CN102973506B - 阳离子脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阳离子脂质体，包括阳离子脂、中性磷脂、聚乙二醇衍生化磷脂以及甘露糖或甘露寡糖；所述阳离子脂、所述中性磷脂以及所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂分子组成球壳状的磷脂双分子层；所述甘露糖或甘露寡糖连接在所述聚乙二醇衍生化磷脂的一端形成甘露糖或甘露寡糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂。这种阳离子脂质体通过添加甘露糖或甘露寡糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂，抗原呈递细胞靶向性和在淋巴结中的富集得到提高，具有免疫促进作用，可以提高脂质体疫苗的免疫效力。本发明还提供一种上述阳离子脂质体的制备方法。
Description
【技术领域】
本发明涉及免疫治疗领域，尤其涉及一种阳离子脂质体及其制备方法。
【背景技术】
疫苗是预防和控制传染性疾病发生发展的重要手段。免疫佐剂(又称非特异性免疫增生剂)则是疫苗中不可或缺的组成成分，能够有效地促进疫苗诱导的特异性免疫反应。随着疫苗研究的飞速发展，新型的基因工程疫苗正逐步取代传统的减毒活疫苗和灭活疫苗。与传统的疫苗相比，基因工程疫苗具有纯度高、特异性强、安全性好等优点，然而由于其免疫原性普遍较差，迫切需要结合有效的免疫佐剂，从而提高疫苗的免疫效力。
脂质体纳米颗粒是由磷脂双层壳包裹水相核心形成的球形的实体，其结构类似生物膜，是一种生物相容性好且无毒的纳米材料。它可包封水溶性和脂溶性药物，具有减少药物剂量、缓释、及靶向性释放药物等优点，因而被广泛用于纳米抗肿瘤药物的开发。此外，纳米脂质体也是一种优良的抗原载体，不仅能够包裹一系列理化性质不同的抗原及免疫佐剂，保护蛋白多肽抗原不被降解，还可以促进抗原呈递细胞对抗原的吞噬及呈递，提高机体的特异性免疫反应。基于以上这些优点，脂质体纳米颗粒作为一种新型的疫苗载体，正逐渐用于细菌疫苗、病毒疫苗、抗寄生虫疫苗以及抗肿瘤疫苗等研制开发。中性脂质体和表面携带正电荷的阳离子脂质体是最常用的纳米疫苗载体。其中特别值得关注的是阳离子脂质体，它不但是优良的蛋白/多肽抗原载体，还是一种新型的免疫佐剂，可直接活化抗原呈递细胞，增强疫苗诱导的免疫反应。目前，阳离子脂质体已被GSK公司用于新一代流感疫苗。
以树突状细胞(dendritic cell,DC)为代表的抗原呈递细胞(antigen-presentingcells，APCs)在免疫反应中占据核心地位。其主要作用是识别、摄取和呈递抗原，继而引发淋巴细胞活化和特异性体液及细胞免疫应答。APCs表面广泛表达C型凝集素类受体，如甘露糖受体(mannose receptor，MR)、DEC205/gp200-MR6等。这些受体直接参与了抗原呈递细胞对抗原的识别、摄取和呈递过程。在抗原和疫苗表面修饰C型凝集素类受体的特异性配体，如甘露糖和甘露聚糖，可促进抗原呈递细胞对抗原的摄取，增强疫苗的免疫效力。Copland(Copland,M.J.,Baird,M.A.,Rades,T.,McKenzie,J.L.,Becker,B.,Reck,F.,Tyler,P.C.and Davies,N.M.(2003)Liposomal delivery of antigen to human dendritic cells.Vaccine 21,883-90.)等在中性脂质体中掺入末端修饰有甘露三糖的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(trimannose-dipalmitoyl phosphatidylethanolamine，man3-DPPE)，从而使脂质体表面携带甘露糖残基。结果表明man3-DPPE修饰的脂质体不但提高DC对抗原的摄取，而且显著增强DC诱导的T淋巴细胞增殖。Kojima等(Kojima,N.,Biao,L.,Nakayama,T.,Ishii,M.,Ikehara,Y.and Tsujimura,K.(2008)Oligomannose-coated liposomes as a therapeutic antigen-delivery and an adjuvantvehicle for induction of in vivo tumor immunity.J Control Release 129,26-32.)则发现，man3-DPPE修饰可促进脂质体肿瘤疫苗在外周淋巴结内的集聚，并显著增强疫苗诱导的抗肿瘤免疫。
目前的研究主要通过化学键合的方法将甘露糖或寡甘露糖直接修饰到脂质体的磷脂分子上，使得脂质体表面携带甘露糖分子，从而提高其抗原呈递细胞靶向性。然而，事实上由于颗粒大小、电荷、及表面性质等理化因素的影响，脂质体疫苗在注射入体内后绝大部分滞留于注射位点，不能有效地进入淋巴器官，降低了脂质体疫苗的免疫效力。
【发明内容】
基于此，有必要提供一种能够提高脂质体疫苗免疫效力的阳离子脂质体及其制备方法。
一种阳离子脂质体，包括阳离子脂、中性磷脂、聚乙二醇衍生化磷脂以及能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖；所述阳离子脂、所述中性磷脂以及所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂分子组成球壳状的磷脂双分子层；所述能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖连接在所述聚乙二醇衍生化磷脂的一端形成能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂。
优选的，所述阳离子脂与所述中性磷脂的摩尔比为1：19～99：1。
优选的，所述能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的摩尔数与所述阳离子脂和所述中性磷脂摩尔数之和的比值范围为1：5～1：50。
优选的，所述聚乙二醇衍生化磷脂中聚乙二醇的分子量为350～2000。
优选的，所述能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖通过醛基-氨基或羟基-氨基缩合的方式连接在所述聚乙二醇衍生化磷脂上。
优选的，所述阳离子脂为一种表面携带正电荷的两性分子，所述阳离子脂的主链是甘油，甘油的三个羟基中中间的羟基连接带正电荷的季铵盐，另外两个羟基被饱和或不饱和脂肪酸酯化。
优选的，所述阳离子脂为双十烷基二甲基溴化铵、二油酰三甲基铵丙烷、二油酰丙基氯化三甲铵、二甲氨基乙基氨甲酰基-胆固醇和二油酰磷脂酰胆碱醚中的至少一种。
优选的，所述中性磷脂为一种两性分子，所述中性磷脂的表面静电荷基本接近0，所述中性磷脂的主链是甘油，甘油的三个羟基中侧端的一个羟基被磷酸酯化，另外两个羟基被饱和或不饱和脂肪酸酯化，磷酸基团又与一个极性的胆碱基团或胆胺基团相连。
优选的，所述中性磷脂为二油酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的至少一种。
优选的，所述能被甘露糖受体识别的单糖包括D-甘露糖、甘露糖苷、L-岩藻糖、D-乙酰葡萄糖胺、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-乙酰半乳糖胺和D-鼠李糖。
优选的，所述由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖中，所述能被甘露糖受体识别的单糖包括D-甘露糖、L-岩藻糖、D-乙酰葡萄糖胺、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-乙酰半乳糖胺和D-鼠李糖。
一种阳离子脂质体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、提供聚乙二醇衍生化磷脂，将能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖连接在聚乙二醇衍生化磷脂上，得到能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂；
步骤二、将阳离子脂、中性磷脂和所述能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂分别溶解于氯仿和甲醇混合溶剂中，混合后得到混合液；
步骤三、用稳定的氮气流或惰性气体流将所述混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥后加入PBS缓冲液并放置4℃水化，然后超声并挤压过膜两次得到所述阳离子脂质体。
这种阳离子脂质体通过添加能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂，提高了抗原呈递细胞靶向性和在淋巴结中的富集，具有免疫促进作用，可以提高脂质体疫苗的免疫效力。
【附图说明】
图1为一实施方式的包覆有抗原的阳离子脂质体的结构示意图。
图2为小鼠树突状细胞在体外对LP、LP-PEG以及实施例1制备的LP-PEG-Man包覆的抗原的摄取图。
图3为小鼠体内引流淋巴结内树突状细胞对LP、LP-PEG、LP-Man以及实施例1制备的LP-PEG-Man包覆的抗原的摄取图。
图4为将o-LP、o-LP-PEG以及o-LP-PEG-Man分别经皮下注射注入到小鼠体内后小鼠体内抗OVA IgG1抗体的表达状况图。
图5为将o-LP、o-LP-PEG以及o-LP-PEG-Man分别经皮下注射注入到小鼠体内后小鼠体内抗OVA IgG2a抗体的表达状况图。
图6为将o-LP、o-LP-PEG以及o-LP-PEG-Man分别经皮下注射注入到小鼠体内后小鼠体内抗OVA IgG2b抗体的表达状况图。
【具体实施方式】
下面通过附图和实施例对阳离子脂质体进行具体的解释说明。
针对现有脂质体疫苗载体设计的不足，设计出一种采用甘露糖修饰的长循环的阳离子脂质体。
如图1所示的一实施方式的包覆有抗原的阳离子脂质体，包括阳离子脂、中性磷脂、聚乙二醇衍生化磷脂(PEG-磷脂)以及能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖。
阳离子脂、中性磷脂以及聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂分子组成球壳状的磷脂双分子层。能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖连接在聚乙二醇衍生化磷脂的一端形成能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂。
本实施方式中，磷脂双分子层的内侧包覆有抗原，抗原可以为蛋白质、多肽、多糖等。抗原可以来自于病毒、细菌、其他微生物、肿瘤或基因工程蛋白产物。
在其他的实施方式中，磷脂双分子层的内侧还可以包覆治疗性药物，例如传统的治疗药物以及基因治疗药物(RNA、DNA等)。
阳离子脂与中性磷脂的摩尔比为1：19～99：1。
聚乙二醇衍生化磷脂可以直接购买得到，由聚乙二醇(PEG)一端连接磷脂，另一端氨基化得到。
本实施方式中的聚乙二醇一端连接二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(distearoylphosphatidylethanolamine，DSPE)，记为DSPE-PEG。在其他的实施方式中，也可以选择聚乙二醇一端连接其他种类的磷脂，可以为上述的阳离子脂或中性磷脂中的任意一种。
聚乙二醇衍生化磷脂中的聚乙二醇的分子量优选为350～2000。
聚乙二醇衍生化磷脂的摩尔数与阳离子脂和中性磷脂摩尔数之和的比值范围为1：5～1：50。
能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖通过醛基-氨基或羟基-氨基缩合的方式连接在聚乙二醇衍生化磷脂的氨基化端。
阳离子脂为一种表面携带正电荷的两性分子，阳离子脂的主链是甘油，甘油的三个羟基中中间的羟基连接带正电荷的季铵盐，另外两个羟基被饱和或不饱和脂肪酸酯化。
具体的，阳离子脂可以为双十烷基二甲基溴化铵(Didecyldimethylammoniumbromide，DDAB)、二油酰三甲基铵丙烷(dioleoyltrimethylammoniumpropane，DOTAP)、二油酰丙基氯化三甲铵(dioleoylpropyltrimethylammonium，DOTMA)、二甲氨基乙基氨甲酰基-胆固醇(3-(N-(N',N'-Dimethylaminoethane)carbamoyl)cholesterol，DC-Chol)和二油酰磷脂酰胆碱醚(dioleyl ether phosphatidylcholine，DOEPC)中的至少一种。
中性磷脂为一种两性分子，表面静电荷基本接近0，中性磷脂的主链是甘油，甘油的三个羟基中侧端的一个羟基被磷酸酯化，另外两个羟基被饱和或不饱和脂肪酸酯化，磷酸基团又与一极性的胆碱或胆胺基团相连。
具体的，中性磷脂为二油酰磷脂酰胆碱(Dioleoylphatidylcholine，DOPC)、二豆蔻酰磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine，DMPC)、二亚油酰磷脂酰胆碱(dilinoleoylphosphatidylcholine，DLPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(Dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine，DSPC)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(Dimyristoylphosphatidylethanolamine，DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(Dipalmitoylphosphatidylethanolamine，DPPE)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(distearoylphosphatidylethanolamine，DSPE)中的至少一种。
能被甘露糖受体识别的单糖包括D-甘露糖(D-mannose)、甘露糖苷、L-岩藻糖(L-fucose)、D-乙酰葡萄糖胺(D-N-acetylglucosamine),D-葡萄糖(D-glucose)、D-半乳糖(D-galactose)、D-乙酰半乳糖胺(D-N-acetylgalactosamine)和D-鼠李糖(D-rhamnose，Largent,B.L.,Walton,K.M.,Hoppe,C.A.,Lee,Y.C.and Schnaar,R.L.(1984)Carbohydrate-specific adhesion of alveolar macrophages tomannose-derivatized surfaces.J Biol Chem 259,1764-9.)。例如：甲基-D-甘露糖苷(Methyl-α-D-mannopyranoside)、4-硝基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷(4-Nitrophenyl-α-D-mannopyranoside)、4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃甘露糖苷(4-Methylumbelliferyl-α-D-mannopyranoside)、4-氨基苯基-D-甘露糖苷(4-Aminophenylα-D-mannopyranoside)等。
由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖中，能被甘露糖受体识别的单糖包括：D-甘露糖(D-mannose)、L-岩藻糖(L-fucose)、D-乙酰葡萄糖胺(D-N-acetylglucosamine),D-葡萄糖(D-glucose)、D-半乳糖(D-galactose)、D-乙酰半乳糖胺(D-N-acetylgalactosamine)、D-鼠李糖(D-rhamnose)等。
这种阳离子脂质体通过添加能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂，抗原呈递细胞靶向性和在淋巴结中的富集得到了提高，具有免疫促进作用，可以提高脂质体疫苗的免疫效力。
相对于单纯用能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖修饰的脂质体，这种阳离子脂质体抗原呈递细胞靶向性得到显著提高。同时由于添加了聚乙二醇分子，使得这种阳离子脂质体在体内的循环时间得到延长，其包覆的药物或抗原在体内半衰期得到延长。
这种阳离子脂质体包覆抗原或药物时，可以采用常规的混合操作，也可以在制备过程中加入抗原或药物制备得到(具体操作见制备方法部分)。
这种阳离子脂质体可以同时包裹一种或多种抗原或药物，作为一种新型的疫苗载体和佐剂系统，促进疫苗的免疫效力。
包覆有抗原或药物的阳离子脂质体可以采用皮内注射、皮下注射或肌肉注射的方式送入体内。
下面提供一实施方式的上述阳离子脂质体的制备方法，包括如下步骤：
S10、提供聚乙二醇衍生化磷脂，将能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖连接在聚乙二醇衍生化磷脂上，得到能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂。
聚乙二醇衍生化磷脂可以直接购买得到，由聚乙二醇(PEG)一端连接磷脂，另一端氨基化得到。
本实施方式中的聚乙二醇一端连接二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(distearoylphosphatidylethanolamine，DSPE)，记为DSPE-PEG。在其他的实施方式中，也可以选择聚乙二醇一端连接其他种类的磷脂，可以为上述的阳离子脂或中性磷脂中的任意一种。
能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖通过醛基-氨基或羟基-氨基缩合的方式连接在聚乙二醇衍生化磷脂的氨基化端。
S20、将阳离子脂、中性磷脂和步骤S10得到的能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂分别溶解于氯仿和甲醇混合溶剂中，混合后得到混合液。
在优选的实施例中，氯仿和甲醇的混合溶剂中氯仿和甲醇的体积比为2：1。
S30、用稳定的氮气流或惰性气体流将步骤S20得到的混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥后加入PBS缓冲液并放置4℃水化，然后超声并挤压过聚碳酸酯膜两次得到上述阳离子脂质体。
惰性气体流可以为氩气流、氦气流等。
如果在PBS缓冲液中加入需要包覆的抗原或药物，可以直接制得包覆有抗原或药物的阳离子脂质体。
由于这种阳离子脂质体外侧具有较多修饰，传统的混合操作包覆抗原或药物，相对于在制备过程中直接包覆抗原或药物，包覆的效率略低。但是，这并不会影响到这种阳离子脂质体的应用。
下面为具体实施例部分，实施例中选择DSPE连接在不同分子量的PEG上得到不同的DSPE-PEG。
实施例1
将D-甘露糖通过醛基-氨基缩合的方式连接在DSPE-PEG2000上，得到D-甘露糖修饰的DSPE-PEG2000。将DOTAP、DOPC和D-甘露糖修饰的DSPE-PEG2000分别溶解于体积比为2：1的氯仿和甲醇混合溶剂中，然后按照DOTAP和DOPC的摩尔比为19：1，D-甘露糖修饰的DSPE-PEG2000的摩尔数与DOTAP和DOPC的总摩尔数之比为1：50，将三者混合后得到混合液后置于圆底烧瓶中。用稳定的氮气流将混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥过夜后第二天加入含有抗原蛋白BSA-FITC的PBS缓冲液并放置4℃水化，然后超声水浴10min再挤压聚碳酸酯膜两次得到包覆有BSA-FITC的阳离子脂质体，记为LP-PEG-Man。
实施例2
将岩藻糖通过醛基-氨基缩合的方式连接在DSPE-PEG2000上，得到岩藻糖修饰的DSPE-PEG2000。将DDAB、DOPC和岩藻糖修饰的DSPE-PEG2000分别溶解于体积比为2：1的氯仿和甲醇混合溶剂中，然后按照DDAB和DOPC的摩尔比为7：3，岩藻糖修饰的DSPE-PEG2000的摩尔数与DDAB和DOPC的总摩尔数之比为2：25，将三者混合后得到混合液后置于圆底烧瓶中。用稳定的氦气流将混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥过夜后第二天加入含有抗原蛋白BSA-FITC的PBS缓冲液并放置4℃水化，然后超声水浴10min再挤压聚碳酸酯膜两次得到包覆有BSA-FITC的阳离子脂质体。
实施例3
将8个分子的通过α1-4键聚合形成的甘露寡糖通过羟基-氨基缩合的方式连接在DSPE-PEG1000上，得到甘露寡糖修饰的DSPE-PEG1000。将DOTMA、DLPC和甘露寡糖修饰的PEG1000分别溶解于体积比为2：1的氯仿和甲醇混合溶剂中，然后按照DOTMA和DLPC的摩尔比为99：1，甘露寡糖修饰的PEG1000的摩尔数与DOTMA和DLPC的总摩尔数之比为4：25，将三者混合后得到混合液后置于圆底烧瓶中。用稳定的氮气流将混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥过夜后第二天加入含有抗原蛋白BSA-FITC的PBS缓冲液并放置4℃水化，然后超声水浴10min再挤压聚碳酸酯膜两次得到包覆有BSA-FITC的阳离子脂质体。
实施例4
将4-硝基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷通过EDC交联的方式连接在DSPE-PEG350上，得到4-硝基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷修饰的PE(14：0)-PEG350。将DOEPC、DMPE和4-硝基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷修饰的PE(14：0)-PEG350分别溶解于体积比为2：1的氯仿和甲醇混合溶剂中，然后按照DOEPC和DMPE的摩尔比为1：19，4-硝基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷修饰的PE(14：0)-PEG350的摩尔数与DOEPC和DMPE的总摩尔数之比为1：5，将三者混合后得到混合液后置于圆底烧瓶中。用稳定的氮气流将混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥过夜后第二天加入含有抗原蛋白BSA-FITC的PBS缓冲液并放置4℃水化，然后超声水浴10min再挤压聚碳酸酯膜两次得到包覆有BSA-FITC的阳离子脂质体。
实施例5
先制备包覆有BSA-FITC阳离子脂质体、包覆有BSA-FITC的PEG修饰的阳离子脂质体以及包覆有BSA-FITC的甘露糖修饰的阳离子脂质体，制备方法如下：
将DOTAP溶解于体积比为2：1的氯仿和甲醇混合溶剂中后置于圆底烧瓶中。用稳定的氮气流将混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥过夜后第二天加入含有抗原蛋白BSA-FITC的PBS缓冲液并放置4℃水化，然后超声水浴10min再挤压聚碳酸酯膜两次得到包覆有BSA-FITC的阳离子脂质体，记为LP。
将DOTAP、DOPC、DSPE-PEG2000分别溶解于体积比为2：1的氯仿和甲醇混合溶剂中，然后按照DOEPC和DOPC的摩尔比为19：1，DSPE-PEG2000的摩尔数与DOEPC和DSPE总摩尔数之比为1：50，将三者混合后得到混合液后置于圆底烧瓶中。用稳定的氮气流将混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥过夜后第二天加入含有抗原蛋白BSA-FITC的PBS缓冲液并放置4℃水化，然后超声水浴10min再挤压聚碳酸酯膜两次得到包覆有BSA-FITC的PEG修饰的阳离子脂质体，记为LP-PEG。
将DOTAP、DSPE和D-甘露糖分别溶解于体积比为2：1的氯仿和甲醇混合溶剂中，然后按照DOEPC和DSPE的摩尔比为19：1，D-甘露糖的摩尔数与脂分子的总摩尔数之比为1：50，将三者混合后得到混合液后置于圆底烧瓶中。用稳定的氮气流将混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥过夜后第二天加入含有抗原蛋白BSA-FITC的PBS缓冲液并放置4℃水化，然后超声水浴10min再挤压聚碳酸酯膜两次得到包覆有BSA-FITC的D-甘露糖修饰的阳离子脂质体，记为LP-Man。
将LP、LP-PEG以及实施例1制备的LP-PEG-Man分别加入到小鼠骨髓细胞诱导的树突状细胞中，使得细胞培养液中上述脂质体浓度均为50umol/L，观察小鼠树突状细胞在体外对抗原的摄取，结果如图2所示。
对照组为空白对照。
由图2可以看出，小鼠树突状细胞在体外对LP-PEG-Man的摄取量远远高于LP和LP-PEG，结果表明LP-PEG-Man在体外显著提高了树突状细胞对抗原的摄取。
将20ul的LP、LP-PEG、LP-Man以及LP-PEG-Man分别经皮下注射注入到C57雌性小鼠体内，24小时后测量小鼠引流淋巴结内树突状细胞对抗原的摄取，结果如图3所示。
由图3可以看出，注射24h后小鼠引流淋巴结内树突状细胞对LEP-PEG-Man的摄取明显高于其他脂质体，结果表明LP-PEG-Man在体内也促进抗原呈递细胞的摄取。
采用相同的方法，制备包覆有卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)的脂质体，分别记为o-LP、o-LP-PEG以及o-LP-PEG-Man。
将200的ul o-LP、o-LP-PEG、o-LP-PEG-Man以及与铝盐佐剂混合的抗原(Alum组)分别经皮下注射注入到C57雌性小鼠体内，2周之后测量小鼠体内抗体表达状况，结果如图4～图6所示。
对照组为直接注射卵清蛋白。
由图4～图6可以看出，o-LP-PEG-Man较其他脂质体以及传统的铝盐佐剂更显著地促进了抗OVA IgG1抗体、抗OVA IgG2a抗体和抗OVA IgG2b抗体的表达。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (11)
1.一种阳离子脂质体，其特征在于，包括阳离子脂、中性磷脂、聚乙二醇衍生化磷脂以及能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖；所述阳离子脂、所述中性磷脂以及所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂分子组成球壳状的磷脂双分子层；所述能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖连接在所述聚乙二醇衍生化磷脂的一端形成能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂；
聚乙二醇衍生化磷脂由聚乙二醇一端连接磷脂，另一端氨基化得到；
所述能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖通过醛基-氨基或羟基-氨基缩合的方式连接在所述聚乙二醇衍生化磷脂上。
2.如权利要求1所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述阳离子脂与所述中性磷脂的摩尔比为1：19～99：1。
3.如权利要求1所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的摩尔数与所述阳离子脂和所述中性磷脂摩尔数之和的比值范围为1：5～1：50。
4.如权利要求1所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述聚乙二醇衍生化磷脂中聚乙二醇的分子量为350～2000。
5.如权利要求1所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述阳离子脂为一种表面携带正电荷的两性分子，所述阳离子脂的主链是甘油，甘油的三个羟基中中间的羟基连接带正电荷的季铵盐，另外两个羟基被饱和或不饱和脂肪酸酯化。
6.如权利要求1或5所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述阳离子脂为双十烷基二甲基溴化铵、二油酰三甲基铵丙烷、二油酰丙基氯化三甲铵、二甲氨基乙基氨甲酰基-胆固醇和二油酰磷脂酰胆碱醚中的至少一种。
7.如权利要求1所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述中性磷脂为一种两性分子，所述中性磷脂的表面静电荷基本接近0，所述中性磷脂的主链是甘油，甘油的三个羟基中侧端的一个羟基被磷酸酯化，另外两个羟基被饱和或不饱和脂肪酸酯化，磷酸基团又与一个极性的胆碱基团或胆胺基团相连。
8.如权利要求1或7所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述中性磷脂为二油酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的至少一种。
9.如权利要求1所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述能被甘露糖受体识别的单糖包括D-甘露糖、甘露糖苷、L-岩藻糖、D-乙酰葡萄糖胺、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-乙酰半乳糖胺和D-鼠李糖。
10.如权利要求1所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖中，所述能被甘露糖受体识别的单糖包括D-甘露糖、L-岩藻糖、D-乙酰葡萄糖胺、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-乙酰半乳糖胺和D-鼠李糖。
11.一种阳离子脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、提供聚乙二醇衍生化磷脂，将能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖连接在聚乙二醇衍生化磷脂上，得到能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂；
步骤二、将阳离子脂、中性磷脂和所述能被甘露糖受体识别的单糖或由2～10个能被甘露糖受体识别的单糖通过α1-2键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或β1-4键任意组合形成的多糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂分别溶解于氯仿和甲醇混合溶剂中，混合后得到混合液；
步骤三、用稳定的氮气流或惰性气体流将所述混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥后加入PBS缓冲液并放置4℃水化，然后超声并挤压过膜两次得到所述阳离子脂质体。
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