KR20010042318A - 신규 핵산 전달제, 이를 함유하는 조성물 및 용도 - Google Patents

신규 핵산 전달제, 이를 함유하는 조성물 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산을 세포로 전달하기 위한 제제로서 유용한 신규 화합물에 관한 것이다. 신규 화합물은 특히 리포폴리아민류에 관한 것이고 적어도 사이클릭 아미딘 작용기를 포함한다. 이들은 해당 핵산을 상이한 세포형으로, 시험관내 또는 생체내 또는 생체외에서 형질감염시키는 데 유용하다.

Description

신규 핵산 전달제, 이를 함유하는 조성물 및 용도{NOVEL NUCLEIC ACID TRANSFER AGENTS, COMPOSITIONS CONTAINING SAME AND USES}
생명공학의 발달과 함께, 세포로 핵산의 효과적인 전달 가능성이 요구되었다. 이는 예를 들면 재조합 단백질의 생산을 위해 시험관내에서 또는 DNA를 포함하는 유전자 발현의 조절, 유전자의 클로닝 또는 기타 조작을 연구하기 위해 실험실에서 핵산의 세포로의 전달을 포함할 수 있다. 이는 또한 예를 들면, 트랜스제닉 동물의 형성, 백신의 생산, 표지 연구의 실행 또는 또한 치료적 접근을 위해 생체내에서 핵산의 세포로의 전달을 포함할 수 있다. 이는 또한 이들의 후속 재투여를 위해 유기체로부터 수집된 세포로 유전자의 전달을 포함하는 골수이식, 면역요법 또는 기타 방법을 위한 접근으로, 생체외에서 핵산의 세포로의 전달을 포함할 수 있다.
다양한 유형의 합성 벡터가 핵산의 세포로의 전달을 향상시키기 위해 개발되었다. 이러한 벡터 중에서, 양이온 지질은 유리한 특성을 지닌다. 이러한 벡터는 핵산과 상호작용하는 양이온 극성 부분과, 세포 침투를 촉진하는 소수성 지질 부분으로 이루어진다. 양이온 지질의 특정예는 특히 일양이온 지질(DOTMA: 리포펙틴R), 일부 양이온 세제(DDAB), 리포폴리아민 및 특히 디옥타데실아미도글리실 스페르민(DOGS) 또는 팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스페르밀아마이드(DPPES)이고, 이의 제조는 예를 들면, 특허 출원 EP 394,111에 설명되어 있다. 다른 리포폴리아민류는 본 출원에 참조로 인용된 특허 출원 WO 97/18185에 설명되어 있는 화합물로 예시되고, 도 1에 도시된다.
그러나, 지금까지, 조직, 특히 근육으로의 주사는 종종 이의 세포로의 투입을 촉진하기 위해 비-제형된 DNA로 제조되었고, 합성 벡터와의 배합은 세포로 도입되기에는 크기가 너무 큰 복합체를 유도한다.
본 발명은 핵산을 세포로 전달하기 위한 제제로서 유용한 신규 화합물에 관한 것이다. 이러한 신규 화합물은 특히 리포폴리아민류와 관련이 있고 적어도 하나의 사이클릭 아미딘 작용기를 포함한다. 이들은 핵산을 다양한 유형의 세포에, 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 형질감염시키는 데 유용하다.
도 1: 본 출원과 본 출원에 참조로 인용된 특허 출원 WO 97/18185에 설명된 지질 A, 지질 B, 지질 C 및 지질 D라고 불리는 합성 벡터의 구조.
도 2: 플라스미드 pXL2774의 개략도.
도 3: 화합물 (1)/DNA 뉴클레오리피드 복합체의 위상도. 화합물 (1)의 DNA와의 결합은 오른쪽에 위치한 y-축에 따라 설명된 것처럼, 에티디움 브로마이드(EtBr)(●, 실선)의 형광(%로, 100%는 네이키드 DNA의 형광이다)의 감소에 의해 측정된다. 복합체 입자의 크기(nm)는 왼쪽에 위치한 y-축에 나타내었다. x-축은 전달제/DNA 전하비를 나타낸다. 공-지질 없는 뉴클레오리피드 복합체의 크기는 실선으로 ■에 의해 표시된다. 25% 콜레스테롤을 함유하는 뉴클레오리피드 복합체의 크기는 점선으로 □에 의해 표시된다. 40% DOPE를 함유하는 뉴클레오리피드 복합체의 크기는 점선으로 ◆에 의해 표시된다. 이 방법은 3 ㎛ 이상의 입자 크기를 측정할 수 없다.
도 4: 공-지질 없이(어두운 중간 바), 25% 콜레스테롤(중간정도로 어두운 왼쪽 바)과 40 몰% DOPE(밝은 오른쪽 바)를 지니고, 본 발명에 따른 화합물 (1)을 함유하는 뉴클레오리피드 복합체의 HeLa 세포로의 시험관내 유전자 전달의, 네이키드 DNA와 비교한 활성. DNA가 본 발명에 따른 화합물로 완전히 포화되고 크기가 100 nm 내지 300 nm인 뉴클레오리피드 복합체만이 사용된다.
도 5: 화합물 (3)으로부터 형성된 뉴클레오리피드 복합체의 HeLa 세포로의 시험관내 유전자 전달 활성. 형질감염된 웰당 pg로 표현된, 루시퍼라제의 발현은 y-축에 표시된다. 화합물 (3)과 DNA 사이의 전하비는 nmol/㎍ 으로 x-축에 표시된다. 발현은 공-지질(미셀) 없이, DOPE와 콜레스테롤을 지닌 제형물에 대해 각 횟수마다 측정된다.
도 6: 화합물 (5)로부터 형성된 뉴클레오리피드 복합체의 HeLa 세포로의 시험관내 유전자 전달 활성. 형질감염된 웰당 pg로 표현된, 루시퍼라제의 발현은 y-축에 표시된다. 화합물 (5)와 DNA 사이의 전하비는 nmol/㎍으로 x-축에 표시된다. 발현은 공-지질(미셀) 없이, DOPE와 콜레스테롤을 지닌 제형물에 대해 각 횟수마다 측정한다.
도 7: 화합물 (6)로부터 형성된 뉴클레오리피드 복합체의 HeLa 세포로의 시험관내 유전자 전달 활성. 형질감염된 웰당 pg로 표현된, 루시퍼라제의 발현은 y-축에 표시된다. 화합물 (6)과 DNA 사이의 전하비는 nmol/㎍으로 x-축에 표시된다. 발현은 공-지질(미셀) 없이, DOPE와 콜레스테롤을 지닌 제형물에 대해 각 횟수마다 측정한다.
도 8: 공-지질 없이(어두운 바), 25% 콜레스테롤(중간정도로 어두운 바)과 40 몰%의 DOPE(밝은 바)를 지니고, 본 발명에 따른 화합물 (1) 또는 화학식 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)17CH3]2(하기에서 "지질 A"라고 언급)의 화합물을 함유하는 복합체의 근육으로의 직접 주사후에, 네이키드 DNA와 비교한 생체내 유전자 전달 활성. DNA가 완전히 지질로 포화되고 이의 크기가 100 nm 내지 300 nm인 복합체만이 사용된다.
도 9: 본 발명의 중요성이 두 상이한 지질, 즉 본 발명에 따른 화합물 (1)과 지질 A 및 네이키드 DNA의 두가지 투여 경로: 정맥내(iv) 경로와 근육내(im) 경로를 통한 유전자 전달 활성을 비교함으로써 설명된다. DNA가 지질로 완전히 포화되고 이의 크기가 100 nm 내지 300 nm인 복합체만이 사용된다.
도 10: 공-지질 없이 전하비 0.25/1에서 본 발명에 따른 화합물 (5) 또는 (6)을 함유하는 뉴클레오리피드 복합체의 i.m. 주사 48시간 후에, 네이키드 DNA와 비교한 생체내 유전자 전달 활성. 발현은 ㎖당 루시퍼라제 pg로 표현된다. 왼쪽부터 출발하여, 바는: (a) 네가티브 조절; (b) 네이키드 DNA; (c) 화합물 (5) 및 (d) 화합물 (6)을 나타낸다.
재료 및 방법
A/ 재료
- 출발 아미노산 또는 폴리아미노산(또는 이의 유도체)는 시판되고 있다. 이는 예를 들면, N-(3-아미노프로필)글리신, N-(2-시아노에틸)글리신 또는 2,4-디아미노부티르산의 경우이거나, 당업자에게 공지된 통상적인 방법으로 합성될 수도 있다.
- 사이클릭 이소티오우레아 또한 시판되는 산물이고, 예를 들면 2-메틸티오-2-이미다졸린 하이드라이오다이드이거나, 당업자에게 공지된 통상적인 방법으로 합성될 수 있다.
- 하나 이상의 지질(들)로 치환된 아민은 시판되거나 알킬화 환원에 의해 상응하는 아민과 알데하이드로부터 합성된다.
-트리에틸아민, 트리플루오로아세트산, 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP), 디메틸아미노피리딘(DMAP), 벤질 클로로포메이트, 디-tert-부틸 디카보네이트와 같은 산물은 시판되는 산물이다. 나트륨 클로라이드와 나트륨 카보네이트 용액은 포화된다. 칼륨 설페이트 용액은 0.5 M의 농도를 가진다.
B/ 방법
1)물리적 측정
양성자 NMR 스펙트럼이 Bruker 400과 600 MHZ 분광계상에 기록된다.
질량 스펙트럼은 API-MS/Ⅲ상에 취해진다.
2) 정제 및 분석 방법
a) 직접-상 크로마토그래피 조건
- 박층 크로마토그래피(TLC)가 0.2 mm 두께 Merck 실리카 겔 플레이트상에서 실행된다. 이들은 U.V.(254 nm)하에서, 닌하이드린으로, 닌하이드린의 에탄올 용액(400 mg/에탄올 100 ㎤)을 분무(가벼운 분무)함으로써 150℃로 가열하여 아민 또는 아마이드를 나타내고, 플루오르스카민으로, 용액(40 mg/아세톤 100 ㎤)을 분무함으로써 1급 아민을 나타내며, 브로모크레졸 그린으로, 용액(2-프로판올에서 0.1 %)을 분무함으로써 산을 나타내며, 바닐린으로 3% 황산을 지닌 바닐린의 에탄올 용액(3%)을 분무(가벼운 분무)한 다음 120℃로 가열함으로써 또는 요오드 분말로 플레이트를 덮어씌움으로써 요오드로 전개된다.
- 컬럼 크로마토그래피는 0.063-0.200 mm의 입자 크기를 가지는 Merck 60 실리카 겔상에서 실행된다.
b) 예비 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 정제 조건
기기는 U.V. 검출을 허용하는, 구배 방법으로 액상 크로마토그래피용 세트이다. 이 예비 체인은 하기 성분으로 이루어진다:
펌프 A: 50 SC 헤드가 장치된 GILSON 모델 305.
펌프 B: 50 SC 헤드가 장치된 GILSON 모델 303.
주사 루프: 5 ㎖
압력 모듈: GILSON 모델 806
혼합기: 23 ㎖ 헤드가 장치된 GILSON 모델 811 C
UV 검출기: 예비셀이 장치된 GILSON 모델 119
분획 수집기: 21번 랙과 10 ㎖ 유리관이 장치된 GILSON 모델 202
적분기: SHIMADZU 모델 C-R6A
컬럼: 25 cm 길이와 2.2 cm의 직경의 스테인리스 강으로 만들어진 컬럼 C4(10 mm), 이는 VYDAC 모델 214 TP 1022로 시판된다.
정제시킬 산물의 용액을 주사 루프의 방법으로 컬럼상에 로딩하고, 용출액을 30초에 하나의 관 분획으로 회수한다. 검출기는 220 nm와 254 nm 파장으로 세팅된다.
이동상은 하기처럼 정의된다:
용매 A 용매 B
탈염수 2500 ㎤ HPLC용 아세토니트릴 2500 ㎤
트리플루오로아세트산 2 ㎤ 트리플루오로아세트산 2.5 ㎤
구배:
시간(분) 용매 A의 % 용매 B의 % ㎤/분으로 유속
0 90 10 18
10 90 10 18
110 0 100 18
120 0 100 18
c) 분석 크로마토그래피 기술
-HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 분석은 HITACHI D 2500 적분기-계산기, 오토샘플러 AS-2000A, 인텔리전트 펌프 L-6200A 및 220 nm로 조절된 파장 세트의 vis-UV 검출기 L-4000이 장치된 Merck-Hitachi 장치상에서 실행된다.
분석 분리를 위한 컬럼은 3 cm 길이와 0.46 cm 직경의 스테인리스 강으로 제조된 Browlee 컬럼이고, 이는 APPLIED BIOSYSTEM에 의해 시판된다.
정지상은 Aquapore Butyl 7 마이크론으로 이루어진다. 이동상은 물(트리플루오로아세트산을 지닌다)과 아세토니트릴(트리플루오로아세트산을 지닌다)이다. 주사액은 0.1 ㎤ 루프 밸브에서 약 1 mg/㎤의 용액 20 ㎕이다. 분석을 위한 유속은 1㎤/분 내지 4 ㎤/분으로 조절된다. 압력은 약 180 bar이다.
분리 조건은 하기에 요약된다:
용매 A 용매 B
탈염수 2500 ㎤ HPLC용 아세토니트릴 2500 ㎤
트리플루오로아세트산 2 ㎤ 트리플루오로아세트산 2.5 ㎤
구배:
시간(분) 용매 A의 % 용매 B의 % ㎤/분으로 유속
0 60 40 1
3 60 40 1
20 0 100 1
35 0 100 1
35.1 60 40 4
36.1 60 40 4
36.2 60 40 2
44 60 40 2
이는 본 발명이 해결하고자 하는 주요 문제점 중 하나이다. 실제로, 본 발명에 따른 화합물은 비-제형된 DNA로 수득되는 것과 적어도 동등한 근육으로의 생체내 형질감염의 수준과 일부 경우에는 매우 양호한 수준의 다른 조직으로의 형질감염을 가지는 예상하지 못한 장점을 가진다. 본 발명에 따른 화합물과의 조합은 DNA의 뉴클레아제에 의한 분해 및/또는 동결-건조 동안의 저하를 방지하여, 핵지질 제형물의 안정성을 상당히 향상시키는 데 기여한다. 또한, 이러한 배합은 핵산의 서서히 조절되는 방출을 허용한다.
또한, 본 발명에 따른 화합물은 양이온 지질류에 속하고 화합물에 향상된 특성, 특히 선행기술의 양이온 벡터와 비교하여 감소된 세포독성을 부여하는 신규 양이온 영역을 운반한다. 이러한 양이온 부분은 실제로 양전하 "탈국재화" 효과를 아마도 가질 하나 이상의 사이클릭 아미딘 작용기를 운반하고, 화합물이 전체적으로 덜 양이온이도록 하여 독성 측면에서 알려진 이로운 효과를 초래하도록 하는 하나 이상의 특정 폴리아민(들)에 의해 더 정확하게 부여된다.
따라서, 본 발명의 첫번째 주제는 D, L 또는 DL형의 화학식 Ⅰ의 신규 화합물에 관한 것이다:
CA-Rep-R
상기식에서,
① CA는 화학식 Ⅱ의 사이클로아미딘 그룹과 이의 메소머 형태를 나타내고,
② Rep는 부재하거나 화학식 Ⅵ의 스페이서이며,
③ R은 화학식 Ⅵ의 Rep 그룹의 카보닐 작용기에 결합하거나, Rep가 부재한다면, R은 CA 그룹에 직접 결합하고,
* R6과 R7이 서로 독립적으로, 수소원자 또는 임의로 불소화되고, 직쇄 또는 측쇄이며, 포화 또는 불포화된 1 내지 22개의 탄소원자를 함유하는 지방족 라디칼을 나타내고, 두 치환체 R6또는 R7중 적어도 하나가 수소와 상이하고 다른 하나는 10 내지 22개의 탄소원자를 함유하는 화학식 NR6R7의 그룹,
* 또는 스테로이드 유도체,
* 또는 화학식 Ⅷ의 그룹을 나타낸다.
[상기식에서,
ㆍ m과 n은 서로 독립적으로 0 내지 3의 정수이고 m+n은 1이상이며,
ㆍ R1은 화학식 Ⅲ(여기에서, p와 q는 서로 독립적으로 0 내지 10의 정수이고, Y는 카보닐, 아미노, 메틸아미노 또는 메틸렌 그룹을 나타내며, Y가 상이한 그룹 [(CH2)p-Y]내에서 상이한 의미를 가지는 것도 가능하며, (*)은 수소 원자를 나타내거나 Rep 그룹에 결합하기 위한 부위이며, R1은 Z를 포함하여, 화학식 Ⅱ의 임의 원자에 결합할 수 있고, 화학식 Ⅱ에는 R1단일그룹이 있다고 이해된다)의 그룹을 나타내며,
ㆍ X는 R2가 수소 원자이거나 상기에서 정의된 R1그룹과 결합하는, NR2또는 CHR2그룹을 나타내며,
ㆍ그룹은:
*첫번째 경우: 화학식 Ⅳ(여기에서, W'는또는를 나타내고,과는 서로 독립적으로, 수소 원자, 메틸을 나타내거나 상기에서 정의된 R1그룹과 결합한다)의 그룹, 또는
*두번째 경우: 화학식 Ⅴ(여기에서, W'는또는을 나타내고,과는 서로 독립적으로, 수소 원자, 메틸을 나타내거나 상기에서 정의된 R1그룹과 결합한다)의 그룹을 나타낸다.]
[상기식에서,
질소 원자는 X, V, W 또는 Z 원자 또는 경우에 따라 R1그룹의 치환체 Y에 결합하고,
ㆍ t는 0 내지 8의 정수이고,
ㆍ r은 0 내지 10의 정수이고, r은 상이한 그룹 -NR4-(CH)r- 내에서 상이한 의미를 가질 수도 있으며,
ㆍ 상이한 그룹 NR4-(CH)rR3내에서 상이한 의미를 가질 수 있는 R3은 수소 원자, 메틸 그룹 또는 화학식 Ⅶ의 그룹(여기에서 u 는 1 내지 10의 정수이고, s는 상이한 그룹 -(CH2)s-NR5내에서 상이한 의미를 가질 수 있는 2 내지 8의 정수이며, R5는 수소 원자, 상기에서 정의된 CA 그룹이며, CA 그룹은 서로로부터 독립적이고 상이할 수 있거나, 화학식 Ⅶ의 그룹이라고 이해되며, 화학식 Ⅶ의 그룹은 서로 독립적이고 상이한 의미를 가질 수 있다고 이해된다)을 나타내며,
ㆍ R4는 R3과 동일한 방법으로 정의되거나 상기에서 정의된 CA 그룹을 나타내며, CA 그룹은 서로 독립적이고 상이할 수 있다고 이해된다.]
[상기식에서,
x는 1 내지 8의 정수이며,
y는 1 내지 10의 정수이며,
Q는 R6과 R7이 상기에서 정의된 바와 같은 C(O)NR6R7그룹을 나타내거나,
Q는 R8이 화학식 Ⅸ(여기에서, z는 2 내지 8의 정수이고, R9는 임의로 불소화되고, 포화 또는 불포화된 8 내지 22개의 탄소 원자를 지니는 지방족 라디칼 또는 스테로이드 유도체이며, 두 치환체 R6은 서로 독립적으로, 상기에서 정의된 바와 같다)의 그룹 또는 R9가 상기에서 정의된 바와 같은 -O-R9그룹을 나타내는 C(O)R8그룹을 나타낸다.]
본 발명의 한 변형에 따라서, R1그룹은 한편으로는 Z 또는 V에 결합하고, 다른 한편으로는 Y를 통해 Rep 그룹에 결합한다.
유리하게는, 화학식 II의 사이클로아미딘 그룹 CA는 5, 6, 7 또는 8멤버를 포함한다.
또한, 본 발명의 다른 변형에서, Rep는 1, 2 또는 3 "암"을 지닌 스페이서이다. 예를 들면 하기 스페이서가 언급될 수 있다:
본 발명의 두번째 변형에 따라서, R3은 수소 원자 또는 메틸을 나타내고 R4는 상기에서 정의된 바와 같거나, 화학식 Ⅵ에 존재하는 R3과 R4는 수소 원자를 나타내거나, R4는 수소 원자이고 R3은 R5가 CA 그룹을 나타내는 화학식 Ⅶ의 그룹이다.
바람직하게는, 화학식 V에서, p와 q는 서로 독립적으로 2, 3 또는 4로부터 선택된다.
일반적으로, R 그룹은 적어도 하나의 소수성 단편을 함유한다. 본 발명의 목적상, "소수성 단편"은 세포 침투를 촉진하는, 지질 유형의 그룹을 의미하는 것으로 이해된다. 특히, R 그룹은 적어도 하나의 지방족 쇄 또는 적어도 하나의 스테로이드 유도체를 함유한다.
바람직한 변형에 따라서, R 그룹은 R6과 R7이 상기에서 정의된 바와 같은 화학식 NR6R7의 그룹을 나타내거나, Q가 C(O)NR6R7(R6과 R7이 상기에서 정의된 바와 같다) 그룹을 나타내는 화학식 Ⅷ의 그룹을 나타낸다.
바람직하게는, R6및/또는 R7은 서로 독립적으로, 10 내지 22개, 바람직하게는 12, 14, 16, 17, 18 또는 19개의 탄소 원자를 함유하는 포화 또는 불포화된 직쇄 지방족 쇄를 나타낸다. 이들은 예를 들면, (CH2)11CH3, (CH2)13CH3, (CH2)15CH3, (CH2)17CH3또는 올레일 그룹 등이다.
특정 양태에서, R6과 R7그룹은 동일하거나 상이하고 각각 선행 단락에서 정의된 것처럼, 임의로 불소화되고, 직쇄 또는 측쇄, 포화 또는 불포화된 10 내지 22개의 탄소 원자를 함유하는 지방족 쇄를 나타낸다.
R이 스테로이드 유도체를 나타내면, 후자는 유리하게 콜레스테롤, 콜레스탄올, 3-α-5-사이클로-5-α-콜레스탄-6-β-올, 콜산, 콜레스테릴 포메이트, 콜레스탄일 포메이트, 3α,5-사이클로-5α-콜레스탄-6β-일 포메이트, 콜레스테릴아민, 6-(1,5-디메틸헥실)-3a,5a-디메틸-헥사데카하이드로사이클로펜타[a]사이클로프로파[2,3]사이클로펜타[1,2-f]나프탈렌-10-일아민 또는 콜레스탄일아민으로부터 선택된다.
화학식 I의 이러한 신규 화합물은 비독성 및 약학적으로 허용되는 염 형태로 제공될 수 있다. 이러한 비독성 염은 무기산(염산, 황산, 하이드로브롬산, 인산 또는 질산) 또는 유기산(아세트산, 프로피온산, 석신산, 말레산, 하이드록시말레산, 벤조산, 퓨마르산, 메탄설폰산 또는 옥살산) 또는 무기염기(나트륨 하이드록사이드, 칼륨 하이드록사이드, 리튬 하이드록사이드 또는 칼슘 하이드록사이드) 또는 유기염기(트리에틸아민, 피페리딘 또는 벤질아민과 같은 3급 아민)과의 염을 포함한다.
설명하는 예의 방법으로 본 발명의 바람직한 화합물은, 하기 화학식을 가지는 화합물이 언급될 수 있다:
화합물 (1)
N-디옥타데실카바모일메틸-2-{3-[4-(2-이미노테트라하이드로피리미딘-1-일)부틸아미노]프로필아미노}아세트아마이드
화합물 (2)
N-디테트라데실카바모일메틸-2-{3-[4-(2-이미노테트라하이드로피리미딘-1-일)부틸아미노]프로필아미노}아세트아마이드
화합물 (3)
2-(3-{4-[3-(4,5-디하이드로-1H-이미다졸-2-일아미노)-프로필아미노]부틸아미노}-N-디테트라데실카바모일메틸아세트아마이드
화합물 (4)
2-(3-{비스[3-(4,5-디하이드로-1H-이미다졸-2-일아미노)프로필]-아미노}-프로필아미노)-N-디테트라데실카바모일메틸아세트아마이드
화합물 (5)
N-디테트라데실카바모일메틸-2-{3-[3-(1,4,5,6-테트라하이드로피리미딘-2-일아미노)프로필아미노]프로필아미노}-아세트아마이드
화합물 (6)
N-디옥타데실카바모일메틸-2-{3-[3-(1,4,5,6-테트라하이드로피리미딘-2-일아미노)프로필아미노]프로필아미노}-아세트아마이드
본 발명의 화합물은 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 첫번째 방법에 따라서, 본 발명의 화합물은 유사 리포폴리아민(즉 사이클로아미딘 그룹을 지니지 않는 것을 제외하고 동일한 구조)의 합성에 의해 수득될 수 있고, 사이클로아미딘 그룹의 사이클화는 두번째 단계에서 실행된다. 유사 리포폴리아민은 당업자에게 공지된 방법, 특히 출원 WO 97/18185에 설명된 방법 또는 유사한 방법에 따라 수득될 수 있다. 아미딘 헤드의 사이클화는 예를 들면, 리포폴리아민의 하나 및/또는 하나 이상의 1급 아민과 O-메틸이소우레아 설페이트 수소 설페이트[J. Med. Chem., 1995, 38(16), pp. 3053-3061] 또는 S-메틸이소티오우레아 헤미설페이트[Int. J. Pept. Prot. Res., 1992, 40, pp. 119-126]와 같은 시약의 반응으로 실행될 수 있다. 바람직하게는, 과정은 뜨거운 상태에서 염기의 존재하에 수성 매질에서 실행된다[J. Med. Chem. 1985, pp. 694-698 및 J. Med. Chem., 1996, pp. 669-672]. 바람직한 용매로서, 물/알콜 혼합물 또는 디메틸포름아마이드가 언급될 수 있다. 염기로서, 트리에틸아민, N-에틸디이소프로필아민, 나트륨 하이드록사이드, 칼륨 하이드록사이드 등이 사용될 수 있다. 온도는 바람직하게는 40℃ 내지 60℃이고, 더 바람직하게는 반응은 50℃에서 실행된다.
다른 방법은 사이클로아미딘 작용기를 운반하는 빌딩 블록의 합성을 실행하고 이어서 이를 스페이서가 구비된 지질상으로 그래프팅하는 단계로 이루어진다. 이 방법은 다수 산물로의 접근을 제공하는 장점을 가진다. 본 발명의 목적상, "블록"은 분자의 작용성 단편을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들면, 화학식 Ⅱ에서 정의된 것처럼 사이클로아미딘 그룹 CA, Rep 또는 R은 각각 본 발명을 위해 구별되는 블록으로 구성된다.
예시의 방법으로, 과정은 예를 들면, 하기 방법으로 실행될 수 있다:
1) 빌딩 블록 R의 합성:
a) R이 -NR6R7을 나타내면, 이는 시판되거나, 하기 방법중 하나에 따라 합성될 수 있다:
ㆍ R6그룹을 운반하는 아민과 R7그룹을 운반하는 알데하이드간의 알킬화 환원에 의한 방법. 과정은 바람직하게는 염소화된 용매(예를 들면 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄 등[J. Org. Chem., 1996, pp. 3849-3862])에서 또는 반응과 상용성인 기타 유기 용매(예를 들면 테트라하이드로퓨란)에서, 나트륨 트리아세트옥시보로하이드라이드, 나트륨 시아노보로하이드라이드 또는 이들의 유도체(예를 들면 리튬 시아노보로하이드라이드)[J. Am. Chem. Soc., 1971, pp. 2897-2904] 및 아세트산의 존재하에 실행된다.
ㆍ 또는 R6에 의해 운반되는 이탈기의 R7그룹을 운반하는 아민에 의한 치환에 의한 방법. 이탈기의 예로서, 할로겐 원자(Br, Cl, I) 또는 토실 또는 메실 치환체 등이 언급될 수 있다. 과정은 바람직하게는 환류하[J. Am. Chem. Soc., 1996, pp. 8524-8530] 알콜(예를 들면 에탄올)에서 염기성 시약, 예를 들면 나트륨 카보네이트, 칼륨 하이드록사이드, 나트륨 하이드록사이드, 트리에틸아민 등의 존재하에 실행된다.
ㆍ 또는 지방산(또는 지방산 클로라이드와 같은 이의 유도체)과 지방 아민간의 커플링에 의한 방법. 이어서 수득된 아마이드를 에테르(예를 들면 테트라하이드로퓨란(THF), t-부틸 메틸 에테르(TBME), 디메톡시에탄(DME) 등)에서, 하이드라이드, 예를 들면 리튬 알루미늄 하이드라이드 또는 당업자에게 공지된 기타 하이드라이드로 환원시킨다.
b) R이 화학식 VIII의 그룹을 나타내면, 펩타이드 커플링은 Q 그룹과 H-[NH-(CH2)x]yCOOH 사이에 실행된다. 펩타이드 커플링은 당업자에게 공지된 통상적인 방법(Bodanski M., Principles and Practices of peptide Synthesis, Ed. Springe-Verlag) 또는 공지된 유사 방법에 따라 실행된다. 특히, 반응은 비친핵성 염기 존재하에, 적당한 비양성자성 용매(예를 들면 클로로포름, 디메틸포름아마이드, 메틸피롤리돈, 아세토니트릴, 디클로로메탄 등)에서, 0 내지 100℃의 온도 및 9 내지 11로 조절된 pH에서 실행된다.
Q는 시판되고 있거나, Q가 화학식 IX의 R8을 지닌 C(O)R8그룹을 나타내면, 이는 시판되고 있는 클로로포메이트(예를 들면 콜레스테릴 클로로포메이트)간의 반응에 의해 합성될 수 있거나 시판되고 있는 클로로포메이트와 시판되고 있는 디아민(예를 들면 N-에틸렌디아민)으로부터 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 따라 수득될 수 있거나 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 따라 수득될 수 있다. 바람직하게는, 과정은 염소화된 용매(예를 들면 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄 등)에서 또는 예를 들면 디메틸포름아마이드, 디메틸 설폭사이드, 아세토니트릴 등과 같은, 반응과 상용성인 기타 유기 용매에서 실행된다.
H-[NH-(CH2)x]y-COOH 그룹은 y가 1과 동등하면 시판되거나, y가 1 이상이면 하기에 설명된 Rep의 합성방법에 따라 하나 이상의 시아노에틸화 반응에 의해 수득된다.
2) 빌딩 블록 Rep의 합성:
Rep 그룹은 화학식 HOOC-(CH2)r-NH2의 아미노산의 시아노에틸화 또는 디시아노에틸화(직쇄 또는 측쇄 Rep 구조 중 어느 것을 수득하기를 원하느냐에 따라서) 다음에 니트릴 작용기의 아민으로의 환원에 의해 수득된다.
a) 모노- 또는 디시아노에틸화:
바람직하게는, 과정은 염기성 수성 매질에서 실행된다. 예를 들면, 반응은 물, 알콜(예를 들면 메탄올, 에탄올 등)과 같은 용매에서, 나트륨 하이드록사이드, 칼륨 하이드록사이드, 트리에틸아민 등과 같은 염기의 존재하에 실행된다. 모노시아노에틸화의 경우에, 작업은 바람직하게는 저온상태에서 실행된다[J. Am. Chem. Soc., 1950, pp. 2599-2603]. 디시아노에틸화의 경우에, 작업은 바람직하게는 뜨거운 상태에서 과량의 아크릴로니트릴로 실행된다[J. Am. Chem. Soc., 1951, pp. 1641-1644].
b) 니트릴 작용기의 아민으로의 환원은 염기성 매질에서 촉매 수소화 또는 당업자에게 공지된 다른 방법으로 실행된다. 예시의 방법으로, 촉매로서 백금 옥사이드 또는 라니 니켈[J. Org. Chem., 1988, pp. 3108-3111]의 사용이 가능하다. 바람직하게는, 선택된 용매는 염기, 예를 들면 나트륨 하이드록사이드, 칼륨 하이드록사이드 등의 존재하에, 알콜(예를 들면 메탄올, 에탄올 등)이다.
3) 빌딩 블록 Rep-R의 합성
빌딩 블록 Rep-R은 전술한 단계에서 수득된 산 Rep와 아민 R간의 펩타이드 커플링에 의해 수득된다.
펩타이드 커플링은 당업자에게 공지된 통상적인 방법(Bodanski M., Principles and Practices of peptide Synthesis, Ed. Springe-Verlag) 또는 공지된 유사한 방법에 따라 실행된다. 특히, 반응은 비친핵성 염기의 존재하에 적당한 비양성자성 용매(예를 들면, 클로로포름, 디메틸포름아마이드, 메틸피롤리디온, 아세토니트릴, 디클로로메탄 등)에서, 0 내지 100℃의 온도 및 9 내지 11로 조절된 pH에서 실행될 수 있다.
4) 본 발명에 따른 화합물 CA-Rep-R의 합성:
본 발명에 따른 화합물은 다수의 가능한 방법에 따라 수득된다:
a) 염기성 매질에서 전술한 단계에서 수득된 Rep-R상에 존재하는 말단 아민과, CA-S-CH3간의 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 따른 커플링에 의한 방법. 과정은 바람직하게는 염소화된 용매(예를 들면 디클로로메탄, 클로로포름 등)에서 또는 예를 들면 물, 알콜, 디메틸포름아마이드 등과 같은 반응과 상용성인 기타 유기 용매에서, 염기(예를 들면 트리에틸아민, 나트륨 하이드록사이드, 칼륨 하이드록사이드, N-에틸디이소프로필아민 등)의 존재하에, 실온(약 20℃)에서 실행된다.
빌딩 블록 CA-S-CH3는 시판되거나(예를 들면 2-메틸티오-2-이미다졸린 하이드라이오다이드의 경우), 적당한 디아민(즉 수득하기를 원하는 사이클로아미딘 그룹의 작용기로서 선택된 것)상의 탄소 디설파이드의 작용에 이어서 메틸화에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 반응 개략도는 하기 방법으로 설명될 수 있다:
바람직하게는, 반응 과정은 알콜(예를 들면 에탄올)에서 실행된다. 메틸화 단계는 할로메틸의 작용으로 실행되고, 할로겐 원자, 예를 들면 요오드 원자도 가능하다[J. Am. Cem. Soc., 1956, pp. 1618-1620 및 Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, pp. 351-354].
b) O-메틸이소우레아 수소 설페이트 또는 S-메틸이소티오우레아 헤미설페이트의 작용에 의한, Rep-R상에 존재하는 아미노 작용기로부터의 사이클로아미딘 그룹의 내부 사이클화에 의한 방법. 바람직하게는, 과정은 수성 매질에서 염기의 존재하에 뜨거운 상태에서 실행된다[J. Med. Chem., 1985, pp. 694-698 및 J. Med. Chem., 1996, pp. 669-672]. 바람직한 용매로서, 물/알콜 혼합물 또는 디메틸포름아마이드가 언급될 수 있다. 염기로서, 트리에틸아민, N-에틸디이소프로필아민, 나트륨 하이드록사이드, 칼륨 하이드록사이드 등이 사용될 수 있다. 온도는 바람직하게는 40℃ 내지 60℃이고, 더 바람직하게는 반응은 50℃에서 실행된다.
c) 상기에서 설명된 것처럼, 당업자에게 공지된 통상적인 기술에 따른 CA-COOH와 Rep-R간의 펩타이드 커플링에 의한 방법.
빌딩 블록 CA-COOH는 다양한 방법으로 수득될 수 있다:
ㆍ 당업자에게 공지된 방법 또는 기타 유사한 방법[J. Am. Chem. Soc., 1956, pp. 1618-1620]에 따른 아미노산 또는 폴리아미노산상 빌딩 블록 CA-S-CH3의 작용에 의한 방법. 빌딩 블록 CA-S-CH3는 상기와 동일한 방법으로 수득되고, 아미노산 또는 폴리아미노산은 본 발명에 따른 바람직한 화합물의 작용기로 선택되거나,
ㆍ 당업자에게 공지된 방법 또는 유사한 방법[J. Org. Chem., 1971, pp. 46-48]에 따라서 폴리아미노산상 S,S-디메틸토실이미노티오카본이미데이트 또는 이의 유도체 중 하나의 작용에 의한 방법. 바람직하게는, 과정은 에탄올 매질에서 염기(예를 들면 나트륨 하이드록사이드)의 존재하에 및 혼합물의 환류 온도에서 실행된다.
상기에서 설명된 방법중 하나에 의해 수득될 수 있는 빌딩 블록 CA-COOH의 예시의 방법으로, 하기 빌딩 블록이 언급될 수 있다:
상기에서 설명된 모든 반응에서, 다양한 그룹으로 존재하는 아미노 치환체가 실행되는 반응을 방해할 수 있을 경우에, 도입하고 나머지 분자에 영향을 끼치지 않고 제거될 수 있는 적합한 라디칼로 전술한 것들을 보호하는 것이 바람직하다. 예시의 방법으로, 보호 라디칼은 T.W. GREENE, Protective Groups in Organic Synthesis, J. Wiley-Interscience Publication(1991) 또는 McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press(1973)에 의해 설명된 라디칼로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 주제는 상기에서 정의된 화학식 Ⅰ의 화합물을 적어도 하나 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 다른 주제는 상기에서 정의된 화학식 Ⅰ의 화합물과 핵산을 포함한다. 본 발명에 따른 화합물과 핵산이 접촉하게 되면, 이들은 생리적 pH에서 본 발명에 따른 화합물상에 존재하는 양전하와 핵산의 음전하간의 상호작용으로 복합체를 형성한다. 이 복합체는 본문의 이하에서 "뉴클레오리피드 복합체"라고 불린다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 화합물과 핵산은 화합물의 양전하 대 핵산의 음전하 비가 0.1 내지 50, 바람직하게는 0.1 내지 20이 되도록 하는 양으로 존재한다. 이 비는 사용되는 화합물, 핵산 및 목적하는 적용(특히, 형질감염시킬 세포형)에 따라 당업자에 의해 용이하게 조절될 수 있다.
본 발명의 목적상, "핵산"은 데옥시리보핵산과 리보핵산을 모두 의미하는 것으로 이해된다. 이들은 천연 또는 인공 서열, 특히 게놈 DNA(gDNA), 상보적 DNA(cDNA), 메신저 RNA(mRNA), 트랜스퍼 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 하이브리드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열, 변형되거나 그렇지 않은 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 이러한 핵산은 인간, 동물, 식물, 박테리아 또는 바이러스 기원 등의 것일 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 기술에 의해, 특히 라이브러리의 스크리닝, 화학적 합성 또는 라이브러리의 스크리닝에 의해 수득된 서열의 화학적 또는 효소적 변형을 포함하는 복합된 방법에 의해 수득될 수 있다. 이들은 화학적으로 변형될 수 있다.
특히 데옥시리보핵산에 관하여, 이들은 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있고, 또한 짧은 올리고뉴클레오타이드 또는 더 긴 서열일 수 있다. 특히, 핵산은 유리하게 플라스미드, 벡터, 에피솜, 발현 카세트 등으로 이루어진다. 이러한 데옥시리보핵산은 표적 세포에서 작용성이거나 그렇지 않은 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 전사 또는 복제를 조절하는 서열, 치료용 유전자, 변형되거나 변형되지 않은 안티-센스 서열, 다른 세포 성분과 결합하는 영역 등을 운반할 수 있다.
바람직하게는, 핵산은 표적 세포에서 활성인 하나 이상의 프로모터와 전사 종결자의 조절하에 하나 이상의 치료 유전자로 이루어진 발현 카세트를 포함한다.
본 발명의 목적상, "해당 유전자의 발현을 위한 카세트"는 특이적 제한 부위에서 벡터로 삽입될 수 있는 DNA 단편을 의미하는 것으로 이해된다. DNA 단편은 RNA 또는 해당 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고 또한, 서열의 발현을 위해 필요한 서열(인핸서(들), 프로모터(들), 폴리아데닐화 서열 등)을 포함한다. 카세트와 제한 부위는 발현 카세트의 전사와 해독을 위해 적당한 판독 프레임으로의 삽입을 보장하도록 정해진다.
일반적으로 플라스미드 또는 에피솜은 하나 이상의 치료용 유전자를 운반한다. 예시의 방법으로, 본 출원에 참조로 인용된 특허 출원 WO 96/26270과 WO 97/10343에 설명된 플라스미드를 언급할 수 있다.
본 발명의 목적상, 치료용 유전자는 특히 치료 효과를 가지는 단백질 산물을 암호화하는 유전자를 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 암호화된 단백질 산물은 특히 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질 산물은 표적 세포에 대해 외생성, 상동성 또는 내생성일 수 있고, 즉 후자가 병리학적 증상을 가지지 않을 경우에 표적 세포에서 통상적으로 발현되는 산물이다. 이 경우에, 단백질의 발현은 예를 들면 세포에서 불충분한 발현 또는 변형으로 인해 불활성이거나 활성이 작은 단백질의 발현을 일시적으로 완화시킬 수 있거나, 단백질을 과발현시킬 수 있다. 치료용 유전자는 또한 향상된 안정성, 변형된 활성 등을 가지는, 세포성 단백질의 돌연변이체를 암호화할 수 있다. 단백질 산물은 또한 표적 세포에 대해 이종일 수 있다. 이 경우에는, 발현된 단백질은 예를 들면, 세포에 결핍된 활성을 보충하거나 제공하여, 병리학적 증상을 제거하거나, 면역반응을 촉진할 수 있도록 한다.
본 발명의 목적을 위한 치료 산물중에서, 특히 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인: 인터류킨, 인터페론, TNF, 등(FR 92/03120), 성장 인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자(BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/플레이오트로핀 등), 아포지단백질(ApoAI, ApoAIV, ApoE 등, FR 93/05125), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(FR 91/11947), 낭포성 섬유증과 관련된 CFTR 단백질, 종양 억제자 유전자(p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등, FR 93/04745), 응고 관련 인자를 암호화하는 유전자(인자 7, 8, 9), DNA 치료와 관련된 유전자, 자살 유전자(티미딘 키나제, 시토신 데아미나제), 헤모글로빈 또는 기타 단백질 캐리어에 대한 유전자, 대사 효소, 이화작용 효소 등이 언급될 수 있다.
치료용 핵산은 또한 유전자 또는 안티-센스 서열일 수 있고 표적세포에서 이의 발현은 유전자의 발현 또는 세포성 mRNA의 전사를 조절할 수 있다. 이러한 서열은 예를 들면, 특허 EP 140 308에 설명된 기술에 따라, 세포성 mRNA에 상보적인 RNA로 표적 세포에서 전사되어, 이들의 단백질로의 해독을 차단할 수 있다. 치료용 유전자는 또한 표적 RNA를 선택적으로 파괴할 수 있는, 리보자임을 암호화하는 서열을 포함한다(EP 321 201).
상기에서 설명할 것처럼, 핵산은 또한 하나 이상의 항원성 펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있고, 이는 인간 또는 동물에서 면역반응을 생성할 수 있다. 이러한 특정 양태에서, 본 발명은 백신의 생산 또는 인간 또는 동물에게 적용되는, 특히 미생물, 바이러스 또는 암에 대한 면역치료 요법의 실행을 가능하게 한다. 이들은 특히 Epstein-Barr 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염 바이러스(EP 185 573), 가성광견병 바이러스, 신시티아 형성 바이러스, 기타 바이러스에 특이적인 항원성 펩타이드 또는 종양(EP 259 212)에 특이적인 항원성 펩타이드일 수 있다.
바람직하게는, 핵산은 또한 치료용 유전자 및/또는 목적한 세포 또는 기관에서 항원성 펩타이드를 암호화하는 유전자의 발현을 허용하는 서열을 포함한다. 이들은 이러한 서열이 감염된 세포에서 작용할 수 있을거라고 생각되는 유전자의 발현을 본래 책임지는 서열일 수 있다. 이들은 또한 상이한 기원의 서열(다른 단백질 또는 심지어 합성 단백질의 발현을 책임진다)일 수 있다. 특히, 이들은 진핵생물 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 이들은 감염시키고자 하는 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 유사하게, 이들은 바이러스의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 이에 관하여, 예를 들면, E1A, MLP, CMV 및 RSV 유전자 등의 프로모터가 언급될 수 있다. 또한, 이러한 발현 서열은 활성화 또는 조절 서열 등의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 프로모터는 또한 유도되거나 억제될 수 있다.
더욱이, 핵산은 또한, 특히 치료용 유전자의 업스트림에, 표적 세포의 분비 경로에서 합성된 치료 산물을 지시하는 시그널 서열을 포함할 수 있다. 이 시그널 서열은 치료 산물의 천연 시그널 서열일 수 있지만, 이는 또한 다른 작용성 시그널 서열 또는 인공 시그널 서열일 수 있다. 핵산은 또한 세포의 특정 구획으로 합성된 치료 산물을 지시하는 시그널 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은, 또한 본 발명에 따른 화합물과 핵산으로 형성된 복합체와 결합하고, 이의 형질감염력을 향상시킬 수 있는 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 그러므로, 다른 양태에서 본 발명은 핵산, 상기에서 정의된 화학식 Ⅰ의 화합물 및 화합물(1)/핵산 뉴클레오리피드 복합체와 결합하고 이의 형질감염력을 향상시킬 수 있는 하나 이상의 보조제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 유형의 보조제의 존재(예를 들면 지질, 펩타이드 또는 단백질)는 유리하게는 화합물의 형질감염력을 향상시킬 수 있다.
이에 관하여, 본 발명의 조성물은, 보조제로서, 하나 이상의 중성 지질을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 특히 전하비 R이 작을 때, 특히 유리하다. 본 출원인은 실제로 중성 지질의 첨가가 뉴클레오리피드 입자의 형성을 향상시키고 이의 막을 불안정화시킴으로써 입자의 세포로의 침투를 증진시킬 수 있음을 보였다.
더 바람직하게는, 본 발명의 범위내에 사용된 중성 지질은 두 지방쇄를 함유하는 지질이다. 특히 유리한 방법으로, 양쪽성이온이거나 생리학적 조건하에서 이온 전하가 부족한 천연 또는 합성 지질이 사용된다. 이들은 특히 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디-스테아로일, -팔미토일, -미리스토일포스파티딜에탄올아민 또한 1 내지 3회 N-메틸화된 이들의 유도체, 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로사이드(예를 들면 특히 갈락토세레브로사이드), 스핑고리피드(예를 들면 특히 스핑고미엘린) 또는 아시알로강글리오사이드(예를 들면 특히 아시알로GM1 및 GM2)로부터 선택될 수 있다.
이러한 상이한 지질은 합성 또는 당업자에게 공지된 통상적인 기술로 기관(예를 들면 뇌) 또는 난으로부터 추출에 의해 수득될 수 있다. 특히, 천연 지질의 추출은 유기 용매(또한 Lehninger, Biochemistry 참조)에 의해 실행될 수 있다.
더 최근에, 본 출원인은 보조제로서, 또한 핵산의 응축(WO 96/25508)에 직접적으로 또는 간접적으로 관여하는 화합물을 사용하는 것이 특히 유리함을 설명하었다. 본 발명에 따른 조성물에 이러한 산물의 존재는 화학식 Ⅰ 화합물의 양을 감소시킬 수 있고, 형질감염 활성에 손상을 주지 않고, 독물학적 관점에서 이로부터 이로운 결과를 초래한다. 핵산의 응축에 관여하는 산물은 핵산을 직접적으로 또는 간접적으로 밀집시키는 산물로 정의하고자 한다. 더 정확하게, 이러한 산물은 형질감염되는 핵산의 수준에 직접적으로 작용할 수 있거나, 핵산의 응축에 직접적으로 관여한 첨가 산물의 수준에 관여할 수 있다. 바람직하게는, 이는 직접적으로 핵산의 수준에 작용한다. 예를 들면, 예비밀집화제는 폴리양이온, 예를 들면 폴리라이신일 수 있다. 바람직한 양태에 따라서, 핵산의 응축에 관여하는 이러한 산물은 프로타민, 히스톤 또는 뉴클레올린 및/또는 이들의 유도체 중 하나로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유도된다. 이러한 제제는 또한, 전체적으로 또는 부분적으로, 펩타이드 단위(KTPKKAKKP) 및/또는 (ATPAKKAA)로 이루어질 수 있고, 단위수는 2 내지 10으로 다양할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물의 구조에서, 이러한 단위는 연속적으로 또는 불연속적으로 반복될 수 있다. 따라서 이들은 생화학적 특성, 예를 들면 하나 이상의 아미노산, 또는 화학적 특성의 연관에 의해 분리될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 몰/몰로 핵산 1당량당 보조제 0.01 내지 20 당량, 더 바람직하게는 0.5 내지 5 당량을 포함한다.
특히 유리한 양태에서, 본 발명에 따른 조성물은, 또한 핵산 전달의 방향을 지시할 수 있는 표적 요소를 포함한다. 이러한 표적 요소는 DNA의 특정 세포형 또는 특정 목적한 조직(종양 세포, 간 세포, 조혈세포 등)으로의 전달 방향을 지시할 수 있는 세포외 표적 요소일 수 있다. 이는 또한 핵산의 특정 바람직한 세포 구획(미토콘드리아, 핵 등)으로의 전달 방향을 지시할 수 있는 세포내 표적 요소일 수 있다. 표적 요소는 본 발명에 따른 화합물 또는 또한 상기에서 설명된 핵산과 결합할 수 있다.
본 발명의 범위내에 사용될 수 있는 표적 요소 중에서, 당, 펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오타이드, 지질, 신경중개물질, 호르몬, 비타민 또는 이들의 유도체가 언급될 수 있다. 바람직하게는, 이들은 당, 펩타이드 또는 항체 또는 항체 단편과 같은 단백질, 세포 수용체 또는 이의 단편의 리간드, 수용체 또는 수용체 단편 등이다. 특히, 이들은 성장 인자 수용체, 시토킨 수용체, 세포성 렉틴형 수용체의 리간드 또는 인테그린과 같은 접착 단백질에 대한 수용체와 친화력이 있는 RGD 서열-함유 리간드일 수 있다. 또한 트랜스페린, HDL 및 LDL의 수용체 또는 엽산염 수송자가 언급될 수 있다. 표적 요소는 또한 아시알로글리코단백질 또는 시아라이드 루이스 X와 같은 시아라이드의 수용체와 같은 렉틴 또는 이와 달리 항체의 Fab 단편 또는 일본쇄 항체(ScFv)를 표적으로 할 수 있는 당일 수 있다.
표적 요소와 본 발명의 뉴클레오리피드의 조합은 당업자에게 공지된 기술, 예를 들면 소수성 부분 또는 본 발명에 따른 화학식 Ⅰ 화합물의 핵산과 상호작용하는 부분 또는 이와 달리 본 발명에 따른 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 핵산과 상호작용하는 그룹에 커플링함으로써 제조될 수 있다. 문제의 상호작용은, 바람직한 모드에 따라서, 이온 또는 공유 특성일 수 있다.
다른 변형에 따라서, 본 발명의 조성물은 또한 적어도 하나의 비이온 계면활성제를 화학식 I의 화합물/핵산 뉴클레오리피드 복합체 입자의 크기를 안정화시키는 충분량으로 도입할 수 있다. 비이온 계면활성제의 도입은 응집체의 형성을 방지하고, 이는 조성물이 특히 생체내에 적당하도록 한다. 이러한 계면활성제를 도입한 본 발명에 따른 조성물은 안전성 측면에서 장점을 가진다. 이들은 또한 뉴클레오리피드 복합체 조성물의 총 전하가 감소하면, 이들이 다른 단백질을 방해할 위험을 감소시킨다는 점에서 추가의 장점을 가진다.
계면활성제는 유리하게는 적어도 하나의 소수성 단편과 적어도 하나의 친수성 단편으로 이루어진다. 바람직하게는, 소수성 단편은 지방족 쇄, 폴리옥시알킬렌, 알킬리덴 폴리에스테르, 벤질 폴리에테르 헤드를 지닌 폴리에틸렌 글리콜 및 콜레스테롤로부터 선택되고, 친수성 단편은 유리하게는 폴리옥시알킬렌, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈 또는 사카라이드로부터 선택된다. 이러한 비이온 계면활성제는 출원 WO 98/34648에 설명되어 있다.
본 발명의 주제는 또한 핵산(및 더 일반적으로 폴리음이온)의 1차 세포 또는 주화 세포주로의 전달에 의해 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서 상기에서 정의된 화학식 Ⅰ 화합물의 용도이다. 이들은 특히 분화된 형태 또는 다분화능 형태(전구체)로 섬유아세포, 근육 세포, 신경 세포(뉴론, 성상세포, 신경교질 세포), 간 세포, 조혈세포주(림프구, CD34, 수상세포 등), 표피 세포 등일 수 있다.
이러한 용도는 본 발명에 따른 화학식 Ⅰ의 화합물이 선행기술의 양이온 지질과 비교하여 감소된 세포독성을 가지기 때문에 특히 유리하다. 본 출원인은 특히 통상적으로 형질감염후에 동물의 죽음을 초래하는 매우 큰 전하비에서, 확실한 세포독성이 검출되지 않음을 설명하였다. 본 발명의 화합물은 특히 시험관내, 생체외 또는 생체내 핵산의 형질감염을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 치료에서 또는 유전자의 조절 또는 병리학적 증상의 동물 모델의 생성 연구를 위한, 생체내 사용을 위해, 본 발명에 따른 조성물은 국소, 피부, 경구, 직장, 질, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 혈관, 기관내 또는 복강내 경로 등에 의한 투여를 위해 제형될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 주사용 제형물, 특히 목적한 기관으로의 직접 주사, 또는 국소 경로에 의한 투여(피부 및/또는 점막)를 위해 약학적으로 허용되는 비히클을 함유한다. 이들은 특히 경우에 따라서, 살균수 또는 생리 식염수의 첨가가 주사용 용액의 구성을 허용하는, 등장성 살균 용액, 또는 건조한 특히 동결-건조된 조성물일 수 있다. 주사를 위해 사용되는 핵산의 투여량과 투여횟수는 다양한 파라미터, 특히 사용된 투여방법, 상대적 병리증상, 발현시킬 유전자 또는 치료의 목적하는 지속기간에 따라서 조절될 수 있다. 특히 투여 방법에 관하여, 이는 예를 들면 종양의 수준에서, 조직 또는 순환계로의 직접 주사 또는 배양액에서 세포의 처리에 이어서 주사 또는 이식에 의한 생체내 재이식일 수 있다. 본 발명의 범위내에서 적당한 조직은 예를 들면, 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 이자, 신장, 방광, 위, 장, 고환, 난소, 직장, 신경계, 눈, 선, 결합 조직 등이다. 유리하게는, 형질감염되는 조직은 근육과 폐이다.
본 발명은, 또한 하기 단계를 포함하는 핵산의 세포로의 전달방법에 관한 것이다:
(1) 핵산을 상기에서 정의된 화학식 Ⅰ의 화합물과 접촉하게 하여, 뉴클레오리피드 복합체를 형성하고,
(2) 세포를 (1)에서 형성된 뉴클레오리피드 복합체와 접촉하게 한다.
세포는 세포를 복합체와 배양함으로써(시험관내 또는 생체외 사용을 위해) 또는 복합체를 기관으로 주사함으로써(생체내 사용을 위해) 뉴클레오리피드 복합체와 접촉할 수 있다. 배양은 바람직하게는 예를 들면, 106세포당 핵산 0.01 내지 1000 ㎍의 존재하에 실행된다. 생체내에서 투여를 위해, 예를 들면 0.01 내지 10 mg 핵산 투여량이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물이, 또한 하나 이상의 상기에서 정의된 보조제를 함유할 경우에는, 보조제(들)는 본 발명에 따른 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 핵산과 미리 혼합된다.
따라서, 본 발명은 단백질을 암호화하거나 질환을 치료할 수 있는 핵산으로 전사될 수 있는 핵산의 투여에 의한 질환의 특히 유리한 치료방법을 제공하고, 여기에서 핵산은 상기에서 정의된 화학식 Ⅰ의 화합물과, 상기에서 정의된 조건하에서 결합한다. 특히, 이 방법은 단백질 또는 핵산 산물의 결여로 초래된 질환에 적용되고, 투여된 단백질 산물을 암호화하거나 핵산 산물로 전사되거나 핵산 산물을 구성한다.
본 발명은 생체내, 생체외 또는 시험관내 세포의 형질감염을 위한 본 발명에 따른 화학식 (I) 화합물의 용도까지 확장된다.
전술한 정리 외에, 본 발명은 또한 하기 실시예와 도면으로부터 나타나게 될 기타 특징과 장점을 포함하고, 이는 본 발명을 제한하지 않고 설명하는 것으로 생각되어야 한다. 특히, 본 출원인은 제한을 의미하지 않고, 화학식 Ⅰ의 화합물을 제조하는 데 사용될 수 있는 다양한 작동 프로토콜과 반응 중간체를 제시한다. 물론, 본 발명에 따른 화학식 Ⅰ의 다른 화합물을 유도하는 유사한 방법을 개발하기 위해 이러한 프로토콜 및/또는 중간체 산물로부터 유추하는 것은 당업자의 능력 내에 있다.
A/ 본 발명에 따른 화합물의 합성
실시예 1: 화합물 (1)의 합성
하기에서 "지질 B"라고 불리는 화학식 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2을 가지는 양이온 지질(이의 제조는 특허 출원 WO 98/18185에 설명되어 있고 이의 구조는 도 1에 도시되었다)로부터 (N-디옥타데실카바모일메틸-2-{3-[4-(2-이미노테트라하이드로피리미딘-1-일)부틸아미노]프로필아미노}아세트아마이드).
지질 B 0.784 mmol을 마그네틱바가 장치된 둥근바닥 플라스크에서 메탄올 25 ㎤에 용해시키고, 트리에틸아민 10.21 mmol을 첨가한다. 이어서 물(9 ㎤)에 O-메틸이소우레아와 황산(1.173 mmol)의 용액을 혼합물에 서서히 붓는다(5분). 혼합물을 50℃에서 20시간 동안 오일조에 유지한다.
다음에, 혼합물을 회전 증발기에서 건조될 때까지 농축시킨다. 건조 추출물을 물(4 ㎤)과 트리플루오로아세트산(1 ㎤)의 용액으로 용해시킨다. 이 용액을 두 분획으로 예비 HPLC에 주입한다.
해당 분획(분석 HPLC에 의해 결정)을 함께 그룹핑하여, 동결시키고 동결-건조시킨다. 이어서 염화된 산물 194 mg(0.163 mmol)이 수득된다.
수율: 20.8%
HPLC분석: Rt = 15.99 분
1H NMR 스펙트럼(400 MHz, (CD3)2SO d6, ppm으로 δ): 0.88(t, J = 6.5 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.24(mt, 60H: 지방쇄의 중심 CH2); 1.35 내지 1.70(mt, 4H: 각 지방쇄의 1 CH2); 1.57(mt, 4H: 부틸의 중심 (CH2)2); 1.88 및 1.96(2 mts, 각각 2H: 프로필의 중심 CH2및 환의 중심 CH2); 2.85 내지 3.35(2 mts, 총 16H: 8 NCH2); 3.81(넓은 s, 2H: NCH2CON); 4.03(d, J = 5 Hz, 2H: 글리실의 CONCH2CON); 7.25 및 7.84(각각 s 와 넓은 s, 각각 1H: 환의 2 NH); 8.61(t, J = 5.5 Hz, 1H: NHCO); 8.70 및 9.02(두개의 비분할 화합물, 각각 1H: 2 NH).
MH+= 846
실시예 2: 화합물 (2)의 합성
하기에서 "지질 C"라고 언급된 화학식 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)13]2을 가지는 화합물(이의 제조는 특허 출원 WO 97/18185에 설명되어 있고 이의 구조는 도 1에 도시되었다)로부터 (N-디테트라데실카바모일메틸-2-{3-[4-(2-이미노테트라하이드로피리미딘-1-일)부틸아미노]프로필아미노}아세트아마이드).
지질 C 1.036 mmol을 마그네틱바가 장치된 둥근바닥 플라스크에서 메탄올 30 ㎤에 용해시키고, 트리에틸아민 13.13 mmol을 첨가한다. 이어서 물중(9 ㎤) O-메틸이소우레아와 황산(1.554 mmol)의 용액을 혼합물에 서서히 붓는다(5분). 혼합물을 20시간 동안 50℃에서 오일조에 유지한다. 이어서 혼합물을 회전 증발기에서 건조될 때까지 농축시킨다. 건조 추출물을 물(3 ㎤), 에탄올(2 ㎤) 및 트리플루오로아세트산(1.5 ㎤)의 용액으로 용해시킨다. 이 용액을 예비 HPLC에 주입한다.
해당 분획(분석 HPLC에 의해 결정)을 함께 그룹핑하고, 동결시키며 동결-건조시킨다. 염화된 산물 218 mg(0.2022 mmol)이 최종적으로 수득된다.
수율: Y = 19.5%
HPLC분석: Rt= 10.76분
1H-NMR-스펙트럼(400 MHz, (CD3)2SO d6, ppm으로 δ): 0.88(t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.15 내지 1.40(mt, 44H: 지방쇄의 중심 (CH2)11); 1.45 및 1.50 내지 1.65(2 mts, 각각 2H: 각 지방쇄의 1 CH2); 1.59(mt, 4H: 부틸의 2 중심 CH2); 1.91 및 1.97(2 mts, 각각 2H: 프로필의 중심 CH2); 2.85 내지 3.10(mt, 10H: 부틸의 2 NCH2- 2 프로필중 하나의 2 NCH2- 및 나머지 프로필의 2 NCH2중 하나); 3.23 및 3.30 내지 3.50(2 mts, 각각 5H 및 1H: 나머지 프로필의 나머지 NCH2및 지방쇄의 NCH2); 3.79(비분할 화합물., 2H: NCH2CON); 4.03(d, J = 5 Hz, 2H: 글리실의 CONCH2CON); 7.27 및 8.40 내지 9.30(각각 넓은 s와 비분할 화합물, 2H 및 4H: NH2 +CF3COO-; NH+CF3COO-및 =NH); 7.88 및 8.61(각각 s와 넓은 s, 각각 1H: 각각 NHC=N 및 CONH).
MH+= 734
실시예 3: 화합물 (3)의 합성
지질 C(실시예 2를 참조하고 이의 구조는 도 1 참조)로부터 (2-(3-{4-[3-(4,5-디하이드로-1H-이미다졸-2-일아미노)프로필아미노}-N-디테트라데실카바모일메틸아세트아마이드).
2-메틸머캅토-2-이미다졸리늄 요오드 0.36 mmol을 버블러와 마그네틱바가 장치된 둥근바닥 플라스크에서 1 N 나트륨 하이드록사이드 0.36 ㎤에 용해시킨다. 1 N 나트륨 하이드록사이드 1.44 ㎤, 물 5 ㎤ 및 에탄올 4 ㎤에 미리 용해된, 지질 C 0.36 mmol을 이 용액에 첨가한다. 혼합물을 메틸 머캅탄의 방출이 정지할 때(24시간)까지 교반하면서 유지한다. 이어서 혼합물을 회전 증발기에서 건조될 때까지 농축시킨다. 건조 추출물을 물(4 ㎤), 에탄올(4 ㎤) 및 트리플루오로아세트산(0.5 ㎤)의 용액으로 용해시킨다. 이 용액을 예비 HPLC에 두 분획으로 주입한다.
해당분획(분석 HPLC에 의해 결정)을 함께 그룹핑하고, 동결시키며 동결-건조시킨다. 염화된 산물 213 mg(0.1727 mmol)이 최종적으로 수득된다.
수율: Y = 48%
HPLC분석: Rt= 8.90분
1H-NMR-스펙트럼(400 MHz, CD3COOD d4를 몇 방울 적가한 (CD3)2SO d6, ppm으로 δ): 0.87(t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.15 내지 1.40(mt, 44H: 지방쇄의 중심 (CH2)11); 1.45 및 1.55(2 mts, 각각 2H: 각 지방쇄의 1 CH2); 1.65(mt, 4H: 부틸의 2 중심 CH2); 1.80 내지 1.95(mt, 4H: 프로필의 중심 CH2); 2.80 내지 3.05(mt, 10H: 부틸의 2 NCH2- 두 프로필 중 하나의 2 NCH2- 및 나머지 프로필의 두 HCH2중 하나); 3.24(mt, 6H: 나머지 프로필의 나머지 NCH2및 지방쇄의 NCH2); 3.56(s, 2H: NCH2CON); 3.62(s, 4H: NCH2CH2CH2N); 4.02(d, J = 5 Hz, 2H: 글리실의 CONCH2CON);
MH+= 777
실시예 4: 화합물 (4)의 합성
"빌딩 블록"의 합성방법에 의한 (2-(3-{비스[3-(4,5-디하이드로-1H-이미다졸-2-일아미노)프로필]아미노}프로필아미노)-N-디테트라데실카바모일메틸아세트아마이드).
Ⅰ) BOC-GLY-디테트라데실아민의 합성 (a)
아민이 Boc 그룹(10 mmol)으로 보호된 Gly 그룹과 디테트라데실아민(10 mmol)을 250 ㎖ 둥근바닥 플라스크에 도입하고, 디클로로메탄 100 ㎤을 첨가한다. 혼합물을 완전한 용해가 달성될 때까지 교반한다. 이어서 N-에틸디이소프로필아민(DIEA) 30 mmol과 벤조트리아졸-1-일옥시트리스디메틸아민 포스포늄(BOP) 11 mmol을 첨가한다. pH를 DIEA에 의해 10으로 유지하고, 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 반응이 완료되면(CLC 및/또는 HPLC에 의해 모니터), 디클로로메탄을 증발시키고 수득된 고체를 에틸 아세테이트(300 ㎤)에 취한다. 유기상을 칼륨 설페이트(100 ㎤로 4회), 나트륨 카보네이트(100 ㎤로 4회) 및 나트륨 클로라이드(100 ㎤로 4회)의 용액으로 세척한다. 이어서 유기상을 마그네슘 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하며 진공하에서 증발시킨다. 산물(a)는 93%의 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.9 (CHCl3/MeOH, 9:1)
MH+= 567
Ⅱ) [Z-NH(CH2)3]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH의 합성 (b)
1) NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH의 합성 (c)
N-(시아노에틸)글리신(0.1 몰/아민, 시판)의 아민을 1 N 나트륨 하이드록사이드(200 ㎤/아민)와 디옥산(200 ㎤)에 용해시킨다. 용액을 아이스조에서 교반한 다음 디옥산 200 ㎤내 O-(t-부톡스우카보닐)2또는 p-클로로벤질옥시카보닐(CIZ, 0.14 몰/아민)의 용액을 적가한다. pH를 9 이상의 값으로 유지한다. 이어서 혼합물을 약 20℃에서 밤새 교반한다. 디옥산을 진공하에서 증발시킨 다음 혼합물을 칼륨 설페이트 용액에 의해 pH 3으로 산성화시킨다. 불용성 물질을 에틸 아세테이트(100 ㎤로 3회)로 추출한 다음 나트륨 클로라이드 용액(100 ㎤로 2회)으로 세척한다. 유기상을 마그네슘 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하며 진공하에서 증발시킨다. 화학식 NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2COOH의 산물(c)가 수율 98%로 수득된다.
TLC: Rf= 0.66 (CHCl3/MeOH, 8:2)
MH+= 229
2) NH2-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH의 합성 (d)
화학식 NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH의 산물 (c) 50 mmol을 1 리터 스테인리스 강 오토클레이브에 도입한다. 에탄올(95%) 10 ㎤과 나트륨 하이드록사이드(80 몰) 3.3 g의 용액을 비커에서 동시에 제조한다. 나트륨 하이드록사이드가 용해되면, 탄소상 라니 니켈 2 ㎤를 도입한다. 오토클레이브를 닫는다. 초기 수소화 압력은 약 52 bar이고, 이는 실온(20℃)에서 밤새 약 48.5 bar로 감소한다. 현탁액을 종이상에 여과하고, 여액을 에탄올로 세척하며(25 ㎤로 4회), 여액을 진공하에서 건조될 때까지 농축시킨다. 산물 (d)이 수득되고 이는 다음 단계에서 추가 정제 없이 사용된다.
TLC: Rf= 0.12 (CHCl3/MeOH, 6:4)
MH+= 233
3) [NC(CH2)2]2-N-(CH2)3-CH-Boc-CH2-COOH의 합성 (e)
화학식 NH2-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH의 산물 (d)(0.05 몰)과 나트륨 하이드록사이드(0.1 몰)를 둥근바닥 플라스크에서 물 150 ㎤에 용해시킨다. 용액을 아이스조에서 냉각시킨다. 아크릴로니트릴(0.12 몰)을 활발히 교반하면서, 서서히 붓고, 물질의 온도는 20℃ 이하로 유지한다. 반응 혼합물을 실온(20℃)에서 밤새 유지한다. 이어서 혼합물을 2시간 동안 50℃에서 유지한다. 용매를 진공하에 증발시킨 다음 혼합물을 칼륨 설페이트의 용액에 의해 pH 3으로 산성화시킨다. 불용성 물질을 에틸 아세테이트(200 ㎤으로 3회)로 추출한 다음, 나트륨 클로라이드 용액으로 세척한다(100 ㎤으로 2회). 유기상을 마그네슘 설페이트 상에서 건조시킨 다음 여과하고 진공하에 증발시킨다. "조물질"을 실리카 컬럼상에서 임의로 정제한다. 산물(e)가 50% 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.75 (CHCl3/MeOH, 6:4)
MH+= 339
4) [Z-NH(CH2)3]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH의 합성 (b)
화학식 [NC(CH2)2]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH의 산물 (e)(50 mmol)을 1 리터 스테인리스 강 오토클레이브에 도입한다. 에탄올(95%) 10 ㎤과 나트륨 하이드록사이드(80 몰) 3.3 g의 용액을 비커에서 동시에 제조한다. 나트륨 하이드록사이드가 용해되면, 이 용액을 오토클레이브에 도입한다. 질소 스트림을 오토클레이크로 통과시키고 탄소상 라니 니켈 2 ㎤를 도입한다. 오토클레이브를 닫는다. 초기 수소화 압력은 약 52 bar이고, 이는 실온(20℃)에서 밤새 약 48.5 bar로 감소한다. 현탁액을 종이상에서 여과하고, 여액을 에탄올로 세척하며(25 ㎤로 4회), 여액을 진공하에 건조될 때까지 농축시킨다. TLC 분석 후에 추가 정제 없이 사용되는 백색 고체가 수득된다.
TLC: Rf= 0.14 (CHCl3/MeOH, 6:4)
상기에서 수득된 고체를 1 N 나트륨 하이드록사이드(200 ㎤/아민)와 디옥산(200 ㎤)에 용해시킨다. 용액을 아이스조에서 교반한 다음 디옥산 200 ㎤중 (t-부톡시카보닐)2O 또는 p-클로로벤질옥시카보닐(0.14 몰/아민)의 용액을 적가한다. pH를 9 이상의 값으로 유지한다. 이어서 혼합물을 실온(20 ℃)에서 밤새 교반한다. 디옥산을 진공하에 증발시킨 다음 혼합물을 칼륨 설페이트 용액으로 pH 3까지 산성화시킨다. 불용성 물질을 에틸 아세테이트로 추출한(100 ㎤로 3회) 다음 나트륨 클로라이드 용액으로 세척한다(100 ㎤로 2회). 유기상을 마그네슘 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하며 진공하에서 증발시킨다. 산물을 TLC 및/또는 HPLC로 분석한다.
조산물을 실리카 컬럼(디클로로메탄/메탄올, 8:2)상에서 정제한다.
산물 (b)는 산물 (d)에 비해 66%의 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.42 (CHCl3/MeOH, 6:4)
MH+= 615
Ⅲ)[Z-NH(CH2)3]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)13-CH3]2의 합성 (f)
아민이 Boc 그룹(1 mmol)으로 보호된 산물 (a)을 마그네틱바가 장치된 둥근바닥 플라스크에 도입한다. 트리플루오로아세트산 30 ㎤을 4℃에서 첨가한 다음 용액을 1시간 동안 교반한다. 반응이 완료되면(TLC 및/또는 HPLC에 의해 모니터링), 트리플루오로아세트산을 진공하에서 증발시킨 다음 산물을 에틸 에테르 30 ㎤로 3회 공증발시킴으로써 건조시킨다.
HPLC: Rt= 12.86분, (H2O/MeCN: 3분[40/60], 3-20분[0/100], 35분[0/100].
수득된 산물(Gly-디테트라데실아민, 10 mmol)과 산물 (b)(10 mmol)을 250 ㎤ 둥근바닥 플라스크에 도입하고, 디클로로메탄(100 ㎤)을 첨가하며 혼합물을 완전한 용해가 달성될 때까지 교반한다. 이어서 N-에틸디이소프로필아민(DIEA) 30 mmol과 BOP 헥사플루오로포스페이트 11 mmol을 첨가한다. pH를 DIEA에 의해 10으로 유지하고 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 반응이 완료되면(TLC 및/또는 HPLC에 의해 모니터), 디클로로메탄을 증발시키고 수득된 고체를 에틸 아세테이트(300 ㎤)에 취한다. 유기상을 칼륨 설페이트 용액(100 ㎤으로 4회), 나트륨 카보네이트(100 ㎤으로 4회) 및 나트륨 클로라이드(100 ㎤으로 4회)로 세척한다. 유기상을 마그네슘 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하며 진공하에 증발시킨다. 산물은 추가 정제 없이 사용된다. 산물 (f)은 실리카 컬럼(디클로로메탄/메탄올, 8:2)상에서 정제 후에 75% 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.86 (CHCl3/MeOH, 8:2)
HPLC: Rt= 17.44분, (H2O/MeCN: 3분[40/60],3-20분[0/100], 35분[0/100]).
Ⅳ) [NH2(CH2)3]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)13-CH3]2의 합성 (g)
아민이 보호된 산물 (f)를 마그네틱바가 장치된 둥근바닥 플라스크에 도입하고 산물 그램당 메탄올 10 ㎤에 용해시킨다. 탄소상 팔라듐(10%, 1 g/산물 g)과 암모늄 포메이트(1 g/산물 g)를 실온에서 첨가한다. 가수소분해가 HPLC에 의해 모니터된다. 두 시간 후에, 반응이 완료되면, 혼합물을 여과하고 여액을 산물 그램당 메탄올 10 ㎤로 3회 세척한다. 두번 증류된 물을 첨가하고 용액을 동결시키고 동결-건조시키거나, 여액을 건조될 때까지 농축시키고 고체를 에틸 아세테이트(300 ㎤)에 취한다. 유기상을 나트륨 카보네이트 용액(100 ㎤으로 2회)과 나트륨 클로라이드 용액(100 ㎤으로 2회)으로 세척한 다음, 이를 마그네슘 설페이트 상에서 건조시키며, 여과하며 진공하에서 증발시킨다. 산물을 HPLC로 분석하고 추가 정제 없이 사용한다. 산물 (g)은 산물 (f)에 비해 40% 수율로 수득된다.
HPLC: Rt= 9.62분, (H2O/MeCN: 3분[40/60], 3-20분[0/100], 35분[0/100]).
MH+: 795
Ⅴ) 화합물 (4)의 합성
변형시킬 1급 아민(1 mmol/아민)을 함유하는 산물 (g)을 디클로로메탄(10 ㎤)에 용해시킨 다음 2-메틸티오이미다졸린 하이드라이오다이드(1.2 mmol/아민)와 트리에틸아민(3 mmol/아민)을 첨가한다. 혼합물을 실온에서(20℃) 메틸 설파이드의 방출이 정지될 때까지 교반한다. 반응의 후반에(HPLC에 의해 모니터), 디클로로메탄을 진공하에서 증발시킨다.
아민이 Boc 그룹(1 mmol)에 의해 보호된, 수득된 산물을 마그네틱바가 장치된 둥근바닥 플라스크에 도입한다. 트리플루오로아세트산 30 ㎤을 4℃에서 첨가한 다음 용액을 1시간 동안 교반한다. 반응이 완료되면(TLC 및/또는 HPLC에 의해 모니터), 트리플루오로아세트산을 진공하에 증발시킨 다음 산물을 에틸 에테르 30 ㎤으로 3회 공증발시킴으로써 건조시킨다.
수득된 산물을 예비 HPLC로 정제하고 분획을 HPLC로 분석한다. 본 발명에 따른 화합물 (4)은 따라서 34% 수율로 수득된다.
HPLC: Rt= 10.07분, (H2O/MeCN: 3분[40/60], 3-20분[0/100], 35분[0/100]).
1H-NMR-스펙트럼(400 MHz, 383 K 온도에서 (CD3)2SO d6, ppm으로 d): 0.92(t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.25 내지 1.45(mt, 44H: 지방쇄의 중심 (CH2)11); 1.57(mt, 4H: 각 지방쇄의 1 CH2); 1.70 내지 1.90(mt, 6H: 프로필의 중심 CH2); 2.50 내지 3.40(mt, 16H: 프로필의 2 NCH2및 지방쇄의 NCH2); 3.68(s, 8H: 2 NCH2CH2N); 3.72(넓은 s, 2H: NCH2CON); 4.06(s, 2H: 글리실의 CONCH2CON).
MH+: 831
실시예 5: 화합물 (5)의 합성:
"빌딩 블록"의 합성방법에 의한 (N-디테트라데실카바모일메틸-2-{3-[3-(1,4,5,6-테트라하이드로피리미딘-2-일아미노)프로필아미노]프로필아미노}-아세트아마이드).
Ⅰ) BOC-GLY-디테트라데실아민의 합성 (a)
과정을 선행 실시예와 동일한 방법으로 실행한다. 산물 (a)는 93% 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.9 (CHCl3/MeOH, 9:1)
MH+: 567
Ⅱ) Z-NH(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CH2-COOH의 합성 (b)
1) NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH의 합성 (C)
과정은 상기의 실시예 4와 동일한 방법으로 실행된다. 산물 (c)는 98% 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.66 (CHCl3/MeOH, 8:2)
MH+: 229
2) NH2-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH의 합성 (d)
산물 (d)는 상기의 실시예 4와 동일한 방법으로 수득된다.
TLC: Rf= 0.12 (CHCl3/MeOH, 6:4)
MH+: 233
3) NC(CH2)2-N-Boc-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH의 합성 (e)
산물 (d)(0.05 몰)와 나트륨 하이드록사이드(0.1 몰)를 둥근바닥 플라스크에서 물 150 ㎤에 용해시킨다. 용액을 아이스조에서 냉각시킨다. 아크릴로니트릴(0.05 몰)을 활발히 교반하면서 서서히 붓고, 물질의 온도를 20℃ 이하로 유지한다. 반응 혼합물을 실온(20 ℃)에서 밤새 유지한다.
용매를 진공하에서 증발시킨 다음 혼합물을 칼륨 설페이트 용액으로 pH 3으로 산성화시킨다. 불용성 물질을 에틸 아세테이트로 추출하고(200 ㎤으로 3회), 이어서 나트륨 클로라이드 용액으로 세척한다(100 ㎤으로 2회). 유기상을 마그네슘 설페이트 상에서 건조시킨 다음 여과하며 진공하에서 증발시킨다. 수득된 산물을 임의로 실리카 컬럼에서 정제한다.
수득된 산물(0.1 몰/아민)을 1 N 나트륨 하이드록사이드(200 ㎤/아민)와 디옥산(200 ㎤)에 용해시킨다. 용액을 아이스조에서 교반한 다음 디옥산 200 ㎤중 (Boc)2O 또는 p-클로로벤질옥시카보닐(0.14 몰/아민)의 용액을 적가한다. pH를 9 이상의 값으로 유지한다. 이어서 혼합물을 실온(20℃)에서 밤새 교반한다. 디옥산을 진공하에서 증발시킨 다음 혼합물을 칼륨 설페이트 용액으로 pH 3으로 산성화시킨다. 불용성 물질을 에틸 아세테이트로 추출한 다음(100 ㎤으로 3회), 나트륨 클로라이드 용액(100 ㎤으로 2회)으로 세척한다. 유기상을 마그네슘 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하며 진공하에서 증발시킨다. 산물을 TLC 및/또는 HPLC로 분석한다.
이렇게 산물 (e)는 93% 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.75 (CHCl3/MeOH, 8:2)
MH+: 386
4)Z-NH-(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CH2-COOH의 합성 (b)
산물 (e)(50 mmol)를 1리터 스테인리스 강 오토클레이브에 도입한다. 에탄올(95%) 10 ㎤ 및 나트륨 하이드록사이드(80몰) 3.3 g의 용액을 비커에서 동시에 제조한다. 나트륨 하이드록사이드가 용해되면, 이 용액을 오토클레이브에 도입한다. 질소 스트림을 오토클레이브로 통과시키고 탄소상 라니 니켈 2 ㎤를 도입한다. 오토클레이브를 닫는다. 초기 수소화 압력은 약 52 bar이고 이는 실온에서(20℃) 밤새 약 48.5 bar로 감소한다. 현탁액을 종이상에서 여과하고, 여액을 에탄올로 세척하며(25 ㎤로 4회) 여액을 진공하에서 건조될 때까지 농축시킨다. TLC 분석 후에 추가 정제 없이 사용되는 백색 고체가 수득된다.
TLC: Rf= 0.14 (CHCl3/MeOH, 6:4)
수득된 산물(0.1 몰/아민)을 1 N 나트륨 하이드록사이드(200 ㎤/아민)와 디옥산(200 ㎤)에 용해시킨다. 용액을 아이스조에서 교반한 다음 디옥산 200 ㎤중 p-클로로벤질옥시카보닐 용액(0.14몰/아민)을 적가한다. pH를 9 이상의 값으로 유지한다. 이어서 혼합물을 실온(20℃)에서 밤새 교반한다. 디옥산을 진공하에서 증발시킨 다음 혼합물을 칼륨 설페이트 용액으로 pH 3까지 산성화시킨다. 불용성 물질을 에틸 아세테이트로 추출한(100 ㎤으로 3회) 다음 나트륨 클로라이드 용액으로 세척한다(100 ㎤으로 2회). 유기상을 마그네슘 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하며 진공하에서 증발시킨다. 수득된 산물을 실리카 컬럼(디클로로메탄/메탄올, 9:1)상에서 정제한다. 산물을 TLC 및/또는 HPLC로 분석한다. 산물 (b)는 산물 (d)에 비해 32% 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.63 (CHCl3/MeOH, 9:1)
MH+: 523
Ⅲ) 2-메틸설파닐-1,4,5,6-테트라하이드로피리미딘의 합성 (f)
3,4,5,6-테트라하이드로-2-피리미딘티올(0.0103몰)을 교반하면서 질소 스트림하에 둥근바닥 플라스크에 로딩하고, 메탄올 5 ㎤와 메틸 아이오다이드(0.0105몰) 0.65㎤를 첨가한다. 혼합물을 환류하에서 1시간 동안 가열한 다음 실온(20℃)으로 냉각시킨다. 산물을 에틸 에테르 5 ㎤의 첨가로 침전시킨다. 침전물을 여과한 다음 에틸 에테르로 세척한다. 이어서 산물을 34 mbar 압력에서 밤새 건조시킨다.
산물 (Ⅵ) 1.5 g(0.0041몰)이 40% 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.25 (CHCl3/MeOH, 9:1)
MH+: 131
d) Z-NH(CH2)3-N-Boc(CH2)3-N-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)13-CH3]2의 합성 (g)
아민이 Boc 그룹(1 mmol)으로 보호된 산물 (a)를 마그네틱바가 장치된 둥근바닥 플라스크에 도입한다. 트리플루오로아세트산 30 ㎤을 4℃에서 첨가한 다음 용액을 1시간 동안 교반한다. 반응이 완료되면(TLC 및/또는 HPLC에 의해 모니터), 트리플루오로아세트산을 진공하에서 증발시킨 다음 수득된 산물을 에틸 에테르 30 ㎤으로 3회 공증발시킴으로써 건조시킨다.
HPLC: Rt= 12.86분, (H2O/MeCN: 3분[40/60], 3-20분[0/100], 35분[0/100]).
수득된 산물(10 mmol)과 산물 (b)(10 mmol)를 250 ㎤ 둥근바닥 플라스크에 도입한다. 디클로로메탄(100 ㎤)을 첨가하고 혼합물을 완전한 용해가 달성될 때까지 교반한다. 이어서 DIEA 30 mmol과 BOP 11 mmol을 첨가한다. pH를 DIEA에 의해 10으로 유지하고 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 반응이 완료되면(TLC 및/또는 HPLC에 의해 모니터), 디클로로메탄을 증발시키고 수득된 고체를 에틸 아세테이트(300 ㎤)에 취한다. 유기상을 칼륨 설페이트의 용액(100 ㎤으로 4회), 나트륨 카보네이트의 용액(100 ㎤으로 4회) 및 나트륨 클로라이드의 용액(100 ㎤으로 4회)으로 세척한다. 유기상을 마그네슘 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하며 진공하에서 증발시킨다. 산물은 추가 정제 없이 사용된다.
실리카 컬럼(디클로로메탄/메탄올, 8:2)상에서 정제한 후에, 산물 (g)가 85% 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.9 (CHCl3/MeOH, 9:1)
HPLC: Rt= 19.79분, (H20/MeCN: 3분[40/60], 3-20분[0/100], 35분[0/100]).
Ⅴ) [NH2(CH2)3]2-N-Boc-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)13-CH3]2의 합성 (h)
산물 (g)를 마그네틱바가 장치된 둥근바닥 플라스크에 도입하고 산물 g당 메탄올 10 ㎤에 용해시킨다. 탄소상 팔라듐(10%, 1 g/산물 g)과 암모늄 포메이트(1 g/산물 g)를 실온(20℃)에서 첨가한다. 가수소분해는 HPLC에 의해 모니터된다. 2시간 후, 반응이 완료되면, 혼합물을 여과하고 여액을 산물 g당 메탄올 10 ㎤으로 3회 세척한다. 두번 증류된 물을 첨가하고 용액을 동결시키며 동결-건조시키거나, 여액을 건조될 때까지 농축시켜 고체를 에틸 아세테이트(300 ㎤)에 취한다. 유기상을 나트륨 카보네이트의 용액(100 ㎤으로 2회)과 나트륨 클로라이드의 용액(100 ㎤으로 2회)으로 세척한 다음 이를 마그네슘 설페이트 상에서 건조시키며, 여과하며 진공하에 증발시킨다. 산물을 HPLC로 분석하고 추가 정제 없이 사용한다. 산물 (h)가 산물 (g)에 비해 93% 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.42 (CHCl3/MeOH, 6:4)
HPLC: Rt= 14.66분, (H20/MeCN: 3분[40/60], 3-20분[0/100], 35분[0/100]).
MH+: 838
Ⅵ) 화합물 (5)의 합성
변형된 1급 아민(1 mmol/아민)을 함유하는 산물 (h)를 디클로로메탄(10 ㎤)에 용해시킨 다음 산물 (f)(1.2 mmol/아민)와 트리에틸아민(1.3 mmol/아민)을 첨가한다. 혼합물을 메틸 설파이드의 방출이 정지할 때까지 실온(20℃)에서 교반한다. 반응의 후반에(HPLC에 의해 모니터), 디클로로메탄을 진공하에 증발시킨다.
수득된 산물을 예비 HPLC로 정제하고 분획을 HPLC로 분석한다. 따라서 화합물 (5)은 38% 수율로 수득된다.
HPLC: Rt= 8.42분, (H20/MeCN: 3분[40/60], 3-20분[0/100], 35분[0/100]).
1H-NMR-스펙트럼(400 MHz, (CD3)2SO d6, ppm으로 δ): 0.86(t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.10 내지 1.35(mt, 44H: 지방쇄의 중심 (CH2)11); 1.44 및 1.53(2 mts, 각각 2H: 각 지방쇄의 1 CH2); 1.80 내지 2.00(mt, 6H: 프로필의 중심 CH2및 1,4,5,6-테트라하이드로피리미딘의 CH2); 2.80 내지 3.10(mt, 10H: 프로필의 NCH2및 1,4,5,6-테트라하이드로피리미딘의 NCH2); 3.14 내지 3.45(mt: 1,4,5,6-테트라하이드로피리미딘의 =NCH2및 지방쇄의 =NCH2에 상응하는 6H); 3.81(비분할 화합물, 2H: NCH2CON); 4.04(d, J = 5 Hz, 2H: 글리실의 CONCH2CON); 7.89 = 8.62 - 8.75 및 9.01(4개의 비분할 화합물, 총 8H: 상호교환적이고 CF3COOH의 OH).
MH+: 720
실시예 6: 화합물 (6)의 합성: "빌딩 블록"의 합성방법에 의한 N-디옥타데실카바모일메틸-2-{3-[3-(1,4,5,6-테트라하이드로피리미딘-2-일아미노)프로필아미노]프로필아미노}아세트아마이드
Ⅰ) BOC-GLY-디테트라데실아민의 합성 (a)
과정은 선행 실시예와 동일한 방법으로 실행된다. 산물 (a)는 93% 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.9 (CHCl3/MeOH, 9:1)
MH+: 567
Ⅱ) Z-NH(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CH2-COOH의 합성 (b)
1) NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH의 합성 (c)
과정은 상기의 실시예 5와 동일한 방법으로 실행된다. 산물 (c)은 98% 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.66 (CHCl3/MeOH, 8:2)
MH+: 229
2) NH2-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH의 합성 (d)
산물 (d)는 상기의 실시예 5와 동일한 방법으로 수득된다.
TLC: Rf= 0.12 (CHCl3/MeOH, 6:4)
MH+: 233
3) NC(CH2)2-N-Boc-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH의 합성 (e)
과정은 상기의 실시예 5와 동일한 방법으로 실행된다. 산물 (e)는 93% 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.75 (CHCl3/MeOH, 8:2)
MH+: 386
4) Z-NH-(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CH2-COOH의 합성 (b)
과정은 상기의 실시예 5와 동일한 방법으로 실행된다. TLC 분석 후에 추가 정제 없이 사용되는 백색 고체가 수득된다.
TLC: Rf= 0.14 (CHCl3/MeOH, 6:4)
수득된 산물은 벤질옥시카보닐 그룹으로 말단 아민을 보호하기 위해 상기와 동일한 방법으로 사용된다. 이렇게 수득된 산물 (b)은 산물 (d)에 비해 32% 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.63 (CHCl3/MeOH, 9:1)
MH+: 523
Ⅲ) 2-메틸설파닐-1,4,5,6-테트라하이드로피리미딘의 합성 (f)
과정은 상기의 실시예 5와 동일한 방법으로 실행된다. 산물 (f) 1.5 g(0.0041 몰)이 40% 수율로 이렇게 수득된다.
TLC: Rf= 0.25 (CHCl3/MeOH, 9:1)
MH+: 131
Ⅳ) Z-NH(CH2)3-N-Boc(CH2)3-N-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)17-CH3]2의 합성 (g)
과정은 상기의 실시예 5와 동일한 방법으로 실행된다. Boc 그룹이 절단된 산물 (a)가 이렇게 수득된다.
HPLC: Rt= 19.44분, (H20/MeCN: 3분[40/60], 3-20분[0/100], 35분[0/100]).
수득된 이러한 산물은 상기 실시예 5의 산물 (b)과 동일한 방법으로 사용된다. 실리카 컬럼(디클로로메탄/메탄올, 8:2)상에서 정제한 후에, 산물 (g)가 84% 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.9 (CHCl3/MeOH, 9:1)
HPLC: Rt= 23.95분, (H20/MeCN: 3분[40/60], 3-20분[0/100], 35분[0/100]).
Ⅴ) [NH2(CH2)3]2-N-Boc-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)17-CH3]2의 합성 (h)
과정은 상기의 실시예 5와 동일한 방법으로 실행된다. 산물 (h)는 산물 (g)에 비해 73% 수율로 수득된다.
TLC: Rf= 0.28 (CHCl3/MeOH, 9:1)
HPLC: Rt= 20.59분, (H20/MeCN: 3분[40/60], 3-20분[0/100], 35분[0/100]).
MH+: 838
Ⅵ) 화합물 (6)의 합성
과정은 상기의 실시예 5와 동일한 방법으로 실행된다. 따라서 화합물 (6)이 68% 수율로 수득된다.
HPLC: Rt= 15.83분, (H20/MeCN: 3분[40/60], 3-20분[0/100], 35분[0/100]).
1H-NMR-스펙트럼(500 MHz, (CD3)2SO d6, ppm으로 δ): 0.88(t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.15 내지 1.35(mt, 60H: 지방쇄의 중심 (CH2)15); 1.46 및 1.54(2 mts, 각각 2H: 각 지방쇄의 1 CH2); 1.80 내지 2.00(mt, 6H: 프로필의 중심 CH2및 1,4,5,6-테트라하이드로피리미딘의 CH2); 2.85 내지 3.05(mt, 10H: 프로필의 NCH2및 1,4,5,6-테트라하이드로피리미딘의 NCH2); 3.15 내지 3.45(mt: 1,4,5,6-테트라하이드로피리미딘의 =NCH2및 지방쇄의 =NCH2에 상응하는 6H); 3.81(비분할 화합물, 2H: NCH2CON); 4.04(d, J = 5 Hz, 2H = 글리실의 CONCH2CON); 7.88 = 8.61 - 8.74 및 8.99(4개의 비분할 화합물, 총 8H: 상호교환적이고 CF3COOH의 OH).
MH+: 832
B/ 본 발명에 따른 형질감염제의 용도
실시예 7: 뉴클레오리피드 복합체의 제조
본 실시예는 본 발명에 따른 뉴크레오리피드 복합체의 제조를 설명한다.
본 실시예에서 사용되는 화합물은 클로로포름 용액내 화합물 (1)이다. DNA ㎍당 화합물 (1) 10 nmol(즉 11.8 ㎍)이 사용된다. 일부 경우에는, 중성 공-지질, 콜레스테롤 또는 DOPE가 화합물과 미리 혼합된다. 클로로포름이 약간의 아르곤 스트림으로 증발되면 순수한 지질 필름이 형성되고, 이어서 4℃에서 밤새 5% 덱스트로즈와 10 mM 나트륨 클로라이드의 혼합물에서 재수화된다. 이어서 샘플을 5분 동안 초음파로 처리하고, 65℃에서 30분 동안 가열하며 최종적으로 5분 동안 초음파로 다시 처리한다. 지질 현탁액이 이렇게 수득되고 이들이 사용될 때까지 4℃에서 저장한다.
사용된 DNA는 0.5 mg/㎖ 또는 1.0 mg/㎖의 농도에서 5% 덱스트로즈와 20 mM 나트륨 클로라이드의 혼합물 용액중 플라스미드 pXL2774(도 2)이다. 플라스미드 pXL2774는 하기 특징을 가진다:
- 50 EU/mg 이하의 내독소 수준,
- 60% 이상의 초나선 DNA 수준,
- 5% 이하의 RNA, 즉 mRNA, tRNA 및 리보솜 RNA 함량(HPLC에 의해 측정),
- 1% 이하의 염색체 DNA의 수준,
- 1% 이하의 단백질 함량,
- 15 모스몰/kg 이하의 오스몰랄농도.
본 발명에 따른 뉴클레오리피드 복합체는 상기에서 설명된 것처럼 등적의 DNA 용액과 지질 현탁액을 신속하게 혼합함으로써 제조된다. DNA와 복합체를 이룬 화합물의 양은 0.5 nmol/DNA ㎍ 내지 12 nmol/DNA ㎍로 다양하다.
실시예 8: 상이한 전하비에서 형성된 복합체의 행동
본 실시예는 상이한 전하비에서 본 발명에 따른 뉴클레오리피드 복합체의 행동을 설명한다. 중성 공-지질의 첨가 효과 또한 설명된다.
복합체의 크기는 우선 Coulter N4plus 장치로 다이나믹 광산란(Dynamic Laser Light Scattering)에 의해 유체역학적 직경을 측정함으로써 분석된다. 샘플을 5% 덱스트로즈와 20 mM 나트륨 클로라이드를 함유하는 용액으로 20배 희석하여 다중 분산을 회피한다. 사이클로아미딘 그룹, 지질 조성물 및 전하비의 본 발명에 따른 뉴클레오리피드 복합체의 크기에 끼치는 영향은 이렇게 연구되었다.
세가지 가능한 상을 본 발명에 따른 화합물 (1)과 DNA의 전하비가 증가할 때 구별할 수 있다. 이러한 세가지 상은 화합물 (1)의 치료능을 결정한다. 도 3은 화합물 (1)에 대해 이러한 세가지 상을 설명한다. 동일한 행동이 본 발명에 따른 다른 화합물에 대해서도 관찰될 수 있다.
낮은 전하비에서, DNA는 화합물 (1)로 포화되지 않는다. 네이키드 DNA는 여전히 남아있고, 복합체는 총체적으로 음으로 하전된다. 입자는 크기가 작다(100 내지 300 nm). 이 상은 "상 A"라고 불린다.
DNA가 화합물 (1)로 완전히 포화되지 않는다는 사실은 DNA가 이에 의해 완전히 보호되지 않음을 의미한다. 그러므로 DNA는 효소(DNAse)에 의해 분해될 수 있다. 또한, 복합체가 전체적으로 음성이기 때문에, 세포막 횡단이 어렵다. 이러한 이유 때문에, 상 A의 뉴클레오리피드 복합체는 형질감염 효율이 훨씬 낮다.
중간 전하비에서, DNA는 화합물 (1)로 완전히 포화되고, 복합체는 중성이거나 전체적으로 약간 양성이다. 이 상은 이온 반발이 최소이기 때문에 불안정하고 "가교결합"현상이 일어날 수 있다. 입자의 크기는 상기처럼 다이나믹 광산란에 의한 검출 한계이다(3 ㎛보다 훨씬 크다). 이 불안정한 상은 "상 B"라고 불린다. 이러한 복합체의 크기는 주사에 의한 사용에 부적당하다. 그러나, 이것이 반드시 복합체가 상 B에서 불활성이지만, 이들이 약학적 목적으로 이들의 주사에 적당하지 않는 제형물에서만 활성임을 의미하지는 않는다.
비교적 높은 전하비에서, DNA는 화합물 (1)로 과포화되고, 복합체는 전체적으로 양성이다. 양전하 사이의 강력한 반발 때문에, 이 상은 안정하다. 이는 "상 C"라는 용어로 표시된다. 상 A와 달리, 뉴클레오리피드 복합체는 DNA가 효소에 대해 매우 잘 보호되고, 이들의 총 양전하가 음이온 특성의 세포막 횡단을 촉진하도록 하는 형태이다. 그러므로 상 C 복합체는 핵산의 세포로의 전달에 사용하기에 특히 적당하다.
본 발명에 따른 화합물의 사이클로아미딘 그룹 외에, 중성 공-지질의 사용은 도 3에서 설명된 것처럼, 복합체의 안정성에 강력한 영향을 끼친다. 첨가된 공-지질은 DOPE(양이온 지질/DOPE = 3/2) 또는 콜레스테롤(양이온 지질/콜레스테롤 = 3/1)이다. 일반적으로, 중성 공-지질의 첨가는 복합체의 불안정성을 증가시키고, 이는 상 C를 수득하는 데 요구되는 화합물 양의 증가를 야기한다. 이는 상 C가 공-지질의 존재하에 및 부재하에 수득되는 전하비가 비교되는 도 3에서 매우 확실히 설명된다.
세가지 상 A, B 및 C를 정하는 전하비 값은 사용되는 화합물에 따라 좌우된다는 것을 주목해야 한다. 따라서, 이러한 값은 화합물 별로 매우 다양하게 변할 수 있다.
최종적으로, 전하비의 함수로서 DNA에 대한 화합물의 친화력이 연구되었다. 이를 위해, 에티듐 브로마이드(EtBr) 3 ㎍의 첨가 후에 형광의 감소를 측정한다. 실제로, 화합물에 의한 DNA의 에티듐 브로마이드의 대체는 DNA와의 결합을 나타낸다.
사용된 제형물을 ㎖당 DNA 25 ㎍의 최종농도로 20배 희석한다. 네이키드 DNA에 대해 측정된 상대 형광은 100%인 것으로 정의된다. 화합물 (1)과의 결합 수준은 샘플의 상대 형광의 감소로 나타낸다. 도 3은 전하비가 증가하면 형광이 감소하고, 이는 화합물 (1)의 더 다량이 DNA와 결합하는 데 이용됨을 의미한다고 보여준다(형광이 더 많이 감소할수록, 더 다량의 화합물이 포화가 달성될 때까지 DNA와 결합한다).
이 방법에서, 본 발명에 따른 화합물 (1)의 DNA에 대한 친화력이 사이클로아미딘 그룹에 의해 결정되지만, 공-지질의 첨가에 의해서는 그렇지 않음이 보여진다.
실시예 9: 화합물 (1)으로의 시험관내 형질감염
본 실시예는 본 발명에 따른 화합물 (1)의 DNA를 세포에 시험관내 형질감염시키는 능력을 비제형된 DNA와 비교하여 설명한다.
24-웰 마이크로플레이트를 웰당 60,000 HeLa 세포(ATCC)로 접종하고, 24시간 후에 형질감염시킨다. DNA 1 ㎍을 함유하는 복합체를 DMEM 배양 배지(Gibco/BRL) 0.5㎖에 혈청의 부재하에 희석시킨 다음, 각 웰에 첨가한다. 세포를 4시간 동안 37℃에서 배양한다. 이어서 복합체를 함유하는 배양액을 제거하고 DMEM과 10% 태 소 혈청의 혼합물로 대체한다. 다음에, 다시 세포를 24시간 동안 배양한다. 최종적으로, 세포를 용해시켜 루시퍼라제 시험 키트(Promega)와 Dynex MLX 루미노미터를 사용하여 시험한다.
도 4에 나타난 결과는 완전히 포화된 본 발명에 따른 화합물 (1)/DNA 복합체와 비교한 네이키드 DNA의 성능 사이의 차이점을 나타낸다: 루시퍼라제 활성은 네이키드 DNA의 시험관내 형질감염 후에 검출될 수 없고(장치의 민감성은 웰당 1 pg 이하이다), 반면 본 발명에 따른 복합체의 유전자 전달 활성은 200 pg/웰 내지 8000 pg/웰로 다양하다.
그러므로 본 실시예는 시험관내 세포의 형질감염을 위한 본 발명에 따른 화합물 (1)의 유리한 용도를 확실히 보여준다.
실시예 10: 화합물 (3), (5) 및 (6)으로의 시험관내 형질감염
본 실시예는 본 발명에 따른 화합물(3), (5) 및 (6)의 DNA를 세포에 시험관내 형질감염시키는 능력을 비제형된 DNA와 비교하여 설명한다.
형질감염은 HeLa 세포로 선행 실시예 9의 프로토콜에 따라 실행될 수 있다. 결과는 도 5, 6 및 7에서 설명된다. 따라서 이러한 3가지 화합물이 시험관내에서 양호한 형질감염 수준을 가짐이 관찰된다.
실시예 11: 화합물 (1)의 생체내 형질감염
본 실시예는 본 발명에 따른 화합물 (1)의 생체내 세포에 DNA를 형질감염시키는 능력을 비제형된 DNA 및 출원 WO 97/18185에 설명되고 이의 구조가 도 1에 도시된 화학식 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)17CH3]2를 가지는 지질 A와 비교하여 설명한다.
생체내 유전자 전달은 근육내 및 정맥내 투여에 의해 Balb/C 마우스에서 실행된다. 비교되는 제형물은 네이키드 DNA의 제형물, 지질 A를 함유하는 제형물 또는 본 발명에 따른 화합물 (1)을 함유하는 제형물이다.
근육내 주사의 경우에, 각 마우스는 종아리의 전면 근육에 DNA 15 ㎍를 함유하는 제형물 30 ㎕를 투여받는다. 조직을 주사 7일 후에 회수하고, 이들은 루시퍼라제 활성 시험의 실행을 기다리는 동안 동결시켜 -80℃에서 저장한다. 루시퍼라제 활성의 측정은 실시예 8에서처럼 실행된다. 정맥내 경로에 의한 주사의 경우에, 각 마우스는 DNA 50 ㎍을 함유하는 제형물 200 ㎕을 투여받는다. 조직을 이 경우에는 주사 24시간 후에 회수하고 이어서 상기와 동일한 방법으로 동결시켜 저장한다.
생체내 유전자 전달의 결과는 도 8과 9에 제시되었다. 화합물 (1)과 DNA의 비는 DNA ㎍당 10 nmol이다. 지질 A와 DNA의 비는 DNA ㎍당 4 nmol이다.
도 8은 네이키드 DNA 및 지질 A와 비교한 본 발명에 따른 화합물 (1)의 근육에서 생체내 활성을 설명한다. 루시퍼라제 활성의 수준은 네이키드 DNA와 화합물 (1) 사이에 동등하고, 또한, 후자는 지질 A와 비교하여 매우 향상된 활성을 가짐이 관찰된다. 관여한 전달 메카니즘은 네이키드 DNA와 본 발명에 따른 화합물 (1)의 사용 사이에 상이한 것 같다. 실제로, 사용된 본 발명에 따른 복합체는 유리 DNA(상 C)를 함유하지 않고, 추가로, 이들의 시험관내 결과는 네이키드 DNA에 대한 것보다 상당히 크다.
도 9는 정맥내 경로 및 근육내 경로에 의한 본 발명에 따른 화합물 (1), 네이키드 DNA 및 지질 A의 활성을 비교한다.
형질감염 효율은 지질 A와 화합물 (1)에 대해서는 정맥내 경로에 의해 대략 동일하다. 반면, 근육내 경로에 의해서는, 본 발명에 따른 화합물 (1)의 형질감염 효율은 지질 A의 그것보다 꽤 상당히 크다.
네이키드 DNA와 비교하면, 화합물 (1)은 정맥내 경로에 의한 형질감염, 또한 적어도 동등한 정맥내 경로에 의한 형질감염을 나타낸다.
그러므로 본 발명에 따른 화합물 (1)로의 생체내 핵산 전달 효율은 공지의 양이온 지질인 지질 A 및 비제형된 DNA의 그것보다 전체적으로 큰 것 같다.
최종적으로, 본 발명에 따른 복합체는 네이키드 DNA의 형질감염과 비교하여, 뉴클레아제에 의한 분해로부터 DNA를 보호하여, 제형물 안정성의 상당한 향상에 기여하는 장점을 가지는 것 같다. 본 발명의 화합물은 또한 여기에서 다시 제형물의 안정성을 향상시키는, 동결건조하는 동안의 손상으로부터 DNA를 보호하는 데 사용될 수 있다.
실시예 12: 화합물 (5)와 (6)의 생체내 형질감염
본 실시예는 효율적인 방법으로 핵산을 생체내 형질감염시키는 화합물 (5)와 (6)의 능력을 설명한다.
선행 실시예와 동일한 프로토콜이 사용된다. 도 10은 공-지질 없이 DNA로 0.25:1의 전하비로 제형된, 화합물 (5)와 (6)이, i.m. 주사 48시간 후에 네이키드 DNA보다 크거나 네이키드 DNA와 동등한 생체내 형질감염 수준을 보임을 보여준다.
하기 표는 다양한 제형으로 화합물 (5)와 (6)으로 수득된 결과를 제시한다.
화합물 화합물/DNA 전하비 공 지질 RLU/폐 pg/폐 투여경로
화합물(5) 6/1 DOPE (1:1) 254.9 1611.3 i.v.
화합물(5) 8/1 DOPE (1:1) 535.2 3558.1 i.v.
화합물(5) 0.5/1 Chol. (3:1) 209.6 1330.5 i.m.
화합물(5) 0.5/1 DOPE (1:1) 155.8 974.6 i.m.
화합물(6) 6/1 - 175.1 1098.7 i.v.
화합물(6) 5/1 DOPE (1:1) 407.7 2700.8 i.v.
화합물(6) 0.5/1 DOPE (1:1) 1768.7 13005.4 i.m.

Claims (28)

  1. D, L 또는 DL형의 화학식 Ⅰ의 화합물 및 이의 염:
    화학식 Ⅰ
    CA-Rep-R
    상기식에서,
    ① CA는 화학식 Ⅱ의 사이클로아미딘 그룹과 이의 메소머 형태를 나타내고,
    ② Rep는 부재하거나 화학식 Ⅵ의 스페이서이며,
    ③ R은 화학식 Ⅵ의 Rep 그룹의 카보닐 작용기에 결합하거나, Rep가 부재한다면, R은 CA 그룹에 직접 결합하고,
    * R6및 R7이 서로 독립적으로, 수소원자 또는 임의로 불소화되고, 직쇄 또는 측쇄이며, 포화 또는 불포화된 1 내지 22개의 탄소원자를 함유하는 지방족 라디칼을 나타내고, 두 치환체 R6또는 R7중 적어도 하나가 수소와 상이하고 다른 하나는 10 내지 22개의 탄소원자를 함유하는 화학식 NR6R7의 그룹,
    * 또는 스테로이드 유도체,
    * 또는 화학식 Ⅷ의 그룹을 나타낸다.
    화학식 Ⅱ
    [상기식에서,
    ㆍ m과 n은 서로 독립적으로 0 내지 3의 정수이고 m+n은 1이상이며,
    ㆍ R1은 화학식 Ⅲ(여기에서, p와 q는 서로 독립적으로 0 내지 10의 정수이고, Y는 카보닐, 아미노, 메틸아미노 또는 메틸렌 그룹을 나타내며, Y가 상이한 그룹 [(CH2)p-Y]내에서 상이한 의미를 가지는 것도 가능하며, (*)은 수소 원자를 나타내거나 Rep 그룹에 결합하기 위한 부위이며, R1은 Z를 포함하여, 화학식 Ⅱ의 임의 원자에 결합할 수 있고, 화학식 Ⅱ에는 R1단일그룹이 있다고 이해된다)의 그룹을 나타내며,
    ㆍ X는 R2가 수소 원자이거나 상기에서 정의된 R1그룹과 결합하는, NR2또는 CHR2그룹을 나타내며,
    ㆍ그룹은:
    *첫번째 경우: 화학식 Ⅳ(여기에서, W'는또는를 나타내고,및는 서로 독립적으로, 수소 원자, 메틸을 나타내거나 상기에서 정의된 R1그룹과 결합한다)의 그룹, 또는
    *두번째 경우: 화학식 Ⅴ(여기에서, W'는또는을 나타내고,및는 서로 독립적으로, 수소 원자, 메틸을 나타내거나 상기에서 정의된 R1그룹과 결합한다)의 그룹을 나타낸다.]
    화학식 Ⅵ
    [상기식에서,
    질소 원자는 X, V, W 또는 Z 원자 또는 경우에 따라 R1그룹의 치환체 Y에 결합하고,
    ㆍ t는 0 내지 8의 정수이고,
    ㆍ r은 0 내지 10의 정수이고, r은 상이한 그룹 -NR4-(CH)r- 내에서 상이한 의미를 가질 수도 있으며,
    ㆍ 상이한 그룹 NR4-(CH)rR3내에서 상이한 의미를 가질 수 있는 R3은 수소 원자, 메틸 그룹 또는 화학식 Ⅶ의 그룹(여기에서 u 는 1 내지 10의 정수이고, s는 상이한 그룹 -(CH2)s-NR5내에서 상이한 의미를 가질 수 있는 2 내지 8의 정수이며, R5는 수소 원자, 상기에서 정의된 CA 그룹이며, CA 그룹은 서로로부터 독립적이고 상이할 수 있거나, 화학식 Ⅶ의 그룹이라고 이해되며, 화학식 Ⅶ의 그룹은 서로 독립적이고 상이한 의미를 가질 수 있다고 이해된다)을 나타내며,
    ㆍ R4는 R3과 동일한 방법으로 정의되거나 상기에서 정의된 CA 그룹을 나타내며, CA 그룹은 서로 독립적이고 상이할 수 있다고 이해된다.]
    화학식 Ⅷ
    [상기식에서,
    x는 1 내지 8의 정수이며,
    y는 1 내지 10의 정수이며,
    Q는 R6과 R7이 상기에서 정의된 바와 같은 C(O)NR6R7그룹을 나타내거나,
    Q는 R8이 화학식 Ⅸ(여기에서, z는 2 내지 8의 정수이고, R9는 임의로 불소화되고, 포화 또는 불포화된 8 내지 22개의 탄소 원자를 지니는 지방족 라디칼 또는 스테로이드 유도체이며, 두 치환체 R6은 서로 독립적으로, 상기에서 정의된 바와 같다)의 그룹 또는 R9가 상기에서 정의된 바와 같은 -O-R9그룹을 나타내는 C(O)R8그룹을 나타낸다.]
  2. 제 1 항에 있어서, 그룹 R1이 한편으로는 Z 또는 V에 다른 한편으로는 Y를 통해 그룹 Rep에 결합함을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제 1 항에 있어서, 화학식 Ⅱ 화합물의 사이클로아미딘 헤드 CA가 5, 6, 7 또는 8멤버를 포함함을 특징으로 화합물.
  4. 제 1 항에 있어서, R3이 수소 원자 또는 메틸을 나타내고 R4가 제 1 항에서 정의된 바와 같거나, 화학식 Ⅵ에 존재하는 R3및 R4가 수소 원자를 나타내거나, R4가 수소 원자이고 R3은 R5가 CA를 나타내는 화학식 Ⅶ의 그룹임을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제 1 항에 있어서, 화학식 Ⅴ에서, p와 q가 서로 독립적으로 2, 3 또는 4로부터 선택됨을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제 1 항에 있어서, R6및 R7그룹이 동일하거나 상이하고 각각이 임의로 불소화되고, 직쇄 또는 측쇄이며, 포화 또는 불포화된 10 내지 22개의 탄소 원자를 함유하는 지방족 쇄를 나타냄을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제 1 항에 있어서, R6및 R7그룹이 동일하거나 상이하고 각각이 임의로 불소화되고, 직쇄 또는 측쇄이며, 포화 또는 불포화된 12, 14, 16, 17, 18 또는 19개의 탄소 원자를 함유하는 지방족 쇄를 나타냄을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제 1 항에 있어서, R이 스테로이드 유도체일 때, 스테로이드 유도체가 콜레스테롤, 콜레스탄올, 3-α-5-사이클로-5-α-콜레스탄-6-β-올, 콜산, 콜레스테릴 포메이트, 콜레스탄일 포메이트, 3α,5-사이클로-5α-콜레스탄-6β-일 포메이트, 콜레스테릴아민, 6-(1,5-디메틸헥실)-3a,5a-디메틸헥사데카하이드로사이클로펜타[a]사이클로프로파[2,3]사이클로펜타[1,2-f]-나프탈렌-10-일아민 또는 콜레스탄일아민으로부터 선택됨을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제 1 항에 있어서, 화학식:
    화합물 (1)
    화합물 (2)
    화합물 (3)
    화합물 (4)
    화합물 (5)
    화합물 (6)
    의 화합물.
  10. 사이클로아미딘 작용기(들)를 운반하는 빌딩 블록의 합성이 실행된 다음 이들 빌딩 블록이 스페이서가 구비된 지질상에 그래프팅됨을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 제조방법.
  11. 유사 리포폴리아민의 합성이 실행된 다음 사이클로아미딘 그룹으로의 사이클화가 실행됨을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 8 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 제조방법.
  12. 적어도 하나의 화학식 1 화합물을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 화학식 1의 화합물과 핵산을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 12 항 또는 13 항에 있어서, 또한 하나 이상의 보조제를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 보조제(들)가 두 지방쇄를 함유하는 하나 이상의 중성 지질임을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 중성 지질이 양쪽성이온이거나 생리학적 조건하에서 이온 전하가 결여된 천연 또는 합성 지질이고, 예를 들면 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디-스테아로일, -팔미토일, -미리스토일포스파티딜에탄올아민 및 1 내지 3회 N-메틸화된 이들의 유도체, 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로사이드(예를 들면, 특히 갈락토세레브로사이드), 스핑고리피드(예를 들면, 특히 스핑고미엘린) 또는 아시알로강글리오사이드(예를 들면, 특히 아시알로GM1 및 GM2)로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 14 항에 있어서, 보조제가 직접적으로 또는 간접적으로 핵산의 응축에 관여하는 화합물임을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 보조제가 전체적으로 또는 부분적으로 프로타민, 히스톤 또는 뉴클레올린 및/또는 이들의 유도체 중 하나로부터 유도되거나, 전체적으로 또는 부분적으로, 펩타이드 단위 (KTPKKAKKP) 및/또는 (ATPAKKAA)로 이루어지며, 단위수가 2 내지 10일 수 있으며 연속적으로 또는 불연속적으로 반복됨을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 12 항 내지 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 또한 하나 이상의 비이온 계면활성제(들)를 뉴클레오리피드 복합체의 입자 크기 안정화 충분량으로 함유함을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 12 항 내지 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 주사용 제형을 위한 약학적으로 허용되는 비히클을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 12 항 내지 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 및/또는 점막에 적용하기 위한 약학적으로 허용되는 비히클을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 13 항에 있어서, 핵산이 데옥시리보핵산 또는 리보핵산임을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서, 핵산이 하나 이상의 프로모터의 조절하에 있는 하나 이상의 치료용 유전자 및 표적 세포에서 활성인 전사 종결자로 이루어진 발현 카세트를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  24. 질환 치료용 약제의 제조를 위한 제 1 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 정의된 화합물의 용도.
  25. 핵산의 세포로의 근육내 경로에 의한 전달로 질환을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 제 1 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  26. (1) 핵산을 상기에서 정의된 화학식 1의 화합물과 접촉하게 하여, 뉴클레오리피드 복합체를 형성하고,
    (2) 세포를 (1)에서 형성된 뉴클레오리피드 복합체와 접촉하게 하는 단계를 포함하는 핵산의 세포로의 전달방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 핵산 및/또는 화합물이 하나 이상의 보조제와 미리 혼합됨을 특징으로 하는 핵산의 세포로의 전달방법.
  28. 단백질을 암호화하거나 질환을 치료할 수 있는 핵산으로 전사될 수 있는 핵산(화학식 Ⅰ의 화합물과 결합한다)의 투여에 의한 질병의 치료방법.
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