JP4842821B2 - ポリエチレングリコール修飾脂質化合物およびその使用 - Google Patents

ポリエチレングリコール修飾脂質化合物およびその使用 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、2003年9月15日出願の米国特許出願第60/503,239号の恩典を主張し、2003年7月16日出願の米国仮特許出願第60/488,144号、2003年9月15日出願の第60/503,279号および2003年12月11日出願の第60/529,406号の恩典を主張する米国特許出願第10/893,121に関係し、それぞれの教示は、すべての目的において、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
発明の背景
遺伝子治療を臨床的に実用化するための、有効で安全な遺伝子送達システムが求められている。ウイルスベクターは比較的有効な遺伝子送達システムであるが、野生型への復帰の可能性および免疫応答の懸念などの、様々な制限を被る。その結果、非ウイルス遺伝子送達システムがますます注目を集めている（Worgall, et al., Human Gene Therapy 8:37-44 (1997); Peeters, et al., Human Gene Therapy 7:1693-1699 (1996); Yei, et al., Gene Therapy 1:192-200 (1994); Hope, et al., Molecular Membrane Biology 15:1-14 (1998)）。プラスミドDNA-カチオン性リポソーム複合体が、現在最も一般的に使用されている非ウイルス遺伝子送達賦形剤である（Felgner, Scientific American 276:102-106 (1997); Chonn, et al., Current Opinion in Biotechnology 6:698-708 (1995)）。しかし、複合体は、全身適用には不適である、大型の、画定度の低いシステムであり、さらに毒性の強い副作用を誘発することがある（Harrison, et al., Biotechniques 19:816-823 (1995); Huang, et al., Nature Biotechnology 15:620-621 (1997); Templeton, et al., Nature Biotechnology 15:647-652 (1997); Hofland, et al., Pharmaceutical Research 14:742-749 (1997)）。
最近の研究は、プラスミドDNAが、脂質二重層小胞内に封入された単一プラスミドからなる小型（直径〜70nm）の「安定化プラスミド-脂質粒子」（SPLP）に封入できることを示している（Wheeler, et al., Gene Therapy 6:271-281(1999)）。これらSPLPは、一般的には「融合性」脂質であるジオレオイルホスファチジル-エタノールアミン（DOPE）、低レベルのカチオン性脂質を含有し、ポリ（エチレングリコール）（PEG）コーティングの存在によって水性媒体中で安定化する。SPLPは、静脈内（i.v.）注射後に長い血中寿命を示すこと、遠位腫瘍領域での高い血管透過性によって遠位腫瘍部位に優先的に蓄積すること、およびこれら腫瘍部位でのトランス遺伝子の発現を仲介できることから、全身適用に供されている。ルシフェラーゼマーカー遺伝子を含有するSPLPをi.v.注射した後に腫瘍部位で観察されるトランス遺伝子の発現レベルは、プラスミドDNA-カチオン性リポソーム複合体（リポプレックス）または裸のDNAを用いて達成できるレベルに比べて遙かに高い。それでも尚、いくつかの応用では最適な治療便益のために、発現レベルの向上が求められると考えられる（例えばMonck et al., J. Drug Targ. 7:439-452 (2000)参照）。
一般的には、リポソームおよびSPLPは共にPEG-脂質誘導体を含む。一般的には、PEG-脂質は、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE）のようなジアシルグリセロリン脂質の極性頭部をPEGを用いて誘導体化することによって調製する。これらリン脂質は、通常、エステル結合によってグリセロールの1-および2-位置に結合している2本の脂肪酸アシル鎖を含有する。残念なことにこれらアシル基は、酸性または塩基性条件下では劈開しやすい。その結果生じるリゾリン脂質およびグリセロリン酸塩の類似体のような加水分解産物は、もはやリポソームまたはSPLPの二重層構造を伴っていない。残念なことにこのような解離は、リポソームまたはSPLP構造の完全性を弱め、リポソームまたはSPLPからの生物活性作用物質または薬物の大きな漏洩をもたらし、および保存中の不安定化の一因となり、かくしてリポソームまたはSPLP製品の保存期間を短縮することがある。これに加えて、リポソームまたはSPLPからのPEG-リゾリン脂質のようなこれら加水分解産物の損失は、一方でPEG-リン脂質の存在から生ずる便益を無効にもする。
脂質安定性は、リポソームまたはSPLP薬物送達システムの開発において重要である。それゆえに、加水分解を受けにくく、それによってリポソームまたはSPLPの血中寿命を長くするPEG-脂質の開発が望まれている。本発明は、この、およびその他の必要性に応えるものである。
発明の概要
本発明は、一般的に用いられているPEG-脂質複合体（例えばPEG-PE複合体）より高い安定性を有する新規のポリエチレングリコール-ジアルキルオキシプロプル（PEG-DAA）複合体を提供する。本発明のPEG-修飾ジアルキルプロピル複合体は、リポソーム、SNALPまたはSPLPの血中寿命または寿命を増すことによって、リポソームならびに核酸-脂質粒子（例えばSNALPおよびSPLP）の特質を高める。事実驚くべき事に、本発明のPEG-DAA複合体は、他の一般的に用いられているPEG-脂質誘導体よりも安定していることが見出されている。それらの安定性が高まった結果、本発明のPEG-DAA複合体は、リポソームまたはSPLPの血中寿命または寿命を増し、また他のPEG-脂質複合体を用いた時のリポソーム二重層またはSPLPの脂肪酸アシル鎖の加水分解による漏洩を減らす。
本発明は、次の構造を有する式Iの新規PEG-DAA複合体を提供する：
Figure 0004842821
上記の式Iでは、「R1およびR2」は独立に選択されかつ約10〜約20個の炭素原子を有するアルキル基であり；PEGはポリエチレングリコールであり；そしてLはリンカー部分（例えば、非エステル含有リンカー部分またはエステル含有リンカー部分）である。好適なアルキル基としては、ラウリル（C12）、ミリスチル（C14）、パルミチル（C16）、ステアリル（C18）およびイコシル（C20）を挙げられるが、それらに限定されるわけではない。好ましい態様では；R1およびR2は、同一であり、すなわちそれらは共にミリスチル（C14）であるか、または共にパルミチル（C16）であるか、または共にステアリル（C18）である。好ましい態様では、アルキル基は、飽和している。
上記の式Iでは、「PEG」は約550ダルトン〜約10,000ダルトン、より好ましくは約750ダルトン〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,000ダルトン〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,500ダルトン〜約3,000ダルトンの範囲の、および、よりさらに好ましくは約2,000ダルトン、または約750ダルトンの平均分子量を有するポリエチレングリコールである。PEGは、アルキル、アルコキシ、アシルまたはアリールで置換することができる。好ましい態様では、末端のヒドロキシル基はメトキシまたはメチル基で置換される。PEGは、脂質に直接共役でき、またはリンカー部分を介して脂質に結合させてもよい。例えば非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含む、脂質にPEGを結合するのに適したいずれのリンカー部分も使用できる。好ましい態様では、リンカー部分は非エステル含有リンカー部分である。本明細書で使用する「非エステル含有リンカー部分」という用語は、カルボン酸エステル結合（-OC(O)-）を含まないリンカー部分を指す。好適な非エステル含有リンカー部分としては、アミド（-C(O)NH-）、アミノ(-NR-）、カルボニル（-C(O)-）、カルバメート（-NHC(O)O-）、尿素（-NHC(O)NH-）、ジスルフィド（-S-S-）、エーテル（-O-）、スクシニル（-(O)CCH2CH2C(O)-）、スクシンアミジル（-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-）、エーテル、ジスルフィド等、ならびにそれらの組合せ（カルバメートリンカー部分およびアミドリンカー部分の両方を含有するリンカーなど）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。好ましい態様では、カルバメートリンカーを用いて、PEGを脂質に結合する。
別の態様では、エステル含有リンカー部分を用いて、PEGを脂質に結合する。好適なエステル含有リンカー部分としては、例えば、カーボネート（-OC(O)O-）、スクシノイル、リン酸エステル（-O-(O)POH-O-）、スルホネートエステルおよびそれらの組合せが挙げられる。
上記の式Iでは、「L」は非エステル含有リンカー部分またはエステル含有リンカー部分である。好ましい態様では、Lは非エステル含有リンカー部分である。好適な非エステル含有リンカーとしては、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバメートリンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、ジスルフィドリンカー部分、スクシンアミジルリンカー部分、およびそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。好ましい態様では、非エステル含有リンカー部分は、カルバメートリンカー部分（すなわち、PEG-C-DAA複合体）である。別の好ましい態様では、非エステル含有リンカー部分は、アミドリンカー部分（すなわち、PEG-A-DAA複合体）である。好ましい態様では、非エステル含有リンカー部分は、スクシンアミジルリンカー部分（すなわちPEG-S-DAA複合体）である。
別の局面では、本発明は、式Iのポリエチレングリコール-ジアルコキシプロピル（PEG-DAA）複合体を含むリポソームを提供する。リポソームは、一般的にはカチオン性脂質および非カチオン性脂質も含む。いくつかの局面では、リポソームはステロール（例えばコレステロール）をさらに含む。リポソームは空でよく、または、あるいはリポソームは一もしくは複数の生物活性作用物質（例えば本明細書に記載の治療用生成物）をさらに含んでもよい。好適な生物活性作用物質としては、抗腫瘍剤、抗生物質、免疫調節剤、抗炎症剤および中枢神経系に働く作用物質が挙げられるが、それらに限定されるわけでなない。同様に、好適生物活性作用物質としては、ペプチド、タンパク質および核酸が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
別の局面では、本発明は細胞に生物活性作用物質を送達する方法であって、生物活性作用物質がリポソーム内に封入されている、式IのPEG-DAA複合体を含むリポソームに細胞を接触させる工程を含む方法を提供する。同様に、別の局面では、本発明は患者に生物活性作用物質を送達する方法であって、生物活性作用物質がリポソームに封入されている、式IのPEG-DAA複合体を含むリポソームを患者に投与する工程を含む方法を提供する。
別の局面では、本発明は核酸-脂質粒子を提供し、核酸-脂質粒子は、核酸；カチオン性脂質；非カチオン性脂質；および式IのPEG-DAA複合体を含む。いくつかの局面では、核酸-脂質粒子はステロール（例えばコレステロール）をさらに含む。
さらに別の局面では、本発明は、核酸を細胞内に導入する方法であって、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、式IのPEG-DAA複合体および核酸を含む核酸-脂質粒子に細胞を接触させる工程を含む方法を提供する。
発明のその他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲および図面より明らかになると思われる。
発明の詳細な説明
I. 序
本発明は、一般的に用いられているPEG-脂質複合体（PEG-PE複合体など）よりも高い安定性を有する新規のポリエチレングリコール-ジアルキルオキシプロプル（PEG-DAA）複合体を提供する。本発明のPEG-修飾ジアルキルプロピル複合体は、リポソームならびに核酸-脂質粒子（例えばSNALPおよびSPLP）の特質を、リポソーム、SNALPまたはSPLPの血中寿命または寿命を増すことによって増強する。事実驚くべき事に、リンカーを介してDAAに共役しているPEGを含むPEG-DAA複合体は、他の一般的に用いられているPEG-脂質誘導体よりも安定していることが見出されている。特に驚くべき事に、非エステル含有リンカー部分を使用すると、一般的に用いられているPEG-脂質複合体（例えばPEG-PE複合体）に比べ高い安定性を有するPEG-DAA複合体が得られることが見出されている。それらの安定性が向上した結果、本発明のPEG-DAA複合体は、リポソーム、SNALPまたはSPLPの血中寿命または寿命を増し、また他のPEG-脂質複合体を用いた際の、リポソーム二重層、SNALPまたはSPLPの脂肪酸アシル鎖の加水分解による漏洩を減じる。
II. 定義
「ジアルキルオキシプロピル」という用語は、2-アルキル鎖、R1およびR2を有し、これらが共に独立に2〜30個の炭素原子を有している化合物を指す。アルキル基は飽和してもよく、または様々な不飽和度を有してもよい。ジアルキルオキシプロピルは、次の一般式を有する：
Figure 0004842821
「PEG」という用語は、2つの末端ヒドロキシル基を持つエチレンPEG反復単位の、直鎖の水溶性ポリマーであるポリエチレングリコールを指す。PEGは、それらの分子量によって分類される；例えばPEG2000は、約2,000ダルトンの平均分子量を有し、およびPEG5000は、約5,000ダルトンの平均分子量を有する。PEGはSigma Chemical Co.およびその他の会社から購入でき、例えば次のものを包含する：モノメトキシポリエチレングリコール（MePEG-OH）、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシネート（MePEG-S）、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシンイミジルスクシネート（MePEG-S-NHS）、モノメトキシポリエチレングリコール-アミン（MePEG-NH2）、モノメトキシポリエチレングリコール-トレシレート（MePEG-TRES）、およびモノメトキシポリエチレングリコール-イミダゾリル-カルボニル（MePEG-IM）。これらに加え、実施例はモノメトキシポリエチレングリコール-酢酸（MePEG-CH2COOH）を合成するための手順を提供するが、これは本発明のPEG-DAA複合体を調製するのに特に有用である。
好ましい態様では、PEGは約550〜約10,000ダルトンの平均分子量を持つポリエチレングリコールであり、またアルキル、アルコキシ、アシルまたはアリールによって置換されてもよい。好ましい態様では、PEGは、末端ヒドロキシル位置がメチルで置換されている。別の好ましい態様では、PEGは約750〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,000〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,500〜約3,000ダルトン、そしてよりさらに好ましくは約2,000ダルトンまたは約750ダルトンの平均分子量を有する。PEGは、アルキル、アルコキシ、アシルまたはアリールで置換されていてもよい。好ましい態様では、末端ヒドロキシル基は、メトキシまたはメチル基で置換されている。
本明細書で使用する、PEG-DAA複合体は、ジアルキルオキシプロピルに共役したポリエチレングリコールを指す。PEGは、DAAに直接共役でき、またはリンカー部分を介してDAAに共役してもよい。好適リンカー部分としては、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分が挙げられる。
本明細書で使用する「非エステル含有リンカー部分」という用語は、カルボン酸エステル結合（-OC(O)-）を含まないリンカー部分を指す。好適な非エステル含有リンカー部分としては、アミド（-C(O)NH-）、アミノ(-NR-）、カルボニル（-C(O)-）、カルバメート（-NHC(O)O-）、尿素（-NHC(O)NH-）、ジスルフィド（-S-S-）、エーテル（-O-）、スクシニル（-(O)CCH2CH2C(O)-）、スクシンアミジル（-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-）、エーテル、ジスルフィド等、ならびにそれらの組合せ（カルバメートリンカー部分およびアミドリンカー部分の両方を含有するリンカーなど）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。好ましい態様では、カルバメートリンカーを用いて、PEGを脂質に結合する。
別の態様では、エステル含有リンカー部分を用いて、PEGを脂質に結合する。好適なエステル含有リンカー部分としては、例えば、カーボネート（-OC(O)O-）、スクシノイル、リン酸エステル（-O-(O)POH-O-）、スルホネートエステルおよびそれらの組合せが挙げられる。
「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルを含むがこれに限定されるものではない有機化合物であって、水に不溶性であるが多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とするグループを指す。それらは、一般には少なくとも3つのクラス：(1) 脂肪および油、ならびにロウを含む「単純脂質」；(2) リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」；(3) ステロイドのような「誘導脂質」に分けられる。
「脂質小胞」とは、その水性体積が両親媒性脂質二重層に封入されているか、または干渉RNA配列を含むプラスミドのような巨大分子成分を少量の水性内部と一緒に含む内部を脂質が覆っているリポソーム；または封入された成分が比較的不規則な脂質混合物中に含まれている脂質凝集物もしくはミセルを含むが、これに限定されるものではない、化合物の送達に用いることができる脂質組成物である。
本明細書で使用する「脂質封入された」とは、完全に封入された化合物、部分的に封入された化合物、またはその両方の化合物を提供する脂質処方物を指すことができる。好ましい態様では、核酸は脂質処方物内に完全に封入される（例えば、SPLP、pSPLP、SNALP、またはその他の核酸脂質粒子を形成する）。核酸脂質粒子およびその調製方法は、米国特許第5,976,567号、米国特許第5,981,501号およびPCT国際公開公報96/40964号に開示されている。
本明細書で使用する「SNALP」という用語は、SPLPを包含する、安定な核酸脂質粒子を指す。SNALPは、核酸（例えばssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、siRNA、または干渉RNAがそこから転写されるプラスミドを包含するプラスミド）を含む、少量の水性内部を覆っている脂質の小胞である。本明細書で使用する「SPLP」という用語は、脂質小胞内に封入された核酸（例えばプラスミド）を含む、核酸脂質粒子を指す。SNALPおよびSPLPは、一般的にはカチオン性脂質、非カチオン性脂質および粒子の凝集を阻止する脂質（例えばPEG-脂質複合体）を含有する。SNALPおよびSPLPは、それらが静脈内投与後の血中寿命の延長、および遠位部位（投与部位から物理的に離れている部位）への蓄積を示し、これら遠位部位でのトランスフェクション遺伝子の発現を仲介できることから、全身性に用いられる。SPLPは、国際公開公報第00/03683号に記載の封入縮合剤-核酸複合体を含む「pSPLP」を包含する。
「小胞形成脂質」という用語は、疎水成分と極性頭部基とを有し、それ自体が水中で、大部分のリン脂質で例示されるように、自発的に二重層小胞を形成する任意の両親媒性脂質を包含することを意味する。
「小胞採用脂質」という用語は、脂質二重層内に安定的に組み入れられ、その疎水成分が二重膜内側の疎水域に接触しており、その極性頭部基成分が膜外側の極性面に向かう形で他の両親媒性脂質と組み合わさっている任意の両親媒性脂質を含むことを意図する。小胞採用脂質としては、それ自体は非層状形態をとる傾向にあるが、二重層安定化成分が存在する場合には二重層構造をとることができる脂質が挙げられる。代表例はDOPE（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）である。二重層安定化成分としては、SNALPの凝集を阻害する複合脂質、ポリアミドオリゴマー（例えばATTA-脂質誘導体）、ペプチド、タンパク質、界面活性剤、脂質誘導体、ジアルキルオキシプロピルに結合したPEG、ジアシルグリセロールに結合したPEG、ホスファチジルエタノールアミンに結合したPEG、およびセラミドと複合したPEGのようなPEG-脂質誘導体を挙げられるが、これに限定されない（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,885,613を参照）。PEGは脂質と直接共役でき、またはリンカー部分を介して脂質に結合してもよい。PEGを脂質に結合するのに適したいずれのリンカー部分も用いることができ、例えば非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分が挙げられる。
「両親媒性脂質」という用語は、一部、その脂質物質の疎水性部分が疎水相内に向き、一方親水性部分は水相に向いている、任意の好適物質を指す。両親媒性脂質は、一般的に、脂質小胞の主成分である。親水性は、炭水化物基、リン酸基、カルボキシル基、硫酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、およびその他同様の基のような極性または荷電基の存在に由来する。疎水性は、長鎖の、飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、および一つまたは複数の芳香族基、脂環式もしくは複素環式基により置換されたこのような基を含むが、これに限定されない非極性基を含めることで付与できる。両親媒性化合物の例としては、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が挙げられるが、これに限定されない。リン脂質の代表例は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、またはジリノレノイルホスファチジルコリンが挙げられるが、これに限定されない。スフィンゴ脂質、グリコスフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロールおよびベータアシルオキシ酸のようなリンを欠いたその他化合物もまた、両親媒性脂質と呼ぶグループに属する。これに加え、上記両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールを含むその他の脂質と混合することもできる。
「中性脂質」という用語は、選択pHにおいて非電荷または両性イオンの形で存在する数多い脂質種のいずれかを指す。生理学的pHでは、このような脂質として、例えばジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、およびジアシルグリセロールを挙げることができる。
「非カチオン性脂質」という用語は、上記の任意の中性脂質およびアニオン性脂質を指す。
「アニオン性脂質」という用語は、生理学的pHにおいて、負電荷を有する任意の脂質を指す。これらの脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、N-ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、N-スクシニルホスファチジルエタノールアミン、N-グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレヨールホスファチジルグリセロール（POPG）および中性脂質に結合したその他アニオン性修飾基を挙げることができるが、これに限定されない。
「カチオン性脂質」という用語は、生理学的pHのような選択pHにおいて、正味の正電荷を有する任意の数多い脂質種を指す。このような脂質としては、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロライド（「DODAC」）；N-(2,3-ジオレイルオキシ）プロピル）-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（「DOTMA」）；N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド（「DDAB」）；N-(2,3-ジオレオイルオキシ）プロピル）-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（「DOTAP」）；3-(N-(N',N'-ジメチルアミノエタン）-カルバモイル）コレステロール（「DC-Chol」）およびN-(1,2-ジミリスチルオキシプロプ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（「DMRIE」）を挙げられるが、これに限定されない。次の脂質はカチオン性であり、また生理学的pH未満において正電荷を有する：DODAP、DODMA、DMDMA等。
「疎水性脂質」という用語は、長鎖の飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、および、場合により一つまたは複数の芳香族、脂環式または複素環式基によって置換されたそれらの基を包含するが、それに限定されるわけではない無極性基を有する化合物を指す。好適例としては、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、N-N-ジアルキルアミノ、1,2-ジアシルオキシ-3-アミノプロパンおよび1,2-ジアルキル-3-アミノプロパンが挙げられるが、これに限定されない。
「融合性」という用語は、リポソーム、SNALPまたはその他ドラッグデリバリーシステムが細胞膜と融合する能力を指す。膜は、原形質膜でもよいし、細胞小器官、例えばエンドゾーム、核等を取り囲んでいる膜でもよい。
「ジアシルグリセロール」という用語は、2-脂肪アシル鎖、R1およびR2を有し、これらの鎖が共にグリセロールの1-および2-位と、エステル結合によって結合している2〜30個の炭素を独立に有している化合物を指す。アシル基は、飽和していてもよいし、様々な程度に不飽和であってもよい。ジアシルグリセロールは次の一般式を有する：
Figure 0004842821
「ATTA」または「ポリアミド」という用語は、米国特許第6,320,017号および第6,586,559号に開示されている化合物を指すが、これに限定されるわけではなく、これら特許は共に参照によって本明細書に組み入れられる。これら化合物は、次式を有する化合物を包含し、
Figure 0004842821
式中、Rは、水素、アルキルおよびアシルからなる群より選択されるメンバーであり；R1は、水素およびアルキルからなる群より選択されるメンバーであり；または場合により、RおよびR1は、窒素に結合してアジド成分を形成し；R2は、水素、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアリールおよびアミノ酸の側鎖から選択される群のメンバーであり；R3は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノおよびNR4R5からなる群より選択されるメンバーであり、このときR4およびR5は独立に水素またはアルキルであり；nは4〜80であり；mは2〜6であり；pは1〜4であり；qは0または1である。本発明の化合物には、他のポリアミドも使用できることは、当業者には明らかである。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも二個のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを、単鎖または二本鎖いずれかの形で含有するポリマーを指す。核酸は、公知ヌクレオチド類似体または修飾主鎖残基もしくは結合を含有する核酸を包含するが、これらは合成物、天然産物、および非天然産物であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、また参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される。このような類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラル-メチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド-核酸（PNA）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。特に限定しない限り、本用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に産するヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知類似体を含む核酸を包含する。特に指示しない限り、特定の核酸配列は、保存的に修飾されたその変種（例えば縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルトログ、SNPおよび相補的配列、ならびに明示的に指示された配列をも暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、一つまたは複数の、選択された（またはすべての）コドンの第3位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成できる（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);および Cassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（DNA）またはリボース（RNA）、塩基、およびリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を通して互いに結合する。「塩基」は、プリンおよびピリミジンを含み、それらは天然化合物であるアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類似体、ならびにプリンおよびピリミジンの合成誘導体をも包含し、合成誘導体は、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、およびハロゲン化アルキルのような、しかしこれに限定されない新規反応基を配置する修飾を含むが、これに限定されるものではない。DNAは、アンチセンス、プラスミドDNA、プラスミドDNAの一部、予備濃縮DNA、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の産物、ベクター（P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体DNA、またはこれらの群の誘導体の形をとることができる。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、遺伝子がコードするmRNA、および干渉RNA分子と互換的に用いられる。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたはポリペプチド前駆体（例えばA型、B型、C型、D型、E型、またはG型肝炎ウイルス、あるいは単純ヘルペスウイルス由来のポリペプチドまたはポリペプチド前駆体）の産生に必要な、部分長または全長のコード配列を含む核酸（例えばDNAまたはRNA）配列を指す。
本明細書の中で使用する「遺伝子産物」は、例えばmRNAを含むRNA転写物のような、遺伝子産物を指す。
III. ポリエチレングリコール-修飾ジアルキルオキシプロピル（PEG-DAA）複合体
本発明は、一般的に用いられているPEG-脂質複合体（PEG-PE複合体など）よりも高い安定性を有する新規のポリエチレングリコール-ジアルキルオキシプロプル（PEG-DAA）複合体を提供する。より具体的には、本発明は、次の構造を有する式Iの新規PEG-DAA複合体を提供する：
Figure 0004842821
上記の式Iでは、R1およびR2は、独立に選択され、かつ約10〜約20個の炭素原子を有するアルキル基である。アルキル基は、飽和でも、または不飽和でもよい。好適なアルキル基としては、ラウリル（C12）、ミリスチル（C14）、パルミチル（C16）、ステアリル（C18）およびイコシル（C20）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一つの態様では、R1およびR2は、共に同一であり、すなわちR1およびR2は、共にミリスチル（C14）であるか、または共にステアリル（C18）である。別の好ましい態様では、R1およびR2は、異なっており、すなわちR1はミリスチル（C14）であり、かつR2はステアリル（C18）である。好ましい態様では、本発明のPEG-DAA複合体は対称性、すなわちR1およびR2は共に同一である。
上記の式Iでは、PEGは、2つの末端ヒドロキシル基を持つエチレンPEG反復単位の、直鎖の水溶性ポリマーであるポリエチレングリコールである。PEGは、それらの分子量によって分類される；例えばPEG2000は、約2,000ダルトンの平均分子量を有し、またPEG5000は、約5,000ダルトンの平均分子量を有する。PEGはSigma Chemical Co.およびその他の会社から購入でき、例えば次のものを包含する：モノメトキシポリエチレングリコール（MePEG-OH）、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシネート（MePEG-S）、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシンイミジルスクシネート（MePEG-S-NHS）、モノメトキシポリエチレングリコール-アミン（MePEG-NH2）、モノメトキシポリエチレングリコール-トレシレート（MePEG-TRES）、およびモノメトキシポリエチレングリコール-イミダゾリル-カルボニル（MePEG-IM）。これらに加え、実施例はモノメトキシポリエチレングリコール-酢酸（MePEG-CH2COOH）を合成するための手順を提供するが、これは本発明のPEG-DAA複合体を調製するのに特に有用である。
好ましい態様では、PEGは約550〜約10,000ダルトンの平均分子量を持つポリエチレングリコールであり、またアルキル、アルコキシ、アシルまたはアリールによって置換されてもよい。好ましい態様では、PEGは、末端ヒドロキシル位置がメチルで置換されている。別の好ましい態様では、PEGは約750〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,000〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,500〜約3,000ダルトン、よりさらに好ましくは約2,000ダルトンまたは約750ダルトンの平均分子量を有する。
上記の式Iでは、「L」は非エステル含有リンカー部分またはエステル含有リンカー部分である。好ましい態様では、Lは非エステル含有リンカー部分、すなわちカルボン酸エステル結合（-OC(O)-）を含有しないリンカー部分である。好適な非エステル含有リンカーとしては、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバメートリンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、ジスルフィドリンカー部分、スクシンアミジルリンカー部分、スクシニルリンカー部分、およびそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。好ましい態様では、非エステル含有リンカー部分は、カルバメートリンカー部分（すなわち、PEG-C-DAA複合体）である。別の好ましい態様では、非エステル含有リンカー部分は、アミドリンカー部分（すなわち、PEG-A-DAA複合体）である。好ましい態様では、非エステル含有リンカー部分は、スクシンアミジルリンカー部分（すなわちPEG-S-DAA複合体）である。
別の態様では、Lはエステル含有リンカー部分である。好適なエステル含有リンカー部分としては、例えばカーボネート（-OC(O)O-）、スクシノイル、リン酸エステル（-O-(O)POH-O-）、スルホネートエステルおよびそれらの組合せが挙げられる。
本発明のPEG-DAA複合体は、当業者公知の標準的な技術および試薬を用いて合成される。本発明のPEG-DAA複合体が様々なアミド、アミン、エーテル、チオ、カルバメートおよび尿素結合を含有することが理解されるだろう。当業者は、これら結合を形作るための方法および試薬が周知であり、容易に利用できることを認識すると思われる。例えば、March、ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY（Wiley 1992）、Larock、COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS（VCH 1989）；およびFurniss、VOGEL'S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 第5版（Longmann 1989）参照。本発明のPEG-DAA複合体の合成では、様々な点で、存在する官能基を保護し、また脱保護する必要があることも理解されるだろう。当業者は、このような技術が周知であることを認識する。例えばGreenとWuts、PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS（Wiley 1991）参照。
本発明のPEG-DAA複合体を形成するための反応の一般的な順番は、以下の実施例の項に記載されている。実施例は、本発明のPEG-A-DMA、PEG-C-DMAおよびPEG-S-DMA複合体を調製するための合成の図式を提供する。同様の手順を用いることで、当業者は、本発明の他のPEG-DAA複合体を容易に生成できる。
上記に加えて、PEGの代わりに他の親水性ポリマーを使用できることは、当業者には容易に明らかになるだろう。PEGの代わりに使用できる好適ポリマーの例としては、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリジメチルアクリルアミド、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ならびにヒドロキシメチルセルロースもしくはヒドロキシエチルセルロースのような誘導体化セルロースが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
IV. PEG-DAA複合体を含有するSPLPおよびSNALP
一つの態様では、本発明は、ポリエチレングリコール（PEG）-ジアルキルオキシプロピル（DAA）複合体、すなわちPEG-DAA複合体を含有する安定化核酸-脂質粒子（例えばSPLPおよびSNALP）ならびにその他脂質をベースとしたキャリアシステムを提供する。本発明の脂質-核酸粒子は、一般的には核酸、カチオン性脂質、非カチオン性脂質およびPEG-DAA複合体を含む。カチオン性脂質は、一般的には該粒子内に存在する全脂質の約2％〜約60％、好ましくは該粒子内に存在する全脂質の約5％〜約45％を構成する。ある好ましい態様では、カチオン性脂質は、該粒子内に存在する全脂質の約5％〜約15％を構成する。別の好ましい態様では、カチオン性脂質は、該粒子内に存在する全脂質の約40％〜約50％を構成する。非カチオン性脂質は、一般的には該粒子内に存在する全脂質の約5％〜約90％を、好ましくは該粒子内に存在する全脂質の約20％〜約85％を構成する。PEG-DAA複合体は、一般的には、該粒子内に存在する全脂質の1％〜約20％を、好ましくは該粒子内に存在する全脂質の2％〜約15％を、より好ましくは該粒子内に存在する全脂質の約4％〜約10％を構成する。本発明の核酸-脂質粒子は、コレステロールをさらぬ含むことができる。存在する場合、コレステロールは、一般的には、該粒子内に存在する全脂質の約10％〜約60％を構成し、好ましくは、コレステロールは該粒子内に存在する全脂質の約20％〜約45％を構成する。例えば実施例の項に記載のERPアッセイを用いて、核酸-脂質粒子の構成成分の割合が変更できることは、当業者に容易に明らかであろう。例えば、全身送達の場合、カチオン性脂質は、該粒子内に存在する全脂質の約5％〜約15％を構成でき、局所または局部送達の場合は、カチオン性脂質は該粒子内に存在する全脂質の約40％〜約50％を構成する。
本発明のSPLPおよびSNALPは、一般的には、約150nm未満の平均直径を有し、実質的に無毒である。これに加えて、核酸は、本発明のSPLPおよびSNALP内に存在する場合には、水性溶液中でのヌクレアーゼによる分解に対し耐性である。SPLPおよびSNALP、ならびにそれらの調製方法は、米国特許第5,976,567号、米国特許第5,981,501号およびPCT国際公開公報96/40964に開示されており、その全ての教示は、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明では、種々の好適カチオン性脂質は、単独または一つもしくは複数のその他カチオン性脂質種もしくは非カチオン性脂質種と組み合わせて用いてよい。
本発明において有用であるカチオン性脂質は、生理学的pHのような選択されるpHにおいて正味の正電荷を持つ、数多い脂質種の任意のものであってもよい。好適なカチオン性脂質としては、DODAC、DOTMA、DDAB、DOTAP、DOSPA、DOGS、DC-CholおよびDMRIE、またはその組合せを挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。本発明でも有用である、これらのカチオン性脂質および関連類似体の多くは、同時係属中のUSSN第08/316,399号；米国特許第5,208,036号、第5,264,618号、第5,279,833号、および第5,283,185号に記載されており、それらの開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。これに加えて、多くの市販のカチオン脂質調製物も利用でき、本発明に用いることができる。そのようなものとしては、例えばLIPOFECTIN（登録商標）（DOTMAおよびDOPEを含む市販のカチオン性リポソームで、GIBCO/BRL, Grand Island, New York, USA）；LIPOFECTAMINE（登録商標）（DOSPAおよびDOPEを含む市販のカチオン性リポソームで、GIBCO/BRL）；およびTRANSFECTAM（登録商標）（DOGSを含む市販のカチオン性リポソームで、Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA）が挙げられる。
本明細書において使用される非カチオン性脂質は、安定した複合体を作ることが出来る、任意の様々な、中性の、電荷を持たない、両性イオンまたはアニオン性脂質でよい。それらは、好ましくは中性であるが、または正または負に帯電していてもよい。本発明に有用な非カチオン性脂質の例としては：レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルリン酸、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(POPE) 、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン4-(N-マレイミドメチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシレート(DOPE-mal) のようなリン脂質関連物質が挙げられる。非カチオン性脂質、またはコレステロールのようなステロールも存在できる。追加の非リン含有脂質は、例えばステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレート、ヘキサデシルステリエート（stereate）、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン-ラウリルスルフェート、アルキル-アリールスルフェートポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド等、ジアシルホスファチジルコリン、ジアセチルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドである。リソホスファチジルコリンおよびリソホスファチジルエタノールアミンのようなその他脂質も存在できる。非カチオン性脂質は、PEG2000、PEG5000、および参照により本明細書に組み入れられる同時係属中のUSSN第08/316,429号に記載されているリン脂質またはセラミドと共役したポリエチレングリコール（PEG-Cerと呼ぶ）のようなポリエチレングリコールをベースとするポリマーも包含する。
好ましい態様では、非カチオン性脂質はジアシルホスファチジルコリン（例えばジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジリノレオイルホスファチジルコリン）、ジアシルホスファチジルエタノールアミン（例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびパルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、セラミドまたはスフィンゴミエリンである。これら脂質中のアシル基は、好ましくはC10〜C24炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基である。より好ましくは、アシル基はラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルまたはオレオイルである。特に好ましい態様では、非陽性脂質は、コレステロール、1,2-sn-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、または卵スフィンゴミエリン（ESM）であると考えられる。
カチオン性および非カチオン性脂質に加えて、本発明のSPLPは、ポリエチレングリコール-ジアルキルオキシプロピル複合体、すなわちPEG-DAA複合体を含む。「ジアルキルオキシプロピル」という用語は、2-アルキル鎖、R1およびR2を有し、これらが共に独立に2〜30個の炭素原子を有している化合物を指す。アルキル基は飽和していてもよく、または様々な不飽和度を有してもよい。ジアルキルオキシプロピルは、次の一般式を有する：
Figure 0004842821
現時点の好ましい態様では、PEG-DAA複合体はジラウリルオキシプロピル（C12）-PEG複合体、ジミリスチルオキシプロピル (C14)-PEG複合体、ジパルミトイルオキシプロピル (C16)-PEG複合体、またはジステリルオキシプロピル（C18）-PEG複合体である。当業者は、他のジアルキルオキシプロピルが、本発明のPEG-DAA複合体に使用できることを容易に理解すると思われる。
一つの好ましい態様では、PEG-DAA複合体は次の式を有する：
Figure 0004842821
式Iでは、R1およびR2は、独立に選択される、約10〜約22個の炭素原子を有する長鎖のアルキル基である。長鎖アルキル基は、飽和でも不飽和でもよい。好適なアルキル基としては、ラウリル(C12)、ミリスチル(C14)、パルミチル(C16)、ステアリル(C18)、およびイコシル(C20)が挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましい態様では、R1およびR2は同一、即ちR1およびR2は共にミリスチル（即ちジミリスチル）、R1およびR2は共にステアリル（即ちジステアリル）であるといった具合である。式Iでは、PEGは約550〜約8,500ダルトンの平均分子量を有するポリエチレングリコールである。好ましい態様では、PEGは約1000〜約5000ダルトン、より好ましくは約1,000〜約3,000ダルトン、さらにより好ましくは約2,000ダルトン、または約750ダルトンの平均分子量を有する。PEGは、アルキル、アルコキシ、アシル、またはアリール基で置換されていてもよい。
式Iでは、Lはリンカー部分である（例えば非エステル含有リンカー部分またはエステル含有リンカー部分）。PEGをジアルキルオキシプロピル主鎖に結合するのに好適な任意のリンカー部分を用いることができる。好ましい態様では、Lは非エステル含有リンカー部分、すなわちカルボン酸エステル結合（-OC(O)-）を含まないリンカー部分である。好適な非エステル含有リンカー部分としては、アミド（-C(O)NH-）、アミノ(-NR-）、カルボニル（-C(O)-）、カルバメート（-NHC(O)O-）、尿素（-NHC(O)NH-）、スクシニル（-(O)CCH2CH2C(O)-）、スクシンアミジル、エーテル、ジスルフィド等、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。好ましい態様では、非エステル含有リンカー部分は、カルバメートリンカー部分（すなわち、PEG-C-DAA複合体）である。別の好ましい態様では、非エステル含有リンカー部分は、アミドリンカー部分（すなわちPEG-A-DAA複合体）である。好ましい態様では、非エステル含有リンカー部分は、スクシンアミジル部分（すなわちPEG-S-DAA複合体）である。
別の態様では、Lはエステル含有リンカー部分である。好適なエステル含有リンカー部分としては、例えば、カーボネート（-OC(O)O-）、スクシノイル、リン酸エステル（-O-(O)POH-O-）、スルホネートエステルおよびそれらの組合せが挙げられる。
驚くべき事に、PEG-DAA複合体は本発明の核酸-脂質粒子（例えばSNALPSおよびSNLP）に特に有用であることが見出されている。PEG-DAA複合体は、PEG-リン脂質誘導体に比べ多くの利点を有している。例えば、PEG-リン脂質誘導体は、それらのリン酸基に負電荷を有しており、これが多くの不利益をもたらしている。第一に、負電荷は処方物中のカチオン性脂質と相互作用して、その結果二重層外へのPEG-リン脂質の交換を妨げる静電力を起こすることがある。第二に、リン酸基の負電荷は、封入工程に必要な部分であるカチオン電荷を中和する。リン酸基の中和作用を相殺するためには、より高いモル％のカチオン性脂質を使用しなければならず、それに伴って処方物の毒性は高くなる。これに加えて、PEG-セラミドに比べ、PEG-DAA複合体は産生および製造が容易である。
前記構成成分に加えて、本発明のSPLPは、脂質二重層に挿入して正電荷を付与するために設計された、カチオン性ポリ（エチレングリコール）（PEG）脂質またはCPLを含むことができる（Chen et al., Bioconj. Chem. 11:433-437 (2000) 参照）。本発明での使用に好適なSPLPおよびSPLP-CPL、ならびにSPLPおよびSPLP-CPLを作製および使用する方法は、例えば2000年4月20日出願の米国特許出願第09/553,639号、および2000年4月20日に出願され、2000年10月26日に国際公開公報第00/62813号として公開されたPCT特許出願第CA00/0451号に開示されており、それぞれの教示は、参照により本明細書に組み入れられる。
A. 関心対象の生成物
上記構成成分に加えて、本発明のSPLPおよびSNALPは、核酸（例えば単鎖または二本鎖DNA、単鎖または二本鎖RNA、RNAi、siRNA等）を含む。好適核酸としては、プラスミド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ならびにその他のポリ-およびオリゴヌクレオチドが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。好ましい態様では、核酸は、関心対象の生成物、例えば治療用生成物をコードする。
関心対象の生成物は、医薬または診断薬としての治療目的を含めた商業目的において有用でありうる。治療用生成物の例としては、タンパク質、核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、tRNA、snRNA、siRNA、抗原、第VIII因子、およびアポプチン（Zhuang et al. (1995) Cancer Res. 55(3):486-489）が挙げられる。遺伝子産物の好適な分類としては、細胞毒性／自殺遺伝子、免疫調節剤、細胞レセプターリガンド、腫瘍サプレッサおよび抗血管新生遺伝子が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。実際に選択される遺伝子は、意図する目的または治療に依存すると考えられる。このような関心対象の遺伝子の例を以下、および明細書全体を通して記載する。
1. SiRNA
SNALPおよびSPLPの核酸成分は、一般的には干渉RNA（即ちsiRNA）を含み、干渉RNAは、例えば一つまたは複数の、単離された、短い干渉RNA（siRNA）二重鎖、より長い二本鎖RNA（dsRNA）、またはDNAプラスミドの中の転写カセットから転写されたsiRNAまたはdsRNAを含むいくつかの形態で提供できる。
RNA集団は、長鎖の前駆体RNAの提供に用いることができ、または選択した標的配列に実質的または完全に同一である長鎖の前駆体RNAを用いてsiRNAを作ることができる。RNAは細胞または組織から単離でき、当業者に周知の方法に従って合成および／またはクローニングできる。RNAは混合集団（細胞または組織から得るか、cDNAから転写するか、サブトラクションするか、選択したもの等）でもよく、または単一の標的配列でもよい。RNAは天然に産するもの、例えば組織または細胞サンプルより単離したもの、例えばT7またはSP6ポリメラーゼとPCR産物またはクローニングcDNAを用いてインビトロで合成したもの；あるいは化学的に合成したものでよい。
長鎖のdsRNAを作る場合、合成RNAであれば、相補体もインビトロで転写し、ハイブリダイゼーションを行ってdsRNAを形作る。天然のRNA集団を用いる場合は、例えばRNA集団に対応するcDNAを転写するか、またはRNAポリメラーゼを用いることによってRNA相補体も得る（例えば、大腸菌RNAase IIIまたはダイサー消化のためのdsRNAを形成するための）。次に前駆体RNAをハイブリダイゼーションし、消化に供する二本鎖RNAを作る。dsRNAはSNALPに直接封入しても、または封入前にインビトロ消化にかけてもよい。
または、一つまたは複数のsiRNA鋳型をコードする一つまたは複数のDNAプラスミドを、核酸-脂質粒子に封入する。siRNAは、例えば短核RNA U6またはヒトRNase P RNA H1のための天然の転写単位を基礎にしたRNAポリメラーゼIII転写単位を有するプラスミドの中で、鋳型DNAからヘアピンループを持つ二重鎖に自動的に折りたたまれる配列として転写できる（Brummelkamp, et al., Science 296:550 (2002); Donze, et al., Nucleic Acids Res. 30:e46 (2002); Paddison, et al., Genes Dev. 16:948 (2002); Yu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 99:6047 (2002); Lee, et al., Nat. Biotech. 20:500 (2002); Miyagishi, et al., Nat. Biotech. 20:497 (2002); Paul, et al., Nat. Biotech. 20:505 (2002);および Sui, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 99:5515 (2002) 参照）。一般的には、転写単位またはカセットは、所望のsiRNA配列の転写の鋳型と機能的に連結しているH1-RNAまたはU6プロモータのようなRNA転写プロモータ配列、および2-3ウリジン残基およびポリチミジン(T5)配列（ポリアデニル化シグナル）（Brummelkamp, Sicence、上記）を含む停止配列を含有すると考えられる。選択したプロモータは、構成的または誘導的転写を提供できる。RNA干渉分子のDNA指導転写のための組成物および方法は、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,573,099号に詳しく記載されている。好ましくは、合成または転写されたsiRNAは、約1〜4ヌクレオチド、好ましくは約2〜3ヌクレオチドの3'オーバーハング、および5'リン酸終端を有する（Elbashir, et al., Genes Dev 15:188(2001); Nykanen, et al., Cell 107:309 (2001)）。転写単位はプラスミドまたはDNAベクター内に組み入れることができ、そこから干渉RNAが転写される。治療のための遺伝材料をインビボ送達するのに好適なプラスミドは、米国特許第5,962,428号および第5,910,488号に詳しく記載されており、両特許は参照により本明細書に組み入れられる。選択されたプラスミドは、標的細胞の一過的または安定した送達を提供できる。本来、所望遺伝子配列の発現を目的に設計されたプラスミドを、siRNA転写のための転写単位カセットを含有するように変更できることは、当業者にとって明らかであろう。
RNAを単離する方法、RNAを合成する方法、核酸をハイブリダイゼーションする方法、cDNAライブラリーを作製およびスクリーニングする方法、ならびにPCRを実施する方法は、PCR法（米国特許第4,683,195号および第4,683,202号; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)）同様に、当技術分野において周知である（例えばGulber & Hoffman, Gene 25;263-269 (1983); Sambrook et al., 上記; Ausubel et al.,上記参照）。発現ライブラリーも当業者に周知である。本発明に使用する一般的方法を開示するその他基本的テキストとしては、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990);およびCurrent Protocol in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)）が挙げられる。
好適なプラスミドは、関心対象の遺伝子産物の部分長配列または完全長配列をコードする鋳型配列を、発現可能な形態で含有するように、遺伝子工学的に操作されている。鋳型配列はまた、単離もしくは合成siRNAおよびdsRNAを提供するためにも使用できる。一般的には、関心対象の遺伝子産物の転写および翻訳をダウンレギュレーションまたはサイレンシングすることが望まれる。遺伝子産物の好適分類としては、腫瘍形成および細胞形質転換に関連する遺伝子、血管新生遺伝子、炎症および自己免疫応答と関係するような免疫調節遺伝子、リガンドレセプター遺伝子、神経変性疾患に関連する遺伝子、ならびにウイルスの感染および生存に関連する遺伝子が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
腫瘍形成および細胞形質転換に関係する遺伝子配列の例としては、MLL融合遺伝子、BCR-ABL（Wilda, et al., Oncogene, 21:5716 (2002); Scherr, et al., Blood 101:1566）、TEL-AML1、EWS-FLI1、TLS-FUS、PAX3-FKHR、BCL-2、AML1-ETO、およびAML1-MTG8（Heidenreich, et al., Blood 101:3157 (2003)）のような転移配列；多剤耐性遺伝子のような過剰発現配列（Nieth, et al., FEBS Lett. 545:144 (2003); Wu, et al., Cancer Res. 63:1515 (2003)、サイクリン（Li, et al., Cancer Res. 63:3593 (2003); Zou, et al., Genes Dev. 16:2923 (2002)）、ベータ-カテニン（Verma, et al., Clin Cancer Res. 9:1291 (2003)）、テロメラーゼ遺伝子（Kosciolek, et al., Mol Cancer Ther. 2:209 (2003)）、c-MYC、N-MYC、BCL-2、ERBB1、およびERBB2（Nagy, et al. Exp. Cell Res. 285:39 (2003)）；およびRASのような変異配列（Tushl and Borkhardt, Mol. Interventions, 2:518(2002)に概説されている）を挙げることができる。DNA修復酵素をコードする配列のサイレンシングは、化学療法薬投与との組み合わせた使用が見出されている（Collis, et al., Cancer Res. 63:1550 (2003)）。腫瘍移動に関係するタンパク質をコードする遺伝子もまた関心対象の標的配列であり、例えばインテグリン、セレクチン、およびメタロプロテアーゼである。上記の例は限定的ではない。腫瘍形成または細胞形質転換、腫瘍増殖または腫瘍移動を容易化または促進する、全体または部分的遺伝子配列は、鋳型配列に含めることができる。
血管新生遺伝子は、新規血管の形成を促進できる。特に関心対象のものは、血管内皮成長因子（VEGF）である（Reich, et al., Mol. Vis. 9:210 (2003)）。
免疫調節遺伝子は、一つまたは複数の免疫反応を調節する遺伝子である。免疫調節遺伝子の例としては、成長因子（例えばTGF-α、TGF-β、EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、CGF、GM-CSF、SCF等）、インターロイキン（例えばIL-2、IL-4、IL-12（Hill, et al., J. Immunol. 171:691 (2003)）、IL-15、IL-18、IL-20等）、インターフェロン（例えばIFN-α、IFN-β、IFNG-γ等）、およびTNFなどのサイトカインが含まれる。FasおよびFasリガンド遺伝子もまた、関心対象の免疫調節標的配列である（Song, et al., Nat. Med. 9:347 (2003)）。造血細胞およびリンパ系細胞の二次シグナル伝達分子をコードする遺伝子もまた、本発明に包含され、例えばBrutonのチロシンキナーゼ（Btk）のようなTecファミリーキナーゼである（Heinonen, et al., FEBS Lett. 527:274 (2002)）。
細胞レセプターリガンドとしては、細胞表面レセプター（例えばインスリンレセプター、EPOレセプター、G-タンパク質共役レセプター、チロシンキナーゼ活性を持つレセプター、サイトカインレセプター、成長因子レセプター等）に結合でき、レセプターが関与する生理学的経路（例えばグルコースレベル調節、血液細胞の発生、有糸分裂誘発等）を変えるリガンドが挙げられる。細胞レセプターリガンドの例としては、サイトカイン、成長因子、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポイエチン（EPO）、インスリン、グルカゴン、G-タンパク質共役レセプターリガンド等）が挙げられる。トリヌクレオチドリピート（例えばCAGリピート）の拡張をコードする鋳型は、脊髄延髄性筋無力症やハンチントン病のようなトリヌクレオチドリピートの拡張を原因とする神経変性障害の病因配列のサイレンシングに用いることができる（Caplen, et al., Hum. Mol. Genet. 11:175 (2002)）。
ウイルスの感染および生存に関連する遺伝子としては、細胞に結合し、細胞内に侵入し、複製するためにウイルスが発現する遺伝子が挙げられる。特に関心の対象となるものは、慢性ウイルス性疾患に関連するウイルス配列である。具体的な関心対象のウイルス配列としては、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）（Banerjea, et al., Mol. Ther. 8:62 (2003); Song, et al., J. Virol. 77:7174 (2003); Stephenson JAMA 289:1494 (2003); Qin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 100:183 (2003)）、肝炎ウイルス（Hamasaki, et al., FEBS Lett. 543:51 (2003); Yokota, et al., EMBO Rep. 4:602 (2003); Schlomai, et al., Hepatology 37:764 (2003); Wilson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 100:2783 (2003); Kapadia, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 100:2014 (2003)）、ヘルペスウイルス（Jia, et al., J. Virol. 77:3301 (2003)）およびヒトパピローマウイルス（HPV）（Hall, et al., J. Virol. 77:6066 (2003); Jiang, et al., Oncogene 21:6041 (2002)）が挙げられる。
2. その他の治療用生成物
上記説明したように、本発明のいくつかの態様では、SPLPおよびSNALPは、例えば腫瘍サプレッサー遺伝子、免疫調節遺伝子、細胞レセプターリガンド遺伝子、抗血管新生遺伝子および細胞毒性／自殺遺伝子のような治療用生成物をコードする核酸を封入する。
(a) 腫瘍サプレッサー
腫瘍サプレッサー遺伝子は、細胞、特に腫瘍細胞の増殖を抑制することができる遺伝子である。かくして、これら遺伝子の腫瘍細胞への送達は、癌治療において有用である。腫瘍サプレッサー遺伝子としては、p53（Lamb et al., Mol. Cell. Biol. 6: 1379-1385 (1986), Ewen et al., Science 255: 85-87 (1992), Ewen et al. (1991) Cell 66: 1155-1164, および Hu et al., EMBO J. 9:1147-1155 (1990)）、RB1（Toguchida et al. (1993) Genomics 17:535-543）、WT1（Hastie, N. D., Curr. Opin. Genet. Dev. 3:408-413 (1993)）、NF1（Trofatter et al., Cell 72:791-800 (1993), Cawthon et al., Cell 62:193-201 (1990)）、VHL（Latif et al., Science 260:1317-1320 (1993)）、APC（Gorden et al., Cell 66:589-600 (1991)）、DAPキナーゼ（例えばDiess et al., (1995）Genes Dev. 9:15-30参照）、p16（例えばMarx(1994）Science 264(5167):1846参照）、ARF（例えばQuelle et al., (1995）Cell 83(6):993-1000参照）、ニューロフィブロミン（例えばHuynh et al., (1992) Neurosci. Lett. 143(1-2):233-236参照）、およびPTEN（例えばLi et al., (1997) Science 275(5308): 1943-1947参照）。
(b) 免疫調節遺伝子
免疫調節遺伝子は、一つまたは複数の免疫応答を調節する遺伝子である。免疫調節遺伝子の例としては、成長因子（例えばTGF-α、TGF-β、EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、CGF、GM-CSF、G-CSF、SCF等）、インターロイキン（例えばIL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12, IL-15, IL-20等）、インターフェロン（例えばIFN-α、IFN-β、IFNG-γ等）、TNF（例えばTNF-α）およびFlt3-リガンドが挙げられる。
(c) 細胞レセプターリガンド
細胞レセプターリガンドとしては、細胞表面レセプター（例えばインスリンレセプター、EPOレセプター、G-タンパク質共役レセプター、チロシンキナーゼ活性を有するレセプター、サイトカインレセプター、成長因子レセプター等）に結合でき、レセプターが関与する生理学的経路（例えばグルコースレベル調節、血液細胞の発生、有糸分裂誘発等）を調節（例えば阻害する、活性化する等）するリガンドが挙げられる。細胞レセプターリガンドの例としては、サイトカイン、成長因子、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポイエチン（EPO）、インスリン、単鎖インスリン（Lee et al. (2000) Nature 408:483-488）、グルカゴン、G-タンパク質共役レセプターリガンド等）が挙げられるがこれらに限定されない。これら細胞表面リガンドは、疾患に苦しむ患者の治療に有用である。例えば、単鎖インスリンをグルコース反応性肝細胞特異的L型ピルビン酸キナーゼ（LPK）プロモータの制御下に発現することで、ストレプトコジン（streptocozin）誘導糖尿病ラットおよび自己免疫性糖尿病マウスの糖尿病を、副作用なしに寛解誘導できた（Lee et al. (2000) Nature 408:483-488）。この単鎖インスリンは、インスリンのCペプチドの35アミノ酸残基を、短い折り返しを形作るヘプタペプチド（Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg）で置き換えることによって作られた。
(d) 抗血管新生遺伝子
抗血管新生遺伝子は、血管新生を抑制できる遺伝子である。これら遺伝子は、血管新生が疾患の病理発生に役割を果たしている癌の治療に特に有用である。抗血管新生遺伝子の例としては、エンドスタチン（endostatin）（例えば米国特許第6,174,861号参照）、アンギオスタチン（angiostatin）（例えば米国特許第5,639,725号参照）およびVEGF-R2（例えばDecaussin et al. (1999) J. Pathol. 188(4):369-737参照）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
(e) 細胞毒性／自殺遺伝子
細胞毒性／自殺遺伝子は、細胞を直接または間接的に殺滅できる、アポトーシスを誘導できる、または細胞周期の中で細胞を捕まえることができる遺伝子である。このような遺伝子としては、抗毒素、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV-TK）、シトシンデアミナーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、p53、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、デオキシシチジンキナーゼ、ニトロレダクターゼ、チミジンホスホリラーゼ、およびチトクロームP450 2B1の遺伝子が挙げられるが、それらに限定されない。
遺伝子送達酵素プロドラッグ治療（「GDEPT」）または、あるいは「自殺遺伝子／プロドラッグ」システムとして知られる遺伝子治療技術では、一般的には、所望の細胞毒性または細胞増殖抑制作用を達成するために、アシクロビルおよびガンシクロビル（対チミジンキナーゼ）、シクロホスファミド（対チトクロームP450 2B1）、5-フルオロシトシン（対シトシンデアミナーゼ）のような薬物を、本発明の自殺遺伝子組成物をコードする発現カセットと一緒に（例えば同時もしくは非同時的、例えば連続的に）全身投与する（例えば、Moolten, F.L., Cancer Res., 46:5276-5281 (1986) 参照）。GDEPTシステムの概説については、Moolten, F.L., The Internet Book of Gene Therapy, Cancer Therapeutics, Chapter 11 (Sobol, R.E., Scanlon, NJ (Eds) Appelton & Lange (1995) 参照）。この方法では、異種遺伝子は、細胞の感受性がより低い第一化合物（すなわち「プロドラッグ」）から、細胞がより感受性である第二化合物への代謝を促進する酵素をコードする異種遺伝子であるRNAPプロモータを含有する発現カセットの形で細胞内に送達される。プロドラッグは、細胞へ遺伝子と同時または遺伝子送達後に送達される。酵素は、プロドラッグを第二化合物に加工処理し、それに応じた形にする。Mooltenが提案する好適システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV-TK）遺伝子およびプロドラッグのガンシクロビルである。この方法は、Zerrouquiら、Can. Gen. Therapy, 3(6):385-392 (1996); Sugayaら、Hum. Gen. Ther., 7:223-230 (1996)およびAokiら、Hum. Gen. Ther., 8: 1105-1113 (1997)によって、カチオン性脂質-核酸凝集体を用いたTK遺伝子のマウス腫瘍への局所送達（すなわち、腫瘍内への直接注射）または局部送達（すなわち腹腔内）に最近用いられている。ウイルスベクターを使用するGDEPTシステムを用いたヒト臨床試験が提案されており（Hum. Gene Ther., 8:597-613 (1997)、およびHum. Gene Ther., 7:255-267 (1996)）、進行中である。
本発明での使用に関して、最も好ましい治療用生成物は、遺伝子送達酵素プロドラッグ治療（「GDEPT」）に有用なものである。任意の自殺遺伝子／プロドラッグの組合せも、本発明に従って使用できる。本発明での使用に好適な、いくつかの自殺遺伝子／プロドラッグの組合せは、参照により本明細書に組み入れられるOECD文書、Gene Delivery Systems, pp.59-71 (1996) の Sikora, K に引用されており、次のものが挙げられるが、それらに限定されるわけではない：
Figure 0004842821
異種遺伝子産物によって細胞がより感受性である化合物に代謝されるものであれば、任意のプロドラッグを用いることができる。好ましくは、細胞は、プロドラッグよりも代謝物に対して少なくとも10倍感受性である。
本発明に有用であるGDEPTシステムの変形としては、例えば、TK遺伝子に突然変異を誘導してプロドラッグから薬物への変換をより迅速化する修飾TK酵素構築体の使用が挙げられる（例えば、Black et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A., 93:3525-3529(1996) 参照）。または、TK遺伝子は、その効果を増強する別の遺伝子を持つ2シストロン型の構築体として送達できる。例えば、「近接効果」としても知られる「傍観者効果」（トランスフェクションされた細胞に近接する細胞も殺滅する）を増強するために、TK遺伝子をコネクシン43のようなギャップジャックションタンパク質の遺伝子と共に送達できる。コネクシンタンパク質は、ある細胞から別の細胞にTK酵素の有毒産物を拡散させる。TK/コネクシン43構築体は、内部リボソーム侵入配列によってTK遺伝子と作動可能に連結されたCMVプロモータ、およびコネクシン43をコードする核酸を有する。
B. SPLPおよびSNALP調製物、ならびにその使用
本発明のSPLPおよびSNALP、すなわちPEG-DAA複合体を含有するSPLPおよびSNALPは、様々ある方法の任意のものを用いて作ることができる。一つの態様では、本発明は疎水性核酸-脂質中間複合体を介して調製される脂質-核酸粒子を提供する。複合体は、電荷が中和されていることが好ましい。これら複合体を、界面活性剤ベースまたは有機溶媒ベースのシステムの中で取り扱うと、その中に核酸が保護されている粒子を形成することができる。
本発明は、その中に核酸が脂質二重層内に封入されて、分解から保護されている血清安定核酸-脂質粒子を調製する方法を提供する。これに加え、本発明で形成される粒子は、好ましくは、生理学的pHにおいて中性または負に帯電している。インビボの応用では中性の粒子が有利であるが、インビトロ応用では粒子は負に帯電していることがより好ましい。これは、カチオン性脂質内に核酸を封入できる正電荷リポソーム処方物に比べ、凝集が小さくなるという別の利点を提供する。
本発明の方法で作られた粒子は、約50〜約150nmの直径を有し、大部分の粒子は約65〜85nmである。粒子は、例えば界面活性剤透析法を用いるか、または有機溶媒を利用して成分を混合する間に単一相を提供する改良逆相法によって形成することができる。特別な形成メカニズムに結びつけるつもりはないが、プラスミドまたはその他核酸は、カチオン性脂質の界面活性剤溶液に接触するとコーティングされたプラスミド複合体を形成する。これらコーティングされたプラスミドは凝集して沈殿する。しかしながら、界面活性剤の存在はこの凝集を減らし、コーティングされた核酸は過剰の脂質（典型的には、非カチオン性脂質）と反応できるようになり、脂質二重層の中にプラスミドまたはその他核酸が封入されている粒子を形成することができる。有機溶媒を用いた、核酸-脂質粒子の形成に関する以下記載の方法も、その図式は同様である。
いくつかの態様では、粒子は界面活性剤透析を用いて作られる。したがって、本発明は、血清安定性プラスミド-脂質粒子を調製するための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
(a) 核酸とカチオン性脂質を界面活性剤溶液の中に混入し、コーティングプラスミド-脂質複合体を形成する工程；
(b) 非カチオン性脂質とコーティング核酸-脂質複合体とを混合し、核酸-脂質複合体および非カチオン性脂質を含む界面活性剤溶液を形成する工程；および
(c) 工程(b)の界面活性剤溶液を透析して、核酸が脂質二重層内に封入され、粒子が血清安定であり、且つ約50〜約150 nmの大きさを有する、血清安定性核酸-脂質粒子の溶液を提供する工程。
コーティングプラスミド-脂質複合体の初期溶液は、界面活性剤溶液の中で核酸とカチオン性脂質とを混合することで作られる。
これら態様では、界面活性剤溶液は、15〜300 mM、より好ましくは20〜50 mMの臨界ミセル濃度を有する中性界面活性剤の水性溶液であることが好ましい。好適界面活性剤の例としては、例えば、N,N'-((オクタノイルイミノ)-ビス-トリメチレン))-ビス-(D-グルコナミド)（BIGCHAP）；BRIJ 35；Deoxy-BIGCHAP；ドデシルポリ(エチレングリコール)エーテル、Tween 20；Tween 40；Tween 60；Tween 80；Tween 85；Mega 8；Mega 9；Zwittergent（登録商標）3-08；Zwittergent（登録商標）3-10；Triton X-405；ヘキシル-、ヘプチル-、オクチル-、およびノニル-β-D-グルコピラノシド；ならびにヘプチルチオグルコピラノシドを挙げることができ；オクチルβ-D-グルコピラノシドおよびTwee 20が最も好ましい。界面活性剤溶液中の界面活性剤の濃度は、典型的には約100 mM〜約2 Mであり、好ましくは約200 mM〜約1.5 Mである。
カチオン性脂質および核酸は、典型的には、混合されて、約1:1〜約20:1（+/-）の電荷比、好ましくは約1:1〜約12:1の比、より好ましくは約2:1〜約6:1の比を生ずる。これに加え、溶液中のプラスミドの全体濃度は、典型的には約25μg/ml〜約1 mg/mL、好ましくは約25μg/mL〜約500μg/mLであり、より好ましくは約100μg/mLから約250μg/mLである。界面活性剤溶液での核酸とカチオン性脂質の組合せは、コーティング複合体が形成されるのに十分な時間、典型的には室温で保たれる。または、核酸とカチオン性脂質を界面活性剤溶液の中で混合してから約37℃までの温度に温めてもよい。温度に特に敏感な核酸の場合は、コーティング複合体をより低い温度、典型的には約4℃に下げて作ることができる。
好ましい態様では、形成されたSPLPまたはSNALPの脂質に対する核酸の比（質量／質量比）は、約0.01から約0.08の範囲内であろう。一般的には、精製工程により、封入されていない核酸および空のリポソームは除去されることから、原料の割合もこの範囲内である。別の好ましい態様では、SPLPまたはSNALP調製では、全脂質10 mg当たり約400μgの核酸を使用するか、または核酸の対脂質比は約0.01〜約0.08、より好ましくは約0.04であり、これは核酸50μg当たり、全脂質1.25 mgに相当する。
次に、コーティングされた核酸-脂質複合体の界面活性剤溶液を、非カチオン性脂質と合わせて、核酸-脂質複合体と非カチオン性脂質の界面活性剤溶液を得る。この段階に有用な非カチオン性脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、およびセラブロシドが挙げられる。好ましい態様では、非カチオン性脂質は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、またはスフィンゴミエリンである。これら脂質のアシル基は、好ましくはC10〜C24炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基である。より好ましくは、アシル基はラウリル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。特に好ましい態様では、非カチオン性脂質は、1,2-sn-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、卵ホスファチジルコリン(EPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、コレステロール、またはそれらの混合物であろう。最も好ましい態様では、核酸-脂質粒子は、インビボで高い特性を有する融合性粒子であり、非カチオン性脂質はDSPCまたはDOPEでありうる。上記で説明するように、本発明の核酸-脂質粒子はさらにPEG-DAA複合体を含む。これに加え、本発明の核酸-脂質粒子は、コレステロールをさらに含んでよい。
本発明に用いられる非カチオン性脂質の量は、一般的には、核酸50μgに対し全脂質で約0.5〜約10 mgである。好ましくは、全脂質量は核酸50μgに対し約1〜約5 mgである。
核酸-脂質複合体と非カチオン性脂質の界面活性剤溶液を処方後、次に界面活性剤を、好ましくは透析によって除去する。界面活性剤の除去により、約50 nm〜約150 nmの大きさを有する血清安定性核酸-脂質粒子を提供する、核酸を取り囲む脂質二重層が形成される。こうして作られた粒子は凝集せず、かつ、任意で、均一な粒度が得られるよう分粒してもよい。
血清安定性核酸-脂質粒子は、リポソームの分粒に利用可能な方法を用いて、分粒できる。分粒は、所望するサイズ幅および比較的狭い粒度分布を得るために行われる。
粒子の所望粒度への分粒には、いくつかの技術が利用できる。リポソームに使用され、本粒子にも同様に応用できる一つの分粒方法は、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,737,323号に記載されている。粒子懸濁液を、超音波槽または超音波プローブを用い超音波処理すると、粒子は約50 nm未満の粒度まで徐々に小さくなる。ホモジェナイゼーションは、大型の粒子をより小さな粒子に断片化する、剪断エネルギーに基づいた別の方法である。代表的なホモジェナイゼーション法では、選択した粒度、一般的には約60〜80 nmになるまで、粒子を標準のエマルジョンホモジェナイザーに繰り返し通す。いずれの方法でも、粒度の分布は、通常のレーザー光線粒度識別法またはQELSによってモニタリングできる。
粒子を小孔性のポリカーボネートメンブレンまたは非対称性セラミックメンブレンを通過させて押出す方法も、粒度を小さくし、比較的良く画定されたサイズ分布に納めるのに効果的な方法である。典型的には、所望の粒度分布が得られるまで、懸濁液をメンブレンに、一回または複数回繰り返し通す。粒子を、連続的に孔径が小さくなるメンブレンに通して押し出し、段階的にサイズを小さくしてもよい。
別の態様の群では、本発明は、血清安定性核酸-脂質粒子を調製するための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
(a) 有機溶媒中にカチオン性脂質と非カチオン性脂質とを含む混合液を調製する工程；
(b) 核酸の水性溶液と、工程 (a) の該混合液とを合わせて、透明な単相を得る工程；および
(c) 該有機溶媒を除去して、核酸が脂質二重層内に封入され、該粒子が血清安定であり、且つ約50〜約150 nmの粒度を有する、核酸-脂質粒子の懸濁液を得る工程。
この態様の群に有用な核酸（例えばプラスミド）、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質は、上記界面活性剤透析法について記載されたものに同じである。
有機溶媒を選択する場合は、一般的には、溶媒の極性、粒子形成の後段階における溶媒除去の容易性を考慮して行う。有機溶媒は、可溶化剤としても用いられるが、プラスミドと脂質の透明な単相混合液を提供するのに十分な量が存在する。好適溶媒としては、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、シクロペンタン、ベンゼン、トルエン、メタノール、またはプロパノール、イソプロパノール、ブタノール、t-ブタノール、イソ-ブタノール、ペンタノール、およびヘキサノールのような脂肪族アルコールが挙げられるが、これに限定されるものではない。二またはそれより多い溶媒の組合せも、本発明に使用できる。
核酸とカチオン性および非カチオン性脂質の有機溶媒液との接触は、核酸の第一溶液、一般的には水性溶液と、脂質の第二有機溶液とを一つに混合することにより達成される。当業者は、この混合が様々な方法、例えばボルテックスミキサーのような機械的手段により実施できることを理解すると思われる。
核酸を脂質の有機溶液に接触させた後、有機溶媒を除去し、それにより血清安定性核酸-脂質粒子の水性懸濁液が作られる。有機溶媒の除去に用いる方法は、典型的には減圧下での蒸発、または混合液への不活性ガス（例えば窒素またはアルゴン）流の吹き込みを含む。
こうして作られた血清安定性核酸-脂質粒子は、典型的には約50 nm〜150 nmの粒度になる。粒度をさらに小さくするか均一にするために、上記のように分粒を行うことができる。
別の態様では、方法は、本組成物を用いた細胞の形質転換の実施に有用である非脂質ポリカチオンをさらに含む。好適な非脂質ポリカチオンの例としては、ヘキサジメトリンブロミド（Aldrich Chemcial Co., Milwaukee, Wisconsin, USAより、POLYBRENE（登録商標）の商品名で販売されている）またはヘキサジメトリンのその他の塩が挙げられるが、それに限定されるわけではない。他の好適ポリカチオンとしては、例えばポリ-L-オリニチン、ポリ-L-アルギニン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ポリアリルアミン、およびポリエチレンイミンの塩が挙げられる。
いくつかの態様では、SPLPまたはSNALP内に核酸を封入する前に、ポリカチオンを用いて核酸を濃縮することができる。例えば、国際公開公報第00/03683号に記載のように、ポリカチオン（例えばポリエチレンイミン）を、PEI-濃縮DNA複合体を形成するための濃縮剤として用いることができる。
ある態様では、核酸-脂質粒子は、単相系（例えばBlighとDyerの単相、または同様の水性および有機溶媒の混合物）または好適混合物を用いる二相系のいずれでも生成できる。
複合体の生成を単相系で実施する場合は、カチオン性脂質および核酸それぞれを単相混合液容積内に溶解する。二溶液を混合して単一の混合液とし、その中で複合体を生成する。または、複合体は、カチオン性脂質を核酸（水相内に存在する）に結合させてから、それを有機相に「引き」入れる二相混合液で生成することもできる。
別の態様では、本発明は、核酸-脂質粒子を調製するための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
(a) 核酸を、非カチオン性脂質と界面活性剤とを含む溶液と合わせて、核酸-脂質混合液を生成する工程；
(b) カチオン性脂質と核酸-脂質混合液とを合わせて核酸の負電荷の一部を中和し、電荷が中和された核酸と脂質の混合液を生成する工程；および
(c) 電荷中和混合液から界面活性剤を除去して、その中の核酸が分解から保護されている脂質-核酸粒子を得る工程。
一群の態様では、非カチオン性脂質と界面活性剤の溶液は、水性溶液である。非カチオン性脂質と界面活性剤の溶液への核酸の接触は、一般的には、核酸の第一溶液と脂質および界面活性剤の第二溶液とを一つに混合することで達成される。当業者は、この混合が、様々な方法、例えばボルテックスミキサーを用いるような機械的手段により実施できることを理解するだろう。好ましくは、核酸溶液は、界面活性剤溶液でもある。本発明に用いる非カチオン性脂質の量は、一般的には、使用するカチオン性脂質の量に基づき決定され、典型的にはカチオン性脂質の約0.2〜5倍、好ましくは使用するカチオン性脂質の約0.5〜約2倍である。
こうして作られた核酸-脂質混合液をカチオン性脂質と合わせ、存在する核酸（またはその他ポリアニオン性物質）に付随する負電荷の一部を中和する。用いるカチオン性脂質の量は、一般的には、核酸の負電荷の少なくとも50%を中和するのに十分な量である。好ましくは、負電荷は、少なくとも70%が中和され、より好ましくは少なくとも90%が中和される。本発明に有用なカチオン性脂質としては、例えばDODAC、DOTMA、DDAB、DOTAP、DC-Chol、およびDMRIEが挙げられる。これら脂質および関連類似体は、同時係属中のUSSN第08/316,399号;米国特許第5,208,036号、第5,264,618号、第5,279,833号、および第5,283,185号に記載されており、各特許の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。これに加えて、多数の市販のカチオン性脂質調製物が入手可能であり、発明に使用することができる。このようなものとしては、例えばLIPOFECTIN（登録商標）（DOTMAおよびDOPEを含む市販のカチオン性リポソーム、GIBCO/BRL、Grand Island, New York, USA）；LIPOFECTAMINE（登録商標）（DOSPAおよびDOPEを含む市販のカチオン性リポソーム、GIBCO/BRL）；およびTRANSFECTAM（登録商標）（DOGSを含む市販のカチオン性リポソーム、Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA）が挙げられる。
カチオン性脂質と核酸-脂質混合液とを接触させることは、様々な技術、好ましくはカチオン性脂質の溶液と核酸脂質混合物を含む溶液とを一つに混合することによって達成できる。二溶液を混合する（または別のやり方で接触させる）ことによって、核酸に付随する負電荷の一部は中和される。しかしながら、核酸は凝縮されない状態のままであり、親水性を獲得する。
カチオン性脂質を核酸-脂質混合液と合わせた後、界面活性剤（または界面活性剤と有機溶媒の組合せ）を除去して脂質-核酸粒子を形成する。界面活性剤の除去に用いる方法は、一般的には透析が挙げられる。有機溶媒が存在する場合、除去は、一般的には、減圧下での蒸発、または混合液への不活性ガス（例えば窒素またはアルゴン）流の吹き込みによって達成される。
こうして作られた粒子は、典型的には約100 nmから数ミクロンの大きさになる。粒子のサイズをさらに小さくするか均一にするために、脂質-核酸粒子を超音波処理、ろ過、またはリポソーム調剤に用いられる、当業者に公知のその他の分粒技術にかけることができる。
別の態様では、方法は、本組成物を用いた細胞のリポフェクション実施に有用である非脂質ポリカチオンを追加することをさらに含む。好適な非脂質ポリカチオンの例としては、ヘキサジメトリンブロミド（Aldrich Chemcial Co., Milwaukee, Wisconsin, USAより、POLYBRENE（登録商標）の商品名で販売されている）またはヘキサジメトリンのその他の塩が挙げられる。他の好適ポリカチオンとしては、例えばポリ-L-オリニチン、ポリ-L-アルギニン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ポリアリルアミン、およびポリエチレンイミンの塩が挙げられる。これらの塩の追加は、粒子形成後に行うのが好ましい。
別の局面では、本発明は、核酸-脂質粒子調製のための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
(a) ある量のカチオン性脂質を核酸溶液と接触させる工程；このとき溶液は約15〜35%の水および約65〜85%の有機溶媒を含み、かつカチオン性脂質の量は、約0.85〜約2.0の+/-電荷比を生じ、疎水性の脂質-核酸複合体を提供するのに十分な量である；
(b) 疎水性の脂質-核酸複合体溶液と非カチオン性脂質とを接触させて、核酸-脂質混合液を提供する工程；および
(c) 脂質-核酸混合液から有機溶媒を除去して、その中の核酸が分解から保護されている脂質-核酸粒子を提供する工程。
本発明のこの局面に有用な核酸、非カチオン性脂質、カチオン性脂質、および有機溶媒は、界面活性剤を用いる上記の方法について記載されたものと同じである。ある群の態様では、工程 (a) の溶液は単相である。別の群の態様では、工程 (a) の溶液は二相である。
好ましい態様では、カチオン性脂質はDODAC、DDAB、DOTMA、DOSPA、DMRIE、DOGS、またはそれらの組合せである。別の好ましい態様では、非カチオン性脂質は、ESM、DOPE、DOPC、DSPC、ポリエチレングリコールをベースとするポリマー（例えば、PEG 2000、PEG 5000、PEG-修飾ジアシルグリセロール、またはPEG-修飾ジアルキルオキシプロピル）、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、コレステロール、またはそれらの組合せである。さらに別の好ましい態様では、有機溶媒はメタノール、クロロホルム、メチレンクロライド、エタノール、ジエチルエーテル、またはそれらの組合せである。
特に好ましい態様では、核酸はプラスミドであり；カチオン性脂質は、DODAC、DDAB、DOTMA、DOSPA、DMRIE、DOGS、またはそれらの組合せであり；非カチオン性脂質はESM、DOPE、PEG-DAA、ジステアリルホスファチジルコリン(DSPC)、コレステロールまたはそれらの組合せ（例えばDSPCとPEG-DAA）であり；かつ有機溶媒はメタノール、クロロホルム、メチレンクロライド、エタノール、ジエチルエーテル、またはそれらの組合せである。
上記同様、核酸とカチオン性脂質との接触は、一般的には、核酸の第一溶液と脂質の第二溶液とを一つに混合する、好ましくはボルテックスミキサーを用いるような機械的手段によって混合することで達成される。生じた混合液は、上記のような複合体を含有する。これら複合体は、次に、非カチオン性脂質の追加、および有機溶媒を除去することによって、粒子に変換される。非カチオン性脂質の添加は、一般的には、非カチオン性脂質を複合体含有混合液に単純に加えることで達成される。加え方を逆にしても良い。続く有機溶媒の除去は、当業者に公知であり、かつ上記の方法によっても達成される。
本発明のこの局面に用いられる非カチオン性脂質の量は、典型的には、電荷中和脂質-核酸複合体を得るために使用したカチオン性脂質の量（モルをベースとして）の約0.2〜約15倍である。好ましくは、この量は、使用したカチオン性脂質の量の約0.5〜約9倍である。
さらに別の局面では、本発明は、上記の方法で調製した脂質-核酸粒子を提供する。これら態様では、脂質-核酸粒子は、正味の電荷が中性であるか、または全体に電荷を帯びており、これによりより高い遺伝子リポフェクション活性を持つ粒子を提供する。好ましくは、粒子の核酸成分は、望ましいタンパク質をコードするか、または望ましくないタンパク質の産生を阻害する核酸である。好ましい態様では、核酸はプラスミドであり、非カチオン性脂質は卵スフィンゴミエリンであり、カチオン性脂質はDODACである。特に好ましい態様では、核酸はプラスミドであり、非カチオン性脂質はDSPCとコレステロールの混合物であり、かつカチオン性脂質はDOTMAである。別の特に好ましい態様では、非カチオン性脂質は、コレステロールをさらに含んでよい。
本明細書には、SPLP-CPL（CPL含有SPLP）またはSNALP-CPL（CPL含有SNALP）を作製するための、様々な一般的な方法が論じられている。二つの一般的な方法としては、「後挿入」技術、即ちCPLを、例えば事前に作られたSPLPまたはSNALPに挿入する技術、および、例えばSPLPまたはSNALP生成段階中の脂質混合物中にCPLを含める「標準」技術がある。後挿入技術では、CPLが主にSPLPまたはSNALP二重層膜の外面に存在するSPLPを提供し、一方標準技術は、CPLが内外両面に存在するSPLPまたはSNALPを提供する。
具体的には、「後挿入」は、SPLPまたはSNALPを形成（任意の方法による）すること、および事前に形成したSPLPまたはSNALPをCPL存在下に適切な条件（好ましくは60℃で2〜3時間）でインキュベーションすることを包含する。CPLの60〜80％がレシピエント小胞の外部小葉内に挿入でき、最大約5〜10モル％の最終濃度を得る（全脂質に対して）。本方法は、リン脂質（コレステロールを含むことができる）から作製する小胞に特に有用であり、またPEG-脂質（PEG-DAAなど）を含有する小胞にも有用である。
「標準的な」技術の例では、本発明のCPL-SPLPおよびCPL-SNALPは、押出によって形成できる。この態様では、CPLを含む全ての脂質はクロロホルムに同時に溶解され、次にこれは窒素下で除去され、続いて高真空によって除去される。脂質混合物は適切なバッファーで水和され、2枚の孔径100nmのポリカーボネートフィルターを通して押し出される。得られたSPLPまたはSNALPは、内外両面にCPLを含有する。さらに別の標準的技術では、CPL-SPLPまたはCPL-SNALPの形成は、例えば、共に参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,976,567号および第5,981,501号に論じられているような、界面活性剤透析またはエタノール透析法を用いて達成できる。
本発明の核酸-脂質粒子は、単独で、または投与経路および標準的な薬学的経験に基づき選択される、生理学的に許容されるキャリア（生理食塩水またはリン酸緩衝液のような）と混合して投与できる。一般的には、通常の生理食塩水は、薬学的に許容されるキャリアとして用いられる。その他の好適キャリアとしては、安定性を高めるための糖タンパク質としてアルブミン、リポタンパク質、グロブリン等を含有する、例えば水、緩衝化水、0.4%生理食塩水、0.3%グリシン等が挙げられる。
薬学的キャリアは、一般的には粒子生成後に加えられる。したがって、粒子が生成された後に、粒子は、通常生理食塩水のような薬学的に許容されるキャリアに希釈できる。
薬学的製剤中の粒子濃度は極めて幅広く、即ち約0.05重量%未満、通常はまたは少なくとも約2〜5重量%から10〜30重量%にまで及び、濃度は選択した実際の投与形態に従って、主に流体容積、粘度等から選択される。例えば、濃度は治療に伴い加えられる流体が少ないほど高くなりうる。このことは、虚血性心不全または重症高血圧を伴うアテローム性動脈硬化症の患者には、特に望ましいと思われる。または、刺激性の脂質から成る粒子は、低濃度に希釈して、投与部位の炎症を小さくできる。
上記のように、本発明の核酸-脂質粒子はPEG-DAA複合体を含む。PEG-DAA複合体と類似の様式で機能するその他成分、および粒子の凝集を阻害して血中寿命を長くし、標的組織への核酸-脂質粒子の送達を高める手段を提供する、その他成分を含めることがしばしば望まれる。このような成分としては、粒子に結合する、PEG-セラミドまたはPEG-リン脂質（PEG-PEのような）のようなPEG-脂質複合体、ガングリオシドGM1-修飾脂質、またはATTA-脂質が挙げられるが、それに限定されるわけではない。典型的には、粒子中の成分濃度は、約1〜20%、より好ましくは約3〜10%である。
本発明の薬学的組成物は、通常の、周知の滅菌技術によって滅菌できる。水性溶液は、無菌条件下に、使用のために包装または濾過して凍結乾燥でき、凍結乾燥された調製物は、投与前に無菌水性溶液と混合する。組成物は、pH調節剤および緩衝化剤のような生理学的条件に近づけるのに必要な、薬学的に許容される補助物質、張性調節剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウムを含有できる。これに加えて、粒子懸濁液は、保存中のフリーラジカルや脂質-ペルオキシダーゼによる損傷から脂質を保護する、脂質保護剤を含んでよい。アルファトコフェロールのような親脂質性フリーラジカル消去剤、およびフェリオキサミンのような水溶性鉄種キレート剤が好適である。
それらの別の使用例では、脂質-核酸粒子は、ゲル、オイル、乳液等を包含するが、しかし、それらに限定されるわけではない広範な局部投与形態に組み入れることができる。例えば、核酸-脂質粒子を含有する懸濁液を調合し、局部用のクリーム、ペースト、軟膏、ゲル、ローション等として投与できる。
一度形成されると、本発明の血清安定核酸-脂質粒子は、細胞内への核酸の導入に有用である。従って、本発明はまた細胞内に核酸（例えばプラスミド）を導入するための方法も提供する。方法は、まず上記のようにして粒子を形成すること、次に粒子を細胞とトランスフェクションが起こるのに十分な期間接触させることによって、インビトロまたはインビボで実施される。
本発明の核酸-脂質粒子は、混合または接触の相手となる、ほとんどすべてのタイプの細胞に吸着されることができる。一度吸着されると、粒子は細胞の一部によって細胞内に取り込まれ、細胞膜と脂質を交換するか、または細胞と融合する。粒子の核酸部分の移動または取り込みは、これら経路のいずれか一つを介して起こる。具体的には、融合が起こると、粒子の膜は細胞膜と一体化し、粒子の内容物は細胞内液と混合する。
本発明のERPアッセイを用いると、SPLPまたはその他脂質ベースのキャリアシステムのトランスフェクション効率を最適化できる。より具体的には、ERPアッセイの目的は、様々なカチオン性脂質の効果とSPLPの補助脂質成分の効果とを、結合／取り込み、またはエンドゾーム膜との融合／不安定化に及ぼすそれらの相対効果に基づいて区別することである。このアッセイによって、SPLPまたはその他脂質ベースのキャリアシステムの各成分が、トランスフェクションの効率にどれだけ影響を与えているか定量的に測定することができ、それによってSPLPまたはその他脂質ベースのキャリアシステムを最適化することができる。本明細書で説明するように、エンドソーム放出パラメータ、またはERPは、次のように定義されている：
Figure 0004842821
任意のレポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グリーン蛍光タンパク質等）も用いることができることは、当業者に容易に明らかになると思われる。これに加えて、細胞内への取り込みを抑制または妨害する場合、脂質構成成分（または、SPLPもしくは脂質ベース処方物の任意の構成成分）を検出可能な標識で標識することもできる。本発明のERPアッセイを用いることで、当業者は様々な脂質構成成分（例えばカチオン性脂質、非カチオン性脂質、PEG-脂質誘導体、PEG-DAA複合体、ATTA-脂質誘導体、カルシウム、CPL、コレステロール等）の細胞取り込みおよびトランスフェクション効率に及ぼす影響を評価でき、それによってSPLPまたはその他脂質ベースのキャリアシステムを最適化できる。様々なSPLPまたはその他脂質ベース処方物ぞれぞれについてERPを比較することによって、最適化されたシステム、例えば最高のトランスフェクション効率と相まって、最大の細胞内取り込みを示すSPLPまたはその他脂質ベースの処方物を容易に決定できる。
本発明のERPアッセイ実施に好適な標識としては、蛍光色素（例えばフルオロセインイソチオシアネート（FITC）およびOregon Green（商標）のようなフルオロセインおよび誘導体；ローダミンおよびテキサスレッド、テトラローダミンイソチオシネート（TRITC）のような誘導体、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリスリン、AMCA、CyDyes（商標）等の分光学的標識；3H、125I、35S、14C、32P、33P等の放射線標識；セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素；コロイド金または着色ガラス、またはポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等のプラスチックビーズのような分光学的比色定量標識が挙げられるが、これに限定されるわけではない。標識は、当技術分野で周知の方法を用いて、SPLPまたはその他脂質ベースキャリアシステムに直接または間接的に結合できる。上記のように、多様な標識が利用でき、必要とされる感度、SPLP成分との結合しやすさ、安定性要求、および利用できる装置や消耗品に応じて標識を選択する。
V. PEG-DAA複合体含有リポソーム
上記のSPLP処方物に加えて、本発明のPEG-DAA複合体は、空のリポソーム、または、例えば本明細書に記載の治療用生成物を含めた、本明細書に記載の生物活性作用物質を一つまたは複数含有するリポソームの調製に用いることができる。リポソームはまた、一般的にはカチオン性脂質および非カチオン性脂質も含む。いくつかの態様では、リポソームは、さらにステロール（例えばコレステロール）も含む。
A. リポソーム調製物
リポソームの調製には、例えばSzoka, et al., Ann, Rev. Biophys. Bioeng., 9:467 (1980)、米国特許第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、第4,946,787号、PCT国際公開公報第91/17424号、Deamer and Bangham、Biochim. Biophys. Acta, 443:629-634 (1976)；Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348-3352 (1979); Hope, et al., Biochim. Biophys. Acta, 812:55-65 (1985); Mayer, et al., Biochim. Biophys. Acta, 858:161-168 (1986); Williams, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:242-246 (1988), the text Liposomes, Marc J. Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Chapter 1、およびHope, et al., Chem. Phys. Lip., 40:89 (1986)に記載されているような各種方法を利用することができ、これらは全て、参照により本明細書に組み入れられる。好適な方法としては、超音波処理、押出し、高圧／ホモジェナイゼーション、マイクロフルイダイゼーション、界面活性剤透析、小さなリポソーム小胞のカルシウム誘発融合、およびエーテル注入法が挙げられるが、それらに限定されるわけではなく、その全ては当技術分野において周知である。
一つの方法は、不均一な大きさの多重膜小胞を生成する。この方法では、小胞形成脂質は、好適な有機溶媒または溶媒系に溶解してから、真空下または不活性ガス下で乾燥して薄層脂質フィルムを形成する。望ましければ、フィルムをtert-ブタノールのような好適溶媒に再溶解し、次に凍結乾燥し、より水和が容易な粉末状の、より均一な脂質混合物に形成してもよい。このフィルムに水性緩衝化溶液を重層し、一般的には15〜60分間攪拌して水和する。生じた多重膜小胞のサイズ分布は、より強い攪拌条件で脂質を水和するか、またはデオキシコール酸塩のような可溶化界面活性剤を加えることによって、より小さなサイズにシフトできる。
単層小胞は、超音波処理または押出しによって調製できる。超音波処理は、一般的には、Bransonチップ超音波発生装置のようなチップ型超音波発生器を用いて、氷槽内で実施される。典型的には、懸濁液を、断続的な超音波サイクルにかける。押出しは、Lipex Biomembrane Extruderのような生体膜押出機を用いて行うことができる。押出しフィルターの規定の孔径により、指定サイズの単層リポソーム小胞を生成することができる。リポソームは、Norton Company, Worcester MAから市販されているCeraflow Microfilterのような非対称型セラミックフィルターを通して押し出すことによっても形成することできる。単層小胞は、さらに、リン脂質をエタノールに溶解して、次に緩衝液中に脂質を噴射し、脂質を自発的に単層小胞に形成させることによって作製することもできる。また、リン脂質は、例えばコール酸塩、Triton Xまたはn-アルキルグルコシドのような界面活性剤に溶解することもできる。溶解した脂質-界面活性剤ミセルに薬物を加えた後、界面活性剤は、透析、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離および限外濾過を含む、多くの可能な方法の任意のものによって取り除かれる。
リポソーム調製後、形成中一定の大きさに作られなかったリポソームは、望ましい大きさの範囲の、比較的狭いリポソームサイズ分布を形成する。約0.2〜0.4ミクロンのサイズ範囲は、通常のフィルターを通した濾過によるリポソーム懸濁液の滅菌を可能にする。リポソームのサイズが約0.2〜0.4ミクロンまで縮小されていれば、フィルター滅菌法を高い処理量ベースで実施できる。
リポソームの大きさを所望のサイズにするには、いくつかの技術が利用できる。一つのサイジング方法は、米国特許第4,737,323号に記載されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。水槽またはプローブ超音波処理操作によるリポソーム懸濁液の超音波処理は、さらにサイズを、大きさ約0.05ミクロン未満の小さな単層小胞まで縮小する。ホモジェナイゼーションは、剪断エネルギーに基づいて大きなリポソームをより小さなものに断片化する別の方法である。典型的なホモジェナイゼーション操作では、多重膜小胞は、選択されたリポソームのサイズ、一般的には約0.1〜0.5ミクロンが認められる、標準的なエマルジョンホモジェナイザーに繰り返しかけられる。リポソーム小胞のサイズは、参照により本明細書に組み入れられる、Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421-450 (1981)に記載されている準電光散乱（QELS）によって決定できる。リポソームの平均直径は、形成されたリポソームを超音波処理することによって縮小できる。間欠的な超音波サイクルとQELS評価を交互に行うことで、効率的なリポソーム合成を行うことができる。
小孔ポリカーボネート膜または非対称型セラミック膜を通したリポソームの押出しも、リポソームの大きさを比較的良く画定されたサイズ分布にまで縮小するための効果的な方法である。一般的には、懸濁液を、一回または複数回、所望のリポソームサイズ分布が得られるまで、メンブレンを通して循環する。リポソームを、連続的に、孔径のより小さな膜を通して押出し、リポソームサイズを漸次的に小さくしてもよい。本発明での使用に関しては、約0.05ミクロン〜約0.40ミクロンの範囲の大きさを有するリポソームが好ましい。特に好ましい態様では、リポソームは、約0.05〜約0.2ミクロンの間である。
好ましい態様では、空のリポソームは、当業者に公知である通常の方法を用いて調製される。
B. 送達賦形剤としてのリポソームの使用
本発明の薬物送達組成物（例えばリポソーム、ミセル、脂質-核酸粒子、ビロゾーム等）は、治療薬または生物活性作用物質の全身または局所送達に有用であり、また診断アッセイにも有用である。
以下の論議は、一般的にはリポソームを指している；しかしながら、この同じ論議が、本発明の別の薬物送達システム（例えばミセル、ビロゾーム、核酸-脂質粒子（例えばSNALPおよびSPLP）等であり、それらは全て本発明のPEG-DAA複合体を用いて都合良く形成することができる）にも完全に適用できることは、当業者には、容易に明らかになるだろう。
治療薬または生物活性作用物質の送達のためには、PEG-DAA含有リポソーム組成物に治療薬を加え、治療を必要とする対象に投与できる。本発明の組成物および方法を用いて投与される治療薬は、治療対象疾患にとって適切な治療薬として選択される任意の様々な薬物でよい。多くの場合、薬物は、ビンクリスチン（ならびにその他のビンカアルカロイド）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カンプトテシン、シスプラチン、ブレオマイシン、シクロホスファミド、メトトレキセート、ストレプトゾトシン等の抗悪性腫瘍剤である。特に好ましい抗腫瘍剤としては、例えばアクチノマイシンD、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シスチンアラビノシド、アントラサイクリン、アルキル化剤、白金化合物、抗代謝薬、ならびにメトトレキセートおよびプリンおよびピリミジン類似体のようなヌクレオシド類似体が挙げられる。本発明の化合物および方法を用いて、特定の組織に抗感染薬を送達することも望ましいであろう。本発明の組成物は、局所麻酔薬、例えばジブカインおよびクロロプロマジン；ベータ-アドレナリン作用ブロッカー、例えばプロパノロール、チモロールおよびラベトロール；高血圧治療薬、例えばクロニジンおよびヒドララジン；抗抑うつ剤、例えばイミプラミン、アミトリプチリンおよびドキセピム（doxepim）；抗発作薬、例えばフェニトイン；抗ヒスタミン剤、例えばジフェンヒドラミン、クロロフェニリミンおよびプロメタジン；抗生物質／抗菌剤、例えばゲンタマイシン、シプロフロキサシンおよびセフォキシチン；抗真菌剤、例えばミコナゾール、テルコナゾール、エコナゾール、イソコナゾール、ブタコナゾール、クロトリマゾール、イトラコナゾール、ナイスタチン、ナフチフィンおよびアンフォテリシンB；抗悪性腫瘍剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、免疫調節剤、神経伝達物質アンタゴニスト、緑内障治療薬、ビタミン、鎮静剤、および造影剤を含むが、それらに限定されるわけではない、その他薬物の選択的送達のために用いることもできる。
上記のように、カチオン性脂質は、細胞内でのいくつかのタンパク質の産生を誘導または阻止することを意図した治療遺伝子またはオリゴヌクレオチドの送達に用いることができる。核酸は負に帯電しており、正電荷成分と組み合わさり、上記核酸の処方物および細胞送達に好適なSPLPを形成することができる。
本発明のPEG-DAA複合体の別の臨床応用は、動物およびヒト両方の免疫用アジュバントとしての応用である。ジフテリア毒素、コレラ毒素、寄生虫抗原、ウイルス抗原、免疫グロブリン、酵素および組織適合性抗原のようなタンパク質抗原を、免疫を目的として、本発明のPEG-DAA複合体を含有するリポソーム内に組み入れる、またはその上に結合することができる。
本発明のPEG-DAA複合体を含有するリポソームはまた、適切なリンパ器官を標的として免疫応答を刺激するワクチンのキャリアーとしても特に有用である。
本発明のPEG-DAA複合体を含有するリポソームはまた、マクロファージに選択的に免疫抑制または免疫刺激作用物質を送達するベクターとしても用いることができる。特に、本発明のリポソームを用いて、マクロファージ活性を抑制するのに有用なグルココルチコイドおよびマクロファージを活性化するリンフォカインが送達できる。
本発明のPEG-DAA複合体を含有し、かつ標的分子を含有するリポソームは、細胞の刺激または抑制に用いることができる。例えば、特定の抗原を組み入れたリポソームは、その抗原に特異的に結合する表面抗体を提示しているB細胞集団を刺激するのに用いることができる。成長因子またはリンフォカインをリポソーム表面に組み入れたリポソームは、これら因子に対し適切なレセプターを発現している細胞を刺激するのに用いることができる。このやり方により、骨髄細胞を刺激し、癌患者の治療の一部として増殖を刺激することができる。
本発明のPEG-DAA複合体を含有するリポソームは、現在PEG-誘導体化リポソームに調合されている生成物を含む、任意の生成物（例えば治療薬、診断薬、標識またはその他化合物）の送達に用いることができる。
ある態様では、本発明のリポソームを、細胞のタイプまたは組織に特異的な標的化成分を用いて、標的化することが望ましい。リガンド、細胞表面レセプター、糖タンパク質、ビタミン（例えばリボフラビン）およびモノクローナル抗体のような様々な標的化成分を用いたリポソームの標的化がこれまで報告されている（例えば、その教示が参照により本明細書に組み入れられている米国特許第4,957,773号および第4,603,044号を参照）。標的化成分は、タンパク質全体またはその断片を含むことができる。
標的化のメカニズムは、一般的には、標的化作用物質を、標的化成分が標的、例えば細胞表面レセプターと相互作用できるようにリポソームの表面上に配置することを必要とする。一つの態様では、リポソームは、リポソーム形成時に膜の中に連結部分を取り込むように設計される。連結部分は、膜内にしっかり埋め込まれ、固定される親油性部分を有していなければならない。それはまた、リポソームの水性表面上にあって、化学的に利用できる親水性部分も有していなければならない。親水性部分は、その部分と標的化作用物質とが安定した化学結合を形成するように、作用物質に対し化学的に好適であるものが選択される。それゆえに、連結部分は通常、リポソーム表面から外に伸びており、標的化作用物質を正しく位置づけるように形成されている。いくつかの例では、標的化作用物質を連結部分に直接結合できるが、多くの場合は、「分子架橋」として機能する第三の分子を用いることがより好適である。架橋は、連結部分とリポソーム表面外にある標的化作用物質とを結び付けており、それによって標的化作用物質は、細胞標的と自由に相互作用できるようになる。
標的化作用物質を結合するための標準的な方法を用いることができる。例えば、標的化作用物質を結合させるために活性化することができるホスファチジルエタノールアミン、または脂質誘導ブレオマイシンのような誘導親油性化合物を用いることができる。抗体-標的化リポソームは、例えばプロテインAを組み入れたリポソームを用いて作成することができる（Renneisen, et al., J. Bio. Chem., 265:16337-16342 (1990) I：およびLeonetti, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 87:2448-2451 (1990）参照）。標的化成分の例としては、新生物または腫瘍と関連する抗原を含む、細胞成分に特異的な他のタンパク質も挙げることができる。標的化成分として使用するタンパク質は、共有結合を介してリポソームに結合することができる。Heath, Covalent Attachment of Proteins to Liposomes, 149 Methods in Enzymology 111-119 (Academic Press, Inc. 1987）参照。その他の標的化の方法としては、ビオチン-アビジンシステムが挙げられる。
いくつかの例では、リポソームの診断標的化を連続して用い、標的細胞または組織を処理することができる。例えば、トキシンを標的化リポソームに結合し、次にトキシンを用いて、新生物細胞のような標的細胞を破壊することができる。
C. 診断薬としてのリポソームの使用
本発明のPEG-DAA複合体を用いて調製した薬物送達組成物、例えばリポソームは、腫瘍、炎症を起こした関節、障害等を含む様々な疾患状態の診断画像化を容易にするマーカーで標識できる。典型的には、これら標識は、放射性マーカーであるが、蛍光標識も用いることができる。ガンマ線を放出する放射性同位元素は、シンチレーションウエルカウンターで容易に測定でき、測定前に組織をホモジェナイゼーションする必要がなく、またガンマカメラを使って画像化できることから、特に有利である。
ガンマ-放出放射性同位元素またはポジトロン-放出放射性同位元素が、例えばガンマ放出体としては99Tc、24Na、51Cr、59Fe、67Ga、86Rb、111In、125Iおよび195Ptが；ポジトロン放出体としては68Ga、82Rb、22Na、75Br、122Iおよび18Fが一般的に用いられる。リポソームは、磁気共鳴映像法（MRI）または電子スピン共鳴（ESR）を用いるようなインビボ診断の目的のために、常磁性同位元素でも標識できる。例えば、米国特許第4,728,575号を参照し、その教示は、参照により本明細書に組み入れられる。
D. リポソームへの付加
通常の薬物をリポソーム内に付加する方法としては、例えば封入技術、二重層内挿入および膜内外電位差付加法がある。
一つの封入技術では、薬物およびリポソーム成分は、全てが混和できる有機溶媒に溶解し、乾燥フィルムに濃縮する。次に緩衝液を乾燥フィルムに加えて、小胞壁内に薬物を取り込んだリポソームを形成する。または、薬物を緩衝液内に入れてから、脂質成分だけの乾燥フィルムに加えることもできる。この様式の場合、薬物はリポソームの水性内部に封入されるようになる。リポソーム形成に用いる緩衝液は、生物学的に適合した任意の緩衝液でよく、例えば、等張食塩水、リン酸緩衝化食塩水、または低イオン強度緩衝液でよい。一般的には、薬物は、約0.01ng/mL〜約50ng/mLの量で存在する。こうして得られた、薬物が水性内部または膜内に取り込まれているリポソームは、次に上記のようにしてサイジングしてもよい。
膜内外電位差付加法は、米国特許第4,885,172号、第5,059,421号および第5,171,578号に詳しく記載されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。簡単に説明すると、膜内外電位差付加法は、適切な水性媒体中に溶解したときに電荷状態で存在できるものであれば、実質すべての通常の薬物に用いることができる。好ましくは、薬物は比較的親油性であって、リポソーム膜内に分配される。膜内外電位差は、リポソームまたはタンパク質-リポソーム複合体の二重層を横切り作成され、薬物は膜内外電位差によってリポソーム内に付加される。膜内外電位差は、膜を横切る、一つまたは複数の電荷種（例えばNa+、K+および／またはH+）の濃度勾配を造ることによって出来る。この濃度勾配は、様々な内部および外部媒体を有するリポソームを調製することで生成され、それに伴うプロトン勾配を有する。このとき薬物は、Henderson-Hasselbach方程式で推測される様式で蓄積する。
本発明のリポソーム組成物は、対象に対し、標準的技術に従い投与できる。好ましくは、リポソーム組成物の医薬組成物は、非経口的、すなわち腹腔内、静脈内、皮下または筋肉内に投与される。より好ましくは、医薬組成物は、大量注射により静脈投与される。本発明での使用に好適な処方物は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Compnay, Philadelphia, Pa., 17版、(1985）に見出される。医薬組成物は、例えば様々な状態の診断、様々な疾患状態（炎症、感染症（ウイルスおよび細菌感染症の両方）、新生物、癌等）の処置に用いることができる。
好ましくは、医薬組成物は静脈内に投与される。かくして、本発明は、許容しうるキャリア、好ましくは水性キャリア中に懸濁したリポソーム溶液を含む、静脈内投与のための組成物を提供する。様々な水性キャリア、例えば水、緩衝化した水、0.9％等張食塩水等を用いることができる。これら組成物は、通常の、周知滅菌技術で滅菌できるが、またはは濾過滅菌してもよい。得られた水性溶液は、そのまま使用するために包装しても、または凍結乾燥してもよく、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水溶液と合わせてもよい。組成物は、pH調整および緩衝化剤、浸透圧調整剤、湿潤剤等のような、適切な生理学的条件に近づけるために必要な薬剤学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリル酸ソルビタン、トリエタノールアミンオレエート等を含有してもよい。
医薬処方物中のリポソーム組成物の濃度は、極めて広範囲であり、すなわち約0.05重量％未満から、一般的にまたは少なくとも約2〜5重量％から10〜30重量％程度までであり、選択された具体的な投与形態に従って、主に液体の容積、粘度等により決まる。診断目的では、組成物の投与量は、使用する具体的標識（すなわち放射線標識、蛍光標識等）、診断対象の疾患状態、および医師の判断に依存するが、一般的には約1〜約5mg/kg体重であると考えられる。
発明を、具体的な実施例を用いて、より詳しく説明する。以下の実施例は、例示を目的として提出するものであり、いかなる形においても、本発明を制限すること意図したものではない。当業者は、実質同一の結果を生ずる変更または改良が可能である、様々な重要でないパラメータを容易に認識するであろう。
実施例
実施例1. PEG-ジアルキルオキシプロピル（PEG-DAA）の合成
以下の実施例では、3種類のPEG-脂質、PEG-A-DMA (7)、PEG-C-DMA (8)、およびPEG-S-DMA (9)の合成を説明する。これらは共通の前駆体、アミン脂質1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン(5)を有する。この脂質は、14炭素単位(C14)の長さのアルキル鎖を持つ。本発明での使用に好適なその他PEG DAAは、同様のプロトコルを用いて合成することができる。例えば、PEG-A-DSAおよびPEG-C-DSAは、(5)のC18類似体を用いて合成することができる。C18類似体は、第一工程（化合物(1)の合成）のミリスチルブロミドを、等モル量のステアリルブロミドに単純に置き換えることによって合成することができる。
1. 1,2-ジミリスチルオキシ-3-アリルオキシプロパン(1)の調製
Figure 0004842821
ベンゼン（250 ml）を95%水素化ナトリウム（11.4 g、450.0 mmol）に加え、フラスコを窒素でフラッシュして密封した。3-アリルオキシ-1,2-プロパンジオール（6.6 g、50.0 mmol）のベンゼン（75 ml）溶液をフラスコに加えた。シリンジを使って、97%の1-ブロモテトラデカン（36.7 ml、120.0 mmol）をフラスコに加え、一定の窒素流を加えながら、一晩反応液を還流した。一度室温に冷却してから、泡立ちが観察されなくなるまで、エタノールを用いて過剰の水素化ナトリウムをゆっくりクエンチングした。溶液を、ベンゼン(250 ml)と一緒に分液ロートに移し、蒸留水（3×200 ml）で洗浄した。硫酸マグネシウムを用いて有機層を乾燥させ、溶媒をロータリーエバポレーターで取り除き、無色の油状物を得た。TLC（5%エーテル-ヘキサン、モリブデン酸塩で発色）は、出発材料の大部分が反応して生成物を形成したことを示した。この得られた生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（1〜5%エーテル-ヘキサン）によりさらに精製し、15.0 g（57.3%）の1,2-ジミリスチルオキシ-3-アリルオキシプロパン1を得た。
2. 1,2-ジミリスチルオキシプロパン-3-オール(2)の調製
Figure 0004842821
1.2-ジミリスチルオキシ-3-アリルオキシプロパン1（15.0 g、28.6 mmol）をエタノール（250 ml)に溶解した。トリフルオロ酢酸（20 ml）を加え、続いてテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0)（4.5 g、3.9 mmol）を加えた。フラスコをスズ箔で覆い、窒素をフラッシュして、光と空気への曝露を減らしてから、次に80℃で一晩攪拌した。ロータリーエバポレーターでエタノールを除いた。TLC（100% CHCl3、モリブデン酸塩で発色）は、出発材料の大部分が反応して生成物を形成したことを示した。得られたこの生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（100% DCM）によりさらに精製し、11.5 g（83.1%）の1,2-ジミリスチルオキシプロパン-3-オール2を得た。
3. O-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル)メタンスルホネート(3)の調製
Figure 0004842821
97%無水メタンスルホン酸（8.4 g、48.0 mmol）の入ったフラスコを窒素でフラッシュし、無水ジクロロメタン（50 ml）に溶解した。無水ピリジン（3.9 ml、48.0 mmol）をゆっくり加え、白色の沈殿物が形成させた。1,2-ジミリスチルオキシプロパン-3-オール 15（11.5 g、24.0 mmol）の無水ジクロロメタン（100 ml）溶液を加え、反応液を一晩、室温で攪拌し続けた。溶液を、ジクロロメタン（100 ml)と一緒に分液ロートに移し、蒸留水（3×100 ml）で洗浄した。合わせた水性洗浄水を、ジクロロメタン（100 ml）で逆抽出した。合わせた有機層を、硫酸マグネシウムを用いて乾燥させ、ジクロロメタンをロータリーエバポレーターで取り除いて、無色の油状物を得た。TLC（100% CHCl3、モリブデン酸塩で発色）は、出発材料がすべて反応し、生成物を形成したことを示した。この反応により、11.9 gの粗O-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル)メタンスルホネート3を得た。
4. N-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル）フタルイミド(4)の調製
Figure 0004842821
粗O-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル）メタンスルホネート 3（14.2 g、25.3 mmol）およびフタルイミドカリウム（13.9 g、75.0 mmol）を窒素でフラッシュし、無水N,N-ジメチルホルムアミド（250 ml）に溶解した。反応液を、70℃で、一晩、一定の窒素流を当てながら攪拌し続けた。N,N-ジメチルホルムアミドを、通常のアスピレータに代わって高真空ポンプ用いたロータリーエバポレーターで除いた。残留物をクロロホルム（300 ml）に溶解し、クロロホルムすすぎ液（50 ml）と一緒に分液ロートに移してから、蒸留水およびエタノール（蒸留水3×300 ml、エタノール50 ml）で洗浄した。合わせた水性洗浄水をクロロホルム（2×100 ml）で逆抽出した。合わせた有機層を、硫酸マグネシウムを用いて乾燥させ、クロロホルムをロータリーエバポレーターで取り除いた。TLC（30%エーテル-ヘキサン、モリブデン酸塩で発色）は、出発材料が反応して生成物を形成したことを示した。この反応により、13.5 gの粗N-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル)フタルイミド4を得た。
5. 1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン(5)の調製
Figure 0004842821
粗N-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル）フタルアミド4（20.0 g、25.0 mmol）をエタノール（300 ml）に溶解した。一水和ヒドラジン（20 ml、412.3 mmol）を加え、反応液を一晩還流し続けた。エタノールをロータリーエバポレーターで取り除き、残留物をクロロホルム（200 ml）に再溶解した。沈殿物を濾取し、クロロホルムをロータリーエバポレーターで取り除いた。TLC（10% MeOH-CHCl3、モリブデン酸塩で発色）は、出発材料の大部分が反応して、生成物を形成したことを示した。こうして得られた生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（0〜5% MeOH-CHCl3）を用いて精製し、10.4 g（1,2-ジミリスチルオキシプロパン-3-オール2から三工程を通して89.7%）の1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン5を得た。
6. メトキシPEG2000酢酸(6)の調製
Figure 0004842821
10%濃硫酸（20 ml）の水溶液（180 ml）を重クロム酸ナトリウム（3.0 g、10 mmol）に加えた。PEG2000メチルエーテル（20.0 g、10 mmol）をこの鮮オレンジ色の溶液に溶解し、反応液を室温で一晩攪拌し続けた。次に生成物をクロロホルム（3×250ml）で抽出すると、暗青色をした水層を残した。クロロホルム溶媒をロータリーエバポレーターで取り除くと、淡青色のワックスが得られた。TLC（13% MeOH-CHCl3、ヨードで発色）は、出発材料の大部分が反応して生成物を形成したことを示した。次に、この粗材料をフラッシュカラムクロマトグラフィー（0〜15% MeOH-CHCl3）を用いてさらに精製した。次に、得られた生成物をエーテル中で結晶化し、白色の固体として5.6 g（27.1%）のメトキシPEG2000酢酸6を得た。
7. N-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル）アミドPEG2000メチルエーテル(7)の調製
Figure 0004842821
N-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル)アミドPEG2000メチルエーテル（即ちPEG-A-DMA）を調製するために、メトキシPEG2000酢酸6（3.4 g、1.7 mmol）をベンゼン（40 ml）に溶解して、窒素でフラッシュした。塩化オキサリル（1.7 ml、2.5 g、20 mmol）を針のついたシリンジを使って、サブシール越しにゆっくり加えた。この反応液を2時間、攪拌し続けてから、ロータリーエバポレーターを使ってベンゼン溶媒を取り除いた。2,3-ミリスチルオキシプロピルアミン5（0.87 g、1.8 mmol）をフラスコに加え、続いて無水ジクロロメタン（40 ml）およびトリエチルアミン（1.5 ml、10 mmol）を加えた。反応液を48時間攪拌し続けた。蒸留水（250 ml）を加え、塩酸（1.5 ml）を使って溶液を酸性化して振とうし、有機層を集めた。生成物を、水層からクロロホルム（2×65 ml）を用いて抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。クロロホルムをロータリーエバポレーターで取り除き、黄色の固体を得た。TLC（10% MeOH-CHCl3、硫酸銅およびヨードで発色）は、出発材料の大部分が反応して生成物を形成したことを示した。次に、この粗材料をフラッシュカラムクロマトグラフィー（0〜7% MeOH-CHCl3）を用いてさらに精製した。次に、活性炭（2 g）およびエタノール（100 ml）を加え、混合液をロータリーエバポレーターで、55℃、30分間、回転させて脱色した。チャコールを濾取し、エタノールをロータリーエバポレーターで取り除いた。生成物を凍結乾燥し、綿毛状の白色の粉末として1.7g（38.1%）のN-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル)アミドPEG2000メチルエーテル7を得た。
8. N-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル）カルバメートPEG2000メチルエーテル (8)の調製
Figure 0004842821
N-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル)カルバメートPEG2000メチルエーテル（即ち、PEG-C-DMA）の調製では、上記の工程1〜5を繰り返した。その後、PEG2000メチルエーテル（2.0g、1.0 mmol）を窒素でフラッシュし、無水ジクロロメタン（15 ml）に溶解した。ジホスゲン（300μl、2.5 mmol）を加えて、反応液を室温で3時間攪拌し続けた。ジクロロメタンをロータリーエバポレーターで取り除き、残留ジホスゲンを高真空ポンプを用いて取り除いた。フラスコを窒素でフラッシュしてから2,3-ジミリスチルオキシプロピルアミン5（0.7g、1.5 mmol）を加えた。これを無水ジクロロメタン（15 ml）に溶解し、トリエチルアミン（280μl）を加え、反応液を室温で一晩、攪拌し続けた。溶液をジクロロメタン（5ml）と一緒に分液ロートに移し、蒸留水（2×20 ml）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ジクロロメタンをロータリーエバポレーターで取り除いた。TLC（3% MeOH-CHCl3、モリブデン酸塩およびヨードで発色）は、出発材料の大部分が反応して生成物を形成したことを示した。得られたこの生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（1.5〜10% MeOH-CHCl3）を用いてさらに精製し、1.2 g（46.5%）のN-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル)カルバメートPEG2000メチルエーテル8を得た。
9. N-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル)スクシンアミドPEG2000メチルエーテル(13)の調製
N-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル)スクシンアミドPEG2000メチルエーテル（13）の調製では、上記の工程1〜5を繰り返した。残りの手順は次のとおりである
a. PEG2000メシレート (9)の調製
Figure 0004842821
無水メシル（8.2 g、47.1 mmol）を無水クロロホルム（80 ml）に溶解した。ピリジン（3.8 ml、47.0 mmol）を溶液に加え、白色の沈殿物が形成する間、煙霧が観察された。PEG2000メチルエーテル（31.5 g、15.5 mmol）の無水クロロホルム（70 ml）溶液を加え、反応液を3時間攪拌し続けた。形成した白色の沈殿物を濾取し、濾液のクロロホルム溶媒はロータリーエバポレーターで取り除いた。TLC（5% MeOH-CHCl3、ヨードで発色）は、出発材料の大部分が反応して生成物を形成したことを示した。この生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（0〜10% MeOH-CHCl3）を用いてさらに精製し、白色の固体として30.1g（92.8%）のPEG2000メシレート9を得た。
b. PEG2000フタルイミド (10)の調製
Figure 0004842821
フタルイミドカリウム（11.1 g、59.7 mmol）を、無水N,N-ジメチルホルムアミド（400 ml）に溶解した。PEG2000メシレート9（35.0 g、16.7 mmol）の無水N,N-ジメチルホルムアミド（100 ml）溶液をフラスコに加え、反応液を75℃で一晩攪拌し続けた。N,N-ジメチルホルムアミド溶媒を、通常のアスピレータの代わりに高真空ポンプを用い、ロータリーエバポレーターで取り除いた。得られた生成物をジクロロメタン（250 ml）に溶解し、蒸留水（2×250 ml）およびブライン（250 ml）で洗浄した。合わせた有機層のジクロロメタン溶媒を、ロータリーエバポレーターで取り除いた。TLC（7% MeOH-CHCl3、UV光およびマリー試薬で視覚化した）は、出発材料の大部分が反応して生成物を形成したことを示した。この得られた生成物は、フラッシュカラムクロマトグラフィー（0〜10% MeOH-CH2Cl2）を用いてさらに精製した。生成物をエーテルから結晶化して19.4 g（54.1%）のPEG2000フタルイミド10を得た。
c. PEG2000アミン (11)の調製
Figure 0004842821
PEG2000フタルイミド10（10.3 g、4.8 mmol）を、エタノール(200 ml）に溶解した。一水和ヒドラジン（6.0 ml、123.7 mmol）をゆっくり加え、反応液を100℃で一晩還流し続けた。白色の沈殿物を濾取し、エタノール溶媒をロータリーエバポレーターで取り除いた。生じた生成物をクロロホルムに溶解し、クロロホルムに不溶性である、残った白色の固体を濾取し、再度クロロホルムをロータリーエバポレーターで取り除いた。TLC（10% MeOH-CHCl3、ヨード、モリブデン酸塩、およびマリー試薬で発色）は、すべての出発材料が反応して生成物を形成したことを示した。この生成物を次にエーテルから結晶化して、白色の粉末として9.0 g（93.0%）のPEG2000アミン11を得た。
d. PEG2000スクシンアミド (12)の調製
Figure 0004842821
PEG2000アミン11（9.0 g、4.4 mmol）および無水コハク酸（3.8 g、38.1 mmol）をピリジン（100 ml）に溶解し、反応液を一晩攪拌し続けた。ピリジン溶媒を、ロータリーエバポレーターを用いて60℃で取り除いた。残留物を蒸留水（100 ml）に溶解し、塩酸で酸性化し、ジクロロメタン（100 ml、2×70 ml）で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。TLC（10% MeOH-CHCl3、ヨードで発色）は、出発材料の大部分が反応して生成物を形成したことを示した。この生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（0〜10% MeOH-CHCl3）を用いてさらに精製し、5.2 g（55.9%）のPEG2000スクシンアミド12を得た。
e. N-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル）スクシンアミドPEG2000メチルエーテル(13)の調製
Figure 0004842821
PEG2000スクシンアミド（2.0 g、0.9 mmol）およびN-ヒドロキシスクシンアミド（0.2 g、2.0 mmol）を無水クロロホルム（10 ml）に溶解した。次に、1,3-ジシクロヘキシル-カルボジイミド（0.3 g、1.5 mmol）の無水クロロホルム（5 ml）溶液を加え、反応液を1時間攪拌し続けた。1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン5（0.48 g、1.0 mmol）の無水クロロホルム（5 ml）およびトリエチルアミン（0.6 ml、4 mmol）溶液を加え、反応液を1時間攪拌し続けた。TLC（12% MeOH-CHCl3、モリブデン酸塩で発色）は、出発材料の大部分が反応して生成物を形成したことを示した。溶液を、ジクロロメタンを用いてセライトで濾過し、塩酸で酸性化し、蒸留水（2×50 ml）およびブライン（50 ml）で洗浄した。水層をジクロロメタン（50 ml）で逆抽出し、合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（0〜7% MeOH-CHCl3）を用いてさらに精製し、1.8 g（69.0%）のN-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル)スクシンアミドPEG2000メチルエーテル13を得た。
それらの安定性を試験するために、各C18PEG-脂質を空リポソームに調合し、37℃インキュベータの中に42日間保管した。リポソームは、次の脂質を、カッコ内に記したモル比で含有した：コレステロール（55％）、1,2-ジオレイルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパン（15％）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（20％）、PEG-脂質(10％）。さらにPEG-CerC20および市販のPEG-DSPEも調合されたが、PEG-DSGは対照として調合された。様々な時点で、インキュベータより各サンプルの一部を取り出し、エタノールで希釈してからHPLCで分析し、存在する特定のPEG2000脂質の濃度を決定した。検出法としては、蒸発性光散乱検出器を用いた。結果を図2に示す。
実施例2：PEG-ジアルキルオキシプロピル複合体を含むSPLPに封入された核酸の発現
本実施例は、PEG-ジアシルグリセロール複合体を含む、SPLPに封入された核酸の発現を、PEG-ジアルキルオキシプロピル複合体を含むSPLPと比較する実験を記載している。全てのSPLP処方物は、CMVプロモータ（pLO55）の制御下にあるルシフェラーゼをコードするプラスミドを含む。
Figure 0004842821
全てのSPLP処方物は、PL055およびDSPC:Chol:DODMA:PEG-脂質（20:55:15:10）を含有した。次の処方物を作製した：
A： PBS（pH 7.4）。
B： L055 PEG-DSG SPLP、0.50mg/ml。
C： L055 PEG-DSPE SPLP、0.50mg/ml。
D： L055 PEG-セラミドC20 SPLP、0.50mg/ml。
E： L055 PEG-A-DSA SPLP、0.50mg/ml。
F： L055 PEG-C-DSA SPLP、0.50mg/ml。
G： L055 PEG-S-DSA SPLP、0.50mg/ml。
Figure 0004842821
0日目に、各マウスに1.5×106個のNeuro2A細胞を含むPBS 50μlを皮下投与した。13日目にマウスを無作為化し、SPLP処方物またはPBSを静脈内（IV）注射の一つにより単回投与処理した。投与量は、投与日に行った体重測定に基づいた。SPLP投与48時間後に、マウスの体重を測定してから屠殺し、それらの血液を採取し、次の組織を収集して、重量を測定し、直ちに凍結して、更なる分析まで-80℃で貯蔵した：腫瘍、肝臓（2分割）、肺、脾臓、および心臓。
集めた組織の遺伝子発現は、発現したルシフェラーゼレポータタンパク質の酵素活性をアッセイすることによって決定した。結果は、図3および4に示す。
結果は、SPLP静脈内注射48時間後、PEG-ジアルキルオキシプロピル複合体を含むSPLPによる腫瘍内のトランスフェクションレベルは、PEG-ジアシルグリセロール複合体を含むSPLPによるものと本質的に同様であることを証明している。PEG-ジアルキルオキシプロピル複合体を含むSPLPを注射したマウスの器官（肝臓、肺、脾臓および心臓）での遺伝子発現量もまた、PEG-ジアシルグリセロール複合体を含むSPLPのものと本質的に同様である。
実施例3：PEG-ジアルキルオキシプロピル複合体を含むSPLPに封入された核酸の発現
本実施例は、PEG-ジアルキルオキシプロピル複合体を含むSPLPに封入された核酸の発現を比較する実験を記載している。全てのSPLP処方物は、CMVプロモータ（pLO55）の制御下にあるルシフェラーゼをコードするプラスミドを含む。
Figure 0004842821
脂質（DSPC:CHOL:DODMA:PEG-脂質）は、SPLP中、次のモル比（20:55:15:10）で存在している。次の処方物を作製した：
A: 濾過滅菌PBS、5mL
B: PEG-DSGを含むpL055-SPLP、0.50mg/mLで2mL。
C: PEG-A-DSAを含むpL055-SPLP、0.50mg/mLで2mL。
D: PEG-A-DPAを含むpL055-SPLP、0.50mg/mLで2mL。
E: PEG-A-DMAを含むpL055-SPLP、0.50mg/mLで2mL。
Figure 0004842821
0日目に、各マウスに1.5×106個のNeuro2A細胞を皮下投与した。腫瘍が適切な大きさ（200〜400mm3）に達した時点でマウスを無作為化し、SPLP処方物またはPBSを静脈内（IV）注射によって単回投与し処理した。投与量は、投与日に行った体重測定に基づいた。SPLP投与48時間後にマウスを屠殺し、それらの血液を採取し、次の組織を収集して、重量を測定し、直ちに凍結して、更なる分析まで-80℃で貯蔵した：腫瘍、肝臓（2分割）、肺、脾臓、および心臓。
集めた組織の遺伝子発現は、発現したルシフェラーゼレポータタンパク質の酵素活性をアッセイすることによって決定した。結果は、図5および6に示す。
結果は、PEG-ジアルキルオキシプロピル（すなわちPEG-DAA）を含むSPLPは、PEG-ジアシルグリセロールを含むSPLPと実質同程度に、遠位腫瘍のトランスフェクションに好都合に使用できることを示している。さらには、PEG-ジアルキルグリセロール含有SPLPに見られたトランスフェクションレベルは、PEG-ジアシルグリセロール（例えばPEG-DSG）含有SPLPに見られるものと同様であった。結果はまた、非腫瘍組織では、殆どトランスフェクションが起こらなかったことも証明した。さらには、PEG-ジアルキルオキシプロピルを含むSPLPは、他のSPLP処方物に比べて低い毒性を示した。
実施例4：PEG-ジアルキルオキシプロピル複合体を含むSPLPおよびpSPLPに封入された核酸の発現
本実施例は、SPLPと比較する形で、PEG-ジアルキルオキシプロピルを含むSPLPに封入された核酸の発現と、PEI濃縮DNA（pSPLP）とを比較する実験を記載している。
Figure 0004842821
全ての処方物は、DSPC:Chol:DODMA:PEG-DAG (20:55:15:10)を含む。次の処方物を作製した：
A: PBS (pH 7.4)。
B: L055 PEG-DSG pSPLP、0.5 mg/ml。
C: L055 PEG-DPG pSPLP、0.43 mg/ml。
D: L055 PEG-DMG pSPLP、0.5 mg/ml。
E: L055 PEG-A-DSA pSPLP、0.5 mg/ml。
F: L055 PEG-A-DPA pSPLP、0.5 mg/ml。
G: L055 PEG-A-DMA pSPLP、0.5 mg/ml。
H: L055 PEG-A-DSA SPLP、0.5 mg/ml。
I: L055 PEG-A-DPA SPLP、0.5 mg/ml。
J: L055 PEG-A-DMA SPLP、0.5 mg/ml。
K: L055 PEG-A-DMA SPLP、2.1 mg/ml。
0日目に、各マウスに1.5×106個のNeuro2A細胞を含むPBS 50μlを皮下投与した。13日目にマウスを無作為化し、SPLP処方物またはPBSを静脈内（IV）注射により単回投与処理した。投与量は、投与日に行った体重測定に基づいた。SPLP投与48時間後に、マウスの体重を測定してから屠殺し、それらの血液を採取し、次の組織を収集して、重量を測定し、直ちに凍結して、更なる分析まで-80℃で貯蔵した：腫瘍、肝臓（2分割）、肺、脾臓、および心臓。
集めた組織の遺伝子発現は、発現したルシフェラーゼレポータタンパク質の酵素活性をアッセイすることによって決定した。結果は、図7および8に示す。
Figure 0004842821
結果は、pSPLP中の短鎖PEG-脂質（すなわちPEG-DMGおよびPEG-A-DMA）の存在が、長鎖型（すなわちPEG-DSGおよびPEG-A-DSA）に比べて、腫瘍のトランスフェクションを約5〜10倍下げることを示している。これらの結果をまとめると、pSPLPがC14PEG-脂質を含有すると、SPLPに対するpSPLP（C18PEG-脂質）に見られる腫瘍トランスフェクションの増加は完全に消失する。これは、いくつかの要因によるものである可能性がある：(1) PEG-脂質がpSPLPの二重層から離れることによるpSPLPの安定性の低下、(2) PEG-脂質除去による電荷増加、または(3) C14 PEG-脂質について、条件が最適化されていない（例えば、二重層内のアニオン性脂質の量）。これらのうちのどれが問題であるか決定するには、さらに実験を行う必要があると考えられる。また、その他の器官での活性は、全てのシステムで極めて低かった。興味深いことに、20mg/kg投与量のPEG-A-DMA SPLPは、腫瘍では、5mg/kg投与量時と同等のルシフェラーゼ発現を示したが、肝臓では同じ5mg/kg投与量に比べ遙かに高い遺伝子発現を示した。
実施例5：SNALPを用いた遺伝子発現のサイレンシング
本実施例は、CMVプロモータの制御下にあるルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLPおよび抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPを同時投与した後の、Neuro2A腫瘍担持マウスにおける遺伝子発現のサイレンシングを例証する。
Figure 0004842821
36匹のオスA/Jマウス（Jackson Laboratories）に、0日目に、1.5×106細胞の投与量のNeuro 2A細胞を、全容積50μLのリン酸緩衝化食塩水液として皮下に接種した。腫瘍が適切な大きさに達した時点（一般的には9日目またはそれ以後）で、200〜240μlのPBS、SPLP、または上記実施例6の記載に従い調製したSNALP処方物（全核酸量100μg）を静脈内に投与した。PBS、SPLPまたはSPLPとSNALPの混合物を投与した24、48または72時間後に、マウスを屠殺して器官（例えば肝臓、肺、脾臓、腎臓、心臓）および腫瘍を集め、ルシフェラーゼ活性について評価した。
pL055 SPLPおよび抗luc siRNA SNALP（共にPEG-A-DMAを含有する）の同時投与は、単回静脈内投与48時間後に、ルシフェラーゼ遺伝子発現を最大40％下げた。結果は図9〜13に示す。
実施例6：PEG-DAA複合体を含むSPLPの取り込み
本実施例は、インビトロにおける哺乳動物細胞による、PEG-DAA複合体を含むSPLPの取り込みを例証する。下表に記載のSPLP処方物を3H-CHEで標識し、細胞と、4℃または37℃で24時間インキュベーションした。SPLPは2、4または10mol％のいずれかのPEG-C-DMA複合体を含んでいた。
Figure 0004842821
SPLPの取り込みは、37℃でおよびPEG-C-DMA量が少ないほど高い効率で起こった。データを図14に示す。
実施例7：PEG-DAA複合体を含むSPLPの生体内分布および血液クリアランス
本実施例は、PEG-DAA複合体を含むSPLPの生体内分布および血液クリアランスを例証する。PEG-C-DMAまたはPEG-C-DSAを含む3H-CHE標識SPLPを、Neuro-2a腫瘍を担持したオスのA/Jマウスに静脈内投与した。SPLPは次のように調合した：
Figure 0004842821
肝臓、脾臓、肺、および腫瘍でのSPLP生体内分布を、SPLP投与48時間後に決定した。結果は、図15に示す。
SPLPの血液クリアランスは、SPLP投与の1、2、4および24時間後に決定した。結果は、図16に示す。
実施例8：PEG-DAA複合体を含むSPLPおよびSNALPの生体内分布および血液クリアランス
本実施例は、PEG-DAA複合体を含むSPLPおよびSNALPの生体内分布および血液クリアランスを例証する。PEG-C-DMAまたはPEG-C-DSAのいずれかを含む3H-CHE標識SPLPまたはSNALPを、Neuro-2a腫瘍を担持したオスのA/Jマウスに静脈内投与した。SPLPは、ルシフェラーゼをコードする封入プラスミドを含み、SNALPは、封入された抗ルシフェラーゼsiRNA配列を含む。SPLPおよびSNALP処方物は、全て次の脂質比を有した：DSPC 20％：コレステロール55％：PEG-脂質10％：DODMA 15％。
肝臓、脾臓、副腎、腫瘍、小腸、リンパ節、腎臓、大腸、大腿骨、心臓、胸腺、精巣、および脳におけるSPLPまたはSNALPの生態分布を、SPLPまたはSNALP投与24時間後に決定した。結果は、図17に示す。
PEG-C-DMAまたはPEG-C-DSAを含むSPLPおよびSNALPの血液クリアランスを、SPLPおよびSNALP投与後1、2、4、8、および24時間後に決定した。結果は、図18に示す。
実施例9：PEG-DAA複合体を含むSPLPおよびpSPLPによる細胞のトランスフェクション
本実施例は、CMVプロモータ制御下にあるルシフェラーゼをコードするプラスミドを封入する各種SPLP処方物を用いたインビボトランスフェクション後の、器官および腫瘍での遺伝子発現を評価するために行われた、3つの別々の実験について記載する。
第一の実験は、SPLPおよびpSPLPを静脈内投与した後に、Neuro 2A腫瘍を担持するオスA/Jマウスにおけるルシフェラーゼ遺伝子発現を評価した。C14およびC18 PEG-C-DAAを含む処方物を、同等のPEG-DAGと比較した。PEG成分の分子量は2000ダルトンであった。SPLPでは、DODMAをカチオン性脂質として用いた。pSPLPでは、POPGまたはDOPのいずれかをアニオン性脂質として用いた。SPLPおよびpSPLPは、次のように調合した：
Figure 0004842821
ルシフェラーゼ遺伝子の発現を、SPLPおよびpSPLP静脈内投与48時間後に、肝臓、肺、脾臓、心臓、および腫瘍について測定した。ルシフェラーゼ発現は、試験した全てのSPLPおよびpSPLPで、他のタイプの組織に比べ腫瘍において最も高かった。結果は、図19に示す。
第二の実験は、PEG-C-DMAを異なる割合で含む（即ち15％、10％、5％、または2.5％）SPLPを静脈内投与した後の、Neuro 2A腫瘍を担持するオスA/Jマウスにおけるルシフェラーゼ遺伝子の発現を評価した。
Figure 0004842821
腫瘍でのルシフェラーゼ発現を、SPLP投与48時間後に測定した。結果は、図20に示す。
第三の実験セットは、異なる大きさのPEG成分（即ち2000または750ダルトン）を有するPEG-C-DMA複合体を含むSPLPを静脈内投与した後の、Neuro 2A腫瘍を担持するオスA/Jマウスにおけるルシフェラーゼ遺伝子の発現を評価した。
Figure 0004842821
ルシフェラーゼ遺伝子の発現を、SPLP投与の48時間後に、肝臓、肺、脾臓、心臓、および腫瘍について測定した。ルシフェラーゼ発現は、試験した全てのSPLPで、他のタイプの組織に比べ腫瘍において最も高かった。結果は、図21に示す。
実施例10：PEG-DAA複合体を含むSNALPを用いた、遺伝子発現のインビトロ遺伝子サイレンシング
本実施例は、siRNA封入SNALP送達後の、遺伝子発現のインビトロでのサイレンシングについて記載する。ルシフェラーゼを発現しているNeuro2A-G細胞を、抗ルシフェラーゼsiRNA（即ち、次の配列：GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUU（SEQ ID NO:1）を含み、DNA配列：GATTATGTCCGGTTATGTATT（SEQ ID NO:2）を標的にするsiRNA）を封入したSNALP処方物と、クロロキン存在下または非存在下で48時間接触させた。SNALP処方物は様々な量、即ち1％、2％、4％、または10％のPEG-C-DMA（C14）を含有した。カチオン性脂質はDODMAであった。
Figure 0004842821
結果は、図22に示す。
実施例11：PEG-DAA複合体を含むSNALPを用いた、遺伝子発現のインビボでのサイレンシング
本実施例は、siRNA封入SNALP投与後の、遺伝子発現のインビボでのサイレンシングを証明する実験について記載する。
実験は、siRNA封入SNALPの投与により、転移性腫瘍での遺伝子発現をサイレンシングできることを証明している。転移性肝臓癌を有する、ルシフェラーゼを発現しているNeuro-2a腫瘍担持オスA/Jマウスを、PEG-DAA複合体を含み、抗ルシフェラーゼsiRNA（即ち、次の配列：
Figure 0004842821
（SEQ ID NO:1）を含み、DNA配列：
Figure 0004842821
（SEQ ID NO:2）を標的にするsiRNA）を封入したSNALPで処理した。全てのSNALPは次の配合を有した：DSPC 20％：コレステロール55％：PEG-C-DMA10％：DODMA 15％。マウスは、SNALPの単回静脈内投与を受けた。腫瘍におけるルシフェラーゼ発現を、SNALP注射の48時間後に決定した。結果は、SNALPの投与が、SNALP投与部位から遠位にある部位でのインビボの遺伝子発現をサイレンシングできることを証明した。これらの結果は、図23に示す。
上記の説明は例示を目的としたものであり、制限するものでないことが理解される。上記説明を読むことにより、多くの態様が当業者に明らかになると考えられる。したがって、本発明の範囲は、上記の記載を基準として決定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲に権利が与えられる同等物の包括的範囲と共に、特許請求の範囲を基準として決定されるべきである。特許出願、特許、PCT公報を含むすべての文献および参考資料の開示は、すべての目的について、参照により本明細書に組み入れられる。
2種類の例示的なPEG-ジアルキルオキシプロピル誘導体、すなわちN-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル)カルバメートPEG2000メチルエーテル（すなわち、PEG-C-DMA）、N-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル)アミドPEG2000メチルエーテル（すなわち、PEG-A-DMA）およびN-(2,3-ジミリスチルオキシプロピル)スクシンアミドPEG2000メチルエーテル（すなわち、PEG-S-DMA）の構造を示す。 PEG-DAA複合体、PEG-DAG複合体、PEG-セラミド複合体、およびPEG-DSPE複合体を含むリポソームの安定性を表すデータを示す。 PEG-DAA複合体、PEG-DAG複合体、およびPEG-セラミド複合体を含むSPLPを静脈内投与した後の、腫瘍におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現を表すデータを示す。 PEG-DAA複合体、PEG-DAG複合体、PEG-セラミド複合体、およびPEG-DSPE複合体を含むSPLPによるインビボトランスフェクションを表すデータを示す。 PEG-DAA複合体およびPEG-DAG複合体を含むSPLPを静脈内投与してから48時間後の、腫瘍におけるルシフェラーゼ遺伝子発現を表すデータを示す。 PEG-DAA複合体およびPEG-DAG複合体を含むSPLPを静脈内投与した後の、肝臓、肺、脾臓、心臓、および腫瘍でのルシフェラーゼ遺伝子発現を表すデータを示す。 PEG-DAA複合体およびPEG-DAG複合体を含むSPLPまたはpSPLPを静脈内投与してから48時間後の、腫瘍におけるルシフェラーゼ遺伝子発現を表すデータを示す。 PEG-DAA複合体およびPEG-DAG複合体を含むSPLPによるインビボトランスフェクションを表すデータを示す。 PEG-DAA複合体を含みかつCMVプロモータ制御下にあるルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLP、ならびにPEG-DAA複合体を含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPで処理されたNeuro-2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおける、ルシフェラーゼ発現のサイレンシングを証明するインビボデータを示す。 PEG-DAA複合体を含みかつCMVプロモータ制御下にあるルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLP、ならびにPEG-DAA複合体を含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPで処理されたNeuro-2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおける、ルシフェラーゼ発現のサイレンシングを証明するインビボデータを示す。 PEG-DAA複合体を含みかつCMVプロモータ制御下にあるルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLP、ならびにPEG-DAA複合体を含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPで処理されたNeuro-2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおける、ルシフェラーゼ発現のサイレンシングを証明するインビボデータを示す。 PEG-DAA複合体を含みかつCMVプロモータ制御下にあるルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLP、ならびにPEG-DAA複合体を含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPで処理されたNeuro-2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおける、ルシフェラーゼ発現のサイレンシングを証明するインビボデータを示す。 PEG-DAA複合体を含みかつCMVプロモータ制御下にあるルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLP、ならびにPEG-DAA複合体を含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPで処理されたNeuro-2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおける、ルシフェラーゼ発現のサイレンシングを証明するインビボデータを示す。 PEG-C-DMA複合体を含むSPLPの細胞による取り込みを証明するデータを示す。 SPLPまたはSNALP投与から24時間後の、Neuro-2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおける、PEG-C-DMAを含むSPLPおよびSNALPの生体内分布を証明するデータを示す。 SPLP投与から24時間後までの、オスA/Jマウスにおける、PEG-C-DMA複合体を含むSPLPの血液クリアランスを証明するデータを示す。 SPLPまたはSNALPの投与から48時間後の、Neuro-2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおける、PEG-C-DMAまたはPEG-C-DSAを含むSPLPおよびSNALPの生体内分布を証明するデータを示す。 SPLPまたはSNALPの投与から24時間後までの、オスA/Jマウスにおける、PEG-C-DMAまたはPEG-C-DSAを含むSPLPおよびSNALPの血液クリアランスを証明するデータを示す。 PEG-DAA複合体およびPEG-DAG複合体を含み、かつルシフェラーゼをコードするプラスミドを封入している、SPLPおよびpSPLPによるインビボトランスフェクションを証明するデータを示す。 PEG-C-DMA複合体を含み、かつルシフェラーゼをコードするプラスミドを封入している、SPLPによるインビボトランスフェクションを証明するデータを示す。 PEG-C-DMA複合体を含み、かつルシフェラーゼをコードするプラスミドを封入している、SPLPによるインビボトランスフェクションを証明するデータを示す。 PEG-C-DMA複合体を含み、かつ抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPと接触したNeuro-2a細胞におけるルシフェラーゼ発現のサイレンシングを証明するデータを示す。 ルシフェラーゼを発現し、ならびにPEG-C-DMA複合体を含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを封入しているSNALPで処理されたオスA/Jマウスにおける、転移性Neuro-2a腫瘍でのルシフェラーゼ発現のサイレンシングを証明するインビボデータを示す。

Claims (60)

  1. 次の構造を有する式Iの化合物：
    Figure 0004842821
    式中、
    R1およびR2は、独立に選択され、かつ10〜20個の炭素原子を有するアルキル基であり；
    PEGは、ポリエチレングリコールであり、ここでその末端のヒドロキシル基がメチル基で置換され；および
    Lは、カルバメート含有リンカー部分である。
  2. アルキル基が、ラウリル（C12）、ミリスチル（C14）、パルミチル（C16）、ステアリル（C18）およびイコシル（C20）からなる群より選択される、請求項1記載の化合物。
  3. R1およびR2が同一である、請求項1記載の化合物。
  4. R1およびR2が共にミリスチル（C14）である、請求項3記載の化合物。
  5. R1およびR2が共にパルミチル（C16）である、請求項3記載の化合物。
  6. R1およびR2が共にステアリル（C18）である、請求項3記載の化合物。
  7. アルキル基が飽和している、請求項1記載の化合物。
  8. アルキル基が不飽和である、請求項1記載の化合物。
  9. PEGが550ダルトン〜10,000ダルトンの範囲の平均分子量を有する、請求項1記載の化合物。
  10. PEGが750〜5,000ダルトンの範囲の平均分子量を有する、請求項9記載の化合物。
  11. PEGが1,000〜5,000ダルトンの範囲の平均分子量を有する、請求項9記載の化合物。
  12. PEGが1,500〜3,000ダルトンの範囲の平均分子量を有する、請求項9記載の化合物。
  13. PEGが2,000ダルトンの平均分子量を有する、請求項9記載の化合物。
  14. Ｌが、式：
    Figure 0004842821
    （式中、点線はＰＥＧの末端の酸素への結合点を示し、波線は化合物の別の部分への結合点を示す）
    である、請求項1記載の化合物。
  15. 次式：
    Figure 0004842821
    を有する、請求項1記載の化合物。
  16. 次の構造を有する式Iのポリエチレングリコール-ジアルキルオキシプロピル（PEG-DAA）複合体を含む、リポソーム：
    Figure 0004842821
    式中、
    R1およびR2は、独立に選択され、かつ10〜20個の炭素原子を有するアルキル基であり；
    PEGは、ポリエチレングリコールであり、ここでその末端のヒドロキシル基がメチル基で置換され；および
    Lは、カルバメート含有リンカー部分である。
  17. 生物活性作用物質をさらに含む、請求項１６記載のリポソーム。
  18. 生物活性作用物質が、抗腫瘍剤、抗生物質、免疫調節剤、抗炎症剤および中枢神経系に働く作用物質からなる群より選択されたメンバーである、請求項１７記載のリポソーム。
  19. 生物活性作用物質が、タンパク質またはペプチドである、請求項１７記載のリポソーム。
  20. 生物活性作用物質が核酸である、請求項１７記載のリポソーム。
  21. 細胞を請求項１６記載のリポソームに接触させる工程を含む、該リポソーム内に封入されている生物活性作用物質を該細胞にイン・ビトロで送達する方法。
  22. リポソーム内に封入されている生物活性作用物質を患者に送達するための薬剤の製造における請求項１６記載のリポソームの使用。
  23. 核酸；
    カチオン性脂質；
    非カチオン性脂質；および
    次の構造を有する式Iのポリエチレングリコール-ジアルキルオキシプロピル（PEG-DAA）複合体
    を含む、核酸-脂質粒子：
    Figure 0004842821
    式中、
    R1およびR2は、独立に選択され、かつ10〜20個の炭素原子を有するアルキル基であり；
    PEGは、ポリエチレングリコールであり、ここでその末端のヒドロキシル基がメチル基で置換され；および
    Lは、カルバメート含有リンカー部分である。
  24. カチオン性脂質が、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）、N-(1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTAP）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、およびN,N-ジメチル-2,3-ジオレイルオキシ)プロピルアミン（DODMA）、ならびにそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  25. 非カチオン性脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（POPC）、卵ホスファチジルコリン（EPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（POPG）、コレステロール、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  26. 非カチオン性脂質がアニオン性脂質である、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  27. 非カチオン性脂質が中性脂質である、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  28. PEG-DAA複合体が、PEG-ジラウリルオキシプロピル（C12）、PEG-ジミリスチルオキシプロピル（C14）、PEG-ジパルミチルオキシプロピル（C16）およびPEG-ジステリルオキシプロピル（C18）からなる群より選択される一員である、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  29. カチオン性脂質が、粒子内に存在する全脂質の2％〜60％を構成している、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  30. カチオン性脂質が、粒子内に存在する全脂質の5％〜45％を構成している、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  31. カチオン性脂質が、粒子内に存在する全脂質の5％〜15％を構成している、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  32. カチオン性脂質が、粒子内に存在する全脂質の40％〜50％を構成している、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  33. 非カチオン性脂質が、粒子内に存在する全脂質の5％〜90％を構成している、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  34. 非カチオン性脂質が、粒子内に存在する全脂質の20％〜85％を構成している、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  35. PEG-DAA複合体が、粒子内に存在する全脂質の1％〜20％を構成している、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  36. PEG-DAA複合体が、粒子内に存在する全脂質の2％〜15％を構成している、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  37. PEG-DAA複合体が、粒子内に存在する全脂質の4％〜10％を構成している、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  38. 非カチオン性脂質がDSPCである、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  39. コレステロールをさらに含む、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  40. コレステロールが、粒子内に存在する全脂質の10％〜60％を構成する、請求項３９記載の核酸-脂質粒子。
  41. コレステロールが、粒子内に存在する全脂質の20％〜45％を構成する、請求項４０記載の核酸-脂質粒子。
  42. PEG-DAA複合体がPEG-ジラウリルオキシプロピル（C12）である、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  43. PEG-DAA複合体がPEG-ジミリスチルオキシプロピル（C14）である、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  44. PEG-DAA複合体がPEG-ジパルミチルオキシプロピル（C16）である、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  45. PEG-DAA複合体がPEG-ジステリルオキシプロピル（C18）である、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  46. 核酸がDNAである、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  47. 核酸がプラスミドである、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  48. 核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  49. 核酸がリボザイムである、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  50. 核酸が小干渉RNA（siRNA）である、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  51. 核酸が関心対象の治療用生成物をコードする、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  52. 関心対象の治療用生成物がペプチドまたはタンパク質である、請求項５１記載の核酸-脂質粒子。
  53. 関心対象の治療用生成物が小干渉RNA（siRNA）である、請求項５１記載の核酸-脂質粒子。
  54. 核酸-脂質粒子内の核酸が、該粒子のヌクレアーゼに対する37℃で20分間の暴露の後でも実質的には分解しない、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  55. 核酸-脂質粒子内の核酸が、該粒子の血清中37℃で30分間のインキュベーション後でも実質的には分解しない、請求項２３記載の核酸-脂質粒子。
  56. 核酸が、核酸-脂質粒子内に完全に封入されている、請求項２３記載の該核酸-脂質粒子。
  57. 請求項２３記載の核酸-脂質粒子および薬学的に許容されるキャリアを含む、医薬組成物。
  58. PEG-DAA複合体がPEG-ジミリスチルオキシプロピル（C14）である、請求項５７記載の医薬組成物。
  59. PEG-DAA複合体がPEG-ジステリルオキシプロピル（C18）である、請求項５７記載の医薬組成物。
  60. 核酸を細胞に導入するための薬剤の製造における、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、請求項１記載の化合物、および核酸を含む核酸-脂質粒子の使用。
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