JPH11507815A

JPH11507815A - ホスホン酸基本カチオン性脂質

Info

Publication number: JPH11507815A
Application number: JP9501788A
Authority: JP
Inventors: ドワイヤー，ブライアン・パトリック; レベデフ，アレキサンダー・ブイ; ブラウン，ボブ・デイル; シュワルツ，デイビッド・アーロン
Original assignee: ジンタ・インコーポレイテッド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 1999-07-13
Also published as: CA2223179A1; EP0840744A4; EP0840744A1; AU6328796A; US6172049B1; AU705549B2; WO1996040725A1; US5958901A

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般構造(Ｉ) 〔式中、(ａ)Ｒ₁は親油性部分；(ｂ)Ｒ₂は陽性電荷部分；(ｃ)Ｒ₃は約１から約２４個の炭素原子の親油性基、正に荷電した基、または負に荷電した基；(ｄ)ｎは１から８の整数；(ｅ)Ｘ^-はアニオンまたはポリアニオン；(ｆ)ＹはＮまたはＯ、および(ｇ)ｍは０から脂質に存在する陽性電荷と同じ数までの整数〕有する脂質、またはその塩または溶媒和物またはそのエナンチオマーに関するものである。本発明はさらに、ポリアニオン性巨大分子と共にこれらの脂質組成物、これらの組成物を使用して細胞におけるタンパク質発現を妨害する方法、および同物を製造するキットを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ホスホン酸基本カチオン性脂質発明の属する技術分野本発明はカチオン性脂質化合物および細胞内への巨大分子の輸送を含むその使用の分野に関する。発明の背景本発明の背景についての以下の記載は、これを本発明の先行技術と認めるものではない。リポソームのような脂質凝集体(lipid aggregates)は、細胞内への(ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質および医薬化合物のような)巨大分子の輸送のための薬剤として有用であることが報告されている。特に、電荷および非電荷脂質を含む脂質凝集体は、ポリアニオン性分子の細胞への輸送に特に有効であることが記載されている。カチオン性脂質の報告されている効果は、正味の陰性電荷を有することが言われている細胞との電荷相互作用に由来し得る。カチオン性脂質凝集体の正味の陽性電荷は、それが核酸のようなポリアニオンと結合するのを可能にし得ることもまた仮定されている。例えば、ＤＮＡを含む脂質凝集体は、細胞の優れたトランスフェクションの有効な薬剤であることが報告されている。脂質凝集体の構造は、脂質の組成および凝集体の形成法を含む因子に依存する。脂質凝集体は、例えば、リポソーム、単薄層小胞、多薄層小胞、ミセル等を含み、ナノメーターからマイクロメーター範囲の粒子サイズであり得る。脂質凝集体の種々の合成法が当分野で報告されている。脂質凝集体の一つのタイプはリポソームを含むリン脂質を含む。このタイプの凝集体を、細胞輸送媒体として使用する上での重要な欠点は、リポソームが陰性に電荷している細胞表面への結合効力を減少させる陰性電荷を有することである。ＤＮＡに結合できる陽性電荷リポソームがカチオン性脂質化合物とリン脂質を組み合わせることにより形成し得ることが報告されている。次いで、これらのリポソームをＤＮＡを標的細胞に輸送するのに使用する。(例えば、Ｆelgner et al.，Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．84 :741 3-7417，1987；Ｅppstein et al．米国特許第４,８９７,３５５号；Ｆelgner et al．米国特許第５,２６４,６１８号；およびＧebeyehu et al．米国特許第５, ３３４,７６１号参照)。既知のカチオン性脂質はＮ[１−(２,３−ジオレオイルオキシ)プロピル]−Ｎ, Ｎ,Ｎ−トリメチルーアンモニウムクロリド(“ＤＯＴＭＡ”)を含む。ＤＯＴＭＡとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(“ＤＯＰＥ”)の組み合わせは商品として入手可能である。ＤＯＴＭＡの、それ自体またはＤＯＰＥとの１：１の組み合わせでの、既知の技術によるリポソームへの調剤が報告されている。しかしながら、ＤＯＴＭＡを含む組成物は細胞にある毒性を示すことが報告されている。他の商品として入手可能なカチオン性脂質である１,２−ビス(オレオイルオキシ)−３,３−(トリメチルアンモニア)プロパン(“ＤＯＴＡＰ”)は、オレオイル分子が、エーテルよりむしろエステル結合により、プロピルアミンに結合していることで、ＤＯＴＭＡと構造が異なる。しかしながら、ＤＯＴＡＰは標的細胞により、より容易に分解されることが報告されている。ＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰの構造修飾を示す他のカチオン性脂質もまた報告されている。他の報告されているカチオン性脂質化合物は、カルボキシスペルミンが二つのタイプの脂質の一つに結合するものを含み、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド(“ＤＯＧＳ”)およびジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミル−アミド(“ＤＰＰＥＳ”)のような化合物を含む。(例えば、Ｂehr et al．米国特許第５,１７１,６７８号参照) 。他の報告されているカチオン性脂質組成物は、ＤＯＰＥとの組み合わせでリポソームに調剤されるカチオン性コレステロール誘導体(“ＤＣ−Ｃhol”)である。(Ｇao，Ｘ.およびＨuang，Ｌ.，Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃommun．179:28 0,1991参照)。ある細胞系に関して、これらのリポソームは低い毒性を示し、ＤＯＴＭＡ−含有組成物よりも有効なトランスフェクションを提供することが報告されていた。ポリリジンのＤＯＰＥへの結合により製造されるリポポリリジンが、血清存在下でのトランスフェクションに有効であることが報告されている。（Ｚhou，Ｘ. et al.，Ｂiochim．Ｂiophys．Ａcta 1065:8 1991）。しかしながら、細胞に巨大分子を輸送するための使用が提案されているカチオン性脂質に関して、特定のカチオン性脂質が広範囲のタイプの細胞に作用することは報告されていない。細胞のタイプ毎に膜組成が異なるため、異なるカチオン性脂質組成物および異なるタイプの脂質凝集体が、その標的細胞膜と直接接触および融合する能力、もしくは、細胞内膜または細胞内環境との異なる相互作用のため異なるタイプの細胞に有効であり得る。これらおよび他の理由のため、有効なカチオン性脂質の設計は非常に経験的なものである。内容物および輸送に加えて、他の重要と考えられる因子は、例えば、意図する目的に適した脂質凝集体を形成する能力、標的細胞への組成物の毒性、輸送すべき巨大分子の担体としての安定性、およびインビボ環境への機能を含む。従って、巨大分子を、高い効率で広範囲の細胞形に輸送できる改善されたカチオン性脂質の必要性がまだある。発明の要約本発明の一つの態様において、構造：〔式中、(ａ)Ｒ₁は親油性部分；(ｂ)Ｒ₂は陽性電荷部分；(ｃ)Ｒ₃は約１から約２４個の炭素原子の親油性基、正に荷電した基、または負に荷電した基；(ｄ)ｎは１から８の整数；(ｅ)Ｘ^-はアニオンまたはポリアニオン；(ｆ)ＹはＮまたはＯ、および(ｇ)ｍは０から脂質に存在する陽性電荷と同じ数までの整数〕を有するホスホン酸−基本カチオン性脂質、またはその塩または溶媒和物またはそのエナンチオマーが提供される。一つの態様において、Ｒ₁は、１から約２４炭素原子の直鎖アルキル、２から約２４炭素原子の直鎖アルケニル、約１０から約５０(好ましくは２５−４０)炭素原子の対称に分枝したアルキルまたはアルケニル、約１０から約５０炭素原子の非対称に分枝したアルキルまたはアルケニル、ステロイジル部分、アミン誘導体、グリセリル誘導体またはＯＣＨ(Ｒ₄Ｒ₅)またはＮ(Ｒ₄Ｒ₅)(式中、Ｒ₄およびＲ₅は、約１０から約３０炭素原子の直鎖アルキル部分またはグリセリル誘導体) を含む種々の親油性部分から選択し得る。好ましくは、Ｒ₁がステロイジル部分である時、それはコレステリル基である。好ましくは、Ｒ₁がアミン誘導体である場合、直鎖、分枝または環状アシルアミンまたはアルキルアミンである。特に、Ｒ₁は３−Ｎ−１,２−ジアシル−１, ２−プロパンジオール−３−アミノ部分、３−Ｎ−１,２−ジアルキル−１,２− プロパンジオール−３−アミノ部分、または３−Ｎ−１,２Ｎ,Ｎ−ジアシル−１ ,２,３−トリアミノプロパニル部分である。アミン誘導体が３−Ｎ−１,２−ジアシル−１,２−プロパンジオール−３−アミノ部分である場合、ジアシル部分は約１０から約３０炭素原子のアルカン酸または約１０から約３０炭素原子のアルケン酸であることが好ましい。また、アミン部分が３−Ｎ−１,２−ジアルキル−１,２−プロパンジオール−３−アミノ部分である場合、アルキル基は約１０から約３０炭素原子のアルキル基または約１０から約３０炭素原子のアルケニル基であることが好ましい。Ｒ₁がグリセリル誘導体である時、好ましくは３−Ｏ−１,２−ジアシルグリセリル部分または３−Ｏ−１,２−ジアルキルグリセリル部分である。特に、Ｒ₁が３−Ｏ−１,２−ジアシルグリセリル部分である時、好ましくはジアシル基が約１０から約３０炭素原子のアルカノン酸または約１０から約３０炭素原子のアルケノン酸である。また、グリセリル部分が３−Ｏ−１,２−ジアルキルグリセリル部分である場合、アルキル部分は約１０から約３０炭素原子のアルキル基または約１０から約３０炭素原子のアルケニル基であることが好ましい。特に好ましくは、部分がアルカノン酸を含む時、酸がステアリン酸であり、部分がアルカノン酸を含む時、酸がパルミトイン酸(palmitoic acid)またはオレイン酸である。他の態様において、Ｒ₂は、側鎖に陽性電荷基を有するアミノ酸残基、アルキルアミン部分、フルオロアルキルアミン部分または１から約６炭素原子の過フルオロアルキルアミン部分、５から約１０炭素原子のアラルキルアミン部分、グアニジニウム部分、エナミン部分、芳香族、５から約１０炭素原子の非芳香族環状アミン部分、アミジン部分、イソチオウレア部分、ヘテロ環状アミン部分、置換ヘテロ環状部分もしくは、ＮＨ₂、Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ₂、ＮＨＲ₆、Ｃ(＝Ｏ)ＮＨＲ₆、ＮＨＲ₆、Ｒ₇またはＣ(＝Ｏ)ＮＨＲ₆Ｒ₇(式中、Ｒ₆およびＲ₇は１から約２４の炭素原子のアルキル部分、２から約２４炭素原子のアルケニル部分、約５から約２０炭素原子のアリール部分、約６から約２５炭素原子のアラルキル部分から独立して選択される)から選択される置換基で置換されている１から約６炭素原子の置換アルキル部分を含む、種々の陽性電荷部分から選択し得る。好ましくは、Ｒ₂がアミノ酸残基である場合、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチンまたはアミノ酸アナログである。特に、Ｒ₂がアミノ酸アナログである場合、それは好ましくは、３−カルボキシスペルミジン、５−カルボキシスペルミジン、６−カルボキシスペルミジンまたはモノアルキル、ジアルキルまたは過アルキル置換誘導体(１から約６炭素原子のアルキル基と共に１個またはそれ以上のアミン窒素で置換されている)である。さらに他の態様において、Ｒ₃は、約３から約２４炭素原子の親油性部分、陽性電荷部分、または陰性電荷部分を含む、種々の部分から選択され得る。Ｒ₃が親油性部分である場合、約１から約２４炭素原子（最も好ましくは１つの炭素メチル基）の直鎖アルキル部分、２から約２４炭素原子の直鎖アルケニル部分、約１０から約５０炭素原子の対称分枝アルキルまたはアルケニル部分、約１０から約５０炭素原子の非対称分枝アルキルまたはアルケニル部分、約５から約２０炭素原子のアリール部分、約６から約２５炭素原子のアラルキル部分、またはステロイジル部分であることが好ましい。好ましくはＲ₃が陽性電荷部分である場合、それは、側鎖に陽性電荷基、アルキルアミノアルキル部分、フルオロアルキルアミノアルキル部分、過フルオロアルキルアミノアルキル部分、グアニジウムアルキル部分、エナミノアルキル部分、環状アミノアルキル部分、アミジノアルキル部分、イソチオウレアアルキル部分、またはヘテロ環状アミン部分を有するアミノ酸残基である。Ｒ₃が陰性電荷部分である場合、それはカルボキシアルキル部分、ホスホノアルキル部分、スルホノアルキル部分または１から約２４炭素原子、より好ましくは６および１２の間の炭素原子、最も好ましくは８と１０の間のホスファチジルアルキル部分であることが好ましい。さらに、ｎは１から８、より好ましくは２から６、最も好ましくは２、３、または４の整数であることが好ましい。また、Ｘ−は医薬的に許容可能なアニオンまたはポリアニオンであることが好ましい。特に好ましい態様において、ホスホン酸基本カチオン性脂質は以下の構造を有する：本発明の他の態様において、ポリアニオン性巨大分子および上記の脂質構造を含む組成物が提供される。特に、ポリアニオン性巨大分子は細胞中でポリペプチドを発現できる発現ベクターを含む種々の巨大分子であり得る。好ましい態様において、ポリアニオン性巨大分子はＤＮＡである。本発明の更に別の態様は、上記の組成物を細胞と接触させることによる、ポリアニオン性巨大分子を細胞内に輸送する方法を提供する。特に、方法は、細胞中のタンパク質の発現を、上記の組成物を細胞と接触させることにより妨害するために提供され、該組成物はタンパク質をコードする細胞中のＲＮＡ配列と実質的に相補的な塩基配列を有するオリゴマーを含む。本発明は、更に、上記組成物を含む、ポリアニオン性巨大分子を細胞内に輸送させるためのキットを提供する。発明の詳細な説明本発明の残りの記載を発表する前に、最初に、以後使用する用語の定義を明らかにするのは、理解の助けとなる。これらの用語は、特記しない限り、以下の意味を有する。 “親油性部分”は、１個またはそれ以上の以下の特性を示す部分を意味する：Ａ．水不溶性の傾向Ｂ．非極性溶媒への溶解性の傾向Ｃ．オクタノール／水分配測定においてオクタノールを選択する傾向、およびＤ．脂質二重層形成と適合し、二重層を形成し得る傾向。特に、オクタノール／水分配係数０．５またはそれ以下の親油性分子が好ましく、オクタノール／水分配係数は水中の濃度をオクタノールの濃度で割って測定する。 “陽性電荷部分”は、ｐＨ範囲２から１２で、カチオン性脂質と独立した、正味の陽性または陰性電荷を有する置換基の部分を意味している“陽性電荷部分および陰性電荷部分”を意味する。カチオン性脂質の正味の電荷は、正味の電荷が陽性、中性または陰性であり得るように、脂質に発生するすべての電荷部分の合計である。 “アルキル”なる用語は、直鎖、分枝鎖および環状基を含む飽和脂肪族基を意味する。適当なアルキル基は、シクロヘキシルおよびシクロヘキシルメチルのようなシクロアルキル基を含むが、これらに限定されない。これらの基は所望により、例えばヒドロキシ、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプトまたはチオ、シアノ、アルキルチオ、ヘテロ環状、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキル、アルケニル、ニトロ、アミノ、アルコキシ、アミド、および所望により置換されたイソチオウレイド、アミジノ、グアニジノ、およびその他などの鎖と共通して結合し、例えばトリフルオロメチル、３−ヒドロキシヘキシル、２−カルボキシプロピル、２−フルオロエチル、カルボキシメチル、４−シアノブチル、２−グアニジノエチル、３−Ｎ,Ｎ'−ジメチルイソチオウロニウムプロピル、およびその他などのアルキル基を形成する１つ以上の官能基で置換され得る。 “低級アルキル”は、１から６炭素原子のアルキル基を意味する。フルオロアルキルまたは過フルオロアルキルは、単独で、部分的に、または完全にフッ素化されたアルキル基を意味する。 “アルケニル”なる用語は、少なくとも一つの二重結合を有する不飽和脂肪族基を意味する。 “アリールアミン”なる用語は、結合パイ電子システムを有する少なくとも一つの環を有する芳香族基を意味し、それらは全て、所望により、例えばヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプトまたはチオ、シアノ、シアノアミド、アルキルチオ、ヘテロ環状、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキル、アルケニル、ニトロ、アミノ、アルコキシ、アミド、およびその他などの鎖と共通して結合し、例えばビフェニル、ヨードビフェニル、メトキシビフェニル、アントリル、ブロモフェニル、ヨードフェニル、クロロフェニル、ヒドロキシフェニル、メトキシフェニル、ホルミルフェニル、アセチルフェニル、トリフルオロメチルチオフェニル、トリフルオロメトキシフェニル、アルキルチオフェニル、トリアルキルアンモニウムフェニル、アミドフェニル、チオゾリルフェニル、オキサゾリルフェニル、イミダゾリルフェニル、イミダゾリルメチルフェニル、シアノフェニル、ピリジルフェニル、ピロリルフェニル、ピラゾリルフェニル、トリアゾリルフェニル、テトラゾリルフェニルおよびその他などのアリール基を形成する１つ以上の官能基で置換され得る。 “アラルキルアミゾ”なる用語は、アリール基で置換されているアルキル基を意味する。適当なアラルキル基は、ベンジル、ピコリル等であり、全て所望により置換されていてもよい。 “オリゴヌクレオシド”または“オリゴマー”なる用語は、一般に約４から約１００ヌクレオシド長さであるが、約１００ヌクレオシド長さより長いこともある、ヌクレオシド間結合により結合しているヌクレオシドの鎖を意味する。通常ヌクレオシドモノマーから製造されるが、また酵素的手段で得ることができる。従って、“オリゴマー”なる用語は、ヌクレオシドモノマーに結合するヌクレオシジル間結合を有するオリゴヌクレオシドの鎖を意味し、従ってオリゴヌクレオチド、ホスホトリエステルのような非イオン性オリゴヌクレオシドアルキル−およびアリールホスホネートアナログ、オリゴヌクレオチドのアルキル−およびアリール−ホスホノチオエート、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートアナログ、オリゴヌクレオチドのホスホロアミデートアナログおよび他のオリゴヌクレオシドアナログおよび修飾オリゴヌクレオシドを含み、またヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーも含む。この用語は、モノマー単位間の１個またはそれ以上のリン酸結合がホルムアセタール結合、チオホルムアセタール結合、モルホリノ結合、スルファメート結合、シリル結合、カルバメート結合、アミド結合、グアニジン結合、ニトロオキシド結合または置換ヒドラジン結合のような非リン酸結合に置換されているヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーも含む。モルホリノ基本アナログまたはポリアミド基本アナログのような両方の糖およびリン酸部分が置換されているかまたは修飾されているヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーも含む。非ヌクレオシドの塩基、糖およびリン酸骨格が非ヌクレオシド部分に置換されているか、または非ヌクレオシド部分がヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーに挿入されているヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーも含む。所望により、該非ヌクレオシド部分は、標的配列と相互作用し得るか、または標的細胞への取り込みを変換する他の小分子と結合するために作用し得る。脂質凝集体は、単薄層および多薄層のタイプのリポソームおよびミセルおよびカチオン性脂質のより無定形の凝集体またはリン脂質のような両親媒性脂質と混合した脂質を含む。標的細胞は、所望の化合物の担体として脂質凝集体を使用する、所望の化合物を輸送させる細胞を意味する。本明細書で使用するトランスフェクションは、標的細胞が核酸の発現をするように、発現可能核酸を標的細胞に輸送させることを意味する。“核酸”なる用語は、分子量に関係無くＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み、“発現”なる用語は、一過性発現および安定発現を含むが、これに限定されない細胞中の核酸の機能的発現の表明を意味する。輸送は、所望の化合物が、標的細胞内部または、標的細胞膜内または上に最後に位置するように、標的細胞に移される方法を意味するために使用する。本発明の化合物の多くの使用において、所望の化合物は標的細胞に容易に取り込まれないので、脂質凝集体を経由した輸送は所望の化合物を細胞内に入れる手段となるのである。ある使用において、特に、インビボ条件下で、具体的標的細胞形への輸送が好ましく、本発明の化合物により促進される。機能的に活性なカチオン性脂質の一般的構造は、３つの連続した部分、例えば、カチオン性頭部基／リンカー／脂質尾部基が必要である。広範囲の構造が各３つの部分に関して考えられるが、そのカチオン性脂質がアニオン性巨大分子を特定の細胞系に十分トランスフェクトするか予測する先験的な手段はないことが証明されている。次に、細胞系をトランスフェクトするように、アニオン性巨大分子と組み合わせるべきカチオン性脂質の特性は、経験的である。我々は、化学的に多重構造物と結合し、巨大分子の取り込みを促進する、新規カチオン性脂質の能力を証明した。本発明の新規ホスホン酸基本カチオン性脂質は、以下の一般式を有する：その塩、溶媒和物またはエナンチオマーを含む。記号Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｙ、Ｘ、ｎおよびｍは下記の通りである。Ｒ₁は、ホスホン酸基本カチオン性脂質の脂質尾部基を示し、種々の親油性部分、特に、例えば、１から約２４炭素原子の直鎖アルキル、２から約２４炭素原子の直鎖アルケニル、約１０から約５０炭素原子の対称分枝アルキルまたはアルケニル、約１０から約５０炭素原子の非対称分枝アルキルまたはアルケニル、ステロイジル部分、グリセリル誘導体、アミン誘導体およびＯＣＨ(Ｒ₄Ｒ₅)またはＮ(Ｒ₄Ｒ₅)(式中、Ｒ₄およびＲ₅は、約１０から約３０炭素原子の直鎖または分枝鎖アルキル部分)を含む。Ｒ₁がステロイダル部分である場合、例えば、プレグネノロン、プロゲステロン、コルチゾール、コルチコステロン、アルドステロン、アンドロステンジオン、テストステロンまたはコレステロールまたはこれらのアナログのような、このような種々の分子を使用し得る。コレステリル部分が特に好ましい。Ｒ₁がアミン誘導体である場合、種々のそのような誘導体、例えば直鎖、分枝または環状アシルアミンまたはアルキルアミンを使用し得る。特に、アミン誘導体は、３−Ｎ−１,２−ジアシル−１,２−プロパンジオール−３−アミノ部分、３−Ｎ−１,２−ジアルキル−１,２−プロパンジオール−３−アミノ部分、および３−Ｎ−１,２Ｎ,Ｎ−ジアシル−１,２,３−トリアミノプロパニル部分を含む。Ｒ₁が３−Ｎ−１,２−ジアシル−１,２−プロパンジオール−３−アミノ部分である場合、ジアシル部分は約１０から約３０炭素原子のアルカン酸、または約１０から約３０炭素原子のアルケン酸であり得る。同様に、Ｒ₁が３−Ｎ−１,２ −ジアルキル−１,２−プロパンジオール−３−アミノ部分である場合、アルキル部分は約１０から約３０炭素原子のアルキル基、または約１０から約３０炭素原子のアルケニル基であり得る。これらのグループは直鎖、対称、または非対称の分枝アルキルおよびアルケニル基であり得る。Ｒ₁がグリセリル誘導体である場合、より具体的には、３−Ｏ−１,２−ジアシルグリセリル部分または３−Ｏ−１,２−ジアルキルグリセリル部分を含む、種々のそのような誘導体を使用し得る。特に、Ｒ₁が３−Ｏ−１,２−ジアシルグリセリル部分である場合、ジアシル基は約１０から約３０炭素原子のアルカン酸、または約１０から約３０炭素原子のアルケン酸であり得る。同様に、Ｒ₁が３− Ｏ−１,２−ジアルキルグリセリル部分である場合、アルキル部分は約１０から約３０炭素原子のアルキル基、または約１０から約３０炭素原子のアルケニル基であり得る。これらの基は直鎖、対称、または非対称の分枝アルキルおよびアルケニル基であり得る。Ｒ₁がアルカン酸を含むアミン誘導体またはグリセリル誘導体である時のいずれの場合においても、酸は好ましくはステアリン酸である。同様に、これらの誘導体がアルケン酸を含む場合、酸は好ましくはパルミトイン酸またはオレイン酸である。Ｒ₂は、ホスホン酸−基本カチオン性脂質のカチオン性頭部基を示し、例えば、側鎖に陽性電荷基を有するアミノ酸残基、アルキルアミン部分、フルオロアルキルアミン部分または過フルオロアルキルアミン部分、約５から約１０炭素原子のアリールアミン部分またはアラルキルアミン部分、グアニジニウム部分、エナミン部分、約５から約１０炭素原子の芳香族または非芳香族環状アミン部分、アミジン部分、イソチオウレア部分、ヘテロ環式アミン部分、置換ヘテロ環式部分並びに、ＮＨ₂、Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ₂、ＮＨＲ₆、Ｃ(＝Ｏ)ＮＨＲ₆、ＮＨＲ₆Ｒ₇またはＣ(＝Ｏ)ＮＨＲ₆Ｒ₇(式中、Ｒ₆およびＲ₇は、１から約２４炭素原子のアルキル部分、２から約２４炭素原子のアルケニル部分、約５か約２０炭素原子つのアリール部分および約６から約２５炭素原子のアラルキル部分から独立して選択される)からなる群から選択される置換基で置換されている１から約６炭素原子の置換アルキル部分種々の陽性電荷部分を含み得る。特に、Ｒ₂がアミノ酸残基である時、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチンまたはアミノ酸アナログであり得る。Ｒ₂は種々の陽性電荷アミノ酸アナログであり得るが、具体的例は、３−カルボキシスペルミジン、５−カルボキシスペルミジン、６−カルボキシスペルミンおよびモノアルキル、ジアルキルまたは過アルキル置換誘導体(１から約６個の炭素原子と共に１個またはそれ以上のアミン窒素で置換されている)を含む。Ｒ₃は、例えば親油性基、陽性電荷部分および陰性電荷部分を含む、種々の基であり得る。特にＲ₃が親油性部分である場合、１から約２４炭素原子の直鎖アルキル部分、２から約２４炭素原子の直鎖アルケニル部分、約１０から約５０炭素原子の非対称分枝アルキルまたはアルケニル部分、約１０から約５０炭素原子の非対称分枝アルキルまたはアルケニル部分、約５から約２０炭素原子のアリール部分、約６から約２５炭素原子のアラルキル部分、またはステロイジル部分であり得る。Ｒ₃が陽性荷電している場合、側鎖に陽性荷電基、アルキルアミノアルキル部分、フルオロアルキルアミノアルキル部分、過フルオロアルキルアミノアルキル部分、グアニジニウムアルキル部分、エナミノアルキル部分、サイクリカミノアルキル部分、アミジノアルキル部分、イソチオウレアアルキル部分、またはヘテロ環状アミンを有するアミノ酸残基であり得る。チロシンおよびシステインなどのその他のアミノ酸は、官能基を含む分枝しているアミノを結合させるように機能する。側にある官能基はまた、樹状の分枝の取り込みの反応部位であり得る。（例えばSzoka、Bioconjugate Chem.4：372、1993参照）Ｒ₃が陰性電荷部分である場合、１から約２４炭素原子のカルボキシアルキル部分、ホスホノアルキル部分、スルホノアルキル部分、またはホスファチジルアルキル部分であり得る。リンカーは、頭部基、Ｒ₁と脂質尾部基、Ｒ₂を結合する構造を含む。この構造は、Ｙ(酸素または窒素であり得る)および−ＣＨ₂−基の連続(その数はｎにより示され、ｎは１から８の整数であり、具体例においてそれは２から６の範囲および具体的態様で２、３または４の整数である)を含む。Ｘ^-により示される逆イオンは、ホスホン酸基本カチオン性脂質に存在する陽性電荷基と、電荷−電荷相互作用により結合するアニオンまたはポリアニオンである。これらのカチオン性脂質をインビボで使用する場合、アニオンまたはポリアニオンは薬学的に許容されるものであるべきである。ｍは、カチオン性脂質に関連するアニオンまたはポリアニオンの数を示す整数である。特に、この整数の範囲は０から脂質に存在する陽性電荷と等価の数の範囲である。本発明のカチオン性脂質は、塩、溶媒和物または、脂質に存在する任意のまたは全ての不斉原子によりもたらされるエナンチオマー異性体を含む。本発明の範囲に、ラセミ体混合物、ジアステレオマー混合物、光学異性体または単離され、または他のエナンチオマーまたはジアステレオマー対を実質的に含まない合成光学異性体が含まる。ラセミ混合物はその個々の、実質的に光学的に純粋な異性体に、例えば、光学活性酸または塩基付加物と形成されたジアステレオマー塩の分離、続いて光学活性物質へ変換して戻すような当分野で既知の技術により分離し得る。ほとんどの場合、所望の光学異性体を、所望の出発物質の適当な立体異性体で開始する、立体特異的反応の手段により合成する。異性体を富ませ、分析する方法および理論は記載されている(Ｊacques et al.，“Ｅnantiomers，Ｒacem ates and Ｒesolutions”Ｋreiger，Ｍalabar，ＦＬ，1991)。塩は、これらの化合物の薬学的にまたは生理学的に許容される非毒性塩を含む。このような塩は、アルカリおよびアルカリ土類金属イオンまたはアンモニウムおよび第４級アミノイオンのような適当なカチオンと、ポリヌクレオチドに存在するリン酸またはホスホロチオエート酸基の酸アニオン部分との組み合わせに由来するものを含む。適当な塩は例えば、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＦ、ＨＩ、Ｈ₂ＳＯ₄ およびトリフルオロ酢酸のような酸付加塩を含む。塩は、ある有機および無機酸、例えば、ＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ₂ＳＯ₄、アミノ酸または有機スルホン酸のようなある有機または無機酸の塩基中心(例えばアミン)または酸性基への付加により形成し得る。本明細書の組成物はまた非イオン化および双性イオン形の形の本発明の化合物を含む。模範的に、本発明のカチオン性脂質は、上記の発明の要約に示した構造を有する。カチオン性脂質は、オリゴヌクレオチド、オリゴマー、ペプチドまたはポリペプチドのようなポリアニオン性巨大分子と、陽性電荷脂質および陰性電荷ポリアニオン性巨大分子の間の誘因により凝集体を形成する。凝集体は多薄層または単薄層リポソームまたは他の粒子を含み得る。カチオン性脂質および芳香族およびアルキル部分のようなポリアニオン性巨大分子の間の疎水性相互作用は、凝集体形成をまた促進し得る。カチオン性脂質は核酸およびペプチドを、血清存在下で有効に輸送することが示され、従ってインビボまたはエキソビボでの使用に好適である。カチオン性脂質−ポリアニオン性巨大分子凝集体は、当分野で既知の種々の方法で形成し得る。代表的な方法は、Ｆelgner et al. 前掲；Ｅppstein et al. 前掲；Ｂehr et al．前掲；Ｂangham，Ａ．et al.，Ｍ．Ｍol．Ｂiol．23:238 ，1965；Ｏlson，Ｆ．et al.，Ｂiochim．Ｂiophys．Ａcta 557:9，1979；Ｓzok a，Ｆ．et al.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．75:4194，1978；Ｍayhew，Ｅ．et al.，Ｂiochim．Ｂiophys．Ａcta 775:169，1984；Ｋim，Ｓ．et al.，Ｂiochi m．Ｂiophys．Ａcta 728:339，1983；およびＦukunaga，Ｍ．et al.，Ｅndocrin ol．115:757，1984に記載されている。運搬媒体として使用するのに適当なサイズの脂質凝集体の製造に一般的に使用されている方法は、超音波処理および凍結融解＋押し出しを含む。例えば、Ｍayer，Ｌ．et al.，Ｂiochim．Ｂiophys．Ａ cta 858:161，1986参照。一貫して小さく(５０から２００nm)、相対的に均質な凝集体が必要な時、微小流動化を使用する(Ｍayhew，Ｅ．前掲)。一般に、凝集体は(１)本発明のカチオン性脂質または(２)共脂質と混合されたカチオン性脂質のいずれかからなる粒子の製造、続く、ほぼ室温(約１８から２６℃)での脂質粒子へのポリアニオン性巨大分子の添加により形成し得る。一般に、条件は、保護基の脱保護の助けとならないように選択する。次いで、混合物を、約１０分から約２０時間、凝集体を形成させ、約１５分から６０分が最も慣用的に使用される。結合体を長時間にわたり形成させ得るが、トランスフェクション効率の更なる増加は、結合体の長時間により通常増加しない。本発明のカチオン性脂質との脂質凝集体の製造に適した共脂質は、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルオレオイルホスファチジル−エタノールアミン、コレステロール、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン、ポリエチレングリコールに共有結合したホスファチジルエタノールアミンおよびこれらの共脂質の混合物である。あるカチオン性脂質のための最適カチオン性脂質：共脂質の比は、約１：０から１：１０のカチオン性脂質：共脂質比を使用したポリアニオン性巨大分子との凝集体のための脂質混合物の製造の混合実験により決定する。最適カチオン性脂質：共脂質比を決定する方法は記載されている(Ｆelgner，前掲、参照)。各脂質混合物は、所望により、１個の以上の異なる核酸：脂質比を有するオリゴヌクレオチド−脂質混合物を使用して試験し、オリゴヌクレオチド：脂質比を最適化するために使用し得る。カチオン性脂質：共脂質の適当な分子比は、約０.１：１から１：０.１、０. ２：１から１：０.２、０.４：１から１：０.４または０.６：１から１：０.６である。共脂質の増加したモル比率を含む脂質粒子調製物は、共脂質濃度の増加に従って、オリゴヌクレオチドの細胞へのトランスフェクションを増加させることが判明した。加えて、カチオン性脂質は共脂質との混合物、または混合物中の２個またはそれ以上のカチオン性脂質の異なる濃度で、または共脂質無しで使用できる。リポソームまたは凝集体は、最初に減圧下で(クロロホルムのような)溶媒中の脂質を乾燥させることにより簡便には製造する。次いで、脂質を水和し、水または低イオン強度緩衝液(通常、約２００mＭ全イオン濃度より低い)を添加することによりリポソームまたは凝集体に変換し、続いて(ボルテックス処理および／または超音波処理のような)撹拌および／または凍結／融解処理をする。形成された凝集体またはリポソームのサイズは、直径で約４０nmから６００nmの範囲である。少なくともあるカチオン性脂質により代表的細胞に輸送されるオリゴヌクレオチドの量は、商品として入手可能な脂質により輸送される量より有意に多いことが判明した。細胞に輸送されるオリゴヌクレオチドの量は、蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用したトランスフェクション後のトランスフェクト細胞の蛍光強度の観察をに基づいて、カチオン性脂質もより約２から１００倍多いと計算された。本明細書に記載のカチオン性脂質もまた、商品脂質により検出可能にトランスフェクトされないあるタイプの細胞をトランスフェクトする。カチオン性脂質− ＤＮＡ凝集体の機能性は、外因性ＤＮＡの遺伝子製造の検定により証明された。同様に、カチオン性脂質−オリゴヌクレオチド凝集体の機能性は、遺伝子生産物のアンチセンス阻害により証明された。本明細書に記載のカチオン性脂質はまた、約５０から１００％コンフルエントな細胞の組織培養物の細胞に、効率的にオリゴヌクレオチドを輸送することにより、商品として入手できる脂質と異なった。ほとんどの商品として入手できる脂質は、最適なトランスフェクション効率のために、相対的に狭いコンフルエント範囲の細胞を必要とする。例えば、Ｌipofectin(登録商標)は、細胞集団の最も高い比率をトランスフェクトするために、７０−８０％コンフルエントな細胞を必要とする。本明細書に記載のカチオン性脂質はまた約１０−５０％コンフルエントな細胞のトランスフェクトに使用し得るが、脂質の毒性が、約５０−１００％コンフルエントな細胞を使用して見られるより促進された。一般に、カチオン性脂質は、約６０−１００％コンフルエント細胞を、最小の毒性および最適効率でトランスフェクトした。従って、６０−９５％または６０−９０％のコンフルエント範囲が組織培養中のほとんどの細胞系のトランスフェクションプロトコールに簡便である。カチオン性脂質凝集体は、組織培養中の細胞のトランスフェクトに使用され、ＲＮＡおよびＤＮＡコード遺伝子生産物が、トランスフェクト細胞中で発現された。カチオン性脂質凝集体は、オリゴヌクレオチドおよびオリゴマーのような種々の巨大分子と形成し得る。凝集体形成に使用するオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、オリゴヌクレオチドアナログおよびプラスミドであり得る。一般に、プラスミドまたはｍＲＮＡのような相対的に大きいオリゴヌクレオチドは、トランスフェクト細胞で発現すべき１個またはそれ以上の遺伝子を運搬し得るが、相対的に小さいオリゴヌクレオチドは、(１)細胞に存在するＤＮＡまたはＲＮＡと相補的(ワトソン・クリックまたはＨoogsteen結合を介して)な塩基配列または(２)ペプチド、タンパク質または糖タンパク質のような細胞内の分子とオリゴヌクレオチドを結合させる塩基配列を含む。典型的に、ＲＮＡはリボザイムおよび細胞内の標的ＲＮＡと相補的なアンチセンスＲＮＡ配列を含む。オリゴヌクレオチドは、(ａ)プリンまたはピリミジン塩基グアニン、アデニン、シトシン、チミンおよび／またはウラシル：(ｂ)リボースまたはデオキシリボース；および(ｃ)隣接ヌクレオシド部分に結合するホスホジエステル基を含む一本鎖非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。オリゴヌクレオチドは、典型的に２から約１００結合ヌクレオシドを含む。典型的なオリゴヌクレオチドは、２−１０、２−１５、２−２０、２−２５、２−３０、２−５０、８−２０、８−３０または２−１００結合ヌクレオチドのサイズ範囲である。オリゴヌクレオチドは、通常、均一極性の直線であり、逆極性の領域が存在する時、このような領域は１０ヌクレオチド当たり１個以上の極性逆転を含まない。２０ヌクレオチド当たり１つの逆転があるのが典型である。オリゴヌクレオチドは環状、分枝鎖または二本鎖であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に、細胞中に存在するＤＮＡまたはＲＮＡ塩基配列と実質的に相補的な約８−３０塩基対または約８−５０塩基対を含む。細胞に輸送するオリゴヌクレオチドのサイズは、合理的に製造できるポリアニオン性巨大分子のサイズによってのみ限定され、従って、０.１から１キロ塩基対(Ｋｂ)、１から２０Ｋｂ、２０Ｋｂから４０Ｋｂまたは４０Ｋｂから１,０００Ｋｂの長さのＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に輸送し得る。オリゴヌクレオチドはまた、１個またはそれ以上の共有結合形修飾を含むＤＮＡまたはＲＮＡを含む。共有結合形修飾は、(ａ)ポリヌクレオチドのホスホジエステル結合の酸素原子の硫黄原子、メチル基等への置換、(ｂ)ホスホジエステル基の−Ｏ−ＣＨ₂Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ₂Ｏ−または−Ｏ−ＣＨ₂Ｏ−Ｓのような非リン部分への置換および(ｃ)ホスホジエステル基の、−Ｏ−Ｐ(Ｓ)(Ｏ)−Ｏ、−Ｏ −Ｐ(Ｓ)(Ｓ)−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(ＣＨ₃)(Ｏ)−Ｏまたは−Ｏ−Ｐ(ＮＨＲ¹⁰)(Ｏ) −Ｏ−(式中、Ｒ¹⁰はアルキル(Ｃ_1-6)またはアルキルエーテル(Ｃ_1-6))のようなリン酸アナログへの置換を含む。このような置換は、非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡのホスホジエステル基の約１０％から約１００％または約２０から約８０％を成した。他の修飾は、モルホリノ、アラビノース２'−フルオロリボース、２'−フルオロアラビノース、２'−Ｏ−メチルリボースまたは２'−Ｏ−アリルリボースのような糖部分のまたは糖部分上の置換を含む。オリゴヌクレオチドおよびそれらを合成する方法は記載されている（例えば、米国特許出願の１９９３年１１月１６日出願の第０８／１５４,０１４号、１９９３年６月６日出願の０８／００１,１７９号および１９９４年５月４日出願の０８／２３３,７７８号、ＰＣＴ／ＵＳ９０／０３１３８、ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６１２８、ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６０９０、ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６１１０、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０３３８５、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８８１１、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３６８０、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６８５５、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０１１４１、ＰＣＴ／ＵＳ９２／１０１１５、ＰＣＴ／ＵＳ９２／１０７９３、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０５１１０、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０５２０２、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４２９４、ＷＰ８６／０５５１８、ＷＯ８９／１２０６０、ＷＯ９１／０８２１３、ＷＯ９０／１５０６５、ＷＯ９１／１５５００、ＷＯ９２／０２２５８、ＷＯ９２／２０７０２、ＷＯ９２／２０８２２、ＷＯ９２／２０８２３、米国特許第５,２１４,１３６号およびＵhl mann Ｃhem．Ｒev．90:543，1990参照)。オリゴヌクレオチドは、通常、均一極性の直線であり、逆極性の領域が存在する時、このような領域は１０ヌクレオチド当たり1個以上の極性逆転を含まない。２０ヌクレオチド当たり１つの逆転があるのが典型である。オリゴヌクレオチドは環状、分枝鎖または二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間の結合は、リン含有部分およびホルムアセタール、チオホルムアセタール、リボアセタール等の非リン含有部分を含む種々の部分であり得る。結合は通常ヌクレオチドの５’位および隣接ヌクレオチドの２'または３'位の間の２または３原子を含む。しかしながら、他の合成リンカーは３原子以上を含み得る。オリゴヌクレオチドに含まれる塩基は、非修飾または修飾または天然または非天然プリンまたはピリミジン塩基であり得、αまたはβアノマーであり得る。このような塩基は、天然ＤＮＡまたはＲＮＡに見られる塩基と比較して、その相補的配列へのオリゴヌクレオチド結合の親和性を促進するために選択し得る。しかしながら、修飾塩基が、相補的配列に結合して、検出可能な安定２重鎖または３重鎖を製造できない程度オリゴヌクレオチドに含まれるのが好ましい。模範的に、塩基はアデニン、シトシン、グアニン、ヒポキサンチン、イノシン、チミン、ウラシル、キサンチン、２−アミノプリン、２,６−ジアミノプリン、５−(４−メチルチアゾル−２−イル)ウラシル、５−(５−メチルチアゾル− ２−イル)ウラシル、５−(４−メチルチアゾル−２−イル)シトシン、５−(５− メチルチアゾル−２−イル)シトシン等を含む。他の模範的塩基は、例えば、ウラシル、チミンまたはシトシン以外のピリミジン塩基由来のピリミジンの５位に置換基を有するアルキル化またはアルキニル化塩基を含む(即ち、５−メチルシトシン、５−(１−プロピニル)シトシン、５−(１−ブチニル)シトシン、５−( １−ブチニル)ウラシル、５−(１−プロピニル)ウラシル等)。オリゴヌクレオチドにおける修飾塩基または塩基アナログの使用は、先に記載されている(ＰＣＴ／ＵＳ９２／１０１１５；ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８８１１；ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９５；ＷＯ９２／０９７０５；ＷＯ９２／０２２５８；Ｎikiforov et al .，Ｔet．Ｌett．33:2379，1992；Ｃlivio et al.，Ｔet．Ｌett．33:65，1992 ；Ｎikiforov et al.，Ｔet．Ｌett．32:2505，1991；Ｘu，et al.，Ｔet．Ｌet t．32:2817，1991；Ｃlivio，et al.，Ｔet．Ｌett．33:69，1992；Ｃonnolly， et al.，Ｎucl．Ａcids Ｒes．17:4957，1989参照)。凝集体は、治療的または診断的ポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーを含み得る。このようなポリペプチドの例は、組織適合性抗原、細胞接着分子、サイトカイン、抗体、抗体フラグメント、細胞受容体、細胞内酵素および細胞外酵素またはこれらのフラグメントを含む。オリゴヌクレオチドはまた所望により発現制御配列を含み得、一般に転写プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、オペレーターまたは他の発現制御配列を含む転写単位を含み得る。細胞をトランスフェクトするための凝集体を形成するために使用するオリゴヌクレオチドは、１つ以上の発現ベクターとして存在し得る。従って、１、２または３またはそれ以上の異なるベクターを、所望により細胞内に輸送し得る。発現ベクターは、細胞にトランスフェクトした時に、典型的に１、２または３個の遺伝子を発現するが、ヘルペスウイルスベクターまたは酵母人口染色体を細胞に輸送する時のように多くの遺伝子が存在し得る。細胞に挿入する発現ベクターは、選択可能マーカー(例えば、ネオマイシン、ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼ等)または代謝酵素または機能的タンパク質のような生理学的活性タンパク質(例えば、免疫グロブリン遺伝子、細胞受容体遺伝子、サイトカイン(例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、γ−ＩＮＦ等)、またはプリンまたはピリミジン代謝を媒介する酵素をコードする遺伝子)をコードできる。興味の対象の具体的遺伝子をコードするオリゴヌクレオチドの核酸配列を、実験成しに、ＥＭＢＬＤＮＡライブラリーのＧenＢankから回収し得る。このような配列は、コード配列、例えば、構造タンパク質、ホルモン、受容体等のコード配列並びに興味の対象の他のＤＮＡ、例えば、転写および翻訳調節要素(プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、シグナル配列等)、ベクター(統合または自律)等のＤＮＡ配列を含み得る。細胞に本発明の薬剤で挿入し得るＤＮＡ配列の非限定的例は、線維芽成長因子(ＷＯ８７／０１７２８参照)；繊毛神経栄養因子(Ｌin et al.，Ｓcience，246:1023，1989)；ヒトインターフェロン−α 受容体(Ｕze，et al.，Ｃell，60:225，1990)；インターロイキンおよびその受容体(Ｍizal，FASEB J.，3:2379，1989にレビュー)；ハイブリッドインターフェロン(ＥＰＯ０５１,８７３参照)；ヒト鼻ウイルスのＲＮＡゲノム(Ｃallahan，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.，82:732，1985)；キメラ抗体を含む抗体(米国特許第４,８１６,５６７号参照)；逆転写酵素(Ｍolleing，et al.，Ｊ．Ｖirol.，32 :370，1979参照)；ヒトＣＤ４およびその可溶性形(Ｍaddon et al.，Ｃell，47: 333，1986，ＷＯ８８／０１３０４およびＷＯ／０１９４０参照)をコードする配列；所望のタンパク質の多数をクローニングするのに有用な急速免疫選択クローニング法を記載したＥＰＯ３３０,１９１を含む。凝集体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に輸送することにより、細胞内の遺伝子発現のアンチセンス阻害に使用できる(Ｗagner，Ｓcience 260:1 510，1993およびＷＯ９３／１０８２０参照)。このようなオリゴヌクレオチドは一般に、細胞により発現される標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を含む。しかしながら、オリゴヌクレオチドは細胞内遺伝子発現を、細胞内核酸結合タンパク質に結合することにより(Ｃlusel，Ｎucl．Ａcids Ｒes．21:3405，1993参照)、または核酸に結合することが知られていない細胞内タンパク質または細胞器官に結合することにより(ＷＯ９２／１４８４３参照)調節し得る。特異的な遺伝子の発現を阻止された細胞は、製造および治療的使用に有用である。模範的に、製造使用は、細胞内のプロテアーゼ合成の阻害を含み、治療的または診断的使用のためのタンパク質製造を増加させる(例えば、プロテアーゼによる標的タンパク質分解を減少させる)。模範的に、治療的使用は、細胞表面抗原の合成阻害を含み、患者に移植された後または細胞をインビボでトランスフェクトした時に、拒絶反応を減少しおよび／または細胞の免疫学的耐性を増加させる(例えば、ＭＨＣクラスII遺伝子のような組織適合抗原等)。凝集体を細胞にインビトロおよびインビボで挿入する方法は、先に記載されている(米国特許第５,２８３,１８５号および第５,１７１,６７８号；ＷＯ９４／００５６９；ＷＯ９３／２４６４０；ＷＯ９１／１６０２４；Ｆelgner，Ｊ．Ｂ iol．Ｃhem．269:2550，1994；Ｎabel，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．90:11307 ，1993；Ｎabel，Ｈuman Ｇene Ｔher．3:649，1992；Ｇershon，Ｂiochem．32: 7143，1993；およびＳtrauss EMBO J．11:417，1992参照)。リポソームまたは凝集体の細胞内への侵入は、エンドサイトシースまたはリポソームまたは凝集体と細胞膜の融合によるものであり得る。融合が行われる時、リポソーム膜を細胞膜に統合し、リポソームの水性成分が細胞内液と溶け合う。リポソームのエンドサイトーシスは限定されたクラスの細胞で起こる；賞食または異物粒子を摂取できるものである。貧食細胞がリポソームまたは凝集物を取り込んだ時、細胞はリソソームとして知られる細胞下細胞器官に球体を移動させ、そこでリポソーム膜が分解されると考えられる。リソソームから、リポソーム脂質成分が恐らく外に移動し、細胞膜の一部となり、リソソーム分解に耐性の他のリポソーム成分(修飾オリゴヌクレオチドまたはオリゴマー)は細胞質に侵入し得る。脂質融合は、リポソームまたは凝集体由来の個々の脂質成分の細胞質膜への移動(およびその逆)に関与する；リポソームの水性成分は次いで細胞に侵入し得る。脂質交換が起こるために、リポソーム脂質は標的細胞に関連した特定の化学を有しなければならない。リポソーム脂質が、細胞膜と結合すると、それは一定期間膜内に残るか、種々の細胞内膜に再分散する。本発明の脂質は、製造および治療的使用のための発現ベクターの細胞内への輸送に使用できる。発現ベクターは、細胞に治療的に有用なタンパク質を輸送するための遺伝子治療プロトコール、または治療的に有効なタンパク質または、宿主にワクチンまたは既知の方法に従った他の免疫調節目的を製造できるタンパク質をコードする核酸コード分子の輸送に使用できる(米国特許第５,３９９,３４６号および第５,３３６,６１５号、ＷＯ９４／２１８０７およびＷＯ９４／１２６２９参照）。ベクター形質転換細胞は、治療的タンパク質または酵素(例えば、エリスロポエチン等)、成長因子( 例えば、ヒト成長ホルモン等)または他のタンパク質を製造する細胞系のような、商品として有用な細胞系の製造に使用できる。凝集体は、ヒトまたはマウス、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジまたは非ヒト霊長目種を含む他の種における遺伝子治療法のための細胞系の開発に使用し得る。凝集体は血清存在下で使用し得、従って、ポリアニオン性巨大分子を、インビトロの血清含有組織培養培地中の細胞またはインビボ動物に輸送する。以下の実施例は、説明のために提供し、限定するものではない。図面の説明図１は、化合物１、２および３の製造における合成スキームを示す。図２は、４(コレスト−５−エン−３−オール(３β)−、[２−２,３−ジアミノ−１−オキソペンチル)アミノ]エチル]カルバメート、ジヒドロクロリド）および５（Ｎ−α−−(６−カルボキシスペルミノ)−Ｎ,Ｎ−ジオクタデシグルタミン酸−γ−アミドの構造を示す。図３は、カチオン性脂質１および４の組合せが、プラスミドおよびオリゴデオキシヌクレオチドを細胞に運搬することを示す。図４は、ＣＯＳ−７およびＳＮＢ−１９細胞における、新規カチオン性脂質による、荷電密度の異なるオリゴヌクレオチドの核への運搬を示す。以下の実施例は説明のために記載されたものであり、制限するためのものではない。実施例一般的方法すべての反応は乾燥アルゴンの正圧下に行った。無水条件を必要とする反応は、アルゴン下で冷却した火炎乾燥ガラス製品を使用した。テトラヒドロフラン( ＴＨＦ、Ａldrich Ｍilwaukee，ＷＩ)はカリウム／ベンゾフェノンケチルから、使用直前に蒸留した。塩化メチレン、ピリジン、トルエン、ヘプタン、メタノールおよびエタノールは無水試薬として(＜０.００５％水)または試薬グレードで得、更に精製せずに使用した。ＴＬＣは０.２mm Ｅ．Ｍerck前コートシリカゲル６０Ｆ₂₅₄ＴＬＣプレート(２０×２０cmアルミニウムシート、Ｆisher，ＰＡ) で行った。フラッシュクロマトグラフィーは、Ｅ．Ｍerck２３０−４００メッシュシリカゲルを使用して行った。全ての¹Ｈ、¹³Ｃおよび³¹ＰＮＭＲスペクトルは、３００ＭＨz Ｂruker ＡＲＸスペクトロメーター(Ｂruker，Ｂoston，ＭＡ)で記録し、特記しない限り、ＣＤＣｌ₂で得た。マススペクトルは、Ｌa Ｌol la，ＣＡのＴhe Ｓcripps Ｒesearch Ｉnstitute Ｍass Ｓpectrometry Ｆacili tyにより提供された。ＦＡＢマススペクトルは、FISONG VG ZAB-VSE２焦点マススペクトロメーター(Ｆisons，Ａltrincham ＵＫ)装置で、セシウムイオンガンで得た。ＥＳＩマススペクトルは、API III PE Sciex３−４極マススペクトロメーター(Ｓciex，Ｔronto ＣＡ)で得た。実施例１：１((３β)−コレスト−５−エン−３−オール、２−(ジメチルアミノ ) エチルメチルホスホネート)の製造試薬はＡｌｄｒｉｃｈ（Milwaukee、WI）から購入し、更に精製することなく使用した：コレステロール（３６、２７９−４）；メチルホスホン酸・ジクロライド（２２、８０５−２）；イミダゾール（Ｉ−２０−２）；無水アセトニトリル（２７、１００−４）；無水ジクロロメタン（２７、０９９−７）。Ｎ,Ｎ− ジメチルエタノールアミン（Ｄ１５、７４０−６）は使用する前に減圧下で蒸留した。工程の全段階は、³¹ＰＮＭＲ分光計でモニターした。イミダゾール（５.５ｇ：(８１ｍｍoｌ)）の熱（５０℃）アセトニトリル（１６ｍＬ）溶液に、メチルホスホン酸・ジクロライド（２.７ｇ；(２０.３ｍｍｏｌ)）の温（４０℃）アセトニトリル（４ｍＬ）溶液に加えた。２−３分後、白色のイミダゾール・クロライドの沈澱が生成した。反応混合物を１５分間放置し、続いてＮ,Ｎ−ジメチルエタノールアミン（Ｒ₁ＯＨ、１.８ｍＬ；(２０.３ｍｍｏｌ)）を加えた。室温で２−３分後、全沈澱物が溶解し、均一な溶液が得られた。溶液を室温で３０分間放置し、続いてコレステロール（Ｒ₂ＯＨ、５.４ｇ；(１３.９ｍｍｏｌ)）のジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液を加えた。室温で３時間後、混合物を蒸発させて油状物を得た。油状物をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、有機層を水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、水から分離した未精製のエタノール（３０ｍＬ）から蒸発させ、２０−３０ｍＬのジクロロメタンを加えながら、３回蒸発させて油状の状態とした。粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製した（ジクロロメタン中５％メタノール）。生成物を含む画分を合わせ、高真空下で蒸発させると、白色固体が３.４ｇ（６.３ｍｍｏｌ）；４６％収率；使用したコレステロールから計算）得られた。Ｒｆ０.２６（１：１９メタノール：ジクロロメタン）。³¹Ｐ−{¹Ｈ}ＮＭＲ（１２１.４ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃；ジアステレオマーの混合物）ｐｐｍ：２９.９８および３０.５８。１−ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃；ジアステレオマーの混合物）実施例２：２（(３β)−コレスト−５−エン−３−オール、２−（(２,５−ジアミノ−１−オキソペンチル)アミノ）エチルメチルホスホネート・ジクロライド）の製造試薬はＡｌｄｒｉｃｈ（Milwaukee、WI）から購入し、更に精製することなく使用した：コレステロール（３６、２７９−４）；メチルホスホン酸・ジクロライド（２２、８０５−２）；イミダゾール（Ｉ−２０−２）；アセトニトリル（無水）（２７、１００−４）；無水ジクロロメタン（２７、０９９−７）。Ｎ−α−Ｎ−δ−ビス−Ｂoc−Ｌ−オルニチン−[Ｎ−(２−ヒドロキシエチル )]アミドを以下のように製造し、更に精製することなく使用した。Ｂis−Ｂoc− Ｌ−オルニチン（１５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１５０ｍＬ）溶液に、Ｎ− ヒドロキシスクシンイミド（１５ｍｍｏｌ）を加え、続いてジシクロヘキシルカルボジイミド（１６.５ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、ジシクロヘキシルウレアを濾別し、エタノールアミン（２２.５ｍｍｏｌ）を加えた。反応を室温で一晩行った。溶媒を除去し、残渣を酢酸エチルで抽出した。有機層を１０％クエン酸、水、飽和重炭酸ナトリウム、および食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧下で除去した。すべての主な工程段階は³¹ＰＮＭＲ分光計でモニターした。イミダゾール（２.２ｇ；（３２.３ｍｍｏｌ）の熱（５０℃）アセトニトリル５ｍＬ溶液にメチルホスホン酸・ジクロライド（１.０ｇ；(７.５ｍｍｏｌ)）の温（４０℃）アセトニトリル（３ｍＬ）溶液を加えた。２−３分後、イミダゾリウム・クロライドの白色沈殿が生成した。反応混合物をさらに１５分間放置し、続いてコレステロール（３.１ｇ(８.０ｍｍｏｌ)）のジクロロメタン（８ｍＬ）を加えた。室温で１時間、混合物を撹拌した後、Ｎ−α−Ｎ−δ−ビス−Ｂoc− Ｌ−オルニチン−[Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)]アミド（１.９５ｇ(５.２ｍｍｏｌ)）のアセトニトリル（５ｍＬ）溶液を加えた。室温で２時間撹拌した後、混合物を蒸発させて油状の状態とし、１００ｍＬジクロロメタンに溶解した。有機層を水（５０ｍＬ）で２回洗浄し、水層および境界層から分離し、２０−３０ｍＬのジクロロメタンを加えながら３回蒸発させて油状の状態とした。粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製した（ジクロロメタン中４％メタノール）。生成物を含む画分を合わせ、高真空下で蒸発させると、無色の油状物が得られた。残渣を乾燥ジオキサン１０ｍＬ中に溶解し、乾燥ジオキサン中７ＭＨＣｌを１０ｍＬ加えた。その直後に、白色の沈澱が生成した。室温で１時間後、混合物を蒸発乾燥させ、高真空下で蒸発させると、白色粉末が１.５６ｇ（１.７５ｍｍｏｌ）；３４％収率で得られた。Ｒ_f０.２２（１：２４メタノール：ジクロロメタン）³¹Ｐ−{¹Ｈ}ＮＭＲ（１２１.４ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃；ジアステレオマーの混合物）ｐｐｍ：３０.５３および３０.６４。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤ₃ＯＤ：ＣＤＣ１₃＝２：１；ジアステレオマーの混合物）実施例３：３（ホスホン酸、メチル−、２−(ジメチルアミノ)エチル１−ヘパデシオクタデシルエステル）の製造試薬はＡｌｄｒｉｃｈ（Milwaukee、WI）から購入し、更に精製することなく使用した：メチルホスホン酸・ジクロライド（２２、８０５−２）；イミダゾール（Ｉ−２０−２）；無水アセトニトリル（２７、１００−４）；無水ジクロロメタン（２７、０９９−７）。Ｎ,Ｎ−ジメチルエタノールアミン（Ｄ１５、７４０−６）は使用する前に減圧下で蒸留した。１８−ヒドロキシペンタトリアコンタンを下記のように製造し、更に精製することなく使用した。アルゴンを満たした乾燥フラスコ中に、新たに蒸留したテトラヒドロフラン(４００mＬ)中の水素化アルミニウムリチウム(０.７５ｇ、(１９ .８mmol))の溶液を製造した。この溶液に、ステアロン(５.０ｇ、(９.９mmol)) を添加した。反応混合物をゆっくり還流にもって行った(そして一晩還流して撹拌した)。室温に冷却後、残った水素化アルミニウムリチウムを水(０.７６mＬ) 、続いて１５％ＮａＯＨ(０.７６mＬ)および再び水(２.２mＬ)を滴下することにより停止させた。反応混合物を１時間撹拌した。溶媒を留去し、得られた固体を熱トルエン(３００mＬ)でトリチル化した。トルエンを留去し、所望のアルコールを得た(４.９ｇ、収率９７％)。全ての主な工程段階は³¹ＰＮＭＲ分光計でモニターした。イミダゾール（２.９ｇ(４２.５ｍｍｏｌ)）の熱（５０℃）アセトニトリル（６ｍＬ）溶液に、メチルホスホン酸・ジクロライド(１.４ｇ；(１０.４ｍｍｏｌ ))の温（４０℃）アセトニトリル（４ｍＬ）溶液を加えた。２−３分後、イミダゾール・クロライドの白色沈澱が生成した。反応混合物を１５分間放置し、続いてＮ,Ｎ−ジメチルエタノールアミン（１.０４ｍＬ（１０.４ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２−３分後、全沈澱物を溶解し、濁りのない溶液が得られた。溶液を室温で３０分間放置し、続いて１８−ヒドロキシペンタトリアコンタン（５.３ｇ(１０.４ｍｍｏｌ)）の熱（５０℃）ジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液を加えた。混合物を、１８−ヒドロキシペンタトリアコンタンの固体が溶解するまで３時間還流した。反応混合物を蒸発させると油状物が得られ、これをジクロロメタン（１００ｍＬ）中に溶解したエタノール（３０ｍＬ）から蒸発させた。有機層を水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ジクロロメタン（３×２０−３０ｍＬ）から蒸発させると油状物が得られた。粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン中５％メタノール）で精製し、生成物を含有する画分を合わせ、蒸発させ、高真空下で放置すると無色の油状物が得られた。油状物を乾燥ジオキサン（１０ｍＬ）に溶解し、ジオキサン中、乾燥ジオキサン（１０ｍＬ）の７ＭＨＣｌを加えた。１５分後、混合物を蒸発乾燥させ、高真空下で放置すると白色固体が２.４５ｇ（３.７ｍｍｏｌ；３６％収率）が得られた。Ｒｆ０ .３２（１：１９メタノール：ジクロロメタン）；³¹Ｐ−{¹Ｈ}ＮＭＲ（１２１. ４ＭＨｚ；ＣＤＣｌ³）ｐｐｍ：２９.９８。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃）実施例４：細胞調製および処理ＣＯＳ７細胞(ATCC#CRL1651)を１．５×１０⁵細胞／ウェルで１２ウェルプレート型にトランスフェクション開始前日に入れた。全培養を５％ＣＯ₂中、３７ ℃に維持した。翌日、トランスフェクション混合物を下記の通り調整した：標的ＣＡＴプラスミド(ｐＧ１０４０、ＵＣＡＴクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を、Ｉnvitrogen社、サンディエゴ、CAから入手したｐＲｃ／ＣＭＶに挿入する、実施例５参照)４μｇをＯpti−ＭＥＭ(登録商標)(Ｇibc o／ＢＲＬ，Ｇaithersburg，ＭＤ)２mＬ中の１０、５０、１００または４００ナノモル最終ホスホロチオエートオリゴマー(ＪＢＬＳcientific，Ｓan Ｌuis，Ｏbispo，ＣＡ)と合わせる。オリゴマー／プラスミド混合物を、脂質２４マイクログラムと合わせ、穏やかにボルテックスにかけた。最終プラスミド濃度は２μ ｇ／mＬであり、最終脂質濃度は１２mg／mＬであった。最終結果は、２つづつ試験したトランスフェクション混合物の４つのものであった：ｐＧ１０４０プラスミド＋２５１９−１オリゴマー＋リポフェクチンｐＧ１０４０プラスミド＋２５２０−１オリゴマー＋リポフェクチンｐＧ１０４０プラスミド＋２５１９−１オリゴマー＋GC-001/GC-003脂質混合物ｐＧ１０４０プラスミド＋２５２０−１オリゴマー＋GC-001/GC-003脂質混合物ホスホロチオエートオリゴマー５１９−１(5'-tag-ctt-cct-tag-ctc-ctg-ca t)は、ＣＡＴｍＲＮＡ上の＋１から＋２１由来のｐＧ１０４０に合致する。ホスホロチオエートオリゴマー２５２０−１(5'-tag-ctt-ccg-caa-ctc-ttg-ca t)は、４ミスマッチ対照ホスホロチオエートであり、またＣＡＴｍＲＮＡ上の＋１から＋２１由来である。培養培地を吸引し、細胞を２回、Ｏpti−ＭＥＭ(登録商標)１mＬ／ウェルで濯ぎ、次いでトランスフェクション混合物１mＬを各ウェルに添加した。細胞を、１６時間、トランスフェクション混合物で培養した。混合物を除去し、完全培養培地(ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清およびペシリン／ストレプトマイシンストックの１／１００希釈、全てＧobco／ＢＲＬ，Ｇaithersburg，ＭＤ由来)１mＬと代え、細胞を更に５時間インキュベートした。ＰＢＳで２回濯ぎ、１×Ｒeporter Ｌｙsis Ｂuffer(Ｐromega，Ｍadison，ＷＩ)０.５mＬで処理して、細胞融解物を製造した。融解細胞を１.５mＬ試験管にピペットで移し、ＣＯ₂／ＥｔＯＨで一度凍結し、融解させた。粗い融解物を次いで１４，０００rpm、１０分のマイクロ遠心によりペレット細胞残骸を浄化した。上清を回収し、直接または−２０℃に凍結させて検定した。次いで、細胞融解物をＣＡＴ活性について検定し、全タンパク質濃度を下記のように決定した。ＣＡＴ活性は下記のように全タンパク質に関して標準化し、プロットした。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ検定以下の反応混合物を各サンプルについて製造した：０.２３Ｍトリス６５mL、ｐＨ８/０.５％ＢＳＡ(Ｓigma，Ｓt．Ｌouis，ＭＯ) ¹⁴Ｃ−クロラムフェニコール４μＬ、５０nＣi／μＬ(Ｄupont，Ｂoston，ＭＡ)およびｎ−ブチリルコエンザイムＡ５μＬ／mＬ(Ｐharmacia，Ｐiscataway，ＮＪ) ＣＡＴ活性標準曲線はＣＡＴストック(Ｐromega，Ｍadison，ＷＩ)を１：１０００、１：１０,０００および１：９０,０００に０.２５Ｍトリス、ｐＨ８／０. ５％ＢＳＡで連続希釈して製造した。本来のストックＣＡＴは７０００単位／m Ｌであった。次いで、ＣＡＴ融解物をトリス／ＢＡＳと共に標識試験管に、最終量５０μＬで入れた。約７４μＬの反応混合物を各試験管に入れ、それを次いで約１時間、３７℃オーブンでインキュベートした。プリスタン／混合キシレン(２：１)(Ｓigma，Ｓt ．Ｌouis，ＭＯ)を各試験管に添加することにより、反応を停止させた。試験管を次いで２分ボルテックスおよび５分回転させた。約４００μＬの上層を、５m ＬＳcintiverse(Ｆisher，Ｐittsburgh，ＰＡ)含有シンチレーションバイアルに移した。次いで、サンプルをシンチレーションカンウターで計数した(Ｐackard) 。クーマシータンパク質検定浄化細胞融解物の全タンパク質含量を、非処理マイクロタイター検定プレート中で、各細胞融解物６μＬにクーマシータンパク質検定試薬(Ｐierce，Ｒorkfor d，ＭＤ)を混合することにより測定した。濃度標準曲線を４μＬの０、７５、１００、２００、２５０、４００、５００、１０００および１５００mg／mＬＢＳＡストック溶液および３００μＬのクーマシー薬を使用して調製した。検定サンプルを約３０分放置し、その後マイクロプレートリーダー(Ｍolecular Ｐrobe s)で５７０nmの光学吸光度を読み取った。結果は、１と４の組み合わせがリポフェクタミンより良好なオリゴ／プラスミド輸送を可能にしたことを示す。事実上、０.０１から０.１マイクロモルのリポフェクタミンで効果は見られなかった。１と４の組み合わせで、特異的阻害が０ .１μＭオリゴマーで非常に明確であり、０.０１から０.１の傾きが合理的用量反応を示す。これらのデータから、１と４の組み合わせが、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、リポフェクチンまたはプラスミド単独よりも良好に輸送できたことが見られる。対照オリゴマー２５２０によるｐＧ１０４０に対する活性の欠如が、これが実際のアンチセンス効果であり、オリゴマーのプラスミド輸送の妨害のような人工物によるものでないことを示す。実施例５：カチオン性脂質３および５およびＣＡＴプラスミドの組合せを用いる、ＣＯＳ−７、ＳＮＢ−１９、ＲＤおよびＣ８１６１細胞の製造およびトランスフェクションプロトコール全細胞系をトランスフェクション前の日に１２ウェルのプレート形式に１.５ ×１０⁵細胞／ウェルで培養した。全培養物を３７℃、５％ＣＯ₂で維持した。次の日、細胞が約８０％の集合に到達したときに、トランスフェクション混合物を以下のように調製した：標的ＣＡＴプラスミド１２６μｇ（ｐＧ１０３５、他方のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を、Invitrogen社のｐＲｃ／ＣＭＶに挿入した、下記参照）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）３６. ０ｍＬに加え、プラスミド貯蔵溶液を調製した。各脂質混合物６３μｇ（１００％エタノール中の高濃度貯蔵物から）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）の個々の１.５ｍＬに加え、よく混合した。ついで、ＤＮＡ貯蔵物２ｍＬ（プラスミドを７μｇ含有）を脂質／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）の各１.５ｍＬ等分に加え、穏やかに撹拌した。本法により、脂質とＤＮＡの比が９対１である、２μｇ／ｍＬプラスミドおよび１８μｇ／ｍＬ脂質のプラスミド／脂質混合物３.５ｍＬが得られた。最終細胞培養物中のエタノールの量は、２％またはそれ以下であった。このようにエタノールが少量であることから、どの細胞系にも副作用はないことが確認された。細胞を実施例４に記載したようにＣＡＴタンパク質についてアッセイを行った。実施例６：ＦＩＴＣ−オリゴヌクレオチド取り込みアッセイ法全細胞系試験でカチオン性脂質媒介オリゴヌクレオチド取り込みの測定に使用するオリゴヌクレオチドは以下の通りであった： #3498-PS：５'ＦＩＴＣ-ggt-ata-tcc-agt-gat-ctt-ctt-ctc、全ホスホロチオエート骨格。このオリゴヌクレオチドは骨格に２３陰性電荷を有し、１００％陰性電荷と見なされる。 #3498：５'ＦＩＴＣ-ggt-ata-tcc-agt-gat-ctt-ctt-ctc，キメラオリゴヌクレオチド。下線塩基はホスホロチオエート骨格により結合しているが、オリゴマー中の他の結合は光学的に純粋なＲｐ−メチルホスホネートおよびホスホジエステルの代わりと考えられる。オリゴマーは１１メチルホネート、７ジエステルおよび５ホスホロチオエート結合を有する。全電荷密度は3498-PSの５７％であった。 #3793-2：５'ＦＩＴＣ-ggu-aua-ucc-agu-gau-cuu-cuu-cut、オリゴヌクレオチドの各リボースの全２'−Ｏ−メチル基の光学的に純粋なＲp−メチルホスホネートおよびジエステル骨格への置換。全電荷密度は3498-PSの５０％であった。オリゴヌクレオチド3498-PSおよび3498ストックは３００μmであったが、3793 -2ストックは４４０μmであった。本試験で使用した商品として入手可能な脂質は以下の通りであった：表のデータに記載のように、これらの評価に使用した各ホスホン酸基本脂質は１００％エタノール中１mg／mＬであった。組織培養細胞ストック、ＳＮＢ−１９(ヒト膠芽腫)、Ｃ８１６１(未確認組織由来ヒト癌)、ＲＤ(ヒト横紋筋肉腫、ATCC#CCL-136)およびＣＯＳ−7(アフリカミドリザル腎臓細胞、ATCC#1651)を標準培養培地：Ｍediatech，Ｌot#150901126 由来ＤＭＥＭ／Ｆ１２(１：１)混合物、Ｇemini Ｂioproducts，Ｌot#A1089K由来１０％ウシ胎児血清、Ｍediatech，Ｌot#30001044由来１００単位／mLペニシリンおよび１００マイクログラム／mＬストレプトマイシンおよび３６５マイクログラム／mＬＬ−グルタミンに維持した。細胞を標準条件下、３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気に固定および顕微鏡試験前の全時間、維持した。各ＦＩＴＣ−標識オリゴヌクレオチド輸送測定は、データ表に記載のような適当な細胞を１６ウェルスライド(Nunc #178599、シリコンガスケットスライド表面に結合した１６個の除去可能プラスチックウェル付きガラス顕微鏡スライド) に、標準組織培養法に従い置くことにより開始した。各細胞系は、健康で、プレーティング後１から２日で６０−８０％コンフルエントになる、出発密度(約２, ０００細胞／ウェル)でプレーティングした。細胞をガラスに接着させ、通常の成育培地中で、トランスフェクション開始２４から４８時間前にプレーティング工程から除去した。オリゴヌクレオチドトランスフェクション混合物をＯpti−ＭＥＭ(登録商標) に、下記のように構成物質内で製造した：3498-PS、3498または3793-2 ０.２５ μm(オリゴヌクレオチド２μｇ)含有Ｏpti−ＭＥＭ(登録商標)５００μＬアリコートを１.５mＬエッペンドルフ試験管にピペットで移動させた。次いで、各カチオン性脂質または脂質混合物を、データ表に記載のように、カチオン性脂質対オリゴヌクレオチドの重量で最終９：１または６：１比(全脂質１８または１２μg )の比率となるようにオリゴヌクレオチド溶液に添加した。試験管を脂質添加直後ボルテックスにかけることにより撹拌した。トランスフェクションを、Ｏpti−ＭＥＭ(登録商標)２００μＬ中の細胞を濯ぎ、次いで細胞をダルベッコリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)溶液で濯ぐことにより開始した。次いで、各オリゴヌクレオチドトランスフェクション混合物２００μＬを各ウェルに直接添加し、各トランスフェクション反応を開始させた。トランスフェクションを４から６時間続けた。次いで、細胞をＰＢＳで濯ぎ、３.７％ホルムアミド(Ｓigma，Ｓt．Ｌouis，ＭＯ)２００μＬで１０分固定化し、トランスフェクションを終了させ、次いで再びＰＢＳで濯いだ。ホルムアルデヒドを５０mＭグリシン(Ｓigma，Ｓt．Ｌouis，ＭＯ)２００μＬで１０分停止させた。最後に、ウェルをグリシン溶液を振って空にし、プラスチックチャンバーおよびシリコンガスケットを除去し、細胞をＦluoromount−Ｇマウンティング培地(Ｆish erから、光タンパク阻害剤と共に)およびカバースリップで覆った。細胞内蛍光を２００×倍率でＮikon Ｌabophot-2顕微鏡およびエピスコピック (episcopic)−蛍光付属品で測定した。この装置を使用して、我々は、核由来の細胞外とエンドソーム蛍光を容易に区別できた。細胞を取り込みに関して下記のように点数付した：核蛍光無し、０；２０％までの蛍光核、１；４０％までの蛍光、２；６０％までの蛍光核、３；８０％までの蛍光核、４；１００％までの蛍光核、５_o 実施例７：プラスミド以下のプラスミドをある実施例で使用した。ｐＧ１０３５：スプライサーＣＡＴ、ｐＲｃ／ＣＭＶベクター内に挿入ｐＧ１０３６：野生型ＣＡＴ、ｐＲｃ／ＣＭＶベクター内に挿入ｐＧ１０４０：ＵＣＡＴ、ｐＲｃ／ＣＭＶベクター内に挿入ｐＧＬ２：ルシフェラーゼ発現プラスミド(Ｐromega) ｐＳＶｂ：ｂ−ガラクトシダーゼ発現プラスミド(Ｃlonetech) プラスミドｐＧ１０３５、ｐＧ１０３６およびｐＧ１０４０の記載は下記の通りである。１．ｐＧ１０３５(スプライサーＣＡＴ)およびｐＧ１０３６(野生型ＣＡＴ)および合成スプライス部位の配列Ａ．プラスミドｐＧ１０３６の製造に使用した野生型ＣＡＴ遺伝子：Ｂ．スプライサーＣＡＴおよびプラスミドｐＧ１０３５を製造するためのＣＡＴコード配列内のイントロン挿入の完全配列：イントロを挿入するＣＡＴ遺伝子の領域は、上記配列Ａ内に示す。野生型ＣＡＴＤＮＡ(Ｐharmacia)をpＲc／ＣＭＷ(Ｉnvitrogen，Ｓan Ｄiego，ＣＡ)に挿入し、プラスミドｐＧ１０３６を製造した。配列はｍＲＮＡとして示す。塩基４０９および４１０をｐＧ１０３５と比較するために標識する。上記配列Ｂとして示す合成イントロンをＣＡＴＤＮＡに挿入し、プラスミドｐＧ１０３５を製造した。成熟ｍＲＮＡ配列を大文字で示し、イントロン配列を小文字で示す。スプライスドナーのカノニカル(canonical)グアノシンは標識＋４０９であり、ＣＡＴ開放読み取り枠の塩基４０９に対応する。イントロンの最初の塩基は標識１である。カノニカル枝別れ点のアデノシンは塩基３９であり、カノニカルイントロンスプライスアクセプターグアノシンはイントロンの塩基８７である。塩基４１０はＣＡＴ開放読み取り枠の回復を示す。オリゴマーが標的とする配列は下線を引く。コンセンサススプライス部位塩基は太字斜字で示す(Ｓmith et al.，Ａnn ．Ｒev．Ｇenet．23:527，1989；Ｇreen，Ａnn．Ｒev．Ｇenet．20:671，1986) 。クローンｐＧ１０３５を合成ＤＮＡＰＣＲプライマーを使用して製造し、開放読み取り枠の最初の２／３および合成イントロンの半分を含むＨind III−Spe I 5'フラグメントおよびイントロンの残りの半分および開放読み取り枠の最後の１／３を含むＳpe Ｉ−Ｎot Iフラグメントを製造した。これらを３方向ライゲーションでＨind III−Ｎot Ｉ切断ｐＲｃ／ＣＭＷと結合し、最終プラスミドを合成した。イントロン含有人口ＣＡＴ遺伝子をスプライサーＣＡＴと名付ける。前記に使用可能な参考文献は、Ｓmith et al.前掲およびＧreen前掲である。２.ｐＧ１０４０(ＵＣＡＴ)５'非翻訳領域およびアミノ末端：野生型ＣＡＴ：ＡＵＧ開始コドンの回りの野生型およびｐＧ１０４０ＵＣＡＴの配列を示す。オリゴマーの標的部位を名前を書き、下線を引き、各標的部位に対するキメラオリゴマーの数を下に示す。ＵＣＡＴを、合成ＤＮＡＰＣＲプライマーを使用して野生型ＣＡＴＤＮＡ (Ｐharmacia，，Ｐiscataway，ＮＪ)から合成した。得られたフラグメントを、Ｈind III(５'末端)、Not Ｉ(３'末端)としてベクターｐＲｃ／ＣＭＷ(Ｉnvitro gen，Ｓan Ｄiego，ＣＡ)にクローンした。開放読み取り枠の最初のアデノシンを＋１と名付けた。野生型およびｐＧ１０４０の間のアミノ酸変化は保存的である。上記の本発明の要約は非限定的であり、本発明の他の性質および利点は以下好ましい態様の記載および請求の範囲から明らかになる。引用した全ての参考文献は、その全体を参考として本明細書に包含させる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｊ 41/00 Ｃ０７Ｊ 41/00 43/00 43/00 (72)発明者ブラウン，ボブ・デイルアメリカ合衆国92024カリフォルニア州エンシニタス、ノース・ウィロー・スプリング・ドライブ445番 (72)発明者シュワルツ，デイビッド・アーロンアメリカ合衆国92024カリフォルニア州エンシニタス、バレダ1544番

Claims

【特許請求の範囲】１．構造：〔式中、(ａ)Ｒ₁は親油性部分；(ｂ)Ｒ₂は陽性電荷部分；(ｃ)Ｒ₃は約１から約２４個の炭素原子の親油性基、正に荷電した基、または負に荷電した基；(ｄ)ｎは１から８の整数；(ｅ)Ｘ^-はアニオンまたはポリアニオン；(ｆ)ＹはＮまたはＯ、および(ｇ)ｍは０から脂質に存在する陽性電荷と同じ数までの整数〕の構造を有する脂質、またはその塩または溶媒和物またはそのエナンチオマー。２．Ｒ₁が、１から約２４炭素原子の直鎖アルキル、２から約２４炭素原子の直鎖アルケニル、約１０から約５０(好ましくは２５−４０)炭素原子の対称に分枝したアルキルまたはアルケニル、約１０から約５０炭素原子の非対称に分枝したアルキルまたはアルケニル、ステロイジル部分、グリセリル誘導体、アミン誘導体、およびＯＣＨ(Ｒ₄Ｒ₅)またはＮ(Ｒ₄Ｒ₅)(式中、Ｒ₄およびＲ₅は、約１０から約３０炭素原子の直鎖または約３から約３０炭素原子の分枝アルキル部分) からなる群から選択される親油性部分である、請求項１記載の脂質。３．ステロイジル部分がコレステリルである、請求項２に記載の脂質。４．Ｒ₁が、直鎖、分枝または環状アシルアミンまたはアルキルアミンから選択されるアミン誘導体である、請求項２に記載の脂質。５．Ｒ₁が、３−Ｎ−１,２−ジアシル−１,２−プロパンジオール−３−アミノ部分、３−Ｎ−１,２−ジアルキル−１,２−プロパンジオール−３−アミノ部分、および３−Ｎ−１,２Ｎ,Ｎ−ジアシル−１,２,３−トリアミノプロパニル部分からなる群から選択されるアミン誘導体である、請求項２に記載の脂質。６．３−Ｎ−１,２−ジアシル−１,２−プロパンジオール−３−アミノ部分が、約１０から約３０炭素原子のアルカン酸または約１０から約３０炭素原子のアルケン酸から選択されるジアシル部分を有するものである、請求項５に記載の脂質。７．３−Ｎ−１,２−ジアルキル−１,２−プロパンジオール−３−アミノ部分が約１０から約３０炭素原子のアルキル基または約１０から約３０炭素原子のアルケニル基から選択されるアルキル部分を有するものである、請求項５に記載の脂質。８．Ｒ₁が、３−Ｏ−１,２−ジアシルグリセリル部分または３−Ｏ−１,２− ジアルキルグリセリル部分である、請求項２に記載の脂質。９．３−Ｏ−１,２−ジアシルグリセリル部分が約１０から約３０炭素原子のアルカン酸または約１０から約３０炭素原子のアルケン酸を有するものである、請求項８に記載の脂質。１０．アルカン酸がステアリン酸である、請求項６または９のいずれかに記載の脂質。１１．アルケン酸がパルミチン酸またはオレイン酸である、請求項６または９のいずれかに記載の脂質。１２．３−Ｏ−１,２−ジアルキルグリセリル部分が約１０から約３０炭素原子のアルキル基または約１０から約３０炭素原子のアルケニル基から選択されるアルキル部分を有するものである、請求項８に記載の脂質。１３．Ｒ₂が、側鎖に陽性電荷基を有するアミノ酸残基、アルキルアミン部分、フルオロアルキルアミン部分または１から約６炭素原子の過フルオロアルキルアミン部分、５から約１０炭素原子のアラルキルアミン部分、グアニジニウム部分、エナミン部分、約５から約１０炭素原子の芳香族または非芳香族環状アミン部分、アミジン部分、イソチオウレア部分、ヘテロ環状アミン部分、置換ヘテロ環状部分もしくは、ＮＨ₂、Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ₂、ＮＨＲ₆、Ｃ(＝Ｏ)ＮＨＲ₆、ＮＨＲ₆ Ｒ₇またはＣ(＝Ｏ)ＮＨＲ₆Ｒ₇(式中、Ｒ₆およびＲ₇は１から約２４の炭素原子のアルキル部分、２から約２４炭素原子のアルケニル部分、約５から約２０炭素原子のアリール部分、約６から約２５炭素原子のアラルキル部分から独立して選択される)からなる群から選択される基で置換されている１から約６炭素原子の置換アルキル部分からなる群から選択される陽性電荷部分である、請求項１記載の脂質。１４．Ｒ₂が、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチンまたはアミノ酸アナログから選択されるアミノ酸残基である、請求項１３記載の脂質。１５．アミノ酸アナログが３−カルボキシスペルミジン、５−カルボキシスペルミジン、６−カルボキシスペルミジンおよびモノアルキル、ジアルキルまたは過アルキル置換誘導体(１から約６炭素原子のアルキル基と共に１個またはそれ以上のアミン窒素で置換されている)からなる群から選択される、請求項１４記載の脂質。１６．Ｒ₃が、約３から約２４炭素原子の直鎖アルキル部分、２から約２４炭素原子の直鎖アルケニル部分、約１０から約５０炭素原子の対称に分枝したアルキルまたはアルケニル部分、約１０から約５０炭素原子の非対称に分枝したアルキルまたはアルケニル部分、約５から約２０炭素原子のアリール部分、約６から約２５炭素原子のアラルキル部分、およびステロイジル部分からなる群から選択される親油性部分である、請求項１記載の脂質。１７．Ｒ₃が、側鎖に陽性電荷基、アルキルアミノアルキル部分、フルオロアルキルアミノアルキル部分、過フルオロアルキルアミノアルキル部分、グアニジニウムアルキル部分、エナミノアルキル部分、環状アミノアルキル部分、アミジノアルキル部分、イソチオウレアアルキル部分およびヘテロ環状アミンを有するアミノ酸残基からなる群から選択される陽性電荷部分である、請求項１に記載の脂質。１８．Ｒ₃が、カルボキシアルキル部分、ホスホノアルキル部分、スルホノアルキル部分、および１から約２４炭素原子のホスファチジルアルキル部分からなる群から選択される陰性電荷部分である、請求項１に記載の脂質。１９．ｎは１から８までの整数である、請求項１に記載の脂質。２０．ｎは２から６までの整数である、請求項１に記載の脂質。２１．ｎは２、３または４である、請求項１に記載の脂質。２２．Ｘ^-は医薬的に許容可能なアニオンまたはポリアニオンである、請求項１に記載の脂質。２３．構造：を有するメチルホスホネート。２４．構造：を有するメチルホスホネート。２５．構造：を有するメチルホスホネート。２６．構造：を有するホスホン酸エステル。２７．構造：を有するホスホン酸エステル。２８．構造：を有するホスホン酸エステル。２９．構造：を有するホスホン酸エステル。３０．構造：を有するホスホン酸エステル。３１．構造：を有するホスホン酸エステル。３２．構造：を有するホスホン酸エステル。３３．ポリアニオン巨大分子および請求項１記載の脂質を含む組成物。３４．ポリアニオン巨大分子が細胞内でポリペプチドを発現できる発現ベクターを含む、請求項３３記載の組成物。３５．ポリアニオン巨大分子がオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーである、請求項３３記載の組成物。３６．ポリアニオン巨大分子がＤＮＡである、請求項３３記載の組成物。３７．請求項３３記載の組成物を細胞と接触させることによる、ポリアニオン性巨大分子を細胞に輸送する方法。３８．オリゴマーが、タンパク質をコードする細胞中のＲＮＡ配列と実質的に相補的な塩基配列を有する、細胞中のタンパク質の発現を、請求項３５の組成物を細胞と接触させることにより妨害する方法。３９．請求項３３記載の組成物を含む、ポリアニオン性巨大分子を細胞内に輸送させるためのキット。４０．(ａ)Ｒ₁が、(ｉ)２５から４０炭素原子の対称に分枝したアルキルまたはアルケニル；(ii)ステロイジル部分；および（iii）グリセロール誘導体からなる群から選択され、 (ｂ)ｎは０から４であり； (ｃ)Ｒ₂が、（ｉ）アルキルアミン部分；および（ii）ＮＨ₂、Ｃ(＝Ｏ）ＮＨ₂、ＮＨＲ₆、Ｃ(＝Ｏ)ＮＨＲ₆、ＮＨＲ₆Ｒ₇、またはＣ(＝Ｏ)ＮＨＲ₆Ｒ₇（ただし、Ｒ₆およびＲ₇は、独立して、１から約２４炭素原子のアルキル部分、２から約２４炭素原子のアルケニル部分、５から約２０炭素原子のアリール部分、または約６から約２５炭素原子のアラルキル部分から選択される）からなる群から選択される置換基で置換された１から約６炭素原子の置換アルキル部分；からなる群から選択される陽性電荷部分であり； (ｄ)Ｘはアニオンまたはポリアニオンであり；および (ｅ)ｍは０から脂質中に存在する陽性電荷に等しい数までの整数である、構造を有する脂質、または塩または溶媒和物、またはそのエナンチオマー。