JP2023553343A - 核酸を送達するための脂質ナノ粒子および関連する使用方法 - Google Patents

核酸を送達するための脂質ナノ粒子および関連する使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、治療用核酸を細胞に送達するためのイオン化脂質ナノ粒子の改善された組成物を提供する。カチオン性イオン化脂質は、高いトランスフェクション活性または効力を細胞内で保持しながら、貯蔵中の酸化的分解に対する安定性を改善するように操作される。これらの脂質は生分解性になるように設計され、したがってｉｎ ｖｉｖｏでそれらによって形成されるナノ粒子の忍容性が改善される。加えて、細胞表面受容体に対する抗体複合体を含めることによる樹状細胞へのこれらのナノ粒子の高度に特異的な手法での標的化が提供される。

Description

関連出願
この特許出願は、２０２０年１１月２５日に出願された米国仮特許出願第６３／１１８，５３４号の利益およびそれに対する優先権を主張するものであり、その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
配列表の参照
本明細書は、２０２１年１１月２４日に作成された、７，０６１バイトのサイズを有する１９１０１６－０１０４０３＿ＳＴ２５．ｔｘｔのファイル名が付けられたファイルを含む、本明細書と共に提出された配列表を含み、その内容が参照により本明細書に援用される。
分野
本開示は、カチオン性イオン化脂質および脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に関する。いくつかの実施形態では、１種以上のカチオン性イオン化脂質を含むＬＮＰが、樹状細胞の標的化またはこれらのＬＮＰ組成物をワクチンとして使用する方法のための核酸化合物の送達に有用である。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、生体還元性イオン化カチオン性脂質または非共役ポリオレフィン性イオン化カチオン性脂質を含んでもよい。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、治療用核酸を細胞に送達するために使用される。例えば、ＬＮＰ医薬組成物をワクチン中に用いてｍＲＮＡ治療薬を送達する。ＬＮＰ製剤は、典型的には、イオン化カチオン性脂質（ＩＣＬ）を含む。しかしながら、特定のＩＣＬ化合物は、望ましくないが、貯蔵中の酸化に感受性であることが当該技術分野において知られている。したがって、貯蔵されている間、酸化的分解に対して改善された安定性を有し、同時に、核酸などの治療剤と共にＬＮＰ中に取り入れたときに細胞内で望ましいトランスフェクション活性または効力ももたらす、改善されたＩＣＬ化合物が必要とされる。
ＳＮＡＬＰ組成物は、さまざまな感染性疾患の核酸治療薬の送達に有用である。結核、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、マラリア、およびＣＯＶＩＤ－１９などの感染性疾患は、ヒトの健康に深刻な問題を示す。例えば、マイコバクテリアは、結核（ＴＢ）に関与する細菌属である。世界保健機関によれば、世界規模で、ＴＢは、死因トップテンのうちの１つであり、単一の病原体の中で一番多い死亡原因である。現在の最大限の努力にもかかわらず、多くの感染性疾患の予防に有効なワクチンの開発には多大な難題が課されてきた。個別の抗原ペプチドまたは抗原ペプチドの組合せの識別における新たな取り組みは、ワクチンの効率の改善を助けた。それにもかかわらず、これらの抗原配列を樹状細胞などの専門的抗原提示細胞に効率的に送達して与えることを助けるためのアジュバントの工学には大きな可能性が残っている。イオン化カチオン性脂質ナノ粒子と組み合わせた抗原ペプチドまたはタンパク質のｍＲＮＡコーディングは、ワクチンの開発において特に有望な戦略を表す。さまざまな疾患の処置および予防のためのｍＲＮＡを送達するためのＳＮＡＬＰ医薬組成物（ワクチン組成物を含む）を含む安全かつ有効な治療が必要とされている。
いくつかの実施形態において、イオン化カチオン性脂質（ＩＣＬ）を提供する。カチオン性脂質は、細胞内で高いトランスフェクション活性または効力を保持しながら、貯蔵中の酸化的分解に対する安定性を改善するように操作される。本開示の態様は、一対のアルキニル二重結合間に２つ以上のメチレン基を含むことによって、ポリエン鎖を有するイオン化脂質の望ましくない酸化および／または分解を改善することができるという発見に一部基づく。本明細書で開示する脂質は、少なくとも２つのメチレン基または置換メチレン基で間隔をとった少なくとも２つの炭素－炭素二重結合（オレフィン）を含み、ここで、置換メチレンはＣ（Ｒ１）（Ｒ２）－であり、式中、Ｒ１およびＲ２は、独立してＨ、アルキル、またはハロゲンである。本明細書で開示する脂質は、２つの対称性ポリエン炭化水素鎖を含み、それぞれ、２つの炭素－炭素二重結合（オレフィン）を、２、３または４つのメチレン基のいずれかの側に有する。少なくとも２つのメチレン基によって分離された脂質テール中のオレフィンは、１つのメチレン基によって分離された化合物、例えばＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡと比較して、本明細書に記載の化合物が酸化を非常に受けにくいようにし、イオン化カチオン性脂質設計において究極の基準と考えられ、安定性の問題を有すると報告された。いくつかの実施形態において、本明細書で提供する化合物は、対照ＬＮＰと比較したとき、酸化副生成物に３０％超、５０％超、７５％超、９０％超、および９５％超の減少がある。いくつかの実施形態において、本明細書で提供する化合物は、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ脂質を含有する対照ＬＮＰと比較したとき、酸化副生成物に３０％超、５０％超、７５％超、９０％超、および９５％超の減少を有する。
いくつかの実施形態において、イオン化カチオン性脂質組成物を提供する。いくつかの態様において、イオン化カチオン性脂質は、２つポリエン炭化水素鎖を含むことができ、それぞれ、１つまたは２つのアルケニル二重結合部分を含む。いくつかの態様において、イオン化カチオン性脂質は、２つのポリエン炭化水素鎖を含むことができ、それぞれ、２つのアルケニル二重結合部分の間に２つ以上のメチレン基を含む。いくつかの態様において、イオン化カチオン性脂質は、２つのＣ１６またはＣ１８ポリエン炭化水素鎖を含有することができる。
いくつかの実施形態において、それぞれが各ポリエン炭化水素鎖中の２つの隣接する不飽和アルキニル二重結合の間に不飽和直鎖状エチレン、ｎ－プロピレンまたはｎ－ブチレンを含む一対の直鎖状ポリエンＣ１６またはＣ１８炭化水素鎖を有するイオン化カチオン性脂質を含むリポソーム組成物を提供する。いくつかの実施形態において、リポソーム組成物は、６～７のｐＫａを有するジアルキルアミノ基を含む頭部基に共有結合されている一対の１６または１８個の炭素の直鎖状ポリ不飽和脂質テールからなる化学構造を有するイオン化脂質を含むことができ、ここで、頭部基は、ジアルキルアミノ基に共有結合されたヘテロシクリルまたはアルキル部分を含み、任意選択によりホスフェート基をさらに含み、各ポリ不飽和脂質テールは、脂質テールの長さに沿った少なくとも２つのメチレン基によって分離された少なくとも２つのオレフィンを除けば不飽和であり、各脂質テールは、任意選択により、頭部基に共有結合された末端に単一のアシル基を含む。いくつかの実施形態において、各脂質テールは同一であり、各脂質テールは、非置換エチレン、ｎ－プロピル、またはｎ－ブチルのみによって分離されたオレフィン合計２つを有する。いくつかの実施形態において、各脂質テールは、頭部基の酸素と合わさってエステルを形成するアシル基をさらに含む。
いくつかの実施形態において、イオン化カチオン性脂質の頭部基のジアルキルアミノ部分は、式（ＩＶ－Ａ）のジアルキルアミノ化学構造を有する。
［ここで、式（ＩＶ－Ａ）中のｎは、２、３または４であり、式（ＩＶ－Ａ）中のＲ１０およびＲ１２は、それぞれ独立して、メチル、エチル、およびｎ－プロピルからなる群から選択されるアルキル基から選択され、Ｒ１０およびＲ１２中のアルキルは、任意選択により、１つ以上のヒドロキシルで置換される］
いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ａ）中のＲ１０およびＲ１２は、それぞれ独立して、メチル、エチル、－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨ、または（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨである。
いくつかの実施形態において、イオン化カチオン性脂質は、
からなる群から選択される化学構造を含み、式中、Ｒ２２は脂質テール第１の末端であり、
は、頭部基の、頭部基のジアルキルアミノ化学構造への連結を示す。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ａ）の化学下部構造を含むイオン化カチオン性脂質は、
からなる群から選択される追加の化学構造をさらに含み、式中、Ｒ２２は脂質テールの第１の末端であり、
は、頭部基の、頭部基のジアルキルアミノ化学構造への連結を示す。
いくつかの実施形態において、イオン化カチオン性脂質は、頭部基に連結されている一対の脂質テールをさらに含み、ここで、各脂質テールは、式Ａまたは式Ｂの化学構造を有する炭化水素鎖を含む。
［ここで、式Ａ中、ａは１、２、３または４であり、ｂは２、３または４であり、式Ａ中、ｃは３、４、５、６、または７である］
［ここで、式Ｂ中、ａは５、６または７であり、式Ｂ中、ｃは３、４または５である］
いくつかの実施形態において、ｂは４であり、式Ａ中のａ、ｂおよびｃの合計は、１０、１１、１２または１３である。いくつかの実施形態において、イオン化カチオン性脂質は、上に示した化学構造中のＲ２２に式Ａまたは式Ｂの脂質テールを含む。いくつかの実施形態において、イオン化カチオン性脂質は、式Ａの脂質テールを含み、ここで、式Ａ中の
は、上で示した化学構造中のＲ２２の連結の位置を示す。いくつかの実施形態において、イオン化カチオン性脂質は、式Ｂの脂質テールを含み、ここで、式Ｂ中の
は、上で示した化学構造中のＲ２２の連結の位置を示す。
いくつかの実施形態において、イオン化カチオン性脂質は、式（Ｉ－Ａ）の化学構造を有する。
［式中、
ａは、１、２、３、４、５または６であり、ｂは、２、３または４であり、ｃは、３、４、５、６、または７であり、ａ、ｂおよびｃの合計は１０または１２であり、ｑは、１、２、３または４であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択により１つ以上のヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、
Ｌは
であり、ここで、ｖは０または１であり、ｑは１、２または３であり、ｑ２は１または２である］
いくつかの実施形態において、式Ｉ－Ａ中、ｖが０のとき、ｑは１、２または３であり、ｖが１のとき、ｑは１、２、３または４である。
いくつかの実施形態において、式Ｉ－Ａ中のｖは０である。いくつかの実施形態において、式Ｉ－Ａ中のｖは０であり、ｑは１、２または３である。いくつかの実施形態において、式Ｉ－Ａ中のｖは０であり、ｑは１または２である。いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、化合物１７～１９、および２３～２５からなる群から選択されるカチオン性脂質である。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、ＡＫＧ－ＵＯ－１、ＡＫＧ－ＵＯ－２、ＡＫＧ－ＵＯ－４、およびＡＫＧ－ＵＯ－５からなる群から選択されるカチオン性脂質である。いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、ＡＫＧ－ＵＯ－１である。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質はＡＫＧ－ＵＯ－１Ａである。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質はＡＫＧ－ＵＯ－１Ｂである。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質はＡＫＧ－ＵＯ－２である。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質はＡＫＧ－ＵＯ－４である。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質はＡＫＧ－ＵＯ－４Ａである。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質はＡＫＧ－ＵＯ－５である。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、ＡＫＧ－ＵＯ－６、ＡＫＧ－ＵＯ－７、ＡＫＧ－ＵＯ－７、ＡＫＧ－ＵＯ－８、ＡＫＧ－ＵＯ－９、またはＡＫＧ－ＵＯ－１０である。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、メチル化ホスフェート部分を含む頭部基を含む。いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式Ｉ－Ａ［式中、ｖは１である］の化学構造を有する。いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式Ｉ－Ａ［式中、ｖは１であり、ｑは３または４である］の化学構造を有する。いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、
からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、イオン化脂質はＡＫＧ－ＵＯ－３である。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式ＩＩ－Ａの化学構造を有する。
［式中、ａは、１、２、３、４、５または６であり、ｂは、２、３または４であり、ｃは、４、５、６、７または８であり、
Ｒ２は、
であり、
ｑは１または２であり、
Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択により１つ以上のヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである］
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、化合物１～３および化合物５～８からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、化合物１～８からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式ＩＩ－Ａの化学構造を有する。
［式中、ａは、１、２、３、４、５または６であり、ｂは、２、３または４であり、ｃは、４、５、６、７または８であり、
Ｒ２は、
であり、
ｑ’は、１または２であり、
Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択により１つ以上のヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである］
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、化合物９～１９からなる群から選択される化合物である。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式ＩＩ－Ａの化学構造を有する。
［式中、ａは、１、２、３、４、５または６であり、ｂは、２、３または４であり、ｃは、４、５、６、７または８であり、
Ｒ２は、
であり、
Ｌは、
であり、ここで、ｖは０または１であり、ｑは、１、２、３または４であり、ｑ２は、１または２であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択により１つ以上のヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである］
いくつかの実施形態において、式ＩＩ－Ａ中、ｖが０のとき、ｑは１、２もしくは３である、またはｖが１のとき、ｑは３もしくは４である。
いくつかの実施形態において、脂質は生分解性になるように設計され、したがってｉｎ ｖｉｖｏでそれによって形成されるナノ粒子の忍容性が改善される。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式ＩＩ－Ｂの化学構造を有する。
［式中、ａは５、６または７であり、ｃは３、４または５であり、
Ｒ２は、
であり、
ｑおよびｑ’は、それぞれ独立して１または２であり、
Ｒ１０およびＲ１２は、それぞれ、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである］
いくつかの実施形態において、イオン化カチオン性脂質は、化合物２９～３４からなる群から選択される化合物である。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、生体還元性のカチオン性脂質である。いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、ステロール化学構造を含む生体還元性のカチオン性脂質である。いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＶＩ－Ａ）：
［式中、ｑは３または４であり、Ｒ３は
である］またはその薬学的に許容される塩の化学構造を有する。いくつかの実施形態において、イオン化カチオン性脂質は、化合物３５～３８からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子組成物は、脂質および核酸を含み、脂質性ナノ粒子は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶもしくはそれらの組合せのイオン化脂質またはそれらの薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子組成物は、脂質および核酸を含み、脂質性ナノ粒子は、式Ｉ－Ａ、ＩＩ－Ａ、ＩＩ－Ｂ、ＩＶ－Ａ、もしくはＶＩ－Ａ、またはそれらの組合せのイオン化脂質またはそれらの薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子組成物は、脂質および核酸を含み、脂質性ナノ粒子は、式Ａ、式Ａ’、式Ａ”、もしくは式Ｂまたはそれらの組合せのポリエン炭化水素鎖を含むイオン化脂質またはそれらの薬学的に許容される塩を含む。
いくつかの実施形態において、本開示はまた、治療用核酸を細胞に送達するための脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の組成物も提供する。本開示の態様は、さまざまなイオン化カチオン性脂質を、組成物中の総脂質の２０モル％未満（例えば、組成物中の総脂質の２．５～１０モル％）の、特定の少量のホスファチジル－Ｌ－セリンと合わせたＬＮＰ組成物が、驚くべきことに、カプセル化核酸の非常に強化された標的化を実証した発見に部分的に基づく。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、（ａ）核酸、（ｂ）イオン化カチオン性脂質、（ｃ）ステロール（例えば、コレステロールもしくはコレステロール誘導体、またはベータシトステロールなどの植物ステロール）、（ｄ）ホスファチジルセリンを含むリン脂質（例えば、ホスファチジルセリンとＤＳＰＣとの混合物）、および（ｅ）複合脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。一態様において、ＬＮＰ組成物は、（ａ）核酸、（ｂ）イオン化カチオン性脂質、（ｃ）ステロール（例えば、コレステロールもしくはコレステロール誘導体、またはベータシトステロールなどの植物ステロール）、（ｄ）組成物中の総脂質の１～１０モル％（例えば、２．５～１０モル％、３～９モル％、５．０～７．５モル％）の総量でホスファチジルセリン脂質、および追加のリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含むリン脂質、ならびに（ｅ）複合脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。一態様において、ＬＮＰ組成物は、（ａ）核酸、（ｂ）イオン化カチオン性脂質、（ｃ）ステロール（例えば、コレステロールもしくはコレステロール誘導体、またはベータシトステロールなどの植物ステロール）、（ｄ）組成物中の総脂質の１～１０モル％（例えば、２．５～１０モル％、３～９モル％、５．０～７．５モル％）の総量でホスファチジルセリン脂質、および追加のリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含むリン脂質、ならびに（ｅ）組成物中の総脂質の０．５～４．５モル％（例えば、０．５～２．５モル％、１．５モル％）の総量の複合脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。一態様において、ＬＮＰ組成物は、（ａ）核酸、（ｂ）組成物中の総脂質の４０～６５モル％（例えば、５０モル％）の総量のイオン化カチオン性脂質、（ｃ）組成物中の総脂質の２５～４０モル％（例えば、３８．５モル％）の総量のステロール（例えば、コレステロールもしくはコレステロール誘導体、またはベータシトステロールなどの植物ステロール）、（ｄ）組成物中の総脂質の１～１０モル％（例えば、２．５～１０モル％、３～９モル％、５．０～７．５モル％）の総量でホスファチジルセリン脂質、および追加のリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含むリン脂質、ならびに（ｅ）組成物中の総脂質の０．５～４．５モル％（例えば、０．５～２．５モル％、１．５モル％）の総量の複合脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。一態様において、ＬＮＰ組成物は、（ａ）核酸、（ｂ）組成物中の総脂質の４０～６５モル％（例えば、５０モル％）の総量のイオン化カチオン性脂質、（ｃ）組成物中の総脂質の２５～４０モル％（例えば、３８．５モル％）の総量のステロール（例えば、コレステロールもしくはコレステロール誘導体、またはベータシトステロールなどの植物ステロール）、（ｄ）組成物中の総脂質の５～２５モル％の総量のリン脂質であって、組成物中の総脂質の１～１０モル％（例えば、２．５～１０モル％、３～９モル％、５．０～７．５モル％）の総量のホスファチジルセリン脂質、および追加のリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）（例えば、組成物中の総脂質の１０モル％）を含むリン脂質、ならびに（ｅ）組成物中の総脂質の０．５～４．５モル％（例えば、０．５～２．５モル％、１．５モル％）の総量の複合脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。
一態様において、ＬＮＰ組成物は、（ａ）核酸、（ｂ）それぞれが、各ポリエン炭化水素鎖中の２つの隣接する不飽和アルキニル二重結合間に、不飽和直鎖状エチレン、ｎ－プロピレンまたはｎ－ブチレンを含む一対の直鎖状ポリエンＣ１６またはＣ１８炭化水素鎖を有するイオン化カチオン性脂質であって、組成物中の総脂質の４０～６５モル％の総量で組成物中に存在するイオン化カチオン性脂質、（ｃ）組成物中の総脂質の２５～４０モル％の総量のステロール（例えば、コレステロール）、（ｄ）組成物中の総脂質の５～２５モル％の総量のリン脂質であって、組成物中の総脂質の１～１０モル％の総量のホスファチジルセリン脂質（例えば、ホスファチジル－Ｌ－セリン脂質）および追加のリン脂質（例えば、組成物中の総脂質の１０モル％の総量のＤＳＰＣ）を含むリン脂質、ならびに（ｅ）組成物中の総脂質の０．５～２．５モル％の総量の複合脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。一態様において、ＬＮＰ組成物は、（ａ）ｍＲＮＡ核酸、（ｂ）組成物中の総脂質の４０～６５モル％の総量の、ｖが０のときの式（Ｉ－Ａ）、式（ＩＩ－Ａ）、または式（ＩＩ－Ｂ）のイオン化カチオン性脂質、（ｃ）組成物中の総脂質の２５～４０モル％の総量のコレステロール、（ｄ）組成物中の総脂質の１～１０モル％（例えば、２．５～１０モル％、３～９モル％、５．０～７．５モル％）の総量のＬ－セリンホスファチジルセリン脂質（例えば、ＤＰＰＳまたはＤＳＰＳ）、および組成物中の総脂質の５～２５モル％の総量のＤＳＰＣ、ならびに（ｅ）組成物中の総脂質の０．５～２．５モル％の総量の複合脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。一態様において、ＬＮＰ組成物は、（ａ）ｍＲＮＡ核酸、（ｂ）組成物中の総脂質の４０～６５モル％の総量の、ｖが０のときの式（Ｉ－Ａ）のイオン化カチオン性脂質、（ｃ）組成物中の総脂質の２５～４０モル％の総量のコレステロール、（ｄ）組成物中の総脂質の３～９モル％の総量のＬ－セリンホスファチジルセリン脂質（例えば、ＤＰＰＳまたはＤＳＰＳ）、および組成物中の総脂質の５～２５モル％の総量のＤＳＰＣ、ならびに（ｅ）組成物中の総脂質の０．５～２．５モル％の総量の複合脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、（ａ）ポリ不飽和イオン化カチオン性脂質、および（ｂ）荷電リン脂質ホスファチジルセリン脂質を含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、（ａ）式ＩＶ－Ａのイオン化カチオン性脂質、ならびに（ｂ）ＤＳＰＳ（Ｌ異性体）、ＤＰＰＳ（Ｌ異性体）、ＤＭＰＳ（Ｌ異性体）、ＤＯＰＳ（Ｌ異性体）、ＤＳＰＳ（Ｄ異性体）、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＧ、Ｎ－Ｇｌｕ－ＤＳＰＥ、およびＮ－Ｓｕｃ－ＤＳＰＥからなる群から選択されるアニオン性リン脂質標的化部分を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、（ａ）式ＩＶ－Ａのイオン化カチオン性脂質、および（ｂ）式Ｖ－Ａのアニオン性リン脂質標的化部分を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、（ａ）式ＩＶ－Ａのイオン化カチオン性脂質、ならびに（ｂ）ＤＳＰＳ（Ｌ異性体）およびＤＰＰＳ（Ｌ異性体）からなる群から選択されるアニオン性リン脂質標的化部分を含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、（ａ）式ＩＶのイオン化カチオン性脂質、および（ｂ）式Ｖ－Ａのアニオン性リン脂質標的化部分を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、（ａ）式ＩＶのイオン化カチオン性脂質、ならびに（ｂ）ＤＳＰＳ（Ｌ異性体）、ＤＰＰＳ（Ｌ異性体）、ＤＭＰＳ（Ｌ異性体）、ＤＯＰＳ（Ｌ異性体）、ＤＳＰＳ（Ｄ異性体）、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＧ、Ｎ－Ｇｌｕ－ＤＳＰＥ、およびＤ－Ｓｕｃ－ＤＳＰＥからなる群から選択されるアニオン性リン脂質標的化部分を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、（ａ）式ＩＶのイオン化カチオン性脂質、および（ｂ）式Ｖ－Ａのアニオン性リン脂質標的化部分を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、（ａ）式ＩＶ－Ａのイオン化カチオン性脂質、ならびに（ｂ）ＤＳＰＳ（Ｌ異性体）およびＤＰＰＳ（Ｌ異性体）からなる群から選択されるアニオン性リン脂質標的化部分を含む。
一態様において、ＬＮＰ組成物は、（ａ）ｍＲＮＡ核酸、（ｂ）組成物中の総脂質の４０～６５モル％の総量の、ＡＫＧ－ＫＣ２－ＯＡ、ＡＫＧ－ＫＣ３－ＯＡ、Ｄｌｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡおよびＤｌｉｎ－ＫＣ３－ＤＭＡからなる群から選択されるイオン化カチオン性脂質、（ｃ）組成物中の総脂質の２５～４０モル％の総量のコレステロール（またはその誘導体）、（ｄ）組成物中の総脂質の５～２５モル％の総量の２種以上のリン脂質の混合物であって、リン脂質が、組成物中の総脂質の３～９モル％（例えば、５．０～７，５モル％）の総量のＬ－セリンホスファチジルセリン脂質（例えば、ＤＰＰＳまたはＤＳＰＳ）を含む、リン脂質の混合物、ならびに（ｅ）組成物中の総脂質の０．５～２．５モル％の総量の複合脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。
一態様において、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物は、核酸、イオン化カチオン性脂質ＡＫＧ－ＵＯ－１、およびＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量の（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質を含む。いくつかの実施形態において、核酸はｍＲＮＡであり、ＰＳ脂質は、（Ｌ－セリン）ＤＳＰＳ、（Ｌ－セリン）ＤＰＰＳ、またはこれらの混合物であり、ＬＮＰ組成物は、コレステロールならびにＤＳＰＣ、ＤＰＰＣおよびＤＯＰＣからなる群から選択される第２のリン脂質をさらに含む。ＬＮＰ組成物は、ＬＮＰ組成物中の総脂質含有量に対して、０．５～１．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ＤＳＧをさらに含む。
一態様において、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物は、核酸、ＫＣ２ＯＡ、ＫＣ２、ＫＣ２－０１、ＡＬＣ－０３１５、およびＳＭ１０２から選択されるイオン化カチオン性脂質、ならびにＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量の（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、３～８のＮ／Ｐ比（例えば、５～７または５の比）を有する。
一態様において、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物は、核酸、ＡＫＧ－ＵＯ－６およびＡＫＧ－ＵＯ－７から選択されるイオン化カチオン性脂質、およびＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量の（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質を含む。いくつかの実施形態において、Ｎ／Ｐ比は３～８（例えば、５～７または５または７の比）である。
一態様において、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ワクチン組成物は、３～８のＮ／Ｐ比を有するｍＲＮＡ核酸、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の４６～６５モル％の総量のＡＬＣ－０３１５イオン化カチオン性脂質、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２５～４０モル％の総量のコレステロール、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量の（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の５～２５モル％の総量のＤＳＰＣリン脂質、およびＬＮＰ組成物の総脂質含有量の０～２．５モル％の総量のＰＥＧ－ＤＭＧを含む。
一態様において、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ワクチン組成物は、３～８のＮ／Ｐ比を有するｍＲＮＡ核酸、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の４０～６５モル％の総量のＤｌｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡイオン化カチオン性脂質、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２５～４０モル％の総量のコレステロール、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量の（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の５～２５モル％の総量のＤＳＰＣリン脂質、およびＬＮＰ組成物の総脂質含有量の０～２．５モル％の総量のＰＥＧ－ＤＭＧを含む。
一態様において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ワクチン組成物は、３～８のＮ／Ｐ比を有するｍＲＮＡ核酸、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の４０～６５モル％の総量のＫＣ３－ＯＡイオン化カチオン性脂質、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２５～４０モル％の総量のコレステロール、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量の（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の５～２５モル％の総量のＤＳＰＣリン脂質、およびＬＮＰ組成物の総脂質含有量の０～２．５モル％の総量のＰＥＧ－ＤＭＧを含む。
一態様において、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ワクチン組成物は、３～８のＮ／Ｐ比を有するｍＲＮＡ核酸、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の４０～６５モル％の総量のイオン化カチオン性脂質、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２５～４０モル％の総量のコレステロール、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量の（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質、およびＬＮＰ組成物の総脂質含有量の５～２５モル％の総量のＤＳＰＣリン脂質、ならびにＬＮＰ組成物の総脂質含有量の０～２．５モル％の総量のＰＥＧ－ＤＭＧを含む。
本開示の一態様は、樹状細胞へのＬＮＰの標的化のためのＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量のＬＮＰ中での（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質の使用に関する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰはｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、コレステロールをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰはＩＣＬをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、ＤＳＰＣを含めた１種以上の追加のリン脂質をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは複合脂質をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、３～８のＮ／Ｐ比を有するｍＲＮＡ核酸、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の４０～６５モル％の総量のイオン化カチオン性脂質（ＩＣＬ）、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量２５～４０モル％の総量のコレステロール、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量の（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の５～２５モル％の総量のＤＳＰＣリン脂質、およびＬＮＰ組成物の総脂質含有量の０～２．５モル％の総量の複合脂質を含む。
酸化に特に感受性の共役した複数の不飽和物を含有するリノール酸の脂質エステルの酸化的分解機構の図である。 Ｆａｂ’抗体フラグメントの還元Ｃ末端システインとマレイミド末端ポリ（エチレングリコール）２０００誘導体化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンとの反応を示す。Ｒ１およびＲ２は、ステアリン酸である。最終抗体リポポリマー複合体は、中間体であり、後続して脂質性ナノ粒子の脂質外層に挿入して、活性的に標的化される。 イオン化カチオン性脂質としてＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡを用いて製剤化したｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ ＬＮＰを使用した樹状細胞（ＭｕｔｕＤＣ１９４０）のトランスフェクション効率への０～２．５モル％のＤＳＰＳ含有の影響。ＩＣＬは５０モル％、コレステロールは３８．５モル％、ＰＥＧ－ＤＭＧは１．５モル％に維持し、ＤＳＰＳ含有量はさまざまであった。添加したＤＳＰＳと同じモル％分だけＤＳＰＣ含有量を減らすことによってＤＳＰＳを含ませた。濃度が１ｕｇ ｍＲＮＡ／ｍＬの各製剤を用いて、細胞を２４時間インキュベートした。ＵＴ試料は、ＬＮＰを添加しなかった細胞に相当する。リポフェクトは、リポフェクタミン処理した試料を指す。 イオン化カチオン性脂質としてＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡを用いて製剤化したｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ ＬＮＰを使用した樹状細胞（ＭｕｔｕＤＣ１９４０）のトランスフェクション効率への０～７．５モル％のＤＳＰＳ含有の影響。ＩＣＬは５０モル％、コレステロールは３８．５モル％、ＰＥＧ－ＤＭＧは１．５モル％に維持し、ＤＳＰＳ含有量はさまざまであった。添加したＤＳＰＳと同じモル％分だけＤＳＰＣ含有量を減らすことによってＤＳＰＳを含ませた。濃度が１ｕｇ ｍＲＮＡ／ｍＬの各製剤を用いて、細胞を２４時間インキュベートした。ＵＴ試料は、ＬＮＰを添加しなかった細胞に相当する。リポフェクトは、リポフェクタミン処理した試料を指す。 イオン化カチオン性脂質としてＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡを用いて製剤化したｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ ＬＮＰを使用した樹状細胞（ＭｕｔｕＤＣ１９４０）のトランスフェクション効率への０～７．５モル％のＤＳＰＳ含有の影響。ＩＣＬは５０モル％、コレステロールは３８．５モル％、ＰＥＧ－ＤＭＧは１．５モル％に維持し、ＤＳＰＳ含有量はさまざまであった。添加したＤＳＰＳと同じモル％分だけＤＳＰＣ含有量を減らすことによってＤＳＰＳを含ませた。濃度が０．３ｕｇ ｍＲＮＡ／ｍＬの各製剤を用いて、細胞を２４時間インキュベートした。ＵＴ試料は、ＬＮＰを添加しなかった細胞に相当する。 イオン化カチオン性脂質としてＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡを用いて製剤化したｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ ＬＮＰを使用した樹状細胞（ＭｕｔｕＤＣ１９４０）のトランスフェクション効率への０～７．５モル％のＤＳＰＳ含有の影響。ＩＣＬは５０モル％、コレステロールは３８．５モル％、ＰＥＧ－ＤＭＧは１．５モル％に維持し、ＤＳＰＳ含有量はさまざまであった。添加したＤＳＰＳと同じモル％分だけＤＳＰＣ含有量を減らすことによってＤＳＰＳを含ませた。濃度が０．１ｕｇ ｍＲＮＡ／ｍＬの各製剤を用いて、細胞を２４時間インキュベートした。ＵＴ試料は、ＬＮＰを添加しなかった細胞に相当する。 さまざまなＩＣＬ（ＫＣ２、ＫＣ２－ＯＡ、ＫＣ３－ＯＡ、およびＳＭ－１０２）および５モル％のＤＳＰＳを含有するＬＮＰを使用したマウス樹状細胞（ＭｕｔｕＤＣ１９４０）のトランスフェクション、ならびにＤＳＰＳではなくＧｌｕ－ＤＳＰＥまたはＳｕｃ－ＤＳＰＥを使用したＬＮＰとの比較。ＵＴ試料は、ＬＮＰを添加しなかった細胞に相当する。 ＤＳＰＳまたはＤＰＰＳは、ＫＣ２、ＫＣ２－０１、ＫＣ２－ＰＡ、ＫＣ３－０１、およびＫＣ３－ＯＡを含むＩＣＬとのｍＣｈｅｒｒｙ ＬＮＰトランスフェクションを増加する。ＵＴ試料は、ＬＮＰを添加しなかった細胞に相当する。 マウス樹状細胞をトランスフェクションする上での、さまざまな化学形態のホスファチジルセリンとＡＫＧ－ＵＯ－１含有ＬＮＰとの比較。ＵＴ試料は、ＬＮＰを添加しなかった細胞に相当する。Ｌｉｐｏは、ＬＮＰと同じ投与量レベルで製造業者の指示に従って使用されたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を指す。 ＡＫＧ－ＵＯ１含有ＬＮＰを使用してマウス樹状細胞をトランスフェクションする上での、ＤＳＰＳと他の負電荷を帯びたリン脂質との比較。ＵＴ試料は、ＬＮＰを添加しなかった細胞に相当する。Ｌｉｐｏは、ＬＮＰと同じ投与量レベルで製造業者の指示に従って使用されたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を指す。 樹状細胞のトランスフェクションへの、ＡＵＧ－ＵＯ－１含有ＬＮＰ中のＤＳＰＳ濃度の影響。ＵＴ試料は、ＬＮＰを添加しなかった細胞に相当する。 樹状細胞のトランスフェクションへの、５モル％のＤＳＰＳを含む場合と含まない場合のＡＵＧ－ＵＯ－１含有ＬＮＰ中のＰＥＧ－ＤＭＧ濃度の影響。Ｙ軸は、後に濃度（０．１１、０．３３、または１μｇ／ｍＬ）のｍＲＮＡが細胞に添加される組成物中で使用される％ＰＥＧを示す。ＵＴ試料は、ＬＮＰを添加しなかった細胞に相当する。 ２つのオレフィンの間に単一のメチレンを有するＩＣＬ（ＫＣ２、ＫＣ３、およびＯ－１１７６９）および２つのオレフィンの間に４つのメチレンを有するＩＣＬ（ＫＣ２－０１、ＫＣ３－０１、およびＵＯ－１）の脂質懸濁液の酸化的分解。 Ｏ－１１７６９（２つのオレフィン間に単一のメチレンを有するＩＣＬ）を含有するリポソーム、およびＵＯ－１（２つのオレフィンの間に４つのメチレンを有するＩＣＬ）を含有するリポソームの酸化的分解。 マウス樹状細胞内の、１μｇ／ｍＬのＫＣ２－０１含有ＬＮＰのｍＣｈｅｒｒｙ発現へのＮ／Ｐの効果。ＵＴ試料は、ＬＮＰを添加しなかった細胞に相当する。 マウス樹状細胞内の、０．３３μｇ／ｍＬのＫＣ２－０１含有ＬＮＰのｍＣｈｅｒｒｙ発現へのＮ／Ｐの効果。ＵＴ試料は、ＬＮＰを添加しなかった細胞に相当する。 ＤＳＰＳ（７．５モル％）を有する場合と有さない場合の異なるイオン化カチオン性脂質を含有するＬＮＰのトランスフェクション効率。ＵＴ試料は、ＬＮＰを添加しなかった細胞に相当する。 マウス樹状細胞内での、さまざまな濃度のＤＯＰＳ（総脂質の％としての０、１０、および２５モル％）およびｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを含有するＬＮＰ製剤のトランスフェクション効率。 ＶＲＮ－０２９のｍＲＮＡ配列、配列を生成するＳＡＲＳ－ＣＯＶ２スパイクタンパク質。 ＶＲＮ－０２９のｍＲＮＡ配列、配列を生成するＳＡＲＳ－ＣＯＶ２スパイクタンパク質。 ＬＮＰワクチン免疫原性への、ＰＥＧ－ＤＭＧ（Ｃ１４）濃度（モル％）の効果。７．５％のＤＳＰＳおよびＰＥＧ－ＤＰＰＥのモル％が増加されたイオン化脂質ＵＯ１を使用してｍＲＮＡ－ＬＮＰで免疫化したマウスの合計抗スパイク抗体力価およびＣＤ４応答。中央のグラフは、３４日目のエンドポイント抗体力価を示す。右のグラフは、対応するＣＤ４ Ｔ細胞応答を示す。 ＬＮＰワクチン免疫原性への、ＰＥＧ－ＤＰＰＥ（Ｃ１６）濃度（モル％）の効果。７．５％のＤＳＰＳおよびＰＥＧ－ＤＭＧのモル％が増加されたイオン化脂質ＵＯ１を使用してｍＲＮＡ－ＬＮＰで免疫化したマウスの合計抗スパイク抗体力価。中央のグラフは、３４日目のエンドポイント抗体力価を示す。ＰＥＧ－ＤＰＰＥのモル％は、抗体レベルに反対に影響を与えた。右のグラフは、対応するＣＤ４ Ｔ細胞応答を示す。 ７．５％のＤＳＰＳおよび１．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧ（１４Ｃ）またはＰＥＧ－ＤＳＧ（１８Ｃ）のいずれかを有するイオン化脂質ＫＣ２ＯＡを使用してｍＲＮＡ－ＬＮＰで免疫化したマウスの合計抗スパイク抗体力価およびＣＤ４応答。左のグラフは、３４日目のエンドポイント抗体力価を示す。右のグラフは、対応するＣＤ４ Ｔ細胞応答を示す。 ７．５％のＤＳＰＳおよび１．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧ（１４Ｃ）またはＰＥＧ－ＤＳＧ（１８Ｃ）のいずれかを有するイオン化脂質ＵＯ１を使用してｍＲＮＡ－ＬＮＰで免疫化したマウスの合計抗スパイク抗体力価およびＣＤ４応答。左のグラフは、３４日目のエンドポイント抗体力価を示す。右のグラフは、対応するＣＤ４ Ｔ細胞応答を示す。 ｍＲＮＡ－ＬＮＰ免疫原性におけるホスファチジルセリン取り込みの効果。さまざまなイオン化脂質およびＰＥＧ－脂質プラス／マイナス７．５モル％のＤＳＰＳを使用してｍＲＮＡ－ＬＮＰで免疫化したマウスの合計抗スパイク抗体力価（Ａ）およびスパイク特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答。抗体データは、対数変換され、シダック多重比較試験により、二元ＡＮＯＶＡを使用して分析した。ＣＤ４ Ｔ細胞データを、シダック多重比較試験により、ＲＥＭＬ混合効果モデルを使用して分析した。 Ｂ（パネルＡ）およびＴ細胞（パネルＢ）応答のｍＲＮＡ－ＬＮＰプライミングへの、ホスファチジルセリン脂質テール（ＤＰＰＳ対ＤＳＰＳ）組成の効果。抗体データは、分析前に対数変換した。データを、ターキー多重比較試験により、一元ＡＮＯＶＡを使用して分析した。 ＫＣ２－０１ ＬＮＰ、７．５モル％のＤＳＰＳ（Ｄ異性体）およびＤＳＰＳ（Ｌ異性体）の、１μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡでの２４時間のｍＣｈｅｒｒｙ発現の比較。 ＫＣ２－０１ ＬＮＰ、７．５モル％のＤＳＰＳ（Ｄ異性体）およびＤＳＰＳ（Ｌ異性体）の、０．３３μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡでの２４時間のｍＣｈｅｒｒｙ発現の比較。 ＫＣ２ ＬＮＰ、５および７．５モル％のＤＳＰＳ（Ｌ異性体）を有するものと、ＳＭ－１０２またはＡＬＣ－０３１５を用いて調製されたＬＮＰ（１μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ、２４時間）とのｍＣｈｅｒｒｙ発現の比較。Ｙ軸は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）である。ＵＴ試料は、ＬＮＰを添加しなかった細胞に相当する。 ＵＯ１、ＵＯ６およびＵＯ７製剤のみ、または７．５モル％のＤＳＰＳのＤ異性体を添加したもの（１μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ、２４時間）のｍＣｈｅｒｒｙ発現の比較。ＵＴ試料は、ＬＮＰを添加しなかった細胞に相当する。 ＵＯ１、ＳＭ１０２、ＡＬＣ－０３１５製剤のみ、またはＤＳＰＳを添加したもの（１μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ、２４時間）のｍＣｈｅｒｒｙ発現の比較。Ｌｉｐｏは、ＬＮＰとして同じ投与量レベルで製造業者の指示に従って使用されたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を指す。ＵＴ試料は、ＬＮＰを添加しなかった細胞に相当する。
前述の概要および以下の詳細な説明の両方は、例示的かつ説明目的のみのものであり、本開示の組成物および方法が限定されるものではないことを理解されたい。
安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）を、ｍＲＮＡまたは他の核酸治療薬の全身送達のためのビヒクルとして使用する。ＳＮＡＬＰ組成物は、単一のメチレン基によって分離された一対の炭素－炭素二重結合を含有する一対の直鎖状の１８個の炭素からなる脂肪族鎖（例えば、リノール酸）と結合したプロトン化可能な第３級アミン頭部基を含む、ＭＣ３またはＫＣ２などのカチオン性脂質を含む。しかしながら、それぞれが、単一のメチレン基によって分離される一対の二重結合を含むこれらの炭化水素鎖の構造は、ＳＮＡＬＰ組成物の所望の生物学的特性を付与するが、この化学的下部構造は、酸化的分解に対する化合物の感受性が高くなる望ましくない問題ももたらす。例えば、図１は、酸化に特に感受性の共役した複数の不飽和物を含有するリノール酸の脂質エステルの酸化的分解機構の図である。ＳＮＡＬＰ組成物中での使用に適するが、酸化的分解に対する耐性が強化された、新規のカチオン性脂質が必要とされる。
本明細書において、細菌感染の処置に関連する化合物、組成物および方法を開示する。本明細書で使用される場合、用語「化合物」、「薬物」および「活性剤」は区別なく用いられる。本開示のいくつかの態様は、新規のイオン化脂質または生体還元性イオン化脂質に関する。これらの脂質は、酸性ｐＨでカチオン性であり（すなわち、正電荷を持つ）、例えば、細胞によるエンドサイトーシスまたは食作用の後に細胞内で遭遇する。同じ脂質およびそれらを含有する組成物は、ｐＨ７．４で存在するとき、ほぼ中性の電荷を持つ。これらの脂質は、それらのアルキル基またはアシル基中に存在する少なくとも２つのメチレン基によって分離される複数のオレフィンも有しうる。
本開示のいくつかの態様は、新規のイオン化脂質の合成のプロセスに関する。
他の態様は、イオン化カチオン性脂質を含む脂質性ナノ粒子を含む組成物に関し、前記脂質性ナノ粒子は核酸を含有する。いくつかの実施形態において、核酸は脂質性ナノ粒子中にカプセル化される。
本開示の他の態様は、感染性疾患または癌の予防用のワクチン中でのこれらのイオン化脂質またはイオン化脂質を含む脂質性ナノ粒子組成物の使用に関する。いくつかの実施形態において、感染性疾患は、細菌またはウイルス感染であってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、結核に関連する感染症、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、マラリア、またはＣＯＶＩＤ－１９などのコロナウイルス関連の感染症を予防するために使用されうる。他の実施形態において、感染症は、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、デング熱、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）、ノロウイルス、おたふくかぜ、麻疹、髄膜炎菌性疾患、肺炎球菌疾患、ポリオ、ロタウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、風疹、帯状疱疹／ヘルペスウイルス、破傷風、または百日咳である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物および組成物は、組織マクロファージおよび樹状細胞を含めた標的細胞の効率的な取り込みおよびトランスフェクションを促進することができる。結果として、感染性ウイルスまたは細菌に特異的な抗原をコードする核酸の効率的な送達および後続する、対応する感染症に対して保護する所望の免疫応答を引き出す該抗原の提示が起こる。いくつかの実施形態において、核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスのエピトープをコードする合成核酸（例えば、操作コドン最適化ｍＲＮＡ）であってもよい。いくつかの実施形態において、核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶもしくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスのＳ－タンパク質（スパイクタンパク質）またはそのフラグメントをコードする合成核酸（例えば、操作コドン最適化ｍＲＮＡ）であってもよい。
定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲の中で用いられる特定の用語をここにまとめる。別段の規定がない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。
本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、以下の意味を有することが意図される。
冠詞「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」は、冠詞の文法上の１つまたは複数の（すなわち、少なくとも１つの）目的語を指すために使用される。例としては、「ある（ａｎ）要素」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、所与の実施形態に存在するが、特定されていない要素の包含にも及ぶ、組成物、方法、およびその各構成要素に関連して用いられる。
本明細書で使用される場合、用語「から本質的になる」は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、本開示のその実施形態の基礎および新規のまたは機能特性に実質的に影響しない追加の要素の存在を許す。
用語「からなる」は、実施形態の記述中に列挙されないすべての要素を除く、本明細書に記載の組成物、方法、およびそれらの各構成要素を指す。
本明細書で用いられる場合の用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「からなる」および「から本質的になる」を含む。
記述中の「上述したとおりの」または「上述の」、「上記」に言及される場合、前の頁のいずれかにおいて明細書中で成された開示のいずれかを指す。
記述中の「本明細書中で述べたように」、「本明細書に記載の」、「本明細書で提供された」、または「本文章中に述べたように」、または「本明細書に規定の」に言及される場合、前の頁または後の頁のいずれかにおける明細書中で成された開示のいずれかを指す。
本明細書で使用される場合、用語「約」は、指定の値の２０％以内、１０％以内および５％以内の許容されるばらつきを意味する。特定の実施形態において、「約」は、＋／－１％、２％、３％、４％、５％、１０％または２０％のばらつきを意味することができる。
化合物または組成物に関連して本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、殺菌または静菌効果を起こすのに十分な活性化合物（本明細書中、活性剤または活性薬物とも呼ばれる）の量を意味する。一実施形態において、有効量は、処置される細菌感染の症状を軽減するのに十分な活性化合物の量を意味する「治療的有効量」である。
本明細書で使用される場合、用語「対象（または代替的には「患者」）」は、予防的または治療的処置のいずれかを受ける動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
本明細書で使用される場合、用語「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」または「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」は、化合物または医薬組成物を、それを必要とする対象に導入するすべて手段を意味し、これらに限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、吸入、口腔、点眼、舌下、膣内、および直腸などが挙げられる。化合物または組成物の投与は、好適には、非経口である。例えば、化合物または組成物は、優先的には静脈内投与できるが、現在、マイコバクテリウム・アビウム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）の処置におけるリポソーム性アミカシンに、クリニックで使用されているように、腹腔内または吸入を介して投与することもできる（Ｓｈｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｉｋａｃｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｌｕｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｄｒｕｇｓ．２０１９ Ａｐｒ；７９（５）：５５５－５６２を参照）。
本明細書で使用される場合、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書に記載のものなどの治療的または予防的対策を指す。
用語「薬学的に許容される塩」は、本開示の化合物の比較的非毒性の無機または有機酸付加塩であって、所望の薬理作用を持つ塩を指す。
用語「アルキル」は、炭素鎖に別段の規定がない限り、直鎖状または分岐状またはこれらの組合せであってもよい、１～２０個の炭素原子を有する飽和炭素鎖を意味する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ－およびｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、およびオクチルなどが挙げられる。本明細書において別段の規定がない限り、アルキル基は、任意選択により置換されている。
用語「ホスファチジルセリン」は、そのアシル鎖組成物のいずれかと共に、特定の実施例で別段の指定がない限り、頭部基中のセリンのＬ－異性体を指す。
用語「脂質複合体」は、脂質粒子の凝集を阻害する複合脂質を指す。そのような脂質複合体としては、これらに限定されないが、ポリサルコシン（例えば、全ての目的のために引用することにより本明細書の一部をなすものとするＷＯ２０２１１９１２６５Ａを参照）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質複合体）、ＰＥＧ－脂質複合体（ジアルキルオキシプロピルとカップリングしているＰＥＧ、ジアシルグリセロールとカップリングしているＰＥＧ、コレステロールとカップリングしているＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンとカップリングしているＰＥＧ、セラミドと共役しているＰＥＧなど）（例えば、すべての目的のために引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許第５，８８５，６１３号を参照）、カチオン性ＰＥＧ脂質、およびこれらの混合物が挙げられる。ＰＥＧは、脂質に直接共役されうる、またはリンカー部分を介して脂質に結合されうる。ＰＥＧを脂質にカップリングさせるのに適した任意のリンカー部分（例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含む）を使用することができる。好ましい実施形態において、非エステル含有リンカー部分が使用される。
イオン化カチオン性脂質の略語は、実施例において、表で使用されるものから切り捨てられうる。例えば、ＡＫＧ－ＵＯ－１またはＡＫＧ－ＫＣ２－０１は、ＵＯ１またはＫＣ２－０１と呼んでもよい。
さまざまな研究で使用される略語ＵＴは、未処理試料を指す。
用語「脂質性ナノ粒子」または「ＬＮＰ」は、約５～５００ｎｍの直径を有する粒子を指す。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、１種以上の活性剤を含む。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は核酸を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、カチオン性脂質、ポリマー、または多価小分子および生物学的環境と相互作用する外部脂質コートを有するナノ粒子の内部で凝縮される。ホスフェート基間の斥力に起因して、核酸は必然的に堅いポリマーであり、細長い形状が好ましい。細胞中にて、体積拘束に対処するために、ＤＮＡは、イオンおよび他の分子の助けを受けて、適当な溶液条件で、それ自体をパックすることができる。通常、ＤＮＡ凝縮は、延長されたＤＮＡ鎖の、１つまたは数個の分子のみを含むコンパクトな系統的粒子への崩壊として定義される。ホスフェート基に結合することにより、カチオン性脂質は、ホスフェート電荷を中和して細密充填させることによってＤＮＡを凝縮することができる。
いくつかの実施形態において、活性剤をＬＮＰ中にカプセル化する。いくつかの実施形態において、活性剤は、アニオン性化合物であってもよく、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、天然および合成オリゴヌクレオチド（アンチセンス・オリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡを含む）、核タンパク質、ペプチド、核酸、リボザイム、ＤＮＡ含有核タンパク質、例えばそのままのまたは部分的に除タンパクされたウイルス粒子（ビリオン）、ＤＮＡ以外のオリゴマーおよびポリマーアニオン性化合物（例えば、酸性多糖類および糖タンパク質））であってもよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、活性剤は、アジュバントと混ぜてもよい。
ＬＮＰワクチン製品において、活性剤は、一般的にＬＮＰの内部に含まれる。いくつかの実施形態において、活性剤は核酸を含む。典型的には、水溶性核酸は、粒子の内部中のカチオン性脂質またはポリカチオン性ポリマーと共に凝縮され、粒子の表面は、中性脂質またはＰＥＧ－脂質誘導体で富む。追加のイオン化カチオン性脂質も表面にあってもよく、正電荷を持つことによって環境中の酸性化に応答し、エンドソーム脱出を促進する。
イオン化脂質は、ＬＮＰとは異なる特性または機能を有しうる。アミノ基のｐＫａに起因して、脂質分子は、酸性条件で正電荷を持つようになりうる。これらの条件下、脂質分子は、核酸のホスフェート基に静電的に結合することができ、ＬＮＰの形成および核酸の封入を可能にする。いくつかの実施形態において、ｐＫａは、生理的ｐＨ値にある血液などの生体液中でＬＮＰの表面電荷を実質的に中性にするのに十分低くてもよい。高いＬＮＰ表面電荷は、毒性、固着性および遊離マクロファージによる循環からの迅速除去、溶血毒性（免疫活性化を含む）と関連する（Ｆｉｌｉｏｎ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９７ Ｏｃｔ ２３；１３２９（２）：３４５－５６）。
いくつかの実施形態において、ｐＫａは、イオン化カチオン性脂質が、酸性のエンドソームｐＨ値で正電荷形態をとることができるのに十分高くてよい。この方法で、カチオン性脂質は、内因性エンドソームアニオン性脂質と組み合わせて、六面ＨＩＩ相などの膜溶解非二分子層構造を促進することができ、より効率的な細胞内輸送をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、ｐＫａは６．２～６．５の範囲である。例えば、ｐＫａは、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５であってもよい。不飽和テールは、非二分子層構造をとる脂質の能力にも貢献する（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２０１２ Ａｕｇ ２０；５１（３４）：８５２９－３３）。
リポソーム除去および循環半減期などの他の特性の中でも、ＬＮＰ製剤からの核酸の放出は、ポリエチレングリコールおよび／またはステロール（例えば、コレステロール）またはＬＮＰ中の他の潜在的な添加剤の存在、ならびに全体的な化学構造（製剤の一部として含まれる任意のイオン化カチオン性脂質のｐＫａを含む）によって修飾することができる。
用語「生体還元性」は、還元環境でジスルフィド結合の開裂に起因して加速された分解を経る化合物を指す。ｓｉＲＮＡなどの他の核酸治療薬と異なり、ｍＲＮＡ系治療薬の成功は、ｍＲＮＡをカプセル化する安全で効率的な送達ビヒクルの有用性によって決まる。ｍＲＮＡは脆弱であり、標的部位に達するまで活性状態を維持するための保護コーティングを必要とする。ｍＲＮＡ含有ＬＮＰは、Ｃｏｖｉｄ－１９免疫に対して有望なワクチンの選択肢である（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０２０ Ｎｏｖ １２；３８３（２０）：１９２０－１９３１）。ＬＮＰの効率および忍容性はアミノ脂質に起因し、数週間または数カ月のサービスを要しうる多くの生体材料の用途と異なり、ｍＲＮＡの機能的ＬＮＰ介在型送達は数時間以内に行われ、永続的な脂質の必要を解消する。実際、長時間投与を要する用途において、これは特に重要になる。ＬＮＰはエンドサイトーシスを介して細胞に入り、エンドリソソーム区画中に蓄積することが実証された。イオン化カチオン性脂質（ＩＣＬ）は、後期エンドソーム／リソソーム中でリパーゼによる酵素加水分解またはリソソームの還元環境によって誘発される加水分解を受けやすく、完全な生分解が可能であるが、エンドサイトーシス後にｍＲＮＡを効率的にサイトゾルへ送達できる。細胞外空間は、比較的酸化環境であるが、細胞内空間は還元環境であり、ジスルフィド結合分子を細胞外空間内でそのまま維持させ、しかし内在化されると迅速に還元される（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５ Ｍａｒ；１１（３）：４０９－１７，２００５）。いくつかの実施形態は、循環中はＬＮＰ製剤中で安定であるがリソソームの還元環境で開裂を経る生体還元性ジスルフィド結合ＩＣＬ分子（化合物２９～３６（表２）参照）を提供する。そのような化合物および組成物は、脂質の迅速な生物学的破壊を促進でき、ＩＣＬ脂質の潜在的に毒性の蓄積を防止することができる（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを有するラットで観察した場合（Ｓａｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１８ Ｊｕｎ ６；２６（６）：１５０９－１５１９）。
本明細書で使用される場合、用語「カプセル化」および「封入された」は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡまたは他の核酸医薬品の脂質性ナノ粒子中の取り込みまたは脂質性ナノ粒子との会合を指す。本明細書で使用される場合、用語「カプセル化された」は、完全なカプセル化または部分的なカプセル化を指す。ｓｉＲＮＡは、対象となる遺伝子の発現を選択的にノックダウンまたは下方制御することができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、それを必要とする対象にｓｉＲＮＡを含むナノ粒子組成物を投与すると、特定の疾患、障害、または病態と関連する遺伝子をサイレンシングするように選択されうる。ｓｉＲＮＡは、対象となる遺伝子またはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に補完的な配列を含んでもよい。
コレステロールに関連する用語「モル％」は、パーセンテージポイントで表されるコレステロールおよび非ＰＥＧ化リン脂質のモル量の合計に対するコレステロールのモル量を指す。例えば、コレステロールおよびＨＳＰＣを含有するリポソーム中の「５５モル％のコレステロール」は、４５モル部のＨＳＰＣ当たり５５モル部のコレステロールの組成物を指す。
ＰＥＧ－脂質の関連する用語「モル％」は、パーセンテージポイントで表されるＰＥＧ－脂質および非ＰＥＧ化リン脂質のモル量の比を指す。例えば、ＨＳＰＣおよびＰＥＧ－ＤＳＰＥを含有するＬＮＰ中の「５モル％のＰＥＧ－ＤＳＰＥ」は、１００モル部のＨＳＰＣ当たり５モル部のＰＥＧ－ＤＳＰＥを有する組成物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」は、ヒトまたは家畜における使用に許容されるものとして米国食品医薬品局によって認可された任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、染料／着色料、風味相乗剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶剤、または乳化剤を含むが、これらに限定されない。
さまざまな態様および実施形態を、以下のサブセクションでさらに詳細に記載する。
化合物
本明細書において、結核を含めた感染性疾患の処置または予防のための化合物、組成物および方法を提供する。本開示の態様によれば、カチオン性脂質は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶを有する化合物またはそれらの薬学的に許容される塩を含む。本開示の態様によれば、イオン化カチオン性脂質は、式ＩＶ、式ＩＶ－Ａ、式Ａ、式Ａ’、式Ａ’’、式Ａ’’’、および／または式Ｂからなる群から選択される１つ以上の化学的下部構造を有する化合物を含む。本開示のいくつかの態様において、イオン化カチオン性脂質は、式Ｉ、式Ｉ－Ａ、式Ｉ－Ａ’、式Ｉ－Ａ’’、式ＩＩ、式ＩＩ－Ａ、式ＩＩ－Ａ’、式ＩＩ－Ｂ、式ＩＩ－Ｂ’、式ＩＩＩ、もしくは式ＩＩＩ－Ａを有する化合物またはこれらの薬学的に許容される塩を含むことができる。本開示のいくつかの態様において、ＬＮＰは、式Ｖもしくは式Ｖ－Ａを有する化合物またはこれらの薬学的に許容される塩を含むことができる。本開示のいくつかの態様において、ＬＮＰは、式ＶＩもしくは式ＶＩ－Ａを有する化合物またはこれらの薬学的に許容される塩を含むことができる。本開示のいくつかの態様において、ＬＮＰは、式ＶＩＩを有する化合物またはその薬学的に許容される塩を含むことができる。本開示のいくつかの態様において、ＬＮＰは、式ＶＩＩＩを有する化合物またはその薬学的に許容される塩を含むことができる。本開示の態様によれば、カチオン性脂質は、（ａ）式Ｉ、式Ｉ－Ａ、式Ｉ－Ａ’、式Ｉ－Ａ’’、式ＩＩ、式ＩＩ－Ａ、式ＩＩ－Ａ’、式ＩＩ－Ｂ、式ＩＩ－Ｂ’、式ＩＩＩ、もしくは式ＩＩＩ－Ａの化合物から選択されるイオン化カチオン性脂質、または式ＶＩ－Ａのステロール脂質、または式ＶＩＩＩの分岐状脂質、および（ｂ）式ＶＩのステロールを有し、任意選択により（ｃ）式ＶＩＩのアルキレングリコール脂質をさらに含む化合物を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、式Ｖまたは式Ｖ－Ａのリン脂質をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、表３のアニオン性リン脂質標的化部分をさらに含む。
また、本明細書において、結核を含めた感染性疾患の処置または予防のための化合物、組成物および方法も提供する。本開示の態様によれば、カチオン性脂質は、式Ａを有する化合物またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、式ＩＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ中にあるような２つの脂肪アシル基を含む。
本明細書において、ワクチンの調製において有用な式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶの化合物またはこれらの薬学的に許容される塩を開示する。また、本明細書において、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶのカチオン性脂質またはこれらの薬学的に許容される塩を含む組成物も開示する。いくつかの実施形態において、ワクチンは、マイコバクテリウム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染の予防のために使用される。いくつかの実施形態において、ワクチンは、結核、非結核性抗酸菌（ＮＴＭ）、非結核性肺疾患、ハンセン病、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ－ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシイ（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム・マリヌム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・ケロナエ（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウム・アブセッサス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、および他の感染性疾患、例えばコロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９、ＳＡＲＳ ＣｏＶ２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ジフテリア、エボラ、フルー（インフルエンザ）、肝炎、Ｈｉｂ病、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ＨＰＶ（ヒト・パピローマウイルス）、マラリア、麻疹、髄膜炎菌性疾患、おたふくかぜ、ノロウイルス、悪疫、肺炎球菌による疾病、ポリオ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ロタウイルス、風疹（三日ばしか）、帯状疱疹（ヘルペス）、破傷風（牙関緊急）、百日咳（疫咳）およびジカの予防のために使用することができる。
本明細書において、結核を含めた感染性疾患の処置または予防のための化合物、組成物および方法を提供する。本開示の態様によれば、カチオン性脂質は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶを有する化合物またはこれらの薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの２つの脂肪アシル基を含む。
本開示の一態様は、式Ａの１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含む脂質を提供する。
［式中、ａは、１、２、３または４であり、ｂは、２、３または４であり、ｃは、３、４、５、６または７である］
いくつかの態様において、イオン化脂質は、ｂが４である、２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。いくつかの態様において、イオン化脂質は、式Ａの２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができ、式中、ａ、ｂおよびｃの合計は１０、１１、１２または１３である。いくつかの態様において、イオン化脂質は、式Ａの２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができ、式中、ａは４であり、ｂは４であり、ｃは４または５である。いくつかの態様において、イオン化脂質は、式Ａの２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができ、式中、ａは１、２または３であり、ｂは４であり、ｃは３、４、５、６または７である。いくつかの態様において、イオン化脂質は、式Ａの２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができ、式中、ａは５または６であり、ｂは２、３または４であり、ｃは３、４、５、６または７である。いくつかの態様において、イオン化脂質は、式Ａの２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができ、式中、ａ、ｂおよびｃの合計は１０、１１、１２または１３である。いくつかの態様において、イオン化脂質は、式Ａの２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができ、式中、ａ、ｂおよびｃの合計は１２である。いくつかの態様において、イオン化脂質は、式Ａの２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができ、式中、ｂは２であり、ａ、ｂおよびｃの合計は１２である。いくつかの態様において、イオン化脂質は、式Ａの２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができ、式中、ｂは３であり、ａ、ｂおよびｃの合計は１２である。いくつかの態様において、イオン化脂質は、式Ａの２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができ、式中、ｂは４であり、ａ、ｂおよびｃの合計は１２である。いくつかの態様において、イオン化脂質は、式Ａの２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。
本開示の一態様は、式Ａの１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含む脂質を提供する。
［式中、ａは１、２または３であり、ｂは２、３または４であり、ｃは３、４、５、６または７である］
いくつかの態様において、イオン化脂質は、ｂが４である、２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。いくつかの態様において、イオン化脂質は、ａ、ｂおよびｃの合計が１０、１１、１２または１３である、式Ａ’の２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。
本開示の一態様は、式Ａ’’の１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含む脂質を提供する。
［式中、ａは４であり、ｂは４であり、ｃは４または５である］
いくつかの態様において、イオン化脂質は、ａ、ｂおよびｃの合計が１２である、式Ａ’’の２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。
本開示の一態様は、式Ａ’’’の１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含む脂質を提供する。
［式中、ａは５または６であり、ｂは２、３または４であり、ｃは３、４、５、６または７である］
いくつかの態様において、イオン化脂質は、ａ、ｂおよびｃの合計が１０、１１、１２または１３である、式Ａ’’’の２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。いくつかの態様において、イオン化脂質は、ａ、ｂおよびｃの合計が１２である、式Ａ’’’の２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。いくつかの態様において、イオン化脂質は、ｂが２であり、ａ、ｂおよびｃの合計が１２である、式Ａ’’’の２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。いくつかの態様において、イオン化脂質は、ｂが３であり、ａ、ｂおよびｃの合計が１２である、式Ａ’’’の２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。いくつかの態様において、イオン化脂質は、ｂが４であり、ａ、ｂおよびｃの合計が１２である、式Ａ’’’の２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。いくつかの態様において、イオン化脂質は、式Ａ’’’の２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。
本開示の一態様は、式Ｂの１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含む脂質を提供する。
［式中、ａは５、６または７であり、ｃは３、４または５である］
いくつかの態様において、イオン化脂質は、ｂが４である、２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。いくつかの態様において、イオン化脂質は、ａおよびｃの合計が９、１０または１１である、式Ｂの２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ－Ａ）の化学構造
またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ａ、式Ａ’、式Ａ’’、または式Ａ’’’または式Ｂのポリエン炭化水素鎖であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである。
いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中のＲ２２は、式Ａのポリエン炭化水素鎖である。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中のＲ２２は、式Ａ’のポリエン炭化水素鎖である。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中のＲ２２は、式Ａ’’のポリエン炭化水素鎖である。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中のＲ２２は、式Ａ’’’のポリエン炭化水素鎖である。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中のＲ２２は、式Ｂのポリエン炭化水素鎖である。
いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中、Ｒ１０およびＲ１２は、それぞれ独立して、メチル、エチル、プロピル、－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨ、および－（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨから選択される。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中、Ｒ１０およびＲ１２は、それぞれ独立して、メチルである。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中、Ｒ１０およびＲ１２は、それぞれ独立して、エチルである。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中、Ｒ１０およびＲ１２の少なくとも１つは、任意選択によりヒドロキシルで置換されているｎ－プロピルである。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中、Ｒ１０はメチルであり、Ｒ１２は、メチル、エチル、－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨ、および－（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨから選択される。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中、Ｒ１０はメチルであり、Ｒ１２は、－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨ、および－（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨから選択される。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）の化学構造を含む化合物において、Ｒ１０はメチルであり、Ｒ１２は、－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨ、および－（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨから選択される。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中、Ｒ１０およびＲ１２は、独立して、任意選択により１つ以上のヒドロキシルで置換されている、メチルまたはエチルから選択される。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中、Ｒ１０およびＲ１２の一方または両方は、式（ＩＶ－Ａ）中の－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨ、または－（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨである。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中、Ｒ１０はメチルであり、Ｒ１２は、ヒドロキシルで置換されているメチルまたはエチルである。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中のＲ１０の一方または両方はメチルであり、Ｒ１２は、式（ＩＶ－Ａ）中の－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨである。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中のＲ１０の一方または両方はメチルであり、Ｒ１２は、式（ＩＶ－Ａ）中の－（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨである。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ－Ａ）のＹ部分に共有結合された１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ａ、式Ａ’、式Ａ’’、式Ａ’’’または式Ｂのポリエン炭化水素鎖であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである。いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ－Ａ）のＹ部分に共有結合された１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ａ、式Ａ’、式Ａ’’、または式Ａ’’’のポリエン炭化水素鎖であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである。いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ－Ａ）のＹ部分に共有結合された１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ｂのポリエン炭化水素鎖であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ－Ａ）のＹ部分に共有結合された１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ａ、式Ａ’、式Ａ’’、式Ａ’’’または式Ｂのポリエン炭化水素鎖であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである。いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ－Ａ）のＹ部分に共有結合された１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ａ、式Ａ’、式Ａ’’、または式Ａ’’’のポリエン炭化水素鎖であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである。いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ－Ａ）のＹ部分に共有結合された１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ｂのポリエン炭化水素鎖であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ－Ａ）のＹ部分に共有結合された１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ａ、式Ａ’、式Ａ’’、式Ａ’’’または式Ｂのポリエン炭化水素鎖であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである。いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ－Ａ）の１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ａ、式Ａ’、式Ａ’’、または式Ａ’’’のポリエン炭化水素鎖であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ－Ａ）のＹ部分に共有結合された１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ａ、式Ａ’、式Ａ’’、式Ａ’’’または式Ｂのポリエン炭化水素鎖であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ－Ａ）のＹ部分に共有結合された１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ａ、式Ａ’、式Ａ’’、式Ａ’’’または式Ｂのポリエン炭化水素鎖であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ）：
のＹ部分に共有結合された１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ａ、式Ａ’、式Ａ’’、式Ａ’’’または式Ｂのポリエン炭化水素鎖である。いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ）：
のＹ部分に共有結合された１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ａのポリエン炭化水素鎖である。いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ）：
のＹ部分に共有結合された１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２の整数であり、Ｒ２２は、式Ａ’のポリエン炭化水素鎖である。
本開示の一態様は、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
［式中、Ｙは、独立してメチルまたはエチル基であり、
ここで、２つの脂肪アシル基は、１６～１８個の炭素を有し、２つの非共役オレフィンを含有する］
本開示の別の態様は、イオン化脂質を含む組成物であって、式Ｉのイオン化脂質またはその薬学的に許容される塩を含む脂質性ナノ粒子を提供する。
［式中、Ｙは、独立してメチルまたはエチル基であり、
ここで、２つの脂肪アシル基は、合計で１６～１８個の炭素を有し、２～４つのメチレン基によって分離される２つのオレフィンを含有する］
いくつかの実施形態において、２つの脂肪アシル基は１６個の炭素を有する。いくつかの実施形態において、２つの脂肪アシル基は１７個の炭素を有する。いくつかの実施形態において、２つの脂肪アシル基は１８個の炭素を有する。
いくつかの実施形態において、式Ｉ－Ａのイオン化脂質またはその薬学的に許容される塩を提供する。
［式中、ａは、１、２、３、４、５または６であり、ｂは、２、３または４であり、ｃは、３、４、５、６または７であり、ａ、ｂおよびｃの合計は１０または１２であり、Ｌは
であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、ｖは０または１であり、ｑは１、２、３または４であり、ｑ２は１または２である］
いくつかの態様において、式Ｉ－Ａのイオン化脂質における、ｖは０であり、ｑは１、２または３であり、ａ、ｂおよびｃの合計は１２である。いくつかの態様において、式Ｉ－Ａのイオン化脂質における、ｖは１であり、ｑは３または４であり、ａ、ｂおよびｃの合計は１２である。いくつかの態様において、式Ｉ－Ａ’のイオン化脂質中、Ｒ１０およびＲ１２は、独立して、メチル、エチル、およびプロピルから選択され、これらはそれぞれ、任意選択により単一のヒドロキシルで置換されている。いくつかの態様において、ａ、ｂおよびｃの合計は１２であり、Ｒ１０およびＲ１２は、独立して、メチル、エチル、－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨ、および－（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨから選択される。
いくつかの実施形態において、式Ｉ－Ａ’のイオン化脂質、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
［式中、ａは１、２または３であり、ｃは３、４、５、６または７であり、Ｌは
であり、Ｙ’はメチルまたはエチルであり、ｖは０または１であり、ｑは２、３または４であり、ｑ２は１または２である］
いくつかの態様において、式Ｉ－Ａ’のイオン化脂質中、ｖは０であり、ｑは１、２または３であり、ａおよびｃの合計は６または８である。いくつかの態様において、式Ｉ－Ａ’のイオン化脂質中、ｖは１であり、ｑは３または４であり、ａおよびｃの合計は６または８である。
いくつかの実施形態において、式Ｉ－Ａ’’のイオン化脂質、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
［式中、ａは４、５または６であり、ｂは２、３または４であり、ｃは３、４、５、６または７であり、Ｌは
であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、ｖは０または１であり、ｑは１、２、３または４であり、ｑ２は１または２である］
いくつかの態様において、式Ｉ－Ａ’’のイオン化脂質中、ｖは０であり、ｑは１、２または３であり、ａ、ｂおよびｃの合計は１２である。いくつかの態様において、式Ｉ－Ａ’’のイオン化脂質中、ｖは１であり、ｑは３または４であり、ａ、ｂおよびｃの合計は１２である。いくつかの態様において、Ｒ１０およびＲ１２は、式Ｉ－Ａ’’のイオン化脂質中、独立して、メチル、エチル、およびプロピルから選択され、それぞれ、任意選択により単一のヒドロキシルで置換されている。いくつかの態様において、ａ、ｂおよびｃの合計は１２であり、Ｒ１０およびＲ１２は、独立して、メチル、エチル、－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨ、および－（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨから選択される。
本開示の別の態様は、式ＩＩの化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
［式中、Ｒは、上で示した構造の１つのジアルキルアミノ基を含む置換基であり、２つの脂肪アシル基は１６～１８個の炭素を有し、少なくとも２つのメチレン基によって分離された２つのオレフィンを含有する］
いくつかの実施形態において、２つの脂肪アシル基は１６個の炭素を有する。いくつかの実施形態において、２つの脂肪アシル基は１７個の炭素を有する。いくつかの実施形態において、２つの脂肪アシル基は１８個の炭素を有する。
本開示の別の態様は、式ＩＩ－Ａの化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
［式中、ａは１、２、３、４、５または６であり、ｂは２、３または４であり、ｃは４、５、６、７または８であり、Ｒ２は
であり、ｑおよびｑ’はそれぞれ、独立して１または２であり、Ｒ１０およびＲ１２はそれぞれ、メチルまたはエチルである］
いくつかの態様において、式Ｉ－Ａのイオン化脂質中、ａ、ｂおよびｃの合計は１１または１３である。いくつかの態様において、式Ｉ－Ａのイオン化脂質は、以下のうちの１つ以上によって特徴付けられる：ａは１、２または３である、ｑは２である、ｑ’は１である、およびＲ１０またはＲ１２の少なくとも１つはエチルである。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ａのイオン化脂質中、ｂは４である。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ａのイオン化脂質中、ａは４であり、ｂは４であり、ｃは４である。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ａのイオン化脂質中、ａは１であり、ｂは４であり、ｃは８である。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ａのイオン化脂質中、ａは２であり、ｂは４であり、ｃは５である。
本開示の別の態様は、式ＩＩ－Ａ’の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
［式中、ａは１、２または３であり、ｂは２、３または４であり、ｃは４、５、６、７または８であり、Ｒ２は
であり、ｑおよびｑ’はそれぞれ、独立して１または２であり、Ｒ１０およびＲ１２はそれぞれ、メチルまたはエチルである］
いくつかの態様において、式Ｉ－Ａ’のイオン化脂質中、ａ、ｂおよびｃの合計は１１または１３である。いくつかの態様において、式Ｉ－Ａのイオン化脂質は、以下のうちの１つ以上によって特徴付けられる：ｑは２である、ｑ’は１である、およびＲ１０またはＲ１２の少なくとも１つはエチルである。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ａ’のイオン化脂質中、ｂは４である。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ａ’のイオン化脂質中、ａは４であり、ｂは４であり、ｃは４である。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ａ’のイオン化脂質中、ａは１であり、ｂは４であり、ｃは８である。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ａ’のイオン化脂質中、ａは２であり、ｂは４であり、ｃは５である。
本開示の別の態様は、式ＩＩ－Ｂの化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
［式中、ａは５、６または７であり、ｃは３、４または５であり、Ｒ２は
であり、ｑおよびｑ’はそれぞれ、独立して１または２であり、Ｒ１０およびＲ１２はそれぞれ、メチルまたはエチルである］
いくつかの態様において、式Ｉ－Ｂのイオン化脂質中、ａおよびｃの合計は９または１１である。いくつかの態様において、式Ｉ－Ｂのイオン化脂質は、以下のうちの１つ以上によって特徴付けられる：ｑは２である、ｑ’は１である、およびＲ１０またはＲ１２の少なくとも１つはエチルである。いくつかの態様において、式Ｉ－Ｂのイオン化脂質は、以下のうちの１つ以上によって特徴付けられる：ｑは１である、ｑ’は２である、ならびにＲ１０およびＲ１２はそれぞれメチルである。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ｂのイオン化脂質中、ｃは４である。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ｂのイオン化脂質中、ａは５または７であり、ｃは４である。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ｂのイオン化脂質中、ａは５であり、ｃは４である。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ｂのイオン化脂質中、ａは７であり、ｃは４である。
本開示の別の態様は、式ＩＩ－Ｂ’の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
［式中、ａは５または７であり、ｃは３または４であり、Ｒ２は
であり、ｑおよびｑ’はそれぞれ、独立して１または２であり、Ｒ１０およびＲ１２はそれぞれ、メチルである］
いくつかの態様において、式Ｉ－Ｂ’のイオン化脂質中、ａおよびｃの合計は９または１１である。いくつかの態様において、式Ｉ－Ｂ’のイオン化脂質中、ｃは４である。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ｂ’のイオン化脂質中、ａは５または７であり、ｃは４である。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ｂのイオン化脂質中、ａは５であり、ｃは４である。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ｂ’のイオン化脂質中、ａは７であり、ｃは４である。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ｂのイオン化脂質中、ａは５であり、ｃは３である。いくつかの態様において、式ＩＩ－Ｂ’のイオン化脂質中、ａは７であり、ｃは３である。
本開示の別の態様は、式ＩＩＩの化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
［式中、Ｙはメチルまたはエチル基であり、
２つの脂肪アシル基は、１６～１８個の炭素を有し、かつ単一のオレフィンを含有するジスルフィド脂肪アシル基である］
いくつかの実施形態において、２つの脂肪アシル基は１６個の炭素を有する。いくつかの実施形態において、２つの脂肪アシル基は１７個の炭素を有する。いくつかの実施形態において、２つの脂肪アシル基は１８個の炭素を有する。
本開示の別の態様は、式ＩＩＩ－Ａの化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
［式中、ａは５、６または７であり、ｃは３、４または５であり、ｑは２または３であり、Ｒ１０およびＲ１２はメチルまたはエチルである］
いくつかの態様において、イオン化脂質は、ａが５または７である、式ＩＩＩ－Ａの化合物を含むことができる。いくつかの態様において、イオン化脂質は、ａおよびｃの合計が８、９または１０である、式Ａの２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。
本開示の別の態様は、式ＩＩＩ－Ａ’の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
［式中、ａは５または７であり、ｃは３、４または５であり、ｑは２または３であり、Ｒ１０およびＲ１２はメチルまたはエチルである］
いくつかの態様において、イオン化脂質は、ｃが３である、２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。いくつかの態様において、イオン化脂質は、ａおよびｃの合計が８または１０である、式ＩＩＩ－Ａ’の２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。いくつかの態様において、イオン化脂質は、ｑが２であり、ａおよびｃの合計が８または１０である、式ＩＩＩ－Ａ’の２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。いくつかの態様において、イオン化脂質は、ｑが２であり、Ｒ１０およびＲ１２がそれぞれメチルであり、ａおよびｃの合計が８または１０である、式ＩＩＩ－Ａ’の２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。いくつかの態様において、イオン化脂質は、ｑが２であり、Ｒ１０およびＲ１２がそれぞれメチルであり、ｃが３である、式ＩＩＩ－Ａ’の２つのポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖を含むことができる。
いくつかの実施形態において、式Ｉ～ＩＩＩ中の化合物は、６～７のｐＫａを有する。いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子組成物は、脂質および核酸を含み、脂質性ナノ粒子は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの化合物、これらの組合せ、またはこれらの薬学的に許容される塩を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、式（ＩＶ）：
の構造を有するイオン化脂質またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｙは
であり、各Ｒ２２は、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはヘテロアルキルであり、それぞれ、任意選択によりＲＢで置換されて、各ＲＢは、独立して、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、シクロアルキル、またはヘテロシクリルであり、ｎは１～１０の整数（両端を含む）であり、
は結合点を示す。
いくつかの実施形態において、Ｙは
である。
いくつかの実施形態において、式ＩＶの化合物は、６～７のｐＫａを有する。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ－Ａ）：
の１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ａ、式Ａ’、式Ａ’’または式Ａ’’’のポリエン炭化水素鎖であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中のＲ１０およびＲ１２は、独立して、メチル、エチル、－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨおよび－（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨから選択される。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ－Ａ）；
の１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ａ、式Ａ’、式Ａ’’または式Ａ’’’または式Ｂのポリエン炭化水素鎖であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中のＲ１０およびＲ１２は、独立して、メチル、エチル、－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨおよび－（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨから選択される。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ－Ａ）：
の１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ａ、式Ａ’、式Ａ’’または式Ａ’’’または式Ｂのポリエン炭化水素鎖であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中のＲ１０およびＲ１２は、独立して、メチル、エチル、－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨおよび－（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨから選択される。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ－Ａ）：
の１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ａ、式Ａ’、式Ａ’’または式Ａ’’’または式Ｂのポリエン炭化水素鎖であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中のＲ１０およびＲ１２は、独立して、メチル、エチル、－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨおよび－（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨから選択される。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、式（ＩＶ－Ａ）：
の１つ以上のポリ不飽和ポリエン炭化水素鎖またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｙは
であり、ｎは２、３または４の整数であり、Ｒ２２は、式Ａ、式Ａ’、式Ａ’’または式Ａ’’’または式Ｂのポリエン炭化水素鎖であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである。いくつかの態様において、式（ＩＶ－Ａ）中のＲ１０およびＲ１２は、独立して、メチル、エチル、－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨおよび－（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨから選択される。
いくつかの実施形態において、化合物は、表１または表２に列挙した化合物の構造を有する。
表１Ａは、カチオン性脂質の例を示す。表２は、生体還元性カチオン性脂質の例を示す。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、核酸をカプセル化する。いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、ＬＮＰ製剤中に核酸をカプセル化する。いくつかの実施形態において、核酸はｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、核酸はｍＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、核酸はＤＮＡ分子である。
いくつかの実施形態において、高度に特異的な手法で脂質ナノ粒子を樹状細胞に標的化するために細胞表面受容体に対する抗体複合体などのリガンドをさらに含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、標的リガンドをさらに含み、この標的リガンドは、ナノ粒子の外側に配向される。いくつかの実施形態において、標的リガンドは抗体である。
いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子は、水性媒体中にある。
いくつかの実施形態において、核酸は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの化合物またはこれらの組合せを含めた本明細書中で開示する化合物と共に脂質性ナノ粒子中に封入され、核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかである。いくつかの実施形態において、核酸は、式Ｉ、Ｉ－Ａ、ＩＩ、ＩＩ－Ａ、ＩＩ－Ｂ、ＩＩＩ、ＩＩＩ－Ａ、ＩＶ、ＩＶ－Ａ、ＩＶ－Ｂ、Ｖ、Ｖ－Ａ、ＶＩ－Ａ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩの化合物またはこれらの組合せを含めた本明細書中で開示する化合物と共に脂質性ナノ粒子中に封入され、核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかである。いくつかの実施形態において、核酸はｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸はｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸はＤＮＡである。
いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子は、ホスファチジルコリンおよびステロールを含む膜を含む。いくつかの実施形態において、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子は、ホスファチジルコリン、イオン化カチオン性脂質（ＩＣＬ）を含む膜を含む。いくつかの実施形態において、ＩＣＬは、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの構造、およびコレステロールを有し、膜は、脂質性ナノ粒子の内側と水性媒体とを分離する。いくつかの実施形態において、ＩＣＬは、表１Ａおよび表２に示す構造を有する。いくつかの実施形態において、ＩＣＬは、表１Ｂに示す構造を有する。いくつかの実施形態において、ホスファチジルコリンは、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）または硬化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）である。いくつかの実施形態において、イオン化カチオン性脂質とコレステロールとのモル比は、約６５：３５～４０：６０である。いくつかの実施形態において、ＩＣＬとコレステロールとのモル比は、約６０：４０～約４５：５５である。
いくつかの実施形態において、ホスファチジルコリンとコレステロールとのモル比は、約１：５～約１：２である。
いくつかの実施形態において、膜は、ポリマー複合脂質をさらに含む。
いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子は、ＩＣＬ、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびポリマー複合脂質を、約４９．５：１０．３：３９．６：２．５モル比で含む。
いくつかの実施形態において、ポリマー複合脂質は、ＰＥＧ（２０００）－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）またはＰＥＧ（分子量２，０００）－ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＭＰＥ）である。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質の酸化的分解生成物のパーセンテージは、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡまたはＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ対照製剤の５０％未満である。
いくつかの実施形態において、組成物は、非経口投与用の液体医薬製剤である。
いくつかの実施形態において、組成物は、皮下、筋肉内、または皮内投与用の液体医薬製剤である。
いくつかの実施形態において、組成物は、凍結乾燥粉末の形態にあり、投与前に、後続して水性媒体によって再構成される。
本開示の他の態様は、細菌またはウイルス感染症を予防する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書で提供する組成物を投与し、免疫応答を生じさせることを含む、方法に関する。いくつかの実施形態は、それを必要とする対象に予防接種をする方法であって、抗原タンパク質をコードする核酸を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、組成物は、皮下、筋肉内、または皮内投与される。
いくつかの実施形態において、細菌感染症は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染症である。いくつかの実施形態において、細菌感染症は、非結核性マイコバクテリウム属（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の形態にある。
いくつかの実施形態において、ウイルス感染症は、コロナウイルスである。いくつかの実施形態において、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
いくつかの実施形態において、ウイルス感染症はＨＩＶ／ＡＩＤｓである。
いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子は、非経口投与される。
いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子組成物は、単回投与の一部として投与される。
本開示は、核酸、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ成分、例えばガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓタンパク質）ならびに脂質を含む脂質ナノ粒子を特徴とする。例示的脂質は、イオン化カチオン性脂質（ＩＣＬ）、リン脂質、ステロール脂質、アルキレングリコール脂質（例えば、ポリエチレングリコール脂質）、スフィンゴ脂質、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、プレノール脂質、糖脂質、脂肪酸、およびポリケチドを含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、単一のタイプの脂質を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、複数の（例えば、２種以上の）脂質を含む。ＬＮＰは、イオン化カチオン性脂質、リン脂質、ステロール、またはアルキレングリコール脂質（例えば、ポリエチレングリコール脂質）の１つ以上を含みうる。
一実施形態において、ＬＮＰは、イオン化カチオン性脂質を含む。本明細書で使用される場合、「イオン化カチオン性脂質」、「イオン化脂質」および「ＩＣＬ」は、区別なく用いられる。ＩＣＬは、特定の条件（例えば、生理的条件下で、例えば、特定のｐＨ範囲にある）下で電荷（例えば、正電荷、例えばカチオン性脂質）を持つことができるイオン化部分を含む脂質である。イオン化部分は、アミン、好ましくは置換アミンを含んでもよい。イオン化脂質は、カチオン性脂質であってもアニオン性脂質であってもよい。イオン化部分に加えて、イオン化脂質は、例えば、６個超の炭素原子の長さ（例えば、約８個超の炭素、１０個の炭素、１２個の炭素、１４個の炭素、１６個の炭素、１８個の炭素、２０個以上の炭素の長さ）のアルキルまたはアルケニル基を含有しうる。本明細書に記載のＬＮＰ中に含まれうる追加のイオン化脂質は、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．５１：８５２９－８５３３（２０１２）），Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１７２－１７６（２０１０））、ならびに米国特許第８，７１０，２００号および同第８，７５４，０６２号に開示されており、それぞれ、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、式（ＩＶ）：
の構造を有するイオン化脂質またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｙは
であり、各Ｒ２２は、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはヘテロアルキルであり、これらはそれぞれ、任意選択によりＲＢで置換され、各ＲＢは、独立して、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、シクロアルキル、またはヘテロシクリルであり、ｎは１～１０（両端を含む）の整数であり、
は結合点を示す。
いくつかの実施形態において、Ｙは
である。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、式（ＩＶ－Ａ）の構造を有するイオン化脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。
［式中、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれは、独立して、任意選択によりヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、ｖは０または１であり、ｑ１は１または２であり、Ｙは
であり、Ｒ２２は
であり、ａは１、２、３、４または５であり、ｃは４、５、６、７または８である］
いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物のｖは０に等しい。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物のｖは１に等しい。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ａ）の化合物のｖは１に等しく、ｑ１は１に等しい。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物のｖは１に等しく、ｑ１は２に等しい。
いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物のＲ２２中、ａおよびｃの合計は６、７、８または９である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物のＲ２２中、ａおよびｃの合計は６である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物のＲ２２中、ａおよびｃの合計は７である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物のＲ２２中、ａおよびｃの合計は９である。
いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物のＲ２２中、ｖは０に等しく、ａおよびｃの合計は６、７、８または９である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物のＲ２２中、ｖは０に等しく、ａおよびｃの合計は６である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物のＲ２２中、ｖは０に等しく、ａおよびｃの合計は７である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物のＲ２２中、ｖは０に等しく、ａおよびｃの合計は９である。
いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、Ｒ１０およびＲ１２は、独立して、メチル、エチル、－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨ、および－（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨから選択される。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物のＲ２２中、Ｒ１０およびＲ１２は、それぞれメチルであり、ａおよびｃの合計は６、７、８または９である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物のＲ２２中、Ｒ１０およびＲ１２は、それぞれメチルであり、ｖは０であり、ａおよびｃの合計は６、７、８または９である。
いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは０に等しく、Ｒ２２は
である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは０に等しく、Ｒ２２は
であり、ａおよびｃの合計は８である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは０に等しく、Ｒ２２は
であり、ａは１であり、ｃは７である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは０に等しく、Ｒ２２は
であり、ａは２であり、ｃは４である。
いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは１に等しく、Ｒ２２は
である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは１に等しく、Ｒ２２は
であり、ａおよびｃの合計は８である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは１に等しく、Ｒ２２は
であり、ａは１であり、ｃは７である。
いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは０に等しく、Ｒ２２は
である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは０に等しく、Ｒ２２は
であり、ａおよびｃの合計は７または９である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは０に等しく、Ｒ２２は
であり、ａは４であり、ｃは５である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは０に等しく、Ｒ２２は
であり、ａは１であり、ｃは８である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは０に等しく、Ｒ２２は
であり、ａは２であり、ｃは５である。
いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは０に等しく、Ｒ２２は
である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは０に等しく、Ｒ２２は
であり、ａおよびｃの合計は７または９である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは０に等しく、Ｒ２２は
であり、ａは４であり、ｃは５である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは０に等しく、Ｒ２２は
であり、ａは１であり、ｃは８である。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－Ｂ）の化合物では、ｖは０に等しく、Ｒ２２は
であり、ａは２であり、ｃは５である。
ＬＮＰは、例えばＬＮＰの総脂質含有量の約０．１モル％超の濃度のイオン化脂質を含んでもよい。一実施形態において、ＬＮＰは、例えばＬＮＰの総脂質含有量の約１モル％、約２モル％、約４モル％、約８モル％、約２０モル％、約４０モル％、約５０モル％、約６０モル％、約８０モル％超の濃度のイオン化脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、約２０モル％、約４０モル％、または約５０モル％超の濃度のイオン化脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、例えばＬＮＰの総脂質含有量の約１モル％～約９５モル％の濃度のイオン化脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、例えばＬＮＰの総脂質含有量の約２モル％～約９０モル％、約４モル％～約８０モル％、約１０モル％～約７０モル％、約２０モル％～約６０モル％、約４０モル％～約５５モル％の濃度のイオン化脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、約２０モル％～約６０モル％の濃度のイオン化脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、約４０モル％～約５５モル％の濃度のイオン化脂質を含む。
一実施形態において、ＬＮＰはリン脂質を含む。リン脂質は、ホスフェート基および少なくとも１つのアルキル、アルケニル、またはヘテロアルキル鎖を含む脂質である。リン脂質は、天然であっても非天然（例えば、合成リン脂質）であってもよい。リン脂質は、アミン、アミド、エステル、カルボキシル、コリン、ヒドロキシル、アセタール、エーテル、炭水化物、ステロール、またはグリセロールを含んでもよい。いくつかの実施形態において、リン脂質は、ホスホコリン、ホスホスフィンゴ脂質、またはプラズマロゲンを含んでもよい。例示的リン脂質としては、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、硬化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１－ミリストイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＭＯＰＣ）、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、１－パルミトイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１－ステアロイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＭＰＣ）、ビス（モノアシルグリセロール）ホスフェート（ＢＭＰ）、Ｌ－α－ホスファチジルコリン、１，２－ジヘプタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルコリン（ＤＨＤＰＣ）、および１－ステアロイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＡＰＣ）が挙げられる。本明細書に記載のＬＮＰに含まれうる追加のリン脂質は、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＬｉ，Ｊ． ｅｔ ａｌ．（Ａｓｉａｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０：８１－９８（２０１５））で開示されている。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、式（Ｖ）：
の構造を有するリン脂質またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、各Ｒ２３は、独立して、アルキル、アルケニル、またはヘテロアルキルであり、各アルキル、アルケニル、またはヘテロアルキルは、任意選択によりＲＣで置換され、各Ｒ２５は、独立して、水素またはアルキルであり、Ｒ２４は、存在しないか、水素またはアルキルであり、各ＲＣは、独立して、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、シクロアルキル、またはヘテロシクリルであり、ｍは１～４（両端を含む）の整数であり、ｕは２または３である。
いくつかの実施形態において、各Ｒ２３は、独立して、アルキル（例えば、Ｃ２～Ｃ３２アルキル、Ｃ４～Ｃ２８アルキル、Ｃ８～Ｃ２４アルキル、Ｃ１２～Ｃ２２アルキル、またはＣ１６～Ｃ２０アルキル）である。いくつかの実施形態において、各Ｒ２３は、独立して、アルケニル（例えば、Ｃ２～Ｃ３２アルキル、Ｃ４～Ｃ２８アルケニル、Ｃ８～Ｃ２４アルケニル、Ｃ１２～Ｃ２２アルケニル、またはＣ１６～Ｃ２０アルケニル）である。いくつかの実施形態において、各Ｒ２３は、独立して、ヘテロアルキル（例えば、Ｃ４～Ｃ２８ヘテロアルキル、Ｃ８～Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ１２～Ｃ２２ヘテロアルキル、Ｃ１６～Ｃ２０ヘテロアルキル）である。いくつかの実施形態において、各Ｒ２３は、独立して、Ｃ１６～Ｃ２０アルキルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２３は、独立して、Ｃ１７アルキルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２３は、独立してヘプタデシルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２３は同一である。いくつかの実施形態において、各Ｒ２３は異なる。いくつかの実施形態において、各Ｒ２３は、任意選択によりＲＣで置換されている。いくつかの実施形態において、ＲＣは、独立して、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、シクロアルキル、またはヘテロシクリルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ２５の１つは水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ２５の１つはアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ２５の１つはメチルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２５は、独立してアルキルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２５は、独立してメチルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２５は、独立してメチルであり、ｕは２である。いくつかの実施形態において、各Ｒ２５は、独立してメチルであり、ｕは３である。
いくつかの実施形態において、Ｒ２４は存在せず、それが結合される酸素は負電荷を帯びている。いくつかの実施形態において、Ｒ２４は水素である。
いくつかの実施形態において、ｍは、１～１０、１～８、１～６、１～４の整数である。いくつかの実施形態において、ｍは、１、２、３または４である。いくつかの実施形態において、ｍは１である。いくつかの実施形態において、ｍは２である。いくつかの実施形態において、ｍは３である。
いくつかの実施形態において、カチオン性イオン化脂質およびアニオン性リン脂質の両方の標的化部分を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、アニオン性リン脂質は、式（Ｖ－Ａ）の組成物である。
［式中、ａは１４または１６であり、ｚは、アミド、グリコール、またはアミジル－アルキル－カルボン酸部分である］
いくつかの実施形態において、Ｚは
であり、式中、ｍは２または３である。いくつかの実施形態において、アニオン性リン脂質標的化部分は、ＤＳＰＳ（Ｌ異性体）、ＤＰＰＳ（Ｌ異性体）、ＤＭＰＳ（Ｌ異性体）、ＤＯＰＳ（Ｌ異性体）、ＤＳＰＳ（Ｄ異性体）、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＧ、Ｎ－Ｇｌｕ－ＤＳＰＥ、およびＮ－Ｓｕｃ－ＤＳＰＥからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、リン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。いくつかの実施形態において、リン脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）である。いくつかの実施形態において、リン脂質は、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）である。いくつかの実施形態において、リン脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
ホスファチジルセリンの取り込み
ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載の）は、以下の成分：（ｉ）約１モル％～約９５モル％（またはこれらの間の任意の値、例えば、約２０モル％～約８０モル％）の濃度でＣ１６アルキルもしくはＣ１６アルケニル基またはＣ１８アルキルもしくはＣ１８アルケニル基を含有するイオン化カチオン性脂質（ＩＣＬ）；（ｉｉ）０．１モル％～約２０モル％（またはこれらの間の任意の値、例えば、約２．５モル％～約１０モル％）の濃度の、Ｃ１６またはＣ１８アルキルまたはアルケニル基も含有するリン脂質；（ｉｉｉ）約１モル％～約９５モル％（またはこれらの間の任意の値、例えば、約２０モル％～約８０モル％）の濃度のコレステロール；（ｉｖ）ＬＮＰの総脂質含有量の約０．５モル％～約２０モル％、約２．５モル％～約１０モル％、約４モル％～約８モル％、またはこれらの間の任意の値の濃度の、ＬＮＰ脂質製剤に添加されたホスファチジルセリン（ＰＳ）またはホスファチジルグリセロール（ＰＧ）；（ｖ）約０．１モル％～約５モル％（これらの間の任意の値、例えば約１モル％～約２．５モル％）の濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－２０００含有脂質（例えば、ＤＰＧ－ＰＥＧ２０００、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）の１つ以上を含んでもよい。一実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）～（ｖ）のうちの２つを含む。一実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）～（ｖ）のうちの３つを含む。一実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）～（ｖ）のうちの４つを含む。一実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）～（ｖ）のそれぞれを含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）および（ｉｉ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）および（ｉｉｉ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）および（ｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉ）および（ｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉｉ）および（ｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）～（ｖ）のうちの４つからなる、またはから本質的になる。一実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）～（ｖ）のそれぞれからなる、またはから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）および（ｉｉ）からなる、またはから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）および（ｉｉｉ）からなる、またはから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）および（ｖ）からなる、またはから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）からなる、またはから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉ）および（ｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）からなる、またはから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉｉ）および（ｖ）からなる、またはから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）からなる、またはから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖ）からなる、またはから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）からなる、またはから本質的になる。
ＬＮＰは、例えば、ＬＮＰの総脂質含有量の約０．１モル％超の濃度のリン脂質を含んでもよい。一実施形態において、ＬＮＰは、例えば、ＬＮＰの総脂質含有量の約０．５モル％、約１モル％、約１．５モル％、約２モル％、約３モル％、約４モル％、約５モル％、約６モル％、約８モル％、約１０モル％、約１２モル％、約１５モル％、約２０モル％、約５０モル％超の濃度のリン脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、約１モル％、約５モル％、または約１０モル％超の濃度のリン脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、例えば、ＬＮＰの総脂質含有量の約０．１モル％～約５０モル％の濃度のリン脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、例えば、ＬＮＰの総脂質含有量の約０．５モル％～約４０モル％、約１モル％～約３０モル％、約５モル％～約２５モル％、約１０モル％～約２０モル％、約１０モル％～約１５モル％、または約１５モル％～約２０モル％の濃度のリン脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、約５モル％～約２５モル％の濃度のリン脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、約１０モル％～２０モル％の濃度のリン脂質を含む。
一実施形態において、ＬＮＰは、ステロールまたはイオン化ステロール分子を含む。ステロールは、多環構造および任意選択のヒドロキシルまたはエーテル置換基を含む脂質であって、天然でも非天然（例えば、合成ステロール）でもよい脂質である。ステロールは、二重結合を含まなくても、単一の二重結合を含んでも、複数の二重結合を含んでもよい。ステロールは、アルキル、アルケニル、ハロ、エステル、ケトン、ヒドロキシル、アミン、ポリエーテル、炭水化物、または環状部分をさらに含んでもよい。ステロールは、ジアルキルアミノ基と分子の多環部分との間に生体還元性ジスルフィド結合をさらに含有してもよい（表２）、化合物３５～３８を参照）。ステロールの例示的なリストには、コレステロール、デヒドロエルゴステロール、エルゴステロール、カンペステロール、β－シトステロール、スチグマステロール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ブラシカステロール、ラソステロール、チモステロール、７－デヒドロデスモステロール、アベナステロール、カンペスタノール、ルペオール、およびシクロアルテノールが含まれる。いくつかの実施形態において、ステロールは、コレステロール、デヒドロエルゴステロール、エルゴステロール、カンペステロール、β－シトステロール、またはスチグマステロールを含む。本明細書に記載のＬＮＰに含まれうる追加のステロールは、Ｆａｈｙ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．４６：８３９－８６２（２００５）に開示されている。
イオン化ステロール
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、式（ＶＩ）：
の構造を有するステロールまたはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｒ２６は、水素、アルキル、ヘテロアルキル、または－Ｃ（Ｏ）ＲＤであり、Ｒ２７は、水素、アルキル、または－ＯＲＥであり、ＲＤおよびＲＥのそれぞれは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールであり、各アルキル、アルケニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールは、任意選択により、アルキル、ハロ、またはカルボニルで置換され、各
は単結合または二重結合のいずれかであり、単結合または二重結合に関与する各炭素原子は、０、１、または２個の水素に結合され、原子価が認められる。
いくつかの実施形態において、
の１つは単結合である。いくつかの実施形態において、
の１つは二重結合である。いくつかの実施形態において、
の２つは単結合である。いくつかの実施形態において、
の２つは二重結合である。いくつかの実施形態において、各
は単結合である。いくつかの実施形態において、各
は二重結合である。
いくつかの実施形態において、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態において、ステロールはデヒドロエルゴステロールである。いくつかの実施形態において、ステロールはエルゴステロールである。いくつかの実施形態において、ステロールはカンペステロールである。いくつかの実施形態において、ステロールはβ－シトステロールである。いくつかの実施形態において、ステロールはスチグマステロールである。いくつかの実施形態において、ステロールはコルチコステロイド（例えば、コルチコステロン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、またはアルドステロン）である。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、式（ＶＩ－Ａ）：
の構造を有するステロールまたはその薬学的に許容される塩を含み、式中、ｑは３または４であり、Ｒ３は
である。
本開示の別の態様は、式（Ｖ－Ａ）のアニオン性リン脂質および式（ＶＩＩＩ）の分岐状イオン化脂質を含む組成物を提供する。
［式中、ｄは２、３または４であり、ｅおよびｆは、それぞれ独立して、５、６または７であり、Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立して、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－または－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－であり、Ｒ１４およびＲ１５は、それぞれ独立して、直鎖状または分岐状（Ｃ１０～Ｃ２０）アルキルである］
いくつかの態様において、式ＶＩＩ中のＲ１４およびＲ１５は、それぞれ、Ｃ１４またはＣ１６分岐状アルキルである。いくつかの態様において、Ｒ１４はＣ１１直鎖状アルキルであり、Ｒ１５はＣ１４またはＣ１６分岐状アルキルである。いくつかの態様において、式ＶＩＩ中のＲ１４は、Ｃ１１直鎖状アルキルであり、Ｒ１５はＣ１４またはＣ１６直鎖状アルキルである。いくつかの態様において、式ＶＩＩ中のＲ１４および／またはＲ１５は、それぞれ独立して
であり、式中、ｇおよびｈは、それぞれ独立して、５、６または７である。いくつかの態様において、式ＶＩＩ中のＲ１４およびＲ１５は、それぞれ独立して
であり、式中、ｇおよびｈは両方とも同一であり、５、６または７である。いくつかの態様において、式ＶＩＩ中のＲ１４は直鎖状Ｃ１１アルキルであり、式ＶＩＩ中のＲ１５は
であり、式中、ｇおよびｈは両方とも同一であり、５、６または７である。
いくつかの実施形態において、イオン化脂質は、ＡＬＣ－０３１５およびＳＭ－１０２から選択される分岐状イオン化脂質であってもよい。
ＬＮＰは、例えば、ＬＮＰの総脂質含有量の約０．１モル％超の濃度のステロールを含んでもよい。一実施形態において、ＬＮＰは、例えば、ＬＮＰの総脂質含有量の約０．５モル％、約１モル％、約５モル％、約１０モル％、約１５モル％、約２０モル％、約２５モル％、約３５モル％、約４０モル％、約４５モル％、約５０モル％、約５５モル％、約６０モル％、約６５モル％、または約７０モル％超の濃度のステロールを含む。一実施形態において、ＬＮＰは、約１０モル％、約１５モル％、約２０モル％、または約２５モル％超の濃度のステロールを含む。一実施形態において、ＬＮＰは、例えば、ＬＮＰの総脂質含有量の約１モル％～約９５モル％の濃度のステロールを含む。一実施形態において、ＬＮＰは、例えば、ＬＮＰの総脂質含有量の約５モル％～約９０モル％、約１０モル％～約８５モル％、約２０モル％～約８０モル％、約２０モル％～約６０モル％、約２０モル％～約５０モル％、または約２０モル％～４０モル％の濃度のステロールを含む。一実施形態において、ＬＮＰは、約２０モル％～約５０モル％の濃度のステロールを含む。一実施形態において、ＬＮＰは、約３０モル％～約６０モル％の濃度のステロールを含む。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、アルキレングリコール含有脂質を含む。アルキレングリコール含有脂質は、少なくとも１つのアルキレングリコール部分、例えば、メチレングリコールまたはエチレングリコール部分を含む脂質である。いくつかの実施形態において、アルキレングリコール含有脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。アルキレングリコール含有脂質は、ＰＥＧ含有脂質であってもよい。ポリマー複合脂質は、ポリ（エチレングリコール）共役（ペグ化）リン脂質（ＰＥＧ－脂質）、例えばＰＥＧ（分子量２，０００）メトキシ－ポリ（エチレングリコール）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ（分子量２，０００）メトキシ－ポリ（エチレングリコール）－１，２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロール（ＰＥＧ－ＤＰＧ）、ＰＥＧ（分子量２，０００）１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）またはＮ－パルミトイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝（ＰＥＧ－セラミド）を含みうる。ＰＥＧ－脂質成分中のＰＥＧ部分の分子量はまた、５００～１０，０００ｇ／ｍｏｌ、１，５００～６０００ｇ／ｍｏｌで変動しうるが、好ましくは約２，０００ＭＷである。脂質アンカーへの共役に使用される他のポリマーには、ポリ（２－メチル－２－オキサゾリン）（ＰＭＯＺ）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ポリ－Ｎ－ビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリグリセロール、ポリ（ヒドロキシエチルＬ－アスパラギン）（ＰＨＥＡ）、およびポリ（ヒドロキシエチルＬ－グルタミン）（ＰＨＥＧ）が含まれうる。
ＰＥＧ含有脂質は、アミン、アミド、エステル、カルボキシル、ホスフェート、コリン、ヒドロキシル、アセタール、エーテル、複素環、または炭水化物をさらに含んでもよい。ＰＥＧ含有脂質は、例えば、ＰＥＧ部分に加えて、例えば、６個超の炭素原子の長さ（例えば、約８個超の炭素、１０個の炭素、１２個の炭素、１４個の炭素、１６個の炭素、１８個の炭素、２０個以上の炭素の長さ）の、少なくとも１つのアルキル基またはアルケニル基を含んでもよい。一実施形態において、ＰＥＧ含有脂質は、少なくとも２０個のＰＥＧモノマー、例えば、少なくとも３０個のＰＥＧモノマー、４０個のＰＥＧモノマー、４５個のＰＥＧモノマー、５０個のＰＥＧモノマー、１００個のＰＥＧモノマー、２００個のＰＥＧモノマー、３００個のＰＥＧモノマー、５００個のＰＥＧモノマー、１０００個のＰＥＧモノマー、または２０００個のＰＥＧモノマーを含むＰＥＧ部分を含む。例示的ＰＥＧ含有脂質としては、ＰＥＧ－ＤＭＧ（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）、ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＳＧ、ＰＥＧ－ＤＰＧ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＥ、ＰＥＧ－ＤＯＰＥ、およびＰＥＧ－ＤＬＰＥが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－脂質としては、ＰＥＧ－ＤＭＧ（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）、ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＳＧ、およびＰＥＧ－ＤＰＧが挙げられる。本明細書に記載のＬＮＰ中に含まれうる追加のＰＥＧ－脂質は、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＦａｈｙ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．４６：８３９－８６２（２００５）に開示されている。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、式（ＶＩＩ）：
の構造を有するアルキレングリコール含有脂質またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、各Ｒ２８は、独立して、アルキル、アルケニル、またはヘテロアルキルであり、それぞれ、任意選択によりＲＦで置換され、Ａは、存在しないか、Ｏ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）、またはＮＨであり、Ｅは、存在しないか、アルキル、またはヘテロアルキルであり、アルキルまたはヘテロアルキルは任意選択によりカルボニルで置換され、各ＲＦは、独立して、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、シクロアルキル、またはヘテロシクリルであり、ｚは１０～２００（両端を含む）の整数である。
いくつかの実施形態において、各Ｒ２８は、独立して、アルキルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２８は、独立して、ヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２８は、独立して、アルケニルである。
いくつかの実施形態において、ＡはＯまたはＮＨである。いくつかの実施形態において、ＡはＣＨ２である。いくつかの実施形態において、Ａはカルボニルである。いくつかの実施形態において、Ａは存在しない。
いくつかの実施形態において、Ｅはアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｅはヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、ＡおよびＥは両方とも存在しない。いくつかの実施形態において、Ａは存在しない。いくつかの実施形態において、Ｅは存在しない。いくつかの実施形態において、ＡまたはＥのいずれか片方は存在しない。いくつかの実施形態において、ＡおよびＥの両方は、独立して、存在しない。
いくつかの実施形態において、ｚは、１０～２００（例えば、２０～１８０、２０～１６０、２０～１２０、２０～１００、４０～８０、４０～６０、４０～５０）の整数である。いくつかの実施形態において、ｚは４５である。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－脂質は、α－（３’－｛［１，２－ジ（ミリスチルオキシ）プロパノキシ］カルボニルアミノ｝プロピル）－ω－メトキシ、ポリオキシエチレン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＧ）である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－脂質はＰＥＧ－ＤＳＧである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－脂質はＰＥＧ－ＤＰＧである。
ＬＮＰは、例えば、ＬＮＰの総脂質含有量の約０．１モル％超の濃度のアルキレングリコール含有脂質を含んでもよい。一実施形態において、ＬＮＰは、例えば、ＬＮＰの総脂質含有量の約０．５モル％、約１モル％、約１．５モル％、約２モル％、約３モル％、約４モル％、約５モル％、約６モル％、約８モル％、約１０モル％、約１２モル％、約１５モル％、約２０モル％、約５０モル％超の濃度のアルキレングリコール含有脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、約１モル％、約４モル％、または約６モル％超の濃度のアルキレングリコール含有脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、例えば、ＬＮＰの総脂質含有量の約０．１モル％～約５０モル％の濃度のアルキレングリコール含有脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、例えば、ＬＮＰの総脂質含有量の約０．５モル％～約４０モル％、約１モル％～約３５モル％、約１．５モル％～約３０モル％、約２モル％～約２５モル％、約２．５モル％～約２０モル％、約３モル％～約１５モル％、約３．５モル％～約１０モル％、または約４モル％～約９モル％の濃度のアルキレングリコール含有脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、約４モル％～９モル％の濃度のアルキレングリコール含有脂質を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、少なくとも２種類の脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、イオン化脂質、リン脂質、ステロール、およびアルキレングリコール含有脂質のうちの２つを含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、少なくとも３種類の脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、イオン化脂質、リン脂質、ステロール、およびアルキレングリコール含有脂質のうちの３つを含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、少なくとも４種類の脂質を含む。一実施形態において、ＬＮＰは、イオン化脂質、リン脂質、ステロール、およびアルキレングリコール含有脂質のそれぞれを含む。
ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載の）は、以下の成分：（ｉ）約１モル％～約９５モル％（例えば、約２０モル％～約８０モル％）の濃度のイオン化カチオン性脂質；（ｉｉ）０．１モル％～約５０モル％（例えば、約２．５モル％～約２０モル％）の濃度のリン脂質；（ｉｉｉ）約１モル％～約９５モル％（例えば、約２０モル％～約８０モル％）の濃度のステロール；（ｉｖ）約０．１モル％～約５０モル％（例えば、約２．５モル％～約２０モル％）の濃度のＰＥＧ含有脂質のうちの１つ以上を含んでもよい。一実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）～（ｉｖ）の１つを含む。一実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）～（ｉｖ）の２つを含む。一実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）～（ｉｖ）の３つを含む。一実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）～（ｉｖ）のそれぞれを含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）および（ｉｉ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）および（ｉｉｉ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）および（ｉｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉ）および（ｉｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む。
ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載の）は、以下の成分：（ｉ）約１モル％～約９５モル％（例えば、約２０モル％～約８０モル％）の濃度のイオン化カチオン性脂質；（ｉｉ）０．１モル％～約５０モル％（例えば、約２．５モル％～約２０モル％）の濃度のＤＳＰＣ；（ｉｉｉ）約１モル％～約９５モル％（例えば、約２０モル％～約８０モル％）の濃度のコレステロール；（ｉｖ）約０．１モル％～約５０モル％（例えば、約２．５モル％～約２０モル％）の濃度のＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋのうちの１つ以上を含んでもよい。一実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）～（ｉｖ）の２つを含む。一実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）～（ｉｖ）の３つを含む。一実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）～（ｉｖ）のそれぞれを含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）および（ｉｉ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）および（ｉｉｉ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）および（ｉｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉ）および（ｉｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む。
一実施形態において、ＬＮＰは、約５０：１～約１：１（例えば、４０：１、３２：３、６：１、７：１、５：１、２４：５、２６：５、１０：３、１５：２、１６：７、１８：１、３：１、３：２、または１：１）のイオン化脂質とリン脂質との比を有する。一実施形態において、ＬＮＰは、約１５：２のイオン化脂質とリン脂質との比を有する。一実施形態において、ＬＮＰは、約５：１のイオン化脂質とリン脂質との比を有する。一実施形態において、ＬＮＰは、約１０：１～約１：１０（例えば、９：１、８：１、８：７、７：１、７：５、７：３、６：１、６：５、５：１、５：３、４：１、４：３、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、３：４、１：４、３：５、１：５、４：５、１：６、５：６、７：６、７：８、または８：９）のイオン化脂質とステロールとの比を有する。一実施形態において、ＬＮＰは、約１：１０～約１０：１（例えば、１：９、１：８、７：８、７：１、７：５、７：３、６：１、６：５、５：１、５：３、４：１、４：３、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、３：４、１：４、３：５、１：５、４：５、１：６、５：６、７：６、７：８、または８：９）のイオン化脂質とアルキレン含有脂質との比を有する。一実施形態において、ＬＮＰは、約１０：１～約１：１０（例えば、９：１、８：１、８：７、７：１、７：５、７：３、６：１、６：５、５：１、５：３、４：１、４：３、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、３：４、１：４、３：５、１：５、４：５、１：６、５：６、７：６、７：８、または８：９）のリン脂質とアルキレン含有脂質との比を有する。一実施形態において、ＬＮＰは、約５０：１～約１：１（例えば、４０：１、３２：３、６：１、７：１、５：１、２４：１、２２：１、２０：１、２２：５、２４：５、２６：５、１０：３、１５：２、１６：７、１８：１、３：１、３：２、または１：１）のステロールとアルキレン含有脂質との比を有する。
一実施形態において、ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載の）は、イオン化脂質、リン脂質、ステロール、およびアルキレングリコール含有脂質（例えば、ＰＥＧ含有脂質）のうちの２つを含む。別の実施形態において、ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載の）は、イオン化脂質、リン脂質、ステロール、およびアルキレングリコール含有脂質（例えば、ＰＥＧ含有脂質）のうちの３つを含む。一実施形態において、ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載の）は、イオン化脂質、リン脂質、ステロール、およびアルキレングリコール含有脂質（例えば、ＰＥＧ含有脂質）のそれぞれを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＬＮＰは、５～５００ｎｍ、例えば、１０～４００ｎｍ、２０～３５０ｎｍ、２５～３２５ｎｍ、３０～３００ｎｍ、５０～２５０ｎｍ、６０～２００ｎｍ、７５～１９０ｎｍ、８０～１８０ｎｍ、１００～２００ｎｍ、２００～３００ｎｍ、および１５０～２５０ｎｍの直径を有する。ＬＮＰの直径は、当該技術分野において公知の任意の方法、例えば、動的光散乱、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）または走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって決定することができる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、５０～１００ｎｍ、７０～１００ｎｍ、および８０～１００ｎｍの直径を有する。一実施形態において、ＬＮＰは、約９０ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＬＮＰは、約３０ｎｍ超の直径を有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１８０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２２５ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２７５ｎｍまたは約３００ｎｍ超の直径を有する。一実施形態において、ＬＮＰは、約７０ｎｍ超の直径を有する。一実施形態において、ＬＮＰは、約９０ｎｍ超の直径を有する。一実施形態において、ＬＮＰは、約１８０ｎｍ超の直径を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の複数のＬＮＰは、約４０ｎｍ～約１８０ｎｍの範囲の平均直径を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の複数のＬＮＰは、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の複数のＬＮＰは、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の複数のＬＮＰは、約６０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態において、複数のＬＮＰは、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１８０ｎｍの平均直径を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の一ナノ粒子または複数のナノ粒子は、－１００ｍｖ未満、例えば、－９０ｍｖ、－８０ｍｖ、－７０ｍｖ、－６０ｍｖ、－５０ｍｖ、－４０ｍｖ、－３０ｍｖ、および－２０ｍｖ未満の平均で中性から負の表面電荷を有する。いくつかの実施形態において、一ナノ粒子または複数のナノ粒子は、－１００ｍｖから１００ｍｖ、－７５ｍｖから０、または－５０ｍｖから－１０ｍｖの中性から負の表面電荷を有する。
いくつかの実施形態において、複数のナノ粒子のうちの少なくとも５％（例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）のナノ粒子は、－１００ｍｖ未満の平均で中性から負の表面電荷を有する。いくつかの実施形態において、一ナノ粒子または複数のナノ粒子は、ｐＨ７．４で－２０ｍｖから＋２０、－１０ｍｖから＋１０ｍｖ、または－５ｍｖから＋５ｍｖの平均表面電荷を有する。中性電荷のＬＮＰは、カチオン性ＬＮＰと比較して、改善された薬物動態および生物学的性能を有する。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の生成
ＬＮＰの生成方法は、第１の溶液と第２の溶液とを混合することを含むことができる。混合は、プロペラ混合、溶液のボルテックスまたは好ましくはマイクロ流体混合もしくは高効率のＴ混合によるものなどの標準液混合技術を用いて達成することができる。いくつかの実施形態において、第１の溶液は、一脂質または複数の脂質および核酸を含み、すべての成分は、水／溶媒系に可溶化される。溶媒は、任意の水混和性溶媒（例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサンまたはテトラヒドロフラン）であってもよい。いくつかの実施形態において、第１の溶液は、わずかな比率の水またはｐＨ緩衝水を含む。第１の溶液は、少なくとも６０体積％までの水、例えば、少なくとも約０．０５体積％、０．１体積％、０．５体積％、１体積％、２体積％、３体積％、４体積％、５体積％、１０体積％、１５体積％、２０体積％、２５体積％、３０体積％、３５体積％、４０体積％、４５体積％、５０体積％、５５体積％または６０体積％までの水を含んでもよい。一実施形態において、第１の溶液は、約０．０５体積％～６０体積％の水、例えば、約０．０５体積％～５０体積％、約０．０５体積％～４０体積％、または約５体積％～２０体積％の水を含む。
いくつかの実施形態において、第１の溶液は、単一のタイプの脂質、例えば、イオン化脂質、リン脂質、ステロール、またはＰＥＧ含有脂質を含む。いくつかの実施形態において、第１の溶液は、複数の脂質を含む。いくつかの実施形態において、複数は、イオン化脂質、リン脂質、ステロール、またはＰＥＧ含有脂質を含む。いくつかの実施形態において、複数の脂質は、コレステロール、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）またはα－（３’－｛［１，２－ジ（ミリスチルオキシ）プロパノキシ］カルボニルアミノ｝プロピル）－ω－メトキシ、ポリオキシエチレン（ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＧ）、およびイオン化脂質を含む。複数の脂質は、任意の比率で存在しうる。一実施形態において、複数の脂質は、イオン化脂質またはステロール、リン脂質、ステロール、上記脂質のＰＥＧ含有脂質またはこれらの組合せを特定の比率（例えば、本明細書に記載の比率）で含む。
いくつかの実施形態において、第２の溶液は水である。いくつかの実施形態において、第２の溶液は、ｐＨが３～６（例えば、約３、約４、約５、または約６のｐＨ）の水性緩衝液である。第２の溶液は、負荷成分、例えば核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含んでもよい。第２の溶液は、わずかな比率の水混和性有機溶媒を含んでもよい。第２の溶液は、少なくとも６０体積％までの少なくとも１種の水混和性有機溶媒、例えば、少なくとも約０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％またはこれらの間の任意の体積％の少なくとも１種の有機溶媒（例えば、水混和性有機溶媒）を含んでもよい。一実施形態において、第２の溶液は、約０．０５体積％～６０体積％の有機溶媒、例えば、約０．０５体積％～５０体積％、約０．０５体積％～４０体積％、または約５体積％～２０体積％の有機溶媒（例えば、水混和性有機溶媒）を含む。水性緩衝溶液は、クエン酸緩衝液の水溶液であってもよい。いくつかの実施形態において、水性緩衝溶液は、ｐＨが４～６（例えば、約４、約５、または約６のｐＨ）のクエン酸緩衝液である。一実施形態において、水性緩衝溶液は、ｐＨが約６のクエン酸緩衝液である。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰ懸濁液を含む第１および第２の溶液の混合物を含む溶液を希釈してもよい。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ懸濁液を含む第１および第２の溶液の混合物を含む溶液のｐＨは調整することができる。ＬＮＰ懸濁液の希釈またはｐＨの調整は、水、酸、塩基または水性緩衝液を添加することによって達成することができる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ懸濁液の希釈またはｐＨの調整は行わない。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ懸濁液の希釈およびｐＨの調整を両方とも行う。
いくつかの実施形態において、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）（例えば、血液透析ろ過）によって、過剰の試薬、溶媒、カプセル化されていない核酸をＬＮＰ懸濁液から除去することができる。有機溶媒（例えば、エタノール）および緩衝液も、ＴＦＦによってＬＮＰ懸濁液から除去することができる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ懸濁液は透析を受け、ＴＦＦを受けない。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ懸濁液はＴＦＦを受け、透析を受けない。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ懸濁液は、透析およびＴＦＦの両方を受ける。
一態様において、本開示は、脂質層を分解することによってカプセル化および／または封入された核酸を放出させるのに好適な期間、核酸を含むＬＮＰ試料を、洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、またはアニオン性洗浄剤（これらに限定されないが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）など、または非イオン性洗浄剤（これらに限定されないが、β－オクチルグルコシドなど）、または両性洗浄剤３～１４）を含む流体で処理することを含む方法を特徴とする。一実施形態において、方法は、存在、不在、および／または放出された核酸の量について試料を分析することをさらに含む。
リガンドを含むＬＮＰ
本開示のいくつかの態様は、細胞表面抗原に対して結合特異性を有するリガンド（本明細書中で標的リガンドとも呼ばれる）を含むＬＮＰであって、抗原へのリガンドの結合が、リガンドの内在化を誘発する、ＬＮＰに関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のリガンドを含むＬＮＰを含む組成物に関する。
いくつかの実施形態において、標的リガンドは、脂質複合体にカップリングされる。例えば、脂質複合体は、これらに限定されないがＰＥＧ（２０００）－ＤＳＰＥまたはＰＥＧ（２０００）－ＤＳＧなどの親水性ポリマー脂質複合体であってもよい。カップリングは、当該技術分野において公知のさまざまな化学によって達成することができる（例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ），３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒを参照）。いくつかの実施形態において、標的リガンドは、リンカーによって脂質複合体にカップリングされる。リンカー分子は、一般的に、ＰＥＧ末端が連結された脂質ドメイン（リン脂質またはステロール）などの親水性ポリマー鎖を含有し、末端にマレイミドなどのチオール反応性官能基を含有する。サイズ、さまざまな炭化水素鎖長のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）脂質アンカー、および末端マレイミドまたはヨードアセテート基のＰＥＧスペーサーを含むリンカーは、現在、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（米国アラバマ州）およびＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（日本）から市販されている。そのような一般的に用いられる一戦略は、タンパク質を、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［マレイミド（ポリエチレングリコール）－２０００］（Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）などのチオール反応性リポポリマーリンカーにカップリングさせるものである。好ましくは、対象となるタンパク質を、Ｃ末端の１つのシステインを含有するように操作して、一点共役を確保する。あるいは、Ｆ（ａｂ）２またはＦａｂ’は、ＩｇＧから、Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥにカップリングするためにシステインチオール基に反応性を持つジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン、（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）ＴＣＥＰ－ＨＣＬなどの還元剤を用いたジスルフィド結合の還元によって酵素的に生成されうる。システインの還元によるＭａｌ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥの反応は、ｐＨ５．５～７．５、例えば、ｐＨ５．５、６、６．５、７、７．５、好ましくはｐＨ６．０の水性緩衝液中で生じる。反応は、典型的には、４時間以内に完了する。少量のシステインまたはメルカプトエタノールを添加して、未反応のマレイミド基と反応させ、カップリング反応を失活させる。後続の膜内挿入工程に先立って非共役タンパク質を除去する必要はないが、貯蔵の目的で複合体を精製し、より精密な特性評価を可能にすることが有用である。大きなサイズのリポポリマーミセル（等分子量８５０ｋＤａ、Ｎｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００５ａ）に起因して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）が便利な方法である。そのようなタンパク複合体の特性評価は、さまざまな技術によって達成される。例えば、純度はＳＥＣによって決定され、分子量はドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって、タンパク質の融点は示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）によって、等電点の決定はキャピラリー電気泳動法によって、ならびに標的結合親和性は表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）およびバイオレイヤー干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）によって定量化される。
標的リガンドの例は、Ｈｅｒ２受容体、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、エフリンＡ２受容体、ＣＬＥＣ９Ａ受容体、ＤＥＣ２０５受容体、ＣＬＥＣ４Ａ受容体、ＸＣＲ１受容体、ＣＤ１４１受容体、ＨＬＡ－ＤＲ受容体、トランスフェリン受容体タイプ１、トランスフェリン受容体タイプ２、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、インテグリン、ＮＧＦ受容体、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ６９、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）またはさまざまな他の細胞表面受容体、または複合糖質、プロテオグリカン、糖タンパク質、およびアシアロ糖タンパク受容体（ＡＳＧＰＲ）を結合する複合糖質Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）リガンドなどの糖脂質、または葉酸受容体を標的化する葉酸ＰＥＧ－ＤＳＰＥなどの小分子複合体を含めた、細胞表面受容体に対する抗体または抗体フラグメントであってもよい。
一実施形態において、標的リガンドは、抗ＤＥＣ２０５抗体である。ＤＥＣ２０５（ＣＤ２０５）は、主に樹状細胞（ＤＣ）によって発現されるＩ型細胞表面タンパク質である。これは、リンパ組織のＴ細胞領域内の指状嵌入ＤＣ、骨髄由来ＤＣ、ランゲルハンス細胞、ならびに低レベルでマクロファージおよびＴ細胞上で見られ、ＤＣの成熟中に有意に上方調節される。ＤＥＣ－２０５の発現は、ＣＤ８ａの発現との間に正の相関が認められ、両方とも、高レベルでリンパＤＣ上に、かつ低レベルで骨髄ＤＣ上に見られる。ＤＥＣ－２０５は、中程度のレベルでＢ細胞によっても発現され、プレＢ細胞からＢ細胞への移行中に上方調節される。組み換え型抗ヒトＤＥＣ２０５抗体は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓから市販されている。
一実施形態において、ＬＮＰ上の抗原特異的標的化は、ＬＮＰを標的リガンド－脂質複合体と共インキュベーションして、リガンド標的化ＬＮＰを調製することによって達成される。標的リガンド－脂質複合体は、ＬＮＰを調製する前に調製してもよい（Ｎｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２００５ Ｊａｎ－Ｆｅｂ；２１（１）：２０５－２０参照）。
一実施形態において、ＬＮＰを、抗体もしくはフラグメント－ＰＥＧ－リン脂質ミセルまたは他のリガンド複合体と共インキュベーションし、３７℃で終夜加熱して、抗体複合体の、ＬＮＰ外膜への挿入を促進する（Ｎｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２００５ Ｊａｎ－Ｆｅｂ；２１（１）：２２１－３２）。別の態様において、挿入は、より短い時間、昇温で、例えば０．５～８時間、３７℃で、または好ましくは０．５～２時間、３７℃で加熱することによって達成することができる。ミセル挿入は、ＬＮＰを氷の上に置いて（その後、冷蔵庫内、４℃で貯蔵することができる）急速に温度を下げることによって止めることができる。添加される脂質複合体の総量は、総脂質の０．０２％～２％、または好ましくは０．１％～１％、または好ましくは０．１％～０．５％であってもよい。抗体－脂質複合体の取り込み効率は、ＳＤＳまたは他の洗浄剤によるＬＮＰ解離後にＳＤＳ－ＰＡＧＥによって測定することができる（同じタンパク質の標準曲線と比較する）（Ｎｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２００５ Ｊａｎ－Ｆｅｂ；２１（１）：２０５－２０）。他の標的リガンドの取り込み効率は、蒸発光散乱検出器を装備した超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤ）によって測定することができる（Ｇａｕｔｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１９ Ｎｏｖ １２；２０（２２）：５６６９）。
図２は、Ｆａｂ’抗体フラグメントの還元Ｃ末端システインとマレイミド末端ポリ（エチレングリコール）２０００誘導体化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンとの反応を示す。Ｒ１およびＲ２は、ステアリン酸である。最終抗体リポポリマー複合体は、後続して脂質性ナノ粒子の外部脂質層に挿入して能動的に標的化させる中間体である。
ＬＮＰの標的化は、脂質を配合物に添加することによっても実現することができる。例えば、ホスファチジルセリンは、アポトーシス中に原形質膜の外面に再分配することが知られ、食作用の細胞引力のための分子的刺激である（Ｆａｄｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．２００３ Ａｕｇ １９；１３（１６）：Ｒ６５５－７）。ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）は、樹状細胞によって認識され、樹状細胞の取り込みおよび活性化を誘発することができる。ＬＮＰの標的化は、特定のアニオン性リン脂質を配合物に添加することによっても実現することができる（表３）。例えば、ホスファチジルセリンは、アポトーシス中に原形質膜の外面に再分配することが知られ、食作用の細胞引力のための分子的刺激である（Ｆａｄｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．２００３ Ａｕｇ １９；１３（１６）：Ｒ６５５－７）。ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）は、樹状細胞によって認識され、樹状細胞の取り込みおよび活性化を誘発することができる（Ｃａｒｏｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ．２０２１ Ａｐｒｉｌ １４；１２：２２３７－２２５３；Ｉｓｃｈｉｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１３）。アニオン性リン脂質は、リポソームの文脈において先に使用されてきたが、凝縮核酸を含む脂質性ナノ粒子中に含有させることは、アニオン性頭部基がｍＲＮＡのリン酸骨格とのイオン化カチオン性脂質の結合部位を競合しうる、表面電荷を変えることによって細胞内脱出を阻害しうる、または形成もしくは貯蔵中にＬＮＰの凝集をもたらしうるため、予期されない。
一実施形態において、アニオン性標的リガンドは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、Ｎ－グルタリル－ホスファチジルエタノールアミン（Ｎ－ｇｌｕ－ＰＥ）、またはＮ－スクシニル－ホスファチジルエタノールアミン（Ｎ－Ｓｕｃ－ＰＥ）からなる群から選択される。一実施形態において、使用されるアニオン性リン脂質は、ホスファチジルセリンである。別の実施形態において、ホスファチジルセリンは、セリンのＬ異性体を含有する。別の実施形態において、ジミリストイルホスファチジル－Ｌ－セリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジル－Ｌ－セリン（ＤＰＰＳ）、またはジステアロイルホスファチジル－Ｌ－セリン（ＤＳＰＳ）の場合などの、ホスファチジルセリンのアシル鎖は、完全に飽和されている。好ましい実施形態において、使用されるＰＳは、ＤＰＰＳまたはＤＳＰＳのいずれかのＬ異性体である。ホスファチジルセリンは、例えば、一アシル鎖がステアリン酸であり、他方がパルミチン酸であるような、不斉アシル鎖組成物も含有しうる。
一実施形態において、ＰＳまたはＰＧを、ＬＮＰの総脂質含有量の約０．１モル％～約２０モル％、約０．１モル％～約１０モル％、約０．１モル％～約５モル％、約０．５モル％～約２０モル％、約０．５モル％～約１０モル％、約０．５モル％～約５モル％、約１モル％～約２０モル％、約１モル％～約１０モル％、または約１モル％～約５モル％の濃度で、ＬＮＰ脂質製剤へ添加する。一実施形態において、ＰＳを、ＬＮＰの総脂質含有量の約１モル％～約２０モル％、約２．５モル％～約１０モル％、約３モル％～約９モル％、または約４モル％～約８モル％の濃度で、ＬＮＰ脂質製剤へ添加する。
一実施形態において、ＰＳ脂質は、ＤＯＤＡＰ、ＡＫＧ－ＯＡ－ＤＭ２、Ｏ－１１７６９、ＤＬｉｎーＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ３－ＤＭＡ、ＡＬＣ－０３１５、およびＳＭ－１０２を含めた、当該技術分野において公知のイオン化カチオン性脂質を含むＬＮＰ組成物中に含まれる。
別の実施形態において、ＰＳ脂質は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩのＩＣＬ、これらの組合せまたはこれらの薬学的に許容される塩を含むＬＮＰ組成物中に含まれる。別の実施形態において、ＰＳ脂質は、３～８、４～７、または５～６のＮ／Ｐ比を用いてＬＮＰ組成物中に含まれる。
いくつかの態様において、核酸を細胞に送達する方法であって、細胞を、細胞表面抗原に対して結合特異性を有するリガンド（本明細書中、標的リガンドとも呼ばれる）を含み、抗原へのリガンドの結合がリガンドの内在化を誘発するＬＮＰを含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、標的リガンドは、これらに限定されないが、内在化抗体もしくはそのフラグメント、小分子複合体または複合糖質であってもよい。いくつかの実施形態において、特異細胞表面抗原への標的リガンドの結合は、ＬＮＰの内在化を誘発し、内在化条件下で細胞と接触し、細胞と共にインキュベートされると、細胞に連結された標的リガンドは、少なくとも１００，０００個または少なくとも１，０００，０００個の抗原分子を発現する。
組成物
いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子組成物は、脂質および核酸を含み、脂質性ナノ粒子は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの化合物、これらの組合せまたはこれらの薬学的に許容される塩を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、式（ＩＶ）の構造を有するイオン化脂質を含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、医薬品賦形剤をさらに含む。
いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子は、水性媒体中にある。
いくつかの実施形態において、核酸は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの化合物またはこれらの組合せと共に脂質性ナノ粒子中に封入され、核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかである。いくつかの実施形態において、核酸はｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸はｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸はＤＮＡである。
いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子は、ホスファチジルコリンおよびステロールを含む膜を含む。いくつかの実施形態において、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子は、ホスファチジルコリン、イオン化カチオン性脂質（ＩＣＬ）を含む膜を含む。いくつかの実施形態において、ＩＣＬは、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの構造およびコレステロールを有し、膜は、脂質性ナノ粒子の内部を水性媒体から分離する。いくつかの実施形態において、ＩＣＬは、表１Ａおよび表２に示す構造を有する。いくつかの実施形態において、ＩＣＬは、表１Ｂに示す構造を有する。いくつかの実施形態において、ホスファチジルコリンは、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）または硬化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）である。いくつかの実施形態において、イオン化カチオン性脂質とコレステロールとのモル比は、約６５：３５～４０：６０である。いくつかの実施形態において、ＩＣＬとコレステロールとのモル比は、約６０：４０～約４５：５５である。
いくつかの実施形態において、ホスファチジルコリンとコレステロールとのモル比は、約１：５～約１：２である。
いくつかの実施形態において、膜は、ポリマー複合脂質をさらに含む。
いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子は、ＩＣＬ、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびポリマー複合脂質を、約４９．５：１０．３：３９．６：２．５のモル比で含む。
いくつかの実施形態において、ポリマー複合脂質は、ＰＥＧ（２０００）－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）またはＰＥＧ（分子量２０００）－ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＭＰＥ）である。
本開示の組成物は、さまざまな経路によって、例えば、静脈内、非経口、腹腔内、または局所経路を介して全身送達を行うために投与されうる。組成物は、対象に、静脈内、皮下、または腹腔内投与されうる。いくつかの実施形態において、本開示は、核酸のｉｎ ｖｉｖｏ送達を対象に対して行うための方法を提供する。
いくつかの実施形態において、組成物は、経口投与用の液体医薬製剤である。
いくつかの実施形態において、組成物は、皮下、筋肉内、または皮内投与用の液体医薬製剤である。
いくつかの実施形態において、組成物は、凍結乾燥粉末の形態にあり、これは、投与前に、後続して水性媒体で再構成される。
使用方法
樹状細胞の標的化
樹状細胞（ＤＣ）は、適応免疫を開始および調節する上で中心的な役割を果たす特殊抗原提示細胞である。その有力な抗原（Ａｇ）提示能および独特なＴ細胞応答を発生する能力により、ＤＣへのＡｇの効率的かつ特異的な送達は、Ａｇ特異的エフェクターおよび腫瘍または病原体に対する記憶細胞を生成する基盤である。
樹状細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－４、およびＩＦＮ－ガンマを添加し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで単球由来のＤＣを分化することによって、ヒト血中単球から生成されうる。培養下の細胞は、樹状およびベールの両方の形状を示し、前者は付着され、後者は懸濁される。表現型の上では、これらは、ＣＤ１ａ－／ｄｉｍ、ＣＤ１１ａ＋、ＣＤ１１ｂ＋＋、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１４ｄｉｍ／－、ＣＤ１６ａ－／ｄｉｍ、ＣＤ１８＋、ＣＤ３２ｄｉｍ／－、ＣＤ３３＋、ＣＤ４０＋、ＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ５０＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ６４－／ｄｉｍ、ＣＤ６８＋、ＣＤ７１＋、ＣＤ８０ｄｉｍ、ＣＤ８６＋／＋＋、ＭＨＣクラスＩ＋＋／、ＨＬＡ－ＤＲ＋＋／、ＨＬＡ－ＤＰ＋、およびＨＬＡ－ＤＱである（Ｇｅｉｓｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；６（１－２）：２５－３９）。
あるいは、ヒト初代血液樹状細胞株が開発され、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓから市販されている。
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、結核菌感染の間に重要な機能を有することが知られているサイトカインＩＬ２、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦを生成することができる。重要なことには、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、顆粒媒介機能を介して（パーフォリン、グランザイム、およびグラニュライシンを介して）結核菌感染した細胞を死滅させるための細胞溶解性機能またはアポトーシスを誘発するためのＦａｓ－Ｆａｓリガンド相互作用を有する。ヒトにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、結核菌を直接死滅させることができるグラニュライシンを生成することができる。したがって、ＤＣに送達される抗原生成ｍＲＮＡ ＬＮＰがＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激して結核菌感染と戦うことが見込まれる。
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、古典および非古典ＭＨＣ分子によって提示された結核（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）特異的抗原（ペプチドとしての）を認識することができる。古典ＭＨＣ Ｉａ（ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ）分子の文脈における抗原提示細胞によって提示された抗原を認識する、古典的に制限されたＣＤ８＋Ｔ細胞が特定された。非古典的に制限されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ｅ分子（非ＭＨＣ Ｉａ）、群１ ＣＤ１分子と関連する糖脂質および粘膜に関係する不変Ｔ細胞（ＭＡＩＴ）などのＭＨＣ Ｉ関連分子（ＭＲ１）の文脈においてＭｇ抗原を認識することができるＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。最後に、γδＴ細胞は、結核菌感染に応答して先天性機能および適応機能の両方を有するＣＤ８（およびＣＤ４）Ｔ細胞の別々の集団を表す。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、結核菌感染に応答して直接機能することが示されたが、全体の宿主免疫反応において多くの異なる機能（例えば、最適なＣＤ４ Ｔ細胞機能を提供するための相互作用）を調整する上でも重要な役割を果たす。
一実施形態において、ＬＮＰを、適当な濃度（例えば、１～５μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ）で、培養ヒト樹状細胞に添加してもよい。細胞取り込みおよび抗原発現のために幾分かの時間が経過された後、ヒトＴ細胞（ＨｅｍａＣａｒｅ）を添加することができ、Ｅｌｉｓａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＩＦ５０Ｃ）によるＩＮＦ－γのために細胞培養培地をさまざまな時点でサンプリングする。あるいは、細胞は、ＣＤ８＋マーカーまたは細胞内ＩＮＦγ生成（ＰＥ抗ヒトＩＦＮ－γ抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）について、フローサイトメトリーによって分析することができる。
一実施形態において、ＬＮＰを、０．０１～５ｍｇ／ｋｇ ｍＲＮＡの用量で、上にまとめた任意の投与経路によって対象に投与することができる。いくつかの実施形態によれば、ある割合のＬＮＰはＤＣ細胞に取り込まれるが、ほとんどは肝臓および脾臓中に蓄積する。ＤＣ細胞は、抗原ペプチドを発現し、それをＭＨＣ Ｉ提示のためにプロセシングし、抗原に対する記憶Ｔ細胞の教育を誘発するナイーブＴ細胞に提示するためにリンパ節に移動することができる。
一実施形態において、抗ＤＥＣ２０５－ＰＥＧ－ＤＳＰＥなどの標的リガンドで改変したＬＮＰを、０．０１～５ｍｇ／ｋｇ ｍＲＮＡの用量で対象に投与することができる。いくつかの実施形態によれば、より高い割合のＬＮＰがＤＣ細胞に取り込まれ得、非標的化ＬＮＰと比較して抗原ペプチドの生成を増加させ、病原体に対してより有効なワクチン接種を可能にする。樹状細胞の追加の標的リガンドは、これらに限定されないが、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＬＥＣ４Ａ、ＸＣＲ１、ＣＤ１４１、およびＨＬＤ－ＤＲを含む。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで生成された抗原に対するＣＤ８＋反応性の評価は、種に特異的なＩＦＮ－ガンマＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔｓ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってＩＮＦγ血漿中濃度を測定することによって実現することができる。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、延長された血中濃度半減期およびｍＲＮＡの安定性のカプセル化などの所望の薬物動態論的特性を提供する。血中濃度半減期は、免疫能の正常なマウスに静脈内注射してから６または２４時間後、血液中に残る注入された容量（ＩＤ）のパーセンテージとして測定されうる。血漿中、２４時間にわたるｍＲＮＡのカプセル化の安定性は、マウスの静脈内投与後のｍＲＮＡと脂質との比（ｍＲＮＡ／Ｌ比）の変化によって決定することができる。いくつかの実施形態において、血液中に残るカプセル化されたｍＲＮＡのパーセンテージは、６時間での注入量の２０％超、好ましくは３０％超、最も好ましくは４０％超である。２４時間後の血液中に保持されるパーセントは、注入量の、好ましくは１０％超、より好ましくは２０％超である。
本明細書において、結核菌などのマイコバクテリア感染症、またはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）などのグラム陽性菌を防止するための方法を開示する。追加のマイコバクテリアおよびグラム陽性菌は、これらに限定されないが、マイコバクテリウム・アビウム複合体、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・ゴルドナエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ）、マイコバクテリウム・アブセッサス、マイコバクテリウム・アブセッサス、マイコバクテリウム・ムコゲニカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｃｏｇｅｎｉｃｕｍ）、レンサ球菌群（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）（ＶＲＥ）、スタフィロコッカス・ニューモニエ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（化膿レンサ球菌）、ビリダンスレンサ球菌群（ｖｉｒｉｄａｎｓ ｇｒｏｕｐ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、およびコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を含む。
第２の免疫応答を誘発するためのワクチンの投与は、ＭＨＣ提示エピトープを誘導する抗原を発現する細胞に対するＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答を誘発することができるＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープをもたらすことができる。あるいは、または加えて、第２の免疫応答を誘発するためのワクチンの投与は、ＭＨＣ提示エピトープを誘導する抗原を発現する細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することができるＭＨＣクラスＩ提示エピトープをもたらすことができる。さらに、第２の免疫応答を誘発するためのワクチンの投与は、１つ以上のネオ－エピトープ（公知のネオエピトープを含む）および癌特異的体細胞変異を含有しないが癌細胞によって発現され、好ましくは癌細胞に対する免疫応答、好ましくは癌特異的免疫応答を誘発する１つ以上のエピトープをもたらしうる。一実施形態において、第２の免疫応答を誘発するためのワクチンの投与は、ＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープでありかつ／またはＭＨＣ提示エピトープを誘導する抗原を発現する細胞に対するＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答を誘発することができるネオ－エピトープならびにＭＨＣクラスＩ提示エピトープでありかつ／またはＭＨＣ提示エピトープを誘導する抗原を発現する細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することができる癌特異的体細胞変異を含有しないエピトープをもたらす。一実施形態において、エピトープは、癌特異的体細胞変異を含有しない。
「細胞性免疫応答」、「細胞性応答」、「抗原に対する細胞性応答」または同義語は、クラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣを有する抗原の提示によって特徴付けられる細胞に向けられた細胞性応答を含むことを意味する。細胞性応答は、「ヘルパー細胞」または「キラー細胞」のいずれかとして作用するＴ細胞またはＴ－リンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも称する）は、免疫応答を調整することによって中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＴＬＳとも称する）は、癌細胞などの異常細胞を死滅させ、より多くの異常細胞の産生を防止する。好ましい実施形態において、本開示は、１つ以上の発現された抗原を発現し、好ましくはクラスＩのＭＨＣを有する該発現された抗原を提示するマイコバクテリウムに対する抗結核菌ＣＴＬ応答の刺激を要する。
本開示による「抗原」は、免疫応答を誘発する任意の物質を包含する。特に、「抗原」は、抗体またはＴ－リンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する任意の物質、好ましくはペプチドまたはタンパク質に関連する。本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、少なくとも１つのエピトープを含む任意の分子を含む。好ましくは、本開示の文脈における抗原は、任意選択により、プロセシング後、好ましくは抗原に特異的な、免疫反応を誘発する分子である（抗原を発現する細胞を含む）。本開示によれば、免疫反応（好ましくは、細胞免疫反応）のための候補である、任意の好適な抗原を使用してもよい。本開示の実施形態の文脈において、抗原は、好ましくは細胞によって、好ましくは異常細胞、特に癌細胞を含む抗原提示細胞によって提示され、ＭＨＣ分子の文脈において、抗原に対する免疫反応が生じる。抗原は、好ましくは、天然抗原に相当するまたは天然抗原に由来する生成物である。そのような天然抗原は、腫瘍抗原を含みうる。
本明細書で使用される場合、「抗原ペプチド」は、抗原の発現、好ましくは異常細胞、特に癌細胞などの抗原の提示によって特徴付けられる抗原または細胞に対する免疫応答、好ましくは細胞性応答を刺激することができる抗原の部分またはフラグメントに関連する。好ましくは、抗原ペプチドは、クラスＩ ＭＨＣを有する抗原の提示によって特徴付けられる細胞に対する細胞性応答を刺激することができる、好ましくは、抗原応答性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激することができる。好ましくは、本開示による抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ提示ペプチドである、またはＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ提示ペプチドを生成するようにプロセシングされうる。好ましくは、抗原ペプチドは、抗原のフラグメントのアミノ酸配列に実質的に相当するアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記抗原のフラグメントは、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示ペプチドである。好ましくは、本開示による抗原ペプチドは、該フラグメントのアミノ酸配列に実質的に相当するアミノ酸配列を含み、該フラグメント、すなわち抗原由来のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示ペプチドを生成するようにプロセシングされる。ペプチドが直接、すなわちプロセシングせずに、特に開裂されずに提示される場合、ＭＨＣ分子、特にクラスＩ ＭＨＣ分子への結合に適した長さを有し、好ましくは７～２０個のアミノ酸の長さ、より好ましくは７～１２個のアミノ酸の長さ、より好ましくは８～１１個のアミノ酸の長さ、特に９または１０個のアミノ酸の長さである。
専門的抗原提示細胞の主なタイプは、最も広範囲の抗原提示を有する樹状細胞であり、恐らくは最も重要な抗原提示細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および特定の活性化上皮細胞である。樹状細胞（ＤＣ）は、ＭＨＣクラスＩＩおよびＩ抗原提示経路を介してＴ細胞へと抹消組織で捕捉される抗原を提示する白血球集団である。樹状細胞は、免疫応答の強力な誘発因子であり、これらの細胞の活性化は、抗腫瘍免疫の誘発のための重要な工程であることが周知である。樹状細胞は、便宜上、「未成熟」細胞および「成熟」細胞に分類され、よく特徴付けられた２つの表現型を区別する単純な方法として使用されうる。
しかしながら、この命名法は、分化のすべての可能な中間段階を排除すると解釈すべきではない。未成熟樹状細胞は、Ｆｃγ受容体およびマンノース受容体の高発現と相関する、抗原取り込みおよびプロセシングの高い能力を有する抗原提示細胞と特徴付けられる。成熟の表現型は、典型的には、これらのマーカーの低発現によって特徴付けられるが、細胞表面分子の高発現は、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４－１ＢＢ）などのＴ細胞活性化に関与する。樹状細胞成熟は、未成熟樹状細胞による提示が忍容性をもたらすのに対して該抗原提示樹状細胞がＴ細胞プライミングにつながる、樹状細胞活性化の状態と称される。樹状細胞成熟は、主に、先天受容体（細菌ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、内毒素など）、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＦＮ）、ＣＤ４０Ｌによる樹状細胞表面上のＣＤ４０の連結反応、およびストレスの多い細胞死を経た細胞から放出される物質によって検出される微生物の特徴を有する生体分子によって引き起こされる。樹状細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ ＣＳＦ）および腫瘍壊死因子アルファなどのサイトカインを用いて骨髄細胞を培養することによって誘導されうる。非専門的抗原提示細胞は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要とされるＭＨＣクラスＩＩタンパク質を構成的に発現せず、これらは、ＩＦＮγなどの特定のサイトカインによる非専門的抗原提示細胞の刺激によってのみ発現する。「抗原提示細胞」は、提示されるペプチドを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸、好ましくはｍＲＮＡ、例えば抗原をコードする核酸を細胞に形質導入することによって、ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドを搭載しうる。
いくつかの実施形態において、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的化する遺伝子送達ビヒクルを含む医薬組成物を患者に投与し、ｉｎ ｖｉｖｏで行われるトランスフェクションをもたらすことができる。本明細書で使用される場合、「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、より好ましくはＲＮＡ、最も好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）または合成ＲＮＡである。核酸は、本開示によれば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組み換え技術により生成され、化学的に合成された分子を含む。本開示によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖の直鎖状または共有結合閉環状分子として存在しうる。核酸は、本開示によれば、単離することができる。用語「単離された核酸」は、本開示によれば、核酸が（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介してｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅された、（ｉｉ）クローニングによる組み換え技術によって生成された、（ｉｉｉ）例えばゲル電気泳動による開裂および分離によって精製された、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。核酸は、特に、ＤＮＡ鋳型からのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製されうるＲＮＡの形態での、細胞への導入、すなわち細胞のトランスフェクションのために用いられうる。その上、配列安定化、キャッピング、およびポリアデニル化による適用前に、ＲＮＡを改変することができる。
本明細書で使用される場合、用語「ＲＮＡ」は、リボヌクレオチド残基を含む、好ましくは全体的にまたは実質的にリボヌクレオチド残基で構成される分子に関連する。「リボヌクレオチド」は、Ｂ－Ｄ－リボフラノシル基の２’位のヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。用語「ＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離ＲＮＡ（部分的または全体的に精製されたＲＮＡなど）、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、および組み換え技術により生成されたＲＮＡ（１つ以上のヌクレオチドの添加、欠損、置換および／または改変により天然ＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡなど）を含む。そのような改変は、例えばＲＮＡの末端または内部での、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドでの非ヌクレオチド材料の添加を含みうる。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドもしくは化学合成ヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドも含みうる。これらの改変ＲＮＡは、類似物または天然ＲＮＡの類似物と称することができる。
本明細書で使用される場合、用語「ＲＮＡ」は、「ｍＲＮＡ」を含み、好ましくは「ｍＲＮＡ」に関連する。用語「ｍＲＮＡ」は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を使用して生成される「転写産物」に関し、ペプチドまたはポリペプチドをコードする。典型的には、ｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ、タンパク質コード領域、および３’－ＵＴＲを含む。ｍＲＮＡは、細胞内およびｉｎ ｖｉｔｒｏで制限された半減期だけを持つ。本開示の文脈において、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成されうる。本開示において用いられるＲＮＡの文脈における用語「修飾」は、前記ＲＮＡ中に自然には存在しないＲＮＡの任意の修飾を含む。本開示の一実施形態において、本開示に従って使用されるＲＮＡは、非キャップド５’－トリホスフェートを有さない。そのような非キャップド５’－トリホスフェートの除去は、ＲＮＡをホスファターゼで処理することによって達成されうる。本開示によるＲＮＡは、その安定性の向上および／または細胞傷害性の低減のために修飾リボヌクレオチドを有しうる。例えば、一実施形態において、本開示に従って使用されるＲＮＡ中、シチジンの場合、５－メチルシチジンは、部分的または完全に置換され、好ましくは完全に置換される。あるいは、または加えて、一実施形態において、本開示に従って使用されるＲＮＡ中、ウリジンの場合、プソイドウリジンは、部分的または完全に置換され、好ましくは完全に置換される。
一実施形態において、用語「修飾」は、５－キャップまたは５’－キャップ類似体を有するＲＮＡを生成することに関する。用語「５－キャップ」は、ｍＲＮＡ分子の５’－末端に存在するキャップ構造を指し、一般的に、通常見られることのない５’－５三リン酸結合を介してｍＲＮＡに接続されるグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態において、このグアノシンは、７位でメチル化される。用語「従来の５’－キャップ」は、天然ＲＮＡ５’－キャップ、好ましくは７－メチルグアノシンキャップ（ｍ’Ｇ）を指す。本明細書で使用される場合、用語「５’－キャップ」は、ＲＮＡキャップ構造と類似し、好ましくはｉｎ ｖｉｖｏおよび／または細胞内で、ＲＮＡを安定化する能力を持ちかつ／または（ＲＮＡに結合される場合）ＲＮＡの翻訳を強化するように修飾される、５’－キャップ類似体を含む。
本開示によれば、ＲＮＡの安定性および翻訳効率は、必要に応じて修正してもよい。例えば、ＲＮＡの安定効果および／または向上した翻訳効率を有する１つ以上の修正によって、ＲＮＡを安定化することができ、かつその翻訳を増加することができる。そのような修正は、例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９４４８に記載されている。本開示に従って使用されるＲＮＡの発現を増加するために、好ましくは、ｍＲＮＡ安定性を向上するためにＧＣ含有量を増加し、コドン最適化を実行し、したがって細胞内の翻訳を強化するように、発現されるペプチドまたはタンパク質の配列を改変することなく、コード領域、すなわち、発現されるペプチドまたはタンパク質をコードする配列内で修飾されうる。
本開示の態様は、細菌またはウイルス感染症を防止する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、本明細書で生成される組成物を投与して、免疫応答を誘発させることを含む方法に関する。
本開示の態様は、対象にワクチン接種するのに有効量のポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含む本明細書に記載の組成物を単回投与量、対象に投与することを含む、対象にワクチン接種をする方法を提供する。いくつかの実施形態において、核酸は、カチオン性脂質性ナノ粒子中に製剤化される。いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子組成物は、単回注射法で投与される。
いくつかの実施形態において、細菌感染症は、結核菌感染症である。
いくつかの実施形態において、ウイルス感染症は、コロナウイルスである。いくつかの実施形態において、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
いくつかの実施形態において、ウイルス感染症は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳである。
いくつかの実施形態において、脂質性ナノ粒子は、非経口投与される。
一般的に、皮内注射による患者への投与が可能である。しかしながら、注射はまた、筋肉内を介してリンパ節中へ行ってもよい（Ｍａｌｏｙ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：３２９９－３０３３）。結果として得られる細胞は、対象となる複合体を与え、自家細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識され、これは次いで増殖する。
いくつかの実施形態において、組成物は吸入法によって投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、鼻腔用スプレーおよび／またはエアロゾルとして製剤化される。
本明細書中で開示する医薬品組成物中の活性剤の実際の投与量レベルは、患者に対して毒性がない状態で、特定の患者、組成、および投与方法に望ましい治療反応を達成するのに有効な活性剤の量を得るように変動しうる。
投与の文脈において本明細書で使用される場合、「非経口」は、腸内および局所投与以外の投与方法を意味し、通常は注射によるものであり、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内注射および注入が挙げられる。
本明細書で使用される場合、語句「非経口投与」および「非経口により投与される」は、通常、注射または注入による、腸内（すなわち、消化管を介した）および局所投与以外の投与方法を指し、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、吸入、被膜下、くも膜下、呼吸器粘膜、髄腔内、硬膜外および胸骨内注射および注入が挙げられる。静脈内注射および注入が、多くの場合（しかし排他的ではなく）、リポソーム薬物の投与に使用される。
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば、治療反応）が得られるように調整することができる。例えば、単回以上の用量を経時的に投与してもよい、または治療状況の要件によって示されるとおりに用量を比例的に減少もしくは増加してもよい。
いくつかの実施形態において、用量は、０．０１～５ｍｇ／ｋｇの核酸を含む。いくつかの実施形態において、用量は、０．０１～５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、用量は、０．０１～３ｍｇ／ｋｇの核酸を含む。いくつかの実施形態において、用量は、０．０１～３ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、用量は、０．０１～１ｍｇ／ｋｇの核酸を含む。いくつかの実施形態において、用量は、０．０１～１ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、用量は、０．０１～０．５ｍｇ／ｋｇの核酸を含む。いくつかの実施形態において、用量は、０．０１～０．５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、用量は、０．０１～１ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、用量は、０．０１～０．１ｍｇ／ｋｇの核酸を含む。いくつかの実施形態において、用量は、０．０１～０．０５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、用量は、０．０１～０．１ｍｇ／ｋｇの核酸を含む。いくつかの実施形態において、用量は、０．０１～０．０５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡを含む。
化合物および／もしくはその薬学的に許容される塩または化合物および／もしくはその薬学的に許容される塩を含むＬＮＰの投与量は、広い範囲内で変動し得、それぞれの特定の場合において、個々の条件および制御される病原体に合わせて必然的に調整すべきである。
追加の実施形態
１． 式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩。
２． 式ＩＩの化合物またはその薬学的に許容される塩。
３． 式ＩＩＩの化合物またはその薬学的に許容される塩。
４． 式ＩＶの化合物またはその薬学的に許容される塩。
５． 表１Ａ中の構造を有する化合物。
６． 生体還元性の化合物であって、表２中の構造を有する化合物。
７． ６～７のｐＫａを有する化合物であって、上記の実施形態１～６のいずれか１つの化合物。
８． 式Ｉのイオン化脂質またはその薬学的に許容される塩、および核酸を含む脂質性ナノ粒子組成物。
９． 式ＩＩのイオン化脂質またはその薬学的に許容される塩、および核酸を含む脂質性ナノ粒子組成物。
１０． 式ＩＩＩのイオン化脂質またはその薬学的に許容される塩、および核酸を含む脂質性ナノ粒子組成物。
１１． 式ＩＶのイオン化脂質またはその薬学的に許容される塩、および核酸を含む脂質性ナノ粒子組成物。
１２． イオン化脂質が核酸をカプセル化する、上記の実施形態８～１１のいずれか１つの組成物。
１３． 核酸がｓｉＲＮＡである、実施形態８～１１のいずれか１つの組成物。
１４． 核酸がＤＮＡである、実施形態８～１１のいずれか１つの組成物。
１５． 核酸がｍＲＮＡである、実施形態８～１１のいずれか１つの組成物。
１６． ステロール、ホスファチジルコリン、またはこれらの組合せをさらに含む、実施形態８～１１のいずれか１つの組成物。
１７． ステロールがコレステロールである、実施形態１６の組成物。
１８． イオン化脂質とコレステロールとのモル比が約６５：３５～約４０：６０である、実施形態１７の組成物。
１９． イオン化脂質とコレステロールとのモル比が約６０：４０～約４５：５５である、実施形態１７の組成物。
２０． ホスファチジルコリンとコレステロールとのモル比が約１：５～約１：２である、実施形態１７の組成物。
２１． ポリマー複合脂質をさらに含む、実施形態１７の組成物。
２２． ポリマー複合脂質が、ＰＥＧ（２０００）－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）またはＰＥＧ（分子量２，０００）－ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＭＰＥ）を含む、実施形態２１の組成物。
２３． 標的リガンドをさらに含み、標的リガンドがナノ粒子の外側に配向される、実施形態８～１１のいずれか１つの組成物。
２４． 標的リガンドが抗体である、実施形態２３の組成物。
２５． 液体医薬製剤である、実施形態８～１１のいずれか１つの組成物。
２６． イオン化脂質の場合の酸化的分解生成物のパーセンテージが、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡまたはＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ対照製剤の場合の酸化的分解生成物の５０％未満である、実施形態８～１１のいずれか１つの組成物。
２７． 有効量の実施形態９～２６のいずれか１つの組成物および医薬品賦形剤を、それを必要とする対象に投与することを含む方法であって、投与が免疫応答を誘発する、細菌またはウイルス感染症を防止する方法。
２８． 組成物を、皮下、筋肉内、または皮内投与する、実施形態２７の方法。
２９． 細菌感染症が結核菌感染症である、実施形態２７の方法。
３０． ウイルス感染症が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である、実施形態２７の方法。
３１． ウイルス感染症がＨＩＶ感染症である、実施形態２７の方法。
３２． 感染症が非結核性の形態である、実施形態２７の方法。
３３． ｐＫａが６～７のジアルキルアミノ基を含む頭部基に共有結合された一対の１６または１８個の炭素の直鎖状ポリ不飽和脂質テールからなる化学構造を有するイオン化脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物であって、
頭部基が、ジアルキルアミノ基に共有結合されたヘテロシクリルまたはアルキル部分を含み、任意選択によりホスフェート基をさらに含み、
各ポリ不飽和脂質テールが、脂質テールの長さに沿った少なくとも２つのメチレン基によって分離される少なくとも２つのオレフィンを除けば不飽和であり、任意選択により、頭部基に共有結合された末端に単一のアシル基を含む、組成物。
３４． 各脂質テールが同一であり、各脂質テールが、非置換エチレン、ｎ－プロピル、またはｎ－ブチルによってのみ分離された合計２つのオレフィンを有する、実施形態３３の組成物。
３５． 各脂質テールが、頭部基の酸素と結合してエステルを形成するアシル基をさらに含む、実施形態３４の組成物。
３６． 各脂質テールが、式Ａ：
［ここで、式Ａ中、ａは１、２、３または４であり、ｂは２、３または４であり、式Ａ中、ｃは３、４、５、６、７である］または式Ｂ：
［ここで、式Ｂ中、ａは５、６または７であり、式Ｂ中、ｃは３、４または５である］の化学構造を有する、実施形態３４の組成物。
３７． ｂが４である、実施形態３６の組成物。
３８． イオン化脂質が、
からなる群から選択される化学構造を含み、式中、Ｒ２２が脂質テールの第１の末端であり、
が頭部基のジアルキルアミノ部分への頭部基の結合を示す、請求項３６の組成物。
３９． 頭部基のジアルキルアミノ部分が、式（ＩＶ－Ａ）：
の化学構造を有し、式（ＩＶ－Ａ）中、ｎが２、３または４であり、式（ＩＶ－Ａ）中、Ｒ１０およびＲ１２がそれぞれ、独立して、メチル、エチル、およびプロピルからなる群から選択されるアルキル基から選択され、Ｒ１０およびＲ１２中のアルキルが、任意選択により１つ以上のヒドロキシルで置換されている、実施形態３８の組成物。
４０． 式（ＩＶ－Ａ）中のＲ１０およびＲ１２が、それぞれ独立して、メチル、エチル、－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨまたは－（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨである、実施形態３９の組成物。
４１． イオン化脂質が、式（Ｉ－Ａ）：
の化学構造を有し、式中、ａが１、２、３、４、５または６であり、ｂが２、３または４であり、ｃが３、４、５、６または７であり、ａ、ｂおよびｃの合計が１０または１２であり、Ｒ１０およびＲ１２のそれぞれが、独立して、任意選択により１つ以上のヒドロキシルで置換された（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、Ｌが
であり、式中、ｖが０または１であり、ｑ２が１または２である、実施形態３３の組成物。
４２． ｖが０である、請求項４１の組成物。
４３． ｖが１である、請求項４１の組成物。
４４． イオン化脂質が、式ＩＩ－Ａ：
の化学構造を有し、式中、ａが１、２、３、４、５または６であり、ｂが２、３または４であり、ｃが４、５、６、７または８であり、Ｒ２が
であり、ｑおよびｑ’が、それぞれ独立して１または２であり、Ｒ１０およびＲ１２がそれぞれ、任意選択によりヒドロキシルで置換された（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである、実施形態３３の組成物。
４５． イオン化脂質が、式ＩＩ－Ａ：

の化学構造を有し、式中、ａが５、６または７であり、ｃが３、４または５であり、Ｒ２が
であり、ｑおよびｑ’が、それぞれ独立して１または２であり、Ｒ１０およびＲ１２がそれぞれ、任意選択によりヒドロキシルで置換された（Ｃ１～Ｃ４）アルキルである、実施形態３３の組成物。
本開示を、特定の実施形態と関連付けて説明し、例示目的で多くの詳細を記載してきたが、本開示が追加の実施形態を含み、本明細書で記載した詳細の一部は、本開示から逸脱することなく大きく変化しうることが、当業者には明らかになるであろう。本開示は、そのような追加の実施形態、変更および同等物を含む。特に、本開示は、さまざまな例示的な構成要素および例の特徴、用語、または要素の任意の組合せを含む。
別段に明らかな指定がない限り、実施例で使用されるホスファチジルセリン脂質の異性体の形態は、ホスファチジル－Ｌ－セリンである。
特定の実施例を以下に提供して、本明細書で開示される実施形態のさまざまな実施形態を例示する。当業者は、本明細書で開示されるさまざまな実施形態が、これらの特定の例示的な実施例に限定されないという知見を得るであろう。
［実施例１Ａ］イオン化脂質の合成
スキーム１ ＡＫＧ－ＵＯ－１からＡＫＧ－ＵＯ－３のための酸中間体の合成
以下に示す酸中間体（６Ｚ，１２Ｚ）－６，１２－オクタデカジエン酸および（６Ｚ，１２Ｚ）－６，１２－ヘキサデカジエン酸を一般的合成により調製した。
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１２－ジエノエート）（ＡＫＧ－ＵＯ－１、Ｏ－１１９５６）
（Ｓ）－４－（ジエチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１２－ジエノエート）（ＡＫＧ－ＵＯ－１Ａ、Ｏ－１１９５５）
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（ヘキサデカ－６，１２－ジエノエート、ＡＫＧ－ＵＯ－４、Ｏ－１２４０１）
（Ｓ）－４－（ジエチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（ヘキサデカ－６，１２－ジエノエート、ＡＫＧ－ＵＯ－４Ａ、Ｏ－１２４０２）
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１１Ｚ，１１’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１１－ジエノエート）（ＡＫＧ－ＵＯ－１ａ）
実験手順
２－（（５－ブロモペンチル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン２の合成
５－ブロモ－１－ペンタノール１（３．６ｇ、２１．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１００ｍＬ）およびピリジニウムｐ－トルエンスルホネート（４０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）中溶液に、０℃で３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン（６．５４ｍＬ、７１．８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で１時間撹拌し、次いで水でクエンチした。混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブラインで洗浄し、次いで硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（（５－ブロモペンチル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、２（４．５ｇ、８３％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.55-4.54 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 3.92-3.72 (m, 2H), 3.42-3.38 (m, 3H), 1.88-1.55 (m, 3H), 1.52-1.50 (m, 10H).
２－（トリデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン４の合成
１，７－オクタジイン３（６ｍＬ、４５．４ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルホスホルアミド（１６ｍＬ、９０．８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中溶液に、－７８℃で［ｎ－ヘキサン中２．５Ｍ ｎ－ブチルリチウム］（１８ｍＬ、４５．４ｍｍｏｌ）を滴下添加した。添加が完了した時点で、溶液を－７８℃で１時間撹拌し、次いで－２０℃に更に１時間加温した。得られた溶液を－７８℃にもう一度冷却し、その時点で２－（（５－ブロモペンチル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、２（５．６７ｇ、２２．７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中溶液を加えた。得られた溶液を室温に加温し、１２時間撹拌した。１２時間後、反応物を０℃に冷却し、水（１００ｍＬ）でクエンチした。次いで反応混合物を真空下で濃縮してテトラヒドロフランを除去し、次いでｎ－ヘキサンで希釈した。有機物を水およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を重量９ｇで得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（トリデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、４（４．５ｇ、７２％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, d6.DMSO): δ ppm 4.544.53 (m, 1H), 3.72-3.61 (m, 1H), 3.60-3.58 (m, 1H), 3.43-3.33 (m, 1H), 3.32-3.29 (m, 1H), 2.77-2.75 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 2.16-2.13 (m, 6H), 1.55-1.41 (m, 16H).
アルキンのアルキル化のための代表的手順
２－（ヘキサデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン７の合成
２－（トリデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、４（７．１４ｇ、２５．８６ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルホスホルアミド（１８ｍＬ、１０３．４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中溶液に、－７８℃で［ｎ－ヘキサン中２．５Ｍ ｎ－ブチルリチウム］（４１．３ｍＬ、１０３．４ｍｍｏｌ）を滴下添加した。添加が完了した時点で、溶液を－７８℃で１時間撹拌し、次いで－２０℃に更に１時間加温した。得られた溶液を－７８℃にもう一度冷却し、その時点で１－ヨードプロパン５（９．９ｍＬ、１０３．４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中溶液を加えた。得られた溶液を室温に加温し、１２時間撹拌した。１２時間後、反応物を０℃に冷却し、水（１００ｍＬ）でクエンチした。次いで反応混合物を真空下で濃縮してテトラヒドロフランを除去し、次いでｎ－ヘキサンで希釈した。有機物を水およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を重量９ｇで得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（ヘキサデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、７（５．９ｇ、７２％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.57-4.55 (m, 1H), 3.86-3.74 (m, 1H), 3.73-3.71 (m, 1H), 3.50-3.39 (m, 1H), 3.37-3.36 (m, 1H), 2.16-2.11 (m, 8H), 1.59-1.56 (m, 2H), 1.55-1.47 (m, 16H), 0.98-0.93 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
２－（オクタデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン８
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.57-4.55 (m, 1H), 3.85-3.74 (m, 1H), 3.73-3.70 (m, 1H), 3.50-3.38 (m, 1H), 3.36-3.35 (m, 1H), 2.23-2.12 (m, 8H), 1.61-1.54 (m, 2H), 1.53-1.48 (m, 16H), 1.47-1.46 (m, 4H), 0.90-0.85 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
「Ｐ－２Ｎｉ」を使用するアルキンからアルケンへの還元のための代表的手順
２－（（（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン９の合成
水素化ホウ素ナトリウム（０．５６ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）のエタノール（８０ｍＬ）中溶液に、水素ブランケット下０℃で酢酸ニッケル（ＩＩ）４水和物（３．２２ｇ、１２．９８ｍｍｏｌ）を加えた。添加が完了した時点で、反応物を真空下で排気し、水素でフラッシュした。１０分撹拌した後、エチレンジアミン（３．７ｍＬ、６５．６ｍｍｏｌ）および２－（ヘキサデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、７（５．９ｇ、１８．５５ｍｍｏｌ）のエタノール（１０ｍＬ）中溶液を加えた。反応物を水素風船下室温で４時間撹拌した。４時間後、反応混合物を水素で排気し、次いで窒素でフラッシュした。粗製の混合物をセライト上で濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を重量４ｇで得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％ジエチルエーテルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（（（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、９（４．６７ｇ、収率７８％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.34 (m, 4H), 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.74 (m, 1H), 3.73-3.71 (m, 1H), 3.51-3.39 (m, 1H), 3.36-3.35 (m, 1H), 2.03-1.98 (m, 8H), 1.57-1.39 (m, 2H), 1.38-1.36 (m, 6H), 1.35-1.32 (m, 10H), 0.91-0.86 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
13C NMR (300 MHz, CDCl3): 129.98, 129.85, 98.93, 77.53, 77.10, 76.68, 67.72, 62.43, 30.86, 29.71, 29.70, 29.45, 29.46, 29.44, 27.20, 27.19, 26.01, 25.59, 22.98, 19.78, 13.91.
２－（（（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，１２－ジエン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン１０
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.29 (m, 4H), 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.76 (m, 1H), 3.74-3.68 (m, 1H), 3.51-3.41 (m, 1H), 3.39-3.36 (m, 1H), 2.14-1.97 (m, 8H), 1.56-1.38 (m, 2H), 1.37-1.35 (m, 6H), 1.34-1.28 (m, 14H), 0.93-0.85 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
13C NMR (300 MHz, CDCl3): 130.13, 129.97, 129.84, 129.71, 98.93, 77.53, 77.10, 76.68, 67.71, 62.42, 31.62, 30.86, 29.72, 29.71, 29.47, 29.46, 27.27, 27.18, 26.01, 25.59, 22.67, 19.78, 14.18.
テトラヒドロピラニルエーテル（ＴＨＰ）の脱保護化のための代表的手順
（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－オール１１の合成
２－（（（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、９（４．６７ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ｍＬ）中溶液に、室温でｐ－トルエンスルホン酸一水和物（３００ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で３時間撹拌し、次いで水でクエンチした。混合物を酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を水で洗浄し、次いで硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を重量４ｇで得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％ジエチルエーテルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－オール、１１（２．５ｇ、７２％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.34-5.33 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 2H), 2.02-2.00 (m, 8H), 1.36-1.34 (m, 2H), 1.34-1.25 (m, 10H), 0.89-0.86 (t, J = 0.82 Hz, 3H).
（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，１２－ジエン－１－オール１２
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.33 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 2H), 2.02-2.01 (m, 8H), 1.36-1.35 (m, 2H), 1.34-1.25 (m, 14H), 0.88-0.85 (t, J = 0.76 Hz, 3H).
ジョーンズ試薬を使用するアルコールからカルボン酸への酸化のための代表的手順
（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン酸１３の合成
（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－オール、１１（２．５ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）およびジョーンズ試薬［硫酸中２Ｍ］（１０．５ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）のアセトン（２０ｍＬ）中混合物を、０℃で２時間撹拌した。混合物を水でクエンチし、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中２０％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン酸、１３（１．７ｇ、６８％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.33 (m, 4H), 2.37-2.32 (t, 2H), 2.06-1.98 (m, 8H), 1.64-1.39 (m, 2H), 1.37-1.32 (m, 8H), 0.91-0.87 (t, J = 0.91 Hz, 3H).
（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，１２－ジエン酸１４
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 4H), 2.35-2.33 (t, 2H), 2.06-2.01 (m, 8H), 1.64-1.42 (m, 2H), 1.34-1.28 (m, 12H), 0.90-0.85 (t, 3H).
（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）エチル４－メチルベンゼンスルホネート１６の合成
（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）エタン－１－オール１５（２５ｇ、１７１．１ｍｍｏｌ）のピリジン（３０ｍＬ）中混合物に、０℃でｐ－トルエンスルホニルクロリド（３５．８ｇ、１８８．２ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１４０ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で終夜撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ、水およびブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水した。溶媒を蒸発させ、粗製の残渣を精製せずに次のステップに使用した。（４３．８ｇ、８５％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.15-4.01 (m, 3H), 3.65-3.47 (m, 2H), 2.43 (s, 3H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.32 (s, 3H), 1.27 (s, 3H).
ジアルキルアミン置換のための代表的手順
（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン１９の合成
（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）エチル４－メチルベンゼンスルホネート１６（１０ｇ、３３．３ｍｍｏｌ）およびジメチルアミン溶液１７（１６６ｍＬ、３３３．３ｍｍｏｌ）（ＴＨＦ中２Ｍ）の混合物を、室温で２日間撹拌した。混合物を濃縮し、粗製の残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３、水およびブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水した。溶媒を蒸発させ、粗製の残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ＣＨ２Ｃｌ２＝１％ＮＨ４ＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２中ＭｅＯＨ１００％から１０％）により精製し、無色の油状生成物１９を得た（２．１ｇ、３７％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.15-4.01 (m, 2H), 3.52 (dd, J = 7.4, 7.4 Hz, 1H), 2.41-2.23 (m, 2H), 2.21 (s, 6H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.39 (s, 3H), 1.33 (s, 3H).
MS (APCI+): 174.1 (M+1)
（Ｓ）－２－（２，２－ジエチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン２０
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.15-4.01 (m, 2H), 3.48 (dd, J = 7.4, 7.4 Hz, 1H), 2.48-2.43 (m, 6H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.36 (s, 3H), 1.27 (s, 3H), 0.97 (t, J = 7.2 Hz, 6H).
MS (APCI+): 202.2 (M+1)
ケタール加水分解のための代表的手順
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジオール塩酸塩２１の合成
（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン１９（２ｇ、１１．５４ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中混合物に、１Ｎ ＨＣｌ水溶液（１７ｍＬ、１７．３ｍｍｏｌ）を加え、反応物を８０℃で４５分間加熱した。ＴＬＣ（Ｒｆ＝０．１、１％ＮＨ４ＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨ）は反応が完結していることを示した。反応混合物を濃縮した後、粗製の残渣を水（５ｍＬ）に溶解し、終夜凍結乾燥した。粘着性シロップ状生成物２１（２．１ｇ、定量的）をＨＣｌ塩として得た。
1H NMR (300 MHz, D2O): δ ppm 3.77-3.72 (m, 1H), 3.54-3.46 (m, 2H), 3.29-3.22 (m, 2H), 2.85 (s, 6H), 1.92-1.79 (m, 2H).
MS (APCI+): 134.1 (M+1)
（Ｓ）－４－（ジエチルアミノ）ブタン－１，２－ジオール塩酸塩２２
1H NMR (300 MHz, D2O): δ ppm 3.77-3.72 (m, 1H), 3.54-3.46 (m, 2H), 3.22-3.15 (m, 6H), 1.92-1.74 (m, 2H), 1.24 (t, J = 7.4 Hz, 6H).
MS (APCI+): 162.1 (M+1)
ジエステル化のための代表的手順
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１２－ジエノエート）ＡＫＧ－ＵＯ－１（Ｏ－１１９５６）の合成
塩化オキサリル（０．３３ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）を、０℃で（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，１２－ジエン酸、１４（０．３６ｇ、１．３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン／ＤＭＦ（１５ｍＬ、２５ｍＬ）中溶液に滴下添加し、反応物を室温に加温し、１時間撹拌した。１時間後、反応物を真空下で濃縮乾固した。残渣をジクロロメタン（１０ｍＬ）に再度溶解し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．３ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（３１７ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）および（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジオール塩酸塩、２１（１０１ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。得られた溶液を２４時間撹拌した。２４時間後、反応物を０℃に冷却し、水（１０ｍＬ）でクエンチした。反応混合物をジクロロメタン（２×１００ｍＬ）で抽出し、有機物を水およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてジクロロメタン中２％メタノールを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１２－ジエノエート）、ＡＫＧ－ＵＯ－１（０．１２ｇ、３０％）を黄色油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.40-5.29 (m, 8H), 5.14-5.12 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 12.1, 6.3 Hz, 1H), 2.32-2.26 (m, 6H), 2.20 (s, 6H), 2.06-1.99 (m, 16H), 1.78-1.70 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 4H), 1.42-1.25 (m, 24H), 0.90-0.85 (m, 6H).
MS (APCI+): 658.5 (M+1)
（Ｓ）－４－（ジエチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１２－ジエノエート）ＡＫＧ－ＵＯ－１Ａ（Ｏ－１１９５５）
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.37-5.29 (m, 8H), 5.12-5.10 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 12.1, 3.6 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.52-2.42 (m, 6H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 4H)), 2.06-1.99 (m, 16H), 1.78-1.70 (m, 2H), 1.64-1.59 (m, 4H), 1.41-1.19 (m, 24H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.96-0.87 (m, 6H).
MS (APCI+): 686.6 (M+1)
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（ヘキサデカ－６，１２－ジエノエート）ＡＫＧ－ＵＯ－４（Ｏ－１２４０１）
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.29 (m, 8H), 5.13-5.12 (m, 1H), 4.24 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.32-2.27 (m, 6H), 2.19 (s, 6H), 2.01-1.99 (m, 16H), 1.75-1.72 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 4H), 1.36-1.31 (m, 16H), 0.91-0.86 (m, 6H).
MS (APCI+): 602.5 (M+1)
（Ｓ）－４－（ジエチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（ヘキサデカ－６，１２－ジエノエート）ＡＫＧ－ＵＯ－４Ａ（Ｏ－１２４０２）の合成
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.40-5.29 (m, 8H), 5.12-5.11 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.54-2.43 (m, 6H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 2.11-1.96 (m, 16H), 1.74-1.65 (m, 2H), 1.65-1.59 (m, 4H), 1.39-1.31 (m, 16H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.91-0.89 (m, 6H).
ＭＳ（ＡＰＣＩ＋）：６３０．５（Ｍ＋１）、ｉ）５－ブロモペンタノールおよび対応するアルデヒドから調製したトリフェニルホスホニウムイリドの最初のウィッティヒ反応、ｉｉ）メシル化および置換による末端アルコールの臭化物への変換、ｉｉｉ）イリド合成およびウィッティヒ反応の順序の繰り返し、ならびに最後にｉｖ）末端アルコールの過ヨウ素酸酸化を含む。得られた酸中間体を下記ＡＫＧ－ＵＯ－１からＡＫＧ－ＵＯ－４の合成に利用した。
スキーム２ ＡＫＧ－ＵＯ－５のための酸中間体の合成
ＡＫＧ－ＵＯ－５の合成に使用する酸中間体（９Ｚ，１５Ｚ）－９，１５－オクタデカジエン酸をスキーム２に示した一般的合成により調製し、これは、ｉ）（５Ｚ）－１－ブロモ－５－オクテンを用いるシリル保護化１０－ヒドロキシ－１－デシンのアルキル化、ｉｉ）アルキンからｃｉｓ－アルケンへの触媒的水素化、ｉｉｉ）アルコール上のシリル保護の除去、および最後にｉｖ）末端アルコールから所望の酸への酸化、を含む。
スキーム３ ＡＫＧ－ＢＤＧ－０１およびＡＫＧ－ＢＤＧ－０２のための酸中間体の合成
ＡＫＧ－ＢＤＧ－１およびＡＫＧ－ＢＤＧ－２の合成に使用する２種の二硫酸中間体の合成を以下に示す。
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１１Ｚ，１１’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１１－ジエノエート）（ＡＫＧ－ＵＯ－１ａ）の合成
実験手順
２－（（５－ブロモペンチル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン２の合成
５－ブロモ－１－ペンタノール１（３．６ｇ、２１．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１００ｍＬ）およびピリジニウムｐ－トルエンスルホネート（４０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）中溶液に、０℃で３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン（６．５４ｍＬ、７１．８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で１時間撹拌し、次いで水でクエンチした。混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブラインで洗浄し、次いで硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（（５－ブロモペンチル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、２（４．５ｇ、８３％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.55-4.54 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 3.92-3.72 (m, 2H), 3.42-3.38 (m, 3H), 1.88-1.55 (m, 3H), 1.52-1.50 (m, 10H).
２－（ドデカ－６，１１－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン４ａの合成
１，６－ヘプタジイン３ａ（５ｇ、５４．３ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルホスホルアミド（１９ｍＬ、１０８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中溶液に、－７８℃で［ｎ－ヘキサン中２．５Ｍ ｎ－ブチルリチウム］（２１．７ｍＬ、５４．３ｍｍｏｌ）を滴下添加した。添加が完了した時点で、溶液を－７８℃で１時間撹拌し、次いで－２０℃に更に１時間加温した。得られた溶液を－７８℃にもう一度冷却し、その時点で２－（（５－ブロモペンチル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、２（６．８ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中溶液を加えた。得られた溶液を室温に加温し、１２時間撹拌した。１２時間後、反応物を０℃に冷却し、水（１００ｍＬ）でクエンチした。次いで反応混合物を真空下で濃縮してテトラヒドロフランを除去し、次いでｎ－ヘキサンで希釈した。有機物を水およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（ドデカ－６，１１－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、４ａ（４．１ｇ、５８％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.57-4.56 (m, 1H), 3.96-3.82 (m, 1H), 3.77-3.69 (m, 1H), 3.50-3.41 (m, 1H), 3.39-3.34 (m, 1H), 2.29-2.25 (m, 4H), 2.15-2.12 (m, 2H), 1.95-1.94 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 1.73-1.43 (m, 14H).
２－（オクタデカ－６，１１－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン６ａの合成
２－（ドデカ－６，１１－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、４ａ（４．１ｇ、１５．６４ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルホスホルアミド（１１ｍＬ、６２．６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中溶液に、－７８℃で［ｎ－ヘキサン中２．５Ｍ ｎ－ブチルリチウム］（１２．５ｍＬ、３１．３ｍｍｏｌ）を滴下添加した。添加が完了した時点で、溶液を－７８℃で１時間撹拌し、次いで－２０℃に更に１時間加温した。得られた溶液を－７８℃にもう一度冷却し、その時点で１－ヨードヘキサン５ａ（９．５ｍＬ、６２．６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中溶液を加えた。得られた溶液を室温に加温し、１２時間撹拌した。１２時間後、反応物を０℃に冷却し、水（１００ｍＬ）でクエンチした。次いで反応混合物を真空下で濃縮してテトラヒドロフランを除去し、次いでｎ－ヘキサンで希釈した。有機物を水およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（オクタデカ－６，１１－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、６ａ（３．１ｇ、５７％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.82 (m, 1H), 3.77-3.69 (m, 1H), 3.51-3.47 (m, 1H), 3.41-3.34 (m, 1H), 2.26-2.21 (m, 6H), 2.14-2.12 (m, 6H), 1.66-1.26 (m, 18H), 0.93-0.85 (t, J = 6.5 Hz, 3H).
２－（（（６Ｚ，１１Ｚ）－オクタデカ－６，１１－ジエン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン７ａの合成
水素化ホウ素ナトリウム（０．２７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）のエタノール（５０ｍＬ）中溶液に、水素ブランケット下０℃で酢酸ニッケル（ＩＩ）４水和物（１．５５ｇ、６．２５ｍｍｏｌ）を加えた。添加が完了した時点で、反応物を真空下で排気し、水素でフラッシュした。１０分撹拌した後、エチレンジアミン（１．８ｍＬ、２６．８ｍｍｏｌ）、および２－（オクタデカ－６，１１－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、６ａ（３．１ｇ、８．９３ｍｍｏｌ）のエタノール（１０ｍＬ）中溶液を加えた。反応物を水素風船下室温で４時間撹拌した。４時間後、反応混合物を水素で排気し、次いで窒素でフラッシュした。粗製の混合物をセライト上で濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を重量４ｇで得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％ジエチルエーテルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（（（６Ｚ，１１Ｚ）－オクタデカ－６，１１－ジエン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、７ａ（２．８６ｇ、収率９２％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.4-5.34 (m, 4H), 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.82 (m, 1H), 3.74-3.68 (m, 1H), 3.51-3.49 (m, 1H), 3.41-3.36 (m, 1H), 2.06-1.99 (m, 6H), 1.83-1.67 (m, 2H), 1.59-1.51 (m, 6H),1.48-1.32 (m, 16H), 0.92-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
（６Ｚ，１１Ｚ）－オクタデカ－６，１１－ジエン－１－オール８ａの合成
手順は前記した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.37-5.33 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 1H), 2.06-1.99 (m, 6H), 1.56-1.41 (m, 4H), 1.38-1.27 (m, 14H), 0.88-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
（６Ｚ，１１Ｚ）－オクタデカ－６，１１－ジエン酸９ａの合成
手順は前記した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.38-5.33 (m, 4H), 2.37-2.33 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.06-1.99 (m, 6H), 1.67-1.59 (m, 2H), 1.41-1.25 (m, 14H), 0.89-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１１Ｚ，１１’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１１－ジエノエート）（ＡＫＧ－ＵＯ－１ａ）の合成
手順は前記した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.29 (m, 8H), 5.14-5.12 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.06 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.32-2.28 (m, 6H), 2.20 (s, 6H), 2.03-2.01 (m, 16H), 1.74-1.64 (m, 2H), 1.62-1.60 (m, 6H), 1.38-1.27 (m, 22H), 0.89-0.85 (m, 6H).
MS (APCI+): 658.5 (M+1)
ＡＫＧ－ＢＤＧ－１のための酸中間体の一般的合成は、ｉ）４－ブロモ酪酸からの４－メルカプト酪酸の合成、ｉｉ）４－メルカプト酪酸とＤＰＳとの反応による４－（２－ピリジニルジスルファニル）ブタン酸の調製、ｉｉｉ）３－デシン－１－オールからｃｉｓ－アルケンへの触媒的水素化、ｉｖ）第一級アルコールのトシル化、ｖ）チオ尿素を使用するトシル基の置換による末端チオールの調製、および最後にｖｉ）上記ステップｉｉにて調製した４－（２－ピリジニルジスルファニル）ブタン酸を用いる末端チオールのカップリングによる酸中間体を含むジスルフィドの調製、を含む。３－ドデシン－１－オールを出発物とする同様の合成順序に従って、ＡＫＧ－ＢＤＧ－２の合成に使用する２番目の酸中間体を得た。
スキーム４ ＡＫＧ－ＵＯ－１、ＡＫＧ－ＵＯ－４、ＡＫＧ－ＵＯ－５、ＡＫＧ－ＢＤＧ－１およびＡＫＧ－ＢＤＧ－２の合成
スキーム４に示した脂質ＡＫＧ－ＵＯ－１、ＡＫＧ－ＵＯ－４、ＡＫＧ－ＵＯ－５、ＡＫＧ－ＢＤＧ－１およびＡＫＧ－ＢＤＧ－２の一般的合成は、以下のステップを含む：ｉ）市販されているキラルなジオキソランの第一級アルコールのトシル化、ｉｉ）ジメチルアミンを使用するトシル基の置換による第三級アミンの調製、ｉｉｉ）ジオールの酸触媒脱保護化、および最後にｉｖ）スキーム１～３に従って合成した対応する酸中間体を用いるジオールのエステル化。以下のスキーム５に示した通り、異なるジオキソランおよび対応する酸中間体を出発物とする同様の合成順序に従って、ＡＫＧ－ＵＯ－２を調製する。
スキーム５ ＡＫＧ－ＵＯ－２の合成
スキーム６に示した脂質ＡＫＧ－ＵＯ－３を含むリン酸トリアルキルの一般的合成は、以下のステップを含む：ｉ）市販されているキラルなジオキソランの第一級アルコールとジクロロ亜リン酸メチルとの反応による、対応するクロロ亜リン酸ジアルキルの調製、ｉｉ）３－ブロモプロパノールで処理することによるクロロ亜リン酸ジアルキルにおける塩化物の置換による、対応する亜リン酸トリアルキルの調製、ｉｉｉ）ジオールの酸触媒脱保護化、ｉｖ）スキーム１に従って合成した対応する酸中間体を用いるジオールのエステル化、および最後にｖ）ジメチルアミンを使用する臭素基の置換による第三級アミンの調製。
スキーム６ ＡＫＧ－ＵＯ－３の合成
代替として、炭化水素鎖における二重結合位置の間に２種のメチレン基を有する酸中間体は、Ｃａｂａｌｌｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，ｖｏｌ．１００，ｐ．３３－４０，１９９９に記載されている通りに、またはＤ’ｙａｋｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（Ｄ’ｙａｋｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２０１６，ｖｏｌ．２５，ｐ．３０－３９；Ｄ’ｙａｋｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１３，ｖｏｌ．４９，ｐ ８４０１－８４０３；Ｄ’ｙａｋｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．）により記載されている通りに合成する。
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１２－ジエノエート）（ＡＫＧ－ＵＯ－１、Ｏ－１１９５６）
（Ｓ）－４－（ジエチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１２－ジエノエート）（ＡＫＧ－ＵＯ－１Ａ、Ｏ－１１９５５）
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（ヘキサデカ－６，１２－ジエノエート、ＡＫＧ－ＵＯ－４、Ｏ－１２４０１）
（Ｓ）－４－（ジエチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（ヘキサデカ－６，１２－ジエノエート、ＡＫＧ－ＵＯ－４Ａ、Ｏ－１２４０２）
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１１Ｚ，１１’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１１－ジエノエート）（ＡＫＧ－ＵＯ－１ａ）
実験手順
２－（（５－ブロモペンチル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン２の合成
５－ブロモ－１－ペンタノール１（３．６ｇ、２１．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１００ｍＬ）およびピリジニウムｐ－トルエンスルホネート（４０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）中溶液に、０℃で３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン（６．５４ｍＬ、７１．８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で１時間撹拌し、次いで水でクエンチした。混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブラインで洗浄し、次いで硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（（５－ブロモペンチル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、２（４．５ｇ、８３％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.55-4.54 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 3.92-3.72 (m, 2H), 3.42-3.38 (m, 3H), 1.88-1.55 (m, 3H), 1.52-1.50 (m, 10H).
２－（トリデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン４の合成
１，７－オクタジイン３（６ｍＬ、４５．４ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルホスホルアミド（１６ｍＬ、９０．８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中溶液に、－７８℃で［ｎ－ヘキサン中２．５Ｍ ｎ－ブチルリチウム］（１８ｍＬ、４５．４ｍｍｏｌ）を滴下添加した。添加が完了した時点で、溶液を－７８℃で１時間撹拌し、次いで－２０℃に更に１時間加温した。得られた溶液を－７８℃にもう一度冷却し、その時点で２－（（５－ブロモペンチル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、２（５．６７ｇ、２２．７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中溶液を加えた。得られた溶液を室温に加温し、１２時間撹拌した。１２時間後、反応物を０℃に冷却し、水（１００ｍＬ）でクエンチした。次いで反応混合物を真空下で濃縮してテトラヒドロフランを除去し、次いでｎ－ヘキサンで希釈した。有機物を水およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を重量９ｇで得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（トリデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、４（４．５ｇ、７２％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, d6.DMSO): δ ppm 4.544.53 (m, 1H), 3.72-3.61 (m, 1H), 3.60-3.58 (m, 1H), 3.43-3.33 (m, 1H), 3.32-3.29 (m, 1H), 2.77-2.75 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 2.16-2.13 (m, 6H), 1.55-1.41 (m, 16H).
アルキンのアルキル化のための代表的手順
２－（ヘキサデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン７の合成
２－（トリデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、４（７．１４ｇ、２５．８６ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルホスホルアミド（１８ｍＬ、１０３．４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中溶液に、－７８℃で［ｎ－ヘキサン中２．５Ｍ ｎ－ブチルリチウム］（４１．３ｍＬ、１０３．４ｍｍｏｌ）を滴下添加した。添加が完了した時点で、溶液を－７８℃で１時間撹拌し、次いで－２０℃に更に１時間加温した。得られた溶液を－７８℃にもう一度冷却し、その時点で１－ヨードプロパン５（９．９ｍＬ、１０３．４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中溶液を加えた。得られた溶液を室温に加温し、１２時間撹拌した。１２時間後、反応物を０℃に冷却し、水（１００ｍＬ）でクエンチした。次いで反応混合物を真空下で濃縮してテトラヒドロフランを除去し、次いでｎ－ヘキサンで希釈した。有機物を水およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を重量９ｇで得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（ヘキサデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、７（５．９ｇ、７２％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.57-4.55 (m, 1H), 3.86-3.74 (m, 1H), 3.73-3.71 (m, 1H), 3.50-3.39 (m, 1H), 3.37-3.36 (m, 1H), 2.16-2.11 (m, 8H), 1.59-1.56 (m, 2H), 1.55-1.47 (m, 16H), 0.98-0.93 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
２－（オクタデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン８
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.57-4.55 (m, 1H), 3.85-3.74 (m, 1H), 3.73-3.70 (m, 1H), 3.50-3.38 (m, 1H), 3.36-3.35 (m, 1H), 2.23-2.12 (m, 8H), 1.61-1.54 (m, 2H), 1.53-1.48 (m, 16H), 1.47-1.46 (m, 4H), 0.90-0.85 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
「Ｐ－２ Ｎｉ」を使用するアルキンからアルケンへの還元のための代表的手順
２－（（（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン９の合成
水素化ホウ素ナトリウム（０．５６ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）のエタノール（８０ｍＬ）中溶液に、水素ブランケット下０℃で酢酸ニッケル（ＩＩ）４水和物（３．２２ｇ、１２．９８ｍｍｏｌ）を加えた。添加が完了した時点で、反応物を真空下で排気し、水素でフラッシュした。１０分撹拌した後、エチレンジアミン（３．７ｍＬ、６５．６ｍｍｏｌ）および２－（ヘキサデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、７（５．９ｇ、１８．５５ｍｍｏｌ）のエタノール（１０ｍＬ）中溶液を加えた。反応物を水素風船下室温で４時間撹拌した。４時間後、反応混合物を水素で排気し、次いで窒素でフラッシュした。粗製の混合物をセライト上で濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を重量４ｇで得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％ジエチルエーテルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（（（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、９（４．６７ｇ、収率７８％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.34 (m, 4H), 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.74 (m, 1H), 3.73-3.71 (m, 1H), 3.51-3.39 (m, 1H), 3.36-3.35 (m, 1H), 2.03-1.98 (m, 8H), 1.57-1.39 (m, 2H), 1.38-1.36 (m, 6H), 1.35-1.32 (m, 10H), 0.91-0.86 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
13C NMR (300 MHz, CDCl3): 129.98, 129.85, 98.93, 77.53, 77.10, 76.68, 67.72, 62.43, 30.86, 29.71, 29.70, 29.45, 29.46, 29.44, 27.20, 27.19, 26.01, 25.59, 22.98, 19.78, 13.91.
２－（（（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，１２－ジエン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン１０
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.29 (m, 4H), 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.76 (m, 1H), 3.74-3.68 (m, 1H), 3.51-3.41 (m, 1H), 3.39-3.36 (m, 1H), 2.14-1.97 (m, 8H), 1.56-1.38 (m, 2H), 1.37-1.35 (m, 6H), 1.34-1.28 (m, 14H), 0.93-0.85 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
13C NMR (300 MHz, CDCl3): 130.13, 129.97, 129.84, 129.71, 98.93, 77.53, 77.10, 76.68, 67.71, 62.42, 31.62, 30.86, 29.72, 29.71, 29.47, 29.46, 27.27, 27.18, 26.01, 25.59, 22.67, 19.78, 14.18.
テトラヒドロピラニルエーテル（ＴＨＰ）の脱保護化のための代表的手順
（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－オール１１の合成
２－（（（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、９（４．６７ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ｍＬ）中溶液に、室温でｐ－トルエンスルホン酸一水和物（３００ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で３時間撹拌し、次いで水でクエンチした。混合物を酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を水で洗浄し、次いで硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を重量４ｇで得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％ジエチルエーテルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－オール、１１（２．５ｇ、７２％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.34-5.33 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 2H), 2.02-2.00 (m, 8H), 1.36-1.34 (m, 2H), 1.34-1.25 (m, 10H), 0.89-0.86 (t, J = 0.82 Hz, 3H).
（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，１２－ジエン－１－オール１２
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.33 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 2H), 2.02-2.01 (m, 8H), 1.36-1.35 (m, 2H), 1.34-1.25 (m, 14H), 0.88-0.85 (t, J = 0.76 Hz, 3H).
ジョーンズ試薬を使用するアルコールからカルボン酸への酸化のための代表的手順
（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン酸１３の合成
（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－オール、１１（２．５ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）およびジョーンズ試薬［硫酸中２Ｍ］（１０．５ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）のアセトン（２０ｍＬ）中混合物を、０℃で２時間撹拌した。混合物を水でクエンチし、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中２０％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン酸、１３（１．７ｇ、６８％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.33 (m, 4H), 2.37-2.32 (t, 2H), 2.06-1.98 (m, 8H), 1.64-1.39 (m, 2H), 1.37-1.32 (m, 8H), 0.91-0.87 (t, J = 0.91 Hz, 3H).
（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，１２－ジエン酸１４
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 4H), 2.35-2.33 (t, 2H), 2.06-2.01 (m, 8H), 1.64-1.42 (m, 2H), 1.34-1.28 (m, 12H), 0.90-0.85 (t, 3H).
（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）エチル４－メチルベンゼンスルホネート１６の合成
（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）エタン－１－オール１５（２５ｇ、１７１．１ｍｍｏｌ）のピリジン（３０ｍＬ）中混合物に、０℃でｐ－トルエンスルホニルクロリド（３５．８ｇ、１８８．２ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１４０ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で終夜撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ、水およびブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水した。溶媒を蒸発させ、粗製の残渣を精製せずに次のステップに使用した。（４３．８ｇ、８５％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.15-4.01 (m, 3H), 3.65-3.47 (m, 2H), 2.43 (s, 3H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.32 (s, 3H), 1.27 (s, 3H).
ジアルキルアミン置換のための代表的手順
（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン１９の合成
（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）エチル４－メチルベンゼンスルホネート１６（１０ｇ、３３．３ｍｍｏｌ）およびジメチルアミン溶液１７（１６６ｍＬ、３３３．３ｍｍｏｌ）（ＴＨＦ中２Ｍ）の混合物を、室温で２日間撹拌した。混合物を濃縮し、粗製の残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３、水およびブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水した。溶媒を蒸発させ、粗製の残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ＣＨ２Ｃｌ２＝１％ＮＨ４ＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２中ＭｅＯＨ１００％から１０％）により精製し、無色の油状生成物１９を得た（２．１ｇ、３７％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.15-4.01 (m, 2H), 3.52 (dd, J = 7.4, 7.4 Hz, 1H), 2.41-2.23 (m, 2H), 2.21 (s, 6H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.39 (s, 3H), 1.33 (s, 3H).
MS (APCI+): 174.1 (M+1)
（Ｓ）－２－（２，２－ジエチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン２０
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.15-4.01 (m, 2H), 3.48 (dd, J = 7.4, 7.4 Hz, 1H), 2.48-2.43 (m, 6H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.36 (s, 3H), 1.27 (s, 3H), 0.97 (t, J = 7.2 Hz, 6H).
MS (APCI+): 202.2 (M+1)
ケタール加水分解のための代表的手順
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジオール塩酸塩２１の合成
（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン１９（２ｇ、１１．５４ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中混合物に、１Ｎ ＨＣｌ水溶液（１７ｍＬ、１７．３ｍｍｏｌ）を加え、反応物を８０℃で４５分間加熱した。ＴＬＣ（Ｒｆ＝０．１、１％ＮＨ４ＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨ）は反応が完結していることを示した。反応混合物を濃縮した後、粗製の残渣を水（５ｍＬ）に溶解し、終夜凍結乾燥した。粘着性シロップ状生成物２１（２．１ｇ、定量的）をＨＣｌ塩として得た。
1H NMR (300 MHz, D2O): δ ppm 3.77-3.72 (m, 1H), 3.54-3.46 (m, 2H), 3.29-3.22 (m, 2H), 2.85 (s, 6H), 1.92-1.79 (m, 2H).
MS (APCI+): 134.1 (M+1)
（Ｓ）－４－（ジエチルアミノ）ブタン－１，２－ジオール塩酸塩２２
1H NMR (300 MHz, D2O): δ ppm 3.77-3.72 (m, 1H), 3.54-3.46 (m, 2H), 3.22-3.15 (m, 6H), 1.92-1.74 (m, 2H), 1.24 (t, J = 7.4 Hz, 6H).
MS (APCI+): 162.1 (M+1)
ジエステル化のための代表的手順
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１２－ジエノエート）ＡＫＧ－ＵＯ－１（Ｏ－１１９５６）の合成
塩化オキサリル（０．３３ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）を、０℃で（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，１２－ジエン酸、１４（０．３６ｇ、１．３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン／ＤＭＦ（１５ｍＬ、２５ｍＬ）中溶液に滴下添加し、反応物を室温に加温し、１時間撹拌した。１時間後、反応物を真空下で濃縮乾固した。残渣をジクロロメタン（１０ｍＬ）に再度溶解し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．３ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（３１７ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）および（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジオール塩酸塩、２１（１０１ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。得られた溶液を２４時間撹拌した。２４時間後、反応物を０℃に冷却し、水（１０ｍＬ）でクエンチした。反応混合物をジクロロメタン（２×１００ｍＬ）で抽出し、有機物を水およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてジクロロメタン中２％メタノールを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１２－ジエノエート）、ＡＫＧ－ＵＯ－１（０．１２ｇ、３０％）を黄色油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.40-5.29 (m, 8H), 5.14-5.12 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 12.1, 6.3 Hz, 1H), 2.32-2.26 (m, 6H), 2.20 (s, 6H), 2.06-1.99 (m, 16H), 1.78-1.70 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 4H), 1.42-1.25 (m, 24H), 0.90-0.85 (m, 6H).
MS (APCI+): 658.5 (M+1)
（Ｓ）－４－（ジエチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１２－ジエノエート）ＡＫＧ－ＵＯ－１Ａ（Ｏ－１１９５５）
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.37-5.29 (m, 8H), 5.12-5.10 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 12.1, 3.6 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.52-2.42 (m, 6H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 4H)), 2.06-1.99 (m, 16H), 1.78-1.70 (m, 2H), 1.64-1.59 (m, 4H), 1.41-1.19 (m, 24H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.96-0.87 (m, 6H).
MS (APCI+): 686.6 (M+1)
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（ヘキサデカ－６，１２－ジエノエート）ＡＫＧ－ＵＯ－４（Ｏ－１２４０１）
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.29 (m, 8H), 5.13-5.12 (m, 1H), 4.24 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.32-2.27 (m, 6H), 2.19 (s, 6H), 2.01-1.99 (m, 16H), 1.75-1.72 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 4H), 1.36-1.31 (m, 16H), 0.91-0.86 (m, 6H).
MS (APCI+): 602.5 (M+1)
（Ｓ）－４－（ジエチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（ヘキサデカ－６，１２－ジエノエート）ＡＫＧ－ＵＯ－４Ａ（Ｏ－１２４０２）の合成
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.40-5.29 (m, 8H), 5.12-5.11 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.54-2.43 (m, 6H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 2.11-1.96 (m, 16H), 1.74-1.65 (m, 2H), 1.65-1.59 (m, 4H), 1.39-1.31 (m, 16H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.91-0.89 (m, 6H).
ＭＳ（ＡＰＣＩ＋）：６３０．５（Ｍ＋１）および最後にｖ）ジメチルアミンを使用する臭化物基の置換による第三級アミンの調製。
スキーム７ ＡＫＧ－ＵＯ－３の合成
代替として、炭化水素鎖における二重結合位置の間に２種のメチレン基を有する酸中間体は、Ｃａｂａｌｌｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，ｖｏｌ．１００，ｐ．３３－４０，１９９９に記載されている通りに、またはＤ’ｙａｋｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（Ｄ’ｙａｋｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２０１６，ｖｏｌ．２５，ｐ．３０－３９；Ｄ’ｙａｋｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１３，ｖｏｌ．４９，ｐ ８４０１－８４０３；Ｄ’ｙａｋｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．）により記載されている通りに合成する。
［実施例１Ｂ］イオン化脂質の合成
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１２－ジエノエート）（ＡＫＧ－ＵＯ－１、Ｏ－１１９５６）
（Ｓ）－４－（ジエチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１２－ジエノエート）（ＡＫＧ－ＵＯ－１Ａ、Ｏ－１１９５５）
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（ヘキサデカ－６，１２－ジエノエート、ＡＫＧ－ＵＯ－４、Ｏ－１２４０１）
（Ｓ）－４－（ジエチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（ヘキサデカ－６，１２－ジエノエート、ＡＫＧ－ＵＯ－４Ａ、Ｏ－１２４０２）
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１１Ｚ，１１’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１１－ジエノエート）（ＡＫＧ－ＵＯ－１ａ）
実験手順
２－（（５－ブロモペンチル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン２の合成
５－ブロモ－１－ペンタノール１（３．６ｇ、２１．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１００ｍＬ）およびピリジニウムｐ－トルエンスルホネート（４０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）中溶液に、０℃で３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン（６．５４ｍＬ、７１．８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で１時間撹拌し、次いで水でクエンチした。混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブラインで洗浄し、次いで硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（（５－ブロモペンチル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、２（４．５ｇ、８３％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.55-4.54 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 3.92-3.72 (m, 2H), 3.42-3.38 (m, 3H), 1.88-1.55 (m, 3H), 1.52-1.50 (m, 10H).
２－（トリデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン４の合成
１，７－オクタジイン３（６ｍＬ、４５．４ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルホスホルアミド（１６ｍＬ、９０．８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中溶液に、－７８℃で［ｎ－ヘキサン中２．５Ｍ ｎ－ブチルリチウム］（１８ｍＬ、４５．４ｍｍｏｌ）を滴下添加した。添加が完了した時点で、溶液を－７８℃で１時間撹拌し、次いで－２０℃に更に１時間加温した。得られた溶液を－７８℃にもう一度冷却し、その時点で２－（（５－ブロモペンチル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、２（５．６７ｇ、２２．７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中溶液を加えた。得られた溶液を室温に加温し、１２時間撹拌した。１２時間後、反応物を０℃に冷却し、水（１００ｍＬ）でクエンチした。次いで反応混合物を真空下で濃縮してテトラヒドロフランを除去し、次いでｎ－ヘキサンで希釈した。有機物を水およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を重量９ｇで得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（トリデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、４（４．５ｇ、７２％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, d6.DMSO): δ ppm 4.544.53 (m, 1H), 3.72-3.61 (m, 1H), 3.60-3.58 (m, 1H), 3.43-3.33 (m, 1H), 3.32-3.29 (m, 1H), 2.77-2.75 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 2.16-2.13 (m, 6H), 1.55-1.41 (m, 16H).
アルキンのアルキル化のための代表的手順
２－（ヘキサデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン７の合成
２－（トリデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、４（７．１４ｇ、２５．８６ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルホスホルアミド（１８ｍＬ、１０３．４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中溶液に、－７８℃で［ｎ－ヘキサン中２．５Ｍ ｎ－ブチルリチウム］（４１．３ｍＬ、１０３．４ｍｍｏｌ）を滴下添加した。添加が完了した時点で、溶液を－７８℃で１時間撹拌し、次いで－２０℃に更に１時間加温した。得られた溶液を－７８℃にもう一度冷却し、その時点で１－ヨードプロパン５（９．９ｍＬ、１０３．４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中溶液を加えた。得られた溶液を室温に加温し、１２時間撹拌した。１２時間後、反応物を０℃に冷却し、水（１００ｍＬ）でクエンチした。次いで反応混合物を真空下で濃縮してテトラヒドロフランを除去し、次いでｎ－ヘキサンで希釈した。有機物を水およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を重量９ｇで得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（ヘキサデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、７（５．９ｇ、７２％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.57-4.55 (m, 1H), 3.86-3.74 (m, 1H), 3.73-3.71 (m, 1H), 3.50-3.39 (m, 1H), 3.37-3.36 (m, 1H), 2.16-2.11 (m, 8H), 1.59-1.56 (m, 2H), 1.55-1.47 (m, 16H), 0.98-0.93 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
２－（オクタデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン８
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.57-4.55 (m, 1H), 3.85-3.74 (m, 1H), 3.73-3.70 (m, 1H), 3.50-3.38 (m, 1H), 3.36-3.35 (m, 1H), 2.23-2.12 (m, 8H), 1.61-1.54 (m, 2H), 1.53-1.48 (m, 16H), 1.47-1.46 (m, 4H), 0.90-0.85 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
「Ｐ－２ Ｎｉ」を使用するアルキンからアルケンへの還元のための代表的手順
２－（（（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン９の合成
水素化ホウ素ナトリウム（０．５６ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）のエタノール（８０ｍＬ）中溶液に、水素ブランケット下０℃で酢酸ニッケル（ＩＩ）４水和物（３．２２ｇ、１２．９８ｍｍｏｌ）を加えた。添加が完了した時点で、反応物を真空下で排気し、水素でフラッシュした。１０分撹拌した後、エチレンジアミン（３．７ｍＬ、６５．６ｍｍｏｌ）および２－（ヘキサデカ－６，１２－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、７（５．９ｇ、１８．５５ｍｍｏｌ）のエタノール（１０ｍＬ）中溶液を加えた。反応物を水素風船下室温で４時間撹拌した。４時間後、反応混合物を水素で排気し、次いで窒素でフラッシュした。粗製の混合物をセライト上で濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を重量４ｇで得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％ジエチルエーテルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（（（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、９（４．６７ｇ、収率７８％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.34 (m, 4H), 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.74 (m, 1H), 3.73-3.71 (m, 1H), 3.51-3.39 (m, 1H), 3.36-3.35 (m, 1H), 2.03-1.98 (m, 8H), 1.57-1.39 (m, 2H), 1.38-1.36 (m, 6H), 1.35-1.32 (m, 10H), 0.91-0.86 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
13C NMR (300 MHz, CDCl3): 129.98, 129.85, 98.93, 77.53, 77.10, 76.68, 67.72, 62.43, 30.86, 29.71, 29.70, 29.45, 29.46, 29.44, 27.20, 27.19, 26.01, 25.59, 22.98, 19.78, 13.91.
２－（（（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，１２－ジエン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン１０
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.29 (m, 4H), 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.76 (m, 1H), 3.74-3.68 (m, 1H), 3.51-3.41 (m, 1H), 3.39-3.36 (m, 1H), 2.14-1.97 (m, 8H), 1.56-1.38 (m, 2H), 1.37-1.35 (m, 6H), 1.34-1.28 (m, 14H), 0.93-0.85 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
13C NMR (300 MHz, CDCl3): 130.13, 129.97, 129.84, 129.71, 98.93, 77.53, 77.10, 76.68, 67.71, 62.42, 31.62, 30.86, 29.72, 29.71, 29.47, 29.46, 27.27, 27.18, 26.01, 25.59, 22.67, 19.78, 14.18.
テトラヒドロピラニルエーテル（ＴＨＰ）の脱保護化のための代表的手順
（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－オール１１の合成
２－（（（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、９（４．６７ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ｍＬ）中溶液に、室温でｐ－トルエンスルホン酸一水和物（３００ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で３時間撹拌し、次いで水でクエンチした。混合物を酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を水で洗浄し、次いで硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を重量４ｇで得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％ジエチルエーテルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－オール、１１（２．５ｇ、７２％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.34-5.33 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 2H), 2.02-2.00 (m, 8H), 1.36-1.34 (m, 2H), 1.34-1.25 (m, 10H), 0.89-0.86 (t, J = 0.82 Hz, 3H).
（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，１２－ジエン－１－オール１２
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.33 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 2H), 2.02-2.01 (m, 8H), 1.36-1.35 (m, 2H), 1.34-1.25 (m, 14H), 0.88-0.85 (t, J = 0.76 Hz, 3H).
ジョーンズ試薬を使用するアルコールからカルボン酸への酸化のための代表的手順
（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン酸１３の合成
（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン－１－オール、１１（２．５ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）およびジョーンズ試薬［硫酸中２Ｍ］（１０．５ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）のアセトン（２０ｍＬ）中混合物を、０℃で２時間撹拌した。混合物を水でクエンチし、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中２０％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、（６Ｚ，１２Ｚ）－ヘキサデカ－６，１２－ジエン酸、１３（１．７ｇ、６８％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.33 (m, 4H), 2.37-2.32 (t, 2H), 2.06-1.98 (m, 8H), 1.64-1.39 (m, 2H), 1.37-1.32 (m, 8H), 0.91-0.87 (t, J = 0.91 Hz, 3H).
（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，１２－ジエン酸１４
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 4H), 2.35-2.33 (t, 2H), 2.06-2.01 (m, 8H), 1.64-1.42 (m, 2H), 1.34-1.28 (m, 12H), 0.90-0.85 (t, 3H).
（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）エチル４－メチルベンゼンスルホネート１６の合成
（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）エタン－１－オール１５（２５ｇ、１７１．１ｍｍｏｌ）のピリジン（３０ｍＬ）中混合物に、０℃でｐ－トルエンスルホニルクロリド（３５．８ｇ、１８８．２ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１４０ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で終夜撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ、水およびブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水した。溶媒を蒸発させ、粗製の残渣を精製せずに次のステップに使用した。（４３．８ｇ、８５％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.15-4.01 (m, 3H), 3.65-3.47 (m, 2H), 2.43 (s, 3H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.32 (s, 3H), 1.27 (s, 3H).
ジアルキルアミン置換のための代表的手順
（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン１９の合成
（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）エチル４－メチルベンゼンスルホネート１６（１０ｇ、３３．３ｍｍｏｌ）およびジメチルアミン溶液１７（１６６ｍＬ、３３３．３ｍｍｏｌ）（ＴＨＦ中２Ｍ）の混合物を、室温で２日間撹拌した。混合物を濃縮し、粗製の残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３、水およびブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水した。溶媒を蒸発させ、粗製の残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ＣＨ２Ｃｌ２＝１％ＮＨ４ＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２中ＭｅＯＨ１００％から１０％）により精製し、無色の油状生成物１９を得た（２．１ｇ、３７％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.15-4.01 (m, 2H), 3.52 (dd, J = 7.4, 7.4 Hz, 1H), 2.41-2.23 (m, 2H), 2.21 (s, 6H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.39 (s, 3H), 1.33 (s, 3H).
MS (APCI+): 174.1 (M+1)
（Ｓ）－２－（２，２－ジエチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン２０
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.15-4.01 (m, 2H), 3.48 (dd, J = 7.4, 7.4 Hz, 1H), 2.48-2.43 (m, 6H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.36 (s, 3H), 1.27 (s, 3H), 0.97 (t, J = 7.2 Hz, 6H).
MS (APCI+): 202.2 (M+1)
ケタール加水分解のための代表的手順
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジオール塩酸塩２１の合成
（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン１９（２ｇ、１１．５４ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中混合物に、１Ｎ ＨＣｌ水溶液（１７ｍＬ、１７．３ｍｍｏｌ）を加え、反応物を８０℃で４５分間加熱した。ＴＬＣ（Ｒｆ＝０．１、１％ＮＨ４ＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨ）は反応が完結していることを示した。反応混合物を濃縮した後、粗製の残渣を水（５ｍＬ）に溶解し、終夜凍結乾燥した。粘着性シロップ状生成物２１（２．１ｇ、定量的）をＨＣｌ塩として得た。
1H NMR (300 MHz, D2O): δ ppm 3.77-3.72 (m, 1H), 3.54-3.46 (m, 2H), 3.29-3.22 (m, 2H), 2.85 (s, 6H), 1.92-1.79 (m, 2H).
MS (APCI+): 134.1 (M+1)
（Ｓ）－４－（ジエチルアミノ）ブタン－１，２－ジオール塩酸塩２２
1H NMR (300 MHz, D2O): δ ppm 3.77-3.72 (m, 1H), 3.54-3.46 (m, 2H), 3.22-3.15 (m, 6H), 1.92-1.74 (m, 2H), 1.24 (t, J = 7.4 Hz, 6H).
MS (APCI+): 162.1 (M+1)
ジエステル化のための代表的手順
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１２－ジエノエート）ＡＫＧ－ＵＯ－１（Ｏ－１１９５６）の合成
塩化オキサリル（０．３３ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）を、０℃で（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，１２－ジエン酸、１４（０．３６ｇ、１．３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン／ＤＭＦ（１５ｍＬ、２５μＬ）中溶液に滴下添加し、反応物を室温に加温し、１時間撹拌した。１時間後、反応物を真空下で濃縮乾固した。残渣をジクロロメタン（１０ｍＬ）に再度溶解し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．３ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（３１７ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）および（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジオール塩酸塩、２１（１０１ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。得られた溶液を２４時間撹拌した。２４時間後、反応物を０℃に冷却し、水（１０ｍＬ）でクエンチした。反応混合物をジクロロメタン（２×１００ｍＬ）で抽出し、有機物を水およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてジクロロメタン中２％メタノールを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１２－ジエノエート）、ＡＫＧ－ＵＯ－１（０．１２ｇ、３０％）を黄色油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.40-5.29 (m, 8H), 5.14-5.12 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 12.1, 6.3 Hz, 1H), 2.32-2.26 (m, 6H), 2.20 (s, 6H), 2.06-1.99 (m, 16H), 1.78-1.70 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 4H), 1.42-1.25 (m, 24H), 0.90-0.85 (m, 6H).
MS (APCI+): 658.5 (M+1)
（Ｓ）－４－（ジエチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１２－ジエノエート）ＡＫＧ－ＵＯ－１Ａ（Ｏ－１１９５５）
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.37-5.29 (m, 8H), 5.12-5.10 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 12.1, 3.6 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.52-2.42 (m, 6H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 4H)), 2.06-1.99 (m, 16H), 1.78-1.70 (m, 2H), 1.64-1.59 (m, 4H), 1.41-1.19 (m, 24H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.96-0.87 (m, 6H).
MS (APCI+): 686.6 (M+1)
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（ヘキサデカ－６，１２－ジエノエート）ＡＫＧ－ＵＯ－４（Ｏ－１２４０１）
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.29 (m, 8H), 5.13-5.12 (m, 1H), 4.24 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.32-2.27 (m, 6H), 2.19 (s, 6H), 2.01-1.99 (m, 16H), 1.75-1.72 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 4H), 1.36-1.31 (m, 16H), 0.91-0.86 (m, 6H).
MS (APCI+): 602.5 (M+1)
（Ｓ）－４－（ジエチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（ヘキサデカ－６，１２－ジエノエート）ＡＫＧ－ＵＯ－４Ａ（Ｏ－１２４０２）の合成
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.40-5.29 (m, 8H), 5.12-5.11 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.54-2.43 (m, 6H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 2.11-1.96 (m, 16H), 1.74-1.65 (m, 2H), 1.65-1.59 (m, 4H), 1.39-1.31 (m, 16H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.91-0.89 (m, 6H).
MS (APCI+): 630.5 (M+1)
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１１Ｚ，１１’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１１－ジエノエート）（ＡＫＧ－ＵＯ－１ａ）の合成
実験手順
２－（（５－ブロモペンチル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン２の合成
５－ブロモ－１－ペンタノール１（３．６ｇ、２１．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１００ｍＬ）およびピリジニウムｐ－トルエンスルホネート（４０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）中溶液に、０℃で３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン（６．５４ｍＬ、７１．８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で１時間撹拌し、次いで水でクエンチした。混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブラインで洗浄し、次いで硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（（５－ブロモペンチル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、２（４．５ｇ、８３％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.55-4.54 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 3.92-3.72 (m, 2H), 3.42-3.38 (m, 3H), 1.88-1.55 (m, 3H), 1.52-1.50 (m, 10H).
２－（ドデカ－６，１１－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン４ａの合成
１，６－ヘプタジイン３ａ（５ｇ、５４．３ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルホスホルアミド（１９ｍＬ、１０８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中溶液に、－７８℃で［ｎ－ヘキサン中２．５Ｍ ｎ－ブチルリチウム］（２１．７ｍＬ、５４．３ｍｍｏｌ）を滴下添加した。添加が完了した時点で、溶液を－７８℃で１時間撹拌し、次いで－２０℃に更に１時間加温した。得られた溶液を－７８℃にもう一度冷却し、その時点で２－（（５－ブロモペンチル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、２（６．８ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中溶液を加えた。得られた溶液を室温に加温し、１２時間撹拌した。１２時間後、反応物を０℃に冷却し、水（１００ｍＬ）でクエンチした。次いで反応混合物を真空下で濃縮してテトラヒドロフランを除去し、次いでｎ－ヘキサンで希釈した。有機物を水およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（ドデカ－６，１１－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、４ａ（４．１ｇ、５８％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.57-4.56 (m, 1H), 3.96-3.82 (m, 1H), 3.77-3.69 (m, 1H), 3.50-3.41 (m, 1H), 3.39-3.34 (m, 1H), 2.29-2.25 (m, 4H), 2.15-2.12 (m, 2H), 1.95-1.94 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 1.73-1.43 (m, 14H).
２－（オクタデカ－６，１１－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン６ａの合成
２－（ドデカ－６，１１－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、４ａ（４．１ｇ、１５．６４ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルホスホルアミド（１１ｍＬ、６２．６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中溶液に、－７８℃で［ｎ－ヘキサン中２．５Ｍ ｎ－ブチルリチウム］（１２．５ｍＬ、３１．３ｍｍｏｌ）を滴下添加した。添加が完了した時点で、溶液を－７８℃で１時間撹拌し、次いで－２０℃に更に１時間加温した。得られた溶液を－７８℃にもう一度冷却し、その時点で１－ヨードヘキサン５ａ（９．５ｍＬ、６２．６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中溶液を加えた。得られた溶液を室温に加温し、１２時間撹拌した。１２時間後、反応物を０℃に冷却し、水（１００ｍＬ）でクエンチした。次いで反応混合物を真空下で濃縮してテトラヒドロフランを除去し、次いでｎ－ヘキサンで希釈した。有機物を水およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（オクタデカ－６，１１－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、６ａ（３．１ｇ、５７％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.82 (m, 1H), 3.77-3.69 (m, 1H), 3.51-3.47 (m, 1H), 3.41-3.34 (m, 1H), 2.26-2.21 (m, 6H), 2.14-2.12 (m, 6H), 1.66-1.26 (m, 18H), 0.93-0.85 (t, J = 6.5 Hz, 3H).
２－（（（６Ｚ，１１Ｚ）－オクタデカ－６，１１－ジエン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン７ａの合成
水素化ホウ素ナトリウム（０．２７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）のエタノール（５０ｍＬ）中溶液に、水素ブランケット下０℃で酢酸ニッケル（ＩＩ）４水和物（１．５５ｇ、６．２５ｍｍｏｌ）を加えた。添加が完了した時点で、反応物を真空下で排気し、水素でフラッシュした。１０分撹拌した後、エチレンジアミン（１．８ｍＬ、２６．８ｍｍｏｌ）および２－（オクタデカ－６，１１－ジイン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、６ａ（３．１ｇ、８．９３ｍｍｏｌ）のエタノール（１０ｍＬ）中溶液を加えた。反応物を水素風船下室温で４時間撹拌した。４時間後、反応混合物を水素で排気し、次いで窒素でフラッシュした。粗製の混合物をセライト上で濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を重量４ｇで得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％ジエチルエーテルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（（（６Ｚ，１１Ｚ）－オクタデカ－６，１１－ジエン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン、７ａ（２．８６ｇ、収率９２％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.4-5.34 (m, 4H), 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.82 (m, 1H), 3.74-3.68 (m, 1H), 3.51-3.49 (m, 1H), 3.41-3.36 (m, 1H), 2.06-1.99 (m, 6H), 1.83-1.67 (m, 2H), 1.59-1.51 (m, 6H),1.48-1.32 (m, 16H), 0.92-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
（６Ｚ，１１Ｚ）－オクタデカ－６，１１－ジエン－１－オール８ａの合成
手順は前記した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.37-5.33 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 1H), 2.06-1.99 (m, 6H), 1.56-1.41 (m, 4H), 1.38-1.27 (m, 14H), 0.88-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
（６Ｚ，１１Ｚ）－オクタデカ－６，１１－ジエン酸９ａの合成
手順は前記した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.38-5.33 (m, 4H), 2.37-2.33 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.06-1.99 (m, 6H), 1.67-1.59 (m, 2H), 1.41-1.25 (m, 14H), 0.89-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
（Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）ブタン－１，２－ジイル（６Ｚ，６’Ｚ，１１Ｚ，１１’Ｚ）－ビス（オクタデカ－６，１１－ジエノエート）（ＡＫＧ－ＵＯ－１ａ）の合成
手順は前記した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.29 (m, 8H), 5.14-5.12 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.06 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.32-2.28 (m, 6H), 2.20 (s, 6H), 2.03-2.01 (m, 16H), 1.74-1.64 (m, 2H), 1.62-1.60 (m, 6H), 1.38-1.27 (m, 22H), 0.89-0.85 (m, 6H).
MS (APCI+): 658.5 (M+1)
［実施例１Ｃ］イオン化脂質のＫＣ－０１シリーズの合成
２－（（Ｓ）－２，２－ジ（（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン（ＡＫＧ－ＫＣ２－０１、Ｏ－１２０９５）の合成
３－（（Ｓ）－２，２－ジ（（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン（ＡＫＧ－ＫＣ３－０１、Ｏ－１２０９６）
（６Ｚ，１２Ｚ）－１－ブロモオクタデカ－６，１２－ジエン、２の合成
（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，１２－ジエン－１－オール、１（３．６ｇ、１３．７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）中溶液に、０℃でメタンスルホニルクロリド（１．２６ｍＬ、１６．４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３．６ｍＬ、２０．５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温に加温し、２時間撹拌した。混合物を水でクエンチし、ジクロロメタン（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブラインで洗浄し、次いで硫酸マグネシウムで脱水し、次いで濾過した。濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。得られた油状物をジエチルエーテル（５０ｍＬ）に溶解し、０℃で臭化マグネシウムエチルエーテレート（７ｇ、２７．４ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル（５０ｍＬ）中撹拌スラリー液に加えた。混合物を室温に加温し、２時間撹拌した。反応混合物を水でクエンチし、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブラインで洗浄し、次いで硫酸マグネシウムで脱水し、次いで濾過した。濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１０％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、（６Ｚ，１２Ｚ）－１－ブロモオクタデカ－６，１２－ジエン、３（２．９ｇ、８．８９ｍｍｏｌ、６５％）を黄色油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.33 (m, 4H), 3.42-3.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.04-1.97 (m, 8H), 1.83-1.83 (m, 2H), 1.37-1.28 (m, 14H), 0.90-0.86 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
（６Ｚ，１２Ｚ，２５Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，１２，２５，３１－テトラエン－１９－オール、３の合成
（６Ｚ，１２Ｚ）－１－ブロモオクタデカ－６，１２－ジエン、２（２ｇ、６．０８ｍｍｏｌ）のエーテル（１０ｍＬ）中溶液を、アルゴン下室温でマグネシウム削り状（１６２ｍｇ、６．６９ｍｍｏｌ）およびエーテル（２ｍＬ）中ヨウ素の混合物に加えた。混合物を室温で９０分間撹拌し（マグネシウム削り状は消費された）、その時点でギ酸エチル（０．２４ｍＬ、３．０４ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、反応物を１Ｎ ＨＣｌ溶液でクエンチした。混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物を水次いでブラインで洗浄した。有機物を硫酸マグネシウム下で乾燥し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。得られた油状物をエタノール（１０ｍＬ）に溶解し、水酸化カリウム（２６０ｍｇ）の水（３ｍＬ）中溶液に加えた。１２時間撹拌した後、混合物のｐＨを２Ｎ ＨＣｌで４に調節した。水性溶液をジクロロメタン（２×）で抽出し、合わせた。有機物をブラインで洗浄し、次いで硫酸マグネシウム下で乾燥し、濾過した。濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中１０～３０％酢酸エチルを使用するシリカ上で精製して、（６Ｚ，１２Ｚ，２５Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，１２，２５，３１－テトラエン－１９－オール、３（０．２９ｇ、０．５５ｍｍｏｌ、１８％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 8H), 3.57 (bs, 1H), 3.33-3.32, (m, 2H), 2.13-1.97 (m, 16H), 1.36-1.29 (m, 34H), 0.90-0.86 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
（６Ｚ，１２Ｚ，２５Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，１２，２５，３１－テトラエン－１９－オン、４の合成
（６Ｚ，１２Ｚ，２５Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，１２，２５，３１－テトラエン－１９－オール、３（０．２９ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（３ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン中混合物に、０℃でピリジニウムクロロクロメート（２３６ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温に加温し、１時間撹拌した。１時間後、シリカゲル（１ｇ）を反応物に加え、混合物を濾過した。濾液を濃縮し、得られた油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中１０～２０％酢酸エチルを使用するシリカ上で精製して、（６Ｚ，１２Ｚ，２５Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，１２，２５，３１－テトラエン－１９－オン、４（０．１２ｇ、０．２３ｍｍｏｌ、４２％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 8H), 3.36-3.32, (m, 1H), 2.40-2.35 (t, J = 6.6 Hz, 3H), 2.14-2.00 (m, 16H), 1.58-1.54 (m, 4H), 1.34-1.29 (m, 28H), 0.90-0.86 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
２－（（Ｓ）－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）エタン－１－オール、７の合成
（６Ｚ，１２Ｚ，２５Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，１２，２５，３１－テトラエン－１９－オン、４（０．１２ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、（４Ｓ）－（＋）－４－（２－ヒドロキシエチル）－２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン５（０．２０ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）およびピリジニウムｐ－トルエンスルホネート（９ｍｇ）のトルエン（１０ｍＬ）中混合物を、窒素の陽圧下加熱還流した。１２時間後、混合物を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。得られた粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中２０～４０％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（（Ｓ）－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）エタン－１－オール、７（０．１１ｇ、０．１７ｍｍｏｌ、７７％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 8H), 4.25-4.20 (m, 1H), 4.10-4.06 (m, 1H), 3.82-3.77 (m, 1H), 3.54-3.49 (m, 1H), 2.23-2.19 (t, J = 6.6 Hz, 3H), 2.14-2.00 (m, 16H), 1.84-1.78 (m, 2H), 1.62-1.51 (m, 6H), 1.34-1.29 (m, 28H), 0.90-0.86 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
３－（（Ｓ）－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）プロパン－１－オール、８の合成
（６Ｚ，１２Ｚ，２５Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，１２，２５，３１－テトラエン－１９－オン、４（０．５０ｇ、０．９５ｍｍｏｌ）、（Ｓ）－（３）－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）プロパノール６（０．７６ｇ、４．７５ｍｍｏｌ）およびピリジニウムｐ－トルエンスルホネート（３６ｍｇ）のトルエン（１０ｍＬ）中混合物を、窒素の陽圧下加熱還流した。１２時間後、混合物を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。得られた粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中２０～４０％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、３－（（Ｓ）－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）プロパン－１－オール、８（０．４８ｇ、０．７６ｍｍｏｌ、８０％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.34-5.29 (m, 8H), 4.06-4.02 (m, 2H), 3.67-3.47 (m, 2H), 3.45-3.43 (m, 1H), 2.12-2.01 (m, 16H), 1.65-1.62 (m, 8H), 1.34-1.29 (m, 32H), 0.89-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
２－（（Ｓ）－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン（ＡＫＧ－ＫＣ２－０１、Ｏ－１２０９５）の合成
２－（（Ｓ）－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）エタン－１－オール、７（０．４９ｇ、０．７９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）中溶液に、０℃でメタンスルホニルクロリド（７３μＬ、０．９５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．２６ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温に加温し、追加の１時間撹拌した。反応物を水でクエンチし、ジクロロメタン（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機物をブラインで洗浄し、次いで硫酸マグネシウムで脱水し、濾過した。濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。２Ｍジメチルアミンの溶液（１０ｍＬ）を得られた粗製の油状物に加え、２４時間撹拌した。次いで混合物を水でクエンチし、ジクロロメタン（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブラインで洗浄し、次いで硫酸マグネシウムで脱水し、次いで濾過した。濾液を真空下で濃縮して、粗製の油状物を得た。粗製の油状物を溶出液としてｎ－ヘキサン中５～１００％酢酸エチルを使用するシリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、２－（（Ｓ）－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン（ＡＫＧ－ＫＣ２－０１、Ｏ－１２０９５）（２０６ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、４１％）を透明油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.32 (m, 8H), 4.08-4.03 (m, 2H), 3.47 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.36-2.27 (m, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.01-1.99 (m, 16H), 1.88-1.77 (m, 2H), 1.68-1.53 (m, 6H), 1.42-1.19 (m, 34H), 0.96-0.86 (t, J = 3.7 Hz, 6H).
C43H79NO2のMS(APCI): 642.6
３－（（Ｓ）－２，２－ジ（（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６－１２－ジエン－４－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン、ＡＫＧ－ＫＣ３－０１、Ｏ－１２０９６）の合成
手順は前記した。
透明油状物としての３－（（Ｓ）－２，２－ジ（（６Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６－１２－ジエン－４－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン（ＡＫＧ－ＫＣ３－０１、Ｏ－１２０９６）（２５５ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ、５１％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.32 (m, 8H), 4.06-4.02 (m, 2H), 3.48-3.44 (m, 1H), 2.35-2.30 (m, 2H), 2.25 (s, 6H), 2.01-1.98 (m, 16H), 1.70-1.51 (m, 12H), 1.35-1.25 (m, 32H), 0.90-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
C44H81NO2のMS(APCI): 656.6
２－（（Ｓ）－２，２－ジ（（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン（ＡＫＧ－ＫＣ２－ＯＡ、Ｏ－１１８８０）の合成
２－（（Ｓ）－２，２－ジ（（Ｚ）－ヘキサデカ－９－エン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン（ＡＫＧ－ＫＣ２－ＰＡ、Ｏ－１１８７９）
３－（（Ｓ）－２，２－ジ（（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン（ＡＫＧ－ＫＣ３－ＯＡ、Ｏ－１１９５７）
実験手順（前記したＡＫＧ－ＫＣ２－０１の合成を参照）
（Ｚ）－１－ブロモオクタデカ－９－エン３の合成
手順は前記した。
透明油状物としての（Ｚ）－１－ブロモオクタデカ－９－エン（６．４ｇ、１９．３３ｍｍｏｌ）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 2H), 3.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.01-1.99 (m, 4H), 1.87-1.82 (m, 2H), 1.44-1.26 (m, 22H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
（Ｚ）－１６－ブロモヘキサデカ－７－エン４
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 2H), 3.42 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.01-1.99 (m, 4H), 1.87-1.82 (m, 2H), 1.44-1.26 (m, 18H), 0.89 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
（９Ｚ，２８Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－９，２８－ジエン－１９－オール５の合成
手順は前記した。
固体としての（９Ｚ，２８Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－９，２８－ジエン－１９－オール（１．２ｇ、２．２５ｍｍｏｌ、４７％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.29 (m, 4H), 3.57 (bs, 1H), 2.01-1.97 (m, 8H), 1.42-1.26 (m, 53H), 0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
（７Ｚ，２６Ｚ）－トリトリアコンタ－７，２６－ジエン－１７－オール６
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.29 (m, 4H), 3.57 (bs, 1H), 2.01-1.97 (m, 8H), 1.42-1.26 (m, 45H), 0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
（９Ｚ，２８Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－９，２８－ジエン－１９－オン７の合成
手順は前記した。
透明油状物としての（９Ｚ，２８Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－９，２８－ジエン－１９－オン（０．８９ｇ、１．６７ｍｍｏｌ、７４％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.29 (m, 4H), 2.03-1.98 (m, 8H), 1.42-1.26 (m, 52H), 0.90-0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
（７Ｚ，２６Ｚ）－トリトリアコンタ－７，２６－ジエン－１７－オン８
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.29 (m, 4H), 2.03-1.98 (m, 8H), 1.42-1.26 (m, 44H), 0.90-0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
２－（（Ｓ）－２，２－ジ（（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）エタン－１－オール９の合成
手順は前記した。
透明油状物としての２－（（Ｓ）－２，２－ジ（（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）エタン－１－オール（０．３９ｇ、０．６３ｍｍｏｌ、７４％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.28 (m, 4H), 4.22-4.10 (m, 1H), 4.08-4.05 (m, 1H), 3.82-3.79 (m, 2H), 3.48 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.24-2.21 (m, 1H), 2.01-1.99 (m, 8H), 1.81-1.80 (m, 2H), 1.59-1.54 (m, 6H), 1.34-1.26 (m, 45H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
２－（（Ｓ）－２，２－ジ（（Ｚ）－ヘキサデカ－９－エン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）エタン－１－オール、１０の合成
手順は前記した。
透明油状物としての２－（（Ｓ）－２，２－ジ（（Ｚ）－ヘキサデカ－９－エン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）エタン－１－オール（１．０２ｇ、１．６５ｍｍｏｌ、５１％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.29 (m, 4H), 4.23-4.10 (m, 1H), 4.07-4.05 (m, 1H), 3.82-3.79 (m, 2H), 3.48 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.24-2.12 (m, 1H), 2.01-1.97 (m, 8H), 1.84-1.78 (m, 2H), 1.57-1.55 (m, 8H), 1.34-1.29 (m, 35H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
３－（（Ｓ）－２，２－ジ（（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）プロパン－１－オール、１１の合成
手順は前記した。
透明油状物としての３－（（Ｓ）－２，２－ジ（（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）プロパン－１－オール（０．４１ｇ、０．６５ｍｍｏｌ、７６％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.32 (m, 4H), 4.06-4.03 (m, 2H), 3.71-3.67 (m, 2H), 3.47-3.46 (m, 1H), 2.01-1.99 (m, 10H), 1.66-1.59 (m, 4H), 1.56-1.54 (m, 6H), 1.34-1.26 (m, 44H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
２－（（Ｓ）－２，２－ジ（（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン（ＡＫＧ－ＫＣ２－ＯＡ、Ｏ－１１８８０）の合成
手順は前記した。
透明油状物としての２－（（Ｓ）－２，２－ジ（（Ｚ）－ヘキサデカ－９－エン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン（ＡＫＧ－ＫＣ２－ＯＡ、Ｏ－１１８８０）（２００ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、４９％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.38-5.28 (m, 4H), 4.08-4.01 (m, 2H), 3.48 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.39-2.24 (m, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.01-1.97 (m, 8H), 1.82-1.77 (m, 2H), 1.68-1.52 (m, 6H), 1.34-1.26 (m, 46H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
C43H83NO2のMS(APCI): 646.7
２－（（Ｓ）－２，２－ジ（（Ｚ）－ヘキサデカ－９－エン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン（ＡＫＧ－ＫＣ２－ＰＡ、Ｏ－１１８７９）の合成
手順は前記した。
透明油状物としての２－（（Ｓ）－２，２－ジ（（Ｚ）－ヘキサデカ－９－エン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン（ＡＫＧ－ＫＣ２－ＰＡ、Ｏ－１１８７９）（１９５ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、１８％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.28 (m, 4H), 4.08-4.02 (m, 2H), 3.48 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.38-2.27 (m, 2H), 2.20 (s, 6H), 2.01-1.99 (m, 8H), 1.97-1.80 (m, 2H), 1.77-1.52 (m, 6H), 1.34-1.29 (m, 38H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
C39H75NO2のMS(APCI): 590.6
３－（（Ｓ）－２，２－ジ（（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン（ＡＫＧ－ＫＣ３－ＯＡ、Ｏ－１１９５７）の合成
手順は前記した。
透明油状物としての３－（（Ｓ）－２，２－ジ（（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン（ＡＫＧ－ＫＣ３－ＯＡ、Ｏ－１１９５７）（１６０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、３７％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.28 (m, 4H), 4.06-4.01 (m, 2H), 3.44 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.26 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.20 (s, 6H), 2.01-1.97 (m, 8H), 1.82-1.77 (m, 2H), 1.60-1.43 (m, 8H), 1.34-1.26 (m, 46H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
C44H85NO2のMS(APCI): 660.6
［実施例２］ヒト肝細胞または癌細胞中の細胞傷害性についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ分析
ＬＮＰを、一連の１０個の希釈液によってｉｎ ｖｉｔｒｏで試験し、ヒト肝細胞／肝臓（ＨｅｐＧ２；ＡＴＣＣ＃ＨＢ８０６５）細胞内のＩＣ５０を決定することができる。これらの製剤は、一般的に非毒性であると思われるため、リポフェクタミン（商標）３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃Ｌ３００００１５）複合ｍＲＮＡ（２μＬの試薬／１μｇのｍＲＮＡ）の陽性対照が全試験で含まれる。使用されるｍＲＮＡは、ＣｌｅａｎＣａｐ ＦＬｕｃ、ＥＧＦＰ、またはＭＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ；Ｔｒｉｌｉｎｋ＃Ｌ－７２０２、＃Ｌ－７２０１、または＃Ｌ－７２０３）である。全細胞生存率曲線および各化合物についての実ＩＣ５０値の計算からデータを記録する。
付着細胞を約８０％のコンフルエンシーまで増殖させる。０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ＃２５２００－０７２）を添加し、後続して細胞を沈降させ、５ｍＬの増殖培地（ＭＥＭ培地；Ｃｏｒｎｉｎｇ＃１００１０ＣＭ）を添加して細胞を分散することによって、細胞をトリプシン処理する。細胞密度は、血球計を使用して決定する。増殖培地（１０％ＦＢＳを含有するＭＥＭ培地；Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３５０１５ＣＶ）を細胞に添加して細胞の適当な濃度に調整する。次いで、２００μＬの細胞（５，０００個の細胞／ウェル）を９６ウェルの透明な平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ＃９８０４）に添加し、５％ＣＯ２と共に、加湿インキュベータ中、３７℃で、プレート中にて２４時間インキュベートする。
溶媒として増殖培地を使用してＬＮＰ製剤の連続希釈液を調製する。これらの化合物は、１ｍｇ／ｍＬ ｍＲＮＡの濃度を有する無菌水溶液として生成される。希釈液を作製するために、各ＬＮＰストックを室温まで温めた。これらを増殖培地中でさらに４倍に希釈して、２５０ｕｇ／ｍＬの試験された中で最高のｍＲＮＡ濃度にした。
古い培地を吸引して取り出し、それを２００μＬのＬＮＰ含有培地と置き換えることによって、ＬＮＰを、各ＬＮＰの初期２５０μｇ／ｍＬの濃度から連続して１：３に希釈してウェルに加える。プレートを、加湿インキュベータ中、３７℃で、５％ＣＯ２と共に７２時間インキュベートした。ＬＮＰインキュベーション期間の終わりに、各ウェル中の培地を１００μＬの１Ｘ ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ＃Ａ１３２６１）で置き換える。加湿インキュベータ中、３７℃で、５％ＣＯ２と共に３０分から２時間、プレートをインキュベートする。３０、６０、および１２０分で読み取る。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、５６０ｎｍの励起および５９０ｎｍの発光の蛍光を読み取る。すべての試料の読み取り値から、培養培地のみを含有する対照（バックグラウンド対照ウェル）のＲＦＵを引くことによって、バックグラウンドを補正する。以下の式を用いて細胞傷害性のパーセンテージを算出する：
％細胞傷害性＝［（ＲＦＵ培地－ＲＦＵ処置）／ＲＦＵ培地］×１００％
ＩＣ５０は、以下の式を用いたＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて決定した：
Ｙ＝１００／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０－Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）））
リポフェクタミン（商標）３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃Ｌ３００００１５）複合ｍＲＮＡ（２μＬの試薬／１μｇのｍＲＮＡ）陽性対照の細胞傷害性は、いくつかの実施形態において、本明細書で開示する化合物より５～１００倍強い毒性でありうる。これは、開示された化合物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ肝細胞傷害性の分析において市販のトランスフェクション試薬より低毒性であることを示す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物は、市販のトランスフェクション試薬より低い毒性のＬＮＰをｉｎ ｖｉｖｏで形成する。
［実施例３］イオン化脂質のｐＫａの決定
イオン化カチオン性脂質のｐＫａは、いくつかの方法で算出することができる。脂質では、膜構造および膜の中の隣接する脂質がアミノ基の解離特性に影響を及ぼすことがあり、不正確な値を出す可能性があるため、これは時として困難である。この場合、ＬＮＰの一部として、脂質が意図される環境内にある間、イオン化脂質の見掛けｐＫａが測定されるインサイチュの測定が理想的である（Ｊａｙａｒａｍａｎ ２０１２，Ｓａｂｉｎｓ ２０１８）。
各ＬＮＰ製剤では、ｐＨ３から１２までの滴定中に２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光を測定することによってアミノ脂質のｐＫａ値を決定する。ＴＮＳは、溶液中では蛍光を発しないが、陽性脂質膜と関与すると蛍光が増加するアニオン性分子であり、従来、膜の表面電荷を調べるためにこの特性が使用されてきた。見掛けｐＫａを決定するためのさまざまなｐＨ値の緩衝液を調製するために使用されるマスター緩衝液ストック（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭホウ酸ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）を調製する。１Ｍ水酸化ナトリウムおよび１Ｍ塩酸を使用して、マスター緩衝液ストックから、約３～１２の種々のｐＨ値の約２０種の特有の緩衝液を調製する。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に可溶化された３００ｍＭ ６－（ｐ－トルイジノ）－２－ナフタレンスルホン酸ナトリウム塩（ＴＮＳ試薬）をストックとして使用する。ＬＮＰを調製し、精製して最終ｍＲＮＡ濃度が０．０４ｍｇ／ｍＬの所望のｐＨの緩衝液を得る。９６ウェルプレートを使用して、所望の緩衝液と共に予め挿入し、ｍＲＮＡの最終濃度が０．７μｇ／ｍＬになるようにｍＲＮＡ含有ＬＮＰを添加する。ＤＭＳＯ濃度が１％（ｖ／ｖ）になるように、各ウェルにＴＮＳを添加する。混合後、各ウェル中のＴＮＳの蛍光を測定（Ｅｘ／Ｅｍ＝３３１ｎｍ／４４５ｎｍ）し、Ｓ字形適合度分析（ｓｉｇｍｏｉｄａｌ ｂｅｓｔ ｆｉｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を蛍光データに適用する。ｐＫａは、半値幅蛍光強度をもたらすｐＨとして決定される。化合物１～３６について測定された見掛けｐＫａは、ｐＨ６．０～７．０の範囲内である。
［実施例４］ＬＮＰの細胞取り込みの測定
ＬＮＰの細胞取り込みの測定は、蛍光イメージングおよび／または蛍光定量化によって達成される。１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＩ）、３，３’－ジリノレイルオキサカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＯ）、１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドジカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＤ）およびヨウ化１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）（Ｔｈｅｒｍｏ）などの多くの好適な蛍光トレーサが利用可能である。これらの脂質は、水中で若干の蛍光を発するが、ＬＮＰ中に存在するものなどの脂質膜中に取り込まれると高い蛍光を示す。選択された脂質は光安定性であり、高い消衰係数を有することが重要である。
これらのタイプの脂質を含有するＬＮＰは、蛍光顕微鏡下で視覚化される。一方法において、ＬＮＰ脂質製剤は、総脂質の０．１～０．５モル％の１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドジカルボシアニン－５，５’－ジスルホン酸（ＤｉＩ５－ＤＳ）などの蛍光脂質トレーサを含有する。対象となる細胞を、２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）などの好適な細胞培養皿の中で増殖させる。５０％のコンフルエンシーでの取り込み研究の前日に細胞を播種し、適当な条件下、例えば３７℃、５％ＣＯ２、湿度９０～１００％下で終夜増殖させる。ＬＮＰを０．１～１００ｕｇ／ｍＬ ｍＲＮＡで細胞培養培地に添加し、ある程度の時間（４～２４時間）細胞と相互作用させ、次いで細胞を媒体で３回洗浄し、内在化されていないＬＮＰを除去した後に観察する。蛍光検出能力を備えた顕微鏡を用いて細胞を観察する。バックグラウンド対照として未処置の細胞を使用して、細胞から得た蛍光強度シグナルからＬＮＰ細胞取り込みの相対的範囲を決定する。あるいは、細胞をペレッティングし、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００などの洗浄剤を用いてそれを可溶化し、分光蛍光計によって蛍光を定量化するまたはＨＰＬＣによって蛍光脂質トレーサを定量化することによって、蛍光細胞脂質の定量的測定を達成することができる。
同様のやり方で、蛍光標識ｍＲＮＡの定量化を達成する。例えば、色素標識高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）および蛍ルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）ｍＲＮＡの両方は、１：３の比のシアニン５－ＵＴＰ：５－メトキシ－ＵＴＰで転写され、現在、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である。シアニン５は、６５０ｎｍの励起極大および６７０ｎｍの発光極大を有する。この比での置換によって得られるｍＲＮＡは、容易に視覚化され、依然として細胞培養で翻訳されうる。蛍光標識ｍＲＮＡを捕捉することによって、上記の方法によるｍＲＮＡの細胞内輸送を視覚化することができる。
細胞内のＬＮＰ取り込みは、ＡｐｏＥ介在などの内因性方法、またはアクティブ標的化などの外因性方法によって達成することができる。イオン化カチオン性脂質を含有するＬＮＰ系は、血液中のアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）を吸着し（Ｃｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ ２０１７）、次いでＡｐｏＥ結合リガンドを含有する多数の受容体によって肝細胞中に能動的に取り込まれる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ． ２０１０）「自然」標的化プロセスを利用することが判明した。非重複フルオロフォアを使用することによって、独立して、ｍＲＮＡおよびＬＮＰの細胞内分布およびオルガネラ蓄積動態をトラックすることが可能である。
ｍＲＮＡ細胞発現レベルは、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能な、ＥＧＦＰ、ＦＬｕｃまたはｍＣｈｅｒｒｙなどのレポーター系を使用することによって定量化することができる。一実施形態において、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡをＬＮＰ中にカプセル化し、０．１～１００ｕｇ／ｍＬ ｍＲＮＡで、対象となる細胞に添加される。４～２４時間後に媒体を置き換えて、細胞の非内在化ＬＮＰを洗い落としてもよい。２４時間で、蛍光顕微鏡検査法またはフローサイトメトリーによってＧＦＰシグナルを定量化する。この方法で、レポータータンパク質発現レベルに基づいてＬＮＰ製剤のパネルを区別することが可能である。
［実施例５］トランスフェクション選択指数
トランスフェクション選択指数（ＴＳＩ）を算出して、哺乳類細胞内の相対的トランスフェクション効率を決定する（同じ細胞内の相対毒性と比較する）。選択指数は、以下の式を用いて算出した：
ＴＳＩ＝ＥＦ哺乳類／ＩＣ５０、哺乳類
式中、ＥＦ哺乳類は、タンパク質（ｎｇ）／百万個の細胞に換算して表されるトランスフェクション効率であり、ＩＣ５０、哺乳類は、半値幅抑制濃度に換算した同じ製剤の細胞生存率に関連する。
本明細書に記載の化合物（１～３６）を使用するＬＮＰは、ＩＣＬとして対照分子ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを用いて作製された以外は同一のＬＮＰを使用して作られたＬＮＰより５０％高いＴＳＩを有する。
［実施例６］脂質過酸化反応の分析
酸化度は、ＬＮＰ試料を３％Ｈ２Ｏ２で２５℃にて処理し、０、１、３および５日目に脂質酸化生成物をサンプリングする強制分解アッセイを用いて決定することができる（Ｂｌｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ４，１５９－１６５）。エタノール中の０．１Ｍブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を添加することによって酸化反応を失活させ、測定まで－８０℃で冷凍保存することができる。脂質酸化生成物を、２－チオバルビツール酸（ＴＢＡ）反応性アッセイ（Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ（１９８２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １５０，４５４－４５８）を用いて測定して、脂質過酸化反応の最終生成物のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を検出することができ、または蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）もしくは帯電エアロゾル検出（ＣＡＤ）を用いたＨＰＬＣアッセイを用いた検出によるものでもよい。脂質酸化および異性化の不純物構造は、既知の先行文献に基づいて割り当てることができ、異性体の混合物であることが予測される。
一般的に、当該技術分野において、アシル鎖に複数の不飽和を有する脂質は酸化により感受性であることが知られている（Ｒｅｉｓ ａｎｄ Ｓｐｉｃｋｅｔｔ（２０１２）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８１８，２３７４－２３８７を参照）。
本明細書に記載の化合物１～３６は、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ脂質を含有する対照ＬＮＰと比較したとき、またはＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを含有する対照ＬＮＰと比較したとき、酸化的損傷または分解に対する脆弱性があまりないことが推測される。いくつかの実施形態において、本明細書で提供する化合物は、対照ＬＮＰと比較したとき、酸化副生成物が３０％超、５０％超、７５％超、９０％超、および９５％超少ない。
［実施例７］リガンド標的化ＬＮＰの調製
免疫細胞などの対象となる細胞へのＬＮＰの特異的取り込みをもたらす、抗体Ｆａｂ’フラグメントまたは一本鎖Ｆｖフラグメントの形態の抗体リガンドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって調製される（例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．米国特許出願第２０１８０２７１９９８号；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．米国特許第１０，４０６，２２５号；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第８，９７４，７９２号に記載されている）。リガンドのＬＮＰへの共役をもたらすために、リガンドは、システイン残基を有するＣ末端配列（ＣＡＡまたはＧＧＳＧＧＣなど）によって構築される。リガンドは、細菌または真核細胞中で発現され、タンパク質親和性クロマトグラフィーまたは金属キレート化クロマトグラフィーなどの標準的な方法を用いて細胞の塊または増殖培地から単離される。末端システイン残基のチオール基を活性化するために、リガンドを、１４０ｍＭ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０～６．２）中の１５ｍＭシステインの存在下で１時間インキュベートし、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５または同様のカラム上で、１４０ｍＭ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０～６．２）を溶離液として使用したゲルクロマトグラフィーによって精製する。精製したシステイン活性化リガンド溶液中のタンパク質濃度を、２８０ｎｍでＵＶ分光測光法を用いて決定する。上記の指名された緩衝液中１～１０ｍｇ／ｍＬの抗体リガンドをマレイミド末端ＰＥＧ－ＤＳＰＥ誘導体（ｍａｌ－ＰＥＧ（２０００）－ＤＳＰＥ、カタログ番号８８０１２６、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、米国アラバマ州、またはＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＤＳＰＥ－０２０ＭＡ、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本）の水溶液と、タンパク質／脂質のモル比４：１で混合する。ＬＮＰ表面とリガンド部分との間の距離が長いことが望ましい場合、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能な分子量３，４００（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＤＳＰＥ－０３４ＭＡ）または５，０００（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＤＳＰＥ－０５０ＭＡ）のＰＥＧスペーサーを有するＭａｌ－ＰＥＧ－脂質を使用することができる。溶液を周囲温度下で２時間インキュベートし、０．５ｍＭ システインに調整して未反応マレイミド基をブロックし、ミセル系リガンド－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ複合体を、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ３４（リガンドがＦａｂの場合）またはＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ４４（リガンドがｓｃＦｖの場合）上で、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０～７．４）で緩衝化した１４４ｍＭ ＮａＣｌを溶離液として使用したゲルクロマトグラフィーによって精製する。共役タンパク質をＵＶ分光測光法によって定量化し、ＳＤＳゲル電気泳動によって純度を確定する。
以下の方法のうちの１つによってリガンドをＬＮＰの表面に付加させる。
方法１ 予め形成されたＬＮＰ（引用することにより本明細書の一部をなすものとするＨｏｐｅ ｅｔ ａｌ．ＵＳ１０，６５３，７８０に記載されているとおりに得られる）を、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０～７．２）中のリガンド－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ複合体のミセル溶液と混合して、ＬＮＰ粒子当たりに必要とされる５～１００（典型的には１５～３０）の範囲のリガンド／脂質の比のリガンドが達成される。混合物を３７～４０℃で２時間または２～８℃で終夜、ゆっくり攪拌しながらインキュベートし、その間、複合体がＬＮＰの外部脂質層に取り込まれる。リガンド複合ＬＮＰを、取り込まれなかったリガンド－ＰＥＧ－ＤＳＰＥから、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－２ＢまたはＣＬ－４Ｂ（同じ分画分子量の親水性サイズ排除媒体も使用できる）上でゲルクロマトグラフィーによって精製し、空隙容量が集められる辺りでＬＮＰ留分が出現する。粒子に共役されたリガンドの量は、クマシーブルーまたは蛍光染色および同時に流すリガンド標準物質を用いたＳＤＳゲル電気泳動によって決定される。
方法２ ＬＮＰの核酸成分も含有する１０ｍＭクエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ４．０）中のリガンド－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ複合体の溶液を、ＬＮＰ脂質のエタノール溶液と混合して、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＳｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．米国特許第８，０２１，６８６号に記載の４０体積％の最終エタノール濃度にする。あるいは、Ｈｏｐｅ ｅｔ ａｌ．米国特許第１０，６５３，７８０号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）のＬＮＰ調製プロトコルを用いる。リガンド－ＰＥＧ－ＤＳＰＥの量は、脂質の０．１～１モル％である。混合物をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に対して透析してエタノールを除去する。リガンド－ＰＥＧ－ＤＳＰＥを、結果として得られたＬＮＰ中に取り込む。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４ＢまたはＣＬ－２Ｂ、溶離剤ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水を使用するゲルクロマトグラフィーによって、または５００ＫＤの分画分子量を有するポリスルホン膜（偏平または中空繊維カートリッジ）上での接線流ろ過法によるＨＥＰＥＳ緩衝食塩水の緩衝液交換によって、すべての残留リガンド－ＰＥＧ－ＤＳＰＥを除去する。
方法３ Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥを、方法１のリガンド－ＰＥＧ－ＤＳＰＥと同じ方法で、ＬＮＰ脂質に対して０．１～１モル％の量のクエン酸塩緩衝食塩水（１０ｍＭクエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．０～６．２）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ）中の予め形成されたＬＮＰと合わせる。取り込まれたｍａｌ－ＰＥ－ＤＳＰＥと共にＬＮＰを、取り込まれなかったｍａｌ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥから、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂ上で同じ緩衝液中のゲルクロマトグラフィーによって精製し、チオール活性化抗体リガンド（ＬＮＰ粒子当たり５～１００種のリガンド）と共に２～２４時間インキュベートする。こうして得られたリガンド共役ＬＮＰを、非共役リガンドから、溶離剤としてＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ｐＨ７．０）を使用するＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂゲルクロマトグラフィーによって精製する。
方法４ 方法２のリガンド－ＰＥＧ－ＤＳＰＥと同じ方法で、Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥを、ＬＮＰ脂質の０．１～１モル％のＬＮＰ中に取り込む。得られたＭａｌ－ＰＥＧ－共役ＬＮＰをチオール活性化リガンドと共にインキュベートし、方法３に記載のとおりに精製する。
方法５ ｍａｌ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥの代わりに、ＰＥＧスペーサー（ｍａｌ－ＤＳＰＥ、Ｃｏａｔｓｏｍｅ（登録商標）ＦＥ－８０８ＭＡ３、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本）なしのマレイミド複合脂質を脂質溶液に添加する点は異なるが、方法４のプロトコルを実施する。結果として得られたマレイミド－ＬＮＰを、方法３のとおりに、チオール活性化リガンドに共役させる。
方法６ 低分子リガンド（例えば、マンノース）を、マンノース－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ（Ｂｉｏｃｈｅｍｐｅｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州、カタログ番号１２１６９）が抗体リガンド－ＰＥＧ－ＤＳＰＥと置き換わる、方法１または２によってＬＮＰに共役させる。
［実施例８］リガンド標的化ＬＮＰの最適なリガンド密度の決定
実施例７の方法のいずれかを用いて、所与の範囲（ＬＮＰ粒子当たり２～２００種のリガンドまたはＬＮＰ粒子当たり５～１００種のリガンド）にリガンド密度を増加したＬＮＰパネルを調製する。実施例４に記載のとおりに蛍光標識脂質または蛍光標識核酸を取り込むことによってＬＮＰを蛍光標識する。標識化リガンド共役ＬＮＰを、実施例４による細胞取り込みについて試験し、ＬＮＰの最大のリガンド特異的細胞取り込みに相当するリガンド含有量を決定する。核酸の細胞内機能（ｍＲＮＡ発現など）を分析出力として使用することができ（実施例４）、この場合、脂質または核酸を検出可能な標識の存在は必要ない。
［実施例９］脂質性ナノ粒子（ＬＮＰ）の調製
５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）で修飾され、ｍＣｈｅｒｒｙ（カタログ＃Ｌ－７２０３）をコードするｍＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。すべてのウリジンヌクレオシドをＮ１－メチル－プソイドウリジンで置換した。ｍＲＮＡを生成するために、ｍＲＮＡ配列をコードする合成遺伝子はＤＮＡプラスミドにクローニングされた。合成遺伝子は、ＲＮＡプロモーター、５’未翻訳領域、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質コード配列、３’未翻訳領域、および約１２０Ａｓのポリ（Ａ）テール領域から構成されていた。ＴｒｉＬｉｎｋ（カタログ＃Ｌ－７２０３）由来のｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム配列は、配列番号１：
AUGGUGAGCAAGGGCGAGGAGGACAACAUGGCCAUCAUCAAGGAGUUCAUGCGGUUCAAGGUGCACAUGGAGGGCAGCGUGAACGGCCACGAGUUCGAGAUCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGGCCCUACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCUGAAGGUGACCAAGGGCGGCCCCCUGCCCUUCGCCUGGGACAUCCUGAGCCCCCAGUUCAUGUACGGCAGCAAGGCCUACGUGAAGCACCCCGCCGACAUCCCCGACUACCUGAAGCUGAGCUUCCCCGAGGGCUUCAAGUGGGAGCGGGUGAUGAACUUCGAGGACGGCGGCGUGGUGACCGUGACCCAGGACAGCAGCCUGCAGGACGGCGAGUUCAUCUACAAGGUGAAGCUGCGGGGCACCAACUUCCCCAGCGACGGCCCCGUGAUGCAGAAGAAGACCAUGGGCUGGGAGGCCAGCAGCGAGCGGAUGUACCCCGAGGACGGCGCCCUGAAGGGCGAGAUCAAGCAGCGGCUGAAGCUGAAGGACGGCGGCCACUACGACGCCGAGGUGAAGACCACCUACAAGGCCAAGAAGCCCGUGCAGCUGCCCGGCGCCUACAACGUGAACAUCAAGCUGGACAUCACCAGCCACAACGAGGACUACACCAUCGUGGAGCAGUACGAGCGGGCCGAGGGCCGGCACAGCACCGGCGGCAUGGACGAGCUGUACAAGAGCGGCAACUGA
に相当する。
各脂質のストック溶液を調製した。イオン化脂質を４ｍＬのガラス瓶（Ｔｈｅｒｍｏ Ｂ７９９９－２）中に秤量し、エタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ２００標準強度、ＲＮａｓｅなし）に溶解して１０ｍＭの最終濃度にした。ＤＳＰＳ、コレステロールおよびＰＥＧ－ＤＭＧなどの他の脂質を秤量し、エタノール中に溶解して１ｍＭの濃度にした。ＤＳＰＳを１ｍＭの濃度のメタノール（Ｓｕｌｐｅｌｃｏ、Ｏｍｎｉｓｏｌｖｅ）に溶解し、軽く７０℃に加熱して溶解を完了させた。
所望の体積の各脂質ストック溶液を新しい瓶に加え、必要に応じてエタノールを添加して最終体積１．２ｍＬを達成することによって、個々の各ＬＮＰの脂質混合物を調製した。例えば、Ｎ／Ｐが５の、ＡＫＧ－ＵＯ－１／ＤＳＰＣ／ＤＳＰＳ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０／２．５／７．５／３８．５／１．５モル％）のＬＮＰ製剤は、１００μｇのｍＲＮＡを使用するごとに、１５００ｎｍｏｌのＡＫＧ－ＵＯ－１、７５ｎｍｏｌのＤＳＰＣ、２２５ｎｍｏｌのＤＳＰＳ、１１５５ｎｍｏｌのＣｈｏｌおよび４５ｎｍｏｌのＰＥＧ－ＤＭＧを含有していた。
凍結ｍＲＮＡ（ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ、Ｔｒｉｌｉｎｋ）瓶を解凍し、ｍＲＮＡを６．２５ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中で希釈して最終濃度０．０３３ｍｇ／ｍＬにすることによって、ｍＲＮＡ溶液を調製した。ＬＮＰを調製するために、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｂｅｎｃｈｔｏｐマイクロ流体デバイス（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用した。ＬＮＰがＤＳＰＳを含有していた場合、７０℃に設定した加熱ブロックアクセサリを使用し、そうでない場合はＬＮＰを室温で混合した。３ｍＬのｍＲＮＡ溶液を３ｍＬの使い捨て注射器（ＢＤ３０９６５６）に充填し、１ｍＬの脂質混合物を１ｍＬの注射器（ＢＤ３０９６５９）に充填し、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ加熱ブロック中に４分間入れた後、混合した。混合速度６ｍＬ／ｍｉｎで、３：１の水：アルコール体積比の液体流を使い捨てマイクロ流体カセットに通してポンピングすることによって、ＬＮＰの形成を達成した。混合後、３．６ｍＬのＬＮＰ混合物を集め、最初の０．３５ｍＬの混合容量および最後の０．０５ｍＬの混合液は廃棄した。ＰＢＳ（Ｃｙｔｉｖｉａ、ＳＨ３０２５６．０１）中でＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ透析管類（１２～１４ｋ ＭＷＣＯ）を使用した緩衝液交換によって、またはＡｍｉｎｏｎ Ｕｌｔｒａ－４遠心濃縮器を使用した連続的な濃縮および希釈によってエタノールを除去した。
ＬＮＰは、典型的には、ｐＨ７．４のＰＢＳに交換され、次いで１５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）２０％スクロースに交換され、２０～５０ｕｇ／ｍＬのｍＲＮＡに濃縮され、細菌ろ過（Ｔｈｅｒｍｏ Ｎａｌｇｅｎｅ ０．２ｕｍ＃７２０－１３２０）した後、液体窒素中で５分間浸漬することによって凍結させ、－２０℃で長期貯蔵した。
［実施例１０］ＬＮＰの特性評価
Ａ． 蛍光結合染料によるｍＲＮＡ濃度および相対的カプセル化効率の決定
材料：ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ＃１１４９１）、蓋付き３×９６ウェルプレート、ＰＢＳ、解離緩衝液（ＰＢＳと１０％ＤＭＳＯおよび１％（ｗｔ／ｗｔ）Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３～１４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ＃６９３０１７））、ｍＲＮＡ、一般的ピペットチップ＆リピーターピペットチップ
１． ５ｍＬの２μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡストックをＤＰＢＳまたはＰＢＳ中で調製した。
２． 希釈標準物質を、以下のとおりに、９６ウェルプレート（プレートＡ）中の単一のウェル中で調製した。
３． プレートＡの種々のウェルを使用して、試料を標準曲線の範囲内になるように希釈した（一試料当たり１つのウェルを必要とする）。例えば、おおよそのｍＲＮＡ濃度は、試料中、約３０ｕｇ／ｍＬであるべきであり、２０倍希釈を実施した（希釈係数）。（２０ｕＬの試料を一ウェル中の３８０μＬのＰＢＳに添加した）。プレートＡに蓋は使用しなかった。ピペットで軽く出し入れして試料を混合した。
プレートＡの例
４． さらに２つのプレートのプレートＢおよびＣを使用した。マルチチャネルピペッターを使用して、６０μＬの各標準物質２を、それぞれのウェル（２部セット）にピペットで入れ、それぞれ３つのウェルにサンプリングした（３部セット）。
プレートＢおよびＣの例
５． 各プレートで使用したウェルの数を計数し、この数に４を足した。プレートＢでは、１：１００に希釈したＲｉｂｏＧｒｅｅｎを用いてＰＢＳを調製した。例えば、４０ウェルでは、４４を数として使用した。４４×６０μＬ＝２．６４ｍＬのＲｉｂｏＧｒｅｅｎ溶液を必要とし、したがって２６．４μＬのＲｉｂｏＧｒｅｅｎを有する２．６１ｍＬのＰＢＳになると思われる。
６． プレートＣでは、２．６１ｍＬの解離緩衝液および２６．４ｕＬのＲｉｂｏＧｒｅｅｎをピペット注入した。
７． ６０μＬのリピーターピペットセットを使用して、ＰＢＳ＋ＲｉｂｏＧｒｅｅｎをプレートＢの各ウェルに添加し、６０μＬの解離緩衝液＋ＲｉｂｏＧｒｅｅｎをプレートＣに添加した。両方のプレートＢおよびＣを軌道ミキサー（１２０ｒｐｍ）で１分間混合した。プレートＢを暗所に１５分間置いた。プレートＣを３７℃の暗所で１０分間、後続して室温で５分間インキュベートした。
８． 励起４６５ｎｍ、発光５３０ｎｍを用いて、両方のプレートを交互に読み取った。
９． 標準曲線を用いて、勾配および切片を算出し、外挿によって、プレートＢおよびＣ上の試料のｍＲＮＡ濃度を算出した（平均および標準偏差）。
１０． ［ｍＲＮＡ］プレートＢ／［ｍＲＮＡ］プレートＣ×１００によるカプセル化効率のパーセント（％ＥＥ）を算出した。
１１． ［ｍＲＮＡ］プレートＣ×希釈係数による総［ｍＲＮＡ］を算出した。
Ｂ． ＬＮＰ粒径
１． ３０μＬのＬＮＰを、ポリスチレンのキュベット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、＃６７．７５４）中の１．５ｍＬのＰＢＳと混合し、ＺＳ Ｘｐｌｏｒｅｒソフトウェア（バージョン番号１．４．０．１０５）を用いたＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｐｒｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用してサイズを分析した。Ｚ－平均サイズおよび多分散性指数値を記録した。典型的には、ＬＮＰのサイズの測定は、ＬＮＰ混合後、緩衝液交換後および細菌ろ過後に行った。
Ｃ． ＬＮＰゼータ電位
１． ３０μＬのＬＮＰを１．５ｍＬのＰＢＳと混合し、使い捨てのひだ状キャピラリー細胞（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｅｒｉｅｓ ＤＴＳ１０７０）中に注入し、ＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｐｒｏ上で、２５℃でゼータ電位を測定した。
［実施例１１］ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを使用した、ＬＮＰのマウス樹状細胞中のトランスフェクション効率の決定
Ａ． 細胞増殖、トランスフェクション、採取および染色プロトコル
１． ＭｕｔｕＤＣ１９４０細胞（ＡＢＭ）を、供給業者の指示にしたがって、Ｔ７５フラスコ中で増殖させた。必要に応じて、トランスフェクションに先立って、これらの細胞を、１８０，０００細胞／ウェルで、１日に２４ウェルプレート中に蒔いた。
２． １ｍＬの媒体中１μｇのＬＮＰを各ウェルに３部セットで添加し、２４時間後、細胞をＤＰＢＳ（ＶＷＲ０２－０１１９－１０００）で１回洗浄した。
３． 次いで、０．２ｍＬのＤＰＢＳ（これに加えて５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））を添加して分離を促進させた。
４． 分離されるまで、細胞を３７℃で３分間置いた。
５． ０．５ｍＬのＤＰＢＳを各ウェルに添加し、液体をフローサイトメトリー管（Ｆａｌｃｏｎ ５ｍＬ＃３５２０５４）に移した。
６． 管を１１００ｒｐｍで３～５分間遠心分離し、液体を捨てた。
７． １００μＬのＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）（ＰＢＳ中１：５００希釈）を各管に添加した。
８． 管を軽くたたいて細胞を再懸濁させ、室温で、暗所に１５分間置いた。
９． 細胞に０．５ｍＬの（ＰＢＳ：ＤＰＢＳ＝１：１中、４％のパラホルムアルデヒド）を添加し、細胞を軽くたたいて再懸濁させ、氷の上に３０分間置いた。さらに２ｍＬのＰＢＳを添加した。
１０． 細胞を上記のとおりにペレットにし、５％ＢＳＡを有する０．５ｍＬのＤＰＢＳ中で再懸濁させ、必要になるまで冷蔵庫内に置いた。
Ｂ． 細胞分析
１． 生存／死滅およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光シグナルのそれぞれのためにＶＬ１およびＹＬ２を使用するＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターによって、細胞懸濁液を分析した。ゲーティング分析をＦｌｏＪｏソフトウェアで実行した。
［実施例１２］イオン化カチオン性脂質としてＫＣ２を有するＬＮＰを使用した樹状細胞のトランスフェクション効率に対するＤＳＰＳの影響
本研究の目的は、ＤＳＰＳを使用して、マウス樹状細胞内のトランスフェクション効率へのホスファチジルセリン標的化の効果を調べることであった。ＬＮＰを実施例９に記載のとおりに調製し、実施例１０に記載のとおりに粒径およびゼータ電位について特性評価し、実施例１１に記載のとおりにマウス樹状細胞内のトランスフェクション効率について評価した。全ＬＮＰは、５のＮ／Ｐ比および総脂質の５０モル％で一定のＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡを有し、ＰＳ脂質は最初の０から２．５モル％まで変動し、ＤＳＰＣリン脂質は０から７．５モル％で変動し（ＤＳＰＣおよびＤＳＰＳの総モル％は１０モル％で一定であった）、コレステロールは３８．５モル％で一定であった（総脂質の全モル％）。全製剤の粒径、多分散指数（ＰＤＩ）、および封入効率を、以下の表５および表６に示す。
初期のＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡを含有するＬＮＰのセットおよび０～２．５モル％のＤＳＰＳの形態の種々のホスファチジルセリンは、０モル％または０．５モル％のＤＳＰＳで若干のトランスフェクションを示したが、ＤＳＰＳを２．５モル％で導入したときに１８倍の増加を示した（図３Ａ）。０～７．５モル％のＤＳＰＳで調製された第２のＬＮＰシリーズは、０．１、０．３、および１μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ濃度で評価した（図３Ｂ、図３Ｃ、および図３Ｄ）。ＤＳＰＳのモル％が２．５モル％を超えて増加したのに伴い、トランスフェクション効率が増加し、最大値は、１μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡでの７．５モル％、ならびに０．１および０．３μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡの両方での５モル％であった。これらのデータは、ホスファチジル－Ｌ－セリンを含ませると、ｍＲＮＡ含有ＬＮＰのトランスフェクション効率を劇的に増加することができ、最大取り込みがＤＳＰＳ（総脂質の％として）の５～７．５モル％で生じることを実証している。
［実施例１３］樹状細胞のｍＲＮＡトランスフェクションへの、ＩＣＬおよびアニオン性リン脂質標的リガンドの影響
本研究の目的は、他のアニオン性リン脂質も、ＬＮＰのトランスフェクション効率を強化できるか、また、種々のＩＣＬおよびＰＳ標的化で調製されたＬＮＰがどのように樹状細胞をトランスフェクションすると考えられるかを確認することであった。ＬＮＰを実施例９に記載のとおりに調製し、実施例１０に記載のとおりに粒径およびゼータ電位を特性評価し、実施例１１に記載のとおりにマウス樹状細胞におけるトランスフェクション効率を評価した。ＬＮＰは、５のＮ／Ｐ比および総脂質の５０モル％で一定の種々のＩＣＬ（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＫＣ２－ＯＡ、ＫＣ３－ＯＡ、またはＳＭ－１０２）、を有し、ＰＳ脂質は５モル％で一定に維持され、ＤＳＰＣは５モル％で、ならびにコレステロールは３８．５モル％で一定に維持されていた（全モル％の総脂質）。全製剤の粒径、ＰＤＩ、および封入効率を、以下の表７に示す。
トランスフェクションの結果を図４に示し、３種の異なるＫＣ系のＩＣＬ（ＫＣ２、ＫＣ２－ＯＡ、およびＫＣ３－ＯＡ）、ならびに分岐状ＩＣＬのＳＭ－１０２を用いて調製されたＬＮＰによる高いトランスフェクション率を示す。代替のアニオン性リン脂質（Ｓｕｃ－ＤＳＰＥまたはＧｌｕ－ＤＳＰＥ）を用いて調製されたものを含めて全ての製剤のカプセル化効率は高く、粒径は１００ｎｍ未満であった。データは、ＤＳＰＳ（Ｌ－セリン）が、Ｎ－グルタリル－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（Ｇｌｕ－ＤＳＰＥ）またはＮ－スクシニル－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（Ｓｕｃ－ＤＳＰＥ）のいずれかで置換される可能性がなく、両方のリン脂質が２つの負電荷も含み、両方とも同じジステアロイル（Ｃ１８：０）完全飽和アシル鎖を含有するにもかかわらず、同じ高レベルのｍＲＮＡトランスフェクションをもたらすことを実証する。これらの研究は、ＤＳＰＳの添加が、単一の不飽和アシル鎖を有するもの（ＫＣ２－ＯＡまたはＫＣ３－ＯＡ）およびＳＭ－１０２のような分岐状ＩＣＬを含むものを含めた他のイオン化カチオン性脂質に対して高いトランスフェクション効率をもたらすことができることも明確に示す。ＳＭ－１０２含有ＬＮＰへのＤＳＰＳの添加は、例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ発現に２２倍の増加をもたらした。
［実施例１４］ＰＳ標的化のＩＣＬおよびＰＳ構造への依存
本研究の目的は、ＰＳ標的化ＬＮＰを、種々のアシル鎖組成のＫＣ２およびＫＣ３系イオン化カチオン性脂質と比較することであった。ジメチルアミノエチル頭部基構造の構造を有するＫＣ２系脂質を、ジメチルアミノプロピル誘導体化頭部基を含有するＫＣ３系と比較した。ＬＮＰは、５のＮ／Ｐ比のＩＣＬおよび５０モル％のＩＣＬとしての種々のＩＣＬ（ＫＣ２、ＫＣ２－０１、ＫＣ２－ＯＡ、ＫＣ２－ＰＡ、ＫＣ３－ＯＡ、およびＫＣ３－０１）、ならびに一定の１．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧを含有していた。コレステロール含有量は、３８．５モル％で一定に維持され、ＤＳＰＣ含有量は、０または５モル％のいずれかのＤＳＰＳのモル％に反して変動した（全ての脂質の濃度は、総脂質のモル％として用いられた）。トランスフェクション効率を、実施例１１に記載のとおりにマウス樹状細胞中で評価した。
トランスフェクションの結果を図５に示し、複数のＫＣ系ＩＣＬへのＰＳ標的化のプラス影響を明確に示す。本明細書において、不飽和Ｃ１６およびＣ１８両方のＩＣＬを含有するＩＣＬがホスファチジル－Ｌ－セリンで標的化され得、樹状細胞に高いトランスフェクション率を与えることを示す。最も高いトランスフェクション率は、ＰＳおよびＰＣが、５モル％のＤＰＰＣおよび５モル％のＤＳＰＳと不適合なアシル鎖の組成物を含有し、Ｃ１６ＩＣＬ（ＫＣ２－ＰＡ）と合わせた場合に生じた。
［実施例１５］ＬＮＰのトランスフェクション効率に対するホスファチジルセリン構造の影響
本研究の目的は、樹状細胞中のトランスフェクション効率への、種々のアニオン性リン脂質構造の影響を調べることであった。ＬＮＰを実施例９に記載のとおりに調製し、実施例１０に記載のとおりに粒径およびゼータ電位を特性評価し、実施例１１に記載のとおりにマウス樹状細胞中のトランスフェクション効率を評価した。全てのＬＮＰは、５のＮ／Ｐ比および総脂質の５０モル％で一定のＡＫＧ－ＵＯ－１を有し、アニオン性脂質は、製剤化に応じて、ＤＳＰＣリン脂質に反して変動し、コレステロールは、２０モル％のＤＳＰＳのＬＮＰの場合以外は３８．５モル％で一定であった（全て総脂質のモル％）。最大１０％のホスファチジルセリン成分を含有していた試料の場合、ホスファチジルコリン組成物はこれに応じて１０モル％減少した。例えば、５モル％のＤＳＰＳを有するＬＮＰは、５モル％のＤＳＰＳおよび５モル％のＤＳＰＣを含有し、１０モル％のＤＳＰＳを含有していたものはＤＳＰＣを有していなかった。しかしながら、２０モル％のＤＳＰＳを含有していた試料の場合、製剤中にＤＳＰＣは存在せず、コレステロールのモル％は１０モル％減って２８．５モル％になった。
全製剤の封入効率は、８４～９０％であり、ｍＲＮＡが高い効率でＬＮＰ中に封入されたことを示す。
図６Ａで種々のホスファチジルセリン化学形態の効果を評価し、マウス樹状細胞中のＬＮＰトランスフェクション活性に対する飽和、アシル鎖長、およびセリン立体化学の重要性を示した。オレイン酸アシル鎖を有するまたはＬ－セリンではなく（Ｄ－セリン）の立体化学を有するＰＳ類似体（ＤＯＰＳ）は、ホスファチジルセリンを一切使わずに調製されたＬＮＰと同等のトランスフェクション活性をＬＮＰにもたらした。しかしながら、セリンのＬ異性体および飽和アシル鎖を含有するＰＳを用いて調製されたＬＮＰは、ＰＳを一切含まないＬＮＰと比較して、樹状細胞へのトランスフェクションが有意に良好である。飽和系列の中でも、Ｃ１６を有するもの（ＤＰＰＳ）またはＣ１８を有するもの（ＤＳＰＳ）は最も高い活性を示し、一方で、Ｃ１４を有するもの（ＤＭＰＳ）は、ＰＳを一切含まないＬＮＰで処理した樹状細胞と比較して依然として改善されたが活性は低かった。図６Ｂにおいて、バックグラウンドと同様の活性を示すＤＳＰＧ含有製剤（５または７．５モル％）、およびこれらのＡＫＧ－ＵＯ－１含有ＬＮＰ中に含めたときに３～５倍のより軽度の強化が活性に示されるＮ－グルタリル－またはＮ－スクシニル－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（Ｇｌｕ－ＤＳＰＥまたはＳｕｃ－ＤＳＰＥ）を用いて他のアニオン性リン脂質の影響を評価した。この例は、飽和ホスファチジル－Ｌ－セリンを用いて調製されたＬＮＰが、不飽和ジオレオイルホスファチジル－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）またはＤＳＰＳのＤ異性体を含有するものより有意に良好に樹状細胞にトランスフェクションすることを示す。ＤＳＰＳおよびＤＰＰＳのＬ異性体を含有するＬＮＰは、他の形態のＰＳ、アニオン性Ｎ－グルタリルまたはＮ－スクシニルＤＳＰＥ類似体、またはジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）（５または７．５モル％のいずれか）と比較して最高レベルのトランスフェクションを示した。
［実施例１６］ＡＫＧ－ＵＯ－１含有ＬＮＰ上のＤＳＰＳ密度の最適化
本研究の目的は、ＬＮＰのトランスフェクション効率へのＤＳＰＳ密度の影響を調べることであった。ＬＮＰを実施例９に記載のとおりに調製した。ＬＮＰは、５のＮ／Ｐ比および０～２０モル％のＤＳＰＳのＩＣＬとしてのＡＫＧ－ＵＯ－１、ならびに一定の１．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧを含有していた。コレステロール含有量は、３８．５モル％で一定に維持され、ＤＳＰＣ含有量は、０～１０モル％のＤＳＰＳのモル％に反して変動した（すべての脂質濃度は、総脂質のモル％として使用された）。２０モル％のＤＳＰＳ製剤中、ＤＳＰＣは存在せず、コレステロール含有量は合計で１０モル％（３８．５モル％から２８．５モル％まで）減少した。トランスフェクション効率を、実施例１１に記載のとおりにマウス樹状細胞中で評価した。
ＡＫＧ－ＵＯ－１を含有するＬＮＰの場合の、ＬＮＰ組成物のＤＳＰＳ濃度への依存を図７に示す。この研究は、製剤中のＤＳＰＳの存在が、ＡＫＧ－ＵＯ－１を含有するＬＮＰの場合、２．５～１０モル％のＤＳＰＳの高レベルの樹状細胞のトランスフェクション、および約５～７．５モル％のＤＳＰＳの見掛けピークを可能にすることを示唆する。
［実施例１７］ＡＫＧ－ＵＯ－１含有ＬＮＰのトランスフェクション効率に対するＰＥＧの影響
本研究の目的は、非標的化ＬＮＰおよびホスファチジル－Ｌ－セリン標的化ＬＮＰのトランスフェクション効率へのＰＥＧ－脂質密度の影響を調べることであった。ＬＮＰを実施例９に記載のとおりに調製した。ＬＮＰは、５のＮ／Ｐ比のＩＣＬとしてのＡＫＧ－ＵＯ－１と、０または５モル％のいずれかのＤＳＰＳおよび０．５～４．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧを含有していた。コレステロール含有量は３８．５モル％で一定に維持され、ＤＳＰＣ含有量は、ＤＳＰＳが存在しない製剤では１０モル％であり、５モル％のＤＳＰＳを有する製剤では５モル％であった。１．５モル％超のＰＥＧ－ＤＭＧ含有量で、総コレステロール含有量は、添加したＰＥＧ－ＤＭＧの量の分だけ減り、例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ含有量が３．５モル％の場合、コレステロール含有量は３８．５モル％から３６．５モル％に減少した。０．５％のＰＥＧ－ＤＭＧを有する粒子は、ｐＨ７．４で負のゼータ電位を示し、ｐＨ５で正のゼータ電位への有意にシフトを示した。１．５～３．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧを有するＬＮＰは、ｐＨ７で本質的に中性であった。
ＡＫＧ－ＵＯ－１のＩＣＬを含有するＤＳＰＳ標的化ＬＮＰによる樹状細胞のトランスフェクションへのＰＥＧ－ＤＭＧの影響を図８に示す。０．５％のＰＥＧ－ＤＭＧを有する製剤は、５％のＤＳＰＳの存在下で、１．５～２．５％のＰＥＧ－ＤＭＧで観察されたものより６～７倍高いトランスフェクション効率を示した。１．５％および２．５％のＰＥＧ－ＤＭＧでのトランスフェクションは同様であったが、３．５モル％および４．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧでは劇的に減少した。各ＰＥＧ密度での標的化と非標的化トランスフェクションとの比は変動し、０．５％のＰＥＧで１２倍、１．５％のＰＥＧで７倍、２．５％のＰＥＧで３７倍、および３．５および４．５％のＰＥＧで５倍未満であったが、これはＰＳ標的化部分の高いＰＥＧ遮蔽によるものだと考えられる。これらのデータの組合せは、最適なＰＥＧ密度範囲が０．５～２．５％のＰＥＧ－ＤＭＧであり、範囲の下端が全体のトランスフェクション効率に最適であり、２．５％が標的特異性に最適であることを示す。
［実施例１８］ＩＣＬの酸化安定性
本研究の目的は、加速酸化下で、イオン化カチオン性脂質の安定性を、共役オレフィン（ＫＣ２、ＫＣ３およびＯ－１１７６９など）ならびに共役オレフィンを有するもの（ＫＣ２－０１、ＫＣ３－０１およびＵＯ－１など）と比較することであった。
個々の脂質ストック（１０ｍＭ）をエタノール中で調製し、－２０℃で貯蔵した。実験に先立って、エタノール中１０ｍＭの脂質ストック（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃４５９８３６）４５μＬを超純水（Ｒｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃Ｐ０１－ＵＰＷ０２－１０００）４５μＬと混合することによって、５ｍＭの懸濁液（ＫＣ２、ＫＣ２－０１、ＫＣ３、ＫＣ３－０１、Ｏ－１１７６９およびＵＯ－１）を調製した。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）上、６ｍＬ／ｍｉｎで、１ｍＬのエタノール中の所望の組成の脂質混合物を３ｍＬの６．２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）と合わせることによって、ＡＫＧ－ＵＯ－１およびＯ－１１７６９イオン化カチオン性脂質をベースとするリポソーム製剤（表１２）を調製した。３．６ｍＬの混合物を保持し、初期混合物０．３５ｍＬおよび最終混合物０．０５ｍＬは廃棄した。Ａｍｉｎｏｎ－Ｕｌｔｒａ４遠心濃縮器を５００ｇで４℃にて１０分間使用して各リポソーム調製物を濃縮し、ＰＢＳで元の容量に戻して希釈することによるＰＢＳ（ｐＨ７．４）への緩衝液交換によってエタノールを除去した。このサイクルを、エタノール濃度が１％未満になるまで複数回繰り返した。最後に、リポソームを０．２μｍのＰＥＳ（Ｎａｌｇｅｎｅ）シリンジフィルターに通して細菌ろ過し、ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ）によってサイズ測定した。ＡＫＧ－ＵＯ－１含有製剤（ロット＃１０２０２１－６）は、８１．８ｎｍの平均サイズおよび０．０９のＰＤＩを有し、一方でＯ－１１７６９含有製剤は、８６．６ｎｍの平均サイズおよび０．１０のＰＤＩを有していた。
一定分量のリポソーム製剤を－８０℃で貯蔵し、実験前に解凍した。合わせた１０％Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃Ｈ１００９）および１ｍＭのＦｅ（ＩＩＩ）Ｃｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃３７２８７０）の水中ストックを、処置前に新たに調製した。１％の最終濃度のＨ２Ｏ２および１００μＭ Ｆｅ（ＩＩＩ）Ｃｌを作製するために、１０μＬの１０％Ｈ２Ｏ２／１ｍＭ Ｆｅ（ＩＩＩ）Ｃｌストックを、９０μＬの両方のリポソーム製剤および個々の脂質に添加した。リポソームおよび個々の脂質を、Ｈ２Ｏ２／Ｆｅ（ＩＩＩ）Ｃｌと共に、３７℃でインキュベートし、次いで種々の時点（０、３、２４、４８および７２時間）で各試料から５μＬを採取し、ＨＰＬＣ解析のために９０μＬのＭｅＯＨ中に溶解した。帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）およびＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｃｃｕｃｏｒｅ（商標）Ｃ１８＋ＵＨＰＬＣカラム（Ｌ＝５０ｍｍ、Ｄ＝２．１ｍｍ、粒径＝１．５μｍ）で占有されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｖａｎｑｕｉｓｈ Ｆｌｅｘ ＵＨＰＬＣを使用して、主要な脂質ピークの劣化を分析した。ＵＨＰＬＣ操作条件を表１３に列挙する。
データは、ゼロの時点で測定された脂質ピークに対する、種々の時点で測定された主要な脂質ピークのパーセンテージとして提示される。
図９Ａおよび図９Ｂに示すように、２つのオレフィンの間に４つのメチレンを有するオレフィンを有する全ＩＣＬ（ＫＣ２－０１、ＫＣ３－０１およびＵＯ－１）は、単一のメチレンが２つのオレフィンを分離している同等物（それぞれ、ＫＣ２、ＫＣ３およびＯ－１１７６９）と比較して、過酸化水素による加速酸化下で劇的に優れた安定性を実証する。過酸化水素による７２時間の処置の後でも、ＫＣ２－０１、ＫＣ３－０１およびＵＯ－１の主要ピークは、処置の開始時点に対して７０％超のままであるが、ＫＣ２、ＫＣ３およびＯ－１１７６９は、４８時間の過酸化水素とのインキュベーション後に完全に分解される。２つの他のポリ飽和ＩＣＬ（ＵＯ－６およびＵＯ－７）も同様に酸化に対して良好な安定性を示したが、頭部基中のヒドロキシエチル置換基を有するＵＯ－７は、ジメチルアミノＩＣＬより急速に分解された（表１４）。
複数のメチレンによって分離されたオレフィンを有するＩＣＬの安定性を、構造に関係があるＵＯ－１およびＯ－１１７６９ＩＣＬを使用して、ｍＲＮＡ非含有リポソーム製剤の一部として試験した。その他のイオン化カチオン性脂質（ＫＣ２、ＫＣ２－０１、ＫＣ３およびＫＣ３－０１）は、これらのクロマトグラフのピークがＤＳＰＣのピークと重なり、データ解釈を損なうため、本試験から除外した。ＵＯ－１およびＯ－１１７６９をベースとするリポソーム製剤の安定性データを図９Ａに示す。リポソーム中に配合されたＵＯ－１は、１％の過酸化水素の存在下で７２時間インキュベートした後に７３±０．０５％の主要ＵＯ－１ピークを有する。対照的に、Ｏ－１１７６９をベースとするリポソームは、７２時間の処置後、わずか３．９±０．０６％のＯ－１１７６９ピークを示す。
このデータの全体性は、オレフィン間に複数のメチレンを有するＩＣＬの、実施例１４および２０で実証された、改善されたトランスフェクション効率に加えて、これらの脂質は、酸化による分解に対して顕著に改善された安定性も示すことを示唆する。
［実施例１９］ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ含有ＬＮＰのトランスフェクション効率に対するＮ／Ｐ比の影響
本研究の目的は、樹状細胞内のトランスフェクション効率への種々のＮ／Ｐ比の効果を調べることであった。ＬＮＰを実施例９に記載のとおりに調製し、実施例１０に記載のとおりに粒径およびゼータ電位を特性評価し、実施例１１に記載のとおりにマウス樹状細胞内のトランスフェクション効率を評価した。ＬＮＰは全て、ＫＣ２－０１をＩＣＬとして使用したが、カチオン性脂質とｍＲＮＡホスフェートの（Ｎ／Ｐ）比は４～７で変動し、ＰＳ脂質は５モル％で一定であり、ＤＳＰＣリン脂質含有量は５モル％で一定であり、コレステロールは３８．５モル％で一定であった。全製剤の封入効率は、８４～９０％であり、ＬＮＰ中のｍＲＮＡ封入効率が高いことを示した。実施例１１に記載のとおりにマウス樹状細胞内のトランスフェクション効率を評価した。
１ｕｇ／ｍＬ（図１０Ａ）および０．３３ｕｇ／ｍＬ（図１０Ｂ）の両方での、ＤＳＰＳ標的化および非標的化の両方のＫＣ－０１ ＬＮＰ製剤についてのトランスフェクション活性を評価した。これらのデータは、広範囲のＮ／Ｐ比にわたるＫＣ２－０１含有ＬＮＰの高いＤＳＰＳ介在トランスフェクション効率を示し、最も高いトランスフェクション効率は、Ｎ／Ｐ＝７で観察される。
［実施例２０］ＬＮＰを含有するトランスフェクション効率へのイオン化脂質構造の影響
本研究の目的は、樹状細胞内のトランスフェクション効率への種々のＩＣＬの効果を調べることであった。ＬＮＰを実施例９に記載のとおりに調製し、実施例１０に記載のとおりに粒径およびゼータ電位を特性評価し、実施例１１に記載のとおりにマウス樹状細胞内のトランスフェクション効率を評価した。ＬＮＰは、一定のＮ／Ｐ比＝５のＩＣＬ中に表１６中のイオン化脂質を使用し、ＰＳ脂質は０または７．５モル％であり、ＤＳＰＣリン脂質は１０または２．５モル％（ＤＳＰＣおよびＤＳＰＣの合計は１０モル％であった）で一定でありコレステロール含有量は３８．５モル％で一定であった。
トランスフェクション活性に対する標的化およびＩＣＬ選択の効果を、非標的化ＬＮＰおよび７．５モル％のＤＳＰＳ標的化ＬＮＰの両方を使用して評価した（図１１）。本試験で使用した全てのＩＣＬは、使用されたアシル鎖または特定のイオン化アミン中の不飽和度および不飽和の位置、ならびに、したがって見掛けｐＫａが様々な関連ジアシル構造を有していた。このデータは、４つのメチレン（全長Ｃ１８）によって分離された２つのオレフィンを有するＡＫＧ－ＵＯ１脂質が、ＬＮＰに導入されると最も高い活性を示したことを示す。Ｏ－１１７６９脂質（ジリノール酸）は、ＡＫＧ－ＵＯ－１含有ＬＮＰのおおよそ半分の活性を示し、後者はＣ１６アシル鎖を有するＡＫＧ－ＵＯ４脂質および両方のアシル鎖に同じ頭部基を有するがオレイン酸（単一のオレフィン）を有するＩＣＬ（ＡＫＧ－ＯＡ－ＤＭ２）と同様の活性を有する。しかしながら、ＡＫＧ－ＵＯ－１中のジメチルアミン置換基をＵＯ－１Ａ中のジエチルアミノに変えるか、または２つのエステルとジメチルアミノ基との間のメチレン数を減らす（ＤＯＤＡＰ）と活性が最も低下した。これらの２つの変更は、後者はＤＳＰＳ標的化の存在下でも、トランスフェクション活性に大きな低下をもたらした。
この系列の中でも、７．５モル％のＤＳＰＳを含有していたＬＮＰは、ＤＳＰＳを含まなかったものと比較して、凍結解凍プロセスを経た後、粒径における悪い変化を受けにくかったことも注目すべきである。平均して、ＤＳＰＳを含まなかったＬＮＰは直径に２８．４ｎｍの変化があったが、一方で、ＤＳＰＳを含有していたＬＮＰは３．９ｎｍの変化であった。貯蔵安定性がｍＲＮＡワクチンの主な懸念であるため、ＤＳＰＳの添加は、これらのＬＮＰに重要な安定効果を与える。
［実施例２１］１０および２５モル％のＤＯＰＳの添加が、ＬＮＰ粒子の形成およびＭｕｔｕＤＣ１９４０樹状細胞株における活性に与える効果の測定
本研究の目的は、樹状細胞へのリポソーム取り込みを強化するために、文献（Ｇａｉｔｏｎｄｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３８，１３５－１４５；Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ（２０１８）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９，２５３）に予め示されたモル％以下の組成でＤＯＰＳをｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤に含める影響を調べることであった。ＬＮＰを実施例９に記載のとおりに２５℃で調製し、実施例１０に記載のとおりに分析した。ＬＮＰは、５のＮ／Ｐ比のＩＣＬとしてのＫＣ２と、０、１０および２５モル％のＤＯＰＳおよび一定の１．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧを含有していた。コレステロール含有量は、０％および１０％のＤＯＰＳ製剤では３８．５モル％で一定に維持され、ＤＳＰＣ含有量は、０～１０％のＤＯＰＳのモル％に反して変動した（すべての脂質濃度は、総脂質のモル％として使用した）。２５モル％のＤＯＰＳ製剤中、ＤＳＰＣは存在せず、コレステロール含有量は、合計で１５モル％（３８．５から２３．５モル％に）減少した。実施例１１に記載のとおりにマウス樹状細胞内のトランスフェクション効率を評価した。
樹状細胞へのＬＮＰの標的化に及ぼす１０～２５モル％のＤＯＰＳの影響を図１２で評価した。この研究は、ＫＣ２系ＬＮＰ製剤中に１０モル％のＤＯＰＳを含めることが、ＭｕｔｕＤＣ１９４０細胞内のｍＣｈｅｒｒｙ発現レベルにプラス効果を有し、ｍＲＮＡの粒径またはカプセル化のいずれにも悪影響を及ぼさなかったことを示す。しかしながら、ＤＯＰＳ含有量が２５モル％に増加すると、ｍＣｈｅｒｒｙの発現はＤＯＰＳを含まない製剤より低く、ＰＤＩの増加によって実証されたようにサイズ分布が広がり、４００ｎｍ超の粒子を含有する分布をもたらした。まとめると、文献には、樹状細胞へのリポソーム取り込みを強化するために２５モル％が示され得たが、ｍＲＮＡを有するＬＮＰ製剤中では、粒径およびトランスフェクション活性の両方に悪影響があった。重要なことには、本明細書および文献中で使用したＤＯＰＳ不飽和アシル鎖（この場合、オレイン酸）を含有していた。これは、ホスファチジルセリンアシル鎖が、ｓｎ－２位で不飽和であることが多い（多くの例では、複数のオレイン（２～４つ）を有する）多くの細胞において典型的なものと同様である。低濃度のＤＯＰＳによって僅かな強化があるが、この強化は、ＰＳが飽和アシル鎖、最も好ましくはジパルミトイル（Ｃ１６）またはジステアロイル（Ｃ１８）から構成されたときに有意に高くなることが実施例１５で示された。
［実施例２２］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ｍＲＮＡワクチン構築物の免疫原性に及ぼすペグ化およびホスファチジルセリン標的化の影響
マウスおよび試験設計。ｉｎ ｖｉｖｏ試験を実施した。雌のＢＡＬＢ／ｃマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから購入し、生体動物園内で少なくとも７日間順応させ、試験開始時に６～８週齢にした。試験０日目に、マウスに、５０μＬの体積中１ｕｇのワクチン候補（量はｍＲＮＡを参照する）を右側の大腿四頭筋に筋肉内注射した。試験群は、５匹のマウスからなり、ビヒクル対照、コンパレーターワクチン、および実験的ワクチン候補を含んでいた。２１日後、マウスに、同じワクチン候補の第２の注射を行った。試験開始時の５つの無作為に選択された対照マウスならびに試験２１日目および３４日目の全てのマウスから採血して血清を単離した。抗体力価についての分析まで、血清を－８０℃で貯蔵した。試験３４日目に、マウスを安楽死させ、脾臓を採取した。
ｍＲＮＡの設計および調製。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２全長スパイクタンパク質をコードし、ＢＮＴ１６２ｂ２（コミナティ）ワクチン中に使用される同じＵＴＲに挟まれたｍＲＮＡは、Ｖｅｒｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。すべてのウリジンヌクレオシドは、Ｎ１－メチル－プソイドウリジンで置換された。ｍＲＮＡを生成するために、ｍＲＮＡ配列（ＶＲＮ０２９；配列番号２、図１３Ａ）をコードする合成遺伝子をＤＮＡプラスミドにクローニングした。合成遺伝子は、ＲＮＡプロモーター、５’未翻訳領域、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２スパイクタンパク質受容体結合ドメイン、３’未翻訳領域、および約１２０Ａｓのポリ（Ａ）テール領域で構成されていた。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の培地中でプラスミドを増殖および拡張し、次いでアニオン交換クロマトグラフィーによって清涼化した大腸菌溶解物から単離した。ポリ（Ａ）テールコード領域の末端部分で切断するＩＩ型制限酵素を使用して精製プラスミドを線状化した。次いで、そのプラスミドを緩衝液中でヌクレオチド三リン酸、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮａｓｅ阻害剤と共にインキュベートした。反応を止めるために、ＤＮａｓｅ Ｉを添加して線状プラスミド鋳型を消化した。次いで、クロマトグラフィーを使用してキャッピングされていないＲＮＡを精製し、次いで別の緩衝液中で、ＧＴＰ、Ｓ－アデノシルメチオニン、グアニリルトランスフェラーゼ、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、およびＲＮａｓｅ阻害剤と共にインキュベートした。次いで、キャッピングされたｍＲＮＡを、クロマトグラフィーを使用して精製し、水に緩衝液交換し、瓶に充填した。
ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の生成。各脂質のストック溶液を調製した。イオン化脂質を４ｍＬのガラス瓶（Ｔｈｅｒｍｏ Ｂ７９９９－２）に秤量し、エタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ２００標準強度、ＲＮａｓｅ非含有）に溶解し、最終濃度１０ｍＭを得た。ＤＳＰＣ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、コレステロール（Ｄｉｓｈｍａｎ）およびＰＥＧ－ＤＭＧ（ＮＯＦ）などの他の脂質を秤量し、エタノール中に溶解し、１ｍＭの濃度にした。ＤＳＰＳ－Ｎａ（ＮＯＦ）を１ｍＭの濃度でメタノール（Ｓｕｌｐｅｌｃｏ、Ｏｍｎｉｓｏｌｖｅ）に溶解し、７０℃に軽く加熱して溶解を完了させた。
所望の容量の各脂質ストック溶液を新しい瓶に添加し、必要に応じてエタノールを添加して最終容量１．２ｍＬを達成することによって、個々の各ＬＮＰの脂質混合物を調製した。例えば、Ｎ／Ｐが５のＡＫＧ－ＵＯ－１／ＤＳＰＣ／ＤＳＰＳ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０／２．５／７．５／３８．５／１．５モル％）のＬＮＰ製剤は、１００μｇのｍＲＮＡを使用するごとに、１５００ｎｍｏｌのＡＫＧ－ＵＯ－１、７５ｎｍｏｌのＤＳＰＣ、２２５ｎｍｏｌのＤＳＰＳ、１１５５ｎｍｏｌのＣｈｏｌおよび４５ｎｍｏｌのＰＥＧ－ＤＭＧを含有していた。ｍＲＮＡ溶液は、凍結ｍＲＮＡ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡ、Ｖｅｒｎａｌ）瓶を解凍し、６．２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中でｍＲＮＡを最終濃度０．０３３ｍｇ／ｍＬに希釈する（濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ上で吸光度によって確定される）ことによって調製した。
ＬＮＰを調製するために、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｂｅｎｃｈｔｏｐマイクロ流体デバイス（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用した。ＬＮＰがＤＳＰＳを含有していた場合、７０℃に設定した加熱ブロックアクセサリを使用し、そうでなければＬＮＰを室温で混合した。３ｍＬのｍＲＮＡ溶液を３ｍＬの使い捨て注射器（ＢＤ３０９６５６）に装填し、混合前に、１ｍＬ注射器（ＢＤ３０９６５９）中１ｍＬの脂質混合物をＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ加熱ブロック中に４分間置いた。混合速度６ｍＬ／ｍｉｎで、３：１の水：アルコール体積比の液体流を使い捨てマイクロ流体カセットに通してポンピングすることによって、ＬＮＰの形成を達成した。混合後、３．６ｍＬのＬＮＰ混合物を集め、最初の０．３５ｍＬの混合容量および最後の０．０５ｍＬの混合液は廃棄した。ＰＢＳ（Ｃｙｔｉｖｉａ、ＳＨ３０２５６．０１）中でＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ透析管類（１２～１４ｋ ＭＷＣＯ）を使用した緩衝液交換によってエタノールを除去した。ＬＮＰは、典型的にはＰＢＳ（ｐＨ７．４）、次いで１５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２０％スクロースに交換され、２０～５０ｕｇ／ｍＬのｍＲＮＡに濃縮され、細菌ろ過（Ｔｈｅｒｍｏ Ｎａｌｇｅｎｅ ０．２μｍ＃７２０－１３２０）し、その後、液体窒素中に５分間浸漬することによって凍結させ、－２０℃で長期貯蔵した。本試験では、試料を＞４０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡまで濃縮し、さまざまな容量の１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０％スクロース（ｐＨ７．４）を用いて標的濃度４０μｇ ｍＲＮＡに希釈し、次いでＬＮ２上で凍結させた。一定分量のＬＮＰを解凍し、最終濃度が、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％スクロース（ｐＨ７．４）中２０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡになるように、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）で１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）希釈した後、ＬＮＰの特性評価を行った。これは、後肢へのＩＭ注射を介した５０μＬの容量中１μｇ ｍＲＮＡの動物への注射による投与に先立って行われた試料の調製の条件をシミュレートした。
ＬＮＰの特性評価。ｍＲＮＡカプセル化およびＬＮＰ中のｍＲＮＡ濃度を、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイを用いて測定した。ナノ粒子サイズおよびゼータ電位は、ＺｅｔａＳｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗スパイク抗体力価。標準間接ＥＬＩＳＡを実施して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する総ＩｇＧ結合抗体について血清試料を分析した。このアッセイでは、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルプレートを、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中２μｇ／ｍＬに希釈した１００μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号４０５８９－Ｖ０８Ｂ１）でコーティングした。プレートを、３７℃で１２時間、静的にインキュベートした。非結合コーティング抗原は、プレートを１００μＬのＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０で３回洗浄することによって除去した。次いで、プレートをＰＢＳ＋５％の脱脂乳中で１時間、３７℃でブロックした。試験試料および陽性対照試料を、アッセイ希釈剤（ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ－２０、１％の脱脂乳）中で、開始点の希釈１：２０に希釈し、後続してＵ底希釈プレートを使用して４倍連続希釈した。ブロッキングが完了したら、転化によってブロッキングバッファーを除去し、各試料を２セットずつプレート化した。プレートを３７℃で２時間、静的にインキュベートした後、１００μＬのＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０で３回洗浄して非結合血清を除去した。１００μＬの二次検出抗体（ヤギ抗マウスＨＲＰ ＩｇＧ、Ａｂｃａｍ）を、１：１０，０００の希釈で各ウェルに添加した。プレートを室温で３０分間、静的にインキュベートし、後続して非結合抗体を除去し、プレートを上述するように洗浄した。展開させるために、１００μＬの１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ基質を各ウェルに添加し、５０μＬのＴＭＢ停止液（ＳｅｒａＣａｒｅ、カタログ番号５１５０－００１９）で約１０分後に反応を停止した。３０分以内に、Ｔｈｅｒｍｏ ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ分光光度計を用いてプレートを４５０ｎｍで読み取った。力価は、滴定曲線の直線部のＯＤ４５０の特異的カットオフ値を出した希釈の逆数として規定される。
Ｅｘ ｖｉｖｏのＴ細胞応答。試験３４日目に、脾臓を機械的に単一細胞懸濁液に解離した。細胞を細胞刺激培地（Ｌ－グルタミンおよびＨＥＰＥＳ緩衝液、非働化ウシ胎児血清、およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを有するＲＰＭＩ）中で再懸濁させ、２×１０６個の細胞を、１００μＬの容量で一定分量とり、９６ウェルプレートに添加した。各マウス由来の脾細胞は、約１８時間、３７℃で、ＰＭＡおよびイオノマイシンを含有する陽性対照のＣｅｌｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ＃００－４９７０－９３）、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を覆う１μｇ／ｍＬのペプチドプール（ＪＰＴ、カタログ＃ＰＭ－ＷＣＰＶ－Ｓ－２）で処理した１００μＬの培地のみによって刺激を受けた。刺激の１時間後、Ｇｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃５５４７２４）を各ウェルに添加した。
フローサイトメトリー。刺激後、細胞をＰＢＳで洗浄し、９６ウェルディープウェルプレートに移した。細胞を、４℃で２０分間、ＰＢＳ中で希釈したＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ近赤外生存色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ＃Ｌ１０１１９）で染色した。細胞をＦＢＳ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃５５４６５６）で洗浄し、Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ５５３１４２）で１０分間、４℃でインキュベートした。次いで、細胞を、４℃で４０分間、ＣＤ３ ＢＶ６０５（ＢＤ、カタログ＃５６４００９）、ＣＤ４ ＢＶ４２１（ＢＤ、カタログ＃５６２８９１）、およびＣＤ８ ＡＰＣ（ＢＤ、カタログ＃５５３０３５）からなる細胞表面抗体カクテルを用いて染色した。ＢＤ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ＃５６３７９４）が染色緩衝液に含まれていた。細胞をＦＢＳ染色感触液で洗浄し、次いでＦｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ＃００－５５２３－００）を用いて、室温で２０分間、固定した。細胞をＰｅｒｍ緩衝液で１回洗浄し、Ｆｃ Ｂｌｏｃｋを用いてインキュベートし、次いでＩＦＮ－ｇ ＰＥ／Ｃｙ７（ＢＤ、カタログ＃５５７６４９）、ＩＬ－２ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ＃５０３８０８）およびＴＮＦ－ａ ＦＩＴＣ（ＢＤ、カタログ＃５５４４１８）からなる細胞内サイトカイン抗体カクテルを用いて、４℃で４０分間、染色した。次いで、細胞を洗浄し、ＦＢＳ染色緩衝液中で再懸濁させ、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １６フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）上で獲得した。ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．８．１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して流量データを分析した。
ワクチン免疫原性に及ぼすＰＥＧ－脂質濃度の影響を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＰＥＧ－脂質（ＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ＤＰＰＥ）を増量して含有するｍＲＮＡ－ＬＮＰで免疫化した。プライム後２１日目およびブースト後１３日目（試験３４日目）に抗体分析のための血清を採集した。脾細胞をスパイクペプチドプールによって刺激し、フローサイトメトリーを使用して、ＩＬ－２を生成するＣＤ４ Ｔ細胞のパーセントを定量化した（図１３Ｂおよび図１３Ｃ）。ＰＥＧ－ＤＭＧ（図１３Ｂ）およびＰＥＧ－ＤＰＰＥ（図１３Ｃ）の両方の形態のＰＥＧは、反対にｍＲＮＡ－ＬＮＰＡワクチン免疫原性に影響を与え、より低い濃度のＰＥＧ－脂質は、より高レベルのＢ細胞およびＴ細胞の両方の応答を示した。
ｍＲＮＡ－ＬＮＰ免疫原性に及ぼすＰＥＧ－脂質アシル鎖組成の影響を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、異なるＰＥＧフォーマット（ＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ＤＳＧ）を含有するｍＲＮＡ－ＬＮＰで免疫化した。プライム後２１日目およびブースト後１３日目（試験３４日目）に血清を採集した。脾細胞をスパイクペプチドプールによって刺激し、フローサイトメトリーを使用して、ＩＬ－２を生成するＣＤ４ Ｔ細胞のパーセントを定量化した。統計分析に先立って、抗体力価データを対数変換した。対応のないｔ検定を用いて群を比較した。イオン化脂質ＫＣ２ＯＡを用いて作製されたＬＮＰの場合、いずれのＰＥＧフォーマットも同様に機能した（図１３Ｄ）。対照的に、イオン化脂質ＵＯ１およびＰＥＧ－ＤＭＧを使用したＬＮＰは、ＰＥＧ－ＤＳＧを含有するＬＮＰより優れた抗体応答を誘発した（図１３Ｅ）。
ホスファチジルセリンの導入がどのようにｍＲＮＡ－ＬＮＰ免疫原性に影響を及ぼすかを評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＤＳＰＳを含むまたは含まない、さまざまなイオン化脂質を含有するｍＲＮＡ－ＬＮＰで免疫化した。３４日目（ブースト後１３日目）に、ＥＬＩＳＡによる総ＩｇＧ抗スパイク抗体の定量化のために血清を採集した。脾細胞をペプチドで刺激し、ＩＬ－２を産生するＣＤ４ Ｔ細胞のパーセントを、フローサイトメトリーを使用して定量化した。
ＤＳＰＳとコンパレーターイオン化脂質ＡＬＣ－０３１５の含有は、総ＩｇＧ抗スパイク抗体レベルに悪影響を及ぼした（図１３Ｆ）。ＤＳＰＳは、イオン化脂質ＵＯ１およびＫＣ２ＯＡを含有するＬＮＰには反対の効果を有し、それぞれ３６倍および４６倍に幾何平均抗体レベルを大きく増加させた。また、ＤＳＰＳは、ＣＤ４ Ｔ細胞応答にも影響があり、応答は、ＵＯ１およびＫＣ２ＯＡを含有するＬＮＰで高くなり、ＳＭ－１０２の場合は顕著に高くなる傾向にあった。まとめると、脂質ナノ粒子中のＤＳＰＳの含有は、ｍＲＮＡワクチンの免疫原性に実質的に影響し得、ＤＳＰＳの影響は、イオン化カチオン性脂質のタイプによって影響される。
血清抗体力価に与える異なるホスファチジルセリンアシル鎖組成の効果（図１３Ｇ、パネルＡ）および脾臓中のスパイク特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の応答度（図１３Ｇ、パネルＢ）を評価した。マウスを、イオン化脂質ＵＯ１およびＤＳＰＳまたはＤＰＰＳのいずれかの形態のホスファチジルセリンを使用するＬＮＰで免疫化した。３４日目（ブースト後１３日目）に、ＥＬＩＳＡによる総ＩｇＧ抗スパイク抗体の定量化のために血清を採集した。脾細胞をペプチドによって刺激し、ＩＬ－２を産生するＣＤ４ Ｔ細胞のパーセントを、フローサイトメトリーを使用して定量化した。
ＰＳアシル鎖組成の影響に関しては、両方の形態のＰＳは、ＰＳを欠く基本製剤と比較して同程度に抗体レベルを増加した（図１３Ｇ、パネルＡ）。また、ＤＰＰＳを含有する製剤のみが、ＰＳを含まない基本製剤より有意に高かったが、両方の形態のＰＳは、ＣＤ４ Ｔ細胞応答にプラス効果も有した（図１３Ｇ、パネルＢ）。まとめると、本発明者らのＬＮＰ、ＤＰＰＳまたはＤＳＰＳに含まれていた両形態のＰＳは、ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンの免疫原性の増加に同様のプラス効果を有していた。
［実施例２３］ＭｕｔｕＤＣ１９４０樹状細胞株内の粒子特性および活性によるＫＣ２－０１系ＬＮＰ中７．５モル％のＤＳＰＳ Ｄ異性体またはＬ異性体のいずれかの添加の効果の測定
本研究の目的は、ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤中に７．５モル％でＤＳＰＳのＤおよびＬ異性体を含める影響を比較することであった。ＬＮＰを実施例９に記載のとおりに２５℃で調製し、実施例１０に記載のとおりに分析した。ＬＮＰは、５のＮ／Ｐ比のＩＣＬとして
のＫＣ２－０１に加えて、２．５モル％のＤＳＰＣ、７．５モル％のＤＳＰＳ（ＤまたはＬ）および一定の１．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧを含有していた。実施例１１に記載のとおりにマウス樹状細胞内でトランスフェクション効率を評価した。
この試験は、ＫＣ２－０１系ＬＮＰ製剤中の７．５モル％のＤＳＰＳ（いずれかの異性体）の含有が、粒径またはｍＲＮＡカプセル化に影響がなかったことを示す。ゼータ電位の値はｐＨ５で同様であるが、ＤＳＰＳ含有製剤は、ｐＨ７で、非ＤＳＰＳ含有製剤よりマイナスの値を有し、追加の負電荷の結果がＤＳＰＳによって与えられたと考えられる。トランスフェクションへの立体化学の影響を、図１４Ａおよび図１４Ｂで評価した。１μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡのＬ異性体と比較して、ＤＳＰＳのＤ異性体を使用したとき、ｍＣｈｅｒｒｙ発現に８倍の増加が観察され（０．３３μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡでは４．７倍）、ＤＳＰＳ含有ＬＮＰの取り込みまたは発現機構は立体特異的であると考えられることを示した。
［実施例２４］ＭｕｔｕＤＣ１９４０樹状細胞株内の粒子特性および活性に及ぼす２５℃および６５℃でのＫＣ２系ＬＮＰ中のＤＳＰＳの含有の効果の測定
本研究の目的は、２つの異なる温度で生成されたＫＣ２系ＬＮＰ中のＤＳＰＳのＤ異性体の含有の影響を比較することであった。ＬＮＰを実施例９に記載のとおりに調製したが、ＤＳＰＳを含有するＬＮＰは６５℃で作製し、ＤＳＰＳを含まないＬＮＰは２５℃で作製し、実施例１０に記載のとおりにすべてのＬＮＰを分析した。
全ＬＮＰは、一定の１．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧと共に、５のＮ／Ｐ比のＩＣＬを含有していた。コレステロール含有量は、３８．５モル％で一定に維持され、ＤＳＰＣ含有量は、５モル％および７．５モル％のＤＳＰＳのモル％に反して変動した（全脂質濃度は、総脂質のモル％として使用された）。これらのｍＲＮＡ ＬＮＰは全て、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを含有し、ｍＲＮＡ－１２７３に使用されたものと同じ脂質組成であるＳＭ－１０２系脂質製剤を使用したコンパレーター製剤、およびＢＮＴ１６２ｂ２に使用されたものと同様のＡＬＣ－０３１５を使用したコンパレーター製剤の組成を、これらのそれぞれの処方情報から得た。ＡＬＣ－０３１５を使用したＢＮＴ１６２ｂ２コンパレーターは、認可されたコロナワクチンのコミナティとは異なる本試験における他の製剤に合わせて、５．０のＮ／Ｐで作製された。
この試験は、６５℃に設定した加熱ブロック中での脂質溶液およびｍＲＮＡ溶液の加熱が、５または７．５モル％いずれかのＤＳＰＳ含有量での粒径またはゼータ電位またはｍＲＮＡカプセル化の読み取りに悪影響がなかったことを示す。ＤＳＰＳ標的化ＫＣ２ ＬＮＰのトランスフェクションへの温度の影響、ならびにＳＭ１０２およびＡＬＣ－０３１５含有ＬＮＰとの比較を図１５に示す。５モル％のＤＳＰＳ製剤は、２５℃で作製した全く同じ製剤より２倍高いｍＣｈｅｒｒｙ発現を有していた（ｐ＜０．０５、Ｔ検定）。いずれの温度で作製された７．５モル％のＤＳＰＳを有する製剤の比較も、有意な差を示さなかった。６５℃で作製された５モル％のＤＳＰＳ含有ＬＮＰは、ＳＭ１０２製剤と比較してｍＣｈｅｒｒｙ発現に６．５倍の増加をもたらした。高温がアルコール中のＤＳＰＳの溶解度を上げ、粒子中の脂質の導入をより良好にし、このｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において強化された取り込みを可能にすると同時に、サイズ、カプセル化またはｍＲＮＡ発現などのＬＮＰの重要な粒子特性の多くに悪影響を与えないと考えられる。
［実施例２５］ＤＳＰＳを有するまたは有さないＬＮＰ中のＵＯ１、ＵＯ６および７の比較
本研究の目的は、７．５モル％のＤＳＰＳを有するＬＮＰおよび７．５モル％のＤＳＰＳを有さないＬＮＰ中のＡＫＧ－ＵＯ－６（「ＵＯ－６」）およびＡＫＧ－ＵＯ－７（「ＵＯ－７」）を評価することであった。先に、７．５モル％のＤＳＰＳが、ＵＯ－１系列から最も適したＬＮＰを生成したことが発見された。本明細書では、７．５モル％のＤＳＰＳを、含有するＤＳＰＳの初期の量として選択し、構造が類似しているＵＯ－６および７を比較した。ＬＮＰを実施例９に記載のとおりに調製し、実施例１０に記載のとおりに分析した。
ＬＮＰは、５０モル％のＩＣＬとしてＵＯ－１、ＵＯ－６またはＵＯ－７のいずれかを含有していた。製剤はまた、３８．５モル％のコレステロール、および１．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧも含有していた。ＤＳＰＳを含有しない試料は、１０モル％のＤＳＰＣを有し、７．５モル％のＤＳＰＳを含有するＬＮＰには、ＤＳＰＳが７．５モル％で添加され、ＤＳＰＣが２．５モル％含まれていた。全製剤のＮ／Ｐは５であった。実施例１１に記載のとおりにマウス樹状細胞内のトランスフェクション効率を評価した。
この試験は、ＵＯ１、ＵＯ６およびＵＯ７をベースとするＬＮＰ中のＤＳＰＳの含有が、粒径またはｍＲＮＡ封入に悪い変化を与えずに、ｍＣｈｅｒｒｙの発現を増加させたことを示す。樹状細胞のトランスフェクション活性に対するＬＮＰ中への７．５％のＤＳＰＳ導入の影響を、３つの異なるＩＣＬ（ＵＯ－１、ＵＯ－６およびＵＯ－７）を用いて調製された製剤について示した（図１６）。ＵＯ－１と７．５モル％のＤＳＰＳの場合、ｍＣｈｅｒｒｙ発現は、ＵＯ６と７．５モル％のＤＳＰＳより１１倍高く、ＵＯ７と７．５モル％のＤＳＰＳより７倍高かった。ＵＯ－７とＤＳＰＳは、ＵＯ６とＤＳＰＳより１．５倍多いｍＣｈｅｒｒｙ発現を有していた。ＤＳＰＳを含有しない製剤の中では、ＵＯ７はＵＯ１より２．２倍活性であり、ＵＯ６より１．９倍活性であった。しかしながら、３つのＩＣＬすべてを用いて調製されたＬＮＰは、良好なカプセル化効率、粒径、およびゼータ電位を維持し、同時に製剤中のＤＳＰＳ含有による標的化からのメリットもあった。
［実施例２６］ＭｕｔｕＤＣ１９４０樹状細胞株の粒子特性および活性の比較によるＵＯ１、ＳＭ１０２およびＡＬＣ－０３１５系ＬＮＰへのＤＳＰＳの添加の効果の評価
本研究の目的は、０、５％および７．５モル％のＤＳＰＣのＬ異性体をｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤中に含める効果を評価することであった。ＬＮＰは、実施例９に記載のとおりに２５℃で調製し、実施例１０に記載のとおりに分析した。
ＬＮＰは、５０モル％でＩＣＬとしてＡＫＧ－ＵＯ－１（「ＵＯ－１」）、ＳＭ１０２のいずれかを含有していた。ＵＯ１およびＳＭ１０２では、製剤は、３８．５モル％のコレステロールおよび１．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧを含有していた。ＤＳＰＳを含有していない試料は１０モル％のＤＳＰＣを有し、ＤＳＰＳ含有ＬＮＰには、５または７．５モル％のＤＳＰＳが添加され、同時にＤＳＰＣが同じモル％減少した。ＡＬＣ－０３１５製剤の場合、ＩＣＬは４６．３モル％であり、ＤＳＰＣは９．４モル％、コレステロールは４２．７モル％およびＰＥＧ－ＤＭＧは１．５モル％であった。ＤＳＰＳが添加され、同時に上述のＤＳＰＣモル％が減少した。全製剤のＮ／Ｐは５であった。実施例１１に記載のとおりにマウス樹状細胞内のトランスフェクション効率を評価した。
この試験は、ＵＯ１、ＳＭ１０２およびＡＬＣ－０３１５をベースとするＬＮＰ中にＤＳＰＳを含有すると、粒径またはｍＲＮＡ封入に悪い変化をもたらさずに、ｍＣｈｅｒｒｙの発現の増加を引き起こした（図１７）ことを示す。ＵＯ－１およびＳＭ１０２の場合、５モル％のＤＳＰＳが最大に見え、一方で、ＡＬＣ－０３１５製剤では、７．５モル％のＤＳＰＳが最大であった。ＵＯ－１およびＳＭ１０２では、発現の増加は、それぞれ、５モル％のＤＳＰＳ試料の場合の１８．１倍および５８．７倍であった。増加は、７．５モル％のＤＳＰＳの場合のＡＬＣ－０３１５ベースの試料で８０．９倍であった。
［実施例２７］追加の例示的ホスファチジル－Ｌ－セリン標的化ＬＮＰ製剤
以下に示す追加の製剤も、上記の実施例に記載の方法を用いて調製することができる。すべての脂質濃度は、ＬＮＰ中の総脂質のパーセンテージとしてのモル％で示す。以下の組成物は、複合脂質含有量が０．５～２．５モル％、ステロール含有量が２５～４５モル％、ＩＣＬ含有量が４０～６５モル％、飽和ホスファチジル－Ｌ－セリン含有量が２～１０モル％、および合計の非カチオン性リン脂質含有量が５～２０モル％で変動する。ほとんどの組成物は、２つのリン脂質、典型的にはホスファチジル－Ｌ－セリン（ＤＳＰＳまたはＤＰＰＳが好ましい）およびホスファチジルコリンを含有すると考えられるが、一部の例示的な製剤は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のようなホスファチジルエタノールアミンを含めた３つ以上のリン脂質を含有しうる。
本開示のさまざまな態様は、単独で、組み合わせて、または前述の実施形態において具体的に考察されなかったさまざまな配置で用いることができ、したがって、前述の説明に記載されたまたは図面に例示された構成要素の詳細および配置への適用に限定されない。例えば、一実施形態に記載される態様は、いずれかの方法で、他の実施形態に記載の態様と組み合わせてもよい。
主題となる開示内容の具体的な実施形態を考察してきたが、上記の明細書は例示目的のものであり、制限されるものではない。本開示の多くの変更が、本明細書を見直すと、当業者に明らかになるであろう。本開示の全範囲は、特許請求の範囲を、その同等物の全範囲と共に参照することによって、また、本明細書を、該変更と共に参照することによって決定するべきである。
本明細書で引用された全ての刊行物、特許文献、および特許出願は、全ての目的のために、それぞれの個々の刊行物、特許文献または特許出願が引用することにより本明細書の一部をなすものとすることが明確に示されたかのように同程度に、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

Claims (71)

  1. 頭部基に共有結合された一対の直鎖状ポリ不飽和脂質テールからなる化学構造を有するイオン化脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物であって、前記頭部基が、６～７のｐＫａを有するジアルキルアミノ基を含み、
    前記頭部基が、前記ジアルキルアミノ基に共有結合されたヘテロシクリルまたはアルキル部分を含み、任意選択によりホスフェート基をさらに含み、
    各ポリ不飽和脂質テールが、前記脂質テールの長さに沿う少なくとも２つのメチレン基によって分離された少なくとも２つのオレフィン以外は不飽和であり、任意選択により、前記頭部基に共有結合された前記脂質テールの末端に単一アシル基を含む、組成物。
  2. 各脂質テールが同一であり、各脂質テールが、非置換エチレン、ｎ－プロピル、またはｎ－ブチルのみによって分離された合計２つのオレフィンを有する、請求項１に記載の組成物。
  3. 各脂質テールが、前記頭部基の酸素に結合してエステルを形成するアシル基をさらに含み、前記アシル基を含む合計１６または１８個の炭素原子を有する、請求項２に記載の組成物。
  4. ａ． 前記頭部基の前記ジアルキルアミノ部分が、式（ＩＶ－Ａ）の化学構造
    ［ここで、
    式（ＩＶ－Ａ）中のｎは、２、３または４であり、
    式（ＩＶ－Ａ）中のＲ１０およびＲ１２は、それぞれ独立して、メチル、エチル、およびプロピルからなる群から選択されるアルキル基から選択され、Ｒ１０およびＲ１２中の前記アルキルは、任意選択により、１つ以上のヒドロキシルで置換される］を有し、
    ｂ． 前記イオン化脂質が、式（ＩＶ－Ａ）の前記ジアルキルアミノ部分から遠位の頭部基の一部に共有結合された各脂質テールのアシル基を含む化学構造
    をさらに含み、ここで、
    は、前記頭部基内の式ＩＶ－Ａへの連結を示し、Ｒ２２は、前記アシル基に共有結合された各脂質テールの一部を示し、式Ａ：
    の化学構造を有し、ここで、式Ａ中、
    は、各脂質テール内の式ＡとＲ２２との連結を示し、
    ａは、４、１、２、または３であり、
    ｂは、４、２、または３であり、
    ｃは、４、３、５、６、または７であり、
    ただし、式Ａ中のａ、ｂおよびｃの合計が１２、１０、１１、または１３である、
    請求項２に記載の組成物。
  5. 式（ＩＶ－Ａ）中のＲ１０およびＲ１２が、それぞれ独立して、メチル、エチル、－（ＣＨ２）（ＣＨ２）ＯＨ、または－（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ＯＨである、請求項４に記載の組成物。
  6. ｂが４であり、式（ＩＶ－Ａ）中のＲ１０およびＲ１２がそれぞれメチルである、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記イオン化脂質が、式（Ｉ－Ａ）
    ［式中、
    ａは、４、１、２、３、５または６であり、
    ｂは、４、３または２であり、
    ｃは、４、３、５、６、または７であり、
    ａ、ｂおよびｃの合計は、１２または１０であり、
    ｑは、１、２、３または４であり、
    Ｒ１０およびＲ１２は、それぞれ独立して、任意選択により１つ以上のヒドロキシルで置換されている（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、
    Ｌは、
    であり、ここで、ｖは０または１であり、ｑ２は２または１である］
    の化学構造を有する、請求項１に記載の組成物。
  8. ｖが０であり、ｑが１、２または３である、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記イオン化脂質が、ＡＫＧ－ＵＯ－１、ＡＫＧ－ＵＯ－１Ａ、ＡＫＧ－ＵＯ－１Ｂ、ＡＫＧ－ＵＯ－２、ＡＫＧ－ＵＯ－４、ＡＫＧ－ＵＯ－４Ａ、ＡＫＧ－ＵＯ－５、ＡＫＧ－ＵＯ－６、ＡＫＧ－ＵＯ－７、ＡＫＧ－ＵＯ－７、ＡＫＧ－ＵＯ－８、ＡＫＧ－ＵＯ－９、およびＡＫＧ－ＵＯ－１０：
    からなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
  10. ａ． 核酸、
    ｂ． 請求項１から９のいずれか１項に記載のイオン化脂質、
    ｃ． ステロール、
    ｄ． ホスファチジルセリン（ＰＳ）脂質を含む１種以上のリン脂質を含み、
    ｅ． 任意選択により複合脂質をさらに含む、
    組成物１から９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記ステロールがコレステロールである、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記１種以上のリン脂質が、
    ａ． ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣおよびＤＯＰＣからなる群から選択される１種以上のリン脂質、ならびに
    ｂ． ＤＰＰＳ、ＤＳＰＳおよびＤＯＰＳからなる群から選択されるＰＳ脂質
    からなる、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記１種以上のリン脂質が、
    ａ． ＤＳＰＳ、ならびに
    ｂ． （Ｌ－セリン）ＤＰＰＳおよび（Ｌ－セリン）ＤＳＰＳからなる群から選択される１種以上のＰＳ脂質
    からなる、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記組成物中の総脂質の２．５～１０モル％の総量の前記ＰＳ脂質を含む、請求項１３に記載の組成物。
  16. 前記複合脂質がＰＥＧを含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. ａ． 核酸、
    ｂ． ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の４０～６５モル％の総量のイオン化カチオン性脂質、
    ｃ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２５～４５モル％の総量のステロール、
    ｄ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の５～２５モル％のリン脂質の総量の１種以上のリン脂質であって、前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量のホスファチジルセリン（ＰＳ）を含む、１種以上のリン脂質を含み、
    ｅ． 任意選択により前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の０．５～２．５モル％の総量の複合脂質をさらに含む、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物。
  18. 前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記ステロールがコレステロールである、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記１種以上のリン脂質が、ＤＳＰＣおよびＬ－セリンＰＳからなる、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記組成物中の総脂質の５．０～７．５モル％の総量の前記ＰＳを含む、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記複合脂質がＰＥＧを含む、請求項１７から２１のいずれか１項に記載の組成物。
  23. 前記複合脂質がＰＥＧ－ＤＭＧである、請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記ＬＮＰが、前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の０．５～１．５モル％の総量の複合脂質を含む、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記ＬＮＰが、前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の１モル％未満の総量の複合脂質を含む、請求項２４に記載の組成物。
  26. ａ． 前記核酸がｍＲＮＡであり、
    ｂ． 前記イオン化カチオン性脂質の総量が、前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の４５～５５モル％であり、
    ｃ． ステロールが、前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の３５～４５モル％の総量のコレステロールであり、
    ｄ． リン脂質の総量が、前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の７～１５モル％であり、
    ｅ． 前記１種以上のリン脂質がＤＳＰＣからなり、前記ＰＳ脂質が、ＤＰＰＳおよびＤＳＰＳのＬ－セリン型からなる群から選択される１種以上の脂質であり、
    ｆ． 前記ＰＳ脂質の総量が、前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の３～９モル％である、請求項１７に記載の組成物。
  27. 前記ＰＳ脂質を、前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の１．２５モル％、２．５モル％、５モル％、７．５モル％、および１０モル％から選択される総量で含む、請求項２６に記載の組成物。
  28. ａ． ｍＲＮＡである核酸、
    ｂ． ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の４５～５５モル％の総量のイオン化カチオン性脂質、
    ｃ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の３５～４５モル％の総量のコレステロールであるステロール、
    ｄ． リン脂質の総量が前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の１０モル％であり、前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の３～９モル％の総量のホスファチジルセリン（ＰＳ）を含む、１種以上のリン脂質、
    ｅ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の０．５～１．５モル％の総量の複合脂質
    を含む、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物。
  29. 前記ＰＳ脂質が、ＤＳＰＳ（Ｌ異性体）、ＤＰＰＳ（Ｌ異性体）、ＤＭＰＳ（Ｌ異性体）、ＤＯＰＳ（Ｌ異性体）、ＤＳＰＳ（Ｄ異性体）、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＧ、Ｎ－Ｇｌｕ－ＤＳＰＥ、およびＮ－Ｓｕｃ－ＤＳＰＥからなる群から選択される、請求項１７から２８のいずれか１項に記載の組成物。
  30. ａ． 前記複合脂質がＰＥＧ－ＤＭＧであり、
    ｂ． 前記ＰＳ脂質が、ＤＳＰＳ（Ｌ異性体）およびＤＰＰＳからなる群から選択される、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記イオン化カチオン性脂質が、化合物１～２８（表１）、化合物２９～３８（表２）、ＡＫＧ－ＵＯ－１、ＡＫＧ－ＵＯ－１Ａ、ＡＫＧ－ＵＯ－１Ｂ、ＡＫＧ－ＵＯ－１Ｂ、ＡＫＧ－ＵＯ－２、ＡＫＧ－ＵＯ－３、ＡＫＧ－ＵＯ－４、ＡＫＧ－ＵＯ－４Ａ、ＡＫＧ－ＵＯ－５、ＡＫＧ－ＢＤＧ－０１、ＡＫＧ－ＢＤＧ－０２、ＡＫＧ－ＵＯ－６、ＡＫＧ－ＵＯ－７、ＡＫＧ－ＵＯ－８、ＡＫＧ－ＵＯ－９、およびＡＫＧ－ＵＯ－１０からなる群から選択される１種以上の化合物である、請求項１７から２８のいずれか１項に記載の組成物。
  32. 前記イオン化カチオン性脂質が、化合物１～３、５～８、９～１２、１４～２８からなる群から選択される１種以上の化合物である、請求項１７から２８のいずれか１項に記載の組成物。
  33. 前記イオン化カチオン性脂質が、化合物２９～３８からなる群から選択される１種以上の化合物である、請求項１７から２８のいずれか１項に記載の組成物。
  34. 前記イオン化カチオン性脂質が、ＫＣ２－ＯＡ、ＫＣ３－ＯＡ、Ｄｌｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤｌｉｎＫＣ３－ＤＭＡ、ＫＣ２－ＰＡ、ＤＯＤＡＰ、ＡＫＧ－ＯＡ－ＤＭ２、ＡＫＧ－ＯＡ－ＤＭ３、Ｏ－１１７６９、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＡＬＣ－０３１５およびＳＭ－１０２からなる群から選択される１種以上の化合物である、請求項１７から２８のいずれか１項に記載の組成物。
  35. ａ． 核酸、
    ｂ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の５０モル％の総量のイオン化カチオン性脂質、
    ｃ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の３８．５モル％の総量のコレステロール、
    ｄ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の７～１５モル％の総量の１種以上のリン脂質であって、前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の３～９モル％の総量のホスファチジルセリン（ＰＳ）脂質を含む、１種以上のリン脂質、および
    ｅ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の０．５～１．５モル％の総量のＰＥＧ含有脂質
    を含む、請求項１７に記載の核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物。
  36. 前記リン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、およびＤＯＰＣからなる群から選択される１種以上のリン脂質からなる、請求項３４に記載の組成物。
  37. 前記ＰＳ脂質が、ＤＰＰＳおよびＤＳＰＳからなる群から選択される１種以上のＬ－セリン脂質である、請求項３６に記載の組成物。
  38. 前記１種以上のリン脂質が、不適合なアシル鎖長を有する少なくとも２つの（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質を含む、請求項１７に記載の組成物。
  39. 前記ＰＳ脂質がＤＰＰＣおよびＤＳＰＳである、請求項３８に記載の組成物。
  40. 前記ＤＰＰＣおよびＤＳＰＳが、それぞれ、前記ＬＮＰ中に、前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量に対して、それぞれ５モル％の総量で存在する、請求項３９に記載の組成物。
  41. 核酸、イオン化カチオン性脂質ＡＫＧ－ＵＯ－１、および（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質を、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量で含む、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物。
  42. 前記核酸がｍＲＮＡであり、前記ＰＳ脂質が、（Ｌ－セリン）ＤＳＰＳ、（Ｌ－セリン）ＤＰＰＳ、またはこれらの混合物であり、前記ＬＮＰ組成物が、コレステロールならびにＤＳＰＣ、ＤＰＰＣおよびＤＯＰＣからなる群から選択される第２のリン脂質をさらに含む、請求項４１に記載の組成物。
  43. 前記ＬＮＰ組成物が、前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量に対して、０．５～１．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ＤＳＧをさらに含む、請求項４２に記載の組成物。
  44. 核酸、ＫＣ２ＯＡ、ＫＣ２、ＫＣ２－０１、ＡＬＣ０３１５、およびＳＭ１０２から選択されるイオン化カチオン性脂質、ならびに（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質を、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量で含む、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物。
  45. 前記ＬＮＰ組成物が、３～８のＮ／Ｐ比を有する、請求項４４に記載の組成物。
  46. ５～７のＮ／Ｐ比を有する、請求項４５に記載の組成物。
  47. ５のＮ／Ｐ比を有する、請求項４５に記載の組成物。
  48. 前記イオン化カチオン性脂質がＫＣ２ＯＡである、請求項４４から４７のいずれか１項に記載の組成物。
  49. 前記イオン化カチオン性脂質がＫＣ２である、請求項４４から４７のいずれか１項に記載の組成物。
  50. 前記イオン化カチオン性脂質がＫＣ２－０１である、請求項４４から４７のいずれか１項に記載の組成物。
  51. 前記イオン化カチオン性脂質がＡＬＣ０３１５である、請求項４４から４７のいずれか１項に記載の組成物。
  52. 前記イオン化カチオン性脂質がＳＭ１０２である、請求項４４から４７のいずれか１項に記載の組成物。
  53. 核酸、ＡＫＧ－ＵＯ－６およびＡＫＧ－ＵＯ－７から選択されるイオン化カチオン性脂質、ならびに（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質を、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量で含む、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物。
  54. Ｎ／Ｐ比が３～８である、請求項１７から２１、２６から２８、３５から４４、または５３のいずれか１項に記載の組成物。
  55. Ｎ／Ｐ比が５～７である、請求項５４に記載の組成物。
  56. Ｎ／Ｐ比が５である、請求項５５に記載の組成物。
  57. Ｎ／Ｐ比が７である、請求項５５に記載の組成物。
  58. 前記核酸が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡである、請求項１７から２１、２６から２８、３５から４７、または５３のいずれか１項に記載の組成物。
  59. ａ． Ｎ／Ｐ比が３～８のｍＲＮＡ核酸、
    ｂ． ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の４０～６５モル％の総量のＡＬＣ－０３１５イオン化カチオン性脂質、
    ｃ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２５～４０モル％の総量のコレステロール、
    ｄ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量の（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質、
    ｅ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の５～２５モル％の総量のＤＳＰＣリン脂質、および
    ｆ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の０～２．５モル％の総量のＰＥＧ－ＤＭＧ
    を含む、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ワクチン組成物。
  60. ａ． Ｎ／Ｐ比が３～８のｍＲＮＡ核酸、
    ｂ． ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の４０～６５モル％の総量のＤｌｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡイオン化カチオン性脂質、
    ｃ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２５～４０モル％の総量のコレステロール、
    ｄ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量の（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質、
    ｅ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の５～２５モル％の総量のＤＳＰＣリン脂質、および
    ｆ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の０～２．５モル％の総量のＰＥＧ－ＤＭＧ
    を含む、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ワクチン組成物。
  61. ａ． Ｎ／Ｐ比が３～８のｍＲＮＡ核酸、
    ｂ． ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の４０～６５モル％の総量のＫＣ３－ＯＡイオン化カチオン性脂質、
    ｃ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２５～４０モル％の総量のコレステロール、
    ｄ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量の（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質、
    ｅ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の５～２５モル％の総量のＤＳＰＣリン脂質、および
    ｆ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の０～２．５モル％の総量のＰＥＧ－ＤＭＧ
    を含む、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ワクチン組成物。
  62. ａ． Ｎ／Ｐ比が３～８のｍＲＮＡ核酸、
    ｂ． ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の４０～６５モル％の総量のイオン化カチオン性脂質、
    ｃ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２５～４０モル％の総量のコレステロール、
    ｄ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量の（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質、
    ｅ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の５～２５モル％の総量のＤＳＰＣリン脂質、および
    ｆ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の０～２．５モル％の総量のＰＥＧ－ＤＭＧ
    を含む、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ワクチン組成物。
  63. 前記核酸が、配列番号２のｍＲＮＡである、請求項５９から６２のいずれか１項に記載の組成物。
  64. 樹状細胞へのＬＮＰの標的化のための、ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量の（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質の前記ＬＮＰ中での使用。
  65. 前記ＬＮＰがｍＲＮＡを含む、請求項６４に記載の使用。
  66. 前記ＬＮＰがコレステロールをさらに含む、請求項６４または６５に記載の使用。
  67. 前記ＬＮＰが、イオン化カチオン性脂質（ＩＣＬ）をさらに含む、請求項６６に記載の使用。
  68. 前記ＬＮＰが、ＤＳＰＣを含めた１種以上の追加のリン脂質をさらに含む、請求項６７に記載の使用。
  69. 前記ＬＮＰが複合脂質をさらに含む、請求項６８に記載の使用。
  70. 前記ＬＮＰが、
    ａ． Ｎ／Ｐ比が３～８のｍＲＮＡ核酸、
    ｂ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の４０～６５モル％の総量のイオン化カチオン性脂質（ＩＣＬ）、
    ｃ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２５～４０モル％の総量のコレステロール、
    ｄ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の２．５～１０モル％の総量の（Ｌ－セリン）ＰＳ脂質、
    ｅ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の５～２５モル％の総量のＤＳＰＣリン脂質、および
    ｆ． 前記ＬＮＰ組成物の総脂質含有量の０～２．５モル％の総量の複合脂質
    を含む、請求項６９に記載の使用。
  71. 前記ＩＣＬが、請求項１から９のいずれか１項に記載の化合物から選択される、請求項７０に記載の使用。
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