋白質，使用的預設評分矩陣係Blosum62（Henikoff和Henikoff, 1992, PNAS [美國國家科學院院刊] 89, 915-919）。序列比對和百分比序列同一性的評分可以使用電腦程式來確定，諸如可從美國92121-3752加州聖地牙哥斯克蘭頓路9685號的阿賽樂德公司（Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA）獲得的GCG Wisconsin套裝軟體10.3版或EmbossWin 2.10.0版（使用程式「needle」）確定。替代性地或另外，可以藉由使用諸如FASTA、BLAST等的演算法對數據庫進行搜索來確定同一性百分比。序列同一性係指在序列的整個長度上的序列同一性。
「訊息序列」係指長度例如介於10至30個胺基酸之間的多肽序列，其存在於新生蛋白的多肽序列的N端，將多肽序列靶向分泌途徑。
如本文所用，術語「靶標」係指包括一個或多個表位的任何實體。例如，靶標可以是化學部分、分子的一部分、分子（例如，過敏原或毒素）、大分子（例如，多肽、核酸或碳水化合物）、大分子的翻譯後修飾狀態（例如，磷酸化、糖基化、醯化、烷基化等的大分子）、高階大分子結構（例如，兩個或多個多肽的複合物）、細胞（例如，癌細胞）、細胞的一部分（例如，腫瘤抗原）、細胞表面上的受體、病原體（例如，病毒或病毒的一部分；細菌或細菌的一部分；真菌或真菌的一部分；或寄生蟲或寄生蟲的一部分）或組織類型。
如本文所用，術語「治療」係指對受試者的疾病或病症（例如，感染性疾病、癌症、中毒或過敏反應）的治療性治療。治療的效果可以包括與沒有治療性治療的情況下，該疾病或病症的狀態和/或狀況相比，逆轉、減輕、降低疾病的嚴重程度，治癒疾病，抑制疾病的進展，降低該疾病、或疾病或病症的一種或多種症狀或表現的復發的可能性，穩定（即不惡化）疾病或病症的狀態，和/或預防疾病或病症的傳播。
如本文所用，術語「終止元件」係終止環狀或線性多核糖核苷酸中表現序列的翻譯的部分，諸如核酸序列。
如本文所用，術語「總核糖核苷酸分子」意指藉由核糖核苷酸分子的總質量所測量的任何核糖核苷酸分子的總量，包括線性多核糖核苷酸分子、環狀多核糖核苷酸分子、單體核糖核苷酸、其他多核糖核苷酸分子、其片段及其經修飾的變體。
如本文所用，術語「翻譯效率」係從核糖核苷酸轉錄物產生蛋白質或肽的速率或量。在一些實施方式中，翻譯效率可以表示為給定量的編碼蛋白質或肽的轉錄本產生的蛋白質或肽的量，例如在給定的時間段內，例如在給定的翻譯系統中，例如體外翻譯系統（像兔網狀紅血球裂解物）或體內翻譯系統（像真核細胞或原核細胞）。
如本文所用，術語「翻譯起始序列」係在環狀或線性多核糖核苷酸中起始表現序列的翻譯的核酸序列。
本揭露提供了編碼一種或多種多肽免疫原的環狀或線性多核糖核苷酸的組成物和藥物製劑及其用途。具體而言，本揭露提供了編碼多種免疫原的環狀或線性多核糖核苷酸和包括多個環狀或線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物。本揭露之特徵還在於包括一種或多種編碼一種或多種免疫原的環狀或線性多核糖核苷酸的藥物組成物和製劑。本文所述之環狀或線性多核糖核苷酸的組成物和藥物製劑在投與後可在受試者中誘導免疫反應。本文所述之環狀或線性多核糖核苷酸的組成物和藥物製劑可用於治療或預防受試者的疾病、病症或病狀。序列表
本申請包含序列表，該序列表已以ASCII格式電子提交，並藉由援引以其整體併入本文。創建於2021年5月18日的所述ASCII副本名稱為51509-024TW3_Sequence_Listing_05.18.21_ST25並且大小係41,145位元組。多核糖核苷酸
多核糖核苷酸除了包括如本文所述之一種或多種免疫原外，也包括如下所述之元件。在特定的實施方式中，多核糖核苷酸係環狀多核糖核苷酸。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）為至少約20個核苷酸、至少約30個核苷酸、至少約40個核苷酸、至少約50個核苷酸、至少約75個核苷酸、至少約100個核苷酸、至少約200個核苷酸、至少約300個核苷酸、至少約400個核苷酸、至少約500個核苷酸、至少約1,000個核苷酸、至少約2,000個核苷酸、至少約5,000個核苷酸、至少約6,000個核苷酸、至少約7,000個核苷酸、至少約8,000個核苷酸、至少約9,000個核苷酸、至少約10,000個核苷酸、至少約12,000個核苷酸、至少約14,000個核苷酸、至少約15,000個核苷酸、至少約16,000個核苷酸、至少約17,000個核苷酸、至少約18,000個核苷酸、至少約19,000個核苷酸或至少約20,000個核苷酸。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）可以具有足夠的大小以容納核糖體的結合位點。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的最大大小可以與產生環狀多核糖核苷酸和/或使用環狀多核糖核苷酸的技術限制內的一樣大。不受任何特定理論的束縛，有可能RNA的多個區段可以從DNA產生並且其5'游離末端和3'游離末端退火以產生一「串」RNA，當只留有一個5'游離末端和一個3'游離末端時，該「串」RNA最終可能會被環化。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的最大尺寸可能受包裝RNA並將其遞送至靶標的能力所限制。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的大小係足以編碼有用的多肽（諸如本揭露之免疫原或其表位）的長度，並且因此至少20,000個核苷酸、至少15,000個核苷酸、至少10,000個核苷酸、至少7,500個核苷酸或至少5,000個核苷酸、至少4,000個核苷酸、至少3,000個核苷酸、至少2,000個核苷酸、至少1,000個核苷酸、至少500個核苷酸、至少400個核苷酸、至少300個核苷酸、至少200個核苷酸、至少100個核苷酸、或至少70個核苷酸的長度可能是有用的。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的最大大小係足以編碼一種或多種免疫原（例如，兩種或更多種，三種或更多種，四重或更多種，以及五種或更多種）的長度。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的最大大小係足以編碼兩種至五種（例如三種、四種和五種）免疫原的長度。環狀多核糖核苷酸元件
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸除了包括編碼免疫原的序列之外，還包括如本文所述之一種或多種元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏聚A序列，缺乏游離的3’末端，缺乏RNA聚合酶識別模體，或它們的任何組合。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括如藉由援引整體併入本文的國際專利公開號WO 2019/118919中揭露的任何特徵或特徵的任何組合。免疫原
本文所述之環狀或線性多核糖核苷酸包括至少一個編碼免疫原的序列。免疫原包括被給定抗體或T細胞受體識別、靶向或結合的一個或多個表位。表位可以是線性表位，例如核酸或胺基酸的連續序列。表位可以是構象表位，例如，含有在蛋白質的折疊構象中形成表位的胺基酸的表位。構象表位可以含有來自一級胺基酸序列的非連續胺基酸。再如，構象表位包括基於其二級結構或三級結構在免疫原性序列的折疊構象中形成表位的核酸。
在一些實施方式中，免疫原包括蛋白質、肽、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、核糖核蛋白、碳水化合物（例如，多糖）、脂質（例如，磷脂或甘油三酸酯）或核酸（例如，DNA、RNA）的全部或一部分。
在其他實施方式中，免疫原包括蛋白質免疫原或表位（例如，來自蛋白質、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白或核糖核蛋白的肽免疫原或肽表位）。免疫原可以包括胺基酸、糖、脂質、磷醯基或磺醯基或其組合。
在特定實施方式中，免疫原係多肽免疫原。
多肽免疫原可以包括翻譯後修飾，例如糖基化、泛素化、磷酸化、亞硝基化、甲基化、乙醯化、醯胺化、羥基化、硫酸化或脂化。
在一些實施方式中，免疫原包括包含至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28個、至少29個或至少30個胺基酸或更多個胺基酸的表位。在一些實施方式中，表位包括或含有至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多21個、至多22個、至多23個、至多24個、至多25個、至多26個、至多27個、至多28個、至多29個或至多30個胺基酸或更少胺基酸。在一些實施方式中，表位包括或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸。在一些實施方式中，表位含有5個胺基酸。在一些實施方式中，表位含有6個胺基酸。在一些實施方式中，表位含有7個胺基酸。在一些實施方式中，表位含有8個胺基酸。在一些實施方式中，表位可以是約8至約11個胺基酸。在一些實施方式中，表位可以是約9至約22個胺基酸。
免疫原可以包括被B細胞識別的免疫原、被T細胞識別的免疫原或其組合。在一些實施方式中，免疫原包括被B細胞識別的免疫原。在一些實施方式中，免疫原係被B細胞識別的免疫原。在一些實施方式中，免疫原包括被T細胞識別的免疫原。在一些實施方式中，免疫原係被T細胞識別的免疫原。
表位可以包括被B細胞識別的表位，被T細胞識別的表位或其組合。在一些實施方式中，表位包括被B細胞識別的表位。在一些實施方式中，表位係被B細胞識別的表位。在一些實施方式中，表位包括被T細胞識別的表位。在一些實施方式中，表位係被T細胞識別的表位。
例如，用於經由電腦模擬鑒定免疫原和表位的技術例如在Sanchez-Trincado JL等人（Fundamentals and methods for T-and B-cell epitope prediction [T細胞和B細胞表位預測的基本原理和方法], J. Immunol. Res. [免疫學研究雜誌], 2017: 2680160. doi: 10.1155/2017/2680160 (2017)）；Grifoni, A等人（A Sequence Homology and Bioinformatic Approach Can Predict Candidate Targets for Immune Responses to SARS-CoV-2 [序列同源性和生物資訊學方法可以預測SARS-CoV-2免疫反應的候選靶點]）, Cell Host Microbe [細胞宿主微生物], 27 (4): 671-680 (2020)）；Russi RC等人（In silico prediction of epitopes recognized by T cells and B cells in PmpD: First step towards to the design of a Chlamydia trachomatis vaccine [PmpD中T細胞和B細胞識別的表位的電腦模擬預測：設計沙眼衣原體疫苗的第一步], Biomedical J. [生物醫學雜誌], 41 (2):109-117 (2018)）；Baruah V等人（Immunoinformatics‐aided identification of T cell and B cell epitopes in the surface glycoprotein of 2019‐nCoV [免疫資訊學輔助鑒定2019‐nCoV表面糖蛋白中的T細胞和B細胞表位], J. Med. Virol. [醫學病毒學雜誌], 92 (5), doi: 10.1002/jmv.25698 (2020)）中已經有描述；其每一者均藉由援引以其全文併入本文。
在一些實施方式中，免疫原包括多核苷酸。在一些實施方式中，免疫原係多核苷酸。在一些實施方式中，免疫原包括RNA。在一些實施方式中，免疫原係RNA。在一些實施方式中，免疫原包括DNA。在一些實施方式中，免疫原係DNA。在一些實施方式中，多核苷酸在環狀或線性多核糖核苷酸中編碼。
本揭露之環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼任何數量的免疫原。在特定實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少15種、至少20種、至少25種、至少30種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種、至少100種、至少120種、至少140種、至少160種、至少180種、至少200種、至少250種、至少300種、至少350種、至少400種、至少450種、至少500種或更多種免疫原。
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼例如至多1種、至多2種、至多3種、至多4種、至多5種、至多6種、至多7種、至多8種、至多9種、至多10種、至多15種、至多20種、至多25種、至多30種、至多40種、至多50種、至多60種、至多70種、至多80種、至多90種、至多100種、至多120種、至多140種、至多160種、至多180種、至多200種、至多250種、至多300種、至多350種、至多400種、至多450種、至多500種或更少的免疫原。
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500種免疫原。
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸編碼多種免疫原。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼1至100種免疫原。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼1至50種免疫原。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼1至10種免疫原；例如，環狀或線性多核糖核苷酸編碼1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種免疫原。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼2種免疫原。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼3種免疫原。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼4種免疫原。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼5種免疫原。
在一些實施方式中，該多種免疫原各自鑒別相同的靶標。換個說法，單個靶標可以包括該多種免疫原中的每一種，該多種免疫原中的每一種都可以源自同一靶標，和/或該多種免疫原中的每一種可以與一部分或整個靶標具有高度相似性。例如，靶標可以是細胞，並且每種免疫原可以對應於該細胞的蛋白質。例如，靶標可以是特定的癌細胞，並且每種免疫原可以對應於與該癌症相關的腫瘤抗原。因此，在一些實施方式中，該多種免疫原中的每一種均源自來自相同靶標的不同蛋白質。
在一些實施方式中，該多種免疫原源自不同靶標。在一些實施方式中，該多種免疫原可以源自給定病毒的各種衣殼蛋白。例如，一種免疫原可以源自正痘病毒（Orthopoxvirus），另一種免疫原可以源自嗜肝DNA病毒（Hepadnavirus），而第三免疫原可以源自黃病毒（Flavivirus）。例如，多核糖核苷酸可編碼多種免疫原，其中每種免疫原源自黃熱病病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒（Zika）、甲型肝炎或B型肝炎。多核糖核苷酸可編碼來自黃熱病病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、甲型肝炎和B型肝炎中的每一種的免疫原。多核糖核苷酸可編碼多種免疫原，其中每種免疫原源自日本腦炎（Japanese encephalitis）、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、甲型肝炎或B型肝炎。多核糖核苷酸可編碼來自日本腦炎、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、甲型肝炎或B型肝炎的每一種的免疫原。多核糖核苷酸可編碼多種免疫原，其中每種免疫原源自SARS-CoV2、痘病毒、呼吸道合胞病毒或人乳頭瘤病毒。多核糖核苷酸可編碼來自SARS-CoV2、痘病毒、呼吸道合胞病毒或人乳頭瘤病毒中的每一種的免疫原。多核糖核苷酸可編碼多種免疫原，其中每種免疫原源自皰疹病毒（CMV、EBV或VZV）。多核糖核苷酸可編碼來自以下每種皰疹病毒的免疫原：CMV、EBV或VZV。多核糖核苷酸可編碼多種免疫原，其中每種免疫原源自帶狀皰疹病毒（Singles）或西尼羅河病毒（West Nile Virus）。多核糖核苷酸可編碼來自帶狀皰疹病毒和西尼羅河病毒中的每一種的免疫原。
在一些實施方式中，由環狀多核糖核苷酸編碼的多種免疫原中的每一種具有小於90%的序列同一性。
免疫原來自例如病毒，諸如病毒表面蛋白、病毒膜蛋白、病毒包膜蛋白、病毒衣殼蛋白、病毒核衣殼蛋白、病毒刺突蛋白、病毒進入蛋白、病毒膜融合蛋白、病毒結構蛋白、病毒非結構蛋白、病毒調控蛋白、病毒輔助蛋白、分泌型病毒蛋白、病毒聚合酶蛋白、病毒DNA聚合酶、病毒RNA聚合酶、病毒蛋白酶、病毒糖蛋白、病毒融合蛋白、病毒螺旋衣殼蛋白、病毒二十面體衣殼蛋白、病毒基質蛋白、病毒複製酶、病毒轉錄因子或病毒酶。
在一些實施方式中，免疫原來自該等病毒之一：
正黏病毒（Orthomyxovirus）：有用的免疫原可以來自甲型、乙型或丙型流感病毒，諸如血凝素、神經胺酸酶或基質M2蛋白。在免疫原係甲型流感病毒血凝素的情況下，它可以來自任何亞型，例如HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。
副黏病毒科（Paramyxoviridae）病毒：病毒免疫原包括但不限於源自肺炎病毒（Pneumovirus）（例如呼吸道合胞病毒（RSV））、風疹病毒（Rubulavirus）（例如腮腺炎病毒）、副黏病毒（例如副流感病毒）、偏肺病毒（Metapneumovirus）和麻疹病毒（Morbillivirus）（例如麻疹病毒）、亨尼巴病毒（Henipavirus）（例如尼帕病毒（Nipah virus））。
痘病毒科（Poxviridae）：病毒免疫原包括但不限於源自正痘病毒的那些，正痘病毒例如天花（Variola vera），包括但不限於大天花（Variola major）和小天花（Variola minor）。
微小核糖核酸病毒（Picornavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自微小核糖核酸病毒的那些，微小核糖核酸病毒諸如腸病毒（Enterovirus）、鼻病毒（Rhinovirus）、嗜肝RNA病毒（Heparnavirus）、心臟病毒（Cardiovirus）和口蹄疫病毒（Aphthovirus）。在一個實施方式中，腸病毒係脊髓灰質炎病毒，例如1型、2型和/或3型脊髓灰質炎病毒。在另一個實施方式中，腸病毒係EV71腸病毒。在另一個實施方式中，腸病毒係柯薩奇病毒（coxsackie）A或B。
布尼亞病毒（Bunyavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自以下的那些：正布尼亞病毒（Orthobunyavirus），諸如加州腦炎病毒（California encephalitis virus）；白蛉病毒（Phlebovirus），諸如裂谷熱病毒（Rift Valley Fever virus）；或內羅病毒（Nairovirus），諸如克裡米亞-剛果出血熱病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus）。
嗜肝RNA病毒（Heparnavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自嗜肝RNA病毒，諸如甲型肝炎病毒（HAV）的那些。
絲狀病毒（Filovirus）：病毒免疫原包括但不限於源自絲狀病毒的那些，絲狀病毒諸如埃博拉病毒（Ebola virus）（包括薩伊（Zaire）、象牙海岸（Ivory Coast）、雷斯頓（Reston）或蘇丹（Sudan）埃博拉病毒）或瑪律堡病毒（Marburg virus）。
披膜病毒（Togavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自披膜病毒的那些，披膜病毒諸如風疹病毒（Rubivirus）、甲病毒（Alphavirus）或動脈炎病毒（Arterivirus）。這包括風疹病毒（rubella virus）。
黃病毒（Flavivirus）：病毒免疫原包括但不限於源自黃病毒的那些，黃病毒諸如蜱傳腦炎（TBE）病毒、登革熱（1、2、3或4型）病毒、黃熱病毒、日本腦炎病毒、科薩努爾森林病毒（Kyasanur Forest Virus）、西尼羅河腦炎病毒（West Nile encephalitis virus）、聖路易斯腦炎病毒（St. Louis encephalitis virus）、俄羅斯春夏腦炎病毒（Russian spring-summer encephalitis virus）、波瓦生腦炎病毒（Powassan encephalitis virus）、寨卡病毒。
瘟病毒（Pestivirus）：病毒免疫原包括但不限於源自瘟病毒的那些，瘟病毒諸如牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、經典豬瘟病毒（CSFV）或邊界病病毒（BDV）。
嗜肝DNA病毒：病毒免疫原包括但不限於源自嗜肝DNA病毒，諸如B型肝炎病毒的那些。B型肝炎病毒免疫原可以是B型肝炎病毒表面免疫原（HBsAg）。
其他肝炎病毒：病毒免疫原包括但不限於源自C型肝炎病毒、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒或G型肝炎病毒的那些。
彈狀病毒（Rhabdovirus）：病毒免疫原包括但不限於源自彈狀病毒，諸如狂犬病病毒（Lyssavirus）{例如狂犬病毒（Rabies virus））和水皰病毒（Vesiculovirus，VSV）的那些。
杯狀病毒科（Caliciviridae）：病毒免疫原包括但不限於源自杯狀病毒科的那些，杯狀病毒科諸如諾沃克病毒（Norwalk virus）（諾如病毒（Norovirus））和諾沃克樣病毒（諸如夏威夷病毒（Hawaii Virus）和雪山病毒（Snow Mountain Virus））。
逆轉錄病毒（Retrovirus）：病毒免疫原包括但不限於源自腫瘤病毒（Oncovirus）、慢病毒（Lentivirus）（例如HIV-1或HIV-2）或泡沫病毒（Spumavirus）的那些。
呼腸孤病毒（Reovirus）：病毒免疫原包括但不限於源自正呼腸孤病毒（Orthoreovirus）、輪狀病毒（Rotavirus）、環狀病毒（Orbivirus）或科蜱病毒（Coltivirus）的那些。
細小病毒（Parvovirus）：病毒免疫原包括但不限於源自細小病毒B19的那些。
博卡病毒（Bocavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自博卡病毒的那些。
皰疹病毒（Herpesvirus）：病毒免疫原包括但不限於源自人皰疹病毒的那些，僅舉例而言，人皰疹病毒諸如單純皰疹病毒（HSV）（例如HSV 1型和2型）、水痘帶狀皰疹病毒（VZV）、愛潑斯坦-巴爾病毒（EBV）、巨細胞病毒（CMV）、人皰疹病毒6（HHV6）、人皰疹病毒7（HHV7）和人皰疹病毒8（HHV8）。
乳多空病毒（Papovavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自乳頭瘤病毒（Papillomavirus）和多瘤病毒（Polyomavirus）的那些。（人）乳頭瘤病毒可以是血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63或65，例如來自血清型6、11、16和/或18中的一種或多種。
正漢坦病毒（Orthohantavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自漢坦病毒（hantavirus）的那些。
沙粒病毒（Arenavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自瓜納裡托病毒（Guanarito virus）、胡寧病毒（Junin virus）、拉薩病毒（Lassa virus）、盧約病毒（Lujo virus）、馬丘波病毒（Machupo virus）、薩比亞病毒（Sabia virus）或白水河病毒（Whitewater Arroyo virus）的那些。
腺病毒（Adenovirus）：病毒免疫原包括源自腺病毒血清型36（Ad-36）的那些。
社區獲得性呼吸道病毒：病毒免疫原包括源自社區獲得性呼吸道病毒的那些。
冠狀病毒（Coronavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自SARS冠狀病毒（例如，SARS-CoV-1和SARS-CoV-2）、MERS冠狀病毒、禽傳染性支氣管炎（IBV）、小鼠肝炎病毒（MHV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的那些。冠狀病毒免疫原可以是刺突多肽或係刺突蛋白的受體結合結構域（RBD）。冠狀病毒免疫原也可以是包膜多肽、膜多肽或核衣殼多肽。
在一些實施方式中，免疫原來自感染魚類的病毒。在一些實施方式中，免疫原引發針對感染魚類的病毒的免疫反應。例如，感染魚類的病毒選自傳染性鮭魚貧血病毒（ISAV）、鮭魚胰腺疾病病毒（SPDV）、感染性胰腺壞死病毒（IPNV）、斑點叉尾鮰病毒（CCV）、魚淋巴囊腫病病毒（FLDV）、傳染性造血組織壞死症病毒（IHNV）、錦鯉皰疹病毒、鮭魚小核糖核酸樣病毒（也稱為大西洋鮭小核糖核酸樣病毒）、陸封鮭病毒（LSV）、大西洋鮭輪狀病毒（ASR）、鱒魚草莓病病毒（TSD）、銀鮭腫瘤病毒（CSTV）或病毒性出血性敗血症病毒（VHSV）。
在一些實施方式中，免疫原來自宿主受試者細胞。例如，可以藉由使用來自病毒用作進入因子的宿主細胞組分的免疫原或表位來產生阻斷病毒進入的抗體。
免疫原來自例如細菌，諸如細菌表面蛋白、細菌膜蛋白、細菌包膜蛋白、細菌內膜蛋白、細菌外膜蛋白、細菌周質蛋白、細菌進入蛋白、細菌膜融合蛋白、細菌結構蛋白、細菌非結構蛋白、分泌型細菌蛋白、細菌聚合酶蛋白、細菌DNA聚合酶、細菌RNA聚合酶、細菌蛋白酶、細菌糖蛋白、細菌轉錄因子、細菌酶或細菌毒素。
在一些實施方式中，免疫原引發來自該等細菌之一的免疫反應：無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae ）（也稱為B族鏈球菌或GBS）；化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes ）（也稱為A族鏈球菌（GAS））；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）；表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermis ）；梅毒螺旋體（Treponema pallidum ）；土拉法蘭西斯菌（Francisella tularensis ）；立克次氏體物種（Rickettsia species）；鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis ）；腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis ）：免疫原包括但不限於膜蛋白，諸如黏附素、自主運輸蛋白、毒素、鐵獲取蛋白和因子H結合蛋白；肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae ）；卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis ）；百日咳博多特氏菌（Bordetella pertussis ）：免疫原包括但不限於百日咳毒素或類毒素（PT）、絲狀血凝素（FHA）、百日咳桿菌黏附素及凝集素2和3；破傷風梭菌（Clostridium tetani）：典型的免疫原係破傷風類毒素；白喉棒狀桿菌（Cornynebacterium diphtheriae ）：典型的免疫原係白喉類毒素；流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae ）；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ）；沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis）；肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae）；幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）；大腸桿菌（Escherichia coli）（免疫原包括但不限於源自產腸毒素的大腸桿菌（ETEC）、腸聚集性大腸桿菌（EAggEC）、彌漫性黏附大腸桿菌（DAEC）、腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）和/或腸出血性大腸桿菌（EHEC）的免疫原）。ExPEC菌株包括尿道致病性大腸桿菌（UPEC）和腦膜炎/敗血症相關大腸桿菌（MNEC）。還包括炭疽桿菌（Bacillus anthracis ）；產氣莢膜梭狀芽孢桿菌（Clostridium perfringens）或肉毒梭狀芽孢桿菌（Clostridium botulinums ）；嗜肺軍團菌（Legionella pneumophila ）；伯納特柯克斯體（Coxiella burnetiid ）；布魯氏菌屬（Brucella ）的種，諸如流產布魯氏菌（B. abortus ）、犬布魯氏菌（B. canis ）、羊布魯氏菌（B. melitensis ）、木鼠布魯氏菌（B. neotomae ）、綿羊布魯氏菌（B. ovis ）、豬布魯氏菌（B. suis ）和鰭型布魯氏菌（B. pinnipediae ）。法蘭西斯菌屬（Francisella ）的種，諸如新兇手法蘭西斯菌（F. novicida ）、哲氏法蘭西斯菌（F. philomiragia ）和土拉法蘭西斯菌（F. tularensis ）；淋病奈瑟球菌（Neisseria gonorrhoeae ）；杜克雷嗜血桿菌（Haemophilus ducreyi ）；糞腸球菌（Enterococcus faecalis ）或屎腸球菌（Enterococcus faecium ）；腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus ）；小腸結腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica ）；結核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis ）；單核細胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes ）；霍亂弧菌（Vibrio cholerae ）；傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi ）；博氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi ）；牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis ）；和克雷白桿菌屬（Klebsiella）的種。
免疫原來自例如真菌，諸如真菌表面蛋白、真菌膜蛋白、真菌包膜蛋白、真菌內膜蛋白、真菌外膜蛋白、真菌周質蛋白、真菌進入蛋白、真菌膜融合蛋白、真菌結構蛋白、真菌非結構蛋白、分泌型真菌蛋白、真菌聚合酶蛋白、真菌DNA聚合酶、真菌RNA聚合酶、真菌蛋白酶、真菌糖蛋白、真菌轉錄因子、真菌酶或真菌毒素。
在一些實施方式中，真菌免疫原源自皮膚癬菌（Dermatophyte），包括：絮狀表皮癬菌（Epidermophyton floccusum ）、頭癬小孢黴（Microsporum audouini ）、犬小孢黴（Microsporum canis ）、畸變小孢黴（Microsporum distortum ）、馬小孢黴（Microsporum equinum ）、石膏樣小孢黴（Microsporum gypsum ）、奈米小孢黴（Microsporum nanum ）、疊瓦毛癬菌（Trichophyton concentricum ）、馬毛癬菌（Trichophyton equinum ）、雞毛癬菌（Trichophyton gallinae ）、石膏樣毛癬菌（Trichophyton gypseum ）、麥格尼毛癬菌（Trichophyton megnini ）、須毛癬菌（Trichophyton mentagrophytes ）、發瘤發癬菌（Trichophyton quinckeanum ）、紅色毛癬菌（Trichophyton rubrum ）、許蘭毛癬菌（Trichophyton schoenleini ）、斷發毛癬菌（Trichophyton tonsurans ）、疣狀毛癬菌（Trichophyton verrucosum ）、疣狀毛癬菌白色變種（T. verrucosum var. album ）、盤狀變種（var. discoides ）、赫色變種（var. ochraceum ）、紫色毛癬菌（Trichophyton violaceum ）和/或蜜塊狀毛癬菌（Trichophyton faviforme ）；或來自於煙麯黴（Aspergillus fumigatus ）、黃麴黴（Aspergillus flavus ）、黑麯黴（Aspergillus niger ）、構巢麯黴（Aspergillus nidulans ）、土麯黴（Aspergillus terreus ）、薩氏麯黴（Aspergillus sydowi ）、黃麴黴菌（Aspergillus flavatus ）、灰綠麯黴（Aspergillus glaucus ）、芽生裂殖菌（Blastoschizomyces capitatus ）、白色念珠菌（Candida albicans ）、烯醇化酶念珠菌（Candida enolase ）、熱帶念珠菌（Candida tropicalis ）、光滑念珠菌（Candida glabrata ）、克魯斯念珠菌（Candida krusei ）、近平滑念珠菌（Candida parapsilosis ）、類星形念珠菌（Candida stellatoidea ）、克魯斯念珠菌（Candida kusei ）、帕拉克斯念珠菌（Candida parakwsei ）、葡萄牙念珠菌（Candida lusitaniae ）、偽熱帶念珠菌（Candida pseudotropicalis ）、季也蒙念珠菌（Candida guilliermondi ）、卡氏枝孢黴（Cladosporium carrionii ）、粗球孢子菌（Coccidioides immitis ）、皮炎芽生菌（Blastomyces dermatidis ）、新型隱球菌（Cryptococcus neoformans ）、棒地黴（Geotrichum clavatum ）、莢膜組織胞漿菌（Histoplasma capsulatum ）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae ）、微孢子目（Microsporidia ）、腦胞內原蟲屬種（Encephalitozoon spp. ）、腸間隔微孢子蟲（Septata intestinalis ）和畢氏腸微孢子蟲（Enterocytozoon bieneusi ）；不太常見的是小孢子蟲屬種（Brachiola spp ）、微孢子蟲屬種（Microsporidium spp. ）、微粒子蟲屬種（Nosema spp. ）、匹裡蟲屬種（Pleistophora spp. ）、氣管普孢蟲屬種（Trachipleistophora spp. ）、條孢蟲屬種（Vittaforma spp ）、 巴西副球孢子菌（ Paracoccidioides brasiliensis ）、卡氏肺孢子蟲（Pneumocystis carinii ）、隱襲腐黴（Pythiumn insidiosum ）、皮屑芽孢菌（Pityrosporum ovale ）、釀酒酵母（Sacharomyces cerevisae ）、布拉氏酵母（Saccharomyces boulardii ）、粟酒裂殖酵母（Saccharomyces pombe ）、尖端賽多孢子菌（Scedosporium apiosperum ）、申克孢子絲菌（Sporothrix schenckii ）、白吉利毛孢子菌（Trichosporon beigelii ）、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii ）、瑪律尼菲青黴（Penicillium marneffei ）、馬拉色菌屬種（Malassezia spp. ）、著色真菌屬種（Fonsecaea spp. ）、萬氏黴菌屬種（Wangiella spp. ）、孢子絲菌屬種（Sporothrix spp. ）、蛙糞黴屬種（Basidiobolus spp. ）、耳黴屬種（Conidiobolus spp. ）、根黴屬種（Rhizopus spp ）、毛黴菌屬種（Mucor spp ）、犁頭黴屬種（Absidia spp ）、被孢黴屬種（Mortierella spp ）、小克銀漢黴屬種（Cunninghamella spp ）、瓶黴屬種（Saksenaea spp. ）、鏈格孢屬種（Alternaria spp ）、彎孢黴屬種（Curvularia spp ）、長蠕孢屬種（Helminthosporium spp ）、鐮刀菌屬種（Fusarium spp ）、麯黴屬種（Aspergillus spp ）、青黴屬種（Penicillium spp ）、鏈核盤菌屬種（Monolinia spp ）、絲核菌屬種（Rhizoctonia spp ）、擬青黴屬種（Paecilomyces spp ）、皮司黴屬種（Pithomyces spp ）和枝孢屬種（Cladosporium spp ）。
免疫原來自例如真核寄生蟲表面蛋白、真核寄生蟲膜蛋白、真核寄生蟲包膜蛋白、真核寄生蟲進入蛋白、真核寄生蟲膜融合蛋白、真核寄生蟲結構蛋白、真核寄生蟲非結構蛋白、分泌型真核寄生蟲蛋白、真核寄生蟲聚合酶蛋白、真核寄生蟲DNA聚合酶、真核寄生蟲RNA聚合酶、真核寄生蟲蛋白酶、真核寄生蟲糖蛋白、真核寄生蟲轉錄因子、真核寄生蟲酶或真核寄生蟲毒素。
在一些實施方式中，免疫原引發針對來自瘧原蟲屬（Plasmodium）的寄生蟲諸如惡性瘧原蟲（P. falciparum ）、間日瘧原蟲（P. vivax ）、三日瘧原蟲（P. malariae ）或卵形瘧原蟲（P. ovale ）的免疫反應。在一些實施方式中，免疫原引發針對來自魚虱科（Caligidae）的寄生蟲，特別是來自瘡痂魚虱屬（Lepeophtheirus）和魚虱屬（Caligus）屬的那些寄生蟲，例如海虱，諸如鮭瘡痂魚虱（Lepeophtheirus salmonis ）或大馬哈魚虱（Caligus rogercresseyi ）的免疫反應。在一些實施方式中，免疫原引發針對寄生蟲剛地弓形蟲的免疫反應。
在一些實施方式中，免疫原係癌症免疫原（例如，新表位）。例如，免疫原係與以下相關的新抗原和/或新表位：急性白血病、星形細胞瘤、膽道癌（膽管癌）、骨癌、乳腺癌、腦幹神經膠質瘤、細支氣管肺泡細胞肺癌、腎上腺癌、肛區癌、膀胱癌、內分泌系統癌、食道癌、頭或頸癌、腎癌、副甲狀腺癌、陰莖癌、胸膜/腹膜癌、唾液腺癌、小腸癌、甲狀腺癌、輸尿管癌、尿道癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、輸卵管癌、腎盂癌、陰道癌、外陰癌、宮頸癌、慢性白血病、大腸癌、結直腸癌、皮膚黑色素瘤、室管膜瘤、表皮樣腫瘤、尤因氏肉瘤（Ewings sarcoma）、胃癌、成膠質細胞瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、血液系統惡性腫瘤、肝細胞癌（肝癌）、肝細胞瘤，霍奇金病（Hodgkin's Disease）、眼內黑色素瘤、卡波西氏肉瘤（Kaposi sarcoma）、肺癌、淋巴瘤、成神經管細胞瘤（medulloblastoma）、黑色素瘤、腦膜瘤、間皮瘤、多發性骨髓瘤、肌肉癌、中樞神經系統（CNS）贅生物、神經元癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、小兒惡性腫瘤、垂體腺瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞癌、軟組織肉瘤、神經鞘瘤、皮膚癌、脊柱腫瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、子宮癌或腫瘤及其轉移癌，包括上述任何癌症的難治性形式或其任何組合。
在一些實施方式中，免疫原係選自以下的腫瘤抗原：(a) 睾丸癌抗原，諸如NY-ESO-1、SSX2、SCP1以及RAGE、BAGE、GAGE和MAGE家族的多肽，例如GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12（該等可用於例如處理黑色素瘤、肺部、頭頸、NSCLC、乳腺、胃腸道和膀胱腫瘤；(b) 突變的抗原，例如p53（與各種實性瘤相關，例如結直腸癌、肺癌、頭頸癌）、p21/Ras（與例如黑色素瘤、胰臟癌和結直腸癌相關）、CDK4（與例如黑色素瘤相關）、MUMl（與例如黑色素瘤相關）、半胱天冬酶-8（與例如頭頸癌相關）、CIA 0205（與例如膀胱癌相關）、HLA-A2-R1701、β連環蛋白（與例如黑色素瘤相關）、TCR（與例如T細胞非何杰金氏淋巴瘤相關）、BCR-abl（與例如慢性髓細胞性白血病相關）、磷酸丙糖異構酶、KIA 0205、CDC-27和LDLR-FUT；(c) 過表現的抗原，例如半乳凝素4（與例如結直腸癌相關）、半乳凝素9（與例如霍奇金病相關）、蛋白酶3（與例如慢性髓細胞性白血病相關）、WT 1（與例如各種白血病相關）、碳酸酐酶（與例如腎癌相關）、醛縮酶A（與例如肺癌相關）、PRAME（與例如黑色素瘤相關）、HER-2/neu（與例如乳腺癌、大腸癌、肺癌和卵巢癌相關）、乳腺珠蛋白、甲胎蛋白（與例如肝細胞瘤相關）、KSA（與例如結直腸癌相關）、胃泌素（與例如胰臟癌和胃癌相關）、端粒酶催化蛋白、MUC-1（與例如乳腺癌和卵巢癌相關）、G-250（與例如腎細胞癌相關）、p53（與例如乳腺癌、大腸癌相關）和癌胚抗原（與例如乳腺癌、肺癌和胃腸道癌諸如結直腸癌相關）；(d) 共有抗原，例如黑色素瘤-黑色素細胞分化抗原，諸如MART-1/黑色素A、gplOO、MC1R、促黑色素細胞激素受體（melanocyte-stimulating hormone receptor）、酪胺酸酶、酪胺酸酶相關蛋白-1/TRP1和酪胺酸酶相關蛋白-2/TRP2（與例如黑色素瘤相關）；(e) 與例如前列腺癌相關的前列腺相關抗原，諸如PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2；(f) 免疫球蛋白獨特型（例如，與骨髓瘤和B細胞淋巴瘤相關）；(g) 新抗原。在某些實施方式中，腫瘤免疫原包括但不限於pi 5、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、愛潑斯坦巴爾病毒抗原、EBNA、人乳頭瘤病毒（HPV）抗原（包括E6和E7）、B型肝炎和C型肝炎病毒抗原、人T細胞淋巴病毒抗原、TSP-180、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、mn-23Hl、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、pl6、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791 Tgp72、beta-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3 (CA 27.29YBCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733 (EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90（Mac-2結合蛋白親環蛋白C相關蛋白）、TAAL6、TAG72、TLP、TPS等。
在一些實施方式中，免疫原引發針對以下物質的免疫反應：花粉過敏原（樹木、草本植物、野草和禾木科植物花粉過敏原）；昆蟲或蜘蛛綱過敏原（吸入物、唾液和毒液過敏原，例如蟎過敏原、蟑螂和蚊蟲過敏原、膜翅目毒液過敏原）；動物毛髮和頭皮屑過敏原（來自於例如狗、貓、馬、大鼠、小鼠等）；以及食物過敏原（例如麥醇溶蛋白）。來自樹木、禾本科植物和草本植物的重要花粉過敏原係源於以下的此類過敏原：分類的殼鬥目（Fagales）、木犀目（Oleales）、松目（Pinales）和懸鈴木科（platanaceae），包括但不限於樺樹（樺屬（Betula））、榿木（榿木屬（Alnus））、榛樹（榛屬（Corylus））、角樹（鵝耳櫪屬（Carpinus））和橄欖（洋橄欖屬（Olea））、雪松（柳杉屬（Cryptomeria）和檜屬（Juniperus））、法國梧桐（懸鈴木屬（Platanus））；禾本目（Poales），包括黑麥草屬（Lolium）、梯牧草屬（Phleum）、早熟禾屬（Poa）、狗牙根屬（Cynodon）、鴨茅屬（Dactylis）、絨毛草屬（Holcus）、虉草屬（Phalaris）、黑麥屬（Secale）和高粱屬（Sorghum）的禾本科植物；菊目（Asterales）和蕁麻目（Urticales），包括豕草屬（Ambrosia）、蒿屬（Artemisia）和牆草屬（Parietaria）的草本植物。其他重要的吸入性過敏原係來自塵蟎屬（Dermatophagoides）和嗜黴蟎屬（Euroglyphus）的屋塵蟎、貯藏蟎（例如嗜鱗蟎屬（Lepidoglyphys）、食甜蟎屬（Glycyphagus）和食酪蟎屬（Tyrophagus））的那些過敏原；來自蟑螂、蚊蟲和跳蚤，例如如小蠊屬（Blatella）、大蠊屬（Periplaneta）、搖蚊屬（Chironomus）和蚤屬（Ctenocepphalides）的那些過敏原；以及來自哺乳動物諸如貓、狗和馬的那些過敏原；毒液過敏原，包括源於叮或咬的昆蟲的此類過敏原，該等昆蟲諸如來自分類的膜翅目的那些，包括蜜蜂（蜜蜂科（Apidae））、黃蜂（胡蜂科（Vespidea））和螞蟻（蟻科（Formicoidae））。
在一些實施方式中，免疫原源自例如毒液中的毒素，諸如來自以下的毒液：蛇（例如，大多數響尾蛇的種（例如，東菱斑響尾蛇）、褐蛇的種（例如，褐蛇王和東部褐蛇）、盧氏蝰蛇（russel’s viper）、眼鏡蛇（例如，印度眼鏡蛇、眼鏡王蛇）、金環蛇的某些種（例如，普通金環蛇）、樹眼鏡蛇（例如，黑色樹眼鏡蛇）、鋸鱗蝰、非洲樹蛇、杜布瓦海蛇、太攀蛇的種（例如，海岸太攀蛇和內陸太攀蛇）、銳蝮蛇的種（例如矛頭蛇和三色矛頭蝮）、巨蝮、銅頭蛇、棉口蛇、珊瑚蛇、死亡蛇、貝爾徹海蛇（Belcher’s sea snake）、虎蛇、澳大利亞黑蛇）、蜘蛛（例如，褐皮花蛛、黑寡婦毒蛛、巴西流浪蜘蛛、漏斗網蜘蛛、紐扣蜘蛛、澳大利亞赤背蜘蛛、卡提波蜘蛛、假黑寡婦蜘蛛、智利隱士蜘蛛、鼠蜘、粒突蛛屬（Macrothele）的種、竹蟶屬（Sicarius）的種、Hexpthalma屬種、狼蛛（tarantulas）的某些種）、蠍子和其他蛛形綱動物（例如，肥尾蠍、以色列金蠍（deathstalker scorpion）、印度紅蠍、刺尾蠍屬（Centruroides）的種、鉗蠍屬（Tityus）的種，諸如巴西黃蠍）、昆蟲（例如，蜜蜂的種、黃蜂的種、某些螞蟻（諸如火蟻）、一些鱗翅目毛蟲的種、某些蜈蚣的種、槳足蟲圖倫冥府蝦（Xibalbanus tulumensis））、魚類（例如某些鯰魚的種（例如，條紋鰻鯰和其他鰻鯰）、某些黃貂魚的種類（例如，藍斑黃貂魚）、蓑鮋、石魚、蠍子魚、蟾魚、鯖帶魚、虎鮋、帆鰭鮋（cockatoo waspfish）、斑馬鳚（striped blenny）、瞻星魚（stargazer）、銀鮫（chimaera）、鱸魚（weever）、狗鯊（dogfish shark））、刺胞動物（例如水母的某些種（例如伊魯康吉水母（Irukanjdi jellyfish）和箱型水母（box jellyfish））、水螅蟲類（例如，葡萄牙戰艦（Portuguese Man o’War））、海葵、珊瑚的某些種）、蜥蜴（例如，吉拉毒蜥、墨西哥須蜥、巨蜥屬（Varanus）的某些種（例如，科莫多巨蜥（科莫多巨蜥））、眼斑巨蜥和樹巨蜥）、哺乳動物（例如，南部短尾鼩、鴨嘴獸、歐鼴鼠、歐亞水鼩、地中海水鼩、北部短尾鼩、埃利奧特短尾鼩（Elliot’s short-tailed shrew）、溝齒鼩的某些種（例如古巴溝齒鼩（Cuban solenodon）、海地溝齒鼩（Hispaniolan solenodon））、懶猴（slow loiris））、軟體動物（例如，雞心螺的某些種）、頭足類動物（例如，章魚的某些種（例如，藍圈章魚）、魷魚和烏賊）、兩棲動物（例如，青蛙，諸如箭毒蛙、布魯諾盔頭蛙（Bruno’s casque-headed frog）、綠蛙（Greening’s frog）、蠑螈（例如火蠑螈、伊比利亞有肋蠑螈（Iberian ribbed newt））。
在一些實施方式中，毒素來自植物或真菌（例如蘑菇）。
在一些實施方式中，毒素免疫原源自毒素，諸如藍藻毒素（cyanotoxin）、二甲毒素（dinotoxin）、肌肉毒素、細胞毒素（例如，蓖麻毒蛋白、蜂毒（apitoxin）、黴菌毒素（mycotoxin）（例如，黃麴黴毒素（aflatoxin））、赭麯黴毒素（ochratoxin）、桔青黴素（citrinin）、麥角生物鹼、棒麯黴毒素（patulin）、鐮刀菌（fusarium）毒素、伏馬菌素（fumonisin）、單端孢黴烯（trichothecene）、心臟毒素（cardiotoxin））、河豚毒素（tetrodotoxin）、箭毒蛙毒素（batrachotoxin）、肉毒桿菌毒素A、破傷風毒素A、白喉毒素、二㗁𠯤（dioxin）、毒蕈鹼、蟾蜍毒素（bufortoxin）、沙林（sarin）、溶血毒素（hemotoxin）、光毒素（phototoxin）、壞死毒素（necrotoxin）、腎毒素（nephrotoxin）和神經毒素（neurotoxin）（例如，鈣蛇毒（calciseptine）、眼鏡蛇毒蛋白（cobrotoxin）、鈣阻蛋白（calcicludine）、筒箭毒-I（fasciculin-I）、鈣利毒素（calliotoxin））。
來自多種微生物或癌症的免疫原可以用於環狀或線性多核糖核苷酸中。在一些情況下，免疫原與以上揭露的一種微生物相關或由其表現。在一些實施方式中，免疫原與以上揭露的兩種或更多種微生物相關或由其表現。在一些情況下，免疫原與以上揭露的一種癌症相關或由其表現。在一些實施方式中，免疫原與以上揭露的兩種或更多種癌症相關或由其表現。在一些實施方式中，免疫原源自如以上揭露的毒素。在一些實施方式中，免疫原來自以上揭露的兩種或更多種毒素。
這兩種或更多種微生物係有關的或無關的。在一些情況下，兩種或多種微生物在系統發育上有關。例如，本揭露之環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼來自兩種或更多種病毒、病毒科的兩個或更多個成員、病毒綱的兩個或更多個成員、病毒目的兩個或更多個成員、病毒屬的兩個或更多個成員、病毒種的兩個或更多個成員、兩種或更多種細菌病原體的免疫原。在一些實施方式中，兩種或多種微生物在系統發育上無關。
在一些情況下，兩種或多種微生物在表現上有關。例如，本揭露之環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼來自兩種或更多種呼吸道病原體、兩種或更多種選擇劑、兩種或更多種與嚴重疾病相關的微生物、兩種或更多種與免疫受損受試者中的不良結果相關的微生物、兩種或更多種與和妊娠有關的不良後果相關的微生物、兩種或多種與出血熱相關的微生物的免疫原。
本揭露之免疫原可以包括野生型序列。當描述免疫原時，術語「野生型」係指天然存在的且由基因組（例如，病毒基因組）編碼的序列（例如，核酸序列或胺基酸序列）。一個物種（例如，微生物物種）可以具有一個野生型序列，或者具有兩個或更多個野生型序列（例如，在參考微生物基因組中存在一個規範的野生型序列，並且存在由突變產生的其他變體的野生型序列）。
當描述免疫原時，術語「衍生物」和「源自」係指與野生型序列的不同之處在於一個或多個核酸或胺基酸，例如相對於野生型序列含有一個或多個核酸或胺基酸插入、缺失和/或取代的序列（例如，核酸序列或胺基酸序列）。
免疫原衍生物序列係與野生型序列（例如，野生型核酸、蛋白質、免疫原或表位序列）具有至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的序列。
在一些實施方式中，免疫原含有影響所編碼的蛋白質的結構的一個或多個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。在一些實施方式中，免疫原含有影響所編碼的蛋白質的功能的一個或多個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。在一些實施方式中，免疫原含有影響細胞對所編碼的蛋白質的表現或加工的一個或多個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。
在一些實施方式中，免疫原含有影響所編碼的免疫原性核酸的結構的一個或多個核酸插入、缺失、取代或其組合。
胺基酸的插入、缺失、取代或其組合可以引入翻譯後修飾的位點（例如，引入糖基化、泛素化、磷酸化、亞硝基化、甲基化、乙醯化、醯胺化、羥基化、硫酸化或脂質化位點，或靶向進行裂解的序列）。在一些實施方式中，胺基酸的插入、缺失、取代或其組合去除翻譯後修飾的位點（例如，去除糖基化、泛素化、磷酸化、亞硝基化、甲基化、乙醯化、醯胺化、羥基化、硫酸化或脂質化位點，或靶向進行裂解的序列）。在一些實施方式中，胺基酸的插入、缺失、取代或其組合修飾翻譯後修飾的位點（例如，修飾位點以改變糖基化、泛素化、磷酸化、亞硝基化、甲基化、乙醯化、醯胺化、羥基化、硫酸化或脂質化位點，或裂解的效率或特徵）。
胺基酸取代可以是保守性或非保守性取代。保守性胺基酸取代可以是一個胺基酸被具有類似生物化學性質（例如，電荷、大小和/或疏水性）的另一胺基酸取代。非保守性胺基酸取代可以是一個胺基酸被具有不同生物化學性質（例如，電荷、大小和/或疏水性）的另一胺基酸取代。保守性胺基酸變化可以是例如對多肽的二級或三級結構影響最小的取代。保守性胺基酸變化可以是從一種親水性胺基酸到另一種親水性胺基酸的胺基酸變化。親水性胺基酸可以包括Thr（T）、Ser（S）、His（H）、Glu（E）、Asn（N）、Gln（Q）、Asp（D）、Lys（K）和Arg（R）。保守性胺基酸變化可以是從一種疏水性胺基酸到另一種親水性胺基酸的胺基酸變化。疏水性胺基酸可以包括Ile（I）、Phe（F）、Val（V）、Leu（L）、Trp（W）、Met（M）、Ala（A）、Gly（G）、Tyr（Y）和Pro（P）。保守性胺基酸變化可以是從一種酸性胺基酸到另一種酸性胺基酸的胺基酸變化。酸性胺基酸可以包括Glu（E）和Asp（D）。保守性胺基酸變化可以是從一種鹼性胺基酸到另一種鹼性胺基酸的胺基酸變化。鹼性胺基酸可以包括His（H）、Arg（R）和Lys（K）。保守性胺基酸變化可以是從一種極性胺基酸到另一種極性胺基酸的胺基酸變化。極性胺基酸可以包括Asn（N）、Gln（Q）、Ser（S）和Thr（T）。保守性胺基酸變化可以是從一種非極性胺基酸到另一種非極性胺基酸的胺基酸變化。非極性胺基酸可以包括Leu（L）、Val（V）、Ile（I）、Met（M）、Gly（G）和Ala（A）。保守性胺基酸變化可以是從一種芳族胺基酸到另一種芳族胺基酸的胺基酸變化。芳族胺基酸可以包括Phe（F）、Tyr（Y）和Trp（W）。保守性胺基酸變化可以是從一種脂族胺基酸到另一種脂族胺基酸的胺基酸變化。脂族胺基酸可以包括Ala（A）、Val（V）、Leu（L）和Ile（I）。在一些實施方式中，保守性胺基酸取代係以下各類之一的一個胺基酸到另一胺基酸的胺基酸變化：I類：ala、pro、gly、gln、asn、ser、thr；II類：cys、ser、tyr、thr；III類：val、ile、leu、met、ala、phe；IV類：lys、arg、his；V類：phe、tyr、trp、his；和VI類：asp、glu。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個胺基酸缺失。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個或至少50個胺基酸取代。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多50個胺基酸取代。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25個胺基酸取代。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代。
這一個或多個胺基酸取代可以處於N端、C端、胺基酸序列內，或為其組合。該等胺基酸取代可以是連續的、非連續的或其組合。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個、至多50個、至多60個、至多70個、至多80個、至多90個、至多100個、至多120個、至多140個、至多160個、至多180個或至多200個胺基酸缺失。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於野生型序列包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20、20-25、20-30、30-50、50-100或100-200個胺基酸缺失。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於野生型序列包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸缺失。
這一個或多個胺基酸缺失可以處於N端、C端、胺基酸序列內，或為其組合。該等胺基酸缺失可以是連續的、非連續的或其組合。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於野生型序列包括至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個或至少50個胺基酸插入。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於野生型序列）包括至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多50個胺基酸插入。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於野生型序列包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25個胺基酸插入。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於野生型序列包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸插入。
這一個或多個胺基酸插入可以處於N端、C端、胺基酸序列內，或為其組合。該等胺基酸插入可以是連續的、非連續的或其組合。
在一些實施方式中，免疫原由環狀或線性多核糖核苷酸表現。在一些實施方式中，免疫原係環狀或線性多核糖核苷酸滾環擴增的產物。
免疫原可以大量產生。這樣，免疫原可以是可產生的任何蛋白質分子。免疫原可以是可從細胞分泌或定位於細胞的細胞質、細胞核或膜區室的多肽。在一些實施方式中，由本揭露之環狀或線性多核糖核苷酸編碼的多肽包括融合蛋白，該融合蛋白包含本文揭露的兩種或更多種免疫原。在一些實施方式中，由本揭露之環狀或線性多核糖核苷酸編碼的多肽包括表位。在一些實施方式中，由本揭露之環狀或線性多核糖核苷酸編碼的多肽包括包含本文揭露的兩個或更多個表位的融合蛋白，例如包含來自本揭露之一種或多種微生物的多個預測表位的人工肽序列。
在一些實施方式中，可以從環狀或線性多核糖核苷酸表現的免疫原係膜蛋白，例如，包括通常作為膜蛋白被發現的多肽序列，或經修飾為膜蛋白的多肽序列。在一些實施方式中，可以從本文揭露的環狀或線性多核糖核苷酸表現的示例性免疫原包括細胞內免疫原或胞質免疫原。
在一些實施方式中，免疫原的長度小於約40,000個胺基酸，小於約35,000個胺基酸，小於約30,000個胺基酸，小於約25,000個胺基酸，小於約20,000個胺基酸，小於約15,000個胺基酸小於約10,000個胺基酸，小於約9,000個胺基酸，小於約8,000個胺基酸，小於約7,000個胺基酸，小於約6,000個胺基酸，小於約5,000個胺基酸，小於約4,000個胺基酸，小於約3,000個胺基酸，小於約2,500個胺基酸，小於約2,000個胺基酸，小於約1,500個胺基酸，小於約1,000個胺基酸，小於約900個胺基酸，小於約800個胺基酸，小於約700個胺基酸，小於約600個胺基酸，小於約500個胺基酸，小於約400個胺基酸，小於約300個胺基酸，小於約250個胺基酸，小於約200個胺基酸，小於約150個胺基酸，小於約140個胺基酸，小於約130個胺基酸，小於約120個胺基酸，小於約110個胺基酸，小於約100個胺基酸，小於約90個胺基酸，小於約80個胺基酸，小於約70個胺基酸，小於約60個胺基酸，小於約50個胺基酸，小於約40個胺基酸，小於約30個胺基酸，小於約25個胺基酸，小於約20個胺基酸，小於約15個胺基酸，小於約10個胺基酸，小於約5個胺基酸，介於之間或更小的任何胺基酸長度都可用。
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括一個或多個免疫原序列並且構造成用於在受試者體內細胞中持續表現。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸構造成使得該一個或多個表現序列在細胞中在較晚的時間點的表現等於或高於較早的時間點的表現。在此類實施方式中，該一個或多個免疫原序列的表現可以維持在相對穩定的水平或可以隨時間增加。免疫原序列的表現可以在延長的時間段內相對穩定。免疫原序列的表現可以暫態相對穩定或僅有限的時間，例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天相對穩定。
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸在受試者中例如暫態或長期表現一種或多種免疫原。在某些實施方式中，免疫原的表現持續至少約1小時至約30天，或至少約2小時、6小時、12小時、18小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更長時間或介於之間的任何時間。在某些實施方式中，免疫原的表現持續不超過約30分鐘至約7天、或不超過約1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或介於之間的任何時間。
免疫原表現包括翻譯本文提供的環狀或線性多核糖核苷酸的至少一個區域。例如，環狀或線性多核糖核苷酸可以在受試者中翻譯以生成包括本揭露之一種或多種免疫原的多肽，從而刺激受試者中適應性免疫反應（例如，抗體反應和/或T細胞反應）的產生。在一些實施方式中，本揭露之環狀或線性多核糖核苷酸經翻譯以在人或動物受試者中產生一種或多種免疫原，從而刺激人或動物受試者中適應性免疫反應（例如，抗體反應和/或T細胞反應）的產生。
在一些實施方式中，用於免疫原表現之方法包括將環狀或線性多核苷酸的總長度的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%翻譯成多肽。在一些實施方式中，用於免疫原表現之方法包括將環狀或線性多核糖核苷酸翻譯成具有至少5個胺基酸、至少10個胺基酸、至少15個胺基酸、至少20個胺基酸、至少50個胺基酸、至少100個胺基酸、至少150個胺基酸、至少200個胺基酸、至少250個胺基酸、至少300個胺基酸、至少400個胺基酸、至少500個胺基酸、至少600個胺基酸、至少700個胺基酸、至少800個胺基酸、至少900個胺基酸或至少1000個胺基酸的多肽。在一些實施方式中，用於蛋白質表現之方法包括將環狀或線性多核糖核苷酸翻譯成約5個胺基酸、約10個胺基酸、約15個胺基酸、約20個胺基酸、約50個胺基酸、約100個胺基酸、約150個胺基酸、約200個胺基酸、約250個胺基酸、約300個胺基酸、約400個胺基酸、約500個胺基酸、約600個胺基酸、約700個胺基酸、約800個胺基酸、約900個胺基酸或約1000個胺基酸的多肽。在一些實施方式中，方法包括將環狀或線性多核糖核苷酸翻譯成本文提供的連續多肽、本文提供的離散多肽或兩者。
在一些實施方式中，用於免疫原表現之方法包括翻譯產物的修飾、折疊或其他翻譯後修飾。在一些實施方式中，用於免疫原表現之方法包括體內翻譯後修飾，例如經由細胞機制。訊息序列
在一些實施方式中，可以從本文揭露的環狀或線性多核糖核苷酸表現的示例性免疫原包括分泌性蛋白，例如天然包括訊息序列的蛋白質（例如，免疫原），或者通常不編碼訊息序列但修飾為含有訊息序列的蛋白質。在一些實施方式中，由環狀或線性多核糖核苷酸編碼的免疫原包括分泌信號。例如，分泌信號可以是分泌性蛋白的天然編碼的分泌信號。再如，分泌信號可以是分泌性蛋白的經修飾的分泌信號。在其他實施方式中，由環狀或線性多核糖核苷酸編碼的免疫原不包括分泌信號。
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸編碼相同免疫原的多個拷貝（例如，相同免疫原的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個拷貝）。在一些實施方式中，免疫原的至少一個拷貝包括訊息序列，且免疫原的至少一個拷貝不包括訊息序列。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸編碼多個免疫原（例如，多個不同的免疫原或多個具有小於100%序列同一性的免疫原），其中該多個免疫原中的至少一個包括訊息序列且該多個免疫原中的至少一個拷貝不包括訊息序列。
在一些實施方式中，訊息序列係野生型訊息序列，其例如在內源表現時存在於相應野生型免疫原的N端。在一些實施方式中，訊息序列係免疫原異源的，例如當野生型免疫原內源性表現時係不存在的。可以修飾編碼免疫原的多核糖核苷酸序列以去除編碼野生型訊息序列的核苷酸序列和/或添加編碼異源訊息序列的序列。
由多核糖核苷酸編碼的免疫原可以包括將免疫原引導至分泌途徑的訊息序列。在一些實施方式中，訊息序列可以引導免疫原駐留在某些細胞器（例如，內質網、高基氏體或內體）中。在一些實施方式中，訊息序列引導免疫原從細胞中分泌。對於分泌性蛋白，訊息序列可以在分泌後裂解，從而產生成熟蛋白。在其他實施方式中，訊息序列可以嵌入細胞膜或某些細胞器中，產生跨膜區段，跨膜區段將蛋白錨定至細胞膜、內質網或高基氏體。在某些實施方式中，跨膜蛋白的訊息序列係在多肽N端的短序列。在其他實施方式中，第一跨膜結構域充當第一訊息序列，將蛋白質靶向膜。
在一些實施方式中，由多核糖核苷酸編碼的免疫原包括分泌訊息序列、跨膜插入訊息序列或不包括訊息序列。調控元件
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括調控元件，例如修飾環狀或線性多核糖核苷酸內表現序列的表現的序列。調控元件可以包括位置與編碼表現產物的表現序列相鄰的序列。調控元件可以可操作地連接至相鄰序列。與不存在調控元件時表現的產物的量相比，調控元件可以增加表現的產物的量。調控元件可用於增加由環狀或線性多核糖核苷酸編碼的一種或多種免疫原的表現。同樣，調控元件可用於減少由環狀或線性多核糖核苷酸編碼的一種或多種免疫原的表現。在一些實施方式中，一種調控元件可用於增加免疫原的表現，而另一種調控元件可用於減少相同環狀或線性多核糖核苷酸上另一免疫原的表現。另外，調控元件可以增加串聯附接的多個表現序列表現的產物（例如，免疫原）的量。因此，調控元件可以增強一個或多個表現序列（例如，免疫原）的表現。也可以使用多種調控元件，例如，差異性地調控不同表現序列的表現。在一些實施方式中，本文提供的調控元件可以包括選擇性翻譯序列。如本文所用，術語「選擇性翻譯序列」係指在環狀或線性多核糖核苷酸中選擇性地起始或激活表現序列的翻譯的核酸序列，例如某些核糖開關適體酶。調控元件還可以包括選擇性降解序列。如本文所用，術語「選擇性降解序列」係指起始環狀或線性多核糖核苷酸或者環狀或線性多核糖核苷酸的表現產物的降解的核酸序列。在一些實施方式中，調控元件係翻譯調節子。翻譯調節子可以調節環狀或線性多核糖核苷酸中表現序列的翻譯。翻譯調節子可以是翻譯增強子或翻譯抑制子。在一些實施方式中，翻譯起始序列可以充當調控元件。在國際專利公開號WO 2019/118919的段落[0154]-[0161]中描述了調控元件的其他實例，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。
與起始翻譯的密碼子（諸如但不限於起始密碼子或替代的起始密碼子）側接的核苷酸已知會影響環狀或線性多核糖核苷酸的翻譯效率、長度和/或結構。（參見，例如，Matsuda和Mauro, PLoS ONE [公共科學圖書館 綜合], 2010 5: 11；其內容藉由援引以其全文併入本文）。掩蔽與起始翻譯的密碼子側接的任何核苷酸可用於改變環狀或線性多核糖核苷酸的翻譯起始位置、翻譯效率、長度和/或結構。
在一個實施方式中，可以在起始密碼子或替代的起始密碼子附近使用掩蔽劑，以掩蔽或隱藏密碼子，以降低在被掩蔽的起始密碼子或替代的起始密碼子處起始翻譯的可能性。在另一個實施方式中，掩蔽劑可用於掩蔽環狀或線性多核糖核苷酸的起始密碼子，以增加翻譯將在替代的起始密碼子處起始的可能性。翻譯起始序列
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸編碼免疫原並且包括翻譯起始序列，例如起始密碼子。在一些實施方式中，翻譯起始序列包括科紮克或夏因-達爾加諾（Shine-Dalgarno）序列。在一些實施方式中，翻譯起始序列包含科紮克序列。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰的翻譯起始序列，例如科紮克序列。在一些實施方式中，翻譯起始序列係非編碼起始密碼子。在一些實施方式中，翻譯起始序列（例如科紮克序列）存在於每個表現序列的一側或兩側，導致表現產物的隔開。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰的至少一個翻譯起始序列。在一些實施方式中，翻譯起始序列為環狀或線性多核糖核苷酸提供構象柔性。在一些實施方式中，翻譯起始序列基本上在環狀或線性多核糖核苷酸的單股區域內。在國際專利公開號WO 2019/118919的段落[0163]-[0165]中描述了翻譯起始序列的其他實例，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。
環狀或線性多核糖核苷酸可以包括多於1個起始密碼子，諸如但不限於至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少50個、至少60個或多於60個起始密碼子。翻譯可以在第一個起始密碼子上起始或可以在第一個起始密碼子的下游起始。
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸可以起始於不是第一起始密碼子的密碼子，例如AUG。環狀或線性多核糖核苷酸的翻譯可以起始於替代性翻譯起始序列，諸如國際專利公開號WO 2019/118919 A1的[0164]中描述的那些翻譯起始序列，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，翻譯係藉由用Rocaglates處理真核起始因子4A（eIF4A）來起始的（藉由阻斷43S掃描來阻遏翻譯，導致過早的上游翻譯起始以及攜帶RocA-eIF4A靶序列的轉錄本的蛋白質表現降低，參見例如，www.nature.com/articles/nature17978）。IRES
在一些實施方式中，本文所述之環狀或線性多核糖核苷酸包括內部核糖體進入位點（IRES）元件。在一些實施方式中，本文所述之環狀或線性多核糖核苷酸包括多於一個（例如，2、3、4和5個）內部核糖體進入位點（IRES）元件。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸在每個表現序列的一側或兩側上包括一個或多個IRES序列，導致所得肽和/或多肽的隔開。在一些實施方式中，IRES側接至少一個（例如2、3、4、5或更多個）表現序列的兩側。包括在環狀或線性多核糖核苷酸中的合適的IRES元件可以是能夠接合真核核糖體的RNA序列。在一些實施方式中，IRES係腦心肌炎病毒（EMCV）IRES。在一些實施方式中，IRES係柯薩奇病毒（Coxsackievirus）（CVB3）IRES。在國際專利公開號WO 2019/118919的段落[0166]-[0168]中描述了IRES的其他實例，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。裂解結構域
本揭露之環狀或線性多核糖核苷酸可以包括裂解結構域（例如，交錯元件或裂解序列）。
術語「交錯元件」係指在翻譯期間誘導核糖體暫停的部分，諸如核苷酸序列。在一些實施方式中，交錯元件係具有強α-螺旋傾向的胺基酸的非保守序列，然後是共有序列-D(V/I)ExNPGP，其中x = 任何胺基酸（SEQ ID NO: 7）。在一些實施方式中，交錯元件可以包括化學部分，如甘油、非核酸連接部分、化學修飾、經修飾的核酸或其任何組合。
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰的至少一個交錯元件。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括與每個表現序列相鄰的交錯元件。在一些實施方式中，交錯元件存在於每個表現序列的一側或兩側，導致表現產物（例如免疫原）的隔開。在一些實施方式中，交錯元件係一個或多個表現序列的一部分。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括一個或多個表現序列（例如，免疫原），並且該一個或多個表現序列中的每一個藉由環狀或線性多核糖核苷酸上的交錯元件與後繼的表現序列（例如，免疫原）隔開。在一些實施方式中，交錯元件阻止 (a) 單個表現序列的兩輪翻譯或 (b) 兩個或更多個表現序列的一輪或多輪翻譯生成單個多肽。在一些實施方式中，交錯元件係與該一個或多個表現序列隔開的序列。在一些實施方式中，交錯元件包括該一個或多個表現序列的表現序列的一部分。
在國際專利公開號WO 2019/118919的段落[0172]-[0175]中描述了交錯元件的實例，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，由環狀或線性核糖核苷酸編碼的該多種免疫原可以被每個免疫原之間的IRES隔開。所有免疫原之間的IRES可以是相同的IRES。不同免疫原之間的IRES可以不同。在其他實施方式中，該多種免疫原可以被2A自裂解肽隔開。此外，由環狀或線性核糖核苷酸編碼的該多種免疫原可以被IRES和2A序列隔開。例如，IRES可以在一個免疫原與第二免疫原之間，而2A肽可以在第二免疫原與第三免疫原之間。特定IRES或2A自裂解肽的選擇可用於在IRES或2A序列的控制下控制免疫原的表現水平。例如，根據所選擇的IRES和/或2A肽，多肽上的表現可以更高或更低。
為了避免產生連續表現產物，例如免疫原，同時保持滾環翻譯，可以包括交錯元件以在翻譯期間誘導核糖體暫停。在一些實施方式中，交錯元件在一個或多個表現序列中的至少一個的3’端。交錯元件可以構造為在環狀或線性多核糖核苷酸的滾環翻譯期間使核糖體停滯。交錯元件可以包括但不限於2A樣或CHYSEL（SEQ ID NO: 8）（順式作用的水解酶元件）序列。在一些實施方式中，交錯元件編碼具有C末端共有序列為X1 X2 X3 EX5 NPGP的序列，其中X1 不存在或G或H，X2 不存在或D或G，X3 係D或V或I或S或M，X5 係任何胺基酸（SEQ ID NO: 9）。在一些實施方式中，該序列包括具有強α-螺旋傾向的胺基酸的非保守序列，然後是共有序列-D(V/I)ExNPGP，其中x = 任何胺基酸（SEQ ID NO: 7）。交錯元件的一些非限制性實例包括GDVESNPGP（SEQ ID NO: 10）、GDIEENPGP（SEQ ID NO: 11）、VEPNPGP（SEQ ID NO: 12）、IETNPGP（SEQ ID NO: 13）、GDIESNPGP（SEQ ID NO: 14）、GDVELNPGP（SEQ ID NO: 15）、GDIETNPGP（SEQ ID NO: 16）、GDVENPGP（SEQ ID NO: 17）、GDVEENPGP（SEQ ID NO: 18）、GDVEQNPGP（SEQ ID NO: 19）、IESNPGP（SEQ ID NO: 20）、GDIELNPGP（SEQ ID NO: 21）、HDIETNPGP（SEQ ID NO: 22）、HDVETNPGP（SEQ ID NO: 23）、HDVEMNPGP（SEQ ID NO: 24）、GDMESNPGP（SEQ ID NO: 25）、GDVETNPGP（SEQ ID NO:26）、GDIEQNPGP（SEQ ID NO: 27）和DSEFNPGP（SEQ ID NO: 28）。
在一些實施方式中，本文所述之交錯元件裂解表現產物，諸如在本文所述之共有序列的G和P之間。作為一個非限制性實例，環狀或線性多核糖核苷酸包括至少一個交錯元件以裂解表現產物。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括與至少一個表現序列相鄰的交錯元件。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括在每個表現序列後的交錯元件。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括存在於每個表現序列的一側或兩側的交錯元件，導致由每個表現序列翻譯一種或多種個體肽和/或多肽。
在一些實施方式中，交錯元件包括一種或多種在翻譯過程中誘導核糖體暫停的經修飾的核苷酸或非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括肽核酸（PNA）、𠰌啉代和鎖核酸（LNA）、以及乙二醇核酸（GNA）和蘇糖核酸（TNA）。諸如此類的實例藉由改變分子主鏈而不同於天然存在的DNA或RNA。示例性修飾可以包括對糖、核鹼基、核苷間鍵（例如對連接的磷酸酯/對磷酸二酯鍵/對磷酸二酯主鏈）進行的可在翻譯期間誘導核糖體暫停的任何修飾以及其任何組合。本文提供的一些示例性修飾在本文其他處描述。
在一些實施方式中，交錯元件以其他形式存在於環狀或線性多核糖核苷酸中。例如，在一些示例性的環狀或線性多核糖核苷酸中，交錯元件包括環狀或線性多核糖核苷酸中的第一表現序列的終止元件，和隔開該終止元件與第一表現序列後繼表現的第一翻譯起始序列的核苷酸間隔序列。在一些實例中，第一表現序列的第一交錯元件在環狀或線性多核糖核苷酸中的第一表現序列後繼表現的第一翻譯起始序列的上游（5’）。在一些情況下，第一表現序列和第一表現序列後繼表現序列係環狀或線性多核糖核苷酸中的兩個隔開的表現序列。第一交錯元件和第一翻譯起始序列之間的距離可以使得第一表現序列及其後繼表現序列能夠連續翻譯。在一些實施方式中，第一交錯元件包括終止元件，並將第一表現序列的表現產物與其後繼表現序列的表現產物隔開，從而產生離散的表現產物。在一些情況下，在環狀或線性多核糖核苷酸中後繼序列的第一翻譯起始序列上游包括第一交錯元件的環狀或線性多核糖核苷酸被連續翻譯，而在第二表現序列後繼表現序列的第二翻譯起始序列的上游包括第二表現序列的交錯元件的對應環狀或線性多核糖核苷酸不被連續翻譯。在一些情況下，環狀或線性多核糖核苷酸中僅存在一個表現序列，並且第一表現序列及其後繼表現序列係相同的表現序列。在一些示例性的環狀或線性多核糖核苷酸中，交錯元件包括環狀或線性多核糖核苷酸中第一表現序列的第一終止元件，和隔開終止元件與下游翻譯起始序列的核苷酸間隔序列。在一些此類實例中，環狀或線性多核糖核苷酸中第一交錯元件在第一表現序列的第一翻譯起始序列的上游（5’）。在一些情況下，第一交錯元件和第一翻譯起始序列之間的距離使得能夠連續翻譯第一表現序列和任何後繼表現序列。在一些實施方式中，第一交錯元件將第一表現序列的一輪表現產物與第一表現序列的下一輪表現產物分開，從而產生離散的表現產物。在一些情況下，在環狀或線性多核糖核苷酸中的第一表現序列的第一翻譯起始序列上游包括第一交錯元件的環狀或線性多核糖核苷酸被連續翻譯，而在相應環狀或線性多核糖核苷酸中的第二表現序列的第二翻譯起始序列上游包括交錯元件的相應環狀或線性多核糖核苷酸不被連續翻譯。在一些情況下，相應環狀或線性多聚核糖核苷酸中第二交錯元件與第二翻譯起始序列之間的距離係環狀或線性多聚核苷酸中第一交錯元件與第一翻譯起始序列之間的距離的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些情況下，第一交錯元件與第一翻譯起始之間的距離為至少2 nt、3 nt、4 nt、5 nt、6 nt、7 nt、8 nt、9 nt、10 nt、11 nt、12 nt、13 nt、14 nt、15 nt、16 nt、17 nt、18 nt、19 nt、20 nt、25 nt、30 nt、35 nt、40 nt、45 nt、50 nt、55 nt、60 nt、65 nt、70 nt、75 nt或更大。在一些實施方式中，第二交錯元件與第二翻譯起始之間的距離為至少2 nt、3 nt、4 nt、5 nt、6 nt、7 nt、8 nt、9 nt、10 nt、11 nt、12 nt、13 nt、14 nt、15 nt、16 nt、17 nt、18 nt、19 nt、20 nt、25 nt、30 nt、35 nt、40 nt、45 nt、50 nt、55 nt、60 nt、65 nt、70 nt、75 nt或大於第一交錯元件和第一翻譯起始之間的距離。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括多於一個表現序列。
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括至少一個裂解序列。在一些實施方式中，裂解序列與表現序列相鄰。在一些實施方式中，裂解序列在兩個表現序列之間。在一些實施方式中，裂解序列包括在表現序列中。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括2至10個裂解序列。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括2至5個裂解序列。在一些實施方式中，多個裂解序列在多個表現序列之間；例如，環狀或線性多核糖核苷酸可以包括三個表現序列和兩個裂解序列，使得在每個表現序列之間存在一個裂解序列。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括裂解序列，例如在犧牲型circRNA或可裂解的circRNA或自裂解的circRNA中。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括兩個或更多個裂解序列，導致將環狀或線性多核糖核苷酸分離成多個產物，例如miRNA、線性RNA、較小的環狀或線性多核糖核苷酸等。
在一些實施方式中，裂解序列包括核酶RNA序列。核酶（來自核糖核酸酶，也稱為RNA酶或催化性RNA）係催化化學反應的RNA分子。許多天然核酶催化其自身的磷酸二酯鍵之一的水解，或催化其他RNA中的鍵的水解，但也發現天然核酶催化核糖體的胺基轉移酶活性。催化性RNA可以藉由體外方法「進化」。類似於上文討論的核糖開關活性，核酶及其反應產物可以調控基因表現。在一些實施方式中，將催化性RNA或核酶置於較大的非編碼RNA中，這使得核酶以許多拷貝存在於細胞內，用於大體積分子的化學轉化的目的。在一些實施方式中，適體和核酶都可以在相同的非編碼RNA中編碼。
在一些實施方式中，裂解序列編碼可裂解的多肽連接子。例如，多核糖核苷酸可以編碼兩種或更多種免疫原，例如，其中該兩種或更多種免疫原由單個開放閱讀框（ORF）編碼。例如，兩種或更多種免疫原可以由單個開放閱讀框編碼，該開放閱讀框的表現受IRES控制。在一些實施方式中，ORF進一步編碼多肽連接子，例如使得ORF的表現產物編碼兩種或更多種免疫原，每種免疫原被編碼多肽連接子的序列（例如，5-200、5至100、5至50、5至20、50至100或50至200個胺基酸的連接子）隔開。多肽連接子可以包括裂解位點，例如被蛋白酶（例如，在向受試者投與多核糖核苷酸後受試者中的內源蛋白酶）識別並裂解的裂解位點。在此類實施方式中，包括兩種或更多種免疫原的胺基酸序列的單一表現產物在表現時裂解，從而使得該兩種或更多種免疫原在表現後分離。示例性的蛋白酶裂解位點係熟悉該項技術者已知的，例如，充當被金屬蛋白酶（例如，基質金屬蛋白酶（MMP），諸如MMP 1-28中的任一種或多種）、解聚素（disintegrin）和金屬蛋白酶（ADAM，諸如ADAM 2、7-12、15、17-23、28-30和33中的任一種或多種）、絲胺酸蛋白酶、尿激酶型纖溶酶原活化劑、蛋白裂解酶（matriptase）、半胱胺酸蛋白酶、天冬胺酸蛋白酶或組織蛋白酶識別的蛋白酶裂解位點的胺基酸序列。在一些實施方式中，該蛋白酶係MMP9和/或MMP2。在一些實施方式中，該蛋白酶係蛋白裂解酶。
在一些實施方式中，本文所述之環狀或線性多核糖核苷酸係犧牲型環狀或線性多核糖核苷酸、可裂解的環狀或線性多核糖核苷酸或自裂解的環狀或線性多核糖核苷酸。環狀或線性多核糖核苷酸可以遞送細胞組分，包括，例如，RNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA或shRNA。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括被以下隔開的miRNA：(i) 可自裂解的元件；(ii) 裂解募集位點；(iii) 可降解連接子；(iv) 化學連接子；和/或 (v) 間隔區序列。在一些實施方式中，circRNA包括被以下隔開的siRNA：(i) 可自裂解的元件；(ii) 裂解募集位點（例如ADAR）；(iii) 可降解連接子（例如丙三醇）；(iv) 化學連接子；和/或 (v) 間隔區序列。可自裂解的元件的非限制性實例包括錘頭結構、剪接元件、髮夾、D型肝炎病毒（HDV）、Varkud衛星（VS）和glmS 核酶。調控元件及表現產物比率
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括一個或多個調控核酸序列或包括一個或多個編碼調控核酸（例如，修飾內源基因和/或外源基因的表現的核酸）的表現序列。在一些實施方式中，本文提供的環狀或線性多核糖核苷酸的表現序列可以包括與調控核酸（像非編碼RNA諸如但不限於tRNA、lncRNA、miRNA、rRNA、snRNA、微小RNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、Y RNA和hnRNA）反義的序列。
在國際專利公開號WO 2019/118919的段落[0177]-[0194]中描述了示例性的調控核酸，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，本文提供的環狀多核糖核苷酸的翻譯效率大於參考物，例如用於環化的線性對應物、線性表現序列或線性多核糖核苷酸。在一些實施方式中，本文提供的環狀多核糖核苷酸具有的翻譯效率高於參考物的翻譯效率至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、70%、800%、900%、1000%、2000%、5000%、10000%、100000%或更高。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的翻譯效率高於線性對應物的翻譯效率10%。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的翻譯效率高於線性對應物的翻譯效率300%。
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸產生化學計量比的表現產物。滾環翻譯連續地以基本上相等的比率產生表現產物。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸具有化學計量的翻譯效率，使得表現產物以基本上相等的比率產生。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸具有多種表現產物（例如來自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個表現序列的產物）的化學計量翻譯效率。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸產生基本上不同比率的表現產物。例如，多個表現產物的翻譯效率的比率可為1 : 10,000、1 : 7000、1 : 5000、1 : 1000、1 : 700、1 : 500、1 : 100、1 : 50、1 : 10、1 : 5、1 : 4、1 : 3或1 : 2。在一些實施方式中，可以使用調控元件來修改多個表現產物的比率。翻譯
在一些實施方式中，一旦起始環狀多核糖核苷酸的翻譯，在完成環狀多核糖核苷酸的至少一輪翻譯之前，結合至環狀多核糖核苷酸的核糖體不會與環狀多核糖核苷酸脫離。在一些實施方式中，如本文所述之環狀多核糖核苷酸能夠滾環翻譯。在一些實施方式中，在滾環翻譯期間，一旦起始環狀多核糖核苷酸的翻譯，在完成環狀多核糖核苷酸的至少2輪、至少3輪、至少4輪、至少5輪、至少6輪、至少7輪、至少8輪、至少9輪、至少10輪、至少11輪、至少12輪、至少13輪、至少14輪、至少15輪、至少20輪、至少30輪、至少40輪、至少50輪、至少60輪、至少70輪、至少80輪、至少90輪、至少100輪、至少150輪、至少200輪、至少250輪、至少500輪、至少1000輪、至少1500輪、至少2000輪、至少5000輪、至少10000輪、至少105輪或至少106輪翻譯之前，結合至環狀多核糖核苷酸的核糖體不會與環狀多核糖核苷酸脫離。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的滾環翻譯導致生成多肽產物，該多肽產物由環狀多核糖核苷酸的多於一輪翻譯得出（「連續」表現產物）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括交錯元件，並且環狀多核糖核苷酸的滾環翻譯導致生成多肽產物，該多肽產物由環狀多核糖核苷酸的單輪翻譯或少於單輪翻譯生成（「離散」表現產物）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸被構造為使得環狀多核糖核苷酸的滾環翻譯期間生成的總多肽（莫耳/莫耳）中的至少10%、20%、30%、40%、50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%係離散多肽。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸構造成使得總多肽的至少99%係離散多肽。在一些實施方式中，在體外翻譯系統中測試離散產物相對於總多肽的量比。在一些實施方式中，用於測試量比的體外翻譯系統包括兔網狀紅血球裂解物。在一些實施方式中，在體內翻譯系統如真核細胞或原核細胞、培養細胞或生物體中的細胞中測試量比。非翻譯區
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括非翻譯區（UTR）。包括基因的基因組區域的UTR可以轉錄但不翻譯。在一些實施方式中，UTR可以被包括在本文所述之表現序列的翻譯起始序列的上游。在一些實施方式中，UTR可以被包括在本文所述之表現序列的下游。在一些情況下，第一表現序列的一個UTR與第二表現序列的另一個UTR相同或連續或重疊。在一些實施方式中，內含子係人內含子。在一些實施方式中，內含子係全長人內含子，例如ZKSCAN1。
在國際專利公開號WO 2019/118919的段落[0197]-[201]中描述了示例性的非翻譯區，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括聚A序列。在國際專利公開號WO 2019/118919的段落[0202]-[0205]中描述了示例性的聚A序列，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少聚A序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括內嵌有一段或多段的腺苷和尿苷的UTR。該等AU富集簽名可能會增加表現產物的轉化率。
富含UTR AU的元件（ARE）的引入、去除或修飾可用於調節環狀多核糖核苷酸的穩定性或免疫原性（例如，免疫或炎性反應的一種或多種標誌物的水平）。工程化特定的環狀多核糖核苷酸時，可以將ARE的一個或多個拷貝引入環狀多核糖核苷酸中，並且ARE的該等拷貝可以調節表現產物的翻譯和/或產生。同樣，可以對ARE進行鑒別和去除或工程化至環狀多核糖核苷酸以調節細胞內穩定性，從而影響所得蛋白質的翻譯和產生。
應當理解，可以將來自任何基因的任何UTR摻入環狀多核糖核苷酸的相應側翼區中。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少5’-UTR，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少3’-UTR，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少聚A序列，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少終止元件，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少內部核糖體進入位點，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少帽，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少5’-UTR、3’-UTR和IRES，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸進一步包括以下序列中的一個或多個：編碼一個或多個miRNA的序列、編碼一個或多個複製蛋白的序列、編碼外源基因的序列、編碼治療劑的序列、調控元件（例如翻譯調節子，例如翻譯增強子或抑制子）、翻譯起始序列、靶向內源基因（例如，siRNA、lncRNA、shRNA）的一種或多種調控核酸和編碼治療性mRNA或蛋白質的序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少5’-UTR。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少3’-UTR。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少聚A序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少終止元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少內部核糖體進入位點。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少核酸外切酶的降解易感性。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少降解易感性的事實可能意味著環狀多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解，或在僅存在核酸外切酶時被降解的有限程度例如與不存在核酸外切酶時相當或相似。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解。在一些實施方式中，當暴露於核酸外切酶時，環狀多核糖核苷酸降解減少。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少與帽結合蛋白的結合。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少5’帽。終止序列
環狀多核糖核苷酸可以包括一個或多個表現序列（例如，編碼免疫原），並且每個表現序列可以具有或可以不具有終止元件。在國際專利公開號WO 2019/118919的段落[0169]-[0170]中描述了終止元件的其他實例，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括聚A序列。在一些實施方式中，聚A序列的長度大於10個核苷酸。在一個實施方式中，聚A序列的長度大於15個核苷酸（例如，至少或大於約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500和3,000個核苷酸）。在一些實施方式中，根據國際專利公開號WO 2019/118919 A1的[0202]-[0204]中對聚A序列的描述來設計聚A序列，該專利公開藉由援引以其全文併入本文。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括聚A、缺少聚A或具有經修飾的聚A以調節環狀多核糖核苷酸的一種或多種特徵。在一些實施方式中，缺少聚A或具有經修飾的聚A的環狀多核糖核苷酸改善了一種或多種功能特徵，例如免疫原性（例如，免疫或炎性反應的一種或多種標誌物的水平）、半衰期、表現效率等。調控核酸
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一種或多種編碼調控核酸（例如，修飾內源基因和/或外源基因的表現的核酸）的表現序列。在一些實施方式中，本文提供的環狀多核糖核苷酸的表現序列可以包括與調控核酸（像非編碼RNA諸如但不限於tRNA、lncRNA、miRNA、rRNA、snRNA、微小RNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、Y RNA和hnRNA）反義的序列。
在一實施方式中，調控核酸靶向基因，諸如宿主基因。調控核酸可以包括國際專利公開號WO 2019/118919 A1的[0177]和[0181]-[0189]中描述的任何調控核酸，該專利公開藉由援引以其全文併入本文。
在一些實施方式中，表現序列包括本文所述之一種或多種特徵，例如，編碼一種或多種肽或蛋白質的序列、一種或多種調控元件、一種或多種調控核酸（例如一種或多種非編碼序列RNA）、其他表現序列及其任何組合。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一個或多個RNA結合位點。微小RNA（或miRNA）係短非編碼RNA，可與核酸分子的3'UTR結合並藉由降低核酸分子的穩定性或藉由抑制翻譯來下調基因表現。環狀多核糖核苷酸可以包括一個或多個微小RNA靶序列、微小RNA序列或微小RNA種子。此類序列可以對應於任何已知的微小RNA，如在美國公開US 2005/0261218和美國公開US 2005/0059005中傳授的那些，其內容藉由援引以其全文併入本文。微小RNA序列包括「種子」區，即成熟微小RNA的第2-8位區域中的序列，該序列與miRNA靶序列具有完美的沃森-克裡克互補性。微小RNA種子可以包括成熟微小RNA的第2-8位或第2-7位。在一些實施方式中，微小RNA種子可以包括7個核苷酸（例如成熟微小RNA的第2-8個核苷酸），其中相應miRNA靶標中的種子互補位點側接與微小RNA第1位相對的腺嘌呤（A）。在一些實施方式中，微小RNA種子可以包括6個核苷酸（例如成熟微小RNA的第2-7個核苷酸），其中相應miRNA靶標中的種子互補位點側接與微小RNA第1位相對的腺嘌呤（A）。參見，例如，Grimson等人；Mol Cell [分子細胞]. 2007 6; 27: 91-105；其藉由援引以其全文併入本文。蛋白質結合
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一個或多個蛋白質結合位點，使得蛋白質例如核糖體能夠結合至RNA序列中的內部位點。藉由將蛋白質結合位點（例如核糖體結合位點）工程化至環狀多核糖核苷酸中，環狀多核糖核苷酸可以逃避或更少地被宿主的免疫系統檢測到，藉由掩蔽宿主免疫系統成分中的環狀多核糖核苷酸來調節降解或調節翻譯。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個免疫蛋白結合位點，例如用於逃避免疫反應，例如CTL（細胞毒性T淋巴細胞）反應。在一些實施方式中，免疫蛋白結合位點係結合至免疫蛋白並有助於將環狀多核糖核苷酸掩蔽為外源的核苷酸序列。在一些實施方式中，免疫蛋白結合位點係結合至免疫蛋白並有助於將環狀多核糖核苷酸隱藏為外源或外來的核苷酸序列。
核糖體與線性RNA接合的傳統機制包括核糖體與RNA的加帽5'端的結合。從5'端，核糖體遷移到起始密碼子，於是形成第一肽鍵。根據本揭露，環狀多核糖核苷酸的翻譯的內部起始（即，不依賴帽）不需要游離末端或加帽端。準確的說，核糖體結合至未加帽的內部位點，由此核糖體在起始密碼子處開始多肽延長。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一個或多個RNA序列，該RNA序列包括核糖體結合位點，例如起始密碼子。
天然5'UTR具有在翻譯起始中起作用的特徵。它們帶有類似科紮克序列的簽名，該等序列眾所周知參與核糖體起始多種基因的翻譯的過程。科紮克序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG（SEQ ID NO: 29），其中R係起始密碼子（AUG）的三個鹼基上游的嘌呤（腺嘌呤或鳥嘌呤），後接另一個「G」。還已知5’UTR形成參與延長因子結合的二級結構。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸編碼與蛋白質結合的蛋白質結合序列。在一些實施方式中，蛋白質結合序列靶向環狀多核糖核苷酸或將其定位至特定靶標。在一些實施方式中，蛋白結合序列特異性結合蛋白的精胺酸富集區。
在一些實施方式中，蛋白質結合位點包括但不限於與蛋白質的結合位點，如ACIN1、AGO、APOBEC3F、APOBEC3G、ATXN2、AUH、BCCIP、CAPRIN1、CELF2、CPSF1、CPSF2、CPSF6、CPSF7、CSTF2、CSTF2T、CTCF、DDX21、DDX3、DDX3X、DDX42、DGCR8、EIF3A、EIF4A3、EIF4G2、ELAVL1、ELAVL3、FAM120A、FBL、FIP1L1、FKBP4、FMR1、FUS、FXR1、FXR2、GNL3、GTF2F1、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPC、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPM、HNRNPU、HNRNPUL1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ILF3、KHDRBS1、LARP7、LIN28A、LIN28B、m6A、MBNL2、METTL3、MOV10、MSI1、MSI2、NONO、NONO-、NOP58、NPM1、NUDT21、PCBP2、POLR2A、PRPF8、PTBP1、RBFOX2、RBM10、RBM22、RBM27、RBM47、RNPS1、SAFB2、SBDS、SF3A3、SF3B4、SIRT7、SLBP、SLTM、SMNDC1、SND1、SRRM4、SRSF1、SRSF3、SRSF7、SRSF9、TAF15、TARDBP、TIA1、TNRC6A、TOP3B、TRA2A、TRA2B、U2AF1、U2AF2、UNK、UPF1、WDR33、XRN2、YBX1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YWHAG、ZC3H7B、PDK1、AKT1和任何其他結合RNA的蛋白質。加密原
如本文所述，環狀多核糖核苷酸包括加密原以減少、逃避或避免細胞先天免疫反應。在一方面，本文提供了環狀多核糖核苷酸，當該環狀多核糖核苷酸被遞送至細胞時，與由參考化合物（例如對應於所述環狀多核糖核苷酸的線性多核苷酸或缺少加密原的環狀多核糖核苷酸）引發的反應相比，導致宿主的免疫反應減少。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的免疫原性小於（例如，免疫或炎性反應的一種或多種標記物的水平低於）缺少加密原的對應物的免疫原性。
在一些實施方式中，加密原增強了穩定性。關於UTR在核酸分子的穩定性和翻譯方面發揮調控作用的證據越來越多。UTR的調控特徵可以包含在加密原中，以增強環狀多核糖核苷酸的穩定性。
在一些實施方式中，5’-或3’-UTR可以構成環狀多核糖核苷酸中的加密原。例如，富含UTR AU的元件（ARE）的去除或修飾可用於調節環狀多核糖核苷酸的穩定性或免疫原性（例如，調節免疫或炎性反應的一種或多種標誌物的水平）。
在一些實施方式中，去除表現序列（例如可翻譯區）中AU富集元件（ARE）的修飾可用於調節環狀多核糖核苷酸的穩定性或免疫原性（例如，調節免疫或炎性反應的一種或多種標誌物的水平）。
在一些實施方式中，加密原包括miRNA結合位點或與任何其他非編碼RNA的結合位點。例如，將miR-142位點摻入本文所述之環狀多核糖核苷酸中不僅可調節造血細胞中的表現，還可減少或消除對環狀多核糖核苷酸編碼的蛋白質的免疫反應。
在一些實施方式中，加密原包括一個或多個蛋白質結合位點，使得蛋白質（例如免疫蛋白質）能夠結合至RNA序列。藉由將蛋白質結合位點工程化至環狀多核糖核苷酸中，環狀多核糖核苷酸可以逃避或更少地被宿主的免疫系統檢測到，藉由掩蔽宿主免疫系統成分中的環狀多核糖核苷酸來調節降解或調節翻譯。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個免疫蛋白結合位點，例如用於逃避免疫反應，例如CTL反應。在一些實施方式中，免疫蛋白結合位點係結合至免疫蛋白並有助於將環狀多核糖核苷酸掩蔽為外源的核苷酸序列。
在一些實施方式中，加密原包括一種或多種經修飾的核苷酸。示例性修飾可以包括對糖、核鹼基、核苷間鍵（例如至連接的磷酸酯/至磷酸二酯鍵/至磷酸二酯主鏈）進行的可防止或減少針對環狀多核糖核苷酸的免疫反應的任何修飾以及其任何組合。本文提供了一些示例性修飾。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含一種或多種如本文其他處所述之修飾，以與由參考化合物（例如缺少修飾的環狀多核糖核苷酸）引發的反應相比，減少宿主的免疫反應。特別地，已顯示添加一個或多個肌苷區分RNA係內源性還是病毒性。參見例如Yu, Z等人, (2015) RNA editing by ADAR1 marks dsRNA as 「self」 [藉由ADAR1進行的RNA編輯將dsRNA標記為「自身」]. Cell Res [細胞研究]. 25, 1283-1284，其藉由援引以其全文併入本文。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一個或多個shRNA的表現序列或可被加工成siRNA的RNA序列，並且shRNA或siRNA靶向RIG-I並降低RIG-I的表現。RIG-I可以感知外源環狀RNA並引起外源環狀RNA的降解。因此，具有靶向RIG-1的shRNA、siRNA或任何其他調控核酸的序列的環狀多核苷酸可降低針對環狀多核糖核苷酸的免疫力，例如宿主細胞免疫力。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少有助於環狀多核糖核苷酸減少、逃避或避免細胞先天免疫反應的序列、元件或結構。在一些此類實施方式中，環狀多核糖核苷酸可能缺少聚A序列、5’端、3’端、磷酸基、羥基或其任何組合。核苷酸間隔區序列
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括間隔區序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個間隔區序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括1、2、3、4、5、6、7或更多個間隔區序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括間隔區序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸的元件可以藉由間隔區序列或連接子彼此隔開。在國際專利公開號WO 2019/118919的段落[0293]-[0302]中描述了示例性的間隔區序列，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。非核酸連接子
本文所述之環狀多核糖核苷酸可以包括非核酸連接子。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸在本文所述之一個或多個序列或元件之間具有非核酸連接子。在一個實施方式中，本文所述之一個或多個序列或元件與連接子連接。非核酸連接子可以是化學鍵，例如一個或多個共價鍵或非共價鍵。在一些實施方式中，非核酸連接子係肽連接子或蛋白連接子。此類連接子可以在2-30個胺基酸之間，或更長。本文所述之環狀多核糖核苷酸還可以包括非核酸連接子。在國際專利公開號WO 2019/118919的段落[0303]-[0307]中描述了示例性的非核酸連接子，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸進一步包括另一種核酸序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括其他序列，其包括DNA、RNA或人工核酸。其他序列可以包括但不限於基因組DNA，cDNA或編碼tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA或其他RNAi分子的序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括siRNA，以靶向與環狀多核糖核苷酸相同的基因表現產物的不同基因座。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括siRNA，以靶向與環狀多核糖核苷酸中存在的基因表現產物不同的基因表現產物。穩定性和半衰期
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括特定的序列特徵。例如，環狀多核糖核苷酸可以包括特定的核苷酸組成。在一些此類實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括一個或多個嘌呤（腺嘌呤或鳥嘌呤）富集區。在一些此類實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括一個或多個嘌呤富集區。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括一個或多個AU富集區或元件（ARE）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括一個或多個腺嘌呤富集區。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括本文其他處所述之一個或多個重複元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一個或多個本文其他處所述之修飾。
環狀多核糖核苷酸相對於參考序列可以包括一個或多個取代、插入和/或添加、缺失和共價修飾。例如，相對於親本多核糖核苷酸具有一個或多個插入、添加、缺失和/或共價修飾的環狀多核糖核苷酸包括在本揭露之範圍內。在國際專利公開號WO 2019/118919的段落[0310]-[0325]中描述了示例性修飾，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括高階結構，例如二級或三級結構。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的互補區段將其自身折疊成雙股區段，與氫鍵結合配對（例如，A-U和C-G）。在一些實施方式中，螺旋，也稱為莖，在分子內形成，具有連接至端環的雙股區段。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有至少一個具有準雙股二級結構的區段。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的一個或多個序列包括基本上單股的與雙股的區域。在一些實施方式中，單股與雙股的比率可以影響環狀多核糖核苷酸的功能。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的一個或多個序列基本上係單股的。在一些實施方式中，基本上單股的環狀多核糖核苷酸的一個或多個序列可以包括蛋白質或RNA結合位點。在一些實施方式中，基本上單股的環狀多核糖核苷酸序列可以是構象柔性的以允許增加相互作用。在一些實施方式中，有目的地將環狀多核糖核苷酸的序列工程化以包括此類二級結構，從而結合或增加蛋白質或核酸結合。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸基本上係雙股的。在一些實施方式中，基本上雙股的環狀多核糖核苷酸的一個或多個序列可以包括構象識別位點，例如核糖開關或適體酶。在一些實施方式中，基本上雙股的環狀多核糖核苷酸序列可以是構象剛性的。在一些此類實例中，構象剛性序列可能在空間上阻礙環狀多核糖核苷酸結合蛋白質或核酸。在一些實施方式中，有目的地將環狀多核糖核苷酸的序列工程化以包括此類二級結構，從而避免或減少蛋白質或核酸結合。
有16種可能的鹼基對，但是其中的六種（AU、GU、GC、UA、UG、CG）可能形成實際的鹼基對。其餘的稱為不匹配，以極低的頻率出現在螺旋中。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的結構不容易被破壞，不影響其功能且無致命後果，這提供了保持二級結構的選擇。在一些實施方式中，莖的一級結構（即其核苷酸序列）仍可變化，同時仍保持螺旋區。鹼基的性質係高階結構的第二位，且只要它們保留二級結構，就可以進行取代。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有準螺旋結構。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有至少一個具有準螺旋結構的區段。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括富U或富A序列或其組合中的至少一個。在一些實施方式中，富U和/或富A序列以將產生三聯準螺旋結構的方式排列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有雙準螺旋結構。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有一個或多個具有雙準螺旋結構的區段（例如2、3、4、5、6或更多個）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括富C和/或富G的序列中的至少一個。在一些實施方式中，富C和/或富G序列以將產生三聯準螺旋結構的方式排列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有有助於穩定的分子內三聯準螺旋結構。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有兩個準螺旋結構（例如，藉由磷酸二酯鍵隔開），使得它們末端的鹼基對堆疊，並且準螺旋結構變為共線性，導致「同軸堆疊」的子結構。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括具有一個或多個模體的三級結構，例如假結結構、g-四鏈體、螺旋和同軸堆疊。
在國際專利公開號WO 2019/118919的段落[0326]-[0333]中描述了如本文所揭露的環狀多核糖核苷酸的結構的其他實例，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。
作為其環化的結果，環狀多核糖核苷酸可能包括某些使其區別於線性RNA的特徵。例如，與線性RNA相比，環狀多核糖核苷酸不易被核酸外切酶降解。這樣，環狀多核糖核苷酸可以比線性RNA更穩定，尤其是在核酸外切酶存在下孵育時。與線性RNA相比，環狀多核糖核苷酸的穩定性提高，可使環狀多核糖核苷酸作為生產多肽（例如，免疫原）的細胞轉化試劑更加有用。與線性RNA相比，環狀多核糖核苷酸的穩定性提高，可使環狀多核糖核苷酸與線性RNA相比，更易儲存更長時間。可以使用本領域標準之方法測試用核酸外切酶處理的環狀多核糖核苷酸的穩定性，該方法確定是否已經發生RNA降解（例如，藉由凝膠電泳）。
此外，與線性RNA不同，當環狀多核糖核苷酸與磷酸酶諸如小牛腸磷酸酶一起孵育時，環狀多核糖核苷酸可能不太容易去磷酸化。
在一些實施方式中，本文提供的環狀多核糖核苷酸製劑具有比參考物，例如具有相同核苷酸序列但未環化的線性多核糖核苷酸（例如，線性對應物）增加的半衰期。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸對例如核酸外切酶的降解有抗性。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸抗自降解。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少酶促裂解位點，例如dicer裂解位點。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有的半衰期長於參考物（例如線性對應物）至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約100%、至少約120%、至少約140%、至少約150%、至少約160%、至少約180%、至少約200%、至少約300%、至少約400%、至少約500%、至少約600%、至少約700%、至少約800%、至少約900%、至少約1000%或至少約10000%。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸在細胞分裂期間持續存在於細胞中。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸在有絲分裂後持續存在於子細胞中。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸在細胞內複製並傳遞給子細胞。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括介導環狀多核糖核苷酸的自複製的複製元件。在一些實施方式中，複製元件介導環狀多核糖核苷酸轉錄成與環狀多核糖核苷酸互補的線性多核糖核苷酸（線性互補）。在一些實施方式中，線性互補的多核糖核苷酸可以在細胞中體內環化為互補的環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，互補的多核糖核苷酸可以進一步自複製成另一個環狀多核糖核苷酸，該環狀多核糖核苷酸具有與起始環狀多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列。一種示例性自複製元件包括HDV複製結構域（如Beeharry等人,Virol [病毒學], 2014, 450-451: 165-173所述）。在一些實施方式中，細胞以至少25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%的效率將至少一種環狀多核糖核苷酸傳遞至子細胞。在一些實施方式中，正經歷減數分裂的細胞以至少25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%的效率將環狀多核糖核苷酸傳遞至子細胞。在一些實施方式中，正經歷有絲分裂的細胞以至少25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%的效率將環狀多核糖核苷酸傳遞至子細胞。
在國際專利公開號WO 2019/118919的段落[0308]-[0309]中描述了如本文所揭露的環狀多核糖核苷酸的穩定性和半衰期的其他實例，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。修飾
相對於參考序列（尤其是親本多核糖核苷酸），環狀多核糖核苷酸可以包括本揭露範圍內包括的一個或多個取代、插入和/或添加、缺失和共價修飾。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一個或多個轉錄後修飾（例如，加帽、裂解、聚腺苷酸化、剪接、聚A序列、甲基化、醯化、磷酸化、離胺酸和精胺酸殘基的甲基化、乙醯化、以及硫醇基團和酪胺酸殘基的亞硝基化等）。一個或多個轉錄後修飾可以是任何轉錄後修飾，如已經在RNA中鑒定的一百多種不同的核苷修飾中的任一種（Rozenski, J, Crain, P和McCloskey, J. (1999).The RNA Modification Database [RNA修飾數據庫]： 1999 年更新 .Nucl Acids Res [核酸研究] 27: 196-197）。在一些實施方式中，第一分離核酸包括信使RNA（mRNA）。在一些實施方式中，mRNA包括選自下組的至少一個核苷酸：諸如國際專利公開號WO 2019/118919 A1的[0311]中描述的那些，該專利公開藉由援引以其全文併入本文。
環狀多核糖核苷酸可以包括任何有用的修飾，如針對糖、核鹼基或核苷間鍵（例如對連接的磷酸酯/對磷酸二酯鍵/對磷酸二酯主鏈）。嘧啶核鹼基的一個或多個原子可以被視需要取代的胺基、視需要取代的硫醇、視需要取代的烷基（例如甲基或乙基）或鹵代（例如氯代或氟代）替代或取代。在某些實施方式中，在每個糖和核苷間鍵中存在修飾（例如，一個或多個修飾）。修飾可以是對去氧核糖核酸（DNA）、蘇糖核酸（TNA）、乙二醇核酸（GNA）、肽核酸（PNA）、鎖核酸（LNA）或其雜交體的核糖核酸（RNA）修飾。本文描述了其他修飾。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括至少一種N(6)甲基腺苷（m6A）修飾以增加翻譯效率。在一些實施方式中，N(6)甲基腺苷（m6A）修飾可降低環狀多核糖核苷酸的免疫原性（例如，降低免疫或炎性反應的一種或多種標誌物的水平）。
在一些實施方式中，修飾可以包括化學或細胞誘導的修飾。例如，細胞內RNA修飾的一些非限制性實例如Lewis和Pan, 「RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions [核糖核酸的修飾和結構共同引導核糖核酸和蛋白的相互作用]」, Nat Reviews Mol Cell Biol [自然評論：分子細胞生物學], 2017, 18: 202-210所述。
在一些實施方式中，對環狀多核糖核苷酸的核糖核苷酸的化學修飾可以增強免疫逃避。環狀多核糖核苷酸可以藉由本領域眾所周知之方法合成和/或修飾，如在Current protocols in nucleic acid chemistry [核酸化學現行方案], Beaucage, S.L等人（編輯）, 美國紐約州紐約約翰威利公司（John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA）（藉由援引以其全文特此併入本文）中描述的那些方法。修飾包括例如端部修飾，如5'端修飾（磷酸化（單、二和三磷酸化）、軛合、反向連接等）、3'端修飾（軛合、DNA核苷酸、反向連接等）、鹼基修飾（例如，用穩定的鹼基、不穩定的鹼基或與擴展的親本庫鹼基配對的鹼基替代）、鹼基去除（脫鹼基核苷酸）或鹼基軛合。經修飾的核糖核苷酸鹼基還可以包括5-甲基胞苷和假尿苷。在一些實施方式中，舉幾個功能作用，鹼基修飾可以調節環狀多核糖核苷酸的表現、免疫反應、穩定性、亞細胞定位。在一些實施方式中，修飾包括雙正交核苷酸，例如非天然鹼基。參見例如Kimoto等人, Chem Commun (Camb) [化學通訊（劍橋）], 2017, 53: 12309, DOI: 10.1039/c7cc06661a，其藉由援引以其全文特此併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的一個或多個核糖核苷酸的糖修飾（例如在2'位置或4'位置）或糖替代以及主鏈修飾可以包括磷酸二酯鍵的修飾或替代。環狀多核糖核苷酸的具體實例包括但不限於包括經修飾的主鏈或非天然核苷間鍵（如核苷間修飾，包括磷酸二酯鍵的修飾或替代）的環狀多核糖核苷酸。具有經修飾的主鏈的環狀多核糖核苷酸尤其包括在主鏈中不具有磷原子的那些。出於本申請的目的，並且如本領域中有時提及的，在其核苷間主鏈中不具有磷原子的經修飾的RNA也可以被認為係寡核苷。在特定的實施方式中，環狀多核糖核苷酸將包括在其核苷間主鏈中具有磷原子的核糖核苷酸。
經修飾的環狀多核糖核苷酸主鏈可以包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯（如3'-伸烷基膦酸酯和手性膦酸酯）、亞膦酸酯、胺基磷酸酯（如3'-胺基胺基磷酸酯和胺基烷基胺基磷酸酯）、硫羰基胺基磷酸酯（thionophosphoramidate）、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、和具有正常3'-5'鍵的硼烷磷酸酯，該等的2'-5'連接的類似物，以及具有相反極性的那些，其中相鄰的核苷單元對3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'連接。也包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以帶負電荷或帶正電荷。
可摻入環狀多核糖核苷酸中的經修飾的核苷酸可在核苷間鍵（例如磷酸酯主鏈）上被修飾。在此，在多核苷酸主鏈的上下文中，短語「磷酸酯」和「磷酸二酯」可互換使用。可以藉由用不同的取代基替代一個或多個氧原子來修飾主鏈磷酸酯基團。此外，經修飾的核苷和核苷酸可以包括用如本文所述之另一個核苷間鍵合進行的對未修飾的磷酸酯部分的整體替代。經修飾的磷酸酯基團的實例包括但不限於硫代磷酸酯、亞磷酸硒酸酯、硼酸磷酸酯、硼酸磷酸酯、氫膦酸酯、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的兩個非連接氧都被硫替代。也可以藉由用氮（橋連的胺基磷酸酯）、硫（橋連的硫代磷酸酯）和碳（橋連的亞甲基膦酸酯）替代連接氧來修飾磷酸酯連接子。
提供a-硫代取代的磷酸酯部分以藉由非天然硫代磷酸酯主鏈鍵賦予RNA和DNA聚合物穩定性。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增強的核酸酶抗性，並因此在細胞環境中具有更長的半衰期。與環狀多核糖核苷酸連接的硫代磷酸酯有望藉由減弱細胞先天免疫分子的結合/激活來降低先天免疫反應。
在特定的實施方式中，經修飾的核苷包括α-硫代-核苷（例如5'-O-(1-硫代磷酸)-腺苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-胞苷（α-硫代胞苷）、5'-O-(1-硫代磷酸)-鳥苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-尿苷或5'-O-(1-硫代磷酸)-假尿苷）。
本文描述了可根據本揭露使用的其他核苷間鍵，包括不包含磷原子的核苷間鍵。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括一種或多種細胞毒性核苷。例如，細胞毒性核苷可以被摻入環狀多核糖核苷酸中，如雙功能修飾。細胞毒性核苷可以包括但不限於阿糖腺苷、5-氮雜胞苷、4'-硫代阿糖胞苷、環戊烯基胞嘧啶、克拉屈濱、氯法拉濱、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷、1-(2-C-氰基-2-去氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)-胞嘧啶、地西他濱、5-氟尿嘧啶、氟達拉濱、氟尿苷、吉西他濱、替加氟和尿嘧啶的組合、替加氟（(RS)-5-氟-1-(四氫呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮）、曲沙他濱、替紮西他濱、2'-去氧-2'-亞甲基胞苷（DMDC）和6-巰基嘌呤。其他實例包括氟達拉濱磷酸酯、N4-山崳醯基-1-β-D-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、N4-十八烷基-1-β-D-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、N4-棕櫚醯基-1-(2-C-氰基-2-去氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)胞嘧啶和P-4055（阿糖胞苷5'-花生酸酯）。
環狀多核糖核苷酸可以沿著分子的整個長度均一地修飾或可以不如此。例如，一種或多種或所有類型的核苷酸（例如，天然存在的核苷酸、嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C、I、pU中的任一種或多種或全部）在環狀多核糖核苷酸中，或在其給定的預定序列區域中可以被均一地修飾或可以不如此。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括假尿苷。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括肌苷，相對於病毒RNA，肌苷可以説明免疫系統將環狀多核糖核苷酸表徵為內源性。肌苷的摻入還可以介導改善RNA穩定性/減少降解。參見例如Yu, Z等人, (2015) RNA editing by ADAR1 marks dsRNA as 「self」 [藉由ADAR1進行的RNA編輯將dsRNA標記為「自身」]. Cell Res [細胞研究]. 25, 1283-1284，其藉由援引以其全文併入本文。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸（或其給定序列區域）中的所有核苷酸均被修飾。在一些實施方式中，修飾可以包括可增強表現的m6A；可減弱免疫反應的肌苷；可增加RNA穩定性、翻譯通讀（交錯元件）的假尿苷；可增加穩定性的m5C；以及有助於亞細胞易位（例如，核定位）的2,2,7-三甲基鳥苷。
在環狀多核糖核苷酸的各個位置上可以存在不同的糖修飾、核苷酸修飾和/或核苷間鍵合（例如主鏈結構）。熟悉該項技術者將理解，核苷酸類似物或其他一個或多個修飾可以位於環狀多核糖核苷酸的任何一個或多個位置，使得環狀多核糖核苷酸的功能基本上不降低。修飾也可以是非編碼區域修飾。環狀多核糖核苷酸可以包含約1%至約100%的經修飾核苷酸（相對於總核苷酸含量，或相對於一種或多種類型的核苷酸，即A、G、U或C中的任一種或多種）或任何中間百分比（例如，1%至20%＞、1%至25%、1%至50%、1%至60%、1%至70%、1%至80%、1%至90%、1%至95%、10%至20%、10%至25%、10%至50%、10%至60%、10%至70%、10%到80%、10%至90%、10%至95%、10%至100%、20%至25%、20%至50%、20%至60%、20%至70%、20%至80%、20%至90%、20%至95%、20%至100%、50%至60%、50%至70%、50%至80%、50%至90%、50%至95%、50%至100%、70%至80%、70%至90%、70%至95%、70%至100%、80%至90%、80%至95%、80%至100%、90%至95%、90%至100%和95%至100%）。結構
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括高階結構，例如二級或三級結構。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的互補區段將其自身折疊成雙股區段，與氫鍵結合配對（例如，A-U和C-G）。在一些實施方式中，螺旋，也稱為莖，在分子內形成，具有連接至端環的雙股區段。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有至少一個具有準雙股二級結構的區段。在一些實施方式中，具有準雙股二級結構的區段具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個配對的核苷酸。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有一個或多個具有準雙股二級結構的區段（例如2、3、4、5、6或更多個）。在一些實施方式中，區段被3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個核苷酸隔開。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的一個或多個序列包括基本上單股的與雙股的區域。在一些實施方式中，單股與雙股的比率可以影響環狀多核糖核苷酸的功能。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的一個或多個序列基本上係單股的。在一些實施方式中，基本上單股的環狀多核糖核苷酸的一個或多個序列可以包括蛋白質或RNA結合位點。在一些實施方式中，基本上單股的環狀多核糖核苷酸序列可以是構象柔性的以允許增加相互作用。在一些實施方式中，有目的地將環狀多核糖核苷酸的序列工程化以包括此類二級結構，從而結合或增加蛋白質或核酸結合。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有至少一個結合位點，例如，至少一個蛋白質結合位點、至少一個miRNA結合位點、至少一個lncRNA結合位點、至少一個tRNA結合位點、至少一個rRNA結合位點、至少一個snRNA結合位點、至少一個siRNA結合位點、至少一個piRNA結合位點、至少一個snoRNA結合位點、至少一個snRNA結合位點、至少一個exRNA結合位點、至少一個scaRNA結合位點、至少一個Y RNA結合位點、至少一個hnRNA結合位點和/或至少一個tRNA模體。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸構造為包括高階結構，諸如國際專利公開號WO 2019/118919 A1中描述的那些，該專利公開藉由援引以其全文併入本文。生產方法
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括非天然存在的去氧核糖核酸序列，並且可以使用重組技術（例如，使用DNA質體體外衍生）或化學合成或其組合產生。
在本揭露之範圍內，用於產生RNA環的DNA分子可以包括天然存在的原始核酸序列的DNA序列、其修飾形式或編碼通常未在自然中發現的合成多肽的DNA序列（例如，嵌合分子或融合蛋白，諸如包括多種免疫原的融合蛋白）。DNA和RNA分子可以使用多種技術修飾，包括但不限於經典誘變技術和重組技術，如定點誘變、化學處理核酸分子以誘導突變、限制性酶裂解核酸片段、連接核酸片段、聚合酶鏈式反應（PCR）擴增和/或誘變核酸序列的選定區域、合成寡核苷酸混合物以及連接混合物基團以「建造」核酸分子混合物、及其組合。
環狀多核糖核苷酸可以根據任何可用的技術製備，該等技術包括但不限於化學合成和酶促合成。在一些實施方式中，線性初級構建體或線性mRNA可被環化或連環化以產生本文所述之環狀多核糖核苷酸。環化或連環化的機制可以藉由諸如但不限於化學、酶促、夾板連接或核酶催化之方法來發生。新形成的5'-/3'-鍵可以是分子內鍵或分子間鍵。
製備本文所述之環狀多核糖核苷酸之方法描述於例如以下參考文獻中：Khudyakov & Fields, Artificial DNA:Methods and Applications [人工DNA：方法與應用], CRC出版社（2002）；Zhao, Synthetic Biology:Tools and Applications [合成生物學：工具和應用],（第一版）, 學術出版社（Academic Press）（2013）；以及Egli & Herdewijn,Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids [人工核酸的化學與生物學],（第一版）, Wiley-VCH（2012）。
多種合成環狀多核糖核苷酸之方法也在本領域中進行了描述（參見例如，美國專利號US 6210931、美國專利號US 5773244、美國專利號US 5766903、美國專利號US 5712128、美國專利號US 5426180、美國公開號US 20100137407、國際公開號WO 1992001813和國際公開號WO 2010/084371；其各自的內容藉由援引以其全文併入本文）。環化
在一些實施方式中，用於環化的線性多核糖核苷酸可以被環化或連環化。在一些實施方式中，用於環化的線性多核糖核苷酸可以在配製和/或遞送之前在體外環化。在一些實施方式中，用於環化的線性多核糖核苷酸可以在細胞內環化。細胞外環化
在一些實施方式中，使用化學方法環化或連環化用於環化的線性多核糖核苷酸以形成環狀多核糖核苷酸。在一些化學方法中，核酸（例如，用於環化的線性多核糖核苷酸）的5'-末端和3'-末端包括化學反應性基團，當基團彼此靠近時，可在分子的3'-末端和5'-末端之間形成新的共價鍵。5'-端可以含有NHS酯反應性基團，且3'-端可以含有3'-胺基末端的核苷酸，使得在有機溶劑中，線性RNA分子3'-端上的3'-胺基末端的核苷酸將在5'-NHS-酯部分上經歷親核攻擊，形成新的5'-/3'-醯胺鍵。
在一些實施方式中，使用DNA或RNA連接酶將5'-磷酸化的核酸分子（例如，用於環化的線性多核糖核苷酸）酶促連接至核酸（例如，線性核酸）的3'-羥基，形成新的磷酸二酯鍵。在示例性反應中，根據製造商的方案，將用於環化的線性多核糖核苷酸與1-10單位的T4 RNA連接酶（新英格蘭生物學實驗室公司（New England Biolabs），麻塞諸塞州伊普斯威奇（Ipswich, MA））在37°C下孵育1小時。連接反應可以在存在線性核酸時發生，該線性核酸能夠與並列的5'-和3'-區域鹼基配對，以輔助酶促連接反應。在一些實施方式中，連接係夾板連接。例如，夾板連接酶，如SplintR®連接酶，可用於夾板連接。對於夾板連接，單股多核苷酸（夾板），如單股RNA，可以被設計成與線性多核糖核苷酸的兩個末端雜交，使得在與單股夾板雜交時可以將兩個末端並列。因此，夾板連接酶可以催化線性多核糖核苷酸並列的兩個末端的連接，生成環狀多核糖核苷酸。
在一些實施方式中，DNA或RNA連接酶用於環狀多核苷酸的合成。在一些實施方式中，用於環化的線性多核糖核苷酸的5'-末端或3'-末端可編碼連接酶核酶序列，使得在體外轉錄期間，所得用於環化的線性多核糖核苷酸包括活性核酶序列，該活性核酶序列能夠連接用於環化的線性多核糖核苷酸的5'-末端至用於環化的線性多核糖核苷酸的3'-末端。連接酶核酶可以衍生自第I組內含子、D型肝炎病毒、髮夾核酶，或者可以藉由SELEX（藉由指數富集進行的配位基系統進化）進行選擇。核酶連接酶反應在0°C與37°C之間的溫度下可能需要1小時至24小時。
在一些實施方式中，可藉由使用至少一個非核酸部分將用於環化的線性多核糖核苷酸環化或連環化。在一方面，該至少一個非核酸部分可與用於環化的線性多核糖核苷酸的5'端附近和/或3'端附近的區域或特徵反應，以環化或連環化用於環化的線性多核糖核苷酸。在另一方面，該至少一個非核酸部分可以位於或連接至或鄰近用於環化的線性多核糖核苷酸的5'端和/或3'端。設想的非核酸部分可以是同源或異源的。作為一個非限制性實例，非核酸部分可以是鍵，如疏水鍵、離子鍵、可生物降解的鍵和/或可裂解的鍵。作為另一個非限制性實例，非核酸部分係連接部分。作為又一個非限制性實例，非核酸部分可以是寡核苷酸或肽部分，諸如，如本文所述之適體或非核酸連接子。
在一些實施方式中，用於環化的線性多核糖核苷酸由於非核酸部分而被環化或連環化，造成位於、鄰近或連接至用於環化的線性多核糖核苷酸的5'末端和3'末端的原子、分子表面之間的吸引。作為一個非限制性實例，可藉由分子間作用力或分子內作用力將一個或多個用於環化的線性多核糖核苷酸環化或連環化。分子間作用力的非限制性實例包括偶極-偶極力、偶極誘導偶極力、誘導偶極誘導偶極力、范德華力和倫敦色散力。分子內作用力的非限制性實例包括共價鍵、金屬鍵、離子鍵、共振鍵、抓氫鍵（agnostic bond）、偶極鍵、軛合、超軛合和反向鍵。
在一些實施方式中，用於環化的線性多核糖核苷酸可在5'端附近和3'端附近包含核酶RNA序列。當序列暴露於核酶的其餘部分時，核酶RNA序列可以共價地連接至肽。在一方面，共價連接至5'端和3'端附近的核酶RNA序列的肽可以彼此締合，引起用於環化的線性多核糖核苷酸環化或連環化。在另一方面，肽共價地連接至核酶RNA序列5'末端和3'末端附近可以引起線性初級構建體或線性mRNA在使用本領域已知之方法（諸如但不限於蛋白連接）進行連接後環化或連環化。用於本揭露之線性初級構建體或線性RNA中的核酶的非限制性實例，或摻入和/或共價連接肽之方法的非窮舉列表在美國專利申請號US 20030082768中描述，該專利內容藉由援引以其全文併入本文。
在一些實施方式中，用於環化的線性多核糖核苷酸可以包括核酸的5'三磷酸，例如藉由使5'三磷酸與RNA 5'焦磷酸水解酶（RppH）或ATP二磷酸水解酶（脫磷酸酶）接觸使其轉化為5'單磷酸。替代性地，將用於環化的線性多核糖核苷酸的5'三磷酸轉化為5'單磷酸可藉由兩步反應完成，該兩步反應包括：(a) 使用於環化的線性多核糖核苷酸的5'核苷酸與磷酸酶（例如，熱敏磷酸酶、蝦鹼性磷酸酶或小牛腸磷酸酶）接觸以除去所有三個磷酸；以及 (b) 在步驟 (a) 之後，使5'核苷酸與添加單個磷酸酯的激酶（例如，多核苷酸激酶）接觸。
在一些實施方式中，本文提供的環化方法的環化效率為至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或100%。在一些實施方式中，本文提供的環化方法的環化效率為至少約40%。在一些實施方式中，所提供的環化方法的環化效率介於約10%至約100%之間；例如，環化效率可為約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%和約99%。在一些實施方式中，環化效率介於約20%至約80%之間。在一些實施方式中，環化效率介於約30%至約60%之間。在一些實施方式中，環化效率為約40%。剪接元件
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個剪接元件。在國際專利公開號WO 2019/118919的段落[0270]-[0275]中描述了示例性剪接元件，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個剪接元件。在本文提供的環狀多核糖核苷酸中，剪接元件可以是可以介導環狀多核糖核苷酸的剪接的完整剪接元件。替代性地，剪接元件也可以是來自完成的剪接事件的剩餘剪接元件。例如，在一些情況下，線性多核糖核苷酸的剪接元件可介導導致線性多核糖核苷酸環化的剪接事件，從而所得的環狀多核糖核苷酸包含來自此類剪接介導的環化事件的剩餘剪接元件。在一些情況下，剩餘剪接元件無法介導任何剪接。在其他情況下，剩餘剪接元件在某些情況下仍可以介導剪接。在一些實施方式中，剪接元件與至少一個表現序列相鄰。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與每個表現序列相鄰的剪接元件。在一些實施方式中，剪接元件在每個表現序列的一側或兩側，導致例如一種或多種肽和/或一種或多種多肽的表現產物的隔開。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括內部剪接元件，該剪接元件在被複製時，剪接端部被連接在一起。一些實例可以包括具有剪接位點序列和短反向重複序列（30-40 nt）的微型內含子（＜ 100 nt），如AluSq2、AluJr和AluSz、側接內含子中的反向序列、側接內含子中的Alu元件以及在接近反向剪接事件的（suptable4富集模體）順式序列元件中發現的模體，如帶有側接外顯子的反向剪接位點（backsplice site）之前（上游）或之後（下游）200 bp中的序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個本文其他處所述之重複核苷酸序列作為內部剪接元件。在此類實施方式中，重複核苷酸序列可以包括來自Alu家族內含子的重複序列。在一些實施方式中，剪接相關的核糖體結合蛋白可以調控環狀多核糖核苷酸的生物發生（例如，盲肌蛋白和震動蛋白（QKI）剪接因子）。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括側接環狀多核糖核苷酸的頭尾接合點處的典範剪接位點。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括隆起-螺旋-隆起模體，包含兩個3-核苷酸隆起側接的4-鹼基對莖。裂解發生在隆起區域的一個位點處，生成末端為5′-羥基和2′,3′-環狀磷酸酯的特徵片段。藉由將5′-OH基團親核攻擊到形成3′,5′-磷酸二酯橋的同一分子的2′,3′-環狀磷酸酯上來進行環化。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括具有HPR元件的多聚重複RNA序列。HPR包含2′,3′-環狀磷酸酯和5′-OH端。HPR元件自加工用於環化的線性多核糖核苷酸的5′-末端和3′-末端，從而將該等末端連接在一起。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括自剪接元件。例如，環狀多核糖核苷酸可以包括來自藍細菌魚腥藻（Anabaena）的內含子。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括介導自連接的序列。在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括HDV序列（例如，HDV複製結構域保守序列，GGCUCAUCUCGACAAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCAAGUUCGAGCAUGAGCC（SEQ ID NO: 5）或GGCUAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCGAGCC（SEQ ID NO: 6），以進行自連接。在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括環E序列（例如在PSTVd中）以進行自連接。在另一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括自環化內含子，例如5′和3’剪接接合，或自環化催化內含子，如I型、II型或III型內含子。I型內含子自剪接序列的非限制性實例可以包括源自T4噬菌體基因td的自剪接置換內含子-外顯子序列和四膜蟲的插入序列（IVS）rRNA。其他環化方法
在一些實施方式中，用於環化的線性多核糖核苷酸可以包括互補序列，包括個體內含子內或側接內含子內的重複或非重複核酸序列。重複核酸序列係在環狀多核糖核苷酸的區段內出現的序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括重複核酸序列。在一些實施方式中，重複核苷酸序列包括聚CA序列或聚UG序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與環狀多核糖核苷酸的另一區段中的互補重複核酸序列雜交的至少一個重複核酸序列，其雜交的區段形成內部雙股。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與環狀多核糖核苷酸的另一區段中的互補重複核酸序列雜交的1至10個（例如，2、3、4、5、6、7、8、9和10個）重複核酸序列，其雜交的區段形成內部雙股。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與環狀多核糖核苷酸的另一區段中的互補重複核酸序列雜交的2個重複核酸序列，其雜交的區段形成內部雙股。在一些實施方式中，兩個單獨的環狀多核糖核苷酸的重複核酸序列和互補重複核酸序列雜交以生成單個環化多核糖核苷酸，雜交的區段形成內部雙股。在一些實施方式中，互補序列位於用於環化的線性多核糖核苷酸的5’末端和3’末端。在一些實施方式中，互補序列包括約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個配對的核苷酸。
在一些實施方式中，環化化學方法可用於生成環狀多核糖核苷酸。此類方法可以包括但不限於點擊化學（例如，基於炔烴和疊氮化物之方法，或可點擊的鹼基）、烯烴複分解、胺基磷酸酯連接、半亞胺-亞胺交聯、鹼基修飾及其任何組合。
在一些實施方式中，環化酶促方法可用於生成環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，連接酶，例如DNA或RNA連接酶，可用於生成環狀多核糖核苷酸或互補物的模板、環狀多核糖核苷酸的互補股或環狀多核糖核苷酸。
環狀多核糖核苷酸的環化可以藉由本領域已知之方法完成，例如，Petkovic和Muller, 「RNA circularization strategies in vivo and in vitro [體內外核糖核酸環化策略]」 Nucleic Acids Res [核酸研究], 2015, 43 (4): 2454-2465，和Muller和Appel, 「In vitro circularization of RNA [核糖核酸的體外環化]」 RNA Biol [RNA生物學], 2017, 14 (8): 1018-1027中描述的那些方法。
環狀多核糖核苷酸可編碼可用於複製的序列和/或模體。在國際專利公開號WO 2019/118919的段落[0280]-[0286]中描述了示例性複製元件，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。環狀多核糖核苷酸的純化
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸係純化的，例如，去除了游離核糖核酸、線性或帶切口的RNA、DNA、蛋白質等。在一些實施方式中，可以藉由本領域通常使用的任何已知方法純化環狀多核糖核苷酸。純化方法的非限制性實例包括柱層析法、凝膠切除、尺寸排阻等。遞送
本文所述之環狀或線性多核糖核苷酸也可以包括在含載劑或不含載劑的藥物組成物中。
本文所述之藥物組成物可以是配製的，例如包含載劑（諸如藥物載劑和/或聚合物載劑，例如脂質體），並藉由已知方法遞送至有需要的受試者（例如人或非人農業動物或家畜，例如牛、狗、貓、馬、家禽）。此類方法包括但不限於轉染（例如脂質介導的陽離子聚合物、磷酸鈣、樹狀聚合物）；電穿孔或其他破壞膜之方法（例如核轉染）、病毒遞送（例如慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒、AAV）、顯微注射、微粒轟擊（「基因槍」）、fugene、直接聲波載入、細胞擠壓、光轉染、原生質體融合、刺穿感染、磁轉染、外來體介導的轉移、脂質奈米顆粒介導的轉移及其任何組合。遞送方法也描述於例如Gori等人, Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy [人類基因治療用CRISPR/Cas9基因組編輯技術的傳遞和特異性]. Human Gene Therapy [人類基因治療]. 2015年7月, 26 (7): 443-451. doi: 10.1089/hum.2015.074; 和Zuris等人, Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editingin vitro andin vivo [陽離子脂質介導的蛋白質遞送能夠在體外和體內進行有效的基於蛋白質的基因組編輯]. Nat Biotechnol [自然－生物技術]. 2014年10月30日; 33 (1): 73-80。
在一些實施方式中，可以以「裸」遞送配製物遞送環狀或線性多核糖核苷酸。裸遞送配製物將環狀多核糖核苷酸遞送至細胞，無需借助於載劑並且無需對環狀或線性多核糖核苷酸進行共價修飾，也無需對環狀或線性多核糖核苷酸進行部分或完全包封。
裸遞送配製物係不含載劑的配製物並且其中環狀或線性多核糖核苷酸沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾，並且環狀或線性多核糖核苷酸沒有部分或完全包封。在一些實施方式中，沒有與有助於遞送至細胞的部分結合的共價修飾的環狀或線性多核糖核苷酸可以是未與諸如蛋白質、小分子、顆粒、聚合物或有助於遞送至細胞的生物聚合物的部分共價結合的多核糖核苷酸。在一些實施方式中，可以將環狀或線性多核糖核苷酸與魚精蛋白或魚精蛋白鹽（例如硫酸魚精蛋白）一起在遞送配製物中遞送。
沒有與有助於遞送至細胞的部分結合的共價修飾的多核糖核苷酸可以不含經修飾的磷酸基團。例如，沒有與有助於遞送至細胞的部分結合的共價修飾的多核糖核苷酸可以不含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸鹽、硼代磷酸酯、磷酸氫鹽、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。
在一些實施方式中，裸遞送配製物可以不含以下任何或全部物質：轉染試劑、陽離子載劑、碳水化合物載劑、奈米顆粒載劑或蛋白質載劑。例如，裸遞送配製物可以不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐改性的植物糖原β-糊精、脂轉染胺（lipofectamine）、聚乙烯亞胺、聚(三甲基亞胺)、聚(四甲基亞胺)、聚丙烯亞胺、胺基糖苷-聚胺、雙去氧-二胺基-b-環糊精、精胺、亞精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基胺基)乙酯、聚(離胺酸)、聚(組胺酸)、聚(精胺酸)、陽離子明膠、樹狀聚合物、殼聚糖、1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷（DOTAP）、N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨（DOTMA）、1-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑鎓氯化物（DOTIM）、2,3-二油醯氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-三氟乙酸丙銨（DOSPA）、3B-[N-(N,N'-二甲胺基乙烷)-胺基甲醯基]膽固醇鹽酸鹽（DC-膽固醇鹽酸鹽）、二-十七烷基胺基甘胺醯基亞精胺（DOGS）、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨（DDAB）、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨（DMRIE）、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨（DODAC）、人血清白蛋白（HSA）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）或球蛋白。
裸遞送配製物可以包含非載劑賦形劑。在一些實施方式中，非載劑賦形劑可以包括不表現出活性細胞穿透作用的非活性成分。在一些實施方式中，非載劑賦形劑可以包括緩衝劑，例如PBS。在一些實施方式中，非載劑賦形劑可以是溶劑、非水溶劑、稀釋劑、助懸劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、透明質酸酶、分散劑、成粒劑、崩散劑、黏合劑、緩衝劑、潤滑劑或油。
在一些實施方式中，裸遞送配製物可以包含稀釋劑，諸如腸胃外可接受的稀釋劑。稀釋劑（例如，腸胃外可接受的稀釋劑）可以是液體稀釋劑或固體稀釋劑。在一些實施方式中，稀釋劑（例如，腸胃外可接受的稀釋劑）可以是RNA增溶劑、緩衝劑或等滲劑。RNA增溶劑的實例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲醯胺和2-丙醇。緩衝劑的實例包括2-(N-𠰌啉代)乙磺酸（MES）、Bis-Tris、2-[(2-胺基-2-側氧基乙基)-(羧甲基)胺基]乙酸（ADA）、N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙烷磺酸（ACES）、哌𠯤-N,N′-雙(2-乙磺酸)（PIPES）、2-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]乙磺酸（TES）、3-(N-𠰌啉代)丙烷磺酸（MOPS）、4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤乙磺酸（HEPES）、Tris、Tricine、Gly-Gly、Bicine或磷酸鹽。等滲劑的實例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖或蔗糖。
在一些實施方式中，如本文揭露的藥物製劑、如本文揭露的藥物組成物、如本文揭露的原料藥或如本文揭露的藥物產品處於腸胃外核酸遞送系統中。腸胃外核酸遞送系統可以包括如本文揭露的藥物製劑、如本文揭露的藥物組成物、所揭露的原料藥或如本文揭露的藥物產品和腸胃外可接受的稀釋劑。在一些實施方式中，腸胃外核酸遞送系統中的如本文揭露的藥物製劑、如本文揭露的藥物組成物、如本文揭露的原料藥或如本文揭露的藥物產品不含任何載劑。
本揭露進一步關於包含本文所述之環狀或線性多核糖核苷酸的宿主或宿主細胞。在一些實施方式中，宿主或宿主細胞係脊椎動物、哺乳動物（例如人）或其他生物體或細胞。
在一些實施方式中，與由參考化合物（例如對應於所述環狀多核糖核苷酸的線性多核苷酸或缺少加密原的環狀多核糖核苷酸）觸發的反應相比，環狀多核糖核苷酸降低或不能產生宿主免疫系統的不需要的反應。在實施方式中，環狀多核糖核苷酸在宿主中是非免疫原性的。一些免疫反應包括但不限於體液免疫反應（例如，免疫原特異性抗體的產生）和細胞介導的免疫反應（例如，淋巴細胞增殖）。
在一些實施方式中，使宿主或宿主細胞接觸（例如，遞送或投與）環狀多核糖核苷酸或線性多核糖核苷酸。在一些實施方式中，宿主係哺乳動物，諸如人。可以在投與後的任何時間測量宿主中環狀多核糖核苷酸或線性多核糖核苷酸、表現產物或兩者的量。在某些實施方式中，測定培養物中宿主生長的時程。如果在環狀多核糖核苷酸或線性多核糖核苷酸的存在下生長增加或減少，則環狀多核糖核苷酸或表現產物或兩者都被認為在增加或減少宿主的生長方面係有效的。
將如本文所述之環狀或線性多核糖核苷酸分子遞送至細胞、組織或受試者之方法包括將如本文所述之藥物組成物、原料藥或藥物產品投與於細胞、組織或受試者。
在一些實施方式中，細胞係真核細胞。在一些實施方式中，細胞係哺乳動物細胞。在一些實施方式中，細胞係有蹄動物細胞。在一些實施方式中，細胞係動物細胞。在一些實施方式中，細胞係免疫細胞。在一些實施方式中，組織係結締組織、肌肉組織、神經組織或上皮組織。在一些實施方式中，組織係器官（例如，肝、肺、脾、腎等）。
在一些實施方式中，遞送方法係體內方法。例如，如本文所述之環狀多核糖核苷酸的遞送方法包括向有需要的受試者腸胃外投與，將如本文所述之藥物組成物、原料藥或藥物產品經腸胃外投與給有需要的受試者。再如，將環狀多核糖核苷酸遞送至受試者的細胞或組織之方法包括將如本文所述之藥物組成物、原料藥或藥物產品腸胃外投與至該細胞或組織。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的量在受試者中有效地引發生物反應。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的量有效地對受試者的細胞或組織具有生物學作用。在一些實施方式中，如本文所述之藥物組成物、原料藥或藥物產品包含載劑。在一些實施方式中，如本文所述之藥物組成物、原料藥或藥物產品包含稀釋劑而不含任何載劑。
在一些實施方式中，腸胃外投與藥物組成物、原料藥或藥物產品。在一些實施方式中，藥物組成物、原料藥或藥物產品藉由靜脈內、動脈內、腹膜內、皮內、顱內、鞘內、淋巴內、皮下或肌內投與。在一些實施方式中，腸胃外投與係靜脈內、肌內、眼、皮下、皮內或局部投與。
在一些實施方式中，如本文所述之藥物組成物、原料藥或藥物產品經肌內投與。在一些實施方式中，如本文所述之藥物組成物、原料藥或藥物產品經皮下投與。在一些實施方式中，如本文所述之藥物組成物、原料藥或藥物產品局部投與。在一些實施方式中，該藥物組成物、原料藥或藥物產品經氣管內投與。
在一些實施方式中，該藥物組成物、原料藥或藥物產品藉由注射投與。投與可以是全身投與或局部投與。在一些實施方式中，如本文所述之任何遞送方法均用載劑進行。在一些實施方式中，無需借助於載劑或細胞穿透劑即可進行如本文所述之任何遞送方法。
在一些實施方式中，在投與步驟後至少1天、至少2天、至少3天、至少4天或至少5天在細胞、組織或受試者中檢測到環狀多核糖核苷酸或從該環狀多核糖核苷酸翻譯的產物。在一些實施方式中，在投與步驟之前評價細胞、組織或受試者中環狀多核糖核苷酸或從該環狀多核糖核苷酸翻譯的產物的存在。在一些實施方式中，在投與步驟之後評價細胞、組織或受試者中環狀多核糖核苷酸或從該環狀多核糖核苷酸翻譯的產物的存在。配製物
在一些實施方式中，本文揭露的藥物配製物可以包含：(i) 本文揭露的化合物（例如，環狀多核糖核苷酸）；(ii) 緩衝劑；(iii) 非離子型洗滌劑；(iv) 張度劑；和/或 (v) 穩定劑。在一些實施方式中，本文揭露的藥物配製物可以包含：(i) 本文揭露的化合物（例如，線性多核糖核苷酸）；(ii) 緩衝劑；(iii) 非離子型洗滌劑；(iv) 張度劑；和/或 (v) 穩定劑。在一些實施方式中，本文揭露的藥物配製物係穩定的液體藥物配製物。在一些實施方式中，本文揭露的藥物配製物包含魚精蛋白或魚精蛋白鹽（例如，硫酸魚精蛋白）。
本揭露提供了包括上述環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物。本揭露提供了包括上述線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物。本揭露之免疫原性組成物可以包含稀釋劑或載劑、佐劑或其任何組合。本揭露之免疫原性組成物還可以包含一種或多種免疫調節劑，例如一種或多種佐劑。佐劑可以包括下面進一步討論的TH1佐劑和/或TH2佐劑。在一些實施方式中，免疫原性組成物包含不含任何載劑的稀釋劑，並且用於將環狀多核糖核苷酸裸遞送至受試者。在一些實施方式中，免疫原性組成物包含不含任何載劑的稀釋劑，並且用於將線性多核糖核苷酸裸遞送至受試者。
本揭露之免疫原性組成物用於在受試者中引起免疫反應。免疫反應較佳的是保護性的，並且較佳的是涉及抗體反應（通常包括IgG）和/或細胞介導的免疫反應。例如，用包括本揭露之環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物使受試者免疫以誘導免疫反應。再如，用包括含免疫原的線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物使受試者免疫，以刺激與免疫原結合的抗體的產生。藉由該等用途和方法在受試者中引起免疫反應，可以保護受試者免受各種疾病和/或感染，例如免受如上所討論的細菌和/或病毒疾病。在某些實施方式中，免疫原性組成物係疫苗組成物。根據本揭露之疫苗可以是預防性的（即預防感染）或治療性的（即治療感染），但是通常將是預防性的。在一些實施方式中，受試者係哺乳動物。在一些實施方式中，受試者係動物，較佳的是哺乳動物，例如人。在一個實施方式中，受試者係人。在其他實施方式中，受試者係非人哺乳動物，例如選自牛（例如，奶牛和肉牛）、綿羊、山羊、豬、馬、狗或貓。在其他實施方式中，受試者係鳥，例如母雞或公雞、火雞、鸚鵡。在一些實施方式中，動物不是小鼠或兔子或牛。在一個特定實施方式中，在免疫原性組成物用於預防用途的情況下，人係兒童（例如，幼兒或嬰兒）或青少年。在另一個實施方式中，在免疫原性組成物用於治療用途的情況下，人係青少年或成人。旨在用於兒童的免疫原性組成物也可以投與給成人，例如以評估安全性、劑量、免疫原性等。
根據本揭露製備的免疫原性組成物可用於治療兒童和成人。人類受試者可小於1歲、小於5歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。在一個特定實施方式中，接受免疫原性組成物的人類受試者係老年人（例如，≥ 50歲、≥ 60歲和 ≥ 65歲）、年輕人（例如，≤ 5歲）、住院患者、醫護人員、武裝部隊和軍事人員、孕婦、長期病患者或免疫缺陷患者。然而，免疫原性組成物不僅僅適合於該等群組，並且可以更普遍地用於群體中。
在一些實施方式中，受試者進一步用佐劑免疫接種。在一些實施方式中，受試者進一步用疫苗免疫接種。免疫接種
在一些實施方式中，本揭露之方法包括用包含本文揭露的環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物為受試者免疫接種。在一些實施方式中，免疫原由環狀多核糖核苷酸表現。在一些實施方式中，免疫接種在受試者中誘導針對由環狀多核糖核苷酸表現的免疫原的免疫反應。在一些實施方式中，免疫接種在受試者中誘導免疫反應（例如，誘導與由環狀多核糖核苷酸表現的免疫原結合的抗體的產生）。在一些實施方式中，免疫原性組成物在單一組成物中包含環狀多核糖核苷酸和稀釋劑、載劑、第一佐劑或其組合。在一些實施方式中，受試者進一步用第二佐劑免疫接種。在一些實施方式中，受試者進一步用疫苗免疫接種。
在一些實施方式中，本揭露之方法包括用包含本文揭露的線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物為受試者免疫接種。在一些實施方式中，免疫原由線性多核糖核苷酸表現。在一些實施方式中，免疫接種在受試者中誘導針對由線性多核糖核苷酸表現的免疫原的免疫反應。在一些實施方式中，免疫接種誘導與由線性多核糖核苷酸表現的免疫原結合的抗體的產生。在一些實施方式中，免疫接種誘導細胞介導的免疫反應。在一些實施方式中，免疫原性組成物在單一組成物中包含線性多核糖核苷酸和稀釋劑、載劑、第一佐劑或其組合。在一些實施方式中，受試者進一步用第二佐劑免疫接種。在一些實施方式中，受試者進一步用疫苗免疫接種。
受試者用包含任何數量的環狀多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。受試者用例如包含至少1種環狀多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。具有非人源化免疫系統的非人動物用例如包含至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少20種不同的環狀多聚核糖核苷酸或更多種不同的環狀多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用包含至多1種環狀多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人動物用包含至多2種、至多3種、至多4種、至多5種、至多6種、至多7種、至多8種、至多9種、至多10種、至多11種、至多12種、至多13種、至多14種、至多15種、至多20種不同的環狀多聚核糖核苷酸或少於21種不同的環狀多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用包含約1種環狀多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人動物用包含約2種、約3種、約4種、約5種、約6種、約7種、約8種、約9種、約10種、約11種、約12種、約13種、約14種、約15種或約20種不同的環狀多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用包含約1-20、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-20、2-15、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-20、3-15、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-20、4-15、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、4-4、4-3、5-20、5-15、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-10、10-15或15-20種不同的環狀多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。不同的環狀多核糖核苷酸具有彼此不同的序列。例如，它們可以包括或編碼不同的免疫原、重疊的免疫原、相似的免疫原或相同的免疫原（例如，具有相同或不同的調控元件、起始序列、啟動子、終止元件或本揭露之其他元件）。在受試者用包含兩種或更多種不同的環狀多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種的情況下，這兩種或更多種不同的環狀多聚核糖核苷酸可以處於相同或不同的免疫原性組成物中並且同時或在不同時間免疫接種。可以將包含兩種或更多種不同的環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與於相同的解剖位置或不同的解剖位置。
受試者可以用包含任何數量的線性多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。受試者用例如包含至少1種線性多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。具有非人源化免疫系統的非人動物用例如包含至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少20種不同的線性多聚核糖核苷酸或更多種不同的線性多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用包含至多1種線性多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人動物用包含至多2種、至多3種、至多4種、至多5種、至多6種、至多7種、至多8種、至多9種、至多10種、至多11種、至多12種、至多13種、至多14種、至多15種、至多20種不同的線性多聚核糖核苷酸或少於21種不同的線性多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用包含約1種線性多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人動物用包含約2種、約3種、約4種、約5種、約6種、約7種、約8種、約9種、約10種、約11種、約12種、約13種、約14種、約15種或約20種不同的線性多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用包含約1-20、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-20、2-15、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-20、3-15、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-20、4-15、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、4-4、4-3、5-20、5-15、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-10、10-15或15-20種不同的線性多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。不同的線性多核糖核苷酸可以具有彼此不同的序列。例如，它們可以包括或編碼不同的免疫原、重疊的免疫原、相似的免疫原或相同的免疫原（例如，具有相同或不同的調控元件、起始序列、啟動子、終止元件或本揭露之其他元件）。在受試者用包含兩種或更多種不同的線性多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種的情況下，這兩種或更多種不同的線性多聚核糖核苷酸可以處於相同或不同的免疫原性組成物中並且同時或在不同時間免疫接種。可以將包含兩種或更多種不同的線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與於相同的解剖位置或不同的解剖位置。
這兩種或更多種不同的線性多核糖核苷酸可以包括或編碼來自相同來源、不同來源或本文揭露的來源的不同組合的免疫原。這兩種或更多種不同的線性多核糖核苷酸可以包括或編碼來自相同病毒或來自不同病毒（例如，不同分離株）的免疫原。
在一些實施方式中，受試者用如本文揭露的包含任何數量的環狀多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物和包含任何數量的線性多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，本文揭露的免疫原性組成物包含如本文揭露的一種或多種環狀多核糖核苷酸和一種或多種線性多核糖核苷酸。
在一些實施方式中，免疫原性組成物包含環狀多核糖核苷酸和稀釋劑、載劑、第一佐劑或其組合。在一個特定實施方式中，免疫原性組成物包含本文所述之環狀多核糖核苷酸和載劑或不含任何載劑的稀釋劑。在一些實施方式中，包含環狀多核糖核苷酸與不含任何載劑的稀釋劑的免疫原性組成物用於將環狀多核糖核苷酸裸遞送至受試者。在另一個特定實施方式中，免疫原性組成物包含本文所述之環狀多核糖核苷酸和第一佐劑。
在某些實施方式中，進一步向受試者投與第二佐劑。佐劑增強先天免疫反應，繼而增強受試者中的適應性免疫反應。佐劑可以是如下所討論的任何佐劑。在某些實施方式中，佐劑作為免疫原性組成物的一部分與環狀多核糖核苷酸一起配製。在某些實施方式中，佐劑不是包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物的一部分。在某些實施方式中，佐劑與包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物分開投與。在這方面，佐劑與包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物共同投與（例如同時投與）或在不同的時間投與給受試者。例如，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與佐劑。在一些實施方式中，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與佐劑。例如，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與佐劑。在一些實施方式中，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與佐劑。將佐劑投與到與包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物相同的解剖位置或不同的解剖位置。
在一些實施方式中，免疫原性組成物包含線性多核糖核苷酸和稀釋劑、載劑、第一佐劑或其組合。在一個特定實施方式中，免疫原性組成物包含本文所述之線性多核糖核苷酸和載劑或不含任何載劑的稀釋劑。在一些實施方式中，包含線性多核糖核苷酸與不含任何載劑的稀釋劑的免疫原性組成物用於將線性多核糖核苷酸裸遞送至受試者。在另一個特定實施方式中，免疫原性組成物包含本文所述之線性多核糖核苷酸和第一佐劑。
在某些實施方式中，進一步向受試者投與第二佐劑。佐劑增強先天免疫反應，繼而增強受試者中的適應性免疫反應。佐劑可以是如下所討論的任何佐劑。在某些實施方式中，佐劑作為免疫原性組成物的一部分與線性多核糖核苷酸一起配製。在某些實施方式中，佐劑不是包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物的一部分。在某些實施方式中，佐劑與包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物分開投與。在這方面，佐劑與包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物共同投與（例如同時投與）或在不同的時間投與給受試者。例如，在包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與佐劑。在一些實施方式中，在包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與佐劑。例如，在包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與佐劑。在一些實施方式中，在包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與佐劑。將佐劑投與到與包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物相同的解剖位置或不同的解剖位置。
在一些實施方式中，受試者用第二試劑，例如不是環狀多核糖核苷酸的疫苗（如下所述）進一步免疫接種。該疫苗與包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物共同投與（例如同時投與）或在不同的時間投與給受試者。例如，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與該疫苗。在一些實施方式中，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與該疫苗。例如，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與該疫苗。在一些實施方式中，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與該疫苗。
在一些實施方式中，受試者用第二試劑，例如不是線性多核糖核苷酸的疫苗（如下所述）進一步免疫接種。該疫苗與包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物共同投與（例如同時投與）或在不同的時間投與給受試者。例如，在包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與該疫苗。在一些實施方式中，在包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與該疫苗。例如，在包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與該疫苗。在一些實施方式中，在包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與該疫苗。
受試者可以用免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種任何合適的次數，以實現所需的反應。例如，初免-加強免疫接種策略可用於引發全身和/或黏膜免疫。受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種，例如至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次或至少15次或更多次。
在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種，至多2次、至多3次、至多4次、至多5次、至多6次、至多7次、至多8次、至多9次、至多10次、至多15次或至多20次或更少次。
在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20次。
在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種一次。在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種兩次。在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種三次。在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種四次。在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種五次。在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種七次。
可以選擇合適的時間間隔以間隔兩次或更多次免疫接種。該時間間隔可以適用於用相同免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如蛋白質亞基疫苗）或其組合進行多次免疫接種，例如，相同免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如蛋白質亞基疫苗）或其組合可以經由相同的免疫接種途徑或不同的免疫接種途徑以相同的量或不同的量投與。該時間間隔可以適用於用不同免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如蛋白質亞基疫苗）或其組合進行多次免疫接種，例如，不同免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如蛋白質亞基疫苗）或其組合可以經由相同的免疫接種途徑或不同的免疫接種途徑以相同的量或不同的量投與。該時間間隔可適用於用不同試劑，例如，包含第一環狀多核糖核苷酸的第一免疫原性組成物和包含第二環狀多核糖核苷酸的第二免疫原性組成物進行免疫接種。該時間間隔可適用於用不同試劑，例如，包含第一環狀多核糖核苷酸的第一免疫原性組成物和包含蛋白質免疫原（例如，蛋白質亞基）的第二免疫原性組成物進行免疫接種。該時間間隔可以適用於包含第一線性多核糖核苷酸的第一免疫原性組成物和包含第二線性多核糖核苷酸的第二免疫原性組成物。對於包括三次或更多次免疫接種的方案，免疫接種的時間間隔可以相同或不同。在一些實例中，兩次免疫接種之間經過約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、17、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、40、48或72小時。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、17、18、20、21、24、28或30天。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過約1、2、3、4、5、6、7或8週。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過約1、2、3、4、5、6、7或8個月。
在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至少1小時、至少2小時、至少3小時、至少4小時、至少5小時、至少6小時、至少7小時、至少8小時、至少9小時、至少10小時、至少15小時、至少20小時、至少24小時、至少36小時或至少72小時或更長時間。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至多1小時、至多2小時、至多3小時、至多4小時、至多5小時、至多6小時、至多7小時、至多8小時、至多9小時、至多10小時、至多15小時、至多20小時、至多24小時、至多36小時或至多72小時或更少時間。
在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天或至少30天或更長時間。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至多2天、至多3天、至多4天、至多5天、至多6天、至多7天、至多8天、至多9天、至多10天、至多15天、至多20天、至多21天、至多22天、至多23天、至多24天、至多25天、至多26天、至多27天、至多28天、至多29天、至多30天、至多32天、至多34天或至多36天或更少時間。
在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至少1週、至少2週、至少3週、至少4週、至少5週、至少6週、至少7週或至少8週或更長時間。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至多2週、至多3週、至多4週、至多5週、至多6週、至多7週、至多8週或更少時間。
在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月或至少8個月或更長時間。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至多2個月、至多3個月、至多4個月、至多5個月、至多6個月、至多7個月、至多8個月、至多9個月、至多10個月、至多11個月或至多12個月或更少時間。
在一些實施方式中，該方法包括向受試者預投與一種試劑以改善對包含編碼免疫原的序列的環狀多核糖核苷酸的免疫原性反應。在一些實施方式中，該試劑係如本文揭露的免疫原（例如，蛋白質免疫原）。例如，該方法包括在投與包含編碼蛋白質免疫原的序列的環狀多核糖核苷酸前1至7天投與蛋白質免疫原。在一些實施方式中，在投與包括編碼蛋白質免疫原的序列的環狀多核糖核苷酸前1、2、3、4、5、6或7天投與蛋白質免疫原。例如，該方法包括在投與包括編碼蛋白質免疫原的序列的線性多核糖核苷酸前1至7天投與蛋白質免疫原。在一些實施方式中，在投與包含編碼蛋白質免疫原的序列的線性多核糖核苷酸前1、2、3、4、5、6或7天投與蛋白質免疫原。蛋白質免疫原可以作為蛋白質製劑投與，在質體（pDNA）中編碼，存在於病毒樣顆粒（VLP）中，以脂質奈米顆粒的形式配製等。
在一些實施方式中，該方法包括在向受試者投與了包含編碼免疫原的序列的環狀多核糖核苷酸之後，向受試者投與一種試劑以改善對包含編碼免疫原的序列的環狀多核糖核苷酸的免疫原性反應。在一些實施方式中，該試劑係如本文揭露的免疫原（例如，蛋白質免疫原）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含編碼蛋白質免疫原的序列。例如，該方法包括在向受試者投與包含編碼免疫原的序列的環狀多核糖核苷酸的1年內（例如，在11個月、10個月、9個月、8個月、7個月、6個月、5個月、4個月、3個月、2個月和1個月內）投與蛋白質免疫原。在一些實施方式中，該方法包括向受試者投與本文所述之任一種環狀多核糖核苷酸或本文所述之任一種免疫原性組成物和蛋白質亞基。
在一些實施方式中，蛋白質免疫原具有與由環狀多核糖核苷酸編碼的免疫原相同的胺基酸序列。例如，多肽免疫原可對應於由環狀多核糖核苷酸序列編碼的多肽免疫原（例如，與之具有90%、95%、96%、97%、98%或100%的胺基酸序列同一性）。在一些實施方式中，蛋白質免疫原具有與由環狀多核糖核苷酸編碼的免疫原的胺基酸序列不同的胺基酸序列。例如，多肽免疫原與由環狀多核糖核苷酸序列編碼的多肽免疫原具有少於90%（例如，80%、70%、30%、20%或10%）的胺基酸序列同一性。
受試者可以在任何合適數目的解剖部位用免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種。可以將相同的免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合投與於多個解剖部位，可以將包含相同或不同的環狀多核糖核苷酸的不同免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合投與於不同的解剖部位，可以將包含相同或不同的環狀多核糖核苷酸的不同免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合投與於相同的解剖部位，或其任何組合。例如，可以將包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與於兩個不同的解剖部位，和/或可以將包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與於一個解剖部位，並且可以將佐劑投與於不同的解剖部位。可以將相同的免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合投與於多個解剖部位，可以將包括相同或不同的線性多核糖核苷酸的不同免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合投與於不同的解剖部位，可以將包括相同或不同的線性多核糖核苷酸的不同免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合投與於相同的解剖部位，或其任何組合。例如，可以將包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與於兩個不同的解剖部位，和/或可以將包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與於一個解剖部位，並且可以將佐劑投與於不同的解剖部位。
任何兩個或更多個解剖途徑的免疫接種可以經由相同的免疫接種途徑（例如，肌內）或藉由兩個或更多個免疫接種途徑來進行。在一些實施方式中，將本揭露之包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合向受試者的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少6個解剖部位免疫接種。在一些實施方式中，將本揭露之包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合向受試者的至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個或至多10個解剖部位或更少解剖部位免疫接種。在一些實施方式中，將本揭露之包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物或佐劑向受試者的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個解剖部位免疫接種。在一些實施方式中，將本揭露之包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合向受試者的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少6個解剖部位免疫接種。在一些實施方式中，將本揭露之包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合向受試者的至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個或至多10個解剖部位或更少解剖部位免疫接種。在一些實施方式中，將本揭露之包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物或佐劑向受試者的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個解剖部位免疫接種。
免疫接種可以經由任何合適的途徑。免疫接種途徑的非限制性實例包括靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、真皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外、胸骨內、腦內、眼內、病灶內、腦室內、腦池內或實質內，例如注射和輸注。在一些情況下，免疫接種可以經由吸入進行。可以藉由相同或不同的途徑進行兩次或更多次免疫接種。
可以向本揭露之受試者投與任何適量的環狀多核糖核苷酸。例如，受試者可以用至少約1 ng、至少約10 ng、至少約100 ng、至少約1 μg、至少約10 μg、至少約100 μg、至少約1 mg、至少約10 mg、至少約100 mg或至少約1 g的環狀多核糖核苷酸免疫接種。在一些實施方式中，受試者可以用至多約1 ng、至多約10 ng、至多約100 ng、至多約1 μg、至多約10 μg、至多約100 μg、至多約1 mg、至多約10 mg、至多約100 mg或至多約1 g的環狀多核糖核苷酸免疫接種。在一些實施方式中，受試者可以用約1 ng、約10 ng、約100 ng、約1 μg、約10 μg、約100 μg、約1 mg、約10 mg、約100 mg或約1 g的環狀多核糖核苷酸免疫接種。
在一些實施方式中，該方法進一步包括評價受試者對免疫原的抗體反應。在一些實施方式中，評價係在投與包含編碼免疫原的序列的環狀多核糖核苷酸之前和/或之後。在一些實施方式中，評價係在投與包含編碼免疫原的序列的線性多核糖核苷酸之前和/或之後。
在一些實施方式中，將本文所述之環狀多核糖核苷酸、免疫原性組成物、藥物製劑或藥物組成物根據表1中提供的給藥時間表投與於出生至15個月之間的受試者，或根據表2的給藥時間表投與於18個月至18歲之間的受試者。給藥可以根據本領域已知的給藥時間表進行，例如，如疾病控制和預防中心（CDC）或美國國立衛生研究院（NIH）所述。表1和表2提供了截至2020年8月29日CDC網站上指示的某些病症的疫苗接種給藥時間表的簡要匯總。 [表1]. 出生至15個月給藥
適應症 （疫苗） 出生 1 個月 2 個月 4 個月 6 個月 9 個月 12 個月 15 個月
B型肝炎 （HepB） 第1劑 第2劑    第3劑
麻疹、腮腺炎、風疹（MMR）；水痘（VAR）                   第1劑
甲型肝炎 （HepA）                   連續2劑
輪狀病毒 （RV1或RV5）       第1劑 第2劑 第3劑*         
白喉、破傷風、無細胞百日咳（DTap）       第1劑 第2劑 第3劑       第4劑
乙型流感嗜血桿菌（Hib）       第1劑 第2劑 第3劑*    第3劑或第4劑
肺炎球菌結合疫苗（PCV13）       第1劑 第2劑 第3劑    第4劑
滅活脊髓灰質炎疫苗（IPV）       第1劑 第2劑 第3劑
流感（IIV）             每年接種1劑或2劑疫苗
*視需要 [表2]. 18個月至18歲給藥
疫苗 18 個月 19-23 歲 2-3 歲 4-6 歲 4-6 歲 7-10 歲 11-12 歲 13-15 歲 16 歲 17-18 歲
B型肝炎 （HepB） 第3劑                           
白喉、破傷風、無細胞百日咳（DTap） 第4劑    第5劑                     
滅活脊髓灰質炎疫苗（IPV） 第3劑    第4劑                     
流感（IIV） 每年接種1劑或2劑疫苗 每年僅接種1劑疫苗
流感（LAIV）       每年接種1劑或2劑疫苗 每年僅接種1劑疫苗
甲型肝炎（HepA） 連續2劑                        
腦膜炎球菌 （MenACWY-D；MenACWY-CRM）                   第1劑    第2劑   
麻疹、腮腺炎、風疹（MMR）；水痘（VAR）          第2劑                  
白喉、破傷風、無細胞百日咳（DTap）                   TDap         
細胞穿透劑
本文所述之細胞穿透劑可以包括增強多核糖核苷酸向細胞內遞送的任何物質。細胞穿透劑可以包括有機化合物或無機分子。在一些情況下，細胞穿透劑係具有一個或多個官能基的有機化合物，該等官能基諸如但不限於烷烴、烯烴和芳烴；鹵素取代的烷烴、烯烴和芳烴；醇、酚（苯衍生物）、醚、醛、酮和羧酸；胺和腈；以及有機硫（例如，二甲亞碸）。在一些實施方式中，細胞穿透劑在極性溶劑中可溶。在一些實施方式中，細胞穿透劑在極性溶劑中不可溶。多核糖核苷酸可以線性或環狀形式存在。
細胞穿透劑可以包括有機化合物，諸如具有一個或多個羥基官能基的醇。在一些情況下，細胞穿透劑包括醇，諸如但不限於一元醇、多元醇、不飽和脂族醇和脂環醇。細胞穿透劑可以包括以下的一種或多種：甲醇、乙醇、異丙醇、苯氧乙醇、三乙醇胺、苯乙醇、丁醇、戊醇、鯨蠟醇、乙二醇、丙二醇、變性醇、苄醇（特別是變性醇）乙二醇、硬脂醇、鯨蠟硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇（PEG）-400、乙氧基化脂肪酸或羥乙基纖維素。在某些實施方式中，細胞穿透劑包括乙醇。
在其他情況下，本文提供的組成物和方法僅包括醇作為細胞穿透劑，而沒有或不使用任何其他試劑來增強多核糖核苷酸向細胞內的遞送。在一些情況下，細胞穿透劑包含乙醇和任何其他可以增強多核糖核苷酸向細胞內遞送的醇。在一些情況下，細胞穿透劑包含乙醇和任何其他可以增強多核糖核苷酸向細胞內遞送的有機或無機分子。在一些情況下，細胞穿透劑包含乙醇和脂質體或奈米顆粒，諸如國際公開號WO 2013/006825、WO 2016/036735、WO 2018/112282 A1和WO 2012/031043 A1中描述的那些，該等國際公開各自藉由援引以其整體併入本文。在一些情況下，細胞穿透劑包含乙醇和細胞穿透肽或蛋白質，諸如Bechara等人，Cell-penetrating peptides: 20 years later, where do we stand? [細胞穿透肽：20年後，我們何去何從？]FEBS Letters [歐洲生化學會聯合會快報] 587 (12): 1693-1702 (2013)；Langel，Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications [細胞穿透肽：方法和應用]（佛羅里達州波卡拉頓CRC出版社（CRC Press, Boca Raton FL, 2002））；El-Andaloussi等人，Curr. Pharm. Des. [當今製藥設計] 11 (28): 3597-611 (2003)；Deshayes等人，Cell. Mol. Life Sci. [細胞與分子生命科學] 62 (16): 1839-49 (2005)，美國專利公開號US 20130129726、US 20130137644和US 20130164219中描述的那些，該等各自藉由援引以其全文併入本文。在一些情況下，乙醇與其他細胞穿透劑的比率為約1 : 0.001、1 : 0.002、1 : 005、1 : 008、1 : 0.01、1 : 0.02、1 : 0.05、1 : 0.08、1 : 0.1、1 : 0.2、1 : 0.3、1 : 0.4、1 : 0.5、1 : 0.6、1 : 0.7、1 : 0.8、1 : 0.9、1 : 1、1 : 1.2、1 : 1.5、1 : 1.8、1 : 2、1 : 2.5、1 : 3、1 : 3.5、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 15、1 : 20、1 : 30、1 : 40、1 : 50、1 : 60、1 : 70、1 : 80、1 : 90、1 : 100、1 : 120、1 : 150、1 : 200、1 : 250、1 : 500或1 : 1000。在一些情況下，乙醇與其他細胞穿透劑的比率為至少約1 : 0.001、1 : 0.002、1 : 005、1 : 008、1 : 0.01、1 : 0.02、1 : 0.05、1 : 0.08、1 : 0.1、1 : 0.2、1 : 0.3、1 : 0.4、1 : 0.5、1 : 0.6、1 : 0.7、1 : 0.8、1 : 0.9、1 : 1、1 : 1.2、1 : 1.5、1 : 1.8、1 : 2、1 : 2.5、1 : 3、1 : 3.5、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 15、1 : 20、1 : 30、1 : 40、1 : 50、1 : 60、1 : 70、1 : 80、1 : 90、1 : 100、1 : 120、1 : 150、1 : 200、1 : 250或1 : 500。
本文揭露的組成物可以包括細胞穿透劑和多核糖核苷酸的混合物。在一些情況下，多核糖核苷酸與細胞穿透劑以預混合的混合物形式存在。在一些情況下，在與細胞接觸之前，將多核糖核苷酸與細胞穿透劑分開提供。在該等情況下，多核糖核苷酸在施加於細胞時與細胞穿透劑接觸，並混合在一起以將多核糖核苷酸遞送到細胞中。不受特定理論的束縛，混合物中細胞穿透劑的濃度可有助於遞送效率。因此，在一些情況下，在混合物中以預定濃度提供細胞穿透劑。在一些其他情況下，當細胞穿透劑和多核糖核苷酸最初係分開的但在施加用於遞送時混合在一起時，以相對於多核糖核苷酸，應確保其在混合物中達到最小預定濃度的足夠的量提供細胞穿透劑。
在一些情況下，細胞穿透劑占混合物的至少約0.01%、至少約0.02%、至少約0.03%、至少約0.04%、至少約0.05%、至少約0.06%、至少約0.07%、至少約0.08%、至少約0.09%、至少約0.1%、至少約0.2%、至少約0.3%、至少約0.4%、至少約0.5%、至少約0.6%、至少約0.7%、至少約0.9%、至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約98%體積/體積（v/v）。在一些情況下，細胞穿透劑占混合物的至多約0.01%、至多約0.02%、至多約0.03%、至多約0.04%、至多約0.05%、至多約0.06%、至多約0.07%、至多約0.08%、至多約0.09%、至多約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90% v/v。在一些情況下，細胞穿透劑占混合物的約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%或約100% v/v。
在一些情況下，細胞穿透劑占混合物的至少約0.01%、至少約0.02%、至少約0.03%、至少約0.04%、至少約0.05%、至少約0.06%、至少約0.07%、至少約0.08%、至少約0.09%、至少約0.1%、至少約0.2%、至少約0.3%、至少約0.4%、至少約0.5%、至少約0.6%、至少約0.7%、至少約0.9%、至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約98%重量/重量（w/w）。在一些情況下，細胞穿透劑占混合物的至多約0.01%、至多約0.02%、至多約0.03%、至多約0.04%、至多約0.05%、至多約0.06%、至多約0.07%、至多約0.08%、至多約0.09%、至多約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90% w/w。在一些情況下，細胞穿透劑占混合物的約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%或約98% w/w。在一些情況下，細胞穿透劑占混合物的約10% v/v。
在一些情況下，本文所述之混合物係液體溶液。例如，細胞穿透劑本身係液體物質。替代性地，細胞穿透劑係固體、液體或氣體物質，並溶解在液體載劑例如水中。在該等情況下，多核糖核苷酸也可以溶解在液體溶液中。
在一些情況下，乙醇占混合物的至少約0.1%、至少約0.2%、至少約0.3%、至少約0.4%、至少約0.5%、至少約0.6%、至少約0.7%、至少約0.9%、至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約98%體積/體積（v/v）。在一些情況下，乙醇占混合物的至多約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90% v/v。在一些情況下，乙醇占混合物的約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%或約100% v/v。在一些情況下，乙醇占混合物的約10% v/v。防腐劑
本文提供的組成物或藥物組成物可以包含用於單次投與的材料，或者可以包含用於多次投與的材料（例如，「多劑量」套組（kit））。多核糖核苷酸可以線性或環狀形式存在。該組成物或藥物組成物可以包含一種或多種防腐劑，諸如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。防腐劑可用於防止使用過程中的微生物污染。合適的防腐劑包括：苯紮氯銨、硫柳汞、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯乙醇、依地酸二鈉、山梨酸、Onamer M或熟悉該項技術者已知的其他試劑。在眼科產品中，例如，此類防腐劑可以以0.004%至0.02%的含量採用。在本文所述之組成物中，防腐劑（例如苯紮氯銨）可以按重量計以0.001%至小於0.01%，例如0.001%至0.008%，較佳的是約0.005%的含量採用。
多核糖核苷酸可易受周圍環境中可能豐富的RNA酶的影響。本文提供的組成物可以包含抑制RNA酶活性的試劑，從而防止多核糖核苷酸降解。在一些情況下，該組成物或藥物組成物包含熟悉該項技術者已知的任何RNA酶抑制劑。替代性地或另外，可以在無RNA酶的環境中製備本文提供的組成物中的多核糖核苷酸和細胞穿透劑和/或藥學上可接受的稀釋劑或載劑、媒介物、賦形劑或其他試劑。該組成物可以在無RNA酶的環境中配製。
在一些情況下，本文提供的組成物可以是無菌的。可以在本領域已知的合適的媒介物中將組成物配製成無菌溶液或懸浮液。可以藉由常規的已知滅菌技術對組成物進行滅菌，例如，可以對組成物進行無菌過濾。鹽
在一些情況下，本文提供的組成物或藥物組成物包含一種或多種鹽。為了控制張度，本文提供的組成物可以包含生理鹽諸如鈉鹽。其他鹽可以包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉和/或氯化鎂等。在一些情況下，該組成物與一種或多種藥學上可接受的鹽一起配製。該一種或多種藥學上可接受的鹽可以包括無機離子，諸如鈉、鉀、鈣、鎂離子等的那些鹽。此類鹽可以包括與無機酸或有機酸的鹽，該無機酸或有機酸諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、乙酸、富馬酸、琥珀酸、乳酸、苦杏仁酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸或馬來酸。多核糖核苷酸可以線性或環狀形式存在。緩衝劑 /pH
本文提供的組成物或藥物組成物可以包含一種或多種緩衝劑，諸如Tris緩衝劑；硼酸鹽緩衝劑；琥珀酸鹽緩衝劑；組胺酸緩衝劑（例如，含氫氧化鋁佐劑）；或檸檬酸鹽緩衝劑。在一些情況下，包含5-20 mM範圍內的緩衝劑。
本文提供的組成物或藥物組成物可以具有約5.0至約8.5、約6.0至約8.0、約6.5至約7.5、或約7.0至約7.8的pH。該組成物或藥物組成物可以具有約7的pH。多核糖核苷酸可以線性或環狀形式存在。洗滌劑 / 表面活性劑
根據預期的投與途徑，本文提供的組成物或藥物組成物可以包含一種或多種洗滌劑和/或表面活性劑，例如聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性劑（通常稱為「吐溫（Tween）」），例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；以DOWFAX™商標出售的環氧乙烷（EO）、環氧丙烷（PO）和/或環氧丁烷（BO）的共聚物，諸如線性EO/PO嵌段共聚物；重複的乙氧基(氧基-1,2-乙二基)基團的數目可以變化的辛基酚聚醚，例如辛基酚聚醚-9（Triton X-100或三級辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇（IGEPAL CA-630/NP-40）；磷脂，諸如磷脂醯膽鹼（卵磷脂）；壬基酚聚氧乙烯醚，諸如Tergitol™ NP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚（稱為Brij表面活性劑），諸如三乙二醇單月桂基醚（Brij 30）；和脫水山梨糖醇酯（通常稱為「SPAN」），諸如脫水山梨糖醇三油酸酯（Span 85）和脫水山梨糖醇單月桂酸酯、辛基酚聚醚（諸如辛基酚聚醚9（Triton X-100）或三級辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）、十六烷基三甲基溴化銨（「CTAB」）或去氧膽酸鈉。該一種或多種洗滌劑和/或表面活性劑可僅以痕量存在。在一些情況下，該組成物可以包含小於各1 mg/ml的辛基酚聚醚-10和聚山梨醇酯80。在本文中可使用非離子表面活性劑。表面活性劑可以按其「HLB」（親水/親脂平衡值）進行分類。在一些情況下，表面活性劑的HLB為至少10、至少15和/或至少16。多核糖核苷酸可以線性或環狀形式存在。稀釋劑
在一些實施方式中，本揭露之免疫原性組成物包含環狀多核糖核苷酸和稀釋劑。在一些實施方式中，本揭露之免疫原性組成物包含線性多核糖核苷酸和稀釋劑。
稀釋劑可以是非載劑賦形劑。非載劑賦形劑用作組成物（諸如，如本文所述之環狀多核糖核苷酸）的媒介物或介質。非載劑賦形劑用作組成物（諸如，如本文所述之線性多核糖核苷酸）的媒介物或介質。非載劑賦形劑的非限制性實例包括溶劑、水性溶劑、非水溶劑、分散介質、稀釋劑、分散劑、助懸劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、透明質酸酶、分散劑、製粒劑、崩散劑、黏合劑、緩衝劑（例如，磷酸鹽緩衝鹽水（PBS））、潤滑劑、油及其混合物。非載劑賦形劑可以是經美國食品和藥物管理局（FDA）批准並列在非活性成分數據庫中的不表現出細胞穿透作用的任一種非活性成分。非載劑賦形劑可以是適於投與於非人類動物（例如，適合獸醫用途）的任何非活性成分。為了使組成物適於向各種動物投與，對適於向人投與的組成物的修飾得到很好的理解，並且普通技術的獸醫藥理師可以僅藉由普通的實驗（如果有）來設計和/或進行此類修飾。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以以裸遞送配製物的形式遞送，諸如包含稀釋劑。裸遞送配製物將環狀多核糖核苷酸遞送至細胞，無需借助於載劑並且無需對環狀多核糖核苷酸、加帽的多核糖核苷酸或其複合物進行修飾或部分或完全包封。
裸遞送配製物係不含載劑的配製物並且其中環狀多核糖核苷酸沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾，或者沒有對環狀多核糖核苷酸的部分或完全包封。在一些實施方式中，沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的環狀多核糖核苷酸係未與蛋白質、小分子、顆粒、聚合物或生物聚合物共價結合的多核糖核苷酸。沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的環狀多核糖核苷酸不含經修飾的磷酸基團。例如，沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的環狀多核糖核苷酸不含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸鹽、硼代磷酸酯、磷酸氫鹽、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。
在一些實施方式中，裸遞送配製物不含以下任何或全部：轉染試劑、陽離子載劑、碳水化合物載劑、奈米顆粒載劑或蛋白質載劑。在一些實施方式中，裸遞送配製物不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐改性的植物糖原β-糊精、脂轉染胺（lipofectamine）、聚乙烯亞胺、聚(三甲基亞胺)、聚(四甲基亞胺)、聚丙烯亞胺、胺基糖苷-聚胺、雙去氧-二胺基-b-環糊精、精胺、亞精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基胺基)乙酯、聚(離胺酸)、聚(組胺酸)、聚(精胺酸)、陽離子明膠、樹狀聚合物、殼聚糖、1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷（DOTAP）、N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨（DOTMA）、1-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑鎓氯化物（DOTIM）、2,3-二油醯氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-三氟乙酸丙銨（DOSPA）、3B-[N-(N,N'-二甲胺基乙烷)-胺基甲醯基]膽固醇鹽酸鹽（DC-膽固醇鹽酸鹽）、二-十七烷基胺基甘胺醯基亞精胺（DOGS）、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨（DDAB）、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨（DMRIE）、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨（DODAC）、人血清白蛋白（HSA）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）或球蛋白。
在某些實施方式中，裸遞送配製物包括非載劑賦形劑。在一些實施方式中，非載劑賦形劑包括不表現出細胞穿透作用的非活性成分。在一些實施方式中，非載劑賦形劑包括緩衝劑，例如PBS。在一些實施方式中，非載劑賦形劑係溶劑、非水溶劑、稀釋劑、助懸劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、透明質酸酶、分散劑、成粒劑、崩散劑、黏合劑、緩衝劑、潤滑劑或油。
在一些實施方式中，裸遞送配製物包括稀釋劑。稀釋劑可以是液體稀釋劑或固體稀釋劑。在一些實施方式中，稀釋劑係RNA增溶劑、緩衝劑或等滲劑。RNA增溶劑的實例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲醯胺和2-丙醇。緩衝劑的實例包括2-(N-𠰌啉代)乙磺酸（MES）、Bis-Tris、2-[(2-胺基-2-側氧基乙基)-(羧甲基)胺基]乙酸（ADA）、N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙烷磺酸（ACES）、哌𠯤-N,N′-雙(2-乙磺酸)（PIPES）、2-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]乙磺酸（TES）、3-(N-𠰌啉代)丙烷磺酸（MOPS）、4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤乙磺酸（HEPES）、Tris、Tricine、Gly-Gly、Bicine或磷酸鹽。等滲劑的實例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖或蔗糖。載劑
在一些實施方式中，本揭露之免疫原性組成物包含環狀多核糖核苷酸和載劑。在一些實施方式中，本揭露之免疫原性組成物包含線性多核糖核苷酸和載劑。
在某些實施方式中，免疫原性組成物包含在囊泡或其他基於膜的載劑中的如本文所述之環狀多核糖核苷酸。在某些實施方式中，免疫原性組成物包含在囊泡或其他基於膜的載劑中的如本文所述之線性多核糖核苷酸。
在其他實施方式中，免疫原性組成物包含在或經由細胞、囊泡或其他基於膜的載劑中的環狀多核糖核苷酸。在其他實施方式中，免疫原性組成物包含在或經由細胞、囊泡或其他基於膜的載劑中的線性多核糖核苷酸。在一個實施方式中，免疫原性組成物包含在脂質體或其他類似囊泡中的環狀多核糖核苷酸。在一個實施方式中，免疫原性組成物包含在脂質體或其他類似囊泡中的線性多核糖核苷酸。脂質體係球形囊泡結構，該等球形囊泡結構由圍繞內部水性隔室的單層或多層的脂質雙層和相對不可滲透的外部親脂性磷脂雙層構成。脂質體可以是陰離子的、中性的或陽離子的。脂質體具有生物相容性，無毒，可以遞送親水性和親脂性藥物分子，保護其貨物免受血漿酶的降解，並將其負載運輸穿過生物膜和血腦屏障（BBB）（有關綜述，參見，例如，Spuch和Navarro, Journal of Drug Delivery [藥物遞送雜誌], 第2011卷, 文章ID 469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679）。
囊泡可由幾種不同類型的脂質製成；然而，最常使用磷脂生成作為藥物載劑的脂質體。製備多層囊泡脂質之方法係本領域已知的（參見例如美國專利號6,693,086，其關於多層囊泡脂質製備的教導藉由援引併入文中）。儘管當脂質膜與水溶液混合時，囊泡的形成係自發的，但也可以藉由使用均質器、超音波儀或擠壓裝置以振盪的形式施加力來加快囊泡的形成（有關綜述，參見，例如，Spuch和Navarro, Journal of Drug Delivery [藥物遞送雜誌], 第2011卷, 文章ID 469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679）。可藉由擠出藉由具有減小尺寸的過濾器來製備擠出的脂質，如Templeton等人, Nature Biotech [自然生物技術], 15: 647-652, 1997中所述，其關於擠出脂質製備的教導藉由援引併入文中。
在某些實施方式中，本揭露之免疫原性組成物包含環狀多核糖核苷酸和脂質奈米顆粒。在某些實施方式中，本揭露之免疫原性組成物包含線性多核糖核苷酸和脂質奈米顆粒。脂質奈米顆粒係為如本文所述之環狀多核糖核苷酸分子提供生物相容性和可生物降解的遞送系統的載劑的另一個實例。脂質奈米顆粒係為如本文所述之線性多核糖核苷酸分子提供生物相容性和可生物降解的遞送系統的載劑的另一個實例。奈米結構化的脂質載劑（NLC）係經修飾的固體脂質奈米顆粒（SLN），其保留了SLN的特性，提高了藥物的穩定性和載藥量，並防止了藥物洩漏。聚合物奈米顆粒（PNP）係藥物遞送的重要組成部分。該等奈米顆粒可以有效地將藥物遞送引導至特定靶並改善藥物穩定性和受控的藥物釋放。也可以使用脂質聚合物奈米顆粒（PLN），其係一種組合了脂質體和聚合物的新型載劑。該等奈米顆粒具有PNP和脂質體的互補優勢。PLN由核-殼結構構成；聚合物核提供了穩定的結構，磷脂殼提供了良好的生物相容性。這樣，這兩種組分提高了藥物包封有效率，促進了表面修飾，並防止了水溶性藥物的洩漏。有關綜述，參見例如Li等人2017, Nanomaterials [奈米材料] 7, 122; doi:10.3390/nano7060122。
載劑的其他非限制性實例包括碳水化合物載劑（例如，酸酐改性的植物糖原或糖原型材料）、蛋白質載劑（例如，與環狀多核糖核苷酸共價連接的蛋白質或與線性多核糖核苷酸共價連接的蛋白質）或陽離子載劑（例如，陽離子脂聚合物或轉染試劑）。碳水化合物載劑的非限制性實例包括植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精和酸酐改性的植物糖原β-糊精。陽離子載劑的非限制性實例包括脂轉染胺（lipofectamine）、聚乙烯亞胺、聚(三甲基亞胺)、聚(四甲基亞胺)、聚丙烯亞胺、胺基糖苷-聚胺、雙去氧-二胺基-b-環糊精、精胺、亞精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基胺基)乙酯、聚(離胺酸)、聚(組胺酸)、聚(精胺酸)、陽離子明膠、樹狀聚合物、殼聚糖、1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷（DOTAP）、N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨（DOTMA）、1-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑鎓氯化物（DOTIM）、2,3-二油醯氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-三氟乙酸丙銨（DOSPA）、3B-[N-(N,N'-二甲胺基乙烷)-胺基甲醯基]膽固醇鹽酸鹽（DC-膽固醇鹽酸鹽）、二-十七烷基胺基甘胺醯基亞精胺（DOGS）、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨（DDAB）、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨（DMRIE）和N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨（DODAC）。蛋白質載劑的非限制性實例包括人血清白蛋白（HSA）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）或球蛋白。
外來體也可用作本文所述之環狀RNA組成物和製劑的藥物遞送媒介物。有關綜述，參見Ha等人2016年7月. Acta Pharmaceutica Sinica B. [藥學學報]第6卷, 第4期, 第287-296頁；https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。
離體分化的紅血球也可以用作本文所述之環狀RNA組成物或製劑的載劑。參見，例如，國際專利公開號WO 2015/073587；WO 2017/123646；WO 2017/123644；WO 2018/102740；WO 2016/183482；WO 2015/153102；WO 2018/151829；WO 2018/009838；Shi等人2014. Proc Natl Acad Sci USA. [美國國家科學院院刊] 111 (28): 10131-10136；美國專利9,644,180；Huang等人2017. Nature Communications [自然通訊] 8: 423；Shi等人2014. Proc Natl Acad Sci USA. [美國國家科學院院刊] 111 (28): 10131-10136。
例如國際專利公開號WO 2018/208728中所述之融合體組成物也可以用作載劑遞送本文所述之環狀多核糖核苷酸分子。例如WO 2018/208728中所述之融合體組成物也可以用作載劑遞送本文所述之線性多核糖核苷酸分子。
病毒體和病毒樣顆粒（VLP）也可用作載劑將本文所述之環狀多核糖核苷酸分子遞送至靶向的細胞。病毒體和病毒樣顆粒（VLP）也可用作載劑將本文所述之線性多核糖核苷酸分子遞送至靶向的細胞。
例如國際專利公開號WO 2011/097480、WO 2013/070324、WO 2017/004526或WO 2020/041784中所述之植物奈米囊泡和植物信使包（PMP）也可用作載劑遞送本文所述之環狀RNA組成物或製劑。
微泡也可以用作載劑遞送本文所述之環狀多核糖核苷酸分子。參見，例如，US 7115583；Beeri, R. 等人, Circulation. [循環] 2002年10月1日; 106 (14): 1756-1759；Bez, M. 等人, Nat Protoc. [自然-實驗室指南] 2019年4月; 14 (4): 1015-1026；Hernot, S. 等人, Adv Drug Deliv Rev. [高級藥物遞送綜述] 2008年6月30日; 60 (10): 1153-1166；Rychak, J.J. 等人, Adv Drug Deliv Rev. [高級藥物遞送綜述] 2014年6月; 72: 82-93。在一些實施方式中，微泡係白蛋白包被的全氟化碳微泡。
包含本文所述之環狀多核糖核苷酸的載劑可以包含多個顆粒。該等顆粒可具有30至700奈米的中值粒度（例如30至50、50至100、100至200、200至300、300至400、400至500、500至600、600至700、100至500、50至500或200至700奈米）。可以優化顆粒的大小以有利於包括環狀多核糖核苷酸在內的有效載荷沈積到細胞中。環狀多核糖核苷酸沈積到某些細胞類型中可有利於不同的粒度。例如，可以優化粒度以使環狀多核糖核苷酸沈積到抗原呈遞細胞中。可以優化粒度以使環狀多核糖核苷酸沈積到樹突細胞中。另外，可以優化粒度以使環狀多核糖核苷酸沈積到引流淋巴結細胞中。佐劑
佐劑會增強在接受佐劑和/或包含該佐劑的免疫原性組成物的受試者中引發的免疫反應（體液和/或細胞免疫反應）。在一些實施方式中，如本文所揭露的，將佐劑投與於受試者。在一些實施方式中，佐劑用於本文所述之方法中以產生如本文所述之免疫反應。在一些實施方式中，佐劑和多核糖核苷酸在分開的組成物中共同投與。在一些實施方式中，將佐劑與多核糖核苷酸混合或配製為單一組成物，並投與於受試者。在一些實施方式中，佐劑和環狀或線性多核糖核苷酸在分開的組成物中共同投與。在一些實施方式中，將佐劑與環狀或線性多核糖核苷酸混合或配製為單一組成物以獲得免疫原性組成物，將該免疫原性組成物投與於受試者。
佐劑可以與多核糖核苷酸一起配製在同一藥物組成物中。佐劑可以與多核糖核苷酸組合分開投與（例如，作為分開的藥物組成物）。
佐劑可以是TH1佐劑和/或TH2佐劑。本揭露考慮的其他佐劑包括但不限於以下的一種或多種：
含礦物質的組成物。適於在本揭露中用作佐劑的含礦物質的組成物包括礦物鹽，諸如鋁鹽和鈣鹽。本揭露包括礦物鹽，諸如氫氧化物（例如羥基氧化物）、磷酸鹽（例如羥基磷酸鹽、正磷酸鹽）、硫酸鹽等，或不同礦物化合物的混合物，其中化合物呈任何合適的形式（例如凝膠、結晶、無定形形式等）。鈣鹽包括磷酸鈣（例如，「CAP」）。鋁鹽包括氫氧化物、磷酸鹽、硫酸鹽等。
油乳劑組成物。適於在本揭露中用作佐劑的油乳劑組成物包括角鯊烯-水乳劑，諸如MF59（5%角鯊烯、0.5%吐溫80和0.5% Span，使用微流化器配製為亞微米顆粒）、AS03（水包油乳劑中的α-生育酚、角鯊烯和聚山梨醇酯80）、Montanide配製物（例如Montanide ISA 51、Montanide ISA 720）、不完全弗氏佐劑（IFA）、完全弗氏佐劑（CFA）和不完全弗氏佐劑（IFA）。
小分子。適於在本揭露中用作佐劑的小分子包括咪喹莫特或847、瑞喹莫德或R848、或嘎德莫特。
聚合物奈米顆粒。適於在本揭露中用作佐劑的聚合物奈米顆粒包括聚(a-羥基酸)、聚羥基丁酸、聚內酯（包括聚己內酯）、聚對二氧環己酮、聚戊內酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、酪胺酸衍生的聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯啶酮或聚酯-醯胺及其組合。
皂苷（即，糖苷，附接至一條或多條糖側鏈的多環苷元）。適於在本揭露中用作佐劑的皂苷配製物包括純化配製物，諸如QS21，以及脂質配製物，諸如ISCOM和ISCOM基質。QS21作為STIMULON（TM）在市場上銷售。皂苷配製物也可以包含固醇，諸如膽固醇。皂苷和膽固醇的組合可用於形成稱為免疫刺激複合物（ISCOM）的獨特顆粒。ISCOM通常還包含磷脂，諸如磷脂醯乙醇胺或磷脂醯膽鹼。任何已知的皂苷都可用於ISCOM中。較佳的是，ISCOM包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。視需要，ISCOM可以不含另外的洗滌劑。
脂多糖。適於在本揭露中使用的佐劑包括腸細菌脂多糖（LPS）的無毒衍生物。此類衍生物包括單磷醯基脂質A（MPLA）、哌喃葡萄糖基脂質A（GLA）和3-O-去醯化MPL（3dMPL）。3dMPL係3去氧-醯化單磷醯基脂質A與4、5或6條醯化鏈的混合物。其他無毒LPS衍生物包括單磷醯基脂質A模擬物，諸如胺基烷基胺基葡萄糖胺磷酸鹽衍生物，例如RC-529。
脂質體。適於在本揭露中用作佐劑的脂質體包括病毒體和CAF01。
脂質奈米顆粒。適於在本揭露中使用的佐劑包括脂質奈米顆粒（LNP）及其組分。
脂肽（即，包含一個或多個脂肪酸殘基和兩個或更多個胺基酸殘基的化合物）。適於在本揭露中用作佐劑的脂肽包括Pam2（Pam2CSK4）和Pam3（Pam3CSK4）。
糖脂。適於在本揭露中用作佐劑的糖脂包括索狀因子（海藻糖二黴菌酸酯）。
從革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌衍生（合成或純化）的肽和肽聚糖，諸如MDP（N-乙醯-胞壁醯-L-丙胺醯-D-異麩醯胺酸）適於在本揭露中用作佐劑。
適於用作佐劑的碳水化合物（含碳水化合物）或多糖包括右旋糖酐（例如，支鏈微生物多糖）、硫酸右旋糖酐、香菇多糖、酵母聚糖、β-葡聚糖、deltin、甘露聚糖和幾丁質。
基於RNA的佐劑。適於在本揭露中使用的基於RNA的佐劑係聚IC、聚IC:LC、帶有或不帶5’三磷酸的髮夾RNA、病毒序列、含聚U的序列、dsRNA天然或合成RNA序列及核酸類似物（例如，環狀GMP-AMP或其他環狀二核苷酸（例如環狀二-GMP）、免疫刺激性鹼基類似物（例如C8-取代的和N7,C8-二取代的鳥嘌呤核糖核苷酸））。在一些實施方式中，佐劑係本文所述之環狀多核糖核苷酸的線性多核糖核苷酸對應物。
基於DNA的佐劑。適於在本揭露中使用的基於DNA的佐劑包括CpG、dsDNA和天然或合成的免疫刺激DNA序列。
蛋白質或肽。適於在本揭露中用作佐劑的蛋白質和肽包括鞭毛蛋白融合蛋白、MBL（甘露糖結合凝集素）、細胞介素和趨化因子。
病毒顆粒。適於用作佐劑的病毒顆粒包括病毒體（磷脂細胞膜雙層）。
在本揭露中使用的佐劑可以是細菌來源的，諸如鞭毛蛋白、LPS或細菌毒素（例如腸毒素（蛋白質），例如熱不穩定毒素或霍亂毒素）。在本揭露中使用的佐劑可以是雜交分子，諸如軛合至咪喹莫特的CpG。在本揭露中使用的佐劑可以是真菌或與卵菌微生物相關分子模式（MAMP），諸如幾丁質或β-葡聚糖。在一些實施方式中，佐劑係無機奈米顆粒，諸如金奈米棒或基於二氧化矽的奈米顆粒（例如介孔二氧化矽奈米顆粒（MSN））。在一些實施方式中，佐劑係用糖脂免疫調節劑（海藻糖6,6-二山梨酸酯（TDB），這可以是位於分枝桿菌細胞壁上的索狀因子的合成變體）穩定的多組分佐劑或佐劑系統，諸如AS01、AS03、AS04（MLP5 + 明礬）、CFA（完全弗氏佐劑：IFA + 肽聚糖或海藻糖二黴菌酸酯）、CAF01（陽離子脂質體媒介物的兩組分系統（二甲基雙十八烷基銨（DDA））。
在一些實施方式中，向受試者投與與佐劑組合的編碼一種或多種免疫原的環狀或線性多核糖核苷酸。如說明書全篇使用的術語「與......組合」包括作為治療方案的一部分投與的任何兩種組成物。這可以包括例如配製成單一藥物組成物的多核糖核苷酸和佐劑。這還包括，例如，根據限定的治療或給藥方案，作為分開的組成物投與給受試者的多核糖核苷酸和佐劑。佐劑可以在多核糖核苷酸投與之前、基本上同時或之後投與給受試者。佐劑可以在多核糖核苷酸投與之前或之後的1天、2天、5天、10天、20天、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月或6個月內投與。佐劑可以藉由與多核糖核苷酸相同的投與途徑（例如，肌內、皮下、靜脈內、腹膜內、局部或口服）或不同的途徑來投與。疫苗
在本文所述之方法的一些實施方式中，還向受試者投與第二試劑，例如，還向受試者投與第二疫苗。在一些實施方式中，投與於受試者的組成物包含本文所述之環狀多核糖核苷酸和第二疫苗。在一些實施方式中，疫苗和環狀多核糖核苷酸在分開的組成物中共同投與。該疫苗與環狀多核糖核苷酸免疫接種同時投與，在環狀多核糖核苷酸免疫接種之前或在環狀多核糖核苷酸免疫接種之後投與。
例如，在一些實施方式中，受試者用非環狀多核糖核苷酸疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）和包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用第一微生物（例如，肺炎球菌）的非多核糖核苷酸疫苗和包含如本文揭露的環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物免疫接種。疫苗可以是任何細菌感染疫苗或病毒感染疫苗。在一個特定實施方式中，疫苗係肺炎球菌多糖疫苗，諸如PCV13或PPSV23。在一些實施方式中，疫苗係流感疫苗。在一些實施方式中，疫苗係RSV疫苗（例如，帕利珠單抗（palivizumap））。
在一些實施方式中，投與於受試者的組成物包含本文所述之線性多核糖核苷酸和疫苗。在一些實施方式中，疫苗和線性多核糖核苷酸在分開的組成物中共同投與。該疫苗與線性多核糖核苷酸免疫接種同時投與，在線性多核糖核苷酸免疫接種之前或在線性多核糖核苷酸免疫接種之後投與。
例如，在一些實施方式中，受試者用多核糖核苷酸（例如，非線性多核糖核苷酸）疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）和包含如本文揭露的包含編碼免疫原的序列的線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用第一微生物（例如，肺炎球菌）的非多核糖核苷酸疫苗和包含如本文揭露的包含編碼免疫原的序列的線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物免疫接種。疫苗可以是任何細菌感染疫苗或病毒感染疫苗。在一個特定實施方式中，疫苗係肺炎球菌多糖疫苗，諸如PCV13或PPSV23。在一些實施方式中，疫苗係流感疫苗。在一些實施方式中，疫苗係RSV疫苗（例如，帕利珠單抗）。其他實施方式
在不脫離本發明的範圍和精神的情況下，本發明所述之組成物、方法和用途的各種修改和變化對熟悉該項技術者將是顯而易見的。雖已結合具體實施方式描述了本發明，但應當理解，所要求的發明不應當過度地局限於此類具體實施方式。事實上，對於熟悉該項技術者顯而易見的用於進行本發明的所述方式的各種修改旨在落入本發明的範圍內。
所有出版物、專利和專利申請均藉由援引以其全文併入本文，其程度如同特別且單獨地指出將每個單獨的出版物、專利或專利申請藉由援引以其全文併入一樣。實例
提出旨在說明而非限制本揭露之以下實例，以向熟悉該項技術者提供可以如何使用、實現和評價本文所述之組成物和方法的描述。該等實例旨在僅是本揭露之示例，而無意限制發明人視為其發明的內容範圍。實例 1 ：編碼免疫原的環狀 RNA 的設計
該實例描述了編碼免疫原的環狀RNA的設計。在該實例中，將環狀RNA設計成包括IRES、編碼免疫原的ORF和側接IRES-ORF的兩個間隔元件。環化能夠實現滾環翻譯，具有交替交錯元件以用於離散的ORF表現和受控的蛋白質化學計量的多個ORF，以及靶向RNA以用於核糖體進入的IRES。由環狀RNA編碼的示例性免疫原係SARS-Cov-2免疫原（RBD和刺突）、流感H1N1免疫原、HPV免疫原和腫瘤新抗原。實例 2 ：環狀 RNA 的生成和純化
在該實例中，藉由兩種示例性方法之一生成環狀RNA，並再次用RNA純化系統純化。示例性方法 1 ： DNA 夾板連接
該示例性方法藉由夾板連接產生環狀RNA。使用夾板DNA將RppH處理的線性RNA環化。使用T7 RNA聚合酶藉由體外轉錄從DNA區段合成未修飾的線性RNA。轉錄的RNA用RNA純化系統（新英格蘭生物學實驗室公司）純化，用RNA 5’磷酸水解酶（RppH）（新英格蘭生物學實驗室公司，M0356）按照製造商的說明處理。
夾板連接如下進行：藉由使用RNA連接酶處理轉錄的線性RNA和長度介於10至40個核苷酸之間的DNA夾板來生成環狀RNA。為了純化環狀RNA，在4%變性PAGE上解析連接混合物，並切除對應於每個環狀RNA的RNA條帶。碾碎切除的RNA凝膠片段，並用凝膠洗脫緩衝劑（0.5 M乙酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA）在37°C下洗脫RNA一小時。收穫上清液，並藉由向碾碎的凝膠中添加凝膠洗脫緩衝劑再次洗脫RNA，並孵育一小時。藉由離心過濾器去除凝膠碎片，並用乙醇沈澱。使用瓊脂糖凝膠電泳作為驗證純度和環化的品質控制測量。示例性方法 2 ：藉由自剪接內含子進行環化
該示例性方法藉由自剪接產生環狀RNA。環狀RNA在體外生成。未修飾的線性RNA從包括以上列出的所有模體的DNA模板體外轉錄。體外轉錄反應包括1 µg模板DNA T7 RNA聚合酶啟動子、10X T7反應緩衝液、7.5 mM ATP、7.5 mM CTP、7.5 mM GTP、7.5 mM UTP、10 mM DTT、40 U RNA酶抑制劑和T7酶。在37°C下轉錄4小時。將轉錄的RNA用1 U的DNA酶I在37°C下DNA酶處理15分鐘。為了有利於藉由自剪接進行的環化，添加額外的GTP至終濃度2 mM，在55°C下孵育15分鐘。然後將RNA進行柱純化，並藉由UREA-PAGE視覺化。實例 3 ：環狀 RNA 的多免疫原表現
該實例描述了由環狀RNA表現多種免疫原。
在該實例中，將一個環狀RNA設計為包括：IRES（SEQ ID NO: 1）；然後是編碼免疫原1的ORF，其對應於來自第一甲型H1N1流感毒株A/加利福利亞/07/2009（H1N1）的血凝素（HA）的一部分（SEQ ID NO: 2）；終止密碼子；IRES（SEQ ID NO: 1）；另一個編碼免疫原2的ORF，其對應於來自第二甲型H1N1流感毒株A/波多黎各/8/1934的血凝素（HA）的一部分（SEQ ID NO: 3）；終止密碼子和間隔區（SEQ ID NO: 4），參見圖 1 。如實例 2 中所述，在體外或在細胞中生成環狀RNA。
簡言之，將環狀RNA在兔網狀紅血球裂解物（RRL；普洛麥格公司（Promega），美國威斯康辛州菲奇堡（Fitchburg, WI, USA））中於30°C下孵育1.5-3小時。反應混合物的最終組成包括70%兔網狀紅血球裂解物、20 μM胺基酸混合物（普洛麥格公司；L446A）和0.8 U/μL RNasin®核糖核酸酶抑制劑（普洛麥格公司，N211A）。藉由三氯乙酸沈澱法去除血紅蛋白。沈澱並離心後，棄去上清液並將糰粒溶解在2x SDS樣本緩衝液（賽默公司（Thermo））中，並在70°C下孵育15分鐘。將樣本在4%-12%梯度聚丙烯醯胺/十二烷基硫酸鈉（SDS）凝膠（賽默公司，NP0326BOX）上解析，然後進行西方印漬術（Western blotting）。使用半乾法將蛋白質電轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（賽默公司）上，進行印跡，並用特異性抗體探測，並在C-Digit掃描器（LI-COR生物科學公司（LI-COR Biosciences））上藉由化學發光視覺化。使用Image-Studio Lite（LI-COR生物科學公司）定量表現水平。
另外，在來自用eRNA轉染的HeLa細胞的培養上清液中藉由ELISA測量免疫原1和免疫原2的表現。簡言之，在Opti-MEM（英傑公司（Invitrogen）；31985062）中使用MessengerMax（英傑公司；LMRNA015）將0.1 pmol eRNA轉染到10,000個HeLa細胞中。在第1天和第2天收穫細胞上清液。ELISA如下進行：將捕獲抗體於4°C在100 µL PBS中包被到ELISA板（MaxiSorp 442404，96孔）上過夜。用TBS-T洗滌三次後，將板用封閉緩衝液（含2% FBS和0.05%吐溫20的TBS）封閉1小時。然後將上清液稀釋液添加到每個孔的100 µL封閉緩衝液中，並在室溫下孵育1小時。用TBS-T洗滌三次後，將板與HRP檢測抗體在室溫下孵育1小時。將四甲基苯（Pierce 34021）添加到每個孔中，使其反應5-15分鐘，然後用2 N硫酸淬滅。將在450 nm下測定光密度（OD）值。實例 4 ：編碼源自相同靶標的多種免疫原的環狀 RNA
對於該實例，環狀RNA編碼源自兩種不同蛋白質的兩種多肽免疫原，但是其中兩種蛋白質都鑒別相同的靶標。設計具有起始密碼子、表現序列、交錯元件和IRES的環狀RNA（圖 2 ）。環化可實現被交錯元件分隔開的多個表現序列的滾環翻譯。
具體地，環狀RNA編碼起始密碼子、包含源自HIV-1包膜糖蛋白120（gp120）的多肽免疫原的第一ORF、視需要的交錯元件、包含源自HIV-1包膜糖蛋白41（gp41）的多肽免疫原的第二ORF和視需要的IRES，其中HIV-1包膜蛋白係多肽免疫原的靶標。三個gp120和三個gp41組合為異二聚體的三聚體，其中gp120的三聚體係頭部區域而gp41的三聚體係尾部區域，它們一起形成HIV-1的包膜刺突。因此，源自gp120和gp41的多肽免疫原都包含在環狀RNA中，以靶向HIV-1包膜蛋白。實例 5 ：編碼源自不同靶標的多種免疫原的環狀 RNA
對於該實例，環狀RNA編碼源自兩種不同蛋白質的兩種多肽免疫原，兩種不同蛋白質鑒別彼此不同的靶標。設計具有起始密碼子、表現序列、交錯元件和IRES的環狀RNA（圖 2 ）。環化可實現被交錯元件分隔開的多個表現序列的滾環翻譯。
源自不同靶標的多種免疫原由環狀RNA編碼，該環狀RNA如此設計成具有起始密碼子，編碼源自水痘-帶狀皰疹病毒（Varicella Zoster Virus ）的包膜糖蛋白1（gP1）的多肽免疫原的ORF，交錯序列和源自血凝素的多肽免疫原。水痘-帶狀皰疹病毒至少有6種包膜糖蛋白，並且糖蛋白gP1、gP2、gP3可以誘導人體產生中和抗體（Zweerink等人，1981; 31 (1): 436-444）。同樣，兩種包膜糖蛋白、血凝素和融合蛋白也是麻疹病毒（Morbillivirus ）的已知免疫原。因此，編碼源自gP1的多肽免疫原和源自血凝素的多肽免疫原的環狀RNA均靶向水痘-帶狀皰疹病毒和麻疹病毒。實例 6 ：來自環狀 RNA 的多免疫原投與
該實例描述了藉由投與多個環狀RNA分子在受試者中表現多種免疫原。
在該實例中，將環狀RNA 1設計為包括：IRES（SEQ ID NO: 1），其後是編碼免疫原1的ORF，對應於來自第一甲型H1N1流感毒株A/加利福利亞/07/2009的血凝素（HA）的一部分（SEQ ID NO: 2）；終止密碼子和間隔區（SEQ ID NO: 4），參見圖 3 。將環狀RNA 2設計為包括：IRES（SEQ ID NO: 1），其後是編碼免疫原2的ORF，對應於來自第二甲型H1N1流感毒株A/波多黎各/8/1934的血凝素（HA）的一部分（SEQ ID NO: 3）；終止密碼子和間隔區（SEQ ID NO: 4），參見圖 3 。如實例 2 中所述，藉由體外轉錄（盧西根公司（Lucigen）；AS3107）以及使用RNA連接酶進行RNA連接來生成環狀RNA。
配製如上所述之編碼多種不同免疫原的多個環狀RNA，以投與於哺乳動物。
環狀RNA以本文包括的任何配製物的形式配製。該等配製的RNA在第0天經由合適途徑，即皮內、皮下、肌內或靜脈內途徑注射。
評價從哺乳動物受試者收集的血液或組織中分泌型免疫原的表現。在給藥後1、2、7、14和21天將血樣收集在無抗凝劑的試管中。藉由在4°C下以1300 g離心25分鐘來分離血清，並藉由ELISA測量分泌型蛋白質的表現。簡言之，將捕獲抗體於4°C在100 µL PBS中包被到ELISA板（MaxiSorp 442404，96孔）上過夜。用TBS-T洗滌三次後，將板用封閉緩衝液（含2% FBS和0.05%吐溫20的TBS）封閉1小時。然後將上清液稀釋液添加到每個孔的100 µL封閉緩衝液中，並在室溫下孵育1小時。用TBS-T洗滌三次後，將板與HRP檢測抗體在室溫下孵育1小時。將四甲基苯（Pierce 34021）添加到每個孔中，使其反應5-15分鐘，然後用2 N硫酸淬滅。在450 nm下測定光密度（OD）值。實例 7 ：由環狀 RNA 編碼的免疫原和小分子佐劑的共同投與
該實例證明將環狀RNA與小分子佐劑組合投與給受試者會刺激免疫反應。
在該實例中，設計編碼多肽免疫原的環狀RNA，生產、純化並製備為配製物。為了刺激免疫反應，向受試者投與小分子佐劑，諸如MF5® 佐劑。將編碼多肽免疫原的環狀RNA的配製物和小分子佐劑都同時投與於受試者。實例 8 ：包括各自編碼對應於不同靶標的多肽免疫原的多個環狀 RNA 的免疫原性組成物的共同投與
對於該實例，將各自編碼多肽免疫原的多個環狀RNA投與於受試者（圖 3 ）。
將編碼如本領域中已知的源自包膜蛋白血凝素的多肽免疫原以鑒別麻疹病毒靶標的一種環狀RNA投與於受試者。還將編碼本領域中已知的源自包膜蛋白糖蛋白E的多肽免疫原以鑒別水痘-帶狀皰疹病毒靶標的另一環狀RNA投與於受試者。設計、生產、純化兩種環狀RNA並製備成配製物。將包含兩種環狀RNA的配製物投與於受試者。實例 9 ：使用環狀 RNA 在哺乳動物中體內誘導針對免疫原的抗體
配製如上所述之編碼免疫原的環狀多核苷酸以投與於哺乳動物受試者。該配製物在鹽水中或在本文中教導的任何配製物中。含環狀多核苷酸的疫苗視需要含有一種或多種樹突靶向劑或部分。在第0天，經由合適的途徑，皮內、皮下、肌內或靜脈內途徑注射包含編碼免疫原的多核苷酸的疫苗。可以將編碼免疫刺激劑或免疫刺激部分的多核苷酸與編碼免疫原的多核苷酸共同投與以刺激免疫反應。按每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次或每八週一次對含有編碼免疫原的環狀多核苷酸的疫苗給予另外的攻擊，直至檢測到抗免疫原的抗體。投與另外的疫苗攻擊以加強免疫原特異性抗體的產生。實例 10 ：檢測哺乳動物細胞中來自環狀 RNA 的蛋白質或免疫原表現
為了測量來自RNA構建體的非分泌型蛋白質或免疫原的表現效率，如實例 1 中所述設計編碼蛋白質或免疫原的環狀RNA（0.1皮莫耳），並如實例 2 中所述產生。使用MessengerMax（英傑公司，LMRNA）將環狀RNA轉染到HEK293（96孔板中無血清培養基中，每孔10,000個細胞）中。
對於非分泌型蛋白質或免疫原，使用免疫原特異性ELISA在24、48和72小時測量蛋白質表現。為了測量表現，在適當的時間點在每個孔中使用裂解緩衝液和蛋白酶抑制劑裂解細胞。回收細胞裂解液，並以12,000 rpm離心10分鐘。收集上清液。
對於分泌型蛋白質或免疫原，使用免疫原特異性蛋白質印跡（Western blot）在24、48和72小時檢測免疫原表現。簡言之，從每個孔中取80 µL來自哺乳動物細胞的上清液。藉由BCA蛋白質測定方法測量收穫的培養基中的蛋白質水平，並將相同量的蛋白質在4%-12%梯度的Bis-Tris凝膠（賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific））上解析，並使用iBlot2轉移系統（賽默飛世爾科技公司）轉移到硝酸纖維素膜上。使用抗免疫原抗體（義翹神州生物技術有限公司（Sino Biological））檢測免疫原。藉由iBright FL1500成像系統（英傑公司）監測來自蛋白質條帶的化學發光信號。實例 11 ：哺乳動物細胞中來自環狀 RNA 的 RBD 免疫原表現
該實例證明哺乳動物細胞中來自環狀RNA的RBD免疫原表現。
在該實例中，如實例 1 中所述設計編碼SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA並且如實例 2 中所述產生和純化。
藉由免疫沈澱聯合西方印漬術（IP-Western）測試編碼RBD的環狀RNA的表現。簡言之，使用Lipofectamine MessengerMax（賽默飛世爾公司（ThermoFisher），LMRNA015）將編碼RBD免疫原的環狀RNA（0.1皮莫耳）轉染到BJ成纖維細胞和HeLa細胞（10,000個細胞）中。使用單獨的MessengerMax作為對照。在24小時時收集上清液，並使用對與蛋白G-戴諾磁珠（Protein G-Dynabeads）（英傑公司，10003D）偶聯的SARS-CoV-2 RBD-刺突糖蛋白（義翹神州生物技術有限公司，目錄號：40592-T62）有特異性的兔抗體進行免疫沈澱並使用相同抗體檢測藉由PAGE解析的免疫沈澱產物。使用重組RBD（42 ng）免疫沈澱作為對照並定量細胞蛋白的表現。使用Image Studio™ Lite蛋白質印跡定量軟體（Li-COR生物科學公司）對膜化學發光進行定量。
在BJ成纖維細胞和HeLa細胞上清液中檢測到由環狀RNA編碼的RBD免疫原，而在對照中則未檢測到（圖 4 ）。
該實例表明，SAR-CoV-2 RBD免疫原（係分泌型蛋白）係從哺乳動物細胞中的環狀RNA中表現的。實例 12 ： SARS-CoV-2 RBD 免疫原在小鼠模型中的免疫原性
在小鼠模型中評價了用陽離子聚合物（例如，魚精蛋白）配製的編碼SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA的免疫原性。在小鼠模型中還評價了用陽離子聚合物配製的針對SARS-CoV-2 RBD抗原的抗體的產生。
在該實例中，將環狀RNA設計成具有IRES和編碼SARS-CoV-2 RBD免疫原的ORF以及側接IRES-ORF的兩個間隔元件。環狀RNA如下生成。以過量的5’單磷酸鳥苷，使用T7 RNA聚合酶藉由體外轉錄從DNA區段合成未修飾的線性RNA。按照製造商的說明，用RNA純化系統（新英格蘭生物學實驗室公司）純化轉錄的RNA。使用夾板DNA將純化的線性RNA環化。
藉由分裂連接生成環狀RNA，如下：將轉錄的線性RNA和DNA夾板混合並退火，並用RNA連接酶處理。為了純化環狀RNA，藉由反相層析法解析連接混合物。藉由增加流動相的有機物含量，從線性RNA中選擇性洗脫環狀RNA。分級收集洗脫的RNA，並測定其環狀RNA的純度。合併選擇的級分並交換緩衝液以去除流動相鹽和溶劑。使用丙烯醯胺凝膠電泳作為驗證純度和環化的品質控制測量。
將純化的環狀RNA在純淨水中稀釋至1100 ng/µL的濃度。將硫酸魚精蛋白溶解在林格氏乳酸溶液（4000 ng/µL）中。在攪拌的同時，將魚精蛋白-林格乳酸溶液添加到一半環狀RNA溶液中，直到RNA : 魚精蛋白的重量比為2 : 1。將該溶液再攪拌10分鐘以確保形成穩定的複合物。然後添加剩餘的環狀RNA（即，將剩餘的環狀RNA添加到環狀RNA : 魚精蛋白溶液中），並短暫攪拌該溶液。使用林格氏乳酸溶液調節混合物（即，環狀RNA混合物）的最終濃度，以獲得環狀RNA製劑，其最終RNA濃度為50 μL中2 μg或10 μg RNA。
每組三隻小鼠在第0天和第21天經肌內或皮內接種2 μg或10 μg劑量的環狀RNA製劑或魚精蛋白媒介物對照。在第0天和第21天投與環狀RNA製劑後24小時，經肌內或皮內向每隻小鼠投與Addavax™佐劑（英傑公司）一次。按照製造商的說明，Addavax™佐劑按50 µL在1X PBS中以50%給藥。
藉由亞莫耳抽吸從每隻小鼠收集血液。在環狀RNA給藥後第7、14、21、23、28、35、41、49、56、63、69、77、84、108和115天，將血液收集到乾燥的無抗凝劑的試管中。藉由在4°C以1200 g離心30分鐘從全血中分離血清。藉由56°C加熱1小時使血清熱滅活。藉由酶聯免疫吸附測定（ELISA），測定各個熱滅活的血清樣本中是否存在RBD特異性IgG。將ELISA板（MaxiSorp 442404 96孔，能肯公司（Nunc））在4°C下用在100 µL PBS中的SARS-CoV-2 RBD（義翹神州生物技術有限公司，40592-V08B；100 ng）包被過夜。然後用封閉緩衝液（含2% FBS和0.05%吐溫20的TBS）將板封閉1小時。然後將血清稀釋液添加到每個孔的100 µL封閉緩衝液中，並在室溫下孵育1小時。用含Tween®洗滌劑的1X Tris緩衝液（TBS-T）洗滌三次後，將板與抗小鼠IgG HRP檢測抗體（Jackson 115-035-071）孵育1小時，接著用TBS-T洗滌三次，然後添加四甲基苯（Pierce 34021）。使ELISA板反應5分鐘，然後使用2 N硫酸淬滅。在450 nm下測定光密度（OD）值。
將每個血清樣本的光密度除以背景（包被有RBD，僅與二抗孵育的板）的光密度。繪製每個樣本相對於背景的倍數。
結果顯示，在注射環狀RNA製劑後第14、21、23、28、35、41、49、56、63、69、77、84、108和115天獲得抗RBD反應（圖 5 ）。注射魚精蛋白媒介物後未獲得抗RBD抗體。該等結果顯示，編碼RBD免疫原的環狀RNA在小鼠中誘導抗原特異性免疫反應。
使用類似的ELISA測定血清樣本中是否存在刺突特異性IgG。將ELISA板（MaxiSorp 442404 96孔，能肯公司）在4°C下用在100 µL PBS中的SARS-CoV-2刺突（義翹神州生物技術有限公司，40589-V08B1；100 ng）包被過夜。然後用封閉緩衝液（含2% FBS和0.05%吐溫20的TBS）將板封閉1小時。然後將血清稀釋液添加到每個孔的100 µL封閉緩衝液中，並在室溫下孵育1小時。用含Tween®洗滌劑的1X Tris緩衝液（TBS-T）洗滌三次後，將板與抗小鼠IgG HRP檢測抗體（Jackson 115-035-071）孵育1小時，接著用TBS-T洗滌三次，然後添加四甲基苯（Pierce 34021）。使ELISA板反應5分鐘，然後使用2 N硫酸淬滅。在450 nm下測定光密度（OD）值。
結果顯示，在注射環狀RNA製劑後35天獲得抗刺突抗體（圖 6 ）。注射媒介物後未獲得抗刺突抗體。
在給藥後第14天，使用測量相對IgG1與IgG2a同種型的測定法來表徵血清抗體（圖 7 ），並且使用PRNT中和測定法來表徵血清抗體中和病毒的能力。結果顯示，隨佐劑一起肌內給藥2 μg RBD eRNA具有中和能力。實例 13 ：使用環狀 RNA 在哺乳動物中體內誘導針對流感 HA 免疫原的抗體
配製如上所述之編碼流感HA免疫原的環狀多核苷酸（參見，例如，實例 1 、 3 和 6 ），以投與於哺乳動物受試者。該配製物在鹽水中或在本文中教導的任何配製物中。含環狀多核苷酸的疫苗視需要含有一種或多種樹突靶向劑或部分。在第0天，經由合適的途徑，皮內、皮下、肌內或靜脈內途徑注射包含編碼免疫原的多核苷酸的疫苗。可以將編碼免疫刺激劑或免疫刺激部分的多核苷酸與編碼免疫原的多核苷酸共同投與以刺激免疫反應。按每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次或每八週一次對含有編碼免疫原的環狀多核苷酸的疫苗給予另外的攻擊，直至檢測到抗HA抗體。投與另外的疫苗攻擊以加強抗HA抗體的產生。實例 14 ： HA 莖抗原的小鼠免疫原性研究比較
在該實例中，進行測定以評價對使用環狀RNA遞送的流感病毒疫苗免疫原的免疫反應。測試候選流感病毒疫苗在小鼠中的免疫原性，該疫苗包含自不同流感病毒株獲得的編碼HA莖蛋白的環狀RNA多核苷酸。測試疫苗包括以下用或未用MC3 LNP配製的環狀RNA。
在第0和3週用兩劑不同的流感病毒RNA疫苗配製物為小鼠肌內免疫接種，並在用第二劑免疫接種後兩週收集血清。實例 15 ： HA 莖抗原的小鼠免疫原性研究比較
在該實例中，進行測定以評價對使用環狀RNA遞送的流感病毒疫苗免疫原的免疫反應。測試候選流感病毒疫苗在小鼠中的免疫原性，該疫苗包含自不同流感病毒株獲得的編碼HA莖蛋白的環狀RNA多核苷酸。測試疫苗包括以下用或未用MC3 LNP配製的環狀RNA。
在第0和3週用兩劑不同的流感病毒RNA疫苗配製物為小鼠肌內免疫接種，並在用第二劑免疫接種後兩週收集血清。
使用ELISA測試血清中是否存在能夠與來自多種流感病毒株的血凝素（HA）結合的抗體。簡言之，將ELISA板在4°C下用100 ng在PBS中的重組HA（義翹神州生物技術有限公司）包被過夜。包被後，將板用含0.05%吐溫20的Tris緩衝鹽水（TBS-T）洗滌，然後在室溫下用TBS-T + 2% BSA封閉1小時。封閉後，將100 μL來自免疫小鼠的對照抗體或血清（稀釋於TBS-T + 2% BSA中）添加到每張板的頂部孔中，並在含2% BSA的TBS-T中連續稀釋。將板密封，然後在室溫下孵育1-2小時。將板用TBS-T洗滌，並且將山羊抗小鼠IgG（H + L）-HRP軛合物添加到含有小鼠血清的每個孔中。將板在室溫孵育1小時，然後用TBS-T洗滌，並與TMB底物（Pierce 340214）孵育。使顏色顯影 ~ 10分鐘，然後用100 μL的2 N硫酸淬滅。在450 nm下在酶標儀上對板進行讀數。計算終點滴定度。實例 16 ：針對甲型流感的環狀 RNA 疫苗的小鼠功效研究
該實例描述了在體內對甲型流感有效的環狀RNA疫苗。
測試疫苗包括配製在魚精蛋白中的以下環狀RNA。NIHGen6HASS-foldon環狀RNA（基於Yassine等人，Nat. Med. [自然·醫學] 2015年9月；21 (9): 1065-70），編碼來自H3N2毒株的核蛋白NP的環狀RNA，或NIHGen6HASS-foldon和NP環狀RNA的幾種組合之一。測試了幾種疫苗抗原共同遞送之方法，包括：在用魚精蛋白配製前將各環狀RNA混合，在混合前配製各環狀RNA，並分別配製環狀RNA並注射遠端部位（對側腿）。對照動物用無環狀RNA的魚精蛋白接種（以控制魚精蛋白的作用）或不接種（原初）。
在第0和第3週，對動物進行肌內（IM）免疫。候選流感病毒疫苗在實例 13 中有描述。在第二劑後兩週從所有動物收集血清。在第6週，從動物的一個子集中收穫脾臟。其餘動物用克他命（Ketamine）和甲苯噻𠯤（Xylazine）的混合物使其鎮靜，然後用致死劑量的小鼠適應流感病毒株H1N1 A/波多黎各/8/1934進行鼻內攻擊。記錄死亡率，並在感染後20天每天評估各小鼠的體重。
為了測試血清中是否存在能夠與來自多種流感毒株的血凝素（HA）或核蛋白（NP）結合的抗體，如上所述進行ELISA測定並計算終點滴定度。
為了探測功能性抗體反應，評估血清中和一組HA-假型病毒的能力。簡言之，將293細胞用含有螢火蟲螢光素酶基因的複製缺陷型逆轉錄病毒載體、編碼人氣道絲胺酸蛋白酶的表現載體以及編碼流感血凝素（HA）和神經胺酸酶（NA）的表現載體共轉染。從培養物上清液中收穫所得假病毒，過濾並滴定。
將血清的連續稀釋液與假病毒原液（每孔30,000-300,000個相對光單位）一起在96孔板中於37°C孵育一小時，然後將293細胞添加到每個孔中。將培養物在37°C下孵育72小時，此時添加螢光素酶底物和細胞裂解試劑，並在發光計上測量相對光單位（RLU）。將中和滴定度表示為抑制50%假病毒感染（IC50）的血清稀釋度的倒數。
評估NIHGen6HASS-foldon抗血清介導體外抗體依賴性細胞毒性（ADCC）替代活性的能力。簡言之，將連續滴定的小鼠血清樣本與在細胞表面上穩定表現來自H1N1 A/波多黎各/8/1934的HA的A549細胞一起孵育。隨後，將ADCC生物測定效應細胞（普洛麥格公司，小鼠FcgRIV NFAT-Luc效應細胞；M115A）添加到血清/靶細胞混合物中。大約6小時後，將Bio-glo試劑（普洛麥格公司；G7940）添加到樣本孔中並測量發光度。
在投與第二劑疫苗三週後，從每組動物的一個子集中收穫脾臟，併合並來自同一組動物的脾細胞。用HA或NP肽庫（安肽生技公司（Anaspec））刺激脾淋巴細胞，並藉由細胞內染色和流動式細胞測量術測量IFN-γ、IL-2或TNF-α的產生。實例 17 ：用於向非人類動物投與的環狀 RNA 的配製
純化後，如下配製環狀RNA或mRNA：
A. 將環狀RNA或mRNA在PBS中稀釋到50 μL中為2.5皮莫耳或25皮莫耳的最終濃度，以獲得環狀RNA製劑或線性RNA製劑（未配製）。
B. 根據製造商的說明（15% TransIT、5% Boost），用脂質載劑（例如TransIT（米盧斯生物公司（Mirus Bio）））和mRNA加強試劑（米盧斯生物公司）配製環狀RNA或mRNA，以獲得50 μL中2.5皮莫耳或25皮莫耳的最終RNA濃度，以獲得環狀RNA製劑或線性RNA製劑。
C. 將環狀RNA或mRNA用陽離子聚合物（例如，魚精蛋白）配製。簡言之，將環狀RNA或mRNA在純淨水中稀釋。將硫酸魚精蛋白溶解在林格氏乳酸溶液（4000 ng/μL）中。在攪拌的同時，將魚精蛋白-林格乳酸溶液添加到一半環狀RNA或mRNA溶液中，直到RNA : 魚精蛋白的重量比為2 : 1。將該溶液再攪拌10分鐘以確保形成穩定的複合物。然後添加剩餘的環狀RNA或mRNA（即，將剩餘的環狀RNA添加到環狀RNA溶液中，將剩餘的mRNA添加到mRNA溶液中），並短暫攪拌該溶液。使用林格氏乳酸溶液調節混合物（即，環狀RNA混合物或mRNA混合物）的最終濃度，以獲得最終RNA濃度為每50 μL中2.5皮莫耳或25皮莫耳的環狀RNA製劑或線性RNA製劑。
D. 用脂質奈米顆粒配製環狀RNA或mRNA。簡言之，將環狀RNA或mRNA在pH = 4的25 mM乙酸鹽緩衝液中稀釋（通過0.2 μm過濾器過濾）到0.2 μg/μL的濃度。首先藉由將可電離的脂質（例如ALC0315）、膽固醇、DSPC和DMG-PEG2000以50/38.5/10/1.5 mol%的莫耳比溶解在乙醇中（通過0.2 μm無菌過濾器過濾）來配製脂質奈米顆粒（LNP）。最終可電離的脂質/RNA重量比為8/1 w/w。使用微流體系統將脂質和RNA溶液在微混合器晶片中混合，流量比為3/1緩衝液/乙醇且總流量為1 ml/min。然後將LNP在pH = 7.4的PBS中透析3小時以去除乙醇。使用Ribogreen測定法測量LNP內部的RNA濃度和包封效率。如有必要，可使用截止值為100 kDa的Amicon離心過濾器將LNP濃縮至所需的RNA濃度。使用Zetasizer Ultra（瑪律文帕納科（Malvern Pananaytical））測量顆粒的大小、濃度和電荷。用PBS將RNA濃度調節至0.1或0.2 μg/μl的最終濃度。對於含有兩種RNA序列的配製物，在LNP中配製之前或在單獨配製每種RNA之後將RNA混合。對於體內實驗，通過無菌的0.2 μm再生纖維素過濾器過濾LNP中配製的最終RNA。實例 18 ：使用定時佐劑遞送調節小鼠體內由環狀 RNA 產生高斯螢光素酶
該實例證實在遞送佐劑以刺激免疫反應的同時，體內由環狀RNA表現蛋白質或免疫原。
在該實例中，如實例 1 中所述設計編碼GLuc的環狀RNA並且如實例 2 中所述產生和純化。如實例 17 中所述配製環狀RNA，以獲得環狀RNA製劑（例如，Trans-IT配製的，魚精蛋白配製的，PBS/未配製的）。經由後腿單次肌內注射向小鼠投與每種環狀RNA製劑的50 µL注射液。藉由單次皮內注射向另一組小鼠背部皮內投與魚精蛋白配製的環狀RNA製劑。
為了刺激免疫反應，在0小時或24小時將Addavax™佐劑（英傑公司）（一種基於角鯊烯的水包油奈米乳劑，其配方類似於MF59® 佐劑）注射至小鼠後腿（與環狀RNA製劑同時遞送）。根據製造商的說明，Addavax™佐劑按50 µL給藥。
藉由亞莫耳抽吸從每隻小鼠收集血樣（~ 25 μL）。在環狀RNA給藥後0、6、24和48小時，將血液收集到EDTA試管中。藉由在4°C下以1300 g離心30分鐘分離血漿，並使用高斯螢光素酶活性測定法（賽默科技皮爾斯公司（Thermo Scientific Pierce））測試了高斯螢光素酶（一種分泌酶）的活性。將50 μL 1x GLuc底物添加到5 μL血漿中，以進行GLuc螢光素酶活性測定。在發光檢測儀（普洛麥格公司）中混合後立即讀取平板。
該實例證明使用以下方法可在長時間內在體內從環狀RNA成功表現蛋白質：(a) 肌內注射TransIT配製的、魚精蛋白配製的和未配製的環狀RNA製劑，不遞送佐劑（圖 8 ）和在0和24小時遞送佐劑（圖 9 ）；以及 (b) 皮內注射魚精蛋白配製的環狀RNA製劑，不遞送佐劑和在24小時遞送佐劑（圖 10 ）。實例 19 ：藉由評估 RNA 酶 H 產生的核酸降解產物表徵環狀 RNA 製劑
該實例證明評估環狀RNA製劑中RNA酶H產生的核酸降解產物可以檢測線性和連環化產物相對於環狀產物。
與連接酶一起孵育時，RNA不能反應或形成分子內或分子間鍵，分別生成環狀（無游離末端）或連環化RNA（線性的）。使用互補DNA引物和RNA酶H（一種識別DNA/RNA雙鏈體的非特異性核酸內切酶）處理每種類型的RNA，預期會依據起始RNA物質產生獨特數量的具有特定大小的降解產物。
基於RNA酶H降解產生的RNA的數目和大小，可證實連接的RNA係無連環化RNA污染的環狀RNA或有連環化RNA污染的環狀RNA。將引物和RNA酶H添加到環狀RNA中時，單個引物與環狀RNA形成雙鏈體，而RNA酶H降解DNA/RNA雙鏈體區以產生單一線性RNA產物。當將引物和RNA酶H添加到連環體中時，至少兩個引物與連環化RNA形成雙鏈體，而RNA酶H降解DNA/RNA雙鏈體以產生三種產物；一種產物係從5’末端到第一引物結合區的RNA，一種產物係在第一引物結合區和下一引物結合區之間的RNA，根據連接在一起的連環體的數目，其可以包括多個RNA，並且最後一種產物係從最後一個引物結合區到3’末端的RNA。將引物和RNA酶H添加到線性RNA中時，單個引物與線性RNA形成雙鏈體以產生從5’末端到引物結合區的一種RNA產物和引物結合區到3’末端的另一種RNA產物。圖 11 的左側草圖說明了該策略。
在該實例中，環狀RNA如下生成。使用T7 RNA聚合酶藉由體外轉錄從DNA區段合成未修飾的線性RNA。轉錄的RNA用RNA純化系統（新英格蘭生物學實驗室公司）純化，按照製造商的說明用RNA 5’焦磷酸水解酶（RppH）（新英格蘭生物學實驗室公司，M0356）處理，並再次用RNA純化系統純化。將環狀RNA設計成包括IRES以及編碼奈米螢光素酶（Nluc）的ORF和側接IRES-ORF的兩個間隔元件。
為了測試RNA的環化狀態，將0.05皮莫耳/µl線性RNA或環狀RNA製劑與0.25 U/µl RNA酶H（消化DNA/RNA雙鏈體的內切核糖核酸酶）和0.3皮莫耳/µl的與Nluc RNA互補的10至30個核酸互補的寡聚體在37°C下孵育30分鐘。孵育後，藉由6%變性PAGE分析反應混合物。將凝膠用SYBR-green染色並藉由E-凝膠成像儀視覺化。藉由ImageJ測量和分析視覺化凝膠上的條帶強度。
圖 11 的右側示出了該實驗中的實際裂解產物。線性RNA泳道中該數目的條帶與RNA酶H核酸內切酶一起孵育產生了預期的兩個條帶，而在泳道A的情況下在環狀RNA泳道中檢測到單條條帶，表明環狀RNA實際上係環狀的而非連環化的。在泳道B和泳道C的情況下，在RNA酶H處理後由於RNA酶H泳道中出現多個較小的片段條帶，可見來自線性和連環化污染的條帶。實例 20 ：細胞中合成環狀 RNA 的滾環翻譯產生離散蛋白質產物
該實例證明在細胞中，經由合成環狀RNA的滾環翻譯翻譯出離散蛋白質或免疫原產物，該環狀RNA缺少終止元件（終止密碼子），例如具有交錯元件代替終止元件（終止密碼子）。另外，該實例顯示，具有交錯元件的環狀RNA比其線性對應物表現更多具有正確分子量的蛋白質或免疫原產物。
將環狀RNA設計為包括具有交錯元件代替終止元件（終止密碼子）的奈米螢光素酶基因（nLUC）。用以下轉染細胞：媒介物：僅轉染試劑；線性nLUC：EMCV IRES、交錯元件（2A序列）、3x帶FLAG標籤的nLuc序列和交錯元件（2A序列）；或環狀nLUC：EMCV IRES、交錯元件（2A序列）、3x帶FLAG標籤的nLuc序列和交錯元件（2A序列）。如圖 12 所示，與線性RNA相比，環狀RNA產生更高水平的具有正確分子量的蛋白質。
24小時後，藉由加入100 μl RIPA緩衝液收穫細胞。以1400xg離心5分鐘後，在10%-20%梯度聚丙烯醯胺/SDS凝膠上分析上清液。
使用乾轉移法電轉移到硝酸纖維素膜上後，將印跡與抗FLAG抗體和抗小鼠IgG過氧化物酶一起孵育。用ECL套組視覺化印跡並藉由Image J測量Western印跡帶強度。
如圖 12 所示，在細胞中檢測到環狀RNA翻譯產物。特別地，不具有終止元件（終止密碼子）的環狀RNA比其線性RNA對應物產生更高水平的具有正確分子量的離散蛋白質產物。實例 21 ：具有調控核酸位點的環狀 RNA 的製備
該實例證明具有調控RNA結合位點的環狀RNA的體外產生。
不同的細胞類型擁有獨特的核酸調控機制來靶向特定的RNA序列。在環狀RNA中編碼該等特定序列可以在不同細胞類型中賦予獨特的特性。如以下實例所示，將環狀RNA工程化以編碼微小RNA結合位點。
在該實例中，環狀RNA包括編碼WT EMCV IRES的序列、mir692微小RNA結合位點和兩個側接IRES-ORF的間隔元件。
環狀RNA在體外生成。除了用於驅動轉錄的T7 RNA聚合酶啟動子外，未修飾的線性RNA還從包括以上列出的所有模體的DNA模板體外轉錄。轉錄的RNA用RNA清除套組（新英格蘭生物學實驗室公司，T2050）純化，按照製造商的說明用RNA 5’-磷酸水解酶（RppH）（新英格蘭生物學實驗室公司，M0356）處理，並再次用RNA純化柱純化。使用長度為10至40個核苷酸的夾板DNA和T4 RNA連接酶2（新英格蘭生物學實驗室公司，M0239）將RppH處理的RNA環化。環狀RNA經過Urea-PAGE純化（圖 13 ），在緩衝液（0.5 M乙酸鈉，0.1% SDS，1 mM EDTA）中洗脫，乙醇沈澱並重懸於無RNA酶的水中。
如圖 13 所示，生成了具有miRNA結合位點的環狀RNA。實例 22 ：檢測血液中的分泌型免疫原
藉由亞莫耳抽吸從每隻小鼠收集血樣（~ 25 μL）進行分析。在環狀RNA給藥後0小時、6小時、24小時、48小時和7天，將血液收集到EDTA試管中。藉由在4°C下以1300 g離心30分鐘來分離血漿。使用ELISA或蛋白質印跡評估分泌型免疫原的表現，例如對於RBD免疫原而言，使用如實例 11 中所述之方法。實例 23 ：免疫原抗體的檢測
該實例描述了如何確定免疫原抗體的存在。
如Chen X等人所述使用ELISA（medRxiv , doi: doi.org/10.1101/2020.04.06.20055475 (2020)）。簡言之，將每孔100 µL PBS中的SARS-CoV-2蛋白於4°C包被在ELISA板上過夜。然後用封閉緩衝液（5% FBS加上0.05%吐溫20）將ELISA板封閉1小時。然後在1小時內將10倍稀釋的血漿添加到每個孔的100 µL封閉緩衝液中。用含Tween® 洗滌劑的1X磷酸鹽緩衝液（PBST）洗滌後，將結合的抗體與抗小鼠IgG HRP檢測抗體（英傑公司）一起孵育30分鐘，接著用PBST洗滌，然後用PBS洗滌，並添加四甲基苯。使ELISA板反應5分鐘，然後使用1 M HCl終止緩衝液淬滅。在450 nm下測定光密度（OD）值。
A. 對於 SARS-CoV-2 RBD 免疫原的抗體 ，所用的SARS-CoV-2蛋白質係SARS-CoV-2 RBD（義翹神州生物技術有限公司，40592-V08B）。
B. 對於 SARS-CoV-2 刺突免疫原的抗體 ，所用的SARS-CoV-2蛋白質係SARS-CoV-2刺突蛋白（義翹神州生物技術有限公司，40591-V08H）。實例 24 ：環狀 RNA 的蛋白質表現增加
該實例證明細胞中的合成環狀RNA翻譯。另外，該實例顯示，環狀RNA比其線性對應物產生更多具有正確分子量的表現產物。
將線性RNA和環狀RNA設計為包括具有終止元件（終止密碼子）的奈米螢光素酶基因（nLUC）。用以下轉染細胞：媒介物：僅轉染試劑；線性nLUC：EMCV IRES、交錯元件（2A序列）、3x帶FLAG標籤的nLuc序列、交錯元件（2A序列）和終止元件（終止密碼子）；或環狀nLUC：EMCV IRES、交錯元件（2A序列）、3x帶FLAG標籤的nLuc序列、交錯元件（2A序列）和終止元件（終止密碼子）。如圖 14 所示，與線性RNA相比，環狀RNA產生更高水平的具有正確分子量的蛋白質。
24小時後，藉由加入100 μl RIPA緩衝液收穫細胞。以1400xg離心5分鐘後，在10%-20%梯度聚丙烯醯胺/SDS凝膠上分析上清液。
使用乾轉移法電轉移到硝酸纖維素膜上後，將印跡與抗FLAG抗體和抗小鼠IgG過氧化物酶一起孵育。用ECL套組視覺化印跡並藉由ImageJ測量Western印跡帶強度。
如圖 14 所示，環狀RNA在細胞中被翻譯成蛋白質。特別地，環狀RNA比其線性RNA對應物產生更高水平的具有正確分子量的蛋白質。實例 25 ：環狀 RNA 的體內再給藥
該實例證明了使用兩劑環狀RNA驅動體內環狀RNA表現的能力。
對於該實例，環狀RNA包括EMCV IRES、編碼高斯螢光素酶（GLuc）的ORF和兩個側接IRES-ORF的間隔元件。
環狀RNA在體外生成。未修飾的線性RNA從包括以上列出的所有模體以及用於驅動轉錄的T7 RNA聚合酶啟動子的DNA模板體外轉錄。轉錄的RNA用Monarch RNA清除套組（新英格蘭生物學實驗室公司，T2050）純化，按照製造商的說明用RNA 5’-磷酸水解酶（RppH，新英格蘭生物學實驗室公司，M0356）處理，並再次用Monarch RNA清除系統純化。使用長度為10至40個核苷酸的夾板DNA和T4 RNA連接酶2（新英格蘭生物學實驗室公司，M0239）將RppH處理的RNA環化。環狀RNA經過Urea-PAGE純化，在緩衝液（0.5 M乙酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA）中洗脫，乙醇沈澱並重懸於RNA儲存溶液（賽默飛世爾科技公司，目錄號AM7000）中。
小鼠在第0天接受單劑尾靜脈注射0.25 µg具有高斯螢光素酶ORF的環狀RNA，或作為對照的線性RNA，二者均在作為載劑的基於脂質的轉染試劑（米盧斯（Mirus））中配製，第56天投與第二劑。
在給藥後1、2、7、11、16和23天，收集每隻小鼠的尾靜脈血樣（50 μl）到EDTA管中。藉由在4°C下以1300 g離心25分鐘分離血漿，並使用高斯螢光素酶活性測定法（賽默科技皮爾斯公司）測試了高斯螢光素酶（一種分泌酶）的活性。將50 µl 1X GLuc底物添加到5 µl血漿中，以進行GLuc螢光素酶活性測定。在發光檢測儀（普洛麥格公司）中混合後立即讀取平板。
在第一劑環狀RNA給藥後1、2、7、11、16和23天，在血漿中檢測到高斯螢光素酶活性（圖 15 ）。
相反，僅在經修飾的線性RNA給藥後1和2天在血漿中檢測到高斯螢光素酶活性（圖 15 ）。
在第二劑環狀RNA給藥後2、3、8和15天再次在血漿中檢測到高斯螢光素酶活性（圖 15 ）。
相反，僅在經修飾的線性RNA給藥後1、2、3天在血漿中檢測到高斯螢光素酶活性。
該實例證明環狀RNA在更長時間段中體內表現蛋白質，以及在注射後數天血漿中的蛋白質活性水平。另外，證明環狀RNA的再給藥產生了相似的表現譜。實例 26 ：環狀 RNA 的體內交錯給藥
該實例證明了使用連續交錯劑量的環狀RNA驅動體內環狀RNA更高表現蛋白質或免疫原的能力。
對於該實例，環狀RNA包括EMCV IRES、編碼高斯螢光素酶（GLuc）的ORF和兩個側接IRES-ORF的間隔元件。
環狀RNA在體外生成。未修飾的線性RNA從包括以上列出的所有模體以及用於驅動轉錄的T7 RNA聚合酶啟動子的DNA模板體外轉錄。轉錄的RNA用RNA清除套組（新英格蘭生物學實驗室公司，T2050）純化，按照製造商的說明用RNA 5’-磷酸水解酶（RppH）（新英格蘭生物學實驗室公司，M0356）處理，並再次用RNA純化柱純化。使用長度為10至40個核苷酸的夾板DNA和T4 RNA連接酶2（新英格蘭生物學實驗室公司，M0239）將RppH處理的RNA環化。環狀RNA經過Urea-PAGE純化，在緩衝液（0.5 M乙酸鈉，0.1% SDS，1 mM EDTA）中洗脫，乙醇沈澱並重懸於無RNA酶的水中。
在第0天、第2天和第5天，小鼠接受一劑尾靜脈注射0.25 pmol具有高斯螢光素酶ORF的環狀RNA，或作為對照的線性RNA，二者均在作為載劑的基於脂質的轉染試劑（米盧斯）中配製。
在給藥後6小時、1、2、3、5、7、14、21、28、35、42天，從每隻小鼠的尾靜脈中收集血樣（50 μl）到EDTA管中。藉由在4°C下以1300 g離心25分鐘分離血漿，並使用高斯螢光素酶活性測定法（賽默科技皮爾斯公司）測試了高斯螢光素酶（一種分泌酶）的活性。將50 µl 1X GLuc底物添加到5 µl血漿中，以進行GLuc螢光素酶活性測定。在發光檢測儀（普洛麥格公司）中混合後立即讀取平板。
在單劑環狀RNA給藥後6小時、1、2、3、5、7、14、21、28天，在血漿中檢測到高斯螢光素酶活性（圖 16 和圖 17 ）。當給藥3個劑量時，在第一劑環狀RNA給藥後6小時、1、2、3、5、7、14、21、28、35天，在血漿中檢測到高斯螢光素酶活性（圖 16 和圖 17 ）。
相反，僅在經修飾的線性RNA給藥後6小時、1、2、3天在血漿中檢測到高斯螢光素酶活性並且表現水平不會增加超過其初始劑量。即使另外的線性RNA給藥，在第x天或之後仍未檢測到高於本底水平的來自線性RNA來源的蛋白質的酶活性（圖 16 和圖 17 ）。
該實例證明環狀RNA在更長時間段中體內表現蛋白質，在多次注射後血漿中的蛋白質活性水平增加。另外，證明環狀RNA而不是線性RNA的重複給藥引起表現。實例 27 ：經由肌內注射裸劑量和重複劑量（ redose ）的環狀 RNA
該實例證明了使用兩劑肌內投與的環狀RNA驅動體內環狀RNA表現蛋白質或免疫原的能力。
對於該實例，環狀RNA包括EMCV IRES、編碼高斯螢光素酶（GLuc）的ORF和兩個側接IRES-ORF的間隔元件。
如實例 2 中所述生成環狀RNA和mRNA。
為了生成未配製的RNA，然後將環狀RNA和mRNA在100 µL PBS中稀釋到2.5皮莫耳的最終濃度。
小鼠接受向後腿單次肌內注射2.5皮莫耳的具有高斯螢光素酶ORF的環狀RNA。在第0天進行注射，並在第49天投與第二劑。使用僅媒介物作為對照。
在給藥後1、2、7、11、16和23天，藉由頦下穿刺將血樣（50 µL）收集到EDTA管中。藉由在4°C下以1300 g離心25分鐘分離血漿，並使用高斯螢光素酶活性測定法（賽默科技皮爾斯公司）測試了高斯螢光素酶（一種分泌酶）的活性。將50 µL 1X GLuc底物添加到5 µl血漿中，以進行GLuc螢光素酶活性測定。在發光檢測儀（普洛麥格公司）中混合後立即讀取平板。
在第一劑未配製的環狀RNA給藥後1、2、7、11、16和23天，在血漿中檢測到高斯螢光素酶活性。（圖 18 ）
相反，僅在未配製的mRNA給藥後1和2天在血漿中檢測到高斯螢光素酶活性。（圖 18 ）
在第二劑未配製的環狀RNA給藥後2、3、8和15天再次在血漿中檢測到高斯螢光素酶活性。（圖 18 ）
相反，僅在未配製的經修飾的mRNA給藥後1、2和3天在血漿中檢測到高斯螢光素酶活性。（圖 18 ）
在每種情況下，高斯螢光素酶活性高於僅媒介物的對照。
該實例證明無載劑的肌內投與的環狀RNA在更長時間段中體內表現蛋白質，以及在注射後數天血漿中的蛋白質活性水平。另外，證明環狀RNA的再給藥產生了相似的表現譜。實例 28 ：靜脈內重複注射五次載劑重複劑量的環狀 RNA 引起功能性蛋白質的表現
該實例證明了使用五劑靜脈內投與的環狀RNA驅動體內環狀RNA表現的能力。
對於該實例，環狀RNA包括EMCV IRES、編碼高斯螢光素酶（GLuc）的ORF和兩個側接IRES-ORF的間隔元件。
如實例 2 中所述生成環狀RNA和mRNA。
使用陽離子脂質載劑配製環狀RNA和mRNA。在該實例中，根據製造商的說明，將10% TransIT（米盧斯生物公司）和5% Boost與RNA複合。
小鼠接受0.25皮莫耳包括高斯螢光素酶ORF的環狀RNA的單尾靜脈注射劑量。在第0天、第71天、第120天、第196天和第359天進行注射。使用僅媒介物作為對照。
在給藥後0.25、1、2、3、7、14、21、28和35天，藉由頦下穿刺將血樣（50 µL）收集到EDTA管中。藉由在4°C下以1300 g離心25分鐘分離血漿，並使用高斯螢光素酶活性測定法（賽默科技皮爾斯公司）測試了高斯螢光素酶（一種分泌酶）的活性。將50 µL 1X GLuc底物添加到5 µL血漿中，以進行GLuc螢光素酶活性測定。在發光檢測儀（普洛麥格公司）中混合後立即讀取平板。
當用Trans-IT配製的環狀RNA給藥時，在以下時間點在血漿中檢測到高斯螢光素酶活性：第一劑給藥後第1、2、3、7、14、21和28天；第二劑給藥後第1、2、3、7、14和21天；第三劑給藥後第1、2、3、7、14和21天；第四劑給藥後第1、2、3、7、14、21和28天；以及，第五劑給藥後第1、2、3、7、14和21天。（圖 19 ）
相反，當用Trans-IT配製的經修飾的mRNA給藥時，在以下時間點在血漿中檢測到高斯螢光素酶活性：第一劑給藥後第0.25、1和2天；第二劑給藥後第0.25、1和2天；第三劑給藥後第0.25、1和2天；第四劑給藥後第0.25、1和2天；以及，第五劑給藥後第0.25、1和2天。（圖 19 ）
在每種情況下，環狀RNA的高斯螢光素酶活性高於mRNA並且因此表現也高於mRNA。
該實例證明靜脈內投與的環狀RNA在更長時間段中在體內表現蛋白質，以及在注射後數天血漿中的蛋白質活性水平，並且可以再給藥至少5次。另外，證明環狀RNA長期再給藥產生了相似的表現譜。實例 29 ：在哺乳動物細胞中由環狀 RNA 表現多種抗原
該實例證明在哺乳動物細胞中由環狀RNA表現多種抗原。實驗 1
根據本文所述之方法設計和純化編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 33；胺基酸SEQ ID NO: 32）和編碼SARS-CoV-2刺突抗原的第二環狀RNA（核酸SEQ ID NO. 31；胺基酸SEQ ID NO: 30）。將第一環狀RNA和第二環狀RNA混合在一起以獲得混合物。使用Lipofectamine MessengerMax（賽默飛世爾公司，LMRNA015）將混合物（各1皮莫耳的環狀RNA）轉染到HeLa細胞（24孔板中每孔100,000個細胞）中。作為對照，使用MessengerMax也將第一環狀RNA和第二環狀RNA單獨轉染到HeLa細胞中。
在24小時時使用SARS-CoV-2 RBD抗原特異性ELISA測量RBD抗原的表現。在24小時時藉由流動式細胞測量術測量刺突抗原表現。
藉由用該混合物轉染，在HeLa細胞上清液中檢測到SARS-Co-V-2 RBD抗原，並且在HeLa細胞的細胞表面檢測到SARS-CoV-2刺突抗原。藉由用第一環狀RNA轉染，檢測到SARS-CoV-2 RBD抗原，但未檢測到SARS-CoV-2刺突抗原。藉由用第二環狀RNA轉染，檢測到SARS-CoV-2刺突抗原，但未檢測到SARS-CoV-2 RBD抗原。這證明在哺乳動物細胞中由環狀RNA的組合混合物表現SAR-CoV-2 RBD和SARS-CoV-2刺突抗原兩者。實驗 2
根據本文所述之方法設計和產生編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 33；胺基酸SEQ ID NO: 32）和編碼高斯螢光素酶（GLuc）的第二環狀RNA（核酸SEQ ID NO. 37；胺基酸SEQ ID NO: 36）。將第一環狀RNA和第二環狀RNA單獨與Lipofectamine MessengerMax（賽默飛世爾公司，LMRNA015）複合，然後混合在一起以獲得混合物。將混合物（各0.1皮莫耳的環狀RNA）轉染到HeLa細胞（96孔板中每孔20,000個細胞）中。作為對照，使用MessengerMax也將第一環狀RNA和第二環狀RNA單獨轉染到HeLa細胞中。
在24小時時使用SARS-CoV-2 RBD抗原特異性ELISA測量RBD抗原的表現。在24小時時使用高斯螢光素酶活性測定法（賽默科技皮爾斯公司）測量GLuc活性。
藉由用該混合物轉染，在24小時時在HeLa細胞上清液中檢測到SARS-CoV-2 RBD抗原和GLuc活性。藉由用第一環狀RNA轉染，檢測到SARS-CoV-2 RBD抗原，但未檢測到GLuc活性。藉由用第二環狀RNA轉染，檢測到GLuc活性，但未檢測到SARS-CoV-2 RBD抗原。這證明在哺乳動物細胞中由環狀RNA的組合混合物表現SAR-CoV-2 RBD和GLuc抗原兩者。實驗 3
根據本文所述之方法設計和產生編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 33；胺基酸SEQ ID NO: 32）和編碼來自甲型流感H1N1 A/加利福利亞/07/2009的血凝素（HA）的第二環狀RNA（核酸SEQ ID NO. 35；胺基酸SEQ ID NO: 34）。將第一環狀RNA和第二環狀RNA混合在一起以獲得混合物。使用Lipofectamine MessengerMax（賽默飛世爾公司，LMRNA015）將混合物（各1皮莫耳的環狀RNA）轉染到HeLa細胞（24孔板中每孔100,000個細胞）中。作為對照，使用MessengerMax也將第一環狀RNA和第二環狀RNA單獨轉染到HeLa細胞中。
在24小時時使用SARS-CoV-2 RBD抗原特異性ELISA測量RBD抗原的表現。在24小時時使用免疫印跡法測量HA抗原表現。簡言之，對於免疫印跡法，在轉染後24小時，裂解細胞並使用甲型流感H1N1 HA（A/加利福利亞/07/2009）單株抗體（MA5-29920（賽默飛世爾公司））作為一抗並使用山羊抗小鼠IgG H & L（HRP）作為二抗（艾博抗公司（Abcam），ab 97023）進行西方印漬術以檢測HA抗原。為了負載對照，將α微管蛋白與作為一抗的α微管蛋白（DM1A）小鼠抗體（細胞傳訊技術公司（Cell Signaling Technology），CST#3873）和作為二抗的山羊抗小鼠IgG H & L（HRP）（艾博抗公司，ab 97023）一起使用。
藉由用混合物轉染，檢測到SARS-CoV-2 RBD和流感HA抗原兩者。藉由用第一環狀RNA轉染，檢測到SARS-CoV-2 RBD，但未檢測到流感HA抗原。藉由用第二環狀RNA轉染，檢測到流感HA抗原，但未檢測到SARS-CoV-2 RBD抗原。這證明在哺乳動物細胞中由環狀RNA的組合混合物表現SAR-CoV-2 RBD和流感HA抗原兩者。實驗 4
根據本文所述之方法設計和產生編碼SARS-CoV-2刺突抗原的第一環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 31；胺基酸SEQ ID NO: 30）和編碼來自甲型流感H1N1 A/加利福利亞/07/2009的血凝素（HA）的第二環狀RNA（核酸SEQ ID NO. 35；胺基酸SEQ ID NO: 34）。將第一環狀RNA和第二環狀RNA混合在一起以獲得混合物。使用Lipofectamine MessengerMax（賽默飛世爾公司，LMRNA015）將混合物（各1皮莫耳的環狀RNA）轉染到HeLa細胞（24孔板中每孔100,000個細胞）中。作為對照，使用MessengerMax也將第一環狀RNA和第二環狀RNA單獨轉染到HeLa細胞中。
在24小時時藉由流動式細胞測量術測量刺突抗原表現。如上文實驗3中所述，在24小時時藉由免疫印跡法測量HA抗原表現。
藉由用混合物轉染，檢測到SARS-CoV-2刺突抗原和流感HA抗原兩者。藉由用第一環狀RNA轉染，檢測到SARS-CoV-2刺突抗原，但未檢測到流感HA抗原。藉由用第二環狀RNA轉染，檢測到流感HA抗原，但未檢測到SARS-CoV-2刺突抗原。這證明在哺乳動物細胞中由環狀RNA的組合混合物表現SAR-CoV-2刺突抗原和流感HA抗原兩者。
該實例顯示，在哺乳動物細胞中從包含環狀RNA的不同組合的環狀RNA製劑表現了多種抗原。實例 30 ：從環狀 RNA 表現多種抗原
該實例證明在哺乳動物細胞中由環狀RNA表現多種抗原。實驗 1
在該實例中，將環狀RNA設計成包括IRES，其後是編碼GLuc的ORF、終止密碼子、間隔區、IRES、編碼SARS-Cov-2 RBD抗原的ORF和終止密碼子。根據本文所述之方法產生並純化環狀RNA。作為對照，如上所述產生以下環狀RNA：(i) 具有IRES和編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的ORF的環狀RNA；(ii) 具有IRES和編碼GLuc的ORF的環狀RNA。
使用Lipofectamine MessengerMax（賽默飛世爾公司，LMRNA015）將環狀RNA（0.1皮莫耳）轉染到HeLa細胞（96孔板中每孔10,000個細胞）中。
在24小時時使用SARS-CoV-2 RBD抗原特異性ELISA測量RBD抗原的表現。在24小時時使用高斯螢光素酶活性測定法（賽默科技皮爾斯公司）測量GLuc活性。
從編碼SARSs-CoV-2 RBD抗原和GLuc的環狀RNA中檢測到RBD抗原的表現（圖 20A ）。從編碼SARSs-CoV-2 RBD抗原和GLuc的環狀RNA中檢測到GLuc活性（圖 20B ）。這證明哺乳動物細胞中從編碼SARS-CoV-2 RBD和GLuc抗原的環狀RNA表現SAR-CoV-2 RBD和GLuc抗原。實驗 2
在該實例中，將環狀RNA設計為包括IRES，其後是編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的ORF、終止密碼子、間隔區、編碼中東呼吸綜合症（MERS）RBD抗原的ORF和終止密碼子。根據本文所述之方法產生並純化環狀RNA。
使用Lipofectamine MessengerMax（賽默飛世爾公司，LMRNA015）以各種濃度將環狀RNA轉染到HeLa細胞（96孔板中每孔10,000個細胞）中。
在24小時時使用SARS-CoV-2 RBD抗原特異性ELISA測量SARS-CoV-2 RBD抗原的表現。在24小時時使用能夠檢測的MERS RBD抗原特異性抗體測量MERS RBD抗原表現。實例 31 ：小鼠模型中來自環狀 RNA 的多種抗原的免疫原性
該實例描述了藉由投與多個環狀RNA分子在受試者中表現多種抗原。實驗 1
在小鼠模型中評價配製於脂質奈米顆粒中的環狀RNA製劑的免疫原性，該環狀RNA製劑包含 (a) 編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的環狀RNA和 (b) 編碼作為模型抗原的GLuc的環狀RNA。還在小鼠模型中評價了針對SARS-CoV-2 RBD抗原的抗體的產生和GLuc活性。
根據本文所述之方法設計和純化編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 33；胺基酸SEQ ID NO: 32）和編碼GLuc的第二環狀RNA（核酸SEQ ID NO. 37；胺基酸SEQ ID NO: 36）。將第一環狀RNA和第二環狀RNA混合在一起以獲得混合物。然後如實例 17 中所述用脂質奈米顆粒配製該混合物，以獲得第一環狀RNA製劑。還如實例 17 中所述用脂質奈米顆粒單獨配製第一環狀RNA和第二環狀RNA，然後混合在一起以獲得第二環狀RNA製劑。
三隻小鼠在第0天肌內接種第一環狀RNA製劑（總劑量為10 μg RBD + 10 μg GLuc）並且在第12天接種第二環狀RNA製劑（總劑量為10 μg RBD + 10 μg GLuc）。另外的小鼠（每組3隻或4隻）也在第0天和第12天肌內接種：(i) 10 μg劑量的用脂質奈米顆粒配製的第一環狀RNA；(ii) 10 μg劑量的用脂質奈米顆粒配製的第二環狀RNA；或 (iii) PBS。
藉由下頜下抽吸從每隻小鼠收集血液。用第一環狀RNA製劑初免後2天和17天將血液收集到乾燥的無抗凝劑的試管中。藉由在4°C下以1200 g離心30分鐘從全血中分離血清。藉由酶聯免疫吸附測定（ELISA），測定各血清樣本中是否存在RBD特異性IgG。將ELISA板（MaxiSorp 442404 96孔，能肯公司）在4°C下用在100 µL的1X包被緩衝液（百進生技公司（Biolegend），421701）中的SARS-CoV-2 RBD（義翹神州生物技術有限公司，40592-V08B；100 ng）包被過夜。然後用封閉緩衝液（含2% BSA和0.05%吐溫20的TBS）將板封閉1小時。然後將血清稀釋液（1 : 500、1 : 1500、1 : 4500和1 : 13,500）添加到每個孔的100 µL封閉緩衝液中，並在室溫下孵育1小時。用含Tween®洗滌劑的1X Tris緩衝液（TBS-T）洗滌三次後，將板與抗小鼠IgG HRP檢測抗體（艾博抗公司，ab97023）孵育1小時，接著用TBS-T洗滌三次，然後添加四甲基苯（百進生技公司，421101）。使ELISA板反應10-20分鐘，然後使用0.2 N硫酸淬滅。在450 nm下測定光密度（O.D.）值。
將每個血清樣本的光密度除以背景（包被有RBD，僅與二抗孵育的板）的光密度。繪製每個樣本相對於背景的倍數。
使用高斯螢光素酶活性測定法（賽默科技皮爾斯公司）測試GLuc的活性。將50 μL 1x GLuc底物添加到10 μL血清中，以進行GLuc螢光素酶活性測定。在發光檢測儀（普洛麥格公司）中混合後立即讀取平板。
結果顯示在初免後17天（即，注射第一環狀RNA製劑後17天）獲得抗RBD抗體（圖 21A ），並且在初免後2天（即，注射第一環狀RNA製劑後2天）檢測到GLuc活性（圖 21B ）。
該等結果顯示，包含兩種編碼不同抗原的環狀RNA的環狀RNA製劑誘導抗原特異性免疫反應。實驗 2
在小鼠模型中評價配製於脂質奈米顆粒中的環狀RNA製劑的免疫原性，該環狀RNA製劑包含 (a) 編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的環狀RNA和 (b) 編碼流感血凝素（HA）抗原的環狀RNA。還在小鼠模型中評價了針對SARS-CoV-2 RBD和流感HA抗原的抗體的產生。
根據本文所述之方法設計和產生編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 33；胺基酸SEQ ID NO: 32）和編碼來自甲型流感H1N1 A/加利福利亞/07/2009的血凝素（HA）的第二環狀RNA（核酸SEQ ID NO. 35；胺基酸SEQ ID NO: 34）。將第一環狀RNA和第二環狀RNA混合在一起以獲得混合物。然後如實例 17 中所述用脂質奈米顆粒配製該混合物，以獲得第一環狀RNA製劑。還如實例 17 中所述用脂質奈米顆粒單獨配製第一環狀RNA和第二環狀RNA，然後混合在一起以獲得第二環狀RNA製劑。
三隻小鼠在第0天肌內接種第一環狀RNA製劑（總劑量為10 μg RBD + 10 μg HA）並且在第12天接種第二環狀RNA製劑（總劑量為10 μg RBD + 10 μg HA）。另外的小鼠（每組3隻或4隻）也在第0天和第12天肌內接種：(i) 10 μg劑量的用脂質奈米顆粒配製的第一環狀RNA；(ii) 10 μg劑量的用脂質奈米顆粒配製的第二環狀RNA；或 (iii) PBS。
如實驗1中所述採集血液。如實驗1中所述，藉由ELISA確定RBD特異性IgG的存在。
藉由ELISA測定各血清樣本中是否存在HA特異性IgG。將ELISA板在4°C下用HA重組蛋白（義翹神州生物技術有限公司，11085-V08B；100 ng）包被過夜，並將板如實驗1中所述進行處理。將每個血清樣本的光密度除以背景（包被有HA，僅與二抗孵育的板）的光密度。繪製每個樣本相對於背景的倍數。
結果顯示，在初免後17天（即，注射第一環狀RNA製劑後17天）獲得抗RBD和抗HA抗體（圖 22A 和圖 22B ）。
結果還顯示，包含兩種編碼不同抗原的環狀RNA的環狀RNA製劑在體內表現並誘導抗原特異性免疫反應。實驗 3
在小鼠模型中評價配製於脂質奈米顆粒中的環狀RNA製劑的免疫原性，該環狀RNA製劑包含 (a) 編碼SARS-CoV-2刺突抗原的環狀RNA和 (b) 編碼流感血凝素（HA）抗原的環狀RNA。還在小鼠模型中評價了針對SARS-CoV-2刺突和流感HA抗原的抗體的產生。
根據本文所述之方法設計和產生編碼SARS-CoV-2刺突抗原的第一環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 31；胺基酸SEQ ID NO: 30）和編碼來自甲型流感H1N1 A/加利福利亞/07/2009的血凝素（HA）的第二環狀RNA（核酸SEQ ID NO. 35；胺基酸SEQ ID NO: 34）。將第一環狀RNA和第二環狀RNA混合在一起以獲得混合物。然後如實例 17 中所述用脂質奈米顆粒配製該混合物，以獲得第一環狀RNA製劑。還如實例 17 中所述用脂質奈米顆粒單獨配製第一環狀RNA和第二環狀RNA，然後混合在一起以獲得第二環狀RNA製劑。
三隻小鼠在第0天肌內接種第一環狀RNA製劑（總劑量為10 μg刺突 + 10 μg HA）並且在第12天接種第二環狀RNA製劑（總劑量為10 μg刺突 + 10 μg HA）。另外的小鼠（每組3隻或4隻）也在第0天和第12天肌內接種：(i) 10 μg劑量的用脂質奈米顆粒配製的第一環狀RNA；(ii) 10 μg劑量的用脂質奈米顆粒配製的第二環狀RNA；或 (iii) PBS。
如實驗1中所述採集血液。藉由在4°C下以1200 g離心30分鐘從全血中分離血清。如實驗1中所述，藉由ELISA測定各血清樣本中是否存在RBD（即刺突的RBD）特異性IgG。
藉由ELISA測定各血清樣本中是否存在HA特異性IgG。將ELISA板在4°C下用HA重組蛋白（義翹神州生物技術有限公司，11085-V08B；100 ng）包被過夜，並將板如實驗1中所述進行處理。將每個血清樣本的光密度除以背景（包被有HA，僅與二抗孵育的板）的光密度。繪製每個樣本相對於背景的倍數。
結果顯示，在初免後17天（即，注射第一環狀RNA製劑後17天）獲得抗RBD抗體和抗HA抗體（圖 23A 和圖 23B ）。
結果還顯示，包含兩種編碼不同抗原的環狀RNA的環狀RNA製劑在小鼠中誘導抗原特異性免疫反應。實驗 4
在小鼠模型中評價包含配製在脂質奈米顆粒中的環狀RNA的環狀RNA製劑的免疫原性，該環狀RNA設計為包括IRES，其後是編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的ORF、終止密碼子、間隔區、IRES、編碼MERS RBD抗原的ORF和終止密碼子。還在小鼠模型中評價了針對SARS-CoV-2 RBD和MERS RBD抗原的抗體的產生。
然後如實例 17 中所述用脂質奈米顆粒配製該環狀RNA，以獲得環狀RNA製劑。
在第0天和初始投與後至少一天，以5 µg、10 µg、20 µg或50 µg的量用環狀RNA製劑對小鼠進行肌內或皮內接種。
如實驗1中所述採集血液。如實驗1中所述，藉由ELISA確定SARS-CoV-2 RBD特異性和MERS RBD特異性IgG的存在。
測定各血清樣本中是否存在抗SARS-CoV-2 RBD結合抗體、抗MERS RBD結合抗體、針對SARS-CoV-2 RBD抗原的中和抗體、針對MERS RBD抗原的中和抗體、對SARS-CoV-2抗原的細胞反應以及對MERS RBD抗原的細胞反應。實例 32 ：包含多種抗原的環狀 RNA 在小鼠模型中的免疫原性
該實例描述了包含多種抗原的環狀RNA的免疫原性。該實例還描述了在小鼠模型中針對由單個環狀RNA編碼的多種抗原的抗體的產生。
在該實例中，將環狀RNA設計成包括IRES，其後是編碼GLuc的ORF、終止密碼子、間隔區、IRES、編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的ORF和終止密碼子，如實例 30 中所述產生和純化。作為對照，如上所述產生以下環狀RNA：(i) 具有IRES和編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的ORF的環狀RNA；(ii) 具有IRES和編碼GLuc的ORF的環狀RNA。
如實例 17 中所述用脂質奈米顆粒配製環狀RNA，以獲得環狀RNA製劑。
每組三隻小鼠在第0天和第12天肌內接種10 μg或20 μg總劑量的環狀RNA製劑。
如實例 31 中所述採集血液。如實例 31 中所述，藉由ELISA確定RBD特異性IgG的存在。如實例 31 中所述測量GLuc活性。 實例33：對T細胞反應的評價
使用ELISpot測定法檢測SARS-CoV-2刺突或RBD特異性T細胞或流感HA特異性T細胞的存在。對來自實例 31 的以下幾組小鼠進行該項測定： 1.      RBD 2.      GLuc 3.      HA 4.      刺突 5.      RBD + HA 6.      刺突 + HA 7.      PBS
在加強後第30天（即，注射第一環狀RNA製劑後30天）收穫小鼠脾臟，並將其加工成單細胞懸液。將脾細胞以每孔0.5 M細胞接種在IFN-g或IL-4 ELISpot板（ImmunoSpot）上。脾細胞不受刺激或用SARS CoV-2和HA肽庫（JPT、PM-WCPV-SRB和PM-IFNA_HACal）刺激。將ELISPOT板根據製造商的方案進行處理。實例中援引的序列
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Figure 02_image009
無
[圖 1 ]係包括兩個表現序列的示例性環狀RNA之示意圖，其中每個表現序列編碼一種免疫原。環狀RNA包含兩個開放閱讀框（ORF），每個ORF編碼和表現序列，其中每個ORF與IRES可操作地連接。
[圖 2 ]係包括兩個表現序列的示例性環狀RNA之示意圖，其中每個表現序列係一種免疫原。環狀RNA包含兩個被2A序列隔開的表現序列，所有表現序列均與IRES可操作地連接。
[圖 3 ]示出了多個多核糖核苷酸之示意圖，其中每個多核苷酸均包括編碼免疫原的ORF。
[圖 4 ]顯示由環狀RNA編碼的RBD免疫原在BJ成纖維細胞和HeLa細胞中檢測到，而在用媒介物對照的BJ成纖維細胞和HeLa細胞未檢測到。
[圖 5 ]顯示在小鼠模型中，投與經陽離子聚合物（例如，魚精蛋白）配製的編碼SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA後，獲得可持續的抗RBD抗體反應。
[圖 6 ]顯示在小鼠模型中，投與經陽離子聚合物（例如，魚精蛋白）配製的編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的環狀RNA後，獲得抗刺突反應。
[圖 7 ]示出了在小鼠模型中，投與經陽離子聚合物（例如，魚精蛋白）配製的編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的環狀RNA後獲得的抗-RBD IgG2a和IgG1同種型水平。
[圖 8 ]顯示在肌內注射環狀RNA製劑（Trans-IT配製的、魚精蛋白配製的、未配製的）、僅魚精蛋白媒介物後和在未注射的對照小鼠中，長期從體內環狀RNA表現蛋白質。
[圖 9 ]顯示在同時肌內遞送Addavax™佐劑與 (i) 未配製的環狀RNA製劑（左圖），(ii) 經TransIT配製的環狀RNA（中間圖），和 (iii) 經魚精蛋白配製的環狀RNA（右圖）後，長期從體內環狀RNA表現蛋白質。在每種情況下，Addavax™佐劑均在0和24小時以單獨注射的形式遞送。
[圖 10 ]顯示在 (i) 經魚精蛋白配製的環狀RNA、(ii) 經魚精蛋白配製的環狀RNA（在24小時注射Addavax™佐劑）、(iii) 僅魚精蛋白媒介物的皮內遞送後，和 (iv) 未注射的對照小鼠，長期從體內環狀RNA表現蛋白質。
[圖 11 ]示出了探針與環狀和線性RNA的結合以及RNA酶H對RNA的後續降解。環狀RNA作為單一裂解的線性條帶被檢測到，相比而言環狀和連環化RNA作為多個條帶被檢測到。藉由使樣本在變性聚丙烯醯胺凝膠上電泳並比較添加或不添加RNA酶H的降解條帶來檢測降解。
[圖 12 ]係示出了具有交錯元件的環狀RNA或線性RNA的表現產物的蛋白質印跡的圖像。
[圖 13 ]示出了藉由自剪接生成示例性環狀RNA。
[圖 14 ]係示出了環狀RNA或線性RNA的表現產物的蛋白質印跡的圖像。
[圖 15 ]示出了實驗數據，證明與線性多核糖核苷酸對應物（「線性」）相比，用環狀多核糖核苷酸（「無末端的」）再給藥後小鼠中的高斯螢光素酶表現的持久性增加。
[圖 16 ]示出了實驗數據，證明與交錯給藥線性多核糖核苷酸對應物（「線性3劑」），或單劑的環狀多核糖核苷酸（「無末端的」），或單劑的線性多核糖核苷酸對應物（「線性」）相比，交錯給藥環狀多核糖核苷酸（「無末端的3劑」）後小鼠中的高斯螢光素酶表現的持久性增加。
[圖 17 ]示出了實驗數據，證明與單劑的線性多核糖核苷酸對應物（「線性RNA」）相比，單劑環狀多核糖核苷酸（「無止境RNA（Endless RNA）」）後；與單劑（「線性RNA」）相比，交錯給藥線性多核糖核苷酸對應物（「3劑線性RNA」）後；或與單劑（「無止境RNA」）相比，交錯給藥環狀多核糖核苷酸（「3劑無止境RNA」）後，小鼠中的高斯螢光素酶表現的持久性增加。
[圖 18 ]顯示在沒有載劑的情況下肌內投與的環狀多核糖核苷酸在更長時間段中在體內表現蛋白質，以及在注射後數天血漿中的蛋白質活性水平。
[圖 19 ]顯示靜脈內投與的環狀多核糖核苷酸在更長時間段中在體內表現蛋白質，以及在注射後數天血漿中的蛋白質活性水平，並且可以再給藥至少5次。
[圖 20A ]示出了環狀多核糖核苷酸的多抗原表現。從編碼SARSs-CoV-2 RBD抗原和GLuc的環狀RNA中檢測到RBD抗原的表現。
[圖 20B ]示出了環狀多核糖核苷酸的多抗原表現。從編碼SARSs-CoV-2 RBD抗原和GLuc的環狀RNA中檢測到GLuc活性。
[圖 21A ]證明了小鼠模型中來自環狀RNA的多種抗原的免疫原性。用編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA和編碼GLuc的第二環狀RNA為小鼠接種。注射後17天獲得抗RBD抗體。
[圖 21B ]證明了小鼠模型中來自環狀RNA的多種抗原的免疫原性。用編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA和編碼GLuc的第二環狀RNA為小鼠接種。注射後2天檢測到GLuc活性。
[圖 22A ]證明了小鼠模型中來自環狀RNA的多種抗原的免疫原性。用編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA和編碼流感病毒血凝素（HA）抗原的第二環狀RNA為小鼠接種。注射後17天獲得抗RBD抗體。
[圖 22B ]證明了小鼠模型中來自環狀RNA的多種抗原的免疫原性。用編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA和編碼流感病毒血凝素（HA）抗原的第二環狀RNA為小鼠接種。注射後17天獲得抗HA抗體。
[圖 23A ]證明了小鼠模型中來自環狀RNA的多種抗原的免疫原性。用編碼SARS-CoV-2刺突抗原的第一環狀RNA和編碼流感病毒血凝素（HA）抗原的第二環狀RNA為小鼠接種。注射後17天獲得抗RBD（刺突結構域）抗體。
[圖 23B ]證明了小鼠模型中來自環狀RNA的多種抗原的免疫原性。用編碼SARS-CoV-2刺突抗原的第一環狀RNA和編碼流感病毒血凝素（HA）抗原的第二環狀RNA為小鼠接種。注射後17天獲得抗HA抗體。
無
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Claims (57)

  1. 一種環狀多核糖核苷酸，該環狀多核糖核苷酸包含多個序列，每個序列編碼多肽免疫原，其中該等多肽免疫原中的至少兩種鑒別不同的靶標。
  2. 如請求項1所述之環狀多核糖核苷酸，其中該等多肽免疫原中的每一種鑒別不同的靶標。
  3. 如請求項1或2所述之環狀多核糖核苷酸，其中每個靶標係不同的病原體。
  4. 如請求項3所述之環狀多核糖核苷酸，其中每個靶標獨立地是病毒、細菌、真菌或寄生蟲。
  5. 如請求項4所述之環狀多核糖核苷酸，其中每個靶標係不同的病毒。
  6. 如請求項4所述之環狀多核糖核苷酸，其中每個靶標係不同的細菌。
  7. 如請求項4所述之環狀多核糖核苷酸，其中該等靶標包括病毒和細菌。
  8. 一種環狀多核糖核苷酸，該環狀多核糖核苷酸包含多個序列，每個序列編碼多肽免疫原，其中該等多肽免疫原中的至少兩種鑒別不同的蛋白質，其中該等不同的蛋白質中的每一種鑒別相同的靶標。
  9. 如請求項8所述之環狀多核糖核苷酸，其中該等多肽免疫原中的每一種鑒別不同的蛋白質。
  10. 如請求項8或9所述之環狀多核糖核苷酸，其中該靶標係病原體。
  11. 如請求項10所述之環狀多核糖核苷酸，其中該病原體係病毒、細菌、真菌或寄生蟲。
  12. 如請求項11所述之環狀多核糖核苷酸，其中該病原體係病毒並且該等不同的蛋白質中的每一種係與該病毒相關的病毒蛋白質。
  13. 如請求項11所述之環狀多核糖核苷酸，其中該病原體係細菌並且該等不同的蛋白質中的每一種係與該細菌相關的細菌蛋白質。
  14. 如請求項8或9所述之環狀多核糖核苷酸，其中該靶標係癌細胞。
  15. 如請求項14所述之環狀多核糖核苷酸，其中該等不同的蛋白質中的每一種係與該癌細胞相關的不同腫瘤抗原。
  16. 如請求項8或9所述之環狀多核糖核苷酸，其中該靶標係過敏原或毒素。
  17. 如請求項1-16中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含500至20,000個核糖核苷酸。
  18. 如請求項1-16中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含至少1,000個核糖核苷酸。
  19. 如請求項1-18中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或至少九個序列，每個序列編碼多肽免疫原。
  20. 如請求項1-18中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含兩個至三個、兩個至五個或五個至十個序列，每個序列編碼多肽免疫原。
  21. 如請求項1-20中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中至少一個編碼多肽免疫原的序列進一步編碼訊息序列。
  22. 如請求項1-21中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中編碼該等多肽免疫原中的每一種的每一個序列與內部核糖體進入位點（IRES）可操作地連接。
  23. 如請求項22所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含單個IRES。
  24. 如請求項23所述之環狀多核糖核苷酸，其中該等多肽免疫原中的每一種由與該單個IRES可操作地連接的單個開放閱讀框編碼，其中該開放閱讀框的表現產生包含該等多肽免疫原中的每一種的胺基酸序列的多肽。
  25. 如請求項24所述之環狀多核糖核苷酸，其中該等多肽免疫原各自被多肽連接子隔開。
  26. 如請求項24所述之環狀多核糖核苷酸，其中該等多肽免疫原各自被裂解結構域隔開。
  27. 如請求項26所述之環狀多核糖核苷酸，其中每個裂解結構域均為2A自裂解肽。
  28. 如請求項22所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含多個IRES。
  29. 如請求項28所述之環狀多核糖核苷酸，其中每個IRES與包含編碼多肽免疫原的序列的開放閱讀框可操作地連接。
  30. 一種包含多個環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物，每個環狀多核糖核苷酸均包含編碼多肽免疫原的序列。
  31. 如請求項30所述之免疫原性組成物，其中該多個環狀多核糖核苷酸中的每一個均為如請求項1-29中任一項所述之環狀多核糖核苷酸。
  32. 如請求項31所述之免疫原性組成物，其中該組成物包含 (a) 包含編碼第一多肽免疫原的序列的至少第一環狀多核糖核苷酸和 (b) 包含編碼第二多肽免疫原的序列的至少第二環狀多核糖核苷酸，其中該第一多肽免疫原和第二多肽免疫原鑒別不同的蛋白質，其中每種不同的蛋白質鑒別相同的靶標。
  33. 如請求項32所述之免疫原性組成物，其中該靶標係病原體。
  34. 如請求項33所述之免疫原性組成物，其中該病原體係病毒、細菌、真菌或寄生蟲。
  35. 如請求項32所述之免疫原性組成物，其中該靶標係癌細胞、過敏原或毒素。
  36. 如請求項30所述之免疫原性組成物，其中該組成物包含 (a) 包含編碼第一多肽免疫原的序列的至少第一環狀多核糖核苷酸和 (b) 包含編碼第二多肽免疫原的序列的至少第二環狀多核糖核苷酸，其中該第一多肽免疫原鑒別第一靶標而該第二多肽免疫原鑒別第二靶標。
  37. 如請求項36所述之免疫原性組成物，其中每個靶標均為病原體。
  38. 如請求項36或37所述之免疫原性組成物，其中每個靶標獨立地是癌細胞、病毒、細菌、真菌、寄生蟲、毒素或過敏原。
  39. 如請求項30-38中任一項所述之免疫原性組成物，其中每種多肽免疫原均與IRES可操作地連接。
  40. 一種藥物組成物，該藥物組成物包含如請求項1-29中任一項所述之環狀多核糖核苷酸或如請求項30-39中任一項所述之免疫原性組成物，以及藥學上可接受的賦形劑。
  41. 如請求項40所述之藥物組成物，該藥物組成物進一步包含佐劑。
  42. 如請求項41所述之藥物組成物，其中該佐劑係無機佐劑、小分子佐劑和水包油乳劑、脂質或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基於RNA的佐劑、基於DNA的佐劑、病毒顆粒、細菌佐劑、雜交分子、真菌或卵母細胞微生物相關分子模式（MAMP）、無機奈米顆粒或多組分佐劑。
  43. 一種治療或預防受試者的疾病、病症或病狀之方法，該方法包括向該受試者投與如請求項1-29中任一項所述之環狀多核糖核苷酸、如請求項30-39中任一項所述之免疫原性組成物或如請求項40-42中任一項所述之藥物組成物。
  44. 如請求項43所述之方法，其中該疾病、病症或病狀係病毒感染、細菌感染、真菌感染。
  45. 如請求項43所述之方法，其中該疾病、病症或病狀係癌症。
  46. 如請求項43所述之方法，其中該疾病、病症或病狀與暴露於過敏原相關。
  47. 如請求項43所述之方法，其中該疾病、病症或病狀與暴露於毒素相關。
  48. 一種在受試者中誘導免疫反應之方法，該方法包括向該受試者投與如請求項1-29中任一項所述之環狀多核糖核苷酸、如請求項30-39中任一項所述之免疫原性組成物或如請求項40-42中任一項所述之藥物組成物。
  49. 如請求項43-48中任一項所述之方法，其中該方法進一步包括向該受試者投與佐劑。
  50. 如請求項49所述之方法，其中該佐劑係無機佐劑、小分子佐劑和水包油乳劑、脂質或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基於RNA的佐劑、基於DNA的佐劑、病毒顆粒、細菌佐劑、雜交分子、真菌或卵母細胞微生物相關分子模式（MAMP）、無機奈米顆粒或多組分佐劑。
  51. 如請求項43-50中任一項所述之方法，其中將如請求項1-29中任一項所述之環狀多核糖核苷酸、如請求項30-39中任一項所述之免疫原性組成物或如請求項40-42中任一項所述之藥物組成物作為單劑量向該受試者投與。
  52. 如請求項43-50中任一項所述之方法，其中將如請求項1-29中任一項所述之環狀多核糖核苷酸、如請求項30-39中任一項所述之免疫原性組成物或如請求項40-42中任一項所述之藥物組成物向該受試者投與兩次或更多次、三次或更多次、四次或更多次、或五次或更多次。
  53. 如請求項52所述之方法，其中如請求項1-29中任一項所述之環狀多核糖核苷酸、如請求項30-39中任一項所述之免疫原性組成物或如請求項40-42中任一項所述之藥物組成物的投與約每週一次，約每兩週一次，約每三週一次，約每個月一次，約每兩個月一次，約每三個月一次，約每四個月一次，約每五個月一次，約每六個月一次，約每年一次，約每兩年一次，約每三年一次，約每四年一次，約每五年一次，或約每十年一次。
  54. 如請求項43-53中任一項所述之方法，其中該方法進一步包括向該受試者投與多肽免疫原。
  55. 如請求項54所述之方法，其中在投與如請求項1-29中任一項所述之環狀多核糖核苷酸、如請求項30-39中任一項所述之免疫原性組成物或如請求項40-42中任一項所述之藥物組成物之後，向該受試者投與該多肽免疫原。
  56. 如請求項54或請求項55所述之方法，其中該多肽免疫原維持或增強該受試者中針對該多肽免疫原的免疫反應。
  57. 一種維持或增強受試者中的免疫反應之方法，該方法包括： (i)     向該受試者投與編碼多肽免疫原的環狀多核糖核苷酸； (ii)    向該受試者投與該多肽免疫原， 其中步驟 (ii) 發生在步驟 (i) 之後的1週至6個月之間，並且其中步驟 (ii) 的該多肽免疫原的投與維持或增強該受試者中針對該多肽免疫原的免疫反應。
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