CN116194139A - 免疫原性组合物及其用途 - Google Patents

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埃里卡·加布里埃尔·韦斯坦
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Abstract

本披露提供了编码一种或多种免疫原性多肽的多核糖核苷酸的组合物、药物制剂和用途。特别地，本披露的特征在于编码一种或多种免疫原性多肽的环状多核糖核苷酸。

Description

免疫原性组合物及其用途
序列表
本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并通过援引以其全文特此并入。创建于2021年5月18日的所述ASCII副本名称为51509-024WO3_Sequence_Listing_05.18.21_ST25并且大小是41,145字节。
背景
疫苗接种对人类和动物健康都做出了巨大贡献。自1796年发明第一款疫苗以来，疫苗已被认为是通过在受试者中激发免疫反应来预防多种传染病最成功的方法。根据世界卫生组织的资料，免疫接种目前每年预防所有年龄段2-3百万例死亡。如今，已开发出疫苗来预防和控制包括白喉、破伤风、百日咳、流感和麻疹在内的超过20种传染病的传播，并已使得天花被完全根除。仍然需要开发新的和改良的免疫原性组合物及其用途。
概述
本披露提供了编码一种或多种免疫原的多核糖核苷酸(例如，环状或线性多核糖核苷酸)的组合物、药物制剂和用途。特别地，本披露提供了编码多种免疫原的环状多核糖核苷酸和包含多个环状多核糖核苷酸的组合物。本披露进一步涉及使用编码一种或多种多肽免疫原的环状多核糖核苷酸的方法。本文所述的环状多核糖核苷酸的组合物和药物制剂在施用后可在受试者中诱导免疫反应。本文所述的环状多核糖核苷酸的组合物和药物制剂可用于治疗或预防受试者的疾病、病症或病状。
在一方面，本披露提供了环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸包括多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种(例如，至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、或至少九种)鉴别不同的蛋白质，其中这些不同的蛋白质中的每一种鉴别相同的靶标。
在一些实施例中，这些多肽免疫原中的每一种鉴别不同的蛋白质。在一些实施例中，该靶标是病原体。在一些实施例中，该病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。在一些实施例中，该病原体是病毒并且这些不同的蛋白质中的每一种是与该病毒相关的病毒蛋白。在一些实施例中，该病原体是细菌并且这些不同的蛋白质中的每一种是与该细菌相关的细菌蛋白。在一些实施例中，该靶标是癌细胞。在一些实施例中，这些不同的蛋白质中的每一种是与该癌细胞相关的不同的肿瘤抗原。在一些实施例中，该靶标是过敏原或毒素。
在另一方面，本披露提供了环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸包括多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种(例如，至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、或至少九种)鉴别不同的靶标。在一些实施例中，这些多肽免疫原中的每一种鉴别不同的靶标。在一些实施例中，每个靶标是不同的病原体。在一些实施例中，每个靶标独立地是癌细胞、病毒、细菌、真菌、或寄生虫。在一些实施例中，每个靶标是不同的病毒。在一些实施例中，每个靶标是不同的细菌。在一些实施例中，这些靶标包括病毒和细菌。
在一些实施例中，由环状多核糖核苷酸编码的多种免疫原中的每一种具有小于90％的序列同一性。
在本文所述的任一种环状多核糖核苷酸的一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括500至20,000个核糖核苷酸(例如500至10,000、500至9,000、500至8,000、500至5,000、500至4,000、500至3,000、1000和10,000、1,000和8,000、1,000至5,000、3,000至8,000、4,000至9,000或10,000至20,000个))。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括500至5,000个。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括1,000至5,000个核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括5,000至10,000个核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少500个核糖核苷酸(例如至少600、至少1000、至少1500、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000、至少4500、至少5000、至少5500、至少6000、至少6500、至少7000、至少7500、至少8000、至少8500、至少9000或至少9500个核糖核苷酸)。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少九个序列，每个序列编码多肽免疫原。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括两个或三个、两个至五个(例如，两个、三个或四个)、或五个至十个序列(例如，五个、六个、七个、八个、九个或多个序列)，每个序列编码多肽免疫原。
在一些实施例中，至少一个编码多肽免疫原的序列进一步编码信号序列。在一些实施例中，每个编码多肽免疫原的序列进一步编码信号序列。在一些实施例中，编码这些多肽免疫原中的每一种的每一个序列与内部核糖体进入位点(IRES)可操作地连接。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括单个IRES。在一些实施例中，这些多肽免疫原中的每一种由与该单个IRES可操作地连接的单个开放阅读框编码，其中该开放阅读框的表达产生包括这些多肽免疫原中的每一种的氨基酸序列的多肽。
在一些实施例中，这些多肽免疫原各自被多肽接头隔开。在一些实施例中，这些多肽免疫原各自被裂解结构域隔开。在一些实施例中，每个交错元件均为2A自裂解肽。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括多个IRES。在一些实施例中，每个IRES与包括编码多肽免疫原的序列的开放阅读框可操作地连接。
在一些实施例中，至少一个编码免疫原的序列进一步编码信号序列。在一些实施例中，每个编码免疫原的序列进一步编码信号序列。在一些实施例中，至少一个编码免疫原的序列不编码信号序列。在一些实施例中，编码免疫原的序列均未进一步编码信号序列。
在本文所述的任一种环状多核糖核苷酸的一些实施例中，其中该环状多核糖核苷酸包括具有5'末端和3'末端的第一多核糖核苷酸，其中5'末端和3'末端各自与第二多核苷酸杂交，由此连接第一多核糖核苷酸的5'末端和3'末端以形成环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸通过夹板连接产生。在一些实施例中，通过提供具有3'末端和5'末端的线性多核糖核苷酸来产生环状多核糖核苷酸，其中3'末端和5'末端各自包括内含子的一部分，并且其中3'末端的内含子部分和5'末端的内含子部分催化剪接反应，从而使5'末端和3'末端共价缀合以产生环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，内含子是I类自剪接内含子。
在另一方面，本披露提供了包含多个环状多核糖核苷酸的组合物，每个环状多核糖核苷酸均包含编码多肽免疫原的序列。在一些实施例中，该多个环状多核糖核苷酸中的每一个均为本文所述的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，这些多肽免疫原中的每一种包括一个或多个鉴别靶标的表位。在一些实施例中，该组合物包含：包括编码第一多肽免疫原的序列的至少第一环状多核糖核苷酸和包括编码第二多肽免疫原的序列的至少第二环状多核糖核苷酸，其中该第一多肽免疫原和第二多肽免疫原鉴别不同的蛋白质，其中每种不同的蛋白质鉴别相同的靶标。在一些实施例中，该组合物包含：包括编码第一多肽免疫原的序列的至少第一环状多核糖核苷酸和包括编码第二多肽免疫原的序列的至少第二环状多核糖核苷酸，其中该第一多肽免疫原鉴别第一靶标而该第二多肽免疫原鉴别第二靶标。在一些实施例中，每个靶标独立地是癌细胞、病毒、细菌、真菌、寄生虫、毒素或过敏原。在一些实施例中，该靶标是病原体。在一些实施例中，该病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。在一些实施例中，该靶标是癌细胞、过敏原或毒素。在一些实施例中，每种多肽免疫原均与IRES可操作地连接。
在另一方面，本披露提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的环状多核糖核苷酸、组合物或药物制剂中的任一种以及药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药物组合物包含本文所述的环状多核糖核苷酸、组合物或药物制剂中的任一种和鱼精蛋白(protamine)或鱼精蛋白盐(例如，硫酸鱼精蛋白)。在一些实施例中，该药物组合物进一步包含佐剂。在一些实施例中，该佐剂是无机佐剂、小分子佐剂和水包油乳剂、脂质或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基于RNA的佐剂、基于DNA的佐剂、病毒颗粒、细菌佐剂、杂交分子、真菌或卵母细胞微生物相关分子模式(MAMP)、无机纳米颗粒或多组分佐剂。在一些实施例中，该佐剂是无机佐剂。在一些实施例中，该无机佐剂是铝盐或钙盐。在一些实施例中，该佐剂是小分子。在一些实施例中，该小分子是咪喹莫特(imiquimod)、瑞喹莫德(resiquimod)或嘎德莫特(gardiquimod)。在一些实施例中，该佐剂是水包油乳剂。在一些实施例中，该水包油乳剂是角鲨烯、MF59、AS03、Montanide配制品(任选Montanide ISA51或Montanide ISA720)或不完全弗氏佐剂(一种水包油乳剂)。在一些实施例中，该佐剂是脂质或聚合物。在一些实施例中，该脂质或聚合物是聚合物纳米颗粒，任选地PLGA、PLG、PLA、PGA或PHB；脂质体，任选地病毒体或CAF01；脂质纳米颗粒或其组分；脂多糖(LPS)，任选地单磷酰基脂质A(MPLA)或吡喃葡糖苷脂质A(GLA)；脂肽，任选地Pam2(Pam2CSK4)或Pam3(Pam3CSK4)；或糖脂，任选地海藻糖二霉菌酸酯。在一些实施例中，该佐剂是肽或肽聚糖。在一些实施例中，该肽或肽聚糖对应于合成或纯化的革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌的全部或一部分，任选地N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)、鞭毛蛋白融合蛋白、甘露糖结合凝集素(MBL)、细胞因子或趋化因子。在一些实施例中，该佐剂是碳水化合物或多糖。在一些实施例中，该碳水化合物或多糖是右旋糖酐(支链微生物多糖)、硫酸右旋糖酐、香菇多糖、酵母聚糖、β-葡聚糖、Deltin、甘露聚糖或几丁质。在一些实施例中，该佐剂是皂苷。在一些实施例中，该皂苷是附接至一条或多条糖侧链的糖苷或多环苷元，任选地是ISCOMS、ISCOMS基质或QS-21。在一些实施例中，该佐剂是基于RNA的佐剂。在一些实施例中，基于RNA的佐剂是聚IC、聚IC:LC、发夹RNA(任选地具有含5'PPP的序列)、病毒序列、含聚U的序列、dsRNA、天然或合成的免疫刺激RNA序列、核酸类似物，任选地环状GMP-AMP或环状二核苷酸(诸如环状二GMP)，或免疫刺激性碱基类似物，任选地C8取代或N7,C8二取代的鸟嘌呤核糖核苷酸。在一些实施例中，该佐剂是基于DNA的佐剂。在一些实施例中，基于DNA的佐剂是CpG、dsDNA或天然或合成的免疫刺激性DNA序列。在一些实施例中，该佐剂是病毒颗粒。在一些实施例中，病毒颗粒是病毒体，任选地是磷脂细胞膜双层。在一些实施例中，该佐剂是细菌佐剂。在一些实施例中，细菌佐剂是鞭毛蛋白、LPS或细菌毒素，任选地肠毒素、热不稳定性毒素或霍乱毒素。在一些实施例中，该佐剂是杂交分子。在一些实施例中，该佐剂是与咪喹莫特缀合的CpG。在一些实施例中，该佐剂是真菌或卵母细胞微生物相关分子模式(MAMP)。在一些实施例中，真菌或卵母细胞MAMP是几丁质或β-葡聚糖。在一些实施例中，该佐剂是无机纳米颗粒。在一些实施例中，无机纳米颗粒是金纳米棒、基于二氧化硅的纳米颗粒，任选地是介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)。在一些实施例中，该佐剂是多组分佐剂。在一些实施例中，多组分佐剂是AS01、AS03、AS04、完全弗氏佐剂或CAF01。
在另一方面，本披露提供了一种治疗或预防受试者的疾病、病症或病状的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的环状多核糖核苷酸、组合物、药物制剂或药物组合物中的任一种。在一些实施例中，该疾病、病症或病状是病毒感染、细菌感染、真菌感染。在一些实施例中，该疾病、病症或病状是癌症。在一些实施例中，该疾病、病症或病状与暴露于过敏原相关。在一些实施例中，该疾病、病症或病状与暴露于毒素相关。
在另一方面，本披露提供了一种在受试者中诱导免疫反应的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的环状多核糖核苷酸、组合物、药物制剂或药物组合物中的任一种。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，该方法是非人哺乳动物。在一些实施例中，非人哺乳动物是牛、绵羊、山羊、猪、狗、马或猫。在一些实施例中，受试者是鸟。在一些实施例中，鸟是母鸡、公鸡、火鸡或鹦鹉。在一些实施例中，该方法进一步包括向该受试者施用佐剂。在一些实施例中，该佐剂是与环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸或其制剂或组合物分开的分子实体。在一些实施例中，该佐剂是无机佐剂、小分子佐剂和水包油乳剂、脂质或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基于RNA的佐剂、基于DNA的佐剂、病毒颗粒、细菌佐剂、杂交分子、真菌或卵母细胞微生物相关分子模式(MAMP)、无机纳米颗粒或多组分佐剂。在一些实施例中，该佐剂是多肽佐剂。在一些实施例中，多肽佐剂是细胞因子、趋化因子、共刺激分子、先天性免疫刺激剂、信号传导分子、转录激活因子、细胞因子受体、细菌组分或先天性免疫系统的组分。在一些实施例中，该佐剂是先天性免疫系统刺激剂。在一些实施例中，先天性免疫系统刺激剂选自包括富含GU的基序、富含AU的基序、包含dsRNA的结构化区域、或适体的RNA。
在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸、组合物、药物制剂或药物组合物中的任一种以单剂量的形式施用给受试者。在一些实施例中，将本文所述的环状多核糖核苷酸、组合物、药物制剂或药物组合物中的任一种向受试者施用两次或更多次、三次或更多次、四次或更多次、或五次或更多次。在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸、组合物、药物制剂或药物组合物中的任一种的施用约每周一次，约每两周一次，约每三周一次，约每个月一次，约每两个月一次，约每三个月一次，约每四个月一次，约每五个月一次，约每六个月一次，约每年一次，约每两年一次，约每三年一次，约每四年一次，约每五年一次，或约每十年一次。
在一些实施例中，该方法进一步包括向受试者施用多肽免疫原(例如，包含多肽免疫原的蛋白质亚基)。在一些实施例中，多肽免疫原对应于由环状多核糖核苷酸序列编码的多肽免疫原(例如，与之具有90％、95％、96％、97％、98％或100％的氨基酸序列同一性)。在一些实施例中，在施用本文所述的环状多核糖核苷酸、免疫原性组合物、药物制剂或药物组合物中的任一种之后，向受试者施用多肽免疫原。在一些实施例中，该多肽免疫原维持或增强该受试者针对该多肽免疫原的免疫反应。
在另一方面，本披露提供了一种维持或增强受试者的免疫反应的方法，该方法包括(i)向该受试者施用编码多肽免疫原的环状多核糖核苷酸并且(ii)向该受试者施用该多肽免疫原，其中步骤(ii)发生在步骤(i)之后的1周至6个月之间(例如1个月至5个月之间，2个月至3个月之间，2周至3个月之间，或3个月至6个月之间)，并且其中步骤(ii)的多肽免疫原的施用维持或增强该受试者针对该多肽免疫原的免疫反应。在一些实施例中，多肽免疫原包含一个或多个鉴别靶标的表位。在一些实施例中，该靶标是病原体。在一些实施例中，该靶标是癌细胞、过敏原或毒素。
编号的实施例：
[1]一种环状多核糖核苷酸，其包含多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种鉴别不同的靶标。
[2]如段落[1]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些多肽免疫原中的每一种鉴别不同的靶标。
[3]如段落[1]或[2]所述的环状多核糖核苷酸，其中每个靶标是不同的病原体。
[4]如段落[3]所述的环状多核糖核苷酸，其中每个靶标独立地是病毒、细菌、真菌或寄生虫。
[5]如段落[4]所述的环状多核糖核苷酸，其中每个靶标是不同的病毒。
[6]如段落[4]所述的环状多核糖核苷酸，其中每个靶标是不同的细菌。
[7]如段落[4]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些靶标包括病毒和细菌。
[8]一种环状多核糖核苷酸，其包含多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种鉴别不同的蛋白质，其中这些不同的蛋白质中的每一种鉴别相同的靶标。
[9]如段落[8]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些多肽免疫原中的每一种鉴别不同的蛋白质。
[10]如段落[8]或[9]所述的环状多核糖核苷酸，其中该靶标是病原体。
[11]如段落[10]所述的环状多核糖核苷酸，其中该病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。
[12]如段落[11]所述的环状多核糖核苷酸，其中该病原体是病毒并且这些不同的蛋白质中的每一种是与该病毒相关的病毒蛋白。
[13]如段落[11]所述的环状多核糖核苷酸，其中该病原体是细菌并且这些不同的蛋白质中的每一种是与该细菌相关的细菌蛋白。
[14]如段落[8]或[9]所述的环状多核糖核苷酸，其中该靶标是癌细胞。
[15]如段落[14]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些不同的蛋白质中的每一种是与该癌细胞相关的不同肿瘤抗原。
[16]如段落[8]或[9]所述的环状多核糖核苷酸，其中该靶标是过敏原或毒素。
[17]如段落[1]至[16]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含500至20,000个核糖核苷酸。
[18]如段落[17]所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含500至10,000个核糖核苷酸。
[19]如段落[18]所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含500至5,000个核糖核苷酸。
[20]如段落[1]至[16]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含至少500个核糖核苷酸。
[21]如段落[20]所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含至少1,000个核糖核苷酸。
[22]如段落[21]所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含至少5,000个核糖核苷酸。
[23]如段落[1]至[22]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少九个序列，每个序列编码多肽免疫原。
[24]如段落[1]至[22]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含两个至三个、两个至五个或五个至十个序列，每个序列编码多肽免疫原。
[25]如段落[1]至[22]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中至少一个编码多肽免疫原的序列进一步编码信号序列。
[26]如段落[1]至[22]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中每个编码多肽免疫原的序列进一步编码信号序列。
[27]如段落[1]至[26]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中编码这些多肽免疫原中的每一种的每一个序列与内部核糖体进入位点(IRES)可操作地连接。
[28]如段落[27]所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含单个IRES。
[29]如段落[28]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些多肽免疫原中的每一种由与该单个IRES可操作地连接的单个开放阅读框编码，其中该开放阅读框的表达产生包含这些多肽免疫原中的每一种的氨基酸序列的多肽。
[30]如段落[29]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些多肽免疫原各自被多肽接头隔开。
[31]如段落[29]所述的环状多核糖核苷酸，其中这些多肽免疫原各自被裂解结构域隔开。
[32]如段落[31]所述的环状多核糖核苷酸，其中每个裂解结构域是2A自裂解肽。
[33]如段落[27]所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含多个IRES。
[34]如段落[33]所述的环状多核糖核苷酸，其中每个IRES与包含编码多肽免疫原的序列的开放阅读框可操作地连接。
[35]如段落[1]至[34]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸包含具有5’末端和3’末端的第一多核糖核苷酸，其中5’末端和3’末端各自与第二多核苷酸杂交，由此连接第一多核糖核苷酸的5’末端和3’末端以形成环状多核糖核苷酸。
[36]如段落[35]所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸通过夹板连接产生。
[37]如段落[1]至[34]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中通过提供具有3’末端和5’末端的线性多核糖核苷酸来产生该环状多核糖核苷酸，其中该3’末端和该5’末端各自包含内含子的一部分，并且其中该3’末端的内含子部分和该5’末端的内含子部分催化剪接反应，从而使该5’末端和该3’末端共价缀合以产生环状多核糖核苷酸。
[38]如段落[37]所述的环状多核糖核苷酸，其中该内含子是I类自剪接内含子。
[39]一种包含多个环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物，每个环状多核糖核苷酸均包含编码多肽免疫原的序列。
[40]如段落[39]所述的免疫原性组合物，其中该多个环状多核糖核苷酸中的每一个均为段落中[1]至[38]中任一项所述的环状多核糖核苷酸。
[41]如段落[39]所述的免疫原性组合物，其中该组合物包含(a)包含编码第一多肽免疫原的序列的至少第一环状多核糖核苷酸和(b)包含编码第二多肽免疫原的序列的至少第二环状多核糖核苷酸，其中该第一多肽免疫原和第二多肽免疫原鉴别不同的蛋白质，其中每种不同的蛋白质鉴别相同的靶标。
[42]如段落[41]所述的免疫原性组合物，其中该靶标是病原体。
[43]如段落[42]所述的免疫原性组合物，其中该病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。
[44]如段落[43]所述的免疫原性组合物，其中该病原体是癌细胞、过敏原、或毒素。
[45]如段落[39]所述的免疫原性组合物，其中该组合物包含(a)包含编码第一多肽免疫原的序列的至少第一环状多核糖核苷酸和(b)包含编码第二多肽免疫原的序列的至少第二环状多核糖核苷酸，其中该第一多肽免疫原鉴别第一靶标而该第二多肽免疫原鉴别第二靶标。
[46]如段落[45]所述的免疫原性组合物，其中每个靶标均是病原体。
[47]如段落[45]或[46]所述的免疫原性组合物，其中每个靶标独立地是癌细胞、病毒、细菌、真菌、寄生虫、毒素或过敏原。
[48]如段落[39]至[47]中任一项所述的免疫原性组合物，其中每种多肽免疫原均与IRES可操作地连接。
[49]一种药物组合物，其包含如段落[1]至[38]中任一项所述的环状多核糖核苷酸或如段落[39]至[48]中任一项所述的免疫原性组合物，以及药学上可接受的赋形剂。
[50]如段落[49]所述的药物组合物，其进一步包含佐剂。
[51]如段落[50]所述的药物组合物，其中该佐剂是无机佐剂、小分子佐剂和水包油乳剂、脂质或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基于RNA的佐剂、基于DNA的佐剂、病毒颗粒、细菌佐剂、杂交分子、真菌或卵母细胞微生物相关分子模式(MAMP)、无机纳米颗粒或多组分佐剂。
[52]如段落[51]所述的药物组合物，其中该佐剂是无机佐剂。
[53]如段落[52]所述的药物组合物，其中该无机佐剂是铝盐或钙盐。
[54]如段落[51]所述的药物组合物，其中该佐剂是小分子。
[55]如段落[51]所述的药物组合物，其中该小分子是咪喹莫特、瑞喹莫德或嘎德莫特。
[56]如段落[51]所述的药物组合物，其中该佐剂是水包油乳剂。
[57]如段落[56]所述的药物组合物，其中该水包油乳剂是角鲨烯、MF59、AS03、Montanide配制品(任选地Montanide ISA 51或Montanide ISA 720)或不完全弗氏佐剂(一种水包油乳剂)。
[58]如段落[51]所述的药物组合物，其中该佐剂是脂质或聚合物。
[59]如段落[58]所述的药物组合物，其中该脂质或聚合物是聚合物纳米颗粒，任选地PLGA、PLG、PLA、PGA或PHB；脂质体，任选地病毒体或CAF01；脂质纳米颗粒或其组分；脂多糖(LPS)，任选地单磷酰基脂质A(MPLA)或吡喃葡糖苷脂质A(GLA)；脂肽，任选地Pam2(Pam2CSK4)或Pam3(Pam3CSK4)；或糖脂，任选地海藻糖二霉菌酸酯。
[60]如段落[51]所述的药物组合物，其中该佐剂是肽或肽聚糖。
[61]如段落[60]所述的药物组合物，其中该肽或肽聚糖对应于合成或纯化的革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌的全部或一部分，任选地N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)、鞭毛蛋白融合蛋白、甘露糖结合凝集素(MBL)、细胞因子或趋化因子。
[62]如段落[51]所述的药物组合物，其中该佐剂是碳水化合物或多糖。
[63]如段落[62]所述的药物组合物，其中该碳水化合物或多糖是右旋糖酐(支链微生物多糖)、硫酸右旋糖酐、香菇多糖、酵母聚糖、β-葡聚糖、Deltin、甘露聚糖或几丁质。
[64]如段落[51]所述的药物组合物，其中该佐剂是皂苷。
[65]如段落[64]所述的药物组合物，其中该皂苷是附接至一条或多条糖侧链的糖苷或多环苷元，任选地是ISCOMS、ISCOMS基质或QS-21。
[66]如段落[51]所述的药物组合物，其中该佐剂是基于RNA的佐剂。
[67]如段落[66]所述的药物组合物，其中该基于RNA的佐剂是聚IC、聚IC:LC、发夹RNA(任选地具有含5’PPP的序列)、病毒序列、含聚U的序列、dsRNA、天然或合成的免疫刺激RNA序列、核酸类似物，任选地环状GMP-AMP或环状二核苷酸(诸如环状二GMP)，或免疫刺激性碱基类似物，任选地C8取代或N7,C8二取代的鸟嘌呤核糖核苷酸。
[68]如段落[51]所述的药物组合物，其中该佐剂是基于DNA的佐剂。
[69]如段落[68]所述的药物组合物，其中该基于DNA的佐剂是CpG、dsDNA或天然或合成的免疫刺激性DNA序列。
[70]如段落[51]所述的药物组合物，其中该佐剂是病毒颗粒。
[71]如段落[70]所述的药物组合物，其中该病毒颗粒是病毒体，任选地是磷脂细胞膜双层。
[72]如段落[51]所述的药物组合物，其中该佐剂是细菌佐剂。
[73]如段落[72]所述的药物组合物，其中该细菌佐剂是鞭毛蛋白、LPS或细菌毒素，任选地肠毒素、热不稳定性毒素或霍乱毒素。
[74]如段落[51]所述的药物组合物，其中该佐剂是杂交分子。
[75]如段落[74]所述的药物组合物，其中该佐剂是与咪喹莫特缀合的CpG。
[76]如段落[51]所述的药物组合物，其中该佐剂是真菌或卵母细胞微生物相关分子模式(MAMP)。
[77]如段落[76]所述的药物组合物，其中该真菌或卵母细胞MAMP是几丁质或β-葡聚糖。
[78]如段落[51]所述的药物组合物，其中该佐剂是无机纳米颗粒。
[79]如段落[78]所述的药物组合物，其中该无机纳米颗粒是金纳米棒、基于二氧化硅的纳米颗粒，任选地是介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)。
[80]如段落[51]所述的药物组合物，其中该佐剂是多组分佐剂。
[81]如段落[80]所述的药物组合物，其中该多组分佐剂是AS01、AS03、AS04、完全弗氏佐剂或CAF01。
[82]一种脂质纳米颗粒(LNP)，其包含如段落[1]至[38]中任一项所述的环状多核糖核苷酸或如段落[39]至[48]中任一项所述的免疫原性组合物。
[83]如段落[82]所述的LNP，其包含可电离脂质。
[84]如段落[82]所述的LNP，其包含阳离子脂质。
[85]如段落[84]所述的LNP，其中该阳离子脂质具有根据以下的结构：
Figure BDA0004113707750000141
Figure BDA0004113707750000151
[86]如段落[82]至[85]中任一项所述的LNP，其进一步包含一种或多种中性脂质，例如，DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM、类固醇，例如，胆固醇，和/或一种或多种聚合物缀合的脂质，例如，聚乙二醇化脂质，例如，PEG-DAG、PEG-PE、PEG-S-DAG、PEG-cer或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯。
[87]一种治疗或预防受试者中的疾病、病症或病状的方法，该方法包括向该受试者施用如段落[1]至[38]中任一项所述的环状多核糖核苷酸、如段落[39]至[48]中任一项所述的免疫原性组合物、如段落[49]至[81]中任一项所述的药物组合物、或如段落[82]-[86]中任一项所述的LNP。
[88]如段落[87]所述的方法，其中该疾病、病症或病状是病毒感染、细菌感染或真菌感染。
[89]如段落[87]所述的方法，其中该疾病、病症或病状是癌症。
[90]如段落[87]所述的方法，其中该疾病、病症或病状与暴露于过敏原相关。
[91]如段落[87]所述的方法，其中该疾病、病症或病状与暴露于毒素相关。
[92]一种在受试者中诱导免疫反应的方法，该方法包括向该受试者施用如段落[1]至[38]中任一项所述的环状多核糖核苷酸、如段落[39]至[48]中任一项所述的免疫原性组合物、如段落[49]至[81]中任一项所述的药物组合物、或如段落[82]-[86]中任一项所述的LNP。
[93]如段落[87]至[92]中任一项所述的方法，其中该受试者是哺乳动物。
[94]如段落[93]所述的方法，其中该受试者是人。
[95]如段落[93]所述的方法，其中该方法是非人哺乳动物。
[96]如段落[93]所述的方法，其中该非人哺乳动物是牛、绵羊、山羊、猪、狗、马或猫。
[97]如段落[87]至[96]中任一项所述的方法，其中该受试者是鸟。
[98]如段落[97]所述的方法，其中该鸟是母鸡、公鸡、火鸡或鹦鹉。
[99]如段落[87]至[98]中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括向该受试者施用佐剂。
[100]如段落[99]所述的方法，其中该佐剂是无机佐剂、小分子佐剂和水包油乳剂、脂质或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基于RNA的佐剂、基于DNA的佐剂、病毒颗粒、细菌佐剂、杂交分子、真菌或卵母细胞微生物相关分子模式(MAMP)、无机纳米颗粒或多组分佐剂。
[101]如段落[99]所述的方法，其中该佐剂是多肽佐剂。
[102]如段落[101]所述的方法，其中该多肽佐剂是细胞因子、趋化因子、共刺激分子、先天性免疫刺激剂、信号传导分子、转录激活因子、细胞因子受体、细菌组分或先天性免疫系统的组分。
[103]如段落[99]所述的方法，其中该佐剂是先天性免疫系统刺激剂。
[104]如段落[103]所述的方法，其中该先天性免疫系统刺激剂选自包括富含GU的基序、富含AU的基序、包含dsRNA的结构化区域、或适体的RNA。
[105]如段落[87]至[104]中任一项所述的方法，其中如段落[1]至[38]中任一项所述的环状多核糖核苷酸、如段落[39]至[48]中任一项所述的免疫原性组合物、如段落[49]至[81]中任一项所述的药物组合物、或如段落[82]-[86]中任一项所述的LNP以单剂量的形式施用给该受试者。
[106]如段落[86]至[99]中任一项所述的方法，其中如段落[1]至[38]中任一项所述的环状多核糖核苷酸、如段落[39]至[48]中任一项所述的免疫原性组合物、如段落[49]至[81]中任一项所述的药物组合物、或如段落[82]-[86]中任一项所述的LNP向该受试者施用两次或更多次、三次或更多次、四次或更多次、或五次或更多次。
[107]如段落[106]所述的方法，其中如段落[1]至[38]中任一项所述的环状多核糖核苷酸、如段落[39]至[48]中任一项所述的免疫原性组合物、如段落[49]至[81]中任一项所述的药物组合物、或如段落[82]-[86]中任一项所述的LNP的施用约每周一次、约每两周一次、约每三周一次、约每个月一次、约每两个月一次、约每三个月一次、约每四个月一次、约每五个月一次、约每六个月一次、约每年一次、约每两年一次、约每三年一次、约每四年一次、约每五年一次、或约每十年一次。
[108]如段落[87]至[104]中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括向该受试者施用多肽免疫原(例如，包含多肽免疫原的蛋白质亚基)。
[109]如段落[108]所述的方法，其中该多肽免疫原对应于由环状多核糖核苷酸序列编码的多肽免疫原(例如，与之具有90％、95％、96％、97％、98％或100％的氨基酸序列同一性)。
[110]如段落[108]所述的方法，其中在施用如段落[1]至[38]中任一项所述的环状多核糖核苷酸、如段落[39]至[48]中任一项所述的免疫原性组合物、如段落[49]至[81]中任一项所述的药物组合物、或如段落[82]-[86]中任一项所述的LNP之后，向该受试者施用该多肽免疫原。
[111]如段落[108]至[110]中任一项所述的方法，其中该多肽免疫原维持或增强该受试者针对该多肽免疫原的免疫反应。
[112]一种维持或增强受试者中的免疫反应的方法，该方法包括(i)向该受试者施用编码多肽免疫原的环状多核糖核苷酸并且(ii)向该受试者施用该多肽免疫原，其中步骤(ii)发生在步骤(i)之后的1周至6个月之间，并且其中步骤(ii)的该多肽免疫原的施用维持或增强该受试者针对该多肽免疫原的免疫反应。
[113]如段落[112]所述的方法，其中该多肽免疫原包含一个或多个鉴别靶标的表位。
[114]如段落[113]所述的方法，其中该靶标是病原体。
[115]如段落[113]所述的方法，其中该靶标是癌细胞、过敏原、或毒素。
定义
本披露将针对特定实施例并参考某些附图进行描述，但是本披露不限于此，而是仅由权利要求书来限定。除非另有说明，否则下文陈述的术语通常应以其共识来理解。
如本文所用，术语“适应性免疫反应”是指体液或细胞介导的免疫反应。为了本披露的目的，“体液免疫反应”是指由抗体分子介导的免疫反应，而“细胞免疫反应”是由T淋巴细胞和/或其他白细胞介导的免疫反应。
如本文所用，术语“佐剂”是指增大或以其他方式改变或修改免疫反应的化合物。免疫反应的修改包括强化或扩大抗体和细胞免疫反应中的任一者或两者的特异性。免疫反应的修改还可以意指降低或阻遏某些免疫原特异性免疫反应。
如本文所用，术语“与疾病、病症或病状相关”是指实体与受试者的疾病、病症或病状的发生或严重程度之间的因果关系或相关性关系。例如，如果靶标与疾病、病症或病状相关，则该靶标可以是该疾病、病症或病状的致病因子。例如，病毒可以是病毒感染的致病因子，细菌可以是细菌感染的致病因子，真菌可以是真菌感染的致病因子，或寄生虫可以是寄生虫感染的致病因子，癌细胞可以是癌症的致病因子，毒素可以是毒性的致病因子，或者过敏原可以是过敏反应的致病因子。与疾病、病症或病状相关的靶标还可以或替代性地与疾病、病症或病状发生的可能性增加或严重程度增加有关联。
如本文所用，术语“载剂”意指利于将组合物(例如，线性或环状多核糖核苷酸)运输或递送到受试者、组织或细胞中的化合物、组合物、试剂或分子。载剂的非限制性实例包括碳水化合物载剂(例如，酸酐改性的植物糖原或糖原型材料)、纳米颗粒(例如，封装或共价连接结合至环状或线性多核糖核苷酸的纳米颗粒)、脂质体、融合体(fusosome)、离体分化的网织红细胞、外泌体、蛋白质载剂(例如，与多核糖核苷酸共价连接的蛋白质)或阳离子载剂(例如，阳离子脂聚合物或转染试剂)。
如本文所用，术语“细胞穿透剂”意指当与细胞接触时利于进入细胞的试剂。在一些情况下，细胞穿透剂利于细胞膜的直接穿透，例如经由与细胞膜带负电荷的磷脂的直接静电相互作用，或通过诱导膜蛋白或磷脂双层的构型变化而引起的瞬时孔形成。在一些情况下，细胞穿透剂利于内吞作用介导的向细胞内的易位。例如，在某些情形下，细胞穿透剂可以刺激细胞经历内吞过程，由此细胞膜可以向内折叠到细胞中。在某些实施例中，细胞穿透剂有助于形成跨细胞膜转运的过渡结构。不希望受特定理论的束缚，如本文所提供的细胞穿透剂可以增加细胞膜的渗透性或增加分子进入细胞的内化，其结果是，与没有细胞穿透剂的其他相同递送相比，当细胞同时与细胞穿透剂接触时，可以更有效地递送到细胞中。
如本文使用的，术语“circRNA”或“环状多核糖核苷酸”或“环状RNA”或“环状多核糖核苷酸分子”可互换使用，并且意指具有没有游离末端(即，没有游离3'和/或5'末端)的结构的多核糖核苷酸分子，例如通过共价或非共价键形成环状或环形结构的多核糖核苷酸分子。
如本文所用，术语“环化效率”是所得环状多核糖核苷酸相对于其非环状起始材料的测量。
如本文所用，术语“circRNA制剂”或“环状多核糖核苷酸制剂”或“环状RNA制剂”可互换使用，并且意指包括circRNA分子和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合的组合物。
词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产物等”应理解为是指本身适合于所指示的治疗、调节等目的的化合物、组合物、产物等。词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产物等”另外作为一个优选实施例披露了此类化合物、组合物、产物等用于治疗、调节等。
词语“用于…的化合物、组合物、产物等”或“化合物、组合物、产物等用于制造用以…的药物、药物组合物、兽用组合物、诊断组合物等的用途”表示这些化合物、组合物、产物等将用于可在人体或动物身上实施的治疗方法中。它们被认为是涉及治疗方法等的实施例和权利要求的等同披露。如果实施例或权利要求因此是指“用于治疗疑似患有疾病的人或动物的化合物”，则这也被认为是披露“化合物在制造用于治疗疑似患有疾病的人或动物的药物中的用途”或“通过向疑似患有疾病的人或动物施用化合物的治疗方法”。
术语“稀释剂”意指包含非活性溶剂的媒介物，本文所述的组合物(例如，包含环状或线性多核糖核苷酸的组合物)可以稀释或溶解在其中。稀释剂可以是RNA增溶剂、缓冲剂、等渗剂或其混合物。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。液体稀释剂的非限制性实例包括水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂(诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯以及1,3-丁二醇。固体稀释剂的非限制性实例包括碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉或糖粉。
如本文所用，术语“疾病”、“病症”和“病状”各自指亚健康状态，例如，通常被或将会被医疗专业人员诊断或治疗的状态。
如本文所用，术语“表位”是指被抗体或T细胞受体识别、靶向或结合的免疫原的一部分或全部。表位可以是线性表位，例如核酸或氨基酸的连续序列。表位可以是构象表位，例如，含有在蛋白质的折叠构象中形成表位的氨基酸的表位。构象表位可以含有来自一级氨基酸序列的非连续氨基酸。再如，构象表位包括基于其二级结构或三级结构在免疫原性序列的折叠构象中形成表位的核酸。
如本文所用，术语“加密原(encryptogen)”是环状多核糖核苷酸的核酸序列或结构，该核酸序列或结构有助于减少、逃避和/或避免被免疫细胞检测到和/或减少针对环状或线性多核糖核苷酸的免疫反应的诱导。
如本文所用，术语“表达序列”是编码产物，例如肽或多肽或调控核酸的核酸序列。编码肽或多肽的示例性表达序列可以包括多个核苷酸三联体，其中每一个都可以编码氨基酸，并被称为“密码子”。
如本文所用，术语“鉴别”是指指示、建立或识别实体的同一性。例如，免疫原或其表位可以鉴别靶标，意指该靶标包括该免疫原或其表位，该免疫原或其表位源自该靶标，和/或该免疫原或其表位与该靶标的一部分或全部具有高度相似性。抗体或T细胞受体对免疫原或其表位的鉴别或结合可以鉴别靶标。当免疫原或其表位鉴别靶标时，该免疫原或其表位将靶标与一个或多个其他靶标区分开。同样，多肽免疫原可以鉴别蛋白质。换句话说，多肽免疫原是蛋白质的组分或蛋白质的一部分(尤其是蛋白质的表位)，源自蛋白质或蛋白质的一部分，或与蛋白质或蛋白质的一部分具有高度相似性。
如本文所用，术语“杂质”是存在于组合物中，例如如本文所述的药物组合物中的不需要的物质。在一些实施例中，杂质是与工艺有关的杂质。在一些实施例中，杂质是最终组合物中除所需产物以外，例如除如本文所述的活性药物成分(例如，环状或线性多核糖核苷酸)以外与产物有关的物质。如本文所用，术语“与工艺有关的杂质”是在最终的组合物、制剂或产物中，除本文所述的线性多核糖核苷酸以外，在组合物、制剂或产物的制造中使用、存在或生成的不需要的物质。在一些实施例中，与工艺有关的杂质是在多核糖核苷酸的合成或环化中使用的酶。如本文所用，术语“与产物有关的物质”是在组合物、制剂或产物或其任何中间体的合成过程中产生的物质或副产物。在一些实施例中，与产物有关的物质是脱氧核糖核苷酸片段。在一些实施例中，与产物有关的物质是脱氧核糖核苷酸单体。在一些实施例中，与产物有关的物质是以下的一种或多种：本文所述的多核糖核苷酸的衍生物或片段，例如10、9、8、7、6、5或4个核糖核酸、单核糖核酸、二核糖核酸或三核糖核酸的片段。
如本文所用，术语“免疫原”是指包括一个或多个被抗体或T细胞受体识别、靶向或结合的表位的任何分子或分子结构。特别地，免疫原在受试者中诱导免疫反应(例如，如本文所定义的那样具有免疫原性)。免疫原能够在受试者中诱导免疫反应，其中该免疫反应是指当免疫原遇到免疫系统时诱导的一系列分子、细胞和生物事件。免疫反应可以是体液和/或细胞免疫反应。这些可以包括抗体的产生以及B细胞和T细胞的扩增。为了确定是否已经发生免疫反应并跟踪其进程，可以监测免疫受试者针对特定免疫原的免疫反应物的出现。对大多数免疫原的免疫反应诱导特异性抗体和特异性效应T细胞的产生。在一些实施例中，免疫原是宿主外源的。在一些实施例中，免疫原不是宿主外源的。免疫原可以包括多肽、多糖、多核苷酸或脂质的全部或一部分。免疫原也可以是混合的多肽、多糖、多核苷酸和/或脂质。例如，免疫原可以是已经翻译修饰的多肽。“多肽免疫原”是指包括多肽的免疫原。多肽免疫原还可以包括一个或多个翻译后修饰，和/或可以与一个或多个其他分子形成复合物，和/或可以呈三级或四级结构，每种结构可以决定或影响多肽的免疫原性。
如本文所用，术语“免疫原性”是在特定的免疫反应测定中诱导超过预定阈值的对物质的反应的潜力。该测定可以是例如某些炎症标志物的表达、抗体的产生或如本文所述的免疫原性的测定。在一些实施例中，当生物体或某种类型的免疫细胞的免疫系统暴露于免疫原时，可以诱导免疫反应。
可以使用总抗体测定法、确认试验、抗体的滴定和同种型分析以及中和抗体评估来评价受试者血浆或血清中的抗体，从而评估免疫原性反应。总抗体测定法测量在已经施用了免疫原的受试者的血清或血浆中作为免疫反应的一部分而生成的所有抗体。检测抗体最常用的试验是ELISA(酶联免疫吸附测定)，检测受试血清中与目标抗体结合的抗体，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。可通过确认测定法进一步评估免疫原性反应。在总抗体评估之后，可以使用确认测定法来确认总抗体测定法的结果。竞争测定法可用于确认抗体与靶标特异性结合，并且筛选测定法中的阳性发现不是试验血清或检测试剂与该测定法中其他物质发生非特异性相互作用的结果。
可通过同种型分析和滴定来评估免疫原性反应。同种型测定可用于仅评估相关抗体的同种型。例如，预期的同种型可以是IgM和IgG，它们可以通过同种型分析和滴定进行特异性检测和定量，然后与存在的总抗体进行比较。
可以通过中和抗体测定法(nAb)来评估免疫原性反应。中和抗体测定法(nAb)可用于确定响应于免疫原而产生的抗体是否中和免疫原，从而抑制免疫原对靶标产生作用并导致异常的药代动力学行为。nAb测定法通常是基于细胞的测定法，其中靶细胞与抗体一起孵育。可以使用多种基于细胞的nAb测定法，包括但不限于细胞增殖、活力、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、细胞病变效应抑制(CPE)、凋亡、配体刺激的细胞信号传导、酶活性、报告基因测定、蛋白质分泌、代谢活性、应激和线粒体功能。检测读数包括吸光度、荧光、发光、化学发光或流式细胞术读数。配体结合测定法还可用于体外测量免疫原和抗体的结合亲和力，以评价中和功效。
此外，可以通过使用从受试者获得的T细胞上的细胞标志物测量受试者中的T细胞活化来评估细胞免疫反应的诱导。可以从受试者收集血液样品、淋巴结活检样品或组织样品，并评价来自样品的T细胞中的以下一种或多种(例如，2、3、4种或更多种)活化标志物：CD25、CD71、CD26、CD27、CD28、CD30、CD154、CD40L、CD134、CD69、CD62L或CD44。也可以在体内动物模型中使用相同的方法评估T细胞活化。也可以通过向体外T细胞(例如，从受试者、动物模型、储库或商业来源获得的T细胞)添加免疫原并测量上述标志物来进行该测定以评估T细胞活化。可以使用类似方法评估对其他免疫细胞(诸如嗜酸性细胞(标志物：CD35、CD11b、CD66、CD69和CD81))、树突细胞(标志物：IL-8、MHC II类、CD40、CD80、CD83和CD86)、嗜碱性细胞(CD63、CD13、CD4和CD203c)和中性粒细胞(CD11b、CD35、CD66b和CD63)的活化的影响。可以使用流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交和其他允许测量细胞标志物的测定法来评估这些标志物。免疫原施用前后的比较结果可用于确定其影响。
如本文所用，术语“诱导免疫反应”是指引发、放大或维持受试者的免疫反应。诱导免疫反应可以指适应性免疫反应或先天性免疫反应。免疫反应的诱导可以如上所讨论的那样进行测量。
如本文所用，术语“线性对应物”是具有与环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或之间的任何百分比的序列同一性)并且具有两个游离末端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))的多核糖核苷酸分子(及其片段)。在一些实施例中，线性对应物(例如，环化前形式)是具有与环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或之间的任何百分比的序列同一性)和相同或相似的核酸修饰并且具有两个游离末端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))的多核糖核苷酸分子(及其片段)。在一些实施例中，线性对应物是具有与环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或之间的任何百分比的序列同一性)和不同的核酸修饰或没有核酸修饰并且具有两个游离末端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))的多核糖核苷酸分子(及其片段)。在一些实施例中，作为线性对应物的多核糖核苷酸分子的片段是线性对应物多核糖核苷酸分子的比该线性对应物多核糖核苷酸分子短的任何部分。在一些实施例中，线性对应物进一步包括5’帽。在一些实施例中，线性对应物进一步包括聚腺苷尾。在一些实施例中，线性对应物进一步包括3’UTR。在一些实施例中，线性对应物进一步包括5’UTR。
如本文所用，术语“线性RNA”或“线性多核糖核苷酸”或“线性多核糖核苷酸分子”可互换使用并且意指具有5'末端和3’末端的多核糖核苷酸分子。5'末端和3’末端中的一个或两个可以是游离末端或者可以与另一部分连接。线性RNA包括尚未经历环化(例如，环化前)的RNA，并且可以用作起始材料通过例如夹板连接或化学、酶促、核酶或剪接催化的环化方法进行环化。
如本文所用，术语“混合物”意指由两种或更多种不同物质混合而成的材料。在一些情况下，本文所述的混合物可以是两种或更多种不同物质的均匀混合物，例如，在混合物的任何给定样品中，混合物可以具有相同比例的组分(例如，两种或更多种物质)。在一些情况下，本文所提供的混合物可以是两种或更多种不同物质的不均匀混合物，例如，混合物组分(例如，两种或更多种物质)的比例在整个混合物中可以不同。在一些情况下，混合物是液体溶液，例如，混合物以液相存在。在一些情况下，可以将液体溶液视为包含液体溶剂和溶质。将溶质混合在液体溶剂中可以称为“溶解”过程。在一些情况下，液体溶液是液液溶液(例如，液体溶质溶解在液体溶剂中)，固液溶液(例如，固体溶质溶解在液体溶剂中)或气液溶液(例如，固体溶质溶解在液体溶剂中)。在一些情况下，存在一种以上的溶剂和/或一种以上的溶质。在一些情况下，混合物是胶体、液体悬浮液或乳液。在一些情况下，混合物是固体混合物，例如，混合物以固相存在。
如本文所用，术语“经修饰的核糖核苷酸”意指具有至少一个针对糖、核碱基或核苷间键的修饰的核苷酸。
如本文所用，术语“裸递送”意指无需借助于载剂且没有对有助于递送至细胞的部分进行共价修饰的情况下将配制品递送至细胞。裸递送配制品不含任何转染试剂、阳离子载剂、碳水化合物载剂、纳米颗粒载剂、或蛋白质载剂。例如，环状或线性多核糖核苷酸的裸递送配制品是包含没有共价修饰的环状或线性多核糖核苷酸且不含载剂的配制品。
如本文所用，术语“带切口的RNA”或“带切口的线性多核糖核苷酸”或“带切口的线性多核糖核苷酸分子”可以互换使用并且意指由于环状RNA切口或降解而产生的具有5'末端和3’末端的多核糖核苷酸分子。
如本文所用，术语“非环状RNA”意指总的带切口的RNA和线性RNA。
术语“通过……可获得”、“通过……可产生”或其他类似短语用于指示权利要求或实施例是指化合物、组合物、产物等本身，即该化合物、组合物、产物等可通过描述用于制造该化合物、组合物、产物等的方法获得或产生，但该化合物、组合物、产物等也可以通过该描述的方法以外的其他方法获得或产生。术语“通过……获得”、“通过……产生”或等等指示化合物、组合物、产物是通过所列举的特定方法获得或产生的。应理解，术语“通过……可获得”、“通过……可产生”等还披露了术语“通过……获得”、“通过……产生”等作为“通过……可获得”、“通过……可产生”等的优选实施例。
如本文所用，术语“病原体”是指在受试者中引起疾病或疾病症状的感染因子，例如，通过直接感染受试者，通过产生在受试者中引起疾病或疾病症状的因子和/或通过在受试者中引发免疫反应。如本文所用，病原体包括但不限于细菌、原生动物、寄生生物、真菌、线虫、昆虫、类病毒和病毒、或其任何组合，其中每种病原体能够(自身或与另一种病原体共同)引发受试者的疾病或症状。
如本文所用，术语“有效载荷”意指如本文所披露的由多核糖核苷酸递送的任何分子。在一些情况下，有效载荷是核酸、蛋白质、化学物质、核糖核蛋白或其任何组合。在一些情况下，有效载荷是如本文所披露的直接包含在多核糖核苷酸内的核酸序列。在一些情况下，有效载荷例如经由互补杂交或经由蛋白质-核酸相互作用与如本文所披露的多核糖核苷酸附接或缔合。在一些情况下，有效载荷是由包含在多核糖核苷酸中、与多核糖核苷酸附接或缔合的核酸序列编码的蛋白质。在一些情况下，“附接”意指两个分子之间的共价键或非共价相互作用。在一些情况下，当在有效载荷与多核糖核苷酸之间的相互作用的上下文中使用时“缔合”意指有效载荷经由之间的一个或多个其他分子间接连接至多核糖核苷酸。在一些情况下，附接或缔合可以是瞬时的。在一些情况下，例如，根据环境pH条件或刺激物或结合伴侣的存在或不存在，有效载荷在一种条件下与多核糖核苷酸附接或缔合，而在另一种条件下不与多核糖核苷酸附接或缔合。
术语“药物组合物”旨在同样披露包括在药物组合物中的环状或线性多核糖核苷酸可用于通过疗法治疗人体或动物体。因此，这意味着等同于“在疗法中使用的环状或线性多核糖核苷酸”。
如本文所用，术语“多核苷酸”意指包含一个或多个核酸亚基或核苷酸的分子，并且可以与“核酸”或“寡核苷酸”互换使用。多核苷酸可以包括一个或多个选自腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体的核苷酸。核苷酸可以包括核苷和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸(PO3)基团。核苷酸可以包括核碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)以及一个或多个磷酸基团。核糖核苷酸是其中糖为核糖的核苷酸。多核糖核苷酸或核糖核酸或RNA可以指包括经由磷酸二酯键聚合的多个核糖核苷酸的大分子。脱氧核糖核苷酸是其中糖是脱氧核糖的核苷酸。
聚脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核酸或DNA意指包括经由磷酸二酯键聚合的多个脱氧核糖核苷酸的大分子。核苷酸可以是核苷一磷酸或核苷多磷酸。核苷酸意指包括可检测标签(诸如发光标签)或标志物(例如，荧光团)的脱氧核糖核苷多磷酸，例如脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，其可以选自脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、尿苷三磷酸(dUTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)dNTP。核苷酸可以包括可以掺入正在生长的核酸链中的任何亚基。此类亚基可以是A、C、G、T或U，或对一个或多个互补A、C、G、T或U有特异性或与嘌呤(即，A或G或其变体)或嘧啶(即C、T或U或其变体)互补的任何其他亚基。在一些实例中，多核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其衍生物或变体。在一些情况下，多核苷酸举几例来说是短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、质粒DNA(pDNA)、短发夹RNA(shRNA)、小核RNA(snRNA)、信使RNA(mRNA)、前体mRNA(前mRNA)、反义RNA(asRNA)，并且涵盖核苷酸序列及其任何结构实施例，诸如单链、双链、三链、螺旋、发夹等。在一些情况下，多核苷酸分子为环状的。多核苷酸可以具有各种长度。核酸分子可以具有至少约10个碱基、20个碱基、30个碱基、40个碱基、50个碱基、100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、1千碱基(kb)、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb、50kb或更大的长度。可以从细胞或组织中分离多核苷酸。如本文所体现的，多核苷酸序列可以包括分离和纯化的DNA/RNA分子、合成的DNA/RNA分子和合成的DNA/RNA类似物。
多核苷酸，例如多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，可以包括一种或多种核苷酸变体，包括非标准核苷酸、非天然核苷酸、核苷酸类似物和/或经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸的实例包括但不限于二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辨苷(galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(mannosylqueosine)、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-D46-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤等。在一些情况下，核苷酸在其磷酸酯部分中可以包括修饰，包括对三磷酸酯部分的修饰。此类修饰的非限制性实例包括长度更长的磷酸酯链(例如，具有4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸酯部分的磷酸酯链)和带有硫醇部分(例如，α-硫代三磷酸酯和β-硫代三磷酸酯)的修饰。核酸分子还可在碱基部分处(例如，在通常可用于与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处和/或在通常不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处)、糖部分或磷酸骨架处被修饰。核酸分子还可含有胺修饰的基团，诸如氨基烯丙基1-dUTP(aa-dUTP)和氨基己基丙烯酰胺-dCTP(aha-dCTP)，以允许胺反应性部分(诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS))的共价附接。本披露的寡核苷酸中标准DNA碱基对或RNA碱基对的替代物可以提供更高的密度(以位/立方毫米计)、更高的安全性(抗天然毒素的偶然或有目的合成)、更容易辨别光程序性聚合酶(photo-programmed polymerases)或较低的二级结构。在Betz K,Malyshev DA,LavergneT,Welte W,Diederichs K,Dwyer TJ,Ordoukhanian P,Romesberg FE,MarxA.Nat.Chem.Biol.[自然-化学生物学]2012年7月；8(7):612-4中描述了与用于从头和/或扩增合成的天然和突变体聚合酶相容的此类替代性碱基对，该文献出于所有目的通过援引并入本文中。
如本文所用，“多肽”意指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然的)的聚合物。如本文所用，该术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽可以包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同系物、直系同源物、旁系同源物、前述物质的片段和其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单分子或者可以是多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包含单链或多链多肽，诸如抗体或胰岛素，并且可以缔合或连接。最常见的二硫键存在于多链多肽中。术语多肽也可以适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。
如本文所用，术语“预防”意指降低发展疾病、病症或病状的可能性，或替代性地降低随后发展的疾病或病症的严重程度。可以将治疗剂施用给相对于一般群体而言发展疾病或病症的风险增加的受试者，以便预防疾病或病状的发展或减轻疾病或病状的严重程度。可以例如在疾病或病症的任何症状或表现发展之前将治疗剂作为预防剂施用。
如本文所用，短语“准螺旋结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分折叠成螺旋结构。
如本文所用，短语“准双链二级结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分产生内部双链。
如本文所用，术语“调控元件”是修饰环状或线性多核糖核苷酸内表达序列的表达的部分，诸如核酸序列。
如本文所用，术语“重复核苷酸序列”是一段DNA或RNA内或整个基因组内的重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚CA序列或聚TG(UG)序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括内含子Alu家族中的重复序列。
如本文所用，术语“复制元件”是可用于复制或起始环状多核糖核苷酸转录的序列和/或基序。
如本文所用，术语受试者身体的“表面区域”意指受试者的暴露于或可能暴露于受试者身体外部环境的任何区域。受试者身体例如哺乳动物身体(例如人体)的表面区域可以包括皮肤，口腔、鼻腔、耳腔、胃肠道、呼吸道、阴道、宫颈、子宫内、泌尿道和眼睛的表面区域。在一些情况下，受试者身体的表面区域常常可以指上皮细胞排列在其下的外部区域。例如，皮肤可以是本文所讨论的一种类型的表面区域，并且可以由表皮和真皮组成，前者形成皮肤的最外层并且可以包括上皮细胞在许多其他类型的细胞中的有组织的组装。
如本文所用，术语“交错元件”是在翻译期间诱导核糖体暂停的部分，诸如核苷酸序列。在一些实施例中，交错元件是具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，然后是共有序列-D(V/I)ExNPG P，其中x＝任何氨基酸。在一些实施例中，交错元件可以包括化学部分，如甘油、非核酸连接部分、化学修饰、经修饰的核酸或其任何组合。
如本文所用，术语“基本上不含”是组合物、制剂或产物或其任何中间体中某一组分的水平低于诱导生物学、化学、物理和/或药理学作用所需的水平。在一些实施例中，如果某一组分的水平可检测到痕量或该水平低于通过相关检测技术(例如色谱法(使用柱、使用纸、使用凝胶、使用HPLC、使用UHPLC等，或通过IC、通过SEC、通过反相、通过阴离子交换、通过混合模式等)或电泳(尿素PAGE、基于芯片、聚丙烯酰胺凝胶、RNA、毛细管、c-IEF等)，用或不用分离前或分离后衍生化方法，使用基于质谱、紫外可见、荧光、光散射、折射率的检测技术或使用银或染料染色或放射性衰变以进行检测的检测技术可检测到的水平，则组合物、制剂或产物基本上不含该组分。替代性地，可以在不使用分离技术的情况下通过质谱法、通过显微镜检查、通过圆二色(CD)光谱法、通过UV或UV-可见分光光度法、通过荧光测定法(例如Qubit)、通过RNA酶H分析、通过表面等离振子共振(SPR)或通过利用银或染料染色或放射性衰变进行检测的方法)来确定组合物、制剂或产品是否基本不含某一组分。
如本文所用，术语“基本上对……有抗性”可以指相较于参考物对效应物具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％抗性的物质。
如本文所用，术语“灭菌剂”意指具有抑菌、杀菌和/或主动杀灭微生物，使微生物失活或防止微生物生长的任何试剂。杀灭微生物的灭菌剂可以是抗微生物的和/或抗菌的。在一些实施例中，灭菌剂是液体，诸如醇、碘或过氧化氢。在一些实施例中，灭菌剂是UV光或激光。在一些实施例中，灭菌剂通过电学方式或通过其他方式(例如，蒸气、接触)传递热量。
如本文所用，术语“化学计量翻译”是从环状或线性多核糖核苷酸翻译获得的表达产物的基本上相等的产生。例如，对于具有两个表达序列的环状或线性多核糖核苷酸，环状或线性多核糖核苷酸的化学计量翻译意指两个表达序列的表达产物可具有基本相等的量，例如两个表达序列之间的量差(例如摩尔差)可以为约0，或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％或之间的任何百分比。
如本文所用，术语“全身递送”或“全身施用”意指将药物组合物或其他物质施用到循环系统(例如血液或淋巴系统)中的途径。全身施用可以包括口服施用、肠胃外施用、鼻内施用、舌下施用、直肠施用、透皮施用或其任何组合。如本文所用，术语“非全身性递送”或“非全身性施用”可以指除药物组合物或其他物质的全身性递送以外的任何其他施用途径，例如，所递送的物质不进入受试者身体的循环系统(例如，血液和淋巴系统)。
如本文所用，术语“序列同一性”是通过使用全局或局部比对算法对两个肽或两个核苷酸序列进行比对来确定的。当序列(例如，通过程序GAP或BESTFIT使用默认参数进行最佳比对时)至少具有某个最小百分比的序列同一性时，则可以将它们称为“基本上相同”或“基本相似”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法在两个序列的整个长度上对其进行比对，从而最大程度地增加了匹配数目并最大程度地减少了空位数目。通常，使用GAP默认参数，空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)，空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna而对于蛋白质，使用的默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff和Henikoff,1992,PNAS[美国国家科学院院刊]89,915-919)。序列比对和百分比序列同一性的评分可以使用计算机程序来确定，诸如可从美国92121-3752加州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的阿赛乐德公司(Accelrys Inc.,9685Scranton Road,SanDiego,CA)获得的GCG Wisconsin软件包10.3版或EmbossWin 2.10.0版(使用程序“needle”)确定。替代性地或另外，可以通过使用诸如FASTA、BLAST等的算法对数据库进行搜索来确定同一性百分比。序列同一性是指在序列的整个长度上的序列同一性。
“信号序列”是指长度例如介于10至30个氨基酸之间的多肽序列，其存在于新生蛋白的多肽序列的N端，将多肽序列靶向分泌途径。
如本文所用，术语“靶标”是指包括一个或多个表位的任何实体。例如，靶标可以是化学部分、分子的一部分、分子(例如，过敏原或毒素)、大分子(例如，多肽、核酸或碳水化合物)、大分子的翻译后修饰状态(例如，磷酸化、糖基化、酰化、烷基化等的大分子)、高阶大分子结构(例如，两个或更多个多肽的复合物)、细胞(例如，癌细胞)、细胞的一部分(例如，肿瘤抗原)、细胞表面上的受体、病原体(例如，病毒或病毒的一部分；细菌或细菌的一部分；真菌或真菌的一部分；或寄生虫或寄生虫的一部分)或组织类型。
如本文所用，术语“治疗”是指对受试者的疾病或病症(例如，感染性疾病、癌症、中毒或过敏反应)的治疗性治疗。治疗的效果可以包括与没有治疗性治疗的情况下，该疾病或病症的状态和/或状况相比，逆转、减轻、降低疾病的严重程度，治愈疾病，抑制疾病的进展，降低该疾病、或疾病或病症的一种或多种症状或表现的复发的可能性，稳定(即不恶化)疾病或病症的状态，和/或预防疾病或病症的传播。
如本文所用，术语“终止元件”是终止环状或线性多核糖核苷酸中表达序列的翻译的部分，诸如核酸序列。
如本文所用，术语“总核糖核苷酸分子”意指通过核糖核苷酸分子的总质量所测量的任何核糖核苷酸分子的总量，包括线性多核糖核苷酸分子、环状多核糖核苷酸分子、单体核糖核苷酸、其他多核糖核苷酸分子、其片段及其经修饰的变体。
如本文所用，术语“翻译效率”是从核糖核苷酸转录物产生蛋白质或肽的速率或量。在一些实施例中，翻译效率可以表示为给定量的编码蛋白质或肽的转录本产生的蛋白质或肽的量，例如在给定的时间段内，例如在给定的翻译系统中，例如体外翻译系统(像兔网织红细胞裂解物)或体内翻译系统(像真核细胞或原核细胞)。
如本文所用，术语“翻译起始序列”是在环状或线性多核糖核苷酸中起始表达序列的翻译的核酸序列。
附图说明
图1是包括两个表达序列的示例性环状RNA的示意图，其中每个表达序列编码一种免疫原。环状RNA包含两个开放阅读框(ORF)，每个ORF编码和表达序列，其中每个ORF与IRES可操作地连接。
图2是包括两个表达序列的示例性环状RNA的示意图，其中每个表达序列是一种免疫原。环状RNA包含两个被2A序列隔开的表达序列，所有表达序列均与IRES可操作地连接。
图3示出了多个多核糖核苷酸的示意图，其中每个多核苷酸均包括编码免疫原的ORF。
图4示出了由环状RNA编码的RBD免疫原在BJ成纤维细胞和HeLa细胞中检测到，而在用媒介物对照的BJ成纤维细胞和HeLa细胞未检测到。
图5示出了在小鼠模型中，施用经阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制的编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的环状RNA后，获得可持续的抗RBD抗体反应。
图6示出了在小鼠模型中，施用经阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制的编码SARS-CoV-2 RBD抗原的环状RNA后，获得抗刺突反应。
图7示出了在小鼠模型中，施用经阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制的编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的环状RNA后获得的抗-RBD IgG2a和IgG1同种型水平。
图8示出了在肌内注射环状RNA制剂(Trans-IT配制的、鱼精蛋白配制的、未配制的)、仅鱼精蛋白媒介物后和在未注射的对照小鼠中，长期从体内环状RNA表达蛋白质。
图9示出了在同时肌内递送AddavaxTM佐剂与(i)未配制的环状RNA制剂(左图)，(ii)经TransIT配制的环状RNA(中间图)，和(iii)经鱼精蛋白配制的环状RNA(右图)后，长期从体内环状RNA表达蛋白质。在每种情况下，AddavaxTM佐剂均在0和24小时以单独注射的形式递送。
图10示出了在(i)经鱼精蛋白配制的环状RNA、(ii)经鱼精蛋白配制的环状RNA(在24小时注射AddavaxTM佐剂)、(iii)仅鱼精蛋白媒介物的皮内递送后，和(iv)未注射的对照小鼠，长期从体内环状RNA表达蛋白质。
图11示出了探针与环状和线性RNA的结合以及RNA酶H对RNA的后续降解。环状RNA作为单一裂解的线性条带被检测到，相比而言环状和连环化RNA作为多个条带被检测到。通过使样品在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳并比较添加或不添加RNA酶H的降解条带来检测降解。
图12是示出了具有交错元件的环状RNA或线性RNA的表达产物的蛋白质印迹的图像。
图13示出了通过自剪接对示例性环状RNA的生成。
图14是示出了环状RNA或线性RNA的表达产物的蛋白质印迹的图像。
图15示出了实验数据，证明与线性多核糖核苷酸对应物(“线性”)相比，用环状多核糖核苷酸(“无末端的”)在给药后小鼠中的高斯(Gaussia)荧光素酶表达的持久性增加。
图16示出了实验数据，证明与交错给药线性多核糖核苷酸对应物(“线性3剂”)，或单剂的环状多核糖核苷酸(“无末端的”)，或单剂的线性多核糖核苷酸对应物(“线性”)相比，交错给药环状多核糖核苷酸(“无末端的3剂”)后小鼠中的高斯荧光素酶表达的持久性增加。
图17示出了实验数据，证明与单剂的线性多核糖核苷酸对应物(“线性RNA”)相比，单剂环状多核糖核苷酸(“无末端的RNA”)后；与单剂(“线性RNA”)相比，交错给药线性多核糖核苷酸对应物(“3剂线性RNA”)后；或与单剂(“无末端的RNA”)相比，交错给药环状多核糖核苷酸(“3剂无末端的RNA”)后，小鼠中的高斯荧光素酶表达的持久性增加。
图18示出了在没有载剂的情况下肌内施用的环状多核糖核苷酸在更长时间段中在体内表达蛋白质，以及在注射后数天血浆中的蛋白质活性水平。
图19示出了静脉内施用的环状多核糖核苷酸在更长时间段中在体内表达蛋白质，以及在注射后数天血浆中的蛋白质活性水平，并且可以再给药至少5次。
图20A示出了环状多核糖核苷酸的多免疫原表达。从编码SARSs-CoV-2 RBD免疫原和GLuc多肽的环状RNA中检测到RBD免疫原表达。
图20B示出了环状多核糖核苷酸的多免疫原表达。从编码SARSs-CoV-2 RBD免疫原和GLuc多肽的环状RNA中检测到GLuc活性。
图21A证明了小鼠模型中来自环状RNA的多种免疫原的免疫原性。用编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的第一环状RNA和编码GLuc多肽的第二环状RNA为小鼠接种。注射后17天获得抗RBD抗体。
图21B证明了小鼠模型中来自环状RNA的多种免疫原的免疫原性。用编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的第一环状RNA和编码GLuc多肽的第二环状RNA为小鼠接种。注射后2天检测到GLuc活性。
图22A证明了小鼠模型中来自环状RNA的多种免疫原的免疫原性。用编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的第一环状RNA和编码流感病毒血凝素(HA)免疫原的第二环状RNA为小鼠接种。注射后17天获得抗RBD抗体。
图22B证明了小鼠模型中来自环状RNA的多种免疫原的免疫原性。用编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的第一环状RNA和编码流感病毒血凝素(HA)免疫原的第二环状RNA为小鼠接种。注射后17天获得抗HA抗体。
图23A证明了小鼠模型中来自环状RNA的多种免疫原的免疫原性。用编码SARS-CoV-2刺突免疫原的第一环状RNA和编码流感病毒血凝素(HA)免疫原的第二环状RNA为小鼠接种。注射后17天获得抗RBD(刺突结构域)抗体。
图23B证明了小鼠模型中来自环状RNA的多种免疫原的免疫原性。用编码SARS-CoV-2刺突免疫原的第一环状RNA和编码流感病毒血凝素(HA)免疫原的第二环状RNA为小鼠接种。注射后17天获得抗HA抗体。
图24证明了施用了编码多种免疫原的环状RNA的小鼠中的抗HA抗体反应。向小鼠施用编码以下的环状RNA：SARS-CoV-2 RBD免疫原、SARS-CoV-2刺突免疫原、流感HA免疫原、SARS-CoV-2 RBD免疫原和流感HA免疫原、SARS-CoV-2 RBD免疫原和GLuc多肽，或SARS-CoV-2RBD免疫原和SARS-CoV-2刺突免疫原。使用血凝抑制测定法(HAI)测量抗流感HA抗体。图24示出了当单独施用或与SARS-CoV-2免疫原例如RBD或刺突组合施用时，施用编码流感HA免疫原的环状RNA制剂的样品中出现了HAI滴度。
具体实施方式
本披露提供了编码一种或多种多肽免疫原的环状或线性多核糖核苷酸的组合物和药物制剂及其用途。特别地，本披露提供了编码多种免疫原的环状或线性多核糖核苷酸，以及包含多种环状或线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物。本披露的特征还在于包含一种或多种编码一种或多种免疫原的环状或线性多核糖核苷酸的药物组合物和制剂。本文所述的环状或线性多核糖核苷酸的组合物和药物制剂在施用后可在受试者中诱导免疫反应。本文所述的环状或线性多核糖核苷酸的组合物和药物制剂可用于治疗或预防受试者的疾病、病症或病状。
多核糖核苷酸
多核糖核苷酸除了包括如本文所述的一种或多种免疫原外，也包括如下所述的元件。在特定的实施例中，多核糖核苷酸是环状多核糖核苷酸。
在一些实施例中，多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)为至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约2,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约6,000个核苷酸、至少约7,000个核苷酸、至少约8,000个核苷酸、至少约9,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约12,000个核苷酸、至少约14,000个核苷酸、至少约15,000个核苷酸、至少约16,000个核苷酸、至少约17,000个核苷酸、至少约18,000个核苷酸、至少约19,000个核苷酸或至少约20,000个核苷酸。
在一些实施例中，多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)可以具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大大小可以与产生环状多核糖核苷酸和/或使用环状多核糖核苷酸的技术限制内的一样大。不受任何特定理论的束缚，有可能RNA的多个区段可以从DNA产生并且其5'游离末端和3'游离末端退火以产生一“串”RNA，当只留有一个5'游离末端和一个3'游离末端时，该“串”RNA最终可能会被环化。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大尺寸可能受包装RNA并将其递送至靶标的能力所限制。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的大小是足以编码有用的多肽(诸如本披露的免疫原或其表位)的长度，并且因此至少20,000个核苷酸、至少15,000个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸或至少5,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少500个核苷酸、至少400个核苷酸、至少300个核苷酸、至少200个核苷酸、至少100个核苷酸、或至少70个核苷酸的长度可能是有用的。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大大小是足以编码一种或多种免疫原(例如，两种或更多种，三种或更多种，四重或更多种，以及五种或更多种)的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大大小是足以编码两种至五种(例如三种、四种和五种)免疫原的长度。
环状多核糖核苷酸元件
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸除了包括编码免疫原的序列之外，还包括如本文所述的一种或多种元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏聚A序列，缺乏游离的3'末端，缺乏RNA聚合酶识别基序，或它们的任何组合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括如通过援引以其全文并入本文的国际专利公开号WO 2019/118919中披露的任何特征或特征的任何组合。
免疫原
本文所述的环状或线性多核糖核苷酸包含至少一个编码免疫原的序列。免疫原包括被给定抗体或T细胞受体识别、靶向或结合的一个或多个表位。表位可以是线性表位，例如核酸或氨基酸的连续序列。表位可以是构象表位，例如，含有在蛋白质的折叠构象中形成表位的氨基酸的表位。构象表位可以含有来自一级氨基酸序列的非连续氨基酸。再如，构象表位包括基于其二级结构或三级结构在免疫原性序列的折叠构象中形成表位的核酸。
在一些实施例中，免疫原包括蛋白质、肽、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、核糖核蛋白、碳水化合物(例如，多糖)、脂质(例如，磷脂或甘油三酸酯)或核酸(例如，DNA、RNA)的全部或一部分。
在其他实施例中，免疫原包括蛋白质免疫原或表位(例如，来自蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白或核糖核蛋白的肽免疫原或肽表位)。免疫原可以包括氨基酸、糖、脂质、磷酰基或磺酰基或其组合。
在特定实施例中，免疫原是多肽免疫原。
多肽免疫原可以包括翻译后修饰，例如糖基化、泛素化、磷酸化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、酰胺化、羟基化、硫酸化或脂化。
在一些实施例中，免疫原包括表位，该表位包括至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或至少30个氨基酸，或更多个氨基酸。在一些实施例中，表位包括或含有至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多21个、至多22个、至多23个、至多24个、至多25个、至多26个、至多27个、至多28个、至多29个或至多30个氨基酸，或更少的氨基酸。在一些实施例中，表位包括或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。在一些实施例中，表位含有5个氨基酸。在一些实施例中，表位含有6个氨基酸。在一些实施例中，表位含有7个氨基酸。在一些实施例中，表位含有8个氨基酸。在一些实施例中，表位可以是约8至约11个氨基酸。在一些实施例中，表位可以是约9至约22个氨基酸。
免疫原可以包括被B细胞识别的免疫原、被T细胞识别的免疫原或其组合。在一些实施例中，免疫原包括被B细胞识别的免疫原。在一些实施例中，免疫原是被B细胞识别的免疫原。在一些实施例中，免疫原包括被T细胞识别的免疫原。在一些实施例中，免疫原是被T细胞识别的免疫原。
表位可以包括被B细胞识别的表位，被T细胞识别的表位或其组合。在一些实施例中，表位包括被B细胞识别的表位。在一些实施例中，表位是被B细胞识别的表位。在一些实施例中，表位包括被T细胞识别的表位。在一些实施例中，表位是被T细胞识别的表位。
例如，用于经由电脑模拟鉴定免疫原和表位的技术例如在Sanchez-Trincado JL等人(Fundamentals and methods for T-and B-cell epitope prediction[T细胞和B细胞表位预测的基本原理和方法],J.Immunol.Res.[免疫学研究杂志],2017:2680160.doi:10.1155/2017/2680160(2017))；Grifoni,A等人,(ASequence Homology andBioinformatic Approach Can Predict Candidate Targets for Immune Responses toSARS-CoV-2[序列同源性和生物信息学方法可以预测SARS-CoV-2免疫反应的候选靶标],Cell Host Microbe[细胞宿主与微生物],27(4):671-680(2020))；Russi RC等人(Insilico prediction of epitopes recognized by T cells and B cells in PmpD:Firststep towards to the design of a Chlamydia trachomatis vaccine[PmpD中T细胞和B细胞识别的表位的电脑模拟预测：设计沙眼衣原体疫苗的第一步],Biomedical J.[生物医学杂志],41(2):109-117(2018))；Baruah V等人,(Immunoinformatics-aidedidentification of T cell and B cell epitopes in the surface glycoprotein of2019-nCoV[免疫信息学辅助鉴定2019-nCoV表面糖蛋白中的T细胞和B细胞表位],J.Med.Virol.[医学病毒学杂志],92(5),doi:10.1002/jmv.25698(2020))中已经披露；其中每一个通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，免疫原包括多核苷酸。在一些实施例中，免疫原是多核苷酸。在一些实施例中，免疫原包括RNA。在一些实施例中，免疫原是RNA。在一些实施例中，免疫原包括DNA。在一些实施例中，免疫原是DNA。在一些实施例中，多核苷酸在环状或线性多核糖核苷酸中编码。
本披露的环状或线性多核糖核苷酸包括或编码任何数量的免疫原。在特定实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种、至少120种、至少140种、至少160种、至少180种、至少200种、至少250种、至少300种、至少350种、至少400种、至少450种、至少500种或更多种免疫原。
在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码例如至多1种、至多2种、至多3种、至多4种、至多5种、至多6种、至多7种、至多8种、至多9种、至多10种、至多15种、至多20种、至多25种、至多30种、至多40种、至多50种、至多60种、至多70种、至多80种、至多90种、至多100种、至多120种、至多140种、至多160种、至多180种、至多200种、至多250种、至多300种、至多350种、至多400种、至多450种、至多500种或更少的免疫原。
在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500种免疫原。
在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸编码多种免疫原。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码1至100种免疫原。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码1至50种免疫原。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码1至10种免疫原；例如，环状或线性多核糖核苷酸编码1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种免疫原。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码2种免疫原。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码3种免疫原。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码4种免疫原。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括或编码5种免疫原。
在一些实施例中，该多种免疫原各自鉴别相同的靶标。换个说法，单个靶标可以包括该多种免疫原中的每一种，该多种免疫原中的每一种都可以源自同一靶标，和/或该多种免疫原中的每一种可以与一部分或整个靶标具有高度相似性。例如，靶标可以是细胞，并且每种免疫原可以对应于该细胞的蛋白质。例如，靶标可以是特定的癌细胞，并且每种免疫原可以对应于与该癌症相关的肿瘤抗原。因此，在一些实施例中，该多种免疫原中的每一种均源自来自相同靶标的不同蛋白质。
在一些实施例中，该多种免疫原源自不同靶标。在一些实施例中，该多种免疫原可以源自给定病毒的各种衣壳蛋白。例如，一种免疫原可以源自正痘病毒(Orthopoxvirus)，另一种免疫原可以源自嗜肝DNA病毒(Hepadnavirus)，而第三免疫原可以源自黄病毒(Flavivirus)。例如，多核糖核苷酸可编码多种免疫原，其中每种免疫原源自黄热病病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒(Zika)、甲型肝炎或乙型肝炎。多核糖核苷酸可编码来自黄热病病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、甲型肝炎和乙型肝炎中的每一种的免疫原。多核糖核苷酸可编码多种免疫原，其中每种免疫原源自日本脑炎(Japanese encephalitis)、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、甲型肝炎或乙型肝炎。多核糖核苷酸可编码来自日本脑炎、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、甲型肝炎或乙型肝炎的每一种的免疫原。多核糖核苷酸可编码多种免疫原，其中每种免疫原源自SARS-CoV2、痘病毒、呼吸道合胞病毒或人乳头瘤病毒。多核糖核苷酸可编码来自SARS-CoV2、痘病毒、呼吸道合胞病毒和人乳头瘤病毒中的每一种的免疫原。多核糖核苷酸可编码多种免疫原，其中每种免疫原源自疱疹病毒(CMV、EBV或VZV)。多核糖核苷酸可编码来自以下每种疱疹病毒的免疫原：CMV、EBV或VZV。多核糖核苷酸可编码多种免疫原，其中每种免疫原源自带状疱疹病毒(Singles)或西尼罗河病毒(West Nile Virus)。多核糖核苷酸可编码来自带状疱疹病毒和西尼罗河病毒中的每一种的免疫原。
在一些实施例中，由环状多核糖核苷酸编码的多种免疫原中的每一种具有小于90％的序列同一性。
免疫原来自例如病毒，诸如病毒表面蛋白、病毒膜蛋白、病毒包膜蛋白、病毒衣壳蛋白、病毒核衣壳蛋白、病毒刺突蛋白、病毒进入蛋白、病毒膜融合蛋白、病毒结构蛋白、病毒非结构蛋白、病毒调控蛋白、病毒辅助蛋白、分泌型病毒蛋白、病毒聚合酶蛋白、病毒DNA聚合酶、病毒RNA聚合酶、病毒蛋白酶、病毒糖蛋白、病毒融合蛋白、病毒螺旋衣壳蛋白、病毒二十面体衣壳蛋白、病毒基质蛋白、病毒复制酶、病毒转录因子或病毒酶。
在一些实施例中，免疫原来自这些病毒之一：
正粘病毒(Orthomyxovirus)：有用的免疫原可以来自甲型、乙型或丙型流感病毒，诸如血凝素、神经氨酸酶或基质M2蛋白。在免疫原是甲型流感病毒血凝素的情况下，它可以来自任何亚型，例如HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。
副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒：病毒免疫原包括但不限于源自肺炎病毒(Pneumovirus)(例如呼吸道合胞病毒(RSV))、风疹病毒(Rubulavirus)(例如腮腺炎病毒)、副粘病毒(例如副流感病毒)、偏肺病毒(Metapneumovirus)和麻疹病毒(Morbillivirus)(例如麻疹病毒)、亨尼巴病毒(Henipavirus)(例如尼帕病毒(Nipah virus))。
痘病毒科(Poxviridae)：病毒免疫原包括但不限于源自正痘病毒的那些，正痘病毒例如天花(Variola vera)，包括但不限于大天花(Variola major)和小天花(Variolaminor)。
微小核糖核酸病毒(Picornavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自微小核糖核酸病毒的那些，微小核糖核酸病毒诸如肠病毒(Enterovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、嗜肝RNA病毒(Heparnavirus)、心脏病毒(Cardiovirus)和口蹄疫病毒(Aphthovirus)。在一个实施例中，肠病毒是脊髓灰质炎病毒，例如1型、2型和/或3型脊髓灰质炎病毒。在另一个实施例中，肠病毒是EV71肠病毒。在另一个实施例中，肠病毒是柯萨奇病毒(coxsackie)A或B。
布尼亚病毒(Bunyavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自以下的那些：正布尼亚病毒(Orthobunyavirus)，诸如加利福尼亚脑炎病毒(California encephalitis virus)；白蛉病毒(Phlebovirus)，诸如裂谷热病毒(Rift Valley Fever virus)；或内罗病毒(Nairovirus)，诸如克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fevervirus)。
嗜肝RNA病毒(Heparnavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自嗜肝RNA病毒，诸如甲型肝炎病毒(HAV)的那些。
丝状病毒(Filovirus)：病毒免疫原包括但不限于源自丝状病毒的那些，丝状病毒诸如埃博拉病毒(Ebola virus)(包括扎伊尔(Zaire)、科特迪瓦(Ivory Coast)、雷斯顿(Reston)或苏丹(Sudan)埃博拉病毒)或马尔堡病毒(Marburg virus)。
披膜病毒(Togavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自披膜病毒的那些，披膜病毒诸如风疹病毒(Rubivirus)、甲病毒(Alphavirus)或动脉炎病毒(Arterivirus)。这包括风疹病毒(rubella virus)。
黄病毒(Flavivirus)：病毒免疫原包括但不限于源自黄病毒的那些，黄病毒诸如蜱传脑炎(TBE)病毒、登革热(1、2、3或4型)病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、科萨努尔森林病毒(Kyasanur Forest Virus)、西尼罗河脑炎病毒(West Nile encephalitis virus)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus)、俄罗斯春夏脑炎病毒(Russian spring-summer encephalitis virus)、波瓦生脑炎病毒(Powassan encephalitis virus)、寨卡病毒。
瘟病毒(Pestivirus)：病毒免疫原包括但不限于源自瘟病毒的那些，瘟病毒诸如牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、经典猪瘟病毒(CSFV)或边界病病毒(BDV)。
嗜肝DNA病毒：病毒免疫原包括但不限于源自嗜肝DNA病毒，诸如乙型肝炎病毒的那些。乙型肝炎病毒免疫原可以是乙型肝炎病毒表面免疫原(HBsAg)。
其他肝炎病毒：病毒免疫原包括但不限于源自丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒或庚型肝炎病毒的那些。
弹状病毒(Rhabdovirus)：病毒免疫原包括但不限于源自弹状病毒，诸如狂犬病病毒(Lyssavirus){例如狂犬病毒(Rabies virus))和水疱病毒(Vesiculovirus，VSV)的那些。
杯状病毒科(Caliciviridae)：病毒免疫原包括但不限于源自杯状病毒科的那些，杯状病毒科诸如诺沃克病毒(Norwalk virus)(诺如病毒(Norovirus))和诺沃克样病毒(诸如夏威夷病毒(Hawaii Virus)和雪山病毒(Snow Mountain Virus))。
逆转录病毒(Retrovirus)：病毒免疫原包括但不限于源自肿瘤病毒(Oncovirus)、慢病毒(Lentivirus)(例如HIV-1或HIV-2)或泡沫病毒(Spumavirus)的那些。
呼肠孤病毒(Reovirus)：病毒免疫原包括但不限于源自正呼肠孤病毒(Orthoreovirus)、轮状病毒(Rotavirus)、环状病毒(Orbivirus)或科蜱病毒(Coltivirus)的那些。
细小病毒(Parvovirus)：病毒免疫原包括但不限于源自细小病毒B19的那些。
博卡病毒(Bocavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自博卡病毒的那些。
疱疹病毒(Herpesvirus)：病毒免疫原包括但不限于源自人疱疹病毒的那些，仅举例而言，人疱疹病毒诸如单纯疱疹病毒(HSV)(例如HSV 1型和2型)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6(HHV6)、人疱疹病毒7(HHV7)和人疱疹病毒8(HHV8)。
乳多空病毒(Papovavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自乳头瘤病毒(Papillomavirus)和多瘤病毒(Polyomavirus)的那些。(人)乳头瘤病毒可以是血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63或65，例如来自血清型6、11、16和/或18中的一种或多种。
正汉坦病毒(Orthohantavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自汉坦病毒(hantavirus)的那些。
沙粒病毒(Arenavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自瓜纳里托病毒(Guanaritovirus)、胡宁病毒(Junin virus)、拉萨病毒(Lassa virus)、卢约病毒(Lujo virus)、马丘波病毒(Machupo virus)、萨比亚病毒(Sabia virus)或白水河病毒(Whitewater Arroyovirus)的那些。
腺病毒(Adenovirus)：病毒免疫原包括源自腺病毒血清型36(Ad-36)的那些。
社区获得性呼吸道病毒：病毒免疫原包括源自社区获得性呼吸道病毒的那些。
冠状病毒(Coronavirus)：病毒免疫原包括但不限于源自SARS冠状病毒(例如，SARS-CoV-1和SARS-CoV-2)、MERS冠状病毒、禽传染性支气管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的那些。冠状病毒免疫原可以是刺突多肽或是刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)。冠状病毒免疫原也可以是包膜多肽、膜多肽或核衣壳多肽。
在一些实施例中，免疫原来自感染鱼类的病毒。在一些实施例中，免疫原引发针对感染鱼类的病毒的免疫反应。例如，感染鱼类的病毒选自传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)、鲑鱼胰腺疾病病毒(SPDV)、感染性胰腺坏死病毒(IPNV)、斑点叉尾鮰病毒(CCV)、鱼淋巴囊肿病病毒(FLDV)、传染性造血组织坏死症病毒(IHNV)、锦鲤疱疹病毒、鲑鱼小核糖核酸样病毒(也称为大西洋鲑小核糖核酸样病毒)、陆封鲑病毒(LSV)、大西洋鲑轮状病毒(ASR)、鳟鱼草莓病病毒(TSD)、银鲑肿瘤病毒(CSTV)或病毒性出血性败血症病毒(VHSV)。
在一些实施例中，免疫原来自宿主受试者细胞。例如，可以通过使用来自病毒用作进入因子的宿主细胞组分的免疫原或表位来产生阻断病毒进入的抗体。
免疫原来自例如细菌，诸如细菌表面蛋白、细菌膜蛋白、细菌包膜蛋白、细菌内膜蛋白、细菌外膜蛋白、细菌周质蛋白、细菌进入蛋白、细菌膜融合蛋白、细菌结构蛋白、细菌非结构蛋白、分泌型细菌蛋白、细菌聚合酶蛋白、细菌DNA聚合酶、细菌RNA聚合酶、细菌蛋白酶、细菌糖蛋白、细菌转录因子、细菌酶或细菌毒素。
在一些实施例中，免疫原引发来自这些细菌之一的免疫反应：无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(也称为B族链球菌或GBS)；化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)(也称为A族链球菌(GAS))；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)；表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)；梅毒螺旋体(Treponema pallidum)；土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)；立克次氏体物种(Rickettsia species)；鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)；脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)：免疫原包括但不限于膜蛋白，诸如粘附素、自主转运蛋白、毒素、铁获取蛋白和因子H结合蛋白；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)；卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)；百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)：免疫原包括但不限于百日咳毒素或类毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)、百日咳杆菌粘附素及凝集原2和3；破伤风梭菌(Clostridium tetani)：典型的免疫原是破伤风类毒素；白喉棒状杆菌(Cornynebacteriumdiphtheriae)：典型的免疫原是白喉类毒素；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)；肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)；幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)；大肠杆菌(Escherichiacoli)(免疫原包括但不限于源自产肠毒素的大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAggEC)、弥漫性粘附大肠杆菌(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)和/或肠出血性大肠杆菌(EHEC)的免疫原)。ExPEC菌株包括尿道致病性大肠杆菌(UPEC)和脑膜炎/败血症相关大肠杆菌(MNEC)。还包括炭疽杆菌(Bacillus anthracis)；产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)或肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridiumbotulinums)；嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)；伯纳特柯克斯体(Coxiellaburnetiid)；布鲁氏菌属(Brucella)的种，诸如流产布鲁氏菌(B.abortus)、犬布鲁氏菌(B.canis)、羊布鲁氏菌(B.melitensis)、木鼠布鲁氏菌(B.neotomae)、绵羊布鲁氏菌(B.ovis)、猪布鲁氏菌(B.suis)和鳍型布鲁氏菌(B.pinnipediae)。弗朗西斯菌属(Francisella)的种，诸如新凶手弗朗西斯菌(F.novicida)、哲氏弗朗西斯菌(F.philomiragia)和土拉弗朗西斯菌(F.tularensis)；淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)；杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)；粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)或屎肠球菌(Enterococcus faecium)；腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)；结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)；博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)；牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)；和克雷白杆菌属(Klebsiella)的种。
免疫原来自例如真菌，诸如真菌表面蛋白、真菌膜蛋白、真菌包膜蛋白、真菌内膜蛋白、真菌外膜蛋白、真菌周质蛋白、真菌进入蛋白、真菌膜融合蛋白、真菌结构蛋白、真菌非结构蛋白、分泌型真菌蛋白、真菌聚合酶蛋白、真菌DNA聚合酶、真菌RNA聚合酶、真菌蛋白酶、真菌糖蛋白、真菌转录因子、真菌酶或真菌毒素。
在一些实施例中，真菌免疫原源自皮肤癣菌(Dermatophyte)，包括：絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccusum)、头癣小孢霉(Microsporum audouini)、犬小孢霉(Microsporum canis)、畸变小孢霉(Microsporum distortum)、马小孢霉(Microsporumequinum)、石膏样小孢霉(Microsporum gypsum)、纳米小孢霉(Microsporum nanum)、叠瓦毛癣菌(Trichophyton concentricum)、马毛癣菌(Trichophyton equinum)、鸡毛癣菌(Trichophyton gallinae)、石膏样毛癣菌(Trichophyton gypseum)、麦格尼毛癣菌(Trichophyton megnini)、须毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、昆克努发癣菌(Trichophyton quinckeanum)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、许兰毛癣菌(Trichophyton schoenleini)、断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)、疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)、疣状毛癣菌白色变种(T.verrucosum var.album)、盘状变种(var.discoides)、赫色变种(var.ochraceum)、紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)和/或蜜块状毛癣菌(Trichophyton faviforme)；或来自于烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、萨氏曲霉(Aspergillus sydowi)、黄曲霉菌(Aspergillus flavatus)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、芽生裂殖菌(Blastoschizomyces capitatus)、白色念珠菌(Candida albicans)、烯醇化酶念珠菌(Candida enolase)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、类星形念珠菌(Candida stellatoidea)、克鲁斯念珠菌(Candida kusei)、帕拉克斯念珠菌(Candida parakwsei)、葡萄牙念珠菌(Candida lusitaniae)、伪热带念珠菌(Candidapseudotropicalis)、季也蒙念珠菌(Candida guilliermondi)、卡氏枝孢霉(Cladosporiumcarrionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、棒地霉(Geotrichumclavatum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、微孢子目(Microsporidia)、脑胞内原虫属种(Encephalitozoon spp.)、肠间隔微孢子虫(Septata intestinalis)和毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)；不太常见的是小孢子虫属种(Brachiola spp)、微孢子虫属种(Microsporidium spp.)、微粒子虫属种(Nosema spp.)、匹里虫属种(Pleistophoraspp.)、气管普孢虫属种(Trachipleistophora spp.)、条孢虫属种(Vittaforma spp)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、隐袭腐霉(Pythiumn insidiosum)、皮屑芽孢菌(Pityrosporum ovale)、酿酒酵母(Sacharomyces cerevisae)、布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiosperum)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、白吉利毛孢子菌(Trichosporon beigelii)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、马尔尼菲青霉(Penicilliummarneffei)、马拉色菌属种(Malassezia spp.)、着色真菌属种(Fonsecaea spp.)、万氏霉菌属种(Wangiella spp.)、孢子丝菌属种(Sporothrix spp.)、蛙粪霉属种(Basidiobolus spp.)、耳霉属种(Conidiobolus spp.)、根霉属种(Rhizopus spp)、毛霉菌属种(Mucor spp)、犁头霉属种(Absidia spp)、被孢霉属种(Mortierella spp)、小克银汉霉属种(Cunninghamella spp)、瓶霉属种(Saksenaea spp.)、链格孢属种(Alternaria spp)、弯孢霉属种(Curvulariaspp)、长蠕孢属种(Helminthosporium spp)、镰刀菌属种(Fusarium spp)、曲霉属种(Aspergillus spp)、青霉属种(Penicillium spp)、链核盘菌属种(Monolinia spp)、丝核菌属种(Rhizoctonia spp)、拟青霉属种(Paecilomyces spp)、皮司霉属种(Pithomycesspp)和枝孢属种(Cladosporium spp)。
免疫原来自例如真核寄生虫表面蛋白、真核寄生虫膜蛋白、真核寄生虫包膜蛋白、真核寄生虫进入蛋白、真核寄生虫膜融合蛋白、真核寄生虫结构蛋白、真核寄生虫非结构蛋白、分泌型真核寄生虫蛋白、真核寄生虫聚合酶蛋白、真核寄生虫DNA聚合酶、真核寄生虫RNA聚合酶、真核寄生虫蛋白酶、真核寄生虫糖蛋白、真核寄生虫转录因子、真核寄生虫酶或真核寄生虫毒素。
在一些实施例中，免疫原引发针对来自疟原虫属(Plasmodium)的寄生虫诸如恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)或卵形疟原虫(P.ovale)的免疫反应。在一些实施例中，免疫原引发针对来自鱼虱科(Caligidae)的寄生虫，特别是来自疮痂鱼虱属(Lepeophtheirus)和鱼虱属(Caligus)属的那些寄生虫，例如海虱，诸如鲑疮痂鱼虱(Lepeophtheirus salmonis)或大马哈鱼虱(Caligus rogercresseyi)的免疫反应。在一些实施例中，免疫原引发针对寄生虫刚地弓形虫的免疫反应。
在一些实施例中，免疫原是癌症免疫原(例如，新表位)。例如，免疫原是与以下相关的新抗原和/或新表位：急性白血病、星形细胞瘤、胆道癌(胆管癌)、骨癌、乳腺癌、脑干神经胶质瘤、细支气管肺泡细胞肺癌、肾上腺癌、肛区癌、膀胱癌、内分泌系统癌、食道癌、头或颈癌、肾癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、胸膜/腹膜癌、唾液腺癌、小肠癌、甲状腺癌、输尿管癌、尿道癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、输卵管癌、肾盂癌、阴道癌、外阴癌、宫颈癌、慢性白血病、结肠癌、结直肠癌、皮肤黑色素瘤、室管膜瘤、表皮样肿瘤、尤因氏肉瘤(Ewings sarcoma)、胃癌、成胶质细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、血液系统恶性肿瘤、肝细胞癌(肝癌)、肝细胞瘤，霍奇金病(Hodgkin's Disease)、眼内黑色素瘤、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肺癌、淋巴瘤、成神经管细胞瘤(medulloblastoma)、黑色素瘤、脑膜瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、肌肉癌、中枢神经系统(CNS)赘生物、神经元癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、小儿恶性肿瘤、垂体腺瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、软组织肉瘤、神经鞘瘤、皮肤癌、脊柱肿瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、子宫癌或肿瘤及其转移癌，包括上述任何癌症的难治性形式或其任何组合。
在一些实施例中，免疫原是选自以下的肿瘤抗原：(a)睾丸癌抗原，诸如NY-ESO-1、SSX2、SCP1以及RAGE、BAGE、GAGE和MAGE家族的多肽，例如GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12(这些可用于例如处理黑色素瘤、肺部、头颈、NSCLC、乳腺、胃肠道和膀胱肿瘤；(b)突变的抗原，例如p53(与各种实体瘤相关，例如结直肠癌、肺癌、头颈癌)、p21/Ras(与例如黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌相关)、CDK4(与例如黑色素瘤相关)、MUMl(与例如黑色素瘤相关)、半胱天冬酶-8(与例如头颈癌相关)、CIA0205(与例如膀胱癌相关)、HLA-A2-R1701、β连环蛋白(与例如黑色素瘤相关)、TCR(与例如T细胞非霍奇金淋巴瘤相关)、BCR-abl(与例如慢性髓细胞性白血病相关)、磷酸丙糖异构酶、KIA0205、CDC-27和LDLR-FUT；(c)过表达的抗原，例如半乳凝素4(与例如结直肠癌相关)、半乳凝素9(与例如霍奇金病相关)、蛋白酶3(与例如慢性髓细胞性白血病相关)、WT 1(与例如各种白血病相关)、碳酸酐酶(与例如肾癌相关)、醛缩酶A(与例如肺癌相关)、PRAME(与例如黑色素瘤相关)、HER-2/neu(与例如乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌相关)、乳腺珠蛋白、甲胎蛋白(与例如肝细胞瘤相关)、KSA(与例如结直肠癌相关)、胃泌素(与例如胰腺癌和胃癌相关)、端粒酶催化蛋白、MUC-1(与例如乳腺癌和卵巢癌相关)、G-250(与例如肾细胞癌相关)、p53(与例如乳腺癌、结肠癌相关)和癌胚抗原(与例如乳腺癌、肺癌和胃肠道癌诸如结直肠癌相关)；(d)共有抗原，例如黑色素瘤-黑色素细胞分化抗原，诸如MART-1/黑色素A、gplOO、MC1R、促黑色素细胞激素受体(melanocyte-stimulating hormone receptor)、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/TRP1和酪氨酸酶相关蛋白-2/TRP2(与例如黑色素瘤相关)；(e)与例如前列腺癌相关的前列腺相关抗原，诸如PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2；(f)免疫球蛋白独特型(例如，与骨髓瘤和B细胞淋巴瘤相关)；(g)新抗原。在某些实施例中，肿瘤免疫原包括但不限于pi 5、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、爱泼斯坦巴尔病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原(包括E6和E7)、乙型肝炎和丙型肝炎病毒抗原、人T细胞淋巴病毒抗原、TSP-180、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、mn-23Hl、TAG-72-4、CA19-9、CA72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、pl6、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、beta-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29YBCAA)、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白亲环蛋白C相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS等。
在一些实施例中，免疫原引发针对以下物质的免疫反应：花粉过敏原(树木、草本植物、野草和禾木科植物花粉过敏原)；昆虫或蜘蛛纲过敏原(吸入物、唾液和毒液过敏原，例如螨过敏原、蟑螂和蚊虫过敏原、膜翅目毒液过敏原)；动物毛发和头皮屑过敏原(来自于例如狗、猫、马、大鼠、小鼠等)；以及食物过敏原(例如麦醇溶蛋白)。来自树木、禾本科植物和草本植物的重要花粉过敏原是源于以下的此类过敏原：分类的壳斗目(Fagales)、木犀目(Oleales)、松目(Pinales)和悬铃木科(platanaceae)，包括但不限于桦树(桦属(Betula))、桤木(桤木属(Alnus))、榛树(榛属(Corylus))、角树(鹅耳枥属(Carpinus))和橄榄(洋橄榄属(Olea))、雪松(柳杉属(Cryptomeria)和桧属(Juniperus))、法国梧桐(悬铃木属(Platanus))；禾本目(Poales)，包括黑麦草属(Lolium)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、绒毛草属(Holcus)、虉草属(Phalaris)、黑麦属(Secale)和高粱属(Sorghum)的禾本科植物；菊目(Asterales)和荨麻目(Urticales)，包括豕草属(Ambrosia)、蒿属(Artemisia)和墙草属(Parietaria)的草本植物。其他重要的吸入性过敏原是来自尘螨属(Dermatophagoides)和嗜霉螨属(Euroglyphus)的屋尘螨、贮藏螨(例如嗜鳞螨属(Lepidoglyphys)、食甜螨属(Glycyphagus)和食酪螨属(Tyrophagus))的那些过敏原；来自蟑螂、蚊虫和跳蚤，例如如小蠊属(Blatella)、大蠊属(Periplaneta)、摇蚊属(Chironomus)和蚤属(Ctenocepphalides)的那些过敏原；以及来自哺乳动物诸如猫、狗和马的那些过敏原；毒液过敏原，包括源于叮或咬的昆虫的此类过敏原，这些昆虫诸如来自分类的膜翅目的那些，包括蜜蜂(蜜蜂科(Apidae))、黄蜂(胡蜂科(Vespidea))和蚂蚁(蚁科(Formicoidae))。
在一些实施例中，免疫原源自例如毒液中的毒素，诸如来自以下的毒液：蛇(例如，大多数响尾蛇的种(例如，东菱斑响尾蛇)、褐蛇的种(例如，褐蛇王和东部褐蛇)、卢氏蝰蛇(russel’s viper)、眼镜蛇(例如，印度眼镜蛇、眼镜王蛇)、金环蛇的某些种(例如，普通金环蛇)、树眼镜蛇(例如，黑色树眼镜蛇)、锯鳞蝰、非洲树蛇、杜布瓦海蛇、太攀蛇的种(例如，海岸太攀蛇和内陆太攀蛇)、锐蝮蛇的种(例如矛头蛇和三色矛头蝮)、巨蝮、铜头蛇、棉口蛇、珊瑚蛇、死亡蛇、贝尔彻海蛇(Belcher’s sea snake)、虎蛇、澳大利亚黑蛇)、蜘蛛(例如，褐皮花蛛、黑寡妇毒蛛、巴西流浪蜘蛛、漏斗网蜘蛛、纽扣蜘蛛、澳大利亚赤背蜘蛛、卡提波蜘蛛、假黑寡妇蜘蛛、智利隐士蜘蛛、鼠蜘、粒突蛛属(Macrothele)的种、竹蛏属(Sicarius)的种、Hexpthalma属种、狼蛛(tarantulas)的某些种)、蝎子和其他蛛形纲动物(例如，肥尾蝎、以色列金蝎(deathstalker scorpion)、印度红蝎、刺尾蝎属(Centruroides)的种、钳蝎属(Tityus)的种，诸如巴西黄蝎)、昆虫(例如，蜜蜂的种、黄蜂的种、某些蚂蚁(诸如火蚁)、一些鳞翅目毛虫的种、某些蜈蚣的种、桨足虫图伦冥府虾(Xibalbanus tulumensis))、鱼类(例如某些鲶鱼的种(例如，条纹鳗鲶和其他鳗鲶)、某些黄貂鱼的种类(例如，蓝斑黄貂鱼)、蓑鲉、石鱼、蝎子鱼、蟾鱼、鲭带鱼、虎鲉、帆鳍鲉(cockatoo waspfish)、斑马鳚(striped blenny)、瞻星鱼(stargazer)、银鲛(chimaera)、鲈鱼(weever)、狗鲨(dogfish shark))、刺胞动物(例如水母的某些种(例如伊鲁康吉水母(Irukanjdi jellyfish)和箱型水母(box jellyfish))、水螅虫类(例如，葡萄牙战舰(Portuguese Man o’War))、海葵、珊瑚的某些种)、蜥蜴(例如，吉拉毒蜥、墨西哥须蜥、巨蜥属(Varanus)的某些种(例如，科莫多巨蜥(科莫多巨蜥))、眼斑巨蜥和树巨蜥)、哺乳动物(例如，南部短尾鼩、鸭嘴兽、欧鼹鼠、欧亚水鼩、地中海水鼩、北部短尾鼩、埃利奧特短尾鼩(Elliot’s short-tailed shrew)、沟齿鼩的某些种(例如古巴沟齿鼩(Cuban solenodon)、海地沟齿鼩(Hispaniolan solenodon))、懒猴(slow loiris))、软体动物(例如，鸡心螺的某些种)、头足类动物(例如，章鱼的某些种(例如，蓝圈章鱼)、鱿鱼和乌贼)、两栖动物(例如，青蛙，诸如箭毒蛙、布鲁诺盔头蛙(Bruno’s casque-headed frog)、绿蛙(Greening’sfrog)、蝾螈(例如火蝾螈、伊比利亚有肋蝾螈(Iberian ribbed newt))。
在一些实施例中，毒素来自植物或真菌(例如蘑菇)。
在一些实施例中，毒素免疫原源自毒素，诸如蓝藻毒素(cyanotoxin)、二甲毒素(dinotoxin)、肌肉毒素、细胞毒素(例如，蓖麻毒蛋白、蜂毒(apitoxin)、霉菌毒素(mycotoxin)(例如，黄曲霉毒素(aflatoxin))、赭曲霉毒素(ochratoxin)、桔青霉素(citrinin)、麦角生物碱、棒曲霉毒素(patulin)、镰刀菌(fusarium)毒素、伏马菌素(fumonisin)、单端孢霉烯(trichothecene)、心脏毒素(cardiotoxin))、河豚毒素(tetrodotoxin)、箭毒蛙毒素(batrachotoxin)、肉毒杆菌毒素A、破伤风毒素A、白喉毒素、二噁英(dioxin)、毒蕈碱、蟾蜍毒素(bufortoxin)、沙林(sarin)、溶血毒素(hemotoxin)、光毒素(phototoxin)、坏死毒素(necrotoxin)、肾毒素(nephrotoxin)和神经毒素(neurotoxin)(例如，钙蛇毒(calciseptine)、眼镜蛇毒蛋白(cobrotoxin)、钙阻蛋白(calcicludine)、筒箭毒-I(fasciculin-I)、钙利毒素(calliotoxin))。
来自多种微生物或癌症的免疫原可以用于环状或线性多核糖核苷酸中。在一些情况下，免疫原与以上披露的一种微生物相关或由其表达。在一些实施例中，免疫原与以上披露的两种或更多种微生物相关或由其表达。在一些情况下，免疫原与以上披露的一种癌症相关或由其表达。在一些实施例中，免疫原与以上披露的两种或更多种癌症相关或由其表达。在一些实施例中，免疫原源自如以上披露的毒素。在一些实施例中，免疫原来自以上披露的两种或更多种毒素。
这两种或更多种微生物是有关的或无关的。在一些情况下，两种或多种微生物在系统发育上有关。例如，本披露的环状或线性多核糖核苷酸包括或编码来自两种或更多种病毒、病毒科的两个或更多个成员、病毒纲的两个或更多个成员、病毒目的两个或更多个成员、病毒属的两个或更多个成员、病毒种的两个或更多个成员、两种或更多种细菌病原体的免疫原。在一些实施例中，两种或多种微生物在系统发育上无关。
在一些情况下，两种或多种微生物在表现上有关。例如，本披露的环状或线性多核糖核苷酸包括或编码来自两种或更多种呼吸道病原体、两种或更多种选择剂、两种或更多种与严重疾病相关的微生物、两种或更多种与免疫受损受试者中的不良结果相关的微生物、两种或更多种与和妊娠有关的不良后果相关的微生物、两种或多种与出血热相关的微生物的免疫原。
本披露的免疫原可以包括野生型序列。当描述免疫原时，术语“野生型”是指天然存在的且由基因组(例如，病毒基因组)编码的序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)。一个物种(例如，微生物物种)可以具有一个野生型序列，或者具有两个或更多个野生型序列(例如，在参考微生物基因组中存在一个规范的野生型序列，并且存在由突变产生的其他变体的野生型序列)。
当描述免疫原时，术语“衍生物”和“源自”是指与野生型序列的不同之处在于一个或多个核酸或氨基酸，例如相对于野生型序列含有一个或多个核酸或氨基酸插入、缺失和/或取代的序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)。
免疫原衍生物序列是与野生型序列(例如，野生型核酸、蛋白质、免疫原或表位序列)具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的序列。
在一些实施例中，免疫原含有影响所编码的蛋白质的结构的一个或多个氨基酸插入、缺失、取代或其组合。在一些实施例中，免疫原含有影响所编码的蛋白质的功能的一个或多个氨基酸插入、缺失、取代或其组合。在一些实施例中，免疫原含有影响细胞对所编码的蛋白质的表达或加工的一个或多个氨基酸插入、缺失、取代或其组合。
在一些实施例中，免疫原含有影响所编码的免疫原性核酸的结构的一个或多个核酸插入、缺失、取代或其组合。
氨基酸的插入、缺失、取代或其组合可以引入翻译后修饰的位点(例如，引入糖基化、泛素化、磷酸化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、酰胺化、羟基化、硫酸化或脂质化位点，或靶向进行裂解的序列)。在一些实施例中，氨基酸的插入、缺失、取代或其组合去除翻译后修饰的位点(例如，去除糖基化、泛素化、磷酸化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、酰胺化、羟基化、硫酸化或脂质化位点，或靶向进行裂解的序列)。在一些实施例中，氨基酸的插入、缺失、取代或其组合修饰翻译后修饰的位点(例如，修饰位点以改变糖基化、泛素化、磷酸化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、酰胺化、羟基化、硫酸化或脂质化位点，或裂解的效率或特征)。
氨基酸取代可以是保守性或非保守性取代。保守性氨基酸取代可以是一个氨基酸被具有类似生物化学特性(例如，电荷、大小和/或疏水性)的另一氨基酸取代。非保守性氨基酸取代可以是一个氨基酸被具有不同生物化学特性(例如，电荷、大小和/或疏水性)的另一氨基酸取代。保守性氨基酸变化可以是例如对多肽的二级或三级结构影响最小的取代。保守性氨基酸变化可以是从一种亲水性氨基酸到另一种亲水性氨基酸的氨基酸变化。亲水性氨基酸可以包括Thr(T)、Ser(S)、His(H)、Glu(E)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Lys(K)和Arg(R)。保守性氨基酸变化可以是从一种疏水性氨基酸到另一种亲水性氨基酸的氨基酸变化。疏水性氨基酸可以包括Ile(I)、Phe(F)、Val(V)、Leu(L)、Trp(W)、Met(M)、Ala(A)、Gly(G)、Tyr(Y)和Pro(P)。保守性氨基酸变化可以是从一种酸性氨基酸到另一种酸性氨基酸的氨基酸变化。酸性氨基酸可以包括Glu(E)和Asp(D)。保守性氨基酸变化可以是从一种碱性氨基酸到另一种碱性氨基酸的氨基酸变化。碱性氨基酸可以包括His(H)、Arg(R)和Lys(K)。保守性氨基酸变化可以是从一种极性氨基酸到另一种极性氨基酸的氨基酸变化。极性氨基酸可以包括Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T)。保守性氨基酸变化可以是从一种非极性氨基酸到另一种非极性氨基酸的氨基酸变化。非极性氨基酸可以包括Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Met(M)、Gly(G)和Ala(A)。保守性氨基酸变化可以是从一种芳族氨基酸到另一种芳族氨基酸的氨基酸变化。芳族氨基酸可以包括Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)。保守性氨基酸变化可以是从一种脂族氨基酸到另一种脂族氨基酸的氨基酸变化。脂族氨基酸可以包括Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)。在一些实施例中，保守性氨基酸取代是以下各类之一的一个氨基酸到另一氨基酸的氨基酸变化：I类：ala、pro、gly、gln、asn、ser、thr；II类：cys、ser、tyr、thr；III类：val、ile、leu、met、ala、phe；IV类：lys、arg、his；V类：phe、tyr、trp、his；和VI类：asp、glu。
在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸缺失。
在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个氨基酸取代。
在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个或至多50个氨基酸取代。
在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25个氨基酸取代。
在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。
这一个或多个氨基酸取代可以处于N端、C端、氨基酸序列内，或为其组合。这些氨基酸取代可以是连续的、非连续的或其组合。
在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个、至多50个、至多60个、至多70个、至多80个、至多90个、至多100个、至多120个、至多140个、至多160个、至多180个或至多200个氨基酸缺失。
在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于野生型序列包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20、20-25、20-30、30-50、50-100或100-200个氨基酸缺失。
在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于野生型序列包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸缺失。
这一个或多个氨基酸缺失可以处于N端、C端、氨基酸序列内，或为其组合。这些氨基酸缺失可以是连续的、非连续的或其组合。
在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于野生型序列包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个氨基酸插入。
在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于野生型序列)包括至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个或至多50个氨基酸插入。
在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于野生型序列包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25个氨基酸插入。
在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于野生型序列包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸插入。
这一个或多个氨基酸插入可以处于N端、C端、氨基酸序列内，或为其组合。这些氨基酸插入可以是连续的、非连续的或其组合。
在一些实施例中，免疫原由环状或线性多核糖核苷酸表达。在一些实施例中，免疫原是环状或线性多核糖核苷酸滚环扩增的产物。
免疫原可以大量产生。这样，免疫原可以是可产生的任何蛋白质分子。免疫原可以是可从细胞分泌或定位于细胞的细胞质、细胞核或膜区室的多肽。在一些实施例中，由本披露的环状或线性多核糖核苷酸编码的多肽包括融合蛋白，该融合蛋白包含本文披露的两种或更多种免疫原。在一些实施例中，由本披露的环状或线性多核糖核苷酸编码的多肽包括表位。在一些实施例中，由本披露的环状或线性多核糖核苷酸编码的多肽包括包含本文披露的两个或更多个表位的融合蛋白，例如包含来自本披露的一种或多种微生物的多个预测表位的人工肽序列。
在一些实施例中，可以从环状或线性多核糖核苷酸表达的免疫原是膜蛋白，例如，包括通常作为膜蛋白被发现的多肽序列，或经修饰为膜蛋白的多肽序列。在一些实施例中，可以从本文披露的环状或线性多核糖核苷酸表达的示例性免疫原包括细胞内免疫原或胞质免疫原。
在一些实施例中，免疫原的长度小于约40,000个氨基酸，小于约35,000个氨基酸，小于约30,000个氨基酸，小于约25,000个氨基酸，小于约20,000个氨基酸，小于约15,000个氨基酸小于约10,000个氨基酸，小于约9,000个氨基酸，小于约8,000个氨基酸，小于约7,000个氨基酸，小于约6,000个氨基酸，小于约5,000个氨基酸，小于约4,000个氨基酸，小于约3,000个氨基酸，小于约2,500个氨基酸，小于约2,000个氨基酸，小于约1,500个氨基酸，小于约1,000个氨基酸，小于约900个氨基酸，小于约800个氨基酸，小于约700个氨基酸，小于约600个氨基酸，小于约500个氨基酸，小于约400个氨基酸，小于约300个氨基酸，小于约250个氨基酸，小于约200个氨基酸，小于约150个氨基酸，小于约140个氨基酸，小于约130个氨基酸，小于约120个氨基酸，小于约110个氨基酸，小于约100个氨基酸，小于约90个氨基酸，小于约80个氨基酸，小于约70个氨基酸，小于约60个氨基酸，小于约50个氨基酸，小于约40个氨基酸，小于约30个氨基酸，小于约25个氨基酸，小于约20个氨基酸，小于约15个氨基酸，小于约10个氨基酸，小于约5个氨基酸，介于之间或更小的任何氨基酸长度都可用。
在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括一个或多个免疫原序列并且构造成用于在受试者体内细胞中持续表达。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸构造成使得该一个或多个表达序列在细胞中在较晚的时间点的表达等于或高于较早的时间点的表达。在此类实施例中，该一个或多个免疫原序列的表达可以维持在相对稳定的水平或可以随时间增加。免疫原序列的表达可以在延长的时间段内相对稳定。免疫原序列的表达可以瞬时相对稳定或仅有限的时间，例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天相对稳定。
在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸在受试者中例如瞬时或长期表达一种或多种免疫原。在某些实施例中，免疫原的表达持续至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或介于之间的任何时间。在某些实施例中，免疫原的表达持续不超过约30分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或介于之间的任何时间。
免疫原表达包括翻译本文提供的环状或线性多核糖核苷酸的至少一个区域。例如，环状或线性多核糖核苷酸可以在受试者中翻译以生成包括本披露的一种或多种免疫原的多肽，从而刺激受试者中适应性免疫反应(例如，抗体反应和/或T细胞反应)的产生。在一些实施例中，本披露的环状或线性多核糖核苷酸经翻译以在人或动物受试者中产生一种或多种免疫原，从而刺激人或动物受试者中适应性免疫反应(例如，抗体反应和/或T细胞反应)的产生。
在一些实施例中，用于免疫原表达的方法包括将环状或线性多核糖核苷酸的总长度的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％翻译成多肽。在一些实施例中，用于免疫原表达的方法包括将环状或线性多核糖核苷酸翻译成具有至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少400个氨基酸、至少500个氨基酸、至少600个氨基酸、至少700个氨基酸、至少800个氨基酸、至少900个氨基酸或至少1000个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状或线性多核糖核苷酸翻译成约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约150个氨基酸、约200个氨基酸、约250个氨基酸、约300个氨基酸、约400个氨基酸、约500个氨基酸、约600个氨基酸、约700个氨基酸、约800个氨基酸、约900个氨基酸或约1000个氨基酸的多肽。在一些实施例中，方法包括将环状或线性多核糖核苷酸翻译成本文提供的连续多肽、本文提供的离散多肽或两者。
在一些实施例中，用于免疫原表达的方法包括翻译产物的修饰、折叠或其他翻译后修饰。在一些实施例中，用于免疫原表达的方法包括体内翻译后修饰，例如经由细胞机制。
信号序列
在一些实施例中，可以从本文披露的环状或线性多核糖核苷酸表达的示例性免疫原包括分泌性蛋白，例如天然包括信号序列的蛋白质(例如，免疫原)，或者通常不编码信号序列但修饰为含有信号序列的蛋白质。在一些实施例中，由环状或线性多核糖核苷酸编码的免疫原包括分泌信号。例如，分泌信号可以是分泌性蛋白的天然编码的分泌信号。再如，分泌信号可以是分泌性蛋白的经修饰的分泌信号。在其他实施例中，由环状或线性多核糖核苷酸编码的免疫原不包括分泌信号。
在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸编码相同免疫原的多个拷贝(例如，相同免疫原的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个拷贝)。在一些实施例中，免疫原的至少一个拷贝包括信号序列，且免疫原的至少一个拷贝不包括信号序列。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸编码多个免疫原(例如，多个不同的免疫原或多个具有小于100％序列同一性的免疫原)，其中该多个免疫原中的至少一个包括信号序列且该多个免疫原中的至少一个拷贝不包括信号序列。
在一些实施例中，信号序列是野生型信号序列，其例如在内源表达时存在于相应野生型免疫原的N端。在一些实施例中，信号序列是免疫原异源的，例如当野生型免疫原内源性表达时是不存在的。可以修饰编码免疫原的多核糖核苷酸序列以去除编码野生型信号序列的核苷酸序列和/或添加编码异源信号序列的序列。
由多核糖核苷酸编码的免疫原可以包括将免疫原引导至分泌途径的信号序列。在一些实施例中，信号序列可以引导免疫原驻留在某些细胞器(例如，内质网、高基氏体或内体)中。在一些实施例中，信号序列引导免疫原从细胞中分泌。对于分泌性蛋白，信号序列可以在分泌后裂解，从而产生成熟蛋白。在其他实施例中，信号序列可以嵌入细胞膜或某些细胞器中，产生跨膜区段，跨膜区段将蛋白锚定至细胞膜、内质网或高基氏体。在某些实施例中，跨膜蛋白的信号序列是在多肽N端的短序列。在其他实施例中，第一跨膜结构域充当第一信号序列，将蛋白质靶向膜。
在一些实施例中，由多核糖核苷酸编码的免疫原包括分泌信号序列、跨膜插入信号序列或不包括信号序列。
调控元件
在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括调控元件，例如修饰环状或线性多核糖核苷酸内表达序列的表达的序列。调控元件可以包括位置与编码表达产物的表达序列相邻的序列。调控元件可以可操作地连接至相邻序列。与不存在调控元件时表达的产物的量相比，调控元件可以增加表达的产物的量。调控元件可用于增加由环状或线性多核糖核苷酸编码的一种或多种免疫原的表达。同样，调控元件可用于减少由环状或线性多核糖核苷酸编码的一种或多种免疫原的表达。在一些实施例中，一种调控元件可用于增加免疫原的表达，而另一种调控元件可用于减少相同环状或线性多核糖核苷酸上另一免疫原的表达。另外，调控元件可以增加串联附接的多个表达序列表达的产物(例如，免疫原)的量。因此，调控元件可以增强一个或多个表达序列(例如，免疫原)的表达。也可以使用多种调控元件，例如，差异性地调控不同表达序列的表达。在一些实施例中，本文提供的调控元件可以包括选择性翻译序列。如本文所用，术语“选择性翻译序列”是指在环状或线性多核糖核苷酸中选择性地起始或激活表达序列的翻译的核酸序列，例如某些核糖开关适体酶。调控元件还可以包括选择性降解序列。如本文所用，术语“选择性降解序列”是指起始环状或线性多核糖核苷酸或者环状或线性多核糖核苷酸的表达产物的降解的核酸序列。在一些实施例中，调控元件是翻译调节子。翻译调节子可以调节环状或线性多核糖核苷酸中表达序列的翻译。翻译调节子可以是翻译增强子或翻译抑制子。在一些实施例中，翻译起始序列可以充当调控元件。在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0154]-[0161]中描述了调控元件的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。
与起始翻译的密码子(诸如但不限于起始密码子或替代的起始密码子)侧接的核苷酸已知会影响环状或线性多核糖核苷酸的翻译效率、长度和/或结构。(参见例如Matsuda和Mauro PLoS ONE[公共科学图书馆期刊],2010 5:11；其内容通过援引以其全文并入本文)。掩蔽与起始翻译的密码子侧接的任何核苷酸可用于改变环状或线性多核糖核苷酸的翻译起始位置、翻译效率、长度和/或结构。
在一个实施例中，可以在起始密码子或替代的起始密码子附近使用掩蔽剂，以掩蔽或隐藏密码子，以降低在被掩蔽的起始密码子或替代的起始密码子处起始翻译的可能性。在另一个实施例中，掩蔽剂可用于掩蔽环状或线性多核糖核苷酸的起始密码子，以增加翻译将在替代的起始密码子处起始的可能性。
翻译起始序列
在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸编码免疫原并且包括翻译起始序列，例如起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列包括科扎克或夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列。在一些实施例中，翻译起始序列包含科扎克序列。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的翻译起始序列，例如科扎克序列。在一些实施例中，翻译起始序列是非编码起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列(例如科扎克序列)存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致表达产物的隔开。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个翻译起始序列。在一些实施例中，翻译起始序列为环状或线性多核糖核苷酸提供构象柔性。在一些实施例中，翻译起始序列基本上在环状或线性多核糖核苷酸的单链区域内。在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0163]-[0165]中描述了翻译起始序列的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。
环状或线性多核糖核苷酸可以包括多于1个起始密码子，诸如但不限于至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个或多于60个起始密码子。翻译可以在第一个起始密码子上起始或可以在第一个起始密码子的下游起始。
在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸可以起始于不是第一起始密码子的密码子，例如AUG。环状或线性多核糖核苷酸的翻译可以在替代性的翻译起始序列处起始，诸如国际专利公开号WO 2019/118919 A1的[0164]中描述的那些，该专利公开通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，翻译是通过用Rocaglates处理真核起始因子4A(eIF4A)来起始的(通过阻断43S扫描来阻遏翻译，导致过早的上游翻译起始以及携带RocA-eIF4A靶序列的转录本的蛋白质表达降低，参见例如，www.nature.com/articles/nature17978)。
IRES
在一些实施例中，本文所述的环状或线性多核糖核苷酸包括内部核糖体进入位点(IRES)元件。在一些实施例中，本文所述的环状或线性多核糖核苷酸包括多于一个(例如，2、3、4和5个)内部核糖体进入位点(IRES)元件。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸在每个表达序列的一侧或两侧上包括一个或多个IRES序列，导致所得肽和/或多肽的隔开。在一些实施例中，IRES侧接至少一个(例如2、3、4、5或更多个)表达序列的两侧。包括在环状或线性多核糖核苷酸中的合适的IRES元件可以是能够接合真核核糖体的RNA序列。在一些实施例中，IRES是脑心肌炎病毒(EMCV)IRES。在一些实施例中，IRES是柯萨奇病毒(Coxsackievirus)(CVB3)IRES。在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0166]-[0168]中描述了IRES的其他实例，该专利公开特此通过援引以其全文并入。
裂解结构域
本披露的环状或线性多核糖核苷酸可以包括裂解结构域(例如，交错元件或裂解序列)。
术语“交错元件”是指在翻译期间诱导核糖体暂停的部分，诸如核苷酸序列。在一些实施例中，交错元件是具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，然后是共有序列-D(V/I)ExNPGP，其中x＝任何氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些实施例中，交错元件可以包括化学部分，如甘油、非核酸连接部分、化学修饰、经修饰的核酸或其任何组合。
在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个交错元件。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括与每个表达序列相邻的交错元件。在一些实施例中，交错元件存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致表达产物(例如一种或多种免疫原)的隔开。在一些实施例中，交错元件是一个或多个表达序列的一部分。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括一个或多个表达序列(例如，一种或多种免疫原)，并且该一个或多个表达序列中的每一个通过环状或线性多核糖核苷酸上的交错元件与后继的表达序列(例如，一种或多种免疫原)隔开。在一些实施例中，交错元件阻止(a)单个表达序列的两轮翻译或(b)两个或更多个表达序列的一轮或多轮翻译生成单个多肽。在一些实施例中，交错元件是与该一个或多个表达序列隔开的序列。在一些实施例中，交错元件包括该一个或多个表达序列的表达序列的一部分。
在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0172]-[0175]中描述了交错元件的实例，该专利公开特此通过援引以其全文并入。
在一些实施例中，由环状或线性核糖核苷酸编码的该多种免疫原可以被每个免疫原之间的IRES隔开。所有免疫原之间的IRES可以是相同的IRES。不同免疫原之间的IRES可以不同。在其他实施例中，该多种免疫原可以被2A自裂解肽隔开。此外，由环状或线性核糖核苷酸编码的该多种免疫原可以被IRES和2A序列隔开。例如，IRES可以在一个免疫原与第二免疫原之间，而2A肽可以在第二免疫原与第三免疫原之间。特定IRES或2A自裂解肽的选择可用于在IRES或2A序列的控制下控制免疫原的表达水平。例如，根据所选择的IRES和/或2A肽，多肽上的表达可以更高或更低。
为了避免产生连续表达产物，例如免疫原，同时保持滚环翻译，可以包括交错元件以在翻译期间诱导核糖体暂停。在一些实施例中，交错元件在一个或多个表达序列中的至少一个的3'末端。交错元件可以构造为在环状或线性多核糖核苷酸的滚环翻译期间使核糖体停滞。交错元件可以包括但不限于2A样或CHYSEL(SEQ ID NO:8)(顺式作用的水解酶元件)序列。在一些实施例中，交错元件编码具有C末端共有序列为X1X2X3EX5NPGP的序列，其中X1不存在或G或H，X2不存在或D或G，X3是D或V或I或S或M，X5是任何氨基酸(SEQ ID NO:9)。在一些实施例中，该序列包括具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，然后是共有序列-D(V/I)ExNPGP，其中x＝任何氨基酸(SEQ ID NO:7)。交错元件的一些非限制性实例包括GDVESNPGP(SEQ ID NO:10)、GDIEENPGP(SEQ ID NO:11)、VEPNPGP(SEQ ID NO:12)、IETNPGP(SEQ ID NO:13)、GDIESNPGP(SEQ ID NO:14)、GDVELNPGP(SEQ ID NO:15)、GDIETNPGP(SEQID NO:16)、GDVENPGP(SEQ ID NO:17)、GDVEENPGP(SEQ ID NO:18)、GDVEQNPGP(SEQ ID NO:19)、IESNPGP(SEQ ID NO:20)、GDIELNPGP(SEQ ID NO:21)、HDIETNPGP(SEQ ID NO:22)、HDVETNPGP(SEQ ID NO:23)、HDVEMNPGP(SEQ ID NO:24)、GDMESNPGP(SEQ ID NO:25)、GDVETNPGP(SEQ ID NO:26)、GDIEQNPGP(SEQ ID NO:27)和DSEFNPGP(SEQ ID NO:28)。
在一些实施例中，本文所述的交错元件裂解表达产物，诸如在本文所述的共有序列的G和P之间。作为一个非限制性实例，环状或线性多核糖核苷酸包括至少一个交错元件以裂解表达产物。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括与至少一个表达序列相邻的交错元件。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括在每个表达序列后的交错元件。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括存在于每个表达序列的一侧或两侧的交错元件，导致由每个表达序列翻译一种或多种个体肽和/或多肽。
在一些实施例中，交错元件包括一种或多种在翻译过程中诱导核糖体暂停的经修饰的核苷酸或非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)、以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。诸如此类的实例通过改变分子主链而不同于天然存在的DNA或RNA。示例性修饰可以包括对糖、核碱基、核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)进行的可在翻译期间诱导核糖体暂停的任何修饰以及其任何组合。本文提供的一些示例性修饰在本文其他处描述。
在一些实施例中，交错元件以其他形式存在于环状或线性多核糖核苷酸中。例如，在一些示例性的环状或线性多核糖核苷酸中，交错元件包括环状或线性多核糖核苷酸中的第一表达序列的终止元件，和隔开该终止元件与第一表达序列后继表达的第一翻译起始序列的核苷酸间隔序列。在一些实例中，第一表达序列的第一交错元件在环状或线性多核糖核苷酸中的第一表达序列后继表达的第一翻译起始序列的上游(5')。在一些情况下，第一表达序列和第一表达序列后继表达序列是环状或线性多核糖核苷酸中的两个隔开的表达序列。第一交错元件和第一翻译起始序列之间的距离可以使得第一表达序列及其后继表达序列能够连续翻译。在一些实施例中，第一交错元件包括终止元件，并将第一表达序列的表达产物与其后继表达序列的表达产物隔开，从而产生离散的表达产物。在一些情况下，在环状或线性多核糖核苷酸中后继序列的第一翻译起始序列上游包括第一交错元件的环状或线性多核糖核苷酸被连续翻译，而在第二表达序列后继表达序列的第二翻译起始序列的上游包括第二表达序列的交错元件的对应环状或线性多核糖核苷酸不被连续翻译。在一些情况下，环状或线性多核糖核苷酸中仅存在一个表达序列，并且第一表达序列及其后继表达序列是相同的表达序列。在一些示例性的环状或线性多核糖核苷酸中，交错元件包括环状或线性多核糖核苷酸中第一表达序列的第一终止元件，和隔开终止元件与下游翻译起始序列的核苷酸间隔序列。在一些此类实例中，环状或线性多核糖核苷酸中第一交错元件在第一表达序列的第一翻译起始序列的上游(5')。在一些情况下，第一交错元件和第一翻译起始序列之间的距离使得能够连续翻译第一表达序列和任何后继表达序列。在一些实施例中，第一交错元件将第一表达序列的一轮表达产物与第一表达序列的下一轮表达产物分开，从而产生离散的表达产物。在一些情况下，在环状或线性多核糖核苷酸中的第一表达序列的第一翻译起始序列上游包括第一交错元件的环状或线性多核糖核苷酸被连续翻译，而在相应环状或线性多核糖核苷酸中的第二表达序列的第二翻译起始序列上游包括交错元件的相应环状或线性多核糖核苷酸不被连续翻译。在一些情况下，相应环状或线性多核糖核苷酸中第二交错元件与第二翻译起始序列之间的距离是环状或线性多聚核苷酸中第一交错元件与第一翻译起始序列之间的距离的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些情况下，第一交错元件与第一翻译起始之间的距离为至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt或更大。在一些实施例中，第二交错元件与第二翻译起始之间的距离为至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt或大于第一交错元件和第一翻译起始之间的距离。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括多于一个表达序列。
在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括至少一个裂解序列。在一些实施例中，裂解序列与表达序列相邻。在一些实施例中，裂解序列在两个表达序列之间。在一些实施例中，裂解序列包括在表达序列中。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括2至10个裂解序列。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括2至5个裂解序列。在一些实施例中，多个裂解序列在多个表达序列之间；例如，环状或线性多核糖核苷酸可以包括三个表达序列和两个裂解序列，使得在每个表达序列之间存在一个裂解序列。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括裂解序列，例如在牺牲型(immolating)circRNA或可裂解的circRNA或自裂解的circRNA中。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括两个或更多个裂解序列，导致将环状或线性多核糖核苷酸分离成多个产物，例如miRNA、线性RNA、较小的环状或线性多核糖核苷酸等。
在一些实施例中，裂解序列包括核酶RNA序列。核酶(来自核糖核酸酶，也称为RNA酶或催化性RNA)是催化化学反应的RNA分子。许多天然核酶催化其自身的磷酸二酯键之一的水解，或催化其他RNA中的键的水解，但也发现天然核酶催化核糖体的氨基转移酶活性。催化性RNA可以通过体外方法“进化”。类似于上文讨论的核糖开关活性，核酶及其反应产物可以调控基因表达。在一些实施例中，将催化性RNA或核酶置于较大的非编码RNA中，这使得核酶以许多拷贝存在于细胞内，用于大体积分子的化学转化的目的。在一些实施例中，适体和核酶都可以在相同的非编码RNA中编码。
在一些实施例中，裂解序列编码可裂解的多肽接头。例如，多核糖核苷酸可以编码两种或更多种免疫原，例如，其中该两种或更多种免疫原由单个开放阅读框(ORF)编码。例如，两种或更多种免疫原可以由单个开放阅读框编码，该开放阅读框的表达受IRES控制。在一些实施例中，ORF进一步编码多肽接头，例如使得ORF的表达产物编码两种或更多种免疫原，每种免疫原被编码多肽接头的序列(例如，5-200、5至100、5至50、5至20、50至100或50至200个氨基酸的接头)隔开。多肽接头可以包括裂解位点，例如被蛋白酶(例如，在向受试者施用多核糖核苷酸后受试者中的内源蛋白酶)识别并裂解的裂解位点。在此类实施例中，包括两种或更多种免疫原的氨基酸序列的单一表达产物在表达时裂解，从而使得该两种或更多种免疫原在表达后分离。示例性的蛋白酶裂解位点是本领域技术人员已知的，例如，充当被金属蛋白酶(例如，基质金属蛋白酶(MMP)，诸如MMP 1-28中的任一种或多种)、解聚素(disintegrin)和金属蛋白酶(ADAM，诸如ADAM 2、7-12、15、17-23、28-30和33中的任一种或多种)、丝氨酸蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活因子、蛋白裂解酶(matriptase)、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或组织蛋白酶识别的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列。在一些实施例中，该蛋白酶是MMP9和/或MMP2。在一些实施例中，该蛋白酶是蛋白裂解酶。
在一些实施例中，本文所述的环状或线性多核糖核苷酸是牺牲型环状或线性多核糖核苷酸、可裂解的环状或线性多核糖核苷酸或自裂解的环状或线性多核糖核苷酸。环状或线性多核糖核苷酸可以递送细胞组分，包括，例如，RNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA或shRNA。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括被以下隔开的miRNA：(i)可自裂解的元件；(ii)裂解募集位点；(iii)可降解接头；(iv)化学接头；和/或(v)间隔序列。在一些实施例中，circRNA包括被以下隔开的siRNA：(i)可自裂解的元件；(ii)裂解募集位点(例如ADAR)；(iii)可降解接头(例如丙三醇)；(iv)化学接头；和/或(v)间隔序列。可自裂解的元件的非限制性实例包括锤头结构、剪接元件、发夹、丁型肝炎病毒(HDV)、Varkud卫星(VS)和glmS核酶。
调控元件及表达产物比率
在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸包括一个或多个调控核酸序列或包括一个或多个编码调控核酸(例如，修饰内源基因和/或外源基因的表达的核酸)的表达序列。在一些实施例中，本文提供的环状或线性多核糖核苷酸的表达序列可以包括与调控核酸(像非编码RNA诸如但不限于tRNA、lncRNA、miRNA、rRNA、snRNA、微小RNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、Y RNA和hnRNA)反义的序列。
在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0177]-[0194]中描述了示例性调控核酸，该专利公开特此通过援引以其全文并入。
在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸的翻译效率大于参考物，例如用于环化的线性对应物、线性表达序列或线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸具有的翻译效率高于参考物的翻译效率至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、70％、800％、900％、1000％、2000％、5000％、10000％、100000％或更高。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的翻译效率高于线性对应物的翻译效率10％。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的翻译效率高于线性对应物的翻译效率300％。
在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸产生化学计量比的表达产物。滚环翻译连续地以基本上相等的比率产生表达产物。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸具有化学计量的翻译效率，使得表达产物以基本上相等的比率产生。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸具有多种表达产物(例如来自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个表达序列的产物)的化学计量翻译效率。在一些实施例中，环状或线性多核糖核苷酸产生基本上不同比率的表达产物。例如，多种表达产物的翻译效率可以具有1:10,000、1:7000、1:5000、1:1000、1:700、1:500、1:100、1:50、1:10、1:5、1:4、1:3或1:2的比率。在一些实施例中，可以使用调控元件来修改多个表达产物的比率。
翻译
在一些实施例中，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少一轮翻译之前，结合至环状多核糖核苷酸的核糖体不会与环状多核糖核苷酸脱离。在一些实施例中，如本文所述的环状多核糖核苷酸能够滚环翻译。在一些实施例中，在滚环翻译期间，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少2轮、至少3轮、至少4轮、至少5轮、至少6轮、至少7轮、至少8轮、至少9轮、至少10轮、至少11轮、至少12轮、至少13轮、至少14轮、至少15轮、至少20轮、至少30轮、至少40轮、至少50轮、至少60轮、至少70轮、至少80轮、至少90轮、至少100轮、至少150轮、至少200轮、至少250轮、至少500轮、至少1000轮、至少1500轮、至少2000轮、至少5000轮、至少10000轮、至少105轮或至少106轮翻译之前，结合至环状多核糖核苷酸的核糖体不会与环状多核糖核苷酸脱离。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致生成多肽产物，该多肽产物由环状多核糖核苷酸的多于一轮翻译得出(“连续”表达产物)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括交错元件，并且环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致生成多肽产物，该多肽产物由环状多核糖核苷酸的单轮翻译或少于单轮翻译生成(“离散”表达产物)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被构造为使得环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间生成的总多肽(摩尔/摩尔)中的至少10％、20％、30％、40％、50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％是离散多肽。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸构造成使得总多肽的至少99％是离散多肽。在一些实施例中，在体外翻译系统中测试离散产物相对于总多肽的量比。在一些实施例中，用于测试量比的体外翻译系统包括兔网织红细胞裂解物。在一些实施例中，在体内翻译系统如真核细胞或原核细胞、培养细胞或生物体中的细胞中测试量比。
非翻译区
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括非翻译区(UTR)。包括基因的基因组区域的UTR可以转录但不翻译。在一些实施例中，UTR可以被包括在本文所述的表达序列的翻译起始序列的上游。在一些实施例中，UTR可以被包括在本文所述的表达序列的下游。在一些情况下，第一表达序列的一个UTR与第二表达序列的另一个UTR相同或连续或重叠。在一些实施例中，内含子是人内含子。在一些实施例中，内含子是全长人内含子，例如ZKSCAN1。
在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0197]-[201]中描述了示例性非翻译区，该专利公开特此通过援引以其全文并入。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括聚A序列。在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0202]-[0205]中描述了示例性聚A序列，该专利公开特此通过援引以其全文并入。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括内嵌有一段或多段的腺苷和尿苷的UTR。这些AU富集签名可能会增加表达产物的转化率。
富含UTR AU的元件(ARE)的引入、去除或修饰可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性(例如，免疫或炎性反应的一种或多种标志物的水平)。工程化特定的环状多核糖核苷酸时，可以将ARE的一个或多个拷贝引入环状多核糖核苷酸中，并且ARE的这些拷贝可以调节表达产物的翻译和/或产生。同样，可以对ARE进行鉴别和去除或工程化至环状多核糖核苷酸以调节细胞内稳定性，从而影响所得蛋白质的翻译和产生。
应当理解，可以将来自任何基因的任何UTR掺入环状多核糖核苷酸的相应侧翼区中。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'-UTR，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3'-UTR，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少帽，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'-UTR、3'-UTR和IRES，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包括以下序列中的一个或多个：编码一个或多个miRNA的序列、编码一个或多个复制蛋白的序列、编码外源基因的序列、编码治疗剂的序列、调控元件(例如翻译调节子，例如翻译增强子或抑制子)、翻译起始序列、靶向内源基因(例如，siRNA、lncRNA、shRNA)的一种或多种调控核酸和编码治疗性mRNA或蛋白质的序列。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'-UTR。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3'-UTR。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少核酸外切酶的降解易感性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少降解易感性的事实可能意味着环状多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解，或在仅存在核酸外切酶时被降解的有限程度例如与不存在核酸外切酶时相当或相似。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解。在一些实施例中，当暴露于核酸外切酶时，环状多核糖核苷酸降解减少。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少与帽结合蛋白的结合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’帽。
终止序列
环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个表达序列(例如，编码免疫原)，并且每个表达序列可以具有或可以不具有终止元件。在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0169]-[0170]中描述了终止元件的其他实例，该国际专利公开特此通过援引以其全文并入。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括聚A序列。在一些实施例中，聚A序列的长度大于10个核苷酸。在一个实施例中，聚A序列的长度大于15个核苷酸(例如，至少或大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500和3,000个核苷酸)。在一些实施例中，根据国际专利公开号WO 2019/118919 A1的[0202]-[0204]中聚A序列的描述设计聚A序列，该专利公开通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括聚A、缺少聚A或具有经修饰的聚A以调节环状多核糖核苷酸的一种或多种特征。在一些实施例中，缺少聚A或具有经修饰的聚A的环状多核糖核苷酸改善了一种或多种功能特征，例如免疫原性(例如，免疫或炎性反应的一种或多种标志物的水平)、半衰期、表达效率等。
调控核酸
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一种或多种编码调控核酸(例如，修饰内源基因和/或外源基因的表达的核酸)的表达序列。在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸的表达序列可以包括与调控核酸(像非编码RNA诸如但不限于tRNA、lncRNA、miRNA、rRNA、snRNA、微小RNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、Y RNA和hnRNA)反义的序列。
在一个实施例中，调控核酸靶向基因，诸如宿主基因。调控核酸可以包括国际专利公开号WO 2019/118919 A1的[0177]和[0181]-[0189]中描述的任何调控核酸，该专利公开通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，表达序列包括本文所述的一种或多种特征，例如，编码一种或多种肽或蛋白质的序列、一种或多种调控元件、一种或多种调控核酸(例如一种或多种非编码序列RNA)、其他表达序列及其任何组合。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个RNA结合位点。微小RNA(或miRNA)是短非编码RNA，可与核酸分子的3'UTR结合并通过降低核酸分子的稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个微小RNA靶序列、微小RNA序列或微小RNA种子。此类序列可以对应于任何已知的微小RNA，如在美国公开US 2005/0261218和美国公开US 2005/0059005中传授的那些，其内容通过援引以其全文并入本文。微小RNA序列包括“种子”区，即成熟微小RNA的第2-8位区域中的序列，该序列与miRNA靶序列具有完美的沃森-克里克互补性。微小RNA种子可以包括成熟微小RNA的第2-8位或第2-7位。在一些实施例中，微小RNA种子可以包括7个核苷酸(例如成熟微小RNA的第2-8个核苷酸)，其中相应miRNA靶标中的种子互补位点侧接与微小RNA第1位相对的腺嘌呤(A)。在一些实施例中，微小RNA种子可以包括6个核苷酸(例如成熟微小RNA的第2-7个核苷酸)，其中相应miRNA靶标中的种子互补位点侧接与微小RNA第1位相对的腺嘌呤(A)。参见例如，Grimson等人；Mol Cell[分子细胞].2007 6；27:91-105；通过援引以其全文并入本文。
蛋白质结合
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白质结合位点，使得蛋白质例如核糖体能够结合至RNA序列中的内部位点。通过将蛋白质结合位点(例如核糖体结合位点)工程化至环状多核糖核苷酸中，环状多核糖核苷酸可以逃避或更少地被宿主的免疫系统检测到，通过掩蔽宿主免疫系统成分中的环状多核糖核苷酸来调节降解或调节翻译。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个免疫蛋白结合位点，例如用于逃避免疫反应，例如CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并有助于将环状多核糖核苷酸掩蔽为外源的核苷酸序列。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并有助于将环状多核糖核苷酸隐藏为外源或外来的核苷酸序列。
核糖体与线性RNA接合的传统机制包括核糖体与RNA的加帽5'端的结合。从5’端，核糖体迁移到起始密码子，于是形成第一肽键。根据本披露，环状多核糖核苷酸的翻译的内部起始(即，不依赖帽)不需要游离末端或加帽端。准确的说，核糖体结合至未加帽的内部位点，由此核糖体在起始密码子处开始多肽延长。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个RNA序列，该RNA序列包括核糖体结合位点，例如起始密码子。
天然5'UTR具有在翻译起始中起作用的特征。它们带有类似科扎克序列的签名，这些序列众所周知参与核糖体起始多种基因的翻译的过程。科扎克序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG(SEQ ID NO:29)，其中R是起始密码子(AUG)的三个碱基上游的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，后接另一个“G”。还已知5'UTR形成参与延长因子结合的二级结构。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码与蛋白质结合的蛋白质结合序列。在一些实施例中，蛋白质结合序列靶向环状多核糖核苷酸或将其定位至特定靶标。在一些实施例中，蛋白结合序列特异性结合蛋白的精氨酸富集区。
在一些实施例中，蛋白质结合位点包括但不限于与蛋白质的结合位点，如ACIN1、AGO、APOBEC3F、APOBEC3G、ATXN2、AUH、BCCIP、CAPRIN1、CELF2、CPSF1、CPSF2、CPSF6、CPSF7、CSTF2、CSTF2T、CTCF、DDX21、DDX3、DDX3X、DDX42、DGCR8、EIF3A、EIF4A3、EIF4G2、ELAVL1、ELAVL3、FAM120A、FBL、FIP1L1、FKBP4、FMR1、FUS、FXR1、FXR2、GNL3、GTF2F1、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPC、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPM、HNRNPU、HNRNPUL1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ILF3、KHDRBS1、LARP7、LIN28A、LIN28B、m6A、MBNL2、METTL3、MOV10、MSI1、MSI2、NONO、NONO-、NOP58、NPM1、NUDT21、PCBP2、POLR2A、PRPF8、PTBP1、RBFOX2、RBM10、RBM22、RBM27、RBM47、RNPS1、SAFB2、SBDS、SF3A3、SF3B4、SIRT7、SLBP、SLTM、SMNDC1、SND1、SRRM4、SRSF1、SRSF3、SRSF7、SRSF9、TAF15、TARDBP、TIA1、TNRC6A、TOP3B、TRA2A、TRA2B、U2AF1、U2AF2、UNK、UPF1、WDR33、XRN2、YBX1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YWHAG、ZC3H7B、PDK1、AKT1和任何其他结合RNA的蛋白质。
加密原
如本文所述，环状多核糖核苷酸包括加密原以减少、逃避或避免细胞先天性免疫反应。在一方面，本文提供了环状多核糖核苷酸，当该环状多核糖核苷酸被递送至细胞时，与由参考化合物(例如对应于所述环状多核糖核苷酸的线性多核苷酸或缺少加密原的环状多核糖核苷酸)引发的反应相比，使得宿主的免疫反应减少。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的免疫原性小于(例如，免疫或炎性反应的一种或多种标志物的水平低于)缺少加密原的对应物的免疫原性。
在一些实施例中，加密原增强了稳定性。关于UTR在核酸分子的稳定性和翻译方面发挥调控作用的证据越来越多。UTR的调控特征可以包含在加密原中，以增强环状多核糖核苷酸的稳定性。
在一些实施例中，5'-或3'-UTR可以构成环状多核糖核苷酸中的加密原。例如，富含UTR AU的元件(ARE)的去除或修饰可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性(例如，调节免疫或炎性反应的一种或多种标志物的水平)。
在一些实施例中，表达序列，例如可翻译区中AU富集元件(ARE)的去除或修饰可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性(例如，调节免疫或炎性反应的一种或多种标志物的水平)。
在一些实施例中，加密原包括miRNA结合位点或与任何其他非编码RNA的结合位点。例如，将miR-142位点掺入本文所述的环状多核糖核苷酸中不仅可调节造血细胞中的表达，还可减少或消除对环状多核糖核苷酸编码的蛋白质的免疫反应。
在一些实施例中，加密原包括一个或多个蛋白质结合位点，使得蛋白质(例如免疫蛋白质)能够结合至RNA序列。通过将蛋白质结合位点工程化至环状多核糖核苷酸中，环状多核糖核苷酸可以逃避或更少地被宿主的免疫系统检测到，通过掩蔽宿主免疫系统成分中的环状多核糖核苷酸来调节降解或调节翻译。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个免疫蛋白结合位点，例如用于逃避免疫反应，例如CTL反应。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并有助于将环状多核糖核苷酸掩蔽为外源的核苷酸序列。
在一些实施例中，加密原包括一种或多种经修饰的核苷酸。示例性修饰可以包括对糖、核碱基、核苷间键(例如至连接的磷酸酯/至磷酸二酯键/至磷酸二酯主链)进行的可防止或减少针对环状多核糖核苷酸的免疫反应的任何修饰以及其任何组合。本文提供了一些示例性修饰。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一种或多种如本文其他处所述的修饰，以与由参考化合物(例如缺少修饰的环状多核糖核苷酸)引发的反应相比，减少宿主的免疫反应。特别地，已显示添加一个或多个肌苷区分RNA是内源性还是病毒性。参见例如Yu,Z等人,(2015)RNAediting by ADAR1 marks dsRNA as“self”[通过ADAR1进行的RNA编辑将dsRNA标记为“自身”].Cell Res[细胞研究].25,1283-1284，其通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个shRNA的表达序列或可被加工成siRNA的RNA序列，并且shRNA或siRNA靶向RIG-I并降低RIG-I的表达。RIG-I可以感知外源环状RNA并引起外源环状RNA的降解。因此，具有靶向RIG-1的shRNA、siRNA或任何其他调控核酸的序列的环状多核苷酸可降低针对环状多核糖核苷酸的免疫力，例如宿主细胞免疫力。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少有助于环状多核糖核苷酸减少、逃避或避免细胞先天性免疫反应的序列、元件或结构。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可能缺少聚A序列、5’末端、3’末端、磷酸基、羟基或其任何组合。
核苷酸间隔序列
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括间隔序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个间隔序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括1、2、3、4、5、6、7或更多个间隔序列。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括间隔序列。在一些实施例中，多核糖核苷酸的元件可以通过间隔序列或接头彼此隔开。在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0293]-[0302]中描述了示例性间隔序列，该专利公开特此通过援引以其全文并入。
非核酸接头
本文所述的环状多核糖核苷酸可以包括非核酸接头。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在本文所述的一个或多个序列或元件之间具有非核酸接头。在一个实施例中，本文所述的一个或多个序列或元件与接头连接。非核酸接头可以是化学键，例如一个或多个共价键或非共价键。在一些实施例中，非核酸接头是肽接头或蛋白接头。此类接头可以在2-30个氨基酸之间，或更长。本文所述的环状多核糖核苷酸还可以包括非核酸接头。在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0303]-[0307]中描述了示例性的非核酸接头，该专利公开特此通过援引以其全文并入。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包括另一种核酸序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括其他序列，其包括DNA、RNA或人工核酸。其他序列可以包括但不限于基因组DNA，cDNA或编码tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA或其他RNAi分子的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括siRNA，以靶向与环状多核糖核苷酸相同的基因表达产物的不同基因座。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括siRNA，以靶向与环状多核糖核苷酸中存在的基因表达产物不同的基因表达产物。
稳定性和半衰期
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括特定的序列特征。例如，环状多核糖核苷酸可以包括特定的核苷酸组成。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个嘌呤(腺嘌呤和/或鸟苷)富集区。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个嘌呤富集区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个AU富集区或元件(ARE)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个腺嘌呤富集区。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括本文其他处所述的一个或多个重复元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个本文其他处所述的修饰。
环状多核糖核苷酸相对于参考序列可以包括一个或多个取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰。例如，相对于亲本多核糖核苷酸具有一个或多个插入、添加、缺失和/或共价修饰的环状多核糖核苷酸包括在本披露的范围内。在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0310]-[0325]中描述了示例性修饰，该专利公开特此通过援引以其全文并入。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括高阶结构，例如二级或三级结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的互补区段将其自身折叠成双链区段，与氢键结合配对(例如，A-U和C-G)。在一些实施例中，螺旋，也称为茎，在分子内形成，具有连接至端环的双链区段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准双链二级结构的区段。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列包括基本上单链的与双链的区域。在一些实施例中，单链与双链的比率可以影响环状多核糖核苷酸的功能。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列基本上是单链的。在一些实施例中，基本上单链的环状多核糖核苷酸的一个或多个序列可以包括蛋白质或RNA结合位点。在一些实施例中，基本上单链的环状多核糖核苷酸序列可以是构象柔性的以允许增加相互作用。在一些实施例中，有目的地将环状多核糖核苷酸的序列工程化以包括此类二级结构，从而结合或增加蛋白质或核酸结合。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸基本上是双链的。在一些实施例中，基本上双链的环状多核糖核苷酸的一个或多个序列可以包括构象识别位点，例如核糖开关或适体酶。在一些实施例中，基本上双链的环状多核糖核苷酸序列可以是构象刚性的。在一些此类实例中，构象刚性序列可能在空间上阻碍环状多核糖核苷酸结合蛋白质或核酸。在一些实施例中，有目的地将环状多核糖核苷酸的序列工程化以包括此类二级结构，从而避免或减少蛋白质或核酸结合。
有16种可能的碱基对，但是其中的六种(AU、GU、GC、UA、UG、CG)可能形成实际的碱基对。其余的称为不匹配，以极低的频率出现在螺旋中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的结构不容易被破坏，不影响其功能且无致命后果，这提供了保持二级结构的选择。在一些实施例中，茎的一级结构(即其核苷酸序列)仍可变化，同时仍保持螺旋区。碱基的性质是高阶结构的第二位，且只要它们保留二级结构，就可以进行取代。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有准螺旋结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准螺旋结构的区段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括富U或富A序列或其组合中的至少一个。在一些实施例中，富U和/或富A序列以将产生三联准螺旋结构的方式排列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有双准螺旋结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有一个或多个具有双准螺旋结构的区段(例如2、3、4、5、6或更多个)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括富C和/或富G的序列中的至少一个。在一些实施例中，富C和/或富G序列以将产生三联准螺旋结构的方式排列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有有助于稳定的分子内三联准螺旋结构。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有两个准螺旋结构(例如，通过磷酸二酯键隔开)，使得它们末端的碱基对堆叠，并且准螺旋结构变为共线性，导致“同轴堆叠”的子结构。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括具有一个或多个基序的三级结构，例如假结、g-四链体、螺旋和同轴堆叠。
在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0326]-[0333]中描述了如本文所披露的环状多核糖核苷酸的结构的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。
作为其环化的结果，环状多核糖核苷酸可能包括某些使其区别于线性RNA的特征。例如，与线性RNA相比，环状多核糖核苷酸不易被核酸外切酶降解。这样，环状多核糖核苷酸可以比线性RNA更稳定，尤其是在核酸外切酶存在下孵育时。与线性RNA相比，环状多核糖核苷酸的稳定性提高，可使环状多核糖核苷酸作为生产多肽(例如，免疫原)的细胞转化试剂更加有用。与线性RNA相比，环状多核糖核苷酸的稳定性提高，可使环状多核糖核苷酸与线性RNA相比，更易储存更长时间。可以使用本领域标准的方法测试用核酸外切酶处理的环状多核糖核苷酸的稳定性，该方法确定是否已经发生RNA降解(例如，通过凝胶电泳)。
此外，与线性RNA不同，当环状多核糖核苷酸与磷酸酶诸如小牛肠磷酸酶一起孵育时，环状多核糖核苷酸可能不太容易去磷酸化。
在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸制剂具有比参考物，例如具有相同核苷酸序列但未环化的线性多核糖核苷酸(例如，线性对应物)增加的半衰期。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸对例如核酸外切酶的降解有抗性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸抗自降解。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少酶促裂解位点，例如dicer裂解位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的半衰期长于参考物(例如线性对应物)至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约180％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％、至少约1000％或至少约10000％。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞分裂期间持续存在于细胞中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在有丝分裂后持续存在于子细胞中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞内复制并传递给子细胞。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括介导环状多核糖核苷酸的自复制的复制元件。在一些实施例中，复制元件介导环状多核糖核苷酸转录成与环状多核糖核苷酸互补的线性多核糖核苷酸(线性互补)。在一些实施例中，线性互补的多核糖核苷酸可以在细胞中体内环化为互补的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，互补的多核糖核苷酸可以进一步自复制成另一个环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸具有与起始环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列。一种示例性自复制元件包括HDV复制结构域(如Beeharry等人,Virol[病毒学],2014,450-451:165-173所述)。在一些实施例中，细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将至少一种环状多核糖核苷酸传递至子细胞。在一些实施例中，正经历减数分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将环状多核糖核苷酸传递至子细胞。在一些实施例中，正经历有丝分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将环状多核糖核苷酸传递至子细胞。
在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0308]-[0309]中描述了如本文所披露的环状多核糖核苷酸的稳定性和半衰期的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。
修饰
相对于参考序列(尤其是亲本多核糖核苷酸)，环状多核糖核苷酸可以包括本披露范围内包括的一个或多个取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个转录后修饰(例如，加帽、裂解、聚腺苷酸化、剪接、聚A序列、甲基化、酰化、磷酸化、赖氨酸和精氨酸残基的甲基化、乙酰化、以及硫醇基团和酪氨酸残基的亚硝基化等)。该一个或多个转录后修饰可以是任何转录后修饰，诸如已经在RNA中鉴定出的多于一百种不同的核苷修饰中的任一种(Rozenski,J,Crain,P和McCloskey,J.(1999).The RNA Modification Database:1999update[RNA修饰数据库:1999年更新].Nucl Acids Res[核酸研究]27:196-197)。在一些实施例中，第一分离核酸包括信使RNA(mRNA)。在一些实施例中，该mRNA包括至少一个选自下组的核苷：诸如国际专利公开号WO 2019/118919 A1的[0311]中描述的那些，该专利公开通过援引以其全文并入本文。
环状多核糖核苷酸可以包括任何有用的修饰，如针对糖、核碱基或核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)。嘧啶核碱基的一个或多个原子可以被任选取代的氨基、任选取代的硫醇、任选取代的烷基(例如甲基或乙基)或卤代(例如氯代或氟代)替代或取代。在某些实施例中，在每个糖和核苷间键中存在修饰(例如，一个或多个修饰)。修饰可以是对脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其杂交体的核糖核酸(RNA)修饰。本文描述了其他修饰。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一种N(6)甲基腺苷(m6A)修饰以增加翻译效率。在一些实施例中，N(6)甲基腺苷(m6A)修饰可降低环状多核糖核苷酸的免疫原性(例如，降低免疫或炎性反应的一种或多种标志物的水平)。
在一些实施例中，修饰可以包括化学或细胞诱导的修饰。例如，细胞内RNA修饰的一些非限制性实例如Lewis和Pan,“RNA modifications and structures cooperate toguide RNA-protein interactions[核糖核酸的修饰和结构共同引导核糖核酸和蛋白的相互作用]”,Nat Reviews Mol Cell Biol[自然评论：分子细胞生物学],2017,18:202-210所述。
在一些实施例中，对环状多核糖核苷酸的核糖核苷酸的化学修饰可以增强免疫逃避。环状多核糖核苷酸可以通过本领域众所周知的方法合成和/或修饰，如在Currentprotocols in nucleic acid chemistry[核酸化学现行方案],Beaucage,S.L等人(编辑),美国纽约州纽约约翰威利公司(John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY,USA)(通过援引以其全文特此并入本文)中描述的那些方法。修饰包括例如端部修饰，如5'端修饰(磷酸化(单、二和三磷酸化)、缀合、反向连接等)、3'端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)、碱基修饰(例如，用稳定的碱基、不稳定的碱基或与扩展的亲本库碱基配对的碱基替代)、碱基去除(脱碱基核苷酸)或碱基缀合。经修饰的核糖核苷酸碱基还可包括5-甲基胞苷和假尿苷。在一些实施例中，举几个功能作用，碱基修饰可以调节环状多核糖核苷酸的表达、免疫反应、稳定性、亚细胞定位。在一些实施例中，修饰包括双正交核苷酸，例如非天然碱基。参见例如，Kimoto等人,Chem Commun(Camb)[化学通讯(剑桥)],2017,53:12309,DOI:10.1039/c7cc06661a，将该文献通过援引以其全文特此并入。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个核糖核苷酸的糖修饰(例如在2'位置或4'位置)或糖替代以及主链修饰可以包括磷酸二酯键的修饰或替代。环状多核糖核苷酸的特定实例包括但不限于包括经修饰的主链或非天然核苷间键(如核苷间修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替代)的环状多核糖核苷酸。具有经修饰的主链的环状多核糖核苷酸尤其包括在主链中不具有磷原子的那些。出于本申请的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的RNA也可以被认为是寡核苷。在特定的实施例中，环状多核糖核苷酸将包括在其核苷间主链中具有磷原子的核糖核苷酸。
经修饰的环状多核糖核苷酸主链可以包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(如3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(如3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、和具有正常3'-5'键的硼烷磷酸酯，这些的2'-5'连接的类似物，以及具有相反极性的那些，其中相邻的核苷单元对3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接。也包括各种盐、混合盐和游离酸形式。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以带负电荷或带正电荷。
可掺入环状多核糖核苷酸中的经修饰的核苷酸可在核苷间键(例如磷酸酯主链)上被修饰。在此，在多核苷酸主链的上下文中，短语“磷酸酯”和“磷酸二酯”可互换使用。可以通过用不同的取代基替代一个或多个氧原子来修饰主链磷酸酯基团。此外，经修饰的核苷和核苷酸可以包括用如本文所述的另一个核苷间键合进行的对未修饰的磷酸酯部分的整体替代。经修饰的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、亚磷酸硒酸酯、硼酸磷酸酯、硼酸磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都被硫替代。也可通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)替代连接氧来修饰磷酸酯接头。
提供a-硫代取代的磷酸酯部分以通过非天然硫代磷酸酯主链键赋予RNA和DNA聚合物稳定性。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增强的核酸酶抗性，并因此在细胞环境中具有更长的半衰期。与环状多核糖核苷酸连接的硫代磷酸酯有望通过减弱细胞先天性免疫分子的结合/激活来降低先天性免疫反应。
在特定的实施例中，经修饰的核苷包括α-硫代-核苷(例如5'-O-(1-硫代磷酸)-腺苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-胞苷(α-硫代胞苷)、5'-O-(1-硫代磷酸)-鸟苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-尿苷或5'-O-(1-硫代磷酸)-假尿苷)。
本文描述了可根据本披露使用的其他核苷间键，包括不包含磷原子的核苷间键。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一种或多种细胞毒性核苷。例如，细胞毒性核苷可以被掺入环状多核糖核苷酸中，如双功能修饰。细胞毒性核苷可以包括但不限于阿糖腺苷、5-氮杂胞苷、4'-硫代阿糖胞苷、环戊烯基胞嘧啶、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷、1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)-胞嘧啶、地西他滨、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、吉西他滨、替加氟和尿嘧啶的组合、替加氟((RS)-5-氟-1-(四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)、曲沙他滨、替扎西他滨、2'-脱氧-2'-亚甲基胞苷(DMDC)和6-巯基嘌呤。其他实例包括氟达拉滨磷酸酯、N4-山嵛酰基-1-β-D-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、N4-十八烷基-1-β-D-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、N4-棕榈酰基-1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)胞嘧啶和P-4055(阿糖胞苷5'-花生酸酯)。
环状多核糖核苷酸可以沿着分子的整个长度均一地修饰或可以不如此。例如，一种或多种或所有类型的核苷酸(例如，天然存在的核苷酸、嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C、I、pU中的任一种或多种或全部)在环状多核糖核苷酸中，或在其给定的预定序列区域中可以被均一地修饰或可以不如此。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括假尿苷。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括肌苷，相对于病毒RNA，肌苷可以帮助免疫系统将环状多核糖核苷酸表征为内源性。肌苷的掺入还可以介导改善RNA稳定性/减少降解。参见例如Yu,Z等人,(2015)RNA editing by ADAR1marks dsRNAas“self”[通过ADAR1进行的RNA编辑将dsRNA标记为“自身”].Cell Res[细胞研究].25,1283-1284，其通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸(或其给定序列区域)中的所有核苷酸均被修饰。在一些实施例中，修饰可以包括可增强表达的m6A；可减弱免疫反应的肌苷；可增加RNA稳定性或翻译通读(交错元件)的假尿苷；可增加稳定性的m5C；以及有助于亚细胞易位(例如，核定位)的2,2,7-三甲基鸟苷。
在环状多核糖核苷酸的各个位置上可以存在不同的糖修饰、核苷酸修饰和/或核苷间键合(例如主链结构)。本领域普通技术人员将理解，核苷酸类似物或其他一个或多个修饰可以位于环状多核糖核苷酸的任何一个或多个位置，使得环状多核糖核苷酸的功能基本上不降低。修饰也可以是非编码区域修饰。环状多核糖核苷酸可以包含约1％至约100％的经修饰核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任一种或多种)或任何中间百分比(例如，1％至20％>、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％到80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。
结构
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括高阶结构，例如二级或三级结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的互补区段将其自身折叠成双链区段，与氢键结合配对(例如，A-U和C-G)。在一些实施例中，螺旋，也称为茎，在分子内形成，具有连接至端环的双链区段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准双链二级结构的区段。在一些实施例中，具有准双链二级结构的区段具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个配对的核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有一个或多个具有准双链二级结构的区段(例如2、3、4、5、6或更多个)。在一些实施例中，区段被3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸隔开。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列包括基本上单链的与双链的区域。在一些实施例中，单链与双链的比率可以影响环状多核糖核苷酸的功能。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列基本上是单链的。在一些实施例中，基本上单链的环状多核糖核苷酸的一个或多个序列可以包括蛋白质或RNA结合位点。在一些实施例中，基本上单链的环状多核糖核苷酸序列可以是构象柔性的以允许增加相互作用。在一些实施例中，有目的地将环状多核糖核苷酸的序列工程化以包括此类二级结构，从而结合或增加蛋白质或核酸结合。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个结合位点，例如，至少一个蛋白质结合位点、至少一个miRNA结合位点、至少一个lncRNA结合位点、至少一个tRNA结合位点、至少一个rRNA结合位点、至少一个snRNA结合位点、至少一个siRNA结合位点、至少一个piRNA结合位点、至少一个snoRNA结合位点、至少一个snRNA结合位点、至少一个exRNA结合位点、至少一个scaRNA结合位点、至少一个Y RNA结合位点、至少一个hnRNA结合位点和/或至少一个tRNA基序。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸构造为包括高阶结构，诸如国际专利公开号WO 2019/118919 A1中描述的那些，该专利公开通过援引以其全文并入本文。
生产方法
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括非天然存在的脱氧核糖核酸序列，并且可以使用重组技术(例如，使用DNA质粒体外衍生)或化学合成或其组合产生。
在本披露的范围内，用于产生RNA环的DNA分子可以包括天然存在的原始核酸序列的DNA序列、其修饰形式或编码通常未在自然中发现的合成多肽的DNA序列(例如，嵌合分子或融合蛋白，诸如包括多种免疫原的融合蛋白)。DNA和RNA分子可以使用多种技术修饰，包括但不限于经典诱变技术和重组技术，如定点诱变、化学处理核酸分子以诱导突变、限制性酶裂解核酸片段、连接核酸片段、聚合酶链式反应(PCR)扩增和/或诱变核酸序列的选定区域、合成寡核苷酸混合物以及连接混合物基团以“建造”核酸分子混合物、及其组合。
环状多核糖核苷酸可以根据任何可用的技术制备，这些技术包括但不限于化学合成和酶促合成。在一些实施例中，线性初级构建体或线性mRNA可被环化或连环化以产生本文所述的环状多核糖核苷酸。环化或连环化的机制可以通过诸如但不限于化学、酶促、夹板连接或核酶催化的方法来发生。新形成的5'-/3'-键可以是分子内键或分子间键。
制备本文所述的环状多核糖核苷酸的方法描述于以下中，例如，Khudyakov&Fields,Artificial DNA:Methods and Applications[人工DNA：方法与应用],CRC Press[CRC出版社](2002)；Zhao,Synthetic Biology:Tools and Applications[合成生物学：工具与应用](第一版),Academic Press[学术出版社](2013)；以及Egli和Herdewijn,Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids[人工核酸的化学与生物学],(第一版),Wiley-VCH[威利-VCH出版社](2012)。
多种合成环状多核糖核苷酸的方法也在本领域中进行了描述(参见例如，美国专利号US 6210931、美国专利号US 5773244、美国专利号US 5766903、美国专利号US5712128、美国专利号US 5426180、美国公开号US 20100137407、国际公开号WO 1992001813和国际公开号WO 2010/084371；其各自的内容通过援引以其全文并入本文)。
环化
在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可以被环化或连环化。在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可以在配制和/或递送之前在体外环化。在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可以在细胞内环化。
细胞外环化
在一些实施例中，使用化学方法环化或连环化用于环化的线性多核糖核苷酸以形成环状多核糖核苷酸。在一些化学方法中，核酸(例如，用于环化的线性多核糖核苷酸)的5'-末端和3'-末端包括化学反应性基团，当基团彼此靠近时，可在分子的3'-末端和5'-末端之间形成新的共价键。5'-端可以含有NHS酯反应性基团，且3'-端可以含有3'-氨基末端的核苷酸，使得在有机溶剂中，线性RNA分子3'-端上的3'-氨基末端的核苷酸将在5'-NHS-酯部分上经历亲核攻击，形成新的5'-/3'-酰胺键。
在一些实施例中，使用DNA或RNA连接酶将5'-磷酸化的核酸分子(例如，用于环化的线性多核糖核苷酸)酶促连接至核酸(例如，线性核酸)的3'-羟基，形成新的磷酸二酯键。在示例性反应中，根据制造商的方案，将用于环化的线性多核糖核苷酸与1-10单位的T4RNA连接酶(新英格兰生物学实验室公司(New England Biolabs)，马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich,MA))在37℃下孵育1小时。连接反应可以在存在线性核酸时发生，该线性核酸能够与并列的5'-和3'-区域碱基配对，以辅助酶促连接反应。在一些实施例中，连接是夹板连接。例如，夹板连接酶，如
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连接酶，可用于夹板连接。对于夹板连接，单链多核苷酸(夹板)，如单链RNA，可以被设计成与线性多核糖核苷酸的两个末端杂交，使得在与单链夹板杂交时可以将两个末端并列。因此，夹板连接酶可以催化线性多核糖核苷酸并列的两个末端的连接，生成环状多核糖核苷酸。
在一些实施例中，DNA或RNA连接酶用于环状多核苷酸的合成。在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸的5'-末端或3'-末端可编码连接酶核酶序列，使得在体外转录期间，所得用于环化的线性多核糖核苷酸包括活性核酶序列，该活性核酶序列能够连接用于环化的线性多核糖核苷酸的5'-末端至用于环化的线性多核糖核苷酸的3'-末端。连接酶核酶可以衍生自I类内含子、丁型肝炎病毒、发夹核酶，或者可以通过SELEX(通过指数富集进行的配体系统进化)进行选择。核酶连接酶反应在0℃与37℃之间的温度下可能需要1小时至24小时。
在一些实施例中，可通过使用至少一个非核酸部分将用于环化的线性多核糖核苷酸环化或连环化。在一方面，该至少一个非核酸部分可与用于环化的线性多核糖核苷酸的5'端附近和/或3'端附近的区域或特征反应，以环化或连环化用于环化的线性多核糖核苷酸。在另一方面，该至少一个非核酸部分可以位于或连接至或邻近用于环化的线性多核糖核苷酸的5'端和/或3'端。设想的非核酸部分可以是同源或异源的。作为一个非限制性实例，非核酸部分可以是键，如疏水键、离子键、可生物降解的键和/或可裂解的键。作为另一个非限制性实例，非核酸部分是连接部分。作为又一个非限制性实例，非核酸部分可以是寡核苷酸或肽部分，诸如，如本文所述的适体或非核酸接头。
在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸由于非核酸部分而被环化或连环化，造成位于、邻近或连接至用于环化的线性多核糖核苷酸的5’末端和3'末端的原子、分子表面之间的吸引。作为一个非限制性实例，可通过分子间作用力或分子内作用力将一个或多个用于环化的线性多核糖核苷酸环化或连环化。分子间作用力的非限制性实例包括偶极-偶极力、偶极诱导偶极力、诱导偶极-诱导偶极力、范德华力和伦敦色散力。分子内作用力的非限制性实例包括共价键、金属键、离子键、共振键、抓氢键(agnostic bond)、偶极键、缀合、超缀合和反向键。
在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可在5'端附近和3'端附近包含核酶RNA序列。当序列暴露于核酶的其余部分时，核酶RNA序列可以共价地连接至肽。在一方面，共价连接至5'端和3'端附近的核酶RNA序列的肽可以彼此缔合，引起用于环化的线性多核糖核苷酸环化或连环化。在另一方面，肽共价地连接至核酶RNA序列5'末端和3'末端附近可以引起线性初级构建体或线性mRNA在使用本领域已知的方法(诸如但不限于蛋白连接)进行连接后环化或连环化。用于本披露的线性初级构建体或线性RNA中的核酶的非限制性实例，或掺入和/或共价连接肽的方法的非穷举列表在美国专利申请号US 20030082768中描述，该专利内容通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可以包括核酸的5'三磷酸，例如通过使5'三磷酸与RNA 5'焦磷酸水解酶(RppH)或ATP二磷酸水解酶(脱磷酸酶)接触使其转化为5'单磷酸。替代性地，将用于环化的线性多核糖核苷酸的5'三磷酸转化为5'单磷酸可通过两步反应完成，该两步反应包括：(a)使用于环化的线性多核糖核苷酸的5'核苷酸与磷酸酶(例如，热敏磷酸酶、虾碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶)接触以除去所有三个磷酸；以及(b)在步骤(a)之后，使5'核苷酸与添加单个磷酸酯的激酶(例如，多核苷酸激酶)接触。
在一些实施例中，本文提供的环化方法的环化效率为至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％。在一些实施例中，本文提供的环化方法的环化效率为至少约40％。在一些实施例中，所提供的环化方法的环化效率介于约10％至约100％之间；例如，环化效率可为约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和约99％。在一些实施例中，环化效率介于约20％至约80％之间。在一些实施例中，环化效率介于约30％至约60％之间。在一些实施例中，环化效率为约40％。
剪接元件
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个剪接元件。在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0270]-[0275]中描述了示例性剪接元件，该专利公开特此通过援引以其全文并入。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个剪接元件。在本文提供的环状多核糖核苷酸中，剪接元件可以是可以介导环状多核糖核苷酸的剪接的完整剪接元件。替代性地，剪接元件也可以是来自完成的剪接事件的剩余剪接元件。例如，在一些情况下，线性多核糖核苷酸的剪接元件可介导导致线性多核糖核苷酸环化的剪接事件，从而所得的环状多核糖核苷酸包含来自此类剪接介导的环化事件的剩余剪接元件。在一些情况下，剩余剪接元件无法介导任何剪接。在其他情况下，剩余剪接元件在某些情况下仍可以介导剪接。在一些实施例中，剪接元件与至少一个表达序列相邻。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与每个表达序列相邻的剪接元件。在一些实施例中，剪接元件在每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括内部剪接元件，该剪接元件在被复制时，剪接端部被连接在一起。一些实例可以包括具有剪接位点序列和短反向重复序列(30-40nt)的微型内含子(<100nt)，如AluSq2、AluJr和AluSz、侧接内含子中的反向序列、侧接内含子中的Alu元件以及在接近反向剪接事件的(suptable4富集基序)顺式序列元件中发现的基序，如带有侧接外显子的反向剪接位点(backsplice site)之前(上游)或之后(下游)200bp中的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个本文其他处所述的重复核苷酸序列作为内部剪接元件。在此类实施例中，重复核苷酸序列可以包括来自Alu家族内含子的重复序列。在一些实施例中，剪接相关的核糖体结合蛋白可以调控环状多核糖核苷酸的生物发生(例如，盲肌蛋白和震动蛋白(QKI)剪接因子)。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括侧接环状多核糖核苷酸的头尾接合点处的典范剪接位点。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括隆起-螺旋-隆起基序，包含两个3-核苷酸隆起侧接的4-碱基对茎。裂解发生在隆起区域的一个位点处，生成末端为5'-羟基和2',3'-环状磷酸酯的特征片段。通过将5'-OH基团亲核攻击到形成3',5'-磷酸二酯桥的同一分子的2',3'-环状磷酸酯上来进行环化。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括具有HPR元件的多聚重复RNA序列。HPR包括2′,3′-环状磷酸酯和5′-OH末端。HPR元件自加工用于环化的线性多核糖核苷酸的5'-末端和3'-末端，从而将这些末端连接在一起。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括自剪接元件。例如，环状多核糖核苷酸可以包括来自蓝细菌鱼腥藻(Anabaena)的内含子。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括介导自连接的序列。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括HDV序列(例如，HDV复制结构域保守序列，GGCUCAUCUCGACAAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCAAGUUCGAGCAUGAGCC(SEQ ID NO:5)或GGCUAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCGAGCC(SEQ ID NO:6)，以进行自连接。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括环E序列(例如在PSTVd中)以进行自连接。在另一个实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括自环化内含子，例如5'和3'剪接接合，或自环化催化内含子，如I类、II类或III类内含子。I类内含子自剪接序列的非限制性实例可以包括源自T4噬菌体基因td的自剪接置换内含子-外显子序列和四膜虫的插入序列(IVS)rRNA。
其他环化方法
在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可以包括互补序列，包括个体内含子内或侧接内含子内的重复或非重复核酸序列。重复核酸序列是在环状多核糖核苷酸的区段内出现的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚CA序列或聚UG序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的至少一个重复核酸序列，其杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的1至10个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9和10个)重复核酸序列，其杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的2个重复核酸序列，其杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，两个单独的环状多核糖核苷酸的重复核酸序列和互补重复核酸序列杂交以生成单个环化多核糖核苷酸，杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，互补序列位于用于环化的线性多核糖核苷酸的5’末端和3'末端。在一些实施例中，互补序列包括约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个配对的核苷酸。
在一些实施例中，环化化学方法可用于生成环状多核糖核苷酸。此类方法可以包括但不限于点击化学(例如，基于炔烃和叠氮化物的方法，或可点击的碱基)、烯烃复分解、氨基磷酸酯连接、半缩醛胺-亚胺交联、碱基修饰、及其任何组合。
在一些实施例中，环化酶促方法可用于生成环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，连接酶，例如DNA或RNA连接酶，可用于生成环状多核糖核苷酸或互补物的模板、环状多核糖核苷酸的互补链或环状多核糖核苷酸。
环状多核糖核苷酸的环化可以通过本领域已知的方法完成，例如，Petkovic和Muller,“RNAcircularization strategies in vivo and in vitro[体内外核糖核酸环化策略]”Nucleic Acids Res[核酸研究],2015,43(4):2454-2465，和Muller和Appel,“Invitro circularization of RNA[核糖核酸的体外环化]”RNA Biol[RNA生物学],2017,14(8):1018-1027中描述的那些方法。
环状多核糖核苷酸可编码可用于复制的序列和/或基序。在国际专利公开号WO2019/118919的段落[0280]-[0286]中描述了示例性复制元件，该专利公开特此通过援引以其全文并入。
环状多核糖核苷酸的纯化
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是纯化的，例如，去除了游离核糖核酸、线性或带切口的RNA、DNA、蛋白质等。在一些实施例中，可以通过本领域通常使用的任何已知方法纯化环状多核糖核苷酸。纯化方法的非限制性实例包括柱色谱法、凝胶切除、尺寸排阻等。
递送
本文所述的环状或线性多核糖核苷酸也可以包括在含载剂或不含载剂的药物组合物中。
本文所述的药物组合物可以是配制的，例如包含载剂(诸如药物载剂和/或聚合物载剂，例如脂质体)，并通过已知方法递送至有需要的受试者(例如人或非人农业动物或家畜，例如牛、狗、猫、马、家禽)。此类方法包括但不限于转染(例如，脂质介导的阳离子聚合物、磷酸钙、树状聚合物)；电穿孔或其他破坏膜的方法(例如，核转染)、病毒递送(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV)、显微注射、微粒轰击(“基因枪”)、fugene、直接声波加载、细胞挤压、光转染、原生质体融合、刺穿感染、磁转染、外泌体介导的转移、脂质纳米颗粒介导的转移、及其任何组合。递送方法也描述于例如Gori等人,Delivery and Specificityof CRISPR/Cas9Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy[人类基因治疗用CRISPR/Cas9基因组编辑技术的传递和特异性].Human Gene Therapy[人类基因治疗].2015年7月,26(7):443-451.doi:10.1089/hum.2015.074；和Zuris等人,Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editingin vitro and in vivo[阳离子脂质介导的蛋白质递送能够在体外和体内进行有效的基于蛋白质的基因组编辑].Nat Biotechnol[自然生物技术].2014年10月30日；33(1):73-80。
在一些实施例中，可以以“裸”递送配制品递送环状或线性多核糖核苷酸。裸递送配制品将环状多核糖核苷酸递送至细胞，无需借助于载剂并且无需对环状或线性多核糖核苷酸进行共价修饰，也无需对环状或线性多核糖核苷酸进行部分或完全包封。
裸递送配制品是不含载剂的配制品并且其中环状或线性多核糖核苷酸没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰，并且环状或线性多核糖核苷酸没有部分或完全包封。在一些实施例中，没有与有助于递送至细胞的部分结合的共价修饰的环状或线性多核糖核苷酸可以是未与诸如蛋白质、小分子、颗粒、聚合物或有助于递送至细胞的生物聚合物的部分共价结合的多核糖核苷酸。在一些实施例中，可以将环状或线性多核糖核苷酸与鱼精蛋白或鱼精蛋白盐(例如硫酸鱼精蛋白)一起在递送配制品中递送。
没有与有助于递送至细胞的部分结合的共价修饰的多核糖核苷酸可以不含经修饰的磷酸基团。例如，没有与有助于递送至细胞的部分结合的共价修饰的多核糖核苷酸可以不含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸盐、硼代磷酸酯、磷酸氢盐、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。
在一些实施例中，裸递送配制品可以不含以下任何或全部物质：转染试剂、阳离子载剂、碳水化合物载剂、纳米颗粒载剂或蛋白质载剂。例如，裸递送配制品可以不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐改性的植物糖原β-糊精、脂转染胺(lipofectamine)、聚乙烯亚胺、聚(三甲基亚胺)、聚(四甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-聚胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1-[2-(油酰氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑鎓氯化物(DOTIM)、2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(DOSPA)、3B-[N-(N\N'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇盐酸盐)、二-十七烷基氨基甘氨酰基亚精胺(DOGS)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白。
裸递送配制品可以包含非载剂赋形剂。在一些实施例中，非载剂赋形剂可以包括不表现出活性细胞穿透作用的非活性成分。在一些实施例中，非载剂赋形剂可以包括缓冲剂，例如PBS。在一些实施例中，非载剂赋形剂可以是溶剂、非水性溶剂、稀释剂、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂、润滑剂、或油。
在一些实施例中，裸递送配制品可以包含稀释剂，诸如肠胃外可接受的稀释剂。稀释剂(例如，肠胃外可接受的稀释剂)可以是液体稀释剂或固体稀释剂。在一些实施例中，稀释剂(例如，肠胃外可接受的稀释剂)可以是RNA增溶剂、缓冲剂或等渗剂。RNA增溶剂的实例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲酰胺和2-丙醇。缓冲剂的实例包括2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、Bis-Tris、2-[(2-氨基-2-氧代乙基)-(羧甲基)氨基]乙酸(ADA)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)(PIPES)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(TES)、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、Tris、Tricine、Gly-Gly、Bicine或磷酸盐。等渗剂的实例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖或蔗糖。
在一些实施例中，如本文披露的药物制剂、如本文披露的药物组合物、如本文披露的药物原料药或如本文披露的药物成品药处于肠胃外核酸递送系统中。肠胃外核酸递送系统可以包括如本文披露的药物制剂、如本文披露的药物组合物、所披露的药物原料药或如本文披露的药物成品药和肠胃外可接受的稀释剂。在一些实施例中，肠胃外核酸递送系统中的如本文披露的药物制剂、如本文披露的药物组合物、如本文披露的药物原料药或如本文披露的药物成品药不含任何载剂。
本披露进一步涉及包含本文所述的环状或线性多核糖核苷酸的宿主或宿主细胞。在一些实施例中，宿主或宿主细胞是脊椎动物、哺乳动物(例如人)或其他生物体或细胞。
在一些实施例中，与由参考化合物(例如对应于所述环状多核糖核苷酸的线性多核苷酸或缺少加密原的环状多核糖核苷酸)触发的反应相比，环状多核糖核苷酸降低或不能产生宿主免疫系统的不需要的反应。在实施例中，环状多核糖核苷酸在宿主中是非免疫原性的。一些免疫反应包括但不限于体液免疫反应(例如，免疫原特异性抗体的产生)和细胞介导的免疫反应(例如，淋巴细胞增殖)。
在一些实施例中，使宿主或宿主细胞接触(例如，递送或施用)环状多核糖核苷酸或线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，宿主是哺乳动物，诸如人。可以在施用后的任何时间测量宿主中环状多核糖核苷酸或线性多核糖核苷酸、表达产物或两者的量。在某些实施例中，测定培养物中宿主生长的时程。如果在环状多核糖核苷酸或线性多核糖核苷酸的存在下生长增加或减少，则环状多核糖核苷酸或表达产物或两者都被认为在增加或减少宿主的生长方面是有效的。
将如本文所述的环状或线性多核糖核苷酸分子递送至细胞、组织或受试者的方法包括将如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药施用于细胞、组织或受试者。
在一些实施例中，细胞是真核细胞。在一些实施例中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞是有蹄动物细胞。在一些实施例中，细胞是动物细胞。在一些实施例中，细胞是免疫细胞。在一些实施例中，组织是结缔组织、肌肉组织、神经组织或上皮组织。在一些实施例中，组织是器官(例如，肝、肺、脾、肾等)。
在一些实施例中，递送方法是体内方法。例如，如本文所述的环状多核糖核苷酸的递送方法包括向有需要的受试者肠胃外施用，将如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药经肠胃外施用给有需要的受试者。再如，将环状多核糖核苷酸递送至受试者的细胞或组织的方法包括将如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药肠胃外施用至该细胞或组织。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的量在受试者中有效地引发生物反应。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的量有效地对受试者的细胞或组织具有生物学作用。在一些实施例中，如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药包含载剂。在一些实施例中，如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药包含稀释剂而不含任何载剂。
在一些实施例中，肠胃外施用药物组合物、药物原料药或药物成品药。在一些实施例中，药物组合物、药物原料药或药物成品药通过静脉内、动脉内、腹膜内、皮内、颅内、鞘内、淋巴内、皮下或肌内施用。在一些实施例中，肠胃外施用是静脉内、肌内、眼、皮下、皮内或局部施用。
在一些实施例中，如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药经肌内施用。在一些实施例中，如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药经皮下施用。在一些实施例中，如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药局部施用。在一些实施例中，该药物组合物、药物原料药或药物成品药经气管内施用。
在一些实施例中，该药物组合物、药物原料药或药物成品药通过注射施用。施用可以是全身施用或局部施用。在一些实施例中，如本文所述的任何递送方法均用载剂进行。在一些实施例中，无需借助于载剂或细胞穿透剂即可进行如本文所述的任何递送方法。
在一些实施例中，在施用步骤后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天或至少5天在细胞、组织或受试者中检测到环状多核糖核苷酸或从该环状多核糖核苷酸翻译的产物。在一些实施例中，在施用步骤之前评价细胞、组织或受试者中环状多核糖核苷酸或从该环状多核糖核苷酸翻译的产物的存在。在一些实施例中，在施用步骤之后评价细胞、组织或受试者中环状多核糖核苷酸或从该环状多核糖核苷酸翻译的产物的存在。
配制品
在一些实施例中，本文披露的药物配制品可以包含：(i)本文披露的化合物(例如，环状多核糖核苷酸)；(ii)缓冲剂；(iii)非离子型洗涤剂；(iv)张度剂；和/或(v)稳定剂。在一些实施例中，本文披露的药物配制品可以包含：(i)本文披露的化合物(例如，线性多核糖核苷酸)；(ii)缓冲剂；(iii)非离子型洗涤剂；(iv)张度剂；和/或(v)稳定剂。在一些实施例中，本文披露的药物配制品是稳定的液体药物配制品。在一些实施例中，本文披露的药物配制品包含鱼精蛋白或鱼精蛋白盐(例如，硫酸鱼精蛋白)。
本披露提供了包括上述环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物。本披露提供了包括上述线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物。本披露的免疫原性组合物可以包含稀释剂或载剂、佐剂或其任何组合。本披露的免疫原性组合物还可以包含一种或多种免疫调节剂，例如一种或多种佐剂。佐剂可以包括下面进一步讨论的TH1佐剂和/或TH2佐剂。在一些实施例中，免疫原性组合物包含不含任何载剂的稀释剂，并且用于将环状多核糖核苷酸裸递送至受试者。在一些实施例中，免疫原性组合物包含不含任何载剂的稀释剂，并且用于将线性多核糖核苷酸裸递送至受试者。
本披露的免疫原性组合物用于在受试者中引起免疫反应。免疫反应优选是保护性的，并且优选涉及抗体反应(通常包括IgG)和/或细胞介导的免疫反应。例如，用包括本披露的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物使受试者免疫以诱导免疫反应。再如，用包括含免疫原的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物使受试者免疫，以刺激与免疫原结合的抗体的产生。通过这些用途和方法在受试者中引起免疫反应，可以保护受试者免受各种疾病和/或感染，例如免受如上所讨论的细菌和/或病毒疾病。在某些实施例中，免疫原性组合物是疫苗组合物。根据本披露的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即治疗感染)，但是通常将是预防性的。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，受试者是动物，优选哺乳动物，例如人。在一个实施例中，受试者是人。在其他实施例中，受试者是非人哺乳动物，例如选自牛(例如，奶牛和肉牛)、绵羊、山羊、猪、马、狗或猫。在其他实施例中，受试者是鸟，例如母鸡或公鸡、火鸡、鹦鹉。在一些实施例中，动物不是小鼠或兔子或牛。在一个特定实施例中，在免疫原性组合物用于预防用途的情况下，人是儿童(例如，幼儿或婴儿)或青少年。在另一个实施例中，在免疫原性组合物用于治疗用途的情况下，人是青少年或成人。旨在用于儿童的免疫原性组合物也可以施用给成人，例如以评估安全性、剂量、免疫原性等。
根据本披露制备的免疫原性组合物可用于治疗儿童和成人。人类受试者可小于1岁、小于5岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。在一个特定实施例中，接受免疫原性组合物的人类受试者是老年人(例如，≥50岁、≥60岁和≥65岁)、年轻人(例如，≤5岁)、住院患者、医护人员、武装部队和军事人员、孕妇、长期病患者或免疫缺陷患者。然而，免疫原性组合物不仅仅适合于这些群组，并且可以更普遍地用于群体中。
在一些实施例中，受试者进一步用佐剂免疫接种。在一些实施例中，受试者进一步用疫苗免疫接种。
免疫接种
在一些实施例中，本披露的方法包括用包含本文披露的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物为受试者免疫接种。在一些实施例中，免疫原由环状多核糖核苷酸表达。在一些实施例中，免疫接种在受试者中诱导针对由环状多核糖核苷酸表达的免疫原的免疫反应。在一些实施例中，免疫接种在受试者中诱导免疫反应(例如，诱导与由环状多核糖核苷酸表达的免疫原结合的抗体的产生)。在一些实施例中，免疫原性组合物在单一组合物中包含环状多核糖核苷酸和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合。在一些实施例中，受试者进一步用第二佐剂免疫接种。在一些实施例中，受试者进一步用疫苗免疫接种。
在一些实施例中，本披露的方法包括用包含本文披露的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物为受试者免疫接种。在一些实施例中，免疫原由线性多核糖核苷酸表达。在一些实施例中，免疫接种在受试者中诱导针对由线性多核糖核苷酸表达的免疫原的免疫反应。在一些实施例中，免疫接种诱导与由线性多核糖核苷酸表达的免疫原结合的抗体的产生。在一些实施例中，免疫接种诱导细胞介导的免疫反应。在一些实施例中，免疫原性组合物在单一组合物中包含线性多核糖核苷酸和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合。在一些实施例中，受试者进一步用第二佐剂免疫接种。在一些实施例中，受试者进一步用疫苗免疫接种。
受试者用包含任何数量的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。受试者用例如包含至少1种环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。具有非人源化免疫系统的非人动物用例如包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少20种不同的环状多核糖核苷酸或更多种不同的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含至多1种环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人动物用包含至多2种、至多3种、至多4种、至多5种、至多6种、至多7种、至多8种、至多9种、至多10种、至多11种、至多12种、至多13种、至多14种、至多15种、至多20种不同的环状多核糖核苷酸或少于21种不同的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含约1种环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人动物用包含约2种、约3种、约4种、约5种、约6种、约7种、约8种、约9种、约10种、约11种、约12种、约13种、约14种、约15种或约20种不同的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含约1-20、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-20、2-15、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-20、3-15、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-20、4-15、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、4-4、4-3、5-20、5-15、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-10、10-15或15-20种不同的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。不同的环状多核糖核苷酸具有彼此不同的序列。例如，它们可以包括或编码不同的免疫原、重叠的免疫原、相似的免疫原或相同的免疫原(例如，具有相同或不同的调控元件、起始序列、启动子、终止元件或本披露的其他元件)。在受试者用包含两种或更多种不同的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种的情况下，这两种或更多种不同的环状多核糖核苷酸可以处于相同或不同的免疫原性组合物中并且同时或在不同时间免疫接种。可以将包含两种或更多种不同的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用于相同的解剖位置或不同的解剖位置。
受试者可以用包含任何数量的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。受试者用例如包含至少1种线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。具有非人源化免疫系统的非人动物用例如包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少20种不同的线性多核糖核苷酸或更多种不同的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含至多1种线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人动物用包含至多2种、至多3种、至多4种、至多5种、至多6种、至多7种、至多8种、至多9种、至多10种、至多11种、至多12种、至多13种、至多14种、至多15种、至多20种不同的线性多核糖核苷酸或少于21种不同的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含约1种线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人动物用包含约2种、约3种、约4种、约5种、约6种、约7种、约8种、约9种、约10种、约11种、约12种、约13种、约14种、约15种或约20种不同的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含约1-20、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-20、2-15、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-20、3-15、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-20、4-15、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、4-4、4-3、5-20、5-15、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-10、10-15或15-20种不同的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。不同的线性多核糖核苷酸可以具有彼此不同的序列。例如，它们可以包括或编码不同的免疫原、重叠的免疫原、相似的免疫原或相同的免疫原(例如，具有相同或不同的调控元件、起始序列、启动子、终止元件或本披露的其他元件)。在受试者用包含两种或更多种不同的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种的情况下，这两种或更多种不同的线性多核糖核苷酸可以处于相同或不同的免疫原性组合物中并且同时或在不同时间免疫接种。可以将包含两种或更多种不同的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用于相同的解剖位置或不同的解剖位置。
这两种或更多种不同的线性多核糖核苷酸可以包括或编码来自相同来源、不同来源或本文披露的来源的不同组合的免疫原。这两种或更多种不同的线性多核糖核苷酸可以包括或编码来自相同病毒或来自不同病毒(例如，不同分离株)的免疫原。
在一些实施例中，受试者用如本文披露的包含任何数量的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物和包含任何数量的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，本文披露的免疫原性组合物包含如本文披露的一种或多种环状多核糖核苷酸和一种或多种线性多核糖核苷酸。
在一些实施例中，免疫原性组合物包含环状多核糖核苷酸和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合。在一个特定实施例中，免疫原性组合物包含本文所述的环状多核糖核苷酸和载剂或不含任何载剂的稀释剂。在一些实施例中，包含环状多核糖核苷酸与不含任何载剂的稀释剂的免疫原性组合物用于将环状多核糖核苷酸裸递送至受试者。在另一个特定实施例中，免疫原性组合物包含本文所述的环状多核糖核苷酸和第一佐剂。
在某些实施例中，进一步向受试者施用第二佐剂。佐剂增强先天性免疫反应，继而增强受试者中的适应性免疫反应。佐剂可以是如下所讨论的任何佐剂。在某些实施例中，佐剂作为免疫原性组合物的一部分与环状多核糖核苷酸一起配制。在某些实施例中，佐剂不是包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物的一部分。在某些实施例中，佐剂与包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物分开施用。在这方面，佐剂与包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物共同施用(例如同时施用)或在不同的时间施用给受试者。例如，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用佐剂。在一些实施例中，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用佐剂。例如，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用佐剂。在一些实施例中，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用佐剂。将佐剂施用到与包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物相同的解剖位置或不同的解剖位置。
在一些实施例中，免疫原性组合物包含线性多核糖核苷酸和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合。在一个特定实施例中，免疫原性组合物包含本文所述的线性多核糖核苷酸和载剂或不含任何载剂的稀释剂。在一些实施例中，包含线性多核糖核苷酸与不含任何载剂的稀释剂的免疫原性组合物用于将线性多核糖核苷酸裸递送至受试者。在另一个特定实施例中，免疫原性组合物包含本文所述的线性多核糖核苷酸和第一佐剂。
在某些实施例中，进一步向受试者施用第二佐剂。佐剂增强先天性免疫反应，继而增强受试者中的适应性免疫反应。佐剂可以是如下所讨论的任何佐剂。在某些实施例中，佐剂作为免疫原性组合物的一部分与线性多核糖核苷酸一起配制。在某些实施例中，佐剂不是包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物的一部分。在某些实施例中，佐剂与包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物分开施用。在这方面，佐剂与包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物共同施用(例如同时施用)或在不同的时间施用给受试者。例如，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用佐剂。在一些实施例中，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用佐剂。例如，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用佐剂。在一些实施例中，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用佐剂。将佐剂施用到与包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物相同的解剖位置或不同的解剖位置。
在一些实施例中，受试者用第二试剂，例如不是环状多核糖核苷酸的疫苗(如下所述)进一步免疫接种。该疫苗与包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物共同施用(例如同时施用)或在不同的时间施用给受试者。例如，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用该疫苗。在一些实施例中，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用该疫苗。例如，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用该疫苗。在一些实施例中，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用该疫苗。
在一些实施例中，受试者用第二试剂，例如不是线性多核糖核苷酸的疫苗(如下所述)进一步免疫接种。该疫苗与包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物共同施用(例如同时施用)或在不同的时间施用给受试者。例如，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用该疫苗。在一些实施例中，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用该疫苗。例如，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用该疫苗。在一些实施例中，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用该疫苗。
受试者可以用免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种任何合适的次数，以实现所需的反应。例如，初免-加强免疫接种策略可用于引发全身和/或粘膜免疫。受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种，例如至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次或至少15次或更多次。
在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种，至多2次、至多3次、至多4次、至多5次、至多6次、至多7次、至多8次、至多9次、至多10次、至多15次或至多20次或更少次。
在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20次。
在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种一次。在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种两次。在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种三次。在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种四次。在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种五次。在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种七次。
可以选择合适的时间间隔以间隔两次或更多次免疫接种。该时间间隔可以适用于用相同免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如蛋白质亚基疫苗)或其组合进行多次免疫接种，例如，相同免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如蛋白质亚基疫苗)或其组合可以经由相同的免疫接种途径或不同的免疫接种途径以相同的量或不同的量施用。该时间间隔可以适用于用不同免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如蛋白质亚基疫苗)或其组合进行多次免疫接种，例如，不同免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如蛋白质亚基疫苗)或其组合可以经由相同的免疫接种途径或不同的免疫接种途径以相同的量或不同的量施用。该时间间隔可适用于用不同试剂，例如，包含第一环状多核糖核苷酸的第一免疫原性组合物和包含第二环状多核糖核苷酸的第二免疫原性组合物进行免疫接种。该时间间隔可适用于用不同试剂，例如，包含第一环状多核糖核苷酸的第一免疫原性组合物和包含蛋白质免疫原(例如，蛋白质亚基)的第二免疫原性组合物进行免疫接种。该时间间隔可以适用于包含第一线性多核糖核苷酸的第一免疫原性组合物和包含第二线性多核糖核苷酸的第二免疫原性组合物。对于包括三次或更多次免疫接种的方案，免疫接种的时间间隔可以相同或不同。在一些实例中，两次免疫接种之间经过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、17、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、40、48或72小时。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、17、18、20、21、24、28或30天。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过约1、2、3、4、5、6、7或8周。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过约1、2、3、4、5、6、7或8个月。
在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少15小时、至少20小时、至少24小时、至少36小时或至少72小时或更长时间。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至多1小时、至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多7小时、至多8小时、至多9小时、至多10小时、至多15小时、至多20小时、至多24小时、至多36小时或至多72小时或更少时间。
在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天或至少30天或更长时间。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至多2天、至多3天、至多4天、至多5天、至多6天、至多7天、至多8天、至多9天、至多10天、至多15天、至多20天、至多21天、至多22天、至多23天、至多24天、至多25天、至多26天、至多27天、至多28天、至多29天、至多30天、至多32天、至多34天或至多36天或更少时间。
在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周或至少8周或更长时间。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至多2周、至多3周、至多4周、至多5周、至多6周、至多7周、至多8周或更少时间。
在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月或至少8个月或更长时间。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至多2个月、至多3个月、至多4个月、至多5个月、至多6个月、至多7个月、至多8个月、至多9个月、至多10个月、至多11个月或至多12个月或更少时间。
在一些实施例中，该方法包括向受试者预施用一种试剂以改善对包含编码免疫原的序列的环状多核糖核苷酸的免疫原性反应。在一些实施例中，该试剂是如本文披露的免疫原(例如，蛋白质免疫原)。例如，该方法包括在施用包含编码蛋白质免疫原的序列的环状多核糖核苷酸前1至7天施用蛋白质免疫原。在一些实施例中，在施用包括编码蛋白质免疫原的序列的环状多核糖核苷酸前1、2、3、4、5、6或7天施用蛋白质免疫原。例如，该方法包括在施用包括编码蛋白质免疫原的序列的线性多核糖核苷酸前1至7天施用蛋白质免疫原。在一些实施例中，在施用包含编码蛋白质免疫原的序列的线性多核糖核苷酸前1、2、3、4、5、6或7天施用蛋白质免疫原。蛋白质免疫原可以作为蛋白质制剂施用，在质粒(pDNA)中编码，存在于病毒样颗粒(VLP)中，以脂质纳米颗粒的形式配制等。
在一些实施例中，该方法包括在向受试者施用了包含编码免疫原的序列的环状多核糖核苷酸之后，向受试者施用一种试剂以改善对包含编码免疫原的序列的环状多核糖核苷酸的免疫原性反应。在一些实施例中，该试剂是如本文披露的免疫原(例如，蛋白质免疫原)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含编码蛋白质免疫原的序列。例如，该方法包括在向受试者施用包含编码免疫原的序列的环状多核糖核苷酸的1年内(例如，在11个月、10个月、9个月、8个月、7个月、6个月、5个月、4个月、3个月、2个月和1个月内)施用蛋白质免疫原。在一些实施例中，该方法包括向受试者施用本文所述的任一种环状多核糖核苷酸或本文所述的任一种免疫原性组合物和蛋白质亚基。
在一些实施例中，蛋白质免疫原具有与由环状多核糖核苷酸编码的免疫原相同的氨基酸序列。例如，多肽免疫原可对应于由环状多核糖核苷酸序列编码的多肽免疫原(例如，与之具有90％、95％、96％、97％、98％或100％的氨基酸序列同一性)。在一些实施例中，蛋白质免疫原具有与由环状多核糖核苷酸编码的免疫原的氨基酸序列不同的氨基酸序列。例如，多肽免疫原与由环状多核糖核苷酸序列编码的多肽免疫原具有少于90％(例如，80％、70％、30％、20％或10％)的氨基酸序列同一性。
受试者可以在任何合适数目的解剖部位用免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种。可以将相同的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用于多个解剖部位，可以将包含相同或不同的环状多核糖核苷酸的不同免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用于不同的解剖部位，可以将包含相同或不同的环状多核糖核苷酸的不同免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用于相同的解剖部位，或其任何组合。例如，可以将包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用于两个不同的解剖部位，和/或可以将包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用于一个解剖部位，并且可以将佐剂施用于不同的解剖部位。可以将相同的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用于多个解剖部位，可以将包括相同或不同的线性多核糖核苷酸的不同免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用于不同的解剖部位，可以将包括相同或不同的线性多核糖核苷酸的不同免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用于相同的解剖部位，或其任何组合。例如，可以将包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用于两个不同的解剖部位，和/或可以将包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用于一个解剖部位，并且可以将佐剂施用于不同的解剖部位。
任何两个或更多个解剖途径的免疫接种可以经由相同的免疫接种途径(例如，肌内)或通过两个或更多个免疫接种途径来进行。在一些实施例中，将本披露的包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合向受试者的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个解剖部位免疫接种。在一些实施例中，将本披露的包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合向受试者的至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个解剖部位或更少解剖部位免疫接种。在一些实施例中，将本披露的包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物或佐剂向受试者的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个解剖部位免疫接种。在一些实施例中，将本披露的包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合向受试者的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个解剖部位免疫接种。在一些实施例中，将本披露的包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合向受试者的至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个解剖部位或更少解剖部位免疫接种。在一些实施例中，将本披露的包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物或佐剂向受试者的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个解剖部位免疫接种。
免疫接种可以经由任何合适的途径。免疫接种途径的非限制性实例包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、胸骨内、脑内、眼内、病灶内、脑室内、脑池内或实质内，例如注射和输注。在一些情况下，免疫接种可以经由吸入进行。可以通过相同或不同的途径进行两次或更多次免疫接种。
可以向本披露的受试者施用任何适量的环状多核糖核苷酸。例如，受试者可以用至少约1ng、至少约10ng、至少约100ng、至少约1μg、至少约10μg、至少约100μg、至少约1mg、至少约10mg、至少约100mg或至少约1g的环状多核糖核苷酸免疫接种。在一些实施例中，受试者可以用至多约1ng、至多约10ng、至多约100ng、至多约1μg、至多约10μg、至多约100μg、至多约1mg、至多约10mg、至多约100mg或至多约1g的环状多核糖核苷酸免疫接种。在一些实施例中，受试者可以用约1ng、约10ng、约100ng、约1μg、约10μg、约100μg、约1mg、约10mg、约100mg或约1g的环状多核糖核苷酸免疫接种。
在一些实施例中，该方法进一步包括评价受试者对免疫原的抗体反应。在一些实施例中，评价是在施用包含编码免疫原的序列的环状多核糖核苷酸之前和/或之后。在一些实施例中，评价是在施用包含编码免疫原的序列的线性多核糖核苷酸之前和/或之后。
在一些实施例中，将本文所述的环状多核糖核苷酸、免疫原性组合物、药物制剂或药物组合物根据表1中提供的给药时间表施用于出生至15个月之间的受试者，或根据表2的给药时间表施用于18个月至18岁之间的受试者。给药可以根据本领域已知的给药时间表进行，例如，如疾病控制和预防中心(CDC)或美国国立卫生研究院(NIH)所述。表1和表2提供了截至2020年8月29日CDC网站上指示的某些病症的疫苗接种给药时间表的简要汇总。
表1.出生至15个月给药
Figure BDA0004113707750001151
Figure BDA0004113707750001161
*任选
表2. 18个月至18岁给药
Figure BDA0004113707750001162
Figure BDA0004113707750001171
细胞穿透剂
本文所述的细胞穿透剂可以包括增强多核糖核苷酸向细胞内递送的任何物质。细胞穿透剂可以包括有机化合物或无机分子。在一些情况下，细胞穿透剂是具有一个或多个官能团的有机化合物，这些官能团诸如但不限于烷烃、烯烃和芳烃；卤素取代的烷烃、烯烃和芳烃；醇、酚(苯衍生物)、醚、醛、酮和羧酸；胺和腈；以及有机硫(例如，二甲亚砜)。在一些实施例中，细胞穿透剂在极性溶剂中可溶。在一些实施例中，细胞穿透剂在极性溶剂中不可溶。多核糖核苷酸可以线性或环状形式存在。
细胞穿透剂可以包括有机化合物，诸如具有一个或多个羟基官能团的醇。在一些情况下，细胞穿透剂包括醇，诸如但不限于一元醇、多元醇、不饱和脂族醇和脂环醇。细胞穿透剂可以包括以下的一种或多种：甲醇、乙醇、异丙醇、苯氧乙醇、三乙醇胺、苯乙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙二醇、变性醇、苯甲醇(特别是变性醇)、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(PEG)-400、乙氧基化脂肪酸或羟乙基纤维素。在某些实施例中，细胞穿透剂包括乙醇。
在其他情况下，本文提供的组合物和方法仅包括醇作为细胞穿透剂，而没有或不使用任何其他试剂来增强多核糖核苷酸向细胞内的递送。在一些情况下，细胞穿透剂包含乙醇和任何其他可以增强多核糖核苷酸向细胞内递送的醇。在一些情况下，细胞穿透剂包含乙醇和任何其他可以增强多核糖核苷酸向细胞内递送的有机或无机分子。在一些情况下，细胞穿透剂包含乙醇和脂质体或纳米颗粒，诸如国际公开号WO 2013/006825、WO 2016/036735、WO 2018/112282 A1、和WO 2012/031043 A1中描述的那些，这些国际公开各自通过援引以其全文并入本文。在一些情况下，细胞穿透剂包括乙醇和细胞穿透肽或蛋白，诸如以下文献中描述的那些：Bechara等人,Cell-penetrating peptides:20years later,wheredo we stand？[细胞穿透肽：20年后，我们在哪里？]FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]587(12):1693-1702(2013)；Langel,Cell-Penetrating Peptides:Processes andApplications[细胞穿透肽：过程和应用](CRC出版社，佛罗里达州波卡拉顿(Boca RatonFL)，2002)；El-Andaloussi等人,Curr.Pharm.Des.[当前药物设计]11(28):3597-611(2003)；Deshayes等人,Cell.Mol.Life Sci.[细胞和分子生命科学]62(16):1839-49(2005)；美国专利公开号US 20130129726、US 20130137644和US 20130164219，其各自通过援引以其全文并入本文)。在一些情况下，乙醇与其他细胞穿透剂的比率为约1:0.001、1:0.002、1:005、1:008、1:0.01、1:0.02、1:0.05、1:0.08、1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:120、1:150、1:200、1:250、1:500或1:1000。在一些情况下，乙醇与其他细胞穿透剂的比率为至少约1:0.001、1:0.002、1:005、1:008、1:0.01、1:0.02、1:0.05、1:0.08、1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:120、1:150、1:200、1:250或1:500。
本文披露的组合物可以包括细胞穿透剂和多核糖核苷酸的混合物。在一些情况下，多核糖核苷酸与细胞穿透剂以预混合的混合物形式存在。在一些情况下，在与细胞接触之前，将多核糖核苷酸与细胞穿透剂分开提供。在这些情况下，多核糖核苷酸在施加于细胞时与细胞穿透剂接触，并混合在一起以将多核糖核苷酸递送到细胞中。不受特定理论的束缚，混合物中细胞穿透剂的浓度可有助于递送效率。因此，在一些情况下，在混合物中以预定浓度提供细胞穿透剂。在一些其他情况下，当细胞穿透剂和多核糖核苷酸最初是分开的但在施加用于递送时混合在一起时，以相对于多核糖核苷酸，应确保其在混合物中达到最小预定浓度的足够的量提供细胞穿透剂。
在一些情况下，细胞穿透剂占混合物的至少约0.01％、至少约0.02％、至少约0.03％、至少约0.04％、至少约0.05％、至少约0.06％、至少约0.07％、至少约0.08％、至少约0.09％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％体积/体积(v/v)。在一些情况下，细胞穿透剂占混合物的至多约0.01％、至多约0.02％、至多约0.03％、至多约0.04％、至多约0.05％、至多约0.06％、至多约0.07％、至多约0.08％、至多约0.09％、至多约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％v/v。在一些情况下，细胞穿透剂占混合物的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约100％v/v。
在一些情况下，细胞穿透剂占混合物的至少约0.01％、至少约0.02％、至少约0.03％、至少约0.04％、至少约0.05％、至少约0.06％、至少约0.07％、至少约0.08％、至少约0.09％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％重量/重量(w/w)。在一些情况下，细胞穿透剂占混合物的至多约0.01％、至多约0.02％、至多约0.03％、至多约0.04％、至多约0.05％、至多约0.06％、至多约0.07％、至多约0.08％、至多约0.09％、至多约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％w/w。在一些情况下，细胞穿透剂占混合物的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约98％w/w。在一些情况下，细胞穿透剂占混合物的约10％v/v。
在一些情况下，本文所述的混合物是液体溶液。例如，细胞穿透剂本身是液体物质。替代性地，细胞穿透剂是固体、液体或气体物质，并溶解在液体载剂例如水中。在这些情况下，多核糖核苷酸也可以溶解在液体溶液中。
在一些情况下，乙醇占混合物的至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％体积/体积(v/v)。在一些情况下，乙醇占混合物的至多约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％v/v。在一些情况下，乙醇占混合物的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约100％v/v。在一些情况下，乙醇占混合物的约10％v/v。
防腐剂
本文提供的组合物或药物组合物可以包含用于单次施用的材料，或者可以包含用于多次施用的材料(例如，“多剂量”试剂盒)。多核糖核苷酸可以线性或环状形式存在。该组合物或药物组合物可以包含一种或多种防腐剂，诸如硫柳汞或2-苯氧乙醇。防腐剂可用于防止使用过程中的微生物污染。合适的防腐剂包括：苯扎氯铵、硫柳汞、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙醇、依地酸二钠、山梨酸、Onamer M或本领域技术人员已知的其他试剂。在眼科产品中，例如，此类防腐剂可以以0.004％至0.02％的含量采用。在本文所述的组合物中，防腐剂(例如苯扎氯铵)可以按重量计以0.001％至小于0.01％，例如0.001％至0.008％，优选约0.005％的含量采用。
多核糖核苷酸可易受周围环境中可能丰富的RNA酶的影响。本文提供的组合物可以包含抑制RNA酶活性的试剂，从而防止多核糖核苷酸降解。在一些情况下，该组合物或药物组合物包含本领域技术人员已知的任何RNA酶抑制剂。替代性地或另外，可以在无RNA酶的环境中制备本文提供的组合物中的多核糖核苷酸和细胞穿透剂和/或药学上可接受的稀释剂或载剂、媒介物、赋形剂或其他试剂。该组合物可以在无RNA酶的环境中配制。
在一些情况下，本文提供的组合物可以是无菌的。可以在本领域已知的合适的媒介物中将组合物配制成无菌溶液或悬浮液。可以通过常规的已知灭菌技术对组合物进行灭菌，例如，可以对组合物进行无菌过滤。
盐
在一些情况下，本文提供的组合物或药物组合物包含一种或多种盐。为了控制张度，本文提供的组合物可以包含生理盐诸如钠盐。其他盐可以包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和/或氯化镁等。在一些情况下，该组合物与一种或多种药学上可接受的盐一起配制。该一种或多种药学上可接受的盐可以包括无机离子，诸如钠、钾、钙、镁离子等的那些盐。此类盐可以包括与无机酸或有机酸的盐，该无机酸或有机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、扁桃酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸或马来酸。多核糖核苷酸可以线性或环状形式存在。
缓冲剂/pH
本文提供的组合物或药物组合物可以包含一种或多种缓冲剂，诸如Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(例如，含氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。在一些情况下，包含5-20mM范围内的缓冲剂。
本文提供的组合物或药物组合物可以具有约5.0至约8.5、约6.0至约8.0、约6.5至约7.5、或约7.0至约7.8的pH。该组合物或药物组合物可以具有约7的pH。多核糖核苷酸可以线性或环状形式存在。
洗涤剂/表面活性剂
根据预期的施用途径，本文提供的组合物或药物组合物可以包含一种或多种洗涤剂和/或表面活性剂，例如聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为“吐温(Tween)”)，例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；以DOWFAXTM商标出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，诸如线性EO/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧基-1,2-乙二基)基团的数目可以变化的辛基酚聚醚，例如辛基酚聚醚-9(Triton X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，诸如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬基酚聚氧乙烯醚，诸如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，诸如三乙二醇单月桂基醚(Brij 30)；和脱水山梨糖醇酯(通常称为“SPAN”)，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯、辛基酚聚醚(诸如辛基酚聚醚9(Triton X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、十六烷基三甲基溴化铵(“CTAB”)或脱氧胆酸钠。该一种或多种洗涤剂和/或表面活性剂可仅以痕量存在。在一些情况下，该组合物可以包含小于各1mg/ml的辛基酚聚醚-10和聚山梨醇酯80。在本文中可使用非离子表面活性剂。表面活性剂可以按其“HLB”(亲水/亲脂平衡值)进行分类。在一些情况下，表面活性剂的HLB为至少10、至少15和/或至少16。多核糖核苷酸可以线性或环状形式存在。
稀释剂
在一些实施例中，本披露的免疫原性组合物包含环状多核糖核苷酸和稀释剂。在一些实施例中，本披露的免疫原性组合物包含线性多核糖核苷酸和稀释剂。
稀释剂可以是非载剂赋形剂。非载剂赋形剂用作组合物(诸如，如本文所述的环状多核糖核苷酸)的媒介物或介质。非载剂赋形剂用作组合物(诸如，如本文所述的线性多核糖核苷酸)的媒介物或介质。非载剂赋形剂的非限制性实例包括溶剂、水性溶剂、非水溶剂、分散介质、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS))、润滑剂、油及其混合物。非载剂赋形剂可以是经美国食品和药物管理局(FDA)批准并列在非活性成分数据库中的不表现出细胞穿透作用的任一种非活性成分。非载剂赋形剂可以是适于施用于非人类动物(例如，适合兽医用途)的任何非活性成分。为了使组合物适于向各种动物施用，对适于向人施用的组合物的修饰得到很好的理解，并且普通技术的兽医药理师可以仅通过普通的实验(如果有)来设计和/或进行此类修饰。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以以裸递送配制品的形式递送，诸如包含稀释剂。裸递送配制品将环状多核糖核苷酸递送至细胞，无需借助于载剂并且无需对环状多核糖核苷酸、加帽的多核糖核苷酸或其复合物进行修饰或部分或完全包封。
裸递送配制品是不含载剂的配制品并且其中环状多核糖核苷酸没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰，或者没有对环状多核糖核苷酸的部分或完全包封。在一些实施例中，没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的环状多核糖核苷酸是未与蛋白质、小分子、颗粒、聚合物或生物聚合物共价结合的多核糖核苷酸。没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的环状多核糖核苷酸不含经修饰的磷酸基团。例如，没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的环状多核糖核苷酸不含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸盐、硼代磷酸酯、磷酸氢盐、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。
在一些实施例中，裸递送配制品不含以下任何或全部：转染试剂、阳离子载剂、碳水化合物载剂、纳米颗粒载剂或蛋白质载剂。在一些实施例中，裸递送配制品不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐改性的植物糖原β-糊精、脂转染胺(lipofectamine)、聚乙烯亚胺、聚(三甲基亚胺)、聚(四甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-聚胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1-[2-(油酰氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑鎓氯化物(DOTIM)、2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(DOSPA)、3B-[N-(N\N'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇盐酸盐)、二-十七烷基氨基甘氨酰基亚精胺(DOGS)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白。
在某些实施例中，裸递送配制品包括非载剂赋形剂。在一些实施例中，非载剂赋形剂包括不表现出细胞穿透作用的非活性成分。在一些实施例中，非载剂赋形剂包括缓冲剂，例如PBS。在一些实施例中，非载剂赋形剂是溶剂、非水溶剂、稀释剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、成粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂、润滑剂或油。
在一些实施例中，裸递送配制品包括稀释剂。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。在一些实施例中，稀释剂是RNA增溶剂、缓冲剂或等渗剂。RNA增溶剂的实例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲酰胺和2-丙醇。缓冲剂的实例包括2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、Bis-Tris、2-[(2-氨基-2-氧代乙基)-(羧甲基)氨基]乙酸(ADA)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)(PIPES)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(TES)、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、Tris、Tricine、Gly-Gly、Bicine或磷酸盐。等渗剂的实例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖或蔗糖。
载剂
在一些实施例中，本披露的免疫原性组合物包含环状多核糖核苷酸和载剂。在一些实施例中，本披露的免疫原性组合物包含线性多核糖核苷酸和载剂。
在某些实施例中，免疫原性组合物包含在囊泡或其他基于膜的载剂中的如本文所述的环状多核糖核苷酸。在某些实施例中，免疫原性组合物包含在囊泡或其他基于膜的载剂中的如本文所述的线性多核糖核苷酸。
在其他实施例中，免疫原性组合物包含在或经由细胞、囊泡或其他基于膜的载剂中的环状多核糖核苷酸。在其他实施例中，免疫原性组合物包含在或经由细胞、囊泡或其他基于膜的载剂中的线性多核糖核苷酸。在一个实施例中，免疫原性组合物包含在脂质体或其他类似囊泡中的环状多核糖核苷酸。在一个实施例中，免疫原性组合物包含在脂质体或其他类似囊泡中的线性多核糖核苷酸。脂质体是球形囊泡结构，这些球形囊泡结构由围绕内部水性区室的单层或多层的脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。脂质体可以是阴离子的、中性的或阳离子的。脂质体具有生物相容性，无毒，可以递送亲水性和亲脂性药物分子，保护其货物免受血浆酶的降解，并将其负载运输穿过生物膜和血脑屏障(BBB)(有关综述，参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。
囊泡可由几种不同类型的脂质制成；然而，最常使用磷脂生成作为药物载剂的脂质体。制备多层囊泡脂质的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号6,693,086，其关于多层囊泡脂质制备的传授内容通过援引并入文中)。尽管当脂质膜与水溶液混合时，囊泡形成可以是自发的，但也可以通过经由使用均质器、超声波仪或挤压设备以振荡的形式施加力来加快囊泡形成(关于综述，参见例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。可通过挤出通过具有减小尺寸的过滤器来制备挤出的脂质，如Templeton等人,Nature Biotech[自然生物技术],15:647-652,1997中所述，其关于挤出脂质制备的传授内容通过援引并入文中。
在某些实施例中，本披露的免疫原性组合物包含环状多核糖核苷酸和脂质纳米颗粒，例如本文所述的脂质纳米颗粒。在某些实施例中，本披露的免疫原性组合物包含线性多核糖核苷酸和脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒是为如本文所述的环状多核糖核苷酸分子提供生物相容性和可生物降解的递送系统的载剂的另一个实例。脂质纳米颗粒是为如本文所述的线性多核糖核苷酸分子提供生物相容性和可生物降解的递送系统的载剂的另一个实例。纳米结构化的脂质载剂(NLC)是经修饰的固体脂质纳米颗粒(SLN)，其保留了SLN的特性，提高了药物的稳定性和载药量，并防止了药物泄漏。聚合物纳米颗粒(PNP)是药物递送的重要组成部分。这些纳米颗粒可以有效地将药物递送引导至特定靶并改善药物稳定性和受控的药物释放。也可以使用脂质聚合物纳米颗粒(PLN)，其是一种组合了脂质体和聚合物的新型载剂。这些纳米颗粒具有PNP和脂质体的互补优势。PLN由核-壳结构构成；聚合物核提供了稳定的结构，磷脂壳提供了良好的生物相容性。这样，这两种组分提高了药物包封有效率，促进了表面修饰，并防止了水溶性药物的泄漏。对于综述，参见例如，Li等人2017,Nanomaterials[纳米材料]7,122；doi:10.3390/nano7060122。
载剂的其他非限制性实例包括碳水化合物载剂(例如，酸酐改性的植物糖原或糖原型材料)、蛋白质载剂(例如，与环状多核糖核苷酸共价连接的蛋白质或与线性多核糖核苷酸共价连接的蛋白质)或阳离子载剂(例如，阳离子脂聚合物或转染试剂)。碳水化合物载剂的非限制性实例包括植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精和酸酐改性的植物糖原β-糊精。阳离子载剂的非限制性实例包括脂转染胺(lipofectamine)、聚乙烯亚胺、聚(三甲基亚胺)、聚(四甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-聚胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1-[2-(油酰氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑鎓氯化物(DOTIM)、2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(DOSPA)、3B-[N-(N\N'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇盐酸盐)、二-十七烷基氨基甘氨酰基亚精胺(DOGS)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)和N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)。蛋白质载剂的非限制性实例包括人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白。
外泌体也可用作本文所述的环状RNA组合物或制剂的药物递送媒介物。外泌体可用作本文所述的线性多核糖核苷酸组合物或制剂的药物递送媒介物。对于综述，参见Ha等人2016年7月.Acta Pharmaceutica Sinica B[药学学报]第6卷第4期,第287-296页；https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。
离体分化的红细胞也可以用作本文所述的环状RNA组合物或制剂的载剂。离体分化的红细胞也可用作本文所述的线性多核糖核苷酸组合物或制剂的载剂。参见，例如，国际专利公开号WO 2015/073587；WO 2017/123646；WO 2017/123644；WO 2018/102740；WO2016/183482；WO 2015/153102；WO 2018/151829；WO 2018/009838；Shi等人2014.ProcNatl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊].111(28):10131-10136；美国专利9,644,180；Huang等人2017.Nature Communications[自然通讯]8:423；Shi等人2014.Proc Natl AcadSci USA[美国国家科学院院刊].111(28):10131-10136。
例如国际专利公开号WO 2018/208728中所述的融合体组合物也可以用作载剂递送本文所述的环状多核糖核苷酸分子。例如WO 2018/208728中所述的融合体组合物也可以用作载剂递送本文所述的线性多核糖核苷酸分子。
病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作载剂将本文所述的环状多核糖核苷酸分子递送至靶向的细胞。病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作载剂将本文所述的线性多核糖核苷酸分子递送至靶向的细胞。
例如国际专利公开号WO 2011/097480、WO 2013/070324、WO 2017/004526或WO2020/041784中所述的植物纳米囊泡和植物信使包(PMP)也可用作载剂递送本文所述的环状RNA组合物或制剂。植物纳米囊泡和植物信使包(PMP)也可用作载剂递送本文所述的线性多核糖核苷酸组合物或制剂。
微泡也可以用作载剂递送本文所述的环状多核糖核苷酸分子。微泡也可用作载剂递送本文所述的线性多核糖核苷酸分子。参见，例如，US 7115583；Beeri,R.等人，Circulation.[循环]2002年10月1日；106(14):1756-1759；Bez,M.等人，Nat Protoc.[自然实验手册]2019年4月；14(4):1015-1026；Hernot,S.等人，Adv Drug Deliv Rev.[高级药物递送综述]2008年6月30日；60(10):1153-1166；Rychak,J.J.等人，Adv Drug Deliv Rev.[高级药物递送综述]2014年6月；72:82-93。在一些实施例中，微泡是白蛋白包被的全氟化碳微泡。
包含本文所述的环状多核糖核苷酸的载剂可以包含多个颗粒。这些颗粒可具有30至700纳米的中值粒度(例如30至50、50至100、100至200、200至300、300至400、400至500、500至600、600至700、100至500、50至500或200至700纳米)。可以优化颗粒的大小以有利于包括环状多核糖核苷酸在内的有效载荷沉积到细胞中。环状多核糖核苷酸沉积到某些细胞类型中可有利于不同的粒度。例如，可以优化粒度以使环状多核糖核苷酸沉积到抗原呈递细胞中。可以优化粒度以使环状多核糖核苷酸沉积到树突细胞中。另外，可以优化粒度以使环状多核糖核苷酸沉积到引流淋巴结细胞中。
脂质纳米颗粒
本披露提供的组合物、方法和递送系统可以采用本文所述的任何合适的载剂或递送形式，在某些实施例中包括脂质纳米颗粒(LNP)。在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含一种或多种离子脂质，诸如非阳离子脂质(例如，中性或阴离子或两性离子脂质)；一种或多种缀合的脂质(诸如WO 2019217941的表5中描述的PEG缀合的脂质或缀合至聚合物的脂质；其通过援引以其全文并入本文)；一种或多种固醇(例如，胆固醇)。
可用于形成纳米颗粒的脂质(例如，脂质纳米颗粒)包括例如WO 2019217941的表4中描述的那些，其通过援引并入本文-例如，含脂质的纳米颗粒可包含WO 2019217941的表4中的一种或多种脂质。脂质纳米颗粒可以包括另外的要素，诸如聚合物，诸如通过援引并入的WO 2019217941的表5中描述的聚合物。
在一些实施例中，缀合的脂质，当存在时，可以包括以下的一种或多种：PEG-二酰基甘油(DAG)(诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEGS-DAG)(诸如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐，以及在WO 2019051289的表2中描述的那些(通过援引并入)和前述的组合。
在一些实施例中，可掺入脂质纳米颗粒中的固醇包括胆固醇或胆固醇衍生物中的一种或多种，诸如通过援引并入的WO 2009/127060或US 2010/0130588中的那些。另外的示例性固醇包括植物固醇，包括通过援引并入本文的Eygeris等人(2020)，dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386中描述的那些。
在一些实施例中，脂质颗粒包含可电离脂质、非阳离子脂质、抑制颗粒聚集的缀合脂质和固醇。这些组分的量可以独立地变化，以获得所需特性。例如，在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含：可电离脂质，其量是总脂质的约20mol％至约90mol％(在其他实施例中，它可以是存在于脂质纳米颗粒中的总脂质的20％-70％(mol)、30％-60％(mol)或40％-50％(mol)；约50mol％至约90mol％)；非阳离子脂质，其量是总脂质的约5mol％至约30mol％；缀合脂质，其量是总脂质的约0.5mol％至约20mol％，以及固醇，其量是总脂质的约20mol％至约50mol％。总脂质与核酸的比率可以根据需要变化。例如，总脂质与核酸(质量或重量)的比率可为约10:1至约30:1。
在一些实施例中，脂质与核酸的比率(质量/质量比率；w/w比率)可以在以下范围中：约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1、或约6:1至约9:1。可以调节脂质和核酸的量以提供所需的N/P比，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更高的N/P比。通常，脂质纳米颗粒配制品的总脂质含量可在约5mg/ml至约30mg/mL的范围内。
可用于(例如，与其他脂质组分组合)形成用于递送本文所述的组合物，例如本文所述的核酸(例如，RNA(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸))的脂质纳米颗粒的脂质化合物的一些非限制性实例包括：
Figure BDA0004113707750001301
在一些实施例中，包含式(i)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
Figure BDA0004113707750001311
在一些实施例中，包含式(ii)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
Figure BDA0004113707750001312
在一些实施例中，包含式(iii)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
Figure BDA0004113707750001313
在一些实施例中，包含式(v)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
Figure BDA0004113707750001314
在一些实施例中，包含式(vi)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
Figure BDA0004113707750001321
在一些实施例中，包含式(viii)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
Figure BDA0004113707750001322
在一些实施例中，包含式(ix)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
Figure BDA0004113707750001323
其中
X1是O、NR1或直接键，X2是C2-5亚烷基，X3是C(＝O)或直接键，R1是H或Me，R3是C1-3烷基，R2是C1-3烷基，或R2与它所附接的氮原子和X2的1-3个碳原子一起形成4-元、5-元或6-元环，或X1是NR1，R1和R2与它们所附接的氮原子一起形成5-元或6-元环，或R2与R3和它们所附接的氮原子一起形成5-元、6-元或7-元环，Y1是C2-12亚烷基，Y2选自
Figure BDA0004113707750001331
(在任一取向上)，(在任一取向上)，(在任一取向上)，
n为0至3，R4为C1-15烷基，Z1为C1-6亚烷基或直接键，
Z2是
Figure BDA0004113707750001332
(在任一取向上)或不存在，条件是如果Z1是直接键，则Z2不存在；
R5是C5-9烷基或C6-10烷氧基，R6是C5-9烷基或C6-10烷氧基，W是亚甲基或直接键，并且R7是H或Me，或其盐，条件是如果R3和R2是C2烷基，X1是O，X2是直链C3亚烷基，X3是C(＝0)，Y1是直链Ce亚烷基，(Y2)n-R4是
Figure BDA0004113707750001333
，R4是直链C5烷基，Z1是C2亚烷基，Z2不存在，W是亚甲基，并且R7是H，则R5和R6不是Cx烷氧基。
在一些实施例中，包含式(xii)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
Figure BDA0004113707750001334
在一些实施例中，包含式(xi)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
Figure BDA0004113707750001335
其中
Figure BDA0004113707750001336
Figure BDA0004113707750001341
在一些实施例中，LNP包含式(xiii)的化合物和式(xiv)的化合物。
Figure BDA0004113707750001342
在一些实施例中，包含式(xv)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
Figure BDA0004113707750001343
在一些实施例中，包含式(xvi)的配制品的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
Figure BDA0004113707750001344
Figure BDA0004113707750001351
其中
Figure BDA0004113707750001352
Figure BDA0004113707750001353
Figure BDA0004113707750001354
在一些实施例中，用于形成用于递送本文所述的组合物，例如本文所述的核酸(例如，RNA(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸))的脂质纳米颗粒的脂质化合物通过以下反应之一制成：
Figure BDA0004113707750001355
在一些实施例中，在包含可电离脂质的LNP中提供了本文所述的组合物(例如，核酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)或蛋白质)。在一些实施例中，可电离脂质是十七烷-9-基8-((2-羟乙基)(6-氧代-6-(十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(SM-102)；例如，如US 9,867,888(通过援引以其全文并入本文)的实例1中所述。在一些实施例中，可电离脂质是9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,12-二烯酸酯(LP01)，例如，如WO 2015/095340(通过援引以其全文并入本文)的实例13中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是9-((4-二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)，例如如US 2012/0027803(通过援引以其全文并入本文)的实例7、实例8或实例9中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)，例如，如WO 2010/053572(通过援引以其全文并入本文)的实例14和实例16中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是咪唑胆固醇酯(ICE)脂质(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊烯并[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯，例如来自WO 2020/106946(通过援引以其全文并入本文)的结构(I)。
在一些实施例中，可电离脂质可以是阳离子脂质、可电离阳离子脂质，例如可以根据pH以带正电荷的形式或中性形式存在的阳离子脂质，或可以容易地质子化的含胺脂质。在一些实施例中，阳离子脂质是例如在生理条件下能够带正电的脂质。示例性的阳离子脂质包括一个或多个带有正电荷的胺基。在一些实施例中，脂质颗粒包含与中性脂质、可电离含胺脂质、可生物降解的炔脂质、类固醇、包括多不饱和脂质的磷脂、结构脂质(例如固醇)、PEG、胆固醇和聚合物缀合脂质中的一种或多种配制的阳离子脂质。在一些实施例中，阳离子脂质可以是可电离的阳离子脂质。如本文所披露的示例性阳离子脂质可具有超过6.0的有效pKa。在实施例中，脂质纳米颗粒可包含具有与第一阳离子脂质不同的有效pKa(例如，大于第一有效pKa)的第二阳离子脂质。脂质纳米颗粒可包含40摩尔％至60摩尔％的包封在脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒缔合的阳离子脂质、中性脂质、类固醇、聚合物缀合的脂质和治疗剂，例如本文所述的核酸(例如RNA(例如环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸))。在一些实施例中，核酸与阳离子脂质共同配制。核酸可以吸附到LNP(例如包含阳离子脂质的LNP)的表面。在一些实施例中，核酸可以包封在LNP(例如包含阳离子脂质的LNP)中。在一些实施例中，脂质纳米颗粒可包含靶向部分，例如用靶向剂包被的靶向部分。在实施例中，LNP配制品是生物可降解的。在一些实施例中，包含一种或多种本文所述的脂质(例如式(i)、(ii)、(ii)、(vii)和/或(ix))的脂质纳米颗粒包封至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或100％的RNA分子。
可用于脂质纳米颗粒配制品中的示例性可电离脂质包括但不限于通过援引并入本文的WO 2019051289的表1中所列的那些。另外的示例性脂质包括但不限于下式中的一种或多种：US 2016/0311759的X；US 20150376115或US 2016/0376224中的I；US 20160151284的I、II或III；US 20170210967的I、IA、II或IIA；US 20150140070的I-c；US 2013/0178541的A；US 2013/0303587或US 2013/0123338的I；US 2015/0141678的I；US 2015/0239926的II、III、IV或V；US 2017/0119904的I；WO 2017/117528的I或II；US 2012/0149894的A；US2015/0057373的A；WO 2013/116126的A；US 2013/0090372的A；US 2013/0274523的A；US2013/0274504的A；US 2013/0053572的A；WO 2013/016058的A；WO 2012/162210的A；US2008/042973的I；US 2012/01287670的I、II、III或IV；US 2014/0200257的I或II；US 2015/0203446的I、II或III；US 2015/0005363的I或III；US 2014/0308304的I、IA、IB、IC、ID、II、IIA、IIB、IIC、IID或III-XXIV；US 2013/0338210；WO 2009/132131的I、II、III或IV；US2012/01011478的A；US 2012/0027796的I或XXXV；US 2012/0058144的XIV或XVII；US 2013/0323269；US 2011/0117125的I；US 2011/0256175的I、II或III；US 2012/0202871的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII；US 2011/0076335的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、X、XII、XIII、XIV、XV或XVI；US 2006/008378的I或II；US 2013/0123338的I；US 2015/0064242的I或X-A-Y-Z；US 2013/0022649的XVI、XVII或XVIII；US 2013/0116307的I、II或III；US 2013/0116307的I、II或III；US 2010/0062967的I或II；US 2013/0189351的I-X；US2014/0039032的I；US 2018/0028664的V；US 2016/0317458的I；US 2013/0195920的I；US10,221,127的5、6或10；WO 2018/081480的III-3；WO 2020/081938的I-5或I-8；US 9,867,888的18或25；US 2019/0136231的A；WO 2020/219876的II；US 2012/0027803的1；US 2019/0240349的OF-02；US 10,086,013的23；Miao等人(2020)的cKK-E12/A6；WO 2010/053572的C12-200；Dahlman等人(2017)的7C1；Whitehead等人的304-O13或503-O13；US 9,708,628的TS-P4C2；WO 2020/106946的I；WO2020/106946的I。
在一些实施例中，可电离脂质是MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)，例如，如WO 2019051289 A9(通过援引以其全文并入)的实例9中所述。在一些实施例中，可电离脂质是脂质ATX-002，例如，如WO 2019051289A9(通过援引以其全文并入)的实例10中所述。在一些实施例中，可电离脂质是(13Z,16Z)-A,A-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺(化合物32)，例如，如WO2019051289 A9(通过援引以其全文并入)的实例11中所述。在一些实施例中，可电离脂质是化合物6或化合物22，例如，如WO 2019051289A9(通过援引以其全文并入)的实例12中所述。
示例性非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰-sn-甘油基-磷酸乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-单甲基PE)、二甲基-磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-二甲基PE)、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、神经鞘磷脂(SM)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰基磷脂酰胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、二反油烯酰-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、双十六烷基磷酸、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱或其混合物。应当理解，也可以使用其他二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基基团优选为衍生自具有C10-C24碳链的脂肪酸的酰基基团，例如月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。在某些实施例中，另外的示例性脂质包括但不限于通过援引并入本文的Kim等人(2020)dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386描述的那些。在一些实施例中，此类脂质包括发现会改善用mRNA进行肝转染的植物脂质(例如DGTS)。
适合用于脂质纳米颗粒中的非阳离子脂质的其他实例包括但不限于非磷脂质，例如硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙酰基棕榈酸酯、蓖麻酸甘油酯、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸盐、烷基-芳基硫酸盐、聚乙氧基化脂肪酸酰胺、双十八烷基二甲基溴化铵、神经酰胺、鞘磷脂等。其他非阳离子脂质在WO2017/099823或美国专利公开US 2018/0028664中有描述，其内容通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，非阳离子脂质是油酸或通过援引以其全文并入的US 2018/0028664的式I、II或IV的化合物。非阳离子脂质可以占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的例如0％-30％(摩尔)。在一些实施例中，非阳离子脂质含量是脂质纳米颗粒中存在的总脂质的5％-20％(摩尔)或10％-15％(摩尔)。在实施例中，可电离脂质与中性脂质的摩尔比为约2:1至约8:1(例如，约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1或8:1)。
在一些实施例中，脂质纳米颗粒不包含任何磷脂。
在一些方面，脂质纳米颗粒可进一步包含诸如固醇的组分以提供膜完整性。可用于脂质纳米颗粒中的一种示例性固醇是胆固醇及其衍生物。胆固醇衍生物的非限制性实例包括极性类似物，诸如5a-胆甾烷醇、53-粪甾烷醇、胆甾醇基-(2,-羟基)-乙基醚、胆甾醇基-(4'-羟基)-丁基醚和6-酮胆甾烷醇；非极性类似物，诸如5a-胆甾烷、胆甾烯酮、5a-胆甾烷酮、5p-胆甾烷酮和胆甾醇癸酸酯；及其混合物。在一些实施例中，胆固醇衍生物是极性类似物，例如，胆甾醇基-(4'-羟基)-丁基醚。示例性的胆固醇衍生物在PCT公开WO 2009/127060和美国专利公开US 2010/0130588中有描述，其各自通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，提供膜完整性的组分，诸如固醇，可占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0％-50％(摩尔)(例如，0％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％或40％-50％)。在一些实施例中，此类组分是脂质纳米颗粒的总脂质含量的20％-50％(摩尔)、30％-40％(摩尔)。
在一些实施例中，脂质纳米颗粒可包含聚乙二醇(PEG)或缀合的脂质分子。通常，这些用于抑制脂质纳米颗粒的聚集和/或提供空间稳定。示例性的缀合脂质包括但不限于PEG-脂质缀合物、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(诸如ATTA-脂质缀合物)、阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物及其混合物。在一些实施例中，缀合脂质分子是PEG-脂质缀合物，例如(甲氧基聚乙二醇)缀合脂质。
示例性的PEG-脂质缀合物包括但不限于PEG-二酰基甘油(DAG)(诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEGS-DAG)(诸如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐或其混合物。另外的示例性PEG-脂质缀合物例如在US 5,885,6l3、US 6,287,59l、US 2003/0077829、US 2003/0077829、US 2005/0175682、US 2008/0020058、US 2011/0117125、US 2010/0130588、US 2016/0376224、US 2017/0119904和US/099823中有描述，所有这些的内容通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，PEG-脂质是US2018/0028664的式III、III-a-I、III-a-2、III-b-1、III-b-2或V的化合物，其内容通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，PEG-脂质具有US 20150376115或US 2016/0376224的式II，两者的内容通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，PEG-DAA缀合物可以是例如PEG-二月桂基氧基丙基、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基、PEG-二棕榈基氧基丙基或PEG-二硬脂基氧基丙基。PEG-脂质可以是以下的一种或多种：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油脂酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油脂酰胺、PEG-二棕榈酰甘油脂酰胺、PEG-二硬脂基甘油脂酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-双十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些实施例中，PEG-脂质包含PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些实施例中，PEG-脂质包含选自以下的结构：
Figure BDA0004113707750001411
在一些实施例中，与PEG以外的分子缀合的脂质也可用于代替PEG-脂质。例如，聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(诸如ATTA-脂质缀合物)和阳离子聚合物脂质(GPL)缀合物可用于代替PEG-脂质或与PEG-脂质一起使用。
示例性的缀合脂质，即PEG-脂质、(POZ)-脂质缀合物、ATTA-脂质缀合物和阳离子聚合物-脂质在WO 2019051289A9的表2中列出的PCT和LIS专利申请中有描述，其全部的内容通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，PEG或缀合脂质可以占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0％-20％(摩尔)。在一些实施例中，PEG或缀合脂质的含量为脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0.5％-10％或2％-5％(摩尔)。可电离脂质、非阳离子脂质、固醇和PEG/缀合脂质的摩尔比可以根据需要变化。例如，脂质颗粒可包含按组合物的摩尔或总重量计30％-70％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计0％-60％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计0％-30％的非阳离子脂质和按组合物的摩尔或总重量计1％-10％的缀合脂质。优选地，组合物包含按组合物的摩尔或总重量计30％-40％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计40％-50％的胆固醇，和按组合物的摩尔或总重量计10％-20％的非阳离子脂质。在一些其他实施例中，该组合物是按组合物的摩尔或总重量计50％-75％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计20％-40％的胆固醇和按组合物的摩尔或总重量计5％至10％的非阳离子脂质以及按组合物的摩尔或总重量计1％-10％的缀合脂质。该组合物可以含有按组合物的摩尔或总重量计60％-70％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计25％-35％的胆固醇，以及按组合物的摩尔或总重量计5％-10％的非阳离子脂质。该组合物还可含有按组合物的摩尔或总重量计至多90％的可电离脂质和按组合物的摩尔或总重量计2％至15％的非阳离子脂质。配制品也可以是脂质纳米颗粒配制品，例如包含按组合物的摩尔或总重量计8％-30％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计5％-30％的非阳离子脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计0％-20％的胆固醇；按组合物的摩尔或总重量计4％-25％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计4％-25％的非阳离子脂质，按组合物的摩尔或总重量计2％至25％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计10％至35％的缀合脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计5％的胆固醇；或按组合物的摩尔或总重量计2％-30％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计2％-30％的非阳离子脂质，按组合物的摩尔或总重量计1％至15％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计2％至35％的缀合脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计1％-20％的胆固醇；或按组合物的摩尔或总重量计甚至高达90％的可电离脂质和按组合物的摩尔或总重量计2％-10％的非阳离子脂质，或按组合物的摩尔或总重量计甚至100％的阳离子脂质。在一些实施例中，脂质颗粒配制品包含摩尔比为50:10:38.5:1.5的可电离脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质。在一些其他实施例中，脂质颗粒配制品包含摩尔比为60:38.5:1.5的可电离脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质。
在一些实施例中，脂质颗粒包含可电离脂质、非阳离子脂质(例如磷脂)、固醇(例如胆固醇)和聚乙二醇化脂质，其中可电离脂质的脂质摩尔比在20至70摩尔％的范围内，目标为40-60，非阳离子脂质的摩尔百分比在0至30的范围内，目标为0至15，固醇的摩尔百分比在20至70的范围内，目标为30至50，并且聚乙二醇化脂质的摩尔百分比在1至6的范围内，目标为2至5。
在一些实施例中，脂质颗粒包含摩尔比为50:10:38.5:1.5的可电离脂质/非阳离子脂质/固醇/缀合脂质。
一方面，本披露提供了包含磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的脂质纳米颗粒配制品。
在一些实施例中，还可以包括一种或多种另外的化合物。那些化合物可以单独施用，或者另外的化合物可以包括在本发明的脂质纳米颗粒中。换言之，除核酸或至少第二核酸之外，脂质纳米颗粒可含有不同于第一核酸的其他化合物。非限制性地，其他另外的化合物可以选自由以下组成的组：小的或大的有机分子或无机分子、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、肽、蛋白质、其肽类似物和衍生物、肽模拟物、核酸、核酸类似物和衍生物、由生物材料制成的提取物，或其任何组合。
在一些实施例中，LNP包含生物可降解的可电离脂质。在一些实施例中，LNP包含(9Z,l2Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,l2-二烯酸酯，也称为3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,l2Z)-十八碳-9,l2-二烯酸酯)或另一种可电离脂质。参见，例如WO 2019/067992、WO/2017/173054、WO 2015/095340和WO 2014/136086，以及其中提供的参考文献的脂质。在一些实施例中，在LNP脂质的上下文中术语阳离子和可电离是可互换的，例如，其中可电离脂质根据pH是阳离子的。
在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可以在数十nm和数百nm之间，例如通过动态光散射(DLS)测量的。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可以为约40nm至约150nm，诸如约40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约50nm至约100nm、约50nm至约90nm、约50nm至约80nm、约50nm至约70nm、约50nm至约60nm、约60nm至约100nm、约60nm至约90nm、约60nm至约80nm、约60nm至约70nm、约70nm至约100nm、约70nm至约90nm、约70nm至约80nm、约80nm至约100nm、约80nm至约90nm或约90nm至约100nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约70nm至约100nm。在特定实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约80nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约100nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径范围为约1mm至约500mm、约5mm至约200mm、约10mm至约100mm、约20mm至约80mm、约25mm至约60mm、约30mm至约55mm、约35mm至约50mm，或约38mm至约42mm。
在一些情况下，LNP可以是相对均质的。多分散性指数可用于指示LNP的均质性，例如脂质纳米颗粒的粒度分布。小的(例如，小于0.3)多分散性指数通常指示窄的粒度分布。LNP的多分散指数可为约0至约0.25，诸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施例中，LNP的多分散指数可为约0.10至约0.20。
LNP的ζ电位可用于指示组合物的电动电位。在一些实施例中，ζ电位可以描述LNP的表面电荷。具有相对低电荷(正电荷或负电荷)的脂质纳米颗粒通常是期望的，因为更高电荷的物质可能不理想地与体内的细胞、组织和其他元素相互作用。在一些实施例中，LNP的ζ电位可为约-10mV至约+20mV、约-10mV至约+15mV、约-10mV至约+10mV、约-10mV至约+5mV、约-10mV至约0mV、约-10mV至约-5mV、约-5mV至约+20mV、约-5mV至约+15mV、约-5mV至约+10mV、约-5mV至约+5mV、约-5mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+15mV或约+5mV至约+10mV。
蛋白质和/或核酸的包封效率描述了相对于所提供的初始量，在制备后被包封或以其他方式与LNP缔合的蛋白质和/或核酸的量。包封效率理想的是较高(例如，接近100％)。包封效率可以例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或洗涤剂破碎脂质纳米颗粒之前和之后含有脂质纳米颗粒的溶液中蛋白质或核酸的量来测量。阴离子交换树脂可用于测量溶液中游离蛋白质或核酸(例如RNA)的量。荧光可用于测量溶液中游离蛋白质和/或核酸(例如RNA)的量。对于本文所述的脂质纳米颗粒，蛋白质和/或核酸的包封效率可以是至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，包封效率可以是至少80％。在一些实施例中，包封效率可以是至少90％。在一些实施例中，包封效率可以是至少95％。
LNP可以任选地包含一层或多层包衣。在一些实施例中，LNP可以配制在具有包衣的胶囊、膜或片剂中。包含本文所述的组合物的胶囊、膜或片剂可具有任何可用的尺寸、拉伸强度、硬度或密度。
另外的示例性脂质、配制品、方法和LNP表征由WO 2020061457传授，其通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))或TransIT-mRNA转染试剂(米卢斯生物公司(Mirus Bio))进行体外或离体细胞脂质转染。在某些实施例中，使用GenVoy_ILM可电离脂质混合物(精密纳米系统(PrecisionNanoSystems))配制LNP。在某些实施例中，使用2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)或二亚油烯基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)配制LNP，其配制和体内用途在Jayaraman等人Angew Chem Int Ed Engl[德国应用化学]51(34):8529-8533(2012)中传授，通过援引以其全文并入本文。
优化用于递送CRISPR-Cas系统(例如Cas9-gRNA RNP、gRNA、Cas9mRNA)的LNP配制品在两者均通过援引并入的WO 2019067992和WO 2019067910中有描述，并且可用于递送本文所述的环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸。
可用于递送核酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)的另外的特定LNP配制品在两者均通过援引并入的US 8158601和US 8168775中有描述，其包括帕替西兰(patisiran)中使用的以名称ONPATTRO销售的配制品。
多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)LNP的示例性给药可包括约0.1、0.25、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10或100mg/kg(RNA)。包含多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)的AAV的示例性给药可包括约1011、1012、1013和1014vg/kg的MOI。
佐剂
佐剂会增强在接受佐剂和/或包含该佐剂的免疫原性组合物的受试者中引发的免疫反应(体液和/或细胞免疫反应)。在一些实施例中，如本文所披露的，将佐剂施用于受试者。在一些实施例中，佐剂用于本文所述的方法中以产生如本文所述的免疫反应。在一些实施例中，佐剂和多核糖核苷酸在分开的组合物中共同施用。在一些实施例中，将佐剂与多核糖核苷酸混合或配制为单一组合物，并施用于受试者。在一些实施例中，佐剂和环状或线性多核糖核苷酸在分开的组合物中共同施用。在一些实施例中，将佐剂与线性或环状多核糖核苷酸混合或配制为单一组合物以获得免疫原性组合物，将该免疫原性组合物施用于受试者。
佐剂可以与多核糖核苷酸一起配制在同一药物组合物中。佐剂可以与多核糖核苷酸组合分开施用(例如，作为分开的药物组合物)。
佐剂可以是TH1佐剂和/或TH2佐剂。本披露考虑的其他佐剂包括但不限于以下的一种或多种：
含矿物质的组合物。适于在本披露中用作佐剂的含矿物质的组合物包括矿物盐，诸如铝盐和钙盐。本披露包括矿物盐，诸如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等，或不同矿物化合物的混合物，其中化合物呈任何合适的形式(例如凝胶、结晶、无定形形式等)。钙盐包括磷酸钙(例如，“CAP”)。铝盐包括氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等。
油乳剂组合物。适于在本披露中用作佐剂的油乳剂组合物包括角鲨烯-水乳剂，诸如MF59(5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％ Span，使用微流化器配制为亚微米颗粒)、AS03(水包油乳剂中的α-生育酚、角鲨烯和聚山梨醇酯80)、Montanide配制品(例如MontanideISA 51、Montanide ISA 720)、不完全弗氏佐剂(IFA)、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。
小分子。适于在本披露中用作佐剂的小分子包括咪喹莫特或847、瑞喹莫德或R848、或嘎德莫特。
聚合物纳米颗粒。适于在本披露中用作佐剂的聚合物纳米颗粒包括聚(a-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚内酯(包括聚己内酯)、聚对二氧环己酮、聚戊内酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、酪氨酸衍生的聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮或聚酯-酰胺及其组合。
皂苷(即，糖苷，附接至一条或多条糖侧链的多环苷元)。适于在本披露中用作佐剂的皂苷配制品包括纯化配制品，诸如QS21，以及脂质配制品，诸如ISCOM和ISCOM基质。QS21作为STIMULON(TM)在市场上销售。皂苷配制品也可以包含固醇，诸如胆固醇。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM通常还包含磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷都可用于ISCOM中。优选地，ISCOM包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。任选地，ISCOM可以不含另外的洗涤剂。
脂多糖。适于在本披露中使用的佐剂包括肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物。此类衍生物包括单磷酰基脂质A(MPLA)、吡喃葡糖苷脂质A(GLA)和3-O-去酰化MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱氧-酰化单磷酰基脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。其他无毒LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，诸如氨基烷基氨基葡萄糖胺磷酸盐衍生物，例如RC-529。
脂质体。适于在本披露中用作佐剂的脂质体包括病毒体和CAF01。
脂质纳米颗粒。适于在本披露中使用的佐剂包括脂质纳米颗粒(LNP)及其组分。
脂肽(即，包含一个或多个脂肪酸残基和两个或更多个氨基酸残基的化合物)。适于在本披露中用作佐剂的脂肽包括Pam2(Pam2CSK4)和Pam3(Pam3CSK4)。
糖脂。适于在本披露中用作佐剂的糖脂包括索状因子(海藻糖二霉菌酸酯)。
从革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌衍生(合成或纯化)的肽和肽聚糖，诸如MDP(N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺)适于在本披露中用作佐剂。
适于用作佐剂的碳水化合物(含碳水化合物)或多糖包括右旋糖酐(例如，支链微生物多糖)、硫酸右旋糖酐、香菇多糖、酵母聚糖、β-葡聚糖、deltin、甘露聚糖和几丁质。
基于RNA的佐剂。适于在本披露中使用的基于RNA的佐剂是聚IC、聚IC:LC、带有或不带5'三磷酸的发夹RNA、病毒序列、含聚U的序列、dsRNA天然或合成RNA序列及核酸类似物(例如，环状GMP-AMP或其他环状二核苷酸(例如环状二-GMP)、免疫刺激性碱基类似物(例如C8-取代的和N7,C8-二取代的鸟嘌呤核糖核苷酸))。在一些实施例中，佐剂是本文所述的环状多核糖核苷酸的线性多核糖核苷酸对应物。
基于DNA的佐剂。适于在本披露中使用的基于DNA的佐剂包括CpG、dsDNA和天然或合成的免疫刺激性DNA序列。
蛋白质或肽。适于在本披露中用作佐剂的蛋白质和肽包括鞭毛蛋白融合蛋白、MBL(甘露糖结合凝集素)、细胞因子和趋化因子。
病毒颗粒。适于用作佐剂的病毒颗粒包括病毒体(磷脂细胞膜双层)。
在本披露中使用的佐剂可以是细菌来源的，诸如鞭毛蛋白、LPS或细菌毒素(例如肠毒素(蛋白质)，例如热不稳定毒素或霍乱毒素)。在本披露中使用的佐剂可以是杂交分子，诸如缀合至咪喹莫特的CpG。在本披露中使用的佐剂可以是真菌或与卵菌微生物相关分子模式(MAMP)，诸如几丁质或β-葡聚糖。在一些实施例中，佐剂是无机纳米颗粒，诸如金纳米棒或基于二氧化硅的纳米颗粒(例如介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN))。在一些实施例中，佐剂是用糖脂免疫调节剂(海藻糖6,6-二山梨酸酯(TDB)，这可以是位于分枝杆菌细胞壁上的索状因子的合成变体)稳定的多组分佐剂或佐剂体系，诸如AS01、AS03、AS04(MLP5+明矾)、CFA(完全弗氏佐剂：IFA+肽聚糖或海藻糖二霉菌酸酯)、CAF01(阳离子脂质体媒介物的两组分体系(二甲基双十八烷基铵(DDA))。
在一些实施例中，向受试者施用与佐剂组合的编码一种或多种免疫原的环状或线性多核糖核苷酸。如说明书全篇使用的术语“与......组合”包括作为治疗方案的一部分施用的任何两种组合物。这可以包括例如配制成单一药物组合物的多核糖核苷酸和佐剂。这还包括，例如，根据限定的治疗或给药方案，作为分开的组合物施用给受试者的多核糖核苷酸和佐剂。佐剂可以在多核糖核苷酸施用之前、基本上同时或之后施用给受试者。佐剂可以在多核糖核苷酸施用之前或之后的1天、2天、5天、10天、20天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月内施用。佐剂可以通过与多核糖核苷酸相同的施用途径(例如，肌内、皮下、静脉内、腹膜内、局部或口服)或不同的途径来施用。
疫苗
在本文所述的方法的一些实施例中，还向受试者施用第二试剂，例如，还向受试者施用第二疫苗。在一些实施例中，施用于受试者的组合物包含本文所述的环状多核糖核苷酸和第二疫苗。在一些实施例中，疫苗和环状多核糖核苷酸在分开的组合物中共同施用。该疫苗与环状多核糖核苷酸免疫接种同时施用，在环状多核糖核苷酸免疫接种之前或在环状多核糖核苷酸免疫接种之后施用。
例如，在一些实施例中，受试者用非环状多核糖核苷酸疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)和包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用第一微生物(例如，肺炎球菌)的非多核糖核苷酸疫苗和包含如本文披露的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物免疫接种。疫苗可以是任何细菌感染疫苗或病毒感染疫苗。在一个特定实施例中，疫苗是肺炎球菌多糖疫苗，诸如PCV13或PPSV23。在一些实施例中，疫苗是流感疫苗。在一些实施例中，疫苗是RSV疫苗(例如，帕利珠单抗(palivizumap))。
在一些实施例中，施用于受试者的组合物包含本文所述的线性多核糖核苷酸和疫苗。在一些实施例中，疫苗和线性多核糖核苷酸在分开的组合物中共同施用。该疫苗与线性多核糖核苷酸免疫接种同时施用，在线性多核糖核苷酸免疫接种之前或在线性多核糖核苷酸免疫接种之后施用。
例如，在一些实施例中，受试者用多核糖核苷酸(例如，非线性多核糖核苷酸)疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)和包含如本文披露的包含编码免疫原的序列的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用第一微生物(例如，肺炎球菌)的非多核糖核苷酸疫苗和包含如本文披露的包含编码免疫原的序列的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物免疫接种。疫苗可以是任何细菌感染疫苗或病毒感染疫苗。在一个特定实施例中，疫苗是肺炎球菌多糖疫苗，诸如PCV13或PPSV23。在一些实施例中，疫苗是流感疫苗。在一些实施例中，疫苗是RSV疫苗(例如，帕利珠单抗(palivizumap))。
其他实施例
在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述的组合物、方法和用途的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。虽已结合特定实施例描述了本发明，但应当理解，所要求的发明不应当过度地局限于此类特定实施例。事实上，对于本领域技术人员显而易见的用于进行本发明的所述方式的各种修改旨在落入本发明的范围内。
所有出版物、专利和专利申请均通过援引以其全文并入本文，其程度如同特别且单独地指出将每个单独的出版物、专利或专利申请通过援引以其全文并入一样。
实例
提出旨在说明而非限制本披露的以下实例，以向本领域普通技术人员提供可以如何使用、实现和评价本文所述的组合物和方法的描述。这些实例旨在仅是本披露的示例，而无意限制发明人视为其发明的内容范围。
实例1：编码免疫原的环状RNA的设计
该实例描述了编码免疫原的环状RNA的设计。在该实例中，将环状RNA设计成包括IRES、编码免疫原的ORF和侧接IRES-ORF的两个间隔元件。环化能够实现滚环翻译，具有交替交错元件以用于离散的ORF表达和受控的蛋白质化学计量的多个ORF，以及靶向RNA以用于核糖体进入的IRES。由环状RNA编码的示例性免疫原是SARS-Cov-2免疫原(RBD和刺突)、流感H1N1免疫原、HPV免疫原和肿瘤新抗原。
实例2：环状RNA的生成和纯化
在该实例中，通过两种示例性方法之一生成环状RNA，并再次用RNA纯化系统纯化。
示例性方法1：DNA夹板连接
该示例性方法通过夹板连接产生环状RNA。使用夹板DNA将RppH处理的线性RNA环化。使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从DNA区段合成未修饰的线性RNA。转录的RNA用RNA纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，用RNA5'磷酸水解酶(RppH)(新英格兰生物学实验室公司，M0356)按照制造商的说明处理。替代性地或另外，RNA在GMP相对于GTP过量的情况下转录。
夹板连接如下进行：通过使用RNA连接酶处理转录的线性RNA和长度介于10至40个核苷酸之间的DNA夹板来生成环状RNA。为了纯化环状RNA，在4％变性PAGE上解析连接混合物，并切除对应于每个环状RNA的RNA条带。碾碎切除的RNA凝胶片段，并用凝胶洗脱缓冲剂(0.5M乙酸钠、0.1％ SDS、1mM EDTA)在37℃下洗脱RNA一小时。替代性地或另外，通过柱色谱法纯化环状RNA。收获上清液，并通过向碾碎的凝胶中添加凝胶洗脱缓冲剂再次洗脱RNA，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并用乙醇沉淀。使用琼脂糖凝胶电泳作为验证纯度和环化的质量控制测量。
示例性方法2：通过自剪接内含子进行环化
该示例性方法通过自剪接产生环状RNA。环状RNA在体外生成。未修饰的线性RNA从包括以上列出的所有基序的DNA模板体外转录。体外转录反应包括1μg模板DNA T7 RNA聚合酶启动子、10X T7反应缓冲液、7.5mM ATP、7.5mM CTP、7.5mM GTP、7.5mM UTP、10mM DTT、40U RNA酶抑制剂和T7酶。在37℃下转录4小时。将转录的RNA用1U的DNA酶I在37℃下DNA酶处理15分钟。为了有利于通过自剪接进行的环化，添加额外的GTP至终浓度2mM，在55℃下孵育15分钟。然后将RNA进行柱纯化，并通过UREA-PAGE可视化。
实例3：环状RNA的多免疫原表达
该实例描述了由环状RNA表达多种免疫原。
在该实例中，将一个环状RNA设计为包括：IRES(SEQ ID NO:1)；然后是编码免疫原1的ORF，其对应于来自第一甲型H1N1流感毒株A/加利福尼亚/07/2009(H1N1)的血凝素(HA)的一部分(SEQ ID NO:2)；终止密码子；IRES(SEQ ID NO:1)；另一个编码免疫原2的ORF，其对应于来自第二甲型H1N1流感毒株A/波多黎各/8/1934的血凝素(HA)的一部分(SEQ IDNO:3)；终止密码子和间隔子(SEQ ID NO:4)，参见图1。根据本文所述的方法，在体外或在细胞中生成环状RNA。
简言之，将环状RNA在兔网织红细胞裂解物(RRL；普洛麦格公司(Promega)，美国威斯康星州菲奇堡(Fitchburg,WI,USA))中于30℃下孵育1.5-3小时。反应混合物的最终组成包括70％兔网织红细胞裂解物、20μM氨基酸混合物(普洛麦格公司；L446A)和0.8U/μL
Figure BDA0004113707750001531
核糖核酸酶抑制剂(普洛麦格公司，N211A)。通过三氯乙酸沉淀法去除血红蛋白。沉淀并离心后，弃去上清液并将团粒溶解在2x SDS样品缓冲液(赛默公司(Thermo))中，并在70℃下孵育15分钟。将样品在4％-12％梯度聚丙烯酰胺/十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶(赛默公司，NP0326BOX)上分离，然后进行蛋白质印迹。使用半干法将蛋白质电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(赛默公司)上，进行印迹，并用特异性抗体探测，并在C-Digit扫描仪(LI-COR生物科学公司(LI-COR Biosciences))上通过化学发光可视化。使用Image-Studio Lite(LI-COR生物科学公司)定量表达水平。
另外，在来自用eRNA转染的HeLa细胞的培养上清液中通过ELISA测量免疫原1和免疫原2的表达。简言之，在Opti-MEM(英杰公司(Invitrogen)；31985062)中使用MessengerMax(英杰公司；LMRNA015)将0.1pmol eRNA转染到10,000个HeLa细胞中。在第1天和第2天收获细胞上清液。ELISA如下进行：将捕获抗体于4℃在100μL PBS中包被到ELISA板(MaxiSorp 442404，96孔)上过夜。用TBS-T洗涤三次后，将板用封闭缓冲液(含2％ FBS和0.05％吐温20的TBS)封闭1小时。然后将上清液稀释液添加到每个孔的100μL封闭缓冲液中，并在室温下孵育1小时。用TBS-T洗涤三次后，将板与HRP检测抗体在室温下孵育1小时。将四甲基苯(Pierce 34021)添加到每个孔中，使其反应5-15分钟，然后用2N硫酸淬灭。将在450nm下测定光密度(OD)值。
实例4：编码源自相同靶标的多种免疫原的环状RNA
对于该实例，环状RNA编码源自两种不同蛋白质的两种多肽免疫原，但是其中两种蛋白质都鉴别相同的靶标。设计具有起始密码子、表达序列、交错元件和IRES的环状RNA(图2)。环化可实现被交错元件分隔开的多个表达序列的滚环翻译。
特别地，环状RNA编码起始密码子、包含源自HIV-1包膜糖蛋白120(gp120)的多肽免疫原的第一ORF、任选的交错元件、包含源自HIV-1包膜糖蛋白41(gp41)的多肽免疫原的第二ORF和任选的IRES，其中HIV-1包膜蛋白是多肽免疫原的靶标。三个gp120和三个gp41组合为异二聚体的三聚体，其中gp120的三聚体是头部区域而gp41的三聚体是尾部区域，它们一起形成HIV-1的包膜刺突。因此，源自gp120和gp41的多肽免疫原都包含在环状RNA中，以靶向HIV-1包膜蛋白。
实例5：编码源自不同靶标的多种免疫原的环状RNA
对于该实例，环状RNA编码源自两种不同蛋白质的两种多肽免疫原，两种不同蛋白质鉴别彼此不同的靶标。设计具有起始密码子、表达序列、交错元件和IRES的环状RNA(图2)。环化可实现被交错元件分隔开的多个表达序列的滚环翻译。
源自不同靶标的多种免疫原由环状RNA编码，该环状RNA如此设计成具有起始密码子，编码源自水痘-带状疱疹病毒(Varicella Zoster Virus)的包膜糖蛋白1(gP1)的多肽免疫原的ORF，交错序列和源自血凝素的多肽免疫原。水痘-带状疱疹病毒至少有6种包膜糖蛋白，并且糖蛋白gP1、gP2、gP3可以诱导人体产生中和抗体(Zweerink等人，1981；31(1):436-444)。同样，两种包膜糖蛋白、血凝素和融合蛋白也是麻疹病毒(Morbillivirus)的已知免疫原。因此，编码源自gP1的多肽免疫原和源自血凝素的多肽免疫原的环状RNA均靶向水痘-带状疱疹病毒和麻疹病毒。
实例6：来自环状RNA的多免疫原施用
该实例描述了通过施用多个环状RNA分子在受试者中表达多种免疫原。
在该实例中，将环状RNA 1设计为包括：IRES(SEQ ID NO:1)，其后是编码免疫原1的ORF，对应于来自第一甲型H1N1流感毒株A/加利福尼亚/07/2009的血凝素(HA)的一部分(SEQ ID NO:2)；终止密码子和间隔子(SEQ ID NO:4)，参见图3。将环状RNA 2设计为包括：IRES(SEQ ID NO:1)，其后是编码免疫原2的ORF，对应于来自第二甲型H1N1流感毒株A/波多黎各/8/1934的血凝素(HA)的一部分(SEQ ID NO:3)；终止密码子和间隔子(SEQ ID NO:4)，参见图3。通过体外转录(卢西根公司(Lucigen)；AS3107)和使用所述的RNA连接酶进行RNA连接通过本文提供的方法产生环状RNA。
配制如上所述的编码多种不同免疫原的多个环状RNA，以施用于哺乳动物受试者。
环状RNA以本文包括的任何配制品的形式配制。这些配制的RNA在第0天经由合适途径，即皮内、皮下、肌内或静脉内途径注射。
评价从哺乳动物受试者收集的血液或组织中分泌型免疫原的表达。在给药后1、2、7、14和21天将血样收集在无抗凝剂的试管中。通过在4℃下以1300g离心25分钟来分离血清，并通过ELISA测量分泌性蛋白的表达。简言之，将捕获抗体于4℃在100μL PBS中包被到ELISA板(MaxiSorp442404，96孔)上过夜。用TBS-T洗涤三次后，将板用封闭缓冲液(含2％FBS和0.05％吐温20的TBS)封闭1小时。然后将上清液稀释液添加到每个孔的100μL封闭缓冲液中，并在室温下孵育1小时。用TBS-T洗涤三次后，将板与HRP检测抗体在室温下孵育1小时。将四甲基苯(Pierce34021)添加到每个孔中，使其反应5-15分钟，然后用2N硫酸淬灭。在450nm下测定光密度(OD)值。
实例7：由环状RNA编码的免疫原和小分子佐剂的共同施用
该实例证明将环状RNA与小分子佐剂组合施用给受试者会刺激免疫反应。
在该实例中，设计编码多肽免疫原的环状RNA，生产、纯化并制备为配制品。为了刺激免疫反应，向受试者施用小分子佐剂，诸如
Figure BDA0004113707750001551
佐剂。将编码多肽免疫原的环状RNA的配制品和小分子佐剂都同时施用于受试者。
实例8：包括各自编码对应于不同靶标的多肽免疫原的多个环状RNA的免疫原性组合物的共同施用
对于该实例，将各自编码多肽免疫原的多个环状RNA施用于受试者(图3)。
将编码如本领域中已知的源自包膜蛋白血凝素的多肽免疫原以鉴别麻疹病毒靶标的一种环状RNA施用于受试者。还将编码本领域中已知的源自包膜蛋白糖蛋白E的多肽免疫原以鉴别水痘-带状疱疹病毒靶标的另一环状RNA施用于受试者。设计、生产、纯化两种环状RNA并制备成配制品。将包含两种环状RNA的配制品施用于受试者。
实例9：使用环状RNA在哺乳动物中体内诱导针对免疫原的抗体
配制如上所述的编码免疫原的环状多核苷酸以施用于哺乳动物受试者。该配制品在盐水中或在本文所传授的任何配制品中。含环状多核苷酸的疫苗任选地含有一种或多种树突靶向剂或部分。在第0天，经由合适的途径，皮内、皮下、肌内或静脉内途径注射包含编码免疫原的多核苷酸的疫苗。可以将编码免疫刺激剂或免疫刺激部分的多核苷酸与编码免疫原的多核苷酸共同施用以刺激免疫反应。按每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次或每八周一次对含有编码免疫原的环状多核苷酸的疫苗给予另外的攻击，直至检测到抗免疫原的抗体。施用另外的疫苗攻击以加强免疫原特异性抗体的产生。
实例10：检测哺乳动物细胞中来自环状RNA的蛋白质或免疫原表达
为了测量来自RNA构建体的非分泌性蛋白或免疫原的表达效率，根据本文所述的方法生产和纯化编码蛋白质或免疫原的环状RNA(0.1皮摩尔)。使用MessengerMax(英杰公司，LMRNA)将环状RNA转染到HEK293(96孔板中无血清培养基中，每孔10,000个细胞)中。
对于非分泌性蛋白或免疫原，使用免疫原特异性ELISA在24、48和72小时测量蛋白质表达。为了测量表达，在适当的时间点在每个孔中使用裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂裂解细胞。回收细胞裂解液，并以12,000rpm离心10分钟。收集上清液。
对于分泌性蛋白或免疫原，使用免疫原特异性蛋白质印迹法(Western blot)在24、48和72小时检测免疫原表达。简言之，从每个孔中取80μL来自哺乳动物细胞的上清液。通过BCA蛋白质测定方法测量收获的培养基中的蛋白质水平，并将相同量的蛋白质在4％-12％梯度的Bis-Tris凝胶(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))上解析，并使用iBlot2转移系统(赛默飞世尔科技公司)转移到硝酸纤维素膜上。使用抗免疫原抗体(义翘神州生物技术有限公司(Sino Biological))检测免疫原。通过iBright FL1500成像系统(英杰公司)监测来自蛋白质条带的化学发光信号。
实例11：哺乳动物细胞中来自环状RNA的RBD免疫原表达
该实例证明哺乳动物细胞中来自环状RNA的RBD免疫原表达。
在该实例中，根据本文所述的方法生产和纯化编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的环状RNA。
通过免疫沉淀联合蛋白质印迹法(IP-Western)测试编码RBD的环状RNA的表达。简言之，使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔公司，LMRNA015)将编码RBD免疫原的环状RNA(0.1皮摩尔)转染到BJ成纤维细胞和HeLa细胞(10,000个细胞)中。使用单独的MessengerMax作为对照。在24小时时收集上清液，并使用对与蛋白G-戴诺磁珠(Protein G-Dynabeads)(英杰公司，10003D)偶联的SARS-CoV-2 RBD-刺突糖蛋白(义翘神州生物技术有限公司，目录号：40592-T62)有特异性的兔抗体进行免疫沉淀并使用相同抗体检测通过PAGE解析的免疫沉淀产物。使用重组RBD(42ng)免疫沉淀作为对照并定量细胞蛋白的表达。使用Image StudioTMLite蛋白质印迹法定量软件(Li-COR生物科学公司)对膜化学发光进行定量。
在BJ成纤维细胞和HeLa细胞上清液中检测到由环状RNA编码的RBD免疫原，而在对照中则未检测到(图4)。
该实例表明，SAR-CoV-2 RBD免疫原(是分泌性蛋白)是从哺乳动物细胞中的环状RNA中表达的。
实例12：SARS-CoV-2 RBD免疫原在小鼠模型中的免疫原性
在小鼠模型中评价了用阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制的编码SARS-CoV-2RBD免疫原的环状RNA的免疫原性。在小鼠模型中还评价了用阳离子聚合物配制的针对SARS-CoV-2 RBD免疫原的抗体的产生。
在该实例中，将环状RNA设计成具有IRES和编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的ORF以及侧接IRES-ORF的两个间隔元件。环状RNA如下生成。以过量的5’单磷酸鸟苷，使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从DNA区段合成未修饰的线性RNA。按照制造商的说明，用RNA纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化转录的RNA。使用夹板DNA将纯化的线性RNA环化。
通过分裂连接生成环状RNA，如下：将转录的线性RNA和DNA夹板混合并退火，并用RNA连接酶处理。为了纯化环状RNA，通过反相色谱法解析连接混合物。通过增加流动相的有机物含量，从线性RNA中选择性洗脱环状RNA。分级收集洗脱的RNA，并测定其环状RNA的纯度。合并选择的级分并交换缓冲液以去除流动相盐和溶剂。使用丙烯酰胺凝胶电泳作为验证纯度和环化的质量控制测量。
将纯化的环状RNA在纯净水中稀释至1100ng/μL的浓度。将硫酸鱼精蛋白溶解在林格氏乳酸溶液(4000ng/μL)中。在搅拌的同时，将鱼精蛋白-林格氏乳酸溶液添加到一半环状RNA溶液中，直到RNA:鱼精蛋白的重量比为2:1。将该溶液再搅拌10分钟以确保形成稳定的复合物。然后添加剩余的环状RNA(即，将剩余的环状RNA添加到环状RNA:鱼精蛋白溶液中)，并短暂搅拌该溶液。使用林格氏乳酸溶液调节混合物(即，环状RNA混合物)的最终浓度，以获得环状RNA制剂，其最终RNA浓度为50μL中2μg或10μg RNA。
每组三只小鼠在第0天和第21天经肌内或皮内接种2μg或10μg剂量的环状RNA制剂或鱼精蛋白媒介物对照。在第0天和第21天施用环状RNA制剂后24小时，经肌内或皮内向每只小鼠施用AddavaxTM佐剂(英威杰公司(Invivogen))一次。按照制造商的说明，AddavaxTM佐剂按50μL在1X PBS中以50％给药。
通过亚摩尔抽吸从每只小鼠收集血液。在环状RNA给药后第7、14、21、23、28、35、41、49、56、63、69、77、84、108和115天，将血液收集到干燥的无抗凝剂的试管中。通过在4℃以1200g离心30分钟从全血中分离血清。通过56℃加热1小时使血清热灭活。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，测定各个热灭活的血清样品中是否存在RBD特异性IgG。将ELISA板(MaxiSorp 442404 96孔，能肯公司(Nunc))在4℃下用在100μL PBS中的SARS-CoV-2 RBD(义翘神州生物技术有限公司，40592-V08B；100ng)包被过夜。然后用封闭缓冲液(含2％FBS和0.05％吐温20的TBS)将板封闭1小时。然后将血清稀释液添加到每个孔的100μL封闭缓冲液中，并在室温下孵育1小时。用含
Figure BDA0004113707750001591
洗涤剂的1X Tris缓冲液(TBS-T)洗涤三次后，将板与抗小鼠IgG HRP检测抗体(Jackson 115-035-071)孵育1小时，接着用TBS-T洗涤三次，然后添加四甲基苯(Pierce 34021)。使ELISA板反应5分钟，然后使用2N硫酸淬灭。在450nm下测定光密度(OD)值。
将每个血清样品的光密度除以背景(包被有RBD，仅与二抗孵育的板)的光密度。绘制每个样品相对于背景的倍数。
结果显示，在注射环状RNA制剂后第14、21、23、28、35、41、49、56、63、69、77、84、108和115天获得抗RBD反应(图5)。注射鱼精蛋白媒介物后未获得抗RBD抗体。这些结果显示，编码RBD免疫原的环状RNA在小鼠中诱导抗原特异性免疫反应。
使用类似的ELISA测定血清样品中是否存在刺突特异性IgG。将ELISA板(MaxiSorp442404 96孔，能肯公司)在4℃下用在100μL PBS中的SARS-CoV-2刺突(义翘神州生物技术有限公司，40589-V08B1；100ng)包被过夜。然后用封闭缓冲液(含2％ FBS和0.05％吐温20的TBS)将板封闭1小时。然后将血清稀释液添加到每个孔的100μL封闭缓冲液中，并在室温下孵育1小时。用含
Figure BDA0004113707750001592
洗涤剂的1X Tris缓冲盐水(TBS-T)洗涤三次后，将板与抗小鼠IgG HRP检测抗体(Jackson 115-035-071)孵育1小时，接着用TBS-T洗涤三次，然后添加四甲基苯(Pierce 34021)。使ELISA板反应5分钟，然后使用2N硫酸淬灭。在450nm下测定光密度(OD)值。
结果显示，在注射环状RNA制剂后35天获得抗刺突抗体(图6)。注射媒介物后未获得抗刺突抗体。
在给药后第14天，使用测量相对IgG1与IgG2a同种型的测定法来表征血清抗体(图7)，并且使用PRNT中和测定法来表征血清抗体中和病毒的能力。结果显示，随佐剂一起肌内给药2ug RBD环状RNA具有中和能力。
实例13：使用环状RNA在哺乳动物中体内诱导针对流感HA免疫原的抗体
配制如上所述的编码流感HA免疫原的环状多核苷酸(参见，例如，实例1、3和6)，以施用于哺乳动物受试者。该配制品在盐水中或在本文所传授的任何配制品中。含环状多核苷酸的疫苗任选地含有一种或多种树突靶向剂或部分。在第0天，经由合适的途径，皮内、皮下、肌内或静脉内途径注射包含编码免疫原的多核苷酸的疫苗。可以将编码免疫刺激剂或免疫刺激部分的多核苷酸与编码免疫原的多核苷酸共同施用以刺激免疫反应。按每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次或每八周一次对含有编码免疫原的环状多核苷酸的疫苗给予另外的攻击，直至检测到抗HA抗体。施用另外的疫苗攻击以加强抗HA抗体的产生。
实例14：HA茎抗原的小鼠免疫原性研究比较
在该实例中，进行测定以评价对使用环状RNA递送的流感病毒疫苗免疫原的免疫反应。测试候选流感病毒疫苗在小鼠中的免疫原性，该疫苗包含自不同流感病毒株获得的编码HA茎蛋白的环状RNA多核苷酸。测试疫苗包括以下用或未用MC3 LNP配制的环状RNA。
在第0和3周用两剂不同的流感病毒RNA疫苗配制品为小鼠肌内免疫接种，并在用第二剂免疫接种后两周收集血清。
实例15：HA茎抗原的小鼠免疫原性研究比较
在该实例中，进行测定以评价对使用环状RNA递送的流感病毒疫苗免疫原的免疫反应。测试候选流感病毒疫苗在小鼠中的免疫原性，该疫苗包含自不同流感病毒株获得的编码HA茎蛋白的环状RNA多核苷酸。测试疫苗包括以下用或未用MC3 LNP配制的环状RNA。
在第0和3周用两剂不同的流感病毒RNA疫苗配制品为小鼠肌内免疫接种，并在用第二剂免疫接种后两周收集血清。
使用ELISA测试血清中是否存在能够与来自多种流感病毒株的血凝素(HA)结合的抗体。简言之，将ELISA板在4℃下用100ng在PBS中的重组HA(义翘神州生物技术有限公司)包被过夜。包被后，将板用含有0.05％吐温20的tris缓冲盐水(TBS-T)洗涤，然后用TBS-T+2％ BSA在室温下封闭1小时。封闭后，将100μL来自免疫小鼠的对照抗体或血清(稀释于TBS-T+2％ BSA中)添加到每张板的顶部孔中，并在含2％ BSA的TBS-T中连续稀释。将板密封，然后在室温下孵育1-2小时。将板用TBS-T洗涤，并且将山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP缀合物添加到含有小鼠血清的每个孔中。将板在室温孵育1小时，然后用TBS-T洗涤，并与TMB底物(Pierce 340214)孵育。使颜色显影约10分钟，然后用100μL的2N硫酸淬灭。在450nm下在酶标仪上对板进行读数。计算终点滴度。
实例16：针对甲型流感的环状RNA疫苗的小鼠功效研究
该实例描述了在体内对甲型流感有效的环状RNA疫苗。
测试疫苗包括配制在鱼精蛋白中的以下环状RNA。NIHGen6HASS-foldon环状RNA(基于Yassine等人Nat.Med.[自然医学]2015年9月；21(9):1065-70)，编码来自H3N2菌株的核蛋白NP的环状RNA，或NIHGen6HASS-foldon和NP环状RNA的几种组合之一。测试了几种疫苗免疫原共同递送的方法，这些方法包括：在用鱼精蛋白配制前将各环状RNA混合，在混合前配制各环状RNA，并分别配制环状RNA并注射远端部位(对侧腿)。对照动物用无环状RNA的鱼精蛋白接种(以控制鱼精蛋白的作用)或不接种(原初)。
在第0和第3周，对动物进行肌内(IM)免疫。候选流感病毒疫苗在实例13中有描述。在第二剂后两周从所有动物收集血清。在第6周，从动物的一个子集中收获脾脏。其余动物用克他命(Ketamine)和甲苯噻嗪(Xylazine)的混合物使其镇静，然后用致死剂量的小鼠适应甲型H1N1流感病毒株/波多黎各/8/1934进行鼻内攻击。记录死亡率，并在感染后20天每天评估各小鼠的体重。
为了测试血清中是否存在能够与来自多种流感毒株的血凝素(HA)或核蛋白(NP)结合的抗体，如上所述进行ELISA测定并计算终点滴度。
为了探测功能性抗体反应，评估血清中和一组HA-假型病毒的能力。简言之，将293细胞用含有萤火虫荧光素酶基因的复制缺陷型逆转录病毒载体、编码人气道丝氨酸蛋白酶的表达载体以及编码流感血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的表达载体共转染。从培养物上清液中收获所得假病毒，过滤并滴定。
将血清的连续稀释液与假病毒原液(每孔30,000-300,000个相对光单位)一起在96孔板中于37℃孵育一小时，然后将293细胞添加到每个孔中。将培养物在37℃下孵育72小时，此时添加荧光素酶底物和细胞裂解试剂，并在发光检测仪上测量相对光单位(RLU)。将中和滴度表示为抑制50％假病毒感染(IC50)的血清稀释度的倒数。
评估NIHGen6HASS-foldon抗血清介导体外抗体依赖性细胞毒性(ADCC)替代活性的能力。简言之，将连续滴定的小鼠血清样品与在细胞表面上稳定表达来自H1N1 A/波多黎各/8/1934的HA的A549细胞一起孵育。随后，将ADCC生物测定效应细胞(普洛麦格公司，小鼠FcgRIV NFAT-Luc效应细胞；M115A)添加到血清/靶细胞混合物中。大约6小时后，将Bio-glo试剂(普洛麦格公司；G7940)添加到样品孔中并测量发光。
在施用第二剂疫苗三周后，从每组动物的一个子集中收获脾脏，并合并来自同一组动物的脾细胞。用HA或NP肽库(安肽生技公司(Anaspec))刺激脾淋巴细胞，并通过细胞内染色和流式细胞术测量IFN-γ、IL-2或TNF-α的产生。
实例17：用于向非人类动物施用的环状RNA的配制
纯化后，如下配制环状RNA或mRNA：
A.将环状RNA或mRNA在PBS中稀释到50uL中为2.5或25皮摩尔的最终浓度，以获得环状RNA制剂或线性RNA制剂(未配制)。
B.根据制造商的说明(15％ TransIT、5％ Boost)，用脂质载剂(例如TransIT(米卢斯生物公司))和mRNA加强试剂(米卢斯生物公司)配制环状RNA或mRNA，以获得50uL中2.5皮摩尔或25皮摩尔的最终RNA浓度，以获得环状RNA制剂或线性RNA制剂。
C.将环状RNA或mRNA用阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制。简言之，将环状RNA或mRNA在纯净水中稀释。将硫酸鱼精蛋白溶解在林格氏乳酸溶液(4000ng/uL)中。在搅拌的同时，将鱼精蛋白-林格氏乳酸溶液添加到一半环状RNA或mRNA溶液中，直到RNA:鱼精蛋白的重量比为2:1。将该溶液再搅拌10分钟以确保形成稳定的复合物。然后添加剩余的环状RNA或mRNA(即，将剩余的环状RNA添加到环状RNA溶液中，将剩余的mRNA添加到mRNA溶液中)，并短暂搅拌该溶液。使用林格氏乳酸溶液调节混合物(即，环状RNA混合物或mRNA混合物)的最终浓度，以获得最终RNA浓度为每50uL中2.5或25皮摩尔的环状RNA制剂或线性RNA制剂。
D.用脂质纳米颗粒配制环状RNA或mRNA。简言之，将环状RNA或mRNA在pH＝4的25mM乙酸盐缓冲液中稀释(通过0.2μm过滤器过滤)到0.2μg/μL的浓度。首先通过将可电离脂质(例如ALC0315)、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000以50/38.5/10/1.5mol％的摩尔比溶解在乙醇中(通过0.2μm无菌过滤器过滤)来配制脂质纳米颗粒(LNP)。最终可电离脂质/RNA重量比为8/1w/w。使用微流体系统将脂质和RNA溶液在微混合器芯片中混合，流速比为3/1缓冲液/乙醇且总流速为1ml/min。然后将LNP在pH＝7.4的PBS中透析3小时以去除乙醇。使用Ribogreen测定法测量LNP内部的RNA浓度和包封效率。如有必要，可使用截止值为100kDa的Amicon离心过滤器将LNP浓缩至所需的RNA浓度。使用Zetasizer Ultra(马尔文帕纳科(Malvern Pananaytical))测量颗粒的大小、浓度和电荷。用PBS将RNA浓度调节至0.1或0.2μg/μl的最终浓度。对于含有两种RNA序列的配制品，在LNP中配制之前或在单独配制每种RNA之后将RNA混合。对于体内实验，通过无菌的0.2μm再生纤维素过滤器过滤LNP中配制的最终RNA。
实例18：使用定时佐剂递送调节小鼠体内由环状RNA产生高斯荧光素酶
该实例证实在递送佐剂以刺激免疫反应的同时，体内由环状RNA表达蛋白质或免疫原。
在该实例中，根据本文所述的方法生产和纯化编码GLuc的环状RNA。如实例17中所述配制环状RNA，以获得环状RNA制剂(例如，Trans-IT配制的，鱼精蛋白配制的，PBS/未配制的)。经由后腿单次肌内注射向小鼠施用每种环状RNA制剂的50μL注射液。通过单次皮内注射向另一组小鼠背部皮内施用鱼精蛋白配制的环状RNA制剂。
为了刺激免疫反应，在0小时或24小时将AddavaxTM佐剂(英威杰公司)(一种基于角鲨烯的水包油纳米乳剂，其配方类似于
Figure BDA0004113707750001641
佐剂)注射至小鼠后腿(与环状RNA制剂同时递送)。根据制造商的说明，AddavaxTM佐剂按50μL给药。
通过亚摩尔抽吸从每只小鼠收集血样(～25μL)。在环状RNA给药后0、6、24和48小时，将血液收集到EDTA试管中。通过在4℃下以1300g离心30分钟分离血浆，并使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司(Thermo Scientific Pierce))测试了高斯荧光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μL 1x GLuc底物添加到5μL血浆中，以进行GLuc荧光素酶活性测定。在发光检测仪(普洛麦格公司)中混合后立即读取平板。
该实例证明使用以下方法可在长时间内在体内从环状RNA成功表达蛋白质：(a)肌内注射TransIT配制的、鱼精蛋白配制的和未配制的环状RNA制剂，不递送佐剂(图8)和在0和24小时递送佐剂(图9)；以及(b)皮内注射鱼精蛋白配制的环状RNA制剂，不递送佐剂和在24小时递送佐剂(图10)。
实例19：通过评估RNA酶H产生的核酸降解产物表征环状RNA制剂
该实例证明评估环状RNA制剂中RNA酶H产生的核酸降解产物可以检测线性和连环化产物相对于环状产物。
与连接酶一起孵育时，RNA不能反应或形成分子内或分子间键，分别生成环状(无游离末端)或连环化RNA(线性的)。使用互补DNA引物和RNA酶H(一种识别DNA/RNA双链体的非特异性核酸内切酶)处理每种类型的RNA，预期会依据起始RNA物质产生独特数量的具有特定大小的降解产物。
基于RNA酶H降解产生的RNA的数目和大小，可证实连接的RNA是无连环化RNA污染的环状RNA或有连环化RNA污染的环状RNA。将引物和RNA酶H添加到环状RNA中时，单个引物与环状RNA形成双链体，而RNA酶H降解DNA/RNA双链体区以产生单一线性RNA产物。当将引物和RNA酶H添加到连环体中时，至少两个引物与连环化RNA形成双链体，而RNA酶H降解DNA/RNA双链体以产生三种产物；一种产物是从5’末端到第一引物结合区的RNA，一种产物是在第一引物结合区和下一引物结合区之间的RNA，根据连接在一起的连环体的数目，其可以包括多个RNA，并且最后一种产物是从最后一个引物结合区到3'末端的RNA。将引物和RNA酶H添加到线性RNA中时，单个引物与线性RNA形成双链体以产生从5’末端到引物结合区的一种RNA产物和引物结合区到3’末端的另一种RNA产物。图11的左侧草图说明了该策略。
在该实例中，环状RNA如下生成。使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从DNA区段合成未修饰的线性RNA。转录的RNA用RNA纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用RNA5'焦磷酸水解酶(RppH)(新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。将环状RNA设计成包括IRES以及编码纳米荧光素酶(Nluc)的ORF和侧接IRES-ORF的两个间隔元件。
为了测试RNA的环化状态，将0.05皮摩尔/μl线性RNA或环状RNA制剂与0.25U/μlRNA酶H(消化DNA/RNA双链体的内切核糖核酸酶)和0.3皮摩尔/μl的与Nluc RNA互补的10至30个核酸互补的寡聚体在37℃下孵育30分钟。孵育后，通过6％变性PAGE分析反应混合物。将凝胶用SYBR-green染色并通过E-凝胶成像仪可视化。通过ImageJ测量和分析可视化凝胶上的条带强度。
图11的右侧示出了该实验中的实际裂解产物。线性RNA泳道中该数目的条带与RNA酶H核酸内切酶一起孵育产生了预期的两个条带，而在泳道A的情况下在环状RNA泳道中检测到单条条带，表明环状RNA实际上是环状的而非连环化的。在泳道B和泳道C的情况下，在RNA酶H处理后由于RNA酶H泳道中出现多个较小的片段条带，可见来自线性和连环化污染的条带。
实例20：细胞中合成环状RNA的滚环翻译产生离散蛋白质产物
该实例证明在细胞中，经由合成环状RNA的滚环翻译翻译出离散蛋白质或免疫原产物，该环状RNA缺少终止元件(终止密码子)，例如具有交错元件代替终止元件(终止密码子)。另外，该实例显示，具有交错元件的环状RNA比其线性对应物表达更多具有正确分子量的蛋白质或免疫原产物。
将环状RNA设计为包括具有交错元件代替终止元件(终止密码子)的纳米荧光素酶基因(nLUC)。用以下转染细胞：媒介物：仅转染试剂；线性nLUC：EMCV IRES、交错元件(2A序列)、3x带FLAG标签的nLuc序列和交错元件(2A序列)；或环状nLUC：EMCV IRES、交错元件(2A序列)、3x带FLAG标签的nLuc序列和交错元件(2A序列)。如图12中所示，与线性RNA相比，环状RNA产生更高水平的具有正确分子量的蛋白质。
24小时后，通过加入100μl RIPA缓冲液收获细胞。以1400xg离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。
使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗FLAG抗体和抗小鼠IgG过氧化物酶一起孵育。用ECL试剂盒可视化印迹并通过ImageJ测量蛋白质印迹带强度。
如图12中所示，在细胞中检测到环状RNA翻译产物。特别地，不具有终止元件(终止密码子)的环状RNA比其线性RNA对应物产生更高水平的具有正确分子量的离散蛋白质产物。
实例21：具有调控核酸位点的环状RNA的制备
该实例证明具有调控RNA结合位点的环状RNA的体外产生。
不同的细胞类型拥有独特的核酸调控机制来靶向特定的RNA序列。在环状RNA中编码这些特定序列可以在不同细胞类型中赋予独特的特性。如以下实例所示，将环状RNA工程化以编码微小RNA结合位点。
在该实例中，环状RNA包括编码WT EMCV IRES的序列、mir692微小RNA结合位点和侧接IRES-ORF的两个间隔元件。
环状RNA在体外生成。除了用于驱动转录的T7 RNA聚合酶启动子外，未修饰的线性RNA还从包括以上列出的所有基序的DNA模板体外转录。转录的RNA用RNA清除试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化，按照制造商的说明用RNA 5'-磷酸水解酶(RppH)(新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并再次用RNA纯化柱纯化。使用长度为10至40个核苷酸的夹板DNA和T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)将RppH处理的RNA环化。将环状RNA进行尿素-PAGE纯化(图13)，在缓冲液(0.5M乙酸钠，0.1％ SDS，1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀并且重悬于无RNA酶的水中。
如图13中所示，生成了具有miRNA结合位点的环状RNA。
实例22：检测血液中的分泌型免疫原
通过亚摩尔抽吸从每只小鼠收集血样(～25μL)进行分析。在环状RNA给药后0小时、6小时、24小时、48小时和7天，将血液收集到EDTA试管中。通过在4℃下以1300g离心30分钟来分离血浆。使用ELISA或蛋白质印迹评估分泌型免疫原的表达，例如对于RBD免疫原而言，使用如实例11中所述的方法。
实例23：免疫原抗体的检测
该实例描述了如何确定免疫原抗体的存在。
如Chen X等人所述使用ELISA(medRxiv,doi:doi.org/10.1101/2020.04.06.20055475(2020))。简言之，将每孔100μL PBS中的SARS-CoV-2蛋白于4℃包被在ELISA板上过夜。然后用封闭缓冲液(5％ FBS加上0.05％吐温20)将ELISA板封闭1小时。然后在1小时内将10倍稀释的血浆添加到每个孔的100μL封闭缓冲液中。用含
Figure BDA0004113707750001681
洗涤剂的1X磷酸盐缓冲盐水(PBST)洗涤后，将结合的抗体与抗小鼠IgG HRP检测抗体(英杰公司)一起孵育30分钟，接着用PBST洗涤，然后用PBS洗涤，并添加四甲基苯。使ELISA板反应5分钟，然后使用1M HCl终止缓冲液淬灭。在450nm下测定光密度(OD)值。
A.对于SARS-CoV-2 RBD免疫原的抗体，所用的SARS-CoV-2蛋白质是SARS-CoV-2RBD(义翘神州生物技术有限公司，40592-V08B)。
B.对于SARS-CoV-2刺突免疫原的抗体，所用的SARS-CoV-2蛋白质是SARS-CoV-2刺突蛋白(义翘神州生物技术有限公司，40591-V08H)。实例24：环状RNA的蛋白质表达增加
该实例证明细胞中的合成环状RNA翻译。另外，该实例显示，环状RNA比其线性对应物产生更多具有正确分子量的表达产物。
将线性RNA和环状RNA设计为包括具有终止元件(终止密码子)的纳米荧光素酶基因(nLUC)。用以下转染细胞：媒介物：仅转染试剂；线性nLUC：EMCV IRES、交错元件(2A序列)、3x带FLAG标签的nLuc序列、交错元件(2A序列)和终止元件(终止密码子)；或环状nLUC：EMCV IRES、交错元件(2A序列)、3x带FLAG标签的nLuc序列、交错元件(2A序列)和终止元件(终止密码子)。如图14所示，与线性RNA相比，环状RNA产生更高水平的具有正确分子量的蛋白质。
24小时后，通过加入100μl RIPA缓冲液收获细胞。以1400xg离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。
使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗FLAG抗体和抗小鼠IgG过氧化物酶一起孵育。用ECL试剂盒可视化印迹并通过ImageJ测量蛋白质印迹带强度。
如图14所示，环状RNA在细胞中被翻译成蛋白质。特别地，环状RNA比其线性RNA对应物产生更高水平的具有正确分子量的蛋白质。实例25：环状RNA的体内再给药
该实例证明了使用两剂环状RNA驱动体内环状RNA表达的能力。
对于该实例，环状RNA包括EMCV IRES、编码高斯荧光素酶(GLuc)的ORF和侧接IRES-ORF的两个间隔元件。
环状RNA在体外生成。未修饰的线性RNA从包括以上列出的所有基序以及用于驱动转录的T7 RNA聚合酶启动子的DNA模板体外转录。转录的RNA用Monarch RNA清除试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化，按照制造商的说明用RNA 5'-磷酸水解酶(RppH，新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并再次用Monarch RNA清除系统纯化。使用长度为10至40个核苷酸的夹板DNA和T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)将RppH处理的RNA环化。环状RNA经过尿素-PAGE纯化，在缓冲液(0.5M乙酸钠、0.1％ SDS、1mMEDTA)中洗脱，乙醇沉淀并重悬于RNA储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号AM7000)中。
小鼠在第0天接受单剂尾静脉注射0.25μg具有高斯荧光素酶ORF的环状RNA，或作为对照的线性RNA，二者均在作为载剂的基于脂质的转染试剂(米卢斯(Mirus))中配制，第56天施用第二剂。
在给药后1、2、7、11、16和23天，收集每只小鼠的尾静脉血样(50μl)到EDTA管中。通过在4℃下以1300g离心25分钟分离血浆，并使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测试了高斯荧光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μl 1X GLuc底物添加到5μl血浆中，以进行GLuc荧光素酶活性测定。在发光检测仪(普洛麦格公司)中混合后立即读取平板。
在第一剂环状RNA给药后1、2、7、11、16和23天，在血浆中检测到高斯荧光素酶活性(图15)。
相反，仅在经修饰的线性RNA给药后1和2天在血浆中检测到高斯荧光素酶活性(图15)。
在第二剂环状RNA给药后2、3、8和15天再次在血浆中检测到高斯荧光素酶活性(图15)。
相反，仅在经修饰的线性RNA给药后1、2、3天在血浆中检测到高斯荧光素酶活性。
该实例证明环状RNA在更长时间段中体内表达蛋白质，以及在注射后数天血浆中的蛋白质活性水平。另外，证明环状RNA的再给药产生了相似的表达谱。
实例26：环状RNA的体内交错给药
该实例证明了使用连续交错剂量的环状RNA驱动体内环状RNA更高表达蛋白质或免疫原的能力。
对于该实例，环状RNA包括EMCV IRES、编码高斯荧光素酶(GLuc)的ORF和侧接IRES-ORF的两个间隔元件。
环状RNA在体外生成。未修饰的线性RNA从包括以上列出的所有基序以及用于驱动转录的T7 RNA聚合酶启动子的DNA模板体外转录。转录的RNA用RNA清除试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化，按照制造商的说明用RNA 5'-磷酸水解酶(RppH)(新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并再次用RNA纯化柱纯化。使用长度为10至40个核苷酸的夹板DNA和T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)将RppH处理的RNA环化。环状RNA经过尿素-PAGE纯化，在缓冲液(0.5M乙酸钠，0.1％ SDS，1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀并重悬于无RNA酶的水中。
在第0天、第2天和第5天，小鼠接受一剂尾静脉注射0.25pmol具有高斯荧光素酶ORF的环状RNA，或作为对照的线性RNA，二者均在作为载剂的基于脂质的转染试剂(米卢斯)中配制。
在给药后6小时、1、2、3、5、7、14、21、28、35、42天，从每只小鼠的尾静脉中收集血样(50μl)到EDTA管中。通过在4℃下以1300g离心25分钟分离血浆，并使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测试了高斯荧光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μl 1X GLuc底物添加到5μl血浆中，以进行GLuc荧光素酶活性测定。在发光检测仪(普洛麦格公司)中混合后立即读取平板。
在单剂环状RNA给药后6小时，1、2、3、5、7、14、21、28天，在血浆中检测到高斯荧光素酶活性(图16和图17)。当给药3个剂量时，在第一剂环状RNA给药后6小时，1、2、3、5、7、14、21、28、35天，在血浆中检测到高斯荧光素酶活性(图16和图17)。
相反，仅在经修饰的线性RNA给药后6小时、1、2、3天在血浆中检测到高斯荧光素酶活性并且表达水平不会增加超过其初始剂量。即使另外的线性RNA给药，在第x天或之后仍未检测到高于背景水平的来自线性RNA来源的蛋白质的酶活性(图16和图17)。
该实例证明环状RNA在更长时间段中体内表达蛋白质，在多次注射后血浆中的蛋白质活性水平增加。另外，证明环状RNA而不是线性RNA的重复给药引起表达。
实例27：经由肌内注射裸剂量和重复剂量(redose)的环状RNA
该实例证明了使用两剂肌内施用的环状RNA驱动体内环状RNA表达蛋白质或免疫原的能力。
对于该实例，环状RNA包括EMCV IRES、编码高斯荧光素酶(GLuc)的ORF和侧接IRES-ORF的两个间隔元件。
根据本文所述的方法生产并纯化环状RNA和mRNA。
为了生成未配制的RNA，然后将环状RNA和mRNA在100μL PBS中稀释到2.5皮摩尔的最终浓度。
小鼠接受向后腿单次肌内注射2.5皮摩尔的具有高斯荧光素酶ORF的环状RNA。在第0天进行注射，并在第49天施用第二剂。使用仅媒介物作为对照。
在给药后1、2、7、11、16和23天，通过颏下穿刺将血样(50μL)收集到EDTA管中。通过在4℃下以1300g离心25分钟分离血浆，并使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测试了高斯荧光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μL 1X GLuc底物添加到5μl血浆中，以进行GLuc荧光素酶活性测定。在发光检测仪(普洛麦格公司)中混合后立即读取平板。
在第一剂未配制的环状RNA给药后1、2、7、11、16和23天，在血浆中检测到高斯荧光素酶活性。(图18)
相反，仅在未配制的mRNA给药后1和2天在血浆中检测到高斯荧光素酶活性。(图18)
在第二剂未配制的环状RNA给药后2、3、8和15天再次在血浆中检测到高斯荧光素酶活性。(图18)
相反，仅在未配制的经修饰的mRNA给药后1、2和3天在血浆中检测到高斯荧光素酶活性。(图18)
在每种情况下，高斯荧光素酶活性高于仅媒介物的对照。
该实例证明无载剂的肌内施用的环状RNA在更长时间段中体内表达蛋白质，以及在注射后数天血浆中的蛋白质活性水平。另外，证明环状RNA的再给药产生了相似的表达谱。
实例28：静脉内重复注射五次载剂重复剂量的环状RNA引起功能性蛋白质的表达
该实例证明了使用五剂静脉内施用的环状RNA驱动体内环状RNA表达的能力。
对于该实例，环状RNA包括EMCV IRES、编码高斯荧光素酶(GLuc)的ORF和侧接IRES-ORF的两个间隔元件。
根据本文所述的方法生产并纯化环状RNA和mRNA。
使用阳离子脂质载剂配制环状RNA和mRNA。在该实例中，根据制造商的说明，将10％ TransIT(米卢斯生物公司)和5％增进剂与RNA复合。
小鼠接受0.25皮摩尔包括高斯荧光素酶ORF的环状RNA的单尾静脉注射剂量。注射在以下时间进行：第0天、第71天、第120天、第196天和第359天。使用仅媒介物作为对照。
在给药后0.25、1、2、3、7、14、21、28和35天，通过颏下穿刺将血样(50μL)收集到EDTA管中。通过在4℃下以1300g离心25分钟分离血浆，并使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测试了高斯荧光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μL 1X GLuc底物添加到5μL血浆中，以进行GLuc荧光素酶活性测定。在发光检测仪(普洛麦格公司)中混合后立即读取平板。
当用Trans-IT配制的环状RNA给药时，在以下时间点在血浆中检测到高斯荧光素酶活性：第一剂给药后第1、2、3、7、14、21和28天；第二剂给药后第1、2、3、7、14和21天；第三剂给药后第1、2、3、7、14和21天；第四剂给药后第1、2、3、7、14、21和28天；以及，第五剂给药后第1、2、3、7、14和21天。(图19)
相反，当用Trans-IT配制的经修饰的mRNA给药时，在以下时间点在血浆中检测到高斯荧光素酶活性：第一剂给药后第0.25、1和2天；第二剂给药后第0.25、1和2天；第三剂给药后第0.25、1和2天；第四剂给药后第0.25、1和2天；以及，第五剂给药后第0.25、1和2天。(图19)
在每种情况下，环状RNA的高斯荧光素酶活性高于mRNA并且因此表达也高于mRNA。
该实例证明静脉内施用的环状RNA在更长时间段中在体内表达蛋白质，以及在注射后数天血浆中的蛋白质活性水平，并且可以再给药至少5次。另外，证明环状RNA长期再给药产生了相似的表达谱。
实例29：在哺乳动物细胞中由环状RNA表达多种免疫原
该实例证明在哺乳动物细胞中由环状RNA表达多种免疫原。
实验1
根据本文所述的方法设计并纯化编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的第一环状RNA(核酸SEQ ID NO:33；氨基酸SEQ ID NO:32)和编码SARS-CoV-2刺突免疫原的第二环状RNA(核酸SEQ ID NO:31；氨基酸SEQ ID NO:30)。将第一环状RNA和第二环状RNA混合在一起以获得混合物。使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔公司，LMRNA015)将混合物(各1皮摩尔的环状RNA)转染到HeLa细胞(24孔板中每孔100,000个细胞)中。作为对照，使用MessengerMax也将第一环状RNA和第二环状RNA单独转染到HeLa细胞中。
在24小时时使用SARS-CoV-2 RBD免疫原特异性ELISA测量RBD免疫原的表达。在24小时时通过流式细胞术测量刺突免疫原的表达。
通过用该混合物转染，在HeLa细胞上清液中检测到SARS-Co-V-2RBD免疫原，并且在HeLa细胞的细胞表面检测到SARS-CoV-2刺突免疫原。通过用第一环状RNA转染，检测到SARS-CoV-2 RBD免疫原，但未检测到SARS-CoV-2刺突免疫原。通过用第二环状RNA转染，检测到SARS-CoV-2刺突免疫原，但未检测到SARS-CoV-2 RBD免疫原。这证明在哺乳动物细胞中由环状RNA的组合混合物表达SAR-CoV-2 RBD和SARS-CoV-2刺突免疫原两者。
实验2
根据本文所述的方法设计并生产编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的第一环状RNA(核酸SEQ ID NO:33；氨基酸SEQ ID NO:32)和编码高斯荧光素酶(GLuc)多肽的第二环状RNA(核酸SEQ ID NO:37；氨基酸SEQ ID NO:36)。将第一环状RNA和第二环状RNA单独与Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔公司，LMRNA015)复合，然后混合在一起以获得混合物。将混合物(各0.1皮摩尔的环状RNA)转染到HeLa细胞(96孔板中每孔20,000个细胞)中。作为对照，使用MessengerMax也将第一环状RNA和第二环状RNA单独转染到HeLa细胞中。
在24小时时使用SARS-CoV-2 RBD免疫原特异性ELISA测量RBD免疫原的表达。在24小时时使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测量GLuc活性。
通过用该混合物转染，在24小时时在HeLa细胞上清液中检测到SARS-CoV-2 RBD免疫原和GLuc活性。通过用第一环状RNA转染，检测到SARS-CoV-2 RBD免疫原，但未检测到GLuc活性。通过用第二环状RNA转染，检测到GLuc活性，但未检测到SARS-CoV-2 RBD免疫原。这证明在哺乳动物细胞中由环状RNA的组合混合物表达SAR-CoV-2 RBD和GLuc免疫原两者。
实验3
根据本文所述的方法设计并生产编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的第一环状RNA(核酸SEQ ID NO:33；氨基酸SEQ ID NO:32)和编码来自甲型H1N1流感A/加利福尼亚/07/2009的血凝素(HA)免疫原的第二环状RNA(核酸SEQ ID NO:35；氨基酸SEQ ID NO:34)。将第一环状RNA和第二环状RNA混合在一起以获得混合物。使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔公司，LMRNA015)将混合物(各1皮摩尔的环状RNA)转染到HeLa细胞(24孔板中每孔100,000个细胞)中。作为对照，使用MessengerMax也将第一环状RNA和第二环状RNA单独转染到HeLa细胞中。
在24小时时使用SARS-CoV-2 RBD免疫原特异性ELISA测量RBD免疫原的表达。在24小时时使用免疫印迹法测量HA免疫原表达。简言之，对于免疫印迹法，在转染后24小时，裂解细胞并使用甲型流感H1N1 HA(A/加利福尼亚/07/2009)单克隆抗体(MA5-29920(赛默飞世尔公司))作为一抗并使用山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)作为二抗(艾博抗公司(Abcam)，ab97023)进行蛋白质印迹法以检测HA免疫原。为了负载对照，将α微管蛋白与作为一抗的α微管蛋白(DM1A)小鼠抗体(细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology)，CST#3873)和作为二抗的山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)(艾博抗公司，ab 97023)一起使用。
通过用混合物转染，检测到SARS-CoV-2 RBD和流感HA免疫原两者。通过用第一环状RNA转染，检测到SARS-CoV-2 RBD，但未检测到流感HA免疫原。通过用第二环状RNA转染，检测到流感HA免疫原，但未检测到SARS-CoV-2 RBD免疫原。这证明在哺乳动物细胞中由环状RNA的组合混合物表达SAR-CoV-2 RBD和流感HA免疫原两者。
实验4
根据本文所述的方法设计并生产编码SARS-CoV-2刺突免疫原的第一环状RNA(核酸SEQ ID NO:31；氨基酸SEQ ID NO:30)和编码来自甲型H1N1流感A/加利福尼亚/07/2009的血凝素(HA)的第二环状RNA(核酸SEQ ID NO:35；氨基酸SEQ ID NO:34)。将第一环状RNA和第二环状RNA混合在一起以获得混合物。使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔公司，LMRNA015)将混合物(各1皮摩尔的环状RNA)转染到HeLa细胞(24孔板中每孔100,000个细胞)中。作为对照，使用MessengerMax也将第一环状RNA和第二环状RNA单独转染到HeLa细胞中。
在24小时时通过流式细胞术测量刺突免疫原的表达。如上文实验3中所述，在24小时时通过免疫印迹法测量HA免疫原表达。
通过用混合物转染，检测到SARS-CoV-2刺突免疫原和流感HA免疫原两者。通过用第一环状RNA转染，检测到SARS-CoV-2刺突免疫原，但未检测到流感HA免疫原。通过用第二环状RNA转染，检测到流感HA免疫原，但未检测到SARS-CoV-2刺突免疫原。这证明在哺乳动物细胞中由环状RNA的组合混合物表达SAR-CoV-2刺突和流感HA免疫原两者。
该实例显示，在哺乳动物细胞中从包含环状RNA的不同组合的环状RNA制剂表达了多种免疫原。
实例30：环状RNA的多免疫原表达
该实例证明在哺乳动物细胞中由环状RNA表达多种免疫原。
实验1
在该实例中，将环状RNA设计为包括IRES，其后是编码GLuc多肽的ORF、终止密码子、间隔子、IRES、编码SARS-Cov-2 RBD免疫原的ORF和终止密码子。根据本文所述的方法产生并纯化环状RNA。作为对照，如上所述产生以下环状RNA：(i)具有IRES和编码SARS-CoV-2RBD免疫原的ORF的环状RNA；(ii)具有IRES和编码GLuc多肽的ORF的环状RNA。
使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔公司，LMRNA015)将环状RNA(0.1皮摩尔)转染到HeLa细胞(96孔板中每孔10,000个细胞)中。
在24小时时使用SARS-CoV-2 RBD免疫原特异性ELISA测量RBD免疫原的表达。在24小时时使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测量GLuc活性。
从编码SARSs-CoV-2 RBD免疫原和GLuc多肽的环状RNA中检测到RBD免疫原表达(图20A)。从编码SARSs-CoV-2 RBD免疫原和GLuc的环状RNA中检测到GLuc活性(图20B)。这证明哺乳动物细胞中从编码SARS-CoV-2 RBD和GLuc免疫原的环状RNA表达SAR-CoV-2 RBD和GLuc免疫原。
实验2
在该实例中，将环状RNA设计为包括IRES，其后是编码SARS-CoV-2RBD免疫原的ORF、终止密码子、间隔子、IRES、编码中东呼吸综合征(MERS)RBD免疫原的ORF和终止密码子。根据本文所述的方法产生并纯化环状RNA。
使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔公司，LMRNA015)以各种浓度将环状RNA转染到HeLa细胞(96孔板中每孔10,000个细胞)中。
在24小时时使用SARS-CoV-2 RBD免疫原特异性ELISA测量SARS-CoV-2 RBD免疫原的表达。在24小时时使用能够检测的MERS RBD免疫原特异性抗体测量MERS RBD免疫原表达。
实例31：小鼠模型中来自环状RNA的多种免疫原的免疫原性
该实例描述了通过施用多个环状RNA分子在受试者中表达多种免疫原。
实验1
在小鼠模型中评价配制于脂质纳米颗粒中的环状RNA制剂的免疫原性，该环状RNA制剂包含(a)编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的环状RNA以及(b)编码多肽作为模型免疫原的GLuc多肽的环状RNA。还在小鼠模型中评价了针对SARS-CoV-2 RBD免疫原的抗体的产生和GLuc活性。
根据本文所述的方法设计并纯化编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的第一环状RNA(核酸SEQ ID NO:33；氨基酸SEQ ID NO:32)和编码GLuc多肽的第二环状RNA(核酸SEQ ID NO:37；氨基酸SEQ ID NO:36)。将第一环状RNA和第二环状RNA混合在一起以获得混合物。然后如实例17中所述用脂质纳米颗粒配制该混合物，以获得第一环状RNA制剂。还如实例17中所述用脂质纳米颗粒单独配制第一环状RNA和第二环状RNA，然后混合在一起以获得第二环状RNA制剂。
三只小鼠在第0天肌内接种第一环状RNA制剂(总剂量为10μg RBD+10μg GLuc)并且在第12天接种第二环状RNA制剂(总剂量为10μg RBD+10μg GLuc)。在第0天和第12天还对另外的小鼠(每组3只或4只)进行以下肌内接种：(i)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第一环状RNA；(ii)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第二环状RNA；或(iii)PBS。
通过下颌下抽吸从每只小鼠收集血液。用第一环状RNA制剂初免后2天和17天将血液收集到干燥的无抗凝剂的试管中。通过在4℃下以1200g离心30分钟从全血中分离血清。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，测定各血清样品中是否存在RBD特异性IgG。将ELISA板(MaxiSorp 442404 96孔，能肯公司)在4℃下用在100μL的1X包被缓冲液(百进生技公司(Biolegend)，421701)中的SARS-CoV-2 RBD(义翘神州生物技术有限公司，40592-V08B；100ng)包被过夜。然后用封闭缓冲液(含2％ BSA和0.05％吐温20的TBS)将板封闭1小时。然后将血清稀释液(1:500、1:1500、1:4500和1:13,500)添加到每个孔的100μL封闭缓冲液中，并在室温下孵育1小时。用含
Figure BDA0004113707750001791
洗涤剂的1X Tris缓冲盐水(TBS-T)洗涤三次后，将板与抗小鼠IgG HRP检测抗体(艾博抗公司，ab97023)孵育1小时，接着用TBS-T洗涤三次，然后添加四甲基苯(百进生技公司，421101)。使ELISA板反应10-20分钟，然后使用0.2N硫酸淬灭。在450nm下测定光密度(O.D.)值。
将每个血清样品的光密度除以背景(包被有RBD，仅与二抗孵育的板)的光密度。绘制每个样品相对于背景的倍数。
使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测试GLuc的活性。将50μL1x GLuc底物添加到10μL血清中，以进行GLuc荧光素酶活性测定。在发光检测仪(普洛麦格公司)中混合后立即读取平板。
结果显示在初免后17天(即，注射第一环状RNA制剂后17天)获得抗RBD抗体(图21A)，并且在初免后2天(即，注射第一环状RNA制剂后2天)检测到GLuc活性(图21B)。
这些结果显示，包含两种编码不同免疫原的环状RNA的环状RNA制剂诱导免疫原特异性免疫反应。
实验2
在小鼠模型中评价配制于脂质纳米颗粒中的环状RNA制剂的免疫原性，该环状RNA制剂包含(a)编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的环状RNA以及(b)编码流感血凝素(HA)免疫原的环状RNA。还在小鼠模型中评价了针对SARS-CoV-2 RBD和流感HA免疫原的抗体的产生。
根据本文所述的方法设计并产生编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的第一环状RNA(核酸SEQ ID NO:33；氨基酸SEQ ID NO:32)和编码来自甲型H1N1流感A/加利福尼亚/07/2009的血凝素(HA)的第二环状RNA(核酸SEQ ID NO:35；氨基酸SEQ ID NO:34)。将第一环状RNA和第二环状RNA混合在一起以获得混合物。然后如实例17中所述用脂质纳米颗粒配制该混合物，以获得第一环状RNA制剂。还如实例17中所述用脂质纳米颗粒单独配制第一环状RNA和第二环状RNA，然后混合在一起以获得第二环状RNA制剂。
三只小鼠在第0天肌内接种第一环状RNA制剂(总剂量为10μg RBD+10μg HA)并且在第12天接种第二环状RNA制剂(总剂量为10μg RBD+10μg HA)。在第0天和第12天还对另外的小鼠(每组3只或4只)进行以下肌内接种：(i)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第一环状RNA；(ii)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第二环状RNA；或(iii)PBS。
如实验1中所述采集血液。如实验1中所述，通过ELISA确定RBD特异性IgG的存在。
通过ELISA测定各血清样品中是否存在HA特异性IgG。将ELISA板在4℃下用HA重组蛋白(义翘神州生物技术有限公司，11085-V08B；100ng)包被过夜，并将板如实验1中所述进行处理。将每个血清样品的光密度除以背景(包被有HA，仅与二抗孵育的板)的光密度。绘制每个样品相对于背景的倍数。
结果显示，在初免后17天(即，注射第一环状RNA制剂后17天)获得抗RBD和抗HA抗体(图22A和图22B)。
结果还显示，包含两种编码不同免疫原的环状RNA的环状RNA制剂在体内表达并诱导免疫原特异性免疫反应。
实验3
在小鼠模型中评价配制于脂质纳米颗粒中的环状RNA制剂的免疫原性，该环状RNA制剂包含(a)编码SARS-CoV-2刺突免疫原的环状RNA以及(b)编码流感血凝素(HA)免疫原的环状RNA。还在小鼠模型中评价了针对SARS-CoV-2刺突和流感HA免疫原的抗体的产生。
根据本文所述的方法设计并生产编码SARS-CoV-2刺突免疫原的第一环状RNA(核酸SEQ ID NO:31；氨基酸SEQ ID NO:30)和编码来自甲型H1N1流感A/加利福尼亚/07/2009的血凝素(HA)的第二环状RNA(核酸SEQ ID NO:35；氨基酸SEQ ID NO:34)。将第一环状RNA和第二环状RNA混合在一起以获得混合物。然后如实例17中所述用脂质纳米颗粒配制该混合物，以获得第一环状RNA制剂。还如实例17中所述用脂质纳米颗粒单独配制第一环状RNA和第二环状RNA，然后混合在一起以获得第二环状RNA制剂。
三只小鼠在第0天肌内接种第一环状RNA制剂(总剂量为10μg刺突+10μg HA)并且在第12天接种第二环状RNA制剂(总剂量为10μg刺突+10μg HA)。在第0天和第12天还对另外的小鼠(每组3只或4只)进行以下肌内接种：(i)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第一环状RNA；(ii)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第二环状RNA；或(iii)PBS。
如实验1中所述采集血液。通过在4℃下以1200g离心30分钟从全血中分离血清。如实验1中所述，通过ELISA测定各血清样品中是否存在RBD(即刺突的RBD)特异性IgG。
通过ELISA测定各血清样品中是否存在HA特异性IgG。将ELISA板在4℃下用HA重组蛋白(义翘神州生物技术有限公司，11085-V08B；100ng)包被过夜，并将板如实验1中所述进行处理。将每个血清样品的光密度除以背景(包被有HA，仅与二抗孵育的板)的光密度。绘制每个样品相对于背景的倍数。
结果显示，在初免后17天(即，注射第一环状RNA制剂后17天)获得抗RBD抗体和抗HA抗体(图23A和图23B)。
结果还显示，包含两种编码不同免疫原的环状RNA的环状RNA制剂在小鼠中诱导免疫原特异性免疫反应。
实例32：包含多种免疫原的环状RNA在小鼠模型中的免疫原性
该实例描述了包含多种免疫原的环状RNA的免疫原性。该实例还描述了在小鼠模型中针对由单个环状RNA编码的多种免疫原的抗体的产生。
实验1
在该实验中，将环状RNA设计成包括IRES，其后是编码GLuc多肽的ORF、终止密码子、间隔子、IRES、编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的ORF和终止密码子，如实例30中所述产生和纯化。作为对照，如上所述产生以下环状RNA：(i)具有IRES和编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的ORF的环状RNA；(ii)具有IRES和编码GLuc多肽的ORF的环状RNA。
如实例17中所述用脂质纳米颗粒配制环状RNA，以获得环状RNA制剂。
每组三只小鼠在第0天和第12天肌内接种10μg或20μg总剂量的环状RNA制剂。
如实例31中所述采集血液。如实例31中所述，通过ELISA确定RBD特异性IgG的存在。如实例31中所述测量GLuc活性。
实验2
在小鼠模型中评价包含配制在脂质纳米颗粒中的环状RNA的环状RNA制剂的免疫原性，该环状RNA设计为包括IRES，其后是编码SARS-CoV-2 RBD免疫原的ORF、终止密码子、间隔子、IRES、编码MERS RBD免疫原的ORF和终止密码子。还在小鼠模型中评价了针对SARS-CoV-2 RBD和MERS RBD免疫原的抗体的产生。
然后如实例17中所述用脂质纳米颗粒配制该环状RNA，以获得环状RNA制剂。
在第0天和初始施用后至少一天，以5μg、10μg、20μg或50μg的量用环状RNA制剂对小鼠进行肌内或皮内接种。
如实验1中所述采集血液。如实验1中所述，通过ELISA确定SARS-CoV-2 RBD特异性和MERS RBD特异性IgG的存在。
测定各血清样品中是否存在抗SARS-CoV-2 RBD结合抗体、抗MERS RBD结合抗体、针对SARS-CoV-2 RBD免疫原的中和抗体、针对MERS RBD免疫原的中和抗体、对SARS-CoV-2免疫原的细胞反应以及对MERS RBD免疫原的细胞反应。
实例33：对T细胞反应的评价
使用ELISpot测定法检测SARS-CoV-2刺突或RBD特异性T细胞或流感HA特异性T细胞的存在。对来自实例31的以下几组小鼠进行该项测定：
1.RBD
2.GLuc
3.HA
4.刺突
5.RBD+HA
6.刺突+HA
7.PBS
在加强后第30天(即，注射第一环状RNA制剂后30天)收获小鼠脾脏，并将其加工成单细胞悬液。将脾细胞以每孔0.5M细胞接种在IFN-g或IL-4ELISpot板(ImmunoSpot)上。脾细胞不受刺激或用SARS CoV-2和HA肽库(JPT、PM-WCPV-SRB和PM-IFNA_HACal)刺激。将ELISPOT板根据制造商的方案进行处理。
实例34：施用了编码多种免疫原的环状RNA的小鼠中的抗体反应的评价
本实例证明由编码多种免疫原表达的环状RNA的施用产生抗体反应。
使用血凝抑制测定法(HAI)测量来自小鼠的血清中妨碍血凝的抗流感HA抗体。向小鼠施用环状RNA的制剂，每种环状RNA根据本文所述的方法设计和产生，并且编码以下物质的表达：SARS-CoV-2 RBD免疫原、SARS-CoV-2刺突免疫原、流感HA免疫原、SARS-CoV-2RBD免疫原和流感HA免疫原、SARS-CoV-2 RBD免疫原和GLuc多肽，或SARS-CoV-2RBD免疫原和SARS-CoV-2刺突免疫原。血液采集如实例30实验1所述，并在注射后第2天和第17天进行。
制备在第2天和第17天从小鼠收集的样品的两倍连续稀释液。将固定量的具有已知血凝素(HA)滴度的流感病毒添加到96孔板的每个孔中，达到相当于4个血凝素单位的浓度，血清对照孔除外，其中不添加病毒。将板在室温下静置60分钟，之后添加红细胞样品并使其在4℃下孵育30分钟。妨碍血凝的最高血清稀释度经确定为血清的HAI滴度。第17天收集的样品显示，当单独施用或与SARS-CoV-2免疫原例如RBD或刺突组合施用时，施用了编码流感HA免疫原的环状RNA制剂的样品中出现HAI滴度(图24)。在未施用HA免疫原(例如单独的SARS-CoV-2 RBD免疫原或单独的SARS-CoV-2刺突免疫原)的样品中，在第17天未见HAI滴度。
实例中援引的序列
Figure BDA0004113707750001851
Figure BDA0004113707750001861
Figure BDA0004113707750001871
Figure BDA0004113707750001881
Figure BDA0004113707750001891
序列表
<110> 旗舰创业创新第六有限责任公司（Flagship Pioneering Innovations VI,LLC）
<120> 免疫原性组合物及其用途
<130> 51509-024WO3
<150> US 63/125,769
<151> 2020-12-15
<150> US 63/125,778
<151> 2020-12-15
<150> US 63/074,442
<151> 2020-09-03
<150> US 63/074,428
<151> 2020-09-03
<150> US 63/068,936
<151> 2020-08-21
<150> US 63/034,704
<151> 2020-06-04
<150> US 63/027,932
<151> 2020-05-20
<160> 37
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 552
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt 60
ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga 120
cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg 180
tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt 240
gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat 300
aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg 360
aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg 420
taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt 480
cgaggttaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac 540
acgatgataa ta 552
<210> 2
<211> 1698
<212> DNA
<213> 甲型H1N1流感病毒
<220>
<223> 毒株A/加利福尼亚/07/2009
<400> 2
atgaaagcga ttctggtggt gctgctgtat acctttgcga ccgcgaacgc ggataccctg 60
tgcattggct atcatgcgaa caacagcacc gataccgtgg ataccgtgct ggaaaaaaac 120
gtgaccgtga cccatagcgt gaacctgctg gaagataaac ataacggcaa actgtgcaaa 180
ctgcgcggcg tggcgccgct gcatctgggc aaatgcaaca ttgcgggctg gattctgggc 240
aacccggaat gcgaaagcct gagcaccgcg agcagctgga gctatattgt ggaaaccccg 300
agcagcgata acggcacctg ctatccgggc gattttattg attatgaaga actgcgcgaa 360
cagctgagca gcgtgagcag ctttgaacgc tttgaaattt ttccgaaaac cagcagctgg 420
ccgaaccatg atagcaacaa aggcgtgacc gcggcgtgcc cgcatgcggg cgcgaaaagc 480
ttttataaaa acctgatttg gctggtgaaa aaaggcaaca gctatccgaa actgagcaaa 540
agctatatta acgataaagg caaagaagtg ctggtgctgt ggggcattca tcatccgagc 600
accagcgcgg atcagcagag cctgtatcag aacgcggatg cgtatgtgtt tgtgggcagc 660
agccgctata gcaaaaaatt taaaccggaa attgcgattc gcccgaaagt gcgcgatcag 720
gaaggccgca tgaactatta ttggaccctg gtggaaccgg gcgataaaat tacctttgaa 780
gcgaccggca acctggtggt gccgcgctat gcgtttgcga tggaacgcaa cgcgggcagc 840
ggcattatta ttagcgatac cccggtgcat gattgcaaca ccacctgcca gaccccgaaa 900
ggcgcgatta acaccagcct gccgtttcag aacattcatc cgattaccat tggcaaatgc 960
ccgaaatatg tgaaaagcac caaactgcgc ctggcgaccg gcctgcgcaa cattccgagc 1020
attcagagcc gcggcctgtt tggcgcgatt gcgggcttta ttgaaggcgg ctggaccggc 1080
atggtggatg gctggtatgg ctatcatcat cagaacgaac agggcagcgg ctatgcggcg 1140
gatctgaaaa gcacccagaa cgcgattgat gaaattacca acaaagtgaa cagcgtgatt 1200
gaaaaaatga acacccagtt taccgcggtg ggcaaagaat ttaaccatct ggaaaaacgc 1260
attgaaaacc tgaacaaaaa agtggatgat ggctttctgg atatttggac ctataacgcg 1320
gaactgctgg tgctgctgga aaacgaacgc accctggatt atcatgatag caacgtgaaa 1380
aacctgtatg aaaaagtgcg cagccagctg aaaaacaacg cgaaagaaat tggcaacggc 1440
tgctttgaat tttatcataa atgcgataac acctgcatgg aaagcgtgaa aaacggcacc 1500
tatgattatc cgaaatatag cgaagaagcg aaactgaacc gcgaagaaat tgatggcgtg 1560
aaactggaaa gcacccgcat ttatcagatt ctggcgattt atagcaccgt ggcgagcagc 1620
ctggtgctgg tggtgagcct gggcgcgatt agcttttgga tgtgcagcaa cggcagcctg 1680
cagtgccgca tttgcatt 1698
<210> 3
<211> 1695
<212> DNA
<213> 甲型H1N1流感病毒
<220>
<223> 毒株A/波多黎各/8/1934
<400> 3
atgaaagcga acctgctggt gctgctgtgc gcgctggcgg cggcggatgc ggataccatt 60
tgcattggct atcatgcgaa caacagcacc gataccgtgg ataccgtgct ggaaaaaaac 120
gtgaccgtga cccatagcgt gaacctgctg gaagatagcc ataacggcaa actgtgccgc 180
ctgaaaggca ttgcgccgct gcagctgggc aaatgcaaca ttgcgggctg gctgctgggc 240
aacccggaat gcgatccgct gctgccggtg cgcagctgga gctatattgt ggaaaccccg 300
aacagcgaaa acggcatttg ctatccgggc gattttattg attatgaaga actgcgcgaa 360
cagctgagca gcgtgagcag ctttgaacgc tttgaaattt ttccgaaaga aagcagctgg 420
ccgaaccata acaccaacgg cgtgaccgcg gcgtgcagcc atgaaggcaa aagcagcttt 480
tatcgcaacc tgctgtggct gaccgaaaaa gaaggcagct atccgaaact gaaaaacagc 540
tatgtgaaca aaaaaggcaa agaagtgctg gtgctgtggg gcattcatca tccgccgaac 600
agcaaagaac agcagaacct gtatcagaac gaaaacgcgt atgtgagcgt ggtgaccagc 660
aactataacc gccgctttac cccggaaatt gcggaacgcc cgaaagtgcg cgatcaggcg 720
ggccgcatga actattattg gaccctgctg aaaccgggcg ataccattat ttttgaagcg 780
aacggcaacc tgattgcgcc gatgtatgcg tttgcgctga gccgcggctt tggcagcggc 840
attattacca gcaacgcgag catgcatgaa tgcaacacca aatgccagac cccgctgggc 900
gcgattaaca gcagcctgcc gtatcagaac attcatccgg tgaccattgg cgaatgcccg 960
aaatatgtgc gcagcgcgaa actgcgcatg gtgaccggcc tgcgcaacat tccgagcatt 1020
cagagccgcg gcctgtttgg cgcgattgcg ggctttattg aaggcggctg gaccggcatg 1080
attgatggct ggtatggcta tcatcatcag aacgaacagg gcagcggcta tgcggcggat 1140
cagaaaagca cccagaacgc gattaacggc attaccaaca aagtgaacac cgtgattgaa 1200
aaaatgaaca ttcagtttac cgcggtgggc aaagaattta acaaactgga aaaacgcatg 1260
gaaaacctga acaaaaaagt ggatgatggc tttctggata tttggaccta taacgcggaa 1320
ctgctggtgc tgctggaaaa cgaacgcacc ctggattttc atgatagcaa cgtgaaaaac 1380
ctgtatgaaa aagtgaaaag ccagctgaaa aacaacgcga aagaaattgg caacggctgc 1440
tttgaatttt atcataaatg cgataacgaa tgcatggaaa gcgtgcgcaa cggcacctat 1500
gattatccga aatatagcga agaaagcaaa ctgaaccgcg aaaaagtgga tggcgtgaaa 1560
ctggaaagca tgggcattta tcagattctg gcgatttata gcaccgtggc gagcagcctg 1620
gtgctgctgg tgagcctggg cgcgattagc ttttggatgt gcagcaacgg cagcctgcag 1680
tgccgcattt gcatt 1695
<210> 4
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
aaaaaacaaa aaacaaaacg gctattaata gccgaaaaac aaaaaacaaa aaaaacaaaa 60
aaaaaaccaa aaaaacaaaa caca 84
<210> 5
<211> 96
<212> RNA
<213> 丁型肝炎病毒
<400> 5
ggcucaucuc gacaagaggc ggcaguccuc aguacucuua cucuuuucug uaaagaggag 60
acugcuggac ucgccgccca aguucgagca ugagcc 96
<210> 6
<211> 74
<212> RNA
<213> 丁型肝炎病毒
<400> 6
ggcuagaggc ggcaguccuc aguacucuua cucuuuucug uaaagaggag acugcuggac 60
ucgccgcccg agcc 74
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Val或Ile
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 7
Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Cys His Tyr Ser Glu Leu
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是不存在或Gly或His
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是不存在或Asp或Gly
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Asp或Val或Ile或Ser或Met
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 9
Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Gly Asp Ile Glu Glu Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Val Glu Pro Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Ile Glu Thr Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Gly Asp Ile Glu Ser Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Gly Asp Val Glu Leu Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Gly Asp Ile Glu Thr Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Gly Asp Val Glu Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Gly Asp Val Glu Gln Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Ile Glu Ser Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Gly Asp Ile Glu Leu Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
His Asp Ile Glu Thr Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
His Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
His Asp Val Glu Met Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Gly Asp Met Glu Ser Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Gly Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Gly Asp Ile Glu Gln Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Asp Ser Glu Phe Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 29
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (3)..(3)
<223> n是a或g
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> n是a或g
<400> 29
ccnnccaugg 10
<210> 30
<211> 1273
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 30
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 31
<211> 3819
<212> DNA
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 31
atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60
agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120
aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggatt tgttcttacc tttcttttcc 180
aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240
aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300
ataagaggct ggatctttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360
aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420
ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480
tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540
ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600
tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660
tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720
ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780
ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840
gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900
tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960
caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020
gtttttaacg ccaccagatt tgcatccgtg tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080
tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140
ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200
gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260
tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320
cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380
ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440
aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500
aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560
ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620
ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680
cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740
acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800
ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860
cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920
aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980
gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040
cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100
gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160
agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220
tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280
acacaattaa accgtgcttt aactgggata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340
gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400
aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460
ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520
cttggtgata ttgctgctag ggacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580
ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640
acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700
caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760
aaattgattg ccaaccaatt taatagtgcc attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820
acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880
acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940
ctttcacgtc ttgaccctcc cgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000
cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060
tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120
gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180
gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240
atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300
cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360
tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420
ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480
tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540
aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600
caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660
atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720
tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780
tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacaca 3819
<210> 32
<211> 241
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 32
Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu
1 5 10 15
Ala Lys Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile
20 25 30
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
35 40 45
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
50 55 60
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
65 70 75 80
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
85 90 95
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
100 105 110
Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
115 120 125
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
130 135 140
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
145 150 155 160
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
165 170 175
Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
180 185 190
Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr
195 200 205
Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
210 215 220
Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn
225 230 235 240
Phe
<210> 33
<211> 723
<212> DNA
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 33
atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcattgctg tggccgaggc caagagagtc 60
caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 120
gtttttaacg ccaccagatt tgcatccgtg tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 180
tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 240
ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 300
gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 360
tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 420
cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 480
ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 540
aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 600
aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 660
ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 720
ttc 723
<210> 34
<211> 566
<212> PRT
<213> 甲型H1N1流感病毒
<400> 34
Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn
1 5 10 15
Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val
50 55 60
Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Val Glu Thr Pro Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe
100 105 110
Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp
130 135 140
Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu
195 200 205
Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser
210 215 220
Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln
225 230 235 240
Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys
245 250 255
Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe
260 265 270
Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro
275 280 285
Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn
290 295 300
Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser
370 375 380
Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His
405 410 415
Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn
435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu
450 455 460
Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly
465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val
485 490 495
Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu
500 505 510
Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr
515 520 525
Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val
530 535 540
Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu
545 550 555 560
Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 35
<211> 1698
<212> DNA
<213> 甲型H1N1流感病毒
<400> 35
atgaaagcaa tactagtagt tcttctatat acatttgcaa ccgctaacgc tgatacattg 60
tgtataggat atcacgcgaa caactccacc gatacagtag atacagtact agagaagaac 120
gtaacagtaa cacattctgt taatcttcta gaagacaagc ataacggcaa actgtgcaaa 180
ctaagaggtg tagccccatt gcatctagga aagtgtaata tagctggctg gattttggga 240
aatccagagt gtgaatcatt aagtacagca agctcctggt cctatatagt ggaaacacct 300
agtagtgata acggaacgtg ttacccagga gattttatag attacgagga gctaagagag 360
cagctgtcgt cagtatcatc atttgaaagg tttgaaattt tcccgaaaac atcctcctgg 420
cccaatcacg atagtaacaa aggagtaaca gcagcctgtc ctcacgctgg agcaaaaagc 480
ttctataaaa atttaatctg gctagtgaag aagggaaatt catatccaaa gctaagtaaa 540
agttatataa acgataaggg caaggaagta ctcgtactgt ggggcattca tcatccatct 600
actagtgctg atcaacaaag tttatatcaa aacgcagacg catacgtttt tgtggggtca 660
agtagatata gcaagaaatt taaaccagaa atagcaataa gacctaaagt aagggatcaa 720
gaaggcagaa tgaactatta ttggacacta gtagaaccgg gagataaaat aacttttgaa 780
gcaacaggaa atctagtggt tcccaggtac gcatttgcaa tggaaagaaa cgctggatca 840
ggcatcatta tatctgatac accagtccac gattgtaata caacttgtca aacacctaaa 900
ggagctataa acaccagctt accatttcaa aatattcatc ctatcacaat tggaaagtgt 960
ccaaaatacg taaaaagtac aaaattgaga ttggccacag gattacgaaa tattccatca 1020
attcaatcta gaggactttt tggtgcaatt gcaggtttca tagaaggagg ctggactggg 1080
atggtagacg gctggtacgg ttatcatcat caaaacgaac agggaagtgg atacgcagct 1140
gatcttaaaa gtacacaaaa cgcaattgac gagattacta ataaagtaaa ttctgtaatt 1200
gaaaaaatga atactcagtt tacagcagta gggaaagagt ttaaccacct ggaaaaaaga 1260
atagaaaatt taaataaaaa agtagacgac ggatttcttg acatttggac ttataacgcc 1320
gaactattgg tattactaga aaacgaaaga actctagatt atcacgattc aaacgtaaaa 1380
aatttatacg aaaaagtaag aagccaactt aaaaataacg caaaagaaat aggaaacggc 1440
tgttttgaat tttatcacaa gtgtgataat acctgcatgg aaagtgttaa aaacgggaca 1500
tacgattatc caaaatactc agaagaagca aaattaaata gagaagaaat agacggcgta 1560
aaattagaat caacaaggat atatcaaata ttagcaatat attcaactgt cgcttcttca 1620
ttggtactgg tagtttctct aggtgcaata tcattttgga tgtgctctaa cggctcccta 1680
cagtgtagaa tttgtata 1698
<210> 36
<211> 185
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu
1 5 10 15
Ala Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala
20 25 30
Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro
35 40 45
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Met Glu Ala Asn Ala
50 55 60
Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile
65 70 75 80
Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg Cys His Thr
85 90 95
Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Ser Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile
100 105 110
Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu
115 120 125
Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys
130 135 140
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp
145 150 155 160
Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val
165 170 175
Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp
180 185
<210> 37
<211> 558
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60
gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120
gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagatg 180
gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240
aagtgcacgc ccaagatgaa gaagttcatc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300
aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360
ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420
acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480
ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540
ggggccggtg gtgactaa 558

Claims (57)

1.一种环状多核糖核苷酸，其包含多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中这些多肽免疫原中的至少两种鉴别不同的靶标。
2.如权利要求1所述的环状多核糖核苷酸，其中所述多肽免疫原中的每一种鉴别不同的靶标。
3.如权利要求1或2所述的环状多核糖核苷酸，其中每个靶标是不同的病原体。
4.如权利要求3所述的环状多核糖核苷酸，其中每个靶标独立地是病毒、细菌、真菌或寄生虫。
5.如权利要求4所述的环状多核糖核苷酸，其中每个靶标是不同的病毒。
6.如权利要求4所述的环状多核糖核苷酸，其中每个靶标是不同的细菌。
7.如权利要求4所述的环状多核糖核苷酸，其中所述靶标包括病毒和细菌。
8.一种环状多核糖核苷酸，其包含多个序列，每个序列编码多肽免疫原，其中所述多肽免疫原中的至少两种鉴别不同的蛋白质，其中所述不同的蛋白质中的每一种鉴别相同的靶标。
9.如权利要求8所述的环状多核糖核苷酸，其中所述多肽免疫原中的每一种鉴别不同的蛋白质。
10.如权利要求8或9所述的环状多核糖核苷酸，其中所述靶标是病原体。
11.如权利要求10所述的环状多核糖核苷酸，其中所述病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。
12.如权利要求11所述的环状多核糖核苷酸，其中所述病原体是病毒并且所述不同的蛋白质中的每一种是与所述病毒相关的病毒蛋白。
13.如权利要求11所述的环状多核糖核苷酸，其中所述病原体是细菌并且所述不同的蛋白质中的每一种是与所述细菌相关的细菌蛋白。
14.如权利要求8或9所述的环状多核糖核苷酸，其中所述靶标是癌细胞。
15.如权利要求14所述的环状多核糖核苷酸，其中所述不同的蛋白质中的每一种是与所述癌细胞相关的不同肿瘤抗原。
16.如权利要求8或9所述的环状多核糖核苷酸，其中所述靶标是过敏原或毒素。
17.如权利要求1-16中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中所述环状多核糖核苷酸包含500至20,000个核糖核苷酸。
18.如权利要求1-16中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中所述环状多核糖核苷酸包含至少1,000个核糖核苷酸。
19.如权利要求1-18中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中所述环状多核糖核苷酸包含至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少九个序列，每个序列编码多肽免疫原。
20.如权利要求1-18中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中所述环状多核糖核苷酸包含两个至三个、两个至五个或五个至十个序列，每个序列编码多肽免疫原。
21.如权利要求1-20中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中至少一个编码多肽免疫原的序列进一步编码信号序列。
22.如权利要求1-21中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中编码所述多肽免疫原中的每一种的每一个序列与内部核糖体进入位点(IRES)可操作地连接。
23.如权利要求22所述的环状多核糖核苷酸，其中所述环状多核糖核苷酸包含单个IRES。
24.如权利要求23所述的环状多核糖核苷酸，其中所述多肽免疫原中的每一种由与所述单个IRES可操作地连接的单个开放阅读框编码，其中所述开放阅读框的表达产生包含所述多肽免疫原中的每一种的氨基酸序列的多肽。
25.如权利要求24所述的环状多核糖核苷酸，其中所述多肽免疫原各自被多肽接头隔开。
26.如权利要求24所述的环状多核糖核苷酸，其中所述多肽免疫原各自被裂解结构域隔开。
27.如权利要求26所述的环状多核糖核苷酸，其中每个裂解结构域均为2A自裂解肽。
28.如权利要求22所述的环状多核糖核苷酸，其中所述环状多核糖核苷酸包含多个IRES。
29.如权利要求28所述的环状多核糖核苷酸，其中每个IRES与包含编码多肽免疫原的序列的开放阅读框可操作地连接。
30.一种包含多个环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物，每个环状多核糖核苷酸均包含编码多肽免疫原的序列。
31.如权利要求30所述的免疫原性组合物，其中所述多个环状多核糖核苷酸中的每一个均为如权利要求1-29中任一项所述的环状多核糖核苷酸。
32.如权利要求31所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包含(a)包含编码第一多肽免疫原的序列的至少第一环状多核糖核苷酸和(b)包含编码第二多肽免疫原的序列的至少第二环状多核糖核苷酸，其中所述第一多肽免疫原和第二多肽免疫原鉴别不同的蛋白质，其中每种不同的蛋白质鉴别相同的靶标。
33.如权利要求32所述的免疫原性组合物，其中所述靶标是病原体。
34.如权利要求33所述的免疫原性组合物，其中所述病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。
35.如权利要求32所述的免疫原性组合物，其中所述靶标是癌细胞、过敏原或毒素。
36.如权利要求30所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包含(a)包含编码第一多肽免疫原的序列的至少第一环状多核糖核苷酸和(b)包含编码第二多肽免疫原的序列的至少第二环状多核糖核苷酸，其中所述第一多肽免疫原鉴别第一靶标而所述第二多肽免疫原鉴别第二靶标。
37.如权利要求36所述的免疫原性组合物，其中每个靶标均为病原体。
38.如权利要求36或37所述的免疫原性组合物，其中每个靶标独立地是癌细胞、病毒、细菌、真菌、寄生虫、毒素或过敏原。
39.如权利要求30-38中任一项所述的免疫原性组合物，其中每种多肽免疫原均与IRES可操作地连接。
40.一种药物组合物，其包含如权利要求1-29中任一项所述的环状多核糖核苷酸或如权利要求30-39中任一项所述的免疫原性组合物，以及药学上可接受的赋形剂。
41.如权利要求40所述的药物组合物，其进一步包含佐剂。
42.如权利要求41所述的药物组合物，其中所述佐剂是无机佐剂、小分子佐剂和水包油乳剂、脂质或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基于RNA的佐剂、基于DNA的佐剂、病毒颗粒、细菌佐剂、杂交分子、真菌或卵母细胞微生物相关分子模式(MAMP)、无机纳米颗粒或多组分佐剂。
43.一种治疗或预防受试者的疾病、病症或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-29中任一项所述的环状多核糖核苷酸、如权利要求30-39中任一项所述的免疫原性组合物或如权利要求40-42中任一项所述的药物组合物。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是病毒感染、细菌感染、真菌感染。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是癌症。
46.如权利要求43所述的方法，其中所述疾病、病症或病状与暴露于过敏原相关。
47.如权利要求43所述的方法，其中所述疾病、病症或病状与暴露于毒素相关。
48.一种在受试者中诱导免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-29中任一项所述的环状多核糖核苷酸、如权利要求30-39中任一项所述的免疫原性组合物或如权利要求40-42中任一项所述的药物组合物。
49.如权利要求43-48中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用佐剂。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述佐剂是无机佐剂、小分子佐剂和水包油乳剂、脂质或聚合物、肽或肽聚糖、碳水化合物或多糖、皂苷、基于RNA的佐剂、基于DNA的佐剂、病毒颗粒、细菌佐剂、杂交分子、真菌或卵母细胞微生物相关分子模式(MAMP)、无机纳米颗粒或多组分佐剂。
51.如权利要求43-50中任一项所述的方法，其中如权利要求1-29中任一项所述的环状多核糖核苷酸、如权利要求30-39中任一项所述的免疫原性组合物、或如权利要求40-42中任一项所述的药物组合物以单剂量的形式施用给所述受试者。
52.如权利要求43-50中任一项所述的方法，其中如权利要求1-29中任一项所述的环状多核糖核苷酸、如权利要求30-39中任一项所述的免疫原性组合物、或如权利要求40-42中任一项所述的药物组合物向所述受试者施用两次或更多次、三次或更多次、四次或更多次、或五次或更多次。
53.如权利要求52所述的方法，其中如权利要求1-29中任一项所述的环状多核糖核苷酸、如权利要求30-39中任一项所述的免疫原性组合物或如权利要求40-42中任一项所述的药物组合物的施用约每周一次、约每两周一次、约每三周一次、约每个月一次、约每两个月一次、约每三个月一次、约每四个月一次、约每五个月一次、约每六个月一次、约每年一次、约每两年一次、约每三年一次、约每四年一次、约每五年一次、或约每十年一次。
54.如权利要求43-53中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用多肽免疫原。
55.如权利要求54所述的方法，其中在施用如权利要求1-29中任一项所述的环状多核糖核苷酸、如权利要求30-39中任一项所述的免疫原性组合物或如权利要求40-42中任一项所述的药物组合物之后，向所述受试者施用所述多肽免疫原。
56.如权利要求54或权利要求55所述的方法，其中所述多肽免疫原维持或增强所述受试者中针对所述多肽免疫原的免疫反应。
57.一种维持或增强受试者中的免疫反应的方法，所述方法包括：
(i)向所述受试者施用编码多肽免疫原的环状多核糖核苷酸；
(ii)向所述受试者施用所述多肽免疫原，
其中步骤(ii)发生在步骤(i)之后的1周至6个月之间，并且其中步骤(ii)的所述多肽免疫原的施用维持或增强所述受试者中针对所述多肽免疫原的免疫反应。
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